(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のa)およびb)：
a) 以下の(i)または(ii)から選択されるGPVI タンパク質:
(i)そのアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸 1〜267によって表されるGPVIの細胞外ドメイン;
(ii) (i)のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により (i)のGPVI の細胞外ドメインと異なっており、かつ、コラーゲンに結合することができる(i)のGPVI の細胞外ドメインの変異体、
b)以下の(iii)または(vi) から選択されるFc 部分:
(iii)そのアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸 273〜504によって表される免疫グロブリンのFc ドメイン;
(iv) (iii) のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により(iii)の免疫グロブリンのFc ドメインと異なっており、かつ、融合タンパク質をコラーゲンとの結合が可能な形態で生産することを可能とすることが出来る(iii)の免疫グロブリンのFc ドメインの機能保存変異体、
を含み、該GPVIタンパク質とFcタンパク質とがアミノ酸配列 Gly-Gly-Argを特徴とするリンカーを介して融合している融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項1の融合タンパク質。
【化１】
0004722480.tif 000007
（配列番号１）
【請求項３】
１または数個のアミノ酸においてグリコシル化されている請求項1または２のいずれかの融合タンパク質。
【請求項４】
ホモ二量体融合タンパク質である請求項1〜３のいずれかの融合タンパク質。
【請求項５】
２つの単量体が共有結合している請求項４の融合タンパク質。
【請求項６】
蛍光標識されている請求項４または５の融合タンパク質。
【請求項７】
その配列が以下の群から選択される核酸:
a)配列番号２の核酸
b)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸
c)配列番号１のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により配列番号１のタンパク質と異なっており、かつ、コラーゲンと結合することが出来るタンパク質をコードする核酸、ただし、該核酸は配列番号１のアミノ酸残基２７０−２７２に対応する位置においてアミノ酸残基Gly-Gly-Argを有するタンパク質をコードする。
【化２】
0004722480.tif 000008
（配列番号２）
【請求項８】
配列番号２の配列からなる請求項７の核酸。
【請求項９】
請求項７または８のいずれかの核酸にコードされるタンパク質。
【請求項１０】
請求項７または８のいずれかの核酸によってコードされる２本のポリペプチド鎖を含み、各鎖が鎖間ジスルフィド結合によって他方の鎖のヒンジ領域に連結しているヒンジ領域を有する、アテローム性動脈硬化症の治療または予防のための抗アテローム硬化性医薬組成物。
【請求項１１】
請求項７または８のいずれかの核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項1〜３のいずれかの融合タンパク質または請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質を発現する細胞。
【請求項１３】
請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項 1の融合タンパク質のホモ二量体であるイムノアドヘシンを含む医薬組成物。
【請求項１５】
イムノアドヘシンが配列番号１のポリペプチドのホモ二量体である請求項１４の医薬組成物。
【請求項１６】
静脈内用調製物である請求項１４または１５の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質を含む、患者におけるアテローム性動脈硬化症の治療または予防のための医薬組成物。
【請求項１８】
アテローム進行の予防のための請求項１７の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質を含む、患者における動脈内血栓症の予防のための医薬組成物。
【請求項２０】
患者が急性冠症候群または頸動脈症候群に罹患しており、かつ、活動性動脈内病変を有する、請求項１９の医薬組成物。
【請求項２１】
糖尿病のアテローム硬化性合併症の治療のための、請求項１７〜２０のいずれかの医薬組成物。
【請求項２２】
請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質、またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質を含む、心筋梗塞および/または脳卒中の治療または予防のための医薬組成物。
【請求項２３】
経口、皮下、腹腔内または静脈内投与用の請求項１７〜２２のいずれかの医薬組成物。
【請求項２４】
融合タンパク質0.5〜6.0 mg/kgを送達するための剤形である請求項１７〜２３のいずれかの医薬組成物。
【請求項２５】
GPVIとコラーゲンとの結合の阻害剤をインビトロでスクリーニングするための請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質の使用。
【請求項２６】
ホモ二量体融合タンパク質が蛍光標識されている請求項２５の使用。
【請求項２７】
以下の工程を含む糖タンパク質 VIのコラーゲンへの結合の阻害剤をインビトロでスクリーニングする方法:
(i)コラーゲンを露出する表面を提供する工程;
(ii)該表面の一部分と、請求項４または５の融合タンパク質またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質とを、該融合タンパク質の該表面への結合を可能とするあらかじめ決められた条件下で接触させる工程;
(iii)該表面の別の部分と、該融合タンパク質とを、工程(ii)の条件下で被験化合物の存在下で接触させる工程;
(iv)該被験化合物の非存在下および存在下での該表面に結合した該融合タンパク質の量を測定する工程;
(v)被験化合物の非存在下と比較して該被験化合物の存在下において該表面への該融合タンパク質の結合が少なければ該被験化合物を阻害剤として同定する工程;および、
(vi)血小板凝集および/または血小板活性化に対する該阻害剤の機能的効果を測定する工程。
【請求項２８】
請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質の、GPVIに媒介される血小板の活動性血管内病変への付着の阻害剤をインビトロでスクリーニングするための使用。
【請求項２９】
請求項４または５のホモ二量体融合タンパク質またはホモ二量体形態の場合の請求項９のタンパク質を免疫原として使用することを含む非ヒト哺乳類からのモノクローナル抗体の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的な糖タンパク質ＶＩドメインを含むイムノアドヘシンに関する。本発明のイムノアドヘシンは、二量体の形でイムノアドヘシンを生成する特定のプロセスによって得られる。本発明はまた、特定グループの患者における動脈内血栓の予防用の医薬品を調製するための糖タンパク質ＶＩイムノアドヘシンの使用に関する。さらに、本発明は、アテローム進行の予防および治療用の医薬品を調製するための糖タンパク質ＶＩイムノアドヘシンの使用に関する。本発明はまた、糖尿病患者におけるアテローム性動脈硬化症の慢性進行の予防および治療用の医薬品を調製するための糖タンパク質ＶＩイムノアドヘシンの使用に関する。本発明はまた、ＧＰＶＩを介した血小板の活性血管内病変への接着を阻害する剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性冠状動脈または頚動脈症候群は、西欧社会における主な死亡原因である。このような心血管系の事象をなんとか生き延びた場合でも、多くの患者は、心筋梗塞や脳卒中へとつながる血管内血栓症などの致命的な合併症に苦しむことになる。
【０００３】
血管内血栓症は、血管内で血小板が凝集した結果であり、それによって、血管内の血流がひどく低下し、あるいは完全に阻害されることがある。特に、アテローム斑の破裂によって下流組織の動脈血栓症から虚血に至る事象のカスケードが引き起こされ、心筋梗塞や虚血性脳卒中などが起こる。血管損傷に対する最初の応答は、循環している血小板が露出した内皮下基質タンパク質へ接着することであり、これによってその後の血小板凝集が誘発される。内皮下層の巨大分子成分のうち、線維性コラーゲンは、血小板の強力な活性化因子として働き、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも血小板接着を起こすので、最も血栓形成性の高い成分であると考えられている（１〜３）。
【０００４】
コラーゲン受容体らしいと報告されている血小板膜タンパク質には、ＧＰＩｂαおよびインテグリンαＩＩｂβ３などの、コラーゲンに結合したフォンビルブランド因子（ｖＷｆ）を介してコラーゲンと間接的に相互作用するもの、ならびにＧＰＶＩ、インテグリンα２β１、およびＣＤ３６などのコラーゲンと直接的に相互作用するものに分けることができる（（２）にその総説がある）。最近、血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）が主要な血小板コラーゲン受容体として同定された（４）。ＧＰＶＩは、６０〜６５ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する（５；６）。ヒトおよびマウス血小板では、ＧＰＶＩは、細胞表面でＦｃＲγ鎖と複合体を形成する（７；８）。ＧＰＶＩと結合するリガンドは、Ｆｃ受容体ｇ鎖のＩＴＡＭモチーフのチロシンリン酸化を誘発して（９〜１３）Ｓｙｋキナーゼ、ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６、およびホスホリパーゼＣと続く下流へのシグナル伝達を開始する。ＧＰＶＩが欠損した血小板では、コラーゲン誘導性接着およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝集が起こらない４；１４）。同様に、機能をブロックする抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体は、コラーゲンおよびコラーゲン三重らせん体を模倣するコラーゲン関連ペプチドＣＲＰに対するｅｘ  ｖｉｖｏの血小板凝集を軽減する（１５；１６）。
【０００５】
血小板の凝集による合併症の問題は、血小板凝集の阻害剤を投与することによって対処できることが知られている。急性冠状動脈症候群を治療する場合、ＲｅｏＰｒｏなどのＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤は、患者の予後を著しく改善する。しかし、最近の臨床試験メタアナリシスの結果から、最適な血栓症予防処置にもかかわらず、死亡または心筋梗塞のリスクがかなり残ることが明らかになった（Ｂｏｅｒｓｍａ  Ｅ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＲＡ、Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ  ＤＪ、Ｗｈｉｔｅ  Ｈ、Ｔｈｅｒｏｕｘ  Ｐ、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｒｆ  Ｆ、ｄｅ  Ｔｏｒｂａｌ  Ａ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＰＷ、Ｗａｌｌｅｎｔｉｎ  ＬＣ、Ｗｉｌｃｏｘ  ＲＧ、Ｓｉｍｅｓ  Ｊ、Ｃａｌｉｆｆ  ＲＭ、Ｔｏｐｏｌ  ＥＪ、Ｓｉｍｏｏｎｓ  ＭＬ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｌ  ｍａｊｏｒ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３５９：１８９〜９８頁）。この治療法特有の深刻な副作用は、出血性合併症である。これらは患者の２．４％に発生し、治療した患者のほぼ０．１％に最も重い脳内出血が発生する。ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体遮断薬の機構的な欠点がいくつか明らかになっている。これが次善の有効性および副作用の原因である（Ｄｉｃｋｆｅｌｄ  Ｔ、Ｒｕｆ  Ａ、Ｐｏｇａｔｓａ−Ｍｕｒｒａｙ  Ｇ、Ｍｕｌｌｅｒ  Ｉ、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ  Ｂ、Ｔａｕｂｉｔｚ  Ｗ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｊ、Ｍｅｉｅｒ  Ｏ、Ｇａｗａｚ  Ｍ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ−ＩＩＩａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．２００１；１０１：５３〜６４頁．Ｇａｗａｚ  Ｍ、Ｎｅｕｍａｎｎ  ＦＪ、Ｓｃｈｏｍｉｇ  Ａ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｏｒｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９；９９：Ｅ１〜Ｅ１１頁）。
【０００６】
血小板凝集を阻害すると、血小板の凝集能力が損なわれる。その結果、好ましくない血栓形成だけでなく、出血を止めるという血小板の一般的な能力も影響を受ける。したがって、血小板凝集阻害剤の投与は本来的に、さらに致命的な合併症を起こす可能性のある出血などの深刻な副作用をひき起こす。これらの副作用は当然、糖尿病患者においてはさらに問題となる。
【０００７】
糖尿病は、アテローム性動脈硬化症に関する主なリスク因子の１つである。さらに、糖尿病は、致命的な合併症のリスクが増え、急性血管症候群特に冠状動脈症候群を示す患者では死亡率が高くなる。不安定狭心症にかかっている糖尿病患者は、非糖尿病患者と比べてプラーク潰瘍および冠内血栓の発生率が高い（Ｂｉｏｎｄｏ−Ｚｏｃｃａｉ  ＧＧＬ；Ａｂｂａｔｅ  Ａ；Ｌｉｕｚｚｏ  Ｇ、Ｂｉａｓｕｃｃｉ  Ｌ：Ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４１；１０７１〜１０７７頁；２００３）。
【０００８】
血小板がアテローム性動脈硬化症の悪化における主な引き金であることがだんだんと分かってきている。アテローム悪化と、血小板応答性の増大および糖尿病との関連は、いまのところわかっていない。糖尿病患者はアテローム性動脈硬化症の程度に関係なく急性血管合併症にかかるが、これは糖尿病性急性血管合併症およびアテローム硬化性急性血管合併症の発生において異なる現在未知の血小板活性化のメカニズムがあることを示す。
【非特許文献１】Ｂｏｅｒｓｍａ  Ｅ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＲＡ、Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ  ＤＪ、Ｗｈｉｔｅ  Ｈ、Ｔｈｅｒｏｕｘ  Ｐ、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｒｆ  Ｆ、ｄｅ  Ｔｏｒｂａｌ  Ａ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＰＷ、Ｗａｌｌｅｎｔｉｎ  ＬＣ、Ｗｉｌｃｏｘ  ＲＧ、Ｓｉｍｅｓ  Ｊ、Ｃａｌｉｆｆ  ＲＭ、Ｔｏｐｏｌ  ＥＪ、Ｓｉｍｏｏｎｓ  ＭＬ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｌ  ｍａｊｏｒ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３５９：１８９〜９８頁
【非特許文献２】Ｄｉｃｋｆｅｌｄ  Ｔ、Ｒｕｆ  Ａ、Ｐｏｇａｔｓａ−Ｍｕｒｒａｙ  Ｇ、Ｍｕｌｌｅｒ  Ｉ、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ  Ｂ、Ｔａｕｂｉｔｚ  Ｗ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｊ、Ｍｅｉｅｒ  Ｏ、Ｇａｗａｚ  Ｍ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ−ＩＩＩａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．２００１；１０１：５３〜６４頁
【非特許文献３】Ｇａｗａｚ  Ｍ、Ｎｅｕｍａｎｎ  ＦＪ、Ｓｃｈｏｍｉｇ  Ａ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｏｒｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９；９９：Ｅ１〜Ｅ１１頁
【非特許文献４】Ｂｉｏｎｄｏ−Ｚｏｃｃａｉ  ＧＧＬ；Ａｂｂａｔｅ  Ａ；Ｌｉｕｚｚｏ  Ｇ、Ｂｉａｓｕｃｃｉ  Ｌ：Ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４１；１０７１〜１０７７頁；２００３
【非特許文献５】Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｚ．Ｍ．：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７；７８、６１１〜６１６頁
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｚａｎｔｅｎ、Ｇ．Ｈ．ら．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３、６１５〜６３２頁
【非特許文献７】Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ、Ｋ．Ｊ．＆Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ、Ｊ．Ｍ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１、８６、１８９〜１９７頁
【非特許文献８】Ｍｏｒｏｉ  Ｍ、Ｊｕｎｇ  ＳＭ、Ｏｋｕｍａ  Ｍ、Ｓｈｉｎｍｙｏｚｕ  Ｋ．Ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋ  ｂｏｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８９；８４：１４４０〜１４４５頁
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ０１／１６３２１
【特許文献２】国際公開ＷＯ  ０１／００８１０
【特許文献３】米国特許第６，３８３，７７９号
【非特許文献９】Ｍｏｒｏｉ  Ｍ、Ｊｕｎｇ  ＳＭ、Ｓｈｉｎｍｙｏｚｕ  Ｋ、Ｔｚｏｍｉｙａｍａ  Ｙ、Ｏｒｄｉｎａｓ  ＡおよびＤｉａｚ−Ｒｉｃａｒｔ  Ｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８８：２０８１〜２０９２頁
【非特許文献１０】Ｍｏｒｏｉ  ＭおよびＪｕｎｇ、ＳＭ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７；７８：４３９〜４４４頁
【非特許文献１１】ＦａｙｅｄおよびＦｕｓｔｅｒ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｏｒ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１；８９：３０５〜３１６頁
【非特許文献１２】Ｈｅｌｆｔら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  Ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２；１０５：９９３〜９９８頁
【非特許文献１３】Ｓａｖａｇｅ、Ｂ．、Ｓａｌｄｉｖａｒ、Ｅ．＆Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｚ．Ｍ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｎｔｏ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  １９９６；８４、２８９〜２９７頁
【非特許文献１４】Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｓ．Ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  １６０，０００  ｄａｌｔｏｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｃａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｃｅｌｌ  １９８６；４６、９１３〜９２０頁
【非特許文献１５】Ｍｏｏｇ、Ｓ．ら．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９８、１０３８〜１０４６頁
【非特許文献１６】Ｍｏｒｏｉ、Ｍ．、Ｊｕｎｇ、Ｓ．Ｍ．、Ｏｋｕｍａ、Ｍ．＆Ｓｈｉｎｍｙｏｚｕ、Ｋ．Ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋ  ｂｏｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８４、１４４０〜１４４５頁
【非特許文献１７】Ｇｉｂｂｉｎｓ、Ｊ．Ｍ．、Ｏｋｕｍａ、Ｍ．、Ｆａｒｎｄａｌｅ、Ｒ．、Ｂａｒｎｅｓ、Ｍ．＆Ｗａｔｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｗｈｉｃｈ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｔｈｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ−ｃｈａｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７；４１３、２５５〜２５９頁
【非特許文献１８】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ、Ｂ．ら．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９３、４５９〜４６９頁
【非特許文献１９】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．ら．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  α２β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００１；２０、２１２０〜２１３０頁
【非特許文献２０】Ｓｃｈｕｌｔｅ、Ｖ．ら．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６、３６４〜３６８頁
【非特許文献２１】Ｇｏｔｏ、Ｓ．、Ｉｋｅｄａ、Ｙ．、Ｓａｌｄｉｖａｒ、Ｅ．＆Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｚ．Ｍ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｈｅａｒｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１、４７９〜４８６頁
【非特許文献２２】Ｓｉｘｍａ、Ｊ．Ｊ．、ｖａｎ  Ｚａｎｔｅｎ、Ｇ．Ｈ．、Ｂａｎｇａ、Ｊ．Ｄ．、Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｌｓ、Ｈ．Ｋ．＆ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、Ｐ．Ｇ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９５；３２、８９〜９８頁
【非特許文献２３】Ｒｅｋｈｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｔｏｏ  ｍｕｃｈ  ａｎｄ  ｎｏｔ  ｅｎｏｕｇｈ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．１９９９；４１、３７６〜３８４頁
【非特許文献２４】Ｒｅｋｈｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．ら．Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ａｍ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３；１４３、１６３４〜１６４８頁
【非特許文献２５】Ｏｐｓａｈｌ、Ｗ．Ｐ．、ＤｅＬｕｃａ、Ｄ．Ｊ．＆Ｅｈｒｈａｒｔ、Ｌ．Ａ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １９８７；７、４７０〜４７６頁
【非特許文献２６】ＫａｓｉｒｅｒＦｒｉｅｄｅ、Ａ．ら．Ｌａｔｅｒａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰ  Ｉｂ−ＩＸ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂβ３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；Ｖｏｌ  ２７７：１１９４９〜１１９５６頁
【非特許文献２７】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ．，Ｒａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｋ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｗ．，Ｚｉｒｎｇｉｂｌ，Ｈ．＆Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰｌｂ−ＩＸ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９５，８８６〜８９３頁
【非特許文献２８】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．，Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ．，Ｒａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｋ．，Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．＆Ｚｉｒｎｇｉｂｌ，Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６，２５２０〜２５２７頁
【非特許文献２９】Ｍａｓｓｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８；９２，５０７〜５１５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、血液の止血能力を維持しながら急性冠状動脈または頚動脈症候群に引き続いて起こる致命的な合併症を回避するのに有用な医薬品を提供することが本発明の課題である。
【００１０】
アテロームの進行を治療または予防するための医薬品を提供することが本発明の他の課題である。
【００１１】
糖尿病、特に糖尿病に関連する合併症を治療するための医薬品を提供することが本発明のさらなる課題である。
【００１２】
血小板の血管内病変接着の阻害剤についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニング法を提供することが本発明の他の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題は、特許請求の範囲に述べるように解決される。本発明は、血管損傷後の生理学的剪断応力下における血小板動員のプロセスにはＧＰＶＩが実際に必須であることを示す直接のｉｎ  ｖｉｖｏにおける証拠をはじめて提供するものである。異なる血管内皮除去マウスモデルでＧＰＶＩを阻害または欠如させると、血小板血管壁相互作用および血小板凝集が実質的に失われるので、ＧＰＶＩが動脈血栓形成の主な決定因子として特定される。これは、ＧＰＶＩ−リガンド相互作用を阻害することによって、アテローム性動脈硬化症の開始における動脈血栓症が抑制されることを示す。本発明は、特定の可溶形態のＧＰＶＩの抗血栓性潜在能力を利用する。特に、ＧＰＶＩの細胞外ドメインおよびヒトＮ末端側Ｆｃ  ｔａｇを含む融合タンパク質を提供する。可溶形態のヒトＧＰＶＩは高い親和性でコラーゲンに特異的に結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは固定化コラーゲン、ｉｎ  ｖｉｖｏでは血管損傷部位への血小板の接着を弱める。したがって、本発明は、急性臨床的合併症である動脈内血栓の必須条件は、始めに血管壁の活性病変に血小板が接着することであるという認識に基づいている。本発明者らは、血管壁の病変において糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）受容体を介して血小板が内皮下基質コラーゲンに接着することが、血栓の形成に関する重要な事象であることに気付いた。したがって、本発明の融合タンパク質が内皮下基質コラーゲンへの血小板接着を阻害すると、活性病変への血小板の接着を抑制するだけでなく、活性病変での血小板の凝集を予防することも可能になる。それによって、一般的な血小板の凝集能力を損なわずに血管内血栓の形成を効率的に回避することができる。
【００１４】
内皮下層の様々な成分、ラミニン、フィブロネクチン、フォンビルブランド因子（ｖＷｆ）およびコラーゲンなどが血小板のリガンドであり活性化因子であることを考えると、ただ１つの血小板受容体の阻害によって血栓形成の複雑なプロセスを阻害できることは驚きである。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では血小板上の多種多様な受容体が提案されているものの、病変部へのｉｎ  ｖｉｖｏでの血小板接着に影響する関連受容体または受容体の組合せは、これまで知られていなかった。
【００１５】
本発明はまた、ＧＰＶＩがアテローム性動脈硬化症の進行における血小板活性の主要なメディエーターであるという認識に基づいている。コラーゲンを介したＧＰＶＩの活性化を阻害することにより、アテローム性動脈硬化症になりやすいＡｐｏ  ｅ  −／−マウスにおけるアテローム進行が軽減されることを実証している（図１６参照のこと）。さらに、進行型アテローム性動脈硬化症や血栓合併症になりやすい糖尿病患者由来の血小板では、ＧＰＶＩ共受容体であるＦｃ受容体の発現が増大することを実証している。したがって、糖尿病患者由来の血小板はプラーク破裂によってコラーゲンが内皮下血管層に覆われていない、即ち内皮剥離がおきている場所でのコラーゲン刺激に対する応答性が増大していて、これが臨床的に観察される不安定狭心症における血栓合併症を増大させるのかもしれない。
【００１６】
したがって、本発明は、患者、特に糖尿病患者におけるアテローム進行の治療を提供する。さらに、本発明は、特に糖尿病患者における血管内血栓症などの急性血管合併症を治療するための医薬品を提供する。イムノアドヘシンＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ＧＰＶＩ受容体によってアテローム進行および血小板のコラーゲンにたいする応答性の増大を減衰させるための強力な治療ツールである。したがって、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、アテローム性動脈硬化症を治療するための、特に糖尿病におけるアテローム硬化性合併症を治療するための医薬品である。
【００１７】
本発明は、以下のセグメント：
（ａ）コラーゲンと結合する機能を有する、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰ  ＶＩ）の細胞外ドメインまたはその変異体、および
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメインまたはその機能保存的部分
を含む融合タンパク質（Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ）を提供する。
【００１８】
融合タンパク質は、図７に示すアミノ酸配列を特徴とする。本発明による融合タンパク質は、以下の工程によって得る、または得ることができる。
（ａ）図７に示すアミノ酸配列をコードしているＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ用アデノウィルスをＨｅｌａ細胞に感染させ、感染から２日後に培養上清を集め；
（ｂ）工程（ａ）の上清を遠心分離（３８００ｇ、３０分、４℃）し；
（ｃ）工程（ｂ）の上清をろ過（０．４５μｍ）し；
（ｄ）同体積量の硫酸アンモニウム（７６１ｇ／ｌ）を加えて４℃で一晩撹拌することによってイムノアドヘシンを沈殿させ；
（ｅ）遠心分離（３０００ｇ、３０分、４℃）によってタンパク質をペレットにし；
（ｆ）工程（ｅ）のペレットにしたタンパク質を０．１倍体積量のＰＢＳ中に溶解し、４℃で終夜ＰＢＳ中で透析し；
（ｇ）遠心分離（３０００ｇ、３０分、４℃）によってタンパク質溶液を清澄化し；
（ｈ）工程（ｇ）の溶液をプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ  ＨＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）に導入し；
（ｉ）ＯＤ２８０＜０．０１になるまでカラムを結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０、０．０２％ＮａＮ３）で洗浄し；
（ｋ）溶出バッファー（１００ｍＭグリシンｐＨ２．７）を用いて画分に分けて溶出させ；
（ｌ）溶出した画分を中和バッファー（１Ｍトリス／ＨＣｌ  ｐＨ９．０、０．０２％ＮａＮ３）を用いて中和し；
（ｍ）画分をプールし；
（ｎ）プールした画分を４℃で終夜ＰＢＳ中で透析し、
（ｏ）透析生成物を小分けして、−２０℃で凍結させる。
【００１９】
上記条件下で、融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって非還元条件下で測定した分子量１６０ｋＤａの共有結合した二量体として得られる。融合タンパク質の二量体化は、図７に示すアミノ酸配列のＧＰＶＩ断片に隣接する特定のドメインにおけるシステインの分子間ジスルフィド結合によって起こると考えられる。融合タンパク質の二量体の性質は、少なくとも図７に含まれているようなＦｃ部分とＧＰＶＩ部分の間の特定領域の存在ならびに調製プロセスによって決まる。二量体融合タンパク質と比較して単量体融合タンパク質の結合特性が劣っているので、同様の効果を得るためにはタンパク質投与量を二量体融合タンパク質よりも一桁大きくすることが必要となるので、単量体の融合タンパク質は実際には治療薬として有用ではない。図９（ｅ）を参照のこと。大量のタンパク質の投与は、治療および経済的な点から、特に慢性病の治療において問題である。
【００２０】
本発明の融合タンパク質は、イムノアドヘシンである。これは、血小板ＧＰＶＩの細胞外ドメインの機能を有するセグメント（ａ）を含む。前記ＧＰＶＩは哺乳動物のＧＰＶＩであってよく、ヒトＧＰＶＩであることが好ましい。前記機能は、好ましくはＧＰＶＩリガンドであるコラーゲンと結合することである。コラーゲン結合性を有している限り、ＧＰＶＩ細胞外ドメイン全体を前記融合タンパク質またはその任意の断片に使用できる。融合タンパク質の変異体は、前記融合タンパク質の１つまたはいくつかのアミノ酸が修飾されていてよい（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、ジスルフィド結合形成、ビオチン化、フルオレセイン標識のような発色団標識など）。変異体は、前記融合タンパク質の同族体であることが好ましい。遺伝子操作した変異体は、本明細書に開示した方法を用いてそのコラーゲンへの結合能力について容易に試験することができる。配列番号１の残基１〜２６７のポリペプチドをセグメント（ａ）として使用することが最も好ましい。しかし、前記ポリペプチドは、選択したアミノ酸を替えることによって、または前記機能を失わないよう前記配列を切詰めることによって改変することもできる。
【００２１】
前記融合タンパク質のセグメント（ｂ）は、以下の目的の少なくとも１つの役割を果たす：前記融合タンパク質を産生する細胞から融合タンパク質を分泌させる、コラーゲンと結合する機能のある形（例えば折りたたみまたは凝集状態）をとっているセグメント（ａ）を供給する、前記融合タンパク質をアフィニティ精製する、抗体によって融合タンパク質を認識する、医薬品として用いた場合に融合タンパク質に有利な特性を与える。驚くべきことで最も重要なことは、セグメント（ｂ）により、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞中で前記融合タンパク質が産生でき、活性形態、すなわちコラーゲンと結合するのに機能的な形で細胞上清へ分泌することが可能になる。セグメント（ｂ）は、免疫グロブリンのＦｃドメインであることが最も好ましい。適当な免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。ＩｇＧおよびＩｇＡが好ましい。ＩｇＧが最も好ましい。前記Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメインまたはその機能保存的変異体であってよい。Ｆｃの変異体は、セグメント（ｂ）の上記機能の少なくとも１つを保持する場合、機能保存的である。最も好ましいのは、配列番号１の残基２７３〜５０４のポリペプチドである。しかし、このようなポリペプチドがその機能を失わずに改変または切断され得ることは周知のことである。
【００２２】
本発明の融合タンパク質のセグメント（ａ）および（ｂ）は、リンカーによって結合されていてよい。このリンカーは、約１〜１００、好ましくは１〜１０アミノ酸残基からなっていてよい。
【００２３】
前記融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有することが最も好ましい（本明細書ではＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔと呼ばれる）。
【００２４】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列をさらに提供する。前記核酸配列は、以下のグループ：
（ｉ）配列番号２の核酸配列または遺伝コードの縮重によって同じポリペプチドをコードするその変異体；
（ｉｉ）配列番号２によってコードされるポリペプチドに対する配列相同性が少なくとも７０％であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）そのうちの少なくとも１００アミノ酸のセグメントがコラーゲンと結合するのに機能的であり、少なくとも２００アミノ酸のセグメントがＦｃドメインとして機能する、少なくとも３００アミノ酸のポリペプチドをコードする核酸；ならびに
（ｉｖ）請求項１の融合タンパク質をコードする核酸配列
から選択される配列を含む。
【００２５】
本発明は、糖タンパク質ＶＩの細胞外ドメインまたはコラーゲンと結合する機能を有するその変異体を含むタンパク質を含有する、動脈内血栓を予防または治療するための医薬品をさらに提供する。前記タンパク質は、本発明の前記融合タンパク質であることが好ましい。前記医薬品が前記融合タンパク質を含有する場合、前記医薬品は、好ましくはさらに適当な担体を含む。前記医薬品は、非経口的に投与することが好ましく、静脈内に投与することがより好ましい。本発明者らが発見したように、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用は、損傷した血管壁への血小板接着の主要因子である。本発明の融合タンパク質は、他の血小板機能を阻害することなく血液に曝されるコラーゲンをブロックすることによって、血管系の血液に露出したコラーゲンへの血小板の結合を抑制することができる。
【００２６】
あるいは、本発明の医薬品は、遺伝子療法のために本発明の前記融合タンパク質をコードする核酸を含有していてよい。前記核酸は、上記で定義した核酸配列を含有していることが好ましい。前記核酸は、ベクター、好ましくはウィルスベクターに含まれていることが好ましい。前記融合タンパク質をコードするベクターは、例えば内皮細胞がそれと共に形質導入されるように患者の血管系に導入することができる。遺伝子療法に適したベクターは、当技術分野で周知である。これらは、例えばアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、または単純疱疹ウィルスに基づくものである。ベクターは、患者の必要に応じて導入された細胞が融合タンパク質を長期または短期間発現するように選ぶことができる。融合タンパク質のＦｃドメインによって、導入された細胞による活性形態の融合タンパク質の分泌が可能になる。
【００２７】
本発明は以下のことを含む、糖タンパク質ＶＩとコラーゲンの結合の阻害剤についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法をさらに提供する：
（ｉ）コラーゲンを提示する表面を準備し；
（ｉｉ）前記表面の一部分を前記融合タンパク質と前記表面の結合を可能にする所定の条件下で本発明の融合タンパク質と接触させ；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）と同じ条件下で、前記表面の別の部分を試験化合物の存在下で前記融合タンパク質と接触させ；
（ｉｖ）前記試験化合物の不在下または存在下で前記表面に結合した前記融合タンパク質の量を測定し；
（ｖ）前記融合タンパク質と前記表面の結合が、試験化合物の不在下と比較して前記試験化合物の存在下のほうが少ない場合、試験化合物を阻害剤として特定し；また
（ｖｉ）場合によって、血小板凝集および／または血小板活性化に対する前記阻害剤の機能的作用を決定する。
【００２８】
工程（ｉ）の表面は、コラーゲンをコーティングしたガラスまたはプラスチック表面であってよい。前記表面の一部分は、タイタープレートまたはマルチウェルプレートのウェルであってよい。コラーゲンを提示する表面は、実施例に記載のようにガラスまたはプラスチック表面をコラーゲンでコーティングすることによって容易に調製することができる。コラーゲンでコーティングしたプレートまたはマルチウェルプレートは、市販もされている。工程（ｉｉ）では、融合タンパク質と表面の結合を可能にする条件（特にｐＨ、バッファー、温度）下で所定量の前記融合タンパク質を前記表面の第１の部分と接触させる。前記表面と最適な結合を可能にする条件を選択することが好ましい。工程（ｉｉｉ）では、別の表面部分を、所定の量または濃度の試験化合物の存在下で工程（ｉｉ）の場合と同じ条件下に同じ量の融合タンパク質と接触させる。試験化合物は１種以上の量または濃度で使用することができる。工程（ｉｖ）の前記測定には、非結合融合タンパク質を除去するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で接触させた前記表面部分を１回または複数回洗浄することが含まれることが好ましい。次いで、例えば融合タンパク質に付けた蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミンなど）の蛍光を測定することによって結合融合タンパク質の量を測定することができる。あるいは、結合融合タンパク質は、前記融合タンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。ここで抗体は蛍光標識されていてよい。あるいは、この抗体は、着色または発光反応生成物をもたらし得る酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ）で標識することもできる。最も好都合には、融合タンパク質は、コラーゲンと結合した後その光吸収または光放出特性が変化するような色素標識で標識することができる。この実施形態では、非結合融合タンパク質の洗浄は必要ではない。
【００２９】
工程（ｖ）では、阻害剤を特定することができる。特定した阻害剤またはその選択された部分は、阻害剤を改善するためのリード構造として使用することができる。こうしたリード構造は、化学的方法を用いて改変でき、改変した構造を再度このスクリーニング法で試験することができる。阻害特性が改善された改変構造または試験化合物を選択し、場合によっては、化学的方法によりさらに変化させることができる。このようにして、阻害剤を繰返し改善することができる。本発明のスクリーニング法を用いて特定した阻害剤は、血栓および動脈硬化症に対して潜在的な薬物として貴重である。
【００３０】
工程（ｖｉ）で、血小板凝集および／または血小板活性化に対する前記阻害剤の機能的作用は、以下に記載の方法、例えば生体蛍光顕微鏡検査法によって決定することができる。
【００３１】
前記スクリーニング法は、試験すべき試験化合物の数に応じて小、中、または大規模で実施することができる。多くの試験化合物を試験すべき場合（例えば化合物のライブラリ）、スクリーニング法は、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）の形をとることが好ましい。ＨＴＳの場合、結合融合タンパク質の量は、蛍光標識した融合タンパク質を用いて検出することが好ましい。
【００３２】
上記スクリーニング法は、ＧＰＶＩとコラーゲンの結合を阻害する抗体、特にＧＰＶＩの細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングするために使用することができる。このような抗体スクリーニングは、例えばモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ技術または任意の他の抗体生成技術と組み合わせるとよく、そこでは本発明の融合タンパク質を抗原として使用することが好ましい。ハイブリドーマ細胞培養上清中の抗体を前記試験化合物として使用することができる。
【００３３】
本発明は、本発明の融合タンパク質を免疫原として用いることによって生成した抗体をも提供するものである。さらに、本発明は、急性冠状動脈または頚動脈症候群の最初の引き金として活性なアテローム硬化性病変の剥き出しになった内皮下基質コラーゲンに血小板が接着することを予防する医薬品を調製するためにＧＰＶＩに対する抗体を使用することを提供する。こうした適応症は、以下のように判断することができる。好ましくは、患者にはさらに不安定アテローム斑があることを特徴とする。前記医薬品は、非経口的に投与することが好ましい。前記抗体がモノクローナル抗体であることが好ましい。こうした抗体は、例えば本発明の融合タンパク質を免疫原として用いて調製することができる。
【００３４】
さらに、本発明は、活性血管内病変におけるＧＰＶＩ介在血小板接着の阻害剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法を提供し、前記方法は、
（ｉ）コラーゲンを提示する表面を準備し；
（ｉｉ）コラーゲンへの血小板の接着を可能にする所定の条件下で表面を血小板と接触させ；
（ｉｉｉ）試験化合物の存在下で血小板の接着を測定し；また
（ｉｖ）コラーゲンへの血小板接着が、試験化合物の不在下と比較して試験化合物の存在下でより少ない場合、試験化合物をＧＰＶＩの阻害剤として特定し；また
（ｖ）場合によって、血小板凝集および／または血小板活性化に対する前記阻害剤の機能的作用を決定する
工程を含む。
【００３５】
この方法で使用すべき血小板は、既知の手順（実施例７を参照のこと）によって単離することができる。これらはマウス、ラット、ウサギ、ブタなどの哺乳動物の血液から単離することができる。好ましくはヒトから単離する。前記血小板は、例えばフルオレセインなどの蛍光色素で標識することができる。前記表面への血小板接着は、実施例に記載のように測定することができる。この方法用の試験化合物は、小有機分子であってよい。この方法用の試験化合物は、ＧＰＶＩとコラーゲンの結合の阻害剤についての上記スクリーニング法で特定された阻害剤であることが好ましい。このようにして、血小板を用いてスクリーニングすべき化合物の数をかなり減らすことができ、血小板に対して機能的な阻害剤を発見する見込みを増大させることができる。
【００３６】
活性血管内病変に対するＧＰＶＩ媒介血小板接着の阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング法は、
（ｉ）活性血管内病変のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用意し；
（ｉｉ）試験化合物の存在下で活性な血管内病変への血小板接着を測定し、
（ｉｉｉ）活性な血管内病変への血小板接着が、試験化合物の不在下と比較して試験化合物の存在のほうが少ない場合、試験化合物をＧＰＶＩの阻害剤として特定する
工程を含む。
【００３７】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、マウス、ラット、ウサギなどの適当な哺乳動物であってよい。マウスが好ましい。好ましくは蛍光標識した血小板をモデルに導入してから、試験化合物の存在下および不在下で活性な血管内病変への血小板接着を測定する。前記試験化合物は、上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法の１つで阻害剤として特定されていることが好ましい。活性血管内病変への血小板接着は、実施例８に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査法を用いて実施することができる。
【００３８】
本発明はまた、糖尿病を治療する医薬品を製造するために
（ａ）コラーゲンと結合するのに機能的な糖タンパク質ＶＩの細胞外ドメインまたはその変異体、および
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメインまたはその機能保存的部分
を含む融合タンパク質を使用することを提供する。
【００３９】
糖尿病を治療する医薬品を製造するために使用する融合タンパク質は、二量体融合タンパク質であることが好ましい。二量体であるためには、融合タンパク質のドメイン（ａ）と（ｂ）の間にヒンジ領域が存在しなければならない。ヒンジ領域は、ポリペプチド鎖の適当な配向および鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にするために必要である。したがって、ヒンジ領域は、十分な長さを有し、システイン残基、好ましくは少なくとも２個のシステイン残基を含む必要がある。融合タンパク質は、配列番号１の残基１〜２６７を含むことが好ましい。融合タンパク質は、糖尿病の急性合併症の治療または糖尿病患者におけるアテローム性動脈硬化症の慢性進行の治療に使用する。融合タンパク質はＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔであることが好ましい。
【００４０】
本発明はまた本発明の融合タンパク質（Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ）を調製する方法を提供するが、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）図７に示すアミノ酸配列をコードしている、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ用アデノウィルスをＨｅｌａ細胞に感染させ、感染から２日後に培養上清を捕集し；
（ｂ）工程（ａ）の上清を遠心分離（３８００ｇ、３０分、４℃）し；
（ｃ）工程（ｂ）の上清をろ過（０．４５μｍ）し；
（ｄ）等体積量の硫酸アンモニウム（７６１ｇ／ｌ）を加えることによってイムノアドヘシンを沈殿させ、４℃で終夜撹拌し；
（ｅ）遠心分離（３０００ｇ、３０分、４℃）によってタンパク質をペレット化し、
（ｆ）工程（ｅ）のペレット化したタンパク質を０．１容のＰＢＳ中に溶解し、４℃で終夜ＰＢＳ中で透析し；
（ｇ）遠心分離（３０００ｇ、３０分、４℃）によってタンパク質溶液を清澄化し；
（ｈ）工程（ｇ）の溶液をプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ  ＨＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）に導入し；
（ｉ）ＯＤ２８０＜０．０１になるまでカラムを結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０、０．０２％ＮａＮ３）で洗浄し；
（ｋ）溶出バッファー（１００ｍＭグリシンｐＨ２．７）を用いて画分に分けて溶出し；
（ｌ）溶出した画分を中和バッファー（１Ｍトリス／ＨＣｌ  ｐＨ９．０、０．０２％ＮａＮ３）を用いて中和し；
（ｍ）画分をプールし；
（ｎ）プールした画分を４℃で終夜ＰＢＳ中で透析し、
（ｏ）透析した生成物を小分けして、−２０℃で凍結させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
従来の仮説では、フォンビルブランド因子ｖＷｆに結合した血小板糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂが、流れている血小板を損傷した血管壁に動員し（Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｚ．Ｍ．：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７；７８、６１１〜６１６頁）、内皮下線維性コラーゲンは、血小板の安定した接着および活性化を支持することが示唆されている（ｖａｎ  Ｚａｎｔｅｎ、Ｇ．Ｈ．ら．「動脈硬化性冠動脈への血小板付着の増大」Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３、６１５〜６３２頁；Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ、Ｋ．Ｊ．＆Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ、Ｊ．Ｍ．「血小板コラーゲン受容体」Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１、８６、１８９〜１９７頁）。しかし、本発明は、マウス頚動脈のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査法によって、主要な血小板コラーゲン受容体であるＧＰＶＩを阻害または欠損させると、内皮の侵食に続く血小板−血管壁相互作用が起こらないことを実証している。意外なことに、ＧＰＶＩを阻害すると、内皮下層への血小板の係留および接着が約８９％低下する。さらに、血小板の安定な捕集および凝集は、これらの条件下ではほとんど失われている。これらのプロセスにＧＰＶＩが必須であることは、ＧＰＶＩ欠損マウスで確認された。その場合、血小板は損傷した血管壁に接着および凝集しなかった。これらの発見により、血管損傷部位での血小板付着の開始におけるＧＰＶＩの意外な役割が明らかになり、血小板−コラーゲン相互作用が動脈血小板誘導性アテローム硬化性合併症の主要な決定因子として明確に特定される。
【００４２】
ＧＰＶＩが一般に内皮下基質コラーゲンの受容体の役目を果たすことは、記載されている（Ｍｏｒｏｉ  Ｍ、Ｊｕｎｇ  ＳＭ、Ｏｋｕｍａ  Ｍ、Ｓｈｉｎｍｙｏｚｕ  Ｋ．「糖タンパク質ＶＩを欠きコラーゲン誘発凝集／接着のない血小板を有する患者」Ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋ  ｂｏｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８９；８４：１４４０〜１４４５頁）。これらの著者らは、ＧＰＶＩ受容体欠損症の患者に由来する血小板をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けた。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況におけるコラーゲンとＧＰ  ＶＩ受容体の相互作用の生理学的重要性ならびに血管損傷後の接着に関するＧＰ  ＶＩ受容体の相対的な寄与は、知られていなかった。特に、この受容体を阻害すると、血管内血栓の形成における重要なステップである血小板係留が阻害されることは知られていなかった。本発明は、ＧＰＶＩ受容体を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける内皮下基質コラーゲンに付着することによって、内皮下層へ血小板が接着するために必須な受容体であることを明らかにしている。我々は驚くべきことに、ＧＰ  Ｉｂ（フォンビルブランド受容体）、αＩＩｂβ３インテグリン受容体、α２β１インテグリンまたはＧＰ  Ｖ受容体などの他の様々な血小板表面タンパク質のうち、ＧＰ  ＶＩ受容体が、血管壁への血小板接着を媒介するのに必須な受容体であることを特定した。血小板接着は、生理学的剪断応力条件下での血小板凝集および動脈内血栓形成に関する第１に最も重要なステップである。したがってそれに続く動脈内閉塞をもたらす有害な作用は、心筋梗塞または脳卒中の臨床症候群の機能的ベースとなる。慢性硬化発症の場合、血小板と内皮の相互作用が動脈硬化症の初期段階を増幅する。我々の発明はまた、動脈硬化症の進行における初期の血小板接着および長期の血小板−内皮相互作用に関し、いくつかの血小板表面タンパク質の様々な組合せの中で、ＧＰＶＩ受容体が決定的な役割を果たすことを初めて示した。
【００４３】
国際公開ＷＯ  ０１／１６３２１およびＷＯ  ０１／００８１０では、ヒトＧＰＶＩ受容体のＤＮＡおよびタンパク質の配列が開示されている。しかし、内皮の病変における血小板の接着および活性化に対する重要性は、ｉｎ  ｖｉｖｏの背景において実証されていない。
【００４４】
米国特許第６，３８３，７７９号では、ＧＰＶＩの融合タンパク質が開示されている。しかし、この参考文献では、二量体融合タンパク質を開示せず、またＧＰＶＩの治療効果についてはなにも開示しない。
【００４５】
最近では、潅流条件中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける人工コラーゲンに対する血小板−コラーゲン相互作用の異なるフェーズが研究された（Ｍｏｒｏｉ  Ｍ、Ｊｕｎｇ  ＳＭ、Ｓｈｉｎｍｙｏｚｕ  Ｋ、Ｔｚｏｍｉｙａｍａ  Ｙ、Ｏｒｄｉｎａｓ  ＡおよびＤｉａｚ−Ｒｉｃａｒｔ  Ｍ．「フロー条件下でのコラーゲン被覆表面への血小板接着の解析：血小板接着におけるグリコプロテインＶＩの関わり」Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８８：２０８１〜２０９２頁）。その研究の著者らは、剪断応力条件中でのコラーゲン−ＧＰＶＩ相互作用の重要性を既に指摘していた。しかし、内皮下基質コラーゲンの接着との関連性は、この人工のｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況では研究することができなかった。彼らのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの限られた関連性の結果として、前述の研究の著者らは、ＧＰＶＩ受容体がむしろ内皮への血小板接着よりも血小板活性化に関与するという結論に達した。対照的に、フォンビルブランドＧＰＩｂ受容体は、血小板−内皮下相互作用にかなり関与している。これらの著者はまた、現在の文献の総説中で血小板−コラーゲン相互作用についての入手可能なすべての情報に焦点を当てている。これまで、Ｍｏｒｏｉ  ＭおよびＪｕｎｇ、ＳＭ「コラーゲンに対する血小板の受容体」Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７；７８：４３９〜４４４頁）は、血小板の接着および血栓形成に関する血小板の様々なコラーゲン受容体とコラーゲン原線維の相互作用について論じている。しかし、著者らは、接着プロセスに対する様々なコラーゲン受容体の重要性を検証できなかったので、臨床的に関連したｉｎ  ｖｉｖｏ状況における接着に関わるＧＰＶＩ受容体の役割を予期しなかった。
【００４６】
したがって、本発明は、出血合併症の好ましくない副作用を引き起こさずに、血小板−内皮下相互作用および血小板接着に関連した標的を阻害する問題の解決策を提供する。ＧＰＶＩ受容体によるコラーゲン−血小板のよく知られた相互作用に加えて、我々は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着によって測定した天然の内皮下基質と血小板の相互作用についてのデータを提供することができた。その結果、我々は、血管内血栓の初期ステップとして血小板接着に関するＧＰＶＩ−内皮相互作用の重要性を検証することができた。したがって、我々の発明により、好ましくない副作用なしで、血小板接着の重要なステップに関する有効な抗血小板薬治療の問題が解決される。
【００４７】
さらに、本発明は、イムノアドヘシン（本発明の融合タンパク質）を提供する。特定の実施形態では、イムノアドヘシンは、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分とＧＰＶＩ受容体の細胞外ドメインからなる（Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ）。この新規な融合タンパク質は、既に発表されているように、ＧＰＶＩの元のＤＮＡ配列の約５０％に基づいている。組換え融合タンパク質は、ＧＰＶＩ受容体のような膜タンパク質を形成せず、個々の宿主細胞によって放出される可溶性の免疫グロブリン様イムノアドヘシンであるので、イムノアドヘシンのタンパク質構造は新規である。このイムノアドヘシンは、コラーゲンとＧＰＶＩのリガンド−受容体相互作用をブロックすることができる。我々の結果から、イムノアドヘシンは、コラーゲン刺激によって誘導される血小板の主要な生理学的機能に著しい影響を与えることが実証されている。コラーゲン誘導性の凝集、接着および放出機能は、イムノアドヘシンによって、特異的なモノクローナル抗体と同程度に阻害することができる。しかし、そのメカニズムは異なる：抗体はＧＰＶＩ受容体のリガンド結合部位に直接結合することによってＧＰＶＩ活性化を阻害するが、イムノアドヘシンはＧＰＶＩのリガンドであるコラーゲンを捕捉し、その結果リガンドによるＧＰＶＩ活性化が阻止される。
【００４８】
本発明のイムノアドヘシンは、新規なＧＰＶＩ阻害剤である。ＧＰＶＩが介在する複数の効果の活性化されたルートを、リガンド捕捉により選択的に阻害する利点がある。抗体によるＧＰＶＩ受容体内部移行のような二次作用を防ぐことができる。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、プラーク破裂または内皮の病変に伴う不安定アテローム斑によって引き起こされるアテローム硬化性合併症の治療に使用することができる。したがって、イムノアドヘシンＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ＧＰＶＩ受容体の固有活性と関連シグナル伝達系に影響を与えずにコラーゲン媒介ＧＰＶＩ活性化に対する治療用阻害剤として働く。
【００４９】
さらに、ＧＰＶＩイムノアドヘシンは、抗体選択の理想的なエピトープとして働く。Ｆｃ部分があるので、タンパク質の精製に都合がよく、抗体ライブラリに対して、すなわちファージディスプレイによって大量の抗体選択を行うために表面に簡単に固定することができる。この選択では、天然のタンパク質と同じ構造をもち無傷のタンパク質に類似した関連エピトープに対して選択的な抗体スクリーニングを行うことできる。
【００５０】
最後に、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ＧＰＶＩ受容体活性化の阻害剤をスクリーニングするための重要なツールである。我々は、リガンドとしてのコラーゲンをプレコーティングしたプレートによってコラーゲンＧＰＶＩ相互作用をシミュレートする、ＥＬＩＳＡに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを確立した。あるいは、このアッセイは、蛍光標識したＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを用いて、高スループットのフォーマットにグレードアップすることができる。このアッセイにより、蛍光測定によってＧＰＶＩ機能を阻害する能力に関して阻害性抗体または小分子の両方のスクリーニングが可能になる。この無細胞系スクリーニングアッセイを用いて、薬物試験のための高スループットでスケールアップ可能な蛍光スクリーニングアッセイのためのプロトタイプ法を確立した。
【００５１】
血管内の超音波または核磁気共鳴映像法によるイメージング技術の最近の改良に基づいて、アテローム性動脈硬化症で急性冠状動脈または頚動脈症候群などの急性臨床的合併症のリスクがある患者の確認が可能である。これらの患者は血管内血栓の原因となる可能性のある活性病変を有する。したがって、本発明は、血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に対する抗体を含有する医薬品を投与することによって好ましくない副作用なしで血管内血栓の形成を予防することを可能にする。
【００５２】
活性な病変は、内皮下基質コラーゲンの露出および血小板活性化を特徴とする。このような病変の発生は、例えば血管内の超音波またはサーモグラフィ（例えば、ＦａｙｅｄおよびＦｕｓｔｅｒ、「高リスクまたは脆弱動脈硬化プラークの臨床イメージング」Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｏｒ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１；８９：３０５〜３１６頁）または核共鳴映像法（Ｈｅｌｆｔら、「動脈硬化病変の悪化と退行」Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  Ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２；１０５：９９３〜９９８頁）によって調べることができる。急性冠状動脈または頚動脈症候群の患者にはこのような病変がある可能性が非常に高く、心筋梗塞または脳卒中など急性臨床的合併症の再発のリスクは極めて高いが、原発性イベントから時間が経つにつれて次第に減少する。
【００５３】
したがって、本発明はまた、急性冠状動脈または頚動脈症候群の患者を治療する方法を提供する。前記方法は、血管内血栓を防止するために
（ａ）患者に活性な血管内病変があるか否か判定し；
（ｂ）血管内病変がある場合には、血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に対する抗体を用いて患者を治療する
工程を含む。
【００５４】
さらに、本発明に基づいて、複合アテローム性プラークの破裂による血管内血栓のリスクがある患者を治療することが可能である。この破裂により、内皮下コラーゲン基質が露出する。動脈内血栓形成の結果として、上記の重要で致命的な臨床症候群によって重要な器官の潅流がブロックされる。
【００５５】
本発明はまた、慢性アテローム硬化性症候群にかかっている患者を治療する方法を提供する。前記方法は、血管内血栓を防止するために
（ａ）患者にアテローム進行が起こっているか否かを判定し；
（ｂ）血管内病変がある場合には、血小板糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に対する抗体を用いて患者を治療する
工程を含む。
【００５６】
したがって、本発明に基づいて、アテローム性動脈硬化症のリスクがある患者を治療することが可能である。アテローム進行を予防するために、血小板と露出した内皮下コラーゲンの相互作用を抑制するために患者を本発明の融合タンパク質を用いて治療する。本発明の融合タンパク質は、血小板と露出した内皮下コラーゲンの相互作用が阻害されるように、ＧＰＶＩ血小板受容体に対する血管壁（例えば内皮下層）のリガンドをブロックする。
【００５７】
本発明の融合タンパク質は、適当な薬剤として許容される液体担体中に分散させてから患者に投与する凍結乾燥粉末の形であってよい。本発明の融合タンパク質は、非経口投与、急性合併症の治療の場合には好ましくは動脈内または静脈内投与投与に適した薬剤組成物に取り込むこともできる。こうした組成物は、通常融合タンパク質および薬剤として許容される担体を含む。薬剤として許容される担体には、薬剤投与に適合した溶媒、分散媒、抗細菌剤および抗真菌剤ならびに等張化剤がある。本発明は、慢性または急性心血管疾患を治療する薬剤組成物の製造方法を含む。こうした方法は、本発明の融合タンパク質と一緒に薬剤として許容される担体を調製することを含む。急性心血管疾患を治療する場合には、組成物を静脈内または動脈内に投与することが好ましい。慢性心血管疾患を治療する場合には、組成物を皮下および腹膜内にも投与することができる。こうした組成物は、他のポリペプチド（インシュリンなど）または治療上活性な小分子などの追加の活性化合物をさらに含むことができる。したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質および１種または複数のインシュリンなどの追加の活性化合物とを薬剤として許容される担体とともに調剤することによって薬剤組成物を調製する方法をさらに含む。糖尿病患者を治療するために融合タンパク質とインシュリンを同時に処方する場合、異なるタンパク質を別々に保存できるような投与形態にし、タンパク質の混合が組成物の投与直前または投与中に起こるようにすることが好ましい。したがって、マルチチャンバー注射器による適用が考えられる。本発明の薬剤組成物は、その所定の非経口投与経路に適合するように調製する。非経口投与経路の例には、例えば、動脈内および静脈内投与がある。非経口的に使用する液剤または懸濁剤には、注射用水、食塩水、ポリエチレングリコール、固定油、グリセリン、プロピレングリコール、ＴＷＥＥＮまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；エチレンジアミン四酢酸なとのキレート剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファーおよび塩化ナトリウム、デキストロース、サッカロースまたはマンニトースなどの等張化剤が含まれていてよい。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調製することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル剤、使い捨て注射器または複数回投与バイアルに封入することができる。注射剤使用に適した薬剤組成物には、無菌の水性液剤または分散剤および無菌の注射用液剤もしくは分散剤を即時調製するための無菌の散剤がある。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理学的食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール）、およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合には必要な粒径の維持、あるいは界面活性剤の使用などによって、維持することができる。微生物の活動は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防ぐことができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば、糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。注射用組成物の吸収を長引かせるには、組成物中に、吸収を遅延させる薬物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含める。無菌注射剤は、必要に応じて上記に挙げた成分の１種または組合せと一緒に、適切な溶媒中に活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を必要量混合し、続いてろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、基本的分散媒および上記で挙げたもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌の賦形剤中に活性化合物を混合することによって調製する。無菌注射剤を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、あらかじめ滅菌ろ過した溶液から活性成分と任意の別の望ましい成分の粉末を得る。経口または非経口組成物を単位投与形態で調製するのが特に有利である。単位投与形態は、患者の単位投与量に合わせた個別の単位である。各単位には、所望の治療効果を得るための所定量の活性化合物と必要とされる薬剤用担体とが含まれる。急性合併症を治療するための融合タンパク質の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。慢性アテローム進行を治療するための融合タンパク質の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、０．５〜６ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは２〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。治療有効量の融合タンパク質を用いて患者を治療するには、１回の治療、好ましくは一連の治療を含めることができる。好ましい例では、本発明の融合タンパク質を、少なくとも週２回、０．５〜６ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは２〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いて慢性アテローム進行患者を治療する。
【００５８】
＜血小板−コラーゲン相互作用および阻害剤による調節を調べる方法＞
血小板凝集およびＡＴＰ放出
マウスの血小板リッチな血漿を、ウシ型Ｉコラーゲンの濃度を０．２〜４μ／ｍｌに増やしながら刺激すると、２〜９５％の凝集が用量依存的に誘発され、また０〜１．６６ｎＭのＡＴＰ放出が用量依存的に誘発される。ハーフ−マキシマム（最大値の半分を誘発する）コラーゲン濃度を選択してさらなる実験を行った。特異的な抗マウスＧＰＶＩ抗体ＪＡＱ  １（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）と一緒にマウス血小板リッチな血漿をインキュベーションすると、２μｇコラーゲン／ｍｌで刺激した後の血小板凝集がほぼ完全に失われた（５０μｇＪＡＱ  １の場合：２±０．７；１００μｇＪＡＱ  １の場合：１．５±０．３％）。さらに、ＡＴＰ放出は抗体の用量依存的に、１０μｇ抗体／ｍｌで１．０９ｎＭ  ＡＴＰに阻害され、５０および１００μｇ抗体／ｍｌで完全になくなった。
【００５９】
同様に、ＧＰＶＩイムノアドヘシン（Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ）（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）とマウスの血小板リッチな血漿をインキュベーションすることにより、２μｇコラーゲン／ｍｌで刺激した後の血小板凝集がほぼ完全に失われ（５０μｇＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの場合：２±０．７；１００μｇＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの場合：１．５±０．３％）、ＡＴＰ放出は０ｎＭ  ＡＴＰとなった。
【００６０】
したがって、イムノアドヘシンは、天然のＧＰＶＩリガンドであるコラーゲンを捕捉することによってＧＰＶＩ活性化を十分に阻害した。重大な血小板機能である凝集とＡＴＰ放出によって測定される血小板の放出メカニズムの両方ともＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響を受けた。
【００６１】
生理学的フロー条件下でのＧＰＶＩ媒介接着（フローチャンバー）
フローチャンバー中で生理学的剪断条件下における血小板の接着を試験した。血小板の初期接着および強固な接着は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔイムノアドヘシンを６０％加えることによって著しく阻害された（図４を参照のこと）。
【００６２】
ＧＰＶＩ結合アッセイ
コラーゲンでコーティングされたプレートへのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの接着は、ＥＬＩＳＡに基づいた蛍光アッセイで測定した。イムノアドヘシンＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの結合は、０．２〜１０μｇＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで用量依存的に増大し飽和レベルにまで達した（図５を参照のこと）。その特異性は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの結合を空のイムノアドヘシンＦｃ−ｎｔの結合またはコーティングしていないプラスチック表面への結合とを比較することによって実証した（図６を参照のこと）。
【００６３】
＜急性血管イベントにおける血小板活性化の重大なステップとしてｉｎ  ｖｉｖｏ血管損傷における血小板接着および凝集を調べる方法＞
病変へのｉｎ  ｖｉｖｏ接着プロセスでの血小板−コラーゲン相互作用の生物学的重要性を評価するために、マウス頚動脈の血管損傷後の血小板−血管壁相互作用を評価する。この重要な血管床での血管損傷は、動脈硬化症の初期の内皮の病変、または内皮下層からのコラーゲン原線維の露出が起こる動脈硬化症の後期段階におけるプラーク破裂などの、動脈硬化症の第１のステップのモデルとなり得る。さらに、このモデルにより、その後の血管損傷の合併症の研究が可能になる。小さな内皮病変により、血小板の活性が最大になり、その後の血小板接着および凝集のステップへと続く。さらなるステップでは、血小板凝集体は、続発性虚血性脳卒中を伴う頚動脈からの塞栓症を招く可能性がある。したがって、この実験構成は、急性冠状動脈症候群および脳卒中をもたらすプラーク破裂および内皮病変を伴う不安定アテローム性動脈硬化症のある、患者のサブグループに関連したｉｎ  ｖｉｖｏモデルとなる。
【００６４】
走査型電子顕微鏡で見るとわかるように、頚動脈を５分間強く結さつすると、内皮細胞層が完全に失われ、損傷部位で血小板接着が開始する（図１ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査法を使用して、血管損傷後の血小板蓄積の動的プロセスを直接可視化し、定量化することができる。多くの血小板は、内皮除去後数分内に血管壁に繋ぎとめられる（４６２０±２０５血小板／ｍｍ２）。実際内皮下層との接触を確立したすべての血小板は、最初は「ｓｔｏｐ−ｓｔａｒｔ」タイプのゆっくりとした表面移動を示す（Ｓａｖａｇｅ、Ｂ．、Ｓａｌｄｉｖａｒ、Ｅ．＆Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｚ．Ｍ．「フィブリノーゲンに捕捉されて起こる血小板接着の開始と、フォンビルブランド因子上での移動」Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｎｔｏ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  １９９６；８４、２８９〜２９７頁）。我々は、初期の緩慢な表面移動から非可逆的な血小板接着への移行をすべての血小板の８８％で観察した（４１８２±２５３血小板／ｍｍ２）（図１ｂ）が、血小板捕捉が一過性のままで終わったのは１２％に過ぎなかった（５４３±３２血小板／ｍｍ２）。強固な捕捉が確立された後、接着血小板は、循環系からさらなる血小板を動員し、凝集形成がもたらされる（図１ｃ）。この血小板動員と類似の特徴が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける固定化コラーゲンでも得られる。対照的に、生理学的条件下で無損傷の血管壁に繋ぎとめられる血小板はほんの少しであり（Ｐ＜０．０５ｖｓ．血管損傷）、実質的にこれらの血小板の１００％が強固に捕らえられることなく血管壁から移動させられる（Ｐ＜０．０５ｖｓ．血管損傷、図１ａ〜ｃ）。
【００６５】
＜ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管損傷についての血小板中の新規で関連した標的たんぱく質としてのＧＰＶＩの同定＞
種々の異なる受容体およびシグナル伝達経路が関与する血小板−血管壁相互作用は非常に複雑なので、このプロセスのｉｎ  ｖｉｖｏにおける阻害は非常に困難になる。フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）によってコラーゲンと間接的に相互作用するＧＰＩｂ−Ｖ−Ｉ−ＸおよびαＩＩｂβ３インテグリンの他に、多くのコラーゲン受容体が血小板上で同定されており、最も重要なものとしてはα２β１インテグリン（Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｓ．Ａ．「初期の２価カチオン依存性の血小板のコラーゲンへの接着を仲介する１６００００ダルトンの血小板膜タンパク質の同定」Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  １６０，０００  ｄａｌｔｏｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｃａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｃｅｌｌ  １９８６；４６、９１３〜９２０頁）、ＧＰＶ（Ｍｏｏｇ、Ｓ．ら．「血小板糖タンパク質Ｖはコラーゲンへの結合と凝集に関与する」Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９８、１０３８〜１０４６頁）、およびＧＰＶＩ（Ｍｏｒｏｉ、Ｍ．、Ｊｕｎｇ、Ｓ．Ｍ．、Ｏｋｕｍａ、Ｍ．＆Ｓｈｉｎｍｙｏｚｕ、Ｋ．「コラーゲンに誘導される凝集と接着がない、糖タンパク質ＶＩの欠損した血小板を有する患者」Ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋ  ｂｏｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８４、１４４０〜１４４５頁）が含まれている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで働く異なるシグナル伝達系についていくつかの報告があるが、そのなかでＧＰＶＩも議論されている（Ｇｉｂｂｉｎｓ、Ｊ．Ｍ．、Ｏｋｕｍａ、Ｍ．、Ｆａｒｎｄａｌｅ、Ｒ．、Ｂａｒｎｅｓ、Ｍ．＆Ｗａｔｓｏｎ、Ｓ．Ｐ．「糖タンパク質ＶＩは血小板中でのコラーゲン受容体であり、Ｆｃ受容体γ鎖のチロシンリン酸化の根底をなす」Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｗｈｉｃｈ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ−ｃｈａｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７；４１３、２５５〜２５９頁；Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ、Ｂ．ら．「マウスにおける血小板グリコプロテインＶＩのインビボ涸渇による長期抗血栓性保護」Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９３、４５９〜４６９頁、Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．ら．「α２β１インテグリンではなく糖タンパク質ＶＩが血小板とｐコラーゲンの相互作用に必須である」Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  α２β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００１；２０、２１２０〜２１３０頁）。
【００６６】
動脈血栓形成における血小板−コラーゲン相互作用のｉｎ  ｖｉｖｏにおける関連性を直接試験するために、我々は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＰＶＩを阻害または除去した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＱ１は、マウスＧＰＶＩ上の主要なコラーゲン結合部位をブロックし（Ｓｃｈｕｌｔｅ、Ｖ．ら．「マウス血小板の活性化に対するコラーゲン中の２つの異なるエピトープ」Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６、３６４〜３６８頁）、また高剪断フロー条件下で固定化線維性コラーゲンへの強固な血小板接着をほぼ完全に阻害する（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．ら．「α２β１インテグリンではなく糖タンパク質ＶＩが血小板とｐコラーゲンの相互作用に必須である」Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  α２β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００１；２０、２１２０〜２１３０頁）。動脈血栓形成における血小板接着／凝集の動的プロセスにおけるＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用の重要性を研究するために、ＪＡＱ１のＦａｂ断片またはアイソタイプの合った対照ＩｇＧと一緒にあらかじめ培養した同系の蛍光標識血小板を与えておいたマウスに、頚動脈損傷を上記のように誘導した。極めて意外なことに、我々は、ＧＰＶＩの阻害により、内皮除去後の初期の血小板係留が総頚動脈において８９％減少すること（Ｐ＜０．０５ｖｓ．対照ＩｇＧ、図２ａ）を発見し、このプロセスは固定化ｖＷＦとのＧＰＩｂαの相互作用によって主に媒介されると考えられた（Ｇｏｔｏ、Ｓ．、Ｉｋｅｄａ、Ｙ．、Ｓａｌｄｉｖａｒ、Ｅ．＆Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｚ．Ｍ．「異なる剪断流条件の結果としての血小板凝集の異なる機構」Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｈｅａｒｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１、４７９〜４８６頁；Ｓｉｘｍａ、Ｊ．Ｊ．、ｖａｎ  Ｚａｎｔｅｎ、Ｇ．Ｈ．、Ｂａｎｇａ、Ｊ．Ｄ．、Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｌｓ、Ｈ．Ｋ．＆ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、Ｐ．Ｇ．「血小板接着」Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９５；３２、８９〜９８頁）。さらに、安定な血小板捕捉は、ＪＡＱ１によって９３％減少した（図２ａ）。我々は、内皮下表面との初期の接触を確立した血小板のうちのたった５８％で、初期の係留／緩慢な表面移動から非可逆的な血小板接着への移行を観察した（対照ＩｇＧ前処理血小板の場合の８９％と比較して、Ｐ＜０．０５、図２ｂ）。接着血小板の凝集は、ＪＡＱ１のＦａｂ断片を用いて血小板を前処理した場合には実質的になかったが、対照の場合はそうではなかった（Ｐ＜０．０５ｖｓ．対照、図２ｃおよびｄ）。これらのデータから、直接的な血小板−コラーゲン相互作用が血管損傷部位における初期の血小板係留およびその後の安定な血小板接着および凝集に極めて重要であることが示された。さらに、これらの発見は、ＧＰＶＩはこのプロセスの重要な制御因子であるが、他の表面受容体、最も重要なことにはＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸおよびα２β１はｉｎ  ｖｉｖｏにおける内皮下層への血小板接着および凝集を開始するのに十分ではないことを示している。
この作用が表面結合ＪＡＱ１によって他の受容体、例えばＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸの立体障害に基づいている可能性を排除するために、我々は、血管損傷の５日前にＪＡＱ１を注射することによってＧＰＶＩ欠損マウスを生成した。既に報告されているように、このような処理により、例えば循環血小板中のＧＰＶＩの内部移行およびたんぱく質分解によってＧＰＶＩの実質的に完全な損失が誘導され、「ＧＰＶＩノックアウト」様表現型が少なくとも２週間もたらされる（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ、Ｂ．ら．「マウスにおける血小板グリコプロテインＶＩのインビボ涸渇による長期抗血栓性保護」Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９３、４５９〜４６９頁）。図３ａに示すように、ＧＰＶＩは、対照ＩｇＧではなく１００μｇ／マウスＪＡＱ１を注射してから５日目のＪＡＱ１処理マウス由来の血小板では検出されなかったが、ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ、αＩＩｂβ３、およびα２β１を含む試験した他のすべての受容体の表面発現および機能は、両方のグループのマウスで変わらず、それまでの結果を裏付けた（図示していないデータおよびＮｉｅｓｗａｎｄｔ、Ｂ．ら．「マウスにおける血小板グリコプロテインＶＩのインビボ涸渇による長期抗血栓性保護」Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９３、４５９〜４６９頁）。
【００６７】
走査型電子顕微鏡によって示されるように、総頚動脈の内皮除去後の血小板接着および凝集は、実質的にＧＰＶＩ欠損マウスで起こらないが、ＩｇＧ前処理マウスではそうではない（図３）。次に、ｉｎ  ｖｉｖｏビデオ蛍光顕微鏡検査法を使用して、ＧＰＶＩ欠損マウスの血管損傷後の血小板接着動力学を定義した（図３ｃ〜ｆ）。
【００６８】
ＧＰＶＩ欠失により、血管損傷部位での血小板の係留／緩慢な表面移動が著しく減少する（ＩｇＧ前処理マウスと比較して８３％、Ｐ＜０．０５）。このＧＰＶＩ非依存性の緩慢な表面移動にはｖＷＦ−ＧＰＩｂα相互作用が必要である。なぜならばｂＧＰＩｂαに対する機能ブロッキング性ｍＡｂのＦａｂ断片（ｐ０ｐ／Ｂ）と血小板をプレインキュベーションすることによって抑制されるからであり、このプロセスにおけるＧＰＩｂαの重要な役割を裏付けている（図示していない）。ＧＰＶＩがない場合、安定な血小板接着は、（ＩｇＧ処理）対照と比較して約９０％減少するが、接着血小板の凝集は実質的に起こらない（図３ｂ〜ｆ）。我々は、血小板係留から安定な血小板接着への移行が見られたのは、損傷部位に初期に繋ぎとめられたすべての血小板のうち５８％だけであり（対照ｍＡｂ前処理血小板の場合の８９％に比較して、Ｐ＜０．０５、図３ｄ）、ＧＰＩｂα依存性表面移動は安定な血小板接着およびその後の凝集を促進するのに十分ではないことを示している。
【００６９】
ＧＰＶＩブロックによる血小板係留の完全な阻害は驚くべきことであり、血管病変への強固な血小板接着の極めて初期のフェーズでのこの受容体のこれまでに認識されていない機能を示唆した。線維性コラーゲンは、ヒトアテローム硬化性病変の主要な成分であり（Ｒｅｋｈｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．動脈硬化におけるコラーゲンの過剰合成および不十分合成」Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｔｏｏ  ｍｕｃｈ  ａｎｄ  ｎｏｔ  ｅｎｏｕｇｈ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．１９９９；４１、３７６〜３８４頁；Ｒｅｋｈｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．ら．ヒト動脈硬化におけるＩ型コラーゲンの遺伝子発現」Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ａｍ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３；１４３、１６３４〜１６４８頁）；（内膜平滑筋細胞および線維芽細胞での）コラーゲン合成の亢進は、アテローム発生のプロセスにおける管腔狭窄に著しく寄与する（Ｏｐｓａｈｌ、Ｗ．Ｐ．、ＤｅＬｕｃａ、Ｄ．Ｊ．＆Ｅｈｒｈａｒｔ、Ｌ．Ａ．「インビボで定量された動脈硬化性動脈におけるコラーゲン合成の亢進」Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １９８７；７、４７０〜４７６頁）。プラーク破裂または開裂（自然発生的またはバルーン血管形成後）は、血流へのコラーゲン原線維の露出をもたらす。
【００７０】
本発明は、このような内皮下コラーゲンが動脈血栓形成の主なきっかけであることを初めて教示し、損傷した血管壁への血小板動員におけるコラーゲン受容体ＧＰＶＩの予期しない機能を明らかにするものである。高い剪断条件下での血小板係留および緩慢な表面移動のプロセスは、固定化ｖＷＦとのＧＰＩｂα相互作用に大きく依存することが知られている。しかし機能的なＧＰＶＩも必要とされるので、この相互作用はｉｎ  ｖｉｖｏにおける初期の血小板−血管壁相互作用を確立するのには十分ではない（図２および３）。したがって、内皮下層に血小板を動員するためにＧＰＩｂαとＧＰＶＩの両方が協力しなければならない。血小板係留中にＧＰＶＩが連結すると、αＩＩｂβ３およびα２β１インテグリンを低親和性状態から高親和性状態にシフトさせることができる。次いで、αＩＩｂβ３とα２β１の両方は協力してその後のコラーゲン上への血小板の安定な捕捉を促進する。αＩＩｂβ３はその後の接着血小板の凝集に必須である。したがって、血小板と内皮下コラーゲンの初期の接触中にＧＰＶＩが結合することにより、その後の安定な血小板接着および凝集に必須の活性化シグナルがもたらされる。重要なことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは低レベルのαＩＩｂβ３インテグリン活性化を誘導した、ＧＰＩｂαの占有または横並びクラスター形成（ＧＰＩｂα依存性表面移動中）（ＫａｓｉｒｅｒＦｒｉｅｄｅ、Ａ．ら．「血小板ＧＰＩＢ−ＩＸ複合体の横並びクラスター形成はインテグリンαＩＩｂβ３の接着機能をアップレギュレートする」Ｌａｔｅｒａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰＩｂ−ＩＸ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂβ３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；Ｖｏｌ  ２７７：１１９４９〜１１９５６頁）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着を促進するのに十分ではないことである。
【００７１】
したがって、本発明は、内皮下層への血小板付着を阻害するのに必須の受容体を同定した。露出したコラーゲンとのＧＰＶＩの相互作用をブロックする抗体は、血栓形成のすべての主なフェーズ、すなわち動脈損傷部位での血小板係留、強固な接着、および凝集を特に阻害することができる（例えば急性冠状動脈症候群において）。ＧＰＶＩの阻害または欠乏によって極めて大きい保護が得られるということは、病理学的なアテローム硬化性病変の発生および進行を制御するためにＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用を選択的薬理学的に調節することの重要性を確立するものである。
【００７２】
アテローム斑の破裂に続いて、内皮下コラーゲンの露出が損傷部位での血小板接着および凝集を開始させる主な引き金であり、その後に動脈血栓が起こる（１；２４；２５）。近年クローン化された（５；６）血小板糖タンパク質ＧＰＶＩは、本発明によって主要な血小板コラーゲン受容体（４）であることが確認されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（２２）とｉｎ  ｖｉｖｏ（病態）生理学的条件下（３）の両方で血小板接着を媒介する。したがって、本発明に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着に対する特異的な融合タンパク質Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの阻害活性によるＧＰＶＩ阻害により、進行型アテローム性動脈硬化症にかかっている患者の血小板動員および動脈血栓が抑制される。
【００７３】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ融合タンパク質は、可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを得るためにアデノウィルス発現系を用いてＨｅｌａ細胞中に発現させる。可溶形態のＧＰＶＩの特徴付けによって、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが分子量約１６０ｋＤａの二量体として分泌されることが明らかになった。一貫してＭｉｕｒａおよび共同研究者らは、ＧＰＶＩ−Ｆｃ−二量体が二量体として存在しており、２個のＧＰＶＩ−Ｆｃ−二量体分子が、各分子のＦｃドメインのＣｙｓが形成するジスルフィド結合によって架橋されていることを最近報告した（２１）。重要なことには、ＧＰＶＩの細胞外ドメインの単量体ではなく、二量体型のＧＰＶＩだけが、コラーゲン結合親和性を示し、コラーゲン誘導性血小板凝集を弱めることが報告されている（２１）。
【００７４】
結合アッセイを行って、ＧＰＶＩ−Ｆｃ−二量体−コラーゲン相互作用を明らかにした。可溶性ＧＰＶＩは、飽和するように固定化コラーゲンと結合する。線維性コラーゲンとＧＰＶＩ−Ｆｃ−二量体の結合は、固定化ｖＷＦまたはＢＳＡでは結合がおこらなかったので、極めて特異的であった。さらに、固定化コラーゲンとＧＰＶＩの結合は、可溶性コラーゲンによって阻害することができる。ＧＰＶＩ−Ｆｃ−二量体結合をブロックするのには高濃度の可溶性コラーゲンが必要であり、融合タンパク質が高い親和性で固定化コラーゲンと結合することを示した。同様に、高い結合解離定数（ＫＤ約５．８×１０−７Ｍ）がＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用について報告されている（２１）。
【００７５】
可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、コラーゲンまたは高い親和性でＧＰＶＩと結合するヘビ毒のコンバルキシン（ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ）による血小板活性化および凝集を軽減させることが以前に実証されている（６；２１；２７）。血小板凝集の他に、ＧＰＶＩは、コラーゲンへの血小板接着のプロセスに決定的に関与している（３；２２）。したがって、本研究では、我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生理学的フロー条件での血小板接着に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響を試験した。我々は、可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが用量依存的にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける低および高剪断条件で血小板接着を阻害することを示す。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの存在下では接着血小板の凝集が実質的に起こらないが、対照Ｆｃペプチドの存在下では起こるので、ＧＰＶＩが血小板接着とその後の固定化コラーゲンによる活性化の両方のプロセスに寄与することが示唆される。ＧＰＶＩは、受容体密度依存性のコラーゲン応答（すなわち接着および凝集）を与える（２２）。同様に、トランスフェクトされたＲＢＬ−２Ｈ３細胞ではＧＰＶＩ発現が５０％以上低下しており、これらの細胞がコラーゲン誘導性凝集を欠くことに関連していることが報告されている（８；２２）。小さな試料集団ではあるが、ＧＰＶＩ受容体密度のばらつきが低いことが報告されている（２２）ので、コラーゲン−ＧＰＶＩ結合の約５０％の阻害が、露出したコラーゲンへの血小板動員を弱めるのに十分であることが予想可能である。本研究では、フロー下での血小板接着の著しい阻害を誘導するのに用量１ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが必要であった。このことは、各コラーゲン線維には複数のＧＰＶＩ結合部位があるという考えを支持している。同様の量の機能ブロッキング抗ＧＰＶＩ抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板−血管壁損傷を軽減するのに必要であった（３）。
【００７６】
線維性コラーゲンは、正常な血管壁の主な成分であるが、アテローム硬化性病変の主な成分でもある（２８）。アテローム斑の破裂または開裂により、循環血小板にコラーゲン原線維が露出することになる。以前に報告されたように、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用は、血管損傷後の動脈血栓形成に本質的に関与している（３）。ここでは我々は、動脈損傷後の血小板動員に対する可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を実証する。頚動脈の可逆的な結さつによって内皮除去を誘導し、血小板付着の動的プロセスを生体ビデオ蛍光顕微鏡検査法によってモニターした（３）。我々は、可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによって内皮除去後の安定な血小板係留、接着および血小板凝集が軽減されることをｉｎ  ｖｉｖｏで初めて実証している。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによる血小板動員の阻害は、用量依存的であった。血小板の安定な制止の抑制以外に、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、内皮除去部位での初期の血小板係留／緩慢な表面移動を著しく低減させた。我々は、ＧＰＩｂαまたはＧＰＶＩの阻害により、血小板係留が同程度弱められることを示し（３）、内皮下コラーゲンへの血小板係留を促進するのにはＧＰＶＩおよびＧＰＩｂαの相互作用が接触して働く必要があること（２；２９〜３１）を支持している。事実、ＧＰＶＩ−リガンド相互作用について報告されている高い「オン」および「オフ」の速度（２２）は、係留受容体としてのＧＰＶＩの役割と整合性がある。
【００７７】
本発明は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを、血管損傷後の動脈血栓を軽減する医薬品の活性成分として特定している。免疫組織化学によって示されるように、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが、血管損傷部位で露出した内皮下層を標的としているという観察はさらにこの考えを支持する。これは、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用の阻害はおそらく血管損傷部位に限られており、一方非結合Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの予想される半減期は短いので、血小板機能が全身的に長期に阻害されることには制限があることを意味している。対照的に、ＧＰＶＩを対象としたモノクローナル抗体を投与すると、すべての循環血小板のＧＰＶＩが全身的阻害を受ける。さらに、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの投与は、血小板数に影響を与えなかった。対照的に、抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂｓは、最終的に免疫性血小板減少症または循環血小板上のＧＰＶＩの完全欠失につながる可能性があり（１４；３２）、臨床で使用できない。したがって、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ療法は、抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂに基づく戦略と比較して、臨床出血を伴う危険性がより低いと思われる。
【００７８】
血管損傷部位での血小板接着および凝集は、止血に関して極めて重要であるが、アテローム性動脈硬化症の状況下では動脈閉塞を招き、冠状動脈血栓および心筋梗塞などの疾患を誘起する。静脈内ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ受容体阻害剤の使用により、冠状動脈ステント術を受けた患者の臨床成功が著しく向上している（３３〜３５）。しかし、重篤な出血合併症がアブシキシマブ(abciximab)で治療した患者の予後を悪くすることが報告されている（３６）。本発明は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによるＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で血小板接着を著しく減少させるのに十分であることを実証する；しかし、可溶形態のＧＰＶＩは、尾部出血時間を適度に延長しただけであった。同様に、ＧＰＶＩ欠損血小板を有する患者で軽い出血障害が報告されており（３７）、ＧＰＶＩが完全にない場合でも凝結および止血が有効であることが示唆されている。一部には、この矛盾は、ＧＰＶＩの阻害または不在により、コラーゲン以外の血小板アゴニスト、例えばＡＤＰ、組織因子またはトロンビンに対して血小板凝集が妨害されないことによるものであるかもしれない。対照的に、例えば７Ｅ３またはそのヒト化誘導体によるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの直接的な阻害は、血小板に結合しているフィブリノーゲンをブロックし、血小板凝集に必須のプロセスであり、これまで知られているほとんどの血小板アゴニストに対して実質的に血小板凝集を軽減させる。したがって、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ療法は、抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａに基づく戦略と比較して、リスクが低い臨床出血を伴う。
【００７９】
結論として、本発明は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるフロー下およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウス頚動脈の内皮除去後での血小板接着を軽減させる初めてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける証拠を提供している。これは、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用が、血栓形成のすべての主なフェーズ、すなわち動脈損傷部位での血小板係留、強固な接着、および凝集で中心的な役割を果たすという概念をさらに支持している（例えば急性冠状動脈症候群中）。本発明は、ＧＰＶＩがアテローム性動脈硬化症の進行において主要な役割を果たすという概念をさらに支持している。さらに、本発明は、ＧＰＶＩと糖尿病の間の因果関係を初めて示している。
次に、以下の具体例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【００８０】
［実施例］
実験動物。  特定病原体不在Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（スルツフェルト、ドイツ）から入手した。実験には１２週齢の雄マウスを使用した。実験動物に行ったすべての実験手順はドイツの動物保護に関する法律で承認されるものである。
【００８１】
モノクローナル抗体。  抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＪＡＱ１）及び抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体（ｐ０ｐ／Ｂ）、ならびにＪＡＱおよびｐ０ｐ／ＢのＦａｂ断片を、既報（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ．，Ｒａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｋ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｗ．，Ｚｉｒｎｇｉｂｌ，Ｈ．＆Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰｌｂ−ＩＸ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９５，８８６〜８９３頁；Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ，Ｂ．，Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ．，Ｒａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｋ．，Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．＆Ｚｉｒｎｇｉｂｌ，Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６，２５２０〜２５２７頁）のように作製した。特異性に無関係な対照（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ）のラットＩｇＧはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（ハンブルク、ドイツ）から入手した。
【００８２】
ＧＰＶＩ欠損マウスの作製。
ＧＰＶＩ欠損マウスを作製するため、野生型Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにＪＡＱ１を１００μｇ投与した。血小板接着のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価のためにはモノクローナル抗体注射後５日目の動物を使用した。。血小板上でのＧＰＶＩの発現が欠損していることは、ウェスタンブロット解析とフローサイトメトリーにより確認した。
【００８３】
フローサイトメトリー
野生型Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスまたはＧＰＶＩ欠損マウスから得たヘパリン化全血を、タイロード−ＨＥＰＥＳバッファー（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．９ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．６）で３０倍に希釈した。試料を蛍光標識した抗ＧＰＶＩ（ＪＡＱ１）および抗ＣＤ４１モノクローナル抗体とともに室温で１０分間培養し、直接ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で解析した。
【００８４】
ヒトおよびマウスの可溶性ＧＰＶＩのクローニング、ウィルス発現および精製
可溶型ヒトＧＰＶＩを作製するため、以下の実施例１から実施例３に従い、ヒトまたはマウスＧＰＶＩ細胞外ドメインをクローン化し、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインに融合した。ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質もしくは対照であるＦｃをコードするアデノウィルス構築体を調製し、組換えタンパク質を作製した。発現タンパク質のミスフォルディングとグリコシル化の欠損を防ぐため、ヒトＨｅＬａ細胞系を使用して、ＧＰＶＩ−Ｆｃおよび対照Ｆｃを可溶性分泌タンパク質として発現させた。
【実施例１】
【００８５】
ＧＰＶＩのイムノアドヘシン（Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ）のクローニング
ＧＰＶＩ細胞外ドメインをコードするＧＰＶＩのＮ端末部と、ＩｇＧのＦｃ部との組換え融合タンパク質を作製することにより、ＧＰＶＩ受容体のイムノアドヘシンを作製した。Ｆｃは、正方向プライマー５’−ｃｇｃｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｇｔｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃ−３’および逆方向プライマー５’−ｇｃｇｇｇａａｇｃｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇ−３’を用い、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、パロ・アルト、カルフォルニア）からＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応はＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、マンハイム、ドイツ）を用い、アニール温度を５８℃として２０サイクル行った。ＰＣＲ断片をＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＡＤＴｒａｃｋＣＭＶプラスミドでクローニングし、配列をシーケンサー（ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ社、マルティンスリート、ドイツ）により確認した。
ヒトＧＰＶＩ細胞外ドメインのクローニングのために、培養巨核球からＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を製造社のプロトコールに従って単離し、２μｇのＲＮＡを用いて３７℃で一晩逆転写を行った（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社）。１００ｎｇの上記反応生成物を鋳型として用い、プライマー５’−ｇｃｇｇｇｇａｇａｔｃｔａｃｃａｃｃａｔｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｃｃｇａｃｃ−３’および５’−ｃｇｃｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｔｔｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｔａｇｔａｃ−３’を用いてｈＧＰＶＩのＰＣＲにより増幅を行った。ＰＣＲ反応はＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、マンハイム、ドイツ）を用い、アニール温度を５４℃として２４サイクル行った。ＰＣＲ断片をＢｇＩＩＩ／ＮｏｔＩを用い上記ｐＤＡＴｒａｃｋＣＭＶ・Ｆｃプラスミドでクローニングし、配列を確認した。
【００８６】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔに基づく単量体融合タンパク質の構築
Ｆｃ単量体断片を、プライマー対５’−ｃｇｃｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇ−３’および５’−ｃｇｃｇｇｇｇａｔａｔｃｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇ−３’を用い、鋳型としてｐＡＤＴｒａｃｋＣＭＶ  ｇｐＶＩ−Ｆｃを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応はＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、マンハイム、ドイツ）を用い、５８℃でアニールを行い、２０サイクル行った。Ｆｃ単量体のＰＣＲ断片（ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ）およびｐＡＤＴｒａｃｋＣＭＶ  ｇｐＶＩ−Ｆｃ（ＢｇＩＩＩ／ＮｏｔＩ）からのｇｐＶＩ断片を、上述と同様にクローニングした。
【実施例２】
【００８７】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（Ａｄ−Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ）のためのアデノウィルスの作製
プラスミドｐＡＤＴｒａｃｋＣＭＶ  Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔをＰｍｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ）で一晩直線化し、脱リン酸化し、精製した（ＧＦＸ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）。組換えのため、１μｇの直線化プラスミドと０．１μｇのｐＡｄｅａｓｙ１を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌ＢＪ５１８３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラジョラ、カルフォルニア）を２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦＤで形質転換し（Ｅ．ｃｏｌｉ−ｐｕｌｓｅｒ；Ｂｉｏｒａｄ社、ハイデルベルク、ドイツ）、培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。コロニーから小規模で調製したプラスミドＤＮＡをＰａｃＩを用いて確認し、陽性クローンで大腸菌ＤＨ５αを再形質転換した。
【００８８】
プラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化し、これを用いて２９３細胞の形質転換を行った（Ｅｆｆｅｃｔｎｅｎｅトランスフェクション試薬；Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）。細胞を７日間培養し、剥がしとり、遠心分離して回収した。ペレットはダルベッコＰＢＳに再懸濁し、凍結（−８０℃）と融解（３７℃）のサイクルを４回繰り返すことにより溶解した。細胞残屑を遠心分離で取り除き、溶菌液を−８０℃で保存した。
【００８９】
組換えウィルスのプラーク選択のために、段階希釈したトランスフェクション溶菌液を用い、２９３細胞をダルベッコＰＢＳ中で、緩和に撹拌しながら、室温で１時間、感染させた。感染後、０．５％アガロースを含む培養培地（２０％血清を含む改変イーグル培地（＃２１９３５；Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）２ｘ、２ｘペニシリン／ストレプトマイシン、２ｘＬ−グルタミン、および１％アガロース（Ｓｅａｃａｍ）溶液との１対１混合物）で細胞を重層した。感染後５日目から１４日目まで細胞のプラーク形成をモニターし、形成されたプラークはパスツールピペットを用いて収集し、０．５ｍＬダルベッコＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。プラークは２９３細胞を用い、さらに増幅を行った。
【００９０】
ヒトｇｐＶＩ−Ｆｃ単量体を安定に発現するＣＨＯ細胞の構築
単量体を発現する細胞を実施例２に従って作製した。
【実施例３】
【００９１】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔタンパク質および対照イムノアドヘシン（Fc）の精製
Ａｄ−Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを感染させたＨｅＬａ細胞の培養上清を感染２日後に収集、遠心分離し（３８００ｇ、３０分、４℃）、濾過した（０．４５μｍ）。イムノアドヘシンに１体積の硫酸アンモニウム（７６１ｇ／ｌ）を加えて、４℃で一晩攪拌した。タンパク質を遠心分離（３０００ｇ、３０分、４℃）でペレット化し、０．１体積のＰＢＳに溶解し、ＰＢＳを用いて４℃で透析した。タンパク質溶液を遠心分離（３０００ｇ、３０分、４℃）で清澄化し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）で精製した。カラム洗浄はＯＤ２８０が０．０１未満になるまで結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０、０．０２％ＮａＨ３）を用いて行い、溶出バッファー（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７）で溶出した。溶出画分を中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０、０．０２％ＮａＨ３）で中和し、回収したものを、ＰＢＳで４℃で一晩透析し、分注して−２０℃で凍結した。
精製されたＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動した後に、クマシーブルー染色もしくはヤギ抗ヒトＦｃペルオキシダーゼ結合抗体または抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体５Ｃ４を用いたイムノブロット法により、分子量約８０ｋＤａで検出された（図１ａ上段と中段）。一方、非還元条件下では約１６０ｋＤａのタンパク質が同定され（図１下段）、これはＧＰＶＩ−Ｆｃは全て二量体として得られるという報告を裏付けるものであった（２１）。
【実施例４】
【００９２】
ＧＰＶＩ阻害剤のスクリーニング試験
ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ２  ＨＢ；Ｄｙｎｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、チャンティリー、バージニア）を１μｇ／ウェルのコラーゲン（ウシ由来Ｉ型；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ベッドフォード、マサチューセッツ）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μＬを用い４℃で一晩コーティングした。プレートを２５０μＬ／ウェルのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で２回洗浄し、２５０μＬ／ウェルのＲｏｔｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ）で一晩ブロッキングした。プレートを２５０μＬ／ウェルのＰＢＳＴで２回洗浄し、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを含むＰＢＳＴを１００μＬ加え（最適値２μｇ／ウェル）、プレートを室温で１時間インキュベートした。２５０μＬのＰＢＳＴで５回洗浄した後、１：１００００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社、ハンブルク、ドイツ）を１００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。２５０μＬのＰＢＳＴで繰り返し洗浄した後、１００μＬの検出試薬（ＢＭブルーＰＯＤ基質；Ｒｏｃｈｅ社、マンハイム、ドイツ）を加え、１５分間インキュベートした。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ加えて反応を停止させ、６９０ｎｍを参照として４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。阻害剤のスクリーニングには、ＰＢＳ−Ｔで様々な濃度に調製した試験物質１００μＬをインキュベートの際に加えた。
【実施例５】
【００９３】
血小板凝集と発光測定法
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血小板凝集は、クエン酸処理した血試料を用いて、３７℃で２チャンネルＣｈｒｏｎｏｌｏｇ凝集測定装置（Ｎｏｂｉｓ社、ドイツ）を用いて、光学式凝集測定法により評価した。多血小板血漿はクエン酸処理した全血から遠心分離（２００ｇで２０分間）により調製し、自家血漿を用いて最終血小板数を２ｘ１０８血小板／ｍＬに調節した。ベースライン補正した後、０．２ないし０．４μｇ／ｍＬのコラーゲン（ウシ由来Ｉ型）を加え、凝集を５分間記録した。また、ＡＴＰの放出をホタル発光測定法で記録した。５０μｇ／ｍＬの抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体ＪＡＱ１と１５分間インキュベートした。
【実施例６】
【００９４】
血小板接着試験を用いたＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用試験
ＡＣＤ血液（最終濃度２０％）から多血小板血漿を調製し、ＨＥＰＥＳ−タイロード液（ｐＨ６．５）により最終濃度を１０８血小板／ｍＬに調節した。異なる濃度の種類の異なる血小板接着タンパク質（コラーゲン、ｖＷＦ）でカバーグラスを単層コーティングした。灌流実験はこれらのカバーガラスを用いて作製した灌流チャンバーで行った。灌流は低〜中５００／ｓ、また高速流２０００／ｓの剪断速度で行った。血小板接着を３７℃で２０分間測定し、自動シリンジポンプを使用して一定の壁剪断速度で５分間チャンバーに引き流した。灌流後、チャンバーから取りはずしたカバーガラスをＨＥＰＥＳ−タイロード液で軽く洗浄した。カバーガラスをＨＥＰＥＳ−タイロード液で繰り返し洗浄して、接着血小板を完全に取り除いた。懸濁液中の血小板をＦＡＣＳ測定により定量分析した。標準的なフローサイトメトリーの手順に従い、表面マーカー発現分析（ＣＤ４１，ＣＤ６１およびＣＤ６２Ｐ）の解析により血小板の機能状態をさらに評価した。
【実施例７】
【００９５】
生体顕微鏡検査法のための血小板の調製
血小板（野生型もしくはＧＰＶＩ欠損型）を既報（Ｍａｓｓｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８；９２，５０７〜５１５頁）のように全血から単離し、５−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＤＣＦ）で標識した。ＤＣＦ標識した血小板懸濁液を最終濃度２００ｘ１０６血小板／２５０μＬに調製した。必要な場合には、蛍光野生型血小板を５０μ／ｍＬの抗ＧＰＶＩ（ＪＡＱ１）Ｆａｂ断片もしくは抗ＧＰＩｂα（ｐ０ｐ／Ｂ）Ｆａｂ断片と１０分間前培養した。その後、前処理した血小板をＦａｂ断片とともに野生型レピシエントマウスに注入し、下記のように、血小板接着を頚動脈損傷の前後でｉｎ  ｖｉｖｏビデオ顕微鏡検査法により評価した。
【実施例８】
【００９６】
生体顕微鏡検査法による血小板接着および凝集の評価
野生型Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスまたはＧＰＶＩ欠損マウスに、ミダゾラム（５ｍｇ／体重ｋｇ、Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ社、ウルム、ドイツ）、メデトミジン（０．５ｍｇ／体重ｋｇ、Ｐｆｉｚｅｒ社、カールスルーエ、ドイツ）およびフェンタニル（０．０５ｍｇ／体重ｋｇ、ＣｕｒａＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社、ミュンヘン、ドイツ）の溶液を腹腔内注射して麻酔した。ポリエチレン製カテーテル（Ｐｏｒｔｅｘ社、ハイズ、イギリス）を右頚静脈に植え込み、蛍光血小板（２００ｘ１０６／２５０μＬ）を静脈注入した。右総頚動脈を切開して開放し、頚動脈分岐部付近を５分間きつく結紮して血管損傷を引き起こした。血管損傷の前後で、右総頚動脈のｉｎ  ｖｉｖｏビデオ顕微鏡検査法により、蛍光血小板をｉｎ  ｓｉｔｕで視覚化した。血小板と血管壁の相互作用は、落射照明用１００Ｗ・ＨＢＯ水銀ランプを付けたＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｔｅｃｈ顕微鏡（２０ｘ水浸対物レンズ、Ｗ２０ｘ／０．５、Ｚｅｉｓｓ社）を使いモニターした。ビデオに撮った画像はすべて、コンピュータ援用画像解析プログラム（Ｃａｐ  Ｉｍａｇｅ７．４；Ｚｅｉｎｔｌ博士、ハデルベルク、ドイツ）を使用して評価した。一過性接着血小板を、中心線速度より著しく低い速度で血管の仮想垂線を横切る細胞と定義した。その数は内皮表面１ｍｍ２あたりの細胞数で決定される。接着血小板の数は、１０秒以内に動かないか内皮表面から離れない細胞数を数えて評価した。血管損傷部位での血小板凝集数も定量化し、１ｍｍ２あたりの数で表した。
【実施例９】
【００９７】
走査型電子顕微鏡検査法
生体ビデオ蛍光顕微鏡検査の後、上記頚動脈にＰＢＳ（３７℃）を１分間還流させ、続いてリン酸緩衝グルタルアルデヒド（１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）で灌流固定した。頚動脈を切除し、縦方向に開き、１％のＰＢＳ緩衝グルタルアルデヒドに１２時間浸してさらに固定化し、エタノールで脱水し、ＣＯ２を用いた臨界点乾燥法により処理した。その後、頚動脈検体の管腔を露出させ、炭素ペーストを用いて試料台に載せ、プラチナをスパッタコーティングし、電界放出形走査電子顕微鏡（ＪＳＭ−６３００Ｆ；日本電子（株））を使用して測定した。
【実施例１０】
【００９８】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの固定化コラーゲンへの結合評価
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの固定化コラーゲンへの結合は以下のとおり測定した。すなわち、ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ２  ＨＢ；Ｄｙｎｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、チャンティリー、バージニア）を１μｇ／ウェルのコラーゲン（ウシ由来Ｉ型；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ベッドフォード、マサチューセッツ）を含むコーティングバッファー（１．５９ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３、２．９３ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、０．２ｇ／Ｌ  ＮａＮ３、ｐＨ９．６）１００μＬを用い４℃で一晩コーティングした。プレートを２５０μ／ウェルのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で２回洗浄し、２５０μＬ／ウェルのＲｏｔｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ）で一晩ブロッキングし、さらに２５０μＬ／ウェルのＰＢＳＴで２回洗浄し、３．０、６．０、１２．５、２５．０、５０．０もしくは１００μｇ／ｍＬのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを含むＰＢＳＴを加え、室温で１時間培養した。必要に応じ、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（２０μｇ／ｍＬ）を可溶性コラーゲンとともに１０分間プレインキュベートした。インキュベート後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで５回洗浄し、１：１００００に希釈したＦｃγ断片特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（１０９−０３５−０９８；Ｄｉａｎｏｖａ社、ハンブルク、ドイツ）を加え、室温で１時間培養した。２５０μＬのＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００μＬの検出試薬（ＢＭブルーＰＯＤ基質；Ｒｏｃｈｅ社、マンハイム、ドイツ）を加え、１０分間培養した。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬを加えて反応を停止させ、プレートを６９０ｎｍを対照として４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９９】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、固定化コラーゲンへの濃度依存的に結合し、その後結合は飽和状態を示した（図９ｂ）。コラーゲンへの結合はＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの最終濃度が６．０μｇ／ｍＬのときに飽和量の２分の１の結合を示した。ＧＰＶＩ−Ｆｃの結合は、ＢＳＡ、ｖＷＦ（図９ｃ左段）あるいはポリ−Ｌ−リジン（データ略）に対しては起こないことより、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの結合が特異的であることが分かる。さらに、同一の条件下で、外部ＧＰＶＩドメインを欠く対照Ｆｃタンパク質では有意な結合は検出されなかった（図９ｃ右段）。
【０１００】
ＧＰＶＩ結合の特異性についてさらに解析するため、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔとの会合について、可溶化線維性コラーゲンを用いて固定化コラーゲンに対する競争阻害実験を行った。ところ、可溶化コラーゲンはＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの固定化コラーゲンへの結合を濃度依存的に阻害した（図９ｄ）。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの結合を５０％以上減少させるには、濃度１００μｇ／ｍＬの可溶化コラーゲンを必要とした。同時にこの結果は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔのコラーゲンへの結合が特異的で、かつ高親和性が特徴であることを示している。
【実施例１１】
【０１０１】
抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を既報（１７）のように作製した。Ｌｏｕ／Ｃラットを、アデノウィルスで発現したヒトＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ融合タンパク質で免疫した。得られたハイブリドーマの培養上清をＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔまたはＧＰＶＩドメインを欠くＦｃを用いて固相イムノアッセイでスクリーニングした。その結果ハイブリドーマ５Ｃ４の上清がＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔに特異的に結合し、かつ対照Ｆｃには結合しないことがわかった。免疫グロブリンの型を、ラットＩｇクラス（抗ＩｇＭ）およびマウスＩｇＧサブクラス特異的モノクローナル抗体を用いて決定した。５Ｃ４モノクローナル抗体はプロテインＧセファロースカラムを使用して精製した。５Ｃ４の抗体特異性をＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔと対照Ｆｃに対するイムノブロット法により確認したところ、モノクローナル抗体５Ｃ４はアデノウィルスで発現させたＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔと結合するたが、対照Ｆｃとは結合しないことが示された。さらに、ヒト血小板から得た溶解物よりヒトＧＰＶＩを回収した。また、フローサイトメトリーを用いた結果より、５Ｃ４は血小板表面に特異的に結合するが、白血球や赤血球の表面には結合しないことが示された（データ略）。
【実施例１２】
【０１０２】
ＣＤ６２Ｐ在外化のＦＡＣＳ測定
クエン酸処理ヒト血液を志願者から調製した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を４℃で２０００ｒｐｍの遠心分離し、洗浄（ＰＢＳ１ｘ、ｐＨ７．２）と再懸濁により作製した。染色バッファー（１ｘＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含）、０．１％アジ化ナトリウム、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ  ＣａＣｌ）で希釈したＰＲＰを、ウマＩ型コラーゲン（０；２；５および１０μｇ／ｍＬ；Ｎｏｂｉｓ社）と、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（１００μｇ／ｍＬ）もしくは等モル濃度の対照Ｆｃの存在下で培養した。フルオロフォア・ペルオキシダーゼで標識した抗ＣＤ６２Ｐ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）を加えた。ＦＡＣＳ測定はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置を用いて行った。
【０１０３】
コラーゲン濃度を増加することにより血小板のアルファ顆粒からの分泌が導かれ、それはＣＤ６２Ｐの外在化によって示される。一方、コラーゲンをＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔとともにインキュベートすることにより、ＣＤ６２Ｐの外在化を低下させることがＦＡＣＳにより測定された（図１０）。
【実施例１３】
【０１０４】
血小板凝集とＡＴＰ放出
ＰＲＰは上述のとおり作製した。血小板凝集は全血凝集測定装置５００ＶＳ（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ社）で測定した。タイロード−ＨＥＰＥＳバッファー（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、５．５ｍｍｏｌ  Ｄ−グルコース、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）により、ＰＲＰの血小板細胞数を１．０ｘ１０８細胞／ｍＬに調製した。ＡＴＰ測定のためにＣｈｒｏｎｏ−Ｌｕｍｅ＃３９５（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ社）を加えた。血小板凝集作用効果を持つ様々な物質を血小板に加え、ピペットで凝集測定装置に入れ、規定の攪拌条件下で凝集を誘導した。凝集は凝固する血小板が原因の光透過率の変化により測定し、内部標準に標準化した。ＡＴＰの放出はＡＴＰに対するＣｈｒｏｎｏ−Ｌｕｍｅの特性波長で測定し、製造会社のプロトコルに従い内部標準に基づいて標準化した。
【０１０５】
コラーゲンによる血小板凝集とＡＴＰ放出は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔにより特異的に阻害された（図１１ａ＆ｂ）。ＡＤＰまたはトロンビン（ＴＲＡＰ１０μＭ）を介する血小板凝集とＡＴＰ放出は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔにより影響されなかった。
【実施例１４】
【０１０６】
ヒト血小板からのＰＤＧＦ放出
志願者から採取した血液より、ＰＲＰを上記のように調製した。ヒト血小板からのＰＤＧＦ放出は、キット（ＤＨＤ００Ｂ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い製造会社のプロトコルに従い測定した。ＰＤＧＦ放出を対照条件下、またはＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（１００μｇ／ｍＬ）もしくは等モル濃度の対照Ｆｃの存在下で、１型コラーゲン（２０μｇ／ｍＬ；Ｎｏｂｉｓ社）を用い刺激した。ＰＤＧＦ放出は製造会社の標準プローブに基づいて標準化された。
【０１０７】
コラーゲンの刺激によって誘導される血小板アルファ顆粒からの内在性伝達物質放出によって引き起こされるＰＤＧＦの放出も、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの投与により低下した（図１１ｃ）。
【実施例１５】
【０１０８】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔがｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト全血の出血時間に与える影響
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの出血時間をＰＦＡ−１００装置（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社）を用いて測定した。８００μＬのヒト全血をＰＦＡ−１００装置に注入した。出血時間は、製造会社のプロトコルに従い、ＡＤＰ／コラーゲンおよびエピネフリン／コラーゲンでコーティングされた測定セルを用いて測定した。
【０１０９】
様々な物質による刺激下で、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの濃度増加に伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＰＦＡ−１００装置）での出血時間の有意な増加は認められなかった。一方、ＲｅｏＰｒｏを治療に用いられる濃度用いた場合は、出血時間をＰＦＡ−１００装置での最大限まで増加させた（図１２）。
【実施例１６】
【０１１０】
可溶性ＧＰＶＩが血流中固定化コラーゲンへの血小板接着に与える影響
ヒト全血は既報（１８）と同様にＡＤＣ抗凝固全血から単離した。洗浄血小板をタイロード−ＨＥＰＥＳバッファー（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、５．５ｍｍｏｌ  Ｄ−グルコースおよび１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、血小板数を２ｘ１０８細胞／ｍＬに調製した。固定化コラーゲンでコーティングしたプレートへの血小板接着を、平行平板型フローチャンバーで、２００μｇ／ｍＬのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔもしくは対照Ｆｃの存在下で測定した。
【０１１１】
ＧＰＶＩはｉｎ  ｖｉｔｒｏで固定化コラーゲンへの血小板動員過程に決定的な役割を担っている（２２）。我々はＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔがヒト血小板の固定化コラーゲンへの接着に与える影響を、様々な剪断速度のもとｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。別グループによる既報（２３）にあるように、血小板は固定化コラーゲンに低剪断速度（５００ｓｅｃ−１）および高剪断速度（１０００ｓｅｃ−１）の両方で強固に接着し血栓を形成する（図１３）。可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは固定化コラーゲンへの血小板接着性を、剪断速度５００ｓｅｃ−１および１０００ｓｅｃ−１でそれぞれ３７％および４４％と有意に減少させるが、外部ＧＰＶＩドメインを欠く対照Ｆｃは減少をもたらさなかった（図１３）。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは固定化ｖＷＦへの血小板接着には影響を与えず、阻害は特異的であることが示された。
【実施例１７】
【０１１２】
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの血漿濃度の測定をヒトＩｇＧ定量キットであるＩＭＭＵＮＯ−ＴＥＫ  ＥＬＩＳＡシステム（Ｃａｔ＃０８１１８２；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社）を用いて行った。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔのＦｃ部に特異的なヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社）を使用した。製造会社のプロトコルに従いＰＢＳＴを用いて複数回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質（ＢＭブルーＰＯＤ；Ｒｏｃｈｅ社）を加え、波長４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡ読取装置（Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ社）を用いて測定し、ヒトＩｇＧ内部標準に基づいて定量化した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態を示した。マウスへ１回の腹膜内注射した後、２４時間後には高血漿レベルを測定することができ、融合タンパク質の半減期は９６時間を超えた（図１４ａ）。腹膜内注射を繰り返すと融合タンパク質は血液中に蓄積し（図１４ｂ）、慢性疾患治療に長期間用いる場合に好ましい動態といえる。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの投与量を増やした１回の腹膜内注射後では、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの濃度依存的血漿濃度が５分ないし６０分間、最大１４時間検出できた（図１４ｃ）。
【実施例１８】
【０１１３】
生体蛍光顕微鏡検査法のためのマウス血小板の調製
マウス血小板を既報（１９）のように全血から単離し、５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＤＣＦ）で標識した。ＤＣＦ標識した血小板懸濁液を最終濃度２００ｘ１０６血小板／２５０μＬに調製した。後述のように、マウス血小板の接着を頚動脈損傷の前後でｉｎ  ｖｉｖｏビデオ顕微鏡検査法により評価した。
【実施例１９】
【０１１４】
頚動脈結紮と生体顕微鏡検査法による血小板接着および凝集の評価
内皮除去後の血小板動態を既報（３）のように行った。すなわち、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、ミダゾラム（５ｍｇ／体重ｋｇ、Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ社、ウルム、ドイツ）、メデトミジン（０．５ｍｇ／体重ｋｇ、Ｐｆｉｚｅｒ社、カールスルーエ、ドイツ）およびフェンタニル（０．０５ｍｇ／体重ｋｇ、ＣｕｒａＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社、ミュンヘン、ドイツ）の溶液を腹腔内注射して麻酔した。必要に応じ、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（１または２ｍｇ／体重ｋｇ）もしくは２ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔと同モル濃度量の対照Ｆｃを静脈投与した。その後、頚動脈分岐部付近を５分間きつく結紮して内皮除去を引き起こした。血管損傷を引き起こした後、蛍光血小板（２００ｘ１０６／２５０μＬ）を右頚静脈に埋め込んだポリエチレン製カテーテル（Ｐｏｒｔｅｘ社、ハイズ、イギリス）を通じて静脈注入した。落射照明用１００Ｗ・ＨＢＯ水銀ランプを付けたＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｔｅｃｈ顕微鏡（２０ｘ水浸対物レンズ、Ｗ２０ｘ／０．５、Ｚｅｉｓｓ社）を用い、右総頚動脈のｉｎ  ｖｉｖｏビデオ顕微鏡検査法により、蛍光血小板をｉｎ  ｓｉｔｕで視覚化した。ビデオ撮影した画像はすべて、コンピュータ援用画像解析プログラム（Ｃａｐ  Ｉｍａｇｅ７．４；Ｚｅｉｎｔｌ博士、ハイデルベルク、ドイツ（１９；２０））を使用して評価した。係留血小板はは、血管壁とはじめに接触し、その、非常にゆっくりと（中心における速度より著しく低い速度で）表面を転位する、もしくは強固に接着する「すべての」細胞数と定義される。その数は内皮表面１ｍｍ２あたりの細胞数で与えられる。本実施例においては１０秒以内に内皮表面から離れなかった細胞を計数することで接着血小板の数を評価した。血管損傷部位での血小板凝集数も定量化し、１ｍｍ２あたりの数で表した。また、血栓の全部位をＣａｐ  Ｉｍａｇｅ  ７．４を使用して評価した。
【実施例２０】
【０１１５】
走査型電子顕微鏡検査法
生体ビデオ蛍光顕微鏡検査の後、１群あたり３匹の実験動物について上記頚動脈にＰＢＳ（３７℃）を１分間還流させ、続いてリン酸緩衝グルタルアルデヒド（１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）で灌流固定した。頚動脈を切除し、縦方向開き、１％のＰＢＳ緩衝グルタルアルデヒドに１２時間浸してさらに固定化し、エタノールで脱水し、ＣＯ２を用いた臨界点乾燥法により処理した。その後、頚動脈検体の管腔を露出させ、炭素ペーストを用いて試料台に載せ、プラチナをスパッタコーティングし、電界放出形走査電子顕微鏡（ＪＳＭ−６３００Ｆ；日本電子（株））を使用して測定した。
【実施例２１】
【０１１６】
免疫組織化学法によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ結合の評価
Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで処理したマウスから得た頚動脈を急速凍結し、クライオブロック（ｍｅｄｉｔｅ社、Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ社、ブルクドルフ、ドイツ）に固定した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの内皮および内皮下層への結合を、Ｆｃγ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（１０９−０３５−０９８；Ｄｉａｎｏｖａ社、ハンブルク、ドイツ）で染色した５μｍのクライオスタット断面で測定した。Ｆｃで処置したマウスから得た頚動脈を対照として使用した。
【実施例２２】
【０１１７】
可溶性ＧＰＶＩがｉｎ  ｖｉｖｏで血小板数、出血時間および血小板接着に与える影響
実験動物を２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ、もしくは等モル濃度の外部ＧＰＶＩドメインを欠く対照Ｆｃで処置した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔもしくは対照Ｆｃを注入した場合も、最大投与量である４ｍｇ／ｋｇまでのいずれの濃度においても、末梢血小板数に有意な影響は与えなかった。さらに、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ融合タンパク質は、対照実験動物と比較して尾部出血時間を有意に増大させなかった（図１５ａ）。出血時間の絶対値は、ＰＢＳ処置マウスでは１．９±０．９ｍｉｎであり、２ｍｇ／ｋｇもしくは４ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで処置したマウスでは２．９±１．９ｍｉｎおよび４．６±０．６ｍｉｎであった。これに対して、Ｉｎｔｅｇｒｉｌｌｉｎ（０．２ｍｇ／ｋｇ、静脈注射）で処置した実験動物では出血時間が顕著に（４２．６±２１．６ｍｉｎ）増大した。
【０１１８】
マウスの頚動脈損傷モデルにおいてＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが血小板動態に与える影響は、生体蛍光顕微鏡検査法を使用して調べることができる。実験動物を上記のように１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ、もしくは等モル濃度量の外部ＧＰＶＩドメインを欠くＦｃで処置した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔもしくは対照Ｆｃを注入した後、既報のように（３）、マウス頚動脈をきつく結紮して内皮除去を引き起こした。頚動脈結紮が内皮細胞層を完全に喪失することを確認した。血小板接着は生体蛍光顕微鏡検査法を使い直接に視覚化そして定量化された（１９；２０）（図１５ｄ）。対照（Ｆｃ処置）マウスでは、内皮除去後１分以内に多数の血小板が血管壁に係留した（１２．０２６±１．１１５係留血小板／ｍｍ２）。内皮下層との接触を確立した血小板は、最初ゆっくりとした表面転位を示し、多くの場合その後強固な血小板接着および血小板凝集となる（５．４９４±８７４接着血小板／ｍｍ２および１１４±１７血小板血栓／ｍｍ２）。対して、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの存在下では、血管損傷部位への血小板動員は劇的に減少した。１ｍｇ／ｋｇもしくは２ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで前処置すると、Ｆｃ処置した場合と比較して、血小板係留は６５％および７１％減少した（対照と比較してＰ＜０．０５）。それと平行して、強固な血小板接着は用量依存的に減少した（１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの投与の後、それぞれ４９％および６５％減少した。対照と比較してＰ＜０．０５）同様に、２ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ融合タンパク質で処理した実験動物では、接着血小板の凝集はほとんど存在しなかった（対照Ｆｃと比較してＰ＜０．０５、図１５ｂ〜ｄ）。走査型電子顕微鏡検査法によっても、総頚動脈内皮除去後の血小板接着および凝集は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ処置したマウスではほとんど存在しないが、Ｆｃで前処置したマウスではそうではないことがはっきりと示された（図１５ｅ）。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが損傷部位に存在していることを確認するため、生体顕微鏡検査法後に頚動脈を切除し、さらに免疫組織染色のためにヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体を使用して処理した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ処置したマウスでは、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが血管損傷部位の管腔面上に検出された（図１５ｆ）。これらの結果は、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔはｉｎ  ｖｉｖｏで血管傷害部位に特異的に結合し、その後の血小板動員を防げることを示している。
【０１１９】
可溶性ＧＰＶＩがアテローム性動脈硬化に与える影響
生後４週目のＡｐｏＥ−／−マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に０．２５％コレステロール食（Ｈａｒｌａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔｓ）を６週間消費させた。２週間経過後、コレステロール食を継続しながら、４匹のＡｐｏＥ−／−マウスに１匹あたり２００μｇのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを週２回注射した。同様のプロトコールで４匹のＡｐｏＥ−／−マウスに対照Ｆｃタンパク質（２００μｇ）を週２回注射し、対照マウスとした。プラーク形成を評価するため、実験動物を屠殺し血管樹を実験動物から慎重に切開し、大動脈および頚動脈全部の標本を０．９％塩化ナトリウム液で洗い流し固定化した。血管全部の標本をＳｕｄａｎＩＩＩ赤でプラーク形成を評価するため染色し、顕微鏡で観察した。アテローム性動脈硬化易発性ＡｐｏＥ−／−ノックアウトマウスをＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで４週間処置すると、アテローム進行は著しく減少した（図１６）。
【実施例２３】
【０１２０】
糖尿病患者由来血小板上ＣＤ６１およびＣＤ３２表面発現のＦＡＣＳ測定
糖尿病患者１１１人または非糖尿病患者３６３人から血液を採取し、クエン酸処理を行った。多血小板血漿（ＰＲＰ）を４℃において２０００ｒｐｍで遠心分離して洗浄し（ＰＢＳ１ｘ、ｐＨ７．２）、再懸濁により作製した。フルオロフォア・ペルオキシダーゼで標識した抗ＣＤ６１および抗ＣＤ３２抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）、もしくはＦＩＴＣで標識した抗・抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体４ｃ９を加えた。ＦＡＣＳ測定はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置を用いて行った。表面発現は蛍光により定量化した。ＣＤ３２の蛍光と４Ｃ９の蛍光の相関は、相関係数ｒ＝０．５１６と計算された。
【０１２１】
統計解析
群中央値の比較を、マン・ホイットニー順位和検定を使用して行った。文中データは中央値±標準誤差を表す。Ｐ＜０．０５ならば有意であるとみなした。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの総頚動脈の血管損傷後の血小板接着および凝集。血管損傷前（左パネル）および血管損傷の２時間後（右パネル）の頚動脈の走査型電子顕微鏡写真である。内皮除去によって血小板接着および凝集が誘発され、血小板リッチな血栓の形成が起こる（右下）。
【図１ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの総頚動脈の血管損傷後の血小板接着および凝集。血管損傷から５分後の血小板内皮細胞相互作用を、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける総頚動脈のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査法によって調べた（黒柱）。血管損傷のない動物を対照とした（白抜き柱）。左および右のパネルは、それぞれ１グループ当り８連の実験における一過性および強固な血小板接着をまとめて示す。血小板は、記載２４のように内皮細胞の内張りとの相互作用によって分類し、血管表面のｍｍ２当りで示す。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、星印は対照と比較しての有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの総頚動脈の血管損傷後の血小板接着および凝集。血管損傷後の血小板凝集をｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査法によって測定した（黒柱）。血管損傷のない動物を対照とした（白抜き柱）。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝８、星印は野生型マウスと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。顕微鏡写真（右）は、対照動物（上パネル）または血管損傷後（下パネル）の代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査像を示す。白い矢印は、接着血小板を示す。
【図２ａ】ＧＰＶＩの阻害により、血管損傷後の血小板接着および凝集が妨げられる。血管損傷後の血小板接着を生体ビデオ蛍光顕微鏡検査法によって測定した。蛍光血小板を５０μｇ／ｍｌ抗ＧＰＶＩ（ＪＡＱ１）Ｆａｂ断片または対照としてラットＩｇＧと一緒にプレインキュベートした。ｍＡｂとのプレインキュベーションをしない血小板を対照とした。左および右のパネルは、それぞれ一過性および強固な血小板接着を示す。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝８、星印は対照と比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図２ｂ】ＧＰＶＩの阻害により、血管損傷後の血小板接着および凝集が妨げられる。初期の係留／緩慢な表面移動後に非可逆的な接着を形成した血小板のパーセント値を示す。
【図２ｃ】ＧＰＶＩの阻害により、血管損傷後の血小板接着および凝集が妨げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管損傷後の血小板凝集。タイロード、関連のないラットＩｇＧ、または抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂ（ＪＡＱ１）と一緒にプレインキュベートした血小板の凝集を、前述の蛍光顕微鏡検査法によって評価した。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝８、星印は対照と比較して有意差がある（Ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図２ｄ】ＧＰＶＩの阻害により、血管損傷後の血小板接着および凝集が妨げられる。顕微鏡写真は、抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂ（ＪＡＱ１）または対照ＩｇＧの不在下または存在下における血小板接着を示す代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査像を示す。
【図３ａ】ＧＰＶＩ欠損マウスの内皮除去後の血小板接着。ＪＡＱ１処理マウスには、ＧＰＶＩがない。上パネル：無関連の対照ＩｇＧ（左）または抗ＧＰＶＩ（ＪＡＱ１）（右）で前処理したマウス由来の血小板を、ＦＩＴＣ標識ＪＡＱ１およびＰＥ標識抗マウスＣＤ４１と一緒に室温で１０分間インキュベートと、ＦＡＣＳｃａｎ（商標）で直接分析した。１グループ当り３匹のマウスの代表的なドットブロットを示した。下パネル：３匹の対照ＩｇＧまたはＪＡＱ１処理マウス由来の血小板溶解物全体を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＦＩＴＣ標識ＪＡＱ１を用いてイムノブロットを行い、続いてＨＲＰ標識ウサギ抗ＦＩＴＣｍＡｂとインキュベーションした。
【図３ｂ】ＧＰＶＩ欠損マウスの内皮除去後の血小板接着。対照動物（上パネル）またはＧＰＶＩ除去マウス（下パネル）の血管損傷から２時間後の頚動脈の走査型電子顕微鏡写真。内皮除去により、対照動物の血小板接着および血小板凝集が誘発された。一方ＧＰＶＩ除去マウスにおいて、損傷した血管壁への血小板の付着は非常に少なかった。除去した領域に沿って内皮下コラーゲン線維が認識できる。
【図３ｃ】ＧＰＶＩ欠損マウスの内皮除去後の血小板接着。血小板係留および強固な血小板接着。
【図３ｄ】ＧＰＶＩ欠損マウスの内皮除去後の血小板接着。初期の係留から安定な捕捉への移行（係留血小板のパーセント値）。
【図３ｅ】ＧＰＶＩ欠損マウスの内皮除去後の血小板接着。頚動脈の血管損傷後の血小板凝集を、ＧＰＶＩ欠損（ＪＡＱ１前処理マウス）または対照ＩｇＧ前処理マウスで測定した（詳しくは材料と方法（ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を参照のこと）。これらのパネルは、１グループ当り８連の実験の血小板接着（一過性および強固な接着）および血小板凝集をまとめて示す。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、星印は対照ＩｇＧと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図３ｆ】ＧＰＶＩ欠損マウスの内皮除去後の血小板接着。顕微鏡写真は、ＧＰＶＩ欠損（ＪＡＱ１）および対照ＩｇＧ処理マウスにおける血小板接着を示す代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査像を示す。
【図４】生理学的フロー条件下でコラーゲンコーティングしたカバーガラス表面への血小板接着をｅｘ  ｖｉｖｏ評価した。関連のない対照ＩｇＧイムノアドヘシン（対照）（左パネル）または抗ＧＰＶＩイムノアドヘシン（Ｆｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔ）（右パネル）と一緒に前処理したマウス由来の血小板を、生理学的フロー条件下での接着について調べた。血小板の数を、各実験の終了時における洗浄したカバーガラスのＦＡＣＳ計測によって評価した。血小板接着の第１のステップとしての血小板係留を３０秒後に、また強固な血小板接着をフロー条件下（詳しくは実施例６を参照のこと）で５分後に評価した。これらのパネルは、１グループ当り８連の実験における一過性および強固な血小板接着をまとめたものである。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、星印は対照ＩｇＧと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図５】コラーゲンとのＦｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔの相互作用をＥＬＩＳＡに基づくアッセイでモニターした。ＧＰ  ＶＩの細胞外ドメインおよびＩｇＧのＦＣ部分からなるイムノアドヘシンＦｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔのコラーゲンコーティングされたプレートに対する接着を、Ｆｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔ（０．５μｇ〜１０μｇ）の濃度を徐々に増加させて調べた。この結合は、Ｆｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔのＦｃ部分に対するペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いて可視化する。最終的に、ペルオキシダーゼをＥＬＩＳＡによって検出する。この代表的な実験では、Ｆｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔがコラーゲンへ十分な親和性で結合することが観察され、この結合はμｇ濃度で飽和に達した。
【図６】コラーゲンとのＦｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔの相互作用およびＧＰ  ＶＩ阻害剤のスクリーニングの可能性を、阻害的な抗マウスＧＰ  ＶＩ抗体ＪＡＱ１を用いて実証した。コラーゲンコーティングしたＥＬＩＳＡプレートへのイムノアドヘシンＦｃ−ＧＰ  ＶＩ−ｎｔ（２μｇ／ウェル）の接着は特異的であることがわかった：空イムノアドヘシンＦｃ−ｎｔは、結合を全く示さなかった。したがって、これは、ハイスループットにスケールアップすることができるＧＰＶＩ阻害剤のスクリーニング用のＥＬＩＳＡに基づくアッセイを提供する。
【図７】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔのアミノ酸配列：配列番号１。
【図８】イムノアドヘシンＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔのＤＮＡ配列：配列番号２。塩基１〜８０７は、ＧＰ  ＶＩの細胞外ドメインをコードする。塩基８１７〜１５１５は、ＩｇＧのＦｃ部分をコードする。
【図９ａ】ＧＰＶＩ−Ｆｃの特徴付け。上パネル：Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ、および細胞外ＧＰＶＩドメインを欠く対照Ｆｃを使用して還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クーマシーブルー染色（左）およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を用いたイムノブロット（右）から、分子量〜８０ｋＤａのＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが確認された。中央パネル：抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体５Ｃ４を用いたＦｃ、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ、またはヒト血小板のイムノブロット。５Ｃ４により、アデノウィルスによって発現されたＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ融合タンパク質も血小板ＧＰＶＩも検出されたが、対照Ｆｃは検出されなかった。下パネル：還元（右）および非還元（左）条件下における分子量。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの分子量は還元条件下で約８０ｋＤａであったが、〜１６０ｋＤａのタンパク質を含む完全なｎｔが、非還元条件下で確認された。（ｂ〜ｄ）Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔコラーゲン相互作用の特徴付け。
【図９ｂ】ＧＰＶＩ−Ｆｃの特徴付け。異なる濃度の可溶性Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔおよび固定化コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）を用いた結合アッセイを行って、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ−コラーゲン相互作用を明らかにした。結合したＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎは抗Ｆｃ  ｍＡｂ抗体（希釈１：１０．０００）によって検出した。結合したＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎは１０μｇ／ｍｌ  Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで観察された結合に比例する。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、可飽和状態でコラーゲンと結合する。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ濃度においてｎ＝６、星印は０μｇ／ｍｌ  Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図９ｃ】ＧＰＶＩ−Ｆｃの特徴付け。（左パネル）Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（２０μｇ／ｍｌ）の様々な基質への結合を示す。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔのＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）またはｖＷＦ（１０μｇ／ｍｌ）への結合を、固定化コラーゲンへのＧＰＶＩ−二量体結合のパーセント値として示す。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの結合は、ＢＳＡまたはｖＷＦでは起こらず、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ結合の特異性を支持する。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、星印はコラーゲンと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。（右パネル）Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（２０μｇ／ｍｌ）またはＦｃ（２０μｇ／ｍｌ）の固定化コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）への結合を示す。結合したＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔまたはＦｃを抗Ｆｃ  ｍＡｂ抗体（希釈１：１０．０００）で検出し、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで観察された結合との関係で示す。Ｆｃまたは抗Ｆｃ  ｍＡｂではなくＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔだけが固定化コラーゲンと結合する。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝８、星印はＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ結合と比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図９ｄ】ＧＰＶＩ−Ｆｃの特徴付け。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（２０μｇ／ｍｌ）を異なる濃度の可溶性コラーゲンと一緒に１０分間プレ培養した。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（希釈１：１０．０００）によってＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを検出した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの結合は可溶性コラーゲンの不在下で観察された結合に対して示す。可溶性コラーゲンは、濃度依存的に固定化コラーゲンに結合したＧＰＶＩ−Ｆｃ−二量体−二量体を阻害する。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各コラーゲン濃度ｎ＝３、星印は０μｇ／ｍｌコラーゲンと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図９ｅ】ＧＰＶＩ−Ｆｃの特徴付け。単量体形態のＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質とＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの間の結合親和性の差を直接比較して評価した。１型コラーゲンをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに対する単量体および二量体の結合を評価した。濃度を徐々に増加させたＧＰＶＩ融合タンパク質は、コラーゲンに飽和状態に達するまで結合する。ここでは、親和性評価についてラインウィーバーバークプロットを示す（ｅ）。単量体ＧＰＶＩ融合タンパク質の親和性は、等モル濃度の二量体型Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔと比較して約１０分の１であった。
【図１０】コラーゲンの投与量を増大することによってひきおこされる、アルファ顆粒由来の細胞内伝達物質の放出のパラメーターとしてのヒト血小板上のＣＤ  ６２  Ｐ活性化をＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは阻害する。ヒト血小板を全血から単離し、ＰＥで標識した抗ＣＤ  ６２抗体と一緒に培養した（詳しくは材料と方法を参照のこと）。蛍光をベクトンディッキンソンＦＡＣＳ装置で測定した。代表的なヒストグラムを示す。０〜１０μｇ／ｍｌでコラーゲンの濃度を徐々に増加させると、対照Ｆｃタンパク質（１００μｇ／ｍｌ；青線）の存在下では蛍光のシフトが誘導された。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（１００μｇ／ｍｌ；赤線）の存在下では、蛍光のシフトは起こらず、したがってＣＤ  ６２  Ｐ活性化は著しく阻害された。
【図１１ａ】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによるコラーゲン媒介血小板凝集ならびに濃染顆粒およびアルファ顆粒からの内在性伝達物質の放出の特異的な阻害。ヒト血小板を対照Ｆｃ（８０μｇ／ｍｌ）またはＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（８０μｇ／ｍｌ）と一緒に培養した。血小板の凝集は、コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）またはＡＤＰ（５μＭ）またはＴＲＡＰ（１０μＭ）を用いて誘導し、撹拌条件下で血小板凝集計を用いて凝集を測定した（詳しくは材料と方法を参照のこと）。ｎ＝５の異なる血液ドナー由来の三連測定を行った。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．は、融合タンパク質を含まない対照凝集の凝集％で示す。
【図１１ｂ】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによるコラーゲン媒介血小板凝集ならびに濃染顆粒およびアルファ顆粒からの内在性伝達物質の放出の特異的な阻害。対照Ｆｃ（８０μｇ／ｍｌ）またはＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（８０μｇ／ｍｌ）と一緒のインキュベーション後に同じプローブでＡＴＰ放出を同時に測定した。ＡＴＰ放出の量は、融合タンパク質を含まない対照の場合の％で示す。
【図１１ｃ】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによるコラーゲン媒介血小板凝集ならびに濃染顆粒およびアルファ顆粒からの内在性伝達物質の放出の特異的な阻害。ＰＤＧＦ放出は、基本条件下およびコラーゲン（２０μｇ／ｍｌ）刺激後に、ヒトＰＤＧＦに特異的なＥＬＩＳＡ系を用いてヒト血小板で測定した（詳しくは材料と方法を参照のこと）。対照Ｆｃとのプレインキュベーションは、コラーゲン刺激血小板からのＰＤＧＦ放出に著しい影響を与えなかったが、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（１００μｇ／ｍｌ）は、ＰＤＧＦ放出を顕著に減少させた。ＰＤＧＦ放出の阻害は、非刺激血小板では起こらなかった。
【図１２】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのヒト血液の出血時間に著しい影響を与えない。ヒト血液の出血時間を、ＡＤＰ／コラーゲン刺激およびエピネフリン／コラーゲン刺激後にＰＦＡ−１００装置でｅｘ  ｖｉｖｏで測定した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（５および２０μｇ／ｍｌ）およびＦｃ（５および２０μｇ／ｍｌ）では出血時間が延びなかったが、治療関連濃度（５μｇ／ｍｌ）のＲｅｏＰｒｏ（登録商標）では、療法の条件下で出血時間が最大にまで延びた。三回測定を行ったｎ＝４の血液ドナーから得られた平均値±ｓ．ｅ．ｍ．をまとめて示す。
【図１３】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、フロー条件下での固定化コラーゲンへの血小板接着を阻害する。ヒト血小板（２×１０８細胞／ｍｌ）を全血から単離した（詳しくは「材料と方法」を参照のこと）。プレートを固定化コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）またはｖＷＦ（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔまたは細胞外ＧＰＶＩドメインを欠いたＦｃ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下で、パラレルプレートフローチャンバー中でコーティングしたプレートへの血小板接着を測定した。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔによる血小板接着の阻害を対照（Ｆｃ対照）の％で示す。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、それぞれ５００秒−１および１０００秒−１の剪断速度で固定化コラーゲン上への血小板接着を著しく弱めた。対照的に、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、固定化ｖＷＦ上への血小板接着に影響を与えなかった。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝４、星印は対照Ｆｃと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。下パネルは、代表的な顕微鏡像を示す。
【図１４ａ】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス腹膜内注射後に血漿中での半減期が長いという、有利な薬物動態を有する。特異的な抗Ｆｃ抗体およびＥＬＩＳＡを用いてＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの血中濃度を測定した（詳しくは「材料と方法」を参照のこと）。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（４μｇ／ｇ）の腹膜内注射を１回行うと、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ血中濃度が急上昇し、約２４時間後に緩やかに低下する。１０匹の動物から得られた平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１４ｂ】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス腹膜内注射後に血漿中での半減期が長いという、有利な薬物動態を有する。特異的な抗Ｆｃ抗体およびＥＬＩＳＡを用いてＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの血中濃度を測定した（詳しくは「材料と方法」を参照のこと）。腹膜内適用を繰返し行うと（１０μｇ／ｇ；週２回）、２８日間にわたってマウス中ｉｎ  ｖｉｖｏで連続的なＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの蓄積がもたらされる。６匹の動物から得られた平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１４ｃ】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス腹膜内注射後に血漿中での半減期が長いという、有利な薬物動態を有する。特異的な抗Ｆｃ抗体およびＥＬＩＳＡを用いてＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの血中濃度を測定した（詳しくは「材料と方法」を参照のこと）。マウス１匹当り３０μｇ（１μｇ／ｇ体重）、６０μｇ（２μｇ／ｇ体重）および１００μｇ（３μｇ／ｇ体重）のＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔを静脈内に１回注射すると、イムノアドヘシン血漿濃度の用量依存的増大がもたらされる。２種のより高い用量（６０および１００μｇ）では、これらのマウスのｉｎ  ｖｉｖｏにおける血漿濃度は、５〜６０分間から２４時間の長期にわたり高レベルに達し、コラーゲン捕捉、つまり血小板上のＧＰＶＩ受容体活性化を有効に阻害するのに十分である。５匹の動物から得られた平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１５ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着および凝集に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。マウス（１グループ当りｎ＝６）を２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ  ｉｖで処理した。インテグリン（０．２ｍｇ／ｋｇ）処理マウスを正の対照とした（ｎ＝８）。出血時間を記載のように測定した（「材料と方法」を参照のこと）。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ融合タンパク質では、対照動物と比較して尾部出血時間が増加しなかった。インテグリン処理マウスでは、尾部出血時間は大幅に延長された。＊＊は対照と比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１５ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着および凝集に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。ＧＰＶＩを阻害すると、血管損傷後の血小板接着および凝集が妨げられる。血管損傷後の血小板接着を生体ビデオ蛍光顕微鏡検査法によって測定した。１または２ｍｇ／ｋｇＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔまたは等モル量の対照Ｆｃでマウスを前処理した。左および右のパネルは、それぞれ血小板係留および強固な血小板接着をまとめて示す。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝５、星印はＦｃと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１５ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着および凝集に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管損傷後の血栓形成に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。血小板血栓数（右）および全血栓領域（左）を記載された蛍光顕微鏡検査法によって評価した。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、各グループｎ＝５、星印はＦｃと比較して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１５ｄ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着および凝集に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。顕微鏡写真は、１もしくは２ｍｇ／ｋｇＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔまたは対照Ｆｃの不在下または存在下での血小板接着を示す代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査像を示す。バーは５０μｍを表す。
【図１５ｅ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着および凝集に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。ＦｃまたはＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ処理動物における血管損傷から１時間後の頚動脈の走査型電子顕微鏡写真。内皮除去により、Ｆｃ処理マウスの血小板接着および血小板凝集が誘発された。対照的に、Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ処理マウスにおいて、損傷した血管壁に沿って付着した血小板はごくわずかであった。除去した領域に沿って内皮下コラーゲン線維が認識できる。バーは、１０μｍを表す。
【図１５ｆ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板接着および凝集に対するＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの影響。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、頚動脈の内皮下層に特異的に結合する。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔの内皮下層への結合をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した頚動脈切片で測定した。Ｆｃ処理マウスから得た頚動脈を対照とした。Ｆｃ対照タンパク質ではなくＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔが、茶色染色によって示された内皮下層で検出された。元の倍率：１００倍。
【図１６】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔは、ｉｎ  ｖｉｖｏでａｐｏ  ｅ  −／−ノックアウトマウスのアテローム進行を著しく弱める。４週間にわたって週２回、Ａｐｏ  ｅ−／−マウスの腹膜内にＦｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ（４μｇ／ｇ）または対照Ｆｃ（４μｇ／ｇ）を投与した。屠殺後、アテロームおよびプラーク形成を可視化するために大血管をスダンレッド染色した後アテローム進行を調べた。対照動物の場合、頚動脈標本における広範なプラーク形成が赤色によって特に分岐領域で示された。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔ処理動物では、ａｐｏ  ｅ−／−マウスの頚動脈ではアテローム性動脈硬化症がほぼ完全に無くなっていた。Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔで処理してから４週間後のａｐｏ  ｅ−／−マウス（左側）および対照Ｆｃタンパク質で処理してから４週間後のａｐｏ  ｅ−／−マウス（右側）の頚動脈の代表的な肉眼的に完全な血管標本を示す。
【図１７】糖尿病に罹患している患者から新たに単離した血小板は、フィブリノーゲン受容体（ＣＤ６１、一番上）の発現低下、Ｆｃ受容体（ＣＤ３２、中央）の発現増大を示し、したがってＧＰＶＩの発現増大を示す。ＣＤ３２発現とＧＰＶＩ発現の相関関係（特異的なモノクローナル抗体４Ｃ９によって検出する）をヒト血小板について示す（一番下）。糖尿病に罹患している患者由来の全血からヒト血小板を単離し、蛍光抗ＣＤ６１および抗ＣＤ３２抗体またはＦＩＴＣ標識４Ｃ９抗体と一緒に培養した。蛍光をベクトンディッキンソンＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置で測定した。糖尿病患者ｎ＝１１１および糖尿病にかかっていない患者ｎ＝３６３から得られた平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。相関係数ｒ＝０．５１６を用いてＣＤ３２蛍光と４Ｃ９蛍光の相関関係を計算した。
【図１８】Ｆｃ−ＧＰＶＩ−ｎｔに基づく単量体融合タンパク質のアミノ酸配列。
【０１２３】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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