(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、
前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
を有することを特徴とするペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法。
【請求項２】
前記のペプチドとアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程は、該ペプチドを担体に支持して行う工程であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記担体は、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記のアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液は、水溶液及びアルコール溶液からなる群から選択された溶液であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アルコールは、炭素数１以上５以下であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールは、メタノールであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記過ハロゲン化カルボン酸は、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸及びヘプタフルオロブチル酸からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記過ハロゲン化カルボン酸は、トリフルオロ酢酸であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記過ハロゲン化カルボン酸の溶液は、水：メタノール：ＴＦＡの容量比で、１００以上６００以下：１５０以上３５０以下：３００以上７００以下であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、
前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、
前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法。
【請求項１１】
前記の分子量に基づいてペプチドを把握する工程は、前記ペプチドの分子量と、前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量との差に基づいて、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を把握する工程であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、
前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
前記ペプチドを部位特異的切断試薬を有する溶液と反応させて、前記Ｃ末端欠損ペプチドに由来するＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、
前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、
前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とするペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法。
【請求項１３】
前記部位特異的切断試薬は、トリプシン、Ｖ８プロテアーゼ及びＣＮＢｒからなる群から選択された試薬であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
担体に支持されたペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、担体に支持されたペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、
前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
前記担体を部位特異的切断試薬を有する溶液に浸漬して、前記Ｃ末端欠損ペプチドに由来するＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、
前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、
前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とする担体に支持されたペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法。
【請求項１５】
前記の分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程は、前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量と、該ペプチド断片に対応し前記ペプチドに由来するペプチド断片の分子量との差に基づいて、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を把握する工程であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記のアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液は、メタノール：ＴＦＡの容量比で、１５０以上３５０以下：３００以上７００以下であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記部位特異的切断試薬は、トリプシン、Ｖ８プロテアーゼ及びＣＮＢｒからなる群から選択された試薬であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記担体は、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法及びペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然より採取されるペプチドやタンパク質（以下、総称して、ペプチドとも言う。）のアミノ酸配列に関する情報は、その生物学的性質や機能を研究する際、不可欠である。現在、ペプチドやタンパク質の全アミノ酸配列は、対応する遺伝子情報、すなわち、これらのペプチドをコードしているゲノム遺伝子やｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、推定されるアミノ酸配列として決定されている。或いは、これらのアミノ酸配列は、ペプチドの配列を直接分析する種々の方法により、タンパク質自体のアミノ酸配列が決定されている。その際、当該ペプチドをコードしているゲノム遺伝子やｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡを特定する上で、ペプチドの部分的なアミノ酸配列の知見は、依然として必要である。【０００３】
このペプチドの部分的なアミノ酸配列の知見として、一般に、ペプチドのＮ末端アミノ酸配列とＣ末端アミノ酸配列とが、特に有用とされている。例えば、多数のｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラリーから目的とするペプチドをコードしているｃＤＮＡを選別する際、仮に、Ｎ末端アミノ酸配列とＣ末端アミノ酸配列とが判明していると、両末端のアミノ酸配列に基づいて核酸プローブを作製し、得られたプローブを利用して、目標とするｃＤＮＡを選別することが可能となる。また、両末端のアミノ酸配列に基づき作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、ＰＣＲ法を適用し、目標とするｃＤＮＡを選択的に増幅することも可能となる。【０００４】
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列を解析する手法として、従来から、エドマン分解法を利用して、Ｎ末端アミノ酸を逐次的に分解しつつ、生成するアミノ酸誘導体を同定する手法が利用されている。【０００５】
一方、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を解析する手段として、化学的手法によりＣ末端アミノ酸を逐次的に分解し、その反応産物として得られる短縮されたペプチドの分子量と元のペプチドの分子量との差から、分解されたＣ末端アミノ酸を特定する方法が提案されている（非特許文献１乃至３）。【０００６】
非特許文献１は、化学的手法によりＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する方法を開示する。この方法は、乾燥したペプチドを９０℃に加熱し、ペンタフルオロプロパン酸（ＣＦ３ＣＦ２ＣＯＯＨ）の高濃度水溶液又はヘプタフルオロブタン酸（ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＯＯＨ）の高濃度水溶液から発生した蒸気を作用させて、ペプチドのＣ末端アミノ酸の選択的な加水分解を促進させる方法である。【０００７】
非特許文献２及び非特許文献３は、パーフルオロアルカン酸高濃度水溶液に代えて、無水ペンタフルオロプロパン酸（（ＣＦ３ＣＦ２ＣＯ）２Ｏ）のアセトニトリル溶液又は無水ヘプタフルオロブタン酸（（ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＯ）２Ｏ）のアセトニトリル溶液を用いて、Ｃ末端アミノ酸を選択的に分解する方法を開示する。このとき、例えば、−１８℃に冷却しつつ、この溶液から発生した蒸気を、乾燥したペプチドに作用させ、溶液から蒸発する水分子を系内に含まないようにすることにより、副次的反応の発生を回避することができるとされている。【０００８】
これらの従来のＣ末端アミノ酸を分解する方法は、下記反応式（Ｉ）で示される脱水反応と下記反応式（ＩＩ）で示される反応とにより進行すると報告されている。つまり、反応式（Ｉ）によると、Ｃ末端アミノ酸から反応中間体として、オキサゾロン環構造がいったん形成される。次いで、パーフルオロアルカン酸がこのオキサゾロン環に作用し、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成されると考えられる。【０００９】
【化１】
0004771296.tif 000002
【００１０】
【化２】
0004771296.tif 000003
【００１１】
これらの非特許文献に開示の方法によると、目的とするＣ末端アミノ酸配列の選択的な分解以外にも、ペプチドのセリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−）のＮ末端側の切断、トレオニン残基のＮ末端側の切断、アスパラギン酸残基のＣ末端側のペプチドの切断等が起き、Ｃ末端アミノ酸配列のみを選択的に分解するには問題があった。また、これら目的としない切断の要因であるセリン残基のα位のアミノ酸とβ位のヒドロキシ基との間、及びトレオニン残基のα位のアミノ酸とβ−ヒドロキシ基（β−ＯＨ基）との間のＮ，Ｏ−アシル転位反応に起因して、Ｃ末端アミノ酸配列の逐次的な分解反応がこの転移部位で阻害される可能性もあった。【００１２】
これらの実状に鑑み、特許文献１は、無水酢酸などのアルカン酸無水物とホルムアミドとを用い、緩和な条件でペプチドの逐次分解を行う方法を開示する。しかしながら、この反応では、しばしば感度の低下が問題となっていた。
【特許文献１】国際公開第２００５／０７８４４７号パンフレット
【非特許文献１】Ｔｓｕｇｉｔａ，Ａ．ら著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０６巻、６９１〜６９６頁、１９９２年
【非特許文献２】Ｔｓｕｇｉｔａ，Ａ．ら著、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２３５−２３８頁、１９９２年
【非特許文献３】Ｔａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２８巻、３６２−３７２頁、１９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、従来のペプチドの逐次分解によるＣ末端アミノ酸配列の決定において感度の低下が新規の切断反応によるものであることを確認し、この知見及び特性を踏まえて、感度の低下が少なく、副反応を抑制したペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法及びペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によるペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法は、ペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、を有することを特徴とする。【００１５】
本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。【００１６】
また、本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記ペプチドを部位特異的切断試薬を有する溶液と反応させて、前記Ｃ末端欠損ペプチドに由来するＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。【００１７】
本発明による担体に支持されたペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法は、担体に支持されたペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、担体に支持されたペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記担体を部位特異的切断試薬を有する溶液に浸漬して、前記Ｃ末端欠損ペプチドに由来するＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、グルタミン酸残基を特異的にエステル化することにより、Ｃ末端のペプチド結合の逐次切断によるグルタミン酸残基のＮ末端側でのペプチドの切断を抑制し、Ｃ末端アミノ酸残基のみを特異的且つ効率的に切断し得るようになる。また、逐次切断で得たＣ末端欠損ペプチド及びこのＣ末端欠損ペプチドに由来するペプチドの帰属が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】大豆トリプシンインヒビターのアミノ酸配列及びこれをトリプシン消化して得られると予測される消化断片の配列を示す図である。
【図２】トリプシンインヒビターの４８〜６３番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトルである。
【図３】トリプシンインヒビターの１１２〜１１９番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトルである。
【図４】トリプシンインヒビターの６６〜７６番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトルである。
【図５】トリプシンインヒビターの３１〜３８番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトルである。
【図６】本発明による分析方法に対するエステル化反応の影響を示す質量分析スペクトルであって、（Ａ）は、エステル化反応を適用しなかったものであり、（Ｂ）は、エステル化反応を適用したものである。
【図７】本発明による分析方法に対するエステル化反応の影響を示す質量分析スペクトルである。
【図８】トリプシンインヒビターの４９〜６３番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
＜導入〜逐次切断による新規な切断反応及び切断様式〜＞
本発明に係り、本発明者らは、従来の無水酢酸などのアルカン酸無水物とホルムアミドとを用いた緩和な条件で行うペプチドの逐次切断において、グルタミン酸残基のＮ末端側で、これまで知られていなかった特異的な切断反応が生じていることを見出した。また、この切断様式は、全く新しいものであることも見出した。これらの知見を以下に示す。【００２１】
図６（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の大豆トリプシンインヒビターを含むゲルを３０％無水酢酸・ホルムアミド溶液に６０℃で１時間浸漬した後、トリプシン消化してゲルから溶出した混合物を分析したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。図６（ａ）に示すように、トリプシンインヒビターをトリプシン消化した際、逐次切断処理後のトリプシン消化により理論的に切断されると考えられる４８番目のアスパラギン残基を有する４８〜６３番目の配列（配列番号２７）のピーク（質量１８０５．７９）の他に、１６７３．６９近傍に他のピークが認められた。このピークは、その質量から判断して、トリプシンインヒビターの４９番目のグルタミン酸残基を含むペプチド断片、つまり、４９〜６３番目のペプチド断片（配列番号２６）であると想定された。しかしながら、４８〜６３番目のペプチド断片に対応するピークと比較しても、１６７３．６９近傍のピークにグルタミン酸残基が含まれると仮定するには、約１８だけ分子量が少ないことが分かった。そこで、このピークの由来を同定するため、この断片をＭＳ／ＭＳ分析した結果が図８である。図８から明らかなように、Ｃ末端のアルギニン（一文字記号Ｒ）を含む断片群（ｙ３乃至ｙ１１）では、理論値通りの質量にピークが見出されたところ、Ｎ末端のアミノ酸残基を含む断片では、いずれも理論値から１８だけ差分した質量位置にピークが見出された。【００２２】
これらの結果をまとめると、
（１）従来のアルカン酸無水物とホルムアミドとを用いたペプチドの逐次切断において、グルタミン酸残基のＮ末端で特異的な切断反応が起こっていること、
（２）この切断反応で得た末端は、予測されるアミノ酸残基の分子量から１８だけ少ない末端となっていること、
が分かった。【００２３】
これらの結果は、上述の逐次切断で生じたペプチド断片のうち、Ｎ末端側にグルタミン酸残基を有するペプチド断片が脱水されていることを強く示すものと考えられる。また、グルタミン酸残基が脱水することにより生じる分子団として、その構造から、ピログルタミン酸残基となっていることが強く示唆された。この切断反応及び切断様式は、上述の従来の逐次切断反応において見出されていなかった、全く新規のものであって、本発明は、この知見に基づいて、感度の低下が少なく、副反応を効果的に抑制したペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法を提供する。【００２４】
なお、以下、逐次切断反応によって生じたペプチド断片のうち、グルタミン酸残基を有するペプチド断片が脱水したペプチド断片を脱水体とも称し、各図では、このペプチド断片の脱水体をｐｙｒで始まる配列で表記する。【００２５】
＜本発明によるペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法に係る一態様＞
本発明によるペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法は、ペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、を有することを特徴とする。以下、それぞれ、エステル化工程、切断工程と称する。【００２６】
（エステル化工程）
エステル化工程は、溶液中で行っても、担体中で行ってもよい。ペプチドを担体中に支持してエステル化工程を行う場合、担体は、ペプチドを保持し得る組成物であれば特に制約はなく、例えば、ポリアクリルアミドゲルが挙げられる。担体は、ゲル電気泳動法として、一次元方向に電気泳動を行う従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で用いられるものはもちろんのこと、二次元泳動法を適用されたものでもよい。【００２７】
上述のアルコールは、アミノ酸残基とエステル化反応し得るアルコール性水酸基を有する化合物であれば特に制約はなく、例えば、炭素数が１以上５以下のアルコールであってもよい。これらの例として、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールなどの低級アルコールが挙げられる。なかでも、メタノールがさらに好ましい。また、このアルコールの水酸基以外を構成する原子（団）は、アミノ酸残基とアルコールとのエステル化反応を阻害しないものであれば、いかなる質量を有するものであってもよい。【００２８】
上述のペプチドは、特に制約はなく、Ｓ−Ｓ結合などの分子内／分子間結合を有するものや、金属などが配位したものや、酸化還元状態によって側鎖の状態が変化するものや、リン酸や糖鎖など翻訳後修飾を受けるものであってもよい。また、担体中で行う場合には、ペプチドは、担体中に保持され得るものであれば特に制約はない。【００２９】
上述の過ハロゲン化カルボン酸は、フッ素、塩素、臭素などのハロゲンを有するカルボン酸であれば、特に制約はなく、低級の炭素鎖を有するものであってもよい。例えば、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸及びヘプタフルオロブチル酸が挙げられる。なかでも、担体への浸透性の点で、トリフルオロ酢酸が好ましい。【００３０】
本発明において、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液としては、アルコールと過ハロゲン化カルボン酸とを溶液の状態とし得る溶媒であれば、特に制約はなく、例えば、溶媒として、水及びアルコールが挙げられる。即ち、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液としては、水溶液及びアルコール溶液が挙げられる。【００３１】
エステル化工程を行う際、温度、時間、濃度及びｐＨは、適宜調節すればよい。【００３２】
反応温度は、担体からペプチドが溶出せず液相が液体状態を保持し得る限り特に制約はないが、例えば４〜４０℃であることが好ましく、２０〜３０℃がさらに好ましく、室温〜２５℃が特に好ましい。０℃未満であると、エステル化の反応速度が低下してしまい、４０℃を越えると、過ハロゲン化カルボン酸によるペプチドの切断反応などの副反応が起きてしまう。【００３３】
反応時間は、反応温度に依存して種々変更すればよく、反応温度によっては、６時間程度であってもよい。１２０分未満であると、過ハロゲン化カルボン酸によるグルタミン酸残基のエステル化反応が十分に進行せず、２日よりも長い場合、酸化やサンプル溶出のため、バックグラウンドが高くなりシグナルの質が低下してしまう。【００３４】
エステル化工程に用いるアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液の各成分の濃度は、特に限定されないが、アルコール濃度で、５〜３０ｖ／ｖ％であることが好ましく、過ハロゲン化カルボン酸で、１０〜４０ｖ／ｖ％であることが好ましい。アルコールの濃度が１ｖ／ｖ％未満であると、グルタミン酸へ供給されるアルコールが酸との反応に消費されてアルコールが不足してしまい、６０ｖ／ｖ％よりも大きい場合には、ゲルが脱水収縮し反応の進行が妨げられる。過ハロゲン化カルボン酸濃度が１ｖ／ｖ％未満であると、酸がアルコールとのエステル化反応により消費されて触媒不足となり、６０ｖ／ｖ％よりも大きい場合には、不必要な脱水が進むなど、結果に良い影響を与えない。これらの濃度のうち、アルコールとしてメタノールを、過ハロゲン化カルボン酸としてトリフルオロ酢酸を用いる場合、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液は、水：メタノール：トリフルオロ酢酸の割合では、１００〜６００：１５０〜３５０：３００〜７００であることが好ましく、１００：５０：１００〜５００：２５０：５００であることがより好ましい。【００３５】
担体に保持されたペプチドをエステル化する際は、その反応収率を高めるためにアルコールで脱水収縮をあえて生じせしめた後、過ハロゲン化カルボン酸アルコール溶液に浸漬させて、過ハロゲン化カルボン酸とアルコールとが反応する際に生成する水分を利用して担体の膨潤を達成して試薬のペプチドへの到達を促すことができる。たとえばアルコールとしてメタノール、過ハロゲン化カルボン酸としてＴＦＡを使用する場合、メタノールで脱水収縮した担体にメタノール：ＴＦＡ＝２５０：５００の割合の溶液を作用させることで、室温数時間の内にゲルの穏やかな膨潤が達成され、グルタミン酸に特異的なエステル化反応が進行する。【００３６】
エステル化工程により、担体に支持されたペプチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基は、主に、上述の反応に用いるアルコールに対応したエステル化体（例えば、メタノールである場合は、メチルカルボキシル基）となる。【００３７】
（切断工程）
切断工程では、アルカン酸無水物を用いてペプチドのペプチド結合を逐次的に切断する。切断の対象となるペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させて、ペプチドのＣ末端のペプチド結合を逐次的に切断し、Ｃ末端から逐次的にアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得ることができる。切断工程に用い得るアルカン酸無水物として、置換又は無置換のアルカン酸無水物が挙げられるが、パーフルオロアルカン酸及びその無水物は含まない。なお、アルカン酸無水物の置換体を用いる場合は、ハロゲン以外の原子で置換されたアルカン酸無水物を用いることが好ましい。ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化に利用されるアルカン酸無水物として、炭素数２〜６程度のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、反応温度まで昇温した際に、適正な反応性が確保される。また、好ましくは、炭素数２〜４程度のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、立体障害を低減することができる。また、酸無水物として、炭素数２〜６程度の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。また、好ましくは、炭素数２〜４程度の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、立体障害を低減することができる。さらに具体的には、炭素数２の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、すなわち無水酢酸を用いることができる。【００３８】
また、アルカン酸無水物は、Ｃ末端カルボキシル基の活性化を図り、５−オキサゾロン環形成に適する配置をとる上で、その配向における立体障害を生じることの少ない化合物とするとよい。その点でも、無水酢酸は好ましく用いられる。【００３９】
なお、アルカン酸無水物は、反応に従って消費されるため、予め担体の膨潤に利用する双極性非プロトン性溶媒中に、ペプチドとの反応に消費される量に対して大過剰量を溶解しておき、その濃度低下を抑制することが望ましい。反応溶液中のアルカン酸無水物の含有濃度を１体積％以上３０体積％以下、好ましくは１０体積％以上２０体積％以下とすることができる。また、反応温度は、例えば５０℃以上、好ましくは６０℃以上とすることができる。こうすることにより、逐次切断を効率よく行うことができる。また、反応温度を例えば１００℃以下、好ましくは８０℃以下とすることができる。こうすることにより、逐次切断を安定的に行うことができる。また、無水酢酸を用いる場合、４〜１１０時間程度の反応させてもよい。このとき、反応条件としては、例えば、５０℃にて１１０時間、６０℃にて５０〜６０時間、８０℃にて２４時間、１００℃にて４時間等とすることができる。反応温度が低いほど、緩和な条件とすることができ、副反応をより一層抑制することができる。【００４０】
一方、切断工程において、アルカン酸無水物は、ホルムアミドなどの双極性非プロトン性溶媒に溶解されてもよい。双極性非プロトン性溶媒は、担体の脱水後、５０〜９０℃程度の温度において担体内に浸潤でき、膨潤状態に維持可能である溶媒とする。また、比較的分子サイズが小さく、担体片の材料に対する親和性に優れた有機溶媒が用いられる。また、双極性非プロトン性溶媒は、上記式（Ｉ）に示した反応中のケト−エノール互換異性化の過程において、そのエノール体の比率を維持可能な高い双極性を示すとともに、溶質分子のアルカン酸無水物及び反応副生成物であるアルカン酸に対して、優れた溶媒であってもよい。また、上述の反応温度において、揮発、蒸散することの少ない双極性非プロトン性溶媒が好ましい。【００４１】
切断工程は、酸素が除去された乾燥雰囲気下で行われてもよい。この雰囲気とする方法として、例えば、反応を行う系を気密状態とし、系外からの水分及び酸素の侵入を防止するとともに、反応に用いる液体の注入及び排出操作も、乾燥処理した窒素、アルゴン等の不活性気体雰囲気下で行う方法が挙げられる。また、酸化防止効果を有するＤＴＴなどの還元性のスルファニル基（−ＳＨ）を含む化合物を利用して、酸化を回避してもよい。酸素を除去することにより、メチオニン残基のイオウの酸化が防止され、測定工程における分子量の確度が向上される。【００４２】
切断工程において、反応促進剤を用いてもよい。反応促進剤としては、塩基性含窒素芳香環化合物が挙げられ、例えばピリジン塩基又はその誘導体等であってもよい。ピリジン塩基は、プロトン受容体として機能するため、例えば、アミノ基へのアシル化に伴う離脱すべきプロトンの除去がより速やかになされる。ピリジン塩基として、具体的には、例えば、ピリジン、ピコリン（メチルピリジン）、ルチジン（ジメチルピリジン）、コリジン（トリメチルピリジン）、エチルメチルピリジン、パルボリン（テトラメチルピリジン）が挙げられる。塩基性含窒素芳香環化合物として、縮合環系のアザアレーンが挙げられ、例えば、キノリン、イソキノリン、インドール等の二環式塩基性含窒素芳香環化合物又はその誘導体を用いてもよい。また、塩基性含窒素芳香環化合物としては、例えば、ベンゾキノリン、ベンゾイソキノリン、アクリジン等のアザアントラセンやフェナントリジン等の三環式塩基性含窒素芳香環化合物又はその誘導体を用いてもよい。【００４３】
反応促進剤としてピリジンを用いる場合、１ｖ／ｖ％以上４０ｖ／ｖ％以下、好ましくは１０ｖ／ｖ％以上３０ｖ／ｖ％以下である。これにより、Ｃ末端の逐次切断の速度を確実に増加させることができる。また、担体をこの溶液に浸積させる際、室温中で担体を２０分間浸漬させる操作を３回繰り返して行ってもよい。その後、極性非プロトン性溶媒を用いて担体中から過剰の触媒及び水分を除去することで、後の酸無水物による逐次切断反応を達成してもよい。【００４４】
なお、切断工程で起こる反応の停止は、反応系の温度を低下させるとともに、担体中に浸潤している反応試薬であるアルカン酸無水物を、水、双極性非プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒などで、希釈、除去することにより、行われてもよい。この際、担体の材料の溶解を引き起こさず、アルカン酸無水物及び双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いてもよい。ポリアクリルアミドゲルを用いる場合、極性非プロトン性溶媒として、アセトニトリルなどの炭素数４以下のニトリル類、アセトンなどの炭素数４以下のケトン類が挙げられる。【００４５】
次に、上述の通り、ペプチドとアルカン酸無水物とを反応させて形成された５−オキサゾロン環を加水分解してカルボン酸末端を形成させる。この加水分解反応は、種々の公知の手法であれば特に制約はないが、塩基性含窒素芳香環化合物又は第三アミン類を触媒として用いてもよい。塩基性含窒素芳香環化合物として、極性非プロトン性溶媒に高い溶解性を示す、単環式の含窒素芳香環化合物を用いてもよい。具体的には、ピリジン又はピリジン塩基等が好ましい。また、第三アミン化合物としては、ピリジン塩基が示す比較的弱い塩基性と同程度の塩基性を有するものが用いられる。第三アミン化合物として、具体的には、例えば、ＤＭＡＥ（ジメチルアミンエタノール：（ＣＨ３）２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）が好ましい。塩基性含窒素芳香環化合物としてピリジンを用いる場合、水溶液全体の体積に対して、５体積％以上１５体積％以下、より具体的には１０体積％であってもよい。また、ＤＭＡＥを利用する場合、水溶液全体の体積に対して、１体積％以上２０体積％以下、より具体的には１０体積％であってもよい。また、この加水分解反応は、５０℃以上で行ってもよく、密閉された反応容器内で反応を行う場合、１００℃以下であってもよい。【００４６】
さらに、加水分解反応は、アルカン酸無水物による５−オキサゾロン環を形成させる反応と同時に進行させてもよい。この場合、Ｃ末端のペプチド結合の逐次的切断反応の反応温度を下げてその反応停止を図りつつ、有機塩基を含有する水溶液を加える。こうすると、アルカン酸無水物の不活化及びその担体中からの溶出が生じる。このため、Ｃ末端のペプチド結合の逐次的切断反応の停止と、反応試薬の不活化、除去がなされる。引き続き、反応産物に対する加水処理を行い、最終的に、極性非プロトン性溶媒を利用する再脱水処理工程を施す。こうすれば、有機塩基を含有する水溶液とともに、アルカン酸無水物に対応するアルカン酸及び双極性非プロトン性溶媒の除去と再脱水が起こる。このため、極性非プロトン性溶媒による洗浄、除去操作を中間に設ける場合と、実質的に差異のない処理を簡便に行うことができる。【００４７】
本発明によるペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法によると、エステル化工程によりグルタミン酸残基に特異的なエステル化反応が進行して、エステル化工程に用いたアルコール（例えば、メタノール）に対応するエステル化体（例えばメチル基）となる。次に、切断工程によりペプチドのＣ末端のペプチド結合が逐次的に切断される。グルタミン酸残基はエステル化されているため、上述したグルタミン酸残基のＮ末端側の結合が切断されることなくＣ末端特異的に逐次切断反応が進行する。従って、対象とする切断物であるペプチドが担体から溶出されることなく担体中に支持されたまま逐次切断反応が進行するため、反応産物の定量性が保たれるので感度の低下を引き起こすことなく、質量分析などのさらに種々の用途に用いることが可能となる。【００４８】
＜本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法に係る一態様＞
本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。この態様は、上述のエステル化工程と、切断工程とを有するとともに、さらに、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、この分子量に基づいてペプチドを把握する工程とを有する。これらの工程を、それぞれ測定工程及び把握工程と称する。本態様において、エステル化工程及び切断工程は、下述する他、上述と同様に行えばよい。この態様は、担体に支持される限り、どのような分子量を有するペプチドについても適用可能であるが、比較的小さな分子量を有するペプチドをＣ末端アミノ酸配列の同定対象とする際に好適に用いられ、その分子量は、例えば、５０００未満であってもよい。また、この態様において、下述する部位特異的切断試薬を用いた消化工程を、切断工程の後、測定工程の前に行ってもよい。【００４９】
（測定工程）
測定工程は、Ｃ末端欠損ペプチドなどのペプチド類の分子量を測定する工程である。この工程は、種々の分子量把握手段を用いればよく、例えば、質量分析装置が例示される。質量分析装置として、例えば、イオントラップ質量分析計、四重極型質量分析計、磁場型質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などを用いることができる。また、イオン化法として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）法などが挙げられる。【００５０】
このうち、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳが好適に用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、イオン化過程において、ペプチド断片を構成するアミノ酸残基から一部の原子団が欠落することを抑制することができる。また、比較的高分子量のペプチド断片の測定を好適に行うことができる。さらに、測定対象のペプチドを担体中で電気泳動により分離し、担体中で上述の処理を施した後、回収して測定に供する場合にも、対応する陰イオンと陽イオンとの両方を測定可能である。これらのことから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、さらに再現性の高い分析を行うことができる。【００５１】
測定工程にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのイオン化過程では、ペプチド断片にプロトン（Ｈ＋）が付加された陽イオン種と、ペプチド断片からプロトンが離脱された陰イオン種とをそれぞれ測定してもよい。【００５２】
なお、測定工程において質量分析に供するペプチド断片の長さは、最大で、３０〜５０アミノ酸残基であってもよく、２０〜３０アミノ酸残基以下であってもよい。これにより、ペプチド断片を確実にイオン化し、高い精度で測定を行うことができる。また、ペプチドの分子量は、４０００を越えない範囲、好ましくは、３０００を越えない範囲であってもよい。こうすることにより、分子量差に基づいて対応するアミノ酸の特定を行う際に、例えば、アスパラギン残基（Ａｓｎ）とアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）や、グルタミン残基（Ｇｌｎ）とグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）のように、式量の差異が１のアミノ酸残基相互の区別を高い精度で行うことができる。【００５３】
（把握工程）
把握工程は、上述の測定工程で得たＣ末端欠損ペプチドや元のペプチドなどの分子量に基づいて、ペプチドを把握する工程である。この工程は、上述の通り逐次切断して得た種々のアミノ酸長を有するＣ末端欠損ペプチドの分子量と元のペプチドの分子量との間の差を比較して、元のペプチドのＣ末端アミノ酸配列を把握することで、行われてもよい。【００５４】
本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法では、グルタミン酸残基のＮ末端側の切断反応が抑制されることから、Ｃ末端アミノ酸配列に特異的に逐次切断が進行することとなる。得られるＣ末端欠損ペプチドは、Ｃ末端側以外のペプチドを構成するアミノ酸残基で非特異的に切断されることなく、逐次切断により段階的にＣ末端側のアミノ酸残基が欠失したものとなる。従って、他の可能性を考慮することなく、上述の通り得たＣ末端欠損ペプチドの分子量と元のペプチドの分子量との差に基づいて、Ｃ末端アミノ酸配列を把握することが可能となる。【００５５】
＜本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法に係る他の態様＞
本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法に係る他の態様は、担体に支持されたペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、担体に支持されたペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記担体を部位特異的切断試薬を有する溶液に浸漬して、前記Ｃ末端欠損ペプチドに由来するＣ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、前記Ｃ末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とすることを特徴とする。この態様は、上述のエステル化工程と、切断工程と、測定工程と、把握工程とを有するとともに、さらに切断工程と測定工程との間で、消化工程を行うことを特徴とする。この態様は、比較的大きな分子量を有するペプチドをＣ末端アミノ酸配列の決定対象とする際に好適に用いられ、その分子量は、例えば、５ｋＤａ〜３００ｋＤａであってもよい。この態様におけるエステル化工程、切断工程、測定工程及び把握工程は、それぞれ、下述する他、上述の通り行えばよい。【００５６】
（エステル化工程）
担体に支持されたペプチドのエステル化工程は、前述のとおりアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液と反応させる方法である。また、このエステル化工程として、アルコールで脱水収縮を行った担体に対して過ハロゲン化カルボン酸アルコール溶液を作用させ、過ハロゲン化カルボン酸とアルコールとが反応する際に生成する水を利用して担体の膨潤と試薬の浸潤を同時に達成する方法を用いてもよい。この方法によれば、より速やかなエステル化反応の達成が可能となる。【００５７】
（消化工程）
消化工程は、ペプチドを支持する担体を蛋白分解酵素などの部位特異的切断試薬を有する溶液に浸漬する工程であって、この工程により、種々のペプチド断片を得るものである。上述のペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法を行った後、元のペプチドのＣ末端から所定の数のアミノ酸残基がそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物に対して、所定のアミノ酸残基の結合部位において、ペプチド鎖の切断を選択的に行う。このとき、例えば、切断部位特異性を有するプロテアーゼ、例えば、トリプシンを用い、比較的分子量の大きいペプチド鎖の酵素消化を行ってもよい。消化工程に用い得る部位特異的切断試薬は、トリプシンの他、グルタミン酸残基のＣ末端側を切断するＶ８プロテアーゼ等、切断位置の特異性を有する他のプロテアーゼを用いてもよい。また、メチオニン残基のＣ末端側アミド結合における開裂に特異性を有するＣＮＢｒ等の化学的な試薬を用いてもよい。【００５８】
消化工程は、担体中にペプチドが支持された状態で行うが、ペプチド群及び／又はペプチド断片群は、担体に支持され得る長さ以下となると、消化工程で用いる液相に溶出される。消化工程を施して得られるペプチド断片の混合物には、元のペプチドに由来するＣ末端側ペプチド断片群と、所定の数のアミノ酸残基がそのＣ末端からそれぞれ除去された一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群とが少なくとも含まれる。【００５９】
（測定工程）
この態様において得られるペプチド類には、元のペプチド、及びＣ末端欠損ペプチドとともに、元のペプチドに由来するペプチド断片、Ｃ末端欠損ペプチドに由来するペプチド断片及びＮ末端側のペプチド断片も含まれる。従って、元のペプチド及び一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群に起因するピークと、それ以外のＮ末端側の複数のペプチド断片に起因するピークとを高い精度で識別した上で、目的とする元のペプチド及び一連の反応産物に由来するＣ末端側ペプチド断片群に起因するピークの各分子量をより精度よく決定可能な手法を採用することにより、汎用性のより一層の向上が可能となる。【００６０】
ここで、測定工程は、消化工程の後に行われるので、消化工程にトリプシンを用いる場合、Ｃ末端側ペプチド断片を構成するアミノ酸残基中にはアルギニン残基が含まれていない。一方、消化工程で得られる他のペプチド断片は、プロトン受容能に富むグアニジノ基を有するアルギニン残基が含まれることとなる。そのため、これらに由来する陽イオン種の安定化が図られる。このように、測定工程では、消化工程に用いる部位特異的切断試薬のペプチドの切断の態様の特徴に応じて、測定条件を種々選択すればよい。【００６１】
このため、質量分析において、陽イオン種を測定した結果と、陰イオン種を測定した結果とを比較すると、Ｃ末端側ペプチド断片と他のペプチド断片とは、その相対強度が異なる。この現象を利用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置によって測定される複数種のピークのうち、一連のＣ末端側ペプチド断片に起因するピークを識別し、特定してもよい。【００６２】
陽イオン種の質量分析スペクトル中では、Ｃ末端にアルギニン残基を有するペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。一方、アルギニン残基を有さないＣ末端側ペプチド断片は、プロトン供与能を示すカルボキシル基をそのＣ末端に有する。このため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置で測定される陰イオン種の質量分析スペクトル中において、Ｃ末端側ペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。このように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにおける陽イオン種の質量分析スペクトル及び陰イオン種の質量分析スペクトルを対比した際の相対的強度の相違を利用して、Ｃ末端側にアルギニン残基を共通して有するペプチド断片に起因するピークを区別してもよい。また、陰イオン種の質量分析スペクトル中において、元のペプチド鎖と、Ｃ末端アミノ酸残基の逐次的な切断反応で生成する一連のＣ末端側ペプチド断片群に起因するピークを容易に特定してもよい。【００６３】
＜更なる工程＞
上述の本発明によるペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法及びペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法は、上述の工程の他、種々の前処理、後処理等の工程をさらに有してもよい。【００６４】
（担体の脱水）
ゲル状物質など担体を構成する成分の溶解を引き起こさず、且つ水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、担体を脱水してもよい。この方法を用いると、脱水処理操作を終えた後も、分析対象のペプチドを、分離されたスポット又はバンドとして担体中に保持された状態に維持できる。担体がポリアクリルアミドである場合、脱水に利用する極性非プロトン性溶媒として、例えば、水に対する親和性に富むアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）などの炭素数４以下のニトリル類、アセトンなどの炭素数４以下のケトン類を用いることができる。また、これらの極性非プロトン性溶媒は、水よりも蒸散し易い。極性非プロトン性溶媒が蒸散し、担体が乾固すると、その嵩体積が減少し、収縮する。アセトニトリル中に浸積する操作を数回繰り返して行う。例えば、担体片を室温で２０分間浸積する操作を３回行ってもよい。【００６５】
（ペプチドの架橋）
エステル化工程を行う前に、担体中に支持されるペプチド同士を架橋させてもよい。架橋剤としては、この化合物の両末端に結合基を有するものであれば特に制約はなく、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を持つものであってもよい。これにより、ペプチドを支持する担体中でペプチド同士が架橋されて、網目構造が形成され、担体とタンパク質とが絡み合って、タンパク質の溶出を抑えることが可能となる。架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いる場合、ペプチドの架橋は、１ピコモル／μＬ以上１０００ナノモル／μＬ以下の濃度のグルタルアルデヒド水溶液中に担体を３０分以上２時間以下の時間、浸積して行われてもよい。【００６６】
（分子内／分子間結合、翻訳後修飾に対する処理）
本発明において、対象となるペプチドの分子内／分子間結合や翻訳後修飾に係る分子団を、適当な処理剤を用いて、分解／切断等の処理を行ってもよい。例えば、分子内又は分子間にＳ−Ｓ結合を有するペプチドを対象とする場合、ＤＴＴなどの還元剤で還元処理してＳ−Ｓ結合を解消してもよい。また、Ｓ−Ｓ結合を還元して得たＳＨ基を、更にアルキル化剤などを用いて、再びＳ−Ｓ結合を形成させないように処理してもよい。【００６７】
（Ｎ，Ｏ−保護）
本発明において、上述の切断工程においてペプチドの逐次切断の反応中に起こる可能性のある上述のＮ，Ｏ−アシル転移反応及びこの転移反応に続く切断反応を回避する目的で、セリン残基やトレオニン残基などのβ−水酸基（β−ＯＨ基）及び／又はリジン残基のε−アミノ基（ε−ＮＨ２基）を保護してもよい。また、天然由来のリジン残基のジメチル化体や、アセチル化体は、消化工程で用いるプロテアーゼの一種であるトリプシンによる切断を受けないことから、リジン残基のトリプシンに対する感受性をペプチド全体で一様とすることを目的として、ε−ＮＨ２基の保護を行ってもよい。この場合、リジン残基は、天然由来のジメチル化体やアセチル化体とともにε−ＮＨ２基を保護された置換基となり、トリプシンによるリジン残基のＮ末端側での切断が起こらなくなる。これらの保護は、水酸基及びアミノ基の公知の保護基であれば特に制限はないが、例えば、Ｏ−アシル化及びＮ−アシル化反応を用いて行われてもよい。例えば、上述のアシル化反応は、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物中で担体片を攪拌して行われてもよい。このとき、アルカン酸無水物が求電子的なアシル化剤となる。また、アルカン酸は、そのプロトン供与能により、アルカン酸無水物とアミノ基及びヒドロキシ基との反応が促進されて、Ｎ−アシル化及びＯ−アシル化が起こる。なお、このアシル化反応の停止は、切断工程で起こる反応の停止に準じて行えばよい。【００６８】
（後処理）
切断工程の後、脱溶媒処理を行ってもよい。脱溶媒処理は、特に限定されたものではないが、上述の担体の脱水に準じて行ってもよい。【００６９】
測定工程を行う前に、測定対象物となるペプチド群及び／又はペプチド断片群を含む混合物を脱塩処理してもよい。これにより、回収、乾燥されるペプチド断片は、各種の塩を形成するものではなく、本来のペプチド単体となる。【００７０】
さらに、再膨潤した担体中に保持されているペプチド鎖のＣ末端に対して無水酢酸を加熱温度で作用させると、アセチル化と同時にペプチド鎖のＣ末端のアミノ酸残基の選択的な切断反応が進行する。具体的には、ペプチドのＣ末端において、上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）の反応経路を経て、５−オキサゾロン環形成を介するペプチド鎖のＣ末端アミノ酸の逐次的切断反応が進行すると推定される。【００７１】
Ｃ末端アミノ酸の逐次的な切断反応が進行すると、担体中には、段階的にＣ末端アミノ酸が除去された一連の反応産物と、アセチル化により保護された元のペプチドとが含まれた混合物が残される。【００７２】
以上、本発明を各態様に分けて詳細に説明した。これらの態様は、例示であり、種々変更され得ること、またこのような変更もまた、本発明の範囲にあることは当業者に理解され得るところである。
【実施例】
【００７３】
（処理例１）
図１の上段に示すアミノ酸配列を有し凍結乾燥した大豆トリプシンインヒビター（配列番号１）とメタノールとを１０ｍｇ：１ｍＬの割合で混和し、５℃に冷却した。この混液に、０．０１Ｎとなるように、６Ｎ塩酸を５℃で攪拌しながら滴下した。１６時間後、０．０２Ｎとなるように、６Ｎ塩酸をさらに滴下し、さらに２４時間後、０．０３Ｎとなるように６Ｎ塩酸をさらに滴下し、さらに３日間攪拌した。これを適当量ピペッターで分取し、真空乾燥させて溶媒を留去して、乾燥物１を得た。なお、図１の下段は、トリプシンインヒビターをトリプシンを用いて消化して得られると推測されるペプチド断片のＮ末端からの残基数及びその理論分子量である。【００７４】
（参考例１）
処理例１により調製した乾燥物１をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー（終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１％の２−メルカプトエタノール及び１％ＳＤＳ）に溶かして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。得たバンドを１ｍｍ×１ｍｍで切り出し、これを、１．２５ｎｇ／μＬのトリプシン溶液に、３７℃で、１６時間浸漬して、ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った。その後、ゲルから液相に溶出された各ペプチド断片をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。測定は、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ、ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅで行った。得た結果を図２乃至図５に示す。図２乃至図５は、トリプシンインヒビターのトリプシン消化で得たペプチド断片に係る質量分析スペクトルであって、図２は、４８〜６３番目（配列番号２１）、図３は、１１２〜１１９番目（配列番号２２）、図４は、６６〜７６番目（配列番号２４）及び１６６〜１７５番目（配列番号２３）、並びに図５は、３１〜３８番目のペプチド断片（配列番号２５）にそれぞれ対応する。なお、横軸は、質量数を示し、縦軸は、相対強度を示す（以下、図７まで同様）。【００７５】
図２乃至図５から明らかなように、処理例１により処理して得たトリプシンインヒビターをトリプシン消化して得た各ペプチド断片のうち、グルタミン酸残基を有するペプチド断片（配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５）でのみ、メチル化体に対応するピーク（図２では、１７７７．０４３２、図４では、１２２５．７７８４、図５では、８２９．４８８０）が観察された。このことから、これらのペプチド断片のグルタミン酸残基は、処理例１の処理により、メチル化されたことが分かった。【００７６】
（参考例２）
上述の実施例１の処理例１に記載の処理をほどこさなかった群のペプチド断片で得た配列番号２６に対応するペプチド断片をナノＬＣにより逆相カラムで分離した後、得た組成物をＭＳ／ＭＳ分析した。その結果を図８に示す。配列番号２６に示すペプチド断片の理論分子量から、この分析で得たＮ末端のグルタミン酸残基を含む各ペプチド断片（図８中、ｂ３〜ｂ１４に対応し、配列番号３７〜４７にそれぞれ対応する）に係る分子量を差分すると、１８となった。また、全体の分子量については、理論値から１８だけ小さい質量にピークが観測された。下述の実施例１で得た結果を考えあわせると、Ｎ末端のグルタミン酸残基は脱水され、ピログルタミン酸残基となっていることが分かる。【００７７】
（実施例１）
処理例１により調製した乾燥物１をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー（終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１％の２−メルカプトエタノール及び１％ＳＤＳ）に溶かして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、トリプシンインヒビターを含むゲル片を１ｍｍ立方に細断し、下述の切断工程処理を行った。結果を図６に示す。図６（ａ）は、処理例１を行わなかった群のペプチド断片に係る質量分析スペクトルであり、図６（ｂ）は、処理例１を行った群のペプチド断片に係る質量分析スペクトルである。【００７８】
図６（ａ）では、質量数１６７３．６９と１８０５．７９とにピークが認められ、それぞれ、配列番号２６に示すアミノ酸配列を有する脱水体、及び配列番号２７に示すアミノ酸配列に相当する。また、図６（ｂ）では、質量数１６７３．９７と１８０６．１１とにピークが認められ、それぞれ、図６（ａ）のアミノ酸配列に相当する。図６から明らかなように、配列番号２６に示すアミノ酸配列の脱水体に係るピーク強度は、処理例１により処理を行った群で顕著に減少し、逆に、配列番号２７に示すアミノ酸配列に係るピーク強度は、処理例１により処理を行った群で顕著に増加した。図２の結果を考えあわせると、グルタミン酸残基をメチル化することにより、切断工程処理の際に起こるグルタミン酸残基のＮ末端の切断は、特異的に抑制されることが分かった。【００７９】
（実施例２）
トリプシンインヒビター５μｇ（配列番号１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、バンドをＣＢＢ染色した。染色したバンドを１ｍｍ×１ｍｍでゲル片を切り出し、水：メタノール：ＴＦＡ＝５００：２５０：５００（μＬ）の溶液に浸漬し、室温で１６時間載置した。その後、このゲル片に下述の切断工程処理を行った。その結果を図７に示す。【００８０】
図６（ａ）で得た結果と比較して明らかなように、上述のエステル化工程で得たグルタミン酸残基をメチル化することによっても、切断工程の際に起こるグルタミン酸残基のＮ末端での切断反応が顕著に抑制された。【００８１】
＜切断工程処理＞
１．２５ｐｍｏｌ／μＬのグルタルアルデヒド溶液で固定を行った。次に、固定されたゲル片をピリジン溶液で処理した後、アセトニトリルで脱水を行い、３０％無水酢酸・ホルムアミド溶液に、６０℃、１時間浸漬した。その後、ゲル片を、１０％ジメチルアミンエタノール溶液で、６０℃、２時間浸漬して、加水分解反応を行った。その後、参考例１に記載のトリプシン消化によるｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行い、得たｔｒｙｐｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて分析した。測定はｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ、ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅで行った。【００８２】
（各配列番号に示す配列について）
本願に添付した明細書、請求の範囲及び図面に記載のアミノ酸配列を、配列番号毎に以下に列挙する。【００８３】
配列番号１：大豆トリプシンインヒビター（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．１ＡＶＵ、以下同様）のアミノ酸配列
配列番号２：大豆トリプシンインヒビターの１〜３０番目のアミノ酸配列
配列番号３：大豆トリプシンインヒビターの３１〜３８番目のアミノ酸配列
配列番号４：大豆トリプシンインヒビターの３９〜４７番目のアミノ酸配列
配列番号５：大豆トリプシンインヒビターの４８〜５２番目のアミノ酸配列
配列番号６：大豆トリプシンインヒビターの５３〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号７：大豆トリプシンインヒビターの６４〜６５番目のアミノ酸配列
配列番号８：大豆トリプシンインヒビターの６６〜７６番目のアミノ酸配列
配列番号９：大豆トリプシンインヒビターの７７〜１０６番目のアミノ酸配列
配列番号１０：大豆トリプシンインヒビターの１０７〜１１１番目のアミノ酸配列
配列番号１１：大豆トリプシンインヒビターの１１２〜１１９番目のアミノ酸配列
配列番号１２：大豆トリプシンインヒビターの１２０〜１２２番目のアミノ酸配列
配列番号１３：大豆トリプシンインヒビターの１２３〜１３２番目のアミノ酸配列
配列番号１４：大豆トリプシンインヒビターの１３３〜１４４番目のアミノ酸配列
配列番号１５：大豆トリプシンインヒビターの１４５〜１５９番目のアミノ酸配列
配列番号１６：大豆トリプシンインヒビターの１６０番目のアミノ酸配列
配列番号１７：大豆トリプシンインヒビターの１６１〜１６５番目のアミノ酸配列
配列番号１８：大豆トリプシンインヒビターの１６６〜１７５番目のアミノ酸配列
配列番号１９：大豆トリプシンインヒビターの１７６〜１７８番目のアミノ酸配列
配列番号２０：大豆トリプシンインヒビターの１７９〜１８１番目のアミノ酸配列
配列番号２１：大豆トリプシンインヒビターの４８〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号２２：大豆トリプシンインヒビターの１１２〜１１９番目のアミノ酸配列
配列番号２３：大豆トリプシンインヒビターの１６６〜１７５番目のアミノ酸配列
配列番号２４：大豆トリプシンインヒビターの６６〜７６番目のアミノ酸配列
配列番号２５：大豆トリプシンインヒビターの３１〜３８番目のアミノ酸配列
配列番号２６：大豆トリプシンインヒビターの４９〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号２７：大豆トリプシンインヒビターの４８〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号２８：大豆トリプシンインヒビターの６１〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号２９：大豆トリプシンインヒビターの６０〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３０：大豆トリプシンインヒビターの５９〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３１：大豆トリプシンインヒビターの５８〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３２：大豆トリプシンインヒビターの５７〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３３：大豆トリプシンインヒビターの５６〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３４：大豆トリプシンインヒビターの５５〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３５：大豆トリプシンインヒビターの５４〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３６：大豆トリプシンインヒビターの５３〜６３番目のアミノ酸配列
配列番号３７：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５１番目のアミノ酸配列
配列番号３８：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５２番目のアミノ酸配列
配列番号３９：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５３番目のアミノ酸配列
配列番号４０：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５４番目のアミノ酸配列
配列番号４１：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５５番目のアミノ酸配列
配列番号４２：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５６番目のアミノ酸配列
配列番号４３：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５７番目のアミノ酸配列
配列番号４４：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５８番目のアミノ酸配列
配列番号４５：大豆トリプシンインヒビターの４９〜５９番目のアミノ酸配列
配列番号４６：大豆トリプシンインヒビターの４９〜６０番目のアミノ酸配列
配列番号４７：大豆トリプシンインヒビターの４９〜６２番目のアミノ酸配列【００８４】
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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