(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体にフォトクロミックインクを塗布することによって物体の真正を防護する方法であって、可視波長域の光で照明するときに、視覚的に検知可能な状態の可逆変化を行うものであってかつ真正チェックにおいて低レベル安全特徴として使用可能な少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体をフォトクロミック部として含むフォトクロミックインクを用いる段階を備え、インクが低レベル安全特徴に加えて、一又は二以上の装置分析によってのみ検知可能でかつ視覚的に検知不不可能な高レベル安全特徴を有する方法。
【請求項２】
バクテリオロドプシン変異体が、機能変異体、シーケンス変異体、誘導変異体、発色変異体、同位体変異体又は／及びスピンラベル変異体から選択されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の特徴を有するバクテリオロドプシンを用いることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれかに記載の方法：
ａ）紫膜形のタンパク質の形成に要する領域はバクテリオロドプシン野生型と比較して変化しない、及び、
ｂ）バクテリオロドプシン野生型と比較して、ポリペプチド鎖のループ又は／及びＣ終端又は／及びＮ終端が、欠失、付加、挿入又は／及び置換を備える少なくとも一つのアミノ酸交換を含み、これらのアミノ酸が、フォトクロミック領域によって特性が決定されるバクテリオロドプシンのフォトクロミック特性を変えない。
【請求項４】
少なくとも一つのアミノ酸をＣ終端に付加されたバクテリオロドプシン変異体が用いられたことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
バクテリオロドプシン変異体が少なくとも一つのシスティンを含む請求項３又は請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
使用されるバクテリオロドプシン変異体は、野生型と異なる光サイクルと、野生型と異なる初期色とを有することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｄ３６Ｃ、Ｄ９６Ｎ、Ｄ８５Ｎから選択されたＢＲ変異体を用いることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
フォトクロミックインクは他のポリマー分子を含むことを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリマー分子がバクテリオロドプシンに結合されているバクテリオロドプシン変異体を用いることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリマー分子が非ペプチド部がないポリペプチドであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリマー分子が、核酸、又は／及び、非核酸部を有する誘導体を備えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
バクテリオロドプシン、又は／及び、その誘導体に結合した核酸が、適当な増幅反応によって検出されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
増幅生成物のシーケンスが決定されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
フォトクロミックインクは、少なくとも２つのバクテリオロドプシン変異体、又は／及び、少なくとも２つの修飾を有する一のバクテリオロドプシン変異体を備えることを特徴とする請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
補助物質が以下のａ）からｃ）の目的で用いられることを特徴とする請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の方法：
ａ）泡形成を防止し、濡れ特性を改善するため、
ｂ）インク材料をマイクロカプセル化し、安定性を改善するためにＵＶ線を遮断するため、
ｃ）外観的光学的印象を改善するためにバクテリオロドプシン材料の吸収スペクトルの影響を与えるため。
【請求項１６】
物理的包含によってフォトクロミック材料を付けるためにマトリックス材料を用いることを特徴とする請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マトリックス材料への共有結合によってフォトクロミック材料を付けるためにマトリックス材料を用いることを特徴とする請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
架橋によってフォトクロミック材料を付けるためにマトリックス材料を用いることを特徴とする請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
バクテリオロドプシン変異体がＵＶ光によって硬化可能な色において十分に分散されることを特徴とする請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
架橋がＵＶ光による照射によって行われることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
フォトクロミックインク自体、又は、インクが塗布された補助基板が、物体に塗布されることを特徴とする請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
２つの領域Ａ及びＢがラベルされる物体に塗布され、第１の領域Ａはバクテリオロドプシン変異体を含むフォトクロミックインクでラベルされ、第２の領域Ｂは非フォトクロミック色素を備え、その非フォトクロミック色素の非照射状態でのスペクトル放射は第１の領域の放射と異ならないが、照射後は第１の領域と比較して異なる放射を示すことを特徴とする請求項１から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
２つの領域Ａ及びＢがラベルされる物体に塗布され、第１の領域はバクテリオロドプシン含有の第１のフォトクロミックインクでラベルされ、第２の領域を第１のインクの光感度とは異なる光感度の第２のフォトクロミックインクを備え、それによって、非照射状態では、第２の領域はそのスペクトル放射においては第１の領域とは異ならず、照射後は第１の領域と比較して異なる放射を示すことを特徴とする請求項１から請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から請求項２３のいずれかに記載の方法によってラベルされた物体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フォトクロミックインクを物体に塗布（付ける）することによって物体の真正（authenticity）を保護する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
文書又は物体の真正を保護する安全性応用は、適切な安全特徴（security feature）あるいは真正ラベルの使用を含む。安全性応用についてのフォトクロミック材料の使用については、例えば、米国特許第4,927,180号に記載されている。周知の例では、フォトクロミック識別特徴（identification feature）をＵＶ光を用いることによって見ることができる。しかしながら、使用されている識別特徴は検知可能だが困難を伴い、そのため、ユーザーが識別特徴の欠失に気付かないという危険がある。ＵＶ光を使用するので、真正を検査する人の目を適切に保護する必要性がある。従って、安全特徴（安全性特徴部、セキュリティ特徴部）を特定するＵＶ光の使用は欠点とみなすことができる。米国特許第5,807,625号は同様な従来技術を記載している。ここでも、ＵＶ光を用いて安全特徴を視覚化している。
【０００３】
上記の文献が開示している有機フォトクロミック材料は、通常、１０4から１０5のスイッチングサイクル数を有する。これは、安全特徴を特定するための可能な検査プロセス数を制限するものである。例えば、自動検査装置又はアクセス制御装置のような自動検査プロセスのために前記安全特徴を用いることが、制限はあるが可能である。
【０００４】
さらに、ラベル標本（preparation）の特別の束を特定することができることは望ましく、安全性目的で準備された標本が消失し又は不法に除去されたときには、特定の原因を決定することができることが望ましい。従来技術の前記文献で開示された安全特徴はこのような応用に対しては用いることはできない。
【０００５】
さらに、従来のフォトクロミック材料は、顕著な特有の色合いを有さない２つのスイッチング状態のうちの一つの欠点を有する。
【０００６】
本発明の目的は、可視波長域の光を用いて退色（bleach）プロセス及び消失プロセスの両プロセスを実行することができる任意の検出可能安全特徴を提供することである。この方法では、廉価でかつ世界中で入手可能な光源、例えば、発光ダイオードを用いて色の変化を誘起することが可能である。ただ簡単なランプの光を用いて、テストが可能で、裸眼で検出可能である。さらに、１０4から１０5より大きいスイッチングサイクル数を有する安全特徴を提供することが望ましい。
【０００７】
他の目的は、色合い及び／又は色の変化が異なる構造的に類似の多数のフォトクロミック材料を提供することである。
【０００８】
従来技術から周知の安全特徴は、それらを確認（検証、検査）するのに要する技術的労力が小さいことから、低レベル安全特徴と定義することができ、一方、他の目的は技術的に要求され、そのため、訓練されていない者には不可能であるようなさらに高レベルの安全特徴を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
国際特許出願WO98/06084は、目に見えない高レベルの安全特徴としてとして、特定のプライマーによって、例えば、ＰＣＲ反応のような適当な増幅反応によって検出可能な、核酸分子、特にＤＮＡ分子の使用について開示している。
【００１０】
本発明は、例えば、フェトクロミズムのような低レベルの安全特徴を、例えば、個々の束の特定を可能にする高レベルの安全特徴に結合することができる材料、すなわち、バクテリオロドプシン（ＢＲ）を検出することが可能とし、また、この材料を物体のラベリング及び物体が真正の物であることを証明するのに用いることができる。
【００１１】
バクテリオロドプシン含有インクを用いることによって物体の真正を保護する本発明の方法は請求項１で述べており、また、その方法の好適な実施形態をその従属項に記載している。
【００１２】
本発明によれば、上記の物体は、フォトクロミックインクを物体に塗布することによって物体の真正を保護する方法によって得られ、方法は、可視波長域の光で証明したときに、真正検査のために低レベル安全特徴として使用可能であって視覚で検出可能な状態の変化、特に色の変化を生ずる少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体（variant）をフォトクロミック部として含むフォトクロミックインクであって、低レベル安全特徴に加えて、装置分析によってのみ検出可能な一又は二以上の視覚的には検出不可能な高レベル安全特徴を有するインクを用いる段階を備える。
【００１３】
本発明は、物体の真正を保護する方法においてフォトクロミックインクの使用に関するものである。本発明によって用いられるインクは、フォトクロミック部として少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体を含む。このようなＢＲ変異体は、真正検査の目的のための視覚的に検出可能な低レベル安全特徴及び、固有に装置分析によってのみ検出可能なより高レベル安全特徴を提供する。
【００１４】
フォトクロミズムは、開始物質の色（吸収スペクトル）が変化する間における物質の状態の光誘起可逆変化（特に、色の変化）を意味する。例えば、異なる波長の光、又は、熱によって、可逆反応が開始されうる。本発明では、可視波長域の光で照射されたときに状態の変化を起こすバクテリオロドプシン変異体をフォトクロミック部として用いるので、本発明ではＵＶ光による照射は不要である。結果として、ＵＶ光の使用に関わる欠点、特に装備に必要性及びそれに関わる保護手段を用いる必要がなくなる。
【００１５】
本発明で用いるバクテリオロドプシン変異体は、両方の状態特に好適にはスイッチング状態全てが着色している変異体であることが好ましい。
【００１６】
従って、本発明の一態様では、物体の真正を保護する方法であって、その方法は、バクテリオロドプシン及び／又はバクテリオロドプシン変異体をフォトクロミック部として含むインクの形でのフォトクロミック準備を物体に塗布し、このフォトクロミック準備を可視波長域の光で照射することによって、真正検査の目的で検知可能な状態変化、特に特定の色変化を生ぜしめる。検知可能な状態変化、特に色変化は好適には可逆であって、本発明で使用するバクテリオロドプシン変異体は、特に１０5より大きいスイッチングサイクル数（すなわち、検査目的のための色変化）、好適には１０6より大きいスイッチングサイクル数、さらに好適には１０7より大きいスイッチングサイクル数を有する。結果として、ルーチン手段のフレーム内の真正保護物体の繰り返し安全性確認が、低レベル安全特徴をもとに可能である。例えば、バクテリオロドプシンのフォトクロミック活性部を破壊することによって状態の変化が不可逆になれば、低レベル安全特徴はキャンセルされ、あるいは、無効にされうる。
【００１７】
真正検査は、バクテリオロドプシンを退色（脱色）するために、可視光でフォトクロミックインクを照明することによって行われることが好ましく、次いで、フォトクロミックインクは第２の波長域の光で照明して、フォトクロミック的にバクテリオロドプシンを始状態に戻すか、あるいは、非退色状態に熱緩和が生ずる。退色の間の光学特性の変化、及び／又は、裸眼であるいは光学装置を用いて消滅プロセスを観察することは可能である。
【００１８】
“低レベル安全特徴”という用語は、特性の存在あるいは特性の欠如が、熟練していない者によって、簡単な方法で技術的な支援なく、又は、低度の複雑さの技術によって、確認することができる特性を意味する。
【００１９】
他方、“高レベル安全特徴”という用語は、熟練していない者によって特性の存在あるいは特性の欠如を検知することが不可能であり、かつ、高度の技術的複雑さのもとで通常専門家によってしか確認することができない特性を意味する。
【００２０】
従って、低レベル安全特徴は、特性の分析はほとんど費用のかかる手段（ペニヒ）を用いることなく、誰にでも実行可能な特性であり、一方、高レベル安全特徴は、特性の分析が数１０万ドイツマルクに達しうるものでありかつ実験室で専門家によって実施される特性である。フォトクロミズムは周知の技術によっては再現できないので、低レベル安全特徴は“エブリマン”の偽造技術からの防護を提供する。高レベル安全特徴は、バッチ符号化のレベルまで、応用に対してあるいはユーザーに対して個々の安全性色の個別化を提供する。
【００２１】
例えば、バクテリオロドプシンの変異体のフォトクロミズム、すなわち、観察者が検知可能な可視光による照明における色変化は低レベル安全特徴を示す。視覚的に検知可能な低レベル安全特徴の別な例は、フォトクロミックインク含有バクテリオロドプシンの様々な初期着色、様々な光サイクル及び／又は変わった動的挙動である。
【００２２】
誰もが簡単な方法で視覚的に知覚可能な低レベル安全特徴に対して、高レベル安全特徴は、技術的に複雑な分析装置の助けを借りてしか、すなわち、装置分析によってしか、確認することができない。高レベル安全特徴の確認は技術的助けを要する。例えば、バクテリオロドプシンシーケンスにおけるアミノ酸の置換は変異体の生成につながり、野生型からずれたその変異体の質量は質量分析器で検出できる。しかしながら、例えば、異なる質量に因って、その分裂（断片化：fragmentation）パターンあるいは他の異なる性質を例えばＥＳＲあるいはＮＭＲを介して検知可能なバクテリオロドプシン変異体を形成することは原子及び／又は分子をつけることによって可能である。
【００２３】
アミノ酸置換によって、特に以下の高レベル安全特徴を提供することが可能となる。液体クロマトグラフ質量分析計／質量分析計（例えば、ＥＳＩ）を用いた検出においては、質量分析計は分子量の変化及び／又は分裂パターンの特徴的変化を測定することができる。ＨＰＬＣを用いた検出及び吸収あるいは蛍光の検出では、ペプチド開裂（cleavage）の特徴的変化、例えば、分裂片の数を増加あるいは減少させる開裂サイトの欠失あるいは付加を検出することができる。これらの方法を用いて、芳香族アミノ酸の数の変化を検出することも可能である。特定の単一クローンの抗体のバクテリオロドプシンのシーケンスあるいはその部位への結合は、ＥＬＩＳＡあるいは同様な方法によって検出することができる。
【００２４】
付属装置で得られる高レベル安全特徴の例は、ＥＳＲによって得ることができるスピンラベル及び安定同位体（例えば、13Ｃ、15Ｎ）でラベルされたタンパク質修飾（modification）試薬によって導入される修飾である。
【００２５】
本発明で用いるフォトクロミックインクは、例えばフォトクロミズムのような低レベル安全特徴、及び、例えば使用されるバクテリオロドプシンのシーケンス情報（その情報は、例えば、個々のバッチの特定を可能にする）のような高レベル安全特徴で防護された物体を提供する。
【００２６】
本発明による方法は、マークされて物体についての二重の安全性を提供する。低レベル安全特徴を容易に認識でき、そのため、容易にかつ迅速に確認可能である一方、高レベル安全特徴は複雑な分析によってのみ検知可能な隠された安全特徴であり、偽造するおそれのある者には全く認識することはでいない。偽造するおそれのある者は、バクテリオロドプシンと結合することができる高レベル安全特徴の総数があるので、特別の特徴を含むべきか否かは初期にはわからない。
【００２７】
この付加安全性は、偽造に対して高い防護を提供し、同時に、例えば、製造者あるいはバッチ符号化への物体の符号化を提供する。バクテリオロドプシン変異体を用いることは、さらに、低レベル安全特徴と高レベル安全特徴とを互いに手が付けられないほどにリンクする。というのも、それらは同じ分子から成るからである。
【００２８】
本発明によりラベルされた物体は、様々な方法で確認することができる。例えば、入金に対して銀行で実施することができるようなルーチンな確認に対して、例えば、簡単な手段によって低レベル安全特徴についてだけチェックすることが可能である。また、二又は三以上の低レベル安全特徴を平行に確認することも可能である。さらに詳細な検査のためには、バクテリオロドプシン変異体の一又は二以上の高レベル安全特徴ことは可能である。少なくとも二つの高レベル安全特徴の存在は、２つの異なるバクテリオロドプシン変異体を用いることによって、あるいは、２回修飾したバクテリオロドプシン変異体を用いることによって、得ることができる。さらに、低レベル安全特徴及び高レベル安全特徴を合わせた確認も可能である。
【００２９】
バクテリオロドプシンは好塩菌の膜タンパク質である。タンパク質バクテリオロドプシンは、好塩菌（Halobacterium）の微生物から大量に得ることができる。基本光化学的及び物理的特性を用いて、野生型バクテリオロドプシンは、光で活性化され、中間体のサイクルシーケンスを介して機能するフォトクロミック材料として熟練した労働者に周知である。フォトクロミック特性はここで、Ｂ状態及びＭ状態と証される２つの状態だけを有する大きく単純化された光サイクルを用いることによってモデル化される。568nm波長の光によって照明することによって、紫Ｂ状態は黄色Ｍ状態に変換される。Ｍ状態の一部は412nm波長の光の吸収によってＢ状態に戻る。バクテリオロドプシン材料を黄緑光で退色することが可能であり、紫色は消え、黄色が現れる。熱緩和によって紫色は再度現れるまで待つことができ、あるいは、バクテリオロドプシン材料を光化学的に再びＢ状態に戻すために青色を用いる。前記バクテリオロドプシンの特性の概説は、N.N.VsevolodovによるBiomolecular Electronics:An introduction via Photosensitive Proteins（Birkhaeuser, Boston, 1998年）、及び、D.Oesterheld, C.Braeuchle, N.HamppによるBacteriorhodopsin:A Biological Material for Information Processing, Quarterly Review of Biophysics, 24(1991) 425-478において見ることができる。
【００３０】
同じ初期色を野生型として有するが、光サイクルの動力学のいくつかにおいてかなり異なっているかなりの数のバクテリオロドプシン変異体があることは熟練した労働者には周知である。好適な例は、様々な刊行物、例えば、A.Miller, D.OesterheldによるKinetic Optimization of Bacteriorhodopsin by Aspartic Acid 96 as an Internal Proton Donor, Biochim. Biophys. Acta 1020 (1990) 57-64に記載されている。
【００３１】
本発明では、可視光を用いて退色することができるバクテリオロドプシンを用いることによるのが好ましい。500nmから600nmまでの波長域が有利であることがわかった。バクテリオロドプシンは熱緩和によってあるいは第２の波長域の光で照明することによって、始状態（初期状態）へ戻る。この第２の波長域に対しては、400nmから500nmの波長を用いるのが有利である。
【００３２】
Ｍ状態の寿命が長いほど、照明下でのバクテリオロドプシンの可視退色を検出することが容易になる。通常、532nmで100mW/cm2以下の光出力を用いると、バクテリオロドプシン材料の約90％の退色が達成する。
【００３３】
今日まで、印刷による応用及び／又は安全性の分野での応用に対して、例えば、標本がフォトクロミック成分としてバクテリオロドプシンを含むコーティング、インクあるいは印刷インクのような標本は、文献に記載されてきた。前記従来のフォトクロミック材料と比較して、バクテリオロドプシンは以下のような利点を提供する：
１．可視光波長が色変化について使用できる。
２．両スイッチング状態が検知可能な固有の着色を有する。
３．遺伝学法の応用によって、バクテリオロドプシンの機能変異体をアミノ酸交換によって準備することが可能となる。この方法で得られるバクテリオロドプシン変異体は、動力学（ＢＲ−Ｄ９６Ｎ）、及び／又は、その初期吸収、及び、その光吸収（ＢＲ−Ｄ８５Ｎ）において野生型バクテリオロドプシンとは異なる。４．可能なスイッチングサイクル数は１０5より大きい。
【００３４】
ハロバクテリア属の微生物におけるバクテリオロドプシンは、“紫膜”型で存在する。紫膜型のバクテリオロドプシンの標本及び単離（isoaltion）は技術的には周知である（例えば、EP0,406,850B1と比較）。
【００３５】
野生型において、バクテリオロドプシンは細胞膜の２次元部の形で見つけられる。その２次元部は専らバクテリオロドプシン及び脂質から成る。この部は紫膜と呼ばれる。この形では、バクテリオロドプシンは熱力学的に特に安定であり、タンパク質に対しては、極端に安定である。これは、多数の技術的応用に対して、及び、バクテリオロドプシンを色素として用いる本発明の標本の領域においても前提条件である。従って、本発明では、紫膜の形でＢＲ及び／又はＢＲ変異体を用いるのが好ましい。
【００３６】
使用されたバクテリオロドプシンは野生型であってもよいが、本発明によれば、フォトクロミックインクについては、少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体をフォトクロミック部として含むことが好ましい。バクテリオロドプシン変異体は少なくても一修飾だけ野生型と異なっている。機能変異体、シーケンス変異体、誘導変異体、発色変異体、同位体変異体及び／又はスピンラベル変異体からバクテリオロドプシン変異体を選択するのが好ましい。
【００３７】
バクテリオロドプシン機能変異体でもあってもよいバクテリオロドプシンシーケンス変異体は、好塩菌サリナリウム（Halobacterium salinarium）で表現してもよい。この結合では、バクテリオロドプシンは分離することができる細胞膜に組み込まれている。場合によっては、得られた材料は二次元結晶ではないが、バクテリオロドプシンは膜結合である。
【００３８】
個々のアミノ酸の特別の置換によってバクテリオロドプシン変異体を生成するときは、シーケンス変異体は、フォトクロミック機能に対して重要でない領域におけるアミノ酸を交換することによって準備することができる。アミノ酸はバクテリオロドプシンについて遺伝子符号化のサイト指向突然変異生成によって置換することが可能である。
【００３９】
しかしながら、これは高レベル安全特徴の進化を示すものである。というのは、バクテリオロドプシン分子における特別なアミノ酸置換は特定の目的に対して用いることができ、それによって安全特徴となる。例えば、４個のアミノ酸位置を２０個の生物起源のアミノ酸で置換することによって、４20＝１０12個の区別可能なバクテリオロドプシン材料を準備することが可能になる。
【００４０】
結果として、大きな技術的複雑さを伴うことなく、フォトクロミック機能的に同一のバクテリオロドプシン材料を備えるが、あいまいさなくすなわちアミノ酸シーケンスにおいて互いに異なる膨大な種類のバクテリオロドプシン分子を準備することができる。
【００４１】
付加的な高レベル安全特徴は、複雑な分析なしで検出することはできない。従来技術において、前記修飾を有するバクテリオロドプシン材料の組成を信頼性高く検出することができる様々な方法がある。真っ先に、質量分析器について述べなければならない(参照されたい：K.L. Schey, D.I. Papac, D.R. Knapp and R.K. Crouch, Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry of Rhodopsin and Bacteriorhodopsin, Biophys., J. 63(1992)1240-1243, P. Hufnagel,U. Schweiger, C. Eckerskorn and D. Qesterhelt, Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Genetically and Chemically modified Bacteriorhodopsins, Anal. Biochem. 243(1996) No.1, 46 54, L.E. Ball, J.E. Jr. Oatis, K. Dharmasiri, M. Busman, J. Wang, L.B. Cowden, A. Galijatovic, N. Chen, R.K. Crouch and D.R. Knapp, Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins: Application to Complete mapping of Bacteriorhodopsins and Rhodopsin, Protein Sci. 7(1998) No. 3, 758 - 764)。好適なバクテリオロドプシン材料は、低レベル安全特徴すなわち光学的に容易に検出できるフォトクロミズムを、高レベル安全特徴例えば、バクテリオロドプシン自体のアミノ酸シーケンスにおけるシーケンス変動に結びつける。
【００４２】
本発明は、以下の１．〜３．を含む低レベル安全特徴を備える：
１．バクテリオロドプシン材料の様々な始めの色
２．様々な光サイクル
３．修飾動力学挙動。
【００４３】
本発明の低レベル安全特徴は、バクテリオロドプシンの機能的変異体を用いることによって実現することができるが、低レベル安全特徴バクテリオロドプシン派生変異体及び／又はバクテリオロドプシンの発光変異体のような他のバクテリオロドプシン変異体によっても実現できることが好ましい。
【００４４】
用語“バクテリオロドプシンの機能的変異体”は、特に、吸収スペクトル及び／又はその光サイクルにおいてバクテリオロドプシン野生型とは異なる変異体を意味するものとして理解されるものである。
【００４５】
周知の機能的変異体の例は、アスパラギン酸が位置９６でアスパラギンによって置換された変異体D96Nである。このバクテリオロドプシンの機能変異体及び他の変異体は以下に記載されている：H. Otto, T. Marti, M. Holz, T. Mogi, M. Lindau, H.G. Kilorana and M.P. Heyn, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989), pp.9228-9232、及び、T.E. Thorgeirsson, S.J. Milder, L.J.W. Miercke, M.C. Betlach, R.F. Shand, R.M. Stroud and D.S. Kliger, Biochemistry 30 (1991),pp. 9133-9142。
【００４６】
用語“バクテリオロドプシン派生変異体”は、特に、分子の共有結合によって野生型と異なるバクテリオロドプシン変異体を意味するものとして理解されるものである。このような分子は、例えば、質量分析計でこの種の分子を特定することができるようにバクテリオロドプシンの分子量を増加するという働きを有してもよいし、又は、このようにバクテリオロドプシン結合蛍光を観察することができるように蛍光分子であってもよい。同様に、バクテリオロドプシン材料はポリマーに共有結合してもよい。カップリング反応は、例えば、Chignell及びChignellによるBiophys.Biochem.Res.Commun.62(1975)p136-143の記載、及び、RenthalらによるBiochemistry 22(1983)p5-12の記載に従って実施してもよい。
【００４７】
適当な色素のバクテリオロドプシン分子への共有結合、及び／又は、受動色素あるいは色素の単純混合は、バクテリオロドプシン材料あるいはフォトクロミックインクのの初期色印象、及び、退色状態の色印象に強く影響を与えうる。色混合を発展させる外観印象は、ＣＩＥダイアグラムにおいて明白に視角化することができる。この種の周知の方法を用いることによって、熟練労働者は色効果を決定することができる。
【００４８】
リンカー（linker）分子をバクテリオロドプシンに結合することが可能であり、その結合は他の化合物を前記リンカー分子に結合することを可能にする。本発明の目的のためにつけることができる分子は、質量分析計においてこの種の分子を特定することができるように、バクテリオロドプシンの分子量を増加する役目を有する。
【００４９】
用語“バクテリオロドプシンの発色変異体”は、特に、発色レチニリデン（retinyldene）群を除去するか、又は、他の分子、特に“レチナール類似体（analog）”に交換することによって野生型と異なるバクテリオロドプシン変異体を意味すると理解されるものである。
【００５０】
バクテリオロドプシン変異体を準備する可能性は、発色レチニリデン群を置換することによって可能となる。これによって、光物理学的特性の修飾を達成し、ジヒドロレチナール（dihydroretinal）あるいは4-ケトレチナール（4-ketoretinal）を使用することができるのが好ましい。
【００５１】
用語“バクテリオロドプシンの同位体変異体”は、特に、アミノ酸の一部あるいは全てをＣ13あるいはＣ15で部分的にあるいは完全にラベルされたバクテリオロドプシン変異体を意味すると理解されるものである。これは、いくつかのラベルされたアミノ酸を成長媒体に付加すること、あるいは、分子全体としてラベルされたペプトンを用いることによって、達成することができる。この方法でラベルされた化合物は、高分解能ＮＭＲによって同定することができる。
【００５２】
用語“バクテリオロドプシンスピンラベル変異体”は、特に、バクテリオロドプシン分子に共有結合されたスピンラベルを含むバクテリオロドプシン変異体を意味すると理解されるものである。これは、例えば、TEMPO(2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl)、あるいは、DOXYL(4,4-dimethyloxazolidine-N-oxyl)、あるいは、PROXYL(2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-N-oxyl)誘導体をバクテリオロドプシン材料に共有結合することによって得ることができる。スピンレベルの存在及びタイプをＥＳＲによってチェックすることができる。
【００５３】
用語“バクテリオロドプシンシーケンス変異体”は、特に、本質的に光サイクルに影響を与えない、一又は二以上のアミノ酸の欠失、置換あるいは付加によって野生型とは異なるバクテリオロドプシン変異体を意味すると理解されるものである。バクテリオロドプシンシーケンス変異体の例は、アミノ酸がＮ終端（terminus）あるいはＣ終端に付加されたＤ３６Ｃあるいは変異体である。
【００５４】
上記の変異体の修飾の結合によって新しい好適な変異体が生成され、その結果、膨大な種類のバクテリオロドプシン標本が可能となる。結果として、高レベル安全特徴が得られる。というのは、分析は非常に複雑になり、同時に各個別のバッチを膨大な多様性をもとに曖昧さなく同定することができる。
【００５５】
バクテリオロドプシン変異体は、Ｄ３６Ｘ、Ｄ９６Ｘ、及び、Ｄ８５Ｘ（Ｘは、自然に生ずるアミノ酸の一つを示す）から選択されるのが好ましい。Ｄ３６Ｃ、Ｄ９６Ｎ、及び、Ｄ８５Ｎから選択されたＢＲ変異体が特に好ましい。
【００５６】
光感度が増大した突然変異体、特に、ホログラフィに対しても使用される材料が特に好適である。
【００５７】
バクテリオロドプシンの他に、バクテリオロドプシン標本はさらに、従来の非発光色素、及び／又は、蛍光色素、及び／又は、バクテリオロドプシンに共有した色素、及び／又は他の発光色素をさらに含むことができる。非発光色素あるいは蛍光色素をバクテリオロドプシンに混合することによって、前記色素あるいは蛍光色素を安全性ラベル内に隠すことができる。このような実施形態では、さらに、可視光に加えて、ＵＶ光を用いることが好都合である。
【００５８】
さらに、蛍光分子あるいは燐光分子をバクテリオロドプシン分子に結合することが可能であり、結果として、その発光が付加的特徴となる。バクテリオロドプシン材料が非退色状態にあるとき、発光位置の適当な選択によって蛍光を抑制することができる。これは、始期のバクテリオロドプシン吸収及び蛍光あるいは燐光材料の発光の位置に強い重なりがあれば、達成される。この場合には、バクテリオロドプシン材料は発射プロトンを吸収し、裸眼ではいかなる蛍光を知覚することも不可能である。蛍光は、バクテリオロドプシン材料が光化学的に退色された場合だけ可視となる。
【００５９】
塗布されたバクテリオロドプシン材料の組成は、例えば、微量分析シーケンシングによって、又は、免疫学的方法で特別な抗体との反応を測定することによって、完全にあるいは部分的にバクテリオロドプシン材料のアミノ酸シーケンスを決定することによって、チェックすることができる。
【００６０】
高レベル安全特徴を含むバクテリオロドプシン材料は、以下の１．〜３．を有するバクテリオロドプシン変異体を含むことが好ましい：
１．特別に修飾されたアミノ酸シーケンス（シーケンス変化は光物理学的特性に影響を与えない）を有する。
２．共有結合分子を有する。
３．13Ｃ及び／又は15Ｎ及び／又は他の同位体でラベルしたアミノ酸を有する。二又は三以上の上記バクテリオロドプシン変異体型の組合せは特に好ましい。
【００６１】
本発明の方法では、以下の特徴を有する少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体を用いることは特に好ましい：
ａ）タンパク質の紫膜形の形成に要する領域はバクテリオロドプシン野生型と比較して変化しない、
ｂ）バクテリオロドプシン野生型と比較して、ポリペプチド鎖のループ又は／及びＣ終端又は／及びＮ終端が、欠失、付加、挿入及び／又は置換を備える少なくとも一つのアミノ酸交換を含み、これらのアミノ酸は、フォトクロミック領域によって特性が決定されるバクテリオロドプシンのフォトクロミック特性を変えない。
【００６２】
このようなバクテリオロドプシンは、タンパク質の紫膜の形の形成に要する領域におけるバクテリオロドプシン野生型と比較して変化しない。この発明の目的に対して、この領域における小さな変化なしで、バクテリオロドプシンは紫膜を形成することができるならば、それは十分である。
【００６３】
アミノ酸シーケンスの本発明の変化は、全ポリペプチド鎖内のいかなる位置でも、例えば、欠失、挿入、置換及び／又は付加のようなアミノ酸置換を備える。アミノ酸をＮ終端及び／又はＣ終端及び／又は特に膜の外に位置するポリペプチドループに付加することは好ましい。高レベル安全特徴の符号化のため本発明によって実施する変化は、フォトクロミック特性に影響を与えるバクテリオロドプシン領域において実施されないことが好ましい。適当な方法で実施するときは、ポリペプチド鎖のループ及び／又はＣ終端及び／又はＮ終端におけるアミノ酸交換は開始バクテリオロドプシンのフォトクロミック特性を変化させない。ここでは、開始バクテリオロドプシンとして、野生型バクテリオロドプシン及びすでに修飾されたバクテリオロドプシン、特にＢＲ−Ｄ９６Ｎを用いることが可能であることを記憶に留めておかれたい。
【００６４】
分析に使用可能なアミノ酸交換は、少なくとも一つの1ドルトン、好適には少なくとも10ドルトン、さらに好適には100ドルトン以上のバクテリオロドプシン分子量に変化に影響を与えるのが好ましい。分析のために、例えば、ＦＴＭＳ（フーリエ変換質量分析計）、及び／又は、ＴＯＦ（飛行時間型質量分析計）、及び／又は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援型レーザー脱離イオン化）、及び／又は、ＥＳＩ（電子スプレーイオン化）のような従来技術の装置及びイオン化方法を用いる。
【００６５】
アミノ酸の付加／挿入は、特に、1,000個までの付加アミノ酸、好適には100個までの付加アミノ酸、さらに好適には50個まであってかつ少なくとも一つの付加アミノ酸、及び、最も好適には3〜20個のアミノ酸を備えてもよい。少なくとも６個のヒスチジン残基の付加は、ＸＲＦあるいはＴＸＲＦによって金属結合を介してバクテリオロドプシン変異体の存在を検知するため利用することができる。
【００６６】
欠失あるいは置換は特に1〜10個のアミノ酸、特に1〜4個のアミノ酸に影響を与える。
【００６７】
好適に用いられる置換変異体は、位置３６のアスパラギン酸残基がシステイン残基（ＢＲ変異体Ｄ３６Ｃ）で置換されているバクテリオロドプシン変異体である。
【００６８】
バクテリオロドプシン分子のアミノ酸シーケンス変異体の分子量は、ＥＳＩあるいはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いた質量分析計によって決定することができる。質量スペクトルを再計算した後、研究している物質の分子量は一の質量数までの分解能で得られる。例えば、欠失あるいは挿入によるアミノ酸シーケンスの変化は、容易に分析的に検知可能な比較的大きな質量数変化につながる。たとえ、いくつかのアミノ酸だけを他のアミノ酸で置換しても、結果的な質量変化は分析的に十分である。
【００６９】
少なくとも一つのアミノ酸をＣ終端で付加されたバクテリオロドプシン変異体を用いるのが好ましい。少なくとも一つのシステインを含むバクテリオロドプシン変異体を用いるのがさらに好ましい。他の好適な実施形態では、野生型と異なる光サイクル及び／又は野生型と異なる始めの色を有する少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体を用いる。
【００７０】
低減された明暗適応（light/dark adaptation）を有するバクテリオロドプシン変異体を用いることは最も好ましい。最大吸収が570nm（Ｂ状態）であるバクテリオロドプシンは、暗闇（in the dark）では約10〜20分の半減期でゆっくりと548nmの最大吸収の状態、“Ｄ状態”に緩和する。バクテリオロドプシン野生型では、Ｂ状態とＤ状態が約50:50の平衡状態が暗闇で確立する。レチナールはＢ状態では全トランス配置を有し、Ｄ状態では13-シス配置を有する。照射中、バクテリオロドプシンはまず100％Ｂ状態に変換する。光サイクルはＢ状態から始まり、その間に所望の強い色変化が生ずる（412nmへ吸収シフト）。
【００７１】
本発明のバクテリオロドプシン含有フォトクロミックインクあるいはラベルした物体が比較的長時間にわたって暗闇で格納されれれば、バクテリオロドプシンは“暗闇適合（dark adapted）状態”に変化する。バクテリオロドプシンを退色するためにチェックすべき領域を始めて光で照明すると、前記領域は低減された光感度あるいは低減された退色率を有するようである。これは、Ｄ状態からＢ状態へバクテリオロドプシンを遷移するのに用いられる照明光の一部によって生ずる。例えば、青色光を用いることによって、一度生成された生成された退色が再度反転すると、すなわち、紫の始状態を再確立すると、材料は直接的な以下のさらなる照射において所望の高い光感度を示す。しかしながら、フォトクロミック特性が第１のサイクルにおいて、暗闇での格納の後でさえ、すでに現れるのが望ましい。このため、低減された明暗適合を有するかあるいは明暗適合が完全に欠失したバクテリオロドプシン変異体は本発明の使用に対して好適な材料である。
【００７２】
低減された明暗適合を有するかあるいは明暗適合が完全に欠失したバクテリオロドプシン変異体は、レチナール類似体、あるいは、修飾アミノ酸シーケンスを有するバクテリオロドプシン変異体を用いることによって得られてもよい。特に適した例は、例えば、13-ジメチル-11,14-エポキシ-バクテリオロドプシン（13-demethyl-11, 14-epoxy-bacteriorhodopsin）(M. Muradin-Szweykowskaらによる Rec.:J.R.Neth. Chem. Soc. 102 (1983), 42-46）のような化学的に修飾した発色団を有するバクテリオロドプシンである。さらに好適な変異体は、13-置換レチナール、特に、位置１３にＨ原子、エチルグループあるいはプロピルグループを保持するレチナールを含むバクテリオロドプシンである（W. Gaertner らによる, Biochemistry27  (1988),  3497-3502.）。同様に好適に使用される低減された光適合を有するArg-82,  Asp-85  and  Asp-212突然変異体は、例えば、M.P. Krebsらによって、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90 (1993), 1987-1991において記載されている。さらに好適な突然変異体は、Ｙ１８５Ｆ (P. Rath et al,  Biochemistry 32  (1993),  2272-2281) であり、and also the mutants described in S.P. BalashowらによってBiochemistry 32 (1993), 10331, 10343 及び、K. Ihara らによる Biophys. J. 67(1994), 1187, 1191, に記載された突然変異体、特にArg-82-Ala、及び、Met-145である。一般に、暗闇でＢ状態に残り、Ｄ状態に変化しない変異体が好ましい。
【００７３】
バクテリオロドプシン分子に共有結合された分子は、高レベル安全特徴の他のオプションを提供する。分子の結合は、例えば、つけられた分子の特定の特性の検知、あるいは、その質量を介して、他の分析寸法を可能にする。付けられた分子は、例えば、ビオチン、及び／又は、アビジン、及び／又は、ジゴキシゲニン（digoxygenin）であってもよい。質量分析器によって独立に検知可能な分子を付けることも可能である。例えば、ＴＥＭＰＯ、ＤＯＸＹＬ、あるいは、ＰＲＯＸＹＬのようなスピンラベルの結合は、固体を用いることによって、制限をもって実施することができるＥＳＲ分析によって決定することができる。安定同位体13Ｃ及び15Ｎでラベルされたアミノ酸はＮＭＲ分析によって検出できる（M. Engelhard, B. Hess, G. Metz, W. Kreutz, F. Siebert, J. Soppa、and D. OesterheltによるEur. Biophys. J. 18 (1990), 17-24に掲載された文献“ High resolution carbon-13-solid state NMR of bacteriorhodopsin: assignment of specific aspartic acids and structural implications of single site mutations”)。
【００７４】
真正チェックのための高レベル安全特徴は、モノマーシーケンスが周知でかつ適当ならばバクテリオロドプシン分子に結合されたポリマー分子によって得てもよい。この結合で用いられるポリマー分子は、例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）あるいは他の合成した自然に生ずるものでないポリマーである。ポリペプチド及びタンパク質は、非タンパク質部、核酸、非核酸部を含んでもよい。非タンパク質部及び非核酸部は、例えば、グリコシド部、ビオチン及び／又はジゴキシゲニン及び／又はアビジンを含んでもよい。
【００７５】
ＢＲに加えて一又は二以上のポリマーをインクと混合することも可能である。ここで、そのポリマーは、情報搬送成分、高レベル安全特徴として備え、又は、単にラベルの粘性及び機械的特性を調整する役目をするに過ぎない。
【００７６】
例えば、ＤＮＡ、及び／又は、ＲＮＡ、及び／又は、ＰＮＡ分子、及び／又は、前記分子型からのハイブリッドのような高レベル安全特徴として、バクテリオロドプシンに結合されたポリマー分子は、例えば、特定のプライマーによってＰＣＲ反応のような適当な増幅反応によって検出してもよい。ここでの検出は、ゲル電気泳動サイズ分析を含むが、核酸ベースシーケンス決定を指向している。ポリペプチドは、微量分析シーケンス決定によって同様に分析され検出されてもよい。核酸及びポリペプチドの有機分析によって得られる可能性のため、自然に生ずるのではないシーケンスを利用することも可能である。
【００７７】
低レベル安全特徴と高レベル安全特徴との組合せは興味深い利点を提供する。このような組合せは、例えば、低レベル安全特徴としてバクテリオロドプシンのフォトクロミック特性を上記高レベル安全特徴の一つを組み合わせることによって得られてもよい。このため、ポリマー分子を有するバクテリオロドプシンを用いることは特に好都合である。しかしながら、バクテリオロドプシンあるいはバクテリオロドプシン変異体は、分析可能なポリマー分子として使用してもよい。大きな変化性にかかわらず、安全特徴は互いに解けないほどリンクされる。また、バクテリオロドプシンに加えて、ＢＲに結合され及び／又は自由形のものと異なるフォトクロミック材料ポリマーとして使用することが可能である。
【００７８】
物体の真正を防護するための本発明の方法は、インクの形のフォトクロミック標本を塗布する段階、あるいは、インクを特定の物体に印刷する段階とを備えている。この結合においては、本発明の発色標本は、野生型バクテリオロドプシン以外に、又は／及び、適当ならば発色部として少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体、適当な補助物質及び／又は適当なマトリックス材料を含んでいる。
【００７９】
補助物質は以下の目的に使用する：応用プロセスのため：泡形成を回避するため、及び、使用特性を改善するため、及び／又は、安定性のため：標本物質をマイクロカプセルに入れるため、及び、ＵＶ線からの保護のため、又は／及び、外観光学印象を改善するため：例えば、バクテリオロドプシン材料の非退色状態及び退色状態において、吸収スペクトルに影響を与えるため。このような補助物質の例としては、所望の初期あるいは終期色を達成するために単純にインクと混ぜる受動染料あるいは色素である。このように、混合色を生成すること、又は／及び、スペクトルをシフトすることも可能である。
【００８０】
物理的包含によって、又は／及び、マトリックス材料への共有結合によって、又は／及び、標本材料あるいはマトリックス材料の化学的あるいは光化学的方法によって連続的に架橋することによって、適当なマトリックス材料を準備材料を固定するために用いる。この結合においては、架橋はグルタルアルデヒド、トランス-グルタミナーゼ、（自由ラジカル）重合、又は／及び、光化学架橋による処理を含んでいる。
【００８１】
本発明の発色標本は、例えば、オフセット、スクリーン、インクジェットのような周知の印刷プロセス、あるいは、ブラシによる機械的な適用によるパッド印刷によって、スプレー、浸漬、あるいは電気泳動によって、塗布してもよい。本発明のバクテリオロドプシン材料は引き続く乾燥によって固体化されてもよいし、合成あるいは生物的マトリックス材料は、処置後によって不溶解性にすることができる。標本自体、あるいは、標本を塗布することができる補助基板を塗布（貼付、取り付け）することができる。バクテリオロドプシン標本はマイクロカプセルに入れた形で存在してもよい。マイクロカプセルに入れた色標本は、印刷プロセスにとって特に適している。
【００８２】
本発明の方法の特に好適な実施形態では、フォトクロミックインクを用いることによって物体にラベルするため、フォトクロミックインクを物体に塗布し、その後、乾燥及びマトリックス材料によって固定することによって固体化する。照射によってフォトクロミック標本の色変化を生成することが可能である。色変化に要する最小光エネルギーは、フォトクロミック標本のpHを介して設定されるのが好ましい。
【００８３】
さらに、特に隣接する２つの領域Ａ及びＢがラベルされる物体に塗布することが好ましく、第１の領域Ａはバクテリオロドプシン変異体を含むインクでラベルされ、第２の領域Ｂは非発色染料（色素）を備え、その非発色染料の非照射状態でのスペクトル放射は第１の領域の放射と異ならないが、照射後は第１の領域と比較して異なる放射を示すものである。さらに、第１の領域をバクテリオロドプシン含有フォトクロミック標本でラベルし、第２の領域を第１の標本の光感度とは異なる光感度の第２のフォトクロミック標本を備え、非照射状態では、第２の領域はそのスペクトル放射においては第１の領域とは異ならず、照射後は第１の領域と比較して異なる放射を示すものであるように、特に隣接する２つの領域Ａ及びＢをラベルするために物体に塗布することも可能である。第２のフォトクロミック標本は、バクテリオロドプシン野生型又は／及び第１の標本で使用されるＢＲと異なりかつ特に参照色として働くバクテリオロドプシン変異体を含むことが好ましい。
【００８４】
本発明はさらに、少なくとも一つの、好適には少なくとも二つのバクテリオロドプシン変異体を含むフォトクロミックインクに関係する。好適なバクテリオロドプシン変異体は上記のようであり、この種のフォトクロミックインクは特に真正を防護するためのラベル物体として適している。
【００８５】
本発明のインクは、蛍光色素、色素、又は／及び、フォトクロミック色素のような当業者には周知の従来の色素に組合せで用いることができる。本発明のバクテリオロドプシン材料含有インクは従来インクのように使用してもよく、物体の真正の防護のために修飾に対して及び他の特殊な効果に対して使用することもできる。
【００８６】
ここで、用語“インク”は、全ての色の書込液体／印刷液体、及び、適当な粉状適合媒体も意味する。用語インクは、印刷インク、及び、物体上で印刷するのに使用できあるいは印刷物を生成するために一般に使用される他の色組成を含んでいる。バクテリオロドプシン材料をインク、水、あるいは、例えば、アルコールをベースにしたもののような他の溶剤として使用してもよい。少なくとも二つのバクテリオロドプシン変異体あるいは少なくとも二つの修飾を有する一のバクテリオロドプシン変異体の使用は、分析が二次元的に実施可能であるという事実によって、分析に対して有利な効果を提供する。バクテリオロドプシンの好適な紫膜を除いて、本発明のインクはさらに固体状のバクテリオロドプシンを含んでいる。
【００８７】
固体状のバクテリオロドプシンは、例えば、大腸菌のようなホストにおいてバクテリオロドプシン遺伝子を表すことによって、かつ、付加レチナールアルデヒドで再構成することによって得ることができる。脂質を除去することによって、紫膜からバクテリオロドプシンを得ることも可能である。このため、例えば、紫膜懸濁液（０Ｄ570＜５）は水あるいはバッファにおいて1%トリトン-X100で混合し、連続して、音波発生器（sonifier）マイクロプローブを用いて１時間超音波処理する。遠心分離後に得られた上清は、可溶性のバクテリオロドプシンを含む。
【００８８】
ＢＲ含有フォトクロミック標本はいかなる物体に塗布されてもよい。特に関心のある物体の例は、文書、証券、銀行券、芸術作品、身分証明書、衣類、モーター車両、テストシンボル、品質シール等である。
【００８９】
従って、本発明の他の実施形態は、少なくとも一つのバクテリオロドプシン変異体を含むラベルを有する物体に関するものである。本発明の方法を用いて前記ラベルを準備することが好ましい。ラベルは上記のようなフォトクロミックインクを含むのが好ましい。
【００９０】
すでに説明したように、バクテリオロドプシン野生型は低い光感度を有し、そのため、通常の強い光源例えば日光のもとでは、裸眼で容易に検知可能な退色を生成することは実質的に不可能である。この低い光感度の理由はＭ状態の半減期が短いことである。
【００９１】
しかしながら、バクテリオロドプシン野生型のＭ状態の半減期を適当な方法によって増加することは可能である。従って、本発明はさらに、物体にフォトクロミックインクを塗布することによって物体の真正を防護する方法に関するものであって、該方法は、可視波長域の光で照明すると、視覚的に検知可能な状態の可逆変化を行い、真正チェックにおいて低レベル安全特徴として使用可能なバクテリオロドプシン野生型をフォトクロミック部として含むフォトクロミックインクを用いる段階を備え、インクがさらに水と結合し及び／又はプロトンの利用度（availability）を低減する補助物質を含む。バクテリオロドプシン野生型の低い光感度を増加する補助物質は、真正を防護するための方法において、バクテリオロドプシン野生型を使用することを可能にするものである。インクにおいて添加物として使用されたこのような補助物質は、バクテリオロドプシン野生型のＭ状態の半減期を増加する働きをする。バクテリオロドプシン野生型のＭ状態の半減期は、水がほとんど完全に除去されるならば増加する。補助物質は実質的には、水を結合し、プロトン利用度を低減することを目的とする。適当な補助物質の例は、主要アミノグループあるいは第２のアミノグループを含む混合物である。アルギニンあるいはグアニジウム×ＨＣｌを補助物質として用いることは特に好ましい。これらの補助物質は、光感度を向上するのにバクテリオロドプシン変異体において使用してもよい。
【００９２】
本発明の物体の真正を防護する方法において、使用するフォトクロミックインクは、ＢＲ変異体あるいはＢＲ突然変異体を含むのが好ましく、突然変異は高レベル安全特徴のため、及び／又は、光感度を向上するための情報として使用される。少なくとも二つの修飾、すなわち、バクテリオロドプシンの光感度を増加するための修飾、及び、周知の方法を用いて高レベル安全特徴として検出可能な他の修飾を含む変異体を用いることは特に好ましい。
【００９３】
（野生型バクテリオロドプシンは、共通照明レベルで著しく色を変化させる）低光感度のため、野生型バクテリオロドプシンだけの使用は適当性が限定され、野生型バクテリオロドプシンの一般的な利用度のため、真正保護のための関心が比較的低い。しかしながら、バクテリオロドプシン野生型と光感度を向上するための上記添加物のうちの一つの組合せを用いることによって、興味深い応用を開発するのを可能にする。他の好適な実施形態では、例えば、初期の色、ラベル等を調整するため、光感度を向上する上記添加物あるいは他の添加物は、一又は二以上のバクテリオロドプシン変異体あるいはバクテリオロドプシン突然変異体と共に用いる。
【００９４】
【発明の実施の形態】
図１及び図２に係る以下の例によって詳細に本発明を例示する。
【００９５】
例１：低レベル安全特徴チェック
ユーザーは、バクテリオロドプシンあるいはＢＲ変異体（図１）のフォトクロミック特性を容易にチェックすることができる。文書１、例えば、銀行券、証券、芸術作品、他の貴重な物体に付けられ、かつ、バクテリオロドプシン変異体Ｄ９６Ｎを含む標本から形成された特徴（特徴部）２は、例えば、それが緑色あるいは黄色域の放射最大値を有する発光ダイオードの光３で照明されたとき、紫色から黄色に色が変化するという現象によって、チェックすることができる。これは、領域が完全には照明されていないときに４において特に容易に認識できる。さらなる操作無しで、数秒から数分後、使用される標本に依存して紫色が再度現れ、初期状態が再確立される。代替として、紫色は、青色域で放射最大を有する発光ダイオードの光５で照明することによって直ちに確立することができる。チェックの技術的複雑さは無視できる。ユーザーは裸眼で色変化を追うことができるが、測定は器械によって行うこともできる。
【００９６】
例２：複製防護
本発明の特徴２を含む文書１であって、その特性において、例えばバクテリオロドプシン野生型の所定量の感光性バクテリオロドプシン材料とより光感度の高いバクテリオロドプシン材料、例えば、バクテリオロドプシン変異体Ｄ９６Ｎとの組み合わせが用いられた文書１は、非照射状態において同一色の均一領域を有する。感度の低いバクテリオロドプシン材料の代わりに、同じ色の適当な色素を用いることも可能である。前記文書を写真複写機３によって複写すると、複写プロセスの間の光の照射によって、感光性バクテリオロドプシン材料は感光性（光感度）の低い周囲材料より強く退色される。結果として、複写物（コピー）４は低レベル安全特徴５を示し、その特性は永遠に異なる色を保持する。これによって、複写物を曖昧さなく複写物として認識することが可能となる。
【００９７】
例３：処理後、補助物質、及び、応用方法
ａ）引き続き架橋
マトリックス材料とバクテリオロドプシンとから成る乾燥したフォトクロミック層を有する基板が、15分間40%グルタルジアルデヒド溶液につけておく。次いで、グルタルジアルデヒド溶液は水で洗い落とす。フォトクロミック層は処理によって水不溶性になる。
ｂ）光化学
10mgの紫膜（ＢＲ−Ｄ９６Ｎ）を、4mlのＵＶ硬化インク（シュミットからＩＦＳ３０００）を精密に分散されていた。ドクターブレードによって混合物を塗布した後、ＵＶ光のもとで一晩硬化を実施した。
ｃ）応用
スクリーン印刷
スクリーン印刷の原理は、マスキング技術に類似したポーラス（多孔質）印刷である。印刷板は、インクが通過できないバリア層を備えたメッシュ構造で成る。印刷はドクターブレードを用いてインク充填スクリーンをブラシすることによって実施する。プロセス中、インクは基板に転写される。スクリーン印刷インクは、100mg/ml色素（バクテリオロドプシン野生型）を7.2%ＰＶＡ溶液（モビル（Mowoil）型56-98）に入れて一晩かき混ぜてとして準備した。流動学的特性が標準サンプルに合致するところでは、従来のスクリーン印刷プレスにおいて印刷に対して得られる混合物を用いることが可能だった。
オフセット印刷
1gの紫膜（ＢＲ−Ｄ９６Ｎ）を50℃で色素無しの5mgのインクに入れてかき混ぜた。共通のオフセット技術による印刷に対してこのようにして得た混合物を用いることが可能だった。
ｄ）機械的防護
積層化
バクテリオロドプシンを含有し基板に塗布されたフォトクロミック混合物は、90℃〜140℃の温度でタイプGHQ-120TRの膜ポーチ（嚢：pouch）を有するホットラミネータを用いて積層した。
ｅ）補助物質
泡形成の防止
ＰＶＡ（モビル（Mowoil）型56-98、68mg/ml）を50℃の水で溶解した。凍結乾燥状の紫膜をこの混合物に付加し、これによって、11mg/ml濃度を得た。1オクタノール（1% v/v）を室温でこの混合物にいれてかき混ぜた。このようにして得られた混合物は、インクを入れたときに泡の形成に対する特性を改善した。
ＵＶ照射からの防護
フォトクロミック色素を防護するためには、混合物を以下のＵＶ吸収体あるいは誘導体のうちのひとつと共に1〜30％、好適には3〜10％の濃度で混合した：ベンゾフェノン、ヒドロキシナフトキノン、ケイ皮エステル、スルホンアミド、アミノベンゼンエステル。
【００９８】
例４
例えば、バクテリオロドプシン含有安全特徴を備えた銀行券のような使用文書。照射の間、安全特徴は紫から黄色に色を変える。短時間（約30-60秒）後、及び／又は青色波長域の光の照射の間、始めの紫色が再度現れる。この種の使用文書は、不法複写あるいは偽造に対して防護される。
【００９９】
例５
例４のようではあるが、青色波長域の光の照射は黄色から紫色への色の変化につながる。照射後、オリジナルの色は周囲の光によって再度現れる。
【０１００】
例６
例えば、紫色の線を備えた契約書のような文書。この線は、正及び負のような振る舞う２つのマスクを用いて二重印刷することによって生成される。これらを用いて、２つのマスクによって、光感度の相異を示す２つのインク標本を用いることができるようになる。白光に曝すと、感光性（光感度の高い）層は紫色から黄色へ色が変わるほど、他の層の色はあっても非常にわずかだけである。これが色のコントラストにつながる。これによって、従来は均一であって領域から、語（例えば、オリジナルの）あるいはサイン及び／又は絵文字の他のシーケンスを強調することが可能になる。
【０１０１】
例７
例６のようではあるが、印刷が通常の紙上、あるいは後で重ねることができる複写物上にされている。ブランド品（例えば、ジーンズ等の衣類）に取り付けされ、あるいは、ブランド品に付加された場合、前記文書は前記ブランド品の真正が保証され、製品の特許権・著作権侵害行為を防止する。
【０１０２】
例８
不法コピーから文書を保護するため、見かけ上均一な領域は例６のように２つのマスクを用いて保証され、均一領域の部分は色変化が生じ、そのため、コピーは不均一領域によってマークされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】   真正検査（チェック）方法の手順を示す図である。
【図２】   安全特徴を用いた複写プロセスを示す図である。
【符号の説明】
１  文書
２  特徴（特徴部）
３  光
５  光
【図１】
0004722292.tif 000002
【図２】
0004722292.tif 000003