(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被検物質の存在下又は非存在下、血管平滑筋細胞とトロンビン−アンチトロンビン
ＩＩＩ複合体とを血清の非存在下において接触させ、該細胞の増殖度を測定する工程、並びに、
（Ｂ）該細胞の増殖度を被検物質の存在下と非存在下で比較する工程を含む、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
該血管平滑筋細胞が、０．１〜０．５％の血清に対して反応し増殖する細胞である、請求
項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
該血管平滑筋細胞が、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に対して反応し増殖す
る細胞である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体がヒトトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ
複合体である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
該血管平滑筋細胞が、グリピカン３を含有する細胞である、請求項１記載のスクリーニン
グ方法。
【請求項６】
該血管平滑筋細胞が、グリピカン３発現ベクターを有する形質転換体である、請求項１記
載のスクリーニング方法。
【請求項７】
血管平滑筋細胞の増殖度を測定する工程が、該血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成量を測定する
工程である請求項１〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
血管平滑筋細胞の増殖度を測定する工程が、該血管平滑筋細胞の細胞数を測定する工程で
ある請求項１〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
血管平滑筋細胞の増殖度を測定する工程が、該血管平滑筋細胞内におけるグリピカン３の
発現量を測定する工程である請求項５又は６記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
動脈硬化性疾患治療剤又は予防剤を探索するものである、請求項１〜６のいずれかに記載
のスクリーニング方法。
【請求項１１】
トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体を含有する、血管平滑筋細胞の増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管平滑筋細胞の増殖阻害剤及び増殖促進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管平滑筋細胞の増殖は、酸化された低密度リポタンパク質による血管内皮細胞の傷害、高血圧や血流による壁ずり応力による刺激等の血管の内的傷害、あるいは創傷、バルーン等による経皮的血管形成手術等の外的傷害や臓器移植によってもたらされるとされている。すなわち、創傷等による障害を改善するために、生体内において血管平滑筋細胞が増殖すると考えられている。これらの知見より、血管平滑筋細胞の増殖は創傷治癒等に有効であることが知られている。【０００３】
また、血管平滑筋細胞の過剰な増殖は血管壁の肥厚、血管内腔の狭窄若しくは閉塞の原因となり、粥状動脈硬化、糖尿病性血管傷害、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞等の動脈硬化性疾患を引き起こす（非特許文献１参照）。これらの知見より血管平滑筋細胞の増殖抑制は上記動脈硬化性疾患の予防及び治療につながると考えられており（非特許文献２参照）、これまでにも血管平滑筋細胞増殖抑制剤の動脈硬化性疾患を対象とした開発が試みられている（非特許文献３参照）。【０００４】
血管平滑筋細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法としては、シグナルペプチドをコードする配列を有するｃＤＮＡを簡単に選別できる方法（ＳＳＴ法）を用いて探索した血管平滑筋細胞の増殖を抑制するポリペプチドを利用する方法（特許文献１及び２参照）や血管平滑筋増殖促進活性を使用する方法（特許文献３参照）等が現在までに報告されている。【０００５】
血管平滑筋細胞増殖促進活性を有する因子としては、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（非特許文献４参照）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（非特許文献５参照）、トロンボスポンジン（非特許文献６参照）、血管平滑筋細胞増殖因子（ＶＳＧＦ）（特許文献４参照）が知られている。また、トロンビンはプロテアーゼ活性により、ＰＡＲ−１を活性化し、活性化ＰＡＲ−１が血管平滑筋細胞増殖と関わっていることも知られている（非特許文献７参照）。ラットを用いて同種系の心臓を異所性移植した動物実験で、アンチトロンビンＩＩＩにより、移植の血管障害の発症率と、血管壁増殖の程度のいずれもが減少したことから、アンチトロンビンＩＩＩが、血管増殖性疾患の予防及び／又は治療に適した薬剤又は活性成分であることも開示されている（特許文献５参照）。【０００６】
血管中膜を構成する血管平滑筋細胞は、以前は均一な細胞の集団であるとみなされていたが、最近の研究により血管中膜は増殖能や形態等について多様な性質を有する雑多な平滑筋細胞の集まりであることが明らかにされてきた（非特許文献３参照）。また血管内膜肥厚部位に存在する平滑筋細胞は中膜から調製した平滑筋細胞に比べ増殖能が高いことが報告されており、中膜に存在する雑多な平滑筋細胞の集まりのなかでも特に増殖能の高いごく一部の細胞が血管壁の肥厚に関与しているものと考えられている（非特許文献８参照）。しかし、それらの高増殖性血管平滑筋細胞の増殖に関与している増殖因子は同定されていない。【０００７】
トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）は血管内で形成されたトロンビンがアンチトロンビンＩＩＩ‐ヘパリン複合体と結合し、さらにこの複合体からヘパリンが外れることによって形成される。アンチトロンビンＩＩＩはトロンビンと不可逆的に結合するため、トロンビンのプロテアーゼ活性は阻害される。血中に生じたトロンビンは急速に消失するので、その濃度を測定できないが、ＴＡＴの濃度は測定可能で、その増加は血管内でのトロンビン形成の亢進、つまり血栓傾向の指標として用いられる（非特許文献９参照）。しかし、これまでに、ＴＡＴの生物活性が記載されている文献は無く、ＴＡＴと動脈硬化との関連についての報告はなされていない。
【特許文献１】国際公開第９９／５５８６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／５５８６４号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１１２７９８号公報
【特許文献４】特開平１１−１２３０９２号公報
【特許文献５】特開２００３−１８３１７８号公報
【非特許文献１】Ross, R.ら、ザ  ニュー  イングランド  ジャーナル  オブ  メディスン（N. Engl. J. Med.）、３１４巻、４８８−５００頁（１９８６）
【非特許文献２】Morishita, R.ら、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、９０巻、８４７４−８４７８頁（１９９３）
【非特許文献３】Gordon, Aら、サイエンス（Science）、２５３巻、１１２９頁（１９９１）
【非特許文献４】Gospodarowicz, D.ら、  エンドクリノロジー（Endocrinology）、１１８巻、８２‐９０頁（１９８６）
【非特許文献５】Antoniades, H. N.ら、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、７９巻、５８６７−５８７０頁（１９８２）
【非特許文献６】Bornstein, P.ら、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８３巻、９０５０−９０５４頁（１９８６）
【非特許文献７】Dabbagh, K.ら、トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Thromb Haemost）、７９巻、４０５−４０９頁（１９９８）
【非特許文献８】Hao, H.ら、アーテリオスクレローシス,  ソロンボーシス,  アンド  ヴァスキュラー  バイオロジー（Arterioscler Thromb Vasc Biol.）、２３巻、１５１０−１５２０頁（２００３）
【非特許文献９】太田ら、日本臨床、５７巻、５８５−５８７頁（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は動脈硬化症疾患における血管壁の肥厚の一因である血管平滑筋細胞の増殖を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。同時に、創傷治癒剤の候補化合物となる血管平滑筋細胞の増殖を促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。より詳しくは、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）の刺激による血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明は、かかるスクリーニング方法により、簡便かつ迅速に、血管平滑筋細胞増殖阻害剤又は血管平滑筋細胞増殖促進剤をスクリーニングすることも１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究の結果、血管平滑筋細胞の新規増殖因子を見出した。新規増殖因子であるＴＡＴはこれまで生物活性が全く知られていなかったが、血管平滑筋細胞の一部の細胞をごく低濃度で増殖させる働きを持つことを見出した。また、ＴＡＴに反応する血管平滑筋細胞と反応しない血管平滑筋細胞で発現遺伝子の比較を行った結果、グリピカン３というタンパク質をコードする遺伝子がＴＡＴに反応する細胞にほぼ特異的に発現していることを見出した。グリピカン３は、胎児や成人の肺、卵巣等の他、肝癌細胞に高発現することが知られているヘパラン硫酸プロテオグリカンであり、胎児において増殖や細胞生存を妨げる働きをすることが示唆されている（Biochemica et Biophysica Acta 1573(2002) 241-246）。しかし、意外にも、ＴＡＴに反応する血管平滑筋細胞において、ＲＮＡｉ技術を用いてグリピカン３の発現を抑制すると、細胞のＴＡＴに対する反応性が低下し、細胞増殖能が低下した。これらの知見から、新規メカニズムによって血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法を開発した。【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）被検物質の存在下又は非存在下、血管平滑筋細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを血清の非存在下において接触させ、該細胞の増殖度を測定する工程、並びに、
（Ｂ）該細胞の増殖度を被検物質の存在下と非存在下で比較する工程を含む、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法、
（２）該血管平滑筋細胞が、０．１〜０．５％の血清に対して反応し増殖する細胞である、（１）記載のスクリーニング方法、
（３）該血管平滑筋細胞が、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に対して反応し増殖する細胞である、（１）記載のスクリーニング方法、
（４）トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体がヒトトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体である（１）記載のスクリーニング方法、
（５）該血管平滑筋細胞が、グリピカン３を含有する細胞である、（１）記載のスクリーニング方法、
（６）該血管平滑筋細胞が、グリピカン３発現ベクターを有する形質転換体である、（１）記載のスクリーニング方法、
（７）血管平滑筋細胞の増殖度を測定する工程が、該血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成量を測定する工程である（１）〜（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（８）血管平滑筋細胞の増殖度を測定する工程が、該血管平滑筋細胞の細胞数を測定する工程である（１）〜（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法、  
（９）血管平滑筋細胞の増殖度を測定する工程が、該血管平滑筋細胞内におけるグリピカン３の発現量を測定する工程である（５）又は（６）記載のスクリーニング方法、
（１０）動脈硬化性疾患治療剤又は予防剤を探索するものである、（１）〜（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキットであり、かつトロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体を含有してなる、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキットであり、かつトロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体に対して反応し増殖する血管平滑筋細胞を含有してなる、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
（１３）トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体を含有する、血管平滑筋細胞の増殖促進剤、に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法により、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物を簡便、かつ迅速にスクリーニングすることができる。また、このスクリーニング方法により、従来知られているメカニズムとは異なる、ＴＡＴが関与するメカニズムによる血管平滑筋細胞の増殖を阻害する作用を持つ動脈硬化性疾患の治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。また、従来知られているメカニズムとは異なる、ＴＡＴが関与するメカニズムによる血管平滑筋細胞の増殖を促進する作用を持つ創傷治癒剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトＴＡＴによる血管平滑筋細胞の増殖
【図２】shRNAをコードするDNA断片構築用オリゴDNA
【図３】ヒトTATによる、GPC3をノックダウンした血管平滑筋細胞の増殖
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の「血管平滑筋細胞の増殖阻害剤又は増殖促進剤のスクリーニング方法」は、これまでに、生物活性が知られていなかったＴＡＴと血管平滑筋細胞を使用し、ＴＡＴの刺激による血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する候補化合物のスクリーニングを行うことを特徴とする。【００１４】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。なお、本明細書において、特に指示のない限り、遺伝子組換え技術、細胞での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法、分子生物学手法及び免疫学的手法等は公知の方法が採用される。【００１５】
「血管平滑筋細胞」とは、主として血管中膜に存在する平滑筋細胞を意味する。血管平滑筋細胞には、様々な表現型の細胞の存在が知られている。本発明において用いることのできる血管平滑筋細胞は、例えば哺乳動物の、具体的にはヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター等の血管、好ましくは大動脈等の動脈から公知の方法により調製することができる。血管平滑筋細胞を調製する方法としては、特に制限されず、実験の目的に応じて適当な方法を選択することができるが、例えば、血管壁から剥離した細胞塊をコラゲナーゼ等の酵素で処理して培養する酵素分散法、血管の小片を培養ディッシュに貼り付ける移植片培養法（エクスプラント法）等を挙げることができる。また、市販の血管平滑筋細胞を本発明に用いることもできる。
本発明においては、いかなる血管平滑筋細胞も使用できる。通常５〜１０％の血清に対してよく反応し増殖する血管平滑筋細胞が存在する中で、特に、低濃度（約０．１〜０．５％）の血清に対して反応し増殖する血管平滑筋細胞が好ましい。さらには、ＴＡＴに対して反応し増殖する血管平滑筋細胞が好ましい。また、グリピカン３を含有する血管平滑筋細胞、つまり、グリピカン３を発現している血管平滑筋細胞を使用することもできる。グリピカン３を含有する血管平滑筋細胞は、調製した時点でグリピカン３を発現している細胞でもよく、人工的にグリピカン３を高発現させた細胞でもよい。人工的にグリピカン３を高発現させた血管平滑筋細胞を得る方法としては、タンパク質を細胞内で高発現させるための公知の方法を使用することができる（参照文献；モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８）。タンパク質を細胞内で高発現させる方法としては、例えば、グリピカン３発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法が挙げられる。【００１６】
「トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体」とは血管内で形成されたトロンビンがアンチトロンビンＩＩＩ‐ヘパリン複合体と結合し、さらにこの複合体からヘパリンが外れることによって形成された複合体をいう。トロンビンとアンチトロンビンＩＩＩは不可逆的に結合しており、トロンビンのプロテアーゼ活性は不活化される。本発明において用いることのできるトロンビン‐アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）は、例えば哺乳動物の、具体的にはヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター等の血清から公知の方法によりトロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを精製し、共にインキュベーションすることによって調製することができる。市販のトロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを用いることもできる。特に、ヒトＴＡＴが好ましい。
上記インキュベーションは、タンパク質の本来の機能を妨げない溶液中において、トロンビン及びアンチトロンビンＩＩＩを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持することによって行われ得る。
前記「タンパク質の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．４で、４℃〜５０℃、好ましくは、２５℃〜４０℃、さらに好ましくは、３７℃、１〜５時間、好ましくは3時間維持すること等が挙げられる。より具体的には、５０ mM Tris(pH７．４)中、前記条件下に維持することが挙げられる。【００１７】
「血清」とは、生体から取り出した血液を静置することにより、血球とフィブリンが凝固して分離する透明な上澄みをいう。アルブミン、グロブリン等のタンパク質を始め、生体の機能維持に必要な様々な成分を含んでいる。動物の細胞培養を行うためには、合成培地に血清を添加することが必須であり、ウシやウマ、ヒト等の血清を用いることができる。血清の調製方法は、公知の方法を用いることができる。例えば、血液から得た上澄を延伸して血球を除き、メンブランフィルターを用いて濾過滅菌する。ウシ血清、特に、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が、優れた細胞増殖を促進させる活性を持つことから、一般的に使用されており、血管平滑筋細胞の培養に使用することができる。【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、血清の非存在下で行うことを特徴とする。血清自体が血管平滑筋細胞の増殖を引き起こすため、血清が存在すると、ＴＡＴによる血管平滑筋細胞の増殖に対する効果が正確に測定できないためである。
例えば、実施例では、血管平滑筋細胞の培養に10%ウシ胎児血清(ICN社)を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium培地（ＤＥＭＥ培地）を用いているが、スクリーニング時には、0.05% ウシ血清アルブミンを含むDMEM培地に交換している。該培地には、血清は含まれていない。【００１９】
本発明のスクリーニング方法としては、具体的には、
（Ａ）被検物質の存在下又は非存在下、血管平滑筋細胞とトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体とを血清の非存在下において接触させ、該細胞の増殖度を測定する工程、並びに、
（Ｂ）該細胞の増殖度を被検物質の存在下と非存在下で比較する工程を含む、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法が挙げられる。【００２０】
前記工程（Ａ）の「接触」は、ＴＡＴの本来の機能を妨げない溶液中において、血管平滑筋細胞、被験物質及びＴＡＴとを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持することによって行われ得る。【００２１】
前記「ＴＡＴの本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。【００２２】
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．４で、ＣＯ２濃度１％〜２０％、好ましくは３％〜１０％、さらに好ましくは、５％、４℃〜５０℃、好ましくは、２５℃〜４０℃、さらに好ましくは、３７℃、１時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間、さらに好ましくは、１日維持すること等が挙げられる。より具体的には、血管平滑筋細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で培養し、前記条件下に維持することが挙げられる。【００２３】
前記（Ａ）に記載の工程において、ＴＡＴと被験物質とを血管平滑筋細胞に接触させる順序は、どちらが先であってもよく、また同時であってもよいが、被験物質は、ＴＡＴ存在下に血管平滑筋細胞と接触させることが好ましい。血管平滑筋細胞と接触させるＴＡＴの濃度としては、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌであればよく、２０ｎｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌが好ましい。血管平滑筋細胞とＴＡＴとを接触させる時間は通常１時間程度〜４日程度である。血管平滑筋細胞と接触させる被験物質の濃度としては、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。血管平滑筋細胞と被験物質とを接触させる時間は通常１時間以上４日程度であり、数時間から２日程度が好ましい。【００２４】
「被験物質」としては、いかなる物質も使用することができる。例えば、有機化合物（アミノ酸、ポリペプチド、核酸、低分子化合物、糖、高分子化合物等）、無機化合物等を使用することができる。例えば、市販されている化合物のライブラリーを用いてもよい。【００２５】
本発明において、血管平滑筋細胞の増殖度を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、細胞の増殖度を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、（１）血管平滑筋細胞の数を直接計測する方法、（２）血管平滑筋細胞の核数を計測する方法、（３）血管平滑筋細胞の代謝活性や血管平滑筋細胞内のミトコンドリアの呼吸活性を適当な色素で検出して定量する方法、（４）血管平滑筋細胞内でのタンパク質量若しくはＤＮＡ合成量を測定する方法等が挙げられる。特に（２）及び（４）が好ましい。【００２６】
（１）血管平滑筋細胞の数を直接計測する方法は、例えば以下の様に行うことができる。１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4及び１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）を含有する溶液（以下、ＰＢＳ溶液と記す。）等の洗浄液で血管平滑筋細胞を洗浄する。その後、トリプシン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液等の適当な分散用溶液を細胞に加えて懸濁させる。この状態で、例えば、セルカウンター（コールカウンター、コールター社）等の自動細胞計数機で測定する、あるいは、細胞計算板を用いて顕微鏡下で数えることによって血管平滑筋細胞の数を測定することができる。【００２７】
（２）血管平滑筋細胞の核数を計測する方法としては、まず、細胞核を調整する。血管平滑筋細胞から細胞核を調製する方法としては、クエン酸を用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ．５８，ｐ．１４３）、非イオン性界面活性剤を用いる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ．７９，ｐ．３６８）等が挙げられる。調製した細胞核は、上記のセルカウンター等で測定することができる。また、蛍光色素により核酸を染色することで細胞数を計測できるキット（ＣｙＱＵＡＮＴTM Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ；和光純薬社）も市販されている。【００２８】
（３）細胞の代謝活性や細胞内のミトコンドリアの呼吸活性を適当な色素で検出して定量する方法としては、ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ法（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．３，ｐ．４７３，１９９３）やＭＴＴ法（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，ｖｏｌ．１７，ｐ．１３６，１９６１）、ＷＳＴ−１法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，ｖｏｌ．４１，ｐ．１１１８，１９９３）等が挙げられ、いずれも市販されているキットを使用することができる。【００２９】
（４）血管平滑筋細胞内でのＤＮＡ合成量を測定する方法は、以下のように行うことができる。例えば、血管平滑筋細胞を、適当なサイズのマイクロウエルプレートに播き込む。播き込んだ細胞は、プレートへの接着に適した培地、例えば１０％の血清を含むＤＭＥＭ培地中で１日〜数日培養する。次いで、培養上清を捨てて、測定に適した基礎培地に交換する。ここで基礎培地とは、細胞を増殖させずに生存状態を維持し得る培地を意味し、例えば２％血清を含むＤＭＥＭ培地等を挙げることができる。該基礎培地中で前記血管平滑筋細胞を１時間から２日間培養した後、培地に細胞のＤＮＡ合成量の指標となる物質、たとえば3Ｈ標識されたチミジンを添加して、さらに１〜２４時間培養する。培養上清を除去後、細胞を適当な方法で回収する。例えば、ＰＢＳ溶液等のバッファーで洗浄し、トリプシン溶液を３７℃で１〜５分間作用させ、細胞をウエルから剥離させる。剥離した細胞を、たとえばセルハーベスター等を用いてガラスファイバーフィルター上に集める。集めた細胞中の３Ｈ標識チミジンに由来する放射能を、液体シンチレーションカウンター用いて測定することができる。あるいは、洗浄後の血管平滑筋細胞を例えばＴＣＡ（トリクロロ酢酸）で処理して沈殿させた後、ＮａＯＨ液等のアルカリ溶液で細胞を溶解し、溶液を中和して細胞溶解液を得る。細胞溶解液中の３Ｈ標識チミジンに由来する放射能を、液体シンチレーションカウンター用いて測定することができる。【００３０】
（４）の別の様態として、血管平滑筋細胞内での特定のタンパク質量、若しくは特定のＤＮＡ合成量を測定する方法が挙げられる。特定のタンパク質若しくは特定のＤＮＡとしては、ＴＡＴに反応して増殖する血管平滑筋細胞に特異的に発現しているグリピカン３、グリピカン３をコードするDNA等が挙げられる。特定のタンパク質量若しくは特定のＤＮＡ合成量を測定する方法としては、タンパク質の検出を行う免疫学的測定方法又はｍＲＮＡの検出を行う分子生物学的測定方法として知られる公知の方法であればいかなる方法でもよい。例えば、分子生物学的測定方法としてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ドットブロット法、マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法等が例示され、免疫学的測定方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、 ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が例示される。【００３１】
上記の方法にて測定した、被験物質と接触させた血管平滑筋細胞の増殖度（以下、測定値1と記す。）を、被験物質と接触させなかった血管平滑筋細胞の増殖度（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、該被験物質の血管平滑筋細胞増殖抑制能を評価することができる。該被験物質の血管平滑筋細胞増殖抑制能を、前記測定値を用いて、下記の数式１に従って求めるとよい。【００３２】
【数１】
0004730967.tif 000002
【００３３】
上記方法により、種々の被験物質の血管平滑筋細胞増殖抑制能の有無又は血管平滑筋細胞増殖促進能の有無を測定することによって、血管平滑筋細胞増殖抑制能又は血管平滑筋細胞促進能を有する物質を選抜するスクリーニングを行うことができる。例えば、被験物質の血管平滑筋細胞増殖抑制率が、３０％以上を示す物質、好ましくは５０％以上を示す物質を、血管平滑筋細胞増殖抑制能を有する物質として選抜することができる。このように選抜された物質は血管平滑筋細胞増殖抑制能を有しており、動脈硬化性疾患抑制剤の有効成分として使用され得る。また、例えば、被験物質の血管平滑筋細胞増殖抑制率が、−３０％以上を示す物質、好ましくは−５０％以上を示す物質を、血管平滑筋細胞増殖促進能を有する物質として選抜することができる。このように選抜された物質は血管平滑筋細胞増殖促進能を有しており、創傷治癒剤の有効成分として使用され得る。【００３４】
本発明は、ＴＡＴにより血管平滑筋細胞を刺激するという特徴を持つスクリーニング方法に関するものであり、検出方法等は公知のものを利用することができるが、特に、莫大な数の化合物をアッセイするスクリーニング、特にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において有用である。本発明を実施すれば、効果的に候補化合物を選択することができる。【００３５】
本発明のスクリーニング法により得られた化合物又はその塩は、ＴＡＴによる血管平滑筋細胞の増殖を阻害して、動脈硬化性疾患に対する治療又は予防作用を発揮する化合物又は塩を見出すことができる。従って、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、動脈硬化性疾患の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。【００３６】
「動脈硬化性疾患」とは、動脈が、動脈硬化の危険因子のため弾力性が失われて硬くなったり、内部にさまざまな物質が沈着して血管の通り道が狭くなったり（狭窄）、詰ったり（閉塞）、あるいは動脈壁が部分的に「こぶ」のように拡張（動脈瘤）したり、動脈全体が拡張したり（拡張症）、内膜に亀裂が入り中膜が裂けたり（解離）、破裂（出血）することにより、組織や臓器全体に血行障害を起こす病気の総称である。例えば、アテローム（粥状）動脈硬化、糖尿病性血管傷害、虚血性発作、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血等が挙げられる。【００３７】
また、本発明のスクリーニング法により、ＴＡＴによる血管平滑筋細胞の増殖を促進して、創傷治癒作用を発揮する化合物又は塩を見出すことができる。従って、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、創傷治癒に用いるための医薬組成物が提供される。【００３８】
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物は、前記血管平滑筋細胞の増殖に関連する疾患に対して、該ＴＡＴの機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。また、該医薬組成物によれば、動脈硬化性疾患、特に、ＴＡＴによる血管平滑筋細胞の増殖に対して、該機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。従って、該医薬組成物によれば、他のメカニズムに基づく既存の抗動脈硬化性疾患薬とは異なる作用機序により抗動脈硬化性疾患を改善することができるという優れた効果を発揮する。
一方で、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物は、前記血管平滑筋細胞の増殖に関連する疾患に対して、該ＴＡＴの機能の亢進を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。また、該医薬組成物によれば、創傷治癒、特に、ＴＡＴによる血管平滑筋細胞の増殖に対して、該機能の亢進を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。従って、該医薬組成物によれば、他のメカニズムに基づく既存の創傷治癒薬とは異なる作用機序により創傷治癒を改善することができるという優れた効果を発揮する。【００３９】
上記の医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇであることが望ましい。【００４０】
上記の医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。【００４１】
上記の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。【００４２】
また、上記の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。【００４３】
本発明は、上記のスクリーニング方法とは別の態様として、本発明のスクリーニング方法に用いるためのキットも包含する。例えば、ＴＡＴを含有するキットや、ＴＡＴに対して反応し増殖する血管平滑筋細胞を含有するキットが挙げられる。これらのキットは、血管平滑筋細胞の増殖を阻害又は促進する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニングに用いることができる。【００４４】
本発明は、さらに別の態様として、ＴＡＴを含有する、血管平滑筋細胞の増殖促進剤を提供する。すなわち、血管平滑筋細胞の増殖を促進するために、ＴＡＴを使用することができる。該促進剤は、バッファー等を含んでいてもよい。
本発明は、さらに別の態様として、血管平滑筋細胞の増殖を促進するためのＴＡＴの使用、及びＴＡＴを投与する血管平滑筋細胞の増殖促進方法も包含する。
【実施例１】
【００４５】
ラット血管平滑筋細胞の調製
ペントバルビタールによる麻酔下で脱血死させたJCL-SDラットより胸部大動脈を取り出し、切り開いた血管の内側をメスの刃で軽くこすることにより内皮細胞を取り除き、さらに実体顕微鏡下で外膜を除去し、中膜のみからなる組織を得た。ハサミで細切した中膜を酵素液（1 mg/ml コラゲナーゼ、0.5 mg/ml エラスターゼ、0.4 mg/ml 大豆トリプシンインヒビター、2 mg/ml ウシ血清アルブミン）中で3時間、37℃でインキュベーションしたのち、1000 rpmで5分間遠心することにより血管平滑筋細胞を得た。得られた血管平滑筋細胞は10%ウシ胎児血清（ICN社）を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium培地（シグマ社）（以下、DMEMと記す。）を用い、37℃、5% CO2の条件で培養した。
【実施例２】
【００４６】
ラット血管平滑筋細胞のクローニング
実施例1により得られた培養ラット血管平滑筋細胞500個を100 mlのDMEM、10% ウシ胎児血清にけん濁し、96穴プレート10枚に播いた。実施例1と同様の条件で培養することにより細胞が増殖してくるが、顕微鏡観察で明らかに1個の細胞から増殖したことが確認できたクローンのみを選択し、ウエルの約半分を占めるほどまで増殖したものはトリプシン-EDTA液（ギブコ社）によりプレートからはがし、より培養面積の大きいプレートに移し増殖させ、以後の実験に用いた。
【実施例３】
【００４７】
高増殖性クローン特異的増殖因子の精製と同定
実施例２で得られたクローンのうち低濃度（0.1-0.5%）のウシ胎児血清に反応し増殖する細胞（高増殖性クローン）を用いて、ウシ胎児血清に含まれる高増殖性クローン特異的増殖因子を精製した。ウシ胎児血清（20 ml）を等量の40 mM Hepes, pH7.4で希釈し、HiTrap Heparin（アマシャム社）に流すことにより、高増殖性クローン特異的増殖活性はカラムに吸着された。吸着されたタンパク質を塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出したところ、本活性は約0.6 Mの塩化ナトリウムにより溶出された。活性画分を集めて、つぎにSP-セファロース（アマシャム社）を用いたクロマトグラフィー（20 mM 酢酸ナトリウム、0.05-1.0 M 塩化ナトリウム）により分画した結果、増殖促進活性は約0.5 Mの塩化ナトリウムで溶出された。活性画分をセントリコン（アミコン社）により濃縮し、つぎにSuperose 12（アマシャム社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより分画した。Superose 12から溶出した活性画分に含まれるタンパク質のアミノ酸配列を分析した結果、トロンビンとアンチトロンビンIIIのアミノ酸配列が検出され、さらにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でタンパク質の分子量を検討したところ、分子量は約8万であることが判明した。これらの結果よりこのタンパク質はトロンビン-アンチトロンビンIII複合体（以下、TATと記す。）であると考えられた。
【実施例４】
【００４８】
ヒトTATの調製
ヒトトロンビン（シグマ社）とヒトアンチトロンビンIII（シグマ社）とを37℃で3時間インキュベーションすることにより、これらのタンパク質は自動的に複合体を形成し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でTATの生成が確認された。0.2 mM PPACK（カルビオケム社）を加えることにより残存したトロンビンを失活させ、残存したトロンビン及びアンチトロンビンI IIはHiTrap Heparin及びSuperose 12を用いたカラムグロマトグラフィーにより除去し、TATを調製した。
【実施例５】
【００４９】
ヒトTATによる血管平滑筋細胞の増殖反応の測定
血管平滑筋細胞を96穴プレートに2 x 103/ウエルの密度で播き、実施例1と同様の条件で培養した。3日後、培地を、0.05% ウシ血清アルブミンを含むDMEMに交換しさらに1日培養したのち、再び培地を、新しい0.05% ウシ血清アルブミンを含むDMEMに交換し、TATを加えた。TAT添加20時間後に0.0 5 μCi/ウエルの[メチル-3H]チミジンを添加し2時間培養した。5%トリクロロ酢酸を用いて細胞を2度洗浄したのち、スーパーミックス（パーキンエルマー社）を加え、マイクロベータ（パーキンエルマー社）を用いて細胞に取り込まれた[メチル-3H]チミジンに由来する放射活性を測定した（図１）。
【実施例６】
【００５０】
TAT反応性細胞クローンでのグリピカン3の発現
TAT反応性クローン及びTAT非反応性クローン（各々3クローンずつ）よりmRNAサンプルを調製し、それぞれの細胞で発現している遺伝子の解析を、ラット オリゴDNAマイクロアレイ（アジレント テクノロジーズ社）を用いて行なった。その結果、TAT反応性クローンにより多く発現している遺伝子の一つとしてグリピカン3を見出した。
さらに上記サンプル中に含まれるグリピカン3 mRNAをリアルタイムPCRにより測定することにより、グリピカン3がTAT反応性クローンにほぼ特異的に発現していることを確認した。
【実施例７】
【００５１】
shRNA発現アデノウイルス（RGD型）の作製
pShuttle ベクター（クロンテック社）のEcoRI, NotI サイトにマウス U6 promoterを挿入し、その下流にBamH1, NotIサイトを導入したpShuttle-U6 Vectorを構築し、そのサイトにshRNA配列（small hairpin配列）を挿入した。
shRNAをコードするDNA断片はオリゴDNAをアニーリングすることで構築した。
オリゴDNAは、図２の、破線部分２１ｂｐに配列番号：１及び２に記載のオリゴDNAをアニールさせ、それをpShuttle-U6 Vector のBamHI,NotIサイトにクローニングすることにより構築した。
今回、G FPｉには配列番号：１、GPC3ｉには配列番号：２に記載の配列を使用した。
pShuttleにクローニング後、定法どおり、PI-Sce1,I-Ceu1で切断した断片をAdx-（RGD型）adenovirus vectorのPI-Sce1,I-Ceu1 siteに挿入しクローニングした。このアデノウイルスベクターをPac1消化後２９３細胞に形質転換し、定法通りアデノウイルスを作製した。
参考文献（Adx-（RGD型）アデノウイルスベクター文献）
Mizuguchi H, Koizumi N, Hosono T et al (2001a) A simplified system for constructing reconbinant adenovirus vectors containing heterologous peptides in the H1 loop of their fiber knob. Gene Ther 8: 730-735
【実施例８】
【００５２】
アデノウイルスの精製とタイターの測定
アデノウイルスは超遠心により精製し、PBSで透析して用いた。タイターはクロンテック社のadenovirus rapid titer kitを使用し、293細胞を用いて測定した。
【実施例９】
【００５３】
アデノウイルスの血管平滑筋細胞に対するM.O.I（multiplicity of infection）の決定
Adx-RGD-LacZ アデノウイルスを細胞に感染させ、３日後にLacZ染色を行うことにより決定した。
【実施例１０】
【００５４】
血管平滑筋細胞でのGPC3のノックダウン率の測定
感染後４日目でRT-PCRを行い、リアルタイムPCRによりGPC3 mRNAを定量した。内部標準にはG 3PDHを使用した。
【実施例１１】
【００５５】
細胞増殖能の測定
GFPi又はGPC3iを組み込んだアデノウイルスを感染MOI=10で１０ｃｍシャーレ上の細胞に添加し感染させた。感染後1日後に２４ウエルプレートにまき直し、その翌日から血清非存在下で24時間培養した後、TAT刺激によるチミジン取り込みを測定した。
グリピカン3（GPC3）のshRNAを組み込んだアデノウイルス（GPC3i）、Green fluorescent protein（GFP）のshRNAを組み込んだアデノウイルス（GFPi）、shRNAを組み込まないアデノウイルス（LacZ）のそれぞれを、TAT反応性のラット血管平滑筋細胞クローンに感染させ、実験方法に従いTATによる細胞増殖能を[メチル-3H]チミジンの取り込みにより測定した。
その結果、図３に示すように、GPC3iを感染させGPC3の発現を抑制した細胞では、コントロールとして用いたGFPi、LacZを感染させた細胞に比べ、TAT刺激による細胞増殖の顕著な低下が認められた。
【実施例１２】
【００５６】
TATの増殖促進活性に対する化合物の抑制活性の測定
実施例５と同様の測定を行い、TAT添加前又は後に被検化合物を加えた場合の放射活性を化合物無添加のときの放射活性と比較することにより、被検化合物の増殖抑制活性又は増殖促進活性を求める。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のスクリーニング方法により、ＴＡＴが関与するメカニズムによる血管平滑筋細胞増殖を阻害又は促進する化合物をスクリーニングすることがでる。スクリーニングされた血管平滑筋細胞増殖阻害剤は動脈効果疾患治療剤又は予防剤として利用することができる。また、スクリーニングされた血管平滑筋細胞増殖促進剤は創傷治癒剤として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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