(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コネキシン32遺伝子及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む転移性腎臓癌治療薬であって、前記非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤がPP1である、転移性腎臓癌治療薬。
【請求項２】
コネキシン32遺伝子が乗った発現ベクターを含む請求項1に記載の治療薬。
【請求項３】
発現ベクターがアデノウイルスベクターである請求項2に記載の治療薬。
【請求項４】
コネキシン32遺伝子を投与された哺乳動物に対して用いるための非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む転移性腎臓癌治療薬であって、前記非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤がPP1である、転移性腎臓癌治療薬。
【請求項５】
コネキシン32遺伝子が発現ベクターに含まれ、前記哺乳動物はこの発現ベクターを投与された請求項4に記載の治療薬。
【請求項６】
発現ベクターがアデノウイルスベクターである請求項5に記載の治療薬。
【請求項７】
前記哺乳動物がヒトである請求項4〜6のいずれか１項に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓癌治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、心疾患、脳血管疾患と共に日本の3大生活習慣病の一つである。特に癌の死因順位は1981年以降第一位で、死亡総数に対する割合も増加の一途をたどっている。厚生省がん研究助成金「地域がん登録」研究の報告によると1994年の推計癌罹患数は約44万人である。
【０００３】
腎細胞癌は日本人のなかで頻度が高いものではないが、腎細胞癌の発生頻度は年々増加傾向にある。しかし、腎細胞癌の転移巣に対する非外科的治療における最近の進歩は乏しい。転移性腎細胞癌患者さんの治療予後は極めて悪く、化学療法、放射線療法やホルモン療法など現行のいずれの治療法も有効ではなく、予後の改善は見られていない。インターフェロン（IFN）やインターロイキン‐2（IL-2）などのサイトカインを用いた治療や抗癌剤との併用療法なども試みられてきているが、いずれも統計的に有効であったと評価できる結果は得られていない。従来のIFN、IL-2のそれぞれ単独あるいは両者併用の効果に関しては、CR（complete response）率が5~10％、PR（partial response）率が10~15％で両者を合わせても15~25％に過ぎず、この割合はここ数年変化していない。多くの患者は2年以内に亡くなられているのが現状である。したがって、これまでとは全く機序を異にする治療法の開発が望まれている。
【０００４】
遺伝子治療もその一つである。東京大学医科学研究所附属病院では現在、転移病巣のある腎細胞癌の患者を対象に免疫遺伝子治療の臨床研究を行っている。また、米国ジョンホプキンス癌センターで既に行われた同様の臨床研究の成績によると本治療法は安全に実施可能であり、一部の症例で有効性も示唆されている。しかし、現時点ではこの免疫反応はまだ十分な臨床的効果には結びついていないのが現状である。転移巣に対する治療は依然として困難なままである。
【０００５】
ところで、隣接した細胞は、主にtight junction, adherence junction, gap junction の3種類の様式で結合しているが、その中でgap junctionのみが細胞間情報伝達に関与している。gap junctionを構成するタンパク質であるコネキシン遺伝子は、1986年にクローニングされて以来、現在までヒトにおいて20種類、マウスにおいて19種類のコネキシン遺伝子の存在が確認されている。
【０００６】
これまでに知られている癌とコネキシン遺伝子に関しての知見としては、(1)ほとんど例外なく癌組織ではコネキシン遺伝子の発現抑制か、細胞内の局在性の乱れが認められ、それによってgap junctional intercellular communication （GJIC）の機能が抑制されている（Lowenstein WR. et al. Intercellular comm.unication and the control of tissue growth: lack of comm.unication between cancer cells. Nature 209, 1248-1249, 1996.（非特許文献１）、Saito T et al. Suppressed gap juncyional intercellular comm.unication in carcinogensis of endometrium. Int J Cancer 93, 317-323, 2001.（非特許文献２））。
【０００７】
(2)コネキシンノックアウトマウスで発癌率の増加が認められる（Moennikes O et al. The effect of connexin32 null mutation on hepatocarcinogenesis in different mouse strains. Carcinogenesis 20,l 1379-1382, 1999.（非特許文献３））。
【０００８】
(3)癌細胞でのコネキシン遺伝子導入によるGJICの機能回復により、癌細胞の分化誘導が認められる（Mesnil M. Connexin and Cancer. Biol Cell. 94, 493-500, 2002.（非特許文献４））。
【０００９】
(4)発癌プロモーターや癌遺伝子（src、rasなど）はコネキシン遺伝子の発現やGJICを低下する（Yamasaki H and naus CCG. Role of connexin genes in growth control. Carcinogensis 17, 1199-1213, 1996.（非特許文献５））。
【００１０】
(5)HSV-tk/GCV癌遺伝子治療の際のbystander effectはGJIC依存性の殺細胞効果であるなどが報告され、これらの根拠から、コネキシン遺伝子は GJICの機能を介して細胞の分化誘導を行い、癌抑制遺伝子として作用していることが推測される（Mesnil M and Yamasaki H. Bystander effect in herpes simplex virus-thimidine kinase/gancicloviir cancer gene therapy: role ofgap-junctional intercellular communication. Cancer Res. 60, 3989-3999, 2000（非特許文献６）。
【００１１】
一方、コネキシンのdominant-negative geneを用いた実験において、コネキシン本来の機能であるGJICは抑制されるにもかかわらず、コネキシンの細胞増殖抑制能は損なわれなかったことから、従来言われていたGJICに依存したコネキシンによる発癌制御に加えて、GJICに非依存的なコネキシンの癌抑制作用がある可能性も示唆されている（Duflot-Dancer A et al. Dominant-negative abrogation of connexin-mediated cell growth control by mutant connexin genes. Oncogene 15, 2151-2158, 1999.（非特許文献７））。
【００１２】
また最近の研究から、各組織および細胞特異的なコネキシン分子種の発現が報告され、各癌細胞の正常母体細胞に特異的に発現しているコネキシン分子種のみがその細胞の癌化を抑制するのに有効であるという仮設も提唱されている（Mesnil M et al., Negative growth control of Hela cells by connexin genes: connexin specifity. Cancer Res. 55, 629-639, 1995.（非特許文献８）、Naus CCG et al. in vitro growth of C6 glioma cells transfected with connexin 43 cDNA. Cancer Res. 52, 4208-4213, 1992.（非特許文献９））。
【非特許文献１】Lowenstein WR. et al. Intercellular comm.unication and the control of tissue growth: lack of comm.unication between cancer cells. Nature 209, 1248-1249, 1996.
【非特許文献２】Saito T et al. Suppressed gap juncyional intercellular comm.unication in carcinogensis of endometrium. Int J Cancer 93, 317-323, 2001.
【非特許文献３】Moennikes O et al. The effect of connexin32 null mutation on hepatocarcinogenesis in different mouse strains. Carcinogenesis 20,l 1379-1382, 1999.
【非特許文献４】Mesnil M. Connexin and Cancer. Biol Cell. 94, 493-500, 2002.
【非特許文献５】Yamasaki H and naus CCG. Role of connexin genes in growth control. Carcinogensis 17, 1199-1213, 1996.
【非特許文献６】Mesnil M and Yamasaki H. Bystander effect in herpes simplex virus-thimidine kinase/gancicloviir cancer gene therapy: role ofgap-junctional intercellular communication. Cancer Res. 60, 3989-3999, 2000
【非特許文献７】Duflot-Dancer A et al. Dominant-negative abrogation of connexin-mediated cell growth control by mutant connexin genes. Oncogene 15, 2151-2158, 1999.
【非特許文献８】Mesnil M et al., Negative growth control of Hela cells by connexin genes: connexin specifity. Cancer Res. 55, 629-639, 1995.
【非特許文献９】Naus CCG et al. in vitro growth of C6 glioma cells transfected with connexin 43 cDNA. Cancer Res. 52, 4208-4213, 1992.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上のことから、腎細胞癌の発癌制御や有効な治療法の開発は、腎細胞癌患者の増加や難治性を考えると必要性が高いと思われる。
そこで本発明の目的は、腎細胞癌の有効な治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
［請求項１］
コネキシン32遺伝子及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む転移性腎臓癌治療薬であって、前記非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤がPP1である、転移性腎臓癌治療薬。
［請求項２］
コネキシン32遺伝子が乗った発現ベクターを含む請求項1に記載の治療薬。
［請求項３］
発現ベクターがアデノウイルスベクターである請求項2に記載の治療薬。
［請求項４］
コネキシン32遺伝子を投与された哺乳動物に対して用いるための非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む転移性腎臓癌治療薬であって、前記非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤がPP1である、転移性腎臓癌治療薬。
［請求項５］
コネキシン32遺伝子が発現ベクターに含まれ、前記哺乳動物はこの発現ベクターを投与された請求項4に記載の治療薬。
［請求項６］
発現ベクターがアデノウイルスベクターである請求項5に記載の治療薬。
［請求項７］
前記哺乳動物がヒトである請求項4〜6のいずれか１項に記載の治療薬。
【００１５】
本発明者は、臨床材料、癌化した後天的腎嚢胞性腎疾患患者由来の細胞株、ヒト正常腎尿細管上皮細胞、既存の腎細胞癌株、不死化したヒト正常近位尿細管上皮細胞株を用いて、腎臓発癌の初期段階でdown regulateされるコネキシン遺伝子の分子種の特定を試みた。また、特定されたコネキシンの発現抑制機構についても検討を行った。さらに、特定されたコネキシン遺伝子の腎細胞癌における癌抑制遺伝子としての機能を解明し、この解明された機能を強化する薬剤を選択し、コネキシン遺伝子の癌抑制遺伝子としての機能を最大限に生かした新たな癌治療法の可能性を探ることを目的として種々の検討を行った。その結果、コネキシン32及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を併用することで、従来の癌治療法に比べて、より効率的で選択性の高い癌治療が可能になることを見出して、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、コネキシン32及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を併用することで、従来の癌治療法に比べて、より効率的で選択性の高い腎臓癌治療、転移性腎臓癌及び原発性腎臓癌の治療が可能になる。
【００１７】
本発明によれば、コネキシン遺伝子のもつbystander effectにより、必ずしも全ての癌細胞にコネキシン遺伝子が導入されなくとも治療効果が得られることが期待される。そのため、遺伝子治療の問題点である遺伝子導入効率の悪さを補うことができ、臨床応用に期待がもてる。さらに、Src阻害剤を組み合わせることにより、より強い殺細胞効果を得ることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、コネキシン32遺伝子及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む腎臓癌治療薬に関する。さらに本発明は、コネキシン32遺伝子を投与された哺乳動物に対して用いるための非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む腎臓癌治療薬に関する。
【００１９】
コネキシン32遺伝子は、配列番号１に示す。但し、本発明で用いられるコネキシン32遺伝子は、コネキシン32遺伝子の導入効果を示す限り、配列番号１に示す塩基配列の一部を修飾したものであることもできる。即ち、配列番号１に示す塩基配列の一部を、別の塩基で置換したもの、または、欠失したもの、または配列番号１に示す塩基配列に別の塩基を追加したものであることもできる。
【００２０】
コネキシン32遺伝子は、発現ベクターに含まれた形で用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、すでにP53遺伝子のような癌抑制遺伝子を導入し、臨床的に用いられているアデノウイルスベクターが挙げられる。
【００２１】
非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、このキナーゼの活性化につながるリン酸化を抑制したり、リン酸化部位を脱リン酸化したり、このキナーゼの活性化そのものを阻害する化合物が挙げられる。
【００２２】
非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の例としては、PP1を挙げることができる。PP1は、ピラゾロピリミジン（pyrazolopyrimidine）化合物であり、その構造は以下に示すとおりである。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
本発明において、治療対象である哺乳動物、例えば、ヒトに対して、コネキシン32遺伝子を投与(遺伝子導入)し、次いで、コネキシン32遺伝子を導入した哺乳動物に対して非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を投与する。即ち、本発明の非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を含む腎臓癌治療薬は、コネキシン32遺伝子を用いての治療(遺伝子導入治療)に併用されるためのものである。
【００２５】
コネキシン32遺伝子の導入は、コネキシン32遺伝子を含む発現ベクター、例えば、アデノウイルスベクターを常法により調製し、得られたコネキシン32遺伝子を含む発現ベクターを常法により導入する。
【００２６】
発現ベクターへの導入法：
自己複製能を欠如させたアデノウイルスDNAと人コネキシン３２遺伝子を組み込んだベクターを人胎児由来細胞２９３細胞に共発現させ、相同組換えによりコネキシン３２遺伝子を発現できるアデノウイルスベクターを作成する。
【００２７】
遺伝子導入法：
in vitroではウイルスの力価を測定し、各細胞に最適な力価に調整したアデノウイルスベクターを細胞培養系に加え、細胞にコネキシン３２遺伝子を発現させる。
in vitroでは癌が腎臓に限定して発生している場合は、腎動脈からカテーテルにより導入する。全身転移の場合は静脈より点滴で導入する。
【００２８】
コネキシン３２の導入量は、腎細胞癌細胞数あたり（１００００細胞数あたり）、発現ベクター量としてin vitroでは例えば、２μgでおこなう。この点を考慮して治療時の導入量を決定することができる。
【００２９】
次いで本発明では、コネキシン32遺伝子を導入した哺乳動物に、非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、PP1を投与する。
【００３０】
転移腎癌におけるPP1の投与量はマウス腫瘍移植系では最大20mg/kg, i.p.である。原発腎癌における投与量も同様である。哺乳動物がヒトの場合、その投与量は、マウスへの投与量が一般的に20mg/kg程度であることから、体重６０ｋｇの人の場合、例えば、20〜40ｍｇの範囲とすることができる。
【００３１】
本発明の治療薬は、腎臓癌が転移性腎臓癌である場合及び原発性腎臓癌である場合に有効である。
【実施例】
【００３２】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
転移性腎細胞癌株（Caki-1）においてコネキシン32遺伝子とPP1との併用効果について検討した。
(実験方法)
［細胞株]
Caki-1 (既存のヒト転移性腎細胞癌株)
Caki-1はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入した。
(Caki-1W細胞：Caki-1細胞に発現ベクターのみを導入した細胞、
Caki-1T細胞：Caki-1細胞にコネキシン32遺伝子を導入した細胞）
［使用薬物］
PP1（BIOMOL）
DMSO（SIGMA）
Cell Proliferation Reagent WST-1（Roche）
【００３３】
［WST-1 assay］
Caki-１W細胞およびCaki-2T細胞を96穴プレートにそれぞれ1×104 cells/well播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で24時間培養した。24時間後、それぞれのwellに5％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、最終濃度がPP1；0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10μMになるように薬剤を添加し、5％ CO2、37℃で72時間インキュベーションした。コントロールにはDMSOを用いた。
薬剤添加72時間後、それぞれのwellにCell Proliferation Reagent WST-1を10μLずついれ、軽くピペッティングし、混合した。5％ CO2、37℃で5分間インキュベーションし、MICROPLATE READER（IWAKI）を用い、波長450 nmで吸光度を測定した。
【００３４】
［Survival assay］
Caki-1W細胞およびCaki-1T細胞を6 cmプレートにそれぞれ500 cells/plate  播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で  24時間培養した。24時間後、それぞれのplateに5％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、最終濃度がPP1；0.01, 0.05, 0.1μMになるように薬剤を添加し、5％ CO2、37℃で10日間インキュベーションした。コントロールにはDMSOを用いた。
薬剤添加10日後、細胞を回収し、細胞数を数えた。
【００３５】
［LDH leakage assay］
Caki-1W細胞およびCaki-1T細胞を96穴プレートにそれぞれ1×104 cells/well播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で24時間培養した。24時間後、それぞれのwellに5％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、最終濃度がPP1；0.1, 0.5μMになるように薬剤を添  加し、5％ CO2、37℃で72時間インキュベーションした。コントロールには  DMSOを用いた。
LDH leakage assayは、CytoTox96R Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)を用い、行った。
細胞を培養していた各wellから培養液50μLをエッペンドルフチューブに移し、4℃で1,000 rpm、4分間遠心した。上清をすべて新しい96穴プレートに入れ、Lysys Solution 5μLを加え、37℃で45分間インキュベーションした。Reconstituted Substrate Mix 50μLを加え、室温で遮光して30分間反応させた。Stop solutionを50μL加え、MICROPLATE READER（IWAKI）を用い、波長450 nmで吸光度を測定した。
【００３６】
(実験結果)
コネキシン32と併用することにより、より有用な併用効果が認められる分子標的治療剤を特定するために、選択的Src-familyチロシンキナーゼ阻害剤であるPP1を用い、検討した。
【００３７】
WST-1 assay法による検討の結果、同濃度で比較した時、PP1では、Caki-1W細胞に比べ、Caki-1T細胞で顕著な細胞増殖・生存活性の低下が認められた。Caki-1T細胞においてPP1処理により、Caki-1W細胞に比べ、より低濃度側から細胞増殖・生存活性の低下が認められた。（図1）。
【００３８】
PP1を用いてSurvival assayを行い、PP1の細胞増殖・生存活性に対する効果を検討した。その結果、PP1処理によりCaki-1T細胞は、Caki-1W細胞に比べ顕著に細胞増殖・生存活性が抑制されていることが示された（図2）。
【００３９】
PP1の細胞傷害性に対する影響を検討するため、LDH leakage assayを行った。その結果、Caki-1W細胞に比べ、Caki-1T細胞でPP1処理による顕著な細胞傷害性の増加が認められた（図3）。
【００４０】
(考察)
PP1を用いた場合、WST-1 assay法により検討した結果、Caki-1W細胞に比べて、Caki-1T細胞で顕著な細胞増殖・生存活性の低下が認められた。そこで、PP1について、Survival assayによりさらなる検討を行った結果、PP1処理によりCaki-1W細胞に比べ、Caki-1T細胞において顕著な細胞増殖・生存活性の低下が認められた。さらに、LDH leakage assayによりPP1の細胞傷害性に対する影響を検討した結果、Caki-1W細胞に比べ、Caki-1T細胞でPP1処理による顕著な細胞傷害性の増加が認められた。以上のことから、PP1はコネキシン32と組み合わせることにより、より強い殺細胞効果を得ることのできる薬剤であることが分かった。
【００４１】
実施例2
転移性腎細胞癌株（Caki-1）に対するコネキシン32遺伝子と分子標的治療剤のin vitroにおける併用効果について検討した。
(実験方法)
［細胞株］
実施例1と同様である。
［使用薬物］
細胞培養およびWestern blotに使用した薬剤は実施例1と同様である。
【００４２】
［Western blot］
Confluent状態での検討：実験時Confluentの状態になるようCaki-１W細胞およびCaki-１T細胞を6 cmプレートにそれぞれ播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で培養した。
阻害剤添加による検討：Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞を6 cmプレートにそれぞれ播種した。薬剤添加後24時間、10％ FBS加McCoy's 5A medium mo  difiedを用い、5％ CO2、37℃で培養した。
ただし、泳動用ゲルは、8％および10％を用い、抗体は、一次抗体：抗β-ACTIN抗体（×6500）＆二次抗体：抗Mouse-IgG抗体（×6500）、一次抗体：抗erbB-2/HER-2抗体（×200）＆二次抗体：抗Rabbit-IgG抗体（×4000）、一次  抗体：抗phospho-erbB2/HER-2抗体（×200）＆二次抗体：抗Rabbit-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗Src抗体（×100）＆二次抗体：抗Mouse-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗phospo-Src Family抗体（×100）＆二次抗体：抗  Rabbit-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗STAT3抗体（×100）＆二次抗体：  抗Mouse-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗phospo-STAT3抗体（×25）＆二次  抗体：抗Mouse-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗MEK抗体（×100）＆二次  抗体：抗Rabbit-IgG抗体（×5000）、一次抗体：抗Phospho-MEK抗体（×100）＆二次抗体：抗Rabbit-IgG抗体（×3000）、一次抗体：抗Cyclin D抗体（×100）＆二次抗体：抗Mouse-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗BAX抗体（×400）＆二次抗体：抗Rabbit-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗bcl-xL抗体  （×50）＆二次抗体：抗Mouse-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗bcl-xL抗  体（×50）＆二次抗体：抗Mouse-IgG抗体（×4000）、一次抗体：抗bcl-2抗  体（×200）＆二次抗体：抗Mouse-IgG抗体（×4000）を用い、行った。
【００４３】
［FACS］
Confluent状態での検討：実験時Confluentの状態になるようCaki-１W細  胞およびCaki-１T細胞を6 cmプレートにそれぞれ播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で培養した。
FBS刺激による検討：Caki-１W細胞およびCaki-2T細胞を6 cmプレートに  それぞれ播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、２４時間、5％ CO2、37℃で培養し、その後、薬剤処理２４時間おこない、それぞれの  細胞をTrypsin-EDTA処理により回収した。これにPBS 1 mLを加え、室温で1,500 rpm、5分間遠心し、細胞を洗浄した。この操作を2回繰り返した。PBS 1 mLを加え、室温で1,000 rpm、10分間遠心した。溶液を約100μL残し、上清を除去した。ボルテックスをかけながら70％ 冷エタノール 1 mLを滴下した。4℃で30分間静置し、固定した。室温で3,000 rpm、5分間遠心した。溶液を約200μL残し、上清を除去し、ボルテックスをかけ懸濁した。PI染色液（10μg/mL Propidium iodide ＋ 100 Unit RNase ）1 mLを加え、ボルテックスをかけ混和し、室温で30分間、軽く震とうした。固まっている細胞をはがすため、Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Capに入れ、ろ過した。FACS Analyser（Becton Dickinson）により解析を行った。
【００４４】
［Caspase-3 activity assay］
Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞を10 cmプレートにそれぞれ3×106 cells/well播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で24時間培養した。24時間後、それぞれのwellに5％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、薬剤を添加し、5％ CO2、37℃で24時間または48時間インキュベーションした。コントロールにはDMSOを用いた。
Caspase-3 activity assayは、Caspase-3/CPP32 Colorimetrc Assay Kit (BioVision)を用い、行った。
【００４５】
薬剤添加24または48時間後、細胞を回収し、細胞数を数え、Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞をそれぞれ1×106 cellsに調節した。細胞を冷却したCell Lysis Buffer 50μLで懸濁し、氷上で10分間インキュベーションした。4℃、10,000 rpmで1分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、氷上に放置した。タンパク定量を行い、Cell Lysis Buffer 50μL中にタンパク量がそれぞれ20μg含まれるように希釈し、サンプルを調製した。2× R  eaction Buffr 1 mLに0.1 M DTT 10μLを加え、Reaction Bufferを調製した。調製したReaction Buffer50μLおよび4 mM DEVD-pNA substrate 5μLをそれぞれのサンプルに添加し、37℃で1〜2時間インキュベーションした。MICROPLATE READER（IWAKI）を用い、波長405 nmで吸光度を測定した。得られた検量線からCaspase-3活性を求めた。
【００４６】
［DNA fragmentation assay］
Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞をそれぞれ2×105 cells/mLに調製し、最終濃度が10μMとなるようにBrdUを加え、5％ CO2、37℃で24時間インキュベーションし標識した。McCoy's 5A medium modifiedを用い洗浄し、最終用量が200μL/wellで薬剤を添加、5％ CO2、37℃で24時間または48時間インキュベートした。コントロールにはDMSOを用いた。
DNA Fragmentation assayは、Cellular DNA Fragmentation ELISA (  Roche)を用い、行った。
【００４７】
インキュベーション後、マイクロタイタープレートから全ての上清を採取し、遠心後、沈殿に100μLのインキュベーション用緩衝液を加え、懸濁させそれぞれもとのwellに戻し、室温で30分間放置し溶解させた。溶解後、250 rpm、10分間遠心を行い、上清 100μLを採取しサンプル（溶解液Lysate）とした。
【００４８】
コーティング緩衝液 1 mLを蒸留水９ mLで希釈し、この溶液 9.8 mLと抗DNA抗体 0.2 mLを混合し、これをコーティング溶液とした。ELISA用マイクロタイタープレートに100μL/wellのコーティング溶液を分注し、室温で1時間インキュベートした。コーティング溶液を完全に除去し、インキュベーション溶液 200μL/well加え、30分間インキュベーションした。インキュベーション溶液を完全に除去し、洗浄溶液 250-300μL/wellで2、3分間ずつ3度洗浄を行った。サンプルをELISA用マイクロタイタープレートに100μL/wellずつ入れ、室温で90分間インキュベーションし、上記と同様に洗浄した。電子レンジで500-1000W、5分間マイクロウェーブ照射し、サンプルを変性、固定し、−20℃で約10分間冷却した。ブランク以外のwellにPeroxidase標識抗-BrdU結合溶液を100μL/wellずつ入れ、室温で90分間インキュベーションし、上記と同様に洗浄した。基質溶液を100μL/well入れ、遮光して約10-30分間インキュベーションした。1M H2SO4を25μL/well入れ、1分間インキュベーションし、MICROPLATE READER（IWAKI）を用い、波長450 nmで吸光度を測定した。
【００４９】
［DNA Ladder assay］
Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞を10 cmプレートにそれぞれ1×106 cells/well（×3）播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で24時間培養した。24時間後、それぞれのwellに5％ FBS  加McCoy's 5A medium modifiedを用い、最終濃度がPP1 5μMになるように薬剤を添加し、5％ CO2、37℃で48時間インキュベーションした。コントロールにはDMSOを用いた。
【００５０】
細胞を回収し、PBSで1度洗浄した。192 mM Na2HPO4と4 mM クエン酸を混合し、これをextraction solutionとした。細胞にextraction solution 40μLを加え、ピペッティングにより完全に懸濁させ、室温で1時間インキュベーションした。4℃で1,500 rpm、5分間遠心し、上清をできる限りすべてγ線エッペンドルフチューブに移した。再び4℃で1,500 rpm、5分間遠心し、上清をできる限りすべて新しいγ線エッペンドルフチューブに移した。これ  にRNase 3μLと0.25％ Triton X-100 3μLを加え、よく懸濁し、37℃で1時間インキュベーションした。さらに10μg/mL Protease K solutionを3μL  加え、50℃で30分間インキュベーションした。5 M Nacl 20μLと100％ イソプロパノール 100μLを加え、よく懸濁し、室温で30分間静置した。室温で1,000 rpm、10分間遠心後、上清を除去し、遠心型エバポレーター真空ポンプ（TOKYO RIKAKIKAI Co.,LTD）を用い、沈殿を乾燥させた。Nuclease Free Water 17μLを加え、ピペッティングにより懸濁させ、50℃で約10分間インキュベートし、沈殿を溶解させた。DNA量を測定し、2％ agarose gelを用い電気  泳動を行った。
【００５１】
［統計処理］
データは、平均値±標準誤差として表記した。統計処理は、パラメトリックデータについてDunnett法を用いて群間の多重比較を行った。
【００５２】
(実験結果)
PP1が細胞周期のどの時期に影響を及ぼしているのか検討するため、Caki-1W細胞およびCaki-1T細胞を用い、FACSによる細胞周期の解析を行った。Caki-1W細胞におけるコントロール0時間後の細胞周期の分布割合はG1期が79.75％、S期が19.75％、G2/M期が0.50％であり、コントロール24時間後の細胞周期の分布割合は、G1期が47.18％、S期が37.80％、G2/M期が15.02％であり、PP1処理24時間後の細胞周期の分布割合は、G1期が53.46％、S期が32.87％、G2/M期が13.67％であった。一方、Caki-1T細胞におけるコントロール0時間後の細胞周期の分布割合はG1期が74.66％、S期が18.14％、G2/M期が7.19％であり、コントロール24時間後の細胞周期の分布割合は、G1期が65.11％、S期が23.30％、G2/M期が11.60％であり、PP1処理24時間後の細胞周期の分布割合は、G1期が84.16％、S期が5.55％、G2/M期が10.29％であった。Caki-1W細胞においては、コントロール0時間後のG1期の分布割合に比べコントロール24時間後のG1期の分布割合は減少しており、細胞周期が進行していることが示された。また、コントロール24時間後のG1期の分布割合に比べPP1処理24時間後のG1期の分布割合は若干増大し、S期の分布割合は減少していることから、PP1処理によりG1 arrestが引き起こされている可能性が示された。Caki-1T細胞においては、コントロール0時間後のG1期の分布割合に比べ、コントロール24時間後のG1期の分布割合は若干減少していたが、Caki-1W細胞と比べるとその減少の割合は極端に小さく、コネキシン32により細胞周期の進行が抑制されていることが認められた。また、コントロール24時間後のG1期の分布割合に比べPP1処理24時間後のG1期の分布割合は増大しており、S期やG2/M期の分布割合は小さくなっていることから、PP1処理によりG1 arrestが引き起こされている可能性が示された。また、Caki-1W細胞と比べ、Caki-1T細胞におけるG1期の分布割合の増大は非常に大きく、コネキシン32とPP1を併用することによりG1 arrestの増大が認められた。アポトーシスのマーカーであるsub G1の割合においては、Caki-1W細胞では、コントロール0時間後は0.20％、コントロール24時間後は0.38％、PP1処理24時間後は2.05％であった。一方、Caki-1T細胞において、コントロール0時間後は0.59％、コントロール24時間後は2.27％、PP1処理24時間後は8.33％であった。Caki-1W細胞において、コントロール0時間後、コントロール24時間後のsub G1の割合にほぼ変化は認められなかったが、PP1処理24時間後のsub G1の割合は若干増加したが、Caki-1T細胞に比べ顕著なものではなかった。Caki-1T細胞においては、コントロール0時間後に比べ、コントロール24時間後のsub G1の割合は若干の増加が見られ、PP1処理24時間後ではさらなる増加が認められた（図4及び5）。
【００５３】
PP1処理をした時の生存・増殖シグナルを調節している主な因子の発現や活性化レベルがどのように変化するか検討した。Western blot法による結果、Caki-1W細胞のコントロールおよびPP1処理、Caki-1T細胞のコントロールおよびPP1処理の間で、HER-2、STAT3、MEKの発現レベルにおいて違いはほとんど認められなかった。HER-2、STAT3、MEKの活性化レベルに関しては、PP1処理したCaki-1T細胞において最も抑制されていることが示された。Cyclin Dの発現もPP1処理したCaki-1T細胞において最も抑制されていた。また、BCL-XLの発現は、PP1処理したCaki-1T細胞において最も抑制されていたが、BCL-2は、若干の増加が認められた。BAXの発現はCaki-1T細胞のコントロールおよびPP1処理において増加が認められた（図6）。
【００５４】
PP1のアポトーシス誘導作用に対する影響について検討した。Caspase-3 activity assayの結果、コントロールのCaki-1T細胞における24時間後および48時間後のCaspase-3 activityは、コントロールのCaki-1W細胞に比べて、ほとんど変化は見られなかった。PP1処理したCaki-1W細胞のCaspase-3 activityは、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-1W細胞に比べ48時間後のCaspase-3 activityに有意な増加が認められたが、PP1処理したCaki-1T細胞の48時間後のCaspase-3 activity に比べ、有意に小さかった。PP1処理したCaki-1T細胞における24時間後および48時間後のCaspase-3 activityは、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-1W細胞に比べ、その増加は有意なものだった。（図7(A)）。
【００５５】
DNA fragmentation assayの結果、コントロールのCaki-1T細胞における24時間後および48時間後のDNA断片化量は、コントロールのCaki-1W細胞に比べて、ほとんど変化は見られなかった。PP1処理したCaki-1W細胞のDNA断片化量は、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-1W細胞に比べ48時間後のDNA断片化量に有意な増加が認められたが、PP1処理したCaki-1T細胞の48時間後のDNA断片化量に比べ、有意に小さかった。PP1処理したCaki-1T細胞における24時間後および48時間後のDNA断片化量は、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-1W細胞に比べ、その増加は有意なものだった。（図7(B)）。
【００５６】
DNA Ladder assayに用いたコントロールおよびPP1処理したCaki-1W細胞およびCaki-1T細胞それぞれの写真を示した。写真から、PP1処理をしたCaki-1W細胞に比べ、PP1処理をしたCaki-1T細胞の方がより細胞が萎縮ならびに脱着し、浮遊している様子が認められた（図8）。
【００５７】
DNA Ladder assayの結果、PP1処理をしたCaki-1W細胞およびCaki-1T細胞において薄くではあるがDNAのLadderが確認された。また、それはPP1処理したCaki-1W細胞に比べ、PP1処理したCaki-1T細胞の方がわずかに濃かった（図9）。
【００５８】
(考察)
FACSの結果から、PP1によりCaki-1細胞においてG1 arrestを引き起こすことが示された。また、コネキシン32とPP1を併用することによりコネキシン32のもつ細胞増殖抑制作用が増強されることが明らかとなった。また、アポトーシスマーカーであるsub G1の割合からPP1またはコネキシン32のみではアポトーシスを誘導する効果はほとんど認められないが、コネキシン32とPP1を併用することによりアポトーシスが顕著に誘導されることが示された。したがって、PP1とコネキシン32を併用することにより、より有用な併用効果が期待できると考えられた。
【００５９】
Western blot法による結果、Caki-1W細胞のコントロールおよびPP1処理、Caki-1T細胞のコントロールおよびPP1処理の間で、HER-2、STAT3、MEKの発現レベルにおいて違いはほとんど認められず、HER-2、STAT3、MEKの活性化レベルに関しては、PP1処理したCaki-1T細胞において最も抑制されていることが示された。また、Cyclin Dの発現およびBCL-XLの発現もPP1処理したCaki-1T細胞において最も抑制され、BAXの増加も認められた。以上のことから、コネキシン32の主な癌抑制機能としては細胞増殖抑制作用が考えられたが、PP1を併用することにより、細胞増殖抑制作用が増強し、さらにアポトーシスが誘導されやすい状態になることが示唆された。
【００６０】
コネキシン32とPP1の併用によるアポトーシス誘導作用に関してさらに検討した。Caspase-3 activity assay、DNA fragmentation assayおよびDNA Ladder assayの結果から、コネキシン32とPP1の併用において最もアポトーシスが誘導されることが示された。以上の結果から、PP1のみではアポトーシスを誘導する作用は弱いが、コネキシン32とPP1を併用することにより、アポトーシスが顕著に誘導されることが示唆された。このことは、Western blot法の結果とも一致していた。よって、in vitroにおいては、転移性腎細胞癌の治療においてコネキシン32発現下でのPP1投与は有用であることが示唆された。
【００６１】
実施例3
転移性腎細胞癌株（Caki-1）に対するコネキシン32遺伝子と分子標的治療剤のin vivoにおける併用効果について検討した。
(実験方法)
［細胞株］
実施例1と同様である。
［動物］
雌性CD-1(ICR)-nu/nuマウス5週令（日本チャールズリバー）を用いた。
【００６２】
［使用薬物］
・20% ホルマリン
・0.3％ H2O2 in methnol溶液
・10％ normal rabbit and goat sera
・抗phospo-STAT3抗体（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）
・Enhancer R（QIAGEN）
・Buffer ECR（QIAGEN）
・STAT3 siRNA（QIAGEN）
・Transmesenger Transfect Reagent（QIAGEN）
・PBS（GIBCO）
【００６３】
［マウスの薬物処置］
Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞のヌードマウスへの移植は、細胞懸濁  液は1.3×107 cells/0.3 mLになるように調製し、ヌードマウスの背中にそ  れぞれ0.3 mLずつ注入した。
PP1 20 mg/kgをDMSOに懸濁し、細胞移植7日後より14日間、マウス体重あたり0.1 mL/20 gで1週間に3回腹腔投与した。腫瘍の大きさは、およそ一週間  ごとに測定した。腫瘍サイズ(mm3)は、0.5×a×b2（a : 最大  直径値 (mm)、b : 垂直値 (mm)）により算出された。最終投与2日後、実験を終了し、腫瘍を摘出および血液を採取し、腫瘍重量を測定した。ただし、採取した血液サンプルはHuman VEGF assayに用いた。
【００６４】
［HE染色］
摘出した腫瘍を20% ホルマリンで固定し、パラフィン包埋を行った。4μm切片を作製し、プレパラートにマウント後、脱パラフィン、脱水処理を行った。その後、ヘマトキシリン‐エオジン染色を行い、組織学的な観察を行った。  
【００６５】
［免疫染色］
脱パラフィン、脱水処理後、0.3％ H2O2 in methnol溶液を用いて30分  間処理をし、内因性のperoxidaseを失活させた。10％ normal rabbit and goat seraで処理し、非特異的な染色のブロッキングをした。抗phospo-STAT3抗体（×200）を用い、37℃で1時間反応させた。ラベルされた抗原は、HistoFin  e kit（Nichirei）およびDAB反応により視角化し、観察を行った。
【００６６】
［Human VEGF Assay］
Caki-１W細胞およびCaki-１T細胞を6 cmプレートにそれぞれ2×105cells/mL播種し、10％ FBS加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で24時間培養した。24時間後、培養液をMcCoy's 5A medium modifiedに交換し、さらに5％ CO2、37℃で48時間培養した。
Human VEGF Assayは、Human VEGF Assay Kitを用い、行った。
細胞を培養しているプレートから培養液上清を500μLずつ採取し、サンプルとした。また、ヌードマウスから採取した血液の血清を10倍希釈したものをサンプルとした。検量線を作成するためにStandard用のサンプルも調製した。  
96穴プレートにIncubation bufferを50μL/well入れ、StandardおよびSampleを100μL/wellずつ加え、手で緩やかにゆらし、混合した。Plate coverをして、室温で2時間インキュベーションした。溶液をすべて除去し、WorkingWash Buffer400μL/wellで30秒間ずつ4回洗浄した。Chromogen Blank 用のwell以外にanti-VEGFを100μL/well加え、Plate coverをして、室温で1時間インキュベーションした。溶液をすべて除去し、上記と同様に洗浄を行った。Chromogen Blank 用のwell以外にStreptavidin-HRP Working Soluionを10  0μL/well加え、Plate coverをして、室温で30分間インキュベーションした。溶液をすべて除去し、上記と同様に洗浄を行った。Stabilized-chromogenを  100μL/well加え、Plate coverをして、遮光、室温で30分間インキュベーションした。Stop Solutionを100μL/well加え、混合し、2時間以内にMICROP  LATE READER（IWAKI）を用い、波長450 nmで吸光度を測定した。得られた検  量線からhVEGF量を求めた。
【００６７】
［STAT3 siRNA処理］
Caki-1W細胞を6穴プレートに2×105 cells/well播種し、10％ FBS、Ab  加McCoy's 5A medium modifiedを用い、5％ CO2、37℃で24時間培養した  。
Enhancer R 6.4μL、Buffer ECR 82.8μL、296.82μg/mL siRNA 10.8μ  Lを混合し、Mixを調製した。Controlには、296.82μg/mL siRNAの代わりに  siRNA Bufferを10.8μL混合した。上記で調製したMixを室温で5分間インキュベーションし、側面についてしまった溶液を落とすために、軽く遠心をした  。Transmesenger Transfect Reagent 16μLをMixに添加し、混合した。室温で5分間インキュベーションした。細胞培養しているプレートをPBS 3mLで1度洗浄し、PBS 3mLで浸しておいた。Ab加McCoy's5A medium modified 900μ  LをMixに添加し、混合した。プレートからPBSを除去し、Mix 1 mLを1滴ずつ滴下した。37℃、5％ CO2インキュベーターで3時間インキュベーションした。培養液を除去し、PBS 2 mLで1度洗浄した。10％ FBS、Ab加McCoy's5A medium modified 2 mL加え、37℃、5％ CO2インキュベーターで72時間インキュベートした。72時間後、細胞を回収、RNAを分離・定量し、RT-PCR法によりcDNAを合成・増幅した。cDNAの増幅は、94℃で5分間インキュベーション後、94℃で30秒間、55℃で1分間、72℃で1分間を1 cycleとして40 cycle行い、1.5% agarose gelで電気泳動を行った。
ただし、RNAの分離・定量、RT-PCRは以下の方法により行った。
【００６８】
［RNA分離］
RNA分離はSV Total RNA Isolation System (Promega)を用い、行った。回収した細胞のペレットにSV RNA Lysis Buffer 175μLを添加し、ピペッティングして細胞を溶解させた。これにRNA Dilution Buffer ( Blue ) 350μLを添加し、3〜4回振り、70℃で3分間インキュベーションした。室温で15,000 rpm、10分間遠心し、違うエッペンに上層を採取した。採取した上層に95% ethanol 200μLを添加、3〜4回ピペッティング後、Spin Basket に入れ、室温で15,000 rpm、1分間遠心した。下層を捨て、SV RNA Wash Solution 600μLを添加、室温で15,000 rpm、1分間遠心した。下層を捨て、氷上に置き、次に使用する試薬の準備を行った。Yellow Core Buffer 40μL、0.09 M MnCl2 5μL、Dnase Ｉ 5μLを順番通り加え、緩やかに混和し、次に使用する試薬とした。準備した試薬 50μLをSpin Basket に入れ、室温で15分間インキュベートした。SV DNase Stop Solution 200μLを添加し、室温で15,000 rpm、1分間遠心した。下層を捨て、SV RNA Wash Solution 600μLを添加し、室温で15,000 rpm、1分間遠心した。下層を捨て、SV RNA Wash Solution 250μLを添加し、室温で15,000 rpm、2分間遠心した。室温でFLASHし、Elution Tube に差し替えた。Nuclease-Free Water 100μLを添加し、室温で15,000 rpm、1分間遠心した。室温でFLASHし、これをTotal RNAとした。RNA量を分光光度計（BECKMAN）を用いて定量した。
【００６９】
［RT-PCR］
10 mM dNTP Mix 1μL、Oligo(dT)12-18 Primer 1μL、最後にTotal RNAを添加し（最も低濃度のTotal RNAサンプルの10μL当たりのRNA量と同じになるように他のサンプルの量を調整し、添加（最大量は10μL））、DEPC-treadted Waterを用い、全量が12μLになるようにfill upした。これをTaKaRa PCR Thermal Cycler MP（TaKaRa）を用い、70℃で10分間インキュベーションし、氷上に2分間放置した。これにRNase inhibitor 1μL、0.1 M DTT 2μL、5 × First Strand Buffer 4μLを添加し、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP（TaKaRa）を用い、25℃で10分間インキュベーションした。Super ScriptTM Rnase H-Reverse Transcriptase 1μLを添加し、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP（TaKaRa）を用い、25℃で5分間、37℃で10分間、42℃で60分間、99℃で5分間インキュベーションし、RNAをcDNAに変換した。
【００７０】
逆転写して得たcDNAを鋳型にして、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP（TaKaRa）を用いPCRを行った。ＰＣＲ条件は94℃で5分間インキュベーション後、94℃で30秒間、55℃で1分間、72℃で1分間を1 cycleとして40 cycle行った。PCR産物は1.5％ agarose gelで電気泳動を行い、発現の強度を検討した。塩基量のマーカーとしてWide-Range DNA Ladderを用いた。
【００７１】
なお、siRNAそのものの副次作用がないことを確認するために、non-specific control siRNA (Qiagen)を用いて、STAT3の発現レベルに影響を与えないことを確認した。
【００７２】
［統計処理］
データは、平均値±標準誤差として表記した。統計処理は、等分散データについてはStudent's t-test法を、非等分散データについてはWelch's t-test法を用いて二群比較を行った。また、パラメトリックデータについてDunnett法を用いて群間の多重比較を行った。
【００７３】
(実験結果)
in vitroにおけるコネキシン32とPP1の併用効果についての検討を行った。Caki-1T細胞を移植したコントロール群およびCaki-1T細胞を移植したPP1処置群における腫瘍容積は、Caki-1W細胞を移植したコントロール群の腫瘍容積に比べて細胞移植21日後から有意に減少していた。細胞移植35日後の腫瘍容積は、Caki-1W細胞を移植したコントロール群では585.45 mm3、Caki-1W細胞を移植したPP1処置群では343.29 mm3、Caki-1T細胞を移植したコントロール群では152.48 mm3、Caki-1T細胞を移植したPP1処置群では94.1 mm3であった。PP1処置群のマウスでは、コントロール群に比べ、Caki-1W細胞、Caki-1T細胞どちらにおいても腫瘍増殖が抑制されていた。また、Caki-1T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍増殖が最も抑制されており、コネキシン32とPP1の併用効果が示された（図10(A)）。
【００７４】
また、摘出した腫瘍重量は、Caki-1W細胞を移植したコントロール群では0.606 g、Caki-1W細胞を移植したPP1処置群では0.432 g、Caki-1T細胞を移植したコントロール群では0.025 g、Caki-1T細胞を移植したPP1処置群では0.007 gであった。Caki-1W細胞を移植したコントロール群の腫瘍増殖に比べ、Caki-1T細胞を移植したコントロール群およびPP1処置群の腫瘍重量は有意に抑制されていた。また、PP1処置群のマウスでは、コントロール群に比べ、Caki-1W細胞、Caki-1T細胞どちらにおいても腫瘍重量が抑制されていた（図10(B)）。
【００７５】
また、実験終了時のそれぞれの群の代表的な写真を示したが、写真からもCaki-1W細胞を移植したコントロール群の腫瘍に比べて、Caki-1T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍増殖が抑制されていることが認められた（図11）。
【００７６】
一般毒性の指標として、それぞれの群の薬物投与前と投与後の体重を測定した。Caki-1W細胞、Caki-1T細胞どちらにおいてもコントロール群とPP1処置群のマウスの体重増加率に有意な差は認められなかった（表1）。
【００７７】
【表１】
0004669959.tif 000003
【００７８】
摘出した腫瘍を用いて、HE染色および免疫染色を行った。HE染色の結果、Caki-1W細胞を移植したコントロール群の腫瘍から、核の大きさが一様でなく、細胞の形が不定形で、接触阻害が認められず多層化していること、さらに周囲との境が不明確でマウスの皮膚の結合組織を巻き込み浸潤している様子が観察された。この腫瘍はGradeＩＩＩ（低分化型）であると診断された。Caki-1W細胞を移植したPP1処置群の腫瘍から、部分的に壊死を起こしている様子が観察された（図12）。
【００７９】
Caki-1T細胞を移植したコントロール群の腫瘍から、核が均一化、細胞接着面が回復し多層化していないことやマウス皮膚の結合組織との境界面がはっきりしており、周囲への浸潤は認められないことが観察された。この腫瘍はGradeＩＩ（中分化型）であると診断された。Caki-1T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍から、腫瘍組織は認められず、全ての細胞が退縮し、壊死を起こしていることや細胞が潰れてしまったことによると思われる炎症性の細胞の遊走が認められること、皮膚の結合組織との境界面がはっきりしており、周囲への浸潤は認められないことなどが観察された（図13）。
【００８０】
免疫染色により活性化STAT3の染色を行ったところ、Caki-1W細胞を移植したコントロール群の腫瘍に比べ、Caki-1W細胞を移植したPP1処置群の腫瘍における活性化STAT3は減少していることが示された。また、Caki-1T細胞を移植したコントロール群の腫瘍およびCaki-1T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍では、活性化STAT3はほとんど認められなかった（図14）。
【００８１】
in vivoにおけるCaki-1W細胞およびCaki-1T細胞の増殖速度の違いがVEGF（Vascular Endothelial Growth Factor : 血管内皮増殖因子）の発現量の違いにあるのではないかと仮定し、in vitroおよびin vivoにおいてCaki-1W細胞およびCaki-1T細胞におけるhVEGFの発現量のちがいについて検討を行った。in vitroにおいては、Caki-1W細胞に比べCaki-1T細胞におけるhVEGFの発現量は有意に減少していた（図15(A)）。
【００８２】
in vivoにおいては、Caki-1W細胞を移植したコントロール群からの血清中hVEGFの発現量に比べCaki-1T細胞を移植したコントロール群からの血清中hVEGFの発現量は有意に減少していた。また、PP1処理により、Caki-1W細胞、Caki-1T細胞どちらにおいてもhVEGFの発現量の減少が認められ、PP1処理したCaki-1T細胞において最も有意なhVEGFの発現量の減少が認められた（図15(B)）。
【００８３】
STAT3がVEGFの転写因子として働き、VEGFの発現を調節しているという報告があるため、STAT3の発現をsiRNA処理により阻害し、それによるVEGFの発現変化について検討を行った。その結果、コントロールでは、STAT3の発現が認められたが、siRNA処理によりSTAT3の発現が阻害されており、STAT3のsiRNA処理が確実に行われたことが確認された。また、コントロールに比べてsiRNA処理によりVEGFの発現が抑制されていたことから、Caki-1細胞においてVEGFの上流にはSTAT3が存在していることが確認された（図16）。
【００８４】
(考察)
In vivoにおけるコネキシン32とPP1の併用効果について検討した結果、Caki-1T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍増殖、腫瘍重量ともに最も抑制されていた。このことから、in vitroにおいてもコネキシン32とPP1の併用効果が認められ、コネキシン32とPP1は転移性腎細胞癌の新たな治療法として有用であることが示唆された。
【００８５】
また、摘出した腫瘍を用いて、HE染色および免疫染色を行った。HE染色の結果、Caki-1細胞へコネキシン32を導入したことにより腫瘍の分化度がGradeIII（低分化型）からGradeII（中分化型）への分化誘導が認められた。さらに、PP1処理により腫瘍の壊死を引き起こすことが明らかとなり、コネキシン32と併用することにより壊死は進み、腫瘍組織はほとんど認められなくなっていた。このコネキシン32による分化誘導作用は、今回データは示していないが、コネキシン32の発現回復により分化誘導マーカーであるCadherin-6の発現も回復するといったことからも裏付けられるものと考えられる。
【００８６】
免疫染色により活性化STAT3の染色を行ったところ、PP1処理により活性化STAT3は減少し、PP1とコネキシン32を併用することにより活性化STAT3はほとんど認められなかった。この結果は、病理学的な癌の悪性度とSTAT3の活性化が相関するといった報告とも一致した。このことから、コネキシン32により癌の悪性度が抑制されていることがわかり、コネキシン32が癌の生存にとって重要なシグナル系をコントロールしていることが示唆された。また、治療後の生存年数とSTAT3の活性化も関連があるといった報告から考えると、癌の治療を考える上でもSTAT3の活性化抑制は重要であることが示唆された。
【００８７】
in vitroおよびin vivoにおけるhVEGFの発現の違いについて検討した結果、in vitroにおいては、Caki-1W細胞に比べCaki-1T細胞のhVEGF発現は有意に抑制されていた。in vivoにおいても、Caki-1W細胞に比べCaki-1T細胞のhVEGF発現に有意な抑制が認められた。また、PP1単独およびコネキシン32とPP1の併用どちらにおいてもhVEGF発現に抑制傾向が認められた。このことから、Caki-1細胞おけるコネキシン32およびPP1によるin vivoでの抗腫瘍効果はVEGF発現抑制に起因するものである可能性が考えられた。そこで、VEGFの発現を調節している転写因子として働くことが報告（128）されているSTAT3の発現を阻害し、それによるVEGFの発現変化について検討をした。その結果、STAT3の阻害によりVEGFの発現が抑制されていた。このことから、Caki-1細胞においてVEGFの上流にはSTAT3が存在し、VEGFの発現調節に関与していることが示唆され、コネキシン32はSTAT3の活性化抑制を介してVEGFの発現を抑制し、in vivoにおける血管新生を妨げ、抗腫瘍効果を示すことが示唆された。
【００８８】
参考例
Caki-2の方法
（細胞株）
Caki-2(既存の人原発性腎細胞癌株：ATCCから購入)
Caki-2W:発現ベクターのみ導入；
Caki-2T：コネキシン３２遺伝子を導入
【００８９】
WST-1assay
実施例１に示すWST-1assayに準じて、Caki-2W 及びCaki-2Tを用いて試験を行った。結果を図１７に示す。ただし、PP1の濃度は0,0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 (μM)で行った。Caki-2T細胞においてPP1処理により、Caki-2W細胞に比べ、より低濃度側から細胞増殖・生存活性の低下が認められた。
【００９０】
マウス薬物処理
実施例３に示すマウス薬物処理の方法に準じて、Caki-2W 細胞及びCaki-2T細胞をヌードマウスに移植し、その後の実験を行った。結果を図１８及び１９及び表２に示す。但し、Human VEGF assayについて行わなかった。
【００９１】
図１８の(A)は、腫瘍サイズを1週間毎に測定した結果である。Caki-2W 細胞のPP1投与群とコントロール、並びにCaki-2T細胞のPP1投与群とコントロールを示す。
in vitroにおけるコネキシン32とPP1の併用効果についての検討を行った。Caki-2T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍増殖が最も抑制されており、コネキシン32とPP1の併用効果が示された。
【００９２】
図１８の(B)は、2週間後にマウスから取り出した固形腫瘍及び組織の重量を示す。
Caki-2W細胞を移植したコントロール群の腫瘍増殖に比べ、Caki-2T細胞を移植したコントロール群およびPP1処置群の腫瘍重量は有意に抑制されていた。また、PP1処置群のマウスでは、コントロール群に比べ、Caki-2W細胞、Caki-2T細胞どちらにおいても腫瘍重量が抑制されていた。
【００９３】
また、図19に実験終了時のそれぞれの群の代表的な写真を示したが、写真からもCaki-2W細胞を移植したコントロール群の腫瘍に比べて、Caki-2T細胞を移植したPP1処置群の腫瘍増殖が抑制されていることが認められた。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
FACS
実施例２に示すFACSと同様にFACS試験を行った。結果を図２０及び２１に示す。PP1が細胞周期のどの時期に影響を及ぼしているのか検討するため、Caki-2W細胞およびCaki-2T細胞を用い、FACSによる細胞周期の解析を行った。Caki-2W細胞において、コントロール0時間後、コントロール24時間後のsub G1の割合にほぼ変化は認められなかったが、PP1処理24時間後のsub G1の割合は若干増加したが、Caki-1T細胞に比べ顕著なものではなかった。Caki-2T細胞においては、コントロール0時間後に比べ、コントロール24時間後のsub G1の割合は若干の増加が見られ、PP1処理24時間後ではさらなる増加が認められた。
【００９６】
aspase 3 activityとDNA frangemntation assay
実施例２に示すCaspase 3 activityとDNA frangemntation assayの方法に準じて各試験を行った。結果を図２２に示す。
PP1のアポトーシス誘導作用に対する影響について検討した。PP1処理したCaki-2T細胞における24時間後および48時間後のCaspase-3 activityは、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-1W細胞に比べ、その増加は有意なものだった。（図22(A)）。
【００９７】
DNA fragmentation assayの結果、コントロールのCaki-2T細胞における24時間後および48時間後のDNA断片化量は、コントロールのCaki-2W細胞に比べて、ほとんど変化は見られなかった。PP1処理したCaki-2W細胞のDNA断片化量は、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-2W細胞に比べ48時間後のDNA断片化量に有意な増加が認められたが、PP1処理したCaki-2T細胞の48時間後のDNA断片化量に比べ、有意に小さかった。PP1処理したCaki-2T細胞における24時間後および48時間後のDNA断片化量は、時間依存的な増加が認められ、コントロールのCaki-2W細胞に比べ、その増加は有意なものだった。（図22(B)）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
Caki-2細胞およびCaki-1細胞においてコネキシン32は癌抑制遺伝子として働いていることが示唆され、コネキシン32の癌抑制作用とPP1のSrc活性阻害を組み合わせることにより、より有用な治療効果が得られる。
【００９９】
癌が限局した場所にだけある場合には手術によって癌細胞を取り除くことで完治できるが、転移が多発するようになった癌には局所的な治療法は役に立たず、化学療法や免疫療法などの全身的な治療法に頼らざるをえない。しかし、これらの治療が現在、外科手術後の補助療法として用いられていることからもわかるように、それら自身に十分な効果を期待することは困難な状況にある。したがって、転移性癌に有効な新たな治療法の開発が望まれている。本発明においては、転移性腎細胞癌において、コネキシン32の癌抑制作用とPP1のSrc活性阻害の組み合わせによる治療は、転移性腎細胞癌に対する新たな治療法の確立へとつながる可能性が示された。また、原発性腎癌においてもその有効性は示され、外科手術以外の新たな治療法としての可能性が考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】WST-1 assay法による検討の結果。
【図２】PP1を用いてSurvival assayを行い、PP1の細胞増殖・生存活性に対する効果を検討した結果。
【図３】LDH leakage assayを行い、PP1の細胞傷害性に対する影響を検討した結果。
【図４】Caki-1W細胞およびCaki-1T細胞を用い、FACSによる細胞周期の解析を行った結果。
【図５】Caki-1W細胞およびCaki-1T細胞を用い、FACSによる細胞周期の解析を行った結果。
【図６】PP1処理をした時の生存・増殖シグナルを調節している主な因子の発現や活性化レベルがどのように変化するかの検討結果。
【図７】PP1のアポトーシス誘導作用に対する影響についての検討結果。
【図８】DNA Ladder assayに用いたコントロールおよびPP1処理したCaki-1W細胞およびCaki-1T細胞それぞれの写真。
【図９】DNA Ladder assayの結果。
【図１０】in vitroにおけるコネキシン32とPP1の併用効果についての検討結果。
【図１１】in vitroにおけるコネキシン32とPP1の併用効果についての実験終了時のそれぞれの群の代表的な写真。
【図１２】摘出した腫瘍を用いてHE染色および免疫染色を行った結果。
【図１３】摘出した腫瘍を用いてHE染色および免疫染色を行った結果。
【図１４】免疫染色により活性化STAT3の染色を行った結果。
【図１５】in vitroおよびin vivoにおいてCaki-1W細胞およびCaki-1T細胞におけるhVEGFの発現量のちがいについての検討結果。
【図１６】STAT3の発現をsiRNA処理により阻害し、それによるVEGFの発現変化についての検討結果。
【図１７】PP1のCaki-2W 及びCaki-2Tに対する殺細胞効果試験(WST-1assay)結果。
【図１８】PP1のCaki-2W 細胞及びCaki-2T細胞のヌードマウスでの増殖に対する影響。
【図１９】各群のヌードマウスの写真。
【図２０】Caki-2W細胞およびCaki-2T細胞を用い、FACSによる細胞周期の解析を行った結果。
【図２１】Caki-2W細胞およびCaki-2T細胞を用い、FACSによるsubG1の解析を行った結果。
【図２２】PP1のアポトーシス誘導作用に対する影響についての検討結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１９】
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【配列表】
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