(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉱化コラーゲン原線維の製造方法であって、
非架橋コラーゲンとカルシウム塩を含む酸性溶液と、リン酸塩を含む中性緩衝溶液とを混合する工程と、
得られた混合液中で、コラーゲンの原線維の形成と該コラーゲンの原線維の鉱化を一工程で行う工程と、
を有し、
前記コラーゲンが天然のＩ型コラーゲンであり、
前記酸性溶液のｐＨは、塩酸を用いて、ｐＨ２の低ｐＨに調整されており、
前記カルシウム塩は、塩化カルシウムであり、
前記リン酸塩は、ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4である
ことを特徴とする、鉱化コラーゲン原線維の製造方法。
【請求項２】
前記コラーゲンの原線維の形成が前記鉱化に先立って開始される
ことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
非架橋コラーゲンとカルシウム塩を含む酸性溶液と、リン酸塩と塩化ナトリウムを含む中性緩衝溶液とを混合する工程と、得られた混合液をインキュベートしてコラーゲンからのコラーゲンの原線維の形成と該コラーゲンの原線維のリン酸カルシウムによる鉱化とを一工程で行う工程からなる反応工程と、
該反応工程で得られた鉱化コラーゲン原線維の精製工程と
を有する
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記混合液の調製温度を、前記コラーゲンの原線維の形成と該コラーゲンの原線維の鉱化を行う際の混合液の温度よりも低くしておき、
前記混合液の調製後にその温度を上昇させて、該混合物中でのコラーゲンの原線維を形成と該コラーゲンの原線維の鉱化を開始させる
ことを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記混合液の調製温度を４℃とし、
該混合液の温度を３０℃に上昇させて、該混合物中でのコラーゲンの原線維を形成と、該コラーゲンの原線維のリン酸カルシウムによる鉱化を開始させる
ことを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記コラーゲンの原線維が２０ないし５００ｎｍの径を有する
ことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記中性緩衝溶液中に、ポリカルボン酸塩、非コラーゲン性タンパク質、またはリンタンパク質を加える
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記中性緩衝溶液中に、ポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩またはポリホスホセリンを加える
ことを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の製造方法によって製造される鉱化コラーゲン原線維を出発原料として、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体を製造する方法であって、
該製造方法は、
鉱化コラーゲン原線維を、リン酸カルシウムセメント中に包埋する工程を有しており、
前記リン酸カルシウムセメントは、リン酸四カルシウム、リン酸水素カルシウム、カルシウムヒドロキシアパタイト、リン酸二水素カルシウム、炭酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、あるいは、それらの混合物から調製され、
得られるコラーゲン／リン酸カルシウム複合体中における、コラーゲン：リン酸カルシウムの重量比は、１：２００〜１：１である
ことを特徴とする、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記リン酸カルシウムが、リン酸四カルシウム、リン酸水素カルシウム、カルシウムヒドロキシアパタイトまたはリン酸二水素カルシウムから調製される
ことを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記リン酸カルシウムが、リン酸二水素カルシウムと炭酸カルシウムの混合物、あるいは、リン酸二水素カルシウム、炭酸カルシウムおよびリン酸ナトリウムの混合物から調製される
ことを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
得られるコラーゲン／リン酸カルシウム複合体中における、該鉱化コラーゲン原線維の包埋は、配向されている、あるいは、配向されていない
ことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原線維（fibril）形成と鉱化を一工程で行う、鉱化コラーゲン原線維の製造方法に関する。さらに本発明は、リン酸カルシウムセメント中に包埋される、鉱化コラーゲン原線維から開始するコラーゲン／リン酸カルシウム複合体の製造方法に関する。後者は次いで、骨代替材料として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
膠原質形成組織は、無機質に比べ、生体適合材料として多くの利点を有している。動物においてコラーゲンは重要なタンパク質であり、脊椎動物のタンパク質の30%を占める。それはin vitroにおいて、原線維と結合する能力を有し、種々改良法で製造することができる。ヒト骨において、コラーゲンは構成材料としての有機マトリックスを意味し、そこにはカルシウムイオン、リン酸塩イオン、ヒドロキシルイオン、フッ化物イオン、および炭酸塩イオンなどからなる無機質が包埋されている。ヒト組織との類似性は代替材料に比べて、重要な利点を提供する。この利点が人工器官および生体適合材料を製造するために利用される。
【０００３】
コラーゲンの鉱化に関する多くの先行技術文書が知られている。
英国特許第1068 587号(Baxendaleら,1963)は、過飽和のリン酸カルシウム溶液中に浸漬することにより再構成および鉱化した可溶性コラーゲン（ラットの尾由来）について開示している。ATPまたは硫酸コンドロイチンの存在下での結合は、いわゆるそれぞれSLSまたはFLSを生じるが（G. Reich "Kollagen", Theodor Steinkopff, Dresden (1966) 134頁以下参照）、誤った仮定のように64nm周期を有するコラーゲン原線維は生じない。
【０００４】
米国特許第5320 844号(Liu, 1992)は、酸性溶液中に分散させ、次いで、中性pHのカルシウムおよびリン酸塩溶液を添加することにより鉱化させた架橋コラーゲンについて記載している。両溶液を同時に加えてもよいし、またはこの２種の溶液の一方をあらかじめコラーゲンと混合してもよい。
【０００５】
米国特許第5455 231号、同第5231 169号およびWO93/12736 (Constantzら)は、塩基性溶液中に可溶化させ、続いて、カルシウムおよびリン酸塩溶液を数時間にわたって滴下する架橋コラーゲンについて記載している。ここでは組立段階は起っていない。
【０００６】
米国特許第5532 217号 (Silverら, 1995)は、中性化緩衝液中に放出した酸性コラーゲン溶液から生じるコラーゲン原線維について開示している。この原線維は20ないし500μmの径を有し、続いて、例えば、ダブル・ディフュージョン・チャンバー中で鉱化させる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、一様に鉱化したコラーゲンゲルを生じる鉱化コラーゲン原線維の製造方法を提供するという目的を有する。それは組換えコラーゲンではなく、天然のコラーゲンのみ使用されるべきである。もう１つの目的は、鉱化した原線維を用い、かつ、コラーゲンとリン酸カルシウムセメントとを確実に結合させたコラーゲン／リン酸カルシウム複合体の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
原線維形成と鉱化を一工程で行う鉱化コラーゲン原線維の製造方法により、驚くほど簡単な方法で第１の目的を達成することができた。特定の重量比でリン酸カルシウムセメント中に鉱化コラーゲン原線維を包埋することによるコラーゲン／リン酸カルシウム複合体の製造方法により、第２の目的を達成することができた。
【０００９】
【発明の実施の形態】
鉱化コラーゲン原線維は可溶性コラーゲンから製造され、このことは不溶性コラーゲンの使用に比べより高純度とすることができることを意味するものである。可溶性コラーゲンから原線維を再構成することが可能なことは、以前から知られていた(A. Veis, K. Payne, "Collagen Fibrillogenesis" from "Collagen" )M.E. Nimni編, 第1巻, Biochemistry, CRC Boca Raton 1988)。
【００１０】
未架橋のコラーゲンは低pH(pH=2)では可溶であり、中性pHでは原線維と結合する。再構成は、酸性コラーゲン溶液を中性緩衝液と混合することによって行う。酸性pH、好ましくはpH=2で、溶解させたカルシウム塩を含んでなるあらゆるコラーゲン溶液が酸性コラーゲン溶液として適している。あらゆる中性緩衝液が緩衝液として適している。
【００１１】
コラーゲン原線維は、過飽和リン酸カルシウム溶液からリン酸カルシウムを沈澱させることにより鉱化させる。この過飽和は、カルシウム成分とリン酸塩成分を混合することにより形成する。コラーゲン溶液と緩衝液と、同時にカルシウム成分とリン酸塩成分を混合することにより、両プロセスが同時に開始する。このプロセスの適した順序は、パラメーターの適切な選択により達成されなければならず、すなわち、コラーゲン原線維は鉱化の鋳型（基質）として働く傾向があるので、原線維形成は鉱化に先立ち開始されなければならない。同時に、密なコラーゲン構造の形成は、カルシウムおよびリン酸塩イオンのコラーゲン原線維への十分な拡散は実際に費やすに値する時間内に可能な範囲に制限されるはずである。求められるプロセスの順序は、パラメーターの狭い範囲内でしか達成されない。コラーゲン繊維とは対照的に、得られたコラーゲン原線維の径は20ないし500nmでしかない。鉱化中、鉱化を改良し、かつ、鉱化工程の速度論に影響を与えるために、本発明のコラーゲン原線維に、所望によりポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、ポリホスホセリン、他のポリカルボン酸塩または非コラーゲン性タンパク質、またはリンタンパク質を加えることができる。また、新しい骨の形成を刺激する骨成長因子の添加も考えられる。
【００１２】
さらに、本発明によれば、第２の工程において、リン酸カルシウムセメント中に鉱化コラーゲン原線維を包埋することができる。このリン酸カルシウムセメントは、リン酸四カルシウム、リン酸水素カルシウム、カルシウムヒドロキシアパタイト、リン酸二水素カルシウムなどのリン酸カルシウム類、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、またはそれらの混合物から製造され、得られる複合体のコラーゲン／リン酸カルシウム(CaP)の重量比は1:200ないし1:1である。このリン酸カルシウムセメントの個々の成分を、固体状態で適切な粒子サイズまで小さくし、液体成分と混合することによりプラスチック組成物へと変換する。この方法で得られたセメント混合物の硬化は、・まず、室温にて所定の時間、空気中、・次ぎに、同様に所定の時間、リン酸塩または他の無機成分を含んでなる水相中という２工程で行う。
【００１３】
鉱化コラーゲン原線維の包埋は、セメント前駆体への混合により行う。鉱化コラーゲン原線維を包埋する利点としては、マトリックス相（リン酸カルシウムセメント）との架橋にあり、これが破壊靱性を増強することとなる。
【００１４】
必要であれば、骨セメントの包埋中に、前記非コラーゲン性物質を加えることもできる。
【００１５】
コラーゲン原線維は、必要条件のプロフィールにより、配向または非配向のいずれかで包埋することができる。この配向は配向した原線維の積層体を包埋することにより達成できる。配向包埋は、その複合体中のコラーゲン含量をより高くすることを可能にする。さらに、この方法で、骨においてもまた存在するような異方性の力学特性を有する材料を製造することができる。
【００１６】
鉱化コラーゲン原線維およびコラーゲン／リン酸カルシウム複合体の具体例を、以下の実施例において詳細に説明する。
【００１７】
【実施例】
鉱化コラーゲン原線維の製造：
実施例１
4℃にて、可溶性コラーゲンＩを、10mM塩酸中に1mg/mlの濃度で溶解する。この溶液は当日処理してもよいし、-80℃にて深冷凍結保存してもよい。
【００１８】
成分１は、4℃にて、700μlのコラーゲン溶液と126μlの塩化カルシウム水溶液(0.1mol/l)とを混合することにより調製する。
【００１９】
成分２は、4℃にて、165μlの塩化ナトリウム水溶液(2mol/l)、240μlのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液(0.5mol/l, pH7.4)、32.4μlのKH2 PO4/K2HPO4水溶液(0.5mol/l, pH7.4)および793μlの水を混合することにより調製する。
574μlの成分２を成分１へ添加し、急速に30℃まで温度を上げて、原線維の溶解と鉱化を開始させる。混合物を30℃でインキュベートする。まず、コラーゲン原線維が形成し、同時に非晶質のリン酸カルシウム相が生じる。約90分後、溶解／再沈殿のメカニズムにより、この非晶質リン酸カルシウム相を結晶質欠陥アパタイトへと変換する。新しく生じた欠陥アパタイトは優先的にコラーゲン原線維に沈着し、比較的大きなリン酸カルシウム結晶塊を形成する。この生成物はゼラチン状の粘度を有する。引き続いて、鉱化コラーゲンの遠心分離および上清のデカンテーションにより後処理を行う。次いで、これを蒸留水に再懸濁する。緩衝塩を洗い去るために、このサイクルを数回繰り返す。最後に凍結乾燥を行う。
【００２０】
実施例２
コラーゲン溶液および成分１は、実施例１に同じ。成分２は、さらに37.5μlのポリ-L-アスパラギン酸ナトリウム水溶液(4mg/ml)および755μlの水を含む以外は、実施例１に同じ。調製は実施例１と同様に行う。
【００２１】
実施例１と同様、まず、コラーゲン原線維と非晶質リン酸カルシウムが生じる。しかしながら、非晶質リン酸カルシウムの欠陥アパタイトへの変換は、約８時間後にしか起こらない。この場合、優先して単一のリン酸カルシウム微結晶がコラーゲン原線維上およびコラーゲン原線維中に沈着する。リン酸カルシウム結晶とコラーゲンとの結合は、実施例１に比べて明らかに向上する。後処理は実施例１と同様にする。
【００２２】
リン酸カルシウムセメント中への鉱化コラーゲン原線維の包埋：
実施例３
5mgの鉱化コラーゲン原線維を、500mgのリン酸二水素カルシウムと炭酸カルシウムとの混合物へ加えた。この混合物を230mlのリン酸塩緩衝液とともに攪拌し、プラスチック組成物を得、これをまず空気中で、続いてリン酸塩緩衝液中で硬化させた。
【００２３】
実施例４
1gのリン酸ナトリウムと288mgの鉱化コラーゲン原線維を、1gのリン酸二水素カルシウムと炭酸カルシウムの混合物へ加えた。この混合物を水とともに攪拌し、プラスチック組成物を得、これを100%湿度下で硬化させた。