(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ又は数個のＣｐＧを含むオリゴヌクレオチド単鎖ＤＮＡ分子からなる人工合成ＣｐＧ単鎖デオキシオリゴヌクレオチドであって、該デオキシオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号１からなる、人工合成ＣｐＧ単鎖デオキシオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ウイルスに抵抗するために細胞を誘導し抗ウイルス物質を産生させる作用を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
上記のウイルスが一本正鎖ＲＮＡウイルス或いは流感ウイルスである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
上記の一本正鎖ＲＮＡウイルスが、変異したコロナウイルス、或いはフラビウイルス科ウイルスである、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
上記の変異したコロナウイルスがＳＡＲＳウイルスである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
上記のフラビウイルス科ウイルスがＣ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、或いは日本脳炎ウイルスである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドのフォスフォジエステルボンドが未硫化、部分硫化、または全硫化である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含有する組成物。
【請求項９】
さらに他の抗ウイルス薬物或いはワクチンを含有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞を誘導し抗ウイルス物質を産生させるための請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド或いは請求項８又は９のいずれかに記載の組成物の、医薬の製造における使用。
【請求項１１】
ウイルスで引き起こされる疾患を予防・治療するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド或いは請求項８又は９のいずれかに記載の組成物の、医薬の製造における使用。
【請求項１２】
上記のウイルスが一本正鎖ＲＮＡウイルス或いは流感ウイルスである、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
上記の一本正鎖ＲＮＡウイルスが、変異したコロナウイルス、或いはフラビウイルス科ウイルスである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記の変異したコロナウイルスがＳＡＲＳウイルスである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
上記のフラビウイルス科ウイルスがＣ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス或いは日本脳炎ウイルスである、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス作用を有する人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドに関する。特に、一本正鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルス等が誘発する伝染性疾患、及び流感ウイルスが誘発するヒトインフルエンザ等の呼吸道感染性疾患とを治療・予防するための、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドに関する。更に、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドによりウイルス、即ち一本正鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルス等が誘発する伝染性疾患と、及び流感ウイルスが誘発するヒトインフルエンザ等の呼吸道感染性疾患とを治療・予防する方法に関する。
【０００２】
背景技術
近年、数種のＣｐＧ構造を有する細菌及びウイルスＤＮＡが、ヒトの免疫系に対しての危険シグナルを表していること、及び多種の免疫細胞を活性化させて、細菌とウイルスに対する生体の抵抗メカニズムを開始することを多くの研究が示している。ＣｐＧは、リン酸を介してシトシンとグアニンとが連結してなるジヌクレオチドである。ここで、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、ｐはリン酸を表している。更なる研究において、人工合成ＣｐＧを一つ又は数個含むオリゴヌクレオチド単鎖ＤＮＡ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）も強い免疫増強機能と免疫調節機能を示し、多種の免疫細胞を活性化させて生体の抗ウイルスメカニズムを起動させること、更には臨床適用の見込みがあることを示している。
【０００３】
マウスとモルモットの膣にＣｐＧ  ＯＤＮを投与することは、致死量であるＨＳＶ−２ウイルスの攻撃に抵抗する機能を向上できる（Pyles,R. B. et al. 2002. Journal of Virology,76(22):11387-11396）。マウスにＣｐＧ  ＯＤＮを投与することは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ、respiratory syncytial virus）のロードを減少できる（Cho, J.Y., et al. 2001. J. Allergy. Clin. Immunol., 108(5):697-702）。Ｆｒｉｅｎｄウイルス（鼠類の白血病ウイルスの一種）に感染したマウスにＣｐＧ  ＯＤＮを適用することは、マウス血中のウイルス載量を著しく低減できる（Olbrich, A. R. M. et al. 2002. Journal of Virology, 76(22):11397-11404）。ウイルスに攻撃される二日前に正常なＣ５７ＢＬ／６マウスにＣｐＧ  ＯＤＮを静脈注射した後、通常致死量の単純疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）で静脈攻撃を行った結果、ＣｐＧ  ＯＤＮがマウス膣の分泌物におけるウイルス力価を著しく低下させ、且つ生殖路粘膜を刺激しＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２およびＩＬ−１８などの保護性細胞因子を急速に産生した（Harandi, A. M., et al. 2003. Journal of Virology, 77(2):953）。
【０００４】
流感ウイルスがヒトインフルエンザを誘発する病原体である。１９１８年〜１９１９年に、全世界で流感ウイルスの流行により二千万の人間が死んでしまった（Patterson, K.D. & Pyle, G. F. 1991. Bull. Hist. Med., 65:4-213）。流感ウイルスがこのように過激で制御しにくいことは、ウイルス自体の下記の特徴と深い関係がある：
（１）空気中で伝播する；
（２）形成された保護性免疫を逸脱（antigenic drift)するように絶え間なく抗原性を変える(Parvin, J. D. & Moscona, A. 1986. J. Virol., 59:377-383; Webster, R. G. 1982. Nature, 296:115-121）。
（３）異なる株のインフルエンザウイルスＲＮＡにより、同一の感染細胞内に、周期的に産生された新しい突然変異体を交互に組み替えできる（Webster, R. G. 1982. Microbiol. Rev., 56:152-179）。
【０００５】
ワクチンを接種すること及び抗ウイルス薬物を適用することは、流感ウイルスを予防・治療する二種類の主な方法であるが（Bridges, C. B. et al. 2001. Morbid. Mortal., Wkly. Rep., 50:1-44）、事実は、この二種類の方法が有効的に流感の流行を抑えることができないことを証明している（Webby, R. J. & Webster, R. G. 2001. Philos. Trans. R. Soc., London, 356:1817-1828）。感染しやすい集団では、ワクチンを接種した短期（半年）保護率は約３９％である（Fukuda, K. & Cox, N. J. 1999. Morbid. Mortal., Wkly. Rep., 48:1-28; Castle, S. C. 2000. Clin. Infect. Dis., 31:578-585）。流感ウイルス抗原［血球凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）］が絶え間なく変化するので、現行のワクチンは殆ど毎年新たに構造を変える必要がある。副作用が大きく、新しい抗薬物流感ウイルス株が絶えず出現するために、許可を得たいくつかの抗流感ウイルス薬物の効果も望ましいものではなかった（Luscher-Mattli, M. 2000. Arch. Virol., 145:2233-2248）。
【０００６】
伝染性非典型肺炎はＳＡＲＳウイルスが引き起こす人間の呼吸道における伝染性疾患であり、激烈呼吸器症候群（severe acute respiratory syndrome、ＳＡＲＳ）を引き起こし得、感染者の死亡率は約４〜１２％である。伝染性非典型肺炎の病原体は変異したコロナウイルス、即ちＳＡＲＳウイルスであり、被膜を有する一本正鎖ＲＮＡウイルスに属する（Drosten, C. 2003. The New England Journal of Medicine, 348:19; Rota, P. A., et al. 2003. Science, 300 (Issue 5624):1394-1399）。Ｃ型肝炎の病原体であるＣ型肝炎ウイルスも被膜を有する一本正鎖ＲＮＡウイルスである（Lindenbach, B. D. & Rice, C. M. 2001. In Fields virology, D. M. Knipe & P. M. Howley (ed.), 1:991-1041, Lippincott/The Williams and Wilkins Co., Philadelphia, Pa）。Ｃ型肝炎ウイルスはフラビウイルス科に属する。フラビウイルス科の他の二種類のウイルスとして、デング熱ウイルス（Wang, W.-K., et al. 2002. Journal of Virology, 76 (9):4662-4665）と日本脳炎ウイルス（Yun, S.-I. 2003. Journal of Virology, 77 (11):6450-6465）も被膜を有する一本正鎖ＲＮＡウイルスである。現在、ＳＡＲＳウイルスが引き起こすヒト呼吸道の伝染性疾患と激烈呼吸器症候群に対して、まだ有効的な治療方法がない。いくつかの抗ウイルス薬物の、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルスなどによって引き起こされた伝染性疾患の治療効果もまた望ましいものではない。
【０００７】
発明の開示
本発明の目的は、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチド、特に、ヒト末梢血細胞を刺激し抗ウイルス物質を産生する、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドを提供することであり、前記のウイルスが一本正鎖ＲＮＡウイルスと流感ウイルスを含む。人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドが一つ又はそれ以上のＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド単鎖ＤＮＡ分子からなり、そのフォスフォジエステルボンドが部分的に硫化されていてもよいし、全て硫化されていてもよく、また硫化されていなくてもよい。本発明の人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドは配列番号１−５に示す配列を有するものが好ましい。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、本発明の人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗ウイルス作用、特に一本正鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルス等及び流感ウイルスに対する作用を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、本発明の人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの、ウイルス、特に一本正鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルス等で引き起こされる伝染性疾患及び流感ウイルスにて引き起こされるヒト流感などの呼吸道疾患に対する治療・予防作用を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドでもって、ウイルス、特に一本正鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルス等にて引き起こされる伝染性疾患及び流感ウイルスにて引き起こされるヒト流感などの呼吸道疾患を治療・予防する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のコンテクストにおいて、特に断らない限り、使用された用語は、一般的に当業者が普通に了解できる意味を有する。特に、下記の用語は以下に示す意味を有する：
【００１２】
本発明のＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドは下記の配列を有するものが好ましい：
配列番号１
DVAX-1: 5'-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3'
配列番号２
DVAX-3: 5'-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3'
配列番号３
DVAX-4: 5'-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3'
配列番号４
DVAX-5: 5'-TCggggACgATCgTCgggggg-3'
配列番号５
DVAX-6: 5'-ggATCgATCgATCgATgggggg-3',
【００１３】
ここで、フォスフォジエステルボンドは部分的に硫化されていてもよいし、若しくは全て硫化されていてもよく、また硫化されていなくてもよい。
【００１４】
本発明のＣｐＧ単鎖デオキシオリゴヌクレオチドは、既知の方法、例えば固相亜リン酸アミドトリエステル法で生産することができる。以下の実施例にて、本発明の人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドを生産する方法を詳しく例示する。
【００１５】
一本正鎖ＲＮＡウイルス、特にＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルスにて引き起こされるヒト伝染性疾患を治療・予防する場合には、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの一回の投与量は約１〜５０００μgである。
【００１６】
本発明の人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの使用方法は、単独で使用すること、他の抗ウイルス薬物又はワクチンと併用することを含む。ここで、前記ウイルスは、一本正鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルスと日本脳炎ウイルス、又は流感ウイルスであることが好ましい。
【００１７】
適用方式は、粘膜（呼吸道、消化管と泌尿生殖路粘膜を含む）表面適用、点眼、皮下・筋肉注射適用、胃腸適用、腹腔適用、静脈注射など常用の方法を含む。
【００１８】
また、本願のコンテクストに開示された内容に基づけば、当業者は、本発明の他の突出した実質的な特徴を有する方面と進歩性を有する有益な効果を直接に推測できる。
【００１９】
発明を実施するための最良の形態
以下、具体的な調製実施例と生物学的効果実施例を参照しつつ、更に詳しく本発明を記述する。これらの実施例は本発明の一例に過ぎず、いずれかの方式でもって本発明の範囲を限定するものではないこと言うまでもない。
【００２０】
以下の実施例において、詳しく記述しない各種過程と方法は本技術分野で公知な常用方法である。例えば、固相亜リン酸アミドトリエステル法がその合成に採用される。以下の実施例において、使った試薬の源、商品名及び／又は組成を挙げる必要があるものは一回だけ記述されている。その後使用される同じ試薬に対しては、特に説明しない限り、前記内容を省略する。
【００２１】
［実施例１］
人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの調製
下記のステップを含む固相亜リン酸アミドトリエステル法を用いて人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２２】
１）脱保護
制御可能な多孔質ガラス（Controlled Pore Glass）上に連結したヌクレオチドの保護基であるジメトキシトリチル（ＤＭＴ）をトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid、TCA）にて除去し、遊離した５’−ヒドロキシル基末端を得て、次の縮合反応に供した。
【００２３】
２）活性化
亜リン酸アミドで保護されたヌクレオチドモノマーとアクチベーターであるテトラゾールを混合して、合成コラムに入れ、亜リン酸アミドテトラゾール活性中間体（その３’−末端はすでに活性化されているが、５’−末端は依然としてＤＭＴに保護されている）を形成した。この中間体は、制御可能な多孔質ガラス上の、脱保護されたヌクレオチドとの縮合反応に供される。
【００２４】
３）カップリング
亜リン酸アミドテトラゾール活性中間体と、制御可能な多孔質ガラス上の、脱保護されたヌクレオチドとを接触させて、５’−ヒドロキシル基と親和反応させると、縮合とテトラゾールの除去が起こる。ここで、合成されたオリゴヌクレオチド鎖は前方へ一個の塩基分伸びる。
【００２５】
４）ブロッキング
縮合反応後に、制御可能な多孔質ガラス上に連結した、未反応の５’−ヒドロキシル基は次のサイクル反応における延伸を防止するために、通常、アセチル化によりこの末端のヒドロキシル基をブロックする。一般的に、アセチル化試薬は無水酢酸とＮ−メチルイミダゾ−ル等とを混合し形成される。
【００２６】
５）酸化
縮合反応において、ヌクレオチドモノマーは、亜リン酸エステルボンドにより制御可能な多孔質ガラス上に連結したオリゴヌクレオチドと連結するが、亜リン酸エステルボンドは不安定で、酸、アルカリで加水分解されやすい。この場合、一般的には沃素のテトラヒドロフラン溶液で亜リン酸エステルをリン酸トリエステルに転換して、安定なオリゴヌクレオチドを得た。
【００２７】
前記の五つのステップを経た後に、一つのデオキシヌクレオチドが制御可能な多孔質ガラスのヌクレオチド上に連結された。同様に、トリクロル酢酸にて、新たに連結されたデオキシヌクレオチド５’−ヒドロキシル基上の保護基であるＤＭＴを除去して、前記の活性化、カップリング、ブロッキング過程を繰り返し、ＤＮＡフラグメントの粗品を得た。最後に、それに対して割裂、脱保護（一般的に、ベンゾイル基でＡ、Ｃ塩基を保護し、イソブチリル基でＧ塩基を保護するが、Ｔ塩基は保護される必要がない。亜リン酸はニトリルエチルで保護した）、精製（常用の方法にはＨＡＰ、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｃ１８、ＯＰＣ等の方法がある）、定量等の合成後処理を行って、本発明の実験要求と合致するオリゴヌクレオチドフラグメントを得た。得られたオリゴヌクレオチドフラグメントを以下に示す（配列番号１〜５に示したものを参照）：
DVAX-1 (配列番号１): 5'-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3'
DVAX-3 (配列番号２): 5'-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3'
DVAX-4 (配列番号３): 5'-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3'
DVAX-5 (配列番号４): 5'-TCggggACgATCgTCgggggg-3'
DVAX-6 (配列番号５): 5'-ggATCgATCgATCgATgggggg-3'
【００２８】
未硫化ＣｐＧ単鎖デオキシオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡシンセサイザＡＢＩ  ３９００上で合成された。全硫化及び部分硫化ＣｐＧ単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの合成は、置換法を採用し、ＤＮＡシンセサイザＡＢＩ  ３９００上でなされた。
【００２９】
［実施例２］
人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗流感ウイルス作用
１、ヒト末梢血単核細胞の分離
ヘパリンで抗凝集されたヒト末梢血（長春市中央血液センターにおける二人の正常な献血者から提供された）を、管壁に沿って、比重が１．０７７±０．００１であるフィコール−カルジオグラフィン（北京鼎国生物技術有限会社から購入）リンパ細胞成層液面に徐々に加えた。分離液とヘパリンで抗凝集したヒト末梢血との比率は約２：１である。
【００３０】
水平遠心機にて、１０００ｘｇで１５〜２０ｍｉｎ遠心処理した後、管内の液体は３層に分かれていた。ピペットにて白色の雲霧層液体層を吸取し、他の管に入れ、等体積のＨａｎｋ’ｓ液（無血清）を添加し、均一に混合し、８００〜１０００ｘｇで１５ｍｉｎ遠心処理して上澄み液を捨てた。前記のＨａｎｋ’ｓ液（カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まない）の調製において、塩化ナトリウム８．０グラム、塩化カリウム０．４グラム、燐酸二ナトリウム（一つの結晶水を付く）０．０６グラム、二燐酸カリウム０．０６グラム、炭酸水素ナトリウム０．３５グラム、ブドウ糖１．０グラム、フェノールレッド０．０２グラムをｄｄＨ２Ｏに添加して１０００ミリリットルとした。前記の成分を混合・溶解した後、８ポンドで１５ｍｉｎ滅菌し、４℃で冷蔵庫に保存した。使用する直前に７．４％ＮａＨＣＯ３でｐＨを７．３〜７．６に調整した。Ｈａｎｋ’ｓ液で細胞を２回遠心・洗浄した。
【００３１】
最後の遠心処理の後で、上澄み液を捨て、２mlの１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０完全培養液を添加し、細胞を懸濁させた。また、ＲＰＭＩ１６４０完全培養液の調製において、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）１０．４グラム、炭酸水素ナトリウム２．０グラム、ゲンタマイシン１０万ユニットを三回蒸留した蒸留水に添加し１０００ミリリットルにし、０．２２μmのろ過隔膜を用い真空ポンプで吸引ろ過して除菌し、分け置いた。
【００３２】
一滴の細胞縣濁液を取り、希釈してから、血球計算を行った。四つの大格子内の総細胞数をカウントした。単核細胞濃度（細胞数／１ミリリットルの細胞縣濁液）＝四つの大格子内の総細胞数／４×１０４×２（希釈倍数）である。
【００３３】
２、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗流感ウイルス作用に対する測定
牛胎児血清を１０％含むＩＭＤＭ培養液（１０００mlで、１０万ユニットのゲンタマイシンを含む。０．２２μmのろ過隔膜で吸引ろ過して除菌し、分け置いた）を用い、ヒト末梢血の単核細胞の最終濃度を３×１０６個／mlに調整した。十二ウェルの培養板にこの細胞懸濁液を加えた（２ml／各ウェル）。これに人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチド（６．２５μg／ml）を加えた。
【００３４】
ＤＶＡＸ−１対照の調製：人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチド（5'-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3'）を添加した。
【００３５】
培養液対照：人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドを添加しなかった。
【００３６】
５％の二酸化炭素孵化箱にて、３７℃、４８時間培養し、上澄み液を採集して、その抗流感ウイルスの活性を検出した。
【００３７】
成長状態が良いＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ）の濃度を５％牛胎児血清ＩＭＤＭにて３×１０５個／mlに調整した。９６ウェルの平底培養板に細胞を接種した（１０μl／各ウェル）。
【００３８】
ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドに刺激された上澄み液を５％胎牛血清ＩＭＤＭにて１０倍に希釈した後、サンプルを添加した［１００μl／各ウェル（この場合、各ウェルの体積が２００μl、即ち１００μl細胞懸濁液＋１００μlの希釈されたＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドが刺激した上澄み液又は対照上澄み液）］。インターフェロン対照、流感ウイルス対照と正常Ｖｅｒｏ細胞対照を設けた。３７℃、５％ＣＯ２液（長春生物製品研究所）２００μlで、引き続き４８〜７２時間培養した。８０〜１００％のウイルス対照ウェル細胞が病変し、細胞対照ウェルの細胞の状態が良い時点までに培養を終了し、クリスタルバイオレットで染色する方法により細胞病変の度合いを判定した。培養液を吸取し捨てた。各ウェルに２００μlの０．５％クリスタルバイオレット染色液を添加し、３７℃で１５分間反応させた。流水でクリスタルバイオレット染色液を洗い流した。０．５％クリスタルバイオレット染色液は、クリスタルバイオレット０．５グラムと、ＮａＣｌ  ０．８５グラムとを５０ミリリットルの脱水エーテルに溶解して得た。３ミリリットルのホルムアルデヒドと４７ミリリットルの蒸留水を添加した。写真を撮ってその結果を記録した。表１に示すようにサンプルを添加し、クリスタルバイオレットで染色した後の結果を図１に示した。
【００３９】
【表１】
0004809220.tif 000002
注：ＤＶＡＸ−１対照：人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチド、その配列：5'-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3'
培養液対照：人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドを加えなかった培養上澄み液
正常Ｖｅｒｏ細胞：流感ウイルスを添加しなかった
流感ウイルス：細胞培養上澄み液を添加せず流感ウイルスを添加
ＤＶＡＸ  １、３、４、５、６は、それぞれ符号がＤＶＡＸ  １、３、４、５、６である人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドを代表する。
ＩＦＮ：インターフェロンα、長春生物製品研究所
Ｃ、Ｄ、Ｅ  １−１０；Ｆ、Ｇ、Ｈ  ３−４：一人の献血者の末梢血単核細胞の誘導上澄み液
Ｃ、Ｄ、Ｅ  １１−１２；Ｆ、Ｇ、Ｈ  ５−１２：もう一人の献血者の末梢血単核細胞の誘導上澄み液
【００４０】
図１の結果から分かるように、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドＤＶＡＸ  １、ＤＶＡＸ  ３、ＤＶＡＸ  ４、ＤＶＡＸ  ５とＤＶＡＸ  ６（配列番号１〜５）は、ヒト末梢血の単核細胞を刺激し抗流感ウイルス物質を産生する作用を有するが、それらの物質は流感ウイルスが攻撃したＶｅｒｏ細胞を確実に保護する作用を有する。人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドＤＶＡＸ  １、ＤＶＡＸ  ３、ＤＶＡＸ  ４、ＤＶＡＸ  ５とＤＶＡＸ  ６（配列番号１〜５）は、流感ウイルス感染で引き起こされる流感等のヒト呼吸道の伝染性疾患に対して、治療・予防作用がある。
【００４１】
［実施例３］
人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗一本正鎖ＲＮＡウイルス（ＳＡＲＳウイルス）作用
１、ヒト末梢血単核細胞の分離
実施例２に同じ。
【００４２】
２、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）に刺激されたヒト末梢血ＰＢＭＣの培養上澄み液の取得
ヒト末梢血ＰＢＭＣを含む１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０完全培養液（１０％牛胎児血清のＲＰＭＩ１６４０の調整：不活性化された子牛血清１０ミリリットル、ＲＰＭＩ１６４０培養液９０ミリリットル）を、１２ウェルの培養板に接種した（各ウェル：２ml；細胞濃度：４×１０６cells／ml；ろ過し細菌を除去したＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）を添加；最終濃度がそれぞれ２５μg／ml、１２．５μg／ml、６．２５μg／ml、３．１３μg／ml）。培養液対照（ＣｐＧ  ＯＤＮを添加せず）を設けた。３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養し、上澄み液を採集し、使用まで−２０℃に置いた。
【００４３】
３、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗ＳＡＲＳウイルス作用に対する測定
本実験は中国疾患予防コントロールセンターウイルス予防コントロール所で行った。
【００４４】
アフリカミドリザルの腎継代細胞（ＶＥＲＯ  Ｅ６、中国疾患予防コントロールセンターウイルス予防コントロール所から提供された）を、９６ウェル培養板に接種した（細胞濃度：４×１０５cells／ml；３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、培養液を吸取し捨てた）。１００ＴＣＣＩＤ５０コロナウイルスＳｉｎｏ−５分離株ウイルス［（ＳＡＲＳ患者の急性血清の０４号標本）：北京佑安門病院から提供され、中国疾患予防コントロールセンターウイルス予防コントロール所で鑑定し保存されたもの］を加えて、３７℃、５％ＣＯ２で２時間培養し、ウイルス液を捨てた。ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）が刺激したヒト末梢血ＰＢＭＣの培養上澄み液を添加（各ウェルに１００μl）し、二つの二重ウェルを設けた。組換えヒトインターフェロンα２ｂ（遠策素、陽性対照薬物、１００万ＩＵ／枝、文号：国薬准字Ｓ１９９９００１３、ロット番号：０００５０３Ａ、北京遠策薬物有限責任会社出品）と培地対照、細胞対照とウイルス対照を設け、３７℃、５％ＣＯ２で６日培養した。顕微鏡で細胞の病変（ＣＰＥ）を観測した。評価基準は以下の通りである。
２５％が病変した場合：＋
２６〜５０％が病変した場合：＋＋
５１〜７５％が病変した場合：＋＋＋
７６〜１００％が病変した場合：＋＋＋＋
【００４５】
ＣＰＥの観測終了後、各ウェルに１００μlの０．５％クリスタルバイオレット染色液（クリスタルバイオレット０．５ｇとＮａＣｌ  ０．８５ｇを無水エーテル５０ml、ホルムアルデヒド３ml、蒸留水４７mlに溶解）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間培養した。流水で洗い流した。各ウェルに脱色液（グリコールモノメチルエーテル５０ml、蒸留水５０ml）を添加した。室温で２時間振動した後に、ＥＬＩＳＡ検出器でＯＤ（４９２nm）値を測定した。
【００４６】
結果の分析：
ＣＰＥ法の実験結果は以下のことを証明した：
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：１６０に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）１２．５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：８０に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）６．２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：４０に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
組換えヒトインターフェロンα２ｂは、５万ユニット以上に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮを含まない培地上澄み液は、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がない。
【００４７】
クリスタルバイオレット染色法の実験結果は以下のことを証明した：
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：８０に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）１２．５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：８０に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）６．２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：２０に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
組換えヒトインターフェロンα２ｂは、５万ユニット以上に希釈された場合まで、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮを含まない培地上澄み液は、コロナウイルス（Ｓｉｎｏ−５分離株）に対して抑制効果がない。
【００４８】
前記の結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）が刺激したヒト末梢血単核細胞は、上澄み液において一本正鎖ＲＮＡウイルス即ちＳＡＲＳウイルスに対する抗ウイルス物質を誘導し、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）は、細胞を刺激することにより抗ウイルス物質を産生し抗一本正鎖ＲＮＡウイルス即ち抗ＳＡＲＳウイルス機能を発揮した。
【００４９】
［実施例４］
人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗一本正鎖ＲＮＡウイルス（デング熱ウイルス）作用
１、ヒト末梢血単核細胞の分離
実施例２に同じ。
【００５０】
２、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）に刺激されたヒト末梢血ＰＢＭＣの培養上澄み液の取得
実施例３に同じ。
【００５１】
３、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗デング熱ウイルス作用に対する測定
ＶＥＲＯ  Ｅ６細胞縣濁液２００μlを、９６ウェル培養板に接種した（細胞濃度：４×１０５cells／ml；３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、培養液を吸取し捨てた）。１００ＴＣＣＩＤ５０デング熱ウイルス（Ｄ２Ｖ  ｓｔｒａｉｎ  ＮＧＣ、Ｃ６／３６昆虫細胞（ＡＴＣＣ）で準備した）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間培養し、ウイルス液を捨てた。ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）が刺激したヒト末梢血ＰＢＭＣの培養上澄み液を添加し、各ウェルに１００μl入れ、三つの二重ウェルを設けた。細胞対照とウイルス対照を設け、３７℃、５％ＣＯ２で８日培養した。顕微鏡で細胞の病変（ＣＰＥ）を観測した。評価基準は以下の通りである。
２５％が病変した場合：＋
２６〜５０％が病変した場合：＋＋
５１〜７５％が病変した場合：＋＋＋
７６〜１００％が病変した場合：＋＋＋＋
【００５２】
ＣＰＥ法の実験結果は以下のことを証明した：
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：８０に希釈された場合まで、デング熱ウイルスに対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）１２．５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：８０に希釈された場合まで、デング熱ウイルスに対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）６．２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：４０に希釈された場合まで、デング熱ウイルスに対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮを含まない培地上澄み液は、デング熱ウイルスに対して抑制効果がない。ウイルス対照においては、全ての細胞が病変した。
【００５３】
前記の結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）が刺激したヒト末梢血単核細胞は、上澄み液において一本正鎖ＲＮＡウイルス即ちデング熱ウイルスに対する抗ウイルス物質を誘導し、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）は、細胞を刺激することにより抗ウイルス物質を産生し抗一本正鎖ＲＮＡウイルス即ち抗デング熱ウイルス機能を発揮した。
【００５４】
［実施例５］
人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗一本正鎖ＲＮＡウイルス（日本脳炎ウイルス）作用
１、ヒト末梢血単核細胞の分離
実施例２に同じ。
【００５５】
２、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）に刺激されたヒト末梢血ＰＢＭＣの培養上澄み液の取得
実施例３に同じ。
【００５６】
３、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチドの抗日本脳炎ウイルス作用に対する測定
ＢＨＫ−２１細胞縣濁液（内モングル生物製薬工場から）２００μlを、９６ウェル培養板に接種した（細胞濃度：４×１０５cells／ml；３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、培養液を吸取し捨てた。１００ＴＣＣＩＤ５０日本脳炎ウイルス（長春生物製品研究所から）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間培養し、ウイルス液を捨てた。ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）が刺激したヒト末梢血ＰＢＭＣの培養上澄み液を添加（各ウェル１００μl）し、三つの二重ウェルを設けた。細胞対照とウイルス対照を設け、３７℃、５％ＣＯ２で４日培養した。顕微鏡で細胞の病変（ＣＰＥ）を観測した。評価基準は以下のとおりである。
２５％が病変した場合：＋
２６〜５０％が病変した場合：＋＋
５１〜７５％が病変した場合：＋＋＋
７６〜１００％が病変した場合：＋＋＋＋
【００５７】
ＣＰＥ法の実験結果は以下のことを証明した：
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：１６０に希釈された場合まで、日本脳炎ウイルスに対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）１２．５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：８０に希釈された場合まで、日本脳炎ウイルスに対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）６．２５μg／mlが刺激（４８時間）したヒトＰＢＭＣ培養上澄み液は、１：４０に希釈された場合まで、日本脳炎ウイルスに対して抑制効果がある。
ＣｐＧ  ＯＤＮを含まない培地上澄み液は、日本脳炎ウイルスに対して抑制効果がない。ウイルス対照においては、全ての細胞が病変した。
【００５８】
前記の結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）が刺激したヒト末梢血単核細胞は、上澄み液において一本正鎖ＲＮＡウイルス即ち日本脳炎ウイルスに対する抗ウイルス物質を誘導し、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＤＶＡＸ−１）は、細胞を刺激することにより抗ウイルス物質を産生し抗一本正鎖ＲＮＡウイルス即ち抗日本脳炎ウイルス機能を発揮した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、人工合成ＣｐＧ含有単鎖デオキシオリゴヌクレオチに刺激されたヒト末梢血単核細胞の培養上澄み液が流感ウイルスに攻撃されたＶｅｒｏ細胞を保護する作用を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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