(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有し、グルコアミラーゼ活性を有する酵素：
（１）SDS-PAGEにより測定した分子量が約70kDaである；
（２）60℃の温度で測定した場合、最適pHは4.5である；
（３）pH 4.3で測定した場合、最適温度は70℃である；
（４）pH 4.5及び70℃の温度で測定した場合、半減期（Ｔ1/2）は少なくとも100分である；
（５）等電点が3.5未満である；及び
（６）タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）種に由来する。
【請求項２】
タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）CBS 793.97に由来する、請求項１に記載のグルコアミラーゼ活性を有する酵素。
【請求項３】
配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含んでなる、グルコアミラーゼ活性を有する酵素。
【請求項４】
配列番号：７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、そしてpH 4.5及び70℃の温度で測定した場合に少なくとも100分間の半減期（Ｔ1/2）を有する、グルコアミラーゼ活性を有する酵素。
【請求項５】
配列番号：33に記載のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列から成る核酸に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされており、そしてpH 4.5及び70℃の温度で測定した場合に少なくとも100分間の半減期（Ｔ1/2）を有する、グルコアミラーゼ活性を有する酵素。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号：33に記載のヌクレオチド配列から成る、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の酵素の製造方法であって、
（１）前記酵素を生産する能力を有し、タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）種に属する微生物を培養し；そして
（２）培養物から前記酵素を採取する；
ことを含んでなる方法。
【請求項１２】
前記タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）種が、タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）CBS 793.97株である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素の製造方法であって、
（１）請求項10に記載の宿主細胞を培養し；そして
（２）培養物から前記酵素を採取する；
ことを含んでなる方法。
【請求項１４】
澱粉または部分的に加水分解された澱粉を、デキストロースを含有するシロップに転化する方法であって；請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの存在下、澱粉の加水分解物を糖化する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記グルコアミラーゼの添加量が、乾燥固形物１ｇ当り0.05〜0.5 AGU の範囲内である請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
乾燥固形物の少なくとも30重量％の澱粉加水分解物を糖化する工程を含む請求項14または15に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖化の工程が、プルラナーゼおよびイソアミラーゼの群から選択される脱分枝酵素の存在下で行われる請求項14〜16のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プルラナーゼが、バシラス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）、バシラス・デラミフィカンス（Bacillus deramificans）またはシュードモナス・アミロデラモーサ（Pseudomonas amyloderamosa)由来のプルラナーゼである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖化の工程が、３〜5.5のpHで60〜80℃の温度にて行われる、請求項14〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記糖化の工程が、63〜75℃で24〜72時間行われる請求項14〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記糖化の工程が、36〜38時間、４〜4.5のpHにて行われる請求項14〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼによる糖化工程を含む、液化澱粉溶液を糖化する方法。
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、澱粉転化方法での使用。
【請求項２４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、連続澱粉転化方法での使用。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、オリゴ糖類の製造方法への使用。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、特殊シロップ類の製造方法への使用。
【請求項２７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、燃料用エタノールの製造方法への使用。
【請求項２８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、嗜好飲料の製造方法への使用。
【請求項２９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコアミラーゼの、有機化合物を製造する醗酵方法への使用。
【請求項３０】
前記有機化合物が、クエン酸、アスコルビン酸、リシン又はグルタミン酸である、請求項29に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、例えば、澱粉からグルコースを生成する澱粉転化反応を行うのに適切な熱安定グルコアミラーゼに関する。また、本発明は、種々の方法における前記熱安定グルコアミラーゼの使用、特に澱粉転化法における糖化ステップでの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
グルコアミラーゼ類（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドラーゼ  EC 3.2.1.3）は、澱粉または類縁のオリゴ糖分子や多糖分子の非還元性末端からＤ−グルコースを放出する反応を触媒する酵素である。
グルコアミラーゼ類は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）およびアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori ）を含む、いく種類もの糸状真菌類および酵母類によって産生される。
【０００３】
これらグルコアミラーゼ類は、α−アミラーゼによって、すでに一部分が加水分解されてグルコースになっているトウモロコシ澱粉を転化するのに、商業的に使用されている。そのグルコースは、グルコースイソメラーゼによってさらに転化して、ほゞ同量のグルコースとフルクトースからなる混合物にすることができる。この混合物、またはこの混合物をフルクトースでさらに強化したものは、世界中で商業化されて一般的に使用されている高フルクトーストウモロコシシロップである。このシロップは、酵素法によって生産される生産物のうち、生産トン数が世界で最大の生産物である。澱粉のフラクトースへの転化反応に関連する３種の酵素が、生産される最も重要な工業用酵素類の中に入っている。
【０００４】
高フルクトーストウモロコシシロップを製造する際グルコアミラーゼを商業的に使用するのに伴う主な問題点の一つは、例えば、市販されているアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（すなわち、Novo Nordisk A/SがＡＭＧとして販売している）などのグルコアミラーゼ類の熱安定性が比較的低いことである。市販のアスペルギルス属のグルコアミラーゼは、α−アミラーゼまたはグルコースイソメラーゼほどに熱に安定ではなく、かつα−アミラーゼまたはグルコースイソメラーゼと比べて、低いpH下で最も活性でかつ安定である。したがって、このグルコアミラーゼは低温でかつ低pHの別個の容器で使用しなければならない。
【０００５】
米国特許第 4,247,637号には、液化澱粉溶液を糖化してシロップにするのに適切なタラロミセス・デュポンティ（Talaromyces duponti ）由来の分子量が約31,000Daの熱安定グルコアミラーゼが記載されている。このグルコアミラーゼは、pH４．５で１０分間７０℃で保たれたとき、その最初のグルコアミラーゼ活性の少なくとも約９０％を保持していると述べられている。
【０００６】
米国特許第 4,587,215号には、タラロミセス・テルモフィルス（Talaromyces thermophilus）の種由来の、分子量が約45,000Daの熱安定アミログルコシダーゼが開示されている。この開示されているアミログルコシダーゼ（すなわちグルコアミラーゼ）は、二つの別個の相でその酵素活性を失う。すなわち、初期に急速に衰退し、次にゆっくり衰退する期間が続く。７０℃（pH＝５．０）では、急速衰退時の半減期は約１８分であり、衰退の第二相では、１hr以内で、測定可能な活性の喪失はない。
【０００７】
Bunni L.ら、Enzyme Microb.Technol., 11巻370 〜375 頁1989年は、タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii ）CBS 814.70が産生した少なくとも一つの形態のα−アミラーゼと一つの形態のα−グルコシダーゼからなる細胞外の澱粉加水分解系の製造、単離および部分的な特性決定に関する文献である。α−アミラーゼだけが単離され、精製され、次いで特性が決定されている。
【０００８】
発明の要約
本発明は、例えば、澱粉の転化方法における糖化ステップで使用するのに適した新規な熱安定グルコアミラーゼを発見したことに基づいている。
用語の“グルコアミラーゼ”と“ＡＭＧ”は、以後、互いに交換して使用される。
本発明のグルコアミラーゼの熱安定性は、以下の“材料と方法”の項に記載の方法を用いて、Ｔ1/2 （半減期）として測定される。
【０００９】
本発明の発明者らは、現在、the Centraal bureau voor Schimmel culturesに番号CBS 793.97で寄託されているタラロミセス・エメルソニイの菌株由来の熱安定グルコアミラーゼを単離し、精製し次いで特性を決定した。
用語“単離された”は、タンパク質に用いた場合、そのタンパク質が、その生来の環境以外の条件下で見出されていることを示す。好ましい形態の単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質〔すなわち、“相同不純物”（下記のことを参照）〕を実質的に含有していない。
【００１０】
純度が４０％より大きい形態のタンパク質を提供することが好ましく、そして、純度が６０％より大きい形態のタンパク質を提供することが一層好ましい。高度に精製されたタンパク質すなわちSDS-PAGEで測定して、純度が８０％より大きいタンパク質を提供することが好ましく、一層好ましいのは純度が９５％より大きいタンパク質であり、そしてさらに一層好ましいのは純度が９９％より大きいタンパク質である。
【００１１】
用語“単離された酵素”は、代わりに“精製された酵素”と呼ぶことができる。
用語“同種性（homologous）不純物”は、本発明のポリペプチドが最初に得られる同種性細胞が生成するあらゆる不純物（例えば本発明のポリペプチド以外のポリペプチド）を意味する。
【００１２】
単離された本発明のグルコアミラーゼは、従来技術のグルコアミラーゼ類、例えばアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる商品名ＡＭＧのグルコアミラーゼ）などに比べて熱安定性が非常に高い。そのＴ1/2 （半減期）を測定した結果、下記実施例２に記載されているように、７０℃（pH４．５）で約１２０分であった。酵母内で発現された組換えＴ．エメルソニイのＡＭＧのＴ1/2 は測定した結果、実施例１２に記載されているように、約１１０分であった。
【００１３】
したがって、第一の側面で、本発明は、Ｔ1/2 （半減期）が、５０mM  NaOAc 、０．２AGU ／ml、pH４．５、７０℃にて少なくとも１００分間であるグルコアミラーゼ活性を有する単離された酵素に関する。
第二の側面で、本発明は、配列番号：１〜６に示す部分配列を一つ以上含有しグルコアミラーゼ活性を有する酵素、または配列番号：７に示す全長の酵素、またはこれら酵素と実質的に相同でありグルコアミラーゼ活性を有する酵素に関する。
【００１４】
用語“部分配列”は、より長いポリペプチドの配列内に含まれている部分ポリペプチドの配列を意味し、そのより長いポリペプチドの配列は注目されている活性を有している。
また、本発明は、本発明のグルコアミラーゼをコードするクローン化ＤＮＡ配列に関する。
さらに、本発明は、澱粉または部分的に加水分解された澱粉を、例えばデキストロースを含有するシロップに転化する方法であって、澱粉の加水分解物を、本発明のグルコアミラーゼの存在下で糖化するステップを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の目的は、酵素による糖化を、本発明のグルコアミラーゼを用いて実施する、液化澱粉溶液の糖化方法を提供することである。
さらに、本発明は、澱粉の転化方法、例えば澱粉の連続転化方法での、本発明のグルコアミラーゼの使用に関する。上記澱粉の連続転化方法の実施態様には、連続糖化ステップが含まれている。
また、本発明のグルコアミラーゼは、オリゴ糖類または特殊シロップ（specialty syrup ）を製造する方法にも利用できる。
最後に、本発明は、本発明のグルコアミラーゼを産生することができる微生物タラロミセス・エメルソニイCBS 793.97またはその変異体の単離された純培養物に関する。
【００１６】
発明の詳細な開示
本発明は、例えば、澱粉の転化方法の糖化ステップで使用するのに適した新規な熱安定グルコアミラーゼを発見したことに基づいている。
本発明の発明者らは、タラロミセス・エメルソニイCBS 793.97の株由来のグルコアミラーゼを単離し、精製し次いで特性を決定した。このグルコアミラーゼは、従来技術のグルコアミラーゼと比較して、熱安定性が非常に高いことが明らかになった。
【００１７】
したがって、第一の側面で、本発明は、５０mM  NaOAc 、０．２AGU ／ml、pH４．５、７０℃にて、Ｔ1/2 （半減期）が少なくとも１００分間、例えば１００〜１４０分間であるグルコアミラーゼ活性を有する単離された酵素に関する。
単離されたタラロミセス・エメルソニイCBS 793.97のグルコアミラーゼのＴ1/2 （半減期）は、測定した結果、後記実施例２に記載されているように７０℃で約１２０分間であり、そして実施例１２に記載されているように、酵母中で産生したティー・エメルソニイについては約１１０分であった。
【００１８】
その単離されたグルコアミラーゼの分子量は、SDS-PAGEが測定した結果、約７０KDa であることが見出された。さらに前記酵素のＰＩは、等電点電気泳動法を用いて測定した結果、３．５未満であった。
等電点ＰＩは、酵素分子複合体（任意に金属などのイオンが結合している）が中性である場合、すなわち、その複合体の静電荷の合計〔実効静電荷（net electrostatic charge）、ＮＥＣ〕がゼロに等しい場合のpH値と定義されている。この合計を行う場合、静電荷が正であるか負であるかを考慮しなければならないことは勿論である。
同じ有利な特性を有する実質的に相同の酵素が、他の微生物、特に糸状真菌などの真菌生物、さらに詳しく述べるとタラロミセス属の真菌の他の菌株、特にタラロミセス・エメルソニイの他の菌株から得ることができると予想される。
【００１９】
寄託された微生物
本発明のグルコアミラーゼが単離された糸状真菌の菌株の分離株は、下記日付けの特許手続のため、オランダ，バーン AG 3740私書箱273 のthe Centraal bureau voor Schimmel culturesに寄託されている。ブダペスト条約に基づいた国際寄託当局であるＣＢＳは、前記条約の第九規則にしたがって寄託された微生物を保管する。
寄託日：１９９７年６月２日
寄託者の参照番号：NN049253
ＣＢＳの呼称：CBS 793.97
【００２０】
糸状真菌のタラロミセス・エメルソニイCBS No. 793.97の分離株は、本特許願が係属中、特許・商標庁長官が、C.F.R §1.14および35U.S.C.§122 に基づいて権利があると決定した人がその単離された真菌を入手できる条件で寄託されている。寄託微生物は、真菌分離株の実質的に純粋の培養物である。寄託微生物は、当該出願の対応出願または当該出願の後継出願が出願された国の外国特許法によって請求されたとき入手できる。しかし、寄託微生物を利用できることが、政府の決定によって付与された特許権を逸脱して、当該発明を実施する免許を構成するものではないと解すべきである。
【００２１】
タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼのアミノ酸配列
本発明の発明者らは、タラロミセス・エメルソニイCBS 793.97由来の熱安定グルコアミラーゼの配列を決定した。このことは以下の実施例３に記載してある。本発明によれば、上記タラロミセスのＡＭＧは、Asp145Asn （すなわちD145N ）の置換を有する（配列番号：７のナンバリングを使用）。
【００２２】
したがって、本発明は、配列番号：１〜６に示す部分配列の一つ以上もしくは配列番号：７に示す全長配列を含む、グルコアミラーゼ活性を有する単離された酵素、またはその酵素に実質的に相同でグルコアミラーゼ活性を有する酵素に関する。配列番号：３４は、アミノ酸No. １〜２７のシグナルペプチドとプレプロペプチドを含む全長配列を示す。
【００２３】
タンパク質配列の相同
二つのグルコアミラーゼ間の相同は、第二の配列から第一の配列の誘導を示す、二つのタンパク質配列の同一度として測定される。その相同は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8 、1994年８月、Genetics Computers Group、米国 53711，ウイスコンシン州，マディソン，サイエンス・ドライブ 575）に提供されているｇａｐなど当該技術分野で知られているコンピュータプログラムによって確認することが適切である（Needleman, S.B. およびWunsch, C.D., Journal of Molecular Biology、48巻443 〜453 頁1970年）。ポリペプチドの配列を比較するには、以下の設定のｇａｐすなわちｇａｐ生成ペナルティ３．０とｇａｐ延長ペナルティ０．１を使用する。
【００２４】
本発明によれば、“実質的に相同の”アミノ酸配列は、配列番号：１〜６に示す部分アミノ酸配列または配列番号：７と、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは９７％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一度を示す。
【００２５】
タラロミセス・エメルソニイのクローン化ＤＮＡ配列
また、本発明は、グルコアミラーゼ活性を示す本発明の酵素をコードするクローン化ＤＮＡ配列に関し、そのＤＮＡ配列は、
（ａ）配列番号：３３に示すＤＮＡ配列の、グルコアミラーゼをコードする部分；
（ｂ）配列番号：３３の 649〜2724位に示すＤＮＡ配列またはその相補的ストランド；
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に定義されたＤＮＡ配列と少なくとも８０％相同の前記ＤＮＡ配列の類似体；
【００２６】
（ｄ）配列番号：３３の 649〜2724に示す配列を含む二本鎖ＤＮＡプローブと、低いストリンジェンシィ（low stringency）でハイブリッドを形成するＤＮＡ配列；
（ｅ）遺伝暗号が縮重しているため（ｂ）の配列とハイブリッドを形成しない配列、もしくは（ｆ）しかしながらこれらのＤＮＡ配列のいずれか一つによってコードされるポリペプチドと正確に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；または
（ｇ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）または（ｅ）に特定されているＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列；
を含有している。
【００２７】
本発明のＡＭＧの成熟部分は、配列番号：３３の 728〜2724位のＤＮＡ配列がコードしている。酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）YNG318中に本発明のＡＭＧを発現させる場合、そのイントロンは、実施例７で説明するように切断する必要がある。
【００２８】
ＤＮＡ配列の相同
上記のＤＮＡ配列の相同は、第一の配列が第二の配列から誘導されたことを示す二つの配列間の同一度として決定される。その相同は、当該技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8 、1994年８月、Genetics Computer Group 、米国，53711 ，ウイスコンシン州，マディソン，サイエンス・ドライブ 575）によって、適切に決定できる（Needleman, S.B. およびWunsch, C.D., Journal of Molecular Biology、48巻443 〜453 頁1970年）。
【００２９】
ＤＮＡ配列を比較するのに、ＧＡＰ生成ペナルティ５．０およびＧＡＰ延長ペナルティ０．３の設定のＧＡＰを使用すると、上記の類似のＤＮＡ配列のコード領域は、配列番号：３３に示すＤＮＡ配列のＡＭＧをコードする領域またはイントロンありもしくはなしのグルコアミラーゼをコードする部分と、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９７％の同一度を示す。
【００３０】
ハイブリッド形成
少なくとも低いストリンジェンシィ条件下であるが好ましくは中位のストリンジェンシィ条件下、または高いストリンジェンシィ条件下で、配列番号：３３の６４９〜２７４８位に示す配列（すなわちＡＭＧをコードする部分）を含む二本鎖ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成する、上記ｄ）で定義した類似ＤＮＡ配列を定義する上記ハイブリッド形成条件を以下に詳細に説明する。
【００３１】
ヌクレオチドプローブおよび相同のＤＮＡもしくはＲＮＡの配列との間の、低い、中位の、または高いストリンジェンシィでのハイブリッド形成を確認するのに適切な試験条件には、ハイブリッドを形成させるＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含有するフィルターの５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrookら、1989年）中への１０分間の予備浸漬；５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Sambrookら、1989年）、０．５％  ＳＤＳおよび１００μｇ／mlの超音波処理された変性さけ精子ＤＮＡ（Sambrookら、1989年）の溶液内での前記フィルターの予備ハイブリッド形成；次いで１０ng／mlの濃度のランダムプライムされ（Feinberg, A.P.およびVogelstein B., Anal.Biochem., 132 巻６〜13頁1983年）、32Ｐ−ｄＣＴＰで標識化（比活性＞１×１０9cpm／μｇ）されたプローブを含有する同じ溶液中での約４５℃で１２hrのハイブリッド形成が含まれている。
【００３２】
そのフィルターを次に、２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中で、３０分間、約５５℃で（低ストリンジェンシィ）、より好ましくは約６０℃で（中位のストリンジェンシィ）、さらに好ましくは約６５℃で（中位の／高いストリンジェンシィ）、さらに一層好ましくは約７０℃で（高いストリンジェンシィ）およびさらに一層好ましくは約７５℃で（非常に高ストリンジェンシィ）、２回洗浄する。
上記オリゴヌクレオチドのプローブがこれらの条件下でハイブリッドを形成する分子を、Ｘ線フィルムを使用して検出する。
【００３３】
澱粉の転化
本発明は、本発明の熱安定グルコアミラーゼを用いて、澱粉からグルコースなどを製造する方法を提供するものである。この方法は、一般に、前駆体の澱粉を、α−アミラーゼの存在下で部分的に加水分解し、次いでグルコアミラーゼの存在下、α−（１→４）およびα−（１→６）のグルコシド結合を開裂させることによってさらに加水分解して、澱粉の非還元性末端からＤ−グルコースを放出させるかまたは類縁のオリゴ糖分子と多糖分子を放出するステップを含んでいる。
【００３４】
α−アミラーゼを利用する前駆体澱粉の前記部分的加水分解反応は、内部のα−（１→４）結合を加水分解することによって、澱粉分子の初期分解を行う。商業用途では、α−アミラーゼを使用する初期加水分解反応は、約１０５℃の温度で行われる。通常、固形分が３０〜４０％の非常に高い濃度の澱粉が加工される。上記の初期加水分解は、通常、上記高温で５分間行われる。その部分的に加水分解された澱粉を、次に、第二タンクに移して、８５〜９０℃の温度で約１hrインキュベートして、１０〜１５のデキストロース当量（Ｄ．Ｅ．）が得られる。
【００３５】
グルコアミラーゼの存在下で、さらに加水分解して、澱粉の非還元性末端からＤ−グルコースを放出させるか、または類縁のオリゴ糖と多糖の分子を放出させるステップが、通常、別個のタンク内で３０〜６０℃の低温で行われる。その基質液の温度は５５〜６０℃まで下げる方が好ましい。その溶液のpHは、６〜６．５から、３〜５．５の範囲まで下げる。その溶液のpHは、４〜４．５が好ましい。その溶液にグルコアミラーゼを添加して、反応を２４〜７２時間、好ましくは３６〜４８時間実施する。
【００３６】
本発明の熱安定グルコアミラーゼを使用することによって、糖化方法を、従来のバッチ式糖化方法より高い温度で実施することができる。本発明によれば、糖化は、６０℃以上〜８０℃の範囲、好ましくは６３〜７５℃の範囲の温度で実施できる。このことは、従来のバッチ式方法（上記）および連続糖化法の両者に当てはまる。
【００３７】
実際に、一つ以上の膜分離ステップすなわち濾過ステップを含む連続糖化方法は、膜の上に適度に高いフラックス（flux）を維持できるように、６０℃を超える温度で行わねばならない。したがって、本発明の熱安定グルコアミラーゼによって、工業的糖化方法として許容できる適正な価格と時間内で大規模な連続糖化方法を実施することができる。本発明によれば、糖化時間は一層、短くすることができる。
【００３８】
本発明のグルコアミラーゼの活性は、従来利用されている３０〜６０℃の温度の場合と比べて、６０℃〜８０℃の温度で一般にかなり高い。したがって、グルコアミラーゼが作用する温度を上げることによって、糖化方法を、より短い時間内で実施できるか、または酵素の添加量を少なくして実施することができる。
【００３９】
本発明のグルコアミラーゼの熱安定性は、例えば、市販されているアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（すなわちＡＭＧ）に比べて非常に高いので、糖化工程中で失活するグルコアミラーゼを取り替えるために加える必要があるグルコアミラーゼの量が減少する。本発明によれば、糖化工程中、一層多くのグルコアミラーゼが活性のまゝ維持される。さらに、糖化工程を６３℃より高い温度で実施すると、微生物による汚染の危険性も低下する。
【００４０】
比活性（マルトースに対する活性として測定）が高いグルコアミラーゼを使用することによって、糖化工程で必要な酵素の添加量を少なくすることができる。
本発明のグルコアミラーゼを有利に使用できる糖化工程の実例としては、JP3-224493, JP1-191693, JP62-272987 、およびEP452,238 に記載されている工程がある。
別の側面で、本発明は、本発明のグルコアミラーゼを用いる酵素による糖化ステップを含んでなる、液化澱粉溶液を糖化する方法に関する。
【００４１】
本発明のグルコアミラーゼは、少なくとも四つのグルコシル残基を有する分子のα−（１→６）グルコシド結合だけを加水分解する酵素と組み合わせて、本発明の方法で使用することができる。本発明のグルコアミラーゼは、プルラナーゼまたはイソアミラーゼと組み合わせて使用することが好ましい。脱分枝を行うためにイソアミラーゼとプルラナーゼを使用すること、これらの酵素の分子特性およびこれらの酵素とグルコアミラーゼの使用の可能性については、G.M.A.Van Beynumら著、“Starch Conversion Technology", Marcel Dekker  ニューヨーク、1985年101 〜142 頁に記載されている。
【００４２】
別の側面で、本発明は、澱粉転化法における、本発明のグルコアミラーゼの使用に関する。
さらに、本発明のグルコアミラーゼは、連続糖化ステップを含む連続澱粉転化法に使用できる。
【００４３】
また、本発明のグルコアミラーゼは、固定化された形態で使用できる。これは、マルトースシロップなどの特殊シロップを製造するのに、さらに、フルクトースシロップの製造と関連してオリゴ糖のラフィネート流（raffinate stream）を得るのに適しており使用されることが多い。
また、本発明のグルコアミラーゼは、燃料または嗜好飲料用のエタノールを製造する方法にも使用することができ、または、クエン酸、アスコルビン酸、リシン、グルタミン酸などの有機化合物を製造する醗酵法にも使用できる。
【００４４】
材料と方法
材料
酵素類：
寄託された糸状真菌のタラロミセス・エメルソニイCBS No. 793.97由来のグルコアミラーゼは、the Centraal bureau voor Schimmel cultures，オランダ，バーン 3740AG の私書箱273 に、特許の手続のため下記の日付けで寄託した。ＣＢＳはブダペスト条約に基づいた国際寄託当局であり、前記条約の第九規則にしたがって寄託微生物を保管する。
寄託日：１９９７年６月２日
寄託者の参照番号：NN049253
ＣＢＳの呼称：CBS 793.97
【００４５】
Boelら、EMBO J.,  ３巻（５）号1097〜1102頁1984年に開示されている、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼＧ１は、Novo Nordiskから入手することができ、配列番号：９に示してある。
【００４６】
菌株類：
JaL228：この菌株の構築は国際特許願公開第WO 98/12300 号に記載されている。SM0110：この菌株の構築は実施例６に記載されている。
酵母菌株：サッカロミセス・セレビシエYNG318：MATa leu2-D2 Ura3-52 his4-539 pep4-D1 〔Ci1+〕。
【００４７】
遺伝子類：
エイ・ニガーのＧ１グルコアミラーゼの遺伝子を配列番号：８に示す。ティー・エメルソニイのグルコアミラーゼのイントロン含有遺伝子を、図５と配列番号：３３に示す。これらのイントロンは図５に示してある。
【００４８】
プラスミド類
pJS0026 （エス・セレビシエの発現プラスミド）（J.S.Okkels、1996年“A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol.782 of the Annals of the New York Academy of Sciences ）。より具体的に述べると、pYES2.0 の誘導可能GAL1−プロモーターを、サッカロミセス・セレビシエ由来の構成的に発現されるＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）−プロモーターで置換し（AlbertおよびKarwasaki, J.Mol.Appl Genet., １巻419 〜434 頁1982年）次いでURA3プロモーターの部分を欠失させることによって、発現プラスミドpJS026がpYES2.0 から誘導される。
【００４９】
pJaL497 ；このプラスミドの構築については実施例５に記載されている。
pJaL507 ；このプラスミドの構築については実施例５に記載されている。
pJaL510 ；このプラスミドの構築については実施例５に記載されている。
pJaL511 ；このプラスミドの構築については実施例５に記載されている。
pJaL518 ；このプラスミドの構築については実施例６に記載されている。
pCaHj483；このプラスミドの構築については実施例６に記載されている。
pJRoy10 ；このプラスミドの構築については実施例６に記載されている。
pJRoy17 ；このプラスミドの構築については実施例６に記載されている。
pSM0127 ；このプラスミドの構築については実施例６に記載されている。
pCR （商標）II；米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のInvitrogen Corpora
tionから入手可能。
【００５０】
装置：
自動ＤＮＡ配列分析装置（Applied Biosystems Model 377）
【００５１】
培地：
SC-ura培地：
Yeast Nitrogen w/o ami                                  ７．５ｇ
コハク酸（Ravsyre ）                                  １１．３ｇ
NaOH                                                    ６．８ｇ
カサミノ酸（casamino acid ）ｗ／ｏ  ｖｉｔ              ５．６ｇ
トリプトファン                                          ０．１ｇ
蒸留水（残量）                                        １０００ml
１２１℃で２０分間オートクレーブにかける。
５％トレオニンの滅菌貯蔵溶液からの４mlを、滅菌２０％グルコース１００mlとともに、９００mlの容積に加える。
【００５２】
ＹＰＤ培地：
酵母エキス                                                １０ｇ
ペプトン                                                  ２０ｇ
蒸留水（残量）                                        １０００ml
１２１℃で２０分間オートクレーブにかける。
滅菌２０％グルコース１００mlを９００mlに加える。
【００５３】
方法：
ＡＧＵの活性の測定
Novoアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）１単位を、下記標準条件下で１分間当り１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量と定義する。
基質………マルトース
温度………２５℃
pH…………４．３（酢酸緩衝液）
反応時間…３０分間
この分析法（AF22）の詳細説明書は請求のあり次第入手できる。
【００５４】
ＰＵＮの活性の測定
プルラン（０．２％プルラン、４０℃、pH５．０）を加水分解して、１マイクロ−モルのグルコースに等しい還元力を有する還元性炭水化物を１分間当り放出する酵素の量と、ＰＵＮを定義する。
AFAUの活性の測定
AFAUの活性を、０．１７ｇ／ｌの濃度の澱粉のpH２．５、４０℃における還元力として算出して求め、ヨウ素−澱粉反応で測定される。
【００５５】
ＡＭＧの熱安定性Ｉ〔Ｔ1/2 （半減期）〕の測定
グルコアミラーゼの熱安定性〔Ｔ1/2 （半減期）として測定〕を、下記の方法を利用して試験する。９５０μｌの５０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）（NaOAc ）を７０℃で５分間インキュベートする。緩衝液中５０μｌの酵素（４AGU ／ml）を添加する。４０μｌずつ二つの試料を、固定した時間間隔をおいて０〜３６０分間にわたって採取して氷上で冷却する。これら試料を冷却した後、残留酵素の活性を、ＡＧＵ測定検定法（上記）を使用して測定する。
インキュベーションを行う前（０分）に測定した活性（AGU ／ml）を基準（１００％）として利用する。Ｔ1/2 は、比活性の百分率が５０％まで低下する時間である。
【００５６】
熱安定性IIの測定
1600μｌの上澄液と 400μｌの0.5M NaAC （pH４．５）を混合する。
上記混合物が２５０μｌずつ入っている７本のエッペンドルフ管各々を、Perkin Elmer thermocycler で、６８℃または７０℃にて、０，５，１０，２０，３０，４５および６０分間インキュベートする。
【００５７】
各混合物からの 100μｌずつを、微量滴定ウェル中の５mM  CNPG3(genzyme 由来の２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトトリオシド）１００μｌと混合する。３７℃で３０分間インキュベートした後、４０５nmの吸光度を測定する。
【００５８】
グルコアミラーゼの比活性の測定
750μｌの基質を、選択した温度、例えば３７℃、６０℃または７０℃で、５分間インキュベートする。
酢酸ナトリウムで希釈した酵素５０μｌを添加して、活性を、上記ＡＧＵ標準法を用いて測定した。酢酸ナトリウムで希釈した酵素５０μｌを、予め加熱した 750μｌの基質に添加することによって、動的パラメータのｋcat とＫm を４５℃で測定する。 100μｌずつを、０，３，６，９および１２分後に取り出して、 100μｌの０．４Ｍ水酸化ナトリウムに移して反応を停止させる。ブランクを一つとっておく。
【００５９】
２０μｌを微量滴定プレートに移して、２００μｌのGOD-Perid 溶液を加える。室温で３０分間インキュベートした後、６５０nmの吸光度を測定する。グルコースを基準として使用して、比活性をｋcat （sec -1）として算出する。
【００６０】
アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の形質転換（一般的な方法）
１００mlのＹＰＤ（Sherman ら“Methods in Yeast Genetics"、1981年、Cold Spring Harbor Laboratory ）に、エイ・オリゼの胞子を接種し、次いで撹拌しながら２４hrインキュベートする。ミラクロス（miracloth ）で濾過することによって菌糸体を収穫し、次いで0.6M MaSO4 200mlで洗浄する。その菌糸体を1.2M MaSO4、10mM NaHPO4 の溶液（pH５．８）１５mlに懸濁させる。その懸濁液を氷上で冷却し、１２０mgのNovozym （商標）２３４を含有する緩衝液１mlを添加する。５分後、12mg／ml BSA（Sigma タイプＨ２５）１mlを添加し、顕微鏡で点検される試料中に、多数のプロトプラストが肉眼で見えるまで、ゆるやかに撹拌しながら、３７℃で１．５〜２．５hr、インキュベーションを続けた。
【００６１】
得られた懸濁液をミラクロスで濾過し、濾液を、滅菌試験管に移し、０．６Ｍソルビトール、１００mMトリス−ＨＣｌ（pH７．０）の溶液５mlで覆う。１０００ｇで１５分間、遠心分離を行い、プロトプラストをＭｇＳＯ4 のクッションの上面から収集する。２容積のＳＴＣ〔１．２Ｍソルビトール、１０mMのトリス−HCl(pH7.5)、10mM CaCl2〕をプロトプラストの懸濁液に添加し、その混合物を1000ｇで５分間遠心分離する。得られたプロトプラストのペレットを３mlのＳＴＣ中に再び懸濁させ、次に再度ペレット化する。この操作を繰り返す。最後に、プロトプラストを０．２〜１mlのＳＴＣ中に再懸濁させる。
【００６２】
100μｌのプロトプラスト懸濁液を、５〜２５μｇのp3SR2 〔Hynes ら、Mol. and Cel.Biol.３巻８号1430〜1439頁1983年８月に記載されている、エイ・ニデュランス（A. nidulans ）のａｍｄｓ遺伝子を保持するプラスミド〕を含有する１０μｌのＳＴＣと混合する。得られた混合物を２５分間室温で放置する。６０％  PEG4000 (BDH29576)、10mM CaCl2および１０mMトリスＨＣｌ（pH７．５）の溶液０．２mlを添加し、注意深く混合し（２回）、最後に、同じ溶液０．８５mlを添加し、注意深く混合する。その混合物を、室温で２５分間放置し、2,500 ｇで１５分間遠心分離し、得られたペレットを１．２Ｍソルビトール２ml中に再懸濁する。
【００６３】
もう一回、沈降させた後、そのプロトプラストを、１．０Ｍスクロース（pH７．０）、１０mMアセトアミド（窒素源）および２０mM  CsClが入っているミニマルプレート（minimal plate)(Cove, Biochem.Biophys.Acta 、113 巻51〜56頁1966年）上に塗抹し、バックグランド増殖（background growth ）を阻止する。３７℃で４〜７日間インキュベートした後、胞子を採取し、滅菌水中に懸濁させ、単コロニーとして塗抹する。この手順を繰り返し、第二の再単離を行った後、単コロニーの胞子を規定の形質転換体として貯蔵する。
【００６４】
フェド・バッチ醗酵
フェド・バッチ醗酵を、炭素源としてのマルトデキストリン窒素源としての尿素および酵母エキスを含有する培地で実施する。このフェド・バッチ醗酵は、対象の真菌宿主細胞の振盪フラスコ培養物を、前記炭素源３．５％と前記窒素源０．５％を含有する培地中に接種することによって行う。pH５．０で３４℃にて２hr培養した後、追加の炭素源と窒素源の連続供給を開始する。
【００６５】
炭素源を限界因子（limiting factor ）として保持し、酸素が過剰に存在することを保証する。そのフェド・バッチ培養は、４日間続け、その後、遠心分離、限外濾過、透明濾過（clear filtration）および胚芽濾過（germ filtration ）を行って酵素を回収することができる。当該技術分野で公知のアニオン交換クロマトグラフィー法で、さらなる精製を行うことができる。
【００６６】
サッカロミセス・セレビシエＹＮＧ３１８の形質転換
ＤＮＡフラグメントと開環ベクターを混合し、次いで、標準方法によって酵母のサッカロミセス・セレビシエＹＮＧ３１８を形質転換する。
【００６７】
実施例
実施例１．精製
野生型醗酵で得た、０．０５AGU ／mlのティー・エメルソニイの培養ブロス３５００mlを、9000rpm で遠心分離し、次いで濾紙を使って減圧濾過し、最後にブランク濾過（blank filtration）を行った。次に以下を手順を使って酵素を精製した。
フェニルセファロース（２５０ml）：1.3M AMS／10mMトリス／２mMCaCl2 、pH  ７；１０mMトリス／２mM  CaCl2 、pH７で溶出。
透析：２０mM  NaAc、２mM  CaCl2 、pH５。
Ｑセファロース（100ml ）：20mM NaAc 、２mM  CaCl2 、pH５；10カラム容積を超える0.〜0.4M NaCl の線形勾配液で溶出。
透析：20mM  NaAc、２mM  CaCl2 、pH５。
着色除去：０．５％コール（coal）、１０分間。
Ｑセファロース（２０ml）：２０mM  NaAc、２mM CaCl2、pH4.5; 10 カラム容積を  超える０〜0.4M NaCl の線形勾配で溶出。
透析：20mM、２mM  CaCl2 、pH５。
Ｓセファロース（１ml）：５mMクエン酸  pH2.9; 10 カラム容積を超える０〜0.3M NaCl の線形勾配液で溶出。
上記Ｓセファロースのステップの後、９０％を超える酵素の純度が得られた。
【００６８】
実施例２．タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの特性決定
精製されたタラロミセス・エメルソニイCBS 793.97グルコアミラーゼを特性を決定するのに使用した。
分子量（Ｍw ）
分子量は、SDS-PAGEで測定した結果、図１に示すように約７０KDa であった。
ＰＩ
ＰＩは、等電点電気泳動法によって測定した結果、３．５未満であった（Pharmacia から入手できるAmploline PAG 、pH３．５〜９．５）。
【００６９】
pH特性
タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼのpH−活性依存性を測定し、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼの特性と比較した。
pH活性の特性を、基質として０．５％マルトースを使用し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中で６０℃にて測定した。０．１〜１AGU ／mlを含有する二つずつの試料で測定した。試験結果を図２に示す。
【００７０】
温度特性
本発明のタラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの温度−活性依存性を測定して、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼの特性と比較した。０．５％マルトース（pH４．３）２００μｌを３７，５０，６０，７０，７５，８０および９０℃でインキュベートし、次に、１０μｌの酵素（０．２５AGU ／ml）を添加することによって反応を開始させた。反応時間は１０分間であった。試験結果を図３に示す。
【００７１】
温度安定性−Ｔ1/2 （半減期）
タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの熱安定性を測定して、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼの熱安定性と比較した。使用した方法は、“材料と方法”の項に、“ＡＭＧの熱安定性Ｉ〔Ｔ1/2 （半減期）〕の測定”として先に述べた方法である。
タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの半減期を測定したところ、７０℃で約１２０分であった。アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼのＴ1/2 は、同条件下で測定して７分であった（図４参照）。
【００７２】
比活性
２８０nmにおける吸光度とタンパク質濃度に基づいて、延長係数（extension coefficient ）を測定した結果、ε＝２．４４ml／mg* cmであった。次に、３７℃におけるマルトースに対する比活性を算出した結果、７．３AGU ／mgであった。試料の純度が約９０％であったので、比活性の修正値は８．０AGU ／mgである。下記比活性が測定された。
【００７３】
【表１】
0004718005.tif 000002
【００７４】
実施例３．ティー・エメルソニイのグルコアミラーゼのＮ末端のアミノ酸配列の
決定
ティー・エメルソニイのグルコアミラーゼのＮ末端のアミノ酸配列を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＰＶＤＦ膜への電気泳動的転写によって決定した。ペプチドは、リシル特異的プロテアーゼによって開裂させることによって、還元しかつＳ−カルボキシメチル化させたグルコアミラーゼから誘導したペプチドであった。得られたペプチドを分画し次にＲＰ−ＨＰＬＣを使って再び精製してから、Ｎ−末端の配列を決定した。
【００７５】
Ｎ−末端の配列（配列番号：１）：
Ala Asn Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Xaa Pro Ile Ala
Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly
ペプチド１（配列番号：２）：
Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu
Gly Glu Pro Lys
【００７６】
ペプチド２（配列番号：３）：
Xaa Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Xaa Gly Arg Pro Gln
Arg Asp Gly Pro Ala Leu
ペプチド３（配列番号：４）：
Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly
Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala
Asn His Lys
【００７７】
ペプチド４（配列番号：５）：
Thr Xaa Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys
ペプチド５（配列番号：６）：
Ala Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser
Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp
Ser Trp Gln
Ｘａａは指定することができなかった残基を意味する。
【００７８】
実施例４．全長のティ・エメルソニイのグルコアミラーゼ
配列番号：７に示す全長のティ・エメルソニイのグルコアミラーゼのアミノ酸配列を標準の方法を使って同定した。
【００７９】
実施例５．タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの遺伝子のクローン
化と配列決定
タラロミセス・エメルソニイＡＭＧの遺伝子の、ＰＣＲでクローン化する部分。
タラロミセス・エメルソニイＡＭＧをクローン化するために、下記表２に示す縮重されたプライマーを、ＡＭＧ遺伝子の部分をＰＣＲで増幅するために設計した。
【００８０】
【表２】
0004718005.tif 000003
【００８１】
タラロミセス・エメルソニイ由来のゲノムＤＮＡを、標準の方法でつくったプロトプラストから調整し（例えば、Christensen ら、Biotechnology 、６巻1419〜1422頁1989年参照）し、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。Ｔａｑ−ポリメラーゼ２．５単位、エイ・オリゼのゲノムＤＮＡ  100ng 、50mM KCl、10mMトリス−HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl2 、250nM の各dNTP、ならびに100pM の下記各プライマーのセット：102434／117360，102434／117361，102435／117360，102434／117361，102434／127420および102434／127420を含有する 100μｌ容積で、増幅反応を行った。
【００８２】
増幅は、Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480 で実施し、９４℃で３分間の１サイクル、これに続く、９４℃で１分、４０℃で３０秒および７２℃で１分の３０サイクルで構成された増幅であった。ＰＣＲ反応102434／117360だけが産物を提供した。1400, 800, 650および５２５bpのサイズの四つのバンドが検出された。これら四つのバンドをすべて精製し、ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１〔Invitrogen（登録商標）〕中にクローン化した。各バンド由来のいくつかのクローンの配列を決定し、エイ・ニガーＡＭＧと配列を比較した結果、６５０bpのバンド由来のクローンがタラロミセス・エメルソニイＡＭＧのＮ末端部分をコードすることが明らかになった。このクローンをpJaL497 と命名した。
【００８３】
前記遺伝子をより多く得るため、特異的プライマー（123036：5'-GTGAGCCCAAGTTCAATGTG-3'( 配列番号：１５）を、クローンpJaL497 の配列で製造した。プライマーのセット123036／127420をタラロミセスのゲノムＤＮＡにＰＣＲを用いて、1500bpの単フラグメントを得た。そのＰＣＲフラグメントをベクターpCR2.1中にクローン化して配列を決定した。配列を決定することによって、そのクローンは、タラロミセス・エメルソニイＡＭＧのＣ末端部分をコードすることが確認された。そのクローンをpJaL507 と命名した。
【００８４】
ゲノムの制限地図の作成およびゲノムクローンのクローン化
上記二つのクローンpJaL497 とpJaL507 とで、前記ＡＭＧ遺伝子の約９５％を占めていた。前記ＡＭＧ遺伝子の欠けている部分（missing part）をクローン化するため、これら二つのＰＣＲフラグメントを、プローブとして、単一の制限酵素またはいくつもの制限酵素を組み合わせたもので消化されたタラロミセス・エメルソニイのゲノムＤＮＡのサザンブロットに使用することによって、ゲノム制限地図を作成した。この地図は、タラロミセス・エメルソニイＡＭＧの遺伝子が、二つのEcoRI フラグメントに位置し、それぞれ約５．６kbと約６．３kbであることを示している。
【００８５】
タラロミセス・エメルソニイのゲノムＤＮＡをEcoRI で消化し、大きさが４〜７kbのフラグメントを精製し、これを、製造業者の使用説明書（Stratagene）に記載されているように使用して、λ2APII 中に部分ゲノムライブラリーを構築した。そのライブラリーを、第一に、pJaL497 由来の０．７kbのEcoRI フラグメント（ＡＭＧ遺伝子のＮ末端の1/2 をコードする）をプローブとして用いて選別して、ＡＭＧ遺伝子の出発物(start）を得た。クローン１種を得て、pJaL511 と命名した。pJaL507 由来の０．７５kbのEcoRV フラグメント（ＡＭＧ遺伝子のＣ末端の1/2 をコードする）をプローブとして使用して、前記ライブラリーの第二の選別を行って、ＡＭＧ遺伝子のＣ末端を得た。１種のクローンが得られ、pJaL510 と命名した。
【００８６】
タラロミセス・エメルソニイＡＭＧの遺伝子の配列分析
プラスミド類：pJaL497, pJaL507, pJaL510 およびpJaL511 ならびにそれらのサブクローンの配列を、ｐＵＣに対する標準の復帰(reverse）プライマーと前進(forward）プライマーを用いて決定することによって、ＡＭＧ遺伝子の配列を得た。残りのｇａｂは、特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して閉じた。
【００８７】
上記配列を、アスペルギルス属の真菌中のイントロンのコンセンサス配列およびエイ・ニガーのＡＭＧの配列と比較することによって、潜在イントロン（potential intron）が見出された。タラロミセス・エメルソニイＡＭＧのヌクレオチド配列は、６１８のアミノ酸のタンパク質をコードし、それぞれ、５７bp、５５bp、４８bpおよび５９bpの四つのイントロンで遮断された(interrupt）オープンリーディングフレームを有している。そのヌクレオチド配列（イントロン含有）と推定アミノ酸配列を図５に示す。
【００８８】
また、そのＤＮＡ配列（イントロン含有）を配列番号：３３に示し、そしてタラロミセス・エメルソニイＡＭＧの配列（１〜２７のシグナル配列含有）を配列番号：３４に示す。前記推定アミノ酸配列を、エイ・オリゼＡＭＧとエイ・ニガーＡＭＧと比較したところ、同一度（identity）がそれぞれ６０．１％と６０．５％であった。図６に示すアミノ酸配列の配列状態は、タラロミセスＡＭＧが、触媒ドメインと澱粉結合ドメインの間に非常に短いヒンジ部を有していることを示している。このことは、エイ・オリゼＡＭＧにも見られる。
【００８９】
実施例６．アスペルギルスのベクターｐＣａＨｊ４８３の構築
pCaHj483の構築を図７に示す。このプラスミドは下記のフラグメントから構築する。
ａ）EcoRI とXbaIで切断されたベクターpToC65（国際特許願公開第WO91／17243 号）。
【００９０】
ｂ）ａｍｄｓ遺伝子(C. M. Corrickら、Gene, 53巻63〜71頁1987年）を保持するエイ・ニデュランス由来の2.7kb のXbaIフラグメント。このａｍｄｓ遺伝子は、真菌を形質転換する際の選択マーカーとして使用される。このamds遺伝子は変形されて、この遺伝子中に通常、存在しているBamHI 部位が破壊されている。この破壊は、プライマー：5'-AGAAATCGGGTATCCTTTCAG-3'(配列番号：１６）を使って、サイレントポイント突然変異を導入することによって行った。
【００９１】
ｃ）エイ・ニデュランスのｔｐｉ遺伝子のｍＲＮＡの５’−非翻訳末端をコードする配列の60bp DNAフラグメントに融合されたエイ・ニガーのＮＡ２プロモーターを保持する０．６kbの EcoRI／BamHI フラグメント。上記ＮＡ２プロモーターは、プラスミドｐＮＡ２（国際特許願公開第WO89／01969 号に記載されている）から単離し、次いで６０bpのｔｐｉ配列に、ＰＣＲによって融合させる。６０bpのｔｐｉ配列をコードするプライマーは下記の配列であった。
【００９２】
5'-GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC-3'(配列番号：１７）
ｄ）エイ・ニガーのグルコアミラーゼの転写ターミネーターを保持する６７５bpのＸｂａＩフラグメント。このフラグメントは、プラスミドpICAMG／Term（欧州特許第 0238023号に記載されている）から単離した。
フラグメントｃのBamHI 部位を、フラグメントｄの転写ターミネーターの先頭のXbaI部位に、pIC19Rリンカーを介して接続した（BamHI からXbaI）。
【００９３】
ＡＭＧ発現プラスミドｐＪａＬ５１８の構築
タラロミセス・エメルソニイＡＭＧ遺伝子のコード領域を、下記の二つのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
プライマー139746：5'-GACAGATCTCCACCATGGCGTCCCTCGTTG-3'（配列番号：１８）、および
プライマー139747：5'-GACCTCGAGTCACTGCCAACTATCGTC-3'(配列番号：１９）
を使用して、ＰＣＲによって増幅した。下線をつけた領域は、タラロミセス・エメルソニイＡＭＧ遺伝子内に存在する配列を示す。クローン化を容易にするため、各プライマーの５’末端に、制限酵素部位を挿入した。プライマー139746はBglIII部位を含有し、そしてプライマー139747はXhoI部位を含有している。
【００９４】
タラロミセス・エメルソニイのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ、１００ngのｐＳ０２，２５nMの各ｄＮＴＰ、および上記２種のプライマー各々の１０pmolを含有する反応緩衝液（50mM KCl、10mMトリス−HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl2 ） 100μｌの容積内で実施した。
【００９５】
増幅はPerkin-Elmer Cetus DNA Termal 480 で実施したが、９４℃で３分間の１サイクルと、これに続く９４℃で１分、５５℃で３０秒および７２℃で１分の２５サイクルで構成されている。このＰＣＲ反応によって、長さが2099bpの単一のＤＮＡフラグメントが産生された。このフラグメントをBglII とXhoIで消化し、次いでゲル電気泳動法で単離し、精製し、次にBamHI とXhoIで消化したpCaHj483中にクローン化してプラスミドを得、これをpJaL518 と命名した。このように、プラスミドpJaL518 が構築されて、タラロミセス・エメルソニイＡＭＧ遺伝子用の真菌発現プラスミド（図８）が得られた。
【００９６】
アスペルギルス・ニガー菌株、ＳＭ０１１０の構築
１．エイ・ニガーのpyrG遺伝子のクローン化
製造業者の説明書に記載されているようにして、エイ・ニガーBO-1をEMBL4 中に作製した。公開されたアスペルギルス・ニガーの配列（Wilsonら、Nucleic Acids Res., 16巻2339〜2339頁1988年）から設計した、ＤＩＧで標識したオリゴヌクレオチド〔PyrG：5'-CCCTCACCAGGGGAATGCTGCAGTTGATG-3'(配列番号：２０）〕によって、前記ライブラリーを選別した。上記ＤＩＧプローブとハイブリッドを形成した陽性のEMBL4 クローンをBO-1ライブラリーから単離し、次に、pyrG遺伝子を含有する3.9kb のXbalフラグメントをEMBL4 からサブクローン化し次いでpUC118中にクローン化してpJRoy10 を作製した。
【００９７】
２．エイ・ニガーのグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）の遺伝子のクローン化
下記のオリゴヌクレオチド950847：5'-CGCCATTCTCGGCGACTT-3'（配列番号：２１）とオリゴヌクレオチド951216：5'-CGCCGCGGTATTCTGCAG-3'（配列番号：２２）〔公開されたアスペルギルス・ニガーの配列（Boelら、EMBO J., 3巻1581〜1585頁1984年）から設計された〕を用いて、エイ・ニガーのゲノムＤＮＡ上で増幅することによって生成させたＤＩＧ標識化ＰＣＲフラグメントで、上記エイ・ニガーのＢＯ−１ライブラリーを選別した。上記ＤＩＧプローブとハイブリッドを形成した陽性のEMBL4 クローンをＢＯ−１ライブラリーから単離し、次にそのＥＭＢＬ４クローンから、ＡＭＧ遺伝子を含有する4.0kb のSpeIフラグメントをサブクローン化し次いでプラスミドpJRoy17aを生成するpBluescriptSkt中にクローン化した。
【００９８】
３．エイ・ニガーＡＭＧの分断カセット（disruption cassette)の構築
pyrGを含有する２．３kbのSpeI−XhoIフラグメントを、pJRoy10 からゲルで単離し、その制限末端にクレノウポリメラーゼを充填した。そのフラグメントを、ＡＭＧ遺伝子内で切断してプラスミドpSM0127 を生成するpJRoy17 のBglIII部位中に挿入した（図９）。pSM0127aの二つのSpeI部位の間に、２．２kbの５’ＡＭＧと２．３kbの３’ＡＭＧが隣接している２．３kbのpyrG遺伝子が入っている。
【００９９】
４．ＡＭＧを得るため分断されたエイ・ニガーの株：SM0110の構築
エイ・ニガーのJRoyP3は、エイ・ニガーBO-1のpyrGの自然突然変異体であり、これを選別して５’−フルオロ−オロト酸（5'-FOA）が入っているプレート上で増殖させた。pyrG遺伝子は、オロチジン５’−ホスフェートカルボキシラーゼをコードするので、その欠失変異体はウリジン要求株として特徴づけることができる。pyrG変異体の同一性は、最少培地での増殖が、エイ・ニデュランスのpyrG遺伝子と相補的であることによって確認された。
【０１００】
２０μｇのプラスミドpSM0127 をSpeIで消化した。そのＤＮＡを０．８％のアガロースゲル上で分割し(resolve）、線状分断カセットからなる６kbをゲルで単離した。その線状ＤＮＡで菌株ＪＲｏｙＰ３を形質転換した。次にＳｐｅＩで消化した２００の形質転換体からゲノムＤＮＡを調製した。前記ゲルで分割したＤＮＡをハイボンドナイロン（hybond nylon）フィルターに移し、ＡＭＧのオープンリーディングフレームからなる非放射性ＤＩＧプローブとハイブリッドを形成させた。分断カセットをＡＭＧ遺伝子座へ入れることによって、野生型の４kb  ＡＭＧのバンドが６．３kbまで増大した。この増大は２．３kbのｐｙｒＧ遺伝子によるものである。上記特性を有する一つの形質転換体＃１１０を選別してさらに分析した。
【０１０１】
形質転換体＃１１０を、ＹＰＭ培地が入っている２５mlの振盪フラスコ中で増殖させた。菌株ＢＯ−１と親菌株JRoyP3を、ＡＭＧ産生の対照物として増殖させた。３日後、３０μｌの透明上澄み液を、８〜１６％のSDS PAGE Novexゲル上で泳動させた。ＡＭＧのバンドは形質転換体＃１１０中に全く見られなかったが、ＡＭＧの多数のバンドが、正の対照の菌株BO-1と親菌株JRoyP3に産生した。形質転換体#110をSM0110と命名した。
【０１０２】
アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス・ニガーにおけるタラロミセス・エメルソニイＡＭＧの発現
JaL228とSM0110の菌株を、Christensen ら、Biotechnology, 6巻1419〜1422頁1988年に記載されているようにしてpJaL518 で形質転換した。一般に、エイ・オリゼの菌糸体を富栄養ブロス中で増殖させた。その菌糸体を、前記ブロスから濾過によって分離した。酵素製剤Novozyme（登録商標）（Novo Nordisk）を、リン酸ナトリウムによってpH５．０に緩衝された１．２Ｍ  ＭｇＳＯ4 などのような浸透によって安定化する緩衝液中の前記菌糸体に添加した。
【０１０３】
得られた懸濁液を、撹拌しながら、３７℃で６０分間インキュベートした。プロトプラストをミラクロスで濾過して菌糸体の破片を除いた。そのプロトプラストを収穫して、STC(1.2Mソルビトール、10mM CaCl2、10mMトリス−HCl pH7.5)で２回洗浄した。最後に、プロトプラストを、 200〜1000μｌのＳＴＣ中に再懸濁させた。
【０１０４】
形質転換を行うため、５μｇのＤＮＡを 100μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、次に 200μｌの PEG溶液（60％PEG4000 、10mM CaCl2、10mMトリス−HCl 、pH7.5)を添加して、その混合物を室温で２０分間インキュベートした。プロトプラストを収穫して、１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。最後に、そのプロトプラストを、２０μｌの１．２Ｍソルビトール中に再び懸濁させ、選択プレート上にプレートし〔最少培地＋10ｇ／ｌのBacto-Agar（Difco)〕、次いで３７℃でインキュベートした。３７℃で３〜４日間、増殖させると、安定な形質転換体が、激しく増殖して胞子を形成するコロニーとして出現する。形質転換体は胞子で２回単離された。
【０１０５】
振盪フラスコ内の100ml のＹＰＭ培地（２ｇ／ｌの酵母エキス、２ｇ／ｌのペプトンおよび２％のマルトース）中で、形質転換体を、３０℃で４日間増殖させた。上澄み液を、先に述べたようにしてＡＭＧ活性について試験し、次いでSDS PAGEゲルで分析した（図１０）。
【０１０６】
実施例７．酵母内で発現させるために行う、タラロミセス・エメルソニイＡＭＧ
のＤＮＡ配列からの四つのイントロンの除去
各エキソンについて、隣りのエキソンに対しオーバーラップ部分を含有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。Tal1とTal4は、酵母ベクターpJSO026 とのオーバーラップ部分を含有している。エキソン１：Ｔａｌ１は５’プライマーとして使用し、そしてTal5は３’プライマーとして用い、そしてＡＭＧをコードするゲノム配列を鋳型として使った。エキソン２：Ｔａｌ６を５’プライマーとして使い、そしてTal7を３’プライマーとして使用し、そしてＡＭＧをコードするゲノム配列を鋳型として使用した。
【０１０７】
エキソン３：Ｔａｌ８を５’プライマーとして使用し、そしてTal9を３’プライマーとして使用し、そしてＡＭＧをコードするゲノム配列を鋳型として使用した。エキソン４：Tal10 を５’プライマーとして使用し、そしてTal11 を３’プライマーとして用いそしてＡＭＧをコードするゲノム配列を鋳型として使用した。エキソン５：Tal12 を５’プライマーとして使用し、そしてTal4を３’プライマーとして使用し、そしてＡＭＧをコードするゲノム配列を鋳型として使用した。
【０１０８】
最後のＰＣＲ反応を行って、上記五つのエキソンを、完全なコード配列を含有する配列に結合させた。このＰＣＲ反応において、最初のＰＣＲ反応由来の前記五つのフラグメントを鋳型として使用し、そしてTal1を５’プライマーとして用い、そしてTal4を３’プライマーとして使用した。
コード領域を含有するこの最後のＰＣＲフラグメントを用いて、（コード領域を取出し同時に各末端に約２０bpのオーバーラップ部分をつくり、組み換え事象を可能にするため）制限酵素ＳｍａＩ（またはBamHI)およびXbaIで切断したpJS026で、酵母内にて生体内組換えを行った。
【０１０９】
Tal 1 : 5'-CAA TAT AAA CGA CGG TAC CCG GGA GAT CTC CAC CATG GCG TCC CTC GTT G-3'（配列番号：２３）；
Tal 4 : 5'-CTA ATT ACA TCA TGC GGC CCT CTA GAT CAC TGC CAA CTA TCG TC-3'（配列番号：２４）；
Tal 5 : 5'-AAT TTG GGT CGC TCC TGC TCG-3'(配列番号：２５）；
Tal 6 : 5'-CGA GCA GGA GCG ACC CAA ATT ATT TCT ACT CCT GGA CAC G-3'(配列番号：２６）；
【０１１０】
Tal 7 : 5'-GAT GAG ATA GTT CGC ATA CG-3'（配列番号：２７）；
Tal 8 : 5'-CGT ATG CGA ACT ATC TCA TCG ACA ACG GCG AGG CTT CGA CTG C-3'(配列番号：２８）；
Tal 9 : 5'-CGA AGG TGG ATG AGT TCC AG-3'（配列番号：２９）；
Tal 10 : 5'-CTG GAA CTC ATC CAC CTT CGA CCT CTG GGA AGA AGT AGA AGG-3'（配列番号：３０）；
Tal 11 : 5'-GAC AAT ACT CAG ATA TCC ATC-3'（配列番号：３１）；
Tal 12 : 5'-GAT GGA TAT CTG AGT ATT GTC GAG AAA TAT ACT CCC TCA GAC G-3'（配列番号：３２）
【０１１１】
実施例８．タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの酵母内での発現
酵母のサッカロミセス・セレビシエYNG318内で、タラロミセス・エメルソニイのＡＭＧを発現させるため、酵母発現ベクターpJS026を、上記“材料と方法”の項に記載したようにして構築した。
【０１１２】
標準の方法(Sambrooksら、“Molecular Cloning : A Laboratory Manual ”第２版1989年、コールド・スプリング・ハーバー参照）によって、タラロミセスＡＭＧをコードするＤＮＡ配列を含有するｐＪＳ０２６で、前記酵母を形質転換した。
得られた酵母細胞を、Sc-ura培地内で、３０℃にて３日間増殖させ、続いて、ＹＰＤ内で３日間増殖させた。次に、その培養物を遠心分離し、次いで、上澄み液を使用して、“材料と方法”の項に記載した熱安定性の検定を行った。
【０１１３】
酵母内で発現させたタラロミセスＡＭＧの、６８℃における熱安定性
酵母（サッカロミセス・セレビシエYNG318）内で発現させたタラロミセス・エメルソニイＡＭＧの醗酵ブロスを使用し、“熱安定性IIの測定”の項で先に述べた方法を利用して６８℃における熱安定性を測定した。試験結果を図１２に示す。
【０１１４】
実施例９．エイ・ニガーＨｏｗＢ１１２を用いて産生させた組換えタラロミセス
ＡＭＧの精製
タラロミセス・エメルソニイ遺伝子を保持するエイ・ニガーHowB112 を醗酵させて得た培養ブロス２００mlを、9000rpm で遠心分離し、次に、２０mM  NaOAc （pH５）に対して一夜透析した。次にその溶液を、２０mM  NaOAc 溶液（pH５）内で予め平衡させておいたＳセファロースカラム（２００ml）に注入した。グルコアミラーゼを溶出液中に集め、次に20mM NaOAc (pH4.5)内で予め平衡させておいたＱセファロースカラム（５０ml）に注入した。未結合物質をＱセファロースカラムから洗い落とし、次に２０mM  ＮａＯＡｃ中０〜0.3M NaCl の直線勾配液の１０カラム容積を超える量を使用して、グルコアミラーゼを溶離した。
【０１１５】
グルコアミラーゼの画分の純度をSDS-PAGEでチェックしたところ一つのシングルバンドだけが見られた。その分子量は、野生型グルコアミラーゼについて見られるように、やはり、約７０kdalであることが見出された。マルトースに対する比活性を測定したところ、野生型酵素についてのデータによって、８．０AGU ／mg（３７℃）と２１．０AGU ／mg（６０℃）という比活性が見出された。
【０１１６】
実施例１０．動力学的パラメータ
アスペルギルス・ニガー内で発現されたアスペルギルス・ニガーのＡＭＧおよび組換えタラロミセス・エメルソニイＡＭＧによるマルトースおよびイソマルトースの加水分解反応の動力学的パラメータ。
【０１１７】
【表３】
0004718005.tif 000004
【０１１８】
【表４】
0004718005.tif 000005
【０１１９】
実施例１１．エイ・ニガー内で産生された組換えタラロミセス・エメルソニイＡ
ＭＧの糖化性能
タラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼの糖化性能を、酸性α−アミラーゼとプルラナーゼの添加ありとなしで、各種温度で試験した。糖化反応は下記の条件下で行った。
基質：１０DEマルトデキストリン、約３０％DS（ｗ／ｗ）
温度：６０，６５または７０℃
初期pH：４．５
【０１２０】
酵素添加量：
エイ・ニガー内で産生される組換えタラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼ：０．２４または0.32AGU/g DS
エイ・ニガー由来の酸性α−アミラーゼ：0.020AFAU/g DS
バシラス属細菌由来のプルラナーゼ：0.03PUN/g DS
タラロミセスＡＭＧだけを使用する場合、高添加量（0.32AGU/g DS）で添加し、その外の場合は低添加量すなわち0.24AGU/g DSで添加した。
【０１２１】
糖化
糖化に使用する基質を、マルトデキストリン（普通トウモロコシから調製した）を沸騰Milli-Q 水に溶解し、その乾燥物質を約３０％（ｗ／ｗ）に調節することによって製造した。pHは４．５に調節した（６０℃で測定）。１５０ｇの乾燥固形分に相当する基質の部分を、５００mlのブルーキャップガラスフラスコに移し、撹拌しながら、それぞれの温度の湯浴中に入れた。酵素を添加し、次に、必要に応じてpHを再調節した（インキュベーション温度において測定）。試料を定期的に採取し、HPLCで分析して、炭水化物の組成を測定した。
【０１２２】
糖化中に産生されたグルコースを下記の表に示し、左側三つの欄はグルコアミラーゼと酸性αアミラーゼとプルラナーゼによる糖化を示し、右側三つの欄はグルコアミラーゼだけによる糖化を示す。数字はDSに対する％ＤＰ１である。
【０１２３】
【表５】
0004718005.tif 000006
【０１２４】
0.03mg/g DS に相当する0.24AGU/g DSの酵素添加量を用いて、９５％を超えるグルコースの収率を、７２hr後に得た。エイ・ニガーのＡＭＧの一般的な添加量は、0.09mg/g DS に相当する0.18AGU/g DSであり、この場合、９５〜９６％の収率でグルコースが得られる。したがって糖化法で必要な、タラロミセスＡＭＧのmg酵素タンパク質の酵素添加量は、ティー・エメルソニイＡＭＧの比活性が高いため、エイ・ニガーＡＭＧと比べて有意に低い。
【０１２５】
実施例１２．酵母内で発現された組換えタラロミセス・エメルソニイのＡＭＧの
温度安定性−Ｔ1/2 （半減期）
酵母内で発現された組換えタラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼ（実施例９に記載の方法を利用して精製）の熱安定性を、“材料と方法”の項に“ＡＭＧの熱安定性Ｉ〔Ｔ1/2 （半減期）〕の測定”として先に記載した方法を利用して、７０℃、pH４．５、０．２AGU ／mlで測定した。
図１３は試験結果を示す。酵母内で発現された組換えタラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼのＴ1/2 は、測定の結果、７０℃で約１１０分であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の精製されたタラロミセス・エメルソニイCBS 793.97のグルコアミラーゼの分子量（Mw）を測定するのに使用したSDS-PAGEゲル（クーマシー・ブルーで染色）を示す。
１：標準マーカー
２：Ｑセファロースのプール（１．ラン）
３：Ｓセファロースのプール
【図２】  図２は、６０℃の０．５％マルトース内でのタラロミセス・エメルソニイとアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）のpH−活性のグラフを示す。
【図３】  図３は、タラロミセス・エメルソニイCBS 793.97のグルコアミラーゼ対アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）の温度−活性のグラフを示す。
【図４】  図４は、タラロミセス・エメルソニイCBS 793.97のグルコアミラーゼ対アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）の50mM NaOAc、0.2AGU／ml、pH4.5 における７０℃でのＴ1/2 （半減期）を測定するための曲線を示す。
【図５】  図５は、タラロミセス・エメルソニイのＡＭＧの遺伝子座の配列を示す。予測アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示してある。四つのイントロンは小文字で示してある。コンセンサスイントロンの配列には下線を施してある。推定シグナルとプロペプチドにはそれぞれ２本の下線と点線の下線をつけてある。
【図６】  図６は、エイ・ニガーのＡＭＧ（An amg-1. pro) 、エイ・オリゼのＡＭＧ（Ao AMG. pro) 、およびタラロミセス・エメルソニイのＡＭＧ（Tal-AMG. pro) のアミノ酸配列の配列状態／比較を示す。同じアミノ酸は＊印で示してある。シグナルペプチドとプロペプチドにはそれぞれ、一本下線と二本下線を施してある。
【図７】  図７は、実施例５で使用したアスペルギルス属真菌の発現カセットｐＣａＨｊ４８３を示す。
【図８】  図８は、タラロミセス・エメルソニイのＡＭＧの遺伝子に用いるアスペルギルス属真菌の発現プラスミドpJa1518 を示す。
【図９】  図９は、エイ・ニガーの分断プラスミドの構築を示す。
【図１０】  図１０は、本発明のタラロミセス・エメルソニイのグルコアミラーゼを発現する２種の形質転換体のJaL228#5.77 とHowB112#8.10のSDS Pageゲルを示す。JaL228とHowB112 は形質転換されていない親の株である。MwはProgmaのタンパク質の分子量である。
【図１１】  図１１は、菌株Ａ．ニガーHowB112 が産生するティー・エメルソニイのAMG の熱安定性〔50mM NaOAc (pH4.5)、70℃、0.2AGU／mlで測定〕を示す。測定した結果、Ｔ1/2 は２０分間であった。
【図１２】  図１２は、酵母内で産生され、酵母内で発現されたティー・エメルソニイのＡＭＧおよびエイ・ニガーのＡＭＧの醗酵ブロスの６８℃における熱安定を比較する図である。
【図１３】  図１３は、酵母中で産生された組換えタラロミセス・エメルソニイＡＭＧの（７０℃、pH４．５、０．２AGU ／mlにおける熱安定性の測定試験結果を示す。測定した結果、Ｔ1/2 は約１１０℃であった。
【配列表】
0004718005.tif 000007
0004718005.tif 000008
0004718005.tif 000009
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0004718005.tif 000015
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0004718005.tif 000019
0004718005.tif 000020
0004718005.tif 000021
0004718005.tif 000022
【図１】
0004718005.tif 000023
【図２】
0004718005.tif 000024
【図３】
0004718005.tif 000025
【図４】
0004718005.tif 000026
【図５】
0004718005.tif 000027
0004718005.tif 000028
0004718005.tif 000029
0004718005.tif 000030
【図６】
0004718005.tif 000031
0004718005.tif 000032
【図７】
0004718005.tif 000033
【図８】
0004718005.tif 000034
【図９】
0004718005.tif 000035
0004718005.tif 000036
【図１０】
0004718005.tif 000037
【図１１】
0004718005.tif 000038
【図１２】
0004718005.tif 000039
【図１３】
0004718005.tif 000040