(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＧＤＮＦファミリー受容体α−４（ＧＦＲα−４）をコードする、単離されたもしくは実質的に純粋な形態の核酸分子であって、配列番号５、６もしくは７に記載される配列を有するか、または前記配列に９０％以上の配列同一性を有する、前記核酸分子。
【請求項２】
配列番号８もしくは９に記載されるアミノ酸配列を有する哺乳動物のＧＤＮＦファミリー受容体α−４（ＧＦＲα−４）をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子である、請求項１または２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる単離されたＧＦＲα−４受容体。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸分子を含んで成るＤＮＡ発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項８】
細胞が真核生物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項７もしくは８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
細胞が、ヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３もしくはＣｏｓ−７細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＧＦＲα−４受容体タンパク質を発現することが可能なトランスジーンを含んで成り、前記トランスジーンが請求項１から４のいずれかに記載の核酸分子を含んで成る、非ヒトトランスジェニック細胞、組織もしくは生物体。
【請求項１２】
配列番号８もしくは９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号８もしくは９に記載される配列と少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を有する、単離された哺乳動物のＧＦＲα−４受容体。
【請求項１３】
配列番号８もしくは９に記載されるアミノ酸配列を有するＧＦＲα−４受容体タンパク質に特異的な抗体。
【請求項１４】
請求項５もしくは１２に記載の受容体を、試験されるべき細胞抽出物もしくは化合物と接触させること、および前記受容体に結合されるいかなる分子も単離することを含んで成る、ＧＦＲα−４受容体タンパク質のリガンドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、本明細書でＧＦＲα−４と呼称される新規哺乳動物受容体タンパク質のクローニングおよび発現、ならびにとりわけ、単離された核酸、受容体タンパク質またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含んで成る製薬学的組成物と一緒に、ＧＦＲα−４タンパク質をコードする単離された核酸配列、前記核酸配列を含んで成る発現ベクター、前記ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされた宿主細胞、単離されたＧＦＲα４タンパク質、ＧＦＲα−４に関してアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する化合物、および、それらの同定方法に関する。
【０００２】
神経栄養増殖因子は、ニューロンの分化、発生および維持に関与する。これらのタンパク質は、多様な型のニューロン細胞の変性を予防しかつ生存を促進することができ、そして従って神経変性性疾患の潜在的治療薬である。膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、ニューロトロフィンと構造的に別個の神経栄養因子の成長する一サブファミリーの最初のメンバーであった。ＧＤＮＦは、アミノ酸配列内の７個の高度に保存されたシステイン残基の特異的パターンを特徴とする、増殖因子のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの遠縁に関係する一メンバーである（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ、１９９４）。ＧＤＮＦは、元は、インビトロでの胚の腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンの生存および機能を維持するその能力に基づくアッセイを使用して精製された（Ｌｉｎら、１９９３）。中枢（ＣＮＳ）もしくは末梢神経系（ＰＮＳ）における他のニューロン細胞型がＧＤＮＦの生存効果に応答性であることが示されている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４、Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏら、１９９５、Ｍｏｕｎｔら、１９９５、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、１９９５）。ＧＤＮＦは不活性なプロ形態（ｐｒｏｆｏｒｍ）で細胞により産生され、これはＲＸＸＲ認識部位で特異的に切断されて活性のＧＤＮＦを産生する（Ｌｉｎら、１９９３）。ドーパミン作動性ニューロンに対するその影響のゆえに、臨床試験は、パーキンソン病（脳の黒質中のドーパミン作動性細胞の高パーセンテージ（７０％まで）の喪失を特徴とする普遍的な神経変性性障害）の可能な治療薬としてＧＤＮＦを評価している。ＧＤＮＦの外因性の投与は、パーキンソン病の動物モデルにおいて強力な保護効果を有する（Ｈｅｎｅｄｅｒｓｏｎら、１９９４、Ｂｅｃｋら、１９９５、Ｔｏｍａｃら、１９９５、Ｙａｎら、１９９５、Ｇａｓｈら、１９９６、Ｃｈｏｉ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９７、Ｂｉｌａｎｇ−Ｂｌｅｕｅｌら、１９９７、Ｍａｎｄｅｌら、１９９７）。
【０００３】
最近、神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーの３つの新たなメンバーが発見された。ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（ＮＴＮ）は、培養物中の交感神経ニューロンの生存を促進する能力に基づくアッセイを使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からの馴化培地から精製された（Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら、１９９６）。成熟ニュールツリンタンパク質は成熟ＧＤＮＦに５７％類似である。ペルセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（ＰＳＰ）はゲノムＤＮＡを使用する縮重プライマーＰＣＲにより発見された。該成熟タンパク質は、成熟ＧＤＮＦと同様、培養物中で腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンおよび運動ニューロンの生存を促進する（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら、１９９８）。成熟ＧＤＮＦおよびニュールツリンとの成熟ペルセフィンタンパク質の類似性は約５０％である。非常に最近、公的なＥＭＢＬデータベース中のゲノムＤＮＡ情報を使用して第四のメンバーがクローン化され、そしてエノビン（Ｅｎｏｖｉｎ）（ＥＶＮ）（Ｍａｓｕｒｅら、１９９９）もしくはアルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）（ＡＲＴＮ）（Ｂａｌｏｈら、１９９８ｂ）と名づけられた。この因子はＮＴＮおよびＰＳＰに±５７％類似であり、そして主として末梢ニューロンに作用する。
【０００４】
全４種のＧＤＮＦファミリーのメンバーは、下流の細胞内シグナル伝達を実施するためにヘテロ二量体の受容体複合体を必要とする。ＧＤＮＦは、ＧＤＮＦファミリー受容体α１（ＧＦＲα−１；ＧＤＮＦＲα、ＲＥＴＬ１もしくはＴｒｎＲ１ともまた命名される；ＧＦＲα命名法委員会、１９９７）サブユニット、すなわちグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に固定される膜タンパク質に結合する（Ｊｉｎｇら、１９９６、Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６、Ｓａｎｉｃｏｌａら、１９９７）。ＧＤＮＦ／ＧＦＲα−１複合体は、その後、ｃＲＥＴ癌原遺伝子（膜結合されたチロシンキナーゼ）に結合しかつこれを活性化し（Ｄｕｒｂｅｃら、１９９６、Ｔｒｕｐｐら、１９９６）、ｃＲＥＴ中のチロシン残基のリン酸化および下流のシグナル伝達経路のその後の活性化をもたらす（Ｗｏｒｂｙら、１９９６）。ＧＦＲα−１に類似であるＧＦＲα−２（ＲＥＴＬ２、ＮＴＮＲ−α、ＧＤＮＦＲ−βもしくはＴｒｎＲ２ともまた命名される）が、多数の異なるグループにより同定されている（Ｂａｌｏｈら、１９９７、Ｓａｎｉｃｏｌａら、１９９７、Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏら、１９９７、Ｓｕｖａｎｔｏら、１９９７）。ヒトＧＦＲα−１およびＧＦＲα−２受容体サブユニットは、タンパク質配列により４９％同一かつ６３％類似であり、３１個のシステイン残基のうち３０個が保存されている。双方の受容体は、膜へのＧＰＩ固定に関与するそれらのカルボキシ末端の疎水性ドメインを含有する。ＧＦＲα−１およびＧＦＲα−２はほとんど全部の組織中で広範に発現され、そして発現は発生的に制御されることができる（Ｓａｎｉｃｏｌａら、１９９７、Ｗｉｄｅｎｆａｌｋら、１９９７）。
【０００５】
ＧＦＲα−１はＧＤＮＦの好ましい受容体である一方、ＧＦＲα−２は優先的にニュールツリンを結合する（Ｊｉｎｇら、１９９６、Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６、Ｋｌｅｉｎら、１９９７）。しかしながら、ＧＤＮＦはｃＲＥＴの存在下でＧＦＲα−２に結合することができ（Ｓａｎｉｃｏｌａら、１９９７）、また、ニュールツリンは低親和性でＧＦＲα−１に結合することができる（Ｋｌｅｉｎら、１９９７）ため、これらの増殖因子と受容体との間になんらかの漏話（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）が存在することもまた明白である。従って、ＧＤＮＦおよびニュールツリンは神経栄養性のシグナル伝達系の一部であり、それにより異なるリガンド結合サブユニット（ＧＦＲα−１およびＧＦＲα−２）が同一のチロシンキナーゼサブユニット（ｃＲＥＴ）と相互作用することができる。
【０００６】
最近、補助受容体のＧＦＲαファミリーの第三のメンバー、ＧＦＲα−３が記述された（Ｊｉｎｇら、１９９７、Ｍａｓｕｒｅら、１９９８、Ｗｏｒｂｙら、１９９８、Ｎａｖｅｉｌｈａｎら、１９９８、Ｂａｌｏｈら、１９９８ａ）。この受容体のアミノ酸配列はＧＦＲα−１およびＧＦＲα−２双方に３５％同一である。ＧＦＲα−３は発生中のもしくは成体のＣＮＳ中で発現されないが、しかし、ＰＮＳの数種の発生中のおよび成体の知覚および交感神経節中で高度に発現される（Ｗｉｄｅｎｆａｌｋら、１９９８、Ｎａｖｅｉｌｈａｎら、１９９８、Ｂａｌｏｈら、１９９８ａ）。ＧＦＲα−３はエノビン／アルテミンの好ましい補助受容体であることが示されており、また、ｃＲＥＴを介してシグナル伝達もまたする（Ｍａｓｕｒｅら、１９９９、Ｂａｌｏｈら、１９９８ｂ）。ＥＶＮ／ＡＲＴＮとＧＦＲα−１との間の漏話もまた、少なくともインビトロで可能であるようである。
【０００７】
ＧＦＲαファミリーの第四のメンバーがニワトリで同定され（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９８）、そしてｃＲＥＴを介してペルセフィンのシグナル伝達を媒介することが示されている（Ｅｎｏｋｉｄｏら、１９９８）。哺乳動物のペルセフィン受容体をコードする機能的な哺乳動物の相同物が、それでもなお発見されなくてはならない。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書でＧＦＲα−４と呼称されるＧＤＮＦファミリーのさらなる新規哺乳動物受容体を同定した。該ＤＮＡ配列をクローン化し、そして、該受容体をコードする多数のスプライス変異体もまた同定した。
【０００９】
従って、本発明により、ＧＦＲα−４と呼称される哺乳動物ＧＤＮＦファミリー受容体α−４をコードする、単離されたもしくは実質的に純粋な形態の核酸が提供される。該核酸分子は好ましくはラット、マウスもしくはヒトからである。好ましくは、前記核酸分子によりコードされる受容体は、配列番号８もしくは９に具体的に説明される、または前記受容体の機能的同等物、誘導体もしくは生物前駆体（ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）をコードするアミノ酸配列を含んで成る。
【００１０】
とは言え、当初、ＧＦＲαの４メンバーのみが既知であったという事実のゆえに、新たな受容体は以前、ＧＦＲα−５と呼ばれていた。しかしながら、ＧＦＲαファミリーメンバーの現存する命名法に応諾し、そして本発明のＧＦＲα受容体はニワトリＧＦＲα−４受容体の哺乳動物の正規物（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）であることを示すために、それは今やα−４と命名された。
【００１１】
従って、本発明は、哺乳動物のＧＤＮＦファミリー受容体α−４（ＧＦＲα−４）、またはその免疫学的におよび／もしくは生物学的に活性のフラグメントをコードする核酸分子に関し、それは、
（ａ）配列番号８もしくは９に描かれるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５もしくは６に描かれるようなコーディング配列を含んで成るヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドから生じられるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）その相補鎖が（ａ）ないし（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｅ）そのアミノ酸配列が（ａ）ないし（ｄ）のいずれか１つのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対する３０％もしくはそれ以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのフラグメントもしくはエピトープを担持する部分を含んで成るペルセフィンを結合することが可能なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の最低１５の連続するヌクレオチドを含んで成りかつペルセフィンを結合することが可能なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）ないし（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重されるヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列
より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１２】
有利には、本発明の核酸分子は、適切な発現ベクターを使用して、例えば宿主細胞などにおける前記ＧＦＲα−４タンパク質の発現に使用することができる。好ましくは、該核酸分子は、配列番号５ないし７のいずれかに具体的に説明されるような配列を有するＤＮＡ分子、およびなおより好ましくはｃＤＮＡ分子、もしくはその相補物である。あるいは、該核酸分子は、高ストリンジェンシーの条件下の本発明の配列もしくはその相補物にハイブリダイズすることが可能である。本明細書で使用されるところのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸が安定である条件を指す。ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは、式：
８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］＋０．４１（％ＧおよびＣ）−６００１／ｌ
により近似することができ、
ここでｌはヌクレオチド中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、配列相同性における１％の減少ごとにおよそ１〜１．５℃減少する。
【００１３】
本発明の核酸分子にハイブリダイズすることが可能な核酸は、本発明のヌクレオチド配列に一般に最低７０％、好ましくは最低８０もしくは９０％、そしてより好ましくは最低９５％相同であることができる。
【００１４】
有利には、アンチセンス分子は、プローブとして、もしくは医薬として、または製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤と一緒に製薬学的組成物中で使用することができる。
【００１５】
本発明の第二の局面に従えば、本発明のＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡ発現ベクターが提供される。このベクターは、有利には、宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクションして本発明のＧＦＲα−４の発現を達成するのに使用することができる。好ましくは、該ＤＮＡは、宿主細胞のその後のトランスフェクションもしくは形質転換のためプラスミド中に包含される。
【００１６】
本発明の発現ベクターは、前記ＤＮＡフラグメントの発現を遂げることが可能である、プロモーター領域のような調節配列に操作可能に連結される本発明の核酸を有するベクターを包含する。「操作可能に連結される」という用語は、記述される成分がそれらの意図された様式でそれらが機能することを可能にする関係にある並置を指す。こうしたベクターを、適する宿主細胞に形質転換して、本発明のポリペプチドの発現を提供することができる。従って、さらなる一局面において、本発明は、本発明の受容体の製造方法を提供し、それは、受容体をコードするコーディング配列のベクターによる発現を提供する条件下で、上述されたような発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされた宿主細胞を培養すること、および発現された受容体を回収することを含んで成る。
【００１７】
ベクターは、例えば、複製開始点、場合によっては前記ヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および場合によってはプロモーターの調節因子とともに提供されるプラスミド、ウイルスもしくはファージベクターであることができる。該ベクターは例えばアンピシリン耐性のような１種もしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有することができる。
【００１８】
発現に必要とされる調節要素は、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのような、およびシャイン・ダルガーノ配列中の転写開始のためのプロモーター、ならびに開始コドンＡＵＧを包含することができる。同様に、真核生物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種もしくは同種のプロモーター、下流のポリアデニル酸化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボソームの分離のための終止コドンを包含することができる。こうしたベクターは、商業的に得ることができるか、もしくは当該技術分野で公知の方法により記述される配列から集成することができる。
【００１９】
本発明の核酸分子は、アンチセンスＲＮＡの産生を提供するために、記述されるベクターにアンチセンスの向きで挿入することができる。アンチセンスＲＮＡもしくは他のアンチセンス核酸は合成手段により製造することができる。
【００２０】
本発明に従えば、定義される核酸は同一の核酸のみならず、しかしとりわけ保存的アミノ酸置換における縮重コドンのため同義コドン（同一のアミノ酸残基を明記する異なるコドン）をもたらす塩基の置換を包含するいずれかのアミノ塩基（ａｍｉｎｏ  ｂａｓｅ）の変動もまた包含する。「核酸配列」という用語は、塩基の変動に関して与えられるいずれかの一本鎖配列に対する相補的配列もまた包含する。
【００２１】
本発明は、本発明の核酸の最低およそ１０の連続するヌクレオチド、および好ましくは１０から５０個までのヌクレオチドの核酸配列もまた有利に提供する。これらの配列は、有利には、複製を開始するプローブもしくはプライマーなどとして使用することができる。こうした核酸配列は、組換えもしくは合成手段によるような当該技術分野で公知の技術に従って製造することができる。それらは、本発明の核酸の存在を検出するための診断キットなどでもまた使用することができる。これらの試験は、一般に、ハイブリダイズする条件下でプローブをサンプルと接触させること、およびプローブとサンプル中のいずれかの核酸との間のいかなる二重鎖もしくは三重鎖の形成の存在についても検出することを含んで成る。
【００２２】
本発明により、これらのプローブを固体支持体に固定することができる。好ましくは、それらは複数のプローブが単一の生物学的サンプルに同時にハイブリダイズすることができるように１個のアレイ上に存在する。プローブは、アレイ上にスポットすることができるか、もしくはアレイ上で現場で合成することができる（Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１４、１９９６年１２月“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ”を参照されたい）。単一のアレイは、別個の位置に１００、５００もしくは１，０００以上の異なるプローブさえ含有することができる。
【００２３】
本発明の核酸配列は、例えば、クローン化されることが望ましい遺伝子の一領域に対するおよそ１０から５０個までのヌクレオチドであることができる一対のプライマーを作成すること、該プライマーをｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはヒト細胞からのゲノムＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、増幅された領域もしくはフラグメントを単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを一般に必要とするＰＣＲクローン化機構を使用することのような、こうした組換えもしくは合成の手段を使用して、製造することができる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８９）に記述されるような、本明細書で定義されるような技術は、当該技術分野で公知である。
【００２４】
本発明の核酸もしくはオリゴヌクレオチドは、示す標識を担持することができる。適する標識は32Ｐもしくは35Ｓのような放射性同位元素、酵素ラベル、またはビオチンのような他のタンパク質標識、または蛍光マーカーを包含する。こうした標識を本発明の核酸もしくはオリゴヌクレオチドに付加することができ、そしてそれ自体既知の技術を使用して検出することができる。
【００２５】
本発明は、その範囲内に、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質もしくはポリペプチド、またはその機能的同等物、誘導体もしくは生物前駆体もまた含んで成る。好ましくは、該タンパク質は配列番号８および９のアミノ酸配列を含んで成る。
【００２６】
本明細書で定義されるところの「機能的同等物」は、同一の特性を表す受容体を意味するように解釈されるべきであり、また、本発明のＧＦＲα−４受容体と機能的に関連すべきである。「誘導体」は、その中である種のアミノ酸が変えられもしくは欠失されもしくは置き換えられていることができるポリペプチドもしくはタンパク質を意味すると解釈されるべきであり、また、このポリペプチドもしくはタンパク質は、前記ＧＦＲα−４受容体の生物学的活性を保持し、そして／もしくは攻撃する抗原として本発明の受容体を使用して生じられる抗体と交差反応することができる。
【００２７】
融合タンパク質およびフラグメントを包含する、ハイブリッドおよび改変された形態の本発明のＧＦＲα−４受容体が本発明の範囲内に包含される。ハイブリッドおよび改変された形態は、例えば、ある種のアミノ酸が例えば点突然変異によるようななんらかの改変もしくは置換にかけられている場合、そしてなお本発明のＧＦＲα−４受容体と同一の受容体特異性を所有するタンパク質をもたらすものを包含する。
【００２８】
この情況において、生物学的活性、受容体特異性および機能的受容体（フラグメント）という用語は、好ましくは特異的にペルセフィンを結合する能力を好ましく包含すること、ならびに本発明のＧＦＲα−４はＧＤＮＦ、ＮＴＮおよび／もしくはＥＶＮ／ＡＲＴに対し結合活性を有しないかもしくは実質的に有しないことが理解される。本発明のＧＦＲα−４、その変異体、誘導体およびフラグメントの生物学的活性、受容体特異性および／もしくは機能性、例えば結合活性は、好ましくは付属として付けられる実施例に記述されるような、当該技術分野で公知の方法に従って測定することができる。好ましくは、ペルセフィンに対する本発明のＧＦＲα−４のＫDは、下述される実施例に従って測定される場合に１ないし１０×１０-9、とりわけ好ましくは５．９±２．８×１０-9であり；表６の記述を参照されたい。
【００２９】
本発明のタンパク質は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドを包含しかつ保存的アミノ酸変化を有する、前記分子によりコードされる全部の可能なアミノ酸変異体を包含すると解釈されるべきである。本発明のタンパク質もしくはポリペプチドは、前記タンパク質もしくはポリペプチドに実質的に相同である天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する、こうした配列の変異体をさらに包含する。この情況において、実質的相同性は、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質もしくはポリペプチドと最低７０％、および好ましくは８０もしくは９０％のアミノ酸相同性を有する配列とみなされる。
【００３０】
実質的相同性は、本発明のＧＦＲα−４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列がある程度の配列の同一性を表すことを意味すると解釈されるべきである。好ましくは、それらは、最低３０％、好ましくは４０％、より好ましくは５０％、なおより好ましくは６０％、最も好ましくは７０％の同一性を共有し、そして、とりわけ、最低８０％、好ましくは９０％以上およびなおより好ましくは９５％以上の同一性が、それぞれ配列番号５ないし９に描かれるヌクレオチドもしくはアミノ酸配列に関して望ましい。クエリ配列（本発明の配列）と対象配列（包括的配列整列ともまた称される）との間の最良の全体的合致の好ましい一決定方法は、例えばＢｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６（１９９０）、２３７−２４５。）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列の整列においては、クエリおよび対象配列は双方がＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに転化することにより比較することができる。前記包括的配列整列の結果はパーセントの同一性である。相同性／同一性を決定するために使用することができるさらなるプログラムを下および実施例に記述する。上述された配列に相同である配列は、例えば、同一の生物学的機能を有する、とりわけ同一のもしくは実質的に同一の受容体特異性、すなわち結合特異性をもつタンパク質をコードする改変を表す前記配列の変異である。それらは、他の哺乳動物からの配列のような天然に存在する変異、もしくは突然変異であることができる。これらの突然変異は天然に生じるか、もしくは突然変異誘発技術により得ることができる。対立遺伝子の変異は、天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに合成で製造されたもしくは遺伝子的に工作された変異体であることができる。好ましい一態様において、配列はマウス、より好ましくはヒトから生じられる。これらの配列は未だ知られていない機能のヌクレオチド配列を用いて現存するデータベースから復活させることもまたできる。例えば、クエリ配列として同定されたラットＧＦＲα−４配列を使用するＥＭＢＬデータベースでのＢＬＡＳＴ検索は、ラットＧＦＲα−４配列の部分（エキソン２、３および４）とほとんど同一の部分とともに、ゲノムマウス配列（受託番号ＡＦ１５５９６０）およびゲノムヒト配列（受託番号ＡＣ０１７１１３；ヒトゲノムＤＮＡ由来のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇｓ．）を含有する）を生じた。これらのヌクレオチド配列もまた本発明に包含される。
【００３１】
本発明のさらなる一局面は、本明細書に記述されるＤＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞それ自身を含んで成り、この宿主細胞は、好ましくは例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞もしくは酵母細胞などであることができる真核生物細胞を含んで成る。一態様において、該細胞はヒト胚腎細胞および好ましくはＨＥＫ２９３細胞系の細胞を含んで成る。あるいは、該細胞はＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞もしくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはＣＯＳ−７細胞を含むことができる。
【００３２】
本発明のＧＦＲα−４を発現する、または前記受容体の機能的同等物、誘導体もしくは生物前駆体を発現することが可能なトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含んで成るトランスジェニックの細胞、組織もしくは生物体が、本発明によりさらに提供される。本明細書で使用されるところの「発現が可能なトランスジーン」という用語は、ＧＦＲα−４と同一の機能および／もしくは活性を有するヒト受容体の発現につながる適する核酸配列を意味する。トランスジーンは、例えば、ラット細胞から単離されたゲノム核酸、または、ゲノム中にもしくは染色体外状態で組込まれるｃＤＮＡを包含する合成核酸を包含することができる。好ましくは、トランスジーンは、本発明のＧＦＲα−４をコードする核酸配列、もしくは前記核酸の機能的フラグメントを含んで成る。前記核酸の機能的フラグメントは、ＧＦＲα−４受容体または前記ＧＦＲα−４の機能的同等物もしくは生物前駆体をコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡのフラグメントを意味すると解釈されるべきであり、このフラグメントは機能的受容体タンパク質を産生するよう発現されることが可能である。例えば、該遺伝子は、欠失もしくは突然変異を含むことができるが、しかし機能的受容体をなおコードすることができる。
【００３３】
配列番号２に具体的に説明されるアミノ酸配列を有する単離もしくは精製されたＧＦＲα−４タンパク質、または前記受容体の機能的フラグメントもしくは生物前駆体、あるいは本発明のトランスジェニックの細胞、組織もしくは生物体により発現されるＧＦＲα−４タンパク質が、本発明によりさらに提供される。ＧＦＲα−４を発現する細胞からの膜調製物もまた本発明により提供される。
【００３４】
本発明は、アンチセンスの技術の使用によりインビボでＧＦＲα−４を阻害することにさらに向けられる。アンチセンスの技術は、三重ヘリックス形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより遺伝子発現を制御するのに使用することができ、この方法の双方はＤＮＡもしくはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明のタンパク質をコードする成熟タンパク質配列の５’コーディング部分を使用して、長さが１０から４０塩基対までのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の一領域に相補性であるように設計し（三重ヘリックス−Ｌｅｅら  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３６０（１９９１）を参照されたい）、それによりＧＦＲα−４の転写および産生を予防する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＧＦＲα−４受容体への翻訳を封鎖する。
【００３５】
本発明のＧＦＲα−４受容体に対する抗体もまた提供され、これは医薬もしくは製薬学的組成物中で使用することができる。
【００３６】
本発明のＧＦＲα−４に対する抗体は、有利には、当該技術分野で既知である技術により製造することができる。例えば、本発明のポリペプチドもしくはそのエピトープをマウスのような宿主動物に接種すること、および免疫血清を回収することにより、ポリクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｒ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６、４９５−４９７により記述されるような既知技術に従って製造することができる。
【００３７】
本発明の抗体は、該抗体をサンプルと反応させること、およびそれに結合されたいかなるタンパク質も同定することにより、ＧＦＲα−４の存在についての検出方法でもまた使用することができる。本発明の抗体、および抗体を前記サンプルと反応させるための手段を含んで成る、前記方法を実施するためのキットもまた提供することができる。
【００３８】
有利には、本発明の抗体は、医薬として、もしくは本発明のＧＦＲα−４の発現に関連する疾患を治療するための医薬の製造においてもまた使用することができる。本発明は、そのための製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤と一緒に前記抗体を含んで成る製薬学的組成物もまたさらに提供する。
【００３９】
本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質は、Ｃｈｉｅｎら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２により最初に提案された二ハイブリッドベクター系を使用してタンパク質−タンパク質相互作用を検討することにより同定することができる。
【００４０】
この技術は、レポーター遺伝子を活性化する転写因子のインビボでの機能の再構成に基づく。より具体的には、該技術は、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含んで成るＤＮＡ構築物を適切な宿主細胞に提供すること、本発明の核酸配列の一フラグメントもしくは全部の第一の融合をコードする第一のハイブリッドＤＮＡ配列および転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメインもしくは前記活性化ドメインのいずれかを宿主細胞中で発現させること、第一の融合中に組込まれない転写因子のＤＮＡ結合もしくは活性化ドメインと一緒に検討されるべき推定の結合タンパク質をコードするライブラリーなどのような最低１種の第二のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主中で発現させること；宿主細胞中でのいかなるレポーター遺伝子産物の存在についても検出することにより本発明のタンパク質との検討されるべきタンパク質のいかなる結合も検出すること；場合によっては結合タンパク質をコードする第二のハイブリッドＤＮＡ配列を単離することを含んで成る。ＧＦＲα−４受容体に結合するタンパク質はこの技術を使用して同定することができる。同定されたタンパク質は、これらのタンパク質のアゴニスト／アンタゴニストとして作用する化合物を同定するのにもまた使用することができる。該受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを設計するのに受容体の構造を使用することもまたできる。本発明は、本発明のヒトＧＦＲα−４受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストもまた含んで成り、このアゴニストもしくはアンタゴニストは、有利には、医薬として、またはそのための製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤と一緒に製薬学的組成物中で使用することもまたできる。
【００４１】
アゴニストもしくはアンタゴニストは、ＧＦＲα−４を発現する細胞を試験されるべき化合物と接触させること、および、例えば、前記細胞中でのリン酸化のレベルをモニターすること、あるいは細胞センサー（ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）、またはｃＲＥＴもしくはシグナル伝達経路中の類似のタンパク質の存在下でのリガンド結合アッセイによるような、いずれかのＧＦＲα−４に媒介される機能的もしくは生物学的応答の程度をモニターすることにより同定することができる。好ましくは、細胞は、宿主細胞もしくは本明細書で定義されるところの本発明のトランスジェニック細胞であることができる。ＧＦＲα−４のアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、ｃＲＥＴ、もしくはＧＦＲα−４が一成分であるシグナル伝達経路に関与する他の類似のタンパク質の存在下で、ＧＦＲα−４を含んで成る膜調製物を試験されるべき化合物と接触させること、およびｃＲＥＴもしくは前記類似のタンパク質とのＧＦＲα−４の相互作用をモニターすることによってもまた同定することができる。有利には、ＧＦＲα−４に関してアゴニストもしくはアンタゴニストとして同定されるいかなる化合物もしくは分子も、上で定義されるような製薬学的組成物中で、もしくは医薬としてそれら自身を使用することができる。
【００４２】
ＧＦＲα−４もしくは機能的同等物が属するシグナル伝達経路に対し作用する分子もしくは化合物もまた本発明により提供される。あるいは、該分子は、ｃＲＥＴ、もしくはＧＦＲα−４が一成分であるシグナル伝達経路中の類似のタンパク質とのＧＦＲα−４もしくはその機能的同等物の複合体形成もしくは相互作用を妨害することができる。
【００４３】
さらに、本発明は、上述されたスクリーニング法のいずれか１つ；および付加的に
（ｉ）患者に対し治療上有効な量で本発明のＧＦＲα−４のアンタゴニストもしくはアゴニストを提供するのに十分な量で、前記方法で得られたもしくは同定された化合物、またはその生理学的に許容できる類似物もしくは誘導体を合成すること；および／あるいは
（ｉｉ）前記方法で得られたもしくは同定された化合物またはその類似物もしくは誘導体を製薬学的に許容できる担体」と組み合わせること
の段階を含んで成る、前記アンタゴニストもしくはアゴニストの製造方法に関する。
【００４４】
上の方法により単離された化合物は、類似化合物の開発のためのリード化合物としてもまた作用する。類似物は、重要な官能基が、リード化合物と実質的に同一の方法でＧＦＲα−４受容体に提示されることを可能にする安定化された電気的配置および分子コンホメーションを有するべきである。とりわけ、類似化合物は、結合領域に匹敵する空間的電気的特性を有するが、しかし頻繁に約２ｋＤより下、および好ましくは約１ｋＤより下の分子量を有する、リード化合物より小さい分子であることができる。類似化合物の同定は、自己一致領域（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ）（ＳＣＦ）分析、配置相互作用（ＣＩ）分析、および通常モードの力学的分析のような技術の使用により実施することができる。これらの技術を実施するためのコンピュータプログラムが利用可能であり；例えば、Ｒｅｉｎ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（アラン  リス（Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、１９８９）。化学的誘導体および類似物の製造方法は当業者に公知であり、そして例えばＢｅｉｌｓｔｅｉｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、シュプリンガー  エディション  ニューヨーク  インク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．）、１７５  Ｆｉｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１００１０  Ｕ．Ｓ．Ａ、およびＯｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、米国ニューヨークに記述される。さらに、前記誘導体および類似物は当該技術分野で既知の方法に従ってそれらの影響について試験することができ；また上記を参照されたい。さらに、ペプチド模倣物ならびに／もしくは適切な誘導体および類似物のコンピュータに補助される設計を使用することができる。
【００４５】
ＧＦＲα−４に関してアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはＧＦＲα−４が一部であるシグナル伝達経路を妨害するリガンドもしくは化合物として同定された化合物は、例えば消化器癌のような多様な癌腫に加えて、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、末梢性ニューロパシー、脊髄損傷、家族性ヒルシュスプルング病のような神経変性性疾患の治療のための医薬の製造、およびまたＧＦＲα−４の機能不全に関連することができる疾患の治療において有利に使用することができる。アンタゴニストとして同定された化合物は、有利には、癌腫の治療のための医薬の製造もしくは痛みの緩和において使用することができる。
【００４６】
本発明は、本発明のＧＦＲα−４のリガンドの同定方法もまたさらに含んで成り、この方法は、ＧＦＲα−４のリガンドとしてのその潜在能力について試験されるべき細胞抽出物あるいは化合物のいずれかと前記受容体を接触させること、およびＧＦＲα−４に結合されたいかなる分子も単離することを含んで成る。
【００４７】
診断キットもまた本発明により提供され、このキットは、試験されるべき生物学的材料を前記核酸プローブと接触させるための手段と一緒に、本発明のＧＦＲα−４タンパク質をコードする核酸分子、高ストリンジェンシーの条件下でそれにハイブリダイズすることが可能な分子、前記核酸のフラグメント、本発明のアンチセンス分子のいずれかを包含するプローブを含んで成る。本発明の診断キットは、ＧＦＲα−４に関するアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはＧＦＲα−４に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体もまた含むことができる。従って、有利には、該キットは、例えば前記受容体もしくは遺伝子欠損などを発現するもしくはそれを欠く細胞を同定するため、またはある化合物がＧＦＲα−４受容体のアゴニストであるかもしくはアンタゴニストであるかを決定するために適切なように使用することができる。ある化合物がＧＦＲα−４に関してアゴニストであるかもしくはアンタゴニストであるかを決定するためのキットは、本発明の前記受容体を発現する細胞もしくは膜調製物、前記細胞を前記化合物と接触させるための手段、および例えば前記細胞中でのリン酸化のレベルを測定すること、あるいは細胞センサー、またはｃＲＥＴ、もしくはＧＦＲα−４が一成分であるシグナル伝達経路に関与する類似のタンパク質の存在下でのリガンド結合アッセイによりいかなるＧＦＲα−４に媒介される機能的もしくは生物学的応答のレベルもモニターするための手段を含むことができる。
ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドの合成およびＤＮＡ配列決定。
【００４８】
使用された全オリゴヌクレオチドプライマーはユーロゲンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（ベルギー・セライング）から注文した。挿入物特異的な配列決定プライマー（１５および１６ｍｅｒ）、ならびにＰＣＲ反応での使用のためのプライマーは人的に設計した。ＤＮＡは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）−チップ−２０もしくは−１００陰イオン交換もしくはキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）スピンカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＧｍｂＨ、ドイツ・デュッセルドルフ）上で調製し、そしてカラムから３０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス．ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ｐＨ８．０）中に回収した。配列決定反応は、ＡＢＩ  プリズム  ビッグダイ  ターミネーター循環（ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ）配列決定キットを使用して双方の鎖で行い、そしてアプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７７ＸＬシークェンサー（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＡＢＩ部門、米国カリフォルニア州フォスターシティ）上で行った。配列の集成および人的エディティングにシークェンチャー［Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ］（商標）ソフトウエアを使用した（ジーンコーズ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）、米国ミシガン州アナーバー）。
ＧＦＲαファミリーの新規メンバーをコードするｃＤＮＡ配列の同定
クエリ配列としてヒトＧＦＲα−１、ＧＦＲα−２もしくはＧＦＲα−３のＤＮＡもしくはタンパク質配列を使用して、公的ＥＭＢＬデータベースの毎日の最新情報でＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）検索を実施した。ＥＭＢＬ受託番号ＡＵ０３５９３８をもつマウスのＥＳＴ（発現される配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ））配列は、ＧＦＲα−１、ＧＦＲα−２およびＧＦＲα−３に対する相同性を示した。ＢＬＡＳＴ解析により得られた最小総和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（ＳＳＰ）を表１に要約する。
【００４９】
【表１】
0004810036.tif 000002
【００５０】
ＡＵ０３５９３８（配列１）はマウス脳ｃＤＮＡライブラリー由来の７９２ｂｐの配列である。翻訳に際してＧＦＲαファミリーの他のメンバーとの一貫した相同性を得るためには、該ＤＮＡ配列の位置１６５近くにフレームシフトが導入されなければならない。これが配列決定の誤りによるのかどうか、もしくは別の説明が存在するのかどうかは明らかでない。このＥＳＴ配列をクエリ配列として使用して、公的ＥＭＢＬデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索を反復した。１個の付加的クローン（受託番号ＡＡ８２３２００；配列２）が１ｅ−１８の有意のＳＳＰを生じた。マウス乳腺ｃＤＮＡライブラリー由来であったこの４９７ｂｐのクローンの検査に際して、最初の６１ｂｐのみがＡＵ０３５９３８の部分（位置３５３ないし４１５）と同一であった。ＡＡ８２３２００の配列の残りはＡＵ０３５９３８と異なったが、しかし、その翻訳されたアミノ酸配列が他のＧＦＲαと相同性を示した部分を含有した。従って、ＡＵ０３５９３８およびＡＡ８２３２００が同一の受容体の２種の変異体の形態を表す可能性があったと仮定し、これをＧＦＲα−４と呼んだ。
マウスＧＦＲα−４  ｃＤＮＡのクローニング
われわれは、最初に、マウス脳およびマウス胚由来のマラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック  ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト）でマウスＧＦＲα−４  ｃＤＮＡのフラグメントを増幅することを試みた。プライマーは、マウスＧＦＲα−４の２７４ｂｐのフラグメントを増幅するように、ＥＳＴ配列（ＥＭＢＬ受託番号ＡＵ０３５９３８およびＡＡ８２３２００）を使用して設計した。マウスＧＦＲα−４の増幅に使用されたプライマーを下の表に示す。
【００５１】
【表２】
0004810036.tif 000003
【００５２】
Ｔａｑポリメラーゼ系（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ・マンハイム）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、１×Ｔａｑ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマーＭＯＵＳＥ−ＧＦＲα４−ｓｐ２およびＭＯＵＳＥ−ＧＦＲα４−ａｐ２、１μｌのＴａｑポリメラーゼ、ならびに２μｌのマウス胚もしくはマウス脳マラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡを含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に５分間加熱し、そして、循環を、７２℃で７分の最終段階を伴い９４℃で３０秒、６０℃で１分および７２℃で４５秒で３５周期の間行った。その後、プライマーＭＯＵＳＥ−ＧＦＲα４−ｓｐ３およびＭＯＵＳＥ−ＧＦＲα４−ａｐ２を用いて、１μｌの一次ＰＣＲ反応で半ネステッドＰＣＲ（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×Ｔａｑ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマーＭＯＵＳＥ−ＧＦＲα４−ｓｐ３およびＭＯＵＳＥ−ＧＦＲα４−ａｐ２、１μｌのＴａｑポリメラーゼならびに１μｌの一次ＰＣＲ産物を含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に５分間加熱し、そして、循環を、７２℃で７分の最終段階を伴い９４℃で３０秒、６０℃で１分および７２℃で４５秒で３５周期の間行った。ＰＣＲ産物は１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ｐＨ８．３）中、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分析した。期待された大きさ（２７０ｂｐ）のＰＣＲフラグメントをゲルから切り出し、そしてキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｇｍｂｈ、ドイツ・ヒルデン）を用いて精製した。ＰＣＲフラグメントを配列決定してそれらの同一性を確認した。得られた配列はＥＳＴデータベースの配列に対応した。マウスＧＦＲα−４の上流および下流のコーディング配列を決定するため、５’および３’ＲＡＣＥ実験を実施した。これらの実験は期待されたように役に立たなかったため、また、翻訳後に他のＧＦＲαと一致した相同性を生じるにはマウスＧＦＲα−４配列中のいくつかの点でフレームシフトが導入されなければならなかったため、われわれは、マウスＧＦＲα−４のラット相同物のクローニングに移行することを決定した。
ラットＧＦＲα−４  ｃＤＮＡ配列の同定およびクローニング
上述された、受託番号ＡＵ０３５９３８およびＡＡ８２３２００をもつｃＤＮＡ配列を、専売のライフシーク（ＬｉｆｅＳｅｑ）およびズーシーク（ＺｏｏＳｅｑ）データベース（インサイト  ファーマシューティカルズ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト）でのＢＬＡＳＴ検索におけるクエリ配列として使用した。マウスＧＦＲα−４配列に対する高い相同性をもつ２個のラットクローン、すなわち番号７０１２９０９１９Ｈ１（２７０ｂｐ；ＡＵ０３５９３８（ＳＳＰ＝１．１ｅ−３２）およびＡＡ８２３２００（ＳＳＰ＝１．３ｅ−２１）でヒットされた）、ならびに番号７０１２９１４７３Ｈ１（２５０ｂｐ；ＡＡ８２３２００（ＳＳＰ＝４．３ｅ−４２）でのみヒットされた）を同定した。クローン７０１２９１４７３Ｈ１および７０１２９０９１９Ｈ１由来の翻訳されたタンパク質配列を既知のＧＦＲαタンパク質配列と比較することから、配列７０１２９０９１９Ｈ１はおそらく配列７０１２９１４７３Ｈ１の５’に配置されたこと、および、これらの配列は完全なＧＦＲα−４  ｃＤＮＡ配列中で相互にほぼ隣接したことを推定することができた。従って、２種の順プライマー（ＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ１およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ２）を配列７０１２９０９１９Ｈ１の５’領域中で、また、２種の逆プライマー（ＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ１およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ２）を配列７０１２９１４７３Ｈ１の３’領域で設計した。ＰＣＲ実験で使用された全プライマー配列を表３に要約する。
【００５３】
【表３】
0004810036.tif 000004
【００５４】
その後、ラット脳クイッククローン（Ｑｕｉｃｋｃｌｏｎｅ）ｃＤＮＡ（クロンテック  ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト）で、プライマーＲＡＴ―ＧＦＲα４−ｓｐ１およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ１を使用してＰＣＲを実施して、脳由来のｃＤＮＡ中でのラットＧＦＲα−４の存在を確認した。ラットＧＦＲα−４配列をコードするＤＮＡ配列はこの領域中で高いＧ＋Ｃ含量を有するため、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）−ＧＣ  ＰＣＲキット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ１およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ１、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物ならびに１μｌのラット脳クイッククローン（Ｑｕｉｃｋｃｌｏｎｅ）ｃＤＮＡを含有する、５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に１分間加熱し、そして、循環を、７２℃で７分の最終段階を伴い９５℃で１分、５６℃で１分および７２℃で１分で３０周期の間行った。その後、プライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ２およびＲＡＴ−ＧＦＲα２−ａｐ２を用いて、１μｌの一次ＰＣＲ反応でネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ２およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ２、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに１μｌの一次ＰＣＲ産物を含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に１分間加熱し、そして、循環を、７２℃で７分の最終段階を伴い、９５℃で３０秒、５６℃で１分および７２℃で１分で２５周期の間行った。ＰＣＲ産物は、１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ｐＨ８．３）中、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分析した。それぞれおよそ１１００および２００ｂｐの２種のＰＣＲフラグメントをゲルから切り出し、そしてキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｇｍｂｈ、ドイツ・ヒルデン）で精製した。ＰＣＲフラグメントを配列決定してそれらの同一性を確認した。最小のフラグメントは、結合された配列７０１２９０９１９Ｈ１および７０１２９１４７３Ｈ１に対応する２１１ｂｐの配列を生じた。より大きいフラグメントは１０４９ｂｐの配列を生じ、その５’端の１８ｂｐ、３’端の５９ｂｐおよび９２ｂｐの内部伸長が２１１ｂｐのフラグメントの配列に対応したが、しかし、間に付加的配列の伸長を有した。このフラグメントはラットＧＦＲα−４の変異体を表した。
【００５５】
クローン７０１２９１９１９Ｈ１および７０１２９１４７３Ｈ１の双方をインサイト  ファーマシューティカルズ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）から得、そして挿入物を完全に配列決定した。該配列を本出願に包含する（配列３＝７０１２９０９１９Ｈ１および配列４＝７０１２９１４７３Ｈ１）。双方のクローンは同一の７日齢のラット脳皮質のｃＤＮＡライブラリー由来であった。双方のクローンはそれらの５’端（７０１２９１４７３Ｈ１中の最初の１３４ｂｐおよび７０１２９０９１９Ｈ１中の最初の２２７ｂｐ）で異なるが、しかしその後は同一である。双方は終止コドン（７０１２９１４７３Ｈ１中の位置１８４−１８６および７０１２９０９１９Ｈ１中の２７７−２７９）までのＧＦＲα−４のコーディング配列の部分を含有する。５４９ｂｐの３’非翻訳領域、次いでポリ（Ａ）尾がその後双方のクローンに存在する。われわれは、双方のクローンがラットＧＦＲα−４遺伝子の異なる変異体であると仮定した。ラットＧＦＲα−４  ｃＤＮＡの５’端を決定するために、双方の変異体に共通な配列の一部分でプライマー（ＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ３およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ４）を設計して、５’ＲＡＣＥ実験を実施した。最初に、ラット脳マラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））で５’  ＲＡＣＥ  ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍもしくは１．５Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ３およびＲＡＣＥ−ａｐ１、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに５μｌのラット脳マラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡを含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に３０秒間加熱し、そして、循環を、６８℃で７分の最終段階を伴い、９５℃で３０秒、７２℃で４分を５周期、その後９５℃で３０秒、７０℃で４分を５周期、その後９５℃で３０秒、６８℃で４分を２５周期の間行った。その後、プライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ４およびＲＡＣＥ−ａｐ２を用いて、１μｌの一次ＰＣＲ反応でネステッドＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍもしくは１．５Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ４およびＲＡＣＥ−ａｐ２、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに１μｌの一次ＰＣＲ産物を含有する５０μｌの総容積中で実施した。循環は、一次ＰＣＲと正確に同一のパラメータを使用して行った。ＰＣＲ産物は、１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ｐＨ８．３）中、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分析した。およそ３５０ｂｐのフラグメントをゲルから切り出し、そして、製造元の説明書（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＢＶ、オランダ・リーク）に従ってＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを使用して、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに��ローン化した。生じるクローンの１つが、５’の方向にラットＧＦＲα−４配列を伸長した３８７ｂｐの挿入物配列を生じた。翻訳に際し、この付加的ｃＤＮＡ配列は、いかなる内的終止コドンも伴わず、かつ、他の既知のＧＦＲα配列に対する実質的相同性をもつタンパク質配列を生じた。この付加的配列内には推定のＡＴＧ開始コドンを検出することができなかったため、新規プライマー（ＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ５およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ６）をこの配列の５’端で設計して、付加的な５’ＲＡＣＥ実験を実施した。最初に、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲをラット心マラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））で実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ５およびＲＡＣＥ−ａｐ１、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに５μｌのラット心マラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡを含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に３０秒間加熱し、そして、循環を、６８℃で７分の最終段階を伴い、９５℃で３０秒、７２℃で４分を５周期、その後９５℃で３０秒、７０℃で４分を５周期、その後９５℃で３０秒、６８℃で４分を２５周期の間行った。その後、プライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ６およびＲＡＣＥ−ａｐ２を用いて、１μｌの一次ＰＣＲ反応でネステッドＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ６およびＲＡＣＥ−ａｐ２、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに１μｌの一次ＰＣＲ産物を含有する５０μｌの総容積中で実施した。循環は、一次ＰＣＲと正確に同一のパラメータを使用して行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。およそ２００ｂｐのフラグメントをゲルから切り出し、そして上述されたとおりＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを使用して、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。２個の生じるクローンの配列決定は、５’の方向に別の１２８ｂｐを伴うラットＧＦＲα−４配列を伸長した。この配列に基づき、別のプライマーの組（ＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ７およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ８）を設計して、付加的な５’ＲＡＣＥ実験を実施した。ＲＡＣＥ  ＰＣＲはラット脳、心および腎のマラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡで実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ７ｂおよびＲＡＣＥ−ａｐ１、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに５μｌのラット心、脳もしくは腎のマラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡを含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプ���を９５℃に３０秒間加熱し、そして、循環を、６８℃で７分の最終段階を伴い、９５℃で３０秒、７２℃で４分を５周期、その後９５℃で３０秒、７０℃で４分を５周期、その後９５℃で３０秒、６８℃で４分を２５周期の間行った。その後、プライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ８およびＲＡＣＥ−ａｐ２を用いて、１μｌの一次ＰＣＲ反応でネステッドＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ８およびＲＡＣＥ−ａｐ２、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに１μｌの一次ＰＣＲ産物を含有する５０μｌの総容積中で実施した。循環は、一次ＰＣＲと正確に同一のパラメータを使用して行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。大きさがおよそ２００ｂｐから１２００ｂｐまでの範囲にわたる数個のフラグメントがゲル上で見え、そして切り出しかつＴＯＰＯ−ＴＡクローニングを使用してベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。数個のクローンの挿入物を配列決定した。これらのクローンから、ラットＧＦＲα−４の配列を５’の方向に伸長することができた。２個の異なる配列を同定した。１個の配列は、５’の方向に２１５ｂｐを伴いラットＧＦＲα−４配列を伸長し、そして同じ読み枠の上流の終止コドンにより先行される同じ読み枠の開始コドンを包含した。生じる予測されるタンパク質配列（５２の付加的アミノ酸残基）は、２９アミノ酸残基の予測されるシグナルペプチドを包含する（ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パッケージ  バージョン１０．０、ジェネティックス  コンピュータ  グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、米国ウィスコンシン州マディソン、中に包含されるＳＰＳｃａｎプログラムにより決定されるとおり；スコア７．０、確率１．１７１ｅ−０２）。これらの５’ＲＡＣＥ実験により決定された他の配列は、５’の方向に５５２ｂｐを伴いラットＧＦＲα−４配列を伸長し、そしてまた同じ読み枠の上流の終止コドンにより先行される同じ読み枠の開始コドンを包含した。この新規配列の大部分の３’の７９塩基対は２１５ｂｐの配列の３’の７９塩基対に同一であったが、しかし該配列の残りは異なった。しかしながら、生じる予測されるタンパク質配列（１１３の付加的アミノ酸残基）は予測されるシグナルペプチド配列をＮＨ2−末端に有しなかった（ＳＰＳｃａｎ、ＧＣＧパッケージ）。インサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）データベースからの配列と一緒のその後の５’ＲＡＣＥ実験から生じる多様な部分的ｃＤＮＡ配列を比較し、そして数個の可能なラットＧＦＲα−４変異体に合流させた。同定された変異体のどれが真であるかを同定するために、翻訳開始コドンの５’（５５２ｂｐのＲＡＣＥフラグメントから生じる「長い」５’変異体のためのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ４およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ５、ならびに２１５ｂｐのＲＡＣＥフラグメントから生じる「短い」５’変異体のためのＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ６）、ならびに翻訳終止コドンの３’（ＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ９お��びＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ１０）プライマーを設計した。その後、多様なラット組織由来のｃＤＮＡを使用して完全なＧＦＲα−４コーディング配列を増幅するのにこれらのプライマーを使用した。
【００５６】
最初に、「長い」５’変異体をコードする配列をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ４およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ９、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに５μｌのラット心、脳もしくは腎のマラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡを含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に１分間加熱し、そして、循環を、７２℃で７分の最終段階を伴い、９５℃で４５秒、５７℃で１分および７２℃で１分の３５周期の間、行った。その後、プライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ５およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ１０を用いて、一次ＰＣＲ反応でネステッドＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ５およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ１０、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物、ならびに１μｌの一次ＰＣＲ産物を含有する５０μｌの総容積中で実施した。循環は、３５の代わりに３０のＰＣＲ周期を行ったことを除き、一次ＰＣＲと正確に同一のパラメータを使用して行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。大きさがおよそ１０００から１２５０ｂｐまでの範囲にわたる数個のフラグメントをゲルから切り出し、そしてＴＯＰＯ−ＴＡクローニングを使用してベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。数個のクローンの挿入物を配列決定した。次に、「短い」５’変異体をコードする配列をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、１×ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｍ  ＧＣ−ＭＥＬＴａｅ、２００ｎＭのプライマーＲＡＴ−ＧＦＲα４−ｓｐ６およびＲＡＴ−ＧＦＲα４−ａｐ９、１μｌのアドバンテージ  クレンタック（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ）ポリメラーゼ混合物ならびに５μｌのラット心マラソン  レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡを含有する５０μｌの総容積中で実施した。サンプルを９５℃に５分間加熱し、そして、循環を、７２℃で７分の最終段階を伴い、９４℃で３０秒、５７℃で１分および７２℃で２分３０秒の３５周期の間行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。大きさがおよそ１５００から２２００ｂｐまでの範囲にわたる数個のフラグメントをゲルから切り出し、そしてＴＯＰＯ−ＴＡクローニングを使用してベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。数個のクローンの挿入物を配列決定した。全部の得られた配列の分析（１６個の生じるクローンを完全に配列決定した）は、ラットＧＦＲα−４のＤＮＡ配列が、全部の同定された変異体に共通の６個の配列の伸長に分割されることを可能にし、変異体に依存して５個の介在配列の伸長が存在もしくは非存在であった。全５種の介在配列は、５’および３’のスプライス部位のコンセンサス部位（イントロン配列の５’端のＧＴおよび３’端のＡＧ）（Ｓｅｎａｐａｔｈ���ら、１９９０）を含有し（下の表４を参照されたい）、そして従ってスプライスされないイントロンを潜在的に表す可能性がある。
【００５７】
同定された変異体がある種のｍＲＮＡ転写物中のスプライスされないイントロンの保存から生じることができたという仮定を強くするため、ラットＧＦＲα−４配列をヒトＧＦＲα−１のゲノム配列（Ａｎｇｒｉｓｔら、１９９８）と比較した。この分析から、全転写物に共通のＧＦＲα−４配列はＧＦＲα−１中のエキソンと一致した（下の表４を参照されたい）ことが明らかであった。いくつかの転写物中に存在しない介在配列はヒトＧＦＲα−１中のイントロン配列と一致した。従って、われわれは、全部の介在配列をスプライスされないイントロンとみなした。エキソン５とエキソン６との間に存在するイントロンは２つの異なる方法でスプライスされる可能性があり、そして、われわれが変異体Ａおよび変異体Ｂと呼んだラットＧＦＲα−４の２種の異なるスプライス変異体の存在をもたらす。
【００５８】
配列５は、イントロン配列を包含するラットＧＦＲα−４のコンセンサス配列を示す（イントロン１：ｂｐ１２５ないし６８４；イントロン２：ｂｐ１０４０ないし１０８８；イントロン３：ｂｐ１１９９ないし１２７８；イントロン４：ｂｐ１４１４ないし２１５４；イントロン５Ａ：ｂｐ２２４７ないし２３８５、およびイントロン５Ｂ：ｂｐ２２３１ないし２３１４）。配列５の位置２２４４で多形が検出され、配列決定されたクローンの５０％でＴが、および他の５０％でＣが見出された。この多形は、ＧＰＩ固定に関与する疎水性領域中のタンパク質（変異体Ａ）におけるＷからＲへのアミノ酸変化につながる。図１は、イントロン配列のスプライシング後のスプライス変異体ＡおよびＢの派生されるｃＤＮＡ、ならびにそれらの特徴を伴う変異体ＡおよびＢの翻訳されたタンパク質配列と一緒の、ラットＧＦＲα−４遺伝子の構造を図で示す。表４は、同定されたイントロンおよびエキソンの大きさと一緒のイントロン−エキソンの境界のＤＮＡ配列を示す。右の欄はヒトＧＦＲα−１のゲノム配列中の対応するエキソンの大きさを示す（Ａｎｇｒｉｓｔら、１９９８から）。
【００５９】
【表４】
0004810036.tif 000005
【００６０】
イントロン１ないし４およびイントロン５Ａを除去することにより得られるコンセンサス配列（配列６；変異体Ａ）は、２９．７ｋＤａの計算される分子量および８．９２の等電点をもつ２７３アミノ酸残基のタンパク質に翻訳される（配列８）。イントロン１ないし４およびイントロン５Ｂを除去することにより得られるコンセンサス配列（配列７；変異体Ｂ）は、２８．０ｋＤａの計算される分子量および８．９１の等電点をもつ２５８アミノ酸残基のタンパク質に翻訳される（配列９）。図２はラットＧＦＲα−４の変異体ＡおよびＢの整列を示す。これらのタンパク質配列は、双方とも既知のＧＦＲα配列に類似であり、そして、カルボキシ末端の小さなアミノ酸伸長において相互と異なるのみである。これら２種の配列は、おそらく、生物学的に活性なＧＦＲα−４変異体を代表する。配列決定された全部の他の変異体は１個もしくはそれ以上のイントロン配列を含有するため、それらはおそらくＲＮＡプロセシングの中間体である。全部のこれらの中間体がなぜ精製されたｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ中に存在するのか、および、完全にスプライスされたｍＲＮＡ転写物由来のｃＤＮＡ配列を増幅することがなぜそれほど困難であるのかは明らかでない。ＧＦＲα−１ないし−４は、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙもしくはＡｓｎのような３種の小型のアミノ酸の伸長を含有する親水性配列により先行される１７〜３１アミノ酸残基の疎水性領域より成る、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に固定されるタンパク質に典型的なＣＯＯＨ末端配列を特徴とする（Ｇｅｒｂｅｒら、１９９２）。ラットＧＦＲα−４変異体Ａのタンパク質配列は、２個の可能なＧＰＩ切断部位（位置２３４ないし２３６のＤＳＳもしくは位置２５０−２５２のＮＡＧ）により先行される２１アミノ酸残基（位置２５３ないし２７３）の疎水性のカルボキシ末端を有する。変異体Ｂはより短い親水性のカルボキシ末端を有し、この変異体についてはＧＰＩ固定が可能でないことを意味する。これは、変異体ＢがラットＧＦＲα−４受容体の可溶性の形態であることを意味する可能性がある。２９アミノ酸の予測されるシグナルペプチドが双方の変異体に存在する（ＧＣＧパッケージに包含されるＳＰＳｃａｎプログラムにより決定されるとおり；スコア７．０、確率１．１７１ｅ−０２）。加えて、Ｎに連結されるグリコシル化のための１個の可能な部位（該タンパク質中の位置１９２ないし１９４のＮＶＳ）が存在する。
【００６１】
最近、マウスＧＦＲα−１ないし−３およびニワトリＧＦＲα−４の配列の比較に基づくＧＦＲαのドメイン構造のモデルが提案された（Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎら、１９９９）。該モデルは、より少なく保存されるアダプター配列により一緒に結合される３個の保存されたシステイン豊富なドメインを包含する。該分子はＧＰＩアンカーにより膜に固定される。ラットＧＦＲα−４はこのモデルに部分的に一致する。なぜなら、それは第二および第三のシステイン豊富な領域ならびに１個の可能なＧＰＩアンカーもまた含有するからである（少なくとも変異体Ａについて）。しかしながら、それは、第一のシステイン豊富な領域が存在しないため、他のＧＦＲαと有意に異なる。図３はラットＧＦＲα−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ５９４８６）、ラットＧＦＲα−２（ＥＭＢＬ受託番号ＡＦ００３８２５）、マウスＧＦＲα−３（ＥＭＢＬ受託番号ＡＢ００８８３３）およびニワトリＧＦＲα−４（ＥＭＢＬ受託番号ＡＦ０４５１６２）とのラットＧＦＲα−４の変異体ＡおよびＢの整列を示す。この整列は、ＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログラム（ＥＭＢＬ、ドイツ・ハイデルベルク）を使用して行った。ＧｅｎｅＤｏｃソフトウェアツール（バージョン２．５．０００）を使用する配列の対にした比較により、ＧＦＲαファミリーのメンバー間の同一性のパーセンテージおよび類似性のパーセンテージを計算し、そして結果を下の表５に提示する。
【００６２】
【表５】
0004810036.tif 000006
【００６３】
神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーの４メンバーがこれまでに同定されている（ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、ＰＳＰ、ＥＶＮ／ＡＲＴＮ）。全４種は、普遍的な膜貫通チロシンキナーゼｃＲＥＴとともに、特異的なＧＰＩに連結されるＧＦＲα受容体（ＧＤＮＦについてＧＦＲα−１、ＮＴＮについてＧＦＲα−２、ＥＶＮ／ＡＲＴＮについてＧＦＲα−３、およびＰＳＰについて（ニワトリ）ＧＦＲα−４）への結合によりシグナル伝達する。ＰＳＰの補助受容体ＧＦＲα−４はニワトリでのみ同定されており、そして、哺乳動物の対照物は未だ見出されていない。
【００６４】
本出願に記述されるラットＧＦＲα−４とニワトリＧＦＲα−４との間の類似性は３７％（２７％の同一性）であり、ラットＧＦＲα−４がＧＦＲαファミリーの新規メンバーであることを示唆する。ＧＦＲα−４は哺乳動物のペルセフィン受容体である可能性があるか、あるいは、同定されないＧＤＮＦファミリーメンバーの受容体である可能性がある。
ＧＦＲα−４へのペルセフィンの特異的結合。
【００６５】
可溶性のＧＦＲα−ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質の発現のための構築物を以下のとおり作成した。シグナルペプチドおよびＧＰＩ固定に関与するＣＯＯＨ末端の疎水性領域をコードする配列を除外する、ヒトＧＦＲα−１、ＧＦＲα−２およびＧＦＲα−３、ニワトリＧＦＲα−４ならびにラットＧＦＲα−４変異体Ａ（それぞれ、アミノ酸残基２７ないし４２７、２０ないし４３１、２８ないし３７１、２０ないし３９９および２９ないし２５２をコードする）のｃＤＮＡ領域を、発現ベクターシグナルｐＩｇプラス（Ｓｉｇｎａｌ  ｐＩｇ  ｐｌｕｓ）（Ｒ＆Ｄ  システムズ  ヨーロッパ  リミテッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ）、英国アビンドン）中に同じ読み枠でクローン化した。全部の構築物の挿入物は完全なＤＮＡ配列分析により確認した。これらの構築物から発現される生じるタンパク質は、１７アミノ酸残基のＮＨ2−末端ＣＤ３３シグナルペプチド、それぞれのＧＦＲαタンパク質領域、および２４３アミノ酸残基のＣＯＯＨ末端ヒトＩｇＧ1−Ｆｃ融合ドメインを含有する。融合タンパク質を記述されたとおりＣＨＯ細胞中で発現させかつ精製した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で慣例に培養した。至適化されたリポフェクタミン  プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ）法を使用して、細胞をＧＦＲα−ＩｇＧＦｃ融合構築物でトランスフェクションした。このために、総量で６．５μｇのＤＮＡを、７５０μｌの血清を含まない培地中で１７．５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬とともに室温で１５分間インキュベートした。リポフェクタミンは血清を含まない培地で５０倍希釈し、この混合物７５０μｌをＤＮＡ溶液に添加した。室温で１５分のインキュベーション後に、３．５ｍｌの血清を含まない培地を添加し、そして混合物を細胞上にもたらした（１００ｍｍペトリ皿中）。細胞を５％  ＣＯ2中３７℃で３時間インキュベートし、その後２０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有する５ｍｌの培地を添加した。２４時間後に培地を通常の培地に変更した。これらの至適化された条件を使用するトランスフェクションの効率は、典型的に５０〜６０％であった。永続的トランスフェクションのためには、選択培地は８００μｇのＧ４１８もしくは８００μｇのＧ４１８および８００μｇのヒグロマイシンのいずれかを含有した。抗生物質耐性のクローンを拡張し、そして特異的抗体を使用して発現についてアッセイした。ＧＦＲα−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質を、プロテインＡクロマトグラフィーにより、永続的にもしくは一過性にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の培地から精製した。結合されたタンパク質を０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で溶出し、そして１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．４中に収集した（希釈比１：６）。１．５の吸光度係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によりタンパク質濃度を推定した。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、バイアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）３０００装置（バイアコア  ＡＢ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）、スウェーデン・ウプサラ）を使用して２５℃で実施した。使用されたセンサーチップＣＭ５、アミンカップリングキットおよび緩衝液もま��バイアコア  ＡＢ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）から得た。組換えＰＳＰ、ＮＴＮ、ＥＶＮ／ＡＲＴおよびＧＤＮＦは固定されたリガンドとして使用した。組換えヒトＧＤＮＦはＲ＆Ｄ  システムズ  ヨーロッパ  リミテッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ）（英国・アビンドン）から得た。ＮＨ2末端で６個のＨｉｓ標識された組換えヒトＮＴＮ、ラットＰＳＰおよびヒトＥＶＮ／ＡＲＴは、既に記述された（Ｃｒｅｅｄｏｎら、１９９７）とおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生させた。ＣＭ５センサーチップのカルボキシル化されたマトリックスを、最初に、４００ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの１：１混合物を用いて１０分間活性化した。組換え神経栄養因子を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中、５μｌ／分の流速で、活性化された表面上に適用した。反応されないカルボキシル基を１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌで封鎖した。結合実験のためには、ｋｉｎｊｅｃｔプログラムを使用して、可溶性のＧＦＲα−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質を３０μｌ／分で注いだ。動力学実験で使用されたＧＦＲα−ＩｇＧＦｃの濃度は、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理的食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．５ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム塩、０．００５％ポリソルベート２０、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中、１と１００ｎＭとの間であった。固定されたリガンドへのＧＦＲα受容体の会合を３分間、および解離を１分間モニターし、次いで１０ｍＭグリシン緩衝液で再生した。Ｈｅｐｅｓ緩衝生理的食塩水を注ぐこと（ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）により解離を開始した。センサーのデータの質を向上させるため、二重参照（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）を使用した（Ｍｙｓｚｋａ、１９９９）。データは、バイアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）評価ソフトウェア（バージョン３．０．１）とともに包括解析を使用して分析した。包括解析は、会合速度（ｋa）および解離速度（ｋd）を同時に計算し、そしてその後見かけの平衡解離定数（ＫD）をｋd／ｋaとして計算する。単純１：１ラングミュアーモデルを使用してデータを適合させた。ＰＳＰへの特異的結合はラットおよびニワトリ双方のＧＦＲα−４−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質で検出することができた。ＧＦＲα４−ＩｇＧＦｃの観察された結合は、ＧＤＮＦ、ＮＴＮもしくはＥＶＮ／ＡＲＴへの結合が存在しなかったため、特異的であった。対照実験は、ＧＤＮＦへのＧＦＲ−１、ＮＴＮへのＧＦＲα−２およびＥＶＮ／ＡＲＴへのＧＦＲα−３の結合を確認した。異なる濃度のラットおよびニワトリのＧＦＲα４−ＩｇＧＦｃでの３回の測定を使用して得られた結合曲線から、結合定数ｋa（会合速度）およびｋd（解離速度）を生じさせた（表６）。
表６：ニワトリＧＦＲα−４およびラットＧＦＲα−４へのペルセフィンの結合。
ＳＰＲにより測定されるような、固定されたペルセフィンへのニワトリＧＦＲα−４−ＩｇＧＦｃおよびラットＧＦＲα−４−ＩｇＧＦｃ結合の結合定数。異なる濃度のそれぞれの可溶性受容体での３回の測定を使用して得られた結合曲線から、平均の会合速度（ｋa）、解離速度（ｋd）および見かけの平衡解離定数（ＫD）±標準誤差を生じさせた。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
見かけのＫD値は双方の融合タンパク質について非常に類似であったが、ＲMAX値は有意に異なった。約１０００相対単位（ＲＵ）の結合レベルがニワトリＧＦＲα−４−ＩｇＧＦｃを用いて慣例に得られた一方、ラットＧＦＲα４−ＩｇＧＦｃの結合レベルはおよそ２０倍より低かった（約５０〜６０ＲＵ）。これは、活性のニワトリＧＦＲ−４−ＩｇＧＦｃおよびラットＧＦＲα−４−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質の濃度の差異による可能性があった。５．９±２．８ｎＭ（ｎ＝３）の計算された平衡解離定数ＫDは、ラットＧＦＲα−４がペルセフィンに特異的な受容体であることを示唆する。
ノーザンブロット分析。
【００６８】
多様なげっ歯類組織由来のポリ（Ａ）豊富なＲＮＡ２μｇを含有するノーザンブロット（マウスＭＴＮ（商標）ブロット、マウス胚ＭＴＮ（商標）ブロットおよびラットＭＴＮ（商標）ブロット；クロンテック  ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を、製造元の説明書に従い、ラットＧＦＲα−４コーディング配列（配列番号６におけるような）由来のα−［32Ｐ］−ｄＣＴＰランダムプライミング標識された（ハイプライム（ＨｉｇｈＰｒｉｍｅ）キット、ロシュ  ディアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））９４８ｂｐのフラグメントとハイブリダイズさせた。ストリンジェンシーの洗浄を０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、５０℃（２種のマウスブロット）もしくは５５℃（ラットブロット）で実施した。結果を図４に示す。ラットにおいては、心、脳、肝および精巣で約２．３ｋｂの非常に弱いシグナルを検出することができた。なおより弱い第二の転写物が同一組織中で約１．４ｋｂに存在した。マウスでは、１．３５ｋｂの転写物が脳および精巣で最も強く、ずっとより弱いシグナルが約２ｋｂに存在した。１５日および１７日のマウス胚中には１．３５ｋｂの転写物の非常に低いｍＲＮＡ発現もまた存在した。より小さい転写物の大きさは、ＧＦＲα−４コーディング配列の予測された大きさと一致する（±８８０ｂｐ＋５７０ｂｐの３’非翻訳領域）。
ラット、マウスおよびヒトＧＦＲα−４の染色体位置推定。
【００６９】
０．９５ｋｂのラットＧＦＲα−４  ｃＤＮＡフラグメント（変異体Ａの完全なラットＧＦＲα−４コーディング配列を含有する）、およびラットＧＦＲα−４のゲノム配列に対応する２．３ｋｂのフラグメント（配列番号５を参照されたい）を、ラット染色体での蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析でプローブとして使用した。これらのプローブは部分的に重なり合っていた。２種のプローブの混合物（１μｇの全ＤＮＡ）をニックトランスレーション（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によりジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ロシュ  ディアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ドイツ・マンハイム）で標識して、２００〜４００ｂｐの最終のプローブフラグメントの大きさを生じさせた。標識されたプローブをハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸）と混合した。変性後、７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中７２℃で２分間変性された分裂中期ラット染色体スライド（ＩｓｌａｍとＬｅｖａｎ、１９８７、Ｈｅｌｏｕら、１９９８）上に混合物を置いた。３７℃で４８時間のハイブリダイゼーション後に、調製物を５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中で１５分間洗浄した。標準的ＦＩＴＣ抗ジゴキシゲニンにより、標識された染色体の検出を行った。染色体スプレッドを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対染色した。結果は１００個の異なる細胞の顕微鏡写真から生じさせた。プローブの小さな大きさにより、かなりのバックグラウンドが存在した。しかしながら、大部分の研究された細胞は位置ＲＮＯ３ｑ３６に標識を示した（図５）。分裂中期の研究の約３５％がＲＮＯ３の双方の相同物で「二重スポット」標識を示した一方、約５０％が相同物の一方のみでの二重のスポット、もしくは双方の相同物に「単一スポット」標識を有した。他の染色体部位はいくつかの細胞において標識を示さなかった。比較マッピングに基づき、対応するマウス遺伝子座はＭＭＵ２（バンドＦ）に位置すると期待することができる一方、該遺伝子の可能なヒトの位置はＨＳＡ２、ＨＳＡ１５もしくはＨＳＡ２０であるとみられる。これと一致して、ＥＭＢＬデータベースで同定されたゲノムのマウスおよびヒトのＧＦＲα−４配列（マウスについて受託番号ＡＦ１５５９６０およびヒトについてＡＣ０１７１１３）は、それぞれ、マウス第２染色体（ＢＡＣクローン３８９Ｂ９）およびヒト第２染色体（ＥＭＢＬ受託番号ＡＣ０１３３２４；ＢＡＣ３８８＿Ｋ＿２４ｍａｐ２）由来である。
【００７０】
【表７】
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【００７１】
【表８】
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【００７２】
【表９】
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【００７３】
【表１０】
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【００７４】
【表１１】
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【００７５】
【表１２】
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【００７６】
【表１３】
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【００７７】
【表１４】
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【００７８】
【表１５】
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【００７９】
【表１６】
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【図面の簡単な説明】
本発明は付随する図面に関して以下の例示的態様からより明瞭に理解することができる。
【図１】  発明にかかる、ラットＧＦＲα−４遺伝子の構造の具体的説明である。上の線はｂｐでの尺度を示す。下の線はラットＧＦＲα−４遺伝子のゲノム構造を示す。エキソンは箱により表しかつ番号付けし、イントロン配列は線として描く。イントロンおよびエキソンの大きさ（ｂｐで）を図の上に示す。翻訳開始コドンは矢印により、また、終止コドンは＊印により示す。イントロン配列からのスプライシングにより得られる変異体ＡおよびＢのｃＤＮＡ配列をゲノム配列の下に示す。イントロン５の選択的スプライシングはスプライス変異体Ｂ中のより早い終止コドンをもたらす。変異体ＡおよびＢの予測されるタンパク質配列を最も下に示す。予測されるシグナルペプチド、推定のＮ−グリコシル化部位、およびＧＰＩ切断のための１もしくは２個の可能な部位により先行される疎水性のＣＯＯＨ末端領域（変異体Ａ中のみ）を図上に示す。
【図２】  発明にかかる、ラットＧＦＲα−４のスプライス変異体ＡおよびＢの予測されるタンパク質配列の整列である。ラットＧＦＲα−４のスプライス変異体ＡおよびＢの配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログラム（ＥＭＢＬ、ドイツ・ハイデルベルク）を使用して整列した。２種の変異体の間で保存されるアミノ酸残基を黒色領域中に包含する。アミノ酸残基は右に番号付けする。ダッシュは整列を至適化するために配列中に導入されたギャップを示す。
【図３】  発明にかかる、ＧＦＲαファミリーメンバーの予測されるタンパク質配列の整列である。ラットＧＦＲα−４の変異体ＡおよびＢ、ラットＧＦＲα−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ５９４８６）、ラットＧＦＲα−２（ＥＭＢＬ受託番号ＡＦ００３８２５）、マウスＧＦＲα−３（ＥＭＢＬ受託番号ＡＢ００８８３３）ならびにニワトリＧＦＲα−４（ＥＭＢＬ受託番号ＡＦ０４５１６２）の配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログラム（ＥＭＢＬ、ドイツ・ハイデルベルク）を使用して整列した。全６種のタンパク質の間で保存されるアミノ酸残基を黒色領域中に包含する。配列の４もしくは５種の間で保存される残基は灰色に影を付ける。全６種のＧＦＲαの間で保存されるシステイン残基は、配列の上に＊印で示す。アミノ酸残基は右に番号付けする。ダッシュは整列を至適化するために配列中に導入されたギャップを示す。
【図４】  発明にかかる、げっ歯類のＧＦＲα−４のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。多様な組織中でのラットおよびマウスのＧＦＲα−４のｍＲＮＡの発現を、ラットＧＦＲα−４のコーディング配列に対応するプローブを使用して評価して、ポリ（Ａ）豊富なＲＮＡのブロットを分析した。（Ａ）ラット多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット；（Ｂ）マウスＭＴＮブロット、および（Ｃ）マウス胚ＭＴＮブロット。見かけの大きさは各図の左への水平線により（キロ塩基対で）示す。
【図５】  発明にかかる、ラットＧＦＲα−４遺伝子は染色体３ｑ３６に位置する。２種のラットＧＦＲα−４プローブの混合物をＦＩＳＨ分析に使用した。（Ａ）ラット第３染色体の中遠位部分上の二重スポットのＦＩＳＨシグナル（矢印）。（Ｂ）ラット染色体３ｑ３６上のＧＦＲα−４遺伝子の遺伝子座の位置。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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