(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、クモ膜下腔へ投与するための脳梗塞の治療または予防剤。
【請求項２】
ＨＧＦ遺伝子がＨＶＪ−リポソームの形態にある、請求項１に記載の治療または予防剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脳血管障害を治療又は予防するための新規な遺伝子治療剤、および当該遺伝子治療剤の新規な投与方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＨＧＦ（肝実質細胞増殖因子）遺伝子及び／又はＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）遺伝子を有効成分として含有する脳血管障害の治療又は予防剤、あるいは当該治療又は予防剤をクモ膜下腔に投与することを特徴とする新規な投与方法などに関する。
背景技術
脳動脈のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる脳閉塞性疾患、もやもや病等はしばしば脳の慢性的な血流量低下を引き起こす。この状態から、その後の脳虚血性事象だけでなく痴呆を含む神経病理学的変化に至ることがある（Ｓｔｒｏｋｅ  ２５，１０２２−１０２７、Ｓｔｒｏｋｅ  ２９，１０５８−１０６２（１９９８）、Ｓｔｒｏｋｅ  ２４，２５９−２６４（１９９３）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９５，１９０−１９３（１９９３））。しかし、これらの脳血管性障害における血流量低下を改善する有効な治療法は未だ確立されていない。虚血性発作においては、特に虚血周辺部で活発な血管新生を生じさせることが知られており、そしてこれはヒトのより長期の生存に関与している（Ｓｔｒｏｋｅ  ２５，１７９４−１７９８（１９９４））。それ故血管新生は、脳虚血症の回復や将来の発作予防において重要な役割を果たすと考えられている。
新しい血管の発生や血管新生は親血管の内皮細胞の活性化と共に開始されるが、インビボでこの血管新生を刺激するだけでなく、インビトロで内皮細胞に対してマイトジェニックであることが示されている増殖因子を「血管新生増殖因子」と称している。
血管新生増殖因子の治療的な関与は、Ｆｏｌｋｓｍａｎらによって最初に文献発表された（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６（１９７１））。またその後の研究によって、組換え血管新生因子、例えば繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，１４０１−１４０３（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８４４−８４６（１９９３））、内皮細胞増殖因子（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ，５４，５７５−５８３（１９９３））、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などを使用して心筋及び後肢虚血症の動物モデルにおける側副血行路の発達を促進及び／又は増進させ得ることが確認されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０，ＩＩ−２２８−ＩＩ−２３４（１９９４））。さらに本発明者らは、ＨＧＦがＶＥＧＦと同様に内皮特異的増殖因子として作用することを見出している（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１４，１０６７−１０７２（１９９６））。
血管障害を治療するために前記の如き血管新生増殖因子を用いる戦略は、「治療的血管新生」と称されている。より最近では、この戦略はヒトの虚血性疾患に適用されている。しかしながら、脳虚血症に対してもこの戦略が有効であるかどうかは、今日までのところ知られていない。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、多様な細胞に対して分裂誘発活性、運動性促進活性及び形態形成活性を示すプレイオトロフィックなサイトカインである（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，４４０−４４３（１９８９））。
ＨＧＦの脳における作用については、以下のような報告がなされている。すなわち、ＨＧＦと膜貫通型チロシンキナーゼのｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターは共に脳の種々の領域で発現しており、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔ間の機能的な結合によって初代培養海馬のニューロンの生存が高められることや、インビトロでのニューロン発達において神経突起の伸長が誘導されることが知られている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２６，４８５−４９４（１９９４）、特開平７−８９８６９号公報）。最近、ＨＧＦが虚血中のニューロン内で誘導されることが報告されており（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７９９，３１１−３１６（１９９８））、また組換えＨＧＦが海馬における虚血後の遅発性神経細胞死に対して神経保護効果を有していることや、組換えＨＧＦを脳内に連続的に注入することにより梗塞の大きさの減少に有効であったことが報告されている（Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８，３４５−３４８（１９９８）。これらの知見から、ＨＧＦは脳虚血中の重要な神経栄養因子として作用するものと考えられる。
他方、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞に対してマイトジェニックな二量体糖タンパク質であり、そして血管透過性を高める能力を有している。ＶＥＧＦは内皮細胞に対して直接的且つ特異的なマイトジェニックな効果を有している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１−８５８（１９８９））。チロシンキナーゼレセプターＦｌｔ、Ｆｌｋ−１及びＫＤＲを含むＶＥＧＦの結合部位は、他のタイプの細胞ではなく内皮細胞上に存在しているため、ＶＥＧＦの効果は内皮細胞に限定されている。
ＶＥＧＦの脳における作用に関しては、中枢神経系においてＶＥＧＦは虚血性障害によって脳内に急速に誘導されることが報告されており（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４６０４−４６１３（１９９６））、また組換えＶＥＧＦの脳表面への投与が、梗塞量の減少に有効であったことが報告されている（Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８，８８７−８９５（１９９８））。しかし詳しいことは分かっていない。
以上のようなＨＧＦおよびＶＥＧＦの作用の他、別の観点からは、前述の如くこれらの因子は強力な血管新生増殖因子である（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９，６２９−６４１（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１，８５１−８５８（１９８９））。虚血性発作は、特に虚血周辺部で活発な血管新生を生じさせることが知られており、そしてこれはヒトのより長期の生存と関係している（Ｓｔｒｏｋｅ  ２５，１７９４−１７９８（１９９４））。それ故、血管新生は脳虚血症の回復や将来の発作予防で重要な役割を果たすと考えられる。しかしながら、脳虚血症等に対して実際に組換えＨＧＦやＶＥＧＦを用いた治療的血管新生が可能かどうかについては知られていない。さらに、組換え血管新生増殖因子は急速に消失するので脳内に連続的に注入しなければならず、そしてこの操作は臨床状況下ではかなり危険であり、非現実的である。それ故、遺伝子導入技術を適用して虚血性の脳内や周辺で血管新生増殖因子を持続して発現及び分泌できれば合理的であると考えられる。しかしながら、ＨＧＦ遺伝子やＶＥＧＦ遺伝子の脳虚血性障害への適用（遺伝子治療）については全く例がなく、また脳という組織の特殊性を反映してか、現在までのところその適用性に関しても何ら示唆されていない。
発明の開示
本発明は、脳血管障害を治療又は予防するための新規な遺伝子治療剤、および当該遺伝子治療剤の新規な投与方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＨＧＦ（肝実質細胞増殖因子）遺伝子及び／又はＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）遺伝子を有効成分として含有する脳血管障害の治療又は予防剤、あるいは当該治療又は予防剤をクモ膜下腔に投与することを特徴とする新規な投与方法などに関する。
本発明者らは、ＨＧＦ及びＶＥＧＦの遺伝子導入によって、虚血状態の脳表面に血管新生を誘導することができるかどうかをｉｎ  ｖｉｖｏで検討した。その結果、（ａ）ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子トランスフェクション後、長期間にわたってこれらのタンパク質が脳内で検出されること、（ｂ）ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子トランスフェクションによる治療法により虚血状態の脳表面に血管新生を誘導できること、（ｃ）ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子のトランスフェクションが血管の閉塞によって引き起こされる脳の血流量低下を治療するのに有効であること、そして（ｄ）この治療法は、閉塞前に実施したときも有効であることを明らかにした。更に、これらの遺伝子導入はクモ膜下腔への導入という新しい投与法により効率的に達成されることも明らかにした。
加えて本発明者らは、虚血による海馬ＣＡ−１領域の遅発性神経細胞死が、ＨＧＦ遺伝子導入により抑制されることをも見出した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明により、以下の（１）から（２３）の発明が提供される。
（１）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、脳血管障害の治療又は予防剤、
（２）脳血管障害が、脳血管閉塞、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、脳卒中、脳出血、もやもや病、脳血管性痴呆、アルツハイマー型痴呆、脳出血後遺症又は脳梗塞後遺症である、上記（１）記載の治療又は予防剤、
（３）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、脳の血流量低下の治療又は予防剤、
（４）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、脳の血管新生促進剤、
（５）ＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、脳の神経細胞死の抑制剤、
（６）脳の神経細胞死が脳虚血に起因する遅発性神経細胞死である、上記（５）記載の抑制剤、
（７）ＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、脳の神経細胞のアポトーシス抑制剤、
（８）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子を有効成分とし、且つＨＧＦタンパク及び／又はＶＥＧＦタンパクとの併用に供するための、上記（１）〜（７）いずれかに記載の剤、
（９）ＨＧＦ遺伝子を有効成分とし、且つＨＧＦタンパクとの併用に供するための、上記（８）記載の剤、
（１０）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子がＨＶＪ−リポソームの形態にある、上記（１）〜（９）いずれかに記載の剤、
（１１）クモ膜下腔へ投与するための、上記（１）〜（１０）いずれかに記載の剤、
（１２）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子と薬学的に許容しうる溶剤とを混合することからなる、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の剤の製造方法、
（１３）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、脳血管障害の治療又は予防法、
（１４）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、脳の血流量低下の治療又は予防法、
（１５）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、脳の血管新生促進法、
（１６）ＨＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、脳の神経細胞死の抑制法、
（１７）ＨＧＦ遺伝子をヒトに導入することを含む、脳の神経細胞のアポトーシス抑制法、
（１８）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子をヒトのクモ膜下腔へ投与する、上記（１３）〜（１７）のいずれかに記載の方法、
（１９）ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子の導入と共に、ＨＧＦタンパク及び／又はＶＥＧＦタンパクを投与する、上記（１３）〜（１８）のいずれかに記載の方法、
（２０）ＨＧＦ遺伝子の導入と共に、ＨＧＦタンパクを投与する、上記（１９）記載の方法、
（２１）脳血管障害の治療又は予防剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子の使用、
（２２）脳の血流量低下の治療又は予防剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子の使用、
（２３）脳の血管新生促進剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子の使用、
（２４）脳の神経細胞死の抑制剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子の使用、
（２５）脳の神経細胞のアポトーシス抑制剤の製造のためのＨＧＦ遺伝子の使用。
発明を実施するための最良の形態
本発明において使用される「ＨＧＦ遺伝子」とは、ＨＧＦ（ＨＧＦタンパク）を発現可能な遺伝子を指す。具体的には、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、特許第２７７７６７８号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９６７（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．，１７２，３２１（１９９０）などに記載のＨＧＦのｃＤＮＡを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものが挙げられる。ここでＨＧＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、前記文献に記載されている他、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、例えば肝臓や白血球由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、ＨＧＦのｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
さらに、本発明のＨＧＦ遺伝子は前述のものに限定されず、発現されるタンパク質がＨＧＦと実質的に同じ作用を有する遺伝子である限り、本発明のＨＧＦ遺伝子として使用できる。すなわち、１）前記ｃＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、２）前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、などのうち、ＨＧＦとしての作用を有するタンパクをコードするものであれば、本発明のＨＧＦ遺伝子の範疇に含まれる。ここで前記１）及び２）のＤＮＡは、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
発明において使用される「ＶＥＧＦ遺伝子」とは、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦタンパク）を発現可能な遺伝子を指す。すなわち、ＶＥＧＦのｃＤＮＡを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものが例示される。ＶＥＧＦ遺伝子は、ヒトにおいては転写に際しての選択的スプライシングにより、４種類のサブタイプ（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）の存在が報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３（１９８３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８４，１４７０（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１（１９８９））。本発明においてはこれらのいずれのＶＥＧＦ遺伝子をも使用することが可能であるが、生物学的に最も活性が強いという観点から、ＶＥＧＦ１６５遺伝子がより好ましい。さらに前記のＨＧＦの場合と同様に、これらＶＥＧＦの遺伝子に対して改変等を施した遺伝子であっても、ＶＥＧＦとしての作用を有するタンパクをコードする遺伝子である限り、本発明のＶＥＧＦ遺伝子の範疇に含まれる。
当該ＶＥＧＦ遺伝子もＨＧＦ遺伝子と同様に、文献（例えばＳｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６（１９８９））記載の配列及びデータベースに登録されている配列情報に基づき、当業者ならば容易にクローニングすることができ、またその改変等も容易に行うことができる。
本発明においては、ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子により、脳血管障害が治療又は予防されることを初めて明らかにしたものである。すなわち本発明において初めて、（ａ）ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子トランスフェクション後、長期間にわたってこれらのタンパク質が脳内で検出されること、（ｂ）ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子トランスフェクションによる治療法により虚血状態の脳表面に血管新生を誘導できること、（ｃ）ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子のトランスフェクションが血管の閉塞によって引き起こされる脳の血流量低下を治療するのに有効であること、そして（ｄ）この治療法は、閉塞前に実施したときも有効であることを明らかにした。従ってＨＧＦ遺伝子及びＶＥＧＦ遺伝子は、脳虚血に起因する障害、脳の血流量低下を伴う障害、脳の血管新生を促進することにより改善が期待される障害等の、種々の脳血管障害に対する治療又は予防剤として、有効に使用される。
具体的には、脳血管閉塞、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、脳卒中（クモ膜下出血や一過性脳虚血、脳動脈硬化症などを含む）、脳出血、もやもや病、脳血管性痴呆、アルツハイマー型痴呆、脳出血後遺症又は脳梗塞後遺症などの治療または予防剤として有効に使用される（以下、本発明の治療又は予防剤を単に遺伝子治療剤と称することもある）。
さらに本発明者らは、虚血による海馬ＣＡ−１領域の遅発性神経細胞死が、ＨＧＦ遺伝子導入により抑制されること、すなわちＨＧＦ遺伝子が脳の神経細胞死を抑制する効果を有することを見出した。そしてこの効果は、ｃ−Ｍｅｔを介した神経細胞のアポトーシス抑制効果に基づくものであることを明らかにした。
ここで海馬ＣＡ−１領域とは神経の密集した領域であり、脳虚血による神経細胞死を受け易い領域として知られている。このようにＨＧＦ遺伝子は、血管新生作用（血流量低下抑制作用）および神経細胞保護作用の双方の作用に基づき、脳血管障害の治療および予防を達成できることが明らかとなった。
またＨＧＦ遺伝子は、前記のようにｃ−Ｍｅｔを介した神経細胞保護効果を有しているため、例えばアルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎縮性側索硬化症、あるいはパーキンソン氏病といった神経変性疾患の治療又は予防剤としても、有効に使用することができる。
本発明においては、ＨＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子各々単独で用いることもできれば、両者を併用して使用することも可能である。また、他の血管内皮増殖因子の遺伝子と共に用いることもできる。さらに、ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子と、ＨＧＦタンパク及び／又はＶＥＧＦタンパクとを併用することも可能である。好ましくはＨＧＦ遺伝子とＨＧＦタンパクとの組み合わせ、又はＶＥＧＦ遺伝子とＶＥＧＦタンパクとの組み合わせであり、さらに好ましくはＨＧＦ遺伝子とＨＧＦタンパクとの組み合わせである。これに関しては後述の実施例４を参照されたい。
なお、ここで用いるＨＧＦタンパクとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば如何なる方法で調製されたものでも良く、また市販品（例えば東洋紡績株式会社、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１等）を使用することもできる。前記クローニングにより得られたＨＧＦのｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦタンパクを得ることができる（例えばＮａｔｕｅ，３４２，４４０（１９８９）、特許第２７７７６７８号等参照）。またＶＥＧＦタンパクも同様にして得ることができる。
次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について記述する。
前記遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いた場合と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９）。以下、具体的に説明する。
Ａ．非ウイルスベクターを用いる場合
慣用の遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。
細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。
また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。
このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＨＶＪ）とを融合させたものである。当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））などに詳しく述べられており、また後述の実施例にも詳しく記載されているため、それらを参照されたい。なおＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７やＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）も用いることができる。
さらに、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。
ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。
Ｂ．ウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁、月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）、日本遺伝子治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。
患者への投与部位としては、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与部位が選択される。例えば、頭蓋内へ直接穴を開けて遺伝子を導入する方法の他、側脳室への投与、あるいはクモ膜下腔への投与などが挙げられる。このうちクモ膜下腔への投与は、本発明において開示された新規かつ効率的な投与法であり、本発明の目的、すなわち脳の血流量低下を血管新生で治療し、及び／又は脳の神経細胞死を抑制しようとする際には、クモ膜下腔への投与が好ましい。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。
製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、本発明のＤＮＡとして０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは０．００１−１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実験Ｉ．ＨＧＦ遺伝子及びＶＥＧＦ遺伝子による脳の血管新生及び血流量改善効果の検討
材料及び実験方法
１）両側頸動脈の結紮
雄スプラーグ・ドゥリーラット（３５０〜４００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ、日本国厚木市）をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、そして外科手術の間中自然呼吸させた。頚部中線切開によって、両側頸動脈を露出させ、そして２−０シルクで堅く結紮した。
２）ＨＶＪ−リポソームコンプレックスの調製
ＨＶＪ−リポソームを調製するために使用した方法は文献（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））に記載されているとおりである。簡単に述べると、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びコレステロールを１：４．８：２の重量比で混合した。この脂質混合物（１０ｍｇ）はロータリーエバポレーター内でテトラヒドロフランを除去してフラスコの側面に沈着させた。乾燥した脂質は、目的遺伝子の挿入された発現ベクターを有する２００μｌの平衡塩類溶液（ＢＳＳ；１３７μＭ  ＮａＣｌ、５．４μＭ  ＫＣｌ、１０μＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中で水和させた。対照群のリポソームは、目的遺伝子の挿入のない発現ベクターを含有している（ＢＳＳ２００μｌ）。振とう及び超音波処理によってリポソームを調製した。
精製ＨＶＪ（Ｚ株）は、使用直前に３分間ＵＶ照射（１秒当たり１１０エルグ／ｍｍ２）して不活性化した。リポソーム懸濁液（０．５ｍｌ、１０ｍｇの脂質を含有する）をＨＶＪ（総容量４ｍｌのＢＳＳ中１０，０００血球凝集単位）と混合した。この混合物を４℃で５分間、そしてその後静かに振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。フリーのＨＶＪはショ糖密度勾配遠心によってＨＶＪ−リポソームから除去した。ショ糖勾配の頂部層を集めて使用した。プラスミドＤＮＡの最終濃度は、以前の報告（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））に従って計算したとき、２０μｇ／ｍｌと同等であった。この調製方法は、最大のトランスフェクション効率を達成するように最適化されている。
３）インビボ遺伝子導入
インビボでの効率的な遺伝子導入法を確立するために、我々はＨＶＪ−リポソームとコンプレックスを形成したプラスミドを送達する３つの異なる方法；１）内頸動脈への直接注入、２）側脳室への注入、及び３）大槽（クモ膜下腔）への注入を試験した。
内頸動脈への注入では、雄スプラーグ・ドゥリーラット（３５０〜４００ｇ）をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、そして左総頸動脈まで切開してポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ、ニュージャージー州パーシッパニー）を左外頸動脈に導入した（Ｒａｋｕｇｉ等）。遠位外頸動脈区域は一時的結紮糸で短時間隔離した。ＨＶＪ−リポソームコンプレックス（１ｍｌ）を外頸動脈区域に注入した。注入後注入カニューレを除去し、そして結紮糸を緩めて総頸動脈への血流を回復させた。
側脳室への注入では、麻酔したラットを定位固定枠（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、日本国東京都）に置き、そして頭蓋を露出させた。特別に設計したテフロン連結器（ＦＥＰ管、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、インディアナ州ウェストラファイアット）を有するステンレス鋼カニューレ（３０ゲージ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を、文献（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））に記載されているようにして左側脳室に導入した。定位固定座標は次のとおりであった。：ブレグマの後ろ１．３ｍｍ、中線の側方２．１ｍｍ、及び頭蓋表面の下３．６ｍｍ。ＨＶＪ−リポソームコンプレックスを側脳室に注入した（２０μｌ）。ＨＶＪ−リポソームコンプレックスを注入した後、注入カニューレを除去した。四肢の痙攣又は異常運動のような挙動変化は、注入を受けたどの動物でも観察されなかった。
クモ膜下腔への注入では、各動物の頭部を臥位に固定し、そして後頭骨頚中線切開によって環椎後頭膜を露出させた。ステンレス鋼カニューレ（２７ゲージ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）をクモ膜下腔に導入した。カニューレの位置を確認しそして脳内圧の上昇を回避するために１００μｌの脳脊髄液を除去した後に、ＨＶＪ−リポソーム溶液（１００μｌ：１００μｇ／ｍｌ）を大槽（クモ膜下腔）に１分以上かけて注意深く注入した。その後、動物は３０分間頭部を下にして置いた。予防的投与量の抗生物質（３０，０００ＵのペニシリンＧ）を投与して無菌手順を完了させた。
４）レーザードップラー画像化
レーザードップラーイメージャー（ＬＤＩ）を使用して、手術後２週間に亘って連続的血流測定を記録した。ＬＤＩシステム（Ｍｏｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国デボン）には、１２×１２ｃｍの組織表面を６００μｍの深さまで連続的に走査する光線を発生させるために２ｍＷのヘリウム−ネオンレーザーが組み込まれている。走査中に、血管系を移動する血球はドップラー原理に従って投射光の振動数を変化させる。フォトダイオードは逆方向の散乱光を集めるので、元の光強度の変動は０〜１０Ｖの範囲の電圧変動に転換される。０Ｖの灌流出力値を０％の灌流に目盛り付けし、一方１０Ｖを１００％の灌流に目盛り付けした。走査が終了しそして逆方向の散乱光が全ての測定部位から集められると、血流分布を示す色分けされた画像がテレビモニターに表示される。灌流シグナルは６つの異なる区分に分けられ、そして各々は別個の色として表示される。血流量低下又は灌流無しは暗青色として示され、一方最大灌流は赤色として表示される。
ＬＤＩを使用して、閉塞前、直後、７日目及び１４日目の脳表面の灌流を記録した。頭皮中線切開部を通して、電気ドリルで１２×１２ｍｍの骨窓を作った。この骨窓上で連続的測定値が得られた。色分けされた画像が記録され、そして分析は各ラットについて灌流平均値を計算して実施した。周辺光や温度を含む変数を考慮するために、灌流計算値は後（虚血）対前（非処置）の脳の比として表した。
５）組織病理学的検査
３％のパラホルムアルデヒド／２０％のショ糖溶液中で１日間固定した後に、Ｘ−ｇａｌ染色用に、２５μｍの冠状面冷凍切片を１００μｍごとに作製した。切片をＸ−ｇａｌで染色してβ−ガラクトシダーゼを発現している染色されたニューロンを同定した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色用に、２５μｍの冠状面冷凍切片を１００μｍごとに作製した。これらの切片を０．３％の過酸化水素を含有するＰＢＳと共にインキュベートして、内因性ペルオキーダーゼ活性を下げ、そしてその後、１０％のウマ血清を有するＰＢＳ中で希釈した一次抗体又はレクチンと共に室温で６０分間インキュベートした。２％のウマ血清を含有するトリス緩衝生理食塩液中で３回洗浄した後、種に適するビオチン付加二次抗体、続いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼコンプレックス（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ，ＰＫ６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）をインキュベートした。抗体結合はジアミノベンジジンを使用して視覚化した。一次抗体を省略し、そしてタイプ及びクラスに適合した無関係な免疫グロブリンで染色して各抗体の陰性対照として使用した。
６）脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＨＧＦ及びＶＥＧＦに対するＥＬＩＳＡ法
両側頸動脈の閉塞前並びに７及び１４日後のラットから得られたＣＳＦ（１００μｌ）をこれらの実験用に使用した。ラット及びヒトＨＧＦはＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、東京都）で測定し、そしてヒトＶＥＧＦもＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）で測定した。
７）実験材料
ヒトＨＧＦ遺伝子は、ヒトのＨＧＦのｃＤＮＡ（特許第２７７７６７８号）を常法によりクローニングし、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ（インビトロゲン社製）に挿入したものを用いた。
ヒトＶＥＧＦ遺伝子は、ヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６，１３０６（１９８９））を常法によりクローニングし、これを発現ベクターｐＵＣ−ＣＡＧＧＳに挿入したものを用いた。
ヒト組換えＨＧＦは、ヒトＨＧＦｃＤＮＡ（特許第２７７７６７８号）を発現ベクターｐｃＤＮＡ（インビトロゲン社製）に挿入した組換え発現ベクターでチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ）又はＣ−１２７細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクションした後、その培養培地から常法により精製したものを用いた。
上記の材料及び実験方法に基づき、以下の実施例１〜４を行った。
実施例１
インビボでのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のトランスフェクションにおけるＨＶＪ−リポソーム送達系の効果
導入する遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（インビトロゲン社製、ＨＶＪリポソーム中の濃度：２０μｇ／ｍｌ）を使用し、上記の材料及び実験方法の記載に従ってＨＶＪ−リポソームを調製した。
まず、ＨＶＪ−リポソームコンプレックスをラットの内頸動脈に直接注入して、脳に到達させた。しかしながら、上記頸動脈での動脈内注入では、注入後３及び７日目に脳又は微小血管内皮細胞での発現は殆ど生じなかった（データは示していない）。それ故、ＨＶＪ−リポソームを側脳室及びクモ膜下腔に注入することとした。ＨＶＪ−リポソーム法によるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の注入はどちらも注入後３及び７日目にβ−ｇａｌの顕著な発現を生じさせた（図１及び図２）。側脳に注入したとき、β−ｇａｌ発現は主として側脳室及び脈絡膜叢周辺に観察された。対照的に、クモ膜下腔に注入したとき、β−ｇａｌ発現は脳表面に観察された。以上の結果より、脳の血流量低下を血管新生で治療しようと試みるとき、クモ膜下腔への注入を使用することがより良好であることが明らかとなった。
実施例２
ＨＧＦ及びＶＥＧＦ遺伝子のインビボトランスフェクション
ＨＧＦやＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子導入の効果を知るために、エリザ法で脳脊髄液（ＣＳＦ）中でのこれら分子のタンパク質発現を測定した（ｎ＝４、各群）。最初に両側頸動脈の閉塞前、７日後及び１４日後に対照ラット（ＨＧＦやＶＥＧＦ遺伝子挿入のない発現ベクターで処置）のＣＳＦ中のヒトＨＧＦ及びＶＥＧＦを測定したが、これらのタンパク質の濃度は検出されなかった（図３及び図４）。
次に、ＨＧＦ遺伝子（ＨＶＪリポソーム中の濃度：２０μｇ／ｍｌ）を頸動脈閉塞直後にクモ膜下腔に導入したラットのＣＳＦ中のヒトＨＧＦタンパク質濃度を測定した。トランスフェクション後７日目に、ヒトＨＧＦが検出されたが、ラットＨＧＦは検出されなかった（図３）。頸動脈を閉塞されていないラット（１．６３±０．１６ｎｇ／ｍｌ）と頸動脈を閉塞されたラット（１．６７±０．２９ｎｇ／ｍｌ）間で顕著な差異はなかった。トランスフェクション後１４日目でさえ、ヒトＨＧＦが（０．４０±０．０４ｎｇ／ｍｌ）で検出された（図３）。
上記のＨＧＦ遺伝子と同様の手法により、ＶＥＧＦ遺伝子（ＨＶＪリポソーム中の濃度：２０μｇ／ｍｌ）をクモ膜下腔に導入したところ、ＣＳＦ中のヒトＶＥＧＦの濃度はＨＧＦよりはるかに低かった（図４）（７日目；頸動脈を閉塞されていないラットで１８．９±２．９ｐｇ／ｍｌ、頸動脈を閉塞されたラットで１６．８±５．８ｐｇ／ｍｌ、１４日目；頸動脈を閉塞されていないラットで１１．７±１．６ｐｇ／ｍｌ、頸動脈を閉塞されたラットで９．９±１．５ｐｇ／ｍｌ）。これらの間のこの差異の理由は不明であるが、慢性の血流量低下を治療するためにはＨＧＦを適用して血管新生を生じさせることがより良好であるように思われる。
実施例３
ＨＧＦトランスフェクションによる脳表面での血管新生
実施例２と同様の処置を施したラットの組織を用いて、ＣＮＳにおけるＨＧＦ遺伝子導入の血管新生効果を確認した。すなわち、血管内皮細胞を検出するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を使用した組織病理学的分析を実施して、脳内及び周辺の内皮細胞を検出した。ＨＧＦ遺伝子導入されていないラットでは、ＡＬＰ陽性細胞は両側頸動脈の閉塞前及び７日後の脳の内部に限定されていた（図５のＡ、Ｃ）。興味深いことにＨＧＦ遺伝子導入ラットでは、ＡＬＰ陽性細胞は脳表面に観察され、両側頸動脈を閉塞されていないラットより閉塞されたラットでより多く脳表面に観察された（図５のＢ、Ｄ）。従ってこれらの結果は、ＨＧＦ遺伝子導入によって、特に虚血状態の脳表面に血管新生が生じるものと考えられた。
実施例４
ＬＤＩで測定したラットの脳血流（ＣＢＦ）
両側頸動脈閉塞前後のラットのＣＢＦを測定した。最初に、閉塞前、直後、７日後及び１４日後に遺伝子を導入されていないラットのＣＢＦの変化を分析した。予期されたように、ＣＢＦは両側頸動脈の閉塞直後に減少し、そして時間依存的に徐々に増加した（図６）。しかしながら、ＣＢＦは非処置ラットと比較して閉塞後７及び１４日目にやはり顕著により低かった（図６）。
次に、組換えＨＧＦ（２００μｇ）、ＨＧＦ遺伝子（ＨＶＪリポソーム中の濃度：２０μｇ／ｍｌ）、及び組換えＨＧＦとＨＧＦ遺伝子の組合せ物で処置したラットを測定した。これらＨＧＦ遺伝子及び組換えＨＧＦは、実施例２および３と同じくクモ膜下腔に注入した。各処置は頸動脈閉塞の１０分後に実施した。組換えＨＧＦで処置したラットでは、対照ラットと比較してＣＢＦの顕著な増加はなかった（対照：８８６．１±９９．６、組換えＨＧＦ；９８５．５±１４２．４）（図７）。しかしながら、ＨＧＦ遺伝子導入による処置では閉塞後７日目にＣＢＦが顕著に増加した（１２１４．５±１４５．１）。更に、組換えＨＧＦと遺伝子導入を組合せて処置したラットでは、予想外に、ＣＢＦは遺伝子導入単独の場合と比較して７日目にはるかにより高かった（１４９０．３±１９７．９）。これらの結果より、ＨＧＦ遺伝子導入による血管新生が脳の慢性的な血流量低下を改善し、そして動脈閉塞後に処置したとき、遺伝子と組換えＨＧＦの組合せが最も効果的であることが示された。
他方、ＶＥＧＦ遺伝子導入もＣＢＦを増加させたことから（１１２２．８±２６５．３）（図７）、ＶＥＧＦ遺伝子も脳の血流量低下の改善に有用であることが明らかとなった。
次に、動脈閉塞前に実施したとき、この処置が有効であり得るかどうかを検討した。興味深いことに、ＨＧＦ又はＶＥＧＦ遺伝子で動脈閉塞前に処置すると頸動脈閉塞によるＣＢＦの減少を防止した（対照；４５９．４±９７．４、ＨＧＦ；７９６．８±２０４、ＶＥＧＦ；７３７．６±２１１．５）（図８）。これらの結果は、虚血前に送達されたとき、ＨＧＦとＶＥＧＦ遺伝子導入が動脈閉塞による血流量低下を防止（予防）するのに有効であることを示している。
実験ＩＩ．ＨＧＦ遺伝子による脳の神経細胞死の抑制効果の検討
実験方法
実験に用いたヒトＨＧＦ遺伝子含有ＨＶＪ−リポソームコンプレックス及びヒト組換えＨＧＦは、前記実験Ｉ．と同様にして調製した。
実験には雄性砂ネズミ（体重５０ｇ〜７０ｇ）を使用した。２４℃に維持された部屋で飼育し、水と食餌は自由摂取とした。この砂ネズミを以下の５つのグループに分けた。「ｓｈａｍ」：コントロールグループ（虚血刺激なしグループ）、「ｖｅｈｉｃｌｅ」：両側頸動脈５分間虚血グループ、「ｐｏｓｔ  Ｇ」：両側頸動脈５分間虚血後ＨＧＦ遺伝子導入グループ、「ｐｒｅ  Ｇ」：両側頸動脈５分間虚血前ＨＧＦ遺伝子導入グループ、「ｐｏｓｔ  Ｒ」：両側頸動脈５分間虚血後１回リコンビナントＨＧＦ投与グループ。麻酔はフェイスマスクを用いて導入は３％ハロセンにて行い、そして１．５％ハロセン、２０％酸素、８０％窒素の混合気で維持した。体温（直腸温）は常にモニターしながら、３７度前後にヒートパッドを用いて維持した。両側頸動脈を露出後、速やかに血管クリップを用いて５分間血流を完全遮断した。その後、クリップを解除、血流を再開した。外科処置の直前または直後に、ＨＶＪリポソーム法を用いてヒトＨＧＦ遺伝子（２０μｇ）をクモ膜下腔より髄液腔へ導入した。リコンビナントＨＧＦ（３０μｇ）は、外科処置直後にクモ膜下腔より髄液腔へ投与した。術後もケージを３７℃に維持し、回復を待った。コントロールグループは血流遮断以外の外科処置を他のグループと同様に行った。虚血４、７日後において、脳を摘出し、切片をＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ染色、免疫染色することにより、病理組織学的な解析を行った。脳脊髄液中のＨＧＦ濃度の測定は、ヒトＨＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。
上記実験方法に基づき、以下の実施例５を行った。
実施例５
ＨＧＦ遺伝子トランスフェクションによる海馬ＣＡ−１領域の神経細胞死の抑制
正常砂ネズミを用いて、ＨＶＪリポソーム法による遺伝子のクモ膜下腔より髄液腔への導入の確認を行なった。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入し、脳切片のβ−Ｇａｌ染色を行なったところ、脳の表面と海馬ＣＡ−１領域に遺伝子の発現が観察された（図９）。
両側頸動脈５分間虚血により、脳の海馬ＣＡ−１領域に遅発性神経細胞死が認められた（図１０、ｖｅｈｉｃｌｅ群）。それに対しＨＧＦ遺伝子（ＰｒｅＧおよびＰｏｓｔＧ群）あるいはリコンビナントＨＧＦ（ＰｏｓｔＲ群）の投与により、遅発性神経細胞死が有意に抑制された（図１１及び図１２）。ＰｏｓｔＧ群の脳脊髄液中ＨＧＦ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定したところ、７日後においてもＨＧＦの発現が認められた（図１３）。よって、脳虚血による遅発性神経細胞死の抑制にＨＧＦが有効であることが示された。
ＨＧＦレセプターであるｃ−Ｍｅｔの発現部位を免疫染色法で検討したところ、ＣＡ−１領域に発現が認められ、ＨＧＦのシグナルは、このｃ−Ｍｅｔを介して伝達されることが示された（図１４）。
さらにＴＵＮＥＬ法によりＣＡ−１領域においてアポトーシスを起こした神経細胞を染色したところ、ｖｅｈｉｃｌｅ群で神経細胞のアポトーシスが多数確認された（図１５）。それに対しＨＧＦ遺伝子投与群（ＰｒｅＧおよびＰｏｓｔＧ群）では、アポトーシスはほとんど検出されなかった（図１５）。よってＨＧＦ遺伝子の投与は、神経細胞のアポトーシスを抑制していると考えられた。アポトーシス抑制のメカニズムを検討するため、アポトーシス抑制作用のあるＢｃｌ−ｘＬおよびＨＳＰ７０のＣＡ−１領域における発現を、免疫染色により検討した。Ｂｃｌ−ｘＬの発現を図１６に、またＨＳＰ７０の発現を図１７及び図１８に示した。両タンパクともＨＧＦ遺伝子の投与により神経細胞において発現が誘導された。以上よりＨＧＦ遺伝子の投与は、Ｂｃｌ−ｘＬやＨＳＰ７０の発現を誘導し、神経細胞のアポトーシスを抑制していることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、ＨＧＦ遺伝子及び／又はＶＥＧＦ遺伝子を有効成分として含有する脳血管障害の治療又は予防剤、あるいは当該治療又は予防剤をクモ膜下腔に投与することを特徴とする新規な投与方法などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、脳表面のβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）の発現を示す生物の形態写真である。下、ＨＶＪ−リポソーム（１ｍｌ）の内頸動脈内注入；中、ＨＶＪ−リポソーム（１００μｌ）の大槽（クモ膜下腔）内注入；上、ＨＶＪ−リポソーム（２０μｌ）の側脳室注入。各群、ｎ＝４。
図２は、脳内のβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）の発現を示す生物の形態写真である。左、内頸動脈内注入；中、側脳室注入；右、大槽（クモ膜下腔）内注入。
図３は、エリザ法によるラット脳脊髄液中でのヒトＨＧＦのインビボタンパク質発現を示すグラフである。図中、ＵＴはＨＧＦ遺伝子を含まない発現ベクターで処置したラットを、７ｄはＨＧＦ遺伝子導入７日目のラットを、１４ｄはＨＧＦ遺伝子導入１４日目のラットを示す。また図中、−は頸動脈の閉塞無しを、また＋は閉塞有りを示す。縦軸はＨＧＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。＊＊：ＵＴに対してＰ＜０．０１。各群、ｎ＝４。
図４は、エリザ法によるラット脳脊髄液中でのヒトＶＥＧＦのインビボタンパク質発現を示すグラフである。図中、ＵＴはＶＥＧＦ遺伝子を含まない発現ベクターで処置したラットを、７ｄはＶＥＧＦ遺伝子導入７日目のラットを、１４ｄはＶＥＧＦ遺伝子導入１４日目のラットを示す。また図中、−は頸動脈の閉塞無しを、また＋は閉塞有りを示す。縦軸はＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。＊＊：ＵＴに対してＰ＜０．０１。各群、ｎ＝４。
図５は、ＨＧＦ遺伝子のトランスフェクション前及び７日後の脳内及び周辺の内皮細胞に対する細胞組織化学的染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ａ（上左）、頸動脈を閉塞しないでベクター（ＨＧＦ遺伝子を含まない発現ベクター）をトランスフェクションした脳；Ｂ（上右）、頸動脈を閉塞しないでＨＧＦ遺伝子をトランスフェクションした脳；Ｃ（下左）、頸動脈閉塞後７日目のベクターをトランスフェクションした脳；Ｄ（下右）、頸動脈閉塞後７日目のＨＧＦ遺伝子をトランスフェクションした脳。各群、ｎ＝４。
図６は、レーザードップラーイメージャー（ＬＤＩ）で測定した脳血流の時間経過を示すグラフである。図中、ｐｒｅは閉塞前を、ｐｏｓｔは頸動脈閉塞直後を、７ｄは閉塞７日後を、１４ｄは閉塞１４日後の結果を示す。縦軸（ＦＬＵＸ）は脳灌流平均値を示す。ｐｒｅに対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。各群、ｎ＝６。
図７は、頸動脈閉塞後７日目にＬＤＩで測定したＣＢＦを示すグラフである。図中、ＵＴは発現ベクターで処置したラットを、ＲＣは組換えＨＧＦ（２００μｇ）で処置したラットを、ＧＥＮＥはＨＧＦ遺伝子（１０μｇ）で処置したラットを、ＧＥＮＥ＆ＲＣは組換えＨＧＦ（２００μｇ）とＨＧＦ遺伝子（１０μｇ）で処置したラットを、またＶＥＧＦにおけるＧＥＮＥはＶＥＧＦ遺伝子（２０μｇ／ｍｌ）で処置したラットの結果を示す。また縦軸（ＦＬＵＸ）は脳灌流平均値を示す。ＵＴに対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。各群、ｎ＝６。
図８は、頸動脈の閉塞前及び直後にＬＤＩで測定したＣＢＦを示すグラフである。図中ｐｒｅは、対照ラットの頸動脈閉塞前を、ｐｏｓｔは対照ラットの頸動脈閉塞直後を、ＨＧＦは動脈閉塞７日前にＨＧＦトランスフェクションを行ったラットの頸動脈閉塞直後の結果を、ＶＥＧＦは動脈閉塞７日前にＶＥＧＦトランスフェクションを行ったラットの頸動脈閉塞直後の結果を示す。ｐｏｓｔに対して、＊＊Ｐ＜０．０１。各群、ｎ＝５。
図９は、脳表面（図中Ｂｒａｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ）及び海馬ＣＡ−１領域（図中ＣＡ１）のβ−ｇａｌ（β−ガラクトシターゼ）の発現を示す、顕微鏡写真である。
図１０は、両側頸動脈の虚血刺激により、海馬ＣＡ−１領域に遅発性神経細胞死が認められた結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｓｈａｍ  ｏｐｅ．７ｄａｙｓはコントロール（外科処置のみで虚血刺激なし）７日目の結果を、またＶｅｈｉｃｌｅ（４ｄａｙｓ，７ｄａｙｓ）は両側頸動脈虚血後４日目及び７日目の結果を、それぞれ示す。
図１１は、両側頸動脈虚血刺激の前後にＨＧＦ遺伝子あるいは組換えＨＧＦタンパクを導入することにより、海馬ＣＡ−１領域の遅発性神経細胞死が抑制された結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｐｏｓｔ  ＨＧＦ  ｇｅｎｅ（４ｄａｙｓ，７ｄａｙｓ）は両側頸動脈虚血直後にＨＧＦ遺伝子を導入した４日目及び７日目の結果を、Ｐｒｅ  ＨＧＦ  ｇｅｎｅ  ７ｄａｙｓは両側頸動脈虚血直前にＨＧＦ遺伝子を導入した７日目の結果を、またｒ−ＨＧＦ  ７ｄａｙｓは両側頸動脈虚血直後に組換えＨＧＦタンパクを導入した７日目の結果を、それぞれ示す。
図１２は、生存している神経細胞を染色することにより、海馬ＣＡ−１領域の神経細胞密度を測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞密度（生存神経細胞数／ｍｍ）を示す。また横軸におけるｓｈａｍはコントロール（虚血刺激なし）の結果を、ｖｅｈｉｃｌｅは両側頸動脈虚血の結果を、Ｐｏｓｔ  Ｇは両側頸動脈虚血後にＨＧＦ遺伝子を導入した結果を、Ｐｒｅ  Ｇは両側頸動脈虚血前にＨＧＦ遺伝子を導入した結果を、またＰｏｓｔ  Ｒは両側頸動脈虚血後に組換えＨＧＦタンパクを導入した結果を、それぞれ示す。ｖｅｈｉｃｌｅに対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図１３は、両側頸動脈虚血後にＨＧＦ遺伝子を導入し、７日後の脳脊髄液中のＨＧＦのタンパク濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＨＧＦのタンパク濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し、また横軸中ｐｏｓｔ  ＨＧＦはＨＧＦ遺伝子導入の結果を、ｓｈａｍはコントロール（虚血刺激なし）の結果を、それぞれ示す。またＮ．Ｄ．は検出されなかった結果を示す。
図１４は、海馬ＣＡ−１領域におけるＣ−Ｍｅｔの発現を、免疫染色法により解析した結果を示す、顕微鏡写真である。
図１５は、海馬ＣＡ−１領域においてアポトーシスを起こした神経細胞をＴＵＮＥＬ法により染色した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、ＤＮＤ  ７ｄａｙｓは両側頸動脈虚血後７日目で遅発性神経細胞死を起こした神経細胞を、Ｐｏｓｔ  ＨＧＦ  ｇｅｎｅ  ７ｄａｙｓは両側頸動脈虚血直後にＨＧＦ遺伝子を導入した７日目の結果を、またＰｒｅ  ＨＧＦ  ｇｅｎｅ  ７ｄａｙｓは両側頸動脈虚血直前にＨＧＦ遺伝子を導入した７日目の結果を、それぞれ示す。
図１６は、海馬ＣＡ−１領域におけるＢｅｌ−ｘＬの発現を免疫染色法により解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、ｓｈａｍ．はコントロール（虚血刺激なし）の結果を、ｐｏｓｔ  ＨＧＦ（４ｄａｙｓ，７ｄａｙｓ）は両側頸動脈虚血直後にＨＧＦ遺伝子を導入した４日目及び７日目の結果を、それぞれ示す。
図１７は、両側頸動脈虚血直後にＨＧＦ遺伝子を導入後７日目の、海馬ＣＡ−１領域におけるＨＳＰ７０の発現を、免疫染色により解析した結果を示す顕微鏡写真である。
図１８は、海馬ＣＡ−１領域におけるＨＳＰ７０の発現を、免疫染色により解析した結果を示す顕微鏡写真である。図中Ｓｈａｍ．はコントロール（虚血刺激なし）の結果を、Ｐｏｓｔ  ＨＧＦ  ７Ｄは両側頸動脈虚血直後にＨＧＦ遺伝子を導入した７日目の結果を、それぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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