(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片をゲノム上に導入してなり、かつ、sigF遺伝子、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子及びsigE遺伝子から選ばれる1以上の胞子関連遺伝子、若しくはflgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子、cheD遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子及びsigD遺伝子から選ばれる１以上の鞭毛関連遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の１以上をゲノムから削除又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物。
【請求項２】
遺伝子の削除又は不活化が、ylbO遺伝子、cheC遺伝子、cheD遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子及びsigD遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を削除又は不活化するか、又はflgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子からなる２９遺伝子を全て削除又は不活化する請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
枯草菌のspoVG遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域が、配列番号９の塩基番号３８〜２１０の塩基配列からなる領域であり、枯草菌spoVG遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域とボソーム結合部位が、配列番号９の塩基番号３８〜２３０の塩基配列からなる領域である請求項１又は２記載の組換え微生物。
【請求項４】
枯草菌のprsA遺伝子に相当する遺伝子が、以下の（１）〜（４）のいずれかに記載の遺伝子である請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価な活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
【請求項５】
微生物がバチルス属細菌である請求項１〜４のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項６】
微生物が枯草菌である請求項５記載の組換え微生物。
【請求項７】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合した請求項１〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項８】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合したものである請求項７記載の組換え微生物。
【請求項９】
分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項７又は８記載の組換え微生物。
【請求項１０】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号５で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項８記載の組換え微生物。
【請求項１１】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が以下の（１）から（３）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項１〜１０いずれか1項記載の組換え微生物。
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有し、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加され、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicumATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
prsA遺伝子は、枯草菌においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質として発見され、これまでの研究から、PrsAは、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有することが推測されている。sigF遺伝子、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子、sigE遺伝子はいずれも胞子形成に関連する遺伝子であることが知られている。また、flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子は、枯草菌ゲノム上においては連続して存在することが知られており、flgM遺伝子、motA遺伝子、sigD遺伝子とともに、鞭毛形成や鞭毛の駆動、或いは鞭毛機能に関わる遺伝子の発現制御等に関与する遺伝子であることが知られている。
しかしながら、prsA遺伝子を過剰発現しており、かつ、これらの胞子形成関連遺伝子や鞭毛関連遺伝子が不活化した微生物はこれまで知られておらず、特にその様な微生物がprsA遺伝子を過剰発現している微生物に比べ、有用なタンパク質又はポリペプチドの優れた生産性を示すことは予想すらされていない。
【非特許文献１】Nature,390,249,1997
【非特許文献２】Science,277,1453,1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高い微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、prsA遺伝子を過剰発現した微生物から、胞子関連遺伝子や鞭毛関連遺伝子を削除又は不活化した微生物は、格段に優れた目的タンパク質又は目的ポリペプチド生産性を示すことを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を微生物に導入してなり、かつ、胞子関連遺伝子若しくは鞭毛関連遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の１以上をゲノムから削除又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、上記の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この明細書においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１１】
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００１２】
本発明の組換え微生物の宿主となる微生物としては、特に限定されず、野生型のものでも変異を施したものでものよく、具体的には、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましく、バチルス（Bacillus）属細菌としては、枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましく、特に枯草菌（Bacillus subtilis）168株が好ましい。
【００１３】
本発明の枯草菌prsA遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌prsA遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス  アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）、バチルス  チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス  イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各prsA遺伝子が挙げられる。また枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子としては以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価な活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１４】
本発明の微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主となる微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位であれば特に限定されないが、例えば、枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましい。枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域の一例としては、配列番号９の塩基番号３８〜２１０の塩基配列からなる領域、又はこれらの配列と相同な配列からなり転写開始制御領域としての機能を有する領域が挙げられる。また、枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一例としては、配列番号９の塩基番号３８〜２３０の塩基配列からなる領域、又はこれらの配列と相同な配列からなり転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有する領域が挙げられる。
【００１５】
prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流への当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の導入には、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。
【００１６】
当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、かかる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片の上流にprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、prsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域、及びprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のprsA遺伝子上流へ導入された転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial.93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5’側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3’側に続く領域を示す。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
【００１７】
また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、本来の転写開始制御領域と当該転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。
【００１８】
本発明において当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、prsA遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。
【００１９】
また、本発明における転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、及びprsA遺伝子断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結することにより得ることができる。かかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができ、また、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。
【００２０】
なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。
【００２１】
以下、具体、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いた当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による親微生物ゲノム上への導入方法について説明する。
ここで用いる導入用DNA断片は、親微生物ゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（２））の間に、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、prsA遺伝子断片（以下、断片（４））、及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加した断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加した断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じる。PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。
薬剤マーカー遺伝子としては、エリスロマイシン耐性遺伝子等を用いることが出来る。また、ここで行うPCR反応は、表１−１〜表１−３に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Presspp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、エリスロマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、エリスロマイシン耐性遺伝子の他には、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。
【００２２】
本発明の組換え微生物で削除又は不活化される胞子関連遺伝子としては、胞子形成に関連する遺伝子であれば特に制限されないが、例えば、sigF遺伝子、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子及びsigE遺伝子が挙げられる。これらは単独で削除又は不活性化してもよいし、2以上を組み合わせて削除又は不活性化してもよい。
【００２３】
本発明の組換え微生物で削除又は不活化される鞭毛関連遺伝子としては、鞭毛の機能に関連する遺伝子であれば特に制限されないが、例えば、flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子、cheD遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子及びsigD遺伝子が挙げられる。これらは単独で削除又は不活性化してもよいし、2以上を組み合わせて削除又は不活性化してもよく、前記の胞子関連遺伝子の1以上と組み合わせて削除又は不活性化してもよい。このうち、fliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子又はsigD遺伝子をそれぞれ削除又は不活性化すること、又はflgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子を同時に削除又は不活性化することが好ましい。
【００２４】
上に挙げた遺伝子について、遺伝子番号、遺伝子機能は後記の表５及び表７に示す。なお、これら各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997)、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００２５】
後記表５及び表７に示される各遺伝子に相当する遺伝子とは、表５及び表７に示される各遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、表５及び表７の各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子が挙げられる。尚、ここで、塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。
【００２６】
遺伝子の削除又は不活化は、表５及び表７に示した１又は２以上の標的遺伝子を計画的に削除又は不活化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法により行うことができる。
【００２７】
標的とする遺伝子を計画的に削除又は不活化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活化した標的遺伝子、又は標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２箇所（好ましくは、上流側、下流側それぞれ1箇所）で二重交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活化することが可能である。
【００２８】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を削除又は不活化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を用いることによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２９】
また、ランダムな遺伝子の不活化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００３０】
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される削除用DNA断片を用いた二重交差法による削除方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子削除方法は下記に限定されるものではない。
【００３１】
本方法で用いる削除用DNA断片は、削除対象遺伝子の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、削除対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図３）。
【００３２】
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片との間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図３）。
【００３３】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１−１〜表１−３に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の削除用DNA断片が得られる。
【００３４】
かくして得られた削除用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある削除対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。即ち、表１−１〜表１−３に示したプライマーセットを用いて調製した削除用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。
【００３５】
なお、本発明の組換え微生物において削除又は不活化される遺伝子のうち、flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子からなる２９の遺伝子から削除又は不活性化する数としては、２５以上が好ましく、２８以上がより好ましい。また、上記２９遺伝子以外の遺伝子から削除又は不活性化する数としては、５以下が好ましく、３以下がより好ましい。
【００３６】
本発明の組換え微生物に導入される目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に限定されず、食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられ、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、α-アミラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERMBP-6946）由来のα-アミラーゼが挙げられる。バチルス  エスピー（Bacillus sp.） KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス(Bacillus)属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。また、セルラーゼの具体例としては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３７】
また、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス(Bacillus)属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、または、配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換、もしくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは複数個の塩基配列が付加されているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関る機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００３８】
上記の目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の導入は、かかる遺伝子を結合させた組換えプラスミドを、コンピテントセル形質転換法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって行うことができる。また、相同組換えにより、かかる遺伝子を含むDNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても行うことができる。
【００３９】
本発明の組換え微生物を用いれば有用なタンパク質又は目的ポリペプチドを効率的に生産することができる。本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００４１】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００４２】
また、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００４３】
培養上清中のアミラーゼの活性測定には、リキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００４４】
実施例１  prsA遺伝子発現強化株の構築
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表１−１に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１−１に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Em2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１−１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.3kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示すamyEfw2とprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.4kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Ka株と命名した。
【００４５】
【表１−１】
0004839144.tif 000002
【００４６】
【表１−２】
0004839144.tif 000003
【００４７】
【表１−３】
0004839144.tif 000004
【００４８】
実施例２  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−１
実施例１にて得られたprsA-Ka株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号３で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（I）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表１−１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
実施例１にて得られたprsA-Ka株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表２に示した様に、宿主としてprsA-Ka株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。これはprsA-Ka株にてprsA遺伝子の発現が野生株より高まり、細胞膜上のPrsAタンパク質量が増加したことにより、タンパク質の分泌効率が向上した結果によるものと推測された。
【００４９】
【表２】
0004839144.tif 000005
【００５０】
実施例３  ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
図３に基づいて、ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。尚、sigF遺伝子は枯草菌の胞子形成期に特異的に機能するシグマ因子SigFをコードする遺伝子である。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１−１に示したsigF-FW及びsigF/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、sigF/Cm-F及びsigF-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表１−１に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.85kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
次に、図３に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１−１に示したsigF-FW2及びsigF-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.8kbのDNA断片（D）を得た。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってsigF遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、sigF遺伝子欠失株（ΔsigF株）を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例１にて構築したprsA-Ka株を用いることにより、prsA-Ka株ゲノム中のsigF遺伝子をCm耐性遺伝子にて置換した菌株（prsAKΔsigF株）を構築した。
【００５１】
実施例４  ゲノム中spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子、或いはsigE遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のspo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子或いは、sigE遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子による置換を行い、spo0J遺伝子欠失株（Δspo0J株）、spoIIR遺伝子欠失株（ΔspoIIR株）、scoC遺伝子欠失株（ΔscoC株）、ylbO遺伝子欠失株（ΔylbO株）、spoIIE遺伝子欠失株（ΔspoIIE株）、及びsigE遺伝子欠失株（ΔsigE株）を構築した。各菌株の構築には表１−１〜表１−３に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表３及び表４に示した。尚、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子、及びsigE遺伝子はいずれも枯草菌の胞子形成に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。各遺伝子の機能を表５に示した。
【００５２】
【表３】
0004839144.tif 000006
【００５３】
【表４】
0004839144.tif 000007
【００５４】
【表５】
0004839144.tif 000008
【００５５】
また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上の上記各遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔspo0J株、prsAKΔspoIIR株、prsAKΔscoC株、prsAKΔylbO株、prsAKΔspoIIE株、及びprsAKΔsigE株を構築した。
【００５６】
実施例５  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−２
実施例３及び４にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。図４に示した様に、ΔylbO株では168株より低い分泌生産を示したのに対し、prsAKΔylbO株ではprsA-Ka株より更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。またprsAKΔsigF株、prsAKΔspo0J株、prsAKΔspoIIR株、prsAKΔscoC株、prsAKΔspoIIE株、及びprsAKΔsigE株においてもprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、それぞれの株のprsA-Ka株に対する生産量の増加（図４の斜線部分に相当）は、ΔsigF株、Δspo0J株、ΔspoIIR株、ΔscoC株、ΔspoIIE株、或いはΔsigE株各々で示された枯草菌168株に対する生産量増加（図４の黒塗りで示す部分に相当）より顕著であった。即ち、prsAKΔsigF株、prsAKΔspo0J株、prsAKΔspoIIR株、prsAKΔscoC株、prsAKΔylbO株、prsAKΔspoIIE株、及びprsAKΔsigE株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。
【００５７】
実施例６  ゲノム中flgB遺伝子〜cheD遺伝子領域の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上で連続して存在するflgB遺伝子〜cheD遺伝子の29遺伝子（flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子、cheD遺伝子）を、実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、クロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換してΔflaA(29)株を構築した。使用したプライマーを表１−１〜表１−３に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表６に示した。また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上の上記29遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔflaA(29)株を構築した。尚、flgB遺伝子〜cheD遺伝子の29遺伝子はいずれも枯草菌の運動性・走化性に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。各遺伝子の機能を表７に示した。
【００５８】
【表６】
0004839144.tif 000009
【００５９】
【表７】
0004839144.tif 000010
【００６０】
実施例７  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−３
実施例６にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。表８に示した様に、ΔflaA株(29)では168株より低い分泌生産を示したのに対し、prsAKΔflaA(29)株ではprsA-Ka株より更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。即ち、prsAKΔflaA(29)株では、prsA遺伝子発現強化とflgB遺伝子〜cheD遺伝子領域欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。
【００６１】
【表８】
0004839144.tif 000011
【００６２】
実施例８  ゲノム中fliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子、或いはsigD遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のfliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子、或いはsigD遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子による置換を行い、fliG遺伝子欠失株（ΔfliG株）、flhA遺伝子欠失株（ΔflhA株）、flgM遺伝子欠失株（ΔflgM株）、motA遺伝子欠失株（ΔmotA株）、及びsigD遺伝子欠失株（ΔsigD株）を構築した。各菌株の構築には表１−１〜表１−３に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表９及び表１０に示した。尚、fliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子、及びsigD遺伝子はいずれも枯草菌の運動性・走化性に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。各遺伝子の機能を表７に示した。
【００６３】
【表９】
0004839144.tif 000012
【００６４】
【表１０】
0004839144.tif 000013
【００６５】
また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上の上記各遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔfliG株、prsAKΔflhA株、prsAKΔflgM株、prsAKΔmotA株、及びprsAKΔsigD株を構築した。
【００６６】
実施例９  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−４
実施例８にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。図５に示した様に、ΔflhA株とΔsigD株では168株と同等、若しくはより低い分泌生産を示したのに対し、prsAKΔflhA株とprsAKΔsigD株ではprsA-Ka株より更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。またprsAKΔfliG株、prsAKΔflgM株、及びprsAKΔmotA株においてもprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、それぞれの株のprsA-Ka株に対する生産量の増加（図５の斜線部分に相当）は、ΔfliG株、ΔflgM株、或いはΔmotA株各々で示された枯草菌168株に対する生産量増加（図５の黒塗りで示す部分に相当）より顕著であった。即ち、prsAKΔfliG株、prsAKΔflhA株、prsAKΔflgM株、prsAKΔmotA株、及びprsAKΔsigD株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。またfliG遺伝子とflhA遺伝子は実施例６及び７記載のflgB遺伝子〜cheD遺伝子領域内に存在する遺伝子であり、prsAKΔfliG株やprsAKΔflhA株にて認められた相乗的な効果は、prsA-Ka株よりflgB遺伝子〜cheD遺伝子領域内の他の遺伝子を単独で欠失させた場合にも同様に得られる効果であると推測された。
【００６７】
比較例１  ゲノム中comA遺伝子領域の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上のcomA遺伝子を、実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、クロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換してΔcomA株を構築した。使用したプライマーを表１−１〜表１−３に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表１１に示した。また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上のcomA遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔcomA株を構築した。尚、comA遺伝子は枯草菌のDNA受容能（コンピテンス）に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。comA遺伝子の遺伝子番号及び機能を表１２に示した。
【００６８】
【表１１】
0004839144.tif 000014
【００６９】
【表１２】
0004839144.tif 000015
【００７０】
比較例２  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−５
比較例１にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。表１３に示した様に、prsA-Ka株に対してcomA遺伝子欠失を行うことによるアルカリアミラーゼの分泌生産向上は認められなかった。即ち、prsA遺伝子発現強化とcomA遺伝子欠失（コンピテンス欠損）との組合せによる相乗効果は認められず、むしろコンピテンス欠損はprsA遺伝子発現強化の効果を損なうことが示された。
【００７１】
【表１３】
0004839144.tif 000016
【００７２】
実施例１０  バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子発現強化と各遺伝子欠失との組み合わせにおけるアルカリアミラーゼ分泌生産評価
バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子（配列番号１１３）は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例１の方法と同様の方法にて、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１４に示したBce/PVG-FとBce/catf-Rのプライマーセットを用いてバチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。また上記比較例にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したamyEfw2とPVG-R、及びcatfとamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片（Ｂ）、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した1.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｄ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｄ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
次いで、実施例４及び実施例６と同様の方法にて、prsAbc-K株のゲノム上よりspoIIE遺伝子、sigE遺伝子、flgB遺伝子〜cheD遺伝子の29遺伝子、及びfliG遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換したprsAbcKΔspoIIE株、prsAbcKΔsigE株、prsAbcKΔflaA(29)株、及びprsAbcKΔfliG株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株、prsAbcKΔspoIIE株、prsAbcKΔsigE株、prsAbcKΔflaA(29)株、及びprsAbcKΔfliG株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株、ΔspoIIE株、ΔsigE株、ΔflaA(29)株、及びΔfliG株についても評価を行った。その結果、図６に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められたが、prsAbc-K株より各遺伝子を欠失した菌株においてはより顕著な生産性向上が認められ、実施例５、実施例７、及び実施例９で見られたのと同様、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子発現強化と各遺伝子欠失との組み合わせがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。
【００７３】
【表１４】
0004839144.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。
【図２】spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結したprsA遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。
【図３】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法の一例を模式的に示したものである。
【図４】本発明の微生物のアミラーゼ分泌生産量を示した図である。
【図５】本発明の微生物のアミラーゼ分泌生産量を示した図である。
【図６】本発明の微生物のアミラーゼ分泌生産量を示した図である。
【図１】
0004839144.tif 000018
【図２】
0004839144.tif 000019
【図３】
0004839144.tif 000020
【図４】
0004839144.tif 000021
【図５】
0004839144.tif 000022
【図６】
0004839144.tif 000023
【配列表】
0004839144000001.app