(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の中から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードし、ここで当該ポリペプチドはストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptcoccus pyogenes）に対する免疫応答を誘導できる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の中から選択されたアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の中から選択された配列からなるポリペプチドに対する結合特異性をもつ抗体を生成する能力をもつポリペプチドをコードする、請求項１又は２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５の中から選択されたヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５の中から選択されたヌクレオチドからなる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
DNAである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
RNAである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに対し相補性である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが発現制御領域に対し作用可能式に連結されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んで成るベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの産生方法であって、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１０に記載の宿主細胞を培養する段階を含んで成る、方法。
【請求項１２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の中から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドであって、ここで当該ポリペプチドはストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptcoccus pyogenes）に対する免疫応答を誘導できる、ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の中から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を誘導する能力をもつ、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６の中から選択されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２、４、６又は８のＮ末端のメチオニン残基が欠失している、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列の分泌性アミノ酸配列が欠失している、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド及び薬学的に受容可能な担体、希釈剤又はアジュバントを含んで成るワクチン組成物。
【請求項１８】
咽頭炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、菌血症、毒素性ショック又は壊疽性筋膜炎の治療的又は予防的処置のためのワクチン組成物であって、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを治療的又は予防的量で含んで成る、ワクチン組成物。
【請求項１９】
個体におけるストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptcoccus pyogenes）感染症の治療的又は予防的処置のためのワクチン組成物であって、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを治療的又は予防的量で含んで成る、ワクチン組成物
【請求項２０】
ストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptcoccus pyogenes）感染症の治療的又は予防的処置のための医薬品の調製のための、請求項１７に記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、連鎖球菌感染の予防、診断及び／又は治療に有用でありうる抗原、より特定的には、ストレプトコッカス・パイオジェンス（連鎖球菌Ａ群（Streptococcus）（ＧＡＳ）とも呼ばれる）細菌病原体のポリペプチド抗原に関する。
【０００２】
発明の背景
連鎖球菌は、細胞表面で発見される群特異性炭水化物抗原ＡからＯによって分化されるグラム陽性菌である。ストレプトコッカス・パイオジェンス分離株は、型特異的タンパク質抗原によってさらに識別される。Ｍタンパク質は、分子量及び配列の両方において高い可変性をもつ重要な毒性因子である。実際、抗原差に基づいて８０以上のＭタンパク質タイプが同定されてきた。
【０００３】
ストレプトコッカス・パイオジェンスは、咽頭炎、丹毒及び膿痂疹、猩紅熱、及び、菌血症及び壊疽性筋膜炎といった侵襲性疾患さらには毒素性ショックを含む数多くのさまざまな感染タイプの原因となっている。近年、侵襲性疾患の復活が、北米及び欧州の国々を含む数多くの国で報告されてきている。この生体は抗生物質に対する感受性をもつものの、高い攻撃速度及び急速な敗血症の発症は、結果として高い罹病率と死亡率をもたらす。
【０００４】
個体をストレプトコッカス・パイオジェンス感染から防御することになるワクチンを開発するために、型特異的Ｍタンパク質といったような毒性因子に研究努力が集中させられてきた。しかしながらＭ−タンパク質のアミノ末端部分は、自己免疫疾患に関与する可能性のあるヒトの心筋、トロポミオシン、ミオシン及びピメンチンと反応した交差反応性抗原を誘発することがわかった。その他の研究では、異なる血清型からＭ−タンパク質のアミノ末端ペプチドを含有する複合ハイブリッドタンパク質を産生するために、組換え型技術が用いられてきた。しかしながら、全てのストレプトコッカス・パイオジェンス血清型を含有する安全なワクチンは、産生及び標準化がきわめて複雑なものとなる。
【０００５】
血清型特異的抗原に加えて、その他のストレプトコッカス・パイオジェンス タンパク質は、潜在的なワクチン候補として関心を呼んだ。少なくともストレプトコッカス・パイオジェンス４０血清型によって発現されるＣ５ａペプチターゼは、マウスにおいて免疫原性をもつことが示されたが、鼻咽頭コロニー化レベルを減少させるその能力には制限がある。その他の研究者は、同様に、感染の病因論において重要な役割を果たすと思われるストレプトコッカス・パイオジェンスの外毒素にも焦点をあてた。これらのタンパク質での免疫化は、毒性ショックの致命的な症候を防止したが、コロニー化は防げなかった。
【０００６】
従って、連鎖球菌感染の予防、診断及び／又は治療のためのワクチン成分内で使用可能なストレプトコッカス・パイオジェンス抗原に対する今だに満たされていないニーズが残っている。
【０００７】
発明の要約
１つの態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体の中から選択された配列をもつ第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
１つの態様に従うと、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体の中から選択された配列をもつ第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
その他の態様では、本発明のポリヌクレオチドによりコードされた新規のポリペプチド、発現制御領域に作用可能式に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに、前記ベクターでのトランスフェクションされた宿主細胞、薬学的又はワクチン組成物及び発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養する段階を含むポリペプチド産生方法、が提供されている。
【００１０】
発明の詳細な説明
１つの態様に従うと、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体の中から選択された配列をもつ第２のポリペプチドに対する少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
１つの態様に従うと、本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体の中から選択された配列を含む第２のポリペプチドに対する少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
１つの態様に従うと、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体を含むアミノ酸配列によって特徴づけされるポリペプチドに関する。
【００１３】
１つの態様に従うと、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体の中から選択された配列を含むポリペプチドに対する結合特異性をもつ抗体を生成する能力をもつポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明に従うと、図１７に描かれているコンセンサスヌクレオチド配列が提供されている。アライメントによってわかるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、充分に保存されている。本発明の範囲を制限する意味なく、以下の表１は、考えられる修飾を示している。配列番号１９は、表１に例示された修飾を伴う図１７に記したコンセンサスヌクレオチド配列を網羅している。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
【表３】
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【００１８】
本発明に従うと、図１８に描かれたコンセンサスアミノ酸配列が提供されている。アライメントによってわかるように、本発明のポリペプチドは、充分に保存されている。本発明の範囲を制限する意味なく、以下の表２は、考えられる修飾を示している。配列番号２０は、表２に例示された修飾を伴う図１８に記したコンセンサスヌクレオチド配列を網羅している。
【００１９】
【表４】
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【００２０】
【表５】
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【００２１】
本発明に従うと、ポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に入る。
【００２２】
さらなる実施形態においては、本発明に従ったポリペプチドは抗原性である。
【００２３】
さらなる実施形態においては、本発明に従ったポリペプチドは免疫原性である。
【００２４】
さらなる実施形態においては、本発明に従ったポリペプチドは、個体内で免疫応答を惹起することができる。
【００２５】
さらなる実施形態においては、本発明は同様に、上述のように本発明のポリペプチドに対する結合特異性をもつ抗体を発生させることのできるポリペプチドにも関する。
【００２６】
「結合特異性をもつ」抗体は、選択されたポリペプチドを認識し結合できるものの、標本、例えば生体標本内でその他の分子を実質的に認識し結合することのない抗体をいう。特異的結合は、選択されたポリペプチドが抗原として用いられるＥＬＩＳＡ検定を用いて測定可能である。
【００２７】
本発明に従うと、生物学的研究における「保護」は、生存曲線、生存率又は生存期間の有意な増加により定義づけされる。生存曲線を比較するためにログランク検定を、又、死に至るまでの日数及び生存率を比較するためにフィッシャー正確検定をそれぞれ用いる統計学的分析は、Ｄ値を計算し２つのグループ間の差異が統計的に有意であるか否かを見極めるために有用であり得る。０.０５のＰ値は、有意ではないとみなされる。
【００２８】
本書で用いられるように、本発明のポリペプチドの「フラグメント」、「類似体」又は「誘導体」には、アミノ酸残基のうちの単数又は複数のものが、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存されたもの）で置換され天然又は非天然でありうるようなポリペプチドが内含される。１実施形態においては、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、図中に例示された配列又はそのフラグメントと約７０％の同一性を有することになる。すなわち、残基の７０％が同じということである。さらなる１実施形態においては、ポリペプチドは７５％を超える相同性をもつことになる。さらなる１実施形態では、ポリペプチドは、８０％を超える相同性をもつことになる。さらなる１実施形態においては、ポリペプチドは８５％を超える相同性をもつことになる。さらなる１実施形態では、ポリペプチドは９０％を超える相同性をもつことになる。さらなる１実施形態では、ポリペプチドは９５％を超える相同性をもつことになる。さらなる１実施形態においては、ポリペプチドは９９％を超える相同性をもつことになる。さらなる実施形態においては、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、約２０個未満のそしてより好ましくは１０個未満のアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失を有することになる。好ましい置換は、保存されたものとして当該技術分野において既知のものである。すなわち置換された残基は、疎水性、サイズ、電荷又は官能基といった物理的又は化学的特性を共有している。
【００２９】
当業者であれば、本発明のタンパク質又はポリペプチドのフラグメント又は誘導体が同様に本発明の状況下ですなわち抗原／免疫原性材料としても使用されることになる、ということがわかるだろう。かくして、例えば、単数又は複数の付加、欠失、置換などを含むタンパク質又はポリペプチドが本発明により包含されている。さらに、１つのアミノ酸の類似の「タイプ」のもう１つのアミノ酸と置換することが可能であり得る。例えば、１つの疎水性アミノ酸をもう１つの疎水性アミノ酸と置換する。
【００３０】
アミノ酸配列を比較するために、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムといったようなプログラムを使用することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、適宜いずれかの配列内に空間を挿入することにより最適なアライメントを発見する。最適なアライメントのためのアミノ酸同一性又は類似性（アミノ酸タイプの同一性プラス保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘといったようなプログラムが、類似の配列の最長区間をアライメントし、適合に対し１つの値を割当てることになる。かくして、各々が異なる評点をもつ複数の類似性領域が発見される比較を得ることが可能である。同一性分析の両方のタイプが、本発明で考慮されている。
【００３１】
一つの代替的アプローチにおいては、類似体又は誘導体は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドに有効にタグ付けすることによって精製をより容易にする部分を内含する融合タンパク質であり得、「タグ」を除去する必要性がでてくるかもしれないし、或いは又融合タンパク質自体が有用であるのに充分なほどの抗原性を保持している場合もあるかもしれない。
【００３２】
本発明のさらなる態様においては、本発明のタンパク質又はポリペプチド又はその類似体又は誘導体の抗原性／免疫原性フラグメントが提供されている。
【００３３】
本発明のフラグメントは、単数又は複数のエピトープ領域を内含しているか又はその抗原／免疫原性特性を保持するために充分なほどにかかる領域に類似しているべきである。かくして、本発明に従ったフラグメントについては、本書に記述するように１つのタンパク質又はポリペプチド、相同性又は誘導体の特定の部分に対し１００％の同一性をもつ可能性があることから、同一性度はおそらく関連性がない。ここでも又、重要な問題は、フラグメントが抗原性／免疫原性特性を保持することにある。
【００３４】
かくして、類似体、誘導体及びフラグメントにとって重要なことは、少なくともそれらが由来するタンパク質又はポリペプチドの抗原性／免疫原性度をそれらが有することにある。
【００３５】
同様に内含されているのは、半減期を延長させるためポリペプチドの生物学的又は薬学的特性を改変するその他の化合物すなわちポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；精製を容易にするためのリーダー又は分泌アミノ酸配列；プレプロ及びプロ配列及び多糖類を融合された状態で有するポリペプチドである。
【００３６】
さらに、アミノ酸領域が多形性であることがわかっているような状況下では、異なる連鎖球菌菌株の異なるエピトープをより有効に擬態するために単数又は複数の特定のアミノ酸を変動させることが望ましい可能性がある。
【００３７】
その上、本発明のポリペプチドを、末端−ＮＨ2アシル化により（例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いたアセチル化、又はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシアミド化）修飾して、支持体又はその他の分子に対する連関又は結合のための増大した疎水性、安定性を提供することが可能である。
【００３８】
同様に考慮されているのは、ポリペプチドフラグメント、類似体及び誘導体のヘテロ及びホモポリペプチド多量体である。これらの重合体形態には、例えば、アビジン／ビオチン、グルテルアルデヒド又はジメチルスーパーイミデードといったような架橋剤と架橋された単数又は複数のポリペプチドが含まれる。かかる重合体形態は同様に、組換え型ＤＮＡ技術により生成された多シストロンｍＲＮＡから生産された２つ以上の縦列又は反転隣接配列を含むポリペプチドをも内含している。
【００３９】
好ましくは、本発明のポリペプチドのフラグメント、類似体又は誘導体は少なくとも１つの抗原性領域すなわち少なくとも１つのエピトープを含むことになる。
【００４０】
抗原性重合体（すなわち合成多量体）の形成を達成するために、試薬がチオ基に特異的である、ビスハロアセチル基、ニトロアリルハロゲン化物などをもつポリペプチドを利用することができる。従って、異なるペプチドの２つのメルカプト基の間の連関は、単結合であってもよいし、或いは又、少なくとも２つ、標準的には少なくとも４つそして１６以下、ただし通常は約１４以下の炭素原子の連関基で構成されていてもよい。
【００４１】
特定の１実施形態においては、本発明のポリペプチドフラグメント、類似体及び誘導体はメチオニン（Ｍet）出発残基を含んでいない。好ましくは、ポリペプチドはリーダー又は分泌配列（シグナル配列）を包含しない。本発明のポリペプチドのシグナル部分は、立証された分子生物学技術に従って決定され得る。一般に、問題のポリペプチドは、連鎖球菌の培養から単離され得その後、成熟タンパク質ひいては成熟ポリペプチドの最初の残基を決定するべく配列決定され得る。
【００４２】
もう１つの態様に従うと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤又はアジュバントと混和した状態で本発明の単数又は複数の連鎖球菌を含むワクチン組成物が提供されている。適切なアジュバントには、オイルすなわちフロイント完全アジュバント；塩すなわちＡｌＫ（ＳＯ4）2、ＡｌＮａ（ＳＯ4）2、ＡｌＮＨ4（ＳＯ4）2、シリカ、カオリン、炭素ポリヌクレオチドすなわちポリＩＣ及びポリＡＵが含まれる。好ましいアジュバントとしては、QuilA及びAlhydrogelが含まれる。本発明のワクチンは、注射、高速輸液、鼻咽頭吸収、皮ふ吸収又は舌下により腸管外投与されるか又は経口投与され得る。薬学的に受容可能な担体は同様に、破傷風トキソイドを内含する。
【００４３】
ワクチンという語は、同様に、抗体を内含するものとされている。本発明に従うと、連鎖球菌感染及び／又はそれにより媒介される疾病及び症候の治療又は予防のための本発明のポリペプチドに対する結合特異性をもつ単数又は複数の抗体の使用も提供されている。
【００４４】
本発明のワクチン組成物は、本書に参考として内含されているP. R. Murray(編集主幹)、E. J. Baron, M. A., Pfaller, F. C., Tenover及びR.H., Yalker「臨床微生物学マニュアル」ASM Press, Washington, D.C. 第６版、１９９５、１４８２ｐ、に記述されているような連鎖球菌感染及び／又はそれにより媒介される疾病及び症候の治療又は予防のために使用される。１つの実施形態においては、本発明のワクチン組成物は、咽頭炎、丹毒及び膿痂疹、猩紅熱、及び、菌血症及び壊疽性筋膜炎といった侵襲性疾患さらには毒素性ショックの予防又は治療のために使用される。１つの実施形態においては、本発明のワクチン組成物は、特に、Ａ群Streptococcus（pyogenes）、Ｂ群Streptococcus（ＧＢＳ又はagglactiae）、 S. pneumoniae、dysgalactiae、uberis、nocardiaならびにStaphylococcus aureusによる連鎖球菌感染及び／又はそれにより媒介される疾病及び症候の予防又は治療のために使用されている。さらなる実施形態においては、連鎖球菌感染はストレプトコッカス・パイオジェンスによるものである。
【００４５】
特定の１実施形態においては、ワクチンは、小児、高齢者及び免疫無防備状態の個体といったような連鎖球菌感染の危険性にさらされた個体に対し投与される。
【００４６】
本出願の中で使用されるように、「個体」という語は、哺乳動物を内含している。さらなる実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【００４７】
ワクチン組成物の好ましい単位投与量は、免疫化の間に約１〜６週間の間隔をおいて１〜３回約０.００１〜１００μｇ／kg（抗原／体重）、より好ましくは０.０１〜１０μｇ／kg、最も好ましくは０.１〜１μｇ／kgである。
【００４８】
ワクチン組成物の好ましい単位投与量は、免疫化間に約１〜６週間の間隔をおいて１〜３回、約０.１μｇ〜１０ng、より好ましくは１μｇ〜１mgそして最も好ましくは１０〜１００μｇである。
【００４９】
もう１つの態様に従うと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそのフラグメント、類似体又は誘導体の中から選択されたアミノ酸配列により特徴づけされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供されている。
【００５０】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、読取り枠（ＯＲＦ）を含みうる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１９に例示されているものである。
【００５１】
図中に例示されているポリヌクレオチド配列は、同義コドンで改変され、それでもなお本発明のポリペプチドをコードできるということがわかるだろう。従って本発明はさらに、配列間で５０％の同一性をもつ上述の本書のポリヌクレオチド配列（又はその補体配列）に対しハイブリダイズ形成するポリヌクレオチドを提供する。１実施形態では配列間で少なくとも７０％の同一性；１実施形態では配列間で少なくとも７５％の同一性；１実施形態では配列間で少なくとも８０％の同一性；１実施形態では、配列間で少なくとも８５％の同一性；１実施形態では、配列間で少なくとも９０％の同一性；さらなる実施形態においては、ポリヌクレオチドはストリンジェント条件下すなわち少なくとも９５％の同一性をもつ条件下でハイブリダイズ形成可能である。さらなる実施形態においては、９７％以上の同一性をもつ。
【００５２】
ハイブリダイゼーションのための適切なストリンジェント条件は、当業者により容易に決定され得る（例えば、Sambrook et al., (１９８９)分子クローニング：実験室マニュアル、第２版 Cold Spring Harbor, N.Y；「分子生物学における現行プロトコル」；編集Ausubel F. M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.（１９９９）を参照のこと）。
【００５３】
さらなる１実施形態においては、本発明は、ストリンジェント条件下で
（ａ）  ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）  ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の補体
に対しハイブリダイズ形成するポリヌクレオチドにおいて、前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６、２０又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００５４】
さらなる１実施形態においては、本発明は、ストリンジェント条件下で
（ａ）  ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）  ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の補体
に対しハイブリダイズ形成するポリヌクレオチドにおいて、前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６、２０又はそのフラグメント又は類似体から選択された配列を含むポリペプチド由来の少なくとも１０個の隣接アミノ酸残基を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【００５５】
さらなる１実施形態においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０で例示されているような本発明のポリペプチドをコードするものである。
【００５６】
さらなる１実施形態においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１９に例示されているものである。
【００５７】
当業者ならば容易にわかるように、ポリヌクレオチドはＤＮＡ及びＲＮＡの両方を内含する。
【００５８】
本発明は同様に、当該出願で記述されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをも内含する。
【００５９】
さらなる態様においては、本発明のポリペプチド又はそのフラグメント、類似体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ免疫化方法において使用することができる。すなわち、これらは、注入時点で複製及び発現可能であるベクター内に取込まれて、in vivoで抗原ポリペプチドを産生できる。例えば、ポリヌクレオチドを、真核細胞内で機能的であるＣＭＶプロモータの制御下でプラスミドベクターの中に取込むことが可能である。好ましくは、ベクターは、筋内注射される。
【００６０】
もう１つの態様に従うと、宿主細胞内で前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現されたポリペプチド産物を回収することにより、組換え型技術によって本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスが提供されている。他には、樹立済み合成化学技術すなわち、完全ポリペプチドを産生するべく連結されているオリゴペプチド（ブロック連結）の溶液相又は固相合成に従って、ポリペプチドを産生することができる。
【００６１】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの獲得及び評価のために一般的方法は、本書に参考として内含されている以下の参考文献の中記述されている： Sambrook et al, 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版Cold Spring Harbor, N.Y., １９８９；分子生物学における現行プロトコル；編集：Ausubel F.M. et al., John Wiley and Sons, Inc. New York；ＰＣＲクローニングプロトコル、分子クローニングから遺伝子工学まで：編集：White B.A., Humara Press, Totowa, New Jersey, １９９７、４９０ページ；タンパク質の精製、原理と実践、Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 第３版、１９９３、３８０ pages；免疫学における現行プロトコル：編集：Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., New York.
組換え体産生のためには、宿主細胞を、ポリペプチドをコードするベクターでのトランスフェクションに付し、次にプロモータを活性化し形質転換体を選択するか又は遺伝子を増幅するために適切であるように修飾された栄養培地の中で培養する。適切なベクターは、選択された宿主の中で生存可能でかつ複製可能であり、例えば細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクターといったような染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列を内含する。ポリペプチド配列は、プロモータ、リボソーム結合部位（コンセンサス領域又はShine-Dalgarno配列）そして任意にはオペレータ（制御要素）を含む発現制御領域に対し操作可能な形で連関されるような形で制限酵素を用いて適切な部位でベクター内に取込まれ得る。樹立済みの分子生物学の原理（本書に参考として内含されている、Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版Cold Spring Harbor, N.Y. １９８９；分子生物学における現行プロトコル； 編集：Ausubel F. M. et al., John Wiley & Sons, Inc., New.York）に従って一定の与えられた宿主及びベクターにとって適切である発現制御領域の個々の成分を選択することができる。適切なプロモータには、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモータ、E. Coli lac、tac又はtrpプロモータ及びファージラムダＰ2プロモータが含まれるがこれらに制限されるわけではない。ベクターは、好ましくは複製起点ならびに選択マーカーすなわちアンピシリン耐性遺伝子を取込むことになる。適切な細菌ベクターには、pET、pQE７０、pQE６０、pQE−９、pbs、pD１０ phagescript、psiX１７４、pbluescript SK、 pbsks、ｐＮＨ８Ａ、ｐNH１６ａ、ｐNH１８A、ｐNH４６A、 ptrc９９a、pKK２２３−３、pKK２３３−３、pDR５４０、pRIT５及び真核生物ベクターpBlueBacIII、pWLNEO、 pSV2CAT、pOG４４、pXT１、pSG、pSVK３、pBPV、pMSG及びｐSVLが含まれる。宿主細胞は細菌すなわち E. coli、Bacillus subtilis、Streptomyces；真菌すなわちAspergillus niger、Aspergillus nidulins； 酵母すなわちSaccharomyces又は真核生物すなわちCHO、COSでありうる。
【００６２】
培養中のポリペプチドの発現時点で、細胞は標準的に遠心分離により収獲され、次に物理的又は化学的手段（発現されたポリペプチドが培地中に分泌されない場合）により分断され、結果としてもたらされる粗製抽出物は、問題のポリペプチドを単離するべく保持される。培地又はリゼイト由来のポリペプチドの精製は、ポリペプチドの特性に応じて樹立済の技術により、すなわち硫酸アンモニウム又はエタノール沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ及びレクチンクロマトグラフィによって達成可能である。最終的精製は、ＨＰＬＣを用いて達成することができる。
【００６３】
ポリペプチドは、リーダー又は分泌配列を伴って又は伴なわずに発現可能である。伴う場合、リーダーは、翻訳後プロセシングを用いて除去される（本書に参考として内含されているＵＳ.４.４３１.７３９号；ＵＳ４.４２５.４３７号；及びＵＳ４.３３８.３９７号）か又は、発現されたポリペプチドの精製に後続して化学的で除去され得る。
【００６４】
さらなる態様に従うと、本発明の連鎖球菌ポリペプチドは、連鎖球菌感染特にストレプトコッカス・パイオジェンス感染についての診断試験において使用することができる。いくつかの診断方法が可能であり、例えば、生体標本内の連鎖球菌生体を検出する場合、以下の手順に従うことができる：
ａ）  個体から生体標本を得る；
ｂ）  混合物を形成するべく生体標本と共に、本発明の連鎖球菌ポリペプチドと反応性をもつ抗体又はそのフラグメントをインキュベートする；そして
ｃ）連鎖球菌の存在を示す、混合物中の特異的に結合した抗体又は結合したフラグメントを検出する。
【００６５】
他には、前記抗体を含有する又は含有する疑いのある生体標本中で連鎖球菌抗原に特異的な抗体を検出する方法は、以下のように実施可能である。
【００６６】
ａ）  個体から生体標本を得る；
ｂ）  混合物を形成するべく生体標本と共に、本発明の単数又は複数の連鎖球菌ポリペプチド又はそのフラグメントをインキュベートする；そして
ｃ）連鎖球菌に特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合したフラグメントを検出する。
【００６７】
当業者であれば、この診断試験が、基本的に、そのタンパク質に特異的な抗体が個体内に存在するか否かを見極める目的で、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法又はラテックス凝集検定法といったような免疫学的試験を含めた複数の形態をとり得るということを認識するだろう。
【００６８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、同様に、連鎖球菌を含有する疑いのある生体標本中の連鎖球菌の存在を検出する上で使用するためのＤＮＡプローブを設計するのに用いることもできる。本発明の検出方法には以下の段階が含まれる。
【００６９】
ａ）  個体から生体標本を得る段階、
ｂ）  混合物を形成するべく生体標本と共に、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントコードするＤＮＡ配列をもつ単数又は複数のＤＮＡプローブをインキュベートする段階、そして
ｃ）連鎖球菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出する段階。
【００７０】
本発明のＤＮＡプローブは同様に、例えば、連鎖球菌感染の診断方法としてポリメラーゼ連鎖反応を用いて、１つの標本内の循環連鎖球菌すなわちストレプトコッカス・パイオジェンス核酸を検出するために使用することもできる。プローブは、従来の技術を用いて合成でき、固相上に固定化することもできるし、又は検出可能な標識を用いて標識づけすることもできる。本出願のための好ましいＤＮＡプローブは、本発明のストレプトコッカス・パイオジェンス ポリペプチドの少なくとも約６個の隣接したヌクレオチドに対し相補的な配列をもつオリゴマである。
【００７１】
個体における連鎖球菌の検出のためのもう１つの診断方法は、以下の段階を含んで成る：
ａ）  検出可能な標識を用い、発明のポリペプチド又はそのフラグメントと反応性をもつ抗体を標識づけする段階；
ｂ）  標識づけした抗体又は標識づけしたフラグメントを患者に投与する段階； 及び
ｃ）  連鎖球菌の存在を示す患者体内の特異的に結合した標識づけされた抗体又は標識づけされたフラグメントを検出する段階。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、連鎖球菌感染の診断特に治療のための特異的抗体の産生を目的とした免疫原としての本発明の連鎖球菌ポリペプチドの使用にある。適切な抗体は、例えばテストモデル内の連鎖球菌感染に対し受動的に防御する特定の抗体の能力を測定することなどによる適切なスクリーニング方法を用いて決定可能である。動物モデルの一例としては、本書の例中で記述されているマウスモデルがある。抗体は、全抗体であっても又その抗原結合フラグメントであってもよく、又あらゆる免疫グロブリンクラスに属していてもよい。抗体又はフラグメントは動物由来のものであり得、特定的には哺乳動物、より特定的にはマウス、ラット、又はヒト由来のものであり得る。それは、天然の抗体又はそのフラグメントであってよく、又望ましい場合には、組換え型抗体又は抗体フラグメントであり得る。組換え型抗体又は抗体フラグメントという語は、分子生物学技術を用いて生産された抗体又は抗体フラグメントを意味する。抗体又は抗体フラグメントは、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであり得る。それは、ストレプトコッカス・パイオジェンスポリペプチドと会合した一定数のエピトープについて特異的でありうるが、好ましくは１つについて特異的である。
【００７３】
本発明のさらなる態様は、受動免疫法のための本発明の連鎖球菌ポリペプチドに向けられた抗体の使用にある。本出願で記述した抗体を使用することが可能であろう。適切な抗体は、テストモデル中の連鎖球菌感染に対し受動的に防御する特定の抗体の能力を測定することといった適切なスクリーニング方法を用いて決定可能である。動物モデルの一例としては、本書の例中で記述されているマウスモデルがある。抗体は、全抗体であっても又その抗原結合フラグメントであってもよく、又あらゆる免疫グロブリンクラスに属していてもよい。抗体又はフラグメントは動物由来のものであり得、特定的には哺乳動物、より特定的にはマウス、ラット、又はヒト由来のものであり得る。それは、天然の抗体又はそのフラグメントであってよく、又望ましい場合には、組換え型抗体又は抗体フラグメントであり得る。組換え型抗体又は抗体フラグメントという語は、分子生物学技術を用いて生産された抗体又は抗体フラグメントを意味する。抗体又は抗体フラグメントは、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであり得る。それは、Streptococcus pneumoniae ポリペプチドと会合した一定数のエピトープについて特異的でありうるが、好ましくは１つについて特異的である。
【００７４】
特にことわりのないかぎり、本書で用いられる全ての技術及び科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本書に言及されている全ての刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、その全体が参考として内含されている。矛盾がある場合、定義づけを含む当該明細書が支配する。さらに、材料、方法及び例は、例示を目的としているにすぎず、制限的意図はない。
【００７５】
例１
この例は、S.パイオジェンス遺伝子のクローニングを例示している。
【００７６】
S.パイオジェンス 遺伝子 ＢＶＨ−Ｐ１（配列番号１）のコーディング領域を、制限部位ＮcoＩ(ＣＣＡＴＧＧ)及びＸhoＴ（ＣＴＣＧＡＧ）の付加のための塩基拡張を含んでいた以下のオリゴを用いて血清型３のS.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４のゲノミックＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡ Thermal Cycler GeneAmp PCR system ２４００ Perkin Elmer, San Jose, CA）によって増幅させた：ＤＭＡＲ１６（５′−ＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＧＧＴＴＡＣ−３′）；ＤＭＡＲ１７（５′−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣ−３′）。ＰＣＲ産物を、メーカーの指示事項（Chatsworth, CA）に従ってＱＩＡgenからのＱＩＡquickゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルから精製し、ＮcoＩ及びＸhoＩで消化した（Pharmacia, canada Inc, Baie d’Urfe, Canada）。ｐＥＴ−２１ｄ（＋）ベクター（Novagen, Madison, WI）をＮcoＩ及びＸhoＩで消化させ、ＱＩＡgen（Chatsworth, CA）からのＱＩＡ quickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。ＮcoＩ−ＸhoＩ ＰＣＲ産物をＮcoＩ−ＸhoＩ ｐＥＴ−２１ｄ（＋）発現ベクターに連結した。連結した産物を、Simanisの方法（Hanahan, D. DNA Cloning, １９８５, D. M. Glover (ed), pp.  １０９−１３５）に従って、E. coli菌株 E. coli菌株ＤＨ５２［Φ８０ｄｌａｃＺΔＭＩＳ  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｅｎｄＡ１  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒk−ｍk＋）  ｄｅｏＲ  ｔｈｉ−１  ｓｕｐＥ４４  λ-ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ, Gaithersburg, ＭＤ）に形質転換させた。ＢＶＨ−Ｐ１遺伝子を含有する組換え型ｐＥＴ−２１ｄ（＋）プラスミド (rpＥＴ２１ｄ（＋）) を、ＱＩＡgneプラスミドキット（Chats worth, CA）を用いて精製し、ＤＮＡインサートを配列決定した（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA）。
【００７７】
ＢＶＨ−Ｐ１についてコードする読取り枠（ＯＲＦ）が１１７０−ｂｐを含有し、予測ｐＩが４.３７で予測分子質量が４１０５４Ｄａの３８７アミノ酸残基ポリペプチドをコードするということが見極められた。
【００７８】
Spscanソフトウェア（Wisconsin配列分析パッケージ；Genetics Computer Group）を用いた予測アミノ酸残基配列（配列番号２）の分析は、アラニンとグルタミンの残基の間にある分割部位で終わる２５アミノ酸残基シグナルペプチド（ＭＩＩＴＫＫＳＬＦＶＴＳＶＡＬＳＬＡＰＬＡＴＡＱＡ）の存在を示唆していた。このＯＲＦの分析は、反復構造、細胞壁固着モチーフ（ＬＰＸＴＧ）又はＩｇＡ結合モチーフ（ＭＬＫＫＩＥ）の存在を顕示しなかった。
【００７９】
S.パイオジェンス ＢＶＨ−Ｐ１遺伝子と６２％を共有するＯＲＦが、当初、Ｂ群連鎖球菌抗原について記述した特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９９／００１１４の中で紹介された。ＢＶＨ−Ｐ１遺伝子は、同様に、S. pneumoniaeのゲノム内に存在するＯＲＦと相同性（６２％の同一性）を共有することが発見された（The Institute for Genomic Research）。
【００８０】
例２
この例は、その他のS.パイオジェンス菌株からのＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＰＣＲ増幅及び配列決定及びこの遺伝子の分子保存レベルの評価について記述する。
【００８１】
Lansfieldの血清群Ａ  S.パイオジェンス  ＬＳＰＱ２２９６（ＡＴＣＣ１９６１５）は、laboratoire de la sante publique du Quebec, Sainte-Anne-de-Bellevue; により提供された。血清型１S.パイオジェンス  ＳＰＹ５７臨床分離株は；centre de recherche en infectiologie du centre hospitalier de l’universite Laval, Sainte-Foy. により提供された；又、当初マウスから単離されたS.パイオジェンス菌株 Ｂ５１４は、University of Arabama, BirminghamからSusan Hollingsheadにより提供された。菌株ＡＴＣＣ１２３８４（配列番号１）ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）（配列番号３）、ＳＰＹ５７（配列番号５）及びＢ５１４（配列番号７）からのS.パイオジェンス 遺伝子のそれぞれのコーディング領域をＤＭＡＲ６９（５′−ＣＴＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＣＴＡＧＣＡＣＡＴＴＡＡＴＡＣ−３′）；ＤＭＡＲ７２（５′−ＣＡＴＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′）というオリゴを用いて細菌細胞リゼイトからＰＣＲ（ＤＮＡ Thermal Cycler GeneAmp PCR system ２４００ Perkin Elmer, San Jose, CA）により増幅させた。メーカーの指示事項（Chats worth, CA）に従ってＱＩＡgen社製のＱＩＡquickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルからＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡインサートを配列決定した。（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA）。菌株ＡＴＣＣ１２３８４（ＱＮ２）、ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）（配列番号４）、ＳＰＹ５７（配列番号６）及びＢ５１４（配列番号８）からの予測されたアミノ酸配列は、それぞれ以下の図２、４、６及び８の中で紹介されている。
【００８２】
図１７及び１８はそれぞれS.パイオジェンス ＢＶＨ−Ｐ１について立証されたコンセンサスヌクレオチド及び予測されたアミノ酸配列を記している。ここで紹介された配列に加えて、オクラホマ大学でのゲノム配列決定プロジェクトから（血清型ＭＩ S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ ７００２９：http://dnal.chem.ou.edu/strep.html）及び（Kil et al. １９９４. Infect. Immun. ６２：２４４０−２４４９：GenBank accession number U０９３５２）からのＢＶＨ−Ｐ１遺伝子配列も同様に内含された。GenBank受入れ番号Ｕ０９３５２の配列については、細菌の病因論又は感染に対する防御におけるいかなる機能も役割も、Kil et alによって記述されなかった。Kil et alによって紹介されたこの後者の配列は、S.パイオジェンス ６７kaDaミオシン−交差反応抗原の上流にあるものとして示された。
【００８３】
ＢＶＨ−Ｐ１の予測されたタンパク質配列の対比較は、受入れ番号Ｕ０９３５２の下でGenBankから得られたＢＶＨ−ＰＣ配列を除いて、９５〜１００％の間の同一性を明らかにした。この特定の配列とその他の５つのＢＶＨ−Ｐ１配列の対比較は、８７〜９１％の間の同一性を示した。このように相同性が比較的低いことは、その他のＢＶＨ−Ｐ１遺伝子配列に比べより発散的である２つの領域（１１９−１２４及び２６２−２８１）の存在によって説明がつく。Ｕ０９３５２という受入れ番号の下でGen Bankから得られたＢＶＨ−Ｐ１配列内のこれら２つの領域の他に、ＢＶＨ−Ｐ１遺伝子は、全体的組織に関し大きい類似性を示した。
【００８４】
例３
この例は、ＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ内のS.パイオジェンス タンパク質遺伝子のクローニングを例示している。
【００８５】
S.パイオジェンス タンパク質のＤＮＡコーディング領域を、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨ内でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの転写制御下にあったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の下流側の相内に挿入した（Tang et al., Nature, １９９２、３５６；１５２）。ＣＭＶプロモータは、E. coli細胞内の非機能的プラスミドであるが、真核細胞内のプラスミドの投与時点で活性である。このベクターは同様に、アンピシリン耐性遺伝子を包含していた。
【００８６】
リーダーペプチド領域のないＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のコーディング領域（配列番号９）を、制限部位BamＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）及びSalＩ（ＧＴＣＧＡＣ）の付加のための塩基拡張を含有していた以下のオリゴを用いて、血清型３ S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４のゲノミックＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡ Thermal Cycler GeneAmp PCR system ２４００ Perkin Elmer, San Jose, CA）によって増幅させた：ＤＭＡＲ２４（５′−ＴＡＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＧＧ−３′）；ＤＭＡＲ２５（５′−ＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＡＴＡＧＧＧＣ−３′）。ＰＣＲ産物を、制限酵素で消化されたＱＩＡgen（Chatsworth, CA）社製のＱＩＡquickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した（Pharmacia Canada Inc, Baie d’Urfe, Canada）。ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（テキサス大学（Dallas, Texas）、生化学部、Stephen A, Johnston博士研究室）をBamＨＩ及びSalＩで消化させ、QIAgen（Chatsworth, CA）社製のQIAquickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。BamHI-SalＩ ＤＮＡフラグメントをBamHI-SalＩ ｐＣＭＶ−ＧＨベクターに連結してＣＭＶプロモータの制御下でｈＧＨ−ＢＶＨ−Ｐ１融合タンパク質を作り上げた。Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, １９８５, D. M. Glover (ed), pp. １０９−１３５)の方法に従ってE. coli菌株ＤＨ５α［Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｅｎｄＡ１  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒk−ｍk＋）  ｄｅｏＲ  ｔｈｉ−１  ｓｕｐＥ４４  λ-ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ, Gaithersburg, ＭＤ）へと、連結産物を形質転換させた。組換え型ｐＣＭＶプラスミドをＱＩＡgenプラスミドキット（Chatworth, CA）を用いて精製し、ＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を確認した。
【００８７】
例４
この例は、S.パイオジェンス抗原に対する免疫応答を惹起するためのＤＮＡの使用を例示している。
【００８８】
５０μｇの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）発現プラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ（テキサス大学（Dallas, Texas）生化学部、Stephan A. Johnston博士研究室）の存在下でＢＶＨ−Ｐ１遺伝子をコードする組換え型ｐＣＭＶ−ＧＨを用いて２〜３週間の間隔で３回１００μｌの筋内注射により、８匹の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（Charles River, St-Constant, Quebee, Canada）のグループを免疫化した。対照として、１グループのマウスに５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨを、５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦの存在下で注射した。各免疫化に先立ち、そして３回目の注入から７日後に眼窩血脈洞から血液標本を収集し、血清抗体応答を、コーティング抗原として配列番号１１のS.パイオジェンス組換え型タンパク質からの精製済ＢＶＨ−Ｐ１Ｈis・Ｔagを用いてＥＬＩＳＡにより決定した。
【００８９】
例５
この例は、組換え型S.パイオジェンス ＢＶＨ−Ｐ１の産生及び精製を例示する。E. coli菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ-ompT hsdSB（ｒ-Bｍ-B）gal dcm（DE３））（Novagen, Madison, WI）を電気穿孔法（Gene pulser II器具、ＢＩＯ−ＲＡＤ Labs, Mississauga, Canada）によって形質転換させるために、配列番号９に対応するＢＶＨ−Ｐ１遺伝子を伴う組換え型ｐＥＴ−２１ｄ（ｔ）プラスミドを使用した。このE. coli菌株の中で、組換え型タンパク質の発現を制御するＴ７プロモータはイソプロピル−β−ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘発可能なlacプロモータの制御下にある遺伝子をもつ（λＤＥ３プロファージ上に存在する）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって、特異的に認識される。形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴは、Ａ600が０.６の値に達するまで、１mlにつき１００μｇのカルベニシリン（Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada）を含有するＬＢブロス（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）中で２５０rpmでの撹拌を伴って３７℃で、形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴを成長させた。（配列番号１０からのS.パイオジェンス ＢＶＨ−Ｐ１−His・Ｔag組換え型タンパク質の産生を誘発するために、細胞をさらに３時間、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧの存在下で細胞のインキュベートした。５００mlの培養からのインキュベートされた細胞を、遠心分離によってペレット化し、−７０℃で凍結させた。
【００９０】
ＩＰＴＧで誘発されたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１ｂ（＋）の可溶性細胞質分画からの組換え型タンパク質の精製は、His・Bind金属キレート化樹脂上に固定化された２価のカチオン（Ｎｉ2+）に結合するべく、His・Tag配列（６つの連続するヒスチジン残基）の特性に基づいて、親和性クロマトグラフィによって行なわれた。簡単に言うと、ＩＰＴＧで誘発された５００ｍＬの培養から得られたペレット化された細胞を、１ｍＭのＰＭＳＦを含む溶菌緩衝液（トリス２０ｍＭ、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ、ｐＨ７.９）の中で再懸濁させ、音波処理し、１２０００×ｇで２０分間遠心分離して、破片を除去した。Ｎｉ―ＮＴＡアガロースカラム（Oiagen, Mississauga, Ontario, Canada）上に上清を被着させた。（配列番号１０からの）S.パイオジェンス ＢＶＨ−Ｐ１−Ｈis・Ｔag組換え型タンパク質を、イミダゾール２５０ｍＭ−ＮａＣｌ ５００Ｍ−トリス２０ｍＭ ｐＨ７.９で溶出させた。４℃でＰＢＳに対する透析により、標本からの塩及びイミダゾールの除去を行なった。E. coliの可溶性分画から得られた組換え型タンパク質の数量を、MicroＢＣＡ（Pierce, Rockford, Illinois）により推定した。
【００９１】
例６
この例は、S.パイオジェンス菌株の表面でのＢＶＨ−Ｐ１タンパク質の抗体に対するアクセス可能性を例示している。
【００９２】
細菌を、８％のＣＯ2雰囲気中で３７℃で０.５％の酵母エキス（Difco Laboratories）及び０.５％のペプトン抽出物（Merck, Darmstadt, Germany）を用いてTood Hewitt（ＴＨ）ブロス（Difco Laboratories, Detroit MI）中で成長させて、０.６００のＯＤ490nm（〜１０8ＣＦＵ／ml）を得た。その後、抗−ＢＶＨ−Ｐ１又は対照血清の希釈液を添加し、細胞に結合させ、これを４℃で２時間インキュベートした。遮断緩衝液〔２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〕中で４回、標本を洗浄し、次に、遮断緩衝液中に希釈されたヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−接合抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを１ml添加した。室温で６０分間さらにインキュベートした後、標本を遮断緩衝液中で４回洗浄し、４℃で１８〜２４時間、ＰＢＳ緩衝液中で０.２５％のホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳ緩衝液中で２回細胞を洗浄し、５００μｌのＰＢＳ緩衝液中で再懸濁させた。フローサイトメトリ（Epics（登録商標） XLi Beckman Coulter, Inc.）により分析されるまで、４℃で細胞を暗所に保った。フローサイトメトリ分析は、ＢＶＨ−Ｐ１特異的抗体が、テスト対象の相同な（ＡＴＣＣ１２３８４：血清型３）及び非相同な（ＳＰＹ５７；血清型１）S.パイオジェンス菌株の両方の上で、それらの対応する表面露呈エピトープを効率よく認識したことを明らかにした。分析対象の１００００のS.パイオジェンス細胞のうちの９０％以上が、ＢＶＨＭＣ１特異的抗血清の中に存在する抗体で標識づけされたということが見極められた。これらの観察事実は明らかに、ＢＶＨ−Ｐ１タンパク質が抗体により容易に認識されうる表面において、このタンパク質にアクセスすることができるということを立証している。抗S.パイオジェンス抗体は、S.パイオジェンス感染に対する防御において重要な役割を果たすことが示された。
【００９３】
例７
この例は、ウサギ超免疫血清を用いたマウスの受動免疫によって誘発された胎児S.パイオジェンス感染に対する防御を例示する。
【００９４】
ニュージーランドウサギ（Charles River laboratories, Montreal, Canada）に、例５に記述された通りに産生され精製されアルヒドロゲルアジュバント（Superfos Biosector a/s）に吸着された（配列番号１０からの）約５０μｇ及び１００μｇのＢＶＨ−Ｐ１−His・Tag タンパク質を、多数の部位において皮下注射した。３週間の間隔をおいて、（配列番号１０からの）ＢＶＴ−Ｐ１−ＨＩＳ・ＴＡＧタンパク質で３回ウサギを免疫化した。３回目の注射から３週間後に、血液標本を収集した。血清中に存在する抗体を、４０％の飽和硫酸アンモニウムを用いて沈殿により精製した。１０匹の雄のＣＤ−１マウス(Charles River)から成るグループに、（配列番号１０からの）ＢＶＴ−Ｐ１−ＨＩＳ・ＴＡＧで免疫化されたウサギ又は非縁故の対照組換え型タンパク質で免疫化されたウサギのいずれかから収集した精製血清５００μｌを、静脈内注射した。１８時間後に、３型S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４を約２×２０7ＣＦＵ用いて、マウスに抗原投与した。血液寒天平板上にS.パイオジェンス抗原投与接種材料の標本を平板固定して、ＣＦＵを決定し、抗原投与量を確認した。５日間にわたり死亡を記録した。
【００９５】
例８
この例は、ＢＶＨ−Ｐ１タンパク質での免疫化によって誘発された胎児S.パイオジェンス感染に対するマウスの防御を例示する。
【００９６】
８匹の雌のＣＤ−１マウス（Charles River）から成るグループを、１０μｇのQuilA アジュバント（Cedarlane Laboratories Ltd, Hornky, Canada）の存在下で２０μｇの親和性精製されたS.パイオジェンス ＢＶＴ−Ｐ１−ＨＩＳ・ＴＡＧタンパク質（配列番号１０から）を用いて、又は対照としてＰＢＳ中のQuilA アジュバント単独を用いて、３週間の間隔をおいて３回皮下で免疫化した。各免疫化に先立つ１日、２２日及び４３日前及び３回目の注入から７日後（５０日目）に、眼窩血脈洞から血液標本を収集した。（配列番号１０からの精製した組換え型ＢＶＨ−Ｐ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡによる分析は、明らかに、このタンパク質が動物の体内できわめて高い免疫原性をもつことを示した。実際、１０6より高い相互ＥＬＩＳＡ力価が、この組換え型タンパク質で免疫化されたマウスについて見極められた。２週間後に、マウスは、約２×１０7ＣＦＵの３型S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４での抗原投与を受けた。S.パイオジェンス抗原投与接種材料の標本を血液寒天平板上で平板固定して、ＣＦＵを決定し、抗原投与量を確認した。５日間にわたり死亡を記録した。２０μｇの精製組換え型ＢＶＨ−Ｐ１（配列番号１０から）及びQuilA アジュバントの３回の注射で免疫化された８匹中５匹（６２％）のマウスが、細菌抗原投与を生き延び、これに対し対照グループではわずか７中２（２８％）であった。
【００９７】
表３．精製済み組換え型ＢＶＨ−Ｐ１タンパク質でのＣＤ−１マウスの免疫化は、S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４でのその後の抗原投与に対する防御を付与する。
【００９８】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  位置１〜７５に分泌シグナルを伴う血清型３ S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４由来のＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である； 配列番号１。
【図２】  位置１〜２５に分泌シグナルを伴う血清型３S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４由来のＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号２
【図３】  位置１〜７５に分泌シグナルを伴うS.パイオジェンス菌株ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）由来のＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号３
【図４】  位置１〜２５に分泌シグナルを伴うS.パイオジェンス菌株ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）由来のＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号４
【図５】  位置１〜７５に分泌シグナルを伴うS.パイオジェンス菌株ＳＰＹ５７由来のＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号５
【図６】  位置１〜２５に分泌シグナルを伴うS.パイオジェンス菌株ＳＰＹ５７由来のＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号６
【図７】  位置１〜７５に分泌シグナルを伴うS.パイオジェンス菌株Ｂ５１４由来のＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号７
【図８】  位置１〜２５に分泌シグナルを伴うS.パイオジェンス菌株Ｂ５１４由来のＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号８
【図９】  血清型３S.パイオジェンス菌株２６９９（ＡＴＣＣ１２３８４）由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号９
【図１０】  血清型３S.パイオジェンス菌株ＡＴＣＣ１２３８４由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号１０
【図１１】  血清型３S.パイオジェンス菌株ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号１１
【図１２】  血清型３S.パイオジェンス菌株ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号１２
【図１３】  血清型３S.パイオジェンス菌株ＳＰＹ５７由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号１３
【図１４】  血清型３S.パイオジェンス菌株ＳＰＹ５７由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１タンパク質のアミノ酸配列である：配列番号１４
【図１５】  血清型３S.パイオジェンス菌株Ｂ５１４由来の分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号１５
【図１６】  血清型３S.パイオジェンス菌株Ｂ５１４由来の、分泌シグナルを伴わないＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号１６
【図１７】  MacVector配列分析ソフトウェア（バージョン６.５）由来のプログラム Clustal Wを使用することによる、ＡＴＣＣ１２３８４、ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）、ＳＰＹ５７、Ｂ５１４、ＡＴＣＣ７００２９（Oklahoma）及びＴ２８／５１／４（Ｕ０９３５２）S.パイオジェンス菌株由来のＢＶＨ−Ｐ１遺伝子のヌクレオチド配列の比較を表わしている。アライメントの下には、コンセンサスラインが存在する。影のついたヌクレオチドは、全ての配列間で同一であり、アライメントにより導入された配列内の空隙はハイフンで示されている。
【図１８】  MacVector配列分析ソフトウェア（バージョン６.５）由来のプログラム Clustal Wを使用することによる、ＡＴＣＣ１２３８４、ＬＳＰＱ２６９９（ＡＴＣＣ１９６１５）、ＳＰＹ５７、Ｂ５１４、ＡＴＣＣ７００２９（Oklahoma）及びＴ２８／５１／４（Ｕ０９３５２）S.パイオジェンス菌株由来のＢＶＨ−Ｐ１読取り枠の予測されたアミノ酸配列の比較を表わしている。アライメントの下には、コンセンサスラインが存在する。影のついたアミノ酸残基は、全ての配列間で同一であり、アライメントにより導入された配列内の空隙はハイフンで示されている。
【図１９】  S. pneumonia由来の遺伝子のＤＮＡ配列である。配列番号１７。
【図２０】  S. pneumonia由来のタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１８。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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