(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、未分化の中胚葉由来細胞の集団を、造血及び血管生成の少なくとも一方を経験するように刺激する方法であって、前記方法は上記細胞が造血及び血管生成の少なくとも一方を経験するように、上記細胞へ化合物を接触させる工程を含み、及び前記化合物は、ヘッジホグタンパク、ヘッジホグタンパクの機能ペプチド、又はベクターに組込まれたそれらのコード配列を含んでいるヘッジホグ化合物であり、及び前記化合物はパッチ（ｐａｔｃｈｅｄ）タンパクに結合し、及びヘッジホグシグナリングを促進し、前記ヘッジホグタンパクがソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択され、及びヘッジホグタンパクの機能ペプチドがソニック・ヘッジホグ、インディアン・ヘッジホグ、又はデザート・ヘッジホグのアミノ末端側断片の機能ペプチドであること特徴とする方法。
【請求項２】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクの機能ペプチドであることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記機能ペプチドがソニック・ヘッジホグタンパクのＮ末端側断片の機能ペプチドであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘッジホグ化合物がＧｌｉを高度に発現させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ヘッジホグタンパクがインディアン・ヘッジホグタンパクのＮ末端側断片であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養培地中に保持されており、前記ヘッジホグ化合物が前記培養培地に提供されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が造血幹細胞の集団であることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記造血幹細胞が臍帯血細胞、胎児末梢血細胞、及び胎児肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記造血幹細胞が成体骨髄細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が成人から得られる前駆細胞であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が前記化合物により刺激される場合、血管生成をすることができる成人からの前駆細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が動物の骨髄から単離された造血幹細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が骨髄、臍帯血細胞、胎児末梢血細胞、及び胎児肝細胞の少なくとも１つにおいて見出される造血細胞の群から選択される造血幹細胞であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
造血又は血管新生の少なくとも１つを刺激するための医薬品の製造において、ヘッジホグシグナリングを促進するヘッジホグ化合物を使用することを特徴とし、前記ヘッジホグ化合物がヘッジホグタンパク、ヘッジホグタンパクの機能ペプチド、又はベクターに組込まれたそれらのコード配列を含み、前記ヘッジホグタンパクがソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択され、及びヘッジホグタンパクの機能ペプチドがソニック・ヘッジホグ、インディアン・ヘッジホグ、又はデザート・ヘッジホグのアミノ末端側断片の機能ペプチド又は誘導体であり、前記ヘッジホグ化合物がパッチ（ｐａｔｃｈｅｄ）タンパクに結合し、及びヘッジホグシグナリングを促進することを特徴とする、医薬品の製造方法。
【請求項１６】
前記医薬品が未分化の中胚葉由来細胞の集団を刺激して、造血又は血管新生の少なくとも１つを経験させることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクであることを特徴とする、請求項１５又は１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片の機能ペプチドであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘッジホグ化合物がＧｌｉを高度に発現させることを特徴とする、請求項１５乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ヘッジホグタンパクがインディアン・ヘッジホグタンパクのＮ末端側断片であることを特徴とする、請求項１５乃至１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記医薬品が未分化の中胚葉由来細胞の集団を刺激して、造血又は血管新生の少なくとも１つを経験させることを特徴とし、及び前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおける動物の骨髄内の造血幹細胞であることを特徴とする、請求項１５乃至２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記医薬品が未分化の中胚葉由来細胞の集団を刺激して、造血又は血管新生の少なくとも１つを経験させることを特徴とし、並びに前記細胞が動物内に存在する造血幹細胞であり、並びに骨髄、臍帯血細胞、胎児末梢血細胞、及び胎児肝細胞の少なくとも１つにおいて見出される造血細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項１５乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬品が、経口投与、皮内投与、皮下投与、経粘膜投与、筋肉内投与、又は静脈内投与のいずれかにより投与されることを特徴とする、請求項１５乃至２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記医薬品が異常な数の赤血球細胞を有する個体を処理するために用いられることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘッジホグ化合物が造血幹細胞の増殖又は造血を刺激することを特徴とする、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクであることを特徴とする、請求項２４又は２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記異常な数の赤血球が個体における貧血により特徴付けられる赤血球数の異常な減少であり、前記貧血は特発の再生不良性貧血、素質性再生不良性貧血、再生不良性貧血の二次形態、脊髄形成異常性貧血、ウイルスにより誘発される慢性貧血、慢性疾患により誘発される貧血、癌誘発性貧血、器官障害により誘発される慢性貧血、血小板減少、及び薬物誘発性のから選択される貧血であることを特徴とする、請求項２４乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記異常な数の赤血球細胞が真性多血症又は赤白血病のいずれかから選択される病気を引き起こすことを特徴とする、請求項２４乃至２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記医薬品が組織中の虚血を治療するための医薬品であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記虚血が心筋虚血であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ヘッジホグ化合物がパッチ（ｐａｔｃｈｅｄ）タンパクに結合し、ソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクの機能ペプチドであることを特徴とする、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクであることを特徴とする、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
個体における異常に高められた血管成長を治療するための医薬品の製造において、ヘッジホグシグナリングを抑制するヘッジホグ化合物を用いることを特徴とし、前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのＮ末端に結合するヘッジホグブロッキング抗体を含むことを特徴とする、医薬品の製造方法。
【請求項３４】
前記異常に高められた血管成長が癌を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が乳癌であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記異常に高められた血管成長が糖尿病に関係した眼の新生血管形成であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
組織における虚血を治療するための医薬品の製造にヘッジホグシグナリングを促進するヘッジホグ化合物を用い、前記ヘッジホグ化合物がヘッジホグタンパク、ヘッジホグタンパクの機能ペプチド、又はベクターにとりこまれたそれらのコード配列から選択されるヘッジホグ化合物を含み、前記ヘッジホグタンパクがソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択され、及びヘッジホグタンパクの機能ペプチドがソニック・ヘッジホグ、インディアン・ヘッジホグ、又はデザート・ヘッジホグのアミノ末端側断片の機能ペプチドであり、前記ヘッジホグ化合物がパッチ（ｐａｔｃｈｅｄ）タンパクに結合し、及びヘッジホグシグナリングを促進することを特徴とする、医薬品の製造方法。
【請求項３８】
前記ヘッジホグ化合物がパッチ（ｐａｔｃｈｅｄ）タンパクに結合するヘッジホグタンパク、又はそれらの機能ペプチドから選択され、及び前記ヘッジホグ化合物がヘッジホグシグナリングを促進し、前記ヘッジホグタンパクがソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されることを特徴とする、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記虚血が心筋虚血であることを特徴とする、請求項３７又は３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記ヘッジホグ化合物がソニック・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、インディアン・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片、又はデザート・ヘッジホグタンパクのアミノ末端側断片から選択されるヘッジホグタンパクであることを特徴とする、請求項３７又は３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記未分化の中胚葉由来細胞の集団が前記ヘッジホグ化合物と接触することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４２】
前記未分化の中胚葉由来細胞の集団が前記ヘッジホグ化合物と接触することを特徴とする、請求項２乃至６のいずれかの方法。
【請求項４３】
造血に関する悪性疾患を治療するための医薬品の製造において、請求項３７又は３８の医薬品の製造方法を用いることを特徴とする、方法。
【請求項４４】
過剰な血管新生又は新血管形成を罹患している個体を治療するための医薬品の製造において、請求項３３の医薬品の製造方法を用いることを特徴とする、方法。
【請求項４５】
腫瘍又はヘムアンギオーマ（ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ）を治療するための医薬品の製造において、請求項４４の医薬品の製造方法を用いることを特徴とする、方法。
【請求項４６】
外傷を治療するための医薬品の製造において、請求項１５又は１６いずれかの医薬品の製造方法を用いることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
インビトロ及びインビボにおいて造血及び血管生成を調節するための新規な方法及び組成物を提供する。
背景技術
新しい個体の生命は、２つの配偶子、精子及び卵の遺伝物質の融合により開始する。数ラウンドの分裂の後、細胞は、最終的に成熟した成体生物を生じる分化の過程を始める。この過程には、成熟にいたる経路の間の特定の時に作用する多様な数の因子を含む多くの工程が関与する。成体型への成熟は、分化の過程を完全には終了しない。これは、成体生物が、充分に分化した細胞に加えて、分解及び再生の自然のサイクルの間の分化した細胞の補充の両方、及び損傷を受けた組織の修復にも利用可能な、未分化の幹細胞を有するからである。成体における未分化な細胞の例としては、骨髄幹細胞（より具体的には造血幹細胞及び前駆細胞）ならびに内皮前駆細胞がある。この種の細胞は、本質的に、個体の損傷した又は疾患を患う組織の修復及び再構成のための治療の道具箱を提供する。ヘルスケア提供者による個体を処置するためのこの治療の道具箱の使用は、これらの細胞の分化経路を操作するための方法及び分化を誘発せずに未分化の細胞の存在する数を高める又は調製するための方法の欠如により、限られている。
したがって、任意の特定の個体からの未分化細胞の供給を、例えば分化を誘導せずに細胞の増殖を刺激することにより、増大させ得る新規な方法を見出す必要が存在する。制御された方式で未分化細胞の分化を調節することもまた望ましい。分化するように刺激された場合に分化する用意のある未分化細胞は、骨髄を破壊する化学療法のような幹細胞自体が枯渇する疾患、あるいは分化した細胞が、身体が未分化の幹細胞の自然の供給を用いることにより損失を補填し得るよりも速い速度で枯渇する疾患を患う個体に、治療を提供する。例えば、ＡＩＤＳ（エイズ）においては、ヒト免疫不全症ウイルスによる成熟血液細胞の急速な破壊が起こり、個体の免疫細胞の激減がもたらされる。幹細胞が増殖することを引き起こす因子及びそのような細胞の利用可能性を強化するために分化を調節する因子を同定する必要性が存在する。
成体生物は、内皮幹細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の両方を含む。これらの細胞は、未分化であるが、適切な条件下で分化して血管及び血液細胞をそれぞれ形成する。成体における血管生成に関して広範な研究がされてきたが、血管生成が管の拡張（angiogenesis；新脈管形成）に限られているかどうか、又はデノボ（新規）の管の発達（vasculogenesis；脈管形成）もあるのかどうかは未知である。血管生成を調節する因子の理解は、いかにして腫瘍、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、乾癬及び毛細血管増殖ならびに糖尿病において起こるもののような異常な血管生成を阻害するかを理解することにおいてだけではなく、外科的手術、移植、及び心臓血管もしくは脳血管疾患のような血管疾患において起こるもののような組織への栄養欠乏を含む外傷事象の後にいかにして管を修復するかを理解することにおいても重要である。
血管生成とは対照的に、造血は、通常、成体の一生を通じての連続的な過程である。血液細胞は、規則的に分解され、新しい細胞が形成されて、毎日数百万の成熟血液細胞の産生がもたらされる。多数の疾患が、血液細胞の分解と再構成とのアンバランス又は不適切な数のある種の血液細胞の生成から生じる。血液細胞分化の単純化した模式図を図１２に掲げる。この模式図は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から由来し得る、そして未熟な前駆細胞の段階を通過する、８種の異なるタイプの血液細胞の発生経路を示す。多能性造血幹細胞は、多数の異なる経路を通じて赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、マスト細胞、単核球、組織マクロファージ、破骨細胞、及びＴ及びＢリンパ球を生じる。成体においては、赤血球は、多能性幹細胞がＢＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー群形成細胞）に分化した場合に形成され、ＢＦＵ−Ｅは、次にＣＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー形成細胞）を形成する。成体において血液を形成する器官としては、骨髄、及びそれより重要ではないが肝臓が挙げられ、一方、脾臓は、老化した、又は異常な血液細胞を後に除去する主要な部位である。造血を調節する因子の探索は、成体に限られていたものではないが、胚においての研究は、胚が既に発生の比較的進んだ段階にある場合に起こる事象に限られていた。
胚における細胞の事象に関しては、Cumanoら、Lymphoid Potential,Probedbefore Circulation in Mouse, Is Restricted to Caudal Intraembryonic Splanchnopleura, 86（1996年）907-16頁は、成体に棲む造血幹細胞（ＨＳＣ）が胚内の部位から生じることを提案していた。最初に胚内の血島から生じることが報告された血液細胞は、発生中の胚内の副大動脈（para-aortic）内臓葉（splanchnopleura）中の造血前駆細胞から由来するようである（Cumano et al.,1996）。マウスの初期発生は、図１４に示すとおりであるが、初期の血島形成の領域は、胚体外体腔の周縁上に同定される。
現在、異なる造血経路において初期の中間体細胞を刺激することが知られている多数の成長因子が存在する。これらとしては、造血（hematopoletic）成長因子、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。例えば、ＣＦＵ−Ｅは、エリスロポエチンに応答して、赤血球系列の第一の認識可能な分化メンバーである前赤芽球（proerythroblast）を産生する。血液酸素レベルが低下するにつれて、エリスロポエチンレベルが増大し、より多くの赤血球の産生がもたらされる。赤血球細胞が成熟するにつれて、それは赤芽球となって大量のヘモグロビンを合成し、次いで赤血球となる。赤血球は、骨髄を去って、身体組織への酸素の配達を行う。公知の因子は、ある種の悪性腫瘍又は血液学的／免疫欠陥の治療において有用性を有し得るが、さらなる療法、特に分化経路の初期に作用するより広い範囲の生物学的活性を有する療法の開発の必要性が非常に存在する。分化の経路の初期においてＨＳＣの増殖及び／又は分化を刺激し得る分子の利用可能性は、治療薬として特に価値が高いであろう。しかし、疑いなく多能性ＨＳＣ自体の成長を刺激することが知られている因子は存在しない。幹細胞因子と呼ばれるタンパク質は、多能性造血細胞に関連することが同定されているが、この因子は、生存因子であって、これらの細胞の増殖を刺激することができる因子ではないと信じられている（Caceres-Cortes et al.,J.Biol.Chem.,269（1994年）12084-91頁）。造血幹細胞の増殖及び分化を調節する必要性が存在する。例えば、ある種の病理学的状態において起こるもののような幹細胞又は前駆細胞の制御されていない増殖を阻害することが望ましいであろう。慢性貧血個体、又は貧血個体に移植するためのＨＳＣの利用可能性を増大させるため、もしくは残りの細胞を効率的に刺激することが必要なように骨髄細胞の大半が破壊される化学療法を受けている個体を治療することにおける使用のために、インビトロ又はインビボで多能性ＨＳＣの数を増大させる方法に対する必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、血管生成及び造血の少なくとも一方に対して効果を有するように、未分化の中胚葉由来の細胞の増殖及び／又は分化を調節する新規な方法及び組成物を提供することにより、上述の必要性を満足する。
本発明の１つの態様においては、造血及び血管生成の少なくとも一方を行うために、未分化の中胚葉由来の細胞の集団を刺激するための方法が提供される。この方法は、胚の胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合物を選択する工程、及び造血及び血管生成の少なくとも一方を行うよう細胞を刺激するように、その化合物の細胞への接近を引き起こす工程を含む。
本発明の別の態様においては、子宮内の胚における血管生成又は造血における発生エラーを処置する方法であって、胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合物の有効用量を選択する工程、及び造血及び血管生成の少なくとも一方を行うよう細胞を刺激するように、インビボでその化合物の胚細胞集団への接近を引き起こす工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様においては、異常な数のエリスロイド（erythroid）細胞を経験する個体を処置する方法であって、胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の有効用量の化合物を選択する工程、増殖又は分化の少なくとも一方を行う細胞の数を調節するように、有効な時間にわたって、その化合物が造血幹細胞の集団に接近することを引き起こす工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様においては、中胚葉由来の細胞を含む組織の虚血を経験する個体を処置する方法であって、胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の有効用量の化合物を選択する工程、及び血管生成を刺激するように、有効な時間にわたって、虚血部位にその化合物を投与する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様においては、造血又は血管生成を調節することができる化合物の活性を決定するためのインビトロアッセイであって、哺乳動物の受精卵由来の組織から細胞の集団を選択する工程であって、ここで前記細胞の集団は予め決定したマーカーの欠如により検出可能なように血液形成が欠陥を有するものである工程、及びその欠陥を逆転するように細胞の集団に薬剤を添加する工程を含むアッセイが提供される。
本発明の別の態様においては、造血又は血管生成を調節することができる化合物の活性を決定するためのアッセイであって、マーカー：ε−グロビンハイブリッド遺伝子を有する第一のトランスジェニック動物を選択する工程であって、このε−グロビン遺伝子は、少なくとも１５．５ｄｐｃまで発現をすることができる工程、この第一のトランスジェニック動物を、同様にトランスジェニックである第二の動物と交配する工程、妊娠期間の最初の３分の１の間に交配から胚を単離する工程、及びマーカーの発現を測定することにより単離された胚における造血及び血管生成の刺激に対する化合物の効果を決定する工程を含むアッセイが提供される。
【図面の簡単な説明】
本発明の上述の特徴は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を参照することにより、さらに容易に理解されるであろう。
図１は、トランスジェニックマウスの作製に用いられた４つの発現カセットを示す。（ａ）−１７９ｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ７０）は、最小ε−グロビンプロモーター（ε−ｐｒｏ）を有する基本構築物であり、転写の開始部位（＋１）に関して−１７９まで、及び〜２０ｂｐのε−グロビン５’非翻訳領域（＋１の下の小さい黒四角として示す）にわたる。ε−ｐｒｏは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及び翻訳開始部位（ＳＤＫ領域）を含むＬａｃＺ発現カセットに連結されている。ＬａｃＺレポーター遺伝子から下流にあるのは、エキソン２の部分、イントロン２（ＩＶＳ２）の全部及びエキソン３の全部を含むε−グロビン遺伝子の３’領域の部分である。これらの配列は、黒四角（エキソン）及び黒線（イントロン）として示す。３’非翻訳領域（ポリアデニル化部位、ｐＡを含む）は、ストライプのある線として示す。ＬＣＲの短縮型（μＬＣＲ）は、ε−ｌａｃＺ配列の下流に位置する。（ｂ）−８４９ｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ７３）、（ｃ）ε−ＰＲＥ（II＋Ｖ）ｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ７２）、及び（ｄ）−２ｋｂｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ９２）。（ａ）〜（ｄ）は、ε−ｐｒｏ及びヒトε−グロビン遺伝子の上流調節領域の異なる部分を含む。（ａ）〜（ｄ）の真核生物配列を、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩでの消化によりベクターから切り出し、次に、マウス接合子の雄性前核へのマイクロインジェクションのために精製した。
図２は、始原（primitive）赤芽球における、青色染色の出現と相関するＬａｃＺ発現を示す。Ａ：（ａ）は、７．５ｄｐｃ胚の図表であり、（ｂ）は、明視野顕微鏡により観察した、ＸＧａｌで染色したトランスジェニック胚であり、（ｃ）は、暗視野顕微鏡で観察した同じ胚である。Ｂ：（ａ）は、非トランスジェニックマウスであり、（ｂ）及び（ｃ）は、ＸＧａｌで染色した８．５ｄｐｃでの胚である。Ｃ：（ａ）は、野生型１２．５ｄｐｃ胚であり、（ｂ）及び（ｃ）は、トランスジェニック１２．５ｄｐｃ胚である。（１）野生型；（２）トランスジェニック；（３）栄養膜円錐（Ectoplacental Cone）；（４）血島；（５）羊膜腔；（６）栄養外胚葉；（７）尿膜；（８）胚体外中胚葉；（９）胚プロパー（Proper）（胚盤葉上層）。
図３は、培養された胚盤胞の卵黄嚢様構造の形成を示す。（ａ）培養前のトランスジェニック胚盤胞、（ｂ）ヘモグロビン含有細胞を明らかにするためにベンジジンで染色された卵黄嚢様構造（非トランスジェニック）、（ｃ）培養９日後の、ヘモグロビン含有細胞を明らかにするためにベンジジンで染色された培養されたトランスジェニック胚盤胞からの嚢、（ｄ）ＸＧａｌで染色された正常８．５ｄｐｃトランスジェニック胚及び卵黄嚢。
図４は、胚盤胞培養のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。（Ａ）比較的平坦な細胞の小丘であった試料中（「ＦＬＡＴ」）にはないが、嚢様構造（「ＳＡＣ」）に発生した胚盤胞中ではε−グロビンが観察された。高分子量のバンドは、内部対照アクチンである。低分子量バンドは、胚性β−グロビンである。（Ｂ）エリスロイド分化に対する基質の効果により明らかにされた、環境の合図に応答した培養胚盤胞。（ｉ）プラスチック上で（コラーゲン上ではなく）胚性β−グロビンを発現した中胚葉組織。内皮マーカー（ＰＴＨｒＰ及びＰＴＨｒＰレセプター）は、プラスチック表面及びコラーゲン表面の両方の上で内皮組織中で発現された。
図５は、始原赤血球生成が原腸形成後期に開始することを示す。左側は、後期ストリーク（線条）（〜７．５ｄｐｃ）胚のホールマウント・インサイチュ解析であり、右側は、初期ストリーク（〜６．５ｄｐｃ）胚である。紫の染色は、色原性基質である。ε−グロビンＲＮＡプローブにより、左側に吻の（後部）面に示すように胚中の血球形成細胞が明らかになるが、右側の胚ではいずれにもなく、６．５ｄｐｃ胚においては血液形成が欠如していることを明らかにする。
図６は、ＲＴ−ＰＣＲ解析の手段による、１０．５ｄｐｃ及び１２．５ｄｐｃでの解剖された卵黄嚢中胚葉におけるｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃ）及びＧｌｉ遺伝子の差次的発現を示し、解剖された卵黄嚢中胚葉におけるＧｌｉ及びｐｔｃの実質的に排他的な発現を明らかにする。「ＷＨＯＬＥ」＝解剖されていない卵黄嚢；「ＭＥＳＯ」＝中胚葉層；「ＥＮＤＯ」＝内胚葉層；「−ｃＤＮＡ」＝ｃＤＮＡ抜きの対照。アクチンを内部対照として役立てた。
図７は、ＸＧａｌ染色により決定したところ、原腸形成中の胚のトランスジェニック外植片（６．２５〜６．５ｄｐｃで単離したもの）をフィルター又はガラススライド上で７２時間培養した場合、胚性血球形成の誘導は、全胚において起こるが、胚盤葉上層のみでは欠如していることを示す。構造の視認を容易にするために、胚盤葉上層の周囲に点線を引いた。（ａ）フィルター上の全胚；（ｂ）フィルター上の胚盤葉上層；（ｃ）スライド上の全胚；及び（ｄ）スライド上の胚盤葉上層。
図７−１は、トランスジェニック胚外植片培養（ｌａｃＺ染色された胚の切片）における血液形成を示す。凍結組織切片をＸＧａｌで染色し、（ａ）全胚、（ｂ）胚盤葉上層、（ｃ、ｄ）後部胚部分、及び（ｅ）ＶＥに隣接するトランスジェニック後部胚盤葉上層部分、におけるＬａｃＺ陽性血液形成細胞のクラスターが明らかになっているが、周辺の内臓内胚葉及び未分化の中胚葉においても、非トランスジェニックＶＥ組織後部／ＶＥ組換え体（ｅ）においてもそうではない。
図８−１は、内臓内胚葉（ＶＥ）シグナルによる造血の誘導を示す。（ａ）トランスジェニック（Ｔｇ）胚盤葉上層を含む組換え体及び内臓内胚葉に隣接する胚中に局在するｌａｃＺ染色を示す非Ｔｇ−ＶＥの暗視野写真；（ｂ）パネル（ａ）に対応する模式図。略号：「Ｔｇ」＝トランスジェニック；「Ｖｅ」＝内臓内胚葉；「ＥｒｙＰ」＝始原エリスロイド細胞。（ｃ）（ａ）に示す組換え体の明視野写真。
図８−２は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、全胚中及び胚盤葉上層プラス内臓内胚葉中における造血の誘導、及び胚盤葉上層のみにはそれがないことを示す。（すべての試料は、６．５ｄｐｃで単離した胚のインビトロでの７２時間のインキュベーションの後に調製した。）アクチンを内部対照として役立てた。
図９は、組換えヘッジホグ（hedgehog；ヘッジホグ）タンパクが培養胚盤葉上層において始原造血を刺激するために内臓内胚葉を代替し得ることを示す。単離された胚盤葉上層を、３種の異なる濃度の組換えヘッジホグタンパクの存在下（０．２５、１及び５μｇ／ｍｌ）及び不在下（「なし」と記したレーン）で培養した。始原造血は、ε−グロビン発現についてのＲＴ−ＰＣＲ解析により評価した。アクチンを内部対照として役立てた。「ＹＳ」＝卵黄嚢対照。
図１０は、ＲＴ−ＰＣＲ解析による、内臓内胚葉における拡散性因子による始原赤血球形成の活性化を示す。
図１１は、ＲＴ−ＰＣＲ解析による、ＳＨＨブロッキング抗体を用いた培養全胚における始原赤血球形成の阻害を示す。
図１２は、成体の造血ヒエラルキーの模式図を示す。
図１３は、哺乳類胚の卵黄嚢における細胞系列の派生を示す。円形の構造は、３．５ｄｐｃ頃の胚盤胞を表す。
図１４は、マウスの初期発生を示す。初期血島形成の領域は、胚盤葉上層（その下は内臓内胚葉で囲まれている）とその上の胚体外胚組織との間の胚体外体腔（ｆ）中に生じる。
図１５は、前部及び後部部分への胚盤葉上層の分離のための実験スキームを示す。（Ａ）は、胚体外中胚葉及び胚盤葉上層の周辺のまわりの内臓内胚葉を伴う６．７５ｄｐｃ胚全体を表す。（Ｂ）は、内臓内胚葉が除去された後の胚を表し、（Ｃ）は、胚盤葉上層のみを示し、横断面の点線は、前部及び後部セクションを別個に培養する前にいかにして物理的に分けたかを示す。
図１６−１は、ｌａｃＺトランスジェニック胚の前部及び後部部分を原腸形成の中期及び後期に収穫した場合に、造血中胚葉が後部始原ストリーク（後部中胚葉）から生じることを示す。パネルＡ：前部胚盤葉上層には染色が検出されない。パネルＢ：暗青色のＸＧａｌ組織化学染色は、培養後部胚盤葉上層における血液形成を示す。スケールバーは１ｍｍである。
図１６−２は、内臓内胚葉が、前部胚外胚葉（胚盤葉上層）が造血マーカーを発現するように再プログラムし得ることを示す。ε−グロビン、β−グロビン、ＧＡＴＡ−１、及びＣＤ３４マーカーの発現を、前部胚盤葉上層（「前部」：レーン６〜１０）、後部胚盤葉上層（「後部」：レーン６〜１０）及び内臓内胚葉と組換えされた前部（「ａ／Ｖｅ組換え体」：レーン１〜５）について示す。対照組織は、未培養全胚〔ｅｍｂ（−ｃｘ）〕、培養全胚〔ｅｍｂ（＋ｃｘ）〕及び１０．５ｄｐｃ卵黄嚢組織であった。対照マーカーは、アクチン及び心臓ミオシンであった。付加的な対照は、逆転写酵素の不在下でＰＣＲに供したｅｍｂ（＋ｃｘ）である。
図１６−３。内臓内胚葉は、前部胚外胚葉（胚盤葉上層）が血管マーカーを発現するように再プログラムすることができる。ＰＥＣＡＭ−１、ｆｌｋ−１及びアクチンの発現を、前部胚盤葉上層（「前部」：レーン６〜１０）、後部胚盤葉上層（「後部」：レーン６〜１０）及び内臓内胚葉と組換えされた前部（ａ／Ｖｅ組換え体：レーン１〜５）について示す。対照組織は、未培養全胚〔ｅｍｂ（−ｃｘ）〕、培養全胚〔ｅｍｂ（＋ｃｘ）〕及び１０．５ｄｐｃ卵黄嚢組織であった。対照マーカーは、アクチンであった。
図１７は、ヌル突然変異体の胚性幹細胞（ＥＳ）を用い、培養に復帰組換え体ＢＭＰ−４を添加したレスキュー実験の結果を示す。（Ａ）及び（Ｃ）は、野生型マウスから単離された胚性幹細胞から生じた野生型組織胚様体を示す。（Ｂ）においては、胚性幹細胞は、ホモ接合体ＢＭＰ−４欠損であり、組織胚様体は、検出可能な血液形成を欠いている。（Ｄ）においては、ＢＭＰ−４タンパクが（Ｂ）の組織胚様体に添加され、血液形成が観察される。
発明の詳細な説明
本発明は、胚組織及び成体組織において、選択された発生上の活性、具体的には造血及び血管生成を特徴とする血液発生を刺激するための方法を、初めて同定するものである。本方法は、さらに、胚又は成体からの幹細胞及び前駆細胞の増殖又は分化を調節することができる胚体外組織により分泌される分子を用いる。本発明の態様は、さらに、造血及び血管生成を刺激することができる化合物を同定するための新規なアッセイに向けられている。本発明の方法のための支持は、本明細書に含まれる実施例において提供される。本発明の１つの態様にしたがって、胚において及び成体において血液発生を刺激することができ、内臓内胚葉及び卵黄嚢中胚葉において発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物が同定されている。このような遺伝子産物は、ヘッジホグ化合物、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ、及びＷＮＴ化合物により例示され、ここでは、未分化の中胚葉由来の組織において造血及び血管生成に関して胚体外組織について観察されるものと同様の効果を達成するとして同定される。本発明の１つの態様においては、ヘッジホグ及びＴＧＦ−βから選択されるものを含む化合物は、標的細胞に対するそれらの刺激効果を強化するように相乗的に作用してもよい。
「成体（の）」は、本明細書及び特許請求の範囲において、誕生後の任意の時点の、動物個体内の又はそれに由来する細胞及び組織の説明として定義される。
「胚性（の）」は、本明細書及び特許請求の範囲において、別に記載がされていない限り、誕生前の任意の時点の、動物個体内の又はそれに由来する細胞及び組織の説明として定義される。
「血液発生」は、本明細書及び特許請求の範囲において、造血及び血管生成として定義される。
「血管生成」は、本明細書及び特許請求の範囲において、脈管形成（vasculogenesis）及び新脈管形成（angiogenesis）の少なくとも一方として定義され、毛細血管、動脈、静脈又はリンパ管の形成を含む。
「造血」は、本明細書及び特許請求の範囲において、血液細胞の産生の過程として定義される。
「造血幹細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、すべてのクラスの血液細胞が由来するもととなる多型潜在性前駆細胞として定義される。
「完全（definitive）血液細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、胎児又は成体生物の血液細胞として定義される。
「始原（primitive）血液細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、胚における血液発生中に形成される一過性の血液細胞の集団として定義される。
「完全内胚葉」は、本明細書及び特許請求の範囲において、腸及び肝臓のような成体の内胚葉由来組織に寄与する始原ストリークの細胞から、原腸形成中に派生する内胚葉として定義される。
「内臓内胚葉」は、本明細書及び特許請求の範囲において、分泌性の胚体外内胚葉細胞であって、充分に形成された生物のいかなる組織にも直接寄与しないものとして定義される。
「前駆細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、分化した細胞タイプを生じる潜在能力において幹細胞と比較してより制限されている未分化細胞として定義される。
「約束された」は、本明細書及び特許請求の範囲において、多能性を保持するかわりに特定の系列に沿って分化するように運命づけられた細胞として定義される。
「ＲＴ−ＰＣＲ」は、本明細書及び特許請求の範囲において、組織中の遺伝子の転写の検出を可能にする逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応として定義される。
「相乗効果」は、本明細書及び特許請求の範囲において、２又は３以上の化合物について、単独のそれらの化合物を用いてはほとんど又は全く効果が観察されないが、一緒の場合にそれらの化合物が強力な生物学的効果を有することとして定義される。
「ヘッジホグ化合物」は、本明細書及び特許請求の範囲において、組換えヘッジホグタンパク、アナログ、及びヘッジホグタンパクの誘導体、及びヘッジホグタンパクレセプターのアゴニスト及びアンタゴニスト、ならびに上述のものの機能的同等物を含むヘッジホグファミリーの分子のクラスとして定義される。
「未分化中胚葉由来細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、未分化であるか、又は約束されていない細胞を含み、さらに幹細胞及び前駆細胞を含むことを意味する。
ＣＦＵ−Ｅは、本明細書及び特許請求の範囲において、赤芽球コロニー形成細胞（ユニット）として定義され、これは、後期（成熟）エリスロイド前駆細胞である。ＣＦＵ−Ｅとして採点されるコロニーは、色素を含む細胞の小さい、密なクラスターであり、培養２〜３日以内に出現する。
ＢＦＵ−Ｅは、本明細書及び特許請求の範囲において、赤芽球コロニー群形成細胞（ユニット）として定義され、これは、始原エリスロイド細胞である。これらのコロニーは、色素を含有し、ＣＦＵ−Ｅよりもサイズが大きい。これらの細胞は、より広範に分散しており、プレーティング後、より遅い時期に出現した。それらの数は、培養中７日頃が最大である。
ＣＦＵ−ＧＭは、本明細書及び特許請求の範囲において、ミエロイド又は顆粒球−マクロファージコロニー形成ユニットとして定義される。これらは、外観はＢＦＵ−Ｅと同様であるが色素を含まない。
ＣＦＵ−Ｓは、本明細書及び特許請求の範囲において、脾臓コロニー形成ユニットとして定義される。
造血及び血管生成は、成長中の組織塊が塊の内部の細胞への栄養の供給を確保するための最初の要件のいくつかである。発生中の胚は、栄養を必要とし、したがって、赤芽球（酸素を運搬する細胞）を形成するための細胞の分化及び血管系（輸送系）の形成は、発生過程の最初の事象の１つである。胚性組織は、トリ及び爬虫類の原腸形成において見られるものを思い出させる細胞運動（始原ストリークを通じた中胚葉及び完全内胚葉細胞の移動）を行う一方、胚体外細胞は、母親の子宮内で胎児が生き残ることを可能にする哺乳類組織を作る。これは、母親の血液供給を刺激して子宮内膜を形成することを含む。胚を栄養芽層に連結する胚体外中胚葉の狭い連結茎状部は、最終的に臍帯の管を形成する。栄養芽層組織及び血管含有中胚葉からなる充分に発生した器官は、漿膜と呼ばれる。漿膜と子宮壁との融合は、胎盤を形成する。妊娠後（ＰＣ）４週までに、ヒト胚は、母親の循環に隣接する胎児血管を通じた栄養の供給源を有する。
成体においては、血管生成は、損傷した組織の修復中、及びガンを含む種々の疾患中に起こり、ガンの場合は、腫瘍が正常組織中での血管の出芽を刺激する因子を放出し、正常組織では新しい血管が腫瘍組織に向けられる。成体に棲む造血幹細胞（ＨＳＣ）は、胚内部位で生じ得る（Cumano,et al.（1996））。この中胚葉組織は、完全造血幹細胞及びおそらく脈管構造を生じる細胞の起源の、主要でないとしても重要な部位であると信じられている。
造血及び血管生成の過程は、部分的にしか理解されていないが、マウスにおける発生の経路は、ヒトにおける同等の過程と似ているようである。マウスの造血系は、６．５ｄｐｃ頃に始原ストリーク段階の胚において形成を始める中胚葉の胚葉に由来する。血島は、７．５ｄｐｃに胚体外中胚葉に最初に出現し、造血前駆細胞は、８ｄｐｃで１〜２中胚葉節対内の胚の内臓卵黄嚢中胚葉中に出現する。８ｄｐｃの中頃に、核を有する始原赤血球細胞が卵黄嚢の脈管構造中に見られるが、８．５ｄｐｃまでは始原循環系に入らない。８．５〜９ｄｐｃに始まって、造血前駆細胞は、胚体内の中胚葉由来領域、特に副大動脈内臓葉に見出される（Cumano,et al.（1996））。卵黄嚢を裏打ちしている内臓の中胚葉細胞は、内皮細胞により裏打ちされている管にくぼむ細胞の帯を形成する。血島の中央の細胞は、胚性血液細胞に分化する。血島が成長するにしたがって、それらは最終的に合体して毛細血管ネットワーク及び最終的には新たに形成される心臓につながる卵黄の管を形成する。
現在まで、脈管形成及び造血においてある役割を果たす８ｄｐｃ頃前の生化学的事象については、ほとんど知られていない。しかし、本発明者らは、発生のこの段階が、胚における血液系の成熟及び成体において重要な役割を果たすことを主張する。本発明の態様にしたがえば、胚の発生における血管生成及び造血の過程は、内臓内胚葉中の化合物によって影響される。例えば、本発明者らは、ヘッジホグタンパクが血液形成を刺激するために未分化の中胚葉由来細胞にインビトロで作用し、造血及び血管生成経路の非常に初期の段階で胚性組織及び卵黄嚢に対して作用することを初めて同定した。さらに、本発明にしたがえば、これらの初期に作用する化合物は、成体動物における造血及び血管生成を調節することにおいて有用性を有する（表１及び２）。本発明の態様にしたがえば、「造血及び血管生成の少なくとも一方を経験するように未分化の中胚葉由来細胞を刺激すること」は、分化前の造血幹細胞及び前駆細胞の増殖を刺激することを含む（実施例４）。
血液発生及び血管生成を刺激する内臓内胚葉の因子の同定は、新規なアッセイの使用を通じて本明細書において明らかにされる。これらのアッセイは、以下のものを含む：
（ａ）  血液発生前、その最中及びその後の胚性外植片組織の解析。例えば、外植片は、哺乳類の発生の最初の段階において形成される胚盤胞から派生してもよい。胚盤胞は、胚が内部細胞塊、栄養外胚葉細胞から形成される外部栄養芽層細胞層、及び胞胚腔として同定される液体を含有する内腔を形成する６４細胞段階に達するときに形成される。内部細胞塊（ＩＣＭ）は、胞胚腔中に置かれ、ＩＣＭの外層を形成する「始原内胚葉」及びＩＣＭ自体に分離するようになる。「始原内胚葉」は、壁及び内臓内胚葉を生じる。内側のＩＣＭ細胞は、始原外胚葉を形成し、胚プロパー（embryo proper）を生じる。胚盤胞は、血液発生が開始される前に単離されるが、拍動する心筋のような脈管構造に付随する器官の特徴的な組織の形成を可能にするような時間、培養中に維持され得る。血液発生は、発生中の胚の卵黄嚢の内胚葉と中胚葉との間に血島が観察されるときに組織学的に最初に観察される。理論によって拘束されることなしに、本発明者らは、観察された島が、未分化の前駆細胞からの赤芽球及び内皮細胞の形成の結果として形成されることを信じる。実験的なマウスのモデルにおいては、胚性外植片は、血島の形成が観察される前に２ｄｐｃで、又はその後に、単離してもよく、また、器官発生が進行中である場合、１４ｄｐｃまでインビトロで維持してもよく、血液及び脈管系の開始及び進行を追跡するためのモデル系を提供する。本発明による血液の形成前の外植片の単離は、従来技術に関して新規であり、従来技術においては、血島形成の開始が既に起こった後の血液発生における事象が記載されている（Cumano et al.（1996年）；Palis et al., Blood 86（1995年），160-63頁；Kanatsu et al., Development 122（1996年），23-30頁）。
（ｂ）  マーカー（例えばＬａｃＺ）が造血及び血管生成の開始を合図するのに役立つように血液形成に付随する初期段階遺伝子（例えばε−グロビン遺伝子）産物の調節領域をマーカーとカップリングしたトランスジェニック動物からの外植片の使用（実施例１）。造血又は血管生成の開始は、血液発生に付随する遺伝子産物の発現の開始及び発現の程度を検出することができるＲＴ−ＰＣＲ；ヘモグロビンのベンジジン染色により例示される組織化学染色；適切な特異性の抗体を用いる免疫組織化学的法；ホールマウントのインサイチュ・ハイブリダイゼーション；放射能標識したリボプローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーション；及び当業界で公知の他の方法のような、高感度の検出方法を用いて検出することができる。
以下で、実施例１及び２において４つの異なるアッセイデザインを記載する。それらは、造血及び血管生成に関与する因子をスクリーニング及び同定するために、個別的にも、また、組み合わせても、有用性を有する。
（ｉ）胚盤葉上層培養：インタクトな（無傷の）胚外植片を、血島の組織学的な出現の前に、例えば６．５ｄｐｃで、収穫して、胚が発生を続けるのを可能にし、それによって血液形成の陽性対照として役立つように、標準的な培養技術を用いて、インタクトな状態でインビトロでインキュベートした（実施例２Ａ−Ｂ）。これらの状況においては、外植片はインビトロで血島を形成し、血液形成は、ε−グロビン、（胚性β−グロビン）、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、ｓｃａ−１（造血幹細胞のマーカー）、ＰＥＣＡＭ−１、ｆｌｋ−１、Ｖｅｚｆ−１（内皮マーカー）のような初期血液発生のマーカーの出現を測定することにより、追跡することができた。実施例２においては、ε−グロビン遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、胚盤葉上層培養のインビトロでの７２時間のインキュベーションの後、検出された。トランスジェニック動物から外植された胚は、ε−グロビン遺伝子プロモーター下にＬａｃＺマーカーを有し、同様の時間の後、ＸＧａｌで染色された。
アッセイは、血島を生成することができず、この無能力が不可逆的である胚外植片の作製を含む。胚が、最初に内臓内胚葉を除去されたとき、得られる胚盤葉上層は、外植片培養中でＸＧａｌで陽性に染色されず、したがってε−グロビンを発現していなかった（図７、８）。造血の開始を直接の細胞−細胞接触に依存しない方式で調節する、拡散性因子が同定された。これらの因子は、胚盤葉上層の外側で、例えば内臓内胚葉において作られる。これらの因子の生物学的な役割は、内臓内胚葉及び胚盤葉上層組織を用いる再構成実験により確認された（図８）。内臓内胚葉中に含まれる因子の要件は、本発明者らが胚盤葉上層を内臓内胚葉細胞培養から得られるコンディションド（馴化）培地で処理する効果を対照の非処理胚盤葉上層と比較したときに、さらに明らかにされた（実施例２Ａ）。一方、コンディションド培地の不在下では、胚盤葉上層は、ε−グロビンを発現せず、分泌された細胞因子を含有するコンディションド培地の添加は、胚性組織におけるε−グロビンの発現を誘導した（実施例１０）。非トランスジェニックマウス由来の胚盤葉上層を、ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション又は免疫染色法を用いて遺伝子発現について解析した。
（ii）胚盤胞培養：胚性β様：ＬａｃＺグロビン（ε−グロビン：ＬａｃＺ）のような血液形成に付随する遺伝子の調節配列により制御された検出可能なマーカーから形成されたハイブリッド遺伝子を有するトランスジェニックマウス由来の胚盤胞におけるＸＧａｌの発現を測定した。実施例２（Ｃ）においては、胚盤胞は、３．５ｄｐｃで単離され、さらに７〜１０日インキュベートされた（図１３）。あるいは、胚盤胞培養は、非トランスジェニックマウスを用いて上記のように調製され、遺伝子発現はホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション又は免疫染色法によって検出された。胚盤胞培養の詳細は、実施例２（Ｃ）及び図３に記載する。
（iii）改変された胚盤葉上層培養アッセイ：原腸形成後期の胚を収穫し、胚体外外胚葉を解剖して除くことにより、胚盤葉上層を調製した（実施例２（Ｂ））。原腸形成中、胚性細胞は、基本的な体の設計及び胚体外中胚葉がそれぞれ胚体外組織に寄与することを確立する。胚体外の部位に運命づけられた中胚葉細胞は、後部始原ストリークを出て、７．５ｄｐｃの後期ストリーク段階までに３つの別個の腔に胚を細分する。中央の腔、すなわち胚体外体腔は、中胚葉細胞で完全に裏打ちされるようになる。これらの中胚葉細胞は、羊膜を形成するために胚性外胚葉に、漿膜を形成するために胚体外外胚葉に、そして内臓卵黄嚢（ＶＹＳ）を形成するために内臓内胚葉に、隣接して存在する。原腸形成の最後に、胚内の細胞は、３つの胚葉、すなわち外側外胚葉（表皮及び神経系を生じる）；内側外胚葉（消化管の裏打ち及び（膵臓、肝臓及び脾臓のような）その関連器官を生じる）；及び中間中胚葉（いくつかの器官（心臓、腎臓、生殖腺）、結合組織（骨、筋、腱）及び完全血液細胞を生じる）に分かれる。
後期原腸形成胚からの単一の胚盤葉上層を、前部及び後部の部分に横に切開し、各部分を個別に数日間培養した（図１４及び１５）。ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてε−グロビンの発現により決定したところ、前部胚盤葉上層部分がほとんど又は全く血島を形成しなかったのに対し、後部部分はインタクトな胚盤葉上層に匹敵するレベルで血液を形成した。このアッセイを用いて、前部胚盤葉上層に組成物を添加して、血液形成の刺激を決定することができる。このアッセイにおける対照は、前部胚盤葉上層が血島を形成することを引き起こすのに充分な内臓内胚葉の添加である。内臓内胚葉又はヘッジホグタンパクのいずれかを培養に添加した場合、血液形成が観察された（図１６）。
（iv）標的タンパクに欠陥を有する突然変異体から由来する外植片又は組織胚様体：組織胚様体は、当業界で周知の技術を用いてインビトロでインキュベートされる収穫された胚性幹細胞から形成される（実施例２（Ｃ））。これらの細胞は、血液細胞及び内皮前駆細胞を含むいくつかの細胞タイプを含む組織胚様体を形成する（図１７（Ａ、Ｃ）を参照されたい）。胚性幹細胞は、相同組換え及び選択可能な薬剤耐性のような充分に確立された技術を用いて、その産物が造血及び血管生成において役割を果たす選択されたマウス遺伝子のターゲティング突然変異誘発に供してもよく、ターゲティングされた遺伝子突然変異についてホモ接合体の細胞が得られる。（ｉ）コード遺伝子又は調節配列の「ノックアウト」；（ｉｉ）コード遺伝子又は調節配列の「ノックアウト」及び何かが作られることを引き起こす「ノックイン」配列でのその配列の置換（ノックイン配列は突然変異を有する配列であってもよい）；又は（ｉｉｉ）ゲノムへの外来ＤＮＡの挿入又は突然変異を起こす化学物質の使用によるランダム突然変異の生成、といった突然変異を、誘発させてもよい。これらの突然変異を形成することの結果には、特定の遺伝子産物の活性を改変すること、及び遺伝子産物の活性を無にすることが含まれ、さらに遺伝子操作の確立された方法により、別の遺伝子産物である遺伝子産物を置換することが含まれ得る。
これらのターゲティングされた突然変異がタンパクの遺伝子発現の欠如をもたらす場合、それらの突然変異はヌル突然変異と呼ばれる。野生型胚性幹細胞を用いて、ヌル突然変異体を作した。本発明にしたがえば、その欠如が血液を作ることの障害をもたらすように内臓内胚葉に関与するタンパクにおいて欠陥があるヌール突然変異体は、胚体外組織に由来するもののようなライブラリーからの新規な化合物のスクリーニングのための好適なモデル系であり、これらのライブラリーは、コンビナトリアル・ペプチドライブラリー及び組換えＤＮＡライブラリーを含む。実験的試験の数を減少させるために、プールする戦略を用いることにより、組織胚様体において造血及び血管生成を調節することにおいて有用な化合物を同定することができる。
この一般的なタイプのアッセイは、血液形成に対するヘッジホグタンパク（例えばインディアン・ヘッジホグ）のようなシグナリング因子の欠陥のような他の突然変異の効果を研究するために用いることができる（実施例３〜５）。例えば、Ｉｈｈヌル突然変異ＥＳ細胞が形成され得、この突然変異を克服し得る因子が同定され得る。これらの細胞は、外来性のヘッジホグタンパクを提供することにより、又は標準的ベクター又はレトロウイルスベクターを用いてヘッジホグ遺伝子を発現するベクターで細胞をトランスフェクトすることにより、レスキューされ得る（図９）。突然変異した細胞は、マウスに再導入してキメラを作製することもできる。
これらの検出技術を、以下のようにして、胚盤葉上層及び胚盤胞培養において造血及び血管生成を検出するために用いた。本発明のアッセイにしたがえば、血島形成の開始は、以下のものを含む、当業界で利用可能ないずれかの高感度の技術を用いて検出することができる。
（１）  ハイブリッド遺伝子、すなわち胚性β−様：ＬａｃＺグロビン（ε−グロビン：ＬａｃＺ）を有するトランスジェニックマウス由来の外植片におけるＸＧａｌの検出。ホモ接合性トランスジェニックマウスの胚を、ＸＧａｌを用いて解析し、エリスロイド細胞の視覚的な検出に先立つ血液発生の指標であるグロビン遺伝子転写を明らかにした（図１、２）。
（２）  妊娠後の種々の時点における胚盤葉上層及び胚盤胞中の放射性半定量的ＲＴ−ＰＣＲプローブを用いるグロビン遺伝子発現の検出。放射性アッセイを用いる顕著な利点は、個別の外植片から回収される組織の量が非常に少なく、高感度のアッセイが、単一の培養生成物からの多くの遺伝子の発現についてのアッセイを可能にすることである（図４）。
上述のアッセイを用いて、本発明者らは、胚体外組織において発現され、血液形成を刺激し得る遺伝子産物と機能的に同等の多数の化合物を同定した。これらの化合物には、ＴＧＦ−βタンパク、より具体的にはＴＧＦ−β１、より具体的には骨形態形成タンパク（bone morphogenic protein；ＢＭＰ）、より具体的にはＢＭＰ−４；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク、より具体的にはＴＮＦ−α；ｗｎｔファミリー；及びヘッジホグタンパクが含まれる（図５、９及び１７）。化合物は、また、上述のものの天然又は合成アゴニスト、アンタゴニスト、アナログ及び誘導体をも含み得る。これらの因子は、シグナル伝達経路を開始して生物学的応答をもたらす膜タンパクと相互作用し得る。したがって、上述の化合物に加えて、それらの、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ｐａｔｃｈｅｄ及びｇｌｉのようなヘッジホグ結合レセプター及びヘッジホグシグナル伝達経路に関連するレセプターアンタゴニスト、レセプターアゴニスト及びレセプターを含むこれらの膜結合タンパクに対するアゴニスト及びアンタゴニストは、造血及び血管生成を調節することにおいて有用性を有し得る。
幹細胞増殖の刺激及び分化の調節のための標的部位は、本明細書において、胚に存在するもののような前分化した中胚葉由来組織と同定された。胚性前分化中胚葉組織としては、内臓卵黄嚢、尿膜、羊膜、漿膜、栄養外胚葉、及び出生前卵黄嚢、胎児肝の造血幹細胞、及び臍帯血が挙げられる。成体における前分化中胚葉由来組織としては、成体骨髄中の造血幹細胞及び前駆細胞、肝臓及び脾臓ならびに胎児及び成体の内皮幹細胞及び前駆細胞が挙げられる。
本発明の新規なアッセイは、以下のものを含む複数の適用において使用することができる：
（ｉ）  造血及び血管生成を刺激することにおける活性についての化合物のスクリーニング；
（ii）  胚性造血及び血管生成に対する成長因子、サイトカイン、及び他のシグナリング分子の効果の試験。
（iii）  胚、胎児及び成体における造血及び血管生成に対するヘッジホグタンパクの効果の決定。例えば、胚盤胞アッセイを、胚盤胞がトランスジェニック又は非トランスジェニック動物由来である場合に卵黄嚢のエクスビボでの発生に対するヘッジホグタンパクの効果を決定するために用いてもよい。
（iv）  通常は血液細胞を産生しないがその中胚葉が卵黄嚢のそれと同じ起源である尿膜のような他の胚性組織の造血潜在能力の検査。
（ｖ）  脈管構造を概説し、造血ならびに血管生成のトラッキングを可能にするための、ＸＧａｌのようなマーカーを用いる染色による始原エリスロイド細胞及び血管構造の発生の追跡。そして、初期胚体内完全造血ならびに始原卵黄嚢造血を解析するための手段を提供する。
（vi）  個別の外植片に対する、ヘッジホグ、ｐａｔｃｈｅｄ、Ｇｌｉ及び他のタンパクを発現するトランスジーン（導入遺伝子）を有するものを含む親動物における造血又は血管生成に影響する遺伝子中のターゲティングされた突然変異の効果の決定。
（vii）  中胚葉由来組織に対する遺伝子治療の効果の検査。例えば、血島形成の効果を調節するように、ヘッジホグタンパクの遺伝子を、種々のプロモーター下で、内臓内胚葉を破壊したストリーク前の胚に導入する。このタイプの遺伝子治療モデルは、造血及び血管生成を調節することができる分子を同定するための実験道具として役立ち得る。
造血及び血管生成における形態形成タンパクの新たに確認された役割：
ヘッジホグ  タンパク：  本発明者らは、ここにおいて、ヘッジホグタンパクが、卵黄嚢中及び胚又は胎児の内臓葉及び他の造血組織中での造血を刺激でき、且つ、成体骨髄中での造血を刺激できることを初めて示した（実施例３〜５、表１−２、図６及び９）。内臓内胚葉中に存在する分子をスクリーニングすることにより、本発明者らは、ヘッジホグ遺伝子産物を同定した。ヘッジホグタンパク（ＳＨＨ）を胚盤葉上層培養物に添加し、２〜３日後にＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって解析した（実施例３、図９）とき、造血が、ε−グロビン遺伝子の活性化によって決定したところ、刺激されたと観察された。さらに、ＳＨＨタンパクは、内臓内胚葉が存在しない胚盤葉上層中で、造血を刺激することができた。実施例４及び図１１に記載されているように、ＳＨＨに対する抗体を全胚に添加したとき、ε−グロビンの発現は実質的に低減された。
上記のアッセイは、胚体外組織で発現されたヘッジホグタンパクも、胚体外組織で発現されたタンパクと非常に関連深いヘッジホグタンパクも、造血及び脈管形成を刺激することを示す。シグナリング分子の明確なファミリー（例えば、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏρ．、１０巻（１９９６年）３０１〜３１２頁においてレビューされている）であるヘッジホグのファミリーのメンバーは、四肢形態発生、神経発生、骨成形機能及び精子形成において、ある種の役割を果たすことが知られている。そのファミリーは、初め、ショウジョウバエ属の正常体節パターン化に携わるとして同定された（Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２８７巻（１９８０年）、７９５〜８０１頁）。ヘッジホグのファミリーは、デザート・ヘッジホグ（ＤＨＨ）タンパク、インディアン・ヘッジホグ（ＩＨＨ）タンパク、ムーンラット・ヘッジホグ（ゼブラフィッシュ）及びティギー・ウィンクル・ヘッジホグ（ゼブラフィッシュ）を含む。
本発明が理論によって限定されることは意図していないが、本発明者らは、内臓内胚葉中でのＩＨＨの初めの発現が、卵黄嚢中胚葉中におけるその後のＤＨＨの活性化をもたらし得ること、及び、ＤＨＨが、卵黄嚢の胚体外中胚葉に自己分泌（オートクライン）で作用し得ることを示唆する。このようにして、６．５ｄｐｃにおいて内臓内胚葉を取り去った胚盤葉上層は、ＤＨＨのシグナリングに作用するＩＨＨの存在下において、７．５ｄｐｃにおいて血島を製造し得る。一旦、このようにしてＤＨＨのシグナリングが開始されると、ＩＨＨは、もはやまったく必要とはされ得ない。本発明者らは、ＩＨＨノックアウトもしくはＤＨＨノックアウトの単独での又は両者一緒での影響を観察した。本発明者らは、ＤＨＨノックアウトが血島の形成を妨害しないことに注目し、ＤＨＨ不存在下において、ＩＨＨは、血液発生に対する連続する刺激効果を有すると結論づけている。本発明者らは、血液細胞及び脈管構造を欠く卵黄嚢表現型をもたらすためには、ＩＨＨとＤＨＨの両者がノックアウトされる必要があるかもしれないことを示唆する。分子それ自体における見掛け上の機能の相違は、それらの生化学的な相違中にはそれ程多くは存在しないかもしれず、むしろ、発現部位又は発現のタイミングにおける相違の結果ということになるのかもしれない。この点についての前例は、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子によって提供されている（Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻（１９９５年）、６７９〜６８２頁）。上で提供された説は、ＤＨＨとＩＨＨとの関係について、好ましい説明を与えるが、これらのタンパク間において観察された関係について、他の説明を排除するということを意味しない。
造血及び血管生成の刺激におけるヘッジホグタンパクの有用性は、本発明者らの目的分子（これらの分子を通じてこれらのタンパクが作用する）についての実験によって、さらに補強される。ｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉの発現を解析するために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて（実施例５、図６）、本発明者らは、卵黄嚢中胚葉、すなわち、その唯一の機能は、血液及び血管内皮細胞を生成することである組織において、これらのタンパクの実質的に独占的な発現を確認した。
ヘッジホグタンパクが造血を刺激することができるという本発明者らの観察を支持して、本発明者らは、卵黄嚢中胚葉におけるＧｌｉ及びｐａｔｃｈｅｄの豊富な発現を確認した。Ｇｌｉは、伝達径路（その径路上でヘッジホグタンパクが作用する）に関与する転写因子であり、一方、ＰＴＣ（ｐａｔｃｈｅｄ）は、ヘッジホグタンパクに結合して、標的細胞において生物学的応答を最終的に引き起こすシグナル伝達径路を開始させる、膜タンパクである。これらのタンパクの卵黄嚢中胚葉との関係は、ヘッジホグタンパクが造血を刺激するという観察をさらに支持する。ｐｔｃは、細胞応答への推定された入り口であるから、パッチを結合することができるヘッジホグのアゴニストは、ヘッジホグと同じ生物学的効果（すなわち、この場合造血及び血管生成）を誘導することが期待される。
ある種のヘッジホグタンパクは、二次シグナリング分子である中胚葉におけるＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４（ＴＧＦ−βファミリーに属するタンパク）と外胚葉におけるＦｇｆ−４（国際公開ＷＯ９５／１８８５６）の発現の開始に関与すると報告されている。本発明者らは、造血及び血管生成を刺激するために、ヘッジホグタンパクが、二次シグナリング分子と相乗的に相互に影響し合うかもしれないことを初めて確認した（実施例６）。これらのシグナリング分子は、内臓内胚葉及び／又は卵黄嚢中胚葉と関係していることが見出され得る、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７、そしてＷｎｔｓとＦＧＦを含むＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーを包含する。
本発明に係る、組換えヘッジホグタンパク、ヘッジホグタンパクのアナログ、誘導体及び解離生成物、及びＰＴＣのようなヘッジホグタンパクレセプターのアゴニスト等の、胚体外組織中で発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物の活性は、成体造血幹細胞及び成体前駆細胞に作用すると同様に、胎児細胞、胎児末梢血及び臍帯血を包含する異なる齢の胚に由来する細胞又は組織にも作用することにより、造血及び血管生成を刺激し得る。本発明は、ヘッジホグタンパクの機能ペプチドの使用を包含する。上で定義したヘッジホグ化合物のサブクラスとしての「機能ペプチド」という用語は、全タンパク（国際公開ＷＯ９６／１６６６８、参照によりここに組込まれる）と同じ又は同等の生物活性を誘導し得るヘッジホグタンパクのペプチドフラグメントを包含することが、意味されている。本発明は、さらに、ヘッジホグタンパクのホモログ、組換えヘッジホグタンパク、ヘッジホグをコードする核酸、アンチセンス分子、当該分野で公知のウイルス・ベクターを含む遺伝子治療での使用のための遺伝子構築物、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのヘッジホグタンパクのコンビナトリアル（無作為配列）突然変異体、及びヘッジホグタンパクのエピトープに特異的な抗体を含め、ＷＯ９５／１８８５６（参照によりここに組込まれる）に記載されたヘッジホグ化合物を包含する。これらの及び他の化合物は、本発明のアッセイにしたがって造血及び血管生成を調節するために選択され得る。
本発明にしたがうと、これらの因子は、哺乳類（ヒトを含む）を含め、動物において造血及び血管生成を刺激するために使用され得る。同様に、本発明の化合物に対するアンタゴニストが、血管生成及び造血を阻害するために使用され得る。これらの因子の治療上の有用性について、以下に論ずる。
本発明者らの新規の胚盤胞アッセイは、卵黄嚢の発生に対するヘッジホグタンパクの影響を決定するために使用され得る。加えて、組織化学マーカーとしてＬａｃＺを用いるばかりでなく、ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション又は免疫染色によっても、遺伝子の発現のために、胚盤嚢をアッセイし得るであろう。
造血及び血管生成に対する選択された化合物の影響を研究するためのトランスジェニックマウスモデル：
トランスジェニックマウスモデルは、発生事象の研究において、有用性を有する。組織学的マーカー遺伝子がマウスのゲノムに導入されると、マークされた細胞と関係したパターン化が確立され得る。
先行技術のトランスジェニックマウスは、少なくとも４つの大きな制限を有している：（ｉ）導入遺伝子の転写を追跡する能力が、ＲＮａｓｅ防御又はｍＲＮＡ生成のＳ１ヌクレアーゼアッセイに依存し、且つ、組織試料が、発生の初期段階において制限的であり得る；（ii）発現の特異性が、単一細胞レベルでは試験され得ない（リボプローブを用いてのインサイチュ・ハイブリダイゼーションの実施の不足、しかし、これらの実験は、技術的に困難（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）であり且つ高価である）；（iii）釣り合わせているα−グロブリン遺伝子の不存在下における外来性β−グロブリン遺伝子の不均衡な発現が、重症サラセミアをもたらし易く（Ｈａｎｓｃｏｍｂｅら、Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐ．、３巻（１９８９年）、１５７２〜１５８１頁）、且つ、子宮内での早期の死を通じて、トランスジェニックの子孫の収量を低下させると考えられる（Ｈａｎｓｃｏｍｂｅら、１９８９年；Ｐｏｎｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻（１９９２年）、５６５５〜５６６０頁）；（iv）トランスジェニックマウスでの、その上流調節配列を伴う全グロビン遺伝子及び８．５〜９．５ｄｐｃ後のマウスの試験の使用が、開始後の血液発生の解析をもたらす。Ｐｏｎｄｅｌら（１９９２年）。
本発明者らは、先行技術のトランスジェニックマウスの制限に打ち克つ、血液発生のモデルを提供するトランスジェニック動物を開発した。本発明者らは、ここにおいて、選択されたマウスモデル（このモデルにおいては、上記のアッセイに適合させた外植片を得るために、マーカー遺伝子は、グロビン調節配列の制御下に置かれている）の使用を採用した。本発明者らは、ε−グロビン遺伝子の主要部の代わりに、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）レポーター遺伝子が実例であるマーカーを選択した。したがって、機能的な外来性ヘモグロビンタンパクは、形成されないであろうし、且つ、導入遺伝子の発現を追跡するために、感度の高い酵素アッセイが使用できるであろう（実施例１）。ＬａｃＺのようなレポーター遺伝子を使用するさらなる利点は、それが、急速で詳細な組織化学的研究（この研究においては、発現の特異性を、単一細胞レベルで又は組織溶解物において定量的に解析し得る）を可能にする点にある。複合組織中で単一細胞の発現を試験する能力は、早期の胚形成に関与する研究のために、特に有用である。
ＬａｃＺのレポーター遺伝子の替わりのレポーター遺伝子としては、アルカリホスファターゼ及び緑色蛍光タンパクとその誘導体が挙げられる。実施例１に従って形成された胚は、発生の７．５ｄｐｃという早期において、頂点のレベルでＬａｃＺを発現することができ、それは、１６．５ｄｐｃという後期まで続く。本発明のマウスモデルでのＬａｃＺの発現は、胎児内副大動脈内臓葉において、及び大動脈−性巣−中腎（ＡＧＭ）領域（以下を参照のこと）において、確認され得る。それ自体では、それらは、より遅い発生段階における造血の研究に、特有の形で適合されており、且つ、様々なインビトロ及びインビボでの胚造血についての研究において、有用性を有する。したがって、これらの動物は、様々な種類の外植片又は胚培養物のための遺伝的にマークされたエリスロイド細胞のソースとして、有用性を有する。
本発明に記載されたトランスジェニックの方法を用い、発生の間の発現のタイミングを指示するエンハンサー（そのようなエンハンサーは、任意に誘導可能である）及び／又はプロモーターを利用することにより、あるいは、発現の組織特異性を指示することにより、胚又は成体動物における造血及び血管生成の発現の調節のために、ＬａｃＺトランスジェニックマウスをモデルとして使用し得る。その例としては、卵黄嚢に遺伝子の発現と腸の発生を指示するα−フェトタンパクエンハンサー、心筋に発現を指示する心アクチンエンハンサー、及び造血幹細胞中でタンパクを発現するためのｓｃａ−Ｉ制御配列（Ｍｉｌｅｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２４巻（１９９７年）５３７〜５４７頁）、又は内部光受容体（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｒｅｃｅｐｔｏｒ）レチノイド結合タンパクの網膜特異的調節エレメント（Ｂｏｂｏｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻（１９９５年）、１２８９〜１２９４頁）が挙げられる。他のトランスジェニックマウス（そのマウス中では、ヘッジホグ遺伝子ファミリーから選択された配列が、上記の種類のエンハンサー及び／又はプロモーターの制御の下に置かれ得る）も形成し得る。さらにまた、トランスジェニックマウス（そのマウス中では、ヘッジホグ、又はヘッジホグのアゴニスト又はアンタゴニストが、上記のような異種組織特異的プロモーター／エンハンサーの制御の下で発現される）を作り出し得る。他のトランスジェニック動物（その動物中では、ヘッジホグ制御配列（例えば、Ｓｈｈ又はＤｈｈを発現させるためのＩｈｈ調節配列）が、特定の胚又は成体組織中で、異種遺伝子コード配列を発現させるために使用される）も作られ得る。
上記にしたがうトランスジェニックマウスのモデルは、実施例１に記載された方法によって作られ得る。「ノック−イン」マウスは、胚性幹（ＥＳ）細胞中の内因性配列の制御の下、ヘッジホグ遺伝子をゲノム中の選択された部位に差し向けるために、Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻（１９９５年）、６７９〜６８２頁の方法を用いて作られ得る。これらの改変されたＥＳ細胞は、その後、キメラ動物を形成するために、胚盤胞にマイクロインジェクションされ得る（Ｊｏｙｎｅｒ、１９９５年）。これらの動物は、標的遺伝子についてヘテロ接合性であり、且つ、導入された配列を誤って発現するであろう。このようにして、遺伝子発現のレベル及び発現が生じる部位の制御は達成され得る。そのようなトランスジェニックマウスの例は、Ｉｈｈ配列が外来性のｆｌｋ−１遺伝子座に「ノック・イン」されており、ＨＳＣ及び内皮細胞前駆体中での発現を許しているマウスである。導入遺伝子（「ノック−イン」遺伝子）は、例えばＬａｃＺ又はＧＦＰとの融合タンパクとして改変され得、都合のよい組織化学的もしくは免疫学的又は分子での検出を可能にする。
トランスジェニック動物の技術の使用は、次の用途を含む適用のための、マウスモデル系を提供し得る：胚、胎児及び成体動物における造血及び血管生成の正常なプロセスでのさらなる事象、及び白血病及び異常な血管生成及び異常な造血のような血液の疾患を引き起こす事象の確認。これらの事象は、ヘッジホグ化合物に関して解析され得る。
治療での適用：
本発明の化合物には、治療での適用が数多く存在する。そのような用途は造血及び血管生成の調節と関係しており、幹細胞の分裂増殖及び／又は分化の阻害をもたらす方法と同様に、刺激をもたらす方法を包含する。本発明の化合物の例は、上で論じた。
本発明の実施態様においては、造血及び血管生成を刺激する方法は、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を利用し得る：
（ａ）  誘導体、アナログ、及び天然に見出されるタンパクの分解生成物を含むヘッジホグタンパク、タンパクレセプターのアゴニスト又はアンタゴニスト、そして上記の化合物の機能同等物のような治療化合物。それらの治療化合物は、胚体外組織の培養物から単離してもよく、組換え技術によって製造してもよく、又は合成化学によって調製してもよい；
（ｂ）  遺伝子治療技術に適したベクターに組込まれた、上記治療化合物のコード配列；及び
（ｃ）  細胞移植のために上記のコード配列で形質転換された哺乳類細胞。
異常な血液の発生が生じている個体の治療は、本発明のアッセイの一つで同定された治療薬を、有効投与量において、ある有効時間、上記方法のいずれかによって個体に投与することにより、達成され得る。あるいは、患者を、その技術分野で利用可能な技術のいずれかを用い、治療薬のためのコード配列を含むプラスミド又はウイルスベクターを作ることにより、遺伝子治療の対象としてもよい。例えば、ヘッジホグ関連化合物のようなある同定されたタンパク（集合的に化合物と称される）のタンパク、アナログ、誘導体、アンタゴニスト又はレセプターを、ベクターに導入し、そして、そのベクターを、適当な標的組織（ここでは、この組織は成体又は胚に位置している）に導入し得る。治療薬の発現は、目標とされた組織での選択的な発現を保証するために、選択されたエンハンサーによって制御し得る。例えば、心臓において所望の化合物を発現させるための心アクチンエンハンサー、骨格筋においてその化合物を発現させるためのＭＣＫエンハンサー、造血幹細胞においてヘッジホグ化合物を発現させるためのｓｃａ−Ｉ調節配列又は網膜においてその化合物を発現させるための内部光受容体レチノイド結合タンパクの網膜特異的調節エレメントの使用。
異常な血液の発生が生じている個体は、分泌された薬の運搬系として遺伝的に操作された細胞株を用い、細胞移植の手段によって治療薬を投与することにより、治療され得る。例えば、自己由来の線維芽細胞のような自己由来の細胞又は免疫保護バリアー中に含まれている異種細胞は、ヘッジホグ、又はタンパクのアナログ、誘導体、アンタゴニスト又は受容体のような選択されたタンパクを分泌するための標準的な技術により、操作され得る。
本発明の１つの態様においては、造血細胞の系列における欠陥と関連した異常を治療するために、個体において造血を刺激するための方法が提供される。そのような治療のための標的の例としては、未分化中胚葉由来細胞の、本発明の化合物へのインビボ又はインビトロでの曝露が含まれる。標的細胞の例としては、骨髄幹細胞、前駆細胞及び臍帯血細胞が挙げられる。これらの細胞は、個体から単離してもよく、その後の使用のために細胞銀行に保存し得る。あるいは、それら細胞は、新たに単離してもよく、培養培地中でインビトロで維持し得る。そのような細胞のその化合物に対する曝露は、高められた細胞の増殖及び／又は分化をもたらし、その刺激された細胞は、移植技術の手段によって、その細胞が得られたその同じ又は別の個体に移植される。あるいは、未分化中胚葉由来の細胞を、経口、皮内、皮下、経粘膜、筋肉内又は静脈内の経路を含めて多くの経路のいずれかによって、インビボで胚又は成体中に接近させてもよい。
本発明の方法は、血液の異常に罹患している個体（胚又は成体）を治療するために使用され得る。これらは、遺伝子の障害、ガンの放射線及び化学療法のような治療の副作用によって生じ得、あるいは、ヒト免疫不全ウイルスのような感染性因子によって引き起こされる疾患によって生じ得る。そして、これらは、造血を刺激する方法及び化合物を用いて治療され得る。もしも治療しなかった場合には、そのような異常の結果は、（赤血球が異常な低レベルであることと関連した）様々な形態の貧血である。貧血の例としては、再生不良性貧血（特発性型、素質型、あるいは二次的な型）；骨髄形成異常性貧血；転移又は壊死ガン腫患者における貧血；ホジキン病；悪性リンパ腫；慢性肝疾患の貧血；慢性腎疾患の貧血（腎不全）；内分泌異常の貧血；赤血球形成不全；慢性炎症性疾患による、特発性又は他の異常に関連した貧血；及び多くの原因の血小板減少症が挙げられる。加えて、造血の刺激は、白血球減少症（例えば、白血病及びエイズ）の治療において有益である。
本発明の１つの態様にしたがうと、遺伝性疾患、慢性変性性疾患、老化、外傷又は感染性因子によってもたらされる異常な血管形成（血管過多）を治療するために、１つの方法が更に提供される。その例には、糖尿病性慢性潰瘍、やけど、凍傷、発作後の局所貧血（虚血）状態及び移植が包含される。本発明の化合物は、局所貧血心筋症又は局所貧血肢体における、そして冠状動脈バイパス及び一般に外傷治療の促進における、血管再生又は側副血管の形成の誘導のために、成体において使用され得る。例えば、本発明の化合物は、微小血管密度を高め、より急速な癒合を促進することにより、十二指腸潰瘍の治療において使用され得る。加えて、本発明の方法は、血管生成における異常によって引き起こされた、（上で定義されたような）胚における発生の異常を正すために使用され得る。
本発明の一つの態様にしたがうと、赤血球の過生成、例えば、真性赤血球増加症及び赤白血病又は他の造血に関する悪性疾患、に罹患している個体において、造血を阻害するための方法が提供される。
同様に、例えば、乳ガンのような様々な固体腫瘍、幼児におけるヘムアンギオーマ（hemangioma）、糖尿病に関連する眼の血管新生、雌の生殖器官の出血異常及び関節炎のある種の型においてみられるように、過剰な血管新生又は新血管形成に罹患している個体において、血管生成を阻害するための方法が提供される。
上で参照したすべての引用文献は、参照により組込まれる。
実施例
実施例１：    始原エリスロイド細胞の形成及び造血の検出のためのトランスジェニックマウスモデルの形成
早期の胚発生の間に形成された単一エリスロイド細胞は、ε−グロビンの発現の監視によって確認することができる。本発明者らは、導入遺伝子発現のための新しいε−グロビン／ＬａｃＺベクターを開発した。本発明者らは、それらのベクターから、造血及び血管生成に関して、詳細な組織化学的データも、単一細胞レベルでの発現の特異性のデータをも得た。ε−グロビン／ＬａｃＺ導入遺伝子は、マウス胚の始原エリスロイド細胞（卵黄嚢及び胎児肝）においてのみ発現されるので、これらのマウスは、（主としてエリスロイドの）胚による造血に影響を与えるかもしれない他の遺伝子を過剰発現又はノックアウトする効果の薬学的な操作又は試験のための理想的な標的としての役割を果たす。例えば、関心のある、ある遺伝子を過剰発現しているトランスジェニックマウスを、上記トランスジェニック系統の一つと交配してもよく（すべての子孫がＬａｃＺレポーターを有するようにホモ接合性にされる）、そして、胚の造血への影響をＬａｃＺ染色で測定してもよい。Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｇｉｕｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（サンディエゴ：アカデミック・プレス社、１９９３年）；Ｈｅｒｂｏｍｅｌら、Ｃｅｌｌ、３９巻（１９８４年）、６５３〜６６２頁に記載された方法を用い、組織溶解物中の発現の定量分析を行った。あるいは、ターゲティングされた突然変異（ヌル突然変異又は他のより複雑な突然変異）を有するマウスを、本発明者らのトランスジェニックマウスと交配させることができ、そして、胚の造血に対する突然変異の影響を評価することができる。このインビボのアッセイは、それゆえ、胚の造血に対する遺伝子産物の影響を評価するための力強い道具である。
本発明者らは、発現を決定するための感度の高い酵素アッセイを提供するために、その導入遺伝子を、レポーター遺伝子との組み合わせで設計した。すなわち、本発明者らは、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）レポーター遺伝子を、ヒト胚性β様ヘモグロビン（ε−グロビン）遺伝子の転写に関連する多数の調節エレメントの下流において、ベクターに挿入した（図１）。血液細胞の発生を追うために使用される導入遺伝子構築物の例は、以下に提供される。これらの構築物は、アッセイの方法の例証であり、アッセイの方法は、これらの構築物のみに限定される必要がなく、他のベクター構築物中で他の導入遺伝子及び他のレポーター遺伝子を利用できる。
導入遺伝子の説明：
「ミクロ−ＬＣＲ」（β−グロビン遺伝子座のずっと上流に位置する制御配列の先端を切った短縮型、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら、１９８９年参照）に、最小ε−グロビン・プロモーター単独を加えたもの（構築物１）；「ミクロ−ＬＣＲ」に、−８４９までの上流調節領域を加えたもの（構築物２）；「ミクロ−ＬＣＲ」に、−２０２５までの上流調節領域を加えたもの（構築物３）；「ミクロ−ＬＣＲ」に、組合わせε−ＰＲＥ＋Ｖによって駆動される最小プロモーターを加えたもの（構築物４）（Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１３巻（１９９３年）、７４５７〜７４６８頁）を含む、数種の異なるトランスジェニック構築物を作った。原核β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列（Ｒａｖｉｄら）を含む短いオリゴヌクレオチド（ＳＤＫ）と一緒に、＋２０と＋４７３との間のＥ−グロブリン配列を削除して、最小プロモーターとε−グロビン遺伝子の第二のイントロンの部分との間に挿入した。各構築物について、８〜１０のファウンダー（創始者）が得られた（１４〜２１％のトランスジェネシティ）。
導入遺伝子構築物の生成：
構築物１：  −１７９ｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ７０）：
これは、「基本カセット」であり、一連のクローニング工程を用いて作った。
先ず、ヒトε−グロビン遺伝子を−８４９から＋１７４６まで含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、改変されたμＬＣＲ（Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、１２号、７４５７〜７４６８頁（１９９３年））を含む２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント、及びＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＣｌａＩ／ＨｉｎｄIII消化誘導体（ここにおいて、ＸｈｏＩ部位は、ＸｈｏＩ消化、クレノウＤＮＡポリメラーゼとの反応及びその後の平滑末端連結によって壊してある）の間で、三方連結により、ＭＨＢ１３５を生成した。その後、ＭＨＢ１３５のＥｃｏＲＶ部位にＫｐｎＩリンカーを挿入し、ＭＨＢ１３５Ｋを作った。ｐＵＣεｘ（Ｂａｒｏｎら、Ｃｅｌｌ、４６巻（１９８６年）、５９１〜６０２頁）に由来する、−１７９から＋２０までの最小ε−グロビン遺伝子プロモーターを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化ＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、その後、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを用いる消化によって切り出し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ消化ＭＨＢ１３５Ｋの主（バックボーン）フラグメントに連結してＭＢ４２を生産した。
標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）を用いたＨｉｎｄIII部位でのＮｏｔＩリンカーの挿入により、ＭＢ４２を、改変した。この工程は、独特のＮｏｔＩ部位をμＬＣＲの末端に挿入してＭＢ６０を生じた。
次に、ＭＢ５９を、次のようにして作った。ｐＳＤＫｌａｃＺｐＡ（ＲＥＦ）に由来するおよそ３．１ｋｂのＸｂａＩ／ＰｓｔＩ  ＬａｃＺフラグメントを、ＳＰ７３にサブクローニングし、ＳＰ７３ｌａｃＺを生じた。ｐＵＣεｘから、ヒトε−グロビン遺伝子の＋４７４から＋１７４６までの３′部分を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り取り、ＳＰ７３ｌａｃＺの平滑にされたＢａｍＨＩ部位に平滑末端連結し、ＭＢ５９を生じた。次に、ＭＢ５９のＫｐｎＩ部位を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでの処理及び再連結（レレゲーション）によって壊し、ＭＢ６９を生じた。最後に、ＭＢ６０のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ主要部（バックボーン）を、ＭＢ６９の部分的なＥｃｏＲＩでのそしてその後のＸｈｏＩでの消化によって得られた、ＬａｃＺ及びε−グロビン３′配列を含むフラグメントと連結した。この最終生成物、ＭＢ７０は、基本的構築物、−１７９ｌａｃＺεμＬＣＲであった。
構築物２：  −８４９ｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ７３）：
−８４９から＋２０までのε−グロビン上流領域を、ＭＨＢ１３５からＢｇｌII／ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、ＢｇｌII／ＸｈｏＩ消化ＭＢ７０の主要部（バックボーン）にサブクローニングし、ＭＢ７３と名付けられた−８４９ｌａｃＺεμＬＣＲを製造した。
構築物３：  −２ｋｂｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ９２）：
ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを用いた消化により、ＭＢ１６−３から、−２０２５から＋２０までのε−グロビン上流領域を含む２ｋｂのフラグメントを切り出し、Ｋｐｎ／ＸｈｏＩ消化ＭＢ７０−３（−１８１ｌａｃＺεμＬＣＲ、上を見よ）の主（バックボーン）フラグメントに連結し、−２ｋｂｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ９２）を作った。
ＭＢ１６−３を、次のようにして作った。ｐＵＣεｘ（Ｂａｒｏｎ及びＭａｎｉａｔｉｓ、１９８６年）から、ＥｃｏＲＩでの消化、クレノウＤＮＡポリメラーゼでの平滑末端化、及びその後のＸｈｏＩでの消化により、２ｋｂのε−グロビン上流領域を単離した。その後、これを、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ消化ＭＨＢ１３５Ｋ（上を見よ）に連結した。
構築物４：  ε−ＰＲＥ（II＋Ｖ）μＬＣＲ（ＭＢ７２）：
参照文献（Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏら、１９９３年）の図４の構築物６に由来するＢｇｌII／ＢａｍＨＩフラグメントを、基本構築物ＭＢ７０のＢａｍＨＩ部位に連結し、このベクターを作った。
トランスジェニックマウスの生成：
胚へのマイクロインジェクションのために、プラスミドＤＮＡをＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ制限酵素で消化し（図１）、真核部分を標準的な方法（Ｈｏｇａｎら、１９９４年）を用いて精製した。標準的な方法（Ｈｏｇａｎら、１９９４年）を用い、胚を、単一細胞段階において、ＤＮＡ試料のマイクロインジェクションを行い、その後、里親に移植した。トランスジェニックマウスを作るために、異系交配（アウトブレッド）マウス系（ＣＤ−１）を使用し、胚提供者（ドナー）、繁殖用雄、偽妊娠雌、精管切除された雄、及び繁殖のための成熟雌の起源としての役割を果たさせた。サザーン・ブロッティング（多くの異なるプローブを使用して、再び標準的な方法で）又はＰＣＲ（下を見よ）による尾の生検材料で、遺伝型を決定した。サザーン・ブロット解析は、転位、重複又は欠失が、導入遺伝子のゲノムへの組込みに伴わなかったことを確認するためにも使用した。トランスジェニックの雄（ヘテロ接合性トランスジェニックＣＤ−１雄）を得るために、ファウンダーを繁殖させ、そのトランスジェニックの雄を、ＬａｃＺ発現解析（図２を見よ）のための胚又は成体動物を生産するために、正常なＣＤ−１雌と交配した。その図に示された時期に、妊娠した雌を殺した（膣栓の観察の日の正午を、交尾後０．５日（ｄｐｃ）とみなした）。胚を切り解剖し、固定し、ＸＧａｌで染色した。段階ごとのマウス胚での導入遺伝子の発現の解析のために、標準的な方法（Ｗａｓｓａｒｍａｎ及びＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、１９９３年）を用いての、全標本（ホールマウント）の胚の染色により、酵素のβ−ｇａｌ活性を追跡した。
トランスジェニックマウスの遺伝型決定のためのＰＣＲ条件：
10日齢の仔の足指の切削物（クリップ）から、又は３週齢の仔の尾の生検材料から、ゲノムDNAを調製した。足指の切削物を、プロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＮＡ抽出緩衝液（５０ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ８、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ）２０μｌに加え、５５℃にて１時間インキュベーションした（但し、初めの３０分間の後にはボルテックスで攪拌した）。その後、試料を２００μｌの水で希釈し、１０分間沸騰させ、２０分間微小遠心分離を行った。ゲノムＤＮＡを、尾の生検材料から標準的な方法（Ｈｏｇａｎら、１９９４年）で調製した。０．４μｌのゲノムＤＮＡ（足指又は尾）を用い、１×緩衝液Ｇ（ＰＣＲ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＩ．Ｕ．Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含む５０μｌの反応物中でＰＣＲを行った。３２サイクルの９４℃での変性（１分）、５５℃でのアニーリング（１分）及び７２℃での伸長（１分）と、その後の最終的な７２℃で６分間の伸長で増幅を行い、４０８ｂｐの生成物がもたらされた。反応物の一部（１０〜１５μｌ）を、１×トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）中で、２％アガロースゲル上で解析した。増幅プライマーの配列は、
５’Ｈε：  ５’−ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＣ  ＡＴＴＡ−３’（Ｈε−グロビンの−１７９〜−１６５に対応）
３’ＬａｃＺ：  ５’−ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧ−３’（ＬａｃＺの＋１５４〜＋１７０に対応）
であった。
結果：
ＬａｃＺの発現は、交尾後７．５日（ｄｐｃ）という早期において（すなわち、卵黄嚢中に血島が初めて見られる頃に）、胚体外体腔のレベルにおいて、期待された「リング」パターンで検出可能であった（図２Ａ）。８．５ｄｐｃまで、卵黄嚢の血管溝内に、始原赤芽球の染色が観察された（図２Ｂ）。実際の胚（胚プロパー）内には、少数のＬａｃ−Ｚ染色始原赤芽球が観察された（図２Ｂ（ｃ））。１２．５ｄｐｃ、すなわちマウスのε−グロビン遺伝子の発現が頂点に達するときまで、卵黄嚢の血管内に、Ｌａｃ−Ｚ染色始原エリスロイド細胞が見られた（図２Ｃ）。本発明者らは、これらの細胞がＬａｃＺを発現することを確かめるために、胚の血液を直接染色した。
ＭＢ７０、ＭＢ７２又はＭＢ７３を有するマウスは、卵黄嚢の始原エリスロイド初期赤血球細胞中で、そして１６．５ｄｐｃの胎児肝中でも、ＬａｃＺを発現した。ＭＢ７０及びＭＢ７３についてトランスジェニックなマウスは、成体組織中でＬａｃＺを発現しなかった。対照的に、プロモーターの上流において負の調節エレメントがないと、ＭＢ７２トランスジェニックマウスも、成体エリスロイド細胞においてＬａｃＺを発現した。
それゆえ、ＭＢ７２は、成体動物での貧血又は赤血球増加症の薬学的な誘導を研究するために使用できる。これらのマウスは、成体での他の遺伝子の過剰発現又はノックアウトの赤血球生成に対する影響を評価するために、他のトランスジェニック又はノックアウトマウスと交配することもできる。（適当な突然変異を有する他のマウスと交配した後）これらのマウスを用いて研究することができる疾患の例は、鎌状赤血球貧血及びサラセミア（例えば、Ｓｋｏｗ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ、３４巻、１０４３〜１０５２頁（１９８３年）；Ｃｉａｖａｔｔａ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９２巻、９２５９〜９２６３頁（１９９５年））を包含する。
卵黄嚢での発現に関して、始原エリスロイド細胞は、ＭＢ９２マウスにおいては、他の３種の構築物のいずれかを有するマウスについて検出されたと同様に、ＬａｃＺ−陽性であった。
実施例２：始原胚の中胚葉は自ら造血及び血管生成をすることができないことの証明；胚外植片培養物はこれらの培養物の中で造血及び血管生成を刺激する因子を同定するために使用される
ヒト胚性β−グロビン上流調節配列のうちの１つに連結されたＬａｃＺレポーターについてトランスジェニックなマウス（図１）を、ホモ接合性を有するように交配した。これらの動物は、導入遺伝子が始原エリスロイド細胞にのみ発現される、マークされた胚の起源として役立つ（図２）。
（Ａ）内臓内胚葉は、始原造血に必要とされる。
胚外植片培養物：実施例１のトランスジェニックマウスに由来する胚を、造血中胚葉の形成の前に、原腸形成の開始付近の６．２５〜６．５ｄｐｃで単離し、８ウェル（ｗｅｌｌ）のスライドのチャンバー（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））又は２４ウェルプレートのウェル（コスター）で個別に、又は、テラサキ（Ｔｅｒａｓａｋｉ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））の個々のウェル又は４ウェルプレートのウェルで、４８〜７２時間、それぞれ維持した。次に、胚を固定し、標準的な技法（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ、Ｐ．Ｍ．及びＭｅｌｖｉｎ  Ｌ．ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ編、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．２２５、４６１〜４６３頁、１９９３年）を使用して、ＸＧａｌで染色し、始原赤芽球の生成を監視した。全胚を、ＬａｃＺ−陽性血島用の血清を含む培地又は化学的に定義された培地（ＣＤＭ）のいずれかで培養した。ＣＤＭは、ペニシリン（１，０００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１，０００μｇ／ｍｌ）、及びヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７．４（２０ｍＭ）を添加した以外は、（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ及びＷｉｌｅｓ、１９９５年）により使用されたのと同様であった。
胚盤葉上層からの内臓内胚葉の分離：前ストリーク（ｓｔｒｅａｋ）から早期ストリークの胚を、トリプシン／パンクレアチン（１５秒〜２分）を使用し、標準的な技術（Ｈｏｇａｎら、１９９４年）を使用して、外胚葉（胚盤葉上層）及び内臓内胚葉成分に酵素的に分離した（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｓ．Ｍ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．６２、１９７〜２１１頁（１９９７年））。この操作の間、組織のクロス・コンタミネーションは、無視してよいことがわかった（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年）。胚盤葉上層又は全胚をそれぞれ培養した。図２ａは、胚盤胞の内部細胞塊の派生物である胚盤葉上層を表し、胚盤胞からＥＳ細胞が派生する。
内臓内胚葉は、中胚葉中における始原造血のために必要とされる。
（ａ）ＬａｃＺ−陽性血島は、全胚培養物中に容易に検出されたが、胚盤葉上層培養物中では、化学的に定義された培地（ＣＤＭ）又は３０％の熱不活性化された（５６℃、３０分）胎児ウシ仔ウシ血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地（ギブコービー・アール・エル（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））のいずれでも、ＬａｃＺ染色はほとんど又は全く観察されなかった。これらの結果は、中胚葉は、自ら胚での造血を行うことはできず、内臓内胚葉と接触すること又は内臓内胚葉から放出されるシグナルを必要とすることを示す。これに対し、より後の（６．７５〜７．５ｄｐｃ）胚から採取される胚盤葉上層は、培養４８時間後に血島を形成するが、これは、おそらく、この段階に存在する中胚葉細胞が、すでに内臓内胚葉に由来するシグナルを受信しているためである。
（ｂ）再構築実験：胚盤葉上層をコラーゲンゲル中で内臓内胚葉と再構築させた（ラット尾コラーゲン・タイプＩ、コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））。コラーゲンは、製造者の指示にしたがって調製した。１０μｌのコラーゲンの滴をプラスチックの表面に凝固させ、次に組織をウオッチメーカーズ（ｗａｔｃｈｍａｋｅｒ’ｓ）ピンセットを使用して作った小さい窪みに並べ、次に１μｌのコラーゲンで覆い、その場に保持した。あるいは、組織を５μｌのコラーゲンの滴の中に丁寧に放出させ、物理的接触を可能にするように並べ、次にコラーゲンを凝固させた。１０分後、外植片培養培地（３０％ＦＢＳ（５６℃、３０分間で熱不活性化されたもの）、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７．４、６８μＭ  α−メチルチオグリセロール、ペニシリン（１，０００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１，０００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥ）を、ウェル（２４ウェルプレートには０．５ｍｌ、より小さいウェルにはより少ない量）に添加した。胚断片は、引き伸ばされたパスツール・ピペットを使用して操作した。全ての培養物を、３７℃及び５％ＣＯ2で維持した。培地は、１日後に交換した。Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．１６２、１５６〜１５９頁（１９８７））の小規模法を使用して、３日後にＲＮＡを収穫し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年）により胚グロビン遺伝子発現を分析した。これらの実験により、胚盤葉上層が内臓内胚葉で再構築された場合にグロビン遺伝子発現の活性化を示すことが明らかとなり、したがって、原腸形成の間、造血誘導中に内臓内胚葉が必要とされることが確立された（図７、図８−１）。
（ｃ）内臓内胚葉細胞中での拡散性因子による始原赤血球生成の活性化：ＥＮＤ−２（Ｍｕｍｍｅｒｙら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０９（１９８５）、４０２〜４１０）−内臓内胚葉に由来する細胞系（セルライン）を、１５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥ中で集密的（コンフルエンス）になるまで増殖させた。細胞をトリプシン処理し、３０％ＦＢＳを含む５ｍｌのＤＭＥ（ＤＭＥ−３０）中に再度懸濁し、137Ｃｓ源を使用してγ線照射（６０００ｒａｄ）した。細胞をピペッティングして塊を壊し、次に、１０ｃｍの皿に、追加の１５ｍｌのＤＭＥ−３０を添加した。細胞に、３日間３７℃（５％）ＣＯ2で培地を馴化させた。培地を収穫し、残りの細胞を、１０分間１５００ｒｐｍで遠心分離して除去し、次に、上清を、０．２ｍｍフィルターを使用して滅菌した。得られる馴化（コンディションド）培地（ＣＭ）を、小分して−８０℃で貯蔵した。
胚盤葉上層を、ＣＭあり（＋）又はなし（−）でインキュベートした。ＣＭなしで培養した胚盤葉上層のほとんどは、始原赤血球生成のマーカー（ε−グロビン遺伝子）を活性化しなかったが、ＣＭの存在下で培養された胚盤葉上層のほとんどは、この遺伝子を活性化した。これらの結果は、細胞−細胞接触は、内臓内胚葉による赤血球生成の刺激には必須ではないが、その効果は、１つ以上の拡散性因子によって媒介されることを示す。図１０中のアスタリスクは、人為的な増幅産物を示す。
これらの結果は、非処理の全胚について、６／６がグロビンを産生したことを示す。これに対し、８つの非処理の胚盤葉上層のうち、１つのみが検出可能な発現を示した。コンディションド培地を添加した場合、８／１０の胚盤葉上層培養物がグロビンを発現した。
マウス発生の間で初めて造血が生じる時の決定
インサイチュハイブリダイゼーション及び組織学：
ＢＭパープル（Ｐｕｒｐｌｅ）（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を、アルカリ性フォスファターゼ検出の基質として使用して、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＮｉｅｔｏ（１９９３年）にあるようにホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーションを実施した。使用するプローブは、マウスε−グロビンプローブである。ジゴキシゲニン標識されたリボプローブを、標準的な方法（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＧｒｅｅｎ、Ｐｏｓｔｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｅｄ．Ａ．Ｃｏｐｐ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年）を使用して、ＳＰ７３ｍεＲＢと表されるＥｃｏＲＩで線状化したＤＮＡテンプレート（鋳型）のＴ７ポリメラーゼ転写により調製した。ＳＰ７３ｍεＲＢは、マウスε−グロビン遺伝子（Ｂａｒｏｎ及びＭａｎｉａｔｉｓ、１９８６年）の＋１８７〜＋４３９のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの連結により生成された。このフラグメントは、この遺伝子の第一のイントロンの小さい領域及び第二のエキソンのほとんどを含む。全胚についての、野生型マウスにおいて造血を検出することのできる時間を決定するためのインサイチュハイブリダイゼーションの結果を、図５に示す。
造血誘導を測定するために、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＲＴ−ＰＣＲ技法を使用した。これは、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ法が、造血誘導に関してＸＧａｌ染色よりもより感度が高く、定量的なアッセイだからである。これは、また、組織中に発現する種々の遺伝子の分析が可能であるため、ＸＧａｌ染色よりも用途が広い。この技術のための出発物質は、ＲＮＡである。オリゴヌクレオチドプライマーを調製した。プライマーの例を、表１に示す。総ＲＮＡを、１つの胚の組織（６．２５〜６．５ｄｐｃの試料）からのグアニジン酸−フェノール抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら（１９８７年））により調製した。
総ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）を使用して、標準的な方法で、ＡＭＶ逆転写酵素（ライフ・サイエンス・インク（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））で逆転写した。マルチプレックスＰＣＲは、５ｐｍｏｌのβ−アクチンプライマー（内部標準物質として）、１０〜４５ｐｍｏｌのテスト遺伝子プライマー、及び、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後のオートラジオグラフィーによる、増幅された産物の検出が可能であるように、痕跡量の［α−32Ｐ］−ｄＣＴＰを含む１５μｌの反応液中で行った。ＰＣＲに使用したプライマーを、表１に記載する。注入したｃＤＮＡの量は、β−アクチンの発現について標準化した。サイクル数及び不飽和増幅を生じるプライマー及びテンプレートｃＤＮＡの量は、各場合において経験的に決定した。
胚性β様グロビン（ε）遺伝子発現は、６．５ｄｐｃの胚盤葉上層、又は、６．２５〜６．５ｄｐｃで単離された全胚では検出されなかった。培養７２時間後、ε−グロビン遺伝子は、全胚中で活性化されたが、単離された胚盤葉上層中には、ほとんど又は全くε−グロビン転写物は検出されなかった（図７及び図８）。これは、胚での造血は、中胚葉自律的ではないこと、及び、胚性グロビン遺伝子発現の誘導は、内臓内胚葉の存在下で生じることを示した。この効果は、胚性グロビン遺伝子発現の誘導のための内臓内胚葉に対する要求と一致する。（観察された効果は、発達がより進んだ段階で胚が収穫された時の単離された胚盤葉上層が、低量のグロビン遺伝子発現をもたらし得る、同腹での胚の発生中の変動によってもたらされる、ランダムな事象の予想された効果とは、容易に区別することができた。）
（Ｂ）後段階の原腸形成胚から得られた胚盤葉上層の前部部分の血液形成
個々の後段階原腸形成胚（約６．７５ｄｃｐ）を収穫し、取り囲む内臓内胚葉を除去した。この段階で、胚盤葉上層はすでに内臓内胚葉シグナルを受信しており、血液を生成する能力を発達させている。しかし、この能力は、この時点では、この胚盤葉上層の後部領域に局在しているように思われる。本発明者らは、ここにおいて、前部部分が、胚体外の内臓内胚葉への依存性を保持することを示している。内蔵内胚葉は、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら（１９９７年）により記載されたように酵素的に除去し、胚体外の外胚葉を切除した。胚盤葉上層（胚外胚葉）を前部部分及び後部部分に横に切開し、３日間別々にインキュベートした。後部方部分を、Ｄｏｗｎｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．１１８（１９９３年）１２５５〜１２６６頁に記載されているように、始原ストリーク（後部の胚盤葉上層）のような形態学上の目標に基づいて同定した（図１５）。結果を図５及び図１６−１、図１６−２、図１６−３、及び図１６−４に示し、以下に議論する。
（ｉ）後段階の原腸形成の間、胚の後部部分は、内臓内胚葉が存在しなくても、血液を形成することが可能であるが、前部部分では不可能である。
上述のようにＲＴ−ＰＣＲを使用して、胚の前部部分では、ほとんど又は全くε−グロビン発現が観察されず、又、血液の発達も組織学的に観察されなかった。これに対し、後部部分は、内臓内胚葉が存在しなくても、インタクトな胚に匹敵する濃度（対照として示されている）で血液を形成した。対照は、（ｉ）ｃＤＮＡテンプレートの不存在下で実施したＰＣＲ反応（−ｃ−ＤＮＡ）、（ｉｉ）逆転写酵素なしで逆転写カクテルを使用して行ったＲＮＡインキュベーション（ａｎｔ（−ＲＴ）、ｐｏｓｔ（−ＲＴ）、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年）を含んでいた。この実験では、アクチンを１８サイクルで増幅し、グロビンを２３サイクルで増幅した。
（ii）内臓内胚葉からのシグナルは、原腸形成の後段階での胚の後部部分に血液を形成する能力を回復させることができる。
（ａ）  後段階の始原ストリーク段階の胚盤葉上層の４つの前部部分及び４つの後部部分を、各々、内臓内胚葉不存在下で培養した。図２Ａの実験において観察されたように、これらの原腸形成後段階の胚の後部部分は血液を形成することができたが、前部部分は形成できなかった。これに対し、胚盤葉上層の前部部分を、内臓内胚葉と共にコラーゲンの滴中で培養すると、４試料中２つで血液形成が再構成された（図中「ｒｅｃｏｍｂｓ」と記されている）。この実験では、アクチンを２１サイクルで増幅し、グロビンを２６サイクルで増幅した。
（ｂ）本発明者らは、以下のようにして、中胚葉による血液形成が内臓内胚葉からのシグナルを必要とすることを決定した：トランスジェニック（Ｔｇ）胚外胚葉（胚盤葉上層）を、その内臓内胚葉（ＶＥ）を剥ぎ取り、コラーゲンの滴中で非トランスジェニックＶＥと再構築した。これらの実験では、造血細胞の可能性のある唯一の起源は、トランスジェニック胚盤葉上層であり、非ＴｇＶＥではない。組織を３〜４日培養し、次にＸＧＡＬで染色してｌａｃＺ発現の領域を同定した。これらの実験は、血液の形成がＶＥ組織の存在下で再構成されることを示す。さらに、ＶＥ組織の近辺の領域に血球細胞が局在することは、直接細胞−細胞接触が必要とされるか、又は、拡散性分子による短い範囲のシグナル伝達が関与することを示唆した（図８−１）。
（ｃ）本発明者らは、以下のように、内臓内胚葉は胚盤葉上層の胚外胚葉の前部が造血及び血管内皮マーカーの両方を発現するようにリプログラムできることを決定した：胚盤葉上層の前部部分を、内臓内胚葉と共に再構築し、図１６−２に示される造血マーカー（ε−グロビン、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ−３４）及び図１６−３に示される内皮マーカー（ＰＥＣＡＭ−１、ｆｌｋ−１及びＶｅｚｆ−１）の両方の活性化を得た。これらのマーカーは、中期〜後段階の原腸形成で単離された、培養された胚盤葉上層の後部部分中（図１６−２、後部のレーン６〜１０、及び図１６−３、後部のレーン６〜１０）、及び培養された全胚中（ｅｍｂ＋ｃｘ）で強度に発現された。同じ発生段階の内臓内胚葉のみ（図１６−２、前部レーン６〜１０；図１６−４、前部レーン６〜１０）又は非培養全胚（図１６−２、ｅｍｂ（−ｃｘ）；図１６−３、ｅｍｂ（−ｃｘ））では、これらのマーカーの発現はほとんど又は全くなかった。これらの実験は、造血及び血管組織が両方とも、内臓内胚葉シグナルにより誘導され、シグナルが有用であることを示した。特異性の対照として、心臓組織中で（及び、したがって、より後の発生段階でのみ、７〜８ｄｐｃあたりに）発現されると予期される心ミオシン（Ｌｙｏｎｓら、１９９０年）は、胚盤葉上層の前部又は後部部分中、又は培養中の初めの３日間の再構築物中（図１６−２、レーン３〜１７）には検出されないが、１０．５ｄｐｃの胚対照で検出された（図１６−２、図１６−３）。Ｖｅｒｆ−１（５’）及び（３’）プライマーは、約７００ｂｐの産物を生成した。Ｖｅｒｆ−１は、ｄｂ−１と呼ばれるヒトタンパク質と相同性を有するジンクフィンガータンパク質であり、発生中の血管構造中で発現される。これは、胚盤葉上層の後部部分及び再構築胚盤葉上層で主に生じるが、胚盤葉上層の前部部分では生じないことが示された（図１６−３）。
マーカーの発現を同定するために使用されたＰＣＲプライマー
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（Ｃ）約３．２５〜３．５ｄｐｃで単離された胚盤胞は、未分化中胚葉細胞の造血及び血管生成を刺激することのできる化合物をスクリーニングするためのモデル系を提供する
胚盤胞培養物を調製し、未分化中胚葉に由来する細胞を、造血及び血管生成を経験するように刺激することに対する化合物の効果を分析するために使用した。本明細書に記載されている胚盤胞培養系は、例えば卵黄嚢のような通常インビボで着床後に形成される胚構造の発生をインビトロで追跡するために適するものである。外部から添加された成長因子又は発生に関するシグナル分子の効果は、定義された条件の下で本明細書において分析される。胚盤胞は、野生型のマウス、トランスジェニックマウス又はノックアウトマウスから得ることができる。ノックアウトマウスの胚での造血を、ヘテロ接合性動物の交配により得られたヌル突然変異胚盤胞を使用して研究した。これらのヌル突然変異胚盤胞は、より優れた単離の容易性から、インビトロの分化実験（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７（１９９５年）８６２〜６９頁）で使用されるヌル突然変異胚性幹（ＥＳ）細胞よりも好ましい。
胚盤胞のアッセイは、約４．５ｄｐｃで母親の子宮内へ胚が着床する前に、マウスから胚を回収することによる。ここでは、胚盤胞は、（ａ）実施例１にしたがって調製し、ＬａｃＺ染色により分析する、ε−グロビン／ＬａｃＺトランスジェニックマウス、及び（ｂ）個々の胚盤胞を、多様な遺伝子の発現について、ＲＴ−ＰＣＲにより分子レベルで分析する、非トランスジェニックマウス又はノックアウトマウスから得た。
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎにより、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３年に記載されているように、３．２５〜３．５ｄｐｃで胚盤胞を収穫した。本発明者らは、いくつかの異なるマウス株からの胚盤胞の培養に成功した。この実施例では、ＣＤ−１マウスを使用した。培養方法は、Ｃｈｅｎ及びＨｓｕ（Ｃｈｅｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．，７（１９７９年）２３１〜４４頁）の方法に基づいた。しかし、過剰排卵のメスは使用しなかった。収穫の後、胚盤胞を、鉱油の下、滴（ドロップ）培養物中で２〜３回連続した移動（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、４７１〜４７８頁、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７）により、夾雑する母体の血液細胞がないように洗浄し、未処理の３５ｍｍのプラスチック組織培養皿又は２４ウェル皿のウェルへ移した。、胚盤胞は、プラスチックに接着し、再編成され、成長した。胚盤胞を、個々に（２４ウェル皿のウェル中）又は２０までの群で（３５ｍｍのプレート又は２４ウェル皿で）、ＣＭＲＬ−１０培地で初めの４８時間、及び次にＣＭＲＬ−２０で１０日まで３７℃及び５％ＣＯ2で培養した。ＣＭＲＬ−１０は、１０％の熱不活性化された胎児ウシ血清、ペニシリン（２，０００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２，０００μｇ／ｍｌ）、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ギブコ−ビー・アール・エル（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））、及び１０-4Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む、ＣＭＲＬ１０６６培地（ギブコ−ビー・アール・エル）であった。嚢様構造は、初めに培養７日あたりに見られ、９〜１０日後では、それらは肉眼で容易に見られる程度に大きくなった（直径０．５〜２ｍｍ）。これらの嚢様構造（本明細書において「ブラストサックス（ｂｌａｓｔｏｓａｃｓ）」という）は、初期のマウス卵黄嚢によく似ていた。
トランスジェニック・ブラストサックスを、標準的な方法（Ｗａｓｓａｒｍａｎ及びＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、１９９３年）により、ＬａｃＺ発現についてインサイチュで染色した。ＲＴ−ＰＣＲによる分析のため、個々のブラストサックスを、Ｐ２００ピペットマンを使用してエッペンドルフ・チューブに移し、１０分間４℃で微量遠心（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅｄ）した。培地を吸引し、ＲＮＡを組織のペレットから単離した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、１９８７年）。一部（２５μｌのうち５〜８μｌ）のＲＮＡをｃＤＮＡの合成に使用した（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年、本明細書に援用する）。０．５〜２μｌのＲＮＡを、記載のとおり（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年）に５０μｌ中でＰＣＲにより増幅した。図４では、試料を３５サイクルの増幅に供し、次に、１０μｌの反応混合物を、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルを通して電気泳動することにより分析した。
アクチン及びマウスＧＡＴＡ−１  ＰＣＲプライマーは、既に記載されている（Ｂａｒｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４、（１９９４年）、３１０８〜３１１４頁）。全ての他のプライマーは、５５℃のアニーリング温度で使用した。プライマーの大きさは、マウスε−グロビン、４８７ｂｐ；マウスＮＦ−Ｅ２、２５７ｂＰ；マウスＥＫＬＦ、１２９ｂｐ；ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター、２７９ｂｐ；ＰＴＨｒＰ、４２１ｂｐであった。プライマーの配列は、
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であった。
ヘモグロビン化された組織は、これらの「ブラストサックス」中で、ベンジジンでの染色の後に同定された（図３ｂ）。ベンジジン染色は、エリスロイド細胞中のヘモグロビンの存在に対応する。これは、トランスジェニックマウスに由来する胚の分析により確認された。これらのマウスでは、ＬａｃＺ発現は、始原赤芽球でのみ観察されたが、他の胚の細胞タイプでは観察されなかった。トランスジェニック胚盤胞を、９日間培養し、次にＸ−Ｇａｌで染色した。図３Ｃからわかるように、発生中のブラストサックス中に生成されたエリスロイド細胞は、染色後にその青色により容易に明らかにされる。野生型のブラストサックス及びトランスジェニック・マーカー株に由来するブラストサックスの両方とも、血管溝（チャンネル）を含むように見え、非常に発達した血管構造を有する後期の卵黄嚢（図２と比較のこと）よりも初期胚卵黄嚢（図３Ｄ）に似ている。上記の培養方法は、４０〜８０％の効率でブラストサックスを提供した。
ＲＴ−ＰＣＲを、発生中のブラストサックス中の中胚葉及び内胚葉マーカーの時間的な発現のパターン、及び、異なる細胞タイプの形成に対する他の成長因子及び細胞外マトリックス成分の影響を同定するために使用した。図４Ａに示すように、胚性グロビンは、卵黄嚢様構造が形成された時にのみ生成されるが、栄養外胚葉細胞の不定形な盛り上がりを越えて、胚盤胞がその発生を進行しない場合には生成されない。
ヌル突然変異体胚を、遺伝子ターゲッティングによリマウス生殖細胞系へ導入された突然変異の、造血及び血管生成への影響を決定するために分析した。胚盤胞培養物を、ホモ接合性のヌル突然変異体の子孫を生じるように交配したヘテロ接合性Ｂｍｐ−４ノックアウト・マウス（Ｗｉｎｎｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｏｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．９、２１０５〜２１１６頁（１９９５年））から３．５ｄｐｃで収穫した。胚盤胞を、種々の期間（例えば、９日間）培養中でインキュベートし、その後、個々のブラストサックスを、栄養外胚葉組織を残してＲＴ−ＰＣＲ分析のために培地プレートから除去した。胚盤胞が由来するトランスジェニックマウスがホモ接合性であることを確立するために、この組織を、ジェノタイピング（遺伝子型決定）するために使用した。ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション及び免疫組織化学もまた、エリスロイド細胞又は内皮での深刻な欠損を引き起こす突然変異についての仮定の変異体を同定するために使用した。
ヌル突然変異体「組織胚様体」組織胚様体は、適当な培養条件下で血島を形成するＥＳ細胞に由来する構造である（Ｋｅｌｌｅｒ（１９９５年））。本発明者らは、組織胚様体を使用して、Ｂｍｐ−４のようなヌル突然変異体の組織胚様体が、ほとんど又は全く血液を形成しないこと、及びこの欠損は、外因性の組換えタンパク質（ＢＭＰ−４）を添加することによって更正できることを示すためのアッセイ系を開発した。この実験に使用するＥＳ細胞は、ＴＬ−１サブラインに由来した。しかし、以下に記載するこのアッセイの条件は、他のＥＳ細胞サブラインの多くにも有効である。これらは、また、細胞がフィーダー非依存性について選択されていても、又はフィーダー細胞上で維持されていても（Ｊｏｙｎｅｒ（１９９５年）Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ））、有効であり、選択された遺伝子中の突然変異は、非変異遺伝子により発現された遺伝子産物と機能的に同等である化合物の添加により更正された。
Ｂｍｐ−４遺伝子の両方の対立遺伝子にヌル突然変異を有するＥＳ細胞を、標準的な技術（Joyner（1995年）Gene Targeting:A Practical Approach.（New York:IRL Press）;Keller、Current Opin.Cell Biol.7、（1995年）862〜869頁;Orkin、Current Opin.Cell Biol.7（1995年）870〜877頁;Mortensen、Molec.Cell Biol.12（1995年）2391〜2395頁））を使用して形成した。これらの細胞は、約２．５×１０5の細胞数で、５ｍｌのＩＭＤＭ／１５％血清（血漿由来の血清又はＰＤＳと胎児ウシ血清の１：１混合物のいずれか）を含む６ｃｍの細菌用皿上にプレート培養した。多くの文献（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ（１９９５年））では、成長因子の異なるカクテルが必須であると主張しているにもかかわらず、エリスロポエチン又はＩＬ−３のような外因性の成長因子の添加は、ここでは必要であるとは思われなかった。２４時間後、ＥＳ細胞は、集塊を形成し、そして、これらを、同じ培地中に丁寧に再懸濁し、１０％血清を含むＩＭＤＭ中０．８％メチルセルロースに、ＢＭＰ−４（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute）からの組換えヒト、２ｎｇ／ｍｌ）あり又はなしで、プレート培養した。図１７（Ａ）及び（Ｃ）は、低い（Ａ）及び高い（Ｃ）拡大倍率での野生型（親の）ＴＬ−Ｉ細胞を示す。野生型のＥＳ細胞に由来する組織胚様体の８７％は、１０日後にヘモグロビン化された（図の上方の表を参照のこと）。これに対し、ヌル突然変異ＥＳ細胞（Ｂ）に由来する組織胚様体の４％のみしかヘモグロビン化されなかった。ＢＭＰ−４を培養物に添加すると（Ｄ）、組織胚様体の数が約５９％に増加した。これらの結果から、上述の胚性β−グロビンについての半定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用することを確認した。これらの結果は、造血の阻害は、Ｂｍｐ−４遺伝子の突然変異の結果として生じうること、及びこの欠損は、外因性のＢＭＰ−４タンパク質を添加することにより回復できることを示す。
実施例３：胚の体外組織中に発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物（ハッジホグタンパク質により例示される）は、未分化の中胚葉細胞（胚盤葉上層中胚葉により例示される）の造血及び血管生成を刺激する。
（ａ）ソニック・ヘッジホグ（Sonic hedgehog）を典型的とする、ヘッジホグタンパク質が、実施例２（Ａ）の方法を使用して胚盤葉上層内胚葉での造血を刺激することを証明した（図９）。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、及び１ｍＭ  ＤＴＴ中の細菌により発現されたアミノ末端ＳＨＨタンパク質（Ｂｕｍｃｒｏｔら、１９９５年）を、１０ｍｇ／ｍｌ胎児ウシ血清アルブミン（ステム・セル・テクノロジー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））中で１μｇ／μｌになるよう希釈した。ＳＨＨタンパク質を、種々の濃度（０．２５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ）で外植片培養培地へ添加した。１日後に培地を交換し、ＲＮＡ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ、１９８７年）をＲＴ−ＰＣＲ分析のために単離した。図９は、ＳＨＨタンパク質が、濃度依存的に内臓内胚葉の代替物となることができることを示す。
（ｂ）胚の胚体外組織で発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物（へッジホグ化合物により例示される）は、未分化の中胚葉細胞（成体骨髄細胞により例示される）の造血及び血管生成を刺激する。
組換えヘッジホグタンパク質が成体造血幹細胞又は前駆細胞の発生又は分化に影響するかどうかを決定するために、本発明らは、インビトロでのクローナルアッセイを実施した。マウス骨髄細胞から単離された単核球を以下のようにメチルセルロース中でプレート培養した：
骨髄造血前駆細胞アッセイ：
骨髄を、標準的な方法（Lord、in Haemopoiesis:A Practical Approach、1〜53頁、Testa及びＭｏｌｉｎｅｕｘ編、１９９３年出版、Oxford University Press）で５〜６週齢の２〜３匹のメスＩＣＲマウスの大腿骨及び脛骨から洗い出し、２％胎児ウシ血清（ハイクローン（hyClone））を含むα−培地（ギブコ・ビー・アール・エル）５ｍｌへ移した。プールされた試料からの単核球を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ、アキュレート・ケミカル社（Accurate Chemical Co.））のクッション上で遠心することにより単離し（Ｔｅｓｔａ及びMolineux、1993年）、コールター・カウンターを使用して細胞数を決定した。細胞を、イスコブス改変ダルベッコス培地（Iscove’ｓ Modified Dulbecco’s Medium）（ＩＭＤＭ）中に３×１０5／ｍｌで再懸濁し、胎児ウシ血清（１０％）、脱イオン化仔ウシ血清アルブミン（細胞培養等級のＢＳＡ、１％）、２−メルカプトエタノール（１×１０Ｍ）及び指示された成長因子及び組換えヘッジホグタンパク質を含むＩＭＤＭ中のメチルセルロース（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１．２％）の混合物中にプレート培養した。組換えヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）から入手し、４０Ｕ／ｍｌで使用した。組換えインターロイキン−３（ＩＬ−３）及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、各々５０Ｕ／ｍｌで使用した。メチルセルロース−単核球混合物の一部（０．３ｍｌ）を、各々、２つの４ウェル皿（ヌンク）のうち、３つのウェルにプレート培養し、各々の成長条件を試験した。各皿の４番目のウェルは、湿度を維持するために、ｄＨ2Ｏを含んでいた。培養物を、５％ＣＯ2中３７℃で、約２週間インキュベーションし、示された日でのコロニー数を記録した。コロニーは、ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、骨髄（ミエロイド）、又は混合として記録した。培養物中に含まれる場合、組換えヘッジホグタンパク質は、１〜５μｇ／ｍｌの間の濃度で添加した。緩衝液のみ（５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）を陽性対照としていくつかの培養物に添加した。各々の培養条件について、データは、２つのプレートの各々の、３つのウェル（総計６つのウェル）のカウント＋／−標準偏差から編集した。
骨髄から単離された単核球を、造血成長因子のみ（エリスロポエチンのみ、又はＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３、又はＥｐｏ＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３の組み合わせ）を含むか、又は、ＳＨＨのヒスチジン・タッグ標識されたアミノ末端ペプチド（ＳＨＨ−ＨＩＳ）、ＳＨＨのアミノ末端ペプチド（ＳＨＨ−Ｎ）、又はＩＨＨのヒスチジン・タッグ標識されたアミノ末端ペプチドを補充されたメチルセルロースにプレート培養した。成長因子のみ又は成長因子に加えて緩衝液を含む培養物を、陰性対照として使用した。
３つの独立した実験において、全てのタイプ（エリスロイド：ＣＦＵ−Ｅ：ＢＦＵ−Ｅ；ミエロイド：ＣＦＵ−ＧＭ）のコロニーの数は、濃度依存的（組換えヘッジホグタンパク質を１、２．５、５μｇ／ｍｌ、Ｘｕｇで添加した）に−１．５〜４倍以上に増加した。ヘッジホグタンパク質が、エリスロイド対ミエロイド系列に対して見かけ上選択的でないという観察は、それらが幹又は初期前駆細胞の発達を刺激するという仮説と一致する。３つのヘッジホグタンパク質は、全てコロニーの形成を刺激した。これらのデータから、本発明者らは、ＳＨＨ及びＩＨＨは両方とも、１つ以上の造血成長因子が存在しようとも、インビトロで造血幹／前駆細胞の増殖、分化、及び／又は生存を促進すると結論づける。
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胚体外組織中で発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物の未分化中胚葉細胞に対する効果を測定するための他の試み：
多型潜在性及び骨髄再集合性細胞のためのインビボＣＦＵ−Ｓ脾臓コロニーアッセイを、造血幹／前駆細胞源をマウスに注射することにより実施した。８〜１０日後に脾臓に形成された肉眼で見えるコロニーは、幹／前駆細胞の存在を反映した（Ｔｅｓｔａ及びＭｏｌｉｎｅｕｘ、１９９３年）。上記のようなインビトロ前駆細胞アッセイの場合と同様、コロニーの成熟度は、コロニーが発達するのにかかった時間を反映し、後に現われるコロニーがより始原的な前駆細胞を表すのに対し、早期に現われるコロニーは、より成熟した前駆細胞を表した。
別の実験では、マウス及びヒト造血組織に由来する幹／前駆細胞集団を、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分析分離、ＦＡＣＳ）、又は磁性免疫選択（Testa及びMolineux、1993年）により濃縮し、その発達を、ヘッジホグタンパク質の存在下で促進した。これらの得られる集団は、ＣＦＵ−Ｓアッセイ（脾臓コロニー形成単位）及び長期骨髄培養を含むインビボアッセイを使用して試験される。典型的な骨髄培養物は、競合的再集合アッセイ及び連続的骨髄移植研究（Morrisonら、1995年a;Morrisonら、1995年ｂ）を含む。
実施例４：ＳＨＨ阻止抗体を使用した培養された全胚での初期造血の阻害
２匹の同腹のマウスに由来する全胚を約６．５ｄｐｃで分離し、外因性ＩｇＧの非存在下（なし）又は精製ＩｇＧ（Ericsonら、Cell 87（1996年）661〜73頁）（４６μｇ／ｍｌ）の存在下でそれぞれ培養した。胚性ε−グロビンの発現を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。結果を図１１に示す。アスタリスクは、人工的に増幅された産物を示す。実験３から予測されるように、ε−グロビンの発現は、ＳＨＨ阻止抗体の存在下で、実質的に減少した。
実施例５：細胞レセプターｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉは、造血及び血管生成を刺激する標的である。
実施例２（ｂ）の方法を使用して、本発明者らは、ｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉの遺伝子発現が、実質的に卵黄嚢中胚葉において限定されていることを示した（図６）。卵黄嚢中胚葉中でのＧｌｉ及びｐａｔｃｈｅｄの豊富な発現は、ヘッジホグシグナルの標的として中胚葉を指す。１０．５〜１２．５ｄｐｃ胚からの卵黄嚢を、内胚葉（ｅ）及び中胚葉（ｍ）画分に分離し、ＲＮＡを、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏら（１９９７年）により記載されたように調製した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、以下のプライマーを使用して上記実施例３に記載されたように実施した。
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Ｇｌｉ及びｐｔｃ（ｐａｔｃｈｅｄ）については、５５℃のアニーリング温度及び２３サイクルを、アクチンについては１６サイクルを使用した（内部対照としてアクチンを使用した）。増幅産物は、２５２ｂｐ（Ｇｌｉ）及び４５３ｂｐ（ｐａｔｃｈｅｄ）であった。Ｇｌｉ及びｐａｔｃｈｅｄの両方の発現は、卵黄嚢の中胚葉画分に実質的に限定されていることがわかった。
実施例６：造血（及び血管生成）に対するＴＧＦ−βタンパク質とのヘッジホグタンパク質の相乗的な効果
上記の実施例３（Ａ）の方法を使用し、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、インディアン・ヘッジホグ及びＢＭＰ−６の両方が、早期の内臓内胚葉に発現されることを示した。全胚（６．５ｄｐｃ）、胚盤葉上層、胚盤葉上層とヘッジホグタンパク質、胚盤葉上層とＢＭＰ−６タンパク質、及び胚盤葉上層とヘッジホグタンパク質とＢＭＰ−６を、７２時間のインキュベーションの後にε−グロビン発現の活性化の程度を決定するために試験する。実験は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−７について繰り返される。本発明者らは、ヘッジホグ及びＢＭＰ−４の両方が存在すると、いずれかのみのときに比べて強化された効果が観察されることを予期する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７−１】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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