(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ドデシル硫酸、テトラデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸若しくはオクタデシル硫酸またはそれらの塩であるアニオン性界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するカチオン化金属ポルフィリン錯体とニオソーム形成物質とを含有し、ＳＯＤ活性剤または抗癌剤または抗酸化剤として用いられる金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項２】
ニオソーム形成物質が、ノニオン性界面活性剤またはこれとコレステロール類もしくはトリアシルグリセロールの混合物である請求項第１項記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項３】
粒径１００ｎｍ以下の小胞体である請求項第１項または第２項記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項４】
前記カチオン化金属ポルフィリン錯体が、次式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）
0004669837.tif 000009
（式中、Ｒ１ないしＲ４の少なくとも一つは、Ｎ−低級アルキルピリジル基、低級アルキルアンモニオフェニル基、Ｎ−低級アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を、Ｒ１１ないしＲ１６およびＲ２１ないしＲ２６は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、Ｒ１７およびＲ１８Ｎ−低級アルキルピリジル基、低級アルキルアンモニオフェニル基、Ｎ−低級アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を、Ｒ２７ないしＲ２８はＮ−アルキルアンモニオ基を示し、低級とは炭素数が１ないし３を示す）で表されるものである請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項５】
前記カチオン化金属ポルフィリン錯体が、金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）または金属［［１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）の１種または２種以上であり、当該錯体の金属部分（Ｍ）が、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）またはイリジウム（Ｉｒ）であることを特徴とする請求項第１項ないし第４項の何れかの項記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項６】
ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルまたはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーの１種または２種以上である請求項第２項ないし第５項の何れかの項記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項７】
コレステロール類が、コレステロール、α−コレスタノール、β−コレスタノール、コレスタン、デスモステロール（５，２４−コレスタジエン−３β−オール）、コール酸ナトリウムまたはコレカルシフェロールである請求項第２項ないし第６項の何れかの項記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム。
【請求項８】
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ドデシル硫酸、テトラデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸若しくはオクタデシル硫酸またはそれらの塩であるアニオン系界面活性剤とカチオン化金属ポルフィリン錯体とを反応させてイオンコンプレックスを形成させ、次いで、このイオンコンプレックスとニオソーム形成物質を混合し、更にこの混合物を媒質中で超音波処理することを特徴とするＳＯＤ活性剤または抗癌剤または抗酸化剤として用いられる金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームの製造法。
【請求項９】
請求項第１項ないし第７項の何れかの項に記載の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームを有効成分として含有する医薬。
【請求項１０】
抗癌剤である請求項第９項記載の医薬。
【請求項１１】
抗酸化剤である請求項第９項記載の医薬。
【請求項１２】
炎症疾患、神経疾患、動脈硬化または糖尿病の治療用薬剤である請求項第１１項記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームに関し、更に詳細には、生体内において抗癌剤あるいは抗酸化剤として作用する金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームおよびその製造法に関する。
【背景技術】
一般に、生体内で生成される数々の活性酸素種は炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、癌、糖尿病等多くの病態に関与しているといわれているが、通常生体では、これらの活性酸素種に対し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ等のラジカル消去酵素を備えてバランスを保っている。
しかしながら、生体内の癌細胞においてはＯ２−・が多量に存在していることが知られており、これらの酵素活性の低下していることが伺える。
一方、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の疾病でも、その原因は、ＳＯＤ、カタラーゼ等のラジカル消去酵素のバランスが崩れ、Ｏ２−・などの活性種が増加したことによるものとされている。
ところで、金属ポルフィリン錯体は高いＳＯＤ活性を示すことが報告されているので、このものを生体内に投与することにより、Ｏ２−・を初めとする活性酸素種を有効に消去させ、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることが予想される。
しかし、金属ポルフィリン錯体を単独で生体内に投与することは、安全性や効果の点から問題も多く、現在まで医薬として利用するに至っていないのが実情である。
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、金属ポルフィリン錯体を安全に生体内に投与することができ、しかも金属ポルフィリン錯体の有するＳＯＤ活性を発揮させることのできる手段を提供することをその課題とするものである。
また、現在臨床的に用いられておりながら、副作用が大きな問題となっているシスプラチンやマイトマイシンＣ等の抗癌剤に代わる、癌細胞にのみ選択的に効果を示す抗癌剤や、活性酸素種が関連するといわれる、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の癌以外の疾患を治療する抗酸化剤の提供もその課題とする。
［発明の開示］
本発明者らは、癌細胞内に存在しているＯ２−・をターゲットとし、金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性作用を利用してこの濃度を低下させる手段について、種々検討した結果、金属ポルフィリン錯体をニオソームに包埋せしめることにより、優れたＳＯＤ活性を有したまま安全に体内に投与可能であり、しかも血液中滞留も可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、アニオン性界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するカチオン化金属ポルフィリン錯体とニオソーム形成物質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームを提供するものである。
更に本発明は、カチオン化金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を反応させてイオンコンプレックスを形成させ、次いで、このイオンコンプレックスとニオソーム形成物質を混合し、更にこの混合物を媒質中で超音波処理することを特徴とする金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームの製造法である。
また更に本発明は、上記金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム有効成分として含有する医薬である。
【図面の簡単な説明】
図１は、金属ポルフィリン錯体としてＦｅＴ２ＭＰｙＰ系を、ニオソーム形成物質としてプルロニックＦ−８８を使用した場合の抗癌特性試験結果を示す図面である。図中、▲はイオンコンプレックス２（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ）を、■（点線）はプルロニックＦ−８８を、■（実線）はＣＤＤＰを、◆はＭＭＣを、●は本発明品９をそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書中において、「金属ポルフィリン包埋ニオソーム」とは、金属ポルフィリン錯体が、ニオソーム形成物質、例えばノニオン系界面活性剤やこれとコレステロール類等の混合物が形成するニオソーム中に組み込まれ、その一部がニオソーム膜外に出ているか、あるいは全くニオソーム膜内に包含されているものを意味する。
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームは、カチオン化金属ポルフィリン錯体とニオソーム形成物質を含有するものである。
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋ニオソーム（以下、単に「Ｐｏｒ包埋ニオソーム」ということがある）の構成成分であるカチオン化ポルフィリン錯体は、置換基としてカチオン性窒素原子を有する基を有するポルフィリン錯体であり、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）
0004669837.tif 000002
（式中、Ｒ１ないしＲ４の少なくとも一つは、Ｎ−低級アルキルピリジル基、低級アルキルアンモニオフェニル基、Ｎ−低級アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を、Ｒ１１ないしＲ１６およびＲ２１ないしＲ２６は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、Ｒ１７およびＲ１８Ｎ−低級アルキルピリジル基、低級アルキルアンモニオフェニル基、Ｎ−低級アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を、Ｒ２７ないしＲ２８はＮ−アルキル  アンモニオ基を示す）
より具体的には、上記式（Ｉ）において、基Ｒ１がメチルピリジル基である、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ２ＭＰｙＰ）、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭＰｙＰ）、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ３ＭＰｙＰ）等や、上記式（ＩＩ）において、基Ｒ２がメチルピリジルアミドエチル基である、［１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン（ＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）等を例示することができる。
これらのカチオン化ポルフィリン錯体に配位する金属としては、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等が好ましい。
上記のうち、金属が配位した式（Ｉ）で表されるカチオン化ポルフィリン錯体の合成は、Ｋ．Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２３，２４５３（１９８４）、Ａ．Ｄ．Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｎｕｃｌ．Ｃｈｅｍ．，３２，２４４３（１９７０）、Ｔ，Ｙｏｎｅｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５，２９８８（１９７０）、Ｐ．Ｈａｍｂｒｉｇｈｔ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１５，２３１４（１９７６）等に記載の方法に準じて行うことができる。
また、金属が配位した式（ＩＩ）で表されるカチオン化ポルフィリン錯体の合成は、Ｅ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｄｅ，Ｈ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｒ．Ｙｏｕｎｇ，ａｎｄ  Ｃ．Ｋ．Ｃｈａｎｇ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９８４，９９１等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明のＰｏｒ包埋ニオソームの製造は、上記カチオン化ポルフィリン錯体のみを使用することによっても行われるが、カチオン化金属ポルフィリン錯体をアニオン系界面活性剤と反応させて得られるイオンコンプレックス（以下、単に「イオンコンプレックス」という）を利用して製造することが好ましい。
このイオンコンプレックスの製造に用いることのできるアニオン系界面活性剤としては、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩が好ましく、その例としては、ラウリン酸（ＬＡＳ）、ミリスチン酸（ＭＡＳ）、パルミチン酸（ＰＡＳ）、ステアリン酸（ＳＡＳ）、オレイン酸（ＯＡＳ）等の脂肪酸のアルカリ金属塩や、ドデシル硫酸（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸（ＳＴＳ）、ヘキサデシル硫酸（ＳＨＳ）、オクタデシル硫酸（ＳＯＳ）等のアルキル硫酸のアルカリ金属塩挙げることができる。なお、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム等が好ましい。
上記イオンコンプレックスを形成するには、適当な溶媒中でカチオン化金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を混合すれば良く、カチオン化金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤との配合比は、それらのモル比で、１：１ないし１：２０程度とすれば良い。
一方、上記カチオン化金属ポルフィリン錯体もしくはこれとアニオン性界面活性剤よりなるイオンコンプレックスは、ニオソーム形成物質物質と混合し、ニオソームを形成させるための常法によりＰｏｒ包埋ニオソームとすることができる。
このニオソーム形成物質としては、ニオソームを形成することが報告されている種々の化合物を利用することができるが、ノニオン系界面活性剤や、これとコレステロール類もしくはトリアシルグリセロールの混合物を利用することが好ましい。
このうちノニオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー等の１種または２種以上を使用することができる。これらノニオン性界面活性剤の具体例としては、Ｔｗｅｅｎ−６１（以下、「ＴＷ６１」と略すことがある）、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｓｐａｎ  ８０（共に日本油脂社製）、プルロニックＦ−８８（以下、「Ｆ８８」と略すことがある）（旭電化社製）等を挙げることができる。
また、コレステロール類としては、コレステロール、α−コレスタノール、β−コレスタノール、コレスタン、デスモステロール（５，２４−コレスタジエン−３β−オール）、コール酸ナトリウムまたはコレカルシフェロール等を挙げることができる。
上記のカチオン化金属ポルフィリン錯体またはイオンコンプレックスとニオソーム形成物質からＰｏｒ包埋ニオソーム形成するには、まず、これら成分を適当な溶媒中に取り、これを十分混合させることが必要である。
ニオソーム形成に当たって、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表されるカチオン化金属ポルフィリン錯体は、そのままでもニオソーム中に包埋させることができるが、式（Ｉ）の、カチオン化金属ポルフィリン錯体はイオンコンプレックスの状態でニオソームを形成することが好ましい。
ニオソームを形成させるに当たってのカチオン化金属ポルフィリン錯体とニオソーム形成物質の使用量は、カチオン化金属ポルフィリン錯体またはイオンコンプレックス１モルに対し、ニオソーム形成物質を１０から５００モル、特に、５０から３００モルとすることが好ましい。
ニオソームの形成は、既に公知の方法により行うことができ、例えば、上記両成分を揮発性溶媒中に溶解、混合した後、揮発性溶媒のみを揮散、除去し、次いでこれに適当な水性溶媒、例えば、精製水、生理食塩水等を加え、激しく攪拌したり、超音波処理すことによりＰｏｒ包埋ニオソームとすることができる。
なお、必要により、水性溶媒に代えて医薬的に有効な成分を溶解した溶液や、ある種の培地等を使用することができ、これらを内包したＰｏｒ包埋ニオソームを得ることもできる。
かくして得られたＰｏｒ包埋ニオソームは、後記のようにその構造解析を蛍光スペクトルや動的光散乱測定等を用いて行った結果、カチオン化金属ポルフィリン錯体部分はニオソームの表面または脂質等の親水部に存在し、界面活性剤のアルキル側鎖は脂質の疎水性部に埋め込まれていることが示された。
また、ニオソームの粒径は１００ｎｍ以下であり、特に３０ｎｍ以下の径の小胞体とすることができ、体内に取り込まれた際、細胞に到達可能な大きさであることがわかった。
更に、後記するように、Ｐｏｒ包埋ニオソームの抗癌特性試験を行った結果、当該ニオソームの原料である単純なカチオン化金属ポルフィリン錯体を投与した場合に比べ、Ｐｏｒ包埋ニオソームを使用した場合の効果が優れており、この効果は、現在抗癌剤として使用されているシスプラチンやマイトマイシンＣより高いことが示された。
更にまた、Ｐｏｒ包埋ニオソームのＳＯＤ活性を評価したところ、このものは当該ニオソームの原料である単純なカチオン化金属ポルフィリン錯体と同等のＳＯＤ活性を示すことがわかり、血中滞留型のＳＯＤ化合物になり得ることがわかった。
以上のように、本発明のＰｏｒ包埋ニオソームは、優れた抗癌作用を有するものであり、癌治療の分野において抗癌剤として使用可能なものである。
従って、癌患者にこのＰｏｒ包埋ニオソームを直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。
同様、本発明のＰｏｒ包埋ニオソームは、優れた抗酸化作用を有し、活性酸素のもたらす生体内障害、例えば、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病から生体を守ることができる。
従って、このものを炎症疾患、神経疾患、動脈硬化または糖尿患者に、直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。
【実施例】
以下に、実施例および試験例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実施例１
鉄［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸５００ｍｌを１１０℃まで攪拌・加熱後、２−ピリジルカルボキシアルデヒド１５ｍｌ（０．１５８ｍｏｌ）を加えた。その後、ピロール１２ｍｌ（０．１７３ｍｏｌ）を注射器で少しずつ滴下し、１１０℃で１時間還流を行って環化縮合した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。中和、洗浄およびカラムクロマトグラフィー（アルミナｂａｓｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ、クロロホルム）を行い、生成物である５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１．１ｇ、収率４．４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ  δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
−２．８２（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、７．７２〜９．１４（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８．８７（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）
４１８、５１３、５４４、５８６、６４５
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）
６１９、６２０
（２）次に、アルゴン（Ａｒ）雰囲気下でジメチルホルムアミド  １５０ｍｌに上記（１）で得た５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン０．２ｇ（３．２×１０−４ｍｏｌ）を加えて溶解させ、さらに、鉄  ０．２ｇと４８％臭化水素酸５ｍｌより得た臭化鉄（ＦｅＢｒ２）を加えて４時間還流した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。
水／クロロホルムによる分液操作およびカラムカラムクロマトグラフィー（アルミナｂａｓｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ、メタノール）を行い、前駆体の鉄［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量０．２１ｇ、収率９４％）。
ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）
４０８、５１２、５６６
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）
６７２
（３）ジメチルホルムアミド３０ｍｌ中に、上記（２）で得た鉄［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン］０．１ｇとｐ−トルエンスルホン酸メチル６ｍｌとを加え、１３０℃で５時間還流した。還流後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムクロマトグラフィー（アルミナｂａｓｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ、メタノール）を行い、目的物質であるＦｅＴ２ＭＰｙＰを得た（収率９１％）。
ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（水、ｎｍ）
４０８、５８４
元素分析（％）
Ｆｏｕｎｄ．Ｃ７５．１１、Ｈ３．９７、Ｎ１７．６６、Ｃ／Ｎ４．２５
Ｃａｌｃｄ．Ｃ７７．５８、Ｈ４．２４、Ｎ１８．１２、Ｃ／Ｎ４．２８
（４）工程（１）において、２−ピリジルカルボキシアルデヒドを４−ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にして鉄［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＭＴ４ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および他の金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）も上記に準じて合成できる。
実施例２
マンガン［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸５００ｍｌを１１０℃まで加熱し、２−ピリジルカルボキシアルデヒド１５ｍｌ、その後にピロール１２ｍｌを少しずつ加え、全て加えた後１時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、中和および洗浄を行った。その後、カラムクロマトグラフィー（塩基性アルミナ、クロロホルム）等で精製し、紫色結晶として、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１．６８ｇ、収率７．０８％）、
１Ｈ−ＮＭＲ  δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）
−２．８（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、７．７（ピリジンのＨ（４位）、４Ｈ）、８．１（ピリジンのＨ（５位）、４Ｈ）、８．２（ピリジンのＨ（６位）、４Ｈ）、９．２（ピリジンのＨ（４位），４Ｈ）、８．８（ピロールのＨ，８Ｈ）
ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）
４１８、５１３、５４４、５８６、６４５
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）
６１９、６２０
（２）次に、上記（１）で得た５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン５００ｍｇを含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液２００ｍｌを、アルゴン（Ａｒ）置換した後、酢酸マンガン・四水和物１．９８ｇを加えて、Ａｒ下で３時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、水／クロロホルムによる分液操作、減圧乾燥を行い、マンガン［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量４０９ｍｇ、収率７５．２％）。
ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）
４６１、５５５
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）
６７２
（３）次に、上記のマンガン［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−ピリジル）ポルフィリン］２００ｍｇとｐ−トルエンスルホン酸メチル１２ｍｌとを反応させた（１３０℃、８時間）。反応後、放冷、水／クロロホルムによる分液操作を行い、更に、カラムクロマトグラフィー［（１）酸性アルミナおよび（２）塩基性アルミナ、メタノール］を行って、目的物質であるＭｎＴ２ＭＰｙＰを得た（収量１５３ｍｇ）。
ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（水、ｎｍ）
４５６、５５５
（４）工程（１）において、２−ピリジルカルボキシアルデヒドを４−ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にしてマンガン［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および他の金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）も上記と同様にして合成できる。
実施例３
Ｐｏｒ包埋ニオソームの合成（１）：
（１）カチオン化金属ポルフィリン錯体であり、実施例１で得られたＦｅＴ２ＭＰｙＰ１．４ｍｇ（１μｍｏｌ）と、界面活性剤であるＳＡＳ  ０．３ｍｇ（１μｍｏｌ）を試験管に取り、これに溶媒としてメタノール１０ｍｌを加えて混合し、イオンコンプレックス１（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ）を調製した。
また、上記のＳＡＳ  １μｍｏｌに代え、ＳＡＳ  １．２ｍｇ（４μｍｏｌ）およびＯＡＳ  １．２ｍｇ（４μｍｏｌ）を用い、それぞれイオンコンプレックス２（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ）およびイオンコンプレックス３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＯＡＳ）を得た。
同様、カチオン化金属ポルフィリン錯体として、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ２ＭＰｙＰ（０．５μｍｏｌ：０．５μｍｏｌ）およびＦｅＴ４ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（０．５μｍｏｌ：０．５μｍｏｌ）を用い、界面活性剤として、ＳＡＳ、ＯＡＳを用い、表１に示すイオンコンプレックス４〜９を調製した。
【表１】
0004669837.tif 000003
（２）次に、試験管に上記のイオンコンプレックス１（１μｍｏｌ）と、ニオソーム形成物質であるＴｗｅｅｎ−６１  ０．１３１ｇ（１００μｍｏｌ）およびコレステロール０．０３８６ｇ（１００μｍｏｌ）を取り、溶媒として少量のクロロホルムを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水１０ｍｌ加え、超音波処理（Ａｒ下、氷浴中、３０Ｗ、３ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（６０℃、３０ｍｉｎ）および濾過滅菌（０．２２μｍφ）し、Ｐｏｒ包埋ニオソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−Ｃｈｏｌニオソーム；本発明品１）を得た。
（３）イオンコンプレックス２（１μｍｏｌ）を用い、上記（２）と同様にして、Ｐｏｒ包埋ニオソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−Ｃｈｏｌニオソーム（本発明品２）を得た。また、イオンコンプレックス１、２、４〜６を用い、上記と同様にすれば、表２に示すＰｏｒ包埋ニオソーム（本発明品３から８）が得られる。
【表２】
0004669837.tif 000004
実施例４
Ｐｏｒ包埋ニオソームの合成（２）：
試験管に、表１のイオンコンプレックス２（０．５μｍｏｌ）とニオソーム形成物質であるプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−８８  ０．５４ｇ（５０μｍｏｌ）およびコレステロール  ０．０１５４ｇ（４０μｍｏｌ）を秤り取り、これに溶媒として少量のクロロホルム（約３ｍｌ）を加え混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、生理食塩水１０ｍｌを加え、超音波処理（氷浴中、３０Ｗ、３０ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（５０℃、３０ｍｉｎ）および濾過滅菌（０．２２μｍφ）し、Ｐｏｒ包埋ニオソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋Ｆ８８−Ｃｈｏｌニオソーム；本発明品９）を得た。
実施例５
Ｐｏｒ包埋ニオソームの動的光散乱測定（その１）：
Ｐｏｒ包埋ニオソームの粒径および粒径分布を測定するため動的光散乱測定（Ｎｉｃｏｍｐ  ３７０、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を行った。実施例３に従い合成したＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品１）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品２）の動的光散乱測定結果を表３に示す。
【表３】
0004669837.tif 000005
この結果より、数分布では平均粒径２８．５ｎｍのものが９０％、１４６ｎｍのものが１０％存在していた。この結果はＴＥＭ観察の結果と対応した。表４より、どのＰｏｒ包埋ニオソームの平均粒径も１００ｎｍ以下であり、体内に投与した場合毛細血管内皮を越えて目的の細胞に到達可能であることが明らかとなった。
実施例６
Ｐｏｒ包埋ニオソームの動的光散乱測定（その２）：
実施例６と同様にして、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品５）の動的光散乱測定を行った結果、このものの平均粒径は２８．５ｎｍ（分布割合は９０％で、残りは平均粒径１４６ｎｍのものが１０％程度）、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品６）の平均粒径は２８．５ｎｍ（分布割合は９０％で、残りは平均粒径１４６ｎｍのものが１０％程度）となり、平均粒径１００ｎｍ以下であって生体内投与しても問題の無い大きさであった。
実施例７
Ｐｏｒ包埋ニオソームの蛍光スペクトル測定：
（１）Ｐｏｒ包埋ニオソームにおいて、包埋したポルフィリン錯体がニオソーム内のどの位置に存在しているかを評価するため、Ｐｏｒ包埋ニオソームの蛍光スペクトル測定（島津製作所、ＲＦ−５３００ＰＣ）を行った。
この測定においては、金属ポルフィリン錯体は一般に蛍光消光するため、金属ポルフィリン錯体に代え、金属挿入を行っていないカチオン化金属フリーポルフィリン錯体（以下、「金属フリー錯体」という）を実施例１、２等に準じて合成し、これを蛍光プローブとして用いた。また、金属フリー錯体包埋ニオソームの合成は実施例３に準じて行った。（以下、金属フリー錯体の略号としては、Ｍの代わりにカチオン化金属ポルフィリン錯体の略号中のＭを、Ｈ２に代えて示す。例えば、金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）の金属フリー錯体はＨ２Ｔ２ＭＰｙＰと、金属［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の金属フリー体ではＨ２Ｔ４ＭＰｙＰと示す。）
上記のようにして、調製したカチオン化金属フリー錯体包埋ニオソーム、例えば、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームおよびＨ２Ｔ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ含有各種溶液におけるＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトル測定（測定波長範囲５００〜８００ｎｍ）を行ったところ、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム水溶液では６４５ｎｍにピークを有する蛍光スペクトルが得られた。
この蛍光ピーク波長は水およびメタノール中でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光波長の中間であった（蛍光ピーク波長（短波長側）水＜包埋ニオソーム溶液＜メタノール（長波長側））。
また各溶媒のピークは、メタノール（６４２ｎｍ）、エタノール（６４３ｎｍ）、２−プロパノール（６４５ｎｍ）、ｎ−ブタノール（６４５ｎｍ）、エチレングリコール（６４２ｎｍ）等の各種溶媒中でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは上記と同様のスペクトル波形であった。しかし、水でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルはピークがブロードとなり、強度も大きく低下し、さらには短波長にシフト（６３０ｎｍ）した。これより、ニオソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境、すなわち、水環境よりもやや非極性な（やや疎水的な）環境である二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。また、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームの結果も同様であった。
（２）次に、ニオソームの二分子膜親水部付近に存在して二分子膜の極性、流動性等の指標となる蛍光プローブである８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を用いた蛍光スペクトル測定を行った。まず、メタノール、メタノール／クロロホルムおよびＡＮＳ包埋ＴＷ６１ニオソーム（ポルフィリン錯体は包埋されていない）溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルは、どれも４８５ｎｍ（励起波長３８５ｎｍ）にピークを示す類似のスペクトルとなった。次に、ポルフィリン錯体とＡＮＳを一緒に包埋したＴＷ６１ニオソーム溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルを測定したところ、４８５ｎｍではなく４５０および５００ｎｍの２つのピークを示し、これら２つのピーク蛍光強度も４８５ｎｍでのそれに比べて減少した。この付近にポルフィリン錯体のＳｏｒｅｔ帯の吸収ピークが存在することより、ＡＮＳとポルフィリン錯体の相互作用が生じたと考えられ、ポルフィリン錯体はＡＮＳ近傍に存在すると考えられる。これらのことよりニオソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。
また、二分子膜内部（疎水部）に存在する蛍光プローブである１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン（ＤＰＨ）とポルフィリン錯体を一緒に包埋させたニオソームではポルフィリン錯体のＳｏｒｅｔ帯、及びＤＰＨのピークである４１０ｎｍ、４３４ｎｍおよび４５７ｎｍにおいてピークの減少は見られず、これよりＤＰＨとポルフィリン錯体との相互作用はなく、ポルフィリン錯体はＤＰＨ近傍には存在しないことが分かった。これらのことよりニオソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。
実施例８
Ｐｏｒ包埋ニオソームの蛍光偏光解消測定：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在する１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン（ＤＰＨ、１μＭ）を用いた金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームにおける蛍光偏光解消測定を行った（島津製作所、ＲＦ−５３００ＰＣおよびＲＦ−５４０／５０００用偏光測定付属装置、測定温度範囲５−６０℃、励起波長３６１ｎｍ、蛍光波長４２８ｎｍ）。例えば、ＤＰＨを含有したＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（ブランク）の蛍光偏光解消測定の温度−偏光度の関係（逆シグモイダル曲線）では、ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム二分子膜の相転移温度（Ｔｃ＝３６℃）付近で蛍光偏光度の減少がみられた。ＤＰＨを含有したＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームの蛍光偏光解消測定の温度−偏光度の関係では、上記のブランクと同様にＴｃ（＝３７℃）付近で蛍光偏光度の減少が見られたが、偏光度はゲル状態で大きい値を示していた。これは、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳとＴｗｅｅｎ−６１およびコレステロールとの相互作用に基づくものであり、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳがＴｗｅｅｎ−６１とコレステロールが形成するニオソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。
また、ＤＰＨを含有したＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ニオソームの蛍光偏光解消測定の温度−編光度の関係は、上記のブランクに比べやや高温側に移行し、縦軸の編光度もゲル領域で増加した。これらのことも、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳとＴｗｅｅｎ−６１およびコレステロールの相互作用に基づき、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳがＴｗｅｅｎ−６１およびコレステロールのニオソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。
実施例９
Ｐｏｒ包埋ニオソームの抗癌特性試験：
本発明のＰｏｒ包埋ニオソームの抗癌特性を、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
本試験の試験試料としては、各種のＰｏｒ包埋ニオソーム（金属ポルフィリン錯体濃度０、１２．５、２５、５０、１００μＭ）を用い、参照試料としては、上記Ｐｏｒ包埋ニオソームの成分である金属ポルフィリン錯体（濃度０、１２．５、２５、５０、１００μＭ）およびニオソーム（濃度、２５００、５０００、１００００、２００００μＭ）を用いた。（どちらもＰｏｒ包埋ニオソームの濃度に対応させた。）
また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７．５、１５、３０、６０μＭ）等を用い、細胞としてマウス肺ガン細胞［Ｌｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＬＬＣ）、理研ジーンバンク］を用いた。
具体的な試験方法は次の通りである。すなわち、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地で細胞を培養し、細胞数計測および細胞濃度調製を行ない、細胞懸濁液（１００μｌ／ｗｅｌｌ、細胞数１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を得た。この細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに加え、二酸化炭素（ＣＯ２）インキュベーター（ＣＯ２  ５％）内で２４時間培養した。ウェルプレート内の培地を除去後、予め調製しておいた各濃度の試料溶液（１００μｌ／ｗｅｌｌ、薬剤濃度０〜１００μＭ）を添加し、さらにＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。濾過滅菌したアラマー・ブルー溶液（１０μｌ／ｗｅｌｌ）を添加し、さらに５時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定（測定波長５７０ｎｍおよび参照波長６００ｎｍ）を行った。
Ｐｏｒ包埋ニオソームとしてＦｅＴ２ＭＰｙＰを包埋したプルロニックＦ−８８ニオソーム（本発明品９）を使用した場合の結果を図１に示す。この結果から、試料の添加濃度の増大と共にＬＬＣの細胞生存率の低下が見られ、効果的な抗癌特性を示した。特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度２５μＭ以上におけるイオンコンプレックスＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳのＬＬＣ細胞生存率は、ＣＤＤＰおよびＭＭＣのそれらに比べやや低かった。更に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋Ｆ８８−Ｃｈｏｌニオソームは、添加濃度の増大と共にＬＬＣ細胞生存率の低下が見られ、添加濃度５０μＭで細胞生存率１０％以下となり、現在使用されているＣＤＤＰおよびＭＭＣより優れた抗癌特性を示した。
また、Ｐｏｒ包埋ニオソームであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品１）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品２）も、現在使用されているＣＤＤＰおよびＭＭＣより優れた抗癌特性を示した。（例えば、添加濃度５０μＭにおいて抗癌特性は現在使用されている抗癌剤＜イオンコンプレックス＜カチオン化金属ポルフィリン錯体＜金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームの順に増大した）。これより、金属ポルフィリン錯体包埋ニオソームは優れた抗癌剤であるといえる。
実施例１０
金属ポルフィリン錯体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の相互作用：
一般に、大過剰の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下において、低分子の金属ポルフィリン錯体はポルフィリン環が露出しているため、Ｈ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易いことが報告されている［Ｒ．Ｆ．Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂ．Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１，１０２６（１９７９）］。そこで、低分子系であるＭｎＴ２ＭＰｙＰ、ニオソーム（高分子）系であるＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品５）、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム（本発明品６）とＨ２Ｏ２の相互作用をＵＶ−ｖｉｓ測定より検討した。すなわち、様々な濃度のＨ２Ｏ２との相互作用およびこれによる分解に基づくポルフィリン錯体Ｓｏｒｅｔ帯吸収ピーク（４５６ｎｍ）の減衰曲線測定およびその減衰曲線から反応速度定数（ｋＨ２Ｏ２）を算出し、それより算出した半減期（ｔ１／２）より評価した。なお、参考として銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ）の結果も合わせて示す。また、試料の調製は実施例２に基づいておこない、Ｈ２Ｏ２濃度は１．２、２．０、３．０、３０ｍＭ、金属ポルフィリン錯体濃度は５μＭとした。これらの結果を表４に示す。
【表４】
0004669837.tif 000006
この結果から、ｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ＜ＭｎＴ２ＭＰｙＰ＜ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソーム＜ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームの順に増加した。この理由は、ＭｎＴ２ＭＰｙＰは低分子系のためポルフィリン環が露出してＨ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易いのに対し、ＭｎＴＭ２ＰｙＰ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームでは高分子系のためポルフィリン環が露出しておらずＨ２Ｏ２と頻度高く相互作用しないので分解し難いためと考えられる。この結果は、実施例７の蛍光スペクトル測定の結果と対応している。また、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームのｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤのそれに比べて大きく、Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤに比べて高いＨ２Ｏ２耐性を有することも示された。
実施例１１
Ｐｏｒ包埋ニオソームのＳＯＤ活性評価（その１）：
Ｐｏｒ包埋ニオソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２−・消去活性）をマッコード、フライドビッチらおよびバトラーらのチトクロームｃ法により評価した［（１）Ｊ．Ｍ．Ｍｃｃｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）および（２）Ｊ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｋｏｐｅｎｏｌ，Ｅ．Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１０７４７（１９８２）］。具体的には下記のように行った。金属ポルフィリン濃度で０〜１０００μＭのＰｏｒ包埋ニオソーム溶液（Ａ溶液）を５水準以上調製した。次に、０．３ｍＭキサンチン水溶液、６０μＭチトクロームｃ水溶液および３０ｍＭリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．８、）を各２０ｍｌ取り、さらに、純水２４ｍｌを加えて混合溶液（Ｂ溶液）を得た。このＢ溶液２．１ｍｌにＡ溶液０．３ｍｌと純水０．２ｍｌを加えて放置（２５℃、１０ｍｉｎ）した。放置後の混合溶液に７μｇ／ｍｌカタラーゼ水溶液０．１ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）水溶液５μｌをすばやく混合して５５０ｎｍ（フェロチトクロームｃ生成に基づく吸収ピーク）におけるＵＶ−ｖｉｓの経時測定を行った（最終的な試験溶液の各成分の濃度は、金属ポルフィリン錯体０〜１００μＭ、キサンチン０．０５ｍＭ、ＸＯＤ２．５Ｕ／ｍｌ、チトクロームｃ１０μＭおよびカタラーゼ０．２３μｇ／ｍｌである）。また、Ｐｏｒ包埋ニオソーム無添加系（ブランク）でも同様に測定した。
これらＵＶ−ｖｉｓの経時測定における「時間−５５０ｎｍでの吸光度」の関係よりＰｏｒ包埋ニオソーム無添加系および添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度（ｖｉおよびｖｏ）を求め、さらに、下式から阻害率（ＩＣ）を算出し、最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度−ＩＣ」の関係よりＩＣ＝５０％おける金属ポルフィリン濃度（ＩＣ５０）を求めてこれをＳＯＤ活性の指標とした（ＩＣ５０が小さいほど高いＳＯＤ活性を示す）。なお、参照としてＭｎＴ４ＭＰｙＰ等についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
阻害率（ＩＣ）＝１−（ｖｉ／ｖｏ）
ｖｏ：Ｐｏｒ包埋ニオソーム無添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
ｖｉ：Ｐｏｒ包埋ニオソーム添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
表５に各種金属ポルフィリン錯体系のＩＣ５０を示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのＩＣ５０はフライドビッチらの文献値を示した［Ｉ．Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ，Ｌ．Ｂｅｎｏｖ，ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２４２５１（１９９８）］。
【表５】
0004669837.tif 000007
この結果、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームおよびＭｎＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームのＩＣ５０は低分子系［ＭｎＴ２ＭＰｙＰ（文献値）］のそれらと類似となり、効果的なＳＯＤ活性を示すことが明らかになった。
実施例１２
Ｐｏｒ包埋ニオソームのＳＯＤ活性評価（その２）：
Ｐｏｒ包埋ニオソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２−・消去活性）をリレイ（Ｒｉｌｅｙ）らのストップドフロー法により評価した［Ｄ．Ｐ．Ｒｉｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．Ｒｉｖｅｒｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｗｅｉｓｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６，３４４（１９９１）］。具体的には下記のように行った。３６℃において、Ｏ２−・発生源である超酸化カリウムを含むジメチルスルホキシド溶液と各種濃度のＰｏｒ包埋ニオソームを含む６０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＥＰＥＳＮａ緩衝溶液（ｐＨ８．１）を急速混合し、Ｏ２−・に基づく２４５ｎｍの吸光度の減衰（Ｏ２−・消失反応の減衰曲線）を経時的に測定した。この減衰曲線より「Ｉｎ（吸光度）−時間」の関係を求め、さらに、この関係の傾きより見かけの速度定数を算出した。最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度−見かけの速度定数」関係の傾きよりＯ２−・消失反応の速度定数（ｋｃａｔ）を求めた。
表６に各種金属ポルフィリン錯体系のｋｃａｔを示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのｋｃａｔはオオセ、カワカミらの文献値で示した［Ｔ．Ｏｈｓｅ，Ｓ．Ｎａｇａｏｋａ，Ｙ．Ａｒａｋａｗａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，ａｎｄ  Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８５，２０１（２００１）］。
【表６】
0004669837.tif 000008
この結果、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ／１ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームおよびＭｎＴ２ＭＰｙＰ／４ＳＡＳ包埋ＴＷ６１−ｃｈｏｌニオソームのｋｃａｔは低分子系［ＭｎＴ２ＭＰｙＰ（文献値）］のそれらと近く、効果的なＳＯＤ活性を示していた。
【産業上の利用可能性】
本発明のＰｏｒ包埋ニオソームは、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）をターゲットとし、これを確実に低減させることができるものである。
従って、癌細胞中のＯ２−・を低下させて癌の治癒に優れた効果を奏することができ、しかもその効果は選択的であるので、副作用のない新たな抗癌剤として利用可能なものである。
また、本発明のＰｏｒ包埋ニオソームは、ＳＯＤ活性を有し、血液中滞留も可能であるという抗酸化剤として優れた効果を有するので、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることができるものである。
【図１】
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