(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子を有効成分として含む製剤と、
肝実質細胞増殖因子の使用に由来する腎臓の糸球体への毒性を軽減するための、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸から選ばれる少なくとも１種の硫酸化多糖類を有効成分として含む製剤とを組み合わせてなる、医薬キット。
【請求項２】
肝実質細胞増殖因子と、肝実質細胞増殖因子の使用に由来する腎臓の糸球体への毒性を軽減するための、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸から選ばれる少なくとも１種の硫酸化多糖類とを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３】
肝実質細胞増殖因子が以下の理化学的性質を有する蛋白性因子であることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬キットまたは医薬組成物：
1) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００である、
2) 肝実質細胞を増殖させる活性を有する、
3) ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する、
4) トリプシンによる消化処理及びキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する、
5) ヘパリンに対して強い親和性を有する。
【請求項４】
肝実質細胞増殖因子が組換え体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の医薬キットまたは医薬組成物。
【請求項５】
デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸から選ばれる少なくとも１種の硫酸化多糖類を含有する、肝実質細胞増殖因子の使用に由来する腎臓の糸球体への毒性を軽減するための腎毒性軽減剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝実質細胞増殖因子含有医薬組成物に関し、詳細には、多糖類により肝実質細胞増殖因子の使用に由来する腎毒性が軽減化された医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
肝実質細胞増殖因子（以下、「ＨＧＦ」と称することもある）は、初代培養肝実質細胞の増殖を促進させうるヒト由来の蛋白性因子として、劇症肝炎患者血漿より見い出された（特開昭63-22526号公報。以下、ヒト肝実質細胞増殖因子を「ｈＨＧＦ」と略す）。その後、ｈＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコ−ドする遺伝子（ｃＤＮＡ）（特開平3-72883 号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用いた組換えｈＨＧＦ蛋白質（以下、「ｒｈＨＧＦ」と略す）の生産方法および形質転換体（特開平3-285693号公報）が報告されている。ｒｈＨＧＦ蛋白質は、生体外（J. Clin. Invest.，87，1853-1857 (1991)）、また生体内（Jpn. J. Pharmacol.，59(suppl. 1)，137 (1992)）において肝実質細胞の増殖及び機能を促進する働きが認められた。さらに、ＨＧＦの標的細胞、組織が広く検索され、肝細胞以外の種々の上皮細胞（尿細管上皮、肺上皮、胆管上皮、胃上皮）や線維芽細胞、リンパ球系細胞がＨＧＦに反応してその増殖や運動性を変化させることが判明した（Mitsubishi Kasei R&D Review ，7 ，16-24 (1993)）。また、これらＨＧＦ標的細胞上のレセプター分子として、癌原遺伝子ｃ−ｍｅｔ産物が機能していることが明らかとなった（Science，251 ，802-804 (1991)）。
【０００３】
ところで特開平5-301824号公報には、ｈＨＧＦの肝実質細胞の増殖測定系に多糖類を添加することにより、培養上清中に存在するｈＨＧＦの分解が抑制されること、すなわち、ｈＨＧＦ分子が多糖類により安定化されことが記載されている。また、特開平6-40938号公報にはヘパリンによりＨＧＦの作用時間の持続性をはかることが、特開平6-145065号公報にはヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体にＨＧＦを結合して固相化された肝実質細胞増殖剤を得ることが、特開平6-312941号公報にはヘパリンまたはその誘導体、ヘパラン硫酸等からならＨＧＦ産生促進剤が、それぞれ記載されている。
しかし、ＨＧＦの使用に由来する腎毒性と多糖類との関連性についてはこれまでに報告された例はなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＨＧＦ投与時に惹起される、ＨＧＦに起因する腎臓の糸球体への毒性と、多糖類との関係について探索、検討を進めてきた結果、ＨＧＦの使用に由来する腎毒性が多糖類により軽減化されることを初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明の要旨は、多糖類により肝実質細胞増殖因子の使用に由来する腎毒性が軽減化された医薬組成物、多糖類が、硫酸化多糖類であることを特徴とする前記医薬組成物、硫酸化多糖類がグリコサミノグリカンであることを特徴とする前記医薬組成物、硫酸化多糖類がデキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記医薬組成物、肝実質細胞増殖因子が以下の理化学的性質を有する蛋白性因子であることを特徴とする前記医薬組成物、
1)  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００である、
2)  肝実質細胞を増殖させる活性を有する、
3)  ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する、
4)  トリプシンによる消化処理及びキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する、
5)  ヘパリンに対して強い親和性を有する
肝実質細胞増殖因子が組換え体であることを特徴とする前記医薬組成物、腎毒性が、腎臓の糸球体への毒性であることを特徴とする前記医薬組成物、および、多糖類を含有し、肝実質細胞増殖因子の使用に由来する腎毒性を軽減することを特徴とする腎毒性軽減剤に存する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明で使用される多糖類は、単糖類２分子以上がグリコシド結合によって脱水縮合して生じる炭水化物、すなわちグリカン全部またはそれらの誘導体をさす。かかる多糖類またはその誘導体は、グリコサミノグリカンの様に、二糖類単位が繰り返してできた構造を有し、その二糖類の１つがグルコサミンまたはガラクトサミンから成る（生命の科学、３９（４）、ｐ．３０６〜３１０（１９８８））ものやグルカンを始めとする多糖類が硫酸エステル化されたものが好適に使用される。具体的には、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デキストラン、デキストラン硫酸等が挙げられる。特に、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸等の多糖類の硫酸誘導体が好適に使用できる。
【０００７】
多糖類は、ｈＨＧＦに対して過剰量使用するのが好ましく、通常、ｈＨＧＦ１モルに対して多糖類またはその誘導体１０2 〜１０5 モルの範囲で使用する。本発明の肝実質細胞増殖剤は主に注射剤として使用される。注射剤は常法に従い調製することができる。その際、ヒト血清アルブミンや界面活性剤等の公知の添加剤を併用してもよい。具体的には、例えば、下記に示す組成物をｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で溶解し、全量を５ｍｌとした後、０．２２μｍのフィルターにて滅菌し、バイアル瓶に分注することによって、或いは、更に凍結乾燥して保存しておき、用時に適宜蒸留水や生理的食塩水等に溶解することによって調製することができる。
【０００８】
（１）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヒト血清アルブミン５０ｍｇ、トライトンＸ−１００  ０．５ｍｇ
（２）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヒト血清アルブミン５０ｍｇ
（３）ｈＨＧＦ１００μｇ、トライトンＸ−１００  ０．５ｍｇ
（４）ｈＨＧＦ１００μｇ、ツイーン８０  ０．５ｍｇ
（５）ヘパリン５ｍｇ
（６）ヘパリン５ｍｇ、ヒト血清アルブミン５０ｍｇ、トライトンＸ−１０００．５ｍｇ
（７）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヘパリン５ｍｇ、ヒト血清アルブミン５０ｍｇ、トライトンＸ−１００  ０．５ｍｇ
（８）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヘパリン５ｍｇ、ヒト血清アルブミン５０ｍｇ
（９）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヘパリン５ｍｇ、トライトンＸ−１００  ０．５ｍｇ
（１０）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヘパリン５ｍｇ、ツイーン８０  ０．５ｍｇ
（１１）ｈＨＧＦ１００μｇ、ヘパリン５ｍｇ
なお、上記多糖類中、本発明において特に好ましいものは下記の構造を有するデキストラン硫酸ナトリウムである。
【０００９】
【化１】
0004676581.tif 000002
【００１０】
本発明において、上記多糖類はＨＧＦの使用に由来する腎毒性を軽減化させる。かかるＨＧＦは、ＨＧＦを含有することの知られているヒトやラット等のほ乳動物由来の体液や組織、または自発的にＨＧＦを産生する細胞から天然のＨＧＦを単離してもよいし、あるいは遺伝子組換え法により該増殖因子ｃＤＮＡを細胞に導入して得られる組換えＨＧＦを用いてもよい。組換えＨＧＦを産生させる宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。具体例には、上記ほ乳動物由来の胎盤、肝障害患者肝組織及び血液、MRC-5 細胞、IMR-9 細胞などの線維芽細胞株、あるいは特開平3-285693号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞等の宿主に導入した産生株などから得られたものが該当する。また、これらＨＧＦにおいては、その前駆体蛋白質や、肝実質細胞を増殖させるという活性を損なわない範囲において一部のアミノ酸を置換、欠失、挿入、修飾するなどの改変を行ったものを用いてもよい。かかる改変体としては、特開平2-288899号公報、WO90/10651号公報、特開平3-130091号公報、同3-255096号公報、同4-30000 号公報、Nature, 342, 440-443(1989)等に記載のものが挙げられる。
【００１１】
本発明においては、ＨＧＦが以下の理化学的性質を有する蛋白性因子であることが好ましい。
1)  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００である、
2)  肝実質細胞を増殖させる活性を有する、
3)  ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する、
4)  トリプシンによる消化処理及びキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する、
5)  ヘパリンに対して強い親和性を有する
【００１２】
またかかるＨＧＦはヒト由来のものであることが好ましく、特に好ましいものは特開平3-72883 号公報及び特開平4-89499 号公報に記載のアミノ酸配列で表されるものを挙げることができる。
ＨＧＦは前述のように、肝細胞増殖活性を有する蛋白性因子として公知であり、種々の肝疾患、腎疾患等の種々の疾患に対し有用な薬理作用を有していることが知られているが、実際の臨床応用に際しては、副作用の問題が生じる。その副作用として腎毒性が挙げられる。すなわち、ＨＧＦを投与すると、腎臓の糸球体にＨＧＦに起因する病変（糸球体上皮の肥大／変性、癒着、半月体形成、糸球体増殖性病変）が惹起される。このようなＨＧＦの使用に起因する腎毒性を多糖類により軽減させることが本発明の主題である。すなわち、本発明は、ＨＧＦを薬剤として使用する場合に生じる腎毒性すべてを対象とするのであって、対象とする疾患は特に限定されるものではない。従って、肝疾患、腎疾患のみならず、ＨＧＦを育毛促進剤、抗癌剤、肺障害治療剤、創傷治癒促進剤、低蛋白血漿治療剤等として使用した際に生じる腎毒性すべてを対象とする。
【００１３】
本発明においては、ＨＧＦと多糖類の両者を含む製剤を調製して使用してもよいし、各々別個の製剤を調製しておいて、いずれかの製剤を投与した後、もう一方の製剤を投与してもよいし、別個の製剤を同時に投与しても良い。なお、ＨＧＦを含む製剤を先に投与する場合は引き続きなるべく速やかに多糖類を含む製剤を投与するのが良い。これらの製剤は、ＨＧＦおよび／または多糖類を単独もしくは適当な希釈剤や他の添加剤と共に製剤形態（剤型）に調合され、使用される。剤型としては、一般に非経口的投与に適する剤型が、好ましくは、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤（バイアル）が使用に供される。各種剤型への調製は、この技術分野で慣用される通常の手法を用いて行われる。製剤化に使用される製剤担体としては、各種剤型への調製に慣用される希釈剤や添加剤などが用いられる。例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記ＨＧＦの有効量を例えば蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどの賦形剤、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミンなどの安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノールなどの保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤などを加え、常法に従い凍結乾燥することにより調製される。また、注射用アンプル剤は、前記ＨＧＦの有効量を例えば蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マンニトールなどの溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセリンなどの緩衝剤、ブドウ糖、添加糖などの等張化剤、上記安定化剤、上記保存剤、上記無痛化剤、上記ｐＨ調節剤などの添加剤を加え、これを通常の加熱滅菌、無菌濾過などにより無菌化して調製される。なお、外用剤として使用する場合は、特開平５−２１３７２１号公報、特開平５−２７９２３０号公報に記載されているような剤型で使用することが可能である。
【００１４】
本発明の薬剤は、これを必要とする患者に対して非経口的に、その所定量を単回、もしくは複数回に分けて投与するか、または連続的に投与する。かかる投与量は、患者の年齢、性別、症状、体重等により適宜調整されるが、１日当たり１μg/kg〜10 mg/kg、より好ましくは10〜1000μg/kgの範囲で投与される。
【００１５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＨＧＦの使用に由来する腎毒性を軽減させることが可能である。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なおＨＧＦは、特開平3-285693号公報に記載された方法に従って製造された組換えヒトＨＧＦを使用し、デキストラン硫酸ナトリウムは生化学工業から購入した分子量約６５００のものを使用し、ヘパリンはサノフィ社から購入した分子量約４４００のものを使用した。
【００１７】
実施例１  デキストラン硫酸による腎毒性軽減効果
ＳＤ系雄性ラット（５週齢）およびＳＤ系雌ラット（５週齢）を使用した。動物入荷後９日間の訓化および検疫の後、健康状態が良好であることを確認し、雌雄各４０匹に投与を開始した。
被験物質は以下の通りとした。
【００１８】
0004676581.tif 000003
【００１９】
デキストラン硫酸添加ＨＧＦ調製液
上記各緩衝液中に、０．２ｍｇ／ｍｌ  デキストラン硫酸を含む
対照群用溶媒
１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
【００２０】
上記被験物質を上記ラットに対し、２８日間（１回／日）静脈内反復投与により投与容量５ｍｌ／ｋｇで投与した。
最終投与の翌日麻酔下で屠殺し、腎臓を摘出しホルマリン液で固定した。その後パラフィン包埋病理標本を作製し、４μｍで薄切、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、光学顕微鏡で病理組織学的評価を行った。
【００２１】
結果を下記表１および表２に示す。なお、表中、糸球体上皮の肥大／変性に関しては肥大／変性が１つの糸球体あたり８０％以上認められたものを＋、癒着に関しては糸球体係蹄部とボウマン嚢の癒着が認められたものを＋、半月体形成に関しては半月体形成がボウマン嚢腔に認められたものを＋、糸球体の増殖性病変に関してはメサンギウム細胞の増殖が認められたものを＋で示し、それぞれについて病理変化が認められなかったものは−で示した。
【００２２】
【表１】
0004676581.tif 000004
【００２３】
【表２】
0004676581.tif 000005