(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸配列を検出および／または定量する方法であって、
前記サンプルを、前記標的核酸と結合することのできる少なくとも１つのプローブ配列を含有するオリゴヌクレオチド配列と接触させる段階であって、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの化学発光分子、および前記化学発光分子から化学発光を減衰することのできる少なくとも１つのクエンチャー分子でそれぞれ標識され、化学発光分子およびクエンチャー分子は、プローブ配列が前記標的核酸に結合しているかどうかに応じてそれらの相互作用が変化するように配置され、そのため結合および非結合のいずれか１つの状態において、前記化学発光は実質的に減ぜられ、他方の状態において、化学発光の減衰は小さくなるか、または減衰されない段階、
化学発光分子を化学的に活性化させる段階、および
化学発光放射をモニターし、前記放射を前記標的核酸が存在しないときの対応する放射と比較する段階を含み、ここで、
（ｉ）前記標的核酸が存在しないとき、エミッターおよびクエンチャー部分が互いに充分に近接して保持され、そのため化学発光クエンチングが起こり、
（ｉｉ）前記標的核酸が存在するとき、エミッターおよびクエンチャー部分がプローブ配列の標的への優先結合によって分離し、そのため化学発光クエンチングがほとんど起こらないか、または起こらない、方法であって、
ここで、前記化学発光分子が、構造ベースとしてアクリジンを有する化合物であり、そして、前記クエンチャー分子がメチルレッドの誘導体である、方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが非結合の状態において、クエンチャー分子が、前記化学発光分子からの化学発光放射を実質的にクエンチする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記標的核酸が存在しないとき、末端領域が互いに隣接、または実質的に隣接しているときに前記プローブ配列の反対の末端領域に結合することのできる架橋分子によって、エミッターおよびクエンチャー部分が互いに充分に近接して保持され、そのため化学発光クエンチングが起こり、
（ｉｉ）前記標的核酸が存在するとき、エミッターおよびクエンチャー部分がプローブ配列の標的への優先結合によって分離し、そのため化学発光クエンチングがほとんど起こらないか、または起こらない請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋分子が、プローブ配列の２つの末端に隣接する連続ヌクレオチド群に相補的である第２のオリゴヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）前記標的核酸が存在しないとき、分子内結合が起こるようにプローブ配列の２つの末端に隣接している互いに相補的である隣接オリゴヌクレオチド配列の存在によって、エミッターおよびクエンチャー部分が互いに充分に近接して保持され、そのため化学発光クエンチングが起こり、
（ｉｉ）前記標的核酸が存在するとき、エミッターおよびクエンチャー部分が、プローブ配列の標的への優先結合によって分離し、そのため化学発光クエンチングがほとんど起こらないか、または起こらない請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記標的核酸が存在しないとき、互いに親和力を有し、以下のグループ：プローブ配列、隣接配列、リンカー基、エミッター、クエンチャーを含むオリゴヌクレオチド配列の任意の領域に位置する、または任意の領域を含む化学種対の存在によって、エミッターおよびクエンチャー部分が互いに充分に近接して保持され、そのため化学発光クエンチングが起こり、
（ｉｉ）前記標的核酸が存在するとき、エミッターおよびクエンチャー部分が、プローブ配列の標的への優先結合によって分離し、そのため化学発光クエンチングがほとんど起こらないか、または起こらない請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の標的核酸を検出および／または定量する方法であって、
前記サンプルを、前記標的核酸に同時に結合することのできる異なる配列を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、少なくとも２つの前記オリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも１つの化学発光放出分子、および少なくとも１つのクエンチャー分子で標識され、クエンチャー分子は、２つの前記標識されたオリゴヌクレオチドが実質的に互いに隣接して前記標的核酸に結合しているときに化学発光を減ずることができる段階、
化学発光分子を化学的に活性化させる段階、および
化学発光放射をモニターし、前記放射を前記標的核酸が存在しないときの対応する放射と比較する段階を含む方法であって、
ここで、前記化学発光分子が、構造ベースとしてアクリジンを有する化合物であり、そして、前記クエンチャー分子がメチルレッドの誘導体である、方法。
【請求項８】
サンプル中の標的核酸を検出および／または定量する方法であって、
前記サンプルを、互いに結合することのできる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、少なくとも２つの前記オリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも１つの化学発光放出分子、および少なくとも１つのクエンチャー分子で標識され、クエンチャー分子は、前記標識されたオリゴヌクレオチドが互いに結合しているときに化学発光を減ずることができ、前記標識オリゴヌクレオチドの互いの結合が前記標的核酸の存在によって阻害されるとき化学発光分子からの前記化学発光がほとんど減衰されないか、または減衰されない段階、
化学発光分子を化学的に活性化させる段階、および
化学発光放射をモニターし、前記標的核酸が存在するとき、および存在しないときにそれぞれ得られた前記放射を比較する段階を含む方法であって、
ここで、前記化学発光分子が、構造ベースとしてアクリジンを有する化合物であり、そして、前記クエンチャー分子がメチルレッドの誘導体である、方法。
【請求項９】
異なる配列を有し、異なる化学発光分子、および同一または異なるクエンチャー分子でそれぞれ標識された少なくとも２つの互いに識別可能なオリゴヌクレオチド系を用いて、少なくとも２つの異なる標的核酸を検出および／または定量する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸のそれぞれ１つにハイブリダイズすることのできる異なる配列をそれぞれ有し、異なる化学発光分子でそれぞれ標識された少なくとも２つの互いに識別可能なオリゴヌクレオチド系、および少なくとも１つの前記標的核酸にハイブリダイズすることのできる異なる配列を有し、クエンチャー分子で標識された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも２つの異なる標的核酸を検出および／または定量する請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
異なる化学発光分子でそれぞれ標識された異なる配列を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、および異なる配列を有し、異なるクエンチャー分子で標識された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも２つの異なる標的核酸を検出および／または定量する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化学発光分子がアクリジニウム塩である請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
化学発光分子がアクリダンである請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
化学発光分子が、２００〜７００ｎｍの波長範囲内の光を放出する請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
クエンチャー分子が、２００〜７００ｎｍの波長範囲内の光を吸収する請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸を検出および／または定量するための標識オリゴヌクレオチドであって、前記標的核酸に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを含み、前記オリゴヌクレオチドが化学的な活性化を必要とする化学発光分子およびクエンチャー分子で標識され、前記クエンチャー分子および化学発光分子が相互に作用して、標識オリゴヌクレオチドが前記標的核酸配列に結合しているかどうかに応じて、後続の化学発光放射に変化をもたらすように配置されており、ここで、前記標的核酸に結合していないとき前記クエンチャー分子は前記化学発光のクエンチングをもたらすが、前記標的核酸への結合が前記クエンチングを防ぐ、または減じる標識オリゴヌクレオチドであって、
ここで、前記化学発光分子が、構造ベースとしてアクリジンを有する化合物であり、そして、前記クエンチャー分子がメチルレッドの誘導体である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが１５から４５個の間である請求項１６に記載の標識オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記化学発光分子がアクリジニウム塩である請求項１６から１７のいずれかに記載の標識オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１６から１８のいずれかに記載の標識オリゴヌクレオチド、および前記化学発光反応を誘導する試薬手段を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、化学発光クエンチングを用いて、リガンド結合対の会合および／または分離をモニターすることに関する。本発明は、その両方が分子複合体の一部として組み込まれるとき、エミッターの化学発光がクエンチャーによって減ぜられる化学発光分子（エミッター）およびエネルギー吸収分子（クエンチャー）を提供する。より詳細には、それらの分子は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの標識として用いることができる。
【０００２】
（発明の背景）
リガンド結合反応をモニターするために、様々なタイプの標識またはリポーター分子を使用することは定着している。それらの手法に関する初期の例には、放射性同位元素（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）、および酵素（酵素結合イムノソルベントアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を使用することが含まれる。より最近では、蛍光分子、および化学発光分子の使用を伴うものなど、発光端点測定法が記載されている。これらの方式はすべて、標識をリガンドに組み込む能力、および標識リガンドの結合パートナーとの結合を検出する能力に依存している。一般にこれらの方法は、結合パートナーの有無を確立するために、結合および非結合標識リガンドを物理的に分離することを必要とする。しかしながら、多くの例では、標識リガンドの結合パートナーとの結合は標識自体の化学的または物理的性質の変化をもたらし、そのため結合複合体をあらかじめ分離する必要がない。この例には、酵素標識リガンドの結合による酵素活性の阻害（ＫＥ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ等（１９７２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ＲｅｓＣｏｍｍ、４７、８４６）、蛍光標識リガンドの結合における蛍光偏光特性の変化（ＷＢ  Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ等（１９７３）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０、２１９）、さらに最近では核酸２重鎖形成における化学発光標識の化学反応性の変化（米国特許第５２８３１７４号）が含まれる。
【０００３】
これらの方法は、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、およびレセプター結合アッセイなど多種の結合アッセイの基礎を作り上げてきた。これら後続の技法は、たとえば血液サンプルにおけるウイルスの検出、ホルモンレベルの測定、遺伝子変異の検出、および環境内の不純物の検出を含む多岐にわたる応用例に適用されてきた。
【０００４】
（従来技術の説明）
とりわけ発光標識の光学的特性の変化が利用されてきた。ある種の状況において、結合パートナー自体が、標識リガンドにおいて物理化学的変化を誘発しうることが見出された。そのような変化は、その性質が多様であり、ある種の特定の状況においてのみ観測可能であることが知られており（Ｍ  Ｐａｚｚａｇｌｉ等（１９８２）、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍ  Ｓｅｒｉｏ、Ｍ  Ｐａｚｚａｇｌｉ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９１頁）、したがって広く用いることはできない。これらの問題を克服するために、結合パートナーとの結合において定義された予測可能な仕方で標識リガンドの光学的性質を変えることのできる、光学的特性が定義された化学物質を導入する試みがなされてきた。
【０００５】
ドナーおよびアクセプター分子対を用いる蛍光クエンチングは、広く記載されてきた。この場合、エネルギー伝達による光学的クエンチングが用いられ、適切な光学的クエンチング分子が近接して置かれるとき、ドナーの蛍光は観測されない。この手法のとくに優れた例が記載されており、その例においては蛍光標識（ドナー）およびクエンチング分子（アクセプター）がヌクレオチド（リガンド）配列に存在する（米国特許第５８７６９３０号）。通常の形態においては、蛍光計で測定するとき、蛍光標識からの放射がクエンチング分子によって減ぜられるようなリガンドのコンホメーションとなっている。しかしながら、適した相補的核酸配列（結合パートナー）が存在するとき、標識リガンドのコンホメーションは、ドナーおよびアクセプター対が空間的に分離するように変化する。これによりアクセプターのクエンチング効果が失われ、したがって蛍光放射が観測される。
【０００６】
この手法の中核は、光学的特性が適合性であることがわかっているドナー／アクセプター対を用いることである。たとえば、クエンチングを最大にし、バックグラウンドを最小にするために、ドナーの蛍光スペクトルは、アクセプターの吸収スペクトルと完全に重なることが重要である。さらに、有効な分子内クエンチングは、共鳴エネルギー伝達の発生が可能となるのに充分なほどドナー／アクセプター対が近接している場合（一般に約１０ｎｍ以下）にのみ起こる。したがって重要なことに、蛍光リガンドの結合による任意の変化は、クエンチングがもはや可能ではない程度にドナー／アクセプター対の空間的分離をもたらさなければならない。
【０００７】
蛍光標識を含む方法はある種の状況において有用であることが示されてきたが、蛍光標識の検出の感度に関して限界のあることが認められている。このことに関する主要な２つの理由は、蛍光標識を励起するために必要な入射放射線による高いバックグラウンド、および分析サンプルの非特異的蛍光物質による干渉である。
【０００８】
他の手法において、化学発光標識の光学的特性の変化は、エネルギー伝達を利用して設計されてきた。化学発光は蛍光に比べて高い感度で検出されうるので、理論上、これによって蛍光標識より感度が増すはずである。この場合、化学発光ドナーは、蛍光アクセプターと共に用いられる。この系の例において（Ａ  Ｐａｔｅｌ、ＡＫ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８３）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、１６０４）、抗原は化学発光分子（ルミノール類似体）で標識され、対応する抗体は蛍光分子（フルオレセイン類似体）で標識される。抗体との結合がないとき、ルミノメータで検出される放射は、その化学発光分子の特性である約４６０ｎｍの波長に一致する。抗原と抗体の免疫複合体の形成によって、ドナー／アクセプター対は共鳴エネルギーの伝達が起こるのに充分なほど近接し、蛍光アクセプターの特性である約５２５ｎｍで放射が見られる。
【０００９】
この手法は、２つの波長を同時にモニターすることのできる高感度のルミノメータを必要とし、複雑な計器装備を用いることが必要となる。さらに、アクセプターの放射特性に注意を払わなければならないので、ドナー／アクセプター対の選択がより重大である。この方法に伴う様々な困難は、その有用性を厳しく制限し、その結果として、この技法は、検出の感度が劣ることによって適用が厳しく制限される蛍光クエンチング法と同様に、使用可能な系の発展に通じることはなかった。
【００１０】
蛍光クエンチングを用いて得られるよりも高い感度を示すことのできる光学的結合の簡単な手段が求められていることは明らかである。化学発光放射の測定は、蛍光放射の測定よりも高感度の検出をもたらすが、エネルギー伝達と共に使用した場合に著しい有用性を示していない。
【００１１】
競合タンパク結合法における化学発光クエンチングの使用が記載されているが（米国特許第４２７７４３７号）、この参照文献は、核酸配列を検出または定量するためにその方法をどのように用いうるかに関していかなる提案も行なっていない。さらに、上述の文献は多くの高分子化学種に言及しているが、有効なクエンチングは距離が１０ｎｍ未満の場合にのみ起こることを認めている。大きな高分子構造はこの寸法を超えるので、要求されるクエンチングの距離を確実に得るために、標識のためのエミッターとクエンチャーの相対位置を特定することが必要となる。米国特許第５９２５５１７号は、蛍光ドナー／クエンチング対の使用を記載しており、化学発光ドナーの使用について簡潔に示唆しているが、化学発光ドナーの使用にあたってその教示を実際にどのように適用するのかは示していない。定義上、一定の化学的条件下で蛍光クエンチングを利用することが可能であるが、この文献は化学発光が化学条件の変化を要する化学反応を伴うという問題に取り組む試みをしていない。したがって、たとえば、上述の文献の蛍光系に用いるために記載されているクエンチャー分子ＤＡＢＣＹＬは、所与の化学発光分子に明らかに適合した吸収スペクトルを有しているが、そのような化学発光系においてクエンチャーとして機能しないであろう。
【００１２】
さらに、再現性の光放射をもたらすために、化学発光反応を誘導する条件を慎重にコントロールする必要のあることが一般に認識されているが、米国特許第５９２５５１７号は、どのようにしてこれを達成し、かつクエンチングの発生を可能にするかということに関して教示していない。
【００１３】
蛍光標識とは異なる化学発光標識の使用において特別に考慮されなければならない多数の事柄を考えると、当分野の技術者は、実際の実験を行なうことなしに、蛍光標識に関する実施可能な説明を化学発光標識に類推することはできないであろう。核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、実行可能な化学発光クエンチング系を開発するために当分野の技術者が利用するであろう科学文献にも実施可能な説明がないという事実をかんがみれば、このことは特に真実である。
【００１４】
（発明の概要）
したがって本出願人等は、化学発光エミッター、および関連するクエンチャーを使用することによる相補的核酸結合反応をモニターする方法を開発し、それらの方法に用いるいくつかの特に有効な化合物を本明細書に開示する。本出願人等はさらに、その新規な化合物と共に用いるのに特に適したさらなるアッセイ技法を開発した。
【００１５】
本発明のコンテクストにおいて、核酸結合、または核酸ハイブリダイゼーション反応は、全核酸ヌクレオチド配列内の離散したヌクレオチド配列の結合を含むものとする。このような配列、またはより大きな核酸配列の一部を必ずしも形成していないヌクレオチド配列も、本明細書ではオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド配列と呼ぶ。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、検出、定量、または他の方法で検定される分析物、またはその成分を構成することができ、標的配列、あるいは標的核酸と呼ばれる。所与の標的配列と結合し、たとえば２重鎖を生じることのできるオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプローブ配列と呼ばれる。そのようなプローブ配列は、離散したオリゴヌクレオチド配列として存在することができ、あるいは標的配列と結合しない配列をさらに有するより大きなオリゴヌクレオチド配列の一部として存在することができる。オリゴヌクレオチド配列は、たとえば検出および／または固相結合を促進するために他の化学部分を付加するための共有または非共有結合手段によって変更できることも当分野において充分に確立されている。この用語はさらにペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことを意図する。
【００１６】
本発明の一態様によれば、サンプル中の標的核酸配列を検出および／または定量する方法が提供され、
【００１７】
前記サンプルを、前記標的核酸と結合することのできる少なくとも１つのプローブ配列を含有するオリゴヌクレオチド配列と接触させる段階であって、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの化学発光分子、および前記化学発光分子から化学発光を減衰することのできる少なくとも１つのクエンチャー分子でそれぞれ標識され、化学発光分子およびクエンチャー分子は、プローブ配列が前記標的核酸に結合しているかどうかに応じてそれらの相互作用が変化するように配置され、そのため結合および非結合のいずれか１つの状態において、前記化学発光は実質的に減ぜられ、他方の状態において、化学発光の前記クエンチャー分子による減衰は小さくなるか、または減衰されない段階、
化学発光分子が化学発光反応を起こすように条件を変える段階、および
化学発光放射をモニターし、前記標的核酸が存在しないときの対応する放射を前記放射と比較する段階が含まれる。
【００１８】
さらなる態様および好ましい特徴は、添付の請求の範囲に記載する。
【００１９】
本発明は、相補的核酸結合反応をモニターする手段として、化学発光（エミッター）標識、およびエネルギーアクセプター（クエンチャー）標識を使用することを含む。このエミッター／クエンチャー対は、エミッターがクエンチャーに近接しているとき、化学発光放射が減衰するように選択される。典型的に、エミッターとクエンチャーとの距離が約１０ｎｍ以下のときに有効なクエンチングが起こる。本発明の好ましい実施形態によれば、エミッターおよびクエンチャー標識は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ配列を含有するオリゴヌクレオチド配列に結合することができ、そのため相補的核酸の結合の有無がエミッターおよびクエンチャーの空間的分離に変化をもたらす。これは化学発光放射の強度の変化として明らかである。所与の化学発光反応をもたらすために必要とされる化学的条件、およびこれに基づいて最適化されたクエンチャー標識を考慮することが重要である。
【００２０】
好ましくは、エミッターおよびクエンチャー分子は、オリゴヌクレオチドに共有的に結合される。本発明のエミッターおよびクエンチャーなどの、小さい分子をオリゴヌクレオチドに連結する適切な手段も当技術分野で充分に確立されており、そのためその方法は科学文献に広く公表されている。
【００２１】
記載された例は化学発光系を提供し、その化学的条件は核酸２重鎖の結合性を維持するのに適合しており、さらにエミッターとクエンチャーとの分子間距離は、化学発光反応の瞬間にクエンチングプロセスが起こるのに適した距離である。
【００２２】
化学発光反応を起こすことのできる条件、および核酸２重鎖が安定である条件はそれぞれ文献から知られている。さらに、約１０ｎｍ以下の距離で有効なエネルギー伝達が起こることが知られている。この化学発光反応および核酸２重鎖の化学的／物理的相互適合性を考慮して、本出願人等は次いで、化学発光放射のクエンチングに適合した吸収特性を有するクエンチャー分子を同定する。通常は、染料分子の化学的および物理的性質は「標準」条件を基準としているが、化学発光反応の誘導を可能にし、再現性のある光放射を生じるために必要とされる条件は決して標準ではなく、そのため「染料分子」に関する標準データはほとんど実用性がない。したがって、本出願人等は、本明細書の教示を用いて、他の適切なクエンチャー分子を求める基礎を提供するために、化学発光反応に必要とされる化学的／物理的条件下での推定されるクエンチャー分子の特性を研究した。
【００２３】
本発明の一態様において、エミッターおよびクエンチャー分子の両方が配列に導入されるとき、エミッターおよびクエンチャー分子が近接することが可能なコンホメーションとなるように、少なくとも１つのプローブ配列を含有する１本鎖オリゴヌクレオチド配列が構成される。そのような状況のもとで、適切な仕方で誘導されるとき、化学発光放射は減ぜられる。しかしながら、標識オリゴヌクレオチド配列が相補的な標的配列にハイブリダイズされているとき、誘発されたコンホメーションの変化は、エミッター／クエンチャー対の空間的な分離を引き起こし、それにより減衰はほとんどなく、またはまったくなく、エミッターからの化学発光が観測できる。化学発光の観測は、このように標的配列との結合を暗示するものである。
【００２４】
他の態様において、それぞれ非相補的な２つの異なる１本鎖オリゴヌクレオチド配列は、エミッターおよびクエンチャーでそれぞれ標識される。そのような状況のもとで、適切な仕方で誘導されるとき、化学発光が観測される。２つの標識オリゴヌクレオチド配列は、両方の標識配列が同時にハイブリダイズされることが可能な標的配列にハイブリダイズされ、それにより両方の標識配列は、クエンチングの発生が可能となるような隣接した、または実質的に隣接した仕方で結合する。この状態において化学発光は減ぜられ、標識配列が同時に結合したことを示している。
【００２５】
他の態様において、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列はそれぞれエミッター、およびクエンチャーで標識される。この配列が反応して２重鎖を形成するとき、誘導された化学発光のクエンチングが起こる。それぞれの配列のいずれかに相補的な核酸配列（検出する分析サンプル中の標的配列など）が存在することによって、化学発光放射の増加として明らかなクエンチングの損失がもたらされる。
【００２６】
他の態様において、それぞれ前記化学発光エミッターおよびクエンチャーで標識された配列は、標的核酸配列と結合することのできるペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる。そのようなＰＮＡの調製、および特性は、文献（Ｕ  Ｓｏｏｍｅｔｓ等、１９９９）に記載されており、当分野の技術者は、本明細書に教示のコンテクストにおいてそのような分子を用いる手段を理解するであろう。
【００２７】
さらなる態様は、エミッターのクエンチャーへの近接が化学発光を減衰し、空間的な分離により化学発光が観測できるという知識を与えられた技術者には明らかであろう。共鳴エネルギーの伝達、すなわち化学発光クエンチングが起こる分子間距離は充分に確立されており、技術者は本明細書の教示に基づいて、結合および非結合状態間の変化に対応する光の強度の違いを最大にできるエミッターおよびクエンチャー標識オリゴヌクレオチド配列を設計することができるであろう。
【００２８】
核酸標的の検出および定量に加えて、本明細書の教示は、実質的に同一であってもよいが、ヌクレオチド１つのみ互いに異なっていてもよい標的配列を識別するために用いることもできる。
【００２９】
ルミノール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、およびジオキセタンなど、多くのよく知られた化学発光系があるが、本発明は存在する他の任意の適切な化学発光分子にも及ぶ。
【００３０】
本発明のクエンチャー分子は、エミッターからのエネルギーを吸収し、次いで好ましくはこのエネルギーを、非放射性プロセスを経て、あるいは測定器によって検出されない長波長の蛍光またはリン光を経て放散する分子であり、「クエンチング」、「減衰」等の用語はそれ相当に解釈されるべきである。
【００３１】
さらなる態様において、標的の存在に関して調査される液体と固相担体との界面で光学測定を行なうことが有利である可能性がある。この固相担体は、たとえば、化学発光の定量に先立ってリガンド結合複合体が妨害物質から都合よく除去されることを可能にするなど、いくつかの目的を果たすために用いることができる。リガンド結合技法において固相担体を一般的に用いることはよく知られている。通例用いられる固体マトリクスには、化学的または物理的に処理されたマクロ表面、たとえば反応器の壁（たとえばマイクロタイタプレートウェル、または試験管）など、他の高分子担体または微粒子、たとえば誘導化セルロース、デキストラン、ポリスチレン（および他の高分子材料）、細孔性ガラス、および常磁性粒子などが含まれる。多様な小さい分子および大きい分子の両方を、そのような固相担体に共有または非共有的に付加する手段も、同様に充分に確立されている。さらなる例として、この固相担体は、光シグナルを変換する手段を提供することができる。たとえば、固相担体を、半導体または高分子材料をベースとする光検出装置に組み込む、またはその装置を構成することができる。
【００３２】
化学発光分子、およびクエンチャー分子などの小さい分子を互いに、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、他の生物学的に関連する分子、および固相マトリクスなどの大きな分子に化学的に結合する適切な方法は、当分野の技術者によく知られているであろう。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、相補的核酸配列の結合を検出および／または定量する手段として、化学発光エミッターおよびクエンチャー分子を組み合わせて用いることに関する。発光分子からの光放射は、光放射に対応するエネルギーを吸収することのできる分子の存在によって減衰、または「クエンチ」されうる。そのようなクエンチングは、分子の間（分子間）、または分子の内部（分子内）で起こることができる。
【００３４】
特定の状況において、クエンチングは放射種から、放射することのできないアクセプター種（クエンチャー）への共鳴エネルギー伝達によって起こりうる。このタイプの有効なクエンチングは、ある種の規準が満たされた場合にのみ起こる。第１に、エミッターとクエンチャーは互いに近接していなければならず（典型的に１０ｎｍ以下）、第２に、ドナーの放射スペクトルとクエンチャーの吸収スペクトルは一致していなければならず、第３に、クエンチャーは高い吸光係数を有していなければならない。
【００３５】
抗原／抗体、相補的核酸配列、レセプター／ホルモン、酵素／基質結合によって例示されるようなリガンド結合反応はすべて、分子複合体が形成されるという共通の特徴を有する。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、確立された技法を用いてオリゴヌクレオチド配列が合成され、これは検出される標的核酸の配列に相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。さらに、この配列は、化学発光エミッターおよびクエンチャーが共有的にリンカーに結合できるように、オリゴヌクレオチド配列の両端に「リンカーアーム」を提供するように構成される。プローブが相補的な標的に結合していないときには、エミッターとクエンチャーとの分子間距離がクエンチングを可能にするように充分に短く、プローブが相補的な標的に結合しているときには、クエンチングを回避するのに充分なほど長いならば、このリンカーはオリゴヌクレオチド配列の結合内に位置することもできる。
【００３７】
前述のアセンブリにおいて、化学発光エミッターおよびクエンチャーは、標的配列が存在しないとき、化学発光エミッターとクエンチャーとの親和力によってそれらが互いに近接して存在するように選択される。したがってこのアセンブリにおいて、クエンチャー分子がエミッターに近接していることにより、化学発光はクエンチされることになる。検出される標的配列が存在するとき、プローブ配列と検出される標的配列との分子間結合のために化学発光エミッターとクエンチャーとの相互作用は壊される。このコンホメーションの変化により、エミッターとクエンチャーは空間的に分離され、クエンチング効果の損失が生じ、したがって化学発光放射が増大する。いくつかの相互作用、またはそれらの組み合わせから生じる親和力を予想することができる。好ましい態様において、電子不足エミッターと電子豊富ドナーとの間の静電引力が用いられる。エミッターとクエンチャーとの間の親和力は、オリゴヌクレオチドプローブ配列の前記標的配列への結合親和力よりも弱くなければならないことが認識されている。エミッター／クエンチャー対の相対親和力は、標識自体、またはリンカーの構造改変によって最適化することができる。さらに、オリゴヌクレオチド配列の以下の領域、プローブ配列、プローブ配列に隣接する配列（すなわち、側面配列）、リンカー、エミッター、クエンチャーに他の化学種を導入することによって親和力を加えることができる。
【００３８】
他の態様において、検出される標的配列が存在しないとき、エミッターおよびクエンチャーは、末端が互いに隣接、または実質的に隣接しているときにプローブ配列の２つの末端に位置する連続ヌクレオチド群に相補的である第２のオリゴヌクレオチド配列、または「ステープル」によって近接して保持される。好ましくは、第２のオリゴヌクレオチドは、４から１６個の範囲のヌクレオチドからなる。第２のオリゴヌクレオチド、または「ステープル」によるヌクレオチド結合は、必要とされる２重鎖安定性、または融解温度（Ｔｍ）が得られ、エミッターとクエンチャーとの間に必要とされる分子間距離が得られるならば、連続相補鎖である必要はない。第２のオリゴヌクレオチド配列は、プローブ配列自体の要素、または合成中に導入された標的に相補的でない側面領域に相補的であることができる。そのような側面配列は、好ましくは２から８個のヌクレオチドを有する。別法として、標的が存在しないとき第１のオリゴヌクレオチド配列の末端を架橋するために第２のオリゴヌクレオチド分子を用いる代わりに、標的が存在しないときには第１のオリゴヌクレオチドを安定して結合し、エミッターとクエンチャーを近接して保つが、標的が存在するときにはオリゴヌクレオチドが好ましくは標的に結合することを可能にする他の形態の架橋分子を用いることによってこの機能を達成することができる。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、確立された技法を用いてオリゴヌクレオチド配列が合成され、これには検出される標的核酸の配列に相補的なヌクレオチドのプローブ配列、ならびに分子内の相補的結合を可能にする側面配列が含まれる。さらに、この配列は、化学発光エミッターおよびクエンチャー分子が共有的にリンカーに結合できるように、側面配列の両端、または内部に「リンカーアーム」を提供するように構成される。したがってこのアセンブリにおいて、側面領域の分子内相補的結合の結果としてクエンチャー分子がエミッターに近接していることにより、化学発光はクエンチされることになる。検出される標的配列が存在するとき、プローブ配列と検出される標的配列との分子間結合のために、側面配列の分子内相補的結合は壊される。このコンホメーション変化の結果、エミッターとクエンチャーは空間的に分離され、クエンチング効果の損失が生じ、したがって化学発光放射が増大する。標的核酸が存在しないときにクエンチングプロセスが起こり、標的核酸が存在するときに起こらないならば、エミッター／クエンチャー対は、側面配列上に存在させるのとは異なり、プローブ配列自体に組み込むこともできる。
【００４０】
本発明の種々の可能な態様において、複数の標識およびクエンチャーを用いることが有利である可能性がある。一態様において、同一のオリゴヌクレオチド配列に存在する同一の複数のエミッター分子を用いることで、より大きな光放射がもたらされるのに対して、複数のクエンチャー分子を用いることによって、より広範なクエンチングがもたらされることが予見できる。第２の態様において、複数の異なるエミッターおよびクエンチャーを用いることで、複合的な分析の実行が可能になることが予想されうる。複合的な分析を行なうために複数の標識を用いる手段は、通常のリガンド結合アッセイとして充分に確立されている。
【００４１】
２つの分析物をモニターするための一構成において、互いに識別可能な２つの異なるオリゴヌクレオチド系を用いる。一例では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは一方の端に化学発光標識、他方の端にクエンチャーを有し、第２のオリゴヌクレオチドプローブは一方の端に識別可能な化学発光標識、他方の端に同一または異なるクエンチャーを有する。
【００４２】
別法として、第１のオリゴヌクレオチド系は、第１の標的核酸にハイブリダイズする第１の配列を有し、第１の化学発光標識で標識された第１のオリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチド系は、第２の標的核酸にハイブリダイズする第２の配列を有し、第２の化学発光標識で標識された第２のオリゴヌクレオチドを含む。第１および第２のオリゴヌクレオチド系はさらにそれぞれ、各系に対して同一であっても、異なっていてもよいさらなるオリゴヌクレオチドを含み、これは第１および第２のヌクレオチドプローブに近いそれぞれの標的核酸にハイブリダイズし、この１つまたは複数のさらなるヌクレオチドは同一または異なるクエンチング分子を有し、そのため前記のさらなるヌクレオチドが前記標的核酸配列の１つに結合することによってクエンチングが起こる。
【００４３】
本発明のすべての態様において、試験されるサンプル中の標的核酸の存在に起因する化学発光強度は、標的が存在しない状況で得られる、または推定される対応するシグナルと比較される。放射強度は、これに限定するものではないが、好ましくはルミノメータを用いて検出および／または定量される。化学発光放射を検出および／または定量する方法は、当分野の技術者によく知られている。
【００４４】
所望の配列のオリゴヌクレオチドを合成する方法は充分に確立されており、エミッターおよびクエンチャーの付加のために、配列の３’または５’末端、あるいは配列の本体内にリンカーを導入する方法も充分に確立されている。プローブ配列は、検出される標的配列に最適な相補的結合特性をもたらすように選択され、適切な配列の選択は当技術分野で充分に確立されている。好ましくは、プローブ配列は１５から４５の間のヌクレオチドからなる。エミッターおよびクエンチャー分子を付加するためのリンカーは市販されており、広く用いられている。多様なそのようなリンカーが入手可能であり、本発明に用いることができる。好ましくは、リンカーは原子４から２０個の長さであり、好ましくはアミンまたはチオール官能基、あるいはそれらの誘導体を有する。そのようなリンカー基を含有するオリゴヌクレオチドの合成に関わる方法は、所望のアセンブリを製造業者に注文し購入できる程度に確立されている。好ましい態様において、アセンブリは合成され、３’−Ｃ７第一アミン末端リンカー、および５’−メトキシトリチル保護チオールリンカーを有する。このアセンブリのヘテロ二官能性によって、エミッター／クエンチャー対の連続結合が可能になる。好ましい態様において、アセンブリは、Ｎ−スクシンイミジルエステル部分を含有する化学発光エミッターでまず標識して、アミンリンカーに付加させる。この生成物を精製し、続いてチオールリンカーを脱保護し、結果として生じる変性アセンブリをクエンチャー分子のヨードアセトアミド誘導体と反応させる。エミッター／クエンチャー標識アセンブリを、最後に使用に先立って精製する。
【００４５】
化学発光を示す分子の数多くの例、および光を吸収する分子の数多くの例が文献に開示されている。
【００４６】
このように好ましい方法において、エミッターの化学発光放射スペクトルは、確立された分光測定法を用いて求められる。次いでエミッターの化学発光をもたらすために必要とされるのと同じ化学的条件のもとで所望の吸収特性を有するクエンチャー分子を選択する。考慮すべき重要な点は、時間の経過につれてクエンチャーの吸収特性に変化が認められることである。したがって、クエンチャーを適切な化学環境に曝露した直後に吸収特性が望ましいように見えても、化学発光反応からの放射を測定するのに必要とされる時間にわたって所望でない特性に変化する可能性がある。あるいは、一般的な溶媒中で求められ、そのように公表されている、好ましい特性を持たない可能性のある推定されるクエンチャー分子が、エミッターからの化学発光を誘導するのに必要とされる化学環境では所望の特性を有する可能性がある。前述のとおり、化学発光放射の測定に必要とされる時間尺度のなかで、これらの好ましい特性が獲得されることを見極めることが重要である。
【００４７】
多くの化学発光分子が本発明において有用となることが予想されるが、化学発光エミッターは、好ましくはアクリジン、またはフェナントリジンをベースとする分子である。より好ましくは、エミッターはアクリジニウム塩、またはアクリダンをベースとする。
【００４８】
同様に、選択されたエミッターの化学発光を促進するのに必要とされる化学条件下でのそれらの吸収スペクトルが知られている、または求めることができるという条件で、多くの染料が本発明においてクエンチャーとして有用となる可能性がある。好ましくは、クエンチャー分子は、所望の吸収波長範囲にわたって高いモル吸光係数を有するアゾ染料である。放射および吸収の波長範囲は、好ましくは２００〜７００ｎｍである。本明細書で言及したエミッターまたはクエンチャーの例など小さな分子を、オリゴヌクレオチドなどの大きな分子、またはヌクレオチドなどの他の小さな分子に化学的に結合させる手段も充分に確立されている。
【００４９】
化学発光反応の開始時および開始直後における推定されるクエンチャー分子の吸収特性を慎重に考慮して、本出願人等は、核酸の新規な化学発光アッセイを設計した。
【００５０】
本発明を上に説明したが、本発明は本明細書に示した特徴の任意の発明性のある組み合わせに及ぶ。
【００５１】
以下の実施例は、本発明の典型的な実施形態を例示するためのもので、本発明の教示の範囲を限定するものではない。
【００５２】
添付の図面を参照とする。
【００５３】
（実施例）
１．オリゴヌクレオチド源
以下のオリゴヌクレオチドは、市販品製造業者によって、確立された方法を用いて合成された。配列は以下のとおりであった。
CCGGTCCAGGTGGAGCAATGATCTTGATCTTCATGACCGG（配列番号１）
このオリゴヌクレオチドは、両端にリンカーを有し、１つのリンカーの端に遊離アミノ基、他方の端にトリチル保護チオール基を有した。
【００５４】
２．ジブロモアクリジニウムエステル（ＡＥ−ＮＨＳ）の合成
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（１．０１１ｇ、６．０２０ｍｍｏｌ）の攪拌した氷酢酸（５０ｍｌ）溶液に、室温でＢｒ２（０．６２０ｍｌ、１．９０１ｇ、１２．０３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を暗所で７０時間攪拌し、その後、減圧下で溶液を蒸発して残渣２．４０１ｇを得た。この残渣をジエチルエーテル（７０ｍｌ）に溶解し、溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄（４０ｍｌ×３）、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発して白色粉末（１．９０２ｇ）を得た。この生成物をベンゼン／ヘキサンから再結晶し、白色針状晶の所望の生成物（１．７６０ｇ、９０％）、ｍｐ１０８〜９℃を得た。ＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ３２４［Ｍ＋、１００％］、２７８［９］、２６５［９８］、２４４［１５］、１９８［１２］、１８５［４０］。
【００５５】
ベンジル３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロパノエート
無水ベンジルアルコール（３．２０ｍｌ、３．３４４ｇ、０．３０９ｍｏｌ）、３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（１．００１ｇ、３．０９０ｍｍｏｌ）、および無水トリフルオロ酢酸（２．５０ｍｌ、３．７０３ｇ、１７．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、８５℃で３時間加熱、次いで冷却し、炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ、８％水溶液）に注加した。この混合物をクロロホルムで残らず抽出（７０ｍｌ×３）、溶媒を蒸発してシロップ（２．００２ｇ）を得た。残渣を、クロマトトロンを用いてクロマトグラフィにかけ［酢酸エチル：ヘキサン（順次１：８、１：４、１：２）］、適切な混成分画から溶媒を蒸発した後、純粋無色油として所望の生成物を得た（１．０２２ｇ、８０％）。ＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ４３２［（Ｍ＋ＮＨ４）＋、９５％］、９１［１００］。
【００５６】
アクリジン−９−カルボニルクロリド
アクリジン−９−カルボン酸（１．７３０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を塩化チオニル（２５ｍｌ）に溶解し、その溶液を６時間還流した。溶液を減圧下で濃縮、ヘキサンをゆっくり添加して、生成物を沈殿させた。この混合物を濾過し、黄色固体（１．７２１ｇ、９４％）、ｍｐ２１８〜９℃を得た。
【００５７】
２，６−ジブロモ−４−（２−ベンジルオキシカルボニルエチル）フェニルアクリジン−９−カルボキシレート
アクリジン−９−カルボニルクロリド（１７０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解した。ベンジル３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロパノエート（２５０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加、この混合物を室温で１８時間攪拌し、次いで氷水（１００ｍｌ）に注加した。この混合物をＣＨＣｌ３で残らず抽出し（５０ｍｌ×４）、混成抽出物をＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄（５０ｍｌ×２）、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発して黄色油（３４０ｍｇ）を得た。残渣を、クロマトトロンを用いてクロマトグラフィにかけ（ヘキサン：酢酸エチル  ４：１）、生成物を含有する混成分画から溶媒を蒸発して、淡黄色結晶固体（２３１ｍｇ、７５％）、ｍｐ１１４〜５℃として所望の生成物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ６１９［Ｍ＋、４５％］、２０６［１００］、１７９［９４］。
【００５８】
２，６−ジブロモ−４−（２−カルボキシエチル）フェニルアクリジン−９−カルボキシレート
２，６−ジブロモ−４−（２−ベンジルオキシカルボニルエチル）−フェニルアクリジン−９−カルボキシレート（１９１ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）、氷酢酸（２０ｍｌ）、および４８％臭化水素酸（５ｍｌ）の混合物を１００℃で３時間加熱、その後、冷却した。この混合物を水（１００ｍｌ）に添加し、クロロホルム中２０％メタノール（１００ｍｌ×４）で抽出した。この有機抽出物を合わせ、蒸発し、残渣をクロロホルム（５０ｍｌ）に懸濁、わずかに過剰のトリエチルアミンで中和した。この混合物を水で洗浄（７０ｍｌ×３）、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。残渣をＣＨＣｌ３から再結晶し、所望の生成物（１１５ｍｇ、７４％）、ｍｐ２４０〜２℃を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ５２９［Ｍ＋、７５％］、５１１［１０］、４８６［１０］、２０７［１００］。
【００５９】
２，６−ジブロモ−４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル  アクリジン−９−カルボキシレート
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、および２，６−ジブロモ−４−（２−カルボキシエチル）フェニル  アクリジン−９−カルボキシレート（５０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、−２０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を−２０℃で２時間攪拌した。この溶液を室温で一晩攪拌、次いで蒸留乾固した。残渣をジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出、濾過液を蒸発して、粗生成物（１００ｍｇ）を得た。クロマトトロンを用い、クロロホルムで溶離してさらなる精製を行なった。適切な混成分画から溶媒を蒸発し、薄茶色の固体（４０ｍｇ、６４％）、ｍｐ１７５〜６℃として所望の生成物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ６２７［（Ｍ＋１）＋、２０％］、２２５［１００］、２０６［１８］、１７９［１０］、１４３［８］。
【００６０】
２，６−ジブロモ−４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル  １０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート  トリフルオロメタンスルホネート
２，６−ジブロモ−４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル  アクリジン−９−カルボキシレート（１００ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液に、アルゴン下でメチルトリフルオロメタンスルホネート（０．１３ｍｌ、０．１８３ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を添加した。生じた溶液を一晩攪拌、沈殿物を濾別し、無水ベンゼンで洗浄して黄色粉末を得た。ＣＨＣｌ３を用いて充分に洗浄し、黄色固体（１１３ｍｇ、９０％）、ｍｐ３２０℃として所望の生成物を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ６４１［（Ｍ−ＳＯ３ＣＦ３）＋、１２％］、６２７［８５］、２２５［３４］、２０７［６］、１９５［１００］、１７９［３２］。
【００６１】
２−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）−Ｎ−［２−（２−ヨードアセチルアミノ）エチル］ベンズアミド（ＩＡ−メチルレッド）  スクシンイミジル２−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］ベンゾエートの合成
ＴＨＦ（３０ｍｌ）中のメチルレッド（１．２５１ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）を０℃に冷却、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１０３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を添加、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５６８ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で２時間攪拌し、温度を室温に上げ、混合物を一晩攪拌した。形成した白色固体を濾過により除去し、濾過液を蒸発乾固して赤色固体を得た。この固体をアセトン−ジエチルエーテルから再結晶し、その後、減圧下で乾燥して、赤色固体（０．８４９ｇ、５０％）、ｍｐ１２４〜１２６℃を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ３６１［（Ｍ＋Ｈ）＋、２３％］、２５２［１７］、１３２［１００］。
【００６２】
Ｎ−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］ベンズアミド
ジオキサン（２ｍｌ）中の上記で得られた活性エステル（７４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）に、メタノール（１ｍｌ）中のｔ−ブチルＮ−（２−アミノエチル）カルバメート（９９ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を暗所、室温で４時間振とうした。ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル１：１）は、すべての出発原料（Ｒｆ０．８５、青紫色）が新成分（Ｒｆ０．６０、オレンジ色）に変換されたことを示した。シリカゲルカラムでトルエン：酢酸エチル１：１で溶出し、精製を行なった。オレンジ色の固体（７５ｍｇ、９１％）、ｍｐ１３１〜１３４℃を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ４３４［（Ｍ＋Ｎａ）＋、６％］、４１２［（Ｍ＋Ｈ）＋、５０］、２５２［８２］、１３２［１００］。
【００６３】
Ｎ−（２−アミノエチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］ベンズアミド
ジオキサン（２ｍｌ）中の上記で得られた保護アミン（７０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に、濃塩酸（０．６ｍｌ）を添加した。オレンジ色の溶液が青紫色に変わった。この混合物を室温で１５分間攪拌し、その後、蒸発乾固した。残渣をジオキサン（２×３ｍｌ）およびジエチルエーテル（３ｍｌ）で洗浄し、メタノール（４ｍｌ）に溶解した。ＮａＨＣＯ３（飽和、２ｍｌ）を添加、混合物はオレンジ色に戻った。ジクロロメタン（２０ｍｌ）、次いで水（２０ｍｌ）を添加した。有機層を集め、ＭｇＳＯ４で乾燥、蒸発して、赤色固体（４２ｍｇ、７９％）、ｍｐ１１９〜１２４℃を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ３１２［（Ｍ＋Ｈ）＋、１３％］、２５２［３１］、１３２［１００］。
【００６４】
２−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）−Ｎ−［２−（２−ヨードアセチルアミノ）エチル］ベンズアミド
ジクロロメタン（ＤＣＭ、５ｍｌ）中の上記で得られたアミン（６０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（２０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃に冷却、ヨードアセチルクロリド（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。５分後（０℃）に、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＬ：ＭｅＯＨ  ４：１）は、ほとんどの出発原料（Ｒｆ０．４）が新成分（Ｒｆ０．６）に変換されたことを示した。さらに５分間０℃での攪拌を維持し、生じた混合物を蒸発乾固した。残渣をＤＣＭ（３ｍｌ）に再溶解し、シリカゲルカラムに載せ、ＣＨ３ＣＬ：ＭｅＯＨ７：１で溶離した。適切な分画から溶媒を蒸発することによって純粋な所望の生成物（２５ｍｇ、２７％）、ｍｐ１４０〜１４２℃を得た。ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ４８０［（Ｍ＋Ｈ）＋、７５％］、２５２［５２］、１０７［１００］。
【００６５】
３．化学発光／クエンチャー標識オリゴヌクレオチドプローブ（ハイブリダイゼーション誘導化学発光シグナル、プローブ）ＨＩＣＳの調製
（ｉ）ＡＥ−ＮＨＳのカップリング
リンカー末端の遊離アミノ基によって、ＡＥ−ＮＨＳをオリゴヌクレオチドに結合した。標識されるオリゴヌクレオチドをマイクロ遠心分離管で蒸発乾固した。乾燥後、緩衝溶液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（０．１２５Ｍ、ｐＨ８．０）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合物、１：１、ｖ／ｖ）（８μｌ）を添加し、次にＤＭＳＯ中のＡＥ−ＮＨＳ（２μｌ、２５ｍＭ）を添加した。内容物を穏やかに混合し、その後、３７℃で２０分間インキュベートした。追加のＤＭＳＯ中ＡＥ−ＮＨＳ（３μｌ、２５ｍＭ）を添加、内容物を混合し、３７℃でさらに２０分間インキュベートした。標識反応を、同じ緩衝溶液（５μｌ、０．１２５Ｍ）に溶解したリシンを添加することによって停止した。内容物を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。酢酸ナトリウム（３０μｌ、３Ｍ、ｐＨ５．０）、水（２４５μｌ）、およびグリコーゲン（５μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ）を管に添加し、内容物を穏やかに混合した。冷却した（−２０℃）無水エタノール（６４０μｌ）を添加し、内容物を渦動によって混合した。管をドライアイス上で１０分間インキュベートし、その後、冷蔵（４℃）遠心分離機で、１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを慎重に吸引し、リチウムラウリルサルフェート（０．１％、ｗ／ｖ）を含有する酢酸ナトリウム緩衝液（２０μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ５．０）にペレットを再懸濁した。
【００６６】
（ｉｉ）標識オリゴヌクレオチドの精製
標識オリゴヌクレオチドを、緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ２５〜７０％の直線状溶出グラジエントを用い、Ｃ−４逆相カラムでＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａは、水性酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）、Ｂは７５％アセトニトリル中の酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）である。流量は１ｍｌ／分、０．５ｍｌの分画を２５分間集めた。２６０ｎｍで吸収をモニターした。採集後すぐにリチウムラウリルサルフェート水溶液（１０μｌ、１０％、ｗ／ｖ）を各分画に添加、渦動後、内容物をマイクロ遠心分離管に移した。各分画の化学発光を以下のように測定した。各分画のアリコート（０．５μｌ）を、リチウムラウリルサルフェート水溶液（１００μｌ、０．１％）を含有する個別のポリスチレン管１２×７５ｍｍにピペットで移し、次に渦動した。ルミノメータを用いて化学発光を測定した。これには、過酸化水素溶液（２００μｌ、１．０％、ｖ／ｖ、塩酸２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝溶液（０．２Ｍ、ｐＨ９．０）中）の自動注入、それに次いで１０秒間シグナルを測定することが含まれた。分画番号に対する相対発光量（ｒｌｕ）として、化学発光をプロットした。
【００６７】
（ｉｉｉ）ＡＥ−ＮＨＳ標識オリゴヌクレオチドの回収
ＡＥ−ＮＨＳ標識オリゴヌクレオチドを沈殿させ、以下のように回収した。所望の各分画に、酢酸ナトリウム緩衝液（３０μｌ、３Ｍ、ｐＨ５．０）、水（２４５μｌ）、およびグリコーゲン（５μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ）を添加、内容物を穏やかに混合した。冷却した（−２０℃）無水エタノール（６４０μｌ）を添加し、内容物を渦動によって混合した。管をドライアイス上で１０分間インキュベートし、その後、冷蔵（４℃）遠心分離機で、１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを慎重に吸引し、リチウムラウリルサルフェート（０．１％、ｗ／ｖ）を含有する酢酸ナトリウム緩衝液（２０μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ５．０）にペレットを再懸濁した。
【００６８】
（ｉｖ）メチルレッドのカップリング
（ｉｉｉ）の生成物に酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（２００μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．０）を添加した。硝酸銀水溶液（６．７μｌ、０．０１Ｍ）を添加することによってチオールから保護トリチル基を除去し、この混合物を室温で３０分間インキュベートした。ジチオトレイトール水溶液（１０μｌ、０．０１Ｍ）を添加、混合物を振とうしながら室温で５分間インキュベートした。混合物を１００００ｒｐｍで２分間遠心分離、上澄みをペレットから慎重に取り除き、新しいマイクロ遠心分離管に移して、ＮａＨＣＯ３緩衝液（１９５μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ９．０）を添加した。ＩＡ−メチルレッド（１ｍｇ）をＤＭＳＯ（３０μｌ）に溶解し、アリコート（６．６μｌ）を混合物に添加、それを次に室温で９０分間インキュベートした。混合物を１００００ｒｐｍで２分間インキュベートして、過剰のＩＡ−メチルレッドを除去、その後、上澄みを新しいマイクロ遠心分離管に移した。結果として生じたＨＩＣＳプローブを（ｉｉｉ）に記載のとおり回収した。
【００６９】
４．標的オリゴヌクレオチドを有するＨＩＣＳプローブのハイブリダイゼーション
以下を含有する反応混合物（全量１００μｌ）を調製した。水酸化リチウム（１２５ｍＭ）、コハク酸（９５ｍＭ）、ＥＧＴＡ（ｐＨ５．２、１．５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１．５ｍＭ）、リチウムラウリルサルフェート（８．５％、ｗ／ｖ）、ＨＩＣＳプローブ（１００ｆｍｏｌ）、および標的核酸０．５ｐｍｏｌ（すなわち配列番号１に示した配列を有するＨＩＣＳプローブの中央の２８塩基、すなわち各末端の６塩基を除いた配列に相補的な核酸）、または非相補的核酸０．５ｐｍｏｌ。この反応混合物を加熱ブロック内で、６０℃で３０分間インキュベートした。生成溶液を加熱ブロックから除去し、室温に冷ました。ルミノメータを用いて化学発光を測定した。これには、過酸化水素溶液（２００μｌ、１．０％、ｖ／ｖ、塩酸２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝溶液（０．２Ｍ、ｐＨ９．０）中）の自動注入、それに次いで１０秒間シグナルを測定することが含まれた。結果を図１に示す。
【００７０】
５．標的核酸を有するＨＩＣＳプローブのハイブリダイゼーションの用量−応答
以下を含有する反応混合物（全量１００μｌ）を調製した。水酸化リチウム（１２５ｍＭ）、コハク酸（９５ｍＭ）、ＥＧＴＡ（ｐＨ５．２、１．５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１．５ｍＭ）、リチウムラウリルサルフェート（８．５％、ｗ／ｖ）、ＨＩＣＳプローブ（１００ｆｍｏｌ）、および多様な濃度（０〜５１２ｆｍｏｌ）の実施例４の標的核酸（すなわち、配列番号１の中央２８塩基に相補的）、または多様な濃度（０〜５１２ｆｍｏｌ）の非相補的核酸。この反応混合物を加熱ブロック内で、６０℃で３０分間インキュベートした。生成溶液を加熱ブロックから除去し、室温に冷ました。ルミノメータを用いて化学発光を測定した。これには、過酸化水素溶液（２００μｌ、１．０％、ｖ／ｖ、塩酸２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝溶液（０．２Ｍ、ｐＨ９．０）中）の自動注入、それに次いで１０秒間シグナルを測定することが含まれた。結果を図２に示す。
【００７１】
６．Ｔ７ポリメラーゼ生成物の測定
以下の配列を有するＨＩＣＳプローブを上述のとおり合成した。
CCG GTC GGC CTC TTC GCT ATT ACG CCA GCT GAC CGG(配列番号２）
さらにＨＩＣＳプローブの中央２４塩基に相補的な配列を、以下の実験のポジティブコントロールとして合成した。上記配列に対するＨＩＣＳプローブの相補的結合を図３に示す。
【００７２】
Ｔ７ポリメラーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を、適切なコントロールを含めて、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販のキットを用い、酵素生成物が上述の標的配列を含むように製造業者の指示に従って、２重で行なった。以下を含有する反応混合物（全量１００μｌ）を１２×７５ｍｍポリスチレン試験管に調製した。水酸化リチウム１２５ｍＭ、コハク酸９５ｍＭ、ＥＧＴＡｐＨ５．２、１．５ｍＭ、ＥＤＴＡ１．５ｍＭ、リチウムラウリルサルフェート８．５％（ｗ／ｖ）、ＨＩＣＳプローブ１００ｆｍｏｌ、および水で１／１００、１／２００、１／４００に希釈したＴ７ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写生成物２５μｌ。この反応物を加熱ブロック内で、６０℃で３０分間インキュベートした。反応物を加熱ブロックから除去し、室温に冷ました。２００μｌの０．２Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１５Ｍ過酸化水素を自動注入、次いで１０秒間シグナルを測定することによって、ルミノメータで化学発光を測定した。結果を図４に示す。
【００７３】
７．ミスマッチ塩基対の分析
以下を含有する反応混合物（全量１００μｌ）を１２×７５ｍｍポリスチレン試験管に調製した。水酸化リチウム１２５ｍＭ、コハク酸９５ｍＭ、ＥＧＴＡｐＨ５．２、１．５ｍＭ、ＥＤＴＡ１．５ｍＭ、リチウムラウリルサルフェート８．５％（ｗ／ｖ）、ＨＩＣＳプローブ（配列：ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＧ（配列番号３））１００ｆｍｏｌ、および標的核酸（すなわち、ＨＩＣＳプローブに１００％相補的な核酸）０〜２２４０ｆｍｏｌ、または下記の表に詳述したとおり、（１００％相補的な標的に比べて）いくつかの改変塩基を有するように設計された標的核酸０〜２２４０ｆｍｏｌ。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
この反応物を加熱ブロック内で、６０℃で３０分間インキュベートした。反応物を加熱ブロックから除去し、室温に冷ました。２００μｌの０．２Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１５Ｍ過酸化水素を自動注入、次いで１０秒間シグナルを測定することによって、ルミノメータで化学発光を測定した。結果を図５に示す。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による化学発光／クエンチャー標識オリゴヌクレオチドプローブ（ハイブリダイゼーション誘導化学発光シグナル（ＨＩＣＳ）プローブ）に関する、相補的な標的配列に結合しているとき、および結合していないときの強度／時間曲線を示すグラフである。
【図２】  本発明による化学発光／クエンチャー標識オリゴヌクレオチドプローブ（ハイブリダイゼーション誘発化学発光シグナル、ＨＩＣＳ）プローブを用いて得られた、様々な量の標的配列に結合しているとき、および結合していないときの用量／応答曲線である。
【図３】  合成標的オリゴヌクレオチドの存在を測定するためにＨＩＣＳプローブを用い、標的物質の量に対する相対発光量（ｒｌｕ）として光出力をプロットして得られた用量／応答曲線である。
【図４】  ポリメラーゼ生成物の様々な希釈度における、ＨＩＣＳを用いたＴ７ポリメラーゼ生成物の２重反復の測定を示すグラフである。
【図５】  ＨＩＣＳプローブと、１００％相補的配列、およびＨＩＣＳの中間の２１塩基に関して増加的にミスマッチな配列との反応で得られた用量／応答曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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