(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されている核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されており、
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を５以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、３１以上とする
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体。
【請求項２】
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されている核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されており、
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を５以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、３１以上とする
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体。
【請求項３】
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を８以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、２５５以上とする
ことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項４】
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を１２以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、４０９５以上とする
ことを特徴とする請求項３に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項５】
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を１６以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の
種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、６５５３５以上とする
ことを特徴とする請求項４に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項６】
前記標識対象の物体の形状は、不定形微粒子、定形微粒子、繊維、またはシートから選択される
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項７】
前記物体は、磁性体である
ことを特徴とする請求項６に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項８】
前記物体の大きさとして、
物体が微粒子形状である場合には、その粒径相当サイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に、
物体が繊維または片々の形状である場合には、その縦、横、高さのうち、少なくとも二つのサイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択する
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項９】
核酸プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチドからなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項１０】
核酸プライマーは、該プライマーの５’末端側において、直接、または、リンカーを介して間接的に、前記物体の表面に共有結合的に結合されている
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体を作製する方法であって、
前記標識が付された物体表面への該核酸プライマーの結合は、
該核酸プライマーの結合がなされる物体表面に、当該核酸プライマーの塩基配列に従って、対応するモノマーを逐次的に供給し、核酸鎖を固相合成法により合成することにより行う
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体を作製する方法であって、
前記標識が付された物体表面への該核酸プライマーの結合は、
当該核酸プライマーの塩基配列に従って、予め合成し、精製を行った核酸鎖を、前記物体表面に付与することにより行う
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の標識を付されている核酸プライマー結合物体の種類、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を判別する方法であって、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体個々に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、個々の核酸プライマー結合物体の種類を識別する
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の判別方法。
【請求項１４】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、質量分析法を用いる
ことを特徴とする請求項１３に記載の核酸プライマー結合物体の判別方法。
【請求項１５】
質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である
ことを特徴とする請求項１４に記載の核酸プライマー結合物体の判別方法。
【請求項１６】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる
ことを特徴とする請求項１３に記載の核酸プライマー結合物体の判別方法。
【請求項１７】
物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、
平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける
ことを特徴とする請求項１３〜１６にいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体の判別方法。
【請求項１８】
複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している
ことを特徴とする請求項１７に記載の核酸プライマー結合物体の判別方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーの特定、検出または定量方法であって、
該物体の種類、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を、
前記標識子を用いて付されている、該物体の標識を、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき識別することにより判別し、
前記種類の判別がなされた、該物体に結合されている核酸プライマーを、該核酸プライマーには含まれ、該物体には含まれない原子、分子、あるいは物質を、該核酸プライマー由来の指標として用いて、検出または定量する
ことを特徴とする物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２０】
前記核酸プライマーを検出または定量する際、指標として用いる、該核酸プライマーには含まれ、前記物体には含まれない原子が、リン原子である
ことを特徴とする請求項１９に記載の物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２１】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記核酸プライマーに由来する指標の検出手段として、質量分析法を用いる
ことを特徴とする請求項２０に記載の物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２２】
質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である
ことを特徴とする請求項２１に記載の物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２３】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記核酸プライマーに由来する指標の検出手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる
ことを特徴とする請求項１９に記載の物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２４】
物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、該物体の表面に結合する核酸プライマーに由来する指標を検出する際、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける
ことを特徴とする請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２５】
複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している
ことを特徴とする請求項２４に記載の物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法。
【請求項２６】
核酸プライマー結合物体を利用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型を検出する方法であって、
該標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型の検出を行う工程は、少なくとも以下の工程（１）〜（３）：
工程（１）：  請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体であって、
前記標識が付されている物体の表面に結合される核酸プライマーとして、
前記標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチドと、その３’末端側の部分塩基配列とからなる領域に対して、前記単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを３’末端に含む相補的な塩基配列を有し、所定の塩基長を示す核酸鎖で構成される、少なくとも一種の核酸プライマーを選択している、少なくとも一種の核酸プライマー結合物体を用意する工程；
工程（２）：  前記検出対象の単一ヌクレオチド多型を有する標的核酸と、工程（１）で用意される少なくとも一種の核酸プライマー結合物体とを、該核酸プライマーと標的核酸との間のハイブリッド体の形成可能な条件下におき、ハイブリッド体を形成させ、
次いで、酵素的核酸鎖伸長反応を行うポリメラーゼ酵素と、該酵素的核酸鎖伸長反応において基質として使用される、少なくとも一種のヌクレオシド三リン酸と、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸とを含む酵素反応液中において、酵素的核酸鎖伸長反応可能な条件下、形成された前記ハイブリッド体に対して、前記標的核酸を鋳型として該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長を行わせ、
該核酸プライマーの３’末端側に伸長される核酸鎖中に、前記標識物質を結合したヌクレオシドを取り込ませる工程；
工程（３）：  前記核酸プライマーの３’末端側に核酸鎖の伸長がなされている、核酸プライマー結合物体について、該伸長された核酸鎖中に取り込まれている前記標識物質を結合したヌクレオシドを、前記標識物質を指標として検出することによって、該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖の伸長を検出し、
該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長が検出された、核酸プライマー結合物体について、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、当該核酸プライマー結合物体の種類を識別し、さらに、当該核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーの有する塩基配列を特定する工程；
を含む
ことを特徴とする標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項２７】
前記標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸中の標識物質として、蛍光物質を用いる
ことを特徴とする請求項２６に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項２８】
前記標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸中の標識物質として、ハロゲン原子、あるいは金属原子を用いる
あることを特徴とする請求項２６に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項２９】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、質量分析法を用いる
ことを特徴とする請求項２８に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３０】
質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である
ことを特徴とする請求項２９に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３１】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる
ことを特徴とする請求項２８に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３２】
前記核酸プライマーの３’末端側に核酸鎖の伸長がなされている、核酸プライマー結合物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、前記標識物質を検出する際、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける
ことを特徴とする請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３３】
前記核酸プライマーの３’末端側に核酸鎖の伸長がなされている、核酸プライマー結合物体が位置する表面上において、
複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している
ことを特徴とする請求項３２に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３４】
前記酵素反応液中に含まれる、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸を構成する、ヌクレオシド三リン酸は、
前記酵素的核酸鎖伸長反応を行うポリメラーゼ酵素の種類に応じて、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ（またはｄｄＵＴＰ）、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰからなる群から選択されている
ことを特徴とする請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３５】
複数の異なる核酸プライマーが、それぞれ結合した複数の物体に対して、該核酸プライマーからの核酸伸長反応条件下におき、前記核酸プライマーからの伸長反応が生起した物体のみに対して、該物体に付されている標識、すなわち、該物体に結合した核酸プライマーの種類を判別する
ことを特徴とする請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３６】
核酸プライマー結合物体を利用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型を検出する方法であって、
該標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型の検出を行う工程は、少なくとも以下の工程（１）〜（３）：
工程（１）：  請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸プライマー結合物体であって、
前記標識が付されている物体の表面に結合される核酸プライマーとして、
前記標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチドに対して、その３’末端側の部分塩基配列からなる領域に対して、相補的な塩基配列を有し、所定の塩基長を示す核酸鎖で構成される、少なくとも一種の核酸プライマーを選択している、少なくとも一種の核酸プライマー結合物体を用意する工程；
工程（２）：  前記検出対象の単一ヌクレオチド多型を有する標的核酸と、工程（１）で用意される少なくとも一種の核酸プライマー結合物体とを、該核酸プライマーと標的核酸との間のハイブリッド体の形成可能な条件下におき、ハイブリッド体を形成させ、
次いで、酵素的核酸鎖伸長反応を行うポリメラーゼ酵素と、該ポリメラーゼ酵素の基質として使用可能な、それぞれ異なる標識物質を結合した４種のジデオキシヌクレオシド三リン酸；｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ｝または｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ｝の少なくとも一方とを含む酵素反応液中において、酵素的核酸鎖伸長反応可能な条件下、形成された前記ハイブリッド体に対して、前記標的核酸を鋳型として該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長を行わせ、
該核酸プライマーの３’末端側に前記標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドを取り込ませる工程；
工程（３）：  前記核酸プライマーの３’末端側に標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドが取り込まれている、核酸プライマー結合物体について、該３’末端側に取り込まれている前記標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドを、前記標識物質を指標として検出することによって、該核酸プライマーの３’末端側に伸長されたジデオキシヌクレオシドの塩基の種類を特定し、
該核酸プライマーの３’末端側へのジデオキシヌクレオシドの取り込みが検出された、核酸プライマー結合物体について、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、当該核酸プライマー結合物体の種類を識別し、さらに、当該核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーの有する塩基配列を特定する工程；
を含む
ことを特徴とする標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３７】
前記標識物質を結合したジデオキシヌクレオシド三リン酸中の標識物質として、蛍光物質を用いる
ことを特徴とする請求項３６に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３８】
前記標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸中の標識物質として、ハロゲン原子、あるいは金属原子を用いる
ことを特徴とする請求項３６に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項３９】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、質量分析法を用いる
ことを特徴とする請求項３８に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項４０】
質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である
ことを特徴とする請求項３９に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項４１】
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる
ことを特徴とする請求項３８に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項４２】
前記核酸プライマーの３’末端側にジデオキシヌクレオシドの取り込みがなされている、核酸プライマー結合物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、前記標識物質を検出する際、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける
ことを特徴とする請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項４３】
前記核酸プライマーの３’末端側にジデオキシヌクレオシドの取り込みがなされている、核酸プライマー結合物体が位置する表面上において、
複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している
ことを特徴とする請求項４２に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【請求項４４】
複数の異なる核酸プライマーが、それぞれ結合した複数の物体に対して、該核酸プライマーからの核酸伸長反応条件下におき、前記核酸プライマーからの伸長反応が生起した物体のみに対して、該物体に付されている標識、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を判別する
ことを特徴とする請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種の核酸プライマーをそれぞれ個別に結合した複数の物体について、該物体個々の種類、すなわち、該物体上に結合されている該核酸プライマー個々の種類を判別するために、識別用の標識を付された核酸プライマー結合物体、その製造方法、ならびに、該物体の種類、すなわち、該物体上に結合されている核酸プライマーの種類の判別方法に関する。さらには、本発明は、かかる識別用の標識を付された核酸プライマー結合物体を利用して、該物体に結合した核酸プライマーの種類の特定と、検出または定量を行う方法、あるいは、該物体に結合した核酸プライマーを利用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数種の物体を取り扱う際には、多くの場合、該物体個々の種類を正確に判別することが必要とされる。特に、取り扱われる複数種の物体自体が、見掛けの上では、容易に区別できない場合には、物体個々の種類に対応する、識別用の標識を付して、該物体個々の種類の判別に利用している。
【０００３】
識別用の標識には、種々の手法があるが、本質的には、区別すべき種類の数以上の判別可能な符号化された識別子（コード）を個々の種類に割り振るものである。標識を付される対象の物体サイズが大きな場合、利用される判別可能な符号化された識別子（コード）として、多くの場合、文字列型の識別子が利用されている。例えば、バー・コードは、文字列型の識別子に対応させ、所定の規則に従って、バーの線幅、間隔の情報へと変換したものに相当する。なお、文字列型の識別子には、本来、一連のシリアル番号で表記可能な識別子の割り振りをより簡便にするため、例えば、電話番号における、国コード（国番号）、エリア・コード（市外局番）、エリア内の個別番号（エリア内局番＋個別回線番号）のような、階層的な標識部複数を組み合わせ、一体化して、一つの文字列型の識別子とする形態を採用するものが多い。
【０００４】
一方、標識を付される対象の物体サイズが小さな場合、上述するような、視覚的に判別可能な文字列型の識別子を付すことは技術的に困難となる。例えば、ＩＣタグでは、文字列型の識別子として、ＩＣチップ上に電子的に記載される情報を、外部の検出器との間でデジタル化された電磁波を介して識別する方法を採用している。なお、このＩＣタグ自体のサイズは、１００μｍのオーダーであり、十数μｍ以下、場合によっては、数μｍ以下の物体サイズに対して、文字列型の識別子を付すことは技術的により困難な課題となる。
【０００５】
例えば、物体サイズが十数μｍ以下、場合によっては、数μｍ以下となるものの一例としては、生体関連物質の検出に利用される、ミクロな粒子の表面にプローブ分子を固定化したものがある。
【０００６】
例えば、各種微生物の分類に際して、類縁種の微生物に特異的な抗体分子の、対象微生物表面の坑原に対する交叉反応性を評価することで、分類学上の近縁関係を調査する手法が古くから利用されている。その際、プローブとして利用する抗体分子を金微粒子表面に固定化し、微生物の周囲への金微粒子の集積を観察し、交叉反応の有無を判断している。また、各種抗体分子が識別するエピトープ配列の特定法として、大腸菌によってデスプレイされているランダムペプチド・ライブラリーから、例えば、ミクロなフェライト粒子の表面に固定化された抗体分子と抗原・抗体反応するペプチドを表現する大腸菌株を、パニング法を応用して分離する手法も、広く知られている。この方法では、磁気的にミクロなフェライト粒子を回収する際、抗体分子と反応可能なアミノ酸配列を有するペプチドを表現する大腸菌株のみが、フェライト粒子に連結された形態で分離される。
【０００７】
これら生体関連物質の検出に利用される、プローブ分子を固定化するミクロな粒子が有する主要な利点は、固形物であるミクロな粒子を液相から分離する手段を利用することで、プローブ分子によって結合された検出対象物質と、液相中に存在しているそれ以外の夾雑物との分離は容易に行えることにある。すなわち、液相中に存在している検出対象物質をプローブ分子と結合させた後、検出対象物質とプローブ分子の結合体と、未反応のプローブ分子とは、一旦、該プローブ分子を固定化するミクロな粒子を利用することで液相から分離・回収される。その後、回収された検出対象物質とプローブ分子の結合体と未反応のプローブ分子の混合物中に、実際に、検出対象物質とプローブ分子の結合体が存在するか、さらには、その存在量の定量が進められる。
【０００８】
プローブ分子を固相表面に固定化することで、液相との分離が簡便となるという利点は、マクロなサイズを有する固相基板表面にプローブ分子を固定化することでも達成される。例えば、検体試料中に存在する特定のＩｇＧ抗体の有無を検出する際、検出対象のＩｇ抗体に対するエピトープ配列を有する抗原ペプチドを固相基板表面に所定の密度で固定化し、かかる固相基板表面に検体試料を接触させ、この抗原ペプチドとの反応を介して、検出対象のＩｇＧ抗体を固相基板表面に固着させる。その後、固相基板表面に検体試料を除去した後、固相基板表面に固着されているＩｇＧ抗体分子に対して、そのＦｃ領域（定常領域）へ、検出用標識を付した坑ＩｇＧ抗体を定量的に反応させる。未反応の「標識を付した坑ＩｇＧ抗体」を、固相基板表面から洗浄除去した後、固相基板表面に固着されているＩｇＧ抗体分子と定量的に反応している、標識を付した坑ＩｇＧ抗体を、その検出用標識を利用して検出し、また、定量する。
【０００９】
マクロなサイズの固相基板表面にプローブ分子を固定化する手法では、固相基板自体が大きいため、同一基板面上を複数の領域に区分した上で、各領域に別種のプローブ分子を固定化することもできる。具体的には、複数の領域に区分する際、個々の区分をアレイ状、あるいは、マトリックス状に配置した上、各区分を特定するアドレスを付し（番地付けし）、個々の区分に別種の核酸プローブ分子を固定化した、核酸プローブ・アレイの形態とすることができる。例えば、核酸プローブ・ハイブリダイゼーション反応によって、核酸プローブの塩基配列と相補的な塩基配列部分を含む標的核酸分子の固定化に利用される、ＤＮＡ核酸プローブを複数種固定するＤＮＡプローブ・アレイ；抗原・抗体反応によって、抗原ペプチドに対して特異性を有する標的抗体分子の固定化に利用される、既知のアミノ酸配列を有する抗原ペプチドを複数種固定するペプチド抗原・アレイ；逆に、抗原・抗体反応によって、特異的抗体を用いた標的抗原分子の固定化に利用される、既知の特異的抗体分子を複数種固定する抗体アレイ；受容体タンパク質上への基質分子の結合によって、該受容体タンパク質に対する標的基質分子の固定化に利用される、既知の受容体分子を複数種固定する受容体タンパク質アレイなどの形態がある。
【００１０】
プローブ・アレイは、検体試料中に含まれる標的分子複数種を、対応するプローブ分子複数種を利用して、同時に固定化する際に利用される。利用している固相基板自体、マクロなサイズを有するので、液相からの分離、その後の洗浄操作は極めて簡単である。また、プローブ・アレイ上の各プローブ分子と結合体として、基板上に固定される標的物質を検出する際、予め各プローブ分子の固定位置（アドレス）は決められており、アドレスに従って、各標的物質の検出を進める。
【００１１】
マクロなサイズの固相基板表面にプローブ分子を固定化する、プローブ・アレイは、液相からの分離や標的物質の検出を行う際、取り扱いが容易であるという利点があり、様々な分野で利用が進んでいる。但し、マクロなサイズの固相基板表面において、特定領域に固定されているプローブ分子と検体試料中に含まれる標的分子との反応を行わせることに起因して、相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）という本質的な欠点を有している。具体的には、プローブ分子は、固相基板表面上の限られた領域に固定化されているが、検体試料中に含まれる標的分子は、液相全体に均一に分布しているため、このプローブ分子と反応可能な標的分子は、限られた領域内で、且つ固相基板表面に近接する範囲に存在するものに限定される。この限られた領域内に存在する標的分子が、固定化されているプローブ分子と結合体を形成すると、この領域内において、液相中に存在する、「自由な標的分子」の濃度は急速に低減する結果、相対的に反応速度の低下が低下する。結果的には、固定化されているプローブ分子の総数当たり、プローブ分子と結合体を形成する標的分子の総数（反応収率）は、限定されたものとなる。この相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）という欠点は、固相基板表面上に占める、各プローブ分子の固定領域の占有面積比率が小さくなるとともに、より顕著なものとなる。換言すると、プローブ・アレイを構成するプローブ分子の種類数が増すとともに、この欠点はより顕著なものとなる。
【００１２】
理想的には、反応液を速やかに攪拌して、液相中の濃度分布の均一化を図ることで、この欠点は解消されるが、現実的には、マクロなサイズの固相基板表面を利用する際には、反応液を緩やかに攪拌する、あるいは、ほぼ静置する状況で反応がなされる場合が少なくない。相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）場合であっても、固定化されているプローブ分子の総数当たり、プローブ分子と結合体を形成する標的分子の総数（反応収率）は、検体溶液中における、当初の標的分子の濃度を反映したものとなる。但し、各プローブ分子の固定領域の占有面積比率が小さくなるとともに、プローブ分子と結合体を形成する標的分子の総数（反応収率）と、検体溶液中における、当初の標的分子の濃度との間における関係は、高い直線性を示さなくなる。すなわち、マクロなサイズの固相基板表面上に、多種のプローブ分子を高密度のマトリクス状に固定する、高密度プローブ・アレイを利用する場合、各プローブ分子との結合体として固定される標的分子の定量によって、検体溶液中における標的分子濃度の定量を図る際、その定量確度の低下要因の一つとなる。
【００１３】
その他、プローブ・アレイを構成する際、各プローブ分子の固定化領域の周囲に、区画分割用の格子状の枠領域を設けることがある。あるいは、前記格子状の枠領域を設けない場合でも、プローブ分子の固定化領域の周囲にプローブ分子の非固定化領域が存在する場合がある。この格子状の枠領域、もしくは、プローブ分子の非固定化領域には、固相基板表面が露呈しているため、種々の標的分子が非選択的に吸着を起こすことも少なくない。この非選択的に吸着した標的分子は、検出の際、バックグランドの信号レベルを引き上げ、プローブ分子の固定領域において検出される信号レベルと、バックグランドの信号レベルとの差違を、プローブ分子と結合体を形成する標的分子に起因する信号と判定する際、システマティックな誤差要因となる。加えて、相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）ため、検体溶液中における標的分子濃度が低い範囲に対して、その定量確度の低下要因の一つとなる。
【００１４】
プローブ・アレイを作製する際、予め別途調製したプローブ分子を、所定の固定化領域に塗布、固定化するスポッティング法が広く利用されている。このスポッティング法は、予め別途調製したプローブ分子を含む液中に、ミクロな粒子を投入し、その表面にプローブ分子を固定する場合と同様に、単位表面積当たりに固定化されるプローブ分子の密度は高い再現性を有するものとなる。一方、固相反応によって、合成可能なＤＮＡプローブ（オリゴヌクレオチド）分子をアレイ状に固定化する際には、フォトリソグラフィー法を利用して、マクロなサイズの固相基板表面上に、各ＤＮＡプローブ（オリゴヌクレオチド）の塩基配列に従って、逐次的に合成されるオリゴヌクレオチドを、固定化プローブ分子として利用する方法もある。この直接、固相基板表面上で合成されるオリゴヌクレオチドに関しては、合成後、その塩基配列の確認を行うことは困難であり、部分的に塩基が欠損したオリゴヌクレオチドが混入する場合がある。あるいは、原理的に1ヌクレオチドずつ短い全ての（オリゴ）ヌクレオチドが、ある割合で全て共存する。このような目的の塩基配列と異なるＤＮＡ分子が混入すると、プローブ・ハイブリダイゼーション反応における反応収率を相対的に低下させる要因となる。場合によっては、目的の塩基配列と異なるＤＮＡ分子が、偶々、他のアドレス上に固定化するＤＮＡプローブ分子と塩基配列が共通するものとなると、本来の標的核酸分子と相違する、別種の核酸分子がかかるアドレス上にも、結合されることになる。従って、上述する所望としないオリゴヌクレオチドの混入は、定量確度の低下要因の一つとなる。
【００１５】
一方、プローブ分子をミクロな粒子の表面に固定化した、プローブ分子固定微粒子は、予め別途調製したプローブ分子を含む液中に、ミクロな粒子を投入し、その表面にプローブ分子を固定する方法で調製されるため、ミクロな粒子の表面へ、種々の標的分子が非選択的に吸着を起こす現象は、実質的に抑制されている。また、固定化されるプローブ分子は、別途調製した後、十分に精製を施したものが利用される。また、後述するように、ミクロな粒子表面での固相逐次合成は、上述のフォトリソグラフィー法の欠点を回避できるので、こちらの手法も好適に用いることが可能である。
【００１６】
プローブ分子固定微粒子は、通常、液相中に均一に分散した状態を維持でき、液相全体に均一に分布している標的分子と、ミクロ的には、固相／液相間での反応はあるが、マクロ的には、液相全体において均一な反応を行うことが可能である。従って、マクロなサイズの固相基板表面上に、多種のプローブ分子を高密度のマトリクス状に固定する、高密度プローブ・アレイを利用する場合に顕著である、相対的に反応収率が低い（見掛けの反応速度が遅い）という欠点は、このプローブ分子固定微粒子を利用する場合には、実質的に解消されたものとなる。従って、プローブ分子固定微粒子を利用すると、プローブ分子との結合体として固定される標的分子の定量によって、検体溶液中における標的分子濃度の定量を図る際、プローブ・アレイにおいて列挙した定量確度の低下要因の大半は回避可能である。
【００１７】
また、プローブ分子固定微粒子は、通常、液相中に均一に分散した状態で反応を終えた後、液相中から簡便に分離することが可能という利点は保持している。例えば、濾過や遠心分離法を適用する固液分離法が利用でき、また、粒子自体が、磁性材料を主成分とする場合、磁力を利用して、液相中から分離することが可能である。
【００１８】
勿論、プローブ分子固定微粒子は、各ミクロな粒子の表面に一つの種類のプローブ分子を固定化するため、多数種のプローブ分子を利用する場合には、対応するプローブ分子固定微粒子を多数種予め準備する必要がある。これらプローブ分子固定微粒子多数種は、個々のプローブ分子固定微粒子を構成するプローブ分子は異なっているが、外見上は、容易に区別することはできない。換言するならば、プローブ分子固定微粒子多数種について、用いているミクロな粒子相互を区別可能なものとし、個々のプローブ分子固定微粒子を特定することが必要となる。すなわち、用いているミクロな粒子に、相互識別用の標識を付すことが必要となる。
【００１９】
プローブ分子固定微粒子を構成する、ミクロな粒子に相互識別用の標識を付す手法に関して、幾つかの提案がなされている。例えば、特許文献１（特開昭６１−２２５６５６号公報）には、用いるミクロな粒子の粒径の差違によって識別する手法；特許文献２（特開昭６２−８１５６６号公報）には、ミクロな粒子の粒径の差違と蛍光標識（合計ｎ種）とを組み合わせて、区別を図る手法；特許文献３（特開昭６２−１９５５５６号公報）には、ミクロな粒子に着色を施すことによって、区別を図る手法；特許文献４（特開平１−９５８００号公報）には、ミクロな粒子を異なる金属元素で形成して、区別を図る手法；特許文献５（特開平２−２９９６９８号公報）では、染色によって、区別を図る手法；特許文献６（特開平７−８３９２７号公報）には、ミクロな粒子を無機蛍光体とし、その蛍光波長によって、区別を図る手法；また、特許文献７（米国特許第６６０２６７１号明細書）には、ミクロな粒子に半導体ナノ結晶を利用して、区別を図る手法；特許文献８（米国特許第６４４０６６７号明細書）には、磁気、色、形状が相違するミクロな粒子を利用して、区別を図る手法；特許文献９（米国特許第６５００６２２号明細書）には、ミクロな粒子に半導体ナノ蛍光粒子を利用して、区別を図る手法が開示されている。
【００２０】
これらの従来技術では、区別可能なミクロな粒子の種類、すなわち、標識の種類は、高々、十数種程度であり、標識の種類を更に増す際、拡張性に乏しい手法である。特に、ミクロな粒子の粒子径、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持した上で、標識の種類を更に増す際、拡張性に乏しい手法である。
【特許文献１】特開昭６１−２２５６５６号公報
【特許文献２】特開昭６２−８１５６６号公報
【特許文献３】特開昭６２−１９５５５６号公報
【特許文献４】特開平１−９５８００号公報
【特許文献５】特開平２−２９９６９８号公報
【特許文献６】特開平７−８３９２７号公報
【特許文献７】米国特許第６６０２６７１号明細書
【特許文献８】米国特許第６４４０６６７号明細書
【特許文献９】米国特許第６５００６２２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
以上に説明するように、液相中に含まれる種々の生体関連物質、例えば、核酸分子、タンパク質、糖鎖分子などについて、その有無の判定、含有濃度を測定する際、検査対象物質（標的物質）に対して特異的に結合する物質（通常、プローブ分子と称される）を作用させて、一旦、結合体として、液相から分離する手法が広く利用されている。具体的には、固相表面にプローブ分子を固定化した上で、液相中に存在する標的物質と結合体を形成し、この固相と液相とを分離する手法が広く利用されている。液相から分離した後、プローブ分子と結合体を構成している標的物質の有無、ならびに、その量を適合する検出手段を用いて行う。
【００２２】
一方で、近年、固相表面に固定化した核酸をプライマーとして用いて、固相上でＰＣＲ（ポリメレース・チェイン・リアクション）反応や、ターミネーターヌクレオチドを併用した一ヌクレオチド伸長反応を行う技術が開発されてきている。例えば、特開２００１−２９９３４６号公報には、二種のオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーの一セットを核酸アレイのひとつのマトリクスに固定して、複数のＰＣＲを一枚の固相上で行う、所謂、固相ＰＣＲの一手法が開示されている。また、米国特許第６，００４，７４４号明細書には、固相に固定した核酸プライマーを用いた一ヌクレオチド伸長についても記載されている。
【００２３】
その際、表面積の大きな固相基板上に、複数種の核酸プライマー分子を規則的に固定化する、核酸プライマー・アレイと比較し、各核酸プライマー分子を微細な粒子表面に個別に固定化した核酸プライマー分子固定微粒子は、液相における標的物質との反応性、またその定量性に関しては、有意に優れていることは、上で述べたプローブ・アレイとプローブ分子固定化微粒子との関係と同様である。また同様に、核酸プライマー・アレイでは、各核酸プライマー分子種類の特定は、その固定化位置（アドレス）に基づき、簡単に行うことができるが、核酸プライマー分子固定微粒子では、固定化に利用する微粒子に予め標識を付し、この標識を識別して、核酸プライマー分子種類の特定を行うことが必要となる。
【００２４】
微粒子に標識を施す手段は、上述したように、従来からいくつか提案されているが、対応可能な種類は限られており、利用する核酸プライマー分子種類が多い場合には、それら全てに個別の標識を付す目的を充足可能なものではなかった。特には、核酸プライマー分子の固定化に利用する微粒子のように、サイズ、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持した上で、標識の種類を必要に応じて増すことが可能な、拡張性に富んだ標識方法の開発が待望されている。
【００２５】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、標識を付す対象の物体が、微小サイズであり、その形状、ならびに、主要構成材料を共通とした上で、利用可能な標識種類を必要に応じて増すことを可能とする、拡張性に富んだ標識方法、該標識方法によって標識された核酸プライマー結合物体を提供することにある。また、本発明のさらなる目的は、該核酸プライマー結合物体の種類、あるいは該物体に結合されている核酸プライマーの種類の判別方法、該核酸プライマーの特定、検出または定量方法、ならびに、該標識を付された物体に結合された核酸プライマーを利用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出を行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者は、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を進めた結果、先ず、以下のことに想到した。例えば、核酸プライマー分子を固定化する際に利用される、ミクロな粒子のサイズは、液相中に均一に分散させるため、粒子径は数μｍ以下、場合によっては、サブミクロンの領域に選択される。その際、ミクロな粒子の表面に固定化される核酸プライマー分子の量の均一化を図る上では、用いる微粒子の粒子径を一定化し、個々の微粒子が有する表面積の一定化を行う必要がある。勿論、微粒子の外形形状も、例えば、球状に統一することも必要である。さらに、この微粒子表面に、別途調製した核酸プライマー分子を固定化する場合、微粒子表面の材質が全く異なると、それに合わせて、異なる固定化手段を利用する必要がある。具体的には、金属微粒子であっても、それを構成する金属元素が全くことなると、異なる固定化手段を利用する必要がある。逆に、表面に対して、核酸プライマー分子を固定化する手段が異なると、単位面積当たりに固定化される核酸プライマー分子の密度を同様にすることは困難となる。
【００２７】
従って、ミクロな粒子の粒子径、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持した上で、標識の種類を必要に応じて増すことが可能な、拡張性に富んだ標識方法が望ましい。この粒子径、形状、ならびに、主要な構成材料は、共通性を維持するという要件をも満足し、且つ、付されている標識の識別に曖昧さが無く、必要に応じて、付与可能な標識の種類を任意に増減可能な、高い拡張性を有する標識方法の開発を進めた。その結果、例えば、ミクロな粒子を作製する際に利用する材料として、主要な構成成分に加えて、少量配合可能な成分として、任意に添加可能な副次的構成成分を有することが可能な材料を選択し、この任意に添加可能な副次的構成成分の組成を利用して、情報を付加することが可能であることを見出した。具体的には、かかる任意に添加可能な副次的構成成分の組成として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無を選択すると、各原子について、二水準の状態となり、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定できることに想到した。更に、この手法を一般化すると、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有量の水準を複数、例えば、Ｍ個の水準を設定すると、各原子について、Ｍ個の水準の状態となり、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の水準とを利用して、Ｍ進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定することも可能であることに想到した。これらの着想に加えて、本発明者は、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、あるいは、含有量の水準の差違は、例えば、粒子径は数μｍ以下の微粒子であっても、各種の分析手段を適用すると、予め選択される複数種の原子に関して、その含有量の水準を特定可能であり、かかる副次的成分の組成として付されている標識情報の判別が十分可能である点をも確認して、本発明を完成するに至った。
【００２８】
加えて、本発明においては、該標識は、予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含んでおり、その標識の読み取り手段として、原子の種類、ならびにその存在量の測定に適する手段である、質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法を利用している。
【００２９】
すなわち、一般的な表現を行うと、本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、
予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含み、
前記標識は質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法により識別される
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体である。
【００３０】
その際、予め選択される複数種の原子は、核酸プライマーを構成する原子ではなく、該核酸プライマーが結合される物体、またはその表面を構成する際に利用される種々の原子から選択することが好ましい。すなわち、物体、またはその表面を構成する際に利用可能な種々の原子の群から、核酸プライマーを構成する原子の群を除いた、残りの原子群から、質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のいずれかで検出可能なものが、この予め選択される複数種の原子として、好適に利用可能である。なお、該標識は、「選択された少なくとも２種類の原子」の何れかが検出されない、すなわち、その含有量が零であるという「検出結果」によって、識別されるものであってもよい。換言するならば、本発明においては、「選択された少なくとも２種類の原子を含む」とは、「その原子の含有量に着目することで、標識の識別を行うことが可能な状態である」ということを意味している。
【００３１】
上記の本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体を、より具体的に表現すると、下記の二つの形態により規定することができる。
【００３２】
本発明の第一の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、然して該物体に結合した核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されている
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体である。
【００３３】
また、本発明の第二の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、然して該物体に結合した核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報が付されている
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明にかかる物体の標識方法を利用することで、例えば、ＰＣＲに用いる核酸プライマー分子の固定化に利用される微細な粒子状の基体等、微小な物体に対しても、それを構成する材料の一部として、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、あるいは、含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件に従って調製される標識用材料を用いることで、必要に応じて多数種の標識を付すが可能となる。本発明では、この利点を利用することで、標識が付されている物体多数種を用意し、この多数種の物体の表面に、それぞれ異なる種類の核酸プライマーを結合して、核酸プライマーを結合した物体としている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
先に概要を説明したように、本発明において利用されている物体の標識方法では、例えば、ミクロな粒子を作製する際に利用する材料として、主要な構成成分に加えて、少量配合可能な成分として、任意に添加可能な副次的構成成分を有することが可能な材料を選択し、この任意に添加可能な副次的構成成分の組成を利用して、標識情報を付加するものである。具体的には、かかる任意に添加可能な副次的構成成分の組成として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無を選択すると、各原子について、二水準の状態となり、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定でき、この設定される含有原子の組成によって、標識情報を付与する方法である。更に、この手法を一般化すると、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有量の水準を複数、例えば、Ｍ個の水準を設定すると、各原子について、Ｍ個の水準の状態となり、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の水準とを利用して、Ｍ進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を設定することで、標識の種類を必要に応じて増すことが可能な、拡張性を有する方法としている。
【００３６】
すなわち、本発明において利用されている物体の標識方法では、まず、物体を作製する際に、任意に添加可能な副次的構成成分として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、選択されている原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を用いて、これらｎ種の原子の各含有量（Ｃi）を要素とするベクトル型の情報｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を設定する。このベクトル型の情報｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝は、対応するｎ次元空間（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）上において、それぞれ離散的に存在する点に相当している。一方、物体は、主要な構成成分と、前記任意に添加可能な副次的構成成分とで構成されており、該主要な構成成分の含有量をＣ0と表現すると、その全体組成は、ベクトル型の情報｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝として表記できる。換言すると、全体組成：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を達成するための含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）は、任意に添加可能な副次的構成成分の組成｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝によって決定されている。物体の組成として、総数ＮTOTAL通りを選択すると、その全体組成：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を達成するための含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）は、総数ＮTOTAL通りとなる。
【００３７】
この総数ＮTOTAL通りの全体組成を示すベクトル型の情報：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝は、対応する（ｎ＋１）次元空間（Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）上において、点（Ｃ0，０，・・，０，・・，０）の近傍に存在する、総数ＮTOTALの離散的な点の集合に相当する。含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）は、全体組成を示すベクトル型の情報：｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝と、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量を示すベクトル型の情報｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝とを、それぞれ対応付ける函数（演算子）に相当する。すなわち、ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇒｛Ｃ0，Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝と表現できる対応付けを行うことができる。本発明では、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝について、総数ＮTOTAL通りの組成条件を予め設定する際、適当な検出手段を選択することで、各組成相互の弁別が可能となるように、利用する検出手段の検出精度を考慮した上で、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を「離散的に」選択している。
【００３８】
各組成相互の弁別が可能な、総数ＮTOTAL通りの全体組成を示す物品に対して、各物品の種類の違い（組成の違い）を示す符号（種番号）として、総数ＮTOTAL通りの離散的な数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝を別途選定する。そして、「離散的に」選択されている、任意に添加可能な副次的構成成分の含有量｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝によって決定される、総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝の各要素ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）に対して、総数ＮTOTAL通りの離散的な数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝中の一つの要素ｆ（Ｎ）を、ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇔ｆ（Ｎ）で示されるような、「１対１の対応付け」を行っている。すなわち、各物品の種類の違い（組成の違い）を示す符号（種番号）に相当する、前記数値情報ｆ（Ｎ）として表記される、前記「離散的な識別情報」を、「離散的に」設定されている組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を利用する標識として付している。
【００３９】
本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、この物体の標識方法を利用する際、各組成相互の弁別が可能な、全体組成を示す物品の種類の総数ＮTOTALが、ＮTOTAL≧２n−１を満たすように、「標識」を構成する組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を「離散的に」設定する手法を新たに見出し、それを応用したものである。
【００４０】
その際、本発明においては、該標識は、予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含んでおり、その標識の読み取り手段として、原子の種類、ならびにその存在量の測定に適する手段である、質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法を利用する。
【００４１】
従って、本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、
予め選択される複数種の原子から選択された少なくとも２種類の原子を含み、
前記標識は質量分析法、Ｘ線光電子分光法、またはオージェ電子分光法のうちの少なくともいずれかの方法により識別される
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体である。
【００４２】
上述する本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、例えば、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されている核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を利用して、総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝を構成することが可能な組成条件の設定手順に従って、前記総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝に対する部分集合に相当する、要素数ＮLABEL（但し、ＮLABELは、１≦ＮLABEL≦ＮTOTALを満たす整数）の含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝を構成し、
要素数ＮLABEL（但し、ＮLABELは、１≦ＮLABEL≦ＮTOTALを満たす整数）の数値情報：ｆj（Ｎ）の集合｛ｆj（Ｎ）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝を構成し、
前記要素数ＮLABELの数値情報：ｆj（Ｎ）の集合｛ｆj（Ｎ）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の各要素ｆj（Ｎ）に対して、１対１に対応する、要素数ＮLABELの含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の各要素ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）を選択した上で、
前記含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）を満足する組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を有する標識子を用いて、
該ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）と、１対１の対応付け（ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇔ｆj（Ｎ））がなされている、前記数値情報ｆj（Ｎ）として表記される、前記離散的な識別情報が付されており、
前記含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝の要素数の総和：ＮTOTALは、ＮTOTAL≧２n−１に選択されており、
前記数値情報：ｆj（Ｎ）の集合｛ｆj（Ｎ）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の要素数ＮLABELならびに前記含有原子の組成条件：ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇj（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）：ｊ＝１，・・・，ＮLABEL｝の要素数ＮLABELは、ＮTOTAL≧ＮLABEL≧ｎ・（ｎ−１）＋１に選択されている
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の形態とすることもできる。さらには、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、すなわち該物体に結合されている核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を利用して、総数ＮTOTAL通りの数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝の各要素ｆ（Ｎ）に対して、１対１に対応する、総数ＮTOTAL通りの含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）の集合｛ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）｝を構成した上で、
前記含有原子の組成条件：ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）を満足する組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝を有する標識子を用いて、
該ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）と、１対１の対応付け（ｇ（Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn）⇔ｆ（Ｎ））がなされている、前記数値情報ｆ（Ｎ）として表記される、前記離散的な識別情報が付されており、
前記数値情報：ｆ（Ｎ）の集合｛ｆ（Ｎ）｝の要素数の総和：ＮTOTALは、ＮTOTAL≧２n−１に選択されている
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体とすることも可能である。
【００４３】
その際、数値情報：ｆ（Ｎ）として、組成：｛Ｃ1，・・，Ｃi，・・，Ｃn｝に関して、原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を、二つの水準、特に、「含有量の有無」という二つの水準の値に変換することで生成される「二進法ｎ桁の数値情報」に相当するものを利用する形態が、本発明の第一の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体である。また、数値情報：ｆ（Ｎ）として、原子個々の含有量（Ｃi；ｉ＝１，・・，ｎ）を、二つの水準以上、例えば、Ｍ個の水準に区分した値に変換することで生成される「Ｍ進法ｎ桁の数値情報」を利用する等、第一の形態の手法をより一般化し、拡張性を付与した形態が、本発明の第二の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体である。
【００４４】
すなわち、本発明の第一の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、然して該物体に結合した核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無とを利用して、二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報を付している
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体であり、
また、前記第一の形態に対して、更なる拡張性を持たせている、本発明の第二の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体は、
核酸プライマーを結合した物体であって、
該物体の表面に前記核酸プライマーが結合されており、
該物体には標識が付されており、
該標識は、標識対象の物体複数、然して該物体に結合した核酸プライマー複数に対して、該物体個々、すなわち該核酸プライマー個々の判別を可能とする離散的な識別情報を付すものであり、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報を付している
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体であるが、それらの好ましい態様とし、以下に示す態様を挙げることができる。
【００４５】
例えば、上述する本発明の第一の形態、ならびに、第二の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体では、
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を５以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、３１以上とすることが可能である。
【００４６】
また、前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を８以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、２５５以上とすることも可能である。
【００４７】
さらに、高い拡張性を示す態様として、
前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を１２以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、４０９５以上とすること、
あるいは、前記標識において、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）を１６以上とし、
該原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量とで表示される、数値情報の種類Ｎ；Ｎ≧ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）を、６５５３５以上とすることも可能である。
【００４８】
以上に示す、本発明の第一の形態、ならびに、第二の形態にかかる標識された核酸プライマー結合物体では、
物体の形状自体は、標識情報に利用されておらず、任意に選択することが可能である。従って、前記物体の形状は、不定形微粒子、定形微粒子、繊維、またはシートから選択することが可能である。
【００４９】
一方、本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体では、標識に、予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、あるいはその水準とを利用しており、例えば、複数種の原子を構成成分とする磁性体材料に対しても適用できる。従って、前記物体は、磁性体である態様を選択することが可能である。
【００５０】
また、物体の形状の他、物体の大きさも、標識情報に利用されておらず、従って、本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体で利用する、標識された物体においては、物体の大きさも、その用途に応じて、任意に選択することが可能である。例えば、前記物体の大きさとして、
物体が微粒子形状である場合には、その粒径相当サイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に、
物体が繊維または片々の形状である場合には、その縦、横、高さのうち、少なくとも二つのサイズを１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択することも可能である。
【００５１】
一方、本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体において、物体に結合される核酸プライマーに関しては、所謂、核酸プライマーとしての機能、すなわち、標的核酸を鋳型として、該プライマーの３’末端から、少なくとも一ヌクレオチド伸長が可能であればよい。具体的には、前記伸長反応における核酸プライマーとして利用可能な一本鎖核酸分子の例として、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチドを挙げることができる。
【００５２】
本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体を作製する際、予め標識を施した物体に対して、その表面に所望の塩基配列を有する核酸プライマーが結合された状態とする。この物体に対して、所望の塩基配列を有する核酸プライマーを結合させる方法は、物体表面に結合された核酸プライマーが、鋳型とすると標的核酸とハイブリッド体を形成し、核酸プライマーとして機能するものであれば、どのような結合方法でもかまわない。例えば、物体表面への結合方式として、共有結合、イオン結合が利用でき、さらには、物理吸着を用いることもできる。
【００５３】
核酸プライマーには、所望の塩基配列を有する一本鎖核酸分子が利用され、該プライマーの５’末端側において、直接、または、リンカーを介して間接的に、前記物体の表面に共有結合的に結合されている形態とすることができる。
【００５４】
また、本発明にかかる標識された核酸プライマー結合物体を作製する方法としては、下記する二つの形態を挙げることができる。
【００５５】
すなわち、第一の形態の作製方法は、
上記の構成を有する本発明にかかる核酸プライマー結合物体を作製する方法であって、
前記標識が付された物体表面への該核酸プライマーの結合は、
該核酸プライマーの結合がなされる物体表面に、当該核酸プライマーの塩基配列に従って、対応するモノマーを逐次的に供給し、核酸鎖を固相合成法により合成することにより行う
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の作製方法であり、
第二の形態の作製方法は、
上記の構成を有する本発明にかかる核酸プライマー結合物体を作製する方法であって、
前記標識が付された物体表面への該核酸プライマーの結合は、
当該核酸プライマーの塩基配列に従って、予め合成し、精製を行った核酸鎖を、前記物体表面に付与することにより行う
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の作製方法である。
【００５６】
従って、物体の表面に核酸プライマーを結合する手法として、所望の塩基配列に従って、物体上において、所謂、固相逐次合成によって、核酸プライマーを合成し、その末端で結合されている形態を採用することができる。固相逐次合成法は、従来から、樹脂基材を利用した核酸合成、ペプチド核酸合成に一般的に利用されている方法であり、本発明においては、微小なサイズの物体表面を基材として、この合成法を採用することができる。
【００５７】
平面状の基材を利用している、所謂、核酸チップの作製においては、例えば、米国特許第５７４４３０５号明細書には、フォトリソグラフィーと光による脱保護反応を用いて、平面状の固相基板上に、複数種の核酸プローブを合成結合する方法が記載されている。この方法では、光脱保護反応の反応効率、あるいは、全ての反応が基板上で行われ、面内における反応効率・反応速度の不均一さに起因し、所望の光脱保護反応、ならびに、塩基の付加反応が達成されず、目的とする塩基の付加が完了しない事態が、ある頻度で発生する。各塩基の伸長ステップで、目的とする塩基の欠落したものの蓄積が進むため、最終的には、基板上に目的の塩基配列中から、一つ塩基以上が欠落し、鎖長が短い核酸鎖の混入比率が相当高くなるという本質的な問題を有している。
【００５８】
一方、本発明において、核酸プライマーを結合する物体を、平面状の基板ではなく、粒子、微粒子等の微小な物体を選択した上で、各物体に対して、核酸プライマー一種類を結合させる形態を選択すれば、上記核酸合成、ペプチド核酸合成に用いられる固相自動合成機に適用可能であるとの利便性がある。加えて、固相合成は、本来、不均一系の合成反応ではあるが、微小な粒子を用いることで、広い表面積を有する平面状の固相基板を用いる場合と比較すると、反応系全体の攪拌・混合を行うことにより、反応速度、反応効率の不均一さは格段に低減される。また、反応系全体の攪拌・混合を行うことで、微小な粒子近傍における、反応試薬の消費に起因する濃度の低下を回避でき、均一系と遜色のない高反応収率、高反応速度を達成することも可能となる。その他、平面状の基板上において、複数種の核酸プライマーを固相合成する際には、それぞれの塩基配列に対応させて、逐次的な合成反応の際、光による脱保護反応を利用して、位置選択的な脱保護を行っている。それに対して、微小な粒子に対して、核酸プライマー一種類を結合させる形態では、脱保護反応自体も、均一に行うことができ、例えば、酸を利用する脱保護反応を利用することが可能となる。この酸を利用する脱保護は、基板上で光脱保護を用いる場合と比較し、その反応効率を高くすることが可能であり、結果的に、目的とする塩基配列中から、一つ塩基以上が欠落し、鎖長が短い核酸鎖の混入比率を大幅に抑制することが可能となる。
【００５９】
上記固相合成を利用して、物体表面上で直接、目的の塩基配列を有する一本鎖核酸分子を合成する際には、核酸プライマーを結合すべき物体表面に水酸基を導入した後、核酸鎖の自動合成を行うことが可能である。また、核酸プライマーがペプチド核酸である場合には、物体表面にアミノ基を導入した後、ペプチド鎖の自動合成を行うことができる。なお、物体表面へのアミノ基の導入は、例えば、アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて、物体表面にアミノ・シランカップリング剤処理を施す手法を用いてもよい。
【００６０】
この固相逐次合成法に代えて、予め合成、精製した核酸プライマーを物体表面に付与し、結合させる方法を採用することも可能である。本発明においても、混入比率は低いが、前記の固相逐次合成法によって結合される核酸プライマー中には、目的とする塩基配列中から、一つ塩基以上が欠落し、鎖長が短い核酸鎖が含まれている。一方、予め合成、精製した核酸プライマーを利用する際には、精製過程において、目的とする塩基配列と相違する核酸分子は除去されており、勿論、鎖長が短い核酸鎖もこの過程で除去されている。従って、物体表面に結合される核酸プライマーは、目的とする塩基配列を有するもののみとなる。
【００６１】
予め合成、精製した核酸プライマーを物体表面に付与し、結合させる方法には、従来から、核酸チップなど、平面状の固相基板表面に核酸プライマーを固定化する際に利用されている手法を応用することができる。例えば、物体を各種官能基（アミノ基、スルファニル基、水酸基、エポキシ基、スクシンイミドエステル基、マレイミド基、ハライド基等）を有するシランカップリング剤で処理して、所望の官能基を物体表面に導入した後、これら官能基と反応することができる官能基を有する核酸プライマーを反応させ、二つの官能基間で結合を形成する方法が利用できる。一方、シランカップリング剤処理によって、物体表面に導入される官能基と、核酸プライマーが有する官能基との間で、直接反応を起こせない場合には、この二つの官能基に対して、それぞれ反応性を有する二種の官能基を有するリンカー物質、例えば、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド（株式会社同仁化学研究所）を介在させて、リンカーを介して、核酸プライマーを物体表面に結合する形態とすることもできる。
【００６２】
従って、本発明において、予め合成、精製した核酸プライマーを物体表面に付与し、結合させる際には、核酸プライマー側に予め、この結合に利用可能な官能基を導入することが必要となる。核酸プライマー側に予め導入する官能基として、上述のように物体表面に導入された官能基と反応する官能基、あるいは、上記リンカー物質中に存在する官能基と反応する官能基を選択する。核酸プライマー側に予め導入する官能基の例として、アミノ基、スルファニル基、スクシンイミド基を挙げることができる。その際、核酸プライマーを、該プライマーの５’末端側において、物体の表面に共有結合的に結合される際には、その結合に利用される官能基を、該プライマーの５’末端に導入しておく。また、核酸プライマーがペプチド核酸の場合には、所望の塩基配列に従って、ペプチド核酸プライマーを合成する際、そのペプチド鎖のＣ末端にシステイン残基を予め導入し、該システイン残基側鎖のスルファニル基（−ＳＨ）を物体表面への結合に利用することもできる。例えば、物体表面に、先ず、アミノシランカプリング剤処理を施し、アミノ基を導入し、次いで、上記リンカー物質のＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドを、このアミノ基と反応させ、物体表面にマレイミド基を導入する。このマレイミド基と、核酸プライマーに導入されているスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させ、リンカーを介して、核酸プライマーを物体表面に結合させてもよい。
【００６３】
核酸プライマーの物体表面への結合に利用可能なイオン性結合の例として、アミノ基（−ＮＨ2）とスルファニル基（−ＳＨ）の間で形成される、−+ＮＨ3・Ｓ-−（⇔−ＮＨ2・ＨＳ−）の形態のイオン性結合を挙げることができる。イオン性結合を利用する場合には、結合形成を行う際、核酸プライマー溶液のｐＨをコントロールして、反応する官能基の電離を制御する必要がある。例えば、−+ＮＨ3とＨＳ−との間、あるいは、−ＮＨ2とＳ-−との間においては、前記の−+ＮＨ3・Ｓ-−（⇔−ＮＨ2・ＨＳ−）の形態のイオン性結合の形成は起こらず、−ＮＨ2とＨＳ−の間、あるいは、−+ＮＨ3とＳ-−の間において、かかるイオン性結合の形成が可能である。この反応する官能基の電離状態を達成できるｐＨ範囲に、核酸プライマー溶液のｐＨを調製することが必要となる。
【００６４】
本発明は、さらに、上述する構成を有する、本発明にかかる核酸プライマー結合物体の発明に加えて、標識を付されている核酸プライマー結合物体について、
その付されている標識を識別して、物体相互の判別を行う方法、すなわち、該物体に結合した核酸プライマー相互の判別を行う方法の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかる核酸プライマー結合物体の判別方法は、
上述する構成を有する、本発明にかかる標識を付されている核酸プライマー結合物体の種類、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を判別する方法であって、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて、付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、個々の核酸プライマー結合物体の種類を識別する
ことを特徴とする核酸プライマー結合物体の判別方法である。
【００６５】
その際、物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、
平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることが好ましい。特には、複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している際には、
平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることがより好ましい。
【００６６】
例えば、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、質量分析法を用いることができ、特に、好適に利用可能な質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である。また、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いることも可能である。
【００６７】
さらに本発明は、本発明にかかる標識を付されている核酸プライマー結合物体について、該核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーを特定、検出または定量する方法を提供する。
【００６８】
すなわち、本発明にかかる物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法は、
上記の構成を有する、本発明にかかる核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーの特定、検出または定量方法であって、
該物体の種類、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を、
前記標識子を用いて付されている、該物体の標識を、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき識別することにより判別し、
前記種類の判別がなされた、該物体に結合されている核酸プライマーを、該核酸プライマーには含まれ、該物体には含まれない原子、分子、あるいは物質を、該核酸プライマー由来の指標として用いて、検出または定量する
ことを特徴とする物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法である。
【００６９】
その際、物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、該物体の表面に結合する核酸プライマーに由来する指標を検出する際、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることが好ましい。特には、複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している際には、
平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることがより好ましい。
【００７０】
また、前記核酸プライマーを検出または定量する際、指標として利用可能な該核酸プライマーには含まれ、前記物体には含まれない原子、分子、あるいは物質は、核酸プライマーの種類に依存して異なる。核酸プライマーが通常の核酸鎖で構成される場合には、例えば、核酸を構成している、核酸塩基、糖、リン酸、炭素原子、リン原子、窒素原子が、指標として利用できる。特に、核酸プライマーが通常の核酸鎖で構成される場合には、前記核酸プライマーを検出または定量する際、指標として用いる、該核酸プライマーには含まれ、前記物体には含まれない原子が、リン原子であると、より好ましい態様となる。
【００７１】
一方、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記核酸プライマーに由来する指標の検出手段として、質量分析法を用いることが好ましい。特に、好適に利用可能な質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である。また、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記核酸プライマーに由来する指標の検出手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いることもできる。
【００７２】
加えて、本発明は、本発明にかかる核酸プライマー結合物体を利用して、ヌクレオチド伸長反応応用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出を行う方法も提供する。
【００７３】
本発明の第一の形態にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出方法は、
核酸プライマー結合物体を利用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型を検出する方法であって、
該標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型の検出を行う工程は、少なくとも以下の工程（１）〜（３）：
工程（１）：  上記の構成を有する本発明にかかる核酸プライマー結合物体であって、
前記標識が付されている物体の表面に結合される核酸プライマーとして、
前記標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチドと、その３’末端側の部分塩基配列とからなる領域に対して、前記単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを３’末端に含む相補的な塩基配列を有し、所定の塩基長を示す核酸鎖で構成される、少なくとも一種の核酸プライマーを選択している、少なくとも一種の核酸プライマー結合物体を用意する工程；
工程（２）：  前記検出対象の単一ヌクレオチド多型を有する標的核酸と、工程（１）で用意される少なくとも一種の核酸プライマー結合物体とを、該核酸プライマーと標的核酸との間のハイブリッド体の形成可能な条件下におき、ハイブリッド体を形成させ、
次いで、酵素的核酸鎖伸長反応を行うポリメラーゼ酵素と、該酵素的核酸鎖伸長反応において基質として使用される、少なくとも一種のヌクレオシド三リン酸と、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸とを含む酵素反応液中において、酵素的核酸鎖伸長反応可能な条件下、形成された前記ハイブリッド体に対して、前記標的核酸を鋳型として該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長を行わせ、
該核酸プライマーの３’末端側に伸長される核酸鎖中に、前記標識物質を結合したヌクレオシドを取り込ませる工程；
工程（３）：  前記核酸プライマーの３’末端側に核酸鎖の伸長がなされている、核酸プライマー結合物体について、該伸長された核酸鎖中に取り込まれている前記標識物質を結合したヌクレオシドを、前記標識物質を指標として検出することによって、該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖の伸長を検出し、
該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長が検出された、核酸プライマー結合物体について、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、当該核酸プライマー結合物体の種類を識別し、さらに、当該核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーの有する塩基配列を特定する工程；
を含む
ことを特徴とする標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法である。
【００７４】
工程（２）において、標的核酸と核酸プライマーとのハイブリッド体を形成させると、該核酸プライマーの３’末端は、標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチド部位と相対する位置となっている。核酸プライマーの３’末端の塩基と、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位の塩基とが、実際に相補的であれば、核酸プライマーの３’末端部位においても、二本鎖構造（塩基対）が構成されており、標的核酸を鋳型として、核酸鎖の伸長反応が進行する。仮に、核酸プライマーの３’末端の塩基と、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位の塩基とが、相補的でない場合には、核酸プライマーの３’末端部位においては二本鎖構造（塩基対）が形成されてなく、標的核酸を鋳型として、核酸鎖の伸長反応は進行しない。すなわち、少なくとも、１ヌクレオチドの核酸鎖の伸長が起こっていれば、核酸プライマーの３’末端の塩基と、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位の塩基とが、実際に相補的であることの証明となる。
【００７５】
この第一の形態では、核酸鎖の伸長反応において、ポリメラーゼ酵素の基質として使用される、少なくとも一種のヌクレオシド三リン酸に加えて、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸を反応液中に添加しておき、伸長される核酸鎖中に、ある頻度で、標識物質を結合したヌクレオシドを取り込ませている。実際に、伸長される核酸鎖中に標識物質を結合したヌクレオシドを取り込ませるためには、標識物質を結合したヌクレオシドは、鋳型の標的核酸中に存在する相補的なヌクレオシドと、塩基対を形成できる必要がある。換言するならば、標識物質を結合したヌクレオシドにおいて、結合されている標識物質は、塩基対の形成を阻害するものであってはならないし、また、核酸鎖の３’末端への連結を阻害するものであってはならない。この標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸を構成する、ヌクレオシド三リン酸は、前記酵素的核酸鎖伸長反応を行うポリメラーゼ酵素の種類に応じて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ（またはｄｄＵＴＰ）、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰからなる群から選択する。また、選択されたヌクレオシド三リン酸において、その塩基部上に標識物質を結合する際には、塩基対の形成を阻害しない部位にその結合位置を選択する、あるいは、元となる塩基と同等の塩基対形成能を保持するように、結合される標識物質とその結合位置を選択する必要がある。
【００７６】
また、伸長される核酸鎖の塩基配列は、標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチド部位より５’末端側に位置する塩基配列と相補的なものとなる。標的核酸の塩基配列は既に判明しており、従って、伸長される核酸鎖の塩基配列も特定できるので、この伸長される核酸鎖中に標識物質を結合したヌクレオシドが取り込まれる頻度を予測することが可能である。伸長される核酸鎖の塩基配列を考慮し、標識物質を結合したヌクレオシドが取り込まれる頻度が、所望の頻度を超えるように、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸を構成する、塩基の種類を選択することが望ましい。例えば、検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチド部位を基準として、その５’末端側の５塩基長の部分塩基配列に対して、相補的な５塩基長の塩基配列中に含まれる塩基から、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸を構成する、塩基の種類を選択することが望ましい。特に、検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチド部位を基準として、その５’末端側に隣接する塩基に対して、相補的な塩基を、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸を構成する、塩基の種類に選択することがより好ましい。
【００７７】
工程（３）においては、核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長は、伸長される核酸鎖中に取り込まれる標識物質を結合したヌクレオシドの有無に基づき、すなわち、その標識物質を指標として検出する。一方、核酸鎖伸長が起こっている核酸プライマーの種類の特定は、該核酸プライマーが結合されている物体に付されている標識を識別することによって行っている。すなわち、本発明が利用する標識方法は、多数種類の標識を行うことで可能であり、多数種の核酸プライマーを取り扱う際にも、特定の標識を付した物体に結合されている核酸プライマーの種類は、その作製時点で、１対１に対応させることが可能となっている。換言するならば、物体の表面に結合されている核酸プライマー自体の塩基配列を特定するため、核酸プライマー自体の分析を行う必要が無くなっている。
【００７８】
なお、前記核酸プライマーの３’末端側に核酸鎖の伸長がなされている、核酸プライマー結合物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、前記標識物質を検出する際、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることが好ましい。特には、
前記核酸プライマーの３’末端側に核酸鎖の伸長がなされている、核酸プライマー結合物体が位置する表面上において、
複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している際には、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることがより好ましい。
【００７９】
一方、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、質量分析法を用いることが好ましい。特に、好適に利用可能な質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である。あるいは、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いることも可能である。
【００８０】
本発明の第一の形態にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出方法では、
標識が付されている物体の表面に結合される核酸プライマーとして、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位に対応する塩基のみが異なる、複数種の核酸プライマーを、それぞれ異なる種類の物体に結合した核酸プライマー結合物体複数種を利用して、検出を行う形態とすることも可能である。その際には、核酸プライマー結合物体複数種のうち、標的核酸において、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位に実際に存在する塩基と相補的な塩基をその３’末端に有する核酸プライマー結合物体においてのみ、核酸鎖伸長が生じる。従って、複数の異なる核酸プライマーが、それぞれ結合した複数の物体に対して、該核酸プライマーからの核酸伸長反応条件下におき、前記核酸プライマーからの伸長反応が生起した核酸プライマー結合物体のみに対して、該物体の種類、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を判別する態様とすることも可能である。
また、本発明の第二の形態にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出方法は、
核酸プライマー結合物体を利用して、標的核酸の単一ヌクレオチド多型を検出する方法であって、
該標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型の検出を行う工程は、少なくとも以下の工程（１）〜（３）：
工程（１）：  上記の構成を有する本発明にかかる核酸プライマー結合物体であって、
前記標識が付されている物体の表面に結合される核酸プライマーとして、
前記標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチドに対して、その３’末端側の部分塩基配列からなる領域に対して、相補的な塩基配列を有し、所定の塩基長を示す核酸鎖で構成される、少なくとも一種の核酸プライマーを選択している、少なくとも一種の核酸プライマー結合物体を用意する工程；
工程（２）：  前記検出対象の単一ヌクレオチド多型を有する標的核酸と、工程（１）で用意される少なくとも一種の核酸プライマー結合物体とを、該核酸プライマーと標的核酸との間のハイブリッド体の形成可能な条件下におき、ハイブリッド体を形成させ、
次いで、酵素的核酸鎖伸長反応を行うポリメラーゼ酵素と、該ポリメラーゼ酵素の基質として使用可能な、それぞれ異なる標識物質を結合した４種のジデオキシヌクレオシド三リン酸；｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ｝または｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ｝の少なくとも一方とを含む酵素反応液中において、酵素的核酸鎖伸長反応可能な条件下、形成された前記ハイブリッド体に対して、前記標的核酸を鋳型として該核酸プライマーの３’末端側への核酸鎖伸長を行わせ、
該核酸プライマーの３’末端側に前記標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドを取り込ませる工程；
工程（３）：  前記核酸プライマーの３’末端側に標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドが取り込まれている、核酸プライマー結合物体について、該３’末端側に取り込まれている前記標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドを、前記標識物質を指標として検出することによって、該核酸プライマーの３’末端側に伸長されたジデオキシヌクレオシドの塩基の種類を特定し、
該核酸プライマーの３’末端側へのジデオキシヌクレオシドの取り込みが検出された、核酸プライマー結合物体について、
予め選択される複数種の原子の種類数（ｎ）と、前記選択された原子個々の含有量の有無、または含有量の水準とを利用して、少なくとも二進法ｎ桁の数値情報に相当する、含有原子の組成条件を構成した上で、
前記含有原子の組成条件を満足する組成を有する標識子を用いて当該物体に付されている標識を、
前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段を用いて、該標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別し、
該標識子の組成において満足される、前記含有原子の組成条件を判別し、対応する少なくとも二進法ｎ桁の数値情報を抽出して、
前記少なくとも二進法ｎ桁の数値情報として表記される、前記離散的な識別情報に基づき、当該核酸プライマー結合物体の種類を識別し、さらに、当該核酸プライマー結合物体に結合されている核酸プライマーの有する塩基配列を特定する工程；
を含む
ことを特徴とする標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法である。
【００８１】
工程（２）において、標的核酸と核酸プライマーとのハイブリッド体を形成させると、該核酸プライマーの３’末端は、標的核酸の塩基配列中に存在する検出対象の単一ヌクレオチド多型を示すヌクレオチド部位を基準として、その３’末端側の隣接する塩基と相対する位置となっている。核酸プライマーの３’末端の塩基と、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位の３’末端側に隣接する塩基とは、実際に相補的であるため、核酸プライマーの３’末端部位においても、二本鎖構造（塩基対）が構成されており、標的核酸を鋳型として、核酸鎖の伸長反応が開始する。すなわち、鋳型となる標的核酸中において、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位に実際に存在している塩基に対して、相補的な塩基のヌクレオチドが、先ず、該核酸プライマーの３’末端に連結される。
【００８２】
この第二の形態では、核酸鎖の伸長反応において、該ポリメラーゼ酵素の基質として使用可能な、それぞれ異なる標識物質を結合した４種のジデオキシヌクレオシド三リン酸；｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ｝または｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ｝の少なくとも一方とを含む酵素反応液中に加えている。すなわち、核酸プライマーの３’末端に、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位に実際に存在している塩基に対して、相補的な塩基を有し、標識物質が結合されているジデオキシヌクレオシドが連結される。このジデオキシヌクレオシドは、糖部分の３’位、２’位のヒドロキシ基が存在していないため、それ以降の核酸鎖の伸長は不可能となっている。すなわち、核酸プライマーの３’末端に連結されている、標識物質が結合したジデオキシヌクレオシドの塩基の種類が判明すれば、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位に実際に存在している塩基は、その相補的な塩基であると決定できる。４種のジデオキシヌクレオシド三リン酸に対して、それぞれ異なる標識物質を結合しており、標識物質を指標として、取り込まれたジデオキシヌクレオシドの塩基の種類を特定する。
【００８３】
実際に、核酸プライマーの３’末端に標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドを取り込ませるためには、標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドは、鋳型の標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型部位に実際に存在しているヌクレオシドと、塩基対を形成できる必要がある。換言するならば、標識物質を結合したヌクレオシドにおいて、結合されている標識物質は、塩基対の形成を阻害するものであってはならないし、また、核酸鎖の３’末端に対する、標識物質を結合したヌクレオシド自体の連結を阻害するものであってはならない。
【００８４】
工程（３）においては、核酸プライマーの３’末端側に連結されている、標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドの有無、その塩基種類の検出は、指標として、標識物質の種類を検出するによってなされる。一方、その標識物質が検出されている、該核酸プライマーの種類、すなわち、プローブ部分の塩基配列の特定は、該核酸プライマーが結合されている物体に付されている標識を識別することによって行っている。
【００８５】
例えば、物体表面に結合されている核酸プライマーを、固相逐次合成法によって、直接、該物体表面に上で合成する際には、目標とする塩基配列を有し、所定の塩基長の核酸プライマーが、その大半を占めているが、僅かながら、目標とする塩基配列中の塩基が欠落することによって、塩基長の短縮された一本鎖核酸分子が混入している。塩基配列の途中に、塩基の欠落を有する場合、標的核酸の塩基配列に対して、フィットする塩基長が短くなっている、また、その３’末端は、塩基対を形成できないものとなっているため、標的核酸を鋳型として、塩基長の短縮された一本鎖核酸分子の３’末端に核酸鎖伸長が起こる確率は極めて低くなっている。但し、欠落している塩基が、偶々目標とする塩基配列の３’末端である場合には、塩基長の短縮された一本鎖核酸分子は、完全にフィットする塩基配列となっており、その３’末端に核酸鎖伸長が起こる。逆に、物体表面に結合されている核酸プライマーが有する塩基配列自体は、その３’末端は、鋳型となる標的核酸の塩基と、相補的でなく、塩基対を形成できない場合、偶々、その３’末端の塩基が欠落し、塩基長の短縮された一本鎖核酸分子は、完全にフィットする塩基配列となっており、その３’末端に核酸鎖伸長が起こる。
【００８６】
このような混入している、３’末端の塩基のみが欠落し、塩基長の短縮された一本鎖核酸分子の３’末端に連結される標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドは、検出対象の単一ヌクレオチド多型部位の塩基ではなく、その３’末端側に隣接する塩基と相補的なものとなっている。このような副次的な産物と、目的とする伸長産物とは、量的な差異を有するため、検出される標識物質の相対的な検出強度を参照して、簡単に区別することができる。加えて、その標識物質が検出されている、核酸プライマーが結合されている物体に付されている標識を識別することによって、該核酸プライマーの種類、すなわち、プローブ部分の塩基配列の特定がなされるため、副次的な産物であるか、目的とする伸長産物であるか、検証を行うことができる。
【００８７】
なお、前記核酸プライマーの３’末端側にジデオキシヌクレオシドの取り込みがなされている、核酸プライマー結合物体が、平面上に位置する場合、
前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、ならびに、前記標識物質を検出する際、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることが好ましい。特には、前記核酸プライマーの３’末端側にジデオキシヌクレオシドの取り込みがなされている、核酸プライマー結合物体が位置する表面上において、
複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している際には、
少なくとも、平面上における該物体の位置を特定するため、
該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設けることがより好ましい。
【００８８】
一方、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、質量分析法を用いることが好ましい。特に、好適に利用可能な質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）である。あるいは、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段、ならびに、前記標識物質の検出手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いることも可能である。
【００８９】
本発明の第二の形態にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出方法では、
核酸プライマー結合物体に対して、標的核酸において、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位に実際に存在する塩基と相補的な塩基がその３’末端に伸長される。従って、伸長反応を行う際、酵素反応液中に含まれる、それぞれ異なる標識物質を結合した４種のジデオキシヌクレオシド三リン酸；｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ｝または｛ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ｝の少なくとも一方の内、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位に実際に存在する塩基と相補的な塩基を有するジデオキシヌクレオシドが取り込まれる。例えば、複数の異なる核酸プライマーが、それぞれ結合した複数の物体に対して、該核酸プライマーからの核酸伸長反応条件下におき、前記核酸プライマーからの伸長反応が生起した核酸プライマー結合物体のみに対して、該物体の種類、すなわち、該物体に結合されている核酸プライマーの種類を判別する態様とすることも可能である。
【００９０】
本発明にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出方法では、上記の第一の形態、第二の形態のいずれにおいても、伸長される核酸鎖中に標識物質を結合したヌクレオシドを取り込ませ、その標識物質を指標として、検出を行っている。この標識物質を結合したヌクレオシドを構成する標識物質として、通常のヌクレオチド標識に用いられている、蛍光標識を用いることが可能である。その際、蛍光標識のヌクレオシドへの結合は、鋳型とする標的核酸上の相補的な塩基と、当該ヌクレオシドとが塩基対を形成することが可能となる部位において、行うことが必要となる。すなわち、塩基対形成を阻害することなく、ヌクレオシドに蛍光標識を導入するためには、例えば、プリン塩基の８位、ピリミジン塩基の５位、あるいは、糖の２’位に対して、リンカーを介して、蛍光性物質を結合させる手法が利用できる。ポリメラーゼ酵素の基質として機能し、本来の塩基対形成能を保持している、標識物質として、蛍光性化合物を結合しているヌクレオシド三リン酸の例として、蛍光性化合物をリンカーを介して、糖の２’位に結合したものを挙げることができる。
【００９１】
核酸鎖伸長の有無、あるいは、取り込まれている標識物質を結合したヌクレオシドの種類の検出を行う際、標識物質として、ヌクレオシドに結合されている蛍光性化合物に起因する蛍光を利用する場合、蛍光顕微鏡等の蛍光検出装置によって、該蛍光性化合物の固有の蛍光を検出する方法を用いることができる。なお、標識物質を結合したヌクレオシドを取り込んだ、核酸プライマー結合物体を回収した後、この蛍光標識を検出する際、目的とする伸長産物に由来する蛍光に加えて、副次的な産物に由来する蛍光も同時に測定される場合がある。その際には、混在している蛍光性化合物に起因する蛍光強度を分離し、目的とする伸長産物に由来する蛍光を特定する解析手法を利用することが好ましい。
【００９２】
一方、上記の第一の形態においては、酵素反応液中に、標識物質として、蛍光性化合物を結合しているヌクレオシド三リン酸を複数種添加している場合には、伸長された核酸鎖中に、標識物質として、蛍光性化合物が結合されているヌクレオシドが取り込まれたものが、複数種混合している場合もある。蛍光性化合物が複数種混在する際には、例えば、一方の蛍光性化合物の発する蛍光を、他の蛍光性化合物が吸収する結果、見掛け上の蛍光強度は、混在する蛍光性化合物の相対的な量比率を反映しない場合もある。従って、混在している蛍光性化合物に起因する本来の蛍光強度を推定する解析手法を利用することが好ましい。あるいは、上記の第一の形態においては、酵素反応液中に添加される、標識物質として、蛍光性化合物を結合しているヌクレオシド三リン酸を一種類に制限することで、混在する蛍光性化合物に由来する解析上の問題を回避することも可能である。
【００９３】
通常、標識物質として、蛍光性化合物を利用している場合、蛍光顕微鏡等の蛍光検出装置によって、この蛍光標識の検出を行った後、核酸プライマーが結合されている物体に付されている標識の識別を行う順序を選択することが望ましい。なお、評価に利用できる、核酸鎖伸長反応を終え、回収された核酸プライマー結合物体の量が十分である場合には、物体に付されている標識の識別を行う測定操作と、蛍光標識の検出操作を、それぞれ小分けしたサンプルを利用して、別途に行うこともできる。また、物体に付されている標識の識別を行う測定操作を施した際、取り込まれている蛍光性化合物に何ら実質的な影響が及ばない場合には、標識の識別を行う測定操作後、蛍光標識の検出操作を行うことも可能である。
【００９４】
また、標識物質を結合したヌクレオシド三リン酸において利用可能な、別の標識物質として、ハロゲン原子、金属原子を利用して、標識を施す方法を利用することができる。標識物質として、ハロゲン原子を用いる場合、四種の塩基｛アデニン、グアニン、シトシン、チミン｝もしくは、｛アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル｝に対応して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素標識を用いれば、四種の塩基を個別に標識することが可能となる。
【００９５】
ポリメラーゼ酵素の基質として機能するヌクレオシド三リン酸に対して、金属原子を標識として導入する際、当該金属を含有する有機金属錯体、もしくは、有機金属錯体を含んだ物質を用いると導入が容易となる場合がある。
【００９６】
上記、有機金属錯体の例として、下記のルテニウム含有有機金属錯体化合物（シグマ・アルドリッチ）を用いれば、ヌクレオシド三リン酸中に存在するアミノ基を利用して、標識物質のルテニウムを導入することが可能である。
Ｂｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）−４’−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ−ｂｉｓ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
次いで、本発明おいて利用されている、物体に付されている標識子の検出方法について述べる。
【００９７】
上で説明した、予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、質量分析法を用いる態様とすることが可能である。その際、質量分析法は、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）であるとより好ましい。あるいは、前記予め選択される複数種の原子個々について、その含有量の有無、または含有量の水準を検出可能な手段として、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いる態様とすることも可能である。
【００９８】
また、物体に結合されている核酸プライマーを検出または定量する際、前記核酸プライマーに由来する指標の検出手段として、同様の分析手段を利用することができる。例えば、核酸プライマーに由来する指標として、上記の原子を選択する場合、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いて、リン原子、あるいは、結合状態に異なる炭素原子、窒素原子を検出し、核酸プライマーの定量を行うこともできる。さらには、該核酸プライマーの３’末端に伸長される核酸鎖の有無を検出する際、この伸長される核酸鎖に存在する標識物質を検出する手法として、該標識物質の種類によっては、同様の分析手段を利用することができる。例えば、伸長される核酸鎖に存在する標識物質として、ハロゲン原子、金属原子を利用する場合には、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）またはオージェ電子分光法（ＡＥＳ）を用いて、ハロゲン原子、金属原子を検出し、標識物質の定量を行うこともできる。
【００９９】
なお、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＸＰＳ、またはＡＥＳを利用する場合、これらの分析手法は二次元的な拡がりを有する測定対象の分析にも適用可能であり、例えば、物体が、平面上に位置する場合、前記標識子の有する組成中における、前記予め選択される複数種の原子に関して、該原子個々の含有量の有無、または含有量の水準を識別する際、平面上における該物体の位置を特定する目的で、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける態様とすることが可能である。特に、複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している場合、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングすることにより、前記複数の物体が位置する領域を特定することが好ましい。
【０１００】
さらには、本発明にかかる物体に結合した核酸プライマーの特定、検出または定量方法においても、標識を付されている核酸プライマー結合物体が、平面上に位置する場合、少なくとも、平面上における該物体の位置を特定する目的で、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける態様とすることが可能である。特に、複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している場合、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングすることにより、前記複数の物体が位置する領域を特定することが好ましい。
【０１０１】
また、本発明にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法においても、核酸鎖伸長を行った後、核酸鎖伸長に伴い、標識物質を結合したヌクレオシドが取り込まれた、核酸プライマー結合物体を回収し、平面上に配置して、検出を行う場合がある。標識物質を結合したヌクレオシドが取り込まれた、核酸プライマー結合物体が、平面上に位置する場合、少なくとも、平面上における該物体の位置を特定する目的で、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングする工程を更に設ける態様とすることが可能である。特に、複数の物体が、同じ平面上の異なる領域に位置している場合、該物体が位置する平面上を、二次元イメージングすることにより、前記複数の物体が位置する領域を特定することが好ましい。
【０１０２】
本発明にかかる核酸プライマー結合物体物体に関して、上述する種々の測定手段を利用して、例えば、標識物質、物体自体を検出する場合、あるいは、本発明にかかる核酸プライマー結合物体を平面状に配置して検出する場合、その配置方法としては、物体が微粒子状であれば、核酸プライマー結合物体を含む分散液を紙に含浸後、分散溶媒を乾燥させる方法、微粒子が磁性微粒子であれば、平面状の磁石に磁力によって吸着させる方法、あるいは、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ２８４，  ２０００，  ｐ．  ４５２に記載の方法、例えば、グラスファイバーの先端表面にフォトリソグラフィーを利用して、微粒子の外径に概略相当する内径を有するホールを形成して、微粒子を埋め込む方法等を用いることができる。
【０１０３】
物体に付されている標識の識別等に利用される検出装置について、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを例にして、本発明に必要な検出装置の性能について説明する。本発明で利用している標識子は、複数種の原子によって構成されており、利用されている各原子の質量は高々１００である。これら複数種の原子を弁別する上で必要となる質量分解能はΔ（ｍ／ｚ）＝１であり、基本的には、飛行時間分解能は、１ｍｓ（マスユニット）あれば十分である。
【０１０４】
核酸プライマーあるいは標識物質の検出、特定、定量を行う際にも、その指標として利用される、原子、分子（原子団）、あるいは物質（断片）についても、その質量上限は高々数１００であり、質量分解能はΔ（ｍ／ｚ）＝１であり、飛行時間分解能も、１ｍｓ（マスユニット）あれば十分である。
【０１０５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは、高質量（ｍ／ｚ）の物質の測定、高い質量分解能（Δｍ／ｚ）の測定を行う際には、より長いフライトチューブと、高速一次イオン速度、二次イオン引出しのための高電圧等を必要となる。それに伴って、装置は大型化し、また、高価であり、ランニングコストも高いものとなる。
【０１０６】
一方、本発明においては、測定対象の質量（ｍ／ｚ）上限は、高々数１００であり、質量分解能（Δｍ／ｚ）、飛行時間分解能も、１程度であり、その性能は、比較的に小型な装置で達成でき、全体的に、低いコストで、検出を行うことが可能となる。
【０１０７】
以下に、本発明を更に詳しく説明する。
【０１０８】
本発明において利用されている、物体の標識方法では、対象とする物体に付す標識子は、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無、あるいは、含有量の水準で示される、組成中に内在する情報を利用している。具体的には、予め選択される複数種（ｎ種）の原子として、例えば、互いに異なるｎ種の元素から、それぞれ一種の原子を選択した上、各原子に関して、含有の有無（二水準）を変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の一つは含まれる組成の種類総数ＮTOTAＬは、ＮTOTAL＝ΣｎＣｍ＝２n−１（１≦ｍ≦ｎ、ｍ、ｎは正の整数）となる。あるいは、各原子に関して、その含有量を、例えば、「微少量、少量」の二段階（二水準）で変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子は含まれ、その含有量の違いを有する組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝２nとなる。
【０１０９】
一方、予め選択される複数種（ｎ種）の原子に関して、その含有量を、例えば、「含有無し、微少量、少量」の三段階（三水準）で変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の一つは含まれる組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝３n−１となる。
【０１１０】
更には、予め選択される複数種（ｎ種）の原子のうち、特定の原子１種に関しては、その含有量を、例えば、「含有無し、微少量、少量」の三段階（三水準）で変え、残る（ｎ−１）種の原子に関しては、含有の有無（二水準）を変えると、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の一つは含まれる組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝３×（２n−１）−１となる。前記の態様は、形式的には、予め選択される複数種（ｎ種）の原子の全てに関して、例えば、「含有無し、微少量、少量」の三段階（三水準）の指標を設定した上、特定の原子１種に関しては、その含有量を、三段階（三水準）の指標に対応させて、変えるが、残る（ｎ−１）種の原子に関しては、三段階（三水準）の指標中、「含有無し、少量」の二種の指標のみを選択することに対応している。つまり、設定可能な組成の種類総数ＮTOTAL＝３n−１のうち、その部分集合の｛３×（２n−１）−１｝種類を選別して、利用する態様に相当する。このように、予め選択される複数種（ｎ種）の原子に関して、その含有量を三段階（三水準）以上の区分に分け、選択肢の多様化を図ることで、例えば、含有量をＭ段階（Ｍ水準）に区分する際には、｛Ｍn−１｝種類に達するまで、組成の種類総数ＮTOTALの範囲を拡張することも可能である。
【０１１１】
以上に説明するように、対象とする物体に付す標識子として、予め複数種の原子を選択し、この種類数（ｎ）の原子に関して、それぞれ含有の有無、あるいは、含有量の水準で示される、組成中に内在する情報を利用することで、少なくとも、予め選択される複数種（ｎ種）の原子に関する、含有量を変化させるのみで、前記のＮTOTAL＝２n−１に達する種類の標識を付与することを可能としている。例えば、前記のＮTOTAL＝２n−１に達する種類の標識は、予め選択される複数種（ｎ種）の原子を各桁に対応させた際、少なくとも二進法ｎ桁の数値に対応したものとなっている。
【０１１２】
また、対象とする物体に付す標識子は、組成中に内在する情報を利用するので、予め選択する原子の種類数（ｎ）は、目的とする標識種類の総種類数に応じて、適宜選択することが望ましい。例えば、予め選択する原子の種類数（ｎ）を５以上とすると、含有の有無、あるいは、含有量の水準を指標として、少なくとも、組成の種類総数ＮTOTALは、ＮTOTAL＝｛２5−１｝以上、つまり、目的とする標識種類の総種類数として、３１種類以上に適用が可能となる。例えば、各種細菌の単一ヌクレオチド多型の検出に際して、個々の細菌に特有な遺伝子情報、例えば、ｒＲＮＡの塩基配列が利用可能である。このｒＲＮＡの塩基配列に対応する、ゲノム遺伝子上のコード領域の判定には、多種の塩基配列を有するＤＮＡ核酸プライマーを使用する必要がある。より具体的には、伸長反応を利用した感染症起炎菌の一ヌクレオチド多型の検出では、利用されるＤＮＡ核酸プライマーの種類は、３１種類を大きく上回ることも少なくない。その場合、各ＤＮＡ核酸プライマーを固定化する微粒子状の基材に、本発明にかかる標識方法を適用して、予め選択する原子の種類数（ｎ）を８以上とすることによって、２５５以上の種類の標識を付すことが可能である。また、ヒトのゲノム遺伝子中に見出されている単一ヌクレオチド多形は、２５５種類を大きく超えた種類が報告されており、個々の単一ヌクレオチド多型の検出に利用されるＤＮＡ核酸プライマーについて、その固定化に利用する微粒子状の基材に付す標識によって、区別を行うことが望ましい。例えば、予め選択する原子の種類数（ｎ）を１２以上とすると、４０９５以上の種類の標識を付すことが可能であり、ヒトのゲノム遺伝子中に見出されている一ヌクレオチド多型の相当部分に対応する標識が提供可能である。更には、予め選択する原子の種類数（ｎ）を１６以上とすると、６５５３５以上の種類の標識を付すことが可能であり、例えば、ヒトのゲノム中に存在する全遺伝子に対応する、膨大な数のＤＮＡ核酸プライマーそれぞれに、独自の標識が提供可能である。このように、本発明にかかる標識方法では、目的とする標識種類の総種類数に対応させて、標識情報の表現に利用される、予め選択する原子の種類数（ｎ）を適正に増減させることができ、多種の核酸プライマーに対して、その固定化に利用される微粒子状の基材に対して付与される標識子によって、相互の弁別を行うなど、極めて広範なアプリケーションへ対応可能な拡張性を有している。
【０１１３】
例えば、特開平１−９５８００号公報に開示する手法では、各ＤＮＡ核酸プライマーを固定化するマイクロビーズに関して、個別の金属元素一種を利用して、標識された粒子とすることで、蛍光Ｘ線を用いて該金属元素一種を分析し、各ＤＮＡ核酸プライマーの種類を特定する手法が開示されている。この標識方法は、標識子として、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｔｉ等の一種類の金属元素を、一文字の標識情報として利用する形態である。従って、本発明において利用されている標識方法のように、予め選択される複数種（ｎ種）の原子を利用して、その含有量水準を指標として、例えば、二進法ｎ桁の数値情報に対応する標識情報の表記を行う技術とは、その技術的思想が異なったものである。また、特開平７−８３９２７号公報に開示する手法では、複数種の無機蛍光物質を利用して、核酸プライマー分子を固定化する超微粒子体を作製し、かかる無機蛍光物質個々に特徴的な蛍光を観測して、各核酸プライマー分子の種類を特定する手法が開示されている。この標識方法では、標識子として、複数種の無機蛍光物質個々に特徴的な蛍光を、一文字の標識情報として利用する形態である。従って、本発明において利用されている標識方法のように、予め選択される複数種（ｎ種）の原子を利用して、その含有量水準を指標として、例えば、二進法ｎ桁の数値情報に対応する標識情報の表記を行う技術とは、その技術的思想が異なったものである。
【０１１４】
より詳細に、技術的思想の特徴を説明するならば、本発明において利用されている標識方法においては、見掛け上は、予め５種類の原子を選択して、標識化に利用している形態であっても、その本質は、予め選択される複数種（ｎ種）の原子として、例えば、１６種類を選択した上、各原子をそれぞれ対応する桁に割付を行い、例えば、二進法１６桁の数値情報に対応させた上、その内、５種類の原子のみを任意に選択して、その含有の有無を指標とする部分集合として、｛２5−１｝種類を利用するものである。すなわち、予め十分に広い適用範囲へと拡張可能な形態であるが、その応用範囲に応じて、その一部の部分集合を利用しているものである。
【０１１５】
一方、本発明において利用されている物体の標識方法では、標識子として、特定の原子に関する含有量の情報を利用可能な限り、物体自体の形状、サイズは任意に選択できる。例えば、核酸プライマーの固定化に利用される微粒子を対象とする場合、針状、棒状、凹凸がある等の不定形微粒子、また、球状、方形等の定形微粒子とすることが好適である。その他、核酸プライマーの固定化に利用される基材として、繊維状、シート状の物体とする際にも、本発明にかかる物体の標識方法を好適に適用できる。加えて、核酸プライマーの固定化に利用される微粒子の材質を、磁性体とすることも可能であり、かかる磁性体微粒子の形態を選択すると、各種核酸プライマー分子を固定化した状態で、液相中から磁力を利用した分離操作を適用可能となる。また、上述のように、微粒子を磁石表面に配置することも可能となる。
【０１１６】
なお、核酸プライマーの固定化に利用される基材は、液相中に均一に分散可能なサイズとすることが望ましい。すなわち、液相中での分散性に利する、微細なサイズが通常選択され、例えば、微粒子においては、その粒径に相当するサイズを、１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択することが望ましい。また、基材が繊維状、または、片々の形態である場合、その縦、横、高さの少なくとも二方向のサイズを、１ｎｍ〜１０μｍの範囲に選択することが望ましい。その他、検出に際して、サイトメトリー法を応用する計数を利用する上では、前記サイズ下限を１００ｎｍ以上に選択することが好ましい。
【０１１７】
例えば、本発明において利用されている物体の標識方法を、核酸プライマー分子の固定化に利用可能な微粒子へ適用する際、この微粒子自体を構成する材質について、その組成を種々に変化させ、予め選択される複数種（ｎ種）の原子について、その含有の有無、あるいは、含有量の水準が異なるものとし、標識を施す形態を採用することができる。所望の組成比に調整した原材料を混合、焼成、粉砕する乾式法、所望の組成比に調整した溶液から、複数種の原子を含む共沈物を得る共沈法、原材料を溶解、噴霧熱分解、解砕する噴霧分解法が利用可能である。例えば、特開昭６４−５１３２２号公報に開示される、酸化物超電導材微粒子の製造方法を利用して、予め選択される複数種（ｎ種）の金属原子について、酸化物の形態で含有される酸化物微粒子として、形成することが可能である。また、特開２００２−１２８５２３号公報に開示される、共沈法を利用するフェライト粒子の製造方法を利用して、予め選択される複数種（ｎ種）の金属原子について、かかる複数の金属元素を含んだフェライト粒子として、形成することが可能である。
【０１１８】
更には、種々の材料で形成される核微粒子に対して、被覆層を付加した被覆微粒子を構成し、前記被覆層の材質について、その組成を種々に変化させ、予め選択される複数種（ｎ種）の原子について、その含有の有無、あるいは、含有量の水準が異なるものとし、標識を施す形態を採用することができる。例えば、核微粒子として、ガラス、プラスティック、シリコン、金属等の粒子を用いて、下記する手段によって、所望の組成を有する被覆層形成することができる。例えば、乾式法として、真空蒸着、イオンプレーティング、スパッタリング等のＰＶＤ（物理的気相堆積）法、あるいは、ＣＶＤ（化学的気相堆積）法、特開平０７−０５３２７１号公報に開示される気中分散法を適用した被覆層形成が利用できる。さらには、被覆層に代えて、所望の元素をイオン注入法を用いて、核微粒子の表面から導入し、その表面部の組成を変更して、表面層を形成することもできる。
【０１１９】
なお、本発明において利用されている物体の標識方法において、標識子を構成する組成成分中に含有させる、予め選択される複数種（ｎ種）の原子は、その種類の特定が高い確度で行え、また、その含有量を再現性良く測定可能である限り、特に制限はない。但し、対象とする物体自体に要求される性能、例えば、磁性体特性を保持する観点では、利用可能な元素に一定の制限がある。加えて、製造方法によっては、原理的に利用できない元素も存在する。従って、対象とする物体自体に要求される性能と、製造方法を考慮した上で、適宜、利用する複数種（ｎ種）の原子を選択するとこが好ましい。その際、例えば、典型金属元素、遷移金属元素のうちから、前記条件を満足するものを選択することが好ましい。
【０１２０】
一例として、利用する複数種原子の組み合わせの例として、例えば、８種の場合には、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、１２種の場合には、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄ、また、１６種の場合には、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｖ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈの組み合わせを挙げることができる。
【０１２１】
本発明にかかる標識を付された物体を分析、検出する方法としては、本発明による物体の標識方法、すなわち、標識子として利用される、予め選択される複数種の原子について、その含有の有無、あるいは、その含有量の水準を識別可能な手段であれば、いかなる分析方法も利用可能である。例えば、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）等の質量分析法、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、オージェ電子分光法（ＡＥＳ）を好適に用いることができる。さらに、二次元イメージング可能なこれらの方法を用いれば、複数の異なる粒子が二次元状に存在する場合の検出法として、利用することも可能である。
【実施例】
【０１２２】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる実施例に示す形態に限定されるものではない。
【０１２３】
（実施例１）
特開２００２−１２８５２３号公報に記載されるフェライト微粒子の製造方法に基づき、２価の鉄イオンを必須成分として含有し、その他、目的とするフェライトを構成する種々の金属元素イオンを添加した溶液を利用し、酸化剤を利用して、２価の鉄イオンを３価の鉄イオンへ酸化して、フェライト微粒子を調製する。調製されるフェライト微粒子は、主要成分の鉄イオン以外に、前記原料溶液中に添加する金属元素イオンの種類、添加濃度を選択することで、主成分金属元素の鉄に加えて、種々の金属元素を所望の含有比率で含むフェライト材質となる。
【０１２４】
本実施例では、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子、ならびに、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を調製する。すなわち、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子は、前記８種の金属元素中、含有される金属元素の種類によって、（２8−１）種＝２５５種に分類される。更に、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を加えて、調製されるフェライト微粒子は、その組成中における、該金属元素８種個々の含有の有無に基づき、合計２５６種に分類される。
【０１２５】
なお、本実施例においては、フェライト微粒子の作製時に利用する、複数の金属元素イオンを含む溶液中では、微量成分として添加される各金属元素イオンの濃度は同一とした。また、最終的に作製されるフェライト微粒子の粒子径は、おおよそ５００  ｎｍであった。
【０１２６】
調製されたフェライト微粒子は、各反応液から分離し、超純水で洗浄する。なお、反応液からの回収分離、洗浄後の回収等、フェライト微粒子の回収・分離操作では、磁石を用いてフェライト粒子を集める手法を利用している。合計２５６種の、洗浄済フェライト微粒子は、それぞれ超純水に懸濁し、分散濃度約５．５ｍｇ／ｍＬ（約５００粒子／μＬ）の懸濁液とする。
【０１２７】
得られるフェライト微粒子懸濁液、合計２５６種から、それぞれ約１μｌを採取し、混合した後、一旦含まれるフェライト微粒子集め、１００μＬの純水に再懸濁し、この再懸濁液１μＬをコピー紙上にスポッティングして乾燥する。次いで、前記コピー用紙を適宜切り取り、各スポッティング部分について、存在しているフェライト微粒子中に含有される金属元素組成を測定する。この例では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置（ＩＯＮ−ＴＯＦ社製：ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  IV）、ＸＰＳ装置（日本電子社製：ＪＰＳ−９２００）、ＡＥＳ装置（日本電子社製：ＪＡＭＰ−９５００Ｆ）を利用し、三種の測定手法によって、それぞれ、各スポッティング部分を含む領域を二次元イメージングしながら、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの９種の金属元素に由来するスペクトルの測定を行う。
【０１２８】
二次元イメージングの結果、三種の測定手法のいずれにおいて、各スポッティング部位から、主成分金属元素に由来するスペクトルに基づき、各フェライト微粒子存在領域（スポット領域）のイメージが得られる。同時に、それぞれのフェライト微粒子中に含有される、微量成分金属元素に由来するスペクトルに関しても、他の成分金属元素に起因する干渉を受けず、少なくとも微量成分金属元素：Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの個々に特徴的なスペクトルが測定可能であることが確認される。すなわち、フェライト微粒子中に含まれる主成分金属元素Ｆｅに対して、配合可能な微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素を選択し、該８種金属元素の含有の有無によって、二進法８桁の数値情報に相当する標識を付すことで、合計２５６種（２8種）のフェライト微粒子を判別可能であることが確認される。
【０１２９】
次いで、上記２５６種のフェライト微粒子のうち、「Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」及び「Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」で標識された、それぞれ、Ａ粒子、Ｂ粒子の二種について、以下の工程により、その表面にオリゴヌクレオチドプライマーを結合する。
【０１３０】
ステップ（１）：エタノール洗浄
適当量の微粒子を０．５ｍｌのマイクロチューブに取り、エタノール１００μｌを加えて振盪・攪拌後、上述の磁石を利用したセパレーターを用いてエタノールを除き、微粒子を回収する。
【０１３１】
ステップ（２）：アミノ基の導入
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−（β−アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解する。次いで、この溶液１００μｌ中に、上記（１）の処理を施した微粒子を室温で１時間浸漬する。この浸漬処理後、純水で洗浄し、微粒子を回収後、乾燥させる。次に、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークすることで、最終的に、前記シランカップリング剤処理を施した微粒子表面には、アミノ基が導入される。
【０１３２】
ステップ（３）：リンカーを介した、マレイミド基の導入
Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１混合溶媒９ｍｌ中に溶解し、濃度０．３ｍｇ／ｍｌの溶液を調製する。シランカップリング剤処理を施した微粒子を、このＥＭＣＳ溶液の１００μｌ中に、室温で２時間浸漬して、シランカップリング剤処理によって微粒子表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳ中のスクシンイミドエステル基とを反応させる。この反応の結果、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が形成され、微粒子表面は、リンカー（−（ＣＨ2）5−ＣＯ−ＮＨ−）を介して、ＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入されたものとなる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた微粒子は、前記ＤＭＳＯ／エタノール混合溶媒、及びエタノールで順次洗浄した後、減圧下、乾燥させる。
【０１３３】
ステップ（４）：核酸プライマー用の一本鎖ＤＮＡの調製
配列番号：１及び配列番号：２の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ分子二種の合成は、ＤＮＡ合成業者（株式会社ベックス）に依頼している。なお、それぞれの一本鎖ＤＮＡの５’末端には、合成時に、チオールモディファイア（グレンリサーチ社）を利用することによって、スルファニル基（−ＳＨ）を導入する。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製には、ＨＰＬＣを用いる。
【０１３４】
配列番号：１
５’  ＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−  ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ  ３’
配列番号：２
５’  ＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−  ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡ  ３’
なお、配列番号：１は、市販の一本鎖核酸分子  Ｍ１３ｍｐ１８（シグマ・アルドリッチ）の６２９０番目のヌクレオチドから６３０７番目のヌクレオチドまでの部分塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列であり、配列番号：２は、配列番号：１の３’末端が、ＴからＡに変異された塩基配列である。
【０１３５】
ステップ（５）：微粒子表面への核酸プライマーの結合
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、上記一本鎖ＤＮＡ二種を濃度８μＭでそれぞれ溶解し、二種の溶液を調製する。この溶液各１００μｌ中に、（３）で調製される、表面にマレイミド基が導入されている微粒子を、室温下１時間浸漬して、微粒子表面のマレイミド基と、一本鎖ＤＮＡの５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させる。この二つの官能基間の反応によって、一本鎖ＤＮＡは、その５’末端で、リンカーを介して、微粒子表面上に結合される。その後、一本鎖ＤＮＡが結合された微粒子を、一本鎖ＤＮＡ溶液中から回収し、残余する一本鎖ＤＮＡ溶液をリン酸緩衝液で適宜洗浄して、除去する。洗浄を終えた後、一本鎖ＤＮＡが結合された微粒子は、リン酸緩衝液中に分散させ、次に使用するまで、リン酸緩衝液中、４℃で保存する。
【０１３６】
なお、Ａ粒子の表面には、配列番号：１のＤＮＡプライマーが、Ｂ粒子の表面には、配列番号：２のＤＮＡプライマーが、それぞれ結合されている。
【０１３７】
この核酸プライマー結合微粒子を純水で適宜洗浄、回収、減圧乾燥した後、上述の方法に基づきＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって観察する。その結果、二種にフェライト微粒子について、それぞれ標識子としての原子に加えて、一本鎖核酸のリン酸部位のフラグメント・イオンであるＰＯ-、ＰＯ2-、ＰＯ3-の各イオン、及び塩基のフラグメント・イオンが強く観察される。観察される上記一本鎖核酸由来のフラグメント・イオンのなかでは、ＰＯ2-、ＰＯ3-が特に強く観察される。また、一本鎖核酸を微粒子表面に結合する際、一本鎖ＤＮＡ溶液中の核酸濃度、０．０５μＭ〜１５０μＭの範囲で種々に変えて、それぞれ、表面に結合されている一本鎖ＤＮＡの面密度が相違する核酸プライマー結合粒子を作製する。この表面に結合されている一本鎖ＤＮＡの面密度が相違する核酸プライマー結合粒子について、同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳで、一本鎖核酸由来のＰＯ2-、ＰＯ3-イオンについて観察したところ、一本鎖ＤＮＡ溶液中の核酸濃度が０．１５μＭ〜４０μＭの範囲では、核酸濃度に直線的に比例したイオン強度が観察される。
【０１３８】
以上の結果により、本発明にかかる、原子による標識子を付与された核酸プライマー結合微粒子に関して、該微粒子に付されている標識の識別、それ基づく、該微粒子表面に結合されている核酸プライマー種類の判別が可能であることが検証される。さらには、該核酸プライマー由来のフラグメント・イオンを指標として、微粒子表面に結合された状態で、核酸プライマーの検出が可能であり、さらには、微粒子表面に結合されている核酸プライマーの量（面密度）に関しても、相対的ではあるが、定量が可能であることが検証される。
【０１３９】
次に、上記微粒子に結合した核酸プライマーを用いて、モデル標的核酸の一本鎖核酸Ｍ１３ｍｐ１８を鋳型として、核酸プライマーの３’末端へのヌクレオチド伸長反応を行う。
【０１４０】
【化１】
0004771521.tif 000002
【０１４１】
すなわち、市販のＰＣＲ増幅キットを利用し、上記二種の核酸プライマー結合微粒子それぞれについて、１００ｎｇのＭ１３ｍｐ１８  ＤＮＡ（シグマ・アルドリッチ）と、各核酸プライマー結合微粒子の適当量、および、四種のデオキシヌクレオシド三リン酸（シグマ・アルドリッチ：各１０μＭ）含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーに対して、９６℃（３０ｓｅｃ）、５０℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４ｍｉｎ）の温度サイクルを２５回繰り返して、伸長反応（ｓｓＰＣＲ：一本鎖ＰＣＲ）を行う。なお、通常、アデニン、グアニン、シトシン、チミンのデオキシヌクレオシド三リン酸を使用するが、ここでは、チミンのデオキシヌクレオシド三リン酸に代えて、２’−デオキシウリジン三リン酸を用い、さらに、標識物質が結合されたデオキシヌクレオチド三リン酸として、臭素標識ヌクレオチドの一種である、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン三リン酸（シグマ・アルドリッチ）を、２’−デオキシウリジン三リン酸に対して、その１／１０の濃度で加えている。
【０１４２】
伸長反応後、各反応液中のフェライト微粒子を、純水で適宜洗浄、回収、減圧乾燥する。その後、上述の方法により、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって、標識物質が結合されたデオキシヌクレオシド三リン酸中の標識物質（Ｂｒ）に由来するイオンを観察する。Ａ粒子からは、標識子として含有される各原子イオンの他に、伸長反応で導入された、上記Ｂｒ−ｄＵＴＰ由来の臭素イオン（79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオン）が検出される。一方、Ｂ粒子からは、標識子として含有される各原子イオンは検出されるが、臭素イオンは検出されない。すなわち、Ｂ粒子の表面に結合されている配列番号：２の一本鎖ＤＮＡでは、その３’末端の一ヌクレオチドが相違しており、鋳型と塩基対形成がなされない結果、３’末端への伸長反応が生起していないことが確認される。
【０１４３】
以上に述べた本実施例の結果は、本発明の第一の形態にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法を適用することで、標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型の検出が可能であることを査証する結果となっている。
【０１４４】
（実施例２）
本実施例２においては、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素に、さらに、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの４種の金属元素を加えた、合計１２種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子、ならびに、これら１２種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を調製する。すなわち、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの１２種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子は、前記１２種の金属元素中、含有される金属元素の種類によって、（２12−１）種＝４０９５種に分類される。更に、これら１２種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を加えて、調製されるフェライト微粒子は、その組成中における、該金属元素１２種個々の含有の有無に基づき、合計４０９６種に分類される。
【０１４５】
なお、本実施例においても、フェライト微粒子の作製時に利用する、複数の金属元素イオンを含む溶液中では、微量成分として添加される各金属元素イオンの濃度は同一とした。但し、主成分金属元素のＦｅ含有量に対する、前記１２種の金属元素個々の含有量は、実施例１における比率の８／１２に低下させている。また、最終的に作製されるフェライト微粒子の粒子径は、おおよそ５００ｎｍであった。
【０１４６】
調製されたフェライト微粒子は、各反応液から分離し、超純水で洗浄する。なお、反応液からの回収分離、洗浄後の回収等、フェライト微粒子の回収・分離操作では、磁石を用いてフェライト粒子を集める手法を利用している。合計４０９６種の、洗浄済フェライト微粒子は、それぞれ超純水に懸濁し、分散濃度約５．５ｍｇ／ｍＬ（約５００粒子／μＬ）の懸濁液とする。
【０１４７】
得られるフェライト微粒子懸濁液、合計４０９６種から、それぞれ約１μｌを採取し、混合した後、一旦含まれるフェライト微粒子集め、１００μＬの純水に再懸濁し、この再懸濁液１μＬをコピー紙上にスポッティングして乾燥する。次いで、実施例１と同様の測定手順・条件において、前記コピー用紙を適宜切り取り、各スポッティング部分について、存在しているフェライト微粒子中に含有される金属元素組成を測定する。
【０１４８】
本実施例２のフェライト微粒子に関しても、二次元イメージングの結果、三種の測定手法のいずれにおいて、各スポッティング部位から、主成分金属元素に由来するスペクトルに基づき、各フェライト微粒子存在領域（スポット領域）のイメージが得られる。同時に、それぞれのフェライト微粒子中に含有される、微量成分金属元素に由来するスペクトルに関しても、他の成分金属元素に起因する干渉を受けず、少なくとも微量成分金属元素：Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの個々に特徴的なスペクトルが測定可能であることが確認された。すなわち、フェライト微粒子中に含まれる主成分金属元素Ｆｅに対して、配合可能な微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの１２種の金属元素を選択し、該１２種金属元素の含有の有無によって、二進法８桁の数値情報に相当する標識を付すことで、合計４０９６種（２12種）のフェライト微粒子を判別可能であることが確認された。
【０１４９】
以上の結果から、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、選択可能な金属元素の種類数を更に増した際、この多数種の金属元素の何れについても、各種の検出手段を適用して、金属元素個々に特徴的なスペクトルを測定し、その含有量の評価が可能である限り、フェライト微粒子に付すことが可能な標識の種類を増すことが可能であることが検証される。
【０１５０】
次いで、上記４０９６種のフェライト微粒子のうち、「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ」及び「Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄ」で標識された、それぞれＣ粒子、Ｄ粒子二種について、本実施例では、エポキシ基を有するシランカップリング剤、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ４０３（信越化学工業）を用いて、グリシジル基（２，３−エポキシプロピル基）を導入する。このシランカップリング剤処理の条件等は実施例１と同様である。表面にグリシジル基（２，３−エポキシプロピル基）が導入されたフェライト微粒子は、純水洗浄後、回収し、減圧乾燥する。
【０１５１】
一方、各粒子表面へ結合させる核酸プライマーとして、５’末端にスルファニル基（−ＳＨ）が導入されている、下記の配列番号：３、配列番号：４の一本鎖ＤＮＡを、それぞれ、核酸自動合成機により、逐次合成する。脱保護、精製等は通常の合成プロトコールに従う。
【０１５２】
配列番号：３
５’  ＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−  ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ  ３’
配列番号：４
５’  ＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−  ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣ  ３’
なお、配列番号：３は、一本鎖核酸Ｍ１３ｍｐ１８の６２９１番目のヌクレオチドから６３０７番目のヌクレオチドまでの塩基配列に完全相補的な塩基配列、配列番号：４は、配列番号：３の３’末端がＧからＣに変異されている塩基配列である。なお、Ｃ粒子の表面には、配列番号：３のＤＮＡプライマーを、Ｄ粒子の表面には、配列番号：４のＤＮＡプライマーを、グリシジル基（２，３−エポキシプロピル基）とスルファニル基（−ＳＨ）との間の反応によって、結合する。
【０１５３】
作製された核酸プライマー結合微粒子二種について、実施例１と同様の方法により、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、二種の微粒子について、それぞれ、標識子として含有されている各原子に加えて、一本鎖ＤＮＡのリン酸部位のフラグメント・イオンであるＰＯ-、ＰＯ2-、ＰＯ3-の各イオン、ならびに塩基のフラグメント・イオンが強く観察される。観察される一本鎖ＤＮＡ由来のフラグメント・イオンのなかでは、ＰＯ2-、ＰＯ3-が特に強く観察される。
【０１５４】
なお、本実施例で言及した４０９６種のフェライト微粒子には、任意の核酸プライマーを結合して、該核酸プライマーと特異的に結合する標的物質の検出に用いることができる。
【０１５５】
次に、上記微粒子に結合した核酸プライマーを用いて、モデル標的核酸の一本鎖核酸Ｍ１３ｍｐ１８を鋳型として、核酸プライマーの３’末端に対して、一ヌクレオチド伸長反応を行う。
【０１５６】
【化２】
0004771521.tif 000003
【０１５７】
すなわち、市販のＰＣＲ増幅キットを利用し、上記二種の核酸プライマー結合微粒子それぞれについて、１００ｎｇのＭ１３ｍｐ１８  ＤＮＡ（シグマ・アルドリッチ）と、各核酸プライマー結合微粒子の適当量、および、標識物質を結合したジデオキシヌクレオシド三リン酸として、５−ブロモ−２’，３’−ジデオキシウリジン三リン酸（Ｂｒ−ｄｄＵＴＰ：１０μＭ）含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーに対して、９６℃（３０ｓｅｃ）、５０℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４ｍｉｎ）の温度サイクルを２５回繰り返して、伸長反応（ｓｓＰＣＲ：一本鎖ＰＣＲ）を行う。
【０１５８】
伸長反応後、各反応液中のフェライト微粒子を、純水で適宜洗浄、回収、減圧乾燥する。その後、上述の方法により、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって、標識物質が結合されたジデオキシヌクレオシド三リン酸中の標識物質（Ｂｒ）に由来するイオンを観察する。Ｃ粒子からは、標識子として含有される各原子イオンの他に、伸長反応で導入された、上記Ｂｒ−ｄｄＵＴＰ由来の臭素イオン（79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオン）が検出される。一方、Ｄ粒子からは、標識子として含有される各原子イオンは検出されるが、臭素イオンは検出されない。すなわち、Ｄ粒子の表面に結合されている配列番号：２の一本鎖ＤＮＡでは、その３’末端の一ヌクレオチドが相違しており、鋳型と塩基対形成がなされない結果、３’末端への伸長反応が生起していないことが確認される。
【０１５９】
以上に述べた本実施例の結果は、本発明の第二の形態にかかる標的核酸の単一ヌクレオチド多型の検出方法を適用することで、標的核酸中に存在する単一ヌクレオチド多型の検出が可能であることを査証する結果となっている。
【０１６０】
（実施例３）
本実施例３においても、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子、ならびに、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を調製する。なお、本実施例３においては、フェライト微粒子の作製時に利用する、複数の金属元素イオンを含む溶液中では、微量成分として添加される各金属元素イオンの濃度に関して、ＮｉとＺｎの二種については、実施例１と同一の濃度と、その１／１０濃度の二つの水準を用いた。
【０１６１】
すなわち、少なくとも、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素から選択される１種以上の金属元素を添加するフェライト微粒子は、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの６種の金属元素中、含有される金属元素の種類（場合の数２6）、ならびに、ＮｉとＺｎの二種に関する含有量の水準（各三水準：０、１／１０、１）の差違（場合の数３2）によって、（２6×３2−１）種＝５７５種に分類される。更に、これら８種の金属元素はいずれも添加されていないフェライト微粒子を加えて、調製されるフェライト微粒子は、その組成中における、該金属元素８種個々の含有量の水準に基づき、合計５７６種（２6×３2種）に分類される。なお、本実施例においても、最終的に作製されるフェライト微粒子の粒子径は、おおよそ５００ｎｍであった。
【０１６２】
得られるフェライト微粒子懸濁液、合計５７５種から、それぞれ約１μｌを採取し、コピー紙上にスポッティングして乾燥する。次いで、実施例１と同様の測定手順・条件において、前記コピー用紙を適宜切り取り、各スポッティング部分について、存在しているフェライト微粒子中に含有される金属元素組成を測定する。
【０１６３】
本実施例３のフェライト微粒子に関しても、二次元イメージングの結果、三種の測定手法のいずれにおいて、各スポッティング部位から、主成分金属元素に由来するスペクトルに基づき、各フェライト微粒子存在領域（スポット領域）のイメージが得られる。同時に、それぞれのフェライト微粒子中に含有される、微量成分金属元素に由来するスペクトルに関しても、他の成分金属元素に起因する干渉を受けず、少なくとも微量成分金属元素：Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｇ、Ｐｄの個々に特徴的なスペクトルが測定可能であること、加えて、ＮｉとＺｎの二種に関する含有量水準の相違も明確に判別可能であることが確認された。すなわち、フェライト微粒子中に含まれる主成分金属元素Ｆｅに対して、配合可能な微量成分金属元素として、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの８種の金属元素を選択し、該８種金属元素の含有量水準の差違によって、二進法８桁の数値情報を超え、例えば、二進法６桁と三進法２桁からなる数値情報に相当する標識を付すことで、合計５７６種（２6×３2種）のフェライト微粒子を判別可能であることが確認された。
【０１６４】
以上の結果から、フェライトを構成する主成分金属元素の鉄に加えて、微量成分金属元素として、選択可能な金属元素の種類数（ｎ）に対して、このｎ種の金属元素の何れについても、各種の検出手段を適用して、金属元素個々に特徴的なスペクトルを測定し、その含有の有無のみでなく、含有量の複数水準（水準数Ｍ）の評価が可能である限り、例えば、Ｍ進法ｎ桁の数値情報に相当する標識をフェライト微粒子に付すことが可能であることが検証される。
【０１６５】
次いで、上記５７６種のフェライト粒子のうち、「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」の８原子のＮｉ原子について、非含有、実施例１と同一の濃度と、その１／１０濃度の二つの水準、計三種の微粒子について、以下の方法により核酸核酸プライマーを結合する。
【０１６６】
実施例１と全く同様の方法により、アミノ・シランカップリング剤、及びＥＭＣＳによる処理を行い、微粒子表面にマレイミド基を導入する。さらに、０．５ｍｇ／ｍｌの１−チオグリセロール（シグマ・アルドリッチ）水溶液を作製し、この１００μｌに上記三種のフェライト微粒子の適量を浸漬して、微粒子表面に水酸基を導入する。
【０１６７】
上記三種のフェライト微粒子の表面に導入した水酸基に対して、核酸自動合成機により、核酸鎖を逐次合成して、下記の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡが、その５’末端で微粒子表面に結合している核酸プライマー結合微粒子を調製する。
【０１６８】
配列番号：１
５’    ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ    ３’
配列番号：２
５’    ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡ    ３’
配列番号：５
５’    ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ    ３’
なお、実施例１に述べたように、配列番号：１は、市販の一本鎖核酸分子  Ｍ１３ｍｐ１８（シグマ・アルドリッチ）の６２９０番目のヌクレオチドから６３０７番目のヌクレオチドまでの部分塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列であり、配列番号：２は、配列番号：１の３’末端が、ＴからＡに変異された塩基配列である。また、配列番号：５は、ポリＡ配列に対して、ハイブリダイズ可能なポリＴ配列に相当する。
【０１６９】
作製された核酸プライマー結合微粒子三種について、実施例１と同様の方法により、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置で観察したところ、三種の微粒子について、それぞれ、標識子として含有されている各原子が検出され、特に、Ｎｉ原子に関しては、その含有濃度の差違に対応して、三水準のイオン強度が検出されている。加えて、一本鎖ＤＮＡのリン酸部位のフラグメント・イオンであるＰＯ-、ＰＯ2-、ＰＯ3-の各イオン、ならびに塩基のフラグメント・イオンが強く観察される。なお、配列番号：５の核酸プライマーを結合した微粒子からは、塩基由来のフラグメント・イオンとして、チミン由来のフラグメント・イオンのみが観察されている。核酸プライマー結合微粒子三種の何れにおいても、観察される一本鎖ＤＮＡ由来のフラグメント・イオンのなかでは、ＰＯ2-、ＰＯ3-が特に強く観察される。
【０１７０】
以上の結果により、本発明にかかる、原子による標識子を付与された核酸プライマー結合微粒子に関して、該微粒子に付されている標識の識別、それ基づく、該微粒子表面に結合されている核酸プライマー種類の判別が可能であることが検証される。特に、該微粒子に付されている標識において、含有される原子の濃度について、その濃度水準を明確に区別可能な三水準に設定することにより、含有される原子の濃度水準を十分に高い確度で識別できる点も確認されている。さらには、該核酸プライマー由来のフラグメント・イオンを指標として、微粒子表面に結合された状態で、核酸プライマーの検出が可能であり、さらには、微粒子表面に結合されている核酸プライマー中に含まれる塩基の種類に関しても、場合によっては、実際に検出することも可能である点も検証される。
【０１７１】
なお、上記の固相逐次合成法を適用して、微粒子表面上に直接一本鎖ＤＮＡを合成することで作製される核酸プライマー結合微粒子に関しては、その核酸プライマーは、一部塩基が欠落した、塩基長の短縮された一本鎖ＤＮＡを含まれる。一方、所望の塩基配列を有する核酸プライマーが相当量存在していることは、実際に、標的核酸を鋳型として、上記実施例２に記載の一ヌクレオチド伸長により取り込まれる標識物質を結合したジデオキシヌクレオシドの量を定量することで確認が可能である。
【０１７２】
また、上述の合計５７６種の微粒子に対して、個別に、別種の核酸プライマーを結合させることも可能である。
【０１７３】
（実施例４）
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １８，  ４３８，  ２０００には、ヒト口腔扁平上皮癌のふたつのセルライン、ＨＳＣ４とＨＳＣ５のゲノムＤＮＡのエキソン７の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドチップの作製と、このチップを用いての、上記エキソンから誘導された蛍光標識核酸の検出に関して記載されている。
【０１７４】
本実施例では上記ゲノムを用いて、オリゴヌクレオチド核酸プライマーを結合したフェライト微粒子を用いた伸長反応により一ヌクレオチド多型を検出する。
【０１７５】
以下に具体的な手順について述べる。
【０１７６】
配列番号：６
５’  ＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡ    ３’
配列番号：７
５’  ＨＳ−（ＣＨ２）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴ    ３’
上記ＨＳＣ４のエキソン７の塩基配列の一部（コドンＮｏ．２４８を含む部分）に相補的な塩基配列を有し、５’末端に微粒子への結合のためのスルファニル基（−ＳＨ）を担持した、配列番号：６の一本鎖核酸を核酸プライマーとして、実施例１と同様に合成する。配列番号：６が、完全に相補的であるのに対して、標的核酸の塩基配列に対して一塩基ミスマッチ部位（下線を付す部位）を有する、配列番号：７の一本鎖核酸も合成する。
【０１７７】
実施例１のＣｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉの原子群で標識を施された２５６種のフェライト微粒子から「Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｔｉ」、および、「Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ａｌ」で標識された、それぞれＥ粒子、Ｆ粒子を選択する。Ｅ粒子、Ｆ粒子の表面に、実施例１と同様の方法でマレイミド基が導入し、配列番号：６、配列番号：７の一本鎖核酸を、それぞれ結合する。作製された核酸プライマー結合フェライト微粒子二種について、粒子に付されている標識の判別と、各粒子表面に結合されている核酸プライマーの確認は、実施例１に記載の手法により行う。
【０１７８】
配列番号：８
Ｅ７Ｓ：  ５’−ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴ−３’  （ｅｘｏｎ７，  ｓｅｎｓｅ）
配列番号：９
Ｅ７Ａ：  ５’−ＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＣ−３’  （ｅｘｏｎ７，  ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）
次に、市販のＰＣＲ増幅キットを利用し、上記配列番号：１０、１１のＰＣＲ核酸プライマー（株式会社ベックスに合成依頼）を用いて、ＨＳＣ４のゲノムからエキソン７の部分をＰＣＲ反応で増幅する。すなわち、２０ｎｇのゲノムＤＮＡと各０．４μＭのセンス核酸プライマーＥ７Ｓ、アンチセンス核酸プライマーＥ７Ａを含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーを、９４℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４５ｓｅｃ）のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲ増幅を行う。得られる増幅産物の鎖長は、１７１ヌクレオチドと設計されている。
【０１７９】
次に、実施例１と同様の方法により、上記二種の核酸プライマー結合粒子それぞれについて、上記増幅産物を鋳型として、各核酸プライマー結合粒子の適当量と、標識物質が結合されたデオキシヌクレオチド三リン酸として、Ｂｒ−ｄＵＴＰを利用して、伸長反応（ｓｓＰＣＲ：一本鎖ＰＣＲ）を行う。
【０１８０】
伸長反応後、各反応液中のフェライト微粒子を、純水で適宜洗浄、回収、減圧乾燥する。その後、上述の方法により、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置によって、標識物質が結合されたデオキシヌクレオシド三リン酸中の標識物質（Ｂｒ）に由来するイオンを観察する。Ｅ粒子からは、標識子として含有される各原子イオンの他に、伸長反応で導入された、上記Ｂｒ−ｄＵＴＰ由来の臭素イオン（79Ｂｒ-、81Ｂｒ-イオン）が検出される。一方、Ｆ粒子からは、標識子として含有される各原子イオンは検出されるが、臭素イオンは検出されない。すなわち、Ｆ粒子の表面に結合されている配列番号：７の一本鎖ＤＮＡでは、その３’末端の一ヌクレオチドが相違しており、３’末端では、鋳型の標的核酸と塩基対形成がなされていない結果、３’末端への伸長反応が生起していないことが確認される。
【０１８１】
これらより、本発明の核酸プライマー結合微粒子により、実際の細胞ゲノム由来の遺伝子の一ヌクレオチド多型が、モデル系ではあるが、より実際に近い系で検出されることが知れる。
【０１８２】
なお、本実施例で言及した２５６種のフェライト微粒子には、任意の核酸プライマーを結合して、一ヌクレオチド多型の検出に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
本発明にかかる標識された物体上に結合されている核酸プライマーを利用することで、例えば、多種のバイオアッセイに利用される、核酸プライマー分子を表面に固定化した微細な粒子状の基体に、各核酸プライマーの種類、塩基配列に対応して、容易に識別可能な標識多数種をそれぞれ付与された、微粒子固定型核酸プライマー分子の提供が可能となる。換言するならば、本発明が利用する標識方法は、核酸プライマー分子を固定化する微細な粒子状の基体に対して、付される標識の種類を極めて多数種とすることが可能であり、該標識付きの微粒子表面に所定の核酸プライマー分子を固定化することで、微粒子固定型の多数種の核酸プライマー分子に対して、核酸プライマー分子個々の種類判別に利用可能な標識が付されたものとできる。例えば、バイオアッセイで利用される核酸プライマー分子の種類が多数に上る場合も、その核酸プライマー分子それぞれを、その固定化に利用する微細な粒子状の基体に付されている標識を識別することで、誤り無く特定することが可能となる。
【配列表】
0004771521000001.app