(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される糖脂質。
【化１】
0004722386.tif 000007
（式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、ＲＣＯはマンノースとマンニトールとの構成要素のうち、マンノースの２位及び３位の水酸基とエステル結合をしており、ｎは２であり、マンノースの残りの水酸基にはアセチル基が結合していてもよい。）
【請求項２】
ＲＣＯが炭素数６〜２０の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする請求項１記載の糖脂質。
【請求項３】
ＲＣＯが炭素数６〜２０の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする請求項１記載の糖脂質。
【請求項４】
ＲＣＯが炭素数６〜２０の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする請求項１記載の糖脂質。
【請求項５】
ＲＣＯが、炭素数６〜１８の飽和脂肪族アシル基と炭素数８〜１２の不飽和脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする請求項１記載の糖脂質。
【請求項６】
シュードジーマ属に属する微生物を培養し、その培養物から得られたことをと特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の糖脂質。
【請求項７】
微生物がＴＭ−４５３であることを特徴とする請求項６記載の糖脂質。
【請求項８】
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール又は４モノ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール。
【請求項９】
シュードジーマ属に属する微生物を培養し、その培養物から糖脂質を回収することを特徴とする請求項１記載の糖脂質の製造方法。
【請求項１０】
微生物がＴＭ−４５３であることを特徴とする請求項９記載の糖脂質の製造方法。
【請求項１１】
生産培地に炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を加えることを特徴とする請求項９又は１０記載の糖脂質の製造方法。
【請求項１２】
生産培地に炭素数６〜２４の脂肪酸を加えることを特徴とする請求項９又は１０記載の糖脂質の製造方法。
【請求項１３】
生産培地に炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを加えることを特徴とする請求項９又は１０記載の糖脂質の製造方法。
【請求項１４】
生産培地に炭水化物を加えることを特徴とする請求項９又は１０記載の糖脂質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なマンノースとマンニトールを構成要素とする二糖類と脂肪酸が結合した糖脂質及びその発酵製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）を利用してきたが、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、界面活性剤の生産量は飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となった。しかしながら、その使用量の拡大につれて環境汚染が広がってきた。そこで、安全性が高く、環境に対する負荷を低減するために生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれていた。
【０００３】
現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。この内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母による多くの種類の物質が報告されている。
【０００４】
ラムノリピッドは、結核菌の抗生物質としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス  アエルジノーサ）（緑膿菌）の培養液から最初に発見された（非特許文献１参照）。以来、これまでにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属の細菌から４種類の同族体が報告され、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
【０００５】
ソホロースリピッドは、Ｃａｎｄｉｄａ（以前はＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（キャンデダ  ボンビコーラ）の培養液から発見された（非特許文献３参照）。これ以外に、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａも生産し、脂肪酸の結合様式によりラクトン型と線状型の２種類が報告されている。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献４及び５参照）。
【０００６】
トレハロースリピッドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）等の細胞表層物質として発見された。類似の物質が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属細菌からも報告されている（非特許文献６参照）。一般に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ロドコッカス  エリスロポリス）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献７参照）。
【０００７】
マンノシルエリスリトールリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ（ウスチラゴ  ヌーダ）とＳｈｉｚｏｎｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍａ（シゾネラ  メラノグラマ）から発見された（非特許文献８及び９参照）。その後、イタコン酸生産の変異株であるＣａｎｄｉｄａ属酵母（特許文献１及び非特許文献１０参照）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（キャンデダ  アンダークチカ）（非特許文献１１及び１２参照）、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ（クルツマノマイセス）属（非特許文献１３参照）等の酵母が生産することを報告している。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている。
【０００８】
セロビオースリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ（ウスチラゴ  マイディス）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献１４及び１５参照）、オリゴ糖リピッドは、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）ことが報告されている。
【０００９】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及を図るためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、２０数種類と少なく、新規のバイオサーファクタントの発見が望まれている。
【００１０】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【非特許文献１】エフ．ジー．ジャービス（Ｆ．Ｇ．Ｊａｒｖｉｓ），エム．ジョンソン（Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ），「ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイティ（Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．
【非特許文献２】エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），ディ．ウルブラント（Ｄ．Ｗｕｌｌｂｒａｎｄｔ）「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．
【非特許文献３】ピー．エー．ゴーリン（Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎ），ジェイ．エフ．ティ．スペンサー（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ），エイ．ピー．ツロテェ（Ａ．Ｐ．Ｔｕｌｌｏｃｈ），「カナデアン  ジャーナル  オブ  ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻,ｐ８４６−８５５（１９６１）．
【非特許文献４】エイ．エム．ダビラ（Ａ．Ｍ．Ｄａｖｉｌａ），アール．マークバル（Ｒ．Ｍａｒｃｂａｌ），ジェイ．ピー．バンデカテーレ（Ｊ．−Ｐ．Ｖａｎｄｅｃａｔｅｅｌｅ），「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４７巻，ｐ４９６−５０１（１９９７）．
【非特許文献５】エイチ．ジェイ．ダニエル（Ｈ．−Ｊ．Ｄａｎｉｅｌ），エム．リュッシ（Ｍ．Ｒｅｕｓｓ），シー．シィルダック（Ｃ．Ｓｙｌｄａｔｋ），「バイテクノロジー  レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．
【非特許文献６】エヌ．コサリック（Ｎ．Ｋｏｓａｒｉｃ），ダブリュ．エル．ケルン（Ｗ．Ｌ．Ｃａｉｒｎｓ），エヌ．シー．シー．グレイ（Ｎ．Ｃ．Ｃ．Ｇｒａｙ），「バイオサーファクタント  アンド  バイオテクノロジー（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャル  デッカー  インコーポレーション  ニューヨーク（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８７）．
【非特許文献７】ジェイ．エス．キム（Ｊ．−Ｓ．Ｋｉｍ），エム．ポワラ（Ｍ．Ｐｏｗａｌｌａ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ），エイチ．ランスドルフ，ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），「ジャーナル  オブ  バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．
【非特許文献８】アール．エイチ．ハスキンス（Ｒ．Ｈ．Ｈａｓｋｉｎｓ），ジェイ．エイ．トーン（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｒｎ），Ｂ．Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ，「カナデアン  ジャーナル  オブ  ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，１巻，ｐ７４９−７５６（１９５５）．
【非特許文献９】ジー．デム（Ｇ．Ｄｅｍｌ），ティ．アンケ（Ｔ．Ａｎｋｅ），エフ．オーバーウインカー（Ｆ．Ｏｂｅｒｗｉｎｋｌｅｒ），ビー．エム．ジアネッティー（Ｂ．Ｍ．Ｇｉａｎｎｅｔｔｉ），ダブリュ．ステグリッチ（Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ），「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９巻，ｐ８３−８７（１９８０）．
【非特許文献１０】ティ．ナカハラ（Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ），エイチ．カワサキ（Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ），ティ．スギサワ（Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ），ワイ．タカモリ（Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ），テイ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ），「ジャーナル  オブ  ファーメンテーション  テクノロジー（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（日本），日本発酵工学会，６１巻，ｐ１９−２３（１９８３）．
【非特許文献１１】ディ．キタモト（Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ），エス．アキバ（Ｓ．Ａｋｉｂａ），シー．ヒオキ（Ｃ．Ｈｉｏｋｉ），ティ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ）「アグリカリチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，５４巻．ｐ３１−３６（１９９０）．
【非特許文献１２】エイチ．エス．キム（Ｈ．−Ｓ．Ｋｉｍ），ビー．ディ．ユーン（Ｂ．−Ｄ．Ｙｏｏｎ），ディ．エイチ．チョン（Ｄ．−Ｈ．Ｃｈｏｕｎｇ），エイチ．エム．オー（Ｈ．−Ｍ．Ｏｈ），ティ．カツラギ（Ｔ．Ｋａｔｓｕｒａｇｉ），ワイ．タニ（Ｙ．Ｔａｎｉ）「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５２巻，ｐ７１３−７２１（１９９９）．
【非特許文献１３】角川（Ｋ．ｋａｋｕｋａｗａ），玉井（Ｍ．Ｔａｍａｉ），今村（Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａ），宮本（Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ），三好（Ｓ．Ｍｉｙｏｓｈｉ），森永（Ｙ．Ｍｏｒｉｎａｇａ），鈴木（Ｏ．Ｓｕｚｕｋｉ），宮川（Ｔ．Ｍｉｙａｋａｗａ）「バイオサイエンス，バイオテクノロジー  アンド  バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，６６巻，ｐ１８８−１９１（２００２）．
【非特許文献１４】ビー．フラッツ（Ｂ．Ｆｒａｕｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｒｇｎｅｒ）「バイオテクノロジー  レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，（オランダ），クルーワー  アカデミック  パブリッシャー（ＫＬＵＷＥＲ  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ），８巻，ｐ７５７−７６２（１９８６）．
【非特許文献１５】エス．スペンサー（Ｓ．Ｓｐｏｅｃｋｎｅｒ），ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），エム．ニミッツ（Ｍ．Ｎｉｍｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．
【非特許文献１６】イー．ボルブレクト（Ｅ．Ｖｏｌｌｂｒｅｃｈｔ），ユー．ラウ（Ｕ．Ｒａｕ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「フェット／リピッド（Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．）」，１０１巻，ｐ３８９−３９４（１９９９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つ糖脂質等のバイオサーファクタントを、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、新規のバイオサーファクタントとなる糖脂質及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、バイオサーファクタントは、自然界に広く存在する微生物自身が生存するために生産している物質であって、今までに発見されてきたバイオサーファクタント生産微生物は、自然界から分離されているという事実に基づき、日本各地から各種の試料を採取し、バイオサーファクタントを生産する微生物を分離し培養方法を検討することにより、新規な糖脂質を得ることを知見し、本発明をなすに至ったものである。
【００１３】
従って、本発明は下記発明を提供する。
［１］．下記式（１）で表される糖脂質。
【化１】
0004722386.tif 000002
（式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、ＲＣＯはマンノースとマンニトールとの構成要素のうち、マンノースの２位及び３位の水酸基とエステル結合をしており、ｎは２であり、マンノースの残りの水酸基にはアセチル基が結合していてもよい。）
［２］．ＲＣＯが炭素数６〜２０の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［３］．ＲＣＯが炭素数６〜２０の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［４］．ＲＣＯが炭素数６〜２０の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［５］．ＲＣＯが、炭素数６〜１８の飽和脂肪族アシル基と炭素数８〜１２の不飽和脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［６］．シュードジーマ属に属する微生物を培養し、その培養物から得られたことをと特徴とする［１］〜［５］のいずれかに記載の糖脂質。
［７］．微生物がＴＭ−４５３であることを特徴とする［６］記載の糖脂質。
［８］．４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール又は４モノ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール。
［９］．シュードジーマ属に属する微生物を培養し、その培養物から糖脂質を回収することを特徴とする［１］記載の糖脂質の製造方法。
［１０］．微生物がＴＭ−４５３であることを特徴とする請求項［９］記載の糖脂質の製造方法。
［１１］．生産培地に炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を加えることを特徴とする請求項［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
［１２］．生産培地に炭素数６〜２４の脂肪酸を加えることを特徴とする［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
［１３］．生産培地に炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを加えることを特徴とする［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
［１４］．生産培地に炭水化物を加えることを特徴とする［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、シュードジーマ（Ｐｓｅｕｄｚｙｍａ）ｓｐ．ＴＭ−４５３の培養物から、新規構造である糖脂質（マンノシルマンニトールリピッド）を得ることができ、この糖脂質はバイオサーファクタントとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
糖脂質
本発明の糖脂質は、下記式（１）で表される糖脂質である。
【００１６】
【化２】
0004722386.tif 000003
（式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、マンノースとマンニトールとの構成要素のうちマンノースのいずれかの水酸基とエステル結合をしており、残りの水酸基にはアセチル基が結合していてもよい。ｎは１〜３を示す。）
【００１７】
上記式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、マンノースとマンニトールとの構成要素のうちマンノースのいずれかの水酸基とエステル結合をしており、下記式の構造となって結合する。
【化３】
0004722386.tif 000004
【００１８】
ＲＣＯとしては、炭素数６〜２０の直鎖飽和脂肪族アシル基、炭素数６〜２０の直鎖不飽和脂肪族アシル基、炭素数６〜２０の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることが好ましい。
【００１９】
本発明の糖脂質は、界面張力の低下能を有する新規構造のバイオサーファクタントであり、たとえば、シュードジーマ属の酵母、より好ましくはシュードジーマ  ｓｐ．ＴＭ−４５３の培養によって得ることができる。前記シュードジーマ  ｓｐ．ＴＭ−４５３は、本発明者らによって分離された新規酵母であり、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センター（ＮＩＢＨ）に平成１５年５月９日に寄託（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３９）されている。
【００２０】
本発明の微生物は、本発明者が自然界に存在するものから、検索して新たに単離したものである。
【００２１】
シュードジーマ属ｓｐ．ＴＭ−４５３（ＮＩＢＨ：受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３９）の菌学的性質は、次の通りである。なお、この菌は，１９９９年に、富山県の名称不明の樹木の葉より分離されたものである。
【００２２】
（ａ）各培地における生育状態
ｉ．ＹＭ液体培地
３０℃で５日間培養後の細胞は，卵円形あるいは円筒形で、その大きさは１〜５×２〜２０μｍで、単独、鎖状で存在している。菌糸の生成が認められる。皮膜及び沈殿物の生成が認められる。
ｉｉ．ＴＭ寒天培地
３０℃での培養では，２日後は白色であるが、１０日後には薄いピンク色となる。
ｉｉｉ．ＹＭ寒天培地によるガラススライド培養
仮性菌糸、真正菌糸の形成が認められる。細胞は，円筒形のものが多く認められ，鎖状で存在している。
（ｂ）生理的性質
ｉ．生育できる範囲
ｐＨ２〜７、温度１０〜３７℃
ｉｉ．窒素化合物の利用
硝酸塩及び硫酸アンモニウムを利用できる。亜硝酸塩の利用は弱い。
ｉｉｉ．ビタミンの要求性：なし
ｉｖ．油脂を分解する。
ｖ．尿素を分解する。
ｖｉ．ウレアーゼ活性あり。
ｖｉｉ．菌体外ＤＮａｓｅ活性あり。
ｖｉｉｉ．ｐ−ニトロフェニル−α、Ｄ−グルコシドを分解する。
ｉｘ．ｐ−ニトロフェニル−β、Ｄ−グルコシドを分解する。
ｘ．糖の発酵性
Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、ショ糖、麦芽糖、乳糖の全てを発酵しない。
（Ｃ）利用する糖
Ｄ−グルコース、ショ糖、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、乳糖、Ｌ−ラムノース、サリシン、メリビオース、ラフィノース、イノシトール
（Ｄ）ｒＤＮＡシーケンス
ｒＤＮＡのＩＴＳ領域（ＩＴＳ５及びＩＴＳ４プライマー使用）の塩基配列を解析し，日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースとの比較により、シュードジーマ属と良く一致した。
【００２３】
微生物のスクリーニング方法
１）培養
多様な微生物の存在が予想される、例えば、植物の葉、花、果実、木の樹液、ため池の水、土壌等の試料を全国から採取する。収集した試料を糖脂質を生産する微生物が優先的に成育できる培地、例えば、大豆油等の植物油脂、オクタデカンのような炭化水素を炭素源とした液体培地に加えて培養する。炭素源以外の培地成分としては、たとえば、北本ら（北本  大：油化学、４１，８３９頁、１９９２年）が使用した培地を改変して使用することができる。本スクリーニング法において好適に用いられる培地の組成を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0004722386.tif 000005
【００２５】
表１に示す液体培地１及び２の培地に試料を加えて、２８〜３２℃で３〜７日間振とう培養する。培養液が白濁したものについて、表１に示す寒天平板上に画線して２８〜３２℃で培養する。培養液が白濁する原因は、大豆油が微生物が生産するリパーゼによって分解されて、脂肪酸が遊離してくる、あるいは炭素源を資化して菌体が増殖したことによるものであり、疎水性の炭素源を細胞内に取り込むためにバイオサーファクタントを生産している可能性が高いと考えられる。寒天平板上に生育したコロニーを釣菌し、再度寒天平板上に画線し、同条件で培養する。顕微鏡観察を行ってコンタミネーションが無くなるまで、この操作を繰り返して微生物を単離する。単離した微生物を再び、表１の液体培地１及び２の入った試験管に接種して、同条件で振とう培養する。
【００２６】
２）糖脂質成分の抽出
糖脂質の存在を確認するために、培養液が白濁したものについて酢酸エチルを加えて糖脂質等の脂質成分を抽出し、エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去する。得られた脂質成分を２Ｎ（Ｎは（１０3ｍｏｌ／ｍ3）／ｚ：ｚはイオンの電荷数、以下同じ）のトリフルオロ酢酸を用いて加水分解して、単糖、脂肪酸等の単位成分に分解する。分解物について高速液体クロマトグラフィーを用いて糖の有無を調べる。糖の存在が認められた菌株について表２に示した液体培地４の入った５００ｍＬ容の坂口フラスコに接種して、２６〜３２℃で１週間振とう培養する。培養終了後、酢酸エチルを加えて脂質成分を抽出し、エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去し、２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解する。分解物についてガスクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析する。脂質成分をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬及びローダミン６Ｇ試薬で糖脂質の存在を確認する。さらに、保持時間（試料をチャージした位置からスポットの中心までの距離／試料をチャージした位置から展開溶液の最高到達点までの距離）を既存の糖脂質の一種であるマンノシルエリスリトールリピッド、ソホロリピッドと比較する。
【００２７】
糖組成の分析及び保持時間の比較の結果、新規の糖脂質の存在が予想される菌株について、例えば表２の組成の液体培地３が４〜６ｍＬ入った試験管に１白金耳接種し、２６〜３２℃で１〜３日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、２６〜３２℃で１〜３日間培養を行った。これを例えば表２の液体培地４が１．４Ｌ入った２．５Ｌ容のジャーファメンターに接種して、２６〜３２℃、通気量１〜２Ｌ／分、撹拌速度６００〜１０００ｒｐｍで１〜２週間培養する。
【００２８】
【表２】
0004722386.tif 000006
【００２９】
培養終了後、等容積量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルをエバポレーターを用いて留去し、脂質成分を回収する。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：酢酸エチル溶液（４：１）、アセトン、メタノールの順で溶出させる。各溶液をＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬及びローダミン６Ｇ試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得た。得られた糖脂質成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離する。
【００３０】
糖脂質の構造決定法
本発明の糖脂質は、以下のようにしてその構造を決定する（構造決定のための糖脂質は、シュードジーマ  ｓｐ．ＴＭ−４５３株を用いて大豆油を炭素源として培養したものについて説明する）。単離した脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、オルシノール硫酸試薬で赤紫色に呈色し、ローダミン６Ｇ試薬でも陽性を示したことから糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析において、擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+  ｍ／ｚ７３１と７５７が検出された（図１−１）。
【００３１】
１）糖組成の解析
糖脂質の糖組成をメチルグリコシド−ＴＭＳ誘導体化法を用いてガスクロマトグラフィーで解析したところ、マンノースとマンニトールが等モル量ずつ検出された（図２）。
ついで、アルカリ（ＫＯＨ）でケン化して得られた糖鎖を完全メチル化してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行ったところ、マンノシールマンニトールの完全メチル化物に相当する擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+  ｍ／ｚ４９３が検出された（図１−３）。さらにこのメチル糖の加水分解物の解析では、等モルの非還元末端マンノースと６−モノ置換マンニトールが検出された（図３）。糖鎖の結合様式は、完全メチル化物の1Ｈ−ＮＭＲ解析により、マンノースのアノメリックプロトン（Ｈ−１）の結合定数からβ−結合であることが確認できた（図４）。以上の結果から、この糖脂質の糖鎖部分の構造は、６−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシール−ｍｅｓｏ−マンニトールであると確認した。
【００３２】
２）脂質組成の解析
一方、脂質部分の組成は、糖脂質を塩酸メタノールでメタノリシスし、ヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析したところ、Ｃ８とＣ１０の直鎖飽和脂肪酸とＣ１０の不飽和脂肪酸が主成分として検出された。
【００３３】
３）脂肪酸成分の結合部位の解析
この糖脂質を、過ヨウ素酸で処理し、酢酸酸性条件下で水素化シアノホウ素ナトリウムで還元して得られた過ヨウ素酸酸化糖脂質は、分子量で１２０の低下が認められた（図１−２）。生成物の組成分析において、糖成分としてマンノースのみが検出され、さらに上述のすべての脂肪酸成分の存在が確かめられた。従って、過ヨウ素酸酸化によりマンニトールが分解されたこと、糖脂質の脂肪酸成分は、すべてマンノースに結合していることが確認された。マンノース残基上の脂肪酸の結合位置の同定は、この過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲによる解析で行った。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖のＨ−２〜Ｈ−６のプロトンは３．５ｐｐｍ付近にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本糖脂質においても脂肪酸の結合によると考えられる低磁場シフトした４つのプロトンシグナルが観測され、それぞれのシグナルは、マンノース残基の各プロトンＨ−２；５．５０３ｐｐｍ、Ｈ−３；５０５４、Ｈ−４；５．２２２、Ｈ−６；４．１９８ｐｐｍと同定できた（図５）。このことから、この糖脂質は、４分子のアシル基が結合していると同定できる。さらに、２．０８１ｐｐｍと２．０１５ｐｐｍに２分子のアセチル基（−ＣＯＣＨ3）の存在を示すシグナルが、そして２．４２２ｐｐｍと２．２０１ｐｐｍに２分子の−ＣＯＣＨ2−の存在を示すシグナルが観測されたことから、マンノースに結合している４分子のアシル基は、２分子が酢酸で、そして残りの２分子が脂肪酸であると同定できる。
【００３４】
さらに、ＨＭＢＣ（1Ｈ−ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）解析において、Ｈ−４とＨ−６のプロトンシグナルが、アセチル基由来のカルボニル基のシグナル（１７０．４ｐｐｍと１７１．６ｐｐｍ）とそれぞれカップリングしていることが認められたことから、マンノースの４位と６位には酢酸がエステル結合していることが証明された（図６）。以上のことから、本糖脂質の構造は、４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール（マンノシールマンニトールリピッド、以下ＭＭＬ）と同定できた。このＭＭＬのマススペクトルで検出された分子イオンのピークから脂肪酸の組成を考えると、７３１のピークはＣ８：０とＣ１０：０の脂肪酸が、そして７５７のピークはＣ１０：１とＣ１０：０の脂肪酸が各１分子ずつ、マンノースの２位と３位にエステル結合していると同定できる。さらに、これらの菌体が生産するＭＭＬには、アセチル基の数とその結合位置の異なる成分も存在していることを認められた。
【００３５】
マンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）の製造方法
マンノシルマンニトールリピッドを生産する能力を有する微生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。現時点では、シュードジーマ（Ｐｓｕｄｏｚｙｍａ）ＴＭ−４５３株本菌株は、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センター（ＮＩＢＨ）に２００３年５月９日に寄託（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３９））のみがマンノシルマンニトールリピッド生産菌と確認されているが、本発明者らはこの菌株以外にも多数のマンノシルマンニトールリピッド生産菌を保有しており、今後、生産菌の種類は増加するものと考えられる。
【００３６】
前記シュードジーマ  ｓｐ．ＴＭ−４５３株の培養に用いる培地には特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができ、酵母に対して一般に用いられる培地、たとえば、ＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇ）を使用することができるが、炭素源を培地に入れることが好ましい。生育可能なｐＨ範囲は２．０〜７．０、好ましくは４．５〜６．０であり、生育可能な温度は１０〜３７℃、好ましくは２６〜３２℃である。良好な生育及びマンノシルマンニトールリピッドの生産のためには、培養液に酸素を供給する必要がある。このためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するあるいは振とう培養を行う必要がある。
【００３７】
炭素源としては、トリグリセリド、脂肪族炭化水素、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。
トリグリセリドとしては、特に制限がなく植物油脂又は動物油脂等が挙げられ、目的に応じて適宜選定することができる。植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、大豆油が好ましい。動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。トリグリセリドとしては、炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドが好ましい。
なお、植物油脂又は動物油脂等としては、てんぷらを製造した後の食品廃油等も利用可能である。
【００３８】
脂肪族炭化水素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。炭化水素の炭素数は６〜２４の範囲であり、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ドデカン、ヘキサデカン、オクタデカンといった飽和炭化水素あるいは１−ペンタデセン（Ｃ15Ｈ30）、１−ヘプタデセン（Ｃ17Ｈ34）等の不飽和炭化水素及びその混合物であって、好ましくは炭素数１４〜２０の飽和あるいは不飽和炭化水素及びその混合物、さらに好ましくはオクタデカンを主成分とする混合物を用いることができる。
【００３９】
脂肪酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。脂肪酸の炭素数は６〜２４の範囲であり、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸といった飽和脂肪酸あるいはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸及びその混合物であって、好ましくは炭素数１４〜２０の飽和あるいは不飽和脂肪酸及びその混合物、さらに好ましくはリノール酸及びリノール酸を主成分とする混合物を用いる。
【００４０】
炭水化物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖とその誘導体、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖及びその混合物であって、好ましくは単糖、さらに好ましくはグルコースである。
【００４１】
炭素源としては特に植物油脂が好ましく、特に大豆油が好ましい。炭素源の含有量は、培地中２〜２４質量％が好ましく、特に４〜１８質量％が好ましい。
【００４２】
本発明のマンノシルマンニトールリピッドの製造方法は、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、グルコース５〜２０ｇ／Ｌ，酵母エキス０．１〜２ｇ／Ｌ，硝酸アンモニウム０．１〜２ｇ／Ｌ，リン酸２水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に、１白金耳接種し、２６〜３２℃で１〜３日振とう培養を行う。これを同じ組成の培地５０〜１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、２６〜３２℃で１〜３日間振とう培養を行う。さらに、これを液体培地中２〜２４質量％、好ましくは４〜１８質量％の炭素源と酵母エキス０．１〜２ｇ／Ｌ，硝酸アンモニウム０．１〜２ｇ／Ｌ，リン酸２水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地１〜２Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、２６〜３２℃で１〜２Ｌ／分の通気速度と６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度本培養を開始する。このときの培養温度は２６〜３２℃、培養時間は、３〜２０日間である。
【００４３】
なお、ｐＨは、ｐＨメーターで、溶存酸素濃度は、溶存酸素濃度メーターで測定できる。
【００４４】
前記回分培養では、１日に１乃至２回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定する。糖脂質、トリグリセリド、ジグリセリド及び脂肪酸は、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収する。この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして所定の方法により各成分を定量分析する。
【００４５】
培養終了後、等〜４容積倍の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルを、エバポレーターを用いて留去して脂質成分を回収する。
【００４６】
本発明の糖脂質は、優れた界面活性能を有するため、バイオサーファクタントとして用いることができる。界面活性能については、下記の方法で測定することができる。
【００４７】
界面活性能の測定
糖脂質の界面活性能は水の表面張力低下能として測定する。糖脂質に蒸留水を加え超音波処理し、所定濃度の懸濁溶液を作製する。この懸濁溶液母液から順に希釈溶液を調製し、デュヌイの表面張力計を用いて、２５℃で各々の濃度の糖脂質溶液の表面張力を測定する。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００４９】
［実施例１］
<微生物のスクリーニング>
１）培養、抽出、分画
日本各地から植物の葉、果実、木の樹液、ため池等の水、土壌等の試料を採取した。試料を表１に示した培地の入った試験管（１８φ×１８０ｍｍ）に移し、２８℃で１週間振とう培養した。培養液が白濁したものについて、表１に示した寒天平板上に画線して２８℃で４日間培養した。この操作を繰り返して、微生物を単離した。単離した微生物を再び、表１の組成の液体培地１及び２の入った試験管に接種して、２８℃で１週間振とう培養した。培養液が白濁したものについて、酢酸エチルを加えて糖脂質等の脂質成分を抽出した。得られた脂質成分を２Ｎのトリフルオロ酢酸を用いて加水分解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖の有無を調べた。さらに、表２の液体培地３が４ｍＬ入った試験管に糖の存在が認められた微生物菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを表２の液体培地４の入った５００ｍＬ容の坂口フラスコに接種して、３０℃で１週間振とう培養した。培養終了後、酢酸エチルを加えて脂質成分を抽出した。エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去し、２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解した後に、ガスクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した。その結果、マンノース、エリスリトール、マンニトールが検出された。
【００５０】
マンノース、エリスリトール、マンニトールが検出された菌株について、表２の組成の液体培地３が４ｍＬ入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間培養を行った。これを表２の液体培地４が１．４Ｌ入った２．５Ｌ容のジャーファメンターに接種して、３０℃、通気量１．５Ｌ／分、撹拌速度８００ｒｐｍで１週間培養した。培養終了後、培養液に酢酸エチルを加えて脂質成分を抽出した。
【００５１】
２）糖脂質の分離
遠心分離して菌体を除いた培養液から等量の酢酸エチルで脂質成分を抽出した。得られた有機相の溶媒を留去し、残渣をメタノール５００ｍＬに溶解した後、倍量のヘキサンで油脂成分の抽出除去を数回繰り返した。メタノール相の溶媒を留去し、少量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、アセトン：メタノール溶液＝９：１（容積比）、メタノールの順で溶出させた。糖脂質の含まれるアセトン：メタノール溶出画分を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得た。得られた糖脂質成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質５成分を単離した。
【００５２】
<糖脂質の構造決定>
（１）上記精製した糖脂質５成分を塩酸メタノールで加水分解し、得られた水溶性成分をトリメチルシリル誘導体化し、カラムにＤＢ−５（０．２５ｍｍ×３０ｍ）を用いたガスクロマトグラフィーで解析した。ＴＬＣ上で保持時間の長い精製糖脂質３成分は、マンノースとエリスリトールと考えられるピークがほぼ１：１の比率で検出された。これらのピークの溶出時間は、標準サンプルとして用いたＤ−マンノースとＤ−エリスリトールの溶出時間と完全に一致した。ＴＬＣでの保持時間と併せて、これらの精製糖脂質は、既知のマンノシルエリスリトールリピッドと考えられる。
（２）ＴＬＣ上で保持時間の短い精製糖脂質２成分は、何れもマンノースを示す２本のピークとマンニトールと考えられる１本のピークがほぼ１：１の比率で検出された（図２）。これらのピークの溶出時間は、標準サンプルとして用いたＤ−マンノースとＤ−マンニトールの溶出時間と完全に一致した。
（３）以下、マンノースとマンニトールが検出された精製糖脂質２成分の内、より保持時間の長い糖脂質１成分について説明する。精製糖脂質を２Ｎの塩酸で加水分解して得られた糖混合物を水素化ホウ素ナトリウムで還元した後、アセチル化して得られたアルジトールアセテート誘導体化物を、同じカラムを用いたガスクロ分析した結果では、マンニトールの完全アセチル化物の溶出時間と同じ位置に単一のピークが検出された。
次いで、精製糖脂質を、水酸化カリウムを用いてケン化し、得られたオリゴ糖成分をアルカリ条件下でヨウ化メチルと反応させ、完全メチルエーテル化オリゴ糖を得た。この完全メチル化オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析では、擬似分子イオンピーク［Ｍ＋Ｎａ］+  ｍ／ｚ４９３が検出された（図１−３）。この分子イオンピークは、完全メチル化されたヘキソシール−ヘキシトールのナトリウムの付加した分子イオンに一致することから、この糖脂質がＤ−マンノースとＤ−マンニトールからなる二糖であることが確認された。
【００５３】
（４）上記（３）で得られた完全メチル化オリゴ糖を酸加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウムで還元し、アセチル化した。得られた部分メチル化アルジトールアセテート混合物を、ＤＢ−５カラムを用いるＧＣ−ＭＳで分析した結果、その溶出位置とマススペクトルから１，５−ジアセチル−２，３，４，６−テトラメチルマンニトールと６−モノアセチル−１，２，３，４，５−ペンタメチルマンニトールと同定できる化合物がモル比１：１の比率で検出された（図３−１）。このうち、１，５−ジアセチル−２，３，４，６−テトラメチルマンニトールのマススペクトルは、１位の水素が重水素に置換されていることを示すフラグメントイオンｍ／ｚ１０２、１１８そして１６２のシグナルが検出されたのに対し（図３−３）、６−モノアセチル−１，２，３，４，５−ペンタメチルマンニトールのマススペクトルは重水素置換を示すシグナルは検出されなかった（図３−２）。このことは、６−モノアセチル−１，２，３，４，５−ペンタメチルマンニトールで表された糖成分はもともと糖アルコールの状態で存在していることを意味しており、この糖脂質の糖鎖配列はＤ−マンノシール１−６−ｍｅｓｏ−マンニトールであると決定できた。
（５）オリゴ糖の結合様式は、1Ｈ−ＮＭＲにより解析し、マンノースのアノメリックプロトンシグナル４．６５ｐｐｍの結合定数が１．５Ｈｚ以下であったことから、β−結合であると決定できた（図４）。
【００５４】
（６）精製糖脂質の脂肪酸は、塩酸メタノールの加水分解物からヘキサンを用いて脂肪酸メチルエステルとして回収した。得られた脂肪酸メチルエステルの混合物をガスクロマトグラフィーにて解析した結果、ｎ−オクタン酸（Ｃ８）約１５質量％、ｎ−デカン酸（Ｃ１０）約６０質量％を主成分とする炭素数６〜１８の飽和脂肪酸と炭素数８〜１２の不飽和脂肪酸（二重結合１個）約２５質量％が検出された。
【００５５】
（７）精製糖脂質１ｍｇに２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム／９０％メタノール溶液を１ｍＬ加え、３７℃で反応させた。６時間後、０．０２ｍＬの酢酸と５ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加えて２時間室温で生じたアルデヒドを還元した。クロロホルム２ｍＬと蒸留水０．７５ｍＬを加えて、２層に分離させた後、過ヨウ素酸酸化された糖脂質成分をクロロホルム層に回収した。得られた糖脂質成分の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで測定したところ、元の糖脂質より分子量１２０少ない擬似分子イオンピーク［Ｍ＋Ｎａ］+  ｍ／ｚ６１１と６３７が検出された（図１−２）。さらに、この酸化反応物の組成をガスクロマトグラフィーで調べたところ、マンニトールは全く検出されず、マンノースだけが検出された。さらに、上記（５）で示した種類の脂肪酸が同じ割合で検出された。これらの結果は、糖脂質は、過ヨウ素酸処理によりマンニトール残基のＣ４とＣ５の間で切断され、しかもアシル基は、すべてマンノースに置換していることを示唆するものであった。
【００５６】
（８）アシル基の結合位置は、過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲにより解析した。この糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、既知のマンノシールエリスリトールリピッド（４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−４−ｍｅｓｏ−エリスリトール）のスペクトルと極めて類似していた。特に４．０ｐｐｍより低磁場側の５つのシグナルは、ほぼ一致していることから、それぞれのシグナルは、マンノース残基の各プロトンＨ−１；４．６８１ｐｐｍ、Ｈ−２；５．５０３ｐｐｍ、Ｈ−３；５．０５４、Ｈ−４；５．２２２、Ｈ−６；４．１９８ｐｐｍと同定でき、マンノースの２，３，４，６位には、それぞれアシル基が結合していることが確認された（図５）。これらのシグナルに加えて、高磁場の領域には、アシル基の特性を示すシグナルが観測されており、特に、２．０８１ｐｐｍと２．０１５ｐｐｍのシグナルは、それぞれアセチル基（−ＣＯＣＨ3）のメチルプロトンの存在を示していることから、マンノースのヒドロキシル基に結合している４分子のアシル基の内２分子は、酢酸であることがわかった。さらにこれよりも少し低磁場のシグナル２．４２２ｐｐｍと２．２０１ｐｐｍは、それぞれ−ＣＯＣＨ2−基の−ＣＨ2−プロトンシグナルと同定できることから、これらは２分子の脂肪酸が存在していることを証明している。
【００５７】
各アシル基の結合位置の解析は、ＨＭＢＣ法による２次元ＮＭＲで行った。まず、アセチルメチルプロトンと−ＣＯＣＨ2−プロトンに隣接しているカルボニル基（−ＣＯ−）のカーボンのシグナルを求めたところ、それぞれのプロトン（２．０１５ｐｐｍ、２．０８１ｐｐｍ、２．２０１ｐｐｍ、２．４２２ｐｐｍ）とカップリングした４つのカーボンシグナル（１７０．４ｐｐｍ、１７１．６ｐｐｍ、１７３．６ｐｐｍ、１７４．１ｐｐｍ）が認められた（図６）。続いて、このカルボニル基のシグナルとカップリングするマンノースのプロトンを検索したところ、１７０．４ｐｐｍのシグナルとマンノースのＨ−４プロトン（５．２２２ｐｐｍ）が、１７１．６ｐｐｍのシグナルとマンノースのＨ−６プロトン（４．１９８ｐｐｍ）が、そして１７３．６ｐｐｍと１７４．１ｐｐｍのシグナルはマンノースのＨ−３とＨ−２プロトン（５．０５４ｐｐｍと５．５０３ｐｐｍ）とそれそれカップリングしていることが示された。これらのことはすなわち、４分子のアシル基のうち、アセチル基は、マンノースの４位と６位に、そして脂肪酸は、２位と３位にそれぞれエステル結合していることを示している。
以上のことから、本糖脂質の構造は、４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトールであると決定できた。
【００５８】
<糖脂質の物性>
得られた糖脂質は無色の油状物であった。
質量分析（ＭＳ）
擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+  ７３１，７５７（図１−１）
溶媒への溶解性
易溶性：アセトン、メタノール、エタノール
溶解性：クロロホルム
難容性：エーテル、水
【００５９】
本菌体から得られる糖骨格がマンノシールマンニトールからなる糖脂質は、上記の成分以外に、分子量が４２少ない成分も存在しており、これらについても、同様の解析を行い、４モノ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトールであることを確認した。
【００６０】
以上のことより、シュードジーマ属ｓｐ．ＴＭ−４５３株は、既知のマンノシルエリスリトールリピッドとマンノシルマンニトールリピッドをその培養液中に生産する。
【００６１】
＜発酵生産＞
ポテトデキストロース培地に保存しておいたシュードジーマｓｐ．ＴＭ−４５３株を表２の液体培地３が４ｍＬ入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間培養を行った。さらに、これを表２の液体培地４が１．４Ｌ入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。１日に１乃至２回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定した。ＭＥＬ、トリグリセリド、ジグリセリド、脂肪酸は、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収した。脂質成分をＴＬＣプレートにチャージして展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬で糖脂質を発色させた結果、ＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、８．２ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトールの混合比（モル比）は、６２：３８であった。これは、マンノースに結合している脂肪酸の炭素数が異なるために正確な値ではないが、生産糖脂質の約３８モル％がＭＭＬであると見積もることができる。
【００６２】
精製した糖脂質の界面活性能は水の表面張力低下能として測定した。糖脂質１０ｍｇに１００ｍＬの蒸留水を加え超音波処理し、０．１ｇ／Ｌ濃度の懸濁溶液を作製した。この母液から順に希釈溶液を調製し、デュヌイの表面張力計を用いて各々の濃度の糖脂質溶液の表面張力を測定した。測定温度は２５℃で行った。その結果、糖脂質溶液の表面張力は約３２ｄｙｎｅ／ｃｍにまで減少した（図７）。この値は、標準物質として用いたラウリル硫酸ナトリウム（２．３ｇ／Ｌ）の（３４ｄｙｎｅ／ｃｍ）とほぼ同程度の表面張力低下能であった。一方、この時の臨界ミセル濃度は、０．００９１ｇ／Ｌ（１．３×１０-5Ｍ）で、ラウリル硫酸ナトリウムに比べて１００倍以上の薄い濃度であった。
【００６３】
［実施例２］
本培養において、大豆油の代わりにリノール酸を用いる以外は実施例１と同様に培養を行った。実施例１と同様にＴＬＣプレート上でＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、７．６ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトール（モル比）の混合比は、６０：４０であった。
【００６４】
［実施例３］
本培養において、大豆油の代わりにオクタデカンを用いる以外は実施例１と同様に培養を行った。実施例１と同様にＴＬＣプレート上でＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、０．７ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２ＮのＴＦＡで加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトールの混合比は、６７：３３であった。
【００６５】
［実施例４］
本培養において、大豆油の代わりにグルコースを用いる以外は実施例１と同様に培養を行った。実施例１と同様にＴＬＣプレート上でＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、１．２ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２ＮのＴＦＡで加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトールの混合比（モル比）は、６５：３５であった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１−１】実施例１に係る糖脂質の質量分析のチャートである。
【図１−２】実施例１に係る糖脂質の過ヨウ素酸酸化物の質量分析のチャートである。
【図１−３】実施例１に係る脱アシル化糖脂質の完全メチル化物の質量分析チャートである。
【図２】実施例１に係る糖脂質の糖鎖の糖分析チャートである。
【図３−１】実施例１に係る完全メチル化物の糖分析チャートである。
【図３−２】図３−１のピーク１成分の質量分析チャートである。
【図３−３】図３−１のピーク２成分の質量分析チャートである。
【図４】実施例１に係る完全メチル化物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】実施例１に係る糖脂質の過ヨウ素酸酸化物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】実施例１に係る糖脂質の過ヨウ素酸酸化物のＨＭＢＣスペクトルである。
【図７】ＭＭＬ濃度に対する表面張力をプロットしたグラフである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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