(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄性における配偶子の数的な染色体変化の処置及び／又は軽減のための医薬組成物であって、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ＣＴＰ−ＦＳＨ、一本鎖ＣＴＰ−ＦＳＨ、追加のグリコシル化部位を有するＦＳＨ分子及びサブユニット間Ｓ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子、から選択される物質を含んで成る医薬組成物。
【請求項２】
配偶子の数的な染色体変化が精子の二倍性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
配偶子の数的な染色体変化が性染色体の二染色体性である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
雄性がヒトである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記物質がＦＳＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記物質がｒＦＳＨである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記物質が１日おきに投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記物質が投与量当たり約７５〜約３００ＩＵ投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記物質が投与量当たり約１５０ＩＵ投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記物質がｒＦＳＨであり、且つヒトの雄性が配偶子の異数性に罹っている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雄性における配偶子の精子染色体異常の減少のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びＦＳＨ変異体の使用に関する。更に具体的には、本発明は、精子の異数性、特に二倍性及び二染色体性に罹患している雄性における卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びＦＳＨ変異体から選択される物質の使用を提供する。本発明は更に、雄性における配偶子の染色体変化の処置及び／又は予防のための医薬組成物の調製のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びＦＳＨ変異体を含む医薬製剤の使用を含んで成る。
【背景技術】
【０００２】
かなりの割合の不妊男性が異常な核型を有しており、そのため、これらの対象者が染色体変化を有する配偶子を産生することが明らかとなっている。更に、正常な核型を有していても、染色体変化を有する精子が存在している可能性を排除することはできない。これは、染色体分離におけるエラーが精子形成における有糸分裂及び／又は減数分裂の間に起こりうるためである。文献で利用可能となった最初のデータによると(Vegetti et al., 2000 Human Reproduction, 15 (2), 351-365)、健常な男性の精子の約０．３〜１．０８％が数的な染色体異常を有しており、そしてこのパーセンテージは精子減少症の男性の精子（０．７〜９．４４％）及び奇形精子症の男性の精子（１．３〜３．９％）を試験した場合により高くなっていることが示唆されている。これらの変化は、性染色体及び常染色体、特に第１、第１８、及び第２１染色体に関連しているようである。
【０００３】
これらの精子の核型の異常は、通常、受精率の低下及び／又は流産率の増大をもたらし、すなわち、染色体が変化している配偶子を産生する、受精能力のある男性が女性のパートナーに対し複数回流産の経験をさせている(Egozcue et al., 2003, Placenta, 24,S62-565 ; Egozcue et al., 2000, Human reproduction, 6, 93-105)。
【０００４】
過剰な又は不足した染色体を特徴とする数的な染色体異常は、「異数性」と称されている。
【０００５】
異なるタイプの異数性が知られており、そしてそれらは染色体の数的な異常の種類に応じて命名されている。例えば、二倍体細胞における正常な数と比較して１つ余分な染色体が存在しているものは、三染色体性（２ｎ＋１）として知られており；二倍体細胞における相同対の一方の染色体の不在は一染色体性として知られており（２ｎ−１）、一方、二倍体細胞における染色体対全体の欠失は零染色体性（２ｎ−２）として知られている。ここで、ｎは染色体の型の数である。
【０００６】
類推すると、一倍体細胞、例えば配偶子の場合、用語「異数体」は、数的異常の染色体、例えば過剰な染色体を有するか、あるいは１つ染色体を欠いている配偶子を特徴とする。これらの「異数体」配偶子は、正常な配偶子と融合した場合に異常な数の染色体（異数性）を有する接合体を形成する。多くの場合、異数体の接合体は妊娠出産時に死ぬ。しかしながら、場合によっては、前記接合体は、「異数性」に影響を受けた子供となり、そしてこの染色体の数的異常の保因者に対する結果は、関与する染色体に依存する。
【０００７】
常染色体及び性染色体の配偶子の異数性の発生は、例えば、精原細胞の有糸分裂の間、そして第一及び第二減数分裂の間に起こる兄弟染色分体の分離の失敗、あるいは、例えば減数分裂時の相同染色体の分離の失敗のようなエラーから生じる。染色体が第一減数分裂期の間に分離を失敗すると、全ての産生した精子は異常な数の染色体を有する（２ｎ：二倍体又は０ｎ）。染色体が第二染色体期に分離を失敗すると、同一の精母細胞に起因する４つの一倍体細胞のうちわずかに２つの一倍体細胞が、染色体の数的異常に影響を受ける。
【０００８】
従って、配偶子の異数性の産生は、それらが子孫に異数性を誘導し、これが胎児及び生存可能な乳児において多数の異常を引き起こすため、遺伝的危険因子を構成する。
【０００９】
例えば、乳児における異数性は乳児に対し、将来の不妊、流産及び当該乳児の周産期死亡、、先天性奇形、精神遅滞、及び異常行動 (Hook, 1985, in : Aneuploidy : Etiology and mechanisms. (eds) V. L. Dellarco, P. E. Voytek A. Hollander, pp. 7-33. New York. Plenum ; Hecht et al., 1987, in : Aneuploidy. Part A : Incidence and etology. (eds J B. K Vig, A. X. Sandberg, 9-49. New York : Alan R. Liss)、感染症に対する感受性の増大、白血病に罹る傾向が高いこと、あるいは子孫のアルツハイマー病の早期発病、を引き起こすことがある。
【００１０】
常染色体の異数性、例えば一倍性は常に胎児にとって致死性であるが、三倍性はそれらが第１３、１８及び２１染色体に関与する場合にだけ致死性がないが、子孫にとって劇的なハンディキャップとなる。
【００１１】
一般的な性染色体の異数性の例は、男性における異数性の最も一般的な形態であるクラインフェルター症候群の患者（４７、ＸＸＸ）、そしてSandberg及び共同研究者によって発見された異数性の別の型である患者（４７、ＸＹＹ）において見られる。
【００１２】
精子染色体異常の存在は、（数的、構造的のいずれでも）多数の割合の不妊患者において指摘されており(Bourrouillou et al., 1985, Hum Genet. 71, 366-367)、そして受精補助技術(assisted fertilization technique)を用いることで患者が子孫を作ることが可能となり、同時に染色体が変化している子供を持つ危険性が増大すると広く受け入れられている。
【００１３】
異数体の配偶子はまた、正常な染色体組を有する乏精子−精子無力−奇形精子症（oligoasthenoteratozoospermia）（ＯＡＴ）の対象者においても発生し、これは、有毒な睾丸の病原が精子形成の間の染色体分離の繊細な過程を妨害しうるためである。異数体の配偶子はまた、老齢の対象者又は異数体誘発剤(aneuploidogenic agent)に潜在的に曝露されている患者においても発生する。このため、精子における異数性の頻度を評価するのは、不妊患者の診断過程の基礎段階となっており、これは特に彼等が受精補助技術を受けることを希望している場合である。
【００１４】
既報のデータは、ＯＡＴ患者が先天的な染色体異数性を有する精子の割合が高いことを示唆している。この異数性の高い頻度は、受精補助技術の間の精子の受精能を低下させる(Storeng et al., 1998, Acta Obstet Gynecol Scand, 77(2), 191-197)。
【００１５】
体外受精・胚移植（ＦＩＶＥＴ）の間に使用する精子分離法が異数体の精子の比率を変えないという事実を考慮すると、ＯＡＴ患者は染色体異数性の子供を作る危険性が高い(Pfeffer et al., 1999, Fertil Steril, 72, 472-478)。
【００１６】
体外受精（ＩＶＦ）のような受精技術の開発は、精子の核型異常が受精障害の原因となることがあり、そして／あるいは子孫の染色体異常を誘導することがあるため、精子の核型異常をモニタリングすることの重要性を高めてきた(Levron et al., 2001, Molecular and Cellular Endocrinology, 183, S23-S28)。
【００１７】
ＩＶＦを受けている雄性の患者は、通常、卵管障害、無排卵又は特発性不妊症が原因の不妊女性のパートナーであるか、又は精子の量が少ない雄性である。
【００１８】
この分野の研究は、ここ数年細胞内精子注入法（ＩＣＳＩ）の開発とより臨床的に関連するようになっている。ＩＣＳＩは不妊治療に非常に有効であることが示されているが、子孫に対する細胞発生障害の伝播はこの受精技術に対する大きな懸案事項であり、このことは観察されてきている(Ushijima et al, 2000, Human Reproduction, 15 (5), 1107-1111 ; Levron et al., 2001, 上記)。この危険性は、例えば、高い血縁関係又は転座を有するドナーの精子の場合に高い(Baccetti et al., 2002, Contraception, 65, 283-287)。ＩＣＳＩを受けている雄性患者は、通常、軽度又は重度の乏精子症及び／又は奇形精子症及び／又は精子無力症の患者である。更に、外科手術的手順（精巣内精子吸引：ＴＥＳＡ；精巣内精子回収：ＴＥＳＥ；微鏡下精巣上体精子吸引：ＭＥＳＡ；経皮的精巣上体精子吸引：ＰＥＳＡ）により得られた精子試料もＩＣＳＩで治療される。
【００１９】
このため、精子の異数性は受精補助技術を受ける予定の全ての患者において評価されるべきである。
【００２０】
精子、特に生殖補助技術（ＡＲＴ）を受ける予定の男性の精子の異数性、例えば二倍性の比率を低下させる方法を開発することが望ましい。
【００２１】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、セルトリ細胞の初期発生及び精原細胞を制御するためのそれらの刺激において役割を果たすことが知られている。実験的な研究により、ＦＳＨがいずれもＦＳＨ受容体を発現しているセルトリ細胞及び丸い胚細胞に存在することが示唆されている(Baccetti et al., 1998, Human Reproduction, 12, 9, 1955-1968)。
【００２２】
更に、外因性ＦＳＨ治療は、電子顕微鏡を通じて可視化した場合、アクロソーム、クロマチン及び軸糸が変化している男性(Baccetti et al., 1997, The FASEB Journal, 12, 1045-1054)及び特発性の乏精子−精子無力症（oligoasthenozoospermia）の男性(Ben- Rafael, 2000, Fertzlity and Sterility, 73 (1), 24-30 ; Strehler et al., 1997, Journal of Andrology, 18(4), 439-447)の精子形態及びの超構造の改善をもたらした。
【００２３】
ＦＳＨは精子減少症に罹患している男性の精子形成を誘導するのにも使用される。１５０ＩＵのＦＳＨを週３回、２５００ＩＵのｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を週２回、併用する計画は、低ゴナドトロピン性性機能低下症に罹患している男性の精子数の向上をもたらすのに成功している(Burges et al., 1997, Hum. Reprod., 12, 980-6)。大量のＦＳＨ（１５０ＩＵ）は特発性の精子減少症を処置するのにも使用されている(Iacono et al., 1996, J. Urol., 102, 81-4)。
【００２４】
これらの研究は、受精率の増大及び、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）／透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で可視化した場合の精子の形態の改善に焦点が当てられている。
【００２５】
異数性は、ＳＥＭ／ＴＥＭで観察した場合に核型に影響を及ぼさず、且つＳＥＭ／ＴＥＭの特徴と相関せず、すなわち、ＳＥＭ／ＴＥＭにおいて正常な特徴を有する精液は、異数性によって影響を受けることがある。上記Baccettiらは（１９９７年）、遺伝的欠陥を有する患者はＦＳＨで処置されるべきでないことを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の目的は、雄性、好ましくは受精補助技術を受けようとしている男性、における配偶子の染色体変化、特に精子の異数性、例えば二倍性及び二染色体性の軽減及び／又は予防のための方法を提供するものであり、ここで、医薬として活性な量のＦＳＨ又はＦＳＨ変異体がこれを必要とする雄性に投与される。
【００２７】
第一の観点において、本発明は、雄性における配偶子の染色体変化、特に精子の異数性、例えば二倍性及び二染色体性の処置及び／又は軽減のための医薬組成物の調製のための、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びＦＳＨ変異体から選択される物質の使用を提供する。
【００２８】
第二の観点において、本発明は、雄性の対象者における配偶子の数的な染色体変化、特に精子の異数性、例えば二倍性及び二染色体性を軽減する方法であって、有効量のＦＳＨ及びＦＳＨ変異体から選択される物質を雄性の患者に対し受胎前に投与することを含んで成る方法を提供する。
【００２９】
第三の観点において、本発明は、雄性の対象者の子孫における染色体異常の発生を予防する方法であって、有効量のＦＳＨ及びＦＳＨ変異体から選択される物質を雄性の対象者に対し受胎前に投与することを含んで成る方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下の段落は、種々の用語の定義を提供し、そして、これらは、他の明示された定義が異なる定義を提供しない限り、本明細書及び特許請求の範囲を通じて一様に適用することが意図される。
【００３１】
「精子減少症」は、低精子含量の精液を特徴とする。通常、精子濃度が２０ｘ１０6／ｍｌ未満の男性がそのように診断される。
【００３２】
「精子無力症」は、精子の運動障害を有する精液を特徴とする、通常、５０％未満の精子が前進するか、あるいは２５％未満の精子が迅速に直進する男性がそのように診断される。
【００３３】
「奇形精子症」は、異常な形態の精子を有する精液を特徴とする。通常、３０％未満の精子が正常な形態を有する男性がそのように診断される。
【００３４】
「乏精子−精子無力−奇形精子症」は、前述の３つの精子の質についての変化が全てに支障をきたしている精液を特徴とする。ＷＨＯの基準によると、患者が以下のパラメーターを示す場合にこのように診断される：密度＜２０ｘ１０6精子／ｍｌ、グレード３の運動性＜２５％及び／又はグレード２＋３の運動性＜５０％、及び正常な精子の形態＜３０％。
【００３５】
用語「核型」は、個体の染色体の構成、例えば染色体数及び可能性のあるあらゆる異常、を意味する。
【００３６】
染色体異常が関与する例示的な疾患には、ダウン症候群、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、ターナー症候群（ＸＯ）、トリプルＸ症候群、テトラＸ症候群、ペンタＸ症候群、ＸＹＹ症候群、任意の染色体、例えば第７，１０，１１，１３，１８，２１、Ｘ及びＹ染色体のモノソミー又はポリソミー、染色体モザイク（ＸＹ／ＸＸＹ）を有する男性及び多数のＸ染色体（例えば、ＸＸＸＸＹ；ＸＸＸＹＹ）を有する男性の性染色体異数性がある。
【００３７】
用語「投与」は、本発明の製剤を、疾患又は症状を処置する必要がある患者の体内に導入することを意味する。
【００３８】
用語「染色体異常(aberration)」は、染色体の異常(abnormality)に使用され、そして染色体の数的異常、例えば倍数性及び異数性を含み、これには、少なくとも１つ過剰な染色体の存在又は１つの染色体の欠如が含まれる。半数体細胞、例えば配偶子における異数性には二倍性が含まれる。
【００３９】
「異数性」及び「倍数性」は、細胞が通常の半数（「ｎ」）又は二倍数（「２ｎ」）と異なる染色体数を有する症状である。
【００４０】
知られているとおり、高等植物及び動物において、それぞれの特定の型の染色体は通常２コピーの相同染色体として存在する（二倍体状態）。例えば、ヒトにおいては、二倍対数は４６である。
【００４１】
性細胞、すなわち配偶子（精子及び卵子）を形成する２回の細胞分割の後、それぞれ生じた精子及び卵子は通常わずかに１コピーの各染色体を含む（半数体状態）。例えば、ヒトにおいて、正常な半数体数（半数体細胞、例えば配偶子の染色体数）は２３である。
【００４２】
受精の間の精子と卵子の融合は、雄性の親に由来する１つの相同染色体及び雌性の親に由来するもう一方の相同染色体を含む「接合体」をもたらし、その結果正常な二倍体の染色体の構成が回復する。
【００４３】
正常な体細胞は、２３対の二倍体染色体含量を有し、又は合計で４６個の染色体を有する。
【００４４】
従って、異数体の体細胞は正常な半数体数の２倍（２ｎ）以外の染色体数を有する。例えば、異数体の体細胞が、トリソミーを有する細胞、すなわちある染色体を３コピー有する細胞、モノソミーを有する細胞、すなわちある染色体を１コピーを有する細胞であることもある。異数性は、有糸分裂の間の染色体不分離から生じることもある。倍数体細胞は、通常の二倍体数、すなわち２ｎより多い正常な半数体数の何倍かの染色体数を有する細胞である。例えば、倍数体細胞は三倍体（ｎ＝６９）又は四倍体（ｎ＝９２）であってもよい。
【００４５】
半数体細胞、例えば配偶子において、天然の状態は半数体であり、これはｎの染色体を意味する。異数性とは、細胞がｎ以外の染色体数を有することを意味する。例えば、１つの染色体が欠失していることもあり（ｎ−１）、あるいは１つ過剰な染色体が加わっている場合もあり（ｎ＋１）、例えば、これは二染色体において起こり、あるいは染色体数が二倍となっていることがあり、例えば、これは二倍性において起こる（２ｎ）。
【００４６】
細胞の「二染色体性」は、１つの過剰な染色体の存在を特徴とする。半数体細胞、例えば配偶子において、二染色体性はｎ＋１の染色体を特徴とする。
【００４７】
細胞の「二倍性」は、染色体数の倍加を特徴とする。半数体細胞、例えば配偶子において、二倍性は２ｎの染色体を特徴とする。
【００４８】
用語「患者」は、疾患又は症状が治療される哺乳類を意味する。患者は、限定しないが、以下の起源のもの、ヒト、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ等である。
【００４９】
用語「生殖補助技術」には、ＩＶＦ（体外受精）、ＩＣＳＩ（細胞内精子注入法）が含まれる。
【００５０】
「有効量」とは、雄性の対象者における配偶子の染色体変化を軽減する、特に雄性の患者における異数性、例えば二倍性及び二染色体の割合を軽減するのに十分なＦＳＨの量を意味する。ＦＳＨの量は当業者がルーチンに決定することができる。実際に投与される化合物の量は、典型的には医師が、関連する状況、例えば処置されるべき症状、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重及び応答、患者の内因性ＦＳＨレベル等の観点から決定される。あるいは、「有効量」は処置の期間によって達成することもできる。典型的に、処置の期間には、少なくとも１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１年の処置が含まれる。
【００５１】
「医薬として許容される」の表現は、活性成分の生物学的活性の有効性を実質的に妨げず、且つ投与される宿主にとって毒性でない任意の担体又は塩を包含することを意味する。
【００５２】
用語「組換え体」は、組換えＤＮ技術の使用を通じて産生するＦＳＨ又はＦＳＨ変異体の調製物を意味する。
【００５３】
異数性、二倍性又は二染色体性の割合は、射精された精子における数的な染色体異常の評価を、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、特に多色ＦＩＳＨ (上記Egozcue et al., 2003)で行うことで決定することができる。ＦＩＳＨは、Shi et al., 2001, Reproduction, 121, 655-666に記載のとおり、標的染色体上の相補的ＤＮＡ配列に対する蛍光色素で標識した特異的ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション、続いて、蛍光顕微鏡のもとでの結合したプローブの検出、を包含する。極度に少量の精子を有するドナー由来の精液試料に対してＦＩＳＨを実施するために、マイクロ波脱凝縮／共変性(microwave decondensation/codenaturation)技術が開発され、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で使用するための解析可能な精子数を増大させている(Rademaker et al., 2001, Cytogenet Cell Genet 95 (3-4), 143-5)。異数性又は二倍性の比率を決定するためのＦＩＳＨプロトコールの例を実施例１で詳述する。
【００５４】
基底血清テストステロンのレベルは、市販のＥＬＩＳＡ／化学発光イムノアッセイで測定することができる。
【００５５】
「ＦＳＨ変異体」の表現は、アミノ酸配列、グリコシル化パターン又はサブユニット間の連結がヒトＦＳＨと異なるが、ＦＳＨ活性を示す分子を包含することを意味する。例としては長期作用性修飾型組換えＦＳＨであるＣＴＰ−ＦＳＨがあり、これは野生型α−サブユニット及び、ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβ−サブユニットのＣ末端と融合しているハイブリッドβ−サブユニット、から成る(La Polt et al. ; Endocrinology; 1992, 131, 2514- 2520;又はKlein et al., 2003, Human Reprod. 2003,18, 50-56)。また、一本鎖分子である一本鎖ＣＴＰ−ＦＳＨも含まれ、これは以下の配列（Ｎ末端からＣ末端へ）から成り：
【化１】
0004718459.tif 000002
（ここで、βＦＳＨはＦＳＨのβ−サブユニットを表しており、βｈＣＧ  ＣＴＰ（１１３−１４５）はｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドを表し、そしてαＦＳＨはＦＳＨのα−サブユニットを表している）、これはKleinらにより説明されたとおりである。ＦＳＨ変異体の他の例には、ＷＯ０１／５８４９３、特にＷＯ０１／５８４９３の請求項１０及び１１に開示されているような、α−サブユニット及び／又はβ−サブユニットに追加のグリコシル化部位が組み込まれているＦＳＨ分子、そしてＷＯ９８／５８９５７に開示されているようなサブユニット間Ｓ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子が含まれる。
【００５６】
本明細書で言及されるＦＳＨ変異体には、完全長成熟タンパク質よりも短いベータサブユニットのカルボキシ末端を欠失したものも含まれる。
【００５７】
本発明で使用するＦＳＨは、「組換え体」であってもよく、あるいは天然のものであってもよい。
【００５８】
本発明のＦＳＨ変異体は、「組換え体」であってもよく、あるいは化学合成で得ることもできる。
【００５９】
ＦＳＨを産生するための組換えＤＮＡ技術の一例はＷＯ８５／０１９５８に記載されている。
【００６０】
組換え技術を用いてＦＳＨを発現させる方法の一例は、真核細胞にＦＳＨのアルファサブユニット及びベータサブユニットをコードするＤＮＡ配列をトランスフェクションすることによるものであり、これは、欧州特許ＥＰ０２１１８９４及びＥＰ０４８７５１２に記載のように、それぞれ別個のプロモーターを有するサブユニットを持つ１つのベクター又は２つのベクターのいずれかで提供される。
【００６１】
ＦＳＨを産生するための組換え技術の使用の別の例は、欧州特許ＥＰ０５０５５００に記載のように、ＦＳＨのサブユニットの一方又は両方をコードする内因性配列に、作用可能に連結するよう異種の制御セグメントを挿入するための相同組換えの使用によるものである。
【００６２】
また、ＷＯ９９／５７２６３に開示されているような方法であって、サブユニットのうちの１つが細胞内に非相同的に挿入され、そして他のサブユニットが相同組換えによる異種の制御セグメントの挿入によるゲノム配列の活性化により発現するものも考慮される。本発明の方法はＦＳＨを発現させるこれらの方法のうちのいずれかと一緒に使用することができる。
【００６３】
本発明における使用に適した組換えヒトＦＳＨは、例えば、セロノ社のＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）（ＦＳＨ、フォリトロピンアルファ）である。
【００６４】
本発明に従い使用されるＦＳＨは、生物学的起源、例えば尿起源、尿ＦＳＨ又はウロフォリトロピン（ｕＦＳＨ）から精製してもよい。許容される方法には、Hakola, 1997, Molecular and Cellular Endocrznology, 127 : 59-69, Keene et al., 1989, J. Biol. Chem., 264 : 4769-4775, Cerpa-Poljak et al., 1993, Endocrinolo, 132 :351-356, Dias et al. 1994, J. Biol. Chem., 269 : 25289-25294 ; Flack et al., 1994, J. Biol. Chem., 269 : 14015-14020及びValove, et al., 1994, Endocrinolov, 135:2657-2661 ; 米国特許第３，１１９，７４０号及び米国特許第５，７６７，０６７号に記載のものが含まれる。
【００６５】
ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体は、筋肉内又は皮下注射、好ましくは皮下注射用に製剤化してもよい。
【００６６】
ＦＳＨ製剤は凍結乾燥してもよく、この場合、これはあらかじめ注射前に注射用水に溶解される。ＦＳＨ製剤はまた液体製剤であってもよく、この場合、溶解することなく直接注射される。
【００６７】
ＦＳＨ製剤は、単回投与又は多数回投与用の液体フォーマットのいずれでもよく、バイアル又はアンプル中にあってもよい。単回投与フォーマットは、使用前の保存の際安定で且つ強力なままでなければならない。多数回投与フォーマットは、使用前の保存の際安定で且つ強力なままでなければならないだけでなく、アンプルの密封が損なわれた後、多数回投与に使用するための治療計画の投与期間を通じて安定で、強力で、且つ比較的細菌を含まない状態で維持されなければならない。このため、多数回投与フォーマットは静菌剤、例えばベンジルアルコール、メタ−クレゾール、チモール又はフェノール、好ましくはベンジルアルコール又はメタ−クレゾールを含んでいる。単回投与製剤も静菌剤を含んで成ることがある。
【００６８】
ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体は、既知の賦形剤及び安定化剤、例えばスクロース及びマンニトールと一緒に製剤化されることがある。当該製剤はまた、抗酸化剤、例えばメチオニンを含んで成ることもある。これは更に界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（好ましくはＴＷＥＥＮ２０）又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）を含んで成ることもある。
【００６９】
ＦＳＨは筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）注射用に現在製剤化されている。ＦＳＨは、２〜２５℃で保存した場合に１年半から２年の貯蔵寿命を有する７５ＩＵ／バイアル、そして１５０ＩＵ／バイアルのバイアル又はアンプルにおいて凍結乾燥（固体）型で供給される。注射溶液は、凍結乾燥型の製品を注射用水（ＷＦＩ）で再構成することで形成する。患者の反応に応じて、漸増用量のＦＳＨを用いる最大３サイクルの治療を使用することができる。凍結乾燥製剤を用いる場合、患者は新規バイアル中の凍結乾燥材料を希釈剤で再構成し、そして毎日それを再構成直後に投与する必要がある：例えば：［Serono Laboratories, Inc., Randolph, MAにより皮下注射用のFertinex（登録商標）（精製型注射用尿性卵胞性刺激ホルモン）について１９９６年２月に発行された添付文書Ｎ１７００１０１Ａ］；Ｍｅｔｒｏｄｉｎ  ＨＰ（登録商標）；Ｇｏｎａｌ  Ｆ（登録商標）ペン(Serono Laboratories, Inc)、すなわち予め充填され、そしてすぐに使用することができる多数回投与ＦＳＨ。
【００７０】
ＦＳＨ用の製剤の例を以下に列記する。
【００７１】
ＥＰ０６１８  ８０８(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)は、ゴナドトロピンと、安定量のスクロース単独又はスクロースとグリシンの固形均質混合物を含んで成る安定な液体医薬組成物を開示している。
【００７２】
ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５０４３２(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)は、ＦＳＨとＰｌｕｒｏｎｉｃの医薬組成物を開示している。
【００７３】
ＥＰ０  ４４８  １４６(AKZO N. V.)は、１重量部のゴナドトロピン；及び当該ゴナドトロピンと会合した２００〜１０，０００重量部のジカルボン酸塩の安定化剤を含んで成る安定化したゴナドトロピン含有凍結乾燥物を開示している。
【００７４】
ＥＰ０  ８５３  ９４５(Akzo Nobel N. V.)は、ゴナドトロピンと、安定化量のポリカルボン酸又はその塩及び安定化量のチオエーテル化合物を含んで成ることを特徴とする液体ゴナドトロピン含有製剤を開示している。
【００７５】
ＦＳＨのレベルは、配偶子の染色体変化に罹っている雄性において、ＦＳＨアゴニスト、例えばＷＯ０２０９７０６及びＷＯ０００８０１５に記載のＦＳＨアゴニストの投与を通じて内因性ＦＳＨレベルを上昇させることで増大させることができる。
【００７６】
１つの態様において、本発明は、雄性における配偶子の染色体変化、特に精子の数的異常、例えば配偶子の異数性、例えば二倍性及び二染色体性の処置及び／又は軽減のための医薬組成物の調製のための、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びＦＳＨ変異体から選択される物質の使用を提供する。
【００７７】
別の態様において、本発明は、雄性における配偶子の染色体変化、特に精子の数的異常、例えば配偶子の異数性、例えば二倍性及び二染色体性と関連する疾患又は障害を処置及び／又は予防するための方法であって、有効量のＦＳＨ及びＦＳＨ変異体から選択される物質を、必要とされる雄性の対象者に対し投与することを含んで成り、対象者がヒト又は動物であってもよい、方法を提供する。
【００７８】
別の態様において、本発明は、雄性における配偶子の染色体変化、特に精子の数的異常、例えば配偶子の異数性、例えば二倍性及び二染色体性を軽減するための方法であって、有効量のＦＳＨ及びＦＳＨ変異体から選択される物質を患者に対し投与することを含んで成る方法を提供する。
【００７９】
別の態様において、本発明は、雄性の対象者の子孫における染色体異常の発生を予防する方法であって、有効量のＦＳＨ及びＦＳＨ変異体から選択される物質を雄性の対象者に対し受胎前に投与することを含んで成る方法を提供する。
【００８０】
別の態様において、本発明は、体外受精、例えばＩＣＳＩの方法であって、精子のドナーを、精子の回収前に、精子の染色体異常を予防又は軽減するのに十分なＦＳＨ又はＦＳＨ変異体の量で処置する段階を含んで成る方法を提供する。
【００８１】
更なる態様において、本発明は、体外受精、例えばＩＣＳＩの方法であって、患者の精子の異数性及び／又は二倍性を蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のような技術で検出する段階、異数体及び／又は二倍体の精子のドナーを、精子の回収前に、精子の染色体異常を予防又は軽減するのに十分なＦＳＨ又はＦＳＨ変異体の量で処置する段階を含んで成る方法を提供する。
【００８２】
本発明の好ましい態様において、雄性はヒトである。
【００８３】
本発明の別の好ましい態様において、前記物質はＦＳＨである。
【００８４】
本発明の別の好ましい態様において、前記物質はｒＦＳＨである。
【００８５】
本発明の別の好ましい態様において、雄性は精子の数的な染色体異常を示す。
【００８６】
本発明の別の好ましい態様において、精子の数的な染色体異常は二倍性である。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様において、精子の数的な染色体異常は、性染色体の二染色体性である。
【００８８】
本発明の別の好ましい態様において、雄性は少なくとも１％又は約１％の精子の異数性を示す。
【００８９】
本発明の別の好ましい態様において、雄性は少なくとも０．５％又は約０．５％の精子の二倍性を示す。
【００９０】
別の好ましい患者群は、少なくとも０．８％又は約０．８％の二倍性を示す雄性に代表される。
【００９１】
別の好ましい患者群は、異数性、そして少なくとも５，０００ｐｇ／ｍｌ又は約５，０００ｐｇ／ｍｌの総テストステロンの基底の血清レベルを示す雄性に代表される。
【００９２】
本発明の別の好ましい態様において、前記物質の投与は一日おきに実施される。
【００９３】
本発明の別の好ましい態様において、前記物質は約７５〜３００ＩＵ／投与量、好ましくは１５０ＩＵ／投与量で投与される。
【００９４】
本発明の別の好ましい態様において、雄性の患者は、生殖補助技術、例えばＩＶＦ（体外受精）及びＩＣＳＩ（細胞内精子注入法）を受ける。
【００９５】
本発明の別の好ましい態様において、ＦＳＨ及びＦＳＨ変異体から選択される物質による雄性の患者の処置は、生殖補助技術を受ける前に少なくとも一週間、一ヶ月、三ヶ月、六ヶ月及び一年前から選択される時間、好ましくは少なくとも３ヶ月の間実施される。
【００９６】
１つの好ましい態様において、本発明は、患者の精子の異数性の処置及び／又は軽減のための医薬組成物の調製のためのｒＦＳＨの使用を提供する。
【００９７】
別の更に好ましい態様において、本発明は、患者の精子の異数性を軽減する方法であって、有効量のｒＦＳＨから選択される物質を当該患者に投与することを含んで成る方法を提供する。
【００９８】
続いて本発明を以下の実施例により説明するが、これは、本発明を何ら限定するものとしてみなされるべきではない。実施例は、下文で説明する図を参照する。
【００９９】
略語：
Ｋｇ（キログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｍｉｎ（分）、ｍｌ（ミリリットル）、ｍＭ（ミリモル）、ｍ2（平方メートル）、ｎｇ（ナノグラム）、ｐｇ（ピコグラム）、ＡＲＴ（生殖補助技術）、ＢＭＩ（体格指数）、ＣＥＰ(Chromosome Enumeration Probe)（染色体列挙プローブ）、ＤＡＰＩ（４，６ジアミジノ-２-フェニルインドール）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール、Biorad）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＦＩＶＥＴ（体外受精・胚移植）、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、ＩＣＳＩ（細胞内精子注入法）、ＩＭ（筋肉内）、ＩＶＦ（体外受精）、ＩＵ（国際単位）、ＬＩＳ（３，５−ジヨードサリチル酸リチウム塩）、ＭＥＳＡ（微鏡下精巣上体精子吸引）、ＯＡＴ（乏精子−精子無力−奇形精子症）、ＰＥＳＡ（経皮的精巣上体精子吸引）、ｒＦＳＨ（組換えＦＳＨ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＲＴ（室温）、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）、ＳＣ（皮下）、ＳＣＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）、ＴＥＳＡ（精巣内精子吸引）、ＴＥＳＥ（精巣内精子回収）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、ｕＦＳＨ（尿ＦＳＨ）、ＵＳＰ（米国薬局方）、ＷＦＩ（注射用水）。
【実施例】
【０１００】
本発明を以下の実施例で例示するが、これらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１０１】
実施例１：ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）（セロノ社の組換えｈＦＳＨ）がヒト不妊男性（８人の患者）の精子の異数性に対して及ぼす効果
【０１０２】
ａ）不妊患者の選別
患者の不妊症は、スペルミオグラム(spermiogram)記録、ホルモン測定（アンドロステンジオン（Ａ）、全テストステロン（Ｔｔｏｔ）、ＤＨＥＡ、プロラクチン（ＰＲＬ）、ＴＳＨ、遊離チロキシン（ＦＴ４））及びＹ染色体微小欠失を含む男性病学への往診の後に決定される。
【０１０３】
正常値は以下の通りである：
Ａ：１２００〜５０００ｎｇ／ｍｌ；Ｔｔｏｔ：１５００〜１１４００ｐｇ／ｍｌ；ＰＲＬ：２〜１５ｎｇ／ｍｌ；ＦＴ４：５０〜１２０ｎｇ／ｍｌ；ＦＳＨ：０．７〜１０ｍＩＵ／ｍｌ．
【０１０４】
血液試料は午前９〜１１時の間に得る。測定は市販のＲＩＡ又はＥＬＩＳＡキットで実施する。
【０１０５】
ｂ）処置前のＦＩＳＨ解析による性染色体における異数性／二倍性の比率の決定
新鮮な精子試料を１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄し、スライドガラス上に塗抹し、そして風乾させた。それらを続いて３：１のメタノール−酢酸中で１０分間固定した。スライドを７０％、８０％及び１００％冷エタノールで脱水し、風乾させた。試料を０．０１ＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール、Biorad）／０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、続いて２０ｍＭＬＩＳ（３，５−ジヨードサリチル酸リチウム塩、Sigma）／前記緩衝液で膨張処理し、精子頭部が膨張しているかを調べた。２ｘＳＳＣ（ｐＨ７）中ですすぎ、そして風乾したスライドを脱水し、そして７０％ホルムアミド(Aldrich)、２ｘＳＳＣ中で７３℃で４分間変性させた。それらを続いてすぐに段階的エタノール系で脱水した。
【０１０６】
この最終段階の間に、異なる蛍光色素で直接標識したＸ、Ｙ、第１８染色体用のＣＥＰ（染色体列挙プローブ、Vysis, IL, USA）−サテライトＤＮＡプローブを使用した。このプローブ混合物を５分間水浴中７３℃で変性させた。ハイブリダイゼーションを３７℃の湿室で１２時間実施した。続いてスライドを０．４ｘＳＳＣ−０．３％ＮＰ４０を用い２分間７３℃で洗浄し、すぐに２ｘＳＳＣ−０．１％ＮＰ４０中室温で洗浄し、そして最終的にantifade溶液(Vysis, IL, USA)中１２５ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩでマウントした。合計３５００〜５０００の精子を三色ＦＩＳＨで解析した。
【０１０７】
スコアリング基準
全体のハイブリダイゼーション効率は９９％超であった。精子核をMartin et al 1995, Mol Reprod. Dev., 42 (l) : 89-93の基準に従いスコアリングした。精子核は、それらが無傷で、オーバーラップしておらず、且つはっきりと定まった境界線を有する場合に限りスコアリングされる。
【０１０８】
異数性の場合、精子尾部の存在が確認された。精子は、２つの蛍光スポットが同じ色であり、同程度のサイズ、形状及び強度であり、そして精子頭部の縁の内側に少なくとも１つの領域と離れて位置する場合に二染色性であるとみなされた。
【０１０９】
二倍性は、上記基準に従い、２つの二重の蛍光スポットの存在により認識した。観察及びスコアリングは、水色、橙色、緑色の蛍光色素用のトリプルバンドパスフィルター(Vysis, IL, USA)及びＤＡＰＩ用のモノクロームフィルターを持つ蛍光装置を備えたLeitz Aristoplanの光学顕微鏡上で実施した。
【０１１０】
以下の特徴を有する患者を選別した：
二倍性は処置前に観察した全ての異数性のうちの５０．２４％に相当した。
−二倍性の存在についての陽性試験が、上述の射精した精子に対するＦＩＳＨ測定で０．８％以上であること。
−ＦＳＨ血清レベルが１０ＵＩ／ｍｌ未満であること。
【０１１１】
これらの特徴のうち少なくとも１つを示す患者は本研究から排除される：
−体格指数［（ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長（ｍ2）ｘ１００）］が３０未満であること；
−ベースライン時の精管の通路における感染の存在（すなわち、クラミジア、ウレアプラズマ、マイコプラズマ）；
−既知の自己免疫障害；
−甲状腺障害及び／又は病理学；
−慢性肝障害；
−ＦＳＨ処置に禁忌の付随の病状の存在。
【０１１２】
ｃ）処置プロトコール
患者は３ヶ月間１日おきに１５０ＵＩに等しい量を投与される（２バイアル、皮下）。
【０１１３】
ｄ）処置後のＦＩＳＨ解析による異数性／二倍性の比率の決定
性染色体における異数性／二倍性の比率は、上記（ｂ）で詳述したプロトコールに従い処置後にＦＩＳＨ解析することで測定する。
【０１１４】
二倍性が−５４％低下したことが８人全ての患者の試料サイズで明らかとなった（９５％の信頼区間：−２０％〜−８７％；ｎ＝３；ｐ＝０．０２）。
【０１１５】
性染色体の異数性の頻度の低下は８人全ての患者の試料で見られた。
【０１１６】
実施例２：ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）が１９人のヒト不妊男性の二倍性及び異数性に対して及ぼす効果
ａ）患者の選別：
１８〜５５歳の全２３人の不妊男性患者を選択する。彼等の不妊症は、実施例１で詳述したプロトコールに従い決定する。
【０１１７】
ｂ）処置：
１９人の患者に３ヶ月間１日おきに１５０ＵＩ（２バイアル、皮下）に等しい量を投与し、そして４人の患者には処置をしない。
【０１１８】
総異数性、二倍性及び総二染色体性のパーセンテージをＦＩＳＨ試験（実施例１を参照のこと）で処置４５日前（−４５）、処置の前の処置当日（０）に測定する。
【０１１９】
総異数性は、二倍性と総二染色体性との和として算出する。特定の二染色体性（性染色体の二染色体性及び第１８染色体の二染色体性）のパーセンテージを算出する。性染色体の二染色体性は更に、ＸＸ、ＹＹ及びＸＹ染色体についての二染色体性の詳細なパーセンテージへと解析する。
【０１２０】
ｃ）終点測定：
処置の３ヶ月後（９０）、患者は本研究の開始時に実施するものと同一の試験を受け、そしてＦＩＳＨ試験を繰り返し、異数性、二倍性及び二染色体性の各パラメーターを測定する。
【０１２１】
ｄ）測定値の統計解析：
平均値間の差異の統計的な有意性は、実施例１で詳述したプロトコールを用いて算出する。
【０１２２】
総異数性及び二倍性に対するＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）を用いた３ヶ月の処置の効果をそれぞれ図１及び２で報告する。
【０１２３】
総異数性における３８．４％の低下及び二倍性における４０．７％の低下が観察される。
【０１２４】
総二染色体性に対するＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）を用いた３ヶ月の処置の効果を図３で報告する。総二染色体性に対する主要な減少効果は、処置後に性染色体の総二染色体性の減少（−２９．３％）により観察された。性染色体の総二染色体性の減少の主な原因は、ＸＸ二染色体性のパーセンテージの低下（−３５．５％）及びＹＹ二染色体性のパーセンテージの低下（−５０％）に起因するものと見られる。
【０１２５】
これらの結果は、男性における組換えＦＳＨによる処置が総異数性、特に二倍性及び性染色体の二染色体性を有意に減少させることができることを示す。
【０１２６】
実施例３：ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）が２２人のヒト不妊男性の二倍性及び異数性に対して及ぼす効果
実施例２で選別したが、実施例２の計算において含められなかった３人以上の患者についての統計的データを解析した。
【０１２７】
総異数性、二倍性及び性染色体の二染色体性に対する実施例２で示した効果を、拡張した患者の試料（２２人の患者）で確認する：総異数性においては３２％の低下、二倍性においては３３％の低下、そして性染色体の総二染色体性においては２６％の低下が観察される。
【０１２８】
性染色体の総二染色体性の減少の主な原因は、ＸＸ二染色体性のパーセンテージの低下（−３２％）及びＹＹ二染色体性のパーセンテージの低下（−２１％）に起因するものと見られる。
【０１２９】
実施例４：ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）が６人のヒト不妊男性の二倍性及び異数性に対して及ぼす効果
使用したプロトコールは実施例２で使用したものと同じであるが、但し、ＦＳＨの投与量は１日おきに３００ＩＵであり、そして登録した患者の数は６人であった。
【０１３０】
処置９０日後の変量の解析は実施例に記載の通りに実施し、そしてこれも染色体異常（異数性、二倍性、全性染色体の二染色体性、ＸＹ、ＹＹ、ＸＸ染色体の二染色体性）の減少を示した。
【０１３１】
統計学的な有意性のために、より多くの投与量（３００ＩＵ）による６人の患者の結果は、より少量の投与量（実施例３の１５０ＩＵの投与量）を受けている２２人の患者に対する研究結果と一緒にした。
【０１３２】
この一緒にした解析は、以下の結論をもたらした：ＦＳＨ処置は、総異数性においては３０％の低下、二倍性においては３２％の低下、そして性染色体の総二染色体性においては２８％の低下、ＸＹ染色体の二染色体性においては２３％の低下、そしてＸＸ染色体の二染色体においては３０％の低下をもたらした。
【０１３３】
従って、患者数の増大とともに統計的な有意性が増大したことで、男性の異数性におけるＦＳＨの有益な効果が裏付けられた。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、処置、すなわち１５０ＵＩ／日（隔日）の異なる段階での総異数性のパーセンテージの変化を表す（−４５：処置４５日前；０：処置の前の処置当日；９０：処置開始９０日後）。
【図２】図２は、処置、すなわち１５０ＵＩ／日（隔日）の異なる段階でのそれぞれの二倍性のパーセンテージの変化を表す（−４５：処置４５日前；０：処置の前の処置当日；９０：処置開始９０日後）。
【図３】図３は、処置、すなわち１５０ＵＩ／日（隔日）の異なる段階での総二染色体性のパーセンテージの変化を表す（−４５：処置４５日前；０：処置の前の処置当日；９０：処置開始９０日後）。
【図１】
0004718459.tif 000003
【図２】
0004718459.tif 000004
【図３】
0004718459.tif 000005