(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式：
【化１】
0004723097.tif 000004
［式中、
Z1、Z2、Z3及びZ4は、-O-であり；
R1及びR2は、同一であり又は異なり、そして水素、C1-C24アルキル又はC1-C24アルケニルであり；
R3及びR4は、同一であり又は異なり、そして水素、C1-C24アルキル又はC1-C24アルケニルであり；
R5、R6、R7及びR8は、同一であり又は異なり、そして水素、C1-C24アルキル又はC1-C24アルケニルであり；
R9はリンカーであって、当該リンカーは、ポリアルキルオキシ基又は置換されたC1-C10アルキルであり、当該置換されたC1-C10アルキルの置換基はヒドロキシ、低級アルキル基のアルコキシ、低級アルキル基のメルカプト、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、ニトロン、オキシ、アミノ、アミド、イミノ、チオ、-C(O)H、アシル、オキシアシル、カルボキシル、カルバメート、スルホニル及びスルホンアミドから成る群から選択され；
ｎ及びｍは、同一であり又は異なり、そして１〜８であり；そして
X及びYは、同一であり又は異なり、そして非毒性の陰イオンである］
により表されるカチオン性脂質化合物。
【請求項２】
前記置換されたC1-C10アルキルが更にペプチド結合を含む、請求項１に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項３】
下記の式：
【化２】
0004723097.tif 000005
で示される、(±)-N-[4-(N'-(3'-トリプトファニルアミのプロピル))-N',N'-ジメチル-2',3'-ビス(テトラデシルオキシ)-1'-プロパナミニウミル]- N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパナミニウミルブロミド（HB-DMRIE-Ox-Trp-γ-DMRIE）である、請求項２に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項４】
前記ポリアルキルオキシ基が、１〜500アルキルオキシマーを含む、請求項１に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項５】
前記ポリアルキルオキシ基が、１〜100アルキルオキシマーを含む、請求項１に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項６】
下記式：
【化３】
0004723097.tif 000006
で示される、α,ω-ビス-(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス-(テトラデシルオキシ)-1-プロパナミニウムブロミドエーテル（PentaEG-bis-DMRIE）である、請求項５に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項７】
前記ポリアルキルオキシ基が更にペプチド結合を含む、請求項５に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項８】
下記式：
【化４】
0004723097.tif 000007
で示される、ポリ(エチレングリコール)-34-ビス-[(±)-N-(N'-プロピルブチルアミド)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパナミニウムブロミド（PEG34-bis-But-DMRIE-propylamide）である、請求項７に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項９】
記の一般式：
【化５】
0004723097.tif 000008
［式中、
Z1、Z2、Z3及びZ4は、-O-であり；
R1及びR2は、同一であり又は異なり、そして水素、C1-C24アルキル又はC1-C24アルケニルであり；
R3及びR4は、同一であり又は異なり、そしてC1-C24アルキル又はC1-C24アルケニルであり；
R5、R6、R7、R8、R12、R13、R14及びR15は、同一であり又は異なり、そして水素、C1-C10アルキル又はC1-C10アルケニルであり；
R9及びR10は、同一であり又は異なり、そしてC1-C10アルキル又はC1-C10アルケニルであり；
R11は、C1-C10アルキル又はC1-C10アルケニルであり；
ｎ及びｍは、同一であり又は異なり、そして１〜８であり；そして
X及びYは、同一であり又は異なり、そして非毒性の陰イオンである］
により表されるカチオン性脂質化合物。
【請求項１０】
下記式：
【化６】
0004723097.tif 000009
で示される、1,4-ビス-(N'-ブチル-(4-(N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパナミニウム))-ウレイル-ブタン（SBDU-DMRIE）；
下記式：
【化７】
0004723097.tif 000010
で示される、1,6-ビス-(N'-プロピル-(3-(N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパナミニウム))-ウレイル-へキサン（SHGU-DMRIE）；又は
下記式：
【化８】
0004723097.tif 000011
で示される、1,4-ビス-(N'-プロピル-(3-(N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパナミニウム))-ウレイル-ブタン（SBGU-DMRIE）；
である、請求項９に記載のカチオン性脂質化合物。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれか１項に記載のカチオン性脂質化合物、及び１又は複数の共脂質を含んで成るアジュバント組成物。
【請求項１２】
請求項１〜10のいずれか１項に記載のカチオン性脂質化合物、及び免疫原を含んで成る免疫原組成物。
【請求項１３】
前記免疫原が免疫原をコードするポリヌクレオチドである、請求項12に記載の免疫原組成物。
【請求項１４】
１以上の共脂質をさらに含む、請求項12又は13に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
脊椎動物に投与するための、請求項12〜14のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１６】
前記脊椎動物が哺乳類である、請求項15に記載の免疫原組成物。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項16に記載の免疫原組成物。
【請求項１８】
植物または動物の細胞に生物学的に活性な薬剤を送達するための組成物であって、請求項１〜10のいずれか１項に記載のカチオン性脂質化合物及び生物学的に活性な薬剤を含む脂質凝集物を含んで成る組成物。
【請求項１９】
脊椎動物にポリヌクレオチドを送達する際の使用のための薬学的キットであって、請求項１〜10のいずれか１項に記載のカチオン性脂質化合物を含んで成るキット。
【請求項２０】
さらにポリヌクレオチドを含み、ここで該ポリヌクレオチドは、インビボで脊椎動物細胞中のポリペプチドを作用可能にコードする、請求項19に記載のキット。
【請求項２１】
１ng〜30 mgの前記ポリヌクレオチドを含む、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
100 ng〜10 mgの前記ポリヌクレオチドを含む、請求項21に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的に、サイトフェクチン及びアジュバント組成物に関するものである。より具体的には、本発明はサイトフェクチンとしておよびアジュバントとして有用な組成物、ならびに細胞への核酸のトランスフェクションを容易にするための方法およびポリヌクレオチドに基づいたワクチンに対する脊椎動物の体液性免疫応答を増強するための方法を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
サイトフェクチンは、生体膜を横切る送達を促進することによって、または生体膜表面への接着を促進することによって、生物学的に活性な薬剤（特にポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、および薬物分子）の送達を増強するために使用される。いくつかの生理活性物質は、それが有する生物学的効果を発揮するために細胞内に入る必要がないものが存在する。なぜなら、生理活性物質は、細胞表面レセプターを通して細胞表面に作用することによって、または細胞外成分との相互作用により細胞表面に対して作用することによってのいずれかで作用するからである。しかし、細胞下、または分子レベルで細胞機能に影響を与え得る、タンパク質及びポリヌクレオチドを含む多くの天然生体分子およびそのアナログ、または薬物などの外来物質などが、その効果を生じるためには細胞内に組み入れられることが好ましい。このような物質にとっては、細胞膜は浸透が困難な選択的障壁を提供する。
【０００３】
天然には細胞に取り込まれない薬剤の首尾良い細胞内送達は、細胞内膜融合の天然のプロセスを利用することによって、または細胞の天然の送達機構（エンドサイトーシスおよびピノサイト−シスを含む）を直接利用することによって達成された（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ、Ｎ．，Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１９５−２８６（１９８５））。さらに、細胞膜バリアは、送達またはトランスフェクトされる薬剤を、天然の細胞膜の脂質組成と非常に似た脂質処方物と複合体化することによって克服され得る。これらの脂質は、細胞膜と接触し融合することができ、またそのプロセスにおいて、脂質複合体または集合体と結合している薬剤が細胞内に送達される。電荷を有する脂質を含む脂質集合体は、細胞膜と融合することによってだけではなく、細胞膜と送達される物質との間の電荷の反発作用を解決することによって細胞内への送達を容易にし得る。
【０００４】
トランスフェクションとして知られている技術である、発現可能なＤＮＡまたはＲＮＡの細胞内への導入により、有益であるか、または関心がもたれるタンパク質の細胞送達が達成され得る。このようにして導入されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によってコードされている対応するタンパク質を産生し得る。多くの疾患の治療は、標的細胞の中に残り得るペプチドの細胞内産生を誘導することによって増強され得るか、標的細胞の局所的な環境に分泌され得るか、または体循環に分泌されてその効果を産生し得る。生理活性ペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡ前駆体を細胞に導入するための様々な技術には、細胞膜を通過するという固有の能力を有する、組換えベクターおよびレトロウイルスも含めたウイルスベクターの利用が含まれる。しかし、外因性ＤＮＡを細胞の染色体物質に組み込むためのそのようなウイルス薬剤の利用は、ゲノムに対する損傷を引き起こす危険性および悪性の形質転換を引き起こす可能性をはらんでいる。この方法のインビボでの利用を制限するこのアプローチの別の局面は、これらの方法によって達成された、ゲノムへのＤＮＡ組込みは、そのＤＮＡがコードするペプチドの発現にわたる制御の損失を意味し、その結果、一過性の治療が達成するには困難であり、そして、治療において起こり得る望まれない副作用を取り去るか、または停止させることは困難もしくは不可能であり得る。
【０００５】
ＤＮＡトランスフェクションの領域における主な進歩は、リポソームまたは小さなベシクルという形態である、ＤＯＴＭＡなどの特定の合成カチオン性脂質が、負に荷電している細胞膜脂質と融合可能な脂質―ＤＮＡ複合体を形成するためにＤＮＡと自発的に相互作用することができ、その結果として外来ＤＮＡの取り込みおよび発現の両方を生じるという発見であった（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）および米国特許第４，８９７，３５５号（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。周知のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTMｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）は，高度にアニオン性のポリヌクレオチドの生体組織、培養細胞の送達のために効果的な試薬で、負に荷電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する、正に荷電したＤＯＴＭＡリポソ−ムを含む。ある程度、サイトフェクチンとしてのカチオン性脂質の有効性は、細胞についての増強された親和性から生じると考えられ、それらの細胞の多くは、膜表面に高度に負に荷電した領域を有する。またある程度、カチオン性脂質を含む脂質集合体上の陽性電荷の存在によって、ポリアニオン（特に核酸）を結合するための凝集が可能になる。このようにして調製された脂質集合体は、自発的に細胞表面上の負電荷に対して接着し、原形質膜との融合が可能となり、そして効果的に、機能的なポリヌクレオチドを細胞へ送達し得る。より最近では、改変されたローゼンタールインヒビター（ＲＩ）化合物のジエステルおよびジエーテルを含む他のカチオン性脂質が効果的なサイトフェクチン化合物であることが見出されている（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号および同第５，２６４，６１８号（これらの開示は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０００６】
１９８０年代後半、脂質―ＤＮＡ複合体の直接的筋肉内注射（ｉ．ｍ．）が、測定可能なタンパク質発現を生じること、そしてまた、「裸の」プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が、脂質―ＤＮＡ複合体より高い程度まで、筋肉内に取り込まれかつ発現され得ることが見出された（Ｆｅｌｇｎｅｒ，１９９７）。ｐＤＮＡ注射技術の最初の適用のうちの１つは、免疫応答の誘導であった。１９９１年、ｇｐ１２０  プラスミド  ＤＮＡを用いるｉ．ｍ．ワクチン投与によって、マウスがＨＩＶ  ｇｐ１２０に対して免疫し得ること（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９１）、およびマウスがインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）抗原を用いたＤＮＡ免疫後、マウスがインフルエンザウイルスの致死的なチャレンジから防御され得ることが最初に報告された。高度に保存されたＮＰ抗原による免疫後に得られた防御は、２つの異なるウイルス系統を越えて拡張された（Ｕｌｍｅｒら、１９９６）。これに続いて、ポリヌクレオチドに基づいたワクチン投与の分野において、多数の発表がなされた（Ｂｏｙｅｒら、１９９６；Ｂｏｙｅｒら、１９９７；Ｄａｖｉｓら、１９９７；Ｗａｎｇら、１９９７；Ａｇａｄｊａｎｙａｎら、１９９８；Ｈｅｐｐｅｌｌら、１９９８；Ｌｏｄｍｅｌｌら、１９９８；Ｖａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎら、１９９８）。
【０００７】
ポリヌクレオチドに基づいたワクチン投与の過程においてしばしば遭遇する問題は、不十分なまたは最適条件に及ばない体液性応答である。より強い体液性および（または）細胞性反応を獲得するために、ワクチン投与を受ける患者の免疫応答を増強する物質であるアジュバントを含む免疫原性組成物でこのようなワクチンを投与するのが一般的である。アジュバントは、特定の免疫原に対して生物の免疫応答を改善するために一般的に有用であり、そして一般的に抗原産生量を増加させるため、および／または免疫原の投与量および投与頻度を減少させるためワクチン組成物に含まれる。
【０００８】
ポリヌクレオチドに基づいたワクチン投与に対して異なるレベルの免疫応答の増強をもたらす様々なアジュバントが報告されてきた。このようなアジュバント物質の例の中には、半合成細菌細胞壁由来モノホスホリルリピドＡ（Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５（９）：３２５０−３２５８（１９９７））、小分子免疫賦活剤（Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１１：３０−３５（１９９８））およびサポニン（Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（６）：４３９１−４９３９（１９９８））が含まれる。ｉ．ｍ．ｐＤＮＡワクチン投与による免疫応答は、また、カチオン性脂質の使用を通して増強されている（例えば、Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．ら、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３（１６）：１４２１−１４２８（１９９７）、Ｏｋａｄａ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５９：３６３８−３６４７（１９９７）；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．ら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４：２２１−２３０（１９９６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０２：１０７−１１０（１９９７）；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１０９−１１８（１９９８）；Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５（８）：８１８−８２０（１９９７）；Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６２：２５４−２６２（１９９９）；Ｅｔｃｈａｒｔ，Ｎ．ら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：１５７７−１５８０（１９９７）；Ｎｏｒｍａｎ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，（分子医学実験法）、Ｖｏｌ．９：ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ＤＮＡワクチン）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（方法およびプロトコール）、Ｄ．Ｂ．ＬｏｗｒｉｅおよびＲ．Ｗｈａｌｅｎ，編、第１６章、１−１３頁（１９９９））。カチオン性脂質は元来、インビトロでの細胞へのトランスフェクションおよびｐＤＮＡの送達を増強するために、サイトフェクチンとして研究されていた（例えば、米国特許第５，３３４，７６１号、同第５，４５９，１２７号および同第５，２６４，６１８号にて開示およびクレイムされているサイトフェクチン（これらの開示は、本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）が；しかし、さらなる発展により、インビボにおいて、満足すべきタンパク質送達の首尾良い適用がもたらされてきた（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１１４５４−１１４５９（１９９６）；Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１８０３−１８１２（１９９６）；ＤｅＢｒｕｙｎｅ，Ｌ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１０７９−１０８７（１９９８））。
他のカチオン性脂質が調製された（例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３：２２８７−２２８８（１９９７）を参照のこと）。そこに開示される化合物は、ビスカチオン性二量体脂質として記載される。開示された化合物のいくつかの物理的特性が報告されているが、開示された化合物がサイトフェクチンとして有用であるかまたは有効であることを示唆するデータは報告されていない。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、サイトフェクチンおよびアジュバント組成物に対する特定の実施形態と同時に、免疫原およびこのようなアジュバント組成物を含む免疫原組成物に対する特定の実施形態に向けられている。他の実施形態において、本発明は細胞へのトランスフェクションおよび生理活性物質の送達を容易にするための方法および、ポリヌクレオチドに基づいたワクチンに対する脊椎動物の体液性免疫応答を増強するための方法と関連している。
【００１０】
本発明はまた、トランスフェクションおよび細胞への生理活性物質の送達を促進するための方法、ならびに免疫化、特にｐＤＮＡ免疫化に対する脊椎動物の免疫応答を増強するための方法を提供する。本発明は、抗体力価レベルより明らかにされるように、ポリヌクレオチドに基づいたワクチンに対する体液性免疫応答の増強を提供することによって、後者の点において特に有用である。抗体レベルの上昇は、免疫原をコードするヌクレオチド配列からの抗体レベルのみが最適となっていない適用において、特に有利である。関連する利点において、所望する抗体レベルが、ｐＤＮＡの所定の用量を用いて産生される場合、前もって決定されている抗体力価レベルに到達するために必要なより低いｐＤＮＡ用量を用いて達成され得る。ｐＤＮＡワクチン投与適用に対して、この利点は重要である。なぜなら、ｐＤＮＡ濃度の機能的な限界と考え合わせて、許容され得るワクチン投与量が所定のワクチン用量の上限を決定するからである。この利点は、多数のプラスミドを含み、しかも、それぞれのプラスミドは、特定の導入遺伝子に対する免疫応答を誘発するために十分な量の存在しなくてはならないプラスミドを含むワクチンにおいて特に重要である。
【００１１】
ポリヌクレオチドに基づいたワクチン投与の局面に関しては、本発明の方法は、脊椎動物を予防的に疾患から防御するために、または疾患を有する脊椎動物を治療的に処置するために、あるいはこれらの両方のために有用である。ある好適な実施形態において、本発明は、脊椎動物に免疫原性組成物を投与することによって脊椎動物を免疫化するための方法に関し、この免疫原性組成物は、免疫原をコードするヌクレオチド配列および、リンカーにより架橋された２つの四級アンモニウムヘッド基を有する新規カチオン性脂質化合物を含むアジュバント組成物を含む。免疫原をコードするヌクレオチド配列は、脊椎動物の細胞への取り込みの際に、免疫学的に有効な量の免疫原（例えば、免疫原性タンパク質）を産生する。本発明のアジュバント組成物は免疫原に対する脊椎動物の免疫応答を増強する。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明の組成物はさらに、１つ以上の共脂質または他の脂質凝集形成成分、例えば、リン脂質、リソリン脂質、リゾ脂質、およびコレステロールを含む。このような共脂質はカチオン性、アニオン性および中性脂質を含む。本発明における使用のための他の適切な共脂質は当業者によって既知であるか、あるいは決定され得る。
【００１３】
本発明の一局面は、疎水性テール、およびリンカーにより架橋された２つの四級アンモニウムヘッド基を有する新規カチオン性脂質化合物を含む組成物であり、このカチオン性組成物は、以下に記載される一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う構造を有する。
【００１４】
特定の好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物が式（Ｉ）に従う構造を有する場合、リンカーは、必要に応じて置換されたＣ1からＣ10のアルキルもしくはアルキルオキシであり、または必要に応じて置換されたＣ1からＣ10のアルケニルもしくははアルケニルオキシである。特に好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物は、ペンタＥＧ−ビス−ＤＭＲＩＥ、つまり図１Ｂにて示される化学構造である。
【００１５】
他の特定の実施形態において、リンカーは好適に、ウレイル結合（すなわち、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、ここでＲは、Ｈまたは必要に応じて置換されたＣ1からＣ10アルキルもしくはアルケニルである）、ビス−ウレイル結合（すなわち、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−Ｒ’−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ、ここでＲは、Ｈまたは必要に応じて置換されたＣ1からＣ10アルキルもしくはアルケニルであり、Ｒ’は必要に応じて置換されたＣ1からＣ10アルキルもしくはアルケニルにである）、またはペプチド結合（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、ここでＲは、Ｈまたは必要に応じて置換されたＣ1からＣ10アルキルまたはアルケニルである）を含む。他の実施形態において、このリンカーは、必要に応じて置換されたポリアルキルオキシ基をさらに含む。このポリアルキルオキシ基は、１〜５００のアルキルオキシマー、または１〜１００のアルキルオキシマーを含み得る。これらの組成物はさらに１つ以上の共脂質を含み得る。
【００１６】
他の特定の実施形態において、カチオン脂質化合物が下記の式（Ｉ）に従う構造を有する場合、リンカーはＤＮＡおよび／または細胞レセプター結合親和性を有する。このようなリンカーは、ヌクレオチドおよび／または細胞膜との相互作用における脂質の有効性を増強し得る。このような結合親和性を有する化学構造部分の例として、例えば、アミノ酸、ペプチド、サッカリド、ポリペプチド、ポリサッカリド、タンパク質、ポリアミン、ペプチド模倣部分およびヒストンを含む。このような結合親和性を有するポリアミンの特異的な例は、スペルミン、スペルミジン、およびその誘導体を含む。ペプチド部分を組み込んだ特に好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物は、ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ―ＤＭＲＩＥまたはＰＥＧ３４−ビスーＢｕｔ−ＤＭＲＩＥ−プロピルアミドなどであり、その化学構造は、図１Ｂに示される。ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ−ＤＭＲＩＥの化学名は、（±）−Ｎ−[４−（Ｎ’−（３’−トリプトファニルアミノプロピル））−Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−２’，３’−ビス（テトラデシルオキシ）−１’−プロパナミニウミル]−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミドである。ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ−ＤＭＲＩＥの分子式は、Ｃ84Ｈ161Ｂｒ2Ｎ5Ｏ6である。ＰＥＧ３４−ビス−Ｂｕｔ−ＤＭＲＩＥ−プロピルアミドの化学名は、ポリ（エチレングリコール）−３４ビス−［（±）−Ｎ−（Ｎ’−プロピルブチラミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド］である。
【００１７】
その組成物はまた、さらに１つ以上の共脂質を含む。
【００１８】
カチオン性脂質化合物が式（ＩＩ）に従った構造を有する、また他の好適な実施形態において、四級アンモニウムヘッド基を架橋しているリンカーは、ビス−ウレイル結合を含む。ある実施形態において、カチオン性脂質化合物は二量体であり、ここでＲ1からＲ4基で表される疎水性脂質テールは同一である。特に好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物はＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥ、ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥまたはＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥであり、これらの化学構造は図１Ａに提供される。ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥの別の一般名は、ブタンビス−ＤＵ−ＤＭＲＩＥである。ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥの化学名は、１，４−ビス−（Ｎ’−ブチル−（４−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウム））−ウレイル−ブタンである。ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥの分子式は、Ｃ80Ｈ166Ｏ6Ｎ6である。ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥの別の一般名は、ヘキサンビス−１，６−ＧＵ−ＤＭＲＩＥである。ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥの化学名は、１，４−ビス−（Ｎ’−プロピル−（４−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウム））−ウレイル−ヘキサンである。ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥの分子式は、Ｃ80Ｈ166Ｏ6Ｎ6である。ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥの別の一般名は、ブタンビス−ＧＵ−ＤＭＲＩＥである。ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥの化学名は、１，４−ビス（Ｎ’−プロピル−（４−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパナミニウム））−ウレイル−ブタンである。ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥの分子式は、Ｃ78Ｈ162Ｏ6Ｎ6である。これらの組成物はまた、必要に応じて１つ以上の共脂質を含み得る。
【００１９】
本発明の別の局面は、免疫原および、以下に記載する一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従うカチオン性脂質化合物を含むアジュバント組成物を含む免疫原性組成物である。好適には、免疫原コードヌクレオチド配列によって、免疫原が提供される。最も好適には、この配列は、プラスミドＤＮＡまたはその部分である。免疫原性組成物は、さらに１つ以上の共脂質を含む。
【００２０】
本発明のなお別の局面は、１つ以上の免疫原コードヌクレオチド配列および、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う１つ以上のカチオン性脂質化合物を含むアジュバント組成物を含む免疫原組成物を、コードされた免疫原に対する免疫応答を生成するに十分な量で脊椎動物に投与することによって、脊椎動物において免疫応答を誘導するための方法である。脊椎動物は、好適には哺乳動物であり、最も好適には、ヒトである。
【００２１】
本発明のさらに別の局面は、植物または動物の細胞への生物学的に活性な物質を送達するために有用な方法である。この方法は、生物学的に活性な物質および以下に記載される一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う１以上のカチオン性脂質化合物を含む組成物を含む脂質集合体を調製する工程、引き続いて細胞をこの脂質集合体と接触させる工程を包含する。この方法は、インビボ、インビトロの両方の細胞への送達のために有用であり、そして細胞のトランスフェクションのために利用され得る。
【００２２】
本発明のさらに別の局面は、サイトフェクチン／アジュバント組成物を含む薬学的組成物であり、この組成物は、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従うカチオン性脂質化合物を、薬学的に有効な量の治療薬剤とともに含む。このサイトフェクチン組成物は、治療剤の細胞送達を容易にする。好適には、この治療剤は、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）である。このポリヌクレオチドは、免疫原、天然のホルモン、または天然のホルモンの合成アナログをコードし得るか、または疾患状態において不足しているかまたは欠損している遺伝子産物をコードし得、そして脊椎動物に対するこの遺伝子産物の投与は、治療的効果を有する。
【００２３】
（発明の好適な実施形態の詳細な説明）
次の詳細な説明および本明細書に添付された特許請求の範囲の見地から、請求されるものとして本発明の範囲から逸脱することなく、様々な置換および改変が、特許請求される本発明に対して行われ得ることが、当業者に対して明らかである。
【００２４】
本発明は、疎水性アルキルテールおよびリンカーにより架橋された２つの第四級アンモニウムヘッド基を持つ新規カチオン性脂質化合物を含む組成物を提供し、このカチオン性脂質化合物は、下記の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う構造を有する。これらの組成物は、サイトフェクチンおよび／またはアジュバントとして使用し得る。本組成物は、サイトフェクチンとして、インビボおよびインビトロ適用両方において、植物または動物細胞への、例えばヌクレオチド配列、タンパク質、ペプチド、および薬物などの、生理活性物質の細胞内送達を容易にする。アジュバントとして、本組成物は、免疫原に対する脊椎動物の体液性免疫応答を増強する。
【００２５】
本発明のカチオン性脂質化合物は、一般式（Ｉ）を持つ化合物を含む：
【００２６】
【化３】
0004723097.tif 000002
ここで、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3およびＺ4は、同じであるかまたは異なり、そして−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−であり；
Ｒ1およびＲ2は、同じであるかまたは異なり、そしてＨ、Ｃ1〜Ｃ24アルキルまたはＣ1〜Ｃ24アルケニルであり；
Ｒ3およびＲ4は、同じであるかまたは異なり、そしてＣ1〜Ｃ24アルキルまたはＣ1〜Ｃ24アルケニルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、同じであるかまたは異なり、そしてＨ、Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ1〜Ｃ10アルケニルであり；
Ｒ9はリンカーであり；
ｎおよびｍは、同じかまたは異なり、そして１〜８であり；そして
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、そして無毒性の陰イオンである。
【００２７】
本発明のカチオン性脂質化合物は、生理活性物質とともに脂質集合体を形成するように加工され得るということから、サイトフェクチンとして有用である。第四級アンモニウム基は、核酸に対する結合アフィニティーを持っていることが公知であり、これにより、カチオン性脂質化合物は、ｐＤＮＡワクチンで見られるようなヌクレオチド配列の細胞への送達において特に有用となる。二座配列の第四級ジアンモニウムイオンのＤＮＡとの結合アフィニティーの議論については、例えば、ＤＮＡとヘキサメチレン連結アンモニウムイオン間の相互作用について記述している、Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：９５１５−９５２０（１９９６）を参照のこと。
【００２８】
好適には、ある実施形態において、式（Ｉ）のＲ9は、ＤＮＡおよび／または細胞レセプター結合アフィニティーを持つリンカーである。このようなリンカーの例の中には、炭化水素、ポリサッカリド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ペプチド模倣物、ポリアミンおよびヒストンが含まれる。これらのタイプのリンカーは、ヌクレオチド配列および／または細胞膜との更なる相互作用を提供し、これによって、カチオン性脂質化合物の細胞への送達能力を増強する。これは、選択された標的細胞タイプへの生理活性物質の送達において、リンカーが特異的に標的細胞膜上の表面抗原またはレセプターに結合し得る場合に、特に有用である。ある特定の細胞タイプに目標を定められるという能力は、インビボでの適用（例えば、遺伝子治療において）において特に有用である。この目標に好適なリンカーには、ポリアミンであるスペルミンおよびスペルミジン（ならびにそれらの誘導体）ならびにアルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を豊富に含むタンパク質（あるいはその誘導体またはアナログ）が含まれる。ヒストン、スペルミンおよびスペルミジンなどのカチオン性物質は、負に荷電した細胞膜表面と結合し変化させることが公知である。例えば、脂質誘導体化スペルミン様構造は効果的に、哺乳動物内分泌細胞への遺伝子の移入を変化させる（Ｂｅｈｒ，Ｊ−Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６（１９８９））。リンカーとして有用な他の好適なタンパク質の中には、免疫グロブリン（例えば、一本鎖免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントなど）、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質（例えば、アシアロフェチュイン）、インテグリン、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）、セレクチン、細胞表面レセプター、レセプターリガンド、主要組織適合タンパク質、ライソソーム栄養タンパク質、細胞外タンパク質、インターナリゼーションシグナルおよび／または核局在化シグナルとしての活性を持つタンパク質、排出タンパク質、タンパク質ホルモン（例えば、インスリン、エリスロポエチンなど）、成長因子（例えば、ヒト成長因子、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子など）、細菌外毒素、低密度リポプロテイン、アルファ−２−マクログロブリン、およびアンギオテンシンが含まれる。さらに、有利なＤＮＡ結合および／または標的化特性を、単独でかまたは組み合わせで有する融合タンパク質およびキメラタンパク質はまた、好適なリンカーとして考えられ得る。これらの実施形態の組成物は、１つ以上の共脂質を随意に含み得る。
【００２９】
ある好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物が式（Ｉ）に従う場合に、リンカーは、随意に置換されるＣ1〜Ｃ10のアルキルまたはアルキルオキシ、あるいは随意に置換されるＣ1〜Ｃ10のアルケニルまたはアルケニルオキシである。特に好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物は、図１Ｂにて示される化学構造である、ペンタＥＧ−ビス−ＤＭＲＩＥである。
【００３０】
ある他の実施形態において、リンカーは好適にはウレイル結合（すなわち、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−であり、ここで、Ｒは、Ｈまたは随意に置換されるＣ1〜Ｃ10アルキルまたはアルケニルである）、ビス−ウレイル結合（すなわち、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−Ｒ’−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−であり、ここで、Ｒは、Ｈまたは随意に置換されるＣ1〜Ｃ10のアルキルまたはアルケニルであり、そしてＲ’は、随意に置換されるＣ1〜Ｃ10のアルキルまたはアルケニルである）またはペプチド結合（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−であり、ここでＲは、Ｈ、または随意に置換されるＣ1〜Ｃ10のアルキルまたはアルケニル）を含む。他の実施形態において、このリンカーは、必要に応じて置換されたポリアルキルオキシ基をさらに含む。このポリアルキルオキシ基は、１〜５００のアルキルオキシマー、または１〜１００のアルキルオキシマーを含み得る。このような結合は、本発明のカチオン性脂質にＤＮＡなどの陰イオン性分子とのさらなる結合アフィニティーを与える。ペプチド構造部分を組み入れている特に好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物は、図１Ｂで示される化学構造である、ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ−ＤＭＲＩＥ、またはＰＥＧ３４−ビス−Ｂｕｔ−ＤＭＲＩＥ−プロピルアミドである。これらの実施形態の組成物には１つ以上の共脂質が随意に含まれ得る。
【００３１】
本発明のカチオン性脂質化合物にはまた、一般式（ＩＩ）を有する化合物が含まれる：
【００３２】
【化４】
0004723097.tif 000003
ここで、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3およびＺ4は、同じであるかまたは異なり、そして−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−であり；
Ｒ1およびＲ2は、同じであるかまたは異なり、そしてＨ、Ｃ1〜Ｃ24アルキルまたはＣ1〜Ｃ24アルケニルであり；
Ｒ3およびＲ4は、同じであるかまたは異なり、そしてＣ1〜Ｃ24アルキルまたはＣ1〜Ｃ24のアルケニルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は、同じであるかまたは異なり、そしてＨ、Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ1〜Ｃ10アルケニルであり；
Ｒ9およびＲ10は、同じであるかまたは異なり、そして随意に置換されるＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ1〜Ｃ10アルケニルであり；
Ｒ11は、随意に置換されるＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ1〜Ｃ10アルケニルであり；
ｎおよびｍは、同じであるかまたは異なり、そして１〜８であり；そして
ＸおよびＹは、同じかまたは異なる、無毒性陰イオンである。
【００３３】
カチオン性脂質化合物が上記式（ＩＩ）に従う、ある実施形態において、第四級アンモニウムヘッド基を架橋するリンカーは、ビス−ウレイル結合を含む。尿素基は当該分野において、細胞膜で見られるように、リン酸基に対する結合アフィニティーを持っていると認識されている（例えば、Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６（３６）：６４８３−６４８６（１９９５）を参照のこと）。好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物は、二量体であり、ここでＲ1基〜Ｒ4基で表される疎水性テールは、同一である。特に好適な実施形態において、カチオン性脂質化合物は、図１Ａで与えられる化学構造の、ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥ、ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥまたはＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥである。これらの組成物はまた、さらに１つ以上の共脂質を含み得る。
【００３４】
本発明で有用な様々な好適なカチオン性脂質化合物は、次の構造を基にした、または次の構造を含む化合物を含む。その構造とは、ＤＭＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム）、ＤＯＲＩＥ（（±）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２，３−（ビス−ｓｙｎ−９−オクタデセニルオキシ−１−プロパンアミニウム）、ＤＬＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−ドデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム）、ＤＤＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス−デシロキシ）−１−プロパンアミニウム）、ＤＰＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−ヘキサデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム）、およびＤＭＯＲＩＥ（（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−（ビス−ｓｙｎ−９−テトラデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウム）である。
【００３５】
定義を目的として、「共脂質」なる語は、カチオン性脂質と合わせられ得る全ての疎水性物質を示し、リン脂質などの両親媒性脂質、およびコレステロールやその他のステロールのような中性脂質、ならびにこのような脂質のリソ体を含む。本発明の共脂質は、どのような、天然または合成リン脂質またはモノ、ジ、もしくはトリアシルグリセロールをも含み得る。天然リン脂質は典型的に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルイノシトールのような、動物および植物源由来のものである。ある好適な実施様態において、ホスファチジルエタノールアミンは、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰｙＰＥを含む。ＤＯＰＥおよびＤＰｙＰＥは特に好適である。アジュバント組成物として、最も好適な共脂質はＤＰｙＰＥであり、これはジアシルホスファチジルエタノールアミン骨格に組み入れられる２つのフィタノイル（ｐｈｙｔａｎｏｌｙ）置換基を含む。合成リン脂質は典型的に、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよび対応する合成ホスファチジルエタノールアミンおよび合成ホスファチジルグリセロールを含むがこれに限定されない、同一の脂肪酸基を持つ化合物である。中性共脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、モノ、ジ、またはトリアシルグリセロールおよびこれらのアナログを含む。負に荷電した脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル酸、または同様のリン脂質アナログが含まれる。他の、例えば、ステロール、脂肪酸、ガングリオシド、糖脂質、リポペプチド、リポサッカリド、ネオビー、ニオソーム、プロスタグランジンおよびスフィンゴ脂質などの、疎水性および両親媒性「共脂質」添加物もまた使用し得る。
【００３６】
好適に、本発明のサイトフェクチン／アジュバント組成物の、カチオン性脂質：共脂質のモル比は、およそ９：１からおよそ１：９である。より好適には、カチオン性脂質：共脂質のモル比は、およそ４：１からおよそ１：４、さらにより好適には、およそ２：１からおよそ１：２である。最も好適なモル比は約１：１である。
【００３７】
本発明のカチオン性脂質および（随意に）共脂質は、様々な非共有結合脂質集合体を調製するための多数の方法で混合されるかまたは組み合わせられ得る。「脂質集合体」なる語は、例えば、リポソーム、脂質ベシクル（例えば、マルチラメラベシクルおよびユニラメラベシクル）、ミセル、アモルファス、脂質複合体および集合体、単純膜を含む。
【００３８】
本発明の組成物は、先行技術のサイトフェクチンまたはアジュバント組成物と同じ方法で調製および使用し得る。リポソームおよび脂質ベシクルなどの、脂質集合体を調製する方法は、当該分野において周知である。代表的な方法は、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第４，８９７，３３５号；Ｂａｎｇｈａｍ，Ａ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：２３８−２５２（１９６５）；Ｏｌｓｏｎ，Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５５７：９−２３（１９７９）；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８（１９７８）；Ｍａｙｈｅｗ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７７５：１６９−１７５（１９８４）；Ｋｉｍ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７２８：３３９−３４８（１９８３）；およびＦｕｋｕｎａｇａ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １１５：７５７−７６１（１９８４）（これらの開示を参考として本明細書に援用する）により開示されている。送達ビヒクルとして使用するために適正な大きさの脂質集合体を調製するために一般的に使用される技術は、超音波処理および、抽出を加えた凍結−解凍を含む。例えば、Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８５８：１６１−１６８（１９８６）を参照のこと。
【００３９】
脂質集合体中での均一性を最大化するために、本発明の組成物中のカチオン性脂質および共脂質（含まれる場合）の成分を好適にクロロホルムなどの溶剤で溶解し、続いてガラス器具（例えば、ロトバップ丸底フラスコ）の内側表面に脂質膜として乾燥するまで減圧下で溶媒を蒸発させる。水性溶剤で懸濁する際、脂質分子は均一な脂質ベシクルに自己集合する。これらの脂質ベシクルは、続いて、例えば、当業者に公知の方法に従って、ｐＤＮＡと複合体化する前に、均一サイズの選択された平均直径を持つように加工される。例えば、脂質溶液の超音波処理は、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）および米国特許第５，２６４，６１８号（これらの開示を参考として本明細書中に援用する）に記述されている。
【００４０】
「脊椎動物」なる語は、単数形「脊椎動物」および複数形「脊椎動物」を含み、哺乳動物および鳥類、ならびに魚類を含むことを意図される。
【００４１】
「アジュバント」なる語は、特定の免疫原に対する免疫応答を増強する能力を持つどのような物質をも意味している。このような能力は、免疫を介する防御の顕著な増強によって示される。体液性免疫応答の増強は、免疫原に対して惹起される抗体価の顕著な増大によって典型的に示される。
【００４２】
「アミノ酸」なる語は、自然に存在するかまたは天然には存在しないどのようなアミノ酸をも意味している。この定義は、置換されたα−アミノ酸ならびに非α−アミノ酸を含むものである。非α−アミノ酸は、アミノ基が、カルボン酸基に隣接していない炭素原子と結合したアミノ酸として定義される。
【００４３】
「ヌクレオチド配列」なる語は、どのような、１つ以上のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学構造部分またはヌクレオチド構築物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマー、ｍＲＮＡまたはｐＤＮＡ）をも意味する。ヌクレオチド配列は、線状、環状（例えば、プラスミド）または分岐型、ならびに二本鎖形態、一本鎖形態で与えられ得る。ヌクレオチド配列は、普通のホスホジエステル結合または特殊な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見られるようなアミド結合）を含み得る。
【００４４】
「アルキル」なる語は、飽和（すなわち、単結合）直鎖および分岐鎖炭化水素化学部分を含む。「置換されたアルキル」なる語は、さらに、ヒドロキシ、（低級アルキル基の）アルコキシ、（低級アルキル基の）メルカプト、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロサイクリック、置換されたヘテロサイクリック、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アリールオキシ、置換されたアリールオキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、ニトロン、オキシ、アミノ、アミド、イミノ、チオ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アシル、オキシアシル、カルボキシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、スルフリルなどから選択される１つ以上の置換基をもつアルキル基を含む。
【００４５】
「アルケニル」なる語は、１つ以上の二重結合を持つ直鎖および分岐鎖炭化水素部分を包含する。「置換されたアルケニル」なる語は、上で述べたようなさらに１つ以上の置換基を持つアルケニル基を意味する。
【００４６】
「アルキル」および「アルケニル」なる語は、さらに炭化水素骨格中にＮ、ＯまたはＳなどのヘテロ原子を含む部分を包含する。
【００４７】
「ペプチド」なる語は、ペプチド結合によって結合した二つ以上のアミノ酸を含む分子を意味する。「ペプチド結合（ｂｏｎｄ）」または「ペプチド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」なる語は、あるアミノ酸のカルボン酸基と第二のアミノ酸のアミノ基との間の水分子を除去することにより形成する共有結合であり、そして−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−の化学構造を有し、ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ10アルキルまたは、Ｃ1〜Ｃ10アルケニルである。この定義は、アミノ酸分子に存在する任意のカルボン酸基およびアミノ基、ならびにアミノ酸ではない連結部分の任意のカルボン酸基およびアミノ基を包含することを意図される。
【００４８】
「ポリペプチド」なる語は、ペプチド結合により結合した１０より多いアミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」なる語は、高分子量の、アミノ酸ポリペプチド意味し、ホルモン、抗体およびある種の抗原を包含するが、これに限定されない。
【００４９】
「ポリアミン」なる語は、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびプトレスチンなどの、多様なアミノ基および／またはイミノ基を含む脂肪族化合物を意味する。「ポリアミン」なる語は、ポリアミノ酸を含む。
【００５０】
「標的細胞」なる語は、本発明のサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）構造物を用いて所望の因子が送達される任意の細胞を意味する。
【００５１】
「トランスフェクション」なる語は、本明細書中で、発現可能なヌクレオチド配列の標的細胞への送達を意味するものとして使用される。その結果、このような標的細胞は、ヌクレオチド配列の発現が可能なように与えられる。「発現」は、制限無しに、一過性発現および安定的発現の両方を含み、細胞におけるヌクレオチド配列の機能的存在の任意の徴候を意味する。「送達」とは、これにより所望の因子を究極的に標的細胞内部、または標的細胞膜上または膜中に局在させるように、所望の因子を標的細胞に移入するプロセスを示す。
【００５２】
本発明はまた、免疫原および、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従うカチオン性脂質化合物を含むアジュバント組成物を含む免疫原構造を提供する。「免疫原」とは、エピトープまたはエピトープの組み合わせ、および免疫原をコードしているポリヌクレオチドを持つポリアミノ酸物質を含む任意の抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドを包含することを意味する。さらに、「免疫原」とはまた、免疫反応を生じるために有用な、任意のポリサッカリド物質をも包含することも意図される。本明細書中で使用されているように、抗原性ポリペプチドまたは免疫原生ポリペプチドは、脊椎動物に導入された時に、脊椎動物の免疫系分子と反応するポリペプチド、すなわち抗原性ポリペプチド、および／または、脊椎動物において目免疫反応を誘導するポリペプチド（すなわち、免疫原性ポリペプチド）である。免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性であるが、その大きさおよびコンフォメーションゆえに抗原性ポリペプチドが必ずしも免疫原性をもたないという可能性が極めて高い。抗原性および免疫原性ポリペプチドの例には、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌などの感染因子からのポリペプチド、ペットの毛、植物、埃および他の環境因子からのアレルゲン、ならびにある種の自己ポリペプチド（例えば、腫瘍関連抗原）が含まれるが、これに限定されない。
【００５３】
本発明における抗原性および免疫原性ポリペプチドは、アレルギー治療はもちろん、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫の感染症の予防または処置（例えば、治療、改善、疾患の重症度の軽減、もしくは予防または伝染の減少のために使用され得る。
【００５４】
さらに、本発明の抗原性、免疫原性ポリペプチドは、癌の予防または処置（例えば、治療、改善、疾患の重症度の軽減のために使用され得る。この癌には、口腔癌および咽喉癌（例えば、舌、口、咽頭）、消化器系癌（例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肛門管、肛門直腸、肝臓、胆嚢、膵臓）、呼吸器系癌（例えば、喉頭、肺）、骨、関節、軟組織（心臓を含む）における癌、皮膚癌、メラノーマ、乳癌、生殖器系癌（例えば、子宮、子宮内膜、卵巣、外陰、膣、前立腺、精巣、陰茎）、泌尿器系癌（例えば、膀胱、腎臓、尿管およびその他の泌尿器系器官）、眼における癌、脳腫瘍、内分泌系癌（例えば、甲状腺およびその他の内分泌腺）、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、様々な骨髄腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病）を含むが、これに限定されない。
【００５５】
ウイルス性の抗原性および免疫原性ポリペプチドの例の中には、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド、例えば、カリシウイルスキャプシド（外殻）抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスコアまたは表面に対する抗原）、ヘルペスウイルスポリペプチド（例えば、単純ヘルペスウイルスまたは、水痘−帯状疱疹ウイルス糖タンパク質、免疫不全症ウイルスポリペプチド（例えば、ヒト免疫不全症ウイルスエンベロープ（外被）またはプロテアーゼ、伝染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素、ノイラミニダーゼまたは核タンパク質）、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスキャプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクチニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチドおよびロタウイルスポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【００５６】
細菌性の抗原および免疫原ポリペプチドの例には、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ポリペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ポリペプチド、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ポリペプチド、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａポリペプチド、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｂｏｒｒｅｌｉａポリペプチド（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ポリペプチド、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａポリペプチド、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ポリペプチド、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ポリペプチド、Ｃｏｘｉｅｌｌａポリペプチド、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ポリペプチド、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ポリペプチド、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ポリペプチド、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ポリペプチド、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ポリペプチド、Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ポリペプチド（例えば、Ｈ．Ｂ型インフルエンザ外膜タンパク質）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ポリペプチド、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｌ−ｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ポリペプチド、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ポリペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ポリペプチド、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ポリペプチド、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ポリペプチド、Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ポリペプチド、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ポリペプチド、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ポリペプチド、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ポリペプチド、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ポリペプチド、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ポリペプチド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ポリペプチド、Ｒｉｃｋｅｔｔｉｓｉａ  ポリペプチド、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ポリペプチド、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ポリペプチド、Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕｓ  ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｐｃｃｕｓポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ  Ｍタンパク質）、ＴｒｅｐｏｎｅｍａポリペプチドおよびＹｅｒｓｉｎｉａポリペプチド（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ  Ｆ１およびＶ抗原）が含まれるが、これに限定されない。
【００５７】
真菌の免疫原性および抗原性ポリペプチドの例の中には、Ａｂｓｉｄｉａ  ポリペプチド、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ポリペプチド、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａポリペプチド、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓポリペプチド、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓポリペプチド、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓポリペプチド、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｃａｎｄｉｄａポリペプチド、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｃｏｎｄｉｏｂｏｌｕｓポリペプチド、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｃｕｒｖａｌａｒｉａポリペプチド、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎポリペプチド、Ｅｘｏｐｈｉａｌａポリペプチド、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍポリペプチド、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａポリペプチド、Ｍａｄｕｒｅｌｌａポリペプチド、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａポリペプチド、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍポリペプチド、Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａポリペプチド、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａポリペプチド、Ｍｕｃｏｒポリペプチド、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍポリペプチド、Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍポリペプチド、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａポリペプチド、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａポリペプチド、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａポリペプチド、Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍポリペプチド、Ｐｙｔｈｉｕｍポリペプチド、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｒｈｉｚｏｐｕｓポリペプチド、Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘポリペプチド、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎポリペプチド、およびＸｙｌｏｈｙｐｈａポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【００５８】
原生動物寄生虫の免疫原性および抗原性ポリペプチドの例には、Ｂａｂｅｓｉａポリペプチド、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａポリペプチド、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｅｉｍｅｒｉａポリペプチド、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎポリペプチド、Ｅｎｔａｍｏｅｂａポリペプチド、Ｇｉａｒｄｉａポリペプチド、Ｈａｍｍｏｎｄｉａポリペプチド、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎポリペプチド、Ｉｓｏｓｐｏｒａポリペプチド、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａポリペプチド、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａポリペプチド、Ｎｅｏｓｐｏｒａポリペプチド、Ｎｏｓｅｍａポリペプチド、Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓポリペプチド、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍポリペプチド、（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  周囲スポロゾイト（ＰｆＣＳＰ）、種虫表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓ステージに対する抗原１のカルボキシル末端（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ１）（ＰｆＬＳＡ１  Ｃ−ｔｅｒｍ）および輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１））、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓポリペプチド、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓポリペプチド、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａポリペプチド、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａポリペプチド、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａポリペプチドおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【００５９】
蠕虫寄生虫の免疫原性および抗原性ポリペプチドの例には、Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａポリペプチド、Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａポリペプチド、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｂｒｕｇｉａポリペプチド、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍポリペプチド、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａポリペプチド、Ｃｈａｂｅｒｔｉａポリペプチド、Ｃｏｏｐｅｒｉａポリペプチド、Ｃｒｅｎｏｓｏｍａポリペプチド、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓポリペプチド、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅポリペプチド、Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａポリペプチド、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍポリペプチド、Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍポリペプチド、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓポリペプチド、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓポリペプチド、Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓポリペプチド、Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｌｏａポリペプチド、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓポリペプチド、Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓポリペプチド、Ｎｅｃａｔｏｒポリペプチド、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓポリペプチド、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍポリペプチド、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａポリペプチド、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓポリペプチド、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａポリペプチド、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓポリペプチド、Ｐａｒａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａポリペプチド、Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｓｅｔａｒｉａポリペプチド、Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａポリペプチド、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａポリペプチド、Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｔｈｅｌａｚｉａポリペプチド、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｔｏｘｏｃａｒａポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓポリペプチド、ＵｎｃｉｎａｒｉａポリペプチドおよびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【００６０】
外部寄生動物の免疫原性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドの例には、ノミ；ダニ（マダニおよびヒメダニを含む）；ハエ（例えば、ユスリカ、蚊、サシチョウバエ類、ブユ類、ウシアブ類、ノサシバエ、アブ類、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ蛆症を引き起こすハエ類、およびヌカカ）；アリ；クモ；シラミ；ダニ類；ならびにカメムシ（トコジラミおよびサシガメ類など）由来のポリペプチド（防御的抗原と同時にアレルゲンを含む）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
腫瘍関連性の抗原性および免疫原性ポリペプチドの例には、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、トンプソン−フリーデンリッヒ抗原（ＴＦ）、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、胎児性癌抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖（ｈＣＧｂｅｔａ），ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＫＳＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＲＡＧＥおよび関連タンパク質が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明のポリペプチドとして、また含まれるのは、先に述べたポリペプチドの抗原性もしくは免疫原性フラグメント、または改変体および先に述べたポリペプチドの任意の組み合わせである。例えば、「Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」Ｔａｌａｒｏら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ（Ｏｃｔ．，１９９８））、Ｆｉｅｌｄｓら、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ（１９９６）、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ」Ｍａｒｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）および、Ｄｅａｃｏｎ，Ｊ．、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ（１９９７）（参考として本明細書中で援用される）において、さらなるポリペプチドが見出され得る。
【００６３】
好適に、免疫原は、免疫原をコードするヌクレオチド配列、最も好適には、プラスミドＤＮＡまたはその一部分によって提供される。免疫原性組成物はさらに、１つ以上の共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）を含み得る。これらの免疫原性組成物は、複数の免疫原をコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本発明の免疫原性組成物は、さらに１つ以上の、例えば細菌および細菌由来物質、ウイルスおよびウイルス由来物質、毒物および毒液を含む既知の免疫原を含み得る。
【００６４】
本発明の関連する局面において、コードされた免疫原に対する免疫反応を引き起こすために十分な量の１つ以上の免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原組成物および一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う１つ以上のカチオン性脂質化合物を含むアジュバント組成物を脊椎動物に投与することによって、脊椎動物での免疫反応を誘導する方法を開示する。脊椎動物は好適には哺乳動物および、最適にはヒトである。ヌクレオチド配列に加えて、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う１つ以上のカチオン性脂質化合物を有するアジュバント組成物を投与することによってポリヌクレオチドに基づいたワクチンに対する脊椎動物の体液性免疫反応を増強するために、本発明の組成物はまた使用され得る。
【００６５】
脂質組成物と混合または複合体を形成する前に、免疫原をコードするヌクレオチド配列（例えば、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたは核酸オリゴマー）は、任意の緩衝液においても溶解され得る。適切な緩衝液の例の中には、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、正常な生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液およびリン酸ナトリウムなどが含まれる。不溶性のヌクレオチド配列は、弱酸性または弱塩基性で可溶化され得、次いで緩衝液で所望の体積に希釈され得る。緩衝液のｐＨは適切な値に調整され得る。さらに、適切な浸透圧を提供するために、薬学的に受容可能な添加剤が使用され得る。このような添加剤は当業者の範囲内である。
【００６６】
好適な実施形態において、ヌクレオチド配列は、例えば、ｐＤＮＡ溶液およびカチオン性脂質／共脂質リポソームの溶液を混合することにより、アジュバント組成物と複合体を形成される。好適には、所望の最終ｐＤＮＡ／脂質比率および所望のｐＤＮＡ最終濃度が２つの溶液を混合する際に得られるようにするために、混合する前にそれぞれの構成溶液の濃度を調整する。例えば、所望の最終溶液が生理食塩水（０．９％（重量／体積））である場合、ｐＤＮＡおよびリポソームの両方を０．９％  食塩水で調製し、次いで単純に混合して、所望する複合体にする。リポソームは好適には、適切な体積の水性溶媒を約１分間室温でボルテックス混合することにより混合した脂質物質の薄膜を脱水することにより調製される。薄膜は、等モルの溶質比率で個々の成分のクロロホルム溶液を混合し、次いで所望する体積の溶液を適切な容器に分注することにより調製される。まず、乾燥不活性ガス気流（例えば、アルゴン、）続いて高真空処理によるエバポレーションによって溶媒を除去した。
【００６７】
ヌクレオチド配列形態の選択は、部分的に、所望する発現反応速度および発現持続時間に依存する。ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質を長時間送達が所望される場合、好適な形態はＤＮＡである。あるいは、短時間の導入遺伝子タンパク質送達が所望される場合は、ＲＮＡは速やかにポリペプチドに翻訳されるのでので、好適な形はｍＲＮＡであるが、ＤＮＡよりも早く分解される。
【００６８】
１つの実施形態において、１つ以上の免疫原をコードするヌクレオチド配列はＲＮＡである。好適には、この実施形態において、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態をとる。ＲＮＡ配列を哺乳動物細胞に導入する方法は、米国特許第５，５８０，８５９号（この開示は、参考として本明細書中で援用される）に記載されている。ＲＮＡ投与に有用である非感染性ベクターであるウイルスアルファベクターは、ＲＮＡを哺乳動物細胞へ導入するために使用され得る。アルファウイルスベクターによる哺乳動物組織へのインビボ導入の方法は、Ａｌｔｍａｎ−Ｈａｍａｍｄｚｉｃ，Ｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：８１５−８２２（１９９７）（この開示は、参考として本明細書中で援用される）に記載されている。
【００６９】
好適には、免疫原コードヌクレオチド配列はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、好適にはプロモーターを作動可能に免疫原をコードするヌクレオチド配列に連結させる。プロモーターは前もって決められた細胞においてのみ、ＤＮＡの本質的な転写を調節する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節因子は、細胞特異的なＤＮＡの転写に対するヌクレオチド配列とともに含まれ得る。作動可能な連結は、免疫原性分子をコードするヌクレオチド配列が１つ以上の調節配列と接続される連結であって、このようにして、免疫原の発現が調節配列の影響下または制御下に置かれるようになる。二つのＤＮＡ配列（例えば、コード配列の５’末端で連結しているコーディング配列およびプロモーター配列）を作動可能に連結されるのは、プロモーター機能の誘導が、所望する免疫原をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、および二つのＤＮＡ配列間における連結の性質によって（１）フレームシフト変異の導入を起こさないか（２）免疫原の発現に対する発現調節配列の能力を妨害しないか、または（３）転写されるためのＤＮＡ鋳型の能力を妨害しない場合である。このように、プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写に効果的であるならば、プロモーター領域は作動可能にＤＮＡ配列と連結される。
【００７０】
好ましくは、免疫原コードヌクレオチド配列は、非感染性（つまり、脊椎動物細胞に感染しない）、非挿入性（つまり、脊椎動物細胞のゲノムに挿入しない）ヌクレオチド配列を含む環状または直鎖状プラスミドの一部である。直鎖化されたプラスミドは、元は環状であったが、例えば制限エンドヌクレアーゼによる消化によって直鎖化されたプラスミドである。免疫原コードヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌を導く配列を含む。
【００７１】
特定の実施形態において、１つ以上の免疫原をコードする単一の免疫原コードヌクレオチド配列を投与し得る。あるいは、各々１つ以上の免疫原をコードする、種々の免疫原コードヌクレオチド配列を、共投与あるいは連続的に投与し得る。免疫原コードヌクレオチド配列を含む、種々のポリヌクレオチド組成物を作製する方法は、米国特許第４，７１３，３３９号および第４，９６５，１９６号に開示され、この開示は、参考として本明細書中で援用される。
【００７２】
本発明はまた、植物または動物細胞に対する生物活性剤の送達に有用である。本方法は、生物活性剤および一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う１つ以上のカチオン性脂質化合物を含む組成物を含有する脂質集合体を調製すること、続いて、細胞を脂質集合体と接触させることを含む。この方法は、インビボおよびインビトロの両方で、細胞への送達に有用であり、細胞のトランスフェクションに利用され得る。
【００７３】
ＤＮＡおよびｍＲＮＡポリヌクレオチドまたはタンパク質のカチオン性脂質を介した送達は、欠損遺伝子または不在遺伝子産物を供給して、この欠損遺伝子またはその産物が同定される任意の遺伝的疾患を処置することによって、遺伝的疾患についての治療を提供し得る。トランスフェクションは、インビボで脊椎動物の細胞にカチオン性脂質をＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と一緒に直接注入することによって達成され得る。しかしながら、カチオン性脂質はまた、細胞のインビトロトランスフェクションを促進する際に有効である。従って、あるいは、治療を、カチオン性脂質送達方法を用いる脊椎動物の細胞のいくらかのインビトロトランスフェクションおよび脊椎動物への細胞の再導入によって行い得る。従って、カチオン性脂質を用いて高い効率で細胞をトランスフェクトする能力は、免疫および治療的処置の代替方法を提供する。本発明サイトフェクチン組成物はまた、アジュバントの特徴を有するので、ポリヌクレオチドに基づいた免疫化の効果は増大する。
【００７４】
本発明の実施において、当該分野で公知の種々の方法のいずれかに従って、投与を行い得る。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号は、カチオン性脂質キャリアと複合体化された一般的物質のマウスへの注入を報告している。また、米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号およびＰＣＴ国際特許出願  ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６０６９（ＷＯ９４／２９４６９）（これらの開示は、参考として本明細書中で援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達するための方法を提供している。
【００７５】
具体的には、本発明の組成物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、粘膜組織、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、膣組織、大腸、神経系、眼、腺、舌および結合組織を含むが、これに限定されない、脊椎動物の任意の組織に対して投与され得る。好ましくは、骨格筋に対して、本組成物は投与される。本発明の免疫原組成物をまた、肺、口、鼻腔、胃、腹腔、腸、心室（心房）、静脈、動脈、毛細血管、リンパ管、子宮、膣、大腸および眼球腔を含むが、これに限定されない、体腔に投与し得る。
【００７６】
好ましくは、本発明の組成物は、筋肉内注射（ｉ．ｍ．）または皮下経路（ｓ．ｃ．）によって投与される。他の適切な投与経路には、経皮、鼻内、吸入、気管内、経粘膜（つまり、粘膜を通して）、腔内（例えば、口、膣または大腸）、眼内、膣、大腸、腹腔内、腸内および静脈内（ｉ．ｖ．）投与が挙げられる。
【００７７】
投与の任意の様式は、投与により所望の免疫反応を得られる限り、用いられ得る。本発明の投与手段には、針注射、カテーテル注入、微粒子銃インジェクター、粒子加速装置（つまり、「遺伝子銃」または空気圧「針なし」インジェクター、例えばＭｅｄ−Ｅ−Ｊｅｔ（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７１，１１−２２（１９９４））、Ｐｉｇｊｅｔ（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５，１９０８−１９１６（１９９７））、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２，１５０３−１５０９（１９９４）；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４，１０９−１１８（１９９８））、ＡｄｖａｎｔａＪｅｔ、Ｍｅｄｉｊｅｃｔｏｒ、ゲルフォームスポンジ貯蔵剤、その他の商業的に利用可能な貯蔵物質（例えばヒドロゲル）、浸透圧ポンプ（例えばＡｌｚａミニポンプ）、経口または座剤固形（錠剤または丸剤）製剤学的処方物、局所的皮膚クリーム、およびデカンティング、ポリヌクレオチドコート縫合糸の使用（Ｑｕｉら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５，２１９３−２２０３（１９９９））または手術中の局所的適用が挙げられるが、これらに限定されない。好適な投与の様式は筋肉内の針ベースの注射および水溶液としての鼻内適用である。
【００７８】
組成物の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造および生物学的活性、患者の年齢および体重ならびに、投与経路を含む多くの要因に依存する。用量の正確な量、回数および用量のスケジュールは、容易に当業者は決定され得る。
【００７９】
ヒトへの投与のために、免疫化の場合におけるヌクレオチド配列の投薬は、好ましくは約０．１〜５ｍｇ（／ヒト／１投与／コードされた免疫原）、より好ましくは、約０．５〜２．５ｍｇである。異なる免疫原をコードする１より多くのヌクレオチド配列は、共投与され得；それによって、総ヌクレオチド配列投薬は、好適な投薬より良好であり得る。
【００８０】
本発明はまた、例えば、薬理学的に有効量の治療剤（例えば、治療タンパク質またはポリペプチド）と一緒に、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従うカチオン性脂質化合物を含むサイトフェクチン組成物を含む薬学的調製物を提供する。サイトフェクチン組成物は、治療剤の細胞内送達を促進する。好ましくは、治療剤は、免疫原、天然ホルモン、天然ホルモンの合成アナログまたは、疾患状態において欠損または不在の遺伝子産物のような分子をコードし得るポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子）であり、ここで、脊椎動物に対する遺伝子産物の投与は、治療的効果を有する。これらの薬学的組成物は、公知の方法に従って、処方され得、これによって、送達されるべき物質は、製剤学的受容可能なキャリアベヒクルと合わせられる。適切なベヒクルおよびその調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．Ｏｓｏｌ編、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に記載される。薬学的組成物は、エマルジョン、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形態または当該分野で公知の他の任意の形態として処方され得る。さらに、製剤学的組成物はまた、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤および防腐剤を含む、製剤学的に受容可能な添加剤を含み得る。
【００８１】
ここで記載されるヌクレオチド配列構造の薬学的に受容可能な塩の投与は、好ましい。このような塩は、有機塩基および無機塩基を含む薬学的に受容可能な非毒性塩基から調製され得る。無機塩基由来の塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に受容可能な有機非毒性塩基由来の塩としては、第一級、第二級および第三級アミン、塩基性アミノ酸など塩が挙げられる。
【００８２】
インビボにて使用される水性薬学的組成物のために、滅菌無病原菌水の使用が好適である。このような処方物は、脊椎動物への投与に適切な薬学的に受容可能な組成物を調製するために、適切な量のベヒクルと一緒に有効量の免疫原組成物を含む。
【００８３】
本発明はまた、本発明カチオン性脂質化合物を含むキットを提供する。このようなキットは、脊椎動物へポリペプチドを送達するために有用である。各々のキットには、同じかまたは異なる容器に、共脂質と一緒に一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従うカチオン性脂質化合物を含む。必要に応じて、各キットは、インビボで脊椎動物細胞内のポリペプチドを操作可能にコードするポリヌクレオチドの１ｎｇ〜３０ｍｇを含む容器を含む。好ましくは、各キットには、およそ１００ｎｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを含む。薬学的なキットの成分のいずれも、単一の容器または複数の容器中に提供され得る。
【００８４】
薬学的キットとともに、任意の適切な容器は、使用され得る。容器の例としては、ガラス容器、プラスティック容器、または、プラスティックもしくは紙の細長い板（ストリップ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
薬学的キットの各々はさらに、投与手段を含み得る。投与のための手段には、シリンジおよび針、カテーテル、微粒子銃インジェクター、分子加速装置、つまり「遺伝子銃」、または空気圧「針なし」インジェクター、ゲルフォームスポンジ貯蔵剤、その他の市販の貯蔵物質（例えばヒドロゲル、浸透圧ポンプ、およびデカンティングまたは手術中の局所的適用）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的キットの各々はさらに、縫合糸（例えば免疫原組成物でコートされた縫合糸（Ｑｕｉら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５，２１９３−２２０３（１９９９）））を含み得る。
【００８６】
本キットは、さらに、脊椎動物に対する組成物の投与のための使用説明書を含む。製剤学的組成物のポリヌクレオチド成分は、好ましくは、液状溶液として提供されるか、またはそれらは、乾燥散剤あるいはケーキのような凍結乾燥形態で提供され得る。ポリヌクレオチドが、凍結乾燥形態で提供される場合、乾燥散剤またはケーキもまた、任意の塩、入口増強剤、トランスフェクション促進剤、および乾燥形態の薬学的組成物の添加剤を含み得る。このようなキットはさらに、薬学的組成物の凍結乾燥成分を適切に再構成するために正確な量の滅菌無病原体水を有する容器を含み得る。
【００８７】
使用前に薬学的組成物が封入されている容器は、その薬学的に有効な用量または複数の有効用量に適切な処方物を含有する凍結乾燥処方物または溶液の量を密封した密封容器を含み得る。薬学的組成物は、滅菌容器に封入され、密封容器は、使用まで薬学的処方物の滅菌性を保つように設計される。必要に応じて、本容器は、使用のための投与手段および／または使用説明書を付随され得る。
【００８８】
以下の実施例は、例示の目的のみのために挙げられ、本発明の範囲を限定することを意図されず、この範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００８９】
（実施例）
以下の実施例において、抗―ＮＰ抗体応答を提供する際の、ｐＤＮＡを有する種々のカチオン性脂質アジュバント対ｐＤＮＡ単独での投与の効果の定量的比較を行った。さらに、本実施例は、種々のカチオン性脂質サイトフェクチンと複合化されたｐＤＮＡのトランスフェクションとｐＤＮＡ単独のトランスフェクションについてインビボでの導入遺伝子発現の定量的比較を提供する。
【００９０】
図２は、マウスワクチンモデルにおける、ｐＤＮＡ／アジュバント免疫化からの幾何的平均力価（ＧＭＴ）と、ｐＤＮＡ免疫化単独からのＧＭＴとの比を報告する。３つのカチオン性脂質化合物（ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥ；ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥ；およびＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥ）を試験した。これらの化学構造は、図１で与えられる。図３では、ｐＤＮＡ／サイトフェクチントランスフェクションからの導入遺伝子発現の、ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥおよびＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥにつてのｐＤＮＡトランスフェクション単独から導入遺伝子発現に対する比を報告する。
【００９１】
外来免疫原をコードするｐＤＮＡの筋肉内注射によって、液性および細胞性免疫応答の両方が誘引される。ヒト免疫応答の増強の程度を決定するために、免疫原コードｐＤＮＡのみを用いた免疫化の後の抗−ＮＰ抗体レベルにおける変化、および種々のカチオン性脂質で複合体化されたこのｐＤＮＡを定量した。免疫化アッセイの一般的特徴は、本質的に、Ｕｌｍｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３））にて記述されているとおりであり、そして抗体力価を定量するための標準ＥＬＩＳＡ技術を使用する。
【００９２】
詳細に記載されてない具体的な手順は、参考文献を引いているか、または、当該分野で公知のものである。
【００９３】
（カチオン性脂質サイトフェクチン／アジュバントの調製）
ビス−ウレイル  サイトフェクチンダイマーを合成するための一般的手順は、α−、ω−ジイソシアネートとの反応によって２コピーのアルキルアミノ保有親サイトフェクチンをカップリングする工程を包含する。抽出後処理、それに続くクロマトグラフィー精製により、所望のサイトフェクチンを得る。
【００９４】
ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥ．ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ．を、  Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（２１）：１１４５４−１１４５９（１９９６）（この開示は、参考として本明細書中に援用される）におけるＧＡＰ−ＤＬＲＩＥについて以前公開された様式と類似の様式で調製した。手短には、第三級アミンＤＭＰ−ＤＭＡを得るために、２，３−ジメチルアミノプロパンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）をテトラデシルメタンスルホネート（ＮｕＣｈｅｋＰｒｅｐ）を用いてアルキル化した。３−ブロモプロピルフタルイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた処理により、このアミンを定量した。ヒドラジンを用いたフタルイミド切断による第一級アミンの脱保護により、ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥを得た。２等量のＧＡＰ−ＤＭＲＩＥを、１，４―ジイソシアネートブタン（ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｏｂｕｔａｎｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させ、ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥを得た。
【００９５】
ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥ．  二等量のＧＡＰ−ＤＭＲＩＥを、１，６−ジイソシアネートヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させ、ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥを得た。
【００９６】
ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥ．  ＤＡＢ−ＤＭＲＩＥを、Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（２１）：１１４５４−１１４５９（１９９６）において、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥに関して以前公開された方法と類似の方法で調製した。簡潔には、２，３−ジメチルアミノプロパンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、テトラデシルメタンスルホネート（ＮｕＣｈｅｋＰｒｅｐ）でアルキル化し、第三級アミンＤＭＰ−ＤＭＡを得た。４−ブロモブチルフタルイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた処理によってこのアミンを４級アンモニウム化（ｑｕａｔｒａｎｉｚｅｄ）した。ヒドラジンを用いたフタルイミド開裂による第一級アミンの脱保護により、ＤＡＢ−ＤＭＲＩＥを得た。二等量のＤＡＢ−ＤＭＲＩＥを、１，４―ジイソシアナトブタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させ、ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥを得た。
ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ―ＤＭＲＩＥ．４−ブロモブチルアセテートを用いてＤＭＦ中で１００oＣにおいて４級アンモニウム化することによって、ＤＭＰ−ＤＭＡ（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１２８０，１−１１，１９９６）から（±）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム  ブロマイド（ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−ｏｘ）を調製し、次に、両性イオン性脂質を得るためにＰＤＣを用いてアルコールの脱保護および酸化を行った。ＣＨＣｌ3（１６ｍｌ）中においてＨＢ−ＤＭＲＩＥ−ｏｘの０oＣ溶液（８３０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（１ｅｑ）を加えて攪拌した。１５分後、ＮＨＳ固形体（２４０ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を加え、次にＤＣＣ（ＣＨ2Ｃｌ2中に、４．２ｍｌ、２．０９ｍｍｏｌ、０．５Ｍ）を加えた。２．５時間、０oＣで攪拌後、Ｔｒｐ−ＯＭｅ  ＨＣｌ（３５４ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．４ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ）／ＣＨＣｌ3（５ｍｌ）を、シリンジを用いて添加した。室温に温めながら、この混合物を、一晩攪拌を続けた。この混合物をろ過し、そしてろ過液を飽和ＮａＨＣＯ3で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、そして濃縮した。溶離液として８５／１５／０．２５／０．２５  ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏを用いて残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、エステル（７６２ｍｇ、６０％収率）を得た。その産物の構造および純度を、1Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲによって確認した。
【００９７】
２Ｎ  ＫＯＨ／ＭｅＯＨを用いてエステル（７５０ｍｇ）を加水分解して、両イオン性酸（６１０ｍｇ、９５％収率）を得た。ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−ｏｘおよびＴｒｐ−Ｏｍｅを結合させる上記の手順を用いて、その酸（６０７ｍｇ）を（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム  ブロマイド（ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ、５０７ｍｇ（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１２８０，１−１１，１９９６におけるＢＡＥ−ＤＭＲＩＥと類似に調製された））と結合した。最適化されていない１４％の収率で、その表題化合物（１７０ｍｇ）を得た。その産物の構造および純度を、1Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲによって確認した。
【００９８】
ペンタＥＧ−ビスーＤＭＲＩＥ．１：１ＴＨＦ／ＤＭＦ中に、Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１２８０，１−１１，１９９６に従って調製した（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ、８０３ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮａＨ（１５１ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ，鉱油中６０％分散）を少しずつ添加した。発泡が止んだ後、固形ペンタ（エチレングリコール）ビス  トシレート（３４５ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、そして混合物をアルゴン下で一晩攪拌し続けた。次いで、混合物を水で希釈し、そしてエーテルで２回抽出した。合わせた抽出物をＮａ2ＳＯ4中で乾燥させ、そして濃縮した。残留物を、溶離液として７８／２０／２  ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏを用いて、シリカゲルにおいてクロマトグラフィーにかけ、ＰＥＧ化脂質（４０４ｍｇ、４４％収率）を得た。溶離液としてヘキサンを用いて、再結晶化を達成し得た。その産物の構造および純度を、1Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲによって確認した。
【００９９】
ＰＥＧ３４−ビス−Ｂｕｔ−ＤＭＲＩＥ−プロピルアミド．  （±）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルー２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロマイド（ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−ｏｘ、８３０ｍｇ）を調製し、上記のように、トリプトファンメチルエステルの代わりに、ビス−アミノプロピル終結ポリ（エチレングリコール）（ｎ＝３４，１．１３ｇ、０．５ｅｑ）を用いて結合させた。溶離液として８７／１２／１／  ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏを用いたシリカゲルクロマトグラフィーに続いて、ヘキサン／エーテル／ＥｔＯＨを用いて摩砕を行い、タ黄褐色固体としてＰＥＧ化脂質（４５２ｍｇ、２２％収率）を得た。その産物の構造および純度を1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲおよびマススペクトロメーターによって確認した。
【０１００】
（脂質集合体の調製）
上記の再水和薄膜法を用いてカチオン性脂質アジュバントリポソ−ムを調製した。アジュバント／ｐＤＮＡ複合体を、等量のｐＤＮＡ溶液およびカチオン性アジュバントリポソ−ムの溶液を混合することによって調製した。
【０１０１】
（ＶＲ４７００（インフルエンザ核タンパク質をコードするプラスミド）の調製）
当該分野で公知の標準的技術を用いてＶＲ４７００プラスミドを調製した。簡潔には、ＶＲ１２５５、ホタルルシフェラーゼをコードする最適化されたプラスミド（Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１２０５−１２１７（１９９６））に、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）についてコード配列をルシフェラーゼコード配列の代わりに挿入した。インフルエンザ核タンパク質配列は、ｎＣＭＶｉｎｔｔｐａＰＲＮＰと名づけられたプラスミド由来のものであった（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７４：１１−２２（１９９４））。より詳細には、次の手順によりＶＲ４７００プラスミドを作製した。ＶＲ１２５５プラスミドを、ＡｃｃＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、次に末端を、Ｋｌｅｎｏｗを用いて平滑末端にし、次いで所望するベクターフラグメントを得た。ＡｃｃＩ＋ＥｃｏＲＩでｎＣＭＶｉｎｔＴＰＡＰＲＮＰを消化し、そして末端をＫｌｅｎｏｗで平滑末端にすることによって核タンパク質コード配列を得た。ベクターフラグメントおよび挿入フラグメントの両方を精製し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ライゲーションを行った。ライゲーション産物を、カナマイシン抵抗性を持つようにＥ．ｃｏｌｉで形質転換し、その後クローンを持つ適切なプラスミドを、制限酵素消化プロフィールに基づいて同定した。適切なクローンを増やすために標準的な細胞培養技術を用い、周知の、市販の技術（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて、そこから得たプラスミドをまず単離しそして精製した。
【０１０２】
プラスミドＤＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ−コンピーテント細胞に形質転換し、そして５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加し、１Ｌシェーカーフラスコ中で、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．Ａ．２（１９８９））において増殖させた。典型的には、１リットルあたり１０グラムの生物量正味重量の回収率となる、指数関数的増殖期の終わり（およそ、１６時間）に、細胞を遠心にて回収した。改変された溶解手順（Ｈｏｒｎ，Ｎ．Ａ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：５６５−５７３（１９９５））にて、共有結合で閉じている環状ｐＤＮＡを単離し、標準的二重ＣｓＣｌ−エチジウムブロマイド平衡密度勾配超遠心法を行って、およそ５ｍｇ／リットルの平均回収率であった。プラスミドに対して、エタノール沈殿を行い、そして４oＣの食塩水で再溶解し、そして食塩水に対して透析を行った。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ分析（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により、エンドトキシン含量を決定した。全てのプラスミド調製物において、ＲＮＡは全く検出されなかった。エンドトキシンレベルは０．０６エンドトキシン単位／ｍｇプラスミドＤＮＡ以下であった。分光光度計による測定で、Ａ260／Ａ280の比率は１．７５と２．０との間であった。
【０１０３】
（動物免疫）
本実験を通しての動物の飼育は、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」米国保健（社会）福祉省、国立衛生研究所（１９８５年に改訂された、ＮＩＨ公開番号８６−２３）に従って行った。
【０１０４】
Ａ）マウス免疫モデル  ８から１２週齢メス  ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に対して、ｐＤＮＡリン酸／アジュバントのモル比が４：１となるようにしてアジュバントと複合体化された、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードしたｐＤＮＡを用いて免疫した。試験群の各動物（１群あたり５匹）に、大腿直筋において片方の脚のあたり、５０μｌの生理食塩水（水中に、０．９％ＮａＣｌ重量／体積）中の５０μｇのｐＤＮＡ（１０μｇ  ｐＤＮＡ全量／各動物）を、ｐＤＮＡ単独、またはｐＤＮＡ／アジュバントの複合体として注入した。注射は０日目および３週間目に行った。滅菌使い捨て、プラスティックインスリンシリンジおよび、マイクロピペットチップから切り取ったプラスティックカラーに合う２８Ｇ  １／２針（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＤ９４３０）を用いて、拘束された、覚醒マウスの大腿直筋に注射を行った。大腿直筋中央部分中に入る針先の距離を約２ｍｍに制限するように、カラーの長さを合わせた。注射する液体およびシリンジを室温にし、そして１回５０μｌ体積の注射は１〜２秒で行った。
【０１０５】
（免疫応答の測定）
Ａ）マウス免疫分析  動物から血清を得て、そして標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて連続希釈によりＮＰ抗体レベルを測定した。簡潔には、マウス血清における抗―ＮＰ  ＩｇＧ抗体のレベルを、組換えＮＰタンパク質（バキュロウイルスにおいて発現され、０．１２５ｍｇ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートをコートするために使用される）を利用して測定した。プレートを一晩、４oＣでコート、洗浄し、５％ノンファットミルクでブロッキングを行い、そして血清で２時間、室温にてインキュベーションを行った。洗浄後、プレートをアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗―マウスＩｇＧ（Ｆｃ−特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）で９０分間室温にてインキュベーションを行い、再び洗浄し、そして基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）で２時間室温にてインキュベーションを行った。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、４０５ｎｍのＯ．Ｄ．の読み取りを行った。血清希釈が、バックグラウンドの非免疫血清のＯ．Ｄ．値の、２倍のＯ．Ｄ．値を産生するよう、力価を決定した。
ｐＤＮＡ投与単独からの幾何的平均力価（ＧＭＴ）によって除したアジュバント−増強群からのＧＭＴの比率を基にして、カチオン性脂質アジュバント免疫反応の増強を解析した（図１を参照のこと）。
【０１０６】
（免疫応答増強）
図２で示すように、例示されるカチオン性脂質化合物の各々は、ｐＤＮＡ単独と比較して、コードされた免疫原に対する抗体反応を顕著に増強した。
【０１０７】
（ヒト投与）
上記の方法に従って、アジュバントと複合体を形成（４：１  ｐＤＮＡ／アジュバント  モル比）した、ヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするｐＤＮＡを含む免疫原性組成物を調製する。アジュバントとの複合体として、生理食塩水中に０．１、０．５、１．０、または２．５ｍｇのｐＤＮＡの３回の注射を、ヒトに対して、交互の三角筋に、４週間隔で行った。ヒトより血清を採取し、そして上記のような標準的ＥＬＩＳＡ法を用いた連続希釈によりＨＡ抗体レベルを測定する。標準化ＧＭＴ値から示されるように、ＨＡ抗体に供するヒトの免疫反応が誘導される。
【０１０８】
（インビボトランスフェクションの、導入遺伝子発現アッセイ）
Ａ）一般的皮下腫瘍トランスフェクションアッセイ  特異的な腫瘍タイプと互換性があるマウス系統の皮下に腫瘍細胞懸濁液を注入することによって腫瘍を形成する。腫瘍を定期的に測定する。腫瘍が注入に適した大きさになったら、球形の腫瘍と仮定し、測定した直径を基にして腫瘍体積を概算する。次いで、処置する腫瘍の体積と等しい体積の食塩水中で、レポーター遺伝子（例えばＣＡＴ）をコードするプラスミドを用いて評価されるサイトフェクチン化合物との複合体を、特定の腫瘍型に対して最適な流速で注入する。適切な時間の後、腫瘍を回収し、凍結し、次いで破砕する。レポーター遺伝子産物を続いて抽出し、そして抽出物と特定の遺伝子産物に適したアッセイ条件で、発現量を測定する。この一般的技術を用いて、種々の腫瘍タイプを評価し得る。メラノーマ腫瘍と関連するこのアッセイの具体的な例を以下に供与する。
【０１０９】
Ｂ）皮下メラノーマ腫瘍モデル  ９０％  ＲＰＭＩ  １６４０／１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）において、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍を増殖させた。ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下の腫瘍に、およそ１０6細胞／ｍｌ組織培養培地を含む懸濁液７５μｌを注入した。腫瘍の直径が４．５ｍｍから７．０ｍｍに達した場合、腫瘍の直径を測定して、球形の腫瘍と仮定することにより各々個々の腫瘍の体積を算出した。各々個々の腫瘍に対して、計算した腫瘍の体積に等量の食塩中のサイトフェクチン／ＣＡＴプラスミド複合体の体積を、２ｍｌ／分の速度で腫瘍に注射した。４８時間後、上記のようにして、腫瘍を回収し、凍結、破砕、１．５ｍｌ抽出緩衝液で抽出した。以下のようにして、ＣＡＴ活性を定量した。
【０１１０】
腫瘍を個々に、リバーシブルドリルおよびチューブにちょうど合うビットを用い、１．５ｍｌチューブ中にて０．４ｍｌ凍結溶解緩衝液で粉砕することにより、細粉に粉末化し、この粉末を同じチューブで、−７８oＣにて、抽出まで保存した。凍結粉末を凍結融解し、１００μｌのＰｒｏｍｅｇａからのＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ３９７Ａ）をそれぞれに添加した。試料を１５分間ボルテックスし、交互に液体窒素および室温浴処理をして３回凍結―融解を行い、そして１０，０００×ｇで３分間遠心を行った。上清を別の１．５ｍｌチューブに移し、そして５００μｌの溶解緩衝液をペレットに添加した後、抽出過程を（凍結融解は除いて）繰り返した。次に、二番目の上清を最初の上清と混合し、−７８oＣにて保存した。
【０１１１】
Ｓａｎｋａｒａｎ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００：１８０−１８６（１９９２）の放射性分離法、またはＣＡＴ  ＥＬＩＳＡ   ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＣＡＴ解析を行った。簡潔には、エタノール／ドライアイスバス中で凍結融解を３回繰り返すことによってＣＡＴ組織ホモジェネートを破壊した。遠心によって細胞の破片を除去し、14Ｃ−クロラムフェニコールおよびアセチルＣｏＡとともにタンパク質抽出物をインキュベーションした。クロラムフェニコールをエチルアセテートで抽出し、抽出細胞性タンパク質により変換された14Ｃ−クロラムフェニコールを測定するために薄層クロマトグラフィーを行った。細胞抽出物を、２０分間インキュベートされた２ｍｇタンパク質に標準化した。組織抽出物を、４時間インキュベートされた２００ｍｇのタンパク質に標準化した。
【０１１２】
肺抽出物にスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）精製酵素（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＥＬＩＳＡキットで提供された酵素を用いて、標準曲線を作成した。二つのＣＡＴアッセイ法によって、同じ組の抽出物から、１サンプルあたり等しいｐｇＣＡＴを回収した。
【０１１３】
使用されたサイトフェクチンは、ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥおよびＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥであった。その結果を、ＣＡＴ活性の平均として表し、図３にまとめる。化合物の各々は、裸のＤＮＡ（ｐＤＮＡのみ）コントロールより高い活性を顕した。
【０１１４】
本発明において、現在の好適な実施形態を参考として記述されているが、本発明の精神から離れることなく、種々の改変が行われ得るということが理解されるべきである。従って、本発明は上記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１１５】
前述の本発明の局面および利点は、図面および前述の詳細な説明を参照して、当業者に対して容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、本発明の組成物における使用のための６つの好適なカチオン性脂質化合物：ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥ；ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥ；ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥ；ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ―ＤＭＲＩＥ；ＰｅｎｔａＥＧ−ビスーＤＭＲＩＥ；およびＰＥＧ３４−ビス−Ｂｕｔ−ＤＭＲＩＥ−プロピルアミドについての様々な化学構造を提供する。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、本発明の組成物における使用のための６つの好適なカチオン性脂質化合物：ＳＢＤＵ−ＤＭＲＩＥ；ＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥ；ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥ；ＨＢ−ＤＭＲＩＥ−Ｏｘ−Ｔｒｐ−γ―ＤＭＲＩＥ；ＰｅｎｔａＥＧ−ビスーＤＭＲＩＥ；およびＰＥＧ３４−ビス−Ｂｕｔ−ＤＭＲＩＥ−プロピルアミドについての様々な化学構造を提供する。
【図２】図２は、抗体刺激により測定された、３つの好適なカチオン性脂質化合物のうち１つ（Ｘ軸で表されている）を含む様々なアジュバント組成物を用いた、マウスにおける体液性免疫応答の増強を表す棒グラフである。それぞれのアジュバント組成物により示される増強の程度は、（ｉ）アジュバント−増大群からの幾何的平均力価（ＧＭＴ）の、（ｉｉ）等価なコントロール動物群を用いたｐＤＮＡのみ投与からのＧＭＴ（すなわち、標準化ＧＭＴ）に対する割合を用いて評価した。
【図３】図３は、２つのカチオン性脂質化合物、ＳＢＧＵ−ＤＭＲＩＥおよびＳＨＧＵ−ＤＭＲＩＥ（ｘ軸に示している）に関して、皮下メラノーマモデルおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）リポーター遺伝子を用いて、マウスにおける、インビボでのトランスフェクション効率を説明する棒グラフである。ｐＤＮＡ単独トランスフェクションのμｇＣＡＴに対する、サイトフェクチン：ｐＤＮＡ投与のμｇＣＡＴの割合として計算された、相対的導入遺伝子発現をｙ軸に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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