(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経学的疾患の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの使用であって、該神経学的疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される使用。
【請求項２】
前記医薬がさらに薬学的に許容し得る担体を含む請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＩＬ６ＲＩＬ６キメラおよび任意には１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤を含む、神経学的疾患を治療および／または予防するための医薬組成物であって、該神経学的疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の分野］
本発明は、一般に、神経学的疾患および障害の分野に属する。詳細には、本発明は、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、神経保護（neutoprotection）、神経ミエリン形成およびミエリン鞘を生産する細胞の産生に関する。さらに詳細には、本発明は、神経学的疾患または障害の治療用医薬、とくに神経保護用ならびに脱髄疾患の治療および神経再生の促進用医薬の製造を目的とするＩＬ６ＲＩＬ６の用途を提供する。
【０００２】
［本発明の背景］
神経鞘形成は、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）区分の形成と機能とにおいて必須の過程である。軸索周囲のミエリン鞘は、神経に沿った電気インパルスの適切な伝導に必要である。ミエリンの破壊は多くの疾患で生じており、その多くの疾患には、ＣＮＳに変調をきたす多発性硬化症（ＭＳ）、ギヤン−バレー症候群、ＣＩＤＰおよびその他がある（Abramsky and Ovadia,1997; Trojaborg, 1998, Hartung et al, 1998参照）。感染性の病原菌または自己免疫による攻撃などの様々な病因があるが、脱髄疾患はすべて神経学的機能の破壊を引き起こし、結果として麻痺や死をもたらし得る。現在の治療剤はＭＳにおける炎症性の攻撃をおさえ、疾患の進行を遅くするが、ミエリン再形成および神経学的機能の回復を導くことができる治療法を開発する必要がある（Abramsky and Ovadia, 1997, Pohlau et al, 1998）。
【０００３】
ミエリンの合成は、特殊化したグリア細胞、すなわちＣＮＳにおけるオリゴデンドロサイトおよびＰＮＳにおけるミエリン形成シュワン細胞、の機能による。完全に分化した状態にあるそれらの２つの細胞型は、ミエリン形成細胞と呼ばれることがある。ミエリンは、多くの異なるタンパク質を含有する脂質膜構造である。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、ＣＮＳおよびＰＮＳのミエリンタンパク質の主要成分（３０％）に相当する。オリゴデンドロサイトおよびミエリン形成シュワン細胞が最終的に分化するあいだ、ＭＢＰおよび様々なミエリンタンパク質をコードするほかの遺伝子が発現する（たとえば、Ｐ０、ＰＭＰ−２２、ＰＮＳにおけるＭＡＧ、ＣＮＳにおけるＰＬＰ、ＭＯＧ）。それらの細胞の起源は胚の神経冠にあって（Fraser, 1991）、胚の神経冠からそれらの細胞は移動し、多くの段階で進行する分化を経る。シュワン細胞（ＳＣ）の発生は、１）移動する細胞に由来する前駆体（ｐＳＣ）の産生；２）増殖、およびＳ１００タンパク質を発現する胚ＳＣ（ｅＳＣ）への変化；３）ｅＳＣ群の一部による、ＭＢＰおよびほかのミエリンタンパク質を発現するミエリン形成ＳＣへの生後（postnatal）の最終的な分化（Kioussi and Gruss, 1996）、の３つの主要段階が関係するようである。神経冠から移動する細胞は、ｐＳＣだけではなく、感覚および交感ニューロン、平滑筋細胞、ならびに皮膚や毛包に到達し色素が沈着したメラニン細胞になる細胞をも生み出す。神経冠細胞の運命は、様々な誘導因子により影響される。すなわち、グリア細胞、ニューロンおよび筋肉への分化は、それぞれ、グリア成長因子（ＧＧＦ）などのニューレグリン、ＢＭＰ２／４およびＴＧＦ−βにより促進される（Anderson, 1997）。メラニン細胞への分化は、ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦまたはＳＤＦなどの成長因子によって促進され得る（Stocker et al, 1991; Anderson, 1997）。
【０００４】
シュワンおよびオリゴデンドロサイトの前駆体から活発にミエリン形成を行なう細胞への最終的な分化、およびミエリン形成そのものは、神経軸索とグリア細胞との間の相互作用によって生じるシグナルに依存するようである（Lemke and Chao, 1988; Trapp et al, 1988）。軸索−シュワン細胞の接触が妨げられると、神経損傷後のように、細胞はミエリン非形成状態に戻り、ミエリンタンパク質遺伝子の発現は失われる（Jessen and Mirsky, 1991）。ミエリン形成またはミエリン再形成を刺激することを可能にするために、神経疾患または外傷ののちに、ミエリン合成を誘導し得る因子を同定することは非常に重要である。
【０００５】
外傷、低酸素症および虚血を含む急性傷害により誘導されるＣＮＳへの損傷は、ニューロンと白質の双方に作用し得る。神経細胞死を導く過程に多くの注意がはらわれているが、増加する証拠は、軸索にミエリンを形成するオリゴデンドロサイトに対する損傷がＣＮＳ損傷の特定の要素でもあることを示唆する。したがって、オリゴデンドロサイトの異常は、ラットにおける脳虚血後の非常に早い時期に（３時間）明示され、それらの細胞が神経細胞に比べて、興奮毒性の事象に対してさらにいっそう弱いことを示唆した（Pantoni et al, 1996）。細胞死を媒介する１つの可能性ある候補は、多くの急性ＣＮＳ損傷に伴うグルタミン酸濃度の著しい上昇である（Lipton et al. 1994）。実際に、ニューロンのあたりでは、オリゴデンドロサイトでさえＡＭＰＡ／カイニン酸サブタイプに属する機能的グルタミン酸受容体を発現することが見出された。そのうえ、オリゴデンドロサイトは、グルタミン酸適用に対して高い脆弱性を示した（McDonald et al, 1998）。
【０００６】
胚シュワン細胞前駆体に作用するＧＧＦなどのニューレグリンはまた、損傷した神経における、生後のオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞のための生存、増殖および成熟因子であり、ＧＧＦは軸索の接触により供給されるマイトジェン因子の１つである（Topliko, et al. 1996）。多発性硬化症のマウスモデル（Cannella et al, 1998）または挫滅した末梢神経（Chen et al, 1998）において、組換え体ｈＧＧＦ２は長期投与によりミエリン再形成を増強することができた。軸索の接触により、シュワン細胞において誘導される別のサイトカインは、毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦである（Lee et al, 1995）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）と同様に、ＣＮＴＦは、ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦとともにインビトロで培養された視神経由来のオリゴデンドロサイトの生存を促進し、それらの培養物において、ＭＢＰを発現するオリゴデンドロサイトの数を増加させることが示された（Mayer et al, 1994）。しかしながら、ＣＮＴＦおよびＬＩＦは、グリア前駆細胞に添加されると、むしろアストロサイトの分化に有利に働いて、アストロサイトのＧＦＡＰマーカーの発現を誘導するようであり、一方、オリゴデンドロサイトにおいては、ＭＢＰ遺伝子発現のレベルにほとんど影響せず、主に生存作用を有するのであろう（Kahn and De Vellis, 1994, Bonni et al, 1997）。それにもかかわらず、ＣＮＴＦと脳由来神経栄養因子ＢＮＤＦとの組み合わせは、損傷を受けた末梢坐骨神経の回復を向上させる（Ho et al, 1998）。
【０００７】
ＣＮＴＦおよびＬＩＦは、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）およびｇｐ１３０鎖からなる共通の受容体系を介して作用するサイトカインである。ｇｐ１３０鎖はインターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体複合体の一部でもある（Ip et al., 1992）。したがって、ＣＮＴＦおよびＬＩＦは、サイトカインのＩＬ−６ファミリーの一部である。ＣＮＴＦおよびＬＩＦの場合、シグナル伝達はＬＩＦＲとｇｐ１３０との二量体形成を介して作動するが、ＩＬ−６の場合、シグナルは２つのｇｐ１３０鎖の二量体形成により生じる（Murakami et al, 1993）。ｇｐ１３０に結びつくために、ＩＬ−６は、ＩＬ−６受容体鎖と複合体をつくる。そのＩＬ−６受容体鎖は、特定の細胞上にｇｐ８０膜貫通タンパク質として存在するが、その可溶型は細胞外から供給されるとＩＬ−６アゴニストとしても機能する（Taga et al, 1989, Novick et al. 1992）。可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）およびＩＬ−６をコードするｃＤＮＡの完全なコード領域を融合することによって、組換え体ＩＬ６ＲＩＬ６キメラをＣＨＯ細胞において生産することができる（Chebath et al, 1997, WO99/02552）。このＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、ＩＬ−６型の生物学的活性を増強し、インビトロでは、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物よりも非常に高い効率でｇｐ１３０に結びつく（Kollet et al, 1999）。
【０００８】
中枢および末梢神経系の細胞に対するＩＬ−６の影響の再検討により、サイトカインは、炎症性神経変性疾患の過程に関与するだけではなく、神経細胞への保護効果を有し得ることが示された（Gadient and Otten. 1997, Mendel et al, 1998）。グリア細胞において、ＣＮＴＦおよびＬＩＦは、ＩＬ−６よりもさらに有効にアストロサイトの分化を刺激し、ミエリンタンパク質生産細胞への影響はなかった（Kahn and De Vellis, 1994）。ＩＬ−６は、線条体のニューロン（Toulmond et al. 1992）だけではなく、海馬のニューロンにおけるグルタミン酸誘導性細胞死を予防することが見出された（Yamada et al. 1994）。グルタミン酸受容体のＮＭＤＡサブタイプに対する選択的アゴニストであるＮＭＤＡによって生じる細胞毒性に対するＩＬ−６の神経保護メカニズムは、なお知られていない。実際上、ＩＬ−６はＮＭＤＡが介在する細胞内カルシウムの上昇を増強することが見出された。脳の舌下神経核の衰退性標識（retrograde labelling）によって示されるように（Hirota et al, 1996）、ＩＬ−６および可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ６−Ｒ）双方を高レベルで発現するトランスジェニックマウスにおいて、舌下神経の損傷の後に加速的な神経再生が観察された。その研究において、後根神経節（ＤＲＧ）細胞の培養物にＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒを添加すると、ニューロンにおいて著しいニューライト伸長が示されたが、ミエリン形成細胞への影響はなんら報告されなかった。
【０００９】
前記したデータを考慮すると、ＣＮＴＦ、ＬＩＦまたはＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物は、グリア細胞からミエリン形成細胞への最終的な分化を誘導することを示していない。しかしながら、上に略記したように、ミエリン形成細胞分化の刺激は、脱髄または神経変性疾患に苦しむ患者にとって非常に有用であろう。
【００１０】
本明細書におけるいかなる文献の引用も、そのような文献が、関連する先行技術または本件出願の請求の範囲の特許性を検討する資料であることを認めるものとして理解されることを意図するものではない。文献の内容または日付に関する記載は、出願時に出願人に利用可能な情報に基づいており、そのような記載の正確性を認めるものではない。
【００１１】
［本発明の要旨］
本発明の目的は、神経学的疾患および障害の治療および／または予防のための手段を提供することである。詳細には、本発明の目的は、前駆体または分化したグリア細胞からミエリン形成細胞への分化を刺激または増強するための手段を提供することである。本発明の原理は、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物よりも、ｇｐ１３０に対して著しく高い親和性を有する組換え体ＩＬ６ＲＩＬ６キメラタンパク質の用途にある。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、インビボでの坐骨神経切断に続いて誘導される軸索のミエリン再形成により、さらにはインビトロでのミエリン遺伝子の誘導へのＩＬ−６キメラのミエリン形成効果により説明される、損傷線維のミエリン形成またはミエリン再形成を刺激または増強するための手段を提供することである。
【００１３】
また本発明の目的は、後根神経節（ＤＲＧ）培養物において発生するシュワン細胞の数を増加させるために、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを使用することである。その上、本発明の目的は、シュワン細胞株と初代ＤＲＧとの共培養において説明されるように、それらの細胞が軸索周囲を包み、ミエリン塩基性タンパク質を生産するまで、それらの細胞の分化を誘導するためにＩＬ６ＲＩＬ６を使用することである。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、マウスのメラノーマに対するＩＬ６ＲＩＬ６の影響により説明されるように、メラニン細胞の表現型を有する細胞がシュワンのミエリン形成表現型に転換する分化転換の系において、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子の転写を誘導するためにＩＬ６ＲＩＬ６キメラを使用することである。
【００１５】
本発明のもう１つの目的は、神経保護剤としてＩＬ６ＲＩＬ６キメラを使用すること、および記憶の記銘に関する領域であってアルツハイマー病や虚血において早期に変性を示す領域である海馬における神経細胞死を予防するためにＩＬ６ＲＩＬ６キメラを使用することである。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、新生ラットの小脳ニューロンの初代培養物においてＩＬ−６キメラによりもたらされるグルタミン酸誘導性神経毒性からの保護によって説明されるように、興奮性アミノ酸により生じる神経毒性の過程に対する保護剤としてＩＬ６ＲＩＬ６キメラを使用することである。
【００１７】
ＭＢＰ遺伝子分化を誘導しミエリン形成表現型をもたらす特異的な転写因子をＩＬ６ＲＩＬ６が誘導して抑制するという分子機構が提案される。
【００１８】
このように、本発明は、神経学的疾患および障害の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途を提供する。詳細には、本発明は、外傷性神経変性、ＣＮＳまたはＰＮＳの脱髄疾患、および／または神経変性疾患の治療用医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途を提供する。
【００１９】
さらに詳細には、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病またはＡＬＳの治療におけるＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途を提供する。
【００２０】
本発明はまた、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラおよび任意には１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤からなる、神経学的疾患および障害を治療および／または予防する医薬組成物を提供する。詳細には、その医薬組成物は、外傷性神経変性、ＣＮＳまたはＰＮＳの脱髄疾患、および／または神経変性疾患の治療用である。
【００２１】
本発明の医薬組成物の好ましい用途は、ＭＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病またはＡＬＳの治療である。
【００２２】
［本発明の詳細な説明］
本発明において、ＩＬ６ＩＬ６Ｒ組換えタンパク質を後根神経節細胞またはメラノーマ細胞の培養物に添加すると、それらの細胞からミエリン形成細胞への分化が刺激されるということが見出された。また、ＩＬ６ＩＬ６Ｒ組換えタンパク質を神経細胞およびシュワン細胞の共培養物に添加すると、後者が軸索周辺における正常な髄鞘の形成を誘導することも見出された。したがって、本発明は、ミエリン形成細胞を産生するための、またはミエリン形成細胞の産生を刺激し、促進し、または加速させる医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００２３】
さらに、ＩＬ−６キメラは、ラットの坐骨神経軸索切断（sciatic nerve axiotomy）に沿った離断線維（transected fibers）のミエリン再形成を、インビボにて誘導する。したがって、本発明はさらに、とくに神経損傷もしくは外傷または軸索損傷ののちに、ミエリン再形成を誘導し、促進し、または加速させる医薬の製造のための、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００２４】
さらに、ＩＬ６ＩＬ６Ｒ組換えタンパク質を器官培養物（organotypic cultures）に添加すると、神経毒性の薬物に対する長期保護効果を誘導することが見出された。したがって、本発明はまた、神経保護とくに神経毒性の薬物に対する神経保護を誘導し、促進し、長期化させ、または加速させる医薬の製造のための、および神経細胞死、たとえばアポトーシスによる神経細胞死を阻害、低減または減速するための、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００２５】
本発明は、生来存在する可溶性ＩＬ−６受容体δ−Ｖａｌの完全なコード配列を、生来存在する成熟ＩＬ−６の完全なコード配列に融合して得られる組換え糖タンパク質である「ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ」（「ＩＬ６ＲＩＬ６」またはＩＬ−６キメラともいう）の用途に関する。両コード配列はヒト由来である。ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、酵母細胞、昆虫細胞などのいかなる適当な真核細胞において生産されてもよい。ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、哺乳類細胞において生産されるのが好ましく、ＷＯ９９／０２５５２に記載されたような遺伝子的に処理されたＣＨＯ細胞において生産されるのがもっとも好ましい。ヒト由来のタンパク質が好ましいけれども、本明細書に記載する生物学的活性を有するかぎり、本発明において、ほかに由来する同様の融合タンパク質を使用し得ることは、当業者により理解されるであろう。
【００２６】
さらに詳細には、本発明は、前駆または分化したグリア細胞からミエリン形成細胞への分化を刺激するためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途にかかわる。本明細書に記載するように、ＩＬ６ＲＩＬ６誘導性ミエリン形成細胞の分化過程は、ミエリン非形成の表現型に必要な遺伝子の抑制に加え、神経軸索周囲のミエリン鞘の形成に必要な遺伝子の活性化に関係する。
【００２７】
本発明において、妊娠１４〜１５日のマウス胚から単離した後根神経節（ｅＤＲＧ）細胞の培養物に対するＩＬ６ＲＩＬ６キメラの添加は、ＤＲＧに存在するシュワン細胞前駆体の発生に強い影響を及ぼすことが観察された。２〜５日後、培養物において、胚シュワン細胞数の著しい増加、ＤＲＧの軸索を膜で包みはじめるというそれらの細胞の著しい表現型の変化、およびＭＢＰの誘導がみられた。本発明によると、シュワン細胞と神経との共培養において、ＩＬ−６キメラは、５時間以内で、ミエリン非形成軸索に沿ったシュワン細胞の結合の顕著な増加を誘導し得ることが、さらに観察された。フッ化金でラベルしたシュワン細胞は伸長し、数日後、蛍光を発する細胞質が、軸索周囲に正常な髄鞘を形成するのをみることができる。キメラがなければ、またはＮＦＧがあれば、シュワン細胞はほとんど結合せず、髄鞘を形成しない。
【００２８】
したがって、さらに本発明は、末梢神経系のシュワン細胞によるミエリン形成だけではなく、シュワン細胞の増殖および／または分化を誘導する医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００２９】
本発明において、ＩＬ−６キメラは、末梢神経のミエリン再形成をインビトロにて誘導し得ることが示された。ラットの坐骨神経軸索切断および近位部と遠位部の断端の対置（juxtaposition of proximal and distal stumps）により、ＩＬ−６キメラは、末梢神経の再生および離断線維のミエリン再形成を、インビボにて誘導することができた。ＩＬ−６キメラの存在するところで、ミエリン形成線維の数および厚みに４倍の増加がみられ、より遠くの線維のミエリン形成の増加がみられた。したがって、本発明はさらに、末梢神経系におけるミエリン再形成を誘導する医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００３０】
そのうえ、本発明において、ＩＬ−６キメラは、シュワン細胞などの末梢神経のミエリン形成細胞、およびオリゴデンドロサイトなどの中枢神経系の細胞においてＭＢＰ、ＰＬＰおよびＰ０遺伝子などのミエリンタンパク質の成分をコードする遺伝子の発現を誘導し得ることが見出された。したがって、本発明はさらに、中枢神経系のオリゴデンドロサイトによるミエリン形成および／またはミエリン再形成を誘導する医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００３１】
本発明において、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラをＢ１６／Ｆ１０．９マウスのメラノーマ細胞株に添加すると、６〜１２時間以内にＭＢＰ遺伝子の発現が誘導されることが見出された。ＣＮＰａｓｅ遺伝子などのミエリンのタンパク質をコードするほかの遺伝子は誘導されるが、メラニン産生（メラニン色素沈着の形成）に関するチロシナーゼなどの遺伝子の発現は、強く抑制される。ＩＬ６ＲＩＬ６で処理されたＦ１０．９細胞はまた、著しい形態変化を経て、シュワン様表現型を獲得する。ＩＬ６ＲＩＬ６が、メラニン細胞の状態からミエリンを形成する状態への細胞の分化転換を生じさせるという仮定は、表現型の変化および特定のミエリン遺伝子の誘導により支持される。胚において、神経冠から移動する細胞は、メラニン細胞、あるいはミエリン形成シュワン細胞およびオリゴデンドロサイトのいずれかを生み出すことができるので、ＩＬ６ＲＩＬ６は細胞の運命に影響を及ぼすことができ、またミエリン形成細胞の形成を開始させることができるということが示唆される。したがって、本発明はまた、末梢神経系および中枢神経系においてミエリン形成細胞の形成を誘導し、促進させ、増強し、または加速させる医薬の製造のための、および／またはメラニン細胞からミエリン形成細胞への分化転換を誘導する医薬の製造のための、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００３２】
そのうえ、ミエリン形成シュワン細胞に分化する前に胚の神経冠細胞で発現される遺伝子、ホメオボックス遺伝子Ｐａｘ−３（Kioussi and Gruss, 1996）をダウンレギュレーションするために、ＩＬ６ＲＩＬ６は作用するということが本発明において示される。Ｐａｘ−３は、ＭＢＰ遺伝子を抑制することが知られている。したがって、Ｐａｘ−３抑制は、ミエリン形成細胞の最終的な成熟における重要な事象であるようである。したがって、ＩＬ６ＲＩＬ６は、重要な分化スイッチに作用する（たとえば、ｐａｘ−３抑制）。
【００３３】
Ｐａｘ−３は、メラニン細胞の表現型に重要なチロシナーゼおよびほかの遺伝子の発現を順番に誘導および維持する小眼球症関連転写因子ＭＩＴＦのトランスアクチベーターである。したがって、ＩＬ６ＲＩＬ６によるＰａｘ−３の速やかな抑制の発見は、神経冠由来細胞のミエリン形成活性を促進する分子的事象を説明することができる。ミエリンを形成された軸索は、神経損傷ののち、ウォーラー変性の一部として脱髄を経る。その過程のあいだ、シュワン細胞は、ＭＢＰ遺伝子およびほかに関係のあるミエリンタンパク質遺伝子の発現を減少させる。同時に、Ｐａｘ−３のアップレギュレーション、およびミエリンを形成するＳＣからミエリン非形成であって増殖するＳＣへの逆転を示すＧＦＡＰのアップレギュレーションがおこる（Kioussi and Gruss 1996）。本発明において、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、ミエリン形成活性化を再開するため、Ｐａｘ−３を抑制し、ＳＣを誘導することでウォーラー神経変性の過程から復帰させるための有力なサイトカインとなるようである。外傷のように、脳脱髄疾患の神経変性は、マクロファージやほかの炎症細胞(inflammatory cells)によって開始される脱髄過程により刺激されるので、同じ考えが脳脱髄疾患に適用されるであろう。したがって、本発明はまた、神経損傷および／または外傷性神経脱髄および／または軸索損傷の治療に対する医薬の製造のための、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００３４】
ＩＬ６ＲＩＬ６は、慢性的な再発性多発性硬化症のモデル系として、ＭＢＰを用いる免疫により自己免疫性脱髄（autoimmune demyelinating）が誘導されているマウス（Cannella et al, 1998）に、注入され得る。ミエリンタンパク質遺伝子やミエリン形成グリア細胞の分化を誘導するというＩＬ６ＲＩＬ６の能力は、この薬学的実例を用いて、インビボにて観察することができる。したがって、本発明はさらに、自己免疫脱髄疾患の治療および／または予防、とくに多発性硬化症の治療および／または予防に対する医薬の製造のための、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００３５】
ＩＬ−６キメラはまた、神経保護効果を有しており、記憶の記銘に関係しアルツハイマー病および虚血において早期変性を示す領域において興奮毒性の薬物により誘導される神経細胞生存能力の低下を予防することが示されている。ＩＬ−６キメラは、グルタミン酸誘導性神経毒性から神経を保護することが見出された。したがって、本発明は、細胞死とくに神経毒性の薬物の影響による細胞死からの神経細胞の保護のための、およびたとえばアルツハイマー病、パーキンソン病またはＡＬＳなどの神経変性疾患の治療および／または予防のための、医薬の製造のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラの用途に関する。
【００３６】
さらに、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラで治療され得る神経学的疾患は、発作、運動障害、てんかん、痛みなどである。
【００３７】
「薬学的に許容し得る」の定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を損なわず、投与する宿主に対して毒性がないあらゆる担体を網羅することを意味する。たとえば、非経口投与用に、ＩＬ６ＲＩＬ６は、食塩水、デキストローズ溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などのビヒクルに、注射剤用の単位量形式（a unit dose form）で処方され得る。
【００３８】
ＩＬ６ＲＩＬ６は、その投与を必要とする患者に、様々な方法で投与することができる。投与経路は、皮内、経皮（たとえば、徐放的な処方にて）、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路である。そのほかの治療に有効な投与経路、たとえば、上皮または内皮組織を介する取り込み、または、インビボでＩＬ６ＲＩＬ６キメラを発現し分泌させるＩＬ６ＲＩＬ６キメラをコードするＤＮＡ分子を患者に投与する（たとえば、ベクターによる）遺伝子治療による取り込みを、利用することができる。さらに、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどのそのほかの生物学的活性剤の成分とともに投与され得る。
【００３９】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋内）投与用に、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストローズ溶液）や等浸透圧性を維持する添加剤（たとえば、マンニトール）もしくは化学的安定性を維持する添加剤（たとえば、防腐剤および緩衝剤）とともに、液剤、懸濁剤、乳剤または凍結乾燥された粉剤として処方され得る。その処方は、一般的に使われる技術により殺菌する。
【００４０】
「有効量」は、前述の疾患の進行および発病度に充分作用し、そのような異常の減少もしくは回復を導く活性成分の量とする。有効量は、投与経路および患者の状態に依存するであろう。
【００４１】
単回量または複数回量のように、個体に投与する量は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの薬物動態学的能力（pharmacokinetic properties）、投与経路、患者の状態および特性（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、現在の治療、治療の頻度ならびに所望の効果を含む様々な要因により、変化するであろう。確立された用量範囲の調整および操作（manipulation）は、神経のミエリン再形成を解決するインビトロおよびインビボでの手法と同様に、当業者の能力内で充分に行うことができる。
【００４２】
本発明は、特定の実施態様とともに記載されるが、さらなる変更が可能であることは理解されるであろう。本出願は、本発明の原理に概ねしたがった本発明のあらゆる変型、用途または適応、および、本発明が属する分野における既知の慣例または慣行の範囲内にあって、添付の請求の範囲で説明される前記の本質的特徴に適用され得る本開示の変更を含む本発明のあらゆる変型、用途または適応を包含することを意図する。
【００４３】
刊行物、論文または要約、公開もしくは未公開の特許出願明細書、発行もしくは外国特許、またはそのほかの参考文献を含む本明細書中で引用されたすべての参考文献は、すべてのデータ、表、図面および引用される参考文献の本文を含めて、参考文献により完全に本明細書中に包含される。さらには、本明細書中で引用された参考文献で引用される参考文献のすべての内容もまた、参考文献により完全に包含される。
【００４４】
さて、本発明は、以下の非限定的な実施例および添付の図面においてさらに詳細に説明される。
【００４５】
実施例
実施例１：インビトロでのミエリン形成およびミエリン再形成へのＩＬ６ＲＩＬ６の影響
脊髄において、後根は本質的に感覚神経からなり、感覚神経は後根神経節（ＤＲＧ）にシナプスを形成する。マウスの胚形成中（ｅ１４〜ｅ１５日）、ＤＲＧは、神経および未だミエリン形成ＳＣに分化していない胚シュワン細胞の手ごろな供給源である。インビトロ培養のためにＤＲＧの外植片を得る方法は、リー（Li）（1998）によって記載されている。培養は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（ギブコ社（Gibco）製）中の、コスタープレート（Costar plates）のウェルに設置されたガラス製カバーガラス上で実施した。カバーガラスは、本質的には同様の結果を有するコラーゲンまたはポリ−Ｄ−リシンのどちらかで被覆されていた。培養は、成長因子またはサイトカインを含まない培地または神経成長因子（ＮＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌ）を補充した培地、またはＩＬ６ＲＩＬ６キメラ組換えタンパク質（３μｇ／ｍｌ）を補充した培地のいずれかにおいてなされた。培養物は、ビデオカメラ画像システム（レイカ（Leica）ＬＩＤＡシステム）に連結したオリンパス倒立顕微鏡を用いる光学顕微鏡検査法により、毎日、検査された。カバーガラスの一部をパラホルムアルデヒドで固定し、ミエリン塩基性タンパク質に対するモノクローナル一次抗体および蛍光接合二次抗体を用いて、ＭＢＰタンパク質を標識した。神経の細胞体および軸索は、神経線維タンパク質に対する抗体を用いて染色された。カバーガラスの一部は、走査型電子顕微鏡法（ＥＭ）により検査された。２〜５日後、何も添加せずに培養されたＤＲＧ外植片は、その外殖片から増殖した細胞が多角形または楕円形のどちらかになることを示した。しかしながら、ＮＧＦが添加されると、楕円形の細胞は長い軸索の突起を形成し、神経線維に対する抗体により染色される散在的なネットワークを形成した。いくつかの軸索は長く、分岐していたが、シュワン細胞は軸索に沿って観察されなかった。対照的に、ＩＬ６ＲＩＬ６を用いた培養では、神経線維を染色される軸索を有する神経細胞だけではなく、先端が分岐し、長く両極に伸長した平らな細胞のようにみえるシュワン細胞も存在することを示した。それらの伸長物は、神経線維タンパク質を染色されなかった。走査型ＥＭにより、それらのシュワン細胞は、軸索周囲を包みはじめる膜ラッフリングとともに、軸索の突起に沿って観察された。
【００４６】
抗ＭＢＰを用いる染色法により、ＩＬ６ＲＩＬ６で処理した培養物において、とくに、順に一列に並ぶ細胞の配置において、はっきりと染色されたシュワン細胞が示された。一方、ＩＬ６ＲＩＬ６ではなくＮＧＦで処理した培養物において、ＭＢＰ特異的蛍光はみられなかった。
【００４７】
同様の結果が、ｅ１５ラット胚由来のＤＲＧ培養物において観察された。マウスの坐骨神経に由来するシュワン細胞はまた、ＩＬ６ＲＩＬ６１．４μｇ／ｌと共にインビトロにて培養され、ＭＢＰのＲＮＡ転写物のレベルが測定された。対照的に、細胞において環状ＡＭＰレベルを人工的に増加させ、また、ＭＢＰを誘導することが知られている薬物であるフォルスコリン（Lemke and Chao, 1998）２０μＭで、同じ培養物が処理された。その結果、ＩＬ６ＲＩＬ６は、ＭＢＰ遺伝子発現を誘導することに対してフォルスコリンと同様の効果があり、培養３日後のＭＢＰのＲＮＡレベルを維持することに対してより効果的であることが示された（図１）。
【００４８】
研究において、１８日胚の後根神経節（ＤＲＧ）では、ＩＬ−６キメラがＭＢＰおよびＰ０のｍＲＮＡの発現を３日以内に誘導するが、Ｐａｘ−３のｍＲＮＡは同じ細胞系において強く抑制されることが見出された。Ｐ０およびＭＢＰ遺伝子発現へのＩＬ−６キメラの影響の用量依存曲線は、５００ｎｇ／ｍｌにおいて、ＩＬ−６キメラの最大効果を示す。したがって、ＩＬ−６キメラは、正常な神経グリア細胞におけるミエリン遺伝子発現の重要な誘導物質であるようである。
【００４９】
ラットの坐骨神経由来またはラットの後根神経節（ＤＲＧ）由来のシュワン細胞株は、ＩＬ−６キメラの影響をさらに研究するために産生された。ラットの坐骨神経由来のシュワン細胞株は、ＩＬ−６キメラに応答し、ＲＴ−ＰＣＲおよびノザンブロット解析による測定によると、２〜３倍のＰ０遺伝子が誘導され、そのタンパク質産物は末梢神経ミエリンの約５０％を形成することが見出された。
【００５０】
ＩＬ−６キメラによるミエリン遺伝子成分の転写活性を研究するために、ＭＢＰプロモーターを発現ベクターのルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に導入し、ラットの坐骨神経シュワン細胞株で試験した。フォルスコリンのない状態で、それらの細胞におけるＩＬ−６キメラに応答して、ＭＢＰプロモーターに由来する７倍以上の転写活性の誘導が観察された。さらなるレポーター遺伝子検定で、それらの細胞において、ＩＬ−６キメラはＰ０遺伝子のプロモーターに由来する転写に関し２．５倍の誘導を誘導することが見出された。
【００５１】
前記の結果は、ＩＬ−６キメラは、導入されたシュワン細胞内で、ミエリン遺伝子転写に直接的な影響を及ぼすことを示唆する。
【００５２】
さらなるシュワン細胞株が、ラットの後根神経節（ＤＲＧ）から単離され、ＣＨ細胞株と名づけられた。この細胞株は、増殖速度が遅いこと、および増殖はＩＬ−６キメラ（１４０ｎｇ／ｍｌ）に依存することが見出された。興味深いことに、ＣＨ細胞はオリゴデンドロサイトに似た星状の形態であった。その細胞は、ＩＬ−６キメラによるミエリン形成の誘導に関して、機能するようであった。その細胞はＰ０およびＭＢＰを発現し、キメラ非存在下の血清含有培地で増殖させられると死滅した。
【００５３】
実施例２：インビトロにおけるオリゴデンドロサイト増殖の阻害
中枢神経系の細胞に対するＩＬ−６キメラの影響が研究された。オリゴデンドロサイトの分化は増殖の阻害につながり、ついでオリゴデンドロサイトによる髄鞘形成およびミエリン形成を促進するということが立証された。
【００５４】
したがって、オリゴデンドロサイトの増殖を阻害するというＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの能力が、インビトロで試験された。ｔ−ｎｅｕ癌遺伝子で不死化されたマウスの初代オリゴデンドロサイト（オリゴデンドログリア）細胞株（「ｏｌｉ−ｎｅｕ」細胞株）が、この実験に使用された。培養条件だけでなくｏｌｉ−ｎｅｕ細胞株の確立および特性も、ユング（Jung）ら（1995）により記載されている。未分化ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞の増殖は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの様々な量（１μｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌ（対照））に対し、１、２および３日後に測定された。増殖速度は、蛍光定量法／比色分析用増殖指示薬（fluorometric/colorimentric growth indicator）アラマーブルー（Alamar Blue）で細胞の代謝活性を測定することにより、定量された。この薬剤は、細胞増殖によって生じた増殖培地の化学的還元に対して蛍光を発し、その色を変化させる酸化還元指示薬である。使用したその薬剤および検定法は、アーメド（Ahmed）ら（1994）および米国特許第５，５０１，９５９号に記載されている。
【００５５】
その結果を図２に示す。ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラをオリゴデンドロサイトの培養培地へ添加すると、４８時間後にはすでに、増殖の顕著な減少が導かれた。７２時間後、対照と比較して、増殖は４０から５０％まで減じられた。興味深いことに、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ（１μｇ）の最大量は、５００から１２５ｎｇ／ｍｌまでの少ない量よりも効果が低かった。
【００５６】
この実験は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラがインビトロでオリゴデンドロサイトの増殖を強く抑制することを示し、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラがオリゴデンドロサイトの分化のプロモーターであることを表す。オリゴデンドロサイトは、ＣＮＳにおいてミエリン鞘を生産するグリア細胞であるので、インビボにてミエリン形成を積極的に促進する薬剤となり得る。
【００５７】
実施例３：オリゴデンドロサイトの形態へのＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの影響
オリゴデンドログリアの形態に対するＩＬ６キメラの影響を研究するために、ｏｌｉ−ｎｅｕ（実施例２参照）を、３日間、１μｇ／ｍｌのＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの存在下で培養した。
【００５８】
ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）は、オリゴデンドロサイトにおいて分化を誘導することが知られている薬剤である（たとえば、ユングら（1995）参照）。ｄｂｃＡＭＰの効果にＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラがどのような形態的影響を加えるかということを検討するために、ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラとｄｂｃＡＭＰの添加前にｄｂｃＡＭＰで３日間前処理された。並行して、前処理をせずに、細胞をＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラで処理した。
【００５９】
形態の変化は、位相差顕微鏡により、またはオリゴデンドロサイトのマーカーＣＮＰａｓｅ（２′，３′−サイクリックヌクレオチド３′−ホスホジエステラーゼ）およびＧａｌＣ（シアロガングリオシド類およびスルファチド類）を染色し、ミエリン脂質ガラクトセレブロシド特異的な抗体Ａ２Ｂ５を用いる免疫組織化学により、評価された。
【００６０】
ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの添加は、ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞における形態変化を明らかに誘導した。細胞体は整列して集合し、それらの突起はより伸長した。それらの細胞そのものが伸長しており、また融合されているように感じられ、分化の進行状態を示した。
【００６１】
オリゴデンドロサイトマーカーの発現は、免疫組織化学により示された。細胞は、オリゴデンドロサイトの特異的マーカーＡ２Ｂ５抗原およびＣＮＰａｓｅに陽性であるが、アストログリアのマーカーＧＦＡＰに陰性であり、つまり実際にオリゴデンドロサイトの表現型を維持していた。
【００６２】
ｄｂｃＡＭＰ前処理、およびＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラとｄｂｃＡＭＰを組み合わせた処理は、３日後に、髄鞘を形成したオリゴデンドロサイトの数を増加させた。ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのみで、伸長した細胞がみられたほか、その細胞の形態はさらによく分化しているようにみえた。シート様の形状の細胞を観察することができ、進行した分化の状態を示していた。
【００６３】
結論として、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラでの処理は、インビトロにてオリゴデンドロサイトの形態変化を生じさせ、つまり、オリゴデンドログリアの分化およびミエリン形成の誘導物質としての役割をさらに裏付けた。
【００６４】
実施例４：神経細胞シュワン細胞相互作用に対するＩＬ−６キメラの影響
ＤＮＡ合成阻害剤アラビノースＣ（ＡｒａＣ）およびフルオロデオキシウリジン（ＦｕｄＲ）の存在下でマウスＤＲＧを培養することにより、神経細胞は軸索を発達させることができるが、グリア細胞の増殖は抑制される。それらのＤＲＧ培養物はミエリン非形成軸索を有する神経細胞の供給源として使用され得る。ニューロンとシュワン細胞とのあいだの相互作用を研究するために、シュワン細胞は、それらの細胞に外因的に添加される。
【００６５】
ラット坐骨神経のシュワン細胞株は、細胞膜の脂質二重層を貫通して細胞の機能に影響を及ぼすことなく長期間維持される標識であるフッ化金で標識された。ＩＬ−６キメラの存在下での神経細胞とシュワン細胞との共培養は、軸索細胞に沿ったシュワン細胞の結合の著しい増加を、５時間以内に導いた。細胞は伸長し、数日後、蛍光を放つそれらの細胞質が軸索の周囲に通常の髄鞘を形成するのを見ることができた。キメラではなくＮＧＦの場合、シュワン細胞の結合は非常に少なく、また髄鞘は形成されない。それらの結果は、ＩＬ−６キメラがグリア細胞と神経細胞との相互作用に対して非常にすばやい効果を有していることを示し、接着分子が誘導または活性化されていることを示唆する。
【００６６】
実施例５：神経細胞とシュワンの混合培養物におけるミエリン形成に対するＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの影響
ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのミエリン形成誘導活性をさらに検討するために、マウスＥ１５（１５日胚）の大脳半球から分離した培養物を調製した。その調製および培養条件は、ルベツキ（Lubetzki）ら（1993）により記載されている。初代細胞は８日間培養され、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６（１．５μｇ／ｍｌ）を添加して１１日間維持された。
【００６７】
ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質ＰＬＰ（プロテオリピドタンパク質）は、成熟および／またはミエリン形成オリゴデンドロサイトに対するマーカーであって、ＣＮＳミエリンの主要な構成物質である。したがって、それらを、細胞培養物において生じる活発なミエリン形成を評価するためのマーカーとして使用することができる。培養条件下、４日で、ミエリン形成はない。したがって、４日後のｍＲＮＡは、この実験における標準物質として使用することができる。培養条件下、１９日で、細胞培養物においてミエリン形成が観察される。
【００６８】
したがって、ＭＢＰおよびＰＬＰのｍＲＮＡを定量するために、４および１９日で、ｍＲＮＡは処理または未処理のウェルから抽出された。
【００６９】
ＭＢＰ、ＰＬＰおよび内部対照ＲＮＡとして使用し得るＧＡＰＤＨのｍＲＮＡは、ＰＥアプライドバイオシステムズプリズムモデル７７００配列決定器械（a PE Applied Biosystems Prism model 7700 sequence detection instrument）を用いて、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（real-time quantitative RT-PCR）（メドハースト（Medhurst）ら、（2000））により、測定された。
【００７０】
その結果を下記の表Ｉに要約する。２つの独立した実験を実施した。ｍＲＮＡ発現は、４日後の対照ＲＮＡの発現の何倍であるかで示した。双方の実験において、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、ＭＢＰおよびＰＬＰの発現を２倍明らかに増強し、ミエリン形成の誘導物質またはエンハンサーとしてのＩＬ６Ｒ／ＩＬ６の役割をさらに裏付けた。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
結論として、実施例１〜５は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラが抗増殖、分化およびミエリン形成誘導活性を有することを示している。ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのこの活性は、末梢および中枢神経系ミエリン形成に対するＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの有益な効果を強く示唆する。この効果は、ＣＮＳまたはＰＮＳ神経細胞のミエリン形成欠損、脱髄もしくは不充分なミエリン形成に基づくすべての障害において、利用することができる。したがって、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、たとえば多発性硬化症などの、ミエリン再形成および／または脱髄障害を治療する有効な薬物となり得る。
【００７３】
実施例６：インビボでの末梢神経再生に対するＩＬ６ＲＩＬ６の影響
ラットの坐骨神経軸索切断および近位部と遠位部の断端の対置により、インビボにて末梢神経の再生を誘導することができ、また離断線維のミエリン再形成を誘導することができた（Sahenk et al. 1994）。軸索切断に続く末梢神経のミエリン再形成に対するＩＬ−６キメラの影響が実験された。ラット（７匹）に、手術の日から１２日間、１００ｍｃｇ／Ｋｇの用量を２日毎に腹腔内に与えた。対照動物（９匹のラット）には、ＰＢＳを注射した。１２日後、軸索切断から２．５および５ｍｍ下方に再生した神経の切片を、透過型電子顕微鏡により解析し、明らかな線維の数を求めた。ＰＢＳ処理した対照に比べ、ＩＬ−６キメラの存在下では、軸索切断のから２．５ｍｍ下方に離れた所で、ミエリン形成した線維の数に２．５倍の増加がみられた。
【００７４】
実施例７：メラノーマＢ１６−Ｆ１０．９細胞の培養物でのＩＬ６ＲＩＬ６によるＭＰＢ遺伝子の誘導
メラニン色素を生産する皮膚メラニン細胞およびシュワン細胞の胚の起点（embryonic origin）は、ｅ８マウス胚の神経冠から移動する共通の前駆細胞に由来する。メラノーマは、メラニン細胞由来の皮膚において発展する悪性腫瘍であり、したがってまた、神経冠の先駆体（ancesors）に由来する。Ｂ１６細胞株はＢａｌｂ／ｃマウスの自然発生的なメラノーマに由来し、Ｆ１０．９細胞は、その強い悪性転移表現型のために、Ｂ１６から単離された。Ｆ１０．９細胞は、ほかのＢ１６のように黒いユーメラニン色素を生産し、メラニン生成経路の最初の酵素であるチロシナーゼが豊富である（Bertolotto et al, 1996）。
【００７５】
Ｆ１０．９細胞は、３０，０００細胞個／穴で９６穴マイクロプレートに播種され、０．３〜１μｇ／μｌの濃度のＩＬ６ＲＩＬ６を含まないまたは含む１０％ＦＣＳとＤＭＥＭにおいて３日間培養された。全細胞のＲＮＡが抽出され、ＭＢＰに対するｃＤＮＡプローブを用いるノザンブロットにより解析された。ＭＢＰのｍＲＮＡは、ＩＬ６ＲＩＬ６により、Ｆ１０．９細胞において４８で非常に強く誘導された（図３Ａ）。時間の経過をみる研究（time course study）は、細胞培養物にＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加したのち１２時間でＭＢＰのＲＮＡの増加が始まったことを示した。
【００７６】
ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、ＭＢＰ遺伝子発現だけでなく、ミエリンの別の成分であって分化したシュワン細胞に対するマーカーである環状２′３′ＡＭＰホスホジエステラーゼまたはＣＮＰａｓｅを誘導する。細胞はまた、細胞体と逆の極で伸長した突起を発達させ、培養物中のシュワン細胞に典型的な長い配置に整列した。
【００７７】
驚いたことに、ＩＬ６ＲＩＬ６は、Ｆ１０．９細胞の表現型をメラニン産生細胞からミエリン生産シュワン細胞に変換させた。チロシナーゼ酵素活性およびメラニンの生産は、細胞にＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加したのち４８時間で完全に失われた。
【００７８】
ＭＩＴＦは、チロシナーゼ遺伝子を活性化する転写因子である（Bertolotto et al. 1996）。ＩＬ６ＲＩＬ６によるＦ１０．９の処理は、ＭＩＴＦ遺伝子発現を強く抑制した。ＭＩＴＦそのものはホメオティック転写因子Ｐａｘ−３によりトランス活性化されており（Watanabe et al. 1998）、ＩＬ６ＲＩＬ６処理されたＦ１０．９細胞におけるＰａｘ−３ｍＲＮＡの測定値は、Ｐａｘ−３発現が６時間から４８時間に徐々に減少することを示した（図３Ｂ）。Ｐａｘ−３はＭＢＰ遺伝子を抑制することが知られている（Kioussi and Gruss, 1996）。したがって、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの効果は、ミエリン形成前の胚シュワン細胞の発生中に発現してミエリン形成が生じるために抑制されなけらばならないＰａｘ−３ホメオボックスス遺伝子に対する遺伝子制御効果にあるといえる。その上、変性し脱髄する神経において、シュワン細胞がＭＢＰ生産を停止すると、それらの細胞におけるＰａｘ−３が再発現された。したがって、ＩＬ６ＲＩＬ６はＰａｘ−３を抑制し、かつ、ミエリンタンパク質遺伝子を誘導することによりシュワン細胞のミエリン形成細胞への分化を生じさせる。
【００７９】
実施例８：慢性的に再発する多発性硬化症のマウスのモデルにおけるＩＬ６ＲＩＬ６の注射
ＳＪＬ／Ｌ種のマウスは、６０μｇのマイコバクテリウム  ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒａ（ディフコ社（Difco）製）を含有する不完全フロイントアジュバント中０．４ｍｇのウシＭＢＰによる免疫ののち、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を発現した。その疾患は、免疫後１０日経た３千万のリンパ腺細胞の静脈注射により、同系のレシピエントに受身的に移入され得る。麻痺の臨床的徴候は、１週間から１０日ののちにあらわれる。疾患の急性期ののち、回復および再発が続く。それらのマウスに対し、マウス（体重約２５ｇ）あたり１、３および５μgの用量で、ＩＬ６ＲＩＬ６を腹腔内的にまたは皮下的に注射した。注射は、受身移入ののち３日または７日のどちらかに開始し、週あたり４回、少なくとも３週間与えられた。動物の臨床スコア（clinical score）は次のとおりであって、１）尾の硬直の低下；２）後ろ足の衰弱；３）片側の手足の麻痺；４）両側の手足の麻痺；５）致死、のように等級分けされた。動物の脳および脊髄は、ルクソールファストブルーによるミエリンの染色に続いて、光学顕微鏡により調べられた。臨床的等級の減少および脳の白質の減少に対するＩＬ６ＲＩＬ６の影響が、確かめられ得る。
【００８０】
実施例９：神経細胞およびオリゴデンドログリアの神経毒性に対するＩＬ６キメラの神経保護効果
器官培養物は、脳の生理機能と異常の多くの側面を調べるための類のない方法を提供する。記憶の記銘にかかわる領域であって、アルツハイマー病および虚血で早期変性を示す領域である海馬に由来する長期切片培養物は、シナプス可塑性機構（たとえば、長期増強）の発現および病理上の傷害（たとえば、興奮性毒性）に対する応答性のために、この点についてはとくに価値がある。
【００８１】
培養物は、重要ではない改変を加えてバーらによって以前に記載されたように（Bahr 1995）調製する。海馬を８日歳のウィスターラット（Wistar rats）から切断し、４００μｍ厚の切片を、多孔性で透明のミリセル−ＣＭ膜（Millicel-CM membrane）（ミリポア社（Millipore）製）上に置き、６穴のマルチウェルプレートにて培養した。４つの切片をそれぞれの膜上に置いた。培養培地は、５０％の最小必須培地（＋２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、＋４ｍＭ ＮａＨＣＯ3＋ＮａＯＨ  ｐＨ７．２）、２５％のウマ血清および２５％ハンクス液、グルコース（６．４ｇ／ｌ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍｌ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）から構成された。使用前、培養物は、３７℃の温度に設定された５％ＣＯ2インキュベーター内で少なくとも３週間維持された。培地は毎週変えられた。
【００８２】
海馬の切片を、１０ｐｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌにわたる濃度でＩＬ６またはＩＬ６キメラに１５分間さらし、そののち、ＮＭＤＡ５０μＭを添加してさらに３０分間おいた。その培養物を、ＩＬ６またはＩＬ６キメラを含むまたは含まない新鮮な培地に置いた。少なくとも４つの切片は、それぞれの実験の観点に役に立った。ＮＭＤＡ誘導性の細胞死は、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）（ＰＩ５μｌ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地中で培養物を１時間保温することによる実験的傷害ののち、１日または３〜７日のどちらかで評価された。ＰＩは、その親水性の特性のため、破裂した細胞に入って核のクロマチンに結合する。放出される赤い蛍光（細胞死のマーカー）は、増強された電荷結合デバイスカメラ（an intensified charged-coupled device camera）に連結した倒立蛍光顕微鏡（ゼイス（Zeiss））を用いて調べた。全蛍光の定量は、画像解析システム（イメージプロプラス（Image Pro Plus）により実施された。
【００８３】
ＩＬ−６およびＩＬ−６キメラの双方はＮＭＤＡ誘導性の海馬の細胞死を防ぐことが見出された。培養１日後、ＩＬ−６は０．１から１０ｎｇ／ｍｌにわたる濃度で、ほぼ５０％〜３０％の神経細胞をそれぞれ保護することが見出され、一方、ＩＬ−６キメラは０．０５から１ｐｇ／ｍｌにわたる濃度で、ほぼ４０％〜７５％の神経細胞を保護した。ＩＬ−６キメラの最大の保護効果（７５％の細胞の保護）は、０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で観察された（図３）。
【００８４】
ＩＬ−６の保護効果は、時間が経つにつれて減少することが見出された。処理後、神経細胞の生存率は低下し、２日後には、５日で細胞の３０％のみに保護効果を有するＩＬ−６の０．１ｎｇ／ｍｌ濃度でだけ、ＩＬ−６の保護効果は維持された。それに比較し、ＩＬ−６キメラは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で、長い保護効果を有しており、およそ６０％の細胞を５日間維持した（図４）。
【００８５】
器官切片におけるオリゴデンドロサイトの存在は、特異的なオリゴデンドロサイトマーカーであるＧａｌ−Ｃを用いる免疫組織化学的に染色することにより、決定された。２〜３週間後、器官切片はインビトロにて３０分間、５０μＭのＮＭＤＡにさらされた。
【００８６】
グルタミン酸イオンチャネル型受容体の活性化は、興奮性アミノ酸により引き起こされる神経毒性の過程における一次事象を示す。新生ラットの小脳の神経細胞の初代培養物（＞９７％の神経細胞を含む）は、グルタミン酸誘導性神経毒性に対するＩＬ６キメラの影響を研究するために用いられ、ＩＬ−６の影響と比較された。小脳の顆粒細胞の初代培養物は、８日歳のスプラグーダウレイラット（Sprague-Dawley rat）の仔から、以前に記載されたように調製した（Pizzi et al. 1993）。２．５×１０5細胞個／ｃｍ2の密度で、細胞をポリ−Ｌ−リシンで被覆された皿の上に載せ、１０％の熱で不活化したウシ胎児血清、グルタミン（２ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびＫＣｌ（２５ｍＭ）を含有する基本イーグル培地にて培養した。非神経細胞の細胞増殖を防ぐために、播種後１８時間後、シトシンアラビノシド（１０μＭ）を培養物に添加した。神経細胞を１０日間培養したのち、実験を実施した。
【００８７】
別段の指示がない限り、培養物は、Ｍｇ2+なしのロック液中で、５０μＭのグルタミン酸に１５分間さらされた。ＩＬ６またはＩＬ６キメラは、グルタミン酸処理の５分前に添加された。ついで、３７℃、９５％大気／５％ＣＯ2において皿を培養条件の培地に戻し、細胞生存率を１８〜２４時間後に測定した。
【００８８】
１８時間後、細胞生存率は、以前に記載されたように（Pizzi et al. 1993）、フルオレセインジアセテートとヨウ化プロピジウムの混合物を用いる生体内染色により評価された。単層において生存する神経細胞のパーセンテージは、それぞれの単層由来の３つの典型的な領域の顕微鏡写真における、フルオレセインジアセテート（緑色の生存細胞）とヨウ化プロピジウムを加えたフルオレセインジアセテート染色（全細胞）との比を評価することにより算出した。値は３つの姉妹皿（sister dises）から得た。
【００８９】
１から１０ｎｇ／ｍｌにわたる用量でＩＬ６を用いても、ラット小脳の顆粒細胞に対する何の保護効果も誘導されなかったが、０．１ｐｇ／ｍｌおよび１ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６キメラは、グルタミン酸誘導性神経毒性から、それぞれ４０〜２０％の神経細胞を保護した。
【００９０】
実施例１０：ＮＧＦ使用中止後の上頸神経節ニューロンの生存に対するＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの影響
ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラにより発揮される神経保護効果はまた、末梢神経培養系でも研究された。
【００９１】
上頸神経節（ＳＣＧ）は、Ｐ０−Ｐ３（出生後０から３日）ラットの上頸神経節から単離された。神経細胞は、５％ラット血清およびＮＧＦを含有する培地において、４日間維持された。ＮＧＦは、生存のために神経細胞に必要とされ、ＮＧＦ除去は、アポトーシスを誘導するために細胞の死を導く。最初の培地は、成長因子の中和抗体を含有するＮＧＦなしの培地で置きかえられた。この時点で、０．１または１μｇのＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、１％ＤＭＳＯ最終濃度中に添加された。その培養物は、３７℃で２４時間維持された。
【００９２】
２４時間の処理後のＮＧＦを除去した神経細胞の生存率に対するＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの影響は、モスマン（Mosmann）（1983）により詳細に記載されているＭＴＴ検定により測定される細胞のミトコンドリア活性によって、ならびに顕微鏡によって評価された。使用されたＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの濃度は、ＮＧＦで処理したＳＣＧ神経細胞に対して、いかなる毒性効果または形態的効果も示さなかった。
【００９３】
ＭＴＴ検定の結果から判断できるように（図６）、１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度でのＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの添加は、４０％までのＳＣＧ神経細胞をＮＧＦ除去により誘導されていた神経細胞死から救った。このように、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、末梢神経に対する神経保護効果を有し、たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病またはＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）などの神経変性における活性化を示唆している。
【００９４】
いまや、本発明を完全に記載したが、本発明の精神および範囲から離れることなく、および過剰な実験をせずに、広い範囲にわたる等価値のパラメータ、濃度および条件において、同じことを実施し得るということは、当業者により理解されるであろう。
【００９５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラまたはフォルスコリン（ＦＳＫ）により処理されたシュワン細胞の培養物、または処理されていない（ＮＴ）シュワン細胞の培養物におけるＭＢＰ  ＲＮＡの増加を示す図である。
【図２】  図２は、異なる量のＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラで処理した２４、４８および７２時間後に測定された未分化ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞の増殖を示す図である。
【図３】  図３は、ＩＬ６ＲＩＬ６がＦ１０．９細胞内で時間をかけて強力にＭＢＰ  ｍＲＮＡを誘導し（Ａ）、Ｐａｘ−３  ｍＲＮＡを減少させる（Ｂ）ことを示す図である。
【図４】  図４は、海馬の器官切片においてＮＭＤＡが介在する神経毒性に関する、ＩＬ−６単独およびＩＬ−６キメラによる神経保護の比較を示す図である。
【図５】  図５は、海馬の器官切片での、ＩＬ−６キメラの延長した神経保護効果に対するＩＬ−６単独の効果を示す図である。
【図６】  図６は、ＭＴＴ分析により測定された、２４時間の処理後のＮＧＦ欠乏ニューロンの生存に対するＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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