(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片をゲノム上に導入してなる微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、且つ当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した組換え微生物であって、分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、前記組換え微生物。
【請求項２】
枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を、微生物のゲノム上に導入してなるものである請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域が、配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、若しくは当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAであり、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、配列番号９の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、若しくは当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAである請求項１又は２記載の組換え微生物。
【請求項４】
枯草菌のprsA遺伝子が、以下の（１）〜（４）のいずれかに記載の遺伝子である請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
（１）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
（２）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
【請求項５】
微生物がバチルス属細菌である請求項１〜４のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項６】
微生物が枯草菌である請求項５記載の組換え微生物。
【請求項７】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号５で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項１〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項８】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が以下の（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAからなる遺伝子である請求項１〜７のいずれか1項記載の組換え微生物。
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有し、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicumATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
prsA遺伝子は、枯草菌においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質をコードする遺伝子として発見され、これまでの研究から、PrsAは、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有することが推測されている。そして、自身のプロモーター領域を含む枯草菌のprsA遺伝子を挿入したプラスミドを導入し、微生物中に複数のprsA遺伝子を持たせることにより、目的タンパク質の生産性が２〜６倍に向上した微生物が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、かかる微生物では、１菌体当たりに導入される複数個のプラスミドの個数を制御するのが困難であり、また生産培養中にプラスミドの脱落がしばしば起こるという問題があり、実用的ではない。更に前記報告において、prsA遺伝子断片を挿入したクローニングベクターpHP13は枯草菌プラスミドpTA1060の複製機能を含んでおり（Mol. Gene. Genet., 209:335 (1987)）、pTA1060の枯草菌1ゲノム当たり、すなわち1菌体当たりにおけるコピー数は平均5.2であることが報告されている（Plasmid, 18:8 (1987)）。すなわち、前記報告における目的タンパク質の増加量は野生株の生産量の１〜５倍であることから、導入したprsA遺伝子1個あたりの生産増加量は野生株生産量の約０．２〜１倍であり、充分な効果が得られているとは言えない。
【０００５】
一方、spoVG遺伝子がコードするSpoVGは、胞子のコルテックス合成に関与するタンパク質である。spoVG遺伝子の転写は胞子形成シグマ因子であるシグマＨの調節を受けており、spoVG遺伝子は胞子形成期にて顕著な発現上昇を示すことが知られている（非特許文献４）。しかしながら、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域やリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子の上流に連結した微生物は知られていない。
【非特許文献１】Nature,390,249,1997
【非特許文献２】Science,277,1453,1997
【非特許文献３】Mol. Microbiology, 8,:727 (1993)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83,:9438 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高い微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を導入して枯草菌prsA遺伝子を強化し、枯草菌PrsAを過剰に発現させることにより、目的タンパク質の生産性が著しく向上することを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入してなる微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、上記の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この明細書においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００１３】
本発明の組換え微生物の宿主となる微生物としては、特に限定されず、野生型のものでも変異を施したものでものよく、具体的には、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点や、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１４】
本発明の枯草菌prsA遺伝子とは、配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられ、枯草菌prsA遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子、例えば、バチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス  アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）、バチルス  チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス  イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各prsA遺伝子等が含まれる。
（１）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる枯草菌PrsAタンパク質と同等の活性又は機能を有するタンパク質をいう。
【００１５】
本発明の微生物においてprsA遺伝子の上流に導入される枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としては、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）により、遺伝子番号BG101126として開示された遺伝子spoVGを制御する領域が挙げられる。より具体的には、配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAが挙げられる。また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、配列番号９の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAが挙げられる。
【００１６】
配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列や塩基番号38〜230で示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、（Ａ）配列番号９の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる塩基配列、（Ｂ）配列番号９の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列等が挙げられる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。
【００１７】
また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するとは、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に導入した際に、prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の発現が強化され、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上し、しかも、その向上の程度が、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に導入した時と同等に向上するものをいう。
【００１８】
本発明におけるspoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上の上流への導入には、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。
【００１９】
当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、かかる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片の上流にprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、prsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域、及びprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位がspoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のprsA遺伝子上流へ導入された転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol.Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5’側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3’側に続く領域を示す。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
【００２０】
また、spoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、本来の転写開始制御領域とspoVG遺伝子の転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。
【００２１】
本発明において枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、prsA遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。
【００２２】
本発明におけるspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の導入は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得たspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、prsA遺伝子断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結して得た遺伝子断片を用いて行うことができる。かかる断片は、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。
導入するprsA遺伝子、及びspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列は、prsA遺伝子、及びspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列である限り、その微生物が本来有するprsA遺伝子、及びspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列と一致しないものであってもよい。核酸断片の宿主への導入方法としては、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
またかかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができる。尚、後記実施例に示す様に、かかる断片は1菌体当たり１コピーの導入で目的タンパク質又はポリペプチドの生産に対し充分な効果を発揮することから、プラスミドによって導入した場合にも、生産培養中のプラスミド脱落の影響を受け難い。
【００２３】
なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いたspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による宿主のゲノム上への導入方法について説明するが、本発明に於ける導入方法は下記に限定されるものではない。
本方法で用いる導入用DNA断片は、宿主のゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（２））の間に、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、prsA遺伝子断片（以下、断片（４））、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を順に挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に（５）断片の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加された断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加された断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じるので、PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。
ここで行うPCR反応は、表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子の他には、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。
【００２４】
本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。ここで、「目的タンパク質又はポリペプチド」は、製造又は精製が目的の一つであるタンパク質又はポリペプチドをいう。また、「目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する微生物」において、遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物は本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。
【００２５】
目的タンパク質又は目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。Bacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号４のアミノ酸番号1〜480のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。また、セルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号８のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。また、プロテアーゼとしては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００２６】
本発明の微生物に導入されるべき目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００２７】
このような目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の導入は、例えば、（１）ベクターによる導入、（２）ゲノムへの挿入により行うことができる。（１）ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。
【００２８】
また、（２）ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。
【００２９】
かくして作製された微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。かかる効果は、細胞外へ輸送されたタンパク質の折りたたみ効率が向上したことにもとづくと推測される。
【００３０】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００３２】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００３３】
また、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００３４】
培養上清中のアミラーゼの活性測定には、リキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００３５】
実施例１  prsA遺伝子発現強化株の構築
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にCm耐性遺伝子が結合した1.8kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した1.8kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた3.8kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とprsA/Cm-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.1kb及び2.7kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Kc株と命名した。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
実施例２  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−１
実施例１にて得られたprsA-Kc株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号３で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｉ）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
【００３８】
実施例１にて得られたprsA-Kc株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表２に示した様に、宿主としてprsA-Kc株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して非常に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。これはprsA-Kc株にてprsA遺伝子の発現が野生株より高まり、細胞膜上のPrsAタンパク質量が増加したことにより、タンパク質の分泌効率が向上した結果によるものと推測された。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
実施例３  prsA遺伝子発現強化株の構築−２
実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位及びybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の２箇所にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたprsA-KcII株を作成した。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表１に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したybdOfwとybdO/PVGr、及びybxG/Em2fとybxGrvのプライマーセットを用いてybdO遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びybxG遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したybdOfw2とybxGrv2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がybxG遺伝子上流の非遺伝子領域内部に挿入された総塩基長4.4kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.4kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すybdOfwとprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとybxGrvのプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.1kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。以上の様にしてprsA-KcII株を構築した。
【００４１】
実施例４  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−２
実施例１で作成したprsA-Kc株と実施例３で作成したprsA-KcII株及び、対照として枯草菌１６８株のアルカリアミラーゼ分泌生産評価を実施例２と同様の方法で行った。その結果、表３に示すようにprsA-Kc株及びprsA-KcII株とも対象の枯草菌１６８株に比較して６倍近く生産性が向上したが、ゲノム上にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結した遺伝子を１つ含むprsA-Kc株に比べて、２つ含有するprsA-KcII株の生産性の向上率は小さかった。このことから、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に結合させた場合、１コピーの導入で十分な生産性の向上効果が得られたことが示唆された。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
比較例１  ゲノム中prsA遺伝子上流へのPspac転写開始制御領域の導入
図３に示される模式図に基づいて、ゲノム中prsA遺伝子上流へPspac転写開始制御領域の導入を行った。
なお、Pspac転写開始制御領域は枯草菌において、誘導物質にて制御が可能なプロモータとして開発された。lacリプレッサー遺伝子を共存させると、リプレッサーによりPspacプロモーターの発現は抑制されるが、誘導物質であるIPTG（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を添加することによりリプレッサーが外れ、プロモーターが活性化することが知られているものである（Yansura, D. G. and D. J. Henner, Genetics and Biotechnology of Bacilli (1984) Development of an inducible promoter for controlled gene expression in Bacillus subtilis）。
すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したprsAUfHin及びprsAUrBamのプライマーセットを用いて、ゲノム中のprsA遺伝子の-30bp〜290bp領域（配列番号１の781〜1100）断片をPCRにより増幅した。尚、それぞれのプライマーの5’末端側には、HindIII及びBamHIの各制限酵素認識配列が付加されている。得られた断片をHindIII及びBamHI処理し、プラスミドｐMUTIN4（Microbiology, 144, 3097, (1998) ）のHindIII及びBamHI制限酵素切断点に挿入した。この結果得られた組換えプラスミドDNAを用いてコンピテント法による枯草菌168株の形質転換を行い、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによって、図３に示す様な一重交差の相同組換えが起こったことによると考えられるゲノム中prsA遺伝子上流へのPspac転写開始制御領域の導入を確認した。構築された菌株はprsA-P株と命名した。
【００４４】
比較例２  アルカリアミラーゼ分泌生産評価−３
比較例１にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。尚、Pspac転写開始制御領域を誘導状態にする為、使用した2xL−マルトース培地にはIPTG（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を終濃度が1mMとなる様に添加した。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Kc株についても評価を行った。表４に示した様に、ゲノム中prsA遺伝子上流へPspac転写開始制御領域を導入したprsA-P株におけるアミラーゼ生産性は野生株と同等であった。Pspac転写開始制御領域を利用してprsA遺伝子の発現を行う方法は、J. Biol. Chem., 279, 19302, (2004)等で用いられている方法であり、その有用性が報告されているが、本検討により、従来のprsA遺伝子発現方法と比べ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を利用したprsA遺伝子発現方法が、極めて優れていることが明らかとなった。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
比較例３  転写開始制御領域の違いによるprsA遺伝子発現強化効果の検証
実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位に、Pspac転写開始制御領域の下流に本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたprsA-Kspac株を構築した。すなわち、プラスミドpMUTIN4を鋳型とし、表５に示したPspac-FとPspac-Rのプライマーセットを用いてPspac転写開始制御領域を含む0.2kb断片（Ａ）をPCRにより増幅し、また枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したamyEfw2とamyE/Pspac-R2、及びprsA/Pspac-F とprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｂ）、及び本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。更に実施例１にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したcatfとamyErv2のプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した1.9kb断片（Ｄ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）4断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、4断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、Pspac転写開始制御領域の下流に本来のリボゾーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｅ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｅ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsA-Kspac株を構築した。
また枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位に、本来の転写開始制御領域及びリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子が挿入されたprsA-Kori株を以下の様に構築した。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したamyEfw2とamyE/prsAUP-R、及びprsAUP-FとprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）、及び本来の転写開始制御領域及びリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子を含む1.7kb断片（Ｇ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｆ）（Ｇ）及び上記（Ｄ）の3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｆ）（Ｇ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、本来の転写開始制御領域と本来のリボゾーム結合部位を伴うprsA遺伝子がその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子を連結した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.4kbのDNA断片（Ｈ）を得た。得られた4.4kbDNA断片（Ｈ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsA-Kori株を構築した。
更に、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位に、spoVG 遺伝子転写開始制御領域の下流に本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたprsA-KVG株を構築した。すなわち、実施例１にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したamyEfw2とPVG2-Rのプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域が連結した1.2kb断片（Ｉ）をPCRにより増幅した。また枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したprsA/PVG2-FとprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｊ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｉ）（Ｊ）及び上記（Ｄ）の3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｉ）（Ｊ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子転写開始制御領域の下流に本来のリボゾーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｋ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｋ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsA-KVG株を構築した。構築したprsA-Kspac株、prsA-Kori株、及びprsA-KVG株の3株は、導入したprsA遺伝子の転写に関わる転写開始制御領域に違いがある他は、導入した位置、リボソーム結合部位、及び薬剤耐性遺伝子について全く同一である。
構築した上記3株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。その結果、表６に示すようにprsA-Kori株とprsA-KVG株において分泌生産の向上が認められたが、prsA遺伝子本来の転写開始制御領域を利用したprsA-Kori株に比べspoVG遺伝子転写開始制御領域を利用したprsA-KVG株における生産量は顕著に高く、分泌生産向上効果としては約3倍であった。尚。Pspac転写開始制御領域を利用したprsA-Kspac株において分泌生産向上は認められなかった。すなわち、prsA遺伝子の強化にはspoVG遺伝子転写開始制御領域の利用が極めて有効であることが明らかとなった。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
【表６】
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【００４９】
実施例５  バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子発現強化株の構築
バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子（配列番号４８）は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例１の方法と同様の方法にて、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表５に示したBce/PVG-FとBce/catf-Rのプライマーセットを用いてバチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。また上記比較例にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したamyEfw2とPVG-R、及びcatfとamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片（Ｂ）、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した1.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス  セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｄ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｄ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。その結果、表７に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。
【００５０】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。
【図２】spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。
【図３】一重交差の相同組換えにより、lacリプレッサー遺伝子とPspac転写開始制御領域をprsA遺伝子上流の染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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