(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)：
【化１】
0004836345.tif 000004
（式中、Ｒは、炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Mは、水素原子又は対カチオンである。）で示される環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、神経細胞の生存促進のための薬剤において、一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体が１−オレオイル環状ホスファチジン酸である、上記の薬剤。
【請求項２】
一般式(I)：
【化２】
0004836345.tif 000005
（式中、Ｒは、炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Mは、水素原子又は対カチオンである。）で示される環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、神経細胞の伸長促進のための薬剤において、一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体が１−オレオイル環状ホスファチジン酸である、上記の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リン脂質の1種である環状ホスファチジン酸誘導体を含む薬剤に関する。より詳細には、本発明は、環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、神経細胞の生存促進のための薬剤、神経細胞の伸長促進のための薬剤、並びに神経障害の治療及び／又は予防のための薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体膜を構成している主成分であるグリセロリン脂質は、一般にグリセロール骨格に疎水性の脂肪酸が2分子結合し、さらにリン酸基を介してコリンやエタノールアミンなどの親水性基が結合している。リン脂質における疎水性部分と親水性部分とのバランスが、安定な脂質二重層を形成する上では重要である。これに対してリゾリン脂質は、脂肪酸が１分子のみ結合したものであり、疎水性部分が親水性基に対して相対的に小さくなるため、安定な膜構造をとれず、逆にそれを壊す界面活性作用を示す。
【０００３】
しかし、近年、低濃度で特有の生理活性を示すリゾリン脂質が多数見つかっており、そのうちの一つとしてリゾホスファチジン酸(lysophosphatidic acid；LPA)が挙げられる。LPAは最も単純な構造を持つリン脂質の一つであり、グリセロールのsn-1位あるいは2位の脂肪酸のどちらか一方が脱アシル化されている点でホスファチジン酸(phosphatidic acid；PA)とは相違する（図１を参照）。
【０００４】
LPAは、生体内にごく微量（細胞全リン脂質中の0.5％以下）しか存在しない。従来、LPAはリン脂質生合成の中間産物又は分解中間物と考えられていた。しかし、1970年代後半に、血漿中（Schumacher, K.A., 他, Thromb. Haemostas., 42, 631-640(1979)）やダイズ粗レシチン画分中（Tokumura, A., 他, Lipids, 13, 468-472(1978)）に存在する血管収縮作用を示す物質がLPAであると同定された。更に、血清中の脂質性増殖因子がLPAであることも示され（van Corven, E., 他, Cell 59, 45-54(1989)）、LPAは生理活性脂質として注目されるようになった。
【０００５】
LPAには、細胞増殖促進作用（Fischer D.J.,他, Mol Pharmacol, 54, 979-988 (1988)）、癌細胞の浸潤促進（Imamura, F.,他:Jpn.J.Cancer Res., 82, 493-496(1991)；Imamura, F.,他:Biochem. Biophys. Res. Commun., 193, 497-503(1993)；及びImamura, F.,他: Int. J. Cancer, 65, 627-632(1996)）、アポトーシスの抑制（Umnaky, S.R.,他: Cell Death Diff., 4, 608-616(1997)）などを含む多様な生理活性のあることが今までに明らかにされている。特に、神経細胞に対しても、LPAは神経突起の退縮を引き起こすことが知られている（Tigyi, G.,他:J. Biol. Chem., 267, 21360-21367(1992)；Jalink, K.,他: Cell Growth & Differ., 4, 247-255(1994)；Jalink, K.,他: J. Cell Biol., 126, 801-810(1994)；及びTigyi, G.,他: J. Nurochem., 66, 537-548(1996)）。また、神経系株化細胞であるPC12細胞では開口放出を誘導することも報告されている（Shiono, S.,他: Biochem. Biophys. Res Commun., 193, 663-667(1993)）。さらに、1996年にChunらによって神経上皮細胞層(ventriluar zone, vz)に特異的に発現するGタンパク質関連受容体遺伝子（ventriluar zone gene-1；vzg-1/edg-2）がクローニングされ、当該遺伝子を過剰発現させた細胞の形態変化に血清中の脂質が必要であるという知見から、その特異的リガンドがLPAであることが明らかにされた（Hecht, J. H.,他:J. Cell Biol. 135, 1071-1083(1996)）。これらの知見は、神経系におけるLPAシグナリングの重要性を示唆しており、神経の発生や分化においてLPAが重要な役割を演じていると考えられる。
【０００６】
一方、本発明者らは、以前より真性粘菌Physarum polycephalumを実験材料として、様々な細胞生化学的解析を行っている。真性粘菌は、外部環境の変化に応じて、形態変化を示し、その増殖・分化に伴って、生体膜脂質の組成と代謝に著しい変化を見せることが明らかにされてきた。1992年に単相体ミクソアメーバから単離・同定された新規の脂質成分は、構造解析の結果、グリセロール骨格のsn-1位にシクロプロパン環を含むヘキサデカン酸を持ち、sn-2位と3位にリン酸が環状にエステル結合をしている物質であると確認された（Murakami-Murofushi, K., 他: J. Biol. Chem.,267, 21512-21517(1992)）。この物質は、Physarum由来のLPA類似体であることから、PHYLPAと命名された（図２を参照）。
【０００７】
PHYLPAは、真核細胞のＤＮＡポリメラーゼαの活性を抑え、動物培養細胞の増殖を抑制した脂質画分より得られたものであり、PHYLPAがこれらの生理活性を示すことが確認されている。PHYLPAは特徴的な脂肪酸を有しているが、この脂肪酸部分を別の一般的な脂肪酸に置換した構造類似体を有機合成し、それらの生理活性を調べた結果、PHYLPAと同様の生理作用が示された（Murakami-Murofushi, K., 他: Biochem.Biophys.Acta, 1258, 57-60(1995)）。このことより、これらの生理作用に重要な構造はグリセロールsn-2位、3位の環状リン酸構造にあると推測される。この構造を持つ脂質は、総称して環状ホスファチジン酸（cyclic phosphatidic acid；cPA）と称される（図２を参照）。
【０００８】
cPAは真性粘菌特有の脂質ではなく、広く生物界に存在していることが確認された。例えば、ヒト血清アルブミン結合脂質より、脂肪酸部分にパルミチン酸（C16:0）を有するcPAが単離・同定され、ミリスチン酸(C14:0)及びステアリン酸（C18:0）が結合したcPAも少量存在することが示唆された。血清中のcPAの濃度は約１０-7Mと予想され、これはLPAの血清中濃度の約１／１０に相当する（Kobayashi.T., 他; Life Science, 65, 2185-2191(1999)）。その後、LPAと同様にヒト血清中やウサギ涙腺液中にもcPAが存在することが確認された（Liliom, K., 他:Am. J. Physiol., 274, C1065-1074(1998)）。
【０００９】
cPAの作用についても、LPAと相反又は類似する生理活性を示すことが報告されている。例えば、細胞増殖の抑制（Murakami-Murofushi, K., 他: Cell Struct. Funct., 18, 363-370(1993)）、癌細胞の浸潤抑制（Mukai, M. 他:Int.J.Cancer, 81, 918-922 (1999)）、および細胞内ストレスファイバーの形成（Fischer, D.J.,他: Mol.Pharmacol., 54, 979-988(1998)）などが報告されている。
【００１０】
ところで、神経細胞は、神経栄養因子（nerve growth factor；NGF）の供給を遮断すると生存できないことが知られており、例えば、海馬では高濃度のNGFが存在する（畠中寛：蛋白質核酸酵素，35, 103-117, 1989）。また、NGF様の細胞成長因子である繊維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor；FGF）が、海馬の神経細胞の生存率を高め、神経突起の伸長を促進するとの報告もある（畠中寛：生化学，61, 1351-1365，1989）。しかしながら、cPAが神経細胞に及ぼす作用についてはこれまで報告がなされていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、cPAの新しい生理活性の一つとして神経細胞への作用を解明し、神経細胞の生存率の向上又は神経細胞の伸長の促進を通じて神経障害の治療及び／又は予防のために有用な新規な薬剤を提供することを解決すべき課題とした。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、cPAの生合成の機構の解明を試み、次いで、ウシ脳中におけるcPAの検出を試みた。そして、ラット胎児脳由来の初代培養系を用いて、cPAが神経細胞の生存や神経突起の形成に及ぼす影響について解析した。これらの解析の結果、本発明者らは、cPAがラット海馬初代培養神経系細胞の生存率を高め、神経突起の伸長を促進することを明らかにすることにより、cPAが神経障害の治療に有用な治療剤となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明によれば、一般式(I)：
【化４】
0004836345.tif 000002
（式中、Ｒは、炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Mは、水素原子又は対カチオンである。）
で示される環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、神経細胞の生存促進のための薬剤が提供される。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、神経細胞の伸長促進のための薬剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、神経障害の治療及び／又は予防のための薬剤が提供される。
【００１５】
神経障害は、例えば、痴呆、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン氏病、脳卒中、脳梗塞または頭部外傷から選択される。本発明で用いる一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体は好ましくは１−オレオイル環状ホスファチジン酸である。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、
治療的有効量の上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、神経細胞の生存を促進する方法；
治療的有効量の上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、神経細胞の伸長を促進する方法；並びに、
治療的有効量の上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、神経障害を治療及び／又は予防する方法；
が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、
上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体の、神経細胞の生存促進のための薬剤の製造における使用；
上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体の、神経細胞の伸長促進のための薬剤の製造における使用；
並びに、上記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体の、神経障害の治療及び／又は予防のための薬剤の製造における使用；
が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の薬剤は、神経細胞の生存率向上、神経細胞の伸長促進、並びに神経障害の治療及び／又は予防のために使用することができ、下記一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む。
【００１９】
【化５】
0004836345.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｒは、炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Mは、水素原子又は対カチオンである。）
【００２１】
一般式(I)において、置換基Ｒが示す炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。
【００２２】
置換基Ｒが示す炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデカジエニル基、ヘキサデカトリエニル基などが挙げられ、より具体的には、８−デセニル基、８−ウンデセニル基、８−ドデセニル基、８−トリデセニル基、８−テトラデセニル基、８−ペンタデセニル基、８−ヘキサデセニル基、８−ヘプタデセニル基、８−オクタデセニル基、８−イコセニル基、８−ドコセニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基、ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３−テトラエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３，１６−ペンタエニル基、ヘニコサ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサエニル基などが挙げられる。
【００２３】
置換基Ｒが示す炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、８−デシニル基、８−ウンデシニル基、８−ドデシニル基、８−トリデシニル基、８−テトラデシニル基、８−ペンタデシニル基、８−ヘキサデシニル基、８−ヘプタデシニル基、８−オクタデシニル基、８−イコシニル基、８−ドコシニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジイニル基などが挙げられる。
【００２４】
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、1個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、オキシラン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、Ｎ−メチルプロリジン環などが挙げられる。
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環などが挙げられる。
【００２５】
従って、置換基Ｒがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロヘキシルエチル基、８，９−メタノペンタデシル基などが挙げられる。
置換基Ｒが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジル基、フェネチル基、ｐ−ペンチルフェニルオクチル基などが挙げられる。
【００２６】
一般式(I)で示される環状ホスファチジン酸（cPA）誘導体中のMは、水素原子又は対カチオンである。Ｍが対カチオンである場合の例としては、例えば、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換若しくは無置換アンモニウム基が挙げられる。アルカリ金属原子としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属原子としては、例えば、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。置換アンモニウム基としては、例えば、ブチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、テトラメチルアンモニウム基などが挙げられる。
本発明で用いられる一般式(I)で示されるcPAの具体例としては、オレオイルcPAが特に好ましい。
【００２７】
一般式(I)で示されるcPA誘導体は、例えば、特開平５−２３００８８号公報、特開平７−１４９７７２号公報、特開平７−２５８２７８号公報、特開平９−２５２３５号公報に記載の方法等に準じて化学的に合成することができる。
あるいは、一般式(I)で示されるcPA誘導体は、特願平１１−３６７０３２号明細書に記載の方法に準じてリゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによって合成することもできる。ここで用いるリゾ型リン脂質は、ホスホリパーゼＤを作用しうるリゾ型リン脂質であれば特に限定されない。リゾ型リン脂質は多くの種類が知られており、脂肪酸種が異なるもの、エーテル又はビニルエーテル結合をもった分子種などが知られており、これらは市販品として入手可能である。ホスホリパーゼＤとしては、キャベツや落花生などの高等植物由来のものやStreptomyces chromofuscus, Actinomadula sp.などの微生物由来のものが市販試薬として入手可能であるが、Actinomadula sp. No.362由来の酵素によって極めて選択的にcPAが合成される（特開平１１−３６７０３２号明細書）。リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、酵素が活性を発現できる条件であれば特に限定されないが、例えば、塩化カルシウムを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５〜６程度）中で室温から加温下（好ましくは３７℃程度）で１から５時間程度反応させることにより行う。生成したcPA誘導体は、常法に準じて、抽出、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにより精製することができる。
【００２８】
本発明において有効成分として用いる環状ホスファチジン酸誘導体は、神経細胞の生存率を向上させ、また神経細胞の伸長を促進することができる。従って、本発明によれば、当該環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む神経障害の治療及び／又は予防のための薬剤が提供される。本明細書で言う神経障害とは好ましくは脳神経障害であり、その具体例としては、神経変性疾患、脳卒中、脳梗塞、痴呆、頭部外傷などが挙げられる。ここで言う神経変性疾患とは、神経細胞が萎縮又は変性脱落する病気であり、例えば、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン氏病等が挙げられる。
【００２９】
本発明の薬剤は、１又は２以上の製剤学的に許容される製剤用添加物と有効成分である一般式(I)で示されるcPA誘導体とを含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
【００３０】
本発明の薬剤は、種々の形態で投与することができるが、主な作用部位が脳であるため、血液−脳関門を通過できる形態であることが好ましい。そのような好適な投与形態としては、経口投与でも非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）でもよい。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の薬剤の剤形はこれらに限定されることはない。さらに、公知の技術によって持続性製剤とすることもできる。
【００３１】
本発明の薬剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、pH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
【００３２】
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、D-マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；
カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；
ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；
ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００３３】
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のpH調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
【００３４】
本発明の薬剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の薬剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１μg／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の薬剤は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与してもよい。
【００３５】
本発明の薬剤は、神経障害の治療又は予防に有効な他の薬剤、脳神経にエネルギーを供給するような栄養剤等と併用することもできる。
なお、cPAそれ自体は、後記する実施例１及び２の結果から明らかなように哺乳類の脳に存在する物質であり、生体にとって安全であると考えられる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００３６】
【実施例】
実施例１：ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）によるcPAの生合成
実施例１では、放線菌由来PLDを用いてリゾホスファチジルコリン（LPC）からcPAを生成できること、並びに哺乳類の脳中にcPAを生成する酵素が存在することを明らかにした。
（Ａ）材料及び方法
（Ａ−１）実験材料
放線菌Streptomyces chromofuscus (S.chromofuscus) 由来のPLD、キャベツ由来のPLDは、Sigma社より購入した。Actinomadura sp. No. 362(A. sp. No.362) 由来のPLDは、名糖産業より購入した。１−オレオイルLPC（1-oleoyl LPC）、リゾホスファチジルセリン（lysophosphatidylserine；LPS）は、Avanti Polar lipid, INC.社より購入し、リゾホスファチジルエタノールアミン（lysophosphatidylethanolamine；LPE）は、Doosan Serdary Res. Lad.社より、１−アルキルリゾホスファチジルコリン（1-alkyl lysophosphatidylcholine；1-alkyl LPC）、１−アルケニルホスファチジルコリン・プラズマロゲン（1-alkenyl phosphatidylcholine plasmalogen；1-alkenyl LPC）は、Sigma社より購入した。また、Kobayashi, S.,他: Tetrahedron Lett., 34, 4047-4050(1993)に記載の方法に準じて有機合成したオレオイルcPA（oleoyl cPA）も使用した。
【００３７】
（Ａ−２）１-NBD-LPCの合成
cPA生成活性測定の為の基質として、蛍光標識されたLPCの調製を行った。すなわち、１−ヘキサデカノイル−２−（１２−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル））−sn−グリセロ−３−ホスホコリン（2-NBD-HPC；Avanti Polar lipids, INC.社製)を出発原料とし、リパーゼ（Rhizopus delemer由来；生化学工業社製)で1位の脂肪酸のみを脱アシル化した後、トリス塩酸バッファー（pH=9）中で、2位の蛍光アシル基を1位に転位させ、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製したものを1-NBD-LPCとした。
【００３８】
（Ａ−３） cPA生成活性測定
基質として、1-NBD-LPCと卵黄由来のLPCを1:99で混ぜ合わせたものを使用した(1％ NBD-LPC)。100μM 1％NBD-LPC存在下、10ｍM塩化カルシウムを含む100ｍM酢酸バッファー(pH＝5.6)中で酵素アッセイを行った。酵素源として、放線菌S.chromofuscus由来のPLD2.2μg/ml、または、放線菌A.sp.No.362由来のPLD1.4μg/mlを用いた。反応は30℃（S.chromofuscusの場合）または、37℃（A.sp.No.362の場合）で行った。反応終了時に反応液の0.3倍容の0.1Mクエン酸を加えて、溶液を酸性にした後に、クロロホルム：メタノール(2:1)混液を反応液の5.4倍量加え、遠心(1,400×g、5分)して下層に、脂質を抽出した。もう一度、クロロホルム：メタノール(2:1)混液抽出操作を同様に繰り返した後に、下層を合わせて窒素気流下で濃縮・乾固させた。得られた脂質を少量のクロロホルム：メタノール(2:1)混液に再溶解させて、シリカゲル（Silica Gel）60F 薄層クロマトグラフィープレート(TLC; E.Merck社製)にスポットし、展開溶媒；クロロホルム／メタノール／酢酸／5%二亜硫酸ナトリウム水溶液(100:40:12:5)で脂質を分離し、各蛍光スポットの強さを、蛍光イメージ分析器（fluoroimage analyzer）FLA-2000(富士フィルム社製)で定量分析した。
【００３９】
（Ａ−４）ESI-MS/MSによる構造解析
エレクトロスプレー型イオン源をタンデム四重極型質量分析計に装備したクアットロII（Quattro II；Micromass社製）とHPLCを連結した装置を使用して、陰イオンモードで分析した。ヒューレットパッカードモデル（Hewlett Packerd model）1050 HPLCポンプ（Hewlett Packerd社製）を用いて、アセトニトリル／メタノール(1:1)混液により5μl/分の流速で溶出した。サンプルは、0.1％ギ酸アンモニウムを含むアセトニトリル／メタノール(1:1)混液中に10〜50pmol／μlの濃度になるように脂質を溶かしたものを、3〜5μl注入した。ギ酸とアンモニアは、サンプルがイオン化される時に、それぞれプロトンの供与体、受容体として働く。HPLCとMSのインターフェイスは80℃に維持し、溶媒を蒸発させる窒素ガスは圧力40psi、流速0.4 l/分に設定した。MS分析においてcone voltage−30eVで分子イオンを、MS/MS分析においてcone voltage−90eVで脂肪酸を、−170eVでリン酸をモニターした。MS/MS分析の際には、不活性ガスを導入して局部的に高圧な部位を作り、分子イオンを衝突活性開裂(collision induced dissociation ; CID)させてドーターイオンを発生させる手法を組み合わせた。衝突ガス（collision gas）にはアルゴン(圧力 3.0〜4.5e-4Torr)を用い、衝突エネルギー（collision energy）は−50eVに設定した。
【００４０】
（Ａ−５）NIH−3T3における各種リゾリン脂質の添加によるストレスファイバーの形成
マウス由来繊維芽細胞NIH-3T3は、10％のウシ胎児血清（fetal bovine serum；FBS；Moregate社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecoo's Modified Eagle's Medium；DMEM）で培養しているものを実験に用いた。NIH-3T3を22mm径のカバーガラスを敷き詰めたシャーレ(10cm径)中に2.5×104細胞で植え継ぎ、24時間後にFBSを含まない培地に変え、その後48時間血清飢餓状態で培養した。10μMのリゾリン脂質を加え、37℃、30分間インキュベートすることで細胞に刺激を与えた後に、3.7%パラホルムアルデヒドと0.1%トリトン（Triton）X-100を含むダルベッコのPBS（Dalbecco's PBS）で室温にて、10分間固定した。その後、5単位／mlのローダミンファロイジン（rhodamine phalloidin；フナコシ社製）で37℃、1時間染色した。カバーガラスをPBSで3回洗浄した後に、共焦点レーザー顕微鏡TCS NTレーザー制御走査型顕微鏡（Control Laser Scanning Microscope；Leica社製）で観察した。
【００４１】
（Ａ−６）ラット脳中のcPA生成活性の測定
材料として、雄4週齢のスプラグ−ドーレイ系ラット（Sprague-Dawley rat）を用いた。ラットはエーテル麻酔をかけた後、断頭し、全脳を摘出し、−80℃で保存した。保存してあったラット全脳の左右いずれかの半分(約0.8g)に、10倍量の0.32Mショ糖液を加え、ポリトロンホモジナイザー（Polytron Homogenizer；Polytron社製）、パワーコントロール（power control）7で、20秒間2回ホモジナイズした。この液の体積の2倍量のヘペスバッファー（Hepes buffer）を加え、ホモジネート溶液とした。cPA生成活性の測定は、以下の溶液組成で行った。すなわち、基質として1%NBD-LPC 40nmolまたは、1位脂肪酸のカルボキシル基の炭素を放射標識した14C-LPCと非標識のLPCを2:55の比率で混ぜたもの(120nCi)を用い、オレイン酸ナトリウム450μM存在下のホモジネート溶液100μl中37℃で反応させた。反応終了後の処理については、放線菌PLDアッセイの条件に準じた。
【００４２】
（Ｂ）結果
（Ｂ−１）放線菌PLDによるLPA/cPAの生成
1%1-NBD-LPCを基質として、リン酸基転位活性の強弱の異なる2種類の放線菌由来のPLDを用いてcPAの生成が見られるか否かを検討した。S.chromofuscus由来のPLDを用いた場合、20分間反応させると、主な生成物として1-NBD-LPAのみが得られた。しかし、リン酸基転移活性が高いとされているA.sp.362由来のPLDを用いると、LPAとは異なった生成物が主に得られ、この化合物のRf値は、有機合成したcPA標品（オレオイルcPA）と一致した。これらの反応の違いを確認するため、それぞれの酵素の濃度依存性、さらに反応の時間依存性を検討した。S.chromofuscus由来のPLDを用いた場合は、基質であるLPCが減少するのに伴って、LPAの生成のみが見られた。それに対し、A.sp.362由来のPLDを用いた場合には、cPAに相当する生成物の増加が見られたのみで、LPAの生成はほとんど見られなかった。このことは、PLDの種類によって、基質が同じであっても生成物が異なることを示している。また、酵素学的解析の進んでいるキャベツ由来のPLDを用いたときには、LPAとcPAの両方が約6:4の割合で生成した。
【００４３】
ここで、cPA相当の化合物を生成するA.sp.362由来の酵素について、さらに基質特異性を調べてみた。基質として各100μMの1-acyl LPC、1-alkyl LPC、1-alkenyl LPC、LPS、LPEを用い、標準的なPLDアッセイ条件に準じて反応を行わせた。それぞれの基質からの生成物をTLCを用いて分離し、LPA、cPA相当のスポットをかきとり、リン定量を行って、生成量を測定した。いずれの基質においてもLPAの生成はほとんど見られなかった。LPC、1-alkyl LPC、あるいは1-alkenyl LPCを基質として用いた場合には、時間依存的にcPAが生成したが、LPS、LPEを基質として用いた場合にはcPAは生成されなかった。この結果より、A.sp.362由来PLDは、極性基部分にコリン（choline）を有するリゾリン脂質から効率よくcPAを生成することが示された。また、alkyl、alkenyl型LPCもcPA生成の基質になりうることがわかった。
【００４４】
（Ｂ−２）A.sp.362由来PLD反応生成物の構造解析
1位脂肪酸にオレイン酸を持つ1-oleoyl LPCを基質としてA.sp.362由来PLDで反応させたときの主生成物（cPAと同じRf値を持つ化合物）について、その構造解析を行う為、質量分析を用いた。まず、質量分析の条件を設定するため、スタンダードとして有機合成した1-oleoyl cPAをESI-MS/MSにかけ、陰イオンモードで分析した。その結果、上記した条件で、1-oleoyl cPAの分子イオン[M−H]-に合致するm/z 417のピークが観察された。同一条件下でPLD反応生成物ついて分析したところ、同様にm/z 417のピークが強く観察された。分子イオンに相当するピーク群について、さらに構造情報を得るため、in-source fragmentationによるタンデムマススペクトリー（MS/MS）を行った。スタンダードcPAの分子イオンm/z 417を親イオンとしたドータースキャンの結果、いくつかの特徴的イオンピークが発生し、以下のように解釈された。すなわち、m/z 281はC17H33COO-、m/z 153は[M−C17H33CO]-、m/z 79はPO3-に相当する。一方、PLD反応によって得られたm/z 417ピークについて同様にMS/MS分析をした結果、同一の特徴的なフラグメントピーク群が認められた。以上より、A.sp.362由来PLD反応によって作られた化合物がcPAであることが確認された。
【００４５】
（Ｂ−３）PLD反応生成物によるNIH-3T3細胞でのストレスファイバーの形成
放線菌A.sp.362由来PLD反応で得られた生成物がcPAと同一の化合物であることを更に確認するために、その生物活性を検討した。すなわち、cPAの持つ生理活性の１つである、繊維芽細胞でのアクチンストレスファイバーの形成能を調べた。血清飢餓状態にしたサブコンフルエント（subconfluent）状態の、マウス由来繊維芽細胞株であるNIH-3T3に10μMのLPA、化学合成されたPHYLPA、あるいはPLD反応生成物であるcPAをそれぞれ37℃で30分間与え、ローダミンファロイジンでアクチンのストレスファイバーを染色し、観察を行った。脂質を添加しなかったコントロールの細胞では、ストレスファイバーの生成が見られなかったのに対し、用いた3種のリゾリン脂質でいずれもストレスファイバーの形成が見られた。
【００４６】
（Ｂ−４）ラット脳におけるcPAの生成
ラット脳中にcPA生成活性があるか否かを検討した。異なる複数の条件下で検討を行った結果、最終的にショ糖水溶液(0.32M)でホモジネートを作成し、20mMヘペスバッファー(pH 7.2)中、オレイン酸(450μM)存在下で活性の測定を行ったところ、37℃で60分間インキュベーション後、cPA相当のスポットが確認された。
【００４７】
（Ｃ）まとめ
上記結果より、PLDと総称されるリン脂質加水分解酵素のうちの特定の酵素によってcPAを生成できることが示された。現在精製品として市販されているPLDの中でも、その酵素源が異なると、LPCを基質にした場合、異なる生成物が得られることがわかった。
実施例１において、ラット脳ホモジネート中にLPCからcPAを生成する酵素活性が検出できたことは、ホスファチジル基転移反応が、生理活性脂質であるcPAの産出に積極的に貢献していることを示している。哺乳類の脳の中には、cPAが存在することが示され、また、PLD活性についても脳は比較的高い活性を有することが分かった。基質のLPCは、通常の生理活性条件下では脳内にほとんど検出されないが、ある種のPLA2の活性化を経て生成されると考えられる。
【００４８】
放線菌A.sp.362由来PLDを用いることにより、効率よくcPAが調製できることはcPAの構造類似体を作成する上で有用である。このような酵素を用いた調製法では、1-alkenyl LPCからcPAを調製することが可能である。1-alkenyl LPAはウサギ角膜損傷時に検出され、細胞増殖活性を有し、創傷の治癒に関与していることが考えられている。この他、脂肪酸の異なったLPCから、対応するLPA/cPAを調製することが可能である。
【００４９】
実施例２：ウシ大脳からの環状ホスファチジン酸の検出
実施例２では、哺乳動物の脳中のcPAの検出を目的として、ウシの大脳にcPAが存在することを確認した。
（Ａ）材料及び方法
（Ａ−１）実験材料
標準品として用いたoleoyl-cPA(有機合成品)は、Kobayashi, S.,他: Tetrahedron Lett., 34, 4047-4050(1993)に記載の方法に準じて有機合成した。ウシ脳は東京芝浦臓器株式会社より購入した。
（Ａ−２）ウシ脳からの脂質成分の抽出
ウシの大脳を出発材料として、cPAの存在を確かめた。図３にその手順をまとめた。すなわち、ウシ大脳の一部40gに、水160ml、クロロホルム・メタノール混液(2：1)800mlを加え、ホモジナイズした後、分液漏斗に移し、撹拌後室温で静置した後、下層(クロロホルム層)を分取し、残りの上・中間層をクロロホルム・メタノール混液(17：3)(v/v)560mlで4回抽出し、下層を分取した。その後、上・中間層にメタノール80ml、１Mクエン酸を加えて、pHを約3に合わせ、そのまま撹拌しながら30分間放置した。さらに、クロロホルム・メタノール混液(17：3)560mlを加え、3回抽出し、下層を分取した。得られたクロロホルム層をすべて合わせ、pH7になるようにクロロホルム・メタノール・3％アンモニア水(6：5：1)で中和した後、窒素エバポレーターで乾固させた。この抽出物をクロロホルム・メタノール混液(1：1)に再懸濁し、脂質画分として以下の精製に用いた。
【００５０】
（Ａ−３）薄層クロマトグラフィー（TLC）による精製
ウシ大脳由来の脂質抽出物を、次の展開溶媒系を用いた薄層クロマトグラフィーによって順次分離した（図４）。分離にはシリカゲル60 TLCプレート(E. Merck No.5745；E. Merck社製)を用いた。
I：クロロホルム／メタノール／７Mアンモニア水(12：12：1)(v/v)
II：クロロホルム／メタノール／酢酸／水(25：15：4：2)(v/v)
【００５１】
スタンダードとして、有機合成したoleoyl-cPAをプレートの端にのせ、展開後スタンダード部分のみをリン特異的呈色試薬であるディットマー（Dittmer）試薬で発色させた。抽出物をのせた部分のプレートについて、スタンダードのRf値に相当する領域をかきとった。シリカ粉末から脂質をクロロホルム・メタノール混液(1：2)、(1：1)、(2：1)の順でそれぞれの溶媒を用いて2回ずつ抽出した。抽出溶液を合わせて、窒素ガスで溶媒を除去した。これをクロロホルム・メタノール(1：1)に再懸濁し、シリカゲルを除いた後、この精製標品を次の展開溶媒を用いた二次元TLCで分析した。分離にはシリカゲル60 TLCプレート(E.Merck No.5721；E.Merck社製)を用いた。
III：クロロホルム／メタノール／水(60：40：9)
IV：クロロホルム／メタノール／酢酸／アセトン／水(10：2：2：4：1)
プレート上の脂質の呈色には、脂質全般を発色するプリムリン試薬を噴霧した後、UVランプで蛍光スポットを検出し、鉛筆で印をつけた。その後、ディットマー試薬を噴霧してリン脂質を含むスポットを検出し、定量した。
【００５２】
（Ｂ）結果
精製は湿重量40gのウシ大脳より開始した。クロロホルム・メタノール混液で抽出を繰り返したところ、6.95g相当の粗脂質画分が抽出された。この抽出物1gをクロロホルム・メタノール混液(1：1)2mlに溶解後、その1mlを厚さ2mmのTLCプレートにスポットした。TLCは、上記展開溶媒系I、IIを順次用いて、それぞれRf値が0.80〜0.98、0.74〜0.85の範囲をかきとった。この部分精製サンプルを、上記展開溶媒系III、IVを用いて二次元TLCで分析したところ、スタンダードcPAと同一のRf値を示すスポットが確認された（図５(a)）。
次に、上記展開溶媒系IIIを用いたTLCによって、リン脂質特異的呈色試薬であるディットマー試薬による発色を、既知量のスタンダードcPAを用いて作成した標準曲線と比較することによって、抽出物中に含まれるcPAの濃度を決定した（図５(b)）。以上のcPAの量を概算すると、湿重量40gのウシ大脳から、約2.1mgのcPAが精製されたことになる。
【００５３】
（Ｃ）まとめ
一般に、脂質は哺乳動物の脳湿重量の5〜15%、乾燥重量の65%を占め、脳は脂質を最も多く含む臓器の一つであると言える。実施例２では、40gのウシ大脳から約7gの総脂質が抽出された。さらに、最終的には約2.1mgのcPA相当の脂質が検出された。精製途中でのロスを考えても、これは、脳中の全脂質重量の0.1%以下に相当する値である。ラット脳中の主要なリン脂質であるホスファチジルエタノールアミン（PE）やホスファチジルコリン（PC）の総脂質に対する割合がそれぞれ約20%であることを考えると、cPAはこれらの約１／２００以下に相当する微量な成分であるが、哺乳動物の脳中にcPAが存在することが証明された。
【００５４】
実施例３：ラット胎児脳由来の初代培養系神経細胞に対する環状ホスファチジン酸の作用（生存率と神経突起への影響）
実施例３では、ラット胎児脳由来の初代培養系を用いてcPAが神経細胞の生存や神経突起の形成に及ぼす影響について解析した結果、cPAの新規な生理活性として、神経細胞への作用（神経細胞の生存率の向上及び神経突起の伸長促進）が実証された。
【００５５】
（Ａ）材料及び方法
（Ａ−１）ラット胎児脳海馬由来の初代培養神経細胞の調製と培養
材料として妊娠16日齢のスプラグ−ドーレイ系ラットを用いた。ラットはエーテル麻酔をかけ、胎児を取り出し、実体顕微鏡下で脳全体を取り出した後、大脳皮質の内側にある海馬を摘出した。摘出した海馬を、15ml遠心用チューブに集め、2.5%トリプシン0.5mlに培養液を加えて5mlとし、これを37℃で15分インキュベートした。その後、3,000rpmで15分遠心後、上清を取り除き、培養液を5ml加えて、3,000rpmで15分遠心した。これをさらに2回繰り返し、3〜5mlの培養液を加え、パスツールピペットでピペッティングし、次に注射針(TERUMO NEEDLE(0.70x38mm)；テルモ社製)を用いてピペッティングした。最後にセルストレーナー(FALCON Cell Strainer 70μm；FALCON社製)に通して解離させた細胞を、プレートを用いて初代培養した。また、神経細胞が凝集を起こさないように培養できる培養液、プレートのコーティング方法を検討した。
なお、本試験に用いたcPA誘導体は、実施例１に記載した方法に従って、基質として、オレオイルLPCを使用し、酵素源として、放線菌A.sp.No.362由来のPLDを用いて合成したオレオイルcPAである。
【００５６】
（Ａ−２）神経細胞の生存率の測定
（Ａ−１）に記載した方法で初代培養を行い、プレートに細胞を播いたのと同時に、それぞれ異なる密度の神経細胞にオレオイルcPA(5μm)を添加し、一定時間後に位相差顕微鏡を用いて、写真を撮り(倍率20倍、24穴プレートの1ウェルにつき5枚の写真)、その写真上で細胞の生死を形態的に判別して生存率を算出した。
さらに、細胞生存率の上昇に最適なcPAの濃度を決定するために、神経細胞の生存率が最も高かった細胞密度(3.0×105細胞／cm2)で培養を行い、0.5、1.0、5.0または10.0μMのオレオイルcPAを細胞を播くのと同時に、細胞培養液に添加して同様に写真を撮り、その写真上で細胞の生死を判別した。
【００５７】
（Ａ−３）神経突起伸長の測定
神経突起の伸長に対するcPAの影響を調べるために、（Ａ−１）に記載した方法で初代培養を行い、培養を始めてから12、18、24時間後に写真を撮り、それぞれの時間における細胞一個あたりの神経突起の平均長、および、神経突起を持つ細胞の数を画像解析ソフト（NIH Image 1.62）を用いて解析した。
【００５８】
（Ａ−４）細胞内シグナル伝達系の解析
ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）の阻害剤である、ウォルトマンニン（Wortmannin；Sigma社製)とLY294002（Sigma社製）をそれぞれ10mM、50mMの濃度でDMSOに溶解後、PBSで希釈し、それぞれ最終濃度30nM、10μMになるように細胞培養液に添加した。阻害剤は、cPAを加える2時間前に細胞培養液に添加し、前処理を行った。cPAの添加後48時間経た時点での細胞の写真を撮り、その写真上で細胞の生死を形態的に判別して生存率を算出した。
【００５９】
（Ｂ）結果
（Ｂ−１）神経細胞初代培養条件に関する実験系の確立
予備実験として、様々な培養条件を検討し、神経細胞がプレートに接着するコーティング、培養液で実験した結果、培養液はハムのF-12(Ham's F-12)、プレートのコーティングはポリ−Ｌ−リジン（Poly-L-lysine）またはポリ−Ｌ−オルニチン（Poly-L-ornithine）が適していたので、以後、ポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたプレート（IWAKI MICROPLATE；IWAKI社製）を用いた。また、血清中にはcPAやLPAがすでに存在している可能性があるため、無血清培地を用いた。なお、血清の代わりに、増殖促進因子（無血清培養補助因子）としてN1サプリメント(インシュリン5μg／ml、トランスフェリン5μg／ml、プロゲステロン20nM、プトレシン100μM、亜セリン酸ナトリウム30nMを含む；Sigma社製)を添加した。
【００６０】
（Ｂ−２）ラット胎児海馬由来の初代培養神経細胞の生存率に対するcPAの作用
まず、5μMのオレオイルcPAを上記（Ｂ−１）に記載した培養条件下の神経細胞培養液に添加したところ、cPA無添加のコントロールに比べて、細胞の生存が良好となり、さらに神経突起の伸長も観察された。そのときの代表的な細胞を図６に示す。次に、細胞の密度と生存率の関係について、さらに詳細に解析を行った。まず、3.0×105、1.0×105、7.5×104、あるいは、5.0×104細胞／cm2の密度で細胞を播いて、48時間後の生存率を比較した結果、3.0×105細胞／cm2の細胞密度で播いた場合の細胞生存率が最も高かった（図７(a)）。
【００６１】
次に、細胞密度を4.5×105、あるいは6.0×105細胞/cm2に高めた結果、細胞の生存率は3.0×105 細胞/cm2の場合よりも低下した（図７(b)）。従って、cPAが最も効果的に細胞の生存率を高めるためには、3.0×105 細胞/cm2の細胞密度が適していることが明らかとなった。
次に、細胞生存率の上昇に最適なcPAの濃度を決定するために、細胞を播いた後、0.5、1.0、5.0、または10.0μMのcPAを培地に添加して生死を判別した。その結果、cPAの濃度が1.0μMの時に、細胞の生存に最も効果的であることが明らかとなった（図８及び図９）。
【００６２】
（Ｂ−３）神経突起の伸長に対するcPAの作用
5μMのオレオイルcPAを細胞培養液に添加し、24時間後、48時間後、72時間後に写真を撮って、画像解析ソフト（NIH Image 1.62）で解析し、細胞１個当たりの神経突起の平均長を解析した。その結果、cPA添加によって、24時間後ではコントロールに比べ、2倍の平均長が観察され、48時間後(1.5倍)や72時間後(1.2倍)に比べて、効果が最も強く現れた（図１０(a)）。そこで、より早い時間で、cPAの神経突起伸長に関する作用を評価する必要があると考え、12時間、18時間、24時間後の神経突起伸長に対する、各濃度のcPAの影響を調べた。その結果、cPA濃度1.0μMを添加したものの神経突起の伸びが、12時間後の時点で、コントロールの約1.7倍になり、最大値を示した（図１０(b)）。この値は、50ng/ml（最適濃度）のNGF添加に匹敵する値であった。
【００６３】
初代培養系において、神経突起はすべての神経細胞に満遍なく存在するのではなく、突起を有する細胞とそうでない細胞が混在する。そこで、神経突起を持つ細胞の割合についてもcPAの効果を解析したところ、24時間後では、cPA濃度1.0μMを添加したものにおいて、神経突起を有する細胞の割合が高かった。これは、NGF添加時と比較しても高い値であった（図１１及び図１２）。
【００６４】
（Ｂ−４）cPAによる生存率上昇における細胞内シグナル伝達系の解析
ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）の阻害剤である、ウォルトマンニン、あるいはLY294002をそれぞれ培地に添加し、ウォルトマンニンによって生存率がコントロールレベル近くまで低下した。また、LY294002の場合は、コントロール値以下の低い生存率を示した。細胞はつぶれて、変形したものが多かった。これはLY294002ｎによる細胞毒性が現れた結果とも考えられる。
以上の結果から、cPAによる生存率上昇作用において、PI3Kの活性を介した細胞内シグナル伝達系が関与していることが示唆された（図１３）。
【００６５】
（Ｃ）まとめ
上記結果より、cPAは1.0μMの濃度においてラット海馬初代培養神経系細胞の生存率を向上させ、また神経突起の伸長を促進することが明らかとなった。今回の試験では、特に、cPAの長期作用として神経細胞伸長作用があることが明らかになり、cPAは長期的には神経細胞の分化を促進している可能性がある。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、一般式(I)で示されるcPA誘導体が、哺乳類の海馬由来の神経細胞の生存率を高め、神経突起の伸長を促進することが確認された。従って、本発明で用いる一般式(I)で示されるcPA誘導体が、痴呆、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン氏病、脳卒中、脳梗塞または頭部外傷などの神経障害治療剤として有用であることが明らかとなった。本発明によれば、神経細胞の生存率を高め、且つ、神経突起の伸長を促すことによって、脳神経細胞の死滅によって起こる種々の疾患の予防、治療、リハビリ等に非常に有効な神経障害治療剤及び予防剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ホスファチジン酸（ＰＡ）とリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の構造を示す図である。
【図２】図２は、リゾリン脂質の構造を示す図である。
【図３】図３は、ウシ大脳からの脂質成分の抽出法の概要を示す図である。
【図４】図４は、薄層クロマトグラフィー（TLC）によるcPAの精製法を示す図である。
【図５】図５は、ウシ大脳由来部分精製物のTLC分析結果を示す図である。
【図６】図６は、BSA、cPA又はNGFの添加48時間後の神経細胞の様子を示す図である。
【図７】図７は、cPAの神経細胞密度に対する影響を示すグラフである。
【図８】図８は、cPAの神経細胞の生存率に対する影響を示すグラフである。
【図９】図９は、細胞生存率の上昇に最適なcPA濃度を決定するためのデータとしての神経細胞を示す図である。
【図１０】図１０は、cPAの神経突起伸長に対する影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、cPA濃度と神経突起を有する細胞の割合を示すグラフである。
【図１２】図１２は、神経突起伸長とcPA濃度との関係を示す神経細胞の図である。
【図１３】図１３は、cPAによる生存率上昇作用に対するPI3K阻害剤の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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