(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸残基24−95、配列番号２のアミノ酸残基96-180または配列番号２のアミノ酸残基24−180からなる結合組織成長因子（CTGF）ポリペプチド断片。
【請求項２】
請求項１に記載のCTGFポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
線維増殖性障害を有する被験者において細胞外マトリックス合成および/またはコラーゲン合成を抑制するための医薬組成物の製造における請求項１に記載のCTGFポリペプチド断片に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項４】
線維増殖性障害を有する被験者において細胞外マトリックス合成および/またはコラーゲン合成を抑制するための医薬組成物の製造における請求項１に記載のCTGFポリペプチド断片をコードする核酸配列に結合するアンチセンス分子の使用。
【請求項５】
該線維増殖性障害が、腎線維症、硬皮症、肺線維症、肝線維症、関節炎、過形成性瘢痕、アテローム硬化症、糖尿病性腎症または糖尿病性網膜症、高血圧、腎障害、新脈管形成関連障害、皮膚線維症障害、および心臓血管障害からなる群から選ばれる、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸残基24−180からなる結合組織成長因子（CTGF)ポリペプチド断片の活性をモジュレートする薬剤または化合物の同定方法であって、
(a) 筋繊維芽細胞に試験薬剤または化合物および前記CTGFポリペプチド断片を、各成分が相互作用しうる条件下で接触させること、および、
(b) 薬剤または化合物の存在下での細胞の分化能を薬剤または化合物の不在下での細胞の分化能と比較し、細胞の分化能の差を前記CTGFポリペプチド断片の分化活性をモジュレートする薬剤または化合物同定の指標とすること、
を含む、上記方法。
【請求項７】
該モジュレーションが活性の抑制である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該モジュレーションが活性の促進である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸残基24−180からなる結合組織成長因子（CTGF)ポリペプチド断片の活性をモジュレートする薬剤または化合物の同定方法であって、
(a) 細胞に試験薬剤または化合物および前記CTGFポリペプチド断片を、各成分が相互作用しうる条件下で接触させること、および、
(b) 薬剤または化合物の存在下での前記CTGFポリペプチド断片が細胞外マトリックス産生を誘導する能力を薬剤または化合物の不在下での前記CTGFポリペプチド断片が細胞外マトリックス産生を誘導する能力と比較し、細胞外マトリックス産生の差を前記CTGFポリペプチド断片の活性をモジュレートする薬剤または化合物同定の指標とすること、
を含む、上記方法。
【請求項１０】
該モジュレーションが活性の抑制である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該モジュレーションが活性の促進である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
被験者において細胞外マトリックス合成および/またはコラーゲン合成を誘導するための医薬組成物の製造における配列番号２のアミノ酸残基24−180からなる結合組織成長因子（CTGF)ポリペプチド断片の使用。
【請求項１３】
該被験者が創傷治癒、骨修復または組織修復を必要とする被験者である、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に成長因子の分野に関し、特に結合組織成長因子（CTGF）の断片およびその使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
成長因子
成長因子とは、広い意味で、個体発生ならびに組織の形態および機能の維持の両方を制御する、多機能性、局所作用性、細胞内シグナル伝達性のポリペプチドとして定義することができる。多くの癌原遺伝子のタンパク質産物が成長因子および成長因子受容体として同定されている。
【０００３】
成長因子はターゲット細胞を刺激して、発生中の組織中で増殖、分化および組織化する。成長因子の作用は、細胞内でのシグナル伝達事象を刺激する特定の受容体への結合に依存する。成長因子の例として、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子ベータ（TGF-β）、トランスフォーミング成長因子アルファ（TGF-α）、表皮成長因子（EGF）、および結合組織成長因子（CTGF）が含まれる。これらの成長因子はそれぞれ、細胞を刺激して増殖させることが報告されている。
【０００４】
結合組織成長因子
CTGFはシステインに富む分子量約38kdの単量体ペプチドである。前述したように、CTGFは結合組織細胞に対するマイトジェン活性および走化性活性を持っている。CTGFは細胞により分泌され、特定の細胞受容体との相互作用において活性であると考えられている。CTGFは成長調節因子のファミリーのメンバーであり、該ファミリーは、例えば、マウス（fisp-12）およびヒトCTGF、Cyr61（マウス）、Cef10（ニワトリ）、ならびにNov（ニワトリ）が含まれる。配列の比較に基づいて、このファミリーのメンバーは典型的には以下： (1)結合に関わるインスリン様成長因子ドメイン、(2)複合体形成に関わるフォン・ビルブラント因子ドメイン、(3)おそらくマトリックス分子の結合に関わるトロンボスポンジンI型反復、および(4)マトリックスタンパク質中にみられ、受容体の結合に関わると仮定されるC-末端モジュール、のうちの少なくとも１つから構成されるモジュール型構造を有することが示唆された。
【０００５】
ヒトCTGF（hCTGF）のためのcDNAの配列は1047ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、だいたいヌクレオチド130に開始部位、およびだいたいヌクレオチド1177にTGA終止部位を持ち、349アミノ酸のペプチドをコードする。ヒトCTGFに対するcDNA配列は、米国特許第5,408,040号に既に開示されている。
【０００６】
CTGFオープンリーディングフレームは39個のシステイン残基を含むポリペプチドをコードし、複数の細胞内ジスルフィド結合を持つタンパク質であることを意味している。このペプチドのアミノ末端は分泌されるタンパク質を示す疎水性シグナル配列を含み、アミノ酸配列中のアスパラギン残基28および225に２つのN-結合グリコシル化部位がある。
【０００７】
CTGFの合成および分泌は、TGF-β、BMP-2およびおそらくTGF-βスーパーファミリーのタンパク質のその他のメンバーによって選択的に誘導されると考えられている。当技術分野で報告されているように、TGF-βはソフトアガー中で正常な線維芽細胞の成長を刺激することができるが、CTGFのみでは線維芽細胞中でこの特性を誘導することができない。しかし、CTGFの合成および作用は、TGF-βにとって足場非依存性線維芽細胞の増殖を刺激するのに不可欠であることが示されている。(例えば、Kothapalli et al., 1997, Cell Growth & Differentiation 8(1):61-68 および Boes et al., 1999, Endocrinology 140(4):1575-1580. 参照)。
【０００８】
生物学的活性に関して、現実に、CTGFは本来、分裂促進性(標的細胞を刺激して増殖させることができる)であると報告されている。また、CTGFは走化活性を有することが報告されている。病理学的には、全長CTGF分子は結合組織細胞の過形成および細胞外マトリックスの過剰沈着が存在する症状に関与していると報告されている。さらにCTGFは、血管内皮細胞の移動および増殖ならびに新生血管形成に関連する症状と関係していることが当技術分野において記述されている。これらの症状に関連する疾患および障害としては、例えば、皮膚および主要器官の線維症、癌、ならびに全身性硬化症、新脈管形成、アテローム硬化症、糖尿病性神経障害、および腎性高血圧のような関連する疾患および障害を含む。(例えば、Toshifumi et al., 1999, Journal of Cellular Physiology 18191:153-159; Shimo et al., 1999, Journal of Biochemistry 126(1): 137-145; Murphy et al., 1999, Journal of Biological Chemistry 274(9):5830-5834; Wenger et al., 1999, Oncogene 18(4): 1073-1080; Frzier et al., 1997, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29(1):153-161; Oemar et al., 1997, Circulation 95(4):831-839.を参照)。
【０００９】
CTGFはまた、創傷の治癒ならびに結合組織、骨、および軟骨の修復において有用であることが報告されている。この点において、CTGFは、骨粗鬆症、変形性関節症もしくは骨軟骨炎、関節炎、骨格障害、過形成性瘢痕、熱傷、血管過形成、または完全癒合のような障害における、骨、組織、あるいは軟骨形成の誘導物質として記載されている。（例えば、米国特許第5837258号；Ohnishi et al., 1998, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 30(11): 2411-2422; Nakanishi et al., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 234(1):206-210;Pawar et al., 1995, Journal of Cellular Physiology 165(3):556-565.を参照）。
【００１０】
要約すると、CTGFは多数の線維性および癌性の症状に深く関わっており、かつ創傷の治癒に寄与していると記載されている。結果として、当技術分野において、これらの様々な疾患および障害を治療するためにCTGFの活性をモジュレートする有用な方法を同定する必要がある。本発明に先立っては、CTGFの領域またはドメインが異なる生物学的活性のシグナリングに関与するという報告はなかった。さらに、本発明に先立っては、CTGFの特定の領域またはドメインの生物学的活性を抑制することによる、細胞増殖および/または細胞外マトリックスの過剰産生に関連する疾患および障害の治療に関する開示は全くなかった。
【００１１】
発明の概要
本発明は、例えば、コラーゲン合成および筋繊維芽細胞分化の誘導を包含する、細胞外マトリックスの沈積が関与するCTGFに関連する疾患、障害、または病気の治療のための新規の組成物および方法を提供する。具体的には、本発明の組成物は、CTGFのN末端領域を含むCTGF断片を含む。１態様において、本発明の断片は、少なくともエキソン２または３の一部、またはそれらによりコードされるポリペプチドを含み、Brigstockら（1997, J. Biol. Chem. 272(32): 20275-82）に開示されるCTGF断片ではなく、さらに細胞外マトリックスの合成を誘導する能力、例えば、限定するものではないが、コラーゲン誘導能および筋繊維芽細胞の分化能を有する。さらなる態様において、本発明の断片は、完全長CTGFタンパク質の約４分の１〜２分の１の長さを含む。
【００１２】
1態様においては、上述の活性を有する結合組織成長因子（CTGF）ポリペプチドの断片を提供する。本発明の断片は、少なくとも図３に示されるエキソン２によってコードされるアミノ酸配列を有するCTGFを含む。断片はまた、少なくとも図３に示されるエキソン３によってコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらに、本発明のCTGF断片は、少なくとも図３に示されるエキソン２およびエキソン３によってコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。また本発明は、そのような断片をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、本発明に開示されるCTGF断片を用いて、該CTGF断片の活性をモジュレートできる組成物を同定する方法を含む。かかる組成物は、細胞外マトリックスの正常な沈積（所望であればコラーゲン沈積など）を制御するために使用しうる。より具体的には、CTGF断片を用いて、例えば、コラーゲン沈積の正常な沈積および筋繊維芽細胞の分化を制御しうる組成物を同定することができる。かかる組成物は、本発明のCTGF断片の活性を阻害、抑制、または増強するために使用しうる。
【００１４】
請求項に係る発明の組成物はさらに、CTGFモジュレーター、例えば、抗体、アンチセンス分子、小分子、および本発明のCTGF断片の活性をモジュレートすることができる上記方法によって同定された他の化合物を含む。1態様においては、本発明は、CTGFまたはCTGF断片の活性を阻害または抑制するCTGFモジュレーターを提供する。本発明の他の態様においては、CTGFモジュレーターが、例えば、CTGF活性の誘導が望まれる適応症(例えば、創傷の治癒、組織修復、および骨修復)において、CTGFまたはCTGF断片の活性を増加させる。
【００１５】
本発明の他の態様においては、本発明の方法は、コラーゲン合成の操作が必要とされる疾患、障害、または病気を治療する必要のある患者に、単独で、または１種以上の化合物と組み合わせてCTGF断片のモジュレーターの有効量を投与することを含む。より具体的には、本発明の方法は、本発明のCTGF断片の活性をモジュレートすることができる化合物を利用して、コラーゲン合成をモジュレートし、その結果、線維症性などの過剰なコラーゲン合成に関連する疾患を治療することに関する。好ましくは、障害は真皮および主要器官の障害、ならびに瘢痕組織の過形成に関する障害である。
【００１６】
本発明はまた、本発明のCTGF断片を含む医薬組成物を提供する。係る組成物は、CTGF活性の増加が望まれる、創傷の治癒、骨および組織の修復において有用でありうる。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコール、細胞系、ベクター、および薬剤等に限定されるものではなく、それらは変更してもよいと理解される。また、本明細書中で使用される語句は、特定の実施形態を記述する目的のみで使用され、本発明の範囲を限定しようとするものではないと理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、特に他に明示しない限り、単数形の表示が複数形の表示を含む事を注意しなければならない。従って、例えば、「１つの抗体」と言う表示は、1つ以上の抗体および当業者に公知の同等物などを表すものである。
【００１８】
別に規定しない限り、本明細書中で使用される技術的・科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。好ましい方法、装置、および材料が記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書中で引用されている全ての参照文献は、参照により本明細書にそっくりそのまま組み入れる。
【００１９】
定義
本明細書中で使用される、語句「CTGF断片」とは、CTGFのN末端領域の少なくとも一部分を含む断片を意味する。1実施形態においては、該断片は全長CTGFのエキソン２または３のタンパク質の少なくとも一部分を含み、さらに細胞外マトリックスの合成を誘導する能力を有する。さらなる実施形態においては、該断片は全長CTGFタンパクの約1/4〜1/2の長さである。「コラーゲン合成の誘導能」とは、コラーゲン合成および筋繊維芽細胞の分化による細胞外マトリックスの形成を誘導する能力を意味する。CTGF断片は、天然源からの単離、合成製造、組換え遺伝子工学的手法、または当技術分野で利用可能な他の技法のいずれかにより得ることができる。
【００２０】
本明細書中で使用される、語句「N末端」とは、図３Ａおよび３Ｂで同定されているように、全長CTGF分子ののほぼ半分で開始するエキソン２およびエキソン３ドメインの少なくとも一部分を含む核酸配列、および、それによってコードされるアミノ酸配列を意味する。語句「エキソン２」とは、全長CTGF分子のほぼ半分で開始するN末端ドメインの核酸配列およびその対応するアミノ酸配列を意味する。語句「エキソン３」とは、全長CTGF分子のN末端ドメインの核酸配列およびそれによってコードされるポリペプチドを意味する。
【００２１】
本明細書中で使用される、語句「C末端」とは、図３Ａおよび３Ｂで同定されているように、全長CTGF分子のエキソン４およびエキソン５ドメインの少なくとも一部分を含む核酸配列、およびそれによりコードされるポリペプチドを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される、語句「障害」および「疾患」とは、CTGFの発現または活性に関連する症状を意味する。CTGFに関連する疾患、障害、および症状としては、限定するものではないが、外科手術または放射線治療を含む急性または反復性外傷による過剰創傷、硬皮症、ケロイド、および過形成性瘢痕を含む、腎臓、肺、肝臓、眼、心臓、および皮膚などの器官の線維症が挙げられる。CTGFの異常発現が、一般組織創傷、皮膚の腫瘍様増殖、および血管の持続的創傷に関連しており、これが血液運搬能力の損傷、高血圧、肥大症などをもたらす。また、血管内皮細胞の増殖または移動によって引き起こされる様々な疾患、例えば、皮膚線維腫、内皮細胞の異常発現に関連する症状、乳癌の線維形成、血管脂肪腫、および血管平滑筋腫を含む癌などがCTGFと関連している。他の関連する症状としては、アテローム硬化症および全身性硬化症、例えば、アテローム性動脈硬化プラーク、炎症性腹部疾患、クローン病、および新脈管形成、ならびにアテローム硬化症、関節炎、癌および他の症状において中心的役割をはたす他の増殖プロセス、緑内障に関わる新生血管形成、関節炎を含む疾患または創傷による炎症、腫瘍増殖転移、間質性疾患、皮膚疾患、慢性関節リウマチ炎を含む関節炎、動脈硬化症、糖尿病性腎症を含む糖尿病性疾患、高血圧、および他の腎障害、ならびに化学療法、放射線療法、透析、および同種移植片拒絶および移植拒絶反応から起こる線維症が挙げられる。
【００２３】
本明細書中において「線維増殖性」疾患とは、上記の疾患または障害のいずれかに限定するものではないが、例えば、腎線維症、硬皮症、肺線維症、関節炎、過形成性瘢痕、およびアテローム硬化症を含む。また、CTGF関連線維増殖性障害としては、糖尿病性腎症および網膜症、高血圧、他の腎障害、腫瘍形成に関連する血管に限定されない脈管形成関連障害、ならびにアテローム硬化症、関節炎および他の症状において中心的役割を果たす他の増殖性プロセス、例えば、皮膚、心臓、肺および腎臓などにおける線維症が挙げられる。一般的に、本明細書中では腎臓、肝臓、肺および心血管系に関連する重度の線維症が含まれる。心臓がポンプの作用をする能力に障害を与える、心臓発作につづく瘢痕組織形成を含む、線維症の例が多数存在する。糖尿病はしばしば腎臓における障害/瘢痕の原因となり、腎機能の進行性喪失を引き起こす。外科手術後ですら、瘢痕組織は内部器官の間に形成され、拘縮、痛み、およびある場合においては不妊を引き起こしうる。心臓、腎臓、肺、眼、および皮膚のような主要器官は、通常、他の疾患と関連している慢性的な瘢痕化を受けやすい。過形成性瘢痕（非悪性組織塊）は、熱傷および他の外傷が原因の線維症に共通の形態である。さらに、硬皮症、ケロイド、およびアテローム硬化症のような、多数の他の線維増殖性障害があり、これらはそれぞれ一般組織瘢痕、皮膚における腫瘍様増殖、または血液運搬能力に障害を与える血管の持続性瘢痕に関連している。線維性障害においてはCTGFが過剰発現されているので、このことは抗線維症の治療の開発のための非常に特定の標的となる。例えば、線維増殖性障害の治療において、小分子および中和抗体の使用によってCTGFは抑制されうる。「線維増殖性」とは上記病理学的事象のいずれかを意味し、細胞増殖に限定するべきでないと理解される。
【００２４】
「細胞外マトリックス(ECM)」とは、例えば、内皮細胞、上皮細胞、表皮細胞、および筋細胞を含む様々な細胞種によって合成され、該細胞を囲んでいる多成分組織である。ECMは主として、コラーゲンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンで形成される。さらに、ECMはフィブロネクチン、ビトロネクチン、硫酸コンドロイチンプロテオグリカン、およびより小さいタンパク質を含む。これらのマトリックスにおいては、ヘパラン硫酸プロテオグリカンのグリコサミノグリカン部との結合よって、増殖因子は封鎖されている。高イズロン酸および高硫酸化の「ヘパリン様」領域は、ヒト線維芽細胞のヘパラン硫酸のhFGF結合領域と関連している。(Turnbell, et al., J. Biol. Chem. 267(15) 10337-10341,1992)。しかし、細胞外マトリックスにおけるヘパラン硫酸の組成は十分には特性評価されていない。
【００２５】
本明細書中で使用される語句「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはこれらいずれかの断片、1本鎖もしくは２本鎖でもよく、かつセンス鎖もしくはアンチセンス鎖をも表しうる、ゲノム起源もしくは合成起源のDNAもしくはRNA、ペプチド核酸(PNA)、または天然起源もしくは合成起源の任意のDNA様もしくはRNA様物質を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列、またはこれらいずれかの断片、部分、またはサブユニット、および天然分子もしくは合成分子を意味する。
【００２７】
「ハイブリダイゼーション」は、それにより核酸鎖が塩基の対合で相補鎖と結合するプロセスを意味する。ハイブリダイゼーション反応は、対象の特定の配列が低濃度で存在するサンプルにおいてですら同定できるように高感度かつ選択的でありうる。適度にストリンジェントな条件が、例えばプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩またはホルムアミドの濃度により、またはハイブリダイゼーション温度により規定することができ、当技術分野で公知である。特に、塩濃度の減少、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリダイゼーション温度の上昇によって、ストリンジェンシーを増加させることができる。
【００２８】
例えば、高ストリンジェンシー条件では、、約37℃〜42℃で約50％ホルムアミドにおいてハイブリダイゼーションを起こすことができた。ストリンジェンシーを下げた条件においては、約30℃〜35℃で約35〜25％ホルムアミドにおいてハイブリダイゼーションを起こすことができた。特に、高いストリンジェンシー条件では、50%ホルムアミド、5X SSPE、0.3% SDS、切断および変性したサケ精子DNA200μg/ml中、42℃でハイブリダイゼーションを起こすことができた。上記のようにストリンジェンシーを下げた条件においては、35％ホルムアミド中、35℃という低下させた温度においてハイブリダイゼーションを起こすことができた。対象の核酸のプリン対ピリミジンの比率を計算することおよびそれに応じて温度を調節することにより、特定のストリンジェンシーレベルに対応する温度範囲をさらに狭めることができる。上記のような範囲および条件の変更は当技術分野で公知である。
【００２９】
「実質的なアミノ酸相同性」という用語は、特定の配列に対して、約75％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90〜95％の配列類似性を有する分子を意味する。「類似性％」または「同一性％」という成句は、2つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の比較において見出せる配列類似性または配列同一性の割合を意味する。類似性パーセントは、当技術分野で公知の方法により決定できる。
【００３０】
アミノ酸配列間の類似性パーセントは、例えばクラスター法を用いて計算できる（Higgins, D.G.およびP.M. Sharp, 1988, Gene 73:237-244を参照されたい）。クラスターアルゴリズムは、すべてのペア間の距離を調査することにより配列をクラスターに分類する。クラスターをペアごとに、その後グループとしてアライメントする。2つのアミノ酸配列（例えば、配列Aおよび配列B）間の類似性パーセントは、配列Aの長さから配列Aのギャップ残基の数を引き、配列Bのギャップ残基の数を引いた数で配列Aと配列B間の残基マッチ数の合計を割り、その値に100を掛けることにより計算できる。2つのアミノ酸配列間の相同性が低いまたは無いときのギャップは、類似性パーセントを決定するのに含まれない。類似性パーセントは、当技術分野で公知の他の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変えることにより計算できる。さらに類似性パーセントは、メガライン（MEGALIGN）プログラム（DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin)のようなプログラムを用いて電子的に計算できる。
【００３１】
「コラーゲンサブユニット」という用語は、単一の遺伝子によりコードされるコラーゲンタンパク質の1つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列、ならびに欠失誘導体、保存的置換体などを含めた、該配列の誘導体を意味する。
【００３２】
「融合タンパク質」は、異なったタンパク質由来のペプチド配列が、共に共有結合で連結されたタンパク質である。
【００３３】
「アンチセンス配列」は、標的配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な任意の配列である。アンチセンス配列は、DNA、RNAまたは、任意の核酸模倣体もしくは核酸類似体であり得る。「アンチセンス技術」という用語は、アンチセンス配列の標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを当てにした技術を意味する。
【００３４】
本明細書で用いる「機能的同等物」という用語は、CTGF断片に対する機能的な、または構造的な特徴を所有するタンパク質または核酸分子を意味する。CTGF断片の機能的同等物は、特定の機能を遂行するためのかかる修飾の必要性に依存した修飾を含んでいてもよい。「機能的同等物」という用語は、ある分子の断片、突然変異体、ハイブリッド体、変異体、類似体、または化学的誘導体を含むことを意図している。
【００３５】
ある分子が、通常はその分子の一部分でない付加的な化学部分を含んでいる場合、その分子は、別の分子の「化学的誘導体」と呼ばれる。かかる化学部分は、分子の溶解性、吸着、生物学的な半減期などを改良できる。あるいは、該化学部分は分子の毒性を低減したり、所望されない分子の副作用などを除去または弱めることができる。かかる作用を媒介することが可能な化学部分は、例えばGennaro, A.D. ed., 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton PAに開示されている。かかる化学部分の分子への結合方法は、当技術分野で公知である。
【００３６】
本明細書で用いる「変異体」という用語は、1つ以上のアミノ酸により改変されたアミノ酸配列を意味する。変異体は、置換されたアミノ酸が、類似の構造的または化学的特性を有する保存的変化（例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換）を有しうる。さらに稀であるが、変異体は、非保存的変化（例えば、グリシンのトリプトファンによる置換）を有しうる。類似したマイナーな変異としては、アミノ酸の欠失または挿入、またはその両方も含まれる。どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失できるかを決定することについてのガイダンスは、当技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウェア（DNASTAR Inc., Madison, WI)を用いて見出すことができる。
【００３７】
CTGF断片の作製方法
CTGFをコードする核酸配列
本発明によれば、米国特許第5,408,040号に記載されるCTGFをコードするヌクレオチド配列、またはその機能的同等物を用いて、全長タンパク質またはその機能的同等物の発現を指令する組換えDNA分子、あるいは所望のCTGF断片（例えば、少なくともCTGFのエキソン２またはエキソン３の部分を含む断片）をコードするヌクレオチド配列を適当な宿主細胞において生成させることができる。
【００３８】
あるいは、ストリンジェントな条件のもとでCTGF配列の部分にハイブリダイズするヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット解析およびノーザンブロット解析などに使用しうる。また別の方法で、CTGFをコードするDNA分子は、共有する構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを含んでなるハイブリダイゼーション方法により単離しうる。
【００３９】
遺伝子コードに固有の縮重のため、実質的なアミノ酸相同性または機能的に同等なアミノ酸配列のタンパク質をコードする他のDNA配列を単離し、本発明の実施においてCTGFまたはCTGF断片のクローニングおよび発現のために使用しうる。かかるDNA配列には、ストリンジェントな条件下にてヒトCTGF配列にハイブリダイズすることが可能なDNA配列が含まれる。
【００４０】
本発明に従って使用しうる改変されたDNA配列には、結果的に同一の遺伝子産物または機能的に同等な遺伝子産物をコードする配列を生じる種々のヌクレオチド残基の欠失、付加または置換が含まれる。遺伝子産物自体は、結果的に機能的に同等なタンパク質をもたらすサイレント変化を生じる、CTGF配列内でのアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有しうる。かかるアミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および/または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある；正に荷電したアミノ酸には、リシンおよびアルギニンがある；類似した親水性値を有する荷電してない極性ヘッド(head)基をもつアミノ酸には、以下のアミノ酸がある：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシン。
【００４１】
本発明のDNA配列は、該遺伝子産物のプロセシングおよび発現を変更する改変を含むがこれらに限定されない種々の目的のために、タンパク質配列を改変すべく遺伝子工学的に操作することができる。例えば、突然変異を、当技術分野で公知である技術（例えば、新しい制限部位の挿入などのための、部位特異的突然変異誘発）を用いて導入しうる。例えば、酵母のようなある発現系においては、宿主細胞が遺伝子産物を過剰にグリコシル化することがある。かかる発現系を用いる場合、いずれかのN-結合グリコシル化部位を除去するようにCTGFまたはCTGF断片コード配列を改変することが好ましいかもしれない。
【００４２】
CTGFまたはCTGF断片配列は、融合タンパク質をコードするように異種配列に連結させることができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングのためには、市販の抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラCTGFタンパク質をコードすることが、有効でありうる。また融合タンパク質は、CTGFまたはCTGF断片配列と異種タンパク質配列（例えば、PDGFに関連した成長因子をコードする配列）の間に切断部位を配置するように操作してもよい。その結果、CTGFまたはCTGF断片を異種部分から切り離すことができる。かかる方法は、当技術分野で公知である。
【００４３】
また、CTGFまたはCTGF断片のコード配列は、当技術分野で公知の化学的方法を用いて、その全体または一部を合成しうる（例えば、Caruthersら, 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; CreaおよびHorn, 1980, Nucleic Acids Res. 9(10):2331; MatteucciおよびCaruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719;および、ChowおよびKempe, 1981, Nucleic Acids Res. 9(12):2807-2817を参照されたい)。あるいは、タンパク質それ自体を、CTGFアミノ酸配列を全体的にまたは部分的に合成するための化学的方法を用いて生産することもできるだろう。例えば、ペプチドを固相法により合成し、樹脂から切断して分離用高性能液体クロマトグラフィーにより精製できる。例えば、Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. FreemanおよびCo., N.Y. pp. 50-60を参照されたい。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析または配列決定により確認しうる。例えば、エドマン（Edman）分解法については、Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49を参照されたい。
【００４４】
CTGFまたはCTGF断片の発現
生物学的に活性なCTGF断片を発現させるためには、全長タンパク質または上記の機能的同等物である、CTGF断片をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター）に挿入する。
【００４５】
より詳しくは、当業者に公知の方法を用いて、CTGFまたはCTGF断片配列および適当な転写/翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro組換えDNA法、合成法およびin vivo組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.、およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.に記載の技術を参照されたい。
【００４６】
多種の宿主-発現ベクター系を利用し、CTGFまたはCTGF断片コード配列を発現しうる。これらには、CTGFまたはCTGF断片コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；CTGFまたはCTGF断片コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）を含めた酵母；CTGFまたはCTGF断片コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；CTGFおよびCTGF断片コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV）を感染させた植物細胞系、またはCTGFおよびCTGF断片コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；またはDM染色体（double minute chromosome）において安定に増幅される（CHO/dhfr）または不安定に増幅される（例えば、マウス細胞系）、多数のCTGF DNAコピーを含有するように操作された細胞系を含めた、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヒト腫瘍細胞（HT-1080を含む））を感染させた動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「宿主-発現ベクター系」、より一般的には「宿主細胞」という用語が、宿主細胞または宿主-発現ベクター系のあらゆる子孫を含むことは言うまでもない。さらに、突然変異が複製の間に起こり得るので、すべての子孫が親細胞と同一というわけではないが、かかる子孫も、本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
【００４７】
これらの系の発現エレメントは、それらの強度および特異性がさまざまである。利用する宿主/ベクター系に応じて、構成プロモーターと誘導プロモーターを含めた多数の適当な転写および翻訳エレメントのいずれかを発現ベクター中で使用しうる。例えば、細菌系にクローニングする場合は、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などのような誘導プロモーターを使用しうる；昆虫細胞系にクローニングする場合は、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターのようなプロモーターを使用しうる；植物細胞系にクローニングする場合は、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCOの小サブユニットのためのプロモーター；クロロフィルa/b結合タンパク質のためのプロモーター）、または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、CaMVの35S RNAプロモーター；TMVのコートタンパク質プロモーター）を使用しうる；哺乳動物細胞系にクローニングする場合は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を使用しうる；多コピー数のCTGFまたはCTGF断片DNAを含有する細胞系を生成する場合は、SV40、BPVおよびEBVに基づいたベクターを適当な選択マーカーとともに使用しうる。
【００４８】
細菌系においては、発現させるCTGFまたはCTGF断片の意図した用途に応じて、幾つかの発現ベクターを好都合に選択しうる。例えば、細菌での発現に適したベクターには、T7に基づいたベクター（Rosenbergら, 1987, Gene 56: 125に記載されるように)が含まれる。別の例として、ぺブチドライブラリーをスクリーニングするために大量のCTGFまたはCTGF断片を産生させようとする場合は、容易に精製されるタンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましいかもしれない。かかるベクターには、大腸菌発現ベクター pUR278 (Rutherら, 1983, EMBO J. 2:1791)(このベクターでは、CTGFまたはCTGF断片コード配列を、lac Zコード領域と読み枠を合わせて該ベクターに連結することができ、その結果としてハイブリッドAS-lac Zタンパク質が産生される）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509);および同種のものが含まれるが、これらに限定されない。pGEXベクターもまた、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）を有するCTGFまたはCTGF断片のような外来ポリペプチドを発現させるために使用しうる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチオン存在下で溶出することにより、溶解した細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、したがって目的のクローン化ポリペプチドを、GST部分から放出させることができる。
【００４９】
より一般的には、宿主が原核細胞である場合、DNA取込み能のあるコンピテント細胞は、指数関数的増殖後に回収し、次いで当技術分野で公知の手法を用いてCaCl2法、あるいはMgCl2法またはRbCl法により処理した細胞から調製することができる。
【００５０】
宿主細胞が真核細胞である場合、種々のDNA導入方法を用いることができる。これらの方法には、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクションを含めた通常の機械的手法、リポソーム内に封入したプラスミドの挿入、またはウイルスベクターの使用によるDNAのトランスフェクションが含まれる。真核細胞はまた、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列、および選択可能な表現型をコードする第2の外来DNA分子（単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子など）で共形質転換しうる。別の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス40（SV40)またはウシパピローマウイルス）を用いて、真核細胞を一過性に感染または形質転換し、タンパク質を発現させることである(Eukaryotic Viral Vectors, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman編を参照されたい）。真核宿主細胞には、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞が含まれる。
【００５１】
酵母においては、構成プロモーター、または誘導プロモーターを含有する多数のベクターを使用しうる。概説として、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Vol.2, 1988, Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grantら, 1987, Methods in Enzymology, Wu & Grossman編, Acad. Press, N.Y., 153:516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol.II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger & Kimmel編, Acad. Press, N.Y., 152:673-684;およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Strathernら編, Cold Spring Harbor Press, Vols.IおよびIIを参照されたい。例えば、酵母において外来遺伝子を発現させるための種々のシャトルベクターが報告されている（Heinernannら, 1989, Nature 340:205; Roseら, 1987, Gene 60:237）。
【００５２】
植物発現ベクターを用いる場合には、CTGFまたはCTGF断片コード配列の発現を、多数のプロモーターのいずれかにより駆動しうる。例えば、CaMVの35S RNAおよび19S RNAプロモーター（Brissonら, 1984, Nature 310:511-514)、またはTMVのコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら, 1987, EMBO J. 6:307-311)のようなウイルスプロモーターを使用しうる；あるいはRUBISCOの小サブユニット(Coruzziら, 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglieら, 1984, Science 224:838-843);または熱ショックプロモーター（例えば、ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(Gurleyら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565))のような植物プロモーターを使用しうる。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的DNA形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて植物細胞に導入できる。かかる技術の概説として、例えばWeissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9を参照されたい。
【００５３】
昆虫細胞系においては、択一的発現系を用いて、CTGFまたはCTGF断片を発現させることができる。1つのかかる系において、外来遺伝子を発現させるためのベクターとしてバキュロウイルスを用いる。次いで、該ウイルスを昆虫細胞の中で増殖させる。CTGFまたはCTGF断片コード配列を該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）中にクローン化し、バキュロウイルスプロモーターの制御下に配置しうる。次いで、これらの組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、そこで挿入遺伝子を発現させる。例えば、Smithら, 1983, J. Virol. 46:584; Smith, 米国特許第4,215,051号を参照されたい。
【００５４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスに基づいた発現系を利用しうる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、CTGFまたはCTGF断片コード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三分節系（tripartite)リーダー配列）に連結しうる。さらに、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに、in vitroまたはin vivo組換えにより挿入しうる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）への挿入により、結果として感染宿主において生存可能で、CTGFまたはCTGF断片を発現することが可能である組換えウイルスが生じるであろう。例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659を参照されたい。あるいは、ワクシニア7.5Kプロモーターを使用しうる。例えば、Mackettら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackettら, 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicaliら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931を参照されたい。
【００５５】
別の実施形態においては、CTGFまたはCTGF断片配列を、リン酸カルシウム沈殿法およびネオマイシン耐性遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトしたヒト腫瘍細胞（例えば、HT-1080)で発現させる。また別の実施形態においては、pMSXND発現ベクターまたはその同種のものを、COS、BHK293およびCHO細胞を含めた多種の哺乳動物細胞における発現に用いる（LeeおよびNathans, 1988, J. Biol. Chem. 263:3521）。
【００５６】
特定の開始シグナルもまた、挿入したCTGFまたはCTGF断片コード配列の効率的な翻訳のために必要とされるかもしれない。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接した配列が含まれる。CTGF遺伝子全体（それ自身の開始コドンおよび隣接した配列を含む）を、適当な発現ベクターに挿入する場合、付加的な翻訳制御シグナルは必要とされないことがある。しかしながら、CTGFコード配列の一部のみを挿入する場合には、ATG開始コドンを含めた外因性の翻訳制御シグナルを供給しなければならない。さらになお、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、CTGFまたはCTGF断片コード配列の読み枠と合わせなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源の、天然のものでも合成のものでもよい。発現効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより高めることができる。例えば、Bitterら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照されたい。種々の分泌経路に沿ったCTGF断片の分泌を指令するために付加的配列（すなわち、リーダー配列など）を加えてもよい。これは、当技術分野で公知の種々の方法を用いて多数の発現系で達成できる。
【００５７】
加えて、挿入した配列の発現をモジュレートする、または所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択しうる。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要でありうる。さまざまな宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的でかつ特異的な機構を有する。適当な細胞系または宿主系は、発現する外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択しうる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保持する真核宿主細胞を使用しうる。かかる哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38、HT-1080などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
組換えタンパク質の長期間の高収量産生には、安定的な発現が好ましい。例えば、CTGFまたはCTGF断片を安定に発現する細胞系を遺伝子工学的に作製しうる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞は、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されたCTGFまたはCTGF断片DNAおよび選択マーカーを用いて形質転換できる。外来DNAの導入に続いて、遺伝子操作された細胞を1〜2日間、富化培地で増殖させ、その後該細胞を選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がその染色体中にプラスミドを安定的に組み込み、増殖して細胞増殖巣（その後細胞系へとクローン化し、増やすことができる）を形成することを可能にする。
【００５９】
多数の選択系を使用しうる。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 48:2026)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817)遺伝子を、それぞれtk-、hgprt-、またはaprt-細胞において使用できるが、これらの選択系に限定されない。
【００６０】
また、代謝拮抗物質耐性はメトトレキサートに対する耐性を与えるdhfr（Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:3567; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:1527); ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:2072); アミノグリコシドG418に対する耐性を与えるneo（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1);およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30:147）遺伝子を選択するための基として用いることができる。最近、付加的な選択遺伝子が記載されおり、すなわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol)を利用することを可能にするhisD（Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:8047);およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を与えるODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)（McConlogue, 1987, In Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory)である。
【００６１】
宿主細胞で発現した本発明のポリペプチドの単離および精製は、クロマトグラフィー分離および免疫学的分離（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を含んだもの）などの、どのような通常の手段で行ってもよい。
【００６２】
CTGFまたはCTGF断片を発現するトランスフェクトタントまたは形質転換体の同定
コード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一般的アプローチにより同定することができる。すなわち、(a)DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション；(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不在；(c)宿主細胞におけるCTGFまたはCTGF断片mRNA転写産物の発現により測定されるような転写レベルの評価；および(d)アッセイまたは遺伝子産物の生物学的活性により測定されるような遺伝子産物の検出である。
【００６３】
第1のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入されたCTGFまたはCTGF断片コード配列の存在は、それぞれCTGFまたはCTGF断片コード配列、またはその一部分もしくは誘導体に相同であるヌクレオチド配列からなるプローブを用いたDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションにより検出できる。
【００６４】
第2のアプローチにおいて、組換え発現ベクター/宿主系は、ある「マーカー」遺伝子機能（例えば、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または不在に基づいて同定および選択できる。例えば、好ましい実施形態においては、CTGFコード配列をベクターのネオマイシン耐性マーカー遺伝子配列の内部に挿入し、CTGFコード配列を含有する組換え体を該マーカー遺伝子機能の不在により同定できる。あるいは、マーカー遺伝子を、CTGFコード配列の発現を制御するために用いたプロモーターと同じまたは異なるプロモーターの制御下にて該CTGF配列とタンデムに配置できる。誘導または選択に応答するマーカーの発現が、CTGFコード配列の発現を示す。
【００６５】
第3のアプローチにおいては、CTGFまたはCTGF断片コード領域の転写活性を、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価できる。例えば、CTGFまたはCTGF断片コード配列、またはその特定の部分に相同なプローブを用いたノーザンブロットによりRNAを単離および解析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し、かかるプローブに対するハイブリダイゼーションについてアッセイしうる。
【００６６】
第4のアプローチは、生物学的に活性な、または免疫学的に反応性のCTGFまたはCTGF断片遺伝子産物の検出を含む。米国特許第5,408,040号に記載のアッセイを含めた多数のアッセイを用いて、CTGF活性を検出できるが、これらに限定されない。
【００６７】
CTGF断片を生成するための全長CTGFタンパク質の切断
全長CTGFタンパク質の発現に続いて、該タンパク質を当業者に公知である任意のタンパク質分解酵素により切断することで、結果として本発明のCTGF断片を生じうる。例えば、CTGFのN末端側の半分とC末端側の半分の間のシステインフリーの架橋は、当技術分野で利用できる方法を用いるキモトリプシン分解に感受性である。
【００６８】
CTGF断片の活性をモジュレートおよび阻害する方法
上記の通り、本発明に記載のCTGF断片は、線維症の症状における細胞外マトリックス沈着の重要な決定因子である。本発明は、該断片の活性および／または発現を調節、モジュレートおよび／または阻害することにより、あるいは望ましい場合には該断片の活性を増大させることにより、該断片に関連する合併症を予防および治療する方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、CTGFの発現および活性に関連する疾患または障害の治療、予防または改善が望まれる場合の、CTGFのN末端断片の細胞外マトリックス産生活性を調節、モジュレートおよび／または阻害する薬剤の治療上有効な量の投与を提供する。
【００６９】
抗体
本発明のある実施形態においては、本発明の方法は、本発明のCTGF断片と特異的に反応する抗体の治療上有効な量の投与を必要とする。CTGFと特異的に反応する抗体は米国特許第5,783,187号およびPCT公開WO 9638172に記載されている。CTGF抗体は当技術分野で公知の方法を使って作製することができる。このような抗体は、限定されるものでないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、1本鎖抗体、ならびにF(ab')2およびFvフラグメントなどのFabフラグメントを含む。フラグメントは、例えば、Fab発現ライブラリーから生産することができる。中和抗体、すなわち２量体形成を阻害する抗体は、特に治療用途に好ましい。
【００７０】
CTGFまたはCTGFの活性および／もしくは発現をモジュレートする薬剤などの標的ポリペプチドを、免疫原性が高い領域を決定するために評価することができる。分析方法およびエピトープ選択方法は当技術分野で公知である。例えば、Ausubelら編、1988, Current Protocols in Molecular Biologyを参照のこと。分析および選択は、例えば、LASERGENE NAVIGATORソフトウエア（DNASTAR; Madison WI）などの種々のソフトウエアパッケージにより達成し得る。抗体を誘導するために使用するペプチドまたは断片は、抗原性であるべきだが、必ずしも生物学的に活性である必要はない。好ましくは、抗原性断片またはペプチドは少なくとも5アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも10アミノ酸長であり、最も好ましくは少なくとも15アミノ酸長である。抗体を誘導する断片またはペプチドは、標的ポリペプチド（例えば、CTGF）のアミノ酸配列の少なくとも一部分と同一であることが好ましい。また、天然に存在する標的ポリペプチドの配列の少なくとも一部分を模倣するペプチドまたは断片を、他のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）と融合させ、そしてそのキメラ分子に対して抗体を産生させることもできる。
【００７１】
抗体の作製方法は当技術分野で公知である。例えば、種々の宿主（ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなど）を、標的ポリペプチドまたは任意のその免疫原性断片もしくはペプチドの注射により免疫することができる。宿主の種に応じて種々のアジュバントを使用し、免疫応答を高めることができる。かかるアジュバントには、限定するものではないが、フロイントアジュバント、無機ゲル（水酸化アルミニウムなど）、ならびに界面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、KLHおよびジニトロフェノールなど）が含まれる。ヒトに使用するアジュバントの中では、BCG（カルメット−ゲラン杆菌(bacilli Calmette-Guerin)）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【００７２】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、培養物中の連続細胞系により抗体分子を産生させる任意の技術を用いて調製し得る。in vivoおよびin vitro産生の技術は当技術分野で公知である。例えば、Pound, J.D., 1998, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ；Harlow, E.およびD. Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照のこと。一本鎖抗体の産生と同様に、キメラ抗体の産生も公知である。例えば、Morrison, S.L.ら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855；Neuberger, M.S.ら, 1984, Nature 312: 604-608；Takeda, S.ら, 1985 Nature 314: 452-454を参照のこと。関連する特異性を有する一方でイディオタイプ構成が異なる抗体は、例えば、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからのチェーンシャフリング法により作製し得る。例えば、Burton D.R., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-11123を参照のこと。
【００７３】
また抗体は、リンパ球集団においてin vivo産生を誘導したり、または免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより産生させてもよい。例えば、Orlandi, R.ら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837；Winter, G.およびC. Milstein, 1991, Nature 349: 293-299を参照のこと。標的ポリペプチドに特異的な結合部位を含有する抗体フラグメントも作製し得る。かかる抗体フラグメントには、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化により生成され得るF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るFabフラグメントが含まれる。あるいはFab発現ライブラリーを、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定が可能となるように構築してもよい。例えば、Huse, W.D.ら, 1989 Science 254: 1275-1281を参照のこと。
【００７４】
抗体は、当技術分野に公知の種々の方法を用いて抗標的ポリペプチド活性について試験し得る。スクリーニングのために種々の技術を使用して、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。該技術には、種々のイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（直接およびリガンド捕捉ELISAなど）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、イムノブロッティング、および蛍光活性化セルソーティング（FACS）が含まれる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いた競合結合アッセイまたはイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコルが当技術分野で公知である。例えば、HarlowおよびLaneを参照のこと。かかるイムノアッセイには、標的ポリペプチドと特異的抗体との複合体形成の測定が典型的には含まれる。標的ポリペプチド上の2種の非干渉エピトープに対して反応性を有するモノクローナル抗体を利用するモノクローナル抗体に基づく2部位イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイなどの他のアッセイもまた使用し得る。例えば、Maddox, D.E.ら、1983, J Exp Med 158: 1211を参照のこと。
【００７５】
本発明は、本発明のCTGF断片の生物学的活性を中和する、CTGFポリペプチドまたはその断片と特異的に反応する抗体の使用を意図する。本発明の方法において投与される抗体は、無傷の抗体、またはエピトープ決定基と結合する能力のある、Fab、F(ab')2およびFvフラグメントなどの抗原結合フラグメントでありうる。該方法において使用する抗体はポリクローナル抗体であるか、またはより好ましくはモノクローナル抗体でありうる。異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の方法により、タンパク質の断片を含有する抗原から作製する。例えば、Kohlerら、Nature 256: 494；Ausubelら、前掲を参照のこと。
【００７６】
本発明において、治療用途には、CTGFまたはその断片に対する「ヒト」または「ヒト化」抗体の使用が含まれる。ヒト化抗体とは、親抗体（すなわち、典型的にはマウス起源）と同じ結合特異性を有し、かつヒト特性が高められた抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体は、例えば、チェーンシャフリング法により、またはファージディスプレイ技術を用いて得ることができる。例えば、CTGFに特異的な非ヒト抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを、ヒト補体（軽もしくは重）鎖可変ドメインのレパートリーと結合させる。目的の抗原に特異的なハイブリッド対合を選択する。続いて選択した対合からのヒトの鎖を、ヒト補体可変ドメイン（重もしくは軽）のレパートリーと結合させ、そしてヒト化抗体ポリペプチド二量体を、抗原に対する結合特異性について選択し得る。本発明の方法に使用し得るヒト化抗体の作製について記載された技術は、例えば、米国特許第5,565,332号、第5,585,089号、第5,694,761号、および第5,693,762号に開示されている。さらに、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の産生について記載された技術は、例えば、米国特許第5,545,806号および第5,569,825号に記載されている。
【００７７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、CTGFメッセージ、特定的には全長CTGF（次いで該全長タンパク質が切断されて本発明のCTGF断片を形成する）またはCTGF断片のメッセージ（集合的に「CTGF mRNA」と呼ぶ）のタンパク質への翻訳を直接妨害する治療手法を提供する。さらに特定的には、本発明は、アンチセンス核酸またはリボザイムを使ってCTGF mRNAと結合するまたは切断する方法を提供する。アンチセンスRNAまたはDNA分子は標的遺伝子のRNAメッセージと特異的に結合し、該遺伝子のタンパク質産物の発現を妨害する。上記アンチセンス分子はメッセンジャーRNAと結合し、細胞が翻訳できない2本鎖分子を形成する。さらに、鉄結合エチレンジアミン四酢酸（EDTA-Fe）のような化学反応基をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、ハイブリダイゼーション部位におけるRNAの切断をもたらし得る。遺伝子の翻訳を阻害するアンチセンス方法のこれらおよび他の使用は当技術分野で公知である。例えば、Marcu-Sakura, 1988, Anal. Biochem 177:278を参照すること。
【００７８】
さらに具体的には、本発明のある実施形態においては、CTGF mRNAの発現を阻害するのに有用なアンチセンスポリヌクレオチドの配列は、オルソロガス（orthologous）遺伝子の配列（種間で保存されている配列）、またはオルソロガス遺伝子の転写産物を比較し、それらの配列内に高度に保存された領域を同定することによって取得することができる。核酸配列の類似性は、当技術分野で公知の方法およびアルゴリズムにより決定してもよい。そのような方法とアルゴリズムは、例えば、BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool；国立生物学情報センターの基本的局所アライメント検索ツール）、ALIGN、AMAS（Analysis of Multiple Aligned Sequences（複数アライメント配列の解析））、およびAMPS（Protein Multiple Sequence Alignment（タンパク質複数配列アライメント））が挙げられる。
【００７９】
所与のポリヌクレオチドの好適な長さを選択するにあたり、最大の有利な特性を達成するために種々の要因を考慮すべきである。ある態様においては、本発明のポリヌクレオチドは長さで少なくとも15塩基対（bp）の長さであり、好ましくは約15〜約100 bp長である。さらに好ましくは、該ポリヌクレオチドは約15〜約80 bp長であり、それよりさらに好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは約15〜約60 bp長である。それより短い10-merから15-mer未満のポリヌクレオチドは、より高い細胞侵入を提供するが、より低い遺伝子特異性を有する。逆に、より長い20〜約30 bpのポリヌクレオチドは、より優れた特異性を与えるものの、細胞中への取込み速度の低下を示す。Stein ら, "Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression," Cohen編., McMillan Press, London (1988)を参照すること。転写RNA標的配列への接近可能性も重要であり、従って、標的RNAのループ形成領域とオルソロガス配列は有望な標的を与える。本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」は、DNAおよびRNAのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造などの天然に見出されるタイプのオリゴマー核酸部分と、天然に見出される核酸に結合しうる人造の類似体との両方を含む。本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により連結されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、またはメチルホスホネート、ホスホロチオネートまたは他の結合により連結された類似体に基づくことができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、改変した塩基構造または他の修飾を有するモノマー部分を含むが、依然として天然の転写産物RNA構造体と結合する能力を保持するものでありうる。このようなポリヌクレオチドは当技術分野で公知の方法、例えば、Perkin-Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA)から市販されているような機械と試薬を使って調製することができる。例えば、標的転写産物に特異的なポリヌクレオチドは、標準方法により合成される。ホスホロチオネートで改変したDNAポリヌクレオチドは、典型的には様々な製造業者から入手可能である自動DNA合成機で合成される。これらの機器は、100ヌクレオチドに匹敵する長さのポリヌクレオチドをナノモル量で合成する能力がある。最近の機器により合成したより短いポリヌクレオチドは、それ以上精製することなく使用するのに適している場合が多い。もし必要であれば、ポリヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動または逆相クロマトグラフィーにより精製してもよい。Sambrookら., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Chapter 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)を参照すること。
【００８０】
ホスホジエステル結合型のポリヌクレオチドは、血清中または細胞内のヌクレアーゼの作用を特に受け易く、従って、好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性であることが分かっているホスホチオネートまたはメチルホスホネート結合型の類似体である。当業者であれば、本発明に使う他の結合を容易に選択することができる。これらの改変はまた、該ポリヌクレオチドの細胞取込みおよび安定性を改善するように設計してもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチドの投与に適した担体としては、例えば、ベクター、抗体、薬理学的組成物、結合もしくはホーミングタンパク質、または標的細胞もしくは組織中への配列を富化するウイルス送達系が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、内皮細胞または腫瘍細胞を認識する結合タンパク質と結合させることができる。投与後、本発明のポリヌクレオチドは、レシピエント細胞または組織にターゲティングされ、例えば、サイトカイン、転写因子、Ｇタンパク質共役型受容体、腫瘍サプレッサータンパク質、およびアポトーシス開始タンパク質の発現強化が起こるようにすることができる。
【００８２】
アンチセンス分子などの送達は、キメラウイルスまたはコロイド分散系のような組換え発現ベクターを使って達成することができる。本明細書に教示するような遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、好ましくはレトロウイルスのようなRNAウイルスが挙げられる。いくつかの公知のレトロウイルスは、選択マーカーの遺伝子を導入または組み込むことができ、その結果形質導入された細胞を同定しかつ作製することできる。目的のポリヌクレオチド配列を、例えば、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする他の遺伝子と一緒にウイルスベクター中に挿入すると、そのベクターは標的特異性となる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異性とすることができる。好ましいターゲティングは、抗体を用いてレトロウイルスベクターをターゲティングすることにより達成し得る。当業者であれば、レトロウイルスゲノム中に挿入可能で、該アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの特異的送達をターゲティングさせ得る特定のポリヌクレオチド配列を理解しているか、または過度の実験を行うことなく容易に確かめることができる。
【００８３】
組換えレトロウイルスは複製欠陥を有し、感染性ベクター粒子を産生するためには補助が必要である。これらの補助は、例えば、LTR内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を使うことにより提供され得る。これらのプラスミドは、パッケージング機構がキャプシド化のためのRNA転写産物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠失している。パッケージングシグナルが欠失しているヘルパー細胞系には、限定するものでないが、Ψ2、PA317およびPA12が含まれる。これらの細胞系は、ゲノムがパッケージングされないので、空ビリオンを産生する。パッケージングシグナルは損なわれていないが構造遺伝子が目的の他の遺伝子により置換されている細胞にレトロウイルスベクターが導入されると、該ベクターはパッケージングされ、ベクタービリオンが産生され得る。
【００８４】
あるいは、NIH3T3または他の組織培養細胞を、通常のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトすることができる。続いて、これらの細胞を、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドを用いてトランスフェクトする。得られる細胞はそのレトロウイルスベクターを培地中に放出する。
【００８５】
アンチセンス分子のための他の標的送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質に基づく系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは人工膜小胞であり、in vivoおよびin vitro送達系として有用である。サイズが0.2〜4.0μmの範囲の大きな単ラメラ小胞（LUV）は巨大分子を含有する水性バッファーを相当な割合で封入することができる。RNA、DNAおよび無傷ビリオンを水性内部に封入することができ、生物学的活性のある形態で細胞に送達することができる。リポソームが有効な遺伝子導入ビヒクルであるためには、次の特性をもたなければならない：(1)目的の遺伝子を高効率で封入するが、生物学的活性を損なわないこと；(2)非標的細胞に比較して標的細胞と優先的かつ実質的に結合すること；(3)小胞の水性含有物を高効率で標的細胞の細胞質へ送達すること；および(4)遺伝子情報を正確かつ効率よく発現すること。
【００８６】
小分子インヒビター
本発明はさらに、本発明のCTGF断片の活性を阻害する小分子を同定しかつ利用する方法を提供する。
【００８７】
CTGF断片活性を阻害する小分子の同定は、種々のスクリーニング技術により実施することができる。該化合物をスクリーニングするためのアッセイは、該化合物とタンパク質または細胞標的との結合に関連する検出可能なシグナルを提供するであろう。アッセイの性質に依って、検出可能なシグナルは光吸収もしくは放出、プラーク形成、または他の適当なシグナルであってもよい。検出結果は定性的でも定量的であってもよい。
【００８８】
特異的な結合により化合物をスクリーニングするために、細胞に結合したヒト（または霊長類動物）抗体を検出するための種々のイムノアッセイを利用し得る。従って、標識抗hIg、例えば抗hIgM、hIgGまたはそれらの組み合わせを使用して、特異的に結合したガラクトシルエピトープのヒト抗体を検出し得る。放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤、粒子などの種々の標識を使用し得る。標識抗hIgを提供する数多くの市販のキットがあり、製造業者のプロトコールに従って使用し得る。
【００８９】
化合物のライブラリーをスクリーニングするために種々のプロトコルを使用し得る。適当なプロトコルの選択は、ある程度までは化合物の調製物の性質に依存する。例えば、化合物を個々の粒子、ピン、膜などに結合させ、それぞれの化合物を分離可能なものとする。さらに、利用可能な化合物の量は、ライブラリーを作製するために使用する方法に依存して変化する。さらにまた、化合物の支持体への結合の性質に応じて、化合物の一部を放出させることができ、一連のアッセイを実施し得る。さらに、化合物をアッセイする方法は、活性を示す化合物を同定する能力により影響を受ける。
【００９０】
化合物がグリッド状に個々に表面上に存在し、グリッドのそれぞれの部位にある化合物が何であるかが分かっている場合には、グリッドとして同様に構成され、固体表面に結合させた化合物についての記録通りに配置された細胞ローン（cellular lawn）を提供し得る。一旦、該ローンおよび固体基質が記録通りにおかれると、化合物を結合させた方法に従って表面から化合物を放出させ得る。該化合物が細胞表面上のタンパク質と結合するのに十分な時間をおいた後、細胞ローンを洗浄して非特異的に結合した化合物を除去し得る。1回以上の洗浄を行い得るが、洗浄は所望の親和性の程度に応じて様々な度合のストリンジェンシーを提供し得る。洗浄が完了した後、哺乳動物血液または血漿を添加し、細胞毒性に十分な時間インキュベートし得る。次に該血漿または血液を除去し、プラークを観察して、化合物の性質をグリッドの位置により決定し得る。勿論、該血漿または血液は、ローンの細胞を天然に殺傷し得るいかなる成分も含有させないようにすべきである。
【００９１】
調製工程は反復して行い得るので、同じ化合物を比較可能な部位に調製して多数の固体基質を調整することができ、同じかまたは異なる細胞を用いてスクリーニングを反復して行い、個々の化合物の活性を決定し得る。
【００９２】
いくつかの例においては、化合物のアイデンティティを、核酸タグの増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該タグにより決定し得る。例えば、PCT公開WO93/20242号を参照のこと。この例においては、活性のある化合物は、その溶解物を取得し、該溶解物を核酸タグに特異的なプライマーを含有するポリメラーゼ連鎖反応用媒質に導入することにより決定し得る。増幅されれば、核酸タグを配列決定したり、またはその配列をほかの方法で決定し、それにより該化合物を調製するために使った合成手法が示されるであろう。
【００９３】
あるいは、粒子から放出されるタグで粒子を標識し、そして粒子に結合した化合物についての合成手法を示すバイナリーコードを提供し得る。例えば、Ohlmeyerら、PNAS USA (1993) 90:10922を参照のこと。これらのタグは、ガスクロマトグラフィー電子捕捉により検出することができるアルキレン化合物の同一系列であることが好ましい。特定の化合物を同定する前に粒子を2〜3回使用できるようにするために、連結する基の性質に応じて粒子から部分的に放出させることもできる。
【００９４】
多くはライブラリーに関して説明してきたが、CTGFエピトープが化合物それぞれに結合することができる限り、化合物の大きなグループはいずれも同様にスクリーニングすることができる。従って、マクロライド、オリゴペプチド、リボ核酸、デンドリマー（dendrimer）などを含む天然および合成両方の種々の供与源由来の化合物も、同様の方法でスクリーニングし得る。
【００９５】
アッセイにおけるプラークの形成は、ライブラリーメンバーと細胞（通常は表面タンパク質）との結合はCTGFエピトープと抗体との結合を妨害せず、該免疫複合体は補体カスケードを開始するのに十分に安定であり、そして、該メンバーは標的に対し高い親和性を有することを実証する。
【００９６】
本発明のCTGFの活性をモジュレートする小分子を得るための他のスクリーニング法は、例えば、PCT公開WO9813353号に記載されている。
【００９７】
医薬品剤形および投与経路
CTGFの活性と発現をモジュレートすることにより腎障害を治療または予防するための本発明の方法において有用な小分子および他の薬剤を同定する目的で、CTGFとその生物学的活性のある断片は、治療化合物をスクリーニングするために、種々のスクリーニング技術のいずれにおいても使用することができる。かかるスクリーニング試験で用いる断片は、溶液中でフリーであっても、固体支持体に固定されていても、細胞表面上に保持されていても、または細胞内に局在化していてもよい。生物学的活性のブロッキングもしくは低下またはCTGFと試験される薬剤との間の結合複合体の形成は、当技術分野で利用可能な方法により測定することができる。
【００９８】
CTGFに対して、あるいはCTGFの発現および／または活性をモジュレート、調節または阻害するために有用な他の標的ポリペプチドに対して、適切な結合親和性を有する化合物の高効率スクリーニングを提供する薬物スクリーニングの他の技術は当技術分野で公知である。例えば、試験化合物を担持するマイクロアレイを当技術分野で利用可能な方法を用いて調製し、使用し、分析し得る。例えば、Shalon, D.ら、1995年、PCT公開WO95/35505号；Baldeschweilerら、1995年、PCT公開WO95/251116号；Brennan, T.M.ら、1995年、米国特許第5,47
4,796号；Heller, M.J.ら、1997年、米国特許第5,605,662号を参照のこと。
【００９９】
CTGF活性をモジュレートする小分子の同定は、他の種々のスクリーニング技術によっても実施し得る。該スクリーニング技術はまた、CTGFと相互作用する抗体および他の化合物の同定に適しており、本発明の方法において薬物および治療薬として使用することもできる。例えば、Enna, S.J.ら編、1998, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sonsを参照のこと。アッセイは典型的には、化合物のタンパク質または細胞標的への結合に関連した検出可能なシグナルを提供する。結合は、例えば蛍光団、酵素コンジュゲート、および当技術分野で公知の他の検出可能な標識により検出し得る。例えば、Ennaらを参照のこと。その結果は定性的または定量的であり得る。
【０１００】
特異的な結合について化合物をスクリーニングするために、例えば、細胞に結合したヒトまたは霊長類動物抗体を検出するための種々のイムノアッセイを使用し得る。従って、標識抗hIg、例えば抗hIgM、hIgGまたはそれらの組み合わせを使用して、特異的に結合したガラクトシルエピトープのヒト抗体を検出し得る。放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤、粒子などの種々の標識を使用し得る。標識抗hIgを提供する数多くの市販のキットがあり、製造業者のプ
ロトコールに従って使用し得る。
【０１０１】
細胞毒性作用について化合物をスクリーニングするために、多種多様なプロトコルを使用して化合物が所望の活性を有することを確認し得る。通常は天然に存在するかまたは改変された細胞、細胞系などであり得る細胞を使用する。該細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。例えば、ある病原体を目的とし、化合物コンジュゲートがどのエピトープに結合するかは重要でない場合には、細胞毒性系に応じて抗体の存在下で病原体細胞をそれぞれの化合物と結合させて細胞毒性作用を判定し得る。化合物が投与される宿主の細胞に及ぼす種々の候補化合物の作用を判定する前またはその後にこのアッセイを実施し得る。このようにして、投与形態に基づいて、病原体標的に対する親和性と、遭遇し得る宿主細胞に対する親和性との間の示差的分析が得られるだろう。
【０１０２】
いくつかの状況においては、自己免疫疾患、移植などにおいてT細胞と共に存在し得る活性化状態などの特定の細胞状態が関心の対象となる。この状況においては、最初に化合物をスクリーニングして静止細胞に結合する化合物を決定し、そして静止細胞に結合しない化合物に関しては、残りの候補化合物を活性化細胞に対する細胞毒性についてスクリーニングする。続いて、化合物と遭遇する可能性のある宿主に存在する他の細胞についてスクリーニングして、その細胞毒性作用を決定し得る。あるいは、癌細胞および正常細胞を使用して、化合物のいずれかが、正常細胞と比較した場合に癌細胞に対してより高い親和性を有するかどうかを決定し得る。また、正常細胞に対する結合について化合物ライブラリーをスクリーニングし、その作用を決定してもよい。次に、正常細胞に対し細胞毒性をもたない化合物を、その癌細胞に対する細胞毒性作用についてスクリーニングし得る。正常細胞に対しある程度の細胞毒性が存在する場合であっても、癌細胞において細胞毒性活性の十分な差異がある場合であれば、該化合物が癌細胞に有効であると示される限り、正常細胞に対する低い細胞毒性は許容され得る。
【０１０３】
天然で入手した細胞を使用する代わりに、組換え技術により改変されている細胞を使用してもよい。従って、特定の遺伝子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることにより改変でき、培養物中で増殖させ得る細胞を使用してもよい。このように、表面上の単一のタンパク質が異なる細胞を入手し得る。続いて、特定のタンパク質が存在するかまたは不在である細胞に対するライブラリーメンバーの作用に関してライブラリーを示差的にアッセイし得る。このように、該化合物が、表面膜上に存在するいずれのタンパク質とも異なる特定の表面膜タンパク質に対して特異的親和性を有するかどうかを決定し得る。
【０１０４】
抗体が補体依存性細胞毒性作用を引き起こさない場合には、例えば、様々な種、イソタイプまたはそれらの組み合わせを用いて特定の表面膜タンパク質に結合する抗体を使用して細胞間を識別し得る。細胞の一部分に抗体を添加し、抗血清またはモノクローナル抗体をブロックすることにより、これらの細胞はライブラリーメンバーとの結合に利用可能な標的タンパク質をもたなくなるであろう。このようにして、一群の単一のタンパク質が利用できないことにより応答が異なる対照細胞（comparative cell）を作製する。抗体は通常使用するのに最も便利な試薬であるが、同じ機能を提供する他の特異的結合の存在も使用できる。
【０１０５】
結合を測定するためのアッセイで使用するために、抗体依存性細胞毒性系を使用し得る。細胞毒性作用に必要な成分のみが存在する合成成分混合物を使用してもよい。これは、血液または血漿の成分がアッセイの結果に悪影響を及ぼし得る場合に望ましい。
【０１０６】
また、多数の候補物質をスクリーニングするためには細胞性ローン（lawn）が極めて都合がよいが、他の技術も有効であり得る。これらの技術には、マルチウエルプレートの使用、ならびにコンビナトリアルライブラリーの調製に使用される種々のデバイス（ピン、ティーバッグなど）の使用が含まれる。種々のデバイスの性質に関連して細胞を別々に増殖させることができ、その後にデバイスを細胞と接触させるか、またはデバイス上で細胞を増殖させ得る。デバイスを細胞を接種した適切な培養物中に浸漬させるか、または細胞と候補化合物とを接触させるために提供する。細胞毒性剤を添加した後、次に種々の方法で溶解物について分析し得る。例えば、FACSは生細胞と死細胞との区別に使用することができ、sup 51 Crの放出、または上清中の細胞内化合物の検出を用いて活性化合物を検出し得る。
【０１０７】
さらに、化合物がアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するかどうかを知りたい場合もあり得る。本発明のアッセイ技術は、ライブラリーに存在して標的タンパク質と結合する化合物を決定するための迅速な方法を提供する。ひとたび候補化合物の数が実質的に絞り込まれると、化合物それ自体の活性を検出するためにより高性能のアッセイを使用し得る。このように、迅速なスクリーニングを実施して結合親和性および特異性を測定し、続いてより集中的なスクリーニングを実施して活性を測定する。活性を測定するための種々の技法が存在し、その場合は、検出可能なシグナルを提供するマーカー遺伝子が活性化されるように細胞を改変する。好適には、シグナルは、色素の生成、標識抗体を用いて検出し得る表面膜タンパク質の産生、または種々の方法のいずれかにより上清中で検出し得るタンパク質の分泌と関連するものであり得る。例えば、発現される遺伝子は、リーダー配列を有するように改変されたルシフェラーゼであり得る。その場合、該ルシフェラーゼが分泌され、その後適切な基質を用いて上清を光発生についてスクリーニングすることができる。
【０１０８】
ライブラリーをスクリーニングするために種々のプロトコルを使用し得る。これは、ある程度、化合物の調製物の性質に依存するだろう。例えば、化合物を個々の粒子、ピン、膜などに結合させ、それぞれの化合物を分離可能なものとする。さらに、利用可能な化合物の量は、ライブラリーを作製するために使用する方法に依存して変化する。さらにまた、化合物の支持体への結合の性質に応じて、化合物の一部を放出させ、それにより一連のアッセイを実施可能にすることができる。さらに、化合物をアッセイする方法は、活性をもつことが明らかな化合物を同定する能力により影響を受ける。
【０１０９】
化合物がグリッド状に個々に表面上に存在し、グリッドのそれぞれの部位にある化合物が何であるかが分かっている場合には、グリッドとして同様に組織化し、固体表面に結合させた化合物とともに記録して配置された細胞ローンを提供し得る。一旦、該ローンおよび固体支持体が記録通りにおかれると、化合物を結合させた方法に従って表面から化合物を放出させ得る。該化合物が細胞表面上のタンパク質と結合するのに十分な時間をおいた後、細胞ローンを洗浄して非特異的に結合した化合物を除去し得る。1回以上の洗浄を行い得るが、洗浄は所望の親和性の程度に応じてさまざまな度合のストリンジェンシーを提供し得る。洗浄が完了した後、次に哺乳動物血液または血漿を添加し、細胞毒性に十分な時間インキュベートし得る。次に該血漿または血液を除去し、プラークを観察して、化合物の性質をグリッドの位置により決定し得る。該血漿または血液は、ローンの細胞を天然に殺傷し得るあらゆる成分を含有させないようにし得る。
【０１１０】
調製工程は反復して行い得るので、同じ化合物を比較可能な部位に調製して多数の固体基質を調整することができ、同じかまたは異なる細胞を用いてスクリーニングを反復して行い、個々の化合物の活性を決定し得る。いくつかの例においては、化合物の正体を、核酸タグの増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、該タグにより決定し得る。例えば、PCT公開WO93/20242号を参照のこと。この例においては、活性のある化合物は、溶解物を取得し、該溶解物を核酸タグに特異的なプライマーを含有するポリメラーゼ連鎖反応用媒質に導入することにより決定し得る。拡大する際には、核酸タグを配列決定するか、またはその配列をほかの方法で決定し、それにより該化合物を調製するために使う合成手法の選択が行われるであろう。
【０１１１】
あるいは、粒子から放出させうるタグで粒子を標識し、そして粒子に結合した化合物についての合成手法を示すバイナリーコードを提供し得る。例えば、Ohlmeyerら, 1993, PNAS 90:10922を参照のこと。これらのタグは、好適にはアルキレン化合物の同一系列であることができ、ガスクロマトグラフィー電子捕捉により検出することができる。特定の化合物を同定する前に粒子を2〜3回使用できるようにするために、連結する基の性質に応じて粒子から部分的に放出させることもできる。
【０１１２】
多くはライブラリーに関して説明してきたが、CTGFエピトープが化合物それぞれに結合することができる限り、化合物の大きなグループはいずれも同様にスクリーニングすることができる。従って、マクロライド、オリゴペプチド、リボ核酸、デンドリマーなどを含む天然および合成両方の種々の供与源由来の化合物も、同様の方法でスクリーニングし得る。
【０１１３】
アッセイにおけるプラークの形成は、ライブラリーメンバーと細胞（通常は表面タンパク質）との結合はCTGFエピトープと抗体との結合を妨害せず、該免疫複合体は補体カスケードを開始するのに十分に安定であり、そして、該メンバーは標的に対し高い親和性を有することを示す。
【０１１４】
本発明の方法は、細胞標的(特に低いCTGFエピトープを有するか全く有しない細胞標的)を殺傷すべきいずれの状況においても使用し得る。従って細胞標的は、病原性の原核生物であり得る。種々の生物には、例えば、ミクロバクテリウム、エルシニア（Yersinia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ボルデテラ  ペルツシス(Bordetella pertussis)、梅毒トレポネーラ(Treponema pallidum)、淋菌(Neisseria gonorrhoea)、ストレプトコッカス（Streptococcus）、インフルエンザ菌(Hemophilus influenza)が含まれる。他の病原体には、真核生物、特に、真菌類（カンジダ(Candida)、ヒストプラスマ(Histoplasma)など）および原生動物（例えば、ジアルジア(Giardia)）が含まれる。さらに、スクリーニングされる細胞を致命的に感染させてある場合、感染細胞において表面膜タンパク質を提供するウイルスもまた、本発明の化合物の標的とすることができる。
【０１１５】
宿主細胞もまた標的として使用することができ、かかる細胞は、宿主または宿主の処置に対して、異常であるかまたは不利に作用するものである。例えば、正常組織と区別し得る癌組織は、本発明の化合物の標的として機能し得る。自己免疫疾患に関連するT細胞もしくはB細胞、またはGVHDもしくは移植拒絶に関連するT細胞もしくはB細胞もまた標的として使用し得る。異常細胞は、その性質に関わらず、正常細胞と区別し得るものであれば標的として使用し得る。従って、乾癬病巣、リンパ腫細胞、細菌細胞、真菌細胞、寄生生物細胞、ウイルス感染細胞が本発明の生成物の標的となり得る。また、細胞すべてを除去することなく、識別マーカーを発現する細胞、例えば、T細胞サブセット、活性化血小板、内皮細胞、ホルモンまたはサイトカイン受容体を発現する細胞などの、細胞の一部の除去を所望の場合にも、本発明の化合物は用途を見出し得る。
【０１１６】
CTGFの活性をモジュレートする小分子を得るための他のスクリーニング法は、例えば、PCT公開WO 9813353号に記載されている。
【０１１７】
化合物／分子
本発明は、CTGFの活性を、モジュレート、調節、または阻害することにより、腎繊維症に関連する疾患を治療および予防する方法を提供する。これらの方法には、結合相互作用をブロックするか、またはCTGFのシグナル伝達経路に関与する酵素をブロックする化合物の治療上有効な量を投与することが含まれ得る。より具体的には、本発明は、CTGFの誘導をブロックする化合物の投与によりCTGFの活性を阻害する方法を提供する。
【０１１８】
本発明の方法におけるCTGF遺伝子発現および／またはCTGF活性をモジュレートする化合物には、細胞中で環状ヌクレオチドの上昇を引き起こす薬剤が含まれる。本発明の方法に従ってCTGFの誘導をブロックし得る他の化合物は、上述のスクリーニング法を使用して同定し得る。
【０１１９】
１実施形態においては、本発明は、CTGF断片、例えば、図３に示すエキソン２および３によりコードされる断片の活性（例えば、細胞外マトリックスタンパク質の産生、筋繊維芽細胞分化の誘導、コラーゲン合成の誘導）をモジュレートする化合物または薬剤を同定する方法を提供する。該方法は、ペプチド、小分子、ポリペプチド、ペプチド擬似体などの目的の薬剤を、所望の活性（例えばコラーゲンの産生）を有することが分かっている細胞（例えば、織維芽細胞）およびCTGF断片と接触させて、当業者に公知の方法のいずれかにより細胞のコラーゲン産生能を測定することを含む（実施例参照）。次に、細胞のコラーゲン産生能を、該薬剤または化合物の不在下で、好適な対照集団細胞のコラーゲン産生能と比較する。
【０１２０】
本明細書で使われる用語「薬剤」または「化合物」とは、本明細書に記載のCTGF断片の活性に影響を与える能力をもつ任意の分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、または医薬品を意味する。該薬剤は、細胞に影響を与える能力をもつことが分かっているかまたは能力をもつと思われるいずれのものであってもよい。該薬剤にはCTGFポリペプチドのペプチド断片が含まれる。該薬剤は、合成化学剤、生化学剤、細胞、抽出物、ホモジネートおよびならし培地、を含む。該試験剤はまた、複数の化合物をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーであってもよい。本発明の方法で同定した化合物はさらに、PCR、オリゴマー制限（Saikiら, Bio/Technology 3:1008-1012, 1985）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブ分析（Connerら, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 80:278, 1983）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA）（Landegrenら, Science 241:1077, 1988）などのような、特定のDNA配列の検出に通常応用される方法のいずれかによって、溶液中でまたは固体支持体と結合した後に、評価、検出、クローニング、配列決定、その他を実施することができる。DNA分析のための分子技術はレビューされている（Landegrenら, Science 242:229-237, 1988）。
【０１２１】
候補剤は多数の化学クラスを包含する。候補剤は、有機分子、好ましくは50〜約2,500ダルトンの分子量を有する小さい有機化合物であり得る。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含有し、典型的には、少なくともアミノ、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの官能化学基を含む。候補剤はしばしば、１以上の上記官能基で置換された炭素環状もしくは複素環状構造および／または芳香族もしくは多芳香族構造を含んでなる。候補剤はまた、生物分子の中にも見出され、限定するものでないが、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体もしくはそれらの組合わせが挙げられる。候補剤は、ポリペプチド、または合成もしくは天然の核酸配列の部位指定もしくはランダム突然変異により作製されたポリペプチドであり得る。
【０１２２】
本発明のまたさらなる実施形態においては、該方法は全長CTGFの翻訳後修飾を遮断するか、またはCTGFの不活性前駆体の活性化をブロックする分子を投与する方法を提供する。本明細書に記載のように、TGF-βへのメサンギウム細胞の暴露によって、28〜30kDaにおける追加のバンドが顕著に現われる。このバンドは、全長CTGF分子のカルボキシ側半分およびアミノ側半分に大きさが対応している。上述のように、TGF-β処置により、全長分子を切断することのできるプロテアーゼまたは他の因子が産生され得る。CTGF活性を阻害する分子は、本明細書に示したスクリーニング法を用いて同定し得る。
【０１２３】
医薬品剤形および投与経路
投与経路
CTGFモジュレーター、すなわち本明細書に記載の抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子、およびその他の化合物を含む組成物はヒトの患者にそれ自体を投与することができ、または、それが適切であると考えられるならば、適当な担体または賦形剤を含む医薬組成物中に含有させて投与することができる。本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性をモジュレートまたは調節する薬剤を必要とする患者に、CTGF断片の活性または発現を治療または予防するために適切な量で該薬剤を投与する治療方法を意図している。本発明の治療および予防方法は、被験動物、それは好ましくは哺乳動物で、最も好ましくはヒトであるが、その被験動物に有効量の該薬剤を投与することを含む。好ましい１つの実施形態においては、被験哺乳動物および投与される薬剤は同種の起源である。最も好ましくは、被験動物と投与される薬剤はヒト起源である。
【０１２４】
有効量は通常の実験で容易に定めることができ、同様に最も有効で便利な投与経路および最も適切な剤形も容易に定めることができる。当技術分野では種々の剤形とドラッグデリバリーシステムが利用可能である。例えば、Gennaro, A. R.編, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co., Easton PAを参照のこと。適切な投与経路としては例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸内投与、ならびに筋肉内、皮下、脊髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内（intraventricular）、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む非経口送達が挙げられる。その組成物は全身的投与よりもむしろ局所へ投与することができる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、従来から用いられている混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、磨砕(levigating)、乳化、カプセル封入、包み込み(entrapping)、または凍結乾燥プロセスなどの当技術分野では良く知られている方法のいずれかを用いて製造することができる。上述のとおり、本発明の組成物は、活性分子の医薬品製剤中への加工を容易とする賦形剤および佐剤などの１種以上の生理学的に許容しうる担体を含むことができる。適切な剤形は選んだ投与経路の如何による。
【０１２６】
例えば注射の場合には、前記組成物は水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル液、または生理食塩液加バッファーなどの生理学的に適合しうるバッファー中に製剤化することができる。経粘膜投与の場合には、貫通すべきバリアーに対して適切な浸透剤が製剤中に用いられる。そのような浸透剤は当技術分野では良く知られている。経口投与の場合には、前記化合物は活性化合物を当技術分野で周知の製薬上許容しうる担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体によって、被験体が経口摂取するために本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などに製剤化することが可能となる。該化合物はまた、例えばカカオ脂またはその他のグリセリドなどの従来から用いられている座剤の基剤を含有する、座剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０１２７】
経口用医薬製剤は、所望により、固形の賦形剤と混合し、任意で混合物を破砕し、適切な補助物質を添加した後に、その顆粒状混合物を加工して錠剤または糖衣錠のコアを得ることができる。適切な賦形剤としては、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム(gum tragacanth)、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース調製品、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などの充填剤が挙げられる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１２８】
糖衣錠のコアは、適切なコーティングを施して提供される。この目的のためには、濃縮糖溶液を用いることができ、それには任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポル(carbopol) ゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物が含まれていてもよい。識別のために、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加してもよい。
【０１２９】
経口投与用の医薬製剤には、ゼラチンで作られた押込み合せ（push-fit）カプセル剤、ならびにゼラチン、およびグリコールもしくはソルビトールなどの可塑剤で作られた、軟質密閉カプセル剤が含まれる。押込み合せカプセル剤は、乳糖などの増量剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに任意で安定化剤と混合された形の有効成分を含有することができる。軟質カプセル剤では、活性化合物は脂肪油、流動パラフィン、もしくは液状ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解もしくは懸濁することができる。さらに安定化剤を添加することが出来る。経口投与用の製剤は全て経口投与に適した用量のものとすべきである。
【０１３０】
吸入による投与の場合には、本発明で用いられる化合物は、加圧パックまたはネブライザーから、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切な気体などの適切な高圧ガス（propellant）を用いてエアロゾルスプレーの形で上手く送達させることができる。加圧エアロゾルの場合には、定められた量を送達するためのバルブを備えることによって適切な投与単位を決定することができる。吸入器または注入器に用いるための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。これらは典型的には前記化合物と乳糖もしくはデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有する。
【０１３１】
例えばボーラス注射または連続的な注射などの注射による非経口投与用に製剤化された組成物は、単位投与量剤形、例えば、保存剤を添加したアンプルまたは複数回投与用容器で提供することができる。その組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、もしくは乳液の形態をとることができ、また、懸濁化剤、安定化剤、および／もしくは分散剤などの製剤補助剤（formulatory agent）を含有することができる。非経口投与のための製剤としては、水溶性の形態でCTGFもしくはその断片の活性に影響を及ぼす薬剤の水溶液が挙げられる。
【０１３２】
活性化合物の懸濁液は適切な油性注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしてはゴマ油、およびオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液はナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの、該懸濁液の粘性を増加させる物質を含有することができる。任意で、高濃縮溶液が調製できるように、その懸濁液に適切な安定化剤または化合物の溶解性を増大させる薬剤を含有させることもできる。あるいはまた、有効成分を、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱性物質を含まない滅菌水などを用いて構成するための粉末剤形とすることができる。
【０１３３】
本発明の組成物はデポー製剤に製剤化することもできる。そのような長時間作用型(long-acting)製剤は(例えば、皮下もしくは筋肉内への)移植によって、または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば、該化合物は適切なポリマー性もしくは疎水性物質を用いて(例えば許容しうる油中の乳剤として)製剤化またはイオン交換樹脂を用いて製剤化することができ、あるいはわずかに溶解性の誘導体、例えばわずかに溶解性の塩とすることができる。
【０１３４】
本発明の疎水性分子の医薬用担体としては、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を含む共溶剤系が挙げられる。共溶剤系はVPD 共溶剤系とすることができる。VPDは3% w/v のベンジルアルコール、8% w/v の非極性界面活性剤ポリソルベート80、および65% w/v のポリエチレングリコール300を無水エタノール中に含有させて作製された溶液である。VPD 共溶剤系(VPD:5W)は、5%ブドウ糖水溶液を用いてVPDを1:1で希釈したものからなる。この共溶剤系は疎水性化合物を溶解するために有効であり、全身投与を行っても毒性は低い。普通は、共溶剤系の比率はその溶解性と毒性の特性を壊すことなくかなりの程度変えることができる。さらに、共溶剤の構成成分の主体(identity)を変えることができる。例えば、他の低毒性の非極性界面活性剤をポリソルベート80の替わりに用いることができ、ポリエチレングリコールの画分のサイズを変えることができ、他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールと置換することができ、ブドウ糖の替わりとして他の糖類または多糖類を用いることができる。
【０１３５】
あるいは、疎水性分子のための他の送達系を用いることができる。リポソームおよび乳剤は疎水性薬剤の送達ビヒクルもしくは担体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどのある特定の有機溶剤も、通常は毒性がより高くなるという犠牲を払わねばならないが、用いることができる。さらに、該化合物は、投与しようとする組成物の有効量を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの徐放系（sustained-release system）を用いて送達することができる。種々の徐放性材料が確立されており、当業者であれば利用することができる。徐放性カプセルは、その化学的性質によって、前記化合物を2、3週間から100日間以上の間放出する。該治療用薬剤の化学的性質および生物学的安定性の如何によっては、タンパク質安定化のための追加的方策を採用することができる。
【０１３６】
有効投与量
本治療方法で用いられるいかなる組成物においても、治療上有効な投与量を当技術分野で周知の種々の技術を用いて最初に推測することができる。例えば、細胞培養アッセイにおいて、細胞培養で決定されるIC50を含む循環濃度の範囲を達成するように動物モデルで投与量を定めることができる。CTGF活性の阻害が望ましい場合には、例えば、CTGF活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度を決定することができる。ヒト被験者に対して適切な投与量の範囲は細胞培養アッセイおよびその他動物での研究で得られたデータを用いて決定することができる。
【０１３７】
治療上有効な投与量とは、被験者において症状の改善または生存の延長をもたらすその分子の量を意味する。そのような分子の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物を用いた標準的な医薬手法により、例えばLD50(集団の50%を死亡させる投与量)およびED50(集団の50%に対して治療上有効な投与量)の決定によって定めることができる。毒性を示す投与量と治療上有効な投与量との比が治療指数であり、それはLD50/ED50の比で表される。高い治療指数を示す分子が好ましい。
【０１３８】
投与量は好ましくは、ED50を含み毒性をほとんどもしくは全く示さない循環濃度の範囲内の量である。投与量はこの範囲内で、用いる投与剤形および用いる投与経路の如何によって変動させることができる。的確な剤形、投与経路、および投与量は被験者の症状の特質を考慮して選択される。
【０１３９】
所望のCTGF活性をモジュレートまたは調節するのに十分な活性部分の血漿レベル、すなわち最小有効濃度(MEC)を提供するために、投与量および投与間隔は個別に調整することができる。MECは各化合物によって異なるが、例えば、本明細書中に記載のアッセイ方法を用いて骨の成長を誘導するためのCTGFの50%〜90%の活性を達成するために必要な濃度などのin vitroデータから推測することができる。
【０１４０】
MECを達成するために必要な投与量は、個々の特質と投与経路の如何による。組成物は、治療期間の約10%〜90%の期間、好ましくは治療期間の約30%〜90%の期間、最も好ましくは50%〜90%の期間、MECより高い血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与すべきである。局所投与または選択的取り込みをさせる場合には、その薬剤の有効な局所濃度は血漿中濃度と相関していなくてもよい。
【０１４１】
投与される組成物の量は、勿論、多数の因子に依存している、そのような因子としては、限定はされないが、特定の被験者の体重、苦痛の重篤度、投与様式、担当医師の判断が挙げられる。
【０１４２】
パッケージング
前記組成物は、所望により、有効成分を含有する1以上の単位投与剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提供することができる。そのパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属製またはプラスチック製ホイルを含むことができる。そのパックまたはディスペンサー装置には投与の説明書を添付することができる。また、適合性の医薬担体中に製剤化された本発明の化合物を含む組成物を調製し、適切な容器中に入れ、適応症を治療するためのラベルを貼ることができる。ラベル上に表示される適切な症状としては、軟骨または骨の誘導、創傷治癒、神経の保護といった治療が望まれる障害または疾患、腎線維症、糖尿病などが挙げられる。
【０１４３】
実施例
下記の実施例は本発明を単に詳細に説明するものである。しかし、本発明は例示した実施形態、それらは本発明の単一の態様を説明することのみを意図したものであるが、それらの実施形態にその範囲を限定されるものではなく、機能的に等価な方法は本発明の範囲内に含まれる。事実、本明細書に記載したものに加えて本発明に種々の変更を加えうることは当業者であれば前述の説明および添付の図面から明白なものとなろう。そのような変更は本明細書の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
【０１４４】
実施例１：CTGF断片は細胞外マトリックス合成を刺激する
CTGF断片を調製するために、ヒト組換えCTGF（全長）をキモトリプシンにより消化してCTGF断片とした。組換えCTGF断片はまた、CTGFのエキソン２およびエキソン３のいずれかまたは両方を発現することによっても作製した。クローンNRK-49Fと称する正常ラット腎（NRK）織維芽細胞の連続培養系を、American Type Culture Collection（ATCC）から入手して細胞培養物を作製した。ヒト包皮織維芽細胞を外植片培養物から確立した。細胞培養物は、2.5%ウシ胎児血清および2.5%Nu-血清I（Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DME）中に維持し、集密的濃度になる前に継代した。
【０１４５】
繊維芽細胞のコラーゲン合成を試験するため、NRKおよびヒト包皮織維芽細胞の増殖停止した単層を、48ウエルプレート中に10,000細胞／ウエルで接種し、該細胞をDMEおよび2.5%ウシ胎児血清／Nu血清中で5〜7日間、集密的濃度になるまで増殖させることによって調製した。次に、織維芽細胞単層を25mMのHEPESおよびITSプレミックス（Collaborative Biomedical）を含有するDME中で1〜8日間、血清枯渇状態にした。次に、アスコルビン酸（50 mg/ml）および生物学的薬剤（CTGF断片）を加えた。コラーゲン合成は、48時間にわたる処理の最後の24時間に関する定量アッセイを用いて、ペプシン抵抗性の塩析沈殿させた細胞外／細胞表面に関連するコラーゲンの3H−プロリン取り込みを測定することにより評価した。図２に示すように、CTGFのエキソン２およびエキソン３を含むCTGF断片は、1ng/mlのTGF-bを添加したNRK繊維芽細胞におけるコラーゲン合成を刺激した。対照的に、カルボキシル末端CTGFはコラーゲン合成を刺激しなかった。
【０１４６】
実施例２：CTGF断片は筋繊維芽細胞の分化を誘導する
CTGF断片および細胞培養物を上述のように調製した。CTGF断片による筋繊維芽細胞の誘導を調べるために、包皮繊維芽細胞のNRKの増殖停止した単層を上述のように調製し、処理した。処理の後、48ウエルプレートの単層をTBSで２回洗浄し、メタノール中で20℃にて10分間かけて固定し、その後α平滑筋の免疫組織学的検出のために処理を施した。免疫組織学的検出法を行った。固定の後、細胞単層をTBSで２回洗浄し、TBS中の10％ウマ血清／２％ミルクを用いて30分間かけてブロッキングした。続いて細胞を、ウマ血清／ミルク／TBS中に200倍希釈したモノクローナルマウス抗α平滑筋アクチンIgG（Clone 1A4, Sigma Chemical）と共に１時間インキュベートした。次に細胞単層をTBSで３回洗浄した後、ウマ血清／ミルク／TBS中に200倍希釈したビオチニル化ウマ抗マウスIgG（Vector Labs, Burlingame, CA）と共に１時間インキュベートした。続いて細胞単層を洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン−ビオチン複合体（Dako, Glostrup, Denmark）と共に30分間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼを、1mMレバミソールの存在下にてファストレッド（fast red）基質（Vector Red, Vector Labs）を用いて可視化した。続いて、処理細胞単層を、赤色染色α平滑筋アクチン陽性筋繊維芽細胞に関して顕微鏡を用いて調べ、１ウエル当たりの筋繊維芽細胞数をカウントし、選択した顕微鏡視野の写真をとった。
【０１４７】
図１に示すように、繊維芽細胞コラーゲン合成についてのアッセイから得られた結果は、筋原細胞誘導アッセイにより示される。特に、本発明のCTGF断片は、筋原細胞の分化を誘導可能であったが、カルボキシル末端CTGF断片と比較した場合、これはそのような分化を誘導することができなかった。
【０１４８】
実施例３：中和抗CTGF抗体はTGF-β誘導型DNA合成、コラーゲン合成、および筋織維芽細胞誘導をブロックする
特異的抗CTGF抗体を、バキュロウイルス発現系にて産生させた生物学的に活性な組換えヒトCTGFに対して、当技術分野で公知の方法を用いて生じさせた。該抗体を、ヤギで調製し、CTGFの中和化活性を、直接またはNRK織維芽細胞中のTGF誘導型DNA合成もしくはコラーゲン合成について試験した。ヤギ抗体は、TGF-β作用の中和化についてのアッセイにおいて活性を示した。これらのアッセイにおいて、ヤギ抗CTGF抗体はDNA合成をブロックすることができた。さらに、図５に示したように、CTGF抗体は、TGF-βにより誘導されるコラーゲン合成および筋織維芽細胞形成をブロックすることができた。コラーゲン合成をブロックするために必要な抗体の量は、DNA合成をブロックするために必要な量よりも著しく少なかったことに留意されたい。ウェスタンブロットアッセイおよび競合ELISAアッセイの両方によて、この調製物中のほとんどの抗体がCTGFのN末端ドメインに対して導かれるものであることが示された。このことは、2つのドメインが、異なる生物学的活性の刺激に関わりうることを示唆している。
【０１４９】
実施例４：CTGFのN末端ドメインに対して特異的な抗CTGF抗体はコラーゲン合成を選択的にブロックする
ドメイン特異的抗CTGF抗体を、精製したN末端またはC末端CTGFドメインを使ってアフィニティクロマトグラフィーにより調製した。これらのドメインは無傷CTGFからキモトリプシンによる限定消化により調製した。該ドメインをお互いからヘパリンセファロース上でのアフィニティクロマトグラフィーにより分離した。CTGFのN末端ドメインはヘパリンと結合しないが、C末端ドメインはヘパリン結合活性を有し、ヘパリンセファロース上に保持される。これらのドメインは純粋で、ウェスタンブロット分析に基づくと無傷CTGFによるコンタミネーションは0.1%未満であった。次に、個々のドメインをAffigel 10と約0.5mg/mlゲルの濃度で結合させた。次に、全抗CTGF IgG（ヤギ）をアフィニティ樹脂に吸着させ、特異的に結合した抗体を溶出させた。次に、これらの抗体をウェスタンブロットで試験してそれらの反応性の特異性を判定した。CTGFのN末端ドメインまたはC末端ドメインのみと反応性があるIgGを、全体のプールから、当技術分野で公知の技術を使って単離した。次に、抗体を、CTGFを使って中和アッセイで試験した。図６に示すように、これらの試験の結果は、CTGFのN末端ドメインに対する抗体がコラーゲン合成を選択的に阻害するが、DNA合成を阻害しないことを示した。対照的に、CTGFのC末端ドメインに対する抗体はDNA合成を選択的に阻害するが、コラーゲン合成を阻害しなかった。このデータは、CTGF分子の異なる領域が、異なる生物学的活性のシグナル伝達に関わりうることを示している。これらの結果を確証しかつ拡張するために、単離したドメインと無傷CTGFおよびTGF-βとの生物学的活性を以下に説明するように比較した。
【０１５０】
実施例５：CTGF N末端ドメインは細胞外マトリックス産生を刺激する
CTGFのN末端ドメインおよびC末端ドメインを当技術分野で公知の技術を使って調製した。最初に、上記のようにキモトリプシンを用いて生物学的に活性な無傷CTGFのタンパク質分解性消化を行うことにより、より小さい断片を生じることなくほとんど排他的に無傷N末端ドメインとC末端ドメインを作製して、純粋なN末端およびC末端ドメインを調製した。第2の純粋なC末端およびN末端ドメインを作製する方法は、CTGFオープンリーディングのごく限られた領域、すなわちC末端ドメインまたはN末端ドメインだけをコードする領域の発現を必要とした。これは、オープンリーディングフレームの一部をPCR増幅し、そして、N末端ドメインだけを産生させるシステイン非含有領域の停止コドンをバキュロウイルスシャトルベクターであるGP67に導入するか、またはシステイン非含有領域の配列AYRLEDで開始するC末端ドメインだけをコードするオープンリーディングフレームの一部を該ベクターGP67にクローニングするか、いずれかによって達成した。こうして、小胞体に所望の組換えタンパク質（または断片）の合成を指令するGP67ウイルス遺伝子からのシグナルペプチドを含有するキメラタンパク質を作製させ、それにより分泌を可能にした。精製した後、種々の方法により作製した単離したドメインをNRK織維芽細胞を用いるバイオアッセイにおいて比較した。これらの試験結果は、ドメイン特異的抗CTGF抗体について先に得た観察を立証した。無傷CTGFのタンパク質分解性消化または直接組換え発現により作製したN末端ドメインは、図７および図８に示すように、コラーゲン合成および筋織維芽細胞誘導のインデューサーとして完全に活性があった。逆に、いずれかの方法により作製したC末端ドメインも、DNA合成アッセイにおいて十分に活性があった。このデータは、CTGFの個々のドメインが完全な生物学的活性を保持し、そしてお互いが独立的に作用して標的細胞に及ぼす特異的な生物学的影響を刺激できることを実証した。個々のドメインは最適濃度において、無傷CTGFまたはTGF-βに匹敵しうる生物学的応答を誘起した。この結果は、TGF-βのマイトジェン（DNA合成、細胞増殖）およびマトリジェン（matrigenic）（コラーゲン合成のような細胞外マトリックス合成）活性には、CTGFおよびそのそれぞれのドメインが介在することを強く示した。
【０１５１】
細胞外マトリックス産生に及ぼすCTGFの誘導活性を高めるために、本発明のCTGF断片と共に他の成長因子を使ってもよい。例えば、ペプチド成長因子であるIGF-2がCTGFのコラーゲンおよび筋繊維芽細胞表現型誘導活性に及ぼす影響に関して、該IGF-2を評価した。CTGFの存在下における2ng/mlまたはそれ以上のIGF-2の濃度によって、図９に示すようにコラーゲン合成および筋繊維芽細胞の表現型が大幅に増大した。
【０１５２】
本発明の記載した方法および系の様々な改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好適な実施形態に関連させて記載してきたが、本願発明は、これらの特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者には明らかであるように、記載した本発明を実施するための形態の様々な改変は、特許請求の範囲内に含まれることを意図する。本明細書に引用した全ての参考文献は、それらの全文を参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、筋原細胞誘導アッセイにおける細胞を示す。
【図２】  図２Ａおよび図２Ｂは、本発明のCTGF断片がNRK細胞のコラーゲン合成を誘導することを示すグラフである。
【図３】  図３Ａおよび図３Ｂは、全長CTGF分子の核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示し、ここでCTGF分子の各エキソンの位置が同定されている。
【図４】  図４は、CTGF分子のエキソン２およびエキソン３を含むCTGFのN末端ドメインの核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】  図５は、抗CTGF抗体を用いた、コラーゲン合成の阻害に関するデータを示す。
【図６】  図６は、CTGFのN末端ドメインに対する抗体によるコラーゲン合成の阻害に関するデータを示す。
【図７】  図７は、CTGFおよびCTGFのN末端ドメインによる、コラーゲン合成の刺激に関するデータを示す。
【図８】  図８は、コラーゲン合成および筋繊維芽細胞の活性インデューサーとしてのCTGFのN末端ドメインに関するデータを示す。
【図９】  図９は、IGF-2がCTGF誘導型コラーゲン合成に及ぼす影響に関するデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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