(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウナタネ(Brassica napus)の細胞、組織又は器官を、420〜500nmの青色光、500〜570nmの緑色光又は590〜700nmの赤色光の光波長と2〜50μmol/m2/sの光強度とから成る光質条件下で培養することを特徴とするシュート誘導方法。
【請求項２】
上記セイヨウナタネ(Brassica napus)の器官が葉柄部を含む葉であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記光波長が、590〜700nmの赤色光であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば特定の光質条件下で植物の細胞、組織又は器官を培養するシュート誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの全ての植物は、無菌的に組織培養が可能である。植物組織培養における制御因子としては、化学的因子、生物的因子及び物理的因子が挙げられる。化学的因子としては、例えばオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質(植物ホルモン)の使用が挙げられる。また、生物的因子としては、例えば、植物に対する遺伝子組換えが挙げられる。
【０００３】
上述したオーキシンは、カルス誘導とその継代培養に必須な植物生長調節物質である。また、サイトカイニンは、細胞増殖の促進や器官再分化を目的として用いられている。さらに、オーキシンとサイトカイニンとの濃度バランスによって、カルス、シュート又は根が誘導される。このように、植物組織培養において、植物生長調節物質の効果は大きい。しかしながら、例えばシュートを誘導させ、植物体を再生させた場合には、オーキシン及びサイトカイニンの濃度や濃度バランスを検討することが必要となり、時間と手間を要する。このように、植物組織培養における植物生長調節物質の使用において、最適物質、最適濃度の検討には時間と手間を要する。また、使用濃度によっては、植物組織に阻害的に働き細胞増殖が止まる場合があり、あるいは植物組織がガラス化、奇形となる場合がある。さらに、一旦、例えばシュートを誘導する使用条件であっても、再現性が得られない場合がある。
【０００４】
一方、植物の遺伝子組換えを行う場合には、遺伝子導入後の植物体再生率が低いために、目的の遺伝子組換え体(形質転換体)を得るために、個体数として例えば400〜500個について遺伝子導入を行う必要がある。これは、非常に時間と手間を要する作業である。また、植物の遺伝子組換えでは、形質転換体を選抜するために、抗生物質耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として、導入すべき遺伝子とともに植物に導入する。この際、形質転換体の選抜には、培養に抗生物質を含む培地を使用する。しかしながら、植物種によっては、抗生物質に対して極めて敏感であり、微量の抗生物質が培地中に含まれているだけでも、植物組織の分化が阻害されてシュート誘導が抑制される場合がある。そのため、植物組織や細胞で遺伝子組換えが生じていても、分化が停止し、シュートが得られない場合がある。また、使用する抗生物質の種類と濃度は、植物種や品種によってその都度検討を要し、最適条件を決定するまでに時間と手間を要する。場合によっては、シュート誘導が生じる条件を見出せずに、遺伝子組換えを断念せざるを得ない。
【０００５】
以上のように、植物組織培養において、植物生長調節物質に拠らず、また遺伝子組換えの際に使用される抗生物質存在下でも行うことができる、シュート誘導を促進する方法が望まれている。
【０００６】
ところで、上述した物理的因子としては、培養の際の温度条件や光条件が挙げられる。植物組織や細胞培養における光条件に関して、例えば、特許文献１には、組織培養苗に、光半導体を主たる光源として特定の波長光を照射することを特徴とする組織培養苗の培養方法が開示されている。当該特定の波長光としては、例えば波長ピークが600〜700nmの赤色光が挙げられている。また、特許文献２には、ユーカリプタス・トレリアーナ(Eucalyptus torelliana)の増殖組織を特定の光強度(50μmol/m2/s以上)で培養し、シュートを分化させる方法が開示されている。さらに、特許文献３には、特定の光質条件(ピーク波長が450〜470nmの青色光及び15μmol/m2/s以上の光強度)下でシュートを培養することで、樹木のシュートからの発根を誘導促進する方法が開示されている。特許文献４には、ブラシノステロイド生産性クラウンゴール細胞を培養する培地に、赤色光又は黄色光を照射することでブラシノステロイドの生産量が向上されることが開示されている。
【０００７】
しかしながら、シュート誘導を促進することができる光質条件は、今まで知られていなかった。
【特許文献１】特開平9-98号公報
【特許文献２】特開2000-139253号公報
【特許文献３】特開2000−60332号公報
【特許文献４】特開平3-191793号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述した実情に鑑み、特定の光質条件下で植物の細胞、組織又は器官を培養することで、シュート誘導を促進する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、植物の細胞、器官又は組織を、420〜500nmの青色光、500〜570nmの緑色光又は590〜700nmの赤色光の光波長と2〜50μmol/m2/sの光強度とから成る光質条件下で培養することで、シュート誘導を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下を包含する。
（１）植物の細胞、組織又は器官を、420〜500nmの青色光、500〜570nmの緑色光又は590〜700nmの赤色光の光波長と2〜50μmol/m2/sの光強度とから成る光質条件下で培養することを特徴とするシュート誘導方法。
（２）上記植物がアブラナ科の植物であることを特徴する、（１）記載の方法。
（３）上記植物の器官が葉柄部を含む葉であることを特徴とする、（１）記載の方法。
（４）上記光波長が、590〜700nmの赤色光であることを特徴とする、（１）記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、培養の光質条件を制御することで、植物のシュート誘導を促進できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るシュート誘導方法(以下では、「本方法」という)は、特定の光質条件下で植物の細胞、組織又は器官(以下、「植物細胞等」という)を培養する方法である。ここで、「光質」とは、光の波長組成と各波長における強度の分布により特徴づけられる光の性質を意味する。具体的に、光質条件は光波長と光強度とから成る。本方法においては、まず植物細胞等を準備する。次いで、準備した植物細胞等を所定の培地中で、420〜500nmの青色光、500〜570nmの緑色光又は590〜700nmの赤色光の光波長と2〜50μmol/m2/sの光強度とから成る光質条件下で培養する。このような光質条件下で植物細胞等を培養することで、シュートを誘導することができる。
【００１３】
本方法において、対象となる植物は、いずれの植物であっても良いが、例えばアブラナ科に属する植物が挙げられる。アブラナ科植物としては、例えばセイヨウナタネ(Brassica napus)、カブの類(Brassica rapa)及びカラシナの類(Brassica juncea)等が挙げられる。
【００１４】
また、培養の対象となる植物細胞等としては、シュートへと生長することができるものであればいずれのものであって良いが、例えば、植物培養細胞、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束)及び植物器官(例えば、子葉等の葉(葉柄部を含む)、葉柄、胚軸、花弁、茎、根、種子)が挙げられる。なお、例えば葉(例えば、子葉)等の植物器官を使用する場合には、シュートが出現するように葉柄部を残して切断する。ここで、葉柄部とは、葉柄の一部又は全部を意味する。
【００１５】
本方法を、例えば、子葉片を植物細胞等として使用した場合を例示として、以下に具体的に説明する。
【００１６】
先ず、植物の種子を滅菌し、滅菌後の種子を発芽用培地(例えば、MS培地、3％シュクロース、0.7％phytagar, pH5.8)に播種し、培養する。発芽後、成長点を含まないように注意して、子葉片を切り取る。切り取った子葉片をシュート誘導用培地(例えば、MS培地、BA(benzyladenine)4.5mg/L、3％シュクロース、0.7％phytagar, pH5.8)中に置床し、例えばプロジェクター型培養装置(浜松ホトニクス社製)内で培養する。当該プロジェクター型培養装置は、光源として超高圧水銀ランプ等を使用し、照射する光の波長、光強度、照射位置、照射面積、照射パターン等を適宜設定することができ、本発明において、このような培養装置を使用することは極めて有用である。そこで、培養にプロジェクター型培養装置を使用し、光波長を420〜500nmの青色光、500〜570nmの緑色光又は590〜700nmの赤色光の光波長に設定する。特に、590〜700nmの赤色光の光波長が好ましい。また、光強度を2〜50μmol/m2/s、好ましくは2〜10μmol/m2/s、特に好ましくは2〜5μmol/m2/sに設定する。子葉片の培養から例えば5〜30日後には、子葉片からシュートが誘導されることとなる。なお、プロジェクター型培養装置に代えて、各種の光源(電灯、蛍光灯、LED)や特定光波長を透過するフィルム等を用いて、本方法の光質条件を設定することもできる。
【００１７】
光質条件以外の培養条件は、植物に応じて適宜決定することができるが、例えば、温度20〜25℃(好ましくは22〜25℃)、pH5.0〜6.0(好ましくはpH5.6〜5.8)が挙げられる。他に、シュート誘導に有効な植物生長調節物質(植物ホルモン)を培地に添加してもよい。このような植物生長調節物質としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン(ベンジルアミノプリン：BAP)、ゼアチン及び2-イソペンテニルアデニン(2-ip)が挙げられる。
【００１８】
また、例えば、通常の蛍光灯(白色光)下で培養した場合と比較して、本方法を適用し、シュート誘導率が有意に増加した場合に、シュート誘導が促進されたと判断することができる。シュート誘導率(シュート形成率)は、シュート誘導個体数 / 置床個体数 × 100 (％)によって算出することができる。
【００１９】
以上に説明した本方法によれば、植物のシュート誘導を促進することができる。本方法は、照射する光の条件を制御することでシュート誘導を促進する方法であるので、シュート誘導に従来から使用されている植物生長調節物質の使用量を極力抑えることができ、奇形を抑制することができる。またコストが従来の植物生長調節物質を使用するシュート誘導方法に比べてかからない。さらに、本方法は、幅広い植物種、品種に適用することができる。
【００２０】
ところで、アグロバクテリウム法によって植物の遺伝子組換えを行う際には、例えば子葉片の切り口部分にアグロバクテリウム菌液を浸すこととなる。このような遺伝子組換えによる形質転換体の選抜の際に、抗生物質を含む培地を使用する場合には、抗生物質が原因で形質転換体のシュート誘導率が低下する。しかしながら、培地に抗生物質が含まれる場合であっても、本方法を適用することで、形質転換体からシュート誘導を効率良く促進することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ナタネ子葉片からのシュート誘導
ナタネの種子を無菌的にシャーレに播種し、発芽3日後程度の子葉を切り取り、植物体再生の材料とした。植物体再生は、子葉片の切り口から新たに出現するシュートが生長することによって起こる。
【００２２】
１．ナタネ子葉片の調製
1-1.  ナタネ種子の滅菌方法
ナタネ(セイヨウナタネ(Brassica napus), 品種名:Westar)の種子を以下のように、滅菌した。
まず、種子を必要数(20〜100粒)ミラクロスで包み、70％(v/v)エタノールに2分間浸漬した。次いで、水20mlを有する50mlファルコン遠心管にミラクロスで包んだ種子を入れた。この遠心管を55℃のウォーターバス中に10分間入れた。その後、0.1％Tween-20を含む1％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に、ミラクロスで包んだ種子を20分間浸漬した。この際、種子を含む溶液を時々ゆすった。20分間の浸漬後、ミラクロスで包んだ種子を滅菌水で数回すすいだ。
【００２３】
1-2.  種子の乾燥方法
上記のように滅菌が終了した種子をミラクロスから取り出し、滅菌済みの濾紙上で水分を吸い取った。次いで、種子をプラスチックシャーレ中に配置し、クリーンベンチ内で1〜3日間乾燥させた。
【００２４】
1-3.  種子の発芽方法
上記のように乾燥させた種子25粒を、発芽用培地(MS培地、3％シュクロース、0.7％phytagar, pH5.8)を含む10cmシャーレに播種し、光強度50μmol/m2/sの条件下で発芽させた。
【００２５】
1-4.  子葉片の調製方法
上記のように発芽用培地に播種後、約2日で発芽を確認した。そこで、播種後3日目の子葉片を、成長点を含まないように注意して切断し、シュート誘導用培地(MS培地、BA(benzyladenine)4.5mg/L、3％シュクロース、0.7％phytagar, pH5.8)を含む6cmシャーレに置床した。図１には、子葉片を培地に置床した時の状態の写真を示す。
【００２６】
２．ナタネシュート誘導の光質条件の検討
子葉片は、通常、25℃で50〜100μmol/m2/sの光照射(蛍光灯)で培養すると、2週間程度でシュートが誘導される(30％以上誘導)。ここでは、ナタネシュート誘導の光質条件を検討した。
【００２７】
2-1.  方法
上記1-4のように置床したナタネ子葉片を、プロジェクター型培養装置(浜松ホトニクス社製)内で照射する様々な光波長条件下で、17日間培養することで、シュート誘導を行った。照射した光波長は、青色光(420-500nm)、緑色光(500-570nm)、赤色光(590-700nm)、白色光(420-700nm)であった。なお、光強度(μmol/m2/s)は、10μmol/m2/sとした。また、各条件について、それぞれ子葉片8枚を用いて実施した。図２には、照射光波長に対する光強度(相対値レベル(A.U.))を示す。図２において、Rは赤色光であり、Gは緑色光であり、Bは青色光であり、FRは近赤外光である。なお、R、G、Bを同時に照射した場合には、W(白色光)となる。
【００２８】
2-2.  結果
培地に植えた子葉片の数とシュート形成を確認し、子葉片の数からシュート誘導率を算出した。算出方法は、シュート誘導子葉片数 / 置床子葉片数 × 100 (％)である。各照射光波長に対するシュート誘導率(シュート形成率(％))の結果を図３に示す。図３において、B10は青色光であり、G10は緑色光であり、R10は赤色光であり、W10は白色光である。この白色光は、プロジェクターの青色光、緑色光及び赤色光の合成によるものである。また、図４には、白色光を照射し培養した際の子葉片の写真を示す。さらに、図５には、赤色光を照射し培養した際の子葉片の写真を示す。
【００２９】
図３から判るように、シュート誘導率としては、赤色光を照射した試験区のシュート誘導効率が最も高かった。一方、白色光照射では、カルス形成が見られてもシュート誘導は見られなかった(図３及び４)。また、シュート誘導率としての数値の高さ以外にも、1本の子葉片から誘導されるシュートの数の多さ、奇形のシュート形成率の低さからも赤色光条件がシュート形成に対して良い光質条件であることが示された（図５）。
【００３０】
以上の結果より、シュート誘導に関しては、赤色光(R)、緑色光(G)及び青色光(B)を混合して照射された白色光(W)よりも、赤色光、緑色光及び青色光を、それぞれ単独で照射した方がシュート誘導を促進することが示された。
【００３１】
〔実施例２〕培地中に抗生物質が含まれる場合のシュート誘導に対する赤色光照射の効果検討
植物に遺伝子導入を行った際には、形質転換体の選択に、マーカー遺伝子として抗生物質耐性遺伝子を使用する場合がある。そこで、特定の光質条件下でのナタネのシュート誘導が、マーカー遺伝子として抗生物質耐性遺伝子を使用して遺伝子導入を行う際と同様に、抗生物質を含む培地においても促進されるか否かを調べた。実施例１に示されるように、照射する光波長について赤色光、緑色光及び青色光の効果を比較した場合には、赤色光の効果が最も良かったので、本実施例では、照射する光波長として赤色光を選択した。
【００３２】
1-1.  方法
シュート誘導培地に抗生物質を添加し、照射する光波長を赤色光、光強度を2、10又は50μmol/m2/sとした以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法で、ナタネの子葉片を用いてシュート誘導を行った。なお、使用した抗生物質は、カナマイシンと同じ作用を有するジェネティシン(Genetisin Disulfate salt, Sigma社)であった。ジェネティシンを2mg/lの濃度でシュート誘導用培地に添加した。なお、ジェネティシンが2mg/lの濃度で培地に含まれている場合には、通常、シュート誘導率は、0〜5％程度まで低下することが知られている。
【００３３】
1-2.  結果
各光質条件に対するシュート誘導率(シュート形成率(％))の結果を図６に示す。図６において、R2は赤色光、光強度2μmol/m2/sの光質条件下の結果であり、R10は赤色光、光強度10μmol/m2/sの光質条件下の結果であり、R50は赤色光、光強度50μmol/m2/sの光質条件下の結果である。また、R平均は、R2、R10及びR50の平均値であり、蛍光灯(対照)は、通常の植物インキュベーター(光源：蛍光灯)下で上記と同じジェネティシンを添加した培地における培養の結果である。
【００３４】
図６から判るように、シュート誘導率(シュート形成率)は、抗生物質(ジェネティシン)を培地に添加した場合には、R2及びR10試験区で37.5％、R50試験区で6.25％、赤色光平均(R平均)で25.0％であった。一方、蛍光灯(対照)では、シュート誘導率は、3.1％であった。
【００３５】
以上の結果より、抗生物質存在下で子葉片からシュート誘導を行った場合、赤色光照射で光強度2及び10μmol/m2/sの光質条件では、蛍光灯照射の場合と比較して、10倍以上のシュート誘導率(シュート形成率)が得られた。一方、光強度が50μmol/m2/sの場合には、効果の度合いが低かった。
【００３６】
赤色光照射のシュート誘導に対する効果は、2μmol/m2/sという弱光下でも示され、通常の植物栽培や植物組織培養の最適条件とは異なることが示された。
【００３７】
また、対照として行った蛍光灯照射実験では、シュート誘導率は3.1％と低かった。このようにシュート誘導率が低い場合には、例えばアグロバクテリウム法によって植物の遺伝子導入を行っても抗生物質存在下では形質転換体が得られない可能性がある。従って、光質条件を制御してシュート誘導促進を行うことは、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、実施例１においてナタネ子葉片を培地に置床した時の状態の写真を示す。
【図２】図２は、照射光波長に対する光強度(相対値レベル(A.U.))を示す。
【図３】図３は、実施例１における各照射光波長に対するナタネのシュート誘導率(シュート形成率(％))の結果を示す。
【図４】図４は、実施例１における白色光を照射し培養した際のナタネ子葉片の写真を示す。
【図５】図５は、実施例１における赤色光を照射し培養した際のナタネ子葉片の写真を示す。
【図６】図６は、実施例２における各光質条件に対するナタネのシュート誘導率(シュート形成率(％))の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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