(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物を部分架橋することにより得られた有効量のリンタンパク質調製物を１つ以上のキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む、哺乳動物における歯エナメルの再石灰化用および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯過敏症、または歯肉炎の治療または予防用組成物であって；
前記加水分解の程度が、ペプチド結合の合計数の３％〜８％の範囲であり、前記部分架橋の程度が、得られたリンタンパク質調製物が、タンパク質１グラムあたり５０および２５０μｍｏｌの間の架橋を含むものである組成物。
【請求項２】
前記部分加水分解物が酸カゼイン、レンネットカゼイン、またはカゼイン塩の酵素加水分解により得られた請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素がトリプシンである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記加水分解度が、前記カゼインまたはカゼイン塩の１０％以下が前記部分加水分解によってｐＨ７で不溶性となるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記部分加水分解物がグルタミン転移酵素を用いて酵素により部分架橋された請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記加水分解度が３．５％〜７％の範囲である請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記加水分解度が４％〜６．５％の範囲である請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記部分架橋の程度が、得られたリンタンパク質調製物がタンパク質１グラムあたり５０および１６８μｍｏｌの間の架橋を含むものである請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記部分架橋の程度が、得られたリンタンパク質調製物がタンパク質１グラムあたり５０および１６０μｍｏｌの間の架橋を含むものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記部分架橋の程度が、得られたリンタンパク質調製物がタンパク質１グラムあたり９２および１６０μｍｏｌの間の架橋を含むものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記部分架橋の程度が、得られたリンタンパク質調製物がタンパク質１グラムあたり１１０および１５０μｍｏｌの間の架橋を含むものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
カルシウムイオン源を更に含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ホスフェートイオン源を更に含む請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
天然ミルクカルシウムを更に含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
カルシウムイオンが、リンタンパク質調製物１グラムあたり少なくとも５ｍｍｏｌのカルシウムイオンのレベルで前記組成物中に存在する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
カルシウムイオンが、リンタンパク質１グラムあたり少なくとも１０ｍｍｏｌカルシウムイオンのレベルで前記組成物中に存在する請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記カルシウムイオンと前記ホスフェートイオンとのモル比が０．８〜１．２：０．４〜０．８の範囲である請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
ストロンチウムイオン源を更に含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
フッ化物イオン源を更に含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
口内洗浄剤、歯磨き剤、練り歯磨き剤、粉末、乳濁液、またはゲルを含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
乳濁液を含み、前記リンタンパク質調製物が該乳濁液の１重量％〜１５重量％の量で存在し、該乳濁液が天然ミルクのリン酸カルシウムを該乳濁液の３％〜１２重量％の量で更に含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
食料品または糖菓を含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
歯エナメルの再石灰化用である、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトおよび動物への生物活性金属イオンのデリバリーのための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、歯の再石灰化、および／又は歯齲蝕（dental caries）および／又は酸蝕症（dental erosion）、歯過敏症、または歯肉炎の予防または治療のための組成物および方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
歯齲蝕（または齲歯（dental decay)）および酸蝕症は、多くの国において水供給源にフッ素添加し、かつ、フッ化物練り歯磨き剤を使用しているにも関わらず、未だ広まっている状態である。歯齲蝕は、通常、歯の表面のエナメルで始まるが、歯の硬組織を次第に破壊していくことができる。多くの国において、５歳の子供の約半数がある種の齲蝕を経験している。更に、ある種の人々の群は、職業ゆえに、酸蝕症および／又は齲蝕に特に影響を受けやすいがある。例えば、ワインの味利き人およびしばしばスポーツ飲料を少しづつ飲む優秀なサイクリストなどの運動選手は、歯が低ｐＨ飲料に継続的に曝され、これによって歯の表面全体が溶けてしまうことがある。
【０００３】
乳製品は、歯齲蝕の進行に対して保護効果を有することが知られている。多くの調査によって、歯エナメルに対して抗齲蝕／再石灰化作用を示すのは主に乳製品のタンパク質成分、具体的にはカゼインであることが示唆されている。更に、カゼイン中の特定の分画の活性ペプチドは、抗齲蝕／再石灰化作用の大きな原因であると同定されている。これらは、カゼインの全重量の約１０％を構成するリン酸カルシウム金属イオン封鎖リンペプチドである。これらのペプチドは、コロイド状のカゼインリンペプチド無定形リン酸カルシウム複合体を形成することによってリン酸カルシウムの溶解性を驚くほど増加させる一まとまりのホスホセリル残基［−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ］を含む。
【０００４】
カゼイン、カゼイン塩、それらの消化産物、または特定のカゼイン由来のリンペプチドを含む齲蝕の阻害および関連する歯の用途における使用のための種々の組成物に関する多くの特許公表物がある。
【０００５】
例えば、ニュージーランド特許明細書１９９８９１は、齲蝕および歯肉炎阻害量のカゼイン、アルファ−ｓ−カゼイン、またはホスビチンを含む練り歯磨き剤および歯磨き剤を記載している。
【０００６】
日本国特許第５９１５２３１７号は、カゼイン、カゼイン加水分解物、またはそれらの混合物と一緒にムタナーゼ（mutanase）を含む経口用組成物（齲蝕予防用薬物）を記載している。
【０００７】
米国特許第５８３３９５３号、日本国特許第９００２９２８号、および米国特許第５４２７７６９号はすべて、ミセル状カゼインを含む種々の歯齲蝕治療または予防用組成物を記載している。
【０００８】
米国特許第５１３０１２３号は、カゼイン塩またはカゼイン塩の消化産物のいずれかの水溶性塩を含む齲蝕または歯肉炎阻害用歯磨き組成物を記載している。
【０００９】
ＷＯ８２／０３００８は、特定のアミノ酸配列を含むリンタンパク質またはリンポリペプチド、具体的にはカゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム、またはホスビチンを含む齲蝕および歯肉炎阻害用組成物を記載している。
【００１０】
日本国特許第４０７７４１５号は、好適な賦形剤と組み合わせてカゼインリンペプチドを含む歯石予防用組成物を記載している。
【００１１】
米国特許第５０１５６２８号は、５〜３０個のアミノ酸を有し、特定のアミノ酸配列を含み、かつ、カゼインのトリプシンの消化により得ることができる抗齲蝕性リンペプチドを記載している。
【００１２】
ＷＯ９８／４０４０６は、抗齲蝕効力を有する特定のカルシウムリンペプチド複合体を記載している。該リンペプチドは、Ｓｅｒ（Ｐ）のまとまりの配列モチーフ［−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ］を含み、アモルファスリン酸カルシウムおよびアモルファスリン酸フッ化カルシウム中で自身の重量を安定化することができると言われている。
【００１３】
ＷＯ００／０６１０８は、１つ以上の単離および精製されたカゼインタンパク質またはその塩の懸濁液または溶液を含む歯の表面などの生物表面への種々の生物活性成分デリバリー用配合物を記載している。
【００１４】
カゼインリンペプチドを含む組成物は、無傷のカゼインを含む組成物と比較して優れた抗齲蝕性／再石灰化活性を有していると報告されている。しかしながら、カゼインリンペプチドを使用することは、所望のリンペプチドを放出するためのカゼインの消化（例えば、酵素トリプシンを用いる）によって、得られた消化産物に苦い香味を与える疎水性ペプチドも放出されるという不利な点を有している。このことは、生産物が許容できる香味を有するため、そのような疎水性ペプチドを除去するための消化産物の分別が必要であることを意味する。あるいは、このことは、カゼイン由来の材料の分画のみを用い、典型的には材料の７５％以上が廃棄されることを意味する。
【００１５】
本出願人らは、今や、驚くべきことに、カゼインを部分加水分解し、続いて部分加水分解物を部分架橋することにより、未修飾カゼインまたはカゼイン部分加水分解物よりも優れたカルシウム結合および歯再石灰化特性を有するリンタンパク質調製物を得ることができることを見出した。そのようなリンタンパク質調製物は、他の生物活性金属イオンを結合する増大した能力を有することも見出された。
【００１６】
日本国特許第４−１２６０３９号は、ダイズ、小麦、若しくはスイートコーンから得られるタンパク質またはゼラチン、動物肉、魚肉、若しくはカゼインなどの動物タンパク質などの食品タンパク質を部分的に加水分解し、続いて得られた加水分解ペプチドをグルタミン転移酵素または希釈した酸で処理することによる官能性ペプチドの調製方法を記載している。得られた処理ペプチドは、苦味がないと言われている。しかしながら、日本国特許第４−１２６０３９号は、そのようなペプチドのカチオン結合特性を記載しておらず、本明細書に具体的に記載されたカゼインから得られるペプチドも記載していない。
【００１７】
ＷＯ００／０５９７２およびＷＯ０１／０１５４５１２は、カゼインまたは重合された加水分解カゼインなどの修飾カゼインをガムのエラストマー成分の一部として含むチューインガム組成物を記載している。しかしながら、これらの公表物は、そのような修飾されたカゼインのカチオン結合特性を記載していない。
【００１８】
本発明の目的は、生物活性金属イオンのデリバリーに有用な方法および／又は組成物、並びに歯エナメルの再石灰化および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯過敏症、または歯肉炎の治療または予防のための方法および／又は組成物を提供することであり、従来技術の不利な点を克服するのにいくらか助けとなるか、少なくとも公衆に有用な選択が提供される。
【００１９】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、有効量の生物活性金属イオン源、カゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物を部分架橋することにより得られるリンタンパク質調製物、および生理学的に許容できる１つ以上の希釈剤またはキャリアを含む、哺乳動物への生物活性金属イオンデリバリー用組成物を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、有効量の金属イオン源をカゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物の部分架橋により得られたリンタンパク質調製物と組み合わせて含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物への生物活性金属イオンのデリバリー方法を提供する。
【００２１】
更に態様において、本発明は、哺乳動物への生物活性金属イオンデリバリー用組成物の調製、およびカゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物の部分架橋により得られるリンタンパク質調製物の調製における使用を提供する。
【００２２】
金属イオンは２価であることが好ましい。
【００２３】
好ましい実施態様において、金属イオンは、カルシウム、鉄、亜鉛、コバルト、銅、およびマグネシウムからなる群から選択される。
【００２４】
組成物は、食料品、飲料、または錠剤若しくはカプセル剤などの薬学的ビヒクルの形態の経口用組成物であることが好ましい。
【００２５】
組成物のｐＨは、約６および９の間であることが好ましく、約６．５および８の間であることがことがより好ましく、約６．８および７．７の間であることが更により好ましく、約７および７．５．の間あることがことが最も好ましい。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、カゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物を部分架橋することにより得られた有効量のリンタンパク質調製物を１つ以上のキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む、哺乳動物における歯エナメルの再石灰化用および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯過敏症、または歯肉炎の治療または予防用組成物を提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物の歯をカゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物を部分架橋することにより得られた有効量のリンタンパク質調製物を含む組成物と接触させる工程を含む、哺乳動物における歯エナメルの再石灰化方法および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯過敏症、または歯肉炎の治療または予防方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における歯エナメルの再石灰化用および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯過敏症、または歯肉炎の治療または予防用組成物の調製、およびカゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物の部分架橋により得られるリンタンパク質調製物の調製における使用を提供する。
【００２９】
好ましい実施態様において、組成物は、カルシウムイオン源を更に含む。
【００３０】
組成物は、ホスフェートイオン源を含むことが好ましい。
【００３１】
組成物は、カルシウムイオンおよびホスフェートイオンの双方を含むことがより好ましく、好都合にはリン酸カルシウムとして加えられる。あるいは、カルシウムイオンおよびホスフェートイオンをリン酸ナトリウムおよび塩化カルシウムとして加えることができる。
【００３２】
特に好ましい実施態様において、カルシウムイオン源は、アラミン（ＡＬAMIN）の商標名（登録商標）で入手可能なものなどの天然ミルクカルシウムを含む。
【００３３】
カルシウムイオンは、好ましくはリンタンパク質調製物１グラムあたり少なくとも約５ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも約１０ｍｍｏｌ／ｇ、更により好ましくは少なくとも約２０ｍｍｏｌ／、より好ましくは少なくとも約３０ｍｍｏｌ／ｇのカルシウムイオンのレベルで組成物中に存在する。
【００３４】
カルシウムイオンとホスフェートイオンとのモル比は、好ましくは約０．８〜１．２：０．４〜０．８、より好ましくは約１：０．６の範囲である。
【００３５】
別の代替実施態様において、組成物は、ストロンチウムイオン源を含む。この実施態様において、組成物は、フッ化物イオン源も含むことが好ましい。
【００３６】
ある好ましい実施態様において、組成物は、チーズなどの食料品の形態であり、好都合には加工チーズまたはチューインガムなどの糖菓である。
【００３７】
好ましい代替実施態様において、組成物は、口内洗浄剤、または液状歯磨き剤などの歯磨き剤、練り歯磨き剤、粉末、乳濁液、若しくはゲルの形態である。
【００３８】
部分加水分解物は、酸カゼイン、レンネットカゼイン、またはカゼイン塩の酵素加水分解により得られることが好ましい。
【００３９】
酵素は、トリプシンであることが好ましく、好都合にはウシ由来のトリプシンまたはブタ膵トリプシンである。
【００４０】
部分加水分解は、約７〜約８のｐＨで行うことが好ましい。
【００４１】
加水分解度は、好ましくはペプチド結合の合計数の約３％〜約８％の範囲、より好ましくは約３．５〜約７％（約４％〜約６．５％など）の範囲である。
【００４２】
加水分解度は、好ましくはカゼインまたはカゼイン塩の約１０％以下、より好ましくは約５％以下が部分加水分解によってｐＨ７において不溶性となるものである。
【００４３】
部分加水分解物は、グルタミン転移酵素を用い、好ましくは約７〜約８のｐＨで、酵素により部分架橋することが好ましい。
【００４４】
部分架橋度は、得られるリンタンパク質調製物が、好ましくはタンパク質１グラムあたり約１０μｍｏｌ以上、より好ましくはタンパク質１ｇあたり約１０および約２５０μｍｏｌ、より好ましくはタンパク質１ｇあたり約５０および１６０μｍｏｌ（タンパク質１ｇあたり約１１０および１５０μｍｏｌの間など）の架橋を含むものである。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、リンタンパク質調製物がカゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物の部分架橋により得られ、架橋前におけるカゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解度がペプチド結合の合計数の約３％〜約８％、より好ましくは約３．５〜約７％（約４％〜約６．５％など）の範囲であり、部分架橋度はリンタンパク質調製物がタンパク質１グラムあたり約１０μｍｏｌ以上、より好ましくはタンパク質１ｇあたり約１０および約２５０μｍｏｌ、より好ましくはタンパク質１ｇあたり約５０および１６０μｍｏｌ（タンパク質１ｇあたり約１１０および１５０μｍｏｌの間など）の架橋を含むものである、新規なリンタンパク質調製物を提供する。
【００４６】
本発明は広範には上記の通りであるが、本発明はそれに限定されず、具体例を提供する以下の詳細な説明の実施態様も含む。
【００４７】
発明の詳細な説明
上記の通り、本発明は、哺乳動物への生物活性金属イオンのデリバリーのための方法および組成物に関する。本発明は、歯エナメルの再石灰化および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯過敏症、または歯肉炎の治療または予防のための方法および組成物にも関する。関連する態様において、本発明は、そのような方法および組成物に有用な新規なリンタンパク質調製物にも関する。
【００４８】
本出願人らは、驚くべくことに、カゼインまたはカゼイン塩を部分的に加水分解し、続いて部分加水分解物を部分架橋することによって、得られるリンタンパク質では、架橋されていない部分加水分解カゼインと比較して、２価カチオンの存在下での溶解性が増加し、かつ、２価カチオンを結合する能力が増加することの双方を見出した。
【００４９】
これらの特性により、そのようなリンタンパク質調製物は、ヒトまたは動物への生物活性金属イオン、特に、カルシウム、鉄、亜鉛、コバルト、銅、およびマグネシウムを含む２価カチオン投与用のデリバリービヒクルとして有用なものとなる。リンタンパク質調製物は、有意な量のカチオンと結合することができ、したがってカチオンの塩の溶液中での沈殿を妨げて、溶液中で該塩を維持し、それによってそのバイオアベイラビリティを増大させる。リンタンパク質調製物は未修飾カゼインより高い溶解性を有するので、それらは比較的容易に経口用組成物に導入できることも見出されている。
【００５０】
リンタンパク質調製物は、歯エナメルを再石灰化し、それによって酸蝕症または歯齲蝕を治療または予防する特定の用途を有する。如何なる理論に拘束されることを望むものではないが、リンタンパク質調製物のカルシウム（およびリン酸）イオンを可溶化する能力は、少なくとも一部はそれらの歯エナメルの再石灰化能力に原因があり得る。特に、リンタンパク質調製物は、歯エナメル表面の近くの溶液中で高濃度のカルシウムおよびホスフェートイオンを維持することができ、これらのイオンが鉱質除去された歯エナメルの孔に拡散して戻ることが容易となり、したがって再石灰化活性が増加する。リンタンパク質調製物は歯エナメル表面上にコーティングを形成することも見出され、カルシウムおよびホスフェートイオンのアベイラビリティを更に増大させることができる。
【００５１】
更に、本出願人らは、驚くべくことに、リンタンパク質調製物が、齲蝕を引き起こす細菌、具体的にはミュータンス連鎖球菌（Streptococus mutans）のエナメル表面への接着を阻害することも見出した。細菌は、齲蝕プロセスを開始するためには歯表面に接着することが必要であるため、細菌の接着の程度を減ずることによって、齲蝕形成の危険性を減ずることができる。したがって、本発明の方法のリンタンパク質調製物は、再石灰化修復機能のみならず、予防機能をも有する。本出願人らは、タンパク質が口腔カンジダ症に関与している酵母Ｃ．アルビカンスの接着を阻害することも見出した。
【００５２】
本発明に好適なリンタンパク質調製物は、カゼインの部分加水分解物、すなわち、全部ではないがいくつかのペプチド結合が加水分解されたカゼインを部分架橋することにより得ることができる。
【００５３】
部分加水分解物を調製するために用いられるカゼインはいずれの形態であることができ、酸カゼイン、レンネットカゼイン、またはカゼイン塩はすべて用いることができる。化合的な加水分解を何ら除外するものではないが、部分加水分解は酵素により水溶液中で行うことがことが好ましい。部分加水分解を行うのに好適な酵素には、トリプシンおよびキモトリプシンなどのプロテアーゼが含まれる。しかしながら、用いる酵素は、トリプシンであることが特に好ましく、好都合にはウシ由来のトリプシンまたはブタ膵トリプシンである。
【００５４】
部分加水分解は、用いる酵素に適当な温度およびｐＨで行うことができる。例えば、ウシ由来のトリプシンを用いる場合、部分加水分解は、約７〜約８のｐＨおよび約３７℃の温度で好都合に行うことができる。このｐＨでは、カゼインは、反応溶液中に用いられている緩衝液に依存して、カゼイン塩、例えばカゼイン酸ナトリウムとして存在することは十分に理解されている。
【００５５】
反応は、所望の加水分解度が達成される酵素およびカゼイン濃度などの適当な条件下で十分な期間行わなければならない。所望の加水分解度が達成されたとき、例えば酵素を変性させる温度（例えば約８０℃）に反応混合物を加熱することによって酵素を不活化することにより、反応を好都合にあるいは少なくとも実質的に終了することができる。所望の加水分解度が達成されたら直ぐに後述の部分架橋反応を開始するならば、加水分解反応を完全に終了させることはあまり重要ではない。すなわち、部分架橋反応が行われている間、軽微な量の加水分解が未だ続いている。
【００５６】
元のペプチド結合加水分解されたのパーセンテージに関して、約３％〜約８％の範囲、より好ましくは約３．５％〜約７％（約４％〜約６．５％など）の加水分解度を有する部分的に加水分解されたカゼインを生ずる条件下で、部分加水分解を行うことが好ましい。
【００５７】
加水分解度は、好ましくはカゼインまたはカゼイン塩の約１０％以下、より好ましくは約５％以下が部分加水分解プロセスによってｐＨ７で不溶性となるものである。
【００５８】
加水分解度は、当業者に既知である方法、好都合にはＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法によって測定することができる。
【００５９】
部分的に加水分解されたカゼインまたはカゼイン塩の分子量プロフィールは、カゼインの分子量より小さいが、以下の分布より大きいことが好ましい：約１．７％≧３０，０００Ｄａ、２２％＜３０，０００Ｄａ、および≧２１，０００Ｄａ、２２％＜２１，０００Ｄａ、および≧１２，０００Ｄａ、５４．３％＜１２，０００Ｄａ。
【００６０】
部分的に加水分解されたカゼインまたはカゼイン塩の分子量プロフィールは、カゼインの分子量より小さいが、以下の分布より大きいことがより好ましい：約９．４％≧３０，０００Ｄａ、４８％＜３０，０００Ｄａ、および≧２１，０００Ｄａ、１１％＜２１，０００Ｄａおよび≧１２，０００Ｄａ、３１．６％＜１２，０００Ｄａ。
【００６１】
部分的に加水分解されたカゼインまたはカゼイン塩の分子量プロフィールは、カゼインの分子量より小さいが、以下の分布より大きいことがより好ましい：約１１％≧３０，０００Ｄａ、５０％＜３０，０００Ｄａ、および≧２１，０００Ｄａ、１０％＜２１，０００Ｄａ、および≧１２，０００Ｄａ、２９％＜１２，０００Ｄａ。
【００６２】
部分的に加水分解されたカゼインまたはカゼイン塩の分子量プロフィールは、カゼインの分子量より小さいが、以下の分布より大きいことが最も好ましい：約１３％≧３０，０００Ｄａ、５３％＜３０，０００Ｄａ、および≧２１，０００Ｄａ、８％＜２１，０００Ｄａ、および≧１２，０００Ｄａ、２６％＜１２，０００Ｄａ。
【００６３】
部分的に加水分解されたカゼインの分子量プロフィールは、好都合には、サイズ排除ゲル濾過により、当業者に既知の方法を用いて測定することができる。例として、部分的に加水分解されたカゼインを好適な溶媒、好都合には６Ｍ尿素に溶解し、例えばスーパーデックス（Superdex）２００１０／３０ＨＲカラムを用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ系）を用いてタンパク質分画を分離し、溶出されたタンパク質をＵＶ吸収（好都合には２８０ηｍで）により検出することができる。次いで、タンパク質吸収曲線の積分により、溶出されたタンパク質の分子量分布を計算することができる。当業者は、タンパク質吸収曲線が緩衝液および緩衝液濃度の選択に依存することを十分に理解している。
【００６４】
当業者は、反応時間および酵素濃度などの反応条件を適切に変えることにより、所望の加水分解度を有する部分的に加水分解されたカゼインを得ることができることを十分に理解している。例示として、好適な加水分解度を有する部分的に加水分解されたカゼインは、まず１０％等電点沈殿カゼイン溶液を５０℃においてＮａＯＨにより可溶化してｐＨ７とすることにより得ることができる。次いで、溶液を３７℃に冷却し、ブタ膵トリプシン調製物（好適な調製物は、ノボ．４５００Ｋ（分子量２３，４００Ｄａ、活性４５００ＵＳＰ単位／ｍｇ）として市販されている）を約０．０１％ｗ／ｗカゼインで加え、１５分間インキュベーションする。酵素の不活化は、８０℃に加熱し、５分間保持することによって達成することができる。
【００６５】
部分的に加水分解されたカゼインが調製されたら直ぐに、それを部分架橋して本発明によるリンタンパク質調製物を形成する。
【００６６】
本明細書中で用いられる通り、「架橋」との用語は、カゼインまたはカゼイン塩の部分加水分解物を部分架橋することとの関連で用いる場合、カゼイン分子のアミノ酸残基および／又は部分加水分解物を含むカゼイン分子フラグメントの間の分子間共有結合の形成を意味する。分子間共有結合は、グルタミンおよびリシン残基間の結合、すなわち、グルタミル／リシル共有結合を含むことが好ましい。いくつかの分子内架橋、すなわち、同じカゼイン分子またはカゼインフラグメント上のアミノ酸残基間での架橋が起こる可能性も高いことも十分に理解されている。
【００６７】
「部分的」との用語は、「部分架橋」との関連で用いる場合、架橋反応後、すべてのアミノ酸残基が架橋されてはないこと、すなわち、いくつかの架橋されていないアミノ酸残基が残っていることを意味する。
【００６８】
本明細書中では、部分架橋度をタンパク質１グラムあたりのマイクロモルの架橋で表す。
【００６９】
グルタミル／リシル結合の量に関する部分架橋度は、好都合には、架橋タンパク質を好適な酵素、好都合にはプロナーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、プロリダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼを用いてタンパク質分解消化を行い、続いてタンパク質分解消化産物のＨＰＬＣおよびε−（γ−グルタミル）リシン（Ｇ−Ｌ）ピークの定量を行うことによって、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により決定することができる。
【００７０】
部分架橋は、好都合には、リシルオキシダーゼまたはグルタミン転移酵素のいずれかの酵素を用いて酵素によって行うことができる。
【００７１】
グルタミン転移酵素を用い、重合を約７および８の間のｐＨにおいて行うことが特に好ましい。部分架橋は、所望の架橋度が起こる条件下および十分な期間行うことが望ましい。反応は、得られるリンタンパク質調製物中の架橋度が、タンパク質１グラムあたり約１０μｍｏｌ以上、より好ましくはタンパク質１グラムあたり約１０および約２５０μｍｏｌの間、より好ましくはタンパク質１グラムあたり約５０および１６０μｍｏｌの間（タンパク質１グラムあたり約１１０および１５０μｍｏｌの間など）の架橋を含むこととなる条件下で行うことが好ましい。
【００７２】
この場合でも、所望の架橋度が達成されたら直ぐに、典型的には酵素を変性させるのに十分な温度（例えば約８０℃）に約５分間反応混合物を加熱することによって酵素を不活化することにより反応を終了することができる。部分架橋および酵素の不活化の完了後、得られたリンタンパク質含有溶液を透析またはダイアフィルトレーションして、任意の残留低分子量ペプチドおよび塩を好都合には約１０，０００〜約１４，０００Ｄａの分子量カットオフを有する膜を用いて除去することも一般的に好ましい。精製リンタンパク質含有溶液を凍結乾燥または噴霧乾燥して固体形態のリンタンパク質調製物を得ることができる。
【００７３】
任意の市販されているグルタミン転移酵素供給源を用いて、部分架橋を行うことができる。例として、好適な酵素は、アクティバ（Activa）ＭＰとして味の素社から市販されている１％グルタミン転移酵素調製物である。
【００７４】
あるいは、プラステイン反応（当業者に既知である酵素反応である）を用いることができる。架橋は、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素を用いてチロシン残基間で行うこともできる。
【００７５】
カゼイン部分加水分解物の部分架橋を酵素により行うことが好ましいが、二官能性アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）などの好適な試薬を用いた化学的方法による部分架橋を除外するものではない。
【００７６】
当業者は、反応時間および酵素濃度などの反応条件を適切に変えることによって所望の架橋度を有するリンタンパク質調製物を得ることができることを十分に理解している。
【００７７】
例として、好適な架橋度を有するリンタンパク質調製物は、上記の通りに調製された部分的に加水分解されたカゼインを、グルタミン転移酵素調製物（味の素社から市販されているアクティバＭＰ）を４．５％ｗ／ｗカゼインの比で加え、反応混合物を４０℃で１８時間インキュベーションすることで処理して得ることができる。
【００７８】
リンタンパク質調製物を、ヒトおよび動物への生物活性金属イオン、特に２価金属イオンのデリバリーに好適な組成物に導入することができる。そのような組成物は、錠剤またはカプセル剤などの薬学的ビヒクルの形態であることができる。リンタンパク質調製物を生理学的に有用な量の生物活性金属イオン源および１つ以上の生理学的に許容できるキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む錠剤またはカプセル剤は、当業者に既知である標準方法を用いて調製することができる。本発明の組成物に導入される生物活性金属イオン源の所望の量、すなわち有効量は、対象の特定のカチオンおよび組成物の対象となる哺乳動物によって必要となる量、例えば、鉄、亜鉛、マンガン、モリブデン、銅、クロムのように微量の鉱質であるか、あるいはカルシウのようにより多量に必要となるかに依存して変わる。
【００７９】
あるいは、リンタンパク質調製物を投与することが望まれる生物活性金属イオン源と組み合わせて食料品または飲料に導入することができる。例えば、リンタンパク質調製物を有効量のカルシウム供給源（リン酸カルシウムなど）または鉄と組み合わせて含む組成物をそれぞれカルシウムまたは鉄の補充が必要なヒトまたは動物に投与することができる。
【００８０】
リンタンパク質調製物は、歯を再石灰化する、および酸蝕症、歯齲蝕、歯過敏症、または歯肉炎治療または予防する特定の用途も有する。
【００８１】
そのような用途に有用であり、かつ、歯をリンタンパク質調製物と接触させるのに好適な組成物は、多くの形態をとることができる。例えば、そのような組成物は、リンタンパク質を含む口内洗浄剤、液状歯磨き剤などの歯磨き剤、練り歯磨き剤、粉末、乳濁液、またはゲルなどの形態をとることができる。あるいは、リンタンパク質調製物は、チーズ（例えば、加工チーズ）などの食料品またはチューインガムなどの糖菓に導入することができる。
【００８２】
リンタンパク質調製物に加えて、そのような組成物はカルシウムイオン源を含むことが好ましく、ホスフェートイオン源も含むことが好ましい。例えば、リン酸カルシウムを組成物中に含ませることができる。カルシウムおよびホスフェートイオンは唾液中に存在しているが、リンタンパク質のカルシウム結合特性を利用し、歯エナメルと接触するカルシウムおよびホスフェートイオンの濃度を最大にするため、これらのイオン源を導入することが好ましい。
【００８３】
カルシウムイオンが、タンパク質調製物１グラムあたり少なくとも約５ｍｍｏｌ（少なくとも約１０ｍｍｏｌなど、約２０ｍｍｏｌなど、約３０ｍｍｏｌなど）のカルシウムイオンリンのレベルで組成物中に存在することが特に好ましい。カルシウムイオンとホスフェートイオンとのモル比は、好ましくは約０．８〜１．２：０．４〜０．８、より好ましくは約１：０．６の範囲である。
【００８４】
いくつかの特に好ましい実施態様において、カルシウムイオン源は、カルシウムが一般的にはカルシウムヒドロキシアパタイトの形態である天然ミルクリン酸カルシウムを含む。天然ミルクリン酸カルシウムは市販されており、特に好ましい実施態様は、カルシウム、ホスフェート、更にタンパク質、ラクトース、脂肪、水分、ナトリウム、カリウム、および塩化物を以下の典型的な割合で含みているラミニンの商品名（登録商標）でニュージーランドミルク生産物社から市販されているものである：
ミネラル含量合計７０％（ｗ／ｗ）：２８％カルシウムおよび４８％ホスフェート
タンパク質（Ｎｘ６．３８）  ７％
ラクトース                  ４％
脂肪                        １％
遊離水分                    ３％
結合水分                    ８％
カルシウム                  ２８，０００ｍｇ／１００ｇ
リン                        １６，０００ｍｇ／１００ｇ
ナトリウム                  ４００ｍｇ／１００ｇ
カリウム                    ３００ｍｇ／１００ｇ
塩化物                      １００ｍｇ／１００ｇ
【００８５】
天然ミルクリン酸カルシウムは、当業者に既知である方法、典型的には、酸ホエー浸透液を清澄および低温殺菌し、浸透液を冷却して限外濾過し、続いて加熱し、ｐＨ調整し、高温で保持し、その結果、リン酸カルシウムを含む鉱質が沈殿し、該沈殿物を回収することにより得ることができる。
【００８６】
別の好適な天然ミルクリン酸カルシウム供給源は、ＤＭＶインターナショナル社（DMV International．）からラクトバル（Lactoval）（登録商標）の商標名の下で市販されている生産物である。
【００８７】
組成物に含ませることができる他のアニオンには、フッ化物およびフロオロホスフェートが含まれる。
【００８８】
別の実施態様において、組成物は、カルシウムイオンに加えて、あるいはカルシウムイオンに代えて、ストロンチウムイオン源を含むことができる。そのような組成物は、歯過敏症の治療に特に有用である。
【００８９】
本発明の組成物のｐＨは、生物活性金属イオンデリバリー用または上記の歯の用途用のいずれの組成物の形態においても、約６および９の間で緩衝化されることが一般的に好ましく、より好ましくは約６．５および８の間、更により好ましくは約６．８および７．７の間、最も好ましくは約７および７．５．の間で緩衝化される。
【００９０】
本発明の一実施態様において、上記のリンタンパク質調製物を天然ミルクリン酸カルシウムと組み合わせて含む加工チーズ生産物を提供する。本発明のこの実施態様において、生産物は、食餌カルシウム供給源としておよび再石灰化／抗齲蝕性性質を有することの両方の働きをすることは十分に理解される。
【００９１】
生産物の加工チーズ成分は、生産物の約９０〜約９８重量％（約９４〜約９６重量％など）、典型的には約９５重量％の量で存在することが好ましい。リンタンパク質調製物は、典型的には、生産物の約０．５〜約３重量％（約１〜約２％など）、典型的には約１．２〜約１．６重量％を含むことができる。天然ミルクリン酸カルシウムは、典型的には、生産物の約０．５％〜約４．５重量（約２〜約３．５％など）、典型的には約２．５％〜約３重量％を含むことができる。
【００９２】
本発明の別の特定の実施態様において、本明細書中に記載されたリンタンパク質調製物を天然ミルクカルシウム、好都合には市販されているアラミン（登録商標）と組み合わせて含む乳濁液の形態の組成物を提供する。リンタンパク質調製物は、好都合には、乳濁液の約１％〜約１５重量％（約５％〜約１２％など）、典型的には約９％〜１１％の量で存在することができる。天然ミルクリン酸カルシウムは、乳濁液の約３％〜約１２重量％（約５％〜約１０％など）、典型的には約６〜約９重量％の量で存在することができる。乳濁液は、乳化剤、増粘剤、香味剤、および甘味料などの１つ以上の追加の成分を含むことが好ましい。そのような追加の成分は、歯の使用のための乳濁液タイプの配合物における使用に好適なものとして、当業者が選択することができる。
【００９３】
以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をより詳細に記載する。
【００９４】
実施例
実施例１
リンタンパク質調製物およびカルシウム結合
トリプシン加水分解
１０％等電点沈殿カゼイン溶液を５０℃においてＮａＯＨにより可溶化してｐＨ７．０とした。可溶性となったら直ぐ、溶液を３７℃に冷却し、ウシ由来のトリプシン（ノボ社（Novo））を０．０１〜０．２％ｗ／ｗカゼインで加え、最高で２時間インキュベーションし、次いで８０℃に加熱し、５分間保持した。
【００９５】
ロット番号        酵素濃度          加水分解時間        加水分解度
％重量／重量カゼイン    ／分
ＭＡＰ１０
ロット５      ０．０１                  １５            ５．７
ロット６      ０．０１                  ３０            ６．０
ロット７      ０．０１                  ４５            ６．３
ロット１      ０．０１                  ６０            ７．０
【００９６】
リンタンパク質調製物の分子量プロフィールを、以下の通り、ゲル濾過によって決定した。６Ｍ尿素中５０ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ７．５の１％タンパク質溶液を緩衝液として調製した。この溶液を１００００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍフィルターを通過させた。試料体積５００μｌをスーパーデックス２００１０／３０ＨＲカラムを備えたファルマシア社（Pharmacia）ＦＰＬＣの１００μｌ試料ループに注入した。用いた流し緩衝液は５０ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ７．５の６Ｍ尿素であり、流量は０．５ｍｌ／分とした。検出は、ＵＶ吸収（２８０ηｍ）によるものとした。タンパク質吸収曲線を積算し、恣意で以下の４つの分子量の群に分けた：１）約３０，０００ダルトンより大きい、２）約３０，０００ダルトンより小さく、約２１，０００ダルトンより大きい、３）約２１，０００ダルトンより小さく、約１２，０００ダルトンより大きい、４）約１２，０００ダルトンより小さい。
【００９７】
ロット５、６、および１の％分布として表したロット５、６、７、および１の分子量プロフィール（部分加水分解後）
分子量範囲                                    ロット番号
５              ６              ７          １
≧３０，０００                  １３．６６  １１．６６    ９．４      ９．８４
＜３０，０００、≧２１，０００  ５３．７４  ５０．７８    ４９．１３  ４８．８７
＜２１，０００、≧１２，０００  ７．５８      ９．９９    １１．３７  １０．９２
＜１２，０００                ２５．０２    ２７．５７    ３０．１    ３０．３７
【００９８】
グルタミン転移酵素処理
ｐＨを７．０に再調整し（必要な場合）、グルタミン転移酵素（市販の１％調製物、味の素社）を４．５％ｗ／ｗカゼインの比で加え、４０℃で所望の期間インキュベーションした。
酵素の不活化は、８０℃に加熱し、５分間保持することにより行った。修飾タンパク質の溶液を凍結乾燥した。
【００９９】
μｍｏｌ架橋／ｇタンパク質として表したグルタミン転移酵素による処理後に形成されたの架橋数
ロット番号                    架橋時間（時）
１          ６          １８
ロット５            ５０        ９８        １６８
ロット６            ５１        ９０        １５２
ロット７            ５５        ９５        １５０
ロット１            ５７      １０９        １５９
【０１００】
タンパク質調製物のカルシウム結合能の測定
水中でタンパク質を再懸濁し、一定のｐＨの下でカルシウムおよびホスフェートイオンを設定比で加え、不溶性の物質（塩およびタンパク質）を除去し、次いで可溶性の結合していない塩を除去し、可溶性タンパク質に結合しているカルシウムの量を決定することにより、タンパク質のカルシウム結合能を決定した。実験の詳細は以下の通りであった。
【０１０１】
タンパク質の１％溶液をミリＱ水に溶解し、１時間放置して確実に完全に水和させた。塩化カルシウムを０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、および５０ｍＭのレベルで加え、よく混合しながら２５℃で１時間インキュベーションした。リン酸ナトリウムを０．６のモル比でカルシウムに加えた。実験全体にわたって、ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０で維持した。試料をよく混合しながら２５℃で６〜１０時間インキュベーションした。インキュベーション後、試料を１００００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍナイロンフィルターを通して濾過し、２部に分けた。
【０１０２】
試料の一方の部を２ｍｌ試料ループに注入し、セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（Ｖｔ＝２５ｍｌ）脱塩カラムを備えるファルマシアＦＰＬＣにローディングした。流し用緩衝液はｐＨ７の１０ｍＭＨＥＰＥＳであり、流量を２ｍｌ／分とし、検出はＵＶ吸収（２８０ηｍ）、伝導率、およびｐＨによって行なった。タンパク質ピークを収集し、カルシウム濃度を原子吸収分光法（ＡＡＳ）により決定した。
【０１０３】
他方の部を用いて、フォリンタンパク質アッセイによって可溶性のタンパク質含量を決定した。
【０１０４】
初期タンパク質１グラムあたりのｍｇＣａ2+として表したグルタミン転移酵素処理前（０時間）および処理後（１、６、または１８時間）のロット５のカルシウム結合能
加えたＣａ2+のｍｍｏｌ        グルタミン転移酵素で処理した時間
０              １                ６            １８
３０                ３．２          ７．３          ２４．２        ３１．２
４０                １．１          １．２          ３４．７        ３７．６
【０１０５】
初期タンパク質１グラムあたりのｍｇＣａ2+として表したグルタミン転移酵素処理前（０時間）および処理後（１、６、または１８時間）のロット６のカルシウム結合能
加えたＣａ2+のｍｍｏｌ        グルタミン転移酵素で処理した時間
０              １            ６            １８
３０                    ９．３        ３２．３      ３２．１        ４０．２
４０                    ０．０          ２．６        ７．１          ４．２
【０１０６】
初期タンパク質１グラムあたりのｍｇＣａ2+として表したグルタミン転移酵素処理前（０時間）および処理後（１、６、または１８時間）のロット７のカルシウム結合能
加えたＣａ2+のｍｍｏｌ        グルタミン転移酵素で処理した時間
０            １                ６          １８
３０                  １６．１      ２４．６        ２８．５      ３２．０
４０                    ３．０        ２．４            なし        ７．４
【０１０７】
初期タンパク質１グラムあたりのｍｇＣａ2+として表したグルタミン転移酵素処理前（０時間）および処理後（１、６、または１８時間）のロット１のカルシウム結合能
加えたＣａ2+のｍｍｏｌ          グルタミン転移酵素で処理した時間
０            １                ６          １８
３０                  ２４．６      １６．０        ２１．９      ３６．４
４０                  ２．４          １．９          ６．１      ２１．１
【０１０８】
初期タンパク質１グラムあたりのｍｇＣａ2+として表したカゼイン塩のカルシウム結合能
加えたＣａ2+のｍｍｏｌ    結合したＣａ2+のｍｇ
０                        ０．０
５                        ２．８
１０                        ２．３
１５                        １．７
【０１０９】
上記の異なるタンパク質は、カゼインの加水分解度の範囲（ロット５で加水分解が最も少なく、ロット１で加水分解が最も多い）、およびグルタミン転移酵素による加水分解産物の架橋の範囲（０時間で架橋なし、１８時間で最も多い架橋）を表す。ロット５のタンパク質がＣａ2+により引き起こされる沈殿に最も抵抗性であり、４０ｍｇＣａ／ｇタンパク質ローディングした最大に近いカルシウムは４０ｍＭのＣａ2+溶液中で未だ可溶なままであった。
【０１１０】
カゼインの加水分解度が大きくなるに従って、タンパク質は、多大なＴｇ架橋後でも、より高いＣａ2+濃度の存在下での沈殿に対して抵抗性が小さくなった。非架橋試料はいずれも沈殿に抵抗性ではなく、すべての試料において架橋が大きくなるに従って抵抗性も増した。
【０１１１】
天然カゼインのＣａ2+結合能は、最後の表で実証されている。天然カゼインは、Ｃａ2+濃度が増加に従って速やかに沈殿し、Ｃａ2+の５ｍＭでちょうど２．８ｍｇＣａ2+／ｇカゼインの最大の結合を有する。
【０１１２】
カゼイン塩の結果は、部分架橋された加水分解カゼインの溶解性／結合の驚くべき性質によって、未修飾カゼイン塩と同様の（あるいはカゼイン塩より大きい）平均分子量を有するタンパク質が実質的により多くのカルシウムイオンを結合し、かつ、可溶なままとすることを例証している。
【０１１３】
実施例２
リンタンパク質の調製
トリプシン加水分解
トリプシン加水分解
１０％等電点沈殿カゼイン溶液を５０℃においてＮａＯＨにより可溶化してｐＨ７．０とした。可溶性となったら直ぐ、溶液を３７℃に冷却し、ウシ由来のトリプシン（ノボ．４５００Ｋ、分子量２３，４００Ｄａ、活性４５００ＵＳＰ単位／ｍｇ）を０．０１ｗ／ｗのカゼインで加え、１５分間インキュベーションした。酵素の不活化は、８０℃に加熱し、５分間保持することにより行った。
【０１１４】
ロット５の分子量プロフィール
分子量範囲
＞３０，０００                    １３．６６
＜３０，０００、＞２１，０００    ５３．７４
＜２１，０００、１２，０００      ７．５８
＜１２，０００                    ２５．０２
【０１１５】
グルタミン転移酵素処理
ｐＨを７．０に再調整し（必要な場合）、グルタミン転移酵素（市販の１％調製物、アクティバＭＰ、味の素社）を４．５％ｗ／ｗカゼインの比で加え、４０℃で１８時間インキュベーションした。酵素の不活化は、８０℃に加熱し、５分間保持することにより行った。３０，０００Ｄａより大きい分子量の材料が１００％増加した。
【０１１６】
実施例３
歯再石灰化（硬化（hardening））
３つの生産物の再石灰化（硬化）ポテンシャルを決定した。生産物は、ヒト唾液、カゼイン塩溶液、および部分的に加水分解されたカゼインの部分架橋により得られるリンタンパク質調製物とした。生産物の再石灰化効力は、処理後に調節された酸エッチングを施したヒトエナメルの硬度の回復を測定することによって決定した。
【０１１７】
エナメル調製物
ヒト未萌出３モル比をすべての実験で用いた。抽出後、歯をアニラック（anylac）ブラシおよび脱イオン水により機械的に清浄し、必要になるまで１０％緩衝化ホルマリン溶液（ｐＨ７．０）中で４℃で保存した。
【０１１８】
使用前、歯を十分にすすぎ、縦方向に切断し、次いでエポキシ樹脂に埋包した（アラルダイト）。各被検物を、流水下、次第に２４０〜６００グリットとなる炭化ケイ素グリットを用いて、ガラスプレート上において手で細かくした。細研磨は、回転研摩機上で、被検物を湿らせておくために蒸留水を用いて、８インチのラップ（Laps）を用いて、３μｍのダイアモンド研摩材で５分間、１μｍのダイアモンド研摩材で更に５分間行った。各研磨処理の間、超音波用浴を用いて残骸を除去した。被検物を解剖顕微鏡（１５×）下で評価し、ヒビ、キズ、発達上の欠陥、または抽出の損傷のいずれの証拠を有するものを除いた。選択した試料を１０％緩衝ホルマリン溶液（ｐＨ７．０）中で４℃において必要となるまで保存した。
【０１１９】
エナメル鉱質除去
研磨された無傷のエナメル被検物を１％（ｗ／ｖ）クエン酸２５ｍｌ中、３７℃で１０分間個々に鉱質除去して、腐食した外傷を作り出した。鉱質除去後、被検物を脱イオン水で十分に洗浄し、次の工程前に脱イオン水中で保存した。溶液のｐＨは２．３であった。
【０１２０】
再石灰化
再石灰化生産物の調製
唾液：顎下腺唾液を健康なボランティアから集め、１０ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムアジドを加えた。再石灰化手順において、２４ミリリットルの唾液を各被検物に用いた。
【０１２１】
１０％カゼイン塩溶液（ＣＮ−６０Ｃａ）：ＣＮ−６０Ｃａは、３６ｍｍｏｌ／Ｌの（ＰＯ4）3-（ｐＨ９．０）、６０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ2+、および１０％（ｗ／ｖ）乳酸カゼインを含むものであった。溶液を磁気撹拌機を用いて室温で十分に混合した。水浴中で５０℃で１５分間インキュベーションし、室温に冷却した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムアジドを保存剤として加え、次いで１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨによりｐＨ７．５に調整した。
【０１２２】
１０％リンタンパク質溶液（ＰＣ−６０Ｃａ）：ＰＣ−６０Ｃａは、３６ｍｍｏｌ／Ｌの（ＰO4）3-（ｐＨ９．０）、６０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ2+、および部分的に加水分解されたカゼイン塩の部分架橋により得られた１０％（ｗ／ｖ）リンタンパク質調製物（ＰＣ）から成るものであった。リンタンパク質調製物は、実施例２に記載される通り、約４％の加水分解度を有するカゼイン塩溶液をグルタミン転移酵素により処理することにより得た。他の条件は、ＣＮ−６０Ｃａ７．５について記載した通りとした。
【０１２３】
エナメル再石灰化プロトコル
選択した被検物を別々の再石灰化溶液中で処理した。被検物を、個々に密封された８０ｍｌビーカー中、フレッシュな再石灰化溶液４０ｍｌ（一定の振盪下）に３７℃において４時間浸漬した。ＣＮ６０Ｃａも１６時間インキュベーションした。
【０１２４】
鉱質除去／再石灰化の評価
表面微小硬度（ＳＭＨ）評価
エナメルのブロックの表面微小硬度（ＳＭＨ）を、ビッカース（Vickers）ダイアモンドを用いて、２０秒間で２００ｇの荷重の下、レイズ・ミニロード（Leitz  MiniLoad）硬度機器により測定した。被検物を硬度機器の化合物ステージへの圧子に対して垂直に保持した。表面硬度決定のために、１５個の押込み（indentations）を個々の被検物の各表面上で平均化した（ダイヤモンド圧子の規格化後、および４００倍の倍率を用いる）。
【０１２５】
エナメルの押込み長さの少なくとも２倍の距離を押込み間で保ち、隣接する押込みの間の相互作用を最小にした。ＳＭＨの読み取りを、以下の通りの３段階のエナメル鉱質除去／再石灰化モデルで行った：（１）鉱質除去溶液（ＤＳ）への暴露前、（２）ＤＳ（１％クエン酸）への暴露および軟化後、および（３）再石灰化溶液または対照溶液への暴露後。ＳＭＨの初期検査後（段階１）、各被検物にＤＳ中で３７℃で１０分間鉱質除去を行なった。各被検物を溶液２５ｍｌに個々に浸漬した。次いで、暴露後に被検物を溶液から取り除き、脱イオン水中で十分に洗浄し、３ｍｍの濾紙で吸い取って乾燥し、ＳＭＨの再検査を行なった（段階２）。選択した再石灰化処理の後、被検物を溶液から取り除き、脱イオン水中で十分に洗浄し、再度吸い取り乾燥し、ＳＭＨの再試験を行なった（段階３）。ベースラインＳＭＨ値（段階１）および再硬化値（段階３）をそれぞれ軟化値（段階２）から差し引くことにより、ＤＳおよび異なる再石灰化溶液の軟化および再硬化ポテンシャルを各被検物について計算した。
【０１２６】
測定したＳＭＨおよび２つのダイアモンドのビッカース押込み平均の長さの間の関係を式１：ＳＭＨ（ｋｇ／ｍｍ2）＝１８５４×Ｐ／ｄ２［１］（式中、Ｐは、荷重（グラム）であり、ｄは、測定された押込みの対角線の平均の長さ（ミクロン）である）により決定した。ＳＭＨの数は、本研究で用いたレイズ・ミニロード硬度機器による顕微鏡測定から直接得たものである。鉱質除去および再石灰化された被検物についてＳＭＨ数を一様目盛で定量的に比較するために、ＳＭＨ前後の測定を軟化したＳＭＨおよび達成された再石灰化の量の間の変化の収率に比例する値に変換することが必要であった。これらの２つの結果の間の比較のため、式２：Ｒ（％）＝［（ＰＳＭＨ）３−（ＰＳＭＨ）２］／［１００−（ＰＳＭＨ）２］×１００％［２］（式中、ＰＳＭＨ３およびＰＳＭＨ２は以下のように意味となる：ＰＳＭＨ３＝［段階３のＳＭＨ／段階１のＳＭＨ］×１００％、ＰＳＭＨ２＝［段階２のＳＭＨ／段階１のＳＭＨ］×１００％）を用いて、再石灰化効果の違いを計算した。
【０１２７】
したがって、式２中のＲは、本研究における段階３の再硬化収率、再石灰化収率、または回復収率である。
【０１２８】
結果
表１．エッチングされたエナメル表面に対する顎下腺唾液、カゼイン塩溶液、およびリンタンパク質調製物（部分的に加水分解されたカゼインの部分架橋により得られる）の効果
【表１】
0004723249.tif 000002
Ｎ＝１５（各被検物）
段階１：初段階での微小硬度試験
段階２：１０分間の１．０％クエン酸エッチング後の微小硬度試験
段階３：処理群：再石灰化溶液による処理後の微小硬度試験
*段階２のすべての値は、段階１の値より有意に小さかった（Ｐ＜０．００１）。
**処理群では、段階３の値は、段階２の値よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）。
***対照群では、段階３の値は、段階２値よりも有意に大きくはなかった。
【０１２９】
エッチングされたエナメル表面に対する唾液の効果
表１により、ヒト顎下腺唾液は４時間の処理後にエッチングされたエナメルのＳＭＨ数を有意に増加させることを示している。酸エッチング後の相対ＳＭＨは元の値の７７．３％に減少し（段階２）、唾液による１６時間の処理後、これは９１．９％に増加した（段階３）。再石灰化収率（Ｒ）の平均は６５．５％であった。
【０１３０】
１０％カゼイン塩（ＣＮ）のエッチングされたエナメル表面に対する効果
有意な再硬化が見出される前に、１０％カゼイン塩溶液（ＣＮ−６０Ｃａ７．５）による１６時間の処理が必要であり、４時間の群では効果が観察されなかった。１６時間処理後、ＳＭＨ数は、４つの被検物うち３つで有意に増加した（それぞれ、Ｐ＝０．００１、Ｐ＜０．００３、Ｐ＝０．０１５）（表１）。酸エッチング後、相対ＳＭＨは元の値の８０．６％に減少し（段階２）、カゼイン塩溶液による１６時間の処理後、これは８６．５％に増加した（段階３）。Ｒの平均は３２．１％であった。
【０１３１】
部分的に加水分解されたカゼインの部分架橋により得られるリンタンパク質（ＰＣ）のエッチングされたエナメル表面に対する効果
表１は、３６ｍｍｏｌ／Ｌの（ＰO4）3-、６０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ2+とともに部分的に加水分解されたカゼインの部分架橋により得られるリンタンパク質調製物（ＰＣ）による処理後のエナメル表面のＳＭＨ数の変化を示す。すべての１０個の被検物とともにＰＣ−６０Ｃａ中で４時間インキュベーションした後のエッチングされたエナメルのＳＭＨ数は有意に増加した。被検物のうち７つは、ほどんど初期（エッチング前）のＳＭＨ値に戻った。ＰＣ−６０Ｃａによる処理後、ＳＭＨ数は、２つの試験において、初期レベルのＳＭＨ数より有意に高かった（２０％）（Ｐ＝０．０１２）。
【０１３２】
酸エッチング後、相対ＳＭＨは元の値の７８．３％に減少し（段階２）、ＰＣ溶液による４時間の処理後、これは９８．２％に増加した（段階３）。再石灰化収率（Ｒ）は９２．１％（ｎ＝１０）であった。
【０１３３】
酸エッチングされたエナメルをＣａ2+なしのリンタンパク質溶液（ＰＣ−Ｃａなし）またはリンタンパク質調製物なしのリン酸カルシウム緩衝液（ＰＣ−６０Ｃａなし）に曝すことによっては、硬度の有意な回復はなかった（表１）。
【０１３４】
エッチングされたエナメル表面の回復収率に対する異なる再石灰化溶液の性能の概要
エナメル再石灰化収率を図１に示す。溶液間の再石灰化収率の違いは明らかであった。ＰＣ−６０Ｃａは、他のものよりも明確に大きい再石灰化ポテンシャルを生じた。
【０１３５】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＡＰ）による鉱質除去および再石灰化評価
エッチング前における走査型電子顕微鏡によるエナメル表面の検査では、表面が滑らかであることが示された（図２）。対照的に、無傷のエナメルの酸エッチングによっては、（１）表面エナメルの損失、（２）歯の表面の荒面化に起因する歯の表面積の増加、および（３）表面の不活性エナメル除去後におけるより活性な表面の暴露がもたらされることが見出された（図３）。
【０１３６】
ＰＣ−６０Ｃａによる処理後、エッチングされたエナメル表面が、よくある桿形状の生成物とともに比較的滑らかで高密度のコーティングで被覆された。ほとんどの領域において、程々に一様な表面コーティングが、長さ０．５〜１μｍの接着性反応生成物とともに存在していた。コーティングは、エナメルプリズムを不明瞭にするのに十分に高密度であった。沈着物の分布は比較的均一であり、ほとんどすべてのエナメル表面を沈着物が覆っていた（図４）。小さな桿形状の生成物はリンタンパク質−リン酸カルシウム複合体（ＰＣＣＰＣ）であると推測されたが、形態学的外観だけでは化合物が同定されない。多くの桿形状の生成物が鉱質除去した小柱間領域に存在していることが分かる。
【０１３７】
議論
鉱質除去したエナメル表面を再石灰化溶液に暴露することにより、微小硬度の回復が示された。これは、リン酸カルシウム含量の部分的な修復を示し得る。正味の結果は、小柱内および小柱間の空間の充填であり、該充填はＳＥＭ形態学的観察により直接に評価され、押込み長さ測定で間接的に評価される。これらのＳＥＭにおけるエナメル表面の間隙率の減少により、試験表面への圧子の入り込みに対する抵抗性が増加し、このことは押込み長さがより小さくなったことによって示され、再石灰化が起こったことを示唆している。
【０１３８】
エッチングされたエナメル表面に対する唾液の再石灰化効果
唾液の再石灰化能力がかなり報告されている通り（Koulourides et al. 1965, Leach et al. 1989, Peretz et al., 1990）、唾液によってエッチングされたエナメルの再硬化が生じることが期待された。唾液は、「歯の血流」と記載することができ、鉱質およびタンパク質に富み、カルシウムおよびホスフェートイオンに関して過飽和である。唾液は、歯を取り囲んで浴に浸け、エナメル表面にイオンを絶え間なく供給する（Peretz et al., 1990)。清浄にされたエナメルが唾液によって濡れているとき、唾液由来の特定のタンパク質（スタテリンおよびプロリンに富むタンパク質など）が歯表面上に吸着し、唾液被膜または獲得被膜を形成する。これらの２つのタンパク質群は、唾液からのカルシウムおよびリン酸の一次（自発的spontaneous）および／又は二次沈殿（結晶成長）を阻害すると考えられる。ヒト唾液はリン酸カルシウム塩に関して過飽和であるゆえ、これは口腔中での必要かつ重要な活性であるようである。これらの沈殿阻害物質により、唾液が過飽和の状態で保たれる。皮膜は、拡散バリアとして働くことによりエナメルの保護に重要な役割を果たす。
【０１３９】
エッチングまたは齲蝕性外傷は、平衡が乱れ、かつ、鉱質の正味の損失が起こったエナメル表面上の特定の位置で起こる。表面エナメル、唾液、および獲得被膜の物理的性質は、体内の他の系で存在している防御機構と類似していると考えることができる。
【０１４０】
エッチングされたエナメル表面に対する部分的に加水分解されたカゼインの部分架橋により得られるリンタンパク質（ＰＣ）およびカゼインの再石灰化効果
実験条件下において、ＰＣおよびカゼインは、ＳＥＭによる微小硬化試験によって評価した際、エッチングされたエナメル表面上でコーティングされ、該表面へ導入され、該表面を再硬化することが示された。エッチングされたエナメルのＳＥＭ数により、ＰＣ溶液による処理後ではほとんど完全に回復することが示された。ＳＥＭにより、高密度コーティング層がエナメル表面上に沈殿し、１０分間の水洗浄後でさえも除去に対して抵抗性であることが示された。しかしながら、表面エナメルの結晶性は、本研究で用いるＳＥＭ法によって決定することができない。
【０１４１】
カゼイン塩はＰＣほど効果的ではなく、有意な再硬化を成すのに１６時間の処理時間を必要とする。この主な理由は、カルシウムおよびホスフェートイオンの存在下ではカゼイン塩の溶解性が低いことであると信じられた。
【０１４２】
ＰＣカルシウムおよびホスフェートイオンを用いたときにエナメルの再硬化が上手くいった。３つの成分（リンタンパク質、カルシウム、およびホスフェート）のうち１つでも省くと再石灰化現象が観察されなかった。期間および化学的条件（口環境では条件はより複雑である）は経験に基づくが、鍵となる結論は鉱質除去および再石灰化がこのモデル系で起こったことである。
【０１４３】
カルシウムおよびホスフェートイオンと関連した（in conjunction with）リンタンパク質の高い再石灰化能力の可能性ある理由は、次の通りである：１）加水分解プロセスに続く部分架橋プロセスによって、カゼイン塩の安定性よりも大きな安定性を有するタンパク質が生ずる。加水分解処理に続く部分架橋処理は、カゼインの自己会合性を妨害するようであり、そのミセル形成傾向を阻害するようである。この自己会合傾向の減少ゆえに、タンパク質は、高いレベルのカルシウムおよびリン酸の存在下で可溶性を維持する。２）リン酸カルシウムに富むリンタンパク質は、ＰＣ溶液の主な成分である。ＰＣによるエナメル再石灰化の促進は、カルシウムおよびホスフェートイオンを可溶化するタンパク質が少なくとも一部カゼインの再石灰化活性の原因になっていることとと一致する。ＰＣによって溶液中のカルシウムイオンの溶解性が増加し、エッチングされたエナメル表面の孔中への利用可能な遊離カルシウムイオンの濃度がより高くなり、再石灰化活性が容易になったと考えられる。３）如何なる理論に拘束されることを望むものではないが、部分的に加水分解されたカゼインの部分架橋により得られたリンタンパク質の再石灰化モデルは、エッチングされたエナメル表面上でコーティングし、該表面に導入する能力に関連することができる。ＰＣは、リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトを非常に強く結合する近く位置しているホルホセリル残基群を含む。タンパク質のこれらの部分は、エナメル表面とカルシウム架橋を形成し、イオン相互作用し、水素結合することができるであろう。ヒドロキシアパタイト表面に結合する際に、タンパク質コーティングは、結晶格子中の鉱質除去領域への再石灰化または再沈着での使用に利用可能なカルシウムイオンを放出するリザーバーとして働くことができる。本研究で示される通り、カゼインリンタンパク質−リン酸カルシウム粒子は、カルシウム放出結合系のエナメル表面上に存在し、エナメル表面上で可能性ある保護沈着を形成する。カゼインリンタンパク質−リン酸カルシウム複合体（ＣＰＰＣＰＣ）由来のカルシウムイオンの溶解およびエナメル中の孔への拡散が起こったのかもしれない。
【０１４４】
実施例４
リンタンパク質（ＭＡＰ１１２）の調製
トリプシン加水分解
５５キログラムのナトリウムカゼイン塩を５０℃の脱イオン水に分散し、最終濃度５２２Ｌとした。溶液を３７℃に冷却し、ｐＨをＮａＯＨにより７．０６に調整し、ブタ由来のトリプシン（ノボ．４５００Ｋ、分子量２３，４００Ｄａ、活性４５００ＵＳＰ単位／ｍｇ）を０．０１％ｗ／ｗカゼインで加え、５分間インキュベーションした。溶液をに８０℃に加熱し、５分間保持し、４５℃に冷却した。
【０１４５】
加水分解後の分子量プロフィール
分子量範囲                            パーセンテージ
≧３０，０００                            １０．７
＜３０，０００、≧２１，０００            ５７．８
＜２１，０００、≧１２，０００            １５．７
＜１２，０００                            １５．８
【０１４６】
グルタミン転移酵素処理
ｐＨを７．０に再調整し、グルタミン転移酵素（市販の１％調製物、アクティバＭＰ、味の素社）を４．５％ｗ／ｗカゼインの比で加え、１５時間インキュベーションした（インキュベーションの最後の温度は３２℃であった）。溶液を８０℃に加熱し、５分間保持した。溶液を１０００Ｌに希釈し、５℃に冷却した。溶液を最終濃度２０％の固体が得られるまで限外濾過し、次いで噴霧乾燥した。３０，０００Ｄａより大きい分子量材料が１００％増加し、タンパク質中の架橋の数は９２μｍｏｌであった。
【０１４７】
実施例５
穏やかな腐食モデルに従ったエナメルの再石灰化
酢酸ベースの系を用いて、腐食の進行性がよりり少ない第２の酸腐食モデルを調べた。
【０１４８】
方法
エナメルは、実施例３のようにして調製した。
【０１４９】
鉱質除去溶液の調製
２４および４８時間鉱質除去溶液
０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸を有するｐＨ４．５およびｐＨ４．８の２つの鉱質除去溶液を調製し、ｐＨをＮａＯＨで調整した。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）７５０ｍｇ／Ｌおよび５００ｍｇ／ＬをそれぞれｐＨ４．５およびｐＨ４．８の鉱質除去溶液に加えた。ナトリウムアジド（０．０５ｇ／Ｌ）を保存剤として各溶液に加え、ボトルを箔でラッピングし、必要になるまで４℃で保存した。
【０１５０】
７２時間鉱質除去溶液
７５０ｍｇ／Ｌおよび１．０ｇ／ＬのＨＡをそれぞれｐＨ４．５およびｐＨ４．８の鉱質除去溶液に加えたことを除き、上記の試料と同じ試料調製手順である。
【０１５１】
再石灰化溶液の調製
ＭＡＰ１１２タンパク質（実施例４に記載の通りに調製したもの）２５グラムを蒸留水３００ｍＬに分散した。２Ｍ塩化カルシウム溶液を滴下して加え、次いで３０分間後、６０ｍｍｏｌのＣａ2+および３６ｍｍｏｌのＰＯ43-の最終濃度となるようにリン酸ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）を加えた。４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整し、合計で体積（５００ｍｌ）とした。ナトリウムアジド（０．０５ｇ／Ｌ）を保存剤として各溶液に加え、ボトルを箔でラッピングし、必要になるまで４℃で保存した。
【０１５２】
エナメル鉱質除去プロトコル
被検物を、鉱質除去溶液２５ｍｌ中（継続的な振盪の下、暗闇において）、２５℃で２４時間、４８時間、および７２時間鉱質除去した。
【０１５３】
エナメル再石灰化プロトコル
鉱質除去したエナメルブロックを６０ｍｍｏｌ／ＬのＣａイオンおよび３６ｍｍｏｌ／Ｌのホスフェートイオンを含むＭＡＰ１１２タンパク質溶液中で再石灰化した。エナメルブロックを暗闇において、２５℃で、種々の期間再石灰化溶液２５ｍｌに（継続的な振盪の下）浸漬した。再石灰化溶液は、３日おきに変えた。
【０１５４】
エナメルの変化の評価
微小硬度
未処理のエナメル、鉱質除去後のエナメル、および再石灰化中の期間におけるエナメルについて、微小硬度を実施例３のように測定した。
【０１５５】
結果
鉱質除去の際、すべての試料で表面微小硬度（ＳＭＨ）の減少が示され、ｐＨ４．８溶液よりもｐＨ４．５溶液で大きな減少が示された。表面の変化は光学顕微鏡で確認した。グラフの再石灰化部分を調べたとき、すべての試料でＳＭＨがゆっくり増加していることが分かった。実施例３で論述した通り、エナメルの鉱質含量はＳＭＨと強い正の関係を示す。
【０１５６】
実施例６
齲蝕様の欠陥を引き起こすために処理されたエナメルの再石灰化
エナメルを実施例３のように調製した。
【０１５７】
鉱質除去溶液の調製
鉱質除去溶液をWhite DJの方法（Use of synthetic polymer gels for artificial carious lesion preparation. Caries Res 21 (3):228-242, 1987）に従って調製した。
【０１５８】
０．２％ポリアクリル酸（カーボポル（carbopol）Ｃ９０７）および０．ｌｍｏｌ／Ｌの乳酸を含むポリアクリル酸／乳酸塩溶液を以下の通りに調製した。ポリアクリル酸（１ｇ）を室温で蒸留水３５０ｍｌに溶解し、ポリアクリル酸が分散した後に乳酸溶液（８７．５％）４．２９ｍｌを加え、ｐＨを４．８０（４Ｍ  ＮａＯＨ）に調整し、合計で体積（５００ｍｌ）とし、溶液を５００ｍｌのスコット（Schott）ボトルに移した。ナトリウムアジド（０．０５ｇ／Ｌ）を保存剤として各溶液に加え、ボトルを箔でラッピングし、必要になるまで４℃で保存した。
【０１５９】
０．２％ポリアクリル酸（カーボポルＣ９０７）および０．１ｍｏｌ／Ｌの乳酸を含む、ヒドロキシアパタイト、ポリアクリル酸／乳酸飽和溶液を以下の通りに調製した。ポリアクリル酸（１ｇ）を室温で蒸留水３５０ｍｌに溶解し、ポリアクリル酸が分散した後に乳酸溶液（８７．５％）４．２９ｍｌを加え、続いてヒドロキシアパタイト３．７ｇを加え、ｐＨを４．８０（４Ｍ  ＮａＯＨ）に調整し、合計で体積（５００ｍｌ）とし、溶液を５００ｍｌのスコットボトルに移した。ナトリウムアジド（０．０５ｇ／Ｌ）を保存剤として各溶液に加え、ボトルを箔でラッピングし、必要になるまで４℃で保存した。
【０１６０】
最後の鉱質除去溶液を、ヒドロキシアパタイトカーボポル／乳酸飽和溶液をヒドロキシアパタイトのないカーボポル／乳酸溶液で希釈することにより、鉱質除去の直前に調製した。
【０１６１】
ヒドロキシアパタイトカーボポル／乳酸飽和溶液約５５ｍｌを２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清５０ｍＬを回収し、ヒドロキシアパタイトのないカーボポル／乳酸溶液５０ｍと混合した。ｐＨを４．８に調整した。
【０１６２】
３つの異なるカルシウムレベルの再石灰化溶液の調製
ＭＡＰ１１２タンパク質２５ｇの３つのロットを蒸留水３００ｍＬに分散した。２Ｍ塩化カルシウム溶液を滴下して加え、次いで３０分間後にリン酸ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）を以下の表に従って加えた：
【表２】
0004723249.tif 000003
【０１６３】
ヒドロキシアパタイト（５００ｍｇ／Ｌ）を各溶液に加え、４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整し、合計で体積（５００ｍｌ）とした。ナトリウムアジド（０．０５ｇ／Ｌ）を保存剤として各溶液に加え、ボトルを箔でラッピングし、必要になるまで４℃で保存した。
【０１６４】
エナメル鉱質除去プロトコル
被検物を、鉱質除去溶液２５ｍｌ中（継続的な振盪の下、暗闇において）、２５℃で９６時間鉱質除去した。
【０１６５】
エナメル再石灰化プロトコル
エナメルブロックを３０、４５、６０、または７５ｍｍｏｌのＣａイオンを含むＭＡＰ１１２タンパク質溶中で再石灰化した。エナメルブロックを、暗闇において、２５℃で、種々の期間、再石灰化溶液２５ｍｌに（継続的な振盪の下）浸漬した。
【０１６６】
エナメルの変化の評価
微小硬度
未処理のエナメル、鉱質除去後のエナメル、および再石灰化中の期間におけるエナメルについて、微小硬度を実施例３のように測定した。
【０１６７】
実施例７
連鎖球菌ミュータンス接着アッセイ法
連鎖球菌ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９を脳／ハート・インフュージョンを含むトライポン（trypone）／酵母抽出培地で増殖し、［3Ｈ］チミジンで放射性標識した。ヒドロキシアパタイトビーズ（２０ｍｇ、バイオラッド社（Biorad））をＫＣｌ緩衝液中で水和し（Cannon et al．, 1995）、次いでプールしたヒト唾液（３０％ｖ／ｖＫＣ１緩衝液）とともにインキュベーションした。ビーズをＫＣＬ緩衝液で洗浄し、次いで唾液でコーティングされたヒドロキシアパタイトビーズを放射性標識したＳ．ミュータンス細胞とともにインキュベーションした。非接着Ｓ．ミュータンス細胞をＫＣｌ緩衝液で洗浄することによってビーズから取り除き、次いでＳＨＡビーズに接着した各アッセイに加えられた細胞のパーセンテージを計算した。
【０１６８】
ＭＡＰ１１１リンタンパク質（ＤＨ５．０、１４０μｍｏｌ架橋／ｇタンパク質）を０．００１％、０．０１％、０．１％、１．０％、および１０．０％（ＫＣｌ緩衝液中）の濃度で加えた。接着に対するリンタンパク質の効果を、リンタンパク質を含みないアッセイに対して計算した。
【０１６９】
各アッセイを３つ組で行い、各実験を３時間行った。
【０１７０】
タンパク質は、０．０１％の低い濃度においてＳ．ミュータンスの接着を効果的に阻害し、０．００１％タンパク質において接着の約４０％阻害を更に達成したことが図１４から分かる。齲蝕プロセスを開始するためには、Ｓ．ミュータンスは歯の表面に接着する必要がある。したがって、接着するＳ．ミュータンスの数を減少させることにより、齲蝕形成の危険性を減少することができる。これらのアッセイの結果は、タンパク質が予防機能も有していることを例証している。
【０１７１】
参照：Cannon, R.D., Nand, A.K. and Jenkinson, H. F. (1995) Adherence of Candidaalbicans to human salivary components adsorbed to hydroxyapatite. Microbiology 141: 213-219。
【０１７２】
実施例８
リンタンパク質調製物の鉄結合能の測定
タンパク質を水に再懸濁し、一定のｐＨ下でＦｅＣｌ2を加え、不溶性材料（塩およびタンパク質）を除去し、次いで可溶性の結合していない塩を除去し、可溶性のタンパク質に結合しているカルシウムの量を決定することにより、タンパク質の鉄結合能を決定した。実験の詳細は以下の通りであった。
【０１７３】
タンパク質の１％溶液をミリＱ水に溶解し、１時間放置して確実に完全に水和させた。塩化鉄を０ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、および５０ｍＭのレベルで加え、よく混合しながら２５℃で１時間インキュベーションした。実験全体にわたって、ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０で維持した。試料をよく混合しながら２５℃で６〜１０時間インキュベーションした。インキュベーション後、試料を１００００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍナイロンフィルターを通して濾過した。
【０１７４】
試料を２ｍｌの試料ループに注入し、セファデックスＧ−２５（Ｖｔ＝２５ｍｌ）脱塩カラムを備えるファルマシアＦＰＬＣにローディングした。running緩衝液はｐＨ７の１０ｍＭＨＥＰＥＳとし、流量を２ｍｌ／分とし、検出はＵＶ吸収（２８０ηｍ）、伝導率、およびｐＨによって行なった。タンパク質ピークを収集し、鉄濃度を原子吸収分光法（ＡＡＳ）により決定した。
【０１７５】
Ｔｇによる１８時間の架橋後のロット６の鉄結合能。ｍｇＦｅ2+／ｇ初期タンパク質、およびｍｇＦｅ2+／ｇ可溶性のタンパク質として表す。
［Ｆｅ2+］      ｍｇＦｅ2+／ｇタンパク質      ｍｇＦｅ2+／ｇタンパク質
（合計）                      （可溶性）
０ｍＭ                ０．０                        ０．０
１０ｍＭ              ２．９                        ６．４
３０ｍＭ              ３．５                        １３．８
４０ｍＭ              ３．７                        １９．５
【０１７６】
Ｆｅ2+は、ロット６（１８時間、Ｔｇリンタンパク質調製物）に最大３．７ｍｇＦｅ2+／ｇタンパク質で結合することが見出された。可溶性を維持しているタンパク質のうち、Ｆｅ2+は約２０ｍｇＦｅ2+／ｇ可溶性タンパク質で結合した。
【０１７７】
リンタンパク質の亜鉛、鉄ＩＩ、およびマグネシウム結合能
加えたイオンｍｍｏｌ      亜鉛        イオン鉄ＩＩ          マグネシウムイオン
５                  ２２．２２          １．７                ４．６
１０                ４１．０          ４４．８                ５．４
１５                ４３．０          ４４．０                ５．４
【０１７８】
実施例９
リンタンパク質強化加工チーズ
以下の２つの加工チーズを調製した：
％重量／重量
配合物                      １            ２
加工チーズ                  ９５．６０    ９５．４２
ＭＡＰ（リンタンパク質）    １．３４      １．３４
天然ミルクリン酸カルシウム  ２．８７      ２．８６
塩化カルシウム              ０．００      ０．１９
水                          ０．１９      ０．１９
【０１７９】
チーズを、ブラベンダー（Brabender）Ｗ５０ミキサー中、４５℃および５０ＲＰＭで調製した。加工チーズ（１ｃｍ3立方体）を約６０秒間にわたってミキサーに供給し、水を加え、３分間混合した。予めブレンドした天然ミルクリン酸カルシウムおよびＭＡＰ１１２を加え、１０分間混合した。ミキサーを停止し、チーズ混合物を取り除き、ブロックに形成し、食品包装用フィルムでラッピングし、必要になるまで５℃で保存した。
【０１８０】
修飾された加工チーズの再石灰化ポテンシャル
エナメルを実施例３のように調製し、鉱質除去を実施例６のように行い、チーズスラリー調製物を再石灰化溶液の代わりに用いたことを除いて再石灰化を実施例６の通りとした。微小硬度を実施例３のように測定した。
【０１８１】
チーズスラリー調製物
修飾された加工チーズは、約２０％タンパク質（該タンパク質のほとんどすべてがカゼインである）を含みた。２５グラムの修飾された加工チーズを重量測定し、蒸留水１４４ｍｌと室温で５分間ブレンドした（ワーリング・ブレンダー（Waring Blender）、高速）。チーズスラリーを４，３５０ｇで２０分間遠心分離し、水溶液（中間層）および脂肪上清を注意深く分液フラスコに移した。混合物を分離させたままにし、水相を取り除いた。ナトリウムアジド（０．０５ｇ／Ｌ）を保存剤として各溶液に加え、ボトルを箔でラッピングし、必要になるまで４℃で保存した。
【０１８２】
結果微小硬度
鉱質除去によって表面硬度が良好に減少し、先に言及した通り、これはエナメル鉱質濃度との相関性が強い。再石灰化の際に、ＳＭＨのゆっくりとした増加が見られる。このＳＭＨの増加は、エナメルが再石灰化されていっていることを示唆している。
【０１８３】
実施例１０
再石灰化乳濁液の配合
成分                                  ％重量／重量
リンタンパク質ＭＡＰ１１２                １０．００
天然ミルクリン酸カルシウム（アラミン）    ７．５０
ソルビトール                              ４．５０
ＧＭＳ４００Ｖ                            １．００
プロピルパラベン                          ０．０７５
メチルパラベン                            ０．０２５
中間鎖トリグリセリド                      ７．５０
グリセロール                              １．００
デリオス（Delios)Ｓ                       ３０．００
キサンタンガム溶液（０．１％）            ３８．３０
ハッカ油                                  ０．０７４
【０１８４】
方法
乾燥成分（ＭＡＰ、アラミン、ソルビトール、メチル、およびプロピルパラベン）をブレンドし、マルチトールシロップおよびキサンタンガム溶液を分散した。ＧＭＳおよびグリセロールを約８０℃に加熱し（溶融するまで）、中間鎖トリグリセリドを加え、混合物の塊がなくなるまで加熱を維持した。水相を約７０℃に加熱し、攪拌を継続しながら水相に油相を加えた。ハッカ油を加え、混合物を９０℃に加熱し（５分間保持し）、次いで均質化した（ウルトラツレックス（Ultraturrex））。混合物を清浄な滅菌ボトル中にに温めて満たし、９６％エタノールですすぎ、患者が必要とするまで５℃で保存した。
【０１８５】
患者により、彼らの口の内側に乳濁液が良好なコーティングを与え、良好な湿気を与えることが見出された。
【０１８６】
実施例１１
カンジダアルビカンス接着アッセイ
Ａ．方法
カンジダアルビカンスＡＴＣＣ１０２６１をＧＳＢ培地（グルコース、塩、ビオチン、Cannon et al, 1995）で増殖させ、［35Ｓ］メチオニンで放射性標識した。ヒドロキシアパタイトビーズ（２０ｍｇ、バイオラッド社）をＫＣｌ緩衝液中で水和し（Cannon et al, 1995）、次いでプールしたヒト唾液（３０％ｖ／ｖＫＣｌ緩衝液）とともにインキュベーションした。ビーズをＫＣＬ緩衝液で洗浄し、次いで唾液でコーティングされたヒドロキシアパタイトビーズを放射性標識したＣ．アルビカンス細胞とともにインキュベーションした。非接着Ｃ．アルビカンス細胞をＫＣｌ緩衝液で洗浄することによりビーズから取り除き、次いでＳＨＡビーズに接着した各アッセイに加えられた細胞のパーセンテージを計算した。
【０１８７】
ＭＡＰ１１１タンパク質（ＤＨ５．０、１４０μｍｏｌ架橋／ｇタンパク質）を０．１％、１．０％、および１０．０％（ＫＣｌ緩衝液中）の濃度で加えた。接着に対するＭＡＰタンパク質の効果を、ＭＡＰタンパク質を含みないアッセイに対して計算した。
【０１８８】
各アッセイを３つ組で行い、各実験を３時間行った。
【０１８９】
Ｂ．結果
タンパク質は０．１％の低い濃度においてカンジダアルビカンスの接着を阻害することが図１３から分かる。阻害は用量に依存しているように思われる。
【０１９０】
参照：Cannon, R.D., Nand, A.K. and Jenkinson, H. F. (1995) Adherence of Candidaalbicans to human salivary components adsorbed to hydroxyapatite. Microbiology 141: 213-219。
【０１９１】
高速液体クロマトグラフィーを用いた架橋度の決定
以下の方法を用いて、リンタンパク質調製物の架橋度をグルタミル／リシル結合の数で決定した。
【０１９２】
化学物質および試薬
ε−（γ−グルタミル）リシン（Ｇ−Ｌ）およびトリフロオロ酢酸（ＴＦＡ、タンパク質配列決定等級）、プロリダーゼ（ブタ腎）、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびブタ腎由来のサイトソル、カルボキシペプチダーゼＡ（ウシ膵）、およびプロナーゼ（ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus））、およびＴＲＩＳ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］をシグマ・ケミカル社（Sigma Chem. Co.）（シドニー、オーストラリア）から購入した。アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）をバイオラボ社（Biolab）（クリストチャーチ、ニュージーランド）から購入した。
【０１９３】
架橋されたタンパク質のタンパク質分解消化
タンパク質試料の４８〜５０ｍｇアリコートをガラス試験管（全体積１５ｍＬ）中で重量測定した。チモールの結晶および０．２Ｍトリス（ｐＨ８．０、ＨＣｌ）２ｍｌを加え、溶液をボルテックスし、次いで４０℃で１時間インキュベーションしてタンパク質を分散させた。プロナーゼ（０．４Ｕ／ｍｇタンパク質）のアリコートを混合物に加え、次いで３７℃で２４時間インキュベーションした。プロナーゼの別の同じサイズのアリコートを加えることにより、プロナーゼ消化を更に２４時間継続した。１００℃（水浴）で１０分間加熱することによりプロナーゼを不活化した後、ロイシンアミノペプチダーゼ（０．４Ｕ／ｍｇタンパク質）を加えて消化を継続し、プロナーゼインキュベーションの場合と同様にして溶液を処理した。プロリダーゼ（０．４５Ｕ／ｍｇタンパク質）、次いでカルボキシペプチダーゼＡ（０．２Ｕ／ｍｇタンパク質）を用いて消化を継続した。最終的な不活化後、混合物を超純水（ミリＱ水精製系）（ミリポア、ノース・ライド、オーストラリア）で希釈して７．５ｇとした。
【０１９４】
Ｇ−ＬのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ系は、ＩＣＩ機器１２１０ＵＶ／Ｖｉｓ検出器に接続されたディオネックス（Dionex）ＧＰ４０勾配ポンプ溶媒デリバリー系から構成されていた。データをＩＴＮＳ取得学会より得て、ＡＺＵＲクロマトグラフィーソフトウェア型式１．１を用いて分析した。試料（１００μｌ）をガードカラム（Ｃ18ＯＤＳ、４ｍｍ×３．０ｍｍＩＤ）（フェノメネックス社（Phenomenex））および２μｍプレフィルターに接続されたイナートシル（Inertsil）ＯＤＳ−２カラム（５μｍｍｏｌ、１５０×７．６ｍｍ）（フェノメネックス社、オークランド、ニュージーランド）上で分離した。分析は２．５℃で行った。移動相は、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むアセトニトリル（溶媒Ｂ）とした。溶媒プログラムは以下の通りとした：１００％溶媒Ａ（２０分間）、０％〜１００％溶媒Ｂ（２０〜２５分）、１００％溶媒Ｂ（２５〜５０分）。検出器の波長を２１０ｎｍに設定し、流量は１．０ｍｌ／分とした。
【０１９５】
タンパク質分解消化由来のすべての試料を０．４５μｍミレックス（Millex）−ＨＡミリポアフィルターユニット上で濾過した。試料２００μｌを蒸留水１００μｌおよび１００μ１ＴＦＡ（２％ｗ／ｗ）と混合した。Ｇ−Ｌピークを標準の溶出時間と比較することによって同定し、Ｇ−Ｌ標準溶液を試料に標準添加することによって確認した。
【０１９６】
実施例１３
部分的に加水分解されたカゼインの加水分解度の決定方法
試料は、蒸留水中の０．１％または１％タンパク質（ｗ／ｖ）溶液のいずれかとして調製した。試料の１００μｌアリコートを０．２１２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２０）８００μｌに加えた。これに０．１％ＴＮＢＳ試薬８００μｌを加え、試薬をよく混合し、箔でラッピングし、蓋をした水浴中で５０℃でインキュベーションした。正確に６０分後、１００ｍＭのＨＣｌ１６００μｌを加えることによって反応を終了し、試料を３０分間室温に冷やしたままとした後、緩衝液／ＴＮＢＳブランクに対する吸光度を３４０ηｍで読み取った。
【０１９７】
産業上の用途
本発明の方法および組成物は、哺乳動物にカルシウムおよび鉄などの生物活性金属イオンをデリバリーすることにおける用途を見出すと信じる。本発明は、歯の再石灰化および／又は歯齲蝕、酸蝕症、歯の過敏、または歯肉炎の予防または治療用組成物における特定の用途が見出されることも期待される。
【０１９８】
本発明は、カゼインの部分加水分解から得られたリンペプチドを含む歯再石灰化／抗齲蝕性組成物（米国特許第５０１５６２８号に記載されるものなど）よりもある種有利な点を有すると信じる。具体的には、生産物が許容できる香味を有するためには取り除くことが必要である苦味の疎水性ペプチドを含むカゼイン部分加水分解物とは対照的に、本発明で用いられるリンタンパク質調製物はきれいな香味を有する。更に、本発明のリンタンパク質調製物は、カゼイン由来のタンパク質の性質を有する材料の大部分を利用し（単にカゼインリンペプチドを含む割合ではない）、それによって廃棄量を減少する。
【０１９９】
本発明で用いられるリンタンパク質調製物は、未修飾カゼインまたはカゼイン塩を含む再石灰化／抗齲蝕性組成物よりも有利な点を有し、具体的には、リンタンパク質調製物のカルシウム結合および歯再石灰化特性は、少なくとも好ましい実施態様において、カゼインの該特性よりも有意に大きいと信じる。更に、リンタンパク質調製物は、比較的可溶性であり、未修飾カゼインより低い粘性を有し、それによってそれらを組成物に導入するこが容易になる。
【０２００】
本発明を特定の実施態様を参照して記載したが、特許請求の範囲で定義された本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変型および改変をなすことができることを当業者は十分に理解している。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
ここで、付随の図面を参照して、本発明をより詳細に記載する。
【図１】図１は、３つの異なる再石灰化溶液、すなわち、唾液、１０％カゼイン塩溶液、および１０％部分架橋された加水分解カゼイン塩溶液による酸エッチングされた歯エナメルの処理後のエナメル再石灰化の収率を示す（実施例３に記載の通り）。
【図２】図２は、酸エッチング前の歯エナメル表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、酸エッチング後の歯エナメル表面走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】図４は、酸エッチングおよび重合された加水分解カゼイン塩溶液による処理の双方の後における歯エナメル表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５】図５は、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ４．５）中で２４時間鉱質除去処理し、続いて６０ｍｍｏｌ／Ｌカルシウムイオンおよび３６ｍｍｏｌ／Ｌホスフェートイオンを含むＭＡＰ１１２リンタンパク質溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図６】図６は、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ４．５）中で４８時間鉱質除去処理し、続いて６０ｍｍｏｌ／Ｌカルシウムイオンおよび３６ｍｍｏｌ／Ｌホスフェートイオンを含むＭＡＰ１１２リンタンパク質溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図７】図７は、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ４．５）中で７２時間鉱質除去処理し、続いて６０ｍｍｏｌ／Ｌカルシウムイオンおよび３６ｍｍｏｌ／Ｌホスフェートイオンを含むＭＡＰ１１２リンタンパク質溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図８】図８は、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ４．８）中で４８時間鉱質除去処理し、続いて６０ｍｍｏｌ／Ｌカルシウムイオンおよび３６ｍｍｏｌ／Ｌホスフェートイオンを含むＭＡＰ１１２リンタンパク質溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図９】図９は、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ４．５）中で２４時間鉱質除去処理し、続いて６０ｍｍｏｌ／Ｌカルシウムイオンおよび３６ｍｍｏｌ／Ｌホスフェートイオンを含むＭＡＰ１１２リンタンパク質溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図１０】図１０は、齲蝕様の鉱質除去処理を行い、続いて５００ｍｇ／ｍＬヒドロキシアパタイトおよび可溶性の塩として添加された異なるレベルのカルシウムおよびホスフェートを含むＭＡＰ１１２溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図１１】図１１は、ツァイス（Zeiss ）直立型共焦点顕微鏡を用いて撮影した鉱質除去した歯エナメルの画像である。エナメルをｐＨ４．８の緩衝液中で９６時間鉱質除去した。
【図１２】図１２は、７５ｍＭ塩化カルシウムおよび４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含むＭＡＰ１１２タンパク質中で再石灰化された鉱質除去した歯エナメルのツァイス共焦点顕微鏡画像の画像である。暴露された六方晶系微構造は、エナメル表面上にカルシウム堆積物が広範囲に残って再石灰化されている。
【図１３】図１３は、３つの実験にわたってヒドロキシアパタイトビーズへの接着が阻害されたＣ．アルビカンスのパーセンテージに対するＭＡＰリンタンパク質濃度の効果を示す。
【図１４】図１４は、３つの実験にわたってヒドロキシアパタイトビーズへの接着が阻害されたＳ．ミュータンスのパーセンテージに対するＭＡＰリンタンパク質濃度の効果を示す。濃度が増加するにしたがい、接着の％阻害が増加することが分かる。
【図１５】図１５は、齲蝕様の鉱質除去処理を行い、続いて加工チーズ（リンタンパク質ＭＡＰ１１２およびミルクリン酸カルシウムを含む）抽出溶液中で再石灰化した後のエナメルの微小硬度の変化を示す。
【図１６】図１６は、ツァイス直立型共焦点顕微鏡を用いて撮影した鉱質除去した歯エナメルの画像である。エナメルをｐＨ４．８の緩衝液中で９６時間鉱質除去した。
【図１７】図１７は、チーズ抽出中で再石灰化された鉱質除去した歯エナメルのツァイス共焦点顕微鏡画像の画像である。エナメルは、六方晶系微構造の間の領域が広範囲に充填されて再石灰化されている。
【図１】
0004723249.tif 000004
【図２】
0004723249.tif 000005
【図３】
0004723249.tif 000006
【図４】
0004723249.tif 000007
【図５】
0004723249.tif 000008
【図６】
0004723249.tif 000009
【図７】
0004723249.tif 000010
【図８】
0004723249.tif 000011
【図９】
0004723249.tif 000012
【図１０】
0004723249.tif 000013
【図１１】
0004723249.tif 000014
【図１２】
0004723249.tif 000015
【図１３】
0004723249.tif 000016
【図１４】
0004723249.tif 000017
【図１５】
0004723249.tif 000018
【図１６】
0004723249.tif 000019
【図１７】
0004723249.tif 000020