(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人間の生体内以外の生物の膜包囲構造に対するバイオパーティクルの導入または抽出を行なう方法において、
生物の膜包囲構造と磁気感応粒子とを含んでいる試料に交流磁界を供給し、その交流磁界により前記磁気感応性粒子に熱および運動エネルギが与えられて急激に加熱されることによって前記生物の膜包囲構造に細孔を形成し、
その細孔によって前記生物の膜包囲構造に対するバイオパーティクルの導入または抽出を可能にする生物の膜包囲構造に対するバイオパーティクルの導入または抽出方法。
【請求項２】
前記磁界は１乃至５ＭＨｚの範囲の周波数の交流磁界方向を有している請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記磁界は１ｍＴの磁界強度を有している請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記磁界は非均一であり、交流勾配磁界方向を有しており、前記交流勾配磁界の方向は２つのコイルによって発生され、前記試料はコイル間に挿入される請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記コイルは異なった周波数の交流電流を供給される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記コイルは供給された交流電流の正または負の部分のいずれかを供給される請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記バイオパーティクルはＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、たんぱく質、その他の生物ポリマー、ペプチド、化学プレパラート、有機化合物、無機化合物または合成ポリマー、あるいはそれらの組合せを含むグループから選択される請求項１乃至６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記生物の膜包囲構造は、身体の組織、細胞、細菌、ウィルス粒子、細胞より小さいレベルの小器官、リポソームまたはたんぱく質を含むグループから選択される請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
特定の細胞溶解のために使用される請求項１乃至８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞の遺伝子コードおよび、または物質代謝を変化させるために使用される請求項１乃至８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
交流磁界を発生する１以上のコイルと、前記コイルに流れる交流電流がオン状態であって処理されるべき試料が供給された磁界にさらされている時間の可変的で正確なタイミング制御を行う手段と、前記交流電流の強度および周波数を正確に設定する制御システムとを具備している請求項１乃至１０のいずれか１項記載の方法を行なうための装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、とくに分子生物学研究において使用される装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物工学および生物医学の研究分野において、大きい分子またはバイオパーティクル(bioparticle) を細菌細胞のような生物構造中に導入することがしばしば必要である。細胞およびウィルスは環境から保護するための外部バリアと栄養物質のための選択的輸送系とを有している。自然保護機構を押し破ってターゲット生物に望ましくない物質を導入するために、ターゲット細胞のある種の化学的または物理的処理が必要である。外部細胞膜（たとえば、細胞壁でもよい）を押し破る技術の例は、遺伝子工学および分子生物学の研究分野に存在する。
【０００３】
新しい遺伝子コードがとくに選択された宿主細胞に導入されたとき、その技術は形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる。全てのタイプの細胞に使用される一般的な方法は１つもないが、ある技術は各細胞タイプおよび目的に利用可能である。さらに、現在利用可能な技術を使用して全ての細胞タイプを形質転換することは不可能である。１９７０年に、MandelおよびHiga氏は文献 ( J.MOL.Bio.53:159-162 ) において、ＣａＣｌ2 で予め処理された大腸菌細胞は温度衝撃を受けたときに外来ＤＮＡを取入れることが可能なことが報告された。その後、その方法は開発され続けている（たとえば、米国特許出願第97/01788号明細書を参照）。何分の一秒かの期間中細胞を高電圧の電気パルスにさらすことによって細胞膜中の細孔が開き、これはエレクトロポレーションと呼ばれ [ Zimmerman  氏他による J.Membr Biol.67:165-82(1983)]、形質転換技術としてよく使用されている。細菌、酵母菌および、ある場合には哺乳類の細胞および植物の細胞は特定の条件でエレクトロポレーションによって形質転換されることができる。また、この場合、その技術の継続的な開発が現在進行中である（米国特許出願第97/16721号明細書、第98/16042号明細書を参照）。上述した２つの方法において、細胞エンベロープは、ＤＮＡ分子がその細胞に入るように十分に長い時間開放されている。第３の、最後に開発された形質転換方法は、外来ＤＮＡがターゲット細胞の外膜と融合する陽イオンリポソームに囲まれる／結合するいわゆるリポフェクションである[ Old および Primrose 氏による Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Gene Manipulation,Blackwell Science(1995)]。植物細胞を形質転換するための工業的技術がもう１つ存在し、この技術ではそのために選択された植物の一部分が外来遺伝子により処理された小さい金粒子を衝突させる( Boynton J.E.et.Science 240,1534-1538,1988)。このような遺伝子導入は、細菌、菌類、昆虫および哺乳類細胞のような別の組織の形質転換のために開発されてきた
ものである(Johnston S.A.Nature 346,776-777,1990)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、とくに上述の用途において使用されることが可能である。しかしながら、特定の細胞およびウィルスの応答特性を研究するために、たんぱく質，ＲＮＡ分子、脂肪酸、ペプチド、医学プレパラート等の直接トランスファのような適用において別の外来(exogenic)材料を導入するために本発明の装置を使用することが完全に可能である。さらに、本発明による装置はとくに、溶解を行なうための細胞溶解、ならびに全く同じ方法での特定の細胞の成分の識別および分離に適している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、交流磁界が発生されることができ、試料が挿入されることができる少なくとも１つのコイルを含んでおり、前記磁界は前記試料中の磁気感応粒子の熱および、または運動エネルギを増加させ、前記粒子の熱および、または運動エネルギの増加により前記試料中で見出されることとなる細孔が生物の膜で包囲された構造内に形成され、前記細孔によりバイオパーティクルが前記生物の膜で包囲された構造中に導入され、あるいはそこから抽出されることが可能になることを特徴とする装置に関する。
【０００６】
その方法はまた、本発明による装置が特定の細胞溶解に対して使用される方法に関する。さらに、本発明はとくに宿主細胞の遺伝子コードおよび、または物質交代を変化させるために使用される方法に関する。
【０００７】
本発明の１つの特徴によると、装置は、磁界が１乃至５ＭＨｚの範囲の周波数の交流磁界方向を有していることを特徴とする。
【０００８】
本発明の別の特徴によると、装置は、前記磁界が少なくとも１ｍＴの磁界強度を有していることを特徴とする。
【０００９】
１以上の特徴によると、本発明は、前記磁界が非均一であり、交流勾配磁界方向を有しており、前記交流勾配磁界の方向は２つのコイルによって発生され、試料がコイル間に挿入される。
【００１０】
１以上の特徴によると、本発明の装置は、前記コイルが異なった周波数の交流電流を供給されることを特徴とする。
【００１１】
さらに別の特徴によると、装置は、前記コイルが供給された交流電流の正または負の部分のいずれかを供給されることを特徴とする。
【００１２】
別の特徴によると、装置は、それが前記コイルおよび、または前記試料を正確に温度制御するためのサーモスタットを備えていることを特徴とする。
【００１３】
さらに別の特徴によると、装置は、それが前記交流電流がオン状態であって試料が供給された磁界にさらされている時間を正確に制御するための可変タイミング装置を備えていることを特徴とする。
【００１４】
別の特徴によると、装置は、それが前記交流電流の強度および周波数を正確に設定する制御システムを備えていることを特徴とする。
【００１５】
生物の膜で包囲された構造は、身体組織、細胞、細菌、ウィルス粒子、細胞より小さいレベルの小器官、リポソームまたはたんぱく質から構成されている。
【００１６】
膜で包囲された構造中への導入／そこからの抽出に適しているバイオパーティクルはとくに、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、たんぱく質、別の生物ポリマー、ペプチド、化学プレパラート、有機化合物、無機化合物または合成ポリマー、あるいはそれらの組合せである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明が部分的に基づいている技術は、磁気ナノ技術(nanotechnology)およびペプチド化学の組合せである。この技術では、数十マイクロメータ乃至１ナノメータのサイズを有する磁気感応粒子が試薬として使用される。このような粒子はある磁界にさらされたときに振動させられ、熱を発生する。図１は、本発明による装置の原理概略図である。生物試料は、その用途に応じた試薬と混合され、その後試料ホルダ(a) 内に配置される。磁界発生装置(b) の所望の強度および周波数が調節され、それによって冷却装置(c) の所望の温度が調節される。磁界発生装置は１つのコイルまたは２つのコイルのいずれかであり、図５にしたがって試料がそれらの間に配置される。磁界発生装置および試料ホルダは、冷却装置によってその温度が決定される隔離された装置内に封入されている。試料ホルダ内の正確な温度を保証するために、そのシステムに対して温度センサ(d) を接続することができる。可変の温度、磁界の強度および周波数ならびに処理間隔が制御され、デジタル表示装置(e) 上で表示されることができる。
【００１８】
図２は、回路ＸＲ２２０６に基づいた発振器1 を含む電子電流源回路の一例を示しており、この発振器1 の出力信号2 は回路ＰＢＤ３５４８／１に基づいた電力増幅段3 により増幅され、この電力増幅段3 の出力信号4 は１以上のコイルによって交流（１ＭＨｚ，２Ａ）で動作することができる。このコイルの一接続例は図３に示されており、振動回路は２Ωの抵抗6 と、０．５０ｎＦのキャパシタ7 と、および５０μＨのコイル8 とから構成され、この回路は交流5 を供給される。当業者は、図２および３に示されている上述の例が容易に修正可能であり、別の接続およびコイルを使って同様の結果を得ることができることは明白である。
【００１９】
本発明による方法において使用される磁気材料の例は、たとえば米国特許第 4,323,056号明細書（Borelli et al ）等に記載されている。磁気感応粒子および可能な形状もまた図４に示されている。粒子の磁気感応性のコア9 は本質的に磁鉄鉱（酸化鉄）からなる。さらに、粒子は、誘導ポリマー（デキストラン）からなる外層10で、あるいは単一層または代わりに２層の誘導脂肪酸で被覆されている。誘導体として使用される配位子11のタイプ（アミノ酸または炭水化物ユニットおよびシーケンスの数）の選択は、磁気感応粒子の各用途に対して個々に適応され、その効果は、１以上のエフェクタ分子12によってさらに変化させられたその表面によってさらに一層拡大されることができる。
【００２０】
細胞懸濁液に前記粒子を加え、その後交流磁界方向を有する磁界にその細胞をさらすことにより、磁気感応性の各粒子を包囲した媒体の瞬時的な加熱が行われる。熱は細胞および細胞膜中に温度衝撃を誘起し、それによって細胞膜において一時的な開口が生じる。熱は試料全体において迅速に、かつ均一に誘起され、それによって試料および細胞は短時間処理にさらされることが可能となり、これは、そのさらされた細胞のサバイバル周波数を増加させる。例１は、大腸菌の形質転換を示している。
【００２１】
温度衝撃を含む通常の形質転換方法において、細胞懸濁液を含む試験管は高い周辺温度（４２℃）にさらされ、それによって温度勾配が試験管壁から試料中に発生し、その構成には本発明による方法より長い時間を要し、それはさらに、細胞壁の最も近くに位置された細胞が管の中心のものよりも長い時間のあいだ高い温度にさらされることを意味する。したがって、細胞のあるものは温度の上昇により死滅し、一方その細胞の一部分は処理されないまま残っている。本発明による方法は、試料ホルダ中での各粒子周囲の瞬時加熱によってこの問題を回避する。その効果は、粒子がその表面上の配位子分子によって細胞エンベロープに直接導かれる場合以外は増大される。これには、最終結果にとって熱衝撃と細胞死滅との間のバランスが重要である通常の形質転換方法と比較して大きな利点がある。
【００２２】
さらに磁界の強度は空間的に変化する可能性が高く、いわゆる勾配磁界は、交流磁界方向と組合せられて粒子内において機械的振動を生じさせ（運動エネルギが増加し）、熱放射（熱エネルギ）と組合せられて全ての細胞（および適切な場合には細胞壁）を取囲む細胞膜に対する粒子の影響を増大させる。本発明は、熱の誘導または剪断力のパワフルな導入あるいはその組合せを含む完全に新しい方法に関する。剪断力は機械的疲労による細胞膜において転移（ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を開始させ、その結果、細胞膜（およびターゲット細胞がたとえば細菌である場合には細胞壁）が破れる。この方法は、外部から供給された交流勾配磁界の使用に基づいている。勾配磁界は少なくとも２つのコイルで供給され、供給された交流電流の正または負の部分のいずれかを供給され、あるいはその代りに、コイルは異なった周波数の交流電流を供給される。勾配磁界を発生することのできる装置は、図５に示されている。機能原理は、図５による対向して配置された２つのコイルA およびB （フェライト磁心を有するか、有しない）に基づいている。制御装置C は、一時に１つのコイルだけが電流をその巻線を通過させるようにコイルを通った電流を制御する。この電流変化はその周波数が発振器OSC によって制御され、その結果コイルは異なった勾配方向を有する勾配磁界D およびE を交互に発生する。コイル間に配置された磁気感応粒子P は、機械的振動を誘導する周期的に交番する方向を有する勾配磁界を受けるであろう。その代り、勾配磁界は、２つのコイルが２つの異なった周波数の電流を供給されたときに発生されることができる。２つのコイル内の電流間＊の周波数の差は、勾配の交番する周波数を制御する。
【００２３】
磁気処理を短時間行なうことによって、処理後に非常に多数の細胞が残存する条件が生成される。細胞エンベロープが開いている限り、形質転換される分子は細胞中に導入されなければならない。この工程を最適化するために、分子はまた細胞エンベロープに導かれることができる。両プロセスは、一方において細胞表面に結合し、他方全く同じ強磁性粒子の前記分子に結合するために認識分子を結付けることによって行われる。生物化学ベースで、異なった種類の生物構造を認識して結合することのできる分子は、たとえば短い合成ペプチド、抗体の部分または酵素であることができる。
【００２４】
組換えたんぱく質のようなターゲットたんぱく質の認識分子を磁気感応粒子に結付けることによって、本発明による装置は、前記ターゲットたんぱく質の全く同じ方法での溶解および特定の精製に使用されることができる。別の溶解技術（主として酵素および機械的溶解）と比較すると、１以上の精製ステップと組合せて本発明による装置を使用することによって上記の全ての時間だけでなく材料もまた節約される。
【００２５】
本発明の利点は、一方では形質転換方法に対して使用され、他方において装置を独特なものにする特定の細胞成分の精製のために使用されることが可能なことである。この方法は、用途に関係なく、コイルが一定温度に維持されているあいだに行われなければならず、それは冷却装置および温度制御装置が制御可能な磁気装置内に組込まれていなければならないことを意味する。さらに、磁界の強度および周波数、ならびに試料が処理にさらされる時間が可変的であることは、装置の種々の可能性のある適用分野にとって利点である。
【００２６】
［例  １］
以下の例では、ｐＵＣ１８プラスミドによる大腸菌（Ｅコリ）の形質転換方法を説明する：
１００μｌの反応性をもつ大腸菌は、３０μｌの０．０５ＭのＣａＣｌ2 中に溶解された５００μｇのｐＵＣ１８と０℃で混合される。本発明による装置内の試料コンテナ中に試料が導入され、コイル内において３０分間０℃で培養される。その後、その試料は３０秒間１ＭＨｚ、２Ａで処理される。その後、１ｍｌの滅菌したＬＢ肉汁が試料に加えられ、それ後これは１時間３７℃で水浴中で培養される。続いて、形質転換された細菌だけを得るために、淘汰圧、５０μｇ／μｌのアンピシリンを含む寒天のプレート上に細胞が塗布される。この実験は、サバイバルおよび形質転換周波数を判定するためにｐＵＣ１８を含まない基準試料を含んでいなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による装置の原理的概略図。
【図２】  例示的な電流源の回路図。
【図３】  例示的なコイルの接続図。
【図４】  磁気感応粒子の例示的な概略図。
【図５】  勾配磁界を発生させることのできる装置の概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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