(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−イソロイシン要求性を有し、かつ、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを０．１ｇ／Ｌ以上の濃度で培地中に生産蓄積する能力を有するエシェリヒア属細菌を、Ｌ−イソロイシンを含む培地で培養し、該培養物中にＬ−プロリン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−プロリン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とする、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの製造法。
【請求項２】
前記細菌はＬ−イソロイシン生合成酵素のいずれかの活性が欠損している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細菌はスレオニンデアミナーゼ活性が欠損している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記細菌はエシェリヒア・コリである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物工学の分野における技術に関する。より詳しくは、発酵によるＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの製造方法及びこの方法で使用される細菌に関する。Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンは、食品、薬剤等として重要である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンは、大腸菌(E. coli)では、共通の前駆体であるＬ−グルタミン酸から合成される。従って、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンの生産量は、それらの共通の前駆体であるＬ−グルタミン酸の利用可能性に依存する。
【０００３】
Ｌ−グルタミン酸合成のレベルが向上したE. coli株が知られている。とりわけ、E. coli K12に由来し、２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損又は低下している変異体はかなり高い生産性でＬ−グルタミン酸を生産することができる（米国特許第5,393,671号及び第5,908,768号）。
【０００４】
また、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンを生産できるE. coli変異体も知られている。これらの変異体は、これらのアミノ酸のアナログに耐性の変異体として、及び、それらの生合成に重要ないくつかの遺伝子をクローニングすることにより得られた（英国特許公開第2080825A号）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産能を有する細菌、及び、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産能を有する細菌を用いて、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、スレオニンデアミナーゼ遺伝子（ｉｌｖＡ遺伝子）が欠損したE. coliのＬ−イソロイシン要求株がＬ−グルタミン酸を生産することを見いだした。また、ｉｌｖＡ遺伝子が欠損した株は、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニンの生産菌の育種のための親株として用いることができる。すなわち、本発明者らは、Ｌ−イソロイシン要求性を、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニンの生産菌の改良に用いることができることを見い出した。このような知見に基づき、本発明は完成されるに至った。
本発明は以下のものを提供する。
【０００７】
（１）Ｌ−イソロイシン要求性を有し、かつ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産能を有するエシェリヒア属細菌。
【０００８】
（２）Ｌ−イソロイシン生合成酵素のいずれかの活性が欠損している（１）記載のエシェリヒア属細菌。
【０００９】
（３）スレオニンデアミナーゼ活性が欠損している（２）記載のエシェリヒア属細菌。
【００１０】
（４）エシェリヒア・コリである（１）〜（３）のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌。
【００１１】
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のエシェリヒア属細菌を、Ｌ−イソロイシンを含む培地で培養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１３】
＜１＞本発明細菌
本発明細菌は、Ｌ−イソロイシン要求性を有し、かつ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産能を有するエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。
【００１４】
「Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産能を有する」とは、細菌を培地で培養したときに培地中に有意の量のＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリンもしくはＬ−アルギニンを蓄積するか、又は、細菌中のＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリンもしくはＬ−アルギニンの量を増加させる能力をいう。「Ｌ−イソロイシン要求性である」とは、細菌が増殖するのに培地中にＬ−イソロイシン（通常には10 mg/l以上）を要求することを意味する。
【００１５】
本発明細菌は少なくともＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを生産するものであり、複数のＬ−アミノ酸を生産してもよい。
【００１６】
本発明細菌は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリンもしくはＬ−アルギニンの生産能を有するエシェリヒア属細菌にＬ−イソロイシン要求性を付与することによって、又は、Ｌ−イソロイシン要求性のエシェリヒア属細菌にＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリンもしくはＬ−アルギニンの生産能を付与することによって得ることができる。
【００１７】
Ｌ−イソロイシン要求性を付与する方法としては、エシェリヒア属細菌を変異処理し、変異処理した細菌のコロニーをＬ−イソロイシンを含む寒天培地に形成させ、これをＬ−イソロイシンを含まない寒天培地にレプリカし、Ｌ−イソロイシンを含まない寒天培地で生育できない菌株を選択する方法が挙げられる。変異処理としては、紫外線照射、又は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常に変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。また、自然突然変異株を選択してもよい。
【００１８】
Ｌ−イソロイシン要求性は、Ｌ−イソロイシン生合成酵素（Ｌ−イソロイシン生合成の反応を触媒する酵素）の活性が欠損していることによるものであることが好ましい。Ｌ−イソロイシン生合成酵素酵素としては、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ等がある。スレオニンデアミナーゼ活性が欠損していることが好ましい。なお、「活性が欠損している」とは、通常には、野生株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が低下した菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味する。
【００１９】
上記のような酵素の活性を欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が欠損するような変異を導入すればよい。
【００２０】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００２１】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子をエシェリヒア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
【００２２】
細胞中の目的酵素の活性の減少もしくは欠損又は活性の減少の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株又は親株と比較することによって確認することができる。また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。
【００２３】
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産能を付与する方法としては、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法が挙げられる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、その活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００２４】
例えば、Ｌ−グルタミン酸生産菌はオレイン酸要求変異株等として育種することができる。
【００２５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６１−２６８１８５号）、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラターゼ（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンターゼ（特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１９６８８号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（特開昭６３−１０２６９２号）、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＷＯ９９／０７８５３）等の酵素をコードするＤＮＡを導入することによって、付与することができる。
【００２６】
さらに、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を欠損させてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。
【００２７】
Ｌ−プロリン生産能は、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持させる、及び／又は、Ｌ−プロリン分解系を破壊することによって付与することができる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持させる方法としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするＤＮＡを細胞内に導入する方法（J. Bacteriol. 170, 5943(1988)）が挙げられる。Ｌ−プロリン分解系を破壊する方法としては、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に変異を導入して、活性のあるプロリンデヒドロゲナーゼを発現させないようにする方法が挙げられる。また、Ｌ−プロリン分解系が破壊された細菌は、Ｌ−プロリン資化能欠損株を取得し、得られた株の中からＬ−プロリン要求性を指標としてＬ−プロリンを菌体外に生産する株を選択することによっても得ることができる。
【００２８】
Ｌ−アルギニン生産能は、例えば、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン又はスルファグアニジンに対する耐性を付与する（特開昭５６−１０６５９８）、又は、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするargA遺伝子を導入する（特開昭５７−５６９３）ことによって得ることができる。
【００２９】
＜２＞本発明方法
本発明方法は、本発明細菌を、Ｌ−イソロイシンを含む培地で培養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とする。
【００３０】
培地は、Ｌ−イソロイシンを含む他は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。Ｌ−イソロイシンの量は、本発明細菌がＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンを生産蓄積するのに十分な量であればよく、通常には、25〜250 mg/lである。
【００３１】
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、又はフマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００３３】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが好ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３４】
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、通常には、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３５】
培養物は、培地及び菌体を包含し、好ましくは培地である。
【００３６】
培養物からのＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの採取は、通常、イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３８】
【実施例１】
ｉｌｖＡ欠損株によるＬ−グルタミン酸の生産
Ａ）ｉｌｖＡ遺伝子へのトランスポゾンＴｎ５（又はその他）の挿入の利用
野生型であるE. coli K12株（VKPM B-7）の細胞を、ｉｌｖＡ遺伝子にトランスポゾンＴｎ５が挿入されているＬ−イソロイシン要求性株のE. coli C600 ilvA::Tn5の細胞を用いて増殖させたバクテリオファージＰ１で処理し、カナマイシン耐性株を選択するために、カナマイシン（20 μg/ml）を含むＬＢ寒天培地にプレートした。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子にトランスポゾンＴｎ５が挿入された、野生型のE. coli K12株の誘導体が得られた。この株は、B7ILEと名付けられ、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムス（VKPM）に、2000年7月18日から寄託され、2001年5月18日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、受託番号VKPM B-8013が付与されている。
【００３９】
Ｂ）ｉｌｖＡ遺伝子に変異を有する、野生株のE. coli K12株のｉｌｖＡ欠損誘導体の構築
VL334株（VKPM B-1641）は、ｔｈｒＣ及びｉｌｖＡ遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性の株である（米国特許第4,278,765号）。ｔｈｒＣ遺伝子の野生型遺伝子座を、野生型のE. coli K12株（VKPM B-7）の細胞を用いて増殖させたバクテリオファージＰ１を用いる普遍形質導入により転移させた。その結果、Ｌ−イソロイシン要求性株VL334thrC+が得られた。
【００４０】
Ｃ）試験管発酵での、Ｌ−イソロイシン要求性株によるＬ−グルタミン酸の生産発酵培地は、60 g/lのグルコース、25 g/lの硫酸アンモニウム、2 g/lのKH2OP4、1 g/lのMgSO4、0.1 mg/lのチアミン、50 mg/lのＬ−イソロイシン及び25 g/lのチョークを含むものであった（pH 7.2）。グルコース及びチョークは別に滅菌した。2 mlの培地を試験管に入れ、試験微生物を一白金耳接種し、培養を37℃で２日間振盪しながら行った。結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
0004810781.tif 000002
【００４２】
【実施例２】
ｉｌｖＡ欠損Ｌ−プロリン生産菌によるＬ−プロリンの生産
野生型であるE. coli K12株（VKPM B-7）の細胞を、変異原であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（0.1 mg/ml）で20分間37℃で処理し、洗浄して、1.25 mg/mlのトリプトン、10 mg/mlのＬ−プロリン及び0.05 mg/mlの２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドを添加した最少寒天培地Ｍ９にプレートした。37℃で３日間のインキュベーション後に出現したコロニーのほとんどは赤色であった。Ｌ−プロリンを酸化できないごく一部のコロニーは白色であった。そのコロニーの一つを、2 mg/mlの濃度でＭ９寒天培地にそれぞれ添加されたプロリンアナログ（３，４−デヒドロキシプロリン及びアゼチジン−２−カルボキシレート）に対して耐性の変異体を得るための親株として使用した。
【００４３】
生じた変異体の一部はＬ−プロリンを生産することができた。最も優れたＬ−プロリン生産菌702を、ｉｌｖＡ遺伝子がクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子の挿入により破壊されているTG1株の細胞を用いて増殖させたバクテリオファージＰ１で処理した。得られたCm耐性（Cmr）導入体の一つである702ilvAはＬ−イソロイシン要求性になり、Ｌ−イソロイシン原栄養性の親株702よりもかなり優れたＬ−プロリン生産菌であった（表２）。培養は実施例１と同様に行った。
【００４４】
【表２】
0004810781.tif 000003
【００４５】
702株及び702ilvA株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムス（VKPM）に、2000年7月18日から寄託され、2001年5月18日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、それぞれ受託番号VKPM B-8011及びVKPM B-8012が付与されている。
【００４６】
【実施例３】
ｉｌｖＡ欠損Ｌ−アルギニン生産菌によるＬ−アルギニンの生産
ピリミジンアナログの６−アザウラシルに耐性の変異株として選択された、Ｌ−アルギニン生産株である237株は、ｉｌｖＡ遺伝子へのトランスポゾンＴｎ５の挿入を有しており、従ってＬ−イソロイシン要求性である。237株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムス（VKPM）に、2000年４月10日から寄託され、2001年5月18日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、受託番号VKPM B-7925が付与されている。
【００４７】
237株の細胞を、野生型のE. coli K12株（VKPM B-7）の細胞を用いて増殖させたバクテリオファージＰ１で処理し、Ｌ−イソロイシン原栄養性形質導入体を選択した。Ｌ−イソロイシン原栄養性形質導入体のＬ−アルギニン生産は著しく減少した（表３）。培養は実施例１と同様に行った。
【００４８】
【表３】
0004810781.tif 000004
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの生産性が向上したエシェリヒア属細菌、及び、その細菌を用いたＬ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−アルギニンの製造方法が提供される。