(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ドキシサイクリンの存在時にはtetオペレータ配列に結合するが不在時には結合しない第一ポリペプチド、及び（ｉｉ）それに作動上連結させた、真核細胞内での転写活性化ドメインを有する第二ポリペプチド、から成る融合タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、前記核酸が
ａ）配列番号1、5又は10に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；
ｂ）配列番号2又は11に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；
ｃ）配列番号1、5又は10に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸であって、コードされた融合たんぱく質が、少なくとも、以下のアミノ酸置換：E19G、A56P、H139H、D148E、及びH179Rを有する、核酸；及び
ｄ）配列番号2又は11に示したアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、コードされた融合タンパク質が、少なくとも、以下のアミノ酸置換：E19G、A56P、H139H、D148E、及びH179Rを有する、核酸、
から成る群より選択され、
そして前記融合タンパク質が、（図８に示す）rtTAに比較してドキシサイクリンの存在時には因子の遺伝子発現誘導の増加を示す、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有するベクタ。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のベクタを含むホスト細胞。
【請求項４】
前記細胞が植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞又は哺乳動物細胞である、請求項３に記載のホスト細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載のベクタにコードされている、あるいは、請求項３又は４に記載のホスト細胞により得られ、請求項１に記載のポリヌクレオチドにコードされている、ポリペプチド。
【請求項６】
第一及び第二ポリペプチドを相互に作動的に連結させて含むトランス活性化因子融合ポリペプチドであって、前記第一ポリペプチドはドキシサイクリンの存在時にtetオペレータに結合し、前記第二ポリペプチドは真核細胞内での転写活性化ドメインを有し、そして前記トランス活性化因子融合ポリペプチドは配列番号23のアミノ酸位置１乃至４５から成るDNA結合ドメインと、配列番号23のアミノ酸位置４６乃至２０７から成るドキシサイクリン結合ドメインとを有し、そして前記トランス活性化因子融合ポリペプチドは（ｉ）E19Gの第一置換と、A56Pの第二置換と、D148Eの第三置換と、H179Rの第四置換とを有するバリアント配列、又は（ｉｉ）S12Gの第一置換と、E19Gの第二置換と、A56Pの第三置換と、D148Eの第四置換と、及びH179Rの第五置換とを有するバリアント配列、である、トランス活性化因子融合ポリペプチド。
【請求項７】
第一及び第二ポリペプチドを相互に作動的に連結させて含むトランス活性化因子融合ポリペプチドであって、前記第一ポリペプチドはドキシサイクリンの存在時にtetオペレータに結合し、前記第二ポリペプチドは真核細胞内でのサイレンサー・ドメインを有し、そして前記トランス活性化因子融合ポリペプチドは配列番号23のアミノ酸位置１乃至４５から成るDNA結合ドメインと、配列番号23のアミノ酸位置４６乃至２０７から成るドキシサイクリン結合ドメインとを有し、そして前記トランス活性化因子融合ポリペプチドは（ｉ）E19Gの第一置換と、A56Pの第二置換と、D148Eの第三置換と、H179Rの第四置換とを有するバリアント配列、又は（ｉｉ）S12Gの第一置換と、E19Gの第二置換と、A56Pの第三置換と、D148Eの第四置換と、及びH179Rの第五置換とを有するバリアント配列、である、トランス活性化因子融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項９】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のベクタを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド又はベクタが内因性遺伝子と相同組換えさせてある、請求項１０に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記動物がサル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスからなる群より選択される、請求項１０又は１１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載のベクタ、請求項５乃至７のいずれかに記載のポリペプチド、又は請求項８もしくは９に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載のベクタ、請求項５乃至７のいずれかに記載のポリペプチド、又は請求項８もしくは９に記載の抗体の、遺伝子治療において適用される医薬組成物の調製のための使用。
【請求項１６】
ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードする、tetオペレータ配列に作動上連結させたポリヌクレオチドとを含むホスト細胞を提供するステップと；
ｂ）無水テトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エピオキシテトラサイクリン又はシアノテトラサイクリンの存在下で培養基中で生産規模の前記細胞を成長させるステップと；
ｃ）採集されたホスト細胞から、又は、細胞培養基から、目的のポリペプチドを単離するステップと
を含む、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項１７】
ホスト細胞中でtetオペレータ連結遺伝子の転写を調節する方法であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドをホスト細胞に導入するステップと；前記ホスト細胞と接触したテトラサイクリン、無水テトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エピオキシテトラサイクリン又はシアノテトラサイクリンの濃度を変調するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
請求項５乃至７のいずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子治療ベクタと、tetオペレータ由来の配列により発現が調節される目的の遺伝子を含む第二遺伝子治療ベクタと、治療上有効量の無水テトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エピオキシテトラサイクリン又はシアノテトラサイクリンとを含む遺伝子治療用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
TTn10にコード化されたTetリプレッサー(TetR)タンパク質は、テトラサイクリン(Tc)に依存する態様では、グラム陰性菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)のテトラサイクリン耐性遺伝子の発現を調節する(Hillen & Berens、1994に評価されている)。Tcの不在下では、TetRタンパク質の二量体はオペレーター配列(tetO)に結合して、テトラサイクリン耐性遺伝子(tetA)の発現を抑制する。誘導物質Tcが細胞内に入り、TetRと結合すると、tetOの親和性が減少し、TetRがtetOから単離して、tetAが発現する。TetR-[Mg-Tc]+複合体(Hinrichs et al., 1994；Kisker et al., 1995)と遊離TetR(Orth et al., 1998)の結晶構造、非誘発性TetR突然変異体の解析(Muller et al., 1995)から、Tcの結合はTetRのコンフォメーション変化を誘導することを暗示している。TetRの二量体化は4本らせん束によって媒介され、二量体化の特異性を決定する残基はすでに特定されている(Schnappinger et al., 1998)。これによって、ヘテロ二量体化できないTetRに基づく調節因子が導かれる。
【０００２】
哺乳動物(Bossen & Bujard 1992)、植物(Weinmann et al., 1994;Zeidler et al., 1996)、及び両生類(Camacho-Vanegas et al., 1998)由来の各種細胞系、ならびに真菌(Gari et al., 1997)、植物(Weinmann et al., 1994)、Drosophila(Bello et al., 1998)、マウス(Kistner et al., 1996；Efrat et al., 1995；Ewald et al., 1996)、及びラット(Fishman et al., 1994；Harding et al., 1998)などあらゆる生物においてテトラサイクリン依存モードで適正に変更された遺伝子(Gossen et al., 1995)の誘導性発現を可能にする、TetRベースの転写活性化因子が開発された。
【０００３】
テトラサイクリン制御トランス活性化因子(tTA)は、TetRと転写活性化因子の適切なドメインとの融合である。1つの上述のような融合タンパク質において、単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)の主要部分が、DNAレベルでTetRに融合された。なおまた、最低活性化ドメインの各種組合わせをTetRのC末端に結合させた結果から、他のtTA'sも段階的な転写活性化促進の可能性を実証している。(Baron et al., 1997)。これらのキメラ「テトラサイクリン制御トランス活性化因子」(tTA)によって、最小プロモーター-tetO融合(Ptet)の下流にある、遺伝子の発現を調節できる。Tcの不在下ではPtetが活性化されるのに対して、抗生物質の存在下ではPtetの活性化が阻害される。
【０００４】
「逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子」(rtTA)が開発された。この因子は、ドキシサイクリン(Dox)又はアンヒドロテトラサイクリン(ATc)などのテトラサイクリン誘導体のある程度の存在下では、オペレーターDNAだけを結合し、このためDoxを追加した時にPtetを活性化する因子である(Gossen et al., 1995)。tTA及びrtTAの両方とも各種系の遺伝子発現を調節するために広く使用されている(レビューにはFreundlieb et al., 1997参照)。
【０００５】
Tet系は、学術及び産業の研究分野、並びに高スループットのスクリーニング及び発酵などの技術工程でも広範に使用されているが、トランス活性化因子の特異的特性、及び誘発エフェクター物質に起因して、いくつかの分野でこれらの使用の妨げとなる限界が存在する。これらの限界では、特に次のような点が問題になる。
・ 誘導物質の不在下におけるtetO配列に対するrtTAの残存親和性
・ Doxに対するrtTAの感受性が比較的低いこと
・ rTAとrtTAの異なるドメイン間の相互依存。これはトランス活性化因子/オペレーターの相互作用の特異性に影響することがある。
・ 異なる真核系におけるrTAとrtTAの安定性
・ rTA/rtTA機能の最適温度範囲が比較的狭いこと
・ いくつかの最良エフェクター分子の抗菌性
・ テトラサイクリン系の物質に対するエフェクターの限界
【０００６】
例えば、上述の知られたrtTAは、ドキシサイクリン(Dox)不在下にtetOに対する残存親和性を保持する。このため、rtTA応答プロモーターの内因性基礎活性を導くことがあり、実際に哺乳動物細胞系統ならびにS.クレビジエ(S.cerevisiae)において、転写の基礎レベルの増加が観察されている。S.クレビジエ(S.cerevisiae)においてrTA及びrtTAを使用した、Tc制御による発現が公開されている(Gallego et al., 1997；Gan et al., 1997；Belli et al., 1998a；Belli et al., 1998b；Nagahashi et al., 1998；Nakayama et al., 1998；Colomina et al., 1998)。tTAを用いた遺伝子調節はすでに達成されており、lacZの高発現及び低基礎活性が示されている(Bari et al., 1997)。これに対して、rtTAは、遺伝子発現の明らかな誘導が示されておらず、基礎発現が極端に高いため、Tcに応答する発現を調節しなかった。このため、リプレッサーを調節して、その基礎発現を下げるためにさらに追加して導入した(Belli et al., 1998)。これまでのところ、S.クレビジエ(S.cerevisiae)において唯一このデュアル制御系だけが相応の誘発因子を産生した。加えて、Doxのレベルが比較的高い場合に限り、既知のrtTAが十分に誘導される。
【０００７】
その上、トランスジェニック(tg)マウス、デュロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)のB細胞を含むいくつかの系、及び植物では、活性rtTAタンパクが合成されないことが明らかである。これは、RNA又はタンパク質のレベル、或いはこの両レベルの不安性のためであるかどうかは全く明らかでない。
【０００８】
既知のトランス活性化因子は、またむしろ狭い最適温度範囲を呈する。哺乳動物系では、これは特別問題にならない。対照的に、Tet調節を植物に応用するには、トランス活性化因子の温度許容度を拡張する必要がある。
【０００９】
これまで、TetR変異体を生産する最も効率的な方法は、ランダム又は指定突然変異誘発、それ以後の大腸菌のTetR機能に依存したスクリーニング手順に基づいていた(Helbl & Hillen, 1998；Helbl et al., 1998；Muller et al., 1995；Hecht et al., 1993；Wissmann et al., 1991)。この後、この方法で特定されたTetR変異体が、真核系で特性を試験した、tTA又はrtTA(あるいはこの両方)融合タンパク質に変換された。頻繁に、大腸菌で特定されたTetR変異体の特性が、真核細胞中の対応するtTA又はrtTAの特性と相関していないような場合があろう。この矛盾の主因は、(a) TetR変異体とアクチベータードメインの融合、又は突然変異の導入、例えば逆表現型を付与する突然変異が、個別のTetR変異体の機能全体に悪影響する可能性がある、(b) 安定性のようなtTA/rtTAの特性又はオペレーター配列との相互作用が、大腸菌系と各種の真核系との細胞環境の相違による影響を受けた、(c) テトラサイクリン及びその誘導体の多くは、本来タンパク質生合成を抑制するように作用する原核生物には有毒があり、そのため、スクリーニング手順がエフェクター分子の亜致死濃度までに限定されることなどが考えられる。これに対して、テトラサイクリンは、真核細胞ではこれより高い濃度でも許容される。
【００１０】
従って、Tetリプレッサーの有用な配列範囲を十分に試験する必要がある。最終的には、ランダム、半ランダム、指定突然変異誘発によって生産された候補の大きなプールの中から、tTA及びrtTAの新規変異体を高速かつ効率的に特定できるスクリーニング方法を開発することが望ましい。
【００１１】
各種真核系においてtTA及びrtTAの変異体を最適に応用するには、定義したタスクに特別に適応させた、トランス活性化因子の開発が必要である。従って、酵母菌又はその他真菌のような真核生物で直接tTA/rtTA表現型を特定できるスクリーニングシステムは、次のような理由から、現在のスクリーニング技術より大幅に改善できるであろう。
・ 特定された表現型は、真核系における転写活性化融合タンパク質(活性化ドメインに融合されたTetR)の特性を直接反映する。
・ 全トランス活性化因子をコード化している遺伝子全体に突然変異誘発が生じることがある。
・ 活性化ドメイン内での突然変異が解析に含まれることがある。
・ 酵母菌系又はその他真菌系を使用すると、大腸菌で得られた効率に匹敵するスクリーニング効率が結果的に得られるであろう。
【００１２】
発明の概要
ある態様において、本発明は、ドキシサイクリン又はその類似体の不在化では、改変した基礎転写活性を有する逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子(rtTA)タンパク質の配列変異体を含む、単離ポリペプチドを提供する。別の態様において、本発明は、ドキシサイクリン又はその類似体存在下では、改変した誘導転写活性を有するrtTAタンパク質の配列変異体を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１３】
ある実施例において、本発明は、DNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有するrtTAタンパク質含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、前記のDNA結合ドメインは、SEQ ID NO:23のアミノ酸1〜45個を含む。好適な実施例においては、前記の突然変異は、S12G、E19G、及びT26Aから成るグループから選択される。また別の好適な実施例においては、ドキシサイクリン又はその類似体の不在下では、前記の突然変異によりTetオペレーターに対する基礎親和性が改変される。また別の好実施例において、本発明は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有するrtTAタンパク質を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例においては、本発明は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有するrtTAタンパク質を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、前記のテトラサイクリン結合ドメインは、SEQ ID NO:23のアミノ酸46〜207個を含む。好適な実施例においては、前記の突然変異は、A56P、R87S 、欠失88、D95G、G96R、V99E、D148E、H179R、及びE204Kから成るグループから選択される。また別の好適な実施例においては、前記の突然変異により、ドキシサイクリン又はその類似体に対する感受性が改変される。
【００１４】
本発明は、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列に少なくとも50%相同を有するアミノ酸配列を含むrtTAタンパク質を含む、単離ポリペプチド(この場合、ポリペプチドは前記のDNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する)を提供する。ある実施例において、本発明は、ID NO:23のアミノ酸配列に少なくとも50%相同を有するアミノ酸配列を含むrtTAタンパク質を含む単離ポリペプチド(この場合、ポリペプチドは前記のテトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する)を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、テトラサイクリン又はその類似体による差次的調節を表示するテトラサイクリン制御トランス活性化因子(tTA)タンパク質の配列変異体を含む、単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、本発明は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有するtTAタンパク質を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例において、前記のテトラサイクリン結合ドメインは、SEQ ID NO:25のアミノ酸46〜207個を含む。好適な実施例において、前記の突然変異は、A56V、F78S、S85G、S85R、Y110C、L113H、Y132C、I164L、P167S、L170V、I174V、I174T、又はE183Kから成るグループから選択される。また別の好適な実施例において、前記の突然変異は、テトラサイクリン又はその類似体に対する差次的感受性を付与する。別の実施例において、本発明は、DNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含むtTAタンパク質を含む単離ポリペプチドである。ある実施例において、前記のDNA結合ドメインは、SEQ ID NO:25のアミノ酸46〜207個を含む。
【００１６】
本発明は、ID NO:25のアミノ酸配列に少なくとも50%相同を有するアミノ酸配列を含むtTAタンパク質を含む単離ポリペプチド(この場合、ポリペプチドは前記のテトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する)を提供する。
【００１７】
ある実施例において、本発明は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45を含むアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。別の実施例において、本発明は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45を含むアミノ酸配列に少なくとも50%同一性を有する単離ポリペプチドを提供する。
【００１８】
本発明の別の実施例では、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44を含む核酸配列によってコード化された単離ポリペプチドを提供する。本発明の別の態様では、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44に少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチドによってコード化された単離ポリペプチドを提供する。
【００１９】
ある態様において、本発明は、非相同アミノ酸配列に機能的に連結する発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、以下から成るむグループから選択される単離多核酸分子を提供する。
(a) SEQ ID NO:1、5、6、8、10、12、14、16、18、又は20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(b) (a)のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド
(c) (a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチド
(d) SEQ ID NO: 1、5、6、8、10、12、14、16、18、又は20のヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも100の連続したヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチド
(e) SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド
(f) SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコード化するポリヌクレオチド。この場合の断片は、SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列の少なくとも30の連続したアミノ酸残基を含む。
(g) SEQ ID NO: 2、7、9、11、13、15、17、19、又は21のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも50%同一性を有するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド
(h) tetオペレーター由来の配列からの転写を調節することが可能なタンパク質をコード化する(a)〜(g)の核酸に少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチド
【００２１】
別の態様において、本発明は、以下から成るグループから選択される単離多核酸分子を提供する。
(a) SEQ ID NO:3、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(b) (a)のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド
(c) (a)又は(b)のポリヌクレオチドに少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチド
(d) SEQ ID NO: 3、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44のヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも100の連続したヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチド
(e) SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド
(f) SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコード化するポリヌクレオチド。この場合、断片はSEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列の少なくとも15の連続したアミノ酸残基を含む。
(g) SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも50%同一性を有するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド
(h) tetオペレーター由来の配列から転写を調節することが可能なタンパク質をコード化する(a)〜(g)の核酸に少なくとも50%同一性を有するポリヌクレオチ
【００２２】
また別の態様においては、本発明は、非相同ペプチドをコード化する核酸配列に機能的に連結する発明のポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
【００２３】
本発明のある態様では、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施例においては、前記のベクターは発現ベクターである。
【００２４】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【００２５】
ある実施例において、本発明は、本発明の単離ポリペプチドを含む組換え細胞を提供する。さらなる実施例において、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え細胞を提供する。好実施例において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。別の実施例において、前記の組換え細胞は、真核細胞、原核細胞及びウイルスから成るグループから選択される。好適な実施例においては、前記の組換え細胞は、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は哺乳動物細胞から成るグループから選択される。
【００２６】
本発明のある態様では、以下から成るグループから選択されたポリペプチドを生産する方法を提供する。
(a) SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b) SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片。この場合の断片は、SEQ ID NO: 4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列の少なくとも15の連続したアミノ酸残基を含む。
(c) SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含むポリペプチドの対立遺伝子変異体。
上記の方法には、上記のポリペプチドが発現されるような条件下で、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する組換え細胞の培養が含まれる。
【００２７】
本発明の別の態様では、細胞内のTetオペレーターと連結する遺伝子の転写を調節するための方法を提供する。上記の方法は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコード化する核酸分子を前記の細胞に導入し、さらにその細胞と接触するテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調製することから成る。
【００２８】
本発明のさらなる態様では、細胞内のTetオペレーター由来の配列によって発現を調節する遺伝子によってコード化されるタンパク質を生産するための方法を提供する。上記の方法は、前記のタンパク質が生産されるように、SEQ ID NO2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、27、29、31、33、35、37、39、41、43、又は45のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコード化する核酸分子を細胞に導入し、その細胞と接触するテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調製することから成る。
【００２９】
また別の態様において、本発明は非ヒト・トランスジェニック生物を提供する。本発明のある実施例では、非ヒト・トランスジェニック生物の細胞内のrtTAタンパク質の発現に適した形質の本発明の核酸分子を含む導入遺伝子を含む非ヒト・トランスジェニック生物である。本発明の別の態様では、非ヒト・トランスジェニック生物の細胞内のtTAタンパク質の発現に適した形質の本発明の核酸分子を含む導入遺伝子を含む非ヒト・トランスジェニック生物である。
【００３０】
本発明のある態様は、Tetオペレーターに連結する遺伝子の発現を調節するための遺伝子治療も包含する。ある実施例において、遺伝子治療は、ドキシサイクリン又はその配列変異体の不在時に基礎転写活性が低下する少なくとも1つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する第1核酸分子、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2核酸分子、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、から成る製薬組成物の供与で構成される。別の実施例において、遺伝子治療は、ドキシサイクリン又はその配列変異体不在時に誘発転写活性が上昇する少なくとも1つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する最初の核酸分子、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2核酸分子、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、から成る製薬組成物の供与で構成される。さらなる実施例において、遺伝子治療は、テトラサイクリン又はその類似体、或いはその配列変異体により差次的に誘発された少なくとも1つのtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する第1核酸分子、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2核酸分子、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、から成る製薬組成物の投与で構成される。
【００３１】
本発明は、Tetオペレーターに連結する遺伝子の発現を調節するための遺伝子治療用組成物も提供する。ある実施例において、遺伝子治療の組成物は、ドキシサイクリン又はその配列変異体の不在時の基礎転写活性が低下する少なくとも1つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクター、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2遺伝子治療ベクター、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、で構成される。別の実施例において、遺伝子治療の組成物は、ドキシサイクリン又はその配列変異体の不在時に誘発転写活性が上昇する少なくとも1つのrtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクター、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2遺伝子治療ベクター、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、で構成される。さらなる実施例において、遺伝子治療は、テトラサイクリン又はその類似体、あるいはその配列変異体により差次的に誘発された少なくとも1つのtTAタンパク質から成るグループから選択されるタンパク質をコード化する遺伝子治療ベクター、発現がTetオペレーター由来の配列によって調節される対象の遺伝子を含む第2遺伝子治療ベクター、及びテトラサイクリン又はその類似体の治療的に有意な投与量、で構成される。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質及び逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質の両方から成る、1群のトランス活性化因子融合タンパク質を提供する。上述のトランス活性化因子は、ドキシサイクリンの不在時に基礎転写活性低下、ドキシサイクリンの存在時に誘導転写活性上昇、又はテトラサイクリン及びテトラサイクリンの類似体による差次的誘導などの、新規の表現型を有する。
【００３３】
本発明のある態様では、特定の突然変異又は改変が転写調節タンパク質の中に導入される。別の態様では、多数の突然変異を転写調節タンパク質の中に導入するために、ランダム突然変異誘発技術は選択又はスクリーニングシステムと合わせて使用される。この後、前記のランダム突然変異した結果のタンパク質の集団は、望ましい表現型についての選択か、又は望ましくない表現型を背景にして望ましい表現型が観察できるスクリーンにかけられる。
【００３４】
前記の ランダム突然変異誘発に従って、本発明のある態様では、1分子全体を突然変異誘発するか、若しくはカセット突然変異誘発によって処置することができる。前例では、1分子のコーディング領域全体を、いくつかの方法(化学、PCR、ドープ処理オリゴヌクレオチド合成)のどれかによって突然変異誘発させ、前記のランダム突然変異した結果のタンパク質の集団を、選択又はスクリーニング手順にかける。研究中の分子が比較的小さく、必然的に発生する突然変異の表現型のクラス選別に強力で厳格な選択又はスクリーンを使用できる場合には、ランダム突然変異誘発をこのような方式で応用することができる。
【００３５】
ランダム突然変異誘発は、以下を含む多くの手段によって達成されよう。
1. PCR突然変異誘発。この場合は、誤り傾性Taqポリメラーゼを利用して、転写調節タンパク質の突然変異対立遺伝子を生成する。前記対立遺伝子のカップリング能力を直接酵母菌で検定する。
2. 化学突然変異誘発。この場合は、転写調節タンパク質をコード化する発現カセットを突然変異体に暴露し、そして突然変異配列のタンパク質産物のカップリング能力を直接酵母菌で検定する。
3. 転写調節タンパク質遺伝子の部分をコード化するオリゴヌクレオチドのドープ処理合成
4. in vivo突然変異誘発。この場合は、ランダム突然変異が、大腸菌の突然変異誘発株XL1-Red (mutD5 mutS mutT) による培養(Stratagene, Menasa, WI)によって、転写調節タンパク質のコーディング領域に導入される。
【００３６】
転写調節タンパク質中の機能ドメインに対応する突然変異ペプチド配列の置換によって、機能達成のための特定配列要件の判別が可能になる。
【００３７】
本発明の前記特定突然変異誘発の態様に従って、定義された構造決定子(即ち、αらせん、βシート、回転、表面ループ)又は機能決定子(例えば、DNA結合決定子、転写調節ドメイン)のどちらかに対応する、タンパク質の個別領域を、飽和又は半ランダム突然変異誘発に暴露する。前記の突然変異誘発された結果のカセットを、それ以外の野生型対立遺伝子のコンテクストに再導入する。1分子の領域に対応する特定機能を示唆するために役立つ実験的証拠があり、さらに対象の突然変異体と非対象の突然変異体を区分するために役立つ選択又はスクリーニング或いはこの両方の方法があるとき、カセット突然変異誘発は有用である。前記の両親分子が比較的大きく、要望は分子の機能ドメイン地図を作成することであり、段階的に分子の突然変異誘発させる方式、即ちまず残基の1つの線状カセットを突然変異させてから機能を検定する方式が用いられるときにも、カセット突然変異誘発は有用である。
【００３８】
tTAをコード化する配列の突然変異誘発によって、異なるエフェクター分子と差次的に相互作用するトランス活性化因子が簡単に特定できるようになる。例えば、突然変異誘発エフェクター結合ポケットの形成を担う配列部分だけに突然変異誘発を限定することができる。このような特性を利用して、トランス活性化因子とエフェクターの特定セットを用いて異なる遺伝子を制御することができる(Baron et al., 1999参照)。エフェクター結合ポケットの修飾は、骨組織に沈着しないテトラサイクリンの検出のためのほぼ必須条件になっている。遺伝子治療には、人間の医療に使用されるテトラサイクリンに対して感受性のないトランス活性化因子を使用すると有効であろう。
【００３９】
tTAに対して10〜30 ng/mlのDox濃度のフルエフェクター機能が、特にトランスジェニック動物が含まれる実験や遺伝子治療では非常に望ましい。従って、本発明はDoxに対してより高い感受性をもつrtTA変異体のスクリーニングに対処する。
【００４０】
さらに、rTA及びrtTAに対応する新しいエフェクター分子を特定できるかもしれない。例えば、現在より低濃度でもrtTAを完全に誘導するエフェクター物質を特定できる可能性がある。本発明に従ったスクリーニング方法を用いると、優れたエフェクター特性と無視し得る抗菌性をもつ新しいエフェクターについて、高スループット形式で優位に物質ライブラリーの試験を簡単に行うことができる。スクリーニング候補として次のようなものがある。
・ 抗菌性がなくなったテトラサイクリン
・ 低濃度でrtTA転写促進を媒介するテトラサイクリン
・ 骨組織に沈着しないようなテトラサイクリン
・ 組織浸透性を向上させたテトラサイクリン
・ テトラサイクリンのアンタゴニスト
・ rTA又はrtTA或いはこの両方に対してエフェクターの役目をする非テトラサイクリン化合物。
【００４１】
同様に、DNA結合ドメイン内のrTA及びrtTAをコード化する配列の突然変異誘発によって、テトラサイクリン又はその類似体の存在・不在に関係なくTetオペレーター配列に対してより低い残存親和性を有するトランス活性化因子タンパク質を簡単に同定できるであろう。tetリプレッサーに基づく転写調節タンパク質の構造・機能解析によっても、温度許容範囲がより広い改良されたトランス活性化因子を特定できそうである。
【００４２】
定義
発明の詳細の前に、本明細書、例及び請求項で使用されるいくつかの用語を参考のために下記にまとめた。
【００４３】
「トランス活性化因子融合タンパク質の対立遺伝子変異体」という用語は、機能及び非機能トランス活性化因子融合タンパク質を含むものとして意図されている。機能対立遺伝子変異体は、転写を調節する能力を維持するトランス活性化因子融合タンパク質のアミノ酸配列変異体である。非機能対立遺伝子変異体は、転写を調節する能力をもたないトランス活性化因子融合タンパク質のアミノ酸配列変異体である。
【００４４】
本書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫的活性部、即ちトランス活性化因子融合タンパク質のような抗原を特異的に結合する(抗原と免疫反応する)抗原結合部位をもつ分子を含むものとして意図されている。免疫グロブリン分子の免疫的活性部の例には、ペプシンのような酵素で抗体を処理すると生成できるF(ab)及びF(ab')2断片も含まれる。本発明は、トランス活性化因子融合タンパク質を結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。本書で使用される、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、トランス活性化因子融合タンパク質の特定エピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を一種だけ含む抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、従って一般に抗体が免疫反応する特定のトランス活性化因子融合タンパク質に対し単一結合親和性を呈示する。
【００４５】
本書で使用される、トランス活性化因子融合タンパク質の「生物学的活性部」は、トランス活性化因子融合タンパク質の転写調節機能を実行するトランス活性化因子融合タンパク質の断片を含むものとして意図されている。
【００４６】
本書で使用される、キメラトランス活性化因子融合タンパク質は、さらに非相同ポリペプチドに機能的に連結するトランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドを含む。「トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチド」は、トランス活性化因子融合タンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すのに対し、「非相同ポリペプチド」はトランス活性化因子融合タンパク質に安定的に相同でないタンパク質(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質と異なっても同一又は異なる生物由来のタンパク質)に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。キメラトランス活性化因子融合タンパク質内では、前記のトランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドはトランス活性化因子融合タンパク質の全体又は部分に対応することができる。
【００４７】
「由来」という用語は、配列が別の配列と同一であるかその配列から修飾されたことを意味するものとして意図されている。ポリペプチド又はタンパク質誘導物は、アミノ酸配列に記述されているか又は既知である配列と異なるか、若しくは配列に関わりない方式である(このどちらか或いは両方)ポリペプチド又はタンパク質配列を含み、なおかつポリペプチド又はタンパク質の活性も保持している。アミノ酸配列の誘導物は、単体又は複数のアミノ酸が、異種の天然アミノ酸、アミノ酸誘導物、又は非天然アミノ酸と置換されるときに生成される。一部の実施例においては、タンパク質誘導物には、単一又は複数の連続アミノ酸置換によって野生型配列と異なる配列をもつが、これらがタンパク質又はペプチドの二次構造及び疎水性に与える作用は一般に最小限である、自然発生したポリペプチド又はタンパク質、或いはこれらの生物学的活性断片が含まれる。誘導物には、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を完全に消失しない単一又は複数の非連続アミノ酸置換、除去又は挿入によって異なる配列をもつものもある。
【００４８】
保存的置換(置換基)には、一般的に、1つのアミノ酸と同様の性質(例えば、電荷、サイズ、形状、及びその他生物学的特性)をもつ別のアミノ酸との置換が含まれる。例えば、バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンなどのグループ内での置換が含まれる。非極性(疎水)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正電荷をもつ(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。負電荷をもつ(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。
【００４９】
本発明の前記ポリペプチド及びタンパク質は、保存的又は非保存的のいずれかで導入、除去及び置換などの各種変更によって修飾できる場合がある。この場合、このような変更によってこれらの用途になんらかの利点が備わるであろう。
【００５０】
その他の実施例において、余り保存的でないアミノ酸置換による誘導物が、例えば、電荷、コンフォメーション、その他の生物学的特性を変更させることによって、結果的に望ましい誘導物になる場合もある。このような置換には、例えば、親水残基を疎水残基に置換、システイン又はプロリンを別の残基に置換、小さな側鎖をもつ残基を大きな側鎖をもつ残基に置換、或いは実効正電荷をもつ残基を実効負電荷をもつ残基に置換、などが含まれよう。所定の置換の結果を確実に予測できないとき、本書に開示されている方法に従って誘導物を検定して要望の性質の有無を容易に判別できるかもしれない。
【００５１】
本発明の前記適用範囲内の誘導物にはポリヌクレオチド誘導物も含まれる。ポリヌクレオチド又は核酸の誘導物は、ヌクレオチド配列に記述されているか又は既知である配列と異なる。例えば、ポリヌクレオチド誘導物は、単一又は複数のヌクレオチドの置換、挿入、又は除去によって特徴付けられる場合がある。
【００５２】
「DNA結合タンパク質」という用語は、遺伝子の調節配列内にある、特にコグネートDNA配列と相互作用する任意のタンパク質又はその機能ドメイン、若しくは応答配列を含むものとして意図されている。転写調節タンパク質のDNA結合ドメインは、基本らせん・ループ・らせんドメイン、ロイシンジッパードメイン、ジンクフィンガードメイン、及びらせん・回転・らせんドメイン/ホメオドメインを含む(ただし、これらドメインに限定されない)構造ファミリーに分類できる。本発明の融合タンパク質には、DNA結合タンパク質、又はこれらの機能DNA結合ドメインで構成されるポリペプチドが含まれる。そのコグネートDNA配列に対するDNA結合タンパク質の認識及び結合は、モジュレータ分子又はリガンドの結合によって与えられたDNA結合タンパク質自体の中のコンフォメーションの変化によって調節できる。同様に、クロマチン内のコグネートDNA配列のコンフォメーション、例えばヌクレオソームに形成されたコンフォメーションは、DNA結合タンパク質とそのコグネートDNA配列の結合にも影響する。
【００５３】
本書で使用される、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、トランス活性化因子融合タンパク質をコード化するオープンリーディングのフレームが組み込まれた核酸分子を含むものとして意図されている。
【００５４】
「遺伝子調節配列」又は「調節配列」という用語は、隣接遺伝子の転写を制御するDNA配列を含むものとして意図されている。遺伝子調節配列には、転写を開始するためRNAポリメラーゼを結合する転写開始部位に近接する遺伝子の5'領域で見つけられるプロモーター配列が含まれるが、これに限定されはしない。遺伝子調節配列には、プロモーターの利用を変調するため、プロモーターに関して任意の位置でどちらか一方の方向に機能できるエンハンサー配列も含まれる。転写制御配列には、プロモーター、エンハンサー、及びリプレッサーならびにアクチベーター結合部位が含まれるが、これに限定されはしない。本発明の遺伝子調節配列は、転写調節タンパク質に対応する結合部位を含有している。好適な実施例においては、遺伝子調節配列はtetリプレッサータンパク質を結合するtetオペレーター(tetO)由来の配列を含む。
【００５５】
本書で使用される「相同組換え生物」という用語は、遺伝子と、動物の細胞(例えば胚細胞)内に導入されたDNA分子との相同組換えによって修飾された遺伝子を含有する生物、例えば動物や植物を含むものとして意図されている。
【００５６】
「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本書では互換的に使用されている。「宿主細胞」には、非相同DNAの導入によって修飾できる任意の培養可能な細胞が含まれる。できれば、宿主細胞は、転写調節タンパク質が安定的に発現でき、翻訳後に修飾でき、適切な細胞細部の区画を突き止めることができ、さらに適正な転写機構を使用できるように作製できる細胞であることが望ましい。適正な宿主細胞の選択は、検出シグナルの選択によっても影響される。例えば、上述されているように、レポーター構成体は、転写調節タンパク質に応答して遺伝子転写の促進又は抑制の際に選択可能又はスクリーニング可能な形質を提供する。従って、最適の選択又はスクリーニングを実現するため、宿主細胞の表現型が考慮される。このような用語は、特定の当該細胞だけでなく、このような細胞の子孫又は潜在的子孫も指すものと理解されている。突然変異又は環境の影響のため後続世代でなんらかの修飾が発生する場合があるので、後代が実際には親細胞と同一でない場合があるが、それでも本書で使用される用語の前記適用範囲内に含まれている。
【００５７】
本発明の宿主細胞には原核細胞と真核細胞が含まれる。原核細胞には、グラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば大腸菌(E.Coli)又は桿菌(Bacilli)が含まれる。形式転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌(E.Coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、及び緑膿菌(Pseudomonas)、ストレプトミセス(Streptomyces)、及びスタヒロコッカス［ブドウ球菌］(Staphylococcus)属のその他多様な種が含まれる。真核細胞には、酵母菌、植物細胞、真菌、昆虫細胞(例えばバキュロウイルス(baculovirus))、哺乳動物細胞、及び寄生生物、例えばトリパノソーマ(trypanosomes)の細胞が含まれるが、これに限定されはしない。
【００５８】
本書で使用される、「酵母」という用語は、厳密に分類学的な意味の酵母、即ち単細胞生物だけでなく、糸状菌の酵母様の多細胞菌も含まれる。典型的な種には、クリュベレイ・ラクティス(Kluyverei lactis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、及びウスチラコ・マイデス(Ustilaqo maydis)が含まれ、サッカロミセス・クレビシエ(Saccharomyces cerevisiae )も好適である。本発明の実施に使用できるその他酵母として、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、及びハンセヌラ・ポリモルフ(Hansenula polymorpha)などがある。
【００５９】
哺乳動物の宿主細胞培養系には、Cos細胞、L細胞、3T3細胞、中国ハムスター卵巣(CHO)細胞、胚幹細胞などの既成の細胞系統が含まれ、HeLa細胞も好適である。
【００６０】
本書で使用される、「単離」又は「精製」タンパク質又はこれらの生物学的活性部分は、細胞質又はトランス活性化因子融合タンパク質の由来細胞又は組織をソースとするその他の汚染タンパク質が実質的にないか、化学合成されたときに化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にないタンパク質を含むものとして意図されている。
【００６１】
「細胞質が実質的にない」という語は、タンパク質が単離されたか又は遺伝子組換えで産生された起原の細胞の細胞構成体から分離されたトランス活性化因子融合タンパク質作用因子を含むものとして意図されている。ある実施例においては、前記のトランス活性化因子融合タンパク質又はその生物学的活性部分が遺伝子組換えで産生されたとき、「細胞状物質が実質的にない」という語には、培養基が実質的にないトランス活性化因子融合タンパク質作用因子が含まれる。培養基が実質的にないとは、培養基約20％未満、もっと望ましいのは約10％未満、そして最も望ましいのは約5％未満を表す。
【００６２】
「化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にない」という語は、タンパク質の合成に関わるなかの化学的前駆物質又はその他化学物質からタンパク質が分離されたそのトランス活性化因子融合タンパク質作用因子を含むものとして意図されている。ある実施例においては、「化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にない」という語は、化学的前駆物質又は非トランス活性化因子融合タンパク質化学物質を約30％未満(重量で)、もっと望ましいのは化学的前駆物質又は非トランス活性化因子融合タンパク質化学物質を約20％未満、さらに化学的前駆物質又は非トランス活性化因子融合タンパク質化学物質を約10％未満、そして最も望ましいのは化学的前駆物質又は非トランス活性化因子融合タンパク質化学物質を約5％未満含有するトランス活性化因子融合タンパク質作用因子が含まれる。
【００６３】
本書で使用される「最小活性化ドメイン」は、転写調節タンパク質の潜在トランス活性化因子で構成されるポリペプチド配列又は断片を含むものとして意図されている。最小活性化ドメインをコード化するポリペプチドは自然発生するポリペプチドであると言える。例えば、天然に存在するタンパク質内で見つかる場合、又は自然発生するタンパク質内に存在しない組成物をもつポリペプチドである場合がある。本発明との関連では、最小活性化ドメインは遺伝子転写を促進する能力を非相同タンパク質に十分与えられるドメインである。好適な実施例においては、最小活性化ドメインは、VP16の「酸性活性化ドメイン」で構成される12のアミノ酸分節、残基436〜447個から由来する。
【００６４】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変させることなく、トランス活性化因子融合タンパク質の野生型配列(即ち、SEQ ID NO:23又は25)から改変でできた残基を含むものとして意図されている。これに対し、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に不可欠である。
【００６５】
本書で使用される「核酸分子」という用語は、DNA分子(例: cDNA)及びRNA分子(例: mRNA)、及びヌクレオチド類似体を使用して生成されたDNA又はRNAの類似体を含むものとして意図されている。核酸分子は一本鎖又は二本鎖のものがあるが、できれば二本鎖DNAが望ましい。
【００６６】
「単離核酸分子」という用語は、他の核酸分子から分離され、かつ細胞質、又は組換え技術によって産生されたときに培養基が実質的にないか、又は化学合成されたときに化学的前駆物質又はその他化学物質が実質的にない核酸分子を含むものとして意図されている。
【００６７】
「機能的に連結する」は、ある分子の活性又は状態の変化が他の分子の活性又は状態によって作用されるように分子が機能的に相互に連結されることを意味するものとして意図されている。調節配列が対象のポリペプチド又はタンパク質をコード化するDNA配列と機能的に関連するとき、ヌクレオチド配列は機能的に連結する。例えば、プロモーターヌクレオチド配列が対象のポリペプチド又はタンパク質をコード化するDNA配列の転写を制御する場合は、プロモーターヌクレオチド配列は対象のポリペプチド又はタンパク質をコード化するDNA配列に機能的に連結する。一般に、機能的に連結する2個のポリペプチドはペプチド結合によって共有結合している。
【００６８】
本書で使用される「真核細胞内で転写を活性化するポリペプチド」は、直接的又は間接的のどちらかに転写を活性化するポリペプチドを含むものとして意図されている。
【００６９】
本書で使用される、「逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子」即ち「rtTA」は、活性化ドメインと機能的に連結する、いくつかのテトラサイクリン誘導体、又はドキシサイクリン(Dox)又はアンヒドロテトラサイクリン(ATc)などの類似体の存在下でのみオペレーターDNAを結合するTetR突然変異体で構成される融合タンパク質を含むものとして意図されている。従って、rtTAタンパク質は、Doxの付加時にPtetによって駆動された遺伝子発現を促進することになる(Gossen et al., 1995)。
【００７０】
「配列変異体」又は「変異対立遺伝子」という用語は野生型対立遺伝子に相対する少なくとも1つの突然変異で構成されるポリペプチド又はタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むものとして意図されている。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、前記ポリヌクレオチドによってコード化されるアミノ酸配列における突然変異に転移され、このためタンパク質の構造及び機能に影響が及ぶ場合がある。突然変異の型には、サイレント、ミスセンス及びナンセンス突然変異、並びに挿入及び除去突然変異も含まれる。
【００７１】
「テトラサイクリン類似体」は、テトラサイクリンと密接に関連しており、少なくと106M-1のKaによってtetリプレッサーに結合するいくつかの化合物のいずれか1つである。できれば、テトラサイクリン類似体は、約106M-1又はそれより大きい親和体(例えば109M-1)によって結合する。(Hlavka and Boothe, "The Tetracyclines," in Handbook of Experimental Pharmacology 78, R.K.. Blackwood et al. (eds.), SpringerVerlag, Berlin-New York, 1985、L.A. Mitscher "The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, Medicinal Research 9, Dekker, New York, 1978、Noyee Development Corporation, "Tetracycline Manufacturing Processes," Chemical Process Reviews, Park Ridge, N.J., 2 volumes, 1969、R.C. Evans, "The Technology of the Tetracyclines," Biochemical Reference Series 1, Quadrangle Press, New York, 1968、及び H.F. Dowling, "Tetracycline," Antibiotics Monographs, no. 3, Medical Encyclopedia, New York, 1955によって開示されたものがあげられるが、これに限定されはしない。これらのそれぞれの内容は全て本書の参考文献に収録されている)。テトラサイクリン類似体の例には、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エポキシテトラサイクリン、シアノテトラサイクリンなどが含まれる。アンヒドロテトラサイクリンやエポキシテトラサイクリンなど一部のTc類似体は、Tcに比べて抗菌性が低下している。
【００７２】
本書で使用される、「テトラサイクリン制御トランス活性化因子」即ち「tTAｓ」は、TetRと転写活性化因子適切なドメインとの融合である。
【００７３】
「トランス活性化因子融合タンパク質」及び「転写活性化因子タンパク質」という用語は、遺伝子の遺伝子調節配列と直接的又は間接的のいずれかに接触することによって、遺伝子の転写を促進できる任意のタンパク質を含むものとして意図されている。一般に、転写調節タンパク質のDNA結合及び転写促進機能、即ち転写因子は、このタンパク質の個別モジューラドメイン内に含有されている。本発明のトランス活性化因子融合タンパク質には、活性化ドメイン由来のアミノ酸配列で構成されたポリペプチドと機能的に連結する、例えば機能的にカップリングされたDNA結合タンパク質で構成されたポリペプチドで構成された融合タンパク質が含まれる。
【００７４】
「転写調節ドメイン」という用語は、遺伝子の転写を変調する転写調節タンパク質の個別ドメインを含むものとして意図されている。転写調節ドメインが転写を変調するための機構には、基礎転写複合体、例えばRNAポリメラーゼ及びTATA結合タンパク質の配列との直接的又は間接的相互作用、他の転写調節タンパク質との直接的又は間接的相互作用、及び遺伝子調節配列のコンフォメーションの改変が含まれるが、これに限定されはしない。転写調節ドメインは転写を促進するか抑制するかのどちらかが可能である。
【００７５】
単純ヘルペス(Herpes simplex)ビリオンタンパク質16は、高い負帯電環境に位置する塊状の疎水アミノ酸によって特徴付けられた2つの活性化ドメインを含有する(Regier, J. L., Shen, F., and Triezenberg, S. J. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 883-887)。GAL4の1つのような非相同DNA結合ドメインと融合されるとき、転写を促進するための各ドメインが呈示される(Seipel, K., Georgiev, O.、及びSchaffner, W. (1992) EMBO-J 11, 4961-4968)。単純ヘルペスビリオンタンパク質16のC末端活性化ドメインは、真核細胞で転写を刺激する能力が強力であるので、トランス活性化因子融合タンパク質の転写促進構成体として頻繁に使用される。
【００７６】
ある実施例においては、本発明の転写調節ドメインは、単純ヘルペス(Herpes simplex)ビリオンタンパク質16由来のポリペプチドである。別の実施例においては、転写調節ドメインは単純ヘルペス(Herpes simplex)ビリオンタンパク質16の最小促進ドメインの少なくとも1つのコピーを含む。別の好適な実施例においては、転写調節ドメインは、単純ヘルペスビリオンタンパク質16の436〜447のアミノ酸残基で構成された酸性領域で構成される。
【００７７】
「転写調節タンパク質」及び「転写調節因子」という用語は、互換的に使用され、遺伝子の遺伝子調節配列と、直接的又は間接的のいずれかに接触させることによって、遺伝子の転写を変調できる任意のタンパク質を含むものとして意図されている。一般に、転写調節タンパク質のDNA結合及び転写促進又は抑制機能、即ち転写因子は、このタンパク質の個別モジューラドメイン内に含有されている。
【００７８】
本発明の転写調節タンパク質には、転写調節ドメイン由来のアミノ酸配列で構成されたポリペプチドと機能的に連結する、例えば機能的にカップリングされたDNA結合タンパク質で構成されたポリペプチドを含む融合タンパク質が含まれる。
【００７９】
本書で使用される、「ベクター」という用語は、自身が連結された別の核酸を運搬することが可能な核酸分子を含むものとして意図されている。ベクターは、このようなDNA配列がベクターの必須の生物学的機能を喪失することなく決定的な態様で切断される場合、及び複製及びクローニングを生じさせるためにDNA断片がスプライシングされて入れられる場合がある、1つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ部位によって特徴が付けられる場合がある。ベクターは、さらにそのベクターによって形質転換された細胞の識別に使用に適したマーカーを含有する。ベクターの一種が「プラスミド」である。プラスミドとは、付加DNA部分が再結合されてできる環状二本鎖DNAループを指す。ベクターの別の種類がウイルスベクターである。この場合は付加DNA部分が再結合されてウイルスゲノムになる。一部のベクターは、自身が導入される宿主細胞に自律的に複製できる能力をもつ(例えば、複製及びエピソーム哺乳動物ベクターの細菌起源をもつ細菌ベクター)。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞へ導入されるときに宿主細胞のゲノムに統合され、これによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、一部のベクターは、自身が機能的に連結される先の遺伝子の発現を命令する能力をもつ。このようなベクターは本書では「発現ベクター」と言う。一般に、組換えDNA技術において使用される発現ベクターは、「プラスミド」の形を取ることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形であるので、本明細書中では、「プラスミド」と「ベクター」とは互換可能に用いられる。ただし、本発明は、同等の機能を有する、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなど)のような発現ベクターのその他の形も包含するものと意図されている。
【００８０】
本発明は、高度に制御される態様でin vitro又はin vivoに遺伝子の発現を調節するために使用できる核酸分子及びタンパク質に関連している。本発明の様々の態様は、tetオペレーター(tetO)配列に結合されているときに遺伝子の転写を活性化する能力をもち、テトラサイクリン、又はその類似体の存在時、又は不在時のどちらか代替的にtetオペレーター配列に結合される融合タンパク質に関連している。従って、宿主細胞では、宿主細胞と接触するテトラサイクリン(又は類似体)の濃度を変化させることによって(例えば、培養基からテトラサイクリンの追加又は除去、或いは宿主生物へのテトラサイクリンの供与又は供与中止など)、tetオペレーター配列に機能的に連結する遺伝子の転写が、本発明の融合タンパク質によって刺激される。
【００８１】
本発明の転写調節タンパク質は、tetオペレーター由来の配列の制御下で遺伝子の転写を刺激するトランス活性化因子である。本発明の前記トランス活性化因子は融合タンパク質である。従って、本発明のある態様は、融合タンパク質をコード化する融合タンパク質及び核酸(例えばDNA)に関連している。「融合タンパク質」という用語は、機能的に連結する、一般に別のソースからの少なくとも2つのポリペプチドを指すものとして意図されている。一般に、機能的に連結する2つのポリペプチドはペプチド結合によって共有結合している。融合タンパク質は、できれば標準組換えDNA技術によって生産されることが望ましい。例えば、第1ポリペプチドをコード化するDNA分子が第2ポリペプチドをコード化する別のDNA分子に再結合され、結果えられた前記ハイブリッドDNA分子が宿主細胞内で発現されて融合タンパク質が産生される。DNA分子は、コード化されたポリペプチドの翻訳フレームが再結合後に改変されないように、相互に5'〜3'の方向で再結合される(即ち、DNA分子がフレーム単位で相互に再結合される)。
【００８２】
トランス活性化因子融合タンパク質の第1ポリペプチド
本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、一部分、テトラサイクリン又はその類似体の存在時又は不在時にtetオペレーター配列を結合する第1ポリペプチドで組成されている。前記融合タンパク質の第1ポリペプチドはTetリプレッサーである。好適な実施例においては、前記融合タンパク質の第1ポリペプチドはTetリプレッサーの配列変異体である。この突然変異したTetリプレッサーは、野生型Tetリプレッサーに類似しているが、野生型Tetリプレッサーと異なるアミノ酸を少なくとも1つ有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むものとして意図されている。「野生型Tetリプレッサー」という用語は、Tcの不在時に原核細胞内でtetオペレーター配列からの転写を抑制する、天然のタンパク質を指すものとして意図されている。「tetリプレッサー」という用語は、例えばクラスA、B、C、D、E、又はGのtetリプレッサーのように異なるクラス型のリプレッサーを含むものとして意図されている。突然変異したTetリプレッサーと野生型Tetリプレッサーのアミノ酸の相違は、単一又は複数のアミノ酸の置換、単一又は複数のアミノ酸の除去、又は単一又は複数のアミノ酸の追加であるの場合がある。
【００８３】
トランス活性化因子融合タンパク質の第1ポリペプチド(例えばTetリプレッサー)は、特定的にtetオペレーター配列に結合する特性をもつ。Tetリプレッサーの各クラスは対応する標的tetオペレーター配列を有する。従って、「tetオペレーター配列」という用語は、例えばクラスA、B、C、D、E、又はGの全クラスのtetオペレーター配列を包含するものとして意図されている。好適な実施例においては、突然変異したTetリプレッサーは、Tn10にコード化されたリプレッサー(即ちクラスB)であり、tetオペレーター配列はクラスBtetオペレーター配列である。他方、突然変異したクラスAのTetリプレッサーはクラスAのtetオペレーターとともに使用でき、他のクラスのTetリプレッサー/オペレーターについても同様である。
【００８４】
トランス活性化因子融合タンパク質の第2ポリペプチド
トランス活性化因子融合タンパク質の第1ポリペプチドは、真核細胞内で直接的又は間接的に転写を促進する第2ポリペプチドと機能的に連結される。第1と第2のポリペプチドを機能的に連結するには、一般的に第1と第2のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列をフレーム単位で相互に再結合し、融合タンパク質をコード化するキメラ遺伝子を作製する。ただし、第1と第2のポリペプチドは、各ポリペプチドの機能を保持している他の手段により機能的に連結できる(例えば、化学的に架橋される)。好適な実施例においては、トランス活性化因子の第2ポリペプチドは、自身が転写促進の働きを保有している(第2ポリペプチドは直接転写を促進する)。別の実施例においては、第2ポリペプチドは、この融合タンパク質と相互作用させるため転写活性化タンパク質を補充する間接的メカニズムによって転写を活性化する。
【００８５】
真核細胞内で転写を活性化する機能をもつポリペプチドはよく知られた技術である。特に、多数のDNAを結合するタンパク質の活性化ドメインについては、ドメインが非相同タンパク質に転移されるときに転写活性化機能を保有することが前述されている。本発明の融合タンパク質での使用に好適なポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスビリオンタンパク質16である(本書ではVP16と言われ、そのアミノ酸配列は、Triezenberg, S.J. et al. (1988) Genes Dev. 2:718-729)に開示されている)。ある実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは、単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)由来のポリペプチドである。別の実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の最小活性化ドメインの少なくとも1つのコピーを含む。別の好適な実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の436〜447のアミノ酸残基を含む酸性領域の少なくとも1つのコピーを含む。
【００８６】
真核細胞内で転写促進能力があるその他のポリペプチドも、本発明の前記融合タンパク質で使用することができる。様々のタンパク質内に見られる活性化ドメインは、類似の構造素性に基づいてカテゴリー別にグループ化されている。活性化ドメインの型には、酸性活性化ドメイン、プロリンの多い活性化ドメイン、セリン/トレオニンの多い活性化ドメイン及びグルタミンの多い活性化ドメインがある。酸性活性化ドメインの例として、前述のVP16領域及びGAL4の753〜881のアミノ酸残基があげられる。プロリンの多い活性化ドメインの例として、CTF/NF1の399〜499のアミノ酸残基及びAP2の31〜76のアミノ酸残基があげられる。セリン/トレオニンの多い活性化ドメインとして、ITF1の1〜427のアミノ酸及びITF2の2〜451のアミノ酸残基があげられる。グルタミンの多い活性化ドメインOct1の175〜269のアミノ酸残基及びSp1の132〜243のアミノ酸残基があげられる。上記の各領域、及びその他の有用な活性化ドメインのアミノ酸配列については、Seipel, K. et al. (EMBO J. (1992) 13:4961-4968)に開示されている。
【００８７】
前記の活性化ドメインに加え、標準技術によって特定できる新規活性化ドメインも、本発明の前記適用範囲内に含まれる。前記のポリペプチドの転写活性化能力は、上記のポリペプチドとDNA結合性を有する別のポリペプチドを連結し、その融合タンパク質によって刺激される標的配列の転写量を判別することによって、検定することができる。例えば、この技術に使用される標準検定は、推定活性化ドメイン及びGAL4 DNA結合ドメインの融合タンパク質を利用する(例えば、1〜93のアミノ酸残基)。この融合タンパク質は、次にGAL4結合部位に連結されたレポーター遺伝子の発現を刺激するために使用される(例えば、Seipel, K. et al. (1992) EMBO J. 11:4961-4968及び本書に引用した参考文献を参照)。
【００８８】
別の実施例においては、融合タンパク質の第2ポリペプチドは、この融合タンパク質と相互作用させるため転写促進因子を補充することによって間接的に転写を促進する。例えば、本発明のtetRは、宿主細胞に存在する内在性転写促進因子のような転写促進タンパク質によってタンパク質相互の作用を媒介することが可能なポリペプチドドメイン(例えば、二量体化ドメイン)に融合できる。DNA結合ドメインと活性化ドメイン間の機能的関連は共有結合である必要はないことはすでに実証されている(例えば、Fields and Song (1989) Nature 340:245-247; Chien et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582; Gyuris et al. (1993) Cell 75:791-803; and Zervos, A.S. (1993) Cell 72:223-232参照)。従って、融合タンパク質の第2ポリペプチドは直接転写を促進しないどころか、適合性のタンパク質相互作用ドメイン及び活性化ドメインを担う内在性ポリペプチドと安定的相互作用を形成することもある。好適な相互作用(二量体化)ドメインの例として、ロイシンジッパー(Landschulz et al. (1989) Science 243:1681-1688)、らせん・ループ・らせんドメイン(Murre, C. et al. (1989) Cell 58:537-544)及びジンクフィンガードメイン(Frankel, A.D. et al. (1988) Science 240:70-73)があげられる。内生的核因子をもつ融合タンパク質に存在する二量体化ドメインの相互作用の結果、核因子の活性化ドメインが融合タンパク質に補充され、それによって融合タンパク質が結合されているtetオペレーター配列にも補充される。
【００８９】
別の好適な実施例においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質はテトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質である。キメラ「テトラサイクリン制御トランス活性化因子」(tTA)によって、最小プロモーター-tetO融合(Ptet)の下流にある遺伝子の発現を調節できる。Tcの不在下には、Ptetが活性化されるのに対して、抗生物質が存在下ではPtetの活性化が阻害される。ある実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)由来のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、DNAからTetRのレベルで融合される。別の実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の最小活性化ドメインの少なくとも1つのコピーをコード化するポリヌクレオチドが、機能的にTetRに連結する。さらなる実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の436〜447のアミノ酸残基を含む酸性領域の少なくとも1つのコピーをコード化するポリヌクレオチドが、機能的にTetRに連結する。
【００９０】
さらなる好適な実施例においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子タンパク質である。ある実施例においては、rtTAタンパク質の活性化ドメインは、単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルスタンパク質16(VP16)由来のポリペプチドである。別の実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の最小活性化ドメインの少なくとも1つのコピーを含むrtTAタンパク質の活性化ドメインは、機能的にTetRに連結する。さらなる実施例においては、単純ヘルペス(Herpes simplex)VP16の436〜447のアミノ酸残基を含む酸性領域の少なくとも1つのコピーを含むrtTAタンパク質の活性化ドメインは、機能的にTetRに連結する。
【００９１】
本発明のある態様においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質はrtTAタンパク質の配列変異体(即ち、SEQ ID NO:22又は23における参考rtTA配列と比較されるような)である。rtTAタンパク質の配列変異体は、このタンパク質に新規の表現型を付与する少なくとも1つの突然変異を含有しているであろう。
【００９２】
ある実施例においては、突然変異したrtTAタンパク質は、ドキシサイクリン又はこれらの類似体の不在下で基礎転写活性を改変した。好適な実施例においては、rtTAタンパク質は、前記のDNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸を有する。ある実施例においては、前記のDNA結合ドメインはSEQ ID NO:23の1〜45のアミノ酸位置を含む。好適な実施例においては、突然変異はS12G、E19G、及びT26Aから成るグループから選択される。別の実施例においては、前記のDNA結合ドメイン内の突然変異は、ドキシサイクリン又はその類似体の不在時のtetオペレーターに対する基礎親和性を増加又は減少させる。
【００９３】
別の実施例においては、突然変異したrtTAタンパク質は、ドキシサイクリン又はその類似体の存在下で誘発転写活性が増加又は減少する。好適な実施例においては、本発明のrtTAタンパク質は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する。ある実施例においては、テトラサイクリン結合ドメインはSEQ ID NO:23の46〜207のアミノ酸位置を含む。好適な実施例においては、突然変異はA56P、R87S、欠失C88、D95G、G96R、V99E、D148E、H179R、及びE204Kで構成されるグループから選択される。別の実施例においては、前記のテトラサイクリン結合ドメイン内の突然変異は、ドキシサイクリン又はその類似体に対する感受性を増加又は減少させる。
【００９４】
表1は、本発明の新規rtTA融合タンパク質内に発生する突然変異を特定したものである。rtTAタンパク質は、できればこれらの位置の少なくとも1つで突然変異されることが望ましい。突然変異させたrtTAタンパク質の前記望ましい機能的特性を保持するこれら又はその他のアミノ酸位置における、その他のアミノ酸置換、除去又は付加は、本発明の前記適用範囲内である。
【００９５】
本発明の別の態様においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質はtTAタンパク質の配列変異体(即ち、SEQ ID NO:24又は25における参考rtTA配列と比較されるような)である。tTAタンパク質の配列変異体は、このタンパク質に新規の表現型を与える少なくとも1つの突然変異を含有しているであろう。
【００９６】
ある実施例においては、前記の突然変異したtTAタンパク質は、テトラサイクリン又はこれらの類似体によって異なる誘導を表示した。好適な実施例においては、tTAタンパク質はテトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸を有する。ある実施例においては、前記のテトラサイクリン結合ドメインは、SEQ ID NO:25の46〜207のアミノ酸位置を含む。好適な実施例においては、前記の突然変異はA56V、F78S、S85G、S85R、Y110C、L113H、Y132C、I164L、P167S、L170V、I174V、I174T、又はE183Kから成るグループから選択される。別の実施例においては、テトラサイクリン結合ドメイン内の突然変異は、テトラサイクリン又はその類似体に対する感受性を増加若しくは減少させる。
【００９７】
別の実施例においては、tTAタンパク質は、前記のDNA結合ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する。ある実施例においては、前記のDNA結合ドメインはSEQ ID NO:25の1〜45のアミノ酸位置を含む。
【００９８】
表2は、本発明の新規tTA融合タンパク質内に発生する突然変異を特定したものである。tTAタンパク質は、できればこれらの位置の少なくとも1つで突然変異されることが望ましい。これらのアミノ酸位置、又は突然変異させたrtTAタンパク質の望ましい機能的特性を保持するこれら又はその他のアミノ酸位置における、その他のアミノ酸置換、除去又は付加は、本発明の前記適用範囲内である。
【００９９】
本発明の技術に従って、さらなる突然変異したトランス活性化因子融合タンパク質を創造することもできる。いくつかのクラス別のTetリプレッサー、例えばA、B、C、D、E、又はGについては前述されている。このクラス別のTetリプレッサーのアミノ酸配列は、上述の突然変異が含まれる領域を含めた、高度の相同(即ち、このタンパク質の全長の40〜60％)を共有する。各クラス別のTetリプレッサーのアミノ酸配列については、Tovar, K. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-80に説明されている。従って、表1及び2に説明されているこれらアミノ酸配列での突然変異は、他のクラスのTetリプレッサーでも本発明の融合タンパク質に組み入れる作製することができる。さらなる好適な等価物の突然変異は、現在では当業者には明らかであろろし、創造して機能性を試験することができる。A、B、C、D、及びEクラスのTetリプレッサーのヌクレオチド及びアミノ酸配列については、Waters, S.H. et al. (1983) Nucl. Acids Res 11:6089-6105, Unger, B. et al. (1984) Gene 31:  103-108, Unger, B. et al. (1984) Nucl Acids Res. 12:7693-7703 and Tovar, K. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-80にそれぞれ開示されている。これらの野生型配列も、遺伝子転写の誘導可能調節に使用するため本発明の教示に従って突然変異させることができる。
【０１００】
本発明に従って、さらなる好例の突然変異したrtTA及びtTAタンパク質(即ち、上述の望ましい機能的特性を有する)を、野生型rtTA又はtTAタンパク質の突然変異誘発によって個別に創造することができる。野生型rtTA及びtTAタンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、本書に表示されている(図8及び9)。突然変異したrtTA及びtTAタンパク質は、例えば、次の方法で創造及び選択することができる。その方法とは、野生型rtTAをコード化する核酸(例: DNA)はランダム突然変異誘発に支配され、その結果として突然変異した核酸を発現ベクターに組み込み、スクリーニングのために宿主細胞に導入する(例えば、「例1」参照)。ドキシサイクリンの存在下でのみtetオペレーター配列に結合するrtTAの選別をできるようなスクリーニング検定が使用される。例えば、発現ベクター内の突然変異した核酸のライブラリーを、タンパク内部のtetオペレーター配列が緑蛍光色のタンパク質をコード化する遺伝子(GFP)の発現を調節する酵母菌株に導入することができる。酵母菌内のtetオペレーターとrtTAタンパク質の結合によって、GFP遺伝子の発現が刺激されよう。GFPを発現する細胞は、蛍光色に基づいて選別される。野生型rtTAでは、GFPの発現がドキシサイクリンの存在下で起きるであろう。突然変異したrtTAをコード化する核酸は、ドキシサイクリンの不在下に酵母菌の内GFP遺伝子の発現が減少する核酸の能力に基づいたこの系を使って選別される。特定の突然変異(例えば、19、56、148 及び179の位置で)を有する突然変異したrtTAタンパク質は、標準分子生物学技術(例えば、ヌクレオチド突然変異を取り込んだオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、部位特異的突然変異誘発又はPCRの媒介による突然変異誘発)によって、野生型リプレッサーをコード化する核酸の中にヌクレオチド変更を導入することにより創造することができる。これに代り、ライブラリーからの選択により突然変異したTetリプレッサーが特定されたときは、そのライブラリーベクターから前記の突然変異した核酸を回収することができる。
【０１０１】
現在では当業者には、突然変異したトランス活性化因子融合タンパク質の遺伝子配列結果から決定されたヌクレオチド配列によって、相同遺伝子内に比較可能なトランス活性化因子融合タンパク質突然変異を生成させることが可能であると理解されている。
【０１０２】
単離核酸分子
本発明のある態様は、トランス活性化因子融合タンパク質又はこれらの生物学的活性部分をコード化する単離核酸分子、並びにトランス活性化因子融合タンパク質をコード化するする核酸分子(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質mRNA)を特定するハイブリダイゼーションプローブとして十分使用できる核酸断片、及びトランス活性化因子融合タンパク質核酸分子の増幅又は突然変異のためのPCRプライマーとして使用するための断片に関連している。
【０１０３】
本発明の核酸分子、例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の核酸配列を有する核酸分子、又はこれらの部分は、標準分子生物学技術及び本書に提供されている配列情報を使用して生成できる。
【０１０４】
好適な実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO:1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44に示されたヌクレオチド配列を含む。
【０１０５】
また別の好適な実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44に示されたヌクレオチド配列の全長に少なくとも約80％、85％、90％、95％、98％又はそれ以上の相同であるヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
さらに、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の核酸配列の部分だけ、例えば、プライマーとして使用できる断片又はトランス活性化因子融合タンパク質の部分をコード化する断片、例えば、トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分を含むことができる。好適な実施例においては、核酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44を含む核酸の少なくとも100の連続したヌクレオチドを含む。
【０１０７】
トランス活性化因子融合タンパク質のヌクレオチド配列に基づいたプローブは、同一又は相同タンパク質をコード化する転写産物を検出するために使用できる。上述のプローブは、被験体から標本細胞中のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸のレベルを測定することによって(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質mRNAを検出するなど)、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を発現する細胞又は組織を特定するための診断テストキットの一部として使用できる。
【０１０８】
トランス活性化因子融合タンパク質の「生物学的活性部分」をコード化する核酸断片は、トランス活性化因子融合タンパク質のコード化部分を発現し(例えば、in vitroの組換え発現による)そのトランス活性化因子融合タンパク質のコード化部分の活動(例えば、転写を調節するためのトランス活性化因子融合タンパク質の活性)を検定する、トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性を有するポリヌクレオチドをコード化するする、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44のヌクレオチド配列の部分を単離することによって、準備できる。好適な実施例においては、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45のアミノ酸配列の連続したアミノ酸残基を少なくとも30含む断片をコード化する。
【０１０９】
さらに、本発明は、遺伝子コードの縮重のため、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44に示されたヌクレオチド配列と異なっており、そのためSEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44に示されたヌクレオチド配列によってコード化されたものと同じトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸分子も包含する。ある実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。別の実施例においては、本発明の単離核酸分子は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に少なくとも約80％、85％、90％、95％、98％又はそれ以上の同一性を有するタンパク質、又はそれらの断片をコード化するヌクレオチド配列を有する。
【０１１０】
SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44に示されたトランス活性化因子融合タンパク質のヌクレオチド配列に加え、現在では当業者によって、トランス活性化因子融合タンパク質のポリペプチド構成体のアミノ酸配列で変更を起こさせるDNA配列多型性が、集団内に存在する場合があることが正当に評価されるであろう。トランス活性化因子融合タンパク質遺伝子のポリペプチドにおける上述のような遺伝子の多型性が、天然の対立遺伝子変異体のために、集団内に存在する場合がある。
【０１１１】
機能的対立遺伝子変異体は、一般に、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45の単一又は複数のアミノ酸の保存的置換、或いは上述のタンパク質の非クリティカル領域にある非クリティカル残基の置換、除去又は挿入を含有しているであろう。
【０１１２】
非機能的対立遺伝子変異体は、一般に、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45の単一又は複数のアミノ酸配列の非保存的置換、除去、又は挿入、又は早すぎる切端、或いは上述のタンパク質のクリティカル残基又はクリティカル領域における置換、挿入、又は除去を含有しているであろう。
【０１１３】
SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45のトランス活性化因子融合タンパク質と相同の上述タンパク質をコード化する単離核酸分子は、単一又は複数のアミノ酸の置換、付加又は除去が上述のコード化されたタンパク質に導入されるように、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44のヌクレオチド配列の中に単一又は複数のヌクレオチドの置換、付加又は除去を導入することによって創造することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発又はPCR媒介による突然変異誘発などの標準技術によっても導入できる。できれば、保存的アミノ酸の置換は、単一又は複数の予測される非必須アミノ酸残基で起きることが望ましい。
【０１１４】
従って、トランス活性化因子融合タンパク質中の1個の予測される非必須アミノ酸残基が同一部位鎖族からの別のアミノ酸残基と置換されることが望ましい。これに代り、別の実施例においては、飽和突然変異誘発のような、トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する配列の全部又は一部に沿って、突然変異をランダムに導入することができ、さらに転写調節活性を保持する突然変異体を特定するため、トランス活性化因子タンパク質の生物学的活性について、結果の突然変異をスクリーニングすることができる。SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の突然変異誘発に後続して、コード化されたタンパク質を組替え的に発現させることができ、そのタンパク質の転写調節活性を判別することができる。
【０１１５】
相同又は同一性
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性のパーセントを判別するには、最適比較をするため上述の配列を整列させる(例えば、最適整列目的には最初及び2番目のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的には非相同配列を無視することができる)。好適な実施例においては、比較目的で整列された照合配列の長さは、その照合配列の長さの少なくとも30％であり、少なくとも40％ならば好適であり、少なくとも50％ならばより好適であり、少なくとも60％ならばよりいっそう好適であり、少なくとも70％、80％、90％又は95％ならばさらによりいっそう好適である。その後に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドが、比較される。最初の配列中の位置が、2番目の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されているときは、その位置にある分子は同一である(本書で使用されるアミノ酸又はヌクレオチドの「同一性」は、アミノ酸又はヌクレオチド「相同」に相当する)。2つの配列間の同一性のパーセントは、2つの配列の最適整列のために導入する必要があるギャップ数の数、及び各ギャップ長が考慮に入れられた、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【０１１６】
2つの配列の比較及び2つの配列間の同一性パーセントの算定は、数学的アルゴリスムを使って達成することができる。好適な実施例においては、2つのアミノ酸配列間の前記同一性パーセントは、Blossom 62マトリクス又はPAM250マトリクスのどちらか一方、及び16、14、12、10、8、6、又は4のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、又は6のレングスウェイトを使って、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)に入っているGAPプログラムに組み込まれているニードルマン・ブンシュ(Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリスムを使って算定される。また別の好適な実施例においては、2つのヌクレオチド配列間の前記同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリクス、及び40、50、60、70、又は80のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、又は6のレングスウェイトを使って、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)に入っているGAPプログラムを使って算定される。別の実施例においては、2つのアミノ酸配列間又はヌクレオチド配列間の前記同一性パーセントは、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティー及び4のペナルティーを使って、ALIGNプログラム(バージョン2.0) (http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgiで入手可能)に組み込まれているE.マイヤーズ・W.ミラー(原語: E. Meyers and W. Miller) (Comput. Appl. Biosci.、4:11-17 (1988)のアルゴリズムを使って算定される。
【０１１７】
核酸配列及びタンパク質配列はさらに「照会配列」としても使用でき、例えば、その他のファミリーのメンバー又は関連配列を識別するため公共のデータベースに対して検索を実行するためにも使用できる。上述のような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST及びXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使って実行できる。BLASTヌクレオチドの検索は、NBLASTプログラム、score = 100、wordlength = 12を用いて実行し、相同ヌクレオチド配列を取得することができる。BLASTタンパク質の検索は、XBLASTプログラム、score = 50、wordlength = 3を用いて実行し、相同アミノ酸配列を取得することができる。比較目的のためギャップのある整列を取得するには、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に説明されているように、Gapped BLASTを利用できる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用するときには、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST) のデフォルトパラメーターを使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【０１１８】
さらに、「クラスタル」方法(Higgins and Sharp, Gene, 73:237-44、1988)及び「メガリーン」プログラム(Clewley and Arnold, Methods Mol. Biol, 70:119-29、1997) も、配列を整列するため、及び類似性、同一性、又は相同を判別するために使用できる。
【０１１９】
単離トランス活性化因子融合タンパク質及び抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体
本発明のある態様は、単離トランス活性化因子融合タンパク質、これらの生物学的活性部分、並びに抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体を高めるためイムノゲンとして使用するために好適なポリペプチド断片に関連している。ある実施例においては、トランス活性化因子融合タンパク質は組換えDNA技術によって生産される。組換え発現と代替して、トランス活性化因子融合タンパク質又はポリペプチドは、化学的に標準ペプチド合成技術を使って合成できる。
【０１２０】
トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分には、このトランス活性化因子融合タンパク質のアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に示されたアミノ酸配列)と十分に相同のアミノ酸を含むか、若しくはこのタンパク質のアミノ酸配列に由来するペプチドが含まれる。上述のトランス活性化因子融合タンパク質は、全長トランス活性化因子融合タンパク質より少ないアミノ酸を含み、トランス活性化因子融合タンパク質の少なくとも1つの活性を示す。トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分は、例えば、10、25、50、100、200又はそれ以上の長さのアミノ酸であるポリペプチドであると言える。トランス活性化因子融合タンパク質の生物学的活性部分は、トランス活性化因子融合タンパク質の媒介による活性(例えば、遺伝子発現の調節)を変調する医薬品を開発するための標的として使用できる。
【０１２１】
好適な実施例においては、このトランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に示されたアミノ酸配列を有する。別の実施例においては、このトランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45と実質的に相同であり、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45の上述タンパク質の機能的活性を保持しているが、天然の対立遺伝子の変異体又は突然変異誘発のためにアミノ酸配列に相違がある。従って、別の実施例においては、トランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45に少なくとも約80％、85％、90％、95％、98％又はそれ以上の相同のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１２２】
ある実施例においては、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、SED ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44の核酸配列によってコード化される。別の実施例においては、トランス活性化因子融合タンパク質は、SEQ ID NO: 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、又は44と80％の同一性を有する核酸分子によってコード化される。
【０１２３】
本発明は、またキメラトランス活性化因子融合タンパク質も提供する。好適な実施例においては、キメラトランス活性化因子融合タンパクは、トランス活性化因子融合タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性部分を含む。この融合タンパク質内では、「機能的に連結する」は、トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチド及び非トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドがフレームで相互に融合されていることを示すものとして意図されている。非トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドは、このトランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドのN末端又はC末端に融合することができる。
【０１２４】
例えば、ある実施例においては、キメラタンパク質は、GST配列のC末端に融合される。上述の融合タンパク質は、組換えトランス活性化因子融合タンパク質の精製を簡便にする。
【０１２５】
別の実施例においては、前記キメラタンパク質は、そのN端末に相同シグナル配列を含有するトランス活性化因子融合タンパク質である。一部の宿主細胞(哺乳動物の宿主細胞)では、発現及び分泌、或いは発現又は分泌トランス活性化因子融合タンパク質が、非相同シグナル配列の使用により増加する可能性がある。
【０１２６】
本発明の前記キメラトランス活性化因子融合タンパク質は、製薬組成物に混入でき、in vivoで被験体に供与できる。さらに、前記キメラトランス活性化因子融合タンパク質を使用して、トランス活性化因子融合タンパク質基質のバイオアベイラビリティ(生物学的利用能)に影響を与えることができる。さらに、本発明の前記キメラトランス活性化因子融合タンパク質はイムノゲンとして使用して、被験体内に抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体を産生させ、トランス活性化因子融合タンパク質のエフェクター分子を精製し、さらにスクリーニングアッセイにおいて、トランス活性化因子融合タンパク質と作用する分子を特定することができる。
【０１２７】
本発明のキメラトランス活性化因子融合タンパク質を、標準組換えDNA技術によって産生できるに超したことはない。例えば、ポリペプチド配列別にコーディングするDNA断片は、従来の技術に従って、フレームで一緒に再連結される。前記の従来技術とは、例えば、再連結のため平滑末端又は付着末端、適応する末端に対応するため制限酵素消化、適応する接着末端のフィルイン、不適な接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素による再連結を利用する技術である。別の実施例においては、前記の融合遺伝子は、自動DNA合成装置も含めた従来の技術によって合成することができる。また代って、遺伝子断片のPCR増幅は、その後にキメラ遺伝子配列を生成するためアニーリング及び再増幅することができる2つの連続遺伝子断片間に相補的張り出しを生じさせるアンカープライマーを使って実行できる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992参照)。さらに、すでに融合成分をコード化する多くの発現ベクターが市販されている(例えば、GSTポリペプチド)。トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸は、非相同成分がフレームでそのトランス活性化因子融合タンパク質に連結するように、上述のような発現ベクターにクローニングできる。
【０１２８】
本発明は、トランス活性化因子融合タンパク質作用薬(擬態)又はトランス活性化因子融合タンパク質拮抗薬のどちらか一方として機能する前記トランス活性化因子融合タンパク質の変異体に関連している。前記トランス活性化因子融合タンパク質の変異体は、突然変異誘発、例えば、トランス活性化因子融合タンパク質の分散した点突然変異又は切除によって生成することができる。トランス活性化因子融合タンパク質の作用薬は、トランス活性化因子融合タンパク質の自然発生形態の生物学的活性の、本質的に同じ活性、又はサブセットの活性を保持することができる。トランス活性化因子融合タンパク質の拮抗薬は、例えば、トランス活性化因子融合タンパク質のトランス活性化因子融合タンパク質媒介活性を競合的に変調することによって、前記トランス活性化因子融合タンパク質の原形の単一又は複数の活性を抑制することができる。このように、限定された機能の変異体を用いた処理によって、特定の生物学的作用を誘発することができる。ある実施例においては、前記タンパク質の原形の生物学的活性のサブセットを有する変異体を用いた被験体の処理は、前記トランス活性化因子融合タンパク質の原形を用いた処理と比較してより大きな有意な作用を有する。
【０１２９】
トランス活性化因子融合タンパク質をコーディングする配列の断片のライブラリーは、トランス活性化因子融合タンパク質の変異体のスクリーニング及びその後の選別のために、トランス活性化因子融合タンパク質のふ入りの集団を生成するために使用することができる。ある実施例においては、次の条件、即ち分子ごとにほぼ1回だけニックが起きる・2本鎖DNAをを変性する・各種のニックされた産物からのセンス/アンチセンス対を組み込むことができる2本鎖DNAを形成するために2本鎖DNAを再生する・S1ヌクレアーゼ処理によってリフォーム済み複式から1本鎖部分を除去する・及び結果の断片ライブラリーを発現ベクターの中に再結合する、という条件下で、ヌクレアーゼを用いてトランス活性化因子融合タンパク質の2本鎖PCR断片を処理することによって、コーディング配列断片のライブラリーを生成することができる。この方法によって、各種サイズの前記トランス活性化因子融合タンパク質のN末端、C末端及び内在断片をコード化する発現ライブラリーを引き出すことができる。
【０１３０】
点突然変異又は切除によって作製されたコンビナトリアル・ライブラリの遺伝子産物のスクリーニング、及び選択された特性を有する遺伝子産物対応のcDNAライブラリーのスクリーニングための技術分野には、いくつか知られた技術がある。上述の技術は、トランス活性化因子融合タンパク質の組み合わせ突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーを高速スクリーニングできるように改良可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット解析に対応可能である最も広範に使用されている技術には、一般に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにするためのクローニング、その結果のベクターライブラリーを用いた適正な細胞の形質変換、及び組み合わせ遺伝子の発現(希望の活性の検出によって検出産物の遺伝子をコード化するベクターの単離が簡便になるという条件下で)が含まれる。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新技術である、リクルーシブ・アンサンブル変異誘発(REM)を、前記スクリーニングアッセイと組み合せて使用して、トランス活性化因子融合タンパク質変異体を特定することができる(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【０１３１】
単離トランス活性化因子融合タンパク質、又はそれらの断片をイムノゲンとして使用して、ポリクロナール及びモノクロナール抗体調製のための標準技術を使って、前記トランス活性化因子融合タンパク質を結合する抗体を産生することができる。全長トランス活性化因子融合タンパク質を使用することができるが、若しくはそれ代り、本発明は、イムノゲンとして使用できる、前記トランス活性化因子融合タンパク質の抗原ペプチド断片を提供する。トランス活性化因子融合タンパク質の抗原ペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 又は45 に示されたアミノ酸配列の少なくとも8つのアミノ酸残基を含み、前記ペプチドに対して高まる抗体はトランス活性化因子融合タンパク質と結合して特定の免疫複合体を形成し、前記トランス活性化因子融合タンパク質のエピトープを包含する。できれば、抗原ペプチドは少なくとも10のアミノ酸残基を含むことが望ましく、少なくとも15のアミノ酸残基を含めばさらに望ましく、少なくとも20のアミノ酸残基を含めばなおいっそう望ましく、さらに少なくとも30のアミノ酸残基を含めば最も望ましい。
【０１３２】
トランス活性化因子融合タンパク質のイムノゲンは、一般に、このイムノゲンを用いて適当な被験体(例えば、うさぎ、やぎ、マウス又はその他哺乳動物)に免疫性をもたせることによって抗体を作らせるために使用することができる。適切な免疫抗原作用因子には、例えば、組換えにより発現されたトランス活性化因子融合タンパク質又は合成トランス活性化因子融合タンパク質ポリペプチドが含まれる。この作用因子には、さらにFreundの完全又は不完全なアジュバントなどのアジュバント、又は免疫刺激作用因子が含まれる。免疫抗原性トランス活性化因子融合タンパク質作用因子により適当な被験体の免疫には、抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体反応も含まれる。
【０１３３】
本発明の別の態様は、抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体に関連している。
【０１３４】
本発明に準拠した抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、トランス活性化因子融合タンパク質のイムノゲンを用いて、適当な被験体に免疫性をもたせることにより、抗体を作らせるために使用できる。固定化トランス活性化因子融合タンパク質を使用する酵素連結によるイムノソルベントアッセイ(ELISA)を用いるなどの標準技術によって、免疫をもたせた被験体内の前記抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体の滴定量を時間経過に従ってモニターすることができる。要求に応じて、哺乳動物から(例えば、その血液から)、トランス活性化因子融合タンパク質と反対方向の前記抗体分子を単離することでき、さらに、IgG分屑を得るためのタンパク質クロマトグラフィーなど、よく知られた技術によって精製することができる。免疫化した後の適切な時点、例えば、抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体の滴定量が最高になったときに、Kohler及びMilstein(1975) Nature 256:495-497) によって最初に発表されたハイブリドーマ技術(Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al.  (1980) J. Biol. Chem .255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; and Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照)、さらに新しいヒトB細胞ハイブリドーマ技術 (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72)、EBVハイブリドーマ技術 (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 又はトリオマ技術などの標準技術によって、その被験体から抗体産生細胞を採取し、さらにモノクロナール抗体を作らせるためにも使用することができる。モノクロナール抗体ハイブリドーマを産生するための技術はよく知られている(通常 R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照) 。不滅細胞系統(一般に骨髄腫)は、前述のトランス活性化因子融合タンパク質のイムノゲンを用いて免疫化した哺乳動物からのリンパ球(一般に脾細胞)と融合させ、その結果のハイブリドーマ細胞の培養上澄みをスクリーニングして、トランス活性化因子融合タンパク質を結合するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマを特定するのが、簡便である。
【０１３５】
抗トランス活性化因子融合タンパク質モノクロナール抗体を生成する目的には、リンパ球及び不滅細胞系統の融合に使用される多くの周知の任意プロトコルを適用することができる(例えば、G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra参照)。さらに、一般当業者は、上述のような方法の変形がたくさんあり、それらも有用と思われることを認めるであろう。一般に、不滅細胞系統(例えば、骨髄腫細胞系統)は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、ネズミのハイブリドーマは、マウスの不滅細胞系統を用いた本発明の免疫抗原作用因子により免疫化したマウスからのリンパ球を融合することによって作ることができる。
【０１３６】
好適な不滅細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン(「HAT培地」)を含む倍地に感受性をもつマウスの骨肉腫細胞系統である。標準技術に準拠する融合相手として、任意数の骨肉腫細胞系統、例えばP3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 or Sp2/O-Ag14骨肉腫系統を使用することができる。これらの骨肉腫細胞系統は、ATCCから入手可能である。一般に、HAT感受性をもつマウス骨肉腫細胞系統は、ポリエチレングリコール(「PEG」)を使ってマウスの脾細胞と融合される。前記の融合で得られたハイブリドーマ細胞は、不融合の細胞及び繁殖力のない融合細胞を死滅させるHAT倍地を使って選別される(不融合の細胞は、形質変換されていないので、数日後に死亡する)。本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、このトランス活性化因子融合タンパク質を結合する抗体のハイブリドーマ培養上澄みのスクリーニングによって検出される(例えば、標準ELISAアッセイの使用による)。
【０１３７】
加えて、標準組換えDNA技術を使って作製できるヒト部分と非ヒト部分の両方を含んだ、キメラ及びヒト化モノクロナール抗体などの、組換え抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、本発明の前記適用範囲内である。上述のキメラ及びヒト化モノクロナール抗体は、例えば、Robinson et al. International Application No. PCT/US86/02269; Akira, et al. European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et al. European Patent Application 173,494; Neuberger et al. PCT International Publication No. WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al. European Patent Application 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison,  S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載される方法を使う、現在知られている組換えDNA技術によって産生することができる。
【０１３８】
抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体(例えば、モノクロナール抗体)は、アフィニティー・クロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準技術によって、トランス活性化因子融合タンパク質を単離するために使用できる。抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、宿主細胞に発現される組み換えによって産生されたトランス活性化因子融合タンパク質の精製を簡便にできる。さらに、抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、このトランス活性化因子融合タンパク質の発現の存在比及びパターンを評価するために、(例えば、細胞の溶解質又は細胞の上澄みで)トランス活性化因子融合タンパク質を検出するためにも使用することができる。抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体は、診断上、臨床検査手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするため、例えば、所定の治療法の臨床応用を判断するためにも使用できる。検出可能な物質に対する抗体のカップリング(物理的連結)によって、検出を簡便にできる。検出可能な物質の例として、各種の酵素、人工グループ、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質があげられる。適当な酵素の例として、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼがあげられ、適当な人工グループ複合体として、ストレプタビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンがあげられ、適当な蛍光物質の例として、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニラミンフルオレセイン、ダンシルクロライド又はフィコエリトリンがあげられ、発光物質の例として、ノミノールがあげられ、生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンがあげられ、そして適当な放射性物質として、125I、131I、35S又は3Hがあげられる。
【０１３９】
組換え発現ベクター
本発明の別の態様は、トランス活性化因子融合タンパク質(又は、これらの部分)をコード化する核酸を含む、ベクター、望ましい発現ベクターに関連している。
【０１４０】
本発明の組換え発現ベクターとは、ウイルスの核酸に導入される核酸の発現に対応するウイルス、又はこれらの部分である。例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスが使用できる。上述のウイルスを用いて組換えレトロウイルスを産生するためのプロトコル及びin vitro又はin vivoの細胞を感染させるプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 及びその他の標準実験マニュアルに記載されている。適当なレトロウイルスの例として、現在では当業者によく知られているレトロウイルスとして周知であるpLJ、pZIP、pWE及びpEMがあげられる。適当なパッケージングウイルス系統の例として、ΨCrip、ΨCre、Ψ2及びΨAmがあげられる。アデノウイルスのゲノムは、転写調節タンパク質をコード化し発現するが、通常の溶菌ウイルスの生活環で複製する能力に関して不活性化されるように操作できる。例えば、Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; and Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155を参照のこと。アデノウイルス株Ad型5 dl324又はその他のアデノウイルス株 (例えば、Ad2、Ad3、Ad7など)に由来する適当なアデノウイルスのベクターは、現在では当業者によく知られている。これに代り、Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に記載されているようなアデノ関連ウイルスベクターを使って、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を発現することができる。
【０１４１】
本発明の前記組換え発現ベクターは、宿主細胞内にの核酸の発現に適した形質で本発明の核酸を含む。このことは、前記組換え発現ベクターには、発現される核酸配列と機能的に連結する、発現のために使用される宿主細胞を基にして選択される、単一又は複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクター内では、「機能的に連結する」は、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現に対応するように調節配列と連結することを意味するものとして意図されている(例えば、in vitro転写/翻訳系で又は、このベクターが宿主細胞に導入されたときに宿主細胞で)。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御配列(例えば、ポリアデニレーションシグナル)が含まれる。上述の調節配列については、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列として、多くの型の宿主細胞でヌクレオチド配列の連続発現を命令する調節配列、及び一部の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を命令する調節配列(例えば、組織特異調節配列)があげられる。発現ベクターの設計は、形質変換される宿主細胞の選択、要望するタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存できることが、現在では当業者に知られた技術よって認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、これによって、本書に記載されている核酸によってコード化された、融合タンパク質又はペプチドも含めた、タンパク質及びペプチド(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質、トランス活性化因子融合タンパク質の突然変異形質、融合タンパク質など)を産生することができる。
【０１４２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞中のトランス活性化因子融合タンパク質の発現に対応するように設計させることができる。例えば、トランス活性化因子融合タンパク質は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス)、酵母菌細胞、哺乳動物細胞、又は植物細胞で発現させることができる。細菌、真菌、酵母菌、植物、及び哺乳動物の細胞の宿主に使用するに適したクローニング及び発現ベクターは現在の技術では既知であり、例えば、Powels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)に記載されている。原核細胞及び真核細胞の両方に適した発現系については、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第16章及び第17章を参照のこと。さらに、適当な宿主細胞については、Goeddel, Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に論じられている。これに代り、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを使って、in vitroで翻訳させることができる。
【０１４３】
原核生物中のタンパク質の発現は、融合又は非融合のどちらかのタンパク質の発現を命令する組成物又は誘導可能プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌で最も頻繁に実行される。融合ベクターは、このベクターにコード化されたタンパク質、通常、その組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。上述の融合ベクターは、一般に1)組換えタンパク質の発現を増加させる、2) 組換えタンパク質の溶解性を増加させる、及びアフィニティ精製においてリガンドとして作用させることにより組換えタンパク質の精製で補助する、の3つの目的に利用できる。融合発現ベクターでは、しばしば、融合タンパク質の精製の後に融合成分から組換えタンパク質を分離できるように、融合成分から組換えタンパク質の結合時に、蛋白質分解切断部位が導入される。上述の酵素、及びこれらのコグネート認識配列として、Xa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼがあげられる。一般融合発現ベクターとして、グルタチオンS転移酵素(GST)マルトースE結合タンパク質、又はタンパク質Aをそれぞれ標的の組換えタンパク質に融合する、pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 及びpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) があげられる。精製されたキメラタンパク質は、トランス活性化因子融合タンパク質の活性アッセイ、又は例えば、トランス活性化因子融合タンパク質特異抗体を産生させるために利用できる。
【０１４４】
適当な誘導可能な非融合大腸菌発現ベクターの例として、pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315)及びpET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89)があげられる。pTrc発現ベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に基づく。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現したウイルスRNAポリメラーゼ(T7 gn1)によって媒介されたT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に基づく。このウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写制御下でT7 gn1遺伝子を宿す残存プロファージからの宿主菌株BL21(DE3)又はHMS174(DE3)によって供与される。
【０１４５】
大腸菌の組換えタンパク質の発現を最大にするための1つの戦略は、その組換えタンパク質を分解により分割する能力に異常がある宿主細菌中のタンパク質を発現させることである(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128)。別の戦略は、各アミノ酸に対応する個別コドンが大腸菌で選択的に利用されるようにするため、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。上述のような、本発明の核酸配列の改変は、標準DNA合成技術によって実行することができる。
【０１４６】
酵母菌には組換えタンパク質の発現に対応するベクターがいくつか存在する。酵母菌S．セリビサエ(S. cerivisae)の発現に対応するベクターの例として、pYepSec1 (Baldari. et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。さらに、 YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、又はYRP17は、遺伝子構成体のS．セリビサエ(S. cerevisae)に導入に有用なクローニング及び発現手段である(例えば、Broach et al. (1983) in Experimental  Manipulation  of Gene  Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83, incorporated by reference herein参照)。これらのベクターは、pBR322 oriの存在により大腸菌(E. coli)内で複製することが可能で、また酵母2ミクロンプラスミドの複製決定子によりS．セリビサエ(S. cerevisae)内で複製することが可能である。さらに、薬剤耐性マーカー、例えば、真菌系で耐性を付与する抗生物質を使用することも可能である。酵母菌内の機能に適したプロモーターには、メタロチオネイン、3ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)又は、その他、エノラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6-リン酸イソメラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどの解糖酵素 (Hess et al., J. Adv. Enzyme Req. 7, 149 (1968); and Holland et al. Biochemistry 17, 4900 (1978))が含まれる。酵母発現に適したベクター及びプロモーターについては、さらにR. Hitzeman et al., EPO Publication. No. 73,657に記載されている。成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有する、その他のプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、及び前述のメタロチオネイン及びグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用に反応可能な酵素に対応するプロモーター領域である。最後に、2つの半数性交配型の一方だけに活性をもつプロモーターがある環境に適している場合がある。これらの半数体に特異的なプロモーターのうち、フェロモンプロモーターMFal及びMFα1は特に重要である。
【０１４７】
別の好適な実施例においては、本発明の前記組換え発現ベクターは、pCM190GFP+、pUHD 15-1、pREP9、及びpUHDから成るグループから選択されたプラスミドである。
【０１４８】
これに代り、トランス活性化因子融合タンパク質は、バキュロウイルスの発現ベクターを使って昆虫細胞で発現させることができる。培養された昆虫細胞(例えば、Sf 9細胞)でタンパク質の発現に使用可能なバキュロウイルスには、pAcシリーズ(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)及びpVLシリーズ(Lucklow  and Summers (1989) Virology 170:31-39)が含まれる。
【０１４９】
また別の実施例においては、本発明の核酸は、哺乳動物の発現ベクターを使って哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物の発現ベクターには、複製起点のような非転写配列、発現される遺伝子と連結する適当なプロモーター及びエンハンサー、及びその他、5'又は3' にフランキングする非転写配列、及び5'又は3' 非翻訳配列(必須のリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライス供与体及び受容体部位など)、及び転写終結配列が含まれよう。哺乳動物細胞で使用されたとき、組換え発現ベクターの制御機能がウイルスの遺伝物質によって提供されることがよくある。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス40に由来する。この融合タンパク質の発現の命令にウイルス調節配列を使用すると、各種の宿主細胞でこの融合タンパク質の高レベル連続発現を可能にできる。哺乳動物の発現ベクターの例には、pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840)及びpMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)が含まれる。
【０１５０】
別の実施例においては、前記の組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の種類の細胞に選択的に核酸の発現を命令する能力を有する(例えば、組織特異調節配列を使用してその核酸を発現させる)。組織特異調節配列は、現在の技術では既知である。適当な組織特異なプロモーターには以下があるが、アルブミンプロモーター(liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277)、リンパ球特異プロモーター (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、特にT細胞受容体のプロモーター(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) 及び免疫グロブリン (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、ニューロン特異プロモーター (e.g., the neurofilament promoter; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異プロモーター (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916)、及び乳腺特異プロモーター (e.g., milk whey promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166)が含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) 及びαフェトプロテインプロモーター (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)、これに限ってはいない。
【０１５１】
本発明は、さらにアンチセンス方向に発現ベクターにクローニングされた本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、このDNA分子は、トランス活性化因子融合タンパク質mRNAのアンチセンスであるRNA分子の発現を可能にするような(DNA分子の転写によって)様態で、機能的に調節配列に連結する。アンチセンス方向にクローニングされた核酸に機能的に連結する調節配列が選択されると、各種の細胞でアンチセンスRNA分子の連続発現を命令させることができ、例えば、ウイルスプロモーター又はエンハンサー、或いはこの両方、若しくは調節配列が選択されると、アンチセンスRNAの連続発現、組織特異発現又は細胞の種類特異発現を命令させることができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形をとることができる。これらではアンチセンス核酸は高効率調節領域の制御下で産生され、これらの活性は、このベクターが導入される細胞の種類によって決定される。アンチセンス遺伝子を使った遺伝子発現の調節についての解説は、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１５２】
宿主細胞
本発明の別の態様は、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質の核酸分子が導入される宿主細胞、例えば、組換え発現ベクター内のトランス活性化因子融合タンパク質核酸分子、又はその分子を相同的に宿主細胞のゲノムの特定部位に組み換えることが可能な配列を含んでいるトランス活性化因子融合タンパク質核酸分子が導入される宿主細胞に関連している。
【０１５３】
上記の融合タンパク質をコード化する核酸は、真核細胞をトランスフェクトするための標準技術によって宿主細胞に導入することが可能である。「トランスフェクト」又は「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈、DEAEデキストラン媒介によるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション(電気穿孔法)及びマイクロインジェクション(微量注入法)が含まれる、従来の技術を全て含有するものとして意図されている。宿主細胞をトランスフェクトさせるのに適した方法については、Sambrook et al. (Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))、及びその他の実験用教科書に掲載されている。例えば、レトロウイルスベクター(例えば、Ferry, N et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; and Kay, M.A. et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647参照)、アデノウイルスベクター(例えば、Rosenfeld, M.A. (1992) Cell 68:143-155; and Herz, J. and Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816参照)、受容体媒介DNAの取込み(例えば、Wu, G. and Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; and U.S. Patent No. 5,166,320参照)、DNAの直接注入 (例えば、Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815-818; and Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468参照) 又は粒子の衝撃的投与(例えば、Cheng, L. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4455-4459; and Zelenin, A.V. et al. (1993) FEBS Letters 315:29-32参照)などの、in vivoの細胞への核酸の導入に適したデリバリー(送達)メカニズムの応用によって、in vivoで核酸を細胞に転移させることができる。このように、遺伝子治療目的のため、in vivoで細胞を修飾し被験体に供与することができ、これに代り、in vivoで細胞を直接修飾することもできる。
【０１５４】
本発明の核酸を用いて形質転換される宿主細胞の数は、少なくとも一部、使用される組換え発現ベクターの型及び使用されるトランスフェクション技術の型によって異なってくるであろう。核酸を一過的に宿主細胞に導入することができ、若しくはもっと一般に、遺伝子発現の長期的調節のため、核酸を宿主細胞のゲノムの中に安定的に組み込むか、又は宿主細胞の中に安定したエピソームとして残存する。哺乳動物細胞に導入されるプラスミドが宿主細胞DNAに組み込まれる頻度は一般に低い。これらの構成体を特定するため、選択可能マーカー(例えば、薬剤耐性)を含有する遺伝子は、一般には対象の核酸と一緒に宿主細胞に導入される。好適な選択可能マーカーには、G418及びヒグロマイシンのようないくつかの薬剤に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択可能マーカーは、対象の核酸からの分離プラスミドに付けて導入するか、又は同じプラスミドに付けて導入することが可能である。本発明の核酸(例えば、組換え発現ベクター)選択可能マーカー対応の遺伝子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞は、この選択可能マーカーを使って細胞のために選択を行って特定することができる。例えば、この選択可能マーカーがネオマイシン耐性を付与する遺伝子をコード化する場合、核酸を取り込んだ宿主細胞をG418を用いて選択することができる(選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るであろうが、他の細胞は死滅する)。
【０１５５】
本発明の融合タンパク質をコード化する核酸を用いてトランスフェクトされた宿主細胞は、融合タンパク質に対して標的の役目をする、単一又は複数の核酸を用いてさらにトランスフェクトすることが可能である。この標的核酸は、少なくとも1つのtetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチドを含む。
【０１５６】
培養中の原核又は真核宿主細胞のような、本発明の宿主細胞は、トランス活性化因子融合タンパク質を産生する(即ち、発現させる)ために使用することが可能である。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使ってトランス活性化因子融合タンパク質を産生するための方法をさらに提供する。ある実施例においては、本発明は、トランス活性化因子融合タンパク質を産生するために適した培地で、(トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する組換え発現ベクターが導入された)本発明の宿主細胞を培養することを含む。
【０１５７】
トランス活性化因子融合タンパク質の発現
本発明の融合タンパク質をコード化する核酸を宿主細胞内に導入すると、その核酸が、宿主細胞中のその融合タンパク質の発現に適した形質である場合には、本発明の融合タンパク質が原核細胞内に発現される。例えば、この融合タンパク質をコード化する、本発明の組換え発現ベクターが、宿主細胞内に導入される。これに代り、調節配列(例えば、プロモーター配列)に機能的に連結するが付加ベクター配列のない、融合タンパク質をコード化する核酸を、宿主細胞に導入することができる。
【０１５８】
細胞系統に加えて、本発明は、遺伝子治療目的で修飾される細胞、又はトランスジェニック又は相同組換え動物を創造するために修飾された胚細胞などのような、正常(例えば、プライマー)にも応用可能である。遺伝子治療目的に特に対象細胞の種類の例には、造血幹細胞、筋芽細胞、膵臓のβ細胞、肝細胞、リンパ球、神経細胞及び皮膚の上皮及び気道の上皮が含まれる。対象のなプライマー細胞には、細胞サイクル制御に関与する遺伝子がtTA/rtTA調節下に置かれている細胞系統も含まれる。上述の新規細胞系統は条件に因っては増殖することもあり、テトラサイクリンの追加又は除去による成長停止に際して鎮静期の分化状態を回復することができ、そして薬理学及び遺伝子治療に役に立つであろう。さらに、トランスジェニック又は相同組換え動物において、トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸を含ませるため、造血幹細胞及び受精卵母細胞を修飾することができる。さらに、トランスジェニック植物を創造するため、植物細胞を修飾することもできる。
【０１５９】
トランスジェニック生物
単一又は複数の細胞の種類で、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物を創造するため、この融合タンパク質の核酸を非ヒト動物の受精卵母細胞に転移させることができる。トランスジェニック動物は、導入遺伝子がこの動物又は出生前にこの動物の先祖に導入された場合、導入遺伝子を含有する細胞を有する動物である。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が開発された起原の細胞のゲノムに組み込まれ、成熟動物のゲノムに残存しているDNAであり、これによって、トランスジェニック動物の単一又は複数の細胞の種類又は組織中のコード化遺伝子産物の発現を命令する。ある実施例においては、非ヒト動物はマウスであるが、本発明がこれに限定されることはない。ある実施例においては、トランスジェニック動物は、やぎ、羊、豚、牛又はその他の家畜である。上述のようなトランスジェニック動物は、タンパク質の大量生産(いわゆる「遺伝子ファーミング(gene pharming)」)に有用である。
【０１６０】
トランスジェニック動物は、例えば、上述の融合タンパク質をコード化する核酸(一般に、構成体又は組織特異エンハンサーなどの適切な調節配列に連結する)を、受精卵母細胞の雄の前核に導入させ(例えば、マイクロインジェクションによって)、この受精卵母細胞を擬似妊娠雌で発育させる方法によって、創造することができる。この導入遺伝子の発現の効率を向上させるため、イントロンの配列及びポリアデニレーションシグナルもこの導入遺伝子に組み込むことができる。トランスジェニック動物を誕生させる方法、特にマウスのような動物は、現在では既成技術になっており、例えば、U.S. Patent Nos. 4,736,866 and 4,870,009 and Hogan, B. et al., (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている。トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させるために使用できる。本発明のこの融合タンパク質をコード化する導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、さらに他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物、例えば、機能的にtetオペレーター配列に連結する遺伝子を含有するトランスジェニック動物(第3章に詳述されている)と交配させることができる。
【０１６１】
本書に記載されている調節系は、トランスジェニック動物に加えて、トランスジェニック植物のような他のトランスジェニック生物にも応用させることができる。トランスジェニック植物は、現在では知られた既成技術によって作製することができる。従って、本発明には、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を包含する細胞を含有する、動植物を含めた非ヒトトランスジェニック生物が包含される(このトランス活性化因子をコード化する核酸は、トランスジェニック生物の細胞内の単一又は複数の染色体に組み込まれる)。
【０１６２】
相同組換え生物
本発明は、本発明の上述の融合タンパク質を発現する相同組換え非ヒト生物を提供する。ある実施例においては、非ヒト動物はマウスであるが、本発明がこれに限定されることはない。この融合タンパク質をコード化する核酸が、ゲノムの特定物に導入された、例えば、その核酸は内生的遺伝子を用いて相同的に組み換えられた、動物を創造することができる。
【０１６３】
上述のような組換え動物を創造するため、相同組換えが発生する真核遺伝子の追加核酸によって、5'及び3'末端に隣接する融合タンパク質をコード化するDNAを含有するベクターを作製する。この融合タンパク質をコード化する追加核酸は、真核遺伝子を用いて正常に相同組み換えできる十分な長さであるものとする。一般に、上記ベクターには数キロベースのフランキングDNA(5'及び3'末端の両方に)が含まれている(相同組換えベクターの説明については、例えば、Thomas, K.R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 を参照のこと)。このベクターは、胚幹細胞系統に導入され(例えば、エレクトロポレーション)、導入されたDNAが内生的DNAと相同的に組み換えられた細胞が選択される(Li, E. et al. (1992) Cell 69:915)。選択された細胞は、その後動物の杯盤胞に注入されて、集合キメラを形成する(例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152参照)。キメラ胚は、適当な擬似妊娠雌養育動物の中に移植され、この胚を出産に至らせる。生殖細胞内に相同的に組み換えられたDNAを宿す子孫を使って、動物の全細胞に相同的に組み換えられたDNAを含有する、動物を繁殖させることができる。これらの「生殖細胞系伝達」動物を、さらに少なくとも1つのtetオペレーター配列に機能的に連結する遺伝子を保有する動物と交配させることができる(第3章に詳述されている)。
【０１６４】
上述の相同組換えアプローチのほか、酵素の助成による部位特異組込み系が、現在の技術では知られており、これを本発明の調節系の構成体に応用して、2番目の標的DNA分子中のあらかじめ決定した位置にあるDNA細胞に組み込むことができる。上述の、酵素の助成による部位特異組込み系の例については、Cre recombinase-lox標的系(例えば、Baubonis, W. and Sauer, B. (1993) Nucl. Acids Res. 21:2025-2029; and Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909に記載されている)及びFLP recombinase-FRT標的系(例えば、Dang, D.T. and Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375; and Fiering, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473に記載されている)。
【０１６５】
tetオペレーター連結によるヌクレオチド配列の発現の調節
tetオペレーター連結によるヌクレオチド配列は、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質によって調節される。従って、この融合タンパク質と標的核酸は、どちらも宿主細胞即ち生物に存在する。同じ宿主細胞即ち生物にトランス活性化因子融合タンパク質と標的転写単位の両方を存在させることは、いくつかの異なった方法によって達成することができる。例えば、この発現系の1つの核酸を用いて、宿主細胞をトランスフェクトさせ(例えば、トランス活性化因子融合タンパク質のコード化)、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択し、そしてそのトランスフェクトした細胞を、その発現系の他の核酸に対応する核酸(転写される標的の核酸)を用いて再トランスフェクトする(「スーパートランスフェクト(supertransfect)する」とも言う)ことができる。2つの区別される選択可能なマーカーは、選択に使用することができる。例えば、最初の核酸の取込みはG418を用いて選択し、2番目核酸の取込みはヒグロマイシンを用いて選択することができる。これに代り、1つの細胞集団を、この系の両方の構成体に対応する核酸を用いてトランスフェクトすることもできる。
【０１６６】
この宿主細胞は、in vivoで培養された細胞であるか、若しくはin vivoに存在する場合がある(例えば、遺伝子治療のための標的にされる細胞)。この宿主細胞は、さらに非ヒトトランスジェニック動物又は相同組換え動物の創造に使用される、受精卵母細胞、胚幹細胞又はその他の胚細胞でも可能である。この発現系の両方の核酸構成体を含むトランスジェニック動物又は相同組換え動物は、両方の核酸を胚の時期にある同じ細胞に導入することによって創造することもできるが、もっと好適な場合は、このゲノムの中にこの系の1つの核酸構成体を保有する動物を、このゲノムの中にこの系の1その他の核酸構成体を保有する動物と交配されることである。両方の核酸構成体を継承した子孫は、この後標準技術によって識別することができる。
【０１６７】
本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸を保有する宿主細胞、及びtetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列(即ち、転写される対象の遺伝子)では、テトラサイクリン又はその類似体によって、tetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列を調節することができる。従って、本発明の別の態様は、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を発現する、宿主細胞又は動物中のtetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列の転写を刺激する方法に関連している。この方法には、テトラサイクリン及びその類似体を用いて上記細胞を接触させること、又はテトラサイクリン又はその類似体をその細胞が含まれる被験体に投与することが必然的に含まれる。
【０１６８】
in vivoの細胞内の遺伝子発現を誘導するためには、Tc又はその類似体の化合物を含有する倍地でその細胞を培養することによって、この細胞をTc又はその類似体と接触させる。in vivoで遺伝子発現を誘導するためには、上述の化合物をこの被験体に投与することによって、被験体内の細胞をTc又はその類似体に接触させる。「被験体」という用語は、去る、牛、やぎ、羊、犬、猫、うさぎ、ラット、マウス、及びこれらのトランスジェニック又は相同組換え種が含まれるものとして意図されている。さらに、「被験体」という用語は、トランスジェニック植物のような植物も含まれるものとして意図されている。Tc又はTc類似体は、遺伝子の誘導に十分なin vivo濃度に達するために有効な任意手段によって、被験体に投与することが可能である。適当な投与方式の例には、経口投与(例えば、飲料水に誘導剤を溶解させる)、緩慢放出ペレット及び拡散ポンプの埋め込みが含まれる。トランスジェニック植物にTc又はTc類似体を植物に投与するためには、植物にかける水に誘導剤を溶解することができる。
【０１６９】
この系における誘導剤として別のTc類似体を使用できる能力があれば、tetオペレーター連結によるヌクレオチド配列の発現レベルを変調することが可能である。このため、所望の遺伝子発現の誘導レベルに基づいて、類似体を誘導剤として適切なテトラサイクリンを選択する。時間経過に伴って、類似体を誘導剤として使用されるTc類似体を変更することにより、宿主細胞内又は動物体内の遺伝子発現レベルを変えることも可能である。例えば、最初に強く突発的に遺伝子発現させ、その後遺伝子発現を低レベルに持続させることが望ましい状況もあり得る。このような場合、最初に高レベルの転写を刺激する類似体を誘導剤として使用し、その後その誘導剤を低レベルの転写を刺激する誘導剤に切り替えることも可能である。さらに、複数のヌクレオチド配列の発現を調節するとき(例えば、ある配列はあるクラスのtetオペレーター配列によって調節され、別のクラスのtetオペレーター配列によって調節されるとき)は、転写の調節に使用されるトランス活性化因子融合タンパク質に応じて、及び誘導剤として使用されるTc類似体に応じて、各配列の発現レベルを独立的に変化させることも可能かもしれない。トランス活性化因子融合タンパク質の違いによって、Tc類似体に対する応答レベルを異なる可能性がある。特定の組み合わせのトランス活性化因子融合タンパク質と誘導剤(Tc又はTc類似体)による遺伝子発現の誘導剤レベルは、本書に前述した技術によって決定することができる。さらに、遺伝子発現のレベルは、誘導剤の濃度の変化によっても変調することができる。このため、本発明の発現系は、遺伝子発現のオン/オフを切り替えるためだけでなく、使用される誘導剤の種類及び濃度に応じて、遺伝子発現のレベルを中間レベルに「微調整」するためのメカニズムも提供する。
【０１７０】
本発明の応用
本発明は、発現のオン/オフを切り替える能力、又は多相遺伝性又は細胞毒性のない高速かつ効率的かつ制御された態様で遺伝子発現のレベルを調節する能力をもつことが望ましい多様な状況に広く応用可能である。例えば、本発明の核酸及びタンパク質は、真核細胞、植動物での細胞の発達及び分化の研究に使用する用途がある。オンコジーン(癌遺伝子)の機序を研究するため、オンコジーンの発現を細胞で制御下の態様で調節することが可能である。さらに、この系は、特定の発育期に制御条件下でトランスジェニック生物の遺伝子型を不可逆的に修飾できるように、CRE又はFLPのような部位特異レコンビナーゼ(原語: recombinase)を調節するために使用することができる。例えば、特定のトランスジェニック植物の選別能力をもつ、トランスジェニック植物のゲノムに挿入された薬剤耐性マーカーを、Tcで調節した部位特異リコンビナーゼによって不可逆的に除去できるかもしれない。本発明の調節系の応用には、その他、以下が含まれる。
【０１７１】
A. 遺伝子治療
本発明は、とりわけ遺伝病又は後天的疾患のどちらかの治療で、遺伝子治療目的に有用であるかもしれない。遺伝子治療の一般アプローチには、導入された遺伝物質によってコード化された単一又は複数の遺伝子産物を細胞内で産生して、機能的活性を回復又は向上させるように、核酸を細胞内に導入することが必然的に含まれる。遺伝子治療アプローチに関するレビューについては、Anderson, W.F. (1992) Science 256:808-813; Miller, A.D. (1992) Nature 357:455-460; Friedmann, T. (1989) Science 244:1275-1281; and Cournoyer, D., et al. (1990) Curr. Opin. Biotech. 1:196-208を参照のこと。ただし、現在の遺伝子治療ベクターは、内生的転写因子に応答可能である構成調節配列を利用する。これらのベクター系では、被験体での遺伝子発現のレベルを変調する能力は考慮されていない。これに対し、本発明の方法によって特定される、上記のタンパク質、モジュレーター分子及び遺伝子調節配列は、in vitro又はin vivoで細胞内の遺伝子発現を変調する能力を提供する。
【０１７２】
ある実施例において、遺伝子治療目的で本発明の系を使用するため、遺伝子治療に必要とする被験体の細胞は、1) この宿主細胞でトランス活性化因子の発現に適した形質で、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸、2) tetオペレーター配列に機能的に連結する対象の遺伝子(例えば、治療目的で)、を含有するように修飾される。その被験体の細胞をex vivoで修飾した後、被験体内に導入するか、若しくは、in vivoでその細胞を直接修飾することもできる。この被験体の細胞内の対象の遺伝子の発現は、Tc又はTc類似体をその患者に投与することによって刺激される。遺伝子発現のレベルは、どの特定Tc類似体を誘導剤として使用するかによって、変化させることができる。その患者に投与するテトラサイクリン又はその類似体の供与量を調節し、それによって対象の循環及び組織で達する濃度を調製することによっても、遺伝子発現のレベルは変調できる。
【０１７３】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与(U.S. Patent 5,328,470参照) によるか、又は定位注射(例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照)によって、被験体に送達することができる。遺伝子治療ベクターの調剤には、受容希釈剤中の遺伝子治療ベクターが含めれるか、若しくは遺伝子デリバリ手段が埋め込まれている緩慢放出基質を含むことができる。これに代り、完全な遺伝子デリバリーベクターは、組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから、完全なまま産生することができる。調剤には、遺伝子デリバリー系を産生する単一又は複数の細胞を含めることができる。製薬組成物は、容器、包み、又はディスペンサーに入れ、それに処方箋を付けることができる。
【０１７４】
宿主細胞内の対象の調節された部分の発現をモニターするには、イムノソルベントなど、現在の技術では知られた既成の検出方法することができ、Tc又はTc類似体の濃度は、対象の部分の発現レベルが要望レベルに達するまで変えることができる。従って、対象の部分の発現は、個人の寿命ごとに変わり得る、個人の医学的ニーズに従って調整することができる。被験体の細胞内の対象の遺伝子の発現を停止するには、誘導剤の投与が停止される。このため、本発明の調節系は、治療状況の要件に応じて、遺伝子発現のレベルの調整に対応能力に関して構成調節系より多くの利点を有する。
【０１７５】
遺伝病又は後天的疾患の治療のため被験体の細胞内に発現される対象の遺伝子には、アデノシンデアミナーゼ、VIII因子、IX因子、ジストロフィン、βグロビン、LDL受容体、CFTR、インシュリン、エリスロポエチン、抗脈管形成因子、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、βグルクロニダーゼ、α1抗トリプシン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、UDP-グルクロニシルトランスフェラーゼ、apoA1、TNF、溶解TNF受容体、インターロイキン(例えば、IL-2)、インターフェロン(例えば、α又はγIFN)及びその他のサイトカイン及び成長因子、をコード化するものが含まれる。遺伝子治療目的のため修飾できる細胞の種類には、造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球、皮膚の上皮及び気道の上皮が含まれる。細胞の種類、遺伝子及び遺伝子治療法の詳細については、Wilson, J.M et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano, D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Wolff, J.A. et al. (1990) Science 247:1465-1468; Chowdhury, J.R. et al. (1991) Science 254:1802-1805; Ferry, N. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Wilson, J.M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Quantin, B. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Dai, Y. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; van Beusechem, V.W. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Rosenfeld, M.A. et al. (1992) Cell 68:143-155; Kay, M.A. et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Cristiano, R.J. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126; Hwu, P. et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; and Herz, J. and Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816を参照のこと。
【０１７６】
癌治療で特に重要な遺伝子治療応用には、腫瘍部位で抗腫瘍免疫応答を誘導するための腫瘍浸潤リンパ球中のサイトカイン遺伝子の過発現(例えば、TNF-α)又は腫瘍細胞中のサイトカインの異所性発現、無毒物を毒物に変換できる腫瘍細胞中の酵素の発現、抗腫瘍免疫応答を誘導するための腫瘍特異抗原の発現、腫瘍細胞中の腫瘍抑制遺伝子(例えば、p53又はRb) 、化学療法の毒性から骨髄細胞を保護するための骨髄細胞中の多剤耐性遺伝子(例えば、MDR1又はMRP、或いはこの両方) の発現が含まれる。
【０１７７】
ウイルス性の病気の治療特に重要な遺伝子治療応用には、HIVに関してトランス−ドミナントネガティブtat及びrev変異体又はHSVに関しトランス−ドミナントなICp4変異体などのトランス−ドミナント・ネガティブウィルストランス活性化たんぱくの発現 (例えば、Balboni, P.G. et al. (1993) J. Med. Virol. 41:289-295; Liem, S.E. et al. (1993) Hum. Gene Ther. 4:625-634; Malim, M.H. et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1197-1201; Daly, T.J. et al. (1993) Biochemistry 32:8945-8954; and Smith, C.A. et al. (1992) Virology 191:581-588参照) 、HIVに対するenv突然変異体などの優生転移外膜タンパク質の発現(例えば、Steffy, K.R. et al. (1993) J. Virol. 67:1854-1859参照)、ウイルス産物を標的とする抗体又はその断片の細胞内発現(「内部免疫」、及び可溶性WCD4について、例えば、 Marasco, W.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893参照) 、可溶性CD4などの可溶性ウイルス受容体の表現などが含まれる。さらに、本発明の系は、細胞内の適当な遺伝子を条件付きで発現させ、それによって目的の機能が提供された後に細胞の除去するためにも使用することができる。例えば、ワクチン接種に使用される細胞は、Tc又はTc類似体を前記被験体に投与してその細胞内の遺伝子の発現を誘導することによって、その被験体に免疫応答を生じさせた後に除去することができる。
【０１７８】
本発明のTcに制御された調節系は、特に遺伝子治療への応用に適している数々の優位特性を有する。例えば、この系は、被験体内の遺伝子産生物の供与を調節することができる、遺伝子発現の「オン/オフ」スイッチを提供する。例えば、群レベルで単純に連続的遺伝子産物を提供するだけでなく、特定のレベル又は特定の時間(或いはこの両方)の定期的な態様に遺伝子産物を供与できたら望ましいと思われる状況がいくつかある。例えば、最も効果的な時間に重要な遺伝子産物を最も有効なレベルで、一定の間隔に対象の遺伝子をオンに切り替えることができる。被験体内で産生された遺伝子産物のレベルは、標準方法によってモニターすることができる(ELISA又はRIAなどの免疫学的検定を使って直接モニターするか、対象の遺伝子産物の機能、例えば血糖レベルなどに応じて間接的に実験室パラメータをモニターすることによって)。被験体内の遺伝子の発現を個別の時間間隔に「オン」に入れ、他方その他の時にはその遺伝子を「オフ」に保つことができると、対象の遺伝子産物の供与を断続的に続ける必要がなくなる。苦痛を与えるか副作用が生じるか、若しくはこの両方が生じる上、医者へ通院し続ける必要がありそうなを遺伝子産物の注射を反復する必要は、このアプローチによってなくなる。これと対照的に、本発明の前記系はこれらの欠点がなくなる。その上、被験体内の遺伝子の発現が個々の時間間隔に「オン」に入る能力があるため、苦痛を伴い顕著な徴候があり治療の必要がある急性期の時機だけ、「突発的」活性を必要とする、疾病の治療に専念することができる。上述のような病気が寛解した時には、前記発現系を「オフ」状態に保つことができる。
【０１７９】
個別の時間間隔中に体内の遺伝子の発現を変調できるこの能力から特に便宜を得る可能性がある遺伝子治療応用には、下記の例が含まれるが、これに限ってはいない。
【０１８０】
リウマチ様関節炎 - 炎症性サイトカインの産生を阻害する遺伝子産物をコード化する遺伝子(例えば、TNF, IL-1及びIL-12)は、被験体で発現させることができる。上述の阻害剤の例には、サイトカインに対する受容体の溶解形質が含まれる。さらに若しくはこれに代り、サイトカインIL-10又はIL-4或いはこの両方(保護的Th2型応答を刺激する)を発現することができる。その上、グルココルチコミメトリック受容体(GCMR)を発現することができる。
【０１８１】
下垂体機能低下症 - ヒト成長ホルモンに対する遺伝子は、遺伝子発現が必要なとき、正常な発達が達成されるまで、若年幼児期だけ上述の被験体で発現させることができる。正常な発達が達成されたときには、遺伝子発現を抑制するように調節することができる。
【０１８２】
創傷治癒/組織再生 - 治癒プロセスに必要な因子(例えば、成長因子、脈管形成因子など)は、必要とするときだけ発現させ、その後、抑制するように調節することができる。
【０１８３】
抗がん治療 - 抗がん治療に有用な遺伝子産物の発現は、腫瘍成長の制止が達成されるまで、治療段階に限定することができる。その後、遺伝子産物の発現を抑制するように調節することができる。可能な全身性抗がん治療には、免疫活性化分子(例えば、IL-2, IL-12 など)を発現する腫瘍浸潤リンパ球、脈管形成阻害剤(PF4、IL-12など)、ヘルレグリン(原語: Her-regulin)、ロイコレグリン(原語: Leukoregulin)(PCT Publication No. WO 85/04662参照)、及びG-CSF、GM-CSF及びM-CSFのような骨髄補助療法のための成長因子、の使用が含まれる。このうち最後に関して、骨髄補助療法のための因子を発現するために、本発明の調節系を使用すると、定期的間隔に簡単に化学療法から骨髄補助療法に切り替えることができる(同様に、上述のようなアプローチはAIDS治療にも応用でき、例えば、簡単に抗ウイルス治療から骨髄補助療法へ切り替えることができる)。さらに、抗がん治療の被制御局部ターゲッティングも可能である。例えば、本発明の調節因子による自殺遺伝子の発現の場合、この調節因子自体が、例えば腫瘍特異プロモーター又は放射線誘導プロモーターによって制御される。
【０１８４】
別の実施例においては、本発明の前記調節タンパク質を使用すると、本発明の前記系を用いて調節された導入遺伝子によって腫瘍中の脈管形成阻害剤が発現される。この態様における脈管形成阻害剤の発現は、この阻害剤の全身投与より効率がよい場合があり、全身投与に伴うことがあるいかなる有害な副作用を解消させるかもしれない。とりわけ、腫瘍内部への脈管形成阻害剤の発現の抑制は、とりわけ正常の細胞成長に関連してまだ脈管形成中である小児のがん治療に有用である。
【０１８５】
別の実施例においては、サイトカインの高レベル発現調節は、患者自身の免疫応答を腫瘍細胞に集中させるための方法の代表である。腫瘍細胞の形質導入によって、個人の自然免疫応答の増加に重要な化学誘引物質及び成長促進サイトカインを発現することができる。腫瘍の近位にサイトカインの濃度が最高になるので、腫瘍抗原に対する免疫学的応答を誘い出す可能性が増大する。このタイプの療法における潜在的問題は、サイトカインを産生するこれらの腫瘍細胞も免疫応答の標的になり、このために全ての腫瘍細胞の根絶が確認される前に、サイトカインのソースが除去されることになる。これに対処するため、免疫系から感染細胞をマスキングすることで知られたウイルスタンパク質の発現を、同じ細胞中のサイトカイン遺伝子とともに、調節下に置くことができる。上述のようなタンパク質の1つがアデノウイルスからのE19タンパク質(例えば、Cox, Science 247:715参照)である。このタンパク質は、クラスＩHLA抗原がこの細胞に移入されるのを阻止し、それによって宿主の細胞傷害性T細胞によるこの細胞の認識及び溶解を阻止する。従って、腫瘍細胞におけるE19の調節された発現は、サイトカイン発現によって誘発された免疫応答がオンの状態中に傷害性T細胞からサイトカイン産生細胞を遮蔽できるであろう。E19を発現するものを除く全ての腫瘍細胞を根絶するだけの十分な期間の経過後、E19はオフに切り替えられて、これらの細胞が以後、誘発された抗腫瘍免疫応答のとりこになるようにする。
【０１８６】
良性前立腺肥大症 - 上述と同様に、自殺遺伝子は、本発明の調節因子によって調節することができる。この場合、この調節因子自体は、例えば、前立腺特異プロモーターによって制御される。
【０１８７】
本発明の前記調節系を使って、制御態様下で自殺遺伝子(例えば、アポトーシス遺伝子、TK遺伝子など)を発現させる能力は、この系の全般的安全性及び有用性をさらに補足する。例えば、要望する療法の終わりに、自殺遺伝子の発現の引き金を引き、生体不活性移植組織中の細胞、意図した元来の位置から外に広がった細胞など、遺伝子療法ベクターを保有する細胞を除去することができる。さらに、移植組織が発癌性になるか、又は副作用があった場合には、自殺遺伝子の誘導によってこれらの細胞を素早く除去することができる。1つの細胞内で、Tcに制御された「オン」/「オフ」スイッチを複数使うと、治療上重要な1つの遺伝子の調節に比べて、自殺遺伝子の調節を完全に独立して行うことができる(本書に前述されている)。
【０１８８】
さらに、本発明の調節タンパク質は、被験体内で対象の1つの遺伝子産物に対する治療に関連した発現レベルを設定するのと対照して、達成できた遺伝子産物発現レベルにフレキシビリティを与えない構成発現の調節を解除するための能力を提供する。生理学的に関連がある遺伝子産物発現のレベルは、その被験体の特定の医療ニーズに基づいて、例えば、関連した遺伝子産物レベルをモニターする実験室テスト(上述の方法を使って)に基づいて、設定することができる。遺伝子産物を供与する遺伝子を用いた上述の臨床例及び遺伝子に加えて、要望時間に要望レベルで発現できる、治療に関連するその他遺伝子産物には次のものが含まれる。即ち、血友病におけるVIII因子及びIX因子(例えば、スポーツなど傷害のリスクがある間は発現を上昇させることができる)、糖尿病におけるインシュリン又はアミリン(必要に応じて、その被験体の病状によって、食餌療法など)、赤血球減少症におけるエリスロポエチン(必要に応じて、例えば、末期の腎不全)、肝臓におけるアテローム性動脈硬化症又は遺伝子治療のための低濃度リポ蛋白受容体(LDLr)又は非常に低濃度リポ蛋白受容体(VLDLr)(例えば、ex vivo移植組織を使用)などがある。中枢神経系障害の治療への応用も包含されている。例えば、アルツハイマー病において、アセチルコリンのレベルを回復するためのコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)の「微調整」発現、神経栄養因子(例えば、NGF、BDNGFなど)又は補体抑制因子(例えば、sCR1、sMCP、sDAF、sCD59など)、 或いはこの両方、を達成することができる。上述のような遺伝子産物は、例えば、本発明の前記系を使って調節された態様で遺伝子産物を発現する移植された細胞によって、供給することができる。さらに、パーキンソン病は、レボドパ及びドーパミンのレベルを増加させるためのチロシン水酸化酵素の「微調整」発現によって治療することができる。
【０１８９】
上述のプロティナーゼの遺伝子産物に加え、機能的RNA分子(アンチセンスRNA及びリボザイムなど)は、治療目的のため被験体内に制御態様下で発現させることができる。例えば、突然変異形質の遺伝子と野生型の遺伝子とを判別するリボザイムを設計することができる。従って、「適切なの」遺伝子(例えば、野生型p53遺伝子)を細胞内に導入し、並行して内生的遺伝子から発現された欠損mRNAを取り除くため遺伝子(例えば、突然変異した内生的p53遺伝子)の突然変異形質に特異的な、調節されたリボザイムを導入することができる。このアプローチは、欠損遺伝子からの遺伝子産物が内生的野生型遺伝子の作用を阻害するような状況において特に有効である。
【０１９０】
本発明の調節タンパク質を使った被験体での遺伝子産物の発現は、テトラサイクリン及びその類似体を使って変調される。このような薬物は、要望する作用部位への薬物のデリバリー(調節される発現の遺伝子を含有する細胞へのデリバリー)に適切な任意の経路によって投与することができる。関わる特定の細胞の種類によって、投与の好適な経路は、経口投与、静脈投与及び局所投与が含まれよう(例えば、ケラチノサイトなど、皮下の局在移植組織の細胞に達するための経皮貼布を使う一方、全身治療からいかなる副作用の可能性もなくす)。
【０１９１】
ある遺伝子治療状況においては、治療を受けた被験体に意に反した免疫応答をなくすか、若しくは抑制するための処置をとる必要があるか、若しくは望ましい場合がある。治療用遺伝子産物を発現する細胞と逆の反応がないように、可能なときは、通常被験体自身の細胞を使って、治療遺伝子産物を発現させる。そのには、その被験体から細胞をin vivoで修飾するか、若しくはその被験体から細胞を採取し、ex vivoでその細胞を修飾し、それらをその被験体に戻すかのどちらかの方法が使われる。異質遺伝子型又は異種の細胞を使用して、対象の遺伝子産物を発現させる状況には、治療遺伝子の調節に加えて、本発明の調節系も使用して、異物細胞に対する免疫防御反応を下方調節するために、その細胞の免疫認識に関わる単一又は複数の遺伝子を調節することができる。例えば、細胞表面分子をコード化するmRNAをはがすリボザイムの異物細胞における発現の調節によって、治療用遺伝子産物のデリバリーのために使用される異物細胞の表面で、Tリンパ球による異物細胞の認識に関わる細胞面分子の反応を下方調節することができる。意に反する免疫応答を抑制するため、上記の態様で反応を下方調節できる特に好適な細胞表面分子には、クラスＩ又はII或いはこの両クラスの主要組織適合複合体(MHC)分子、補刺激活性分子(例えば、B7-1又はB7-2或いはこの両方)、CD40、及びICAM-1又はICAM-2のような各種の「接着」分子が含まれる。同じ細胞内の複数遺伝子の独立的かつ協調的調節のための、本書に記載したアプローチを使用すると、宿主細胞の細胞表面分子の発現の抑制的調節を、治療遺伝子の発現の活性化調節と強調させることができる。従って、治療が完了し、治療遺伝子の発現が止められた後、内生的細胞表面分子の発現を正常に回復させることができる。
【０１９２】
さらに、前述したように、抗がん治療に関して、MHC抗原の発現を下方調節するウイルスタンパク質(アデノウイルスE19タンパク質)は、意に反する免疫反応を避ける手段として、本発明の前記系を使って宿主細胞内で調節することができる。
【０１９３】
治療用遺伝子産物を送達する異物細胞に対する免疫防御反応をなくすか、若しくは抑えるのに加えて、これらの融合タンパク質は、意に反する免疫反応を刺激することがある非哺乳動物のポリペプチドを含有しているので、被験体に発現する、本発明の調節系の一部の構成体(例えば、本書に記載されている調節融合タンパク質)に対する免疫防御反応をなくすか、若しくは抑える必要がある場合が、状況によってはある。この点に関しては、宿主細胞の免疫応答を刺激する能力を低下させるように、調節融合タンパク質を設計することができる。例えば、トランス活性化因子ドメインを設計するか、若しくは選択するか、或いはこの両方を行い、調節融合タンパク質に使用することができる。この点に関しては、単純ヘルペスウイルスタンパク質VP16の野生型転写活性化ドメインは、哺乳動物の免疫応答を刺激することがあるので、in vivoで使用するには好適な転写活性化ドメインとは言えない。被験体の免疫原性の低下に基づいて、代替の転写活性化ドメインを使用することができる。例えば、宿主と同じ種のタンパク質の転写活性化ドメインが好適かもしれない(例えば、ヒトの調節融合タンパク質に使用するには、ヒト蛋白からの転写活性化ドメイン)。これに代り、例えば、調節融合タンパク質のポリペプチド(例えば、VP16ポリペプチドのような、Tetリプレッサーの成分又は転写モジュレーターの成分)内の単一又は複数の優生T細胞エピトープを特定及び修飾することによって、被験体の免疫原性が低下するように、本発明の調節融合タンパク質を修飾することができる。上記のような細胞エピトープは、標準方法で特定することができ、再び、標準方法である突然変異誘発によって改変することもできる。その後は、修飾されない融合タンパク質と比べれば、まだ被験体の免疫原性が低下を呈示する元の転写調節能力を保持している、修飾された形質の調節融合タンパク質を選択することができる。
【０１９４】
上記に加えて、免疫応答の抑制が望ましい状況には、被験体の免疫応答を全般的又は特定的に下方調節するための従来の全ての方法を、本発明の調節系の使用と組み合わせることもできる。サイクロスポリンA又はFK506或いはこの両方のような一般的免疫抑制剤を被験体に投与することができる。これに代り、より特定の免疫抑制に対応できる免疫抑制剤を使用することができる。このような薬剤は補刺激活性分子の抑制剤が含まれている可能性がある(例えば、CTLA4Ig 融合タンパク、可溶性CD4、抗CD4抗体、抗B7-1又は抗B7-2抗体或いはこの両方、又は抗体gp39抗体)。
【０１９５】
最後に、ある状況下では、移植された細胞の免疫系へ暴露を最小限にできる、治療遺伝子を発現する細胞のデリバリー手段を選択することができる。例えば、移植組織の中からタンパク質(例えば、対象の治療用遺伝子産物)の拡散及び移植組織内への栄養素及び酸素の拡散に対応できる生体不活性カプセル/多孔性の生物学的適合膜の中に細胞を移植し、このようにして、移植された細胞が免疫系に暴露されないようにできる(すでに島細胞の移植に適用されている)。
【０１９６】
本発明のトランス活性化因子融合タンパク質の核酸分子、トランス活性化因子融合タンパク質の断片、及び抗トランス活性化因子融合タンパク質抗体(本書では「活性分子」とも言う)は、投与に適した製薬組成物に組み込むことができる。上述のような組成物は、一般に核酸分子、タンパク質、又は抗体及び医薬的に受容可能伝達体を含む。本書で使用される「医薬的に受容可能伝達体」という用語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、皮膜、抗菌剤及び抗真菌剤、等調及び吸収遅延剤、及び医薬的投与と適合する同等のものが含まれる。医薬的活性物質として上記のような媒体及び作用物質の使用は、現在ではよく知られた技術である。いずれのか従来の媒体及び作用物質は活性化合物と不適合である場合を除き、製薬組成物にこれらの使用は考慮に入れられる。補助活性化合物もこれらの組成物に組み込まれることがある。本発明の製薬組成物は、その意図する投与経路と適合するよう処方指示される。投与経路の例には、非経口(例えば、静脈、皮内、皮下)、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。
【０１９７】
B. in vitroでのタンパク質の産生
対象のタンパク質の量産は、1) 細胞内でトランス活性化因子の発現に適した形質で本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸、2) tetオペレーターに機能的に連結する対象のタンパク質をコード化する遺伝子、を含有するように修飾された、in vitroで培養された細胞を使って、達成することができる。例えば、哺乳動物、酵母菌又は真菌の細胞は、本書に記載されている、これら核酸構成体を含有するように修飾することができる。これらの修飾された哺乳動物、酵母菌又は真菌の細胞を、その後Tc又はその類似体の存在下で標準発酵技術によって培養し、その遺伝子の発現を誘導し、対象のタンパク質を産生することができる。従って、本発明は、対象のタンパク質を単離するための生産プロセスを提供する。この目的で、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸、及び少なくとも1つのtetオペレーター配列に機能的に連結する対象のタンパク質をコード化する核酸の両方を導入した宿主細胞(例えば、酵母菌又は真菌)は、対象のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列(即ち、tetオペレーター配列に機能的に連結するヌクレオチド配列)の転写を刺激するために、テトラサイクリン又はその類似体の存在下の培地で生産規模で増殖され、対象のタンパク質が収穫された宿主細胞からか、又はその培地から単離される。標準タンパク質精製技術を使用して、この培地から又は収穫された細胞から対象のタンパク質を単離することができる。
【０１９８】
C. B. in vivoでのタンパク質の産生
本発明は、トランスジェニック畜産動物のような動物により対象のタンパク質の量産にも対処できる。トランスジェニック技術の進歩によって、牛、やぎ、豚及び羊などのトランスジェニック家畜を生産することが可能になった(Wall, R.J. et al. (1992) J. Cell. Biochem. 49:113-120; and Clark, A.J. et al. (1987) Trends in Biotechnology 5:20-24でレビューされている)。従って、対象のタンパク質をコード化する遺伝子が、tetオペレーターに機能的に連結する場合は、そのゲノムの中に本発明の誘導可能調節系の構成体を保有するトランスジェニック家畜を作成することができる。遺伝子の発現、及びその後のタンパク質の産生は、そのトランスジェニック動物にTc(又はその類似体)を投与することによって誘導される。タンパク質の産生は、トランス活性化因子融合タンパク質をコード化する核酸を、このトランス活性化因子の発現を一部の細胞に限定する、適切な組織特異調節配列と連結することによって、特定組織を標的にすることができる。例えば、乳漿プロモーター(U.S. Patent No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166)のような哺乳動物の乳腺特異調節配列を、このトランス活性化因子の移植遺伝子と連結させて、このトランス活性化因子の発現を哺乳動物組織に限定させることができる。このように、Tc(又は類似体)の存在下、タンパク質がトランスジェニック動物の哺乳動物組織で産生されることになる。このタンパク質は、上記トランスジェニック動物の乳汁中に潜ませるように設計することができ、要望に応じて、このタンパク質を乳汁から単離することもできる。
【０１９９】
D. 人間のかかる病気の動物モデル
本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、人間のかかる病気の動物モデルを創造することによ人間のかかる病気病理生理学を最小にするためり、動物の特定遺伝子の発現を刺激するためにも、単体で又は組み合せて使用することができる。例えば、宿主細胞では、病気に関わりがあると思われる対象の遺伝子を、単一又は複数のtetオペレーター配列の転写制御下に置くことができる(本書に記載されている、相同再組換えによる)。このような動物と、トランス活性化因子融合タンパク質又は抑制因子融合タンパク質、或いはこの両方に対応する単一又は複数の導入遺伝子を保有する第2世代とを交配して、テトラサイクリン調節による融合タンパク質遺伝子とtet調節による標的配列の両方を保有する子孫を創造することができる。これらの子孫における対象の遺伝子の発現は、テトラサイクリン(類似体)を使って変調させることができる。例えば、対象の遺伝子の発現を転写抑制因子融合タンパク質を使って下方調節し、遺伝子発現とこれらの病気の関係を検査することができる。上述のようなアプローチは、病気の動物モデルを創造するには、相同組換えによる遺伝子の「ノックアウト」より利点がありそうである。その理由は、本書に記載されている、tet調節による系では、対象の遺伝子の発現のレベルと遺伝子発現が抑制又は活性化調節されるタイミングの双方について制御することができるからである。
【０２００】
E. 遺伝子クローニング及びその他の利用法のための安定した細胞系統の生産
本書に記載されている、トランス活性化因子タンパク質は、遺伝子の発現を調節するために使用することができ、それによって、他の方法では生産することができないような安定した細胞系統の生産を可能にする。例えば、その細胞に細胞毒性である遺伝子を保有する安定した細胞系統は、有毒遺伝子の発現で「漏出」のために創造することが難しいか、不可能であろう。本発明のトランス活性化因子融合タンパク質を使って、上述のような有毒遺伝子の遺伝子発現を厳格に調節することにより、有毒遺伝子を保有する安定した細胞系統を創造することができよう。この後、上述のような安定した細胞系統は、上述のような有毒遺伝子をクローニングするためにも使用できる(Tc又は類似体を使って制御条件下で有毒遺伝子の発現を誘導する)。遺伝子の発現クローニングの一般的方法は、現在では知られた技術であるが、本発明の転写抑制因子系もこの方法に応用できる可能性がある(例えば、 Edwards, C. P. and Aruffo, A. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:558-563参照)。さらに、この転写調節タンパク質は、造血幹(ES)細胞などにおいて、他細胞中の遺伝子の発現を変調するためにも使用することができる。ES細胞に導入されたいくつかの遺伝子の残りの発現は、安定したトランスフェクトされたクーロンを単離できない結果になろう。本書に記載されている、トランス活性化因子融合タンパク質を使って上述のような遺伝子の転写を調節すると、この問題の解消に有用であろう。
【０２０１】
実施例
本発明の多様な態様を図で示すため、以下の例を提供する。これらによって、本発明が制限されると解釈してはならない。
【０２０２】
以下の例に掲載したスクリーニングは、アエクオローレ・ビクトリア(原語: aequorae victoria)からの、tTA/rtTAに依存する緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいている(Niedenthal et al., 1996; Wach et al., 1998; Oldenburg et al., 1997, as optimized for enhanced fluorescence)。GFPタンパク質は、次の突然変異、即ち、F99S、M153T、及びV163A (Crameri et al. (1996), Nature Biotechnology 14, 315-319による)、F64L及びS65T (Cormack et al. (1996), Gene 173, 33-38による)、及びQ80Rの挿入、並びにGFP+を産生する2'位へのアラニンの挿入によって、最適化されている。GFPを発現する酵母菌コロニーの蛍光は、UV光の照射下の適当な寒天プレートで都合よく検出でき、FACS又は蛍光分光法で定量化することができる(Niedenthal et al., 1996)。
【０２０３】
このように、次の配列を含有するプラスミド、指定pCM 190GFP+が作製された。
・ tTA/rtTA応答可能プロモーターによって制御された、GFP対応のコーディング配列
・ 組成物分別に発現される、tTA/rtTAをコード化する配列
・ 適切な酵母菌株で選別できる、URA3
・ S.クレビジエ(S.cerevisiae)の2μエピソームの複製機能
適切なのエンドヌクレアーゼ切断部位によって、TetR、活性化ドメイン、又はtTAをコード化する配列全体を除去することができ、これらは、前述したように、一般に獲得した突然変異誘発された対立遺伝子のプールによって置換される (Leung et al., 1989)。
【０２０４】
このプラスミド混合物はS.クレビジエ(S.cerevisiae)に形質転換され、形質転換体をウラシル原栄養性によって選別された。結果の形質転換体は、次のような多様な特性の試験が可能な寒天プレート上でスクリーニングされた。
・ Tc誘導物又はその他の化学物質によるGFPの誘導
・ 誘導因子の不在下の基礎発現を減少するrtTAの新規対立遺伝子
・ 誘導因子の存在下の発現レベルの増大
【０２０５】
活性化ドメインをコード化する配列が適切な配列ライブラリーで置換された場合は、スクリーニングにより、TetR変異体との融合に最適機能をもつ新規活性化因子又はサイセンサーを識別できる。
【０２０６】
例1    向上した特性のrtTA変異体
遺伝子をコード化するGFPをpCM190の複数クローニング部位にクローニングし(Gari et al., 1997) 、プラスミドpCM190GFP+を産生する、rtTA活性の標識として使用した。tTAのTetR部分は、突然変異誘発のため、前述したベクターpCM190からの、5'-GACCGATCCAGCCTCCGCGG (SEQ ID NO:46)と5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA (SEQ ID NO:47)の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅された(Leung et al., 1989)。PCR断片及びpCM190-GFP+ をXbalI及びBsiWIを用いて制限し、精製した。PCRとこのベクターは再連結され、大腸菌DH5aに形質転換された。数千の大腸菌クーロンが共存して培養され、これらのプラスミドプールが作製され、LiAc法を使ってS.クレビジエ(S.cerevisiae)に形質転換された(Ito et al., 1983)。このスクリーニングプロトコルには、S.クレビジエ(S.cerevisiae)のRS453株 (MATa; ade2-1; trp1-1; can1-100; leu2-3,112; his3-1;ura3-52) が使用された。
【０２０７】
このプラスミドを酵母菌に形質転換すると、UV照射下に置かれたコロニーの直接試験によって広範にわたるGFP活性の強度差を記録することができる。このようにして、酵母菌細胞の大集団をスクリーニングして、有望tTA/rtTA候補を見つけることができる。GFPの蛍光色の差は、標識タンパク質の発現レベルの違いに起因する。これで、一般的にトランス活性化因子の活性度の差が反映されよう。通常のスクリーニングの後、少数の有力候補だけに絞って生化学的分析を実行することができる。
【０２０８】
従って、この結果得られたウラシル・プロトトロフ(uracil-prototroph)酵母菌クローンは、Tc又はDoxのどちらか或いはこの双方を含有するウラシルのない最小培地にリプレカ平板され、30℃で2〜3日間増殖された後、GFP蛍光色を刺激するため長波長のUV光を使って記録された。これによって、数種の新種rtTA対立遺伝子34R、44R、MT1R、22R、52R、68R及び92Rを特定することができる。図1は、Tc及びDoxを用いて刺激された、酵母菌中のrtTA-34R及びrtTA-44R対立遺伝子の表現型を示したものである。図2は、Doxを用いて刺激された、酵母菌中の 34R、44R、MT1R、22R、52R、68R及び92R対立遺伝子の表現型を示したものである。GFPの蛍光は、左軸上の対数目盛りで示されている。誘導因子の不在下、10 μg/mlのTcの存在下、又は10 μg/mlのDoxの存在下におけるトランス活性化因子別の蛍光強度が示されている。tTA及びrtTAを用いて達成された活性が比較のため示されている。
【０２０９】
rtTA-34R, rtTA-44R及びGFP株を含有するS.クレビジエ(S.cerevisiae)株、並びにその起点のtTA及びrtTA株を含有するS.クレビジエ株が、最小培地で一夜増殖された。これらの細胞の1 OD600 を含有する等価物を収穫し、PBSにより洗浄し、2mlのPBS中に浮遊させた。490 nmの励起波長及び最高512 nmの照射を用いて、これらの細胞の光の放射を蛍光メーターで記録した。rtTA-34R及びrtTA-44Rの基礎活性は、rtTAに比べ明らかに低かった。図1に示すように、発現の活性は、少なくとも一例では起原のrtTA又はtTAでそれぞれ達成された活性より僅かに高かった。誘導因子は100倍〜300倍の変化があった。このように、新規rtTA対立遺伝子は、40倍の発現の誘導にしか達しなかった起原のrtTAより、酵母菌における遺伝子発現の調節に優れている。
【０２１０】
新規rtTA対立遺伝子の利点は、不誘導の状態の低い基礎活性と、Tc又はDoxの付加時のに高レベルの誘導が組み合わされていることである。これは任意のリプレッサーの不在下でも達成されるので、S.クレビジエ(S.cerevisiae)でも広範囲にわたり遺伝子発現の調節ができる可能性がある。
【０２１１】
S.クレビジエ(S.cerevisiae)からの個別プラスミドの単離に続いて、突然変異誘発されたrtTA領域が配列された。下記の表1は、新規rtTA対立遺伝子の遺伝子型を示したものである。両親rtTAの参照配列は図8に示されている。
【０２１２】
【表１】
0004836375.tif 000002
【０２１３】
次にrtTA-34R及びrtTA-44Rは、tTAの各部分と置換され、 pUHD15-1に再クローニングされた (Gossen & Bujard, 1992)。HeLa細胞は、Ptetによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子をコード化する、 pUHC13-3(Gossen & Bujard, 1992)、及び個別トランス活性化因子の遺伝子を含有するプラスミドpUHD15-1を用いて一過的にトランスフェクトされた。図3に示すように、5 μg/mlのテトラサイクリン (Tc、淡いグレー)又はドキシサイクリン(Dox、濃いグレー)のエフェクターの不在下(左欄)と存在下におけるルシフェラーゼの活性が測定された。X軸上、(-)はDNAが中に転移されなかったコントロールHeLa細胞に対応する。図3に示した結果は、rtTA-34Rが rtTAに比べてはるかに高いルシフェラーゼ活性の誘導に達したことを示している。観察された増加した調節因子は、より低い基礎活性とより高い誘導活性から得られた結果である。このように、単離されたrtTA-34R は、HeLa細胞だけでなくS.クレビジエ(S.cerevisiae)でも改善された逆表現型を呈示する(図3及び6)。S.クレビジエ(S.cerevisiae)では、突然変異体rtTA-44RもHeLa細胞で逆表現型を示す。しかし、rtTAと比較すると、誘導レベルはrtTAより改善されていない。
【０２１４】
このように、新規rtTA対立遺伝子についての上述スクリーニング手順により、HeLa細胞でDoxの追加後に転写誘導を示す突然変異体を特定することができる。 さらに、ほとんどの突然変異体についてHeLa細胞で観察された表現型は、酵母菌で見られる特性を忠実に反映している。 このことは、S.クレビジエ(S.cerevisiae)におけるスクリーニング手順は、哺乳動物細胞においてTetRに基づく新規活性調節タンパク質を発見するための貴重なツールであることを実証している。
【０２１５】
例2    テトラサイクリン類似体を用いた差次的誘導によるtTA突然変異体の選択
テトラサイクリン類似体に対して異なる感受性をもつtTA突然変異を特定するには、前に略述されているように、酵母菌でtTAのTetR部分の突然変異誘発、形質転換及び選択を実行する。さらに分析するため、結果得られた候補は酵母菌に形質転換され、10 μg/ml のテトラサイクリン、アンヒドロサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロロテトラサイクリン又はドキシサイクリンのいずれかを含有したウラシル不在下の最小培地プレートで繁殖された。この酵母菌は30℃で2〜3日間増殖され、これらのGFP発現表現型が前述したように試験された。これによって、いくつかの新規tTA対立遺伝子、即ち2、11、19、22、23、24、31、36、38、45、及び50が特定されるに至った。下記の表2は、新規tTA対立遺伝子の遺伝子型を示したものである。両親tTAの参照配列は図9に示されている。
【０２１６】
【表２】
0004836375.tif 000003
【０２１７】
このスクリーンから単離された1個の突然変異体、tTA-45を配列し、ロイシンからバリン(L170V)まで170の位でアミノ酸交換を保有することが発見された。Tc又はDoxの濃度の変化に対するtTA-45の応答の誘導効率は、HeLa細胞での一過性トランスアフェクションアッセイで判別された。ルシフェラーゼ活性(IC50)の抑制を50％に導く誘導因子濃度が判別され、下記の表3に示されている。
【０２１８】
【表３】
0004836375.tif 000004
【０２１９】
突然変異体tTA-45はTcに対する感受性が100倍低いが、Doxに対する感受性は約10倍低いだけである。
【０２２０】
従って、Tc依存性の真核トランス活性化因子に対するS.クレビジエ(S.cerevisiae)に基づくスクリーンも、改変した誘導因子認識特性によりtTAの特定化に適していると結論付けた。このことは実践的応用に重要である。その理由は、このスクリーンを使用して、Tc依存性の転写因子の誘導特性を変更することができ、それによって化学的に別個の誘導物質に異なる応答をする新規対立遺伝子の作製が可能になるからである。Tc類似体の様々な組み合わせによって、相当数の異なる遺伝子を異なるように調節できる場合には、これらのTc依存性の転写因子は、さらに哺乳動物細胞系統又はトランスジェニック動物を作製するために使用できるかもしれない。
【０２２１】
5個の新規tTA対立遺伝子、即ちtTA-19、tTA-31、tTA-36、tTA-45及びtTA-50の解析は、一過的にヒト上皮細胞にトランスフェクトすることによって実行された。図4に示すように、2 μg/mlのドキシサイクリン (Dox、淡いグレー)又はテトラサイクリン(Tc、濃いグレー)のエフェクターの不在下(左欄)と存在下におけるルシフェラーゼの活性が測定された。X軸上、(-)はDNAが中に転移されなかったコントロールヒト上皮細胞に対応する。
【０２２２】
例3    TetRに基づく新規トランス活性化因子: rtTA-34R
逆Dox誘導可能なトランス活性化因子rtTA-34Rをコード化する新規対立遺伝子rtTA-34Rを配列し、以前の特徴をもつrtTAと異なる突然変異を含有することが発見された。このことは、rtTA-Rの異なる領域にある突然変異によって、逆トランス活性化因子表現型を獲得することができることを実証している。rtTA-34Rで発見された突然変異は、E19G、A56P、H139H (silent)、A148E、及びH179Rである。95、101、及び102の位置にあるアミノ酸は、起原rtTA内で突然変異してもので、rtTA-34Rの野生型残基である。
【０２２３】
突然変異した残基の役割についてさらに情報を得るため、139、148及び179の位置の突然変異から19及び56位置の突然変異が分離された。結果得られたタンパク質は、rtTA-1956R及びrtTA-148179Rと言う。rtTA-1956R及びrtTA-148179Rの潜在的活性を、一過的発現実験で検定した。個別rtTA変異体をコード化するプラスミドは、pUHC13-3ルシフェラーゼ標識プラスミドを用いてHeLa細胞に共にトランスフェクトされ、ルシフェラーゼ活性が判別された。図5に示す結果は、逆表現型にはE19G及びA56Pの2つの交換で十分であることを示している。148及び179の位置の突然変異は、これら自体で逆表現型を産生しないので、表現型の支えにすぎない。
【０２２４】
例4    エピソームに安定化されたプラスミドからrtTA-34Rを産生するHeLa細胞
このプラスミドをエピソームにより維持する細胞系統を生成し、これによって、より長期にわたりトランス活性化因子を生産するには、hCMV プロモーターによって制御されたrtTA-34Rコーディング配列を含有する転写単位をpREP9に挿入した (Invitrogen, Carlsbad, USA)。RSVプロモーターはこのpREP9の中から切り取られた。この結果、Epstein Barrに基づくベクターpCEP4-rtTA-34Rが得られた。プラスミドpCEP4-rtTA-34Rを用いてHeLa細胞をトランスフェクトし、G418選択によりクーロンを単離した。安定的にトランス活性化因子を産生するクーロンを選択して、一過的にトランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター構成体UHC13-3から転写を活性化する能力が、Doxの存在時及び不在時にあるかを試験した。
【０２２５】
表4に示したデータは、各種のクーロン(0.34R-16、-33及び-36)由来の3つのHeLa細胞系統が、両親細胞系統よりわずかに高い類似のバックグラウンドの活性を呈示した。5 μg/mlのDoxの追加時に、ルシフェラーゼ活性が最高600倍まで誘導されている。rtTA遺伝子の染色体コピーを宿すHeLa細胞 HR5 (Gossen et al., 1995)と比較して、背景レベルが低下する。さらに、誘導されたルシフェラーゼのレベルが著しく上昇する。これによって、rtTA-34R クローンの場合は数百倍の遺伝子誘導に達するのに対し、HeLa細胞ではこれらの条件下で僅か20〜30倍の誘導しか達成できない。
【０２２６】
【表４】
0004836375.tif 000005
【０２２７】
例5    最小活性化ドメインに融合されたrTA-34R対立遺伝子をコーディングする遺伝子
プラスミドpUHrT61-1を生成するためrTetR-34Rのコーディング配列を適切なpUHD ベクターの中に挿入することにより、rTetR-34Rのコーディング配列が、4つの最小活性化ドメイン (FFFF)をコード化するDNAと融合された(Baron et al., 1997)。 PhCMVの制御下で、rtTA-34R-FFFF遺伝子を保有するプラスミドpUHrT51-1 を用いて、HeLa細胞系統 X1/6をトランスフェクトした。この結果得られたHeLa細胞系統 X1/6-34R-FFFF は、加えて、「サイレントであるが活性可能座位」に Ptetルシフェラーゼ発現単位を含有する。
【０２２８】
ゲノムに安定的に挿入されそこで構成的に発現するたpUHrT51-1を含有する各種のクーロン由来の細胞系統を、ヒグロマイシンB選別を用いて単離し、Dox依存性ルシフェラーゼ活性について解析した。図6に示すように、Doxの不在下ではルシフェラーゼ活性を検出されなかったのに対し、Doxの追加時には、最高50000倍のルシフェラーゼ活性が誘導された。これに対し、前述したHR5-CL11細胞系統では(Gossen et al., 1995)、Doxの不在下で有意な背景ルシフェラーゼ活性が観察され、Doxによる誘導は約700倍に達した。これはrtTA とtetO間の残存親和性による可能性が最も大きい。
【０２２９】
例6    最小活性化ドメインに融合されたrTA-34Rをコーディングする合成遺伝子(rtTA2-34Rs)
さらにrtTA-34Rを改良するために、3つの最小活性化ドメイン(FFF)と融合されたrtTA-34Rをコード化するDNA配列が、人体に見つかるコドン頻度でトランス活性化因子をコード化するポリヌクレオチドに変換された。前述した各種の追加パラメーターに関して、このrtTA2-34Rs 配列は最適化された(Pan et al., 1999)。従って、この配列にはスプライス供与体部位もスプライス受容体部位も含まれていない。この発現を制限する可能性があるその他の特質も同様に取り除かれた。この合成遺伝子を用いると、rtTA媒介による遺伝子調節に現在従属しない各種の真核細胞において、rtTA2-34Rs を安定的に産生することができると予測される。この点については、現在、肝細胞及び成熟B細胞でrtTA2-34Rs を産生すると予想される、数種のトランスジェニックマウス系統の世代により試験中である。
【０２３０】
rtTA2-34Rをコード化する合成遺伝子を pUHD15-1 発現にクローニングし、HeLa 細胞で試験した。機能的解読として相対光単位のルシフェラーゼ活性を使った一過性トランスフェクション実験において、図6に示すように、Doxにより処理された細胞では最高20倍までの誘導が観察された。
【０２３１】
【表５】
0004836375.tif 000006
【０２３２】
上述のようにトランスフェクトされた細胞からの細胞質をまた使用して、DNAリターデイション実験で rtTA2-34Rs及びrtTA2の結合 (3つの最小活性化ドメインに融合されたrtTA)とオペレーターDNAの比較を行った。
【０２３３】
rtTA2及びrtTA2-34RsはHeLa細胞で産生され、Doxの存在下 (+) 及び存在下 (-)で放射性標識したtetO DNAに暴露された。この複合体の電気泳動移入により、tetOと2つのトランス活性化因子とは異なる親和性を有することが明らかになる。図7に示したように、オペレーターDNAとのrtTA2-34Rs の残りの結合(Doxの不在下の結合)が大幅に減少している。
【０２３４】
従って、新しいトランス活性化因子は、これまでの特徴をもつものと比較したとき顕著な改善を示す。この結果について実行されたスクリーニングが完全であると仮定する理由はほとんどないので、さらに改善した特性をもつその他のrtTAを獲得できる可能性があると予測している。
【０２３５】
参考文献
Baron, U., Gossen, M. & Bujard, H. (1997) Tetracycline controlled transcription in eukaryotes: novel transactivators with graded transactivation potential. Nucl. Acids Res. 25, 2723-2729.
Baron, U., Schnappinger, D., Helbl, V., Gossen, M., Hillen, W. & Bujard, H. (1999) Generation of conditional mutants in higher eukaryotes by switching between the expression of two genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1013-1018.
Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., & Herrero, E. (1998). An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Res. 26, 942-947.
Bello, B., Resendez-Perez, D., & Gehring, W. J. (1998). Spatial and temporal targeting of gene expression in Drosophila by means of a tetracycline-dependent transactivator system. Development 125, 2193-2202.
Bieschke, E. T., Wheeler, J. C., & Tower, J. (1998). Doxycycline-induced transgene expression during Drosophila development and aging. Mol. Gen. Genet. 258, 571-579.
Camacho-Vanegas, O., Mannucci, L. & Amaldi, F. (1998) Construction of Xenopus (B3.2) and human (HeLa) cell lines expressing the tetracycline-controlled transactivator (tTA). In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 14-15.
Cohlan, S. Q. (1977). Tetracycline staining of teeth. Teratology 15, 127-129.
Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., Emran, O.A. & Wang, X. (1995) Conditional transformation of a pancreatic s-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline regulated oncogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3576-3580.
Ewald, D., Li, M., Efrat, S., Auer, G., Wall, R.J., Furth, P.A. & Hennighausen, L. (1996) Time-sensitive reversal of hyperplasia in transgenic mice expressing SV40 T antigen. Science 273, 1384-1386.
Fishman, G.I., Kaplan, M.L. & Buttrick, P.M. (1994) Tetracycline-regulated cardiac gene expression in vivo. J. Clin. Invest. 93, 1864-1868.
Fruh, K., Gossen, M., Wang, K., Bujard, H., Peterson, P. A., & Yang, Y. (1994). Displacement of housekeeping proteasome subunits by MHC-encoded LMPs: a newly discovered mechanism for modulating the multicatalytic proteinase complex. EMBO J. 13, 3236-3244.
Furth, P. A., Onge, L. S., Boger, H., Gruss, P., Gossen, M., Kistner, A., Bujard, H., & Henninghausen, L. (1994). Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9302-9306.
Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., & Herrero, E. (1997). A set of vectors with a tetracycline-regulatable promoter system for modulated gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13, 837-848.
Gatz, C., & Quail, P. H. (1988). Tn10-encoded Tet repressor can regulate an operator-containing plant promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1394-1937.
Gossen, M., & Bujard, H. (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551.
Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W., & Bujard, H. (1995). Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 268, 1766-1769.
Harding, T.C., Geddes, B.J., Murphy, D., Knight, D. & Uney, J.B. (1998) Switching transgene expression in the brain using an adenoviral tetracycline-regulatable system. Nat. Biotechnol. 16, 553-555.
Helbl, V., & Hillen, W. (1998). Stepwise selection of TetR variants recognizing tet operator 4C with high affinity and specificity. J. Mol. Biol. 276, 313-318.
Helbl, V., Tiebel, B., & Hillen, W. (1998). Stepwise selection of TetR variants recognizing tet operator 6C with high affinity and specificity. J. Mol. Biol. 276, 319-324.
Hillen, W., & Berens, C. (1994). Mechanisms underlying expression of tn10 encoded tetracycline resistance. Annu. Rev. Microbiol. 48, 345-369.
Hinrichs, W., Kisker, C., Duvel, M., Muller, A., Tovar, K., Hillen, W., & Saenger, W. (1994). Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance. Science 264, 418-420.
Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., & Kimura, A. (1983). Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bact. 153, 163-168.
Kisker, C., Hinrichs, W., Tovar, K., Hillen, W., & Saenger, W. (1995). The complex formed between tet repressor and tetracycline-Mg2+ reveals mechanism of antibiotic resistance. J. Mol. Biol. 247, 260-280.
Kistner, A., Gossen, M., Zimmermann, F., Jerecic, J., Ullmer, C., Lubbert, H., & Bujard, H. (1996). Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10933-10938.
Leung, D. W., Chen, E., & Goeddel, D. V. (1989). A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction. Technique 1, 11-15.
Muller, G., Hecht, B., Helbl, V., Hinrichs, W., Saenger, W., & Hillen, W. (1995). Characterization of non-inducible Tet repressor mutants suggests conformational changes necessary for induction. Nature Struct. Biol. 2, 693-703.
Niedenthal, R. K., Riles, L., Johnston, M., & Hegemann, J. H. (1996). Green fluorescent protein as a marker for gene expression and subcellular localization in budding yeast. Yeast 12, 773-786.
Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., & Paddon, C. (1997). Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucl. Acids Res. 25, 2.
Orth, P., Cordes, F., Schnappinger, D., Hillen, W., Saenger, W., & Hinrichs, W. (1998). Conformational changes of the Tet repressor induced by tetracycline trapping. J. Mol. Biol. 279, 439-447.
Pan, W., Ravot, E., Tolle, R., Frank, R., Mosbach, R., Turbachova, I. & Bujard, H. (1999) Vaccine candidate MSP-1 from Plasmodium falciparum: a redesigned 4917 bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full length protein from E.coli and mammalian cells. Nucl. Acids Res. 27, 1094-1103.
Paulus, W., Baur, I., Oberer, D. M., Breakefield, X. O., & Reeves, S. A. (1997). Regulated expression of the diphtheria toxin A gene in human glioma cells using prokaryotic transcriptional control elements. J. Neurosurg. 87, 89-95.
Schnappinger, D., Schubert, P., Pfleiderer, K., & Hillen, W. (1998). Determinants of protein-protein recognition by four helix bundles: changing the dimerization specificity of Tet repressor. EMBO J. 17, 535-543.
Shockett, P., Difilippantonio, M., Hellman, N., & Schatz, D. G. (1995). A modified tetracycline-regulated system provides autoregulatory, inducible gene expression in cultured cells and transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6522-6526.
Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., & Philippsen, P. (1997). Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13, 1065-1075.
Weinmann, P., Gossen, M., Hillen, W., Bujard, H. & Gatz, C. (1994) A chimeric transactivator allows tetracycline-responsive gene expression in whole plants. Plant J. 5, 559-569.
Zeidler, M., Gatz, C., Hartmann, E. & Hughes, J. (1996) Tetracycline-regulated reporter gene expression in the moss Physcomitrella patens. Plant Mol. Biol. 30, 199-205.
Zhou, Y., Zhang, X., & Ebright, R. H. (1991). Random mutagenesis of gene-sized DNA molecules by use of PCR with Taq DNA polymerase. Nucl. Acids Res. 19, 6052.
Gallego, C., Gari, E.,Colomina, N., Herrero E. and Aldea, M. (1997) The Cln3
cyclin is down-regulated by translational repression and degradation during
the G1 arrest caused by nitrogen deprivation in budding yeast. EMBO Journal
16, 7196-7206.
Gan, E., Piedrafita, L., Aldea, M. and Herrero, E. (1997) A set of vectors
with a tetracycline-regulatable promoter system for modulated gene
expression in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13, 837-848.
Belli, G., Gari, E., Aldea, M. and Herrero, E. (1998a) Functional analysis of
yeast essential genes using a promoter-substitution cassette and the
tetracycline-regulatable dual expression system. Yeast 14, 1127-1138.
Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M. and Herrero, E. (1998b) An
activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated geneexpression in budding yeast. Nucl. Acids Res. 26, 942-947.
Nagahashi, S., Lussier, M. and Bussey, H. (1998) Isolation of Candidaglabrata homologs of the Saccharomyces cerevisiae KRE9 and KNH1 genes and
their involvement in cell wall beta-1, 6-glucan synthesis. J. Bacteriol.180, 5020-5029.
Nakayama, H., Izuta, M., Nagahashi, S., Sihta, E.Y., Sato, Y. Yamazaki, T.,
Arisawa, M. and Kitada, K. (1998) A controllable gene expression system for
the pathogenic fungus Candida glabrata. Microbiology 144, 2407-2415.
Colomina, N., Gari, E., Gallego, C., Herrero, E. and Aldea, M. (1999) G1
cyclins block the Ime1 pathway to make mitosis and meiosis incompatible in
budding yeast. EMBO J. 18, 320-329.
Wissmann, A., Wray, L.V. Jr., Somaggio, U., Baumeister, R., Geissendoerfer,
M. and Hillen, W. (1991) Selection for Tn10 Tet repressor binding to tetoperator in Escherichia coli: Isolation of temperature sensitive mutants and
combinatorial mutagenesis in the DNA binding motif. Genetics 128, 225-232.
【０２３６】
言及による編入
ここに引用したすべての特許、公開された特許出願及び出版物を、言及によりここに編入することとする。
【０２３７】
等価物
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるだけで、ここに説明した具体的な方法の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価物は、本発明の範囲内にあり、また以下の請求の範囲の網羅するところと見なされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Tc及びドキシサイクリン(Dox)と依存関係にあるS.クレビジエ(S.cerevisiae)におけるrtTA依存性のGFP蛍光を示したグラフである。
【図２】ドキシサイクリン(Dox)と依存関係にあるS.クレビジエ(S.cerevisiae)におけるrtTA依存性のGFP蛍光を示したグラフである。
【図３】Tc又はDox或いはこの両方と依存関係にあるHeLa細胞における、tTAに依存するルシフェラーゼの発現を示したグラフである。
【図４】Tc又はDox或いはこの両方と依存関係にある一過的に核酸が導入される人体上皮細胞における、tTAに依存するルシフェラーゼの発現を示したグラフである。
【図５】前記の逆表現型の一因である、rtTA-34Rにおける各種突然変異の寄与度を示したグラフである。
【図６】安定的にトランスフェクトされたHeLa細胞における、rtTA及びrtTA-34R-FFFFによるドキシサイクリン依存によるルシフェラーゼ調節を示したグラフである。
【図７】rtTA2及びrtTA2-34Rの存在時のTetオペレーターDNAの可動性モビリティ変化を示しているゲルである。
【図８】前記の両親rtTAタンパク質をコード化する核酸配列を示している。
【図９】前記の両親tTAタンパク質をコード化する核酸配列を示している。
【配列表】
0004836375.tif 000007
0004836375.tif 000008
0004836375.tif 000009
0004836375.tif 000010
0004836375.tif 000011
0004836375.tif 000012
0004836375.tif 000013
0004836375.tif 000014
0004836375.tif 000015
0004836375.tif 000016
0004836375.tif 000017
0004836375.tif 000018
0004836375.tif 000019
0004836375.tif 000020
0004836375.tif 000021
0004836375.tif 000022
0004836375.tif 000023
0004836375.tif 000024
0004836375.tif 000025
0004836375.tif 000026
0004836375.tif 000027
0004836375.tif 000028
0004836375.tif 000029
0004836375.tif 000030
0004836375.tif 000031
0004836375.tif 000032
0004836375.tif 000033
0004836375.tif 000034
0004836375.tif 000035
0004836375.tif 000036
0004836375.tif 000037
0004836375.tif 000038
0004836375.tif 000039
0004836375.tif 000040
0004836375.tif 000041
0004836375.tif 000042
0004836375.tif 000043
0004836375.tif 000044
0004836375.tif 000045
0004836375.tif 000046
0004836375.tif 000047
0004836375.tif 000048
0004836375.tif 000049
0004836375.tif 000050
0004836375.tif 000051
0004836375.tif 000052
0004836375.tif 000053
0004836375.tif 000054
0004836375.tif 000055
0004836375.tif 000056
0004836375.tif 000057
0004836375.tif 000058
0004836375.tif 000059
0004836375.tif 000060
0004836375.tif 000061
0004836375.tif 000062
0004836375.tif 000063
0004836375.tif 000064
0004836375.tif 000065
0004836375.tif 000066
0004836375.tif 000067
0004836375.tif 000068
0004836375.tif 000069
0004836375.tif 000070
0004836375.tif 000071
0004836375.tif 000072
0004836375.tif 000073
0004836375.tif 000074
0004836375.tif 000075
0004836375.tif 000076
0004836375.tif 000077
0004836375.tif 000078
0004836375.tif 000079
0004836375.tif 000080
0004836375.tif 000081
0004836375.tif 000082
0004836375.tif 000083
0004836375.tif 000084
0004836375.tif 000085
0004836375.tif 000086
0004836375.tif 000087
0004836375.tif 000088
0004836375.tif 000089
0004836375.tif 000090
0004836375.tif 000091
0004836375.tif 000092
0004836375.tif 000093
0004836375.tif 000094
0004836375.tif 000095
0004836375.tif 000096
0004836375.tif 000097
0004836375.tif 000098
0004836375.tif 000099
0004836375.tif 000100
0004836375.tif 000101
0004836375.tif 000102
0004836375.tif 000103
0004836375.tif 000104
0004836375.tif 000105
0004836375.tif 000106
0004836375.tif 000107
0004836375.tif 000108
0004836375.tif 000109
0004836375.tif 000110
0004836375.tif 000111
0004836375.tif 000112
0004836375.tif 000113
0004836375.tif 000114
0004836375.tif 000115
0004836375.tif 000116
0004836375.tif 000117
0004836375.tif 000118
0004836375.tif 000119
0004836375.tif 000120
0004836375.tif 000121
0004836375.tif 000122
0004836375.tif 000123
0004836375.tif 000124
0004836375.tif 000125
0004836375.tif 000126
0004836375.tif 000127
0004836375.tif 000128
0004836375.tif 000129
0004836375.tif 000130
0004836375.tif 000131
0004836375.tif 000132
【図１】
0004836375.tif 000133
【図２】
0004836375.tif 000134
【図３】
0004836375.tif 000135
【図４】
0004836375.tif 000136
【図５】
0004836375.tif 000137
【図６】
0004836375.tif 000138
【図７】
0004836375.tif 000139
【図８】
0004836375.tif 000140
【図９】
0004836375.tif 000141