(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物を準備すること；および
ｂ）前記融合物をｐＨ１０〜１２の緩衝液の存在下で核酸鋳型と接触させることを含む、ＤＮＡ合成のための方法。
【請求項２】
ａ）ＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物を準備すること；
ｂ）前記融合物をｐＨ１０〜１２の緩衝液の存在下で核酸鋳型と接触させて合成ＤＮＡ産物を生成すること；および、
ｃ）前記合成ＤＮＡ産物をクローニングベクターに挿入すること；
を含む、ＤＮＡ合成産物のクローニングのための方法。
【請求項３】
（ａ）鋳型ＤＮＡ鎖を配列決定ＤＮＡプライマーに接触させること；
（ｂ）工程（ａ）の前記鋳型ＤＮＡ鎖と配列決定ＤＮＡプライマーを、ＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および鎖終止ヌクレオチド類似体（アナログ）と接触させること；
（ｃ）前記鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ分子のランダム集団を合成するために十分な条件下で工程（ｂ）の混合物をｐＨ１０〜１２の緩衝液の存在下でインキュベートして工程（ａ）の前記鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ分子のランダム集団を合成すること、ただしここで前記合成されたＤＮＡ分子は工程（ａ）の前記鋳型ＤＮＡ鎖よりも短いこと、そしてここで前記合成されたＤＮＡ分子はその５’末端において終止ヌクレオチドを含むこと；および、
（ｄ）工程（ａ）の前記鋳型ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定できるようにサイズにより前記合成されたＤＮＡ分子を分離すること；
を含む、ＤＮＡを配列決定するための方法。
【請求項４】
核酸鋳型、少なくとも１つのＰＣＲプライマーおよび、ＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物を含む反応混合物を、ｐＨ１０〜１２の緩衝液の存在下でインキュベートして前記核酸鋳型を増幅することにより変異した増幅産物を生成することを含む、部位指向性またはランダムの変異誘発のための、線形または指数的ＰＣＲ増幅の方法。
【請求項５】
核酸鋳型、少なくとも１つのＰＣＲプライマーおよびＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物を含む反応混合物を、ｐＨ１０〜１２の緩衝液の存在下でインキュベートして、前記融合物による前記核酸鋳型の増幅をする工程を含む、逆転写酵素ＰＣＲの方法。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼ融合物が、ＰＣＲ増強因子および／または添加剤と組合わせて使用される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が、野生型Ｐｆｕよりも低減されたＤＮＡ重合活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が、Ｐｆｕのアミノ酸位置３８７におけるグリシンからプロリンへの置換（Ｇ３８７Ｐ）を含み、かつ野生型Ｐｆｕよりも低減されたＤＮＡ重合活性を有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が野生型Ｐｆｕよりも低減された塩基類似体検出活性を有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が、野生型Ｐｆｕよりも低減された塩基類似体検出活性およびＰｆｕのＶ９３部位における変異を含み、ここで前記変異は、バリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が、前記キメラＤＮＡポリメラーゼを３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損とする、Ｐｆｕのアミノ酸１４１におけるアスパルテートからアラニンへの置換（Ｄ１４１Ａ）およびＰｆｕのアミノ酸位置１４３におけるグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が更に、プロセシビティ、プルーフリーディング、忠実度、ＤＮＡ結合活性、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド結合および認識、効率性、鋳型長増幅能力、ＧＣリッチ標的増幅効率、特異性、熱安定性、内因性ホットスタート能力、または塩耐性よりなる群から選択される、少なくとも１つの活性の増大を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼ融合物が更に、室温におけるＤＮＡポリメラーゼ活性、トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の増幅（翻訳）スリップ、ＰＣＲ反応における伸長時間、またはＰＣＲ反応における増幅サイクルよりなる群から選択される、少なくとも１つの低減された活性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物およびそのためのパッケージング材料を含む、ＤＮＡ合成；ＤＮＡ合成産物のクローニング；ＤＮＡの配列決定；ＲＴ  ＰＣＲ；および線形または指数的ＰＣＲ増殖からなる群から選択される方法を、ｐＨ１０〜１２の緩衝液の存在下で実施するためのキット。
【請求項１５】
ｐＨ１０〜１２の緩衝液を含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
更にＰＣＲ増強因子および／または添加剤を含む、請求項１４又は１５記載のキット。
【請求項１７】
ＰｆｕとＳｓｏ７ｄとのＤＮＡポリメラーゼ融合物およびｐＨ１０〜１２の緩衝液を含む、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ合成産物のクローニング、ＤＮＡ配列決定、部位指向性またはランダム変異誘発のための線形または指数的ＰＣＲ増殖、及びＲＴ−ＰＣＲのうち、何れか１つのための組成物。
【請求項１８】
更にＰＣＲ増強因子および／または添加剤を含む請求項１７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００３年３月２５日に出願された米国出願第６０／４５７，４２６号の利益を請求する。上記出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明はキメラおよび非キメラのＤＮＡポリメラーゼの混合物、その合成方法およびその使用方法に関する。本明細書に開示したＤＮＡポリメラーゼ混合物は多くの組み換えＤＮＡ手法、特に核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅または変異誘発のために有用である。
【背景技術】
【０００３】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の鋳型指向性重合を触媒してＤＮＡを形成する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅および変異誘発のような種々のインビトロのＤＮＡ合成用とにおいて使用されている。しかしながら、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびその関連の活性（Ａｂｒａｍｓｏｎ，１９９５，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｇｅｇｉｅｓ，（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）参照）は所定の用途に対して常時最適であるわけではない（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０１／６１０１５号参照）。一般的に核酸ポリメラーゼにより潜在的に示される特質および特性の多様性のために、当該分野の専門家等は、酵素の新しい有用な変種（ｖａｒｉａｎｔ）を開発する研究において核酸ポリメラーゼの種々の特徴を修飾、改変または組み換えることを追求している。
【０００４】
１つの試みは触媒特質の独特および／または進歩した触媒特性を有する新しい好熱性の核酸ポリメラーゼの発見および単離を指向している。その結果、熱安定性のポリメラーゼは、種々の生物学的原料、例えば分類学上の属であるＴｈｅｒｍｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、ＰｙｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓの種から単離されている。
【０００５】
これらの天然に存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは酵素的に活性な３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを有し、天然のプルーフリーディング能力をもたらし、これによりＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を示す。しかしながら、これらのＤＮＡポリメラーゼはまた、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較して、より低いＤＮＡ伸長速度および全体的により低いプロセシビティを示し、即ち、これらの天然に存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、その高い忠実度にもかかわらず、ＰＣＲのためにはより望ましくないものとしている。
【０００６】
個々の熱安定性ポリメラーゼの欠陥を補う研究において、例えばＴａｑポリメラーゼおよびプルーフリーディング酵素、例えばＰｆｕポリメラーゼまたはＶｅｎｔＮＤＡポリメラーゼを組み合わせた多酵素集合体を開発する第２の試みが行われている。これらの多酵素混合物はＴａｑポリメラーゼのみと比較して高いＰＣＲ効率および低減されたエラー率を示す（Ｂａｒｎｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ９１：２２１６−２２２０（１９９４））。
【０００７】
別の試みは欠失／切断手法を介したＴａｑポリメラーゼの新しい有用な変種を開発することであった。例えばＳｔｏｆｆｅｌフラグメントは酵素的に活性な５’３’ポリメラーゼドメインは保有するが３’−５’エキソヌクレアーゼおよび５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は欠失しているＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５４４アミノ酸Ｃ末端切断である。他の市販の熱安定性ポリメラーゼの欠失はＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）およびＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）を包含する（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。しかしながら欠失変異は核酸ポリメラーゼの機能的ドメインを除去する作用を有するのみであり、如何なる新しい特徴や酵素特質も付加しない。
【０００８】
ポリメラーゼ変異誘発は新しく有用な核酸ポリメラーゼ変種を開発するために試みられている別の方法である。例えば、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチド類似体（アナログ）の取り込みを強力に識別する。この特質はＤＮＡの複製と修復の忠実度に寄与している。しかしながら、ヌクレオチド類似体の取り込みは多くのＤＮＡ合成用途、特にＤＮＡ配列決定に有用である。従って、５’−ヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の何れかである関連するエキソヌクレオリシス活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列決定には好ましい。低減されたヌクレオチド識別性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを作成するために、部位指向性変異誘発試験が開始され、ＤＮＡ配列決定に適する必要な活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの多くの変異型が発見されている（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４６６，５９１号）。
【０００９】
ＤＮＡポリメラーゼの特質を修飾する更に別の試みは必要な活性を有する蛋白ドメイン１つ以上がＤＮＡポリメラーゼと組み合わせられたＤＮＡポリメラーゼ融合物を作成することである。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡトポイソメラーゼＶ由来の螺旋−ヘアピン−螺旋ＤＮＡ結合モチーフにインフレームに融合しており、そして、Ｐａｖｌｏｖら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１３５１０−１３５１５に記載の通りキメラＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティ、塩耐性および熱安定性を増大することがわかっている。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼへのチオレドキシン結合ドメインの融合は国際公開ＷＯ９７／２９２０９号、米国特許第５，９７２，６０３号およびＢｅｄｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４７９−４８４（１９９７）に記載の通りチオレドキシンの存在下のＤＮＡポリメラーゼ融合物のプロセシビティを増強する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼへの古細菌ＰＣＮＡ結合ドメインの融合は増強されたプロセシビティを有しＰＣＮＡの存在下でＰＣＲ増幅ＤＮＡのより高い収率を与えるＤＮＡポリメラーゼ融合物をもたらす（Ｍｏｔｚ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年５月３日；２７７（１８）；１６１７９−８８）。更にまた、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来の配列非特異的ＤＮＡ結合蛋白Ｓｓｏ７ｄまたはＳａｃ７ｄのＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼへの融合は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１に開示されている通りこれらのＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティを大きく増大させることがわかっている。異なるＤＮＡポリメラーゼの相当するドメインを有するＤＮＡポリメラーゼの全体または部分のドメイン置換も記載されている（米国特許出願第２００２／０１１９４６１号）。
【００１０】
これらの集中的研究にも関わらず、ＤＮＡポリメラーゼの核酸合成、配列決定および増幅の活性を支援するためにより適当である条件を開発する必要性がなお当該分野に存続している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はＤＮＡ合成、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ合成産物のクローニング、または、線形または指数的ＰＣＲ増幅のために高ｐＨにおいてＤＮＡポリメラーゼを使用する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
当業者の知るとおり、本発明に有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物は高ｐＨにおいて活性であるＤＮＡポリメラーゼ機能１つ以上を有する。ＤＮＡポリメラーゼ機能は当該分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）：Ｍｏｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ）。即ち、本発明は特に当該分野で現在知られているか、入手可能となるＤＮＡポリメラーゼ融合物のための高ｐＨにおいて本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物を使用する方法を包含する。
【００１３】
本明細書においては、「ＤＮＡポリメラーゼ機能」とは、本明細書に記載するＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。ＤＮＡポリメラーゼの活性は、例えば、後に定義する、プロセシビティ、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド遺伝子結合および認識、３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度および／または室温における低減したＤＮＡ重合を包含する。ＤＮＡポリメラーゼ活性は当該分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）：Ｍｏｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる別の参考文献を参照）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ）。即ち、本発明は特に、当該分野で現在知られている、または入手可能となるＤＮＡポリメラーゼ活性のための高ｐＨにて本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物を使用する方法を包含する。
【００１４】
ＤＮＡポリメラーゼの「機能」はまた本明細書において定義する「変異体」ＤＮＡポリメラーゼの活性も包含する。本発明は例えば本発明の「変異体」の以下のような活性、即ち：塩基類似体検出活性、ＤＮＡ重合活性、逆転写酵素活性、プロセシビティ、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ヌクレオチド結合および認識、３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度、効率、特異性、熱安定性および内因性のホットスタート能または室温における低減されたＤＮＡ重合、トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の低減された増幅（翻訳）スリップ、低減された増幅サイクル、低減された伸長時間および本明細書に記載した用途のために必要とされるポリメラーゼの量の低減を包含する。１つの実施形態においては、本発明の「変異体」ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性１つ以上を低減する変異１つ以上を含有するＤＮＡポリメラーゼを指す。１つの実施形態においては、「変異体」とはポリメラーゼに向上した重合速度または忠実度を付与する変異を有するポリメラーゼを指す。好ましい実施形態において、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減されたウラシル検出活性を有する。好ましい実施形態において、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減されたイノシン検出活性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減されたウラシルおよびイノシン検出活性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減されたＤＮＡ重合活性を有する。「変異体」の何れか、例えば低減したウラシル活性を有する変異体は、野生型ポリメラーゼと比較して向上したポリメラーゼ速度および／または忠実度を有してもよい。
【００１５】
本発明は以下の工程：ａ）ＤＮＡポリメラーゼ融合物を準備すること；およびｂ）該融合物を核酸鋳型と接触させ、ここで該融合物がＤＮＡ合成を可能とすることを含む、高ｐＨにおけるＤＮＡ合成のための方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた以下の工程、即ち：ａ）ＤＮＡポリメラーゼ融合物を準備すること；ｂ）融合物を核酸鋳型と接触させること、ただしここで融合物はＤＮＡ合成を可能にして合成ＤＮＡ産物を生成するものであること；および、ｃ）合成ＤＮＡ産物をクローニングベクターに挿入すること；を含む、高ｐＨにおけるＤＮＡ合成産物のクローニングのための方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、以下の工程、即ち：（ａ）鋳型ＤＮＡ鎖を配列決定ＤＮＡプライマーに接触させること；（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ融合物、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および鎖終止ヌクレオチド類似体と接触させること；（ｃ）第１のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子のランダム集団を合成するために十分な条件下で工程（ｂ）の混合物をインキュベートすること、ただしここで合成されたＤＮＡ分子は第１のＤＮＡ分子よりも短いこと、そしてここで合成されたＤＮＡ分子はその５’末端において終止ヌクレオチドを含むこと；および（ｄ）第１のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定できるようにサイズにより合成されたＤＮＡ分子を分離すること；を含む、高ｐＨにおいてＤＮＡを配列決定するための方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、核酸鋳型、ＰＣＲプライマー少なくとも１つおよびＤＮＡポリメラーゼ融合物を含む反応混合物を、融合物による核酸鋳型の増幅を可能とする条件下でインキュベートすることにより変異した増幅産物を生成することを含む、部位指向性またはランダムの変異誘発のための高ｐＨにおける線形または指数的ＰＣＲ増殖の方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、核酸鋳型、ＰＣＲプライマー少なくとも１つおよびＤＮＡポリメラーゼ融合物を含む反応混合物を、該融合物による該核酸鋳型の増幅を可能とする条件下でインキュベートすることにより増幅産物を生成する工程を含む、高ｐＨにおける逆転写酵素ＰＣＲの方法を提供する。
【００２０】
本発明は高ｐＨにおけるＤＮＡ合成産物のクローニング、ＤＮＡ配列決定、部位指向性またはランダム変異誘発のための線形または指数的ＰＣＲ増殖、ＤＮＡポリメラーゼ融合物および高ｐＨ緩衝液を含むＲＴ−ＰＣＲの何れか１つのための組成物を提供する。高ｐＨ緩衝液およびポリメラーゼ融合物のほかに、反応混合物の他の成分も組成物中に存在してよく、例えば鋳型、プライマー、ヌクレオチド、標識、標識ヌクレオチド等が包含される。
【００２１】
本発明はまた、ＤＮＡ合成のための組成物を提供し、ここで組成物はＤＮＡポリメラーゼ融合物および高ｐＨ  ＤＮＡ合成緩衝液を含む。本発明は、ＤＮＡ合成緩衝液の組成が、当該分野で知られ本明細書において「要件発明の用途」と題されたセクションで記載するＤＮＡ合成緩衝液のものであり、そしてＤＮＡ合成緩衝液が本明細書において定義する「高ｐＨ」緩衝液であるような、高ｐＨ  ＤＮＡ合成緩衝液を意図する。
【００２２】
本発明はＤＮＡ合成産物のクローニングのための組成物を提供し、ここで組成物はＤＮＡポリメラーゼ融合物および高ｐＨ  ＤＮＡクローニング緩衝液を含む。本発明は、ＤＮＡクローニング緩衝液の組成が、当該分野で知られ本明細書において「要件発明の用途」と題されたセクションで記載するＤＮＡクローニング緩衝液のものであり、そしてＤＮＡクローニング緩衝液が本明細書において定義する「高ｐＨ」緩衝液であるような、高ｐＨ  ＤＮＡクローニング緩衝液を意図する。
【００２３】
本発明はＤＮＡを配列決定するための組成物を提供し、ここで組成物はＤＮＡポリメラーゼ融合物および高ｐＨ  ＤＮＡ配列決定緩衝液を含む。本発明は、ＤＮＡ配列決定緩衝液の組成が、当該分野で知られ本明細書において「要件発明の用途」と題されたセクションで記載するＤＮＡ配列決定緩衝液のものであり、そしてＤＮＡ配列決定緩衝液が本明細書において定義する「高ｐＨ」緩衝液であるような、高ｐＨ  ＤＮＡ配列決定緩衝液を意図する。
【００２４】
本発明は部位指向性またはランダム変異誘発のための線形または指数的ＰＣＲ増殖のための組成物を提供し、ここで組成物はＤＮＡポリメラーゼ融合物および高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液を含む。本発明は、ＰＣＲ反応緩衝液の組成が、当該分野で知られ本明細書において「要件発明の用途」と題されたセクションで記載するＰＣＲ反応緩衝液のものであり、そしてＰＣＲ反応緩衝液が本明細書において定義する「高ｐＨ」緩衝液であるような、高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液を意図する。
【００２５】
１つの実施形態においては、本発明の方法および組成物は更にＰＣＲ増強因子および／または添加剤も含む。
【００２６】
別の実施形態において、本発明の方法において使用するＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減されたＤＮＡ重合活性を有する。
【００２７】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物はアミノ酸位置３８７におけるグリシンからプロリンへの置換（Ｇ３８７Ｐ）を含み、そして、低減されたＤＮＡ重合活性を含む。
【００２８】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減された塩基類似体検出活性を含む。
【００２９】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減した塩基類似体検出活性およびＶ９３部位における変異を含み、ここで変異はバリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換である。
【００３０】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減した塩基類似体検出活性を有する。
【００３１】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減した塩基類似体検出活性を含む。
【００３２】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は更にＶ９３部位における変異を含み、ここで変異はキメラＤＮＡポリメラーゼに低減された塩基類似体検出活性表現型を付与するバリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換である。
【００３３】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は更に低減したＤＮＡ重合活性を含む。
【００３４】
別の実施形態においてＤＮＡポリメラーゼ融合物は更に該キメラＤＮＡポリメラーゼに低減されたＤＮＡ重合表現型を付与するアミノ酸位置３８７におけるグリシンからプロリンへの置換（Ｇ３８７Ｐ）を含む。
【００３５】
別の実施形態においては、ＤＮアポリメラーゼ融合物は更に該キメラＤＮＡポリメラーゼを３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損とするアミノ酸１４１におけるアスパルテートからアラニンへの置換（Ｄ１４１Ａ）およびアミノ酸位置１４３におけるグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）を更に含む。
【００３６】
別の実施形態においては、低減された塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ融合物は更に該キメラＤＮＡポリメラーゼを３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損とするアミノ酸１４１におけるアスパルテートからアラニンへの置換（Ｄ１４１Ａ）およびアミノ酸位置１４３におけるグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）を更に含む。
【００３７】
別の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は野生型、変異体または化学修飾ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００３８】
別の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ融合物はプルーフリーディングポリメラーゼである。
【００３９】
別の実施形態においては、プルーフリーディングポリメラーゼがＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｇｏ、ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐＶｅｎｔよりなる群から選択される。
【００４０】
別の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は更に、プロセシビティ、プルーフリーディング、忠実度、ＤＮＡ結合活性、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド結合および認識、効率性、鋳型長増幅能力、ＧＣリッチ標的増幅効率、特異性、熱安定性、内因性ホットスタート能力または塩耐性よりなる群から選択される活性の増大を有するポリペプチドを含む。
【００４１】
別の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は更に室温におけるＤＮＡポリメラーゼ活性、トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の増幅スリップ、ＰＣＲ反応における伸長時間またはＰＣＲ反応における増幅サイクルよりなる群から選択される低減された活性を有するポリペプチドを含む。
【００４２】
別の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ融合物は、バクテリオファージＴ７のチオレドキシンプロセシビティ因子結合ドメイン、古細菌ＰＣＮＡ結合ドメイン、ＰＣＮＡ、ＤＮＡトポイソメラーゼＶ由来の螺旋−ヘアピン−螺旋ＤＮＡ結合モチーフまたはＤＮＡ結合蛋白Ｓｓｏ７ｄまたはＳａｃ７ｄよりなる群から選択される蛋白ドメインよりなる。
【００４３】
本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼ融合物およびそのためのパッケージング材料を含む、ＤＮＡ合成；ＤＮＡ合成産物のクローニング；ＤＮＡの配列決定；ＲＴＰＣＲ；および線形または指数的ＰＣＲ増殖、または、本明細書に含まれる何れかの別のポリメラーゼ機能よりなる群から選択される方法を高ｐＨで実施するためのキットを提供する。
【００４４】
本発明のキットは、高ｐＨ緩衝液、またはＰＣＲ増強因子および／または添加剤をさらに含んでもよい。
【００４５】
（定義）
「融合体」とは、本明細書においては、例えばプロセシビティ、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド遺伝子結合および認識、３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度および／または室温における低減したＤＮＡ重合を包含するＤＮＡポリメラーゼの活性１つ以上をモジュレートするポリペプチドを定義する第２のアミノ酸配列に連結している本発明の野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼを含む第１のアミノ酸配列（蛋白）であり、ここで第１および第２のアミノ酸は天然には同じ関係においては存在しない。本発明によれば「融合体」とは連結して新しい機能性蛋白を形成する、無関係の蛋白に由来する２つ以上のアミノ酸配列（例えば野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼをコードする配列およびプロセシビティおよび／または塩耐性を増大させるポリペプチド）を包含する。１つの実施形態において、本発明の「融合体」は第１のポリメラーゼ種（例えばＰｆｕＮ末端）より誘導された第１のアミノ酸配列および第２のポリメラーゼ種（例えばＫＯＤ  Ｃ末端）から誘導された第２のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態においては、本発明の「融合体」は第１のポリメラーゼから誘導された第１のアミノ酸およびポリメラーゼではないポリペプチドから誘導された第２のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態においては、ポリメラーゼではないポリペプチドから誘導されたアミノ酸配列は酵素的に活性ではない。
【００４６】
本明細書においては、「酵素的に活性」とは特定の酵素反応を触媒することを意味する。
【００４７】
本発明の融合体は第１の蛋白も発現する生物中に存在する（ただし異なる蛋白中）外来性ポリペプチドを提示するか、または、異なる種類の生物により発現される蛋白構造の「種間」、「遺伝子間」等の融合体であってよい。本発明はプロセシビティおよび／または塩耐性を増大させるポリペプチドが、本明細書に記載する、または当該分野で知られている、野生型ＤＮＡポリメラーゼまたは変異体ＤＮＡポリメラーゼとＮ末端またはＣ末端で連結されるか、または、その何れかの内部の位置に挿入される融合物を含む。
【００４８】
１つの実施形態においては、本発明の融合体は例えばＰｆｕまたはＴａｑのような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するか有さない野生型または変異した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む融合ＤＮＡポリメラーゼである。ＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡに付加されるキメラ成分は、キメラ成分およびポリメラーゼが天然には存在しないような関係にあるように、ＮまたはＣ末端または何れかの内部の位置においてＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼに融合した塩基性または非塩基性の、蛋白または蛋白ドメインである。ＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの活性へのキメラの寄与はプロセシビティ、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド結合および認識、プルーフリーディング、忠実度および塩耐性および／または室温における低減したＤＮＡ重合活性を増大または増強する。
【００４９】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物はゲノムおよび／またはプラスミド鋳型を用いた融合物ではないＤＮＡポリメラーゼと比較した場合に、以下の活性（後述する試験法を用いる）、即ち：プロセシビティ、効率性、鋳型長増幅能力、ＧＣリッチ標的増幅効率、特異性、熱安定性、内因性ホットスタート能力、プルーフリーディング活性、忠実度、ＤＮＡ結合活性、鎖置換活性、ヌクレオチド結合および認識、および、塩耐性の１つ以上が＞１０％増大している。本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物はゲノムおよび／またはプラスミド鋳型を用いた融合物ではないＤＮＡポリメラーゼと比較した場合に、以下の活性（後述する試験法を用いる）、即ち：トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の増幅スリップまたは室温におけるＤＮＡポリメラーゼ活性の１つ以上が＞１０％低減している。１つの実施形態においては、本発明の「融合物」は融合物単独ではないＤＮＡポリメラーゼの存在下で観察される伸長時間と比較して、５秒、好ましくは１５秒、より好ましくは４５秒低減しているＰＣＲ反応における伸長時間を有する。別の実施形態においては、本発明の「融合物」は融合物単独ではないＤＮＡポリメラーゼと比較して、１、１〜５または５以上ＰＣＲ増幅サイクル数が低減している。別の実施形態においては、融合物ではないＤＮＡポリメラーゼと比較して、本発明の「融合物」のより少ない単位（０．００１、０．０１、０．１または１以上）が本発明の用途において有用である。「融合物」の活性を融合物ではないＤＮＡポリメラーゼの活性と比較する全ての場合において、融合物でないＤＮＡポリメラーゼは融合物のポリメラーゼドメインと同一であり、そして本明細書に定義する融合物の第２のアミノ酸配列の非存在により融合物と異なるのみである。
【００５０】
本明細書においては、「ゲノム鋳型」とは細胞または生物のゲノムを構成する核酸物質を含む鋳型を意味する。
【００５１】
本明細書においては、「融合した」または「連結した」とは、例えば、介在ドメインを有するか有さない組み換え融合物、インテイン媒介融合物、非共有結合性の会合および共有結合、例えばジスルフィド結合、水素結合、静電気的結合およびコンフォーメーション性の結合を含む、機能的に結合したポリペプチドのドメインを得るための当該分野で知られた何れかの方法を指す。
【００５２】
「ドメイン」とは、ポリペプチド配列、完全なポリペプチド配列、または複数のペプチド配列を含む蛋白または蛋白複合体の単位を指す。
【００５３】
本明細書においては、「モジュレート」という用語は、融合物ではないＤＮＡポリメラーゼと比較した場合の、本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性の２倍、好ましくは５倍、好ましくは２０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは５００倍以上の増大または低減を指す。１つの実施形態においては、融合物のＤＮＡポリメラーゼドメインは本明細書に記載した変異を１つ以上含む。この実施形態においては、「モジュレート」という用語は、融合物ではないＤＮＡポリメラーゼと比較した場合の、本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性の２倍、好ましくは５倍、好ましくは２０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは５００倍以上の増大または低減を指し、ここで融合物ではないＤＮＡポリメラーゼは融合物の変異体ＤＮＡポリメラーゼドメインと同一であるが、本明細書に記載した融合物の第２のアミノ酸配列を欠失している。
【００５４】
ＤＮＡポリメラーゼ融合物は本明細書に記載するＰＣＲ増強因子および／または添加剤と組み合わせて使用される。
【００５５】
本明細書においては、「高ｐＨ」とは、９より高値のｐＨを指す。「高ｐＨ」とは好ましくは１０以上、例えば１０、１１、１２、１３または１４である。「高ｐＨ」には９より高値のｐＨが包含され、そして１４までのｐＨ、例えばｐＨ９．１、９．５、９．８、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５または１４が本発明の「高ｐＨ」である。
【００５６】
本明細書においては、「プロセシビティおよび／または塩耐性を増大させるポリペプチド」とは、ポリペプチド配列または複数のペプチド配列を含む蛋白、または蛋白の領域または蛋白複合体であるドメインを指し、ここでその領域は本明細書に定義されるとおりプロセシビティを増大するか、または本明細書に定義されるとおり塩耐性を増大させる。本発明において有用な「プロセシビティおよび／または塩耐性を増大させるポリペプチド」は例えば、上記したＰａｖｌｏｖら、または国際公開ＷＯ０１／９２５０１号に記載されるドメインの何れかを包含し、例えばＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、ＨＭＦ様蛋白、ＰＣＮＡホモログ、螺旋−ヘアピン−螺旋ドメイン、例えばトポイソメラーゼＶから誘導されたもの、または国際公開ＷＯ９７／２９２０９号、米国特許第５，９７２，６０３号およびＢｅｄｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４７９−４８４（１９９７）に記載されるＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメインが挙げられる。
【００５７】
本明細書においては、「プロセシビティ」とは鋳型または基質に結合したまま存続し、複数の修飾反応を行うことができる核酸修飾酵素、例えばポリメラーゼの能力を指す。「修飾反応」とは例えば重合およびエキソヌクレアーゼ分解を包含する。「プロセシビティ」はまた比較的長い（例えば０．５〜１ｋｂ、１〜５ｋｂまたは５ｋｂ以上）ヌクレオチド索を修飾する核酸修飾酵素、例えばポリメラーゼの能力を指す。「プロセシビティ」とはまた、成長中のＤＮＡ鎖からの酵素の解離を妨害することなく一連の重合工程を行える核酸修飾酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼの能力を指す。「プロセシビティ」はポリメラーゼの性質、ＤＮＡ鋳型の配列および反応条件、例えば塩濃度、温度または特定の蛋白の存在により異なる。
【００５８】
本明細書においては、「増大したプロセシビティ」とは、本明細書に定義したプロセシビティおよび／または塩耐性を増大させるポリペプチドを欠失した野生型または変異体の古細菌ＤＮＡポリメラーゼと比較して、５〜１０％、好ましくは１０〜５０％、より好ましくは５０〜１００％以上の増大を指す。プロセシビティおよび増大したプロセシビティは、本明細書および上述したＰａｖｌｏｖら、および国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１に記載の方法に従って測定できる。本明細書で定義するプロセシビティを増大させるポリペプチドを含むキメラである増大したプロセシビティを有するポリメラーゼは上述したＰａｖｌｏｖら、および国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１に記載されている。
【００５９】
本明細書においては、「増大した塩耐性」とは野生型ポリメラーゼが活性である最大塩濃度よりも高値であることが分かっているある塩濃度において＞５０％の活性を示すポリメラーゼを指す。最大塩濃度は各ポリメラーゼにより異なっており、そして当該分野で知られているか、または、本発明の方法に従って実験的に決定できる。例えば、Ｐｆｕは３０ｍＭ塩（ＰＣＲ反応中）で抑制され、従って、増大した塩耐性を有するＰｆｕ酵素は３０ｍＭより高い塩濃度で有意な活性（＞５０％）を有するはずである。本明細書に定義する塩耐性を増大させるポリペプチドを含む融合物である増大した塩耐性を有するポリメラーゼは、上述したＰａｖｌｏｖら、および国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１に記載されている。
【００６０】
本明細書においては、「忠実度」とは、重合の精度、または、鋳型に相補である核酸分子（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）を合成する際に正しい基質を正しくない基質から識別できるポリメラーゼの能力を指す。ポリメラーゼの忠実度がより高いほど、核酸合成の間の成長中の鎖においてポリメラーゼのヌクレオチドの誤取り込みがより低くなり；即ち、忠実度の増大または増強はエラー率の低い（誤取り込み率の低減した）より信頼できるポリメラーゼをもたらす。
【００６１】
「忠実度」という用語は本明細書においてはまた、鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の精度を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度はエラー率（不正確なヌクレオチド、即ち、鋳型依存的方法において取り込まれていないヌクレオチドが取り込まれる頻度）により測定される。ＤＮＡ重合の精度または忠実度はＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方により維持される。「高忠実度」という用語は塩基対当たり５×１０−６以下のエラー率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率は当該分野で知られた試験を用いて測定してよい。例えばＤＮＡポリメラーゼ変異体のエラー率はＣｌｉｎｅ，Ｊ．，Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．，及びＨｏｇｒｅｆｅ，Ｈ．Ｈ．（９６）ＮＡＲ  ２４：３５４６−３５５１に記載のｌａｃＩＰＣＲ忠実度試験を用いて試験できる。慨すれば、ｌａｃＩＯｌａｃＺα標的遺伝子をコードする１．９ｋｂのフラグメントを適切なＰＣＲ緩衝益虫２．５ＵＤＮＡポリメラーゼ（即ち７２℃３０分で総ｄＮＴＰ２５ミリモルを取り込むために必要な酵素の量）を用いてｐＰＲＩＡＺプラスミドＤＮＡから増幅する。次にｌａｃＩ含有ＰＣＲ産物をラムダＧＴ１０アームにクローニングし、そしてｌａｃＩ変異体のパーセント（ＭＦ、変異頻度）を記載するとおり色スクリーニング試験により測定する（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｄ．Ｄ．，Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｗ．Ｗ．，Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．Ａ．，及びＭａｔｈｕｒ，Ｅ．Ｊ．（１９９１）Ｇｅｎｅ１８０：１−８）。エラー率は倍加当たりのｂｐ当たりの変異頻度（ＭＦ／ｂｐ／ｄ）であらわされ、ここでｂｐはｌａｃＩ遺伝子配列の検出可能な部位の数（３４９）でありｄは有効な標的倍加の数である。各ＤＮＡポリメラーゼ変異体につき、少なくとも２つの独立したＰＣＲ増幅を実施する。
【００６２】
増大／増強／高値の忠実度を有するＤＮＡポリメラーゼはある長さのある核酸分子の合成の間、誤取り込みされたヌクレオチドの数が約２〜約１０，０００倍、約２〜約５，０００倍、または約２〜約２，０００倍（好ましくは約５倍超、より好ましくは約１０倍超、更により好ましくは約５０倍超、なお好ましくは約１００倍超、更に好ましくは約５００倍超、最も好ましくは約１０００倍超）低減しているポリメラーゼとして定義される。例えば、変異したポリメラーゼは１０００塩基の合成中１ヌクレオチドを誤取り込みするのに対し、非変異ポリメラーゼは１０ヌクレオチドを誤取り込みする。このような変異体ポリメラーゼは１０倍の忠実度の増大を有していると言うことができる。
【００６３】
低減された誤取り込みを有するＤＮＡポリメラーゼは、本明細書においては、相当する非変異、非修飾または野生型の酵素と比較して、相対的誤取り込みが約５０％未満、または好ましくは約２５％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約１％未満である変異または修飾されたＤＮＡポリメラーゼの何れかとして定義する。より低い忠実度のＤＮＡポリメラーゼもまた非正確なヌクレオチド取り込みのＤＮＡ合成を開始させる場合がある（Ｐｅｒｒｉｏｎ＆Ｌｏｅｂ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２８９８−２９０５）。
【００６４】
ポリメラーゼの忠実度または誤取り込み率は当該分野で知られている他の方法により配列決定反応において測定できる（Ｅｃｋｅｒｔ＆Ｋｕｎｋｅｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７３９−３７４４（１９９０））。１つの実施形態においては、非変異および変異のポリメラーゼにより合成されたＤＮＡ分子の配列を予測（既知）配列と比較することができる。このようにしてエラー（誤取り込み）の数を各酵素について測定し、比較することができる。
【００６５】
ＤＮＡ結合およびＤＮＡ結合を検出するための試験はＰＣＴ／ＵＳ０１／１７４９２に記載されている。
【００６６】
鎖置換とは、Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２００１）３３４：９１−１１６およびＫｏｎｇら（９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５に記載されている活性を指す。鎖置換活性を測定するための試験法はＨｏｇｒｅｆｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２００１）３３４：９１−１１６およびＫｏｎｇら（９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５に記載されている。
【００６７】
室温におけるＤＮＡポリメラーゼ活性はＴｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２００１）３３４：９１−１１６に記載されている。室温におけるＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するための方法はＴｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２００１）３３４：９１−１１６およびＮｉｅｌｓｏｎら（１９９７）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：４０−４３  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ記事に記載されている。
【００６８】
本明細書においては「ＧＣリッチ標的増幅効率」とはＧＣ含量が５０％超であり、ＰＣＲ中に溶融することがより困難であるＤＮＡ鋳型の増幅効率を指す。これらの標的は温度がアニーリング温度までサイクルする場合に頻繁に二次構造を形成し、ＰＣＲ増幅を困難にする。「ＧＣリッチ標的増幅」は５０％より高いＧＣ含量を有する標的上でＰＣＲ増幅を実施し、そして、ゲル上に生成したアンプリコンの収率を比較することにより試験される（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００１年４月；３２（４）：８６６，８６８，８７０−２，８７４）。
【００６９】
「内因性ホットスタート能力」を有するポリメラーゼとは、非ストリンジェントなプライマーアニーリング温度（≦４５℃）において極めて低い（＜２５°）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを指す。これらのポリメラーゼおよびその検出のための試験はＮｉｅｌｓｏｎら（１９９７）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：４０−４３に記載されている。
【００７０】
「ＤＮＡ（翻訳）スリップ」または「トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の増幅（翻訳）スリップ」およびこの活性の検出のための試験法はＪ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１年９月１４日；３１２（２）：３２３−３３，Ｊ．Ｂｉｏｌ  ＣＨｅｍ  １９９９年９月２４日；２７４（３９）：２７４８１−９０，ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００１年５月１５日；２０（１０）：２５８７−９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６年１月２３日；３５（３）：１０４６−５３に記載されている。
【００７１】
室温で低減されたＤＮＡポリメラーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼ融合物は好ましくは、低減されたポリメラーゼ活性が最適未満の温度（例えば非特異的プライマーアニーリング／伸長温度）で観察され、そして野生型ポリメラーゼ活性がストリンジェントなプライマーアニーリング／伸長温度において観察されるように、活性対温度の特徴におけるシフトを示す。このような融合物はＰＣＲにおいて向上した特異性を示すことが期待される。
【００７２】
ＤＮＡポリメラーゼの効率を測定する方法はＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９５，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＣｈａとＴｈｉｌｌｙ，ｐｐ．３７−５１に記載されている。
【００７３】
鋳型長増幅能力を測定するための方法はＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２，９９：５９６−６０１およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，８８：１４１−１４９に記載されている。
【００７４】
ＤＮＡポリメラーゼの特異性を測定するための方法はＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１９９９，１２６：７６２−８に記載されている。
【００７５】
ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を測定する方法はＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，２００２，２１７：８９−９４に記載されている。
【００７６】
ヌクレオチドの結合および認識を測定するための方法はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ／．２００２，３２２：７１９−７２９およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．，２００２，３０：６０５−１３に記載されている。
【００７７】
本発明に有用な「ドメイン」は当該分野で知られた、または当該分野で知られることになる、何れかの２本鎖または１本鎖のＤＮＡ結合ドメインを包含する。
【００７８】
本明細書においては、「ポリメラーゼ」とはヌクレオチドの重合を触媒する（即ちポリメラーゼ活性）酵素を指す。一般的に酵素はポリヌクレオチド鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端において合成を開始し、そして鋳型鎖の５’末端に向けて進行する。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。好ましい実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である。別の好ましい実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは古細菌ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７９】
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼに言及する場合は、ＤＮＡポリメラーゼという用語は「その官能性フラグメント」を包含する。「その官能性フラグメント」とは、ポリメラーゼの全アミノ酸配列に満たないものを包含し、そして、ポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を、少なくとも１セットの条件下において、温存している野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼの何れかの部分を指す。このような機能的フラグメントは別の実態として存在するか、または、融合蛋白のようなより大型のポリペプチドの構成成分であってよい。
【００８０】
本発明において使用する核酸ポリメラーゼは中温性または高温性であってよく、そして好ましくは高温性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼはＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎｏｗフラグメントＤＮＡポリメラーゼＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ等を包含する。本発明の方法において使用してよい好ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶＥＮＴ（商標）およびＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ３およびこれらの変異体、変種および誘導体を包含する（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８Ｓ号；米国特許第５，０７９，３５２号；米国特許第５，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；国際公開ＷＯ９２／０６１８８号；国際公開ＷＯ９２／０６２００号；国際公開ＷＯ９６／１０６４０号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｈｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍら、Ｎｕｃ．Ａｃｏｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４）。長核酸分子（例えば長さ約３〜５Ｋｂより長い核酸分子）の増幅のためには、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼ（１つは実質的に３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したもの、もう１つは３’エキソヌクレアーゼ活性を有するもの）が典型的に使用される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；Ｆａｍｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；および２０００年１２月２１日出願の同時係属米国特許出願第０９／７４１，６６４号を参照できる。３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠失しているＤＮＡポリメラーゼの例はＴａｑ、Ｔｎｅ（ｅｘｏ−）、Ｔｍａ（ｅｘｏ−）、Ｐｆｕ（ｅｘｏ−）、Ｐｗｅ（ｅｘｏ−）、ｅｘｏ−ＫＯＤおよびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体、変種および誘導体を包含する。
【００８１】
本明細書においては、「古細菌」ＤＮＡポリメラーゼとは、ファミリーＢ／ｐｏｌＩ型の群（例えばＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｔｇｏ、Ｐｗｏ）またはｐｏｌＩＩ群（例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓＤＰ１／ＤＰ２２−サブユニットＤＮＡポリメラーゼ）の何れかに属するＤＮＡポリメラーゼを指す。１つの実施形態においては、「古細菌」ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ可能）を指し、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ｆｕｒｉｏｓｕｓ，ＧＢ−Ｄ種、ｗｏｅｓｉｉ，ａｂｙｓｉｉ，ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１，ｌｉｒｏｒａｌｉｓ，９度Ｎｏｒｔｈ−７種、ＪＤＦ−３種、ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍおよびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼを包含する。適当な古細菌は最高生育温度＞８０〜８５℃または最適生育温度＞７０〜８０℃を示す。古細菌ｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼ群由来の適切なＰＣＲ酵素は市販されており、例えばＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｉｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）を包含する。上記列挙したものに関連する別の古細菌は以下の参考文献：Ａｒｃｈａｅａ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．とＰｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．，編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州，１９９５に記載されている。
【００８２】
本明細書においては、「変異体」ポリメラーゼとはＤＮＡポリメラーゼの活性の１つ以上、例えば、塩基類似体検出活性、ＤＮＡ重合活性、逆転写酵素活性、プロセシビティ、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ヌクレオチド結合および認識、３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度、効率、特異性、熱安定性および内因性のホットスタート能または室温における低減されたＤＮＡ重合、トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の低減された増幅スリップ、低減された増幅サイクル、低減された伸長時間および本明細書に記載した用途のために必要とされるポリメラーゼの量の低減を本明細書で定義するとおり変調する変異を１つ以上含む、本明細書に定義されるＤＮＡポリメラーゼを指す。１つの実施形態においては、本発明の「変異体」ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性の１つ以上を低減する変異１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼを指す。１つの実施形態においては、「変異体」とは向上した重合速度または忠実度をポリメラーゼに与える変異を有するポリメラーゼを指す。好ましい実施形態においては、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減したウラシル検出活性を有する。好ましい実施形態においては、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減したイノシン検出活性を有する。別の好ましい実施形態においては、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減したウラシルおよびイノシン検出活性を有する。別の好ましい実施形態においては、本発明の「変異体」ポリメラーゼは低減したＤＮＡ重合活性を有する。「変異体」、例えば低減したウラシル活性を有するいずれの変異体はまた、野生型ポリメラーゼと比較して向上した重合速度および／または忠実度を有してよい。本明細書に定義する「変異体」ポリメラーゼは１つ以上のアミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸挿入、切断または内部の欠失を含むポリメラーゼを包含する。本明細書に定義する「変異体」ポリメラーゼは本明細書に定義する非融合および融合ポリメラーゼを包含する。
【００８３】
本明細書における「変異体」ポリメラーゼは本明細書に記載する１重、２重または３重変異体ＤＮＡポリメラーゼ、本明細書に記載する挿入を含む何れかの変異体ＤＮＡポリメラーゼ、または、切断された、または本明細書に記載する欠失した変異体ＤＮＡポリメラーゼの何れかが、ＤＮＡポリメラーゼの活性、例えば、ＤＮＡ重合活性、塩基類似体検出活性、ＤＮＡ重合活性、逆転写酵素活性、プロセシビティ、塩耐性、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ヌクレオチド結合および認識、ウラシルへの感受性、３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、プルーフリーディング、忠実度、効率、特異性、熱安定性および内因性のホットスタート能または室温における低減されたＤＮＡ重合、トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の低減された増幅スリップ、低減された増幅サイクル、低減された伸長時間および本明細書に記載した用途のために必要とされるポリメラーゼの量の低減の１つ以上をモジュレートするポリペプチドと組み合わせて存在することにより本明細書に定義する融合物を形成するような、融合ポリメラーゼを包含する。例えばプロセシビティおよび／または塩耐性を増大させるポリペプチドは参照により本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１およびＰａｖｌｏｖら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１３５１０−１３５１５に記載されている。商業上有用な変異の他の特定の例は、ウラシル非感受性をＰｆｕに付与するＰｆｕにおけるＶ９３Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａである。商業上有用な切断は、例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＴａｑにおけるＮ末端切断（ＫｌｅｎＴａｑ）である。
【００８４】
本明細書においては、「変異」とはＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を変化させる親または野生型ＤＮＡ配列内に導入される変化、例えば置換、挿入、欠失または切断を指す。変異の結果は、例えば、親ＤＮＡによりコードされる蛋白内には存在しなかった新しい性質、特質、機能または形質、例えばＮ末端切断、Ｃ末端切断または化学修飾の創生である。「変異体」ＤＮＡポリメラーゼは本明細書においては本明細書に定義する変異を含むＤＮＡポリメラーゼを指す。本発明の「変異体」ＤＮＡポリメラーゼは本発明のＤＮＡポリメラーゼ「融合物」を包含する。
【００８５】
本明細書においては、「低減したＤＮＡ重合活性」を有するＤＮＡポリメラーゼは野生型酵素よりも低値のＤＮＡ重合活性を含む、例えば、野生型酵素の１０％未満（例えば１９．９％、９％、８％、６％、４％、２％または１％未満）のまたは融合物ではないＤＮＡポリメラーゼよりも低値の重合活性を含む、ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。低減したＤＮＡ重合活性を有するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを作成し特性化するために使用される方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／０３５，０９１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００１年１２月２１日出願）；係属米国特許出願第１０／０７９，２４１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年２月２０日出願）；係属米国特許出願第１０／２０８，５０８号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年７月３０日出願）；および係属米国特許出願第１０／２２７，１１０号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年８月２３日出願）に開示されている。本発明低減したＤＮＡ重合活性を有するＤＮＡポリメラーゼ融合物を意図する。
【００８６】
本明細書においては、「プルーフリーディング」活性とはＤＮＡポリメラーゼの３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を指す。
【００８７】
「非プルーフリーディング」酵素とは「３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損」または「３’〜５’ｅｘｏ−」であるＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００８８】
本明細書においては、「３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損」または「３’〜５’ｅｘｏ−」とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を実質的に欠いた酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性、例えばファミリーＢポリメラーゼのメンバーにより例示される３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性は、変異を介して消失する場合があり、エキソヌクレアーゼ−欠損ポリメラーゼを生じる。本明細書においては、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損であるＤＮＡポリメラーゼとは、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いていいる。「実質的に欠いている」とは、活性の完全な消失、例えば親酵素に対して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％またはさらには５０％までのエキソヌクレアーゼ活性を包含する。Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異並びに３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を低減または消失させる他の変異を含む３’〜５’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを作成し特性化するために使用できる方法は係属米国特許出願第０９／６９８，３４１号（Ｓｏｒｇｅら；２０００年１０月２７日出願）に開示されている。３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を低減または消失させる別の変異は当該分野で知られており、本発明で意図するものである。
【００８９】
本明細書においては、「合成」とは鋳型依存的な方法でポリヌクレオチドの新しい鎖を作成するか、または、既存のポリヌクレオチド（即ちＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長するための何れかのインビトロの方法を指す。本発明によれば合成はポリメラーゼを使用しながらポリヌクレオチド鋳型配列のコピー数を増大させる増幅を包含する。ポリヌクレオチド合成（例えば増幅）はポリヌクレオチド（即ちプライマー）へのヌクレオチドの取り込みをもたらし、これにより、ポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子を形成する。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、それ以上のポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用できる。
【００９０】
本発明によれば「ＤＮＡ合成」とは、例えばＰＣＲ、ポリヌクレオチドの標識（即ちプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーのため）、および、ポリヌクレオチド配列決定を包含する。本発明は低減された塩基類似体検出（例えば特定の塩基類似体、例えばウラシルまたはイノシンの低減された検出、または、少なくとも２つの塩基類似体の低減された検出）を示す変異体ＤＮＡポリメラーゼおよびその融合物を意図している。
【００９１】
本明細書においては、「塩基類似体（ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇ）」とはＰＣＲ反応に必要な上昇した温度の結果として化学修飾を起こしている塩基を指す。好ましい実施形態においては、「塩基類似体」はシトシンの脱アミノ化により生じるウラシルを指す。別の好ましい実施形態においては、「塩基類似体」はアデニンの脱アミノ化により生じるイノシンを指す。
【００９２】
本明細書においては、「熱安定性」とは、例えば同様の活性を有する酵素の非熱安定性形態と比較して、熱に対し、好ましくは約９０〜１００℃、より好ましくは約７０〜９８０℃高温において安定で活性である酵素を指す。例えば、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ，Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ，Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓまたはＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのような熱安定性生物から誘導した熱安定性の核酸ポリメラーゼはＥ．ｃｏｌｉ由来の核酸ポリメラーゼと比較して、より高温においてより安定であり活性である。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓから単離された代表的な熱安定性核酸ポリメラーゼ（ｐｆｕ）はＬｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１−６に記載されている。別の代表的な温度安定性ポリメラーゼは、例えば好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（これは列挙した他のものよりも幾分低温最適である）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａから、または、好熱性の古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓから抽出されたポリメラーゼを包含する。
【００９３】
温度安定性ポリメラーゼは２本鎖核酸がＰＣＲサイクル中の高温（約９５℃）への曝露により変性する熱サイクリング過程において好ましい。
【００９４】
本明細書においては、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は例えばプライマー伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼにより相補核酸鎖が合成される元となる核酸の鎖を指す。
【００９５】
本明細書においては、「鋳型依存的方法」という用語はプライマー分子の鋳型依存的伸長（例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含む過程を指すものとする。「鋳型依存的方法」という用語は、ポリヌクレオチドの新しく合成された鎖が相補塩基対形成のよく知られた規則により予測される、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成を指す（例えばＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  カリフォルニア州（１９８７）を参照できる）。
【００９６】
本明細書においては、「増幅産物」とはＰＣＲ増幅反応の終了時の２本鎖ポリヌクレオチド集団を指す。増幅産物は元のポリヌクレオチド鋳型およびＰＣＲ反応中にポリヌクレオチド鋳型を用いてＤＮＡポリメラーゼにより合成されたポリヌクレオチドを含む。
【００９７】
本明細書においては「ポリヌクレオチド鋳型」または「標的ポリヌクレオチド鋳型」または「鋳型」とは、増幅された領域を含むポリヌクレオチドを指す。「本明細書においては「増幅された領域」とは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成されるべきポリヌクレオチドの領域である。例えば、ポリヌクレオチド鋳型の増幅された領域は２つのＰＣＲプライマーが相補である配列の間にある。
【００９８】
本明細書においては、「プライマー」という用語はポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズでき、そして、第２のポリヌクレオチド鎖の酵素的合成をプライミングする１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。本発明において有用なプライマーは１０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜４５ヌクレオチド長である。
【００９９】
「相補的」とは、塩基対形成を介して２つのポリヌクレオチド鎖の領域の間、または、２つのヌクレオチドの間の配列の相補性の広範な概念を指す。アデニンヌクレオチドはチミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特定の水素結合を形成する（「塩基対形成」）ことができる。同様にシトシンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドと塩基対形成することができることが知られている。
【０１００】
「野生型」という用語は天然に存在する原料から単離される場合に遺伝子または遺伝子産物の特性を有するその遺伝子または遺伝子産物を指す。一方、「修飾された」または「変異体の」という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に改変された特性を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。例えば、本発明における変異体ＤＮＡポリメラーゼは低減されたウラシル検出活性を示すＤＮＡポリメラーゼである。
【０１０１】
本明細書においては、「低減された塩基類似体検出」とはＤＮＡ鋳型中の存在する塩基類似体、例えばウラシルまたはイノシンを認識する低減された能力を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。この点に関し、「低減された」塩基類似体検出活性を有する変異体ＤＮＡポリメラーゼは野生型よりも低値である塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体である。変異体ＤＮＡポリメラーゼ融合物の場合は、変異体ＤＮＡポリメラーゼの活性は、相当する非融合物ＤＮＡポリメラーゼに匹敵するもの、即ち、野生型酵素の塩基類似体検出活性の１０％未満（例えば９．９％、９％、８％、６％、４％、２％または１％未満）を有する。塩基類似体検出活性はＧｒｅａｇｇら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６，９０４５−９０５０に記載の通り低減したウラシル検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼの検出のために記載されたものと同様の試験法に従って測定してよい。あるいは、「低減された」塩基類似体検出とは、塩基類似体を認識する低減された能力を有する変異体ＤＮＡポリメラーゼを指し、塩基類似体のその「低減された」認識は、低減された塩基類似体検出活性を有さない野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９９％以上の＞１０ｋｂＰＣＲの量の増大により顕在化される。＞１０ｋｂＰＣＲ産物の量はゲル溶出された＞１０ｋｂＰＣＲＤＮＡ産物の分光光度計による吸光度試験によるか、または、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｘｓ（メリーランド州）ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６３−０００７−７９）を用いた臭化エチジウム染色アガロース電気泳動ゲルにおける＞１０ｋｂＰＣＲ産物の蛍光分析により測定される。
【０１０２】
本明細書においては、「低減されたウラシル検出」とはＤＮＡ鋳型中に存在するウラシル塩基を認識する低減された能力を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。この点に関し、「低減された」ウラシル検出活性を有する変異体ＤＮＡポリメラーゼは野生型酵素よりも低値のウラシル検出活性を有する、即ち、野生型酵素のウラシル検出活性の１０％未満（例えば９．９％、９％、８％、６％、４％、２％または１％未満）を有するＤＮＡポリメラーゼである。ウラシル検出活性は、Ｇｒｅａｇｇら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６，９０４５−９０５０に記載の測定法によって決定してもよい。あるいは、「低減された」ウラシル検出とは、ウラシルを認識する低減された能力を有する変異体ＤＮＡポリメラーゼを指し、ウラシルのその「低減された」認識は、低減されたウラシル検出活性を有さない野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９９％以上の＞１０ｋｂＰＣＲの量の増大により顕在化される。＞１０ｋｂＰＣＲ産物の量はゲル溶出された＞１０ｋｂＰＣＲＤＮＡ産物の分光光度計による吸光度試験によるか、または、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｘｓ（メリーランド州）ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６３−０００７−７９）を用いた臭化エチジウム染色アガロース電気泳動ゲルにおける＞１０ｋｂＰＣＲ産物の蛍光分析により測定される。
【０１０３】
本明細書においては、「化学修飾された」とは、化学的または生化学的に修飾されるか、または、非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む核酸を指す。このような修飾は、例えば標識、メチル化、類似体との天然に存在するヌクレオチド１つ以上の置換、未荷電結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホロジチオエート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、介入物（例えばアクリジン、ソラレン等）キレート形成剤、アルキル化剤および修飾結合（例えばアルファアノマー性核酸等）を包含する。また、水素結合または他の化学相互作用を介した所定の配列への結合能力においてポリヌクレオチドを模倣している合成の分子も包含される。このような分子は当該分野で知られており、例えばペプチド結合が分子の骨格においてリン酸結合の代替となっているものも包含する。
【０１０４】
本明細書においては、「ＰＣＲ増強因子」または「ポリメラーゼ増強因子」（ＰＥＦ）とは、ポリヌクレオチドポリメラーゼ増強活性、例えばＰＥＦ、ｄＵＴＰａｓｅ、ｓｓｂＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ヘリカーゼ等を有する複合体または蛋白を指す（共に参照により本明細書に組み込まれるＨｏｇｒｅｆｅら、１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：９３−９６；および米国特許第６，１８３，９９７号）。「ＰＣＲ増強因子」はまた非蛋白因子、例えばＤＭＳＯおよびベタインも包含する。
【０１０５】
本発明はまた例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３３３，１５８号および国際公開ＷＯ０１／０９３４７号Ａ２に記載されている補助的因子と組み合わせた変異体の古細菌ＤＮＡポリメラーゼも意図する。
【０１０６】
本明細書においては、「添加剤」とはＰＣＲ増強添加剤、例えばＰｆｕｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）、ＰＣＮＡ、ＲＰＡ、ｓｓｂ、抗体、ＤＭＳＯ、ベタインまたは３’〜５’エキソヌクレアーゼ（例えばＰｆｕＧ３８７Ｐ）を指す。
【０１０７】
本発明はまたＤＮＡポリメラーゼ融合物およびそのためのパッケージング材料を含む、ＤＮＡ合成；ＤＮＡ合成産物のクローニング；ＤＮＡの配列決定；および線形または指数的ＰＣＲ増殖よりなる群から選択される方法を高ｐＨで実施するためのキットを提供する。本発明のキットは高ｐＨ緩衝液および／またはＰＣＲ増強因子および／または添加剤を含んでよい。
【０１０８】
本明細書においては、高ｐＨ緩衝液とは９より高値のｐＨを有する緩衝液を指す。本明細書においては、「高ｐＨ」とは、９より大きいｐＨを指す。「高ｐＨ」は好ましくは１０以上、例えば１１、１２、１３または１４である。「高ｐＨ」には９より高値のｐＨが包含され、そして１４までのｐＨ、例えばｐＨ９．１、９．５、９．８、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５または１４が本発明の「高ｐＨ」である。
【０１０９】
好ましい実施形態においては、高ｐＨ緩衝液は、標準的なＰＣＲ反応緩衝液、例えば実施例３に記載するクローニングされたＰｆｕの反応緩衝液であるが、緩衝剤成分は高ｐＨとなっている（即ち９．１〜１４）。例えば、本発明の緩衝剤成分は１０．０または１１．８のｐＨの３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］である。標準的なＰＣＲ反応緩衝液中の緩衝剤成分のｐＨは８．３〜８．８である。緩衝剤成分は最終的ＰＣＲ反応においては１ｍＭ〜１Ｍの濃度で使用し、そしてｐＨ９．１〜１４である。ＰＣＲ反応用の高アルカリ緩衝液は本発明の融合ＤＮＡポリメラーゼまたは融合ＤＮＡポリメラーゼ混合物と共に使用する。本発明の緩衝剤成分は例えば、トリス、トリシン、ｂｉｃｉｎｅ、ビス−トリス、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ，ＴＡＰＳおよびＴＥＳを包含する。
【０１１０】
本明細書においては、「ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ」とは本発明において有用な熱安定性ＦＥＮ−１を指し、そして例えばＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ，Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓおよびＰ．ｗｏｅｓｅｉ由来の「超好熱性物質」から精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを包含する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４３，６６９号を参照できる。
【０１１１】
本発明の方法によれば、増幅反応にＦＥＮ−１を含めることで多部位の変異誘発の効率が劇的に増大する。４００ｎｇ〜４０００ｎｇのＦＥＮ−１を各増幅反応に使用してよい。好ましくは４００〜１０００ｎｇ、より好ましくは４００〜６００ｎｇのＦＥＮ−１を増幅反応に使用する。本発明の好ましい実施形態においては、４００ｎｇのＦＥＮ−１を使用する。
【０１１２】
本明細書においては、「ＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡリガーゼ」とは各変異誘発プライマーを伸長することにより合成された変異フラグメントをライゲーションして環状の変異体鎖を形成するための多部位変異誘発増幅反応において使用される熱安定性ＤＮＡリガーゼである。ＴｔｈおよびＴａｑＤＮＡリガーゼはコファクターとしてＮＡＤを必要とする。
【０１１３】
好ましくは、１〜２０ＵのＤＮＡリガーゼを各増幅反応に使用し、より好ましくは２〜１５ＵのＤＮＡリガーゼを各増幅反応に使用する。
【０１１４】
好ましい実施形態においては、１５ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼを増幅反応に使用する。ＴａｑＤＮＡリガーゼコファクターＮＤＡを０〜１ｍＭ、好ましくは０．０２〜０．２ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭの濃度で使用する。
【０１１５】
本明細書においては、「混合物」とはＤＮＡポリメラーゼ融合物少なくとも１つおよび非融合のＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の組み合わせを指す（実施例２参照）。本発明は該融合または非融合のＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１つが熱安定性であり、古細菌または真正細菌目のＤＮＡポリメラーゼであり、そして／または、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼである「混合物」を意図する。１つの融合および１つの非融合のポリメラーゼを含む「混合物」中のＤＮＡポリメラーゼ酵素の比率は１：１〜１：５〜５：１、または１：１〜１：１０〜１０：１または１：１〜１：２５〜２５：１または１：１〜１：１００〜１００：１である。「混合物」が１つの融合および２つの非融合のポリメラーゼを含む実施形態においては、第１の非融合ＤＮＡポリメラーゼの第２の非融合ＤＮＡポリメラーゼに対する比率は、１：１〜１：５〜５：１、または１：１〜１：１０〜１０：１または１：１〜１：２５〜２５：１または１：１〜１：１００〜１００：１である。本発明の「混合物」はゲノムおよび／またはプラスミド鋳型を用いた混合物の非融合成分と比較した場合、以下の活性、即ち：プロセシビティ、効率、鋳型長増幅能力、ＧＣリッチ標的増幅効率、特異性、熱安定性；内因性ホットスタート能、プルーフリーディング活性、忠実度、ＤＮＡ結合活性、鎖置換活性、ヌクレオチド結合および認識および塩耐性の１つ以上において＞１０％増大（後述する試験を用いる）を有する。本発明の混合物はまた、以下の活性、即ち：トリヌクレオチドリピートストレッチを有する鋳型上の増幅スリップまたは室温におけるＤＮＡポリメラーゼ活性の１つ以上において、ゲノムおよび／またはプラスミド鋳型を用いた非融合混合物と比較して＞１０％低減（後述する通り試験）を有する。１つの実施形態においては、本発明の「混合物」は、単なる混合物の非融合成分の存在下に観察される伸長時間と比較して、５秒、好ましくは１５秒、より好ましくは４５秒以上低減し得るＰＣＲ反応の伸長時間を有する。別の実施形態において、本発明の「混合物」は単なる混合物の非キメラ成分と比較した場合、１、１〜５または５以上のサイクルのＰＣＲの増幅サイクル数が低減している。別の実施形態においては、ブレンドの非融合成分と比較した場合に、より少ない単位（０．００１、０．０１，０．１または１以上）の本発明の「混合物」が本発明の適用において有用となる。
【０１１６】
混合物は本明細書に記載したＰＣＲ増強因子および／または添加剤も含有してよい。
【０１１７】
本発明はまた本発明の方法を実施するために作成された組成物および本発明の方法を実施しながら得られる組成物に関する。このような組成物は本発明のポリメラーゼ１つ以上、ヌクレオチド１つ以上、鋳型１つ以上、反応緩衝液または緩衝塩１つ以上、プライマー１つ以上、本発明の方法により作成された核酸産物１つ以上等よりなる群から選択される成分１つ以上を含んでよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１８】
本発明は高ｐＨにおけるＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定および変異誘発のプロトコルにおいて使用するためのＤＮＡポリメラーゼを開示する。本発明はゲノムＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅を促進し、そして、長ＰＣＲの効果を向上させるより短い伸長時間のＰＣＲ反応を可能とする。
【０１１９】
Ｉ．本発明のＤＮＡポリメラーゼ
本発明はＤＮＡポリメラーゼ融合物を提供する。本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物は３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有していても有していなくてもよく、即ち、プルーフリーディングまたは非プルーフリーディングであり、そして好ましくは熱安定性である。本発明は本明細書に定義する融合物ではない野生型ＤＮＡポリメラーゼに通常存在する活性１つ以上を修飾する変異１つ以上を保有するＤＮＡポリメラーゼ融合物を提供する。
【０１２０】
本発明において有用な別の核酸ポリメラーゼを以下に示す。
【０１２１】
Ａ．バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ（３７℃試験で有用）
バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が別のポリペプチドによりコードされているため、この活性を欠いている。適当なＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ４、Ｔ７およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。市販されている酵素は、Ｔ４（入手元多数、例えばＥｐｉｃｅｎｔｒｅより入手可能）およびＴ７（入手元多数、例えば３’〜５’ｅｘｏ−Ｔ７「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」ＤＮＡポリメラーゼの未修飾およびＵＳＢについてはＥｐｉｃｅｎｔｒｅより入手可能）である。
【０１２２】
Ｂ．古細菌ＤＮＡポリメラーゼ
古細菌に発見されているＤＮＡポリメラーゼには２種の異なるクラス、即ち１．ファミリーＢ／ｐｏｌＩ型（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕホモログ）および２．ｐｏｌＩＩ型（ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＰ１／ＤＰ２の２−サブユニットポリメラーゼのホモログ）がある。両方のクラスに由来するＤＮＡポリメラーゼが関連する５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を生来欠いており、そして３’〜５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を有することが分かっている。適当なＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩまたはｐｏｌＩＩ）は所望の試験温度と同様の最適生育温度で古細菌から誘導することができる。
【０１２３】
熱安定性の古細菌ＤＮＡポリメラーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ｆｕｒｉｏｓｕｓＧＢ−Ｄ種、ｗｏｅｓｉｉ，ａｂｙｓｉｉ，ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１，ｌｉｒｏｒａｌｉｓ，９度Ｎｏｒｔｈ−７種、ＪＤＦ−３種、ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍおよびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓから単離される。適当な古細菌は最高生育温度＞８０〜８５℃または最適生育温度＞７０〜８０℃を示す。古細菌ｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼ群由来の適切なＰＣＲ酵素は市販されており、例えばＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｉｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）を包含する。
【０１２４】
上記列挙したものに関連する別の古細菌は以下の参考文献：Ａｒｃｈａｅａ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．とＰｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．，編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州，１９９５およびＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＫｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｍＪ．Ｋ．編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，フロリダ，１９９２に記載されている。
【０１２５】
従って本発明はファミリーＢ／ｐｏｌＩ型またはｐｏｌＩＩ型並びにこれらの変異体または誘導体の何れかの熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１２６】
表１．クローニングされたファミリーＢポリメラーゼの受託情報
Ｖｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
受託  ＡＡＡ７２１０１
ＰＩＤ  ｇ３４８６８９
バージョン  ＡＡＡ７２１０１．１  ＧＩ：３４８６８９
ＤＢソース  遺伝子座  ＴＨＣＶＤＰＥ  受託  Ｍ７４１９８．１
ＴＨＥＳＴ  ＴＨＥＲＭＯＣＯＣＣＵＳ  ＳＰ．（系統  ＴＹ）
受託  Ｏ３３８４５
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２４
バージョン  Ｏ３３８４５  ＧＩ：３９１３５２４
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳＴ，受託  Ｏ３３８４５
Ｐａｂ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ
受託  Ｐ７７９１６
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２９
バージョン  Ｐ７７９１６  ＧＩ：３９１３５２９
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＡＢ，受託  Ｐ７７９１６
ＰＹＲＨＯ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ
受託  Ｏ５９６１０
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２６
バージョン  Ｏ５９６１０  ＧＩ：３９１３５２６
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＨＯ，受託  Ｏ５９６１０
ＰＹＲＳＥ  ＰＹＲＯＣＯＣＣＵＳ  ＳＰ．（系統  ＧＥ２３）
受託  Ｐ７７９３２
ＰＩＤ  ｇ３９１３５３０
バージョン  Ｐ７７９３２  ＧＩ：３９１３５３０
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＳＥ，受託  Ｐ７７９３２
ＤｅｅｐＶｅｎｔ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．
受託  ＡＡＡ６７１３１
ＰＩＤ  ｇ４３６４９５
バージョン  ＡＡＡ６７１３１．１  ＧＩ：４３６４９５
ＤＢソース  遺伝子座  ＰＳＵ００７０７  受託  Ｕ００７０７．１
Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ
受託  Ｐ８００６１
ＰＩＤ  ｇ３９９４０３
バージョン  Ｐ８００６１  ＧＩ：３９９４０３
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＦＵ，受託  Ｐ８００６１
ＪＤＦ−３  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．
未発表
Ｂａｒｏｓｓ  ｇｉ｜２０９７７５６｜ｐａｔ｜ＵＳ｜５６０２０１１｜１２配列  米国特許５６０２０１１由来の１２
９ｄｅｇＮ  ＴＨＥＲＭＯＣＯＣＣＵＳ  ＳＰ．（系統  ９ＯＮ−７）．
受託  Ｑ５６３６６
ＰＩＤ  ｇ３９１３５４０
バージョン  Ｑ５６３６６  ＧＩ：３９１３５４０
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳ９，受託  Ｑ５６３６６
ＫＯＤ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．
受託  ＢＡＡ０６１４２
ＰＩＤ  ｇ１６２０９１１
バージョン  ＢＡＡ０６１４２．１  ＧＩ：１６２０９１１
ＤＢソース  遺伝子座  ＰＹＷＫＯＤＰＯＬ  受託  Ｄ２９６７１．１
Ｔｇｏ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ．
受託  ４６９９８０６
ＰＩＤ  ｇ４６９９８０６
バージョン  ＧＩ：４６９９８０６
ＤＢソース  ｐｄｂ：鎖  ６５，公開  １９９９年２月２３日
ＴＨＥＦＭ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ
受託  Ｐ７４９１８
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２８
バージョン  Ｐ７４９１８  ＧＩ：３９１３５２８
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＦＭ，受託  Ｐ７４９１８
ＭＥＴＴＨ  Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ
受託  Ｏ２７２７６
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２２
バージョン  Ｏ２７２７６  ＧＩ：３９１３５２２
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＴＨ，受託  Ｏ２７２７６
Ｍｅｔｊａ      Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ
受託  Ｑ５８２９５
ＰＩＤ  ｇ３９１５６７９
バージョン  Ｑ５８２９５  ＧＩ：３９１５６７９
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＪＡ，受託  Ｑ５８２９５
ＰＯＣ  Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ
受託  Ｂ５６２７７
ＰＩＤ  ｇ１３６３３４４
バージョン  Ｂ５６２７７  ＧＩ：１３６３３４４
ＤＢソース  ｐｉｒ：遺伝子座  Ｂ５６２７７
ＡｐｅＩ  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ
受託  ＢＡＡ８１１０９
ＰＩＤ  ｇ５１０５７９７
バージョン  ＢＡＡ８１１０９．１  ＧＩ：５１０５７９７
ＤＢソース  遺伝子座  ＡＰ００００６３  受託  ＡＰ００００６３．１
ＡＲＣＦＵ  Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ
受託  Ｏ２９７５３
ＰＩＤ  ｇ３１２２０１９
バージョン  Ｏ２９７５３  ＧＩ：３１２２０１９
ＤＢソース  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座  ＤＰＯＬ＿ＡＲＣＦＵ，受託  Ｏ２９７５３
Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｔｏｋ．
受託  ６４３５７０８
ＰＩＤ  ｇ６４３５７０８９
バージョン  ＧＴ：６４３５７０８
ＤＢソース  ｐｄｂ．鎖  ６５，公開  １９９９年１月２日
【０１２７】
Ｃ．真正細菌目のＤＮＡポリメラーゼ：
真正細菌目のＤＮＡポリメラーゼには３つのクラス、即ち、ｐｏｌＩ、ＩＩおよびＩＩＩが存在する。ＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼファミリーの酵素は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、そして特定のメンバーは３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性も示す。ＰｏｌＩＩＤＮＡポリメラーゼは生来より５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性は示す。ＰｏｌＩＩＩＤＮＡポリメラーゼは細胞の大部分の複製ＤＮＡポリメラーゼに相当し、複数のサブユニットよりなる、ＰｏｌＩＩＩの触媒サブユニットは５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、場合により、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性が同じポリペプチド内に位置する。
【０１２８】
真正細菌目ｐｏｌＩＩおよびｐｏｌＩＩＩのＤＮＡポリメラーゼの市販元はない。
【０１２９】
種々の市販ＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼがあり、その一部は５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を低減または消失するように修飾されている。
【０１３０】
適当な熱安定性ｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼは種々の好熱性の真正細菌目、例えばＴｈｅｒｍｕｓ種およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、例えばＴｈｅｒｍｕｓ  Ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（ＴｍａＵ１Ｔｍａ）から単離できる。
【０１３１】
上記の真正細菌目に関連した他の真正細菌目は、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｋｒｉｓｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，フロリダ，１９９２に記載されている。
【０１３２】
本発明は更に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６７７，１５２号、第６，４７９，２６４号および第６，１８３，９９８号に開示されている方法に従って化学修飾されるキメラまたは非キメラのＤＮＡポリメラーゼも提供する。
【０１３３】
ＩＩ．変異体ＤＮＡポリメラーゼの製造
本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼは野生型の、または、野生型ポリメラーゼとは異なった挙動をＤＮＡポリメラーゼにとらせる変異１つ以上、例えば点変異１つ以上、Ｎおよび/またはＣ切断、内部の欠失または挿入を含むように修飾された何れかのＤＮＡポリメラーゼから作成できる。本発明に有用なＤＮＡポリメラーゼの変異は、例えば、塩基類似体またはウラシル非感受性を付与するか、忠実度を上昇させるか、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を消失させるか、または、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を消失させるか、ポリメラーゼ活性を低減するような変異である。有用な変異または切断の特定の例は、ウラシル非感受性を付与するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにおけるＶ９３Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにおけるＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、および、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ末端切断（ＫｌｅｎＴａｑ）である。ＤＮＡポリメラーゼ変異体を作成するための方法は以下に記載するとおりであり、そして他の方法は当該分野で知られている。
【０１３４】
遺伝子修飾−変異誘発
多様な生物に由来するＤＮＡポリメラーゼの直接の比較によれば、これらの酵素のドメイン構造は高度に保存されており、多くの場合において酵素の十分定義されたドメインにある特定の機能を割り付けることが可能である。例えば、約３４０アミノ酸に渡る６つの最も保存されたＣ末端領域は同じ線状の配置で位置しており、そして金属とｄＮＴＰの結合部位およびＤＮＡ鋳型を保持するための裂け目を形成し、従って重合機能に必須である高度に保存されたモチーフを含んでいる。別の例においては、金属結合１本鎖ＤＮＡ結合および３’〜５’エキソヌクレアーゼ反応の触媒に関与するＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ内の重要な残基を含む３アミノ酸領域がいくつかの原核生物および真核生物のＤＮＡポリメラーゼ中でアミノ末端半分に同じ線状のアレンジメントで位置している。これらの保存された領域の位置は、必須の機能、例えばＤＮＡ重合およびプルーフリーディング活性を保存しながら、修飾された活性を有する変異体のＤＮＡポリメラーゼを製造するための遺伝子的修飾を指向するための有用なモデルを与える。
【０１３５】
例えば、変異体ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子的修飾により（例えば野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列の修飾により）作成できる。ＤＮＡ配列のランダム並びにターゲティングされた変異を可能にする多くの方法が当該分野で知られている（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。更に、従来およびＰＣＲ系の方法の両方を含む部位指向性変異誘発のための多くの市販キットが存在する。例としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なＥＸＳＩＴＥ（商標）ＰＣＲ系部位指向的変異誘発キット（カタログ番号２００５０２）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位指向性変異誘発キット（カタログ番号２００５１８）およびやはりＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）２本鎖部位指向性変異誘発キット（カタログ番号２００５０９）が挙げられる。
【０１３６】
更にまた、変異体ＤＮＡポリメラーゼは当業者の知る方法に従って挿入変異または切断（Ｎ末端、内部またはＣ末端）により作成してもよい。
【０１３７】
当該分野で知られている部位指向性変異誘発のより以前の方法は１本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能にするＭ１３バクテリオファージベクターのようなベクターに変異導入される配列サブクローニングに依存している。これらの方法においては、変異誘発性のプライマー（即ち変異すべき部位にアニーリングすることができるが変異すべき部位においてミスマッチのヌクレオチド１つ以上を保有するプライマー）を１本鎖鋳型にアニーリングし、次に変異誘発性プライマーの３’末端から鋳型の相補物の重合を開始する。次に得られた二重らせんを宿主細菌に形質転換し、所望の変異を有するプラークをスクリーニングする。
【０１３８】
より最近では、部位指向性変異誘発は１本鎖鋳型を必要としない利点を有するＰＣＲ法を使用している。更に、サブクローニングを必要としない方法も開発されている。ＰＣＲ系の部位指向性変異誘発を行う際にはいくつかの懸案がある。第１にこれらの方法においてはポリメラーゼにより導入される望ましくない変異の拡大を防止するためにＰＣＲサイクルの数を低減することが望ましい。第２に反応中存続し続ける非変異の親分子の数を低減するために選択を使用しなければならない。第３に、単一のＰＣＲプライマーセットの使用を可能とするためには伸長ＰＣＲ法が望ましい。そして第４に、一部の熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存性の末端伸長のため、ＰＣＲ生成した変異体産物の平滑末端ライゲーションの前に、末端ポリッシング工程を操作に組み込む必要が生じる場合が多い。
【０１３９】
後述するプロトコルは以下の工程を介して上記懸案に対応している。第１に使用する鋳型濃度は従来のＰＣＲ反応で使用したものより約１０００倍高値とし、これにより産物の収率を劇的に低下させること無く、サイクル数を２５〜３０から５〜１０まで低減することができる。第２に、Ｅ．ｃｏｌｉＤａｍの最も一般的な菌株は配列５−ＧＡＴＣ−３においてそのＤＮＡをメチル化するため、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３、ここでＡ残基はメチル化されている）を用いて親ＤＮＡとの選別を行う。第３に長（即ちプラスミド完全長）のＰＣＲ産物の比率を増大させるためにＴａｑエクステンダーをＰＣＲミックス中に使用する。最後に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物の末端をポリッシュした後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いた分子内ライゲーションを行う。
【０１４０】
非キメラ変異体ＤＮＡポリメラーゼの単離に関する非限定的な例を以下に詳述する。
【０１４１】
プラスミド鋳型ＤＮＡ（約０．５ｐｍｏｌ）を１×変異誘発緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；８ｍＭ  ＭｇＣｌ２；４０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）；１２〜２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（当業者はオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング特性に影響する塩基の組成、プライマー長および意図する緩衝塩濃度のような要因を考慮しながら、必要に応じて変異誘発性プライマーを設計してよく；１つのプライマーは所望の変異を含むようにし、そして１つ（同じものまたは他方）は後のライゲーションを促進するための５’リン酸を含有しなければならない）、２５０μＭ各ｄＮＴＰ、２．５ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および２．５ＵのＴａｑ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能；Ｎｉｅｌｓｏｎら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ７：２７および米国特許第５，５５６，７７２号参照）を含有するＰＣＲカクテルに添加する。プライマーは参照により本明細書に組み込まれるＭａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１のトリエステル法を用いて製造できる。あるいは、例えばシアノエチルホスホロアミダイト化学を用いたＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ８７００  ＤＮＡシンセサイザー上の自動合成が好ましい場合がある。
【０１４２】
ＰＣＲサイクルは以下の通り、即ち：４分９４℃、２分５０℃および２分７２℃の１サイクル；次いで１分９４℃、２分５４℃および１分７２℃の５〜１０サイクルを行う。親鋳型ＤＮＡおよび変異誘発プライマーを組み込んだ線状のＰＣＲ作成ＤＮＡをＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これによりインビボメチル化親鋳型およびハイブリッドＤＮＡのＤｐｎＩ消化および線状ＰＣＲ鎖物上の非鋳型志向性のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによる除去が起こる。反応液を３０分間３７℃でインキュベートし、更に３０分７２℃とする。０．５ｍＭ  ＡＴＰを含有する変異誘発緩衝液（１×を１１５ｕｌ）をＤｐｎＩ消化ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼポリッシュＰＣＲ産物に添加する。溶液を混合し、１０ｕｌを新しいミクロ遠沈管に写し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２〜４Ｕ）を添加する。ライゲーションは３７℃で６０分間超インキュベートする。最後に、処理した溶液を定法に従ってコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ内に形質転換する。
【０１４３】
ランダムに位置する変異１つ以上を保有する変異体のパネルをもたらすランダム変異誘発の方法が当該分野で存在している。次にこのような変異体パネルを、野生型ポリメラーゼと比較して進歩した活性、例えば、低減したＤＮＡ重合活性、３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠失および/または低減したウラシル検出活性を有するものがあるかどうか、スクリーニングする（例えば２００μＭ  ｄＵＴＰの存在下および所定のＤＮＡポリメラーゼに対する最適温度における３０分間の重合体形態へのｄＮＴＰ１０ナノモルの取り込みを測定することによる）。ランダム変異誘発のための方法の一例はいわゆる「変異性（ｅｒｒｏｅ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ法」である。名称が意味するとおり、方法はＤＮＡポリメラーゼが高忠実度取り込みを支援しない条件下で所定の配列を増幅する。種々のＤＮＡポリメラーゼに関する変異性の取り込みを促進する条件は変動するが、当業者は所定の酵素に関するそのような条件を決定してよい。増幅の信頼性において多くのＤＮＡポリメラーゼで変動する要因は例えば緩衝液中の２価の金属イオンの種類および濃度である。従ってマンガンイオンの使用および/またはマグネシウムまたはマンガンイオン濃度の変動をポリメラーゼのエラー率に影響させてよい。
【０１４４】
変異誘発により生成する所望の変異体ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子は変異の部位および数を発見するために配列決定してよい。１つ以上の変異を含む変異対に関しては、所定の変異の作用は特定の変異体により運ばれる他の変異とは独立した部位指向性変異誘発により野生型遺伝子に発見された変異を導入することにより評価してよい。次にこのようにして作成された単一の変異体のスクリーニング試験によりその変異単独の作用を調べることができる。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明は本明細書に記載した添加剤を使用するか使用することなく、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１４６】
好ましい実施形態においては、本発明は少なくとも１つがＰｆｕＤＮＡポリメラーゼより誘導されている、ＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上および変異体ＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１４７】
別の好ましい実施形態においては、本発明は少なくとも１つがＴａｑＤＮＡポリメラーゼより誘導されている、ＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上および非キメラＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１４８】
別の好ましい実施形態においては、本発明は融合ＤＮＡポリメラーゼを用いるか、または、融合ＤＮＡポリメラーゼと野生型、変異体または化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼの混合物および/または野生型、変異体または化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼの製剤を用いるＰＣＲ増幅反応において使用される高ｐＨ緩衝液を提供する（実施例２参照）。本明細書においては、「ＤＮＡポリメラーゼ」製剤は、本明細書に定義する添加剤を伴った、または伴わない、ＤＮＡポリメラーゼ２つ以上、例えば２、３、４、５またはそれ以上の混合物である。
【０１４９】
本開示の利益を有する当業者が知る通り、他のｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼから誘導されたＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ等を対象となる組成物中で適宜使用してよい。
【０１５０】
野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸およびＤＮＡのコーディング配列は図２０に示すとおりである（Ｇｅｎｂａｎｋ  受託番号Ｐ８００６１）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの構造および機能の詳細な説明は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９４８，６６３号；第５，８６６，３９５号；第５，５４５，５５２号；第５，５５６，７７２号に記載されている。
【０１５１】
対象となる組成物の酵素はまだ単離されていないＤＮＡポリメラーゼを含む場合がある。
【０１５２】
本発明はＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上および融合物ではない変異体または野生型のＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１５３】
本発明はＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上および参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／２８０，９６２号（Ｓｏｒｇｅら、２００２年１０月２５日出願）および係属米国特許出願第１０／２９８，６８０号（Ｓｏｒｇｅら、２００２年１１月１８日出願）に開示されているような塩基類似体検出活性を低減させる変異１つ以上を含有する非融合の変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１５４】
好ましい実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物はＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上およびアミノ酸位置９３においてバリンからアルギニン、バリンからグルタミン酸、バリンからリジン、バリンからアスパラギン酸またはバリンからアスパラギンへの置換を含む本発明の非融合ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含む。
【０１５５】
本発明は更にＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上およびアミノ酸位置９３においてバリンからアルギニン、バリンからグルタミン酸、バリンからリジン、バリンからアスパラギン酸またはバリンからアスパラギンへの置換を含む低減された塩基類似体検出活性を有する非融合変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１５６】
低減したウラシル検出を有するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ変異体は以下の通り製造できる。変異はポリメラーゼまたはプルーフリーディング活性に対する影響を最小限としながらウラシル検出を低減させると思われるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ中に導入する。変異誘発に使用するＤＮＡ鋳型はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＰｆｕｐｏｌ遺伝子を含む（米国特許第５，４８９，５２３号記載のｐＦ７２クローン）。点変異はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅまたはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて導入する。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットを用いる場合、点変異は変異誘発プライマーの対を用いて導入する（Ｖ９３Ｅ、Ｈ、Ｋ、ＲおよびＮ）。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＭｕｌｔｉキットを使用する場合、１つのリン酸化変異誘発プライマーを取り込むことにより、または、変性コドン（Ｖ９３ＧおよびＬ）を取り込んで作成されたＰｆｕＶ９３変異形のライブラリからランダム変異体を選択することにより導入される。クローンを配列決定して取り込まれた変異を発見する。
【０１５７】
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにおけるバリン９３は図１０に示すＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプライマー配列を用いてグリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン［Ｒ］、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）およびロイシン（Ｌ）で置換した。
【０１５８】
変異体のキメラまたは非キメラのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの活性の試験は以下の通り行う。
【０１５９】
低減されたウラシル検出活性を有する部分精製された融合または非融合のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ製剤（熱処理細菌抽出液）のＰＣＲ中のｄＵＴＰ取り込みについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる同時係属米国特許出願第１０／２８０，９６２号（Ｓｏｒｇｅら、２００２年１０月２５日出願）に記載の通り試験した。この例では、Ｐｆｕｐｏｌ遺伝子を含む２．３ｋｂのフラグメントをＰＣＲプライマー（ＦＰｆｕＬＩＣ）５’ｇＡＣｇＡＣｇＡＣＡＡｇＡＴｇＡＴＴＴＴＡｇＡＴｇＴｇｇＡＴ−３’（配列番号１）および（ＲＰｆｕＬＩＣ）５’−ｇｇＡＡＣＣＡＡｇＡＣＣＣｇＴＣＴＡｇｇＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴｇ−３’ （配列番号２）を用いてプラスミドＤＮＡより得た。増幅反応の組成は１×クローニングＰｆｕＰＣＲ緩衝液、７ｎｇプラスミドＤＮＡ、１００ｎｇ各プライマー、２．５ＵＰｆｕ変異体（または野生型Ｐｆｕ）および２００μＭ各ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰとした。相対的なｄＵＴＰ取り込みを評価するために、種々の量のｄＵＴＰ（０〜４００μＭ）および/またはＴＴＰ（０〜２００μＭ）をＰＣＲ反応カクテルに添加する。増幅反応は以下の通りのサイクルとした。
【表Ａ’】
0004722035.tif 000002
0004722035.tif 000003
【０１６０】
本発明は更にＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上および低減されたＤＮＡ重合活性を有するＧ３８７Ｐ変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼを有する非融合変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１６１】
本発明は更に、ＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上およびＶ９３ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの別の活性１つ以上、例えばＤＮＡ重合活性または３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性をモジュレートする別の変異１つ以上を含む低減されたウラシル検出活性を有する非融合のＶ９３変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。１つの実施形態においては、本発明の非融合Ｖ９３変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼを３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損とする変異１つ以上を含む。別の実施形態においては、本発明の非融合Ｖ９３変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは非融合Ｖ９３ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ重合活性を低減する変異１つ以上を含む。
【０１６２】
本発明は更に、ＤＮＡポリメラーゼ融合物１つ以上および参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／０３５，０９１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００１年１２月２１日出願）；係属米国特許出願第１０／０７９，２４１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年２月２０日出願）；係属米国特許出願第１０／２０８，５０８号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年７月３０日出願）；および係属米国特許出願第１０／２２７，１１０号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年８月２３日出願）に記載のＤＮＡ重合を低減する変異１つ以上を含む低減したウラシル検出活性を有する非融合Ｖ９３変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を含むＤＮＡポリメラーゼ２つ以上の混合物を提供する。
【０１６３】
１つの実施形態において本発明は低減されたＤＮＡ重合活性および低減されたウラシル検出活性を有するＶ９３Ｒ／Ｇ３８７Ｐ、Ｖ９３Ｅ／Ｇ３８７Ｐ、Ｖ９３Ｄ／Ｇ３８７Ｐ、Ｖ９３Ｋ／Ｇ３８７Ｐ二重変異ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１６４】
本発明は更に、係属米国特許出願第０９／６９８，３４１号（Ｓｏｒｇｅら、２０００年１０月２７日出願）に開示される３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を低減または消失させる変異１つ以上を含む低減されたウラシル検出活性を有するＶ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｄ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｎ変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１６５】
１つの実施形態においては、本発明は低減された３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性および低減されたウラシル検出活性を有する非融合Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ三重変異体ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１６６】
本発明は更に、古細菌ＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性を増大または消失させる変異１つ以上の何れかの組み合わせを含む本発明のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ１つ以上を提供する。
【０１６７】
別の変異を含むＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で知られており、本明細書に記載する鋳型ＤＮＡ分子として本発明のＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｆｕＤＮＡポリメラーゼまたはＰｆｕＶ９３ｃＤＮＡを使用しながら部位指向性変異誘発により作成される。
【０１６８】
本発明は本明細書に記載する、そして当該分野で知られた変異の何れかを融合物のＤＮＡポリメラーゼドメインが含んでいるＤＮＡポリメラーゼ融合物を意図している。
【０１６９】
本発明の低減したＤＮＡ重合活性を有するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを作成する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる争中の米国特許出願第１０／０３５，０９１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００１年１２月２１日出願）；係属米国特許出願第１０／０７９，２４１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年２月２０日出願）；係属米国特許出願第１０／２０８，５０８号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年７月３０日出願）；および係属米国特許出願第１０／２２７，１１０号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年８月２３日出願）；および係属米国特許出願第１０／３２４，８４６号（Ｂｏｒｎｓら、；２００２年１２月２０日出願）に開示されている。
【０１７０】
Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異を含む３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを作成するために使用する方法は係属米国特許出願第０９／６９８，３４１号（Ｓｏｒｇｅら；２０００年１０月２７日出願）に開示されている。係属米国特許出願第０９／６９８，３４１号（Ｓｏｒｇｅら；２０００年１０月２７日出願）に開示されている内容を把握している当業者は、確立された部位指向性変異誘発方を用いて、係属米国特許出願第０９／６９８，３４１号に開示されている通り、非キメラＶ９３ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼｃＤＮＡを含む本発明のＤＮＡポリメラーゼに、相当するＤ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異の両方または他の３’〜５’エキソヌクレアーゼ変異を容易に導入できる。
【０１７１】
３種の３’〜５’エキソヌクレアーゼモチーフが発見されており、これらの領域における変異はＫｌｅｎｏｗ、φ２９、Ｔ４、Ｔ７およびＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、酵母Ｐｏｌα、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌγおよびバチルス・サブチルスのＰｏｌＩＩＩにおける３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を消失させることが分かっている（Ｄｅｒｂｅｙｓｈｉｒｅら、１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６２：３６３参照）。３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性が低減されるか消失した別のＤＮＡポリメラーゼ変異体を作成する方法は当該分野で知られている。
【０１７２】
５’〜３’および３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠いた市販の酵素はＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ｅｘｏ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕｅｘｏ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｌａｄｄｅｒｍａｎ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ），Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）を包含し、これらのいずれも本明細書に開示した本発明の混合物中の非キメラＤＮＡポリメラーゼ成分として使用してよい。
【０１７３】
本発明によれば、上記した変異のほかに、別の変異または修飾（またはその組み合わせ）１つ以上を目的のポリメラーゼに対して行ってよい。特定の目的の変異または修飾は（１）３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を消失または低減する；および（２）ジデオキシヌクレオチドの識別を低減する（即ちジデオキシヌクレオチドの取り込みを増大させる）変異の修飾を包含する。ポリメラーゼの５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性はポリメラーゼ遺伝子を変異することにより、または、５’〜３’エキソヌクレアーゼドメインを欠失させることにより、低減または消失させることができる。そのような変異は、点変異、フレームシフト変異、欠失、および挿入を含む。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性をコードしている遺伝子の領域を当該分野でよく知られた方法を用いて欠失させる。例えば、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性に関連する６つの保存されたアミノ酸の何れか１つを変異させる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに関するこれらの保存されたアミノ酸の例はＡｓｐ１８、Ｇｌｕ１１７、Ａｓｐ１１９．Ａｓｐ１２０、Ａｓｐ１４２およびＡｓｐ１４４である。
【０１７４】
ポリメラーゼ変異体はポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドのような非天然のヌクレオチドを識別できなくするように作成することもできる（米国特許第５，６１４，３６５号参照）。Ｏ−螺旋内の変化、例えば他の点変異、欠失および挿入を行うことにより、ポリメラーゼを非識別性とすることができる。例えば、この性質を有する１つのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体はＯ−螺旋内のＰｈｅ７３０に対してＴｙｒのような非天然のアミノ酸を置換する。
【０１７５】
典型的には、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性、識別化成および忠実度は典型的には異なる特質を有するアミノ酸の置換により影響を受ける。例えば、Ａｓｐのような酸性アミノ酸は塩基性、中性または極性であるが未荷電のアミノ酸、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ（塩基性）；Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ（中性）またはＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎ（極性であるが未荷電）に変えてよい。ＧｌｕはＡｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎに変えてよい。
【０１７６】
好ましくは、オリゴヌクレオチド指向変異誘発を用いて、コードするＤＮＡ分子に沿った何れかの所定の部位における塩基対交換の全ての可能なクラスが行えるような変異対ポリメラーゼを作成する。一般的に、本手法は目的のＤＮＡポリメラーゼをコードする１本鎖ヌクレオチド配列に相補的（１つ以上のミスマッチがあることを除く）なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることを含む。次にミスマッチしたオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸長し、一方の鎖において配列の望ましい変化を含んでいる２本鎖ＤＮＡ分子を作成する。配列の変化は当然ながら、アミノ酸の欠失、置換または挿入をもたらす。次に２本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入し、このようにして変異ポリペプチドを作成することができる。上記したオリゴヌクレオチド指向変異誘発は当然ながらＰＣＲを介して実施できる。
【０１７７】
１つの実施形態において非キメラ変異ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４８９，５２３号に記載されている通り発現させ、精製される。
【０１７８】
ＩＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼ融合物の製造
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、一方のポリペプチドは１つの蛋白の配列またはドメインに由来し、もう一方のポリペプチドは別の蛋白の配列またはドメインに由来する共有結合したポリペプチド少なくとも２個を有する。本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼ融合物のドメインの少なくとも１つは本発明の野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼを起源としている。ポリペプチドは直接、または、共有結合リンカー、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリギリシンリンカーまたは他の型の化学リンカー、例えば炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばＰＥＧ等を介して連結してよい（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）参照）。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することもできるが、典型的にはＣ末端からＮ末端に連結される。ポリペプチドドメイン１つ以上を本発明のＤＮＡポリメラーゼ内の内部位置に挿入してよい。融合蛋白のポリペプチドはいずれの順序であることもできる。「融合ポリペプチド」または「キメラ」という用語はまた、保存的に修飾された変種、多形変種、対立遺伝子、変異体、融合蛋白を構成するポリペプチドのサブ配列および種間のホモログとも称する。融合蛋白は１つの蛋白配列に由来するアミノ酸の鎖を別の蛋白配列に由来するアミノ酸の鎖に共有結合することにより、例えば融合蛋白を隣接してコードしている組み換えポリペプチドを製造することにより、作成してよい。融合蛋白は同じか異なる種に由来するアミノ酸の異なる鎖２、３、４以上を含むことができる。融合蛋白内のアミノ酸の異なる鎖は、直接共にスプライシングされるか、または、化学結合基または約２００アミノ酸長以上、典型的には１〜１００アミノ酸であることができるアミノ酸連結基を介して間接的にスプライシングしてよい。一部の実施形態においては、プロリン残基をリンカーに組み込むことにより、リンカーによる大きな二次構造エレメントの形成を防止する。リンカーは組み換え融合蛋白の一部として合成される可変アミノ酸配列である場合が多い。そのような可変リンカーは当該分野でよく知られている。
【０１７９】
好ましい実施形態においては、本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減されたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するか、低減されたウラシル検出活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。更に本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもいなくてもよい。
【０１８０】
１つの実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼに融合する成分はＮまたはＣ末端において、または何れかの内部の位置において、ＤＮＡポリメラーゼに融合した何れかの非天然の蛋白または蛋白ドメインである。ＤＮＡポリメラーゼ融合相手（即ち本明細書に記載する融合物の第２のアミノ酸配列）からのＤＮＡポリメラーゼの活性への寄与は、例えば、以下のＤＮＡポリメラーゼ活性、即ち、プロセシビティ、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレオチド結合および認識、プルーフリーディング、忠実度および塩耐性および/または室温における低減されたＤＮＡポリメラーゼ活性の１つ以上の増大を包含する。
【０１８１】
ＤＮＡポリメラーゼ融合物は当該分野で知られた融合蛋白を製造する分子生物学的な手法により製造できる。
【０１８２】
当該分野でよく知られた方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州）を用いて、ＤＮＡポリメラーゼの蛋白ドメインを所望の活性を有する別のポリメラーゼのドメインで置換することができる。本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物を製造する方法はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１およびＰａｖｌｏｖら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１３５１０−１３５１５に記載されている。
【０１８３】
１つの実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は変異１つ以上を含む本発明の異なるＤＮＡポリメラーゼの蛋白ドメインに融合した本発明の１つの野生型ＤＮＡポリメラーゼの蛋白ドメインを含む。
【０１８４】
別の好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物はＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの全体または一部を含む。
【０１８５】
１つの実施形態においては本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／０３５，０９１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００１年１２月２１日出願）；係属米国特許出願第１０／０７９，２４１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年２月２０日出願）；係属米国特許出願第１０／２０８，５０８号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年７月３０日出願）；および係属米国特許出願第１０／２２７，１１０号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年８月２３日出願）に開示されているとおり、低減されたＤＮＡ重合を有するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼまたはその一部を含む。
【０１８６】
１つの実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／２８０，９６２号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年１０月２５日出願）および係属米国特許出願第１０／２９８，６８０号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年１１月１８日出願）および係属米国特許出願第１０／３２４，８４６号（Ｂｏｒｎｓら；２００２年１２月２０日出願）に開示されている通り、塩基類似体検出活性を低減する変異１つ以上を有するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼまたはその一部を含む。
【０１８７】
１つの実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物が変異１つ以上を含む本発明の異なるＤＮＡポリメラーゼの蛋白ドメインに融合する本発明の１つの変異ＤＮＡポリメラーゼの蛋白ドメインを含む。
【０１８８】
１つの実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は本発明の別のＤＮＡポリメラーゼ内の類似の蛋白ドメインを置き換える１つのＤＮＡポリメラーゼの蛋白ドメインを含む。本明細書においては、２つの蛋白ドメインは、それらが少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ活性、例えばプロセシビティ、ＤＮＡ結合、鎖置換活性、ヌクレオチド結合および認識、プルーフリーディング、例えば３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性、忠実度、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性または塩耐性を付与するドメインを共有している場合に「類似の」といわれる。
【０１８９】
１つの実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物はＰａｖｌｏｖら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１３５１０−１３５１５に記載の通りプロセシビティ、塩耐性および熱安定性を増大させるＤＮＡトポイソメラーゼＶ由来の螺旋−ヘアピン−螺旋ＤＮＡ結合モチーフを含む。
【０１９０】
別の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は、国際公開ＷＯ９７／２９２０９号記載の通りＤＮＡポリメラーゼ融合物のプロセシビティを増大させるチオレドキシン結合ドメインを含む。
【０１９１】
別の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物はＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたは関連の真正細菌目ＤＮＡポリメラーゼに融合した古細菌ＰＣＮＡ結合ドメインを含む。ＰＣＮＡ結合ドメイン−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼキメラを含むＰＣＲ反応にＰＣＮＡを加えることにより、ＤＮＡポリメラーゼ融合物のプロセシビティが増強され、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの収率が向上する（Ｍｏｔｚ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年５月３日；２７７（１８）；１６１７９−８８）。
【０１９２】
別の実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は本発明のＤＮＡポリメラーゼに融合した例えばＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来の配列非特異的ＤＮＡ結合蛋白Ｓｓｏ７ｄまたはＳａｃ７ｄを含む。本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物、例えばＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼへのＤＮＡ結合蛋白Ｓｓｏ７ｄおよびＳａｃ７ｄの融合は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１に開示されている通りこれらのＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティを大きく増大させる。
【０１９３】
本発明は当該分野で知られたＨｈＨドメインの何れか（Ｂｅｌｏｖａら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：６０１５，および図１８参照）が本明細書に記載する野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼの何れかに融合しているＤＮＡポリメラーゼ融合物を意図する。ＨｈＨは本明細書に記載した野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼのＮまたはＣ末端に直接融合するか、または、何れかの内部の部位に融合できる。１つ以上（例えばＨ−ＬまたはＥ−Ｌ）のＨｈＨドメインを用いてＤＮＡポリメラーゼ融合物を作成できる。
【０１９４】
別の実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は低減された３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼまたはその一部を含む。Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異を含む３’〜５’エキソヌクレアーゼ欠損ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを作成するために使用される方法は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第０９／６９８，３４１号（Ｓｏｒｇｅら；２０００年１０月２７日出願）に開示されている。係属米国特許出願第０９／６９８，３４１（Ｓｏｒｇｅら；２０００年１０月２７日出願）に開示されている内容を把握している当業者は、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物の何れか１つ、即ち、本明細書に定義した低減された塩基類似体検出活性または低減されたＤＮＡ重合活性を有するＤＮＡポリメラーゼ融合物内に、相当するＤ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異の両方または他の３’〜５’エキソヌクレアーゼ変異を容易に導入できる。
【０１９５】
別の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は５’〜３’および３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠いたＤＮＡポリメラーゼまたはその一部、例えば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ｅｘｏ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕｅｘｏ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｌａｄｄｅｒｍａｎ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ），Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）を含み、これらのいずれも本明細書に開示した本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼ融合物として使用してよい。
【０１９６】
別の実施形態においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７９５，７６２号に開示されている通り本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物に増大した忠実度を付与する増強された３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたはその一部を含む。
【０１９７】
ＩＶ．本発明の野生型または変異体の酵素の発現
当該分野で知られている方法を本発明のＤＮＡポリメラーゼを発現させ単離するために適用してよい。多くの細菌発現ベクターは外来性配列によりコードされる蛋白の高濃度の誘導発現を可能とする配列エレメントまたは配列エレメントの組み合わせを含んでいる。例えば、上記した通り、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の組み込み誘導型を発現する細菌を、Ｔ７プロモーターに連結した変異したＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換してよい。ｌａｃ−誘導性プロモーターに対する適切なインデューサー、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導は、Ｔ７プロモーターからの変異した遺伝子の高濃度の発現を誘導する。
【０１９８】
細菌の適切な宿主系統は当業者の使用できるものから選択してよい。非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉの他の菌株と比較してプロテアーゼ欠損であることから、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ−２１が外因性蛋白の発現のために一般的に使用されている。誘導Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するＢＬ−２１菌株はＷＪ５６およびＥＲ２５６６を包含する（Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ，１９９９，上出）。特定のポリメラーゼ遺伝子のためのコドンの使用がＥ．ｃｏｌｉ遺伝子において通常観察されるものとは異なる場合は、より希少なアンチコドンを有するｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子（例えばａｒｇＵ、ｉｌｅＹ、ｌｅｕＷおよびｐｒｏＬのｔＲＮＡ遺伝子）を担持するように修飾されたＢＬ−２１系統が存在し、クローニングされた蛋白遺伝子、例えばクローニングされた古細菌酵素遺伝子の高効率発現を可能とする（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅから希少コドンｔＲＮＡを担持する数種のＢＬ２１−ＣＯＤＯＮＰＬＵＳＴＭ細胞系統が入手可能である）。
【０１９９】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの精製のために適している当該分野で知られた多くの方法がある。例えばＬａｗｙｅｒら（１９９３，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．＆Ａｐｐ．２：２７５）はＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＤＮＡポリメラーゼの単離に適しており、Ｔａｑポリメラーゼの単離のために当初設計された。あるいは、宿主蛋白を破壊するための過熱変性工程および２つのカラム精製工程（ＤＥＡＲ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅおよびヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上）を使用して高活性で約８０％純度のＤＮＡポリメラーゼを単離するＫｏｎｇら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５，参照により本明細書に組み込まれる）の方法を使用してよい。更にまた、ＤＮＡポリメラーゼは硫酸アンモニウム分画、次いでＱＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＤＮＡセルロースカラム、またはＨｉＴｒａｐＱカラム上の夾雑物吸着、次いでＨｉＴｒａｐヘパリンカラムからの勾配溶離により単離してよい。
【０２００】
Ｖ．融合および非融合ＤＮＡポリメラーゼの混合物
本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物ブレンド製剤は少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、および、（１）プルーフリーディングまたは非プルーフリーディングのキメラＤＮＡポリメラーゼ；または（２）プルーフリーディング＋非プルーフリーディング、非プルーフリーディング＋非プルーフリーディング、または、プルーフリーディング＋プルーフリーディングの非融合ＤＮＡポリメラーゼ混合物、例えばＰｆｕ、Ｔａｑ、Ｐｆｕ／Ｔａｑ、Ｐｆｕ／ｅｘｏ−Ｐｆｕ、Ｔａｑ／ｅｘｏ−Ｐｆｕ、Ｐｆｕ／ＪＤＦ３、またはｐｏｌ−Ｐｆｕ（ＰｆｕＧ３８７Ｐ）とのこれらの組み合わせの何れかを含むことができる。１つの融合および１つの非融合のポリメラーゼを含む「混合物」中のＤＮＡポリメラーゼ酵素の比率は１：１〜１：５〜５：１、または１：１〜１：１０〜１０：１または１：１〜１：２５〜２５：１または１：１〜１：１００〜１００：１である。「混合物」が１つの融合および２つの非融合のポリメラーゼを含む実施形態においては、第１の非融合ＤＮＡポリメラーゼの第２の非融合ＤＮＡポリメラーゼに対する比率は、１：１〜１：５〜５：１、または１：１〜１：１０〜１０：１または１：１〜１：２５〜２５：１または１：１〜１：１００〜１００：１である。本発明の製剤は個々の成分の比に関する限定条項はない。
【０２０１】
１つの実施形態において、本発明の混合物製剤は２．５ＵＰｆｕ／０．２５ＵキメラＰｆｕである。
【０２０２】
ＤＮＡポリメラーゼ融合物とブレンドされる野生型ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性およびプルーフリーディング活性のネイティブの水準を有する何れかのネイティブまたはクローニングされたＤＮＡポリメラーゼであることができ、そして、好ましくは、ＰｆｕまたはＴａｑのような熱安定性である。ＤＮＡポリメラーゼ融合物および野生型ＤＮＡポリメラーゼは上記した比の範囲でブレンドされ、そして、何れかの複製アクセサリ因子またはＰＣＲ増強添加剤、例えばＰｆｕｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）、ＰＣＮＡ、ＲＰＡ、ｓｓｂ、抗体、ＤＭＳＯ、ベタインまたは３’〜５’エキソヌクレアーゼ（例えばＰｆｕＧ３８７Ｐ）と混合することもできる。
【０２０３】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物とブレンドされる変異体ＤＮＡポリメラーゼは野生型ＤＮＡポリメラーゼとは異なる活性を有するＤＮＡポリメラーゼを生成する導入された変異および/または切断を有する何れかのＤＮＡポリメラーゼである。変異体は何れかの量のポリメラーゼおよび/またはプルーフリーディング活性を有する。有用な変異または切断の特定の例は、ウラシル非感受性を付与するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにおけるＶ９３Ｒ、Ｋ、ＥまたはＤ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにおけるＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、および、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＴａｑのＮ末端切断（ＫｌｅｎＴａｑ）である。
【０２０４】
本発明はまた向上した逆転写活性を有する別の変異１つ以上を含む変異体Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｄ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｎ非融合ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０２０５】
本発明はＤＮＡポリメラーゼ融合物の非融合ＤＮＡポリメラーゼに対する比率が１：１〜１：５〜５：１、または１：１〜１：１０〜１０：１または１：１〜１：２５〜２５：１または１：１〜１：１００〜１００：１である混合物を提供する。本発明はＤＮＡポリメラーゼ融合物と１つより多い非融合ＤＮＡポリメラーゼの混合物を含む混合物を意図する。非融合ＤＮＡポリメラーゼ２つと組み合わせられたＤＮＡポリメラーゼを含む混合物については、第１の非融合ＤＮＡポリメラーゼの第２の非融合ＤＮＡポリメラーゼに対する比の範囲は１：１〜１：５〜５：１、または１：１〜１：１０〜１０：１または１：１〜１：２５〜２５：１または１：１〜１：１００〜１００：１である。
【０２０６】
ＶＩ．要件発明の用途
本発明は本明細書に定義する高ｐＨで本発明のポリメラーゼ融合物を使用する方法を提供する。
【０２０７】
本発明で有用な高ｐＨ緩衝液は例えば緩衝成分が高ｐＨ（即ち９．３〜１４）であるクローニングＰｆｕ反応緩衝液（実施例３に記載）のような標準的なＰＣＲ反応緩衝液である。以下の実施例において使用する緩衝成分はｐＨ１０．０または１１．８における３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］である。標準的なＰＣＲ反応緩衝液の緩衝成分のｐＨは８．３〜８．８である。緩衝成分は最終ＰＣＲ反応において１ｍＭ〜１Ｍの濃度で使用し、そして９．５〜１４の何れかのｐＨであってよい。本発明の緩衝成分は例えばトリス、トリシン、ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−トリス、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳおよびＴＥＳである。
【０２０８】
１つの態様において、本発明は要件となる発明の組成物を用いたＤＮＡ合成のための方法を提供する。典型的には、ポリヌクレオチドの合成は合成プライマー、合成鋳型、新しく合成されるポリヌクレオチドに取り込まれるためのポリヌクレオチド前駆体（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）等を必要とする。ポリヌクレオチド合成を行うための詳細な方法は当該分野の当業者にはよく知られており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９８９）に記載されている。
【０２０９】
Ａ．増幅反応における適用
「ポリメラーゼ連鎖反応」即ち「ＰＣＲ」は特定のポリヌクレオチド鋳型配列を増幅するためのインビトロの方法である。ＰＣＲの手法は多くの文献、例えばＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）およびＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。ＰＣＲはまた、多くの米国特許、例えば米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号；第４，８８９，８１８号；第５，０７５，２１６号；第５，０７９，３５２号；第５，１０４，７９２号；第５，０２３，１７１号；第５，０９１，３１０号；および第５，０６６，５８４号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
本発明により与えられる利点を簡単に理解するために、ＰＣＲの要約を示す。ＰＣＲ反応は温度サイクルの反復シリーズを含み、典型的には５０〜１００μｌの容量で行われる。反応混合物はｄＮＴＰ（４種のデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼおよびポリヌクレオチド鋳型を含む。ＰＣＲは増幅すべき標的ポリヌクレオチド配列の２本鎖とハイブリダイズするプライマー２つを必要とする。ＰＣＲにおいては、この２本鎖標的配列を変性させ、プライマー１つを変性した標的の各鎖にアニーリングする。プライマーは標的ポリヌクレオチドが相互に脱離した部位において、相補体から分離した際の一方のプライマーの伸長産物が、もう一方のプライマーにハイブリダイズできるような方向において、アニーリングする。あるプライマーが標的配列にハイブリダイズすると、プライマーはＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される。次に伸長産物を標的配列から変性させて方法を反復する。
【０２１１】
この方法の継続的サイクルにおいて、早期のサイクルで生成した伸長産物はＤＮＡ合成の鋳型として作用する。第２サイクルの開始時に、増幅産物は対数的速度で蓄積を開始する。増幅産物は最終的には第２のプライマーに相補的な配列が後続する第１のプライマーの配列を含む第１の鎖および第１の鎖に相補的な第２の鎖を含む個別の２本鎖ＤＮＡ分子である。
【０２１２】
ＰＣＲ法によれば大量の増幅が可能であるため、高濃度ＤＮＡの試料、陽性対照鋳型または前の増幅から引き継がれた低濃度のＤＮＡは、意図的に添加された鋳型ＤＮＡの非存在下であっても、ＰＣＲ産物を与えうる。可能であれば、全ての反応混合物をＰＣＲ産物分析および試料調製から離れた領域でセットアップする。ＲＮＡ／ＤＮＡの調製、反応混合および試料分析のための専用または使い捨ての容器、溶液およびピペット（好ましくは陽圧置換ピペット）を使用することにより、交差汚染を最小限にする。参照により本明細書に組み込まれるＨｉｇｕｃｈｉとＫｗｏｋｍ  １９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：２３７−２３８，ＫｗｏｋとＯｒｒｅｇｏ，Ｉｎｎｉｓら編、１９９０，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州を参照できる。
【０２１３】
本明細書に記載する酵素はｄＵＴＰを取り込むＰＣＲ酵素を必要とするｄＵＴＰ／ＵＮＧクリーンアップ法のためにも有用である（Ｌｏｎｇｏら、上出）。
【０２１４】
１．熱安定性酵素
ＰＣＲ増幅のためには、本発明において使用される酵素は好ましくは熱安定性である。本明細書においては、「熱安定性」とは熱に対して安定であり、熱抵抗性であり、そして、高温、例えば５０〜９０℃で機能する酵素を指す。本発明の熱安定性酵素は増幅反応のために有効であるべき唯一の基準、即ち、酵素は２本鎖ポリヌクレオチドの変性を起こすために必要な時間、高温に付されても非可逆的に変性（不活性化）されてはならないということを満足しなければならない。「非可逆的な変性」とは、この関連において使用する場合は酵素活性の永久的および完全な消失をもたらす過程を意味する。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝塩濃度および変性すべきポリヌクレオチドの長さおよびヌクレオチド組成により異なるが、典型的には、温度およびポリヌクレオチド長に主に依存する時間、典型的には短いポリヌクレオチドの場合の０．２５分〜ＤＮＡの長片の場合の４．０分にわたり、短いポリヌクレオチドの場合の８５℃から１０５℃までの範囲である。緩衝塩濃度および/またはポリヌクレオチドのＧＣ組成が上昇するに従い、より高温も耐容性となる場合もある。好ましくは、酵素は９０〜１００℃で非可逆的に変性されない。本発明によれば非可逆的に変性されない酵素は増幅反応の間、少なくとも１０％、または少なくとも２５％、または少なくとも５０％以上の機能または活性を維持する。
【０２１５】
２．ＰＣＲ反応混合物
要件となる酵素混合物の他に、当業者は合成／増幅反応の忠実度を向上させるために他のＰＣＲパラメーターも使用してよい。ＰＣＲの忠実度はｄＮＴＰの濃度、反応当たり使用する酵素の単位、ｐＨおよび反応中に存在するｄＮＴＰに対するＭｇ２＋の比のような要素に影響されることが報告されている（Ｍａｔｔｉｌａら、上出）。
【０２１６】
Ｍｇ２＋濃度はプライマー−鋳型相互作用を安定化させることにより鋳型ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングに影響し、有機層はまた鋳型−プライマーとのポリメラーゼの複製複合体も安定化させる。従って、非特異的アニーリングを増大させ、望ましくないＰＣＲ産物を生成する（ゲル中の複数のバンドを生じる）。非特異的増幅が起こる場合は、Ｍｇ２＋の濃度を低下させる必要が生じるか、または、ＥＤＴＡを添加してＭｇ２＋をキレートし、増幅の精度および特異性を上昇させることができる。
【０２１７】
他の２価のカチオン、例えばＭｎ２＋またはＣｏ２＋もまたＤＮＡ重合に影響する場合がある。各ＤＮＡポリメラーゼに適するカチオンは当該分野で知られている（例えばＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  第２版、上出を参照）。２価のカチオンはＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣｌ２、Ｍｎ（ＯＡｃ）２またはＭｎＳＯ４のような塩の形態で供給される。トリス−ＣＨｌ緩衝液中の使用可能なカチオン濃度はＭｎＣｌ２の場合は０．５〜７ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭであり、ＭｇＣｌ２の場合は０．５〜１０ｍＭである。Ｂｉｃｉｎｅ／ＫＯＡｃ緩衝液中の使用可能なカチオン濃度はＭｎ（ＯＡｃ）２の場合は１〜２０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭである。
【０２１８】
ＤＮＡポリメラーゼに必要な１価のカチオンは塩化物または酢酸塩としてのカリウム、ナトリウム、アンモニウムまたはリチウム塩で供給される。ＫＣｌの場合は、濃度は１〜２００ｍＭ、好ましくは濃度は４０〜１００ｍＭであるが、最適濃度は反応において使用されるポリメラーゼにより変動してよい。
【０２１９】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を２ナトリウムまたはリチウムの塩のようなｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＴＴＰのような塩の溶液として添加する。本発明においては各々１μＭ〜２ｍＭの範囲の終濃度が適当であり、そして１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適濃度は総ｄＮＴＰおよび２価金属イオンの濃度、および、緩衝液、塩、特定のプライマーおよび鋳型によりＰＣＲ反応において変動してよい。より長い産物、即ち１５００ｂｐより長いものについては、トリス−ＨＣｌ緩衝液を用いる場合は５００μＭの各ｄＮＴＰが好ましい。
【０２２０】
ｄＮＴＰは２価のカチオンとキレート形成するため、使用する２価のカチオンの量は反応におけるｄＮＴＰの濃度に従って変更する必要がある。過剰な量のｄＮＴＰ（例えば１．５ｍＭ超）はエラー率を増大させ、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する可能性がある。従って、ｄＮＴＰを低下（例えば１０〜５０μＭまで）させることがエラー率を低下させる。より長いサイズの鋳型を増幅するためのＰＣＲ反応はより多くのｄＮＴＰを要する場合がある。
【０２２１】
ＰＣＲ反応緩衝液は高ｐＨ（即ち９．１〜１４）の緩衝成分を有する以外はクローニングＰｆｕ反応緩衝液のような標準的なＰＣＲ反応緩衝液である。適当な緩衝成分の一例はｐＨ１０．０または１１．８の３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］である。標準的なＰＣＲ反応緩衝液中の緩衝剤成分のｐＨは８．３〜８．８である。緩衝剤成分はｐＨ９．１〜１４の最終的ＰＣＲ反応においては１ｍＭ〜１Ｍの濃度で使用する。本発明で有用な緩衝剤成分は例えば、トリス、トリシン、ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−トリス、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳおよびＴＥＳを包含する。
【０２２２】
ＰＣＲはＤＮＡ増幅のための極めて強力なツールであり、従ってほとんど鋳型ＤＮＡを必要としない。しかしながら一部の実施形態においては、エラーの確立を低下させるために、より高いＤＮＡ濃度を用いるが、鋳型が多すぎると夾雑物の量を増大させ、効率を低下させる場合がある。
【０２２３】
通常は３μＭまでのプライマーを使用するが、高いプライマーの鋳型に対する比は非特異的増幅およびプライマー−二量体形成をもたらす場合がある。従って通常はプライマー−二量体形成を回避するためにプライマー配列を確認する必要がある。
【０２２４】
本発明は鋳型におけるシトシンの脱アミノ化を最小限にすることにより、そして、より高値の変性時間および変性温度の使用を可能にすることにより、ＧＣリッチのＤＮＡ鋳型のＰＣＲを増強する低減したウラシル検出活性を有するＰｆｕＶ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＤまたはＶ９３Ｎの融合または非融合のＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０２２５】
３．サイクリングパラメータ
変性時間は鋳型のＧＣ含量が高値の場合は増大する場合がある。より高いアニーリング温度は高いＧＣ含量を有するプライマーまたはより長いプライマーの場合に必要となる。勾配ＰＣＲはアニーリング温度を決定する通常の方法である。伸長時間はより大きいＰＣＲ産物の増幅の場合には延長しなければならない。しかしながら、伸長時間は酵素の損傷を制限するため可能な限り低減する必要がある。
【０２２６】
サイクル数は鋳型ＤＮＡの数が極めて少ない場合は増大し、そして多量の鋳型ＤＮＡを使用する場合は低下する。
【０２２７】
４．ＰＣＲ増強因子および添加剤
ＰＣＲ増強因子もまた増幅の効率を向上させるために使用してよい。本明細書においては「ＰＣＲ増強因子」または「ポリメラーゼ増強因子（ＰＥＦ）」とは、ポリヌクレオチドポリメラーゼ増強活性を有する複合体または蛋白を指す(共に参照により本明細書に組み込まれるＨｏｇｒｅｆｅら、１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：９３−９６；米国特許第６，１８３，９９７号)。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの場合は、ＰＥＦはネイティブの形態（Ｐ５０およびＰ４５の複合体）で、または組み換え蛋白としてＰ４５を含む。ＰｆｕＰ５０およびＰ４５のネイティブの複合体においては、Ｐ４５のみがＰＣＲ増強活性を示す。Ｐ５０蛋白は細菌フラボ蛋白と構造において同様である。Ｐ４５蛋白はｄＣＴＰ脱アミノ酵素およびｄＵＴＰａｓｅと構造が同様であるが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびピロリン酸に変換するｄＵＴＰａｓｅとしてのみ機能する。ＰＥＦは本発明によれば、古細菌細菌原料（例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得られる単離または精製された天然に存在するポリメラーゼ増強蛋白；ポリメラーゼ増強活性を有するＰｆｕＰ４５と同じアミノ酸配列を有する完全または部分的に合成された蛋白またはその類似体；天然に存在するか完全または部分的に合成された蛋白の１つ以上のポリメラーゼ増強混合物；天然に存在するか完全または部分的に合成された蛋白の１つ以上のポリメラーゼ増強蛋白複合体；または、該天然に存在する蛋白の１つ以上を含有するポリメラーゼ増強制の部分精製された細胞抽出液よりなる群から選択することもできる（米国特許第６，１８３，９９７号、上出）。ＰＥＦのＰＣＲ増強活性は当該分野で知られた手段により定義される。ＰＥＦの単位の定義はｄＵＴＰからのピロリン酸（ＰＰｉ）の生成をモニタリングすることにより測定されるＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰａｓｅ活性に基づいている。例えば、ＰＥＦをｄＵＴＰ（１×クローニングＰｆｕＰＣＲ緩衝液中１０ｍＭ  ｄＵＴＰ）と共にインキュベートし、その間、ＰＥＦがｄＵＴＰを加水分解してｄＵＭＰとＰＰｉとする。形成されたＰＰｉの量をＳｉｇｍａ（＃Ｐ７２７５）から市販されているカップルド酵素試験系を用いて定量する。活性の１単位は時間当たり（８５℃）形成されたＰＰｉの４．０ナノモルとして計算上定義される。
【０２２８】
他のＰＣＲ添加剤もまたＰＣＲ反応の精度および特異性に影響する。０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡを増幅反応混合物中に存在させてよい。Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）およびＮｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０のような洗剤は酵素希釈緩衝液中に存在させる。ノニオン系洗剤の終濃度は約０．１％以下が適切であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼの活性を妨害しない。同様に、グリセロールを酵素調製物中に存在させる場合が多く、一般的には反応混合物中１〜２０％の濃度まで希釈する。グリセロール（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）またはＤＭＳＯ（２〜１０％）を高ＧＣ含量または長い（例えば＞１ｋｂ）鋳型ＤＮＡのＰＣＲにおいて添加することができる。これらの添加剤はプライマー−鋳型ハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融点）およびポリメラーゼ酵素の熱安定性を変化させる。ＢＳＡ（０．８μｇ／μｌ以下）がＰＣＲ反応の効率を向上させる場合がある。ベタイン（０．５〜２Ｍ）もまた高ＧＣ含量およびＤＮＡ長フラグメントについては有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）およびトリメチルアミンＮオキシド（ＴＭＡＮＯ）も使用してよい。上記した各添加剤の最適濃度を決定するために試験ＰＣＲ反応を実施してよい。
【０２２９】
本発明は添加剤、例えば抗体（ホットスタートＰＣＲの場合）およびｓｓｂ（１本鎖ＤＮＡ結合蛋白；より高い特異性）を提供する。本発明はまたアクセサリ因子、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３３３，１５８号および国際公開ＷＯ０１／０９３４７号Ａ２に記載のものと組み合わせた変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼも意図する。
【０２３０】
種々の特異的ＰＣＲ増幅が当該分野で使用可能である（例えば参照により本明細書に組み込まれるＥｒｌｉｃｈ，１９９９，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，Ｉ：１２７−３４；ＰＰｒｅｄｉｇｅｒ  ２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：４９−６３；Ｊｕｒｅｃｉｃら、２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１６−２１；Ｔｒｉｇｌｉａ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：７９−８３；ＭａＣｌｅｌｌａｎｄら、１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：Ｓ６６−８１；ＡｂｒａｍｓｏｎとＭｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：４１−４７を参照できる）。
【０２３１】
要件となる発明はＰＣＲ用途、例えばｉ）非特異的増幅を低減するホットスタートＰＣＲ；ｉｉ）高いアニーリング温度で開始し、次に段階的にアニーリング温度を低下させることにより非特異的なＰＣＲ産物を低減させるタッチダウンＰＣＲ；ｉｉｉ）アウターセットのプライマーおよびインナーセットのプライマーを使用することより信頼性の高い産物を合成するネステッドＰＣＲ；ｉｖ）既知配列に隣接する領域の増幅のためのＰＣＲ；（この方法では、ＤＮＡを消化し、所望のフラグメントをライゲーションにより環化し、次に既知配列に相補のプライマーを用いたＰＣＲにより外側に伸長する）；ｖ）ＡＰ−ＰＣＲ（任意プライミング）／ＲＡＰＤ（ランダム増幅多形ＤＮＡ）；これらの方法は任意のオリゴヌクレオチドを使用した増幅によりあまり知られていない標的配列を有する種からゲノムフィンガープリントを作成する；ｖｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを合成し、次にこれをＰＣＲに使用するするＲＴ−ＰＣＲ。この方法は組織または細胞における特定の配列の発現の検出において極めて感度が高い。これはまたｍＲＡ転写物の定量のためにも使用してよい；ｖｉｉ）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）。これはＤＮＡ／蛋白配列の情報が限定されている場合に使用する。この方法はｃＤＮＡの３’または５’末端を増幅し、各々１つのみの特異的プライマー（＋アダプタープライマー）を有するｃＤＮＡのフラグメントを形成する。次にオーバーラップするＲＡＣＥ産物を合わせて完全長ｃＤＮＡとする；ｖｉｉｉ）種々の組織において異なって発現される遺伝子を発見するために使用されるＤＤ−ＰＣＲ（示差ディスプレイＰＣＲ）。ＤＤ−ＰＣＲにおける第１工程はＲＴ−ＰＣＲを含み、次に短い意図的に非特異性とされたプライマーを用いて増幅を行う；ｉｘ）同じ標本におけるＤＮＡ配列の独特の標的２つ以上を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ。１つのＤＮＡ配列を対照として使用することによりＰＣＲの品質を評価する；ｘ）同じセットのプライマーにつき標的ＤＮＡを競合させる（競合的ＰＣＲ）内標準ＤＮＡ配列（ただしサイズは異なる）を用いるＱ／Ｃ−ＰＣＲ（低調的競合的）；ｘｉ）遺伝子を合成するために使用する帰納的ＰＣＲ。この方法で用いられるオリゴヌクレオチドは末端が重複（〜２０塩基）したセンスおよびアンチセンスの鎖に交替して遺伝ストレッチ（＞８０塩基）に相補的である；ｘｉｉ）非対称ＰＣＲ；ｘｉｉｉ）インサイツＰＣＲ；ｘｉｖ）部位指向性ＰＣＲ変異誘発、において使用できるが、これに限定されない。
【０２３２】
本発明は何れかの特定の増幅系に限定されるわけではない。他の系が開発されれば、それらの系は本発明の実施による利益を被る。
【０２３３】
Ｂ．ＰＣＲ増幅産物の直接クローニングにおける適用
要件となる酵素を使用して作成した増幅産物は当該分野で知られた何れかの方法によりクローニングすることができる。１つの実施形態においては、本発明はＰＣＲ増幅産物の直接のクローニングを可能にする組成物を提供する。
【０２３４】
ＰＣＲ産物をクローニングするための最も一般的な方法はプライマー分子末端上へのフランキング制限部位の取り込みを含む。ＰＣＲサイクルを実施し、次に増幅されたＤＮＡを精製し、適切なエンドヌクレアーゼで制限し、適合するベクター調製物にライゲーションする。
【０２３５】
ＰＣＲ産物を直接クローニングするための方法は、制限認識配列を有するプライマーの調製の必要を排除し、そしてクローニングのためのＰＣＲ産物を調製する制限工程の必要を排除する。更に、そのような方法は好ましくは精製工程を介することなく直接ＰＣＲ産物をクローニングできるようにする。
【０２３６】
米国特許第５，８２７，６５７号および第５，４８７，９９３号（参照により本明細書に組み込まれる）はＰＣＲ生成した核酸の３’末端に結合させた単一の３’−デオキシ−アデノシンモノリン酸（ｄＡＭＰ）残基を利用するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物の直接クローニングのための方法を開示している。適当な制限酵素と反応させると単一の３’−末端デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）残基を与える認識配列を有するベクターを作成する。即ち、適当な制限部位を内部に有するプライマーを作成する必要なく、遺伝子のＰＣＲ生成コピーをベクターに直接クローニングできる。
【０２３７】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは鋳型の非存在下においてＰＣＲ産物の３’末端に単一のｄＡＴＰを付加させる末端トランスフェラーゼ活性を示す。この活性はＴａｑを用いて増幅したＰＣＲ産物を単一の３’ｄＴオーバーハングを含有するベクターに直接ライゲーションするＴＡクローニング法の基本となる。一方、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは末端トランスフェラーゼ活性を欠いており、即ち、平滑末端ベクターに効率的にクローニングされる平滑末端ＰＣＲ産物を生成する。本発明はまた参照によりその全体が本明細書に組み込まれる争中の米国特許出願第１０／０３５，０９１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００１年１２月２１日出願）；係属米国特許出願第１０／０７９，２４１号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年２月２０日出願）；係属米国特許出願第１０／２０８，５０８号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年７月３０日出願）；および係属米国特許出願第１０／２２７，１１０号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年８月２３日出願）に開示されている通り、Ｔａｑ（５Ｕ／ｕｌ）、組み換えＰＥＦ（４Ｕ／ｕｌ）およびＰｆｕＧ３８７Ｐ（４０ｎｇ／μｌ）の混合物を含有するＥａｓｙＡ組成物を包含する。２．５Ｕ／ｕｌ即ちｕｌ当たり〜２０〜５０ｎｇの低減された塩基類似体検出活性を有するクローニングされた古細菌ＤＮＡポリメラーゼを用いると、Ｔａｑ:Ｐｆｕの比率は好ましくは１：１、より好ましくは２：１以上である。
【０２３８】
１つの実施形態において、本発明は高ｐＨにおいてＤＮＡポリメラーゼ融合物の存在下に生成され、その後、１５〜３０分間７２℃でｄＡＴＰの存在下ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートされるＰＣＲ産物を提供する。次に増幅されたＤＮＡ産物の末端に３’−ｄＡＭＰを添加することにより、当該分野でよく知られた方法に従ったＴＡクローニングベクター内へのクローニングを可能とする。
【０２３９】
Ｃ．ＤＮＡ配列決定における適用
本発明はまた高ｐＨでプライマー伸長反応を触媒するための熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ融合物を使用したジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列決定方法を提供する。ジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列決定のための方法は当該分野で知られており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，０７５，２１６号、第４，７９５，６９９号および第５，８８５，８１３号に開示されている。本発明は低減されたｄｄＮＴＰ識別を有するｅｘｏ−Ｐｆｕ（例えばＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ二重変異体）またはＪＤＦ３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体を含むＤＮＡポリメラーゼ融合物を包含する。
【０２４０】
Ｄ．変異誘発における適用
本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物はまたＰＣＲ系または直線増幅系の変異誘発に関わる向上した効果を提供する。従って本発明は高ｐＨにおける部位指向性変異誘発のためのＤＮＡポリメラーゼ融合物および市販のキット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）への、その組み込みを提供する。部位指向性変異誘発法および試薬は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／１９８，４４９号（Ｈｏｇｒｅｆｅら；２００２年７月１８日出願）に記載されている。本発明はまたＭｕｔａｚｉｍｅ（ＰＥＦと組み合わせたｅｘｏ−Ｐｆｕ、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｋｉｔ）も包含する。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈのキットは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる係属米国特許出願第１０／１５４，２０６号（２００２年５月２３日出願）に開示されている。
【０２４１】
本明細書に記載したＤＮＡポリメラーゼ融合物は従来のＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡポリメラーゼ製剤と同様の方法で使用され、そして、ＰＣＲを含む何れかのプライマー伸長用途において高ｐＨで使用することによりより短い伸長時間で高い生成物収率をもたらすことができる。特に、典型的には１〜２分／ｋｂの伸長時間を必要とし、増幅に数時間かかるゲノム標的の増幅は、本明細書に記載したＤＮＡポリメラーゼ融合物を用いれば伸長時間が５〜３０秒／ｋｂ以下まで低減されるため、開示した発明により大きく促進される（実施例３参照）。
【０２４２】
本発明の他の用途はＲＴ−ＰＣＲ、部位指向性変異誘発およびランダム変異誘発を包含する。これらの用途の全てにおいて使用される本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物は長さの許容力を増大させ、反応時間を短縮し、そして、全ての標準的プロトコルにおいて全体的な性能を向上させる（例えば３参照）。
【０２４３】
プルーフリーディング活性（３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性）を有するＤＮＡポリメラーゼ融合物は高忠実度のＰＣＲのために有用である。高忠実度ＰＣＲに有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物は、複合ゲノムおよび/またはプラスミド鋳型を用いた相当する非融合ポリメラーゼ（３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有する）のみの場合と比較して、≧１０％増大した３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲ忠実度および取り込み精度を示す。
【０２４４】
より高い誤挿入および/または誤対形成伸長の頻度を有するＤＮＡポリメラーゼ融合物はＰＣＲランダム変異誘発に有用である。ＰＣＲランダム変異誘発に有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物は好ましくは、プラスミド鋳型のための相当する非融合のポリメラーゼと比較して、≧１０％増大した変異誘発特性または変異スペクトルの変化を示す。
【０２４５】
「変異誘発特性」とは変異率およびアンプリコンのｋｂ当たりの変異例の全体数を意味する。
【０２４６】
「変異スペクトル」とは一過性および転換型の変異の数を意味する。「変異スペクトル」とはまた一過性の転換型に対する比も包含する。好ましくは、一過性の転換型に対する比は１：１である。
【０２４７】
本発明において意図するＤＮＡポリメラーゼ融合物は全てＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲに有用である。
【０２４８】
ＰＣＲ増幅および直線増幅のために使用されるプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ融合物は部位指向性変異誘発に有用である。
【０２４９】
３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼ融合物は配列決定用途に有用である。配列決定に有用なＤＮＡポリメラーゼ融合物はより短い伸長時間、より高い効率、より高い特異性、より高い忠実度（より高精度の取り込み）およびより高いプロセシビティ（配列決定鋳型のための混合物の非キメラ成分より≧１０％高値の増大）の１つ以上を示す。３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼ融合物もまたランダム変異誘発に有用である。
【０２５０】
キット
本発明はまた、要件となる組成物の容器１つ以上、および、一部の実施形態においてはＰＣＲにおける合成を含むポリヌクレオチド合成のために使用する種々の試薬の容器を有するパッケージユニットを含むキットフォーマットを意図する。キットはまた、以下の要素、即ち：ポリヌクレオチド前駆体、プライマー、緩衝液（好ましくは高ｐＨ緩衝液）、使用上の注意および対照品の１つ以上を含んでよい。キットは本発明の方法を実施するための適当な比率で混合された試薬の容器を含んでよい。試薬の容器は好ましくは要件となる方法を実施する際に測定工程を不要にする単位量の試薬を含有する。
【０２５１】
本発明は本発明のＤＮＡポリメラーゼ融合物および高ｐＨ緩衝液、ＰＣＲ増強試薬、および、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ配列決定または変異誘発のための試薬を含むキットを意図する。
【０２５２】
ＤＮＡを配列決定するためのキットは多くの容器手段を含む。第１の容器手段は例えば本発明のポリメラーゼの実質的に精製された試料を含む。第２の容器手段はＤＮＡ鋳型に相補なＤＮＡ分子を合成するために必要とされる１種または多くの種類のヌクレオチドを含んでよい。第３の容器手段は１種または多くの異なる種類のターミネーター（例えばジデオキシヌクレオシド三リン酸）を含んでよい。第４の容器手段はピロリン酸を含んでよい。上記した容器手段のほかに、１種または多くのプライマーおよび/または適当な配列決定緩衝液、好ましくは高ｐＨ緩衝液を含む、別の容器手段をキットに含めてよい。
【０２５３】
核酸の増幅または合成のために使用されるキットは例えば本発明の実質的に純粋なポリメラーゼ融合物を含む第１の容器手段、および、単一種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物および/または高ｐＨ緩衝液を含む別の容器手段の１つまたは多くを含む。
【０２５４】
種々のプライマー並びに適当な増幅用または合成用の緩衝液をキットに含めてよい。
【０２５５】
所望により、本発明のキットはまた核酸分子の合成または配列決定の間に使用してよい検出可能に標識されたヌクレオチドを含む容器手段も含んでよい。多くの標識の１つをこのようなヌクレオチドを検出するために使用してよい。代表的な標識の例は、放射性同位体、蛍光標識、ケミルミネセント標識、バイロルミネセント標識および酵素標識である。
【０２５６】
以上のように本発明を詳述したが、これは特段の記載が無い限り本発明を限定する意図のない説明目的のみに提示される以下の実施例を参照することにより更に容易に理解される。
【実施例】
【０２５７】
実施例１.
ＤＮＡポリメラーゼ融合物の構築
異なるＤＮＡポリメラーゼのドメインを組み合わせることにより、例えばＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ中の相同部位内にバクテリオファージＴ７のＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシンプロセシビティ因子結合ドメインの挿入により、キメラを作成する。これによりチオレドキシン存在下におけるキメラＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのプロセシビティの実質的な増大が促進される（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｅ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４，ｐｐ．４７９−４８４，１９９７年１月、Ｂｉｏｃｈｅｍ．）。この手法の別の例はＴａｑＤＮＡポリメラーゼへの古細菌ＰＣＮＡ結合ドメインの付加である。次にＰＣＮＡをＴａｑキメラを有するＰＣＲ反応液に添加し、プロセシビティを増強し、より高値の収率を得る（Ｍｏｔｚ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年５月３日；１７７（１８）；１６１７９−８８）。
【０２５８】
キメラＤＮＡポリメラーゼはまたＤＮＡポリメラーゼに２本鎖ＤＮＡ結合蛋白のエレメント（蛋白またはドメイン）を組み合わせることにより作成する。ＤＮＡトポイソメラーゼＶ由来の螺旋−ヘアピン−螺旋ＤＮＡ結合モチーフがＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮＨ（２）末端またはＣＯＯＨ末端、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントに付加されている。得られるキメラは増大したプロセシビティ、塩耐性および熱安定性を有する（Ｐａｖｌｏｖ，ＡＲ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００２年１０月１５日；９９（２１）；１３５１０−５）。別の例はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来の配列非特異的ＤＮＡ結合蛋白Ｓｓｏ７ｄまたはＳａｃ７ｄまたは古細菌ＰＣＮＡＤＮＡ結合ドメインとのＤＮＡポリメラーゼの融合物である。この手法はＰｆｕまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティを増強するために使用される（国際公開ＷＯ０１／９２５０１号Ａ１）。
【０２５９】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｆｕ融合物蛋白はＰＣＴ／ＵＳ０１１７４９２またはＰａｖｌｏｖら、上出に記載の通り精製する。
【０２６０】
（実施例２）
キメラＤＮＡポリメラーゼ混合物製剤
キメラＤＮＡポリメラーゼ混合物製剤はキメラＤＮＡポリメラーゼ、および、（１）プルーフリーディングまたは非プルーフリーディングのキメラＤＮＡポリメラーゼ；または（２）プルーフリーディング＋非プルーフリーディング、非プルーフリーディング＋非プルーフリーディング、または、プルーフリーディング＋プルーフリーディングのＤＮＡポリメラーゼ混合物、例えばＰｆｕ、Ｔａｑ、Ｐｆｕ／Ｔａｑ、Ｐｆｕ／ｅｘｏ−Ｐｆｕ、Ｔａｑ／ｅｘｏ−Ｐｆｕ、Ｐｆｕ／ＪＤＦ３、またはｐｏｌ−Ｐｆｕ（ＰｆｕＧ３８７Ｐ）とのこれらの組み合わせの何れかよりなる。混合物製剤の特定の非限定的な例は２．５ＵＰｆｕ／０．２５ＵキメラＰｆｕである。キメラＤＮＡ混合物は少なくとも１つの野生型および/または少なくとも１つの変異体のＤＮＡポリメラーゼ（本明細書において定義）と組み合わせてキメラＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０２６１】
ＤＮＡポリメラーゼキメラとブレンドする野生型ＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼ活性、プルーフリーディング活性のネイティブの水準を有する何れかのネイティブまたはクローニングされたＤＮＡポリメラーゼであり、そして好ましくはＰｆｕまたはＴａｑのような熱安定性である。キメラＤＮＡポリメラーゼとｗｔＤＮＡポリメラーゼをブレンド（例えば本明細書に記載した何れかの比において）し、そして何れかの複製アクセサリ因子（ＤＮＡ合成を増強する蛋白）またはＰＣＲ増強添加剤、例えばＰｆｕｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）、ＰＣＮＡ、ＲＰＡ、ｓｓｂ、抗体、ＤＭＳＯ、ベタインまたは３’〜５’エキソヌクレアーゼ（例えばＰｆｕＧ３８７Ｐ）と混合する。市販の有用な変異または切断の特定の非限定的な例は、ウラシル非感受性を付与するＰｆｕにおけるＶ９３Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＰｆｕにおけるＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、および、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を排除するＴａｑのＮ末端切断（ＫｌｅｎＴａｑ）である。キメラＤＮＡポリメラーゼおよび変異体ＤＮＡポリメラーゼは何れかの比率でブレンドし、そして何れかの複製アクセサリ因子またはＰＣＲ添加剤と混合する。ＤＮＡポリメラーゼ製剤はｗｔ、ｗｔおよび変異体、変異体および変異体ＤＮＡポリメラーゼの何れかの混合物である。キメラＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ製剤はいずれかの比で混合し、そして、いずれかの複製アクセサリ因子またはＰＣＲ添加剤と混合する。
【０２６２】
高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液
高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液は１０×濃度で製剤し、最も一般的に作成されているＰＣＲ反応緩衝液のための標準である終濃度１×でＰＣＲ反応に使用する。本発明において有用な１０×緩衝液製剤は３００ｍＭトリスｐＨ１０．０またはｐＨ１１．８；１００ｍＭ  ＫＣｌ；１００ｍＭ硫酸アンモニウム；２０ｍＭ硫酸マグネシウム；１％ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００；１ｍｇ／ｍｌヌクレアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。この製剤は本発明で用いる成分または成分濃度を限定するものではない。緩衝成分以外の緩衝剤の成分は特定のＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ混合物の最高の活性のための要件に応じて変動する。
【０２６３】
（実施例３）
キメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた、またはキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含有するＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いたＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応条件
ＰＣＲ反応は１）トリス成分はｐＨ１０．０または１１．８であり、終濃度３０ｍＭであること、および２）混合物は０．１５〜１．３ＵＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄキメラＤＮＡポリメラーゼ（配列は本明細書および参照によりその全体が本明細書に組み込まれる１００１／９２５０１に記載）または０．２５ＵＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄおよび２．５Ｕまたは５．０Ｕの何れかのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼよりなるキメラＤＮＡポリメラーゼ混合物を含有していたこと以外は、標準的な条件下において１×クローニングＰｆｕＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で実施した。全てのＰＣＲ反応は２Ｕ／５０μｌのクローニングされたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）を含有していた。長さ０．９〜６．０ｋｂの全てのゲノム標的に対し、ＰＣＲ反応の組成は１００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ、３００μＭ各ｄＮＴＰおよび１００ｎｇ各プライマーとした。１９ｋｂのゲノム標的に対しては、ＰＣＲ反応の組成は２５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ、５００μＭ各ｄＮＴＰおよび２００ｎｇ各プライマーとした。
【表Ｂ】
0004722035.tif 000004
0004722035.tif 000005
【０２６４】
ＰＣＲ増幅に対する緩衝液ｐＨの影響
キメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応に対するｐＨの影響を明らかにするために、１×Ｐｆｕ反応緩衝液を用いてＰＣＲ反応を準備し、その際トリス成分のｐＨをｐＨ５．０〜１２．０に滴定した（図＃１＆２）。Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ／ＰｆｕＴｕｒｂｏ混合物（０．２５ＵＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ＋２．５Ｕまたは５．０ＵのＰｈｕＴｕｒｂｏ）を用いながらｋｂ当たり１５秒の伸長時間で６ｋｂのヒトベータグロビンゲノム標的を増幅した。ＰｈｕＴｕｒｂｏ単独では、この標的をｋｂ当たり１５秒で増幅することはできない。増幅はよりプロセシビティの高いＰｈｕ−Ｓｓｐｏ７ｄの寄与によってのみ達成される。増幅はｐＨ８．５で生じ、ｐＨ１０．０〜１２．０で最強となり、キメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼに対する高ｐＨの増強作用が明らかになった（図１＆２）。
【０２６５】
長ゲノム標的のＰＣＲ増幅のための高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液の増強作用を明らかにするために、ヒトベータグロビンの１９ｋｂフラグメントをＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ／ＰｆｕＴｕｒｂｏ混合物を用いてｋｂ当たり３０秒の伸長時間で増幅した。ｋｂ当たり３０秒の伸長時間によるこの標的の増幅は混合物のよりプロセシビティの高いＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄキメラＤＮＡポリメラーゼの寄与によってのみ達成できる、ｐＨ１０．０およびｐＨ１１．８の反応緩衝液中のＰＣＲ増幅をＰｕｆＴｕｒｂｏのための最適ＰＣＲ反応緩衝液である１．５×クローニングＰｆｕ反応緩衝液中の増幅と比較した（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：Ｖｉｏｌ．１２，＃４；Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｕｐ  ｔｏ  １９ｋｂ）。高ｐＨ１０．０および１１．８反応緩衝液を用いたＰＣＲは１．５×クローニングＰｆｕ緩衝液よりも劇的に優れており、Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄによるＰＣＲ増幅に対する高ｐＨの増強作用が更に明らかになった（図３）。
【０２６６】
キメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅に対する高ｐＨの増強作用を更に明らかにするために、１９ｋｂヒトベータグロビンゲノム標的の増幅をｋｂ当たり３０秒の伸長時間でｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ／ＰｆｕＴｕｒｂｏ混合物（０．２５ＵＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ＋２．５Ｕまたは５．０ＰｆｕＴｕｒｂｏ）および０．８３Ｕおよび１．３ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄを用いて比較した（図４）。これらのＰＣＲ反応の間の有意差は、これらが全てｐＨ１０．０を用いているため、各反応に次いでＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄの量となる（即ち混合物では０．２５ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄであり、非混合物の反応では０．８３Ｕおよび１．３ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄとなる）。クローニングされたＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いない０．８３Ｕおよび１．３ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄを有する反応（＃３および＃４図４）はＤＮＡポリメラーゼの総単位は混合物反応のほうが高値であったにもかかわらず僅か０．２５ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄを有していた混合物の反応（＃１および＃２図４）よりも劇的に高値の収率をもたらしている（混合物では２．７５Ｕ＃１、５．２５Ｕ＃２，そしてＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ反応の場合は０．８３Ｕ＃３および１．３Ｕ＃４−図４）。
【０２６７】
ｐＨ１０．０における反応緩衝液を用いたＰＣＴの性能
ＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄキメラＤＮＡポリメラーゼの単位滴定を用いた１９ｋｂヒトベータグロビン標的の増幅効率を比較した（図５）。全ての酵素はその最適反応緩衝液中で使用した。Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄについてはｐＨ１０．０の緩衝液を使用し、ＫＯＤホットスタートについてはＫＯＤホットスタート緩衝液を、そしてＨｅｒｃｕｌａｓｅにはＨｅｒｃｕｌａｓｅ緩衝液を使用した。長さ１０ｋｂ超のゲノム標的の増幅のために最適であるＨｅｒｃｕｌａｓｅ反応には３％ＤＭＳＯを添加した。ｋｂ当たり３０秒の伸長時間を用いた。大部分のＰＣＲ酵素はこの長さの標的についてはｋｂ当たり１〜２分の伸長時間を必要とする。ｐＨ１０．０緩衝液中のＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄの全ての単位量（０．２５〜１．３Ｕ）はＰＣＲ産物をもたらした。ＨｅｒｃｕｌａｓｅおよびＫＯＤホットスタート反応はこの伸長時間ではいずれのＰＣＲ産物も生成しなかった。
【０２６８】
より小さいゲノム標的の増幅も高ｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄキメラＤＮＡポリメラーゼおよびＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて比較した。ヒトアルファ−１抗トリプシン（Ｈα１ＡＴ）の９００ｂｐフラグメントを１）ｐＨ１０．０またはｐＨ１１．８のＰＣＲ反応緩衝液中０．５Ｕまたは０．８３ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ、および２）ＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタート１Ｕを用いて１秒の総伸長時間で増幅した（図６）。Ｈα１ＡＴの２．６ｋｂフラグメントを、ｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中０．５Ｕ、０．８３Ｕおよび１．３ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ、および、ＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中１．２５Ｕおよび２．５ＵのＫＯＤホットスタートを用いながら、ｋｂ当たり２秒の伸長時間（総伸長時間５秒）（図７）およびｋｂ当たり３０秒の伸長時間（総伸長時間１分１８秒）（図９）で増幅した。６ｋｂのヒトベータグロビンをｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中０．５Ｕ、０．８３Ｕおよび１．３ＵのＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ、および、ＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中１．２５Ｕおよび２．５ＵのＫＯＤホットスタートを用いながら、ｋｂ当たり１０秒の伸長時間（総伸長時間１分）（図８）で増幅した。全ての標的の伸長時間は大部分のＰＣＲ酵素の標準的な時間より短かった。ｋｂ当たり３０秒〜２分が大部分のＰＣＲ酵素の標準である。全ての標的に対し、高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼは全ての単位量（反応当たり０．２５〜１．３Ｕ）において非常に優れた性能を示した。
【０２６９】
プロセシビティのあるキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと共に高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液を使用することにより（ＰＥＦ／ｄＵＴＰａｓｅ存在下）、ＰＣＲ伸長時間はゲノム標的の増幅において大きく低減した。１〜６ｋｂのゲノム標的の場合は、非キメラＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡポリメラーゼ製剤に対して１分／ｋｂの伸長時間はｋｂ当たり１〜１０秒に低減された。１７〜１９ｋｂのゲノム標的の場合は、非キメラＤＮＡポリメラーゼ／ポリメラーゼ製剤に対して２分／ｋｂの伸長時間は３０秒／ｋｂに低減された。高ｐＨ反応緩衝液／キメラＤＮＡポリメラーゼ／キメラＤＮＡポリメラーゼ混合物の組み合わせは従来のＰＣＲ反応緩衝液／ＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡポリメラーゼ混合物の組み合わせと同様の方法で使用され、そして、ＰＣＲを含む何れかのプライマー伸長用途において使用することにより短縮された伸長時間で高収率とすることができる。主な用途は典型的にはｋｂ当たり１〜２分の伸長時間を有し、増幅に数時間かかる場合があるゲノム標的の増幅である。伸長時間は高ｐＨ緩衝液およびキメラＤＮＡポリメラーゼを用いれば、ｋｂ当たり１〜３０秒またはそれより短時間まで低減できる。増幅時間も劇的に低減され、ＰＣＲ用途が大きく向上した。他の用途はＲＴ−ＰＣＲ、部位指向性変異誘発およびランダム変異誘発を包含する。これらの用途の全てにおいて使用される高ｐＨ反応緩衝液／キメラの組み合わせは長さの許容性を増大させ、反応時間を短縮し、そして全ての標準的プロトコルにおいて全体的性能を高度に増大させる。
【０２７０】
本発明の実施は特段の記載が無い限り当業者のよく知る分子生物学、細胞生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ手法の従来の手法を使用する。このような手法は文献に詳述されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｃｓｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．とＬａｎｅ，Ｄ．）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｂｅｌら編、１９９５）を参照できる。
【０２７１】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願および公開された参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明はその好ましい実施形態を参照しながら特に示し記載されているが、当業者の知るとおり、添付の請求項により包含される本発明の範囲を外れることなく種々の形態および詳細事項の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】ｋｂ当たり１５秒の伸長時間により増幅した６ｋｂヒトベータグロビンゲノムＤＮＡ標的（総伸長時間１分３０秒）。ＰＣＲ反応緩衝液は５．０〜１０．０の３０ｍＭトリスｐＨ勾配を用いた１×クローニングＰｆｕ緩衝液よりなるものとした。キメラＤＮＡポリメラーゼ混合物は、Ａ；合計２．７５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび２．５ＵＰｆｕＴｕｒｂｏ、およびＢ；合計５．２５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび５．０ＵＰｆｕＴｕｒｂｏとした。Ｍは１ｋｂＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【図２】ｋｂ当たり１５秒の伸長時間により増幅した６ｋｂヒトベータグロビンゲノムＤＮＡ標的（総伸長時間１分３０秒）。ＰＣＲ反応緩衝液は９．５〜１２．０の３０ｍＭトリスｐＨ勾配を用いた１×クローニングＰｆｕ緩衝液よりなるものとした。キメラＤＮＡポリメラーゼ混合物は、合計２．７５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼとした。Ｍは１ｋｂＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【図３】１９ｋｂベータグロビンゲノム標的に関する高ｐＨ反応緩衝液と１．５×クローニングＰｆｕ反応緩衝液の比較。レーン１および２はｐＨ１０緩衝液の場合である。レーン３および４はｐＨ１１緩衝液の場合である。レーン５および６は１．５×クローニングＰｆｕ反応緩衝液の場合である。レーン１、３および５は合計２．７５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび２．５ＵＰｆｕＴｕｒｂｏよりなるキメラＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いて増幅した。レーン２、４および６は合計５．２５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび５．０ＵＰｆｕＴｕｒｂｏよりなるキメラＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いて増幅した。Ｍは１ｋｂＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。ｋｂ当たり３０秒の伸長時間を用いた。
【図４】１９ｋｂベータグロビンゲノム標的のＰＣＲ増幅に関する、キメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ／ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ混合物および高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよびＨｅｒｃｕｌａｓｅＰＣＲ反応緩衝液中のＨａｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼの比較。レーン１〜４はｐＨ１０のＰＣＲ反応緩衝液を使用した。レーン５〜８はＨｅｒｃｕｌａｓｅＰＣＲ反応緩衝液を使用した。レーン１は合計２．７５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび２．５ＵＰｆｕＴｕｒｂｏよりなるキメラＤＮＡポリメラーゼ混合物で増幅した。レーン２は合計５．２５Ｕ／反応に対し０．２５ＵキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび５．０ＵＰｆｕＴｕｒｂｏよりなるキメラＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いて増幅した。レーン３は０．８３ＵのＰｆｕキメラＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。レーン４は１．３ＵのキメラＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。レーン５および６はＤＭＳＯ非存在下で５．０ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。レーン７および８は３％ＤＭＳＯ存在下で５．０ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。ｋｂ当たり３０秒の伸長時間を用いた。ＭはＬａｍｂｄａＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【図５】高ｐＨ  ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの単位滴定およびｋｂ当たり３０秒の伸長時間による１９ｋｂヒトベータグロビンの増幅に関するのＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼおよびＫＯＤホットスタートとの性能の比較。＃１〜４、ｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼ。＃１−０．２５Ｕ；＃２−０．５Ｕ；＃３−０．８３Ｕ；＃４−１．３Ｕ。＃５〜６、１×ＨｅｒｃｕｌａｓｅＰＣＲ反応緩衝液および３％ＤＭＳＯ中のＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼ５．０Ｕ。＃７〜８、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。＃７−１．２５Ｕ；＃８−２．５Ｕ。ＭはＬａｍｂｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【図６】１秒の総伸長時間による９００ｂｐヒトアルファ−１アンチトリプシン（Ｈα１ＡＴ）の増幅に関するｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕＤＮＡポリメラーゼとＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートの性能の比較。＃１〜２、ｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼ。＃３〜４、ｐＨ１１．８ＰＣＲ反応緩衝液中のＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼ。＃５〜６、ＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中の１．０ＵＫＯＤホットスタート。＃１−０．５Ｕ；＃２−０．８３Ｕ；＃３−０．５Ｕ；＃４−０．８３Ｕ。Ｍ−１ｋｂＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【図７】ｋｂ当たり２秒の伸長時間（総伸長時間５秒）による２．６ｋｂヒトアルファ−１アンチトリプシン（Ｈα１ＡＴ）の増幅に関するｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼとＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ性能の比較。＃１〜３、ｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼ。＃４〜５、ＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。＃１−０．５Ｕ；＃２−０．８３Ｕ；＃３−１．３Ｕ；＃４−１．２５Ｕ：＃５−２．５Ｕ。Ｍ−１ｋｂＤＮＡラダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【図８】ｋｂ当たり１０秒の伸長時間による６ｋｂヒトベータグロビンの増幅に関するｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼとＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートのＰＣＲ性能の比較。＃１〜３、ｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼ。＃４〜５、ＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。＃１−０．５Ｕ；＃２−０．８３Ｕ；＃３−１．３Ｕ；＃４−１．２５Ｕ：＃５−２．５Ｕ。Ｍ−１ｋｂＤＮＡラダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【図９】ｋｂ当たり３０秒の伸長時間（総伸長時間１分１８秒）による２．６ｋｂＨα１ＡＴの増幅に関するｐＨ１０．０ＰＣＲ反応緩衝液中のキメラＰｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼとＫＯＤホットスタートＰＣＲ反応緩衝液中のＫＯＤホットスタートのＰＣＲ性能の比較。＃１〜３、Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄＤＮＡポリメラーゼ。＃４〜５、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ。＃１−０．５Ｕ；＃２−０．８３Ｕ；＃３−１．３Ｕ；＃４−１．２５Ｕ：＃５−２．５Ｕ。Ｍ−１ｋｂＤＮＡラダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【図１０】ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６〜１４）。
【図１１】（ａ）野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと比較した場合のＶ９３ＥおよびＶ９３Ｒ変異体のｄＵＴＰ取り込み。 （ｂ）１００％ｄＵＴＰ存在下におけるＰｆｕＶ９３Ｒ変異体抽出物のＰＣＲ増幅。
【図１２】ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ変異体とｗｔ酵素の「長」ＰＣＲ増幅の効果の比較。
【図１３Ａ】変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列。
【図１３Ｂ】変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列。
【図１４】変異体ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼＤＮＡのＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図１５Ａ】野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと比較した場合のＰｆｕ変異体のｄＵＴＰ取り込み。野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと比較した場合のＰｆｕ変異体Ｖ９３Ｗ、Ｖ９３Ｙ、Ｖ９３Ｍ、Ｖ９３ＫおよびＶ９３ＲのｄＵＴＰ取り込み。
【図１５Ｂ】野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと比較した場合のＰｆｕＶ９３ＤおよびＶ９３Ｒ変異体のｄＵＴＰ取り込み。
【図１５Ｃ】野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと比較した場合のＰｆｕＶ９３ＮおよびＶ９３Ｇ変異体のｄＵＴＰ取り込み。
【図１６】Ｎ末端ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ切断変異体のＤＮＡポリメラーゼ活性。
【図１７】以下の配列を示す。
【０２７３】
Ａ．ＨＭｆ様蛋白
Ｂ．ＨＭｆ様蛋白−Ｔａｑ融合物
Ｃ．ＨＭｆ様蛋白−Ｔａｑ融合物
Ｄ．ＰｆｕＷＴ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｅ．ＰｆｕＷＴ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｆ．Ｐｆｕ−Ｖ９３ＲまたはＥ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｇ．Ｐｆｕ−Ｖ９３ＲまたはＥ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｈ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｉ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｊ．Ｐｆｕ−Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｋ．Ｐｆｕ−Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｌ．ＫＯＤ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｍ．ＫＯＤ−ＨＭｆ様蛋白融合物
Ｎ．ＨＭｆ様蛋白−Ｖｅｎｔ融合物
Ｏ．ＨＭｆ様蛋白−Ｖｅｎｔ融合物
Ｐ．ＨＭｆ様蛋白−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
Ｑ．ＨＭｆ様蛋白−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
Ｒ．ＨＭｆ様蛋白−ＫＤＦ３融合物
Ｓ．ＨＭｆ様蛋白−ＫＤＦ３融合物
Ｔ．ＰＣＮＡ
Ｕ．ＰＣＮＡ−Ｔａｑ融合物
Ｖ．ＰＣＮＡ−Ｔａｑ融合物
Ｗ．ＰＣＮＡ−ＰｆｕＷＴ融合物
Ｘ．ＰＣＮＡ−ＰｆｕＷＴ融合物
Ｙ．Ｐｆｕ−Ｖ９３ＲまたはＥ−ＰＣＮＡ融合物
Ｚ．Ｐｆｕ−Ｖ９３ＲまたはＥ−ＰＣＮＡ融合物
ＡＡ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＰＣＮＡ融合物
ＢＢ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＰＣＮＡ融合物
ＣＣ．Ｐｆｕ−Ｄ１４１Ａ／Ｅ１３４Ａ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＰＣＮＡ融合物
ＤＤ．Ｐｆｕ−Ｄ１４１Ａ／Ｅ１３４Ａ／Ｖ９３ＲまたはＥ−ＰＣＮＡ融合物
ＥＥ．ＫＯＤ−ＰＣＮＡ融合物
ＦＦ．ＫＯＤ−ＰＣＮＡ蛋白融合物
ＧＧ．ＰＣＮＡ−Ｖｅｎｔ融合物
ＨＨ．ＰＣＮＡ−Ｖｅｎｔ融合物
ＩＩ．ＰＣＮＡ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
ＪＪ．ＰＣＮＡ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
ＫＫ．ＰＣＮＡ−ＪＤＦ３融合物
ＬＬ．ＰＣＮＡ−ＪＤＦ３融合物
ＭＭ．Ｓａｃ７ｄ
ＮＮ．Ｓａｃ７ｄ−Ｔａｑ融合物
ＯＯ．Ｓａｃ７ｄ−Ｔａｑ融合物
ＰＰ．Ｓａｃ７ｄ−ＰｆｕＷＴ融合物
ＱＱ．Ｓａｃ７ｄ−ＰｆｕＷＴ融合物
ＲＲ．Ｐｆｕ−Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓａｃ７ｄ様蛋白融合物
ＳＳ．Ｐｆｕ−Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓａｃ７ｄ融合物
ＴＴ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓａｃ７ｄ融合物
ＵＵ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓａｃ７ｄ融合物
ＶＶ．Ｐｆｕ−Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓａｃ７ｄ融合物
ＷＷ．ＫＯＤ−Ｓａｃ７ｄ融合物
ＸＸ．ＫＯＤ−Ｓａｃ７ｄ蛋白融合物
ＹＹ．Ｓａｃ７ｄ−Ｖｅｎｔ融合物
ＺＺ．Ｓａｃ７ｄ−Ｖｅｎｔ融合物
ＡＡＡ．Ｓａｃ７ｄ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
ＢＢＢ．Ｓａｃ７ｄ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
ＣＣＣ．Ｓａｃ７ｄ−ＪＤＦ３融合物
ＤＤＤ．Ｓａｃ７ｄ−ＪＤＦ３融合物
ＥＥＥ．Ｓｓｏ７Ｄ
ＦＦＦ．Ｓｓｏ７Ｄ−Ｔａｑ融合物
ＧＧＧ．Ｓｓｏ７Ｄ−ＰｆｕＷＴ融合物
ＨＨＨ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓｓｏ７Ｄ融合物
ＩＩＩ．Ｐｆｕ−Ｇ３８７Ｐ／Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓｓｏ７Ｄ融合物
ＪＪＪ．Ｐｆｕ−Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ｖ９３ＲまたはＥ−Ｓｓｏ７Ｄ融合物
ＫＫＫ．ＫＯＤ−Ｓｓｏ７Ｄ融合物
ＬＬＬ．ＫＯＤ−Ｓｓｏ７Ｄ融合物
ＭＭＭ．Ｓｓｏ７Ｄ−Ｖｅｎｔ融合物
ＮＮＮ．Ｓｓｏ７Ｄ−Ｖｅｎｔ融合物
ＯＯＯ．Ｓｓｏ７Ｄ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
ＰＰＰ．Ｓｓｏ７Ｄ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ融合物
ＱＱＱ．Ｓｓｏ７Ｄ−ＪＤＦ３融合物
ＲＲＲ．Ｓｓｏ７Ｄ−ＪＤＦ３融合物
【図１８】ＨｈＨモチーフ配列。（ａ）ｔｏｐｏＶ、ＲｅｃＡおよびロイシン応答性レギュレーターシグニチャー配列の間で保存されているモチーフ。ＴｏｐｏＶアミノ酸領域２３６〜２９８はデータベースにヒットがなく、図示しない。リピートＧおよびＨを連結している位置６７７〜６９５および配列末端の１９ａａ残基の間の短い領域は簡便化のため図示しない。不変の残基は白色レタリングを伴ったブルーのバックグラウンド腕に示す。保存位置は黄色バックグラウンド上のハイライトとする。（ｂ）ｔｏｐｏＶＨｈＨモチーフの構造。−ｐｏｌのＬｙｓ−６８およびＬｙｓ−７２およびｔｏｐｏＶのＣおよびＧリピートにおける相当する位置のバックグラウンドはそれぞれシアンとマゼンタの色とする。ａおよびｂにおける二次構造はＪＰＲＥＤを用いて推定した。シリンダーは−螺旋およびそれらの間の線（ｂ）は−ヘアピンを示す。ＭｋＴｐＶ、Ｍ．ｋａｎｄｌｅｒｉ  ｔｏｐｏＶ；ＨＴＨａｓｎＣ、ａｓｎＣの細菌調節蛋白のＨＴＨモチーフのシグネチャーを与える３エレメントのフィンガープリント；ＨＴＨＳＳ，ＨＴＨモチーフの二次構造；Ａ−Ｌ、ｔｏｐｏＶのＨｈＨリピート；ＥｃＲｕｖＡ、Ｅ．ｃｏｌｉＲｕｖＡ蛋白、ＨｓＰｏｌＢ、ヒトポリメラーゼ；ＴａｑＰｏｌ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼＩ；ＨｈＨＳＳ、ＨｈＨモチーフの二次構造。ＡＬＳＣＲＩＰＴ（Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７６７８−７６８５）を用いてアライメントを説明する。引用はＢｅｌｏｖａら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：６０１５。
【図１９】本発明の別の配列。
【図２０】野生型ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
0004722035.tif 000021
【図１３Ａ−３】
0004722035.tif 000022
【図１３Ａ−４】
0004722035.tif 000023
【図１３Ａ−５】
0004722035.tif 000024
【図１３Ａ−６】
0004722035.tif 000025
【図１３Ｂ−１】
0004722035.tif 000026
【図１３Ｂ−２】
0004722035.tif 000027
【図１３Ｂ−３】
0004722035.tif 000028
【図１３Ｂ−４】
0004722035.tif 000029
【図１４】
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0004722035.tif 000031
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0004722035.tif 000035
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ−１】
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【図１７Ｂ−２】
0004722035.tif 000043
【図１７Ｂ−３】
0004722035.tif 000044
【図１７Ｂ−４】
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【図１７Ｂ−５】
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【図１７Ｃ−１】
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【図１７Ｃ−２】
0004722035.tif 000048
【図１７Ｃ−３】
0004722035.tif 000049
【図１７Ｃ−４】
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【図１７Ｃ−５】
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【図１７Ｄ−１】
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【図１７Ｄ−２】
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【図１７Ｄ−３】
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【図１７Ｄ−４】
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【図１７Ｅ−１】
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【図１７Ｅ−２】
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【図１７Ｅ−３】
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【図１７Ｅ−４】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ−１】
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【図１７Ｍ−２】
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【図１７Ｍ−３】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１７Ｐ】
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【図１７Ｑ】
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【図１７Ｒ】
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【図１７Ｓ】
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【図１７Ｔ】
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【図１７Ｕ−１】
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【図１７Ｕ−２】
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【図１７Ｕ−３】
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【図１７Ｕ−４】
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【図１７Ｕ−５】
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【図１７Ｕ−６】
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【図１７Ｖ−１】
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【図１７Ｖ−２】
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【図１７Ｖ−３】
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【図１７Ｖ−４】
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【図１７Ｖ−５】
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【図１７Ｖ−６】
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【図１７Ｗ−１】
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【図１７Ｗ−２】
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【図１７Ｗ−３】
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【図１７Ｗ−４】
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【図１７Ｗ−５】
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【図１７Ｘ−１】
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【図１７Ｘ−２】
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【図１７Ｘ−３】
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【図１７Ｘ−４】
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【図１７Ｙ−１】
0004722035.tif 000098
【図１７Ｙ−２】
0004722035.tif 000099
【図１７Ｙ−３】
0004722035.tif 000100
【図１７Ｚ】
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【図１７ＡＡ−１】
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【図１７ＡＡ−２】
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【図１７ＢＢ−１】
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【図１７ＢＢ−２】
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【図１７ＣＣ−１】
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【図１７ＣＣ−２】
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【図１７ＤＤ−１】
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【図１７ＤＤ−２】
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【図１７ＤＤ−３】
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【図１７ＥＥ】
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【図１７ＦＦ−１】
0004722035.tif 000112
【図１７ＦＦ−２】
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【図１７ＦＦ−３】
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【図１７ＧＧ】
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【図１７ＨＨ−１】
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【図１７ＨＨ−２】
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【図１７ＩＩ−１】
0004722035.tif 000118
【図１７ＩＩ−２】
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【図１７ＩＩ−３】
0004722035.tif 000120
【図１７ＪＪ−１】
0004722035.tif 000121
【図１７ＪＪ−２】
0004722035.tif 000122
【図１７ＫＫ】
0004722035.tif 000123
【図１７ＬＬ−１】
0004722035.tif 000124
【図１７ＬＬ−２】
0004722035.tif 000125
【図１７ＭＭ】
0004722035.tif 000126
【図１７ＮＮ−１】
0004722035.tif 000127
【図１７ＮＮ−２】
0004722035.tif 000128
【図１７ＮＮ−３】
0004722035.tif 000129
【図１７ＮＮ−４】
0004722035.tif 000130
【図１７ＮＮ−５】
0004722035.tif 000131
【図１７ＯＯ−１】
0004722035.tif 000132
【図１７ＯＯ−２】
0004722035.tif 000133
【図１７ＯＯ−３】
0004722035.tif 000134
【図１７ＯＯ−４】
0004722035.tif 000135
【図１７ＯＯ−５】
0004722035.tif 000136
【図１７ＰＰ−１】
0004722035.tif 000137
【図１７ＰＰ−２】
0004722035.tif 000138
【図１７ＰＰ−３】
0004722035.tif 000139
【図１７ＰＰ−４】
0004722035.tif 000140
【図１７ＱＱ−１】
0004722035.tif 000141
【図１７ＱＱ−２】
0004722035.tif 000142
【図１７ＱＱ−３】
0004722035.tif 000143
【図１７ＱＱ−４】
0004722035.tif 000144
【図１７ＲＲ】
0004722035.tif 000145
【図１７ＳＳ】
0004722035.tif 000146
【図１７ＴＴ】
0004722035.tif 000147
【図１７ＵＵ】
0004722035.tif 000148
【図１７ＶＶ】
0004722035.tif 000149
【図１７ＷＷ】
0004722035.tif 000150
【図１７ＸＸ】
0004722035.tif 000151
【図１７ＹＹ】
0004722035.tif 000152
【図１７ＺＺ】
0004722035.tif 000153
【図１７ＡＡＡ】
0004722035.tif 000154
【図１７ＢＢＢ】
0004722035.tif 000155
【図１７ＣＣＣ】
0004722035.tif 000156
【図１７ＤＤＤ】
0004722035.tif 000157
【図１７ＥＥＥ】
0004722035.tif 000158
【図１７ＦＦＦ−１】
0004722035.tif 000159
【図１７ＦＦＦ−２】
0004722035.tif 000160
【図１７ＦＦＦ−３】
0004722035.tif 000161
【図１７ＦＦＦ−４】
0004722035.tif 000162
【図１７ＦＦＦ−５】
0004722035.tif 000163
【図１７ＧＧＧ−１】
0004722035.tif 000164
【図１７ＧＧＧ−２】
0004722035.tif 000165
【図１７ＧＧＧ−３】
0004722035.tif 000166
【図１７ＧＧＧ−４】
0004722035.tif 000167
【図１７ＨＨＨ】
0004722035.tif 000168
【図１７ＩＩＩ】
0004722035.tif 000169
【図１７ＪＪＪ】
0004722035.tif 000170
【図１７ＫＫＫ】
0004722035.tif 000171
【図１７ＬＬＬ】
0004722035.tif 000172
【図１７ＭＭＭ】
0004722035.tif 000173
【図１７ＮＮＮ】
0004722035.tif 000174
【図１７ＯＯＯ】
0004722035.tif 000175
【図１７ＰＰＰ】
0004722035.tif 000176
【図１７ＱＱＱ】
0004722035.tif 000177
【図１７ＲＲＲ−１】
0004722035.tif 000178
【図１７ＲＲＲ−２】
0004722035.tif 000179
【図１８】
0004722035.tif 000180
【図１９−１】
0004722035.tif 000181
【図１９−２】
0004722035.tif 000182
【図１９−３】
0004722035.tif 000183
【図１９−４】
0004722035.tif 000184
【図１９−５】
0004722035.tif 000185
【図１９−６】
0004722035.tif 000186
【図１９−７】
0004722035.tif 000187
【図１９−８】
0004722035.tif 000188
【図１９−９】
0004722035.tif 000189
【図１９−１０】
0004722035.tif 000190
【図１９−１１】
0004722035.tif 000191
【図２０Ａ】
0004722035.tif 000192
【図２０Ｂ】
0004722035.tif 000193
【図２０Ｃ】
0004722035.tif 000194
【図２０Ｄ】
0004722035.tif 000195
【図２０Ｅ】
0004722035.tif 000196
【図２０Ｆ】
0004722035.tif 000197
【図２０Ｇ】
0004722035.tif 000198
【図２０Ｈ】
0004722035.tif 000199
【図２０Ｉ】
0004722035.tif 000200
【図２０Ｊ】
0004722035.tif 000201
【図２０Ｋ】
0004722035.tif 000202
【図２０Ｌ】
0004722035.tif 000203
【図２０Ｍ】
0004722035.tif 000204
【図２０Ｎ】
0004722035.tif 000205
【配列表】
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