(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列において、以下の(a)〜(g)の塩基置換：
(a)2110番塩基ＡがＧ；
(b)3100番塩基ＡがＧ；
(c)3818番塩基ＴがＣ；
(d)4006番塩基ＡがＧ
(e)1251番塩基ＡがＧ；
(f)2226番塩基ＡがＧ；および
(g)3657番塩基ＡがＧ
を有する弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子62、または前記(a)〜(g)の塩基置換に加え、以下の(h)〜(o)の少なくとも１以上の塩基置換：
(h)162番塩基ＴがＣ；
(i)225番塩基ＴがＣ；
(j)523番塩基ＴがＣ；
(k)1565番塩基ＴがＣ；
(l)1763番塩基ＴがＣ；
(m)2652番塩基ＴがＣ；
(n)4052番塩基ＴがＣ；および
(o)4193番塩基ＴがＣ
を有する遺伝子62をコードするDNAの断片であって、弱毒水痘ウイルス株を野生型水痘ウイルス株から区別するためのプローブとして使用することのできるDNA断片。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列において、以下の(a)〜(g)の塩基置換：
(a)2110番塩基ＡがＧ；
(b)3100番塩基ＡがＧ；
(c)3818番塩基ＴがＣ；
(d)4006番塩基ＡがＧ
(e)1251番塩基ＡがＧ；
(f)2226番塩基ＡがＧ；および
(g)3657番塩基ＡがＧ
を有する遺伝子62、または前記(a)〜(g)の塩基置換に加え、以下の(h)〜(o)の少なくとも１以上の塩基置換：
(h)162番塩基ＴがＣ；
(i)225番塩基ＴがＣ；
(j)523番塩基ＴがＣ；
(k)1565番塩基ＴがＣ；
(l)1763番塩基ＴがＣ；
(m)2652番塩基ＴがＣ；
(n)4052番塩基ＴがＣ；および
(o)4193番塩基ＴがＣ
を有する遺伝子62の塩基置換と同一の塩基置換を有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
【請求項３】
請求項１のDNA断片がハイブリダイズするゲノムDNAを保有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列における少なくとも2107番塩基から2229番塩基までのDNA配列を制限酵素NaeＩおよびBssＨIIで切断し、このDNA配列が２または３断片化される水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
【請求項５】
DNA配列が、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとし、水痘ウイルスの遺伝子62を鋳型とするPCR法によって調製されたDNA配列である請求項４の同定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願は、弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２と、この遺伝子６２を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株（以下、「弱毒水痘ウイルス株」と記載する）の同定方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願は、弱毒水痘生ワクチンの有効成分として使用されている弱毒水痘ウイルス岡株およびその有効成分として許容し得る弱毒水痘ウイルス株を、その野生型水痘ウイルス岡株（以下、「強毒親株」または「親株」と記載する）や他の野生型水痘ウイルス株と区別することのできる遺伝子６２と、この遺伝子６２の塩基配列等に基づく弱毒水痘ウイルスの同定方法等に関するものである。
背景技術
水痘・帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ：ＶＺＶ。以下「水痘ウイルス」または「ＶＺＶ」と記載する）は、ヒト水痘および帯状疱疹の原因ウイルスであり、その弱毒株である「弱毒水痘ウイルス岡株」（特公昭５３−４１２０２号公報；Ｌａｎｃｅｔ  ２：１２８８−１２９０，１９７４）に由来のウイルスを唯一のシードとして生ワクチンが製造され、世界各国で広く使用されている［Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ  １９８４：ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．７２５，ｐｐ．１０２−１２４，１９８５］。
この弱毒生水痘ワクチンの安全性および有効性は、現在のところ、製造承認された水痘シードウイルスの継代数の制限（シードロットシステム）によって確保されている。すなわち、シードウイルスを連続継代することによって弱毒ウイルスが遺伝的に変化して病原性を回復することの危険性を回避するため、シード承認時の継代数を０代とし、そこから総継代数１０代以内のウイルスをワクチンとして用いることが義務づけられている。換言すれば、弱毒生水痘ワクチンの品質管理および品質保証は、各ワクチン製造者によるシードロットシステムの遵守に依存している。
なお、健常児ではこの弱毒生水痘ワクチンの接種によって臨床反応を呈することはないが、被接種者が免疫機能に障害のある者の場合には、希に水痘や帯状疱疹を発症することがある。しかしながら、そのような臨床反応が、ワクチン接種によるものか、あるいは野生型水痘ウイルスの自然感染によるものかは特定不能であった。従って、弱毒生水痘ワクチンのシードウイルスである弱毒水痘ウイルス岡株と他の野生型ＶＺＶとの相違を分析することが疫学的に重要となり、そのための方法が幾つか提案されてきた。すなわち、ＶＺＶゲノム遺伝子の構造が報告（Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：１７５９−１８１６，１９８６）されて以来、例えば、ＶＺＶ株間のＤＮＡ塩基配列の違い（Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９：６６０−６６８，１９８６）、制限酵素ＰｓｔＩサイトの有無（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５９：２３３−２３７，１９８９）、ＰＣＲ（Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いるＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）に基づく判定（Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６：１０１６−１０２０，１９９２）、上記ＰｓｔＩサイトの有無とＰＣＲ産物のＲＦＬＰとの組み合わせ（Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３３：６５８−６６０，１９９５）等に基づく方法が報告されてきた。しかしながら、これらの方法はいずれも各々単独では信頼性が低いため、弱毒水痘ウイルス岡株と他の野生株とを正確に区別することは困難であった。
これに対して、この出願の出願人は、弱毒水痘ウイルス岡株と他の水痘ウイルス株（例えば、公知の野生株および自然感染の水痘患者から分離した新鮮野生株等）について広範な遺伝子解析を行い、両者を区別しうる８つの要件を特定するとともに、未知の水痘ウイルスがこれら８要件の全てを満たす場合にのみ、それが生水痘ワクチン用の弱毒水痘ウイルス岡株として許容しうることを見出し、既に特許出願している（ＷＯ９７／４３４２０号公報。以下、先願発明と記載する）。
この出願人らによる先願発明の方法は、弱毒水痘ウイルス岡株と他の水痘ウイルス株とを区別することは可能であるが、弱毒水痘ウイルス岡株とその親株とを区別することは不可能であった。また８つの指標について全てを検査しなければならないため、判定までに多くの時間と手間を要するという問題も存在した。
この出願の発明者らは、弱毒水痘ウイルス岡株とその親株とを区別しうる方法について鋭意研究を重ねた結果、水痘ウイルスの遺伝子６２の変異を検出することによって、弱毒水痘ウイルス岡株と、その親株並びに他の野生型水痘ウイルス株とを簡便かつ確実に区別しうろことを見出した。
この出願の発明は、このような新規な知見に基づいてなされたものであり、弱毒水痘ウイルス岡株に特徴的な遺伝子６２を提供することを課題としている。
またこの発明は、上記遺伝子６２がコードするタンパク質とそのペプチド、これらを抗原として用いることにより得られる抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、並びに上記の遺伝子６２を有する弱毒水痘ウイルス株を提供することを課題としている。
さらにこの発明は、遺伝子６２の変異の有無を指標とする弱毒水痘ウイルス株の同定方法、この方法によって同定された弱毒ウイルス株をシードウイルスとする弱毒生水痘ワクチンを提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、上記の課題を解決する発明として、以下の各発明を提供する。
（１）配列番号１の塩基配列において、少なくとも以下の（ａ）〜（ｄ）の塩基置換：
（ａ）２１１０番塩基ＡがＧ；
（ｂ）３１００番塩基ＡがＧ；
（ｃ）３８１８番塩基ＴがＣ；  および
（ｄ）４００６番塩基ＡがＧ
を有する弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２。
（２）（ａ）〜（ｄ）の塩基置換に加え、以下の（ｅ）〜（ｇ）の少なくとも１以上の塩基置換：
（ｅ）１２５１番塩基ＡがＧ；
（ｆ）２２２６番塩基ＡがＧ；  および
（ｇ）３６５７番塩基ＡがＧ
を有する前記（１）の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２。
（３）（ａ）〜（ｄ）の塩基置換、および（ｅ）〜（ｇ）の少なくとも１以上の塩基置換に加え、以下の（ｈ）〜（ｏ）の少なくとも１以上の塩基置換：
（ｈ）１６２番塩基ＴがＣ；
（ｉ）２２５番塩基ＴがＣ；
（ｊ）５２３番塩基ＴがＣ；
（ｋ）１５６５番塩基ＴがＣ；
（ｌ）１７６３番塩基ＴがＣ；
（ｍ）２６５２番塩基ＴがＣ；
（ｎ）４０５２番塩基ＴがＣ；  および
（ｏ）４１９３番塩基ＴがＣ
を有する前記（２）の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２。
（４）前記（１）から（３）のいずれかの遺伝子６２をコードするＤＮＡの断片であって、塩基置換部分を含む１０塩基対以上の配列からなるＤＮＡ断片。
（５）前記（１）の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２がコードするタンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列において、少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｄ）のアミノ酸置換：
（Ａ）６２８番アミノ酸残基ＳｅｒがＧｌｙ；
（Ｂ）９５８番アミノ酸残基ＡｒｇがＧｌｙ；
（Ｃ）１１９７番アミノ酸残基ＶａｌがＡｌａ；  および
（Ｄ）１２６０番アミノ酸残基ＩｌｅがＶａｌ
を有するタンパク質。
（６）（Ａ）〜（Ｄ）のアミノ酸置換に加え、以下の（Ｅ）〜（Ｈ）の少なくとも１以上のアミノ酸置換：
（Ｅ）９９番アミノ酸残基ＭｅｔがＴｈｒ；
（Ｆ）４４６番アミノ酸残基ＬｅｕがＰｒｏ；
（Ｇ）５１２番アミノ酸残基ＶａｌがＡｌａ；  および
（Ｈ）１２７５番アミノ酸残基ＬｅｕがＳｅｒ
を有する前記（５）のタンパク質。
（７）前記（５）または（６）のタンパク質の一部であり、そのアミノ酸置換部分を含む５アミノ酸残基以上の配列からなるペプチド。
（８）前記（５）または（６）のタンパク質、もしくは前記（７）のペプチドを抗原として用いることにより得られた抗体またはＣＴＬ。
（９）ウイルスゲノムの遺伝子６２が前記（１）から（３）のいずれかの遺伝子６２である弱毒水痘ウイルス株。
（１０）前記（１）から（３）のいずれかの遺伝子６２の塩基置換と同一の塩基置換を有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
（１１）前記（４）のＤＮＡ断片がハイブリダイズするゲノムＤＮＡを保有する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
（１２）前記（８）の抗体またはＣＴＬによって認識される抗原を産生する水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
（１３）配列番号１の塩基配列における少なくとも２１０７番塩基から２２２９番塩基までのＤＮＡ配列を制限酵素ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、このＤＮＡ配列が２または３断片化される水痘ウイルスを選択することを特徴とする弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株の同定方法。
（１４）ＤＮＡ配列が、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとし、水痘ウイルスの遺伝子６２を鋳型とするＰＣＲ法によって調製されたＤＮＡ配列である前記（１３）の同定方法。
（１５）前記（１０）から（１４）のいずれかの方法によって同定された弱毒水痘ウイルス株。
（１６）前記（９）または（１５）の弱毒水痘ウイルス株をシードウイルスとする弱毒生水痘ワクチン。
発明を実施するための最良の形態
水痘ウイルスの遺伝子６２は、トランスアクチベーション機能（転写をトランスに活性化する機能）を司る遺伝子であって、水痘ウイルスゲノムの全配列（Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：１７５９−１８１６，１９８６）中の塩基番号１０５１４２−１０９２４２の領域に存在する遺伝子である。この遺伝子６２は、図１上段に示したように、転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）から矢印方向に転写が進行するため、ゲノム全配列の塩基番号１０９２４２→１０５１４２が“＋”ストランドとなる。従って、配列番号１の第１番塩基“Ａ”はこの＋ストランドの５’末端塩基（ゲノム全配列の１０９２４２番塩基）に対応する。なお、以下の説明においてはゲノム全配列の塩基番号を示す場合があるが、このゲノム全配列に示される遺伝子６２の配列は“−”ストランドであるため、配列番号１に示した塩基とは相補的である。
この発明の弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２は、配列番号１の塩基配列において、表１に示した（ａ）〜（ｄ）の塩基置換を有する遺伝子である。また、この弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子６２は、上記（ａ）〜（ｄ）の塩基置換に加え、表１の（ｅ）〜（ｇ）の少なくとも１以上の塩基置換を有する遺伝子、さらには表１の（ｈ）〜（ｏ）の少なくとも１以上塩基置換を有する遺伝子である。
また、この発明の弱毒水痘ウイルスのタンパク質は、上記の遺伝子６２がコードするタンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列において、表１に示す（Ａ）〜（Ｄ）のアミノ酸置換を有するタンパク質である。また、このタンパク質は、上記（Ａ）〜（Ｄ）のアミノ酸置換に加え、表１に示す（Ｅ）〜（Ｈ）の少なくとも１以上のアミノ酸置換を有するタンパク質である。
0004676063.tif 000002
このようなアミノ酸置換をもたらす塩基置換を有する遺伝子６２を保有する水痘ウイルス岡株は、トランスアクチベーター機能の欠損あるいは減弱によってウイルス粒子形成に必要なタンパク質の発現が全体として低下する結果、弱毒性となるとも考えられる。
このような弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子６２は、例えば公知の弱毒水痘ウイルス岡株（ＢＩＫＥＮ  Ｌｏｔ−６５：（財）阪大微生物病研究会、またはＡＴＣＣ  ＶＲ−７９５）から定法により単離することができる。あるいはまた、後記の方法によって同定された弱毒水痘ウイルス株から単離することもできる。
この発明のＤＮＡ断片は、上記の遺伝子６２をコードするＤＮＡの断片であって、塩基置換部分を含む１０塩基対以上のＤＮＡ断片である。このＤＮＡ断片は、弱毒水痘ウイルス岡株またはこの発明の方法によって新たに同定された弱毒水痘ウイルス株のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素によって切断するなどの方法により得ることができる。このＤＮＡ断片は、例えば、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス株を強毒親株や他の野生型水痘ウイルス株と区別するためのＤＮＡプローブ等として利用することができる。
また、この発明のタンパク質は、上記の遺伝子６２を、例えば大腸菌や酵母などの微生物で発現させることによって得ることができる。すなわち、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡ配列クローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、上記遺伝子６２のコード領域を含むＤＮＡ断片を挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、遺伝子６２がコードしているタンパク質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他のタンパク質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、目的とするタンパク質部分のみを取得することもできる。
これらのタンパク質は、例えば抗体やＣＴＬ作成のための抗原として用いることができる。
この発明のペプチドは、上記タンパク質のアミノ酸配列において、そのアミノ酸置換部分を含む５アミノ酸残基以上の配列である。これらのペプチドもまた抗体やＣＴＬを作製するための抗原等として用いることができる。
この発明の抗体は、上記のタンパク質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。また、この発明のＣＴＬも、上記のタンパク質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として公知の方法により得ることができる。これらの抗体およびＣＴＬは、新たに分離された弱毒水痘ウイルス株の同定方法に用いることができる。
この発明の弱毒水痘ウイルス株は、その遺伝子６２が、上記の弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子６２と同様の塩基置換を有する水痘ウイルス株であって、弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株として許容しうるウイルス株である。このような新しい弱毒水痘ウイルス株は、上記の塩基置換を有する遺伝子６２を保有する水痘ウイルスを選択することにより同定することができる。具体的には、例えば上記のＤＮＡ断片または抗体もしくはＣＴＬを用いた方法により、野生型水痘ウイルス株から鑑別することができる。
あるいはまた、この出願によって提供される方法、すなわち、配列番号１の塩基配列における少なくとも２１０７番塩基から２２２９番塩基までのＤＮＡ配列を制限酵素ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、このＤＮＡ配列が２または３断片化される水痘ウイルスを選択する方法によって同定することができる。上記のとおり、弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２は、２１１０番塩基ＡがＧに置換されている。また、２２２６番塩基ＡがＧに置換されている場合もある。その結果、２１１０番塩基Ａ→Ｇの置換によって配列番号１の２１０７−２１１２番塩基配列には制限酵素ＮａｅＩ認識部位（ＧＣＣＧＧＣ）が形成され、２２２６番塩基Ａ→Ｇの置換によって配列番号１の２２２４−２２２９配列にＢｓｓＨＩＩ認識部位（ＧＣＧＣＧＣ）が形成される。従って、少なくとも配列番号１の２１０７−２２２９番塩基までのＤＮＡ配列を上記２種の制限酵素で切断すれば、そのＤＮＡ配列は、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルス由来であれば、２または３に断片化される。一方、野生型水痘ウイルスや、弱毒水痘ウイルス岡株の強毒親株に由来するＤＮＡ配列の場合には、上記のような塩基置換がないため、上記２種の制限酵素で切断されることはなく１断片のままである。なお、制限酵素で切断するＤＮＡ配列は、例えば、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとし、同定対象とする水痘ウイルス遺伝子６２を鋳型とするＰＣＲ法によって調製することができる。
この発明の弱毒生水痘ワクチンは、上記の方法によって同定された新しい弱毒水痘ウイルス株をシードウイルスとして用いることにより製造されたワクチンである。このような生ワクチンは、弱毒水痘ウイルス岡株をシードウイルスとして用いる既存の弱毒生水痘ワクチンと同様にして製造することができる。
実施例
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２およびその強毒親株の遺伝子６２の塩基配列を決定した。弱毒水痘ウイルス岡株（生ワクチン株）は、ＢＩＫＥＮ  Ｌｏｔ−６５［（財）阪大微生物病研究会］を使用した。強毒親株（野生型水痘ウイルス岡株）は、ＭＲＣ−５細胞で継代増殖させたものを使用した。
具体的には、先願発明（ＷＯ９７／４３４２０号公報）の実施例１に記載の方法に従い、弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株からＤＮＡを抽出し、Ｄｕｍａｓ株の塩基配列（Ｊ．Ｇｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．，６７：１７５９−１８１６，１９８６）に基づいてデザインしたプライマーを用いて各遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。遺伝子６２の全長は、３組のプライマー（表２に示したセンスプライマーＧ６２Ｎ１、Ｇ６２Ｎ２、Ｇ６２Ｎ３、およびアンチセンスプライマーＧ６２Ｒ１、Ｇ６２Ｒ２、Ｇ６２Ｒ３）を用い、それぞれ重複する３断片として増幅した。なお、各センスプライマーはその５’末端にＭ１３フォワード（−３８）配列（Ｇ６２Ｎ１−３の１−１９番塩基）を接続している。またアンチセンスプライマーはその５’末端にＭ１３リバース配列（Ｇ６２Ｒ１−３の１−２０番塩基）を接続している。
0004676063.tif 000003
ＰＣＲ反応溶液は、各デオキシヌクレオチド三燐酸２００ｍＭ、各プライマー０．３μＭ、極微量の鋳型ＤＮＡ、２．５ＵのＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬのＥｘＴａｑバッファーを用いた。また、配列番号３および８のプライマーを用いる場合には、上記の組成に６％ＤＭＳＯを加えた。増幅は、ＰＣＲ自動化装置（米国Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、変性（９４℃：１分間）、アニーリング（５５℃：１．５分間）、伸長（７２℃：２分間）を３０サイクル行った。
次いで、ＰＣＲ精製キット（ドイツＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ社製）を用いてＰＣＲ増幅産物とプライマーとを分離し、精製ＰＣＲ産物をシークエンジングキット（英国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて配列決定し、ＤＮＡシークエンサーＭｏｄｅｌ  ４０００Ｌ（米国ＬＩ−ＣＯＲ社製）で分析した。なお、配列決定の際には、蛍光色素ＩＲＯ−４０で標識したＭ１３フォワードプライマーまたはリバースプライマーを用いた。
また、同様の方法により、弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株の遺伝子４、１４、６１の配列決定も行った。
その結果、遺伝子４、１４および６１については、弱毒水痘ウイルス岡株と強毒親株との間で塩基配列の違いは認められなかった。一方、表３に示したとおり、遺伝子６２については、弱毒水痘ウイルス岡株は１５塩基が強毒親株と異なっていた。これらの塩基置換はＴ→ＣまたはＡ→Ｇであり、８カ所の塩基置換は異なるアミノ酸残基をコードするように２種類の塩基が混在していた（表３のＲ）。また、弱毒水痘ウイルス岡株と強毒親株の遺伝子６２は、Ｄｕｍａｓ株の遺伝子６２とは９塩基が異なっていた。
以上の結果から、弱毒水痘ウイルス岡株と強毒親株とは、それぞれの遺伝子６２の配列の相違によって区別しうることが確認された。
0004676063.tif 000004
実施例２
弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２およびその強毒親株の遺伝子６２のそれぞれ全長配列をＰＣＲ法により増幅し、クローニングした。
プライマーとして表１のＧ６２ＮおよびＧ６２Ｒのオリゴヌクレオチドを用い、反応溶液中に６％ＤＭＳＯを加え、伸長反応を６分間とした以外は実施例と同一の方法により遺伝子６２の全長をＰＣＲ法により増幅した。
プライマーは、それぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ認識部位を有しているため、精製ＰＣＲ産物をこれらの制限酵素で切断した後、同一酵素で予め開列したｐＵＣ１９にクローニングした。次いで、これらをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した後、弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株の各々について９個のプラスミドを各形質転換体から抽出し、インサートの配列を決定した。
結果は第１図に示したとおりである。この第１図から明らかなように、弱毒水痘ウイルス岡株の９クローンは、１５箇所の塩基のいずれか複数が強毒親株とは異なっていた。特に、塩基番号１２５１、２１１０、２２２６、３１００、３６６７、３８１８および４００６の８塩基は全クローンにおいて異なっていた。一方、強毒親株の９クローンでは上記の１５箇所を含め、全て同一の配列であった。
実施例３
種々の水痘ウイルス株の遺伝子６２の部分配列のＲＦＬＰ分析を行った。
弱毒水痘ウイルス岡株および強毒親株は実施例１と同様のものを使用した。その他、水痘ウイルス野生株である河口株、ワクチン未接種の水痘患者５例および帯状疱疹患者５例のそれぞれの水泡液から分離した新鮮野生型ウイルス株１０検体を使用した。なお、河口株および患者から分離した野生型水痘ウイルス株はヒトＨＥＬ細胞またはＭＲＣ−５細胞で２−３代継代の後、使用した。
各水痘ウイルスの遺伝子６２は、配列番号２および３のオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法により増幅した。配列番号２のオリゴヌクレオチドは、水痘ウイルス遺伝子６２（配列番号１）の１８４６−１８６３番塩基に対応するリバースプライマーであり、配列番号３のオリゴヌクレオチドは２６０９−２６２０番塩基に対応するフォワードプライマーである。ＰＣＲ条件は、伸長時間を１分間とした以外は実施例１と同様とした。得られた各ＰＣＲ産物３μＬを、４ＵのＮａｅＩ（宝酒造社製）を３７℃、１．５時間反応させて切断し、次いで４ＵのＢｓｓＨＩＩ（宝酒造社製）を５０℃、１．５時間反応させて切断した。切断したＤＮＡ断片は、４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ  ３：１，ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色して分析した。
結果は第２図に示したとおりである。この第２図にから明らかなように、弱毒水痘ウイルス岡株の遺伝子６２由来のＰＣＲ産物（レーン１）は、ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩによって３つの断片（４０２ｂｐ、２６４ｂｐ、１１６ｂｐ）に切断された。一方、強毒親株および患者から分離した新鮮野生型ウイルス株のＰＣＲ産物（レーン２−１３）はこれら制限酵素では切断されることはなく、１断片のままであった。
以上の結果から、水痘ウイルス遺伝子６２の少なくとも２１０７番塩基から２２２９番塩基までのＤＮＡ配列を、制限酵素ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩによって切断し、このＤＮＡ配列が２または３断片化される水痘ウイルスを、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルスとして許容されるウイルス株として同定しうることが確認された。
実施例４
遺伝子６２発現産物における８カ所のアミノ酸変異とそのトランスアクティベーション活性の関係を分析するため、ＶＺＶの各遺伝子のプロモーター配列とクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子とを有するレポータープラスミドと、弱毒水痘ウイルス岡株または強毒親株の遺伝子６２を保有するエフェクタープラスミドをコトランスフェクションした細胞においてＣＡＴアッセイを行った。
１．材料と方法
１．１  プラスミド
遺伝子４、１４、２８、２９、６２および６８の各プロモーター領域開始コドンの約７５０塩基上流の配列を含むレポータープラスミドｐＩＥ４−ＣＡＴ、ｐｇＣ−ＣＡＴ、ｐＰｏｌ−ＣＡＴ、ｐＭＤＢＰ−ＣＡＴ、ｐＩＥ６２−ＣＡＴおよびｐｇＥ−ＣＡＴ構築した。各プロモーター領域の配列は、５’端にＮｈｅＩまたはＢｇｌＩＩ部位を有するプライマーを用いたＰＣＲ法により弱毒岡株ゲノムから増幅した。ＰＣＲ条件は、伸長時間を１分間とした以外は実施例１と同様とした。増幅産物をＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃｐｌａｓｍｉｄ（米国ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣＡＴ遺伝子の上流に挿入結合した。
エフェクタープラスミドｐＰａｒ−Ｇ６２は強毒親株の遺伝子６２クローンを用いて構築した。また弱毒岡株の遺伝子６２から得た９個のクローンから、第１図のクローン９（１３塩基置換と８アミノ酸置換を有するクローン）を選択し、エフェクタープラスミドｐＶａｃ−Ｇ６２を構築した。
１−２．トランスフェクション
ＣＶ１細胞を、３５−ｍｍプラスチック皿に１０５細胞／ｄｉｓｈの割合で培養し、この細胞にＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いたリポフェクションにより各プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション用の各反応溶液には、０．２５μｇのレポータープラスミドと、様々な量（０−１μｇ）のエフェクタープラスミドを含めた。また、各トランスフェクションにおいては、ベクターｐＵＣ１９の添加によってＤＮＡの全量を２．５μｇに一定するようにした。全ての実験は、各ＤＮＡトランスフェクションにつき少なくとも３回行った。
１−３．ＣＡＴアッセイ
トランスフェクションから４４時間後、細胞の全タンパク質とＣＡＴ量を測定した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、溶解バッファー（ドイツ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で溶解した。各溶出物のＣＡＴ濃度は、ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ドイツ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で決定し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬（米国  Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により決定したタンパク質量に対して標準化した。
２．結果
試験したＶＺＶ遺伝子の全てのプロモーターは、ほとんど背景活性を示さなかった。すなわち、エフェクタープラスミドをトランスフェクトしなかった場合には、ＣＡＴの発現はほとんど観察されなかった。
弱毒岡株由来の遺伝子４プロモーターは、強毒親株および弱毒岡株のそれぞれの遺伝子６２発現産物（ＩＥ６２）によってトランスアクティベートされた（第３図Ａ）。ただし、イフェクタープラスミドが低量の場合には、強毒親株のＩＥ６２が弱毒岡株のＩＥ６２よりも強い転写活性を示した。すなわち、イフェクタープラスミドが最も低量（０．２５μｇ）の場合には、強毒親株ＩＥ６２の転写活性は弱毒岡株ＩＥ６２の７．８倍であり、イフェクタープラスミド量が増加するに従って両者の倍率は小さくなった。
一方、レポータープラスミドｐＣＡＴ−ＩＥ６２をトランスフェクトした細胞からは、ＣＡＴ活性はほとんど検出されなかった（第３図Ｂ）。
さらに、ＶＺＶ遺伝子２８および２９のそれぞれのプロモーター領域を有するｐＣＡＴ−ＰｏｌおよびｐＣＡＴ−ＭＤＢＰ（第３図ＣおよびＤ）、ならびに遺伝子６８のプロモーター配列を有するｐＣＡＴ−ｇＥ（第３図Ｅ）は、強毒親株および弱毒岡株のＩＥ６２によって活性化された。これらのＣＡＴ活性の量依存曲線はｐＣＡＴ−ＩＥ４の場合と類似しており、しかも、弱毒岡株ＩＥ６２に比較して強毒親株ＩＥ６２のほうが強い活性を示した。特にイフェクタープラスミドが最も低量の場合、強毒親株ＩＥ６２の活性は、弱毒岡株ＩＥ６２よりも、各々、７．６倍、５．６倍および１．８倍であった。しかし、遺伝子１４のプロモーター領域を有するｐＣＡＴ−ｇＣをトランスフェクトした細胞ではＣＡＴ活性は検出されなかった（第３図Ｆ）。
以上の結果から、ＶＺＶ遺伝子６２の発現産物（ＩＥ６２）は、前初期の遺伝子４（ＯＲＦ４）、初期の遺伝子２８（ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｏｌ）および遺伝子２９（主要ＤＮＡ結合タンパク質：ＭＤＢＰ）、ならびに後期の遺伝子６８（糖タンパク質Ｅ：ｇＥ）のプロモーターを活性化することが確認された。しかもより重要な点は、弱毒岡株ＩＥ６２の転写活性は常に強毒親株ＩＥ６２よりも低いということである。すなわち、弱毒岡株の遺伝子６２における変異がウイルス複製に影響し、このことがＶＺＶの弱毒化を生じさせていると考えられる。
産業上の利用の可能性
この出願の発明によって、弱毒水痘ウイルス岡株または弱毒水痘ウイルスとして許容される水痘ウイルス株と、他の野生型水痘ウイルスおよび弱毒水痘ウイルス岡株の強毒親株とを簡便かつ正確に区別することが可能となる。また、この出願の発明によって、生ワクチン用の弱毒水痘ウイルス抗原を大量製造することが可能となる。これらの発明によって、ワクチン製造およびワクチン接種の安全性および有効性がより一層確実なものとなる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図の上段は、水痘ウイルス遺伝子６２の構成を示した模式図であり、下段は弱毒水痘ウイルス岡株遺伝子６２から得た９クローンおよび強毒親株の遺伝子６２の配列分析の結果の要約である。
第２図は、次の各水痘ウイルス株遺伝子６２ＰＣＲ産物に対するＲＦＬＰ分析の結果を示すアガロースゲル電気泳動図である。レーン１：弱毒水痘ウイルス岡株、レーン２：強毒親株、レーン３：河口株、レーン４−８：野生型水痘ウイルス、レーン９−１３：野生型帯状疱疹ウイルス。なお、両側のレーンはサイズマーカーである。
第３図は弱毒水痘ウイルス岡株とその強毒親株のそれぞれの遺伝子６２産物（ＩＥ６２）によるＶＺＶ各遺伝子プロモーターの活性化を試験した結果である。ＡはＩＥ４をコードする遺伝子４のプロモーターのエフェクタープラスミド量依存的な活性を示すグラフである。ＣＶ１細胞は、一定量（０．２５μｇ）のｐＣＡＴ−ＩＥ４および様々な量のｐＶａｃ−Ｇ６２（□）またはｐＰａｒ−Ｇ６２（●）をコトランスフェクトされている。以下、ＢはＩＥ６２をコードする遺伝子６２、ＣはＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子２８、Ｄは主要ＤＮＡ結合タンパク質（ｍａｊｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＤＢＰ）をコードする遺伝子２９、Ｅは糖タンパク質Ｃ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ：ｇＣ）をコードする遺伝子１４、ＦはｇＥをコードする遺伝子６８のそれぞれのプロモーター活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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