(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ生産を目的とする微生物の流加培養における培養条件の設定方法であって、
ＲＮＡ収量と呼吸商との関係を求め、
前記関係は、呼吸商が設定値となるように培地を供給する流加培養において、培養が定常状態となったときに測定された微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量から求められるＲＮＡ収量から求められ、
得られたＲＮＡ収量と呼吸商との関係に基づいて、培地組成、培地の流加速度、培養液の抜き取り速度、培養温度、ｐＨ、攪拌条件から成る群から選ばれる少なくとも1種である培養条件を、最適呼吸商を示す条件に設定する、但し、最適呼吸商は、ＲＮＡ収量が最大となる値であるか、微生物内ＲＮＡ含有量が最大となる値である、前記方法。
【請求項２】
呼吸商と微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量との関係を示す制御用マップを予め作成し、制御用マップに基づいて培養条件を、最適呼吸商を示す条件に設定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養条件が、（培地の流加速度／培養容器内の液量）で表される希釈率である請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
呼吸商は、質量分析により検出した、流入気体および排出気体中の酸素および二酸化炭素濃度に基づいて決定する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により、ＲＮＡ収量が最大となる呼吸商または微生物内ＲＮＡ含有量が最大となる呼吸商である最適呼吸商を求め、
培地組成、培地の流加速度、培養液の抜き取り速度、培養温度、ｐＨ、攪拌条件から成る群から選ばれる少なくとも1種である培養条件を、前記最適呼吸商を示す条件に設定し、
設定した培養条件下で、微生物を流加培養する、ＲＮＡ生産用微生物の製造方法。
【請求項６】
培養条件の設定を所定の培養容器で行い、設定した培養条件での微生物培養を前記所定の培養容器より大きい容量または小さい容量の培養容器で行う請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物が酵母である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物培養条件の設定方法およびこの方法を利用したＲＮＡ生産用微生物の製造方法に関する。特に、本発明は、呼吸商を指標として最適培養を行うことで、ＲＮＡ高含有酵母を高効率で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の中でも特に、イノシン酸およびグアニル酸は調味料等の用途がある有用な物質であり、酵母を培養し、得られた酵母からＲＮＡを抽出し、それを原料とすることで製造される。この方法においては、如何に多くのＲＮＡを含有する酵母が得られるかが製造効率の上で重要なポイントのひとつであり、ＲＮＡ含有量の高い変異型酵母の提供がなされている。(特許文献１および２)
【特許文献１】特開昭52-90684号公報
【特許文献２】特公平7-93871号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記ＲＮＡ含有量の高い変異型酵母を用いることで、ＲＮＡの生産量を増強することができる。しかし、これらの酵母を用いる場合でも、実際の生産装置においてＲＮＡの生産を行う場合、用いる酵母の種類、培養液の組成、培養温度、通気条件、培養容器の容量や攪拌装置の種類等により、ＲＮＡの生産量は変化し、実生産において、最大のＲＮＡ生産量を得るための生産条件の設定は容易ではなかった。特に、連続培養においては、時々刻々と培養容器内の状態(例えば、酵母の成育状態、培地の濃度、通気状態等)が変化し、制御すべきファクターが多岐に渡るため最適条件を設定することは至難の技であった。
【０００４】
特許文献１には、一般に微生物内ＲＮＡ含有量は、増殖速度に比例して増加すること、および同じ増加速度においては、培養温度が低いほど微生物内ＲＮＡ含有量は高いことが知られている、と記載されている。一方、特許文献２には、ＲＮＡ高含有酵母を連続培養によって製造した場合の、酵母の比増殖速度（μ）と生成菌体濃度および酵母中のＲＮＡ含有率の関係についての実験結果（実施例２）が示されている。この結果も、比増殖速度が増加すると微生物内ＲＮＡ含有量も増加することを示している。但し、この結果は、比増殖速度が一定以上になると、微生物内ＲＮＡ含有量は頭打ちになり、かつ低下していくことも示している。また、特許文献２の実施例２の結果は、菌体の種類が違うと比増殖速度とＲＮＡ含有率との関係が変化することも示しており、微生物内ＲＮＡ含有量を最大化するためには、菌体毎に培養条件の最適化をする必要があることを示している。
【０００５】
このように、比増殖速度と微生物収量およびＲＮＡ生産量との関係は菌体毎に変化するため、連続培養において、微生物内ＲＮＡ含有量を最大化するためには、最適な比増殖速度を得るために、最適な希釈率（培地の供給速度／培養容器内の液量）を経験的に決定して、この希釈率を用いてケモスタット連続培養で生産する必要があった。ところが、この最適な希釈率は、培養用の培地や容器等の条件が変化すると変化してしまい、培地や容器等の条件が変わる毎に探索しなければならなかった。
【０００６】
特に、実際の培養においては、小スケールでの実験において最適条件（菌体の種類を含めた種々の条件）を検討し、得られた結果を基に、スケールアップをして行くが、スケールアップする毎に容器の条件（容器の容量、形状、攪拌装置、培地の供給方法、培養液の抜き取り方法等）が変化する。そのため、小スケールでの実験結果が、そのまま、スケールアップした培養において活用できず、再度、最適条件を探査する必要があった。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、培養用の培地や容器等の変わった場合でも、再度、最適希釈率等の培養条件を、再度探索することなしに最適条件で酵母等の微生物の培養を行い、ＲＮＡ高含有微生物、例えば、酵母を得ることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の通りである。
［１］
ＲＮＡ生産を目的とする微生物の流加培養における培養条件の設定方法であって、
ＲＮＡ収量と呼吸商との関係を求め、
前記関係は、呼吸商が設定値となるように培地を供給する流加培養において、培養が定常状態となったときに測定された微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量から求められるＲＮＡ収量から求められ、
得られたＲＮＡ収量と呼吸商との関係に基づいて、培地組成、培地の流加速度、培養液の抜き取り速度、培養温度、ｐＨ、攪拌条件から成る群から選ばれる少なくとも1種である培養条件を、最適呼吸商を示す条件に設定する、但し、最適呼吸商は、ＲＮＡ収量が最大となる値であるか、微生物内ＲＮＡ含有量が最大となる値である、前記方法。
［２］
呼吸商と微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量との関係を示す制御用マップを予め作成し、制御用マップに基づいて培養条件を、最適呼吸商を示す条件に設定する［１］に記載の方法。
［３］
培養条件が、（培地の流加速度／培養容器内の液量）で表される希釈率である［１］〜［２］のいずれかに記載の方法。
［４］
呼吸商は、質量分析により検出した、流入気体および排出気体中の酸素および二酸化炭素濃度に基づいて決定する［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
［１］〜［４］のいずれかに記載の方法により、ＲＮＡ収量が最大となる呼吸商または微生物内ＲＮＡ含有量が最大となる呼吸商である最適呼吸商を求め、
培地組成、培地の流加速度、培養液の抜き取り速度、培養温度、ｐＨ、攪拌条件から成る群から選ばれる少なくとも1種である培養条件を、前記最適呼吸商を示す条件に設定し、
設定した培養条件下で、微生物を流加培養する、ＲＮＡ生産用微生物の製造方法。
［６］
培養条件の設定を所定の培養容器で行い、設定した培養条件での微生物培養を前記所定の培養容器より大きい容量または小さい容量の培養容器で行う［５］に記載の方法。
［７］
微生物が酵母である［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、培養用の培地や容器等の変わった場合でも、再度、最適希釈率等の培養条件を、再度探索することなしに最適条件で酵母の培養を行い、ＲＮＡ高含有酵母等の微生物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
[培養条件の設定方法]
本発明は、ＲＮＡ生産を目的とする微生物培養における培養条件の設定方法である。本発明の設定方法では、
（１）ＲＮＡ収量と呼吸商との関係を求め、
（２）得られた結果に基づいて、培養条件を、最適呼吸商を示す条件に設定する。
【００１１】
本発明の方法における微生物培養は、例えば、流加培養である。流加培養は、例えば、連続培養であることができ、連続培養とは、培養液に所定の速度で培地を供給し、かつ培養容器内の培養液を所定の速度で排出(抜き取り)していく方法である。但し、流加培養は、連続培養に限定されず、呼吸商によって培養液に培地を供給する培養方法を包含する。
【００１２】
本発明の設定方法では、（１）において、ＲＮＡ収量と呼吸商との関係を求める。ここで、ＲＮＡ収量は、例えば、微生物収量と微生物内ＲＮＡ含有量との積として求められ、ある微生物を用いる場合の呼吸商と微生物収量との関係、および呼吸商と微生物内ＲＮＡ含有量との関係を求める。
【００１３】
微生物収量は、以下のように求められる。即ち、培養液を容器にとりその重さ（Ａ）を測定する。その後、量りとった培養液を遠心分離し、その遠心上清を廃棄した後、洗浄のため等量の蒸留水を加え懸濁する。この作業を3回繰り返した後、懸濁液を１０５℃で乾燥させ、乾燥した微生物重量（Ｂ）を測定する。Ｂ÷Ａより培養液当たりの微生物収量を算出する。一方、微生物内ＲＮＡ含有量は、STS法（C.Schmit and S.J.Thannhauser: J. Biol. Chem., 161,83(1945)）に準じて測定することができる。
【００１４】
呼吸商は、理論的には、培養系に供給される酸素量、二酸化炭素量と系外に排出される酸素量、二酸化炭素量のそれぞれの流量からを算出される。この算出法で得られる呼吸商RQ1を以下に示す。
【００１５】
【数１】
0004722600.tif 000002
【００１６】
F inは、気体供給速度であり、CO2 in、O2 inは、供給気体中の二酸化炭素、酸素の濃度であり、F outは、気体排出速度であり、 CO2 out、O2 outは、排出気体中の二酸化炭素、酸素の濃度である。
【００１７】
RQ1は、理論的に正しく、呼吸商が1.0より離れたところで制御する場合であっても正確に測定することが出来る。但し、供給する空気及び排出される気体（空気及び微生物によって排出された炭酸ガス等を含む）を流量として正確に測定することが一般には難しい。しかし、質量分析により求めた、流入気体及び排出気体中の酸素及び二酸化炭素濃度からRQ1を算出することで、正確に測定することができる。呼吸商を流入気体及び排出気体中の酸素及び二酸化炭素濃度から算出するに当たり、酸素及び二酸化炭素濃度を質量分析により求めることで、特に、炭酸ガスを低濃度であっても測定でき、高い感度で（一般に使用される赤外線吸収による分析法の100倍程度で）呼吸商を測定できるという利点がある。
【００１８】
質量分析は、磁場固定型質量分析計を用いて行うことが好ましい。質量分析計は、試料をイオン化し、加速するイオン源、イオンを分離する質量分析部、および分離されたイオンを検出するイオン検出部からなり、分析性能は、主として質量分析部の性能に依存する。質量分析部としては、磁場固定型と四重極型が一般によく用いられているが、その他に、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換型があり、そのいずれかを用いて、質量分析を行うことが可能である。但し、本発明では、質量分析を、磁場固定型質量分析計を用いて行うことで、高感度で炭酸ガスを検出することが可能であり、呼吸商の算出が高精度でできるという利点がある。
【００１９】
さらに、質量分析により、流入気体及び排出気体中の不活性ガス濃度もさらに求め、得られた不活性ガス濃度を内部標準として前記呼吸商を算出することが好ましい。不活性ガス濃度を内部標準として算出した呼吸商は、より精度が高く、この精度が高い呼吸商を用いることで、流加制御もより、緻密に行うことができる。
【００２０】
不活性ガス濃度を内部標準として用いた呼吸商RQ4の測定方法および計算方法を図1に示す。この方法では、質量分析計を用いて酸素、炭酸ガスの濃度を測定する。それに加え、供給エアー中の不活性ガスも測定し、内部標準として用いる。その結果、理論的にも正しく、呼吸商が1.0から大きく離れた場合でも正確に呼吸商を算出でき、流加の制御も的確に行うことができる。
【００２１】
培養系内に供給される空気中の不活性ガス（窒素他）は酵母の発酵または呼吸に関与しない気体であるため、供給された空気中の不活性ガス（例えば、窒素等）はそのまま系外に排出される。即ち、流入気体及び排出気体中の不活性ガス濃度は一定している。そこで、系外に排出される気体中に含まれる不活性ガス（窒素）を内部標準として用い、かつその不活性ガス（窒素他）の系内への供給濃度と系外へ排出濃度の比率を求めることにより、通気量に左右されない呼吸商を求めることが可能である。
【００２２】
内部標準に用いる不活性ガスとしては、空気に含まれる量が多く一定である窒素を使用することが好ましい。しかし、窒素以外の不活性ガスである、例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン、ラドンなどを用いることもできる。これらの不活性ガスは、必要により、供給側エアーに予め一定量を添加することができ、それを内部標準として使用することもできる。一定量の不活性ガスを供給側エアーに添加する場合の添加量は、不活性ガスの種類に応じ、かつ使用する不活性ガスに対する質量分析計の感度を考慮して、適宜決定することができる。
【００２３】
呼吸商として、前述のRQ1に代わって、RQ2及びRQ 3を利用することもできる。
【数２】
0004722600.tif 000003
【００２４】
RQ2及びRQ 3は、供給する空気及び排出される気体の流量は測定せず、検出器として安価なガルバニ電極及び赤外吸光分析計を用い、系内に入る空気と排出される気体に含まれる酸素量と二酸化炭素量を測定する方法である。そのため簡易に行える方法であり、一般的に広く使用されている。
【００２５】
工程（１）では、呼吸商と微生物収量および微生物内ＲＮＡ生産量との関係を示す制御用マップを予め作成し、制御用マップに基づいて培養条件を設定することが好ましい。制御用マップは、呼吸商と微生物収量および微生物内ＲＮＡ生産含有量およびＲＮＡ収量との関係を示すマップからなる。制御用マップの作成は、具体的には、以下のように行うことができる。即ち、前述の任意の測定および計算方法により微生物培養時の呼吸商を任意のいくつかの設定値になるように培養する。具体的には、例えば任意の呼吸商となるように培地の流加もしくは培地の流加および培養液の引き抜きを行うことによって呼吸商一定値にすることができるが、呼吸商を任意の値に操作することができれば、この方法に限らない。各々の呼吸商設定値における微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量を測定し、ＲＮＡ収量を算出する。その結果を呼吸商値に対してプロットし、制御マップとする。
【００２６】
工程（２）では、工程（１）で得られた結果に基づいて、培養条件を、微生物収量と微生物内ＲＮＡ含有量のバランスの取れる呼吸商を示す条件、またはＲＮＡ収量が最大になる最適呼吸商あるいは微生物内ＲＮＡ含有量が最大となる最適呼吸商を示す条件に設定する。
【００２７】
設定される培養条件としては、例えば、培地組成、培地の流加速度、培養液の抜き取り速度、培養温度、ｐＨ等を挙げることができる。あるいは、培養条件は、（培地の流加速度／培養容器内の液量）で表される希釈率であることもできる。
【００２８】
培養条件は、最適呼吸商を示す条件に設定される。即ち、工程（１）で求めた、呼吸商と微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量との関係から、微生物収量と微生物内ＲＮＡ含有量のバランスの取れる呼吸商、ＲＮＡ収量が最大になる呼吸商、あるいは微生物内ＲＮＡ含有量が最大となる呼吸商を最適呼吸商として抽出し、この最適呼吸商を与えるように培養条件を設定する。
【００２９】
具体的には、例えば培養条件として培地の流加速度を決める場合、工程（１）で求めた最適呼吸商となるような培地の流加速度または培地の流加および引抜き速度を設定する。また、例えばＲＮＡ生産に最適な培地組成を決める場合、数種類の培地を使用して工程（１）で求めた最適呼吸商となるように培養を行う。各々の培地での微生物収量と微生物内ＲＮＡ収量を測定し、最適な培地組成を決めればよい。すなわち、最適呼吸商は培地が変わった場合でも、変化させた培地を使用した場合の最適呼吸商となり再度最適な呼吸商を探す必要はない。
【００３０】
[ＲＮＡ生産用微生物の製造方法]
本発明は、ＲＮＡ生産用微生物の製造方法を包含し、この方法では、上記本発明の設定方法により設定した培養条件下で微生物を培養する。
【００３１】
微生物は、ＲＮＡ生産用微生物であれば特に制限はなく、公知の微生物を適宜用いることができる。ＲＮＡ生産用微生物としては、例えば、酵母（Saccharomyces属、Candida属他）、大腸菌、糸状菌、放線菌、乳酸菌等を挙げることができる。
【００３２】
本発明の方法は、培養条件の設定を所定の培養容器で行い、設定した培養条件での微生物培養を前記所定の培養容器より大きい容量の培養容器で行う方法に特に適している。即ち、予め小スケールで最適条件を検討し、その最適条件をスケールアップした培養容器で実施する場合に適している。勿論、逆の場合(スケールダウンする場合)にも適用可能であり、あるいは、培養容器の容量は同一であるが、容器の形状が変わったり、攪拌装置等の付随装置が変わったりした場合にも、本発明の方法は良好に適用可能である。
【００３３】
本発明の製造方法により培養された微生物は、適宜、ＲＮＡ抽出方法に供されて、ＲＮＡ抽出が行われる。ＲＮＡ抽出は、常法により適宜行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３５】
実施例１
培養装置として５Ｌジャーファーメンターを用い、３０℃、攪拌数６００ｒｐｍ、通気量1vvm、pH4.5、菌株は酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ａ株を用いた。表１でグルコース３％となるように調製した培地1.5Ｌを入れ加圧殺菌し回分培養を行い、呼吸商測定装置にて呼吸商を測定した。回分培養で数時間経過した後、呼吸商が設定値（1.2、1.4、1.6、1.8）となるように滅菌済の表１の培地を供給し、供給量と等量の培養液の引き抜きを行うという連続培養を行った。連続培養を行い定常状態となったときの微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量を測定した。そのときの結果を制御用マップ図2に示した。図2に示したとおり、微生物内ＲＮＡ含有量は呼吸商1.6でピークを示した、微生物収量は呼吸商が高くなるにつれ低くなった。微生物内ＲＮＡ含有量が高い方が好ましい場合はＲＱ1.6に設定すればよく、微生物収量と微生物内ＲＮＡ含有量を掛け合わせたＲＮＡ収量が高いほうが好ましい場合はＲＱ1.4に設定すればよい。このように本方法では、呼吸商を変化させたときの微生物内ＲＮＡ含有量と微生物収量をしらべることにより、バランスのよいポイントを見つけ出す事が可能である。
【００３６】
【表１】
0004722600.tif 000004
グルコース濃度を変えた場合、それにあわせて他の物質の濃度も変えた。
【００３７】
実施例２
ＫＬａ（酸素移動容量係数）の違いによるＲＮＡへの影響
実施例１において、攪拌数を８００ｒｐｍにする以外は同じ条件で培養を行った。尚、６００ｒｐｍでのＫＬａは380で８００ｒｐｍのときのＫＬａは980である。このときの微生物内ＲＮＡ含有量の比較を図3に示した。図3から明らかなように、ＫＬａが異なっていても微生物内ＲＮＡ含有量のピークはどちらのＫＬａでも1.6にあることが確認された。これにより培養容器が異なるようなＫＬａが異なる場合でも、本方法を用いることにより呼吸商が普遍的な指標として使える事が確認された。尚、図4にＫＬａ＝980のときの微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量、ＲＮＡ収量を示した。
【００３８】
実施例３
菌株を酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ｂ株を用いて、攪拌数を８００ｒｐｍ（ＫＬａ＝980）にした場合以外は実施例1と同じ条件で培養を行った。その結果を図5に、各呼吸商でのＡ株（実施例2の結果）とＢ株の微生物内ＲＮＡ含有量の比較を図6に示した。図5および6に示したとおり、Ｂ株の微生物内ＲＮＡ含有量ピークはＲＱ＝1.4であり、Ａ株とは異なることを確認した。このように本発明の方法を用いて、呼吸商を変化させて微生物内ＲＮＡ含有量と微生物収量を調べる事により、各種菌株での最適な制御呼吸商を見出して、最適条件でＲＮＡ含有酵母を培養する事ができる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
ＲＮＡ製造分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】不活性ガス濃度を内部標準として用いた呼吸商RQ4の測定方法および計算方法を示す。
【図２】実施例1において連続培養を行い定常状態となったときの微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量、ＲＮＡ収量を測定した結果を示す。
【図３】実施例2において連続培養を行い定常状態となったときの微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量を測定した結果を示す。
【図４】実施例2において求めたＫＬａ＝980のときの微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量、ＲＮＡ収量の結果を示す。
【図５】実施例3において連続培養を行い定常状態となったときの微生物収量および微生物内ＲＮＡ含有量、ＲＮＡ収量を測定した結果を示す。
【図６】各呼吸商でのＡ株（実施例2の結果）とＢ株の微生物内ＲＮＡ含量の比較を示す。
【図１】
0004722600.tif 000005
【図２】
0004722600.tif 000006
【図３】
0004722600.tif 000007
【図４】
0004722600.tif 000008
【図５】
0004722600.tif 000009
【図６】
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