(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺気腫の兆候を減少させるかまたは肺気腫を防止するのに有効な量の単離された哺乳動物のＳＰ−Ｄタンパク質を含むエアロゾル製剤である、肺気腫の防止および治療のための薬理学的組成物。
【請求項２】
前記肺気腫は、慢性肺損傷後におこる、請求項１記載の薬理学的組成物。
【請求項３】
気管内投与用途に適する、請求項１又は２記載の薬理学的組成物。
【請求項４】
前記ＳＰ−Ｄタンパク質はアデノウィルスベクターにより発現され、単離されたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の薬理学的組成物。
【請求項５】
肺気腫の兆候を減少させるのに有効な量のＳＰ−Ｄタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の薬理学的組成物。
【請求項６】
肺気腫を防止するのに有効な量のＳＰ−Ｄタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の薬理学的組成物。
【請求項７】
薬理学的に認められる担体を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の薬理学的組成物。
【請求項８】
緩衝液を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の薬理学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明における政府の関連
本明細書に記載した本発明のある様態は、National Institutes of Health、交付番号ＨＬ４１３２０、ＳＣＯＲ  ＨＬ  ５６３８７、ＨＬ  ２８６２３、ＨＬ  ５８７９５およびＨＬ  ０３９０５の下に、米国政府の支持によりなされた。米国政府は、本発明のこれらの態様に対して一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に、生物学的に活性なタンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、肺表面活性剤ホメオスタシスおよび構造、並びに肺およびＳＰ−Ｄ（−／−）ヌルマウスにおける肺胞の構造に含まれるＳＰ−Ｄタンパク質に関する。
【０００３】
発明の背景
肺表面活性化は、正常な肺機構および肺におけるガス交換に必須である。肺表面活性剤は、ＩＩ型上皮細胞により生成され、表面活性化の能力を与えて肺における表面張力を低下させるリン脂質成分から構成されている。さらに、コラーゲン性であり、レクチンドメイン含有ポリペプチドであるコレクチンと呼ばれる表面活性化と関連するタンパク質がある。表面活性剤タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）および表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）と呼ばれるこれらのうちの２つは、同様に表面活性化構造および機能および宿主防御に関連する。肺表面活性剤の定量的欠失および定性的欠失は、共に、新生児の呼吸窮迫、成人呼吸窮迫症候群、表面活性剤タンパク質Ｂの先天性欠失およびアレルギー性喘息に関連する。さらに、肺表面活性剤の欠失は、特に、不適切なまたは悪化した特定の免疫性の設定における微生物攻撃に対するいくつかの個体の増大した罹病性に関与しうる。これらの疾患、並びに肺炎の増大した危険に関連するいくつかの疾患（嚢胞性線維症、早熟、慢性気管支炎、びまん性肺胞損傷）はまた、コレクチン機能における後天性の欠損または欠失と関連し得る。肺胞表面活性剤蓄積は、肺胞マクロファージによるこれらの成分の細胞内合成、分泌、再取り込みおよび分解を含む複数のレベルにおいて調節される。表面活性剤リン脂質およびタンパク質の合成およびクリアランスは、さらに、生後の定常状態表面活性剤濃度を維持する作用を有する発生、機能的、および体液性刺激により影響される。
【０００４】
表面活性剤および正常な肺機能におけるコレクチンの役割は、広範囲に試験されている。Ｃ型レクチンのコレクチン族は、既知の宿主防御機能を有する多数の分子を含む。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄ、またＣ型レクチンは、インフルエンザウィルスおよび単純ヘルペスウィルス並びにグラム陽性およびグラム陰性細菌および種々の菌類に結合する。結合により、これらは、肺胞マクロファージおよび好中球による取り込みを増大する。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄにおける種々の細胞結合部位は、肺胞マクロファージまたは、ＳＰ−Ａの場合には、ＩＩ型上皮細胞において同定された。宿主防御におけるＳＰ−Ａの決定的に重要な役割は、ＳＰ−Ａ欠失マウスが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ群連鎖球菌、シュードモナス  アルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、呼吸性シンシチウムウィルス、アデノウィルスおよびマイコプラスマによる感染症に感受性であるという観察により、支持される。したがって、呼吸性防御機構におけるＳＰ−Ａの明確な役割およびＳＰ−Ｄのそれらしい役割がある。コレクチンはまた、他の複合有機物質、例えば花粉および塵ダニアレルゲンの認識またはクリアランスに関与し得る。しかし、現在、いずれのヒト疾患も、ＳＰ−ＡまたはＳＰ−Ｄにおける特定の欠失には関連していない。
【０００５】
ＳＰ−Ｄは、肺における宿主防御において役割を果たすと提案された４３キロダルトンタンパク質である。このｃＤＮＡおよび遺伝子は、ヒトを含む種々の哺乳動物において配列決定されている。ＳＰ−Ｄは、表面活性剤タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、コングルチニン、ウシコレクチン−４３およびマンノース結合タンパク質を含む他のＣ型レクチンと顕著な構造相同性を共有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究および哺乳動物Ｃａ2+依存性レクチン族（特に共有された構造モチーフ）に対するその密接な構造的関連性は、この宿主防御における役割を支持する。ＳＰ−Ｄは先ず、肺中のＩＩ型上皮細胞および繊毛を有さない細気管支の上皮細胞により比較的高濃度で合成されるが、また胃腸管、心臓、腎臓、膵臓、尿管、生殖器管および腸間膜細胞においても発現され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、ＳＰ−Ｄは、結合、凝集、オプソニン処理および、若干の例においてはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの食細胞による殺菌の活性化を引き起こすレクチンドメイン（または糖結合ドメイン）により生物の表面に結合する。ＳＰ−Ｄは、リポ多糖、種々の細菌、菌類およびインフルエンザウィルスを含むウィルスに結合する。これはまた、肺胞マクロファージおよび多形核細胞の両方に結合する。これは、場合によっては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＩ型細胞によるリン脂質に対するＳＰ−Ａの影響を含む表面活性リン脂質ホメオスタシスにおいて役割を奏し得るが、これには論争の余地があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＰ−Ｄの正確な役割は、依然として不明確である。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、表面活性剤タンパク質が表面活性剤ホメオスタシスの調節において重要であり得るという概念を支持する。疎水性表面活性剤タンパク質ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは、表面活性剤単一層の生成において役割を果たすが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、表面活性剤タンパク質Ａはまた、ＩＩ型上皮細胞による表面活性剤取り込みおよび／または分泌を促進し得ることが示された。事実、ＳＰ−Ａが表面活性剤ホメオスタシスにおいて重要な役割を有することが広く信じられてきた。しかし、ＳＰ−Ａヌルマウスの最近の研究は、表面活性剤分泌または再取り込みにおいて表面活性剤タンパク質Ａの主要な役割を支持していなかった。ＳＰ−Ａの欠失は、肺の明らかな生理学的または形態的構造的異常に至らない。ＳＰ−Ａヌル突然変異マウスは、管状ミエリン図式を欠くが、迅速に吸収され、単一層を生成する高度に機能的な表面活性剤を生成する。表面活性剤脂質合成、分泌および再取り込みは、本質的にＳＰ−Ａヌルマウスにおいて本質的に正常であった。
【０００７】
したがって、表面活性剤調節において作用するさらなる表面活性剤タンパク質は、依然として同定されていない。さらに、正常な肺機能におけるＳＰ−Ｄの正確な役割は、この時点では明確には規定されておらず、その疾患および疾患罹病性における役割は、不明確である。
【０００８】
発明の概要
本発明は、気腫のモデルとして用いることができるＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを提供する。以前は、ＳＰ−Ｄタンパク質が肺の脂質ホメオスタシスに関与していることは、知られていなかった。またＳＰ−Ｄヌルマウスが、気腫の兆候を有することは、知られていなかった。
【０００９】
本発明の１つの実施形態は、ヒト以外のＳＰ−Ｄ（−／−）哺乳動物を含む気腫のヒト以外の哺乳動物モデルである。
【００１０】
さらなる実施形態は、哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質を発現するベクターを、ヒトまたは哺乳動物中に、疾患の兆候を減少させるかまたは疾患を防止するのに有効な量で導入することによる、肺疾患の浄化または治療方法である。
【００１１】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄタンパク質と薬として認められる担体との混合物である、肺疾患を治療するのに有効な量の薬理学的組成物である。
【００１２】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄを上方調節する薬剤である、哺乳動物における肺疾患を治療するための生物学的に活性な薬剤である。
【００１３】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄタンパク質と相互作用する薬剤である、哺乳動物における肺疾患を治療するための生物学的に活性な薬剤である。
【００１４】
さらなる実施形態は、不完全なＳＰ−Ｄを生じるＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異を同定し、試験哺乳動物におけるこの突然変異を、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションまたはＥＬＩＳＡにより同定することによる、哺乳動物における肺疾患への罹病性の診断方法である。
【００１５】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄヌルマウスに肺疾患を発生させ、哺乳動物に薬剤を投与し、その薬剤を、肺疾患が改善されたか否かの効果として同定することによる、肺疾患を治療するのに有用な薬剤の同定方法である。
【００１６】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄ抗体を、ＳＰ−Ｄタンパク質を生成しない任意のマウスからの肺ホモジネートの固体相で精製する方法である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明者等は、ＳＰ−Ｄ（−／−）ノックアウトマウスを作製して、正常な肺機能および発達におけるＳＰ−Ｄの役割を同定し、これらのマウスの肺における生後の気室拡大および自発的な炎症の変化のその時点の進行を例示した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスには、肺胞マクロファージによる慢性炎症および増大したオキシダント生成に関連する進行性肺気腫が発生する。肺の異常は、このマウスを気腫についての優れたモデルにする。気腫の治療における在来の療法、最も一般的なのは肺容積減少手術である、は極めて少ないため、モデルが緊急に必要とされている。気腫におけるモデルマウスに基づいて、本発明者等は、ＳＰ−Ｄタンパク質および発現ベクターを試験する多くの方法、並びにモデルマウスにおいて気腫または慢性肺損傷の他の形態の治療に有効な薬物を提案した。本発明者等はまた、異所の表面活性生成、肺線維症、サルコイドーシス、肺損傷、毒薬／酸素露出、感染症、オキシダント露出の増大といった種々の他の疾患を治療するためのＳＰ−Ｄタンパク質および発現ベクターの使用を提案した。最後に、本発明者等は、ＳＰ−ＤのｃＤＮＡ、ＳＰ−Ｄ抗体、ＰＣＲおよびディファレンシャルハイブリダイゼーション手法を用いて、気腫、肺窮迫症候群、および他の種類の呼吸疾患の危険がある患者を同定することを提案した。本明細書に記載したものに類似するかまたはこれと同等である他の材料および方法を、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい材料および方法をここで記載する。実施例１は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを作製するのに必要なステップについて記載する。
【００１８】
【表１】
0004807902.tif 000002
*  有意な統計的差異が、２日、ｐ＝０．００００１；７日、ｐ＝０．０００２；２週、ｐ＝０．００７；および３週、ｐ＝０．０４の体重において観察された。**ＬＶ：ＢＷ比における有意な統計的差異が、３週において（ｐ＝０．０２）、および６週において（ｐ＝０．０３）体重における差異により観察されたが、体重および肺容積は、この後の時点において統計的に異ならなかった。群あたりの動物Ｎ＝３.７１である。ＬＶ：ＢＷ、肺容積対体重比；ＮＤ、検出されず。
【００１９】
実施例１
ＳＰ−Ｄ（−／−）ノックアウトマウス作製
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、標的遺伝子の不活性化により発生させた。ＳＰ−Ｄ遺伝子のエクソン２の配列を含むｐＧＫｎｅｏ標的ベクターの組み込みにより、ＳＰ−Ｄ遺伝子の第２のエクソンの欠失が発生し、これは、開始メチオニンおよび翻訳開始配列の欠失を含んでいた。エクソン１および２のマウスＳＰ−Ｄ遺伝子配列は、Genbank登録番号ＡＦ０４７７４１に見出すことができる。標的ベクターは、ｐＧＫｎｅｏを用いて、先ずイントロン２〜エクソン６をコードする５．１ｋｂの平滑末端化されたＫｐｎｌを末端に接続したＨｉｎｄＩＩＩゲノムフラグメントを、ネオマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼカセットとの間のＫｐｎｌ部位中にサブクローニングして作製した。その後、イントロンＩの部分を含む１．５−ｋｂゲノムＰｓｔｌフラグメントを、ＸｈｏＩリンカーを末端に接続し、ネオマイシン耐性カセットの５’のＸｈｏＩ部位中にクローニングした。二重選択プロセス下で生存した１０４個のＥＳクローンうちの８個は、５’および３’の両ＰＣＲ分析において、正確に標的されていることが確認された。高度に未分化および増殖性クローンであるクローン９３は、キメラ雄を生じるためＣ５７／Ｂ１６胚盤胞中に発達させされ、注入された。キメラ雄を、ＮＩＨスイスブラック雌に交配した。標的遺伝子を有する雌を得て、ＮＩＨスイスブラック雄に交配し、正常のＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（±）マウスを発生した。異種接合の組合せからの遺伝子型の分布は、メンデルパターンに従い、１１５の子の３０（＋／＋）、４５（＋／−）および２５％（−／−）であり、ＳＰ−Ｄ対立遺伝子に関連する生存における明らかな異常はなかった。
【００２０】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohioにおけるバリア内施設の飼育器において正常に生存し、交配した。マウスは、血清学的に評価されてウィルスフリーであった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるウィルス感染の血清学的証拠は、検死において決定された。
【００２１】
遺伝子型を決定するために、尾切片からのＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化し、エクソン２およびイントロン２の一部を含むゲノムマウスＤＮＡから由来するＰＣＲ生成物およびＧ４１８耐性ｃＤＮＡクローンと検査した。ＳＰ−Ｄ（±）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるＧ４１８耐性をコードする配列の存在とエクソン２欠失が同時に示された。
【００２２】
ＳＰ−Ｄがヌル動物において発現されなかったことを示すために、ＲＮＡブロット分析をヌル、正常および異種接合動物からの肺の全てのＲＮＡを用いて実施した。結果は、正常な大きさのＳＰ−Ｄ  ｍＲＮＡがヌルマウスにおいては完全に消失し、異種接合動物においてはＳＰ−Ｄハイブリダイゼーションバンドの強度が約５０％低下した。長期の露出後、正常のＳＰ−Ｄ  ｍＲＮＡよりも約１５０ヌクレオチド小さい拡散ｍＲＮＡバンドが検出された。デンシトメトリーを走査することにより、このバンドは、異種接合動物の正常なＳＰ−Ｄ転写物の強度の５％未満を示す。
【００２３】
ウサギ抗ラットＳＰ−Ｄ抗血清を用いた肺ホモジネートのウェスタンブロット分析により、ＳＰ−Ｄが、異種接合ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいて約５０％低下し、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて消失することが明らかになった。
【００２４】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスが、共に出生前および出生後の期間において正常に生存した。選択された齢において、体、肺および心臓重量は、直接測定により得られ；肺および心臓容積は流体置換により得られた。肺タンパク質およびＤＮＡ含量は、それぞれ基準としてウシ血清アルブミンおよびサケ精子ＤＮＡを用いて評価した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの体重は、離乳の前にわずかに小さかったが、３週齢後ではＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと有意には異ならなかった（表１）。肺の容積は顕著には異ならなかった一方、肺容積対体重比は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて３および６週齢において増加した（表１）。心臓容積または心臓容積対体重比において有意な差異は観察されなかった。成熟期（５ヶ月）において、湿潤肺重量、合計肺ＤＮＡまたはタンパク質における変化は、記録されなかった。
【００２５】
しかし、体重においては異常が観察されなかったが、実施例２〜５では、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて見出された他の異常または変化を記載する。
【００２６】
実施例２は、リン脂質レベルに対する効果を例示する。肺胞および組織リン脂質レベル、特にホスファチジルコリン蓄積レベルは顕著に上昇し、一方、合計の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）タンパク質レベルは、不変のままであった。
【００２７】
実施例２
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるリン脂質レベル
肺胞、組織および合計飽和ホスファチジルコリン（Ｓａｔ−ＰＣ）（ｐ＜０．００１）は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて約３倍増加した。Ｓａｔ−ＰＣのレベルは、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいて変化しなかった。肺胞洗浄リン脂質組成分析については、２〜３匹のマウスからの蓄積した洗浄液から成る２〜４の試料を、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびリソビスホスファチジン酸の相対量について評価した。リン脂質組成は、遺伝子型間で異ならなかった。（3Ｈ）コリンの肺の総Ｓａｔ−ＰＣへの導入は、注射後８時間にわずかに増加し、導入はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて約２０％大きかった（ｐ＜０．０５）。
【００２８】
この結果は、以前の研究が、肺のリン脂質ホメオスタシスにおいてＳＰ−Ａについての明らかな役割およびＳＰ−Ｄについての限定された役割を提唱していたので、完全に予測されなかったものである。前記の疾患は、表面活性剤タンパク質および脂質の両方の蓄積を伴う表面活性剤ホメオスタシスと関連し、したがってＳＰ−Ｄ（−／−）ヌルマウスは、ＳＰ−Ｄは表面活性剤脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を有すること、および表面活性剤において合計のタンパク質濃度が変化しないため、表面活性剤脂質およびタンパク質ホメオスタシスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで別のものとして考えることができることを初めて例証した。しかし、実施例３に例示するように、ＳＰ−Ａの合計濃度における若干の減少はあった。
【００２９】
実施例３
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるＳＰ−Ａレベルの低下
ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ  ｍＲＮＡまたはタンパク質における差異は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察されなかった。対照的に、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの全肺ＲＮＡのＳＰ−Ａプローブとのノーザンブロットハイブリダイゼーションは、ＳＰ−Ａ  ｍＲＮＡがＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて減少したことを示す。ＳＰ−Ａ  ｍＲＮＡの減少と一致して、、ＢＡＬ  ＳＰ−Ａタンパク質における３匹のマウスからの肺胞洗浄のウェスタンブロット分析により評価されたように、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて明らかに約２５％減少した。
【００３０】
したがって、ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ａ生成の調節の役割を有する。ＳＰ−Ａが肺における宿主防御に関係しており、ＳＰ−Ｄは、２つの方法で宿主防御に影響することができる。ＳＰ−Ａ生成の上方調節により、および免疫および微生物細胞との直接相互反応によるものである。
【００３１】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのＢＡＬから分離されたリン脂質に富む物質の超構造は、実施例４に記載したように評価された。
【００３２】
実施例４
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける表面活性化構造の変化
大きい表面活性剤凝集体が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスの蓄積した肺胞洗浄液から単離され、以下に概説する手法を用いてＥＭにより試験された。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける脂質凝集体は、拡大され、電子密リン脂質アレイを構築された。ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して少ない管状ミエリンを含んでいた。超構造は、顕著に異常であり、減少した量の管状ミエリンを含み、独特の密に詰め込まれた脂質構造を形成することが明らかになった。したがって、ＳＰ−Ｄは、肺胞脂質の構造的機構における役割を有する。
【００３３】
肺胞洗浄液からの凝集形態。肺胞における表面活性体は、大きい凝集体（重い、高密度）および小さい凝集体（軽い、小胞状）分画に遠心分離により分離することができる。肺胞洗浄液を、４０，０００×ｇで０．８Ｍスクロース緩衝剤で１５分にわたり遠心分離した。大きい凝集表面活性体を、次に界面から採集し、通常の生理的食塩水で希釈し、再び４０，０００×ｇで１５分遠心分離した。小さい凝集表面活性体を含む第１の４０，０００×ｇの遠心分離からの上清液を、４℃で限外濾過により３００，０００分子量の保持フィルター(Minitan, Miliore Corp., Bedford, MA)または遠心分離濃縮器(Amicon Corp., Danvers, MA)を用いて濃縮した。小さい凝集体表面活性剤を、５０ｍｌの通常の生理的食塩水で希釈し、３回限外濾過して可溶性タンパク質を除去した。
【００３４】
最後に、肺の構造を分析した。ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいては正常であったが、大きい泡状肺胞マクロファージの増大した数および拡大された肺胞が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察された。実施例５においては、肺異常の同定についての方法および結果を概説する。
【００３５】
実施例５
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺異常
ＳＰ−Ｄ発現の消失が構造異常に至ったか否かを決定するために、ヌル、正常および異種接合マウスからの肺を、膨張させて固定し、形態および組織化学的分析を、光学顕微鏡により切片に対して実施した。感染の証拠はなく、光学顕微鏡のレベルにおける気道上皮細胞における明らかな変化はなかった。しかし、拡大された肺胞とは異質の肺柔組織における異常は、ＳＰ−Ｄ（−／−）においては一貫して観察されたが、ＳＰ−Ｄ（＋／−）またはＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照においては観察されなかった。
【００３６】
形態的および組織化学的方法
肺組織は２週間、３週間、および６週間にＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスを屠殺したものである。動物を秤量し、ケタミン、アセプロマジンおよびキシラジンの４：１：１混合物で麻酔し、動脈空洞下部および大動脈下流を切断することにより放血した。気管にカニューレ挿入し、横隔膜を穿通することにより肺をつぶした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した４％パラホルムアルデヒドで２５ｃｍの水圧において１分間肺を膨張固定した。カニューレをはずす際に気管を縛って、膨張した肺の固定を維持した。切除した肺および心臓を、これらが容器の底に沈むまで低温の固定液中で平衡化した。次に、肺および心臓の容積を、流体置換により決定した。各葉をその最長の軸に沿って測定し、長軸に垂直に二分し、パラフィンブロック中に加工した。５ミクロンの切片を、各葉の長さにわたり連続して切り、ポリシン(polysine)で被覆したスライド上に置き、コラーゲンについてヘマトキシリンおよびエオシン、マッソンの三色染色、またはエラスチンについてオセイン(ocein)で染色した。
【００３７】
肺形態
さらに詳細には、生命の最初の２週間以内の試験は、肺形態における検出可能な異常を例証しなかったが、正常な肺胞マクロファージの出現の数の増大が、１４日齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺胞において記録された。対照的に、肺組織学における異常が、拡大された気室およびまれな泡状の肺胞マクロファージの湿潤が、３および６週齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察された。肥大した泡状の肺胞マクロファージおよび血管周囲／細気管支周囲単細胞浸潤物の蓄積に関連した拡大された気室は、６〜７ヶ月齢により観察されたが、個別のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気室拡大の程度は、この齢の群において中程度から高程度に変化した。
【００３８】
７ヶ月齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて、胸膜下の線維症部位を観察し、コラーゲンについて強度に染色した。エラスチン体積における異常はまた、この時点においてＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺の柔組織において観察された。これらは、わずかな厚さの肺柔組織の領域、および一層高度にらせんまきした弾性繊維、並びにエラスチン染色が隣接する肺胞中隔（マクロファージ蓄積および線維症に隣接する）から成った。
【００３９】
増大した気管支付属リンパ組織（ＢＡＬＴ）は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて記録された。ＩＩ型細胞におけるＳＰ−Ｂ免疫染色の強度は、３つの遺伝子型間で類似した。ＩＩ型細胞は、以下に概説するように精製された。しかし、大きい泡状の肺胞間細胞の増大した数の病巣領域があり、これは豊富な細胞質小胞を含む肺胞マクロファージであると見られる。細胞質小胞の数および容積が増大した結果、これらの細胞の大きさが増大した。小胞をナイルブルーで染色した後、ナイルレッドで染色し、５２０〜５５０ｎｍの緑色光で励起された際蛍光化したので、つまり脂質またはリン脂質を含んでいた。これらのマクロファージはまた、ＳＰ−Ｂ抗血清により染色された。肺胞洗浄において、約４倍多いマクロファージ（マウスあたり１．２×１０6）が、正常なマウス（マウスあたり０．３６×１０6）と比較して観察されたが、相対的な好中球またはリンパ球数に変化はなかった。マクロファージの大きさを、１５００×ｇで２分間ガラススライド上に沈降したサイトスピン(cytospin)調整物から固定し、染色したマクロファージの直径から評価した。（＋／＋）からのマクロファージの平均直径は１１．７５±１.７５μｍであり、これと比較して（−／−）マウスは１８．７５±７．２５μｍであった。正常の２倍の直径を有するものとして定義された異常に大きいマクロファージは、（−／−）マウスからのマクロファージの２２．４±０．６％であり、これと比較して（＋／＋）マウスからは１８±１．０％であった。肺胞マクロファージの数および形態は、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいて異ならなかった。ＩＩ型細胞の超構造特性は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較してＳＰ−Ｄ（−／−）において同様であった。肺胞マクロファージにおける形態は、炎症と関連すると知られている活性化された「泡」細胞のものと一致する。
【００４０】
マウスＩＩ型細胞の単離
ＩＩ型細胞は、以下の方法を用いてこの実験室において日常的に単離される。マウスを、腹腔内注射およびペントバルビタール（５０ｍｇ／ｍｌ、３．２５ｍｌ／体重１ｋｇ）により麻酔した。腹部凹部を開いた後、マウスを、動脈空洞下部を切断することにより放血した。気管を露出させ、２０ゲージのルエルスタブ(luer stub)アダプターでカニューレ挿入し、縫合により固定した。胸プレートを除去し、肺を、見かけ上血液がなくなるまで肺動脈を通して１０〜２０ｍｌの無菌生理食塩水で潅流した。ディスペース(Dispase)(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)を、気管カテーテルを通して肺中に点滴し、次に１％低融点アガロースを、４５℃に加温した。肺を直ちに氷で覆い、２分間インキュベートしてアガロースを固定した。肺を切り出し、さらに１ｍｌのディスペースを含む培養管中に入れ、室温で４５分間インキュベートした。次に、肺を、７ｍｌのＤＭＥＭ(Gibco BRL, Gaithersburgh, MD)に溶解した１００Ｕ／ｍｌのＤＮＡアーゼ１(Sigma, St Louis, MO)を含む６０ｍｍの培養皿に移した。組織を丁寧に気道から引き裂き、５分間かきまぜた。次に、細胞を、しみ出されるまで氷上に置いた。細胞懸濁液を連続的に１００μｍおよび４０μｍの細胞ストレーナー、次に２５μｍのナイロンガーゼ(Tetko, Briarcliff Manor, NY)を通して濾過した。細胞を、４℃で１３０×ｇで７分間ペレット化し、１０％  ＦＢＳ(Intergen Co., Purchase, NY)を含む１０ｍｌ  ＤＭＥＭ中に再懸濁した。粗細胞懸濁液を、予めＣＤ−４５およびＣＤ−３２抗体(Pharmingen. San Diego, CA)で被覆した１００ｍｍの培養皿に加え、５％  ＣＯ2の存在下で、３７℃で１０２時間インキュベートした。プレートをインキュベーターから除去し、静かに「動か」し、ＩＩ型細胞を自由に沈降させた。細胞懸濁液を、１３０×ｇで４℃で遠心分離し、１０％  ＦＢＳ(Intergen Co., Purchase, NY)を含む１０ｍｌ  ＤＭＥＭ中に再懸濁した。粗細胞懸濁液を、予めＣＤ−４５およびＣＤ−３２抗体(Pharmingen. San Diego, CA)で被覆した１００ｍｍの培養皿に加え、５％  ＣＯ2の存在下で、３７℃で１０２時間インキュベートした。プレートをインキュベーターから除去し、静かに「動か」して、ＩＩ型細胞を自由に沈降させた。細胞懸濁液を、１３０×ｇで７分間遠心分離し、細胞を、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に再懸濁した。
【００４１】
気室および呼吸柔組織
形態計測測定を、５日（０．５週）、１４日（２週）および１７日（２．５週）、３および６週、および６〜７ヶ月齢においてマウスに対して実施した。呼吸柔組織および気室の全体の割合（％部分領域）を、点計数法を用いて測定した。測定は、左、右上および右下葉を通して間隔をおいて採取した切片において実施した。２０×対物レンズを用いてスライドを観察し、画像（場）をビデオカメラによりコンピューター画面にMetaMorph画像形成ソフトウエア(Universal Imaging Corp., West Chester, PA)を用いてうつした。コンピューターにより発生させた１２１点の格子を、各場上に重ね合わせ、呼吸柔組織（肺胞および肺胞ダクト）または気室上の交差点（点）を計数した。細気管支、大血管および小動脈および細静脈上の点を、研究から除外した。部分領域（％  Ｆｘ  Ａｒｅａ）を、各区画についての点の数（ｎ）を場内に含まれる点の合計数（Ｎ）で除算して、次に１００倍することにより計算した：
【数１】
％  部分領域＝ｎ／Ｎ×１００
【００４２】
切片あたりの場を分析して、データを採集した。測定した各場についてのｘおよびｙ座標を、乱数発生器を用いて選択した。
【００４３】
図１に示すように、気室（ａ）および呼吸柔組織（ｂ）の相対的割合（％部分領域）における差異が、５日（０．５週）、１４日（２週）および１７日（２．５週）齢において観察されなかった一方、気室の％部分領域は、３週齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて有意に増大した（ｐ＝０．０１３）。より具体的には、気室（ａ）および柔組織（ｂ）の両方についての部分領域は、３週（*ｐ＝０．０１３）、６週（*ｐ＝０．０００７）および２８週（*ｐ＝０．００４）齢において、２つの異なる遺伝子型間で顕著に異なった。同様に、呼吸柔組織の％部分領域は、年齢に対応させたＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照（それぞれ３４％柔組織／６６％気室、これに対して４２．５％柔組織／５７．５％気室）と比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて減少した（図１）。気室および呼吸柔組織の相対的割合は、後の時点において対照とは有意に異なり続け、％部分領域は、７ヶ月齢ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて２７％柔組織／７３％気室〜３７％柔組織／６３％気室の範囲内であった（ｎ＝５）。年齢に対応させたＳＰ−Ｄ（＋／＋）対象は、比較的小さい可変性を示し、この時点において４５％柔組織／５５％気室〜４７％柔組織／５３％気室の範囲内であった（ｎ＝４）。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける７ヶ月齢においての柔組織の全体的な％減少は、対照値の３２％であり、一方ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気室の％増加は、対照値の２７％であった。
【００４４】
細胞増殖
屠殺の４時間前に、動物にＢｒｄＵを予め注入して、細胞増殖の変化を評価した。含入されたＢｒｄＵの免疫組織化学的検出を、市場で入手できるキット(Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA)を用いて実施した。各動物からの小腸の切片を、ＢｒｄＵ含入についての正の対照として肺切片と平行して免疫染色した。
【００４５】
ＢｒｄＵ標識係数は比較的低く、呼吸柔組織細胞または肺胞マクロファージのＢｒｄＵ標識における変化は、対照と比較してＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺においては観察されなかった。
【００４６】
肺容積
圧力−容積曲線を用いた肺容積の測定は、以下のように行われた：１２週齢マウスに、ペントバルビタールナトリウムを注射し、１００％酸素を含む室中に配置して、酸素吸収により肺胞が完全につぶれるのを確実にした。マウスを放血により屠殺し、気管にカニューレを挿入し、３方向コネクター(Mouse Pulmonary Testing System, TSS Incorporated, Cincinnati, OH)により圧力センサーに結合させたシリンジに接続した。横隔膜を開いた後、肺を、１０秒おきに７５μｌの増分で膨張させて水の最大圧力２８ｃｍとし、次に空気を抜いた。圧力−容積曲線を、各動物について作成し、収縮曲線間の１０、５、および０ｃｍの水圧において肺容積を測定した（体重で除算した）。図２において、圧力−容積曲線を、１２週齢において５〜６匹のマウスにおいて作成した。圧力−容積曲線の収縮葉に関連する肺容積は、１０ｃｍＨ2Ｏにおいて、および２８ｃｍＨ2Ｏの最大圧力において年齢に対応させたＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して１２週齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスについて有意に大きかった（*ｐ＜０．０５）。
【００４７】
統計的に有意な差異が、部分領域および圧力−容積曲線についての変化の分析、続いてステューデント−ニューマン−ケウルスの手順、または体重、肺および心臓容積、容積：体重比、合計タンパク質およびＤＮＡ含量の比較のためのステューデントＴ検定の分析のいずれかを用いることにより決定された。ｐ＜０.５の差異を、有意であると考慮した。値は、平均±ＳＥとして示した。
【００４８】
増加した肺容積は、１２週齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて容易に明らかであり、これは気腫を例証する組織学的および形態計測研究と一致した（図２参照）。
【００４９】
肺胞
拡大された肺胞は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて一貫して観察された。したがって、ＳＰ−Ｄは、肺において肺胞のリモデリングの調節に関与する傾向が極めて強い。異常および気室のリモデリングが気腫の決定的な特性であるため、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、気腫についての理想的なモデルである。
【００５０】
実施例６
サイトカイン、過酸化水素生成、およびメタロプロテイナーゼ活性
方法
サイトカイン測定
６〜９週齢マウスからの肺ホモジネートを、２０００ＲＰＭにおいて遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６およびマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−２を、ムリンサンドウィッチＥＬＩＳＡキット(R&D Systems, Minneapoles, MN)を用いて、製造者の指示に従って定量した。すべてのプレートを、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)上で読み取り、コンピューターでアシストされた分析プログラム(Softmax, Molecular Devices)を用いて分析した。＞０．９５の計算された回帰線値を有する標準曲線を有するアッセイのみを、分析に受け入れた。
【００５１】
過酸化水素生成
肺胞マクロファージを、３倍の１ｍｌの色素を含まないＲＰＭＩ培地(Gibco, Grand Island, NY)を有する気管支肺胞洗浄により採集した。８〜１０匹のマウスからの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を蓄積して、分析用に十分な数のマクロファージを提供させた。洗浄を、１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離して、１００万のマクロファージをＰＢＳ中に再懸濁させた。マクロファージによる過酸化水素生成を、酸性条件下での過酸化水素による第一鉄イオン（Ｆｅ2+）の第二鉄イオン（Ｆｅ3+）への酸化に基づいて、市場で入手できるアッセイ(Bioxytech H2O2-560 assay, OXIS International, Portland, OR)を用いて測定した。方法は、製造者の推薦に従った。過酸化水素生成を、１００ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）での活性化の後または刺激を加えずに測定した。
【００５２】
メタロプロテイナーゼ活性
マウス洗浄試料を、ＳＷ−２８ローター(Beckman, Palo Alto, CA)において遠心分離した（１００，０００×ｇ、１時間）。上清液を、Centricon-30濾過ユニット(Amicon, Inc., Beverly, MA)を用いて濃縮した。試料（２００μｇタンパク質）を、非還元条件下で（レムリー）、１０％ザイモグラム(Zymogram)、ゼラチンおよびカゼインゲル(Novex, San Diego, CA)中に電気泳動した。電気泳動に続いて、ゲルを、２．５％のトライトン(Triton)Ｘ−１００で２回洗浄し（３７℃、１５分）、４０ｍＭのトリス(Tris)−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ2、１ｕＭのＺｎＣｌ2で１６時間インキュベートした。ゲルを、５０％メタノール、１０％酢酸に溶解した０．５％（ｗ／ｖ）クマシーブルーで１時間染色し、次に脱色した。メタロプロテイナーゼを、青いバックグラウンドに対して透明なバンドとして検出した。メタロプロテイナーゼ２および９のｍＲＮＡを、［32Ｐ］で標識したｃＤＮＡプローブ(Chemicon International, Inc., Temecula, CA)を用いて、野生型およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの全肺のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により定量した。
【００５３】
結果
６および９週齢において、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネートは、プロ炎症サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＭＩＰ−２の炎症レベルを含まなかったが、ＩＬ−１βの基底レベルは顕著に上昇した。図３。対照的に、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離された肺胞マクロファージによる過酸化水素生成を測定することにより評価されたオキシダント生成は、１０倍増大した。図４。過酸化水素およびスーパーオキシド生成は、マクロファージ活性化、特に殺微生物活性化の基準である。オキシダント生成が、多くのメタロプロテイナーゼの活性化並びにヒトおよび動物研究における気腫と関連していたので、メタロプロテイナーゼ活性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスから単離されたＢＡＬＦ上清液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後のゼラチン基質の分解により評価された。メタロプロテイナーゼ−２および−９と一致する活性のバンドは、両方の遺伝子型において容易に検出されたが、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬＦにおいて変化しなかった。同様に、メタロプロテイナーゼ−２および−９のｍＲＮＡに富んでいることは、ノーザンブロット分析により評価されたように、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスからの全肺ＲＮＡ試料において同様であった。
【００５４】
実施例１〜６の結果は、完全に予測されないものであった。ＳＰ−Ｄヌルマウスが気腫のモデルであることを示唆するものは、文献中には何も存在しない。
【００５５】
要するに、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、表面活性剤ホメオスタシスの調節、肺中の肺胞表面活性剤、ＳＰ−Ａ発現の調節におけるＳＰ−Ｄの顕著で驚異的な役割を決定的に例証し、または肺中のオキシダント、過酸化水素生成における決定的な阻害の役割を果たす。したがって、このレベルは、継続するオキシダント生成および損傷および肺胞リモデリングの調節の抑制に重要である。これにより、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、気腫の優れたモデルとなる。実施例７は、気腫のモデルマウスについての結果を要約する。
【００５６】
実施例７
気腫のモデルとしてのＳＰ−Ｄ（−／−）マウス
ＳＰ−Ｄ欠失は、炎症、単離された肺胞マクロファージによる増大されたオキシダント生成、気腫および遺伝子不活性化ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける局所的な線維症を引き起こした。これらの肺異常のタイミングおよび進行性性質は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺胞拡大が、肺胞発生(alveologenesis)の間に発生する発生異常よりむしろ、慢性炎症に関連する肺胞リモデリングにより引き起こされたという結論を支持する。ここでの知見は、肺炎症およびオキシダント生成の調節におけるＳＰ−Ｄの重要であり予測されない役割と一致し、ＳＰ−Ｄの調節または機能における変化が、慢性肺損傷に続く気腫に至る病理学的プロセスにおいて役割を奏し得ることを示唆する。
【００５７】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺の組織学的および形態計測分析で、生後３週齢まで肺構造における異常は表れず、肺胞発生の１週間後にマウスにおいて見られる。これは、呼吸柔組織および気室の相対的割合が、生後５日と１７日との間のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスとＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスとの両方において同様であったという観察結果と一致した。２週齢の後に、増大した柔組織−気室比率が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察されたが、これは柔組織および肺胞室の進行するリモデリングと一致する。拡大された気室は、一般的に大きい泡状の肺胞マクロファージの集中した蓄積と関連するが、炎症浸潤物および比較的加齢したマウスの局所化および範囲において若干の異質性があった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における肺胞マクロファージの集中した蓄積が、２週齢と早く観察された際には、この時点においてマクロファージ形態は通常のままであった。拡大された泡状細胞から成る異常な肺胞マクロファージ形態は、３週齢において記録され、その後の肺胞構造の拡大と一致した。以前の研究は、８週齢までのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける拡大された肺胞マクロファージの増加した数を例証した。したがって、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の発生は、活性化されたマクロファージの一時的および空間的な蓄積と一致し、これは、リモデリングにおけるこれらの役割を示唆する。ここでの知見は、通常の長い形態発生および肺胞発生におけるＳＰ−Ｄの役割を支持せず、プロセスは、一般的にマウスにおける生後約２週齢により完成される。
【００５８】
ここでの知見は、気腫および線維症に至る肺胞マクロファージの活性化およびオキシダント生成の調節におけるＳＰ−Ｄの重要な役割を支持する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるマクロファージ浸潤および肺リモデリングは、ＩＬ−１ｂ、ＭＩＰ−２を含むがＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含まず、むしろ単離された肺胞マクロファージによる顕著に増大した過酸化水素を含む種々のプロ炎症メディエイターの炎症レベルにおける中程度であるが有意な差異と関連した。ＩＬ−β１の基底レベルが、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて顕著に増大したが、ＩＬ−β１は、重度の炎症において代表的に検出されたレベルには増大しなかった。増大されたＩＬ−１βおよび過酸化水素生成が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察された一方、これらのマウスに見られる肺異常がサイトカインまたはオキシダント誘発損傷により直接媒介されたか否かは、不明確なままである。ＳＰ−Ｄは、宿主防御において重要な役割を果たすことが提案されているが、ＳＰ−Ｄ（−／−）コロニーにおいて感染の組織学的または血清学的証拠はない。
【００５９】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺において見出された増強された過酸化水素生成および増加した数の肺胞マクロファージは、ＳＰ−Ｄが、肺において決定的に重要な抗炎症役割を奏し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける肺胞マクロファージによる過酸化水素生成を調節するという概念を支持する。オキシダント損傷と気腫および肺線維症の発生との間の関係は、多くの動物および遺伝子モデルにおいて確立されている。例えば、高酸素症への新生仔の暴露は、新生マウスにおいて肺胞のリモデリングおよび線維症を引き起こす。メタロプロテイナーゼの活性化が、オキシダント損傷および気腫と関連するため、メタロプロテイナーゼ活性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬＦにおいて評価された。メタロプロテイナーゼ−２および−９と一致するプロテアーゼ活性が、ザイモグラフィーにより容易に検出された一方、これらのプロテナーゼまたはこれらのｍＲＮＡの活性の一致する変化は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて検出されなかった。しかし、他のプロテアーゼまたは抗プロテアーゼにおけるメタロプロテイナーゼの増大し局所化された組織濃度がＳＰ−Ｄ欠失と関連し得ることは、依然として可能性がある。抗プロテアーゼにおける欠失並びに酸化毒薬（例えばブレオマイシンまたはパラカート）からの喫煙およびオキシダント損傷はすべて、ヒト肺における気腫または肺線維症と関連する。
【００６０】
表面活性剤リン脂質含量が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて増加し、大きい泡状の肺胞マクロファージの増加した数と関連した一方、増大したリン脂質含量のみでは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察された肺胞リモデリングを生じるのに十分ではない傾向がある。実際に、表面活性剤リン脂質の全体的な効果は、抗炎症性であり、食作用、オキシダント生成およびサイトカイン放出を変化させ、リンパ球増殖、免疫グロブリン生成および接着分子の発現を阻害すると見られる。他方、ＧＭ−ＣＳＦが呼吸上皮において過剰発現されたトランスジェニックマウスは、通常存在する肺胞マクロファージの顕著に増大した数を有したが、肺胞タンパク症／リポイド沈着症、気腫または線維症を発生しなかった。対照的に、表面活性剤リン脂質およびタンパク質は、肺胞マクロファージ蓄積および血管周囲／気管周囲単球浸潤と関連するＧＭ−ＣＳＦ（−／−）およびＧＭ受容体共通ベータサブユニット（βｃ）の両方からの肺において顕著に増大した；しかし、肺胞タンパク症／リポイド沈着症のいずれのモデルも、気腫または線維症に関連していなかった。同様に、肺においてＩＬ−４を過剰に発現するトランスジェニックマウスはまた、増大した量の表面活性剤タンパク質および脂質並びに増加した数の炎症細胞を示したが、気腫を生じなかった。
【００６１】
肺におけるＳＰ−Ｄの濃度が、発生中に変化して、年齢の進行に伴い増加するが、ＳＰ−Ｄレベルはまた、種々の臨床的条件により影響される。最近の研究は、嚢胞性線維症（ＣＦ）を患っている患者から得られたＢＡＬＦのＳＰ−Ｄ濃度の顕著な減少を例証し、ＣＦ肺疾患に関連する慢性炎症の病理学におけるＳＰ−Ｄの強力な役割を支持する。ＳＰ−Ｄレベルはまた、喫煙者のＢＡＬＦにおいても減少し、これは、これらの患者において、減少したレベルのＳＰ−Ｄが後に慢性閉塞性肺病（ＣＯＰＤ）を発生させるのに寄与し得ることを示唆している。ＢＡＬＦにおけるＳＰ−Ｄの濃度が、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）を患っている患者において増大するが、特発性肺線維症（ＩＰＦ）およびコラーゲン血管病（ＩＰＣＤ）と関連する間質性肺炎を患っている患者は、ＳＰ−Ｄの減少したＢＡＬＦレベルを有する。他方、ＳＰ−Ｄの血清濃度は、ＰＡＰ、ＩＰＦおよびＩＰＣＤを患っている患者において増大した；しかし、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄの両方の血清レベルは、ＩＰＦの重篤度と共に、および抗炎症療法の経過の間に変化する。これらの臨床的知見および本研究は、ＳＰ−Ｄが正常の肺構築およびオキシダント生成の抑制の維持に必要であることを例証するが、ＳＰ−Ｄ濃度における変化が、オキシダント損傷、肺膿瘍(abcess)、二次的疾患、嚢胞性線維症、間質性肺線維症（ＩＰＦ）、および慢性閉塞性肺病（ＣＯＰＤ）、種々の肺感染症、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、化学療法誘発肺損傷、一次膿瘍に対して二次的な肺線維症（即ちサルコイド）、および喘息を含む種々の臨床的条件と関連する肺損傷の病理学に関連するという概念を支持する。
【００６２】
本発明者等の以前の研究において、肺胞マクロファージまたは肺形態における異常は、異種接合ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいて観察されず、ＢＡＬＦにおけるＳＰ−Ｄ濃度の５０％の減少は、肺異常を引き起こすのに十分ではないことを例証する。オキシダント誘発損傷および肺リモデリングの阻害に必要なＳＰ−Ｄの正確な濃度は、現在不明確である。ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスまたはＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺のさらなる損傷またはオキシダントストレスが、動物モデルにおいて気腫および線維症を悪化させるか否かは、決定されるべき問題として残っている。
【００６３】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて見出された肺ＳＰ−Ａ濃度の中程度の減少は、これらのマウスにおいて観察された肺形態の変化に寄与する傾向はない。その理由は、ＳＰ−Ａ（＋／−）マウスもＳＰ−Ａ（−／−）マウスも、気腫を発生しないからである。さらに、ＳＰ−Ａ欠失マウスの肺形態は正常であり、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスとは対照的に、ＳＰ−Ａ欠失は、単離された肺胞マクロファージにより減少した過酸化水素生成と関連した。
【００６４】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、重篤な進行性気腫を発生した。肺胞リモデリングおよびマクロファージ異常は、３週齢という早期に明らかであり、一方穏やかな病巣の肺線維症は、６〜７週齢において観察され、炎症および肺胞リモデリングの調節におけるＳＰ−Ｄの役割を例証する。本研究はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける肺胞マクロファージによる過酸化水素生成の調節においてＳＰ−Ｄの予期されない役割を例証し、これは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺の気腫の発生に寄与し得る。ＳＰ−Ｄ欠失が、進行する炎症または、喫煙または他のオキシダントにより発生したものである種々のヒト慢性肺疾患において見出される気腫および線維症の発生に寄与するか否かは、決定されるべき問題として残っている。
【００６５】
モデルマウスにおける試験療法
気腫の治療のための薬理学的療法がないために、可能な療法を試験するためのモデルが必要不可欠である。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、このモデルを提供する。したがって、実施例８は、薬物の試験、タンパク質調製、または気腫の治療のための遺伝子操作のための試料枠組みを提供する。
【００６６】
実施例８
適切な緩衝液で希釈した多くの用量または濃度のタンパク質または薬剤を、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに気管内に投与した。タンパク質および薬剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適するように精製した。関連する遺伝子を含む組換えアデノウィルスまたは他の遺伝子ベクターを、以下のようにして投与した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、免疫抑制して、Ｔ細胞媒介免疫応答を特異的に遮断し、遺伝子導入された細胞において関連する遺伝子を発現するように設計されたアデノウィルス構成体で処理した。マウスに、アデノウィルス構成体を与える３日前に、Ｈ５７抗体を腹腔内に注射した。Ｈ５７は、Ｔ細胞受容体における免疫認識を変化させ、脾臓のおよび肺のＴおよびＢリンパ球を減少させた。１用量を、気管内に点滴し、他の群をＨ５７で腹腔内処理し、次に賦形剤のみの気管内投与を施した。関連するタンパク質のレベルを投与の１週間後に測定して、ベクターの取り込みおよび発現を検出した。４匹のマウスを試験し、未処理ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを対照として用いた。気管内接種は、イソフルオランでの麻酔を含み、前方の中心線切開を実施して気管を露出させた。ツベルクリンシリンジに付着させた３０ゲージ針を気管内に挿入し、タンパク質または薬物の１００μｌ接種物を肺中に分散させた。切開を１滴のネクサバンド(Nexaband)を添加し閉じた。非化膿性ＰＢＳを、対照として気管内に注入した。
【００６７】
タンパク質、薬物、または気腫の消失における遺伝子複製の効率を試験するために、多くの試験を実施した。
【００６８】
肺構造に対するタンパク質または薬剤の効果を測定するために、肺を膨張固定し、切片を電子顕微鏡により評価した。処理および未処理マウスからの肺を、４％のパラホルムアルデヒドを含む圧力２０ｃｍの気管カニューレにより膨張させ、胸郭から一括して除去した。肺を脱水し、パラフィン中に包埋した。組織切片（５μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００６９】
マクロファージの数および形態を試験するために：ナイルレッドでの染色は、小胞を検出し、ナイルブルーでの染色および５２０〜５５０ｍｍの緑色光での励起は、脂質またはリン脂質を検出するための追加の方法である。マクロファージ数は、ＳＰ−Ｂ抗血清での染色により決定される。マクロファージの大きさは、１５００×ｇでの２分間のガラススライド上に沈降したサイトスピン(cytospin)調製物からの固定し染色したマクロファージの直径から推定する。
【００７０】
表面活性剤組成および超構造を、以下のようにして分析する：表面活性化の構造を、ＳＰ−Ｄ（−／−）処理および未処理マウスの蓄積した肺胞洗浄液からの大きい凝集物を単離することにより分析し、ＥＭにより試験する（以下の原理を参照）。肺胞洗浄リン脂質組成分析のために、２〜３匹のマウスからの蓄積した洗浄液から成る２〜４個の試料を、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびリソビスホスファチジン酸の相対的量について評価する。（3Ｈ）コリンの合計肺Ｓａｔ−ＰＣ中への導入を評価して、合計リン脂質濃度を測定する。
【００７１】
肺胞洗浄液からの凝集形態。肺胞からの表面活性体を、大きい凝集体（重い、高密度）および小さい凝集体（軽い、小胞状）部分に遠心分離により分離することができる。肺胞洗浄は、４０，０００×ｇで０．８Ｍスクロース緩衝剤で１５分にわたり遠心分離した。大きい凝集表面活性体を、次に界面から採集し、通常の生理的食塩水で希釈し、再び４０，０００×ｇで１５分遠心分離した。小さい凝集表面活性体を含む第１の４０，０００×ｇの遠心分離からの上清液を、４℃で限外濾過により３００，０００分子量の保持フィルター(Minitan, Miliore Corp., Bedford, MA)または遠心分離濃縮器(Amicon Corp., Danvers, MA)を用いて濃縮した。小さい凝集表面活性体を、５０ｍｌの通常の生理的食塩水で希釈し、３回限外濾過して可溶性タンパク質を除去した。
【００７２】
肺疾患のための治療としてのＳＰ−Ｄ
ＳＰ−Ｄの欠失が気腫のためのモデルマウスを生成するため、ＳＰ−Ｄは、気腫の治療または防止として明らかな選択である。これはまた、これらの疾患が異常な表面活性剤生成により特徴づけられるため、他の種類の肺疾患の明らかな治療である。さらに、ＳＰ−Ａに対する効果および宿主防御における可能な役割は、これを、肺における免疫機能を増大するための有用なツールとする。呼吸上皮に対する遺伝子の導入は、種々の肺疾患のための治療として極めて有望である。種々のウィルスに基づく、およびウィルスに基づかないベクターが、遺伝子を気道の細胞に移動させるために開発されてきたが、これには組換えアデノウィルスベクターが含まれる。これらのベクターは、これらがエアロゾル化できるため、呼吸治療において用いるのに特に有望である。したがって、実施例９は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の治療のための精製したマウスＳＰ−Ｄタンパク質を用いた実験である。実施例１０は、アデノウィルスを用いて、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の治療のためのラットＳＰ−Ｄを発現する実験である。実施例１１は、ＳＰ−Ｄペプチドの使用のための試料基盤またはこれらの疾患の防止および治療のためのＳＰ−Ｄを発現するベクターを提供する。気腫は、例示的な肺疾患として用いられる。アデノウィルスは、例示的なベクターとして用いられる。
【００７３】
精製したＳＰ−Ｄでの処理
実施例９
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、精製したマウスＳＰ−Ｄで処理し、以下に概説するように精製した。飽和ＰＣレベルを、肺胞洗浄液および合計肺洗浄液において分析した。２４時間間隔での気管内への繰り返した投与の結果、３〜７投与の後に脂質蓄積の部分的な補正が生じた（図１２参照）。
【００７４】
ＳＰ−Ｄの気道における半減期を、マウスにおいて１３時間であると判定した（図１３参照）（この手法を以下に概説する）；したがって、ＳＰ−Ｄ欠失を、エアロゾルまたは粒状吸入器または表面活性体混合物により合理的な間隔でＳＰ−Ｄタンパク質の置換により処理することができる。
【００７５】
マウスＳＰ−Ｄの精製
ＧＭＣＳＦおよびＳＰ−Ａ二重ヌル突然変異マウスからのマウス気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を採集し、凍結し、後のＳＰ−Ｄの精製のために蓄積した。マルトシル−アガロース(Sigma)を、重力フローカラム（１０×８０ｍｍ）中に詰め、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭの塩化カルシウム、０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含む緩衝液（ＴＣＢ）で平衡にした。ＢＡＬを、トリス−ＨＣｌに対して２０ｍＭ、ＥＤＴＡに対して１０ｍＭとし、ｐＨ７．４とし、室温で１時間かきまぜた。混濁溶液を、１０，０００×ｇで４０分間、４℃で遠心分離した。上清液を、塩化カルシウムに対して２０ｍＭとし、マルトシル−アガロースカラムに装填する前にｐＨ７．４に再調整した。カラムをバックグラウンド吸収のためＴＣＢで洗浄し、続いて１．０Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＣＢで洗浄した。マルトースへの結合において特別の要求を有するＳＰ−Ｄを、５０ｍＭの塩化マグネシウム、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４で溶出した。ＳＰ−Ｄを含むフラクションを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動または直接ＥＬＩＳＡにより測定し、蓄積し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の３回交換で透析した。このプロトコルは、Strong, Peter; Kishore, Uday; Morgan, Cloff; Bernal, Anders Lopez; Singh, Mamta; およびReid, Kenneth B. M.; Journal of Immunological Methods 220 (1998) 139-149から適合された。
【００７６】
マウスの表面活性体成分での処理。本発明者等は、問題なく、７日目まで毎日ＳＰ−Ｄでマウスを反復して処理するため、イソフルランでの麻酔の下に、マウスにおいて２６ｇの供給管を用いた経口盲目挿管法のための手法を、好首尾に用いた。この方法は、外科手術を回避し、ＳＰ−Ｄ置換のために提案された実験および突然変異ＳＰ−Ｄタンパク質での処理の形を可能にする。
【００７７】
最初に、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、気管点滴により精製したマウスＳＰ−Ｄで処理した。２４時間間隔で与えられた２．９ｇのＳＰ−Ｄの３回以上の投与により、肺胞および飽和ＰＣ蓄積の両方が減少した（図１４参照）。与えられたＳＰ−Ｄのこの用量は、およそＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおける内因性蓄積に存在する量である。肺結合およびクリアランスカイネティックスが考慮されると、これは、低い用量である。ＳＰ−Ｄの外因性投与は、表面活性剤脂質代謝に直接影響し、本発明者等がｉｎ  ｖｉｖｏで改変ＳＰ−Ｄ分子の機能を試験することができる実験モデルを提供する。
【００７８】
生物学的半減期プロトコル。本発明者等は、マウスにおけるＳＰ−Ｄの生物学的半減期を測定して、ＳＰ−Ｄでの処理のための実験を設計した。本発明者等は、以前に本発明者等がＳＰ−Ａおよび他の表面活性剤タンパク質について実施したように、ボルトン−ハンター(Bolton-Hunter)試薬を用いて、125Ｉで精製したマウスＳＰ−Ｄをヨウ素標識した。ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺胞洗浄液からのＳＰ−Ｄのクリアランスは、約１３時間の半減期と同様であった（図１３参照）。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺におけるＳＰ−Ｄについての１７時間のｔ1/2は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスについての１３時間のｔ1/2のものより若干長かった。
【００７９】
ＧＭ−ＣＳＦ欠失は、ＳＰ−Ｄにおいて４８倍の増加を生じ、ＧＭ−ＣＳＦ（−／−）×ＳＰ−Ａ（−／−）の交差は、同様にＳＰ−Ｄを上昇させたがＳＰ−Ａを上昇させなかった。本発明者等は、高純度で、および大量に、Persson等により記載された方法により、Ｃａ2+の存在下においてマンノース−セファロースのアフィニティーカラムを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ（−／−）×ＳＰ−Ａ（−／−）マウスからの肺胞洗浄液からＳＰ−Ｄを単離した。
【００８０】
実施例１０
アデノウィルスで発現させたＳＰ−Ｄでの処理
本発明者等は、ラットＳＰ−Ｄを発現する新規なアデノウィルスを作成した。このウィルスは、正常またはＳＰ−Ｄ欠失マウスの細胞および肺においてＳＰ−Ｄを生成する。本発明者等は、２９３細胞およびマウスにおいて生成したラットＳＰ−Ｄのウエスタンブロットを有する。
【００８１】
Ａｄ−ｒＳＰＤアデノウィルスの構成（図１４参照）。野生型ラットＳＰＤ  ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲ  Ｉ消化でプラスミドＷＴ−ｒＳＰＤ／ｐＧ３Ｚから切り出し、３’末端をクレノウ(Klenow)で埋めた。１．３ｋＢ  ｒＳＰＤ  ｃＤＮＡを、プラスミドｐＡｖＳ６ａのＥｃｏＲ  Ｖ部位に挿入して、プラスミドｐＡｖＳ６ａ−ｒＳＰＤを作成した。プラスミドｐＡｖＳ６ａ−ｒＳＰＤは、ＲＳＶプロモーター、ｒＳＰＣ  ｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリＡシグナルおよびＡｄ５配列（９．２４〜１７．３４ｍｕ）を有する。Ｎｏｔ  ＩでｐＡｖＳ６ａ−ｒＳＰＤを直鎖化したものは、アデノウィルスＤＮＡ  Ａｄ．ｄｌ３２７のＣｌａ  Ｉ消化された大きなフラグメントと２９３細胞中に同時トランスフェクトさるが、これは、Ｅ３領域（７８．５〜８４．７ｍｕ）が削除されている。相同組換えの後、個別のプラークを、ウエスタンブロットアッセイにより分析して、ｒＳＰＤタンパク質発現を決定した。１つのｒＳＰＤ陽性クローンに、プラーク精製を一回施した。Ａｄ−ｒＳＰＤアデノウィルスは、Ｅ１およびＥ３領域において欠失を有し、複製欠損である。２９３細胞の増幅の後、精製されたＡｄ−ｒＳＰＤアデノウィルスを、２回のＣｓＣｌ勾配超遠心分離により生成した。ＳＰ−Ｄを発現するアデノウィルスは、気管内投与により若干の脂質異常を補正することができた。したがって、これは、気腫および多くの他のＳＰ−Ｄ欠失疾患並びに種々の他の形態の肺損傷および欠失の治療のために極めてよい可能性を残す。
【００８２】
実施例１１
他のベクター、タンパク質または薬剤から発現したＳＰ−Ｄでの処理
リン脂質ホメオスタシスの回収におけるＳＰ−Ｄに対する時間的、空間的および化学量論的要求を、実施例９において決定した。ＳＰ−Ｄのクリアランスカイネティックスを決定する最初の研究を、125Ｉで標識したＳＰ−Ｄを気管内に投与して実施し；半減期を計算し、情報をＳＰ−Ｄ置換実験の設計において用いた。投与後のＳＰ−Ｄの通常の生理学的濃度を達成するのに必要なＳＰ−Ｄの用量を、明らかにした。
【００８３】
実施例９において、精製したＳＰ−Ｄタンパク質の投与を用いて、種々の肺疾患を治療した。しかし、肺疾患における生理学的異常は、肺中のＳＰ−Ｄの長期間補正を必要とし得る。したがって、哺乳動物ＳＰ−Ｄ遺伝子を含む組換えアデノウィルスまたは他の遺伝子ベクターを用いる（実施例１０および１１参照）。組換えアデノウィルスベクターは、クララ(Clara)細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）およびＳＰ−Ｃプロモーターを用いて、細気管支（クララ細胞）および肺胞（ＩＩ型細胞）区画においてＳＰ−Ｄを選択的に発現する（実施例１０参照）。アデノウィルスベクターでの処理の３日前に、マウスを、２００ｕｇのモノクローナル抗Ｔ細胞受容体抗体、Ｈ５７を腹腔内注入することにより免疫抑制した。アデノウィルスを、ウィルスの５×１０8ＰＦＵの気管内注入により投与した。ＳＰ−Ｄタンパク質のレベルを、投与の１週間後に測定して、ベクターの取り込みおよび発現を検出した。４匹のマウスを試験し、処理を受けていないＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、対照として用いた。気腫の影響を消失させるＳＰ−Ｄの効率を試験するために、多くの試験を以下のように実施した。
【００８４】
肺構造に対するタンパク質または薬剤の効果を決定するために（実施例１１）、肺を膨張固定し、切片を電子顕微鏡により評価する。肺を、４％のパラホルムアルデヒドを含む圧力２０ｃｍの気管カニューレにより膨張させ、胸郭から一括して除去する。肺を脱水し、パラフィン中に包埋する。組織切片（５μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
【００８５】
マクロファージの数および形態を分析する。ナイルレッドでの染色は、小胞を検出し、ナイルブルーでの染色および５２０〜５５０ｍｍの緑色光での励起は、脂質またはリン脂質を検出するための追加の方法である。マクロファージ数は、ＳＰ−Ｂ抗血清での染色により決定される。マクロファージの大きさは、１５００×ｇでの２分間のガラススライド上に沈降したサイトスピン調製物から固定し、染色したマクロファージの直径から推定する。
【００８６】
表面活性体組成および超構造を、以下のようにして分析する：表面活性体の構造を、ＳＰ−Ｄ（−／−）処理および未処理マウスの蓄積した肺胞洗浄液からの大きい凝集物を単離することにより分析し、ＥＭにより試験する。肺胞洗浄液リン脂質組成分析のために、２〜３匹のマウスからの蓄積した洗浄液から成る２〜４個の試料を、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびリソビスホスファチジン酸の相対量について評価した。（3Ｈ）コリンの合計肺Ｓａｔ−ＰＣ中への導入を評価して、合計リン脂質濃度を測定した。
【００８７】
処理の効率が決定されれば、処理を他の適切な哺乳動物に対して試験することができる。
【００８８】
ＳＰ−Ｄの肺感染の改善
肺での宿主防御におけるＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａの役割を、繰り返して例証した。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄは、サイトカインおよびフリーラジカル生成の調節によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肺炎症を調節をする種々の微生物とｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的な相互作用を有する。細菌クリアランスおよび肺の炎症応答におけるＳＰ−Ｄの役割を、ＳＰ−Ｄ欠失のモデルマウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。ＳＰ−Ａ欠失マウスは、感染症に一層罹病性であることが知られている。多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ＳＰ−Ａの上方調節におけるこの役割に加えて、宿主防御についてのＳＰ−Ｄの可能な役割を示した。実施例８〜１１は、細菌または菌類感染したＳＰ−Ｄ（−／−）マウス並びにＳＰ−Ａ（−／−）マウスにおける治療としてＳＰ−Ｄを試験するための試料プロトコルを概説する。実施例１２〜１４は、細菌、菌類およびウィルス感染に対する応答におけるＳＰ−Ｄの役割を示す実験である。実施例１３は、呼吸シンシチウムウィルスに感染したＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの効果を示す実験である。
【００８９】
実施例１２
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの細菌病原体のクリアランス
ＳＰ−Ｄ欠失マウス（ＳＰ−Ｄ  −／−）に、Ｂ群ストレプトコッカス（ＧＢＳ）またはヘモフィルス・インフルエンザ(Hemophilus influenzae)（Ｈｆｌｕ）を気管内に感染させて、野生型マウスと比較してのクリアランスを評価した。Ａ群ストレプトコッカスを、１０4ＣＦＵにおいて投与した。また、肺炎症を、合計細胞数（図５、６および７）、肺ホモジネートにおけるサイトカインレベル（図８）、肺胞マクロファージによる酸素ラジカル生成（図１１）およびＢＡＬにおける亜硝酸塩レベル（図９）について、ＢＡＬ液の分析により評価した。
【００９０】
ＳＰ−Ｄ  −／−マウスは、野生型マウスと同様に、細菌を排出した（図５および６参照）。ＧＢＳおよびＨｆｌｕでの感染の結果、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ  −／−マウスのＢＡＬ液における有意に大きい合計細胞数を生じた（図７）。サイトカインレベルの選択的変化は、ＳＰ−Ｄ  −／−マウスにおいて検出された。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）およびインターロイキン（ＩＬ）−６レベルは、ＧＢＳまたはＨｆｌｕでの感染の後の早期のＳＰ−Ｄ  −／−マウスからの肺ホモジネートにおいて大きかった（図８）。マクロファージ炎症タンパク質−２（ＭＩＰ−２）、好中球化学誘引物質は、Ｈｆｌｕ感染の後にＳＰ−Ａ  −／−マウスからの肺ホモジネートにおいて顕著に多かったが、ＧＢＳ感染ではなかった（図８）。ＳＰ−Ｄ  −／−マウスからのマクロファージは、野生型マウスと比較して、顕著にスーパーオキシドおよび過酸化水素を多く発生した（図１１）。
【００９１】
ＢＡＬ亜硝酸塩レベルは、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて増加した。一酸化窒素は、ＢＡＬＦ中の亜硝酸塩として測定された。一酸化窒素は、殺菌に寄与し、宿主防御の役割を有する。一酸化窒素は、スーパーオキシドと反応して、有力な殺微生物剤であるペルオキシ硝酸塩を生成する。
【００９２】
図１０において、光学顕微鏡を用いて、食作用を評価した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、野生型と比較して、顕著に減少した細菌の食作用を示した。
【００９３】
したがって、ＳＰ−Ｄの非存在時に、増大した炎症応答が、ＧＢＳまたはＨｆｌｕでの細菌感染に続いて観察された。肺胞マクロファージによる活性酸素種の生成は、ＳＰ−Ｄ  −／−マウスにおいて増大した。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌感染に対する肺免疫および炎症応答におけるＳＰ−Ｄの決定的に重要であり明らかな役割を支持する。
【００９４】
実施例１３においては、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに、呼吸シンシチウムウィルスを感染させた。
【００９５】
宿主防御機構は、細菌の生来のメディエイタおよびウィルスクリアランスおよび後天性免疫応答を含む微生物病理学の肺クリアーを維持した。
【００９６】
実施例１３
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのウィルスのクリアランス
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに、呼吸シンシチウムウィルス（ＲＳＶ）、小児における一般的な呼吸病原菌を気管内に感染させた。ウィルス力価および肺炎症を、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよび野生型マウスにおいて評価した。肺ホモジネートにおけるＲＳＶ力価は、投与の３日後および５日後で、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスと野生型マウスとの間で同様であった。しかし、炎症細胞の顕著に増加した数は、ＲＳＶ感染の３日後および５日後に、野生型マウスと比較して、ＰＭＮの大きい割合を有するＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのＢＡＬ液において見出された。さらに、ＲＳＶ感染の５日後に、組織学的に評価された肺炎症は、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）において多かった。ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２を含むプロ炎症サイトカインは、ＲＳＶ感染の３日後および５日後に、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネートにおいて多かった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、肺からの効率的なウィルスクリアランスを有していたが、ＲＳＶ感染に続いて野生型マウスよりも大きい炎症応答を例示した。これらの発見は、ＳＰ−Ｄが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＳＶ感染の後に肺における生体の防御および炎症の調節において重要な役割を果たすことを例証する。
【００９７】
実施例１４
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの菌のクリアランス
マウスを以下のように感染させる：菌類病原菌の適切なプロトタイプを用いる。感染性病原菌を、適切に精製し、適切な緩衝液中に懸濁し、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス中にＳＰ−Ｄと共に、またはこれを含めずに気管内に投与する（実施例１２および１３におけるように）。菌プロトタイプを、適切な用量において投与する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスを用いて、感染に対するマウスの罹病性におけるＳＰ−Ｄの効果を試験する。ＳＰ−Ｄタンパク質を含む、または含まないＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを用いて、感染についての治療としてＳＰ−Ｄを試験する。感染のクリアランスを、実施例１２および１３におけるように、および以下のようにして評価する：
【００９８】
菌クリアランスを、動物に感染性病原菌またはＳＰ−Ｄを含む感染性病原菌を接種した６、２４および４８時間後において肺および脾臓ホモジネートを精製することにより、決定した。肺からの細菌クリアランスを、ＳＰ−Ｄ濃度を適切に変化させた後に決定した。また、定量的培養を、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスについて決定して、ＳＰ−Ｄの５０％の減少が、細菌またはウィルスクリアランスについて十分な内因性ＳＰ−Ｄを提供するか否かを決定する。
【００９９】
哺乳動物ＳＰ−Ｄの適切な濃度を、肺感染症の治療のために他の哺乳動物において用いる。
【０１００】
ＳＰ−Ｄレベルを調節する薬剤
通常の機能および肺の発達におけるＳＰ−Ｄの重要性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）ヌルマウスにより明確に例証される。したがって、ＳＰ−Ｄの生成、発現または作用を調節する薬剤は、重要な将来的な薬剤であり、さらにこのような薬剤を同定するための実験的補剤である。このような薬剤を同定するための多くの手法は、当業者には自明であろう。実施例１５および１６は、これらの手法の２つについての試料プロトコルを概説する。実施例１７は、ＩＬ−４が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＳＰ−Ｄレベルを顕著に増大させ、したがってＳＰ−Ｄを付加したかまたは付加しない種々の肺疾患を治療するのに用いることができることを示す。
【０１０１】
実施例１５
ＳＰ−Ｄプロモーターと相互作用するタンパク質
ＳＰ−Ｄプロモーターを用いて１つのハイブリッドを行い、ＳＰ−Ｄの発現を上方調節するタンパク質を同定する。次に、これらのタンパク質を、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて、気腫並びに実施例８における他の肺疾患および感染症の治療の効率について試験する。
【０１０２】
実施例１６
ＳＰ−Ｄタンパク質と直接相互作用するタンパク質
２つのハイブリッド手法を行い、ＳＰ−Ｄタンパク質と直接相互作用するタンパク質を同定する。次に、これらのタンパク質を、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて、気腫並びに実施例８における他の肺疾患および感染症の治療の効率について試験する。
【０１０３】
実施例１７
ＩＬ−４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＰ−Ｄレベルを上昇させる
クララ細胞においてＩＬ−４を発現するマウス（ＣＣＳＰ−ＩＬ−４）は、慢性気道炎症および肺胞タンパク症状症候群を発生する。表面活性剤ホメオスタシスにおけるＩＬ−４の役割を同定するために、本発明者等は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウスの肺における脂質およびタンパク質代謝を測定した。肺胞の飽和ホスファチジルコリン（Ｓａｔ  ＰＣ）蓄積を、６．５倍増加させ、肺組織Ｓａｔ  ＰＣ蓄積を、ＩＬ−４トランスジェニックマウスにおいて４．８倍増大させた（図１５参照）。ＳＰ−Ｄは、野生型マウスと比較して、ＩＬ−４マウスにおいて約９０倍増加し、ＳＰ−Ｄ  ｍＲＮＡの２．８倍の増加に関連した（図１５参照）。パルミチン酸塩およびコリンのＳａｔ  ＰＣへの導入は、ＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウスにおいて約２倍増加した。ＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウスの肺からのＳａｔ  ＰＣの正味のクリアランスは、野生型のマウス（１０．３モル／ｋｇ）よりも、ＩＬ−４マウスにおいて６倍高かった（６０モル／ｋｇ）。クララ細胞におけるＩＬ−４の発現は、表面活性剤脂質合成およびクリアランスを増大させたが、これは、ＳＰ−Ｄタンパク質における選択的増大に関連する増大した表面活性剤蓄積および肺胞タンパク症との新たな平衡を確立し、肺表面活性剤ホメオスタシスの従来予測されなかった効果を例証する。
【０１０４】
ＳＰ−Ｄタンパク質または配列を用いた診断
ＳＰ−Ｄは、正常な肺の機能および発達に重要である。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、気腫のモデルである。次に、これは、遺伝子またはＳＰ−Ｄについての遺伝子の対立遺伝子における突然変異が、肺疾患罹病性に対して顕著な効果を有することを示唆する。したがって、突然変異または対立遺伝子、および突然変異体タンパク質を同定する方法は、気腫、肺感染症および多くの他の呼吸疾患の恐れのある個体を同定する。実施例１８および１９は、これらの診断手法の試料プロトコルである。
【０１０５】
ＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異を有する患者の診断
実施例１８
ＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異は、気腫の兆候および病因論に関与する傾向がある。したがって、突然変異は、統計的に有意な数の患者の配列分析により同定される。これらの突然変異を用いて、診断試験を得る。ＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異は、以下の方法により検出される：適切なプライマーを用いたＳＰ−Ｄ遺伝子のＰＣＲ分析を実施する。得られたＰＣＲフラグメントを、ＳＳＣＰにより分析し、配列決定して、突然変異または対立遺伝子を決定する。あるいはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いて、突然変異を検出する。
【０１０６】
突然変異体ＳＰ−Ｄタンパク質を有する患者の診断
実施例１９
気腫および他の肺疾患に関連する突然変異体ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄの対立遺伝子を特異的に認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を得る。次に、これらの抗体を用いて、これらの肺疾患に対する酵素結合イムノアッセイを行う。実施例２０の抗体を、このアッセイに用いることができる。
【０１０７】
実施例２０は、トランスジェニック技術を用いたポリクローナル抗体の精製またはモノクローナル抗体のさらなる精製についてのプロトコルを示す。
【０１０８】
実施例２０
ＳＰ−Ｄ特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体の精製
高い反応性での特異的なポリクローナル抗体の生成は、関連する抗原の広範囲な精製を必要とする。本発明者等は、投与のための関連する抗原に関して高い力価を有し、不純物と反応性である抗体を得た部分的に精製された抗原を用いて、いくつかのポリクローナル抗体を開発した。トランスジェニックマウスからの組織固体相を用いて、これらの抗血清から非特異的抗体を除去した。表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）を、マンガン溶出液を有するマルトースカラムを用いて、精製した。精製したＳＰ−Ｄを、不完全フロイントアジュバント中のニュージーランドラビット中に注入した。得られた抗血清を、ウエスタンブロットにおいて全肺洗浄液に対して試験し、ＳＰ−Ｄおよび他のタンパク質に対する結合を明らかにした。この抗血清を、ＳＰ−Ｄタンパク質を生成しないヌル突然変異体マウスからの肺ホモジネート固体相と共に一夜反応させた。抗血清を、ＳＰ−Ｄに対してのみ反応性を示す吸着の後に、全肺洗浄液に対して反応させた。また、この抗血清を、免疫組織化学的実験において評価し、これは、ＳＰ−Ｄヌル突然変異体マウスからの肺切片に対する極めて低い反応性および正常な対照マウスにおける極めて特異的なＩＩ型細胞反応性を例証した。この手法は、高い力価を有する高度に特異的な抗体を調製する能力を大きく増強し、吸着抗体を用いる際のブロッキング剤を用いる必要性を解消する。
【０１０９】
この抗体は、診断、精製およびＳＰ−Ｄタンパク質の他の研究に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄ。
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの齢および齢一致したＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照との気室（ａ）および呼吸柔組織（ｂ）の部分領域（％  Ｆｘ  Ａｒｅａ）における変化の比較。各個別の遺伝子型についての齢に伴うこれらのパラメーターの変化（ｃおよびｄ）。データは％部分領域として表現し、平均±ＳＥを示す。
【図２】  ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの収縮葉の圧力―容積曲線。データはｍｌ／ｋｇとして表し、平均±ＳＥを示す。
【図３】  ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネートにおけるプロ炎症サイトカイン。ＴＮＦ−、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２の濃度は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（黒塗り棒）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス（斜線棒）からの肺ホモジネートにおいて評価した。データは、ｐｇ／ｍｌで表し、群あたりｎ＝５で平均±ＳＥを示す；ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、*ｐ＜０．０５。
【図４】  ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（黒塗り棒）からの肺胞マクロファージにおける過酸化水素生成を、ＰＭＡ刺激を有するおよび有さないＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス（斜線棒）と比較して気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から単離した１×１０8マクロファージから評価した。データを、Ｈ2Ｏ2のＭとして表し、群あたりｎ＝４で平均±ＳＥを示す；ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、*ｐ＜０．０５。
【図５】  Ｂ群ストレプトコッカス（ＧＢＳ）で感染させた後のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおける肺のコロニー数。
【図６】  ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｆｌｕ）で感染させた後のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおける肺のコロニー数。
【図７】  図７Ａおよび図７Ｂ。
ＧＢＳおよびＨ．ｆｌｕで感染させた後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液における合計細胞数。
【図８】  図８Ａおよび図８Ｂ。
ＧＢＳおよびＨ．ｆｌｕで感染させた後の肺ホモジネートにおけるサイトカインレベル。
【図９】  図９Ａおよび図９Ｂ。
ＧＢＳおよびＨ．ｆｌｕで感染させた後のＢＡＬ亜硝酸塩レベル。
【図１０】  図１０ＡおよびＢ。
ＧＢＳおよびＨ．ｆｌｕで感染させた後の光学顕微鏡により分析した食作用およびＦＡＣＳ分析。
【図１１】  図１１Ａおよび図１１Ｂ。
ＧＢＳおよびＨ．ｆｌｕで感染させた後のＢＡＬから単離されたマクロファージにおける過酸化水素およびスーパーオキシドレベル。
【図１２】  ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに対するＳＰ−Ｄタンパク質処理の効果。
【図１３】  図１３Ａおよび図１３Ｂ。
マウスにおけるＳＰ−Ｄタンパク質の全肺および肺胞クリアランスカイネティックス。
【図１４】  ラットＳＰ−Ｄ  ｃＤＮＡを含むアデノウィルスベクターＡｄ−ｒＳＰＤ。
【図１５】  野生型マウスおよびＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウス（ＩＬ−４マウス）からの肺胞洗浄におけるＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄのイムノブロットの定量。ｐ＜０．０１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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