(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦまたはＩＦＮγから選択されるサイトカインと、ＣＤ１３受容体のリガンドとの間のコンジュゲートであって、前記リガンドが、ＮＧＲモチーフを含むペプチドであるコンジュゲート。
【請求項２】
前記サイトカインが、ＴＮＦαまたはＴＮＦβである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状および環状のＣＮＧＲＣからなる群から選択される、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記サイトカインが、スペーサーを介して前記ペプチドと連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記サイトカインが、ＴＮＦであり、前記ペプチドが線状または環状のＣＮＧＲＣであり、ＴＮＦのアミノ末端が、スペーサーグリシンを介して前記ペプチドに連結されている、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記サイトカインが、ポリエチレングリコールまたはアシル残基により誘導体化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記サイトカインが、腫瘍抗原、腫瘍血管形成マーカーまたは細胞外マトリックス成分に対する抗体またはそのフラグメントと、さらにコンジュゲートしている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記サイトカインがＴＮＦであり、前記サイトカインが異なるサブユニットにおいて、ＮＧＲモチーフを含むペプチドと、抗体またはそのフラグメントとにコンジュゲートしており、前記抗体またはそのフラグメントが、腫瘍抗原、腫瘍血管形成マーカーまたは細胞外マトリックス成分に対するものである、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ＮＧＲモチーフを含むペプチドをコードする５’または３’隣接配列を担持するＴＮＦおよびＩＦＮγから選択されるサイトカインをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１０】
前記ペプチドが、請求項３に記載のペプチドである、請求項９に記載のｃＤＮＡ。
【請求項１１】
前記ｃＤＮＡが、請求項５に記載のコンジュゲートをコードする、請求項９に記載のｃＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項９〜１０のいずれか１項に記載のｃＤＮＡを含む、遺伝子療法用ベクター。
【請求項１３】
薬学的に許容できる担体および賦形剤と一緒に、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲートの有効量を含む医用組成物。
【請求項１４】
注射可能な溶液または懸濁液、または注入用液の形態である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
リポソームの形態である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
癌の診断用または治療用の医薬品を調製するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１７】
他の抗腫瘍薬または診断の腫瘍画像化用化合物と組合せた、請求項１６に記載のコンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、癌の治療に使用するための修飾サイトカイン類に関する。さらに詳細には、本発明は、腫瘍血管および抗原提示細胞を「ホーミング(homing)」することができるサイトカイン誘導体に関する。
【０００２】
幾種かのサイトカインの抗腫瘍活性は周知であり、記述されている。幾種かのサイトカイン類は、ヒトでも既に治療に使用されている（２９）。たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロンａ（ＩＦＮａ）等のサイトカイン類は、異なる型の腫瘍、たとえば、腎転移性癌、毛様細胞白血病、カポジ肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫、等々を有する患者で、確然たる抗腫瘍活性を示した。ＩＦＮＢ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦＢ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびコロニー刺激因子（ＣＦＳ）のような、他のサイトカイン類は、幾つかの型の腫瘍に対して、ある一定の抗腫瘍活性を示し、従って、さらなる研究対象である。
【０００３】
一般に、サイトカイン類の治療的使用は、全身性毒性のため、強度に限定される。たとえば、ＴＮＦは、当初、幾種かの腫瘍の出血性壊死を誘導できる力（１）、および、異なる腫瘍系に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害作用（２）を求めて発見されたが、その後、過剰産生状態の場合には、人体に対して危険な影響を及ぼすこともある、プロ炎症活性を有することが証明された（３）。
【０００４】
全身性毒性が、ヒトにおける薬理学有効量のサイトカイン類の使用に伴う基本的な問題であるため、治療効果を維持しながら、この部類の生物学的エフェクターの毒作用を減少させるために、新規な誘導体および治療戦略を現在評価中である。
【０００５】
幾つかの新規なアプローチは、以下のことに関する。
ａ）ＴＮＦを腫瘍に送達し、局所濃度を高めることができる融合タンパク質の開発。たとえば、ＴＮＦおよび腫瘍特異的抗体からなる融合タンパク質が産生される（４）。
ｂ）抗腫瘍活性を維持し、且つ全身性毒性を低減されたＴＮＦ突然変異体の開発。従って、唯一の受容体（ｐ５５またはｐ７５）を選択的に認識することができる突然変異体が既に作製されている（５）。
ｃ）ＴＮＦの抗腫瘍活性を損なわずに、毒作用を幾らか減少させることができる、抗ＴＮＦ抗体の使用。このような抗体は、既に、文献に記述されている（３０）。
ｄ）より高い半減期を有するＴＮＦ誘導体（たとえば、ポリエチレングルコールとコンジュゲート(conjugate)した、ＴＮＦ）の使用。
【０００６】
腫瘍部位を選択的に標的とすることができるＴＮＦ誘導体の作製について、最近報告された。たとえば、抗トランスフェリン受容体ｍＡｂの重鎖の遺伝子とＴＮＦ遺伝子とを融合することによって得られる融合タンパク質（４）、または、ＴＮＦと腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するモノクローナル抗体の「ヒンジ」領域との融合タンパク質（６）、またはＦｖ−ＴＮＦ融合タンパク質（６）が記載されている。
【０００７】
欧州特許ＥＰ  ２５１  ４９４号には、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートした抗体、コンジュゲートした抗体を複合体化することができる薬剤、および、抗体により認識される標的細胞に対するビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、治療薬または診断用薬を集中させることができるように、逐次的に且つ十分に遅らせて投与されるビオチンと結合した診断用薬または治療薬からなる化合物を含む、診断用薬または治療薬を投与するためのシステムが開示されている。記載されている治療薬または診断用薬は、金属キレート、特に、シスプラチナム、ドキソルビシン等々の、放射性核種および低分子量抗腫瘍薬のキレートを含む。
【０００８】
欧州特許ＥＰ  ４９６  ０７４号には、ビオチニル化した抗体、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチニル化した診断薬または治療薬を逐次投与できる方法が開示されている。リシンのような細胞傷害剤が総括的に記述されているものの、放射標識化合物に関連のある利用が、主として開示されている。
【０００９】
ＷＯ９５／１５９７９号には、リガンドまたは抗リガンドとコンジュゲートした特異的標的分子を含む第１のコンジュゲートを投与し、その後、抗リガンドまたはリガンドにコンジュゲートした有毒な薬剤からなる第２のコンジュゲートを投与することに基づく、極めて有毒な薬剤を、細胞標的上に集中させる方法が開示されている。
【００１０】
ＷＯ９９／１３３２９号には、上記分子と、ＮＧＲ受容体のリガンドとのコンジュゲートに基づいて、分子を、腫瘍血管形成性血管に向けて送る方法が開示されている。多数の分子が可能な候補であると示唆されているが、ドキソルビシンのみについて具体的に記述されている。ＮＧＲ受容体のリガンドを、免疫応答を誘導するサイトカイン媒体として使用することについては、全く開示されていない。
【００１１】
アミノペプチダーゼ−Ｎ受容体（ＣＤ１３）のリガンドと結合させることによって、ある特定のサイトカインの治療係数を顕著に改善できること、また、それらの免疫療法特性を増強できることが、意外にも判明した。ＣＤ１３は、様々な種で高度に保存されている１５０ｋＤａの貫膜糖タンパク質である。ＣＤ１３は、正常細胞上、ならびに骨髄性腫瘍系統、血管形成性内皮および一部の上皮で発現される。ＣＤ１３受容体は、そのペプチドリガンドが、アミノ酸性「ＮＧＲ」モチーフを共有するという理由で、通常、「ＮＧＲ」受容体として同定される。
【００１２】
第１の態様によれば、本発明は、ＴＮＦおよびＩＦＮ７から選択されるサイトカインと、ＣＤ１３受容体のリガンドとのコンジュゲーション(conjugation)生成物を提供する。上記リガンドは、抗体であってもよく、そのフラグメント、たとえば、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、任意に、修飾された、天然ではないアミノ酸を含む、ＣＤ１３受容体に結合することができる、ペプチドまたはペプチド擬似物、すなわち、ペプチド様分子であってもよい。リガンドは、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣまたはシクロＣＮＧＲＣ等の、ＮＧＲモチーフを含む直鎖状または環状のペプチドであることが好ましく、ペプチドＣＮＧＲＣであることがさらに好ましい。このペプチドは、サイトカインに直接結合させてもよく、またはアミノ酸１個、アミノ酸配列または有機残基、たとえば、６−アミノカプリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであってもよい、スペーサーを介して、間接的に結合させてもよい。結合手順は、当業者に周知であり、遺伝子工学または化学合成技術を含む。
【００１３】
ペプチドリガンドは、サイトカインＮ末端に連結している、従って、修飾サイトカインが、その受容体に結合する際の妨害を最小限に抑えることが好ましい。あるいは、ペプチドは、分子上の天然の、または、遺伝子工学技術で人工的に挿入された、アミド結合またはカルボン酸結合アクセプターである、アミノ酸残基に連結されていてもよい。修飾サイトカインは、このペプチドをコードする５’隣接配列を含むｃＤＮＡを使用して作製することが好ましい。
【００１４】
好ましい実施形態によれば、ＴＮＦとＣＮＧＲＣ配列との間にコンジュゲーション生成物が提供される。さらに好ましくは、ＴＮＦのアミノ末端は、スペーサーＧ（グリシン）を介して、ＣＮＧＲＣペプチドに連結されている。
【００１５】
結果として得られる生成物（ＮＧＲ−ＴＮＦ）は、ＲＭＡ−Ｔリンパ腫動物モデルで、ＴＮＦより活性であった。さらに、ＮＧＲ−ＴＮＦを投与した動物は、ＲＭＡ−Ｔ細胞またはＲＭＡ細胞の、さらなる腫瘍形成性用量を排除することができた。免疫適格動物では、通常のＴＮＦと比較して、抗腫瘍活性の増大が確認できたが、免疫不全動物では確認できなかった。このことから、「ＮＧＲ」ペプチドと結合したＴＮＦの抗腫瘍活性の増大は、結合体の直接的な細胞傷害活性よりむしろ、免疫応答増強に起因することがわかる。
【００１６】
ＮＧＲ−ＴＮＦによって誘導されるｉｎ  ｖｉｖｏ免疫作用は、ＣＤ１３受容体に直接関係していることも証明されている。たとえば、ＣＤ１３受容体に対する抗体ならびにＧＮＧＲＣリガンドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＧＲ−ＴＮＦと競合することが観察されていて、従って、ＮＧＲ−ＴＮＦによる受容体ターゲティングの機序が示唆される。
【００１７】
２つのＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦＲおよびｐ５５ＴＮＦＲの１つに選択的に結合することができるＴＮＦの突然変異体形を使用することによって、ＴＮＦ／ＣＤ１３リガンド結合体の治療係数をさらに向上させることができる。上記ＴＮＦ突然変異体は、位置指定突然変異誘発によって得ることができる（５；７）。
【００１８】
本発明による修飾サイトカイン類の薬物動態は、サイトカイン自身の血漿半減期を延長できるポリエチレングルコール誘導体を作製することによって改良することができる。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＤ１３リガンドで修飾されたサイトカインが、腫瘍抗原または他の腫瘍血管形成性マーカー、たとえば、αｖインテグリン、メタロプロテアーゼまたは血管成長因子に対する抗体またはそれらのフラグメント、または細胞外マトリックスの成分に対する抗体またはそれらのフラグメント、たとえば、抗テネイシン抗体または抗フィブロネクチンＥＤＢドメインとコンジュゲートしている、二官能性誘導体によって実現される。ＴＮＦと、胃および卵巣の腺癌によって発現される腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するｍＡｂのヒンジ領域との間の、融合生成物の作製が最近報告された（６）。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、ビオチン／アビジン系を用いた腫瘍のプレターゲティングによって実現される。このアプローチによれば、１）ビオチニル化ｍＡｂ、２）アビジン（またはストレプトアビジン）および３）ＣＤ１３リガンドおよびビオチンで修飾された二価サイトカインによって形成される、異なるステージの、腫瘍の抗原性部位上に、三元複合体が得られる。免疫結合体を用いた従来のターゲティングと比較して、プレターゲティングアプローチは、標的にホーミング（自動誘導）された活性分子と自由活性分子との比率を実際に高めることができ、従って、投与毒性を減少できることが、多数の論文で証明されている（１１，１０，９，８）。このアプローチは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞傷害性を誘導することができ、また、正常なＴＮＦが不活性な条件で腫瘍細胞成長を低減させることができる、ビオチニル化ＴＮＦで、良好な結果をもたらした（１４，２６）。腫瘍抗原および修飾サイトカインに同時に結合する二重特異性抗体を使用することによって、２相法で、プレターゲティングアプローチを実行することもできる。最近、癌胎児抗原に対する二重特異性抗体およびＴＮＦの使用が、ＴＮＦ腫瘍プレターゲティングのための手段として記述された（３１）。
【００２１】
さらなる実施形態によれば、本発明は、異なるＴＮＦサブユニット上において、ＣＤ１３リガンドと抗体またはそのフラグメント（抗体またはそのフラグメントは、腫瘍細胞上に発現される抗原、または、腫瘍間質の他成分、たとえばテネイシンおよびフィブロネクチンＥＤＢドメインに対する）との両者に、（直接的に、またはビオチン−アビジン架橋を介して間接的に）結合したＴＮＦ分子を含む。この結果、修飾サイトカインの腫瘍誘導特性がさらに向上し、後者は、三量体−単量体−三量体転移を介して、腫瘍微小環境にゆっくり放出される。事実、先の研究で示した通り、ＴＮＦ結合体の修飾サブユニットは、非修飾三量体ＴＮＦ分子を形成するために、標的複合体から解離して再会合することができ、次いで、腫瘍微小環境に拡散する。生物活性なＴＮＦの放出は、ターゲティング後２４〜４８時間以内に起きることが証明されている（２１）。
【００２２】
治療で使用するために、本発明の修飾サイトカイン類を、経口または非経口投与向けの医薬品に、適当に製剤化する。非経口投与向けの製剤が好ましく、注射可能な溶液または懸濁液および注入用液を含む。非経口向け製剤の場合、任意に、可溶化剤、等張化剤、保存料、安定剤、乳化剤または分散剤等の賦形剤を加えて、有効成分の有効量を無菌担体中に溶解または懸濁させ、続いて、密閉したバイアルまたはアンプルに分配する。
【００２３】
サイトカイン類をリポソームの形態で製剤化することにより、その生物活性を向上させることができる。事実、ＴＮＦアミノ基のアシル化によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を失わずに、疎水性が上昇することが確認されている。さらに、脂質に結合したＴＮＦは、影響を受けないｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性、免疫調節作用、および低減したｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を有することが報告されている（１２，１３）。
【００２４】
ヒトでのボーラスＴＮＦの最大耐量は、動物での有効用量より約１０倍低い、２１８〜４１０μｇ／ｍ2である（３２）。ネズミモデルのデータに基づけば、ヒトで抗腫瘍作用を達成するためには、少なくとも１０倍高い用量が必要であると考えられる（１５）。高温摘出肢灌流を用いた第１の臨床試験において、メルファランおよびインターフェロンγと併用したＴＮＦ  ４ｍｇという独特の用量で高い応答率が得られた（１６）。その他の研究で、インターフェロンγを省略できること、および治療応答を誘導するのに、さらに低用量のＴＮＦで十分なことが証明されている（１７，１８）。２種のサイトカインは、内皮細胞に対して相乗効果を発揮するため、それらを組合せた、選択的ターゲティングは、より強い抗腫瘍活性を示す公算が高く、従って、同じサイトカイン類を併用した癌療法で遭遇する全身毒性の問題を克服することが可能である。さらに、ＴＮＦは、内皮裏打血管のバリヤー機能を低下させ、従って、それらの巨大分子透過性を高められることが判明している。本発明による修飾ＴＮＦ分子を用いた治療が低毒性であること、およびそれらの腫瘍血管ホーミング特性を利用して、代替用途は、治療向けまたは診断向けの、他の化合物の腫瘍血管透過性を高めるためのそれらの使用である。たとえば、腫瘍のラジオイムノシンチグラフィーまたは放射免疫療法で、修飾ＴＮＦを使用して、腫瘍による放射標識抗体またはホルモン類（腫瘍画像化用化合物）の取り込みを増加させることができる。あるいは、化学療法薬、免疫毒素、薬剤または遺伝子を含むリポソーム、または他の抗癌薬の取り込みも増加させることができ、それらの抗腫瘍作用が増強される。
【００２５】
従って、癌の治療または診断で、本発明のサイトカイン類を、複合製剤で、分離製剤で、または、逐次的製剤で、他の診断用物質または治療用物質とも一緒に、使用することができる。
【００２６】
本発明の最後の態様は、ＣＤ１３リガンド、好ましくは、上述のホーミングペプチドをコードする、５’隣接ＤＮＡ配列または３’隣接ＤＮＡ配列を付加することによって、サイトカインｃＤＮＡから作製することができる、本明細書に開示されている結合サイトカインをコードするｃＤＮＡに関する。この複合ｃＤＮＡを、そのままで、またはベクターに挿入後、遺伝子療法に使用することができる。適当なベクターの作製および治療的利用が開示されており（１９）、これを、参照することにより、本明細書に組み込む。
【００２７】
以下の実施例で、本発明をさらに説明する。
【００２８】
［実施例Ｉ］
ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの作製
ネズミ組換えＴＮＦおよびＣｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＮＦ（ＮＧＲ−ＴＮＦ）は、大腸菌における細胞質ｃＤＮＡ発現によって産生した。ネズミＭｅｔ−ＴＮＦｌ〜１５６をコードするｃＤＮＡ（２０）は、
５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ−３’および
５’−ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’を、
３’および５’プライマーとして使用し、リポ多糖刺激ネズミＲＡＷ−２６４．７単球−マクロファージ細胞から単離されたｍＲＮＡを用いて、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製した。
【００２９】
この増幅フラグメントを、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）で消化し、同一酵素で予め消化したｐＥＴ−１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした（ｐＴＮＦ）。
【００３０】
５’プライマーとしての５’−ＧＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’、および上記３’プライマーを使用し、ｐＴＮＦを用いて、ＰＣＲにより、Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＮＦ1〜156をコードするｃＤＮＡを増幅した。上述の通りに、この増幅フラグメントを消化し、ｐＥＴ−１１ｂにクローニングして、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）の形質転換に使用した。ｐＥＴ１１ｂ製造業者の説明書に従って、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの発現を誘導した。細菌を２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で超音波処理し、続いて遠心分離（１５０００×ｇ、２０分、４℃）することにより、２リットル培養から、可溶性ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦを回収した。両抽出液を硫酸アンモニウム（飽和の２５％）と混合し、４℃で１時間放置し、さらに、上述の通りに遠心分離した。次いで、上澄中の硫酸アンモニウムを飽和の６５％とし、４℃で２４時間放置し、さらに遠心分離した。各ペレットを、２００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解し、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィで精製した（勾配溶出、緩衝溶液Ａ：１Ｍ硫酸アンモニウムを含む、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；緩衝溶液Ｂ：２０％グリセロール、５％メタノール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）。ＴＮＦ免疫反応性物質を含む分画（ウエスタンブロッティングによる）をプールし、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、ＤＥＡＥ−セファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）を用いたイオン交換クロマトグラフィでさらに精製した（勾配溶出、緩衝溶液Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；緩衝溶液Ｂ：１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）。ＴＮＦ−免疫反応性を含む分画をプールし、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で予め平衡化し、同緩衝溶液で溶出する、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィで精製した。４００００〜５００００Ｍｒ生成物に対応する分画をプールし、等分して−２０℃で保存した。クロマトグラフィステップで使用した溶液は全て、無菌で且つ内毒素を含まない水（Ｓａｌｆ，Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）で調製した。最終収量は、ＴＮＦ  ４５ｍｇおよびＮＧＲ−ＴＮＦ  ３４．５ｍｇであった。
【００３１】
精製したＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの分子量を、エレクトロスプレー質量分析法で測定した。市販のタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、タンパク質含量を測定した。ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの内毒素含量は、定量的色素生産性Ｌｙｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で測定したとき、それぞれ、０．７５単位／μｇおよび１．３８単位／μｇであった。
【００３２】
１２．５％または１５％ポリアクリルアミドゲルを使用し、標準手順で、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット分析を実施した。
【００３３】
以下の通りに、可溶性ｐ５５−ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒｌ）−セファロースを用いたアフィニティクロマトグラフィで、少量のＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦをさらに精製した：組換えｓＴＮＦ−Ｒ１  ５ｍｇを、記載の通りに作製し（２２）、製造業者の説明書に従って、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２ｍｌに結合させた。別個のカラム２個（それぞれ１ｍｌ）を、無菌で且つ内毒素を含まない溶液で徹底的に洗浄し、ＰＢＳ中の、精製ＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦを充填し、勾配溶出（１時間、緩衝溶液Ａ：ＰＢＳ；緩衝溶液Ｂ：０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ）で脱着させた。ＴＮＦ−抗原含有分画を中和し、無菌生理学的溶液に対して透析した。膜上にタンパク質が吸着するのを防止するために、内毒素を含まないヒト血清アルブミンを加えてから透析した（０．５ｍｇ／ｍｌ）。各分画中のＴＮＦ含量を、ＥＬＩＳＡおよび細胞溶解アッセイで測定した。
【００３４】
ＴＮＦの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、単量体ＴＮＦの予想値、１７〜１８ｋＤａの単一バンドを示した（表示せず）。相反して、ＮＧＲ−ＴＮＦの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、単量体、二量体および三量体に対応すると思われる、１８、３６および５０ｋＤａという異なる免疫反応形を示した。還元条件では、５０ｋＤａおよび３６ｋＤａのバンドのほとんどが、１８ｋＤａ形に転換されており、鎖間ジスルフィド架橋を有するＮＧＲ−ＴＮＦ分子の存在が示唆される。１８ｋＤａの  バンドが、物質総量の約２／３を占め、３６ｋＤａのバンドが、残りの部分のほとんどであった。これらの電気泳動パターンから、ＮＧＲ−ＴＮＦは、適切な鎖内ジスルフィドを有する３つの単量体サブユニットで構成される三量体（少なくとも５０％）と、主として１つ以上の鎖間ジスルフィドを有する三量体による残りの部分との混合物であったことが示唆される。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも確認された３６ｋＤａのバンドから、ＮＧＲ−ＴＮＦが不可逆的変性二量体（総量の約１０％）も含んでいたことが示唆される。
【００３５】
ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦ単量体の分子量は、エレクトロスプレー質量分析法で、それぞれ、１７３８６．１±２．０Ｄａおよび１７８４３．７±２．５Ｄａであった。これらの値は、Ｍｅｔ−ＴＮＦ１〜１５６（１７３８６．７Ｄａ）およびＣＮＧＲＣＧ−ＴＮＦ１〜１５６（１７８４４．２Ｄａ）の予想分子量と非常によく一致する。
【００３６】
［実施例ＩＩ］
ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性
記載されている通りに（２３）、Ｌ−Ｍマウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）に基づいた標準細胞溶解アッセイで、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの生物活性を推定した。ＲＭＡ−Ｔ細胞に対するＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの細胞溶解活性を、３０ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤの存在下で試験した。３種の異なる希釈で、各サンプルを二重に分析した。結果を、２〜３の独立したアッセイの、平均値±ＳＤとして示す。
【００３７】
ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性は、Ｌ−Ｍ細胞を用いた標準細胞溶解アッセイで、それぞれ、（１．２±０．１４）×１０8単位／ｍｇおよび（１．８±０．７）×１０8単位／ｍｇであった。これらの結果から、ＮＧＲ−ＴＮＦ分子のＣＮＧＲＣＧ部分は、フォールディング、オリゴマー化およびＴＮＦ受容体への結合を妨げないことが分かる。
【００３８】
先の研究で、我々は、ＲＭＡ−Ｔ細胞は、３０ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤの存在下で、ＴＮＦによって死滅するが、転写インヒビターがない場合には、これらの細胞は、数日間インキュベートした後でも、ＴＮＦに抵抗することを示した。ＴＮＦ（（１．２±０．１４）×１０8単位／ｍｇ）を標準として使用して測定したとき、ＲＭＡ−Ｔ細胞に対するＮＧＲ−ＴＮＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性は、アクチノマイシンＤの存在下で、（１．４±０．８）×１０8単位／ｍｇであった。従って、Ｌ−Ｍ細胞およびＲＭＡ−Ｔ細胞の両者に対するＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの細胞傷害活性は、類似していた。
【００３９】
［実施例ＩＩＩ］
ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの治療活性および毒性の特性決定
Ｃ５７ＢＬ／６由来のラウシャーウイルス誘導性ＲＭＡリンパ腫を、ＲＰＭＩ  １６４０、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、２ｍＭグルタミンおよび５０Ｍ  ２−メルカプトエタノール中で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持した。ＲＭＡ−Ｔは、Ｔｈｙ１．１対立遺伝子をコードする構築物を用いたトランスフェクションによるＲＭＡ細胞系に由来し、記載されている通りに培養した（１４）。
【００４０】
Ｂ１６Ｆ１黒色腫細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０、５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、２ｍＭグルタミン、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で培養した。
【００４１】
動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＳａｎＲａｆｆａｅｌｅＨＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｅに認可され、所定のガイドラインに従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）（１６〜１８ｇ）に、それぞれ、５×１０4個のＲＭＡ−ＴまたはＢ１６Ｆ１生細胞を、左横腹に皮下投与した。腫瘍移植の１０〜１２日後、内毒素を含まない０．９％塩化ナトリウムで希釈した、ＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦ溶液２５０μｌをマウスに腹腔内投与した。
【００４２】
予備実験から、担体として、ヒト血清アルブミンをＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦ溶液に加えることによって、抗腫瘍活性は変化しないことが分かった。各実験は、群当たり５匹のマウスで実施した。腫瘍サイズをカリパスで測定することによって、腫瘍成長を毎日モニタリングした。腫瘍面積は、ｒｌ×ｒ２を計算することによって推測し、腫瘍体積は、ｒ１×ｒ２×ｒ３×４／３を計算することによって推測した（ここで、ｒｌおよびｒ２は、縦半径および横半径であり、ｒ３は、正常な皮膚の表面から突出している腫瘍の厚さである。腫瘍が直径１．０〜１．３ｃｍに達する前に、動物を屠殺した。腫瘍サイズは、平均値±ＳＥ（図の説明に示す通り、群当たり５〜１０匹の動物）として示し、ｔ検定によって比較した。
【００４３】
Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるＲＭＡ−Ｔリンパ腫およびＢ１６Ｆ１黒色腫モデルを使用して、ＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性および毒性を、ＴＮＦと比較した。ＲＭＡ−Ｔモデルは、以前に特性化されており、異なるターゲティングプロトコール（２６）によるＴＮＦの抗腫瘍活性の研究に使用されているため、我々は、このモデルを本研究にも使用することに決定した。
【００４４】
確立した皮下ＲＭＡ−Ｔ腫瘍を担持する動物に投与されたネズミＴＮＦは、２４時間後に、腫瘍塊および腫瘍の中心部分の出血性壊死を減少させ、続いて、数日間、有意な成長遅延を引き起こした（２６）。投与の数日後に、壊死領域の周囲に残っている生細胞が再び成長し始めるため、ＬＤ５０に近い用量でも、ＴＮＦの１回投与では、腫瘍は完全に退縮しない。
【００４５】
第１組の実験で、我々は、様々な用量（ｉ．ｐ．）のＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦの、動物生存に対する作用を調査した。過度の苦痛を避けるために、腫瘍直径が１〜１．３ｃｍより大きくなったとき、動物を屠殺した。投与後３日の、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの死亡率は、類似していた（ＬＤ５０、それぞれ、６０μｇおよび４５μｇ）が、それらの抗腫瘍活性は著明に異なっていた（表１）。
【００４６】
【表１】
0004836384.tif 000002
【００４７】
たとえば、１または３μｇのＮＧＲ−ＴＮＦは、２７μｇのＴＮＦより効率よく腫瘍成長を遅らせ、ＮＧＲ−ＴＮＦが、少なくとも１桁、より活性であることが分かる。興味深いことに、一部の動物は、ＬＤ５０より低い用量のＮＧＲ−ＴＮＦで治癒したが、ＴＮＦでは、全く治癒しなかった。治癒した動物は、発癌用量のＲＭＡ−Ｔ細胞または野生型ＲＭＡ細胞のさらなる投与を無効にし、ＮＧＲ−ＴＮＦの１回投与で、防御的免疫を誘導できたことが示唆される。ＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦの用量を、９〜２７μｇ以上に増加することによって、毒性は著明に増強したが、治療活性は、十分に増強しないかまたは全く増強しなかったことは注目に値する。
【００４８】
ＴＮＦ投与の結果として起こる体重の減少は、周知の全身性毒性の兆候である（２６）。従って、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの効力／毒性比をさらに比較するために、我々は、投与後、腫瘍成長および動物体重をモニタリングした。ＮＧＲ−ＴＮＦ  １μｇの、腫瘍成長に対する作用は、ＴＮＦ  ９μｇの作用に類似していたか、または、それより高かった（図１ａ）が、投与後１〜２日の体重減少は、ＴＮＦ  １μｇの体重減少に匹敵した（図１ｃ）。対数曲線を用いて、データを用量−応答プロットに挿入したとき、１４日における、ＴＮＦ  ９μｇの治療効果は、ＮＧＲ−ＴＮＦ  ０．６μｇという少量で得られることがが分かった（図１ｂ）。対照的に、匹敵する毒作用を誘導するためには、８．５μｇが必要であった（図１ｄ）。従って、上記条件で、ＮＧＲ−ＴＮＦの計算上の効力／毒性比は、ＴＮＦのそれより１４倍大きい。
【００４９】
Ｂ１６Ｆ１黒色腫モデルで、同様の結果が得られた。１１日および１７日に、ＮＧＲ−ＴＮＦ  １μｇを投与することにより、１９日に、ＴＮＦ  ４μｇで得られるものより大きい抗腫瘍応答、およびＴＮＦ  １２μｇで得られるものに類似した抗腫瘍応答を誘導した（データ示さず）。対照的に、ＮＧＲ−ＴＮＦ  １μｇによって生じた体重減少は、ＴＮＦ  ４μｇおよび１２μｇで生じたものより著明に低かった。ＮＧＲ−ＴＮＦ  １２μｇを投与することにより、さらに強い抗腫瘍作用を生じたが、毒作用は、ＴＮＦ  １２μｇのそれと同様であった。
【００５０】
１９日に、３回目の注射を行ったとき、１〜２日後に、全群で、幾らかの動物が死亡した（食塩水およびＮＧＲ−ＴＮＦ  １２μｇ投与群で５匹中２匹、および残りの群で、５匹中１匹）。ＮＧＲ−ＴＮＦ  １２μｇを投与した動物１匹が、腫瘍を完全に排除したことに、注目すべきである。この動物に２回目の発癌用量のＢ１６Ｆ１細胞を投与したとき、触診可能な腫瘍が１８日後に発生したが、対照動物には、６〜７日後に腫瘍が発生した。
【００５１】
以上の結果を全部合わせてみると、腫瘍成長阻害におけるＮＧＲ−ＴＮＦの効力は、ＴＮＦのそれより１０〜１５倍大きく、毒性は類似していると考えられる。さらに、ＮＧＲ−ＴＮＦは、ＴＮＦより効率よく、防御的免疫応答を誘導することができる。
【００５２】
［実施例ＩＶ］
ＮＧＲ−ＴＮＦの作用機序
抗マウスＣＤ１３  ｍＡｂ  Ｒ３−６３は、タンパク質−Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって腹水から精製し、０．９％塩化ナトリウムに対して透析した。
【００５３】
ウサギポリクローナル抗血清は、Ｐｒｉｍｍ  ｓｒｌ（Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）から購入し、タンパク質−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）を用いたアフィニティクロマトグラフィで精製した。ＣＮＧＲＣおよびＣＡＲＡＣペプチドは、既述の通りに作製した（２８）。
【００５４】
ＮＧＲ−ＴＮＦの改良された活性は、ＮＧＲ部分を介してターゲティングする腫瘍によって異なるという証拠を提供するために、我々は、ＮＧＲ−ＴＮＦのｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、ＣＮＧＲＣとある程度競合できるかどうかを調査した。このために、我々は、過剰のＣＮＧＲＣと一緒に、またはＣＮＧＲＣなしで、ＮＧＲ−ＴＮＦ（１μｇ）をＲＭＡ−Ｔ腫瘍担持マウスに投与した。並行して、やはり、ＣＮＧＲと一緒に、またはＣＮＧＲＣなしで、ＴＮＦ（３または９μｇ）を他の動物に投与した。予想通り、ＣＮＧＲＣは、ＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性を有意に低下させた（図２ａ）が、ＴＮＦの抗腫瘍活性は低下させなかった（図２ｂ）。相反して、対照ペプチド（ＣＡＲＡＣ）は、ＮＧＲ−ＴＮＦ活性を有意に低下させることができなかった（図２ｃ）。以上の結果から、ＣＮＧＲＣは、ＮＧＲ−ＴＮＦのＣＮＧＲＣ受容体への結合に関して競合することが示唆され、改良された活性のためのターゲティング機序に関する仮説が裏付けられる。ＣＮＧＲＣは、ＮＧＲ−ＴＮＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を低下させることができなかったことに、注目すべきである（データ示さず）。
【００５５】
アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）は、ＣＮＧＲＣペプチドの受容体であることが最近報告されたため、我々は、次に、ＮＧＲ−ＴＮＦのターゲティング機序における、この受容体の寄与について調査した。このために、我々は、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの抗腫瘍活性に対する、抗ＣＤ１３ｍＡｂ（Ｒ３−６３）の作用について研究した。ＭＡｂ  Ｒ３−６３は、ＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性を有意に阻害した（図２ａ）が、ＴＮＦの抗腫瘍活性は阻害せず（図２ｂ）、ＣＤ１３は、実際に、ＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性に決定的に関与していることが分かる。ｍＡｂ  Ｒ３−６３を用いた培養細胞のＦＡＣＳ分析で、ＲＭＡ−Ｔ細胞表面上でのＣＤ１３の発現は全く認められず（表示せず）、ｉｎ  ｖｉｖｏで、他の細胞が抗体に認識されたことが示唆される。
【００５６】
以上のデータは、ＣＤ１３が、ＮＧＲ−ＴＮＦ重要な受容体であることを示すが、我々は、他の未だ同定されていないＮＧＲ受容体への結合も、たとえ程度が低くても、ターゲティング機序に寄与することを完全に除外することはできない。
【００５７】
部分的タンパク質分解の予備実験は、ＴＮＦのＮ末端セグメント（残基２〜３）におけるＡｒｇ−Ｓｅｒ結合は、トリプシンに非常に敏感であるが、分子の残りは、はるかに耐性であることを示した。従って、ＮＧＲ−ＴＮＦの改良された活性は、そのＮＧＲ部分と関係があるというさらなる証拠を提供するために、我々は、固定化トリプシンを用いた部分的消化によって、突然変異タンパク質のＮ末端領域から、ＮＧＲドメインを切り取ろうとした。この処理によって、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの両者が、ＴＮＦ３−１５６フラグメントに対応する分子に転換した（予想質量１６９８６．２Ｄａ；測定された質量および予測される配列については、図３ａを参照）。
【００５８】
消化によって、Ｌ−Ｍ細胞に対するＮＧＲ−ＴＮＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解活性は低下しなかった（２．３±１．４）×１０8Ｕ／ｍｇ）が、そのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、ＴＮＦのレベルまで低下した（図３ｂ）。投与１日後の動物体重減少から判断される、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの毒性は、消化の前後ともに類似しており（図３ｂ、右パネル）、ＮＧＲ依存的ターゲティング機序によって毒性は変化しないことが示唆されることに注目すべきである。
【００５９】
［実施例Ｖ］
ヒトＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの作製および特性決定
ヒト組換えＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦ（ＣＮＧＲＣＧのＣ末端と融合したヒトＴＮＦ１〜１５７からなる）を、組換えＤＮＡテクノロジーによって作製し、本質的にネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦに関して記載した通りに精製した。ヒトＮＧＲ−ＴＮＦをコードするｃＤＮＡは、以下のプライマー：
ＮＧＲ−ｈＴＮＦ／１（センス）：５’Ａ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＴＣｄＴ  ＴＣＴ  ＣＧ  ３’
ＮＧＲ−ｈＴＮＦ／２（アンチセンス）：５’ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ３’を使用して、ｈＴＮＦコード配列を含むプラスミドｐＥＴ１１ｂ／ｈＴＮＦを用いたＰＣＲで作製した（３３）。
【００６０】
増幅フラグメントを消化し、ｐＥＴ−１ｌｂ（Ｎｄｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ）にクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）の形質転換に使用した。ｐＥＴ１１ｂ製造業者の説明書に従って、ＮＧＲ−ｈＴＮＦの発現を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導した。細菌を、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で超音波処理し、続いて遠心分離（１５０００×ｇ、２０分、４℃）することにより、可溶性ＮＧＲ−ＴＮＦを２リットル培養から回収した。
【００６１】
抽出液を硫酸アンモニウム（飽和の３５％）と混合し、４℃で１時間放置し、さらに、上記の通りに遠心分離した。次いで、上澄中の硫酸アンモニウムを６５％にし、４℃で２４時間放置し、さらに遠心分離した。各ペレットを、１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解し、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィで精製した（勾配溶出、緩衝溶液Ａ：１Ｍ硫酸アンモニウムを含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；緩衝溶液Ｂ：７０％エチレングリコール、５％メタノール、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）。ｈＴＮＦ免疫反応性物質を含む（ＥＬＩＳＡによる）分画をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）を用いたイオン交換クロマトグラフィでさらに精製した。（勾配溶出、緩衝溶液Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；緩衝溶液Ｂ：１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）。クロマトグラフィステップで使用した溶液は全て、無菌で且つ内毒素を含まない水（Ｓａｌｆ，Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）で調製した。
【００６２】
この時点で、２リットル培養から、ＴＮＦ約３０ｍｇおよびＮＧＲ−ＴＮＦ  ３２ｍｇが回収された。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、単量体、二量体および三量体に対応するバンドを示し、ヒトＮＧＲ−ＴＮＦも、ネズミＮＧＲ−ＴＮＦで確認されたのと同様、適切な鎖内ジスルフィドを有する三量体と、１つ以上の鎖間ジスルフィド架橋を有する三量体との混合物であったことが示唆される（図４Ａ、レーンｂ）。
【００６３】
この混合物から、以下の通りに、４−ステップ変性−リフォールディング工程で、適切な鎖内ジスルフィド架橋を有する三量体を単離した。精製したヒトＮＧＲ−ＴＮＦを、７Ｍ尿素で変性させ、７Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で予め平衡化しておいたＨＲ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（１０２５ｍｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させてゲル濾過した。単量体のＴＮＦに対応する分画をプールし、ＹＭ  ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ膜（Ａｍｉｃｏｎ）で限外濾過し、４℃で、３３倍量の２．３３Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に対して透析し（１４０分）、続いて、１．５５Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８（１４０分）および１Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８（１４０分）に対してすることにより、リフォールディングした。最後に、この生成物を、８０倍量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに対して透析（１６時間）し、１３０００×ｇで遠心分離し（３０分）、ｓＳＦＣＡ  ０．４５μｍ膜（Ｎａｌｇｅｎｅ）で濾過し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ＰＢＳ）で予め平衡化しておいたＨＲ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（１０２０ｍｌ）でゲル濾過した。リフォールディングしたタンパク質約２３ｍｇが回収された。
【００６４】
最終生成物は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、主として単量体であり（図４Ａ、レーンｃ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲカラムを用いた分析用ゲル濾過ＨＰＬＣで、三量体ヒトＴＮＦに類似した水力学的体積を有し（表示せず）、エレクトロスプレー質量分析法で、１７９３７．８＋１．８Ｄａという分子量を有していた（ＣＮＧＲＣＧ−ＴＮＦ１〜１５７の予想値、１７９３９．４Ｄａ）。リフォールディングしていないＮＧＲ−ＴＮＦおよびリフォールディングしたＮＧＲ−ＴＮＦの、マウスＬ−Ｍ細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解活性は、それぞれ、（６．１１×１０７）＋４．９および（５．０９×１０７）＋０．３単位／ｍｇであったが、精製ヒトＴＮＦのそれは、（５．４５×１０７）＋３．１単位／ｍｇであった。以上の結果から、変性−リフォールディング工程は、ヒトＮＧＲ−ＴＮＦとネズミｐ５５受容体との相互作用に影響を及ぼさなかったと考えられる。
【００６５】
ヒトＮＧＲ−ＴＮＦ（フォールディングしていない）１μｇのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、ＴＮＦ  １０μｇより大きかった（図４Ｂ）が、動物体重減少によって判断される毒性は、有意に低かった（図４Ｃ）。リフォールディング後、ＮＧＲ−ＴＮＦ  ０．３μｇは、ＴＮＦ  １０μｇで達成されるものより強い抗腫瘍作用を誘導するのに十分であった（図４Ｄ、４Ｅ）。
【００６６】
以上の結果から、ヒトＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性は、ヒトＴＮＦのそれより大きいことがわかる。
【００６７】
さらに、リフォールディングしたヒトおよびマウスのＮＧＲ−ＴＮＦは、非常に低い用量（１〜１０ｎｇ／マウス）でも、ＲＭＡ−Ｔ−担持マウスに対して、毒作用の証拠なしに、有意な抗腫瘍作用を誘導することができるが、ＴＮＦは、これらの用量で、有意な作用を誘導できない（表示せず）ことを、我々は確認した。
【００６８】
［実施例ＶＩ］
マウスＮＧＲ−ＩＦＮγの作製および特性決定
ＣＮＧＲＣＧと融合した組換えネズミインターフェロン（ＩＦＮ）γ（ＮＧＲ−ＩＦＮγ）を、本質的に、ＮＧＲ−ＴＮＦに関して記載した通りに、組換えＤＮＡテクノロジーで作製した。ＣＮＧＲＣドメインを、ＩＦＮγのＣ末端と融合させた。さらに、大腸菌細胞で発現させるために、１３４位のシステインを、セリンと取り替え、メチオニンを−１位に導入した。ＮＧＲ−ＩＦＮγ  ｃＤＮＡの産生に使用したＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：５’−Ａ  ＴＡＴ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  Ｃ  （センス）および５’−ＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣ。このｃＤＮＡをｐＥＴ−１１ｂ（Ｎｄｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ）にクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）の形質転換に使用した。ｐＥＴ１１ｂ製造業者の説明書に従って、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで、タンパク質発現を誘導した。標準技術に従って、アガロース上に固定された抗マウスＩＦＮγｍＡｂ（ＡＮ１８）を使用した、免疫アフィニティクロマトグラフィで、この生成物を、大腸菌抽出液から精製した。最終生成物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１６ｋＤａの単一バンドを示した。エレクトロスプレー質量分析法は、ネズミＭｅｔ−ＩＦＮγ１〜１３４（Ｃｌ３４Ｓ）ＣＮＧＲＣ（ＮＧＲ−ＩＦＮγ）に一致する、１６２２３＋３．６Ｄａの分子量を示した（予想値、１６２５．５Ｄａ）。
【００６９】
ＮＧＲ−ＩＦＮγおよびＮＧＲ−ＴＮＦが、抗ＣＤ１３抗体の腫瘍関連血管への結合について競合できる力を、免疫組織化学的アプローチを使用して調査した。
【００７０】
ヒト腎細胞癌の新鮮な外科標本は、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。Ｂｏｕｉｎ固定（４〜６時間）パラフィン包埋標本の薄切（５〜６μｍの厚さ）を作製し、ポリリシン被覆スライド上に吸着させた。以下に記載のアビジン−ビオチン複合方法を使用して、ＣＤ１３抗原を検出した：標準手順に従って、キシレンおよび段階的アルコールシリーズを使用して、組織薄切を再水和した。組織薄切、１ｍＭ  ＥＤＴＡが入っている容器に入れ、マイクロウエーブオーブン（１０００Ｗ）を使用して、７分間沸騰させた。次いで、この容器を１ｍＭ  ＥＤＴＡで再び満たし、再度、５分間沸騰させた。組織薄切を冷却し、内因性ペルオキシダーゼを失活させるために、０．３％過酸化水素を含むＰＢＳ中で１５分間インキュベートした。次いで、このサンプルをＰＢＳですすぎ、１００〜２００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡと共にインキュベートし（室温で１時間）、続いて、ＰＢＳ−ＢＳＡ（４℃で一晩）中のｍＡｂ  ＷＭ１５（抗ｈＣＤ１３）（単独でまたは様々な競合剤と混合して）（表２参照）と共にインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで３回洗浄し（各回３分）、２％正常なウマ血清（ＰＢＳ−ＢＳＡ−ＮＨＳ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を含むＰＢＳ−ＢＳＡと共に５分間インキュベートした。次いで、この溶液に、ＰＢＳ−ＢＳＡ−ＮＨＳ中の３μｇ／ｍｌビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を補充し、さらに、室温で１時間インキュベートした。スライドを再度洗浄し、ＰＢＳで１：１００希釈したＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩の錠剤（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、０．０３％過酸化水素を含む脱イオン水１０ｍｌに溶解し、０．２μｍ膜で濾過し、組織薄切上に５〜１０分間載せた。このスライドを、上述の通りに洗浄し、Ｈａｒｒｉｓのヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍関連血管は、抗ＣＤ３１  ｍＡｂ（ＤＡＫＯ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋからの、ｍＡｂ  ＪＣ／７０Ａ、抗ヒトＣＤ３１、ＩｇＧ１）を用いて、組織の染色連続切片で、同定した。
【００７１】
結果を、表２にまとめる。この表からわかるように、ＷＭ１５の、腫瘍関連血管への結合は、過剰のＮＧＲ−ＴＮＦ、ＮＧＲ−ＩＦＮγおよびＣＮＧＲＣで阻害されたが、ＮＧＲモチーフが欠如している他の対照試薬では阻害されなかった。このことから、ＣＤ１３上のＮＧＲ結合部位は、ＷＭ１５エピトープと立体的に重なっていることが示唆される。対照的に、ＮＧＲ−ＴＮＦは、１３ＣＯ３の上皮細胞への結合に関して、競合することができなかった。
【００７２】
我々は、ＮＧＲ−ＩＦＮγおよびＮＧＲ−ＴＮＦのＮＧＲ部分は、腫瘍関連血管上のｍＡｂ  ＷＭ１５によって認識されるＣＤ１３形と相互に作用することができると結論を下した。さらに、以上の結果から、ＣＮＧＲＣモチーフは、サイトカインのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに連結したとき、機能できることがわかる。
【００７３】
【表２】
0004836384.tif 000003
【００７４】
［実施例ＶＩＩ］
抗腫瘍抗体およびアビジンを使用した、ビオチニル化ＮＧＲ−ＴＮＦの腫瘍への標的化送達（プレターゲティング）
以下の実施例で、腫瘍誘導抗体とペプチドＣＮＧＲＣとの組合せに基づいた、ＴＮＦの「二重」ターゲティングの可能性を例証する。
【００７５】
ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦ結合体は、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ６．８中で、ＮＧＲ−ＴＮＦとＤ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｏｃｉｅｔｄ  Ｐｒｏｄｏｔｔｉ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｉ  Ｓ．ｐ．Ａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）とを混合する（室温で３時間）ことによって作製した（２１）。この反応を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５でブロックした。
【００７６】
この結合体を質量分析法で特性決定し、（平均して）１ビオチン／三量体を含むことが判明した。次いで、５×１０4のＲＭＡ−Ｔ生細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）の左横腹に皮下注射により（ｓ．ｃ．）投与した。腫瘍面積が４０ｍｍ2に達したとき、既述の「３日」プロトコール（２６）に従って、ビオチニル化抗体、アビジンおよびビオチン−ＴＮＦを、マウスに逐次注射した。我々は、ビオチン−ｍＡｂｌ９Ｅｌ２  ４０μｇ（ｉ．ｐ．、ステップＩ）、それぞれ、１８および１９時間後に、アビジン６０μｇおよびストレプトアビジン６０μｇ（ｉ．ｐ．、ステップＩＩ）、２４時間後に、ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦ  ３μｇ（ｉ．ｐ．、ステップＩＩＩ）を注射した。各化合物は、無菌０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈した。対照実験では、アビジンおよびストレプトアビジンを省略した。各実験は、５マウス／群で実施した。腫瘍サイズをカリパスで測定することによって、腫瘍成長を毎日モニタリングした。ｍＡｂ  １９Ｅｌ２−ビオチン／アビジン／ストレプトアビジン／ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦ投与群の、投与前および投与１０日後の腫瘍面積は、それぞれ、３９±４ｍｍ2および８±５ｍｍ2であった（動物５匹、平均値±ＳＥ）。対照群（ｍＡｂ  １９Ｅ１２−ビオチン／ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦのみを投与）では、投与前および投与１０日後の腫瘍面積は、それぞれ、４０±４ｍｍ2および２０±６ｍｍ2であり、腫瘍誘導抗体およびアビジンを用いたプレターゲティングは、ＮＧＲ−ＴＮＦの活性を増強したことがわかる。
【００７７】
［文献］
【表３】
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【００７８】
【表４】
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【００７９】
【表５】
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【００８０】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＲＭＡ−Ｔリンパ腫の成長（ａおよびｂ）および動物体重（ｃおよびｄ）に対する、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの作用。
腫瘍移植の１０日後に、動物５匹／群に、ＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦを１回投与した（ｉ．ｐ．）。用量の関数としての、１４日における腫瘍面積値（ｂ）および投与後の体重減少（１１日および１２日の平均値）（ｄ）を、対数曲線から補間した。１４日に、１μｇまたは９μｇのＮＧＲ−ＴＮＦによって誘導された抗腫瘍作用は、匹敵する量のＴＮＦによって誘導されたものより大きかった（それぞれ、Ｐ=０．０２４およびＰ=０．０３２）が、これらの投与後の体重減少は類似していた。矢印は、外挿された、比較可能な作用を誘導したＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの用量を示す。
【図２】  ＮＧＲ−ＴＮＦ（ａ）およびＴＮＦ（ｂ）の抗腫瘍活性に対する、ｍＡｂ  Ｒ３−６３およびＣＮＧＲＣの作用。
腫瘍移植の１２日後に、ＭＡｂＲ３−６３またはＣＮＧＲＣを、ＮＧＲ−ＴＮＦまたはＴＮＦと混合して、ＲＭＡ−Ｔ腫瘍担持動物に投与した（ｎ＝５動物／群）。別の実験（ｃ）では、１１日齢の腫瘍を担持する動物（ｎ＝５）に、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦと、ＣＮＧＲＣまたはＣＡＲＡＣ（対照ペプチド）とを、同時に投与した。ＮＧＲ−ＴＮＦ  １μｇの抗腫瘍作用は、ＴＮＦ  ９μｇのものより大きく（２０日におけるｔ検定、Ｐ＝０．００９）、また、ＣＮＧＲＣ（Ｐ＝０．０３５）およびｍＡｂ  Ｒ３−６３（Ｐ＝０．０１１）によって有意に阻害された。
【図３】  ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの制限的トリプシン消化が、それらの質量（ａ）および抗腫瘍活性（ｂ）に及ぼす作用。
トリプシン−アガロースは、製造業者の説明書に従って、トリプシン１ｍｇを、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）１ｍｌに結合することによって作製した。ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦ（３００μｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３中に、各１７０μｇ）を、１５μｌの樹脂懸濁液（１：４）または緩衝溶液のみと混合し、３７℃で、指示された時間、エンド・オーバー・エンド回転させた。４つの生成物を、０．２２μｍ  Ｓｐｉｎ−Ｘ装置（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で濾過し、使用するまで−２０℃で保存した。（ａ）エレクトロスプレー質量分析法分析。分子量値および対応する生成物（Ｎ末端配列）を、各ピークの上に示す。配列の上の矢印は、切断部位を示す。（ｂ）トリプシンなしで（上のパネル）またはトリプシンと共に（下のパネル）インキュベートした、１または３μｇのＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの、ＲＭＡ−Ｔ腫瘍の成長および動物体重に対する作用（用量１および３μｇを投与した群の、平均値±ＳＥ）。腫瘍移植の１３日後に、動物に投与した（ｎ＝５動物／群）。
【図４】  変性／リフォールディング前および後の、ヒトＮＧＲ−ＴＮＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗腫瘍活性。
ヒトＴＮＦ（ａ）、実施例Ｖに記載されている変性／リフォールディング工程の前（ｂ）および後（ｃ）の、ＮＧＲ−ＴＮＦの非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）。ＴＮＦおよびリフォールディングしていないＮＧＲ−ＴＮＦの、ＲＭＡ−Ｔリンパ腫の成長（Ｂ）および体重（Ｃ）に対する作用。ヒトＴＮＦ（Ｄ）およびリフォールディングしたＮＧＲ−ＴＮＦ（鎖内ジスルフィドを有する三量体＞９５％からなる）（Ｅ）の、腫瘍成長に対する作用。腫瘍移植の１０日後に、動物（各パネルに示してある通り、マウス１５または５匹／群）に、ＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦを１回投与（ｉ．ｐ．）した。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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