(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１細胞の少なくとも１つの表面分子に結合し、第１細胞からの第１トランス信号の減少をもたらす第１蛋白質と、
第２細胞の少なくとも１つの表面分子に結合し、第２トランス信号を第２細胞に送る第２蛋白質と、を含んでおり、
第１蛋白質は、ＣＴＬＡ-４及びＣＤ２７からなる群から選択され、第２蛋白質は、ＦａｓＬ及びＴＲＡＩＬからなる群から選択される、キメラ蛋白質。
【請求項２】
第１蛋白質は、第１細胞のトランス信号を直接マスキングすることによって第１トランス信号を減少させる請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項３】
第１蛋白質は、第１細胞のトランス信号を間接的にマスキングすることによって第１トランス信号を減少させる請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項４】
間接マスキングはアロステリック阻害により行われる請求項３のキメラ蛋白質。
【請求項５】
間接マスキングは、機能性多分子トランス信号伝達錯体の破壊によって行われる請求項３のキメラ蛋白質。
【請求項６】
間接マスキングは、細胞内信号伝達による第１信号の機能修飾によって行われる請求項３のキメラ蛋白質。
【請求項７】
第２蛋白質は免疫系を阻害する請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項８】
エピトープタグをさらに含んでいる請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項９】
エピトープタグはポリヒスチジンタグである請求項８のキメラ蛋白質。
【請求項１０】
第１蛋白質はＣＴＬＡ-４、第２蛋白質はＦａｓＬである請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項１１】
第１蛋白質はＣＴＬＡ-４、第２蛋白質はＴＲＡＩＬである請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項１２】
第１蛋白質はＣＤ２７、第２蛋白質はＴＲＡＩＬである請求項１のキメラ蛋白質。
【請求項１３】
第１蛋白質はＣＤ２７、第２蛋白質はＦａｓＬである請求項１のキメラ蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件は、国立健康研究所(National Institute of Health)の承認R01 CA-74958及びR01 AI-31044に基づく支援を一部受けている。
【０００２】
関連出願の記載
本願は２０００年１月３日出願の米国仮特許出願第６０/１７４２５８号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、第１細胞に付着することができ、該細胞から第１信号をマスキング又は第１信号に干渉することができ、一方で第２の型の信号を第２細胞へ授与することのできる新規なキメラ蛋白質に関する。この蛋白質は、数多くの免疫障害及びその他疾患の治療に有用である。一方の細胞の減少(decrement)に影響を与え、他方の細胞にトランス信号(trans signal)を送る方法についても開示する。
【０００４】
背景情報
免疫系には２種類の異なる細胞、つまりＢリンパ球(Ｂ細胞)とＴリンパ球(Ｔ細胞)がある。Ｂ細胞は抗原に出くわすと抗体を作り、多くの場合、これら抗体は保護する性質を有する。しかしながら、自己免疫疾患の場合、抗体の中には、個体の組織と反応を起こすものがある。それらの抗体が組織中に蓄積すると、炎症性反応及び組織損傷をもたらす。Ｔ細胞もまた、Ｂ細胞と同様、抗原に出くわすと活性化される。Ｔ細胞が発達するにつれて、「胸腺教育」と呼ばれるプロセスを受ける。この胸腺教育中、Ｔ細胞の９５％以上は死に到る。Ｔ細胞は個体自体の組織(自己抗原)を認識し反応するＴ細胞受容体を有するが、このＴ細胞は特異的に排除される。自己反応性Ｔ細胞の中には、排除プロセスを免れるものもあるが、免疫応答を開始して自己免疫性疾患を生ずる。
【０００５】
Ｔ細胞活性を調節することは、免疫病原性Ｔ細胞に関する病気の治療目標として有意義である。Ｔ細胞受容体(T cell receptor; TCR)の刺激の後のＴリンパ球の宿命は、共刺激と阻害受容体の投入を一体化することによって導かれる。抗原提示細胞(antigen presenting cells; APC)の共刺激リガンドは、Ｔ細胞のコグネイト受容体分子をトリガし、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌及び分化を増進する。これに対し、阻害リガンド分子がＴリンパ球のコグネイトカウンター受容体に結合すると、Ｔ細胞の不応答又は予定細胞死(programmed cell death; PCD)(アポトーシスとも称される)を誘発するので、エフェクター機能を減少させる。共刺激及び阻害受容体経路の相互作用は、共刺激遮断剤の存在下で阻害剤活性の向上を示す実験によって提案されている。
【０００６】
細胞障害性Ｔリンパ球関連蛋白質(ＣＴＬＡ-４(ＣＤ１５２))は、活性化されたＴリンパ球の表面に発現した阻害受容体分子である。ＡＰＣに存在するＢ７-１(ＣＤ８０)及び／又はＢ７-２(ＣＤ８６)のリガンドと関与した後、ＣＴＬＡ-４カウンター受容体は、関連するＳＨＰ-２フォスファターゼを経て、Ｔ細胞活性を阻害する。活性化されたＴ細胞には、ＣＴＬＡ-４が、二流化物と結合したホモ二量体糖蛋白質錯体として存在する。組換え型で可溶性のＣＴＬＡ-４：免疫グロブリンンＧ(ＣＴＬＡ-４：Ｉｇ)キメラ蛋白質は、Ｔ細胞表面に活性化ＣＤ２８受容体に対するＣＤ８０/ＣＤ８６分子の結合を競合的にブロックすることにより、阻害機能を示す。ＣＴＬＡ-４：Ｉｇはまた、ＣＤ２８を通じてＴ細胞の共刺激をブロックすることにより、拒絶反応及び自己免疫疾患の動物モデルにおいて、免疫抑制活性を示す。さらにまた、細胞内Ｔ細胞のＣＤ２８を経た生存信号の伝達は、ＡＰＣをＣＴＬＡ-４：Ｉｇで処理することにより拮抗する。このＣＴＬＡ-４：Ｉｇは、Ｆａｓ依存性ＰＣＤに対する感受性を向上させる。ＣＴＬＡ-４と、ＣＴＬＡ-４：Ｉｇの作用については、米国特許第５８８５７７６号、第５８８５５７９号、第５８５１７９５号及び第５９６８５１０号に開示されている。
【０００７】
アポトーシス(又はＰＣＤ)は、細胞ホメオスタシスの調節に不可欠な細胞死とは異なる形態である。免疫系において、Ｆａｓ(ＣＤ９５)受容体と、そのリガンドＦａｓＬ(ＣＤ９５Ｌ)は、免疫細胞性細胞障害などのアポトーシスの誘導、及び細胞免疫応答の調節に伴う種々のプロセスに参加する。ＦａｓＬは腫瘍壊死因子のファミリー分子(superfamily)の一部であり、免疫細胞(例えば、単核白血球、ＮＫ細胞、活性化Ｂ細胞及び活性化Ｔ細胞など)の限定サブセットによって発現する。細胞表面では、ＦａｓＬは、三量体錯体内のタイプII膜蛋白質として方向づけられる。膜型ＦａｓＬのメタロプロテナーゼ切断によって、可溶性ＦａｓＬ(ｓＦａｓＬ)の三量体が膜から解放される。ＦａｓＬ分子は、Ｆａｓ依存性ＰＣＤをトリガする。
【０００８】
分子又は分子錯体の価数(valency)は、細胞表面との関与によって増加する。組換え型ｓＦａｓＬ分子の異なるコーディングシーケンスは、マクロ分子の凝集に影響を及ぼし、この凝集はｓＦａｓＬの前アポトーシス機能に影響を及ぼす。特に、天然ｓＦａｓＬ分子は、三量体を形成し、アポトーシスの誘導は少ない。これに対し、組換え型の全長細胞外ドメインであるｓＦａｓＬポリペプチドは、もっと高いオーダの凝集物を形成し、より強力なアポトーシス活性を示す。さらにまた、ヒト２９３細胞の組換え体発現によって作られるｓＦａｓＬの錯体は、Ｆａｓ感受性細胞の溶解に架橋結合を必要とする。
【０００９】
米国特許第５８３０４６９号は、ヒトＦａｓ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体と結合蛋白質を開示しており、抗原及び抗体の幾つかは、Ｔ細胞の増殖を刺激し、抗ＦａｓＣＨ-１１モノクローナル抗体が介在する細胞の溶解を抑制し、Ｆａｓリガンドが介在する細胞の溶解をブロックするものとして報告されている。Ｆａｓ・Ｆｃ融合蛋白質もまた開示されている。
米国特許第５２４２６８７号、第５６０１８２８号及び第５６２３０５６号は、細胞に結合するが、細胞によって作られる信号をマスクしないＣＤ８コンポーネントを含む様々な融合蛋白質を開示している。
米国特許第５３５９０４６号は、ＭＨＣ以外の遺伝子が制限された形で、リガンドに結合できる細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び信号伝達経路を活性化させることのできる細胞質ドメインを含むキメラ蛋白質を開示している。同様な技術が米国特許第５６８６２８１号に開示されている。
【００１０】
これらの先行技術は、免疫抑制分子を、キメラ蛋白質や細胞に移す方法についての記載はあるが、本発明のキメラ蛋白質の２つの特徴を組み合わせる蛋白質の使用についての開示は全くない。より具体的に説明すると、これまで報告されたキメラ蛋白質には、ブロッキング蛋白質と信号伝達(signaling)蛋白質の両方として機能するように設計されたものはない。そのような結果や、そのような結果が好ましいことを開示したものはなく、示唆すらされていない。これらの蛋白質を、免疫系障害その他の疾患の治療に適用することは有用である。
【００１１】
発明の要旨
本発明は、新規なキメラ蛋白質を提供するもので、それらコンポーネントの蛋白質要素による固有の特徴を有しており、その特徴として、第１細胞の表面に結合する能力、第１細胞からの正常なトランス信号(trans signal)を減少させる能力及び異なるトランス信号を第２細胞へ送る能力という３つの能力を挙げることができる。第１細胞への結合は、キメラ蛋白質を細胞に局在化(localize)させる作用がある。キメラ蛋白質は、通常は第１細胞の「アンカー」分子によって送られるトランス信号に干渉し又は該信号をブロックすることができる。また、キメラ蛋白質は、それ自身のトランス信号を第２細胞へ送ることができる。このように、同じキメラ蛋白質が、第１の信号をブロック若しくはマスクするか又は該信号に干渉することできると共に、第２の信号を与えることができる。本発明のキメラ蛋白質は、その他にも、エピトーグタグ及び／又はその他蛋白質又は蛋白質以外の要素のように、追加の生物学的特性又は治療上の利点をもたらす有用な特徴を含んでおり、例えば、インビボでの組換え型蛋白質の半減期を長くし、アフィニティ・クロマトグラフィー又はその他の生化学的方法を通じて増殖を容易にし、抗体又はその他の結合要素を通じてエクスビボ及びインビボでの蛋白質の検出を容易にすることができる。本発明のキメラ蛋白質は、数多くの方法で、所望の能力を達成させることができる。例えば、阻害性の第２蛋白質を用いることにより、本発明の蛋白質を、自己免疫やアロ免疫のような免疫系障害の治療用として適したものにすることができるし、第２の蛋白質コンポーネントの中に刺激性のトランス信号伝達要素(trans signaling element)を用いることにより、本発明の蛋白質を、癌や感染性疾患のように免疫細胞の刺激が必要とされる病気の治療に適したものにすることができる。
【００１２】
さらに、本発明は、本発明のキメラ蛋白質を作る方法を提供し、また、自己免疫及びアロ免疫の研究及び治療にこれら蛋白質を用いる方法を提供するものである。その他に、自己免疫及びアロ免疫疾患を研究及び治療する方法についても開示する。これらの方法は、インビボ及びインビトロの両方に適用できる。
それゆえ、本発明の目的は、一方の信号をブロックし、他方へ送るという２つの機能を具える新規なキメラ蛋白質を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、自己免疫及びアロ免疫疾患の研究及び治療用として、また、癌及び感染性疾患の研究及び治療用としてのキメラ蛋白質を提供することである。
本発明のこれらの目的及び他の目的については、以下の説明及び請求の範囲の記載から明らかになるであろう。
【００１４】
発明の詳細な記述
本発明は、第１細胞に結合する機能を有し、この結合機能を通じて該細胞から発生する信号に干渉する第１蛋白質と、第２細胞へ異なる信号を送る第２蛋白質とを具えるキメラ蛋白質に関するものである。ここで、「干渉(interference)」とは、通常は第１細胞から送られるトランス信号の減少のことである。望ましい実施例において、第１蛋白質は、第１細胞から送られる信号を直接ブロック又はマスクするもので、ここでは「アンカー」細胞として記載することもある。本発明のキメラ蛋白質は、アンカー細胞に対して定量的に付着することができる。すなわち、アンカー細胞に結合するキメラ蛋白質の量は、放射性同位元素又はその他物質でラベルされたキメラ蛋白質の量を測定することによって評価される。アンカー細胞に結合するキメラ蛋白質の最大量は、キメラ蛋白質が結合するアンカー細胞に存在する蛋白質又はその他分子の量によって決定される。
【００１５】
第１蛋白質は、特定の型又は集団(population)のアンカー細胞を標的とすることができるように選択される。同様に、第２蛋白質は、蛋白質からのトランス信号を受ける特定の型又は集団の細胞を標的とすることができるように選択される。様々な表面分子が、蛋白質及び糖脂質を含む第１及び第２細胞で標的とされることができる。本発明の自由度及び有用性は、様々な細胞型を標的とするキメラ蛋白質の機能に由来するだけではない。個々の細胞の表面分子表現型は、それら分子や細胞の環境変化(例えば、代謝、増殖及び／又は分化状態における指令の変遷)の結果、時間と共に変化するから、与えられた第１細胞(アンカー細胞)及び第２細胞が特定表面の分子形態を表示するとき、キメラ蛋白質はこれら細胞に選択的に結合するように設計される。従って、本発明のキメラ蛋白質は、異なる細胞型を区別できるだけでなく、同じ細胞型が異なる細胞状態にある場合も区別することができるので、一時的選択性(temporal selectivity)と空間選択性(spatial selectivity)を組み合わせることができる。
【００１６】
本発明のキメラ蛋白質は、使用者の必要性及び要望に応じて、多くの方法により、様々な機能目的を達成することができるように構成される。この目的のために、キメラ蛋白質は２以上の蛋白質コンポーネントを含むように構成される。例えば、蛋白質は２以上のトランス信号伝達コンポーネントを含むことができ、各コンポーネントは、同じものでも異なるものでもよい。また、エピトーグタグを含んでもよい。さらにまた、安定性を向上させ、アフィニティ・クロマトグラフィー又はその他の生化学的方法を通じて増殖を容易にし、抗体又はその他結合要素を通じてエクスビボ及びインビボでの蛋白質の検出を容易にし、ロイシンジッパー等の要素を通じてその他分子との関与を可能とし、プロテアーゼの如き物質による切断を可能ならしめる等の特別な特性を付与することのできる他の蛋白質又は蛋白質以外の要素を含むことができる。本発明のキメラ蛋白質の第１及び第２の蛋白質コンポーネントは、Ｉ型又はII型の膜蛋白質に由来することができる。これらの蛋白質は、そのアミノ末端が細胞膜の細胞外又は細胞内のどちらかの側にある。さらにまた、第１及び第２の蛋白質コンポーネントは、天然可溶性の蛋白質に由来することもできる。
【００１７】
どんな細胞も、アンカー細胞、及びトランス信号を受ける第２細胞として標的にされることができる。また、第１及び第２蛋白質は、特定の病気を治療するために、又は所望される特定の目的のために、適当な細胞型を標的にするよう構成することができる。例えば、第１細胞／第２細胞の組合せとして、抗原提示細胞(ＡＰＣ)／Ｔ細胞、Ｔ細胞／Ｔ細胞、Ｔ細胞／Ｂ細胞、内皮細胞／造血細胞、癌細胞／癌細胞、正常細胞／癌細胞、癌細胞／正常細胞などの組合せを挙げることができる。なお、これらの組合せは単なる代表例であって、第１細胞／第２細胞の可能性のある組合せの全てを網羅している訳ではないことは認識されるべきである。
【００１８】
蛋白質が細胞の表面に結合できるのであれば、第１蛋白質としてどんな蛋白質を用いることができる。この結合機能により、細胞から発生する特定のトランス信号は減少する。本発明の一実施例では、トランス信号の減少が起こるのは、通常は第２細胞のカウンター受容体と接触する接触サイトにあるアンカー細胞のトランス信号伝達蛋白質の中で、これら蛋白質構造要素の直接マスキング又は「競合的ブロッキング(competitive blocking)」によるものである。本発明の他の実施例では、トランス信号の減少は、間接的機構によって起こる。この機構として、正常なトランス信号を介在する蛋白質の「アロステリック阻害」によってトランス信号が減少する例を挙げることができる。この例では、キメラ蛋白質の第１蛋白質がアンカー細胞のトランス信号伝達蛋白質のサイト(このサイトは、第２細胞のカウンター受容体と直接接触するサイトとは区別される)に結合する。幾つかの天然トランス信号伝達分子は実際には多分子錯体であるので、本発明のキメラ蛋白質の第１蛋白質は、多分子錯体の一方の蛋白質又は他方の分子コンポーネントに結合することができ、この結合を通じて、本発明の他の実施例における錯体の他方の分子コンポーネントからのトランス信号と干渉する。本発明のさらに他の実施例において、本発明のキメラ蛋白質の第１蛋白質は、アンカー細胞内の信号伝達経路(signaling pathway)をトリガすることができる。このように、本発明のキメラ蛋白質の第１蛋白質の固有の特徴は、直接的及び／又は間接的な数多くの機構のどれかを介して天然トランス信号を減少又は排除することであり、前記機構の例として、競合的遮断物質(competitive blockade)、アロステリック阻害、機能性多分子のトランス信号伝達錯体の破壊、細胞内信号伝達による第１信号の機能修飾(functional modification)などを挙げることができる。
【００１９】
第１蛋白質は、様々な細胞型又は異なる機能状態の細胞からの多くのトランス信号におけるどの信号も減少させることができるように選択される。一実施例において、第１蛋白質は、ＡＰＣ表面の共刺激物質(costimulator)をブロックする。望ましい共刺激ブロッカーとして、ＣＴＬＡ-４、ＣＤ２７及びＩＣＯＳの如き共刺激受容体分子を挙げることができる。ＣＴＬＡ-４は、Ｂ７共刺激物質に結合し、これによって該共刺激物質をブロックすることが知られている。Ｂ７共刺激物質として、ＡＰＣのＢ７-１(ＣＤ８０)及びＢ７-２(ＣＤ８６)を挙げることができる。ＣＤ２７は、共刺激物質ＣＤ７０に結合する。ＩＣＯＳは、共刺激物質Ｂ７-ｈに結合する。他の実施例において、第１蛋白質は、細胞表面の阻害分子をブロックする。阻害分子の望ましいブロッカーとして、Ｆａｓ、ＤｃＲ３、Ｆａｓの天然可溶性類似体を挙げることができ、これらは、阻害Ｆａｓリガンドが、第２細胞のＦａｓ受容体への結合に干渉する。
【００２０】
第１蛋白質は、トランス信号伝達分子に対する、天然の細胞表面カウンター受容体に限定されるものではない。可溶性サイトカインもまた、本発明のキメラ蛋白質における第１蛋白質として用いることができる。第１蛋白質の例として、腫瘍成長因子−ベータ(ＴＧＦ-β)、ミューラー阻害物質(ＭＩＳ)、肝細胞成長因子(ＨＧＦ)を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これに関連して説明すると、サイトカインは、キメラ蛋白質を適当なアンカー細胞(関連するサイトカイン受容体を意味する)に向けるだけではなく、アンカー細胞内の信号伝達経路を同時にトリガし、その信号伝達レパートリーと共に、代謝、増殖及び／又は分化状態を変化させる。それゆえ、一実施例において、第１蛋白質は癌細胞のサイトカイン受容体に対して作用する。ＴＧＦ-beta受容体は、様々な種類の癌細胞に存在するから、癌細胞に対して望ましい標的である。卵巣癌に対しては、例えばＴＧＦ-beta受容体が細胞増殖の低下をトリガすることができる。また他の望ましい標的として、肝細胞成長因子受容体があり、これは悪性神経膠腫の他に、乳癌や卵巣癌にも存在する。
【００２１】
例えば、免疫グロブリンＩｇＧ１分子の免疫グロブリン(ｓｃＦｖ)のＦｖ領域を含む単一ポリペプチド鎖誘導体もまた第１蛋白質として用いることができる。ｓｃＦｖの具体例として、サイトカイン及びその他受容体(例えばＨＥＲ-２/ｎｅｕ)、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、前立腺特異抗原(ＰＳＡ)、ＣＤ３３並びにＡＩＲＭ１に対して特異性を有するものを挙げることができる。ＨＥＲ-２/ｎｅｕ受容体は、乳房や卵巣の上皮癌に存在するため、癌細胞に対して望ましい他の標的である。ＣＥＡは、大腸癌などの胃腸腫瘍に多く発現し、それによる免疫阻害特性を有する。ＰＳＡは殆んどの上皮前立腺癌によって多く発現する。ＣＤ３３とＡＩＲＭ１は、骨髄単球性系統の細胞に発現したシアロアドヘジンファミリーである。慢性骨髄白血病細胞のＣＤ３３又はＡＩＲＭ１を抗体でライゲーション(ligation)すると、細胞の増殖と生存は減少する。
【００２２】
なお、第２細胞に例えばトランス信号などの信号を送ることができ、その信号がキメラ蛋白質の第１蛋白質コンポーネントによって変化したトランス信号とは区別されるものであれば、前記と同様、第２蛋白質として適当などんな蛋白質を用いることができる。第２蛋白質は、阻害信号を送る蛋白質、活性化信号を送る蛋白質、又は第２細胞の数多くの生物学的特性(例えば、代謝、増殖又は分化状態)を変える蛋白質であってよい。阻害蛋白質の望ましい例として、Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)を挙げることができる。ＦａｓＬは、活性化されたＴ細胞のＦａｓ受容体に結合し、これによって該受容体をトリガするものとして知られている。阻害蛋白質の他の例として、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＣＡＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８、ＰＰ１４、ＢＡＦＦ/ＴＡＬＬ-１/ＴＨＡＮＫ/ＢＬｙｓ、ＰＤ-１及びＲＣＡＳ１を示すことができる。活性化蛋白質の望ましい例として、Ｂ７-１(ＣＤ８０)を示すことができる。これは、活性化トランス信号をＴ細胞へ送達するのに用いられる。活性化蛋白質の他の例として、Ｂ７-２(ＣＤ８６)、Ｂ７-ｈ、ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４)、ＣＤ３０Ｌ、ＯＸ-４０Ｌ(ＣＤ１３４Ｌ)、４-１ＢＢＬ(ＣＤ１３７Ｌ)、ＣＤ７０、ＩＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-２、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)、ＨＳＡ(ＣＤ２４)、ＬＩＧＨＴ、ＳＬＡＭ、リンホトキシン、及び周知の数多くのケモカインの任意の一種を挙げることができる。分化蛋白質因子の例として、ＴＲＡＮＣＥ、ｃ-ＫｉｔＬ/ＳＣＦ、ＩＬ-３、及びＧＭ-ＣＳＦがある。これらの例は、大部分が、免疫系及び造血系に関連する蛋白質から引き出されるものであり、本発明のキメラ蛋白質の中の第２蛋白質として示すことのできる蛋白質の極く一部を表しているにすぎない。
【００２３】
本発明の望ましいキメラ蛋白質はＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬである。ＦａｓＬ配列を有するＣＴＬＡ-４の遺伝学的キメラ化と組換え体発現により、キメラＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ"トランス信号変換蛋白質"が得られ、これは、ＣＴＬＡ-４とＦａｓＬの両方に起因する構造的及び機能的特性を呈する。細胞が関与した可溶性キメラＦａｓＬポリペプチドの有効性を比較すると、細胞表面に関わった後の機能について有意的な向上が認められる。ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬで前処理した細胞は、Ｆａｓ依存性エフェクタ機能を仲介する能力を獲得する。病原性Ｔ細胞の機能をなくすには、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬキメラ蛋白質を用いて、ＡＰＣによるＴ細胞のＢ７共刺激を同時にブロックして主細胞の生存と活性化経路に干渉し、Ｔ細胞のＦａｓ介在の信号伝達をトリガすることによって行なうことができ、幾つかの場合に予定細胞死がもたらされる。ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、このように、外因性送達によるＦａｓＬの発現と、混合細胞集団内のＣＤ８０又はＣＤ８６を発現する細胞の選択的なコーティングを行なう手段を提供する。さらにまた、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの具体例は、II型膜蛋白質(この場合はＦａｓＬ)の機能誘導が本発明のキメラ蛋白質に対して特に適していることを示している。
【００２４】
本発明の蛋白質は、数多くの形態で存在することができる。例えば、直線状又は枝分かれしたポリペプチドの形態であってよい。直線状キメラ蛋白質は、組換えＤＮＡ技術によって作ることができる。例えば、キメラ転写カセットの組立ては、制限エンドヌクレアーゼサイトのオーバラップ、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)に基づくスプライス・バイ・オーバーラップ・エクステンション(splice-by-overlap-extension)［Horton,et al.,Gene,77:61-68(1989)］の方法によって行なうことができる。具体的方法は以下の実験の中に含められている。
【００２５】
分枝ポリペプチドのキメラ蛋白質の生成は、テンプレート組織化合成ペプチド(ＴＡＳＰ)の技術［Mutter,Trends Biochem.Sci.13:260-265(1988)］によって行なうことができる。このプロセスにより、ペプチド単位は別個に合成され、化学結合試薬を用いて、コアペプチドの如き多機能担体に共有結合される。例えば、グラシジンＳの環状デカペプチド類似体は、その中に２つの逆平行ベータシートセグメント(lys-ala-lys)が２つのベータターンによってリンクされており、これをコアペプチドとして用いることができる。第１及び第２蛋白質を、４リジン側鎖のイプシロンアミノ基に付着させるのに、セグメントの固体化(segment condensation)の方法を用いることができる。
【００２６】
本発明の蛋白質は、化学結合のような橋架け結合された２以上の別個の蛋白質として存在することもできる。例えば、２以上の蛋白質コンポーネントは、例えばジチオビス(スクシニミジルプロプリオネート)(ＤＳＰ)の如き化学架橋試薬を用いて、分枝構造の中で直接互いに共有結合されることができる。この方法により、例えば第１及び第２蛋白質を直接結合させることができる。直線状のポリペプチドと比べて、分枝状のキメラ蛋白質は、例えばＬＦＡ-１をＩＣＡＭ-１、-２及び-３に結合するときのような低アフィニティの相互作用に非常に適している。また、分枝状ポリペプチド錯体を一体化させるのと同時に、トランス信号伝達蛋白質の混合物を施すことができる。理論的には、２以上のトランス信号伝達コンポーネントがもたらす相乗効果により、錯体の全体的性能の向上が期待される。
【００２７】
本発明のキメラ蛋白質は、前述したように、１又は２以上の数多くの他のコンポーネントを含めることにより、特に、免疫学的研究、動物モデル、診断学及び治療学の分野において、本発明のキメラ蛋白質の有用性を高めることができるであろう。例えば、蛋白質はエピトープタグを含むように設計することができる。エピトープタグは、特にラボラトリー環境において、本発明の蛋白質の精製(purification)を容易にし、細胞上又は細胞集団内の蛋白質の局在化を進め、蛋白質の生物学的活性を高める。例えば、第１蛋白質又は第２蛋白質の一次配列は、遺伝子工学的手法により、種々蛋白質の生化学的分離を促進するためにエピトープタグを含むように変えることができる。この配列を変えるには、隣接する２以上のヒスチジン残留物を挿入することが有用である。この場合、ペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に挿入することができる。ポリヒスチジンのエピトープタグを、前述の直線状ポリペプチドキメラ蛋白質に対するリンカーペプチドの中へ挿入することもできる。枝分かれしたポリペプチドの場合、ヒスチジンはコアペプチドの中へ挿入することができる。ヒスチジン残留物の挿入は、スプライス・バイ・オーバラップ・エクステンション法を用いて容易に行なうことができ、ヒスチジンをエンコードするＣＡＴ及びＣＡＣトリプレットコドンがＰＣＲプライマーのコード配列の適当な位置に挿入される。ヒスチジン修飾蛋白質は、ニッケル・セファロース・クロマトグラフィー法によって、効率的に量的に分離される。また、特定の化学結合試薬に対する反応性アミノ酸の挿入のように、他の一次配列修飾を行なうこともできる。或いはまた、イムノアフィニティーのように従来の多くの生化学的分離法を用いることもできる。その他方法の例として、蛋白質の架橋を許容するＦｌａｇエピトープ、マーカー配列及び視覚化配列を挙げることができる。例えば、二量体又は三量体錯体を安定化させるために、ロイシンジッパーを含めることができる。
【００２８】
本発明はまた、患者の病気を治療する方法に関するもので、本発明のキメラ蛋白質を患者に対して有効量投与することことを含んでいる。ここで、「患者(patient)」とは、動物界のメンバーを意味し、ヒトに限定されるものではない。免疫調節作用を有するキメラ蛋白質に関して、本発明の方法は一般的に、少なくとも最小の免疫応答を検出できる患者に適用することができる。本発明の方法を用いて、例えば、癌(卵巣癌、乳癌、大腸癌、多形性膠芽腫、前立腺癌、白血病など)、ウイルス感染症(ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ-１、ＨＴＬＶ-II、ＥＢＶ、ＨＳＶ-１、ＨＳＶ-II、ＫＳＨＶなどにによる慢性ウイルス感染症)、並びに自己免疫及びアロ免疫疾患(関節炎、喘息、移植片対宿主病、臓器拒絶反応、乾せん(psoriasis)、全身エリマトーデス、アトピー性アレルギー、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アレルギー性皮膚炎、シューグレン症候群、進行性全身硬化症、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性肝臓病、骨髄異形性症候群など)の如く、様々な病気の治療を行なうことができる。なお、病気はこれらに限定されるものではない。「病気(illness)」とは、癌、ウイルス、自己免疫又はアロ免疫のあらゆるものの状態を意味する。
【００２９】
本発明に用いられる具体的な第１蛋白質及び第２蛋白質は、治療する病気に応じて異なる。例えば、癌又はウイルス感染症の治療の場合、第２蛋白質として、免疫細胞応答を刺激するものが一般的に用いられる。病原性免疫応答が存在する免疫系障害を治療する場合、阻害作用を有する第２蛋白質が用いられる。このように、癌とウイルス性疾患に対しては、キメラ蛋白質が一般的に用いられ、阻害信号は、活性化免疫性トランス活性化信号に変換される。充実性腫瘍の場合、腫瘍母地内の腫瘍細胞は、このようにして「免疫原性腫瘍細胞」に変換され、インシチュー生成の癌ワクチン細胞として機能することができる。ここで、免疫活性化する第２蛋白質コンポーネントは、異なる抗腫瘍免疫エフェクタに作用する。このエフェクタとして、蛋白質、Ｔ細胞(ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞など)、天然キラー細胞、及び樹状細胞(腫瘍抗原を再処理し提示するために、バイスタンダー抗原提示細胞として機能することができる)を挙げることができる。これに対し、自己免疫及びアロ免疫疾患の場合、キメラ蛋白質の作用により、活性化信号は、阻害作用を有する免疫トランス信号に変換される。この場合、免疫阻害作用を有する第２蛋白質コンポーネントは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、天然キラー細胞、抗原提示細胞などの異なる病原性免疫エフェクタに作用する。
【００３０】
本発明のキメラ蛋白質は、免疫調節そのものをはるかに超える治療用として用いることができる。例えば、キメラ蛋白質を用いて、血栓症を治療するために内皮細胞と血小板との間の信号伝達を変更したり、骨髄異形成症候群のような造血疾患を治療するために骨髄間質細胞／他の髄質要素及び造血前駆体(プロジェニター)との間の信号伝達を変更したり、増殖性阻害及び／又は腫瘍細胞糖の細胞死を誘導するために、所定の腫瘍の腫瘍細胞間の信号伝達を変更することができる。一般的には、各疾患について、キメラ蛋白質候補の小ライブラリを作り、適当なエクスビボ及びインビボモデルにおいて比較評価を行ない、相対的な効果及び毒性を決定する。例えば、自己免疫性疾患の場合、キメラ蛋白質(つまり「トランス信号変換蛋白質」)の中には、数多くのＴ細胞アポトーシス誘導物質の任意の１つに結合された数多くの共刺激受容体(不溶解性)の任意の１つを有するものが含まれている。
【００３１】
本発明の望ましい方法は、治療用キメラ蛋白質を必要とする患者に対して該蛋白質を投与することを含むものであるが、他の治療様式として、前記患者に対して、本発明の治療用キメラ蛋白質をエンコードする遺伝子配列を投与することを含んでいる。「遺伝子配列(genetic sequence)」とは、所定蛋白質並びに関連する調節塩基配列及びその他の非コード配列を含むポリヌクレオチドを意味する。ｃＤＮＡクローンの形態をした遺伝子配列は、広範囲の遺伝子について商業的に入手可能である。また、商業的にもその他の調達源からも入手が容易でないｃＤＮＡクローンの場合、それらのヌクレオチドシーケンスの知識を用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応法により、それらのｃＤＮＡを複製し、関連する遺伝子配列をプライマーに組み込むことはできる。この遺伝子治療法は、外因性遺伝子配列を患者の細胞に組み込んだ後、蛋白質を内生的に生成するものであるから、治療剤の投与を繰り返して行なう必要のある患者に特に適している。
【００３２】
当該分野において、治療遺伝子を患者に投与する様々な方法が広く知られている。これらの方法は、治療遺伝子を送達するベクターの宿主、関連遺伝子に付加される転写及び翻訳調節要素、これらベクターを作製し使用する方法、遺伝子及びベクターを患者に投与する方法、治療遺伝子の効果と毒性を監視する方法を包含している。望ましい実施例では、本発明のキメラ蛋白質をエンコードする遺伝子配列の筋肉に注射する。一旦患者の筋肉細胞に注入されると、エンコードされた蛋白質が生成され、全身に分泌する。自己免疫の治療において、このような筋肉内遺伝子治療を用いることは、文献［Chang,J.Gene Medicine,1:415-43(1999) and Pccirillo,J.Immunology,161:3950-3956(1998)］に記載されている。他の実施例では、キメラ蛋白質をエンコードする遺伝子配列を、例えば炎症関節のような炎症部の如き患部に直接局部注入を行なう。文献［Lubberts,J.Immunology,163:4546-4556(1999)］は、実験動物におけるコラーゲン誘導関節炎を治療するために、治療遺伝子を膝関節に直接間接内注入行なうことを記載している。
また、エンコードされた蛋白質を調節するために、トランスフェクトされた遺伝子の発現を調節するための誘導プロモータは当該分野で知られている。それらの誘導プロモータは、経口投与される薬剤で調節することができる点において特に有用である。本発明の遺伝子配列は、肝臓、肺、皮膚などのその他器官へ送達されることができる。
或いはまた、数多くのトランスフェクション方法の任意の１つを用いて、エクスビボの細胞の中へ導入することもできる。トランスフェクトされたこれら細胞は、当該分野で広く知られた方法に基づいて、治療細胞として患者へ投与することができる。このように、実験的な変形性関節症の治療のために、トランスフェクトされた細胞を治療細胞として用いることは、文献［Pelletier, Arthritis and Rheumatism, 40:1012-1019(1997)］に記載されており、ここでは、トランスフェクトされた滑膜細胞は、患部の関節に戻すために再び注入される。これについては、文献［Yasuda,J.of Clinica Investigation,102:1807-1814(1998)］においても、自己免疫性糖尿病の治療を、トランスフェクトされた島細胞で行なうことが記載されている。
【００３３】
さらに他の実施例において、第１(アンカー)細胞から生じるトランス信号を減少させ、異なるトランス信号を第２細胞へ与えることは、一緒に機能する２以上のキメラ蛋白質又は非キメラ蛋白質を用いて行なうことができる。望ましい実施例において、第１のキメラ蛋白質は第１細胞に結合し、それによって、細胞から生じる第１トランス信号を減少させる。第２のキメラ蛋白質は第１キメラ蛋白質に結合し、一旦第１細胞の第１キメラ蛋白質に結合すると、異なるトランス信号を第２細胞へ送る能力を授ける。この実施例において、第１キメラ蛋白質は、第２キメラ蛋白質を特定の細胞へ引き寄せる「標識(beacon)」として機能する。第１キメラ蛋白質は、２以上の機能部を具えており、１つは前記蛋白質を第１細胞に固着する(そして第１トランス信号を減少させる)ことであり、別のものは第２キメラ蛋白質が特異的に結合するサイトを提供することである。第２キメラ蛋白質もまた、２以上の機能部を具えており、１つは第２キメラ蛋白質を細胞表面が固着された第１キメラ蛋白質に向けることであり、他のものは第２トランス信号をもう１つの細胞へ送る能力である。
【００３４】
第１及び第２のキメラ蛋白質の患者への投与は、同時に(例えば、分子結合コンポーネント又は別個の注入コンポーネントとして)行なうことができるし、１つずつ順番に行なうこともできる。第１及び第２キメラ蛋白質の重要な機能は、前述したキメラ蛋白質の第１及び第２蛋白質コンポーネントの具体例の中から選択される。各キメラ蛋白質の追加のコンポーネントは、第１キメラ蛋白質と第２キメラ蛋白質を結合する、対の(paired)認識ユニットである。このような認識ユニットは、当該分野で広く知られた様々な対認識ユニットの中から選択されることができ、例えば、エピトープタグと、該タグ(例えば、自己再生機能を有するロイシンジッパー)に特異性のｓｃＦｖを挙げることができる。
【００３５】
さらに他の実施例において、第１トランス信号を減少さる機能と第２トランス信号を提供する機能の２つの機能は、互いに直接相互作用しないが各々が第１細胞に独立して結合する２以上の異なる蛋白質を用いて達成される。蛋白質の少なくとも１つは、アンカー細胞からの信号をマスクするか又は該信号と干渉する能力を有しており、蛋白質の少なくとも１つはトランス信号を第２細胞へ送る能力を有している。また、前述したどの第１及び第２蛋白質コンポーネントも、この実施例の蛋白質として用いることができる。
【００３６】
それゆえ、本発明はまた、第１細胞からの第１トランス信号を減少させ、該第１細胞からの第２トランス信号を付与する２以上の分子コンポーネントを患者に投与する治療方法を提供するものである。ここで、「分子コンポーネント(molecular components)」は、キメラ蛋白質と、キメラ蛋白質以外の非キメラ蛋白質の両方を意味する。前述したように、分子コンポーネントが両方ともキメラ蛋白質であるとき、第１のコンポーネントはアンカー細胞に結合し、第２のコンポーネントは第１コンポーネントに結合する。分子コンポーネントの両方が非キメラ蛋白質であるとき、互いに結合せず、各々が直接アンカー細胞に結合する。
【００３７】
様々なキメラ蛋白質並びに各蛋白質によって治療される病気及び臨床症候群の例を以下に説明する。なお、以下の例は全てを網羅しているのではなく、キメラ蛋白質の種類と、本発明に基づいて治療される病気の種類についての単なる一例にすぎないことは理解されるべきである。
【００３８】
【表１】
0004723782.tif 000002
【００３９】
【表２】
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【００４０】
【表３】
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【００４１】
前述したように、本発明の蛋白質の有効量が患者の治療に用いられる。同じように、本発明の蛋白質をエンコードする遺伝子配列は、有効量の蛋白質を生じさせるのに十分な量が投与される。ここで用いられる「有効量(effective amount)」は、１回又は２回以上の用量で送達され、患者に所望の結果をもたらすのに必要なキメラ蛋白質の量を意味する。ここで、所望の結果とは、一般的には、治療される病気に応じて、免疫応答の刺激又は免疫応答の抑制のことである。例えば癌治療での有効量とは、腫瘍の成長から患者を保護する量、又は腫瘍を排除できないまでも低減させることのできる量である。自己免疫、アロ免疫又はウイルス症の治療での有効量とは、治療される疾患の１又は２以上の症状をなくすことはできないまでも緩和することのできる量である。従って、「有効量」とは、既に病気に掛かっている患者の治療に有用な治療学的に有効な量であってよく、患者の病気の広がり又は再発を予防するのに予防的に有効な量であってよい。また、この有効量は、治療される病気の種類、病気の重症度、治療される患者のサイズ、患者の免疫応答能力などのファクターに応じて異なる。各患者に対する有効量の決定は、当該分野の専門家が成し得る範囲内である。一般的に、有効量の決定は、標準のエクスビボ細胞系での能力を評価し、臨床前及びインビボ臨床の評価を行なうことによってなされ、体重１ｋｇ当たり約０.００５〜０.５ｍｇである。
【００４２】
投与は、例えば注射等のように、当該分野で公知の手段によって行なうことができる。キメラ蛋白質又は非キメラ蛋白質又はこれら蛋白質をエンコードする遺伝子配列は、本発明の方法に基づく投与を行なうために適当な薬学的担体の中に含めることができる。「適当な薬学的担体(suitable pharmaceutical carrier)」として、あらゆる溶剤、分散用媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張・吸収遅延剤などを挙げることができる。薬学用としてこのような媒体及び作用剤は当該分野において広く知られている。本発明は、どの媒体又は作用剤を用いることも含んでおり、キメラ蛋白質との適合性問題はない。生理食塩水は適当な担体といえる。
投与の容易性及び用量の均一性のために、投薬ユニットの形態の非経口組成物を調製することが有利である。ここで用いられる投薬ユニットは、治療される患者に対して単位量を投与するのに適した、物理的に分離したユニットを意味する。各ユニットは、薬学的担体に関する所望の効果を生じさせるために、所定量のキメラ蛋白質又は該蛋白質をエンコードする遺伝子配列、或いは有効量のキメラ蛋白質又は該蛋白質をエンコードする遺伝子配列を含んでいる。本発明の投薬ユニットの仕様は、具体的なキメラ蛋白質及び該蛋白質が達成する具体的効果に応じて直接決めることができる。
【００４３】
本発明はまた、前述した病気の研究のために動物モデルを作る方法に関するものである。例えば、本発明のキメラ蛋白質と共に用いられることができる動物の自己免疫性疾患の育成セットがある。これらの動物モデルとして、自然発生(例えば糖尿病ＮＯＤマウス)するか又は形質転換によって導入された遺伝子突然変異の結果として、自己免疫が自発的に起こるものが挙げられる。その他の動物モデルとして、病原性物質の導入を通じて人工的に自己免疫が誘導されるものが挙げられる。
【００４４】
実施例
以下の実験は本発明の例示であって、いかなる意味でも発明を限定するものと解するべきでない。
実験１
［プラスミドの構造とトランスフェクション］
２種類の標的ドメインを、可溶性ＦａｓＬをエンコードする配列で遺伝学的にキメラ化した。ヒトＣＴＬＡ-４からの細胞外ドメイン配列と、ヒトbeta-２-ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)である。ＦａｓＬをＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ内でＣＴＬＡ-４でキメラ化すると、ＦａｓＬのプロアポーシス活性がもたらされ、さらにＡＰＣに固有のＢ７-１/Ｂ７-２(ＣＤ８０/ＣＤ８６)に結合することができる。可溶性のＢ２Ｍ・ＦａｓＬ蛋白質は、対照(control)として用いた。ｓＦａｓＬを含有するキメラ蛋白質を発現させるために、組換え型発現プラスミドを作製し、発現細胞株は、トランスフェクトされた２９３ヒト胎児腎細胞から選択した。
【００４５】
ヒトＦａｓＬのｃＤＮＡｓについては、既に文献［Takahashi(1994)］に記載されている。合成オリゴヌクレオチドの購入先は、Genosys,Inc.(The Woodlands, TX)である。ＤＮＡプライマーは、ヒトＢ２Ｍの停止コドンをＨｉｎｄIII制限サイト置換するように設計されている。Ｂ２Ｍのアミノ酸−２０乃至９０をエンコードするヒトＢ２Ｍ配列を生成するためのＤＮＡプライマーは、５'-ＴＴＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣ-３'、及び５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴ-３'である。ＰＣＲは、製造者［Siratagene,La Jolla,CA］の仕様によるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで実行され、ＤＮＡテンプレートとして、ｐＢ２Ｍ/ＲＥＰ１２β(入手先：H. Meyerson, University Hospitals of Cleveland)を用いた。精製と酵素制限(enzymatic restriction)の後、３６０ｂｐ Ｋｐｎ Ｉ-ＨｉｎｄIIIＤＮＡのフラグメントを、エピソームの発現ベクターｐＣＥＰ９β［Invitrogen,Lajolla,CA］の各サイトにサブクローン化し、ｐＢ２ＭＸ/ＣＥＰ９βを生成する。
ヒトＦａｓＬのアミノ酸１２７乃至２８１をエンコードする配列の増幅が可能なＤＮＡプライマーは、５'-ＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣ-３'と、５'-ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＣＣＧＡＡ-３'である。精製と酵素消化の後、４８０ ｂｐ ＨｉｎｄIII-ＢａｍＨＩ ＤＮＡのフラグメントを、ｐＢ２ＭＸ/ＣＥＰ９βとｐＣＥＰ９βの各サイトにサブクローン化し、夫々、ｐＢ２Ｍ・ＦａｓＬ/ＣＥＰ９βとｐＸＦａｓＬ/ＣＥＰ９βを生成する。合成オリゴヌクレオチド５'-ＡＧＣＴＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡ-３'と、５'-ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴ-３'を部分的にオーバーラップし、両側にリンカー配列(ＧＧＧＳ)2ＤＹＫＤＤＤＤＫ(ＧＧＧＳ)2があるＦｌａｇエピトープタグをエンコードし、ｐＢ２Ｍ・ＦａｓＬ/ＣＥＰ９βのＨｉｎｄIIIサイトにサブクローン化し、ｐＢ２Ｍ・Ｆｌａｇ-ＦａｓＬ/ＣＥＰ９βを生成する。全ての構造体は、塩基配列の決定によって確認した。ｐＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ/ＣＥＰ９βの生成は、ｐＸＦａｓＬ/ＣＥＰ９βのスタッファー断片配列を、オンコスタチンＭ信号配列及びｐｈＣＴＬＡ-４:ＩｇＧ１/ＲＥＰ７βから移動したヒトＣＴＬＡ-４細胞外配列をエンコードするＨｉｎｄIIIインサートと置換することにより行なった。これは文献［Brunschwig,(1995)］に記載されている。トランスフェクトされた細胞株の生成は、エピソームの発現プラスミドを、リポフェクチンを有する２９３細胞［Life Technologies,Bethesda,MD］の中へ導入することにより行なった。安定細胞株の選択は、ｐＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ/ＣＥＰ９β、ｐＢ２Ｍ・Ｆｌａｇ-ＦａｓＬ/ＣＥＰ９β又はｐＢ２Ｍ/ＲＥＰ１２βを含むトランスフェクタント細胞株について、Ｇ４１８［Life Technologies,Bethesda,MD］を０.４ｍｇ/ｍＬ補充したＤ１０の中で行なった。多くのコロニーの中から、組換え型ポリペプチド発現をスクリーニングした。トランスフェクタント細胞株による組換え型ｓＦａｓＬ含有蛋白質の分泌を、市販のＦａｓＬ ＥＬＩＳＡ［MBL,Cambridge,MA］によって計量したところ、１００-１０００ｎｇ/ｍＬであった。
【００４６】
［細胞の培養］
ＡＴＣＣ［Bethesda, MD］から入手した細胞株として、Jurkat形質転換ヒトＴ細胞、２９３酵素腎細胞、及びRaji＆Daudi形質転換Ｂ細胞株がある。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のＪＹは、Francis V. Chisari(Scripps Institute)から入手した。全ての細胞は、５％ＣＯ2を供給する湿雰囲気の培養器の中に維持した。ＲＰＭＩ-１６４０及び高グルコースＤＭＥＭ媒体、抗生物質、グルタミン並びにウシ胎児血清(ＦＢＳ)は、BioWhittaker(Bethesda,MD)から入手した。ＲＰＭＩ-１６４０に、ペニシリン１００μｇ/ｍｌ、ストレプトマイシン/ストレプトマイシン１００Ｕ/ｍＬ、グルタミン２ｍＭ、熱処理で不活性化されたＦＢＳ(Ｒ１０)１０％加え、その中でJurkat細胞を培養した。ＤＭＥＭに、ペニシリン/ストレプトマイシン１００μｇ/ｍｌ、グルタミン２ｍＭ、熱処理で不活性化されたＦＢＳ(Ｒ１０)１０％加え、その中で２９３細胞を培養した。ペニシリン/ストレプトマイシン及びＬグルタミンを含有するCellGro Free媒体［Mediatech］の中で５〜６日間細胞を培養し、調整された媒体(conditioned)を作った。細胞培養液上清を遠心分離(４００×ｇで６分)して細胞残渣を取り除き、２２ミクロンの殺菌済み注射器フィルターを通して濾過した。清浄化された上清を４２℃で２か月間、活性を実質的に損なうことなく貯蔵した。市販のｓＦａｓＬ ＥＬＩＳＡ［MBL,Cambridge,MA］を用いて、試料中のｓＦａｓＬ含有蛋白質を計量した。
【００４７】
［ウエスタンブロッティング法及びゲル濾過クロマトグラフィー］
ＦａｓＬとＣＴＬＡ-４分子は両方とも、それらの自然形態で、多量体錯体を形成する。天然ＦａｓＬは、共有結合されていないホモ三量体として存在し、ＣＴＬＡ-４は二硫化物結合ホモ二量体として存在する。ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが多量体錯体を形成するかどうかを調べるために、免疫ブロット法による実験を行なった。２種類のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬトランスフェクタント細胞株クローンから上清試料を、置換剤(メルカプタノール)の存在下及び不存在下で調製し、沸騰させ、ＳＤＳゲル電気泳動を行ない、ＦａＳＬ特異性抗血清を用いて免疫ブロットした。
【００４８】
より具体的には、清浄化された細胞培養液上清を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ-１０超濾過装置［Amicon,Beverly,MA］を用いて、１５〜３０倍に濃縮した。濃縮されたＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを、予め較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘ-２００カラムに１×ＰＢＳ投入した。０.５ｍＬフラクションを集めて、細胞障害性検定法を用いて機能的な分析を行なった。活性ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ分子を含むフラクションを５０倍に濃縮し、化学架橋剤ジチオビス[スクシニミジルプロプリオネート](ＤＳＰ,Pierce)で共培養し、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５でクエンチした。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析用試料は、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液(２-メルカプトエタノールが入っているものと入っていないもの)の中で調製し、１０％アクリルアミドＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの中へ投入する前に、沸騰させた。電気泳動の後、ゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ膜［Millipore, Beverly, MA］にブロットし、５％のmilk/ＰＢＳでブロックし、抗ヒトＦａｓＬ抗血清(anti-Ｃ２０)［Santa Cruz Biological］でプローブした。十分に洗浄した後、ブロットをホースラディッシュ・ペルオキシラーゼ(ＨＲＰ)と共有結合した抗ウサギ抗血清［BioRad,Richmond］でインキュベートし、化学発光サブストレート［New England Nuclear,Boston,MA］で処理した後、Ｘ線フィルムに露出した。
【００４９】
還元剤の不存在下で、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬクローンに由来する試料について、約４５ｋＤａの弱帯域及び７０-９０ｋＤａの強帯域を観察した。還元剤を追加すると、７０-９０ｋＤａ分子種は消滅し、約４５ｋＤａ種は増加した。対照２９３細胞上清試料については、有意的なＦａｓＬ免疫反応性は認められなかった。
【００５０】
ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ錯体の化学量論分子量を求めるために、トランスフェクト細胞調整媒体の蛋白質を、同種二機能性の還元性架橋剤ＤＳＰで架橋結合し、ＦａｓＬ特異性抗血清を用いて、免疫ブロット法により分析した。より具体的には、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを含む上清試料を、溶媒のみの中、又はＤＭＳＯにＤＳＰを溶解した溶媒の中で、室温で３０分間予め培養した。反応は、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５でクエンチさせた。試料は、ＳＤＳゲル電気泳動の処理を行なった。免疫ブロット法は前述した通りである。高分子量の９０ｋＤａ及び約１８０−２００ｋＤａのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ分子種の免疫検出は、ＤＳＰ架橋結合の後増加した。架橋結合されたＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ錯体の部分還元は、二量体錯体(約９０ｋＤａ)及び三量体錯体(１８０−２００ｋＤａ)と一致する帯域と同様、約４５ｋＤａの帯域であることを示した。同様な化学架橋実験において、約４０ｋＤａ Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬ単量体もまた、約１２０ｋＤａの三量体を形成することが示した。ゲル濾過クロマトグラフィーを、独立した方法として採用し、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ三量体錯体の分子量を測定した。ピークのカラムフラクションを固相検定法により決定し、約１８０−２００ｋＤａで溶離した。ピークフラクションの化学結合の後、抗ＦａｓＬ免疫ブロット法により、９０ｋＤａ及び１８０−２００ｋＤａ ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ錯体であることがわかった。化学的架橋結合及びゲル濾過分析は共に、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ錯体が二硫化物の分子間橋架け結合を含んでいることを示し、三量体の化学両論分子量であることを示している。
【００５１】
［フローサイトメトリー］
Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬ又はＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬのどちらかを含む培養液上清の種々の希釈液を用いて、氷の上で３０分間、細胞を予め培養した。細胞をペレットにし、ＦＡＣＳ緩衝液(１×ＰＢＳ/０.５％ＢＳＡ/０.０２％アジ化ナトリウム)で２回洗浄し、１０μｇ/ｍＬの一次抗体を用いて３０−４５分間、氷の上で培養した。ヒトＦａｓＬ(ＣＤ９５Ｌ、クローンＮＯＫ-１)に対して特異性の抗体を、Pharmingen (La Jolla,CA)から購入した。マウスＩｇＧ１(Ｄａｋｏ)を対照として用いた。次に、細胞を、ＦＩＴＣ共役結合したヤギＦ(ａｂ')２抗マウスＩｇＧ［Boerhinger Mannheim］を用いて３０−４５分間、氷の上で培養した。洗浄後、蛍光標識した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎで処理し、ヨウ化プロピジウムを含まない集団を、ＬＹＳＩＳIIソフトウエアパッケージ［Becton-Dickinson,Mountain View,CA］で分析した。細胞障害性検定法により、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬとＢ２Ｍ・ＦａｓＬキメラ蛋白質のアポトーシス活性を決定した。
【００５２】
ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ及びＢ２Ｍ・ＦａｓＬ蛋白質が作動体機能を示すかどうかを決定するために、蛋白質含有細胞培養液についてＦａｓ感受性JurkatＴ細胞のアポトーシス誘導を調べた。アポトーシスは、放射性ＤＮＡ断片化検出法により測定した。
【００５３】
検定は、Matzinger(1991)の方法に少し修正を加えて、３回行なった。指数関数的に増殖したJurkat細胞を、Ｒ１０の3Ｈ-チミジン［ICN,Costa Mesa,CA］３マイクロキューリー/ｍＬを用いて、３７℃で４−５時間ラベル付けし、ペレットにし、２回洗浄した。細胞を、２×１０5/ｍＬで再び懸濁させて、この細胞懸濁液０.１ｍＬを各ウエルに加えた。清浄化された上清はＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ又はＢ２Ｍ・ＦａｓＬを含有しており、これをＲ１０に希釈し、この細胞懸濁液０.１ｍＬを、丸底９６ウエルの培養プレートの各ウエルに加えた。架橋結合剤として、０.５μｇ/ｍＬの抗Ｆｌａｇ抗体を、指示された試料に加えた。所定量のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ又はＢ２Ｍ・ＦａｓＬを有する細胞の前培養を、氷の上で１時間を行ない、次に、遠心分離(４００×ｇで６分)を行ない、Ｒ１０で２回洗浄した。cell-cell killingアッセイのために、前処理した１０4個のエフェクタ細胞を各ウエルに加えた。培養液を３７℃で一晩中培養し、放射性同位体でラベル付けされたＤＮＡをガラスフィルターに採取し、シンチレーション計数を行なった。ブロッキングの実験では、Jurkat細胞(抗Ｆａｓ、クローンＺＢ４、Coulter Immunotech)又はキメラ蛋白質含有上清(抗ＦａｓＬ)のどちらかと共に、抗体を予め培養した。Ｆａｓ依存性溶解率(percent Fas-dependent specific lysis)＝１００×｛(自然放出−実験放出)/(自然放出)｝である。最大の致死(killing)は、検定法に応じて４０−７０％であった。可溶性ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ蛋白質は、Jurkat細胞に対する細胞障害能力は低いが、ＣＤ８０/ＣＤ８６陽性Daudi細胞(図１Ａ参照)で共培養することにより増強される。既知量のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ蛋白質を含有する上清をウエルに滴定し、図１Ａのｘ軸に示している。図１Ａ中、Daudi細胞を加えないものを白丸、Daudi細胞を加えたものを黒四角で示している。図に示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、Jurkat細胞の用量依存性致死作用をを有しており、１−１００ｎｇ/ｍｌである。
【００５４】
Daudi Burkittのリンパ腫Ｂ細胞をえたことにより、中レベルのＣＤ８０と他レベルのＣＤ８６を構造的に発現し、アポトーシスの検出限界を、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬについて０.１ｎｇ/ｍＬまで低下させる。これにより、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの細胞障害活性は約６０倍高められる。他の２種類のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株ＹＪとRajiについても、ＣＤ８０及びＣＤ８６発現形態はDaudi細胞と同様であり、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ分子によって細胞障害性を増強したが、Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬによる細胞障害性の増強は認められなかった(データを図示せず)。加えるDaudi細胞の数を増すと、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬについて細胞障害活性も増加した。さらに、ウエルに加えたDaudi細胞の数を滴定すると、Jurkat細胞死は用量依存性の増加を示した(図１Ｂ参照)。Jurkat細胞に対する添加Daudi細胞の比をｘ軸に示しており、図１Ｂ中、０.６ｎｇ/ｍＬのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを黒四角、１ｎｇ/ｍＬのＢ２Ｍ・ＦａｓＬを黒丸、媒体のみを白丸で示している。
【００５５】
ＦａｓとＦａｓＬの拮抗的モノクローナル抗体によるＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ細胞障害性の阻害を、図１Ｃに示している。ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、放射性同位体でラベル付けされたJurkat細胞を加える前に、１０μｇ/ｍｌのＦａｓＬ特異性抗体(抗ＦａｓＬ(ＮＯＫ-１)又はアイソタイプ整合(matched)対照抗体(Ｌｅｕ２ａ)を用いて、３７℃で１時間、予め培養した。抗Ｆａｓブロッキングについても、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ、２ｎｇ/ｍＬの存在下で共培養する前に、拮抗的抗体ＺＢ４を、放射線同位体でラベル付けされたJurkat細胞と共に予め培養した。図１Ｃ中、灰色棒線は抗ＦａｓＬ抗体、黒色棒線は抗Ｆａｓ抗体、ハッチング入り棒線は対照抗体、白色棒線は添加なしの抗体を示している。図示の如く、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ媒介細胞障害性は抗ＦａｓＬ及び抗Ｆａｓモノクローナル抗体ブロッキング剤に感受性であり、このキメラ蛋白質によるJurkat細胞アポトーシスに対するＦａｓＬ及びＦａｓの要件と一致する(図１Ｃ参照)。
【００５６】
Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬは、図１Ｄに示されるように、Jurkat細胞の細胞溶解(cytolysis)に対して架橋結合を必要とする。Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬのウエルへの滴定をｘ軸に示しており、Jurkat細胞の細胞障害性を検定した。３７℃で１６−２０時間培養した後、ファイバーグラスフィルターに採取し、シンチレーションカウンターで計数し、溶解率を計算し、ｙ軸上に示している。図１Ｄ中、Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬ＋抗Ｆｌａｇの存在下で培養した試料を黒丸、Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬ＋Daudi細胞の場合を白四角、Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬ単独の場合を白丸で示している。取消線は標準偏差値１を示している。図示の如く、Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬ単独の場合、０.１−１００ｎｇ/ｍＬの範囲では、架橋エピトープタグされた特異性抗体の存在下を除いて、Jurkat細胞に有意的な致死は認められなかった。それゆえ、ＣＤ８０/ＣＤ８６陽性細胞は、Jurkat細胞におけるトランス位置のＦｅｓ受容体を通じて信号伝達するためのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ分子の能力を高める。
【００５７】
実験２
［ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬトランスエフェクタ活性の媒介における細胞−細胞接触の役割］
例えばＣＴＬＡ-４・Ｉｇのように、可溶性ＣＴＬＡ-４ポリペプチド誘導体はＣＤ８０及び／又はＣＤ８６を発現する細胞に結合する。ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ分子のＣＤ８０/ＣＤ８６陽性細胞に対する結合がJurkat細胞アポトーシスを増強するかどうかを調べるために、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬのDaudi細胞及びJurkat細胞に対する結合能力を検定した。ＣＤ８０/ＣＤ８６陽性Daudi細胞を、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ含有細胞上清と共に前培養し、ＦａｓＬ特異性モノクローナル抗体又はアイソタイプ整合対照抗体を用いて間接的な免疫蛍光検査及びフローサイトメトリーの処理を施した。より具体的に説明すると、前培養は、０℃で３０−４５分間行なった。２回洗浄した後、細胞を、１０ｍｇ/ｍｌの抗ＦａｓＬ抗体(ＮＯＫ-１,Ｊ)又はアイソタイプ整合対照抗体(対照，Ｅ)と共に、３７℃で３０−４０分間培養した。２回洗浄した後、細胞を、ＦＩＴＣ共役結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に培養した。洗浄後、取得データをＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータに実行し、データをＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウエアで分析した。図２Ａのｘ軸に示される各ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ濃度に対する平均蛍光強度をｙ軸上にプロットした。ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ(図２Ａの上側)の量を増やして前処理した後、細胞表面のＦａｓＬでは用量依存性の増加が観察され、染色は約１００ｍｇ/ｍＬで飽和した。Jurkat細胞におけるＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬのＦａｓへの結合分析でも、同じように、ＣＴＬＡ-４エピトープに３０−３００ｎｇ/ｍＬの用量依存性の増加が観察された(図２Ａの下側)。これらの結果は、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの二重結合活性と一致しており、ＣＴＬＡ-４の部位はＣＤ８０/ＣＤ８６分子に結合し、ＦａｓＬドメインはＦａｓ受容体に結合する。
【００５８】
Daudi細胞を、媒体のみ又はＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを含有させて、３７℃で１時間、前培養した。３回洗浄した後、細胞を計数し、ウエルの中へ入れて、放射性ＤＮＡ断片化検定を行なった。溶解率(percent specific lysis)の結果をｘ軸にプロットしている。機能検定の試験において、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬで前処理したDaudi細胞は、前処理していないDaudi細胞と比べて、用量依存性のJurkat細胞ＰＣＤを誘導した(図２Ａ参照)。Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬでDaudi細胞を前培養しても、Jurkat細胞の細胞溶解の結果に有意的な差は認められなかった(データは示さず)。
【００５９】
ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬでコートされたDaudi細胞の細胞溶解に細部−細胞接触は必要かどうかを決定するために、膜分離実験を行なった。Daudi細胞は、媒体単独で、又はＢ２Ｍ・ＦａｓＬ若しくはＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを加えて、氷の上で１時間、前培養した。３回洗浄した後、細胞の計数結果は０.２５×１０6であった。２４ウエルプレートの中に、ポアサイズ３ミクロンのTranswell半透過性膜の下方に０.５×１０6Jurkat細胞と共に入れた。０.５×１０6のJurkat細胞を膜の上方にも加えた。３７℃で１６時間培養した後、細胞を採取し、フローサイトメトリーの処理を施した。全ＰＩ陰性のＣＤ３ブライトに対して、ＰＩ陰性ＣＤ３ブライトのアネキシンＶブライトの割合を、図２Ｃのｘ軸にプロットしている。２０時間培養した後、Jurkat細胞のアポトーシスを、結合された蛍光色素結合アネキシンＶをフローサイトメトリー検出法により監視した。Jurkat細胞ＰＣＤは、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬでコートされたDaudi細胞の存在下でのみ有意差が観察された。膜の下方で、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの前処理が施されたDaudi細胞を加えても。膜の上方から採取したJurkat細胞にどんな効果ももたらさなかった。これは。細胞−細胞接触に対する要件と一致する(図２Ｃ、上パネル)。予想されたように、対照Daudi細胞又はＢ２Ｍ・ＦａｓＬ処理済みのDaudi細胞について、Jurkat細胞アポトーシスには何の効果も観察されなかった。
【００６０】
実験３
ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬについて、細胞分裂誘起抗ＣＤ３抗体に対するヒト末梢血Ｔ細胞のポリクローナル増殖の阻害能力を調べた。９６個のウエル付きＵ底組織培養プレートの中で、２人の異なるドナーから単離したばかりのヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)２×１０5 ＰＢＭＣ/ウエルを、免疫アフィニティにより精製された異なる量のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが存在しない場合と存在する場合において、１ｎｇ/ｍｌのＣＤ３特異性抗体(ＯＫＴ３)と共に培養した。検定は３回行なった。２人の異なるドナーから単離したばかりのヒト末梢血単核細胞を、免疫アフィニティにより精製された異なる量のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが存在しない場合と存在する場合において、１ｎｇ/ｍｌのＣＤ３特異性抗体(ＯＫＴ３)と共に培養した。比較のために、１００００ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・Ｉｇと組換え型ヒトの可溶性ＦａｓＬを平行培地の中へ滴定した。３６時間後、さらに３日間２４時間間隔で、培養地ウエルを3Ｈチミジンでパルスし、活性的に分割するＴ細胞のＤＮＡをラベル付けした。２０時間後、放射線同位体でラベル付けされたＤＮＡをファイバーグラスフィルターに採取し、シンチレーション計数を行なった。図３Ａに示されるように、１０ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ(黒四角)は、細胞分裂誘起抗ＣＤ３モノクローナル抗体によって刺激されたヒト末梢血Ｔ細胞の増殖を強く阻害した。比較のために準備した、１００００ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・Ｉｇ(白丸)は、約５０％の阻害を示し、１００ｎｇ/ｍｌのｓＦａｓＬ(黒三角)は殆んど阻害を示さなかった。増殖のピーク(３日目)にて、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ、ＣＴＬＡ-４・Ｉｇ、ｓＦａｓＬの量を変えて、ポリクローナルＴ細胞応答の阻害を調べた。図３Ｂに示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ(黒四角)は、ＣＴＬＡ-４・Ｉｇ(白丸)やｓＦａｓＬ(黒三角)よりも阻害能力が大きかった。Ｆｌａｇタグ付けされたｓＦａｓＬと、Ｆｌａｇエピトープ特異性抗体との抗体介在架橋結合により、Ｆａｓ感受性Jurkat細胞のアポトーシスが増すので、抗ＣＤ３に対するポリクローナル増殖応答に対しても同様な効果があるかどうかを調べた。このため、０.５μｇ/ｍｌの抗体を、ｓＦａｓＬの量を種々変えて、幾つかの検定用ウエルの中へ加えた。図３Ｃ(左側)に示されるように、Ｆｌａｇ−エピトープ特異性の抗体(ｓＦａｓＬ＋抗Ｆｌａｇ、黒三角)を含んだ場合、ｓＦａｓＬ単独(白三角)と比べて、ｓＦａｓＬの最も高い濃度(１０００ｎｇ/ｍｌ)のときにのみ阻害は増加した。図３Ｃに示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＩｇとｓＦａｓＬの組合せ(抗Ｆｌａｇ架橋の如何に拘わらず)は、増殖性阻害に追加の効果を示した。１００００ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・Ｉｇと１０００ｎｇ/ｍｌのｓＦａｓＬの組合せに抗Ｆｌａｇ抗体架橋結合したものが最大の阻害を示した。このように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、個々のドメインコンポーネントであるＣＴＬＡ-４・ＩｇとｓＦａｓＬが単独の場合、又は組み合わせた場合よりも大きな阻害能力を示した。
【００６１】
実験４
ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬについて、破傷風トキソイドの特異性抗原に応答するヒト末梢血Ｔ細胞の増殖の阻害能力を調べた。９６個のウエル付きＵ底組織培養プレートの中で、単離したばかりのヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)２×１０5 ＰＢＭＣ/ウエルを、免疫アフィニティにより精製された異なる量のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが存在しない場合と存在する場合において、５００ｎｇ/ｍｌの破傷風トキソイドと共に培養した。検定は３回行なった。６日後、培養地を3Ｈチミジンでパルスし、活性的に分割するＴ細胞のＤＮＡをラベル付けした。２０時間後、放射線同位体でラベル付けされたＤＮＡをファイバーグラスフィルターに採取し、シンチレーション計数を行なった。図４に示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、破傷風トキソイドの特異性抗原によって刺激されたヒト末梢血Ｔ細胞の増殖を阻害した。このように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、Ｔ細胞のポリクローナル活性だけでなく、特異性抗原に対するＴ細胞の応答を阻害するのにも有用である。
【００６２】
実験５
ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬについて、アロ抗原に応答するヒト末梢血Ｔ細胞の増殖応答を阻害する能力を調べた。一次刺激検定において、アロ抗原提示細胞、ヒトEpstein-Barrウイルスの形質変換されたヒトＢリンパ芽球状細胞株(ＥＢＶ-ＬＣＬ)を、放射線処理し、精製されたばかりのヒトＰＢＭＣと１００ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを含有する培地へ加えた。検定は、９６個のウエル付きＵ底プレートの中で３回行ない、プレートには、１０5 ＰＢＭＣと放射線ラベル付けされた２×１０4のＥＶＢ-ＬＣＬが含まれている。培地を４日間培養し、ＥＶＢ-ＬＣＬに対するＴ細胞増殖応答を3Ｈチミジンでパルスすることによって測定し、放射線同位体でラベル付けされたＤＮＡをファイバーグラスフィルターの中へ採取し、シンチレーション計数を行なった。図５に示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの存在は、媒体単独の場合と比べて、ヒト末梢Ｔ細胞の一次アロ抗原応答を有意的に低下させた。一次刺激検定と平行して、末梢血単核細胞、放射線ラベル付けされたＥＢＶ-ＬＣＬ、及び３０ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを同じ割合で含むＴ２５フラスコの中で、ラージスケール(１０ｍｌ)のバルク培養を行なった。７日後、細胞をフラスコから採取し、２回洗浄し、新鮮な媒体の中で再び培養した。更なる３日間はＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを欠いている。一次アロ抗原刺激を開始してから１０日後、遠心分離によって細胞を収集し、２回洗浄し、二次刺激検定を行なうために、放射線ラベル付けされたＥＶＢ-ＬＣＬと共に９６個のウエル付きプレートの中へ入れた。これらの二次刺激の間、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬを追加しなかった。同じように、図５に示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、同じアロ抗原に対するヒト末梢血Ｔ細胞の二次応答を低減した。このように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、アロ抗原に対する一次応答と二次応答の両方を阻害するのに有用であり、宿主対移植片病及び移植片対宿主病のアロ抗原Ｔ細胞応答の治療用として適している。
【００６３】
実験６
単離したばかりのマウスＢＡＬＢ/ｃの脾細胞を、免疫アフィニティにより精製された異なる量のＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが存在する場合と存在しない場合において、細胞分裂誘起抗ＣＤ３抗体と共に培養した。検定は、９６個のウエル付きＵ底プレートの中で３回行ない、プレートには、２×１０5の脾細胞と３３ｎｇ/ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体(２Ｃ１１)が含まれている。２４時間後、培地を3Ｈチミジンでパルスし、活性的に分割するＴ細胞のＤＮＡをラベル付けした。２０時間後、放射線同位体でラベル付けされたＤＮＡをファイバーグラスフィルターに採取し、シンチレーション計数を行なった。図６に示されるように、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬは、抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＢＡＬＢ/ｃＴ細胞の増殖を阻害した。マウスＴ細胞は、ヒトＴ細胞と同様、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬによる阻害を受けることができる。
【００６４】
実験７
アミノ酸９５−２８１をエンコードし、ＴＮＦ関連性のアポトーシスリガンド(ｈＴＲＡＩＬ)ｃＤＮＡ配列を生成するＤＮＡプライマーは、５'-ＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡ-３'と、５'-ＴＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡ-３'である。ＰＣＲは、製造者の仕様によるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで実行し、ｈＴＲＡＩＬ ｃＤＮＡをエンコードするものとして知られている発現配列タグＤＮＡサブクローン(ye16e08.r1, GenBank Acc:#T90422)を、ＤＮＡテンプレートとして用いた。精製及び酵素限定の後、フラグメント(564 bp Hind III-BamH I DNA)を、エピソームの発現ベクターｐＣＥＰ９βの夫々のサイトにサブクローン化し、ｐＸ・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９βを生成した。ｐＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９βの生成は、オンコスタチンＭ信号とヒトＣＴＬＡ-４細胞外配列をエンコードするＨｉｎｄIIIインサートを、ｐｈＣＴＬＡ-４:ＩｇＧ１/ＲＥＰ７βから移動させると共に、ｐＸ・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９βのＨｉｎｄIIIサイトにサブクローニングすることにより行なった。
【００６５】
アミノ酸−２０−２１８をエンコードし、ヒトＣＤ２７(ｈＣＤ２７)ｃＤＮＡ配列を生成するＤＮＡプライマーは、５'-ＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣ-３'と５'-ＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＴＧ-３'である。ＰＣＲは、製造者の仕様によるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで実行し、ｈＣＤ２７ ｃＤＮＡをエンコードするものとして知られている発現配列タグＤＮＡサブクローン(EST#yg25h11.rl, GenBank Acc# R25016.1)を、ＤＮＡテンプレートとして用いた。精製及び酵素限定の後、フラグメント(652 bp Kpn I-Hind III DNA)を、エピソームの発現ベクターｐＸ・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９βの夫々のサイトにサブクローン化し、ｐＣＤ２７・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９βを生成した。
【００６６】
ＣＤ２７・ＴＲＡＩＬ又はＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬを含有する細胞培養上清を、ｐＣＤ２７・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９β又はｐＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬ/ＣＥＰ９βを有するヒトの胎児腎細胞株２９３のリポフェクションに由来する安定トランスフェクタントから得た。
【００６７】
単離したばかりのヒトＰＢＭＣを、１:３００(ｖ/ｖ)に希釈したＣＤ２７・ＴＲＡＩＬ又はＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬで調整された細胞培養液上清が存在する場合と存在しない場合において、細胞分裂有機抗体ＣＤ３と共に培養した。検定は、９６個のウエル付きＵ底プレートの中で３回行ない、プレートには、２×１０5 ＰＢＭＣと０.３ｎｇ/ｍｌの抗ＣＤ３(ＯＫＴ３)が含まれている。２４時間後、さらに３日間２４時間間隔で、培養液を3Ｈチミジンでパルスし、活性的に分割するＴ細胞のＤＮＡをラベル付けした。２０時間後、放射線同位体でラベル付けされたＤＮＡをファイバーグラスフィルターに採取し、シンチレーション計数を行なった。図７に示されるように、ＣＤ２７・ＴＲＡＩＬとＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬは両方とも、３日後、ヒト末梢Ｔ細胞の増殖を強く阻害した。これらのデータは、キメラ蛋白質(ＣＤ２７・ＴＲＡＩＬ及びＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬ)の２つの追加例を導入するものであり、本発明のキメラ蛋白質の概念の一般性をさらに示している。また、前記データは、本発明によって、追加の機能性キメラ蛋白質の迅速な設計、生産及び評価がどのように可能となるかを示している。
【００６８】
図１乃至図３に示されるように、Jurkat細胞ＰＣＤが、Daudi細胞の存在下で、０.１ｎｇ/ｍｌのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの追加によって観察された。可溶性ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの濃度が高くなると、Jurkat細胞アポトーシスを誘導するために架橋結合は必要でない。Ｂ２Ｍ・ＦａｓＬの場合と比べて、架橋抗体の不存在下では有意的な細胞破壊効果は観察されなかった。実験４と実験５は、実験１乃至実験３の結果をさらに発展させたもので、ポリクローナルＴ細胞活性化剤を凌いで、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが、特異性抗原(実験４)又は特異性抗原(実験５)のどちらの抗原に対しても特異性Ｔ細胞応答を阻害することを示している。実験６は、ヒトＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬがマウスＴ細胞のキラー細胞を阻害することを示している。
【００６９】
実験１乃至実験４は、第１蛋白質としての標的ドメイン配列、つまりＣＴＬＡ-４細胞外ドメインを使用することにより、ｓＦａｓＬは、ＣＤ８０/ＣＤ８６標的分子の細胞表面へ結合する。このように、細胞表面の分子を標的とするために、また、II型膜蛋白質誘導体をキメラ蛋白質内の第２蛋白質コンポーネントとして用いるために、キメラ蛋白質のアミノ末端ドメインを用いることが有効であることがわかる。また、生成した新規なキメラ蛋白質ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬがＡＰＣに結合されると、共刺激ブロッキングとＦａｓＬトランスエフェクタ活性を仲介することを示している。この細胞に基づく修飾(modification)を用いて、共刺激分子のブロッキングと阻害分子の提示を同時に行なうことにより、刺激性ＡＰＣを免疫阻害性ＡＰＣに変換することができる。
【００７０】
同様な結果が実験７でも示されており、追加の２種類の蛋白質ＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬ及びＣＤ２７・ＴＲＡＩＬは、ＡＰＣに結合し、阻害性トランス信号を送る。これらの結果は、本発明の新規なキメラ蛋白質の一般性を示すものであり、この種の一連の機能性蛋白質についてさらなる実験を行なう必要性はないと考えられる。
【００７１】
前述の実験は、本発明の可溶性キメラ蛋白質が、個々のドメインに由来する結合及び機能特性を有することを示している。さらにまた、実験データは、可溶性蛋白質が予定細胞死のための病原性Ｔ細胞の治療標的に有用であることを示している。
【００７２】
本発明の具体的実施例を例示して説明したが、当該分野の専門家であれば、請求の範囲に規定された発明の範囲から逸脱することなく、数多くの変形をなし得るであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  これらの図は実験１により得られたもので、（Ａ)はＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの細胞障害活性、(Ｂ)はＣＤ８０/ＣＤ８６発現細胞の添加によるＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ活性の増進、(Ｃ)はキメラ蛋白質のＦａｓＬコンポーネントのＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬ阻害活性の依存性、(Ｄ)は抗体架橋に必要なＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬの欠乏(Ｎ２Ｍ・ＦａｓＬとの比較)を示している。
【図２】  これらの図は実験２により得られたもので、(Ａ)乃至(Ｃ)は、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬで前処理された細胞が、細胞接触依存性に基づいて、Ｆａｓ感受性細胞の細胞障害性をトリガする能力を獲得することを示している。
【図３】  これらの図は実験３により得られたもので、(Ａ)乃至(Ｃ)は、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬによる抗ＣＤ３抗体刺激に応答して、ヒト末梢血の単核細胞の増殖の用量依存性阻害を示している。
【図４】  実験４により得られたもので、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが、破傷風抗原に対して抗原特異性の増殖性応答を阻害する能力を有することを示している。
【図５】  実験５により得られたもので、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが、一次リンパ球と二次リンパ球が混合された共培養の中で、アロ抗原に対して特異性の増殖性応答を阻害する能力を有することを示している。
【図６】  実験６により得られたもので、ＣＴＬＡ-４・ＦａｓＬが、抗ＣＤ３抗体刺激に応答してＢａｌｂ/ｃ脾細胞の増殖を阻害する能力を有することを示している。
【図７】  実験７により得られたもので、ＣＴＬＡ-４・ＴＲＡＩＬ及びＣＤ２７・ＴＲＡＩＬによる抗ＣＤ３抗体刺激に応答して、ＰＢＭＣ増殖が阻害されることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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