(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＧ−３、およびＬＡＧ−３を結合させるＭＨＣクラスII分子に結合する能力を維持するＬＡＧ−３の誘導体からなる群から選択される、抗原特異的免疫応答を誘導するＭＨＣクラスIIリガンドの、感染性疾患または癌を治療するための薬剤の製造のための使用であって；
ＬＡＧ−３の誘導体がＬＡＧ−３の変異体または可溶性フラグメントであって、当該変異体またはフラグメントが：
４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの少なくとも１つからなる、ＬＡＧ−３の可溶性ポリペプチドフラグメントであって、ＬＡＧ−３配列のアミノ酸２３からアミノ酸４４８に及ぶ細胞外領域を含むＬＡＧ−３の可溶性部分である前記フラグメント；
Ｄ１およびＤ２イムノグロブリン細胞外ドメインの全てまたは４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの全てからなる、ＬＡＧ−３のフラグメント；
Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを含む可溶性ＬＡＧ−３のフラグメント；
可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメントであって、Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを含み、そして、
以下の位置；
７３位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
７５位（ＡＲＧをＡＬＡまたはＧＬＵで置換）、
７６位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
の少なくとも一つでのアミノ酸の置換、または、２つ以上のそれらの置換の組み合わせ；
以下の位置；
３０位（ＡＳＰをＡＬＡで置換）、
５６位（ＨＩＳをＡＬＡで置換）、
７７位（ＴＹＲをＰＨＥで置換）、
８８位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）、
１０３位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）、
１０９位（ＡＳＰをＧＬＵで置換）、
１１５位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）、
の少なくとも一つでのアミノ酸の置換；または
５４位と６６位の間に含まれる領域の欠損；または
２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、
からなる可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメント；または、
Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む可溶性５２ｋＤタンパク質を含むＬＡＧ−３の生理的変異体
からなる群から選択され、ここで４つのイムノグロブリン細胞外ドメインは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４イムノグロブリン細胞外ドメインに対応する、
前記使用。
【請求項２】
抗原特異的免疫応答が、抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アジュバント剤としてＬＡＧ−３を含む、ＣＤ８+ Ｔ細胞による細胞免疫が関与する感染性疾患または癌を治療するための治療ワクチン。
【請求項４】
Ｔ細胞免疫応答が求められる抗原をさらに含む、請求項３に記載の治療ワクチン。
【請求項５】
癌を治療するために使用される、請求項３または４に記載の治療ワクチン。
【請求項６】
薬剤が前記リガンドを発現するトランスフェクト細胞の形またはそのリガンドの可溶性分子の形で前記ＭＨＣクラスIIリガンドを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
感染性疾患または癌の発生を予防するための、またはひとたび発症した感染性疾患または癌を治療するためのワクチン製造における、請求項１または２に記載の使用。
【請求項８】
抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答による影響を原因とする感染性疾患または癌の発生を予防するための、またはひとたび発症した感染性疾患または癌を治療するためのワクチン製造における、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
ＭＨＣクラスIIリガンドが、ＬＡＧ−３をコードするＤＮＡ配列を取り込んだ裸のプラスミドで用いられる、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
プラスミドが免疫応答を求める抗原をコードするＤＮＡをも含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
抗癌免疫療法のための薬剤製造での、ＬＡＧ−３の使用。
【請求項１２】
アジュバント機能を有する薬剤としての有効量のＭＨＣクラスIIリガンドと共に、抗原特異的免疫応答を誘導する能力を持つ有効量の抗原を含む医薬組成物であって、ＭＨＣクラスIIリガンドがＬＡＧ−３および請求項１に定義されたＬＡＧ−３誘導体より選択され、感染性疾患または癌を治療するために使用される、前記医薬組成物。
【請求項１３】
アジュバント機能を有する薬剤として有効量のＭＨＣクラスIIリガンドと共に、抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を誘導する能力を持つ有効量の抗原を含む医薬組成物であって、ＭＨＣクラスIIリガンドがＬＡＧ−３および請求項１に定義されたＬＡＧ−３誘導体より選択され、感染性疾患または癌を治療するために使用される、前記医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＭＨＣクラスIIリガンドがｈＬＡＧ−３である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＭＨＣクラスIIリガンドがヒトＬＡＧ−３の可溶性フラグメントである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ワクチンとしての、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＬＡＧ−３またはその誘導体から選択されるＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクトした癌細胞であって、該誘導体が、
４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの少なくとも１つからなる、ＬＡＧ−３の可溶性ポリペプチドフラグメントであって、ＬＡＧ−３配列のアミノ酸２３からアミノ酸４４８に及ぶ細胞外領域を含むＬＡＧ−３の可溶性部分である前記フラグメント；
Ｄ１およびＤ２イムノグロブリン細胞外ドメインの全てまたは４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの全てからなる、ＬＡＧ−３のフラグメント；
ＬＡＧ−３の突然変異型または可溶性フラグメントであって、Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを含み、そして、
（ｉ）以下の位置；
７３位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
７５位（ＡＲＧをＡＬＡまたはＧＬＵで置換）、
７６位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
の一つでのアミノ酸の置換、または、２つ以上のそれらの置換の組み合わせ；および
（ｉｉ）以下の位置；
３０位（ＡＳＰをＡＬＡで置換）；
５６位（ＨＩＳをＡＬＡで置換）；
７７位（ＴＹＲをＰＨＥで置換）；
８８位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
１０３位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
１０９位（ＡＳＰをＧＬＵで置換）；
１１５位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
の一つでのアミノ酸の置換、または５４位と６６位の間に含まれる領域の欠損、または
（ｉｉｉ）２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、
からなる可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメント；または、
Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む可溶性５２ｋＤタンパク質を含むＬＡＧ−３の生理的変異体
からなる群から選択され、ここで４つのイムノグロブリン細胞外ドメインは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４イムノグロブリン細胞外ドメインに対応する、
前記トランスフェクトされた癌細胞。
【請求項１８】
請求項１、２および７〜１１のいずれか一項に記載の薬剤製造における細胞の使用であって、該細胞が、ＬＡＧ−３またはその誘導体から選択される少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞、および、請求項１７に記載の癌細胞から選択され；
該誘導体が、
４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの少なくとも１つからなる、ＬＡＧ−３の可溶性ポリペプチドフラグメントであって、ＬＡＧ−３配列のアミノ酸２３からアミノ酸４４８に及ぶ細胞外領域を含むＬＡＧ−３の可溶性部分である前記フラグメント；
Ｄ１およびＤ２イムノグロブリン細胞外ドメインの全てまたは４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの全てからなる、ＬＡＧ−３のフラグメント；
可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメントであって、Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを含み、そして、
（ｉ）以下の位置；
７３位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
７５位（ＡＲＧをＡＬＡまたはＧＬＵで置換）、
７６位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
の一つでのアミノ酸の置換、または、２つ以上のそれらの置換の組み合わせ；および
（ｉｉ）以下の位置；
３０位（ＡＳＰをＡＬＡで置換）；
５６位（ＨＩＳをＡＬＡで置換）；
７７位（ＴＹＲをＰＨＥで置換）；
８８位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
１０３位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
１０９位（ＡＳＰをＧＬＵで置換）；
１１５位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
の一つでのアミノ酸の置換、または５４位と６６位の間に含まれる領域の欠損、または
（ｉｉｉ）２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、
からなる可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメント；または、
Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む可溶性５２ｋＤタンパク質を含むＬＡＧ−３の生理的変異体
からなる群から選択され、ここで４つのイムノグロブリン細胞外ドメインは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４イムノグロブリン細胞外ドメインに対応する、
前記使用。
【請求項１９】
ＬＡＧ−３またはその誘導体から選択される少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクトした腫瘍細胞を調製する方法であって、患者から採取されていた腫瘍細胞にＬＡＧ−３またはその誘導体から選択される少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをトランスフェクトし、得られたトランスフェクト癌細胞を回収することからなる段階を含み、該誘導体が、
４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの少なくとも１つからなる、ＬＡＧ−３の可溶性ポリペプチドフラグメントであって、ＬＡＧ−３配列のアミノ酸２３からアミノ酸４４８に及ぶ細胞外領域を含むＬＡＧ−３の可溶性部分である前記フラグメント；
Ｄ１およびＤ２イムノグロブリン細胞外ドメインの全てまたは４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの全てからなる、ＬＡＧ−３のフラグメント；
可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメントであって、Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを含み、そして、
（ｉ）以下の位置；
７３位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
７５位（ＡＲＧをＡＬＡまたはＧＬＵで置換）、
７６位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
の一つでのアミノ酸の置換、または、２つ以上のそれらの置換の組み合わせ；および
（ｉｉ）以下の位置；
３０位（ＡＳＰをＡＬＡで置換）；
５６位（ＨＩＳをＡＬＡで置換）；
７７位（ＴＹＲをＰＨＥで置換）；
８８位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
１０３位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
１０９位（ＡＳＰをＧＬＵで置換）；
１１５位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
の一つでのアミノ酸の置換、または５４位と６６位の間に含まれる領域の欠損、または
（ｉｉｉ）２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、
からなる可溶性ＬＡＧ−３の突然変異型またはフラグメント；または、
Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む可溶性５２ｋＤタンパク質を含むＬＡＧ−３の生理的変異体
からなる群から選択され、ここで４つのイムノグロブリン細胞外ドメインは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４イムノグロブリン細胞外ドメインに対応する、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＬＡＧ−３およびＣＤ４の用途、より一般的には、抗原特異的免疫応答を高めるためのワクチン用アジュバントとしてのＭＨＣクラスIIリガンドまたはＭＨＣクラスII様リガンドの用途、ならびに、癌免疫療法での治療薬剤としてのＬＡＧ−３の用途に関する。
【０００２】
現在では、ＭＨＣクラスII領域によってコードされるタンパク質は、リンパ球および抗原提示細胞のような異なるリンパ系細胞の間の相互作用を含む、数多くの免疫認識の態様に含まれると、認識されている。ＣＤ４を通して起こらないその他の機構は、Tヘルパーリンパ球のエフェクター機能にあずかるという別の見解も示されている。
【０００３】
ヒトＣＤ４+ およびＣＤ８+ 活性化Ｔ細胞ならびに活性化ＮＫ細胞内に発現するリンパ球活性化遺伝子(lymphocyte activation gene 3)（ＬＡＧ−３）は、４つの細胞外イムノグロブリンスーパーファミリー(immunoglobulin superfamily)（ＩｇＳＦ）ドメインを持つ５０３アミノ酸（ａａ）からなるＩ型膜タンパク質をコードし（１）、ＭＨＣクラスＩＩ分子のリガンドでもある（２）。この配列分析では、ＣＤ４内の相当する位置に認められるアミノ酸配列のストレッチと同一の注目に値するパッチが認められたが、ヒトＣＤ４との全体的なアミノ酸配列の相同性は、バックグラウンドのレベルよりわずかに高いのみである（おおよそ２０％の配列同一性）。また、ＬＡＧ−３分子ではドメイン１（Ｄ１）と３（Ｄ３）の間ならびにドメイン２（Ｄ２）と４（Ｄ４）の間にある程度の内部配列相同性が存在し、このことから、ＬＡＧ−３は、先に存在する２つのＩｇＳＦ構造からの遺伝子複製によりＣＤ４様に進化すると、考えられる（１）。さらに、ＬＡＧ−３およびＣＤ４遺伝子は、染色体１２の短いアームの末端部分上の非常に近い位置にある（３）。それ故、ＬＡＧ−３およびＣＤ４は、ＩｇＳＦ内では進化論上の「実のいとこ」であると考えることができる（２）。
【０００４】
ＣＤ４様のｈＬＡＧ−３は、ドメイン２および４内にＷｘＣ記号モチーフを持つＩｇ様エクトドメインからなる：しかしながら、ＣＤ４との違いは、（１７Ｂ４ｍＡｂによって認識される）ドメイン１内にループ外配列が存在すること、およびヒトＬＡＧ−３（ｈＬＡＧ−３）内に細胞質内でプロリンを多く含むモチーフ（ＥＰリピート）が存在することである。最近、ネズミのリンパ球活性化遺伝子３（ｍＬＡＧ−３）がクローン化され、細胞質内尾内に同じプロリンに富むモチーフを持つｈＬＡＧ−３と、おおよそ７０％の相同性が認められた。
【０００５】
抗−ＬＡＧ−３  ｍＡｂ存在下でのＣＤ４+ Ｔ細胞クローンの抗原特異的刺激は、成長の長期化およびサイトカイン生成を導く（５）。ＣＤ４+ リンパ球上でのｈＬＡＧ−３の調節役割は、ＬＡＧ−３  Ｉｇ融合タンパク質を持つＴ細胞上で発現した架橋されたＭＨＣクラスII分子によって活性化されることが、示唆された（６）。ＬＡＧ−３  ＭＨＣクラスII相互作用は、ＣＤ４+ Ｔ細胞上に発現したＭＨＣクラスII分子による信号を阻害し（増殖およびサイトカイン生成の減少）、このことから、ＬＡＧ−３およびＭＨＣ−３クラスIIは両方共、Ｔヘルパー細胞仲介免疫応答のダウンレギュレーションに関するエフェクター分子である、と考えられる。ｈＬＡＧ−３  Ｉｇ融合タンパク質は、異種（ネズミとサル）のＭＨＣクラスII分子と結合することが分かった。さらに、ＬＡＧ−３ヌル変異を持つトランスジェニックマウスはＮＫ細胞区画に欠陥を持つので、エフェクター細胞内にポジティブシグナルを導入するために、ｍＬＡＧ−３が提供された（７）。
【０００６】
膜（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ９５Ｌ、．．．）に発現するように処理された、または分子（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、．．．）を分泌する、マウスの腫瘍細胞系は、免疫応答または抗腫瘍効果を調べるために時折用いられる。この研究は、多くの腫瘍細胞が潜在的に抗原性を持ち（９）、それらが分子を発現する場合、免疫原となることを、示唆している。実験マウスの腫瘍は、それを非複製細胞ワクチンとして同系マウス内に一回注射した後、次に起こる致命的挑戦に対する防御免疫応答を同系マウスが誘発する場合の本質的な免疫原に分類される。このような残存する免疫原性を保っていない腫瘍は、免疫原性に乏しいかまたは非免疫原性であると定義される。
【０００７】
抗腫瘍免疫応答は、主に、Ｔ細胞によって仲介される（１２）。最近の研究は、理想的癌ワクチンの実用的実施への問題として知られている有効な抗原提示およびＴ細胞の不足を包含している。事実、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦのような様々なサイトカインをコードする遺伝子、またはＢ７の様な共刺激分子をコードする遺伝子、をもつトランスフェクトされた腫瘍細胞は、修飾細胞の初期の拒絶反応を導くだけでなく、続いて起こる未修飾の腫瘍細胞による挑戦に対する防除免疫を誘発する場合もある（１３）。
【０００８】
専門化した抗原提示細胞(antigen presenting cells)（ＡＰＣｓ）は、Ｔ細胞活性化に必要とされる共刺激シグナルでＴ細胞に抗原を取り込ませ、プロセシングして提示し、最適な抗原提示を導く能力をもつ。特に、ＭＨＣクラスII+ 樹状突起細胞(dendritic cells) （ＤＣｓ）は、抗原のプロセシングおよび免疫系への提示に重要な役割を果たすことが立証されている。本発明者らは、腫瘍を修飾してマクロファージおよび樹状突起細胞のような宿主のＡＰＣｓを直接誘発させることができたならば、腫瘍の免疫原性は増加するであろうと仮定した。事実、ｍＡｂまたはスーパー抗原を用いて、そのような細胞が特異的に発現するＭＨＣクラスII分子を架橋すると、シグナルが導入され、その結果としてＴＮＦαおよびＩＬ−１２が生成されると、報告されている（１４、１５）。リンパ球活性化遺伝子−３ (Lymphocyte Activation Gene-3) （ＬＡＧ−３）は、ＣＤ４座にあり（１、１６）、ＣＤ４より高いアフィニティーでヒトおよびネズミのＭＨＣクラスII分子と結合するタンパク質をコードすることが、以前から報告されていた（１７、６）。
【０００９】
本出願の発明者らは、３つのＭＨＣクラスII−マウス腫瘍（免疫原性の乏しい肉腫ＭＣＡ２０５および非免疫原性のＴＳ／Ａ＋ＲＥＮＣＡ腺癌）上のｈＬＡＧ−３、ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）およびｍＬＡＧ−３の発現が、免疫応答を仲介し、その結果、マウスの腫瘍を排除し、そして全身性免疫を誘導することができるか否かについて研究した。
【００１０】
結果として、ヒトまたはマウスのＬＡＧ−３は、固体腫瘍細胞系内に膜タンパク質として発現させるか、または悪性の強いマウス腫瘍に対する潜在的免疫を誘導する可溶性タンパク質としてマウス内に接種されるかのいずれかであることが分かった。免疫はＴ細胞依存性であり、抗原特異的である。
【００１１】
さらに、本発明者らはＣＤ４の役割について研究し、ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）もまた全身に抗腫瘍応答を誘導することが分かった。
【００１２】
同一の抗腫瘍応答がＴリンパ球欠損ヌードマウスでも得られたため、誘導された免疫はＴ細胞仲介であることが分かった。
【００１３】
抗腫瘍効果は、異なる固有の免疫原性を提示する異なる腫瘍細胞系ならびに異なるＭＨＣ遺伝子を発現する異なるマウス系を用いた場合にも、認められた。
【００１４】
さらに、効果を誘導するｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４は、ｈＬＡＧ−３またはｈＣＤ４を発現する腫瘍細胞系を野生型腫瘍細胞系の初回接種部位から離れた部位に注射した場合にも、認められた。
【００１５】
さらに、可溶性のｈＬＡＧ−３の全身投与は、直ちに、インビボでの腫瘍の増殖阻害を誘導する。
【００１６】
前記の結果はすべて、ＬＡＧ−３およびＣＤ−４は、抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を促進する能力を持ち、母集団中の癌の発生の危険を防ぐための免疫治療の道具として、より一般的には抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む任意の免疫療法の道具として有用であり、そして、ＬＡＧ−３はさらにインビボでの腫瘍の増殖を阻害するための道具として有用であることを証明している。
【００１７】
さらに、本発明者らは、可溶性ＬＡＧ−３を、免疫応答を探索する抗原と共に投与した場合に、ワクチンのアジュバントとして働く能力を持つことを示した。
【００１８】
この役割は、皮膚直下に位置しＭＨＣクラスIIを通して誘発される、専門化したＡＰＣｓ（樹状突起細胞およびマクロファージ）による抗原提示が改善されることから説明することができる。
【００１９】
このように、ＣＤ８+ Ｔ細胞免疫の誘導は、ウイルス内（例えば、ＡＩＤＳ、肝炎およびヘルペス）、ならびに細胞内寄生虫および細菌（例えば、ライ結核）感染ならびに癌にも含まれるので、ＬＡＧ−３は、これらの疾病に含まれる病原体作因に対する治療用ワクチンの接種、および癌の治療におけるそれ、に特に有用となる。
【００２０】
その態様の一つによれば、本発明は、抗原特異的免疫応答、好ましくは抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状況を予防または治療するための薬剤製造にＭＨＣクラスIIリガンドまたはＭＨＣクラスII様リガンドを用いることに関する。
【００２１】
第一の実施態様では、ＭＨＣクラスII結合分子は、ＬＡＧ−３、ならびにＬＡＧ−３のＭＨＣクラスIIリガンドと結合する能力を持つその誘導体である。
【００２２】
本発明では、ＬＡＧ−３の誘導体とは、ＭＨＣクラスII分子を結合するＬＡＧ−３の能力を維持する限りにおいて、ＬＡＧ−３の突然変異体(mutants) 、変異体(variants)およびフラグメント、いわゆるＬＡＧ−３の可溶性フラグメント、を意味する。
【００２３】
即ち、以下の形のＬＡＧ−３：
−全ＬＡＧ−３タンパク質
−４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの少なくとも１つからなる、その可溶性ポリペプチドフラグメント、即ち、フランス特許出願ＦＲ９０ ０００ １２６に開示されたＬＡＧ−３配列のアミノ酸２３からアミノ酸４４８に及ぶ細胞外領域を含むＬＡＧ−３の可溶性部分、
−実質上、第一および第二の全ドメインからなるＬＡＧ−３のフラグメント
−以下のように、ＷＯ９５／３０７５０に定義されたような、実質上、第一および第二の全ドメインまたは４つの全ドメインからなる、ＬＡＧ−３のフラグメント
−可能性ＬＡＧ−３の突然変異型、または、Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを含む、および以下の位置；
・７３位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、
・７５位（ＡＲＧをＡＬＡまたはＧＬＵで置換）、
・７６位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）；
の一つでのアミノ酸の置換、または、２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、
−以下の位置；
・３０位（ＡＳＰをＡＬＡで置換）；
・５６位（ＨＩＳをＡＬＡで置換）；
・７７位（ＴＹＲをＰＨＥで置換）；
・８８位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
・１０３位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
・１０９位（ＡＳＰをＧＬＵで置換）；
・１１５位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；
の一つでのアミノ酸の置換、または５４位と６６位の間に含まれる領域の欠損、または２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、からなるそのフラグメント（そのようなフラグメントは、ＰＮＡＳ、１９９７年６月（４）に記載されている）、
−または、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む可溶性５２ｋＤタンパク質を含むＬＡＧ−３の生理的変異体：
を用いることができる。
【００２４】
第二の実施態様によれば、ＭＨＣクラスII結合タンパク質は、ＣＤ４またはＣＤ４のＭＨＣクラスIIリガンドと結合する能力を持つその誘導体である。
【００２５】
ＣＤ４の誘導体は、ＬＡＧ−３の誘導体として定義されたようなそれらである。それらは、ＭＨＣクラスII分子と結合するＣＤ４の能力を維持する限りにおいて、いわゆるＣＤ４の突然変異体、変異体およびフラグメント、即ちＣＤ４の可溶性フラグメントである。
【００２６】
ＬＡＧ−３およびＣＤ４、即ちｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４または上記のようなその誘導体は、前記分子を発現する組換え体の一部分、例えばトランスフェクトされた細胞または組換えウイルスとして投与することができる。
【００２７】
また、本発明は、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような、少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍細胞に関する。
【００２８】
また、本発明のさらなる目的は、薬剤、好ましくは抗原特異的免疫応答様抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状態を予防または治療するための、または癌のような病的疾病を治療するための薬剤の製造に、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラスＩＩリガンドをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた、腫瘍細胞のような細胞を用いることである。
【００２９】
トランスフェクト細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、特に哺乳動物の腫瘍細胞である。
【００３０】
一つのその態様によれば、本発明は、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を調製する方法であって、細胞を患者から採取し、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡを前記細胞にトランスフェクトし、そしてその結果得られたトランスフェクト細胞を回収することからなる段階を含む、前記の細胞調製方法に関する。
【００３１】
本発明では、腫瘍細胞を調製するために、この方法を、患者から採取した腫瘍細胞で再現させる。
【００３２】
しかしながら、好ましい実施態様によれば、ＭＨＣクラスII結合タンパク質、即ちＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体を、遊離型、即ち可溶型で、全身接種、例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射によって、投与する。
【００３３】
本発明の薬剤は、抗原特異的免疫応答、好ましくはＴ細胞仲介免疫応答と関連する疾病を防ぐためのワクチンとして用いることができる。
【００３４】
そのため、本発明の薬剤は、免疫応答を得るための一つまたはいくつかの抗原と共に、適当なベヒクル内に投与される。抗原は、好ましくはＴ細胞仲介免疫応答を促進することのできる、感染作因の抗原または腫瘍抗原のような、最終的にはタンパク質組換え法によって得られる、不活性化あるいは弱毒化された感染性作因、または精製された抗原であることができる。
【００３５】
ワクチンを用いて、感染性作因が抗原特異的免疫応答、好ましくはＴ細胞仲介免疫応答を促進する、ウイルス、細菌または寄生虫病のような、感染性疾病から患者を防御することができる。
【００３６】
また、Ｔ細胞仲介免疫応答、いわゆるＣＤ８+ Ｔ細胞仲介免疫応答、を含む上記のような感染性疾病の患者を治療するために、ワクチンを用いることができる。
【００３７】
存在するＴ細胞仲介免疫の増進を必要とする疾病の例を、以下の表に提供する。
【００３８】
0004723722.tif 000002
そのような場合、抗原は細胞内で切り刻まれ、関連するペプチドがＭＨＣクラスＩ分子内に取り込まれ、ＣＤ８+ 細胞によって認識される細胞表面に提示される。ＬＡＧ−３ｌｇ分子が動物内に有効なＴ細胞応答を誘導し、インビトロでの未成熟樹状突起細胞および単球を刺激することを示した本発明者らの結果から、専門化ＡＰＣｓ内でＭＨＣクラスII分子を架橋することのできる状況下ではＬＡＧ−３は天然発生のＴ細胞アジュバントであることが、強く示唆される。
【００３９】
また、ワクチンを用いると、固形腫瘍癌(solid tumor cancer)または白血病のいずれの癌からも患者を防御することができる。
【００４０】
さらに、癌患者を治療するために、ワクチンを用いることもできる。
その場合、ＭＨＣクラスII結合タンパク質、いわゆるＬＡＧ−３またはＣＤ４は、免疫応答、好ましくはＴ細胞仲介免疫応答を促進することのできる一つまたはいくつかの抗原と共に、皮下、皮内または鼻腔噴霧のいずれかで、患者に投与される。抗原は、ペプチド、リポペプチド、組換えタンパク質またはこれらの抗原をコードするＤＮＡであることができる。
【００４１】
抗癌ワクチンを、それらの遺伝子型で同定した危険集団に接種する（予防用ワクチン）、または腫瘍を持つ、あるいは手術後の再発の危険性の高い患者に接種する（治療用ワクチン）ことができる。
【００４２】
ワクチンを慣用のワクチン（予防用）として用いる場合も、また治療用ワクチンとして用いる場合も、好ましくは、強力なプロモーター制御下で、ＬＡＧ−３またはＣＤ４をコードするＤＮＡ配列を取り込んだ「裸」のプラスミド（１９）として投与することができる。
【００４３】
また、好ましくは、プラスミドは、免疫応答を探求する抗原をコードするＤＮＡを含む。
【００４４】
従って、本発明のさらなる目的は、有効量のＭＨＣクラスIIリガンドを、好ましくはＴ細胞応答を通して、免疫系を強化することのできる有効量の抗原と組み合わせて含む、医薬組成物である。
【００４５】
さらなるもう一つの態様では、本発明は、癌性腫瘍を持つ患者の抗癌免疫療法のための薬剤としてＬＡＧ−３を用いることに関する。
【００４６】
そのような場合、好ましくは、ＬＡＧ−３は、遊離のＬＡＧ−３タンパク質または医薬として許容しうるベヒクル内のその誘導体として、好ましくは上記のような可溶性誘導体として、投与される。
【００４７】
ＬＡＧ−３を、腫瘍内注射または全身注射、例えば皮下、静脈内または筋肉内注射として、投与することもできる。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、腫瘍の遺伝子治療法であって、患者の腫瘍細胞の一部分を採取し、前記細胞にＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような、少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクトし、そしてそうして得られたトランスフェクト細胞を患者に再導入することからなる段階を含む、前記の治療方法に関する。
【００４９】
以下の実施例は、Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状況の予防または治療におけるＬＡＧ−３およびＣＤ４の活性を示している。
【００５０】
本発明をより良く理解するために、以下の添付図を参考にすることができる：  図１は、野生型ＭＣＡ ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡ ＷＴ）、ｈＣＤをトランスフェクトしたＭＣＡ ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡ ｈＣＤ４）およびｈＬＡＧ−３をトランスフェクトしたＭＣＡ ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡ ｈＬＡＧ−３）、を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍サイズを示し；
図２は、野生型ＭＣＡ腫瘍を最少の腫瘍形成性投与量で同一マウスに再投与した後に得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；
図３は、無関係の適切なＭＣ３８腫瘍細胞系を同一マウスに再投与した後に得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；
図４は、異なるマウスの系統（ＢＡＬＢ／ｃ）および異なる腫瘍細胞系（ＴＳ／Ａ）の野生型（ＴＳ／Ａ  ｗｔ）またはｈＣＤ４（ＴＳ／Ａ  ｈＣＤ４）またはｈＬＡＧ−３（ＴＳ／Ａ  ｈＬＡＧ−３）でトランスフェクトされたそれを用いて得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；
図５は、存在する腫瘍を、ｈＬＡＧ−３を発現する異なる投与量のＭＣＡ細胞で治療して得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；
図６は、可溶性ＬＡＧ−３をＭＣＡ細胞と共に（ＭＣＡ  ｗｔ、ＭＣＡ  ｗｔ＋２５μｇ  ＬＡＧ−３、およびＭＣＡ  ｗｔ＋２５０μｇ  ＬＡＧ−３）注射して得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；
図６のフレーム内側の図は、腫瘍を持つマウスの割合（％）を示す。
【００５１】
図７および図８は、腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）の５人の患者（Ｐ１−Ｐ５）の腫瘍透過性リンパ球(tumor infiltrating lymphosytes)（ＴＩＬＳ）の膜内でのＬＡＧ−３の発現の結果を示し；
図９は、ＣＤ８+ リンパ球によって仲介されるｈＬＡＧ−３+ 腫瘍細胞の排除を示す。
【００５２】
ａ，ｈＬＡＧ−３  ＭＣＡ２０５マウスからのＴＩＬｓと対照（ｗｔ  ＭＣＡ２０５）からのＴＩＬｓを比較した、ＣＤ８発現のＦＡＣＳ分析。ｂ，ＣＤ８+ Ｔ細胞は、ｈＬＡＧ−３ ＴＳ／Ａ 腫瘍の成長を制御する一因となる。マウスは、−３、−２、−１、＋４および＋８日に、腹腔内に２００μｇの精製ＣＤ４またはＣＤ８−特異的ｍＡｂを投与された。野生型またはｈＬＡＧ−３  ＴＳ／Ａ腫瘍細胞（ＭＴＤ）を０日目に皮下に接種した。データは、一回の実験での、個々のグループ当たり５マウスの平均値±s.e.m.で示した。このような実験を２回行い、同様の結果を得た。ｃ，ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ細胞を排除したマウス内での抗腫瘍ＣＴＬｓの活性の増加。マウスは、皮下に５ｘ１０4 ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ細胞の移植を受け、３０日目に非経口で２．５ｘ１０5 ＴＳ／Ａ細胞を再投与した。腫瘍を持たないマウスから、６０日目に脾臓を収集し、細胞を、６日間、照射し指標となる標的細胞と共に同時培養した。指標の標的細胞に対する細胞溶解活性を、標準４時間51Ｃｒ遊離アッセイで試験し、エフェクター対標的の比率(effector-to-target ratio)（Ｅ．Ｔ．）の差で示した。２マウスについての結果を示す。これらの実験は、４マウスで２度行い同様の結果を得た。
【００５３】
図１０は、ＬＡＧ−３ｌｇのワクチン接種を一回受けた同系ＭＣＡ２０５肉腫細胞のＭＴＤを移植したマウス（２０Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の結果（平均腫瘍サイズ）を示している。６日目に、５マウスづつ４グループに分け、皮下ワクチン接種（２００μｌ）を一回行った。Ａｇは、照射（１００Ｇｙ）ＭＣＡ２０５細胞を示す。
【００５４】
実施例内に示す実験は、以下の材料および方法を用いることによって行われた。
【００５５】
材料および方法
１．  腫瘍細胞系
用いたＭＨＣクラスＩ+ およびクラスII+ 腫瘍細胞系は：免疫原性の乏しいメチルコラントレン誘導肉腫ＭＣＡ２０５細胞系（Ｃ５７ＢＬ／６ Ｈ−２bマウスと同系）、免疫原性腎癌腫細胞系ＲＥＮＣＡおよび非免疫原性の非分化の自然発生乳腺癌ＴＳ／Ａ細胞系（両方ともＢＡＬＢ／Ｃ Ｈ−２dマウスと同系）：を用いた。ＭＣ３８結腸癌細胞系（Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系）を、対照腫瘍として、再投与実験に用いた。細胞を、完全培地（グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、エンドトキシンを含まない１０％の胎児ウシ血清および０．０５ｍＭ  ２−βメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培養基）中、空気中に１０％ＣＯ2 の給湿大気中で、３７゜Ｃに保持した。免疫染色実験およびインビボ実験を行うために、細胞を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを入れたそれらの培養ベッセルから採取した。皮下注射(Subcutaneous injection) (s.c.)の前に、細胞を、３回、冷ＰＢＳ  １Ｘで洗浄し、同一バッファーに再縣濁した。細胞は、２週間より長くは培養しなかった。
【００５６】
２．マウス
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６−８週齢）を、ＩＦＦＲＡ−ＣＲＥＤＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（４−８週齢）を、ＪＡＮＶＩＥＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。このマウス系統はすべて、特定の病原体を含まない状態で飼育した。雌のヌードは、ｔｈｅ  ａｎｉｍａｌ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙより購入し、保護的微小環境下に保った。
【００５７】
３．遺伝子構築物
ｈＬＡＧ−３、ｍＬＡＧ−３およびｈＣＤ４のｃＤＮＡを、ＮＴハイグロマイシンプラスミドベクター内にクローン化した（クローン化部位は、ＳＲαプロモーター下、ｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４用にはＸｂａｌ、ｍＬＡＧ−３用にはＸｈｏｌである）（１８）。逆方向にクローン化したＬＡＧ−３  ｈｃＤＮＡを、負の対照として用いた。すべての腫瘍細胞系（２．５ｘ１０6 細胞）を、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いてエレクトロポレート：ＭＣＡ２０５細胞では２００Ｖ、ＴＳ／ＡおよびＲＥＮＣＡ細胞では３００Ｖ、１５００μＦおよび無限シャント耐性：によって、トランスフェクトした。トランスフェクタントをハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ）中で：ＭＣＡ２０５を１００μｇ／ｍｌ中で、ＲＥＮＣＡおよびＴＳ／Ａトランスフェクタントを２００μｇ／ｍｌ中で、選択した。トランスフェクトされた分子を発現する耐性細胞は、Ｅｌｉｔｅ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて定量し、そして限定希釈を行ってクローン化した。個々の腫瘍細胞系内の個々の構築物についての最良のクローンをこの研究に用いた。
【００５８】
４．細胞蛍光定量法分析
トランスフェクトされた分子を発現する耐性細胞は、飽和量の精製されたかまたは腹水液のｍＡｂｓで、間接免疫蛍光によって染色した。最初に、細胞を、ｍＡｂｓ：１７Ｂ４（抗−ｈＬＡＧ−３）（１）（２）、ＯＫＴ４（抗−ｈＣＤ４）、負の対照として用いられるウサギの免疫前血清（ＰＩＳと呼ばれる）およびウサギの免疫血清抗−ＬＡＧ−３（ＩＳと呼ばれる）：と共に、インキュベートした。腫瘍上のマウスＭＨＣクラスＩおよびII分子の発現を、以下のｍＡｂｓ：Ｈ−２Ｋd およびＤd 用に３４−１−２Ｓ、Ｈ−２ＫdおよびＤd用に２８−８−６Ｓ、１４−４−４Ｓ（Ｅd 用）、Ｍ５０１１４（ＩＡおよびＩＥ用）：で検出した。
【００５９】
次いで、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣを結合したヤギの抗−マウス血清（ＧＡＭ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＦＩＴＣを結合したヤギの抗−ウサギ血清（ＧＡＲ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とインキュベートした。浸潤細胞の存在または腫瘍周辺での細胞の漸増を研究するために、数匹のマウスを殺し、腫瘍を分離した。細胞を、１７Ｂ４−ＦＩＴＣまたは以下のｍＡｂｓ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗−ｍＣＤ４−ＰＥ（Ｌ３Ｔ４）、抗−ｍＣＤ８（Ｌｙ−２およびＬｙ−３．２）、抗−ｍＮＫ（２Ｂ４）および抗−ｍＣＤ２２（Ｌｙｂ−８．２）；で、直接免疫蛍光によって染色した。Ｅｌｉｔｅ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、細胞を選別した。
【００６０】
次いで、陽性の細胞系を、限定希釈によってクローン化し、後に用いるため、ＬＡＧ−３+またはＣＤ４+クローンを凍結した。
【００６１】
可溶性ＬＡＧ−３分子を生成するために、ｈＬＡＧ−３およびｍＬＡＧ−３の細胞外ドメインを、（６）に記載の方法に従って、それぞれ、ｈＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ部分と融合させた。得られた組み換えタンパク質、ｈＬＡＧ−３ＩｇおよびｍＬＡＧ−３Ｉｇを、ＣＨＯ細胞内で生成させ、プロテイン−Ａカラムで精製した。
【００６２】
５．インビボでの腫瘍実験
５．１  腫瘍増殖の確立およびワクチン接種
腫瘍細胞系を、最少腫瘍形成量(minimal tumorigenic dose)（ＭＴＤ）、ＭＣＡ２０５では２．１０8 細胞／マウス、ＴＳ／Ａでは５．１０4 細胞、そしてＲＥＮＣＡでは１０5 細胞またはＭＴＤの５倍、を皮下注射することによって確立した。注射３０日後、腫瘍を持たないマウスに、親の腫瘍細胞系（５ｘＭＴＤ）を再投与した。対照細胞として、ＭＣ３８結腸癌細胞系を１０5 細胞、ＴＳ／Ａ腫瘍を切り取ったＣ５７ＢＬ／６内に、投与した。年齢の釣り合う無垢のＣ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウスに腫瘍細胞系を注射した。
【００６３】
腫瘍の成長は、カリパスを用いて２つの腫瘍の垂直直径を測定することによって、週に２−３回モニターした。インビボでの腫瘍実験日には、インビトロでも細胞を細胞蛍光計によって分析し、増殖アッセイを行った。
【００６４】
５．２  腫瘍治療モデル
０日、野生型腫瘍細胞系を左側腹部に皮下接種（ＭＴＤ）した。０、３または６日目に、ＬＡＧ−３+ 腫瘍細胞を右腹部に注射（ＭＴＤまたは５倍のＭＴＤ）し、遠隔部位のトランスフェクトされていない細胞への抗腫瘍効果を調べた。腫瘍増殖を前記の方法に従ってモニターした。
【００６５】
５．３  サイトメトリー分析を行うために、上記の方法に従って、マウスに５ｘＭＴＤ腫瘍細胞を皮下接種した。８日目、腫瘍を分離し、Ｅｌｉｔｅ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ８６−ＦＩＴＣ、２Ｂ４−ＰＥ（ＮＫ細胞）、ＣＤ２２−ＰＥ（Ｂ細胞）またはｈＬＡＧ−３−ＦＩＴＣ  ｍＡｂｓで分析した。
【００６６】
５．４  リンパ球を消耗させるために、−３、−２、−１、＋４および＋８日目に、マウスに２００μｇの精製された（１８）抗−ＣＤ４（ＹＴＳ  １９１．１．２）または抗−ＣＤ８（ＹＴＳ  １６９．４．２．１）ｍＡｂｓを静脈内投与した。野生型またはｈＬＡＧ−３  ＴＳ／Ａ腫瘍細胞を、０日に皮下接種（ＭＴＤ）した。このような投与量のｍＡｂを投与された対照マウスの細胞蛍光計分析から、脾臓内の標的集団が９５％以上減少することが、示された（データには示されていない）。
【００６７】
６．  インビトロでの研究
細胞毒性アッセイのために、腫瘍特異的短期ＣＴＬを、混合リンパ球腫瘍細胞培養を用いて、生成した。簡単に言えば、確立された腫瘍を除去したマウスから、３０日目に３ｘ１０7 の脾臓細胞を収集した。これらの細胞を、完全培地中で４日間、次いで、５０ＩＵ／ｍｌの組換えｈＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ）を添加して２日間、３ｘ１０6 の照射した親腫瘍細胞で刺激した。脾臓細胞のエフェクター機能を、標識した標的細胞：自己由来の腫瘍細胞、Ｈ−２d 不適切肉腫ＷＥＨＩ１６４およびＮＫ感受性ＹＡＣ細胞系に対して、標準４時間51Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター対標的比率２５／１から２００／１まで）で試験した。三重実験での溶解割合（％）を、［（平均実験ｃｐｍ−平均自然ｃｐｍ）／(平均最大ｃｐｍ−平均自然ｃｐｍ）］ｘ１００として、計算した。我々ユーザーは、特異的溶解を、腫瘍細胞を排除するマウス脾臓細胞の溶解−無垢なマウス脾臓細胞の溶解、と定義した。
【００６８】
結果
実施例Ｉ：
腫瘍細胞系上でのｈＣＤ４、ｈＬＡＧ−３、ｍＬＡＧ−３およびＭＨＣ分子の表面発現
トランスフェクトした腫瘍クローンを、２．２節に詳述した方法に従って、染色し、ｈＣＤ４、ｈＬＡＧ−３およびｍＬＡＧ−３の発現レベルを比較した。個々の構築物につき最良のクローンをこの研究に用いた。以下の腫瘍細胞系ＴＳ／Ａは、高レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現し、そしてＭＣＡ２０５は、低レベルのＭＨＣクラスＩを発現する。トランスフェクトしたクローンと比較した親の腫瘍細胞系上へのＭＨＣクラスＩの発現の間に有意な差異は認められなかった。
【００６９】
実施例II：
腫瘍確立モデルおよびワクチン接種：ｈＣＤ４およびｈＬＡＧ−３の効果の比較
遺伝子トランスフェクション後の細胞の腫瘍形成性を試験するために、これらの実験を行った：図１および４に示したＭＣＡ２０５およびＴＳ／ＡならびにＲＥＮＣＡ。ＬＡＧ−３+ 腫瘍の抗腫瘍免疫の誘導を、親の腫瘍細胞系と比較した。
【００７０】
野生型ＭＣＡ２０５、ＴＳ／ＡおよびＲＥＮＣＡ細胞は、同系のＣ５７  ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／Ｃマウスまたはｎｕ／ｎｕマウスのいずれかに皮下注入した場合、累進的に増殖した。安定にトランスフェクトされ次にヒドロマイシン選択した逆方向にクローン化したｈＬＡＧ−３  ｃＤＮＡを持つ腫瘍細胞も、同様の増殖速度を持っていた。
【００７１】
ＭＣＡ−ＬＡＧ−３を接種された動物は、腫瘍を排除した。ＭＣＡ−ＣＤ４を接種された動物は、ｗｔ  ＭＣＡを接種された動物より腫瘍増殖が低かった（図１）。
【００７２】
同様の結果は、ｍＬＡＧ−３でも得られた（データは示していない）。
これらの結果から、ｈＬＡＧ−３、ｍＬＡＧ−３およびｈＣＤ４の異所性発現は、ＭＣＡ肉腫細胞系の免疫原性を増加し、ＭＣＡトランスファクタントの腫瘍形成を妨害する、即ち、それは悪性の高いマウス腫瘍に対する潜在的免疫を誘導する。
【００７３】
類似の結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウス内のＴＳ／Ａ腫瘍細胞でも得られる（図２）。
【００７４】
さらに、類似の結果が、同系ＢＡＬＢ／ＣマウスのＲＥＮＣＡ腫瘍細胞でも得られる。
【００７５】
即ち、抗腫瘍効果は、
−異なるＭＨＣ複合遺伝子を発現する異なるマウス系統内で；
−（異なる内在性免疫原性、ＴＳ／Ａ＜ＭＣＡ、を提示する）異なる腫瘍細胞系を用いて；
得られる。
【００７６】
ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、ｗｔ  ＭＣＡ、ＭＣＡ  ｈＬＡＧ−３およびＭＣＡ  ｈＣＤ４型の腫瘍細胞を接種し、トランスフェクタントを同様に増殖させた。
【００７７】
これは、全身性−、長命−、腫瘍特異的−ｈＬＡＧまたはｈＣＤ４−増進免疫がＴ細胞仲介であるという事実を実証する。
【００７８】
前もって、ｗｔ  ＭＣＡ、ＭＣＡ  ｈＬＡＧ−３およびＭＣＡ  ｈＣＤ４を接種し、ＭＴＤ注射後３０日目に腫瘍を持たないマウスに５倍のＭＴＤ親腫瘍細胞系または関連しない同系ＭＣ３８結腸癌腫細胞系を再投与（１倍）した。
【００７９】
結果を図２および３に示す。
再投与後、ＭＣＡ−ＬＡＧ−３細胞およびＭＣＡ−ＣＤ４細胞を投与された動物の両方が、生き残った動物のｗｔ  ＭＣＡの増殖を遅らせた（図２）。
【００８０】
不適切な腫瘍ＭＣ３８を再投与された動物では、そのような効果は認められなかった。
【００８１】
このことから、ｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４の異所性発現は両方ともアジュバント様効果を持ち、非修飾の親腫瘍に対する長期にわたる抗原特異的免疫を誘導することが、分かる。
【００８２】
実施例III：
ＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３を持つＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＣＡ２０５腫瘍の治療
それぞれ５マウスからなる３グループを実験に用いた。
【００８３】
それぞれのグループは、片腹にｗｔ  ＭＣＡを、そして３日後にＭＣＡ  ｗｔ（グループ１）、ＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３を２．１０5 細胞（グループ２）、およびＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３を１．１０6 細胞（グループ３）のいずれかを接種した。
【００８４】
元からの腫瘍サイズを、それぞれのグループにつき３０日以上にわたって測定した。結果を図５に示す。
【００８５】
ＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３の注入は、投与量依存様式で腫瘍の成長を遅らせた。
この実験から、腫瘍成長へのＬＡＧ−３の全身的効果が確認され、ＬＡＧ−３は固体腫瘍に対する治療薬剤となることが分かった。
【００８６】
実施例IV：
可溶性ＬＡＧ−３でのＣ５７ＢＬ／６マウス内のｗｔ ＭＣＡ ２０５腫瘍の治療。
【００８７】
それぞれ５マウスからなる３つのグループに、ＰＢＳ（グループ１）または可溶性ヒトＬＡＧ−３（ｓｈＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ４）を２５μｇ（グループ２）あるいは２５０μｇ（グループ３）含むＰＢＳのいずれかに縣濁したｗｔＭＣＡを同時接種した。
【００８８】
腫瘍サイズを、それぞれのグループにつき３０日間にわたって測定した。
結果を図６に示す。
【００８９】
ｈＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ４の同時投与は、投与量依存性腫瘍成長遅滞を誘導した。
【００９０】
このことから、可溶性ｈＬＡＧ−３の全身投与は、インビボでの腫瘍成長の阻害を直ちに誘導することが、証明される。
【００９１】
実施例Ｖ：
インビボでの、ヒト腫瘍リンパ球浸潤(tumor lymphocytes infiltrating)（ＴＩＬｓ）腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）上のＬＡＧ−３の発現。
【００９２】
ヒトでは、ＬＡＧ−３を、組織（即ち、炎症を起こした第二リンパ系器官）内に発現するが、ＰＢＭＣｓの表面上には発現せず（３）、インビボでは活性化されたＣＤ２５+、ＣＤ６９+  ＰＢＭＣｓ上にさえ発現しない。ＬＡＧ−３は、ＭＨＣクラスII−制限ＣＤ４+ 細胞（３）上より、活性化されたＭＨＣクラスＩ−制限ＣＤ８+ 細胞上に、ＩＬ−１２より高いレベルで発現し、ＩＬ−１２によって、あるいはＩＬ−２＋ＩＬ−１２のより可能性のある組み合わせによるＬＡＧ−３発現の誘導は、ＣＤ４+細胞よりＣＤ８+細胞上でより強い。ＬＡＧ−３は、インビトロならびにインビボでは、わずかに発現する活性化抗原であり、新たに分離された腫瘍内の蛍光標識の割合（％）および／または特異性の評価が難しいことがある。ＬＡＧ−３はヒト腫瘍内のＭＨＣクラスII+ ＡＰＣｓを阻害することができるので、免疫組織化学（ＡＰＡＡＰ法）を用いて、Ｔ細胞によって浸潤されることが知られている一連の腫瘍内でのその発現を評価した。ＴＩＬｓ上のＬＡＧ−３の発現は、５の黒色腫、１０の腎細胞腺腫、および７のＢ細胞リンパ腫を含む、試験したサンプルのすべてで検出された。
【００９３】
腎細胞癌腫瘍内の腫瘍浸潤リンパ球上のＬＡＧ−３発現について、８患者を調査した。
【００９４】
分離した腫瘍を、細胞蛍光計アッセイによる実験に用いた。ＬＡＧ−３の発現を、そのサイズおよび顆粒症を測定することによって、リンパ球集団間で研究した。死亡した細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色することによって研究から除外した。ＴＩＬｓは１７Ｂ４、ＬＡＧ−３のループ外のエピトープに特異的なモノクローナル抗体、で染色された。
【００９５】
患者Ｐ１−Ｐ３についての結果を図７に示し、患者Ｐ４およびＰ５の結果を図８に示している。
【００９６】
すべての患者で、リンパ球表面での１７Ｂ４抗体の結合を示す、蛍光ピークのシフトが認められた。
【００９７】
従って、すべての患者で、ＴＩＬｓは、無関係の患者の有意の割合（３０％）のＲＣＣ−ＴＩＬと共に、ＬＡＧ−３を実際に発現した。
【００９８】
すべてのサンプル内で、ＣＤ３+ Ｔ細胞は、ＣＤ８+ Ｔ細胞上でより高発現するＬＡＧ−３を（１１％−４８％の範囲で）発現することが認められた。
【００９９】
対照的に、末梢血液単核細胞は、これらの患者内ではＬＡＧ−３- であり、このことから、リンパ球上でのＬＡＧ−３の発現は、腫瘍内でのＴ細胞活性化に関連する現象であることが分かった。
【０１００】
さらに、ＥＬＩＳＡアッセイを用いることによって、高濃度（約１ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ＬＡＧ−３を癌患者の血液内に見出した。
【０１０１】
これらのデータは、ＬＡＧ−３がヒトの自然発生抗腫瘍応答に含まれる分子であることを示しており、ヒトの腫瘍細胞の免疫学的監視を後援するためにＬＡＧ−３を用いることを支持している。
【０１０２】
実施例VI：
ＣＤ８+ Ｔ細胞は初期排除を仲介する。
【０１０３】
Ｔ−細胞欠如ｎｕ−ｎｕマウスでは排除は認められなかったため、ｈＬＡＧ−３  ＭＣＡ  ２０５およびＴＳ／Ａトランスフェクタントの排除は、Ｔリンパ球に依存する。これら細胞を５ｘＭＴＤ注入した後、１０ｍｍ直径の腫瘍を８日目に取り出し、分離した腫瘍細胞および腫瘍浸潤リンパ球の両方を、ＦＡＣＳについて分析した。ｗｔ腫瘍ならびにＬＡＧ−３トランスフェクタント（最初はＣＤ８０-およびＣＤ８６-）は、接種後、依然これらのマーカーについて（−）のままであったが、ＬＡＧ−３は、抗−ＬＡＧ−３  １７Ｂ４  ｍＡｂを用いるとｈＬＡＧ−３腫瘍上に常に検出された（データには示されていない）。外植片化した腫瘍−８日目には、ＣＤ８+ 細胞の割合は、ｈＬＡＧ−３  ＭＣＡ２０５腫瘍内で約３１％であったのに対してｗｔ  ＭＣＡ２０５腫瘍内では４％であった（図９ａ）が、これに対して、ＣＤ４+ 、ＢまたはＮＫ細胞のサブセットを分析した場合、差異は認められなかった。同様の結果は、ＴＳ／Ａ腫瘍でも認められた（データには示されていない）。最終的に、抗腫瘍応答に対するＣＤ４+ およびＣＤ８+ Ｔ細胞のそれぞれの構築は、これらの細胞サブセットのマウスを減らして試験した。図９ｂに示すように、ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ  ＭＴＤ接種時にＣＤ８−特異的ｍＡＢを投与すると、ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ腫瘍細胞は排除されなくなった。ＣＤ４+ ヘルパーＴ細胞の参与は、ＣＤ−４特異的ｍＡｂで認められた部分的影響によって示唆される（図９ｂ）。
【０１０４】
実施例VII：
腫瘍−特異的ＣＴＬ応答はｈＬＡＧ−３によって強められる。
【０１０５】
ＬＡＧ−３の抗腫瘍活性の裏に隠されたメカニズムをさらに調べるために、我々は、細胞毒性Ｔ−リンパ球(cytotoxic T lymphocyte)（ＣＴＬ）の生成へのその影響−非免疫原性ＴＳ／Ａ細胞の刺殺−について評価した。脾臓細胞を、再投与実験で５ｘＭＴＤ  ｗｔ腫瘍細胞を排除することができたｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ腫瘍−移植マウスから収集し、そして、インビトロで、照射ＴＳ／Ａ細胞で６日間、再刺激した。ｈＬＡＧ−３腫瘍細胞−移植マウスの脾臓細胞内にＣＴＬ活性を検出した（図９ｃ）が、無垢の動物からの脾臓細胞は、細胞毒性活性を示さなかった（データには示されていない）。ＣＴＬ活性は、同系のＷＥＨＩ肉腫細胞ならびにＮＫ−感受性ＹＡＣ細胞を溶解しなかった（図９ｃ）ため、非免疫原性ＴＳ／Ａ細胞に選択的であると考えられる。
【０１０６】
実施例VIII：
確立された腫瘍の治療
発明者らは、ワクチンアジュバントとして可溶性ＬＡＧ−分子を用いることによって、腫瘍成長が制御されることを示した。抗原（照射腫瘍細胞）＋ブースター（ｍＬＳＧ−３Ｉｇ、１μｇまたは０．１μｇ）の混合物の一回の注射は効果的であった（図１０）。
【０１０７】
インビボで、可溶性ＬＡＧ−３分子は、ＭＨＣクラスII分子を通してランゲルハンス島細胞（またはワクチン部位に存在する任意のＡＰＣ）をシグナル化し、有効にＣＤ８+ Ｔ細胞を初期化することが出来ると、考えられる。
【０１０８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型ＭＣＡ ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡ ＷＴ）、ｈＣＤをトランスフェクトしたＭＣＡ ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡ ｈＣＤ４）およびｈＬＡＧ−３をトランスフェクトしたＭＣＡ ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡ ｈＬＡＧ−３）、を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍サイズを示している。
【図２】  野生型ＭＣＡ腫瘍を最少の腫瘍形成性投与量で同一マウスに再投与した後に得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。
【図３】  無関係の適切なＭＣ３８腫瘍細胞系を同一マウスに再投与した後に得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。
【図４】  異なるマウスの系統（ＢＡＬＢ／ｃ）および異なる腫瘍細胞系（ＴＳ／Ａ）の野生型（ＴＳ／Ａ  ｗｔ）またはｈＣＤ４（ＴＳ／Ａ  ｈＣＤ４）またはｈＬＡＧ−３（ＴＳ／Ａ  ｈＬＡＧ−３）でトランスフェクトされたそれを用いて得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。
【図５】  存在する腫瘍を、ｈＬＡＧ−３を発現する異なる投与量のＭＣＡ細胞で治療して得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。
【図６】  可溶性ＬＡＧ−３をＭＣＡ細胞と共に（ＭＣＡ  ｗｔ、ＭＣＡ  ｗｔ＋２５μｇ  ＬＡＧ−３、およびＭＣＡ  ｗｔ＋２５０μｇ  ＬＡＧ−３）注射して得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。
図６のフレーム内側の図は、腫瘍を持つマウスの割合（％）を示している。
【図７】  腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）の５人の患者（Ｐ１−Ｐ５）の腫瘍透過性リンパ球(tumor infiltrating lymphosytes)（ＴＩＬＳ）の膜内でのＬＡＧ−３の発現の結果を示している。
【図８】  腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）の５人の患者（Ｐ１−Ｐ５）の腫瘍透過性リンパ球(tumor infiltrating lymphosytes)（ＴＩＬＳ）の膜内でのＬＡＧ−３の発現の結果を示している。
【図９】  ＣＤ８+ リンパ球によって仲介されるｈＬＡＧ−３+ 腫瘍細胞の排除を示している。
Ａ）ｈＬＡＧ−３  ＭＣＡ２０５マウスからのＴＩＬｓと対照（ｗｔ  ＭＣＡ２０５）からのＴＩＬｓを比較した、ＣＤ８発現のＦＡＣＳ分析。Ｂ）ＣＤ８+ Ｔ細胞は、ｈＬＡＧ−３ ＴＳ／Ａ 腫瘍の成長を制御する一因となる。マウスは、−３、−２、−１、＋４および＋８日に、腹腔内に２００μｇの精製ＣＤ４またはＣＤ８−特異的ｍＡｂを投与された。野生型またはｈＬＡＧ−３  ＴＳ／Ａ腫瘍細胞（ＭＴＤ）を０日目に皮下に接種した。データは、一回の実験での、個々のグループ当たり５マウスの平均値±s.e.m.で示した。このような実験を２回行い、同様の結果を得た。Ｃ）ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ細胞を排除したマウス内での抗腫瘍ＣＴＬｓの活性の増加。マウスは、皮下に５ｘ１０4 ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ細胞の移植を受け、３０日目に非経口で２．５ｘ１０5 ＴＳ／Ａ細胞を再投与した。腫瘍を持たないマウスから、６０日目に脾臓を収集し、細胞を、６日間、照射し指標となる標的細胞と共に同時培養した。指標の標的細胞に対する細胞溶解活性を、標準４時間51Ｃｒ遊離アッセイで試験し、エフェクター対標的の比率(effector-to-target ratio)（Ｅ．Ｔ．）の差で示した。２マウスについての結果を示している。これらの実験は、４マウスで２度行い同様の結果を得た。
【図１０】  ＬＡＧ−３ｌｇのワクチン接種を一回受けた同系ＭＣＡ２０５肉腫細胞のＭＴＤを移植したマウス（２０Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の結果（平均腫瘍サイズ）を示している。６日目に、５マウスづつ４グループに分け、皮下ワクチン接種（２００μｌ）を一回行った。Ａｇは、照射（１００Ｇｙ）ＭＣＡ２０５細胞を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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