(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i-1)Ile Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種のアミノ酸配列を有するタンパク質、(ii)乳酸菌資化性糖、及び(iii)乳酸菌を含む混合原料(a)を調製する工程(1-A)と、
混合原料(a)を撹拌しながら、且つアルカリ剤を用いてpH調整しながら乳酸発酵させ、Ile Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種を含むペプチド混合物を生成させる工程(1-B)とを含み、
前記工程(1-A)において混合原料(a)中の、(i-1)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53倍以上であり、且つ前記工程(1-B)におけるpH調整を4.8〜5.8に制御しながら実施することを特徴とするIle Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種を高濃度で含むペプチド混合物の製造法。
【請求項２】
(i-1)タンパク質が、乳タンパク質、コーンタンパク質、小麦タンパク質及び大豆タンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１の製造法。
【請求項３】
混合原料(a)が、(i-1)タンパク質を含む材料として、脱脂粉乳、全粉乳、還元乳、牛乳、コンデンスミルク及びこれらの混合物からなる群より選択される乳材料を含む請求項１の製造法。
【請求項４】
前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量が9〜15重量％であり、且つ混合原料(a)中の、(i-1)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53〜3.9倍量である請求項３の製造法。
【請求項５】
前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量が6重量％を超え9重量％未満であり、且つ混合原料(a)中の、(i-1)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53〜4.62倍量である請求項３記載の製造法。
【請求項６】
前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量が3〜6重量％であり、且つ混合原料(a)中の、(i-1)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53〜9.3倍量である請求項３の製造法。
【請求項７】
工程(1-B)の前に、工程(1-A)で調製した混合原料(a)を、連続滅菌法により140℃以下の条件で滅菌処理する工程を含む請求項１の製造法。
【請求項８】
工程(1-B)の前に、工程(1-A)で調製した混合原料(a)を、115℃以下のバッチ滅菌法により滅菌処理する工程を含む請求項１の製造法。
【請求項９】
工程(1-B)に用いるアルカリ剤が、水酸化ナトリウムである請求項１の製造法。
【請求項１０】
工程(1-B)において、混合原料(a)の撹拌を、該混合原料(a)中のタンパク質の平均粒径が5〜40μｍとなる条件で行なう請求項１の製造法。
【請求項１１】
(i-2)抗高血圧ペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質、(ii)乳酸菌資化性糖、及び(iii)乳酸菌を含む混合原料(a)を調製する工程(1-A)と、
混合原料(a)を撹拌しながら、且つアルカリ剤を用いてpH調整しながら乳酸発酵させ、抗高血圧ペプチドを生成させる工程(1-B)とを含み、
前記工程(1-A)において混合原料(a)中の、(i-2)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53倍以上であり、且つ前記工程(1-B)におけるpH調整を4.8〜5.8に制御しながら実施する抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法。
【請求項１２】
(i-2)タンパク質が、乳タンパク質、コーンタンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質及びこれらの混合物からなる群より選択される請求項１１の製造法。
【請求項１３】
抗高血圧ペプチドが、トリペプチドIle Pro Pro、トリペプチドVal Pro Pro、ジペプチドTyr Pro及びこれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む請求項１１の製造法。
【請求項１４】
混合原料(a)が、(i-2)タンパク質を含む材料として、脱脂粉乳、全粉乳、還元乳、牛乳、コンデンスミルク及びこれらの混合物からなる群より選択される乳材料を含む請求項１１の製造法。
【請求項１５】
前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量が9〜15重量％であり、且つ混合原料(a)中の、(i-2)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53〜3.9倍量である請求項１４の製造法。
【請求項１６】
前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量が6重量％を超え9重量％未満であり、且つ混合原料(a)中の、(i-2)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53〜4.62倍量である請求項１４の製造法。
【請求項１７】
前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量が3〜6重量％であり、且つ混合原料(a)中の、(i-2)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53〜9.3倍量である請求項１４の製造法。
【請求項１８】
工程(1-B)の前に、工程(1-A)で調製した混合原料(a)を、連続滅菌法により140℃以下の条件で滅菌処理する工程を含む請求項１１の製造法。
【請求項１９】
工程(1-B)の前に、工程(1-A)で調製した混合原料(a)を、115℃以下のバッチ滅菌法により滅菌処理する工程を含む請求項１１の製造法。
【請求項２０】
工程(1-B)に用いるアルカリ剤が、水酸化ナトリウムである請求項１１の製造法。
【請求項２１】
工程(1-B)において、混合原料(a)の撹拌を、該混合原料(a)中のタンパク質の平均粒径が5〜40μｍとなる条件で行なう請求項１１の製造法。
【請求項２２】
請求項１１の製造法により得られた発酵乳から乳清を分離する工程(2-A)を含む抗高血圧ペプチド製剤の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ile Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種を高濃度で含むペプチド混合物の製造法、抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法及び抗高血圧ペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシン変換酵素(以下ACEと略す)は、主に肺や血管内皮細胞に存在し、アンジオテンシンIから強力な血圧上昇作用を有するアンジオテンシンIIを産生する一方、ブラジキニン等の降圧ペプチドを分解、不活化するので、結果として血圧を上昇させる作用を示す。したがって、この酵素活性を阻害する物質は、血圧上昇を抑制させる物質として用いうる。
近年、低毒性で安全性の高い降圧物質として、ACE阻害ペプチド(以下ACEIペプチドと略す)が注目され、このような作用を有する天然又は合成のペプチドが多数報告されている。例えば、トリペプチドIle Pro Pro及びVal Pro Pro（以下、それぞれIPP及びVPPと略す）は、特開平3-120225号公報及び特開平6-40944号公報においてACE阻害活性があることが記載されている。
特開平6-197786号公報の段落0011には、配列IPP及びVPPを含む配列を有するタンパク質を含む培地にて乳酸菌を培養するACEIペプチドの製造法を開示している。ここでは、乳酸菌の培養の際の培地として、各種の食品素材を用いることが記載されている。これらの中でも、タンパク質約35重量％及び乳糖約43〜50重量％を含む脱脂粉乳の水溶液が、乳酸菌の培養に最適なものとして、これまで一般的に用いられている。
また、ジペプチドTyr-Pro(以下、YPと略す)についても降圧作用が知られており、特開平10-95736号公報の段落0016には、各種食品素材に由来する培地に、その他の乳酸菌用培地、酵母エキス、ビタミン類、ミネラル類を添加した培地を用いることが記載されているが糖については言及されていない。
上述した従来の乳酸菌の培養によるACEIペプチドをはじめとする抗高血圧ペプチドの製造は、時間がかかり、また原料であるタンパク質の利用効率が低いという欠点がある。したがって、抗高血圧ペプチドをより高効率で生産できる製造法、更には抗血圧作用をはじめ、他の有用な生理活性等が期待できるIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物の製造法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、抗血圧作用をはじめ、他の有用な生理活性等が期待できるIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物を高効率で生産できる製造法を提供することにある。
本発明の別の課題は、抗高血圧ペプチドを含む発酵乳及び抗高血圧ペプチド製剤を高効率で生産できる製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するために種々検討したところ、これまで乳酸菌の培養において最適と考えられていた脱脂粉乳の水溶液に代え、特定の培地を採用し、この培地と、特定の条件下での発酵操作とを組み合わせることにより、抗高血圧ペプチドやIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物の産生量を大きく向上させることができることを見出し、本発明を完成した。
即ち本発明によれば、(i-1)Ile Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種のアミノ酸配列を有するタンパク質、(ii)乳酸菌資化性糖、及び(iii)乳酸菌を含む混合原料(a)を調製する工程(1-A)と、混合原料(a)を撹拌しながら、且つアルカリ剤を用いてpH調整しながら乳酸発酵させ、Ile Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種を含むペプチド混合物を生成させる工程(1-B)とを含み、前記工程(1-A)において混合原料(a)中の、(i-1)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53倍以上であり、且つ前記工程(1-B)におけるpH調整を4.8〜5.8に制御しながら実施するIle Pro Pro及びVal Pro Proの少なくとも１種を高濃度で含むペプチド混合物の製造法が提供される。
また本発明によれば、(i-2)抗高血圧ペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質、(ii)乳酸菌資化性糖、及び(iii)乳酸菌を含む混合原料(a)を調製する工程(1-A)と、混合原料(a)を撹拌しながら、且つアルカリ剤を用いてpH調整しながら乳酸発酵させ、抗高血圧ペプチドを生成させる工程(1-B)とを含み、前記工程(1-A)において混合原料(a)中の、(i-2)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合が、重量比で1.53倍以上であり、且つ前記工程(1-B)におけるpH調整を4.8〜5.8に制御しながら実施する抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法が提供される。
更に本発明によれば、前記抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法により得られた発酵乳から乳清を分離する工程(2-A)を含む抗高血圧ペプチド製剤の製造法が提供される。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物の製造法、抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法及び抗高血圧ペプチド製剤の製造法は、乳酸菌資化性糖を高濃度で含む培地と、特にｐHを特定範囲に制御しながら行なう発酵操作とを組合わせた工程を採用するため、各種生理活性等に有用なIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物や抗高血圧ペプチドを含む発酵乳及び製剤を高効率で生産でき、医薬及び特定保健用食品等の機能性食品の分野において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】実施例９で行った超高温加熱滅菌法による加熱滅菌処理時間を30秒間とした際の各加熱温度におけるIPP及びVPPペプチド濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図２】実施例９で行ったバッチ滅菌法による加熱滅菌処理時間を10分間とした際の各加熱温度におけるIPP及びVPPペプチド濃度を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明のIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物及び発酵乳の製造法は、特定の混合原料(a)を調製する工程(1-A)を含む。
混合原料(a)は、(i-1)IPP及び／又はVPPのアミノ酸配列を有するタンパク質や、(i-2)ACEIペプチド等の抗高血圧ペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。これらタンパク質(以下、(i)タンパク質という)としては、抗高血圧ペプチドのアミノ酸配列として、配列IPP、VPP、YP又はこれらの組合わせを含むタンパク質が挙げられる。具体的には、乳タンパク質、コーンタンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質等の各種の動物性及び植物性タンパク質が挙げられる。
混合原料(a)は、特定割合の(ii)乳酸菌資化性糖を含む。前記(ii)乳酸菌資化性糖としては、乳糖、グルコース、ガラクトース、又はこれらの混合物を挙げることができる。【０００８】
前記混合原料(a)中の、(i)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合は、重量比で1.53倍以上である。(ii)乳酸菌資化性糖をこの割合で含有し、且つ後述する操作と組み合わせて発酵を行なうことにより、高効率の抗高血圧ペプチドが製造できる。また、混合原料(a)中の無脂乳固形分含量は3〜15重量％が好ましい。
特に、前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量を9〜15重量％とした場合、(i)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合を重量比で1.53〜3.9倍量とすることが、発酵に供した無脂乳固形分に対する抗高血圧ペプチドやIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物の生成量が高く好ましい。また、前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量を、6重量％を超え9重量％未満とした場合、(i)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合を重量比で1.53〜4.62倍量とすることが、発酵に供した無脂乳固形分に対する抗高血圧ペプチドやIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物の生成効率が高くなるので好ましい。更に前記混合原料(a)中の無脂乳固形分含量を3〜6重量％とした場合、(i)タンパク質に対する(ii)乳酸菌資化性糖の含有割合を重量比で1.53〜9.30倍、特に1.90〜9.30倍とすることが、発酵に供した無脂乳固形分に対する抗高血圧ペプチドやIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物の生成量は高くないが、混合原料全量当りの抗高血圧ペプチドやIPP及び／又はVPPの生成量が高くなるので好ましい場合がある。【０００９】
このような混合原料(a)は、脱脂粉乳、全粉乳、還元乳、牛乳、コンデンスミルク又はこれらの混合物等の乳材料に(ii)乳酸菌資化性糖を添加するか、又は水等の溶媒に当該乳材料及び(ii)乳酸菌資化性糖を添加することにより得ることができる。【００１０】
本発明の製造法では、前記混合原料(a)を、後述する乳酸発酵させる工程(1-B)に先立ち、殺菌処理あるいは滅菌処理等の加熱工程を行うことが好ましい。例えば、乳酸菌をおおよそｐH5.0〜5.5以下に制御して中和培養する場合、乳酸菌の増殖が優位となり、汚染微生物の増殖が抑制される。しかし、このような場合であっても、混合原料(a)を通常の発酵食品で採用されるような条件で加熱処理して殺菌処理することが好ましい。該殺菌処理は、熱履歴による影響が小さいため混合原料(a)の品質低下が少なく、乳酸菌による発酵が進み、効率よく所望の抗高血圧ペプチド又は該ペプチドを含む発酵乳を得ることができる。
一方、得られる発酵乳等に高い衛生上の品質が求められる場合、即ち、汚染微生物の増殖を厳密にかつ完全に管理することが求められる場合には、前記混合原料(a)を工程(1-B)に先立ち、滅菌処理することが望ましい。【００１１】
前記滅菌処理の方法としては、例えば、バッチ滅菌法又は連続滅菌法が挙げられる。バッチ滅菌法は、圧力容器中に混合原料の全てを封入し、高圧高温条件において加熱処理する方法である。滅菌条件としては、例えば、温度を115℃以下、通常100〜115℃程度に設定することが好ましく、滅菌時間は20分間以下、好ましくは10分間以下、更に好ましくは5〜10分間程度に設定することが望ましい。この場合、目的とする滅菌温度への到達時間が長い場合や、滅菌処理終了から標的温度まで冷却するのに要する時間が長い場合には、培地中の熱履歴管理が困難となり、成分変化が進み易くなる。その結果、乳酸菌による発酵が進み難くなり、培養液中への所望のペプチドの蓄積量が少なくなる恐れがある。【００１２】
一方、連続滅菌法としては、間接加熱方式と直接加熱方式が挙げられ、特に、超高温加熱滅菌器(UHT)を使用することが有益である。間接加熱方式の場合、プレートヒーター・タイプとチューブタイプを使用することができる。また、直接加熱方式の場合、スチームインジェクション・タイプとスチームインフュージョン・タイプを使用することができる。また、超高温加熱滅菌器(UHT)を用いる場合、加熱処理後にプレート熱交換器で急速に冷却することができ、熱履歴の管理制御を容易に行うことができる。
連続滅菌法により混合原料(a)を滅菌することは、続く乳酸発酵を行うにあたり、混合原料(a)の品質が維持されるため、乳酸菌による発酵が進み易く、バッチ滅菌法に比べより高い効率で抗高血圧ペプチドを培養液中に蓄積させることが可能になる。連続滅菌法による滅菌条件としては、例えば、温度は140℃以下、通常115〜140℃程度に制御することが好ましく、滅菌時間は60秒間以下、特に2〜30秒間程度に制御することが好ましい。【００１３】
本発明の製造法では、前記混合原料(a)を、撹拌をしながら、且つアルカリ剤を用いてpHを4.8〜5.8に調整しながら乳酸発酵させる工程(1-B)を含む。
前記撹拌は、通常の静置培養とは異なり、連続的又は間欠的に撹拌して発酵させることにより行なうことができ、その条件は例えば、タンパク質粒子と、抗高血圧ペプチドを含む乳清とを生成させるような条件、例えば、得られるタンパク質粒子の粒径が5〜40μｍとなるように、撹拌装置に応じて撹拌条件を設定することが好ましい。この際、空気の巻込みがなるべく生じない撹拌の仕方が特に好ましい。【００１４】
撹拌の形式は、撹拌翼形式によるものとエアリフト形式によるものが使用できる。しかし、エアリフト形式の場合、せん断力の発生が低いためタンパク質粒子のせん断は起こりにくく粒子が微細化しにくい。また、気泡発生が著しく、発酵制御が困難となる場合がある。従って、撹拌翼を用いることが望ましい。撹拌翼の形式は、パドル型、プロペラ型、ヘリカルリボン型、タービン型等、様々なものがある。培養液全体を培養期間中に継続的に十分に混合できるものであれば、いずれの形式でも使用可能である。特に、タービン型、パドル型の場合、タンパク質粒子に対するせん断力が大きいため、粒径の低いタンパク質粒子を形成し易い。細片効率を高めるために、撹拌翼の形状の選択に合わせて、発酵層内に邪魔板を設置することもできる。また、せん断力は、タンクの大きさ、回転速度にも影響をうけるのでこれらも考慮して条件を設定することが好ましい。
通常、撹拌速度が速過ぎるとタンパク質粒子の粒径は小さくなり過ぎて5μｍ未満になる。撹拌速度が遅過ぎるとタンパク質粒子の粒径は大きくなり過ぎて40μｍより大きくなる。【００１５】
前記アルカリ剤を用いたｐHの調整は、培地中のｐHをモニターし、ｐHが所定値より低下した際にアルカリ剤を適量添加しうる装置等を設けることにより行なうことができる。前記アルカリ剤としては、特に限定されないが、水酸化ナトリウム水溶液等を好ましく用いることができる。【００１６】
本発明の製造法では、抗高血圧ペプチドを含む発酵乳又はIPP及び／又はVPPを高濃度で含むペプチド混合物を製造することができる。当該抗高血圧ペプチドとしては、トリペプチドIPP、トリペプチドVPP、ジペプチドYP及びこれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含むことができる。当該抗高血圧ペプチドや、IPP及び／又はVPPの含有割合は、発酵乳全量中10〜30mg／100mlとすることができる。特に、高濃度にする場合は、無脂乳固形分を9〜15重量％とすることで20〜30mg／100mlにでき、効率的に得る場合には無脂乳固形分を3〜6重量％とすることで10〜20mg／100mlにすることができる。【００１７】
本発明の抗高血圧ペプチド製剤の製造法は、前記製造法により得られた発酵乳から乳清を分離する工程(2-A)を含む。
分離工程(2-A)は、遠心分離及び圧搾ろ過の少なくとも一方の操作により行なうことができる。前記遠心分離は、遠心分離機を用いて、例えば回転数2000〜10000rpm程度で行なうことができる。一方前記圧搾ろ過は、圧搾ろ過機を用いて、2〜8kg／cm2の加圧条件で行なうことができる。
分離工程(2-A)により分離された乳清はそのまま本発明の抗高血圧ペプチド製剤とすることもできるが、必要に応じて更に製剤化処理をすることによって製剤とすることもできる。具体的には例えば、濃縮、乾燥、脱塩処理、添加物の添加、打錠等の工程を行なうことにより製剤化することができる。当該製剤化により得られる製剤の形態は特に限定されないが、注射剤、又は経口投与のための錠剤、顆粒、粉末、溶液、懸濁液等の形態とすることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例及び比較例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
尚、例中の無脂乳固形分(SNF)の内訳は、SNF 1重量％のものが乳糖0.57重量％、タンパク質0.43重量％、SNF 2重量％のものが乳糖1.13重量％、タンパク質0.87重量％、SNF 3重量％のものが乳糖1.7重量％、タンパク質1.3重量％、SNF 6重量％のものが乳糖3.4重量％、タンパク質2.6重量％、SNF 9重量％のものが乳糖5.1重量％、タンパク質3.9重量％、SNF 12重量％のものが乳糖6.8重量％、タンパク質5.2重量％、SNF 15重量％のものが乳糖8.5重量％、タンパク質6.5重量％である。【００１９】
実施例１
(スターターの調製)
脱脂粉乳9kgを水91kgに溶解し、全量を100kgとした。これを115℃で20分間殺菌した後、37℃まで冷却した。これに、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM-４株(独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6)寄託番号 BP-6060、寄託日1997年8月15日)を、菌数2.0×107cells／mlとなるよう接種し、37℃で24時間培養し、スターター(乳酸菌数5×108個／ml)を調製した。
（培地の調整）
イオン交換水に脱脂粉乳をSNFの終濃度が9重量％となるように添加した。更に、脱脂粉乳中の乳糖と合わせた含有割合が10重量％となるように乳糖を添加し全量を1000kgとした。これを95℃達温殺菌した後、37℃まで冷却した。従って、得られた培地中のタンパク質に対する乳糖の含有割合は、重量比で約2.56倍である。【００２０】
（中和培養による発酵）
中和培養装置において、前記スターターのうち60kgを培地に接種し24時間発酵させた。発酵が進むに従いｐHは低下したが、ｐHが5.0以下に達したところでｐHが5.0に戻るまで20重量％水酸化ナトリウムを徐々に滴下する中和操作を行い、発酵終了までｐHを5.0に維持した。また、発酵期間中、タービン型翼の撹拌装置を用い、表１に示す条件で撹拌した。
得られた発酵物中のACEIペプチド(VPP、IPP)量を、高速液体クロマトグラフィー(HITACHI社製)により測定した。また、発酵物中のタンパク質の粒径を、粒度分布測定装置(HORIBA社製)により分析した。乳清回収率は、連続遠心分離機(日立製作所(株)製、20PR52)を用いて、3000rpm、10分間の条件で、カード画分を遠心分離により除去し、乳清画分を回収し、この割合を測定した。結果を表１に示す。
表１より中和操作と強い撹拌操作を実施することにより、タンパク質粒子の粒径は小さくなり、ACEIペプチド生成量及び乳清回収率は、中和操作なしに比べ大きくなることがわかった。【００２１】
【表１】
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【００２２】
実施例２
(培地の調製)
イオン交換水に、脱脂粉乳をSNFの終濃度が表２に示す濃度(重量％)となるように添加した。更に、乳糖を添加し、脱脂粉乳中の乳糖と合わせた乳糖含有割合が10重量％となるようにし、それぞれ全量を1000ｋｇとした。これらを95℃達温殺菌した後、37℃まで冷却し培地を調製した。従って、得られた培地中のタンパク質に対する乳糖の含有割合は、SNF 1重量％のものが約33.3倍、SNF 2重量％のものが約11.49倍、SNF 3重量％のものが約7.69倍、SNF 6重量％のものが約3.85倍、SNF 9重量％のものが約2.56倍、SNF 12重量％のものが約1.92倍、SNF 15重量％のものが約1.54倍である。
(中和培養による発酵)
中和培養装置において、実施例１で調製したスターターのうちの60kgをそれぞれの培地に接種し、24時間発酵させた。発酵が進むに従いｐＨは低下したが、ｐＨが5.0以下に達したところでｐＨが5.0に戻るまで20重量％水酸化ナトリウムを徐々に滴下する中和操作を行ない、発酵終了までｐＨを5.0に維持した。また、発酵期間中、タービン型翼の撹拌装置を用い、中和培養後の発酵培地中のタンパク質粒子の粒径が8〜40μｍになるように150rpmで撹拌し続けた。得られた発酵物中のACEIペプチド(VPP、IPP)量を、高速液体クロマトグラフィーにより測定した。結果を表２に示す。また乳清回収率を表３に示す。【００２３】
比較例１
撹拌及び中和操作を行なわず、更に乳糖を添加しなかった他は実施例２と同様に操作し、発酵を行ない、ACEIペプチド(VPP、IPP)量及び乳清回収率を実施例２と同様に測定した。結果をそれぞれ表２及び表３に示す。得られた発酵物中では、硬いカードが形成され粒径は40μｍを超える大きな値となった。
尚、比較例１で使用した培地中のタンパク質に対する乳糖の含有割合は、乳糖の添加を行なっていないので、SNF 1重量％のものが約1.30倍、SNF 2重量％のものが約1.30倍、SNF 3重量％のものが約1.30倍、SNF 6重量％のものが約1.30倍、SNF 9重量％のものが約1.30倍、SNF 12重量％のものが約1.30倍、SNF 15重量％のものが約1.30倍である。【００２４】
比較例２
撹拌及び中和操作を行なわなかった他は実施例２と同様に操作し、発酵を行ない、ACEIペプチド(VPP、IPP)量及び乳清回収率を実施例２と同様に測定した。結果をそれぞれ表２及び表３に示す。得られた発酵物中では、硬いカードが形成され粒径は40μｍを超える大きな値となった。
尚、比較例２で使用した培地中のタンパク質に対する乳糖の含有割合は、実施例２の場合と同様である。【００２５】
比較例３
中和操作を行なわず、乳糖を添加しなかった他は実施例２と同様に操作し、発酵を行ない、ACEIペプチド(VPP、IPP)量及び乳清回収率を実施例２と同様に測定した。結果をそれぞれ表２及び表３に示す。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され粒径は40μｍ以下の小さい値となった。
尚、比較例３で使用した培地中のタンパク質に対する乳糖の含有割合は、比較例１の場合と同様である。【００２６】
比較例４
乳糖を添加しなかった他は実施例２と同様に操作し、発酵を行ない、ACEIペプチド(VPP、IPP)量及び乳清回収率を実施例２と同様に測定した。結果をそれぞれ表２及び表３に示す。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され粒径は40μｍ以下の小さい値となった。
尚、比較例４で使用した培地中のタンパク質に対する乳糖の含有割合は、比較例１の場合と同様である。【００２７】
【表２】
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【００２８】
【表３】
0004723501.tif 000004
【００２９】
実施例３
中和操作において維持するｐHを5.5とした他は実施例２のSNF 9重量％の場合と同様に操作し、発酵物を得、ACEIペプチド(VPP、IPP)量及び乳清回収率を測定した。結果を表４に示す。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され粒径は40μｍ以下の小さい値となった。【００３０】
比較例５〜７
中和操作において維持するｐHを4.0(比較例５)、4.5(比較例６)又は6.0(比較例７)とした他は、実施例２と同様に操作し、発酵物を得、ACEIペプチド(VPP、IPP)量及び乳清回収率を測定した。結果を表４に示す。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され粒径は40μｍ以下の小さい値となった。【００３１】
【表４】
0004723501.tif 000005
【００３２】
実施例４、比較例８及び９
中和操作において維持するｐＨを4.0(比較例８)、5.0(実施例４)又は6.0(比較例９)とし、発酵時間を48時間とした他は、実施例２のSNF 9重量％の場合と同様に操作し、中和培養による発酵を行なった。発酵期間中のACEIペプチド(VPP、IPP)量を測定した。結果を表５に示す。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され粒径は40μｍ以下の小さい値となった。【００３３】
【表５】
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【００３４】
実施例５
培地中の乳糖含有割合、並びにタンパク質に対する乳糖の含有割合(重量比の倍率)をそれぞれ表６に示すとおりとした他は、実施例２と同様に操作し、発酵物を得、ACEIペプチド(VPP、IPP)量を経時的に測定した。結果を表７に示す。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され粒径は40μｍ以下の小さい値となった。乳清回収率は70％以上で良好であった。
【００３５】
【表６】
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【００３６】
【表７】
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【００３７】
実施例６
イオン交換水に脱脂粉乳9重量％(内訳：乳糖5.1重量％、乳蛋白3.9重量％)及び乳糖4重量％となるように添加し、培地を調製した。この培地に実施例１と同一の手順で調製したスターターを3重量％となるよう添加し、全量を2.3リットルとした。この混合物を37℃で24時間発酵させた。発酵が進むに従いｐＨは低下したが、20重量％水酸化ナトリウムを5ml／分で滴下する中和操作を行い、発酵終了までｐＨを5.0±0.05に維持した。また、発酵期間中、タービン型撹拌翼を有する撹拌装置により培地を150rpmで撹拌し続けた。得られた発酵物中のジペプチドYPの量を、LC／MSにより測定したところ、7.7mg／100mlであった。得られた発酵物中では、タンパク質が細片され、その粒径は40μm以下の小さな値であった。また乳清回収率は75％で良好であった。【００３８】
比較例１０
培地中に乳糖を添加せず、中和及び撹拌を行わなかった他は、実施例６と同様に操作し、発酵物を得、ジペプチドYP量を測定したところ、1.2mg／100mlであった。得られた発酵物中では、硬いカードが形成され粒径は40μmを超える大きな値となった。また乳清回収率は30％で不良であった。
【００３９】
実施例７
イオン交換水に脱脂粉乳9重量％(内訳：乳糖5.1重量％、乳蛋白3.9重量％)と表８に示す量(重量％)の乳糖、グルコース、ガラクトース、スクロース又はマルトースを添加し、培地を調製した。この培地に実施例１と同一の手順で調製したスターターを3重量％となるよう添加した。この混合物を37℃で24時間発酵させた。発酵が進むに従いｐＨは低下したが、20重量％水酸化ナトリウムを5ml／分で滴下する中和操作を行い、発酵終了までｐＨを5.0±0.05に維持した。また、発酵期間中、タービン型撹拌翼を有する撹拌装置により培地を150rpmで撹拌し続けた。得られた発酵物中のACEIペプチド(VPP、IPP)量を、高速液体クロマトグラフィーにより測定した。結果を表８に示す。得られた発酵物中では、タンパク質の粒径は40μm以下の小さな値となった。また乳清回収率は70％以上で良好であった。
【００４０】
【表８】
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【００４１】
実施例８
実施例１と同一の操作により、中和培養発酵乳100kgを得た。連続遠心分離機(株式会社コクサン製、商品名H-923)を用い、回転数13000rpm、送液速度150ml／分で不溶性タンパク質を分離し、清澄液の水分を減圧濃縮機を用いて除去し30kgまで濃縮した。
この濃縮液30kgに含まれる乳酸ナトリウム塩を、電気透析装置(徳山曹達株式会社製、商品名TS-2-10)を用いて除去した。この脱塩処理済濃縮液10kgをスプレードライヤー(大河原化工機株式会社製、商品名FGA-8)を用いて粉末化した。得られた粉末中のACEIペプチド(VPP、IPP)量を高速液体クロマトグラフィーにより測定したところ、3.6mg／gであった。この粉末2kgに結晶ソルビトール(メルク社)1.0kgとシュガーエステル(第一工業製薬株式会社製、商品名「DKエステル F-20W」)0.08kgを加え、混合した。この混合物を打錠機(畑鉄工所株式会社製、商品名HT-P18)を用いて打錠し、錠菓(総重量2g／錠)を製造した。得られた錠菓１錠中のACEIペプチド(VPP、IPP)量を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ4.7mgであった。【００４２】
実施例９
イオン交換水に脱脂粉乳3％、乳糖10.6％となるように添加し、1000kgとした。これらを、プレートヒーター・タイプの超高温加熱滅菌法(UHT)により滅菌処理した。滅菌処理温度は115、120、130、140℃とし、滅菌処理時間はそれぞれ30秒間とした。加熱滅菌処理後、プレートヒーター・タイプの熱交換器を用いて速やかに37℃まで冷却した。一方、上記原料をバッチ滅菌法により、105、110、115、120℃で10分間滅菌処理した。
これらにスターター3％を添加し、中和培養を開始した。中和培養による発酵の方法及び発酵物中のIPP及びVPPペプチド濃度測定は、実施例２に従った。UHT滅菌処理時間を30秒間とした結果を図１に、バッチ滅菌法による滅菌時間を10分間とした結果を図２に示す。尚、グラフの○はVPPペプチド濃度を、△はIPPペプチド濃度を表わす。
図１及び図２の結果から、UHTでは115〜140℃、バッチ滅菌法では105〜115℃でIPP及びVPPペプチド濃度が高いことが判った。
【図１】
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【図２】
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