(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシ亜硝酸塩によって誘起される酸化反応またはニトロ化反応が引起す損傷効果を減少させるための局所用または経口用の配合剤の製造における化合物の使用であって、該化合物が、一般式ＡまたはＢである、化合物の使用。
【化１】
0004723705.tif 000012
[式中、Ｒ１およびＲ２が同一であるかまたは異なっており、かつ‐ＯＨ、‐ＣＨ３、‐ＣＦ３ＣＨ２Ｏ‐、およびＣＨ３Ｏ‐から成るグループから独立に選択される]
【請求項２】
一般式ＡまたはＢの化合物が、ゲル、乳濁液、クリーム、ローション、トニック、または懸濁液としうる局所用の配合剤に含まれることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
一般式ＡまたはＢの化合物が、前記配合剤の総重量に対して、０．０５％〜２０％の範囲の濃度で含まれることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
一般式ＡまたはＢの化合物を、直接または半加工状態で最終配合剤に使用することを特徴とする請求項１から３の中のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
一般式ＡまたはＢの化合物が、リポソームまたはマイクロカプセルに封入され使用されることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸化反応、および遊離基によって誘起される酸化反応を化学的に減少させるための、経口または局所配合剤における、酸化防止剤の使用方法特にクロマンおよび／またはクロメンの使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酸化反応、または遊離基によって誘起される酸化反応の重要性は広く知られている。いろいろな産業、たとえば化粧品産業および食品産業ならびに製薬産業において、前記酸化反応が引起す損傷効果を小さくするために、前記酸化反応が継続的に研究されている。
【０００３】
化粧品の観点からは、皮膚は常に空気に接触しており、不断に紫外線にさらされており、また不可避的に環境要因にさらされているので、皮膚科学問題または早期老化をもたらしうる漸進的変質を被っている。
【０００４】
食品および製薬産業においては、目的は使用原料の安定化以外のところにある。主目的は、生物体の酸化過程を減少させることであり、たとえば、生物膜の脂質成分の過酸化によって引起される生物膜の不安定化過程を減少させること、あるいはまた、大食球および好中球によって生体内で生成されるペルオキシ亜硝酸塩によって誘起されるすべての過程を減少させることである。実際、ペルオキシ亜硝酸塩は多数の有生分子たとえばＤＮＡの窒素化塩基および蛋白質のアミノ酸残基と反応する。さらに、ペルオキシ亜硝酸塩は細胞膜の脂質過酸化をもたらし、そのためにアテローム硬化、大脳虚血、肺水腫、脳出血、アルツハイマー症、および腫瘍形成に関係している。
【０００５】
本件の発明人は、米国特許第５，６０５，７０３号明細書において、一般式ＡおよびＢ（図１参照）を有する一連の２，２‐ジメチルクロマンおよびクロメンが示す、抗腫瘍薬ドキソルビシンがもたらす脂質過酸化反応の防止剤としての可能性を明らかにした。同様に、前記薬を含むリポソームにクロマン６を添加することにより、クロマン６を含まないリポソームに封入したドキソルビシンの生体内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）および局所（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）使用に比して、毒性の著しい低下がもたらされる。
【０００６】
最近の研究によれば、意外にも、この一連の２，２‐ジメチルクロマンおよびクロメンはペルオキシ亜硝酸塩によって引起されるニトロ化反応の防止剤としての大きな可能性を示した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の技術の概観から、本発明の一般的目的は、酸化反応、または遊離基によって誘起されるそれを化学的に減少させ、またこの反応によって引起される損傷効果を小さくするために、一連の２，２‐ジメチルクロマンおよびクロメンを含む経口および局所配合剤を得ることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段１】
したがって、本発明は、ゲル、乳濁液、クリーム、ローション、トニック、または懸濁液の形の配合剤であって、有効量の一般式ＡまたはＢの化合物から成り、局所塗布または経口投与しうる配合剤を提供する。
【化２】
0004723705.tif 000002
【０００９】
前記式において、Ｒ１およびＲ２は同一であるかまたは異なっており、かつ‐ＯＨ、‐ＣＨ3、‐ＣＦ3ＣＨ2Ｏ‐、およびＣＨ3Ｏ‐、ならびに化粧、食物、または薬剤的に許容されるビヒクルから成るグループから独立に選択される。
【００１０】
本発明による配合剤は、食物、食養生、栄養補給、および／または薬剤の目的に使用できる。
【００１１】
好ましくは、本発明の配合物は、該配合物の総重量に対して、０．０５〜２０％の式ＡまたはＢの前記化合物を含む。
【００１２】
式ＡまたはＢの活性化合物は、最終配合剤に、直接に、または半加工状態たとえばリポソームまたはマイクロカプセルに封入した状態で、使用することができる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題２】
したがって、本発明のさらなる目的は、前記化合物を経口および局所配合剤に効率的に取り込む方法を確立することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段２】
以下、添付の図面により、本発明を説明する。
【００１５】
本発明の開発の第一段階として、酸化反応、または遊離基によって引起される酸化反応を化学的に減少させ、かつこの反応によって生じる損傷効果を小さくする目的のために、２，２‐ジメチルクロマンおよびクロメンの可能性を確認する研究を実施した。
【００１６】
本発明で述べる第一の研究（例１）において、紫外線によって誘起される脂質過酸化の防止におけるこれらの化合物の能力を、簡単ではあるが確実な生体外法で調べた。ホスファチジルコリンリポソームの溶液を、過酸化の標的として使用した。２層（ｂｉ‐ｌａｙｅｒｓ）のリン酸脂質から成る生物膜に似ているからである。ＵＶＣ線は、生物に悪影響を及ぼさないが、ＵＶＥ線に似た効果を、ずっと短い時間で生じるので、生体外研究においては、後者を常用した。紫外線への暴露中、アリコートを採取し、チオバルビツル酸と反応する物質の量の増大を分光光度計によって５３２ｎｍで測定して、誘起される脂質過酸化が測定できるようにした。
【００１７】
本発明の確認のために実施した、第二の研究を例２に述べる。これは、ペルオキシ亜硝酸塩によって誘起されるニトロ化反応に関するものである。ペルオキシ亜硝酸塩は、血管拡張剤、神経伝達物質、および免疫調節剤として作用する生物学的に非常に重要な分子であるＮＯ・ラジカルと、超酸化物ラジカル陰イオンＯ２・ ‐と、生体内で、拡散によって支配される反応により、次の式に示すように生成される。
【化３】
0004723705.tif 000003
【００１８】
ペルオキシ亜硝酸塩とペルオキシ亜硝酸とは、強塩基媒質中では割合に安定な種であるペルオキシ亜硝酸塩が優勢であるが、生物学的ｐＨでは平衡がペルオキシ亜硝酸側にずれる、という形で平衡する（ｐＫａ＝６．８）のが見られた。この酸は反応性が大きく、二つのタイプの非常に速い過程に従うことができる。すなわち、硝酸への異性化（この硝酸は硝酸塩とプロトンに完全に解離している）、および生体マトリックスに重大な損傷を引起しうる大きな酸化能力とニトロ化能力とを有するラジカルタイプの種の生成である。チロシンとペルオキシ亜硝酸塩との反応を有効に防止するならば、ペルオキシ亜硝酸塩の作用の遮断薬として働く可能性があるということを意味する。ｐＨ７．４で実施したこの反応では、主生成物として、３‐ニトロチロシンが生成された。細胞および生物体液内での３‐ニトロチロシンの検出は、最近、生体内でのペルオキシ亜硝酸塩生成に関するバイオマーカーとして使用されている（ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，４１１，１５７−１６０）。
【００１９】
本発明の一般的目的に合わせて、２，２‐ジメチルクロマンおよびクロメンのの無害性を示すために、皮膚の炎症と重大な経口毒性とに関する評価を、例３と４で実施した。
【００２０】
最後に、例５〜８で、局所塗布および経口投与の目的のための、溶解性に関する研究と、２，２‐ジメチルクロマンおよびクロメンをいろいろな最終調合剤に取り込むいろいろな方法とについて述べる。
【００２１】
下記の例は、本発明のそれぞれの側面を確認するためのものであり、どのような理由でも、本発明の範囲を限定するものであると解釈してはならない。
【００２２】
例１
膜モデルとしてリポソームを使用する脂質過酸化の評価
Ｐｅｌｌｅほかが提案したモデル（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮｅｗＹｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，５７０，４９１−４９４）に小さな修正を加えたモデルにしたがって、２７ｍｇの大豆レシチンを秤量し、１．５ｍｌのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４（ＰＢＳ）を加えた。脂質過酸化の防止剤としての作用を調べる化合物を加えて、存在するレシチンをいろいろなモル百分率とするのに必要な量のエタノールに溶解させた。すべての場合に、一分間の機械的攪拌により、多層リポソームが得られた。
【００２３】
次に、酸化防止剤を含む前記リポソームと酸化防止剤を含まないリポソームとを、ＵＶＣ線（２５４ｎｍ）に暴露した。酸化防止剤を含まず、紫外線に暴露していないサンプルを、対照として用意した。ＵＶＣ線は、ＵＶＢ線と類似の効果があるが、ずっと短い時間しかかからないので、使用した。たとえば、ＵＶＣ線への１時間の暴露はＵＶＢ線への７時間の暴露と同様の効果がある。
【００２４】
暴露中、いろいろな時刻にアリコートを採取し、脂質過酸化を調べた。
【００２５】
ＴＢＡＲＳ試験。脂質過酸化を、チオバルビツル酸（ＴＢＡＲＳ）と反応する物質の生成量の増大を分光光度計で測定することにより、調べた。簡単に、０．２ｍｌのリポソーム懸濁液、３ｍｌの２０％トリクロロ酢酸、および１ｍｌの１％チオバルビツル酸を、１００℃で２５分間温置してから、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、５３２ｎｍで吸収を測定した。
【００２６】
図２に示すように、ＵＶＣ暴露リポソームは、ＵＶＣ暴露していない対応する対照に比して、大きな脂質過酸化物生成を示す。このモデルを使用して、クロマン６によって与えられる、脂質過酸化に対する防護力を、親液性酸化防止剤として知られているαトコフェロールおよびγトコフェロールの場合と比較した。その結果、ここで評価した濃度の場合、クロマン６は、αトコフェロールの少なくとも１０倍、またγトコフェロールと同程度の防止能力を有するということがわかった。
【００２７】
例２
３‐ニトロチロシン生成の防止に対するクロマン６の有効性
チロシン（１ｍＭ）とペルオキシ亜硝酸塩（１ｍＭ）との反応性を、図３に示すように、いろいろな濃度のクロマン６の存在下で決定した。
【００２８】
もっと詳しく言うと、０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）：メタノール＝３：１  ｖ／ｖの混合物２ｍｌとともに、３７℃で温置し、激しくゆすった。１ｍＭのチロシンと漸増するいくつかの濃度のクロマン６とを含む各溶液にペルオキシ亜硝酸塩の溶液を加え、この塩の最終濃度が１ｍＭとなるようにした。１０分後、１ｍｌの４‐クロロフェニルアラニンの溶液（２ｍＭ）を内標準として加え、ヘキサンによる抽出を実施した。抽出によって得られた水性相を高速液体クロマトグラフィーによって分析し、反応で消費されたチロシンの量を決定した。
【００２９】
例３
皮膚の炎症の評価
背部塗布による１次炎症指数（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）の決定を、“Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆｆｉｃｉｅｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｐｕｂｌｉｑｕｅ  Ｆｒａｎ〓ａｉｓｅ”（１９８２年２月２１日号）に記載されている方法によって、実施した。
【００３０】
もっと詳しく言うと、この評価を、体重１９００〜２０００ｇの３匹のニュージーランドアルビノウサギのグループに関して実施した。ウサギの背の毛を剃ってから、０．５％のクロマン６を含むクリームを０．５ｍｌ背に塗布した。処置したウサギの観察から得られた結果を、表１に示す。
【００３１】
得られた実験データによれば、ＩＩＣ値は０である。したがって、前記条件下でのクロマン６の使用は非炎症性に分類される。
【００３２】
【表１】
0004723705.tif 000004
【００３３】
例４
経口投与後の重大な毒性の評価
この評価のために、体重約２０ｇの５匹のスイスアルビノハツカネズミを使用し、ポリソルベート８０に溶かした、体重１ｋｇあたり５０００ｍｇの投与量に相当する量のクロマン６を投与した。ネズミは標準的な小屋（ｓｔａｂｌｉｎｇ）内に入れ、投与後１４日間観察することにより、評価を実施した。結果によれば、ウサギの挙動に変化はなく、また処置群における死亡も発生しなかった。したがって、体重１ｋｇあたり５０００ｍｇの投与量のクロマン６の経口投与は、なんら毒性を示さないと結論することができると思われる。
【００３４】
例５
クロマン６の溶解性の評価
本発明の確認のために、いろいろな溶剤を使用して、局所および経口投与のための生成物の製造にあとで使用するための、クロマン６の溶解性の評価を実施した。二つの濃度のクロマン６溶液（２および５％）を、表２に示す溶剤中で６５℃において攪拌することにより、溶解性を評価した。十分な時間が経過して混合物が２５℃になってから、不溶解生成物が存在するかどうかを調べた。
【００３５】
【表２】
0004723705.tif 000005
【００３６】
例６
局所使用のための調合剤におけるクロマン６の使用
ａ）ＵＶＢ線からの保護のためのクリーム（Ｗ／Ｏ型）
１０００ｇのクリームの製造のために、表３に示す百分率となるように原料を秤量した。
【００３７】
【表３】
0004723705.tif 000006
【００３８】
ＡおよびＢの化合物を別々に７０℃で混合した。
【００３９】
二つの均一な溶液を得たあと、タービン攪拌しながら、部分Ｂを部分Ａにゆっくりと加えた。１０分後、混合物を穏やかに攪拌しながら室温まで冷却し、香料を加えた。
【００４０】
ｂ）ＵＶＢ線からの保護のためのサンオイル
１０００ｇのオイルの製造のために、表４に示す百分率となるように、必要な原料を秤量した。
【００４１】
【表４】
0004723705.tif 000007
【００４２】
ユーソレックス６３００をミリスチン酸イソプロピルに溶解させ、クロマン６をオクチルココエートに溶解させた。得られた混合物と香料を、穏やかに攪拌しながらパラフィン油にゆっくりと加えた。
【００４３】
ｃ）ＵＶＢ線からの保護のためのヒドロ‐アルコールゲル
１０００ｇのゲルの製造のために、表５に示す百分率となるように、必要な原料を秤量した。
【００４４】
【表５】
0004723705.tif 000008
【００４５】
ゲルの製造のために、ユーソレックスを、トリエタノールアミンの添加により、水（全部）に溶解させた。次に、アリアンチオンを溶解させ、カルボポールを分散させた。カルボポール（ｃａｒｂｏｍｅｒ）が水和したあと、溶液Ｂを加え、必要な場合には、ｐＨを調節した。
【００４６】
例７
経口使用のための調合剤におけるクロマン６の使用
ａ）抗ラジカル性を有するエネルギードリンク
１０００ｍｌのドリンクの製造のために、表５に示す百分率となるように、必要な原料を秤量した。
【００４７】
【表６】
0004723705.tif 000009
【００４８】
このドリンクの製造のために、クロマン６を大豆油に溶解させた。得られた混合物に、レシチンを溶解させ、得られる混合物を、強い攪拌を加えながら、残りの成分から成る溶液に加え、ｐＨを７．４に調節した。最後に、この懸濁液にマイクロ流体化（ｍｉｃｒｏ‐ｆｌｕｉｄａｔｉｏｎ）処理を加え、小さな粒径を有する均一配合剤を得た。
【００４９】
ｂ）抗ラジカル性を有するミリカプセルの製造
スペイン特許Ｐ９６０２４７０号明細書に従うドリンク製造法のために、まず第一に、ミリカプセルを得た。相対組成を、表７に示す。
【００５０】
【表７】
0004723705.tif 000010
【００５１】
ミリカプセルの製造のために、ナトリウムグルチネートと寒天を溶解させ、この系を９５℃に加熱した。得られた溶液に、大豆油に溶解させたクロマンを加え、防腐剤としてベンゾエートを加え、またグリセリンに分散させた酸化チタン着色剤を加えた。
【００５２】
得られた溶液を、Ｃａ２Ｃｌの０．３％水溶液に、０．５ｍｍのオリフィスを通して一滴ずつ加えた。得られたミリ球を、ろ過によって採取し、Ｃａ２Ｃｌを蒸留水で洗浄した。
【００５３】
抗ラジカル性を有するドリンクを得るために、表８に示す百分率となるように、必要な原料を秤量した。
【００５４】
【表８】
0004723705.tif 000011
【００５５】
適当な容器内で下記の手順を実施した。
【００５６】
１．成分Ａの混合物を、強く攪拌しながら、脱イオン水に分散させた。
【００５７】
２．ステップ１から得られる溶液を、沸騰するまで加熱した。
【００５８】
３．この溶液を、５０℃まで冷却し、いわゆるカラゲーネート溶液を得た。
【００５９】
４．このカラゲーネート溶液を、濃厚ドリンクシロップと混合し、得られる溶液を、２０℃に冷却した。
【００６０】
５．前に得たミリ球を加えて、分散させ、最終的な形のドリンクを得た。
【００６１】
ｃ）クロマン６を含有する凍結乾燥リポソームカプセルの製造
スペイン特許Ｐ９７０００７３号明細書に記載されている方法にしたがって、２００ｍｌのクロロホルム／メタノール（７５：２５）に、１２４４．２ｍｇの水素化卵レシチン、４９９．７ｍｇのコレステロール、および１７５ｍｇのクロマン６から成る混合物を溶解させた。次に、回転蒸発により、有機溶剤を除去し、さらに溶剤の残留痕跡を、混合物にＮ２を通すことにより、または凍結乾燥により、除去した。このようにして得られる脂質膜を、０．９％のＮａＣｌ溶液５０ｍｌを用いて、振動ミキサーで３０秒間攪拌してから同じ時間だけ６０℃の浴内に置くという操作を有効攪拌時間が１０分になるまで繰返すことにより、水和させた。このようにして、リポソーム懸濁液を得た。
【００６２】
得られたリポソーム懸濁液を、凍結または凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末を得、この粉末をハードゼラチンカプセルに入れた（それぞれのゼラチンカプセルに５０ｍｇの凍結乾燥粉末）。得られたカプセルを、胃保護剤（ＥＵＤＲＡＧＩＴ‐Ｌ）ポリマーのイソプロパノール溶液に繰返し浸漬することにより、この胃保護剤で被覆し、そのあと、空気流内で乾燥させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に関係するクロメン（１‐４）およびクロマンの化学式である。
【図２】いろいろな酸化防止剤の存在下でＵＶＣ線に暴露された大豆レシチンのリポソームの脂質過酸化の増大を、暴露時間の関数として示す。
【図３】ペルオキシ亜硝酸塩による３‐ニトロチロシン形成の防止に関するクロマン６の有効性を示す。
【図１】
0004723705.tif 000013
【図２】
0004723705.tif 000014
【図３】
0004723705.tif 000015