(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシメチルキチンまたはキトサンの水溶液と有機溶媒とを混合し、沈殿した繊維を得る工程と、
該繊維を真空中で架橋する工程と、
該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、
該混合物を凍結乾燥する工程とからなることを特徴とする多孔質骨修復材料の製造方法。
【請求項２】
カルボキシメチルキチンまたはキトサンの水溶液と有機溶媒とを混合し、沈殿した繊維を得る工程と、
該繊維を真空中で架橋する工程と、
該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、
該混合物を凍結乾燥する工程とからなる製造方法によって得られる多孔質骨修復材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野における、骨欠損部を修復するための多孔質骨修復材料およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍や壊死等の骨病変に対する骨組織の除去手術、または外傷による骨組織の欠損部位に対する治療方法として、近年、再生医療的手法が用いられるようになった。それまでは、骨の欠損部位に対しては、金属などの生体非吸収性の材料を補填し、単に欠損部の形態を修復するのみで、骨組織そのものの再生は考えられていなかった。再生医療的手法は組織工学のコンセプトに基づき、生体組織を構成する細胞と足場となる材料及び細胞の分化を誘導する因子(シグナル物質など)を組み合わせ、失われた生体組織(今の場合は骨組織)を再生させようとする医療手法である。
【０００３】
足場材料としては、生体に対する為害性が低く、一定期間後には代謝吸収される特性が要求され、有機材料ではコラーゲン、ゼラチン、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の応用が試みられている。また、特に骨組織や歯の再生に限っては、無機材料としてトリカルシウムフォスフェートなどのリン酸カルシウム系材料が応用されている。
【０００４】
カルボキシメチルキチン(以下ＣＭキチンと記す)は、キトサンと同じくカニなどの甲殻類の外骨格を構成するキチン質の誘導体で、適当な架橋処理により足場材料としての特性を有することが確認されている。
【０００５】
例えば、リン酸カルシウム系化合物の粉末を混入したキチン（キチン、キトサン及びそれらの誘導体を含む）溶液を真空熱乾燥などを施し、架橋状態のキチンがリン酸カルシウム系化合物の粒子を担持した複合体を形成し、さらに該複合体の表面を未架橋のキチンによって皮膜し、この生体移植材が生理食塩水などの液体と練和し適度な粘着性を持つようにしたものが知られている（特許文献１参照）。
【０００６】
特許文献１によれば、この手法により、未架橋のキチンよりなる皮膜が水溶性であるので、生理食塩水などの液体と練和し適度な粘度をもち、さらにキチンが架橋してリン酸カルシウム系化合物の粒子を担持する複合体が水に対し不溶性であるので、前記粒子が複合体内にしっかりと担持され骨の欠損部に充填されても移動したり、脱落することがなく、早期に骨が骨欠損部に再生増殖し、大きな治療効果がある生体移植材料を提供することができる、としている。
【０００７】
また、熱架橋したキチン又はその誘導体からなる吸収性生体材料、及び真空熱架橋処理を施すことが主特徴たる吸収性生体材料の製造方法が知られている（特許文献２参照）。
【０００８】
特許文献２によれば、比較的容易に生体内で安全な吸収性材料としての生体材料を提供するとともに、これを用いることによって骨生成を促進する環境を提供することができる、としている。
【０００９】
また、吸収性生体材料におけるトリミングの際の強度および生体内環境下での強度を向上させ、また、生体内での吸収速度を十分遅くさせるために、カルシウムを含み、且つエポキシ化合物により架橋されたキチン誘導体からなる吸収性生体材料が知られている（特許文献３参照）。
【００１０】
また、生体の骨形成を促進させる材料として、キチン・キトサンを有機酸によって溶解してキチン・キトサンゾルとする工程と、該キチン・キトサンゾルに骨形成用クンパク質を混合して該骨形成用タンパク質を含有するキチン・キトサンゾルを作る工程と、前記骨形成用タンパク質を混合した前記キチン・キトサンゾルを、ハイドロキシアパタイト、α-ＴＣＰ、β-ＴＣＰ、ＣａＣＯ3、ＣａＯ、ＺｎＯ、ＣａＳｉＯ3，ＭｇＯなどの粉末と練和して練和物を得る工程とを含む骨形成材料が提示されている（特許文献４参照）。
【特許文献１】特開平６−１０５９０１号公報
【特許文献２】特開平７−１１６２４１号公報
【特許文献３】特開２００２−１１０９０号公報
【特許文献４】特開平１１−３４７１１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
先に述べたように、再生医療的手法は組織工学のコンセプトに基づき、生体組織を構成する細胞と足場となる材料及び細胞の分化を誘導する因子(シグナル物質など)を組み合わせ、失われた生体組織(今の場合は骨組織)を再生させようとする医療手法である。材料のみを生体に埋入する場合、生体内にあらかじめ存在している細胞および因子の材料内部への進入により、その場(in situ)にて組織の再生を期待することになる。このような視点から従来技術を検討すると以下のような問題が考えられる。
【００１２】
まず、特許文献１に記載される生体移植材料は、リン酸カルシウム系化合物顆粒を生体吸収性が遅いキチンまたはその誘導体で被覆しており、骨芽細胞が、リン酸カルシウム系顆粒に接触することを遅らせてしまっている。
【００１３】
次に、特許文献２，３に記載の材料は、溶液の凍結乾燥によって多孔質体を形成するため、得られた成形体の微細構造は、氷の結晶が昇華して残った空洞を溶質(この場合はキチン誘導体)が凝集してできた隔壁が遮る形（いわゆるセルラー構造）をなしている。このような構造の場合、各気孔は完全な連続気孔とはならないため、骨組織を再生する骨芽細胞等の細胞群の材料内部への進入が遅れてしまう。特許文献３記載の材料の場合は、さらに、キチン誘導体をエポキシ化合物で架橋するため、架橋剤の残留も懸念される。
【００１４】
さらに、特許文献４に記載される骨形成促進材料は、生体内または生体外にて練和物を硬化させる方法を採っている。この手法では、硬化物は数ミクロン以下の気孔しか含むことができず、骨組織を再生する細胞を実質的に遮断している。このため、骨組織の再生は、材料の生体への吸収の後にしか生じ得ない。
【００１５】
以上のように、従来の手法はいずれも、リン酸カルシウム系の粒子と骨芽細胞等の骨を再構築する細胞群との接触を遅らせるという欠点をもっていた。
【００１６】
また、キチンとリン酸カルシウム顆粒の複合体形成方法の観点からは、以下の課題が存在している。
【００１７】
前記先行技術は、いずれもキチン溶液にリン酸カルシウム顆粒を混合するという手法を用いている。一般にキチン溶液の密度は、１をわずかに越える程度であり、リン酸カルシウム顆粒の密度は、約３である。このため、成形の途中で密度差による顆粒の沈降が起こり、作製された複合体はリン酸カルシウムの下部の配合比が高いという不均一なものとなってしまう。このような問題点を回避するには、溶液の氷点以下の温度での顆粒の撹拌混合及び成形などの煩雑な手法を採用しなければならない。
【００１８】
このような従来技術の問題点に鑑み本発明は、リン酸カルシウム顆粒分布の偏りを防止することで骨の内部進入が均一となるようにすること、骨修復材内部の気孔を略完全な連通状態とすることで骨の内部進入を盛んにすること、骨修復材内部の気孔内でのリン酸カルシウム顆粒の露出面積を大きくし骨の内部進入を盛んにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記課題を解決するため本発明の多孔質骨修復材は、カルボキシメチルキチンまたはキトサンの水溶液と有機溶媒とを混合し、沈殿した繊維を得る工程と、該繊維を真空中で架橋する工程と、該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、該混合物を凍結乾燥する工程とからなる製造方法によって得られる。
【００２０】
また、本発明の多孔質骨修復材料の製造方法は、カルボキシメチルキチンまたはキトサンの水溶液と有機溶媒とを混合し、沈殿した繊維を得る工程と、該繊維を真空中で架橋する工程と、該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合し
て略均一な混合物を形成する工程と、該混合物を凍結乾燥する工程とからなることを特徴とする。
【００２１】
前記多孔質骨修復材において、キチンまたはその誘導体が再生医療的手法における、足場となる材料であり、リン酸カルシウム顆粒が細胞の分化を誘導する材料である。
【００２２】
本発明において、キチンまたはその誘導体を繊維の集合体とするのは、次のような理由による。
【００２３】
すなわち、繊維の集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持する構成とすることにより、骨修復材作製時に顆粒が沈降して顆粒の分布に偏りが生じてしまうことを防止することができる。また、繊維の集合体はほぼ完全に連続気孔を備えるので骨細胞の内部への侵入を盛んにすることができる。さらに、リン酸カルシウム顆粒が連続気孔内で露出する状態となるので、細胞の分化を盛んに誘導することができる。
【００２４】
キチンまたはその誘導体としては、中性の水に溶解可能なカルボキシメチルキチン(ナトリウム塩)や水溶性キトサンが製造工程上好ましい。その他、ヒドロキシエチルキチン(グリコールキチン)やグリコールキトサン等の水溶性キチン誘導体を用いても良い。
【００２５】
ここで、誘導体とは、天然に存在するキチンに対して化学修飾を行ったものを指す。
【００２６】
リン酸カルシウムとしては、アパタイト、リン酸３カルシウム、オクタカルシウムフォスフェート等、どの様な材料でも可能である。
【００２７】
リン酸カルシウム顆粒の大きさとしては、2000マイクロメートル以下であれば適応可能であり、応用部位の骨種類(皮質骨、海綿骨)や部位の違いによる骨反応性の変動に合わせて、至適な大きさを選択可能である。
【００２８】
キチンまたはその誘導体の繊維を形成する方法としては、水溶性キチン誘導体の場合は、該材料の水溶液をエタノールやアセトン等の水溶性有機溶媒と混合し、素早く撹拌することにより短繊維状の沈殿物を析出させ、この沈殿物を採取、洗浄した後、乾燥させて溶媒を除去することによって繊維を得ることができる。その他、次のような方法で繊維を得ることもできる。すなわち、キチンをアルカリ溶剤を用いて溶液化しこれを細孔（数十ミクロン）のノズルから熱水中に高圧で押し出すことにより凝固させ繊維状とすることができる。
【００２９】
また、前記水溶性キチン誘導体に関しては、繊維が体内で容易に溶出しないように架橋処理を行う。
【００３０】
架橋処理は、2kPa程度の減圧下にて、120℃から180℃の加熱により熱架橋を行うことで、実現する。前述のリン酸カルシウム顆粒と同様、応用部位に合わせて至適な温度を選択することができる。
【００３１】
また、架橋繊維とリン酸カルシウム顆粒の混合にあたっては、架橋繊維の保水量以下の水を加える。ここで、架橋繊維の保水量とは、繊維集合体を多量の水に浸した後に引き上げた時に、繊維集合体が繊維間および繊維内に取り込んで保持している水の量を指す。保水量以上の水を加えると、リン酸カルシウム顆粒との混合を行った際、余剰の水が過度の流動性を持つために顆粒の重力による沈降や凝集が生じ、その分散が不均一となるためである。保水量以下の場合、繊維集合体が保持する水分は流動しにくく、リン酸カルシウム顆粒の凝集や沈降を抑制し、結果として均質な複合体が形成される。
【００３２】
架橋繊維とリン酸カルシウム顆粒の混合比は、1:0から1:10程度まで作製可能である。
【００３３】
この混合体を使用可能な形態とするため、混合体の凍結乾燥を行う。凍結乾燥は、医薬品や、乾燥食品の製造などで一般的に行われている工程であり、凍結乾燥機内部を混合体に含まれる水分の凝固点以下の温度(０℃以下)に保ち、真空ポンプなどを用いて減圧し、水分を昇華蒸発させる事により実現する。凍結乾燥の条件としては、温度、減圧度、乾燥時間など、特に制限はない。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の多孔質骨修復材によれば、繊維の集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持する構成としたことにより、骨修復材作製時に顆粒が沈降して顆粒の分布に偏りが生じてしまうことを防止することができる。したがって、骨細胞の内部への侵入に偏りなく実現することができる。また、繊維の集合体はほぼ完全に連続気孔を備えるので骨細胞の内部への侵入を盛んにすることができる。さらに、リン酸カルシウム顆粒が連続気孔内で露出する状態となるので、細胞の分化を盛んに誘導することができる。
【００３５】
また、本発明の製造方法によれば、キチンまたはその誘導体の繊維を形成する工程と、該繊維を真空中で架橋する工程と、該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、該混合物を凍結乾燥して多孔性材料とする工程とから、前記多孔質骨修復材を製造することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を示すが、本発明の範囲は、以下の例に限定されるものではない。
【００３７】
ＣＭキチン原料を３g精秤し、ガラス製容器に純水(ミリQ水)７２ｇと共に加え、マグネチックスターラーにて撹拌、溶解して、４ｗｔ％のCMキチン水溶液を作製した。ＣＭキチンの溶解を早める目的で、容器をウォーターバスにて３０〜５０℃に加熱し、３〜５時間の撹拌を行い、目視レベルで均質な溶液を得た。
【００３８】
エタノールを１５０ｍｌ入れたビーカーに溶液を流し込みガラス棒にて素早く攪拌した。この操作により、短繊維状のＣＭキチン沈殿物が析出してきた。沈殿物を別容器に移し、さらにエタノール１００ｍｌを使って数回洗浄した。エタノールをできる限り除去した後、該沈殿物を４０℃の乾燥器中に１２時間以上置き、エタノール及び残留水分を蒸発させた。その後、真空熱処理装置にて減圧下(約 ２ｋＰａ以下)、１４０℃にて１２時間処理した。
【００３９】
上述のＣＭキチン及びβ-ＴＣＰ顆粒(粒径50〜150ミクロン)及び純水を重量比１:５：３２の割合で秤量してシャーレにとり、スパーテルにて攪拌混合した。該混合物を以後の実験に適したサイズのポリスチレン製円筒に充填し、円筒の両端をＰＥＴフィルムで封鎖した後、速やかに−８０℃の冷凍庫に入れた。１時間以上経過して混合物が完全に凍結した後、両端のＰＥＴフィルムを除いて凍結乾燥器に移し、凍結状態のまま水分を蒸発させた。その後、試験体をポリスチレン製円筒から取り出し以下の試験に供した。
【００４０】
[微細構造観察]
走査型電子顕微鏡[ＳＥＭ]にて実施。試料を金蒸着した後、倍率35倍、2次電子像にて観察した(図１参照)。繊維状のＣＭキチン（繊維の集合体）中の繊維間にＴＣＰ顆粒が担持されている状態が観察された。気孔のサイズは、数十〜数百μmであった。
【００４１】
ＴＣＰ顆粒の分散状態を観察するため、試験体をエポキシ樹脂に包埋した後、切断し切断面を研磨して平坦化した後、同様のＳＥＭ観察を実施した。この際、ＴＣＰ顆粒のみを明瞭に観察するため、反射電子像により観察を行った(図２参照)。観察した断面全体(約４×８ｍｍ)にわたって、ＴＣＰ顆粒のほぼ均一な分散が観察され、顆粒の沈降による偏積は観察されなかった。
【００４２】
[骨欠損への埋入実験]
本材料を、家兎下顎骨に形成した直径４ｍｍの骨欠損に埋入し、手術後４，８週後に周囲組織と共に回収して、骨組織の再生状況を調査した。所定期間後に回収した組織に対して、通法に従って非脱灰樹脂包埋組織標本を作製し、各標本における骨欠損部位にしめる再生骨組織の面積比を求めた。比較として、骨欠損のみを形成し、材料を何も埋入しない例(ブランク例)と、先行技術として前記特許文献２（特開平７-１１６２４１号公報）に記載された手法によって作製した試験体を埋入する例を同様の試験に供した。ブランク例の骨修復面積比を１として、各々の材料埋入例の面積比の値を比較検討した。
【００４３】
この先行技術サンプルの作成は次のように行った。CMキチンの4.24wt％のCMキチン水溶液を冷却バス(-10℃)中で攪拌しながら凍結させ、微細な氷の結晶と溶液が混ざり合った状態(フローズン)を作製した。TCP顆粒(粒径50ー150μm)を所定量加えて攪拌し、均一に分散させた。以後の実験に適したサイズのポリスチレン製円筒に該フローズンを充填し、円筒の両端をＰＥＴフィルムで封鎖した後、速やかに−８０℃の冷凍庫に入れ、その後凍結乾燥させた。円筒を除き、真空熱処理装置にて減圧下(2kPa以下)にて140℃又は160℃にて24時間加熱処理し、スポンジ成形体を得た。常温冷却後、成形体見かけ体積の20倍以上の純水で3時間洗浄し、液部分をエタノールに置換し、80℃の乾燥器にて乾燥させた。作製した試験体は、25kGyのガンマ線照射により滅菌処理し、試験に供した。
【００４４】
なお、単に先行技術による手法を用いただけでは、ＴＣＰ顆粒の偏積が出来てしまうが、上述のように溶液の氷点以下の温度での顆粒の撹拌混合及び成形などの手法を併用し、ほぼ均質に顆粒が分散した試験体を作製し、本実験に用いた。
【００４５】
この試験の結果を表１にまとめた。
【表１】
0004671596.tif 000002
【００４６】
表１から明らかなように、ブランク例に比べて、本発明によって作製した材料を埋入した場合は、４週間後、８週間後のどちらの時点においても骨修復が勝っていた。先行技術によって作製したものは、４週間後ではブランク例よりやや骨修復が劣り、８週間後でも同等であった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例の多孔質骨修復材表面のＳＥＭ画像である。
【図２】実施例の多孔質骨修復材断面のＳＥＭ画像（反射電子像）である。
【符号の説明】
【００４８】
符号なし
【図１】
0004671596.tif 000003
【図２】
0004671596.tif 000004