(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫クロマトグラフィ−法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量する際の唾液の前処理方法に用いる唾液の前処理用具であって、把持棒(１)の先端に唾液を所定量以上吸収可能な軟質合成樹脂製スポンジ(２)が固定されているスワブ(Ｘ)と、該スワブ(Ｘ)の軟質合成樹脂製スポンジ(２)より充分に大きな開口部(3a)を有する先細り状の導入部(3b)の終点である括れ部(3c)に連続して該軟質合成樹脂製スポンジ(２)が挿入可能な袋状部(3d)が一体形成されている透明又は半透明な軟質合成樹脂製である唾液と水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)のいずれか一方から成る処理液との混和容器(Ｙ)とから成り、該混和容器(Ｙ)は括れ部(3c)と袋状部(3d)とがその内部に該軟質合成樹脂製スポンジ(２)が挿入されている状態で指圧によって該軟質合成樹脂製スポンジ(２)を押しつぶすことが可能な弾性を有しており、且つ括れ部(3c)は指で押圧できる幅を有していると共に指圧によって押しつぶした状態で該スワブ(Ｘ)の軟質合成樹脂製スポンジ(２)を抜き取ると唾液の前処理を行うのに必要な最低量以上の唾液を絞り取ることができる形状を成していることを特徴とする唾液の前処理用具。
【請求項２】
スワブ(Ｘ)の軟質合成樹脂製スポンジ(２)が連続気泡スポンジでありその気泡の径が５０〜４００μｍである請求項１に記載の唾液の前処理用具。
【請求項３】
混和容器(Ｙ)の袋状部(3d)の底部から所定距離だけ離れた位置に、該袋状部(3d)内に収容された液量が唾液の前処理を行うのに必要な最低量の目安となる下限線(3e)が設けられている請求項１又は２に記載の唾液の前処理用具。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の唾液の前処理具を用いて免疫クロマトグラフィ−法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量する際の唾液の前処理方法であって、該唾液の前処理具の把持棒(１)の先端に固定されている軟質合成樹脂製スポンジ(２)に唾液を吸収させたスワブ(Ｘ)を該軟質合成樹脂製スポンジ(２)側から、該唾液の前処理具の該軟質合成樹脂製スポンジ(２)より充分に大きな開口部(3a)を有する先細り状の導入部(3b)の終点である括れ部(3c)に連続して該軟質合成樹脂製スポンジ(２)が挿入可能な袋状部(3d)が一体形成されている透明又は半透明な軟質合成樹脂製である混和容器(Ｙ)の該袋状部(3d)内に挿入し、その状態で該混和容器(Ｙ)内に該開口部(3a)から水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)のいずれか一方を滴下した後に該袋状部(3d)に指圧を加えて該軟質合成樹脂製スポンジ(２)を押しつぶす操作によって唾液と滴下した液とを混和した後に、該括れ部(3c)を指圧しながら該スワブ(Ｘ)を該混和容器(Ｙ)内から抜き取ることによって該軟質合成樹脂製スポンジ(２)に吸収されている液を該袋状部(3d)内に搾り出し、該混和容器(Ｙ)内に該開口部(3a)から該水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)のいずれか他方を滴下して混和することを特徴とする唾液の前処理方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の唾液の前処理具を用いて免疫クロマトグラフィ−法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量する際の唾液の前処理方法であって、該唾液の前処理具の把持棒(１)の先端に固定されている軟質合成樹脂製スポンジ(２)に唾液を吸収させたスワブ(Ｘ)を該軟質合成樹脂製スポンジ(２)側から、該唾液の前処理具の該軟質合成樹脂製スポンジ(２)より充分に大きな開口部(3a)を有する先細り状の導入部(3b)の終点である括れ部(3c)に連続して該軟質合成樹脂製スポンジ(２)が挿入可能な袋状部(3d)が一体形成されている透明又は半透明な軟質合成樹脂製である混和容器(Ｙ)の該袋状部(3d)内に挿入し、その状態で該混和容器(Ｙ)内に該開口部(3a)から水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)のいずれか一方を滴下した後に該袋状部(3d)に指圧を加えて該軟質合成樹脂製スポンジ(２)を押しつぶす操作によって唾液と滴下した液とを混和した後に、該混和容器(Ｙ)内に該開口部(3a)から該水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)のいずれか他方を滴下して混和し、しかる後に該括れ部(3c)を指圧しながら該スワブ(Ｘ)を該混和容器(Ｙ)内から抜き取ることによって該軟質合成樹脂製スポンジ(２)に吸収されている液を該袋状部(3d)内に搾り出すことを特徴とする唾液の前処理方法。
【請求項６】
水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)として、更にｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬が混合されている水溶液を使用する請求項４又は５に記載の唾液の前処理方法。
【請求項７】
水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)と酸性水溶液(Ｂ)とのいずれか一方が滴下された後であって水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)と酸性水溶液(Ｂ)の他方が滴下される前に、ｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬を滴下して混和しておく請求項４又は５に記載の唾液の前処理方法。
【請求項８】
ｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬が、メチルレッド，アゾリトミン，ｐ−ニトロフェノール，ｍ−ニトロフェノール，ブロモクレゾールパープル，ブロモフェノールレッド，クロロフェノールレッド，フェノールレッド，ニュートラルレッド，ブロモチモールブルー，フェノールフタレイン，チモールフタレインから成る群より選ばれる一種を使用する請求項６又は７に記載の唾液の前処理用方法。
【請求項９】
水酸化ナトリウム水溶液(Ａ)又は酸性水溶液(Ｂ)として、更に非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤が混合されている水溶液を使用する請求項４から８のいずれか１項に記載の唾液の前処理方法。
【請求項１０】
任意の時期に非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を滴下して混和する請求項４から８のいずれか１項に記載の唾液の前処理方法。
【請求項１１】
酸性水溶液(Ｂ)として、酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液を、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤として、ポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル，ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド，ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド，ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド，ノニルフェノキシポリエトキシエタノール，オクチルフェノキシポリエトキシエタノール，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート，３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート，３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−ヒドロキシプロパンスルホナートから成る群より選ばれる一種又は二種以上の混合物を使用する請求項９又は１０に記載の唾液の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトの唾液中の齲蝕原性細菌の一種であるミュータンス連鎖球菌を抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィー法によって同定・定量を行うために用いる唾液の前処理用具及び唾液の前処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの口腔内におけるミュータンス連鎖球菌の存在と齲蝕の発生との間には密接な関係があることが知られており、ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の有無や量を簡便に検査できれば、罹患リスクや現状の罹患状況の把握ができ、極めて多くの人々に恩恵をもたらすことが可能である。
【０００３】
従来から、細菌の検査には抗原抗体反応を利用した検査が行われてきた。例えば酵素抗体法は、酵素を用いた発色濃度で同定・定量を行う方法であるが、抗体やサンプルを扱うために特殊な洗浄機や煩雑で正確な操作を必要とし、酵素反応のためのインキュベーターが必要であった。また、蛍光抗体法は、抗体を蛍光色素で標識し抗体と反応した抗原を特異的に染色する方法であるが、測定器として蛍光顕微鏡を必要とするため一般的ではない。
【０００４】
そのため、抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く提案されてきた。例えば、米国特許第5,591,645号、米国特許第4,855,240号、米国特許第4,435,504号、米国特許第4,980,298号、特開昭61-145459号、特開平6-160388号等に開示されているクロマトグラフィーを利用した測定方法は、採取した体液を同定・定量を目的とする抗原を含んだ試験溶液に混入して検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる簡便性に優れた方法である。このような方法は一般に免疫クロマトグラフィー法と呼ばれている。この方法では、ニトロセルロースなどの多孔質膜（孔径：数十μｍ）の片端に目的とする抗原のみに付く特定の抗体（以後、特異抗体と記す）が染み込まされており、多孔質膜の中程には同様に特定の抗原のみに付く別の特異抗体が帯状に染み込まされて多孔質膜に固定されている。片端に染み込まされている特異抗体は、予め金コロイド等の粒子で着色されており、その特異抗体が存在している多孔質膜の片端上にサンプル液を染み込ませると、サンプル液中に特異抗体と反応する抗原があればその抗原は特異抗体と結び付いて着色粒子を付けた状態で多孔質膜を毛細管現象によってサンプル液を染み込ませた側と反対の片端へ向かって移動して行く。移動の途中で帯状に固定されている別の特異抗体の個所を通過する際に、抗原は多孔質膜上の特異抗体に捕捉され、多孔質膜上に帯状の染みが現れる。このことによって目的の抗原がサンプル中に存在していること及びその量を知ることができるのである。
【０００５】
このような技術を応用すれば前述の口腔内のミュータンス連鎖球菌の同定・定量を行うことができそうであるが、現実には以下のような問題が存在するため実用化されていない。即ち、免疫クロマトグラフィ−法で利用できるサンプルは、原理上、多孔質膜中を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、ミュータンス連鎖球菌のような口腔内細菌の検査に用いられる主要なサンプルは唾液であるため、唾液中に存在するムチンと呼ばれる高粘性物質が多孔質膜の孔を塞いでしまい、またムチンは唾液中に存在する口腔粘膜面から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させる働きもするため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれてミュータンス連鎖球菌を通過させることができない。
【０００６】
また、ムチン以外にもミュータンス連鎖球菌の測定を困難なものとする問題が存在する。即ち、対象であるミュータンス連鎖球菌は、単体では直径１μｍ程度の菌であるが、連鎖球菌であるためしばしば１０〜２０個若しくはそれ以上に連鎖しており多孔質膜中の移動を妨げる要因となる。しかも、ミュータンス連鎖球菌は、食品中のスクロースから粘着性のグルカンを生成し、しばしば激しく凝集することもある。また、ミュータンス連鎖球菌の連鎖と凝集とは、多孔質膜中での目詰まりの原因となる他にも連鎖球菌の表面積を減少させ、ミュータンス連鎖球菌表面に存在する抗原の数に影響を与えてしまい、測定の正確性を低下させる原因ともなる。
【０００７】
そこで本発明者らは、ヒトの唾液中の齲蝕原性細菌の一種であるミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィー法によって同定・定量する際に、簡便な方法で唾液中のムチンを溶解してムチンによる上皮付着細胞の凝集を抑制すると共に、ミュータンス連鎖球菌の凝集を抑えることが可能な唾液の前処理キットを特願２００１−９２７６９号で提案した。
【０００８】
即ち、唾液を水酸化ナトリウム水溶液を用いて処理すると、唾液中のムチンやグルカンは溶解し上皮付着細胞の凝集の抑制或いはミュータンス連鎖球菌の外膜に作用してミュータンス連鎖球菌間の凝集を抑えることができ、また特定の酸性水溶液を用いて処理するとミュータンス連鎖球菌の連鎖を抑制し凝集を抑えることができ、更にこれに特定の界面活性剤を用いるとミュータンス連鎖球菌に存在するタンパク質を可溶化させてミュータンス連鎖球菌が多孔質膜内をスムーズに通り抜けるようにすることができることを究明したのである。
【０００９】
しかし、このような唾液の前処理キットを用いて、唾液と前記水酸化ナトリウム水溶液や特定の酸性水溶液、又は前記特定の界面活性剤が混合されている前記水酸化ナトリウム水溶液や特定の酸性水溶液とをミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィー法によって同定・定量できるように短時間で効率良く混和しようとすると、電動式ミキサーのような強力な混和作用を発揮する混和機が必要となるのであるが、通常検査のために被検者から採取される唾液の量は微量であるので特殊な混和機を使用しなければならず、またこのような混和機を使用すると混和機が存在しない場合にはミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィー法によって同定・定量することができず、更には１回混和機を使用するとその度に混和機を洗浄しなければならないので非常に煩雑であるという事態に直面した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、唾液と、前記水酸化ナトリウム水溶液や特定の酸水溶液、又は更に特定の界面活性剤が混合されているこれら水酸化ナトリウム水溶液と特定の酸性水溶液とを特殊な混和機を使用することなく混和する前処理を行うことができる唾液の前処理用具及び唾液の前処理方法を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、免疫クロマトグラフィ−法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量する際の唾液の前処理方法に用いる唾液の前処理用具として、所定量以上の唾液を吸収できる所定の形状条件を有する軟質合成樹脂製スポンジが把持棒の先端に固定されているスワブ及び所定形状の弾性を有する透明又は半透明な軟質合成樹脂製である唾液と処理液との混和容器から成る唾液の前処理具を用いて、軟質合成樹脂製スポンジに唾液を吸収させたスワブを軟質合成樹脂製スポンジ側から混和容器の袋状部内に挿入し、その状態で混和容器内に水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方を滴下した後に袋状部に指圧を加えて軟質合成樹脂製スポンジを押しつぶす操作によって唾液の軟質合成樹脂製スポンジへの急激な排出及び吸入を繰り返せば急激な攪拌効果により唾液と滴下した液とを混和することができるので、しかる後に括れ部を指圧しながらスワブを混和容器内から抜き取ることによって軟質合成樹脂製スポンジに吸収されている液を袋状部内に搾り出してから水溶液のいずれか他方を滴下して混和するか、又は水溶液のいずれか他方を滴下して混和した後に括れ部を指圧しながらスワブを混和容器内から抜き取ることによって軟質合成樹脂製スポンジに吸収されている液を袋状部内に搾り出せばよいことを究明して本発明を完成したのである。
【００１２】
即ち本発明は、免疫クロマトグラフィ−法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量する際の唾液の前処理方法に用いる唾液の前処理用具であって、把持棒の先端に唾液を所定量以上吸収可能な軟質合成樹脂製スポンジが固定されているスワブと、該スワブの軟質合成樹脂製スポンジより充分に大きな開口部を有する先細り状の導入部の終点である括れ部に連続して該軟質合成樹脂製スポンジが挿入可能な袋状部が一体形成されている透明又は半透明な軟質合成樹脂製である唾液と水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方から成る処理液との混和容器とから成り、該混和容器は括れ部と袋状部とがその内部に該軟質合成樹脂製スポンジが挿入されている状態で指圧によって該軟質合成樹脂製スポンジを押しつぶすことが可能な弾性を有しており、且つ括れ部は指で押圧できる幅を有していると共に指圧によって押しつぶした状態で該スワブの軟質合成樹脂製スポンジを抜き取ると唾液の前処理を行うのに必要な最低量以上の唾液を絞り取ることができる形状を成していることを特徴とする唾液の前処理用具と、
前記唾液の前処理具を用いて免疫クロマトグラフィ−法によりミュータンス連鎖球菌を同定・定量する際の唾液の前処理方法であって、前記唾液の前処理具の把持棒の先端に固定されている軟質合成樹脂製スポンジに唾液を吸収させたスワブを該軟質合成樹脂製スポンジ側から、前記唾液の前処理具の該軟質合成樹脂製スポンジより充分に大きな開口部を有する先細り状の導入部の終点である括れ部に連続して該軟質合成樹脂製スポンジが挿入可能な袋状部が一体形成されている透明又は半透明な軟質合成樹脂製である混和容器の該袋状部内に挿入し、その状態で該混和容器内に該開口部から水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方を滴下した後に該袋状部に指圧を加えて該軟質合成樹脂製スポンジを押しつぶす操作によって唾液と滴下した液とを混和した後に、該括れ部を指圧しながら該スワブを該混和容器内から抜き取ることによって該軟質合成樹脂製スポンジに吸収されている液を該袋状部内に搾り出し、該混和容器内に該開口部から該水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか他方を滴下して混和するか、又は前記該軟質合成樹脂製スポンジを押しつぶす操作によって唾液と滴下した液とを混和した後に、該混和容器内に該開口部から該水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか他方を滴下して混和し、しかる後に該括れ部を指圧しながら該スワブを該混和容器内から抜き取ることによって該軟質合成樹脂製スポンジに吸収されている液を該袋状部内に搾り出すことを特徴とする唾液の前処理方法とに関するものである。
【００１３】
そして、前記唾液の前処理用具においては、軟質合成樹脂製スポンジが連続気泡スポンジでありその気泡の径が５０〜４００μｍであることや、袋状部の底部から所定距離だけ離れた位置に、袋状部内に収容された液量が唾液の前処理を行うのに必要な最低量の目安となる下限線が設けられていることが好ましいことや、また前記唾液の前処理方法においては、水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液として、更にｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬が混合されている水溶液を使用したり、水酸化ナトリウム水溶液と酸性水溶液とのいずれか一方が滴下された後であって水酸化ナトリウム水溶液と酸性水溶液の他方が滴下される前にｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬を滴下して混和しておいたりすることが好ましく、ｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬としては、メチルレッド，アゾリトミン，ｐ−ニトロフェノール，ｍ−ニトロフェノール，ブロモクレゾールパープル，ブロモフェノールレッド，クロロフェノールレッド，フェノールレッド，ニュートラルレッド，ブロモチモールブルー，フェノールフタレイン，チモールフタレインから成る群より選ばれる一種が使用でき、また水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液として、更に非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤が混合されている水溶液を使用したり、任意の時期に非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を滴下して混和したりするとより好ましく、酸性水溶液としては酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液が、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤としてはポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル，ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド，ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド，ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド，ノニルフェノキシポリエトキシエタノール，オクチルフェノキシポリエトキシエタノール，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート，３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート，３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−ヒドロキシプロパンスルホナートから成る群より選ばれる一種又は二種以上の混合物が好ましく使用できることも究明したのである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、図面により本発明に係る唾液の前処理用具及び唾液の前処理方法について詳細に説明する。
図１は本発明に係る唾液の前処理用具のスワブを示す斜視図、図２は本発明に係る唾液の前処理用具の混和容器を示す斜視図、図３は本発明に係る唾液の前処理方法においてスワブの軟質合成樹脂製スポンジから軟質合成樹脂製スポンジに吸収されている液を搾り出している状態を示す説明図、図４は本発明に係る唾液の前処理方法において唾液を吸収させたスワブの軟質合成樹脂製スポンジを混和容器の袋状部内に挿入し水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方を滴下している状態を示す説明図、図５は本発明に係る唾液の前処理方法において唾液を吸収させたスワブの軟質合成樹脂製スポンジを混和容器の袋状部内に挿入し水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方を滴下した後に袋状部に指圧を加えて唾液と滴下した液とを混和している状態を示す説明図、図６は本発明に係る唾液の前処理方法において混和容器の袋状部内の唾液と滴下した液との混和液に水酸化ナトリウム水溶液又は酸性水溶液のいずれか他方を滴下している状態を示す説明図である。
【００１５】
図面中、Ｘは本発明に係る唾液の前処理用具の一方を構成するスワブであり、図１に示す如く把持棒１の先端に唾液を所定量以上（通常１cc以上）吸収可能な軟質合成樹脂製スポンジ２が固定されており、その長さは後述する混和容器Ｙの長手方向の長さに比べて５〜１０ｃｍ程度長いことが好ましい。
【００１６】
把持棒１は或る程度以上の強度を有し且つ比較的軽量で可塑剤等が溶出することがないポリプロピレン樹脂の如き合成樹脂や、天然の木材や竹で形成されていることが好ましい。
【００１７】
軟質合成樹脂製スポンジ２は、吸収させた唾液と滴下した液との混和効果を高め得るように連続気泡スポンジであることが好ましく、その素材としては可塑剤等が溶出することがないウレタンであることが好ましく、その気泡径としては製造の容易性や連鎖球菌の連鎖を断ち切るという目的の観点から５０〜４００μｍであることが好ましい。またその形状は、後述する混和容器Ｙの括れ部3cで吸収させた唾液の大部分を絞り取ることができるものであることが好ましいので、外側面の大部分が把持棒１の長手方向と平行で且つ凹凸がなく、把持棒１の長手方向と直角な横断面における外周長が混和容器Ｙの括れ部3cの内周長以上である部分が把持棒１の長手方向において大部分を占めていることが好ましく、例えば円筒型，四角柱等の多角柱型，図示した実施例のような長方形等の板状型などが好ましいが、球型や砲弾型や涙滴型等であってもよい。
【００１８】
Ｙは本発明に係る唾液の前処理用具の他方を構成する唾液と処理液との混和容器であり、図２に示す如くスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２より充分に大きな開口部3aを有する先細り状の導入部3bの終点である括れ部3cに連続して軟質合成樹脂製スポンジ２が挿入可能な袋状部3dが一体形成されている透明又は半透明な軟質合成樹脂製であり、括れ部3cと袋状部3dとはその内部にスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２が挿入されている状態で指圧によって軟質合成樹脂製スポンジ２を押しつぶすことが可能な弾性を有しており、且つ括れ部3cは指で押圧できる幅を有していると共に指圧によって押しつぶした状態でスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２を抜き取ると唾液の前処理を行うのに必要な最低量以上の唾液を絞り取ることができる形状を成している。そして、袋状部3dの底部から所定距離だけ離れた位置に袋状部3d内に収容された液量が唾液の前処理を行うのに必要な最低量の目安となる下限線3eが設けられていることが好ましい。
【００１９】
このようなスワブＸと混和容器Ｙとから成る唾液の前処理用具を用いて本発明に係る唾液の前処理方法を実施するには、先ず被検者にガム等を噛ませることによって充分に唾液を分泌させた後に、スワブＸを軟質合成樹脂製スポンジ２側から口腔内に挿入し舌や口辱で押しつぶすことによってスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２に唾液を吸収させるか、又は唾液をコップ等に吐き出させてスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２に唾液を吸収させる。
【００２０】
次に、唾液を軟質合成樹脂製スポンジ２に吸収させたスワブＸを軟質合成樹脂製スポンジ２側から混和容器Ｙ内に挿入した後、図３に示す如く軟質合成樹脂製スポンジ２が混和容器Ｙの括れ部3cに挿入された状態で括れ部3cを指圧しながらスワブＸを混和容器Ｙ内から抜き取ることによって軟質合成樹脂製スポンジ２に吸収されていた唾液を袋状部3d内に搾り出し、唾液の前処理を行うのに必要な最低量以上が採取されていることを確認する。この操作は、袋状部3dの底部から所定距離だけ離れた位置に、袋状部3d内に収容された唾液が前処理を行うのに必要な最低量の目安となる下限線3eが設けられていると容易である。なお、唾液の量が前処理を行うのに必要な最低量に満たない場合には、前記の操作を繰り返し唾液を補充する。しかる後、スワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２を唾液が収納されている袋状部3dに再度挿入する。
この操作は、スワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２に吸収させた唾液の量が唾液が前処理を行うのに充分な量であることが予め分かっている場合には必要ない。
【００２１】
しかる後、その状態で図４に示す如く混和容器Ｙ内に開口部3aから水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂのいずれか一方を滴下した後に、図５に示す如く袋状部3dに指圧を加えて軟質合成樹脂製スポンジ２を押しつぶす操作を繰り返すと、唾液と滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂとが軟質合成樹脂製スポンジ２への急激な排出及び吸入によって強力に攪拌されるため、唾液と滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂとを容易に混和することができるのである。なお、この軟質合成樹脂製スポンジ２を押しつぶす操作は、１０回以上繰り返すことが好ましい。
【００２２】
かくして滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂと混和された唾液を軟質合成樹脂製スポンジ２から採取するため、前述した図３に示す操作、即ちスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２が混和容器Ｙの括れ部3cに挿入された状態で括れ部3cを指圧しながらスワブＸを混和容器Ｙ内から抜き取ることによって、軟質合成樹脂製スポンジ２に吸収されていた滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂと混和された唾液を袋状部3d内に搾り出し、次に図６に示す如く水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂのいずれか他方を袋状部3d内に滴下し、混和容器Ｙを振って滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂのいずれか他方と混和する。その際、後述するように処理された唾液のｐＨは５〜９であることが好ましいため、水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂの少なくともいずれか一方にｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬が混合されていたり、また水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂの少なくともいずれか一方にｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬が混合されていない場合には水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂとのいずれか一方が滴下された後であって水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂの他方が滴下される前にｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬を滴下して混和しておくと、唾液の処理液の色の変化によってｐＨの値を確認できるので好ましい。
【００２３】
このｐＨ５〜９に変色域を持つｐＨ指示薬としては、メチルレッド，アゾリトミン，ｐ−ニトロフェノール，ｍ−ニトロフェノール，ブロモクレゾールパープル，ブロモフェノールレッド，クロロフェノールレッド，フェノールレッド，ニュートラルレッド，ブロモチモールブルー，フェノールフタレイン，チモールフタレインから成る群より選ばれる一種が好ましく使用できる。
【００２４】
また、このように滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂと混和された唾液を軟質合成樹脂製スポンジ２から採取する操作を行う前に、図４に示す如く水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂのいずれか他方を袋状部3d内に滴下し、混和容器Ｙを振って滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ又は酸性水溶液Ｂのいずれか他方と混和したり、図５に示す如く袋状部3dに指圧を加えて軟質合成樹脂製スポンジ２を押しつぶす操作を繰り返して混和したりした後に、前述した図３に示す操作、即ちスワブＸの軟質合成樹脂製スポンジ２が混和容器Ｙの括れ部3cに挿入された状態で括れ部3cを指圧しながらスワブＸを混和容器Ｙ内から抜き取ることによって、軟質合成樹脂製スポンジ２に吸収されていた滴下した水酸化ナトリウム水溶液Ａ及び酸性水溶液Ｂと混和された唾液を袋状部3d内に搾り出してもよい。
【００２５】
本発明に係る唾液の前処理方法に使用される水酸化ナトリウム水溶液Ａは、唾液中のムチンやミュータンス連鎖球菌の外膜に存在するグルカンに作用してミュータンス連鎖球菌の凝集を抑え、抗原であるミュータンス連鎖球菌の多孔質膜中の移動を容易とする作用を成すものであり、炭酸ナトリウム，リン酸水素２ナトリウム水溶液を含む水溶液は適しておらずミュータンス連鎖球菌の検査を正確に行うことはできない。これは水酸化ナトリウム以外のアルカリ性水溶液では、ミュータンス連鎖球菌の抗原の構造に障害を与えている可能性があると推測されるからである。
【００２６】
また、本発明に係る唾液の前処理方法に使用される酸性水溶液Ｂは、ミュータンス連鎖球菌の連鎖を抑え、抗原であるミュータンス連鎖球菌の多孔質膜中の移動を容易とする作用を成すものであり、酒石酸及び／又はクエン酸を含有する水溶液が最も適しており、その他の酸、例えば塩酸，硫酸，硝酸，酢酸，乳酸，マレイン酸等の水溶液は適しておらず、水酸化ナトリウム水溶液Ａと組み合わせて用いても目的とする検査の感度を得ることが難しい。これは酒石酸及びクエン酸以外の水溶液ではミュータンス連鎖球菌の抗原の構造に障害を与えている可能性があると推測される。本発明に係る唾液の前処理方法に於いては、水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂとの間に中和反応が起こるため緩衝剤を利用することが好ましく、酒石酸及び／又はクエン酸を含有する水溶液にはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを緩衝剤として含有することが好ましい。緩衝作用を効果的に得るためには、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを酸性水溶液Ｂ側に使用する必要があるが、同時に水酸化ナトリウム水溶液Ａに使用しても良いのは勿論である。しかしこの時、その他の緩衝剤、例えば炭酸水素ナトリウムと炭酸ナトリウムや、クエン酸とクエン酸ナトリウムのような組み合わせでは緩衝作用が充分得られないことを確認している。
【００２７】
水酸化ナトリウム水溶液Ａ及び酸性水溶液Ｂの濃度は０.０１Ｎ以上であることが好ましく、各濃度が０.０１Ｎ未満であるとそれぞれの効果を得難い傾向や多孔質膜中で目詰まりを起こし易い傾向がある。実際には、濃度は高い方が検出感度の点で有利である。また、本発明に係る唾液の前処理用方法に於いて、水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂとは、中和作用があるため必ず別になっていることが必要である。
【００２８】
本発明に係る唾液の前処理方法に使用される水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂとの一者又は両者には、ミュータンス連鎖球菌表面のタンパク質を可溶化してミュータンス連鎖球菌が多孔質膜内をスムースに通り抜けることを可能とする作用を成すように非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤が混合されていることが好ましい。従来から、免疫クロマトグラフィー法ではサンプル液や抗原液が検査器具内をスムーズに移動できるようにイオン性界面活性剤を使用することがよくあるが、ミュータンス連鎖球菌抗原の同定・定量を行うための本発明に係る唾液の前処理方法に使用される界面活性剤は、実験の結果から非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤であることが必要であり、ラウリル硫酸ナトリウムやドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤では特異抗体による抗原の検出を行うことができない。
【００２９】
本発明に係る唾液の前処理方法に使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤であれば特に限定されず、一般に膜タンパクの可溶化剤として使用されるものがいずれも使用できる。しかし、用いる非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤の種類によってミュータンス連鎖球菌抗原の検出感度に差があり、中でも非イオン性界面活性剤としてのポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル，ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド，ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド，ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド，ノニルフェノキシポリエトキシエタノール，オクチルフェノキシポリエトキシエタノール，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートや、両性界面活性剤としての３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート，３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−ヒドロキシプロパンスルホナートから成る群より選ばれる一種又は二種以上の混合物が検出感度の点で好ましい。
【００３０】
この非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤が水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂとの一者又は両者に予め混合されていない場合には、任意の時期に非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を唾液に滴下して混和すればよい。
【００３１】
本発明に係る唾液の前処理方法に使用される水酸化ナトリウム水溶液Ａ及び酸性水溶液Ｂはそれぞれ独立した機能を持つため任意の順で滴下することが可能である。
【００３２】
本発明に係る唾液の前処理方法で使用する非イオン性界面活性剤及び／又は両性イオン界面活性剤は、唾液の前処理後に唾液試料中の非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤の濃度が０.０５〜９０重量％となるように使用することが好ましい。０.０５重量％未満では、抗原抗体反応による検出感度がなくなってしまい、９０重量％を超えると抗原抗体反応による検出感度が低下してしまうため適していない。
【００３３】
本発明に係る唾液の前処理方法では水酸化ナトリウム水溶液Ａと酸性水溶液Ｂとの中和作用によって、前処理後の唾液のｐＨが５〜９の範囲内になるように処理を行う。これは抗原抗体反応がこのｐＨの範囲内で行われるため、用いる特異抗体によって異なるが、ｐＨが範囲外であると特異抗体が抗原と離れてしまったり、非特異的な親和性を持ってしまうため測定結果の信頼性が低下することを防ぐためである。
【００３４】
本発明に係る唾液の前処理方法によって前処理を行った唾液試料は、従来の免疫クロマトグラフィ−法を用いた抗原抗体反応によってミュータンス連鎖球菌の同定・定量することが可能であり、ミュータンス連鎖球菌以外の口腔内細菌にも応用できる。特異抗体は通常用いられる方法によって得ることができ、例えば、KohlerとMilstein（Kohler G, C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256:495-497. 1975）による細胞融合によるハイブリドーマの樹立法によっても良いし、単に抗原を動物に免疫してその血清を精製したものでも構わない。
【００３５】
【発明の効果】
以上に詳述したように本発明は、ヒトの唾液試料中のミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィー法によって同定・定量する際に、簡便な方法で唾液中のムチン及びミュータンス連鎖球菌の連鎖による凝集を取り除くことを可能とする唾液の前処理用具及び唾液の前処理方法であり、本発明に係る唾液の前処理用具は電動式ミキサーのような強力な混和作用を発揮し且つ微量な唾液でも混和できる特殊な混和機を使用しなくても簡便に唾液の前処理を行うことができる安価なものであり、また本発明に係る唾液の前処理方法は本発明に係る唾液の前処理用具を使用して迅速且つ容易に唾液の前処理を行うことができる方法であり、その歯科分野に貢献する価値の非常に大きなものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係る唾液の前処理用具のスワブの１実施例を示す斜視図である。
【図２】  本発明に係る唾液の前処理用具の混和容器の１実施例を示す斜視図である。
【図３】  本発明に係る唾液の前処理方法においてスワブの軟質合成樹脂製スポンジから軟質合成樹脂製スポンジに吸収されている液を搾り出している状態を示す説明図ある。
【図４】  本発明に係る唾液の前処理方法において唾液を吸収させたスワブの軟質合成樹脂製スポンジを混和容器の袋状部内に挿入しアルカリ性水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方を滴下している状態を示す説明図である。
【図５】  本発明に係る唾液の前処理方法において唾液を吸収させたスワブの軟質合成樹脂製スポンジを混和容器の袋状部内に挿入しアルカリ性水溶液又は酸性水溶液のいずれか一方を滴下した後に袋状部に指圧を加えて唾液と滴下した液とを混和している状態を示す説明図である。
【図６】  本発明に係る唾液の前処理方法において混和容器の袋状部内の唾液と滴下した液との混和液にアルカリ性水溶液又は酸性水溶液のいずれか他方を滴下している状態を示す説明図である。
【符号の説明】
Ｘ  スワブ
１  把持棒
２  軟質合成樹脂製スポンジ
Ｙ  混和容器
3a  開口部
3b  導入部
3c  括れ部
3d  袋状部
3e  下限線
Ａ  アルカリ性水溶液
Ｂ  酸性水溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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