(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸バッファー（ｐＨ６）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）からなる溶液Ａと、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）からなる溶液Ｂとを主成分とする基板の活性化キット。
【請求項２】
前記溶液Ａが、リン酸バッファー（ｐＨ６）：０．０１〜５Ｍ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）：１〜５００ｍＭ（０．１１５〜５７．５ｇ／Ｌ）の水溶液である請求項１記載の活性化キット。
【請求項３】
前記溶液Ｂが、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）が０．０５〜１０Ｍ（９．５９〜１９１８ｇ／Ｌ）のジオキサン溶液である請求項１又は２記載の活性化キット。
【請求項４】
前記溶液Ａ：５０〜９９容量％に対し、溶液Ｂ：１〜５０容量％を配合して用いる請求項１〜３のいずれかに記載の活性化キット。
【請求項５】
前記基板が、ダイヤモンドライクカーボンの表面処理層を有するスライドグラスに化学修飾を施した基板であることを特徴とする請求項１記載の基板の活性化キット
【請求項６】
前記化学修飾が、末端に水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基を有することを特徴とする請求項５記載の基板の活性化キット
【請求項７】
前記化学修飾が、基板にアンモニアガス中でプラズマによりアミノ化することを特徴とする請求項５または６記載の基板の活性化キット
【請求項８】
請求項１記載の活性化キットを用いて活性化した基板にＤＮＡ又は蛋白質をスポッティング後であって、スポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質への蛍光標識ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行う前において、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーションを行うことを特徴とするＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項９】
プレハイブリダイゼーションが、基板表面にスポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質とは異なるＤＮＡ又は蛋白質を固定化することによる請求項８記載のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１０】
請求項１記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのＤＮＡ又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板の乾燥工程、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーション工程、スポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質への蛍光標識ＤＮＡのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とするＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１１】
請求項１記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのＤＮＡ又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板のインキュベーション工程、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーション工程、スポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質への蛍光標識ＤＮＡのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とするＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１２】
プレハイブリダイゼーション工程が、基板表面にスポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質とは異なるＤＮＡ又は蛋白質を固定化する工程である請求項１０記載のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１３】
請求項１記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのＤＮＡ又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板のインキュベーション工程、スポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質への蛍光標識ＤＮＡのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とするＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１４】
前記インキュベーション工程が、ゲルからなる溶液で処理することを特徴とする請求項１１乃至１３記載のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１５】
前記ゲルからなる溶液が、吸水性高分子を含むことを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１６】
前記吸水性高分子が、アガロース、ゼラチン、架橋ポリエチレンオキサイドであることを特徴とする請求項１５記載のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【請求項１７】
前記ゲルからなる溶液が、蛋白質、サーモン精子ＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、デンハルト液を含むことを特徴とする請求項１４乃至１６記載のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医療分野、生化学や分子生物学等の研究分野において有用な基板の活性化キット、および、前記キットを用いてＤＮＡ又は蛋白質等を検出する方法に関する。
背景技術
遺伝子解析は分子生物学、生化学の分野で有用であり、近年では病気の発見等医療分野でも利用されている。
近年ＤＮＡを固定化した基板が開発され、遺伝子解析における解析速度が著しく速くなり、これを応用して、医療分野においては疾病診断等も行われている。
基板上にＤＮＡを固定する方法としては、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布した後に固定する方法、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いて基板上にＤＮＡを合成する方法等がある。
しかし、ポリリジン等の高分子を塗布してＤＮＡを固定する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定なため、ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題が生じていた。
また、半導体技術を用いた方法は、製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
このような課題を解決すべく、本発明者らは既に、基体表面を化学修飾してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル或いはｐ−ニトロフェノールエステル等の活性化エステル基で活性化すると、ＤＮＡを安定して固定可能なことを見いだしている。
しかし、このような化学修飾には、いくつもの化学反応を経る煩雑な操作が必要であった。
また、化学修飾して活性化された基板は、基板上にＤＮＡをスポッティングした後も余分な活性点がそのまま残っていることがあった。
そのために、スポッティングしたＤＮＡに、検出したいＤＮＡをハイブリダイズさせようとすると、余分な活性点にもＤＮＡが付着してしまい、正確なＤＮＡ検出ができないという問題もあった。
本発明は、ＤＮＡ等の固定化における上記従来の問題点を解決し、基板にＤＮＡ等を簡便に、しかも従来の方法と同様に高密度で且つ強固に固定化するための方法および、正確にＤＮＡ等を検出する方法の提供を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、２種類の溶液を混合するだけで簡単に基板の活性化が可能なことを見出した。
また、基板を活性化してＤＮＡ又は蛋白質をスポッティング後、ハイブリダイゼーションする前に、プレハイブリダイゼーション工程により余分な活性点をマスキングすることにより、正確なＤＮＡ又は蛋白質等の検出が可能となることを見出し、本発明に到達した。また、このマスキングはスポッティング後の後処理工程で乾燥および洗浄を行い、活性基が十分に失活した場合には、行わなくても良いことも見出した。
更に、ハイブリダイゼーション工程前あるいはプレハイブリダイゼーション工程前のインキュベーション工程において、ゲル溶液を使うことにより、より正確なＤＮＡ又は蛋白質等の検出が可能となることを見出した。
本発明の基板の活性化キットは、リン酸バッファー（ｐＨ６）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）からなる溶液Ａと、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）からなる溶液Ｂとを主成分とすることを特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、溶液Ａが、リン酸バッファー（ｐＨ６）：０．０１〜５Ｍ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）：１〜５００ｍＭ（０．１１５〜５７．５ｇ／Ｌ）の水溶液であることを第２の特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、溶液Ｂが、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）が０．０５〜１０Ｍ（９．５９〜１９１８ｇ／Ｌ）のジオキサン溶液であることを第３の特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、溶液Ａ：５０〜９９容量％に対し、溶液Ｂ：１〜５０容量％を配合して用いることを第４の特徴とする。
本発明のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法は、活性化キットを用いて活性化した基板にＤＮＡ又は蛋白質をスポッティング後であって、スポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質への蛍光標識ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行う前において、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする。
本発明のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法は、プレハイブリダイゼーションが、基板表面にスポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質とは異なるＤＮＡ又は蛋白質を固定化することを特徴とする。
本発明のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法は、活性化キットを用いた基板の活性化工程、活性化された基板へのＤＮＡ又は蛋白質のスポッティング工程、スポッティング後の基板のインキュベーション工程或いは乾燥工程、スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーション工程、スポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質への蛍光標識ＤＮＡのハイブリダイゼーション工程、及び、ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とする。
本発明のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法は、プレハイブリダイゼーション工程が、基板表面にスポッティングされたＤＮＡ又は蛋白質とは異なるＤＮＡ又は蛋白質を固定化する工程であることを特徴とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明について以下詳細に説明する。
（１）基板の準備
本発明において用いる基板は、ガラス、プラスチック、シリコンなどの支持体に表面処理層を形成し、更に化学修飾を施すことによって、ＤＮＡプローブ、蛋白質、ペプチド等の生体物質等を載せた場合に、基板を洗浄してもＤＮＡ断片、蛋白質、ペプチド等が洗い流されずに強固に固定化され、蛍光照射した際に、蛍光スポットが明瞭となることを特徴とする。表面処理層としては、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものであることが望ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物でもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定しなくても良い。
このような基板の一例としては、スライドグラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。
このような基板は、前記表面処理層の厚みが、１ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましい。
このような基板は、前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス１〜９９体積％、残りメタンガス９９〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
また、このような基板の表裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、ＷＣ、等の単層又はこれらの複合膜を製膜しても良い。反射層の厚みは、全体に均一に被覆されなければならないことから、１００ｎｍ以上が好ましい。さらに好ましくは１０００ｎｍ以上である。
なお、ガラス基体の表面は、Ｒａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて、多量のＤＮＡプローブ等を密度を上げて固定化することに好都合である。
基板の表面処理層の製造は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法などによることができる。
基板は支持体に表面処理層を形成した構造だけではなく、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然のダイヤモンド、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン等の金属、ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック、また、金属粉末や、セラミック粉末等に樹脂をバインダーとして混合して結合形成したものでもよい。また、金属粉末やセラミック粉末等の原料をプレス形成機を用いて圧粉したものを高温で焼結してもよい。また、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば、２相体）であってもよい。
基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。
基体表面には、ＤＮＡや蛋白質を固定するために、更に化学修飾を施す。化学修飾の一例としては、炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合した基を、支持体表面にアミド結合を介して固定化することをいう。このような化学修飾によって、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド等の生体物質を基体の表面に固定化しやすくする。その他の化学修飾は、末端に極性基、例えば、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基、イソシアネート基等を有する炭化水素基で固体支持体表面を置換することによる。
前期炭化水素基としては、炭素数が１〜１２のもの、中でも１〜６のものが好ましい。例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカルボン酸；トリメリト酸等の多価カルボン酸が挙げられる。中でも、シュウ酸、コハク酸が好ましい。
化学修飾方法としては、例えば、塩素ガス中で支持体に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。また、別の化学修飾方法として、表面を塩素化しないで、アンモニアガス中でプラズマによりアミノ化した後、酸クロリドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。
（２）活性化キット
本発明の活性化キットは、リン酸バッファー（ｐＨ６）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）からなる溶液Ａ（水溶液）と、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）からなる溶液Ｂ（ジオキサン溶液）の２種類からなる。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）の代わりにｐ−ニトロフェノールを使用することもできる。
本発明の活性化キットにより、基板表面にカルボキシル基を導入した軟ダイヤモンドをコーティングしたスライドグラス（軟ダイヤモンドコートスライドグラス）等をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で活性エステル化し、図１のような基板を得ることができる。
すなわち、ダイアモンド表面を活性化した後に、ＤＮＡの塩基に含まれる第１級アミノ基とアミド結合させることができる（図２参照）。
溶液Ａ（水溶液）中に占める濃度は、リン酸バッファー（ｐＨ６）は、０．０１〜５Ｍであるのに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）は、１〜５００ｍＭ（０．１１５〜５７．５ｇ／Ｌ）とすることができる。
リン酸バッファー（ｐＨ６）は、例えば０．１Ｍ  リン酸二水素カリウム溶液および０．１Ｍ  リン酸水素二カリウム溶液を用意した上で、リン酸二水素カリウム溶液のｐＨをモニターしながらｐＨ６になるまでリン酸水素二カリウム溶液を添加することにより調整することができる
溶液Ｂ（ジオキサン溶液）については、ジオキサンに、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を０．０５〜１０Ｍ（９．５９〜１９１８ｇ／Ｌ）の濃度で添加したものが用いられる。
本発明の活性化キットにおいて、溶液Ａと溶液Ｂとの配合割合は、溶液Ａが５０〜９９容量％であるのに対し、溶液Ｂが１〜５０容量％とすることが好ましい。
ビーカー等の容器中で溶液ＡとＢとを混合後、混合溶液中に基板を浸漬し、好ましくは撹拌しながら、４〜５０℃で５〜１２０分間反応させる。軟ダイヤモンドコートスライドグラス等の基板表面のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で活性エステル化、すなわち、ダイアモンド表面を活性化した後に、ＤＮＡの塩基に含まれる第１級アミノ基とアミド結合させることができる（図２）。活性化した基板は、滅菌水等により洗浄する。
活性化後の基板は、活性が落ちてしまわないように、なるべく早く使用することが望ましい。保管する場合は、乾燥後、デシケータ中で保管することが望ましい。
本発明においては、前記のように活性化キットで活性化した基板を用いて、以下の工程を経ることにより、ＤＮＡを検出することができる。
（３）スポッティング工程
本発明の活性化キットにより活性化した基板に、以下のようにしてＤＮＡを貼り付ける（スポッティング）。
まず、濃度が０．０１〜１０μｇ／μＬとなるように超純水を用いてＤＮＡ溶液を調製する。また、スポッティング用バッファーとしてはＳＳＣやＴＥ等も用いることができるが、１〜５０％ホルムアミド溶液あるいは１〜５０％グリセリン溶液、１〜５０％ＤＭＳＯ溶液を用いると、粘性が高くなり安定してスポットでき、更に蒸発を抑制することが出来る。
続いてスポッティング用溶液を、活性化された基板上にスポッターを用いてスポットする。このとき、スポッティング用溶液を熱変性またはアルカリ変性して、ＤＮＡ２本鎖を１本鎖とし、急冷してもよい。このスポッティング用溶液を、例えば、図３に示すようにスポッターの針で液を吸取り（図３のａ）、基板に押し付けて（同ｂ）、ＤＮＡ液を基板に押し付ける（同ｃ）。このようにしてスライドグラス表面に多種類のＤＮＡを貼り付ける（同ｄ）。
（４）インキュベーション工程
次に、スポッティングしたＤＮＡが基板表面に固定する反応を進行させるべく、インキュベーションを行う。ＤＮＡの基板への固定化は、化学反応による共有結合であるため、反応を確実に進めるべく、スポット後に速やかにインキュベーションを行う必要がある。
インキュベーションは、高湿化で行うことが望ましいが、例えば、図４に示すタイトボックスを用いて行うことができる。タイトボックスには飽和ＮａＣｌ溶液を入れ、湿度を一定に調整した調湿チャンバーとする。例えば０〜８０℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が０〜８０℃前後になるまで放置することによる。好ましくは４５〜７０℃程度である。また、飽和ＮａＣｌ溶液は、例えば５０％ホルムアミド水溶液とすることができる。ＮａＣｌ溶液以外にも、水や塩化カリウム溶液を用いることもできる。
インキュベーターは０〜８０℃の範囲とすることができるが、固定化反応をより進行させるためには、４５〜７０℃程度とすることが好ましい。
タイトボックスが調湿チャンバーとなったら、スポッティング済みの基板を入れ、一定湿度に調整してインキュベーションを行う。
基板は、ＮａＣｌ飽和水あるいは５０％ホルムアミド水溶液にふれないようにすることが好ましい。例えば図４のように底上げをした上に載せることができる。
インキュベーションは、０．１〜２４時間程度行うことが好ましい。
また、インキュベーション後、６５〜９０℃の恒温室の中に１時間以上放置して乾燥することが好ましい。
上記のようにインキュベーションを高湿度雰囲気中で行う方法以外に、ゲル溶液を使うことにより、より安定し、より促進した固定化反応を得ることができる。例えば、ゲル溶液の成分として、アガロース、ゼラチン、架橋ポリエチレンオキサイド等の吸水性の高分子が好ましい。添加剤として、アルブミン等の蛋白質、サーモン精子ＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、デンハルト液等ブロッキング効果のあるものが好ましい。ゲル溶液の濃度は、０．０１〜９９％の範囲が好ましい。より好ましくは、０．３〜３％の範囲が良い。
作成したゲル断片を、ＤＮＡをスポットした場所に載せ、０〜８０℃に設定した調湿チャンバー中で反応を進ませることが出来る。このとき、ＤＮＡの流れ出しを抑制するために、ゲルを載せる前に、４０〜８０℃の恒温室中で、基板を乾燥させることが望ましい。
基板を調湿チャンバーから出した後に基板の洗浄を行う。まず洗浄液（例えば２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）をはったバット中に基板を浸す。このとき、ＤＮＡをスポットした面を上にして入れる。その後、振とう機等を用いて振とう洗浄し、更にもう一度洗浄液を入れ替えて洗浄する。さらに薄い洗浄液（例えば０．１×ＳＳＣ）で濯いだ後、遠心機やブロアーを用いて基板を乾燥させる。
なお、蛋白質等の添加剤を含むゲル溶液を用いてインキュベーション工程を行った場合には、次のプレハイブリダイゼーション工程は必要ない。
（５）プレハイブリダイゼーション工程
次に、インキュベーション後の基板にハイブリダイゼーションの前処理として余分な活性点をマスキングするためのプレハイブリダイゼーションを行う。プレハイブリダイゼーションとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、サケ精子ＤＮＡ、デンハルト液等を用いることが出来るが、これらに２０×ＳＳＣ、ＳＤＳ、ホルムアミド等を加えて溶液を調製し、プレハイブリダイゼーション用溶液とする。プレハイブリダイゼーション用溶液中にサケ精子ＤＮＡ等のＤＮＡが含まれる場合、熱変性により、２本鎖を１本鎖にすべく、加熱して、急冷する。
プレハイブリダイゼーション用溶液の一例としては、溶液にデンハルト液とホルムアミドを加えたもの（５×デンハルト液、５０％ホルムアミド）が挙げられる。
基板中の予めＤＮＡをスポットした場所に、プレハイブリダイゼーション用溶液を滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せる。
プレハイブリダイゼーションは、０．１〜２４時間行うことが好ましい。
プレハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーション溶液が乾燥しないように高湿で行うことが望ましく、（４）インキュベーションの項で述べたような調湿チャンバーを利用できる。
タイトボックスが０〜８０℃に設定したインキュベーター内で調湿チャンバーとなった状態で、（４）と同様にＮａＣｌ飽和水または５０％ホルムアミド溶液に触れないように軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れる。  こうして、基板上にスポットしたＤＮＡとは無関係なＤＮＡで、スポット部位以外のスライドグラス表面がマスキングされる（図５）。
次に、洗浄を行う。例えば、基板を０．１×ＳＳＣ溶液に入れて、カバーグラスをはずす。次に、振とう機等を用いて滅菌水で洗浄した後に、遠心機やブロアーを用いて基板を乾燥させる。
なお、このプレハイブリダイゼーション工程は、インキュベーション工程の後に、３０℃〜８０℃の恒温室中で０．１〜２４時間基板を乾燥させ、その後洗浄液（例えば、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）をはったバット中で十分洗浄し、リンス液（例えば、０．１×ＳＳＣ）で洗浄して乾燥し、活性化エステルが完全に加水分解し、失活した場合には行わなくても良い。ただし、失活が不十分な場合、後のハイブリダイゼーション工程においてスポット以外の部分へのＤＮＡの固定化が起こるため、確実な結果を得るには、プレハイブリダイゼーション工程を行うことが好ましい。
（６）ハイブリダイゼーション工程
ターゲットとなるＤＮＡサンプルを、蛍光標識ラベルキットにしたがって行うか、あるいは逆転写酵素反応を利用して蛍光標識する。
この蛍光標識ＤＮＡサンプルに滅菌水、２０×ＳＳＣ、ＳＤＳ、ホルムアミド等を添加し、撹拌してハイブリダイゼーション用溶液を調製する。
このとき、スポッティング工程において、スポッティング用溶液の熱変性あるいはアルカリ変性を行わず、２本鎖のままでスポットした場合には、基板上ＤＮＡの熱変性を行う。（５）のプレハイブリダイゼーション工程が終了した基板を３〜５分間熱水に浸漬し、その後に氷冷する。スポッティング溶液を熱変性あるいはアルカリ変性してからスポットした場合には、この工程は必要ない。
作成したハイブリダイゼーション用溶液を基板のＤＮＡをスポットした場所にに滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せる。
ハイブリダイゼーションも高湿で行うことが望ましく、（４）インキュベーションの項で述べたような調湿チャンバーを利用できる。
タイトボックスが０〜８０℃に設定したインキュベーター内で調湿チャンバーとなった状態で、（４）と同様にＮａＣｌ飽和水あるいは５０％ホルムアミドに触れないように基板を入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れる。
こうして、図７のように、蛍光標識したＤＮＡが基板上に予めスポッティングしたＤＮＡにハイブリダイズする。
最後に洗浄を行う。洗浄は基板を０．１×ＳＳＣ溶液でカバーグラスを外し、その後洗浄液（例えば、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）をはったバット中で２度繰り返して洗浄し、リンス液（例えば、０．１×ＳＳＣ）で洗浄して遠心機やブロアーを用いて乾燥する。
（７）蛍光部位検出工程
検出は、基板表面のＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光標識を、蛍光画像読み取り用スキャナー等を用いて読み取ることで行うことができる。
実施例
（実施例１）
軟ダイヤモンドコートスライドグラスの使用プロトコルについて説明する。
（１）軟ダイヤモンドコートスライドグラスの準備
まず、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のガラス表面に、イオン化蒸着法により、メタンガス９５体積％と水素ガスを５体積％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ膜２５ｎｍの厚みに形成したスライドグラスを作成した。
次に、このスライドガラス表面を化学修飾した。
すなわち、ガラス基板表面をアンモニア雰囲気下で高圧水銀灯を１０分間照射してアミノ化し、さらに無水コハク酸のＮ−メチルピロリドン溶液中に６０分間浸漬した。このようにして、基板表面にカルボキシル基を持つ、軟ダイヤモンドコートスライドグラスを得た。
軟ダイヤモンドコートスライドグラスへのＤＮＡの固定化は、図１のように表面のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で活性化エステル化した後に行う。
ダイヤモンド表面のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）活性エステル基を、ＤＮＡの塩基に含まれる第１級アミノ基とアミド結合させる（図２）。
（２）活性化
活性化は活性化キットを用いて行う。活性化キットの溶液組成は以下のものを用いた。
・溶液Ａ（水溶液）
リン酸バッファー（ｐＨ６）：    ０．１Ｍ
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）：  ２２ｍＭ（２．５ｇ    ／Ｌ）
・溶液Ｂ（ジオキサン溶液）
１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド：１Ｍ（１９１．８ｇ／Ｌ）
（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
次に、リン酸バッファー（ｐＨ６）は以下のようにして作成した。
まず、０．１Ｍ  リン酸二水素カリウム溶液（１３．６ｇ／Ｌ）および０．１Ｍ  リン酸水素二カリウム溶液（１７．４ｇ／Ｌ）を用意する。リン酸二水素カリウム溶液のｐＨをｐＨ計で測定し、ｐＨをモニターしながらｐＨ６になるまでリン酸水素二カリウム溶液を添加する。
活性化後の基板は、活性が落ちてしまわないように、なるべく早く使用することが好ましい。保管する場合は、６５℃で３０分乾燥後、デシケータ中で保管するのが好ましい。
溶液Ａを９０ｍＬビーカーに入れ、更に溶液Ｂを１０ｍＬ加える。液を良く撹拌したあとに、この溶液をシャーレに入れ、軟ダイヤモンドコートスライドグラスを溶液に浸漬し、３０分間室温放置する（振とう機等の撹拌装置がある場合は撹拌を行う）。活性化後の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを、滅菌水により２回洗浄した。
活性化後の基板は、活性が落ちてしまわないように、なるべく早く使用することが好ましい。保管する場合は、６５℃で３０分乾燥後、デシケータ中で保管することが好ましい。
一方、活性化キットを用いないで基板を活性化することもできる。この場合は、以下のようにして行う。
まず、基板表面を活性化する。以下のものを準備する。
・軟ダイヤモンドコートスライドグラス
・１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド
（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔ
ｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
・Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｅ）
・リン酸二水素カリウム
・リン酸水素二カリウム
・滅菌水
まず、活性エステル化（カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）活性エステル化）を行う。活性化液の組成は以下のとおりのものを用いた。
・Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｅ）：２０ｍＭ
・１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド：０．
１Ｍ
（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈ
ｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
・リン酸バッファー（ｐＨ６）：０．１Ｍ
２００ｍＬビーカーに、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミド（１−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）９５９ｍｇと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）１１５ｍｇを採り、５０ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ６）で溶解し、これにスライドグラスを浸漬して前記の活性化キットを用いた場合と同様に反応させ、洗浄した。
（３）スポッティング
次に、活性化した基板にＤＮＡを貼り付けた（いわゆるスポッティング）。
まず、以下のものを準備した。
・軟ダイヤモンドコートスライドグラス（活性化済み）
・ＤＮＡサンプル
・ホルムアミド
・滅菌水
・スポッター
ＤＮＡサンプルを濃度が１μｇ／μＬとなるように１０％ホルムアミド溶液（スポッティング用バッファー）に溶解してスポッティング用溶液を準備した。スポッティング用溶液を９５℃で５分熱変性し、４℃まで急冷した。図３に示すようにスポッターの針で液を吸取り（図３のａ）、軟ダイヤモンドコートスライドグラス表面に押し付けて（同ｂ）、ＤＮＡ液を基板に押し付けた（同ｃ）。このようにしてスライドグラス表面に多数貼り付けた（同ｄ）。
（４）インキュベーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス、飽和ＮａＣｌ水溶液、タイトボックス及びインキュベーターを準備して行った。飽和ＮａＣｌ溶液（例えば水＋ホルムアミド（１：１）溶液）を入れたタイトボックスを、４℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が４℃になるまで約１時間放置し、調湿チャンバーを準備した。
タイトボックスが調湿チャンバーとなった状態でインキュベーターから取り出し、ＮａＣｌ飽和水にふれないようにタイトボックス内に軟ダイヤモンドコートグラスを入れた（底上げをした上に載せた）。タイトボックスを再びインキュベーターに入れ、１時間放置した。この間も湿度を高く保つべく温度調整を行った。軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れた状態のタイトボックスを図４に示す。その後、８０℃のオーブン中で３時間乾燥した。
（５）プレハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス（スポット及びインキュベーション済み）、カバーグラス、サーモンＤＮＡ、２０×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳ、ホルムアミド、滅菌水、１．５ｍＬ  反応チューブ、２００μＬエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、２００ｍＬ  ビーカー、ブロアー、飽和ＮａＣｌ水溶液、タイトボックス及びインキュベーターを用意して以下の操作を行った。
まず、前記（４）インキュベーションの場合と同様に、飽和ＮａＣｌ溶液を入れたタイトボックスを、３７℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が３７℃になるまで約１時間放置し、調湿チャンバーを準備した。これとは別にプレハイブリダイゼーション用溶液を調製した。
サーモンＤＮＡ（サンプルとは関係のないＤＮＡをいう）サンプルを１ｍｇ反応チューブに測り採り、５００μＬ滅菌水で溶解する。その後、２０×ＳＳＣを２５０μＬ、１０％ＳＤＳを５０μＬ、ホルムアミドを２００μＬ添加する。攪拌後、必要な量をエッペンドルフチューブに採り、プレハイブリダイゼーション用溶液とした。
本実施例においてはスポット範囲が１ｃｍ×１ｃｍの場合、基板１枚あたり１５μＬとした。
続いて、プレハイブリダイゼーション用溶液を９５℃で５分間熱変性し、４℃まで急冷した。軟ダイヤモンドコートスライドグラス中の予めＤＮＡをスポットした場所に、プレハイブリダイゼーション用溶液を滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せた。こうして、サーモンＤＮＡでスポット部位以外のスライドグラス表面をマスキングした（図５参照）。
次に、タイトボックスをインキュベーターから取り出し、ＮａＣｌ飽和水に触れないように軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れ、反応を進めるため１時間放置した。
次に、洗浄を行った。軟ダイヤモンドコートスライドグラスをインキュベーターから取り出し、２００ｍＬビーカーに入れた１×ＳＳＣ溶液中で、カバーグラスをはずした。次に、１×ＳＳＣと０．２％ＳＤＳをはったバット中に表面を上にして入れ、振とう機を用いて５分間振とうした（図６）。その後、１×ＳＳＣと０．２％ＳＤＳを捨ててもう一度１×ＳＳＣと０．２％ＳＤＳを入れ、５分間振とうした。もう一度同様に１×ＳＳＣと０．２％ＳＤＳで洗浄した後、０．１×ＳＳＣで軽くリンスし、ブロアーを用いて基板表面の溶液を除去した。
（６）ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス（プレハイブリダイゼーション済み）、カバーグラス、ターゲットＤＮＡ、２０×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳ、ホルムアミド、滅菌水、２００μＬエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、２００ｍＬ  ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、飽和ＮａＣｌ水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、飽和ＮａＣｌ溶液を入れたタイトボックスを、３７℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が３７℃になるまで約１時間放置して、調湿チャンバーを準備した。
次に、ＤＮＡサンプルの蛍光標識を行った。蛍光標識は、蛍光標識ラベルキットに従って行うか、あるいは逆転写酵素反応を利用して蛍光標識することができる。
続いて、１μｇ／μＬの蛍光標識ＤＮＡサンプル２μＬを反応チューブに採り、４８μＬの滅菌水を加えた。その後、２０×ＳＳＣを２５μＬ、１０％ＳＤＳを５μＬ、ホルムアミドを２０μＬ添加し、撹拌し、ハイブリダイゼーション用溶液を調製した。
ハイブリダイゼーション用溶液を軟ダイヤモンドコートスライドグラスに滴下し、気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せた。次に、タイトボックスをインキュベーターから取り出し、ＮａＣｌ飽和水に触れないように前記スライドグラスを入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れ、１時間放置した。このようにして、蛍光標識したＤＮＡが基板上に予めスポッティングしたＤＮＡにハイブリダイズさせた（図７参照）。
最後に洗浄を行った。基板をインキュベーターから取り出し、２００ｍＬ  ビーカーを入れた１×ＳＳＣ溶液中で、カバーグラスをはずした。次に、１×ＳＳＣと０．２％ＳＤＳを張ったバット中に表面を上にして入れ、振とう機を用いて５分間振とうした。もう一度同様に１×ＳＳＣと０．２％ＳＤＳで洗浄した後、０．１×ＳＳＣで軽くリンスし、ブロアーを用いて基板表面の溶液を除去した。（７）検出
検出は蛍光画像読み取り用スキャナーを用意し、軟ダイヤモンドコートスライドグラス表面のＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光標識を、蛍光画像を読み取ることにより行った。
なお、上記説明では、ＤＮＡの検出について説明したが、ＤＮＡの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
（実施例２）
実施例１と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、実施例１と同様な活性化を行った。スポッティングは、実施例１で用いた溶液のうち、ホルムアミドの替わりに１０％グリセリンを用いた。
（４）インキュベーション
インキュベーションはＮａＣｌ飽和水を入れたタイトボックスを、４℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が４℃になるまで、約１時間放置する。タイトボックスをインキュベーターから取り出し、ＮａＣｌ飽和水にふれないように基板を入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れ、１時間放置する。ＮａＣｌ飽和水を入れたタイトボックスを、６５℃に設定したインキュベーターに入れ、１時間放置し、乾燥した。乾燥後、２０ｘＳＳＣと１０％ＳＤＳを含んだバッファー液で洗浄した。なお、実施例１で実施したプレハイブリダイゼーションは行わなかった。
（６）ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス（プレハイブリダイゼーション済み）、カバーグラス、ターゲットＤＮＡ、２０×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳ、ホルムアミド、滅菌水、２００μＬエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、２００ｍＬ  ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、飽和ＮａＣｌ水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、飽和ＮａＣｌ溶液を入れたタイトボックスを、４５℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が４５℃になるまで約１時間放置して、調湿チャンバーを準備した。以後の処理は実施例１と同様に行った。
検出も実施例１と同様に、行った。なお、ＤＮＡの検出について説明したが、ＤＮＡの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
（実施例３）
実施例１と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、実施例１と同様な活性化を行った。スポッティングは、実施例１で用いた溶液のうち、ホルムアミドの替わりに１０％グリセリンを用いた。
（４）インキュベーション
インキュベーションはＮａＣｌ飽和水を入れたタイトボックスを、４℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が４℃になるまで、約１時間放置する。タイトボックスをインキュベーターから取り出し、ＮａＣｌ飽和水にふれないように基板を入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れ、１時間放置する。ＮａＣｌ飽和水を入れたタイトボックスを、６５℃に設定したインキュベーターに入れ、１時間放置し、乾燥した。基板表面に、濃度が０．５％のアガロースゲルを載せた後、基板をタイトボックス中に入れ、タイトボックスを４５℃インキュベーターに１２時間入れた。
２ｘＳＳＣと０．２％ＳＤＳを含んだバッファー溶液で洗浄後、更に、０．１ｘＳＳＣで洗浄した。最後に、７０％エタノール溶液で洗浄した。なお、実施例１で実施したプレハイブリダイゼーションは行わなかった。
（６）ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス（プレハイブリダイゼーション済み）、カバーグラス、ターゲットＤＮＡ、２０×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳ、ホルムアミド、滅菌水、２００μＬエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、２００ｍＬ  ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、飽和ＮａＣｌ水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、飽和ＮａＣｌ溶液を入れたタイトボックスを、４５℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が４５℃になるまで約１時間放置して、調湿チャンバーを準備した。以後の処理は実施例１と同様に行った。
検出も実施例１と同様に、行った。なお、ＤＮＡの検出について説明したが、ＤＮＡの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
（実施例４）
実施例１と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、実施例１と同様な活性化を行った。スポッティングは、実施例１で用いたホルムアミドを添加せず、超純水のみで調製した。
（４）インキュベーション
インキュベーションは５０％ホルムアミド水溶液を入れたタイトボックスを、６０℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が６０℃になるまで、約１時間放置する。タイトボックスをインキュベーターから取り出し、５０％ホルムアミド水溶液にふれないように基板を入れ（底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れ、３時間放置した。２ｘＳＳＣと０．２％ＳＤＳを含んだバッファー溶液で洗浄後、更に、０．１ｘＳＳＣで洗浄し、滅菌水で濯いだ後にブロアーで乾燥した。次にプレハイブリダイゼーション溶液（５×デンハルト液、５０％ホルムアミド）を基板に滴下し、気泡が入り込まないようにカバーバラスを静かに載せる。タイトボックスを６０℃に設定したインキュベーターから取り出し、５０％ホルムアミドにふれないように基板をいれた。基板の入ったタイトボックスを６０℃に設定したインキュベーターに入れ、１時間プレハイブリダイゼーションを行った。
０．１×ＳＳＣでカバーグラスを洗い落とし、滅菌水で１５分間洗浄した。その後、ブロアーで氷塩の溶液を吹き飛ばした。
（６）ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライドグラス（プレハイブリダイゼーション済み）、カバーグラス、ターゲットＤＮＡ、２０×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、１０％ＳＤＳ、ホルムアミド、滅菌水、２００μＬエッペンドルフチューブ、バット、振とう機、２００ｍＬ  ビーカー、ブロアー、蛍光標識キット、５０％ホルムアルデヒド水溶液、タイトボックス、インキュベーターを用意した。
まず、５０％ホルムアルデヒド水溶液を入れたタイトボックスを、４５℃に設定したインキュベーターに入れ、タイトボックス全体が４５℃になるまで約１時間放置して、調湿チャンバーを準備した。以後の処理は実施例１と同様に行った。
検出も実施例１と同様に、行った。なお、ＤＮＡの検出について説明したが、ＤＮＡの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
産業上の利用可能性
本発明の活性化キットを用いることにより、Ａ液とＢ液とを調整し、一段階の反応だけで基板を活性化できるので、基板を簡便にかつ迅速に活性化できる。
また、本発明のＤＮＡ又は蛋白質の検出方法によれば、プレハイブリダイゼーションを行うので、余分な活性点にもＤＮＡが付着してしまうことなく、正確なＤＮＡ検出が可能である。
さらに、ゲル溶液を使ってインキュベーションを行うと、安定かつ促進した固定化反応が行われるので、正確なＤＮＡ又は蛋白質の検出が可能である。
したがって、本発明は、医療分野での疾病診断、生化学、分子生物学分野での研究等、各分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、表面が活性エステル化された基板の模式図である。図２は、基板表面にＤＮＡを固定化する反応の概略を示す図である。図３は、スポッティングのプロセスを示す図である。図４は、タイトボックスの断面図である。図５は、プレハイブリダイゼーションのプロセスを示す図である。図６は、洗浄工程を示す図である。図７は、ハイブリダイゼーションのプロセスを示す図である。
【図１】
0004730808.tif 000002
【図２】
0004730808.tif 000003
【図３】
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【図４】
0004730808.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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