(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの加熱ステップを伴う食品を製造するための方法であって、前記製造方法における前記食品の中間形態にアスパラギナーゼを添加することを含み、前記アスパラギナーゼは、
前記食品の前記中間形態に存在し前記加熱ステップ中のアクリルアミド形成に関与するアミノ酸のレベルを低下させるのに有効な量で、前記加熱ステップの前に添加されるものであり、
アスパラギンの側鎖を修飾するものであり、かつ、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるアスパラギナーゼである、方法。
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一なアミノ酸配列を有し且つアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドからなる単離されたアスパラギナーゼ
（ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得ることが可能な、前記アスパラギナーゼ（ａ）
（ｃ）適切な宿主細胞であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおいて、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）を発現させることによって得られる、単離されたアスパラギナーゼ
（Ｉ）下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド
（ｉ）高ストリンジェントな条件下で、配列番号１のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な、単離されたポリヌクレオチド
（ｉｉ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得ることが可能な、前記ポリヌクレオチド（ｉ）
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一なアミノ酸配列を有し且つアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドからなるアスパラギナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であり且つアスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド
（ｖ）配列番号１からなる、単離されたポリヌクレオチド
（ＩＩ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれるベクター
（ｉ）前記（Ｉ）のポリヌクレオチド配列を含むベクター
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチド配列が、適切な宿主細胞内での前記ポリヌクレオチド配列の発現に適切な調節配列に、動作可能に結合する、前記ベクター（ｉ）
（ｉｉｉ）前記適切な宿主細胞が糸状菌である、前記ベクター（ｉｉ）
【請求項２】
前記食品が少なくとも１種の植物原料から作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記食品が、小麦粉及びジャガイモを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アスパラギナーゼが、前記製造方法の加熱ステップ中のアクリルアミド形成に関与するアミノ酸の側鎖を修飾することができ、前記アミノ酸の分解生成物が、非修飾形態のアミノ酸に比べてアクリルアミドの形成を引き起こすことがなく、又は少なくともより少ない程度にしか引き起こさない、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アスパラギナーゼが、酵素製剤として添加され、又は前記アスパラギナーゼを生成することができる微生物によってその場で生成される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素製剤が微生物に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、細菌、真菌、又は酵母菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
高ストリンジェントな条件で配列番号１又は配列番号２のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であり、且つアスパラギナーゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１又は配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％が同一である、請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
糸状菌から得ることが可能な、請求項８又は９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得ることが可能な、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一なアミノ酸配列を有し且つアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドからなるアスパラギナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１若しくは配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号１若しくは配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であり且つアスパラギナーゼをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１又は配列番号２からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項８から１４のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞内での前記ポリヌクレオチドの発現に適切な調節配列に、動作可能に結合する、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１７】
前記適切な宿主細胞が糸状菌である、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞から前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを単離するステップと、を含む、請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターを製造するための方法。
【請求項１９】
配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一なアミノ酸配列を有し且つアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドからなる単離されたアスパラギナーゼ。
【請求項２０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得ることが可能な、請求項１９に記載の単離されたアスパラギナーゼ。
【請求項２１】
適切な宿主細胞の中で、請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターを発現することによって得ることが可能な、単離されたアスパラギナーゼ。
【請求項２２】
請求項８から１４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターで、適切な宿主細胞を形質転換するステップと、前記ポリヌクレオチドの発現が可能な条件下で前記細胞を培養するステップと、前記細胞又は培地からコードされたポリペプチドを任意に精製するステップと、を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼを製造するための方法。
【請求項２３】
請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクター、を含む、組換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１９から２１のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼを発現する、組換え宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１から７のいずれか一項に記載の食品を製造するための方法における、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの加熱ステップを含んだ食品を製造するための方法と、それによって得られた食品に関する。さらに本発明は、本発明による方法に適した新規な酵素と、この新規な酵素をコードする遺伝子を含む新たに同定されたポリヌクレオチド配列に関する。
【０００２】
アクリルアミドは、様々な技術的応用例のために、長い間商業的に生産されており、従ってその毒物学的背景については十分調べられている。アクリルアミドはポリアクリルアミドの生成に使用され、この後者の化合物が、飲料水の製造、土質安定化、工場排水処理、油の採掘、及び実験室での応用例で利用される。
【０００３】
アクリルアミドは、動物及びヒトに対して、おそらくは発癌性があるものと見なされている。１９９１年、食品に関する科学評議会（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ）は、食品材料と接触させたモノマーアクリルアミドについて調査し、その評価において、アクリルアミドは遺伝毒性のある発癌性物質であると結論付けた。Ｂｅｒｇｍａｒｋら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１０、７８〜８４（１９９７））は、アクリルアミドがタバコの煙の成分でもあることを実証し、これが生体物質の加熱とアクリルアミドの形成との最初のリンクであった。最近、オーブンで調理された食品や多くの食品中にアクリルアミドが発生することが公表され（Ｔａｒｅｋｅら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１３、５１７〜５２２（２０００））、それが世界的な関心となった。別の調査では、様々な焼き物、揚げ物、及びオーブンで調理された一般的な食品中にかなりの量のアクリルアミドを検出できることが明らかになり、食品中でのアクリルアミドの発生は、ベーキングプロセスを経た結果であることが実証された。
【０００４】
食品のアクリルアミド汚染に関する英国での公式の限度は１０ｐｐｂ（キログラム当たり１０マイクログラム）に設定され、多くの製品、特にシリアル、パン製品、及びポテトチップにおける上述した値は、この限度値を大幅に超える。
【０００５】
投与されるアクリルアミドの用量と腫瘍発生率との関係を動物実験で観察した。この実験では飲料水を介してラットにアクリルアミドを与え、２年間でどのような運命を辿るのかを観察した（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｆｕｎｄａｍ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８５：１５４〜１６８．Ｍ．（１９８６）、及びＪｏｈｎｓｏｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８５：１５４〜１６８（１９８６））。３４４匹のＦｉｓｃｈｅｒラットの飲料水に取り込まれたアクリルアミドに関して、慢性毒性及び腫瘍原性の研究がなされた。
【０００６】
これらのデータと、ヘモグロビン（Ｎ−（２−カルバモイルエチル）バリン）に結合したアクリルアミドがラットの餌に含まれているアクリルアミドの機能であることを研究したＴａｒｅｋｅらによって収集された結果とを組み合わせると、アクリルアミドの１日の摂取量は１．６μｇアクリルアミド／ｋｇであることが計算され、これはヒトが生涯にわたって曝露され場合の癌リスクが７×１０−３であること相当する。
【０００７】
メイラード反応の結果として、アミノ酸及び還元糖からアクリルアミドを形成するための経路が、ＭｏｔｔｒａｍらのＮａｔｕｒｅ  ４１９；４４８（２００２）に提案されている。この仮説によれば、アクリルアミドはメイラード反応中に形成されているかもしれない。ベーク中及びロースト中、メイラード反応は主に色、香り、及び味を左右する。メイラードに関連した反応はアミノ酸のＳｔｒｅｃｋｅｒ分解であり、アクリルアミドへの経路が提案された。アクリルアミドの形成は、温度が１２０℃を超えたときに検出可能になり、最も高い形成速度は１７０℃程度で観察された。アスパラギン及びグルコースが存在する場合はアクリルアミドが最も高いレベルで観察され、一方、グルタミン及びアスパラギン酸ではごく微量であった。アクリルアミドが主にアスパラギン及びグルコースから形成されることは、オーブンで調理し又はローストした植物ベースの製品等のアクリルアミドが高レベルであることを説明することができる。いくつかの植物原材料は、かなりのレベルのアスパラギンを含有することが知られている。ジャガイモでは、アスパラギンが、最も多く含まれる遊離アミノ酸であり（９４０ｍｇ／ｋｇ、全アミノ酸含量の４０％に相当）、小麦粉では、アスパラギンが、約１６７ｍｇアスパラギン／ｋｇ粉のレベルで存在し、これは全遊離アミノ酸プールの１４％に相当する（ＢｅｌｉｔｚとＧｒｏｓｃｈ、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）。
【０００８】
従って公衆衛生のため、アクリルアミドが実質的に低レベルであり、又は好ましくはアクリルアミドを含まない食品が至急求められている。第１の例では、食品中でのアクリルアミド形成のメカニズムを明らかにするために研究活動を開始した。これまで、その結果は、依然として満足のいく問題解決策には至っていない。第２に、食品会社は、オーブン調理及びローストプロセスの温度を低下させることによってアクリルアミドの形成を回避する可能性について調査している。当然ながら、このようにすることによって、本質的に味の特性が変わった食品になり（メイラード生成物が少ない）、また、このようにすることによって、サルモネラ菌などの微生物汚染が増大するという危険性が高まる。
【０００９】
本発明は、少なくとも１つの加熱ステップを伴う、食品を製造するための方法であって、前記製造方法で前記食品の中間形態に１種又は複数の酵素を添加することを含み、前記酵素が、前記加熱ステップ中のアクリルアミド形成にアミノ酸が関与する前記食品の、前記中間形態に存在するアミノ酸のレベルを低下させるのに有効な量で、前記加熱ステップの前に添加される方法を提供する。
【００１０】
本明細書では、中間形態にある食品を、食品の最終形態を得る前の製造過程で生ずる任意の形態と定義する。中間形態は、使用される個々の原材料、及び／又はそれらの混合物、及び／又は添加剤及び／又は加工助剤との混合物、あるいはこれらを引き続き加工した形態を含めることができる。例えば、食品としてのパンの場合、その中間形態には例えば、小麦、小麦粉、これらと例えば水や塩、イースト菌、パン改質組成物などその他のパン成分との初期混合物、ミックス生地、練り生地、発酵生地、半焼き生地が含まれる。
【００１１】
食品は、例えばジャガイモやタバコ、コーヒー、ココア、米、穀物、例えば小麦やライ麦、トウモロコシ（ｃｏｒｎ、ｍａｉｚｅ）、大麦、グロート、ソバ、カラスムギなど、植物由来の少なくとも１種の原材料から作製することができる。小麦は、ここではまた以下において、コムギ（Ｔｒｔｉｃｕｍ）属で知られている全ての種、例えばａｅｓｔｉｖｕｍ種、ｄｕｒｕｍ種、及び／又はｓｐｅｌｔａ種を包含するものとする。また、１以上の原材料から作製された食品も本発明の範囲に含まれ、例えば小麦（粉）とジャガイモの両方を含む食品がある。
【００１２】
本発明による方法を適切に用いることができる食品の例は、任意の穀粉ベースの製品、例えば、パン、ペーストリー、ケーキ、プレッツェル、ベーグル、ダッチハニーケーキ、クッキー、ジンジャーブレッド、ジンジャーケーキ、及びクリスプブレッド、任意のジャガイモベースの製品、例えばフレンチフライ、フライドポテト、ポテトチップス、コロッケである。
【００１３】
上述の原材料は、製造方法の加熱ステップ中にアクリルアミドの形成に関与するかなりの量のアミノ酸を含有することが知られている。あるいは、このようなアミノ酸は、原材料以外の供給源、例えば食品製造方法で添加剤として使用される酵母エキスや大豆加水分解物、カゼイン加水分解物などのタンパク質加水分解物から由来し得る。好ましい製造方法は、パンと、小麦粉及び／又はその他の穀物由来の穀粉から得られるその他のベークド製品を焼くことである。別の好ましい製造方法は、ポテトスライスからポテトチップスをたっぷりの油で揚げることである。
【００１４】
好ましい加熱ステップは、中間食品の少なくとも一部、例えば食品の表面を、アクリルアミドの形成が促進する温度、例えば１１０℃以上、最高でも１２０℃以上の温度に曝すことである。本発明による方法の加熱ステップは、オーブンの中で、例えばパン及びその他のベーカリー製品を焼くように１８０〜２２０℃の温度で実施することができ、又は油の中で、ポテトチップを揚げるように例えば１６０〜１９０℃の温度で実施することができる。
【００１５】
本発明の方法で使用される酵素は、製造方法の加熱ステップ中にアクリルアミドの形成に関与するアミノ酸の側鎖を修飾する酵素であることが好ましく、そのようにすると、前記アミノ酸の分解生成物は、分解していない形のアミノ酸に比べ、アクリルアミドの形成が全く引き起こさず、又は少なくともより少ない程度でしか引き起こさない。酵素は、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、チロシン、及び／又はトリプトファンの少なくとも１種のアミノ酸の側鎖を修飾させることが好ましい。酵素は、酵素製剤として添加することができ、又は前記酵素を産生することが可能な微生物によってその場で生成することができる。酵素製剤は微生物由来であり、当技術分野で知られている発酵プロセスによって得ることが好ましい。その微生物は、細菌、真菌、又は酵母菌でよい。本発明の好ましい実施形態では、方法が、アスパラギナーゼ（ＥＣ  ３．５．１．１）又はグルタミナーゼ（ＥＣ  ３．５．１．２）を添加することを含む。
【００１６】
アスパラギナーゼは、様々な供給源、例えば植物や動物、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ）種などの微生物から得ることができる。適切なエシェリキア株の例は大腸菌である。適切なエルウィニア株の例はＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉである。適切なストレプトマイセス株の例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓである。適切なアスペルギルス株の例は、コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、為巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、又は黒色コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）である。適切なバチルス株の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｕｉｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓである。バチルス株、ストレプロマイセス株、エシェリア株、又はシュードモナス株からアスパラギナーゼを得るのに適切な方法の例は、ＷＯ０３／０８３０４３に記載されている。しかし、ＷＯ０３／０８３０４３では、本発明で述べるように食品中のアクリルアミドの量を低下させるのにアスパラギナーゼを使用することが開示されていない。
【００１７】
食品級の生物、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒやＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを使用することが好ましい。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得ることができる新規なアスパラギナーゼをコードする遺伝子を含む、新たに同定されたポリヌクレオチド配列を提供する。新規なアスパラギナーゼは、本発明の食品製造方法、例えば生地からベークド製品を製造する際に使用することができる。
【００１９】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、新規なアスパラギナーゼ酵素をコードする新規なポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号３に基づくアミノ酸配列からなるアスパラギナーゼ又はその機能的均等物であって、暫定的にＡＳＰＡ０１と呼ばれるアスパラギナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＡＳＰＡ０１をコードする遺伝子の配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得られるゲノミッククローンの配列決定を行うことによって決定した。本発明は、ＡＳＰＡ０１アスパラギナーゼの完全長ｃＤＮＡ配列及びそのコード配列と同様に、ＡＳＰＡ０１アスパラギナーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を提供する。従って本発明は、配列番号１又は配列番号２によるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド又はその機能的均等物に関する。
【００２０】
より詳細には、本発明は、ストリンジェントな条件下、好ましくは高ストリンジェントな条件下で配列番号１又は配列番号２に基づくポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な、単離されたポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、糸状菌、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得られることが有利である。より詳細には、本発明は、配列番号１又は配列番号２によるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
また本発明は、配列番号３によるポリペプチド又はその機能的均等物の少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００２２】
本明細書で使用する「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、例えばＡ．ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼなど、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、染色体ＤＮＡから単離することができる核酸分子を指す。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロン、及び調節配列を含んでもよい。さらに遺伝子は、本明細書で定義される単離された核酸分子を指す。
【００２３】
配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はその機能的均等物などの本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学技法及び本明細書に記載する配列情報を使用して単離することができる。例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸配列又は配列番号２のヌクレオチド配列の全て又は一部を使用することにより、本発明の核酸分子を、標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技法を使用して単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載）。
【００２４】
さらに、配列番号１又は配列番号２の全て又は一部を包含する核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に含有される配列情報に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することができる。
【００２５】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法によって、適切なオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡを使用することにより増幅することができる。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングすることができ、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。
【００２６】
さらに、本発明によるヌクレオチド配列に対応し又はこの配列とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技法によって、例えば自動ＤＮＡ合成装置を使用して調製することができる。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号２の配列は、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＳＰＡ０１  ｃＤＮＡのコード領域に対応する。このｃＤＮＡは、配列番号３によるＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＳＰＡ０１ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態で、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列又はこれらヌクレオチド配列の機能的均等物の相補鎖である核酸分子を含む。
【００２９】
別のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、その他のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができそれによって安定な二重鎖が形成されるよう、他方のヌクレオチド配列に十分相補的なものである。
【００３０】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子又はその機能的均等物であって、生物学的に活性のある断片やドメインなど、ならびに本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子、及び核酸分子の増幅又は変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するのに適切な核酸分子の断片に関する。
【００３１】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離された核酸」は、それが得られる生物で自然に生ずるゲノムにおいては直接隣接しているコード配列の両方に（一方は５’末端に、他方は３’末端に）、直接隣接していないＤＮＡ又はＲＮＡである。従って一実施形態では、単離された核酸が、コード配列に直接隣接する５’末端非コード（例えばプロモーター）配列の一部又は全てを含む。従ってこの用語は、例えば、ベクターに組み込まれ、自律的に複製するプラスミド又はウイルスに組み込まれ、あるいは原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいはその他の配列とは無関係の別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素処理によって生成されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。またこの用語は、（組換えＤＮＡ技法によって生成する場合は）細胞性物質、ウイルス性物質、又は培地、あるいは、（化学的に合成する場合は）化学的前駆体又はその他の化学物質を、実質的に含まない追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として自然に生じることなく、また自然の状態で見出すことのできない核酸断片である。
【００３２】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）と、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）と、ヌクレオチド類似体を使用して生成したＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むものである。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であるが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。核酸は、オリゴヌクレオチドの類似体又は誘導体（例えばイノシン又はホスホロチオエート型ヌクレオチド）を使用して合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば塩基対合能力が変化し又はヌクレアーゼ耐性が増大した核酸を調製することができる。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、ＡＳＰＡ０１核酸分子に対してアンチセンスである単離した核酸分子を提供し、例えばＡＳＰＡ０１核酸分子のコーディング鎖である。また本発明の範囲には、本明細書に記載される核酸分子の相補鎖も含まれる。
【００３４】
（配列決定エラー）
本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基を含める必要があるほど狭く解釈すべきではない。本明細書で開示される特定の配列は、糸状菌、特にＡ．ｎｉｇｅｒから完全遺伝子を単離するのに容易に使用することができ、これをさらに簡単に配列分析にかけ、それによって配列決定エラーを特定することができる。
【００３５】
他に特に指示しない限り、本明細書でＤＮＡ分子の配列決定によって決定された全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシーケンサーを使用して決定し、また本明細書で決定したＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上述のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予測した。従って、この自動化手法により決定された任意のＤＮＡ配列に関する技術分野で知られているように、本明細書で決定されたどのヌクレオチド配列も、いくつかのエラーを含む可能性がある。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、配列決定したＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対し、典型的な場合には少なくとも約９０％が同一であり、より典型的な場合には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％が同一である。実際の配列は、当技術分野で周知の手動によるＤＮＡ配列決定法を含めたその他の手法によって、より精密に決定することができる。当技術分野でも知られるように、実際の配列と比較したときに決定済みのヌクレオチド配列の１カ所に挿入又は欠失がある場合、その挿入又は欠失は、ヌクレオチド配列のフレームシフト翻訳を引き起こすことになり、その結果、決定済みのヌクレオチド配列によってコードされた予測されるアミノ酸配列は、そのような挿入点又は欠失点を起点として、配列決定済みのＤＮＡ分子によって実際にコードされたアミノ酸配列とは完全に異なるようになる。
【００３６】
当業者なら、そのように誤って同定された塩基を特定することができ、そのようなエラーをどのように訂正すべきかわかっている。
【００３７】
（核酸断片、プローブ、及びプライマー）
本発明による核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に示される核酸配列の一部又は断片のみを含んでよく、例えば、プローブ又はプライマーとして使用することができる断片、あるいはＡＳＰＡ０１タンパク質の一部をコードする断片を含む。ＡＳＰＡ０１遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングから決定されたヌクレオチド配列によって、その他のＡＳＰＡ０１ファミリーメンバーならびにその他の種のＡＳＰＡ０１相同体の同定及び／又はクローニングでの使用に向けて設計されたプローブ及びプライマーの生成が可能になる。典型的には、プローブ／プライマーは、好ましくは高ストリンジェントな条件下で、配列番号１又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列又はその機能的均等物中の少なくとも約１２又は１５個、好ましくは約１８又は２０個、好ましくは約２２又は２５個、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５個以上の連続したヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を典型的に含む、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００３８】
ＡＳＰＡ０１ヌクレオチド配列に基づくプローブを使用して、例えばその他の生体において同じか又は類似のタンパク質をコードする転写物又はゲノムＡＳＰＡ０１配列を検出することができる。好ましい実施形態では、プローブはさらに、そこに結合した標識基を含み、例えばこの標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素補助因子とすることができる。そのようなプローブは、ＡＳＰＡ０１タンパク質を発現する細胞を同定するための診断検査キットの一部として使用することもできる。
【００３９】
（同一性＆相同性）
「相同性」又は「同一性％」という用語は、本明細書では同義として使用する。本発明の目的において、本明細書では、これらは２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性％を決定するために定義され、これらの配列を、最適な比較が行われるよう整列化する（例えば、第１のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入して、第２のアミノ酸配列又は核酸配列に対して最適なアライメントを行うことができる）。次いでアミノ酸残基又はヌクレオチドを、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置で比較する。第１の配列におけるある位置が、これに対応する第２の配列の位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性％は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重なり位置）×１００）。２つの配列は同じ長さであることが好ましい。
【００４０】
当業者なら、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能である点に気付くであろう。例えば、配列の比較及び２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。好ましい実施形態で、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、又は４と、レングスウェイト１、２、３、４、５、又は６とを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定する。当業者なら、これら異なるパラメータの全てによってわずかに異なる結果がもたらされるが、２つの配列の全体的な同一性％は、異なるアルゴリズムを使用した場合に著しく変化しないことが理解されよう。
【００４１】
さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスと、ギャップウェイト４０、５０、６０、７０、又は８０と、レングスウェイト１、２、３、４、５、又は６とを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定する。別の実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性％は、ＰＡＭ１２０ウェイトレズィデュウテーブルと、ギャップレングスペナルティ１２と、ギャップペナルティ４とを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉで入手可能）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７（１９８９））を使用して決定する。
【００４２】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えばその他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定するために、公用データベースに対して探索を行うための「照会配列」としてさらに使用することができる。そのような探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、本発明のＡＳＰＡ０１核酸分子に類似するヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、本発明のＡＳＰＡ０１タンパク質分子に類似するアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実施することができる。比較のためギャップ付きアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されたようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
（ハイブリダイゼーション）
【００４３】
本明細書で使用する「ハイブリダイジング」という用語は、典型的な場合に、互いに対して少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％から９０％、より好ましくは少なくとも９５％が相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままになる、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を述べるものとする。
【００４４】
そのようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例では、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイズした後、５０℃で、好ましくは５５℃で、好ましくは６０℃で、さらにより好ましくは６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄する。
【００４５】
高ストリンジェントな条件には、例えば５×ＳＳＣ／５×デンハート溶液／１．０％  ＳＤＳ中、６８℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、室温で洗浄することが含まれる。あるいは、洗浄を４２℃で行ってよい。
【００４６】
当業者なら、ストリンジェント及び高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のいずれの条件を適用すればよいかわかるであろう。そのような条件に関する追加の指針は当技術分野で容易に入手可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）で入手可能である。
【００４７】
当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域）又はＴ（又はＵ）残基の相補的領域とだけハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズするのに使用される本発明のポリヌクレオチドに含めることができないが、それはこのようなポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）領域又はその相補鎖を含有する任意の核酸分子とハイブリダイズする可能性があるからである（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）。
【００４８】
（その他の生物から完全長ＤＮＡを得ること）
典型的な手法では、その他の生物、例えば糸状菌、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種から構成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００４９】
例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株は、ノーザンブロット分析により、相同なＡＳＰＡ０１ポリヌクレオチドを目的としてスクリーニングすることができる。本発明によるポリヌクレオチドに相同な転写物を検出することにより、当業者に周知の標準的な技法を利用して、適切な株から単離したＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。あるいは、本発明によるＡＳＰＡ０１ポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブを使用して、トータルゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００５０】
相同遺伝子配列は、例えば本明細書で教示するヌクレオチド配列に基づいて設計された、２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用するＰＣＲを実施することによって、単離することができる。
【００５１】
反応用の鋳型は、本発明によるポリヌクレオチドを発現することが知られており又は発現すると考えられる株から調製したｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡとすることができる。ＰＣＲ産物は、増幅した配列が新しいＡＳＰＳ０１核酸配列又はその機能的均等物の配列を表すことを確実にするために、サブクローニングし、また配列決定することができる。
【００５２】
次いでＰＣＲ断片を使用して、様々な既知の方法により完全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。例えば、増幅した断片を標識し、これを使用してバクテリオファージ又はコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいは、標識した断片を使用してゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００５３】
ＰＣＲ技法は、その他の生物から完全長ｃＤＮＡ配列を単離するのにも使用することができる。例えばＲＮＡは、標準的な手順に従って、適切な細胞又は組織源から単離することができる。逆転写反応は、第１鎖の合成を刺激するため、増幅した断片の５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＮＡ上で行うことができる。
【００５４】
次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応を使用して（例えばグアニンで）「テイルド」し、そのハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化後、次いで第２の鎖合成を刺激することができる（例えばポリＣプライマーで）。このため、増幅した断片の上流にあるｃＤＮＡ配列を、容易に単離することができる。有用なクローニング戦略の概説については、例えば前掲のＳａｍｂｒｏｏｋら、及び前掲のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。
【００５５】
相同ＤＮＡ断片が機能的ＡＳＰＡ０１タンパク質をコードするか否かは、当技術分野で知られている方法によって容易に試験することができる。
【００５６】
（ベクター）
本発明の別の態様は、ＡＳＰＡ０１タンパク質をコードする核酸又はその機能的均等物を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、核酸分子、すなわちそこに結合している別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメンセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、このベクターが導入される宿主細胞内で自律複製することが可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソーム性哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムと一体化し、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、これが動作可能に結合された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技法で役立つ発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、プラスミドが最も一般的に使用される形のベクターであるので、本明細書では同義として使用する。しかし本発明は、同等の機能を発揮するウイルスベクター（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）など、その他の形の発現ベクターを含むものとする。
【００５７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適切な形をした本発明の核酸を含み、これはすなわち組換え発現ベクターが、発現する核酸配列に動作可能に結合される、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択された１つ又は複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「動作可能に結合する」とは、問題のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする手法で（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、又はベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞内で）調節配列に結合することを意味するものとする。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞内で、ヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及びある特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。当業者なら、形質転換される宿主細胞に何を選択したか、また所望のタンパク質の発現レベルなどのファクタに応じて、発現ベクターの設計を変えることができることが理解されよう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入することができ、それによって、本明細書に記載する核酸によってコードされたタンパク質又はペプチドを生成することができる（例えばＡＳＰＡ０１タンパク質、ＡＳＰＡ０１タンパク質の変異形態、それらの断片、変種、又は機能的均等物など）。
【００５８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞でＡＳＰＡ０１タンパク質を発現させるように設計することができる。例えばＡＳＰＡ０１タンパク質は、例えば大腸菌のような細菌性細胞や昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、哺乳類細胞などで発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）でさらに論じられている。あるいは組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し翻訳することができる。
【００５９】
本発明で有用な発現ベクターには、染色体ベクター、エピソームベクター、及びウイルス由来ベクターが含まれ、例えば細菌性プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルスやパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどのウイルス由来のベクターと、これらの組合せから得られるベクターであって、コスミドとファージミドなどや、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝因子から得られるものなどが含まれる。
【００６０】
ＤＮＡインサートは、数例挙げると、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、及びレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターに動作可能に結合すべきである。当業者ならその他の適切なプロモーターがわかるであろう。特定の実施形態では、プロモーターは、糸状菌でのアスパラギナーゼの発現を高レベルで誘導できることが好ましい。そのようなプロモーターは当技術分野で知られている。発現構成体は、転写開始及び終了のための部位を含んでよく、転写領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでよい。この構成体によって発現する成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの初めに翻訳開始ＡＵＧを、また翻訳されるペプチドの終わりには適切に位置決めされた終止コドンを含むことになる。
【００６１】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技法を介して原核細胞又は真核細胞に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、外来の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当技術分野で認められている様々な技法を指すものとし、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、又は電気穿孔法が含まれる。宿主細胞を形質転換し又はトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）、Ｄａｖｉｓ他、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、及びその他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【００６２】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションでは、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、細胞のごく一部が外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込むことができることが知られている。これらのインテグラントを同定し選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子は、一般に目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８やハイグロマイシン、メトトレキセートなどの薬物に対する耐性を与えるものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＡＳＰＡ０１タンパク質をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入することができ、又は別個のベクターに導入することができる。導入された核酸を安定した状態でトランスフェクトした細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、その他の細胞は死ぬ）。
【００６３】
原核細胞でのタンパク質の発現は、しばしば、タンパク質の発現を指揮する誘導プロモーターあるいは構成的プロモーターを含有するベクターにより大腸菌で行われる。
【００６４】
示したように、発現ベクターは選択可能なマーカーを含有することが好ましい。そのようなマーカーは、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性を、また大腸菌及びその他の細菌における培養ではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を含む。適切な宿主の代表例には、大腸菌やストレプトマイセス、サルモネラ・チフィムリウムなどの細菌細胞；ショウジョウバエＳ２やスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯやＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞；及び植物細胞が含まれる。上述の宿主細胞に適切な培地及び条件は、当技術分野で知られている。
【００６５】
細菌で使用するのに好ましいベクターには、Ｑｉａｇｅｎ社から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ＰＱＥ−９と、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能なｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａと、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核生物用ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能なＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＺＴ１、ｐＳＧと、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＬＶがある。その他の適切なベクターは、当業者に容易に理解されよう。
【００６６】
本発明で使用される既知の細菌プロモーターには、大腸菌ｌａｃｌ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ、ＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターであって例えばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモーター、メタロチオネインプロモーターであって例えばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが含まれる。
【００６７】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増やすことができる。エンハンサーは、通常は約１０〜３００ｂｐであるＤＮＡのシス作動性エレメントであって、所与の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大させるように働くものである。エンハンサーの例には、１００〜２７０ｂｐの複製開始点の後ろ側に位置付けられたＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後ろ側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイスルエンハンサーが含まれる。
【００６８】
翻訳されたタンパク質を小胞体の管腔内、細胞周辺腔、又は細胞外環境に分泌する場合は、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込むことができる。そのようなシグナルは、ポリペプチドに対して内生的なものでよく、又は異種のシグナルでよい。
【００６９】
ポリペプチドは、修飾型で発現させてもよく、分泌シグナルだけではなく追加の異なる機能領域を含めてもよい。このため、例えば追加のアミノ酸領域、特に荷電アミノ酸をポリペプチドのＮ末端に付加することにより、精製中又はその後の取扱い及び貯蔵中において、宿主細胞内での安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分をポリペプチドに付加して、精製を容易にすることもできる。
【００７０】
（本発明によるポリペプチド）
本発明は、配列番号３によるアミノ酸配列、適切な宿主中で配列番号１のポリヌクレオチドを発現することによって得ることができるアミノ酸配列、ならびに適切な宿主中で配列番号２のポリヌクレオチド配列を発現することによって得ることができるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドの機能的均等物を含むペプチド又はポリペプチドも、本発明に含まれる。上記ポリペプチドは、まとめて「本発明によるポリペプチド」という用語に含まれる。
【００７１】
「ペプチド」及び「オリゴペプチド」という用語は同義と見なされ（一般に認められるように）、各用語は、文脈がペプチド結合によって連結された少なくとも２個のアミノ酸鎖を示す必要があるとき、区別なく使用することができる。「ポリペプチド」という単語は、本明細書では８個以上のアミノ酸残基を含有する鎖に使用する。本明細書のオリゴペプチド及びポリペプチドの全ての式又は配列は、左から右に、またアミノ末端からカルボキシ末端に向かう方向に書かれる。本明細書で使用されるアミノ酸の１文字表記は、当技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に見出すことができる。
【００７２】
「単離された」ポリペプチド又はタンパク質とは、その自然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質を意味する。例えば、宿主細胞内で発現した組換え生成によるポリペプチド及びタンパク質は、例えばＳｍｉｔｈとＪｏｈｏｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０（１９８８）に開示された単一ステップ精製法などの任意の適切な技法によって実質的に精製された天然の又は組換えポリペプチドとして、本発明のために単離されたと見なされる。
【００７３】
本発明によるＡＳＰＡ０１アスパラギナーゼは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、及びレシチンクロマトグラフィを含めた周知の方法によって、組換え細胞培養から回収し精製することができる。より好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）を用いて精製を行う。
【００７４】
本発明のポリペプチドには、自然に精製された生成物と、化学合成手順による生成物と、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞を含めた原核又は真核宿主から組換え技法によって生成された生成物が含まれる。組換え生成手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドがグリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよい。さらに本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、初期修飾メチオニン残基を含んでもよい。
【００７５】
（タンパク質断片）
本発明は、本発明によるポリペプチドの生物学的に活性を有する断片も特徴とする。
【００７６】
本発明のポリペプチドの生物学的に活性を有する断片は、完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、かつ対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの生物活性を示す、ＡＳＰＡ０１タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号３のアミノ酸配列）と十分に同一なアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。典型的な場合、生物学的に活性な断片は、ＡＳＰＡ０１タンパク質の少なくとも１つの活性を持つドメイン又はモチーフを含む。
【００７７】
本発明のタンパク質の生物学的に活性のある断片は、例えば、アミノ酸の長さが１０、２５、５０、１００、又はそれ以上であるポリペプチドとすることができる。さらに、タンパク質の生物学的に活性のある領域以外が欠失しているその他の生物学的に活性のあるタンパク質は、組換え技法によって調製することができ、本発明のポリペプチドの自然の形態の生物活性の１つ又はそれ以上について評価することができる。
【００７８】
本発明は、ＡＳＰＡ０１タンパク質の上記生物学的に活性を有する断片をコードする核酸断片も特徴とする。
【００７９】
（機能的均等物）
「機能的均等物」及び「機能的変種」という用語は、本明細書では同義として使用する。ＡＳＰＡ０１  ＤＮＡの機能的均等物は、本明細書で定義するＡＳＰＡ０１  Ａ．ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼの特定の機能を示すポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ断片である。本発明によるＡＳＰＡ０１ポリペプチドの機能的均等物は、本明細書で定義するＡ．ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼの少なくとも１つの機能を示すポリペプチドである。従って機能的均等物は、生物学的に活性な断片も包含する。
【００８０】
機能的なタンパク質又はポリペプチドの均等物は、配列番号３の１つ又は複数のアミノ酸の同類置換、あるいは非必須アミノ酸の置換、挿入、又は欠失のみ含んでよい。従って非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変えることなく配列番号３の中で変えることができる残基である。例えば、本発明のＡＳＰＡ０１タンパク質の中で保存されるアミノ酸残基は、特に変化しにくいことが予測される。さらに、本発明によるＡＳＰＡ０１タンパク質及びその他のアスパラギナーゼの中で保存されるアミノ酸は、変化を受けにくい。
【００８１】
「同類置換」という用語は、アミノ酸残基の代わりに同様の側鎖を有するアミノ酸残基が用いられる置換を意味するものとする。これらのファミリーは、当技術分野で知られており、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝状側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００８２】
機能的核酸均等物は、典型的な場合、サイレント変異又はコードされたポリペプチドの生物学的機能を変化させない変異を含んでよい。従って本発明は、特定の生物活性に必要不可欠なものではないアミノ酸残基の変化を含む、ＡＳＰＡ０１タンパク質をコードする核酸分子を提供する。そのようなＡＳＰＡ０１タンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号３とは異なっているが、少なくとも１つの生物活性をまだ保持している。一実施形態で、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上が相同な、実質的に相同なアミノ酸配列を含む。
【００８３】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をどのように行うかに関する指針が、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）によって提供されており、この著者は、変化に対するアミノ酸配列の耐性を研究するための、２つの主な手法があることを示している。第１の方法では、変異が自然淘汰によって受け入れられ、又は拒絶される進化のプロセスを利用する。第２の手法は、クローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入するのに遺伝子工学を使用し、機能性を維持する配列を選択し又はスクリーニングする。この著者が主張するように、これらの研究によって、タンパク質が意外にもアミノ酸置換に対して耐性があることが明らかになった。著者はさらに、タンパク質のある特定の位置でどの変化が生じ易いか示している。例えば、ほとんどの隠れたアミノ酸残基は無極性側鎖を必要とし、表面側鎖のごくわずかな特徴は一般的に保存される。このような他の表現型的なサイレント置換については、前掲のＢｏｗｉｅら及びそこに引用されている参考文献に記載されている。
【００８４】
配列番号３によるタンパク質に相同なＡＳＰＡ０１タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入がコードされたタンパク質に導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加、欠失を配列番号１又は配列番号２によるコーディングヌクレオチド配列に導入することによって生成することができる。そのような変異は、部位特異的突然変異誘発やＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な技法によって導入することができる。
【００８５】
「機能的均等物」という用語は、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＳＰＡ０１タンパク質のオーソログも包含する。Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＳＰＡ０１タンパク質のオーソログは、その他の株又は種から単離することのできるタンパク質であり、類似の又は同一の生物活性を持つ。そのようなオーソログは、配列番号３に対して実質的に相同なアミノ酸配列を含んでいると容易に同定することができる。
【００８６】
本明細書で定義するように、「実質的に相同な」という用語は、第１及び第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通のドメインを有するように、第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して十分な又は最小限の数の同一又は同等（例えば類似の側鎖を持つ）のアミノ酸又はヌクレオチドを含有する第１のアミノ酸又はヌクレオチド配列を指す。例えば、約４０％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有する共通のドメインを含有するアミノ酸又はヌクレオチド配列を、本明細書では十分に同一であると定義する。
【００８７】
また、その他のＡＳＰＡ０１ファミリーメンバーをコードする核酸、従って配列番号１又は配列番号２とは異なるヌクレオチド配列を有するものも、本発明の範囲内にある。さらに、異なる種から得たＡＳＰＡ０１タンパク質をコードする核酸、従って配列番号１又は配列番号２とは異なるヌクレオチド配列を有するものも、本発明の範囲内にある。
【００８８】
本発明のＡＳＰＡ０１  ＤＮＡの変種（例えば天然の対立変種）及び同種に対応する核酸分子は、好ましくは高ストリンジェントなハイブリダイゼーシション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技法によるハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書に開示されるｃＤＮＡ又はその適切な断片を使用して本明細書に開示されるＡＳＰＡ０１核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。
【００８９】
ＡＳＰＡ０１配列の天然に生ずる対立変種に加えて、当業者なら、変異によって配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列に変化を導入することができ、それによって、ＡＳＰＡ０１タンパク質の機能を実質的に変えることなくＡＳＰＡ０１タンパク質のアミノ酸配列を変化させることができることが理解されよう。
【００９０】
本発明の別の態様では、改善されたＡＳＰＡ０１タンパク質が提供される。改善されたＡＳＰＡ０１タンパク質は、少なくとも１つの生物活性が改善されるタンパク質である。そのようなタンパク質は、飽和突然変異誘発などによりＡＳＰＡ０１コード配列の全て又は一部に沿って変異をランダムに導入することによって得ることができ、得られた変異体は、組換えによって発現させることができ、生物活性に関してスクリーニングすることができる。例えば当技術分野は、アスパラギナーゼの酵素活性を測定するための標準的なアッセイを提供し、従って改善されたタンパク質を容易に選択することができる。
【００９１】
好ましい実施形態では、ＡＳＰＡ０１タンパク質が配列番号３によるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＡＳＰＡ０１ポリペプチドが配列番号３によるアミノ酸配列と実質的に相同であり、配列番号３によるポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持するが、上述の天然の変種又は突然変異誘発が原因でアミノ酸配列が異なっている。
【００９２】
さらに好ましい実施形態では、ＡＳＰＡ０１タンパク質は好ましくは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、配列番号１又は配列番号２による核酸とハイブリダイズすることが可能な単離された核酸断片によってコードされたアミノ酸配列を有する。
【００９３】
従ってＡＳＰＡ０１タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を含み、配列番号３によるポリペプチドの少なくとも１つの機能的活性を保持するタンパク質である。
【００９４】
本発明によるタンパク質の機能的均等物は、例えば、アスパラギナーゼ活性を求めるために、本発明のタンパク質の変異体、例えば切断型変異体などのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。一実施形態では、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって変化に富む変種ライブラリーを生成する。変化に富む変種ライブラリーは、例えば、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして発現可能になるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素作用によって遺伝子配列にライゲーションすることによって生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変種のライブラリーを生成するのに使用することができる様々な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ他（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。
【００９５】
さらに、本発明のポリペプチドのコード配列の断片ライブラリーを使用して、ポリペプチドの変化に富む集団を生成し、後で選択される変種のスクリーニングに用いることができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、分子１個当たりおよそ１回だけニックが生ずる条件下で、問題のコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、その二本鎖ＤＮＡを変性させ、そのＤＮＡを再生して、ニックを入れた種々の生成物からのセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによって改質された二重鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターにライゲーションすることによって生成することができる。この方法により、問題のタンパク質の様々なサイズのＮ末端及び内部断片をコードする、発現ライブラリーを得ることができる。
【００９６】
切断点変異によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、また選択された性質を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技法が当技術分野で知られている。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために、高処理量の分析に適した最も広く使用される技法は、典型的な場合、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、及び所望の活性の検出によって、その遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。帰納的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）、すなわちライブラリー内の機能的変異体の頻度を高める技法は、本発明のタンパク質の変種を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ及びＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ他（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７〜３３１）。
【００９７】
配列番号１で示されるＡＳＰＡ０１遺伝子配列の他、ＡＳＰＡ０１タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらす可能性のあるＤＮＡ配列多型が所与の集団の中に存在する可能性があることは、当業者に明らかにされよう。そのような遺伝的多型は、天然の対立変種が原因で、種々の集団からの細胞又はある１つの集団の中の細胞に存在する可能性がある。対立変種は機能的均等物を含んでもよい。
【００９８】
本発明によるポリヌクレオチドの断片は、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含んでもよい。そのようなポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のプローブ又はプライマーとして機能することができる。
【００９９】
本発明による核酸は、これが機能的又は非機能的ポリペプチドをコードするか否かに関わらず、ハイブリダイゼーションプローブ又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用することができる。ＡＳＰＡ０１活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、（１）ｃＤＮＡライブラリー、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ以外の生物から、ＡＳＰＡ０１タンパク質をコードする遺伝子又はその対立変種を単離すること、（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、ＡＳＰＡ０１遺伝子の正確な染色体位置を得るための、中期染色体スプレッドとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、（３）特定の組織及び／又は細胞におけるＡＳＰＡ０１  ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析、及び（４）所与の生体（例えば組織）サンプル中でＡＳＰＡ０１プローブとのハイブリダイゼーションが可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用することができるプローブ及びプライマーが含まれる。
【０１００】
本発明は、ＡＳＰＡ０１遺伝子又はｃＤＮＡの機能的均等物を得る方法も包含する。そのような方法では、配列番号３又はその変種の配列の全て又は一部をコードする単離された核酸を含む標識プローブを得ること、そのプローブとライブラリー中の核酸断片とのハイブリダイゼーションが可能になる条件下、標識プローブで核酸断片ライブラリーをスクリーニングし、それによって核酸二重鎖を形成すること、及び任意の標識された二重鎖の核酸断片から完全長遺伝子配列を調製して、ＡＳＰＡ０１遺伝子に関係する遺伝子を得ることが含まれる。
【０１０１】
一実施形態では、本発明のＡＳＰＡ０１核酸は、配列番号１、配列番号２に示される核酸配列又はその相補鎖に対し、少なくとも４０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同である。
【０１０２】
別の好ましい実施形態では、本発明のＡＳＰＡ０１ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも４０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同である。
【０１０３】
（宿主細胞）
別の実施形態では、本発明は、本発明により包含される核酸を含有する細胞、例えば形質転換宿主細胞又は組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換細胞」又は「組換え細胞」は、組換えＤＮＡ技法によって、本発明による核酸が内部に導入される細胞（又はその祖先）である。原核細胞と真核細胞のどちらも、例えば細菌、真菌、酵母菌などが含まれており、特に好ましいのは糸状菌、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得た細胞である。
【０１０４】
挿入された配列の発現を調節し、又は遺伝子産物を特定の所望の方法で修飾し、プロセッシングする宿主細胞を選択することができる。タンパク質生成物のそのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の最適な機能を促進させることができる。
【０１０５】
様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセッシング及び修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現した外来タンパク質の、望ましく正確な修飾及びプロセッシングを確実にするには、分子生物学及び／又は微生物学の当業者に馴染みのある適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。このため、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、及びリン酸化の適正な処理を行うための細胞機構を持つ真核宿主細胞を使用することができる。そのような宿主細胞は問う技術分野で周知である。
【０１０６】
宿主細胞には、ＣＨＯやＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３，ＷＩ３８、脈絡叢細胞系などの哺乳類細胞系も含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
望むなら、本発明によるポリペプチドは、安定にトランスフェクションした細胞系によって生成することができる。哺乳類細胞の安定なトランスフェクションに適切ないくつかのベクターが公に利用可能であり、そのような細胞系を構成するための方法も、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（前掲）により公に知られている。
【０１０８】
別の態様では本発明は、食品を製造するために、既に述べた本発明の方法によって又は既に述べた新規なアスパラギナーゼの使用によって得ることが可能な食品を提供する。これらの食品は、前記加熱ステップ中のアクリルアミドの形成に関わるアミノ酸レベルを低下させるのに有効な量で１種又は複数の酵素を添加することを含まない製造方法によって得られる食品に比べ、アクリルアミドのレベルを著しく低下させることを特徴とする。本発明による方法は、製造した食品のアクリルアミド含量を、従来の方法により得られた食品に比べ、好ましくは５０％超、より好ましくは２０％超、さらにより好ましくは１０％超、最も好ましくは５％超の低下をもたらすのに使用することができる。
【０１０９】
（材料＆方法）
（アクリルアミドの測定）
（サンプルの前処理）
６００ｍｇの乾燥し均質化したサンプルを、ミリＱ水５ｍｌを使用して抽出する。この抽出物に、内部標準１３Ｃ３アクリルアミド溶液（ＣＩＬ）１μｇを添加する。遠心分離（６０００ｒｐｍ）に１０分間かけた後、上層３ｍｌをＥｘｔｒｅｌｕｕｔ−３ＢＴカラム（Ｍｅｒｃｋ）に導入する。酢酸エチル１５ｍｌを使用して、カラムからアクリルアミドを溶出する。窒素の穏やかな流れの中で、酢酸エチルを約０．５ｍｌになるまで蒸発させる。
【０１１０】
（クロマトグラフィ条件）
酢酸エチル溶液を、ガスクロマトグラフィを使用して分析する。ＣＰ−Ｗａｘ５７（Ｖａｒｉａｎ）カラム（長さ２５ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜１．２μｍ）と、キャリアガスとして５．４ｍｌ／分の定流であるヘリウムとを使用して、分離を行う。３μｌのスプリットレス注入を実施する。オーブンの温度を１分間５０℃に保ち、その後、温度を３０℃／分で２２０℃まで上昇させる。２２０℃の一定温度で１２分間過ぎた後、オーブンを冷却し、安定させ、その後に次の注入を行う。検出は、イオン化ガスとしてメタンを使用する、陽イオンモードでのオンライン化学イオン化質量分析を使用して実施する。特性イオンｍ／ｚ７２（アクリルアミド）及びｍ／ｚ７５（１３Ｃ３アクリルアミド）を、定量化のためモニタする。
【０１１１】
（使用した機器）
ＧＣ：    ＨＰ６８９０（Ｈｅｗｌｅｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
【０１１２】
ＭＳＤ（質量選択的検出器）：    ＨＰ５９７３（Ｈｅｗｌｅｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
【０１１３】
（アスパラギナーゼ活性の測定）
Ｓｈｉｒｆｒｉｎら（Ｓｈｉｒｆｒｉ，Ｓ．、Ｐａｒｒｏｔｔ，Ｃ．Ｌ．、及びＬｕｂｏｒｓｋｙ，Ｓ．Ｗ．（１９７４）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４９、１４４５〜１３４０）に従ってアスパラギナーゼ活性を測定した。この酵素アッセイのバックグラウンドは、アスパラギナーゼ活性の結果として放出されたＮＨ３を測定したものである。
【０１１４】
放出されたＮＨ３を測定するため、以下のピペットスケジュールに従った。
溶液Ａ：    ０．１Ｍクエン酸＋０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．５
溶液Ｂ：    ０．１８９Ｍ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ）
溶液Ｃ：    ０．００６Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ）
溶液Ｄ：    ２５％（ｖ／ｖ）  トリクロロ酢酸（Ｍｅｒｃｋ）
溶液Ｅ：    アンモニア着色試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ）
【０１１５】
アスパラギナーゼ活性測定のため、これらの溶液は新鮮な状態で調製しなければならない。
【０１１６】
表１に、較正曲線（ＣＰ＝較正点）に使用した溶液をまとめる。
【０１１７】
【表１】
0004723247.tif 000002
【０１１８】
表１による溶液を直ちに反転させ、反転によって３７℃でインキュベートした。３０分後、０．１ｍｌの溶液Ｄを添加することによって反応を終了させた。参照酵素試験では、０．１ｍｌの酵素溶液を後で添加した。これらの溶液を直ちに混合し、遠心分離にかけて、全ての沈殿物を除去した。上澄み０．２ｍｌを、４．３ｍｌの脱イオン水と０．５ｍｌの溶液Ｅが入っている試験管にピペットで移した。これらの混合物を直ちに混合し、１分後、Ａ  ４３６ｎｍを、較正サンプル、参照物質、及び試験サンプルに関して測定した。
【０１１９】
較正曲線は、以下の通り作成した。
ΔＡ４３６ｎｍ較正点＝Ａ４３６ｎｍ較正点−Ａ４３６ｎｍ較正点１
較正曲線は、アンモニア（ＮＨ３）濃度に対して標準物質のΔＡ４３６ｎｍをプロットすることによって作成する。
【０１２０】
酵素活性は、以下の通り計算した。
ΔＡ４３６ｎｍ酵素試験＝Ａ４３６ｎｍ試験−Ａ４３６ｎｍ試験参照
【０１２１】
遊離したＮＨ３のμモル数は、標準曲線を使用して決定する
【数１】
0004723247.tif 000003
上式で、Ｖｓ＝反応溶液の体積（スケジュール内＋０．１ｍｌの溶液Ｄ）；２．２ｍｌ
Ｖｔ＝ＮＨ３を決定するために第２の反応で使用した反応溶液の体積；０．２ｍｌ
ｔｉ＝インキュベーション時間、単位は分；３０
Ｖｅ＝試験をする酵素サンプルの体積；０．１
【数２】
0004723247.tif 000004
他に特に指示しない限り、１単位のアスパラギナーゼ活性は、ｐＨ５．５及び３７℃で１分当たりＬ−アスパラギンから遊離したＮＨ３  １μモルと定義する。生地のｐＨは約５．５であり、従ってこのｐＨは測定に好ましい。しかし、異なるｐＨ値を持つその他の物質では、この異なるｐＨをアスパラギナーゼ活性の決定に使用することが好ましい。
【０１２２】
ｐｐｍで表す量は、他に特に指示しない限り、穀粉の量をベースとする。
【０１２３】
（材料）
アスパラギナーゼは、大腸菌（Ｓｉｇｍａ、特異的活性が２８５ユニット／ｍｇである）、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（Ｓｉｇｍａ、特異的活性が１００ユニット／ｍｇである）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得た（発酵の詳細については実施例参照）。
【０１２４】
ＣＳＬ培地は（１リットル当たりの量で）：Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｓｏｌｉｄ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）１００ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、グルコース・Ｈ２Ｏ  １０ｇ、及びＢａｓｉｌｄｏｎ（アンチフォーム）０．２５ｇからなるものであった。これらの成分を脱塩水に溶解し、そのｐＨをＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４でｐＨ５．８に調節し、バッフル及びフォームボールを備えた１００ｍｌフラスコに２０ｍｌの発酵ブロスを満たし、１２０℃で２０分間滅菌した後、５０００ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する溶液２００μｌを、室温に冷却した後に各フラスコに添加した。
【０１２５】
ＣＳＭ培地は、マルトース・Ｈ２Ｏ  １５０ｇ、Ｓｏｙｔｏｎｅ（ペプトン）６０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．０８ｇ、Ｂａｓｉｌｄｏｎ（アンチフォーム）０．０２ｇ、ＭＥＳ  ２０ｇ、Ｌ−アルギニン  １ｇ（１リットル当たりの量で）からなるものであった。これらの成分を脱塩水に溶解し、そのｐＨをＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４でｐＨ６．２に調節し、バッフル及びフォームボールを備えた５００ｍｌフラスコに１００ｍｌの発酵ブロスを満たし、１２０℃で２０分間滅菌した後、５０００ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する溶液１ｍｌを、室温に冷却した後に各フラスコに添加した。
【０１２６】
（実施例１）
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの発酵）
本明細書に示されるヌクレオチド配列によってコードされたアスパラギナーゼは、ＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを構成し、このプラスミドでＡ．ｎｉｇｅｒ株を形質転換し、そのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株を以下の方法で成長させることによって得た。
【０１２７】
Ａ．ｎｉｇｅｒ株の新鮮な胞子（１０６〜１０７）を２０ｍｌのＣＳＬ培地（１００ｍｌフラスコ、バッフル）に接種し、２０〜２４時間、３４℃及び１７０ｒｐｍで成長させた。５〜１０ｍｌのＣＳＬ前培養物を１００ｍｌのＣＳＭ培地（５００ｍｌフラスコ、バッフル）に接種した後、その株を３４℃及び１７０ｒｐｍで３〜５日間発酵させた。
【０１２８】
５０ｍｌのＧｒｅｉｎｅｒ管で遠心分離することにより（３０分、５０００ｒｐｍ、４℃）、細胞を含まない上澄みを得て、その後の全てのステップを氷上で実施した。上澄みを、ＧＦ／Ａ  Ｗｈａｔｍａｎ  Ｇｌａｓｓマイクロファイバーフィルタ（１５０ｍｍφ）に通して前濾過することにより大きい粒子を除去し、４Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５に調節し（必要に応じて）、吸引により０．２μｍ（ボトルトップ）フィルタに通して滅菌濾過し、真菌物質を除去した。上澄みを４℃（又は２０℃）で保存した。
【０１２９】
（限外濾液中のＡｓｐｅｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼ含量とアスパラギナーゼ活性の測定）
（ステップ１−限外濾液の調製）
実施例１で得た培養物の上澄みを限外濾過して、より高い酵素濃度を得て、酵素活性の決定及びベーキング試験を妨げる可能性のある低分子汚染を除去した。上澄み３００ｍｌの限外濾過は、１０ｋＤａカットオフのフィルタを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦシステムで実施した。
【０１３０】
サンプルを、その色及び体積に応じて１０〜３０ｍｌの冷却した脱塩水で３〜５回洗浄した。酵素溶液の最終体積は１０〜３０ｍｌであり、これをさらに「限外濾液」と呼ぶ。
（ステップ２−Ａ２８０及びＨＰＳＥＣによるアスパラギナーゼ濃度の決定）
【０１３１】
限外濾液中のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼの濃度を、アスパラギナーゼに起因する２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）及び計算されたアスパラギナーゼの分子吸光係数から計算した。Ａ２８０の測定は、Ｕｖｉｋｏｎ  ＸＬ  Ｓｅｃｏｍａｍ分光光度計（Ｂｅｕｎ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ、Ａｂｃｏｕｄｅ、オランダ）で行った。
【０１３２】
酵素の分子吸光係数は、酵素分子１個当たりのチロシン、トリプトファン、及びシステイン残基の数から計算することができる（Ｓ．Ｃ．ＧｉｌｌとＰ．Ｈ．ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２、３１９〜３２６（１９８９））。これらのアミノ酸の分子吸光係数は、それぞれ１２８０、５６９０、及び１２０Ｍ−１ｃｍ−１である。本発明のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼのチロシン、トリプトファン、及びシステイン残基の数は、配列番号３で示されるタンパク質配列から推論することができる。本発明のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼの計算された吸光係数を表２に示す。
【０１３３】
【表２】
0004723247.tif 000005
【０１３４】
アスパラギナーゼに起因する２８０ｎｍでの限外濾液の吸光度（Ａ２８０）は、酵素サンプルの純度に依存する。この純度は、ＴＳＫ  ＳＷ−ＸＬカラム（３００×７．８ｍｍ；ＭＷ範囲１０〜３００ｋＤａ）を用いるＨＰＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフィ）を使用して決定した。溶出緩衝液は、ｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液からなり、これを１ｍｌ／分の流量で使用した。５〜１００μｌのサンプルを注入した。２８０ｎｍでの吸光度を測定した。
本発明のアスパラギナーゼに起因する限外濾液のＡ２８０は、クロマトグラムにおけるそれぞれのアスパラギナーゼのピークのピーク表面と、２８０ｎｍで吸収されるピークの全表面との比から得られる。次いで各アスパラギナーゼに関し、限外濾液中のアスパラギナーゼ濃度を、限外濾液のＡ２８０に上述の比を掛けて０．３（計算された吸光係数）で割ることによって計算した。溶液は、４０ｍｇタンパク質／ｍｌを含有していた。
【０１３５】
（ステップ３−アスパラギナーゼ活性の決定）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼ溶液は、ｐＨ５．５で４００００Ｕ／ｍｌの活性を示した。従って、タンパク質含量４０ｍｇ／ｍｌを考慮に入れると、１０００ユニット／ｍｇタンパク質の特異的活性が計算できる。
【０１３６】
（実施例２）
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼのｐＨ最適条件）
この実施例では、活性を様々なｐＨ値で測定した。ｐＨ値を一定に保ち、緩衝液の効果を修正するために、いくつかのアスパラギナーゼ活性測定を、異なる緩衝液中で同じｐＨ値で実施した。
【０１３７】
３種の異なる緩衝液を使用して、アスパラギナーゼ活性をｐＨ範囲５〜９で測定した：
１．クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５〜６．２）；
２．リン酸緩衝液（ｐＨ８．５〜７．６）；及び
３．トリス緩衝液（ｐＨ７．２〜８．９）。
【０１３８】
基質濃度は、アスパラギン１７．２ｍＭであった。表３に、Ａ．ｎｉｇｅｒから得られたアスパラギナーゼに関して、ｐＨに対するアスパラギナーゼ活性を示す。
【０１３９】
【表３】
0004723247.tif 000006
【０１４０】
データからわかるように、このＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼは、およそ５．５という生地のｐＨ値で酵素が比較的高い酵素活性を示すので、ベーキングへの適用分野に非常に適している。
【０１４１】
（実施例３）
（大腸菌及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのアスパラギナーゼに関するＫＭ値及びＶｍａｘ値）
ＫＭ値及びＶｍａｘ値の決定を、大腸菌又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼのアスパラギナーゼ活性の測定により、ｐＨ５．５及び３７℃でそれぞれ実施した。表４に、これらの測定結果をまとめる。
【０１４２】
【表４】
0004723247.tif 000007
【０１４３】
Ａ．ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼは、大腸菌アスパラギナーゼよりも著しく高い活性を示す。
【０１４４】
（実施例４）
（バタールタイプのパンの調製と、Ｅｒｗｉｎｉａ、大腸菌、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのアスパラギナーゼがパンの皮及び中身のアクリルアミドレベルに及ぼす影響）
生地は、穀粉２０００ｇ（１００％）、水１０４０ｍｌ（５７％）、新鮮なＫｏｎｉｎｇｓ酵母４４ｇ、塩４０ｇ（５％）、アスコルビン酸１３６ｍｇ（６８ｐｍ）、本発明によるＥｒｗｉｎｉａ（Ｓｉｇｍａ）又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼからの指示量のアスパラギナーゼから調製した。これらの成分を、螺旋型混合機Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ１２により混合して生地にした（速度１で２分、その後、速度２で全エネルギー入力が８５ｗｈに達するまでの混合時間）。この後、完成した生地を、３２℃で１５分間ねかせた。引き続き、３５０ｇずつに分けた生地の小片を手でまるめ、３２℃で１５分間ねかせた。その後、生地の小片をまるめて形作り、最後に７５分間ねかせた。ねかせた後、１ｃｍの深さで、生地の小片の上面の長さの切込みを入れた。生地のサンプルを得た直後にベーキングを行って、アクリルアミド含量を決定した。生地の小片は、２４０℃のオーブンで３０分間ベークした。
【０１４５】
その後、サンプルをパンの皮から得て（外側２ｍｍ）、上述のようにアクリルアミドに関して分析した。パンの皮を、バタールの上側から得たが、その皮の部分は、平均的に褐色を示して濃すぎずかつ白すぎない部分を選択した。アクリルアミドの決定では、各条件での１個及び２個のパンの２つの測定値の平均を、下記の表５、６、及び７に示す。
【０１４６】
【表５】
0004723247.tif 000008
【０１４７】
上記の表から、新規なＡＳＰＡ０１を含むいくつかのタイプのアスパラギナーゼを使用することによって、パンの皮の中で形成されるアクリルアミドの量を低下させる効果があると結論付けることができる。
【０１４８】
【表６】
0004723247.tif 000009
【０１４９】
上記表から、アスパラギナーゼの量が増加すると、パンの皮の中で形成されるアクリルアミドの量が低下すると結論付けることができる。
【０１５０】
（実施例５）
（アスパラギンを添加したバタールのアクリルアミドレベルに対してアスパラギナーゼが及ぼす影響）
パンの生地、塊、及びサンプルを、実施例４と同じ手法で調製したが、アスアラギナーゼを添加したステップと同じステップでは、表７に示す量でＬ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ）を生地に添加した。得られたサンプル中のアクリルアミドを決定し、その結果を以下に見出すことができる。
【０１５１】
【表７】
0004723247.tif 000010
【０１５２】
表７から、アミノ酸アスパラギンをパンに添加することによって、パンの皮のアクリルアミド含量が著しく増加すると結論付けることができる。しかしこれは、アスパラギナーゼを使用することによって再び低下させることができる。
【０１５３】
（実施例６）
（様々なパラメータが、パンの皮のアクリルアミドレベルに及ぼす影響）
生地を、全粒小麦粉２０００ｇ（１００％）（Ｌｉｎｄｅ（登録商標）−Ｍｅｎｅｂａ、オランダ）又は通常の白い小麦粉（Ｋｏｌｉｂｒｉ（登録商標）−Ｍｅｎｅｂａ、オランダ）、水１１４０ｍｌ（５７％）、新鮮なＫｏｎｉｎｇｓｇｉｓｔ（登録商標）４７ｇ、塩４０ｇ（１．７５％）、アスコルビン酸１３６ｍｇ（３４ｐｐｍ）、指示量のＬ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ）とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得られたアスパラギナーゼＡＳＰＡ０１から調製した。これらの成分を、螺旋型混合機Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ１２により混合して生地にした（速度１で２分、その後、速度２で全エネルギー入力が８５ｗｈに達するまでの混合時間）。この後、完成した生地を、３２℃で１５分間ねかせた。引き続き、３５０ｇずつに分けた生地の小片を手でまるめ、３２℃で１５分間ねかせた。その後、生地の小片をまるめて形作り、最後に９０分間ねかせた。ねかせた後、１ｃｍの深さで、生地の上面の長さの切込みを入れた。生地の小片をオーブンでベークした。
【０１５４】
３つのベーキングプロセスを使用した。
１．２４０℃で３０分
２．３００℃で２０分
３．３２０℃で２０分
【０１５５】
ベーキングの後、実施例４に示したようにパンの皮からサンプルを得た。サンプルのアクリルアミド分析の結果を以下に示す。生地内部のアクリルアミドの量は、ベーキングを行う直前に測定した。それぞれの数字は、各条件ごとの、１個のパンに関する２つの測定値の平均である。
【０１５６】
【表８】
0004723247.tif 000011
【０１５７】
表８から、アクリルアミドの形成は、適用されるベーキングプロセスに依存すると結論付けることができる。高温で短いベーキングプロセスでは、アクリルアミドの形成が、低温でベークしたときよりも著しく多い。ベーキングプロセス３では、非常に色の濃い塊が得られた。従って、このベーキング条件下ではさらに実験を行わなかった。
【０１５８】
【表９】
0004723247.tif 000012
【０１５９】
表９から、穀粉のタイプは、形成されるアクリルアミドの量に影響を及ぼすことが明らかである。
【０１６０】
【表１０】
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【０１６１】
糖の存在は、アクリルアミドの形成を刺激した。さらにアスパラギンを添加した場合、この作用はさらに増大した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼを、この糖に富む生地系に添加した場合、パンの皮の中のアクリルアミドレベルは著しく低下した。驚くべきことに、アクリルアミドに比較的富む塊では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから得られた同量のアスパラギナーゼを使用したときに、アクリルアミドの低下が非常に大きい。
【０１６２】
（実施例７）
（ダッチハニーケーキの作製）
ダッチハニーケーキの作製を２段階で行った。第１段階では、プレバターを下記の通り作製した：Ｋｏｅｋｚｏｅｔ（登録商標）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｄｅｔｈｍｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ−Ｈｏｌｌａｎｄ）４ｋｇと、ばらばらにしたダッチハニーケーキ５００ｇに、水２リットルに加え、温度が１１６Ｃに達するまで加熱した。ライ麦粉５ｋｇを加え、これをバターが滑らかになるまで混合する。その後、生地を冷却し、室温で１〜２日間保存する。
【０１６３】
このプレバター２７５０グラムに対し、下記の成分を加えた：Ｋｏｅｋｚｏｅｔ（登録商標）５００グラム、シフトしたダッチハニークックスパイス２７．５ｇ、シフトしたＫａｒａｍ（登録商標）ベーキングパウダー２２ｇ、Ｖｕｌｋａａｎ（登録商標）ベーキングパウダー１６．５ｇ（全てＡｔｌａｎｔａ  Ｄｅｔｈｍｅｒｓ）。さらに、様々な量のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼを添加したが、その酵素活性は４００００Ｕ／ｍｌであった（酵素活性は、ｐＨ５．５で、実施例１により測定した）。
【０１６４】
この混合物を、ＤｉｏｓｎａミキサタイプＳＤ１２（Ｄｉｏｓｎａ、Ｄｉｅｒｋｓ＆Ｓｏｈｎｅ、Ｏｓｎａｂｒｕｃｋ−ドイツ）で６分間、１０４ｒｐｍで混合した。３２５０ｇのバターを計り取り、外で湿らせ、ケーキパンに入れた。この後、バターを３０℃で１０５分間保温した。この後、バターを１８０℃で６０分間ベークした。ダッチハニーケーキの外側の層及び内側の部位（「中身（ｃｒｕｍｂ）」）のサンプルを、アクリルアミドの存在に関して分析した。
【０１６５】
ベーキング後、サンプルを中身（ケーキの中心）と皮（外側２ｍｍ）から引き出し、上述のようにアクリルアミドに関して分析した。皮のサンプルでは、平均的な色を示す皮部分を選択することによって、ケーキの上側から採取した。
【０１６６】
【表１１】
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【０１６７】
【数３】
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この実施例で示されるように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアスパラギナーゼを添加することによって、処理をしなかったダッチハニーケーキと比較してアクリルアミド含量を５％に低減させた。さらにダッチハニーケーキでは、その中身に高レベルのアクリルアミドが見られることは驚くべきことである。全てのパンの実験で、パンの中身のアクリルアミドの量は、アスパラギン又は糖を添加した場合であってもアクリルアミド分析の検出限界よりも下であった（＜３０ｐｐｂ）。
【配列表】
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