(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドの測定のための、免疫学的定量法であって、
（１）リガンド、リガンドに対する第１標識特異的結合物質およびリガンドに対する第２標識特異的結合物質を溶媒中で接触させて第１標識特異的結合物質−リガンド−第２標識特異的結合物質複合体を生成せしめ、
（２）上記複合体を、第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子と接触せしめて上記複合体と上記担持固相粒子とが第１標識物質を介して結合した固相複合体を生成せしめ、ここで、上記担持固相粒子の固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒径を有し、
そして
（３）上記固相複合体を、粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有する多孔質繊維マトリックスに捕捉して上記固相複合体を多孔質繊維マトリックスの内部においても捕捉した固相複合体捕捉マトリックスを生成し、そして
（４）上記固相複合体捕捉マトリックスについて第２標識特異的結合物質の該第２標識物質の存在量を測定する、
ことを特徴とする免疫学的定量法。
【請求項２】
リガンドが抗原であり、第１標識特異的結合物質が該抗原に対する第１標識抗体でありそして第２標識特異的結合物質が該抗原に対する第２標識抗体である請求項１に記載の免疫学的定量法。
【請求項３】
リガンドが抗体であり、第１標識特異的結合物質が該抗体に対する第１標識抗原でありそして第２標識特異的結合物質が該抗体に対する第２標識抗原または第２標識抗体である請求項１に記載の免疫学的定量法。
【請求項４】
多孔質繊維マトリックスが予め下記組成：
カゼイン、非イオン性界面活性剤およびカルシウムイオンと反応して水不溶性塩を形成することがない、ｐＨ７〜９の緩衝能力を持つ緩衝剤を含有し且つｐＨ７〜９の水溶液からなるブロック液で処理されている請求項１に記載の免疫学的定量法。
【請求項５】
上記固相複合体捕捉マトリックスを該多孔質繊維マトリックスの濾過流量が６〜４８ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ２となるように、該多孔質繊維マトリックスについて下方から吸引して生成する、請求項１に記載の免疫学的定量法。
【請求項６】
リガンドの測定のための、免疫学的定量法であって、
（１）リガンド、リガンドに対する第１標識特異的結合物質および第１標識特異的結合物質に対する第２標識特異的結合物質を溶媒中で接触させて第１標識特異的結合物質−リガンド複合体および第１標識特異的結合物質−第２標識特異的結合物質複合体の混合物を生成せしめ、
（２）上記複合体混合物を、第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子と接触せしめて上記複合体のそれぞれと上記担持固相粒子とが第１標識物質を介して結合した固相複合体混合物を生成せしめ、ここで上記担持固相粒子の固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒径を有し、
そして
（３）上記固相複合体混合物を、粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有する多孔質繊維マトリックスに捕捉して上記固相複合体混合物を多孔質繊維マトリックスの内部においても捕捉した固相複合体捕捉マトリックスを生成し、そして
（４）上記固相複合体捕捉マトリックスについて第２標識特異的結合物質の該第２標識物質の存在量を測定する、
ことを特徴とする免疫学的定量法。
【請求項７】
リガンドが抗原であり、第１標識特異的結合物質が該抗原に対する第１標識抗体でありそして第２標識特異的結合物質が標識された該抗原である請求項６に記載の免疫学的定量法。
【請求項８】
リガンドが抗体であり、第１標識特異的結合物質が該抗体に対する第１標識抗原でありそして第２標識特異的結合物質が標識された該抗体である請求項６に記載の免疫学的定量法。
【請求項９】
多孔質繊維マトリックスが予め下記組成：
カゼイン、非イオン性界面活性剤およびカルシウムイオンと反応して水不溶性塩を形成することがない、ｐＨ７〜９の緩衝能力を持つ緩衝剤を含有し且つｐＨ７〜９の水溶液からなるブロック液で処理されている請求項６に記載の免疫学的定量法。
【請求項１０】
上記固相複合体捕捉マトリックスを該多孔質繊維マトリックスの濾過流量が６〜４８ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ２となるように、該多孔質繊維マトリックスについて下方から吸引して生成する、請求項６に記載の免疫学的定量法。
【請求項１１】
あるリガンドに対する第１標識特異的結合物質、あるリガンドに対する第２標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子および多孔質繊維マトリックスの組合せを有し、ここで
上記担持固相粒子の固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒径を有しそして
上記多孔質繊維マトリックスは粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有することを特徴とする、リガンドの測定のための免疫学的定量試薬。
【請求項１２】
あるリガンドに対する第１標識特異的結合物質、第１標識特異的結合物質に対する第２標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子および多孔質繊維マトリックスの組合せを有し、ここで
上記担持固相粒子の固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒径を有しそして
上記多孔質繊維マトリックスは粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有することを特徴とする、リガンドの測定のための免疫学的定量試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学的定量法および試薬に関する。さらに詳しくは、短い反応時間で高感度化が可能な免疫学的定量法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来不均一系免疫学的測定法として、特許文献１には、リガンドが結合した微粒子を液体に分散させて多孔性マトリックス上に滴下して捕捉し、測定対象物質を含む検体を、上記微粒子を捕捉した多孔性マトリックス上に滴下し、さらにその上に標識物が結合した標識リガンドを滴下して免疫複合体を形成し、次いで該免疫複合体について該標識物を測定する方法、免疫測定法が開示されている。この方法は、上記のとおり、多孔性マトリックス上で免疫複合体を形成する不均一反応を２度行う手順を含み、免疫複合体の形成が十分でないため、感度が上がらない難点がある。
【０００３】
特許文献２には、リガンドに対する特異的結合物質を固相に固定し、供試試料と反応させ、ビオチン−標識リガンド−特異的結合物質と反応させ、さらに標識ラベルのアンチビオチンと反応させ、未反応試薬を分離しそして固相または未反応試薬中の標識の存在を測定して供試試料に存在するリガンドの量を検出する免疫学的測定法が開示されている。
上記方法では、リガンドに対する特異的結合物質が固相に固定されているため、それ以降の２つの反応すなわちビオチン標識のリガンドに対する特異的結合物質との反応および標識ラベルのアンチビオチンとの反応がいずれも不均一系で行われるため、特許文献１に記載の方法と同様に免疫複合体の形成が十分でなく、感度の上昇が十分でない難点がある。
さらに、特許文献３には、ガラス繊維フィルターに被測定物質と特異的に反応する第１の物質が結合した多孔質マトリックスを準備し、その上に、順次、被測定物質を含む試料、検出可能なシグナル発生物質を結合した、被測定物質または第１の物質と特異的に反応する第２の物質および洗滌液を供給して、多孔質マトリックス上に残存する免疫複合体についてシグナル発生物質を測定して被測定物質の量を求める固相生物学的特異反応測定方法が開示されている。
上記方法もまた、ガラス繊維フィルター上で免疫複合体を形成する不均一反応を２度行う手順を含む、特許文献１の方法と同様の難点を伴う。
【０００４】
また、特許文献４にも、特許文献３とは、反応の手順は異なるものの、免疫複合体を形成するための不均一反応を、多孔性フィルタ上で行う手順を含む免疫学的測定法が開示されている。
さらに、上記方法におけるガラス繊維フィルター等の多孔質マトリックスは使用に際し、非特異的反応を抑えるため、予めブロック液で処理することが行われるが、従来知られたブロック液はリン酸緩衝生理食塩水をベースとするため、ある種の免疫学的定量法には非特異的反応が起こり易くまたそれに起因して再現性も劣っていた。
【０００５】
一方、ガラス繊維フィルターの如きフィルターに免疫複合体を捕捉するために、フィルターの下方から強制的に吸引する方法が行われる（特許文献５、特許文献６、特許文献７および特許文献８参照）。しかしながら、従来の吸引方法では液が急激にフィルターを通過するため、免疫複合体のフィルターに確実に捕捉され難かったりあるいはそれを防ごうとすると圧力センサー等を余分に設けたりする必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−３０６２０４号公報
【特許文献２】特開昭６０−２５０２５７号公報
【特許文献３】特開平４−３１８４６２号公報
【特許文献４】特開２００１−２３５４７１号公報
【特許文献５】特開平６−１４８１８４号公報
【特許文献６】特開平６−２５８３２２号公報
【特許文献７】特許第２９３５９６５号公報
【特許文献８】特許第３１３４２３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、短い反応時間で高感度化が可能な免疫学的定量法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、リガンドと、リガンドに対する特異的結合物質との反応を均一系で反応させてリガンドと特異的結合物質の反応生成物である複合体を生成せしめ、その後特異的結合物質を介して固相粒子に固定することにより、上記反応を短時間で十分に進行せしめて十分な感度を達成することができる免疫学的定量法を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、上記方法により固相粒子に固定されたリガンドを、多孔質繊維マトリックスで捕捉することにより、捕捉を確実に且つリガンドの存在量を検出し易い状態で行うことができる免疫学的定量法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、測定対象のリガンドの種類に依らずに、上記複合体を固定するための固相粒子を予め準備しておくことができ、そのため種々のリガンドの定量に適用可能な免疫学的定量法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、圧力センサー等の複雑な機構や吸引圧力の微調整を必要としない吸引機構を含有する免疫学的定量法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、液が穏やかにマトリックスを濾過するようにして固相免疫複合体を確実に捕捉することを可能とする吸引構造を含有する免疫学的定量法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、濾過マトリックスの下方に吸水層を設けなくても濾過を円滑に行うことができ、そのため吸水層に免疫反応残余物が含有されるために起る誤検知を防止することを可能とした吸引機構を含有する免疫学的定量法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、濾過マトリックス上で免疫反応を行わず、そのため濾過マトリックスへの免疫反応成分の非特異的吸着を防止することを可能とする免疫学的定量法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、本発明の上記免疫学的定量法に用いられる免疫学的定量試薬を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、
リガンドの測定のための、免疫学的定量法であって、
（１）リガンド、リガンドに対する第１標識特異的結合物質およびリガンドに対する第２標識特異的結合物質を溶媒中で接触させて第１標識特異的結合物質−リガンド−第２標識特異的結合物質複合体を生成せしめ、
（２）上記複合体を、第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子と接触せしめて上記複合体と上記担持固相粒子とが第１標識物質を介して結合した固相複合体を生成せしめ、ここで、上記担持固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒子を有し、
そして
（３）上記固相複合体を、粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有する多孔質繊維マトリックスに捕捉して上記固相複合体を多孔質繊維マトリックスの内部においても捕捉した固相複合体捕捉マトリックスを生成し、そして
（４）上記固相複合体捕捉マトリックスについて第２標識特異的結合物質の該第２標識物質の存在量を測定する、
ことを特徴とする免疫学的定量法（以下、第１方法ということがある）によって達成される。
【００１７】
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、
リガンドの測定のための、免疫学的定量法であって、
（１）リガンド、リガンドに対する第１標識特異的結合物質および第１標識特異的結合物質に対する第２標識特異的結合物質を溶媒中で接触させて第１標識特異的結合物質−リガンド複合体および第１標識特異的結合物質−第２標識特異的結合物質複合体の混合物を生成せしめ、
（２）上記複合体混合物を、第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子と接触せしめて上記複合体のそれぞれと上記担持固相粒子とが第１標識物質を介して結合した固相複合体混合物を生成せしめ、ここで、上記担持固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒子を有し、
そして
（３）上記固相複合体混合物を、粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有する多孔質繊維マトリックスに捕捉して上記固相複合体混合物を多孔質繊維マトリックスの内部においても捕捉した固相複合体捕捉マトリックスを生成し、そして
（４）上記固相複合体捕捉マトリックスについて第２標識特異的結合物質の該第２標識物質の存在量を測定する、
ことを特徴とする免疫学的定量法（以下、第２方法ということがある）によって達成される。
【００１８】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、
あるリガンドに対する第１標識特異的結合物質、あるリガンドに対する第２標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子および多孔質繊維マトリックスの組合せを有し、ここで上記担持固相粒子の固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒径を有しそして上記多孔質マトリックスは粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉する捕捉能力を有することを特徴とする、リガンドの測定のための免疫学的定量試薬によって達成される。
【００１９】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第４に、
あるリガンドに対する第１標識特異的結合物質、第１標識特異的結合物質に対する第２標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子および多孔質繊維マトリックスの組合せを有し、ここで
上記担持固相粒子の固相粒子は０．３〜１．０μｍの平均粒径を有しそして
上記多孔質繊維マトリックスは粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有することを特徴とする、リガンドの測定のための免疫学的定量試薬によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明方法を詳述する。先ず、第１方法について説明する。第１方法では、工程（１）において、第１標識特異的結合物質−リガンド−第２標識特異的結合物質複合体を均一系で生成せしめる。リガンドは抗原および抗体のいずれでもよい。例えばＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、フェリチン、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３などの腫瘍マーカー；ＴＳＨ、Ｔ３、Ｔ４、ＬＨ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、プロラクチン、ｈＧＨ、ガストリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インスリンなどのホルモン；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＴＢＧ、ＣＲＰ、β２−マイクログロブリンのようなタンパク質；エラスターゼ、アルカリフォスファターゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エノラーゼなどの酵素；肝炎ウイルス、エイズウイルスなどのウイルスおよびウイルスに対する抗体などが挙げられる。
リガンドを含む検体としては、例えば血液（血清や血漿を含む）、リンパ液、唾液、尿などの体液；便や生体由来の組織の抽出液などが挙げられる。
【００２１】
また、第１標識特異的結合物質および第２標識特異的結合物質における当該特異的結合物質は同一でも異なる物質でもよく、いずれもリガンドに対し特異的な結合性を有するものであり、例えば抗体、抗原、レクチン、プロテインＡなどが挙げられる。
第１標識特異的結合物質の当該標識としては、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、糖鎖等を挙げることができる。
また、第２標識特異的結合物質の当該標識としては、例えばアイソトープ（１２５Ｉなど）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光体（フルオレセイン、ユーロピウム誘導体など）、発光体（アクリジニウムエステル、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノールなど）が挙げられる。
工程（１）の反応は、溶媒中で行われる。溶媒としては、それ自体公知の緩衝液やそれにさらに少量の界面活性剤または／およびタンパク質を含むものが用いられる。
反応時間はリガンドおよび特異的結合物質の種類によっても異なるが、好ましくは１〜３０分、より好ましくは２〜１０分である。
工程（１）で生成された上記複合体は次いで工程（２）において第１標識特異的結合物質の該第１標識物質例えばビオチンと特異的に結合する物質例えば抗ビオチン抗体が担持された担持固相粒子と接触せしめられる。実際の操作は、工程（１）が終了した反応液中に上記担持固相粒子を加えて、必要により攪拌しながら、放置すればよい。
【００２２】
固体粒子としては、例えばカオリンや炭素などの無機物の微粒子；天然ゴムラテックス中のゴム微粒子；ポリスチレンなどの有機高分子化合物のラテックス中のポリマー微粒子などが挙げられる。上記ポリマー微粒子の素材としては、例えばポリスチレン、スチレンなどのモノマーとアミノ基、チオール基、カルボキシル基、活性エステル基、アルデヒド基などの官能基を有するモノマーとの共重合体、ポリアクロレインが挙げられる。さらに具体的には、例えば活性エステル基を有する、スチレンとメタクリル酸フェニルメチルスルホニウム硫酸塩の共重合体、ジエチレングリコールジメタクリレートとＮ−アクリロイルオキシスクシンイミドの共重合体、ジエチレングリコールジメタクリレートと１−メタクリロイルオキシベンゾトリアゾールの共重合体およびアルデヒド基を有するポリアクロレインを挙げることができる。固相粒子は単一粒子であっても、凝集粒子であってもよい。固相粒子の平均粒子径は、０．３〜１．０μｍの範囲内にある。また、粒子径の分布は狭い方がよい。固相粒子の平均粒子径が大きくなると、水性溶液中での分散性が低下し、粒子重量当りの表面積が低下するため、測定感度の低下をきたす。また、平均粒子径が小さすぎる場合、フィルターでの捕捉効率が低下し、最終的な測定感度が低下する。
【００２３】
固相粒子に、第１標識物質と特異的に結合する物質を担持させるには、従来公知の方法を使用することができる。例えば、物理吸着による方法や、表面に官能基を有する固相粒子を用い、担持される上記物質の官能基と架橋性試薬で結合する方法などがある。
工程（２）における反応で、上記複合体が担持固相粒子に当該第１標識物質を介して結合した固相複合体が生成される。
【００２４】
次いで、工程（２）で生成した固相複合体を多孔質繊維マトリックスに捕捉して固相複合体捕捉マトリックスを生成する工程（３）を実施する。
工程（２）で生成した固相複合体は、リガンドに対する第２標識特異的結合物質、リガンド、リガンドに対する第１標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質と特異的に結合する物質を担持した固体粒子が遂次この順序で結合したものである。
【００２５】
多孔質繊維マトリックスとしては、例えば、ガラス繊維フィルター、石英繊維フィルター、シリカ繊維フィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリアセテートフィルター、ろ紙などが挙げられる。
これらのうち、ガラス繊維フィルターが好ましい。非特異的な吸着を防ぐため、多孔質繊維マトリックスを適当なタンパク質、糖、ポリマーなどでコーティングしておいてもよい。
多孔質繊維マトリックスは、３次元的に交差する多数の繊維からなるため、それらの繊維によって形成される孔（空隙）は種々の大きさの粒子を捕捉することができる。このことは、多孔質繊維マトリックスは、捕捉しうる大きさの粒子を、多孔質繊維マトリックスの内部においても捕捉しうることを示している。固相複合体が多孔質繊維マトリックスの内部にも分布するように捕捉されると、固相複合体の検出が容易に且つ正確に行われる。本発明で用いられる多孔質繊維マトリックスは、粒径０．２〜８．０μｍの粒子を捕捉しうる捕捉能力を有する。かかる多孔質繊維マトリックスは、市販品として、例えばいずれもガラス繊維製の、ミリポア社の商品名  ＡＰ２５、ワットマン社の商品名  ＧＦ／Ｄとして入手できる。
【００２６】
この多孔質繊維マトリックスは、工程（３）に使用する前は、予めカゼイン、非イオン性界面活性剤およびカルシウムイオンと反応して水不溶性塩を形成することがない、ｐＨ７〜９の緩衝能力を持つ緩衝剤を含有し且つｐＨ７〜９の水溶液からなる免疫学的ブロック液で処理しておくのが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ノイゲン１５７、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０などを用いることができる。また、上記緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥＳ−ＮａＯＨ、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ＥＰＰＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ＴＡＰＳ−ＮａＯＨなどを好ましく用いることができる。上記免疫学的ブロック液は、カゼイン、非イオン界面活性剤および緩衝剤の他に、例えばＮａＮ３、Ｍｉｃｒ−Ｏ−ｐｒｏｔｅｃｔ、ｐｒｏｃｌｉｎｅ、ｍｉｃｒｏｃｉｄｅなどの防腐剤：塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ボウ硝、四級アンモニウム塩などの中性塩：ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、フィコールなどの水溶性高分子およびグルコース、スクロース、トレハロースなどの糖を含有することができる。上記免疫ブロック液のｐＨは７〜９である。
多孔質繊維マトリックスの免疫学的ブロック液による処理は、例えば多孔質繊維マトリックスを免疫学的ブロック液に浸漬する方法、多孔質繊維マトリックスに免疫学的ブロック液を噴霧するなどして浸潤させる方法等により行うことができる。
多孔質繊維マトリックスに固相複合体を捕捉する操作である工程（３）は、多孔質繊維マトリックスの濾過流量が６〜４８ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ２となるように、該多孔質繊維マトリックスについて下方から吸引して行うのが好ましい。濾過流量は、好ましくは９．５〜１６ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ２である。
【００２７】
このような濾過流量は、例えば上記多孔質繊維マトリックスの吸引方向下方に連続空隙物質を配置しそして該連続空隙物質を介して、例えば吸引ポンプにより、吸引するかあるいは上記多孔質繊維マトリックスの吸引方向下方に大気中に開いた空間を設けそして該空間を介して吸引する、ことにより達成できる。
上記連続空隙物質としては、液体を吸収でき、通気性もあるものであれば特に限定されない。その材質としては、例えばセルロース、ガラス、ＰＶＡ、ポリウタレン、ポリエステル、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリエチレン、セラミックなどが挙げられる。
連続空隙物質の気孔率は５０〜９５％が好ましい。より好ましくは８０〜９５％である。また、空隙の気孔径は２０〜２０００μｍが好ましい。より好ましくは１００〜５００μｍである。連続空隙物質の市販品の好ましい例としては、アイオン株式会社製  ベルイーターＤシリーズ  Ｙ（Ｄ）が挙げられる。
吸引を、上記連続空隙物質を介して行うことにより、連続空隙物質が多孔性繊維マトリックスと接触していない側面に開孔する気孔を通じて空気が吸引されるため、多孔性繊維マトリックスと接触する面から多孔性繊維マトリックスを通じて穏やかに液体を吸引することができる。吸引の強さは、連続空隙物質の厚さ、気孔率、気孔径あるいは吸引ポンプの吸引力等に依存するが、連続空隙物質および吸引力が同じである状況では連続空隙物質の厚さ、つまり多孔質繊維マトリックスと吸引ポンプから伸びる吸引端との間に配置された連続空隙物質の厚さによって調節することが多くの場合、可能であり、望ましい。
【００２８】
また、別の態様では、吸引を多孔質繊維マトリックスの吸引方向下方に大気中に開いた空間を設け、その空間を介して行うこともできる。この場合、多孔性繊維マトリックスと吸引端とを離して位置せしめ、その離す距離によって吸引力を調節することが可能である。このとき離して生じる空間を囲うように連続空隙物質を配置することにより、吸引力を穏やかに調節することが可能となる。この場合の連続空隙物質は、例えば多孔性繊維マトリックスの直下から吸引端までの間をくり抜いて筒状空間を形成したものとすることができる。
【００２９】
次いで、工程（４）において、工程（３）で生成された上記固相複合体捕捉マトリックスについて、第２標識特異的結合物質の該第２標識物質の存在量を測定する。この固相複合体には、リガンドが検体中に存在する濃度に依存する濃度で固定されているので、工程（４）において、固定されたリガンドの濃度を第２標識特異的結合物質の該第２標識の量を測定することにより、検体中のリガンドの濃度を定量することができる。
固相複合体中の第２標識の存在量を測定する方法としては、標識に応じて従来公知の方法が使用できる。例えば、標識が酵素からなる場合、（１）発色基質と接触させ、発色を、積分球を用いた比色計で測定する方法、（２）蛍光基質と接触させ、反応型の蛍光測定機で蛍光強度を測定する方法、（３）発光基質と接触させ、発光強度を計測する方法などが挙げられる。標識物が蛍光体の場合、マトリックス上に、適当な励起光を照射することで生じる蛍光を計測できる。標識物が発光体の場合、適当なトリガーを添加することで、生じる発光を計測することができる。実際には、固相複合体捕捉マトリックスに、第２標識物質に依存して、発色物質や蛍光物質を滴下して、発色等を行うことができる。
【００３０】
上記第１方法は、より具体的に、（ｉ）リガンドが抗原であり、第１標識特異的結合物質が該抗原に対する第１標識抗体でありそして第２標識特異的結合物質が該抗原に対する第２標識抗体であることができ、あるいはリガンドが抗体であり、第１標識特異的結合物質が該抗体に対する第１標識抗原でありそして第２標識特異的結合物質が該抗体に対する第２標識抗原または第２標識抗体であることができる。
本発明の第２方法は、いわゆる競合法とか競合阻害法といわれるそれ自体公知の方法を利用するものである。
第２方法では、工程（１）において、第１標識特異的結合物質−リガンド複合体および第１標識特異的結合物質−第２標識特異的結合物質複合体の混合物を均一系で生成せしめる、リガンド、リガンドを含む検体としては、第１方法において記載したものと同じものとすることができる。第２標識特異的結合物質は、第１方法とは異なり、リガンドに対するものではなく、第１標識特異的結合物質に対するものである。第１標識特異的結合物質としては第１方法に記載したものと同じものが使用できる。第２標識特異的結合物質としては、例えば酵素標識リガンド、蛍光体標識リガンド、リガンドがコンジュゲートした酵素標識ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）を挙げることができる。
工程（２）において、上記複合体混合物を、第１標識特異的結合物質の該第１標識と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子と接触せしめる。第１方法と異なるのは、複合体混合物を使用しているため、その複合体のそれぞれと担持固相粒子とが第１標識を介して結合した固相複合体の混合物を生成する点である。すなわち、これらの混合物のそれぞれにおいて、第１標識特異的結合物質に対しリガンドが結合した複合体と、第２標識特異的結合物質が結合した複合体が存在する。それらの複合体の割合は、第１標識特異的結合物質に対するリガンドと第２標識特異的物質との結合強度およびリガンドと第２標識特異的結合物質の存在量に依存して、互いに競合する。
【００３１】
次いで、工程（２）で生成した固相複合体混合物を多孔質繊維マトリックスに捕捉して固相複合体捕捉マトリックスを生成する工程（３）を実施する。工程（３）は第１方法の工程（３）と同様にして行うことができる。
第２方法の工程（３）で生成した固相複合体混合物は、リガンド、リガンドに対する第１標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識と特異的に結合する物質を担持した担持固相粒子が遂次この順序で結合した第１固相複合体ならびに、該第１標識特異的結合物質に対する第２標識特異的結合物質、第１標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識と特異的に結合する物質を担持した担体固相粒子が遂次この順序で結合した第２固相複合体からなる。
【００３２】
次いで、工程（４）において、工程（３）で生成した固相複合体補足マトリックスについて、リガンドの濃度すなわち第１標識特異的結合物質と結合して固定されたリガンドの濃度を測定して、検体中のリガンドの量を定量する。
なお、本発明の第２方法について、記載のない事項は第１方法に記載の事項がそのままあるいは当業者に自明の変更を加えて適用されると理解される。
本発明の第１〜第２方法では、各工程の間に、必要に応じて、洗滌工程を設けることができる。
【００３３】
本発明によれば、上記説明から理解されるとおり、担持固体粒子に担持された物質がリガンドと特異的に結合するものではない、第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質であるため、リガンドの種類によらず担持固体粒子を準備できる利点がある。それ故、本発明によれば、かかる利点を利用して、（ｉ）あるリガンドに対する第１標識特異的結合物質、あるリガンドに対する第２標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子および多孔質繊維マトリックスの組合せを有することを特徴とするリガンドの測定のための免疫学的定量試薬、および（ii）あるリガンドに対する第１標識特異的結合物質、第１標識特異的結合物質に対する第２標識特異的結合物質、該第１標識特異的結合物質の該第１標識物質と特異的に結合する物質が担持された担持固相粒子および多孔質繊維マトリックスの組合せを有することを特徴とする、リガンドの測定のための免疫学的定量試薬が提供される。
【００３４】
また、本発明によれば、本発明を実施するために好適に用いられる免疫学的ブロック液として、カゼイン、非イオン性界面活性剤およびカルシウムイオンと反応して水不溶性塩を形成することがない、ｐＨ７〜９の緩衝能力を持つ緩衝剤を含有し且つｐＨ７〜９の水溶液からなることを特徴とする、免疫学的ブロック液が同様に提供される。
【実施例】
【００３５】
本発明をさらに詳細に説明するために、以下実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
１）抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液の作製
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、リン酸緩衝液と略す。）で遠心洗浄した１．０％ラテックス粒子（積水化学工業株式会社製、Ｎ−５００、平均粒子径０．５μｍ）溶液１ｍＬに、０．７ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で調製したヤギ由来の抗ビオチンポリクローナル抗体を１ｍＬ添加し、３７℃で２時間振とうした。次いで、リン酸緩衝液で調製した１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（オリエンタル酵母工業株式会社製）を添加し、さらに３７℃、２時間振とうした。上記抗ビオチンポリクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を遠心分離して上清を除去した後、０．８％のＮａＣｌと１％のＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＨＥＰＥＳ−Ｓ緩衝液と略す。）を４ｍＬ添加し、該ラテックス粒子を分散した。次いで、再度、該ラテックス粒子を遠心分離して上清を除去した後、ＨＥＰＥＳ−Ｓ緩衝液を４ｍＬ添加し、該ラテックス粒子を分散させ、抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液とした。
【００３７】
２）アルカリホスファターゼ標識抗インスリン抗体の作製
１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で調製した抗インスリンモノクローナル抗体（ダコ社製、ＯＸＩ００５、マウス由来）溶液１ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬの２−イミノチオラン塩酸塩水溶液０．１ｍＬを加え、２５℃で１時間振とうした。次いで、ゲルろ過にて前記モノクローナル抗体溶液から未反応の２−イミノチオランを除去し、チオール基導入抗インスリン抗体を作製した。前記の１ｍｇ／ｍＬチオール基導入抗インスリン抗体溶液１ｍＬにアルカリホスファターゼ（キッコーマン株式会社製）を溶解した後、５ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルホルムアミドに溶解したＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（株式会社同仁化学研究所製）を２０μＬ添加し、２５℃で一晩振とうした。その後、ゲルろ過にて、抗体活性と酵素活性の両方が見られる画分を分取し、アルカリホスファターゼ標識抗インスリン抗体を作製した。
【００３８】
３）ビオチン標識抗インスリン抗体の作製
１ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で調製した抗インスリンモノクローナル抗体（ダコ社製、ＨＵＩ０１８、マウス由来）溶液１ｍＬに、１ｍＭになるようにジメチルスルホキシドで溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−ＯＳｕ（株式会社同仁化学研究所製）０．１ｍＬを加え、２５℃で４時間静置した。次いで、ゲルろ過にて未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−ＯＳｕを除去し、ビオチン標識抗インスリン抗体を作製した。
【００３９】
４）測定対象物質（被検体）
測定に用いた被検体は、市販のインスリン（和光純薬工業株式会社製）を０、０．１、１、１０、１００μＩＵ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝液で希釈して作製した。
【００４０】
５）粒子の捕捉器具
円柱状のカップに吸水材、ガラスフィルター（ミリポア社製、ＡＰ−２５）が下から順次積層されたものを作製し、ラテックス粒子の捕捉材とした。
【００４１】
６）測定操作
１％のカゼインを含むリン酸緩衝液で５μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識抗インスリン抗体溶液１８μＬ、１％のカゼインを含むリン酸緩衝液で０．２μｇ／ｍＬとなるように希釈したアルカリホスファターゼ標識抗インスリン抗体溶液１８μＬ、および被検体２４μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、上記１）にて作製した抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液を２０μＬ添加し、さらに３７℃で３分間インキュベーションし、ビオチン標識抗インスリン抗体とインスリンを介してアルカリホスファターゼ標識抗インスリン抗体が固定化された粒子（以下、アルカリホスファターゼ固定粒子と記す。）を調製した。調製したアルカリホスファターゼ固定粒子溶液５０μＬを、２５％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）５０μＬで浸潤させた捕捉材に滴下し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業株式会社製）を含むリン酸緩衝液０．１ｍＬを２回捕捉材に滴下し、捕捉材中のガラスフィルターを洗浄した。続いて、この捕捉材をアルカリホスファターゼ活性の測定に供した。
【００４２】
７）アルカリホスファターゼ活性の測定
捕捉材中のアルカリホスファターゼ活性の測定は、全自動化学発光免疫測定装置ＭＩ０２（株式会社エイアンドティー製）にて行った。化学発光基質として、ＡＰＳ−５（ルミジェン社製）を用い、捕捉材１個につき３０μＬのＡＰＳ−５を滴下した。
【００４３】
８）測定結果
インスリン濃度と上記測定によって得られたシグナル強度の関係を表１に示す。
【００４４】
【表１】
0004771941.tif 000002
【００４５】
実施例２
実施例１で、アルカリホスファターゼ標識した抗インスリン抗体を抗ＰＳＡモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製、１０−Ｐ２０）に、ビオチン標識した抗インスリン抗体を抗フリーＰＳＡモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製、１０−Ｐ２１）に変えてそれぞれの標識を行い、測定時のビオチン標識抗フリーＰＳＡモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を２０μｇ／ｍＬ、溶液量を１０μＬに、アルカリホスファターゼ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を２μｇ／ｍＬ、溶液量を１０μＬに、被検体量を５０μＬに変更し、被検体をリン酸緩衝液で希釈して作製したフリーＰＳＡ（濃度：０、０．００５、０．０５、０．５、５ｎｇ／ｍＬ）としたこと以外は、実施例１に従って測定を行った。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
0004771941.tif 000003
【００４７】
実施例３
実施例１で、アルカリホスファターゼ標識した抗インスリン抗体を抗Ｎ−ＡＮＰモノクローナル抗体（メディックスバイオケミカ社製、７９０５）に、ビオチン標識した抗インスリン抗体を抗Ｎ−ＡＮＰモノクローナル抗体（メディックスバイオケミカ社製、７８０１）に変えてそれぞれの標識を行い、測定時のビオチン標識抗Ｎ−ＡＮＰモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を１０μｇ／ｍＬ、溶液量を１５μＬに、アルカリホスファターゼ標識抗Ｎ−ＡＮＰモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を２μｇ／ｍＬ、溶液量を１５μＬに、被検体量を３０μＬに変更し、被検体をリン酸緩衝液で希釈して作製したＮ−ＡＮＰ（濃度：０、５、５０、５００、５，０００ｐｍｏｌ／Ｌ）としたこと以外は、実施例１に従って測定を行った。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
0004771941.tif 000004
【００４９】
実施例４
実施例１で、アルカリホスファターゼ標識した抗インスリン抗体を抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体（ダコ社製、ＰＥＰ−００１）に、ビオチン標識した抗インスリン抗体を抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体（ダコ社製、ＣＰＴ−３Ｆ１１）に変えてそれぞれの標識を行い、測定時のビオチン標識抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を５μｇ／ｍＬ、溶液量を２０μＬに、アルカリホスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を０．２μｇ／ｍＬ、溶液量を２０μＬに、被検体量を２０μＬに変更し、被検体をリン酸緩衝液で希釈して作製したＣ−ペプチド（濃度：０、０．０１、０．１、１、１０ｎｇ／ｍＬ）としたこと以外は、実施例１に従って測定を行った。結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
0004771941.tif 000005
【００５１】
実施例５
実施例１で、アルカリホスファターゼ標識した抗インスリン抗体を抗ペプシノーゲンＩモノクローナル抗体（メディックスバイオケミカ社製、８００３）に、ビオチン標識した抗インスリン抗体を抗ペプシノーゲンＩモノクローナル抗体（メディックスバイオケミカ社製、８００９）に変えてそれぞれの標識を行い、測定時のビオチン標識抗ペプシノーゲンＩモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を１０μｇ／ｍＬ、溶液量を２０μＬに、アルカリホスファターゼ標識抗ペプシノーゲンＩモノクローナル抗体溶液中の抗体濃度を０．４μｇ／ｍＬ、溶液量を２０μＬに、被検体量を２０μＬに変更し、被検体をリン酸緩衝液で希釈して作製したペプシノーゲンＩ（濃度：０、０．１、２、１６、１６０ｎｇ／ｍＬ）としたこと以外は、実施例１に従って測定を行った。結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
0004771941.tif 000006
【００５３】
実施例６
実施例１で、捕捉材中のガラスフィルターをＡＰ−２５からＧＦ／Ｄ（ワットマン社製）に変更したこと以外は、実施例１と同じ方法で被検体を測定した。結果を表６に示す。
【００５４】
【表６】
0004771941.tif 000007
【００５５】
実施例７
実施例１で、抗ビオチンポリクローナル抗体を担持するラテックス粒子をＮ−３００（積水化学工業株式会社製、平均粒子径０．３μｍ）に変更し、捕捉材中のガラスフィルターをＡＰ−２５からＡＰ−１５（ミリポア社製）に変更したこと以外は、実施例１と同じ方法で被検体を測定した。結果を表７に示す。
【００５６】
【表７】
0004771941.tif 000008
【００５７】
実施例８
１）抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液の作製
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、リン酸緩衝液と略す。）で遠心洗浄した１．０％ラテックス粒子（積水化学工業株式会社製、Ｎ−５００、平均粒子径０．５μｍ）溶液１ｍＬに、０．７ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で調製したヤギ由来の抗ビオチンポリクローナル抗体を１ｍＬ添加し、３７℃で２時間振とうした。次いで、リン酸緩衝液で調製した１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（オリエンタル酵母工業株式会社製）を添加し、更に３７℃、２時間振とうした。上記抗ビオチンポリクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を遠心分離して上清を除去した後、０．８％のＮａＣｌと１％のＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＨＥＰＥＳ−Ｓ緩衝液と略す。）を４ｍＬ添加し、該ラテックス粒子を分散した。次いで、再度、該ラテックス粒子を遠心分離して上清を除去した後、ＨＥＰＥＳ−Ｓ緩衝液を４ｍＬ添加し、該ラテックス粒子を分散させ、抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液とした。
【００５８】
２）アルカリホスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体の作製
１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で調製した抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体（ダコ社製、ＰＥＰ００１、マウス由来）溶液１ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬの２−イミノチオラン塩酸塩水溶液０．１ｍＬを加え、２５℃で１時間振とうした。次いで、ゲルろ過にて前記モノクローナル抗体溶液から未反応の２−イミノチオランを除去し、チオール基導入抗インスリン抗体を作製した。前記の１ｍｇ／ｍＬチオール基導入抗インスリン抗体溶液１ｍＬにアルカリホスファターゼ（キッコーマン株式会社製）を溶解した後、５ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルホルムアミドに溶解したＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（株式会社同仁化学研究所製）を２０μＬ添加し、２５℃で一晩振とうした。その後、ゲルろ過にて、抗体活性と酵素活性の両方が見られる画分を分取し、アルカリホスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体を作製した。
【００５９】
３）ビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体の作製
１ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で調製した抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体（ダコ社製、ＣＰＴ３Ｆ１１、マウス由来）溶液１ｍＬに、１ｍＭになるようにジメチルスルホキシドで溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−ＯＳｕ（株式会社同仁化学研究所製）０．１ｍＬを加え、２５℃で４時間静置した。次いで、ゲルろ過にて未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−ＯＳｕを除去し、ビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体を作製した。
【００６０】
４）測定対象物質（被検体）
測定に用いた被検体は、市販のＣ−ペプチド（コスモバイオ株式会社製）を０、０．１、３ｎｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝液で希釈して作製した。
【００６１】
５）粒子の捕捉器具
円柱状のカップに吸水材、ガラスフィルター（ミリポア社製、ＡＰ−２５）が下から順次積層されたものを作製し、ラテックス粒子の捕捉材とした。
【００６２】
６）測定操作
１％のカゼインを含むリン酸緩衝液で５μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体溶液２０μＬ、１％のカゼインを含むリン酸緩衝液で０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈したアルカリホスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体溶液１０μＬ、および被検体１０μＬを混合し、３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで、上記１）にて作製した抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液を２０μＬ添加し、更に３７℃で３分間インキュベーションし、ビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体とＣ−ペプチドを介してアルカリホスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体が固定化された粒子（以下、アルカリホスファターゼ固定粒子と記す。）を調製した。調製したアルカリホスファターゼ固定粒子溶液５０μＬを、１％カゼイン（和光純薬工業株式会社製）と０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．８％のＮａＣｌが溶解したトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）から成るブロック液５０μＬで浸潤させた捕捉材に滴下し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業株式会社製）を含むリン酸緩衝液０．１ｍＬを２回捕捉材に滴下し、捕捉材中のガラスフィルターを洗浄した。続いて、この捕捉材をアルカリホスファターゼ活性の測定に供した。同一被検体について、上記の測定操作を２回行った。
【００６３】
７）アルカリホスファターゼ活性の測定
捕捉材中のアルカリホスファターゼ活性の測定は、全自動化学発光免疫測定装置ＭＩ０２（株式会社エイアンドティー製）にて行った。化学発光基質として、ＡＰＳ−５（ルミジェン社製）を用い、捕捉材１個につき３０μＬのＡＰＳ−５を滴下した。
【００６４】
８）測定結果
Ｃ−ペプチド濃度と上記測定によって得られたシグナル強度の関係を表８に示す。
【００６５】
【表８】
0004771941.tif 000009
【００６６】
実施例９
１）抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液の作製
０．０５ｍｏＬ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、リン酸緩衝液と略す）で遠心洗浄した１．０％ラテックス粒子（積水化学工業株式会社製、Ｎ−５００、平均粒子径０．５μｍ）溶液１ｍＬに０．７ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で調製したヤギ由来の抗ビオチンポリクローナル抗体を１ｍＬ添加し、３７℃で２時間振とうした。次いで、リン酸緩衝液で調製した１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（オリエンタル酵母工業株式会社製）を１ｍＬ添加し、更に３７℃、２時間振とうした。上記抗ビオチンポリクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を遠心分離して上清を除去した後、０．８％のＮａＣｌと１％のＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＨＥＰＥＳ−Ｓ緩衝液と略す）を４ｍＬ添加し、該ラテックス粒子を分散した。次いで、再度、該ラテックス粒子を遠心分離して上清を除去した後、ＨＥＰＥＳ−Ｓ緩衝液を４ｍＬ添加し、該ラテックス粒子を分散させ、抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液とした。
【００６７】
２）アルカリフォスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体の作製
１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で調製した抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体（ダコ社製、ＰＥＰ−００１、マウス由来）溶液１ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬの２−イミノチオラン塩酸塩水溶液０．１ｍＬを加え、２５℃で１時間振とうした。次いで、ゲル濾過にて前記モノクローナル抗体溶液から未反応の２−イミノチオランを除去し、チオール基導入抗Ｃ−ペプチド抗体を作製した。前記の１ｍｇ／ｍＬチオール基導入抗Ｃ−ペプチド抗体溶液１ｍＬにアルカリフォスファターゼ（キッコーマン株式会社製）を溶解した後、５ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルホルムアミドに溶解したＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（株式会社同仁化学研究所製）を２０μＬ添加し、２５℃で一晩振とうした。その後、ゲル濾過にて、抗体活性と酵素活性の両方が見られる画分を分取し、アルカリフォスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体を作製した。
【００６８】
３）ビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体の作製
１ｍｇ／ｍＬとなるように０．０１ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で調製した抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体（ダコ社製、ＣＰＴ−３−Ｆ１１、マウス由来）溶液１ｍＬに、０．００１ｍｏｌ／Ｌになるようにジメチルスルホキシドで溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−ＯＳｕ（株式会社同仁化学研究所製）０．１ｍＬを加え、２５℃で４時間静置した。次いで、ゲル濾過にて未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−ＯＳｕを除去し、ビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体を作製した。
【００６９】
４）測定対象物質（被検体）
測定に用いた被検体は、市販のＣ−ペプチド（コスモバイオ株式会社製）を０、０．１、３ｎｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝液で希釈して作製した。
【００７０】
５）粒子の捕捉器具
底面に直径６ｍｍの穴が開いた円柱状カップの底に、ガラスフィルター（ミリポア社製、ＡＰ−２５）を設置したものを作製し、ラテックス粒子の捕捉材とした。
【００７１】
６）吸引排液装置
吸引ノズル（内径２．５ｍｍのステンレスパイプ）の一端にＰＶＡスポンジ（アイオン株式会社製ベルイーターＤシリーズＹ（Ｄ））を１辺が１ｃｍの立方体に加工したものを取り付け該スポンジが上記ガラスフィルターを設置した円柱状カップの穴の下に位置するように配置した。該ステンレスパイプの別の一端には耐圧チューブを取り付け、排液トラップを介して真空ポンプ（メドー産業株式会社製、ＶＰ０１２５、吐出空気量：７Ｌ／ｍｉｎ）に接続し、吸引排液装置とした。該装置を用いたときの上記５）の捕捉材に用いたガラスフィルターにおける濾過流量は１２ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ２である。
【００７２】
７）測定操作
１％のカゼインを含むリン酸緩衝液で５μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体溶液２０μＬ、１％のカゼインを含むリン酸緩衝液で０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体溶液１０μＬ、および被検体１０μＬを混合し、３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで、上記１）にて作製した抗ビオチン抗体担持固相粒子溶液を２０μＬ添加し、更に３７℃で３分間インキュベーションし、ビオチン標識抗Ｃ−ペプチド抗体とＣ−ペプチドを介してアルカリフォスファターゼ標識抗Ｃ−ペプチド抗体が固定化された粒子（以下、アルカリフォスファターゼ固定粒子と記す）を調製した。上記５）にて作製した捕捉材を上記６）にて作成した吸引排液装置のＰＶＡスポンジ上に設置した。調製したアルカリフォスファターゼ固定粒子溶液３０μＬを、予め１％カゼイン（和光純薬工業株式会社製）と０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．８％のＮａＣｌが溶解したトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなるブロック液５０μＬで浸潤させた捕捉材に滴下し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業株式会社製）を含むリン酸緩衝液０．１ｍＬを２回捕捉材に滴下し、捕捉材中のガラスフィルターを洗浄した。続いて、この捕捉材をアルカリフォスファターゼ活性の測定に供した。同一被検体について、上記の測定操作を２回行った。
【００７３】
８）アルカリフォスファターゼ活性の測定
捕捉材中のアルカリフォスファターゼ活性の測定は、暗所にて、光電子増倍管モジュール（浜松ホトニクス株式会社製、Ｈ７３６０−０２）を用いて行なった。化学発光基質として、ＡＰＳ−５（ルミジェン社製）を用い、捕捉材１個につき３０μＬのＡＰＳ−５を滴下した。滴下１分後から０．１秒ごとに１０回シグナル強度を測定し、その平均値を測定値とした。
【００７４】
９）測定結果
【００７５】
Ｃ−ペプチド濃度と上記測定によって得られたシグナル強度を表９に示す。
【００７６】
【表９】
0004771941.tif 000010
【００７７】
以上のとおり、本発明の免疫学的定量法および試薬によれば、測定対象のリガンドの存在量を、再現性良く、短時間で且つ高感度で定量することができる。
また、本発明の好ましい免疫学的定量法によれば、多孔質繊維マトリックスで固相複合体を捕捉する際に、圧力センサー等の複雑な機構や吸引圧力の微調整が不要であり、液が穏やかに多孔質繊維マトリックスを通過するので、固相複合体粒子を確実に吸着することができ、多孔質繊維マトリックスの下方に反応残余物を含む吸水層を設置する必要が無いため、誤検知を防ぐことができ、さらに、多孔質繊維マトリックス上で長時間の免疫反応を行わないので、反応成分の該マトリックスへの非特異吸着を減ずることができ、そのため測定対象のリガンドの存在量を、再現性よく、短時間で且つ高感度で定量することができる。