(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものであることを特徴とする光架橋されたコンドロイチン硫酸を有効成分とする髄核充填剤であって、当該光架橋コンドロイチン硫酸を髄核に注入することによって投与されることを特徴とする、髄核充填剤；
・光反応性基が結合してなる光反応性コンドロイチン硫酸、
・該光反応性コンドロイチン硫酸を溶解しうる水性溶媒、及び
・水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選ばれるいずれか一つの物質、
を少なくとも含む光反応性コンドロイチン硫酸含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋コンドロイチン硫酸。
【請求項２】
アルコールが、前記光反応性コンドロイチン硫酸の水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するアルコールであることを特徴とする、請求項１に記載の髄核充填剤。
【請求項３】
アルコールが、下記式（１）で示されるものであることを特徴とする、請求項１又は２の髄核充填剤；
Ｒ−ＯＨ      （１）
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）ｌ−ＣＨ２ＯＨ（ｌは０〜５の整数である）、
【化１】
0004722837.tif 000004
（ｍは３〜５の整数である）及び
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ（ｎは３〜７０の整数である）
からなる群から選ばれる。
【請求項４】
界面活性剤が、非イオン界面活性剤又はアニオン界面活性剤であることを特徴とする、請求項１に記載の髄核充填剤。
【請求項５】
非イオン界面活性剤がポリエチレングリコールであり、アニオン界面活性剤がアルキル硫酸塩であることを特徴とする、請求項４に記載の髄核充填剤。
【請求項６】
キレート剤が、オキシカルボン酸類又はポリアミノカルボン酸類であることを特徴とする、請求項１に記載の髄核充填剤。
【請求項７】
オキシカルボン酸類がクエン酸又はその塩であり、ポリアミノカルボン酸類がエチレンジアミン四酢酸であることを特徴とする、請求項６に記載の髄核充填剤。
【請求項８】
コンドロイチン硫酸の重量平均分子量が、１００００〜１０００００であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の髄核充填剤。
【請求項９】
光反応性コンドロイチン硫酸における光反応性基が、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基に結合してなることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の髄核充填剤。
【請求項１０】
光反応性コンドロイチン硫酸含有溶液中に、光反応性コンドロイチン硫酸が１〜２０重量％含有されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の髄核充填剤。
【請求項１１】
架橋されたコンドロイチン硫酸が、さらに以下の性質を有していることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の髄核充填剤；
回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３００００ｍＰａ・Ｓであり、かつゲル状を示す。
【請求項１２】
髄核の再生のために用いられることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の髄核充填剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の髄核充填剤と、該髄核充填剤を押し出すことができる容器からなり、該髄核充填剤が該容器に充填されていることを特徴とする髄核充填剤キット。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の髄核充填剤を製造するための、架橋されたコンドロイチン硫酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋されたコンドロイチン硫酸を有効成分とする髄核充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず初めに、本明細書において用いる略号を説明する。
・ＣＳ：コンドロイチン硫酸
・ＣＳ−Ａ：コンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン４−硫酸；グルクロン酸残基と４位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基からなる二糖構造を主な構成二糖単位として含むコンドロイチン硫酸）
・ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸；イズロン酸残基と４位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基からなる二糖構造を主な構成二糖単位として含むコンドロイチン硫酸）
・ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン６−硫酸；グルクロン酸残基と６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基からなる二糖構造を主な構成二糖単位として含むコンドロイチン硫酸）
・ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ（２位が硫酸化されたグルクロン酸残基と６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基からなる二糖構造を主な構成二糖単位として含むコンドロイチン硫酸）
・ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ（グルクロン酸残基と４位と６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基からなる二糖構造を主な構成二糖単位として含むコンドロイチン硫酸）
・ＣＳ−Ｋ：コンドロイチン硫酸Ｋ（３位が硫酸化されたグルクロン酸残基と４位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基からなる二糖構造を主な構成二糖単位として含むコンドロイチン硫酸）
・ＥＤＣＩ・ＨＣｌ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
・ＨＡ：ヒアルロン酸
・架橋ＣＳ：架橋されたＣＳ
・光架橋ＣＳ：光を照射することによって架橋されたＣＳ
・光架橋反応：光の照射によって架橋が形成される反応
・光反応性基：光の照射によって架橋が形成される化合物における、当該架橋が形成される部分の残基
・光反応性ＣＳ：光反応性基が導入され、光を照射することによって架橋が形成される性質を保持するＣＳ
・ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
・ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
・ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
また、「髄核充填剤」とは、椎間板の髄核が存在する領域に充填される薬剤を意味する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において「充填」の用語は、所定の領域を完全に満たすまで詰めることのみならず、当該領域を完全に満たすまでには至らないような場合をも含む概念として用いる。【０００３】
椎間板の変性は脊椎疾患の大きな原因の１つであり、正常な状態ではゲル様を呈している髄核が存在する領域のゲル様性状が失われ、これによって疼痛（例えば腰痛など）などの症状が引き起こされる。このような椎間板変性に由来する疼痛に対しては、疼痛をコントロールするためのリハビリテーションを実施したり、脊椎が固定される時期を待たざるを得なかった。【０００４】
もし、変性した椎間板において、正常な髄核が存在すべき領域がゲル様の組成を取り戻し、これを長期間維持することができれば、バイオメカニカルの面や椎間板の機能維持の面からみて、疼痛（腰痛など）の長期間にわたる改善が期待できる。【０００５】
また、脊椎外科分野においても椎間板細胞を用いた組織再生の研究が行われている。変性した椎間板において、正常な髄核が存在すべき領域がゲル様の組成を取り戻し、これを長期間維持することができれば、髄核再生にとって良好な環境が長期間にわたって形成され、効率よく良好な髄核が再生されることも期待できる。【０００６】
さらに、椎間板の髄核が存在する領域がゲル様の組成を長期間維持できれば、椎間板の変性の防止や脊椎疾患そのものをコントロールできる可能性もある。【０００７】
特許文献１には、ＣＳやＨＡを髄核に注入し、椎間板の傷害や変性を回復させることが開示されている。【０００８】
しかし、架橋ＣＳを椎間板の髄核に注入することについては開示も示唆もない。【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／４００７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、椎間板の髄核が存在する領域において、長期間維持される髄核充填剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、架橋ＣＳが、椎間板の髄核が存在する領域において顕著に長期間維持されることを見出し、本発明を提供するに至った。【００１２】
すなわち本発明は、架橋ＣＳを有効成分とする髄核充填剤（以下、「本発明充填剤」という。）を提供する。この架橋は、光架橋であることが好ましい。【００１３】
また、この光架橋ＣＳは、以下のものであることが好ましい；
・光反応性基が結合してなる光反応性ＣＳ、
・該光反応性ＣＳを溶解しうる水性溶媒、及び
・水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選ばれるいずれか一つの物質、
を少なくとも含む光反応性ＣＳ含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋ＣＳ。【００１４】
ここで用いるアルコールは、前記光反応性ＣＳの水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するアルコールであることが好ましい。また、アルコールは、下記式（１）で示されるものであることが好ましい；
Ｒ−ＯＨ      （１）
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数1〜10の鎖状アルキル、
炭素数3〜10の分岐を有するアルキル、
−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）l−ＣＨ2ＯＨ（lは０〜５の整数である）、【００１５】
【化１】
0004722837.tif 000002
【００１６】
（mは３〜５の整数である）及び
−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ（nは３〜７０の整数である）
からなる群から選ばれる。【００１７】
また、ここで用いる界面活性剤は、非イオン界面活性剤又はアニオン界面活性剤であることが好ましい。非イオン界面活性剤を用いる場合にはポリエチレングリコールであることが好ましく、アニオン界面活性剤を用いる場合にはアルキル硫酸塩であることが好ましい。【００１８】
また、ここで用いるキレート剤は、オキシカルボン酸類又はポリアミノカルボン酸類であることが好ましい。オキシカルボン酸類を用いる場合にはクエン酸又はその塩であることが好ましく、ポリアミノカルボン酸類を用いる場合にはエチレンジアミン四酢酸であることが好ましい。【００１９】
また、架橋ＣＳにおけるＣＳの重量平均分子量は１０，０００〜１００，０００であることが好ましい。【００２０】
また、光反応性ＣＳにおける光反応性基は、ＣＳのカルボキシル基に結合してなることが好ましい。【００２１】
また、光反応性ＣＳ含有溶液中には、光反応性ＣＳが１〜２０重量％含有されていることが好ましい。【００２２】
また、架橋ＣＳは、さらに以下の性質を有しているものが好ましい；
回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３０，０００mPa・Sであり、かつゲル状を示す。【００２３】
また、本発明充填剤は、注入することによって投与されることが好ましい。【００２４】
さらに本発明充填剤は、髄核の再生のために用いられることが好ましい。【００２５】
また本発明は、本発明充填剤と、該充填剤を押し出すことができる容器からなり、該充填剤が該容器に充填されていることを特徴とする髄核充填剤キット（以下、「本発明キット」という。）を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明充填剤を用いると、変性した椎間板において、正常な髄核が存在すべき領域をゲル様の組成とすることができ、しかもこれを長期間維持することができることから、バイオメカニカル面での改善や椎間板機能の改善を通して疼痛（腰痛など）の長期間にわたる改善等に利用することができ、極めて有用である。【００２７】
また、本発明充填剤は、変性した椎間板において、正常な髄核が存在すべき領域をゲル様の組成とし、これが長期間維持されることから、髄核再生にとって良好な環境が長期間にわたって形成され、髄核の再生医療等に利用することができ、極めて有用である
さらに、本発明充填剤は、椎間板の髄核が存在する領域をゲル様の組成で長期間維持できることから、椎間板の変性の防止や脊椎疾患そのもののコントロール等にも応用することができ、極めて有用である。【００２８】
さらに、本発明キットを用いれば、本発明充填剤を簡便かつ迅速に投与することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
＜１＞本発明充填剤の有効成分
本発明充填剤は、架橋ＣＳを有効成分とする髄核充填剤である。ここで用いる架橋ＣＳは、ＣＳが架橋されたものである限りにおいて、その架橋様式、架橋方法、架橋ＣＳの性状（ゲル状、スポンジ状など）などは特に限定されない。【００３０】
架橋されるＣＳとしては、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基と、グルクロン酸残基（又はイズロン酸残基）から成る二糖繰り返し構造を主な骨格として含み、本発明の技術分野においてＣＳであると認識されるものである限りにおいて特に限定されない。このようなＣＳとしては、例えば、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ＣＳ−Ｋが例示される。架橋されるＣＳは、これらのＣＳを含有する混合物であってもよい。【００３１】
このようなＣＳの由来等も特に限定されず、天然物由来、化学的に合成したもの、遺伝子工学的手法により酵母等の微生物に生産させたもの等のいずれをも用いることができる。例えば天然物からＣＳを取得する場合には、所望のＣＳの種類等に応じて、原料とすべき天然物を適宜選択することができる。例えば、ＣＳ−Ａはチョウザメの脊索、クジラ軟骨、サメ軟骨などから、ＣＳ−Ｂはブタの皮、鶏冠などから、ＣＳ−ＣやＣＳ−Ｄはサメ軟骨などから、ＣＳ−Ｅはイカ軟骨などから、ＣＳ−Ｋはカブトガニ軟骨などから取得することができる。なかでも、サメ軟骨由来のＣＳを用いることが好ましい。【００３２】
また、架橋されるＣＳの重量平均分子量も特に限定されないが、１０，０００〜１００，０００が好ましく、２０，０００〜５０，０００がより好ましい。【００３３】
このようなＣＳに架橋基を導入後、架橋反応を起こさせることにより、架橋ＣＳを製造することができる。【００３４】
例えば、ＣＳを架橋させる方法の一例として、架橋剤としてジグリシジルエーテルを用いて架橋させる方法（Eur J. Pharm Sci 2002 Mar;15(2):139-48）、光反応性の架橋剤をＣＳに結合させて光反応性ＣＳを得、これを精製して未反応の架橋剤を除去した後に光を照射して架橋させる方法（特開平6-73102号公報）、光反応性の架橋剤をＣＳに結合させて光反応性ＣＳを得、これを水性溶媒に溶解して凍結させた後、凍結状態を保ったまま光を照射して架橋させる方法（この方法では、スポンジ性状を示す架橋グリコサミノグリカンが得られる）（WO02/060971）などを例示することができる。【００３５】
これらのいずれの方法をも採用することができるが、光を照射することによって架橋すること（光架橋）が好ましい。【００３６】
光架橋をする場合に予めＣＳに導入される架橋基は、光反応性基である限りにおいて特に限定されないが、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合化反応を生じる化合物の残基が好ましい。このような化合物としては、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、アクリル酸、アクリル酸誘導体、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン等を例示することができる。なお、置換ケイ皮酸としては、例えばベンゼン環の何れかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸であるアミノケイ皮酸（例えばp-アミノケイ皮酸）などを挙げることができ、アクリル酸誘導体としては、例えばチオフェンアクリル酸、フリルアクリル酸などを例示することができる。【００３７】
これら光反応性基の中でも、光反応によりシクロブタン環を形成することができるビニレン基を有するものであることが好ましく、光反応性及び安全性の面から、ケイ皮酸または置換ケイ皮酸がより好ましい。置換ケイ皮酸としては、アミノケイ皮酸が好ましい。【００３８】
また、光反応性ＣＳを形成した際に、光反応性基とＣＳの両方に結合して一定の距離を保つための分子（スペーサー）を含んでいてもよい。本発明において使用される光反応性ＣＳは、光反応性基が該スペーサーを介してＣＳに結合しているものが好ましい。従って、光反応性ＣＳとしては、スペーサーに結合したケイ皮酸又は置換ケイ皮酸が、該スペーサーを介して結合しているＣＳであることが最も好ましい。【００３９】
このような「スペーサーに結合したケイ皮酸又は置換ケイ皮酸」の具体例としては、アミノアルコール（H2N-(CH2)p-OH：ｐ=１〜１８、又はH2N-(CH2-O)q-CH2-OH：ｑ＝１〜９）がケイ皮酸のカルボキシル基にエステル結合したケイ皮酸アミノアルキルエステル誘導体、ジアミン（H2N-(CH2)ｒ-NH2：ｒ＝１〜１０）やジオール（HO-(CH2)s-OH：ｓ＝１〜１０）がケイ皮酸又は置換ケイ皮酸に導入された誘導体、アミノ酸（HOOC-(CHR)t-NH2：ｔ＝１〜１０、Rはアルキル基やヒドロキシアルキル基等、天然型のアミノ酸のα位の置換基を示す。）やペプチドなどが置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸など）に導入された誘導体などが挙げられる。中でも、アミノアルコールがケイ皮酸のカルボキシル基に導入された誘導体（ケイ皮酸アミノアルキルエステル）が好ましい。このアミノアルコールは、上記一般式においてｎが１〜１８のものが好ましく、特に３〜６のものが好ましく、３〜４のものが極めて好ましい。【００４０】
この場合、光反応性基を導入するＣＳ分子中の位置は、光反応性基に結合したスペーサーが保持している官能基に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、ＣＳ分子中のアミノ基（アセチルアミノ基又はスルファミノ基として存在する）、ヒドロキシル基、カルボキシル基等が例示される。例えば、ケイ皮酸アミノアルキルエステルを「スペーサーに結合した光反応性基」として用いる場合には、アミノアルキルのアミノ基と、ＣＳ分子中のカルボキシル基とをアミド結合させることによって、スペーサーを介して光反応性基をＣＳに導入することができる。【００４１】
ＣＳに導入される光反応性基の導入率は、０．１〜７５％、好ましくは０．３〜７０％である。光反応性基のＣＳへの導入反応は、例えば特開平６−０７３１０２号公報などに記載の方法で行うことができ、また、この導入率の値は、反応させるＣＳのモル数と光反応性基のモル数とを調節することにより、適宜変更・調節することができる。なお、光反応性基の導入率は、後述の実施例１に記載された方法で算出することができる。また、光架橋ＣＳの架橋率は、１〜７５％、好ましくは１５〜５０％である。架橋率は、後述の実施例１に記載された方法で算出することができる。【００４２】
このような光架橋ＣＳのなかでも、以下のものであることが好ましい；
・光反応性基が結合してなる光反応性ＣＳ、
・該光反応性ＣＳを溶解しうる水性溶媒、及び
・水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選ばれるいずれか一つの物質、
を少なくとも含む光反応性ＣＳ含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋ＣＳ。【００４３】
ここで用いる「アルコール」は、水性溶媒と混和性を有する限りにおいて特に限定されないが、前記光反応性ＣＳの水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するものであることが好ましい。そのなかでも、下記式（１）で示されるアルコールであることが好ましい；
Ｒ−ＯＨ      （１）
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数1〜10の鎖状アルキル、
炭素数3〜10の分岐を有するアルキル、
−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）l−ＣＨ2ＯＨ（lは０〜５の整数である）、【００４４】
【化２】
0004722837.tif 000003
【００４５】
（mは３〜５の整数である）及び
−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ（nは３〜７０の整数である）
からなる群から選ばれる。【００４６】
また、ここで用いる「界面活性剤」も、水性溶媒と混和性を有する限りにおいて特に限定されないが、非イオン界面活性剤又はアニオン界面活性剤であることが好ましい。非イオン界面活性剤を用いる場合にはポリエチレングリコールであることが好ましく、アニオン界面活性剤を用いる場合にはアルキル硫酸塩であることが好ましい。【００４７】
また、ここで用いる「キレート剤」も、水性溶媒と混和性を有する限りにおいて特に限定されないが、オキシカルボン酸類又はポリアミノカルボン酸類であることが好ましい。オキシカルボン酸類を用いる場合にはクエン酸又はその塩であることが好ましく、ポリアミノカルボン酸類を用いる場合にはエチレンジアミン四酢酸であることが好ましい。【００４８】
また、光反応性ＣＳ含有溶液中には、光反応性ＣＳが１〜２０重量％含有されていることが好ましい。【００４９】
また、本発明充填剤の素材となる架橋ＣＳは、さらに以下の性質を有しているものが好ましい；
回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３０，０００mPa・Sであり、かつゲル状を示す。
＜２＞本発明充填剤の形態等
本発明充填剤中の架橋ＣＳの配合量も特に限定されない。したがって、架橋ＣＳをそのまま本発明充填剤としてもよく、架橋ＣＳに悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、医学的又は薬学的に許容される溶媒を添加して本発明充填剤としてもよい。【００５０】
また、架橋ＣＳに悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、香料等、医薬等に用いられる他の成分を使用することができる。本発明充填剤の製剤化は、公知の方法を用いることができる。
＜３＞本発明充填剤の投与対象等
本発明充填剤は、椎間板の髄核領域に充填されることから、脊椎動物に投与される。脊椎動物のなかでも哺乳動物に投与されることが好ましく、ヒトに投与されることが特に好ましい。【００５１】
本発明充填剤は、これらの動物における変性した椎間板において、正常な髄核が存在すべき領域を充填する目的で投与される。したがって、この領域が本発明充填剤によって充填される限りにおいて、投与方法は限定されないが、注入することによって投与されることが好ましい。【００５２】
本発明充填剤の１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明充填剤の投与方法、投与形態、投与目的等、投与対象となる動物の年齢、性別、体重、具体的な臨床症状等に応じて個別に決定されるべき事項であり特に限定されない。例えば、通常成人１人あたり１ｍｌ〜４ｍｌ程度で１〜数回投与することができる。【００５３】
本発明充填剤を充填することにより、変性した髄核の代わりに本発明充填剤が長期間維持されることになり、バイオメカニカルの面や椎間板の機能維持の面からみて、疼痛（腰痛など）の長期間にわたる改善が期待できる。【００５４】
また、変性した椎間板において、正常な髄核が存在すべき領域をゲル様の組成とすることができ、これを長期間維持することができることから、髄核再生にとって良好な環境が長期間にわたって形成され、効率よく良好な髄核が再生されることも期待できる。本発明充填剤は、髄核の再生のために用いられることが好ましい。【００５５】
さらに、椎間板の変性の防止や脊椎疾患そのものをコントロールできる可能性もある。
＜４＞本発明キット
本発明キットは、本発明充填剤と、該充填剤を押し出すことができる容器からなり、該充填剤が該容器に充填されていることを特徴とする髄核充填剤キットである。【００５６】
「本発明充填剤を押し出すことができる容器」は、容器に充填された本発明充填剤を押し出すことができる容器である限りにおいて特に限定されず、例えば注射用のシリンジ等を例示することができる。【００５７】
本発明充填剤を前記の容器に充填する方法も特に限定されず、容器の種類に応じて適宜選定することができる。【００５８】
本発明キットを用いることにより、本発明充填剤をより簡便かつ迅速に投与することができる。
【実施例１】
【００５９】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
＜１＞材料・方法等
まず、本実施例において用いた被験物質、分析方法等を説明する。
（１）被験物質
（１−１）架橋ＣＳ
架橋ＣＳは、以下の通り製造したものを用いた。
（１）サメ軟骨由来のＣＳ（生化学工業株式会社製、重量平均分子量約30,000）5gを蒸留水150mLに溶解させ、1,4-ジオキサン 75mLを加えた後に、HOSu 13.7g、EDCI・HCl 11.4mg、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩14.4gを順次添加し、室温で３時間反応させ、NaCl4g添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、40℃で減圧乾燥を行って、光反応性ＣＳ 4gを得た。後述の方法によって算出した光反応性基の導入率は、32.4％であった。
（２）上記で得られた光反応性ＣＳを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００を重量濃度が２％となるように添加し、溶解させて反応用溶液とした。この反応用溶液を0.22μmのメンブレンフィルター（日本ミリポア株式会社製）でろ過した後、間隙が1mmとなるよう調節したガラス板に流し込み、-20℃雰囲気下で液を凍結させた。凍結状態を維持したまま800W高圧水銀ランプ（オーク製作所製）を用いて照射光量が5000mJ/cm2となるよう紫外線照射を行った。照射後、室温に戻して融解させるとゲル状の光架橋ＣＳ組成物が得られた。後述の方法によって算出した架橋率は33％であった。さらに回転粘度計を用いてコーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定したところ、試料1mLの回転粘度は3840.0mPaであった。
（１−２）１％  ＨＡナトリウム（商品名：アルツ、生化学工業株式会社製）
（２）光反応性基の導入率の算出方法
ＣＳにおける光反応性基の導入率は、ＣＳの繰り返し二糖単位あたりに導入された光反応性基の数を百分率で表した値を意味する。導入率の算出に必要なＣＳの量は、検量線を利用したカルバゾール測定法により測定し、光反応性基としてケイ皮酸を使用した場合のケイ皮酸の量は、検量線を利用した吸光度測定法（測定波長269nm）により測定した。ただし、カルバゾール測定法が利用できない場合は、検量線を利用した乾燥減量法により測定した。
（３）架橋率の算出方法
架橋率は1mol/lの水酸化ナトリウム1mLで被検物質1gを1時間鹸化した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光反応性基由来物（光反応性基の単量体及び二量体）を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって解析し、検量線を利用して二量体の量を測定した。そしてＣＳに導入された光反応性基に対する二量体となった光反応性基のモル数を百分率（％）により算出した。
（４）動物モデルの作製
８週齢の日本白色家兎（体重約２〜２．５ｋｇ）を第３〜第７腰椎椎間板（Ｌ３〜Ｌ７）における４つの椎間（Ｌ３とＬ４の間、Ｌ４とＬ５との間、Ｌ５とＬ６との間及びＬ６とＬ７の間）に、Ｘ線透視下で太さ１８ゲージの針を刺すことで椎間板の髄核を破裂させ、これによってウサギ椎間板変性モデルを作製した。約２週間後にＸ線透視下で椎間板が狭小化していることを確認した。
（５）薬効薬理試験
上記（４）で作製したモデルにおける破裂した髄核の部分に、Ｘ線透視下でそれぞれ被験物質を約３００μｌ注入した。以下、架橋ＣＳゲルを注入した群を架橋ＣＳゲル群、１％ＨＡナトリウムを注入した群をＨＡ注入群、ＰＢＳを注入した群をＰＢＳ群と呼ぶ。各群５匹の動物を用いた。【００６０】
被験物質の注入前、注入直後並びに注入後１ヵ月目及び３ヵ月目にＭＲＩで腰椎部分を撮影し、髄核部分を観察した。ＭＲＩ画像上で輝度が高ければ水分が保持されており、輝度が低ければ水分が失われていることがわかる。【００６１】
その結果、注入後１ヵ月目では、架橋ＣＳゲル、１％ＨＡナトリウム、ＰＢＳのいずれを被験物質として用いた場合においても、髄核部分におけるＭＲＩ画像上の輝度は高く維持されていた。したがって、注入後１ヵ月目では髄核部分で水分が維持されており、これらの被験物質が残留し維持されていることが確認された。しかし注入後３ヵ月目においては、架橋ＣＳゲルについてのみ高い輝度が維持されていた。したがって、注入後３ヵ月目では、架橋ＣＳゲル群のみにおいて水分維持が確認され、架橋ＣＳゲルのみが残留し維持されていることが確認された。【００６２】
また、ＭＲＩによる撮影後、髄核およびその周辺の部分について切片標本を作製し、これをサフラニン−Ｏで染色して病理組織学的に検討した。その結果、ＭＲＩにおける結果と同様に、架橋ＣＳゲルを投与したものでは、注入後３ヵ月目においても変性椎間板の内側繊維輪部の染色性が高く、被験物質が残留・維持されていることが示された。さらにこの結果から、変性椎間板に架橋ＣＳゲルを注入することにより、繊維輪内側組織における変性を抑制する効果があることが示唆された。【００６３】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、2004年5月7日出願の日本特許出願（特願2004-138034）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明充填剤は、長期間安定に維持することができる「髄核の代替素材」として利用することができる。これにより、バイオメカニカル面での改善や椎間板機能の改善を通じた疼痛（腰痛など）の長期間にわたる改善等への利用の可能性もある。さらに、髄核の再生医療等に利用への利用、椎間板の変性の防止や脊椎疾患そのもののコントロール等への利用の可能性もある。また本発明キットは、より簡便かつ迅速に本発明充填剤を投与したい場合に利用することができる。