(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸およびモナティンを含有する被処理液を、芳香族環を含有する非極性樹脂で処理することにより、前記被処理液から４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸とモナティンとを分離する工程を含むことを特徴とする４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項２】
前記芳香族環を含有する非極性樹脂は、芳香族環にハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基を有していてもよいスチレンおよびジビニルベンゼンの共重合体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項３】
前記被処理液の処理を、ｐＨ７〜１１の範囲内で行うことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項４】
前記被処理液を、前記芳香族環を含有する非極性樹脂で処理する際、水とアルコールとの混合溶剤を溶出液として用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項５】
前記被処理液が、無機塩基及び有機塩基から選ばれる少なくとも１種の塩基を含有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項６】
前記被処理液は、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸をアミノ化してモナティンを生成する反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、および、アミノ基供与体の存在下で、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸をアミノ化反応させることによって得られる酵素反応液であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項７】
前記アミノ基供与体は、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれる少なくとも1種類のアミノ酸であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法。
【請求項８】
請求の範囲第６項または第７項に記載の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の回収方法を含む、モナティンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不純物を含有するモナティンの水性溶液からモナティンを分離して製造する方法に関し、詳しくは、酵素反応によって、モナティン前駆体である４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（4-(Indol-3-ylmethyl)-4-hydroxy-2-oxoglutarate；以下、ＩＨＯＧ）からモナティンを生成させる場合に好適に利用できるモナティンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記の構造を有するモナティンは、南アフリカの潅木の根から単離・抽出された天然の甘味アミノ酸であり、ショ糖の数十倍〜数千倍に相当する強い甘味を有し、甘味剤として利用が期待されている。モナティンは、(２Ｓ,４Ｓ)体の他に、(２Ｓ,４Ｒ)体、(２Ｒ,４Ｓ)体、(２Ｒ,４Ｒ)体の３種の光学異性体が存在しており、何れもショ糖の数百倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている。
【０００３】
【化１】
0004760375.tif 000002
【０００４】
上記モナティンの製造方法については、過去に下記の５例の報告が為されている。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５９９４５５９号明細書
【非特許文献１】テトラヘドロン  レターズ（Tetrahedron Letters）、２００１年、４２巻、  ３９号、６７９３〜６７９６頁
【非特許文献２】オーガニック  レターズ（Organic Letters）、２０００年、２巻、１９号、２９６７〜２９７０頁
【非特許文献３】シンセティック  コミュニケーション（Synthetic Communication）、１９９４年、２４巻、２２号、３１９７〜３２１１頁
【非特許文献４】シンセティック  コミュニケーション（Synthetic Communication）、１９９３年、２３巻、１８号、２５１１〜２５２６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
モナティンの製造方法および分離方法については何例か報告されているものの、モナティンの有用性に関しては発見されたばかりであり、工業的生産レベルでモナティンを製造し、得られたモナティンを効率よく分離する方法に関してはまだ確立されていない。
【０００７】
かかる状況下、本発明者らは、工業的規模で容易に入手可能であるインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とを用いて、下記の反応（1）および（2）の工程からなる新たなモナティンの合成方法を開発した。
（1）  インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応工程
（2）  ＩＨＯＧの２位をアミノ化する反応工程
【０００８】
【化２】
0004760375.tif 000003
【０００９】
上記モナティンの合成方法において、（2）のアミノ化反応を触媒する酵素としては、例えばＩＨＯＧに対してアミノ基転移反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、また、ＩＨＯＧの還元的アミノ化反応を触媒するデヒドロゲナーゼ等を用いることができる。
【００１０】
このような酵素反応液は、モナティンだけでなく未反応のＩＨＯＧや、ＩＨＯＧから生成する数種の副生物を含んでいる。また、その他にも反応に用いた酵素、補酵素、アミノ基供与体等の有機成分などの不純物を含んでいる。従って、酵素法で製造されるモナティンを酵素反応液から純粋な形で得る為には、これらの多くの未反応物、副生物等の不純物を効率良く除去することが大きな課題となる。このようなモナティンを含有する酵素反応液は、後述のように、本発明で処理されるべき被処理液の典型的な一例である。
【００１１】
モナティンの分離方法として、ＺＡ−８７４２８８は、植物の根に含まれる天然モナティンを強酸性樹脂にて吸着後、アンモニア等のアルカリ液にて溶出させ精製する方法を開示している。
【００１２】
また、特開２００２−６０３８２号公報は、化学合成された立体異性体モナティン混合物をオクタデシル基等の脂肪族アルキル鎖で修飾されたシリカゲルにて分離し、さらに強酸性樹脂にて吸着後、アンモニア等のアルカリ液にて溶出させ精製する方法を開示している。
【００１３】
また、モナティンを直接分離する方法ではないが、ＺＡ−８７４２８８では、モナティン前駆体混合物をオクタデシル基等の脂肪族アルキル鎖で修飾されたシリカゲルにて分離し、アルカリ加水分解しモナティンを製造している。
【００１４】
しかしながら、今までに報告されたモナティンの分離方法では、モナティンを分離する際、酵素反応液中に含まれるモナティン前駆体（ＩＨＯＧ）を回収することが困難であった。製造コスト面からは、酵素反応液からモナティンを分離する際、未反応のＩＨＯＧをも回収し、回収したＩＨＯＧをモナティンの生成反応に再利用することが好ましい。
【００１５】
従来の方法でＩＨＯＧを回収できなかった理由として、ＩＨＯＧが極端なｐＨに対して不安定な化合物であることが考えられる。従来のモナティンの分離法では、モナティンを強酸性樹脂にて吸着後、アンモニア等のアルカリ液にて溶出させていたため、分離処理の段階でＩＨＯＧの分解反応などが生じ、ＩＨＯＧを効率よく回収することが困難であった（参考例３参照）。
【００１６】
従って、モナティンを分離する際、ＩＨＯＧを分解することなく同時に回収できるよう、温和なｐＨ条件下で効率よくモナティンを分離する方法の開発が求められる。
【００１７】
本発明が解決しようとする課題は、モナティンを工業的規模で効率よく分離することができ、かつ、その前駆体のＩＨＯＧをも回収することが可能なモナティンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、モナティンを含有する酵素反応液を、芳香族環を含有する非極性樹脂で処理することにより、温和なｐＨ条件下で効率よくモナティンを分離することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに到った。
【００１９】
また、酵素反応液を、芳香族環を含有する非極性樹脂でクロマトグラフ処理する際、酵素反応液に残存する未反応のＩＨＯＧを同時に回収できることを見出した。
【００２０】
即ち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  モナティンと不純物とを含有する被処理液を、芳香族環を含有する非極性樹脂で処理することにより、前記被処理液からモナティンを分離する工程を含むことを特徴とするモナティンの製造方法。
〔２〕  前記芳香族環を含有する非極性樹脂は、芳香族環にハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基を有していてもよいスチレンおよびジビニルベンゼンの共重合体であることを特徴とする〔１〕に記載のモナティンの製造方法。
〔３〕  前記被処理液の処理を、ｐＨ７〜１１の範囲内で行うことを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載のモナティンの製造方法。
〔４〕  前記被処理液を、前記芳香族環を含有する非極性樹脂で処理する際、水とアルコールとの混合溶剤を溶出液として用いることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のモナティンの製造方法。
〔５〕  前記被処理液が、ｐＨ７未満およびｐＨ１１超のいずれかのｐＨ領域で不安定な化合物を不純物として含有することを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載のモナティンの製造方法。
〔６〕  前記被処理液は、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸からモナティンを生成する反応を触媒する酵素の存在下で、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を反応させることによって得られる酵素反応液であることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載のモナティンの製造方法。
〔７〕  前記酵素反応液は、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸をアミノ化してモナティンを生成する反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、および、アミノ基供与体の存在下で、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸をアミノ化反応させることによって得られる酵素反応液であることを特徴とする〔６〕に記載のモナティンの製造方法。
〔８〕  前記アミノ基供与体は、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸であることを特徴とする〔７〕に記載のモナティンの製造方法。
〔９〕前記被処理液を、前記芳香族環を含有する非極性樹脂で処理する際、前記被処理液に含まれる４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を回収することを特徴とする〔６〕〜〔８〕のいずれか１項に記載のモナティンの製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に係るモナティンの製造方法は、モナティンおよび不純物を含有する被処理液を、芳香族環を含有する非極性樹脂で処理することにより、前記被処理液中に含まれるモナティンを分離することを特徴とする。
【００２２】
芳香族環を含有する非極性樹脂で被処理液を処理すると、被処理液に含まれるモナティンおよび不純物はそれぞれ芳香族環を含有する非極性樹脂と相互作用する。相互作用の大きさは各成分によって異なるので、相互作用の弱い成分から順に非極性樹脂から遊離する。例えば、被処理液中にモナティンおよびＩＨＯＧが含まれている場合、まずＩＨＯＧが溶出し、ついでモナティンが溶出する。この相互作用の差を利用して不純物が混在する被処理液からモナティンを分離することができる。
【００２３】
モナティンの分離方法としては、強酸性樹脂で処理する方法が知られていたが、本発明は、芳香族環を含有する非極性樹脂を用いてモナティンを分離するという従来にはない新規な方法である。
【００２４】
芳香族環を含有する非極性樹脂で被処理液を処理することによって、温和なｐＨ条件下でモナティンを分離することが可能となる。従って、例えばモナティンを分離する際に、酸性およびアルカリ性に対して不安定な化合物（例えば、ＩＨＯＧ）を同時に回収することが可能となる。
【００２５】
従来法では、強酸性樹脂にモナティンを吸着した後、アンモニア等のアルカリ液にて溶出させていたため、アルカリ性に対して不安定なＩＨＯＧの分解反応が起こり、酵素反応液中に含まれるＩＨＯＧを効率よく回収して再利用することが困難であった。本発明によれば、芳香族環を含有する非極性樹脂にモナティンを吸着した後、ＩＨＯＧを安定に保持できるｐＨ領域の溶出液を用いてモナティンを溶出できる。したがって、本発明は、モナティンを分離すると同時にＩＨＯＧをも回収しようとする場合に特にその効果を発揮する。
【００２６】
以下、本発明のモナティンの製造方法について下記の順に詳細に説明する。
〔Ａ〕被処理液の調製
（Ａ−１）ＩＨＯＧの調製
（Ａ−２）モナティンを含有する酵素反応液
〔Ｂ〕モナティンの分離方法
（Ｂ−１）芳香族環を含有する非極性樹脂
（Ｂ−２）被処理液の処理
【００２７】
〔Ａ〕被処理液の調製
被処理液は、本発明においてモナティンの分離源であり、モナティン（塩の形態を含む）とモナティン以外の少なくとも１種の不純物とが溶解した水性溶液である。被処理液は水性溶液であるが、後のモナティンの分離工程で支障とならない範囲内であれば水以外の他の溶媒を含有していても良い。
【００２８】
被処理液中でのモナティンの存在形態は、遊離体のほか、塩の形態でもよい。本発明において、モナティンと記載する場合は、特にことわらない限り、遊離体および塩のいずれの形態をも含む。塩の形態としては、塩基との塩を挙げることができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機塩基、アンモニア、各種アミン等の有機塩基を挙げることができる。
【００２９】
このような被処理液としては、酵素反応法または化学合成法によってモナティンの生成反応を行うことにより得られた反応液を用いることができる。当該反応液中には、反応によって生成したモナティンのほか、未反応のモナティン原料、反応副生物、反応触媒、酵素等の不純物が含まれている。
【００３０】
本発明においては、ＩＨＯＧからモナティンを生成する反応を触媒する酵素の存在下で、ＩＨＯＧを反応させることによって得られる酵素反応液を用いることが好ましい。酵素反応液中には、モナティンのほか、未反応の状態で残存するＩＨＯＧが含まれる。ＩＨＯＧは、ｐＨに対して不安定な化合物であるが、本発明のモナティンの製造方法によればＩＨＯＧを分解することなく回収することが可能となる。回収したＩＨＯＧはモナティンの生成反応に再利用可能である。以下、当該酵素反応液の調製法について説明する。
【００３１】
（Ａ−１）ＩＨＯＧの調製
モナティン前駆体であるＩＨＯＧは、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とをアルドール縮合することによって得られる。
【００３２】
ＩＨＯＧを取得する方法は特に限定されず、化学合成法および酵素法のどちらを用いてもよい。ＩＨＯＧの調製方法について、化学合成法および酵素法に分けて説明する。
【００３３】
(ｉ) 化学合成法によるＩＨＯＧの調製
化学合成法を用いたＩＨＯＧの調製は、以下に示す方法や後述の参考例２を利用して容易に実施することができるが、当然この方法に限定されるものではない。
【００３４】
例えば、インドール−３−ピルビン酸とオキサロ酢酸とを、交差アルドール反応及び脱炭酸反応に付して、ＩＨＯＧを製造することができる。前記アルドール反応に付して得られる化合物が、反応系内で形成され重要な中間体となるが、敢えてこの化合物を単離することなく次の工程である脱炭酸反応に進むことができる。
【００３５】
当該アルドール反応の条件には特に困難は無く、無機塩基又は有機塩基存在下において適当な溶媒中にて置換ピルビン酸及びオキサロ酢酸を作用させるだけで容易に進行する。
【００３６】
用いる溶媒の種類としては、反応に不活性なものであれば特に制限は無い。
【００３７】
当業者であれば、本発明の実施を妨げない範囲で反応温度、塩基の使用量、反応時間、出発物質の添加方法を適宜選択することができる。
【００３８】
溶媒として好ましくは、水、メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等を挙げることができる。
【００３９】
使用する場合の塩基として好ましくは、無機塩基、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム等のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属に対応する水酸化物、若しくは炭酸化物や、有機塩基、例えばトリエチルアミン等を挙げることができる。
【００４０】
反応温度としては、好ましくは−２０〜１００℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度を採用することができる。
【００４１】
アルドール反応縮合物を脱炭酸させる反応においては、自発的な脱炭酸反応によっても達成されるが、反応液に酸又は金属イオン又はその両方を添加することで脱炭酸反応をより効果的に行うことができる。その場合に使用する酸としては、塩酸、硫酸、燐酸、酢酸、パラトルエンスルホン酸、イオン交換樹脂等の固体酸等を、金属イオンとしては、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオン等の遷移金属イオン等を、それぞれ挙げることができる。反応温度として好ましくは−１０〜１００℃程度、より好ましくは０〜６０℃程度を選択することができる。
【００４２】
(ii) 酵素法によるＩＨＯＧの調製
酵素法を用いたＩＨＯＧの調製は、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とからＩＨＯＧを生成するアルドール反応を触媒する酵素（以下、アルドラーゼ）を用いて行う。
【００４３】
このようなアルドラーゼとしては、Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属にその存在が確認されている。このうち、Pseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３、Pseudomonas coronafaciens ＡＪ２７９１、 Pseudomonas desmolytica ＡＪ１５８２、 Erwinia sp. ＡＪ２９１７、Xanthomonascitri ＡＪ２７９７、Flavobacterium rhenanum ＡＪ２４６８が好ましい。なかでも、特にPseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３、Pseudomonas coronafaciens ＡＪ２７９１が好ましい。これらの微生物の寄託先を下記に示す。
【００４４】
（１）Pseudomonas coronafaciens ＡＪ２７９１株
(i)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８１より移管）
(ii)受託日    ２００２年６月１０日
(iii)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【００４５】
（２）Pseudomonas desmolytica ＡＪ１５８２株
(i)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８２より移管）
(ii)受託日    ２００２年６月１０日
(iii)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【００４６】
（３）Erwinia sp. ＡＪ２９１７株
(i)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８０より移管）
(ii)受託日    ２００２年６月１０日
(iii)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【００４７】
（４）Flavobacterium rhenanum ＡＪ２４６８株
(i)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２
(ii)受託日    １９８５年９月３０日
(iii)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【００４８】
（５）Xanthomonas citri ＡＪ２７９７株
(i)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−８４６２より移管）
(ii)受託日    １９８５年９月３０日
(iii)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【００４９】
上記菌株には、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき上記受託番号が付与されている。この株の公衆利用可能性についての制限は、特許の付与により確定的に解除される。
【００５０】
ＩＨＯＧの生成反応に用いるアルドラーゼとしては、微生物由来の酵素や、遺伝子組換え技術により得られた酵素を用いることができる。
【００５１】
上記微生物のうち、Pseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３由来のアルドラーゼ（以下、ＰｔＡＬＤと略す場合がある）、および、Pseudomonas coronafaciens ＡＪ２７９１由来のアルドラーゼ（以下、ＰｃＡＬＤを略す場合がある）については、そのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列が特定されているので、これらのＤＮＡ配列を利用して、遺伝子組換え技術によりアルドラーゼを大量生産することも好ましい。
【００５２】
ＰｔＡＬＤをコードするＤＮＡを配列表の配列番号１に示す。また、配列表の配列番号２および３に、配列番号１の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列を示す。配列番号２は、配列番号１記載の塩基配列のうち、４５６〜１１１８位の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列である。また、配列番号３は、配列番号１記載の塩基配列のうち、４４４〜１１１８位の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列である。
【００５３】
ＰｃＡＬＤをコードするＤＮＡを配列表の配列番号４に示す。また、配列表の配列番号５に、配列番号４の塩基配列がコードするＰｃＡＬＤのアミノ酸配列を示す。配列番号５は、配列番号４記載の塩基配列のうち、３９８〜１１４１位の塩基配列がコードするＰｃＡＬＤのアミノ酸配列である。
【００５４】
アルドラーゼを取得するには、上記アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させてもよいし、組み換えＤＮＡ技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させてもよい。
【００５５】
アルドラーゼの存在下、反応を進行させるには、アルドラーゼ、インドール−３−ピルビン酸、および、オキサロ酢酸またはピルビン酸のうち少なくとも一種を含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ６〜１２に保ちつつ、３０分〜５日静置、振とう、または攪拌すればよい。
【００５６】
当該反応液にＭｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+などの２価のカチオンを添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはＭｇ2+を用いる。
【００５７】
これら２価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＭｎＳＯ4等を用いることがある。これら２価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．５ｍＭ〜２ｍＭの範囲で添加することができる。
【００５８】
反応を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙げれば、１００ｍＭ バッファー、５０ｍＭ インドール−３−ピルビン酸、２５０ｍＭ ピルビン酸、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に、酵素源としてアルドラーゼ発現E. coliの洗浄菌体を１０％ (ｗ／ｖ)となるように添加し、３３℃で４時間振とう反応させることにより、ＩＨＯＧが得られる。
【００５９】
（Ａ−２）モナティンを含有する酵素反応液
（Ａ−１）の方法によって得られたＩＨＯＧを、上記反応式に示すようにアミノ化することによってモナティンを生成する。当該反応を触媒する酵素としては、例えばＩＨＯＧに対してアミノ基転移反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、また、ＩＨＯＧの還元的アミノ化反応を触媒するデヒドロゲナーゼ等を用いることができる。
【００６０】
本発明においては、このような酵素又はこのような目的とする酵素活性を有する微生物をＩＨＯＧに作用させることにより、モナティンを生成することができる。
以下、酵素としてアミノトランスフェラーゼを使用する場合を中心に説明する。
【００６１】
アミノトランスフェラーゼとしては、モナティンの前駆体であるＩＨＯＧとアミノ基供与体からモナティンを生成する反応を触媒する酵素を用いる。
【００６２】
この際、アミノ基供与体には、アミノ基を含む化合物が用いられる。例えば、天然及び非天然のＬ−アミノ酸やＤ−アミノ酸等のアミノ化合物が挙げられる。即ち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、システイン、ヒスチジン、リジン等がアミノ酸の例として挙げられる。反応に添加するアミノ基供与体は１種類でもよいし、複数の供与体の混合物でもよい。
【００６３】
アミノ基供与体としては、反応性の観点からは、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸が好ましく、またＤ-アラニン、Ｄ-グルタミン酸、Ｄ-アスパラギン酸がさらに好ましい。また、反応性ならびにコストの観点から特に好ましくはＤＬ-アラニンを用いることがある。
【００６４】
アミノトランスフェラーゼとしてはＬ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アミノトランスフェラーゼのいずれも使用することが可能である。Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は、ＩＨＯＧの２位にＬ−アミノ酸のアミノ基を転移することによって２Ｓ−モナティンを選択的に生成する。また、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は、ＩＨＯＧの２位にＤ−アミノ酸のアミノ基を転移することによって２Ｒ−モナティンを選択的に生成させることができる。
【００６５】
本発明の課題とするモナティンは、(２Ｓ,４Ｓ)体の他に、(２Ｓ,４Ｒ)体、(２Ｒ,４Ｓ)体、(２Ｒ,４Ｒ)体の３種の光学異性体が存在しており、何れもショ糖の数百倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている。本発明における一つの好ましい態様として、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いることにより、高甘味度異性体である２Ｒ−モナティン、特に、(２Ｒ,４Ｒ)−モナティンを生成させることが好ましい。
【００６６】
ここで、Ｄ−アミノ酸をアミノ基供与体とするとき、対応するＬ−アミノ酸を反応液中に添加し、該アミノ酸をラセミ化する反応を触媒する酵素を共存させることにより、Ｄ−アミノ酸供与体として供与体を供給することもできる。
【００６７】
アミノトランスフェラーゼは、当該アミノトランスフェラーゼを生産する微生物を培養することによっても調製することができる。
【００６８】
Ｌ−アミノトランスフェラーゼを生産する微生物としては、例えばアエロモーナス(Aeromonas)属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属、モルガネラ（Morganella）属に属する微生物を挙げることができる。これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。
【００６９】
（１）アエロモーナス  ヒドロフィラ  Aeromonas hydrophila  ＩＦＯ３８２０
（２）アグロバクテリウム  ツメファシエンス  Agrobacterium tumefaciens ＩＦＯ３０５８
（３）アルカリゲネス  フェカリスAlcaligenes faecalis ＡＴＣＣ８７５０
（４）ベイジェリンキア  インディカBeijerinckia indica ＡＴＣＣ９０３７
（５）エシェリヒア  コリ  Escherichia coli ＡＴＣＣ １２８１４
（６）プロテウス  レットゲリ  Proteus rettgeri ＩＦＯ１３５０１
（７）モルガネラ  モルガニイ  Morganella morganii ＩＦＯ３８４８
【００７０】
また、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを生産する微生物としては、例えばバチルス(Bacillus)属及びパエニバチルス(Paenibacillus)属に属する微生物を挙げることができる。これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。
【００７１】
（１）バチルス  スフェリカス  Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８
（２）バチルス  プルビファシエンス  Bacillus pulvifaciens ＡＪ１３２７
（３）パエニバチルス  ラバエ  サブスピシーズ  プルビファシエンス  Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens ＡＴＣＣ １３５３７
（４）バチルス  マセランス  Bacillus macerans ＡＪ１６１７
（５）パエニバチルス  マセランス  Paenibacillus macerans ＡＴＣＣ ８２４４
（６）バチルス  レンタス  Bacillus lentus ＡＪ１２６９９
（７）バチルス  レンタス  Bacillus lentus ＡＴＣＣ １０８４０
【００７２】
尚、バチルス  マセランス  Bacillus macerans ＡＪ１６１７については下記の通り寄託されている。
(i)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５３より、２００２年１１月２２日に国際寄託へ移管）
(ii)受託日    ２００１年１２月１３日
(iii)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目１番地１中央第６）
【００７３】
上記菌株には、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき上記受託番号が付与されている。この株の公衆利用可能性についての制限は、特許の付与により確定的に解除される。
【００７４】
上記微生物のうち、バチルス  マセランス  Bacillus macerans ＡＪ１６１７（以下、ＢＭＤＡＴと略す場合がある）、および、バチルス  スフェリカス  Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８（以下、ＢＳＤＡＴと略す場合がある）については、そのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列が特定されているので、これらのＤＮＡ配列を利用して、遺伝子組換え技術によりＤ−アミノトランスフェラーゼを大量生産することも好ましい。
【００７５】
ＢＭＤＡＴをコードするＤＮＡを配列表の配列番号６に示す。また、配列表の配列番号７に、配列番号６の塩基配列がコードするＢＭＤＡＴのアミノ酸配列を示す。
【００７６】
また、ＢＳＤＡＴをコードするＤＮＡを配列表の配列番号８に示す。また、配列表の配列番号９に、配列番号８の塩基配列がコードするＢＳＤＡＴのアミノ酸配列を示す。
【００７７】
本発明においては、モナティンの４種の光学異性体のうち最も甘味度の高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの含有率が高いモナティンを効率よく生成させることが好ましい。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの一部のアミノ酸残基を置換することにより、ＩＨＯＧから（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するように人為的に変異を起こさせることも好ましい。
【００７８】
本発明者らの研究により、配列番号７のＢＭＤＡＴにおいて、１００位、１８０〜１８３位、２４３位、２４４位の少なくとも一箇所のアミノ酸残基に置換を導入すると、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するよう改変しうることが分かっている。また、配列番号９のＢＳＤＡＴにおいて、２４３位、２４４位の少なくとも一箇所のアミノ酸残基に置換を導入すると（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成することが確認されている。
【００７９】
ＩＨＯＧの２位をアミノ化してモナティンを生成する反応を触媒する酵素又は当該酵素活性を有する微生物の存在下で、ＩＨＯＧおよびアミノ基供与体を反応させることによりモナティンを生成できる。反応系に反応促進物質、例えば補酵素、界面活性剤、有機溶剤等を添加、含有せしめることにより反応の効率をより高めることができる。
【００８０】
反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは１０〜５０℃で行われるが、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲で行われる。酵素反応液のｐＨ値については、通常、２〜１２、好ましくは７〜１１、より好ましくは８〜９の範囲で調節される。ｐＨが高いと、モナティンの原料となるＩＨＯＧが自発的にインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸に分解され易く、また、ｐＨが低いと、ＩＨＯＧが環化し易くアミノ化できなくなるので好ましくない。モナティンの原料となるＩＨＯＧの分解反応および環化反応を効果的に抑制するためには、酵素反応液をｐＨ７〜１１、より好ましくはｐＨ８〜９の範囲に保つことが好ましい。反応時間については、通常１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、更に好ましくは１〜２４時間程度が選択される。
【００８１】
尚、酵素反応液中のモナティン又はＩＨＯＧを定量する場合、周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはMerck社製「Silicagel 60F254」等を利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A」、資生堂製「カプセルパック  MG」等の逆相カラムやダイセル化学工業（株）製「CROWNPAK CR（＋）」等の光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を用いればよい。
【００８２】
酵素反応終了後、酵素反応液中には、モナティン、ＩＨＯＧ、アミノ基供与体等の可溶成分以外に、酵素源として用いた菌体、菌体破砕物等の不溶成分が含まれる場合がある。本発明においては、芳香族環を含有する非極性樹脂で処理する前に、予め酵素反応液中に含まれる不溶成分を除去しておくことが好ましい。不溶成分の除去は、遠心分離法、濾過法等の通常の手法によって行うことができる。
【００８３】
〔Ｂ〕モナティンの分離方法
本発明においては、モナティンおよび不純物を含有する被処理液を、芳香族環を含有する非極性樹脂で処理することにより、モナティンを分離する。
ここで、「芳香族環を含有する非極性樹脂で被処理液を処理する」とは、芳香族環を含有する非極性樹脂の表面に被処理液を接触させながら通過させることを意味する。
【００８４】
芳香族環を含有する非極性樹脂は、イオン交換基のような官能基を有しないが、van der Waals力により有機成分を吸着する。芳香族環を含有する非極性樹脂で被処理液を処理すると、被処理液中に含まれるモナティンおよび不純物はそれぞれ芳香族環を含有する非極性樹脂と相互作用し非極性樹脂の表面に吸着する。相互作用の強さは各成分によって異なるので、非極性樹脂の表面に溶出液を流すと、相互作用の弱い成分から順に非極性樹脂から遊離する。この相互作用の差を利用して不純物が含まれる被処理液からモナティンのみを分離することができる。
【００８５】
（Ｂ−１）芳香族環を含有する非極性樹脂
本発明においては、分子内に芳香族環を含有する非極性樹脂を用いて被処理液を処理する。このような非極性樹脂は、側鎖に芳香族環を有することが好ましい。また、非極性樹脂は、分子内に高密度に芳香族環を有することが好ましく、具体的には非極性樹脂の分子内に含まれる炭素のうち２０％以上、好ましくは５０％以上が芳香族環に由来する炭素であることが好ましい。
【００８６】
非極性樹脂の分子内に含まれる芳香族環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環などを例示することができる。このうち、ベンゼン環が最も好ましい。非極性樹脂の分子内に含まれる芳香族環は、モナティンの分離効率に影響を与えない範囲で置換基を有していてもよく、具体的には、ハロゲン原子、炭素数４以下のアルキル基等の置換基を有していても良い。このうち、好ましい置換基としてはハロゲン原子を挙げることができ、中でも臭素が特に好ましい。
【００８７】
非極性樹脂の分子内に含まれる芳香族環にハロゲン原子を導入すると、疎水吸着力が高まり、非極性樹脂から有機成分を溶出する際、溶出液を多く必要とする。このため、各成分の溶出時間の差が大きくなり、得られるモナティン画分は他成分の混入の少ない精製度の高いものとなる。
【００８８】
本発明において特に好ましく用いることのできる芳香族環を含有する非極性樹脂としては、スチレンとジビニルベンゼンを重合して得られる三次元架橋構造ポリマーを挙げることができる。ここで、スチレン、ジビニルベンゼンはベンゼン環にハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。芳香族環を含有する非極性樹脂は、スチレン、ジビニルベンゼンから導出される構成単位を主体とする重合体であれば、芳香族環を含有しないモノマー（例えばエチレン等）から導出される構成単位を一部に含んでいても良い。
【００８９】
本発明の好ましい実施の形態としては、芳香族環を含有する非極性樹脂を粒子状にしてカラム中に充填し、このカラム中に被処理液を通液する、いわゆるクロマトグラフィーの手法を用いて処理する方法が挙げられる。
【００９０】
芳香族環を含有する非極性樹脂からなる粒子の平均粒径は、膨潤状態で０．１ｍｍ〜１ｍｍが好ましく、０．２ｍｍ〜０.４ｍｍがより好ましい。ここでいう平均粒径は有効径算出法によるものである。有効径算出法とは、篩にかけた場合、９０ｖｔ％の粒子が通過する篩目の径の大きさ（有効径）を算出する方法である。具体的には、粒子を篩目の径の異なる複数の篩にかけ、各篩ごとに残留した粒子の容積を求め、片軸に各篩の残留分累計（％）、他の軸に篩目の径（ｍｍ）をとり、対数確率紙上にプロットする。粒子の残留分の多い順に３点をとり、この３点をできるだけ満足するような線を引き、この線から残留分累計が９０％に相当する篩目の径（ｍｍ）を求め、これを有効径とするものである。
【００９１】
粒子の粒度分布は特に限定されないが、均一係数算出法により算出した値で２.０以下であることが好ましい。均一係数は、有効径算出法と同一要領により、残留分累計４０％に対応する篩の目の径（ｍｍ）を求め、次式によって均一係数を算出する方法である。
【００９２】
均一係数＝残留分累計４０％に対応する篩の目の径（ｍｍ）／有効径（ｍｍ）
【００９３】
芳香族環を含有する非極性樹脂からなる粒子の比表面積は２００〜２０００ｃｍ2/g、より好ましくは５００〜１５００ｃｍ2/gであることが好ましい。
【００９４】
芳香族環を含有する非極性樹脂からなる粒子は、多数の細孔を有する多孔粒子であることが好ましい。多孔粒子の細孔半径は、１０Å〜５００Å、好ましくは３０Å〜３００Å、より好ましくは５０Å〜１５０Åである。多孔粒子の細孔容積は、樹脂１ｇ当たり１ｍｌ以上であることが好ましい。
【００９５】
（Ｂ−２）被処理液の処理
被処理液の処理温度は０℃〜８０℃、より好ましくは１０℃〜５０℃である。温度が低すぎると被処理液から結晶が析出し収率が低下する。また、温度が高すぎると分解や着色等が起こりモナティンの品質が低下する。
【００９６】
芳香族環を含有する非極性樹脂の表面に被処理液を接触させると、被処理液中に含まれるモナティンおよび不純物はそれぞれ非極性樹脂と相互作用し非極性樹脂の表面に吸着する。相互作用の強さは各成分によって異なるので、相互作用の弱い成分から順に非極性樹脂から遊離する。この相互作用の差を利用して不純物が含まれる被処理液からモナティンを分離することができる。
【００９７】
本発明においては、芳香族環を含有する非極性樹脂の表面に被処理液を接触させた後、溶出液を用いて各成分を溶離展開することが好ましい。
【００９８】
溶出液として使用する溶剤は水と混和する有機溶剤であればよい。有機溶剤としてはメタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール溶剤が望ましい。水との混合比率は好ましくは０．１％〜１００％、より好ましくは１％〜５０％、更に好ましくは５％〜２５％がよい。水のみではモナティンの溶出に長時間を要するため、水のみで一旦水溶性不純物を溶出し、後に有機溶剤と水との混和物を用いてモナティンを溶出することもできる。また、アルコール含量が高すぎると他の成分との分離性が低下する。
【００９９】
被処理液のｐＨは２〜１２、より好ましくは７〜１１、特に好ましくは８〜９である。強酸性領域ではモナティンが一部ラクタム体やラクトン体に分解する。
【０１００】
また、被処理液がＩＨＯＧを含む場合、強酸性及び強アルカリ性ではＩＨＯＧが分解し回収できない。具体的には強酸性では、ＩＨＯＧが環化し易い。この環化反応は不可逆反応であるため、一度環化したＩＨＯＧを再生してモナティンの生成反応に再利用することは困難である。また強アルカリ性では、モナティンの原料となるＩＨＯＧが自発的にインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸に分解され易くなるので好ましくない。ＩＨＯＧの分解反応および環化反応を効果的に抑制するためには、被処理液をｐＨ７〜１１、より好ましくはｐＨ８〜９の範囲に保つことが好ましい。
【０１０１】
芳香族環を含有する非極性樹脂の使用量は、被処理液に含まれるモナティンに対して、２０〜２００Ｌ／ｍｏｌ、より好ましくは５０〜１００Ｌ／ｍｏｌがよい。使用量が少なすぎるとモナティンと他の成分との分離性が低下する。また多すぎると使用する溶出液が増加し経済的ではない。
【０１０２】
溶出液を所定時間ごとにサンプリングし、各成分の溶出挙動をＨＰＬＣにて測定することにより、モナティンが溶出される溶出容量（溶出液量／樹脂容量（Ｌ／Ｌ−Ｒ））の経験値を確認できる。溶出容量は、処理条件によって異なるが、モナティンおよびＩＨＯＧを含有する被処理液を処理する場合、まずＩＨＯＧが溶出し、ついでモナティンが溶出する。予めＩＨＯＧが溶出される溶出容量、および、モナティンが溶出される溶出容量をそれぞれ把握しておき、各溶出容量において溶出液を回収することにより、ＩＨＯＧ画分、モナティン画分をそれぞれ採取することができる。
【実施例】
【０１０３】
以下に実施例を示し本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
本実施例において、モナティンの定量は、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A 」(5μm, 6X150mm)又は資生堂製「カプセルパック  MG」(5μm, 4.6X250mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析条件は、以下に示す通りである。
【０１０５】
ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A 」(5μm, 6X150mm)の場合
移動相：12％(v/v) アセトニトリル/0.05%(v/v) トリフルオロ酢酸水溶液
流速：1.5 ml/min
カラム温度：30℃
検出：UV210nm
本分析条件により、（２Ｓ,４Ｓ）−モナティン及び（２Ｒ,４Ｒ）−モナティンは１２．１分に、（２Ｓ,４Ｒ）−モナティン及び（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンは９．７分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１０６】
資生堂製「カプセルパック  MG」(5μm, 4.6X250mm)の場合
移動相A液：(20ｍM燐酸1カリウム＋20ｍM燐酸2カリウム)水溶液
移動相B液：(20ｍM燐酸1カリウム＋20ｍM燐酸2カリウム)水溶液/ アセトニトリル=50/50(v/v) 水溶液
タイムプログラム：0→15min A液100％  15min→45min B液75％まで直線グラジエント  45→60min A液100％
分析サイクル：60min
流速：1 ml/min
カラム温度：40℃
検出：UV210nm
本分析条件により、（２Ｓ,４Ｓ）−モナティン及び（２Ｒ,４Ｒ）−モナティンは１６．３分に、（２Ｓ,４Ｒ）−モナティン及び（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンは１２分に、ＩＨＯＧは１１分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１０７】
また、必要に応じて、ダイセル化学工業製光学分割カラム「CROWNPAK CR(+)」(4.6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。分析条件は以下に示す通りである。
移動相：過塩素酸水溶液（pH1.5）/10%(v/v)メタノール
流速：0.5 ml/min
カラム温度：30℃
検出：UV210nm
本条件によりモナティン光学異性体は（２Ｒ,４Ｓ）、（２Ｒ,４Ｒ）、（２Ｓ,４Ｒ）、及び（２Ｓ,４Ｓ）の順に４２分、５７分、６４分、及び１２５分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１０８】
実施例１
参考例１の方法にてＩＨＯＧからモナティン生成させることにより取得した酵素反応液１２１．８４ｇ（（２Ｒ、４Ｒ）−モナティン（以下（RR）monatinと表記する場合がある）  ２．７２ｗｔ％）を合成吸着剤(三菱化学製DIAION−SP207)が６００ｍｌ充填された樹脂塔（直径４ｃｍ）に通し、流速７．５ｍｌ／分で純水を３時間通液し、更に流速７．５ｍｌ／分で１５％２−プロパノール水溶液を３時間通液し、２．６〜３．５（溶出液量／樹脂容量（Ｌ／Ｌ−Ｒ））を収集することにより、（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンをほぼ定量的に分取した。
【０１０９】
図１に酵素反応液の分離パターンを示す。図１において、ＰＡはＩＨＯＧの分解反応及びＤ−アラニンのアミノ基転移反応によって生じたピルビン酸を表している。ＩＨＯＧ−ａはＩＨＯＧの環化反応によって生じた1,3-Dihydroxy-2,3,4,9-tetrahydro-1H-carbazole-1,3-dicarboxylic acid（下記化学式参照）を表している。また、ＩＨＯＧ−ｂは、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸のアルドール縮合反応によりＩＨＯＧを合成する際に副生物として生じた2-Hydroxy-3-(1H-indol-3-yl)-2-methyl-4-oxo-pentanedioic acid（下記化学式参照）をそれぞれ表している。
【０１１０】
【化３】
0004760375.tif 000004
【０１１１】
得られたモナティン画分を１３．３ｇまで濃縮し、２−プロパノール６４ｍｌを添加して１０℃で１６ｈｒ撹拌した。結晶をろ過した後、得られた湿結晶３．０ｇを水１０ｍｌに溶解し、２−プロパノール３０ｍｌを３５℃で添加し、更に３５℃で２−プロパノール３０ｍｌを２時間かけて滴下した。溶液を室温に冷却し、結晶をろ過した後、減圧乾燥にて（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンのＫ塩２．５９ｇを得た。（area純度９７．４％）
【０１１２】
実施例２〜９、比較例１
表１に示す合成吸着剤（三菱化学製）が４０ｍｌ充填された樹脂塔（直径４ｃｍ）に酵素反応モデル液2mlを注入した。使用した酵素反応モデル液中の各組成含量は、モナティン０．２４ｍｍｏｌ、アラニン１ｍｍｏｌ、ＩＨＯＧ ０．２４ｍｍｏｌ、ＩＰＡ（インドールピルビン酸） ０．１７ｍｍｏｌである。表１記載の移動層にて通液し、所定時間ごとに溶出液をサンプリングし各成分の溶出挙動をＨＰＬＣにて測定した。
【０１１３】
表１に各成分の平均溶出容量（Ｌ／Ｌ−Ｒ）を示す。ここでの平均溶出容量（Ｌ／Ｌ−Ｒ）は加重平均法にて算出した値である。
【０１１４】
また、表１に記載の合成吸着剤の化学構造および性質について、表２に示す。なお、表２に記載の見掛密度、水分、有効径および均一係数は下記の方法により算出した値である。
【０１１５】
見掛密度＝樹脂重量（ｗｅｔ−ｇ）／樹脂容量（Ｌ−Ｒ）
【０１１６】
樹脂容量は、基準形（膨潤状態）で計測した値であり、樹脂重量は、基準形にした樹脂を遠心分離して付着水分を除いた後に計測した値である。
【０１１７】
水分（％）＝乾燥減量（ｇ）×１００／樹脂重量（ｗｅｔ−ｇ）
【０１１８】
樹脂重量は、基準形にした樹脂を遠心分離して付着水分を除いた後に計測した値であり、乾燥減量は樹脂重量を計測後１０５℃±２℃の恒温乾燥機中で４時間乾燥し、デシケータ中に３０分放冷した後に計測した値である。
有効径
有効径算出法により算出した樹脂の粒度
均一係数
均一係数算出法により算出した樹脂の粒度分布
【０１１９】
【表１】
0004760375.tif 000005
【０１２０】
【表２】
0004760375.tif 000006
【０１２１】
比較例２
強酸性樹脂（三菱化学製DIAION−PK208 Na型）５０ｍｌに、モナティン３００ｍｇとアラニン４８４ｍｇを含む水溶液１０ｍｌを注入し、流速１ｍｌ/分で純水を通液したがモナティンはアラニンと分離されずに溶出した。
【０１２２】
比較例３
塩基性樹脂（三菱化学製DIAION−WA30）２５ｍｌにモナティン２５０ｍｇとアラニン５３４ｍｇを含む水溶液１０ｍｌを注入し流速１ｍｌ/分で純水を通液した。アラニンは溶出分離されたが、モナティンは溶出されず樹脂に吸着されたままであった。
【０１２３】
＜参考例１＞  酵素反応液の調製
［I］  Bacillus macerans ＡＪ１６１７株由来ｄａｔ遺伝子(以下、ｂｍｄａｔ)のクローニングと発現プラスミドの採取
(1)染色体ＤＮＡの調製
Bacillus macerans ＡＪ１６１７株を５０ ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ ｍｌを遠心分離操作（12000x g、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１２４】
(2)遺伝子ライブラリからのｂｍｄａｔ遺伝子の単離
まず、Bacillus macerans ＡＪ１６１７株の染色体ＤＮＡ３０μｇに制限酵素EcoRIを１Ｕ添加し、３７℃にて３時間反応させて部分消化した。次にこのＤＮＡからアガロースゲル電気泳動にて３〜６ｋｂｐの断片を回収した。これをプラスミドpUC118のEcoRI切断物（BAP処理済み・宝酒造製）１μｇにライゲーションし、E. coli JM109を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリン ０．１ ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５ ％、塩化ナトリウム１％、寒天２％、ｐＨ７．０）にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリン ０．１ ｍｇ／ｍｌとイソブチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ ｍＭ含むＬＢ液体培地１ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養した。培養液２００〜４００μｌを遠心分離により集菌・洗浄し菌体を得た。得られた菌体を、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)、５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ Ｄ−グルタミン酸、１ ｍＭ  ピリドキサール−５'−リン酸、１％ （v/v）トルエンからなる反応液２００μlに接種し、３０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清５μlを２００μｌのピルビン酸定量反応液（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７．６)、１．５ ｍＭ ＮＡＤＨ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６ Ｕ／ｍｌ Lactate dehydrogenase（オリエンタル酵母製））を含む９６ウェルプレートに加え、３０℃で１０分間反応させた後に３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（SPECTRA MAX190、Molecular Device社製）を用いて測定した。同様の反応を終濃度０．２ ｍＭ 〜１ ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（以下、ＤＡＴ）活性を検出した。
【０１２５】
上記のＤＡＴ活性クローンのスクリーニングにより、ＤＡＴ活性を示すクローンを採取した。この形質転換体よりＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製し、pUCBMDATと命名した。プラスミドpUCBMDATをEcoRI処理してアガロースゲル電気泳動に供したところ、挿入断片の長さは約3.3kbpと見積もられた。
【０１２６】
(3)挿入断片の塩基配列
プラスミドpUCBMDATの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表６に示す配列のうち、６３０番から１４８１番に対応する約８５０ｂｐからなるＯＲＦを見出した。本ＯＲＦについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において９１％の相同性を、Bacillus sp. YM-1株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において６６％の相同性を、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１０７１６株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において４２％の相同性を示した。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「genetyx 6」（GENETYX社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。この結果より、本ＯＲＦはＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子をコードしていることが明らかとなった。
【０１２７】
［II］  変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドの作製
部位特異的変異(Site-Directed mutagenesis)による変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドの作製には、STRATAGENE社製QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitを使用した。まず、目的とする塩基置換を導入し、かつ２本鎖ＤＮＡのそれぞれ鎖に相補的になるように設計した合成オリゴＤＮＡプライマーをそれぞれ（２本１組）合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表３に示す。変異型酵素の名称についてであるが、「野生型酵素でのアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えばS243N変異型酵素は野生型酵素の２４３番目のSer（S）残基をAsn（N）残基に置換した変異型酵素であることを意味する。
【０１２８】
【表３】
0004760375.tif 000007
【０１２９】
該キットの方法に従い、［I］にて採取した野生型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドpUCBMADTを鋳型として変異型プラスミドpS243N/A182Sを作製した。pS243N/A182Sの作製方法を説明する。まず、pS243Nの作製にあたっては、pUCBMDATを鋳型としてプライマーS243N-S, S243N-ASを用いて、以下の条件で変異型ＢＭＤＡＴ発現プラスミドを増幅することによって、pS243Nを作成した。
95℃ 30秒
55℃  1分
68℃  8分          ×18サイクル
【０１３０】
メチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素DpnI処理によって鋳型pUCBMDATを切断した後に、得られた反応液でE.coli JM109を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収して塩基配列を決定し、目的とする塩基置換が導入されていることを確認した。
【０１３１】
次いで、pS243Nを鋳型としてプライマーA182S-S、A182S-ASを用いて同様の操作を行うことによりpS243N/A182Sを作製した。
【０１３２】
［III］  S243N/A182S変異型ＢＭＤＡＴを用いた(±)−ＩＨＯＧの２Ｒ-モナティンへの変換
（１）菌体の調製
pS243N/A182Sを持つE. coli形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地（バクトペプトン １ｇ／ｄｌ、酵母エキス ０．５ｇ／ｄｌ、ＮａＣｌ １ｇ／ｄｌ）に接種し、３７℃、１６時間シード培養した。この培養液２．５ｍｌを、０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリン、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含むカザミノ酸培地（０．５ｇ／ｄｌ 硫酸アンモニウム、０．１４ｇ／ｄｌ ＫＨ2ＰＯ4、０．２３ｇ／ｄｌ クエン酸・２Ｎａ・３Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／ｄｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２ｍｇ／ｄｌ ＦｅＳＯ4、２ｍｇ／ｄｌ ＭｎＳＯ4、２ｍｇ／ｄｌ 塩酸ピリドキシン、０．１ｍｇ／ｄｌ thiamine、１ｇ／ｄｌ カザミノ酸、０．３ｇ／ｄｌ グリセロール、ｐＨ７．５）５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコに添加し、３７℃、１８時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、S243N/A182S変異型ＢＭＤＡＴ発現E. coliを調製した。
【０１３３】
（２）ＩＨＯＧアミノ化反応
上記（１）にて、２４０ｍｌ培養液より集菌・洗浄して調製した菌体を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、２４４ｍＭ （±）−ＩＨＯＧ、６００ｍＭ ＤＬ−Ａｌａ、１ｍＭ ピリドキサール−５’−リン酸からなる反応液１２０ｍｌに懸濁し、３７℃で２４時間攪拌し、反応を実施した。なお、ここで使用した（±）−ＩＨＯＧは後述する参考例２の方法により取得されたものである。
【０１３４】
反応中のｐＨの低下を防ぐため、１Ｎ ＫＯＨにてｐＨをｐＨ８．４±０．１に制御した。その結果、２４時間で７９．２ ｍＭの（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンが反応液中に蓄積した（対４Ｒ−ＩＨＯＧモル収率６５％）。得られた反応液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を取得した。この上清を実施例１の酵素反応液として用いた。
【０１３５】
＜参考例２＞  ＩＨＯＧの合成
水酸化カリウム１８．９１g（２８６．５ｍｍｏｌ、含量８５重量％）を溶解した水６４．４５ｍｌに、インドール−３−ピルビン酸７．５０ｇ（３５．８ｍｍｏｌ、 含量９７．０重量％）とオキサロ酢酸１４．１８ｇ（１０７．４ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた。この混合溶液を３５℃にて２４時間攪拌した。
【０１３６】
更に、３Ｎ−塩酸４０．０ｍｌを加えて中和（ｐＨ＝７．０）し、１５３．５ｇの反応中和液を得た。この反応中和液には、ＩＨＯＧが５．５５ｇ含まれており、収率５３．３％（対インドール−３−ピルビン酸）であった。
【０１３７】
この反応中和液に水を加え、１６８ｍｌとし、合成吸着剤（三菱化学製 ＤＩＡＩＯＮ−ＳＰ２０７）８４０ｍｌにて充填された樹脂塔（直径４．８ｃｍ）に通液した。更に、流速２３．５ｍｌ毎分にて純水を通液し、１．７３〜２．５５ (Ｌ / Ｌ−Ｒ)を収集することにより、高純度のＩＨＯＧを３．０４ｇ含む水溶液を、収率５４．７％（樹脂への投入量に対して）にて得た。
【０１３８】
（ＮＭＲ測定）
1H-NMR(400MHz, D2O): 3.03 (d, 1H, J = 14.6 Hz), 3.11(d, 1H, J = 14.6 Hz), 3.21(d, 1H, J= 18.1 Hz), 3.40 (d, 1H, J = 18.1 Hz), 7.06-7.15 (m, 3H), 7.39 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.66 (d, 1H, J = 7.8 Hz).
13C-NMR(100MHz, D2O): 35.43, 47.91, 77.28, 109.49, 112.05, 119.44, 119.67, 121.91, 125.42, 128.41, 136.21, 169.78, 181.43, 203.58
【０１３９】
＜参考例３＞  ＩＨＯＧのｐＨ安定性の評価
[I] ＩＨＯＧアミノ化反応液中におけるｐＨ安定性
ＩＨＯＧアミノ化反応液中でのＩＨＯＧの安定性を試験するために、ＩＨＯＧアミノ化反応溶液の菌体無添加区でのＩＨＯＧの経時変化を測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、３００ｍＭ （±）ＩＨＯＧ、６００ｍＭ ＤＬ−Ａｌａ、１ｍＭ ピリドキサール−５´−リン酸からなる反応液１ｍｌを含む試験管を、３７℃で４０時間振とうし、反応を実施した。その結果、（±）ＩＨＯＧの残存率は１６時間後に８１％、２４時間後に７０％、４０時間後には５７％にそれぞれ減少しており、ＩＨＯＧが経時的に分解していることが明らかとなった。これは反応液中でＩＨＯＧがインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸に分解する分解反応や、ＩＨＯＧの環化反応が生じることが原因であると推察される。
【０１４０】
[II] 緩衝液中におけるｐＨ安定性
ｐＨの異なる４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中でのＩＨＯＧ（０．５４ｍＭ）の残存率を測定した。保存温度３５℃とした。
【０１４１】
【表４】
0004760375.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明により、甘味料等として期待できるモナティンのなかでも最も甘味度の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを酵素反応を利用して効率良く製造することができるので、本発明は工業上、特に食品の分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】第１図は、酵素反応液の分離パターンを示す図である。
【図１】
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【配列表】
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