(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法であって、
ａ）組換え宿主細胞中で、ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させ、ＶＬＰを生産させる段階、
ｂ）細胞残渣からＶＬＰを分離する段階、及び
ｃ）該ＶＬＰを成熟工程に付す段階であって、該成熟工程は３０℃〜４５℃、１０〜４８時間のＶＬＰのインキュベーション、ＶＬＰの金属表面への暴露、０．５ｍＭ〜１０ｍＭのグルタチオンを用いたグルタチオンにより促進されるチオール酸化、０．５ｍＭ〜２５ｍＭの酸化型グルタチオンを用いたグルタチオンにより促進されるチオール酸化、及びこれらの組合せからなる群から選択される工程である段階を含んでなる製造方法。
【請求項２】
該ＨＰＶタンパク質が、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
段階ｃ）がＶＬＰを１５〜２０時間インキュベートすることを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
グルタチオンが１ｍＭ〜７ｍＭ存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
酸化型グルタチオンが１〜１７ｍＭで存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、より大きな安定性を有するワクチン用途に適した組成物を与えるヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製および加工するための新規方法に関する。また、本発明は、この方法により製造されたＶＬＰに関する。
【０００２】
（発明の背景）
組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せのいずれかを含有するが、ウイルス核酸を含有しない。それは、酵母および昆虫細胞を含む種々の宿主細胞型において発現されることが可能であり、性器ＨＰＶ感染ならびにそれに続く性器疣贅および／または子宮頚癌の発生を予防するためのワクチン開発の魅力的な候補である。動物での研究においては、精製されたＶＬＰがコンホメーション型特異的Ｌ１エピトープに対する高力価の抗体を誘導することが示されている。これらの抗体はインビトロアッセイにおいて相同ビリオンを中和し、いくつかのモデル動物における実験的攻撃に対して防御する。
【０００３】
「成熟」（すなわち、ＶＬＰの安定性、構造的明瞭性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）および他の特性の変化）が精製、加工および保存中にＶＬＰで観察されている。理論に束縛されるものではないが、これは、少なくとも１つには、ビリオンの集合および更にはその安定化に要求される分子間ジスルフィド結合形成における変化によるものであるらしい。
【０００４】
安定であることがワクチン製剤には重要である。したがって、安定であり保存中に免疫原性をも維持するＶＬＰを製造することが望ましいであろう。
【０００５】
（発明の詳細な記載）
本発明において、パピローマウイルスＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を成熟プロセス（過程）に付すことにより、改善された抗原性、サイズ分布および安定性を有するウイルス様粒子が産生されることが見出された。したがって、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法であって、
ａ）ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させること、
ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、
ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を成熟工程に付すことを含んでなる製造方法に関する。
【０００６】
本発明に含まれる種々の成熟プロセスがあり、それらには、上昇した温度でのインキュベーション、グルタチオンにより促進されるチオール酸化、金属表面への暴露および光への暴露が含まれる。１つの好ましい成熟プロセスは、少なくとも部分的に精製されたタンパク質を、上昇した温度でインキュベートする工程である。したがって、本発明の特定の実施形態は、
ａ）ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させること、
ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、
ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を、上昇した温度でインキュベートすることを含んでなるＨＰＶ  ＶＬＰの製造方法でである。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態においては、該タンパク質を組換え的に産生させる。さらに、他の好ましい実施形態においては、上昇した温度は約３０℃〜約４５℃である。特に好ましい実施形態においては、該温度は約３７℃である。
【０００８】
もう１つの実施形態においては、前記の少なくとも部分的に精製されたＶＬＰを、成熟工程として、グルタチオンまたは酸化型グルタチオンのいずれかで処理する。得られる成熟ＶＬＰは加熱処理体と実質的に同じである。
【０００９】
本方法により製造されたＶＬＰは、該成熟工程無しで製造されたものから区別されうるため、本発明はまた、Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させ、該タンパク質を少なくとも部分的に精製し、その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を成熟工程に付す製造方法により製造されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明はまた、そのようにして製造されたＶＬＰを含有するワクチン組成物に関する。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、個体における免疫応答の誘導方法であって、成熟工程に付されたＶＬＰを含むワクチン組成物の有効量を該個体に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１１】
（図面の簡単な記載）
図１は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析により測定した場合の、成熟工程を加えることにより得られた抗原性の増強を示すグラフである。ＥＩＡ／ＢＣＡ比および中和ｍＡｂへの相対結合は、ＶＬＰ成熟による抗原性の増強に関する同様の増加を示した。数値は、同一実験における対応対照に対する成熟アーム（ａｒｍ）の相対抗原性の割合（％）である。＊  ロット＃４からの対照アームは、成熟アームと比較して有意な凝集を示した（すなわち、ＥＩＡ／ＢＣＡ（０．３対０．９）およびＢｉａｃｏｒｅ（１０対６７））。
【００１２】
図２Ａおよび２Ｂは、最終産物のＶＬＰの電子顕微鏡写真である。図２Ａは、対照プロセスを用いて製造したＶＬＰである。図２Ｂは、成熟プロセスを用いて製造したＶＬＰであり、それは、対照より有意に均一に分布している。
【００１３】
図３は、動的光散乱により分析したＶＬＰのサイズ分布を示すグラフである。
【００１４】
図４Ａおよび４Ｂは、ＨＰＶ６ａ  ＶＬＰ沈降速度の変化を示すグラフである。図４Ａは対照プロセスである。図４Ｂ（成熟プロセス）においては、粒子サイズの不均一性の減少が分析用遠心分離により示されている。
【００１５】
図５Ａおよび５Ｂは、ＶＬＰの高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）の結果である。対応する対照プロセスと比較して、より大きなＶＬＰ集団が単分散状態にある。図５ＡはＨＰＶ６ａ  ＶＬＰであり、図５ＢはＨＰＶ１１  ＶＬＰである。
【００１６】
図６Ａ〜Ｄは、ＨＰＶ６ａ（図６Ａおよび６Ｂ）およびＨＰＶ１１（図６Ｃおよび６Ｄ）に関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。成熟により変換が促されるため、単量体含量における有意な減少が認められる。
【００１７】
図７は、該プロセス中のＨＳＰ成熟によるＶＬＰのタンパク質分解活性の減少を示すグラフである。成熟ＶＬＰのタンパク質分解活性はすべて、同じ実験におけるそれぞれの対照アームに対して正規化されており、基質としてカゼインを使用してペアでアッセイしたものである。
【００１８】
図８。促進された成熟によるＨＰＶ１６  ＶＬＰの改善された安定性。対照（４℃から；黒丸）ＶＬＰは４２℃の処理中に迅速に抗原性を失うことが示されたが、該処理産物（黒三角）はより良好な安定性を示した。もう１つの対照調製物（最下方に引かれている黒丸）は、ＧＳＳＧの不存在下ではＨＰＶ１６  ＶＬＰがインキュベーション中に抗原性を失うことを示した。
【００１９】
図９。滅菌濾過産物（ＳＦＰ）のＨＰＶ１６  ＶＬＰの、酸化還元処理の存在下（ＳＦＰ  Ｂ）または不存在下（ＳＦＰ  Ａ）の沈降プロフィール。左パネル：両方のアームのＶＬＰは直径約４０〜６０ｎｍ（ｌｏｇｓ＊は約１．４〜２．４に等しい）のサイズを示す。右パネル：変性条件下、対照プロセスからのＶＬＰはＬ１タンパク質（ｐ５５）に完全に変性し、一方、酸化還元により促進された成熟からのＶＬＰは粒子構造を保有していた。
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲の全体においては、以下の定義が適用される。
【００２１】
「成熟」は、ＶＬＰの特性におけるいくつかの有益な変化をもたらす過程（プロセス）を意味する。成熟工程に付されたＶＬＰは、溶液のイオン強度に感受性ではなく、広いｐＨ範囲にわたり安定であり、室温の生理的塩およびｐＨ条件で少なくとも１／２〜２日の半減期を有する。これに対して、成熟していないＶＬＰは、溶液のイオン強度に非常に感受性であり、狭いｐＨ範囲にわたり安定であるにすぎず、室温の生理的塩およびｐＨ条件において直ちに凝集する。
【００２２】
ＶＬＰは、ＨＰＶのビリオンの主要カプシド成分である天然に発現された又は組換え的に産生されたＬ１タンパク質から組立て得る。また、ＶＬＰは、Ｌ１およびＬ２の両方のタンパク質から製造することが可能であり、以下、それは「Ｌ１＋Ｌ２」と称される。
【００２３】
特にカプソメア間ジスルフィド結合を含むジスルフィド結合は、ＶＬＰの安定性、そして恐らくはＶＬＰの組立てに決定的に重要であることが示されている。
【００２４】
組換えＨＰＶ  ＶＬＰを製造し精製するための一般的方法は公知である。本方法においては、実質的に任意の血清型ＨＰＶを使用することができる。該ＶＬＰは最終的にはワクチン製剤の製造に使用されることになるため、疾患に関連した血清型が用いられることが好ましい。これらの血清型には、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ６８が含まれる。該ワクチン製剤はまた、所望により「カクテル」を形成するよう種々の血清型からのＶＬＰの混合物を含みうる。例えば、好ましいワクチン製剤は、ＨＰＶ６ａおよび／またはＨＰＶ６ｂをＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８と共に含む。
【００２５】
該組換えタンパク質は、任意の望ましい宿主細胞において産生させることができる。公知の有用な宿主細胞の具体例には、酵母および昆虫細胞が含まれるが、他の宿主細胞を使用することが可能である。好ましい実施形態においては、酵母細胞、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｃａｅ）が該宿主である。該宿主細胞を適当な遺伝的構築物で形質転換し、ＨＰＶタンパク質を産生させる。これらにはすべて、公知方法が用いられる。十分なＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質が産生したら、該タンパク質を集め、精製する。本発明においては、一般には、少なくとも１つの成熟工程を含む任意の精製方法を用いることができる。一般に用いられる方法においては、該精製方法の前に、該細胞を凍結し、細胞スラリーとして保存する。
【００２６】
ついで細胞を融解し、所望により、該細胞スラリーをバッファーで希釈することができる。この段階で用いる温度は、典型的には、約５〜２０℃である。所望により、望ましくない核酸を分解するために、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）のような酵素を加えることができる。クロマトグラフィー工程を含む種々の技術を用いて、該細胞残渣からＶＬＰを分離することができる。
【００２７】
本発明の１つの実施形態においては、陽イオン交換クロマトグラフィーのようなイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて該ＶＬＰを分離する。この方法から得られた中間産物（「ＣＥＰ」と称される）を更なる精製工程および成熟工程に付すか、または成熟工程、ついで更なる精製工程に付すことができる。該ＣＥＰを成熟工程に付すのが一般には好ましい。
【００２８】
本発明においては、多数の成熟プロセスが確認されている。成熟は、成熟プロセスに付されていないカプシドと比較して増強した安定性を有するＶＬＰを与える。成熟は、上昇した温度でのインキュベーション、グルタチオンにより促進されるチオール酸化、金属表面への暴露、または光への暴露により達成されうる。
【００２９】
１つの好ましい実施形態においては、該成熟工程は、上昇した温度でのインキュベーションである。これは、ＣＥＰに対して又は後続の精製工程の産物に対して行うことができる。それは、典型的には、上昇した温度での約１０〜４８時間、好ましくは約１５〜２０時間のインキュベーションである。典型的には、上昇した温度は、約２５℃〜約４５℃、好ましくは約３７℃である。
【００３０】
あるいは、該ＣＥＰまたは更に精製された産物をグルタチオンまたは酸化型グルタチオンで処理して、それらを成熟させる。グルタチオンの絶対量は決定的に重要なものではないらしい。それは、０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲であることが可能であり、１ｍＭを超える量が好ましい。１ｍＭを用いる成熟プロセスと７ｍＭを用いる成熟プロセスとの間には、ほとんど差がないようである。酸化型グルタチオンを使用する場合には、該量は約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲であることが可能であり、１ｍＭ〜１７ｍＭが好ましい。
【００３１】
該ＣＥＰまたは更に精製された産物を、金属表面への暴露により成熟させることが可能である。これは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ１＋またはＣｕ２＋のような可溶性遷移金属の存在下で生じる反応を含む。該成熟反応には、触媒量の金属を要するにすぎない。
【００３２】
該成熟産物を、望ましい他の任意の精製工程に付すことができる。好ましい方法においては、該成熟産物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムにより加工（プロセス）し、ついで限外濾過に付して最終的なＶＬＰ産物を得る。ついで該最終産物を、公知方法および所望により添加物を用いて、ワクチン組成物に製剤化することができる。
【００３３】
あるいは、該ＣＥＰを更に加工し、および／または精製し（例えば、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー法および限外濾過により）、ついで成熟させることができる。
【００３４】
本発明のワクチン製剤は、成熟したＶＬＰを他の生理的に許容される成分と共に含む。例えば、それは、ミョウバン、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート誘導体、好ましくは、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０）、塩およびバッファーを含有しうる。好ましい実施形態においては、該ワクチンは、ミョウバン（２００〜５５０μｇ／ｍｌミョウバン）に吸着された成熟ＶＬＰ、０．００５〜０．５％（ｗｔ／ｖ）ポリソルベートまたは誘導体、２〜１０ｍＭ  バッファー、および０．１０〜０．２０Ｍ  ＮａＣｌまたはより低い食塩濃度の製剤には０．０１〜０．０５  ＮａＣｌを含む。好ましい実施形態は、約４５０μｇ／ｍｌ  ミョウバン、０．０３％  ｗｔ／ｖ  ポリソルベート８０またはポリソルベート２０、５ｍＭ  ヒスチジンバッファー、および０．１５Ｍ  ＮａＣｌまたは０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。
【００３５】
該最終製剤は、一般には、１０〜２００μｇ／ｍｌ  ＶＬＰ、好ましくは、約２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ  ＶＬＰを有する。典型的な投与は０．５ｍｌの注射となろう。
【００３６】
該成熟プロセスの結果として、該ＶＬＰに対する改善がもたらされる。成熟プロセスにより製造されたこれらの改善されたＶＬＰは、本発明のもう１つの態様である。改善は以下のとおりに分類されうる。
【００３７】
成熟によるＨＰＶ  ＶＬＰの抗原性の増強
６ａ型に関する８つの実験室規模プロセスロットおよび１１型に関する１つのロットについての成熟プロセスおよびそのそれぞれの対照プロセスに由来するＣＥＰに関するＥＩＡ／ＢＣＡ比は、実施例４で詳しく説明する。該成熟工程を加えた場合には、ＥＩＡ／ＢＣＡ比が約３０〜５０％増加することが判明した。モノクローナル抗体結合試験を用いた場合、抗原性における一貫した２０〜３０％の増加が認められた。
【００３８】
図１は、該成熟産物の、それらのそれぞれの対照に対する相対抗原性（％）を示す。中和ｍＡｂを使用するＢＩＡｃｏｒｅアッセイによる相対抗原性アッセイは、自発的成熟による該抗原性の改善に関する同様の結果を示した（実施例４）。ロット＃２からのＣＥＰの組合せをミョウバン上に製剤化した。また、該ミョウバン吸着調製物上でのＩＶＲＰアッセイ（インビトロ放出効力アッセイ）は、抗原性における約３０％の増強を示した。
【００３９】
ＣＥＰ成熟によるＶＬＰのサイズおよび不均一性の減少
より多数の分子内および分子間ジスルフィド結合を形成することによりＶＬＰが成熟するにつれて、該ＶＬＰは、より明瞭（ｄｅｆｉｎｅｄ）になり、したがってお互いに対する又は容器表面に対するその結合性が低下する。該成熟プロセスにより製造されたＶＬＰは、一貫して、より小さな全体サイズを示した。最も重要なことは、該ＶＬＰの不均一性が、ＥＭ（図２Ａおよび２Ｂ）、動的光散乱によるサイズ分布分析（図３）および速度沈降（図４Ａおよび４Ｂ）により示されるとおり劇的に減少することが判明したことである。より初期のロットから得られた観察と一致して、より後の２つのロット（ロット＃８および＃９）に関するＨＰＳＥＣは、同様の結果を示した。すなわち、該成熟アームは、より明瞭且つより単分散の粒子を与えた（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００４０】
成熟後の収率の増加
該ＣＥＰを成熟工程に付す非常に重要な利点の１つは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）工程から回収される収率の増加にあった。該ＶＬＰの成熟は、より選択的なヒドロキシアパタイトカラム過程をもたらす。なぜなら、ＶＬＰの、お互いに対する及び固体表面に対する非特異的な結合性が低下しているからである。６ａ型および１１型に関して種々の出発物質でＶＬＰの成熟を試験したが、試験したロットの大多数については、該ＨＡ工程の収率は、該成熟アームでは該対照アームの場合より高かった。例えば、１つの６ａ型ロットにおいては、該ＨＡ工程の収率は該成熟アームでは３３％であったのに対して、該対照アームでは２４％であった。同様に、１１型ロットについては、該ＨＡ工程の収率は該成熟アームでは３５％であったのに対して、該対照では３０％であった。
【００４１】
より著しいＬ１タンパク質の架橋
Ｌ１タンパク質は、ジスルフィド結合形成により隣接カプソメアからのその他のＬ１分子と相互架橋する強力な傾向を有する。この構造的合体過程は、温度、条件には無関係に、あるいはそれが認識されるか否かには無関係に、加工中および保存中に生じるであろう。ＶＬＰの成熟は、そのようなコンホメーション探索およびそれに続く鎖間架橋による構造的合体に有利な条件をもたらす。共有ジスルフィド結合を利用して該カプソメアが互いに結びつくことにより、ＶＬＰの集合過程が完了する。インキュベーション工程を加えることにより、単量体段階に残存するＬ１タンパク質が非常に減少したが、これは、より著しいＶＬＰ内架橋を示すものである（図６Ａ〜Ｄ）。
【００４２】
残留タンパク質分解活性の減少
非特異的基質でのタンパク質分解活性アッセイは、全タンパク質分解活性が、該成熟アームでは、それらの対応対照アームと比較して一貫して減少することを示した（図７）。理論により束縛されるものではないが、インキュベーション中の熱不活性化、およびＨＡカラムの、より良好な選択性が、プロテアーゼの不活性化および／または除去をもたらしうるのであろう。実験は、３７℃での成熟後にプロテアーゼ活性における若干の減少が生じることを示した。しかし、この減少は、該プロテアーゼ活性における総減少のごく一部に相当するにすぎない。
【００４３】
成熟によるミョウバン上のＶＬＰの改善された抗原性および安定性
該成熟ロットの１つからの産物をミョウバン吸着産物に製剤化した。室温および３７℃での時間「０」および３ヶ月間のストレスは、該放出ＩＶＲＰアッセイにより、増強した抗原性および安定性を示した。
【００４４】
本発明を更に詳しく例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。
【００４５】
実施例１
プロセスの説明
発現された組換えＨＰＶを有する酵母細胞を、３６％  含水細胞重量（ｗｃｗ）の凍結スラリーとして−７０℃で保存した。該細胞ペーストを３０℃で２時間かけて融解し、回収バッファー（２００ｍ  ＭＯＰＳ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．０）を使用して希釈して約３０％  スラリーとした。融解中および融解後、該細胞ペーストの温度は５〜１０℃の範囲に維持した。ｗｃｗ  １グラム当たり、ほぼ１：１のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（１μＬ／Ｌ）を加えた。該３０％  希釈細胞スラリーを１４００〜１５０００ｐｓｉｇのホモジナイザーに２回通した。得られたライセートを４℃で一晩（約１６時間）インキュベートして、一連の精製における除去の改善のために核酸のサイズを減少させた。そのインキュベートしたライセートを、回収バッファー（２００ｍ  ＭＯＰＳ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７）およびクエン酸ナトリウムスパイクバッファー（１Ｍ  クエン酸ナトリウム，２００ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７）の添加により更に９％  ｗｃｗにまで希釈した。接線流動（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過法を用いて、２５０ｍＭ  クエン酸ナトリウムバッファーに対する２．２５容積のダイアフィルトレーションを伴う０．６５ミクロン精密濾過膜を使用して、該ＶＬＰを該細胞残渣から分離した。
【００４６】
該精製の大部分は、ＨＳ  ＰＯＲＯＳ陽イオン交換クロマトグラフィー工程で達成された。ローディングされたカラムを、５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＭＯＰＳおよび８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する８カラム容積（ＣＶ）のバッファーで洗浄した。共に５ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を含有する洗浄バッファー（８００ｍＭ  ＮａＣｌ）と溶出バッファー（１５００ｍＭ  ＮａＣｌ）との間の７ＣＶの直線勾配で、該ＨＳカラムから該産物を溶出した。
【００４７】
上昇した温度での成熟
得られた中間産物（「ＣＥＰ」と称される）を、ステンレス鋼またはガラス容器内で３７℃で１７時間インキュベートした。該実験のいくつかにおいては、生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を最小限に抑えるために、３７℃での成熟工程の前に、０．２２ミクロンＭｉｌｌｉｐａｋユニットを使用して、該ＣＥＰを滅菌濾過した。
【００４８】
該成熟工程後、該ＨＰＶ産物中の核酸およびプロテアーゼの両方のレベルを減少させるために、該成熟ＣＥＰをヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーにより加工した。必要に応じたＢＣＡタンパク質分析に基づき、樹脂１ｍｌ当たりタンパク質２ｍｇで該ＨＡカラムをローディングした。ローディングされたＨＡカラムを５ＣＶのバッファーで洗浄し、５ｍＭ  リン酸ナトリウムから２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（どちらのバッファーも１．２５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を含有する）までの４ＣＶの直線リン酸勾配で溶出した。該ＨＡ産物の、必要に応じたタンパク質分析を行って、８５０μｇ／ｍｌの標的タンパク質濃度で限外濾過中に達成されるのに必要な濃度因子を測定した。
【００４９】
１０ｋＤａ  中空糸膜を使用し、２５０ｍｇ／ｓｑｆｔのロード、６０００ｓ−１のせん断速度、２０ｐｓｉの膜間圧および０．０３％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ標的（これは、８５０μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度が得られるよう後続の限外濾過工程中での算出容積減少をもたらす）で運転する限外濾過を行った。Ｔｗｅｅｎ−８０を該ＨＡ産物に加えて、ＵＦ工程（この場合、該産物が０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液に対してダイアフィルトレーションされる）中の凝集を妨げた。得られたＵＦ産物のプールを滅菌濾過して、最終水性産物（ＦＰ）を得た。一連のアッセイを用いて、該ＦＰを特徴づけした（後記を参照されたい）。
【００５０】
対照として、前記と同じ方法を、該ＣＥＰの成熟無しで行った。その代わりに、該ＣＥＰを４℃で１６時間保存し、ついで該ＨＡクロマトグラフィーにより加工した。該対照および成熟プロセスの総プロセス時間は同一（約４８時間）であり、実質的には、唯一の相違は該ＨＳ産物のインキュベーション温度であった（該対照プロセスでは４℃、該成熟プロセスでは３７℃）。
【００５１】
【表１】
0004689914.tif 000002
【００５２】
実施例２
抗原のＥＩＡ定量−抗原性の測定
ＨＰＶ  ６ａ型および１１型を定量するために、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ形式を用いた。該ＶＬＰはポリクローナルヤギ抗ＨＰＶ６ａおよび１１抗体により捕捉された。コンホメーション感受性マウス抗ＨＰＶ  ｍＡｂ、Ｂ１０．５（ＨＰＶ６ａ）およびＢ２（ＨＰＶ１１）を使用して、検出用にホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧと共役した捕捉されたＶＬＰの量を定量した。すべての実験は９６ウェルプレート内で行った。該ペルオキシダーゼは該反応を触媒して、プレートリーダーにより読取られうる４５０ｎｍにおけるＯＤを有する産物を与える。参照体およびサンプルは、常に、並べて実施した。インキュベーションは、両方の型に特異的な抗体および該共役抗体の結合のために、３７℃で行った。
【００５３】
実施例３
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
すべてのＢｉａｃｏｒｅアッセイは、２０℃でＣＭ５センサーチップを使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００ユニット（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。センサーチップＣＭ５の表面上で、カルボキシラート基をデキストランマトリックスに導入した。ラット抗マウス抗体またはαマウスＦＣγを、アミンカップリングにより該センサーチップ表面のカルボキシラート基に共有的に固定化した。活性化のための０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）ならびに不活性化のためのエタノールアミンを含有するアミンカップリングキットは、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。中和抗ＨＢｓＡｇ抗体ｍＡｂ、Ｂ１０．２（ＨＰＶ６ａ型用）およびＢ２（１１型用）は、Ｎｅｉｌ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ博士（Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖ．）がら提供された。ＨＰＶ  ＶＬＰとｍＡｂ  Ｂ１０．５またはＢ２との特異的相互作用を研究するための水溶液中の抗原またはｒＨＢｓＡｇの注入の前に、該ｍＡｂをαマウスＦＣγにより該センサー表面上に捕捉した。
【００５４】
【表２】
0004689914.tif 000003
【００５５】
【表３】
0004689914.tif 000004
【００５６】
実施例４
電子顕微鏡検査
該滅菌濾過産物のすべてに関する電子顕微鏡検査（ＥＭ）は、Ｅｌｋｒｉｄｇｅ，ＭＤのＥＭＢＳ研究室により行われた。該サンプルを室温で４５分間融解し、ついでチューブの穏やかな反転および回転により十分に再懸濁させた後、グリス（ｇｒｉｓ）調製を行った。該分析に付した各サンプルを、２〜８の種々の希釈度で０．５Ｍ  ＮａＣｌバッファー中で希釈した。希釈後、各サンプルを十分に再懸濁させた。ホルムバールおよび炭素でコーティングされた３００メッシュの銅格子を鉗子でしっかり締め固定した。各格子を０．０１％  ウシ血清アルブミンでリンスし、ついで濾紙を使用して過剰の溶液を吸い取った。２％  ＶＬＰの２μｌ  アリコートを別々の格子上に配置し、乾燥させた。１０分後、残留物質を該格子から吸い取った。各サンプルを完全に風乾した後、該サンプルを固定し、２０μｌの２％  リンタングステン酸で染色し、各格子上に配置し、３０秒間インキュベートした。過剰の染色剤を濾紙で除去した。該サンプルを、ＪＥＯＬ  １２００  ＥＸ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＴＥＭ）中で高倍率で集中的に検査した。顕微鏡写真を撮る前に、各格子からの多数の領域を十分に検査した。１００〜１５０μｇ／ｍｌの濃度範囲のＢＣＡ中でサンプルを一貫して検査するために、１：２〜１：８で希釈したサンプルを調製した。
結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【００５７】
実施例５
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）
Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ−８０５−ＨＱカラムを該ＨＰＳＥＣ分析において使用した。このカラムの排除限界はＲη＝６５ｎｍ（デキストラン標準）を超えるが、Ｒη＝１１０ｎｍ（ポリアクリルアミド標準）未満である。該カラムを、使用前に、部分的に凝集したＨＰＶ１８およびＨＰＶ１６サンプルで調整した。適切な調整が保証されるよう、いくつかの注入の領域を比較した。いくつかのＨＰＶおよび非ＨＰＶ（デキストラン）サイズ／参照標準をまず注入し、ついでＨＰＶ６ａおよびＨＰＶ１１を注入した。Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０ポンプ（流速：０．４ｍＬ／分）を使用して、各サンプルを二重に注入した。該移動相は、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）により緩衝化された０．７５Ｍ  ＮａＣｌであった。該クロマトグラフィーをＵＶ（λ＝２１４，２６０および２８０ｎｍ）および蛍光（ｅｘ  λ＝２８０ｎｍ、ｅｍ  λ＝３４０ｎｍ）によりモニターした。
【００５８】
実施例７
動的光散乱（ＤＬＳ）
ＤＬＳ測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００装置を使用して行った。測定前に、すべてのサンプルおよび希釈剤を室温にした。モノモード（ｍｏｎｏｍｏｄａｌ）解析アルゴリズムを使用した。５回の反復測定（それぞれ１０秒間の持続時間）を各サンプルについて行った。バックグラウンドバッファー組成が希釈の際に有意に改変されないよう、関心のあるサンプル用の適当なマトリックスバッファーを使用してサンプルを希釈した。該希釈度は、該シグナルの強度が１００〜５００ｋｐｃｓの範囲となるようなものであった。典型的には、該ＳＦＰサンプルは、約２５の希釈度を要する。
【００５９】
サイズ分布に関しては、動的光散乱装置ＤｙｎａＰｒｏ−ＬＳＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）を使用した。該アッセイの前に、サンプルを約２０μｇ／ｍｌの最終濃度にまで０．５Ｍ  ＮａＣｌ中に希釈した。結果を図３に要約する。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
【表５】
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【００６２】
実施例７
沈降速度分析用遠心分離
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＸＬ１分析用超遠心機を使用して、沈降速度実験を行った。該沈降係数分布プロフィールを、ＨＰＶでの使用のために開発された可変性速度沈降プロフィールに基づき、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌワークシートを使用して作製した。小容積の該サンプルをガラスセル内にローディングし、該サンプルのサイズ分布を特徴づけるためにオンラインＵＶ検出を行いながら該サンプルを非常に高速で遠心した。結果を図４Ａおよび４Ｂに要約する。
【００６３】
実施例８
Ｌ１タンパク質の架橋：ＨＰＳＥＣによるオリゴマーアッセイ
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＣ）を変性かつ非還元条件下で行うことにより、三量体、二量体および単量体の含量を定量した。ジスルフィド結合は著しいリシャフリング（ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を受けることが知られていた。したがって、該リシャフリングを最小限に抑えるために、低いｐＨを用いた。最終的なサンプル条件は、タンパク質濃度２００μｇ／ｍｌで、５％  ナトリウムドデシルスルホナート（ＳＤＳ）／０．１％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であった。サンプルを５秒間ボルテックスし、７５℃で１０分間（±１０秒）加熱した。カラム上への注入の前に、サンプルを室温でせいぜい５分間静置した。クロマトグラフィーは、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０３シリカゲルカラムを使用するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １１００シリーズＨＰＬＣ上で行った。該移動相は、０．１％  ＳＤＳ／１５ｍＭ  ＮａＰｉ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３）であった。移動相バッファーは、一塩基ＮａＰｉを使用して調製し、該ｐＨは、ＨＣｌを使用して低下させた。１００μｌのサンプル注入物を、０．２ｍｌ／分の流速で室温で９０分間で溶出した。該溶出は２２０ｎｍでモニターした。結果を図５Ａ〜Ｂおよび６Ａ〜Ｄに要約する。
【００６４】
実施例９
タンパク質活性アッセイ
すべての該中間プロセスおよび最終産物サンプルを総タンパク質分解活性に関してアッセイした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＥｎｚＣｈｅｋキットを修飾し、それを使用して、蛍光標識ペプチドの放出を招くカゼインの非特異的切断をモニターした。
【００６５】
【表６】
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【００６６】
【表７】
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【００６７】
【表８】
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【００６８】
実施例１０
グルタチオン促進成熟による精製ＨＰＶ１６の安定化：中和ｍＡｂ  Ｖ５結合により示された抗原性の最小限度の及びより遅い喪失
成熟または架橋過程を促進するために、ＨＰＶ  １６の精製ＶＬＰの最終産物（０．５Ｍ  ＮａＣｌ中、約０．８ｍｇ／ｍｌ）を酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ，１〜１７ｍＭ）で処理した。該混合物を、攪拌することなく３７℃で１６〜２０時間放置した。表面プラズモン共鳴またはＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップに基づくアッセイにより、中和ｍＡｂ（Ｈ１６．Ｖ５）の結合により、該ＨＰＶ１６  ＶＬＰの抗原性をモニターした。該抗原性は、抗体（ｍＡｂ  Ｖ５）に対する抗原（ＨＰＶ  １６  ＶＬＰ）の比率として表されている。
【００６９】
未処理対照は４２℃での熱ストレス中に不安定であることが、図８において明らかである。それは、４２℃で約６時間のうちに抗原性を完全に喪失した（黒丸、図８）。興味深いことに、ＧＳＳＧで処理されたＨＰＶ１６  ＶＬＰは、４２℃で２５時間後に５０％を超える抗原性を保有することが判明した（黒三角、図８）。これらの結果は、グルタチオン処理による促進された成熟後に、ＨＰＶ１６  ＶＬＰがはるかに安定であり、熱誘発凝集に抵抗性であることを、明らかに示している。ＧＳＳＧにより促進されるジスルフィド結合形成はタンパク質化学においてよく知られており、それは、該分子間相互作用を強固にする、分子レベルでのメカニズムの基礎であると考えられる。その結果、ＶＬＰ構造は、より明瞭となり、その凝集傾向が低下する。
【００７０】
実施例１１
部分精製されたＣＥＰのプロセス段階グルタチオン促進成熟によるＨＰＶ１６  ＶＬＰの安定化：ＧＳＳＧ媒介酸化的リフォールディングの結果としてのＳＤＳ誘発変性に対する抵抗性
実施例１に記載の方法と同じ方法を用いて、ＨＰＶ１６  ＶＬＰを精製し、ＶＬＰを以下のとおりに成熟させた。部分精製されたＣＥＰを、１ｍＭ  ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ  ＧＳＨおよび５０μＭ  ＦｅＣｌ２の酸化還元カクテルバッファーで２５℃で２０時間処理した。ついで該混合物を、常法どおりに、ＨＡカラムおよびそれに続く０．５Ｍ  ＮａＣｌ中へのバッファー交換のための限外濾過により加工（プロセス）した。比較のために、対照アームを行った。すべての実験条件は、酸化還元バッファーを使用しないこと以外は同じであった。図９の結果は、成熟後のＶＬＰの安定性の改善を明らかに示した。天然条件下（左パネル）、対照産物および処理産物は共に、ＶＬＰが直径４０〜６０ｎｍのサイズを有することを示した。該ＶＬＰを変性条件（１％  ＳＤＳおよび加熱）に付した場合に、酸化還元処理の効果は明らかとなる。同じ条件下、未処理対照は変性サブユニット（Ｌ１タンパク質）に分解したが、該処理調製物は、該沈降プロフィールからはウイルス様構造体として維持されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＢＩＡＣＯＲＥ分析により測定した場合の、成熟工程を加えることにより得られた抗原性の増強を示すグラフである。
【図２Ａ】  最終産物のＶＬＰの電子顕微鏡写真であり、対照プロセスを用いて製造したＶＬＰを用いた。
【図２Ｂ】  最終産物のＶＬＰの電子顕微鏡写真であり、成熟プロセスを用いて製造したＶＬＰを用いた。
【図３】  動的光散乱により分析したＶＬＰのサイズ分布を示すグラフである。
【図４Ａ】  ＨＰＶ６ａ  ＶＬＰ沈降速度の変化を示すグラフ（対照プロセス）である。
【図４Ｂ】  ＨＰＶ６ａ  ＶＬＰ沈降速度の変化を示すグラフ（成熟プロセス）である。
【図５Ａ】  ＶＬＰ（ＨＰＶ６ａ  ＶＬＰ）の高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）の結果を示す。
【図５Ｂ】  ＶＬＰ（ＨＰＶ１１  ＶＬＰ）の高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）の結果を示す。
【図６Ａ】  ＨＰＶ６ａに関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。
【図６Ｂ】  ＨＰＶ６ａに関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。
【図６Ｃ】  ＨＰＶ１１に関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。
【図６Ｄ】  ＨＰＶ１１に関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。
【図７】  このプロセス中のＨＳＰ成熟によるＶＬＰのタンパク質分解活性の減少を示すグラフである。
【図８】  促進された成熟によるＨＰＶ１６  ＶＬＰの改善された安定性を示す。
【図９Ａ】  滅菌濾過産物（ＳＦＰ）のＨＰＶ１６  ＶＬＰの、酸化還元処理の存在下（ＳＦＰ  Ｂ）または不存在下（ＳＦＰ  Ａ）の沈降プロフィールを示す。
【図９Ｂ】  滅菌濾過産物（ＳＦＰ）のＨＰＶ１６  ＶＬＰの、酸化還元処理の存在下（ＳＦＰ  Ｂ）または不存在下（ＳＦＰ  Ａ）の沈降プロフィールを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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