(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
推定リガンドと予め選択された１３Ｃ集積標的分子の結合の検出方法であって、
ａ）前記標的分子の第１の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｂ）前記標的分子と少なくとも１種の推定リガンド化合物の混合物を形成する段階と、
ｃ）段階（ｂ）の混合物の第２の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｄ）第１のスペクトルと第２のスペクトルを比較する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、４−（１３Ｃ）−α−ケト酪酸及び４−（１３Ｃ）−３−（１３Ｃ）−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。
【請求項２】
前記標的分子がリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント、及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的分子がタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培地が前記４−（１３Ｃ）−α−ケト酪酸又は前記４−（１３Ｃ）−３−（１３Ｃ）−α−ケトメチル酪酸の塩を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予め選択された１３Ｃ集積標的分子と結合するか否かについて化合物混合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）前記標的分子の第１の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｂ）前記標的分子を前記化合物混合物と接触させる段階と、
ｃ）段階（ｂ）の混合物の第２の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｄ）第１のスペクトルと第２のスペクトルを比較する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、４−（１３Ｃ）−α−ケト酪酸及び４−（１３Ｃ）−３−（１３Ｃ）−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。
【請求項６】
前記方法が更に、
ｅ）段階ｄ）で第１のスペクトルと第２のスペクトルの相違が検出された場合には前記混合物中の各化合物に前記標的分子を個々に暴露する段階と、
ｆ）各化合物に暴露した前記標的分子の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｇ）段階ｆ）で生成した各スペクトルを標的分子単独から生成した第１のスペクトルと比較する段階を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的分子がリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的分子がタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
予め選択された１３Ｃ集積標的分子と結合するリガンドの解離定数の決定方法であって、
ａ）前記標的分子の第１の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｂ）前記標的分子を種々の濃度の前記リガンドに暴露する段階と、
ｃ）段階ｂ）の各リガンド濃度で二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｄ）段階（ｃ）からの各スペクトルを段階（ａ）からの前記第１のスペクトルと比較する段階と、
ｅ）解離定数を計算する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、４−（１３Ｃ）−α−ケト酪酸及び４−（１３Ｃ）−３−（１３Ｃ）−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。
【請求項１０】
前記標的分子がリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分子がタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドと予め選択された１３Ｃ集積標的分子の結合により影響を受ける前記標的分子中の特定アミノ酸残基の決定方法であって、
ａ）二次元相関スペクトルにおける１３Ｃ／１Ｈシグナルの化学シフト値が前記標的分子中の原子団の少なくとも１個の既知特定位置に対応するように前記標的分子の第１の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｂ）前記標的分子と既知リガンド化合物の混合物を形成する段階と、
ｃ）段階（ｂ）の混合物の第２の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成する段階と、
ｄ）第１のスペクトルと第２のスペクトルを比較する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、４−（１３Ｃ）−α−ケト酪酸及び４−（１３Ｃ）−３−（１３Ｃ）−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は化合物と１３Ｃ集積標的分子の結合を検出するための核磁気共鳴の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
新規薬剤候補を発見するための最も強力なツールの１つは合成及び天然産物ライブラリーをランダムスクリーニングし、特定標的分子と結合する化合物を発見する方法（例えば、特定標的に対するリガンドの同定）である。この方法を使用すると、標的分子と物理的結合を形成するか否か又は標的分子の機能を変化させるか否かによりリガンドを同定することができる。
【０００３】
物理的結合を探査する場合には、一般に標的分子を１種以上のリガンド候補化合物に暴露し、標的分子と前記化合物の１種以上の間に複合体が形成されるか否かを決定するアッセイを実施する。このようなアッセイは当分野で周知の通り、複合体形成の指標となる標的分子の肉眼的変化（例えば、寸法、電荷、移動度の変化）を試験する。
【０００４】
機能変化を測定する場合には、標的分子に関する生物又は化学的イベント（例えば、酵素触媒反応、レセプター媒介酵素活性化等）を測定できるようにアッセイ条件を設定する。変化を確認するために、試験化合物に暴露する前後に標的分子の機能を測定する。
【０００５】
既存の物理アッセイ及び機能アッセイは治療用化合物の設計に使用する新規薬剤候補の同定に使用され、成果を上げている。しかし、正確さと信頼性と効率を折衷させたこれらのアッセイには自ずと制約がある。既存アッセイの大きな問題の１つは、例えば「偽陽性」の発生に関連している。典型的な機能アッセイでは、所望生理応答を誘導できないにも拘わらずアッセイに反応する化合物が「偽陽性」を生じる。典型的な物理アッセイでは、例えばそれ自体は標的に結合するが非特異的である化合物（例えば非特異的結合）が「偽陽性」である。多くの化合物はリガンド濃度が高いと非特異的効果を生じるので、偽陽性は高濃度の推定リガンドをスクリーニングする場合に特に問題となる。
【０００６】
同様に、既存アッセイは「偽陰性」の問題を生じることも多く、アッセイでは陰性応答であった化合物がその後の他の何らかの方法により実際には標的のリガンドであると判明することは多い。アッセイで使用する試験化合物の濃度が化合物の標的結合定数又は解離定数に対して高過ぎる（従って、毒性となる）か又は低過ぎる場合に一般に偽陰性は発生する。
【０００７】
既存アッセイには、アッセイ自体により得られる情報量が限られるという問題もある。既存アッセイは標的分子に結合するか又は標的分子から応答を誘導する化合物を正確に同定することができるが、一般にこれらのアッセイでは標的分子上の特定結合部位又は被験化合物と標的分子の構造活性関係に関する情報は得られない。このような情報が得られない点は、後続試験の候補を同定するためにスクリーニングアッセイを使用している場合に特に問題となる。
【０００８】
Ｘ線結晶解析を使用して高分子上の有機溶媒の結合部位を同定する方法が最近提案されている。しかし、この方法は標的上の種々の部位の相対結合親和性を測定することができない。高濃度の有機溶媒の存在下でも変性しない非常に安定した標的タンパク質にしか適用できない。また、個々の結晶構造を決定するために長時間を要するため、このアプローチは化学的に多様な多数の化合物を迅速に試験するのに適した方法ではなく、ごく少数の有機溶媒の結合部位のマッピングに限られている。
【０００９】
Ｆｅｓｉｋらの米国特許第５，６９８，４０１号及び５，８０４，３９０号には、リガンド／標的結合を決定し、標的物質上の結合部位をマッピングする迅速、効率的且つ確実な方法が開示されている。これらの特許はＮＭＲで検出可能な同位体１５Ｎ核を集積した標的生体分子から第１及び第２の核磁気共鳴相関スペクトルを生成することにより、リガンド化合物と標的生体分子の結合を検出する方法を開示している。第１のスペクトルはリガンドの不在下に標的物質で収集したデータから生成し、第２のスペクトルは１種以上のリガンドの存在下に収集したデータから生成する。２つのスペクトルを比較すると、推定リガンドの混合物中のどの化合物が標的生体分子と結合するかを決定することができ、更に結合部位に関する特定情報も決定することができる。これらの方法は標的分子上の結合部位に関する情報が得られるので、予め選択された標的に対するリガンドの設計を最適化するために使用することができる。
【００１０】
Ｆｅｓｉｋら，前出のＮＭＲ法は標的分子の１５Ｎ同位体集積に依存しているため、窒素を含有する標的物質が必要であるが、別の型の同位体集積標的分子を利用した代替方法を提供できるならば当分野に有益であろう。
【００１１】
発明の要約
本発明は１種以上の推定リガンドと予め選択された同位体集積標的分子の結合の検出方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に、予め選択された同位体集積標的分子と結合するか否かについて化合物混合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１３】
本発明は更に、予め選択された同位体集積標的生体分子と結合するリガンド化合物の解離定数の決定方法を提供する。
【００１４】
本発明は更に、リガンドの結合により変化する１３Ｃ集積標的分子中の特定アミノ酸の決定に使用する方法を提供する。
【００１５】
本発明は更に、予め選択された同位体集積標的分子と結合するか否かについて化合物混合物をスクリーニングする方法により同定した化合物を提供する。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は均質に１３Ｃで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを示す。
図２は２−フェニルイミダゾール（０．１２ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）の均質１３Ｃ標識ＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルのメチル領域を示す。
図３は２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）のバリニル残基とロイシル残基を選択的に１３Ｃ／１５Ｎ／２Ｈで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルのメチル領域を示す。
図４は２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）のアラニル残基を選択的に１３Ｃで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルのメチル領域を示す。
図５はＦＫＢＰの三次元構造の「棒モデル」図を示す。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書全体を通して使用する用語は通常認められている意味をもつ。下記用語は下記に指定する意味をもつ。
【００１８】
「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味する。
【００１９】
「ＦＫＢＰ」はＦＫ結合タンパク質を意味する。
【００２０】
「ＨＥＰＥＳ」はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エチルスルホン酸を意味する。
【００２１】
「ＩＰＴＧ」はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味する。
【００２２】
「ＰＭＳＦ」はα−トルエンスルホニルフルオリドを意味する。
【００２３】
「ＳＣＤ」はストロメライシンの触媒ドメイン（残基８１〜２５６）を意味する。
【００２４】
高解像度ＮＭＲスペクトルが得られ、均質又は選択的に１３Ｃを集積できるものであれば任意標的生体分子を本発明の方法で使用することができる。従って、これらの方法はリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の任意の所望１３Ｃ集積標的生体分子に適用可能である。１３Ｃの天然同位体の存在率は１．１１％である。従って、有機分子内の任意所与炭素原子が１３Ｃである確率は一般に約０．０１１１である。
【００２５】
１３Ｃ炭素原子の核と任意隣接水素原子のスピン結合に関するデータを表すＮＭＲシグナルの強度を増すためには、被験標的分子の天然１３Ｃ含量を増すことが望ましい。これは標的分子に均質又は選択的に１３Ｃを集積することにより達成される。本明細書及び請求の範囲全体を通して使用する「均質集積」、「均質に集積する」、「均質に集積した」、「均質に標識する」及び「均質に標識した」等の用語は、標的分子全体を通してランダムに選択された炭素原子が１３Ｃである確率を合成手段により０．０１１１よりも大きい値に増すことを意味する。他方、「特異的集積」、「特異的に集積する」、「特異的に集積した」、「特異的に標識する」及び「特異的に標識した」等の用語は、標的分子内の１個以上の予め選択された特異的部位の炭素原子が１３Ｃである確率を合成手段により０．０１１１よりも大きい値に増すことを意味する。
【００２６】
例えば、均質に１３Ｃを集積したグルコースを含む栄養培地で増殖させた遺伝子改変微生物により発現される生体分子は均質に１３Ｃを集積することになる。他方、メチル側鎖のみにＣ１３を集積したアラニンを含む栄養培地で遺伝子改変微生物により発現されるタンパク質は発現されるタンパク質に含まれるこれらのアラニル残基に特異的に１３Ｃを集積することになる。
【００２７】
１３Ｃ同位体集積を利用する本発明の方法は窒素含有分子を含む任意有機標的分子に適用可能である。本方法は特定炭素原子部位（例えば、アラニル、ロイシル、イソロイシル及びバリニル残基のメチル基）に集積した標的分子も分析できる。メチル基はアミド基よりも緩和性に優れているため、大型の標的生体分子（ＭＷ＞３０ｋＤａ）に適用する場合に有利である。
【００２８】
ポリペプチドとタンパク質は生体で多くの重要な役割を果たす。下記実施例ではポリペプチドを使用して本方法を説明する。ポリペプチドとタンパク質フラグメントは本発明の方法に好ましい類の標的分子である。しかし、本発明の方法は１３Ｃを集積できる他の標的物質にも適用できると理解すべきである。
【００２９】
均質及び特異的に１３Ｃを集積した典型的ポリペプチド標的分子の製造を以下に説明する。十分な量の均質又は特異的に１３Ｃを集積したポリペプチドを含む標的分子を製造する手段の１つとして、所望ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法が挙げられる。タンパク質又はポリペプチドタンパク質フラグメントは当分野で周知の１３Ｃ同化性源を含む培地で形質転換細胞系を培養することにより発現される。均質１３Ｃ標識に好ましい同化性源の１例はＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている均質１３Ｃ標識グルコース即ちＵ−１３Ｃ−グルコースである。部位特異的標識で標的ポリペプチドを１３Ｃ標識するための同化性源としては、市販の特異的１３Ｃ標識アミノ酸が挙げられる。特異的集積の代替態様では、栄養培地に含まれる１３Ｃ同化性源はアミノ酸の１３Ｃ標識生合成前駆物質である。例えば、α−ケト酪酸はイソロイシンの生合成前駆物質であり、α−ケトイソ吉草酸はバリンとロイシンの生合成前駆物質である。下記スキームＩはロイシン、イソロイシン及びバリンの特異的１３Ｃ集積生合成前駆物質の合成方法を示す。比較的廉価な１３Ｃ集積ヨウ化メチル（Ｈ３１３ＣＩ）を同位体集積源として使用してＣ末端標識α−ケト酪酸及びα−ケトイソ吉草酸を生成することができる。
【００３０】
１３Ｃ集積グルコース等の均質に１３Ｃを集積した栄養の使用は標的物質に１３Ｃ集積を導入する好都合な手段であるが、非常に高価である。更に、均質に１３Ｃで標識した標的中の炭素部位の大半は同様に１３Ｃで標識した共有結合隣接原子をもつため、１３Ｃ−１３Ｃ結合を導入し、標的生体分子中の１３Ｃ標識部位の信号対雑音と緩和性の両者に負の影響を与える恐れがある。標的ポリペプチドを１３Ｃで部位特異的に標識することにより特に利点が得られる。上述のように、これは栄養培地に市販１３Ｃ標識アミノ酸を加えることにより実施できる。しかし、これも費用がかかるが、標的ポリペプチド中の所定種のアミノアシル残基の標識が必要な状況では望ましい場合もある。他方、ポリペプチド標的分子を１３Ｃ標識するには、アミノ酸の１３Ｃ標識生合成前駆物質を含む栄養培地で遺伝子改変細胞系を増殖させる方法が好ましい。特に、標識するアミノ酸前駆物質としてはα−ケト酪酸とα−ケトイソ吉草酸が好ましい。これらの前駆物質の生合成物は特定側鎖メチル基に１３Ｃを集積したロイシン、イソロイシン及びバリンである。メチル基は各々１３Ｃ標識炭素原子に結合した３個の水素原子をもつため、対応するＮＭＲシグナルは特に強く、明白である。
【００３１】
標識α−ケト酪酸及びα−ケトイソ吉草酸の合成配列はピルビン酸中の末端炭素原子を１３Ｃ集積ヨウ化メチルでメチル化している。一般に、ピルビン酸等のα−ケト酸のアルキル化は元々難しく、エノラート中間体の分解を伴い、多数の副生物を形成する。しかし、Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９７５，３８８９とＤ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，前出，１９９０，５８８１は対応するオキシムのアルキル化を容易に実施できることを示しており、Ｄ．Ｅｎｄｅｒｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇ．Ｅｄ．，１９９２，６１８とＤ．Ｅｎｄｅｒｓら，Ｓｙｎｌｅｔｔ，１９９２，９０１はヒドラゾンも分解を伴わずに容易にアルキル化されることを示している。
【００３２】
スキームＩでは、ｔｅｒｔ−ピルビン酸ブチル１を室温でジエチルエーテル中、Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドラジンとの反応により対応するＮ，Ｎ−ジメチルヒドラゾン２に変換する。得られたヒドラゾン２をテトラヒドロフラン溶液中で−７８℃まで冷却し、臭化リチウム、次いでリチウムジイソプロピルアミドで処理し、中間体アザアリルエノラートを形成する。エノラートを１３Ｃ標識ヨウ化メチルでアルキル化し、ヒドラゾン３を生成する。３の２番目のアルキル化過程で標識ジメチル化ヒドラゾン４が生成する。３と４を０℃で塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸で処理し、ヒドラジン基とエステル基を開裂し、対応する１３Ｃ末端標識α−ケト酸５及び６（夫々４−（１３Ｃ）−酪酸と４−（１３Ｃ）−３−（１３Ｃ）−メチル酪酸）を生成する。
【００３３】
【化１】
0004723094.tif 000002
【００３４】
反応スキームＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは夫々これらのα−ケト酸を１３Ｃ−ロイシン、１３Ｃ−イソロイシン及び１３Ｃ−バリンに生合成変換する方法を示す。全スキーム中、同位体集積部位を星印で示す。
【００３５】
【化２】
0004723094.tif 000003
【００３６】
【化３】
0004723094.tif 000004
【００３７】
【化４】
0004723094.tif 000005
【００３８】
特定ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換するための手段は当分野で周知である。（例えば、Ｒ．Ｗ．Ｏｌｄら，“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，”Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４及び同分野の同様の処理参照。）同様に、形質転換細胞を培養してコード化ポリペプチドを発現させ、ポリペプチドを単離、精製及びリフォールディングするための方法も当分野で周知である。下記実施例ではヒトストロメライシンの８１〜２５６アミノ酸触媒領域とＦＫ結合タンパク質（ＦＫＢＰ）の１３Ｃ集積サンプルを改変大腸菌から調製する方法と、本発明の方法におけるこれらの同位体集積ポリペプチドの使用について説明する。
【００３９】
標的分子と結合するか否かについて２種以上の化合物（例えば化合物の混合物又はライブラリー）をスクリーニングするために本方法を利用する場合や、標的分子単独から生成した第１のスペクトルと化合物の存在下で標的分子から生成したスペクトルが相違する場合には、混合物に含まれるどの特定化合物が実際に標的分子に結合しているかを同定する付加段階を実施する。この付加段階では、混合物の各化合物に１３Ｃ集積標的分子を個々に暴露し、各化合物に個々に暴露した標識標的分子の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成し、各スペクトルを標的分子単独から生成した第１のスペクトルと比較し、比較したスペクトル間の相違を調べる。スペクトルの相違からリガンドである化合物を容易に同定することができる。
【００４０】
二次元相関スペクトルにおける特定１３Ｃ／１Ｈシグナルの化学シフト値は標的分子中の原子団の既知特定位置（例えば、標的分子中の特定アミノ酸残基の炭素原子又は特異的に標識したポリペプチドの場合はアラニル、ロイシル、イソロイシル及びバリニル残基のメチル基）に対応する。従って、本発明のスクリーニング方法はどの化合物が特定標的分子と結合するかを同定できるだけでなく、化合物と標的分子の結合により変化する特定アミノ酸を決定することもできる。化学シフト値は標的分子の配座の変化や、特定シグナルに対応する部位へのリガンド化合物の結合を表す場合もある。
【００４１】
更に、所望により、１３Ｃ標識標的分子の第１の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成し、標識標的分子を種々の濃度のリガンドに暴露し、使用する各リガンド濃度で二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成し、生成したスペクトルを標的分子の第１のスペクトルと比較し、その差から式１：
ＫＤ＝｛（［Ｐ０］−ｘ）（［Ｌ０］−ｘ）｝／ｘ
（式中、［Ｐ０］は標的分子の合計モル濃度であり、［Ｌ０］はリガンドの合計モル濃度であり、ｘは結合種のモル濃度である）を使用して標的分子とリガンドの間の解離定数を計算することにより、本方法により所与リガンドとその標的分子の解離定数ＫＤを決定することができる。ｘの値は式２：
ｘ＝（δｏｂｓｅｒｖｅｄ−δｆｒｅｅ）／Δ
［式中、δｏｂｓｅｒｖｅｄは実測化学シフト値であり、δｆｒｅｅは遊離種の化学シフト値であり、Δは飽和限界化学シフト値（δｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）と結合リガンドを含まない標的分子の化学シフト値（δｆｒｅｅ）の差である］によりＮＭＲ化学シフトデータから決定する。
【００４２】
次に、標準曲線適合統計法を使用して実測データとの間に最良の適合が得られるまでその値を変化させることにより解離定数を決定する。δｓａｔｕｒａｔｉｏｎの値が直接不明の場合には、ＫＤとδｓａｔｕｒａｔｉｏｎを変化させ、得られたデータで同じく曲線適合統計法を実施する。
【００４３】
本スクリーニング法の利点の１つはリガンドに既に結合している第２の分子の存在下に標的分子の１種のリガンドの解離定数を決定できるという点である。これは、リガンドと標的分子物質の結合を決定する「ウェット化学」分析法を使用する他の方法では一般に不可能である。
【００４４】
リガンドの解離定数を決定する方法は第２の結合リガンドの存在下に実施することができる。従って、１３Ｃ標識標的分子を試験化合物に暴露する前に第２のリガンドに結合する。本スクリーニング法は更に第２以降のリガンドと標的分子の結合に関する情報も提供することができる。この第２のリガンドを標的分子に結合した第１のリガンドに化学結合すると、標的分子を変化させるのに使用する新規複合分子が得られる。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法はまず同位体集積標的分子の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成又は獲得することから開始する。上述のように、標的分子は均質に１３Ｃを集積してもよいし、アラニル、ロイシル、バリニル及びイソロイシル残基に１３Ｃメチル基を取込むことにより特異的に集積してもよい。二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成するための手段は当分野で周知である。通常記録するＮＭＲスペクトルは二次元１３Ｃ／１Ｈ異核単量子相関（ＨＳＱＣ）スペクトルであるが、当業者に公知の他の技術も使用できる。タンパク質に対応する１３Ｃ／１Ｈシグナルは通常は十分に分解しているので、個々の１３Ｃ／１Ｈ対の化学シフト変化を容易にモニターすることができる。１３Ｃ標識標的ポリペプチド（ＦＫＢＰ）の代表的な二次元１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを図１に示す。特異的に１３Ｃを集積したＦＫＢＰの代表的な二次元１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを図３に示す。
【００４６】
１３Ｃ標識標的分子を１種以上の試験化合物に暴露した後、第２の二次元１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを生成する。このスペクトルは上述と同様に生成する。次に、第１のスペクトルと第２のスペクトルを比較し、２つのスペクトル間に相違があるか否かを調べる。二次元１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトル間の相違がリガンドの存在を示し、標的分子中の１３Ｃ標識部位に対応する。この相違は当分野で周知の標準手順を使用して測定する。図２は２−フェニルイミダゾール（０．１２ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）の均質１３Ｃ標識ＦＫＢＰのメチル領域を示す。
【００４７】
二次元１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルにおける特定シグナルは標的分子中の特定炭素及びプロトン原子（例えば、タンパク質中のアミノ酸残基の特定メチル基）に対応する。例えば、図３から明らかなように、試験化合物に暴露したＦＫＢＰの二次元１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルに観察される化学シフトは残基位置９７（ロイシン）及び５５（バリン）に生じた。各化合物との結合に関与するタンパク質の領域は化合物添加後に変化する特定炭素及びプロトン原子対から同定される。
【００４８】
実施例
調製１：均質に１３Ｃを集積したヒトストロメライシン触媒ドメイン（ＳＣＤ）の調製
ストロメライシンの８１〜２５６フラグメント（配列番号１）（ＳＣＤ）はこのタンパク質フラグメントの生産をコードするプラスミドを大腸菌株に挿入し、適当な培地で遺伝子改変細菌株を増殖させることにより調製した。培地からタンパク質フラグメントを単離し、精製した後、本発明の方法により試験化合物に対するその親和性の二次元ＮＭＲ分析で使用した。調製工程手順を以下に説明する。
【００４９】
Ｃｌａｒｋら，Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４１：３６（１９８５）に記載されている手順を使用してヒト皮膚繊維芽細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５０７）を増殖誘導した。ＲＮＡｇｅｎｔｓ（登録商標）全ＲＮＡ単離システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を製造業者の指示に従って使用して細胞１ｇから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ１μｇを８０℃で５分間加熱して変性させた後、ＧｅｎＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を製造業者の指示に従って使用して逆転写酵素ＰＣＲを実施した。
【００５０】
第１のプライマー（ａ）ＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＡ（配列番号２）及び（ｂ）ＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧ（配列番号３）を使用し、９４℃２分間、４５℃２分間及び７２℃３分間の３５サイクルを使用してネステドＰＣＲを実施した。その後、内部プライマー（ｃ）ＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣ（配列番号４）及び（ｄ）ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧＧＡ  ＧＴＣＡＧＧ（配列番号５）を使用して上記と同一条件下の３０サイクルで再増幅させ、ヒトストロメライシンのアミノ酸残基１〜２５６をコードするＤＮＡ配列を生成した。
【００５１】
次に、ＰＣＲフラグメントを製造業者の指示に従ってＰＣＲクローニングベクターｐＴ７ＢＩｕｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。得られたプラスミドをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断し、ストロメライシンフラグメントを発現ベクターｐＥＴ３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。
【００５２】
アミノ酸残基８１〜２５６と開始メチオニンアミノアシル残基をコードする成熟ストロメライシン発現構築物を１〜２５６発現構築物からＰＣＲ増幅により生成した。得られたＰＣＲフラグメントを上述のように製造業者の指示に従ってまずｐＴ７ＢＩｕｅ（登録商標）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローニングした後、ｐＥＴ３ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にサブクローニングし、プラスミドｐＥＴＳＴ−８３−２５６を生成した。この最終プラスミドはヒトストロメライシン配列で２アミノ酸だけ前の８１位から開始するペプチド配列をコードする以外はＱｉ−Ｚｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１２３１（１９９２）に記載されているプラスミドと同一である。プラスミドｐＥＴＳＴ−８３−２５６を製造業者の指示に従って大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に形質転換し、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴＳＴ−２５５−１を生成した。
【００５３】
ＮａＨ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．６９８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４５ｇ、ＮａＣｌ  ０．０７５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  ０．１５０ｇ、Ｕ−１３Ｃ−グルコース０．３ｇ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４水溶液３００μｌ及びＣａＣｌ２水溶液１５ｍＬを脱イオン水１５０ｍｌに溶かすことにより予備培地を調製した。得られた予備培地溶液を滅菌し、滅菌５００ｍｌバッフルフラスコに移した。予備培地に細菌株を接種する直前に１００％エタノール中に３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する溶液１５０ｍｌと、アンピシリン２０ｍｇ／ｍｌを含有する溶液１．５ｍｌをフラスコ内容物に加えた。次に、遺伝子改変大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴＳＴ−２５５−１のグリセロールストック１ｍｌをフラスコ内容物に接種した。光学密度０．６５が観察されるまでフラスコ内容物を３７℃で振盪した（２２５ｒｐｍ）。
【００５４】
ＮａＨ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ  １１３．２８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ３０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び１％ＤＦ−６０消泡剤１０ｍＬを脱イオン水９６０４ｍＬに溶かすことにより発酵栄養培地を調製した。この溶液をＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒに入れ、１２１℃で４０分間滅菌した。発酵培地を接種する直前に、１０％ＮＨ４Ｃｌ水溶液１００ｍｌと、均質１３Ｃ集積グルコース１５ｇと、１Ｍ  ＭｇＳＯ４水溶液２０ｍｌと、１Ｍ  ＣａＣｌ２水溶液１ｍｌと、塩酸チアミン（１０ｍｇ／ｍｌ）水溶液５ｍｌと、１００％エタノール中に３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する溶液１０ｍｌと、クロラムフェニコール溶液に溶かしたアンピシリン１．９ｇからなる予備滅菌成分を発酵槽内容物に加えた。４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４水溶液を加えることにより、得られた溶液のｐＨをｐＨ７．００に調整した。
【００５５】
上記振盪フラスコ規模手順からの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴＳＴ−２５５−１の予備培養物を発酵槽内容物に加え、光学密度０．４８に達するまで細胞増殖させた。この工程中は、必要に応じて４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４又は４Ｎ  ＫＯＨを加えることにより発酵槽内容物をｐＨ７．０に自動的に維持した。溶存酸素濃度が５５％よりも低下すると撹拌速度を増すカスケードループにより、発酵槽内容物の溶存酸素濃度を空気飽和率５５％以上に維持した。発酵槽内容物に７標準リットル／分（ＳＬＰＭ）で空気を供給し、工程を通して培養温度を３７℃に維持した。
【００５６】
４℃、１７，０００×ｇで１０分間遠心分離により細胞を回収し、得られた細胞ペレットを集め、−８５℃で保存した。湿潤細胞収率は３．５ｇ／Ｌであった。細胞溶解液の可溶性フラクションと不溶性フラクションをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した処、ストロメライシンの約５０％が可溶性相に存在することが判明した。
【００５７】
上述のように調製したストロメライシンフラグメントをＹｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１２３１（１９９２）に記載されている方法の変法により精製した。１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２、２５単位／ｍｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｂｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａ）、及び４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）とＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（登録商標）とＡｐｒｏｔｉｎｉｎ（登録商標）とＰｅｐｓｔａｉｎ（登録商標）（いずれも濃度１ｍｇ／ｍｌ）からなる阻害剤混合物を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）ナトリウムアジド溶液に回収した細胞を懸濁した。ＡＥＢＳＦ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（登録商標）及びＰｅｐｓｔａｉｎ（登録商標）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌの市販品である。得られた混合物を１時間温和に撹拌した後、４℃まで冷却した。次に、５０％デューティーサイクルを使用して細胞を音波処理により破壊した。得られた溶解液を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、不溶性フラクションのペレットを後期処理に備えて−８０℃で凍結した。
【００５８】
固体硫酸アンモニウムを２０％飽和点まで上清に加え、得られた溶液を７００ｍｌフェニルセファロース高流速（”Ｑ−セファロースＦＦ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）にロードした。ロードする前に、セファロースカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４℃でｐＨ７．６）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４で平衡化しておいた。ロードしたカラムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中に減少濃度の水性（ＮＨ４）２ＳＯ４（１Ｍ→０Ｍ）と増加濃度の水性ＣａＣｌ２（５ｍＭ→２０ｍＭ）を含む直線勾配で溶離した。溶離液の活性フラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）で濃縮した。Ｑ−セファロースＦＦカラムで使用した出発緩衝液である５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（４℃でｐＨ８．２）に１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を加え、濃縮サンプルを一晩透析した。
【００５９】
次に、透析したサンプルをＱ−セファロースＦＦカラムにロードし、出発緩衝液と２００ｎＭ  ＮａＣｌを含む直線勾配で溶離した。ストロメライシンフラグメントの精製可溶性フラクションを濃縮し、４℃で保存した。ペレットを８Ｍグアニジン−ＨＣｌで可溶化した。溶液を２０分間２０，０００ｒｐｍで遠心分離し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２及びＡＥＢＳＦとＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（登録商標）とＡｐｒｏｔｉｎｉｎ（登録商標）とＰｅｐｓｔａｉｎ（登録商標）（いずれも濃度１ｍｇ／ｍｌ）からなる阻害剤カクテルを含むフォールディング緩衝液に上清を滴下した。フォールディング緩衝液の容量は上清の１０倍とした。上清とフォールディング緩衝液の混合物を２０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この遠心分離からの上清を４℃で保存し、グアニジン−ＨＣｌで可溶化し、緩衝液中でリフォールディングし、遠心分離する上記工程をペレットに２回実施した。３回の遠心分離の各々からの最終上清を合わせ、固体硫酸アンモニウムを２０％飽和点まで加えた。こうして不溶性フラクションから誘導された溶液を可溶性フラクションについて上述したようにフェニルセファロース及びＱ−セファロース上で精製した。精製した可溶性フラクションと不溶性フラクションを合わせると、元の細胞ペースト１ｇ当たり約１．８ｍｇの均質に１３Ｃを集積した精製ストロメライシン８１〜２５６フラグメント（ＳＣＤ）が得られた。
【００６０】
調製２：特異的に１３Ｃを集積したヒトストロメライシン触媒ドメイン（ＳＣＤ）の調製
１３Ｃ集積α−ケト酪酸及びα−ケトイソ吉草酸を含む培地でＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴＳＴ−２５５−１改変大腸菌株を培養することによりＳＣＤを発現させた。遺伝子改変大腸菌株の作製と、タンパク質フラグメントの発現、単離及び精製に使用する方法は、Ｕ−１３Ｃ−グルコースの代わりに−Ｕ−１２Ｃ−グルコースを使用する以外は上述の通りである。
【００６１】
調製３：均質及び特異的に１３Ｃを集積したＦＫＢＰの調製
Ａ．特異的に１３Ｃを集積したＶａｌ／ＬｅｕＦＫＢＰの調製
単一窒素源（１．０ｇ／Ｌ）として１５ＮＨ４Ｃｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）と炭素源（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）として過重水素化グルコース（１．５ｇ／Ｌ）を含む１００％Ｄ２Ｏ培地で（Ｅｇａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１９２０−１９２７（１９９３）に記載されているように）ヒトＦＫＢＰをコードするプラスミドで形質転換した細胞を増殖させた。細胞を３７℃で増殖させ、１．０の光学密度が得られるまでフラスコ内容物を振盪した。誘導の１時間前にＬ−バリン−Ｕ−１３Ｃ５−１５Ｎ−２，３−ｄ２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）８０ｍｇを培地に加えた。１ｍＭ  ＩＰＴＧで１２時間培養を誘導した。
【００６２】
４℃、１７，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を回収し、５ｍＭ  ＤＴＴと１ｍＭ  ＰＭＳＦを加えた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に得られた細胞ペレットを懸濁し、フレンチプレスを使用して機械的に溶解させた。得られた溶解液を２５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。固体硫酸アンモニウムを４０％飽和点まで上清に加え、１８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を１０ｍＭ  ＧＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で１２時間４℃で透析した。得られた溶液を次に透析緩衝液で予め平衡化しておいた１０ｍＬ  Ｑ−セファロース高流速カラム（Ｓｉｇｍａ）にロードした。フラクションを集め、プールし、Ａｍｉｃｏｎフローセルを使用して濃縮した。次に、１０ｍＭ  ＤＴＴと０．０１％ナトリウムアジドを加えた２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で溶液を透析した。
【００６３】
Ｂ．特異的に１３Ｃを集積したＶａｌ／Ｌｅｕ／ＩｌｅＦＫＢＰの調製
単一窒素源（１．０ｇ／Ｌ）としてＮＨ４Ｃｌと炭素源としてグルコース（１．５ｇ／Ｌ）を含む培地で（Ｅｇａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１９２０−１９２７（１９９３）に記載されているように）ヒトＦＫＢＰをコードするプラスミドで形質転換した細胞を増殖させた。細胞を３７℃で増殖させ、１．０の光学密度が得られるまでフラスコ内容物を振盪した。誘導の１時間前にα−ケト酪酸とα−ケトイソ吉草酸１００ｍｇを培地に加えた。１ｍＭ  ＩＰＴＧで１２時間培養を誘導した。発現、単離及び発現したタンパク質の精製は上述の通りである。
【００６４】
Ｃ．均質に１３Ｃを集積したＦＫＢＰの調製
単一窒素源（１．０ｇ／Ｌ）として１５ＮＨ４Ｃｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）と炭素源（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）として均質１３Ｃ集積グルコース（１．５ｇ／Ｌ）を含む培地で（Ｅｇａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１９２０−１９２７（１９９３）に記載されているように）ヒトＦＫＢＰをコードするプラスミドで形質転換した細胞を増殖させた。発現、単離及び発現したタンパク質の精製は上述の通りである。
【００６５】
実施例１：均質に１３Ｃを集積したＦＫＢＰによる１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを使用したリガンドのスクリーニング
上記手順に従って均質に１３Ｃを集積したＦＫＢＰを調製した。スクリーニングアッセイに使用したタンパク質溶液はＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９／１）リン酸緩衝液溶液（２０ｍＭ，ｐＨ６．５）中に均質１３Ｃ集積ＦＫＢＰ（０．２ｍＭ）とナトリウムアジド（０．０５％）を含むものとした。
【００６６】
三重共鳴プローブとＢｒｕｋｅｒサンプルチェンジャーを備えるＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００  ＮＭＲスペクトロメーターで３０℃で二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを生成した。１３Ｃ／１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルは掃引幅３７７１Ｈｚ（１３Ｃ，ｔ１）及び８３３３Ｈｚ（１Ｈ，ｔ１）を使用して６４×１０２４個の複素点として獲得した。走査間遅延１秒と自由誘導減衰（ｆｉｄ）当たり８走査をデータ収集に使用した。全ＮＭＲスペクトルはＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｓコンピューターで処理及び分析した。
【００６７】
上述のように１３Ｃ標識ＦＫＢＰ標的分子で第１の二次元１３Ｃ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを獲得した。次にＦＫＢＰ標的を試験化合物のライブラリー混合物に暴露した。１００ｍＭと１Ｍの化合物のストック溶液を調製した。更に、サンプル当たり８〜１０種の化合物を各化合物１００ｍＭの濃度で含有する組合せライブラリーを調製した。
【００６８】
１Ｍストック溶液のｐＨは酢酸とエタノールアミンで調節し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈後にｐＨ変化が認められないようにした。ｐＨが少しでも変化すると生体分子の化学シフトが変化し、ＮＭＲデータの解釈が混乱する恐れがあるのでｐＨ調節は重要である。
【００６９】
ライブラリー内の化合物はサイズ（分子量＝１００〜３００）と分子ダイバーシティに基づいて選択した。ライブラリーの分子は多様な結合部位と相互作用する化合物を発見する可能性が最大限になるように、種々の形状（例えば、平坦芳香環、折れ曲がった脂肪族環、単結合、二重結合又は三重結合をもつ直鎖及び分枝鎖脂肪族）と多様な官能基（例えばカルボン酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン及び種々の複素環）をもつように選択した。
【００７０】
ＮＭＲサンプルは均質１３Ｃ標識タンパク質のＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９／１）緩衝溶液０．５ｍｌに各化合物を１００ｍＭの濃度で含有する化合物混合物のジメスルスルホキシドストック溶液１．２５μｌを加えることにより調製した。ＮＭＲサンプル中の各化合物の最終濃度は約０．２５ｍＭとした。
【００７１】
スクリーニング実験では、１種の化合物２−フェニルイミダゾールがＦＫＢＰに結合することが判明した。図１は均質に１３Ｃで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを示す。スペクトル（１２８複素点、４走査／ｆｉｄ）は２０ｍＭリン酸（ｐＨ６．５）、０．０１％ナトリウムアジド及び１０％酸化ジューテリウム（Ｄ２Ｏ）中０．１ｍＭ  ＦＫＢＰサンプルで獲得した。
【００７２】
図２は２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）の均質１３Ｃ標識ＦＫＢＰ（０．２ｍＭ）の１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトル（６４複素点、８走査／ｆｉｄ）のメチル領域を示す。アミノアシル残基Ｌｅｕ９７、Ｖａｌ５５、Ｉｌｅ５６及びＩｌｅ９０に化学シフトの変化が認められる。
【００７３】
図３は２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）のバリニル残基とロイシル残基を選択的に１３Ｃ／１５Ｎ／２Ｈで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトル（４８複素点、８走査／ｆｉｄ）を示す。他の全条件は図１に示すスペクトルの生成に使用した条件と同一である。選択残基は結合後に有意変化を示すことが認められる。この場合も、化学シフト値が変化しており、Ｌｅｕ９７及びＶａｌ５５残基又はその近傍に結合が生じていると判断される。
【００７４】
図４は２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）のアラニル残基を選択的に１３Ｃで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを示す。リガンドの添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）の化学シフト値は重なっており、アラニル残基は結合に関与していないと判断される。
【００７５】
図５はＦＫＢＰの三次元構造の「棒モデル」図を示す。分かり易くするために選択残基の番号を示す。タンパク質の結合部位に含まれるアミノアシル残基は太線で示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  均質に１３Ｃで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルを示す。
【図２】  ２−フェニルイミダゾール（０．１２ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）の均質１３Ｃ標識ＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルのメチル領域を示す。
【図３】  ２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）のバリニル残基とロイシル残基を選択的に１３Ｃ／１５Ｎ／２Ｈで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルのメチル領域を示す。
【図４】  ２−フェニルイミダゾール（０．２５ｍＭ）の添加前（細い多重閉曲線）と添加後（太い一重閉曲線）のアラニル残基を選択的に１３Ｃで標識したＦＫＢＰの１３Ｃ／１Ｈ相関スペクトルのメチル領域を示す。
【図５】  ＦＫＢＰの三次元構造の「棒モデル」図を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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