(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチド、配列番号１のペプチド配列における９番目のアミノ酸残基ＡｒｇがＬｙｓへ置換および／もしくは１０番目のアミノ酸残基ＬｙｓがＡｒｇへ置換されたペプチド、ならびに／または配列番号２のペプチド配列における１１番目のアミノ酸残基ＬｙｓがＡｒｇへ置換されたペプチドを含有する、カルパインによるカルシニューリンＡサブユニットの切断阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のカルシニューリンＡサブユニットの切断阻害剤を有効成分とする神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のカルシニューリンＡサブユニットの切断阻害剤を有効成分とする痴呆性疾患の進行抑制剤。
【請求項４】
請求項１記載のカルシニューリンＡサブユニットの切断阻害剤を含有する細胞および脳スライス培養培地の添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシニューリンの恒常的活性化阻害剤に関する。詳しくは、本発明は、カルパインによるカルシニューリンＡサブユニット（ＣａＮＡ）の切断を阻害する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシニューリンは、カルシウムおよびカルモジュリン依存的に活性化される脱リン酸化酵素であり、活性中心を有するカルシニューリンＡサブユニット（ＣａＮＡ）および調節因子であるカルシニューリンＢサブユニット（ＣａＮＢ）からなる複合体である。カルシニューリンは、活性中心と基質との会合を自己阻害ドメインにより阻害しているため、通常細胞内において非活性型である。細胞内のカルシウム濃度が上昇すると、カルシニューリンの構造が変化して自己阻害ドメインが開き（活性型）、基質が活性中心に会合できるようになる。また、カルシウム濃度が減少すると、カルシニューリンは再び非活性型に戻る。このように、カルシニューリンについては従来、カルシウム濃度により可逆的に活性化されることが知られている。
【０００３】
１９９９年、カルシニューリンが神経細胞死に重要な役割を担っていることが報告された（非特許文献１参照）。さらに、カルシニューリンの特異的阻害剤（免疫抑制剤ＦＫ５０６およびサイクロスポリンＡ）が神経細胞死を抑制することも報告されている（非特許文献２および非特許文献３参照）。これらの文献を含む多くの報告に基づき、脳虚血および脊椎損傷などで認められる神経細胞死に関しては、神経細胞の興奮によってグルタミン酸受容体の１つであるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ受容体）が異常に活性化し、該受容体から細胞内への多量のカルシウムの流入によりカルシニューリンが活性化されて細胞死を誘発するというメカニズムが現在提唱されている。しかしながら、該カルシウムの流入は一過性であり、カルシニューリンの活性化状態は長期間持続しない。したがって、一過性の細胞内カルシウム濃度上昇ではなく、長期にカルシニューリンが活性化されるほかのメカニズムの存在が想像されていたが、そのようなメカニズムに関する報告はなされていない。
【０００４】
前述したように、神経細胞死の抑制、具体的には虚血性および興奮性神経細胞死の抑制に対しては、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびサイクロスポリンＡが効果を有することが知られている。しかしながら、それらの薬剤はカルシニューリンが関与するすべての情報伝達を抑制するために副作用が大きいことが知られている（たとえば腎毒性および糖尿病など）。したがって、長期間のカルシニューリン活性化を阻害し、かつ、従来のものと比較してより副作用の少ない神経細胞死の抑制剤が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】アサイ  アキオ等、ジェー・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biological Chemistry）、第２７４巻、ｐ．３４４５０、１９９９年
【非特許文献２】モリオカ  モトヒロ等、プログレス・イン・ニューロバイオロジー（Progress in Neurobiology）、第５８巻、ｐ．１、１９９９年
【非特許文献３】スプリンガー  ジョー  イー（Springer Joe E）等、ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（The Journal of Neuroscience）、第２０巻、ｐ．７２４６、２０００年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来の問題点を解決し、副作用が少なく、様々な疾患に有効な神経細胞死抑制を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。
１）グルタミン酸投与により神経細胞死を誘導すると、カルシニューリンＡサブユニット（ＣａＮＡ）の断片化が認められた。
２）ＣａＮＡの切断部位は、アミノ酸配列における３９２番目（アルギニン）と３９３番目（リジン）との間および４２１番目と４２５番目との間であった。
３）カルシニューリンが同部位で切断されると、カルシウムおよびカルモジュリン非依存的に活性を有することが明らかになった。
４）前記断片化は、カルシニューリンとは異なる情報伝達経路に属すると考えられていたカルパインにより引き起こされ、カルパイン阻害剤で阻害された。
５）ＣａＮＡの３９２〜３９３アミノ酸残基を含むペプチドまたは同４２１〜４２５アミノ酸残基を含むペプチドを神経細胞内に導入すると、グルタミン酸投与による神経細胞死が抑制された。
【０００８】
前記知見に基づき、一過性の細胞内カルシウム濃度上昇によるカルシニューリン活性化ではなく、長期的なカルシニューリン活性化のメカニズムを標的とした細胞死の抑制剤を開発し、本発明を完成した。すなわち本発明は、
（１）配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチドおよび／またはそれらの類似体を含有する、カルパインによるＣａＮＡの切断阻害剤、
（２）前記（１）記載のＣａＮＡの切断阻害剤を有効成分とする神経細胞死抑制剤、
（３）前記（１）記載のＣａＮＡの切断阻害剤を有効成分とする痴呆性疾患の進行抑制剤、および
（４）前記（１）記載のＣａＮＡの切断阻害剤を含有する細胞および脳スライス培養培地の添加剤
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明はＣａＮＡの切断阻害剤を提供した。本発明のＣａＮＡの切断阻害剤は、カルシニューリンの不可逆的な活性化を阻害することができるため、該活性化により誘発される神経細胞死を抑制することができる。また、ＣａＮＡの切断阻害剤を含有する本発明の神経細胞死抑制剤は、痴呆性疾患など神経細胞死に関連する疾患の予防ないし治療薬として使用することができるため、極めて有用である。さらに、ＣａＮＡの切断阻害剤を含有する本発明の培養細胞培地の添加剤を用いれば、培養細胞の生育をよくすることもできる。また、本発明のＣａＮＡの切断阻害剤は、神経細胞死に関する研究用試薬としても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】グルタミン酸添加による神経細胞死誘導時のＣａＮＡの切断、および本発明のＣａＮＡの阻害剤によるＣａＮＡ切断の抑制効果を示す写真である。図１（ａ）はグルタミン酸添加ののち３時間インキュベーションした試料の結果、図１（ｂ）はグルタミン酸添加ののち２４時間インキュベーションした試料の結果を示す。図１（ａ）および（ｂ）において、レーン１はコントロール、レーン２はグルタミン酸のみを添加した試料、レーン３は切断阻害ペプチドのみを添加した試料、ならびにレーン４はグルタミン酸および切断阻害ペプチドを添加した試料を示す。
【図２】グルタミン酸添加により神経細胞死を誘導された神経細胞の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のカルパインによるカルシニューリンＡサブユニット（ＣａＮＡ：配列番号３）の切断阻害剤は、配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチドおよび／またはそれらの類似体を含有する化合物であって、カルパインによるＣａＮＡの３９２〜３９３アミノ酸残基間または同４２１〜４２５アミノ酸残基間の切断を阻害し、カルシニューリンの恒常的活性化を阻害する物質を意味する。
【００１２】
前記配列番号１のペプチドの類似体としては、配列番号１のペプチドのアミノ酸配列において、たとえばその一部が欠失、置換及び／又は他のアミノ酸配列を挿入もしくはペプチドの末端に付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルパインによるＣａＮＡの切断を阻害するペプチドが包含される。たとえば、配列番号１のペプチド配列における９番目のアミノ酸残基ＡｒｇがＬｙｓへ置換および／または１０番目のアミノ酸残基ＬｙｓがＡｒｇへ置換されたペプチドは、本発明の配列番号１のペプチドの類似体に含まれる。
【００１３】
前記配列番号２のペプチドの類似体としては、配列番号２のペプチドのアミノ酸配列において、たとえばその一部が欠失、置換及び／又は他のアミノ酸配列を挿入もしくはペプチドの末端に付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルパインによるＣａＮＡの切断を阻害するペプチドが包含される。たとえば、配列番号２のペプチド配列における１１番目のアミノ酸残基ＬｙｓがＡｒｇへ置換されたペプチドは、本発明の配列番号２のペプチドの類似体に含まれる。
【００１４】
配列番号１または配列番号２のペプチドの類似体（類似体ペプチド）によるＣａＮＡ切断阻害活性は、以下のようにして評価することができる。すなわち、試験溶液（０．１μＭまたは１０μＭの類似体ペプチド、５μＭ  精製カルパイン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭ  ＣａＣｌ2）を調製したのち精製カルシニューリン（最終濃度１μＭ）を添加し、３０℃で１時間インキュベーションする。ついで、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより反応液をゲル上で電気泳動し、クマシーブルーにてゲルを染色する。染色の結果、４５ｋＤａおよび４８ｋＤａの分子量としてみられるカルパイン依存性断片化カルシニューリンを定量することにより、評価することができる。
【００１５】
前記ペプチドは、Ｂｏｃ法またはＦｍｏｃ法による固相または液相合成など、公知の方法を用いて製造することができる。また、そのようにして製造したペプチドを、エーテル沈殿・濾過法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、パフュージョンクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて精製することもできる。
【００１６】
本発明のカルパインによるＣａＮＡの切断阻害剤は、配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチドおよび／またはそれらの類似体を含有するものであれば、さらなる化合物を含有してもよい。さらなる化合物としては、たとえば、ポリアルギニンペプチド（たとえば、５個のアルギニンからなるポリアルギニンペプチド）やＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質に含有される１１個のアミノ酸残基からなるタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ；配列番号４））などのように５０％以上のアルギニンまたはリジンを含有する７〜３０個で構成される細胞内導入シグナルペプチド、または陽イオン性の水溶性ポリマーである直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などが挙げられる。これらの化合物は、（ｉ）配列番号１または２のペプチドおよび／またはそれらの類似体に連続して通常のペプチド合成により合成する方法、または（ｉｉ）いずれか片方のペプチドに２価性架橋剤を、もう一方のペプチドの末端にはシステイン残基を連結させて、両ペプチドを反応させることにより結合する方法などを用い、配列番号１または２のペプチドおよび／またはそれらの類似体に結合（または融合）することができる。また、そのようにして得られたＣａＮＡの切断阻害剤は、前述の精製方法を用いて精製することができる。
【００１７】
本発明の神経細胞死抑制剤は、前記カルパインによるＣａＮＡの切断阻害剤を有効成分として含有し、神経細胞における長期間の神経細胞死誘導を抑制する薬剤を意味する。神経細胞死抑制剤は、神経細胞死に関連する疾患の予防ないし治療剤としても使用し得る。本発明の神経細胞死抑制剤は、配列番号２のペプチドおよび細胞内導入シグナルペプチドからなるＣａＮＡの切断阻害剤を含有することが好ましく、配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチドおよび細胞内導入シグナルペプチドからなるＣａＮＡの切断阻害剤を含有することがさらに好ましい。前記神経細胞死に関連する疾患の予防ないし治療剤は、神経細胞死に関連する疾患の予防ないし治療のために有効量の神経細胞死抑制剤を含有する医薬を意味する。神経細胞死に関連する疾患としては、たとえばアルツハイマー病、痴呆性疾患、脳虚血性疾患、くも膜下出血などの脳内出血、脊髄損傷、パーキンソン病およびてんかんなどが挙げられる。
【００１８】
本発明の神経細胞死抑制剤の投与経路としては、たとえば経口投与、経静脈的投与および脳内直接投与などが挙げられ、患者への負担、副作用の点から、経口投与がより望ましい。
【００１９】
本発明の神経細胞死抑制剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液、乳剤、懸濁液などの液剤、錠剤およびカプセル剤などが挙げられる。たとえば、経口投与の場合は錠剤またはカプセル剤が好ましく、経静脈的投与あるいは脳内直接投与の場合は液剤が好ましい。本発明の神経細胞死抑制剤の製剤化には、その剤形に合わせて通常当業者により使用される様々な添加物を使用することができる。例えば、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、防腐剤などが挙げられる。
【００２０】
前記神経細胞死抑制剤の投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重および病状などによって適宜設定することができる。たとえば、本発明のカルパインによるＣａＮＡの切断阻害剤に換算して一日に０．１ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、１ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましい。投与量が０．１ｍｇ／ｋｇより少ない場合にはＣａＮＡ切断阻害効果が半減する傾向がある。また、投与量は、本発明のカルパインによるＣａＮＡの切断阻害剤に換算して一日に１００ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、２０ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましい。投与量が１００ｍｇ／ｋｇを超える場合、細胞毒性を示す傾向がある。本発明の神経細胞死抑制剤の投与は、単回または複数回のどちらで行っても良い。
【００２１】
本発明の細胞培養培地または脳スライス培養培地の添加剤は、少なくともＣａＮＡの切断阻害剤を含有する培養培地の添加剤を意味する。本発明の細胞培養培地の添加剤は、配列番号２のペプチドおよび細胞内導入シグナルペプチドからなるＣａＮＡの切断阻害剤を含有することが好ましく、配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチドおよび細胞内導入シグナルペプチドからなるＣａＮＡの切断阻害剤を含有することがさらに好ましい。
【００２２】
培養細胞に適用する場合、本発明のカルパインによるＣａＮＡの切断阻害剤の添加量としては、細胞濃度１×１０5細胞／ｍｌの培養液に０．０１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌが好ましく、０．１〜１０ｎｍｏｌ／ｍｌがより好ましい。添加量が０．０１ｎｍｏｌ／ｍｌより少ない場合、ＣａＮＡの切断阻害剤の効果が半減する傾向があり、１００ｎｍｏｌ／ｍｌより多い場合には細胞毒性を示す傾向がある。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限を受けるものではない。
【００２４】
実施例１
本発明のＣａＮＡの切断阻害剤としてＦＤＧＡＴＡＡＡＲＫＥＶＩＲＮＫ（配列番号１）およびＲＥＥＳＥＳＶＬＴＬＫＧＬＴＰＴＧ（配列番号２）を培養細胞内に導入するため、以下に示すようにＮ末端に細胞内導入シグナルペプチド（１０個のアルギニン）を付加したオリゴペプチドを製造した（ペプチド研究所社製）。
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＦＤＧＡＴＡＡＡＲＫＥＶＩＲＮＫ（配列番号５）
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＥＥＳＥＳＶＬＴＬＫＧＬＴＰＴＧ（配列番号６）
【００２５】
（神経細胞の調製）
ウィスターラット（Wister rat）胎児１８日目の脳海馬を摘出後、０．０５％トリプシンを含むＰＢＳで１５分間３７℃で処理した。ガラスピペットを用いて神経細胞を分散させた後、あらかじめポリ-Ｄ-リジンでコーティングした直径３．５ｃｍ培養皿に、細胞を１×１０6個培養した。培地は、Ｂ２７サプルメント（０．０３ｍｌ; インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）製）、ペニシリン（最終濃度１００単位／ｍｌ; インビトロジェン社製）およびストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ; インビトロジェン社製）を添加した３ｍｌ  Ｎｅｕｒｏ  Ｂａｓａｌ培地（インビトロジェン社製）を使用し、炭酸ガスインキュベーター(５％ＣＯ2、３７℃)中で行った。
【００２６】
（ペプチドの添加）
培養開始１０日後に、培養液中に最終濃度１μＭで前記配列番号５および６のペプチドを添加し、炭酸ガスインキュベーター(５％ＣＯ2、３７℃)においてインキュベーションした。添加後３時間してから、最終濃度５００μＭのグルタミン酸を添加し、１５分間インキュベーションした。ついで、培養液を交換し、さらに培養した。グルタミン酸添加後３時間および２４時間後、細胞を回収し、１％ＳＤＳ溶液で細胞を超音波粉砕し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーを加えた。同サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法に供した後、ＣａＮＡを認識する抗体（ラビット血清、サンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology, Inc）製）でウエスタンブロッティングを行った。なお、本実施例においては、グルタミン酸および切断阻害ペプチドを添加しない細胞試料をコントロールとして用いた。また、並行して、グルタミン酸のみを添加した細胞試料および切断阻害ペプチドのみを添加した細胞試料も作製した。
【００２７】
結果を図１に示す。グルタミン酸添加群では、カルシニューリンの断片化が認められた。一方、切断阻害ペプチドを導入した神経細胞では、グルタミン酸添加により通常起こり得るカルシニューリンの切断が阻害された。
【００２８】
実施例２
実施例１と同様に神経細胞を培養し、ついで実施例１と同様に神経細胞に最終濃度１μＭになるように前述の配列番号５および６のペプチドを添加した。コントロールとして、カルシニューリン阻害剤のＦＫ５０６(フジサワ製薬株式会社；最終濃度１μＭ)またはカルパイン阻害剤のＡＬＬＭ（メルク社；最終濃度２５μＭ）加えた。それぞれの薬剤を２時間インキュベーションした後、最終濃度５００μＭのグルタミン酸を添加し、１５分間インキュベーションした。ついで、培養液を交換し、さらに培養した。添加後３時間、６時間、１２時間または２４時間後、それぞれの神経細胞は４％パラフォルムアルデヒドで固定した。その後、細胞死を起こした神経細胞を同定するために、ＴＵＮＥＬ染色（ロッシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics, Inc）製）を行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞をカウントした。
【００２９】
結果を図２に示す。グルタミン酸投与群では、投与後時間経過と共に細胞死を起こしている神経細胞の数が上昇した。切断阻害ペプチドはグルタミン酸で誘導される神経細胞死を抑制する効果があることが判明した。また、その効果は、ＦＫ５０６、ＡＬＬＭと同程度の効果であった。
【００３０】
参考例１
牛脳より精製したカルシニューリン１μＭを１μＭカルモジュリン（メルク社（Merck, Inc）製）および／または１μＭ  ｍ−カルパイン（メルク社製）と反応液中（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）で３０℃、１時間それぞれ反応させ、その後１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法を行なった後、クマシーブルーにて同ゲルを染色した。
【００３１】
その結果、カルパインを添加していない場合、精製ＣａＮＡは、電気泳動上６０Ｋｄａの大きさにみられた。これは、これまで報告されているＣａＮＡの大きさに一致するものである。一方、カルモジュリンとカルパインとを添加した場合、６０Ｋｄａにバンドは認められず、４８および４５Ｋｄａにバンドが認められた。カルパインのみと反応させると、４５Ｋｄａの大きさに切断されたＣａＮＡが認められた。
【００３２】
前記結果より、カルシニューリンがカルパインにより切断されることは明らかである。
【００３３】
さらに、カルパインによるＣａＮＡの切断部位を決定したところ、４５Ｋｄａ切断蛋白は、アミノ酸配列３９２番までのアミノ酸で構成され、４８Ｋｄａの切断蛋白は、４２１番まで、４２２番まで、４２３番まで、および４２４番までのアミノ酸で構成されていた。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
配列番号５：ヒト由来のペプチド配列と人工的なペプチド配列とからなるペプチド配列
配列番号６：ヒト由来のペプチド配列と人工的なペプチド配列とからなるペプチド配列
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【図２】
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【配列表】
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