(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度を測定するためのバイオセンサーであって、
（ａ）ベース層、
（ｂ）参照電極及び作用電極からなり、前記作用電極の導電性部分の表面が１０，０００Å以下の表面粗度を有し、前記表面粗度が前記試料中に少なくとも２８Ｕ／Ｌの濃度で存在するＡＬＴ濃度の正確な検出を可能とする検出層、
（ｃ）前記電極の上にある乾燥試薬を含む層、及び
（ｄ）測定中試料の凝固を防止する位置に設けられている抗凝固剤
及び、更に前記電極を囲む前記試料の蒸発を抑えるための液体不透過性の被覆層を含むことを特徴とする前記バイオセンサー。
【請求項２】
作用電極が炭素、白金、金、パラジウム、塩化銀及び銀からなる群から選択される材料から作られていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
更に、流体輸送層を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
流体輸送層が親水性メッシュからなることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
作用電極が更にレドックスポリマーを含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
作用電極が更にペルオキシダーゼ酵素及び炭素を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
作用電極が全血に接触したときに溶解しないことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
流体輸送層が全血を複数の成分に分離し得ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
複数の成分が赤血球及び血漿を含むことを特徴とする請求の範囲第８項に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
全血試料中のＡＬＴ濃度の測定方法であって、
（１）（ａ）ベース層、（ｂ）参照電極及び作用電極からなり、前記作用電極の導電性部分の表面が１０，０００Å以下の表面粗度を有し、前記表面粗度が前記試料中に少なくとも２８Ｕ／Ｌの濃度で存在するＡＬＴ濃度の正確な検出を可能とする検出層、（ｃ）前記電極の上にある乾燥試薬を含む層、及び（ｄ）測定中試料の凝固を防止する位置に設けられている抗凝固剤及び、更に前記電極を囲む前記試料の蒸発を抑えるための液体不透過性の被覆層を含むバイオセンサーを用意するステップ、
（２）前記バイオセンサーに前記全血を導入するステップ、
（３）前記全血で前記乾燥試薬を溶解するステップ、
（４）前記検出層において化学反応が起るようにするステップ、及び
（５）前記化学反応の出力を読んで、前記ＡＬＴの濃度を測定するステップ
を含む前記方法。
【請求項１１】
作用電極が炭素、白金、金、パラジウム、塩化銀及び銀からなる群から選択される材料から作られていることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
更に、バイオセンサーが流体輸送層を含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１３】
流体輸送層が親水性メッシュからなることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
作用電極が更にレドックスポリマーを含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１５】
作用電極が更にペルオキシダーゼ酵素及び炭素を含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１６】
作用電極が全血に接触したときに溶解しないことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１７】
流体輸送層が全血を複数の成分に分離し得ることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１８】
複数の成分が赤血球及び血漿を含むことを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、生物学的流体中のアナライト濃度を測定するためのバイオセンサー、例えば全血中のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を測定するためのバイオセンサーに関する。
【０００２】
２．従来技術の説明
アラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、“ＡＬＴ”）は、主に肝に存在し、肝が損傷したときに血液中に遊離する酵素である。ＡＬＴは重要なアナライトであり、その濃度は殆どすべての肝障害で高い。ＡＬＴ測定は肝障害または肝損傷（例えば、肝炎、毒素または医療用医薬品の副作用）の診断を助けるために使用されている。１９９４年に米国で薬の副作用に起因すると推定される死亡数は１００，０００人を越え、薬の副作用は米国における死亡原因の５番目となっている。米国での薬の副作用の推定コストは７７０億ドル／年を越える。１回のＡＬＴ測定では肝損傷が進行しているかが分からない。そのため、一連のＡＬＴ測定が肝障害の診断を助け、その進行をフォローするために頻繁に使用されている。
【０００３】
従来技術のＡＬＴアッセイでは、通常人から針を腕に刺し、真空チューブに集め、血清または血漿を得るために遠心して処理した血液を使用している。次いで、前記血清または血漿のＡＬＴ活性は専門技術者により通常少なくともパーソナルコンピューターと同じ大きさの装置を用いる検査システムで調べられる。このＡＬＴアッセイに使用されている試薬は通常、周囲温度及び高温での安定性に乏しい。従って、試薬は通常前記装置とは離れた場所において低温条件下で保存しなければならない。液体試薬を使用するアッセイでは、正確なＡＬＴ測定値を得るためには通常血清または血漿に試薬を正確に添加し、添加した試薬を血清または血漿と混合しなければならない。
【０００４】
現在利用されているＡＬＴアッセイは複雑であるために、当該アッセイは専門技術者が実施しなければならない。更に、アナライザーが大型であるためにシステムを携帯することができない。これらの理由により、患者はＡＬＴアッセイを受けるために患者ケア施設に行かなければならない。患者によっては、担当医がＡＬＴレベルを数ヶ月または数年間も定期的にモニターしなければならない。
【０００５】
自己モニタリングの技術は糖尿病の分野では十分確立されている。血中グルコースレベルを測定するための自己モニタリングデバイスは１９８０年半ばから患者に提供されている。前記デバイスは全血を得るためにフィンガースティックを使用し、操作が非常に簡単である。患者が患者ケア施設に行く必要はなく患者自身が実施し得るように十分簡単なＡＬＴアッセイの開発が望まれている。
【０００６】
米国特許第５，７０５，０４５号明細書は、ＡＬＴ及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を同時に測定し得るバイオセンサーを記載している。前記バイオセンサーは２組の電極を含み、その各々が別々の肝酵素に感受性である。各電極は炭素、酵素及び結合剤を含有するスクリーン印刷層からなる。この層の上に、試薬及び結合剤を含有するスクリーン印刷層がある。前記バイオセンサーを使用するアッセイでは、ＡＬＴまたはＡＳＴを含む生物学的流体をバイオセンサー上に載せる。ＡＬＴまたはＡＳＴは試薬と反応してペルオキシドまたはＮＡＤＨを生成し、その後生じたペルオキシドまたはＮＡＤＨは酸化を受けて、測定対象の肝酵素の濃度に比例した電流が生ずる。前記特許明細書は、肝酵素を測定するための２つの異なる化学反応を記載している。１つの化学反応でペルオキシド、他の化学反応でＮＡＤＨが生ずる。ＡＬＴを検出するためにＮＡＤＨを使用するシステムは高価で不安定であるＮＡＤを必要とする。ＡＬＴを検出するためにペルオキシドを使用するシステムはＮＡＤを必要とせず、よってより安価で、より安定である。前記センサーは、試料を試料適用ゾーンから電極に移動させるための毛管ゾーンを形成するカバーを有する。前記センサーは結合剤に混合した試薬を含む。前記試薬及び前記結合剤は試料に接触すると溶解する。前記システムでは、電極を試料に接触させた直後にアナライト測定を実施しなければならない。なぜならば、化学反応生成物及び炭素が電極の表面から拡散し、よって長い反応時間では信号がかなり低下するからである。ヒト中のＡＬＴ濃度は非常に低い。米国特許第５，７０５，０４５号明細書のＡＬＴ反応経路は、測定可能量のＨ２Ｏ２を生成させるために数分の反応時間を要する。従って、このＡＬＴ測定方法は可溶性結合系を用いては機能しない。
【０００７】
米国特許第５，７０５，０４５号明細書には、全血を好適試料として挙げられていない。全血を試料として使用した場合には、試料が反応時間中にセンサー上で凝固するであろう。全血試料はバイオセンサーとは離れた場所で抗凝固剤で処理しなければならない。フィンガースティックからの毛細管血は使用できない。なぜならば、毛細管血に抗凝固剤を添加することが容易でないからである。この欠点により、毛細管血は患者から入手可能な唯一の試料であるので、センサーを家庭での検査のために使用できない。
【０００８】
バイオセンサーによるＡＬＴ及びＡＳＴの測定は、Ｃｏｏｐｅｒら，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２４５，５７−６２（１９９１）に記載されている。Ｃｏｏｐｅｒらは白金化炭素から作成した電極を使用している。測定前に、血清試料を液体試薬で希釈する。液体試薬はアッセイの開始前に試料と混合しなければならないので望ましくない。液体試薬は、通常乾燥試薬よりも不安定である。試料に液体試薬を添加すると試料が希釈され、その結果試料中のＡＬＴ濃度が低下する。これは、未希釈試料中の高濃度のＡＬＴよりも測定するのが難しい。液体試薬の試料への添加は、正確な結果を得るためには定量的に実施されなければならない。前記システムは複雑であり、よって家庭での使用には適さない。
【０００９】
患者自身が実施することができる患者にとって便利なＡＬＴアッセイは現在のところない。既存のＡＬＴアッセイの場合、結果を得ることができるまでに多くの時間及び手間のかかるステップを要する。通常、患者はアッセイを受けるために医院、病院または患者ケア施設に行かなければならない。多くのＡＬＴアッセイは試料として血清が必要であり、そのため採血専門家が患者から不快な静脈処置により試料を得なければならない。その後、血液試料を遠心処理して、血清または血漿試料を得なければならない。多くのＡＬＴアッセイは、冷温条件下で保存しなければならない液体試薬を使用している。アッセイを実施する場合、液体試薬を検査システムに添加しなければならない。アッセイまたは検査システムが複雑であるために、通常専門技術者が必要である。更に、血中ＡＬＴ濃度が低く、そのためＡＬＴ濃度を正確に測定することは難しい。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は生物学的流体（例えば、全血）試料中のアナライト（例えば、ＡＬＴ）濃度を測定するためのバイオセンサーを提供し、前記バイオセンサーは
（ａ）ベース層、
（ｂ）参照電極及び作用電極からなり、前記作用電極の導電性部分の表面が低濃度（例えば、１ｍＭ未満）で存在するアナライトを測定し得るように十分に平滑である検出層、
（ｃ）前記電極の上にある乾燥試薬を含む層、及び
（ｄ）測定中試料の凝固を防止する位置に設けられている抗凝固剤
を含む。
【００１１】
ベース層は、バイオセンサー中のすべての他の層を機械的に支持する。検出層により、アナライト（例えば、ＡＬＴ）の化学反応により遊離した生成物のパラメータを測定可能な電流に変換することができる。検出層は参照電極及び作用電極からなる。作用電極は、低濃度（例えば、１ｍＭ未満）で存在するアナライトの濃度を測定することができるように十分な平滑度を有する導電性表面を有していなければならない。前記電極は、（１）純粋な金属そのもの、（２）表面をレドックスポリマーでコートした純粋な金属または炭素、（３）酵素含有炭素を含めた材料から作られるが、材料はこれらに限定されない。試薬層は、生物学的流体中のアナライト（例えば、血中ＡＬＴ）と反応し、検出層で測定し得る生成物を生成するのに必要な化学物質を備えている。ＡＬＴとの反応用試薬及びＡＬＴ測定用の化学反応は米国特許第５，７０５，０４５号明細書に詳細に記載されている。抗凝固剤により、測定前及びその間の生物学的流体試料（例えば、血液試料）の凝固が防止される。
【００１２】
グルコースをモニターするためのバイオセンサーのように全血試料を用いるバイオセンサーでは、所要の化学反応を短時間、通常１分以内で実施する。従って、抗凝固剤を必要としない。血中ＡＬＴ濃度は低いので、測定可能な信号を発生させるために数分の反応時間を要する。血液は約１分で凝固し始めるので、ＡＬＴアッセイを実施するためには血液試料に抗凝固剤を添加しなければならない。本発明のバイオセンサーでは、抗凝固剤はバイオセンサーに収容されており、血液試料がバイオセンサーに流れると血液と混合される。
【００１３】
好ましくは、バイオセンサーは更に、試料を試料適用ゾーンから電極にデリバリーするのを助けるために流体輸送層を含む。流体輸送層は試料を電極上に均一に移動させ、試料により電極表面を十分に湿らすことができる。流体輸送層は、界面活性剤をコートしたメッシュ材料からなり得、更にＡＬＴアッセイのための１つ以上の試薬及び抗凝固剤を含んでいてもよい。
【００１４】
好ましくは、バイオセンサーは更に、アッセイ中試料の蒸発を抑え且つ流体輸送路及び検出層上の流体容量を規定するのを助けるために電極領域の上に被覆層を含む。ＡＬＴアッセイが比較的長い反応時間を要するので、ＡＬＴアッセイでは被覆層が非常に望ましい。
【００１５】
バイオセンサーは、しばしば体が虚弱で、不器用な素人でも持ち上げて、モニターデバイスに挿入することができるような大きさを有する。
【００１６】
バイオセンサーは更に、作用電極の表面をコートしたレドックスポリマーを含み得、ペルオキシダーゼのような酵素がレドックスポリマーに共役結合されている。前記レドックスポリマーを使用する電極は高感度を有し、低い作用電圧（０〜１００ｍＶ）で作動し得、よってシステムの電気化学干渉物質に対する感度が低下する。検出層は更に、米国特許第５，７５５，９５３号明細書に記載されているように作用電極に組み込まれている酵素を含み得る。組み込まれた酵素を使用する電極は高感度を有し、低い作用電圧（０〜１００ｍＶ）で作動し得、よってシステムの電気化学干渉物質に対する感度が低下する。
【００１７】
本発明は幾つかの利点を与える。ＡＬＴアッセイは、患者自身が行うことができるほどに十分に簡単である。バイオセンサーが抗凝固剤を含んでいるので試料の予備処理は必要でない。結果を得るために必要なステップ数が少ない。ＡＬＴアッセイは針を用いて抜き取った血液試料の代わりにフィンガースティック試料からの全血を使用し得るので、検査を患者ケア施設の外部（例えば、自宅）で患者が実施することができる。ＡＬＴアッセイは通常約３．５〜約２０μｌの試料容量を必要とする。この量はフィンガースティック試料から容易に得ることができる。システムは携帯できる。更に、結果を数分以内に記録することができる。本発明の別の利点は、バイオセンサーが乾燥試薬を使用しているので、アッセイが液体試薬を要する場合に比してより長い貯蔵安定性が得られる。加えて、バイオセンサーは低温条件下で貯蔵する必要がない。
【００１８】
本発明のバイオセンサーにより、殆ど訓練を受けていない患者でも実施できる全血を用いる迅速且つ簡単なＡＬＴアッセイが提供される。血液は、訓練を受けた医療従事者がいない施設でフィンガースティックから集めることができる。
【００１９】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、本発明で使用するのに適したバイオセンサーの分解斜視図である。
図１Ｂは、本発明で使用するのに適したバイオセンサーの分解斜視図である。
図２は、実施例２、４、５及び６のデータを作成するために使用したタイプのバイオセンサーの平面図である。
図３は、グルコースの酵素反応から生成したペルオキシドの量及びＡＬＴの酵素反応から生成したペルオキシドの量を比較したグラフである。
図４は、ペルオキシド濃度に対する信号が直線であることを示すグラフである。
図５は、各種濃度のＡＬＴについて時間に対する信号を示すグラフである。
図６は、ＡＬＴ濃度に対する信号を示すグラフである。
図７は、血清中のＡＬＴ濃度に対する信号を示すグラフである。
図８は、作用電極の表面の粗度に対するバックグラウンド信号を示すグラフである。
【００２０】
（詳細説明）
本明細書中、用語「導電性部分」は電子が流れ得る電極の部分を意味する。この部分は、電子が流れない電極部分、例えばレドックスポリマーコーティングと対比される。「レドックスポリマー」は酸化・還元され得るポリマーを意味する。レドックスポリマーは、還元及び酸化され得る１つ以上の機能を有し得る。また、用語「レドックスポリマー」は１つ以上のレドックス中心を含むポリマーを意味し、「レドックス中心」は電子を受容したり電子を移動する化学機能を意味する。
【００２１】
本発明は、全血試料中のＡＬＴを測定するためのバイオセンサーを提供する。前記バイオセンサーは、
（ａ）ベース層、
（ｂ）参照電極及び作用電極からなり、前記作用電極の導電性部分の表面が低濃度（例えば、１ｍＭ未満）で存在するアナライトの濃度を測定し得るように十分に平滑である検出層、
（ｃ）前記電極の上にある乾燥試薬を含む層、及び
（ｄ）測定中試料の凝固を防止する位置に設けられている抗凝固剤
を含む。
【００２２】
図１Ａ及び１Ｂは本発明で使用するのに適したバイオセンサーの分解図である。ここで図１Ａを参照すると、バイオセンサーは多層素子１００の形態であり、作用電極１０４及び参照電極１０６からなる検出層１０２を有する。作用電極１０４の導電性部分の表面は十分平滑であり、低濃度（例えば、１ｍＭ未満）で存在するアナライトの濃度を測定できる。本発明において、作用電極の表面は算術平均粗度（Ｒａ）が５０，０００Åを越えない、好ましくは３０，０００Åを越えない、より好ましくは１０，０００Åを越えないときに十分平滑である。電極は非導電性ベース層１０８の上に配置されている。ベース層１０８は検出層１０２及びバイオセンサー１００の他のすべての層を支持する。多層素子１００の非導電性ベース層の電極１０４，１０６から端部１１２までの導電性トラック１１０ａ，１１０ｂにより、メーター（図示せず）に電気的に接続している。ベース層１０８はメーター接触可能層ともしはしば称される。ベース層及びメーター接触可能層の名称は互換可能に使用される。
【００２３】
検出層１０２は、メーター接触可能層１０８の大表面上に配置され得る。検出層１０２はメーター接触可能層１０８に沿って延びている第１導電性トラック１１０ａ及び第２導電性トラック１１０ｂを含み、更に測定ディスプレーを有する回路への接続手段をも含む。接続手段は電気接点１１３ａ，１１３ｂである。検出層１０２の電気接点１１３ａ，１１３ｂは、発生した電流を目視表示し得るメーターに挿入され得る。作用電極１０４は液体血液試料及び第１導電性トラック１１０ａと接触するように配置されており、ＡＬＴと試薬層１１４中の試薬との反応の結果電流が生じ得る純粋な金属または炭素からなる。参照電極１０６は液体血液試料及び第２導電性トラック１１０ｂと接触するように配置されている。
【００２４】
本発明の多層素子は、複数のアナライトの濃度を測定するために使用され得る。しかしながら、前記素子は全血中のＡＬＴ濃度を測定するために特に有用である。従って、試薬の説明は主に全血中のＡＬＴ濃度を測定するために有用な試薬に向けられている。
【００２５】
試薬層１１４は検出層１０２の上にあり、生物学的流体中のアナライトと反応して、作用電極１０４で検出される反応生成物を生成するのに必要な試薬を含む。ＡＬＴの場合、反応生成物は通常過酸化水素であるが、グルタメートであってもよい。試薬層１１４は生物学的流体と接触すると溶解し得る。試薬層１１４は、（１）ＡＬＴと反応する少なくとも１つの基質、及び任意に（２）ＡＬＴと基質の反応生成物と反応する少なくとも１つの酵素からなる試薬混合物を含む。ＡＬＴと反応する基質にはＬ−アラニン及びα−ケトグルタレートが含まれるが、これらに限定されない。ＡＬＴと基質の反応生成物と反応する酵素にはグルタメートオキシダーゼ及びピルベートオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。ＡＬＴ酵素を活性化するのを助ける補助因子には５’−リン酸ピリドキサルが含まれるが、これに限定されない。試薬層１１４はまた抗凝固剤をも含み得る。抗凝固剤にはヘパリン、オキサレート、サイトレート及びＥＤＴＡが含まれるが、これらに限定されない。抗凝固剤は測定中血液試料が凝固するのを防止するのに十分な量存在しなければならない。試薬層１１４を作成するための典型的な組成物は、血液中に溶解したときの最終濃度に基づいて、０．５Ｍ／ＬのＬ−アラニン、１０ｍＭ／Ｌのα−ケトグルタレート、１３μＭ／Ｌの５’−リン酸ピリドキサル、２Ｕ／ｍｌのグルタメートオキシダーゼ及び１０ｍＭ／Ｌのトレハロースを含む。
【００２６】
好ましい実施態様では、通常界面活性剤をコートしたメッシュ層からなる流体輸送層１１６を検出層１０２の上に配置し得る。流体輸送層１１６により、試料の電極への化学的吸上作用が助けられる。流体輸送層１１６は被覆層１２０の試料適用ゾーン１１８までの延びている。試料適用ゾーン１１８の特徴は、試料を下の流体輸送層１１６に接近させる開口部にある。被覆層１２０は液体不透過性である。流体輸送層１１６は、生物学的流体（例えば、血液）に曝される電極区域を規定し且つ電気絶縁層として機能するオーバーコート層１２２により定位置に維持される。被覆層１２０は、数分を要する測定中の試料蒸発を防止するために電極を包囲するようにも機能する。
【００２７】
流体輸送層１１６は、好ましくはポリマー材料、セルロース材料、天然繊維材料または均等材料から作成される。本発明の流体輸送層に適したポリマー材料の代表例にはアミドモノマー単位を含むポリマー（例えば、ナイロン）、エステルモノマー単位を含むポリマー、アルキレンモノマー単位を含むポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン）、セルロースモノマー単位を含むポリマー及びその組合せが含まれるが、これらに限定されない。流体輸送層はメッシュであってもよい。メッシュは、好ましくはポリマー材料の細目ストランドから構成される。しかしながら、血液が蒸発または凝固する前に流体輸送層が血液を検出層１０２に輸送するならば、任意の織材料または不織材料を使用し得る。本発明の多層素子に適した細メッシュは約４０〜約４５％の孔面積率、約９５〜約１１５繊維／ｃｍのメッシュ数、約２０〜約４０μｍの繊維直径及び約４０〜約６０μｍの厚さを有する。特に好ましいメッシュは、スイス国Ｒｕｓｃｈｉｌｋｏｎ，ＣＨ−８８０３に所在のＳｅｆｅｒ（旧ＺＢＦ）から入手可能なＮＹ６４  ＨＣメッシュである。本発明の多層素子に適した粗メッシュは約５０〜約５５％の孔面積率、約４５〜約５５繊維／ｃｍのメッシュ数、約５５〜約６５μｍの繊維直径及び約１００〜約１０００μｍの厚さを有する。好ましいメッシュは、スイス国Ｒｕｓｃｈｉｌｋｏｎ，ＣＨ−８８０３に所在のＳｅｆｅｒ（旧ＺＢＦ）から入手可能なＮＹ１５１  ＨＣメッシュである。メッシュの特性は、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，６２８，８９０号明細書に更に記載されている。
【００２８】
流体輸送層１１６は化学的吸上作用により血液を輸送する。本明細書中、「化学的吸上作用(chemically aided wicking action)」は、
（ａ）それ自体親水性である材料（例えば、セルロース）に沿った流体の流れ、
（ｂ）その表面に少なくとも１つの化学物質が適用されている材料（例えば、界面活性剤をコートしたナイロン）に沿った流体の流れ、または
（ｃ）化学的または物理的方法（例えば、コロナ放電処理、プラズマ処理、火炎処理等によるポリエステル処理）により親水性とされた材料に沿った流体の流れのいずれかを指す。
【００２９】
流体輸送層１１６の材料の表面に適用される少なくとも１つの化学物質の目的は、材料の表面に沿った流体の流れを促進させることにある。前記目的に適した化学物質は、通常界面活性剤と称される化合物類に属する。界面活性剤は、該界面活性剤がコートされている表面の表面張力を低下させ、コートした表面により流体は撥水されるよりもむしろ引きつけられる。本発明で使用するのに適した市販されている界面活性剤は、ミネソタ州セントポールに所在のＭｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｒｎｙから入手可能な商品名「ＦＣ  １７０Ｃ  ＦＬＵＯＲＡＤ」のフルオロケミカル界面活性剤である。この界面活性剤はフルオロ脂肪族オキシエチレン付加物、低級ポリエチレングリコール、１，４−ジオキサン及び水を含む溶液である。流体輸送層１ｍｇあたり約１〜１０μｇの界面活性剤が好ましいことが判明した。好ましい界面活性剤添加量は使用する流体輸送層の材料及び界面活性剤の種類に応じて異なり得る。好ましい量は、異なる量の界面活性剤を添加した流体輸送層に沿った試料の流れを観察することにより実験的に決定され得る。界面活性剤は、メッシュが親水性材料からなる場合には必要でないことがある。流体輸送層１１６の材料の厚さ及び性質によりその強度が決まる。
【００３０】
流体輸送層１１６により、蒸発または凝固により試料の大きさが妥当な時間（例えば、最高５分）内にアナライトレベルを測定するのに不十分になる前に十分量（例えば、０．１〜１０μｌ、好ましくは５μｌまで、より好ましくは３．５μｌまで）の流体（例えば、血液）が検出層１０２に達するのに十分な速度で十分量の流体を該層に均一に流すことができる。流体輸送層１１６は、メーター接触可能層１０８に面する被覆層１２０の大表面上にホットメルト接着剤により被覆層１２０に接着され得る。
【００３１】
被覆層１２０は、好ましくは疎水性材料から形成される。被覆層１２０が多層素子１００の残りの層に適合するように十分可撓性であることが好ましい。被覆層１２０を作成するのに適した材料の代表例にはポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアクリル及びその組合せ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
被覆層１２０の厚さは臨界的でないが、好ましくは約０．００５〜約２．０ｍｍの範囲である。この層の表面寸法は臨界的でないが、大表面寸法は好ましくは約５〜約６０ｍｍ、小表面寸法は好ましくは約２〜約３０ｍｍの範囲である。層を細長い長方形に図示しているが、他の形状、例えば円形、楕円形、三角形、四角形及び他の形も好適である。図１Ａの具体例は被覆層を有しているが、好ましくはないが被覆層を完全になくしてもよい。
【００３３】
好ましくは、被覆層１２０及び流体輸送層１１６は、血液が流体輸送層に到達するのを被覆層により妨げられないように配置されている。流体輸送層１１６は、被覆層１２０とメーター接触可能層１０８の間に配置されている。
【００３４】
検出層１２０により、ＡＬＴと試薬層中の成分の反応により生ずるＨ２Ｏ２またはグルタメートが検出される。作用電極は、好ましくは炭素、白金、金、パラジウム、塩基銀及び銀からなる群から選択される部材からなる。作用電極が酵素（例えば、ペルオキシダーゼまたはグルタメートオキシダーゼ）をその表面層上に固定化したり堆積させて有していてもよい。上記したように、典型的な検出層は支持体に沿って延びる第１導電体及び第２導電体を含み、更に測定値を表示するための回路に接続するための手段を含む。作用電極は液体血液試料及び第１導電体と接触するように配置されている。血液試料中のＡＬＴが試薬層１１４中の試薬と反応すると、作用電極１０４で検出される生成物が生ずる。電子は酵素触媒反応と第１導電体の間を移動して、電流が発生する。参照電極１０６は液体血液試料と第２導電体と接触するように配置されている。参照電極１０６は電気回路を完成する。
【００３５】
本発明の多層素子のための検出層１０２の１つの好ましい具体例では、レドックスポリマーを作用電極１０４上に被覆する。別の好ましい具体例では、作用電極１０４は、血液により溶解し得ないぺルオキシダーゼ酵素／炭素混合物からなる。検出層の別の好ましい具体例では、電子メディエーター（例えば、フェロセン）を電子を移動させるために作用電極堆積物中に含める。作用電極１０４及び参照電極１０６はメーター接触可能層１０８に対してコートされている。例えば、作用電極１０４は導電性化合物を含むインキで印刷（例えば、スクリーン印刷）して形成される。ＡＬＴ反応生成物と反応させなければならない酵素（例えば、グルタメートオキシダーゼ）は作用電極１０４に適用されるか、または作用電極１０４上に堆積される試薬層の一部であってもよい。この試薬層はアラニン、α−ケトグルタレート、５’−リン酸ピリドキサル及び抗凝固剤を含み得る。参照電極１０６も印刷（例えば、スクリーン印刷）して形成される。表示回路に接続させるための手段はメーター接触可能層１０８の１端に対して配置され、電極はその端部から離れて配置されている。上記具体例の別の変更は上掲した米国特許第５，６８２，８８４号明細書に記載されている。
【００３６】
メーター接触可能層１０８は、好ましくはポリマー材料から作成される。メーター接触可能層を作成するのに適したポリマー材料の代表例にはアクリル酸モノマー単位、メタクリル酸モノマー単位、アクリレートモノマー単位、メタクリレートモノマー単位、塩化ビニルモノマー単位及びその組合せからなるポリマーが含まれるが、これらに限定されない。メーター接触可能層を作成するのに適した他のポリマーにはポリエステルが含まれる。メーター接触可能層の機能は、（１）検出層１０２を印刷するための表面を与えること、（２）多層素子１００の検出層１０２からの信号を読む目的で多層素子１００とメーターとの接触を与えること、及び（３）多層素子１００が容易に持ち上げられ得、メーターと接触して配置され得るように硬質層を与えることである。
【００３７】
本発明の多層素子の各層の寸法に関する好適範囲を下表に示す。本発明の多層素子の各層の寸法を下表に示す範囲に限定するつもりはない。
【００３８】
【表１】
0004836328.tif 000002
【００３９】
流体輸送層１１６の表面寸法、例えば長さは、メーターに容易に挿入されるべく検出層１０２上の電気接点１１３ａ，１１３ｂが露出されているように検出層１０２が印刷される層の表面寸法よりも短いことが好ましい。
【００４０】
メーター接触可能層１０８の表面寸法、例えば長さは、メーターに容易に挿入されるべく電気接点が露出されているように被覆層１２０の表面寸法よりも長いことが好ましい。
【００４１】
多層素子１００は、好ましくは使用者が容易に取り扱い得るように十分に剛性である。好ましい具体例では、メーター接触可能層１０８は、流体輸送層１１６及び被覆層１２０を支持するのに十分に剛性である材料から作成される。後記した２つの層は高度の可撓性及び最小の剛性を有し得る。
【００４２】
多層素子１００の層の多孔度は層の位置及び機能に依存する。被覆層１２０及びメーター接触可能層１０８は、血液に対する壁またはチャンバを形成するために十分に非多孔質であることが好ましい。流体輸送層１１６は、血液を孔を介して検出層１０２に均一且つ迅速に流すことができるように十分に多孔質であることが好ましい。
【００４３】
上記したように、任意のオーバーコート層１２２（図１Ａ参照）を、流体輸送層中の血液の流れを制限するために被覆層１２０とメーター接触可能層１０８の間に介在させることができる。オーバーコート層１２２は、当初は液体形態であるかまたはメッシュの間隙を貫通することができる形態の材料で作成され得る。この材料は、好ましくは疎水性の電気絶縁性インキである。前記材料は、好ましくは流体輸送層１１６（好ましくは、メッシュの形態である）の周辺部分にスクリーン印刷され、こうして血液試料が流体輸送層１１６と接する点から検出層１０２に移動するための適当な路が包囲され、規定される。オーバーコート層がメッシュ層を圧迫し、適所に固定する方法に関する追加情報は米国特許第５，６２８，８９０号明細書を参照されたい。オーバーコート層１２２及び流体輸送層１１６は実質的に共平面にある。本明細書中、用語「共平面」は２つの材料の各々の少なくとも１表面が同一平面にあることを意味する。これらの層が共平面に配置されていることが好ましい。なぜならば、流体輸送層１１６により液体があらゆる方向に拡散するからである。多層素子の望ましくない区域における血液の拡散を制限するために、オーバーコート層１２２は流れる血液に対するバリヤとして働く。流体輸送層１１８は、流体輸送層１１６の端部をオーバーコート層１２２で埋没させることによりメーター接触可能層１０８に結合させる。本明細書中、用語「実質的に共平面」はオーバーコート層１２２の少なくとも１つの大表面及び流体輸送層１１６の少なくとも１つの大表面が同一平面上にある状況及びオーバーコート層１２２の少なくとも１つの大表面が流体輸送層１１６の少なくとも１つの大表面を越えて僅かに延びている状況の両方を含む。真の共平面性、すなわち前者の状況は、主に製造条件のために達成不可能である。実質的共平面性、すなわち後者の状況については、実際の製造条件下で達成される可能性がより高い。しかしながら、抜き取る血液の容量ができるだけ少なくて済むようにオーバーコート層１２２及び流体輸送層１１６ができるだけ真の共平面性に近づくことが好ましい。援用により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第９８／２４３６６号パンフレット参照。
【００４４】
図１Ｂは、本発明のバイオセンサーの別の具体例を図示する。図１Ｂは、試料適用ゾーン１１８を有するメーター接触可能層１０８、被覆層１２０、試薬層１１４、流体輸送層１１６及びオーバーコート層１２２を含むバインセンサーを示す。図１Ｂには検出層が示されていない。図１Ｂには存在するが隠れている検出層は、オーバーコート層１２２と面するメーター接触可能層１０８の大表面上に配置されている。図１Ａに示すバイオセンサーと同様に、図１Ｂのバイオセンサー１００の検出層は作用電極、参照電極、導電性トラック及び電気接点を含む。図１Ｂでは、試薬層１１４が流体輸送層１１６とメーター接触可能層１０８の大表面の間に配置され、メーター接触可能層１０８はオーバーコート層と面している。図１Ｂのバイオセンサー１００の各構成部品、すなわち図示されている構成部品及び隠れている構成部品は図１Ａの対応構成部品と同一の機能及び同一材料を有する。このために、図１Ｂにおける構成部品の参照番号は図１Ａにおける対応構成部品の参照番号と同一である。
【００４５】
本発明のＡＬＴセンサーは複数のタイプの化学反応を利用し得る。ＡＬＴバイオセンサーのための化学反応の５つの代表例を以下に示す。
【００４６】
反応例１：電極表面でのＨ２Ｏ２の酸化
作用電極は金属からなる。作用電極の上にある試薬層は試薬Ｌ−アラニン、α−ケトグルタレート及びグルタメートオキシダーゼを含む。
【００４７】
【化１】
0004836328.tif 000003
反応（１）において、血液中のＡＬＴは、基質Ｌ−アラニンからのアミノ基がα−ケトグルタレートに移動して生成物ピルベート及びＬ−グルタメートを生成する反応を触媒する。反応（１）は可逆的である。反応（２）において、グルタメートオキシダーゼは反応（１）で生成したＬ−グルタメートを酸化して、α−ケトグルタレート、ＮＨ３及びＨ２Ｏ２（過酸化水素）を形成する。反応（３）において、反応（２）で生成したＨ２Ｏ２が電極表面でＯ２及び２Ｈ＋に酸化される。Ｈ２Ｏ２の酸化は、酸化電位で釣り合っている電極の金属表面により触媒される。２つの電子がこの反応により遊離して、電流が発生する。電極で発生した電流の量は反応（２）で生成したＨ２Ｏ２の量に比例し、Ｈ２Ｏ２の量は反応（１）で生成したグルタメートの量に比例し、またグルタメートの量は血液試料中のＡＬＴの量に比例する。
【００４８】
反応例２：ペルオキシダーゼレドックスポリマーを含む電極
作用電極は金属または炭素電極及びレドックスポリマーコーティングからなる。レドックスポリマーコーティングは、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を該ポリマー中に固定して有する架橋構造である。レドックスポリマーは、電子を受容し、電子をポリマーコーティングに供与し得る金属中心、例えばオスミウム（Ｏｓ）をも含む。電子はＯｓ金属中心とペルオキシダーゼ酵素間のレドックスポリマーコーティング内を効率的に移動し得る。レドックスポリマーコーティングは電気的にペルオキシダーゼを金属または炭素電極表面に結合する。即ち、電子はペルオキシダーゼと電極表面の間を効率的に移動し得る。作用電極の上にある試薬層は試薬Ｌ−アラニン、α−ケトグルタレート及びグルタメートオキシダーゼを含む。
【００４９】
【化２】
0004836328.tif 000004
反応（１）において、血液中のＡＬＴは、基質のＬ−アラニンからのアミノ基がα−ケトグルタレートに移動して生成物ピルベート及びＬ−グルタメートが生ずる反応を触媒する。反応（１）は可逆的である。反応（２）において、グルタメートオキシダーゼは反応（１）で生成したＬ−グルタメートを酸化して、α−ケトグルタレート、ＮＨ３及びＨ２Ｏ２（過酸化水素）を形成する。反応（３）において、Ｈ２Ｏ２はレドックスポリマー中のペルオキシダーゼを酸化する。次いで、ペルオキシダーゼはＯｓ中心から供与された電子により還元される。この反応により、ポリマー中のＯｓ中心はＯｓＩＩからＯｓＩＩＩに酸化される。次いで、酸化されたＯｓ中心は適正な電圧（０〜２００ｍＶ）で電極で生ずる電子により再還元される。Ｏｓ中心、その結果ペルオキシダーゼが再還元されると、電流が発生する。電極で発生した電流の量は反応（２）で生成したＨ２Ｏ２の量に比例し、Ｈ２Ｏ２の量は反応（１）で生成したグルタメートの量に比例し、またグルタメートの量は血液試料中のＡＬＴの量に比例する。
【００５０】
反応例３：グルタメートオキシダーゼレドックスポリマーを含む電極
作用電極は金属または炭素及びレドックスポリマーコーティングからなる。レドックスポリマーコーティングは、グルタメートオキシダーゼ（ＧＬＯＸ）を該ポリマー中に固定して有する架橋構造である。レドックスポリマーは、電子を受容し、電子をポリマーコーティングに供与し得る金属中心、例えばオスミウム（Ｏｓ）をも含む。電子はＯｓ金属中心とＧＬＯＸ間のレドックスポリマーコーティング内を効率的に移動し得る。レドックスポリマーコーティングはＧＬＯＸを電極表面の金属または炭素に電気的に結合させる。すなわち、電子はＧＬＯＸと電極表面間を効率的に移動し得る。作用電極の上にある試薬層は試薬Ｌ−アラニン及びα−ケトグルタレートを含む。
【００５１】
【化３】
0004836328.tif 000005
反応（１）において、血液中のＡＬＴは、基質のＬ−アラニンからのアミノ基がα−ケトグルタレートに移動して生成物ピルベート及びＬ−グルタメートが生ずる反応を触媒する。反応（１）は可逆的である。反応（２）において、グルタメートはレドックスポリマー中のＧＬＯＸを還元する。次いで、ＧＬＯＸはＯｓ金属中心により酸化される。この反応により、ポリマー中のＯｓ中心はＯｓＩＩＩからＯｓＩＩに還元される。次いで、還元したＯｓ中心は適正な電圧（１００〜３００ｍＶ）で電極表面で電子を遊離すると再還元される。Ｏｓ中心、その結果ＧＬＯＸ酵素が再酸化されると、電流が発生する。電極で発生した電流の量は反応（１）で生成したグルタメートの量に比例し、グルタメートの量は血液試料中のＡＬＴの量に比例する。
【００５２】
反応例４：メディエータを含む電極
作用電極は金属または炭素からなる。作用電極の上にある試薬層は試薬Ｌ−アラニン、α−ケトグルタレート、ＤＬＯＸ及びメディエータを含む。メディエータは電子を非電気化学活性種（ＧＬＯＸ）から電気化学的活性成分（電極）に移動させることができる。
【００５３】
【化４】
0004836328.tif 000006
反応（１）において、血液中のＡＬＴは、基質のＬ−アラニンからのアミノ基がα−ケトグルタレートに移動して生成物ピルベート及びＬ−グルタメートが生ずる反応を触媒する。反応（１）は可逆的である。反応（２）において、グルタメートはＧＬＯＸを還元する。次いで、ＧＬＯＸはメディエータのフェリシアニドと反応することにより酸化される。この反応により、フェリシアニドはフェロシアニドに還元する。次いで、フェロシアニドは適正な電圧（３００〜５００ｍＶ）で作用電極と反応するとフェリシアニドに再酸化される。この反応で電子が遊離し、電流が発生する。電極で発生した電流の量は反応（１）で生成したグルタメートの量に比例し、グルタメートの量は血液試料中のＡＬＴの量に比例する。メディエータはフェリシアニドに限定されないと留意すべきである。
【００５４】
反応例５：平滑面電極におけるペルオキシダーゼ
作用電極は、ペルオキシダーゼ酵素を含有する炭素電極からなる。電子は、電極を構成する炭素粒子と電極内に含有されているペルオキシダーゼの間を効率的に移動し得る。作用電極の上にある試薬層は試薬Ｌ−アラニン、α−ケトグルタレート及びＤＬＯＸを含む。
【００５５】
【化５】
0004836328.tif 000007
反応（１）において、血液中のＡＬＴは、基質のＬ−アラニンからのアミノ基がα−ケトグルタレートに移動して生成物ピルベート及びＬ−グルタメートが生ずる反応を触媒する。反応（１）は可逆的である。反応（２）において、グルタメートオキシダーゼは反応（１）で生じたＬ−グルタメートを酸化して、α−ケトグルタレート、ＮＨ３及びＨ２Ｏ２（過酸化水素）を形成する。反応（３）において、Ｈ２Ｏ２は作用電極内に含まれているペルオキシダーゼ（Ｐｅｒ）を酸化する。次いで、ペルオキシダーゼは適正な電圧（０〜１００ｍＶ）で電極で生ずる電子により再還元される。この結果、電流が発生し、電流の量は反応（２）で生成したＨ２Ｏ２の量に比例し、Ｈ２Ｏ２の量は反応（１）で生成したグルタメートの量に比例し、またグルタメートの量は血液試料中のＡＬＴの量に比例する。
【００５６】
多層素子の作成方法
多層素子は好ましくは大量生産される。しかしながら、多層素子１つを作成するために以下の方法を使用することができる。
【００５７】
メーター接触可能層１８０をシート状で用意し得る。典型的な構成では、メーター接触可能層１０８はポリ塩化ビニルシートであり得る。導電性トラック１１０ａ，１１０ｂはメーター接触可能層上にスパッタリングされ得るか、または別の方法（例えば、スクリーン印刷）で適用され得る。電極１０４，１０６はメーター接触可能層１０８上にスクリーン印刷され得る。レドックスポリマーを含む電極は次のようにして作成し得る。まず、界面活性剤含有溶液を作用電極上に分配し、乾燥させる。液体形態で用意したレドックスポリマーを作用電極上の乾燥界面活性剤層の上に０．０７μｌ／ｍｍ２の容量で分配し、周囲条件下で一晩硬化させる。次いで、試薬層１１４を適当なコーティング法（例えば、ドロップコーティング）を用いて検出層１０２上に堆積させ得る。
【００５８】
次に、流体輸送層１１６を、該層が検出層１０２と流体連通するような位置に配置する。その後、被覆層１２０をホットメルト接着剤を用いて流体輸送層１１６及びメーター接触可能層１０８に接着させ得る。
【００５９】
抗凝固剤は、電極上に広がっている流体輸送層１１６にコートしても、電極上に分配しても、血液適用域に配合してもよく、または前記を組み合わせてもよい。
【００６０】
操作
図１Ａ及び１Ｂは、多層素子の各構成部品を詳細に示す。血液をバイオセンサーの試料適用ゾーン１１８に集め、化学的吸上作用により流体輸送層を介して電極１０４，１０６に輸送し得る。
【００６１】
試料（例えば、血液）は流体接触層１１６と接触し、流体輸送層１１６に沿って流れ、試薬層１１４に達する。試薬層１１４は血液試料と接触すると溶解し、その結果検出層１２０が試料に曝される。検出層１２０で化学反応が起こる。化学反応の出力は検出層１０２の電気接点１１３ａ，１１３ｂで読み取ることができる。
【００６２】
メーター接触可能層１０８は、センサー、すなわち検出層１０２を有し、例えば電気コネクタに挿入することによりメーターと電気的に接触させるためにメーター（図示せず）と物理的に接触しなければならない。
【００６３】
好ましくはないが、流体輸送層１１６を省いた作動可能な多層素子を用意することも可能である。流体輸送層１１６を省くためには、メーター接触可能層１０８及び被覆層１２０は、血液が毛管作用によりその間を通り検出層１０２に流れ得るように配置され得る。毛管作用による流れを含む１つの具体例では、被覆層１２０の大表面と面するメーター接触可能層１０８の大表面及びメーター接触可能層の大表面と面する被覆層１２０の大表面は親水性でなければならない。前記した大表面の少なくとも１方、好ましくは前記大表面の両方を親水性材料から作成するかまたは親水性材料（例えば、界面活性剤）でコートし得る。前記層の親水性により、試料適用ゾーン１１８に適用した流体はメーター接触可能層１０８と被覆層１２０の間の空間を通り検出層１２０に流れる。こうして、流体輸送層１１６を省くことができることは明白である。この具体例では、メーター接触可能層１０８は、メーター接触可能層１０８と被覆層１２０の間に毛管チャネルが形成され得るように十分な長さを有していなければならない。毛管チャネルは、実際にはオーバーコート層１２２により形成され得、こうして毛管幅の空間がメーター接触可能層１０８と被覆層１２０の間に形成される。
【００６４】
本発明の多層素子１００を使用することにより、患者の肝機能を検査するためにＡＬＴアッセイを非常に効率的に実施することができる。この迅速且つ簡単なアッセイを使用し得る用途には以下のものが含まれる：
（１）肝機能の定期的検査が必要な薬物療法を受けている患者をモニターする、（２）新規薬物の臨床トライアル中に肝機能をモニターする、
（３）肝炎感染の兆しであり得る高い肝酵素について潜在的血液ドナーをスクリーニングする、
（４）肝炎、他の肝疾患及び心疾患を患っている患者を診断及び治療する、及び（５）肝を損傷する物質に曝される恐れのある作業者を調べたりモニターする。
【００６５】
本発明のバイオセンサーは、化学反応中に血液が凝固するのを防止するために抗凝固剤を含む。血液中のＡＬＴ濃度は非常に低いので、測定可能な信号を発生させるためには数分の反応時間が必要である。しかしながら、血液は約１分で凝固し始める。米国特許第５，７０５，０４５号明細書（Ｐａｒｋ）で使用されている試薬はセンサー上にスクリーン印刷した層に限定されており、その結果試薬は血液試料の凝固を防止するために使用できない。本発明のバイオセンサーは、フィンガースティックからの全血を直接バイオセンサーに適用し得るように特別に設計されており、これにより採血の専門家が必要でなくなり、アッセイが非常に簡単になり、患者が自分自身で実施できるようになる。
【００６６】
米国特許第５，７０５，０４５号明細書（Ｐａｒｋ）のバイオセンサーのペルオキシド信号を改善するために、炭素の平滑層よりも大きな表面積を有するスクリーン印刷した多孔質炭素層を使用した。多孔質表面により、ペルオキシドが接触する表面積は平滑表面よりも大きくすることができ、その結果より大きなマグニチュードを有する信号が発生する。残念ながら、表面積が大きいとバックグラウンド信号も大きくなる。多孔質炭素層は信号を１００倍増加させ得るが、電極のバックグラウンド信号を安定化させるために必要な時間が数秒から数分に延長する。純粋な金属から作成した平滑な導電性電極は非常に迅速に安定化させ、よってアッセイ時間が短縮する。
【００６７】
低濃度で存在するアナライト（例えば、ＡＬＴ）の測定誤差の主原因の１つは、検出層の全部または一部を形成する導電性表面の表面粗度が変化することにある。流体と接触している導電性表面に電圧を印加すると、電流が発生する。この電流は二重層充電電流と称される。接触している金属表面と溶液により、印加電圧に応じて反対の極性が生ずる。金属上の過剰の電荷がその表面上に残る。溶液は、その電荷を金属上の電荷と反対に配向するイオンの多くの秩序層上に散逸させた。金属は金属の伝導バンドに大量の移動可能な電子を供給するので、金属は殆ど直ぐにその電圧に達する。溶液キャパシタンスは、溶液中のイオンの拡散に頼っているのでよりゆっくり形成される。電極の表面は電解コンデンサーと同様に働く。このコンデンサーを充電するのに必要な電流は下記式により表される：
【００６８】
【数１】
0004836328.tif 000008
式中、ｉ＝二重層充電電流、Ｅ＝印加電圧、Ｒ＝バイオセンサー及び溶液の抵抗、ｔ＝時間、及びＣｄ＝二重層キャパシタンスである。
【００６９】
印加電圧Ｅは各測定毎に固定されており、通常測定の間一定に保たれる。抵抗も通常測定の間一定である。しかしながら、二重層キャパシタンスは電極表面の粗度に直接比例する。溶液と接触する金属の全表面は同一電圧下にある。表面がより粗度になると、より多くの溶液が表面と直接接触し、充電されるようになるはずである。その場合、充電電流は電極の粗度に直接影響される。
【００７０】
血液中に低濃度で存在するアナライト（例えば、ＡＬＴ）の濃度の測定は、再現性があり、バックグラウンド信号が低くなければならない。電極粗度が高くなると、二重層充電電流が上昇する。電極表面がかなり粗い場合には、ＡＬＴ電流の測定が以下の理由で困難になる：
（１）大きな二重層充電電流と組合されている小さなＡＬＴ電流を正確に測定することは困難であろう、
（２）ＡＬＴ電流の小さな変化が非常に大きな充電電流に重なっている場合にはＡＬＴ電流の小さな変化を検出することは困難であろう、
（３）大きな電流を検出するためには低感度の電子機器を使用しなければならないので大きな信号の小さな変化を検出することはしばしば困難である、
（４）低感度の電子機器は、二重層充電電流がＡＬＴ電流に比して小さい場合に使用され得る感度のより高い電子機器ほど正確には、小さな電流変化を検出できない。
【００７１】
電極の表面平滑度が非再現性であると、ＡＬＴ信号も非再現性となる。測定信号はＡＬＴ電流と二重層充電電流の組合せであるので、二重層充電電流が非再現性であると測定電流も非再現性となる。二重層充電電流がＡＬＴ電流に対して大きいと、問題はより深刻になる。従って、二重層充電のＡＬＴ信号に対する影響を少なくし、信頼性のあるＡＬＴ測定値を得るためには表面は平滑でなければならない。
【００７２】
低濃度で存在するアナライトから生ずる小さな電流を正確に検出するために必要な金属表面の平滑度は、幾つかの因子により決定される。
【００７３】
式１を精査することにより容易にわかるように、二重層充電電流は時間と共に指数的に減衰する。アナライトに起因する電流は通常非常にゆっくりと経時的に減衰したり、または実際経時的に上昇し得る。電流を印加し、比較的長時間待機すると、二重層充電電流は減衰する。従って、アナライト測定を実施しなければならない時間がどの程度電極を平滑にしなければならないかを決定する際の重要な因子である。粗度及び二重層充電の問題は長い待機時間により解消され得るが、この解決法は全血測定に対しては実際的でない。十分に長い時間を与えると、全血は血漿と赤血球に分離する。細胞膜が漏れ始めてアナライト濃度が変化する。細胞代謝はアナライト濃度を変化させ得る。全血試料の分析の場合、分析に利用可能な時間は必ず短い時間である。
【００７４】
アナライトの濃度は、正確な測定に必要な平滑度を決定する別の因子である。アナライト濃度が低く、その結果アナライトにより発生する電流が低いと、電極はより平滑でなければならない。
【００７５】
必要な平滑度を決定する別の因子は、アナライト濃度の測定のために要求される精度レベルである。各アナライトについて、測定結果を意味あるものとするためには測定を或る精度レベルで実施する必要がある。これは、医学診断の分野でのアナライトの例によりうまく理解される。アナライトがある医学的に決定される判定ポイントに達すると、医者は患者に対してある治療クールをとる。前記判定ポイント付近のアナライト濃度の測定は、医者が自信を持って治療を決定するために比較的正確でなければならない。前記判定ポイントは各アナライトにより変化するので、精度の要件は各アナライト毎に特定されなければならない。その結果、平滑度レベルも、各判定ポイントについての精度要件を満たすために各アナライト毎に特定しなければならない。二重層充電電流及びアナライトに起因する電流を定量するための最も簡単な因子は１方対他方の大きさである。二重層充電電流の大きさがアナライトに起因する電流の大きさに近づくと、正確な測定が困難となる。電流レベルが等しいと、二重層信号の１０％変化により全電流は５％変化する。信号が５％変化し、その結果アナライト測定誤差は多くの医学的アナライトに関係がある。実施例６はＡＬＴアッセイに対する作用電極の表面平滑度の影響を記載している。
【００７６】
正確な測定を実施する際の二重層充電電流により生ずる問題は、溶解バインダーを使用して作用電極を形成する場合には非常に重大である。作用電極に対する溶解バインダー系は米国特許第５，７０５，０４５号明細書に基づく。溶解バインダーにより、アナライト測定中予め乾燥した金属は溶液に絶えず曝されている。電流は各導電性粒子が溶液に曝されるにつれて該粒子により引き出される。
【００７７】
従って、米国特許第５，７０５，０４５号明細書で提案されている溶解バインダーのスキームはＡＬＴせンサーには好ましくない設計である。本発明の設計は、溶解金属バインダーの必要が排除されているので米国特許第５，７０５，０４５号明細書に記載されているものより明らかに優れている。米国特許第５，７０５，０４５号明細書（Ｐａｒｋ）で提案されている２つの化学反応の１つから、ＡＬＴ反応でＮＡＤを使用することが示唆される。この化学システムは、ＮＡＤが高価で不安定であるのでペルオキシドを生成するものより劣る。ペルオキシドを生成する本発明の化学反応はＮＡＤを必要としないので好ましい。この反応は試料を試料適用ゾーンから電極に輸送するために化学的吸上作用を使用する。米国特許第５，７０５，０４５号明細書（Ｐａｒｋ）では試料を試料適用ゾーンから電極に輸送するために毛管作用を利用している。測定可能な信号を発生させるためには試料を電極で試薬と数分間反応させなければならない。正確な測定値を得るためには試料をこの間蒸発させてはならない。試料の蒸発を防止するように試料を試料適用ゾーンから電極に輸送することが本発明方法において重要なステップである。
【００７８】
本発明では、試薬層のための試薬を電極上にペーストの形態でスクリーン印刷する必要がない。試薬層の試薬は電極上に液体として垂らし、乾燥させればよい。スクリーン印刷は電極上に液体を垂らすよりも複雑である。スクリーン印刷は正確な結果を得るためにしっかりした耐性（tight tolerances）を必要とする。本発明はしっかりした耐性を必要としない標準の液体分配法を使用し、従って簡単な製造方法を提供する。
【００７９】
本発明は、液体試薬の正確な添加を必要とせず、液体試薬の添加エラーに関連する精度の問題を被らない。本発明は全血試料でうまく機能する。
【００８０】
本発明は、試薬層中の試薬と肝酵素の反応により生ずるペルオキシドを測定するために平滑な、好ましくは純粋金属からなる導電性表面を有する作用電極を必要とする。血液中の肝酵素濃度は非常に低いので、生成されるペルオキシドの量は非常に少ない。低濃度のペルオキシドを検出するために、ペルオキシドの酸化の点で非常に有効な金属表面が必要である。平滑表面を有する純粋な金属、例えば白金またはパラジウムが前記した表面を与える。白金はペルオキシドの酸化に関して炭素よりも１９倍良好である。白金または他の純粋金属から作成した作用電極を有するＡＬＴバイオセンサーは、炭素からなる作用電極を有するＡＬＴバイオセンサーよりもはるかに優れている。平滑な導電性表面を形成するのに適した材料の他の例には金、銀及び塩化銀が含まれる。炭素からなり、平滑表面を有する作用電極は、レドックスポリマーを添加したりまたは電極に酵素を配合することにより使用され得る。レドックスポリマーの添加または酵素の配合により、炭素電極の性能が改善され、その性能は純粋金属からなる電極の性能と同等である。
【００８１】
本発明の特徴を更に説明するために下記非限定的実施例を示す。
【００８２】
（実施例）
実施例１
図３は、以下の反応経路を介するグルコースの酵素反応から生成したペルオキシドの量及びＡＬＴ酵素反応から生成したペルオキシドの量を図示する。
【００８３】
【化６】
0004836328.tif 000009
上に示すグルコース反応経路は典型的には、市販されている電気化学的血液グルコースアッセイで使用されている。５分間進行させたＡＬＴの酵素反応は、３０秒進行させたグルコースの酵素反応から生じたペルオキシド濃度よりも最高ほぼ２桁低いペルオキシドを生成する。前記データは、ＡＬＴが血中にグルコースよりも非常に低い濃度で存在することを立証する。
【００８４】
実施例２
本実施例は、過酸化水素に応答して電極から生じた電流は低い過酸化水素濃度において再現性と直線性があることを立証する。ペルオキシドは、実施例１に示すようにＡＬＴ酵素反応の最終生成物である。炭素電極、補助電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用いるセンサーは（＃７１０１，ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パークに所在の）ＡｎｄＣａｒｅから購入した。図２を参照すると、ＡｎｄＣａｒｅセンサー２００はメーター接触可能層２２０及びオーバーコート層２０４を含む。前記センサー２００は更に作用電極２０６、補助電極２０８及び参照電極２１０をメーター接触可能層２０２上に配置されて含む。電極２０６，２０８，２１０から電気接点２１２，２１４，２１６まで導電性トラック２１８，２２０，２２２が設けられている。オーバーコート層の下に配置されている導電性トラック２１８，２２０，２２２はファントム画法で示している。炭素電極を過酸化水素に対して感受性とすべく改質した。ある容量の界面活性剤溶液（０．９μｌ、＃ＣＦ−１０７５  ＷＥＮＺ，インディアナ州Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅに所在のＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｌシリンジを用いて炭素作用電極（直径４ｍｍ）上に分配しし、界面活性剤を２０分間乾燥させた。次に、ペルオキシダーゼレドックスポリマー（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｒｅｄｏｘ  ｐｏｌｙｍｅｒ，＃８０２１７，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）０．９μｌを界面活性剤層の上に適用し、ポリマーを周囲条件下で一晩乾燥させた。電気化学的測定を当社製ポテンショスタットで実施した。５つのセンサーを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖ  Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（登録商標））中０、５、１０、２０、５０及び１００μＭの過酸化水素濃度で調べた。ペルオキシド試料（５０μｌ）を電極区域上に分配して、作用電極、参照電極及び補助電極を被覆し、１００ｍＶの電圧を６０秒間印加した。作用電極で発生した電流を０．５秒毎に測定した。最後の２．５秒の測定中に得た電流を平均化し、図４に各センサーについてペルオキシド濃度に対してプロットした。本実施例は、低レベルのペルオキシドからの電流はＡｎｄＣａｒｅセンサーで再現性と直線性があることを示す。ＡｎｄＣａｒｅセンサーは平滑表面を有すると判明している。
【００８５】
実施例３
本実施例は、幾つかのＡＬＴ濃度でのＡＬＴ反応の結果として純粋白金電極で発生した電流を示す。直径１．６ｍｍの白金作用電極（＃ＭＦ−２０１３）、白金ワイヤ補助電極（＃ＭＷ−１０３２）及びＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極（＃ＭＦ−２０６３）はＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。実験を始める前に、白金電極をアルミナ（＃ＣＦ−１０５０，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で磨いて新鮮な平滑表面を得た。電気化学測定を当社製ポテンショスタットで実施した。ＡＬＴ試薬を、０．５Ｍ  アラニン、１０ｍＭ  α−ケトグルタレート、１３μＭ  ５’−リン酸ピリドキサル、０．８Ｕ／ｍｌ  グルタメートオキシダーゼ、０．３４ｍＭ  トレハロース、０．０４９％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ  Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（以下“ＨＥＰＥＳ”と略記する）（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム及び０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（登録商標）を混合して調製した。作用電極、補助電極及び参照電極をＡＬＴ試薬１０ｍｌを含むバイアルに導入した。ＡＬＴの濃厚ストック溶液（＃Ｇ８２５５，ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）を、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（登録商標））中２００Ｕ／ｍｌの活性を有するように調製した。異なる容量のＡＬＴストック溶液またはＨＥＰＥＳ緩衝液をバイアルに添加して、以下にリストするＡＬＴ検査溶液を作成した。ＡＬＴストック溶液をＡＬＴ試薬含有バイアルに添加した後、反応混合物を更に混合した、生じた混合物を室温において２．５分間インキュベートした。システムに５００ｍＶの電圧を印加し、電流を２分間２秒毎に測定した。上記手順を０、６９、１３４、２７１、３８７Ｕ／ＬのＡＬＴ濃度で全部で５回実施した。図５は、異なるＡＬＴ濃度について２分間の測定中の白金電極からの電流変化を示す。電流（ｎＡｍｐｓ）は各試験ランについて最後の１０秒間について平均化し、試料中のＡＬＴ濃度（Ｕ／Ｌ）に対してプロットした。図６は、平滑な白金電極のＡＬＴ用量応答曲線を示す。本実施例は、ＡＬＴが平滑な白金電極で検出され得ることを示す。
【００８６】
実施例４
本実施例は、乾燥試薬層及びレドックスポリマーを付着させた平滑面電極を用いたヒト血清におけるＡＬＴ用量応答曲線を示す。電極は実施例２と同様に作成した。
【００８７】
ＡＬＴ試薬の調製
グルタメートオキシダーゼ（＃７８０４，日本国のヤマサ醤油（株））をＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ｗ／ｖ  Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（登録商標））２ｍｌ中に溶解した。酵素をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（商標）（＃６６４２５，イリノイ州ロックフィールドに所在のＰｉｅｒｃｅ）３ｍｌを用いて２回バッファー交換した。グルタメートオキシダーゼ溶液をＨＥＰＥＳ緩衝液中５０Ｕ／ｍｌに希釈し、トレハロースを０．０８５Ｍ濃度で添加した。ＡＬＴ試薬を調製し、溶解するまで十分混合した。ＡＬＴ試薬のアリコート（１２５μｌ）を微量管(microfuge tube)に分配した。管を乾燥した真空チャンバに入れて、試薬を一晩乾燥した。グルタメートオキシダーゼ溶液のアリコート（１０μｌ）を乾燥ＡＬＴ試薬含有微量管に分配した。管を乾燥した真空チャンバに入れて、酵素溶液を乾燥した。試料で再溶解したときのＡＬＴ試薬成分の最終濃度は、０．５Ｍ  アラニン、１０ｍＭ  α−ケトグルタレート、１３μＭ  ５’−リン酸ピリドキサル、２Ｕ／ｍｌ  グルタメートオキシダーゼ、３．４ｍＭ  トレハロース、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０２５％ｗ／ｖ  Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（登録商標）であった。
【００８８】
実験方法
実験を始める前に、すべての試薬及びヒト血清を室温に平衡化した。ＡＬＴストック溶液を、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン含有ＨＥＰＥＳ緩衝液中で１０Ｕ／ｍｌに調製した。ＡＬＴストック溶液をヒト血清アリコート（１ｍｌ）に加えて、９３、１７４、２５９及び４０１Ｕ／Ｌの最終ＡＬＴ濃度とした。内在性血清ＡＬＴは２８Ｕ／Ｌであった。試料のＡＬＴ濃度をＡｂｂｏｔｔ  ＶＩＳＩＯＮ（商標）アナライザーにおいてＳＧＯＴ（ＡＬＴ）テストパック（＃１４２３，イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて複数回測定した。ＡＬＴ血清試料（２５０μｌ）を乾燥ＡＬＴ試薬含有微量管に添加した。管を１分間軽く振盪した。反応を微量管において全部で１４０秒間進行させ、この時点で試料−反応混合物５０μｌを作用電極、参照電極及び補助電極を覆っているレドックスポリマー電極の電極区域に分配した。全部で１５０秒間インキュベート後、電圧１００ｍＶを電極に印加し、電流を２分間２秒毎にモニターした。異なる５つのＡＬＴ濃度の各々について２回実験した。各ランの最後の１０秒間に発生した電流を平均化した。複数回の実験からの電流を平均化した。図７において、各ＡＬＴ濃度で得た平均電流値を平均ＶＩＳＩＯＮ（商標）ＡＬＴ結果に対してプロットした。ＡＬＴ用量曲線は、乾燥試薬及び平滑面電極を用いて実験した範囲（２８〜４０１Ｕ／Ｌ）で直線であったことが分かる。
【００８９】
実施例５
本実施例の目的は、電極の表面粗度がＡＬＴアッセイのバックグラウンド電流に対する影響を示すことである。バックグラウンド電流は、アナライトの非存在下で電極から発生した電流である。バックグラウンド電流の１つのソースは二重層充電電流である。比較的粗い表面を有する電極は、比較的平滑な表面を有する電極に比してより多い二重層充電電流を有する。ＡｎｄＣａｒｅ炭素電極（比較的平滑な表面）及び当社製の印刷した炭素電極（比較的粗い表面）を本実験で使用した。当社製電極は米国特許第５，７５５，９５３号明細書に従って作成した。表面粗度は、Ｄｅｋｔａｋ３表面プロフィール測定システム（カリフォルニア州サンタバーバラに所在のＶｅｅｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて代表的な平滑面電極及び粗面電極で測定した。算術平均粗度Ｒａは、ＡｎｄＣａｒｅ電極で６，７７９Å、当社製電極で５４，７００Åであった。ＡｎｄＣａｒｅ電極及び当社製電極を、実施例２に記載されているように作用電極上に界面活性剤溶液及びペルオキシダーゼレドックスポリマーを分配することにより改質した。分配した容量はＡｎｄＣａｒｅ電極及び当社製電極でそれぞれ０．９μｌ及び２．０μｌであった。電流測定をＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム）中１００ｍＶで実施した。電流を２分間２秒毎にモニターした。平滑面電極及び粗面電極についての電流密度の比較を図８に示す。図８から明らかなように、当社製電極はＡｎｄＣａｒｅ電極に比して有意に高いバックグラウンド電流を有する。更に、当社製電極では電流の変動が大きかった。実施例６から明らかなように、バックグラウンド電流が大きいために当社製電極では小さなＡＬＴ信号の正確な測定がより困難である。
【００９０】
実施例６
本実施例の目的は、小さなＡＬＴ電流を正確に検出するために作用電極が十分に平滑でなければならないことを示すことである。ＡｎｄＣａｒｅ炭素電極（比較的平滑な表面）及び当社製の印刷した炭素電極（比較的粗い表面）には、実施例５に記載されているようにレドックスポリマーがコートされている。ＡｎｄＣａｒｅ炭素電極及び当社製電極の電極面積はそれぞれ０．１２５７ｃｍ２及び０．０４５２ｃｍ２であった。各タイプの電極についてバックグラウンド電流を実施例５に記載のＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で測定した。表Ｉに、各電極の表面粗度及び電流バックグラウンド結果を示す。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
ＡＬＴ試薬は、実施例４に記載のようにＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて調製した。ＡＬＴ試料はウシ血清アルブミン（０．１％ｗ／ｖ）含有ＨＥＰＥＳ緩衝液において調製した。試料中のＡＬＴ濃度は、臨床的に正常なレベルの約２８Ｕ／Ｌである。ＡＬＴ測定を実施例４に記載の電極を用いて実施した。ＡＬＴ試料の電極面積について補正した電流出力を表ＩＩに示す。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
粗面電極の場合、面積について補正したバックグラウンド電流は平滑面電極に比して１６倍以上高かった（表Ｉ）。平滑面電極の場合のバックグラウンド電流レベルはＡＬＴ電流の３％未満であった（表ＩＩ）。粗面電極のバックグラウンド電流レベルはＡＬＴ電流の４５％であった。粗面電極を用いて小さなＡＬＴ電流を正確に測定することは、バックグラウンド電流がＡＬＴ電流に比してかなり高いので難しい。本実施例において粗面電極の場合のバックグラウンド信号の変動はＡＬＴ試料の総電流測定において最高４．２％の変化をもたらし、このためにＡＬＴ測定において実質的な誤差が生ずる。平滑面電極では、バックグラウンド信号の変動はＡＬＴ試料の総電流測定において最高０．４％の変化しかもたらさない。粗面電極についてのＡＬＴ電流の結果の変動係数（１０．３％ＣＶ）は、平滑面電極の場合（５％ＣＶ）に比して１０６％高かった。従って、平滑な作用電極を有する多層素子により、粗な表面を有する作用電極を有する多層素子に比してより正確な結果が得られることが分かる。
【００９５】
本発明の各種変更及び改変は本発明の範囲及び思想を逸脱することなく当業者に自明であり、本発明が本明細書に記載されている特定実施例に不当に限定されないと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  本発明で使用するのに適したバイオセンサーの分解斜視図である。
【図１Ｂ】  本発明で使用するのに適したバイオセンサーの分解斜視図である。
【図２】  実施例２、４、５及び６のデータを作成するために使用したタイプのバイオセンサーの平面図である。
【図３】  グルコースの酵素反応から生成したペルオキシドの量及びＡＬＴの酵素反応から生成したペルオキシドの量を比較したグラフである。
【図４】  ペルオキシド濃度に対する信号が直線であることを示すグラフである。
【図５】  各種濃度のＡＬＴについて時間に対する信号を示すグラフである。
【図６】  ＡＬＴ濃度に対する信号を示すグラフである。
【図７】  血清中のＡＬＴ濃度に対する信号を示すグラフである。
【図８】  作用電極の表面の粗度に対するバックグラウンド信号を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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