(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗PTHrP(1-34)抗体を含む癌細胞増殖抑制剤であって、前記癌細胞がPTHrP(34-53)によって増殖刺激される腎癌又は甲状腺癌細胞であり、前記抗PTHrP(1-34)抗体がモノクローナル抗体である、癌細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト型化抗体である請求項１記載の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド断片によって増殖刺激される細胞の増殖抑制剤等に関する。
背景技術
副甲状腺ホルモン関連タンパク質（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＰＴＨｒＰ」ともいう。）は、高カルシウム血症の主原因物質の腫瘍が産生するタンパク質であり、骨吸収・腎尿細管でのカルシウム再吸収を促進することにより腫瘍産生性の高カルシウム血症（Ｈｕｍｏｒａｌ  ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ、以下「ＨＨＭ」という。）を惹起する。これらの作用は、ＰＴＨｒＰのＮ末端側の１〜３４番目のアミノ酸配列のペプチド部位（ＰＴＨｒＰ（１−３４）という）が、その受容体であるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を介して、誘導されることが知られている（Ｊ．ｂｏｎｅ  ＆  Ｍｉｎｅ．Ｒｅｓ．（１９９３）８，８４９−８６０）。現在、ＨＨＭの治療には、骨吸収抑制作用を有するカルシトニンやビスホスホネート製剤が用いられているが、ＨＨＭの進行は速く、末期癌患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を著しく悪化させていることから、原因に則したより効果的な治療薬の開発が求められている。ところで、従来よりＰＴＨｒＰは、ＰＴＨｒＰ（１−３４）以外のペプチド部位にも生物活性を有することが示唆されている（永田直一；ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＣＡＬＣＩＵＭ，５（３），１０３−１０６，１９９５の表２に記載）。しかし、ＰＴＨｒＰのＮ末端側の３４〜５３番目のアミノ酸配列のペプチド部位（ＰＴＨｒＰ（３４−５３）という）が、細胞の増殖を刺激する効果を有することは今まで知られていない。
発明の開示
本発明は、副甲状腺ホルモン関連蛋白の特定のペプチド部位によって増殖刺激される細胞の増殖抑制剤等を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の受容体が発現している細胞に対して、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）断片を添加すると、該細胞の増殖が刺激されることを見出し、抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体がＰＴＨｒＰ（３４−５３）断片で刺激された該細胞の増殖を抑制すること、さらに驚くべきことに、抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体も、該細胞増殖を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＰＴＨｒＰ（１−３４）とその受容体との結合を阻害する物質を含むことを特徴とする、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激される細胞の増殖抑制剤に関する。さらに本発明は、ＰＴＨｒＰ（１−３４）とその受容体との結合を阻害する物質を含むことを特徴とする、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する疾患の治療剤に関する。
ここで、「ＰＴＨｒＰ（１−３４）」とは、副甲状腺ホルモン関連ペプチドのアミノ酸配列において、第１番目〜第３４番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片を意味する。また、「ＰＴＨｒＰ（３４−５３）」とは、副甲状腺ホルモン関連ペプチドのアミノ酸配列において、第３４番目〜第５３番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片を意味する。
さらに本発明は、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）とその受容体との結合を阻害する物質を含むことを特徴とする、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激される細胞の増殖抑制剤に関する。さらには、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）とその受容体との結合を阻害する物質を含むことを特徴とする、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する疾患の治療剤に関する。
さらに本発明は、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）とその受容体との結合を阻害する物質を含むことを特徴とする、ＰＴＨｒＰ産生抑制剤に関する。
ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する疾患としては、例えば、癌、悪液質、関節リウマチ、骨転移、陣痛、敗血症、神経圧迫、骨粗鬆症等が挙げられる。
ＰＴＨｒＰ（１−３４）とその受容体との結合を阻害する物質としては、抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体又はＰＴＨｒＰ（７−３４）などが挙げられる。「ＰＴＨｒＰ（７−３４）」とは、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の部分配列であってＰＴＨｒＰ（１−３４）の第１番目〜第６番目のアミノ酸が欠失したペプチド断片を意味する。
ＰＴＨｒＰ（３４−５３）とその受容体との結合を阻害する物質としては、抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体又は抗ＰＴＨｒＰ（３４−５３）抗体等が挙げられる。「ＰＴＨｒＰ（３８−６４）」とは、副甲状腺ホルモン関連ペプチドのアミノ酸配列において、第３８番目〜第６４番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片を意味する。
本発明で用いられる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも用いることができるが、好ましくはモノクローナル抗体である。さらに、モノクローナル抗体としては、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト型化抗体が好ましい。
さらに本発明は、ＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する受容体を有し、かつＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激される新規細胞株に関する。本発明の新規細胞株としては、通常、実質的にＰＴＨｒＰを産生していない細胞株が好ましい。「通常」とは、細胞外にＰＴＨｒＰが存在しない状態を意味し、「実質的にＰＴＨｒＰを産生していない」とは、ＰＴＨｒＰの検出限界以下、例えば０．０１ｐＭ／Ｌの濃度以下の産生量を意味する。
さらに本発明は、上記細胞株を含む培地に被検対象物質を添加して培養し、得られる培養結果から上記細胞株の増殖抑制又は促進が認められた物質を細胞の増殖抑制又は促進物質として選別することを特徴とする、細胞の増殖抑制又は促進物質のスクリーニング方法に関する。
さらに本発明は、上記細胞株由来のｃＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを宿主に導入し、得られる形質転換宿主を培地に培養して細胞表面分子を発現させた後、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）の標識物を前記培地に添加して前記宿主と反応させ、陽性を示した宿主クローンから、該細胞表面分子をコードする遺伝子を単離することを特徴とする、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）と結合することができる細胞表面分子の遺伝子のクローニング方法である。そして、上記遺伝子を発現させることにより、本発明の細胞株の細胞表面に発現し、かつＰＴＨｒＰ（３４−５３）と結合することができる細胞表面分子（細胞表面に発現するタンパク質）を取得することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０００−１３１７９３号及び２０００−１７３８３４号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の全アミノ酸配列（配列番号１、２又は３）のうち、第３４番目から５３番目の配列（「ＰＴＨｒＰ（３４−５３）」）に相当するペプチド部位が有する生物活性を阻害する物質（例えば抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体など）を用いて、当該ペプチド部位により増殖刺激がなされる細胞の増殖を抑制させるための増殖抑制剤を提供しようとするものである。なお、ＰＴＨｒＰには遺伝子の選択的スプライシングに基づく１３９個、１４１個及び１７３個のアミノ酸からなる３種類が知られており、第１３９位アミノ酸までは３種とも同一のアミノ酸配列を有する。１３９個のアミノ酸配列のものを配列番号１に、１４１個のアミノ酸配列のものを配列番号２に、１７３個のアミノ酸配列のものを配列番号３に示す。
さらに本発明において、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）ペプチド断片により刺激された細胞増殖が、抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体によって抑制されるとの知見を得た。すなわち、ＰＴＨｒＰの全アミノ酸配列のうち第１番目から３４番目の配列からなるペプチドに結合する抗体である抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体は、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）ペプチド断片に直接結合しなくても、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）ペプチド断片により増殖刺激がなされる細胞の増殖を抑制できることが判明した。従って、ＰＴＨｒＰ（１−３４）とその受容体の結合を阻害する物質（例えば、抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体等）も、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）ペプチド断片により増殖刺激がなされる細胞の増殖を抑制させるための増殖抑制剤として有効である。
さらに本発明により、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）のペプチド断片は、直接細胞増殖を刺激するのではなく、細胞表面上の分子（受容体など）を介してＰＴＨｒＰ自身の産性を促し、産性されたＰＴＨｒＰが、ＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する受容体を介して、細胞の増殖が刺激さていることが示唆された。
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
１．細胞株の樹立
本発明における、ＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する受容体を有し、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激される新規細胞株は、例えば、以下の方法により樹立することができる。
（１）培養用細胞の調製
未分化甲状腺癌患者から摘出した腫瘍細胞を解剖用ハサミを用いて細分化する。但し、摘出した細胞を一旦ヌードマウスに移植して増殖させてから細分化することもできる。
（２）培養
得られた細胞を通常の条件で培養する。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０又はＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児血清、グルタミン、抗生物質等を添加し、３７℃で２〜３週間培養する。増殖した細胞をトリプシン、ＥＤＴＡ等で処理して継代培養する。細胞濃度は１〜１００，０００個／ｍｌとなるように調製し、これを培養用プレート又はディッシュに静置する。培養を開始して１〜３週間後に増殖した細胞を、順次ウェルの大きさをスケールアップしてもよく、さらに、培養用フラスコ（例えば２５ｍｍ２、７５ｍｍ２など）に植え替えることもできる。
細胞の継代は、週に２〜３回、３日〜４日毎に新しい培地で置き換えて細胞を継代する。
（３）樹立細胞であることの判定
以上のようにして６種類の甲状腺癌細胞株（ＴＴＡ−１、ＴＴＡ−２、ＫＴＡ−１、ＫＴＡ−２、ＫＴＡ−３及びＫＴＡ−４）が得られた。これらの細胞は、以下の特徴を有するものである。
（ａ）形質：ＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する受容体（ＰＴＨｒＰＲという）の有無をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果、５株（ＴＴＡ−１、ＫＴＡ−１、ＫＴＡ−２、ＫＴＡ−３及びＫＴＡ−４）の細胞表面にＰＴＨｒＰＲの存在を認めた。
（ｂ）機能的特徴：
▲１▼各細胞株の１×１０５個を２日間培養すると、以下の濃度のＰＴＨｒＰを産生する。
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▲２▼トリチウムチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）の取り込みによる細胞増殖能を調べると、ＰＴＨｒＰＲを発現する細胞ではＰＴＨｒＰ（３４−５３）断片の濃度依存的に増殖する。また、増殖した細胞に抗体を加えることにより、増殖が抑制される。
本発明の細胞は、ＰＴＨｒＰＲが発現している公知の組織（骨、腎、大動脈、心臓、脳、乳腺、肝、脾、肺、胃、小腸、副腎、膀胱、卵巣、精巣、胎盤、皮膚、骨格筋など：滋野長平：ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＣＡＬＣＩＵＭ，５（３），７９−８３，１９９５）からも上記方法と同様にして、ＰＴＨｒＰＲが発現していることと、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）断片の濃度依存的に増殖することを確認することにより、入手することが可能である。また、公知の細胞株に、遺伝子工学的手法を用いることにより、ＰＴＨｒＰＲを発現させ、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）断片の濃度依存的に増殖することを確認して、入手することも可能である。
（４）細胞の寄託
上記細胞株ＴＴＡ−１、ＫＴＡ−１、ＫＴＡ−２及びＫＴＡ−３は、独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、以下の通り寄託されている。
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２．ＰＴＨｒＰ（３４−５３）断片の調製
本発明においては、前記のように調製された腫瘍細胞をＰＴＨｒＰ（３４−５３）で刺激する。ＰＴＨｒＰの全アミノ酸配列（配列番号１、２又は３）は公知であり、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）はペプチド合成により得ることができ、あるいは市販のものを使用することもできる。
ペプチド合成を採用する場合は、通常行われているペプチド化学合成により得ることができる。ペプチドの化学合成を行う場合は、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。
すなわち、本発明のペプチドを構成し得るアミノ酸同士を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドが合成される。縮合方法や保護基の脱離としては、公知のいずれの手法を用いてもよい（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５）、泉屋信夫他，ペプチド合成の基礎と実験，丸善（１９７５）等）。
反応後は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて目的のペプチドを精製する。合成されたペプチドが目的のものであるか否かは、質量分析、核磁気共鳴、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等により分析することができる。
３．ＰＴＨｒＰ（１−３４）とその受容体との結合を阻害する物質
「ＰＴＨｒＰ（１−３４）とＰＴＨｒＰ（１−３４）受容体との結合を阻害する物質」とは、以下の（ａ）及び（ｂ）の物質のいずれか一方又は両方を意味する（以下、「ＰＴＨｒＰ（１−３４）阻害物質」ともいう）
（ａ）リガンドであるＰＴＨｒＰ（１−３４）に結合することにより、ＰＴＨｒＰ（１−３４）がＰＴＨｒＰ（１−３４）受容体と結合することを阻害する物質
（ｂ）ＰＴＨｒＰ（１−３４）受容体に結合することにより、ＰＴＨｒＰ（１−３４）がＰＴＨｒＰ（１−３４）受容体と結合することを阻害する物質
上記（ａ）の物質の例としては、例えば抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体が挙げられる。
抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体としては、例えばヒト型化抗体、ヒト抗体（ＷＯ９６／３３７３５号公報）又はキメラ抗体（特開平４−２２８０８９号公報）などの抗体のほか、ハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１によって産生される抗体（＃２３−５７−１３７−１抗体）などが挙げられる。なお、抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好ましい。
また、上記（ｂ）の物質の例としては、例えばＰＴＨｒＰ（１−３４）受容体に対するアンタゴニスト（ＰＴＨｒＰ（１−３４）アンタゴニストともいう）が挙げられる。ＰＴＨｒＰ（１−３４）アンタゴニストとしては、ポリペプチド又は低分子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的にはＰＴＨｒＰ（１−３４）ペプチドの少なくとも一つ（例えば１個又は数個）のアミノ酸を置換、欠失したもの、あるいはＰＴＨｒＰ（１−３４）ペプチドの部分配列（例えばＰＴＨｒＰ（７−３４）などを例示することができる。また、ＰＴＨｒＰ（１−３４）に対して拮抗的にＰＴＨｒＰ（１−３４）受容体に結合する物質として、特開平７−１６５７９０号公報、特表平５−５０９０９８号公報又はＰｅｐｔｉｄｅｓ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）１９９５，１６（６）１０３１−１０３７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ａｐｒ．２８１９９２，３１（１６）４０２６−４０３３に記載のＰＴＨｒＰ（１−３４）アンタゴニスト活性を有するポリペプチドが挙げられる。また、上記例示のポリペプチドのうち、少なくとも１個（例えば１個又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加、挿入されたポリペプチドであって、同等のＰＴＨｒＰ（１−３４）アンタゴニスト活性を有するものも本発明におけるＰＴＨｒＰ（１−３４）アンタゴニストに含まれる。
４．ＰＴＨｒＰ（３４−５３）とその受容体との結合を阻害する物質
本発明において、「ＰＴＨｒＰ（３４−５３）とその受容体との結合を阻害する物質」とは、以下の（ａ）及び（ｂ）の物質のいずれか一方又は両方を意味する（以下、「ＰＴＨｒＰ（３４−５３）阻害物質」ともいう）
（ａ）リガンドであるＰＴＨｒＰ（３４−５３）に結合することにより、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）がＰＴＨｒＰ（３４−５３）受容体と結合することを阻害する物質
（ｂ）ＰＴＨｒＰ（３４−５３）受容体に結合することにより、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）がＰＴＨｒＰ（３４−５３）受容体と結合することを阻害する物質
上記（ａ）の物質としては、例えば抗ＰＴＨｒＰ（３４−５３）抗体、抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体などが挙げられる。上記（ｂ）の物質としては、ポリペプチド又は低分子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
これらのＰＴＨｒＰ（３４−５３）阻害物質は、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）のペプチド部位が腫瘍細胞表面に発現する受容体に結合するのを阻害して細胞増殖を抑制する。
５．抗ＰＴＨｒＰ抗体
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体（ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体、抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体など）としては、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される上記抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
（１）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＨｒＰを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
まず、Ｓｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３７，８９３に開示されたＰＴＨｒＰ遺伝子／アミノ酸配列に基づいて、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＰＴＨｒＰの部分断片であるＰＴＨｒＰ（１−３４）及びＰＴＨｒＰ（３８−６４）を、化学合成により作製する。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物（例えばマウス、ラット、ハムスター等）、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）の腹腔内、皮下または皮内に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに、所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等を適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付す。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＨｒＰまたはその断片に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＨｒＰまたはその断片への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＨｒＰ断片を投与して抗ＰＴＨｒＰ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＨｒＰ断片に対するヒト抗体を取得してもよい（国際公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
このような抗体としては、例えばハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１により産生される＃２３−５７−１３７−１抗体（抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体）等が挙げられる。
なお、ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１は、ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ＃２３−５７−１３７−１として、独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、平成８年８月１５日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（２）ポリクローナル抗体
前記のようにして調製した抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、アジュバントを用いるときは０．００１〜１０００μｇである。
免疫は、哺乳動物に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、３〜１０回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終の免疫日から３〜１０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３）組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）．１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ＰＴＨｒＰ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＰＴＨｒＰ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認する。
目的とする抗ＰＴＨｒＰ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
さらに、トランスジェニック動物の代わりに、タバコ等を用いたトランスジェニック植物を使用することもできる。
（４）改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、或いはトランスジェニックマウス等を用いて作成したヒト抗体を使用できる。これらの改変抗体は、以下の方法を用いて製造することができる。
本発明に有用なキメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により増幅する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体を得ることができる（ＥＰ  ２３９４００号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を、Ｌ鎖ではＣκ又はＣλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の抑制剤又は治療剤の有効成分として有用である。
本発明に使用できるヒト型化抗体としてはヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体が挙げられる。ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体は、マウス由来の＃２３−５７−１３７−１抗体の相補性決定領域を、Ｌ鎖についてはヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ−ＢＡＮＫ，Ｄｅｆｔｏｓ  Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来の３つのＦＲ断片（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ）由来のＦＲ断片（ＦＲ４）に連結したものであり、Ｈ鎖についてはヒト抗体Ｓ３１６７９（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ  ＡＭら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）のフレームワーク領域と連結し、抗原結合活性を有するようにフレームワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
なお、ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌は、独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、平成８年８月１５日付で、Ｈ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２９として、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３０として、ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されている。
さらには本発明の抗体として、トランスジェニックマウス等を用いて作成したヒト抗体も使用することができる（特開２０００−８０１００号公報）。
（５）抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、上記（１）〜（４）の抗体の断片又はその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遣伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＰＴＨｒＰ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
（６）組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ  ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ  ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅ１Ｂシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ  ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
（７）抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
（８）抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）をコーティングしたプレートに、抗ＰＴＨｒＰ抗体を含む試料、例えば、抗ＰＴＨｒＰ抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、抗ＰＴＨｒＰ抗体の中和活性を測定する。
６．ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する疾患の治療剤
本発明において、「ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する疾患」とは、副甲状腺ホルモン関連蛋白（以下「ＰＴＨｒＰ」という）の全アミノ酸配列（配列番号１、２又は３）のうち第３４番目から５３番目の配列に相当するペプチド部位が有する生物活性により、増殖刺激がなされた細胞に起因する疾患を意味する。
ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する疾患としては、例えば、癌、悪液質、慢性関節リウマチ、変形性関節症、骨転移、骨溶解、骨破壊、骨組織に存在する癌細胞の増殖、陣痛、敗血症、神経圧迫、骨折、歯肉炎、歯槽膿漏、歯周病、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、骨粗鬆症等が挙げられる。さらに、ＰＴＨｒＰ（３４−５３）によって増殖刺激された細胞に起因する癌としては、扁平上皮癌、肺癌、食道癌、子宮頸部癌、外陰部癌、頭癌、頸部癌、皮膚癌、腎癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、咽頭癌、舌癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌、大腸癌、直腸癌、尿路上皮癌、白血病、骨髄腫、乳癌、リンパ腫、甲状腺癌等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、上記疾患を複数発症したもの、あるいは他の疾患と合併したものも含まれる。
本発明の抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体又は抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体を有効成分として含有する治療剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には経肺剤型（例えばネフライザーなどの器具を用いた経肺投与剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の治療剤を投与する時期としては、上記疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。
本発明の治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明の抑制剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
７．細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法
本発明においては、前記の通り樹立した細胞株を、例えば、後述の実施例で記載するように、抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）又は抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）の代わりに、スクリーニングの対象となる被検物質とともに培養し、その結果、細胞株の増殖を指標として、被検物質が細胞増殖抑制または促進作用を有するか否かを判断することができる。
８．ＰＴＨｒＰの産生促進剤又は産生抑制剤のスクリーニング方法
本発明においては、前記の通り樹立した細胞株を、スクリーニングの対象となる被検物質とともに培養し、培養物中のＰＴＨｒＰの量を指標として、被検物質がＰＴＨｒＰの産生促進剤又は産生抑制剤として使用できるか否かを判断することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、及び培養細胞又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
９．細胞表面分子をコードする遺伝子のクローニング
本発明において、前記樹立した細胞株の細胞表面分子は、いわゆる発現クローニングにより単離することができる。「細胞表面分子」とは、細胞外情報（タンパク質、無機物質、各種低分子）を細胞内に伝達してその細胞の増殖に関与する分子を意味し、例えばＰＴＨｒＰ（３４−５３）に対する受容体として機能するタンパク質をいう。また、「発現クローニング」とは、目的の遺伝子が発現して示す機能を指標として遺伝子をクローニングする方法を意味する。この方法は、遺伝子の塩基配列や遺伝子産物のアミノ酸配列などの情報は必要とせず、しかも、発現量の少ない遺伝子のクローニングに好適である。
本発明においては、前記細胞株由来のｃＤＮＡを組み込んで発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を調製する。得られる形質転換宿主を培養すると、ｃＤＮＡによりコードされる細胞表面分子を発現させることができる。通常はプレート培養で行い、プレート上に膜を接触させて発現したコロニーを移しとり、移し取った膜に、適当な標識物で予め標識しておいたリガンド（本発明の場合はＰＴＨｒＰ（３４−５３））を膜に添加して反応させ、標識シグナルを指標として陽性を示した宿主クローンを選択し、得られるクローンから細胞表面分子をコードする遺伝子を単離する。
まず、前記の通り樹立された細胞を培養し、適当な集密度に達した段階で細胞を回収し、ｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は、公知の任意の方法を使用することができる。例えば、前記樹立細胞をグアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。次に、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで組換えベクターを作製することによって、ｃＤＮＡライブラリーを得る。
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター等が使用される。プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等）が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。さらに、ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇなどが連結された融合プラスミドを用いることもできる。
細胞表面分子をコードする遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、発現ベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列などを連結することができる。また、発現誘導剤として、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が使用される。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
ｃＤＮＡライブラリーを構成する宿主としては、細胞表面分子遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌のほか、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げらる。また、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞を使用することも可能であり、さらにＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０−２１１４（１９７２））、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２−１８７（１９９０））等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９−１９３３（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３−１６８（１９８３））等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス骨髄腫細胞などが用いられる。プロモーターとしてＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが挙げられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
次いで、前記形質転換された宿主細胞を適当な培地（例えば固体プレート培地）上に接種し、培養する。培養は宿主細胞内でＤＮＡライブラリーが好適に発現されるような条件で行うことができる。これにより、例えば、発現ベクターとしてファージベクターを使用した場合にはプラークが形成される。そして、挿入した遺伝子の発現によりプラーク部分にタンパク質が産生される。なお、発現ベクターが組み込んだ遺伝子を発現させるために発現誘導剤を必要とする場合には、発現誘導剤を添加する。発現誘導剤の添加は、予め直接培養液に加えてもよく、膜に発現誘導剤を含浸させてもよい。
続いて、前記プレート上に膜を接触させて、産生されたタンパク質を膜に移行させる。本発明の方法に使用される膜としては、発現誘導剤を含浸させ、かつタンパク質が移行し得る膜が好ましく、通常用いられているニトロセルロース膜、ナイロン膜等のブロッティング膜を使用することができる。ここで、プレートから移行した培地成分や細胞等を除去するため、膜を洗浄し、さらにタンパク質変性剤で処理してもよい。洗浄液としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が挙げられ、タンパク質変性剤としては、例えばグアニジン塩酸塩、尿素または種々の還元試薬等が挙げられる。次に、再生液で膜を処理して膜上のタンパク質を再生させ、膜を洗浄した後、標識されたリガンドを含有する溶液を膜に適用する。本発明において使用されるリガンドはＰＴＨｒＰ（３４−５３）である。標識としては、例えば蛍光標識、ビオチン標識、酵素標識、抗体標識等を採用することができる。
これにより、前記プレート上にリガンド結合蛋白質をコードするＤＮＡを含む宿主クローン（陽性クローン）が存在すれば、それに対応する膜上の蛋白質に標識されたリガンドが結合し、この標識を検出することにより、プレート上の陽性クローンを同定する。
こうして得られた宿主クローンから常法に従ってベクターを単離し、目的とする遺伝子を得る。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が制限されるものではない。
〔実施例１〕未分化甲状腺癌細胞株の樹立
複数の未分化甲状腺癌患者からそれぞれ摘出した腫瘍を解剖用ハサミを用いて細分化した。なお、一部の腫瘍はヌードマウスに移植し、腫瘍を形成させたものを切除し、細分化した。
細分化した腫瘍を培養皿に静置し、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、ＣＯ２インキュベーター中で２０日培養した。なお、培地の交換は３〜７日間隔で行った。培養後、増殖した細胞を０．２５％トリプシン、０．０２ｍＭ  ＥＤＴＡで処理して継代した。
以上のようにして得られた細胞株をＴＴＡ−１及びＴＴＡ−２（いずれもヌードマウスに形成させた腫瘍由来）、並びにＫＴＡ−１、ＫＴＡ−２、ＫＴＡ−３、ＫＴＡ−４と命名した。
〔実施例２〕細胞株のＰＴＨｒＰ産生能及び受容体発現の測定
（１）ＰＴＨｒＰ産生能
ＴＴＡ−１及びＴＴＡ−２並びにＫＴＡ−１及びＫＴＡ−４をトリプシンで処理した後、トリパンブルーで染色されない生細胞を血球計算板でカウントした。その後、１×１０５個の細胞を３５ｍｍの培養皿に播き込んで、３７℃で２日培養した。得られた培養液を回収し、ＰＴＨｒＰ測定キット（第一ラジオアイソトープ研究所）を用いて、キット添付の説明書に従ってＰＴＨｒＰ量を測定した。
結果を以下に示す。
0004846169.tif 000004
ＰＴＨｒＰ量測定の結果、ＫＴＡ−１、ＫＴＡ−２、ＫＴＡ−３及びＫＴＡ−４がＰＴＨｒＰを産生していることが分かった。
（２）受容体発現
ＴＴＡ−１及びＴＴＡ−２並びにＫＴＡ−１及びＫＴＡ−４をトリプシンで処理した後、トリパンブルーで染色されない生細胞を血球計算板でカウントした。その後、１×１０５個の細胞を３５ｍｍの培養皿に播き込んで、３７℃で２日培養した。得られた培養細胞を回収し、ｍＲＮＡ調製キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、キット添付の説明書に従ってｍＲＮＡを調製した（ＴＲＩＳ０１試薬）。
上記の通り得られたｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲキット（東洋紡，ＲＴ−ＰＣＲ  Ｈｉｇｈ）を用いて遺伝子を増幅した。なお、プライマーの配列は以下の通りである。
センス鎖：５’−ＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号４）
アンチセンス鎖：５’−ＴＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号５）
ＰＣＲは、以下の反応組成液を用いて、９４℃で６０秒反応させた後、９４℃で６０秒、５７℃で６０秒及び７２℃で６０秒の反応を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。
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ＰＣＲ終了後、３μＬの反応液を２％アガロースゲル（１×ＴＡＥバッファー）により電気泳動を行った。
その結果、２０１ｂｐの位置にバンドがあることを確認した。また、コントロールのβアクチンは３０８ｂｐの位置にバンドを確認した。
〔実施例２〕ＰＴＨｒＰ刺激試験
ＴＴＡ−１、ＴＴＡ−２及びＫＴＡ−２をトリプシンで処理した後、トリパンブルーで染色されない生細胞を血球計算板でカウントした。その後、１×１０４個の細胞を９６穴のマルチプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播き込んで、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２日間培養した。培養２日目に培養液を血清不含の培地に置換し、１日間培養した。ＰＴＨｒＰ（３４−５３）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を０（無添加）、１、１０、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４及び４８時間後にトリプシン処理した。
細胞を３Ｈ−ＴｄＲで６時間ラベルし（０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ）、回収した後、液体シンチレーションカウンターにより３Ｈ−ＴｄＲの取り込みを測定した。なお、測定は３連組（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行い、その平均値を求めた。
結果を図１に示す。図１より、２４時間後及び４８時間後のトリプシン処理のいずれにおいても、ＴＴＡ−１及びＫＴＡ−２細胞株が、ＰＴＨｒＰの濃度に依存して増殖することが認められた。
〔実施例３〕細胞増殖抑制試験
ＴＴＡ−１、ＴＴＡ−２及びＫＴＡ−２をトリプシンで処理した後、トリパンブルーで染色されない生細胞を血球計算板でカウントした。その後、１×１０４個の細胞を９６穴のマルチプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播き込んで、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２日間培養した。培養２日目に培養液を血清不含の培地に置換し、１日間培養した。ＰＴＨｒＰ（３４−５３）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を０（無添加）、１、１０、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、さらに中和抗体（抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）抗体は中外製薬社、抗ＰＴＨｒＰ（３８−６４）抗体はＯｎｃｏｇｅｎｅ社のもの）を添加した。それぞれの抗体は、ＰＴＨｒＰを添加するのと同時に１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。抗体添加２４及び４８時間後にトリプシン処理した。なお、抗体を添加しない試験群を対照とした。
細胞を３Ｈ−ＴｄＲで６時間ラベルし（０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ）、回収した後、液体シンチレーションカウンターにより３Ｈ−ＴｄＲの取り込みを測定した。
結果を図２及び３に示す。図２（２４時間後のトリプシン処理）及び図３（４８時間後のトリプシン処理）より、いずれのトリプシン処理においても、ＰＴＨｒＰの濃度とは関係なく、抗ＰＴＨｒＰ抗体がＴＴＡ−１及びＫＴＡ−２細胞株の増殖を顕著に抑制することが認められた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチド断片によって増殖刺激される細胞の増殖抑制剤が提供される。本発明の増殖抑制剤は、当該細胞増殖によって引き起こされる疾患、例えば癌の治療に有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＴＨｒＰによる細胞増殖刺激試験の結果を示す図である。
図２は、細胞増殖抑制試験の結果を示す図である。
図３は、細胞増殖抑制試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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