(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌を液体培地を収容した容器中で静置培養して、液体表面に分生子を生成させたのち、その培養生成物を乾燥し、この間に菌糸体を容器壁面に吸着させ除去することを特徴とする高純度糸状菌分生子の製造方法。
【請求項２】
菌糸体を容器壁面に吸着させたのち、さらに分生子の水分含量が１〜２０質量％になるまで乾燥を継続する請求項１記載の高純度糸状菌分生子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病原微生物の活動を抑制する糸状菌を液体培地で静置培養することにより得られる、粒径のそろった高純度分生子及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、分生子を生産する方法として、赤玉土、焼成赤玉土、鹿沼土、黒ボク土、アタパルジャイト、バーミキュライト、モンモリロナイト、パーライト、ゼオライトなどの無機質素材、ピートモス、木炭、パルプ、油粕、魚粕、骨粉、炭粉、貝化石、カニ殻、卵殻、腐葉土、ふすま、ビール粕などの固形物を単独で又は２種以上混合した固体培地で培養する方法が提案されている（特開昭６０−２３７９８６号公報、特開平６−４１５３２号公報、特開平８−２６８７１号公報）。
【０００３】
しかしながら、固体培地で培養し、分生子を生産する場合、分生子は菌糸と共に回収されるため、大きな塊となり、これには培地由来の固形分も混入するのを避けられないため、水に対する分散性や水和性が低くなり、水和剤などに製剤化した場合、沈殿を生じたり分散しないなど、品質低下の原因となる。このため、一般に得られた胞子を粉砕して菌糸から分離させ、ふるい分けによって粒径のそろった胞子を取得しているが、このように粉砕を行うと、糸状菌の分生子はしばしば死滅することがあるし、またふるい分けの操作は煩雑であるため、工業的方法としては不適当である。
【０００４】
一方、気中菌糸の生育を抑制し、ドレックスラ属糸状菌などの分生子を大量に生産する方法として、栄養菌糸の増殖時にコーンスティープリカーを添加し、栄養菌糸を増殖させ、得られた栄養菌糸を気中に静置して分生子を大量に形成させ、蒸留水を添加後、撹拌し、分生子をろ別する方法が提案されている（特開平９−３１３１６８公報）。
【０００５】
しかしながら、ろ過を用いる分離方法は、大量処理の場合操作が煩雑になる上に、特殊な設備を必要とするという欠点がある。
このため、菌糸片や培地由来の固形分が混入せず、粒径のそろった分生子を簡便に得る方法が求められていたが、現在までこの要求にこたえられる方法は実現していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、菌糸片や培地由来の固形分が混入せず、かつ粒径のそろった高純度分生子を簡便に得ることを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、粒径のそろった高純度の分生子を簡便に得る方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、容器中に収容した固形分を含まない液体培地で糸状菌を培養し、菌糸体を容器壁面に吸着させ、培養物をそのまま乾燥すれば、目的とする糸状菌の分生子を菌糸片や培地由来の固形分の混入がなく、かつ粒径のそろった状態で効率よく多量に生産しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、糸状菌を液体培地を収容した容器中で静置培養して、液体表面に分生子を生成させたのち、その培養生成物を乾燥し、この間に菌糸体を容器壁面に吸着させ除去することを特徴とする高純度糸状菌分生子の製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明にいう分生子は、分生胞子とも称される糸状菌類にみられる無性的な胞子の１種で、分生子柄上に生じ、球形、長円形、線形その他いろいろな形状をとり、細胞壁は厚膜胞子と異なり、あまり厚くない。一般に糸状菌胞子は１個当り２〜１０μｍの大きさを有する。この大きさは菌種によって異なるが、同一菌ではほぼ一定で、一般に培地組成や培養法によって大きく変わることはない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、液体静置培養に用いる種菌としては、分生子や厚膜胞子状態、又はそれらの菌糸体との混合物を用いることができるが、液面全体に均一に分生子を形成させるためには、菌糸体を用いるのが好ましい。そして、このため糸状菌をあらかじめ振とう培養法などにより栄養培地中で菌糸体を大量増殖させておくのが有利である。
【００１１】
また、栄養培地で糸状菌を培養する際、増殖した菌糸体が塊状となる場合があるが、このような場合には、ワーニングブレンダーなどを用いてこの塊を分散し、液体静置培養するのがよい。また、この際バットのような表面積の大きい容器に菌糸体糸状菌を移し、菌糸体をバット表面全体に拡散させて行うのが効率的である。
【００１２】
本発明における糸状菌としては、真菌門のうち栄養繁殖の期間に菌糸体の発達が極めて旺盛で、分生子を形成する菌類であればどのようなものでもよく、例えば、鞭毛菌亜門（Ｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、接合菌亜門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する多数の菌を用いることができるが、特にトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属する農薬成分として有効な糸状菌が好ましい。
【００１３】
この中で、農薬成分として特に好適なのは、トリコデルマ属に属する糸状菌であって、このような糸状菌としては、例えばトリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ポリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）などがある。
【００１４】
次に、本発明において分生子を製造するために用いる液体培地としては、固形分を含まず、糸状菌菌体を円滑に増殖することができるものであればどのようなものであってもよい。すなわち糸状菌菌体の振とう培養もしくは静置培養に慣用されている液体培地で、静置培養の際、菌糸の生育が十分に進行し、静地培養により分生子が生成するものであればどのようなものでもよく、培養の途中で栄養成分を変更したり、添加することもできる。
この培地は、固形分、すなわち水不溶成分を含んでいてはいけないが、培養中に溶解し、吸収されて、培養後には消失するような固形分は含んでいてもよい。
【００１５】
本発明において使用しうる液体培地の例としては、ポテト・デキストロース液体培地、グルコース・ペプトン液体培地、レシチンとポリソルベート８０加グルコース・ペプトン液体培地、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト液体培地などがある。
【００１６】
本発明方法により、高純度糸状菌分生子を製造するには、上記の液体培地に、所定の菌糸を接種し、振とう培養又は静置培養により十分に増殖させる。この間に塊状物が形成されたならば、撹拌などによって粉砕する。
次いで、培地全体に菌糸が広がったのを確認したならば、この培養物を平皿状容器、例えばアルミニウム製バットに移し、室温下で空気を送りながら、液体静置培養する。この静置培養を５〜１５日間継続すると、液体と空気との接触面一面に一面に分生子が形成するので、水抜きし、乾燥すると菌糸はアルミニウム製バットの底面や壁面に付着して培養物から除かれる。さらに、乾燥を続け、分生子の水分含量が１〜２０質量％になるまで乾燥すると、分生子が回収される。
【００１７】
この際の乾燥方法は、分生子が安定した状態で乾燥できる方法であればよく、特に制限はない。このような方法としては、例えば、自然乾燥法、送風乾燥法、真空乾燥法、減圧乾燥法、温風乾燥法、凍結乾燥法などを挙げることができる。
また、本発明方法においては、分生子が十分生育した時点で乾燥を行うに先立って、水抜きして余分な液体成分を除去することもできる。
【００１８】
このようにして得られた分生子は、菌糸体や培地由来の固形分を含まないため、純粋なものである。また、分生子が１胞子ずつ分離して存在するので、粉砕やふるい分けを行わなくても、糸状菌の１分子の大きさに近い、体積中位径２〜１０μｍの分生子が、体積９０％径と体積１０％径のそれぞれの常用対数の値の差が０．７５以下という均一な粒度分布で得られる。
【００１９】
本発明の高純度糸状菌分生子は、前記したように粒径が均一で、不純分が少ないために、そのまま農業用展着剤水溶液で希釈して使用することができ、また界面活性剤や担体と混合して水和剤にすることもできる。さらに、その薬効をそこなうことなく単独でマイクロカプセルに封入したり、顆粒や錠剤に製剤化しうるので、従来の化学農薬と同様に製品化することができる。
【００２０】
このようにして製品化した分生子は、水に懸濁した際、良好な分散性を示し、凝集粒子を生じないため、均一な懸濁液とすることができる。また、植物に散布した場合、植物表面に均一に付着し、過剰な使用量を抑制しうる上に、生物農薬で問題となっている効果の安定性にも寄与しうる。
【００２１】
本発明の分生子は、水分含量が低く、飛散しやすいため、糸状菌に対して不活性な賦形剤を用いて顆粒化、錠剤化したり、あるいは飛散しにくい担体に担持させて使用するのが好ましい。
また、この分生子は、保存中又は輸送中における発芽を抑制するために、水分を１〜２０質量％の範囲内に維持する必要がある。
【００２２】
次に、本発明の分生子を農薬製剤として使用する場合には、これを農薬基剤１００質量部に対し、０．０１〜１００質量部、好ましくは１〜２０質量部を配合するか、あるいは不活性希釈剤で１〜１０，０００倍、好ましくは５〜１，０００倍に希釈する。これよりも濃度を低くすると分生子を発芽させて病原微生物の活動を抑制することができなくなるし、またこれよりも濃度を高くしても効果の点では差がなく、単にコスト高になるにすぎない。
【００２３】
農薬製剤について水和剤の場合を例として説明すると、分散剤、例えばナフタレンスルホン酸塩のホルマリン縮合物５〜２０質量％、湿潤剤、例えばナフタレンスルホン酸塩１〜５質量％及び担体、例えばホワイトカーボンのような含水ケイ酸質微粉末残部からなる基剤１００質量部に、本発明の分生子１〜１０質量部を加え、さらに蒸留水１０〜３０質量部を加え、十分に混練りしたのち、噴霧乾燥して顆粒を形成させ、分級して粒度０．１〜１ｍｍの範囲のものを集めることにより製造する。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば糸状菌の分生子を、粉砕、ふるい分けすることなく、かつ生存したまま粒径のそろった状態で得ることができる。したがって、微生物農薬として製剤化に用いるのに大変有利である。
【００２５】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
なお、実施例及び比較例で使用するトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６５１０として寄託されている。
【００２６】
実施例１
精糖蜜３６ｇ、脱脂大豆６ｇ、リン酸二水素カリウム１．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．６ｇ、塩化カリウム０．６ｇ及び硫酸第一鉄・７水和物０．０１２ｇを、ｐＨ無調整のまま蒸留水１．２リットルに溶解し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。滅菌後冷却して液体培地を調製した。
次に、この液体培地を３リットル体積の三角フラスコに移し、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１を植菌し、２７℃で４８時間振とうして培養を行った。
培地全体に菌糸が広がったのを確認し、この培養物を底面積６００ｃｍ2のアルミニウム製のバットに広げ、そのまま２７℃で空気を送りながら１週間液体静置培養を続けた。培養後、菌糸が空気と接触面一面に分生子を形成されているのが認められた。
次いで、水抜きし、風乾したところ、菌糸が徐々にバットの底面及び側面に付着してきた。さらに、分生子の水分含量が１０質量％になるまで乾燥したのち、分生子のみを回収した。
【００２７】
このようにして得た分生子を０．５％ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム水溶液に懸濁し、レーザー粒度分布測定装置（セイシン企業社製，製品記号ＬＭＳ−２４）により粒度分布を調べたところ、体積中位径は３．７μｍ、体積９０％径と体積１０％径のそれぞれの常用対数の値の差は０．５９であった。
この体積中位径測定値はトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１の分生子１個当りの大きさと極めて近似していた。この分生子の粒度分布のヒストグラムを図１に示す。
次いで、実施例１により得られた分生子１ｇを農薬用展着剤（クミアイ化学工業社製，商品名「クミテン」）０．０３ｇを含む水溶液１００ｍｌに添加したところ、完全に自己分散し、沈殿物は認められなかった。
【００２８】
実施例２
市販のポテトデキストロース培地（ディフコ社製）２８．８ｇを１．２リットルの蒸留水に溶解し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、液体培地を調製した。この液体培地を３リットル体積の三角フラスコに移し、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−５３７５を植菌し、２７℃で４８時間振とう培養した。
次いで液体培地に形成された菌糸塊を回収し、ワーニングブレンダーにより菌糸を繊維化して、底面積６００ｃｍ2のアルミニウム製バットに広げ、そのまま２７℃で空気を送りながら１週間静置培養した。培養後、空気との接触面一面に分生子が形成されるのが認められた。
次に、これを風乾して菌糸をバットの底面及び側面に粘着させた。さらに分生子の水分含量が約１０質量％になるまで乾燥を続けたのち、分生子を回収した。
【００２９】
実施例１と同様にして粒度分布を調べたところ、体積中位径は６．６μｍ、体積９０％径と体積１０％径のそれぞれの常用対数の値の差は０．４５であった。
この粒度分布のヒストグラムを図２に示す。
このようにして得た分生子１ｇを農薬用展着剤（クミテン）０．０３ｇを含む水溶液１００ｍｌに投入したところ、完全に自己分散し、沈殿物は認められなかった。
【００３０】
比較例１
実施例１と同様の方法により得られた菌糸体を、滅菌したふすま培地に接種し、混合して、２７℃で空気を送りながら１週間静置培養した。培養後、空気との接触面一面に分生子が形成されたので、風乾により分生子の水分含量が約１０質量％になるまで乾燥を続けたのち、分生子を回収した。
このようにして得た分生子を卓上ミルで粉砕し、ふるい分けして固形成分と分生子を得た。
実施例１と同様にして粒度分布を調べたところ、体積中位径は６．８μｍ、体積９０％径と体積１０％径のそれぞれの常用対数の値の差は０．７８であった。
この体積中位径測定値はトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１の分生子１個当りの大きさとは異なっていた。この分生子の粒度分布のヒストグラムを図３に示す。
このようにして得た分生子１ｇを農薬用展着剤（クミテン）０．０３ｇを含む水溶液１００ｍｌに添加したところ、完全な自己分散は認められず、沈殿物及び水面上に浮遊物が認められた。
【００３１】
比較例２
実施例２と同様の方法により得られた、繊維化した菌糸を滅菌したふすま培地に接種し、混合して、２７℃で空気を送りながら１週間静置培養をした。培養後、空気との接触面一面に分生子が形成したので、風乾により分生子の水分含量が約１０質量％になるまで乾燥したのち、分生子を回収した。
このようにして得た分生子を卓上ミルで粉砕し、ふるい分けして固形成分と分生子を分離した。
実施例１と同様にして粒度分布を調べたところ、体積中位径は９．７μｍ、体積９０％径と体積１０％径のそれぞれの常用対数の値の差は１．２０であった。
この体積中位径測定値はトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１の分生子１個当りの大きさとは異なっていた。この分生子の粒度分布のヒストグラムを図４に示す。
次にこの分生子１ｇを農薬用展着剤（クミテン）０．０３ｇを含む水溶液１００ｍｌに添加したところ、完全な自己分散は認められず、沈殿物が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１で得た分生子の粒度分布のヒストグラム。
【図２】  実施例２で得た分生子の粒度分布のヒストグラム。
【図３】  比較例１で得た分生子の粒度分布のヒストグラム。
【図４】  比較例２で得た分生子の粒度分布のヒストグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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