(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式(II)：
【化１】
0004810043.tif 000027
（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、R1は１個でも、同一又は異なる５以下の複数個でもよく、互いに環を形成してもよく、
R2は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R5は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R6は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R7は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R8はハロゲン原子、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、5-メチルヘキシル基、シクロヘプチル基、オクチル基、6-メチルヘプチル基、ノニル基、7-メチルオクチル基、デシル基、8-メチルノニル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R2とR3とは環を形成していてもよく、
R4とR5、R6、R7及びR8のいずれかとは環を形成していてもよく、
実線と破線とで描かれた結合は炭素−炭素一重結合又は炭素−炭素二重結合を表す。）
もしくはこのE体で示される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記式(II)において、実線と破線とで描かれた結合が炭素−炭素二重結合である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記式(II)において、R7及びR8の少なくとも一方が1,1-ジメチル-2-プロペニルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
R2、R3、R4、R5、R6およびR7のそれぞれが水素であり、R8が1,1-ジメチル-2-プロペニルであり、実線と破線とで描かれた結合が炭素−炭素二重結合を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8のそれぞれが水素であり、実線と破線とで描かれた結合が炭素−炭素二重結合を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
R8がブチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
R8がtert-ブチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
3-[(5-エチルイミダゾール-4-イル)メチレン]-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；
3-[(5-ブチルイミダゾール-4-イル)メチレン]-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；
3-[(5-ペンチルイミダゾール-4-イル)メチレン]-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；および
3-{[5-(1,1-ジメチル-2-プロペニル)イミダゾール-4-イル]メチレン}-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を含む、抗腫瘍剤。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
次式(II)：
【化２】
0004810043.tif 000028
（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、R1は１個でも、同一又は異なる５以下の複数個でもよく、互いに環を形成してもよく、
R2は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R5は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R6は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R7は水素原子、ハロゲン原子、C1-25アルキル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R8はハロゲン原子、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、5-メチルヘキシル基、シクロヘプチル基、オクチル基、6-メチルヘプチル基、ノニル基、7-メチルオクチル基、デシル基、8-メチルノニル基、C2-25アルケニル基、C2-25アルキニル基、C1-25アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
R2とR3とは環を形成していてもよく、
R4とR5、R6、R7及びR8のいずれかとは環を形成していてもよく、
実線と破線とで描かれた結合は炭素−炭素一重結合又は炭素−炭素二重結合を表す。）
もしくはこのE体で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、治療に使用するための医薬。
【請求項１２】
前記式(II)において、実線と破線とで描かれた結合が炭素−炭素二重結合である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記式(II)において、R7及びR8の少なくとも一方が1,1-ジメチル-2-プロペニルである、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
R2、R3、R4、R5、R6およびR7のそれぞれが水素であり、R8が1,1-ジメチル-2-プロペニルであり、実線と破線とで描かれた結合が炭素−炭素二重結合を表わす、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１５】
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8のそれぞれが水素であり、実線と破線とで描かれた結合が炭素−炭素二重結合を表わす、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１６】
R8がブチルである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１７】
R8がtert-ブチルである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１８】
化合物が、
3-[(5-エチルイミダゾール-4-イル)メチレン]-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；
3-[(5-ブチルイミダゾール-4-イル)メチレン]-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；
3-[(5-ペンチルイミダゾール-4-イル)メチレン]-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；および
3-{[5-(1,1-ジメチル-2-プロペニル)イミダゾール-4-イル]メチレン}-6-(フェニルメチレン)ピペラジン-2,5-ジオン；
からなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１９】
癌の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２０】
細胞分裂の阻害に使用するための、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２１】
自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２２】
腫瘍の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２３】
微生物感染の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２４】
慢性関節リウマチの治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞分裂阻害剤（細胞周期阻害剤）及び抗腫瘍剤並びに酵素を用いたそれらの製造方法に関する。
背景技術
人体を構成する細胞は恒常性を維持するためにその増殖と分化は厳密に制御されている。細胞は、Ｍ期・Ｇ１期・Ｓ期・Ｇ２期という一連の過程からなる細胞周期を回転することにより分裂、増殖を行う。この細胞周期の制御機構に異常が生じると癌や免疫疾患になる。
最近では、細胞周期の調節機構が分子レベルで解明されつつあり、細胞周期を調節する物質には、抗腫瘍剤、免疫抑制剤の可能性が知られている。そして、近年パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチンのように、細胞骨格蛋白質の一つで細胞分裂の際に複製された遺伝子の娘細胞への正確な分配に中心的な役割を果たすチューブリンの機能を阻害する物質が、抗腫瘍剤として、あるいは抗腫瘍剤のリード化合物として注目をあびている。
福島らは、アルボノルシン（ａｌｂｏｎｏｕｒｓｉｎ）が抗腫瘍活性及び抗菌活性があることを見出し（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１７５，１９７３）、小林らは、アルボノルシンに雌核雄核融合阻害作用があることを見出している（小林他、天然有機化合物討論会講演要旨集第５１頁、１９８９年）。また、神崎らは、テトラデヒドロシクロ（Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）が、ウニ胚分裂阻害活性を示すことを見出している（日本放線菌学会講演要旨集第４２頁、１９９９年）。
加納らは神奈川県内の土壌より分離した糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ  ＮＳＣ−ＦＯ３７株及び同ＮＳＣ−ＦＯ３８株が新規抗腫瘍物質フェニラヒスチンを生産することを発見し、この物質の構造決定を行った。フェニラヒスチンは分子内に不斉炭素原子を有し、詳細な解析の結果、本生産菌の生産するフェニラヒスチンは（−）−フェニラヒスチンと（＋）−フェニラヒスチンの混合物であり、（−）−フェニラヒスチンの抗腫瘍活性が（＋）−体の約３０〜１００倍強力であることを発見している（特開平１０−１３０２６６号公報；Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２２，ｐｐ．２８４７−２８５２，１９９７；Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１３０−１１３３，１９９９）。そして、（−）−フェニラヒスチンがチューブリンの重合を阻害することを明らかにしている（Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ，５２，Ｎｏ．２，ｐｐ．１３４−１４１，１９９９）。また、癌細胞を移植したモデル動物を用い（−）−フェニラヒスチンの抗腫瘍効果を検討し、（−）−フェニラヒスチンがある程度の抗腫瘍活性を有することを示した（Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１３０−１１３３，１９９９）。しかし、臨床上の立場からは、（−）−フェニラヒスチンの抗腫瘍効果よりも更に強力な抗腫瘍活性を有する薬剤が望まれている。
発明の開示
本発明は、より強力な細胞周期阻害活性、特に抗腫瘍活性を有する細胞分裂阻害剤、及び酵素を用いたその製造方法の提供を目的とする。
本発明者は前記課題の解決のために鋭意検討した結果、デヒドロフェニラヒスチンをはじめとする種々のデヒドロジケトピペラジン類又はその類縁体が（−）−フェニラヒスチンより強力な細胞周期阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）次式（Ｉ）：
0004810043.tif 000002
［式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に酸素原子又は硫黄原子を表し、
Ｙ３は酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ３−又は−ＣＲ３１Ｒ３２−を表し、
Ｙ４は酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ４−又は−ＣＲ４１Ｒ４２−を表し、
Ｒ１０はハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ２０はハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立に、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ１０とＲ３、Ｒ３１、Ｒ３２のいずれかとは環を形成していてもよく、
Ｒ２０とＲ４、Ｒ４１及びＲ４２のいずれかとは環を形成していてもよく、
（Ｂ１）及び（Ｂ２）は、それぞれ独立に炭素−炭素一重結合又は炭素−炭素二重結合を表し、少なくとも一方は炭素−炭素二重結合であり、その立体配置はＥ，Ｚのいずれでもよく、
前記の基の少なくとも１つは、生体において分解可能な保護基を有していてもよい。但し、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３及びＹ４が共に−ＮＨ−で、Ｒ１０がベンジル基で、（Ｂ１）及び（Ｂ２）が共に炭素−炭素二重結合であり、かつ、Ｒ２０がイソブチル基又はベンジル基である場合、並びにＸ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３及びＹ４が共に−ＮＨ−で、Ｒ１０がベンジル基で、（Ｂ１）が炭素−炭素一重結合で、（Ｂ２）が炭素−炭素Ｚ−二重結合であり、かつ、Ｒ２０が次式（ａ）：
0004810043.tif 000003
（式中、＊は結合位置を表す。）
で示される基である場合を除く。］
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する細胞分裂阻害剤。
（２）前記式（Ｉ）において、（Ｂ１）及び（Ｂ２）が共に炭素−炭素二重結合である前記（１）に記載の細胞分裂阻害剤。
（３）前記式（１）において、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３が−ＮＲ３−、Ｙ４が−ＮＲ４−である前記（１）又は（２）に記載の細胞分裂阻害剤。
（４）前記式（Ｉ）において、Ｙ３及びＹ４は共に−ＮＨ−である前記（３）に記載の細胞分裂阻害剤。
（５）次式（ＩＩ）：
0004810043.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、Ｒ１は１個でも、同一又は異なる５以下の複数個でもよく、互いに環を形成してもよく、
Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ６は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ２とＲ３とは環を形成していてもよく、
Ｒ４とＲ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のいずれかとは環を形成していてもよく、
（Ｂ２）は炭素−炭素一重結合又は炭素−炭素二重結合を表し、
前記の基の少なくとも１つは、生体において分解可能な保護基を有していてもよい。）
もしくはこのＥ体で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する細胞分裂阻害剤。
（６）前記式（ＩＩ）において、（Ｂ２）が炭素−炭素二重結合である前記（５）に記載の細胞分裂阻害剤。
（７）前記式（ＩＩ）において、Ｒ７及びＲ８の少なくとも一方が１，１−ジメチル−２−プロペニル基である前記（６）に記載の細胞分裂阻害剤。
（８）抗腫瘍剤である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞分裂阻害剤。
（９）前記式（Ｉ）における（Ｂ１）及び（Ｂ２）の少なくとも一方が炭素−炭素一重結合である化合物、又は前記式（ＩＩ）における（Ｂ２）が炭素−炭素一重結合である化合物の当該炭素−炭素一重結合を炭素−炭素二重結合に変換する活性を有する脱水素酵素。
（１０）分子量が７００ｋＤａから８００ｋＤａである前記（９）に記載の脱水素酵素。
（１１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓが生産する前記（９）又は（１０）に記載の酵素。
（１２）前記式（Ｉ）における（Ｂ１）及び（Ｂ２）の少なくとも一方が炭素−炭素一重結合である化合物、又は前記式（ＩＩ）における（Ｂ２）が炭素−炭素一重結合である化合物を基質として用い、前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の脱水素酵素を含む細胞、無細胞抽出液又は酵素液を用いて、当該炭素−炭素一重結合を炭素−炭素二重結合に変換することを含む前記（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞分裂阻害剤の製造方法。
（１３）前記（１１）に記載の脱水素酵素を用いた前記（１２）に記載の方法。
（１４）次式（ＩＩ）：
0004810043.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよくヘテロ原子を含んでいてもよく、Ｒ１は１個でも、同一又は異なる５以下の複数個でもよく、互いに環を形成してもよく、
Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ６は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基又はアリール基を表し、これらの基は他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、
Ｒ２とＲ３とは環を形成していてもよく、
Ｒ４とＲ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のいずれかとは環を形成していてもよく、
（Ｂ２）は炭素−炭素一重結合又は炭素−炭素二重結合を表し、
前記の基の少なくとも１つは、生体において分解可能な保護基を有していてもよい。）
もしくはこのＥ体で示される化合物又はその薬学的に許容される塩。
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本発明の範囲内に含まれる種々の定義の適当な例と説明を以下に述べる。
前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）において“ハロゲン原子”という用語は特に指示がなければ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味する。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表されるＣ１−２５アルキル基は、炭素原子１〜２５を有するアルキル基であり、直鎖状、分枝状又は環状のいずれでもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ヘプチル、５−メチルヘキシル、シクロヘプチル、オクチル、６−メチルヘプチル、ノニル、７−メチルオクチル、デシル、８−メチルノニルが挙げられ、好ましくはＣ１−１０アルキルであり、更に好ましくはＣ１−６アルキルである。これらのアルキル基は他の置換基により置換されていてもよく、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表されるＣ２−２５アルケニル基は、炭素原子２〜２５を有するアルケニル基であり、直鎖状、分枝状又は環状のいずれでもよく、例えばビニル、プロペニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、３−メチル−３−ブテニル基が挙げられ、好ましくはＣ２−１０アルケニルであり、更に好ましくはＣ２−６アルケニルである。これらのアルケニル基は他の置換基により置換されていてもよく、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表されるＣ２−２５アルキニル基は、炭素原子２〜２５を有するアルキニル基であり、直鎖状、分枝状又は環状のいずれでもよく、例えばエチニル、プロピニル、ブチニルが挙げられ、好ましくはＣ２−１０アルキニルであり、更に好ましくはＣ２−６アルキニルである。これらのアルキニル基は他の置換基により置換されていてもよく、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表されるＣ１−２５アルコキシ基は、炭素原子１〜２５を有するアルコキシ基であり、直鎖状、分枝状又は環状のいずれでもよく、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、シクロペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、シクロヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、５−メチルヘキシルオキシ、シクロヘプチルオキシ、オクチル、６−メチルヘプチルオキシ、ノニルオキシ、７−メチルオクチルオキシ、デシルオキシ、８−メチルノニルオキシが挙げられ、好ましくはＣ１−１０アルコキシであり、更に好ましくはＣ１−６アルコキシである。これらのアルコキシ基は他の置換基により置換されていてもよく、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表されるアリール基は、単環又は多環の芳香族炭化水素基であり、例えばフェニル、ナフチル、アントラニルが挙げられ、好ましくはフェニルである。これらのアリール基は他の置換基、例えばＣ１−６アルキル（好ましくはメチル、エチル、プロピル）、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシにより置換されていてもよく、環員として酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表されるアラルキル基は、前記アリール基で置換されたＣ１−６アルキルであり、例えばベンジル、フェネチル、ナフチルメチル、アントラニルメチルが挙げられ、好ましくはベンジルである。これらのアラルキル基は他の置換基、例えばＣ１−６アルキル（好ましくはメチル、エチル、プロピル）、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシにより置換されていてもよく、環員として酸素、硫黄、窒素等のヘテロ原子を含んでいてもよい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１又はＲ４２で表される置換アミノ基における置換基としては、例えばＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、カルボキシル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシが挙げられる。
前記式（Ｉ）において、Ｒ１０とＲ３、Ｒ３１、Ｒ３２のいずれかとは環を形成していてもよく、Ｒ２０とＲ４、Ｒ４１及びＲ４２のいずれかとは環を形成していてもよく、前記式（ＩＩ）において、Ｒ２とＲ３とは環を形成していてもよく、Ｒ４とＲ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のいずれかとは環を形成していてもよい。
なお、Ｒ７又はＲ８で表されるＣ２−２５アルケニル基としては、炭素原子５個よりなるイソプレン単位に相当するアルケニル基、即ち１，１−ジメチル−２−プロペニル、３−メチル−３−ブテニル基、及びこれらのイソプレン単位に相当するアルケニル基が複数個、好ましくは３個までのユニットとして（炭素原子数１５まで）結合したものが好ましい。
前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）中の置換基は、生体において分解可能な保護基を有していてもよい。このような保護基のうち、例えば、アミノ基の保護基としては、具体的には、「医薬品の開発」第１３巻、「薬物送達法」（瀬崎仁編集、広川書店、平成元年７月発行）１１６頁の表２．２９に記載されているような酸アミド、カルバメート等の結合様式を有する保護基であればよく、アセチル基等の脂肪酸由来のアシル基が好ましい。
前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物の二重結合は、いずれもＺ配置でもＥ配置でもよいが、Ｚ配置であることが好ましい。
なお、（Ｂ１）及び／又は（Ｂ２）が炭素−炭素二重結合である場合、当該炭素−炭素二重結合に結合する前記の置換基は、対応する２価の基となる。例えば、メチル基はメチレン基、ベンジル基はフェニルメチレン（ベンジリデン）基となる。
前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３及びＹ４が共に−ＮＨ−で、Ｒ１０がベンジル基で、（Ｂ１）及び（Ｂ２）が共に炭素−炭素二重結合であり、かつ、Ｒ２０がイソブチル基である化合物（一般名：アルボノルシン、化合物名：３−（Ｚ）−ベンジリデン−６−（Ｚ）−イソブチリデン−２，５−ピペラジンジオン）は、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１７５，１９７３）に記載されている公知の抗腫瘍剤、及び天然有機化合物討論会講演要旨集第５１頁、１９８９年に記載されている公知の雌核雄核融合阻害剤であり、本発明の細胞分裂阻害剤は、これを除くものである。また、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３及びＹ４が共に−ＮＨ−で、Ｒ１０及びＲ２０が共にベンジル基で、（Ｂ１）及び（Ｂ２）が共に炭素−炭素二重結合である化合物（テトラデヒドロシクロ（Ｐｈｅ−Ｐｈｅ））は、日本放線菌学会講演要旨集第４２頁、１９９９年に記載されている公知のウニ胚分裂阻害剤であり、本発明の細胞分裂阻害剤は、これを除くものである。また、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３及びＹ４が共に−ＮＨ−で、Ｒ１０がベンジル基で、（Ｂ１）が炭素−炭素一重結合で、（Ｂ２）が炭素−炭素Ｚ−二重結合であり、かつ、Ｒ２０が次式（ａ）：
0004810043.tif 000006
（式中、＊は結合位置を表す。）
で示される基である化合物（一般名：フェニラヒスチン、化合物名：３−｛［５−（１，１−ジメチル−２−プロペニル）イミダゾール−４−イル］メチレン｝−６−ベンジルピペラジン−２，５−ジオン）は、特開平１０−１３０２６６号公報等に記載されている公知の細胞分裂阻害剤であり、本発明の細胞分裂阻害剤は、これを除くものである。また、本発明の細胞分裂阻害剤としては、通常、前記式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２が、それぞれ独立に、酸素原子又は硫黄原子で、Ｙ３が−ＮＲ３−、Ｙ４が−ＮＲ４−（ここで、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である。）で、Ｒ１０が置換又は非置換のベンジル基で、（Ｂ１）が炭素−炭素一重結合で、（Ｂ２）が炭素−炭素Ｚ−二重結合であり、かつ、Ｒ２０が置換又は非置換のイミダゾール−４−イルメチレンである化合物以外のものが用いられる。
また、前記式（Ｉ）において、（Ｂ１）が炭素−炭素二重結合で、（Ｂ２）が炭素−炭素一重結合又は炭素−炭素二重結合であるものが好ましく、（Ｂ１）及び（Ｂ２）が共に炭素−炭素二重結合であるものが更に好ましい。
前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物の好ましい例は、３−（イミダゾール−４−イルメチレン）−６−（フェニルメチレン）ピペラジン−２，５−ジオン、３−［（５−メチルイミダゾール−４−イル）メチレン］−６−（フェニルメチレン）ピペラジン−２，５−ジオン、
３−［（５−エチルイミダゾール−４−イル）メチレン］−６−（フェニルメチレン）ピペラジン−２，５−ジオン、
３−［（５−ブチルイミダゾール−４−イル）メチレン］−６−（フェニルメチレン）ピペラジン−２，５−ジオン、
３−［（５−ペンチルイミダゾール−４−イル）メチレン］−６−（フェニルメチレン）ピペラジン−２，５−ジオン、
３−｛［５−（１，１−ジメチル−２−プロペニル）イミダゾール−４−イル］メチレン｝−６−（フェニルメチレン）ピペラジン−２，５−ジオンである。
前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物の薬学的に許容される塩は、通常の有機又は無機の無毒性塩類であり、当該化合物が塩基性物質である場合には、好ましくは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸塩として用いられ、当該化合物が酸性物質である場合には、好ましくは無機塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）として用いられる。本明細書において「薬学的に許容される」とは、医薬、獣医薬、農薬、殺菌剤、殺虫剤等の他、研究用試薬も含める分野において許容される意味である。
本発明の細胞分裂阻害剤は、原核又は真核生物の細胞分裂、細胞周期及び雌核雄核融合を阻害するような目的に用いることができる。具体的には、殺菌剤、農薬、獣医薬、殺虫剤、医薬品、研究用試薬として有用である。更に医薬品の中でも、特に抗腫瘍剤として有用である。本発明の細胞分裂阻害剤は、無秩序に細胞分裂を繰り返すような病態に対して有効である。特に癌に対して有用で、またある種の自己免疫疾患、慢性関節リューマチ等ある種の細胞が無秩序に増殖を続けるに至った病態に対しても有効である。
更に本発明の抗腫瘍剤は種々の疾患の治療において、前記活性成分の他に、必要に応じて他の医薬として有効な成分、例えば他の抗腫瘍剤を含有させることもできる。顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤又はカプセル剤の形態をとる場合には、前記活性成分を５〜８０重量％含有させるのが好ましい。液剤の場合には、前記活性成分を１〜３０重量％の割合で含有させるのが好ましい。更に、非経口投与剤のうち注射剤として用いる場合には、前記活性成分を１〜１０重量％の割合で含有させるのが好ましい。
臨床投与量は、経口投与の場合、成人に対し前記活性成分として、１日当たり０．１ｍｇ〜１ｇを内服するのが好ましい。しかしながら、患者の年齢、体重、症状等によって適宜投与量を増減させることもできる。前記の本発明の抗腫瘍剤は、１日１回投与も可能であるが、適当な間隔をおいて２〜３回にわけて投与することもできる。更に、注射剤として用いる場合には、前記活性成分として成人に対し１回量１〜数百ｍｇを投与するのが望ましい。また、その投与は注射による１日１〜３回の、又は２〜３日に１回の投与、あるいは点滴等による持続投与で行うことが可能である。
本発明の脱水素酵素は、前記式（Ｉ）における（Ｂ１）及び（Ｂ２）の少なくとも一方が炭素−炭素一重結合である化合物、又は前記式（ＩＩ）における（Ｂ２）が炭素−炭素一重結合である化合物を基質とすることができるが、好ましくは、前記式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３が−ＮＲ３−、Ｙ４が−ＮＲ４−（ここで、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である。）である化合物、更に好ましくは前記式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２が共に酸素原子で、Ｙ３及びＹ４は共に−ＮＨ−である化合物を基質とし、特に好ましくはＬ体のアミノ酸２つが縮合してジケトピペラジン環を形成した環状ジペプチド又はその置換体を基質とする。前記縮合するアミノ酸としては、好ましくはフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン等の環状（芳香族）アミノ酸が挙げられる。前記環状ジペプチドの置換体における置換基としては、ハロゲン原子、Ｃ１−２５アルキル基、Ｃ２−２５アルケニル基、Ｃ２−２５アルキニル基、Ｃ１−２５アルコキシ基、アラルキル基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、アリール基が挙げられ、これらの基は、他の置換基により置換されていてもよく、炭素鎖の一部は分岐していてもよく、環状であってもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、互いに環を形成していてもよく、生体において分解可能な保護基を有していてもよく、好ましくは炭素数２〜６のアルキル基又はアルケニル基、更に好ましくは１，１−ジメチル−２−プロペニル基が挙げられる。
なお、前記の基質として用いる化合物の多くは公知の化合物であり（特開平１０−１３０２６６号公報；Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２２，ｐｐ．２８４７−２８５２，１９９７；Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１３０−１１３３，１９９９；Ｋａｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．１４５１−１４５７，１９９９）、これらを用いることができる。また、その他の化合物は、Ｋｏｐｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．８６２−８６４，１９６８又はＮｉｔｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．８６４−８６６，１９６８に記載の方法と同様にして製造することができる。
本発明の脱水素酵素は、種々の分子量のものが存在するが、分子量が７００ｋＤａから８００ｋＤａであるものが好ましい。
本発明の脱水素酵素は、補酵素としてニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、チトクローム類等の天然物の他、ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化物、テトラメチルフェニレンジアミン、キノン類等の合成化合物等を用いることができるが、ＦＭＮ、ＰＱＱ、チトクローム類、ＤＣＩＰ、ＰＭＳ、フェリシアン化物、テトラメチルフェニレンジアミン、キノン類が好ましく、ＤＣＩＰ及び／又はＰＭＳが特に好ましい。
本発明の脱水素酵素は、如何なる生物から得られたものでもよいが、好ましくは細菌、放線菌、糸状菌等の微生物由来、更に好ましくは放線菌由来、特にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ由来のものが好ましい。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ由来の脱水素酵素は、以下に示す理化学的性質を有する。
（ｉ）作用
３位又は６位に存在する炭素−炭素一重結合を炭素−炭素二重結合に変換する活性を有する。
（ｉｉ）基質特異性
フェニラヒスチンをデヒドロフェニラヒスチンに変換し、シクロフェニルアラニルヒスチジルをデヒドロ又はテトラデヒドロシクロフェニルアラニルヒスチジルに変換する。
（ｉｉｉ）至適ｐＨ  ８．３
（ｉｖ）ｐＨ安定性  ７．０〜９．０で安定
（ｖ）至適温度      ６０℃
（ｖｉ）熱安定性    ２０〜７０℃で安定、８０℃で失活
（ｖｉｉ）分子量    ７００ｋＤａから８００ｋＤａ
本発明の脱水素酵素の使用形態は、組織あるいは細胞のままでもよく、無細胞抽出液、あるいはこれを部分精製あるいは完全に精製した酵素液でもよい。精製方法は、一般的な酵素精製方法に従えばよい。また、他の酵素を混合して多段階反応を一度に行ってもよい。
本発明の脱水素酵素を用いることにより、前記式（Ｉ）における（Ｂ１）及び（Ｂ２）の少なくとも一方が炭素−炭素一重結合である化合物、又は前記式（ＩＩ）における（Ｂ２）が炭素−炭素一重結合である化合物を基質として用いて、前記式（Ｉ）における（Ｂ１）及び（Ｂ２）の少なくとも一方が炭素−炭素二重結合である化合物、又は前記式（ＩＩ）における（Ｂ２）が炭素−炭素二重結合である化合物を製造することができ、これらは細胞分裂阻害剤又は抗腫瘍剤として有用である。
以下、本発明を、例を挙げて詳細に説明する。
本発明の細胞分裂阻害剤の活性成分は前記式（Ｉ）における（Ｂ１）及び（Ｂ２）の少なくとも一方が炭素−炭素二重結合である物質であるが、代表的なものとして置換又は非置換デヒドロジケトピペラジン類、置換又は非置換テトラデヒドロジケトピペラジン類、置換又は非置換デヒドロ環状ジペプチド、置換又は非置換テトラデヒドロ環状ジペプチド、特に前記式（ＩＩ）で示される置換又は非置換デヒドロあるいはテトラデヒドロシクロフェニルアラニルヒスチジル、ことにデヒドロフェニラヒスチンを挙げることができる。
以下に、デヒドロフェニラヒスチンを例に取り、その製造法について述べるが、本発明の態様が本例に限らないことはいうまでもない。
放線菌、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ＫＯ２３株（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９４として平成１２年１月１４日付で寄託されている。）を培養し、当該培養物から脱水素酵素を調製し、フェニラヒスチンに作用させ、新規化合物デヒドロフェニラヒスチンを採取する方法は、具体的には後述する実施例にも記載するが、酵素を精製して用いてもよいし、菌体抽出液をそのまま用いてもよい。その脱水素酵素の調製に当たっては、概ねストレプトマイセス属に属する放線菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了後、培養液から本発明の脱水素酵素を精製、もしくは、本酵素活性を含有する菌体抽出液を調製するには、一般に微生物由来酵素を精製するのに通常用いられる手段を適宜利用することができる。例えば、超音波破砕、遠心分離、塩析、透析、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー、或いは結晶化、凍結乾燥等の手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、或いは反復して使用することが可能である。
また、前記のように調製した酵素液もしくは菌体抽出液を用いて脱水素反応を行う方法は具体的には後述する実施例にも記載するが、リン酸緩衝液等の緩衝液中、酵素溶液とその基質であるフェニラヒスチンを混合し反応を行う。必要であれば、有機溶媒を反応液中に加えることも可能である。
前記反応液からデヒドロフェニラヒスチンを精製、単離するには、一般に有機化合物の単離・精製に通常用いられる手段を適宜利用することができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、又は活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー、或いは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥等の手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、或いは反復して使用することが可能である。
以上のようにして製造されるデヒドロフェニラヒスチンは、後述の実施例に示すように細胞分裂阻害活性を有する。デヒドロフェニラヒスチンを活性成分とする本発明の細胞分裂阻害剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤形、投与量（使用量）が適宜決定される。例えば、デヒドロフェニラヒスチンを活性成分とする本発明の抗腫瘍剤の場合、その投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。剤形としては、例えば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤又は注射剤もしくは坐剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の薬学的に許容される添加剤を用いて、既知の方法で製造される。また、前記のデヒドロフェニラヒスチンを活性成分として含有する抗腫瘍剤の臨床的投与量は、患者の年齢、体重、感受性、症状の程度により異なるが、通常効果的な量は、成人一日０．１ｍｇ〜１ｇ程度であり、一日一回又は数回にわけて投与することも可能である。また、必要により前記の範囲外の量を用いることもできる。
また、生化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤又は含水有機溶剤に溶解して各種培養細胞系へ直接投与すると、細胞周期の進行をＧ２／Ｍ期で阻止する。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。剤形としては、例えば、粉末、顆粒等の固形剤もしくは有機溶剤又は含水有機溶剤に溶解した液剤等を挙げることができる。通常前記デヒドロフェニラヒスチンを活性成分とする細胞分裂阻害剤の効果的な使用量範囲は０．０１〜１００μｇ／ｍＬであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により前記の範囲外の量を用いることもできる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０００−９３７０号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例等を記載して本発明を具体的に記載する。なお、以下ｃｙｃｌｏ（Ａ１−Ａ２）（Ａ１及びＡ２のアミノ酸２つが縮合してジケトピペラジン環を形成した環状ジペプチド）をＣＡ１Ａ２（Ａ１及びＡ２はそれぞれアミノ酸１文字表記）と表記し、特記しない限り全てＬＬ体を示し、必要に応じてＤ体をＤＡ１等と表記する。また、デヒドロ体はΔで表し、ＣΔＡ１Ａ２はｃｙｃｌｏ（ΔＡ１−Ａ２）、ＣＡ１ΔＡ２はｃｙｃｌｏ（Ａ１−ΔＡ２）、ＣΔＡ１ΔＡ２はｃｙｃｌｏ（ΔＡ１−ΔＡ２）、ΔＣＡ１Ａ２はＣΔＡ１Ａ２、ＣＡ１ΔＡ２及びＣΔＡ１ΔＡ２の混合物を表す。また、ＰＬＨはフェニラヒスチンを示す。
（実施例１）
（１）フェニラヒスチンの製造を以下のように行った。
グルコース０．５％、グリセリン２％、酵母エキストラクト０．２％、ファーマメディア（綿実かす）２％、塩化ナトリウム０．２５％及び寒天１．５％（ｐＨ６．５）からなる固形培地（直径９ｃｍシャーレに２０ｍＬの前記培地）にフェニラヒスチン生産菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ  ＮＳＣ−ＦＯ３８株（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８３０として平成８年９月３日付で寄託されている。））を５点接種し２６℃で７日間、暗所にて培養を行い、胞子懸濁液を得た。この胞子懸濁液を前記固形培地２０ｍＬを含むシャーレ４００枚に０．１ｍＬずつ接種し、２６℃で８日間、暗所にて培養を行った。この培養物をミキサーにて破砕し、８Ｌの酢酸エチルを加え、２日間放置し、抽出した。回収した酢酸エチル層を減圧濃縮し、褐色のシロップ１５ｇを得た。このシロップを２０ｍＬの酢酸エチルに溶解し、アセトン−酢酸エチル（１：６）で調製したシリカゲルカラム（直径８ｃｍ、長さ２０ｃｍ）に浸潤させ、アセトン−酢酸エチル（１：６）にて溶出を行った。溶出液を５００ｍＬずつを溶出順に従って分画した。フェニラヒスチンは５〜１０番目の分画に溶出され、この溶出物を減圧濃縮することにより計４．７ｇの濃茶色粉末を得た。この濃茶色粉末を１０ｍＬのクロロホルムにて溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲルカラム（直径４ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に浸潤させ、最初にクロロホルム５００ｍＬで溶出し、次にクロロホルム−メタノール（５０：１）にて溶出した。本化合物は、クロロホルム−メタノール（５０：１）溶液にて溶出され、計１．０５ｇの茶色粉末を得た。この茶色粉末に酢酸エチル１００ｍＬを加え、よく撹拌し２日間静置することにより、フェニラヒスチンを白色粉末６２８ｍｇとして析出させた。
（２）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ＫＯ２３株の培養及び無細胞抽出液の調製は以下のように行った。
灰色の胞子が十分に形成されたスラントに、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）５０〜２００μＬを含む滅菌水１０ｍＬを加え、懸濁したものを胞子懸濁液とした。これを培地量の１／１０００量添加し、以下の条件で培養を行った。培地組成を表１に示す。
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培養条件を表２に示す。
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無細胞抽出液の調製は以下のように行った。
培養液４０ｍＬを遠心分離（２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）し、菌体を得た。この菌体を生理食塩水４０ｍＬに懸濁し、再度遠心分離（２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を行い菌体を洗浄した。この菌体をリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．０）７．３ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１５０Ｗ，１．５ｍｉｎ、ＫＵＢＯＴＡ  ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ）を行った。この溶液を遠心分離（２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）した上清をもって無細胞抽出液とした。
（３）フェニラヒスチンのデヒドロフェニラヒスチンへの変換反応、及び反応生成物の精製は以下のように行った。
反応液組成を表３に示す。
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前記反応液１００ｍＬを２０ｍＬずつ２００ｍＬ三角フラスコに分注し、１６０ストローク／分、２４時間反応を行った。反応後、遠心分離（２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）により、黄色沈殿を得た。この沈殿を５５ｍＬのメタノールに溶解し、再度遠心分離（２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を行った。得られた上清を減圧乾固し、メタノールから再結晶を行うことによってデヒドロフェニラヒスチンの黄色針状結晶５．５８ｍｇを得た。
デヒドロフェニラヒスチンの物理化学データを以下に示す。
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ：３４８（Ｍ＋，１００），１３３（２５），１６０（１７），２６０（１６）．
ＵＶ（ＭｅＯＨ）１ｍａｘ，ｎｍ（ｅ）：２０５（１６６００），３６３（３５３００）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ  １．５１，６Ｈ，ｓ
δ  ５．１６，１Ｈ，ｄ（Ｊ＝１７．４）
δ  ５．２０，１Ｈ，ｄ（Ｊ＝１０．７）
δ  ６．０３，１Ｈ，ｄｄ（Ｊ＝１０．７，１７．４）
δ  ６．９６，１Ｈ，ｓ
δ  ６．９８，１Ｈ，ｓ
δ  ７．３２，１Ｈ，ｄ（Ｊ＝７．０）
δ  ７．３７，２Ｈ，ｄ（Ｊ＝７．３）
δ  ７．４３，２Ｈ，ｄｄ（Ｊ＝７．０，７．３）
δ  ７．５７，１Ｈ，ｓ
δ  ８．０４，１Ｈ，ｓ
δ  ９．０６，１Ｈ，ｂｒ  ｓ
δ  １２．２３，１Ｈ，ｓ
また、ジケトピペラジンのプロトン（δ８．０４，１Ｈ，ｓ）とフェニル基のプロトン（ｄ７．４３，２Ｈ，ｄｄ（Ｊ＝７．０，７．３））との間にＮＯＥが観測されたことから本化合物を（Ｚ，Ｚ）−ｄｅｈｙｄｒｏｐｈｅｎｙｌａｈｉｓｔｉｎと決定した。その構造式を式（ＩＩＩ）として示す。
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（実施例２）
シクロフェニルアラニルヒスチジル（ＣＦＨ）の脱水素反応によるデヒドロ体の製造を以下のように行った。
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表４に示す組成の反応液１００ｍＬを作成し、５本の２０ｍＬ三角フラスコに分注し、レシプローカル（１６０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ）、５０℃、２４時間反応を行った。２４時間後、反応液を遠心分離（４℃、２０，０００×ｇ、１５分）し、上清を得た。この上清を酢酸エチルで抽出、高速液体クロマトグラフィーによる精製（精製条件：Ｗａｔｅｒｓ  ６００  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ，４８６  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，６１６  Ｐｕｍｐ，カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３直径２０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶媒６０％メタノール，流速１０ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ  ２５６ｎｍ）を行い、リテンションタイム３．９分、９．１分、１１．６分に３種類のデヒドロ体を得た。機器分析の結果、保持時間９．１分の物質は式（ＩＶ）で示されるＥ−テトラデヒドロ体（ＣＥ−ΔＦΔＨ）であり、１１．６分の物質は式（Ｖ）で示されるＺ−テトラデヒドロ体（ＣＺ−ΔＦΔＨ）であり、３０．１分の物質は式（ＶＩ）で示されるデヒドロ体（ＣＦΔＨ）であることがわかった。
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式（Ｖ）で示される化合物の物理化学データを以下に示す。
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ：２８０（Ｍ＋，１００），１０７（３６），２７９（２９），２８１（１８）．
ＵＶ（ＭｅＯＨ）１ｍａｘ，ｎｍ（ｅ）：２０５（１４８００），２５７（６５００），３５１（２７１００）．
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ  ６．７７，１Ｈ，ｓ
δ  ７．０２，１Ｈ，ｓ
δ  ７．２２，１Ｈ，ｍ
δ  ７．３３，１Ｈ，ｔ（Ｊ＝７．３）
δ  ７．３７，２Ｈ，ｄ（Ｊ＝７．３）
δ  ７．４３，２Ｈ，ｄｄ（Ｊ＝７．３，７．３）
δ  ７．７５，１Ｈ，ｓ
δ  ８．０９，１Ｈ，ｓ
δ  ９．３０，１Ｈ，ｂｒ  ｓ
δ  １１．９１，１Ｈ，ｓ
（実施例３）
各種ジケトピペラジン類を基質とし、本発明の酵素を用いて脱水素反応を行うことにより、各種ジケトピペラジンデヒドロ体の製造を以下のように行った。
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表５に示す組成の反応液を用い、３７℃で反応を行った。反応生成物はＨＰＬＣで分析し、ＵＶ吸収（２５６ｎｍ）で生成物の検出を行った。以下に、本方法により得られたデヒドロ体を示す。
ΔＣＡＦ、ΔＣＦＦ、ΔＣＦＧ、ΔＣＦＨ、ΔＣＦＬ、ＣΔＦＬ、ＣＦΔＬ、ΔＣＦＳ、ΔＣＦＶ、ΔＣＦＷ、ΔＣＬＷ、ΔＣＬＹ、ΔＣＶＹ、ΔＣＷＷ、ΔＣＷＹ、ΔＣＤＷＹ（Ｗ残基がＤ−体）、ΔＰＬＨ
（実施例４）
各種ジケトピペラジン類を基質とし、本発明の酵素を用いて脱水素反応を行うことにより、各種ジケトピペラジンデヒドロ体の製造を以下のように行った。
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表６に示す組成の反応液を用い、３７℃で反応を行った。反応生成物はＨＰＬＣで分析し、フォトダイオードアレイ検出器（多波長ＵＶ，２２０ｎｍ〜４００ｎｍ）で生成物の検出を行った。以下に、本方法により得られたデヒドロ体を示す。ただし、物質名においてＤ（ＯＭｅ）はアスパラギン酸の側鎖（γ位）のカルボキシル基がメチル化されたものを示し、Ｄ（ＯＥｔ）はアスパラギン酸の側鎖（γ位）のカルボキシル基がエチル化されたものを示す。
ΔＣＡＨ、ΔＣＡＷ、ΔＣＡＹ、ΔＣＤ（ＯＭｅ）Ｄ（ＯＭｅ）、ΔＣＤＦ、ΔＣＦＧ、ΔＣＦＳ、ΔＣＦＶ、ΔＣＦＷ、ΔＣＧＬ、ΔＣＧＷ、ΔＣＧＹ、ΔＣＨＨ、ΔＣＨＷ、ΔＣＨＹ、ΔＣＬＰ、ΔＣＬＷ、ΔＣＬＹ、ΔＣＭＭ、ΔＣＳＹ、ΔＣＶＷ、ΔＣＷＷ、ΔＣＷＹ、ΔＣＤＷＹ（Ｗ残基がＤ−体）、ΔＣＤ（ＯＥｔ）Ｇ
（実施例５）
各種ジケトピペラジン類を基質とし、本発明の酵素を用いて脱水素反応を行うことにより、各種ジケトピペラジンデヒドロ体の製造を以下のように行った。
反応は実施例３と同様に行い、補酵素に起因する６００ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより酵素反応量を求めた。表７に各基質毎の酵素反応量（吸光度変化、ＣＦＬを１００とした相対値）を示す。
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（実施例６）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ＫＯ２３株由来の、ジケトピペラジンを基質とする脱水素酵素の精製を実施例１に準じて以下のように行った。  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ＫＯ２３株の培養はミニジャーを用いて行い、培地３Ｌを用いて１６７．１２ｇの菌体を得て、無細胞抽出液を以下のように調製した。
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同抽出液を以下のようにＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけた。
・カラム：  ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ直径２．６ｃｍ×長さ３０ｃｍ
・流速：  １ｍＬ／ｍｉｎ
・フラクションサイズ：  １０ｍＬ
・サンプル：  無細胞抽出液１１３ｍＬ
緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用い、ＤＴＴを０．１ｍＭ加えた。溶出は、サンプル吸着後、緩衝液３６０ｍＬでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌ入り緩衝液４００ｍＬ、０．３ＭのＮａＣｌ入り緩衝液４１０ｍＬ、０．５ＭのＮａＣｌ入り緩衝液６００ｍＬでステップワイズに溶出し、下記の活性フラクションを得た。
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比活性の高いフラクション５０−５６を次のＭｏｎｏ−Ｑカラムクロマトグラフィーにかけた。
・カラム：  ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５
・流速：  １ｍＬ／ｍｉｎ
・フラクションサイズ：  ０．６ｍＬ
・サンプル：  ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌフラクション５０−５６（緩衝液で２倍に希釈）１ｍＬ×４回
緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用い、ＤＴＴを０．１ｍＭ加えた。溶出は、サンプル吸着後、緩衝液で４分間カラムを洗浄し、１ＭのＮａＣｌ入り緩衝液で２５分かけて直線的な濃度勾配をかけて溶出した。４回分のカラムクロマトグラフィーで得られた活性画分は以下のとおりであった。
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前記活性画分を、以下のようにゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２）にかけた。
・カラム：  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３０
・流速：  ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・フラクションサイズ：  ０．２５ｍＬ
・サンプル：  ＭｏｎｏＱ活性フラクション（濃縮  ２２５μＬ）
緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用い、ＤＴＴを０．１ｍＭ、ＮａＣｌを０．３Ｍ加えた。各フラクションにおける活性を表１１に示す。最も活性の高いフラクション１３−１６をまとめ、限外濾過で濃縮した。
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前記活性画分を、以下のように更にＷａｔｅｒｓ  ＬＣ  Ｍｏｄｕｌｅｌを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ）にかけた。
・カラム：  ＴＳＫ  ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ
・流速：  ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・サンプル：  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ活性フラクション（濃縮）  ４０μＬ
緩衝液は１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、ＤＴＴを０．１ｍＭ、ＮａＣｌを０．３Ｍ加えた。活性画分をまとめ、限外濾過で濃縮したものの活性等を表１２に示す。
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以下に、本精製の各ステップにおける活性と最終的な活性を表１３に示す。
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（実施例７）
各種ジケトピペラジン類を基質とし、本発明の酵素を用いて、表１４に示す反応液組成で酵素反応を行った。得られた酵素反応液について、反応生成物を精製することなく反応液のままでサンショウウニの胚分裂阻害活性測定試験を行った。測定方法は、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．１０１７，１９９９記載の方法に従った。ただし、ウニの種類により、第一卵割の時期が異なるため、サンショウウニを用いた本試験においては、受精１時間後に卵割阻害を観察した。また、反応生成物を精製していないので、阻害剤濃度として、酵素反応系中に加えた基質濃度を基準とした。基質濃度相当で、２５μｇ／ｍＬを最高濃度とし、以下段階的に希釈をしてサンショウウニの胚分裂阻害活性測定試験を行った結果を表１５に示す。
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（実施例８）
各種脱水素型ジケトピペラジン類の生理活性について以下に述べる。細胞分裂阻害活性として、バフンウニ、ハスノハカシパン及びサンショウウニを用い、それぞれに対する卵割阻害活性（細胞分裂阻害活性）を測定した。測定方法はＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．１０１７，１９９９記載の方法に従った。ただし、ウニの種類により、第一卵割の時期が異なるため、バフンウニ、ハスノハカシパンを用いた試験においては受精４時間後に、また、サンショウウニを用いた試験においては、受精１時間後に卵割阻害を観察した。その結果を表１６に示す。
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デヒドロフェニラヒスチンのハスノハカシパン、サンショウウニの細胞分裂に対するＭＩＣは、いずれも、０．００６１μｇ／ｍＬ、バフンウニの細胞分裂に対するＭＩＣは、０．０００３８μｇ／ｍＬであり、脱水素化されていない（−）−フェニラヒスチンと比べると２５０倍から１０００倍の阻害活性を示した。また、ＣＦＨを脱水素化することによって得られた（Ｚ，Ｚ）−ｔｅｔｒａｄｅｈｙｄｒｏ−ＣＦＨは、ＣＦＨの１５倍以上の阻害活性を示した。いずれにしても、デヒドロフェニラヒスチンや（Ｚ，Ｚ）−ｔｅｔｒａｄｅｈｙｄｒｏ−ＣＦＨをはじめとする種々のデヒドロジケトピペラジン類に細胞分裂阻害効果が見られたことは、デヒドロジケトピペラジン類が細胞分裂阻害剤及び抗腫瘍剤として有用であることを示している。
（製剤例１）  注射・点滴剤
デヒドロフェニラヒスチン１ｍｇを含有するように、粉末ブドウ糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、０．８５％生理食塩水１００ｍＬを添加して静脈内注射剤とし、１日１０〜１００ｍＬを症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与する。
（製剤例２）  注射・点滴剤
デヒドロフェニラヒスチン０．２ｍｇを用いて、製剤例１と同様の方法により軽症用静脈内注射剤とし、１日１０〜１００ｍＬを症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与する。
（製剤例３）  顆粒剤
デヒドロフェニラヒスチン１００ｍｇ、乳糖９８ｇ及びヒドロキシプロピルセルロース１ｇを各々とり、よく混合した後、常法に従って粒状に成形し、これをよく乾燥して篩別してビン、ヒートシール包装等に適した顆粒剤を製造した。１日１００〜１０００ｍｇを症状に応じて経口投与する。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、強力な細胞周期阻害活性、特に抗腫瘍活性を有する細胞分裂阻害剤、及びその製造に使用可能な酵素が提供される。