(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｉタンパク質発現または免疫調節機能の特異的調節因子を含有するが、哺乳類のＢ７分子をコードする外来の構築物を含まないＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞であって、該特異的調節因子が配列番号：５４、５３、５２、４０、５５、３２、６２、６４、４８、１１、６８、７１、７２、７５、７７、７８及び７９よりなる群から選択される配列のヌクレオチド塩基である共重合体からなるものであり、該共重合体が生理条件下で哺乳類のＩｉタンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的領域に特異的にハイブリダイズし、ハイブリダイズしたＲＮＡ分子を形成することに特徴があるものであり、かつ、該特異的調節因子がＩｉ発現を阻害することに特徴があるものである、上記ＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２】
ヌクレオチド塩基がホスホロアミデート、ホスホトリエステル、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルケニルリボース、２’−Ｏ−置換アルキルリボース、モルホリン及びアミド結合よりなる群から選択される成分を含む主鎖に結合されている請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３】
ＲＮＡ分子のヌクレオチド塩基がアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２、６−ジアミノプリン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンよりなる群から選択される請求項２記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項４】
ヌクレオチド塩基配列が哺乳類Ｉｉタンパク質をコードするＲＮＡ分子の翻訳開始部位に相補的である請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項５】
特異的調節因子が配列番号：５４のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項４記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項６】
特異的調節因子が配列番号：５３のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項４記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項７】
特異的調節因子が配列番号：５２のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項４記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項８】
特異的調節因子が配列番号：４０のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項４記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項９】
特異的調節因子が配列番号：５５のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項４記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１０】
ヌクレオチド塩基配列が該ＲＮＡ分子のスプライス部位の境界となるエキソンの部分に相補的である請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１１】
特異的調節因子が配列番号：３２のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項１０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１２】
特異的調節因子が配列番号：６２のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項１０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１３】
特異的調節因子が該ＲＮＡ分子のイントロンスプライシングを阻害する請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１４】
特異的調節因子が該ＲＮＡ分子の第一エキソンの３’末端の部分及び第一イントロンの５’末端の部分に相補的な請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１５】
特異的調節因子が該ＲＮＡ分子の終止コドンの３’の領域に相補的である請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１６】
特異的調節因子が配列番号：６４のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項１５記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１７】
特異的調節因子が該ＲＮＡ分子の開始コドンの５’の領域に相補的である請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１８】
特異的調節因子が配列番号：４８のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項１７記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項１９】
特異的調節因子がＣＬＩＰペプチドをコードする領域に相補的である請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２０】
特異的調節因子が配列番号：１１のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項１９記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２１】
特異的調節因子がハイブリダイズしたＲＮＡ分子に特異的調節因子を架橋する１つまたはそれ以上の化学基に末端または内部の部位で結合している請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２２】
化学基がアルキル化基である請求項２１記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２３】
特異的調節因子が該ＲＮＡ分子の切断を触媒する化学基に結合している請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２４】
化学基がキレート化剤である請求項２３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２５】
特異的調節因子が該ＲＮＡ分子を切断するように設計されたリボザイムである請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２６】
特異的調節因子がハイブリダイゼーションを安定させるために哺乳類Ｉｉタンパク質をコードするＲＮＡ分子のヌクレオチド塩基中に挿入される化学基に結合している請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２７】
特異的調節因子が細胞の取り込みを高める化学成分に結合している請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２８】
特異的調節因子が特定の細胞タイプによる取り込みを導く化学成分に結合している請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項２９】
特異的調節因子が薬理学的性質または毒性プロフィールを改善する化学成分に結合している請求項３記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３０】
特異的調節因子がｃＤＮＡ分子である請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３１】
特異的調節因子が配列番号：６８のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３２】
特異的調節因子が配列番号：７１のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３３】
特異的調節因子が配列番号：７２のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３４】
特異的調節因子が配列番号：７５のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３５】
特異的調節因子が配列番号：７７のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３６】
特異的調節因子が配列番号：７８のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３７】
特異的調節因子が配列番号：７９のヌクレオチド塩基配列を含んでなる請求項３０記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３８】
特異的調節因子がウイルス発現ベクターから発現される請求項１記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【請求項３９】
ウイルス発現ベクターが哺乳類細胞へのトランスフェクションを増大できることを特徴とする請求項３８記載のＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
特定の抗原に対する免疫応答は、Tリンパ球によるこれらの抗原のペプチドフラグメントの認識により調節される。抗原提示細胞内で、プロセシングされた抗原のペプチドフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の抗原性ペプチド結合部位に結合されるようになる。次に、これらのペプチド-MHC複合体は、ヘルパーまたは細胞傷害性Tリンパ球上のT細胞受容体による（外来ペプチド及び提示するMHC分子の隣接する表面の両方の）認識のために細胞表面に輸送される。ペプチドを送達する２つのクラスのMHC分子、クラスI MHC及びクラスII MHCがある。
【０００２】
クラスI MHC分子は抗原をCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球に提示し、これらは次に活性化されるようになり、抗原提示細胞を直接殺すことができる。クラスI MHC分子は、感染性ウイルスのような内因的に合成されたタンパク質からのペプチドのみをそれらの合成の時点ごろに小胞体において受け取る。
【０００３】
クラスII MHC分子は、抗原をCD4陽性ヘルパーTリンパ球（Tヘルパー細胞）に提示する。いったん活性化されると、Tヘルパー細胞は、物理的接触及びサイトカイン放出により細胞傷害性Tリンパ球（Tキラー細胞）及びBリンパ球の活性化に寄与する。クラスI MHC分子と異なり、クラスII MHC分子は、非特異的または特異的エンドサイトーシスにより内在化されている外来抗原に結合する。合成の時点ごろに、クラスII MHC分子は、インバリアント鎖タンパク質（Ii）を代わりに結合することにより内因性抗原を結合するのを阻止される。これらのクラスII MHC-Iiタンパク質複合体は、小胞体から後ゴルジコンパートメントに輸送され、そこでIiはタンパク質分解により遊離され、外来抗原性ペプチドが結合される（Daibata et al., Molecular Immunology 31: 255-260 (1994); Xu et al., Molecular Immunology 31: 723-731 (1994)）。
【０００４】
クラスI MHC及びクラスII MHC分子は、細胞間で異なる分布を有する。発現のレベルは細胞タイプ間で異なるが、ほとんど全ての有核細胞はクラスI MHC分子を発現する。免疫系の細胞はそれらの表面上に多量のクラスI MHCを発現し、一方、肝臓細胞は比較的低いレベルを発現する。非有核細胞は、ほとんどまたは全くクラスI MHCを発現しない。クラスII MHC分子は、Bリンパ球及びマクロファージ上に非常に発現されるが、他の組織細胞上には発現されない。しかしながら、サイトカインにさらすことにより多数の他の細胞タイプをクラスII MHC分子を発現するように誘導することができる。
【０００５】
正常な状態では、Iiタンパク質が新生のクラスII MHC分子といつも共合成されるので、（自己免疫疾患を潜在的に導く自己抗原決定基を有する）内因性ペプチドはクラスII MHC分子に結合されない。自己抗原決定基ペプチド及びクラスII MHC分子を含有する複合体は、体の免疫監視系により決して認識されないので、これらの抗原決定基に対してトレランスは発達しない。発生した個体においてクラスII MHC分子がIiにより妨げられない場合、内因性自己抗原決定基はクラスII MHC分子により提示されるようになり、これらの内因性抗原に対する自己免疫応答を開始する。このようなことがある種の自己免疫疾患において言える。悪性細胞においてそのような効果を設計することにより、増殖を制限するかまたは腫瘍細胞を除くために腫瘍細胞の内因性抗原に対する「自己免疫応答」を治療的に用いることができる。
【０００６】
Iiタンパク質の付随する増加のない増加したクラスII MHC分子発現の治療効果が、クラスII MHC陰性、Ii陰性腫瘍において示されている（Ostrand-Rosenberg et al., Journal of Immunol. 144: 4068-4071 (1990); Clements et al., Journal of Immunol. 149: 2391-2396 (1992); Baskar et al., Cell. Immunol. 155: 123-133 (1994); Baskar et al., J.Exp. Med. 181: 619-629 (1995); 及びArmstrong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6886-6891 (1997)）。これらの研究では、クラスII MHC陰性のマウス肉腫へのクラスII MHC分子の遺伝子のトランスフェクションにより、クラスII MHC陽性であるがIi陰性の腫瘍細胞系が作製された。これらの細胞をMHC適合宿主に注入することにより、親腫瘍の遅延増殖が導かれた。クラスII MHC遺伝子と一緒に肉腫細胞系にIiタンパク質の遺伝子を共トランスフェクションすることにより、Ii鎖が内因性腫瘍抗原の提示を阻止するのでクラスII MHC遺伝子の腫瘍治療効果は抑制された。同様の結果がマウス黒色腫で示されている（Chen及びAnanthaswamy, Journal of Immunology 151: 244-255 (1993)）。
【０００７】
この治療方法の成功は、樹状細胞の生来の活性を伴うと考えられる。樹状細胞は、外来抗原をペプチドにプロセシングし、それらの細胞表面上のMHC抗原からTリンパ球にそれらを提示するプロフェッショナルスカベンジャーである。樹状細胞は、クラスI及びクラスII MHC分子の両方により抗原を提示する能力があり、それらがTヘルパー細胞及びTキラー細胞の両方を活性化できるようにする。強力なTキラー細胞応答を引き出すためには効果的なTヘルパー細胞応答が必要とされ、そして樹状細胞により引き起こされる複合活性化は増大した抗腫瘍応答を導くと考えられる（Ridge et al., Nature 193: 474-477 (1998); Schoenberger et al., Nature 193: 480-483 (1998)）。マクロファージ直系の樹状細胞は、腫瘍細胞を見つけると腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原の両方を摂取し、プロセシングする。次にこれらの樹状細胞は、腫瘍部位に排出する（drain）リンパ節に移動し、新しいT細胞が発生する節皮質近くのこれらの節において存在する。節皮質において、樹状細胞上の腫瘍抗原決定基を認識する休止T細胞は活性化されるようになり、増殖し、続いて能力を有する抗腫瘍キラーT細胞として循環中に放出される。
【０００８】
Tヘルパー細胞との相互作用は、クラスI MHC分子により抗原を提示するように、従ってTキラー細胞を活性化するように樹状細胞を活性化するかまたは「認可する（license）」が、Tヘルパー細胞及びTキラー細胞との同時の相互作用は必要でなく；活性化された樹状細胞は、Tヘルパー細胞によりもたらされる活性化の後しばらくの間Tキラー細胞を刺激するそれらの能力を維持する。クラスII MHCまたはクラスI MHC抗原決定基のいずれかにより提示されるようになるそれぞれの抗原性ペプチドは、１つの抗原性タンパク質に由来する必要はなく、悪性細胞からの２つまたはそれ以上の抗原を樹状細胞によりプロセシングし、提示することができる。従って、おそらく腫瘍特異的でないある抗原決定基に対する認可は、それと共に別のおそらく腫瘍特異的な抗原決定基に対するTキラー細胞の活性化を認可する能力を保有する。そのような「副次的（minor）」または「隠れた」抗原決定基は、様々な治療目的のために用いられている（Mougdil et al., J. Immmunol. 159: 2574-2579 (1997)）。
【０００９】
クラスII MHC抗原提示の実験的改変は、これらの副次的抗原決定基に対する免疫応答を拡大すると考えられる。クラスII MHC分子に載せるために通常利用できない一連のペプチドは、クラスII MHC提示のための多様なペプチドの豊富な供給源を提供する。この一連の抗原決定基の利用により、応答性Tヘルパー細胞の集団の拡大が導かれる。そのような拡大した集団は樹状細胞認可を引き出し、そのいくつかは腫瘍特異的及び腫瘍関連抗原決定基に対して導かれる。正常細胞は潜在的に腫瘍細胞抗原決定基を共有するが、正常細胞にはわずかな細胞損傷のみが起こる。これは、抗腫瘍応答の多数のエフェクター応答（多量のキラーT細胞、周囲の活性化するサイトカイン、貪食するマクロファージ及びそれらの生成物等）が正常細胞に対して導かれないからである。
【００１０】
通常のクラスII MHC抗原提示は、Iiタンパク質とクラスII MHC分子との相互作用を阻害することにより改変することができる。これは総Iiタンパク質を減らすことにより（例えば、発現を減らすことにより）またはそうでなければIi免疫調節機能を妨げることにより成し遂げられる。Ii発現の阻害は、様々なアンチセンス技術を用いて成し遂げられている。Iiタンパク質のmRNAのAUG部位と相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、外来抗原のクラスII MHC提示を減らすために記述されている（Bertolino et al., Internat. Immunology 3: 435-443 (1991)）。しかしながら、Iiタンパク質の発現及びクラスII MHC分子による内因性抗原の提示に対する影響は調べられなかった。より最近では、Humphreys et al., 米国特許5,726,020 (1998)は、クラスII MHC分子を発現する抗原提示細胞に導入するとIiタンパク質発現を効果的に抑制する３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド及び１つの逆遺伝子構築物を同定している。この機構によりIi抑制される腫瘍細胞を接種したマウスは、未処置の親腫瘍細胞を接種したマウスより著しく長く生存することが示された。この結果は、Iiタンパク質の抑制が抗原性決定基提示の範囲の増加を引き起こし、腫瘍細胞に対するより効果的な免疫応答を誘発することを示す。
発明の要約
一つの態様として、本発明は、Iiタンパク質発現または免疫調節機能の特異的調節因子に関する。詳細には、Iiタンパク質合成を翻訳レベルで阻害するために哺乳類Iiタンパク質をコードするRNA分子との二本鎖分子の形成によって機能するものを包含する、Iiの特異的調節因子のいくつかの形態が開示される。この種類には、哺乳類Iiタンパク質をコードするRNA分子に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド塩基を含んでなる共重合体、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド並びにIi RNAに特異的にハイブリダイズするRNA分子をコードする発現可能な逆遺伝子構築物が包含される。別の態様として、本開示は、Ii発現の特異的調節因子を含有するクラスII MHC陽性抗原提示細胞に関する。そのような細胞は、例えば、クラスII MHCタンパク質と会合した自己抗原決定基ペプチドの展示において有用である。別の態様として、本発明は、望まれていない細胞に対する免疫学的攻撃を高めることにより患者における疾患、例えば悪性腫瘍及び自己免疫疾患を処置する方法に関する。これらの方法は、クラスII MHC陽性抗原提示細胞を用意すること及び内因性抗原決定基の提示を高めるためにIiタンパク質発現の特異的調節因子を導入することを含む。次にこれらの細胞及びその生成物は患者の免疫系を刺激するために用いられる。
発明の詳細な記述
以前の発見の組み合わせは、総合的に、クラスII MHC抗原提示細胞におけるIiタンパク質発現の阻害がIiタンパク質の機能を妨げ、そして免疫系に対してクラスII MHC分子により提示される抗原性エピトープの範囲及び選択を非常に改変することを示す。細胞におけるIiタンパク質発現は、特定のオリゴヌクレオチドまたは逆遺伝子構築物を用いてアンチセンス技術で特異的に且つ効率よく阻害できることが以前に示されている。米国特許第5,726,020号（Humphreys et al.）は、この以前の研究を例示しており、この特許の開示は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は、一つには、Iiタンパク質発現の阻害を引き起こすさらなる組成物の発見に基づく。これらの組成物及びそれらを同定した方法は、本明細書において開示されている。これらの発見から生じるのは、個体内の細胞のIiタンパク質発現または免疫調節機能を妨げることに起因する抗原決定基の増大した提示により、個体から関連細胞集団を取り除く免疫応答が導かれるという発見である。この発見は、いくつかの有用な治療目標を達成するために本発明において利用され、それらの多くは、個体から望まれていない細胞集団を取り除くことに対して向けられる。
【００１１】
本発明の一つの態様は、Iiタンパク質発現または免疫調節機能の特異的調節因子である（オリゴヌクレオチドCTCGGTACCTACTGGを特に除く）。クラスII MHC分子を発現する細胞へのIiのこの特異的調節因子の送達により、細胞のクラスII MHC分子が結合する抗原決定基の範囲及び選択が改変され、従って、その細胞の抗原提示が改変される。いくつかの組成物がIiの特異的調節因子として機能し、そして各々をそれらの作用機構により分類することができる。
【００１２】
一つの態様として、Iiの特異的調節因子は、哺乳類Iiタンパク質をコードするRNA分子との二本鎖分子の形成によって機能する。二本鎖分子の形成は、Iiタンパク質合成を翻訳レベルで阻害する。この特異的調節因子は、ワトソン-クリック塩基対合によりIi RNAのもう一方の塩基とのヌクレオチド塩基の結合をもたらすように共重合体主鎖上に適切に間隔を置いたヌクレオチド塩基を含有することができる。二本鎖分子の形成に関与するIi RNA配列は、限定なしに：タンパク質コーディングセグメント（エキソン）中、介在セグメント（イントロン）中、エキソンとイントロンの間の重複部分（スプライス部位）、タンパク質翻訳の開始部位（AUG部位）、AUG部位の上流（例えばCAP部位もしくは他の配列特異的調節部位）またはコーディングセグメントから下流（3'ポリアデニル化配列特異的調節部位中）であることができる。
【００１３】
Ii RNAと二本鎖分子を形成するために２つの一般的なタイプの特異的調節因子を用いることができる。第一のタイプは、10〜50ヌクレオチド塩基を含有する化学的に合成した共重合体である。この共重合体は、アンチセンス配列として別に知られている、RNA分子の標的部分に相補的なヌクレオチド塩基配列を含有する。そのような共重合体の一例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。この共重合体は、２つの機構によりRNAからのタンパク質翻訳を阻害する。一つの方法は、リボソーム、スプライソソームまたはRNA成熟もしくは翻訳のために必須である他の因子と相互作用しなければならないRNAの部分への接近を阻止することである。もう一つの方法は、DNAにハイブリダイズしたRNAの配列を切断する酵素、リボヌクレアーゼHの相乗作用（potentiation）を伴う。従って、RNA中の対応するセグメントへのDNAまたはDNA様共重合体の結合により、共重合体結合部位でRNAの切断が導かれる。
【００１４】
この共重合体は、ワトソン-クリック塩基対合により標的RNAにハイブリダイズする。この共重合体の配列は、標的RNAの相補的配列により定義される。共重合体は、一般に、標的RNAの少なくとも６個の相補的ヌクレオチドにまたがるヌクレオチド配列の長さで化学的に合成することができ、12-25が最も一般的である。統計学的に、約15ヌクレオチドの配列は、細胞内の全てのRNAの集団内で独特であり、高度の特異性であらゆる特定のRNAを標的とすることができる。20塩基対を含む共重合体では、RNAへの結合はまたKd値約10-17Mで非常に安定である。
【００１５】
ある場合には、培養中の細胞は、有用な効果を得るために十分な量の共重合体を自然に取り込む。そのような取り込みは、生化学的エネルギー及びある種の細胞表面タンパク質の関与を必要とする能動プロセスであるようである。取り込みはまた、飲作用によっても起こる。この経路は、共重合体を含有する高張培地中で細胞をインキュベーションし、続いてそれらの細胞をわずかに低張な培地に再懸濁して細胞内の飲作用小胞の破裂を引き起こすことにより高めることができる。別の場合には、脂質もしくはリポソームの使用により、電気穿孔により、または細胞膜を透過性にするためのストレプトリジンO処理により取り込みを助けることができる。インビボの細胞は、培養した細胞より容易に共重合体を取り込むことが多い。電気穿孔による共重合体の細胞取り込みの最適条件を以下の実施例2において示す。
【００１６】
標的RNAの可能性がある部位は、タンパク質の機能性複合体の結合を受けやすいもの及びそうでなければ共重合体結合を受けやすいさらなる部位である。そのような部位は、DNAにハイブリダイズしているRNAを切断する酵素、リボヌクレアーゼH（RNアーゼH）を用いて同定することができる。リボヌクレアーゼHの存在下で5'-放射性リン標識したRNAにDNAオリゴヌクレオチドを単独でまたは混合物で加えることにより、RNAのゲル電気泳動及びオートラジオグラフィー後にオリゴヌクレオチド及び他の共重合体がハイブリダイズするRNA上の部位が同定される。Iiアンチセンスオリゴヌクレオチドでのそのような実験を実施例１において示す。RNアーゼH切断を最も受けやすいと本発明において見出されたIi RNA中の部位は、AUG開始コドンの領域及びmRNA前駆体中の第一スプライス部位の領域であった。
【００１７】
本発明に関する「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合によりつながれた天然に存在する塩基及びペントフラノシル糖と共に形成されたヌクレオチド単位を含んでなるポリヌクレオチドをさす。「共重合体」という用語には、オリゴヌクレオチド並びにオリゴヌクレオチドの非天然に存在するかまたは改変したサブユニットから形成される構造的に関連した分子が包含される。これらの改変は、ヌクレオチドの塩基部分、ヌクレオチドの糖部分またはヌクレオチド間結合基のいずれかに対して起こる。共重合体を作製するためにさらなる結合基が天然のオリゴヌクレオチドの糖及びリン酸エステル主鎖の代わりに用いられることも多く、以下にさらに詳細に説明する。
【００１８】
そのようなオリゴヌクレオチド改変及び生み出される特徴は、当業者が容易に利用できる。典型的な改変は、米国特許第4,469,863号(1984)；米国特許第5,216,141号(1993)；米国特許第5,264,564号(1993)；米国特許第5,514,786号(1996)；米国特許第5,587,300号(1996)；米国特許第5,587,469号(1996)；米国特許第5,602,240号(1997)；米国特許第5,610,289号(1997)；米国特許第5,614,617号(1997)；米国特許第5,623,065号(1997)；米国特許第5,623,070号(1997)；米国特許第5,700,922号(1997)；及び米国特許第5,726,297号(1998)に示されており、これらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００１９】
相補的RNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力は、化学的改変に非常に寛容である。従って、多数の異なる機能性共重合体が可能である。特に、糖リン酸エステル主鎖は、ワトソン-クリック塩基対合を形成する能力を失わずに大きく改変することができる。自明のこととして、ヌクレオチドは、糖、窒素複素環及びリン酸エステル成分を含んでなる。オリゴヌクレオチドのある合成類似体は、糖もしくはリン酸エステル基のいずれかまたは両方を欠くが、それでもなおアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じようにワトソン-クリック塩基対によりハイブリダイズすることができ、同じ目的のために用いることができる。ヌクレオチド塩基を含有するこれらの共重合体は、RNAにハイブリダイズすることにおいてオリゴヌクレオチドの機能性同等物である。以下に要約するのは、アンチセンス用途のためのオリゴヌクレオチドに対するそれらの特性を変え改善する改変のいくつかである。
1.  負に荷電した類似体を与えるためにリン酸エステルの非架橋酸素原子の一つを硫黄（Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)）、セレン（Mori et al., Nucleic Acids Res. 17: 8207-8219 (1989)）または置換されたホウ素（Porter et al., Nucleic Acids Res. 25: 1611-1617(1997)）により置換する。
2.  両方の非架橋酸素原子を硫黄で置換する（Vaughn et al., Nucleic Acids Res. 24: 4558-4564 (1996)）。
3.  荷電していないホスホトリエステル（Hayakawa et al., J. Org. Chem. 60: 925-930 (1995); Iyer et al., Tetrahedron 52: 14419-14436 (1996); Zhang et al., Bioorg. Medicinal. Chem. Letter 6: 1911-1916 (1996)）、ホスホン酸エステル（Sarin et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 85: 7448-7451 (1988)）またはアミドリン酸エステル（Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)）を与えるために非架橋酸素原子の一つをメチルまたは置換された窒素原子によりエステル化するかまたは置換する。
4.  2個の架橋酸素原子を異なる順列及び組み合わせで硫黄または窒素により置換する（Gryaznov et al., Nucleic Acids Res. 24: 1508-1514 (1996); Goodchild, Bioconjugate Chem. 1: 165-187 (1990)）。
5.  （例えば、メチルホスホノチオエート（methylphosphonothioate）を生成するために）上記置換を組み合わせる（Padmapriya & Agrawal, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 3: 761-764 (1993)）。
6.  リンを含有せず且つ荷電していない原子の他の配置によりヌクレオシド間リン酸エステル基を置換する（Sanghvi & Cook, Carbohydrates: synthetic methods and applications in antisense therapeutics. An overview. 1章. Carbohydrate Modifications in Antisense Research中. (:Sanghvi, Cook) (ACS Symposium Series, 580). American Chemical Society, Washington, DC 1-22 (1995); De Mesmaeker et al., Account. Chem. Res. 28: 366-374 (1995); Kiely, Nucleic Acids Res. 20: 1339-1344 (1994)）。
7.  糖はリボースまたは2'-デオキシリボースである。リボース中の2'-ヒドロキシル基をハロゲン、アミノもしくは炭素置換基（Kiely, Nucleic Acids Res. 20: 1339-1344 (1994); De Mesmaeker et al., Account. Chem. Res. 28: 366-374 (1995); Sanghvi & Cook, Carbohydrates: synthetic methods and applications in antisense therapeutics. An overview. 1章. Carbohydrate Modifications in Antisense Research中. (:Sanghvi, Cook) (ACS Synposium Series, 580). American Chemical Society, Washinton, DC 1-22 (1995); Freier & Altmann, Nucleic Acids Res. 25: 4429-4443 (1997)）またはメルカプト（Hamm & Piccirilli, J. Org. Chem. 62: 3415-3420 (1997)）によりアルキル化するかまたは置換する。
8.  α-ヌクレオシド系を与えるために1'位で（Lavignon et al., Antisense Research and Development 2: 315-324 (1992)）、アラビノース系を与えるために2'-位でまたはキシロース系を与えるために3'-位で（Seela et al., Helv. Chim. Acta. 79: 1451-1461 (1996)）糖環の周りの立体化学を変える。
9.  糖はフラノシルもしくはピラノシル（Pitsch et al., Helv. Chim. Acta. 78: 1621-1635 (1995)）、ペントースもしくはヘキソース（Herdewijn, Liebigs Annalen 1996: 1337-1348 (1996)）である。
10.   ハイブリダイゼーションを改善するためにC3'-C5'位を挟んでまたは糖と塩基の間に別の環を縮合させることによりリボフラノシル環をより堅固にする（Tarkoy et al., Helv. Chim. Acta. 77: 716-744 (1994); Herdewijn, Liebigs Annalen 1996: 1337-1348 (1996)）。
11.  ヌクレオチドを（通常のように）3'-5'または2'-5'連結する（Maran et al., Science 265: 789-792 (1994)）。
12.  糖をモルホリンにより置換する（Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug D. 7: 63-70 (1997)）。
13.  「ペプチド核酸」（pna）を与えるために糖リン酸エステル主鎖をペプチド主鎖により置換する（Egholm et al., Nature 365: 566-568 (1993)）。
【００２０】
現在、以下のサブセットの改変が最も一般的に用いられる：
糖は2'-デオキシリボースまたは2'-O-メチルリボース [または2'-O-アリルリボースまたは2'-O-(2-メトキシ)エチルリボース] であり、そしてリン酸エステル基は以下のもののいずれかである：
1．改変されていないホスホジエステル
2．硫黄（モノチオリン酸エステル）、メチル（メチルホスホン酸エステル）または置換された窒素（アミドリン酸エステル）により置換された非架橋酸素を有する。
【００２１】
3．NHにより置換されたC3'に架橋する酸素原子を有する（アミドリン酸エステル）。
【００２２】
オリゴヌクレオチド同等物の中で、ペプチド核酸及びモルホリノ誘導体が効果的な共重合体として最も一般的に用いられる。また、ピロール-イミダゾールポリアミドを用いることもできる（Gottesfeld, J. M., Nature 387: 202-205 (1997)）。
【００２３】
各改変は異なる特性を有し、所望の特性を有する共重合体を生成するために単一のオリゴヌクレオチド鎖に様々な改変を組み合わせることができる。例えば、リボヌクレアーゼHを活性化するホスホジエステルまたはモノチオリン酸エステル結合の中心ブロックをエキソヌクレアーゼに対してより抵抗性である隣接する配列と組み合わせることができる（米国特許第5,491,133号 (1996)）。
【００２４】
共重合体の塩基は、ワトソン-クリック塩基対合を妨げないかぎり改変することができる。そのような改変は、ハイブリッドの安定性を増すために一般的に利用される。例には、CもしくはU及びTに置き換わる5-置換されたシトシンもしくはウラシル、特に5-プロピニルシトシン及び5-プロピニルウラシルまたはAに置き換わる2,6-ジアミノプリンがある（Freier & Altmann, Nucleic Acids Res. 25: 4429-4443 (1997)）。
【００２５】
mRNAの二次及び三次構造のために、分子のある部分は、共重合体ハイブリダイゼーションのために接近できないかまたは利用できない可能性がある。タンパク質結合に利用できるRNA部位は、より共重合体結合のために利用可能であると思われる。これらには、リボソーム集合が起こる5'-キャップ及びAUG開始コドン、mRNA前駆体中のスプライス部位並びにポリアデニル化シグナル（Goodchild et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 85: 5507-5511 (1988); Dominski & Kole, Mol. Cell. Biol. 14: 7445-7454 (1994)）が包含される。翻訳の無細胞研究において、mRNAの5'-キャップ及びAUG開始コドンが特に効果的な部位であること並びにキャップにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドがリボソームの結合及びポリソームの集合を妨げることが見出された（Goodchild et al., Arch. Biochem. Biophys. 263: 401-409 (1988)）。
【００２６】
以下の実施例の節の実施例１及び3において詳述する初期研究において、AUG開始領域に相補的な配列番号:40（表１）及びIi ｍRNA中の第一スプライス供与部位に相補的な配列番号:32に記載した共重合体は、ハイブリダイゼーション及びIi阻害で最大活性を示した。
【００２７】
共重合体結合に利用できる領域が同定されると、これらの領域を標的とするために最も有効な配列を見出すために追加の重複する共重合体を合成した(表5)。これらの共重合体を前のようにアッセイし、Ii阻害における活性（表6A）並びに細胞毒性（表6B）に関して調べた。これらの規準により最も有効な化合物、配列番号:54は、AUGイニシエーターに相補的であり、またクラスII MHC発現、細胞の回収及び生存能力に対して最低限の影響しか生じない。RNA分子のスプライス部位の境界となるエキソンの部分に、より詳細には第一スプライス供与領域中の配列に相補的な配列に相当する配列番号:62に記載した共重合体もまた強い活性を示す。
【００２８】
以下の実施例の節において示すように、特定の共重合体は、RNアーゼHアッセイで明らかにされるようにIi RNAの特定のセグメントにハイブリダイズし、そして免疫蛍光FACSアッセイで明らかにされるようにIiタンパク質発現を抑制する。翻訳開始部位に相補的な共重合体の中で、配列番号:54、配列番号:53、配列番号:52、配列番号:40、配列番号:55はRNアーゼHアッセイにおいて効果的であり、そしてIi発現の抑制において特に有効である。スプライス部位の境界となるエキソンの部分に相補的な共重合体、配列番号:32及び配列番号:62は、RNアーゼHアッセイにおいて効果的であり、そしてIi発現の抑制においても有効である。スプライス部位のエキソン及びイントロン境界内の領域に結合するさらなる共重合体は、イントロンスプライシング、従ってIiタンパク質発現を阻害する。詳細には、第一エキソンの3'末端の部分及び第一イントロンの5'末端の部分に相補的なオリゴヌクレオチドは、イントロンスプライシング、従ってIiタンパク質発現を阻害する。終止コドンの3'の領域に相補的なオリゴヌクレオチドの中で、例えば、配列番号:64はIiタンパク質発現を阻害する。開始コドンの5'の領域に相補的なオリゴヌクレオチドの中で、例えば、配列番号:48はIiタンパク質発現を阻害する。CLIPペプチドをコードする領域に相補的なオリゴヌクレオチドの中で、例えば、配列番号:11はIiタンパク質発現を阻害する。
【００２９】
上記の主鎖改変に加えて、共重合体の活性を様々なように高めるためにその
上の部位に他の基を結合させることができる。これらの基は機能性群に分けられる。ハイブリダイズしたRNA分子に共重合体を架橋するために共重合体の末端または内部の部位でアルキル化剤及び他の活性種のような化学基を結合させる。ハイブリダイズしたRNA分子の切断を触媒するように他の化学基を結合させる（例えばキレート化剤）。共重合体中に設計されたリボザイムもまたIi RNAの切断を促進する。共重合体に結合させる化学基の別の群は、共重合体及びIi RNAのハイブリダイゼーションを安定させるためにRNA分子のヌクレオチド塩基中に挿入される。さらに別の結合させる化学成分は、共重合体の細胞取り込みを高める（例えばポリリシン）。さらに別のものは、特定の組織または細胞タイプに共重合体の送達または取り込みを導く。これらの異なる基を共重合体の末端のヒドロキシル基にまたは内部のリン酸エステルに結合させる。さらに、それらは、末端もしくは内部の糖もしくは塩基残基につけたリンカーにまたは鎖中のヌクレオチド間に挿入したリンカーに結合させることができる（総説（Goodchild, Bioconjugate Chem. 1: 165-187 (1990)）を参照）。
【００３０】
架橋及びアルキル化基には以下のものが包含される：
1.  ナイトロジェンマスタード誘導体（Knorre & Vlassov, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 32: 291-320 (1995)）
2.  ジアゾメタン誘導体（Nakatani et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 7626-7635 (1997)）
3.  スペーサー鎖を介してヌクレオシド塩基上の様々な部位に結合させたヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミド官能基（Meyer et al., J. Amer. Chem. Soc. 111: 8517-8519 (1989); Kido et al., Nucleic Acids Res. 20: 1339-1344 (1992); Coleman & Pires, Nucleic Acids Res. 25: 4771-4777 (1997)）
4.  フェナジンジ-N-オキシド（Nagai & Hecht, J. Biol. Chem. 266: 23994-24002 (1991)）
5.  光活性化される（Chatterjee & Rokita, J. Amer. Chem. Soc. 112: 6397-6399 (1990)）かまたはシトクロムcレダクターゼによりキノンメチドに活性化される（Chatterjee & Rokita, J. Amer. Chem. Soc. 113: 5116-5117 (1991)）ナフトキノン
6.  ポルフィリン（Le Doan et al., Bioconjugate Chem. 1: 108-113 (1990)）及び光活性化後のパラジウム(II)-コプロポルフィリン（Fedorova et al., FEBS Letters 259: 335-337 (1990)）
7.  シトシンの代わりに用いることができる5-メチル-N4, N4-エタノシトシン（Webb & Matteucci, Nucleic Acids Res. 14: 7661-7674 (1986)）
8.  光活性化されるソラレン（Bhan & Miller, Bioconjugate Chem. 1: 82-88 (1990)
RNA鎖に結合したハイブリッドの加水分解を触媒する共重合体に結合させる基には以下のものが包含される：
1.  スタフィロコッカスヌクレアーゼ（Zuckermann et al., J. Amer. Chem. Soc. 110: 1614-1615 (1988)）
2.  イミダゾール及び第一級アミン（Ushijima et al., Bba. Gen. Subjects 1379: 217-223 (1998)）またはジアミン（Reynolds et al., Nucleic Acids Res. 24: 760-765 (1996)）
3.  ヒスタミン（Hovinen et al., J. Org. Chem. 60: 2205-2209 (1995)）
共重合体に結合させるキレート化基は、RNA加水分解の金属助成される触媒作用を促進する。いくつかの例には以下のものが包含される：
1.  イミノジアセテート（Matsumura et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994: 2019-2020 (1994)）
2.  フェナントロリン（Perrin et al., Biochemistry 33: 3848-3854 (1994)）
3.  2,2'-ビピリジン及び2,2' : 6',2"-テルピリジン（Bashkin et al., J. Org. Chem. 61: 2314-2321 (1996)）
4.  テキサフィリン（Magda et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 2293-2294 (1997)）
5.  EDTA（Joseph et al., Science 278: 1093-1098 (1997)）
6.  ポルフィリン（Sigman, Biochemistry 29: 9097-9105 (1990)）
7.  ブレオマイシン（Bergstrom & Gerry, J. Amer. Chem. Soc. 116: 12067-12068 (1994)）
8.  2,6-ピリジンジカルボキシレート（Bergstrom & Gerry, J. Amer. Chem. Soc. 116: 12067-12068 (1994)）
9.  2,2'-ジポシリルアミン（2,2'-dipocylylamine）（Bergstrom & Gerry, J. Amer. Chem. Soc. 116: 12067-12068 (1994)）
相補的Ii RNAの切断を触媒する人工リボザイムを作製するためにハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムからの触媒的活性部位を共重合体中に設計することができる（Santoro及びJoyce, A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme 94: 4262-4266 (1997)）。現実に、多数のリボザイムが、RNAプロセシング中にRNAの部位特異的切断において役割を果たす。これらは、他のあまり十分には特性化されていない型に加えて、グループI、グループII、ハンマーヘッド、ヘアピン及びHDVリボザイムを包含するいくつかのタイプに分けることができる（Cech & Bass, Annu. Rev. Biochem. 55: 599-629 (1986)）。触媒的に活性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発は、Christoffersen & Marr, J. Med. Chem. 38: 2023-2037 (1995)により概説されている。あるいはまた、逆遺伝子構築物中にリボザイムを設計するために同じ原理を用いることができ、それは以下に詳細に説明する。
【００３１】
共重合体に結合させる挿入基の例には以下のものが包含される：
1.  蛍光インターカレーター（Endo & Komiyama, J. Org. Chem. 61: 1994-2000 (1996)）
2.  アクリジン（Lancelot et al., Biochemistry 24: 2521-2529 (1985); Asseline et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 81: 3297-3301 (1984); Asseline et al., EMBO J. 3: 795-800 (1984); Asseline et al., J. Biol. Chem. 260: 8936-8941 (1985)）
3.  アントラキノン（Deshmukh et al., Bioconjugate Chem. 6: 578-586 (1995)）
4.  ダウノルビシン（Timofeev et al., Tetrahedron. Lett. 37: 8467-8470 (1996)）
5.  メチジウム（Timofeev et al., Tetrahedron. Lett. 37:8467-8470 (1996)）
6.  オキサゾールイエロー(Ishiguro et al., Nucleic Acids Res. 24: 4992-4997 (1996))
7.  フェナントリン（Puri et al., Tetrahedron 53: 10409-10432 (1997)）
8.  ピレン（Mann et al., Bioconjugate Chem. 3: 554-558 (1992)）
共重合体の細胞取り込みを促進するために結合させる基には以下のものが包
含される：
1.  生物学的膜を通ってトランスロケーションするフューゾジェニック（fusogenic）及び他のペプチド（Bongartz et al., Nucleic Acids Res. 22: 4681-4688 (1994); Allinquant et al., J. Cell. Biol. 128: 919-927 (1995); Chaloin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 243: 601-608 (1998)）
2.  ポリリシン（Degols et al., Antisense Research and Development 2: 293-301 (1992)）
3.  コレステロール及びコール酸（Chow et al., Antisense Research and Development 4: 81-86 (1994)）
共重合体またはIiの特異的調節因子の他の形態の細胞取り込みを増やすため
に用いる複合体、添加剤及び配合物には以下のものが包含される：
1.  リポソーム（Zelphati & Szoka, Pharmaceut. Res. 13: 1367-1372 (1996); Juliano & Akhtar, Antisense Research and Development 2: 165-176 (1992)）
2.  不活化センダイウイルスまたは他の融合タンパク質を含有するリポソーム（Kitajima et al., J. Biol. Chem. 272: 27099-27106 (1997); Morishita et al., Gene 149: 13-19 (1994); Kitajima et al., Arthritis. Rhem. 40: 2118-2127 (1997)））
3.  シクロデキトリン（Zhao et al., Antisense. Res. Dev. 5: 185-192 (1995)）
4.  フューゾジェニックペプチド（Hughes et al., Pharmaceut. Res. 13: 404-410 (1996); Morris et al., Nucleic Acids Res. 25: 2730-2736 (1997)）
5.  カチオン脂質（Zelphati & Szoka, Pharmaceut. Res. 13: 1367-1372 (1996); Capaccioli et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 818-825 (1993)）
6.  核酸に結合する部分及び細胞表面上に広く発現されるインテグリン受容体に結合する別の部分を含んでなるペプチド（Bachmann et al., J. Molecular Med. Imm. 76: 126-132 (1998)）
7.  ストレプトリジン-O（Giles et al., Nucleic Acids Res. 26: 1567-1575 (1998)）
8.  ポリエチレンイミン（Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301 (1995)）
9.  カチオンホスホノリピド（Le Bolc'h et al., Tetrahedron Lett. 36: 6681-6684 (1995)）
10.  デンドリマー（dendrimers）（Hughes et al., Pharmaceut. Res. 13: 404-410 (1996)）
11.  カチオン表面両親媒性物質（cationic facial amphiphiles）（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1585-1590 (1996)）
特定の細胞タイプまたは組織への選択的取り込みを促進する共重合体に結合させる基には以下のものが包含される：
1.  糖タンパク質を内在化する膜レクチンを有する単球及びマクロファージに取り込みを導くためのネオ糖タンパク質（Bonfils et al., Nucleic Acids Res. 20: 4621-4629 (1992)）
2.  核への輸送シグナルとして働くペプチド（Delatorre et al., Tetrahedron. Lett. 35: 2733-2736 (1994)）
3.  好中球を標的とするためのコレステロール、コール酸及びテトラペプチド、fMFLY（Chow et al., Antisense Research and Development 4: 81-86 (1994)）
4.  マンノース特異的表面レクチンを有するマクロファージを標的とするためのマンノース（Akhtar et al., Tetrahedron Lett. 36: 7333-7336 (1995)）
5.  肝臓を標的とするためのアシアロ糖タンパク質（Rajur et al., Bioconjugate Chemistry 8: 935-940 (1997)）
6.  インシュリン増殖因子1受容体を発現する細胞による取り込みを増やすためのインシュリン様増殖因子1のペプチド類似体（Basu & Wickstrom, Bioconjugate Chemistry 8: 481-488 (1997)）
7.  インターロイキン-1βの受容体を発現する細胞による取り込みを増やすためのインターロイキン-1β
特定の細胞または組織タイプに共重合体の取り込みを導くために用いる複合体、添加剤及び配合物には以下のものが包含される：
1.  肝臓特異的アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするアシアロ-オロソムコイドまたはアシアロ糖タンパク質に結合させたポリリシンと複合体を形成するオリゴヌクレオチド（Bunnell et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 18: 559-569 (1992); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 267: 12436-12439 (1992); Lu et al., J. Nucl. Med. 35: 269-275 (1994)）
2.  高レベルのトランスフェリン受容体を発現する細胞を標的とするためにトランスフェリンに結合させたポリリシンと複合体を形成するオリゴヌクレオチド（Citro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7031-7035 (1992)）
3.  ビタミンオリゴヌクレオチドの受容体を過剰発現する急速に分裂する細胞を標的とするために葉酸に結合させたポリリシンと複合体を形成するオリゴヌクレオチド(Citro et al., British J. of Cancer 69: 463-467 (1994); Leopold et al., Blood 85: 2162-2170 (1995))
4.   ストレプトアビジンと結合させたマンノースは、ビオチニル化したオリゴヌクレオチドに結合してマンノース特異的表面レクチンを有するマクロファージへの取り込みを導く（Bonfils et al., Bioconjugate Chem. 3: 277-284 (1992)）
5.  肝細胞を標的とするためのガラクトシル化ポリエチレンイミン（Zanta et al., Bioconjugate Chem. 8: 839-844 (1997)）
好ましい態様として、共重合体の薬理学的性質または毒性プロフィールを改善するために、共重合体を上記の１つまたはそれ以上の化学成分に結合させる。
【００３２】
もたらすことができる薬理学的性質には、生物学的利用能、安定性、血清及び/または生理学的に関係のあるコンパートメントにおける半減期、毒性、並びに有毒なまたは有毒でない可能性がある競合する生物学的作用が包含されるが、これらに限定されるものではない。例えば、共重合体の物理的性質は、コレステロールのような脂肪親和性または荷電した成分の結合により改変される（Ojwang et al., J. Acq. Immun. Defic. Syndrome 7: 560-570 (1994)）。この改変は、共重合体の生物学的性質に影響を与える（Chow et al., Antisense Research and Development 4: 81-86 (1994); Demirhan et al., Virus Genes 9: 113-119 (1995)）。別の例はビオチンに結合させた共重合体であり、これを次にストレプトアビジンに結合させる。この生成物は、結合されていないオリゴヌクレオチドより10倍以上遅く腎臓により取り除かれ、全身クリアランス速度を50％下げ、そしてより多くの共重合体を肝臓に向け直す（Kang et al., Drug Metab. Dispos. 23: 55-59 (1995)）。
【００３３】
翻訳を阻害するためにIi RNAと二本鎖分子を形成する特異的調節因子の別のタイプは、発現可能な逆遺伝子構築物である。本発明において、そのような逆遺伝子構築物は発現可能なDNA構築物であり、その発現により、野生型IiをコードするRNA分子のセグメントに相補的なRNA分子の合成または翻訳が導かれる。Ii産生細胞において共発現させると、逆遺伝子構築物のRNA産物はIiをコードするRNAにハイブリダイズすることができ、それにより二本鎖構造を形成する。この二本鎖構造の形成は、IiをコードするmRNAの翻訳を妨げ、それにより細胞におけるIiタンパク質レベルを下げる。
【００３４】
好ましくは、逆遺伝子構築物は、逆遺伝子構築物を発現させる細胞タイプに対応する生物体からのIiをコードするcDNAまたはそのフラグメントを用いて合成される。本発明の方法及び組成物は、一般に哺乳類系に適応できる。Iiタンパク質をコードするcDNAは、様々な哺乳類系より単離されたmRNAから生成されており、そしてその核酸配列は決定されている（Singer et al., EMBO J. 3: 873-877 (1984); Strubin et al., EMBO J. 3: 869-872 (1984); Henkes et al., Nucl. Acids Res. 16: 11822 (1988)）。Iiをコードする哺乳類遺伝子は、非常に保存されていると決定されている。例えば、マウス及びヒトIiをコードするcDNA配列は、約85％相同であると決定されている。マウスとラット配列間の保存の程度は90％より大きい（Henkes et al., Nucl. Acids Res. 16: 11822 (1988)）。哺乳類Ii遺伝子間の高度の保存を考慮に入れて、対応するIi遺伝子を単離するために目的の実質的にあらゆる哺乳類系からのcDNAライブラリーをIiプローブ（例えばヒトまたはマウス起源）でスクリーニングできるはずである。
【００３５】
逆遺伝子構築物の構築における使用のための発現ベクターバックグラウンドの選択は、発現が所望される細胞タイプにより影響を受ける。非常に様々な適当なベクターが利用でき、当業者は過度の実験の必要なしに多数の利用できるものの中から適当なベクターを選択することができる。同様に、効率のよい発現のために必要とされる調節シグナルは、発現が所望される細胞タイプに基づいて選択される。そのような調節シグナルの必要条件は当該技術分野において周知であり、そのようなシグナルの制限されない供給源は一般に既知である。
【００３６】
好ましい態様として、逆遺伝子構築物はウイルス発現ベクターから発現される。ウイルス発現ベクターは、哺乳類細胞へのトランスフェクションを増大できることを特徴とする。そのようなベクターには、限定なしに、MFGレトロウイルスベクター、pLJ、pEm及びアルファSGCベクターのような他のレトロウイルスベクター並びにアデノウイルスベクターが包含される。そのようなベクターは、与えられた細胞タイプにおける高効率の発現及び機能を有する特定の構築物を同定するためにアッセイ系において多数の逆遺伝子構築物をスクリーニングするために特に有用であることができる。さらに、そのようなベクターは、特定の細胞タイプへの結合及び/またはそれらによる取り込みを高める特性を有するタンパク質を発現することができる。そのようなベクターはまた、一般的性質として哺乳類細胞において及び/または特定の細胞タイプ、例えばある種の器官もしくは組織クラスの癌から単離されたものにおいて逆遺伝子構築物の発現を高める転写プロモーターを含有するので、好ましい可能性がある。
【００３７】
逆遺伝子構築物は、適当な発現ベクター中に野生型の向きと比較した場合にプロモーターに対して逆向きにIi cDNAまたはそのフラグメントを導入することにより作製することができる。mRNAは相補的な分子にハイブリダイズするその能力を妨げることができる複雑な二次構造をとると分かっていることを考慮に入れて、全長逆遺伝子構築物（すなわち、IiをコードするmRNAにその全長に沿って相補的であるmRNA分子をコードする逆遺伝子構築物）は、必ずしも最も効率のよい設計とは限らない。Ii阻害のためのより効率のよい構築物を開発するためには、逆遺伝子構築物に用いた場合にIi合成を阻害することにおいて効果的である全長より小さいcDNAフラグメントを同定するために慣例的実験を行うことが必要であることが多い。そのような実験の例は、本願の実施例の節において詳述する。
【００３８】
全長より小さい構築物を設計する際に、IiをコードするmRNAの機能的に重要な領域を同定し、そして逆遺伝子構築物によりコードされるmRNAがその機能的に重要な領域と相補的であるように逆遺伝子構築物を設計することがたいてい望ましい。例えば、機能的に重要な領域には、mRNAのリボソーム認識に関与する領域、翻訳開始部位、mRNAスプライス部位及びポリアデニル化のために必要とされる翻訳終止コドンの3'の領域が包含される。
【００３９】
真核細胞において、mRNAとの最初のリボソームのかみ合いの機構は原核生物における機構と異なる。真核生物では、一般に、それは翻訳開始点として用いられる最も５'のMetを特定するコドンである。真核生物のmRNAの5'末端は、1番目の未修飾のヌクレオチドに5'-5'ピロリン酸エステル結合で連結されたメチル化グアニレート基を含んでなる修飾された末端を有する（たいてい5'キャップと呼ばれる）。例えば、5'キャップを欠いているmRNAは効率よく翻訳されないことが実験により示されている。従って、真核生物における翻訳開始は、5'キャップ及びそれに続くAUGコドンを取り囲む共通配列の位置の認識を伴うようである。すぐ近くのタンパク質コーディング配列のリボソーム認識のための共通配列は「5'−ACCAUGG−」である。
【００４０】
一次転写産物内のスプライス部位の位置は、（一次転写産物をコードする）ゲノムDNA配列を（プロセシングされた転写産物から生成した）対応するcDNA配列と比較することにより決定することができる。そのような比較において同定される切れ目は、イントロン/エキソン境界を示す。そのような境界の研究により、イントロン/エキソン境界の適度に保存された短い共通配列及び３'スプライス部位のすぐ上流のピリミジンに富んだ領域の傾向が明らかになっている。さらに、普遍的に保存されたヌクレオチド塩基が、最初の２個（GC）及び最後の２個（AG）のイントロン部分に存在する。
【００４１】
ポリアデニル化は、ポリ(A)シグナル、AAUAAA及びポリA付加部位から下流の約30ヌクレオチドを必要とする。ポリアデニル化はmRNAを安定させ、それにより細胞内でその半減期を延ばす。
【００４２】
以下の実施例の節において記述する実験において、マウス細胞におけるIi発現の阻害のための逆遺伝子構築物を設計し、試験した。マウスIiタンパク質は、215アミノ酸残基を含んでなる（Singer et al., EMBO J. 3:873-877 (1984)）。従って、この分子をコードする全長cDNAは、645塩基対のコーディング配列を含んでなる。
【００４３】
以下の実施例において、いくつかの逆遺伝子構築物を設計し、試験した。それらのいくつかは、SaI/CIITA細胞においてIiタンパク質発現を阻害することが見出された。Iiタンパク質発現の阻害は、全てではないがいくつかのmIi逆遺伝子構築物によるトランスフェクション体（transfectants）において認められた。配列番号:68、71、72、75、77、78及び79に記載した逆遺伝子構築物は、Iiタンパク質発現を著しく阻害した。
【００４４】
上記に説明したように、逆遺伝子構築物を用いたタンパク質発現の阻害の効率は、標的mRNAの二次構造に大いに依存する。本明細書において記述する実験により、Iiタンパク質は逆遺伝子構築物による発現の阻害を特に受けやすいことが示される。この結論は、いくつかの逆遺伝子構築物がIi発現を著しく阻害する能力を示したことに基づく。さらに、全長逆遺伝子構築物の欠失バージョンはよりいっそう高い阻害を引き起こした。この実験研究は、哺乳類Ii遺伝子間の既知の高度の保存と共に、ヒト系を包含する他の哺乳類系における逆遺伝子構築物活性を確かに予測するものと考えられる。
【００４５】
別の態様として、Iiの特異的調節因子は、Ii遺伝子に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド塩基を含んでなる共重合体である。このハイブリダイゼーションにより、標的細胞のIi遺伝子の転写及び/または発現の調節が妨げられる。ハイブリダイゼーションは、DNAの2本の逆平行鎖のヌクレオチド塩基の相補的ワトソン-クリック対合が保たれる場合、フーグスティーン対の形成によってであることができる。あるいはまた、治療因子のヌクレオチド塩基の対合は、「Dループ」の形成により、細胞DNAの一方の鎖のヌクレオチド塩基配列と逆並行にであることができる。適当な共重合体組成物及び細胞への送達方法は上記である。
【００４６】
別の態様として、Iiの特異的調節因子は、20〜1000ダルトンの有機分子である。有機分子は、例えば標的細胞の小胞体において、クラスII MHC分子への内因性抗原決定基の結合を高めるようにクラスII MHC分子とIiタンパク質との相互作用を改変することによりIiタンパク質機能を阻害する。本発明の有機分子の例には、ペプチド、ペプチド模倣物、小有機分子が包含されるがこれらに限定されるものではない。Iiの特異的調節因子として機能する有機分子は、クラスII MHC分子及びIiタンパク質の構造の結晶学的またはNMR証拠に基づく合理的設計のためのプログラムによって同定される。より詳細には、Iiタンパク質とクラスII MHC分子間の相互作用部位を同定し、その相互作用部位でいずれかのタンパク質のペプチジルセグメントによく似た化合物を調製し、クラスII MHC/Iiタンパク質複合体の形成の崩壊に関して試験する。あるいはまた、化合物の組み合わせライブラリーの調製によりまたは多数の体系的に変えられた化学基を用いてそのような小有機分子を同定する。次に、そのような化合物をいくつかのタイプのアッセイにおいて試験する。インビトロ化学レベルで、特定のカテプシン及び他の細胞内プロテアアーゼの存在下または非存在下で、クラスII MHC α、βタンパク質からのIiタンパク質の解離をアッセイする。そのようなアッセイからの候補分子をさらに例えばトランスフェクションした遺伝子形態でコードされるニワトリ卵リゾチームから内因的に合成された抗原決定基の提示の増大に関して試験する。次に、主要化合物（lead compounds）を機能性アッセイにおいて例えば以下に説明する癌細胞ワクチンモデルにおける腫瘍免疫原性の誘導の増大に関してアッセイする。
【００４７】
好ましい態様として、Iiタンパク質発現または免疫調節機能の特異的調節因子は、製薬学的に許容しうる担体中に調合される。担体は、例えば限定なしに、変性からの保護、安定性、一般的な物理化学的手段による及び/または細胞表面受容体への特異的付着による標的細胞集団の表面への吸着に関して好ましい性質を有する。製薬学的に許容しうる担体はまた、細胞の集団へのIiの特異的調節因子の送達を増大することもできる。
【００４８】
一つの態様として、製薬学的に許容しうる担体は、例えば、保護、分画または標的細胞集団への送達の１つまたはそれ以上の所望の性質を有する、リポソームまたは1種もしくはそれ以上の脂質及び/もしくはリポ多糖類の小胞調製物である。
【００４９】
別の態様として、製薬学的に許容しうる担体は、細胞の特定の集団へのIiの特異的調節因子の送達を増大する。この例は、例えば標的細胞上の相補的受容体分子との相互作用により標的細胞集団の表面に結合する性質を有する分子が配合物につながれるか、上に吸着しているか、そうでなければ付着している配合物、例えばリポソームまたは小胞調製物である。
【００５０】
本発明の別の態様は、Iiタンパク質発現または免疫調節機能の特異的調節因子が導入されている細胞に関する。適当なレシピエント細胞への上記のIiの特異的調節因子の導入は、様々な方法により実施することができる。用いる方法は、送達する特異的調節因子、特異的調節因子の配合物及びレシピエント細胞により決まる。これらの細胞は、疾患治療において並びにそのような細胞により提示されるエピトープからの新規な診断及び治療試薬（抗原性ペプチド及びそれらの誘導体）の開発においていくつかの用途を有する。
【００５１】
適当なレシピエント細胞は、クラスII MHC分子を発現する細胞、そうでなければクラスII MHC分子により抗原を提示するように機能する細胞である。この細胞は、天然に存在するかあるいはまた以下に説明する１つもしくはそれ以上の細胞の操作から作製することができる。クラスII MHC分子を発現する細胞は、本明細書においてクラスII MHC陽性と呼ばれる。上記の必要条件を満たす細胞は、本明細書においてクラスII MHC陽性抗原提示細胞と呼ばれる。
【００５２】
天然に存在する機能性抗原提示細胞は、クラスII MHC分子並びにクラスII MHCペプチド結合部位への取り込みの途中の抗原性ペプチドのプロセシング、輸送、結合及びエディティングのために必要とされる他の補助機能を発現する。さらに、そのような細胞は、B7、CD24、CD40、インターロイキン受容体のような細胞表面相互作用分子並びにインターロイキン及び他のそのようなタンパク質を発現し、これらは、クラスII MHC分子に関連した抗原性ペプチドの認識の際に最適な生物学的応答のために必要とされる可能性がある。天然に存在しない場合、必要とされる補助機能の発現は、インターフェロンガンマもしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインの使用により、または上記の免疫応答を促進するもののいずれかを用いた遺伝子トランスフェクションにより、細胞において誘導することができる。そのような細胞及び細胞誘導体並びにそれらの子孫は、本発明により包含される。
【００５３】
本発明の一つの最終目標は、クラスII MHCタンパク質と会合した特定の抗原性ペプチドを展示する細胞を作製することである。従って、レシピエントクラスII MHC陽性抗原提示細胞は、このペプチドを発現するかそうでなければ含有しなければならない。好ましい態様として、クラスII MHC陽性抗原提示細胞は、免疫反応が所望される抗原性ペプチドまたは抗原決定基を含有する細胞またはその細胞の誘導体と抗原提示装置及び関係のあるクラスII MHC分子を含有する細胞との融合から作製される。大部分の場合において、この生成物は、樹状細胞、マクロファージ、Bリンパ球またはある種の多能性細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞の類と目的の抗原性エピトープを発現する細胞との融合物である。そのような抗原性エピトープを発現する細胞には、例えば、悪性細胞、ウイルスに感染したまたはトランスフォーメーションされた細胞、自己免疫応答の誘導に関係のある細胞、及び例えば抗−イディオタイプネットワーク機構により自己免疫応答を調節する細胞（例えば、慢性関節リウマチにおいて病原となる関連のあるT細胞受容体（TCR）を発現する）が包含される。融合生成物は、エクスビボで新たに得られる場合またはインビトロでの複製後、細胞の全く不均質な調製物であることができる。それらは、インビトロでそのような融合物から得られる細胞系またはそのような細胞系から得られるクローン調製物のいずれかであることができる。
【００５４】
あるいはまた、レシピエントクラスII MHC陽性抗原提示細胞は、抗原提示装置及び関係のあるクラスII MHC分子の両方を生来発現する細胞への所望の抗原性エピトープを保有する細胞からの遺伝物質またはタンパク質誘導体の導入から作製される。例えば、細胞からのポリアデニル化mRNAの調製物よりcDNAを合成する。このcDNA調製物を抗原性エピトープの合成が所望される別の細胞に確立した方法により導入する。遺伝子銃または他の技術でのDNA導入の方法が利用でき、当業者はそれらをうまく適用することができる（米国特許第5,593,972号 (1997); 米国特許第5,643,578号 (1997); 米国特許第5,716,613号 (1998); 米国特許第5,741,486号 (1998)）。さらに、内容が本明細書に組み込まれる米国特許第5,627,025号 (1997)により開示されているように、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的タンパク質の遺伝子またはそのようなタンパク質の遺伝子のセグメントを患者の樹状細胞または別のプロフェッショナル抗原提示細胞集団に導入することができる。これらの方法から生じた細胞集団は、未精製で不均質なレベル、細胞系レベルまたはクローンレベルでワクチンとして用いることができる。
【００５５】
一つの態様として、レシピエントクラスII MHC陽性抗原提示細胞は悪性細胞であるかまたは悪性細胞に由来する成分を含有する。そのような細胞には、癌腫並びに胃、結腸または直腸、乳房、肺、前立腺、膀胱、膵臓及び脳の他の腫瘍並びに黒色腫、白血病及びリンパ腫細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない。好ましい態様として、細胞は、例えばクラスI MHCまたはクラスII MHC分子に関連して、細胞表面受容体におけるイディオタイプ抗原決定基を発現する。そのようなイディオタイプ抗原決定基は、例えば、免疫グロブリンまたはT細胞受容体から得ることができ、そしてMHC分子により提示される。すなわち、イディオタイプペプチドは細胞クローンに特異的な受容体から得られるのでこの抗原決定基は全く腫瘍特異的である。、B-リンパ球系悪性腫瘍の免疫グロブリン受容体は、イディオタイプペプチド配列をそれらの抗原連結部位で含有する。そのような受容体及びそれらのイディオタイプペプチドは、そのような細胞集団に特有である。
【００５６】
別の態様として、レシピエントクラスII MHC分子-抗原提示細胞は非悪性細胞である。これらの細胞には、ウイルス、細菌、寄生虫または他の病原体を含有する細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない。また、免疫系において機能する細胞、例えばT細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞も包含される。
【００５７】
上記の細胞は、疾患治療において並びにそのような細胞により提示されるエピトープからの新規な診断及び治療試薬の開発においていくつかの用途を有する。これらの方向に沿って、本発明はまた疾病の処置のための治療試薬の製造方法及び治療方法も提供する。本発明の一つの態様は、クラスII MHC陽性抗原提示細胞の表面上にクラスII MHCタンパク質と会合した自己抗原決定基ペプチドを展示する方法である。自己抗原決定基ペプチドは、本明細書において、Tリンパ球への提示のためにクラスII MHC分子の抗原性ペプチド結合部位に結合することができるペプチドと定義される。そのようなペプチドは、抗原提示細胞自体内で合成されたタンパク質または例えば抗原もしくは補体の細胞表面受容体により抗原提示細胞中に導入されたタンパク質のいずれかから得ることができる。この方法は、所望の自己抗原決定基ペプチドを含有する上に詳細に記述したクラスII MHC陽性抗原提示細胞を用意することを含んでなる。いったん用意されると、クラスII MHCタンパク質と会合した自己抗原決定基ペプチドの展示をもたらすためにIiタンパク質発現または免疫調節機能の特異的調節因子を細胞中に導入する。Iiの特異的調節因子は、前記のあらゆる形態であることができる。好ましい態様として、Iiの特異的調節因子は、ヌクレオチド塩基を含んでなる共重合体であるかまたは発現可能な逆遺伝子構築物のいずれかである。そのような組成物が導入される細胞は、悪性または非悪性のいずれかであることができ、そしてそのような処理細胞の内因性抗原決定基での免疫から治療効果が所望される個体または別の個体のいずれかからであることができる。さらに、そのような組成物が導入される細胞は、個体から新たに得られるかまたは細胞系もしくはクローンの樹立のためを包含する培養後に得られるサンプルであることができる。好ましくは、Iiの特異的調節因子は電気穿孔によりレシピエント細胞中に導入される。
【００５８】
別の態様として、本発明は、悪性腫瘍に対する免疫学的攻撃を高めることによる患者における悪性腫瘍の治療処置のための方法を提供する。これは、腫瘍細胞ワクチンの作製及び使用により成し遂げられる。腫瘍細胞ワクチンは、悪性腫瘍に向かって患者の免疫系を特発しようと努力して、クラスII MHC分子によりエピト−プを提示するように、悪性腫瘍の抗原性エピトープを含有する細胞を操作することにより作製される。このタイプの治療は、２つの方法のいずれかにより、１）エクスビボ法により、この場合、細胞は、腫瘍ワクチン細胞を作製するためにインビトロで操作され、そして次に患者に導入される、そして２）インビボで腫瘍ワクチン細胞を直接作製することにより成し遂げられる。第一の方法では、悪性細胞の集団を様々な起源から得ることができる。そのような調製物は、付随する正常細胞から分離したもしくは分離していない、患者から得られた悪性細胞の任意の集団からであることができ、または細胞系としてもしくはそのような細胞系からクローンとして得られた細胞であることができる。そのような細胞は、樹立した悪性細胞系または新しい悪性組織（例えば結腸もしくは卵巣腺癌）の外植片から得られる。必要に応じて、得られた細胞集団をインビトロで増やすことができる。あるいはまた、非悪性細胞を用いることができる。
【００５９】
起源が何であれ、細胞は、処置する悪性腫瘍の抗原性決定基を発現するかまたは含有しなければならない。さらに、細胞が十分な量のクラスII MHC分子を生来発現しない場合、そうするようにそれらを誘導しなければならない。これは上記の方法により成し遂げることができる。
【００６０】
いったん細胞の適当な集団が得られるかまたは作製されると、Ii発現の特異的調節因子を前記の方法により、好ましくは電気穿孔により細胞中に導入する。特異的調節因子の導入後、一般に、Ii発現のインヒビターがIi発現を抑制することに対してその効果を出し、クラスII MHCが内因性抗原決定基を載せ、そしてその後そのような複合体が表面に発現されるようになるために必要とされる期間細胞をさらに培養する。
【００６１】
次に、処理した細胞を患者に導入する。あるいはまた、処理した細胞の誘導体を患者に導入する。細胞の導入は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内であることができる。好ましい態様として、導入する細胞を患者への導入の前に複製能なしにする（例えば、放射線処理によりまたは固定により）。
【００６２】
癌ワクチン免疫療法の確立したプロトコールは、Clements et al., Immunol. 149: 2391-2396 (1992); Baskar et al., Cell. Immunol. 155: 123-133 (1994); Baskar et al., J. Exp. Med. 181: 619-629 (1995); Hersey, Drugs 47: 373 (1994);及びPardoll, Immunol. Today 14: 310 (1993)により説明されている。
【００６３】
本発明により提供される、患者における悪性腫瘍の治療処置の第二の方法は、抗癌免疫応答を誘導するために十分な量のIiの特異的調節因子を患者に投与することによる、患者から除かれない到達可能な腫瘍細胞へのIiの特異的調節因子の導入を伴う。そのような応答は、癌細胞を殺すことをもたらしそして/または癌細胞を殺すことをもたらすように他の細胞を調節するTリンパ球の活性及び/または数の誘導を特徴とする。抗癌免疫応答を誘導するために必要とされる量は、各患者及び特定の悪性腫瘍で異なる。一つの態様として、この量は毎日10μg〜100mgの間である。
【００６４】
適当な投与手段には、静脈内注入（例えば注射による）、皮膚または粘膜表面を越えた注入（例えば局所施用）、適当な担体粒子（例えばコロイド状金）上に被覆した後の遺伝子銃での挿入が包含されるが、これらに限定されるものではない。特に、標的組織を視覚化するために透視診断法を用いた放射線科医による内臓転移への微量注入が、十分に記述された標準的な方法論である。そのような投与はまた、体腔または例えば卵巣癌の場合にはそのような腔に含まれる腹水液への注入によることができる。そのような方法によりIiの特異的調節因子は、免疫系への腫瘍細胞による内因性腫瘍抗原決定基のクラスII MHC分子提示を高めるために、原発または転移性腫瘍細胞のいずれかに接触し、導入される。
【００６５】
一つの態様として、Iiの特異的調節因子を製薬学的に許容しうる担体と共に投与する。簡潔に言えば、全身または局所注入後に治療オリゴヌクレオチドを保護するため並びに選択した細胞集団への送達及び進入を目標とするために十分に確立した方法がある。全身または局所処置の方法を腫瘍及びその提示に適応させる。例えば、腹転移及び腹水を有する卵巣癌は、悪性細胞による取り込みを高めるために適当な配合で投与されるオリゴヌクレオチドの腹腔内注入で処置される。これらの方法は、本明細書において引用する文献及び特許にまたは米国特許第5,098,890号 (1992); 米国特許第5,273,745号 (1993); 米国特許第5,290,551号 (1994); 米国特許第5,637,483号 (1997); 米国特許第5,648,223号 (1997); 米国特許第5,679,647号 (1997); 米国特許第5,693,522号 (1997);及び米国特許第5,788,963号 (1998)に示されており、これらの関連する内容は引用することにより組み込まれる。
【００６６】
上記のものと同様の方法は、そうでなければ望まれていない非悪性細胞に向かって個体の免疫系を特発するために適用させることができる。本発明の別の態様は、個体の望まれていない細胞集団に対する免疫学的攻撃を高めることにより個体における非悪性症状を処置する治療方法である。望まれていない細胞集団からの細胞は、一般に患者から直接得られ、そして望まれていない細胞集団に共通の抗原決定基を含有するクラスII MHC陽性抗原提示細胞を作製するために前記のようにインビトロで操作される。いったん適当なレシピエント細胞集団が作製されると、上記のように、抗原決定基のクラスII MHC提示を高めるためにIiタンパク質発現の特異的調節因子をレシピエント細胞に導入する。この導入の好ましい方法は電気穿孔である。次に、これらの細胞を個体に再導入する。これは上記の方法により実施することができる。好ましい態様として、前に説明したように、細胞を個体への再導入の前に複製能なしにする。
【００６７】
一般に、望まれていない細胞集団は、疾病の原因または産物である。ウイルスまたは他の細胞内病原体を保有する細胞の集団は一つの例である。そのような細胞は、病原体によりコードされるかまたは病原体に応答して引き出されるいずれかのタンパク質を発現する。病原性免疫学的応答に関与する細胞の集団は別の例である。
【００６８】
ウイルスまたは他の細胞内病原体を保有する細胞は、病原体の感染に特異的
な分子を発現する。病原体によりコードされるかまたは病原体によりコードされるトランス作用因子により引き出されるいずれかのトランス作用因子で宿主細胞構造遺伝子のある上流調節領域を活性化することができる。宿主細胞タンパク質はまた、病原体に対する免疫応答の成分として、例えばサイトカインにより引き出すこともできる。感染細胞に絶対的または相対的特異性を有するそのようなタンパク質は、感染細胞によりまたは宿主抗原提示細胞、例えばマクロファージもしくは樹状細胞によりプロセシングし、提示することができる。病原体のタンパク質または病原体に応答して引き出されたタンパク質を提示する細胞にIiタンパク質を標的とするアンチセンス試薬が適切に接触すると、追加の抗原決定基がクラスII MHC分子により提示され、Tヘルパー細胞クローンの拡大が導かれ、これは次に病原体に対するそうでなければクラスI MHCに限定される免疫応答を高める。この方法は、追加のウイルス抗原決定基またはウイルスに感染した細胞に絶対的もしくは相対的に特異的な抗原決定基のクラスII MHC提示を増大する。クラスII MHCに限定されるヘルパー細胞の誘導は、キラーTリンパ球によるウイルス感染細胞の増大した破壊及び治療免疫グロブリンの増大した誘導を導く。これに関して、ウイルスに感染した細胞のほんの一部分がIiアンチセンス治療で処置され、患者に再導入される必要がある。特に、一つには抗-エプスタイン-バーウイルス免疫応答を抑制するためにIiが非常に過剰発現されることが示されている、正常なB細胞のEBV感染の場合、そのような処置は抗-EBV免疫応答を高めることにおいて有効であると思われる。同様に、活性化の際にクラスII MHC抗原を発現することができるHIV感染したCD4+ Tリンパ球の場合、抗-Ii構築物でのそれらの細胞の処置により抗-HIV免疫応答が高められる。処置の効果をモニターする方法は、現在存在する方法から適応することができる。細胞及び組織にウイルスDNAを導入する方法は、米国特許第4,689,320号 (1987)及び米国特許第5,620,896号 (1997)により提供され、これらの関連する内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００６９】
別の態様として、望まれていない細胞集団は自己反応性Tリンパ球を含んでなる。病原性免疫応答に関与する細胞もまた、その集団に特異的な抗原決定基を発現する。そのようなものとして、自己反応性Tリンパ球によりもたらされる自己免疫疾患は、本発明の組成物及び方法で処置することができる。クラスII MHC分子を発現する病原性T細胞は、これらの分子を介して、それらのTCRのイディオタイプペプチドを提示する。上記の方法を用いることにより、病原性T細胞に対する患者の免疫応答を誘導するためにそのような細胞集団を用いることができる。これらの方法は、癌細胞ワクチンの調製に関して上に記述したものから適応される。詳細には、これらの方法には、限定なしに、T細胞ワクチンの調製のための病原性T細胞の培養における増殖及びTCRの鎖またはセグメントをコードする核酸共重合体での別の細胞集団、例えば樹状細胞のトランスフェクションが包含される。クラスII MHCに限定されるヘルパー細胞の誘導は、他のキラーTリンパ球による病原性T細胞の増大した破壊を導く。これに関して、病原性T細胞またはその培養物もしくはクローンのほんの一部分がIiアンチセンス治療で処置され、患者に再導入される必要がある。
【００７０】
例えば、慢性関節リウマチは、炎症を起こした関節に局在する抗原に対して導かれる細胞傷害性T細胞からの破壊作用によりもたらされると提示されている。そのような細胞傷害性T細胞は、特有のT細胞受容体（TCR）をもち、これらをプロセシングし、免疫系に提示することができる。これらのTCRに由来するイディオタイプペプチドに対する他のT細胞の免疫応答を高めることは、慢性関節リウマチにかかっている患者の臨床状態を改善する。そのような病的Tリンパ球がクラスII MHC分子を発現するのであれば、Iiタンパク質発現の特異的調節因子の導入は、関係のあるTCR中のエピトープに対するヘルパーT細胞応答の特発を導く。上記に説明したように、レシピエントクラスII MHC陽性抗原提示細胞の作製に関連して、増大した樹状細胞認可によりそのような治療をもたらすこともできる。上記に説明したように、この治療形態には、限定なしに、T細胞集団の単離及び樹状細胞へのTCR遺伝子のトランスフェクションが包含される。
【００７１】
処置の効果をモニターする方法は、自己免疫疾患の処置をモニターする以前から存在する方法から適応することができる。そのような関連する方法は、本明細書において引用するものを包含する文献に示されているか、または米国特許第5,614,192号 (1997)により示されているかもしくは概説されており、その関連する内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００７２】
別の態様として、自己免疫疾患にかかっている患者の治療処置は、疾病の経過の適当な時期にIi発現の特異的調節因子の投与を用いて実施される。すなわち、処置は、自己免疫応答のサプレッサーT細胞によりもたらされる消散中よりむしろ、自己免疫応答の拡大する有毒期（expanding toxic phase）に関係のある抗原決定基に対する応答をダウンレギュレーションするためにタイミングを調節される。処置スケジュールのそのようなタイミングは、例えばラットアジュバント関節炎及び実験的アレルギー性脳脊髄炎の場合に記述されている。この方法では、Ii機能の特異的調節因子は、抗疾患免疫応答を誘導するために十分な量で患者に投与される。抗疾患免疫応答は、病的免疫応答をもたらすTリンパ球の活性及び/もしくは数の減少並びに/または病的免疫応答をもたらす細胞の活性及び/もしくは数を調節するTリンパ球の活性及び/もしくは数の誘導を特徴とする。、抗疾患免疫応答を誘導するために必要とされる量は、各患者及び特定の疾病で異なる。一つの態様として、この量は、毎日10μg〜100mgの間である。
【００７３】
適当な投与手段には、例えば、関節腔への注入、静脈内または体腔への投与及び局所施用が包含される。患者は、一つには疾患の抑制を引き起こすように投与のタイミングを調節するために、疾患の進行または疾患の急性増悪の病期に関してモニターされる。
【００７４】
一つの態様として、Ii機能の特異的調節因子は、化合物を保護するため及び/またはある種の組織へのターゲッティング及びそこでの取り込みを高めるために製薬学的に許容しうる担体と共に患者に投与される。局所または全身注入の際に治療オリゴヌクレオチドを保護するため及び選択した細胞集団への送達及び進入を目標とするために十分に確立した方法がある。局所または全身投与の方法は、自己免疫疾患及びその提示に適応される。例えば、慢性関節リウマチによる一方の膝関節の急性炎症は、その関節腔へのIi発現または免疫調節機能の特異的調節因子の注入により処置することができる。共重合体及びIi機能の他の特異的調節因子を投与することに関係のある方法は、上記並びに本明細書において引用する文献及び特許に示されている。そのような方法は、以下に引用する文献または米国特許第5,356,779号 (1994); 米国特許第5,672,473号 (1997); 米国特許第5,731,160号 (1998); 米国特許第5,736,507号 (1998)のいずれかに示されており、引用した特許の関連する内容は引用することにより組み込まれる。
【００７５】
本発明はまた、細胞から自己抗原決定基ペプチドを単離する方法も提供する。自己抗原決定基ペプチドは、上記の方法を用いて自己抗原決定基ペプチドのクラスII MHC抗原提示を誘導し、次にクラスII MHC分子を可溶化して精製し、それによりそれらが会合している自己抗原決定基ペプチドと共精製することにより得られる。
【００７６】
所望の自己抗原決定基ペプチドを含有する細胞は、患者から新たにまたはそのような細胞の培養から得られる。細胞が生来抗原提示細胞でない、例えばクラスII MHC分子を発現しない場合、それは上記に説明した方法により、必要とされる活性を示すようにインビトロで操作される。いったんレシピエント抗原提示細胞が作製されると、上記のIiタンパク質発現の特異的調節因子を細胞に導入し、そして特異的インヒビターの発現及びその結果起こる自己抗原決定基ペプチドのクラスII MHC抗原提示の増大を与えるために十分な時間細胞をインキュベーションする。次に、細胞を標準的な方法により可溶化し、可溶化した細胞からクラスII MHC分子及び会合した自己抗原決定基ペプチドを精製する。精製方法には、洗剤で可溶化し、レクチン-アフィニティー濃縮した膜タンパク質の免疫精製が包含されるが、これに限定されるものではない。次に、免疫精製したクラスII MHC分子から、例えば酸処理により、自己抗原決定基ペプチドを遊離させる。次に、遊離した自己抗原決定基ペプチドを単離し、同定する。精製は高速液体クロマトグラフィーにより、そして同定は質量分析法の使用により実施することができる。推定の自己抗原決定基ペプチド配列をそのようなペプチドの化学合成並びにその後の物理的、化学的及び生物学的分析により確かめる。そのような方法は、Urban et al. Crit. Rev. Immunol. 17: 387-397 (1997)により概説されるような文献に示されている。
【００７７】
本発明はまた、患者における病原性自己免疫応答の処置においても用途が見出される。より詳細には、病原性自己免疫応答をダウンレギュレーションするために自己免疫疾患周期のある時期の間に内因性抗原提示の増大を刺激する。例えば、関節炎のある種の動物モデル（例えばラットアジュバント関節炎）において、疾患の攻撃的発生の初期段階の後、発病プロセスを開始した同じ抗原決定基に対して導かれるサプレッサーTリンパ球は次にそれらの免疫応答を抑制することが示されている。疾患プロセスのダウンレギュレーションのその第二期（臨床的に寛解の指標とみなされる）の間に、Iiの阻害による細胞における内因性自己抗原の提示の治療的増大は、疾患をダウンレギュレーションする。さらに、共刺激シグナルを欠く細胞（例えば、B7のない細胞またはB7発現がB7アンチセンス構築物での処理により抑制される細胞）におけるIi阻害は、アネルギー応答を引き起こす。
【００７８】
最初に、標準的な方法を用いて個体から細胞の集団（例えば、病的プロセスにおいて活性のあるT細胞受容体を発現するTリンパ球、または自己免疫疾患プロセスの標的細胞、またはウイルス感染細胞）を単離する。必要に応じて、そのような細胞において上記の技術によりクラスII MHC分子を誘導する。次に、細胞の集団をIiタンパク質発現の特異的調節因子で処理する。次に、細胞を可溶化し、クラスII MHC分子及び会合したペプチドを例えばクラスII MHC分子に対するモノクローナル抗体での免疫沈降により精製する。ペプチドをクラスII MHC分子から例えば酸処理により単離し、特性化し、例えば高速液体クロマトグラフィーにより分離した後、個々のペプチドを質量分析法によりアッセイする。ペプチドの配列を質量分析器におけるそのイオンフラグメンテーションパターンから推定し、そして推定した配列を有する合成ペプチドの分光測定の分析により確かめる。さらに、生物学的アッセイにより、疾患プロセス及びその消散と合成ペプチドとの関連性を確かめることができる。次に、同定したペプチドの１つまたはそれ以上の合成形態または相同物を、臨床的変化をもたらすために、その患者または同じ病的プロセスにかかっている患者に導入する。これらの処置患者を寛解の徴候に関してモニターする。
【００７９】
この方法に関係のある方法は、本明細書に引用する文献または米国特許第5,356,779号(1994); 米国特許第5,672,473号(1997); 米国特許第5,736,507号(1998);及び米国特許第5,773,570号(1998)により示されており、これらの関連する内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００８０】
上記に開示した方法の重要な利点は、開示した組成物の一時的または特定の場合の使用により疾患特異的または疾患に関連した抗原決定基に対する免疫系の特発が導かれることである。そのような特発事象の後、免疫系は、追加のアンチセンス処置なしに、腫瘍または病原性自己反応性T細胞を拒絶することができる。それに反して、疾患（例えばHIVのようなウイルス性疾患）の制御のためのアンチセンス治療の大部分の現在の適用では、アンチセンス薬剤を中止すると、疾患(例えばウイルス)が反跳する。本方法の別の好ましい価値は、開示したアンチセンス組成物のインビボまたはエクスビボのいずれかの使用で免疫応答の抗疾患特発の誘導を実行できることである。
【００８１】
本発明の別の態様は、自己免疫性破壊が誘発される組織においてIiタンパク質を増やすことにより組織特異的自己免疫疾患を処置するための個体の遺伝子治療に関する。この治療方法は、自己抗原決定基のクラスII MHC分子提示を増大するためにIiタンパク質発現を減らす上に示した応用の概念的鏡象である。逆に、この方法は、細胞活性化事象の間にIiタンパク質の増加した存在をもたらす。そのような事象において、Iiタンパク質の付随する増加した発現のないクラスII MHC α及びβ鎖の増加した発現は、自己抗原の増大した提示を導く。自己抗原のこの増大した提示により、組織に損傷を与える自己免疫反応が導かれる。この組織においてIiを治療的に増やすことにより、内因性抗原のクラスII MHC分子提示が減らされ、自己免疫応答及び同様に組織破壊が最小限に抑えられる。Iiタンパク質は、Iiの構成的発現を増やすことにより標的組織において増加される。標的組織細胞において活性のあるプロモーターの制御下であるIi遺伝子を導入することによりこれを実施する。好ましくは、プロモーターは組織特異的、すなわち、非標的組織では最低限にしか活性がない。Ii遺伝子及びプロモーターは、発現構築物の形態で提供される。適当な発現構築物（例えばウイルスベクター）及び患者の細胞への発現構築物の導入のために適当な方法は、上記に示されている。遺伝子治療の様々な方法に共通である手順及び組成物は、有用な臨床結果を得ることに従って選択されるべきである。
【００８２】
本方法は、膵臓β細胞の破壊をもたらす疾患の糖尿病を処置するために用いることができる。かかりやすい個体にインシュリンプロモーターの制御下のIi遺伝子を挿入することにより、膵臓β細胞におけるIiタンパク質の増大した発現が導かれる。処置は、自己免疫が引き起こす破壊からの膵臓β細胞の防御をもたらす。さらに、上記の方法は、甲状腺濾胞細胞の破壊を導く甲状腺炎の形態を処置するために用いることができる。サイログロブリンプロモーターの制御下のIi遺伝子を挿入することにより甲状腺濾胞細胞におけるIiの増大した発現が導かれ、自己免疫が引き起こす破壊からそれらを防御する。
【００８３】
例示
実施例１．アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションするＩｉ  ＲＮＡ部位の同定
ＤＮＡにハイブリダイゼーションされる部位でＲＮＡを切断する（ｃｌｅａｖｅ）リボヌクレアーゼＨの作用を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたＩｉ  ＲＮＡの部位を同定した。ずれた重なりパターン（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）（表１）でＩｉ  ＲＮＡのセグメントに対して頭−尾様式（ｈｅａｄ−ｔ−ｔａｉｌ  ｆａｓｈｉｏｎ）で相補的な配列において各々１８塩基を含む一連のデオキシオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションアッセイで使用した。ＲＮＡを転写しそして３２Ｐで５′末端を標識した。この３２Ｐ標識されたＩｉ  ｍＲＮＡのサンプルをリボヌクレアーゼＨの存在下に、別々に各オリゴヌクレオチドとインキュベーションした。ＲＮＡにハイブリダイゼーションしているオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨがハイブリダイゼーションの領域においてＲＮＡを切断するように指令した（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）。切断の部位は、ＲＮＡの５′末端から測った標識された生成物の長さにより示された。反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフイーにより分析した（表２）。切断生成物の可変性の発生により示されたとおり、オリゴヌクレオチドのすべてではないが、そのいくらかがＲＮＡに有効にハイブリダイゼーションした。いかなるオリゴヌクレオチドも存在しない場合、オリゴヌクレオチドが存在してもＲＮアーゼＨが欠けている場合、又はセンスオリゴヌクレオチド対照（配列番号４６）もしくは１個の内部欠失を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号４３、４４及び４５）の存在下では、Ｉｉ  ＲＮＡの切断は観察されなかった。
【００８４】
最も強い切断を生じるオリゴヌクレオチド配列を、実施例３、４及び５に提示されたアンチセンス効力の追加の研究のためにホスホロチオエート結合により再合成した。
【００８５】
この研究はマウスＩｉ  Ｐ３１  ｍＲＮＡを使用して行われたが、ハイブリダイゼーション部位の分析のための同様な方法がいかなる種のＲＮＡにも適用できる。
【００８６】
【表１】
0004836327.tif 000002
【００８７】
【表２】
0004836327.tif 000003
【００８８】
Ｉｉ  ｍＲＮＡ配列（Ｋｏｃｈ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１６７７−１６８３，（１９８７））は、最初のＡＵＧコドンのＡがオリゴヌクレオチド配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３及び配列番号４６においてヌクレオチド１であるように番号を付けられる。負の対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）として包含されるものは、各々内部欠失（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有するオリゴヌクレオチド配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５、並びにセンス配列方位（ｓｅｎｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有するオリゴヌクレオチド配列番号４６である。配列番号４３及び４４の＊ネイティブ配列（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（欠失のない）は括弧内に示されており、そして表４に示されたその後の実験で使用された。
【００８９】
【表３】
0004836327.tif 000004
【００９０】
【表４】
0004836327.tif 000005
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号、Ｉｉ  ｍＲＮＡにおけるそれらのヌクレオチド開始位置及び−、＋〜＋＋＋のスケールで判定された生成物の強度が各オリゴヌクレオチドについて与えられている。
【００９２】
実験
化合物．
ホスホジエステルデオキシオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（アイオワ州、コーラルビレ）により合成された。配列番号：ＴＨ１オリゴヌクレオチドのＩｉ  ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列及びヌクレオチド番号（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｎｕｍｂｅｒ）は表１に列挙されている。
【００９３】
Ｉｉ  ｍＲＮＡの製造
ネズミＩｉ  Ｐ３１  ｃＤＮＡを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳプラスミドを、Ｘｈｏ  Ｉにより線状化し、そしてＴ７−リボマックス（Ｔ７−Ｒｉｂｏｍａｘ）大規模ＲＮＡ製造システム（ウィスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ）を使用して製造会社のプロトコルに従って生体外で転写した。ＤＮＡテンプレートをＲＱ１  ＲＮアーゼ不含有ＤＮアーゼ（ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ）（ウィスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ）による処理により除去し、そしてＲＮＡ生成物を、子牛腸アルカルホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ウィスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ）により脱リン酸させた（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）。ＲＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ウィスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ）を使用して［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５′末端標識した。すべての手順は標準分子生物学的技術に従って行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。
【００９４】
ハイブリダイゼーション部位のＲＮアーゼ  Ｈマッピング
３２Ｐ標識マウスＩｉ  Ｐ３１  ｍＲＮＡ（３２Ｐ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｉｉ  Ｐ３１  ｍＲＮＡ）（５×１０５ｃｐｍ）を１×ＲＮアーゼ  Ｈ緩衝液中で酵母ｔＲＮＡ２ｍｇと混合し、７０℃で３分間加熱し、そして室温にゆっくりと冷却した。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（０．２〜１ピコモル（ｐｍｏｌ））を加えそして３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで大腸菌ＲＮアーゼ  Ｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ）（インディアナ州、インディアナポリスのＢｏｅｈｌｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））０．５単位を加えて１０ｍｌの最終反応容積を与えた。３７℃で１０分間インキュベーションした後、電気泳動負荷緩衝液（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）８ｍｌを加えそして９０℃で５分間加熱することにより反応を停止させ、次いで氷上で急冷した。各調製物５ｍｌを６％ポリアクリルアミドゲルにおいて５０ワットで２時間電気泳動に付し、次いでこれをＸ線フイルムに露光させた（ｅｘｐｏｓｅｄ）。主なＲＮＡ切断生成物（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）をオートラジオグラフィーの検査により同定し、そしてそれらの強度を表２に要約する。
【００９５】
実施例２．エレクトロポレーションによる細胞へのオリゴヌクレオチドの導入の最適条件
ここに述べた研究はマウスＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞で行われたが、いかなる哺乳動物細胞系（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）にも適用できる。
【００９６】
哺乳動物細胞へのオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションの種々の異なる条件を試験して、最小の細胞損傷で最大の取り込みを生じる条件を決定した。ＳａＩ／ＣＩＩＴＡマウス肉腫細胞（ｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）を、電圧とキャパシタンスの種々の組み合わせを使用してエレクトロポレーションに付した。フルオレセイン標識されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（配列番号６４）を使用してオリゴヌクレオチド取り込みの検出及び定量を可能とした。対照細胞をフルオレセイン標識されたオリゴヌクレオチドの不存在下にエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレーションされた細胞を１時間培養し（ｃｕｌｔｕｒｅｄ）、次いでトリパンブルー色素排除（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）により生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの取り込みを蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）で測定した。ＦＡＣＳは、フルオレセイン標識された部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を活性化するレーザビームを通して個々の細胞を決定する。ビームを横切る各細胞の蛍光の強度を光電子増倍管により測定する。死んだ細胞又は凝集した（ｃｒｕｍｐｅｄ）細胞を排除するために各細胞からの光の前方及び側部散乱（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）を同時に測定する。例えば１万個の細胞の分析の後、二次元ヒストグラムとしてのデータのコンピュータ支援表示を創り出す。その場合縦座標は検出された細胞の数を表す等分目盛であり、横座標は各細胞の定量的蛍光を表す対数目盛である。エレクトロポレーション最適化アッセイからのデータは、対照細胞の蛍光強度より大きい蛍光強度を有するすべての細胞の百分率を表す陽性細胞（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）の百分率として表３に示される。
【００９７】
最大オリゴヌクレオチド取り込み及び細胞生存率は２００Ｖ及び１２００ｍＦを使用して起こった（表３Ａ）。細胞の９０％以上が、２ｍＭオリゴヌクレオチドを使用してこれらの条件下に最大に蛍光性となった（表３Ｂ）。
【００９８】
【表５】
0004836327.tif 000006
【００９９】
【表６】
0004836327.tif 000007
【０１００】
Ａ）０．０１７マイクロモルのフルオレセイン標識ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列番号６４及び２．１５マイクロモルのホスホジエステルオリゴヌクレオチドを使用して、並びにＢ）２マイクロモルのフルオレセイン標識ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列番号６４を使用して、２つの実験を行った。
【０１０１】
実験
化合物
これらの研究で使用されたホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号６４（表５参照）をフルオレセインで５′標識した。それはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（アイオア州、コーラルビレ）により合成されそしてＨＰＬＣ精製された。
【０１０２】
細胞培養
ＳａＩ／ＣＩＩＴＡマウス肉腫細胞系を、５％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ、ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ユタ州、ローガン）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充されたイスコベの変性されたダルベッコの培地（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ，ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カンサス州、レネキサ）中に加湿された雰囲気で３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。
【０１０３】
エレクトロポレーション
細胞を補充物なしのＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄しそしてこの培地中に再懸濁させた。種々の量の５′−フルオレセイン標識ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列番号６４を含有する培地５００μｌ中の２〜５×１０６個の細胞を、４ｍｍギャップのキュベットに加え、氷上で１０分間インキュベーションし、そしてＥｌｅｃｔｒｏＣｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ＥＣＭ  ６００システム（ＢＴＸ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州、サンジエゴ）においてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後細胞を１０分間室温に保ち、２×補充物を有する等容積のＩＭＤＭと混合し、そして分析の前に５％ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベーションした。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除により測定した。オリゴヌクレオチド取り込みを、０．２Ｍグリシン、ｐＨ４．４で１回、ハンクスの緩衝塩溶液（Ｈａｎｋｓ′  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄されそして氷上で１５分間２％ホルマリンで固定された細胞のＦＡＣＳ分析により評価した。細胞生存率及びオリゴヌクレオチド取り込みを示す細胞の百分率は表３に示される。
【０１０４】
実施例３．ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞におけるＩｉ発現の特異的阻害
上記に決定したアンチセンスオリゴヌクレオチド取り込みの最適の方法を、腫瘍細胞系におけるＩｉタンパク質発現に対するＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を決定するためのアッセイにおいて使用した。これらのアッセイにおいてＳａＩ／ＣＩＩＴＡネズミ肉腫細胞系を使用した。これらの細胞はクラスＩＩＭＨＣ転写活性化因子ＣＩＩＴＡの遺伝子を含有するプラスミドで安定にトランスフェクションされ、そして高いレベルのクラスＩＩＭＨＣ及びＩｉタンパク質を発現する。
【０１０５】
ネズミＩｉ  ＲＮＡに強くハイブリダイゼーションすることが実施例１で決定された１３の配列を、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとして合成した。これらのオリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションによりＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞に導入した。２４時間インキュベーションした後、細胞を蛍光抗体を使用してＩｉ及びクラスＩＩＭＨＣタンパク質のレベルについてアッセイした。結合した抗クラスＩＩＭＨＣ抗体及び抗Ｉｉ抗体の存在は、実施例２に記載の如くしてＦＡＣＳで定量された。Ｉｉタンパク質又はクラスＩＩＭＨＣ分子のいずれかの発現の抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、対照Ｉｉ陰性及びクラスＩＩＭＨＣ陰性細胞（ＣＩＩＴＡトランスフェクションなしの親ＳａＩ肉腫細胞）と同じ強度の蛍光を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド処理された細胞の百分率として測定された。この測定は、指示されたタンパク質発現の完全な抑制を有する細胞のフラクションを反映する点から細胞の数を数えており、従って抑制のレベルを過小評価する可能性がある。何故ならばＩｉタンパク質の部分的抑制を有する細胞は係数されない可能性があるからである。
【０１０６】
表４に与えられたこれらのアッセイの結果は、種々のオリゴヌクレオチドは各々様々のレベルのＩｉ阻害を生じさせることを示す。最も大きな活性はＡＵＧイニシエーター領域（ＡＵＧ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ）にたいして相補的なオリゴヌクレオチド配列番号４０（表１）及びＩｉ  ｍＲＮＡにおける第１スプライスドナー部位（ｆｉｒｓｔ  ｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｏｒ  ｓｉｔｅ）にたいして相補的なオリゴヌクレオチド配列番号３２により示された。センスオリゴヌクレオチド（配列番号４６）又はオリゴヌクレオチドなしで行われた対照反応は阻害を示さなかった。クラスＩＩＭＨＣタンパク質発現は細胞のいずれにおいても影響を受けなかったが、これはアンチセンスオリゴヌクレオチドにより生じた阻害がＩｉ発現に特異的であることを証明した。
【０１０７】
次いで追加の重なっているオリゴヌクレオチド（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を合成して最も活性な配列を見いだしてこれらの領域を標的とした（表５）。これらのオリゴヌクレオチドは前と同様にアッセイされそしてＩｉ阻害の活性（表６Ａ）及び細胞毒性（表６Ｂ）について検査された。最も活性な化合物、配列番号５４は、ＡＵＧイニシエーターにたいして相補的でありそしてクラスＩＩＭＨＣ発現、細胞の回収率及び生存率に対する最小の効果も示した。第１スプライスドナー領域における最善の化合物は配列番号６２である。３′非翻訳領域におけるポリアデニル化部位にたいして相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号６４）もいくらかの活性を示した。
【０１０８】
【表７】
0004836327.tif 000008
【０１０９】
Ｉｉ陰性細胞及びＩ−Ｅ陰性細胞（Ｉｉ  ａｎｄ  Ｉ−Ｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）の百分率の平均値及び標準偏差（ＳＤ）並びにアンチセンスオリゴヌクレオチドの不存在下に処理された対照細胞のフォールド（ＦＯＬＤ）と比較して該陰性細胞のフォールドは、２つの独立した実験から報告される。
【０１１０】
【表８】
0004836327.tif 000009
【０１１１】
【表９】
0004836327.tif 000010
【０１１２】
【表１０】
0004836327.tif 000011
【０１１３】
実験
化合物
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（アイオア州、コーラルビレ）により合成されそしてＨＰＬＣ精製された。
【０１１４】
エレクトロポレーション
個々のオリゴヌクレオチド（５０μＭ）による２００Ｖ及び１２００μＦでのＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞のエレクトロポレーションを実施例２に記載の如くして行った。細胞を、クラスＩＩＭＨＣ及びＩｉタンパク質を定量する前に２４時間インキュベーションした。
【０１１５】
膜結合クラスＩＩＭＨＣタンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ＭＨＣ ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｐｒｏｔｅｉｎ）についてのアッセイ
細胞を、２０μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩ−Ｅｋモノクローナル抗体Ｍ５／１１４．１５．２［メリーランド州、ロックビレのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］と共に氷上で６０分間インキュベーションし、ハンクスの平衡塩類溶液で２回洗浄し、この後室温で３０分間のヤギ抗ラットＩｇＧのＦＩＴＣ標識されたＦ（ａｂ′）２（アラバマ州、バーミンガムのＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ）の１：１００希釈を行った。細胞をハンクスの溶液で３回洗浄しそして氷上で１５分間２％ホルマリンで固定した。ＦＡＣＳ分析を使用してクラスＩＩＭＨＣタンパク質の存在を示す蛍光細胞の百分率を決定した。
【０１１６】
細胞内Ｉｉタンパク質のアッセイ
細胞を２％ホルマリンで固定し、１Ｍグリシンで１回洗浄し、そして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及びサポニン０．２％を含有するハンクスの緩衝塩溶液で２回洗浄した。細胞を最初にハイブリドーマ培養上澄液としてのラット抗マウスＩｉモノクローナル抗体Ｉｎ．１（Ｋｏｃｈ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９９；６４４−６４５，１９８２）で染色し、洗浄し、次いでヤギ抗ラットＩｇＧのＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ′）２とインキュベーションした。細胞を洗浄しそしてやはり上記の如くして固定した。個々の細胞の免疫蛍光をＦＡＣＳで決定した。
【０１１７】
実施例４．  Ｉｉタンパク質発現の阻害における種々のバックボーン修飾（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）の相対的効力
この研究では、実施例３で同定された最も活性なアンチセンス配列、配列番号５４を使用してＩｉタンパク質発現の阻害における種々のバックボーン修飾の相対的効力を比較した。同じ配列の４つのバックボーン修飾を調製した（表７）：（１）ホスホロチオエート（配列番号５４）、（２）５′及び３′末端に２′メチルオキシル修飾されたホスホロチオエートを有し中央においてホスホジエステルである混合バックボーン（配列番号６５）、（３）５′及び３′末端で２′メチルオキシル修飾されたホスホロチオエートを有し中央がホスホロチオエートである混合バックボーン（配列番号６６）、及び（４）２′メチルオキシル修飾されたホスホジエステル（配列番号６７）。オリゴヌクレオチドの各々１０及び５０ｍＭをＳａＩ／ＣＩＩＴＡ肉腫細胞にエレクトロポレーションし、次いでこれを２４時間又は４８時間培養した。Ｉｉタンパク質発現における阻害のレベル及びクラスＩＩＭＨＣタンパク質発現に対するオリゴヌクレオチドの効果をＦＡＣＳ分析により定量した。表８に示されたとおり、各々ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチド配列番号５４及び配列番号６６は、クラスＩＩＭＨＣ発現に影響を与えることなくＩｉタンパク質の匹敵する阻害を生じさせた。ホスホジエステルバックボーンを有する他の２つのオリゴヌクレオチドはＩｉ発現のより少ない阻害を示した。細胞生存率をオリゴヌクレオチドの存在下又は不存在下に試験したが、すべてのオリゴヌクレオチドは最小の細胞毒性効果を有することを示した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、より低い費用でより高い収率、より速いターンオーバー（ｑｕｉｃｋｅｒ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ）を生じさせるので、このタイプのバックボーンを有するコポリマーをすべてのその後の実験で使用した。
【０１１８】
【表１１】
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【０１１９】
【表１２】
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【０１２０】
実験
化合物
表７に列挙されたとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（アイオア州、コーラルビレ）により合成されそしてＨＰＬＣ精製された。エレクトロポレーション、細胞培養並びに細胞内Ｉｉ及び表面Ｉ−Ｅ発現についてのＦＡＣＳアッセイは実施例３の場合と同じである。
【０１２１】
実施例５．Ｉｉリバース遺伝子構築物によるＩｉタンパク質発現の阻害
これらの実験では、ＳａＩ肉腫細胞を、クラスＩＩＭＨＣ分子の発現をアップレギュレーションする（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ）ＣＩＩＴＡトランスアクティング因子（ＣＩＩＴＡ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）の遺伝子（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４；６８８６（１９９７））で最初にトランスフェクションしてＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞を生成させた。Ｉｉ  ｍＲＮＡ配列に対応する表９に列挙されたＤＮＡ配列（対応する配列番号が示されている）を発現ベクターに挿入することによりいくつかのＩｉリバース遺伝子構築物（Ｉｉ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を製造した。次いでリバース遺伝子構築物をＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞にトランスフェクションした。発現ベクターを受け取った細胞はハイグロマイシン含有培地中での増殖により選ばれた。これらの細胞をモノクローナル抗体Ｉｎ．１を使用してＩｉの発現について細胞内染色した。次いでこれの細胞のＩｉ発現をＦＡＣＳ分析により定量した。
【０１２２】
Ｉｉタンパク質発現の阻害（細胞の６０％まで）はｍＩｉリバース遺伝子構築物のいくらかによるトランスフェクタントにおいて観察された。表１０に要約されたデータは、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９に列挙された配列から作られたリバース遺伝子構築物は処理された細胞の認められ得るフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）においてＩｉタンパク質発現を有意に抑制した（ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ）ことを示す。
【０１２３】
【表１３】
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【０１２４】
【表１４】
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【０１２５】
【表１５】
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【０１２６】
実験
リバース遺伝子構築物の発生
２つのプラスミドの１つから種々のＩｉリバース遺伝子構築物を作った。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から製造された構築物はサイトメガロウイルスプロモーターを利用して遺伝子発現を駆動する。ＲＳＶ．５から製造された構築物はラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１：２２９−２３５（１９９１））を利用する。両プラスミド共、トランスフェクションされた細胞の選択のために使用されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでいた。ｍＩｉリバース遺伝子断片はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により発生させた。ＰＣＲ断片はＮｈｅ１及びＡｐａ１で消化され、次いで同じエンドヌクレアーゼにより消化されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングされた。ｍＩｉリバース遺伝子断片の挿入はＮｈｅ１及びＡｐａ１消化により確認された。ＰＣＲ断片をＳａｌ  １及びＢａｍＨ１で消化し、次いで同じエンドヌクレアーゼで消化されたＲＳＶ．５プラスミドにクローニングした。すべてのｍＩｉ断片は配列決定により確認された。
【０１２７】
細胞
メリーランド州、バルチモアのメリーランド大学のオストランド・ローゼンバーグ（Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）博士の贈物である、ＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞を５％ＦＣＳ（ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ  Ｉ、ユタ州、ローガンのＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＩＭＤＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カンサス州、レネキサ）中で培養した。
【０１２８】
トランスフェクション
ＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞を、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を製造会社の教示に従って使用してｍＩｉリバース遺伝子構築物でトランスフェクションした。簡単に言えば、１０μｌのリポフェクチン及び３〜５ｍｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのＯｐｔ．ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）と、別々に穏やかに混合した。反応を室温で４０分間インキュベーションした。２つの反応を一緒に穏やかに混合しそしてさらに１５分間室温でインキュベーションした。一方、１０５個のＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞をＯｐｔ．ＭＥＭ  Ｉで洗浄しそして８００μｌのＯｐｔ．ＭＥＭ  Ｉ中に再懸濁させた。リポソーム・ＤＮＡ反応をＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞に穏やかに滴下し、次いで細胞を３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。トランスフェクション培地を培養培地２ｍｌで置き換えそして細胞を２４〜４８時間インキュベーションした後８００単位のハイグロマイシンＢ（カリフォルニア州、コスタメサのＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，）を加えて９６ウエルのプレートにおいてトランスフェクションされた細胞を選択した。
【０１２９】
ＦＡＣＳ分析
ハイグロマイシン耐性細胞を、モノクローナル抗体Ｉｎ．１によりＩｉの発現について細胞内染色した（詳細な手順については実施例３及び４参照）。染色された細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【０１３０】
実施例６．Ｉｉタンパク質抑制されそして固定されたワクチン細胞による腫瘍チャレンジに対する保護
親腫瘍（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｔｕｍｏｒ）によるチャレンジから宿主を保護するための腫瘍細胞ワクチンとしてのＩｉタンパク質抑制された腫瘍細胞の使用を探索するために実験を行った。これらの実験では、ＳａＩ肉腫細胞を最初にクラスＩＩＭＨＣ分子の発現をアップレギュレーションするＣＩＩＴＡトランスアクティング因子の遺伝子（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６８８６（１９９７））でトランスフェクションして、ＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞を生成させた。トランスフェクションされた細胞はクラスＩＭＨＣ及びクラスＩＩＭＨＣ分子の両方を発現する。ＣＩＩＴＡ遺伝子のトランスフェクションがなければ、ＳａＩ細胞はクラスＩＭＨＣ分子のみを発現する。ＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞はクラスＩＩＭＨＣ分子と共に有意な量のＩｉタンパク質も発現する。Ｉｉタンパク質とクラスＩＩＭＨＣ分子の同時発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が起こる。何故ならば、ＣＩＩＴＡトランスアクティング因子はＩｉタンパク質の構造遺伝子から上流（及びその第１イントロン以内）の遺伝子調節単位に対しても作用するからである（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３９０６（１９９０）；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１８４４（１９９８））。
【０１３１】
Ｉｉタンパク質の発現を抑制するために、ＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞（クラスＩＭＨＣ、クラスＩＩＭＨＣ分子及びＩｉタンパク質を発現する）をＩｉ  ｍＲＮＡに向けられた（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｉｉ  ｍＲＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号５４）で処理した。ＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞におけるＩｉタンパク質の抑制の程度及びクラスＩＩＭＨＣ分子の抑制のないことを、実施例３で上記した方法により測定した。アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物配列番号５４は、クラスＩＩＭＨＣ分子の発現のレベルに対する有意な効果なしにＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞の約３５％においてＩｉタンパク質を十分に（ｐｒｏｆｏｕｎｄｌｙ）抑制した。接種された宿主における複製を防止するために、ワクチン細胞をホルムアルデヒドで固定した。
【０１３２】
Ｉｉ抑制されたワクチン細胞を受け取ったマウスを３つのサブグループに分け、各サブグループは、２．５×１０５個の細胞／マウス、７．５×１０５個の細胞／マウス及び２０×１０５個の細胞／マウスでＳａＩ腫瘍によりチャレンジされた（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。Ｉｉを抑制するためのコポリマーで処理されなかった固定されたＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞で処理された対照マウスも上記濃度の腫瘍細胞でチャレンジされた。マウスの６つのサブグループの各々における腫瘍の発生は表１１に示される。１３日目に、腹水腫瘍を有するすべての対照マウス（Ｃ）は１．５〜２．５ｍｌの腹水を有しておりそして終結させた。ＣＩＩＴＡ遺伝子トランスフェクションされたワクチン細胞を受け取ったマウス（ＡＳマウス）の中で、２．５×１０５個の細胞／マウス群の１匹のマウス及び７．５×１０５個の細胞／マウス群の１匹のマウスは１．５〜２．５ｍｌの腹水で終結させた。２０×１０５個の細胞／マウス群のマウスのどれも６１日で腫瘍を発生しなかった。
【０１３３】
これらの観察は、クラスＩＩＭＨＣ分子を発現するがＩｉタンパク質を殆ど又は全然発現しない腫瘍細胞によるマウスの予防接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）は防御性腫瘍免疫（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）をもたらすことを証明する。その防御はクラスＩＭＨＣを発現するがクラスＩＩＭＨＣ分子を発現しない親ＳａＩ細胞にたいしてであるので、免疫は、クラスＩＩＭＨＣ分子により拘束されるヘルパーＴ細胞により媒介され、そして最終の、エフター、キラーＴ細胞応答の発展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のために必要である。即ち、これらのワクチン細胞は、クラスＩＭＨＣ陽性であるがクラスＩＩＭＨＣ及びＩｉタンパク質陰性である親ＳａＩ細胞に対する防御を誘発するので、防御は２つのクラスのＴ細胞により媒介される。第１は、ヘルパーＴ細胞が免疫調節Ｉｉタンパク質なしにクラスＩＩＭＨＣ分子により提示された抗原決定基により刺激される。第２に、クラスＩＭＨＣにより拘束されるキラーＴ細胞はヘルパーＴ細胞の作用により刺激されて活性を拡大する。
【０１３４】
【表１６】
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【０１３５】
１．５ｍｌに等しいか又は１．５ｍｌより大きい容積を有する腫瘍腹水の発生は、配列番号５４で処理されたか（アンチセンスは“ＡＳ”、サブグループ）又は処理されなかった（対照は“Ｃ”、サブグループ）ＣＩＩＴＡ遺伝子トランスフェクションされた腫瘍細胞で予防接種されたマウスにおいて評価された。
【０１３６】
実験
トランスフェクション
ＣＩＩＴＡ遺伝子トランスフェクションされたＳａＩ細胞を、５０μＭの化合物配列番号５４と共に２×１０６個の細胞／ｍｌでインキュベーションし、そしてＢＴＸ  ＥＣＭ６００エレクトロポレーションシステムにおいて２００Ｖ、１２００μｆｄでエレクトロポレーションに付した。次いで細胞をウシ胎仔血清５％を有するＩＭＤＭ中で２０時間培養した後、タンパク質発現についての免疫蛍光分析及び固定を行った。
【０１３７】
固定
細胞を、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ｐＨ７．２中で室温で１５分間０．５％ホルムアルデヒドで固定し、そして洗浄した。
【０１３８】
接種
ワクチン細胞を２．５×１０５個の細胞／マウスで１５匹のマウスに腹腔内に注入した。平行群（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｇｒｏｕｐ）の１５匹のマウスに、配列番号５４コポリマーで処理されなかったＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞を注入した。
【０１３９】
腫瘍チャレンジ
２７日後、配列番号５４で処理されたＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞で予防接種されたマウスの３つのサブグループ（サブグループ当たり５匹）のマウスは、それぞれ、３つの用量：２．５×１０５個の細胞、７．５×１０５個の細胞及び２０×１０５個の細胞でＳａＩ親細胞でチャレンジされた。平行して、配列番号５４で処理されなかった固定されたＳａＩ／ＣＩＩＴＡ細胞で予防接種されたマウスの３つのサブグループは、それぞれ、同じ３つの用量でＳａＩ親細胞でチャレンジされた。これらのチャレンジ用量は細胞用量／腫瘍発生曲線をタイトレーションする予備実験で決定された。
【０１４０】
実施例７．Ｉｉタンパク質抑制されそして照射されたワクチン細胞による腫瘍チャレンジに対する防御
この実施例の実験は、主として２つの要素を除いて実施例６の計画実験に対応した。第１には、ＣＩＩＴＡの遺伝子のトランスフェクションの後ではなくてインターフェロンγの遺伝子のトランスフェクションの後ＳａＩ細胞においてクラスＩＩＭＨＣ分子及びＩｉタンパク質を誘導させた。第２に、ワクチン細胞の生存率は、悪性潜在力（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（複製能力）を破壊しながら、照射により維持された。
【０１４１】
ＣＩＩＴＡではなくてインターフェロンγの作用によりクラスＩＩＭＨＣ分子を誘導するのを好むいくつかの実際的な科学的及び経済的理由がある。例えば、インターフェロンγの作用は、腫瘍関連抗原決定基の最適プロセッシング及び提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）のために必要な追加の機能を誘導する可能性がある。更に、腫瘍細胞を宿主への導入の後ある時間生存させ続ける（複製なしで）ことは、例えば、抗原決定基への連続する暴露、累積抗原用量（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｏｓｅ）、免疫系の多数の補助細胞及びエフェクター細胞との相互作用の持続の点から有利な性質を与える。
【０１４２】
これらの実験では、ＳａＩ肉腫は、ｐＧＫＮｅｏプラスミドに挿入されたインターフェロンγ遺伝子（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ａｎａｎｔｈａｓｗａｍｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２４４−２５５（１９９３）でのエレクトロポレーションによりトランスフェクションされた。最初の選択は８００μｇ／ｍｌＧ４１８においでありそして維持は４００ｕｇ／ｍｌＧ４１８においてであった・インターフェロンγ産生細胞は限界希釈で培養すること、そして視覚免疫蛍光によりＡＴＣＣハイブリドーマＴ１ＢＩ２０からの５／１１４．１５．２モノクローナル抗体によりクラスＩＩＭＨＣ分子の表面発現により同定されたクローン集団（ｃｌｏｎａｌ．ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）の拡大により選択された。
【０１４３】
細胞集団を保護する２つのクラスのワクチンを調製した：１）Ｉｉタンパク質発現を抑制するためのコポリマー配列番号５４でトランスフェクションされた細胞及び２）トランスフェクションされなかった細胞。ＣＩＩＴＡ遺伝子トランスフェクションされたＳａＩ細胞を、５０μＭのコポリマー配列番号５４と２×１０６個の細胞／ｍｌでインキュベーションし、そしてＢＴＸ  ＥＣＭ６００エレクトロポレーションシステムにおいて２００Ｖ、１２００μｆｄでエレクトロポレーションした。次いで細胞を、タンパク質発現の免疫蛍光分析又はワクチンの製造の前に、２４時間又は４８時間５％ウシ胎仔血清を有するＩＭＤＭ中で培養した。予防接種の前に細胞をセシウム照射装置（ｃｅｓｉｕｍ  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ）において３，５００ラドの照射にさらした。
【０１４４】
マウスは、１、２及び３日目に、３つのタイプの照射されたインターフェロン［ＩＦＮ］γ遺伝子トランスフェクションされた細胞：１）ＩＦＮγ遺伝子トランスフェクションされた細胞（表１２における“Ｃ”）、２）クラスＩＩＭＨＣ分子（表１２の“ＡＳ−２４”）に対する効果なしに細胞の約３４％においてＩｉタンパク質が抑制されるように、化合物配列番号５４により処理の後２４時間培養されたＩＦＮγ遺伝子トランスフェクションされた細胞（表１２の“ＡＳ−２４”）及び３）クラスＩＩＭＨＣ分子に対する効果なしに細胞の約４５％においてＩｉタンパク質が抑制されるように、化合物配列番号５４による処理の後４８時間培養されたＩＦＮγ遺伝子トランスフェクションされた細胞（表１２の“ＡＳ−４８”）の２×１０６個の細胞／用量で注入された。
【０１４５】
２４日後、各予防接種グループにおけるサブグループはＳａＩ肉腫細胞の３つのレベル：２×１０６、５×１０６又は１２．５×１０６個の細胞、の１つでチャレンジされた（表１２）。対照サブグループの０／４、２／４及び４／４は１１日目に２〜３ｍｌの腹水を生じそして１３日目に終結させた。ＡＳ−２４及びＡＳ−４８マウスでは、表１２に報告された終点は２ｍｌより多くの腹水を有するマウスの終結の日を示す。３１に目に生存しているマウスは悪性の証拠がなかった。
【０１４６】
これらの結果は、Ｉｉタンパク質は抑制されそしてクラスＩＩＭＨＣ分子は発現される「工学的に作り出された」誘導体−腫瘍細胞での予防接種によって、クラスＩＭＨＣ陽性、クラスＩＩＭＨＣ陰性「親」細胞に対する有効な腫瘍防御を証明する。これはＩｉタンパク質の不存在下でのクラスＩＩＭＨＣ分子による「ヘルパー」抗原決定基（“ｈｅｌｐｅｒ”  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）の拡大した能力範囲（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を与えることは抗腫瘍応答の増進をもたらすことを示す。
【０１４７】
【表１７】
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