(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に支持されたペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液とを反応させて、前記ペプチドのグルタミン酸残基を選択的にエステル化することを特徴とするペプチドの修飾方法。
【請求項２】
前記アルコールは、炭素数１以上５以下であることを特徴とする請求項１に記載のペプチドの修飾方法。
【請求項３】
前記過ハロゲン化カルボン酸は、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸及びヘプタフルオロブチル酸からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチドの修飾方法。
【請求項４】
前記担体は、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のペプチドの修飾方法。
【請求項５】
前記アルコールは、メタノールであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のペプチドの修飾方法。
【請求項６】
前記過ハロゲン化カルボン酸は、トリフルオロ酢酸であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のペプチドの修飾方法。
【請求項７】
ペプチドのグルタミン酸残基を選択的にエステル化するように、担体に支持されたペプチドとアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液とを反応させる工程と、
前記担体をプロテアーゼ溶液に浸漬して、前記ペプチドに由来するペプチド断片を得る工程と、
前記ペプチド断片の分子量を測定する工程と、
前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とするペプチドの同定方法。
【請求項８】
前記の分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程は、前記の選択的にエステル化されたグルタミン酸残基を有するペプチドに由来するペプチド断片の分子量と、該ペプチド断片に対応し前記ペプチドに由来するペプチド断片の分子量との差に基づいて、該ペプチドが有するグルタミン酸残基の数と該ペプチドの分子量とを同時に把握することを特徴とする請求項７に記載のペプチドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの修飾方法及びこれを用いたペプチドの同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然より採取されるペプチドやタンパク質など（以下、総称して、ペプチドとも言う）のアミノ酸配列に関する情報は、その生物学的性質や機能を研究する上で、不可欠である。現在、ペプチドやタンパク質などの全アミノ酸配列は、対応する遺伝子情報、すなわち、これらアミノ酸配列をコードしているゲノム遺伝子やｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、推定されるアミノ酸配列として決定されている。また、これらのアミノ酸配列は、ペプチドの配列を直接分析する種々の方法によりタンパク質自体のアミノ酸配列が決定されている。その際、ペプチドのアミノ酸配列に関する情報は、ペプチドをコードするゲノム遺伝子やｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡを特定する上で、依然として必要である。【０００３】
アミノ酸配列の情報を得る方法として、ペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ）がある。この方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの電気泳動で分離したバンドを切り出し、切断部位特異的なプロテアーゼなどの蛋白分解酵素を用いてバンド中に含まれるペプチドを複数のペプチド断片に消化した後、質量分析を用いて測定した各ペプチド断片に由来する分子量等の情報から、元のペプチドを同定する方法である。この方法を用いて十分な確度でペプチドを同定するには、ペプチドが切断されて少なくとも４〜５つのペプチド断片が生成される必要がある。【０００４】
しかしながら、分子量の小さいペプチドを測定対象とする場合、蛋白分解酵素により得られるペプチド断片の数は、非常に限られる場合が多い。また、たとえ分子量の大きいペプチドを対象とする場合であっても、蛋白分解酵素を用いてペプチドを消化して得られるペプチド断片の数は、蛋白分解酵素の切断様式に依存することから、十分な数のペプチド断片が得られない場合も考えられる。【０００５】
ＰＭＦ法を用いたペプチドの同定確度を向上させる方法として、複数の蛋白分解酵素を用いて得たペプチド断片に関する質量分析スペクトルを比較する方法が挙げられる。しかしながら、この方法では、得られるスペクトルが多数となり、比較すべきピークも多数となり、同定が煩雑となってしまう。【０００６】
また、他の方法として、ペプチドを構成するアミノ酸残基を非特異的に修飾するなどして、ペプチドに由来するペプチド断片の分子量を修飾の前後で比較する方法が挙げられる。しかしながら、この方法は、ペプチドが非特異的に修飾されるため、修飾の前後でどのような変化が起きたかを追跡／比較する工程が煩雑となるという問題があった。【０００７】
さらに、別の方法として、ペプチドのアミノ酸残基を特異的に修飾する酵素を用いて、ペプチドに由来するペプチド断片の分子量を修飾の前後で比較する方法も考えられる。しかしながら、このような酵素をゲル中で作用させることは困難である。また、修飾反応の後の分子量情報を得る工程で、蛋白分解酵素で分解を受けた上述の修飾する酵素に由来する酵素断片が目的とするペプチドに由来するペプチド断片のピークに影響を及ぼすなどの問題があり、簡便であるとは言い得ない。【０００８】
さらに、理論的には十分な数のペプチド断片が得られた場合であっても、質量分析を用いた分子量測定において、得たペプチド断片のいくつかは、イオン化の傾向の著しい不均一性やサプレッション効果などの複合的な作用により、観測できない場合もある。いずれの場合であっても、ＰＭＦ法を用いてペプチドの同定に係る確度を向上させることが求められている。【０００９】
なお、出願人は出願時点までに本発明に関連する公開された先行技術文献を発見することができなかった。よって、先行技術文献情報を開示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、簡便且つ特異的にペプチドを構成する特定のアミノ酸残基を修飾する方法を提供することを目的とする。また、この特異的な修飾方法により修飾されたアミノ酸残基の数を特定して得られるペプチドに関する新規の情報を用いて、ペプチドの同定確度を向上させる手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によるペプチドの修飾方法は、担体に支持されたペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液とを反応させて、前記ペプチドのグルタミン酸残基を選択的にエステル化することを特徴とする。【００１２】
また、本発明によるペプチドの同定方法は、ペプチドのグルタミン酸残基を選択的にエステル化するように、担体に支持されたペプチドとアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液とを反応させる工程と、前記担体をプロテアーゼ溶液に浸漬して、前記ペプチドに由来するペプチド断片を得る工程と、前記ペプチド断片の分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、担体中で、ペプチドのグルタミン酸残基を特異的に修飾し得るようになる。また、この修飾反応の結果、ペプチドを構成するグルタミン酸の数が決定されるので、ペプチドの同定確度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ウマミオグロビンの配列、トリプシン消化して得られると予測される消化断片及び観測された消化断片の配列を示す。
【図２】本発明による方法によるグルタミン酸残基をエステル化して得たミオグロビンに係る質量分析スペクトルを示す図であって、（Ａ）は、ウマミオグロビンをトリプシン消化したものであり、（Ｂ）は、グルタミン酸残基をエステル化したミオグロビンをトリプシン消化したものである。
【図３】ミオグロビンの１３４〜１３９番目（断片a）の残基に係る質量分析スペクトル図であって、上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【図４】ミオグロビンの３２〜４２番目（断片ｂ）の残基に係る質量分析スペクトル図であって上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【図５】ミオグロビンの６４〜７７番目（断片ｃ）の残基に係る質量分析スペクトル図であって、上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【図６】ミオグロビンの１１９〜１３３番目（断片ｄ）の残基に係る質量分析スペクトル図であって上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【図７】ミオグロビンの１７〜３１番目（断片e）の残基に係る質量分析スペクトル図であって上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【図８】ミオグロビンの１〜１６番目（断片ｆ）及び８０〜９６番目（断片ｇ）の残基に係る質量分析スペクトル図であって上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【図９】ミオグロビンの１０３〜１１８番目（断片ｈ）の残基に係る質量分析スペクトル図であって上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（本発明によるペプチドの修飾方法）
本発明によるペプチドの修飾方法は、担体に支持されたペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液とを反応させて、前記ペプチドのグルタミン酸残基を選択的にエステル化することを特徴とする。【００１６】
本発明において、担体は、ペプチドを保持し得るゲル状の組成物であれば特に制約はなく、例えば、ポリアクリルアミドゲルが挙げられる。担体は、ゲル電気泳動法として、一次元方向に電気泳動を行う従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で用いられるものはもちろんのこと、二次元泳動法を適用され得るものでもよい。【００１７】
本発明において、アルコールは、アミノ酸残基とエステル化反応し得るアルコール性水酸基を有する化合物であれば特に制約はなく、例えば、炭素数が１以上５以下のアルコールであってもよい。これらの例として、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールが挙げられる。なかでも、メタノールが好ましい。また、このアルコールの水酸基以外を構成する原子（団）は、いかなる質量を有するものであってもよく、例えば、水素であれば、その同位体である２Ｈ又はこれを有するものであってもよい。これらの原子は、上述の通り、アミノ酸残基とアルコールとのエステル化反応を阻害しないものであれば、この限りでない。【００１８】
本発明において、ペプチドは、グルタミン酸残基を有するものであっても有さないものであっても特に制約はなく、Ｓ−Ｓ結合などの分子内結合を有するものや、金属などが配位したものや、酸化還元状態によって側鎖の状態が変化するものや、リン酸や糖鎖など翻訳後修飾を受けるものであってもよい。Ｓ−Ｓ結合が試薬のグルタミン酸へのアタックを立体的に阻害する場合は、定法に従って還元を行いＳ−Ｓ結合の開裂を行うことで、本発明は問題なく適用できる。また、ペプチドの分子量は、担体中に保持され得るものであれば特に制限はないが、７ＫＤａ以上２００ＫＤａ以下であってもよい。【００１９】
本発明において、過ハロゲン化カルボン酸は、低級の炭素鎖を有するものであれば特に制約はなく、またフッ素や塩素など種々のハロゲン原子を有していればよい。例えば、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸及びヘプタフルオロブチル酸等が挙げられる。なかでも、担体への浸透性の点で、トリフルオロ酢酸が好ましい。【００２０】
本発明によるペプチドの修飾方法において、温度、時間、濃度及びｐＨなどの反応条件は、適宜調節すればよい。【００２１】
反応温度としては、担体からペプチドが溶出せず液相が液体状態を保持し得る限り特に制約はないが、例えば０〜４０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、室温〜２５℃が特に好ましい。４０℃を越えると、過ハロゲン化カルボン酸によるペプチドの切断反応などの副反応が起きてしまう。また、０℃未満であると、液相が固体化するなど、反応が十分進行しない。【００２２】
反応時間としては、反応温度に依存して種々変更すればよく、２時間〜２４時間であってもよい。２時間未満であると、過ハロゲン化カルボン酸によるグルタミン酸残基の選択的なエステル化反応が十分進行せず、２４時間よりも長い場合、ペプチドのアスパラギン酸残基がエステル化されてしまうなどの副反応が起こってしまう。また、長時間反応を行うと、本発明によるペプチドの修飾方法を行った後に得られるペプチドを用いて得られる質量分析スペクトルのシグナルが乱れたり、セリン、スレオニンのアミノ酸側での加水分解などの副反応が起きたり、サンプルであるペプチドが担体から溶出したりなどの不具合が生じる。【００２３】
本発明によるペプチドの修飾方法に用いるアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液の各成分の濃度は、特に限定されないが、アルコール濃度で、５〜３０ｖ／ｖ％であることが好ましく、過ハロゲン化カルボン酸濃度で、１０〜４０ｖ／ｖ％であることが好ましい。アルコールとしてメタノールを用いる場合、メタノールの濃度が１ｖ／ｖ％未満であると、グルタミン酸へ供給されるアルコールが酸との反応に消費されてアルコールが不足してしまう。また、６０ｖ／ｖ％よりも大きい場合には、担体が脱水収縮し反応の進行が妨げられることとなってしまう。過ハロゲン化カルボン酸濃度が１ｖ／ｖ％未満であると、酸がアルコールとのエステル化反応により消費されて触媒不足となり、６０ｖ／ｖ％よりも大きい場合には、不必要な脱水が進むなど、良い結果を与えない。これらの濃度のうち、アルコールとしてメタノールを、過ハロゲン化カルボン酸としてトリフルオロ酢酸を用いる場合、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液の濃度は、良好な結果が得られる点で、水：メタノール：トリフルオロ酢酸の体積比が、１００〜６００：１５０〜３５０：３００〜７００であるものが好ましく、５００：２５０：５００であるものがより好ましい。【００２４】
本発明によるペプチドの修飾方法により、担体に支持されたペプチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基のみが特異的に、アルコールに対応したエステル体（例えば、メタノールである場合は、メチルカルボキシル基）となる。【００２５】
（本発明によるペプチドの同定方法）
本発明によるペプチドの同定方法は、ペプチドのグルタミン酸残基を選択的にエステル化するように、担体に支持されたペプチドとアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸水溶液とを反応させる工程と、前記担体をプロテアーゼ溶液に浸漬して、前記ペプチドに由来するペプチド断片を得る工程と、前記ペプチド断片の分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。以下、それぞれの工程を、反応工程、消化工程、測定工程及び把握工程と称する。【００２６】
（反応工程）
反応工程は、上述の本発明によるペプチドの修飾方法を用いればよい。これにより、担体に支持されたペプチドのグルタミン酸残基は、反応に用いたアルコールに対応したエステル体（例えば、メタノールを用いたのであれば、メチル化体）となる。この反応の材料、条件等は、上述した通りであればよい。なお、この反応工程によりエステル化されたペプチドのグルタミン酸残基に結合されるアルコールに対応する置換基（例えば、メタノールを用いたのであれば、メチル基）を、以下、置換残基と称する。【００２７】
この反応工程において、上述の所定の条件で、ペプチドと、アルコールと、過ハロゲン化カルボン酸とで反応を行った後、種々のｐＨ調節剤で担体／液相のｐＨを調節してもよい。この際、好適なｐＨは、後の消化工程で用いるプロテアーゼの至適ｐＨであることが好ましく、例えば、ｐＨ７〜９であることが挙げられる。また、好適なｐＨ調節剤としては、公知のものを用いればよく、例えば、重炭酸アンモニウム溶液が挙げられる。【００２８】
さらに、この反応工程において、ゲル中の水分を除去する脱水処理を行ってもよい。脱水処理には、ゲル状物質の溶解を引き起こさず、且つ水に対して親和性を有する種々の脱水剤であれば特に制約されないが、例えば、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）など炭素数４以下のニトリル類や、アセトンなど炭素数４以下のケトン類などの、極性非プロトン性溶媒が例示される。これにより、担体の微細な穴構造の間隙サイズを維持していた水溶媒が除去されて、分析対象のペプチドは、担体中に保持された状態に維持され得る。【００２９】
脱水処理は、所望する脱水の程度に応じて、適宜行われればよい。例えば、担体片を脱水剤中に浸漬する操作を数回繰り返して行ってもよく、担体片を室温にて２０分間浸漬する操作を３回行ってもよい。このとき、担体片がＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）等の色素により染色されていれば、溶媒置換に伴い色素が除去され、脱色する。このため、色の変化により溶媒置換の完了をおおむね把握することができる。【００３０】
また、本発明において、対象となるペプチドの分子内／分子間結合や翻訳後修飾に係る分子団を、適当な処理剤を用いて、分解／切断等の処理を本反応工程の前に行ってもよい。例えば、分子内又は分子間にＳ−Ｓ結合を有するペプチドを対象とする場合、ＤＴＴなどの還元剤で還元処理してＳ−Ｓ結合を解消してもよい。また、Ｓ−Ｓ結合を還元して得たＳＨ基を、更にアルキル化剤などを用いて、再びＳ−Ｓ結合を形成させないように処理してもよい。【００３１】
（消化工程）
消化工程は、担体をプロテアーゼ溶液に浸漬する工程である。プロテアーゼは、対象となるペプチドの所定の位置で切断し得るものであれば、特に制約はない。例えば、本技術分野において周知なセリンプロテアーゼの一種であるトリプシンを用いてもよい。これにより、担体に支持されたペプチドは、プロテアーゼの作用により、所定の位置で切断されたペプチド断片となる。【００３２】
なお、この消化工程により、担体に支持されていたペプチドに由来するペプチド断片は、担体から液相に溶出され、この液相が、後の測定工程に供される。【００３３】
（測定工程）
測定工程は、ペプチド及び／又はペプチド断片の分子量を測定する工程である。測定工程は、ペプチドの分子量を測定し得る方法であれば特に制約はなく、種々の質量分析機器を用いて行えばよい。質量分析機器としては、例えば、イオントラップ質量分析計、四重極型質量分析計、磁場型質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などが挙げられる。また、イオン化法として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）法などが挙げられる。【００３４】
このうち、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳが好適に用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、イオン化過程において、ペプチド断片を構成するアミノ酸残基から一部の原子団が欠落することを抑制することができる。また、比較的高分子量のペプチド断片の測定を好適に行うことができる。また、測定対象のタンパク質を試料中からゲル電気泳動を用いて分離し、ゲル中で上述の処理を施した後、回収して測定に供する場合にも、対応する陰イオンと陽イオンの両方を測定可能である。これらのことから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、さらに再現性の高い分析を行うことができる。【００３５】
質量分析にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合、ペプチド断片にプロトン（Ｈ＋）が付加された陽イオン種と、ペプチド断片からプロトンが離脱された陰イオン種とをそれぞれ測定することが可能となる。【００３６】
（把握工程）
把握工程は、上述に従って得たペプチドに由来するペプチド断片に係る分子量等の情報に基づいて、ペプチドを把握する工程である。【００３７】
従来から、質量分析により得たペプチドに由来するペプチド断片の分子量から、データベース上でペプチドの帰属を行う手法は、ＰＭＦ法において公知である。つまり、特定のペプチドと特定のプロテアーゼとの組合せにより得られるペプチド断片に係る質量分析スペクトルは、プロテアーゼの有する切断部位特異性に起因して、略一義的である。本発明によるペプチドの同定方法において、この把握工程は、このような本技術分野公知の手法により、行えばよい。【００３８】
把握工程は、ペプチドに上述の反応工程を行った群と、行わなかった群とに由来するペプチド断片の分子量に基づいて行ってもよい。ペプチドがグルタミン酸残基を有する場合、把握工程により、そのグルタミン酸残基には、置換残基が結合する。この結合された置換残基は、分子量の変化として、質量分析スペクトルに反映されることになる。従って、特定のペプチド断片に着目した場合、把握工程の有無に起因する置換残基に由来する分子量の変化は、この特定のペプチド断片にグルタミン酸残基が少なくとも１個以上含まれることを反映する。【００３９】
このことを例示した図が、図３である。図３は、ミオグロビンの１３４〜１３９番目（断片a）の残基に係る質量分析スペクトル図であって、上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。図３の上段と下段とを比較すると、上段では出現していなかった７６２近傍のピークは、下段では、出現している。このことは、上段で観測した断片ａの分子量（７４７．４２８）との関係から、ミオグロビンの１３４〜１３９番目に係るペプチド断片にグルタミン酸残基が含まれていることを示すものである。なお、配列番号３に示すように、ミオグロビンの１３４〜１３９番目の配列は、１つのグルタミン酸残基を有し、図３の結果を明確に支持している。同様に、図９に示すように、ミオグロビンの１０３〜１１８番目に係るペプチド断片の配列は、グルタミン酸残基を含み、このことは、図９の上段と下段とを比較して観察される１９００近傍のピークに示されている。【００４０】
また、対象となるペプチド断片に複数のグルタミン酸残基が含まれていても、上述の１個のグルタミン酸残基が含まれる際に適用した例が適用され得る。これを例示したのが、例えば、図４及び図７である。図４では、上段と下段とを比較すると、１２８５近傍及び１２９９近傍に新たなピークが出現している。これは、ミオグロビンの３２〜４２番目に含まれる二つのグルタミン酸残基を反映したものである。これら新たなピークである１２８５及び１２９９は、断片ｂの理論分子量１２７０．６５６から見ると、約１４の倍数だけ加えた数字である。この約１４という数字は、反応工程に用いたメタノールに係る置換残基であるメチル基を反映した数字である。つまり、特定のペプチド断片に由来するピークについて、反応工程の前後で、反応工程で用いたアルコールに由来する置換残基の分子量だけ大きい質量に新たなピークが出現した場合、この特定のペプチド断片にはグルタミン酸残基が含まれていると把握できる。また、置換残基の分子量だけ大きい質量に新たなピークが出現し、且つ置換残基の分子量の倍数だけ大きい質量に新たなピークが出現した場合、この特定のペプチド断片にはグルタミン酸残基がこの倍数個含まれていると把握できる。【００４１】
逆に、特定のペプチド断片に由来するピークについて、反応工程の前後で、新たなピークの出現が観察されなかった場合、この特定のペプチド断片にはグルタミン酸残基が含まれていないと把握できる。【００４２】
なお、アルコールとしてメタノールを用いて反応工程を行った例（置換残基がメチル基）を示したが、置換残基に由来する分子量の変化は、上述の本発明によるペプチドの修飾方法で挙げた種々のアルコールに対応する置換残基に依存する。従って、把握工程で述べた事項については、反応工程に用いたアルコールに対応する置換残基の分子量で読み替えて適用すればよい。【００４３】
これらの情報、つまり、特定のペプチド断片に含まれるグルタミン酸残基の個数、又は特定のペプチド断片にグルタミン酸残基が含まれるかどうかを示す情報は、質量分析を用いて得られる分子量と併せて、特定のペプチド断片の帰属及び／又はこのペプチド断片に由来するペプチドの帰属を検討する際、非常に有用である。【００４４】
一般に、ＰＭＦ法では、測定結果である分子量とその誤差の範囲にあるペプチド断片をデータベースから網羅的に抽出する。つまり、特定の分子量範囲に包含されるペプチド断片を網羅的に検索して、これらすべてを候補蛋白質として扱う。従って、データベースから抽出される候補蛋白質であるペプチド断片は、あくまで分子量を一指標としたものである。【００４５】
一方、本発明によるペプチドの同定方法では、分子量に加えて、グルタミン酸残基の有無や個数といった変数が得られる。従って、上述の検索の一指標であるペプチド断片の分子量に加えて、グルタミン酸残基の有無及び／又は数を指標として利用することが可能となる。つまり、従来のＰＭＦ法で用いていた分子量を一指標とした網羅的なペプチド断片の同定に加えて、グルタミン酸残基の数を指標として加えて考慮することが可能となり、候補蛋白質のいっそうの絞込みが可能となる。
【実施例】
【００４６】
ミオグロビン５μｇ（配列番号１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、バンドをＣＢＢ染色した。染色したバンドを１ｍｍ×１ｍｍで切り出し、水：メタノール：ＴＦＡ＝５００：２５０：５００（μＬ）の溶液に浸漬し、室温で４時間載置した。その後、水を用いて、このゲルに、室温で１５分洗浄する工程を４回繰り返した。その後、ゲル内のｐＨが約８となるまで（例えば約２０分間）、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）溶液に浸漬し、さらに、１００％のアセトニトリル溶液で脱水し、その後１２．５ｎｇ／μＬのトリプシン溶液に浸漬して３７℃、１６時間、ｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った。得た消化断片をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。また、コントロールとして、エステル化処理をしていないミオグロビンのトリプシン消化断片群を用い、同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。これらの結果をまとめたのが、図１であり、詳細な結果を示すのが、図２乃至図９である。【００４７】
図１は、ウマミオグロビンの配列、トリプシン消化して得られると予測される消化断片及び観測された消化断片の配列を示す。図１中、上段は、ウマミオグロビンのアミノ酸配列（配列番号１）であり、中段は、このアミノ酸配列から推測されるトリプシン消化断片であり、下段は、上述のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により観測された消化断片を示す。下段に示す各消化断片は、ミオグロビンの、１３４〜１３９番目（断片ａ；配列番号２）、３２〜４２番目（断片ｂ；配列番号３）、６４〜７７番目（断片ｃ；配列番号４）、１１９〜１３３番目（断片ｄ；配列番号５）、１７〜３１番目（断片ｅ；配列番号６）、１〜１６番目（断片ｆ；配列番号７）、８０〜９６番目（断片ｇ；配列番号８）及び１０３〜１１８番目（断片ｈ；配列番号９）にそれぞれ対応する。【００４８】
図２は、本発明による方法によるグルタミン酸残基をエステル化して得たミオグロビンに係る質量分析スペクトルを示す図であって、（Ａ）は、ウマミオグロビンをトリプシン消化したものであり、（Ｂ）は、グルタミン酸残基をエステル化したミオグロビンをトリプシン消化したものである。【００４９】
さらに、図２に示す質量分析スペクトルの横軸を拡大して、上述の各断片ａ乃至ｈについて示したのが、それぞれ、図３乃至図９である。図３乃至図９は、それぞれ、ミオグロビンの：
図３：１３４〜１３９番目（断片ａ；配列番号２）；
図４：３２〜４２番目（断片ｂ；配列番号３）；
図５：６４〜７７番目（断片ｃ；配列番号４）；
図６：１１９〜１３３番目（断片ｄ；配列番号５）；
図７：１７〜３１番目（断片ｅ；配列番号６）；
図８：１〜１６番目（断片ｆ；配列番号７）及び８０〜９６番目（断片ｇ；配列番号８）；並びに
図９：１０３〜１１８番目（断片ｈ；配列番号９）；
に対応し、図３乃至図９の上段は、本発明における反応工程を行っていないものであり、下段は、本発明における反応工程を行ったものである。また、図３乃至図９のうち、分子量の後に「Ｍｅ」及び「Ｏｘ」と記したピークは、各図に記載のペプチド断片に係るメチル化体及び酸化体に由来するピークである。【００５０】
図３乃至図９の上段と下段とを比較すると、断片にグルタミン酸残基（一文字表記でＥ）を有する断片ａ、ｂ、ｅ、ｆ及びｈに係る質量分析スペクトルでは、上段では見出されておらず下段でのみ見出されているピークのうち、元の断片に由来するピークから分子量１４だけシフトしたピークが観察された（各図中、Ｍｅで示した）。この分子量のシフトは、本発明における反応工程に用いたメタノールのメチル基に由来するものである。特に、断片中に複数のグルタミン酸残基を有する断片ｂ及びｅ（それぞれ、図４及び図７）では、元のピークから分子量１４だけシフトした位置にピークが新たに出現し、このピークからさらに分子量１４シフトした位置にも新たにピークが出現した（図４では、元のピーク１２７１．６７２７に対して、それぞれ、１２８５．６８６６及び１２９９．７５２７に相当し、図７では、元のピーク１６０７．０６１２に対して、それぞれ、１６２１．０６９８及び１６３５．０８７０に相当）。【００５１】
なお、ミオグロビンの８０〜９６番目に対応する断片ｇ（配列番号８）に係るピークは、コントロールでも非常にかすかにしか検出されておらず、スペクトルが観察されにくいペプチド断片であったと考えられるので、検出限界以下であったものと推察される。【００５２】
一方、グルタミン酸残基を有さない断片ｃ及びｄ（図５及び図６）では、本発明における反応工程の有無で得られたスペクトルを比較しても、上述のピークシフトは観察されてなかった。なお、断片ｄに係る図６で観察された大きな二本のピーク（上段では、１５０２．８４３７と１５１８．８５３７、下段では、１５０２．８１３９と１５１８．８３７６）は、メチオニン残基の酸化に由来するものであり、これらの分子量の差は、１６であり、上述のメチル基の分子量とは異なる。【００５３】
また、上述したいずれの断片においても、本発明によるペプチドの修飾方法では、ペプチドに含まれるアスパラギン酸残基にはエステル化などの修飾反応は起こらないか、起こっても非常にわずかであり、グルタミン酸残基に特異的であるといえる。また、仮にアスパラギン酸残基にエステル化が起こった場合であっても、グルタミン酸残基のメチルエステル体とは、強度の観点から識別が可能である。【００５４】
また、本発明によるペプチドの修飾方法では、過ハロゲン化カルボン酸を用いることにより、Ｓｅｒ−Ｎ、Ｔｈｒ−Ｎ、Ａｓｐ−Ｃなどといった塩酸などの強酸に弱い結合に由来する切断スペクトルが観察されなかったこと、及びグルタミン、アスパラギンのデアミデーションも観察されなかった。従って、本発明によるペプチドの修飾方法は、蛋白質の構造解析に非常に有用であるといえる。【００５５】
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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