(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、生物学的サンプルからの核酸の安定化及び単離の方法：臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、チオ硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、及び酒石酸塩からなる群から選ばれるアニオンAを使用し、カチオン性化合物(I)とアニオンからなる物質は全体で中性である、少なくとも１つの式(I)のカチオン性化合物と生物学的サンプルを接触させる。
【化１】
0004809967.tif 000039
式中、
Xは、窒素(N)又は燐(P)を示し、
ｋは、１又は２の整数を示し、
Bkは、エタン-1,1-ジイル、エタン-1,2-ジイル、プロパン-1,1-ジイル、プロパン-1,2-ジイル、プロパン-1,3-ジイル、ブタン-1,1-ジイル、ブタン-1,2-ジイル、ブタン-1,3-ジイル、及びブタン-1,4-ジイルから選択される脂肪族C2-C4アルカンジイル架橋を示すか、
又は、以下の構造の置換されたフェニル架橋：
【化３】
0004809967.tif 000040
（式中、ｍ及びｌは０であり、ｎ及びｐは１である。）
若しくは、以下の構造の置換又は無置換のナフチル架橋：
【化４】
0004809967.tif 000041
（式中、ｍ、ｎ、ｌ及びｐは０であり、上記ナフチル架橋は１以上の炭素原子においてメチル基で置換されていてもよい。）
を示し、
R1、R2、R3kは、同一又は異なり、メチル又はエチルを示し、
RBKは、メチルもしくはエチル、又はオクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、及びエイコシルから選択される直鎖C8-C20アルキル基を示し、ｋが２のとき、２つのRBKは、同一又は異なり、
RA、RCは、同一又は異なり、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、及びエイコシルから選択される直鎖C8-C20アルキル基を示す。
【請求項２】
ｋが１であり、R1、R2、R3k、RBKがメチルである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カチオン性化合物として、エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)が使用される請求項1に記載の方法。
【請求項４】
カチオン性化合物としてプロパンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)が使用される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
カチオン性化合物としてエタンジイル-1,2-ビス(ジメチルテトラデシルアンモニウムブロミド)が使用される請求項1に記載の方法。
【請求項６】
カチオン性化合物としてN,N',N''-トリデシル-N,N,N,N",N"-ペンタメチル-ビス(2-アンモニオエチル)アンモニウムブロミドが使用される請求項1に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1つのカチオン性化合物は固体の形態でサンプルに添加される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つの前記カチオン性化合物は、溶液の形態でサンプルに添加される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1つの前記カチオン性化合物の溶液は、飽和に対して０．０１％の濃度である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法であって、下記の段階：
− 少なくとも1つのカチオン性化合物を生物学的サンプルと混合する
を付加的に含む前記方法。
【請求項１１】
核酸を直接単離するために、前記混合に続いてインキュベーションが行われる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1つのカチオン性化合物及び／又は核酸とカチオン性化合物で形成された複合体は、細胞溶解を補助するための付加的な手段、及び／又は均質化のための手段及び／又は機械的露出の手段及び／又は酵素的露出の手段とともに添加される請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞溶解を補助するために使用される手段は、アルコール、アルデヒド、フェノール、フェノール誘動体、イオン性、両性イオン性及び非イオン性界面活性剤、スルフヒドリルを還元する試薬、リン酸誘導体、カオトロピック試薬、カルボン酸、又は単純な塩であり、これらは単独で又は組み合せで使用される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸とカチオン性化合物から形成される複合体は遠心分離により沈殿とされる請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
遠心分離は５００から５０００ gで、３から１０分間行われる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
沈殿中に形成された複合体は緩衝液中に溶解される請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸とカチオン性化合物の複合体は、真空吸引、過圧、遠心分離、又は毛細管力により膜の表面に濃縮される請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
膜の表面に濃縮された複合体は核酸を遊離するために溶解され、遊離した核酸は膜に再結合する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的サンプルは、遊離若しくは結合核酸若しくは核酸含有細胞を含む食品サンプル、遊離若しくは結合核酸若しくは核酸含有細胞を含む環境的サンプル、細胞を含まないサンプル材料、細胞、ウイルス、細菌若しくは酵母の懸濁液、いずれの種類の組織若しくは臨床的サンプル、植物若しくは植物の一部、又は遊離核酸である請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、さらに下記の段階のいずれか１つ以上：
− 組み合わされたサンプル／カチオン性化合物の細胞溶解及び／又は酵素的露出及び／又は機械的露出を補助するための適切な手段の添加、
− 得られたサンプルの混合、
− 遠心分離、真空吸引、過圧及び／又は毛細管力を用いる、器の底又は膜上の核酸とカチオン性化合物の複合体の収集、
− 遠心分離、過圧、真空吸引、及び／又は毛細管力を用いた適切な洗浄溶液による複合体の洗浄、
− 適切な試薬溶液の添加、
− 非結合又は結合条件下で、核酸を遊離するための複合体の溶解、
− 遊離核酸の単離
を含む方法。
【請求項２１】
自動化されている請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸の安定化及び／又は単離の方法であって、核酸を含む生物学的サンプルをカチオン性化合物に接触させる方法に関する。また、本発明は、前記カチオン性化合物自体、及び、核酸の安定化及び／又は単離における前記カチオン性化合物の使用に関する。更に、本発明は、カチオン性化合物又は前記カチオン性化合物と核酸の接触により形成された複合体を含む医薬組成物、診断用組成物、及び研究用組成物に関する。
【０００２】
核酸を研究することにより、遺伝子的由来及び細胞の機能的な活性を決定及び研究することが可能であることは以前から知られている。核酸の分析は、細胞活性の原因に直接近づくことを可能にする。従って、これは、例えば、代謝生成物の検出のような間接的な従来法に比べ潜在的に優れている。そのため、核酸分析の大きな進歩が、将来的に期待されている。従って、分子生物学的分析は、様々な分野、例えば、環境分析及び様々な研究分野に加えて、医学的及び臨床的診断、薬物の発展及び評価における薬学、食品分析及び食品製造モニターリング、有用な植物及び家畜繁殖における農学で既に使用されている。
【０００３】
RNA、特に細胞内のｍRNAを分析することで、遺伝子活性の直接的な決定が可能になる。例えば、リアルタイム（real-time）逆転写PCR（real-time RT PCR）又は遺伝子発現チップ分析のような近年の分子生物学を用いた細胞の転写パターン（mRNAパターン）の定量的分析により、例えば、誤って発現された遺伝子の認識ができるため、代謝疾患、感染、又は癌の発生の認識が可能になる。PCR、RFLP、AFLP又は配列決定法のような分子生物学的方法を用いて細胞のDNAを分析することにより、例えば、遺伝子欠陥の検出、又は、HLAや他の遺伝子標識の種類を決定することが可能になる。
【０００４】
遺伝子DNA及びRNAの分析は、更に、例えばウイルス、細菌等の感染性病原菌の直接検出に使用される。
【０００５】
核酸分析のために欠くことのできない1つの必須条件は、天然環境から生物学的サンプルを抽出した後、直ちに核酸を安定化することである。これは、DNA及びRNA、特に生物学的サンプルが抽出された後、直ぐに急激な分解が起こるRNAに適用される。一方、生物学的サンプルの抽出に続いて、例えば、ストレス遺伝子の誘導の結果、新しいｍRNA分子の合成が起こり、細胞の転写パターンが変化する可能性がある。そのため、続く分析は不正確になってしまう。
【０００６】
近年では、日常的な分析に適した手段を用いて、特に、長時間内、例えば、数時間又は数日又は数週間、核酸を安定化することがかろうじて可能な程度である。これは、とても不利である。なぜなら、例えば、医学分野、例えば、医療現場では、核酸を含むサンプルは多くの場合収集され、長期間の保存及び実験室への輸送等の後、更なる試験が行われるからである。
【０００７】
現時点では、サンプルに含まれる核酸は、変化したり又は完全に分解してしまっていることがある。明らかに、これは、後に行われる試験の結果に大きな影響を与えるか、又は、完全に試験を不可能にしてしまう。分子生物学的技術、例えば、PCR、逆転写PCR（RT PCR）、SunRise、LCR、分岐DNA（bDNA）、SDA、DNA、及びRNAチップ、及び遺伝子発現及び突然変異分析のための整列(arrays)、積分ディスプレイ分析、RFLP、AFLP、cDNA合成、サブトラクティブ（subtractive）ハイブリダイゼイション，又はTaqMan技術及び同様のreal-time定量法は、これらの試験に使用される。
【０００８】
安定化に加えて、本発明は更に核酸の単離に関する。
【０００９】
この明細書内では、「核酸」と言う言葉は、広い意味、即ち、二本鎖、単鎖、環状及び直線状、分岐等のようなあらゆる長さや形態を有するデオキシリボ核酸（DNA）及びリボヌクレオチド核酸（RNA）、並びに単量のヌクレオチド、オリゴマー、プラズミド、ウイルス及び細菌のDNA及びRNAのようなあらゆる可能なサブタイプ、並びに、動物及び植物の細胞又は他の真核生物のゲノム及び非ゲノムDNA及びRNA、処理及び非処理形態のmRNA、tRNA、hn-RNA、rRNA、cDNA等を含むと理解すべきである。
【００１０】
安定化及び単離は、核酸に基づく分析を示す反応カスケード内における２つの重要な段階である。前記カスケードは下記のよう模式的に表される：
【００１１】
サンプル収集→安定化保存→核酸単離/精製→酵素的操作→検出→データ解析
【００１２】
本発明は、上記カスケードの強調されている段階を扱う。
【００１３】
細胞が破壊され、RNA及び/又はDNAが溶液中に遊離される多くの核酸単離方法がある。基本的に、血液、血清、尿、又は排泄物のような複雑な材料からの核酸単離の良く知られた工程は、タンパク分解酵素の存在下での界面活性剤を使用する生物学的材料の細胞溶解、続くフェノール及び／又はクロロフォルムのような有機溶媒を用いた様々な抽出、エタノール沈殿、及び核酸透析（dialysis）を含む。この種の手順は、例えば、Chirgwinら、Biochem． 18、5294-5299 （1979）、D.M. Wallace、Meth. Enzym. 152、33-41 （1987）、P. ChomczynskiとN. Sacchi、 Anal. Biochem. 162、156-159 （1987）、及び分子生物学における「RNAの調製及び分析（Preparation and Analysis）」の最近のプロトコル、4.2章（Supplement 14）、編集：F.M. Ausubelら、John Wiley （1991）、T.Maniatisら、分子クローニング（Molecular Cloning）、実験室マニュアル（A Laboratory Manual）、Cold Spring Harbour Laboratory（1992）； L.G. Davisら、分子生物学における基本的な方法「全RNAからのグアニジン イソチオシアネート調製（Guanidine Isothiocyanate Preparation of Total RNA）」及び「RNA調製(RNA Preparation)：ミニ方法(Mini Method)」、Elsevier、N.Y.、ページ130-138 (1991)、及びChomczynskiへの米国特許No.4,843,155に記載されている。
【００１４】
更に、カオトロピック物質及び核酸を結合する固相と出発材料を混合することにより様々な出発材料から核酸を単離することは良く知られている。続く段階では、固相は液体から分離され洗浄される。必要があれば、核酸は固相から抽出することができる(米国特許5,234,809)。
【００１５】
しばしば、生物学的材料からのこれらの良く知られた核酸単離法は、非常に手間がかかり長い時間を必要とする。このような出発物質から核酸を精製するために必要とする多くの段階(大部分が比較的大きい)は、種々雑多の臨床サンプルを同時に処理する場合、サンプルからサンプルへと核酸を移動させるというリスクを増加させる。
【００１６】
核酸増幅法、例えば、高感度ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)を用いた病原性生物等の核酸存在を次いで検出するために核酸を単離する場合、分離したサンプル間での核酸移動のようなリスクは、明らかに重大な障害となる間違った陽性(positives)結果を与える場合もある。
【００１７】
MacFarlane、米国特許5,010,183とMacFarlan、米国特許5,300,635では、第４級アンモニウム化合物に基づく、カチオン性界面活性剤を用いた核酸単離法が記載されている。上記特許で保護されたアンモニウム化合物の全ては、一般形態［N(R)4］+  X- (式中、Rは様々な数のC原子を有する様々なアルキル又はアリール基を示し、Xは、カルボン酸、硫酸塩、リン酸塩又はハロゲン化物からなる群から選ばれる対イオンを示す)を有している。更に、核酸と界面活性剤の複合体をペレット状にするために高いｇ値が必要である。上記方法を用いた核酸の単離は、大量のキャリアー及び高いg値を必要とする。
【００１８】
上記米国特許に記載されている例の全ては、全血又は細胞 (ヒト及び大腸菌) からの核酸の抽出に関する。ある最低分量の核酸が、これらのサンプル材料中に存在している。幾つかの場合、更にｔRNAがキャリアーとして添加されている。血漿のような細胞を含まないサンプル材料からの少量のRNA(例えば、ウイルス性感染での少ない数のコピー)精製の例を挙げると、テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートの例では、複合体形成／ペレット形成は大量のキャリアーRNA(血漿100μg/ml)を用いた場合にのみ行うことが可能になる。例えば、このような精製は、血漿又は血清サンプルのウイルス性RNAの検出において必要となる。この大量のキャリアーの存在は、続くRT PCRを用いたウイルス性RNA検出において問題を生じる。なぜなら、逆転写は高濃度のキャリアーに阻害されるからである。MacFarlaneは、更に血液と比較して血漿中HCV(キャリアーなし)検出での低い感度についても記載している(Schmidtら、J. Med. Virol. 47、 153-160 (1995))。大量の核酸が存在しない場合、感受性はとても低い。米国特許5,300,635において、MacFarlaneは、更に、高いｇ値(実施例４、5及び６の16,000×ｇ)での遠心によるRNA界面活性剤複合体の沈殿形成を記載している。更に、低いg値での遠心は、血漿からのRNA-テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート複合体を沈殿するためには適していないことが示されている。大容積の血漿又は血清( > 1ml)からウイルス性RNAを精製するためには、低いg値で核酸-界面活性剤複合体沈殿を得ることが必要である。なぜなら、単純な実験室用遠心器(最大可能g値、5,000-6,000)の代わりに、高額で複雑な遠心分離器を使用しなければならないからである。
【００１９】
米国特許5,300,635における態様では、MacFarlaneは、少なくとも2倍から10倍容積の界面活性剤のサンプルへの添加が記載されている。従って、処理される全容積は、幾つかの場合、特に、数mlのサンプル材料(例えば、血漿集合)からの核酸精製に対応する場合増加する。しかし、大容積の処理は、特に、ピペットロボットにおける任意の自動化されたサンプル調製においては好ましくない。なぜなら、例えば、ピペット体積には制限があるからである。
【００２０】
従って、上記従来技術の欠点を含まない核酸の安定化及び／又は単離の方法が必要とされている。
【００２１】
更に詳しくは、核酸の安定化及び／又は核酸を含むサンプルの細胞溶解及び同じ溶液からの核酸の単離を1つの工程で行うことができる方法が必要である。例えば、ストレス(stress)遺伝子の誘導、つまり、新しいm-RNA分子の合成がサンプルの抽出において起こり、細胞の転写パターンが変化する可能性があるようなサンプルから核酸を安定化／単離する必要がある場合、これは重要である。特に、核酸とカチオン性化合物の複合体を低いg値で沈殿させることができる方法も必要とされる。更に、少量のキャリアー核酸若しくはへパリンのようなキャリアー補助物質のみを必要とするか、又は、全く必要としない方法が特に必要である。加えて、より少ない体積のカチオン性化合物のサンプルへの添加が許容される方法が必要とされる。最後に、第一処理段階の後であっても、小さい体積で操作を行うことができる方法が必要である。
【００２２】
これらの目的は、請求項1及び続く独立した請求項に記載されている方法によって達することができる。好ましい態様は、従属項に特定されている。
【００２３】
本発明は、生物学的サンプルからの核酸の安定化及び／又は単離の方法を提供する。本発明によれば、この目的は、独立した請求項１記載されている生物学的サンプルからの核酸の安定化及び／又は単離の方法、独立請求項27に記載の核酸の安定化及び／又は単離のためのキット、独立請求項32に記載の複合体、独立請求項33に記載の医薬組成物、独立請求項34に記載の診断用組成物、独立請求項35に記載の研究用組成物、及び独立請求項36に記載のカチオン性化合物により達せられる。
【００２４】
本発明によれば、生物学的サンプルを、核酸を安定化及び／又は単離するために、少なくとも1つの式(I)のカチオン性化合物と接触させる：
【００２５】
【化１５】
0004809967.tif 000002
【００２６】
本発明の範囲内においては、「カチオン性化合物」という言葉は、1以上の陽性電荷を持つ化合物を示すと理解される。式(I)で表されるカチオン性化合物は、溶解した形態並びに／又は、以下「A」と略記される強い及び／若しくは弱い、無機及び／若しくは有機酸の共役塩基により行われる電荷中和が行われた塩の形態で使用される。従って、電荷生成物及び塩基数は、残りの化合物の陽性電荷を完全に相殺する。
【００２７】
上記式(I)では、Xは窒素原子(N)又はリン原子(P)を示す。式(Ia)では、カチオン性化合物はX = Nで示され、式(Ib)ではカチオン性化合物はX = Pで示される。
【００２８】
【化１６】
0004809967.tif 000003
【００２９】
【化１７】
0004809967.tif 000004
【００３０】
加えて、ｋは整数、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24を示し、Bkは、1以上の隣接していない炭素原子は酸素に置換されており、構造
【００３１】
【化１８】
0004809967.tif 000005
を有する脂肪族アルカンジイル架橋を示す。
【００３２】
本発明の範囲内には、1以上の炭素原子で置換することができるアルカンジイル架橋が含まれる。パラメーターn及びmは、それぞれ独立しており、n ＋ m ＞ 0を満たす、整数、0、1、2、3、4、5、又は6の1つを示す。
【００３３】
上記特定された構造の代りとして、Bkも、構造
【化１９】
0004809967.tif 000006
又は、
【化２０】
0004809967.tif 000007
又は、
【化２１】
0004809967.tif 000008
(式中、n、m、l、p、qは、それぞれに対して独立して、整数0、1、2、3、4、5、又は６の1つを示す)
を有する置換されたフェニル、ナフチル、又はビフェニル架橋を示す。加えて、フェニル、ナフチル、又はビフェニル架橋は1以上の炭素において置換される。
【００３４】
更に、上記式(I)のR1、R2、R3kは、同一であるか異なり、1以上の炭素原子において置換されていないか又は置換されており、水素、直鎖又は分岐C1-C6アルキル、直鎖又は分岐C1-C6アルケニル、直鎖又は分岐C1-C6アルキニル、フェニル、ベンジル、構造
【００３５】
【化２２】
0004809967.tif 000009
(式中、n、mは独立して、整数0、1、2、3、4、5、又は６を示し、Zは、構造、-O-、-CO-、-CO2-、-OCO-、-CO-N-、-N-CO-、-O-CO-N-、-N-CO-O-、-S-、又は-S-S-の１つを示す) を有するフェノキシエチルを示す。
【００３６】
更に、R1、R2、R3kは、フェニル、ベンジル、構造
【化２３】
0004809967.tif 000010
(式中、n、mは、独立して整数、0、1、2、3、4、5、又は6を示す)
を有するフェノキシエチルを示す。
【００３７】
RA、RBK、RCは、同一であるか異なり、かつ1以上の炭素原子において置換されていないか又は置換されており、水素、直鎖若しくは分岐C1-C21アルキル、直鎖若しくは分岐C1-C21アルケニル、直鎖若しくは分岐C1-C21アルキニル、又は下記の構造
【００３８】
【化２４】
0004809967.tif 000011
(式中、ｎ、ｍは、独立して、整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24を示し、及び、Zは、構造、-O-、-CO-、-CO2-、-OCO-、-CO-N-、-N-CO-、-O-CO-N-、-N-CO-O-、-S-、又は-S-S-の1つを示す)
を示す。
【００３９】
それに代えて、RA及びRCが共同して環状構造
【００４０】
【化２５】
0004809967.tif 000012
(式中、1以上の炭素原子において置換されていない又は置換された残基RACは、直鎖若しくは分岐C1-C8アルキル、直鎖若しくは分岐C1-C8アルケニル、又は直鎖若しくは分岐C1-C8アルキニルを示す)
である残部RACを形成する。
【００４１】
但し、k < 1である場合、架橋基BK及び基RBK及びR3Kは同一であるか又は異なる。
【００４２】
上記特定された化合物は、本発明の方法において使用され、核酸の安定化、核酸含有サンプルの細胞溶解、及び/又は核酸の単離を1つの段階で行うことを可能にする。安定化された核酸は、調製中安定であるだけでなく、長期間、例えば、96時間以上安定である。特に、核酸とカチオン性化合物からなる複合体は、少量のキャリアー核酸又はキャリアー補助物質のみを必要とするか、又はまったく必要とせずに、かつ、サンプルへ少ない体積のカチオン性化合物のみ添加することを必要とする場合、低いg値で沈殿させることができる。加えて、複合体のペレット化により、この段階の後、即座に小さい体積で操作を行うことが可能である。
【００４３】
本発明の核酸安定化の結果として、サンプル中の核酸は、長期間の保存又は移動中でさえもその構造を変化させることはなく、後に行われる試験の精度は明らかに増加する。幾つかの場合、例えば、核酸含有材料が長距離を移送された場合、又は長期間の保存を行われた場合、試験は、本発明の方法により正確に行うことができる。
【００４４】
化合物は、溶液中に又は固体として添加することができる。固体として添加する場合、固体は多くの場合高い化学的安定性を有し、サンプルへの添加は頻繁により簡単に行うことができるという利点がある。1つのカチオン性化合物又は2以上のカチオン性化合物の混合物を添加することも可能である。
【００４５】
本発明の方法は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、過塩素酸塩、過臭素酸塩、過ヨウ素酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、ヒドロキシド、カルボン酸、α-ハロカルボン酸、及び／又はヒドロキシカルボン酸からなる群から選ばれるアニオンAが使用され、kは整数、1、2、3、4、5、又は6を示し、Bkが置換されたフェニル、ナフチル、又はビフェニル架橋を示す場合、n、m、l、p、qは独立して整数0、1、又は2を示す上記一般式(I)の化合物を好ましくは使用する。
【００４６】
一般式(I)の化合物において、本発明において好ましいのは、残基R1、R2及びR3kは同一であるか異なり、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、及び／若しくは1-エチル-2-メチル-プロピルからなるC1-C6アルキル基、並びに／又は、2-プロペニル(アリル)、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、2-ペンチル、3-ペンチル、4-ペンチル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1,1-ジメチル-2-プロペニル、1,2-ジメチル-2-プロペニル、1-エチル-2-プロペニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、5-ヘキセニル、メチル-2-ペンテニル、2-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-2-ペンテニル、1-メチル-3-ペンテニル、2-メチル-3-ペンテニル、3-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、1-メチル-4-ペンテニル、3-メチル-4-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、1,1-ジメチル-3-ブテニル、1,2-ジメチル-2-ブテニル、1,2-ジメチル-3-ブテニル、1,3-ジメチル−2-ブテニル、1,3-ジメチル-3-ブテニル、2,2-ジメチル-3-ブテニル、2,3-ジメチル-2-エチル-2-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニル、及び／若しくは1-エチル-2-メチル-2-プロペニルからなるC3-C6アルケニル基、並びに/又は、2-プロピニル(プロパルギル)、2-ブチニル、3-ブチニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-ペンチニル、3-メチル-2-ブチニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル、5-ヘキシニル、3-メチル-2-ペンチニル、4-メチル-2-ペンチニル、2-メチル-3-ペンチニル、4-メチル-3-ペンチニル、1-メチル-4-ペンチニル、1,1-ジメチル-2-ブチニル、1,1-ジメチル-2-ブチニル、1,1-ジメチル-3-ブチニル、1,2-ジメチル-3-ブチニル、1,3-ジメチル-2-ブチニル、2,2-ジメチル-3-ブチニル、1-エチル-2-ブチニル、1-エチル-3-ブチニル、2-エチル-3-ブチニル、及び／若しくは1-エチル-1-メチル-2-プロピニルからなるC3-C6アルキニル基、並びに/又は、ベンジル、下記の構造
【００４７】
【化２６】
0004809967.tif 000013
(式中、ｎ、ｍは、独立して整数０、１、又は２を示す)
を有するフェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルイソプロピル、フェニルイソブチル、フェノキシメチル、フェノキシエチル、フェノキシプロピル、フェノキシイソプロピル、フェノキシブチル、フェノキシイソブチルを示す。
【００４８】
残基RA、RBK、RCは同一であるか異なり、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、及び／若しくはエイコシルからなる直鎖若しくは分岐C8-C20アルキル基、並びに／又は、オクテニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、及び／若しくはエイコセニルからなる直鎖若しくは分岐C8-C20アルケニル基、並びに／又は、オクチニル、デシニル、ウンデシニル、ドデシニル、トリデシニル、テトラデシニル、ペンタデシニル、ヘキサデシニル、ヘプタデシニル、オクタデシニル、ノナデシニル、及び／若しくはエイコシニルからなる直鎖若しくは分岐C8-C20アルキニル基、並びに／又は、構造
【００４９】
【化２７】
0004809967.tif 000014
(式中、ｎ、ｍは互いに独立であり、かつ、ｎは、整数２、３、又は４を示し、ｍは、整数、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８を示し、Zは、構造-O-、-CO-、-OCO-、-CO-N-、又は-N-CO-の1つを示す)
を示す。
【００５０】
本発明の範囲内では、1以上のRA、RBK、及びRCと表示された基が構造、
【００５１】
【化２８】
0004809967.tif 000015
又は、
【化２９】
0004809967.tif 000016
の1つを示す一般式(I)の化合物を使用することが好ましい。
【００５２】
本発明において好ましい上記化合物の内で、残基R1、R2、R3k、RA、RBk、及びRCの1以上の基が二重結合又は三重結合を有している化合物は、特に好ましい。
【００５３】
特に、アリル基が残基R1、R2及び／又はR3kとして使用される化合物が好ましい。
【００５４】
本発明の範囲内では、臭化物、ヨウ化物、過塩酸塩、リン酸水素塩、硫酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、安息香酸塩、シュウ酸塩(oxalate)、コハク酸塩(succinate)、フタル酸塩(phthalate)、クエン酸塩(citrate)、酒石酸塩(tartrate)、マレイン酸塩(maleate)、マロン酸塩(malonate)、フマル酸塩(fumarate)の群から選ばれるアニオンAが用いられる上記特定一般式(I)の化合物を使用することが、特に、好ましい。更に、ｋは整数１又は２を示し、Bkは、脂肪族C2-C4アルカンジイル架橋であるエタン-1,1-ジイル、エタン-1,2-ジイル、プロパン-1,1-ジイル、プロパン-1,2-ジイル、プロパン-1,3-ジイル、ブタン-1,1-ジイル、ブタン-1,2-ジイル、ブタン-1,3-ジイル、及び／又はブタン-1,4-ジイルを示す。R1、R2、R3kは、メチル、エチル又はヒドロキシエチルを示し、一方、RA、RBk、RCは、直鎖C8-C20アルキル基であるオクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、及び／又はエイコシルを示す。
【００５５】
本発明の方法では、前記残基R1、R2、及びR3kは同一であり、及び／又は、RA、RBk及びRCは同一であり、及び／又はｋ ＞ 1である場合、架橋基Bkは同一である一般式(I)の化合物を使用することが特に好ましい。
【００５６】
本発明の使用される全ての化合物では、R1、R2、R3k、RA、RBk及びRC基の炭素原子は1以上のハロゲン原子、特に1以上のフッ素原子、及び／又は1以上の一級、二級及び／又は三級ヒドロキシ基、及び／又は1以上の-SH、-NH2、-NH-、及び/又は=N-基で置換することができ、置換基は互いに同一であるか又は同一でなくてもよい。一般式(I)に描かれた第一に置換された炭素原子と窒素原子の間の距離は、少なくとも2つの共役結合である化合物が好ましい。従って、化合物
【００５７】
【化３０】
0004809967.tif 000017
内の原子(窒素又はリン)の１つに直接結合していないR1 R2、R3k、RA、RBk及びRC基の1以上の炭素原子は置換される。
【００５８】
全ての態様において、架橋基Bkの脂肪族及び／又は芳香族炭素原子は、1以上のハロゲン原子、特にフッ素原子、並びに／又は1以上の一級、二級、並びに／又は三級ヒドロキシ基、並びに／又は１以上の-SH、-NH2、-NH-及び／若しくは =N-基、並びに／又は1以上の直鎖若しくは分岐C1-C4アルキル基で同様に置換されることができ、置換基は互いに同一であるか又は同一でなくてもよい。特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、2-メチルプロピル、及び／又はtert-ブチル基は、架橋基Bkの炭素原子における置換基として好ましい。
【００５９】
カチオン性化合物として、エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウム ブロミド)、プロパンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)、 エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルテトラデシルアンモニウムブロミド)又はN,N',N''-トリデシル-N,N,N,N",N"-ペンタメチル-ビス(2-アンモニオエチル(ammonioethly))アンモニウムブロミドを用いて行われる本発明の方法が特に好ましい。
【００６０】
上記のように、少なくとも1つのカチオン性化合物は、固体及び溶解した形態の両方でサンプルに添加することができる。カチオン性化合物が溶液に添加される場合、0.001から10体積、好ましくは0.01から10体積、より好ましくは0.05から２体積、及び、最も好ましくは1体積の溶液がサンプルに添加される。即ち、従来技術において知られている量に比べ、明らかに少量である。実施上の利点が得られる場合、より多くの又はより少ない体積とすることも可能である。カチオン性化合物溶液は、0.01％から飽和濃度、好ましくは0.5％から5％、より好ましくは2％から4％の濃度を有する。
【００６１】
もちろん、更なる処理において有利である場合、生物学的サンプルは、接触前に一次精製される。
【００６２】
カチオン性化合物を生物学的サンプルに接触させた後、カチオン性化合物は生物学的サンプルと混合され、混合物はインキュベートすることができ、インキュベーションは好ましくは、10分間室温で行われる。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、カチオン性化合物及び／又は核酸とカチオン性化合物から形成された複合体は、細胞溶解を補助する手段を添加されることができる。アルコール、特に、分岐した若しくは分岐していないC1からC4アルカノール、例えば、イソプロパノール、アルデヒド、特に、分岐若しくは直鎖低級C1-からC4-アルデヒド、例えば、グリオキサル、フェノール類、2-ビフェニロールのようなフェノール誘動体、イオン性、両性イオン性及び非イオン性化合物、スルフヒドリルを還元する試薬、特に、ジチオスレイトール、リン酸誘導体、特に、リン酸トリブチル、カオトロピック試薬、例えば、尿素、カルボン酸、例えば、クエン酸若しくはマロン酸、又は単純な塩、例えば、アンモニア塩若しくはアルカリリン酸塩は単独で又は組み合せで細胞溶解を補助するために使用することができる。
【００６４】
本発明の他の好ましい態様では、カチオン性化合物の添加の前又は添加中に、生物学的サンプルを均質化するか、又は機械的又は酵素的露出にかけることもできる。例えば、機械的露出は、電気ナイフ、ボールミル、粒子の添加、又はシリンジを通した押し付け(pressing through a syringe)を用いて行うことができる。一方、サンプルに働かせるのに適した酵素は、例えば、ヒドロラーゼ、プロティアーゼ、又はリパーゼである。他の選択肢は当業者によく知られており、これに包含される。生物学的サンプルのこのような処理は、カチオン性化合物がその標的に接近し接触するより多くの機会を持つため有利である。
【００６５】
本発明によれば、核酸とカチオン性化合物から形成された複合体は、遠心分離により沈殿される。遠心分離は、好ましくは低いg値、特に、500から5000 × gで3から10分間行われる。複合体の沈殿物を小さいペレットにするため、続く核酸の精製を比較的小さい体積で行うことが可能である。これは、決められた使用法、特に、自動化された操作において特に有利である。低いg値での遠心分離は、単純な実験室用遠心分離器の使用を可能にする。
【００６６】
場合によっては、複合体は、不純物の除去のために、適切な緩衝液又は水で続いて洗浄される。カチオン性化合物と核酸からなる複合体は、その後、核酸を緩衝液中に遊離させるために、比較的小さい体積の適切な緩衝液に再溶解される。必要があれば、核酸は、比較的小さい体積で、様々な良く知られた操作を用いて、更なる精製にかけられる。従って、適当な結合条件の調整に従うことにより、例えば、更なる精製において膜に結合させることができる。遠心分離による除去の代りに、核酸とカチオン性化合物の複合体は、真空吸引、過圧、遠心分離、又は毛細管力を用いて、例えば、膜の表面等の表面又は器の底上に濃縮することができる。場合によっては、複合体は、適切な洗浄溶液により洗浄することができ、有利な方法で不純物を除去することができる。続いて、核酸を溶液中に遊離するため、任意に酵素を含む適当な試薬溶液を添加することにより、及び／又は結合又は非結合条件下での機械的露出により複合体を溶解することができる。結合条件下で溶解された場合、核酸は、遠心分離、真空吸引、過圧、又は毛細管力(これらの方法は、例えば、PCT出願番号PCT/EP98/06756に記載されており、ここでは参照として組み入れられる)を用いて、例えば、同じ膜上に上記のように結合することができ、更なる精製にかけることができる。複合体が非結合条件下で溶解される場合、核酸は遠心分離、真空吸引、又は過圧を用いて収集チューブに収集することができる。必要があれば、その後、様々な良く知られた操作を用いて、比較的小さい体積で更なる精製にかけることができる。従って、例えば、一度適当な結合条件が調整されれば、更なる精製のために、膜上又は他の表面にそれらを再結合することが明らかに可能である。
【００６７】
細胞の入っていないサンプル、遊離若しくは結合核酸又は核酸含有細胞を含む食品サンプル、遊離若しくは結合核酸又は核酸含有細胞を含む環境的サンプル、細胞の懸濁液、細菌、ウイルス、酵母、様々な種類の組織若しくは臨床的サンプル、例えば、血液、血漿、血清、白血球フラクション、炎症性痂皮、つば、尿、精液、便、若しくは少量の被検材料、又は植物若しくは植物の一部、又は遊離核酸、同様に他の核酸を含む予想可能なサンプルを生物学的サンプルとして使用することができる。
【００６８】
本発明によれば、上記カチオン性化合物は、好ましくは付加的かつ適切な緩衝液を含む、核酸の安定化及び／又は単離のためのキットにおいて使用することができる。加えて、このキットは、適当な細胞溶解を補助する手段並びに／又は核酸を精製するための手段並びに／又は機械的露出手段並びに／又はサンプル及び／若しくは複合体の酵素処理手段を含むことができる。
【００６９】
本発明によれば、上記カチオン性化合物は、核酸、核酸とカチオン性化合物から形成された複合体を安定化及び／又は単離するために使用することができる。前記複合体は、高い安定性という特に有利な点において顕著であり、従って、核酸をサンプル自体内での分解から保護するか、又は、環境への露出から保護する。
【００７０】
本発明によれば、上記カチオン性化合物又は複合体は、医薬組成物、診断用組成物(前記診断用組成物は、医学-薬学分野での診断並びに食品及び環境的サンプルの試験の両方を包含するために意図的に作られている)、同様に、研究用組成物において使用することができる。例えば、生成され、安定化された核酸とカチオン性化合物の複合体は、病気に犯された細胞の内側へ、薬理学的に効果のあるNAを移動するために有利に使用することができる。
【００７１】
本発明の範囲内で請求項に挙げられている事項は、更に、上記カチオン性化合物の全てが含まれている。
【００７２】
本発明の方法は、核酸の安定化及び/又は単離を自動化するための単純な方法において使用することができる。本発明の方法のそれぞれの利点、つまり、ペレット化の後の小さい体積のカチオン性化合物及び小さいサンプル体積と同様に、核酸の安定化、1段階での核酸を含むサンプルの細胞溶解及び/又は同じ溶液からの核酸の単離、低いg値での核酸とカチオン性化合物からなる複合体の沈殿、少量のキャリアー核酸若しくはキャリアー補助物質の使用又はキャリアー核酸若しくはキャリアー補助物質をまったく使用しないこと等は、自動化を容易にすることに寄与しており、加えて、それぞれ組み合わせることができる。操作は、例えば、8ウェル又は96ウェルモジュール(module)のような複数ウェルモジュールで行うことができる。
【００７３】
本発明は、下記の態様を参照して説明される。
【００７４】
直鎖、分岐及び環状カチオン性化合物は、実施例1又は2により調製される。求核置換により、残基RA及びRBk(k = 1の場合、RCはRBkの代りに使用される)を窒素原子に結合させるために、3級窒素原子の数が予め決定された3級ジアミン又は3級ポリアミン(k > 1)に、アルゴン保護ガス下で過剰ハロゲン化アルキル溶液が添加された。窒素原子は、適当な長さnを持つ直鎖(分岐していない)アルカンジイル架橋又は置換されたキシリレン架橋により連結される。この公知の第4級反応は、昇温下において行われた。臭化アルキル又はヨウ化アルキルのようなハロゲン化アルキルは、大部分が完全に4級化(quaternaized)されたアンモニウム塩を調製するために過剰に使用された。上記のように得られたアンモニウム化合物は、様々な溶媒及び溶媒の混合物、例えば、ジエチルエーテル／メタノールから再結晶により精製された。
【００７５】
代りに、２つのカチオン性窒素原子(k = 1)を有するカチオン性化合物が、合成された。この為に、1級ジハロゲン化α,ω-アルカニルを、実施例1の反応条件下で過剰アルキルジメチルアミンと反応させた。アミン化合物のアルキル鎖は、ヒドロキシ化することができるが、ハロゲン原子を持たない。カチオン性化合物は上記のように精製される。
【００７６】
対イオン(アニオンA)は、イオン交換カラムを用いて交換することができる。実施例３は、ブロミドのアセテートとの交換を例示している。
【００７７】
実施例１：エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)の合成
【００７８】
【化３１】
0004809967.tif 000018
【００７９】
還流コンデンサー、加熱用ジャケット及び磁気攪拌器が装備された2リットルの丸底フラスコ内に、850 mlのアセトニトリル及び280 mlのアセトン中の46.0 mlのN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (35.4 g、0.30 ml)及び151.4 mlの1-ブロモデカン(161.8 g、0.73モル、20％過剰) の溶液は、還流温度で42時間加熱された。その後、反応混合物は、室温に冷却され、反応生成物の再結晶を完了するために氷温に冷却された。そして、結晶体(crystal mass)は、吸引濾過され、合計200 mlの冷たいアセトンで2回洗浄された。固体の反応生成物は、その後、還流コンデンサーを装備した2リットルの丸底フラスコへ移動され、1.8リットルのジエチルエーテルが添加された。一度還流温度に達したら、固体が完全に溶解するまで少量のメタノールが添加された。その為に、合計約350 mlのメタノールの添加される。生成物は終夜4℃で結晶化され、その後、吸引濾過され、60℃の真空乾燥機内で乾燥された。第一のフラクションからは、102 gの乾燥生成物(理論上収率60％)を得た。反応バッチの第二フラクションからは、1.8 gの乾燥生成物が再結晶の後に得られた。乾燥生成物のTLC分析(シリカRP18プレート；移動相：クロロホルム25％、メタノール16％、n-プロパノール25％、エチルアセテート25％、0.25％の塩化カリウム水溶液9％)は、ヨウ素容器内での染色の後、新しい物質スポットを示した。それ以外に抽出物はなかった。
【００８０】
環状化合物、即ち、残基RA、RCが共同して前記RACを形成する化合物は、上記エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)の調製と類似た方法で調製された。1,4-ジメチルピパラジンと臭化オクタデシルからのN,N'-ジオクタデシル-N,N'-ジメチルピパラジン-ジウムジブロミドの調製の反応式を例として挙げる：
【００８１】
【化３２】
0004809967.tif 000019
【００８２】
実施例２：N,N',N"-トリテトラデシル-N,N,N',N",N"-ペンタメチル-ビス-(2-アンモニオエチル)アンモニウムブロミドの合成
【００８３】
【化３３】
0004809967.tif 000020
【００８４】
還流コンデンサー、加熱ジャケット、及び磁気攪拌器が装備された２リットルの丸底フラスコ中に、500 mlのアセトニトリル及び150 mlのアセトン中の20.9 mlのN,N,N',N',N"-ペンタメチルジエチレントリアミン(17.3 g、0.10 ml)及び93.5 mlの1-ブロモテトラデカン(99.8 g、0.36モル、20％過剰)の溶液が、還流温度で72時間加熱された。
【００８５】
その後、反応混合物は、室温に冷却され、反応生成物の再結晶のために終夜4℃で保存された。そして、結晶化された固体は吸引濾過され、合計200 mlの冷たいアセトンで2回洗浄された。固体は、還流コンデンサーを装備した1リットルの丸底フラスコへ移動され、その中に1.8リットルのジエチルエーテルが添加され、還流温度まで加熱された。250 mlのメタノールが固体を完全に溶解するために添加された。その後、溶液は室温に冷却され、4℃で終夜保存された。沈殿した生成物は、濾過され、60℃の真空乾燥機内で乾燥された。得られたものは60.1 g(理論上収率59％)であった。再結晶に続いて、更に3.1 gの生成物が元の反応バッチの濾過物から得られた。ヨウ素容器内での染色の後、TLC分析(シリカRP18薄層プレート；移動相：クロロホルム25％、メタノール16％、n-プロパノール25％、エチルアセテート25％、0.25％の塩化カリウム水溶液9％)では、新しい物質スポットは検出されなかった。
【００８６】
実施例３：対イオンとしてアセテートを用いたカチオン性化合物の調製
クロマトグラフィーカラムは、8 gのDowex(登録商標) 1ｘ8-400アニオン交換剤で満たされた。50％メタノール水溶液を用いて、溶出液が無色になるまで完全に洗浄された。次いでこのカラムは、合計20カラム体積分の1 M酢酸を載せられ、中和するため蒸留水で洗浄され、最終的に10カラム体積分の5％メタノール水溶液により洗浄された。これらの洗浄段階に続いて、2 mlの50％メタノール水溶液中のブロミド形態の1 gのカチオン性化合物の溶液は、流速1 ml/分でカラムに載せられた。50％メタノール水溶液を用いて、化合物は15カラム体積分溶出された。生成物は、凍結乾燥を用いて溶出物から単離された。
【００８７】
実施例1に特定された反応により、以下の化合物は調製され、それら全てはジエチルエーテル／メタノールから再結晶された：
【００８８】
【表１】
0004809967.tif 000021
【００８９】
【表２】
0004809967.tif 000022
【００９０】
特定された代替に従って、以下の化合物は調製され、それら全てはジエチルエーテル／メタノールから再結晶された。
【００９１】
【表３】
0004809967.tif 000023
【００９２】
実施例４：参照実施例
長さが4.5 kbの放射線標識(radiolabelled)されたマウスEvx遺伝子のインビトロ転写物は、血漿からのウイルス性RNAの単離のモデルとして使用された。放射線標識は、T7 RNAポリメラーゼを用いてRNA転写物中にα32P-UTPを結合させることにより行われた。
【００９３】
実験A
3.6％テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート水溶液の4体積(560 μl)が、1.5 mlの反応容器中の140 μlの血漿に添加される。様々な量のキャリアーRNA(700塩基から7 kbの長さのポリA RNA)及び放射線標識された転写物が、反応容器の蓋に置かれる。反応容器に蓋がされ、サンプルは完全に混合され、室温で10分間インキュベートされる。RNAとカチオン性化合物からなる複合体は、10,000 × gで2分間沈殿させられ、上清は除去され、ペレットはグアニジウムチオシアネートを含む600 μlの緩衝液に再懸濁され、1当量の70％エタノールを添加される。サンプルは、シリカ膜を有するスピンカラムに載せられ、約6,000 × gで1分間の遠心を用いて膜を透過させられる。スピンカラムはエタノール及びNaClを含む緩衝液で2回洗浄され、緩衝液は約6,000 × gで1分間の遠心を用いて同様に膜を透過させる。膜は、20,000 × gで3分間、乾燥させるために遠心にかけられ、RNAは約10,000 × g、1分間の遠心を用いて50 μlのRNaseを含まない水により溶出される。
【００９４】
操作中、全てのフラクション(上清、突破物(breakthrough)、洗浄緩衝液、スピンカラム、及び溶出物)は収集され、その後、それぞれのフラクション内の放射線標識された転写物の分布がシンチレーションカウンターでの測定により決定される。
【００９５】
【表４】
表１：上清及び溶出物内の放射線標識されたRNAの、キャリアー量の関数としての分布。100％とするための違いは、他のフラクション(スピンカラム及び洗浄緩衝液)中のRNA量から得られる。
0004809967.tif 000024
【００９６】
実験B
2 mlの3.6％テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート溶液は15 mlの反応容器中の1 mlの血漿に添加される。様々な量のキャリアーRNA(700塩基から7 kbの長さを有するポリA RNA)及び放射線標識された転写物は、反応容器の蓋に入れられる。反応容器に蓋がされ、サンプルは完全に混合され、室温で10分間インキュベートされる。RNAとカチオン性化合物からなる複合体は約4,500 × gで2分間沈殿させられる。
【００９７】
その後、沈殿物及び上清中の放射線標識された転写物の量はシンチレーションカウンターでの測定により決定される。
【００９８】
【表５】
表２：キャリアーの量と遠心時間の関数としての沈殿物中の放射線標識されたRNAの量(％)。100％とするための違いは上清中のRNAの量から得られる。
0004809967.tif 000025
【００９９】
両方の実験は、高いg値と同様に、非常に多い量のキャリアーがRNA／テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート複合体をペレット化するために必要であることを示す。
【０１００】
実施例５：
本発明の方法の利点は下記の実施例において例示される。
長さ4.5 kbのマウスEvx遺伝子の放射線標識されたインヴィトロ転写物は、血漿からのウイルス性RNAの単離のモデルとして使用された。放射線標識は、T7 RNAポリメラーゼを用いてRNA転写物中にα32P−UTPを結合されることにより行われた。
【０１０１】
1 mlの0.5％エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)溶液が15 mlの反応容器中の1 mlの血漿に添加される。様々な量のキャリアーRNA(700塩基から7 kbの長さを有するポリA RNA)及び放射線標識された転写物は、反応容器の蓋に入れられる。反応容器に蓋がされ、サンプルは完全に混合され、室温で10分間インキュベートされる。RNAとカチオン性化合物からなる複合体は約4,500 × gで20分間沈殿させられる。
【０１０２】
その後、沈殿物及び上清中の放射線標識された転写物の量はシンチレーションカウンターの測定で決定された。
【０１０３】
【表６】
表３：キャリアーの量及び遠心時間の関数としての沈殿物中の放射線標識されたRNAの量(％)。100％とするための違いは、上清中のRNAの量からかられる。
0004809967.tif 000026
【０１０４】
少量のキャリアー又はまったくキャリアーを含まないことを除いて、及びカチオン性化合物からなる複合体の低いg値でのRNA沈殿を除いて、沈殿物中に高い収率のRNAが得られる。
【０１０５】
実施例６：  様々な膜上におけるRNAとカチオン性化合物からなる複合体の濃縮200 mlの血漿が1％エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)溶液に混合された。放射線標識された転写物(実施例5参照)は反応容器の蓋に入れられる。付加的なキャリアーRNAは添加されなかい。反応容器に蓋がされ、サンプルは完全に混合され、室温で10分間インキュベートされる。RNAとカチオン性化合物からなる複合体は、機械的な支持のためにポリプロピレンフリット上に置かれ、かつ、ロックリング(lock ring)により固定された適当な膜を含むスピンカラム内で、10,000 × gで2分間の遠心を用いて膜を通すことにより、様々な膜上に濃縮された。ここで溶解性成分は膜に結合しない。
【０１０６】
その後、突破物及びスピンカラム中の放射線標識された転写物の量は、シンチレーションカウンターでの測定により決定された。
【０１０７】
【表７】
表４：それぞれの膜上に残されたの放射線標識されたRNA(％)の量。100％とするための違いは、突破物中のRNAの量から得られる。それぞれ2回決定が行われた。
0004809967.tif 000027
【０１０８】
結果は、核酸とカチオン性化合物の複合体は適切な膜上で濃縮することができることを示す。
【０１０９】
実施例７： カチオン性化合物との複合化による血漿からのRNAの単離及び続くシリカ膜上での精製
2 mlの反応容器中で、1-20％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)に加えて、1-6 Mの濃度の尿素、及び／又は0.1−1％ (v/v)の濃度のトリブチルホスフェート、及び／又は5−40mMの濃度のジチオスレイトール、及び／又は10−50％(w/v)の濃度のイソプロパノールを含む1 mlの細胞溶解緩衝液が1 mlの血漿に添加される。放射線標識された転写物及び10 μgのポリAキャリアーRNA(実施例４参照)は反応容器の蓋にピペットで添加され、蓋がされ、バッチは完全に混合された。バッチは室温で10分間インキュベートされる。RNAとカチオン性化合物の複合体は、3,000 rpm = 約1000 × gで3分間のエッペンドルフ5417遠心により沈殿させられ、その上清はピペットにより除去される。ペレットは、pH値6〜8の高塩濃度、例えば、2〜5 MのLiCl、2〜5 Mの酢酸ナトリウム、4〜6 Mのチオシアン酸グアニジニウム又は2〜6 Mのグアニジンヒドロクロレート(GuHCl)を有する500 μlのトリヒドロキシメチルアミノメタン(トリスHCl)緩衝液中に溶解される。ペレットの再懸濁を改善するために、緩衝液は60℃に加熱されてもよい。更に、プロティアーゼK(400 μg)を緩衝液に添加することでができ、バッチはその後60℃で10分間インキュベートされる。続いて、40〜98％(v/v)のエタノールを含む溶液500 μlが添加される。加えて、これらの溶液の1つ又は両方は、１から20％の濃度範囲でトリトンX-100(Triton X-100)、ノニデット-P40(Nonidet-P40)、トゥウィーン20(TWEEN 20)、チャプソ(CHAPSO)、又はツビッタージェント3-12(ZWITTERGENT 3-12)を含むことができる。溶液はシリカ膜を含むスピンカラム上に載せられ、約3,700 × g、1分間の遠心を用いて膜を透過させられる。スピンカラムはエタノールとNaClを含む700 μlの緩衝液で洗浄され、洗浄緩衝液は10,000 × gでの遠心を用いて膜を透過される。スピンカラムは乾燥するために20,000 × gで3分間遠心にかけられ、RNAは30 μlの水をそれぞれ用いてシリカ膜から2段階で溶出される。
【０１１０】
操作中、全てのフラクション(上清、突破物、スピンカラム、及び溶出物)は収集され、その後、それぞれのフラクション中の放射線標識された転写物の分布は、シンチレーションカウンターでの測定により決定される。
【０１１１】
表5は、血漿からの放射線標識RNAの上記条件下で行われた精製の結果を例示している。
【０１１２】
【表８】
表５：溶出物中の放射線標識されたRNAの収率。図は、使用された放射性RNAの全量に対するパーセントである。100％とするための違いは、他のフラクション(上清、突破物、及びスピンカラム)中のRNA量から得られる。
0004809967.tif 000028
【０１１３】
【表９】
0004809967.tif 000029
【０１１４】
【表１０】
0004809967.tif 000030
【０１１５】
実施例８：HeLa細胞からの全RNAの単離
懸濁培養液から得られた１× 107のHeLa細胞からなる細胞ペレットは、トリス-HCl緩衝液pH 7.0により緩衝された2％(w/v)のエタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)溶液1ml中に取り入れられ、溶液1 ml当たり10μlのβ-メルカプトエタノールが添加され、エッペンドルフ反応容器中でポリトロンホモジナイザーを用いて大きさを減少させ、室温で10分間インキュベートされる。
【０１１６】
その後、溶液は約1000×g、3分間遠心分離される。上清は除去され、沈殿物は4 Mのグアニミニウムチオシアネート、0.2 Mの酢酸ナトリウム、及び10％ (v/v)のノニデットP40の溶液200 μlに溶解される。その後、100 μlの酸性フェノールが添加され、溶液は勢いのある攪拌により抽出される。100μlのクロロホルムの添加に続いて、溶液は勢いのある攪拌によりもう一度抽出され、相の分離を促すため20,000 × gで1分間遠心される。水相は除去され、上記のように100μlのクロロホルムにより再抽出される。水相は除去され、核酸は200μlのイソプロパノールを−20℃で30分間かけて添加することにより沈殿させる。沈殿させられた核酸は、20,000 × gで5分間の遠心により沈殿させ、上清は除去され、核酸沈殿物は80％エタノールで一度洗浄され、乾燥され、RNaseを含まない蒸留水に溶解される。
【０１１７】
単離された核酸の量は、波長260nmでの光吸収測定により決定され、核酸の純度は260nm及び280nmでの光吸収の比率を決定することにより明らかにされる(表6参照)。
【０１１８】
【表１１】
表6：１× 107 HeLa細胞を用いた時のRNA収率及び純度。収率を決定するために、RNAの計算因子が使用され(1 OD260nm = 40 μg/ml)、OD測定は水中で行われる。決定は3回行われる。
0004809967.tif 000031
【０１１９】
結果は107のHeLa細胞から単離することができる全RNAの予測される量と合致する。
【０１２０】
実施例９：ネズミの肝臓からの全RNAの単離
2％(w/v)のエタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)、3 M尿素及び1 ml当たり10μlのβ-メルカプトエタノールを含み、50 mMトリスHCl緩衝液(pH 7.0)により緩衝された1 mlの溶液中に、20 mgの肝臓組織がエッペンドルフ反応容器中でポリトロンホモジナイザーにより一度磨り潰され、続いて、室温で10分間インキュベートされる。その後、溶液は約1000 × gで3分間遠心される。
【０１２１】
上清は除去され、沈殿物は、4 Mのチオシアン酸グアニジニウム、0.2 M酢酸ナトリウム及び10％(v/v)ノニデットP40からなる溶液200μlに溶解される。その後、100 μlの酸性フェノールが添加され、溶液は勢いのある攪拌により抽出される。100 μlのクロロホルムの添加に続いて、溶液はもう一度勢いのある攪拌により抽出され、相分離を行うため20,000 × gで1分間遠心される。水相は除去され上記のように100μlのクロロホルムにより再抽出される。水相は除去され、核酸は200μlのイソプロパノールを−20℃で30分間かけて添加することにより沈殿させられる。沈殿した核酸は20,000 × gで5分間の遠心により沈殿させられ、上清は除去され、核酸沈殿物は80％エタノール溶液で一度洗浄され、乾燥され、RNaseを含まない蒸留水に溶解される。
【０１２２】
単離された核酸の量は波長260nmでの光吸収測定により決定され、核酸の純度は260nm及び280nmでの光吸収の比率を決定することにより明らかにされる(表7参照)。
【０１２３】
【表１２】
表7：20 mgの肝臓組織を用いた時のRNA収率及び純度。収率を決定するために、RNAの計算因子が使用され(1 OD260nm = 40 μg/ml)、OD測定は水中で行われる。決定は3回行われる。
0004809967.tif 000032
【０１２４】
実施例10
カチオン性化合物との複合化による血漿からのRNAの精製及び続くフェノール／クロロホルム抽出
ウイルス性RNAのモデルとして(例えば、HCV又はHIV RNA)、HeLa RNAは140 μlの血漿と140μlの2％(w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)の混合物に添加され、50 mMのトリス-HCl (pH 7.0)により緩衝され、続いて10分間インキュベートされる。溶液は、その後約1000 × gで 3分間遠心される。
【０１２５】
上清は除去され、沈殿は4 Mのチオシアン酸グアニジニウム、0.2 M酢酸ナトリウム及び10％(v/v)ノニデットP40からなる溶液200μlに溶解される。その後、100 μlの酸性フェノールが添加され、溶液は勢いのある攪拌により抽出される。100 μlのクロロホルムの添加に続いて、溶液はもう一度勢いのある攪拌により抽出され、相分離を行うため20,000 × gで1分間遠心される。水相は除去され、上記のように100μlのクロロホルムにより再抽出される。水相は除去され、核酸は200μlのイソプロパノールを−20℃で30分間かけて添加することにより沈殿させられる。沈殿された核酸は20,000 × gで5分間の遠心により沈殿させられ、上清は除去され、核酸沈殿物は80％エタノール溶液で一度洗浄され、乾燥され、RNaseを含まない蒸留水に溶解される。
【０１２６】
単離された核酸の量は、波長260nmでの光吸収測定により決定され、核酸の純度は260nm及び280nmでの光吸収の比率を決定することにより明らかにされる(表8参照)。
【０１２７】
【表１３】
表8： RNA収率及び純度。収率を決定するために、RNAの計算因子が使用され(1 OD260nm = 40 μg/ml)、OD測定は水中で行われる。3回決定は行われる。
0004809967.tif 000033
【０１２８】
実施例11
カチオン性化合物との複合化によるRNAの単離、及び特許出願ファイル番号PCT/EP98/06756に記載の膜技術を用いた続く精製。
100 μlの水中に10 μgのRNAが、50 mMトリス-HCl中の2％(w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)(pH 7.0) 100 μlと共に一度に添加され、エッペンドルフ反応容器中、室温で10分間インキュベートされる。その後、溶液は20,000 × gで 3分間遠心され、上清は除去され、ペレットは6 Mのチオシアン酸グアニジニウム、50 mMトリス-HCl(pH 7.0)及び1％(v/v)ノニデットP40の溶液300μlに溶解される。80％エタノール及び10％ノニデットP40(v/v)の溶液300μlの添加に続いて、バッチは、ロックリングにより固定された核酸結合のための膜上の機械的な支持のためのポリプロピレンフリットを含むプラスチックカラム中で、10,000 × gで1分間の遠心により膜を透過される。
【０１２９】
1.  パル・フルオロ・トランス（Pall Fluoro Trans） G、ポリ(ジフッ化ビニリジン)、疎水性、孔サイズ0.2μm、
2.  ゴアテックス（GORE-TEX）ポリエステルフリース(fleece) 9318、ポリテトラフルオロエチレン、親水性、孔サイズ3 μm、
3.  ミリポア・フルオロポア（Millipore Fluoropore） PTFE、ポリテトラフルオロエチレン、疎水性、孔サイズ 3 μm、
が膜として使用される。
【０１３０】
透過された材料は、回収チューブに回収され捨てられる。続いて、膜は、チオシアン酸グアニジニウムを含む緩衝液600 μl及びチオシアン酸グアニジニウムを含まない緩衝液を用いて、それぞれの緩衝液を10,000 × gでの遠心により膜を透過させ洗浄される。第二の洗浄に続いて、乾燥させるために20,000 × gで2分間膜を遠心する。その後、RNAは、膜に70 μlの水をピペットで移すことにより膜から溶出され、室温で2分間インキュベートされる。溶出物は、ピペットを用いて、膜の上からピペットで移される。溶出は、更に70μlの水を用いて繰り返され、抽出物は混合される。
【０１３１】
単離されたRNAの量は、波長260 nmでの光吸収測定により決定され、RNAの純度は核酸の純度は260nm及び280nmでの光吸収の比率を決定することにより明らかにされる(表９)参照)。
【０１３２】
【表１４】
表９： RNA収率及び純度。収率を決定するために、RNAの計算因子が使用される(1 OD260nm = 40 μg/ml)。測定は水中で行われる。それぞれ決定は4回行われる。
0004809967.tif 000034
【０１３３】
実施例12：  2以上のアンモニウム中心を有するカチオン性化合物を用いた血液中のRNAの安定化
下記の600 μlの溶液に一度に200 μlの新鮮な血液が添加される：
200 mM クエン酸ナトリウム (pH 3.0)中2％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)
200 mM クエン酸ナトリウム (pH 3.0)中2％ (w/v)プロパンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)
200 mM クエン酸ナトリウム (pH 3.0)中2％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルテトラデシルアンモニウムブロミド)
200 mM クエン酸ナトリウム (pH 3.0)中2％ (w/v)Ｎ,Ｎ',Ｎ“-トリドデシル-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ”,Ｎ“-ペンタメチル-ビス(2-アンモニオエチル)アンモニウムブロミド
【０１３４】
そして、室温で48時間インキュベートされた。全てのバッチについて決定が2回行われた。
【０１３５】
RNAを単離するために、サンプルは1,000 × gで2分間遠心され、上清は捨てられ、ペレットは700 μlの6 M塩酸グアニジン、200 mMトリス-HCl(pH 7.0及び1％ (v/v)ノニデットP40の溶液に溶解される。その後、80 μgのプロティアーゼKが添加され、バッチは40℃で30分間インキュベートされる。350μlの酸性フェノールは毎回添加され、バッチは勢いのある攪拌により抽出される。350μlのクロロホルムの添加及び他の抽出に続いて、バッチは、相分離を行うため14,000 × gで3分間遠心される。水相は除去され、700 μlのクロロホルムを用いてもう一度抽出される。更なる遠心に続いて、水相はまた除去され、RNAは70μlの3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)及び700 μlのイソプロパノールを−20℃で30分間かけて添加することにより沈殿させられる。RNAは20,000 × gで10分間遠心され、上清は除去され、ペレットは600 mlの80％ (v/v)エタノールで一度洗浄され、続いて乾燥され、100 μlのRNaseを含まない水に再溶解される。
【０１３６】
単離されたRNAの量は、波長260 nmでの光吸収測定により決定され、RNAの純度は核酸の純度は、260nm及び280nmでの光吸収の比率を決定することにより明らかにされる(表10参照)。
【０１３７】
【表１５】
表10：RNA収率及び純度。収率を決定するために、RNAのための計算因子が使用される(1 OD260nm = 40 μg/ml)。それぞれ2回決定が行われる。
0004809967.tif 000035
【０１３８】
実施例１３：2以上のアンモニウム中心を有するカチオン性物質を用いたRNAの単離
140μlの水に一度に溶解された25 μgの純粋なHeLa RNAに、140 μlの水に溶解した1〜15％ (w/v)の様々な濃度の物質が添加され、室温で10分間インキュベートされ、物質-RNA複合体は5,000 × gで10分間遠心され、3.5 Mのチオシアン酸グアニジニウム、25 mM クエン酸ナトリウム (pH 7.5)からなる緩衝液150μlに入れられ、以下の操作により精製される。サンプルに150 μlの70％エタノールを添加する。真空を用いて、サンプルはその後シリカ膜を含むスピンカラムに載せられる。スピンカラムはエタノール及びNaClを含む緩衝液を用いて2回洗浄され、洗浄緩衝液は、真空により同様に膜を透過される。スピンカラムは真空を用いて10分間乾燥される。その後、RNAはそれぞれ60 μlの水を用いて2回抽出され、スピンカラムは10,000 × gで1分間遠心される。結果は、表11にまとめられている。
【０１３９】
【表１６】
表11：使用された物質濃度の関数として表された溶出物中のHeLa RNAの収率。収率を決定するために、RNAのための計算因子が使用される(1 OD260nm = 40 μg/ml)。
0004809967.tif 000036
【０１４０】
結果は、これら全ての物質はRNAの複合化に使用することができることを示す。しかし、選択された条件下では、これらの物質の幾つかは他に比べて顕著に効果的に働く。
【０１４１】
実施例１４：カチオン性化合物を用いた血液中のRNAの安定化
2％ (w/v) エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)、50 mM酢酸カリウム (pH 5.5)及び50 mMトリス-HCl (pH 7.0)からなる1 mlの安定化緩衝液が1 mlの血液に添加される。バッチは完全に混合され、室温又は40℃で24時間又は96時間保存される。核酸とカチオン性化合物からなる複合体は4,000 × gで3分間遠心され、上清は除去され、ペレットは6 Mの塩酸グアニジン、50 mMのトリス-HCl (pH 7.0)、及び1％ (v/v)ノニデットP40からなる１ mlの緩衝液に再溶解される。そして、800 μgのプロティアーゼKが添加され、バッチは60℃で1時間インキュベートされる。その後、1 mlの80％ (v/v)エタノール、10％ (v/v)ノニデットP40が添加され、真空を用いて、サンプルはシリカ膜を有するスピンカラムに載せられる。スピンカラムは、チオシアン酸グアニジニウム及びエタノールを含む350 μlの緩衝液により洗浄される。そして、MgCl2及び75 UのDNase I(Pharmacia)を含む80 μlのトリス-HCl緩衝液は、シリカ膜上にピペットで移され、ゲノムDNAを分解するために室温で15分間インキュベートされる。スピンカラムはチオシアン酸グアニジニウム及びエタノールを含む350 μlの前記緩衝液によりもう一度洗浄され、続いて700 μｌのエタノールを含む洗浄緩衝液により洗浄される。スピンカラムは20,000 × ｇで3分間乾燥させるために遠心され、RNAは30μｌの水をそれぞれ用いて2段階で抽出される。
【０１４２】
一度にこの抽出物3μｌは、ABI PRISM 7700配列検出器(Applied Biosystems)でのβ-アクチンmRNAのRT-PCR検出のために使用される(TaqMan技術と呼ばれる)。TaqMan技術はレポーター(reproter)色素とクエンチャー(quencher)色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いる。PCR増幅中、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は、クエンチャー色素からレポーター色素を分離するために用いられ、増幅サイクル毎に増加する配列特異的蛍光信号を生成する。定量は、前もって決定された蛍光限度に達する限界(threshold)サイクルに基づいている。限界サイクルの比較は、異なるサンプル内のテンプレートの相対濃度を提供する。PCR精度が最大である対数相における測定は、正確な決定のための正確なデータを提供する。
結果は表12に示されている。
【０１４３】
【表１７】
表12： TaqManTM RT PCRを用いたβ-アクチンmRNAの分析。TaqManTM評価の限界サイクル(CT)は安定化されたサンプルの保存の関数として示されている。それぞれのサンプルはABI PRISM 7700配列決定検出器で決定が2回行われた。
0004809967.tif 000037
【０１４４】
実施例１５：カチオン性化合物を用いた血漿中のRNA安定化
2 mlの反応容器中、2％ (w/v) エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)、200 mM クエン酸カリウム (pH 3.0)からなる500 μlの溶液が500 μlの血漿に添加される。15 μgのHeLa RNAは反応容器の蓋にピペットで移され、蓋は閉められバッチは混合される。一度に1つのサンプルが室温で10分間インキュベートされ、その後直ちに更なる処理が行われる。他のサンプルは、4℃で24時間又は48時間保存され、その後RNAは単離される。参照として、HeLa RNAが直接血漿にピペットで移され、10秒後、500 μlの2％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)、200 mMクエン酸カリウム (pH 3.0)が添加され、サンプル調製が行われる前に、更に室温で10分間インキュベートされるか、又は、参照は安定化されたサンプルと共に4℃で24時間又は48時間インキュベートされる。サンプル調製のために、500 μlの2％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド) 、200 mMクエン酸カリウム (pH 3.0)が添加され、バッチは室温で10分間インキュベートされ更に処理される。
【０１４５】
RNAとカチオン性化合物からなる複合体は、約1,100 × gで3分間遠心され、上清は除去され、ペレットは、6 M塩酸グアニジン、50 mMトリス-HCl (pH 7.0)及び1％ (v/v)ノニデットP40からなる600μlの緩衝液により再溶解される。そして、800 μgのプロティアーゼKが添加され、バッチは40℃で30分間インキュベートされる。その後、600 μlの80％ (v/v)エタノール、10％ (v/v)ノニデットP40は添加され、サンプルはシリカ膜を含むスピンカラムに載せられ、サンプルは3,700 × ｇで1分間の遠心を用いて、膜を透過される。
【０１４６】
スピンカラムは、チオシアン酸グアニジニウム及びエタノールを含む350 μlの緩衝液により洗浄される。そして、MgCl2及び75 UのDNase I(Pharmacia)を含む80 μlのトリス-HCl緩衝液が、シリカ膜上にピペットで移され、ゲノムDNAを分解するために室温で15分間インキュベートされる。スピンカラムはチオシアン酸グアニジニウム及びエタノールを含む350 μlの前記緩衝液によりもう一度洗浄され、続いて500 μｌのエタノールを含む洗浄緩衝液により洗浄される。スピンカラムは乾燥させるために20,000 × ｇで3分間遠心され、RNAは50μｌの水をそれぞれ用いて2段階で溶出される。4 μlのこの溶出物は一度に、ABI PRISM 7700配列決定器(Applied Biosystems)でのβ-アクチンmRNAのRT-PCR検出のために使用される。RT PCR検出の反応条件は、実施例12に記載されているのと同一である。30 μlの抽出物は、一度に1.2％ アガロース/ホルムアルデヒド/MOPSゲルで分離される。結果は、表13及び図1に示される。
【０１４７】
【表１８】
表13：TaqManTM RT-PCRを用いたβ-アクチンmRNAの分析。TaqManTM評価の限界サイクル(CT)は、安定化されたサンプルの保存時間及び参照の関数として示されている。それぞれのサンプルはABI PRISM 7700配列決定器で決定が2回行われる。
0004809967.tif 000038
参照では、RNAは、安定化緩衝液が添加される前に保護されていない状態で約10秒間血漿中でインキュベートされ、インキュベーションは更に室温で10分間続けられる。
** これら40サイクル内では、β-アクチンmRNAの増幅はない。
【０１４８】
実施例14及び15では、β-アクチン遺伝子のｍRNAは、ABI PRISM 7700配列決定器出の増幅を用いて検出された。
【０１４９】
β-アクチンmRNAは、1ポットTaqMan RT PCRで増幅された。25 μlの反応バッチのために、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズカンパニー（Perkin Elmer Applied Biosystems Company）(TaqMan PCR試薬キット、β-アクチン検出キット、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、MuLV逆転写)及びPromega Company(Rnasin)製のキット形態の標準試薬が使用された。ｃDNAは37℃で60分間合成され、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼは続いて95℃で12分間活性化された。特異的β-アクチンフラグメントは、PCRを直接続ける形で増幅された。そのために、40 PCRサイクルが95℃で15秒間及び60℃で1分間行われた。
【０１５０】
実施例15では、安定化緩衝液が10秒後に添加された参照サンプル「10分間 室温」においての約16から22までのCT値の増加(限界サイクル値)は、RNAが保護されていない状態で血漿中に存在していた10秒間で99％を超えるRNAが分解されたこと(参照10分間 室温)を示している。ここで、1 限界サイクル(1 CT)の違いは、分析されるサンプルのβ-アクチンmRNA量の約2倍の違いを示していると考えられる。この結果は、参照が高度に分解されたRNAに対応する弱い線(streak)以上を示さない(図1、レーン4及び5、10分間室温)というゲル分析により確認される。安定化緩衝液を添加しない状態での24時間及び48時間の長期保存の後、参照のRNAは完全に分解される(参照24時間4℃及び参照48時間4℃)。アガロース/ホルムアルデヒドゲル電気泳動(図1、レーン4及び5)又はβ-アクチンTaqMan RT PCR(参照)ではRNAは検出不可能であり、限界(threshold)の40は40 PCRサイクル中に増幅信号が生成されなかったことを示しており、よって、β-アクチンmRNAは検出できなかった。
【０１５１】
それに対して、β-アクチンmRNA増幅の結果及びゲル分析の結果(図1)は、安定化緩衝液を添加したサンプル(安定化されたサンプル10分間室温、24時間4℃、48時間4℃)中ではRNAの分解は起こらなかったことを示している。これは、ゲル上のはっきりと可視化されたリボソームRNAのバンド及び(この方法の精度の限界を考慮して)一定であるとされるべきTaqMan RT PCR CT値においてみることができる。
【０１５２】
この結果は、TaqManTM RT PCRを用いた血液サンプル中のβ-アクチンmRNAの高感度検出は室温における96時間の保存の後でも可能である実施例14においても確認される。
【０１５３】
これらの生物学的サンプル中のRNAはカチオン性化合物を用いて分解から保護することが可能であることが血漿及び血液の両方において示された。一方、保護されていないRNAは両方のサンプル材料中で、数秒以内に完全に分解される。
【０１５４】
実施例16：エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)を用いた、クエン酸を用いてpH範囲3〜7に緩衝された血漿からのHeLa-RNAの単離
【０１５５】
15 μgのHeLa-RNAが500μlの血漿に打ち込まれ (spiked into)、2％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)及び異なるpH値(pH 3から7)の0.5 Mのクエン酸を含む500 μlの緩衝液と混合され、その後、室温で10分間インキュベートされた。RNA単離のために、カチオン性物質及び核酸からなる複合体は1100 × gで3分間の遠心によりペレット化され、ペレットは、6 Mの塩酸グアニジン、1％ (v/v)のノニデット-P40及び50 mMのトリスHCl(pH 7.0)を含む600 μlの緩衝液に続いて溶解された。800 μgのプロティアーゼKが添加され、サンプルは40℃で30分間インキュベートされた。そして、80％ (v/v)のエタノール及び10％ (v/v)のノニデット-P40を含む600μlの溶液が添加され、サンプルはシリカ膜を含むスピンカラムに載せられた。膜上に単離されたRNAは、グアニジンチオシアネート及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄され、塩化ナトリウム及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄された。シリカ膜は、20,000 × gで3分間のスピンカラムの遠心により乾燥された。RNAは、100 μlのRNaseを含まない水を用いた遠心を用いてシリカ膜から溶出された。30 μlの溶出物は、1.2％ (w/v)アガロース/ホルムアルデヒドゲル上にかけられた。
【０１５６】
陰性参照実験(K)として、HeLa-RNAが、500 μlの血漿に直接打ち込まれ，10秒後、2％ (w/v)のエタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)及び0.5 Mのクエン酸(pH 3.0)を含む500 μlの緩衝液が添加された。サンプルは、更に10分間インキュベートされ、RNAは上記のように単離された。
【０１５７】
図2のアガロース/ホルムアルデヒドゲルの写真では、異なるpH値で単離されたRNAのバンドを示しており、サンプルは室温で10分間インキュベートされた。
【０１５８】
実験は、全pH範囲内で、完全なRNAは同じ効率で単離されることを示す。一方、陰性参照実験(K)は、保護されていないRNAは血漿内で数秒内に分解されることを示す。
【０１５９】
実施例17：エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)を用いたクエン酸によりpH値が3〜5の範囲で緩衝された血漿のHeLa-RNAの安定化
15 μgのHeLa-RNAが500μlの血漿に打ち込みされ、2％ (w/v)エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)及び異なるpH値(pH 3から7)の0.5 Mのクエン酸を含む500 μlの緩衝液と混合され、その後、室温で10分間、4℃で24時間及び48時間それぞれインキュベートされた。RNA単離のために、カチオン性物質及び核酸からなる複合体は1100 × gで3分間の遠心によりペレット化され、ペレットは、続いて6 Mの塩酸グアニジン、1％ (v/v)のノニデット-P40及び50 mMのトリスHCl(pH 7.0)を含む600 μlの緩衝液に再溶解された。800 μgのプロティアーゼKが添加され、サンプルは40℃で30分間インキュベートされた。そして、80％ (v/v)のエタノール及び10％ (v/v)のノニデット-P40を含む600μlの溶液が添加され、サンプルはシリカ膜を含むスピンカラムに遠心により載せられた。膜は、グアニジンチオシアネート及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄され、塩化ナトリウム及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄された。シリカ膜は、20,000 × gで3分間の遠心により乾燥された。RNAは、100 μlのRNaseを含まない水を用いた遠心を用いてシリカ膜から溶出(eluted)された。30 μlのそれぞれの溶出物は、1.2％ (w/v)アガロース/ホルムアルデヒドゲル上にかけられた。
【０１６０】
陰性参照実験(K)として、HeLa-RNAは、500 μlの血漿に直接打ち込まれ，10秒後、2％ (w/v)のエタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)及び0.5 Mのクエン酸(pH 3.0)を含む緩衝液が添加された。サンプルは、更に10分間インキュベートされ、RNAは上記のように単離された。
【０１６１】
図3のアガロース/ホルムアルデヒドゲルの写真では、異なるpH値で単離されたRNAのバンドを示しており、サンプルは室温で10分間、4℃で24時間及び48時間インキュベートされた。
【０１６２】
この実験は、エタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)及びクエン酸を含む緩衝液により長期間血漿内でRNAを安定化することができることを示す。
【０１６３】
実施例18：芳香族化合物又はエタンからなる架橋により連結された2つの窒素又はリンの中心を有するカチオン性物質を用いたHeLa-RNAの血漿からの単離
5 μgのHeLa-RNAが500 μlの血漿に打ち込まれ、カチオン性物質A、B、C、D、又はE(下記参照)の1つを含む500 μlの溶液と混合され、室温で10分間インキュベートされた。RNAの単離のために、1つのカチオン性物質と核酸からなる複合体は1530 × gで3分間の遠心によりペレット化され、ペレットは続いて6 M塩酸グアニジン、1％ (v/v)のノニデット-P40及び50 mMのトリスHCl(pH 7.0)を含む300μlの緩衝液 に溶解された。400 μgのプロティアーゼが添加され、サンプルは40℃で10分間インキュベートされた。その後、80％ (v/v)エタノール及び10％ (v/v)のノニデット-P40を含む300 μlの溶液が添加され、サンプルは遠心によりスピンカラムに備えられたシリカ膜に載せられた。膜は、チオシアン酸グアニジン及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄され、塩化ナトリウムとエタノールを含む緩衝液により一度洗浄された。シリカ膜は、20000 × gで3分間の遠心により乾燥された。RNAは、遠心を用いて80 μlのRNaseを含まない水によりシリカ膜から溶出された。25 μlの溶出物が、1.2％ (w/v)アガロース/ホルムアルデヒドゲル上に載せられた。
【０１６４】
図4における、複数の5つのアガロース/ホルムアルデヒドゲル写真は、使用された5つのカチオン性物質、A、B、C、D及びEに対応する単離されたRNAバンドを示す：
A：  o-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
B：  m-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
C：  p-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
D：  ［1,8］-ジメチルナフタレノ,アルファ,アルファ’,ビス-ジメチルデシルアンモニウムブロミド
E：  エタンジイル-1,2-ビス(デシルジメチルホスホニウムブロミド)
【０１６５】
この実験は、カチオン性物質が血漿からRNAを単離するために使用することができることを示す。打ち込まれたRNAの収率は、63％ (=3.2 μg)と74％ (=3.7 μg)の間であった。
【０１６６】
実施例19：芳香族化合物又はエタンからなる架橋により連結された2つの窒素又はリンの中心を有するカチオン性物質を用いた1 × 106のHeLa細胞からのRNA及びゲノムDNAの単離
1 × 106 HeLa細胞が500 μlのPBS緩衝液に溶解され、カチオン性物質A、B、C、D、又はE(下記参照)の500 μlの溶液と混合され、室温で10分間インキュベートされた。RNAの単離のために、カチオン性物質と核酸からなる複合体は、1530 × gで3分間の遠心によりペレット化され、ペレットは続いて6 M塩酸グアニジン、1％ (v/v)のノニデット-P40及び50 mMのトリスHCl(pH 7.0)を含む300 μlの緩衝液 に再溶解された。400 μgのプロティアーゼKが添加され、サンプルは40℃で10分間インキュベートされた。その後、80％ (v/v)エタノール及び10％ (v/v)のノニデット-P40を含む300 μlの溶液が添加され、サンプルは遠心によりシリカ膜を有するスピンカラムに載せられた。スピンカラムは、グアニジンチオネート及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄され、塩化ナトリウムとエタノールを含む緩衝液により一度洗浄された。シリカ膜は、20000 × gで3分間の遠心により乾燥された。RNAは、遠心を用いて80 μlのRNaseを含まない水によりシリカ膜から溶出された。25 μlのその溶出物は、1.2％ (w/v)アガロース/ホルムアルデヒドゲル上に載せられた。
【０１６７】
図5における、複数の5つのアガロース/ホルムアルデヒドゲル写真は、使用された5つのカチオン性物質、A、B、C、D及びEに対応する単離されたRNA及びゲノムDNAバンドを示す：
A：  o-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
B：  m-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
C：  p-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
D：  ［1,8］-ジメチルナフタレノ,アルファ,アルファ’,ビス-ジメチルデシルアンモニウムブロミド
E：  エタンジイル-1,2-ビス(デシルジメチルホスホニウムブロミド)
【０１６８】
実施例20：芳香族化合物又はエタンからなる架橋により連結された2つの窒素又はリンの中心を有するカチオン性物質を用いたゲノムDNAの血液からの単離
0.5 mlの血液が、0.5 mlのカチオン性物質A、B、C、D、又はE(下記参照)の0.5  mlの溶液と混合され、室温で10分間インキュベートされた。ゲノムDNAの単離のために、1つのカチオン性物質と核酸からなる複合体は、1530 × gで3分間の遠心によりペレット化され、ペレットは続いてEDTA及び塩化ナトリウムを含む360 μlの緩衝液 に再溶解された。その後、400 μlの緩衝液AL(QIAGEN GmbH； Cat. No. :19075)及び20 μlのプロティアーゼK(18 mg/ml)が添加され、サンプルは65℃で10分間インキュベートされた。その後、420 μlのエタノールが添加され、サンプルは遠心によりスピンカラムに備えられたシリカ膜に載せられた。スピンカラムは、緩衝液AW 1(QIAGEN GmbH、 Cat. No.：19081)により一度洗浄され、緩衝液AW 2 (QIAGEN GmbH、 Cat. No.：19072)により一度洗浄された。シリカ膜は、20000 × gで3分間の遠心により乾燥された。DNAは、遠心を用いて100 μlの水によりシリカ膜から溶出(eluted)された。25 μlの溶出物(eluate)が、1.8％ (w/v)アガロース/TBEゲル上で分析された。
【０１６９】
図6における、複数の5つのアガロース/ホルムアルデヒドゲル写真は、使用された5つのカチオン性物質、A、B、C、D及びEに対応するゲノムDNAバンドを示す：
A：  o-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
B：  m-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
C：  p-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
D：  ［1,8］-ジメチルナフタレノ,アルファ,アルファ’,ビス-ジメチルデシルアンモニウムブロミド
E：  エタンジイル-1,2-ビス(デシルジメチルホスホニウムブロミド)
0.5 mlの血液からのゲノムDNA収率は、6 μgから11 μgの範囲内にある。
【０１７０】
実施例21：  酒石酸で緩衝された芳香族化合物又はエタンからなる架橋により連結された2つの窒素又はリンの中心を有するカチオン性物質を用いたRNAの血漿中での安定化
6 μgのHeLa-RNAが、500 μlの血漿に打ち込まれ、濃度4から5％ (w/v)のカチオン性物質A、B、C、D、又はE(下記参照)及び0.25 Mの酒石酸 (pH 4)を含む500 μlの緩衝液と混合され、室温で24時間インキュベートされた。RNAの単離のために、カチオン性物質と核酸からなる複合体は1530 × gで3分間の遠心により最初にペレット化され、ペレットは続いて6 M塩酸グアニジン、1％ (v/v)のノニデット-P40及び50 mMのトリスHCl(pH 7.0)を含む300 μlの緩衝液 に再溶解された。400 μgのプロティアーゼKが添加され、サンプルは40℃で10分間インキュベートされた。その後、80％ (v/v)エタノール及び10％ (v/v)のノニデット-P40を含む300 μlの溶液が添加され、サンプルは遠心によりシリカ膜を含むスピンカラムに載せられた。スピンカラムは、グアニジンチオネート及びエタノールを含む緩衝液により一度洗浄され、塩化ナトリウムとエタノールを含む緩衝液により一度洗浄された。シリカ膜は、20000 × gで3分間の遠心により乾燥された。RNAは、遠心を用いて80 μlのRNaseを含まない水によりシリカ膜から溶出された。25 μlの溶出物が、1.2％ (w/v)アガロース/ホルムアルデヒドゲル上で分析された。
【０１７１】
陰性参照実験(K)として、HeLa-RNAが、500 μlの血漿に直接打ち込まれ，10秒後、2％ (w/v)のエタンジイル-1,2-ビス(ジメチルデシルアンモニウムブロミド)及び0.25 Mの酒石酸(pH 4.0)を含む緩衝液が添加された。サンプルは、更に10分間インキュベートされ、RNAは上記のように単離された。
【０１７２】
図7における、複数の5つのアガロース/ホルムアルデヒドゲル写真は、使用された4つのカチオン性物質、A、B、D及びEに対応する単離されたRNAバンドを示し、Kは陰性参照実験を示す：
A：  o-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
B：  m-キシリレン-ビス-デシルジメチルアンモニウムブロミド
D：  ［1,8］-ジメチルナフタレノ,アルファ,アルファ’,ビス-ジメチルデシルアンモニウムブロミド
E：  エタンジイル-1,2-ビス(デシルジメチルホスホニウムブロミド)
K：  陰性参照実験
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１５において得られたTaqManTM RT-PCRを用いたβ-アクチンmRNAのゲル電気泳動による分析結果を示す図。
【図２】実施例１６において得られたアガロース/ホルムアルデヒドゲルによる分析結果を示す図。
【図３】実施例１７において得られたアガロース/ホルムアルデヒドゲルによる分析結果を示す図。
【図４】実施例１８において得られたアガロース/ホルムアルデヒドゲルによる分析結果を示す図。
【図５】実施例１９において得られたアガロース/ホルムアルデヒドゲルによる分析結果を示す図。
【図６】実施例２０において得られたアガロース/ホルムアルデヒドゲルによる分析結果を示す図。
【図７】実施例２１において得られたアガロース/ホルムアルデヒドゲルの分析結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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