(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種核酸フラグメントの混合物を含む参照ライブラリーを作製する方法であって、該方法が、以下：
第１制限部位を含むプールされた核酸を第１制限エンドヌクレアーゼで消化し、制限フラグメントの混合物を産生する工程；
該制限フラグメントの第１部分集団由来の一本鎖核ＤＮＡフラグメントの第１集団を形成する工程であって、
ａ：第１アダプターを、制限フラグメントの消化混合物の第１集団に含まれる制限フラグメントの両末端にライゲートさせて第２制限部位を含むフラグメント−第１アダプター複合体を与えるステップ；
ｂ：前記フラグメント−第１アダプター複合体を第２制限エンドヌクレアーゼで消化して、前記第２制限部位を含まず、一方の末端に前記第１アダプターが付着し、他方の末端が突出鎖であるＤＮＡフラグメントの集団を与えるステップ；
ｃ：前記突出鎖に第２アダプターをライゲートして、両末端に前記第１アダプターを有するフラグメントの集団と、一方の末端に第１アダプター、他方の末端に第２アダプターを有するフラグメントの集団と、を含むフラグメント−アダプター複合体を与えるステップ；
ｄ：前記フラグメント−アダプター複合体の混合物を３’エキソヌクレアーゼで消化して、一本鎖フラグメントを形成するステップ；
ｅ：第２アダプターのプライマーで一本鎖フラグメントを伸長させて、二重鎖フラグメントを与えるステップ；
ｆ：第１アダプターのプライマー及び第２アダプターのプライマーで前記二重鎖フラグメントを増幅するステップ；
ｇ：二重鎖フラグメントを第１制限エンドヌクレアーゼで切断して、第１アダプターを除去するステップ；及び
ｈ：切断した二重鎖フラグメントをエキソヌクレアーゼで消化して、前記制限フラグメントの第１部分集団由来の一本鎖核ＤＮＡフラグメントの第１集団を形成するステップ；
によって、該制限フラグメントの第１部分集団が、該第１制限部位とは異なる第２制限部位を含む、工程；
該制限フラグメントの第２部分集団から一本鎖ＤＮＡフラグメントの第２集団を形成する工程であって、
ａ’：第３アダプターを制限フラグメントの消化混合物の第２集団に含まれる制限フラグメントの両末端にライゲートさせるステップ；
ｂ’：両末端に第３アダプターを有する前記制限フラグメントの混合物を第２制限エンドヌクレアーゼで消化するステップ；
ｃ’：両末端に第３アダプターを有する前記制限フラグメントの混合物を第３アダプターのプライマーで増幅させるステップ；及び
ｄ’：両末端に第３アダプターを有する増幅されたフラグメントを３’エキソヌクレアーゼで消化して、前記制限フラグメントの第２部分集団から一本鎖ＤＮＡフラグメントの第２集団を形成するステップ；
によって、該制限フラグメントの第２部分集団が、該第２制限部位を含まず、そして該第１一本鎖ＤＮＡフラグメントが、同一の制限フラグメントに由来する場合、第１一本鎖ＤＮＡフラグメントが、第２一本鎖ＤＮＡフラグメントに対して相補的である、工程；
一本鎖ＤＮＡフラグメントの該第１集団および第２集団をハイブリダイズし、二重鎖の集団を形成する工程；ならびに
該二重鎖を単離し、制限フラグメントの参照集団を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記プールされた核酸を前処理し、非反復配列を富化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験核酸の少なくとも２つの異なるプール間の多型部分領域の比を決定する方法であって、該方法が、以下：
第１プールを第１制限エンドヌクレアーゼで消化して、第１プール由来の前記フラグメントの両末端に第４アダプターをライゲートすることによって第１制限部位を含む試験核酸の第１プール由来の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの第１のプールを生成する工程；
第２プールを該第１制限エンドヌクレアーゼで消化して、第２プール由来の前記フラグメントの両末端に第５アダプターをライゲートすることによって第１制限部位を含む試験核酸の第２プール由来の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの第２のプールを生成する工程；
第１富化集合および第２富化集合を形成するために、制限フラグメントの第１プールと制限フラグメントの第２プールを第２制限エンドヌクレアーゼで消化し、これらのフラグメントを第２制限部位を含むか含まないかで選択することによって、第２制限部位を含むフラグメント又は、第２制限部位を含まないフラグメントについて制限フラグメントの該第１のプールおよび制限フラグメントの該第２のプールを富化する工程であって、
第２制限部位を含むフラグメントの選択は、第２制限エンドヌクレアーゼによって消化された制限フラグメントの第１プールと第２プールを前記第２アダプターでライゲートして、前記第２アダプターがライゲートしたフラグメントを、第４アダプター又は第５アダプターのプライマーと、第２アダプターのプライマーを用いて増幅することによって行われ、
第２制限部位を含まない第１及び第２集団の選択は、第２制限エンドヌクレアーゼで消化されなかった制限フラグメントの第１及び第２プールを第４又は第５アダプターのプライマーを用いて増幅することによって行われる、工程；
該第１富化集合および該第２富化集合を、該第２制限部位についての多型である部分領域を富化した請求項１に記載の参照ライブラリー由来であって、固相支持体に付着したプローブと接触させる工程；ならびに
該プローブの該第１富化集合および該第２富化集合との結合の比を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
試験核酸の前記第１プールが、第１表現型を有する個体の集団由来であり、そして試験核酸の前記第２プールが、第２表現型を有する個体の集団由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記富化する工程が、前記第２制限部位を欠失する前記プール由来のフラグメントを選択する工程を包含し、そして前記接触させる工程が、該選択されたフラグメントと該第２制限部位を含むプローブとを接触させる工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記富化する工程が、前記第２制限部位を含む前記プール由来のフラグメントを選択する工程を包含し、そして前記接触させる工程が、該選択されたフラグメントと該第２制限部位を欠失するプローブとを接触させる工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、多型ＤＮＡフラグメントをゲノムまたは他の核酸集団から単離するための方法に関し、より詳細には、多型配列を含む制限フラグメントを単離し、そしてこのようなフラグメントを遺伝的同定および比較のために用いるハイスループット方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝因子は、実質的に全ての疾患に寄与して、感受性、抵抗性を付与するか、または環境因子との相互作用に影響を与える（Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：１５８０−１５８１）。ゲノムマッピングおよび配列決定プロジェクトが進展するにつれ、異なる個体のゲノム間の配列差異を決定するという課題に対してますます多くの注意が向けられている。ヒトの健康の分野では、遺伝子型と、疾患感受性、治療に対する応答性、副作用の可能性および他の複雑な形質との間の相関の詳細な理解によって、治療の改善、既存の治療の適用の改善、より良好な予防的尺度、およびより良好な診断手順がもたらされると考えられている（Ｃａｓｋｅｙ（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１２２３−１２２９；ＷｈｉｔｅおよびＣａｓｋｅｙ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１４８３−１４８８；Ｌａｎｄｅｒら（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：２０３７−２０４８；Ｓｃｈａｆｅｒら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：３３−３９；ならびにＨｏｕｓｍａｎら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ，１６：４９２−４９３）。
【０００３】
直接的配列決定、連結に基づくアッセイ、制限断片長分析、多重および／または対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、異なる電気泳動移動度に基づくアッセイ、プライマー伸長に基づくアッセイ、ミスマッチ修復酵素に基づくアッセイ、および特異的ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを含む多くの技術が、疑われる変異または多型配列の存在または非存在の検出のために利用可能である（例えば、Ｔａｙｌｏｒ編，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ＤＮＡ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９７）；Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：２２９−２３７；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９９８），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：７６９−７７６（１９９８）；Ｂｒｏｗｎ（１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：３６６−３７３（１９９４）；Ｓｈｕｍａｋｅｒら（１９９６），Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，７：３４６−３５４；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４１６７−４１７５；Ｐａｓｔｉｎｅｎら（１９９７），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：６０６−６１４；Ｓｈｕｂｅｒら（１９９７），Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：３３７−３４７；など）。しかし、これらの技術の大部分は、ゲノム全体を通しての多型配列の大規模での同定（または調査）に関するものではなく、上記の技術のうちのいくつかは、多型が予め公知であることを必要とする。関連のない個体における１ヌクレオチド多型の頻度が、平均して７００塩基対あたり１つという高さであると見積もられているので、この制限は重大である（例えば、Ｃｏｏｐｅｒら（１９８５），Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６９：２０１−２０５；Ｗａｎｇら（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１０７７−１０８２）。従って、個体間のあり得る配列の相違の数は莫大であり、そして重大な相違（例えば、疾患状態と関連する相違）を見出すという課題は、同時に１つまたはいくつかの多型配列に適用可能である技術を用いては極めて困難である。
【０００４】
代表的相違分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）（例えば、Ｌｉｓｉｔｓｙｎら（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９４６−９５１）、ゲノムミスマッチスキャニング（ＧＭＳ）（例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４：１１−１８）およびマイクロアレイに基づく方法（例えば、Ｗａｎｇら（同書）およびＷｉｎｚｅｌｅｒら（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１１９４−１１９７）を含めて、ゲノムの大規模比較のためにいくつかの技術が開発されているが、これらの技術の各々は、重大な制限を有する。ＲＤＡは、ＤＮＡの非常に複雑な混合物をハイブリダイズする工程およびこのようなハイブリダイゼーションの産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する工程の反復サイクルを必要とする。この技術の名称が示すように、これらの操作に関与するＤＮＡは、大きなフラグメントをＰＣＲを用いて増幅することが困難であるので、比較されるゲノムのごく一部である（約１０％，Ａｌｄｈｏｕｓ（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：２００８−２０１０）。また、ハイブリダイゼーション反応におけるフラグメントの複雑さおよびサイズに起因して、１ヌクレオチド多型相補体のような、わずかであるが、全体に広がる相違を単離する際にこの技術がどれほど有効であるかは明確でない。ＧＭＳもまた、ＤＮＡフラグメントの非常に複雑な混合物のハイブリダイゼーションを必要とするが、より重要なことには、この技術の目的は、２つの集団における同一の配列を同定することである；従って、この技術は、遺伝的関連研究のような相違の同定を必要とする分析において制限された適用性を有する。ＧＭＳはさらに、用いられる酵素の種類および存在するミスマッチの種類に依存して広範に変化する感度を有し得るミスマッチ認識酵素の使用を必要とする（例えば、Ｃｏｔｔｏｎ（同書））。最後に、ＧＭＳおよびマイクロアレイに基づく方法は両方とも、処理される配列に相補的なＤＮＡのアレイを、一次測定の道具として用いる。従って、ＧＭＳの場合、同じであると疑われる配列、またはマイクロアレイによる直接的検出の場合、多型を含むと疑われる配列は、予め公知でなければならない。
【０００５】
上記を考慮すると、迅速かつ高感度の、ゲノムの範囲にわたる、個体群間の遺伝組成の相違の同定を可能にする利用可能なアプローチが存在するならば、非常に望ましい。
【０００６】
（発明の要旨）
上記に概説した目的に従って、本発明は、プールされたゲノムＤＮＡから核酸参照ライブラリーを形成するための組成物および方法を提供する。この参照ライブラリーは、多型核酸フラグメントについて富化された不均質な混合物である。この多型核酸フラグメントは、プールされたＤＮＡの、制限部位多型を有するサブ領域にハイブリダイズする。
【０００７】
参照ライブラリーを作製するための方法は、（１）プールされたゲノムＤＮＡを、第１の制限エンドヌクレアーゼで消化して、第１の制限フラグメントを形成する工程；（２）一本鎖制限フラグメントの第１の集団を、第２の制限エンドヌクレアーゼについての制限部位を含む第１の制限フラグメントから形成する工程；（３）一本鎖制限フラグメントの第２の集団を、第２の制限エンドヌクレアーゼについての制限部位を欠く第１の制限フラグメントから形成する工程；（４）一本鎖ＤＮＡフラグメントの第１の集団と第２の集団とをハイブリダイズさせて、二重鎖の集団を形成する工程；および（５）この二重鎖を単離して、参照ライブラリーを形成する工程を包含する。得られるライブラリーは、第２の制限酵素についての制限部位に関して多型であるゲノムのサブ領域にハイブリダイズするフラグメントについて富化されている。
【０００８】
本発明はさらに、例えば異なる集団間で、このような多型サブ領域の比を決定するための方法を提供する。参照ライブラリーを作製しそして使用するために配列情報は必要でないので、この方法は、従来のマーカー関連研究を超える重要な改善を提供する。手短には、第１のプールされた試験集団および第２のプールされた試験集団由来のプールされたＤＮＡは、第１の制限エンドヌクレアーゼで消化される。次いで、この集団は、第２の制限エンドヌクレアーゼについての制限部位に関連した多型を有するフラグメントについて富化される。次いで、富化された集団を、（好ましくは、同じ制限エンドヌクレアーゼを用いて上記の通りに作製された）参照ライブラリーと接触させる。ハイブリダイゼーションの程度の相違は、例えば、２つのＤＮＡプール間で異なる多型の比または頻度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、このような相違は、２つの集団間で表現型において観察された相違と相関付けられ得る。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸多型と関連した核酸フラグメントの参照ライブラリーに関する。このようなライブラリーは、異なる表現型と関連した単一または複数の対立遺伝子を同定する際に有用である。実際問題として、この参照ライブラリーは、制限エンドヌクレアーゼについての制限部位内の多型に基づいて作製される。
【００１０】
不均質な核酸フラグメントの混合物から作製される参照ライブラリーは、図１を参照して記載され得る。図１は、１以上の制限酵素に関連した制限エンドヌクレアーゼ多型に関するので、本発明の種々の成分の相関を示す。図１Ａでは、Ｎ個の個体のプールからの理論的ゲノムＤＮＡは、それらの配列間で最大の相同性を提供するように整列される。４個の個体からのゲノムＤＮＡを図１に示す。図１Ａでは、酵素Ｓによって認識および／または切断され得る、第１のエンドヌクレアーゼ制限部位ｓを示す。さらに、制限エンドヌクレアーゼＴによって認識および／または切断され得る第２のエンドヌクレアーゼ制限切断部位ｔを示す。第１の制限部位ｓに及ぶ領域は、サブ領域ｆ1からｆ7に対応する。各々の個体からのゲノムＤＮＡを混合物として合わされ、そして制限エンドヌクレアーゼＳで消化した場合、サブ領域ｆ1からｆ7に対応する制限フラグメントの集団が形成される。
【００１１】
図１Ａに示される配列の中では、いくつかのサブ領域は、ｔ制限エンドヌクレアーゼ部位を含まず（例えば、ｆ3およびｆ5）、一方、他のサブ領域は、ｔ制限エンドヌクレアーゼ部位を全ての例において含む（例えば、ｆ6）。他のサブ領域は、ｔ制限部位が存在するか否かについての個体間での相違を含む。例えば、ｆ1、ｆ2、ｆ4およびｆ7を参照のこと。これらの制限部位の各々が、単一の理論的配列に提示された場合、図１Ｂの多型のコンセンサス配列が得られる。サブ領域ｆ1からｆ7を比較目的で示す。サブ領域ｆ1、ｆ2、ｆ4およびｆ7の場合、制限部位ｔを、存在するまたは存在しないのいずれか（すなわち、ｔ+/-）として示す。サブ領域ｆ1、ｆ2、ｆ4およびｆ7を、多型コンセンサス配列および図１Ａに示す配列に対する相関について図１Ｃに示す。これらのサブ領域は、時々「多型サブ領域」と呼ばれ、参照ライブラリーを規定する。
【００１２】
この参照ライブラリーを図１Ｄに示す。理解され得るように、このライブラリーは、多型サブ領域の一部を含むフラグメントを含む。本明細書中以下でより詳細に説明されるように、このライブラリーを作製するための方法により、多型サブ領域間に位置するフラグメント以外のフラグメントが富化される。従って、このライブラリーは、過剰に提示されたサブ領域ｆ1、ｆ2、ｆ4およびｆ7を有するが、サブ領域ｆ3、ｆ5およびｆ6は過少提示されているかまたは存在しないように歪められる。正味の効果は、さもなければプールされたゲノムライブラリーの、ＳおよびＴによる単純な二重消化によって得られる、ライブラリーの複雑さを減少させることである。これは、異なる表現型と関連付けられ得る、ｔ制限部位での多型について他の集団を試験するために用いられ得るライブラリーを提供する。
【００１３】
この参照ライブラリーは、多型サブ領域間に位置するフラグメント以外のフラグメントについて富化される。本明細書中では、「富化される」によって、多型サブ領域に対して、非多型サブ領域に対応するフラグメントのいくつかまたは全てが、本発明の方法において選択されていることが意味される。図１Ａを参照して、非多型サブ領域は、ｔ制限エンドヌクレアーゼ部位を含まない領域（例えば、ｆ3およびｆ5）、およびｔ制限エンドヌクレアーゼ部位を全ての例において含む領域（例えば、ｆ6）である。本明細書中で使用される場合、非多型フラグメントは、非多型サブ領域と必ずしも同じではない。
【００１４】
好ましい実施形態では、５０パーセントの非多型サブ領域が除去される。好ましくは、７５パーセントの非多型サブ領域が除去される。より好ましくは、９０パーセントの非多型サブ領域が除去されて、非多型サブ領域を実質的に含まないライブラリーが残される。
【００１５】
好ましい実施形態では、参照ライブラリーは、特定の集団の遺伝子プールの存在を最大にするに十分に大きい、個体のプールに由来する多型サブ領域に対応するＤＮＡのフラグメントから作製される。好ましくは、核酸の出発プールは、５０パーセント；より好ましくは７５パーセント；より好ましくは９０パーセント；そして最も好ましくは９５パーセントの対立遺伝子を所定の集団内に含む。
【００１６】
参照ライブラリーを作製する核酸プールを形成するための供給源として使用される異なる個体の数は、所定の遺伝子座においてライブラリー中に存在する多型および対立遺伝子の数を決定する。例えば、いくつかの個体を用いる場合、制限された数の多型しか存在し得ない。同様に、このような多型について連鎖不平衡な遺伝子座が、このライブラリーから存在しなくなり得る。一方、多くの個体を用いる場合、集団中に存在する多型のより大きな提示が、この参照ライブラリーにおいて見出される。好ましくは、出発核酸プールは、同じ種（例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタなど）から入手される。同様に、核酸は、種々の植物種ならびに種々の真核生物および原核生物からプールされ得る。
【００１７】
参照ライブラリーが、ライブラリーにおける多型の提示を増強するように、核酸のランダム集団から作製されることが好ましい。しかし、いくつかの実施形態では、１以上の規定された表現型を有する個体から選択された核酸を含む核酸プールを用いることが所望され得る。
【００１８】
他の集団を分析するために用いられる場合、参照ライブラリーからの多型プローブは好ましくは、例えば、核酸の異なるプールの間で、種々の多型の頻度を比較するために用いられる。「多型プローブ」によって、本明細書中で、多型サブ領域の一部を含む核酸フラグメントを意味する。このようなプローブは、参照ライブラリー由来のフラグメントまたはその配列部分を含み得る。ライブラリーフラグメントの一部は好ましくは、このような配列が独特である場合に用いられる。
【００１９】
この参照ライブラリーは、多数の方法で用いられ得る。１つの実施形態では、１つの集団由来のＤＮＡはプールされ得、そして第２の集団に対して比較され得る。参照ライブラリーを使用する前に各集団を表現型によって規定することは経験的に必要ではない。しかし、好ましい実施形態では、各集団は、観察された多型における相違を、例えば、２つの集団の間でまたは参照ライブラリーと比較して、表現型における相違と相関付けるために表現型的に規定される。いくつかの例では、この多型は、１以上の対立遺伝子について連鎖不平衡であり得、このことは、表現型と関連したハプロタイプの決定を可能にする。
【００２０】
参照ライブラリーを使用する好ましい実施形態において、第１の表現型を有する個体からのＤＮＡのプールは、第１の制限エンドヌクレアーゼＳで消化されて、制限フラグメントのプールを形成する。次いで、ｔ-であるフラグメントが選択される。第２の表現型を有する個体からの第２のＤＮＡのプールが、同様に処理されて、またｔ-であるフラグメントについて選択される。次いで、多型プローブは、ｔ-富化されたフラグメントと接触され、そしてｔ-集団中の多型サブ領域の相対的な頻度が決定される。例として図１Ａを参照すると、サブ領域ｆ1は、４個体からのＤＮＡの集団によって等しく表され、ｆ1サブ領域の半分はｔ+であり、他の半分はｔ-である。これが第１の集団であると仮定する。例示のみとして、第２の集団がｔ-ｆ1サブ領域を含む場合、第２のｔ-プールにおいて得られるシグナルの比は、第１の集団より得られた類似のプールについて得られたものの２倍である。このような差違は、ｔ-多型が、表現型の観察された差違と相関し得る関連性を示す。他の関連性もまた、１以上の他の多型サブ領域について検出され得る。
【００２１】
本発明の利点は、参照ライブラリーを生成および使用するために配列情報が必要でないということである。必要とされることのすべては、異なる核酸配列を認識および切断する少なくとも２つの制限酵素の使用である。好ましい実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ切断は、少なくとも４塩基対の突出を有する「突出末端」を生じる。これに対して、平滑末端は、以下の方法においてより詳細に示されるように、制限フラグメントをさらに操作するために使用され得る。
【００２２】
「制限部位」は、通常、核酸（好ましくは二本鎖核酸）中の４〜８ヌクレオチドの間の領域を意味する。この核酸は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位および／または切断部位を含む。好ましくは、認識部位および切断部位は、同じ広さに広がっている。認識部位は、制限エンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼの群が結合する核酸中の配列に対応する。切断部位は、制限ヌクレアーゼによる切断の特定の点に対応する。二本鎖核酸の場合、突出末端を提供するために、切断は、相補鎖上の異なる位置で起こることが好ましい。制限エンドヌクレアーゼに依存して、切断部位は、認識部位内であり得る。しかし、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位の外側である切断部位を有する。
【００２３】
好ましい実施形態において、参照ライブラリーを生成するために使用される多型は、選択された酵素についての制限部位内にある。従って、認識部位および／または切断部位における点変異は、もはやその特定のエンドヌクレアーゼによる切断に感受性でない制限部位を生じ得る。あるいは、変異は、エンドヌクレアーゼについての切断部位を作製し得る。１以上のヌクレオチドの挿入または欠失のような多型は、同様に、制限ヌクレアーゼによる消化に対して耐性または感受性を生じ得る。従って、多型は、特定の制限部位中の１以上のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失と相関し得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「変異」および「多型」はいくぶん交換可能に使用され、参照ＤＮＡ分子または野生型からのヌクレオチド配列と、１以上の塩基の挿入および／または欠失で異なるＤＮＡ分子（例えば、遺伝子）を意味する。生物にとって生理学的であるか否かに関わらず、変異は任意の塩基の変化であることが理解されるという点で、ワタの使用（前出）が理解されるが、多型は通常直接的な生理学的な結果を伴わない塩基の変化であることが理解される。しかし、いくつかの例において、多型は、特定の表現型と関連する遺伝子型を産生する変異であり得る。
【００２５】
好ましくは、核酸のプール中の多型は、所定の遺伝子座において少なくとも１％の割合（例えば、プール中に１０００の異なる核酸）で存在し、所定の遺伝子座において多型を含む少なくとも１０の核酸が存在する。より好ましくは、多型は所定の遺伝子座において１０％の割合で存在する。従って、各多型の遺伝子座は、多型の適切なサブセットを含み、すなわち、そのサブセットは、多型を伴う遺伝子座の少なくとも１つのメンバーおよび多型を欠く遺伝子座中の少なくとも１つの他のメンバーを含む。
【００２６】
好ましい実施形態において、参照ライブラリーは、核酸フラグメントから作られる。本明細書中において「核酸」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合において、核酸アナログは、例えば、以下を含む別の骨格を有し得る：ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９（１０）：１９２５）およびその中の引用文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ、２６：１４１）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら（１９８９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸骨格およびペプチド核酸結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：２０７を参照のこと、これらのすべては参考として援用される）。他のアナログ核酸には、以下を有するものが挙げられる：正電荷の骨格（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：６０９７）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号；同第５，６３７，６８４号；同第５，６０２，２４０号；同第５，２１６，１４１号；および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら（１９９１）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ、３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、１３：１５９７；第２章および第３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ、３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３７：７４３（１９９６）および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編）に含まれる）。１以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義の中に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９−１７６頁を参照のこと）。いくつかの核酸アナログが、Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５頁において記載されている。これらの参考文献のすべてが、本明細書によって明確に参考として援用される。リボースリン酸骨格のこれらの修飾は、さらなる部分（例えば、標識）の添加を容易にするために、または生理学的環境におけるそれらの分子の安定性および半減期を増加させるためになされ得る。さらに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物も作製され得る。あるいは、異なる核酸アナログの混合物、ならびに天然に存在する核酸およびアナログの混合物が作製され得る。当業者は、本発明の種々の実施形態において使用するための適切なアナログをいかにして選択するかを知っている。例えば、制限酵素を用いる消化の場合、天然の核酸が好ましい。
【００２７】
核酸はまた、ヌクレオシドを含み得る。本明細書中において、「ヌクレオシド」は、２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシ型（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２）に記載されるような）を含む天然のヌクレオシドおよびアナログを意味する。ヌクレオシドに関する「アナログ」には、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４などによって記載される）が含まれる（これらが、特異的にハイブリダイゼーションし得るという条件でのみ）。このようなアナログには、結合特性を増強するため、複雑さを減少させるため、特異性を増強するためなどのために設計された合成ヌクレオチドが含まれる。
【００２８】
核酸は、特定されるように、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖配列もしくは一本鎖配列の両方の部分を含む。核酸は、ＤＮＡであり得、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方であり得、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、および塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含む）の任意の組み合わせを含む。
【００２９】
以下は、本発明の参照ライブラリーの調製に関するより詳細な情報を提供する。好ましい実施形態において、制限フラグメントの参照集団は、図２Ａ〜図２Ｃにおいて例証される方法によって産生される。図２Ａにおいて、ゲノムＤＮＡ（２００）は、目的の集団の各個体から抽出され、そしてプールされる。本明細書中において、「プールされた核酸」は、目的の集団において個体から得られたゲノムＤＮＡのような核酸を組み合わせることを意味し、その結果、核酸フラグメントの不均一な混合物が、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼで消化した場合に得られる。
【００３０】
集団中の個体の数は重要ではない；しかし、十分に大きな集団を有することが望ましい。その結果、すべてではないが多くの目的の多型配列が獲得される。好ましくは、その集団は少なくとも５個体からなり、そしてより好ましくは、この集団は少なくとも１０個体からなる。さらにより好ましくは、その集団は１０〜１００の範囲の数の個体からなる。ゲノムＤＮＡがプロセシングのために合わされた場合、好ましくは集団の各ゲノムから等しい量が提供される。ＤＮＡ（２００）が第１の制限エンドヌクレアーゼＳで切断され（２０２）制限フラグメント（２０４）の集団を生成する。Ｑアダプターは、従来的な連結反応においてそれに連結され（２０６）、フラグメント−アダプター複合体（２０８）を与える。
【００３１】
制限エンドヌクレアーゼＳは、その切断が予想可能な突出末端鎖を有するフラグメントを生じる任意の制限酵素であり得る。好ましくは、第１の制限酵素Ｓを用いる切断は、少なくとも４つのヌクレオチドの突出鎖を生じる。さらに好ましくは、制限エンドヌクレアーゼＳは、５’突出鎖を有する末端を有するフラグメントを生じる。これは、３’陥凹末端を適切なヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長することを可能にする。好ましい実施形態において、このようなフラグメントの３’陥凹鎖は、突出鎖の長さを３ヌクレオチドまで減少するために１ヌクレオチド伸長する。これによって、突出鎖の自己相補性を破壊する。この工程は、フラグメントおよびＱアダプターの両方の自己連結を減少させる助けになる。
【００３２】
Ｑアダプターは、制限フラグメントの突出鎖（２０４）に対する相補的な突出鎖を含む便利な二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターである。Ｑアダプターは、長さおよび組成において非常に広範に変化し得るが、しかし好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるフラグメント−アダプター複合体を増幅するためのプライマー結合部位を含むのに十分な長さである。好ましくは、Ｑアダプターの二本鎖領域は、１４〜３０塩基対の範囲内、より好ましくは、１６〜２４塩基対の範囲内にある。
【００３３】
フラグメント−アダプター複合体（２０８）は、第２の制限エンドヌクレアーゼ、Ｔで消化され（２１０）、ｔ制限部位を欠くフラグメント（２１３）の集団（２１２）を産生し、そしてフラグメント（２１１）は一端にＱアダプターを、他端にＴによる切断から生じる突出末端を有する。
【００３４】
制限エンドヌクレアーゼＴは、Ｓと異なる任意の制限エンドヌクレアーゼであり得、その二本鎖ＤＮＡの消化は突出末端を残す。
【００３５】
好ましくは、Ｔは、標的ＤＮＡ中の制限部位の頻度がｓ制限部位の頻度よりも有意に少ないように選択され、それによって、Ｓ生成フラグメントが複数の内部ｔ制限部位を有する可能性を最小化する。好ましくは、大部分のＳ生成フラグメントは、１つだけの潜在的なｔ制限部位を有する。これらの条件は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓについて４塩基対認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼおよびＴについて６塩基対認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼ）の多くの組み合わせによって満たされる。
【００３６】
ヒトＤＮＡについて、好ましくは、Ｓは、４ヌクレオチド認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼであり、そしてその切断は、４ヌクレオチドの突出末端（例えば、Ｓａｕ  ３Ａ、Ｔｓｐ  ５０９Ｉ、Ｎｌａ  ＩＩＩなど）を生じ、そしてＴは、その認識配列中にＣＧを有する４ヌクレオチド認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼであり、その切断は、少なくとも２つのヌクレオチドの突出鎖（例えば、Ｔａｑ  Ｉ、Ｍｓｐ  Ｉ、ＨｉｎＰ１  Ｉ、Ｈｈａ  Ｉ、Ａｃｉ  Ｉなど）を生じる。ヒトＤＮＡにおける「ＣＧ」の欠損のために、後者の酵素認識部位頻度は、ランダム配列ＤＮＡにおいて予測されるよりも非常に低い。例えば、Ｔａｑ認識配列は、２５６塩基対毎に約１回ではなく１２００塩基対毎に約１回の頻度で生じる。
【００３７】
フラグメント（２１２）の混合物にＭアダプターを添加する。これは、Ｔを用いる切断によって生成する末端を有するフラグメントの突出鎖に（２１１）に、従来の反応条件下で連結され得る。また、これは、少なくとも２種のフラグメントの集団（２１６）を生じる：各末端にＱアダプターを有するもの（２１３）（「Ｑ−Ｑフラグメント」）、および１つの末端にＱアダプターを、他の末端にＭアダプターを有するもの（２１５ａおよび２１５ｂ）（「Ｑ−Ｍフラグメント」）。同じフラグメント中に複数のｔ制限部位が存在する例において、「Ｍ−Ｍフラグメント」が形成される。この場合、フラグメント（８１２）によって図８Ａにおいて例証されるように、ＭおよびＱプライマーを用いる増幅は、１つのＭ−Ｍフラグメントの鎖において存在する１塩基対のギャップのために、混合物からＭ−Ｍフラグメントを除去する。Ｍアダプターの長さは、Ｑアダプターについて記載されるように選択される；しかし、Ｍアダプターの配列は、Ｑアダプターの配列とは十分に異なるように選択され、その結果、操作（例えば、ＰＣＲ）の間にプライマー間の交差ハイブリダイゼーションの可能性はほとんどないか、または全くない。Ｍアダプターはさらに、それが連結されるその制限フラグメントからの遠位端に３’突出鎖を有し、その結果、そのような鎖は、二本鎖ＤＮＡ基質を必要とする３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ）によって消化されない。
【００３８】
Ｑ−Ｍフラグメントの全長一本鎖形態を生成するための代替的な手段（非対称ＰＣＲを含む）が利用可能である。非対称ＰＣＲは、１つのヌクレアーゼ耐性プライマー、続いてエキソヌクレアーゼ消化、アビジン捕捉したビオチン化鎖から相補物の融解など（例えば、Ｂｉｒｒｅｎら編、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第１巻（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７）；Ｈｕｌｔｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：４９３７−４９４６（１９８９）；Ｓｔｒａｕｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１０：３７６−３８４（１９９１）；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｗら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、３：２８５−２９１（１９９４）など、これらの参考文献は、参考として援用される）を有するＰＣＲである。
【００３９】
図２Ｂに戻ると、混合物（２１６）は、３’エキソヌクレアーゼを用いて消化されて（２１８）、各Ｑ−Ｍフラグメント（２１５）からの全長一本鎖フラグメント（２１７）、および各Ｑ−Ｑフラグメント（２１３）からの２つの半分の長さの一本鎖フラグメント（２１９）を含む混合物（２２０）を産生する。混合物（２２０）に、Ｍアダプターのプライマー結合部位に特異的なプライマー（２２４）を添加する（２２２）。アニーリング後、プライマー（２２４）は、伸長されて二本鎖フラグメント（２２８）を与え、次いでこれは、Ｑアダプターにおいて特異的なプライマーおよびＭアダプターについて特異的なプライマー（２２４）を用いて、ＰＣＲで増幅される。プライマー（２２４）は、その５’末端にいくつかのヌクレアーゼ耐性結合を含む。好ましくは、このような結合の数は、２〜４の範囲内にある。また好ましくは、ヌクレアーゼ耐性結合は、ホスホロチオエート結合であり。これは、従来的なプロトコールを用いて合成され得る（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１））。
【００４０】
次いで、フラグメント（２２８）をＳで切断し（２３２）、フラグメント（２３０）を遊離するＱアダプターを除去し、次いで、５’３’エキソヌクレアーゼで消化し、一本鎖フラグメント（２３８）の集団を産生する。このような５’３’エキソヌクレアーゼには、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）が含まれ、そしてＳｔｒａｕｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：３７６−３８４（１９９１）のプロトコールに従って使用され得る。
【００４１】
図２Ｃに示されるように、反応混合物（２０４）からのフラグメント（２５２）は、以下のように別々にプロセスされる：フラグメント（２５２）に、各末端にＮアダプターを有するフラグメントの集団（２５６）を産生するための従来のプロトコールを使用してＮアダプターを連結する。Ｎアダプターの長さは、Ｑアダプターについて記載されるように選択される；しかし、Ｎアダプターの配列は、ＭアダプターおよびＱアダプターの配列と十分に異なるように選択され、その結果、操作（例えば、ＰＣＲ）の間に交差ハイブリダイゼーションの可能性はほとんどないか、または全くない。次いで、集団のフラグメント（２５６）がＴで切断され（２５８）、その後混合物のフラグメントは、Ｎに特異的なプライマーを使用して増幅される；従って、混合物はｔ制限部位を欠くフラグメントで非常に富化される。次いで、増幅されたフラグメントが３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ）で消化され（２６２）、一本鎖の半分の長さのフラグメント（２６４）の混合物（２６６）を与える。
【００４２】
図２Ｄに示されるように、フラグメント（２３８）およびフラグメント（２６６）は、相補鎖のハイブリダイズを可能にする条件下で合わされる（２６８）。安定なハイブリッドが形成された後に、修復合成がハイブリッド上で行われて、二本鎖フラグメント（２７３）を産生し、そして制限エンドヌクレアーゼＳおよびＴに関して、二本鎖フラグメントが増幅されて制限フラグメントの参照集団を形成する。
【００４３】
参照ライブラリーの性質は、ライブラリーを構築するために使用される制限酵素およびアダプターによって影響される。例えば、図２Ａ〜図２Ｄにおいて制限酵素ＳおよびＴの順番を逆転させることならびにｓ制限部位に結合するＭアダプターおよびｔ制限部位に結合するＱおよびＭアダプターを付加することは、制限部位ｓにおける多型に対応する参照ライブラリーを生じる。当業者はまた、ＳおよびＴの代わりに他の制限酵素を置換することは、核酸プール中で異なる部位で異なる突出末端を有するフラグメントを産生することを理解する。これは、使用される制限エンドヌクレアーゼによって具体的に規定される異なる多型サブ領域からのフラグメントから作られる参照ライブラリーを生じる。
【００４４】
本発明の方法が、完全なゲノム（特に、哺乳動物または高等植物のゲノム）のすべてまたは実質的な画分を含むＤＮＡの集団に適用される場合には常に、ハイブリッドを形成する工程は、ＤＮＡ集団の複雑さを減少させるために、ハイブリダイゼーションに先立ってＤＮＡの亜集団を形成する工程を含み得る。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの集団に関する用語「複雑さ」は、集団中に存在するポリヌクレオチドの異なる種の数を意味する。例えば、核酸プールは、異なる３’−末端ヌクレオチド（例えば、Ｐａｒｄｅｅら、米国特許第５，２６２，３１１号）；指標リンカーの連結後増幅（例えば、Ｋａｔｏ、米国特許第５，７０７，８０７号；Ｄｅｕｇａｕら、米国特許第５，５０８，１６９号；およびＳｉｂｓｏｎ、米国特許第５，７２８，５２４号など、これらの引用文献は、参考として援用される）を有するプライマーのセットを使用する示差的なＰＣＲ増幅を用いてＤＮＡ集団の複雑さを減少するために処理され得る。複雑さを減少させる他の方法は、繰り返し配列を取り除くためにＤＮＡの前処理することを含む。
【００４５】
反復配列は、真核生物ゲノムを通して分散している。ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＢｒｉｔｔｅｎ（１９７３）Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：５６５−６１３；ＢｒｉｔｔｅｎおよびＤａｖｉｄｓｏｎ（１９７１）Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４６：１１１−１３８を参照のこと。
【００４６】
ヒトにおいては、反復配列は、少なくともゲノムの８０％にわたって数千塩基対の間隔で見出される。Ｓｅａｌｅｙら（１９８５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１３：１９０５−１９２３を参照のこと。従って、参照ライブラリーは、このような反復エレメントの存在によって歪められ得る。このような反復配列は、ライブラリー形成の間にゲノムの他の部分において共有される反復エレメント間で生じ得る交差ハイブリダイゼーションのために、参照ライブラリーにおいて存在する多型配列に影響を与え得る。この問題は、実質的に、前処理されたゲノムＤＮＡによって減少されて、非反復配列について富化されたゲノムＤＮＡの亜集団を形成し得る。
【００４７】
本明細書中において、「反復配列」は、ゲノムサイズから予測されるよりも低いＣoｔ値で何回も反復し、そして再結合しているヌクレオチド配列を意味する（ＬｉｎおよびＬｅｅ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、６５３：１９３−２０３）。
【００４８】
核酸プールは、参照ライブラリーが作製される前に、またはその間に反復配列中で欠損したＤＮＡの亜集団を形成するために処理され得る。好ましくは、１０％の反復配列が取り除かれる。より好ましくは、２５％の反復配列が取り除かれる。なおより好ましくは、５０％の反復配列が取り除かれる。開始核酸プールに存在する反復配列の７５％〜９０％の除去を含む、さらなる反復配列の減少もまた、所望され得る。
【００４９】
反復配列が枯渇している部分集団は、比較的高い濃度で存在する相補的核酸配列の比較的高い効果的なハイブリダイゼーション速度に依存する方法を使用して、形成され得る。従って、核酸フラグメントの不均一混合物が、変性されそしてハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートされる場合、比較的高い濃度で存在する配列（例えば、反復配列）は、比較的低い濃度で存在する配列よりも迅速に二本鎖になる。この二本鎖分子は、当業者に周知の方法を使用して、その一本鎖分子から分離される。
【００５０】
従って、非反復ＤＮＡについて濃縮されたＤＮＡの部分集団は、ゲノム核酸プールを事前に処理することによって入手され得る。本明細書中で使用される場合、「非反復ＤＮＡ」とは、反復ＤＮＡ以外のＤＮＡである。非反復ＤＮＡは、ゲノムサイズと一致するＣoｔ値で再会合し、そして単コピーのＤＮＡ配列および低コピーのＤＮＡ配列を含む。「単コピーの」ＤＮＡ配列および「低コピー」のＤＮＡ配列とは、真核生物ゲノムには比較的まれにしか存在しない配列として、本明細書中に定義される。Ｃoｔは、所定の溶媒での再会合を可能にした時間を掛けた、ＤＮＡのモル濃度である。ＬｉｎおよびＬｅｅ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，６５３：１９３〜２０３。
【００５１】
好ましい実施形態において、非反復ＤＮＡの部分集団が、プールされたゲノムＤＮＡを事前に処理して反復配列を除去することにより、形成される。例えば、プールされたゲノムＤＮＡが切断され、変性され、次いで短時間に再会合するさせられる。二本鎖反復ＤＮＡ配列の形成は、より独特な配列よりも速度論的に好ましい。ＬｉおよびＬｅｅ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，６５３：１９３〜２０３を参照のこと。二本鎖分子に対して作用し得るヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）の添加によって、その反応混合物中に存在する二本鎖反復配列が枯渇または除去され得る。このヌクレアーゼによる処理の後、残りの配列が増幅され、それにより非反復ＤＮＡについて濃縮された核酸フラグメントの部分集団が形成される。アダプター（すなわち、Ｑ、Ｎ、またはＭ）が、残りの配列が増幅され得るように、このヌクレアーゼによる処理の前または後に添加され得る。
【００５２】
あるいは、二本鎖反復配列が、ヒドロキシアパタイトカラムを使用して除去され得る。一本鎖核酸分子および二本鎖核酸分子は、ヒドロキシアパタイトへの異なる結合特徴を有する。これらの差異に依存する方法を使用して、ゲノムＤＮＡを変性し、そのゲノムＤＮＡを特定のＣoｔ値に適切な条件下で再会合させ、続いてヒドロキシアパタイトに結合する二本鎖分子を分離することによって、反復配列を含むゲノムＤＮＡの画分が非反復ＤＮＡから分離され得る。Ｇｒａｙら、米国特許第５，７５６，６９６号（１９９８年５月２６日発行）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）２．１３．１〜２．１３．３；Ｓｏａｒｅｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９２２８〜９２３２；Ｋｏ（１９９０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１８：５７０５；ＫａｎｔｏｒおよびＳｃｈｗａｒｔｚ（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９７：７７〜８４を参照のこと。
【００５３】
反復ＤＮＡ配列を除去するために有用な他のアプローチとしては、磁気的精製（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびＰＣＲ補助（ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）アフィニティークロマトグラフィー（Ｃｒａｉｇら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１００：４７２〜４７６；Ｄｕｒｍら（１９９８）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：８２０〜８２５）；固体支持体へ結合した一本鎖「吸収（ａｂｓｏｒｂｉｎｇ）」ＤＮＡ（Ｂｒｉｓｏｎら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：５７８〜５８７；ならびに非常に反復した配列ファミリーを表すハイブリダイゼーションプローブの使用（Ｓｅａｌｙら（１９８５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１３：１９０５〜１９２３；Ｗｅｔｍｕｒ（１９９１）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７〜２５９）。
【００５４】
あるいは、非反復ＤＮＡについて濃縮された核酸フラグメントの部分集団が、プールされたゲノムＤＮＡを変性しそして長時間にわたって再会合させることによって、形成され得る。このアプローチは、反復ＤＮＡ二重鎖におけるＤ−ループの形成を支持するが、一方安定な二重鎖が、非反復ＤＮＡの相補的配列間で形成される。一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＳ１）の添加によって、その混合物からＤ−ループを形成した反復配列の除去が生じ、それにより非反復ＤＮＡ配列について濃縮する。Ｗｅｔｍｕｒ（１９９１）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７〜２５９を参照のこと。
【００５５】
一旦作製されると、種々の適用における用途が、この参照ライブラリーには見出される。一般的に、この参照ライブラリーは、目的の集団における種々の多型の頻度を比較するために使用される。ある１つの集団において別の集団よりも頻繁に存在する多型が、本発明の方法を使用して単離および同定され得る。他の集団を分析するために使用される場合、第１の表現型を有する個体由来のＤＮＡのプールが、第２の表現型を示す集団と比較される。
【００５６】
従って、本発明の参照ライブラリーは、１つ以上の表現型または遺伝子型と関係し得る遺伝子の非常に近位にある多型マーカーについてスクリーニングするために使用され得る。表現型または遺伝子型と関係がある多型マーカーについてスクリーニングするためにこの参照ライブラリーを使用する利点は、その形質の予備知識が必要でないということである。従って、単純なメンデル遺伝を示す遺伝子型と関係がある多型、ならびに複雑な形質と関係がある遺伝子型または表現型が、本発明の組成物および方法を使用して検出され得る。例えば、薬物に対する応答（多数の遺伝子により支配される複雑な形質）は、この型のアプローチに受け入れられる。特に、このアプローチは、開発中の新規な薬物から利益を受けるであろう個体および有害な副作用に苦しむであろう個体を同定するために使用され得る。
【００５７】
多型プローブを使用してスクリーニングされ得る生物学的に興味深い他の表現型としては、ヒトにおける一般的疾患（例えば、心血管疾患、自己免疫疾患、癌、糖尿病、精神分裂病、双極性障害および他の精神医学的障害）が、挙げられる。ＫｗｏｋおよびＧｕ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ，５：５３８；ＲｉｓｃｈおよびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１５１６；ＬａｎｄｕおよびＳｃｈｏｒｋ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：２０３７を参照のこと。さらに、疾患の抵抗性および収量のような表現型の形質と関係がある他の生物（すなわち、植物）における多型もまた、本発明の種々の実施形態を使用してスクリーニングされ得る。Ｋｅｓｓｅｌｉら（１９９４）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３６：１４３５；Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８８；９８２８を参照のこと。
【００５８】
一般的に、目的の集団における多型の頻度は、以下のように比較される。第１の表現型を有する個体由来のＤＮＡのプールが、第１の制限エンドヌクレアーゼにより切断されて、制限フラグメントのプールが形成される。次いで、その多型を欠くフラグメントが選択される。第２の表現型を有する個体由来のＤＮＡの第２のプールが、同様に処理されて、またこの多型を欠く部分領域について選択される。次いで、この参照ライブラリーが、この多型を欠くフラグメントと接触させられ、そしてこの多型を欠く個体における多型部分領域の相対的頻度が、決定される。
【００５９】
その２つの集団由来のプールは、別々に分析され得るし、または一緒に混同されて分析され得る。この２つの集団における多型の頻度は、その２つのプールにおけるフラグメントを標識することによって、決定され得る。この標識は、その２つのプールが別々に分析される場合に同じであり得る。または別々の標識が、そのプールを混合する場合に、その２つの集団からそのフラグメントを識別するために使用され得る。本明細書中で以後より詳細に説明されるように、使用に適切な標識としては、蛍光色素のような光生成標識が挙げられる。
【００６０】
この参照ライブラリーの使用に好ましい方法は、図３に示される。ゲノムＤＮＡが、第１の個体プール（３００）および第２の個体プール（３０２）（図３においてそれぞれＸおよびＹと呼ばれる）の個体から抽出される。好ましくは、当量のＤＮＡが、各個体から寄与される。プールＸ由来のＤＮＡが、制限エンドヌクレアーゼＳにより切断（３０４）され、そしてＢアダプターが、生じたフラグメントの末端に連結される。Ｂアダプターは、Ｑアダプターについて上記に記載されるように選択される。別々に、プールＹ由来のＤＮＡが、制限エンドヌクレアーゼＳにより切断（３０６）され、そしてＣアダプターが、生じたフラグメントの末端に連結される。Ｃアダプターは、Ｑアダプターについて上記で記載されるように選択される。Ｑアダプターを用いてのように、ＢアダプターおよびＣアダプターは、後のＰＣＲによる増幅のための、プライマー結合部位を含む。これらのプライマー結合部位について選択された配列は、各プライマーの交差ハイブリダイゼーションがほとんどまたは全く存在しないほど十分異なるべきである。反応（３０４）および（３０６）からの等量のアダプター−フラグメント複合体が混合され、その後、その複合体が、制限エンドヌクレアーゼＴにより切断され、続いて従来のＰＣＲにおいて、Ｂ特異的プライマーおよびＣ特異的プライマーの両方を使用して増幅される。これにより、内部ｔ制限部位を欠くアダプター−フラグメント複合体の集団（３１０）が生じる。集団（３１０）は、３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ）により切断され（３１２）、半分の長さのフラグメント（３１３）が生じ、次いでこれは、フラグメント（２３８）とハイブリダイズして、ハイブリッド（３１６）が形成される。修復合成（３１８）がハイブリッド（３１６）に対して実行され、その後、生じたフラグメントが、Ｂアダプター、ＣアダプターおよびＭアダプターのプライマー結合部位に特異的なプライマーを使用して増幅される。
【００６１】
好ましくは、各プライマーは、識別可能な標識（例えば、蛍光標識）を保有し、この標識によって、その２つのプール由来の相対数のフラグメントが、固相支持体に結合した参照集団由来の相補鎖への競合ハイブリダイゼーションによって、比較される。このような増幅の結果は、フラグメント（３２０）として例示され、ここでＢアダプターに特異的なプライマーは蛍光標識ｆ1を保有し、Ｃアダプターに特異的なプライマーは蛍光標識ｆ2を保有し、そしてＭアダプターに特異的なプライマーは、反応混合物からフラグメントを精製するために、「ｂ」により示されるビオチンを保有する。図３においてフラグメント（３２０）により示唆されるように、一本鎖標識プローブは、固相アビジン化支持体を介してフラグメントを単離し、続いて蛍光標識を保有する非共有結合鎖の融解によって、そのフラグメント（３２０）から誘導され得る。
【００６２】
当業者は、類似の分析が、図３において参照されるプロトコルを適合させることによって、第１の集団および第２の集団においてｔ+制限部位について選択することによって行われ得ることを理解する。図３におけるように、プールＸおよびＹは、制限酵素Ｓにより切断される。プールＸからのフラグメントは、Ｂアダプターと連結され、そしてプールＹからのフラグメントは、Ｃアダプターと連結される。次いで、そのフラグメントは、Ｔにより切断され、そしてＭアダプターと連結される。ｔ-フラグメントを排除するために、この混合物は、まずエキソヌクレアーゼＩＩＩにより処理される。エキソヌクレアーゼＩＩＩ処理後、ｔ+フラグメントが、ＢプライマーおよびＭプライマーを使用して増幅される。これによりｔ+ＤＮＡについて選択され、このｔ+ＤＮＡは、次に上記のように参照ライブラリーを用いて分析される。
【００６３】
一旦作製されると、この参照ライブラリーまたは多型プローブは、直接にかまたはオリゴヌクレオチドタグまたはタグ補体（以下により完全に記載される）を介してかのいずれかで、固相支持体に結合され得る。この参照ライブラリーを用いる使用のための固相支持体は、広範な種々の形態（微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、微細加工（ｍａｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ）チップなどを含む）を有し得る。同様に、固相支持体は、広範な種々の組成物（ガラス、プラスチック、ケイ素、アルカンチオレート誘導体化金、セルロース、低架橋ポリスチレンおよび高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む）を含み得る。
【００６４】
参照ライブラリー由来の同じ配列（すなわち、多型プローブ）の同一のコピーが、微粒子の部分集団を形成するように、別個の粒子に結合され得る。各部分集団が異なる多型プローブを含むこのような部分集団の多重度は、他の集団を試験するために使用され得る参照ライブラリー組成物を形成する。あるいは、同じ配列の同一のコピーは、異なる多型プローブの同じ配列を各々含む空間的に分散した領域が形成されるように、単一の支持体または複数の支持体に結合され得る。後者の実施形態において、この領域の面積は、特定の適用に従って変化し得；通常、その領域は、数μｍ2（例えば、３〜５）〜数百μｍ2（例えば、１００〜５００の面積の範囲である。好ましくは、このような領域は、隣接領域での事象により生成されるシグナル（例えば、蛍光発光）が、使用されている検出系により分離され得るように、空間的に分散している。
【００６５】
好ましい実施形態において、固相支持体の表面上に規定された領域を有するアレイが、本発明の多型プローブを使用して形成され得る。このようなアレイを作製するための方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）規定された領域において予備形成された核酸溶液を分布するためにピンを使用すること（ＢｒｏｗｎおよびＢｏｓｔｅｉｎ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１（補遺）：３３；Ｄｕｇｇａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１（補遺）：１０；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２１（補遺）：１３８７；Ｓｃｈｅｎａら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７）；（２）固体支持体上の規定された領域において参照ライブラリーを配置するためのキャピラリーディスペンサーを使用すること（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７６５９を参照のこと）；（３）オリゴヌクレオチドが、固体表面上の連続的溶液ベースの反応を介して一塩基ずつ合成される、インクジェット技術を使用すること（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら（１９９６）Ｂｉｏｓｅｎｓ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１１：６８７）；（４）パターン化した光指向性コンビナトリアル化学合成を使用して固体支持体の表面上に直接オリゴヌクレオチドタグを合成し、そして規定された領域中にタグ補体に結合した多型プローブを選別するためにそのタグを使用すること（Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５ｍ７４４，３０５号（１９９８年４月２８日発行；Ｃｈｅｅら、米国特許第５，８３７，８３２号（１９９８年１１月１７日；Ｆｏｄｏｒ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：３９３）；（５）および光ファイバーアレイを調製するための微粒子にオリゴヌクレオチドを結合することによる（Ｗａｌｔら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０９１６３）。
【００６６】
ハイブリダイゼーション反応における使用のために、参照ライブラリー由来のフラグメントの同一コピー（すなわち、本明細書中で「クローン化部分集団」と呼ばれる）が、そのフラグメントがハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得るように、別々の領域における１つ以上の固相支持体に結合される。このようなハイブリダイゼーション支持体の構築は、種々の様式で実行され得る。例えば、このフラグメントは、ＰＣＲによってか、またはベクター中にクローニングすることによって、増幅され得る。「ベクター」または「クローニングベクター」または文法上の等価物は、本明細書中では、宿主生物においてＤＮＡフラグメントを複製するために使用され得る、染色体外遺伝エレメントが意味される。本発明との使用ために広範な種々のクローニングベクターが、市販されており、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）などからである。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の核酸フラグメントは、細菌ベクター中にクローニングされる。このような場合、細菌コロニーが形成され得、そして個々のクローンがさらなる増幅および平面アレイまたは微粒子のいずれかへの結合のために選ばれる。このような操作を実行するための技術は、周知である（例えば、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号；Ｇｈｏｓｈら、米国特許第５，４７８，８９３号；Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５，４４５，９３４号；同第５，７４４，３０５号；同第５，８００，９９２号）。
【００６８】
クローン化部分集団におけるフラグメントのコピーの数は、以下を含むいくつかの要素に依存して、別々の実施形態において広範に変化し得る：固相支持体上のタグ補体の密度、使用される微粒子のサイズおよび組成、ハイブリダイゼーション反応の持続時間、タグのレパートリーの複雑度、個々のタグの濃度、タグ−フラグメントサンプルのサイズ、光学シグナルを生成するための標識手段、粒子選別手段、シグナル検出系など。これらの要素に関する設計選択を行うための指針は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、分子生物学、ハイブリダイゼーション技術、および関連する分野に関する文献において、本明細書中に引用される参考文献によって示されるように、容易に入手可能である。
【００６９】
好ましくは、クローン化部分集団におけるフラグメントのコピーの数は、微粒子の蛍光細胞分析分離装置（「ＦＡＣＳ」）選別を可能にするに十分であり、ここで、蛍光シグナルは、その微粒子に結合したフラグメントにより保有される１つ以上の蛍光色素分子により生成される。代表的には、この数は、蛍光分子（例えば、フルオレセイン）が使用される場合には、数千（例えば、３〜５，０００）程度の少なさであり得、そしてローダミン６Ｇのようなローダミン色素が使用される場合には、数百（例えば、８００〜８０００）程度の低さであり得る。より好ましくは、ロードされた微粒子は、ＦＡＣＳにより選別され、クローン化部分集団は、少なくとも１０4コピーのフラグメントからなり；そしてより好ましくは、このような実施形態において、クローン化部分集団は、少なくとも１０5コピーのフラグメントからなる。
【００７０】
簡単には、図２Ｄにまとめられ（２７４）そして図４により十分に例示されるように、大きなレパートリー（４０４）由来のオリゴヌクレオチドタグが、タグ−フラグメント結合体を形成するようにフラグメント（４００）に結合され（４０２）、タグ−フラグメント結合体のサンプルが、実質的にすべての異なるフラグメントが異なるタグを有するように採取され、そのタグ−フラグメント結合体のサンプルが増幅され（４０８）、そしてその増幅されたコピー（４１０）が、１つ以上の固相支持体（４１２）に特異的にハイブリダイズされる（４１４）。好ましくは、この１つ以上の固相支持体は、そのタグ−フラグメント結合体のタグに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを保有する、微粒子の集団（４１２）である。微粒子を使用する好ましい実施形態において、特異的ハイブリダイゼーションの後、タグ−フラグメント結合体が、その微粒子に結合したタグ補体に連結され、そしてその非共有結合した鎖が融解して、下記のハイブリダイゼーションプローブをすぐに受けることができる微粒子（４１６）を生じる。
【００７１】
フラグメントにオリゴヌクレオチドタグを結合する好ましい方法は、図５Ａおよび５Ｂにさらに示される。好ましくは、フラグメントは、ベクター（５３０）に挿入され、挿入後、そのベクターは、以下の順序のエレメントを含む：第１のプライマー結合部位（５３２）；制限部位ｒ1（５３４）、オリゴヌクレオチドタグ（５３６）、結合部（５３８）、フラグメント（５４０）、制限部位ｒ2（５４２）、および第２のプライマー結合部位（５４４）。サンプルが、タグ−フラグメント結合体を含むベクターから採取された後、以下の工程が実行される：そのタグ−フラグメント結合体が、５−メチルデオキシシチジントリホスフェートの存在下での従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるビオチン化プライマー（５４８）および標識プライマー（５４６）の使用によって、好ましくはベクター（５３０）から増幅され、その後、生じたアンプリコンは、ストレプトアビジン捕捉により単離される。本明細書中で使用される場合、「アンプリコン」は、増幅反応の産物を意味する。すなわち、アンプリコンは、通常は、二本鎖の、少数の開始配列から複製された、ポリヌクレオチドの集団である。アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応においてか、またはクローニングベクターにおける複製によって、生成され得る。
【００７２】
アンプリコンのフラグメントの内部の部位で生じる切断の可能性を最小にしつつ支持体から捕捉されたアンプリコンを解放するために、制限部位ｒ1は、好ましくは、まれにしか切断しない制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩなど）に対応する。以下の配列：
５’・・・ＧＧＧＣＣＣ・・・
３’・・・ＣＣＣＧＧＧ・・・
として示される結合部（５３８）は、適切なＤＮＡポリメラーゼがｄＧＴＰとともに使用される場合、Ｇトリプレットで停止されるＤＮＡポリメラーゼ「ストリッピング」反応を引き起こす。簡単には、「ストリッピング」反応において、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７号；およびＫｕｉｊｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１１２：１４７〜１５５（１９９２）により教示されるように、タグ−フラグメント結合体のタグを一本鎖にするために使用される。
【００７３】
選別が、タグとタグ補体との間の二重鎖の形成によって達成される好ましい実施形態において、タグ−フラグメント結合体のタグは、４つの天然のヌクレオチドのうち３つしか含まないワードをまず選択し、次いでその３つのヌクレオチド型をそのダグ−フラグメント結合体から３’→５’方向でＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により優先的に切断することによって、一本鎖にされる。
【００７４】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、Ａ、Ｇ、およびＴのみを含むように設計され、従って、タグ補体（二本鎖タグ−フラグメント結合体におけるものを含む）が、Ａ、Ｃ、およびＴからなる。その解放されたタグ−フラグメント結合体がｄＧＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより処理された場合、そのタグの相補鎖が、第１のＧまで「除去される（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）」。その地点で、ＤＮＡポリメラーゼによるｄＧの取り込みが、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を釣り合わせ、この「ストリッピング」反応を効果的に停止する。上記の説明から、当業者が、同じ目的（すなわち、タグを一本鎖にすること）を実行するために、多くの代わりの設計選択を行い得ることが明らかである。このような選択としては、異なる酵素の選択、タグを構成するワードの異なる組成などが挙げられ得る。
【００７５】
「ストリッピング」反応が停止される場合、その結果は、１本鎖タグ（５５７）を伴う二重鎖（５５２）である。単離後、工程（５５８）が実行され：タグ−フラグメント結合体が、微粒子に付着したタグ相補体に対してハイブリダイズされ、フィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応が行われて、そのタグ−フラグメント結合体の相補鎖と微粒子（５６０）に付着したタグ相補体（５６２）の５’末端との間の任意のギャップが埋められ、そしてタグ−フラグメント結合体の相補鎖は、リガーゼを用いた処理により、タグ相補体（５６２）の５’末端（５６３）に共有結合的に結合される。この実施形態は、もちろん、タグ相補体の５’末端が、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどのようなキナーゼによって、リン酸化されることを必要とする。このフィルイン反応は、好ましくは、行われる。なぜなら、この「ストリッピング」反応は、常に第１のＧにおいて停止されるわけではないからである。好ましくは、フィルイン反応は、５’３’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用する。また好ましくは、４つ全てのｄＮＴＰは、「ストリッピング」がＧのトリプレットを越えて及ぶ場合、フィルイン反応において使用される。
【００７６】
さらに以下で説明されるように、タグ−フラグメント結合体は、タグ相補体の全レパートリー（ｆｕｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）に対してハイブリダイズされる。つまり、微粒子の集合のうち、レパートリー全体の全てのタグ配列を有する微粒子が存在する。従って、タグ−フラグメント結合体は、ほんの約１％の微粒子上のタグ相補体に対してハイブリダイズする。タグ−フラグメントがハイブリダイズした微粒子は、本明細書中で、「ロードされた微粒子」と言われる。より大きな効率のために、ロードされた微粒子は好ましくは、さらなる処理のためにロードされていない微粒子から分離される。このような分離は、ＦＡＣＳまたは多数の個々の微粒子の迅速な操作および選別を可能にする類似の機器の使用により都合よく達成される。図６Ａにおいて例示される実施形態において、蛍光標識である、例えば、ＦＡＭ（フルオレセイン誘導体、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅ．１９９６））が、プライマー（５４６）によって付着される。
【００７７】
図６Ｂにおいて示されるように、ＦＡＣＳ、または同様の選別（５８０）の後、ロードされた微粒子（５６０）が単離され、標識（５４５）を除去するために処理され、そして非共有結合的に付着した鎖を融解させて離すために処理される。標識（５４５）が除去または不活化されると、その結果、標識（５４５）は、競合的にハイブリダイズされた鎖の標識を妨げない。好ましくは、このタグ−フラグメント結合体は、プライマー結合部位（５４４）に隣接するタグ−フラグメント結合体を切断する、制限エンドヌクレアーゼ認識部位ｒ3（５４２）を用いて処理され、それによって「ボトム」鎖（すなわち、微粒子から遠位に５’末端を有する鎖）によって運ばれる標識（５４５）を除去する。好ましくは、この切断は、突出（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）鎖（５８５）を有する二本鎖タグ−フラグメント結合体（５８４）を伴う微粒子（５６０）を生じる。次いで、３’標識アダプター（５８６）は、突出鎖（５８５）に対してアニーリングされ、そして連結され（５８７）、その後、ロードされた微粒子は、３’標識により再選別される。３’標識を運ぶ鎖が融解され、プローブを受容する準備のある、共有結合的に付着した１本鎖のフラグメント（５９２）（図４において例示されるように産生される）を残す。好ましくは、３’標識鎖は、水酸化ナトリウム処理または同じような試薬を用いた処理によって融解によって離される。
【００７８】
本発明の重要な特徴は、固相支持体（好ましくは、微粒子）に付着した参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ＤＮＡ集団を構築するために、最少に交差ハイブリダイズするセット（ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｓｅｔ）のオリゴヌクレオチドのメンバーであるオリゴヌクレオチドタグの使用である。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」としては、モノマー対モノマー相互作用の規則的パターン（例えば、ワトソン−クリック型の塩基対合、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対合など）の方法によって標的ポリヌクレオチドと特異的に結合可能な、天然または改変された、モノマーまたは結合（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む）の直鎖状オリゴマーが挙げられる。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって結合され、数個のモノマー単位（例えば、３〜４）〜数十のモノマー単位（例えば、４０〜６０）のサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、一連の文字（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）によって示される場合はいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、左から右へ、５’→３’の順番であり、そして「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、そして「Ｕ」がウリジンを示すことが理解される。用語「ｄＮＴＰ」は、「デオキシリボヌクレオシド三リン酸」についての略語（ａｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ）であり、そして「ｄＡＴＰ」、「ｄＣＴＰ」、「ｄＧＴＰ」、「ｄＴＴＰ」および「ｄＵＴＰ」は、個々のデオキシリボヌクレオシドの三リン酸誘導体を示す。通常、オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチドを含む；しかしこれらのオリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドアナログもまた含み得る。天然のヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合、例えば、酵素によるプロセシングが必要とされる場合、通常、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要とされることが当業者に明らかである。
【００８０】
二重鎖に関して「完全にマッチした」は、二重鎖を構成するポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、他の鎖と二本鎖構造を形成し、その結果、各鎖の全てのヌクレオチドが他の鎖におけるヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対合を起こすことを意味する。この用語はまた、使用され得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を含むヌクレオシドなど）の対合を含む。三重鎖に関して、この用語は、３重鎖が、完全にマッチした二重鎖、および全てのヌクレオチドが完全にマッチした二重鎖の塩基対とフーグスティーン会合または逆フーグスティーン会合を起こす第３の鎖からなることを意味する。
【００８１】
本明細書中で「ミスマッチ」により、塩基Ａ、Ｔ（またはＲＮＡについてはＵ）、ＧおよびＣの任意の２つの間でのワトソン−クリック塩基対Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ以外の塩基対が意味される。８つの可能なミスマッチは、Ａ−Ａ、Ｔ−Ｔ、Ｇ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｔ−Ｇ、Ｃ−Ａ、Ｔ−ＣおよびＡ−Ｇである。
【００８２】
最少に交差ハイブリダイズするセットのオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドによって、同じセットの全ての他のメンバーの配列とは異なる。従って、このようなセットの各メンバーは、任意の他のメンバーの相補体と２未満のミスマッチを伴って二重鎖（または３重鎖）を形成し得ない。本明細書中で「タグ相補体」といわれるオリゴヌクレオチドタグの相補体は、天然のヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。オリゴヌクレオチドタグが選別のために使用される場合、参照ＤＮＡ集団を構築する場合と同様に、タグ相補体を、好ましくは固相支持体に付着させる。オリゴヌクレオチドタグと対応するタグ相補体と共に使用される場合、オリゴヌクレオチドタグは、分子（特に、発現された遺伝子由来のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド）を選別、追跡、または標識するためのハイブリダイゼーションの特異性を増強する手段を提供する。
【００８３】
オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補体の最少に交差ハイブリダイズするセットは、所望されるセットのサイズおよび交差ハイブリダイゼーションを最少化するのが求められる程度（またはいいかえれば、特異性を増幅するのが求められる程度）に依存して、組み合わせてまたは個々でのいずれかで、合成され得る。例えば、最少に交差ハイブリダイズするセットは、Ｂｒｅｎｎｅｒら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３に開示されるように構築される場合、少なくとも４個のヌクレオチドによって互いに異なる、個々に合成された１０マー配列のセット（このようなセットは、３３２個の最大サイズを有する）からなり得る。あるいは、最少に交差ハイブリダイズするセットのオリゴヌクレオチドタグはまた、サブユニットから組み合わせて組み立てられ得、このサブユニット自体は、最少に交差ハイブリダイズするセットから選択される。例えば、少なくとも３つのヌクレオチドにより互いに異なる、最少に交差ハイブリダイズする１２マーのセットが、各々が３つのヌクレオチドにより互いに異なる最少に交差ハイブリダイズする４マーのセットから選択される３つのサブユニットを組み立てることにより合成され得る。このような実施形態により、９3、すなわち７２９個の１２マーの最大のサイズのセットが得られる。
【００８４】
組み合わせて合成された場合、オリゴヌクレオチドタグは、好ましくは複数のサブユニットからなり、各サブユニットは、３個〜９個の長さのヌクレオチドからなり、ここで、各サブユニットは、同じ最少に交差ハイブリダイズするセットから選択される。このような実施形態において、利用可能なオリゴヌクレオチドのタグの数は、タグあたりのサブユニットの数およびサブユニットの長さに依存する。
【００８５】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、以下の形態：
Ｓ1Ｓ2Ｓ3．．．Ｓn
のオリゴヌクレオチドを含む。
【００８６】
本明細書中に使用される場合、「Ｓ1〜Ｓn」は、３個〜９個のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドタグを含む、サブユニットをいい、そして最少に交差ハイブリダイズするセットから選択される。「ｎ」は、４〜１０の範囲であり、そしてタグの全体の長さは、１２個〜６０個のヌクレオチドの範囲であり得る。
【００８７】
１つ以上の固相支持体に付着したオリゴヌクレオチドタグの相補体は、各々がタグを含むポリヌクレオチドの混合物からポリヌクレオチドを選別するために使用される。このようなタグ相補体は、固相支持体（例えば、微粒子または単一の支持体上の合成位置のアレイにおける特定の位置）の表面上で合成され、その結果、同一、または実質的に同一の配列の集団が、特定の領域において産生される。つまり、ビーズの場合、各支持体の表面は、またはアレイの場合、各領域の表面は、特定の配列を有する１つの型のタグ相補体のみのコピーにより、誘導体化される。このようなビーズまたは領域の集団は、各々が別個の配列を有するタグ相補体のレパートリーを含む。オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補体に関して本明細書中に使用される場合、用語「レパートリー」は、固相クローニング（選別）または同定のために使用される異なるオリゴヌクレオチドタグまたはタグ相補体の総数を意味する。レパートリーは、個々に合成されるオリゴヌクレオチドの１セットの最少に交差ハイブリダイズするセットからなり得る。または、レパートリーは、各々が、最少に交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの同じセットから選択されるオリゴヌクレオチドの連鎖物（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）からなり得る。後者の場合において、レパートリーは、好ましくは組み合わせて合成される。
【００８８】
好ましくは、タグ相補体は、微粒子上で組み合わせて合成され、その結果、各微粒子は、付着した多くのコピーの同じタグ相補体を有する。広範な種々の微粒子支持体は、本発明と共に使用され得、これは、制御された孔隙のガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、高度架橋（ｈｉｇｈｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレイン（ｐｏｌｙａｃｒｏｌｅｉｎ）などを含み、以下の例示的参考文献において開示される：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第Ａ節、１１−１４７頁、第４４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；同第４，４１３，０７０号；および同第４，０４６，７２０号；およびＰｏｎ，第１９章、Ａｇｒａｗａｌ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９３）。微粒子支持体としては、さらに、市販されているヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンビーズ（例えば、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）；誘導体化された磁気ビーズ；ポリエチレングリコールとグラフト化されたポリスチレン（例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌTM、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）；などが挙げられる。微粒子はまた、デンドリマー構造からなり得る（例えば、Ｎｉｌｓｅｎら、米国特許第５，１７５，２７０号により開示される）。一般的に、微粒子のサイズおよび形は、決定的ではない；しかし、数μｍ（例えば、１〜２μｍ）〜数百μｍ（例えば、２００〜１０００μｍ）の直径を有するサイズ範囲の微粒子が好ましい。なぜなら、それらの微粒子は、最少の試薬および最少のサンプルの使用による、オリゴヌクレオチドタグの大きなレパートリーの構築および操作を容易にするからである。好ましくは、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ，Ｉｎｄ．）から入手可能なグリシダルメタクリレート（ＧＭＡ）ビーズが本発明において微粒子として使用される。このような微粒子は、種々のサイズにおいて有用であり、そしてタグおよび／またはタグ相補体を合成するために、種々の連結基を伴って利用可能である。より好ましくは、５μｍ直径のＧＭＡビーズが使用される。
【００８９】
選別されたか、または固体支持体上にクローン化されたポリヌクレオチドは、各々が、付着したオリゴヌクレオチドタグを有し、その結果、異なるポリヌクレオチドは、異なるタグを有する。この条件は、ポリヌクレオチドの集団よりも実質的に大きい、タグのレパートリーを使用することにより、そしてタグ化されたポリヌクレオチド全体からタグ化されたポリヌクレオチドの十分に小さいサンプルを得ることにより達成される。このようなサンプリングの後、支持体およびポリヌクレオチドの集団が、オリゴヌクレオチドタグのそれらのそれぞれの相補体との特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されたとき、同一のポリヌクレオチドが特定のビーズまたは領域に選別される。もちろん、サンプリングされたタグ−ポリヌクレオチド結合体は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応、プラスミドにおけるクローニング、ＲＮＡ転写などによって増幅されて、後の分析のための十分な材料を提供する。
【００９０】
オリゴヌクレオチドタグは、本発明の特定の実施形態における２つの異なる目的のために使用される：（１）オリゴヌクレオチドタグは、Ｂｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，６０４，０９７号；および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３において記載されるように、固相クローニングを実行するために使用され、ここで、多数のポリヌクレオチド（例えば、数千〜数十万のポリヌクレオチド）が、分析のために、混合物から１つ以上の固相支持体において同一のポリヌクレオチドのクローンの部分集団へと選別され；そして（２）それらのオリゴヌクレオチドタグは、例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９４７２に開示されるように、コードされたアダプターのような、数十〜数千の範囲の数に達するポリヌクレオチドを同定するための標識を送達する（または受容する）ために使用される。前者の使用のために、多数のタグ、またはタグのレパートリーが、代表的に必要とされ、そして従って個々のオリゴヌクレオチドタグの合成は難しい。これらの実施形態において、タグの組み合わせ合成が好ましい。一方、タグの極めて大きなレパートリーが、例えば、２個〜数十個の範囲の、複数の種類のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部分集団（例えば、コードされたアダプター）に標識を送達するためには必要とされない場合、最少に交差ハイブリダイズするセットのオリゴヌクレオチドタグが、個別に合成され得、そして組み合わせて合成され得る。
【００９１】
数百〜数千の、または数万でさえあるオリゴヌクレオチドを含むセットは、種々の平行な合成アプローチによって、例えば、以下に開示されるように直接合成され得る：Ｆｒａｎｋら、米国特許第４，６８９，４０５号；Ｆｒａｎｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１：４３６５−４３７７（１９８３）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２４：１１０−１１６（１９９５）；Ｆｏｄｏｒら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：５０２２−５０２６（１９９４）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３５：２１７−２２７（１９９４）、Ｂｒｅｎｎａｎ、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５８９６；Ｌａｓｈｋａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：７９１２−７９１５（１９９５）など。
【００９２】
好ましくは、組み合わせてであろうと個々にであろうと合成された、混合物中のタグ相補体は、互いに類似の二重鎖安定性または三重鎖安定性を有するように選択され、その結果、完全にマッチしたハイブリッドが、類似の融解温度、または実質的に同一の融解温度を有する。これは、ミスマッチのタグ相補体が、ハイブリダイゼーション工程において、例えば、ストリジェントな条件下で洗浄することにより、完全にマッチしたタグ相補体と、より容易に区別されることを可能にする。組み合わせて合成されるタグ相補体について、最少に交差ハイブリダイズするセットは、そのセットにおける全ての他のサブユニットとほぼ等価に二重鎖安定性に貢献するサブユニットから構築され得る。このような選択を行うための指針は、最適なＰＣＲプライマーを選択することおよび二重鎖安定性を算出することについて公開された技術（例えば、Ｒｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：８５４３−８５５１（１９８９）および１８：６４０９−６４１２（１９９０）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８３：３７４０−３７５０（１９８６）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６：２２７−２５９（１９９１）など）によって提供される。最少に交差ハイブリダイズするセットのオリゴヌクレオチドは、さらなる基準（例えば、ＧＣ−含量、ミスマッチの分布、理論上の融解温度など）によりスクリーニングされて、最少に交差ハイブリダイズするセットでもあるサブセットを形成し得る。
【００９３】
本発明のオリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補体は、標準的な化学（例えば、ホスホルアミダイト化学）（例えば、以下の参考文献において開示される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４１５，７３２号；４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号など）を用いて、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）Ｍｏｄｅｌ  ３９２または３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）において都合よく合成される。
【００９４】
選別するためのオリゴヌクレオチドタグは、１２個から６０個のヌクレオチドまたは塩基対の長さに及び得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、１８個〜４０個のヌクレオチドまたは塩基対の長さに及ぶ。より好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、２５個〜４０個のヌクレオチドまたは塩基対の長さに及ぶ。好ましい数およびより好ましい数のサブユニットに関して、これらの範囲は、以下のように表され得る：
【００９５】
【表１】
0004669614.tif 000002
もっとも好ましくは、選別するためのオリゴヌクレオチドタグは、一本鎖であり、そして特異的なハイブリダイゼーションは、タグ相補体とのワトソン−クリック対合を介して生じる。
【００９６】
好ましくは、選別のための一本鎖オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、少なくとも１００個のメンバーを含み；より好ましくは、このようなタグのレパートリーは、少なくとも１０００個のメンバーを含み；そしてもっとも好ましくは、このようなタグのレパートリーは、少なくとも１０，０００個のメンバーを含む。
【００９７】
好ましくは、標識を送達するための一本鎖タグ相補体の長さは、８個と２０個との間である。より好ましくは、長さは、９個と１５個との間である。
【００９８】
選別のための例示的なタグライブラリーは、以下で示される（配列番号１）。
【００９９】
【化１】
0004669614.tif 000003
オリゴヌクレオチドタグの隣接領域が操作されて、クローニングベクターへの都合のよい挿入およびクローニングベクターからの切除のために、上記で例示されるように、制限酵素部位を含み得る。必要に応じて、右プライマーまたは左プライマーが、（従来の試薬（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）を用いて）付着されたビオチンを用いて合成されて、増幅および／または切断後の精製を容易にし得る。好ましくは、タグ−フラグメント結合体を作製するために、上記のライブラリーが従来のクローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）に挿入される。必要に応じて、タグライブラリーを含むベクターは、例えば、Ｂａｍ  ＨＩおよびＢｂｓ  Ｉを用いて十分に消化されたフラグメントの単離を容易にする「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」領域（「ＸＸＸ．．．ＸＸＸ」）を含み得る。
【０１００】
本発明の重要な局面は、例えば、ｃＤＮＡ参照ライブラリーから微粒子へ、または固相支持体上の個別の領域へのＤＮＡ配列の集団の選別および付着であり、その結果、各微粒子または領域は、付着された実質的に一種のみの配列を有し；つまり、その結果、このＤＮＡ配列は、クローン部分集団に存在する。この目的は、実質的にすべての異なるＤＮＡ配列が、付着された異なるタグを有することを保証することにより達成される。この条件は、次に、分析のためのタグＤＮＡ配列結合体の全体のうちの１つのサンプルのみを取り出すことによってもたらされる。同一のＤＮＡ配列が異なるタグを有することが容認される。なぜなら、ただ、同じＤＮＡ配列が２回操作されるか、または分析されるだけだからである。サンプリングは、タグが、ＤＮＡ配列に付着した後に（例えば、より大きな混合物から少容量を採取することにより）以下のいずれかにより明白に行われ得る；サンプリングは本質的に、ＤＮＡ配列およびタグを処理するために使用される技術の二次的な効果として行われ得；または、サンプリングは、明白に、かつ処理工程の固有の部分としての両方で行われ得る。
【０１０１】
ｎタグ−ＤＮＡ配列結合体のサンプルが、ランダムに、反応混合物から引き抜かれる場合（サンプル量を得ることによって果たされ得るように）、同じタグを有する結合体を引き抜く確率は、ポアソン分布、
【０１０２】
【数１】
0004669614.tif 000004
によって記載される。ここで、ｒは、同じタグを有する結合体の数であり、そしてλ＝ｎｐであり、ここで、ｐは、選択された所定のタグの確率である。ｎ＝１０6およびｐ＝１／（１．６７×１０7）（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒらに記載される８つの４塩基文字が、タグとして使用された場合）の場合、次いでλ＝０．０１４９であり、そしてＰ（２）＝１．１３×１０-4である。従って、１００万個の分子のサンプルが、好ましい範囲内で、予期された数の２倍のウエルを生じる。このようなサンプルは、タグ−フラグメント結合体を含む混合物の連続希釈によって容易に得られる。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、分子への付着タグ（特に、ポリヌクレオチド）に関して、用語「実質的にすべて」は、本質的に２倍を含まないタグ−分子結合体の集団を得るために使用されるサンプリング手順の統計学的性質を反映することを意味する。好ましくは、少なくとも９５パーセントのＤＮＡ配列が、付着した独特のタグを有する。
【０１０４】
好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列を、タグライブラリーを保有する従来のクローニングベクターに挿入することによって、オリゴヌクレオチドタグに結合体化される。例えば、５’末端にＢｓｐ１２０Ｉ部位を有するｃＤＮＡが構築され得、そしてＢｓｐ１２０Ｉおよび別の酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡまたはＤｐｎＩＩ）で消化した後、式Ｉのタグを保有するｐＵＣ１９へ直接的に挿入されて、タグ−フラグメントライブラリーを形成し得る。このタグ−フラグメントライブラリーは、あらゆる可能なタグ−フラグメント対形成を含む。サンプルは、増幅および分類のために、このライブラリーから得られる。サンプリングは、ライブラリーの連続希釈によって達成され得るか、またはコロニーからプラスミド含有細菌宿主を単に選ぶことによって、達成され得る。増幅後、タグ−フラグメント結合体は、プラスミドから切り出され得る。
【０１０５】
特定のハイブリダイゼーション（例えば、このタグを、上記のように一本鎖にすることによって）のためのオリゴヌクレオチドタグの調製後、このポリヌクレオチドは、タグとそれらの相補体との間の完全に整合した二重鎖の形成に有利である条件下で、タグの相補的配列を含む微粒子と混合される。これらの条件を作成することに関する文献中に、広範なガイダンスが存在する。このようなガイダンスを提供する例示的な参考文献としては、Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；などが挙げられる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件が、完全に整合する配列のみが安定な二重鎖を形成するように、十分にストリンジェントである。このような条件下で、タグを通じて特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、微粒子に付着した相補的配列に連結され得る。最終的に、この微粒子は、連結されないタグおよび／またはミスマッチのタグを有するポリヌクレオチドを取り除くために洗浄される。
【０１０６】
タグのその相補体へのハイブリダイゼーションの特異性は、十分に小さいサンプルを得ることによって増大され得、その結果、サンプル中の高い割合のタグの両方が独特であり、そしてサンプル中の実質的にすべてのタグの最も近接している隣接物が、少なくとも２文字異なる。この後者の条件は、使用されているレパートリーのサイズが約０．１パーセント以下である、多くのタグ−ポリヌクレオチド結合体を含むサンプルを得ることによって満たされ得る。例えば、タグが、８8の８文字のレパートリー、または約１．６７×１０7の８文字のレパートリーを用いて構築される場合、タグおよびタグの相補体が産生される。上記のように、タグ−ＤＮＡ配列結合体のライブラリーにおいて、０．１パーセントのサンプルとは、約１６，７００の異なるタグが存在することを意味する。このサンプルが、微粒子のレパートリー等価物（または、この実施例において、１．６７×１０7個の微粒子のサンプル）上に直接ロードされる場合、次いで、サンプリングされた微粒子の低密度のサブセットのみがロードされる。好ましくは、ロードされた微粒子は、ＤＮＡ配列が、蛍光標識され、そして変性された後に、従来のプロトコルを使用したＦＡＣＳ機器によって、ロードされない微粒子から分離され得る。ローディングおよびＦＡＣＳの選別後に、この標識は、付着したＤＮＡ配列の使用または他の分析の前に切断され得る。
【０１０７】
以下は、どのように、本発明に従って単離されたフラグメントが、従来技術を使用して、単離され、そして標識されるかについてのより詳細な説明を提供する。多くの発光標識が、蛍光標識、比色標識、化学発光標識および電気発光標識を含むフラグメントの標識化に利用可能である。一般的に、このような標識は、吸収周波数、放射周波数（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、強度、シグナル寿命またはそれらの特性の組み合わせを含み得る光学シグナルを産生する。好ましくは、蛍光標識は、蛍光標識されたヌクレオシド三リン酸の直接取り込み、または捕捉部分（例えば、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸、もしくはオリゴヌクレオチドタグ）の取り込みによる間接的な適用、その後の蛍光シグナルを産生し得る部分（例えば、ストレプトアビジン−蛍光色素結合体または蛍光標識化タグ相補体）との複合体化のいずれかによって、使用される。好ましくは、蛍光標識から検出される光学シグナルは、１以上の特性放射周波数での強度である。蛍光色素の選択、および蛍光色素のＤＮＡ鎖への付着または取り込みのための手段は、周知である（例えば、ＤｅＲｉｓｉら（上記で引用された）、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１６９巻、１−２５頁（１９８８）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）；ならびにＥｃｋｓｔｅｉｎ、編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）；Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：４３４７−４３５１（１９９５）ならびにＪｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：２４６−２４９（１９９６）；など）。
【０１０８】
好ましくは、発光標識は、それぞれの光学シグナルが、存在する標識化ＤＮＡ鎖の量に関連し得るように、そして異なる発光標識によって産生される光学シグナルが比較され得るように選択される。蛍光標識の放射強度の測定は、この設計の目的を満たす好ましい手段である。蛍光色素の所定の選択について、標識化ＤＮＡ鎖のそれぞれの量に対する放射強度の関連は、いくつかの因子（異なる色素の蛍光放射極大、量子収量、放射帯域幅、吸収極大、吸収帯域幅、励起光源の性質などを含む）の考慮を必要とする。蛍光強度測定の作製のためのガイダンス、および分析物の量に対するこの測定の関連のためのガイダンスは、化学分析および分子分析に関連する文献（例えば、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、編、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、第２版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｐｅｓｃｅら、編、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）；など）において入手可能である。本明細書中で使用されるように、用語「相対的な光学シグナル」とは、同一または実質的に同一の配列（相補的な参照ＤＮＡ鎖と二重鎖を形成する）の異なって標識化されたＤＮＡ鎖の比に関連し得る異なる発光標識由来のシグナルの比を意味する。好ましくは、相対的な光学シグナルは、２つ以上の異なる蛍光色素の蛍光強度の比である。
【０１０９】
個々の異なるプール由来の標識化ＤＮＡ鎖との間の競合的なハイブリダイゼーションは、従来のハイブリダイゼーション反応における参照ＤＮＡ集団とともにロードされる微粒子に対する各々のこのような供給源由来の等量の標識化ＤＮＡ鎖の適用によって行われる。競合的なハイブリダイゼーション反応に添加される標識化ＤＮＡ鎖の特定の量は、本発明の実施形態に依存して広く変化する。このような量の選択に影響を及ぼす因子としては、使用される微粒子の量、使用される微粒子の型、微粒子に対する参照鎖のローディング、反応量、標識化ＤＮＡ鎖の集団の複雑さなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、同一の配列または実質的に同一の配列を有する異なる標識化ＤＮＡ鎖が、同じ相補的参照ＤＮＡ鎖にハイブリダイズするために競合する点において競合的である。この競合的なハイブリダイゼーション条件は、相補的参照ＤＮＡ鎖との二重鎖を形成する標識化ＤＮＡ鎖の比率が反映され、そして好ましくは、それらのそれぞれの集団における同一の配列の競合するＤＮＡ鎖の量と比較すれば、その集団におけるそのＤＮＡ鎖の量に直接的に比例するように選択される。従って、同一の配列を有する第一の異なって標識されたＤＮＡ鎖および第二の異なって標識されたＤＮＡ鎖が、相補的参照鎖とのハイブリダイゼーションのために競合し、その結果、第一の標識化ＤＮＡ鎖は、１ｎｇ／ｌの濃度であり、そして第二の標識化ＤＮＡ鎖は、２ｎｇ／ｌの濃度であり、次いで、平衡で、参照ＤＮＡとともに形成された二重鎖の３分の１が、第一の標識化ＤＮＡ鎖を含み、そして二重鎖の３分の２が、第二の標識化ＤＮＡ鎖を含むことが期待される。ハイブリダイゼーション条件を選択するためのガイダンスが、以下を含む多くの参考文献において提供される：ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ，（上記で引用された）；Ｗｅｔｍｕｒ，（上記で引用された）；Ｈａｍｅｓら、編、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；など。
【０１１０】
蛍光標識されたＤＮＡ鎖を含む微粒子は、簡便に、市販されているＦＡＣＳ機器によって類別され、そして選別される（例えば、Ｖａｎ  Ｄｉｌｌａら、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）。参照鎖に競合的にハイブリダイズされた蛍光標識されたＤＮＡ鎖のために、好ましくは、ＦＡＣＳ機器は、多重蛍光チャネル能を有する。好ましくは、１つ以上の高強度の光源（例えば、レーザー、水銀アークランプなど）を有する励起に際して、各々の微粒子が、微粒子によって輸送される各々の細胞型または組織型由来の標識化ＤＮＡ鎖の量に関連する蛍光シグナル（通常、蛍光強度）を産生する。
【０１１１】
微粒子によって輸送されるフラグメントは、従来のＤＮＡ配列決定プロトコルを使用して、例えば、ＦＡＣＳによる選別後に同定され得る。このような配列決定のための適切な鋳型は、目的のフラグメントを輸送する選別された微粒子から開始されるいくつかの異なる方法で産生され得る。例えば、図６Ａおよび６Ｂにおいて例示されるように、単離された微粒子に付着した参照ＤＮＡは、サイクル配列決定（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２６７８による教示のように）によって、標識化伸長産物を産生するために使用され得る。この実施形態において、プライマー結合部位（６００）が、図６Ａにおいて示されるように、タグ相補体（６０６）に遠位の参照ＤＮＡ（６０２）に操作される。微粒子の単離（例えば、別々のマイクロタイターウエルなどへの選別によって）後、差次的に発現された鎖が解離し、プライマー（６０４）が添加され、そして従来のＳａｎｇｅｒ配列決定反応が行われ、その結果、標識化伸長産物が形成される。次いで、これらの産物は、配列決定のために、電気泳動または同様の技術によって分離される。同様の実施形態において、配列決定テンプレートは、個々の微粒子を選別せずに産生され得る。プライマー結合部位（６００）および（６２０）が、プライマー（６０４）および（６２２）を使用するＰＣＲによって、テンプレートを産生するために使用され得る。次いで、テンプレートを含む得られたアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が、Ｍ１３のような従来の配列決定ベクターにクローニングされる。トランスフェクション後、宿主をプレーティングし、そして個々のクローンが、配列決定のために選択される。
【０１１２】
図６Ｂに例示される別の実施形態において、プライマー結合部位（６１２）が、競合的にハイブリダイズした鎖（６１０）に操作され得る。この部位は、参照ＤＮＡ（６０２）において相補鎖を有する必要がない。選別後、参照ＤＮＡ（６０２）の競合的にハイブリダイズした鎖（６１０）が解離され、そして増幅され（例えば、プライマー（６１４）および（６１６）を使用するＰＣＲによって）、これらは、より容易な操作のために、ビオチンで標識および／または誘導体化され得る。次いで、解離され、そして増幅された鎖が、Ｍ１３のような従来の配列決定ベクターにクローニングされ、このベクターは、（順にプレーティングされる）宿主にトランスフェクトさせるために使用される。個々のコロニーを、配列決定のために選び取る。
【０１１３】
以下の実施例は、上記の発明を使用する様式をより十分に記載するため、ならびに、本発明の種々の局面を実施するために意図された最良の形態を示すために役立つ。これらの実施例が、決して本発明の真の範囲を制限するために役立つわけではなく、むしろ、例示の目的のために示されることが理解される。本明細書中で引用されるすべての参考文献が、参考として援用される。
【０１１４】
（実施例）
（実施例１）
（λファージＤＮＡの存在および非存在におけるＳａｕ３Ａ消化ｐＵＣ１９由来のＴａｑＩ多型フラグメントの単離）
本実施例において、従来のｐＵＣ１９プラスミドを改変し、塩基位置４３０に位置するＴａｑＩ部位と、プラスミドの９０６との間に、２つのさらなるＳａｕ３Ａ部位を作成する（図７Ａ）。次いで、この新規に作成されたプラスミド（ｐ０Ｔ２Ｓ）を、２つの新規のＳａｕ３Ａ部位の間のＴａｑＩ部位のさらなる添加とともに改変し、プラスミドｐ１Ｔ２Ｓを作成する。従って、この２つのプラスミドが、新規のＴａｑＩ部位で多型である。この２つのプラスミドを、別々に、Ｓａｕ３Ａで消化した。
【０１１５】
ＴａｑＩ部位（Ｔａｑ+フラグメント）を含むＳａｕ３Ａフラグメントの一本鎖部分を、アダプターおよびプライマー（配列は、以下に列挙される）を使用して、図８Ａにおいて概説されるプロトコルを用いて産生した。Ｓａｕ３Ａ消化ｐ１Ｔ２Ｓプラスミド（８００）を、ｄＧＴＰで満たし、次いで、過剰のＱアダプターを、従来の連結反応において添加し（８０２）、産物（８０４）を形成した。次いで、この産物を、ＴａｑＩで消化し（８０６）、３つの可能な産物（８０８）、（８１０）および（８１２）を与えた。この混合物に対して、過剰のＭアダプターを、従来の連結反応において添加し（８１４）、３つの可能な産物（８１６）、（８１８）および（８２０）を形成した。好ましくは、Ｍアダプターは、以下の２つの構造的特徴を有する：（ｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化を防ぐための、以下に示されるような５’伸長、および（ｉｉ）ＴａｑＩによって消化されたＳａｕ３Ａフラグメントに連結される末端での３つのヌクレオチドの突出鎖。それによって、アダプターの１つの鎖とフラグメントとの間にギャップを残しながら、連結される。この後者の特徴は、２つのＭアダプター（すなわち、ＴａｑＩ−ＴａｑＩフラグメント（８２０））を有するフラグメントが、ＰＣＲによって増幅されないことを保証する。Ｍアダプターの連結後、この混合物を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理し（８２２）、フラグメント（８１６）および（８１８）を一本鎖にする。次いで、ＭプライマーおよびＱプライマーを、反応混合物に添加し、そしてＰＣＲを行い（８２４）、産物（８２６）を形成する。次いで、この産物をＳａｕ３Ａで消化し（８２８）、Ｑアダプターを取り除く。次いで、得られたフラグメント（８３０）を、Ｔ７遺伝子６  ５’−エキソヌクレアーゼで処理し（８３２）、一本鎖フラグメント（８３４）を産生する。
【０１１６】
ＴａｑＩ部位を欠失するＳａｕ３Ａフラグメント（Ｔａｑ-フラグメント）の一本鎖部分を、アダプターおよびプライマー（これらの配列は、以下に列挙される）を用いて、図８Ｂにおいて概説されるプロトコルを用いたプラスミドｐ０Ｔ２Ｓから産生した。Ｓａｕ３Ａ消化ｐＯＴ２Ｓを、ｄＧＴＰで満たし、次いで、過剰のＮアダプターを、従来の連結反応において添加し（８５２）、産物（８５４）を形成し、次いで、この産物を、ＴａｑＩで消化し（８５６）、３つの可能な産物（８５８）、（８６０）および（８６２）を与える。好ましくは、Ｎアダプターの５’末端に、ホスホロチオエート連結または他の保護改変の提供によって、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を与える。次いで、反応混合物を、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理し、付着した２つのＮアダプターを有するフラグメント（８５８）を除いて、すべてのフラグメントを一本鎖にした。一本鎖フラグメントを除去するために、エキソヌクレアーゼＩで処理した（８６６）後、Ｎプライマーを反応混合物に添加し、そしてＰＣＲを実施し（８６８）、フラグメント（８５８）についての混合物を富化した。次いで、得られたフラグメントを、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理し（８６０）、一本鎖フラグメント（８６２）を産生した。
【０１１７】
図８Ｃに例示されるように、以下に与えたプロトコルを使用して、上記の反応由来のフラグメント（８３４）および（８６２）をアニールし（８７０）、そして得られた二重鎖の３’鎖（８７２）を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで伸長し（８７４）、ＭプライマーおよびＮプライマーのためのプライマー結合部位を有するフラグメント（８７６）を形成する。ＭプライマーおよびＮプライマーを、反応混合物に添加し、そしてフラグメント（８７６）を、ＰＣＲによってコピーした。この反応由来のＰＣＲアンプリコンを、ゲル電気泳動によって分離し、そして図７Ａにおいて例示されるＳａｕ３Ａフラグメントの部分ＡおよびＢに対応する２つのフラグメント（１９０塩基対および２３０塩基対）を同定した（「プラスミド」の下のレーン＋／−）。
【０１１８】
上記の実験を、以下の変更を伴って繰り返した：ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡに等モルのλファージＤＮＡの量を、最初のＳａｕ３Ａ消化反応に添加した。図８Ａ〜８Ｃにおいて概説される反応の実施後、得られたフラグメントを、ゲル電気泳動によって分離し、そして図７Ａにおいて例示されるＳａｕ３Ａフラグメントの部分ＡおよびＢに対応するバンドを同定した（「λ＋プラスミド」の下のレーン＋／−）。
【０１１９】
Ｑアダプター、ＮアダプターおよびＭアダプターについての配列は、以下の通りである：
【０１２０】
【化２】
0004669614.tif 000005
ＰＣＲのために使用されたプライマーの配列は、以下を含む：
【０１２１】
【化３】
0004669614.tif 000006
（実施例２）
（ＢｓｔＹＩ−消化ヒトゲノムＤＮＡ由来のＴａｉ  Ｉ多型フラグメントの単離）
本実施例において、ゲノムＤＮＡの第一のサンプルが、５人の糖尿病患者の集団から単離された白血球から得られ、そしてプールされた。別々に、ゲノムＤＮＡの第二のサンプルが、５人の正常な個体の集団から単離された白血球から得られ、そしてプールされた。白血球由来のゲノムＤＮＡを、以下に与えたプロトコルによって全血から単離した。第一のサンプルおよび第二のサンプル由来の等量のＤＮＡを、Ｔａｉ  Ｉ制限部位多型を含み得るＢｓｔ  ＹＩフラグメント（「Ｂｓｔ  ＹＩ参照フラグメント」）を単離するために合わせた。２つのアリコートを、合わせたＤＮＡサンプルから取り除き、そして製造業者の推薦するプロトコルを使用して、Ｂｓｔ  ＹＩで完了するまで別々に消化した。Ｔａｉ  Ｉ部位を含むＢｓｔ  ＹＩフラグメント（「Ｔａｉ+フラグメント」）を、図９Ａおよび９Ｂにおいて概説されるプロトコルによって、あるアリコートから単離し、そしてＴａｉ  Ｉ部位を欠失するＢｓｔ  ＹＩフラグメント（「Ｔａｉ-フラグメント」）を、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて概説されるプロトコルによって、他のアリコートから単離した。次いで、多型フラグメントの参照集団を、図１１に記載されるように、Ｔａｉ+フラグメントＴａｉ-フラグメントを合わせることによって産生し、その後、この参照集団を、以下に記載されるように、タグ含有ベクター（例えば、ｐＮＣＶ）にクローニングし得、タグ化された参照フラグメントのライブラリーを形成した。適切なクローニングベクターにおけるトランスフェクションおよび伸長後、サンプルを、さらなる増幅および微粒子上へのローディングのために得る。次いで、集団特異的プローブを、上記のように、いずれかの集団に関連した多型配列の同定のために構築する。
【０１２２】
以下は、ＴａｉＩ多型フラグメントを単離するために使用された方法のより詳細な記載である。第一に、ゲノムＤＮＡを単離し、そして以下のようにＢｕｆｆｙ−ｃｏａｔ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓから精製する：開始時の全血が、５〜１０ｍｌである場合、約１０×１０6〜６０×１０6に富化された白血球であることを予期し得る。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で、少なくとも１００分の１に、バフィーコート調製物を希釈し、細胞数を測定する。この調製物中には、少量の赤血球がおそらく存在している。１００／Ｇのゲノムチップカラム（ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡキット、カタログ番号１３３４３）当たり、２×１０7個を超える細胞を使用しない。バフィーコート調製物を、５０ｍｌのコニカルチューブ中で、２×１０7個の細胞まで冷ＰＢＳで５ｍｌにする。１容の氷冷緩衝液溶解緩衝液（Ｃ１−Ｑｉａｇｅｎキット）を添加し、そして３容の氷冷蒸留水を添加する。懸濁液が半透明になるまで、数回転置することによって、穏やかにチューブを混合する。氷上で１０分間インキュベートする。溶解されて富化された白血球を、４℃で１５分間、１３００×ｇで遠心分離する。上清を捨てる。ペレットが白色になるまで（このことは、残留ヘモグロビンが取り除かれたことを示す）、１ｍｌのＣ１および３ｍｌの蒸留水を用いて、洗浄を繰り返す。この時点で、洗浄したペレットを、収率のロスを伴わずに、−２０℃で保存し得る。プロトコルを続ける場合、ペレットを、５ｍｌの緩衝液Ｇ２（ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡキット）で再懸濁し、そして高速で１０〜３０秒間、核をボルテックスする。９５μｌのＱｉａｇｅｎプロテアーゼを添加し、そして５０℃で３０〜６０分間インキュベートする。この溶解物は、この段階で透明になるはずである。もし透明にならない場合、インキュベーション時間を延ばすか、または溶解しない物質を、５０００×ｇで１０分間、４℃でペレット化する。このサンプルを、Ｑｉａｇｅｎゲノムチップ上に迅速にロードするべきである。
【０１２３】
ＤＮＡを精製するために、Ｑｉａｇｅｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  １００／Ｇを、重力流を使用して、４ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  ＱＢＴ（Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ）で平衡化する。ゲノムＤＮＡサンプルを最高速度で１０秒間ボルテックスし、そしてこれを平衡化されたカラムにかける。Ｑｉａｇｅｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｉｐを、７．５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＣで２回洗浄する。ＤＮＡを、５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＦで溶出する。３．５ｍｌの室温イソプロパノールを添加し、そしてチューブを１０〜２０回混合して、ＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡペレットを、一晩シェーカー上または５５℃で数時間、水（１００〜２００μｌ）に溶解する。ＤＮＡを溶解した後、それを１：５０で希釈し、そして２６０／２８０で光学密度（ＯＤ）を測定する。血球の割合は、残渣のヘモグロビンに起因して、低くあり得る。収量は、約５０〜２００μｇであるべきである。
【０１２４】
一本鎖Ｔａｉ+ＢｓｔＹ１フラグメントを、ｄＧＴＰで充填ことによって調製する。後の連結工程におけるフラグメントの連鎖を避けるために、エタノール沈澱したＢｓｔＹ１消化した混合ゲノムＤＮＡを、ｄＧＴＰで充填する。ｄＧＴＰで充填するために、以下を混合する：２μｌ  １０×Ｋｌｅｎｏｗ  ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  トリス．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；５００ｎｇ  ＢｓｔＹ１消化された（エタノール沈澱された）ゲノムＤＮＡ；０．４μｌ  １．６５ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．５μｌ  ５Ｕ／μｌ  Ｋｌｅｎｏｗ（Ｅｘｏ−）；および２０μｌの最終体積までのＨ2Ｏ。３７℃で３０分間インキュベートし、そして７５℃で１０分間不活性化する。
【０１２５】
Ｑアダプターを、充填したＢｓｔＹ１フラグメントの両端に連結し、それによって、ＢｓｔＹ１部位を保持する。Ｑアダプターに連結するために、以下を２０μｌの最終体積で混合する：４μｌ  ５×ＬＢ１（１２５ｍＭ  トリス．ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２２．５ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；１μｌ  １０μＭ  アダプター；２μｌ  ２ｍＭ  ＡＴＰ；２．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ；および０．５μｌ  ２０００Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ。そしてこれを、１６℃で一晩インキュベートする。
【０１２６】
メチル化されていないＤＮＡを産生するために、メチル化感受性制限酵素（例えば、Ｔａｑ  Ｉ）で完全に切断し、このＤＮＡをＱ−ｔｏｐプライマーを用いて増幅する。ＰＣＲの条件は、１μｌのテンプレート（２０μｌの連結反応由来）を使用して、以下のようである；５５℃のアニーリング温度；３５サイクル、３０秒伸長、１００μｌ反応；０．８μＭプライマー（すなわち、各末端が０．４μＭ）；最終濃度が２．５ｍＭのＭｇＣｌ2。
【０１２７】
増幅に続いて得られたＤＮＡを精製するために、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、次いで、クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出する。エタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１２８】
次いでこの精製したＤＮＡをＴａｉで消化する。Ｔａｉで消化するために、以下を１００μｌの最終体積で混合する：１μｇ  ＤＮＡ；１０μｌ  １０×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｒ+（ＭＢＩ；１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５））、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）；９８μｌまでのＨ2Ｏ；および２μｌ  Ｔａｉ。そしてこれを、６５℃で５時間インキュベートする。
【０１２９】
Ｔａｉを用いた消化の後、そのＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、続いてクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出することによって精製する。次いで、このＤＮＡをエタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１３０】
次に、この精製したＤＮＡをＡｖａＩＩで消化する。ＡｖａＩＩで消化するために、以下を１００μｌの最終体積で混合する：１０μｌ  １０×ＮＥＢ４（５００ｍＭ  ＫＯＡｃ、２００ｍＭ  トリスＯＡｃ、１００ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；２μｌ  ＡｖａＩＩ（５０Ｕ／μｌ）；および７８μｌ  Ｈ2Ｏ。そしてこれを３７℃で５時間インキュベートする。
【０１３１】
ＤＮＡの脱リン酸化は、コンカテマーの形成を防ぐために必要である。ＤＮＡを脱リン酸化するために、以下を１０１μｌの最終体積で混合する：１００μｌ  ＤＮＡ；および１μｌ  ＳＡＰ（エビアルカリホスファターゼ）（１Ｕ／μｌ）。３７℃で３０分間インキュベートし、そして６５℃、２０分間で不活性化する。
【０１３２】
Ｍアダプターへの連結の前に、このＤＮＡを精製する。ＤＮＡを精製するために、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出する。このＤＮＡをエタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１３３】
Ｍアダプターへの連結は、ＢｓｔＹ１フラグメントが増幅されるのを許容するが、Ｔａｉ部位は保持する。Ｍアダプターの３’末端は、エキソヌクレアーゼＩＩＩから保護されている。
【０１３４】
Ｍアダプターに連結するために、以下を２０μｌの最終体積で混合する：４μｌ  １０×ＬＢ３（２５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；０．５μｌ  １０μＭ  Ｍ−ｔａｉアダプター；２μｌ  ２ｍＭ  ＡＴＰ；３μｌ  Ｈ2Ｏ；０．５μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ／μｌ）。そしてこれを、１６℃で一晩インキュベートする。
【０１３５】
次に、このＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩで直線化し、一本鎖ＤＮＡを産生する。このＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理するために、以下を２０μｌの最終体積で混合する：２０μｌ  ＤＮＡ；１μｌ  ＥｘｏＩＩＩ（１００Ｕ／μｌ）。そしてこれを、３７℃で２時間インキュベートし；次いで７５℃で１０分間不活性化させる。
【０１３６】
エキソヌクレアーゼＩＩＩでの処理後に得られたＤＮＡフラグメントをｓｓｓｓＭＮ．ａｍｐおよびＱ−ｔｏｐプライマーを用いて増幅する。ネガティブコントロールには、Ｍプライマー単独およびＱプライマー単独を使用する。このＤＮＡを増幅するために、以下を５０μｌの最終体積で一緒に混合した：３９．７５μｌ  Ｈ2Ｏ；５μｌ  １０×Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ；１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ；１μｌ  テンプレート；１μｌ  各１０μＭ  プライマー；２μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（最終２．５ｍＭ）；および０．２５μｌ  ＨＳ  Ｔａｑ。以下の条件を用いて増幅した：９５℃で１５分間の予熱工程、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で１分間を３５サイクル。７２℃で５分間の最終工程。
【０１３７】
増幅に続いて、このＤＮＡを、第１にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出することによって精製する。このＤＮＡをエタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１３８】
Ｑアダプターを除去するために、上記由来のこのＤＮＡをＢｓｔＹ１で消化する。ＢｓｔＹ１で消化するために、以下を２０μｌの最終体積で混合する：２μｌ  １０×ＢｓｔＹ１  ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ；１００ｍＭ  トリス、ｐＨ７．９、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；０．２μｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；１０μｌ  ＤＮＡ；６．８μｌ  Ｈ2Ｏ；および１μｌ  ＢｓｔＹ１（２０Ｕ／μｌ）。そしてこれを６０℃で２時間インキュベートする。
【０１３９】
Ｑアダプターの除去後、このＤＮＡをＴ７遺伝子６で直線化する。このＤＮＡをＴ７遺伝子６で処理するために、以下を４０μｌの最終体積で一緒に混合する：２０μｌ  ＤＮＡ；１９μｌ  Ｈ2Ｏ；および１μｌ  Ｔ７遺伝子６。２３℃で６０分間インキュベートし、そして８０℃で２０分間不活性化し、ハイブリダイゼーションへの準備のできた一本鎖ＤＮＡを形成する。
【０１４０】
Ｔａｉ制限部位を欠く全てのＢｓｔＹ１フラグメントからなる一本鎖ＤＮＡを産生するために、Ｔａｉ消化工程が完了までゆくことが重要である。なぜなら切断されていない部位が、多型性として誤って同定されるからである。第１に、エタノール沈澱されたＢｓｔＹ１消化された混合ゲノムＤＮＡを、後の連結工程におけるフラグメントの連鎖を防ぐために、ｄＧＴＰで充填する。ｄＧＴＰで充填するために、以下を２０μｌの最終体積で混合する：２μｌ  １０×Ｋｌｅｎｏｗ  ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭトリス．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；５００ｎｇ  ＢｓｔＹ１消化された（エタノール沈澱された）ゲノムＤＮＡ；０．４μｌ  １．６５ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．５μｌ  ５Ｕ／μｌ  Ｋｌｅｎｏｗ（Ｅｘｏ−）；２０μｌまでのＨ2Ｏ。３７℃で３０分間インキュベートし、そして７５℃で１０分間不活性化する。
【０１４１】
Ｎアダプターを、充填したＢｓｔＹ１フラグメントの両端に連結し、それによって、ＢｓｔＹ１部位を保持する。５’保護されたアダプターを使用する。Ｎアダプターに連結するために、以下を２０μｌの最終体積で混合する：４μｌ  ５×ＬＢ１（１２５ｍＭ  トリス．ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２２．５ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；１μｌ  １０μＭ  アダプター（＝ｓｓｓｓＮアダプター）；２μｌ  ２ｍＭ  ＡＴＰ；２．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ；および０．５μｌ  ２０００Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ。そしてこれを、１６℃で一晩インキュベートする。
【０１４２】
メチル化されていないＤＮＡを産生するために、メチル化感受性制限酵素（例えば、Ｔａｑ  Ｉ）で完全に切断し、前工程から得られたＤＮＡをｓｓｓｓＮ−ｔｏｐプライマーを用いて増幅する。増幅の条件は、以下のようである；５０℃のアニーリング温度；３５サイクル、３０秒伸長；０．８μＭプライマー（すなわち、各末端が０．４μＭ）、２．５ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ2および２０μｌの連結反応からのテンプレートを含む１００μｌ反応。
【０１４３】
増幅後のＤＮＡを精製するために、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、続いてクロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出する。エタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１４４】
次いで上記から精製されたＤＮＡをＴａｉで消化する。Ｔａｉで消化するために、以下を１００μｌの最終体積で混合する：１μｇ  ＤＮＡ；１０μｌ  １０×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｒ＋（ＭＢＩ；１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５））、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）；９８μｌまでのＨ2Ｏ；および２μｌ  Ｔａｉ。そしてこれを、６５℃で５時間インキュベートする。
【０１４５】
消化したフラグメントの直線増幅をさけるために、このＤＮＡを最初に、Ｔ７遺伝子６で直線化し、次いでエキソヌクレアーゼＩで処理する。このＤＮＡをＴ７遺伝子６で処理するために、以下を全量１０１μｌの最終体積で一緒に混合する：１００μｌ  ＤＮＡ；および１μｌ  Ｔ７遺伝子６。
【０１４６】
２３℃で３０分間インキュベートし、そして７０℃で２５分間不活性化する。このＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩで処理するために、以下を１０２μｌの最終体積で一緒に混合する：１０１μｌ  ＤＮＡおよび１μｌ  エキソヌクレアーゼＩ。これを３７℃で３０分間インキュベートし、そして７０℃で２５分間不活性化する。
【０１４７】
このＤＮＡを、最初にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出することによって精製する。エタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１４８】
次いで上記から得られた精製したＤＮＡをＡｖａＩＩで消化する。ＡｖａＩＩで消化するために、以下を１００μｌの最終体積で混合する：１０μｌ  ＮＥＢ４（５００ｍＭ  ＫＯＡｃ、２００ｍＭ  トリスＯＡｃ、１００ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；７９μｌ  Ｈ2Ｏ；および１μｌ  ＡｖａＩＩ。これを３７℃で５時間インキュベートし、そして６５℃で２０分間不活性化する。ＡｖａＩＩでの消化に続いて、このＤＮＡを、最初にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、続いてクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出することによって精製し、エタノールで沈澱し（８０％エタノール洗浄）、そして２０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１４９】
上記からの精製されたＤＮＡを、２０μｌの最終体積で以下：２μｌ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ  トリス．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；０．４μｌ  １．６５ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．５μｌ  ５Ｕ／μｌ  Ｋｌｅｎｏｗ（Ｅｘｏ−）；および７．１μｌ  Ｈ2Ｏを混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、そして７０℃で２０分間不活性化することによってｄＧＴＰで充填する。
【０１５０】
ｄＧＴＰを用いた充填反応に続いて、このＺ−アダプターを２０μｌの最終体積で以下：４μｌ  ５×ＬＢ１（２５０ｍＭトリス．ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２２．５ｍＭ  ＤＴＴ）；１０μｌ  ＤＮＡ；１μｌ  ５μＭ  アダプター（＝ＺａｖａＷアダプター）；２μｌ  ２ｍＭ  ＡＴＰ；２．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ；および０．５μｌ  ２０００Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを混合し、そして１６℃で一晩インキュベートすることによって、ＤＮＡフラグメント上に連結する。
【０１５１】
Ｚアダプターの連結後に、このＤＮＡを、２１μｌの最終体積で以下：２０μｌ  ＤＮＡ；および１μｌ  エキソヌクレアーゼ（１００Ｕ／μｌ）を混合し、３７℃で２時間インキュベートし、そして７５℃で１０分間不活性化させることによって、エキソヌクレアーゼＩＩＩで直線化する。
【０１５２】
Ｔａｉ部位を欠くこれらのフラグメントの増幅のために、以下を５０μｌの最終体積で一緒に混合する：３８．７５μｌ  Ｈ2Ｏ；５μｌ  １０×Ｔａｑ  Ｐｏｌ  ｂｕｆｆｅｒ、１μｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  ｄＮＴＰ；１μｌ  １０μＭ  ｓｓｓｓＮ．ｔｏｐ；１μｌ  １０μＭ  Ｚ．ｔｏｐ；２μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１μｌ  ＤＮＡ；および０．２５μｌ  ＨＳ  Ｔａｑ。
【０１５３】
次いで、このＤＮＡを、以下の条件下で増幅する：９５℃で１５分間の予熱；続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で１分間を３５サイクル。５分間の最終工程を７２℃で行う。ｓｓｓｓＮ−ｔｏｐプライマー単独がネガティブコントロールである。生じたＤＮＡを、最初にフェノール／クロロホルムで抽出し、続いてクロロホルムで抽出することによって精製し、エタノールで沈澱し、そして１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁する。
【０１５４】
一本鎖Ｔａｉ-フラグメントを得る最終工程は、ＤＮＡをＴ７遺伝子６で直線化する。この工程によって全長Ｎ−Ｚ（Ｔａｉ）フラグメントが生成され、そしてこの工程は、無関係な反復配列からの誤ったプライミングを避けるために重要である。このＤＮＡをＴ７遺伝子６で処理するために、４０μｌの最終体積で以下を一緒に混合する：８μｌ  ５×Ｔ７遺伝子６  ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  トリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）；１０μｌ  ＤＮＡ；２１μｌＤＮＡ；および１μｌ  Ｔ７遺伝子６。２３℃で６０分間インキュベートし、そして７５℃で１０分間不活性化する。
【０１５５】
多型性Ｔａｉ-およびＴａｉ+一本鎖フラグメントを、最初にハイブリダイズし、次いでＮプライマーおよびＭプライマーを用いて増幅することによってレスキューする。ＮアダプターおよびＭアダプターを含むこれらのフラグメント（すなわち、多型性フラグメント）のみ、増幅されるべきである。一本鎖ＤＮＡサンプルを、２０μｌの最終体積で以下を一緒に混合することによってハイブリダイズさせる：４μｌ  Ｔａｉ+ＤＮＡ；４μｌ  Ｔａｉ-ＤＮＡ；１２μｌ  １×ＢｓｔＹ１  ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）。次いでこの混合物を９４℃で５分間インキュベートし、次いでこれを氷上で急冷する。２μｌの１Ｍ  ＮａＣｌを添加し、０．１Ｍの最終濃度のＮａＣｌを得る。次いで、この混合物を６５℃で一晩インキュベートする。
【０１５６】
２μｌのハイブリダイズされたＤＮＡを除去し、そして最終体積が１０μｌの以下に添加する：０．１μｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  ｄＮＴＰ；１μｌ  １０Ｐ  ｂｕｆｆｅｒ（４００ｍＭ  トリス  ７．５、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）；０．８μｌ  配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；６．１μｌ  Ｈ2Ｏ。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、そして７５℃で１０分間不活性化する。
【０１５７】
このＤＮＡを増幅するために、以下を２５μｌの最終体積で、一緒に混合する：１９．８７５μｌ  Ｈ2Ｏ；２．５μｌ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ；０．５μｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  ｄＮＴＰ；０．５μｌ  １０μＭ  Ｎ．ｔｏｐ  ｐｒｉｍｅｒ；０．５μｌ  １０μＭ  ＢＮ．ａｍｐ  ｐｒｉｍｅｒ；１μｌ  テンプレート（伸長された）；０．１２５μｌ  ＨＳ  Ｔａｑ。
【０１５８】
このＤＮＡを以下の条件下で増幅する：９５℃で１５分間の予熱工程；続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で１分間を３５サイクル；続いて５分間の最終工程を７２℃で行う。
【０１５９】
この実施例において使用したアダプターは、以下である。
【０１６０】
【化４】
0004669614.tif 000007
この実施例におけるＰＣＲに使用したプライマーは、以下である。
【０１６１】
【化５】
0004669614.tif 000008
注意：太字で書かれたヌクレオチドは、ホスホロチオエートであり、これは、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼに対する保護を提供する（これが、プライマーおよびアダプターが、ｓｓｓｓ（４つの５’ホスホチオエートヌクレオチドを示す）を有する理由である）。
【０１６２】
（実施例３）
（８文字タグライブラリーの構築）
ヌクレオチド４文字を有する８文字タグライブラリーを、ベクターｐＬＣＶ−２およびｐＵＣＳＥ−２中の２つの２文字ライブラリーから構築した。８文字タグライブラリーの構築の前に、６４の２文字（６４  ｔｗｏ−ｗｏｒｄ）２本鎖オリゴヌクレオチドを、別々にｐＵＣ１９ベクターに挿入し、そして増殖させた。これらの６４ヌクレオチドは、Ｂｒｅｎｎｅｒの米国特許第５，６０４，０９７号に記載される、８文字の最小に交差ハイブリダイズするセットから選択される４ヌクレオチド文字で構成される、全ての可能な２文字対からなる。挿入物の同一性を配列決定によって確認した後、この挿入物をＰＣＲによって増幅し、そして当量の各アンプリコンをあわせ、ベクター（ｐＬＣＶ−２およびｐＵＣＳＥ−２）中に２文字ライブラリーの挿入物を形成させた。次いでこれらを以下のように使用し、ｐＵＣＳＥ中に８文字タグライブラリーを形成させた。この後、この８文字挿入物をベクターｐＮＣＶ３に移した。このベクターｐＮＣＶ３は、ポリヌクレオチドフラグメントのタグ化および分類を容易にするための、さらなるプライマー結合部位および制限酵素部位を含む。
【０１６３】
ｐＵＣ１９を、製造者らのプロトコールおよび単離された多きなフラグメントを用いてＳａｐ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで完全に消化し、ｐＵＣＳＥを得た。全ての制限エンドヌクレアーゼは、他に記載しない限り、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）から購入した。小さなＳａｐ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントは、β−ｇａｌプロモーター配列（これは、最終ライブラリーにおける文字のいくつかの組み合わせの表示をゆがめることが見出された）を排除するために除去した。以下のアダプター（配列番号１３）を、単離された大きなフラグメントに従来の連結反応で連結し、連結産物としてプラスミドｐＵＣＳＥ得る。
【０１６４】
【化６】
0004669614.tif 000009
細菌宿主を、エレクトロポレーションを用いて連結産物で形質転換する。この後、形質転換された細菌をプレートに蒔き、クローンを選択し、そしてそのプラスミドの挿入を確認のために配列決定した。次いでクローンから単離したｐＵＣＳＥを、製造業者らにプロトコールを用いてＥｃｏ  ＲＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、そして大きなフラグメントを単離した。以下のアダプター（配列番号１４）をこの大きなフラグメントに連結し、第１の２文字（ｄｉ−ｗｏｒｄ）（下線）を含むプラスミドｐＵＣＳＥ−Ｄ１を得た。
【０１６５】
【化７】
0004669614.tif 000010
（調製Ｉ）
２文字（ｄｉ−ｗｏｒｄ）を含むさらなるプラスミド（ｐＵＣＳＥ−Ｄ２〜ｐＵＣＳＥ−Ｄ６４）をｐＵＣＳＥ−Ｄ１をＰｓｔ  ＩおよびＢｓｐ１２０  Ｉで消化し、大きなフラグメントのための以下のアダプター（配列番号１５）を別々に連結することによってｐＵＣＳＥ−Ｄ１から別々に構築した。
【０１６６】
【化８】
0004669614.tif 000011
（調製ＩＩ）
上鎖のワードを、以下の最小限にクロスハイブリダイズするセットから選択した：ｇａｔｔ，ｔｇａｔ，ｔａｇａ，ｔｔｔａ，ｇｔａａ，ａｇｔａ，ａｔｇｔおよびａａａｇ。クローニングおよび単離の後、ベクターの挿入物を配列決定して、二ワードの正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を確実にした。
【０１６７】
プラスミドクローニングベクターｐＬＣＶ−Ｄ１を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、プラスミドベクターｐＢＣ．ＳＫ-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から以下のように作製した。
【０１６８】
【化９】
0004669614.tif 000012
【０１６９】
【化１０】
0004669614.tif 000013
オリゴヌクレオチドＳ−７２３およびＳ−７２４を、キナーゼで処理し、互いにアニールし、そしてＫｐｒＩおよびＸｂａＩで消化し、かつ仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したｐＢＣ．ＳＫ-に連結して、プラスミドｐＳＷ１４３．１を作製した。
【０１７０】
オリゴヌクレオチドＳ−７８５およびＳ−７８６をキナーゼで処理し、互いにアニールし、そしてＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、かつ仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したプラスミドｐＳＷ１４３．１に連結し、プラスミドｐＳＷ１６４．０２を作製した。
【０１７１】
オリゴヌクレオチドＳ−９６０、Ｓ−９６１、Ｓ−９６２、およびＳ−９６３をキナーゼで処理し、互いにアニールし、４つのオリゴヌクレオチドからなる二重鎖を形成した。プラスミドｐＳＷ１６４．０２を、ＸｈｏＩおよびＳａｐＩで消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲルにおいて電気泳動し、そして約３０４５ｂｐ産物を適切なゲル片から精製した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＰｓｔＩで消化し、そしてアガロースゲルにおいて電気泳動した。約１２４０ｂｐ産物を適切なアガロースゲル片から精製した。２つのプラスミド産物（ｐＳＷ１６４．０２およびｐＵＣ４Ｋ由来）を（Ｓ−９６０／９６１／９６２／９６３）二重鎖と共に連結してプラスミドｐＬＣＶａを作製した。
【０１７２】
Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ５由来のＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてアガロースゲルにおいて電気泳動した。約２８５３ｂｐ産物を適切なアガロースゲル片から精製した。このフラグメントを、ＰａｃＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで消化したプラスミドｐＬＣＶａに連結し、プラスミドｐＳＷ２０８．１４を作製した。
【０１７３】
プラスミドｐＳＷ２０８．１４を、ＸｈｏＩで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてアガロースゲルにおいて電気泳動した。約５３７４ｂｐ産物を、適切なアガロースゲル片から精製した。このフラグメントをオリゴヌクレオチドＳ−１１０５およびＳ−１１０６（これらは、キナーゼで処理され、互いにアニールされている）に連結し、プラスミドｐＬＣＶｂを作製した。このプラスミドｐＬＣＶｂをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この大フラグメントを単離し、そして調製Ｉ（Ｆｏｒｍｕｌａ  Ｉ）のアダプター（配列番号１４）に連結して、ｐＬＣＶ−Ｄ１を得た。
【０１７４】
ｐＵＣＳＥに関して上記のように、二ワードを含むさらなるプラスミド（ｐＬＣＶ−Ｄ２からｐＬＣＶ−Ｄ６４）を、ＰｓｔＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで消化し、大フラグメントを単離し、そして調製ＩＩ（Ｆｏｒｍｕｌａ  ＩＩ）のアダプターを連結することによってｐＬＣＶ−Ｄ１から別々に構築された。クローニングおよび単離の後、ベクターの挿入物を、配列決定して、二ワードの正体を確実にした。
【０１７５】
ベクターｐＬＣＶ−Ｄ１からｐＬＣＶ−Ｄ６４およびベクターｐＵＣＳＥ−Ｄ１からｐＵＣＳＥ−Ｄ６４の各々は、ＰＣＲによって別々に増幅した。この反応混合物の組成は、以下の通りである：
１０μｌ  鋳型（約１〜５ｎｇ）
１０μｌ  １０×ＫｌｅｎｔａｑTM緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）
２．５μｌ  ビオチン化ＤＦプライマー（１００ｐｍｏｌｅ／ｌ）
２．５μｌ  ビオチン化ＤＲプライマー（１００ｐｍｏｌｅ／ｌ）
２．５μｌ  １０ｍＭ  デオキシオリゴヌクレオシド三リン酸
５μｌ  ＤＭＳＯ
６６．５μｌ  Ｈ2Ｏ
１μｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎｔａｑTM（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉ
ｆ．）
この反応の温度は、以下のように制御した：９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１０秒間を２５サイクル；続いて７２℃で３分間、次いで４℃。ＤＦプライマーおよびＤＲプライマー結合部位は、長さ１０４塩基対のアンプリコンを得るために選択されたベクターの上流部分および下流部分であった。反応を完了後、５μｌの各々のＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（１×ＴＢＥで２０％）で分離し、反応収率が、各々のＰＣＲに関してほぼ同一であることを目視検査によって確認にした。このような確認の後、従来のプロトコルを使用して、１０μｌのそれぞれのＰＣＲをフェノールで２回そしてクロロホルムで１回抽出して、その後、水層中のＤＮＡをエタノールで沈殿した。２００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液♯２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）中に再懸濁後、このＤＮＡを、５０μｌの製造業者の推奨する（ｒｅｃｏ  ｍＭｅｎｄｅｄ）緩衝液中で酵素を添加することによってＢｂｖＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。この消化は、３つのフラグメントの産物を生じた：３８塩基対のビオチン化フラグメント、２９塩基対の二ワード含有フラグメント、および３７塩基対のビオチン化フラグメント。この反応の完了後、過剰なビオチン化プライマーを５０μｌの５０％Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ（ストレプトアビジン−セファロース、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）を添加することによって除去し、そして室温で３０分間、この混合物をボルテックスした。このＵｌｔｒａｌｉｎｋ物質を、遠心分離によって反応混合物から分離し、その後、混合物の約半分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％ゲル）によって分離した。２９塩基対のバンドをゲルから切り出し、そしてこの２９塩基対のフラグメントを「クラッシュおよびソーク（ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ）」法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９））を使用して溶出した。次いで、この物質を、製造業者の推奨する（ｒｅｃｏ  ｍＭｅｎｄｅｄ）プロトコルを使用してｐＬＣＶ−Ｄ１またはｐＵＣＳＥ−Ｄ１（後者は、ＢｂｓＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した後に）のいずれかに連結した。
【０１７６】
ｐＮＣＶ３を、以下の合成オリゴヌクレオチド由来のフラグメント（配列番号２６）を最初に会合することによって構築した：
【０１７７】
【化１１】
0004669614.tif 000014
単離の後、このフラグメントを、従来のプロトコルを使用してＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＬＣＶ−Ｄ１にクローン化した。
【０１７８】
ｐＬＣＶ−２の二ワードを、ＰＣＲまたはプラスミド増幅のいずれかによって増幅し、この産物をＥｃｏＲＩおよびＢｂｖＩで消化し、その後、このＥｃｏＲＩ−ＢｂｖＩフラグメントを、挿入物１として単離した。二ワードライブラリーｐＵＣＳＥ−２を、ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、およびＰｓｔＩで消化し、その後、この大フラグメントを、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、ベクター１を得た。ベクター１および挿入物１を、従来の連結反応で結合して、三ワードライブラリーであるｐＵＣＳＥ−３を得た。ｐＵＣＳＥ−３は、ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、およびＰｓｔＩで消化し、その後、この大フラグメントを仔ウシアルカリホスファターゼで処理して、ベクター２を得た。次いで、ベクター２および挿入物１を、従来の連結反応で結合して、４ワードライブラリーであるｐＵＣＳＥ−４を得た。このｐＵＣＳＥ−４の４マーのワードをＰＣＲまたはプラスミド増幅のいずれかによって増幅し、この産物をＥｃｏＲＩおよびＢｂｖＩで消化し、その後、このＥｃｏＲＩ−ＢｂｖＩフラグメントを挿入物２として単離した。ｐＬＣＶ−２を、ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、およびＰｓｔＩで消化し、その後、この大フラグメントを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して、ベクター３を得た。次いで、ベクター３および挿入物２を、従来の連結反応で結合して、５ワードライブラリーであるｐＬＣＶ−５を得た。このｐＬＣＶ−５の５マーのワードは、ＰＣＲまたはプラスミド増幅のいずれかによって増幅し、この産物をＥｃｏＲＩおよびＢｂｖＩで消化し、その後このＥｃｏＲＩ−ＢｂｖＩフラグメントを、挿入物３として単離した。ｐＵＣＳＥ−４を、ＥｃｏＲＩ、ＢｂｓＩ、およびＰｓｔＩで消化し、その後、この大フラグメントを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して、ベクター４を得た。次いで、ベクター４および挿入物３を、従来の連結反応で結合して、８ワードライブラリーであるｐＵＣＳＥ−８を得た。このｐＵＣＳＥ−８の８マーのワードをＰＣＲまたはプラスミド増幅のいずれかによって増幅した。この産物をＢｓｅＲＩおよびＢｓＰ１２０Ｉで消化し、その後、このＢｓｅＲＩ−ＢｓＰ１２０Ｉフラグメントを挿入物４として単離した。ｐＮＣＶ３を、ＢｓｅＲＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、およびＳａｃＩで消化し、その後、この大フラグメントを単離し、そして仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して、ベクター５を得た。次いで、ベクター５を、挿入物４と従来の連結反応で結合して、８ワードライブラリーであるｐＮＣＶ３−８を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜図１Ｄは、参照ライブラリーの概念を例示する。
【図２Ａ】  図２Ａは、多型フラグメントの参照集団を作製するための好ましいスキームを例示する。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、多型フラグメントの参照集団を作製するための好ましいスキームを例示する。
【図２Ｃ】  図２Ｃは、多型フラグメントの参照集団を作製するための好ましいスキームを例示する。
【図２Ｄ】  図２Ｄは、多型フラグメントの参照集団を生成するための好ましいスキームを例示する。
【図３】  図３は、制限フラグメントの参照集団に対して競合的にハイブリダイズするための、ゲノムＤＮＡの２つのプールの各々から標識プローブを生成するための方法を模式的に例示する。
【図４】  図４は、同一のタグ−フラグメント結合体の集団を微粒子に付着させるための方法を模式的に例示する。
【図５Ａ】  図５Ａは、参照集団のフラグメントを微粒子に対して付着させるための好ましい方法を例示する。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、参照集団のフラグメントを微粒子に対して付着させるための好ましい方法を例示する。
【図６】  図６Ａおよび図６Ｂは、配列決定のためのフラグメントを、蛍光活性化セルソーター（「ＦＡＣＳ」）によって選別した後に単離するための好ましい方法を例示する。
【図７Ａ】  図７Ａは、実施例１の２つのｐＵＣ１９プラスミドの制限部位地図を示す。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、Ｔａｑ  Ｉ多型を含むＳａｕ  ３Ａ制限フラグメントから形成される推定（ｅｘｐｒｅｃｔｅｄ）サイズのフラグメントの単離を示す電気泳動図である。
【図８Ａ】  図８Ａは、一本鎖Ｔａｑ+フラグメントをＳａｕ  ３Ａ消化ｐＵＣ１９プラスミドから生成するための反応スキームを例示する。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、一本鎖Ｔａｑ-フラグメントをＳａｕ  ３Ａ消化ｐＵＣ１９プラスミドから生成するための反応スキームを例示する。
【図８Ｃ】  図８Ｃは、Ｔａｑ  Ｉに関して多型である二本鎖Ｓａｕ  ３Ａフラグメントを回収するための反応スキームを例示する。
【図９Ａ】  図９Ａは、一本鎖Ｔａｉ+フラグメントをＢｓｔ  ＹＩ消化ヒトＤＮＡから生成するための反応スキームを例示する。
【図９Ｂ】  図９Ｂは、一本鎖Ｔａｉ+フラグメントをＢｓｔ  ＹＩ消化ヒトＤＮＡから生成するための反応スキームを例示する。
【図１０Ａ】  図１０Ａは、一本鎖Ｔａｉ-フラグメントをＢｓｔ  ＹＩ消化ヒトＤＮＡから生成するための反応スキームを例示する。
【図１０Ｂ】  図１０Ｂは、一本鎖Ｔａｉ-フラグメントをＢｓｔ  ＹＩ消化ヒトＤＮＡから生成するための反応スキームを例示する。
【図１１】  図１１は、参照ＳＮＰライブラリーをＴａｉ+フラグメントおよびＴａｉ-フラグメントから生成するための反応スキームを例示する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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