(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド/HLA複合体に特異的な、単離されたCTLクローンであって、当該複合体が、SAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7からなる群より選択されるクローン。
【請求項２】
単離された抗原性ペプチドであって、当該ペプチドが、DPARYEFLW(配列番号:42）、GVYDGREHTV(配列番号:44)、SAFPTTINF(配列番号:47)、及びAELVHFLLL(配列番号:55)からなる群より選択されるペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項４】
単離されたペプチド/HLA複合体であって、当該複合体が、SAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7からなる群より選択されるペプチド/HLA複合体。
【請求項５】
請求項４に記載のペプチド/HLA複合体を発現する抗原提示細胞。
【請求項６】
薬学的担体、及びSAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3に特異的なCTLクローン、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53に特異的なCTLクローン、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2に特異的なCTLクローン、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2に特異的なCTLクローン、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28に特異的なCTLクローン、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40に特異的なCTLクローン、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7に特異的なCTLクローンからなる群より選択される少なくとも一の単離されたCTLクローンを含む薬学的組成物。
【請求項７】
薬学的担体、及びDPARYEFLW(配列番号:42)、GVYDGREHTV(配列番号:44)、SAFPTTINF(配列番号:47)、及びAELVHFLLL(配列番号:55)からなる群より選択される少なくとも一のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項８】
薬学的担体、及びSAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7からなる群より選択される少なくとも一のペプチド/HLA複合体を含む薬学的組成物。
【請求項９】
薬学的担体、及びSAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3を発現している抗原提示細胞、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53を発現している抗原提示細胞、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2を発現している抗原提示細胞、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2を発現している抗原提示細胞、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28を発現している抗原提示細胞、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40を発現している抗原提示細胞、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7を発現している抗原提示細胞からなる群より選択される少なくとも一の抗原提示細胞を含む薬学的組成物。
【請求項１０】
被験者由来の試料中において、その細胞表面にペプチド/HLA複合体を異常に発現している細胞の存在を検出する方法であって、当該ペプチド/HLA複合体が、SAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40、又はRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7のいずれか一つであり、当該方法は、当該試料を当該複合体に特異的なCTLクローンと接触させることを含む方法。
【請求項１１】
被験者の試料中において、ペプチド/HLA複合体に特異的なCTL細胞の存在を検出する方法であって、当該複合体は、SAYGEPRKL(配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW(配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV(配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)/HLA-B7からなる群より選択され、当該方法は、当該試料を、その細胞の表面上に当該ペプチド/HLA複合体を提示している細胞と接触させ、そしてCTL応答を当該CTL細胞の存在の指標として検出することを含む方法。
【請求項１２】
前記の細胞が、自己抗原提示細胞であり、そして前記のペプチド/HLA複合体の細胞表面上への提示が、当該細胞に、当該ペプチド/HLA複合体中のペプチドをロードすることにより達成される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記の細胞が、自己抗原提示細胞であり、そして前記のペプチド/HLA複合体の細胞表面への提示が、当該ペプチド/HLA複合体中のペプチドをコードしているヌクレオチド配列で、当該細胞を形質移入することにより達成される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)クローンの単離に関する。本発明のCTLクローンは、リンパ球を、異なる発現系、例えば、組換エルシニア、組換サルモネラや、組換ウイルス由来の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激及び試験して単離したものである。本発明は更に、MAGEファミリー蛋白質に特異的である、単離されたCTLクローンに関する。抗原性ペプチドもまた、単離されたCTLクローンにより認識されるペプチド/HLA複合体と同様に提供される。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳類の被験者での免疫応答における重要な側面は、細胞表面分子の複合体、即ち、ペプチドとHLA(ヒト白血球抗原)の複合体、又はMHC(主要組織適合複合体)分子の、Ｔ細胞による認識である。これらのペプチドは、より大型の分子であって、これもまたHLA/MHC分子を提示している細胞により処理されるものに由来する。この点に関しては、Male et al.、Advanced Imunology(J.P. Lipincott Company，1987)、特に第6-10章を参照のこと。Ｔ細胞とHLA/ペプチド複合体との間の相互作用は、制限されていて、HLA分子とペプチドの特定の組み合わせに特異的なＴ細胞を必要とする。もし特異的Ｔ細胞が存在しないと、たとえパートナー複合体が存在してもＴ細胞応答は一切生じない。同様に、特定の複合体は存在しないが、Ｔ細胞が存在する場合にも、応答は一切生じない。この機構には外来性物質に対する免疫システム応答、自己免疫病理学、及び細胞性異常への応答が関与する。
【０００３】
最も進行的に増殖している新生物細胞は、腫瘍拒絶抗原(TRA)ともよばれる、潜在的に免疫原性の腫瘍付随性抗原(TAA)を発現している。腫瘍拒絶抗原前駆体(又はTRAP)をコードしている数多くの遺伝子が同定されているが、これは腫瘍細胞においてTRAへと処理される。このようなTRAP-コード遺伝子には、MAGEファミリー、BAGEファミリー、DAGE/PRAMEファミリー、GAGEファミリー、RAGEファミリー、SMAGEファミリー、NAG、チロシナーゼ、Melan-A/MART-1、gp100、MUC-1、TAG-72、CA125、変異癌原遺伝子（例えばpraise）、変異癌抑制遺伝子（例えばp53）、腫瘍付随ウイルス抗原（例えばHPV16 E7）のメンバーが含まれる。例えば、Van den Eynde and van der Bruggen (1997）Current Opin. Immunol. 9:684-693、Sahin et al. (1997) in Curr. Opin. Immunol. 9:709-716、及びShawler et al. (1997) Advances in Pharmacology 40: 309-337、Academic Press、Inc.、San Diego、Californiaのレビューを参照されたし。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
TRAは、他の抗原性エピトープと同様に、腫瘍細胞の表面においてMHC分子により提示され、そして生体内及び試験管内でのCTL応答を誘導することが示されている。例えば、van der Bruggen et al.(1991) Science 254: 1643-1647を参照されたし。しかしながらこのようなTRA発現性腫瘍細胞は、悪性細胞の増殖を制御することが可能な、信頼性のある抗腫瘍性免疫応答を生体内で惹起することはない。Boon et al. (1992) Cancer Surveys 13: 23-37；T. Boon (1993) Int. J. Cancer 54: 177-180； T. Boon (1992) Advances Cancer Res. 58: 177-209。従って、特定のTRAを認識するCTLクローンは、腫瘍療法学の強力なツールを提供する。TRAの同定により、多様な病理的状態の治療のための組換ワクチンの設計が可能になる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、CTLクローンを単離するための新規の方法を提供する。その方法に従うことにより、抗原性ペプチドまたは蛋白質、好ましくはMAGEファミリーのものを特異的に認識する新規のCTLクローンが単離された。これらのペプチドを提示するMHC分子も同様に同定された。
【０００６】
発明の要約
本発明の一の態様は、CTLクローンを試料から単離する方法を提供する。
【０００７】
本発明の方法は、リンパ球を抗原提示細胞で逐次、刺激及び試験する工程を含む。この方法は、異なる抗原提示細胞を異なる工程で使用することにより、当該方法において生じる非特異的なCTL活性を顕著に減少させ、より効率的なCTLクローンの単離を許容する。
【０００８】
本発明の方法において使用される抗原提示細胞は、提示する当該抗原が由来する細胞のタイプ及び／又は発現システムにおいて異なっていてもよい。本方法において、抗原提示細胞として使用する細胞には、専門的及び条件的な（professional and facultative）抗原提示細胞が含まれる。好ましい抗原提示細胞は、自己樹状細胞、EBVで形質転換された自己Ｂ細胞や、活性化Ｔ細胞である。
【０００９】
抗原提示細胞は、種々の方法、好ましくは組換エルシニア、組換サルモネラ、組換ウイルスによる感染により修飾して、細胞表面において興味ある抗原の発現に影響を与えることができる。好ましい組換ウイルスには、ワクシニア、カナリア痘ウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスが含まれる。
【００１０】
CTLクローンの産生の対象とした蛋白質は、腫瘍付随蛋白質、病原体の抗原性蛋白質等とすることができる。好ましくは、当該蛋白質は、MAGEファミリーのメンバー、具体的には、MAGE-A1、MAGE-A3、及びMAGE-A4である。
【００１１】
本発明の別の態様においては、本発明の方法を使用して単離したCTLクローンが意図されている。
【００１２】
好ましい態様において本発明は、単離されたCTLクローンであって、以下のそれぞれのペプチド/HLA複合体に特異的なもの：SAYGEPRKL（配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW（配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV（配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF(配列番号:47)/HLA-Cw2、EIIYDGREHSA(配列番号:48）/HLA-A28、AELVHFLLL(配列番号:55)/HLA-B40、及びRVRFFFPSL(配列番号:57）/HLA-B7を提供する。
【００１３】
より好ましい態様において本発明は、単離されたCTLクローンである、LB1137 452/F3.2、LB1801 456/H7.11、LB1118 466/D3.31、LB1801 456/H8.33、LB1137 H4.13、LB1841 526/F7.1、及びLB1803 483/G8.4を提供する。
【００１４】
更に本発明は、本発明の方法により単離したCTLクローンを使用して、蛋白質の抗原性ペプチドエピトープを同定する方法を提供する。
【００１５】
更に別の態様において本発明は、新規の単離された抗原性ペプチド：DPARYEFLW（MAGE-A1 258-266)(配列番号:42)、GVYDGREHTV(MAGE-A4 230-239)(配列番号:44)、SAFPTTINF（配列番号:47)（MAGE-A1 62-70）、EVYDGREHSA(配列番号:48)（MAGE-A1 222-231)、AELVHFLLL(配列番号:55)（MAGE-A3 114-122)、RVRFFFPSL(配列番号:57)（MAGE-A1 289-297）を提供する。このようなペプチドをコードする配列もまた、意図する。
【００１６】
別の態様において本発明は、単離されたペプチド/HLA複合体：HLA-Cw3と複合体化したペプチドSAYGEPRKL(配列番号:2)、HLA-B53と複合体化したペプチドDPARYEFLW（配列番号:42)、HLA-A2と複合体化したペプチドGVYDGREHTV（配列番号:44)、HLA-Cw2と複合体化したペプチドSAFPTTINF(配列番号:47)、HLA-A28と複合体化したEVYDGREHSA（配列番号:48)、HLA-B40と複合体化したAELVHFLLL(配列番号:55)、及びHLA-B7と複合体化したRVRFFFPSL(配列番号:57）を提供する。
【００１７】
別の態様においては、これらのペプチド/HLA複合体のいずれかを発現している細胞を意図している。
【００１８】
本発明の更に別の態様は、薬学的組成物であって、単離されたCTLクローン、抗原性ペプチド、ペプチド/HLA複合体、及び本発明のペプチド/HLA複合体を発現しているもののうちのいずれか一つを含むものを提供する。
【００１９】
更なる態様においては、本発明は種々の病理的状態を診断・治療するのに有益な方法を提供する。
【００２０】
本発明の一の態様は、被験者においてペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴づけられる多様な病理的状態を診断する方法であって、当該被験者におけるそのような複合体を異常に発現している細胞の存在を検出することによるものを提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明の単離されたCTL細胞であってこのような複合体を特異的に認識するものを使用することにより、本発明のペプチド/HLA複合体を異常に発現している細胞の存在を検出する方法を提供する。
【００２２】
本発明の一の態様は、被験者において、ペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴づけられる病理的状態を、このような複合体に特異的なCTL細胞の増加を検出することにより診断する方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明のペプチド/HLA複合体に特異的なCTL細胞の存在を、このような複合体が細胞表面に発現している抗原提示細胞を使用して検出する方法を提供する。
【００２４】
更に別の態様において本発明は、被験者における病理的状態であって、本発明のペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴づけられるものを、当該被験者に対してそのような複合体に特異的なCTLクローンの治療的に有効な量を投与することにより治療する方法を提供する。
【００２５】
別の態様は、被験者における病理的状態であって、本発明のペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴づけられるものを、当該被験者に対して、当該ペプチドの治療的に有効な量を投与することにより治療する方法を提供する。
【００２６】
更に別の態様は、被験者から抗原提示細胞を得、当該細胞がその細胞表面にペプチド/HLA複合体を提示するように修飾し、そしてこのようなロードされた（loaded）細胞を当該被験者へ再灌流することにより、本発明のペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴づけられる病理的状態を治療する方法を提供する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の一の態様は、CTLクローンを単離する新規な方法を提供する。本発明の方法は、異なる抗原提示細胞を異なる工程において使用することにより、リンパ球を逐次的に刺激し、試験することを含む。
【００２８】
試験管内で特異的CTLクローンを作製する方法を記述している。簡潔にいうと、Ｔ細胞前駆物質を含む血液試料を、哺乳動物より取り出す。PBLをこの血液試料から精製し、そして適切なMHC分子と複合体化した抗原性ペプチドを発現した刺激細胞とインキュベーションする。刺激細胞は、腫瘍細胞(例えば米国特許第5，342，774、Knuth et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2804-2808，1989、及びVan Den Eynde et al. (Int. J. Cancer 44:634-640，1989)、又は規定されたペプチドでパルスした抗原提示細胞）とすることができる。付加的成分、例えば、同種間支持細胞（feeder cells）、及びサイトカインをインキュベーション混合物中に加えることができる。当該刺激細胞の表面に発現している抗原に特異的なCTLは、増殖し、そして刺激の結果として細胞集団中において豊富化する。CTLクローンは、引き続いて例えば、限界希釈により単離することができる。しかしながら、規定されたペプチドでパルスされた抗原提示細胞を刺激細胞として使用するこのアプローチは、時として関連腫瘍細胞を認識できないCTLを産生してしまう。
【００２９】
本発明者らは、CTLクローンの効率的な単離は、異なる抗原提示細胞を異なる工程において使用して、Ｔ細胞前駆体を刺激・試験する逐次的工程により達成できることを見いだした。CTLクローンを単離する本方法により、非特異的分子、例えば発現ベクターのバックボーン配列から発現している分子に向けて産生されるCTL活性を顕著に低減することが可能になる。
【００３０】
「異なる抗原提示細胞」とは、抗原提示細胞が、細胞タイプ又は発現システムにおいて、提示された興味ある抗原が由来するものとは異なっていてもよいことを意味する。
【００３１】
本願における「抗原提示細胞」は、少なくとも一のクラスＩ又はクラスII  MHCの決定基を発現していて、そして専門的な抗原提示細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞、及びＢ細胞）として知られるものが含まれる。他の専門的抗原提示細胞には、単球、周辺帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、嵌合樹状細胞（interdigitating dendritic cells）、濾胞性樹状細胞、及びＴ細胞が含まれる。条件的抗原提示細胞も、本発明においては使用することができる。条件的な抗原提示細胞の例には、活性化T細胞、星状細胞、濾胞性細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞が含まれる。本願における「抗原提示細胞」には、専門的及び条件的タイプの抗原提示細胞の両方が包含される。
【００３２】
抗原提示細胞は、ほ乳動物、例えばヒトから得た組織又は血液試料(末梢血単核細胞を含む)より単離することができる。このような試料から確立された株化細胞もまた、使用することができる。株化細胞を確立する手順は、当該技術分野で周知である。ある種の株化細胞は、Americal Type Culture Collection、12301 Parklawn Drive、 Rockville、 Maryland、 20852 -1776より直接的に入手することができる。正常細胞及び悪性細胞の両方ともに、使用することができる。
【００３３】
好ましくは、抗原提示細胞が発現しているMHC決定基は、Ｔ細胞前駆物質を含む試料を採取した哺乳動物により発現されているものと適合性を有する。より好ましくは、自己抗原提示細胞又はこれより確立された株化細胞が使用される。非-自己細胞は、その細胞が自然に、又は形質移入若しくは他の適切な手段のいずれかにより発現しているMHC決定基が、適合するかぎりにおいて使用することができる。当業者は更に、分子抗原提示細胞が発現しているMHC分子が、関与しているほ乳動物の被験者のものと適合するかどうかを決定する方法、例えば周知のHLA-分類方法を習熟している。一般的な事項については、Coligan et al. (1994) Current Protocol in Immunology, John Wiley & Sons Inc: New York、 New Yorkを参照されたし。
【００３４】
好ましい抗原提示細胞は、自己樹状細胞、EBVで形質転換された自己B細胞、及びPHAで活性化された自己Ｔ細胞である。
【００３５】
本発明によれば更に、本方法で使用される抗原提示細胞は、興味ある抗原が由来した発現システムにおいても異なるものとすることができる。より具体的には抗原提示細胞は、多様な方法により修飾して、細胞表面での抗原の発現に影響することができる。例えば抗原提示細胞は、組換エルシニア、組換サルモネラ、又は組換ウイルスに感染させることができる。それぞれの場合、組換微生物は、ペプチド抗原が由来する蛋白質をコードしている。
【００３６】
これらの発現システムのいずれかより発現された蛋白質は、抗原提示細胞内で、小型のペプチドに処理されるが、これらは次に適切なMHC分子と複合体化し、そして細胞表面に提示される。本発明においては、MHC分子と複合体化し、細胞表面に提示されたペプチドは、「抗原」と呼ぶ。
【００３７】
本願で使用する「エルシニア」という用語には、エルシニアのすべての種（エルシニア・エンテロコリティカ、エルシニア・シュードツベルキュローシス、及びエルシニア・ペプティスを含む）が含まれる。本願で使用する「組換エルシニア」は、発現ベクターで遺伝的に形質転換したエルシニアを意味する。本願で使用する「デリバリー」とは、エルシニアから抗原提示細胞への蛋白質輸送を意味し、エルシニア内で蛋白質を発現する工程、発現した蛋白質を当該エルシニアから分泌する工程、そして当該エルシニアから分泌した蛋白質を抗原提示細胞のサイトゾルへ転位させる工程を含む。
【００３８】
本発明によれば、興味ある蛋白質を発現し、そしてデリバリーするのに使用する好ましいエルシニアは、機能性のエフェクター蛋白質の産生において欠陥の有る変異体エルシニアである。
【００３９】
興味有る蛋白質の発現及びデリバリーのための使用に好ましい変異体エルシニア株は、エフェクターをコードする全ての遺伝子が、得られるエルシニアがもはやいかなるエフェクター蛋白質をも産生しないようにして変異した、エルシニアの五重変異体株である。このような五重変異体エルシニア株は、Y.エンテロコリチカの場合にはyopEHOMP、Y.シュードツベルキュローシスの場合にはyopEHAMJと命名した。このようなyopEHOMP株の一の例が、Y.エンテロコリティカMRS40(pABL403)である。
【００４０】
興味有る抗原性蛋白質は、当該蛋白質の抗原提示細胞へのデリバリー用の変異体エルシニアと組み合わせて使用されるエルシニア発現ベクター、Ffr中へクローニングすることができる。本発明によれば、このようなベクターは、(5’から3’方向における)プロモーター、デリバリーシグナルをコードする第一の核酸配列、これに融合し、デリバリーされる蛋白質をコードした第二の核酸配列、及び他の適切な配列(例えば、ポリアデニル化シグナル)により特徴づけられる。
【００４１】
発現ベクターのプロモータは好ましくは、エルシニアヴィルロン（virulon）遺伝子である。「エルシニアヴィルロン遺伝子」とは、エルシニアpYVプラスミド上の遺伝子であって、その発現が温度、及び標的細胞との接触の両方により制御されているものを意味する。Cornelis et al.(1997)のレビューを参照されたし。このような遺伝子には、分泌機構の因子をコードしている遺伝子(Ysc遺伝子)、輸送体をコードしている遺伝子(YopB、YopD、及びLcrＶ）、調節領域をコードしている遺伝子(YopN及びLcrG)、及びエフェクターをコードしている遺伝子(YopE、YopH、yopO/YpkA、YopM、及びYopP/YopJ）が含まれる。好ましくは、当該プロモータは、YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM、及びYopP/YopJのいずれかの一から選択されるエフェクターをコードする遺伝子由来である。より好ましくは、当該プロモータはYopE由来である。
【００４２】
更に本発明によれば、デリバリーシグナルをコードする第一のＤＮＡ配列は、操作可能なようにしてプロモータへ連結されている。上記に記載の「デリバリーシグナル」とは、エルシニアの分泌及び転位システムにより認識されうるポリペプチドであって、従って蛋白質の抗原提示細胞への転位を差し向けるものを意味する。このようなポリペプチドは、エフェクター蛋白質（YopE、YopH、YopO/YpkA、YopN、及びYopP/YopJ）に由来し、そして好ましくはYopEである。より好ましくはこのエフェクター蛋白質は、エルシニア・エンテロコリチカのYopEである。
【００４３】
当業者は、蛋白質をデリバリーすることができるエフェクター蛋白質のポリペプチド配列を同定することに習熟している。例えばそのような一の方法は、Sory et al.(1994)により記載されている。このようなデリバリーシグナルポリペプチドの例には、Y.エンテロコリチカ由来のもの:YopE130（YopEのN-末端の130アミノ酸)、YopE50、YopM100及びYopH71が含まれる。
【００４４】
エルシニア発現ベクターは、電気穿孔法、リン酸カルシウム仲介形質転換、接合、又はこれらの組み合わせが含まれるがこれらには限定されない多くの既知の方法により、エルシニアへ形質転換することができる。例えばベクターは、第一の細菌株へ、標準的な電気穿孔法により形質転換することができる。次にそのようなベクターは、当該第一の細菌株から、接合によりエルシニアへ形質転換することができ、このプロセスは「動員（mobilization）」とも呼ばれている。エルシニア形質転換体(即ち当該ベクターを取得したエルシニア)は、例えば抗生物質で選択することができる。これらの技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Sory et al .(1994)を参照されたし。
【００４５】
組換エルシニアから抗原提示細胞のサイトソルへの蛋白質のデリバリーは、抗原提示細胞を適切な条件下で組換エルシニアと接触させることにより実行することができる。ヴィルロン遺伝子の発現と転位を誘導する条件に関して、複数の参考文献及び技術が当業者らに入手可能であるが、これらには、所望の温度、Ca++濃度、エルシニア及び標的細胞を混合する様式等が含まれる。例えば、 Cornelis、“Cross talk between Yersinla and eukariotic cells” Society for General Microbiology Symposium、 55； Mocrae、 Saundets、Smyth、 Stow (eds) 、Molecular aspects of host-pathogen interactions、 Cambridge University Press、 1997を参照されたし。条件は、標的細胞のタイプに依存して変動するかもしれない。例えば:ヒトの上皮癌であるHela細胞用の条件はSory et al. (1994) ；マウス胸腺腫又はメラノーマ細胞を標的にする条件は、Starnbach et al. (1994 ) J. Immunol. 153:1603；そしてマウスのマクロファージを標的にする条件は、Boland et al.(1996)。このような変異は、当業者らが通常のテクニックを使用して処理することができる。
【００４６】
当業者らはまた、数多くのアッセイを使用して、融合蛋白質のデリバリーが成功したか否かを決定することができる。例えば、当該融合蛋白質は、 同位元素又は免疫フルオレセインで標識することができ、また、免疫フルオレセインで共役した抗体で検出することができるが、これはRosqvist et a1. (1994)EMBO J. 13: 964に公開されている。決定はまた、デリバリーされる蛋白質の酵素的活性基づくこともできるが、例えば、Sory et al. (1994)が記述したアッセイがある。決定は、デリバリーされる蛋白質の抗原性に基づくこともできる。例えばMAGE-A1蛋白質のEBＶ形質転換済ヒトＢ細胞へのデリバリーは、MAGE-A1エピトープに特異的なCTL細胞による、そのような標的Ｂ細胞の認識により検出することができる。このようなCTL認識は結果として、活性化したCTLからのIFN-γ分泌、又は溶解した標的細胞からのCr51の放出をアッセイすることを含む、数多くのアッセイにより検出することができる。例えばデリバリーされる蛋白質に特異的な抗体を使用したウエスタンブロット分析、ＰＣＲ in  situハイブリダイゼーションや、ＥＬＩＳＰＯＴ（Mabtech AB, Sweden）等の方法もまた、このような決定に使用することができる。例えばW. Herret al. (1997) J. Immunol. Methods 203: 141-152、 及びW.Herr et al. (1996) J. Immunol. Methods  191: 131-142を参照されたし。
【００４７】
本発明によれば、興味有る抗原性蛋白質は、組換サルモネラより発現できる。例えば、サルモネラ・チフィムリウムの非病原性株を、抗原デリバリーベクターとして使用できる。ウイルス性エピトープ等の抗原性エピトープは、S.チフィムリウムのIII型蛋白質分泌システムを使用して、宿主細胞のサイトゾルへうまくデリバリーできることは当該技術分野において既知である。例えばRussmann et al. (1998) 281: 565-568を参照されたし。
【００４８】
本発明によれば、興味有る蛋白質の抗原提示細胞内での発現はまた、抗原提示細胞を組換ウイルスで感染させて実行することが可能である。具体的には本発明は、ワクシニア、カナリア痘ウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、及び他の何れかの適切なウイルス、についての組換えウイルスを意図している
【００４９】
本発明での使用に好ましいワクシニア株は、WR株(Panicali et al.(1981)、 J. Virol. 37: 1000-1010)である。興味有る蛋白質をコードする核酸配列は、操作可能なようにしてプロモーター、例えばワクシニアプロモーターH6、に連結し、そしてワクシニアベクター内へ挿入し、これによりドナープラスミドを作製することができる。アデノプラスミドを作製するために使用できるワクシニアベクターが、当業者らに入手可能であり、例えば、米国特許第4，769，330号に記載されている。ワクシニアの組換WR株は、生体内組換えを介してドナープラスミドを使用し、次に周知の手順を行って作製できる。例えば、Perkins et al.、J. Virol. 63: 3829-3936(1989）を参照されたし。
【００５０】
本発明において使用する、カナリア痘ウイルスの好ましい株はALVACである（Cox et al. (1993) 、Virology 195: 845-850）。興味ある蛋白質をコードする核酸配列は、プロモーター、例えばワクシニアプロモーターH6に操作可能にして連結し、そしてALVACベクターに挿入してドナープラスミドを作製できる。多重ALVACベクターが、当業者らに入手可能であり、例えば米国特許第5，756，106号；Cox et a1. (1993) Virology195: 845-850；Tartaglia et al . (1993) J. Virology 67: 2370-2375；及びTaylor et al. (1992) Virology 187: 321-328に記載されている。このようなドナープラスミドを使用して、生体内組換を介して、組換ALVACウイルスを作製できる。例えばCox. et al. (1993)； Tartaglia et al. (1993) 、及びTaylor et al. (1992)を参照されたし。
【００５１】
当業者らはまた、例えば以下の実施例５のようにして、興味有る蛋白質を発現する組換アデノウイルス産生できる。
【００５２】
興味有る抗原性蛋白質コードする核酸配列は、上述のようにして多様な発現ベクター中へクローニングできる。本方法においてCTLクローンを単離するのに使用できる蛋白質には特に制限はない。
【００５３】
本願において使用する「蛋白質」という用語は、天然の蛋白質及び人工的に操作した蛋白質、又はその一部を意味する。「蛋白質の一部」という用語には、抗原性であるのに十分な長さの、蛋白質のペプチド断片が含まれる。好ましくはそのような断片は、少なくとも8又は9アミノ酸からなる。本願で使用する「人工的に操作した蛋白質」とは、非天然の蛋白質、例えば非天然の蛋白質の修飾した形態、又は一以上の天然蛋白質又はその一部の融合物であって、ポリトープともよばれるもの(二以上のエピトープがインフレームで融合したものであって、Thompson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5845-5849に例示されているもの）が含まれる。
【００５４】
本発明は特に、腫瘍付随蛋白質、又は病原体関連抗原を意図している。
【００５５】
「腫瘍付随蛋白質」とは、腫瘍で特異的に発現しているか、又は正常な組織に対して、腫瘍において異常なレベルで発現している蛋白質を意味する。このような腫瘍付随蛋白質には、MAGEファミリー、BAGEファミリー(例えばBAGE-1)、DAGE/PRAMEファミリー(DAGE-1など)、GAGEファミリー、RAGEファミリー(例えばRAGE-1)、SMAGEファミリー、NAG、チロシナーゼ、Melan-A/MART-1、gp100、MUC-1、TAG-72、CA125、変異プロトオンコジーン（例えばp21ras）、変異癌抑制遺伝子（例えばp53）、腫瘍付随ウイルス性抗原（例えばHPV16 E7)、SSXファミリー、HOM-MEL-SS、NY-COL-2、HOM-HD-397、HOM-RCC-1.14、HOM-HD-21、HOM-NSCLC-11、HOM-MEL-2.4、HOM-TES-11、RCC-3.1.3、NY-ESO-1、及びSCPファミリーのメンバーが含まれるがこれらには限定されない。MAGEファミリーのメンバーには、MAGE-Al、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A11が含まれるがこれらには限定されない。GAGEファミリーのメンバーには、GAGE-1、GAGE-6が含まれるがこれらには限定されない。例えばVan den Eynde and van der Bruggen (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 684-693、 Sahin et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 709-716、及びShawler et al. (1997)のレビューを参照されたし。これらの蛋白質は、ある種の腫瘍、例えばメラノーマ、肺癌、前立腺癌、乳がん、腎臓癌等に付随することが示されている。
【００５６】
病原体に由来する、数多くの既知の抗原性蛋白質もまた、本発明において意図されている。病原体にはウイルス、細菌、寄生虫、菌類が含まれる。病原体に特徴的な抗原性蛋白質の特定の例には、インフルエンザウイルスの核蛋白質(残基218-226、F. et al. (1997) J. Virol. 71: 2715-2721に定義されている）、センダイウイルス由来の抗原、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(An et al. ( 1997) J. Virol. 71: 2292-2302を参照)、C型肝炎ウイルスのB1蛋白質(Bruna-Romero et al. (1997）Hepatology 25: 470-477)、HIVのウイルスエンベロープ糖蛋白質gp160 (Achour et al. (1996) J. Virol. 70: 6741-6750)、プラスモジウム・ヘルギのアミノ酸252-260又はサーカムスポロザイト（circumsporozite）蛋白質（Allsopp et al. (1996) Eur. J.Immunol. 26: 1951-1958) 、Ａ型インフルエンザウイルスの核蛋白質(残基366-374、Nomura et a1. (1996) J. Immunol. Methods 193: 4149)、リステリア菌のリステリオリシンO蛋白質(残基91-99、An et al. (1996) Infect. Immun. 64: 1685-1693)、E6蛋白質(残基131-140、Gao et al. (1995) J. Immunol. 155: 5519-5526) 、及びヒトパピローマウイルス16型のE7蛋白質(残基21-28及び48-55、Bauer et al. (1995) Scan. J. Immunol. 42: 317-323) 、ＲＳウイルスのM2蛋白質(残基82-90及び81-95、Hsu et al. (1995) Immunology 85: 347-350)、単純疱疹ウイルス１型リボヌクレオチド還元酵素(Salvucci et al.、(1995)J. Gen. Virol. 69: 1122-1131を参照) 、及びロタウイルスVP7蛋白質(Franco et al. (1993) J. Gen. Virol. 74: 2579-2586を参照)、P.ファルシパルム抗原(マラリアの原因)、及びＢ型肝炎表面抗原(Gilbert et al. (1997) Nature Biotech. 15: 1280-1283)が含まれる。
【００５７】
数多くの短い抗原性ペプチドもまた、本発明において使用できる。当業者ならば、免疫原性ペプチドの産生に必要な断片の長さを容易に決定できる。あるいは、熟練した技術者は、特異的T細胞応答(CD4+又はCD8+Ｔ細胞のいずれか)誘発することが既知のペプチド、例えば米国特許第5，462,871号、 米国特許第5,558，995号、米国特許第5,554、724号、米国特許第5,585,461号、米国特許第5,591,430号、米国特許第5,554,506号、米国特許第5,487,974号、米国特許第5,530,096号、米国特許第5,519、117号に開示されている腫瘍付随抗原性ペプチド(TAA、腫瘍拒絶抗原を意味するTRAとしても知られる)のコード配列を使用することができる。TRAの例を表1に示す。Van den Eynde and van der Bruggen (1997)、及びShawler et al. (1997)のレビューも参照されたし。病原体起源の抗原性ペプチドも使用することができる。例えばGilbert et al. (1997)により開示されているものがある。
【００５８】
【表１】
0004722289.tif 000002
【００５９】
上述のごとく、完全長天然蛋白質のコード配列、天然蛋白質の一部、天然蛋白質の一部の組み合わせ、又は異なる天然蛋白質、若しくは異なる蛋白質の部分の組み合わせを使用して、上述の発現ベクター中にクローン化することができる。
【００６０】
本発明は更に、本発明で使用できる組換え発現ベクターを提供するが、これには組換エルシニア発現ベクター、例えば、pMS111-YoPE130-MAGE-A1、及びPMS111-YopE130-MAGE-A4；組換ワクシニアベクター、例えば、WR-MAGE-A1、及びWR-MAGE-A4；組換カナリア痘ウイルスベクター、例えば、ALVAC-MAGE-A1；組換えアデノウイルスベクター、例えば、adeno-MAGE-A4；及びレトロウイルスベクター、例えば、M1-CSMが含まれる。
【００６１】
本発明の方法を実施するには、Ｔ細胞前駆物質を含む試料は、被験者から入手するが、典型的にはヒトの被験者の血液試料である。被験者は、癌患者又は癌でない個人とすることができる。試料は、刺激前にＴ細胞前駆物質を濃縮する処置をしてもよい。
【００６２】
試料を、蛋白質を発現している第一の抗原提示細胞に、他の何れかの適切な材料、例えばリンホカインとともに接触する。接触すると、特異的Ｔ細胞前駆物質は活性化して、増殖し始める。
【００６３】
試料中の細胞は引き続き、当該細胞を、蛋白質の提示されている第二の抗原提示細胞と接触して試験する。試料はまず希釈して、そして個々の細胞が別個に試験できるように、ミクロプレートへ分配することができる。当該蛋白質に特異的なCTL細胞、又は「応答性CTL」は、種々の標準アッセイ、例えば51Cr放出アッセイ、IFN-γ分泌アッセイや、TNF産生アッセイにより同定して選択できる。
【００６４】
本発明の好ましい態様においては、このように選択されたCTL細胞は、少なくとも一の付加的サイクルの刺激及び試験工程にかけられる。
【００６５】
本発明によれば、一の工程で使用される抗原提示細胞は、細胞のタイプ又は蛋白質を発現する発現システムのいずれかにおいて、引き続く工程で使用される細胞と異っていてもよい。
【００６６】
刺激後のCTL応答の特異性の試験には、クラスI  HLA分子を高い量で発現しているタイプの抗原提示細胞が好ましく、例えばEBV-形質転換済Ｂ細胞がある。
【００６７】
本発明の好ましい態様においては、一の工程(刺激又は試験のいずれか)における抗原提示細胞により使用される一の発現システムは、別の工程で使用される他の発現システムの少なくとも一つと異なる。
【００６８】
より好ましくは、刺激工程で使用される抗原提示細胞は、すぐ後の試験工程で使用されるものとは異なる発現システムを使用する。
【００６９】
本発明は、特異的CTLクローンの単離に使用できる、異なる抗原提示細胞の組合せの例を提供する。本発明によれば、個人より入手したCD8+Ｔリンパ球は、ミクロウェル中で、興味有る蛋白質をコードした組換えALVACカナリア痘ウイルスに感染した樹状細胞由来の自己単球で刺激できる。数回の刺激後、それぞれのミクロ培養物の一定分量を、興味有る蛋白質をコードした組換ワクシニアに感染した自己EBV-Ｂ細胞の特異的溶解について試験することができる。陽性のミクロ培養物を次に希釈し、そして興味有る蛋白質をコードした組換エルシニアに感染した自己EBV-Ｂ細胞で刺激することができる。特異的クローンは、当該興味有る蛋白質をコードした組換ワクシニアに感染した自己EBV-Ｂ細胞の特異的溶解で試験して、検出及び単離することができる。従って、上の手順において使用した抗原提示細胞の組み合わせは、樹状-ALVAC/EBV-B-ワクシニア/EBV-B-エルシニア/EBV-B-ワクシニアとして特徴づけられる。本方法において使用できる抗原提示細胞の好ましい組合せにはさらに以下のものが含まれる:樹状-アデノ/EBV-B-ワクシニア/EBV-B-エルシニア/EBV-B-ワクシニア、樹状-ALVAC/EBV-B-ワクシニア/T細胞-レトロウイルス/EBV-B-ワクシニア。本発明は、上記の例示の組合せによっては制限されない。
【００７０】
本発明の更なる態様においては、本発明は本発明の方法を使用して単離されたCTLクローンを意図している。
【００７１】
本発明の別の態様において本発明は、蛋白質の抗原性ペプチドエピトープを同定する方法を意図している。この方法によれば、蛋白質のある種の抗原性エピトープを認識するCTLクローンが、本発明のCTLクローン単離方法を上述のごとく使用して単離される。このようなクローンは次に、種々の有名な方法、例えば、実施例7-11に記載される方法を使用して、特異的抗原性ペプチド、並びに提示性のHLA分子の同定に使用できる。
【００７２】
本発明の方法によれば、蛋白質の抗原性ペプチドエピトープの同定は、ペプチド/HLA複合体が、抗原提示細胞の表面において、特異的CTLを活性化する能力に基づいている。このように同定された抗原性ペプチドエピトープは、生体内で処理されて細胞表面に適切に発現するエピトープをおそらくは表す。本発明のこのような方法を使用して、MAGEファミリー由来の蛋白質の抗原性ペプチドエピトープた；即ち、MAGE-A1ペプチド230-238(HLA-Cw3で提示され、そしてクローンLB1137 462/F3.2で認識される）、MAGE-A1ペプチド258-266(HLA-B53で提示され、クローンLB1801 456/H7.11で認識される)、MAGE-A1ペプチド62-70(HLA-Cw2で提示され、そしてクローンLB1118 466/D3.31で認識される)、MAGE-A1ペプチド222-231(HLA-A28で提示され、そしてクローンLB1801 456/H8.33で認識される）、MAGE-A1ペプチド289-297(HLA-B7で提示され、そしてクローンLB1803 483/G8.4で認識される)、MAGE-A3ペプチド114-122(HLA-B40で提示され、そしてクローンLB1841 526/F7.1で認識される)、及びMAGE-A4ペプチド230-239(HLA-A2で提示され、そしてクローンLB1137 H4.13で認識される)が同定された。表2参照。これらの中では、MAGE-A1ペプチド238（SAYGEPRKL(配列番号:2))が以前に同定されていたものであるが、これは異なるHLA分子である、HLA-Cwl6(米国特許第5，558，995号)で提示されていた。
【００７３】
【表２】
0004722289.tif 000003
【００７４】
従って本発明の別の態様は、ペプチド/HLA複合体であるSAYGEPRKL（配列番号:2)/HLA-Cw3、DPARYEFLW（配列番号:42)/HLA-B53、GVYDGREHTV（配列番号:44)/HLA-A2、SAFPTTINF（配列番号:47)/HLA-Cw2、EVYDGREHSA(配列番号:48)/HLA-A28、AELVHFLLL（配列番号:55)/HLA-B40、及びRVRFFFPSL（配列番号:57)/HLA-B7のそれぞれに特異的な単離されたCTLクローンを提供する。
【００７５】
好ましい態様において本発明は、単離されたCTLクローン：LB1137 462/F3.2、LB1801 456/H7.11、LB1118 466/D3.31、LB1801 456/H8.33、LB1137 H4.13、LB1841 526/F7.1、及びLB1803 483/G8.4を提供する。
【００７６】
別の態様において本発明は、新規の単離された抗原性ペプチド、即ち、DPARYEFLW（配列番号:42)（MAGE-A1 258-266)、GVYDGREHTV（配列番号:44)（MAGE-A4 230-239)、SAFPTTINF（配列番号:47)（MAGE-A1 62-70)、EVYDGREHSA(配列番号:48)(MAGE-A1 222-231)、AELVHFLLL(配列番号:55)(MAGE-A3 114-122)、及びRVRFFFPSL(配列番号:57)（MAGE-A1 289-297）に関する。これらのペプチドをコードする核酸配列も意図している。
【００７７】
本発明の別の態様は、本発明のペプチド/HLA複合体を単離することに関する。特に本発明は、単離された、ペプチドSAYGEPRKL（配列番号:2)及びHLA-Cw3の複合体、ペプチドDPARYEFLW（配列番号:42)及びHLA-B53の複合体、ペプチドGVYDGREHTV（配列番号:44)及びHLA-A2の複合体、ペプチドSAFPTTINF(配列番号:47）及びHLA-Cw2の複合体、ペプチドEVYDGREHSA（配列番号:48）及びHLA-A20の複合体、AELVHFLLL(配列番号:55)及びHLA-B40の複合体、並びにRVRFFFPSL(配列番号:57）及びHLA-B7の複合体を提供する。
【００７８】
抗原性ペプチドエピトープに対する提示性HLA分子がいったん確認されれば、当該ペプチドと当該HLA分子との複合体が、種々の方法により調製できる。例えばHLA分子は、いずれかの適切な組換え発現システム、例えば大腸菌ベースの発現系により産生及び単離できる。ペプチドは、例えば化学合成又は組換発現により作製できる。当該ペプチド及び当該HLA分子は次に、HLA/ペプチド複合体の形成に好適な条件下で試験管内で混合することができる。このような条件は当該技術分野で周知である。例えば、Garboczi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3429-3433，1992）及びAltman et al. (Science 274: 94-96，1996)を参照。
【００７９】
本発明は更に、本発明のペプチド/HLA複合体のいずれかを細胞表面に発現している細胞を意図している。このような細胞は、いずれかの適切な抗原提示細胞（株化細胞(例えば、COS細胞、CHO細胞等)を含む）を使用して、そして例えば、ペプチドローディング（peptide loading）、又は本願の実施例に記載されている同時形質移入により作製できる。
【００８０】
本発明の別の態様は、単離されたCTLクローン、単離された抗原性ペプチド、単離されたペプチド/HLA複合体、本発明のペプチド/HLA複合体発現している抗原提示細胞、又はこれらの組み合わせのいずれか一つを含む薬学的組成物を意図している。
【００８１】
本発明の薬学的組成物には他の物質、例えばサイトカイン、アジュバント、及び薬学的に許容される担体を含めることができる。本願における治療的に許容される担体には、水、分散媒体、培地（culture from cell media）、等張剤等を含む、いずれかの、そしてすべての溶媒であって宿主に無毒のものが含まれる。好ましくはこれは水性の等張性緩衝済溶液であってpHが7.0付近のものである。このような媒体及び剤の治療的組成物中での使用は、当該技術分野で周知である。補充活性成分もまた、組成物中に導入できる。
【００８２】
本発明の更なる態様においては、単離されたCTLクローン、単離された抗原性ペプチド、本発明のペプチド/HLA複合体を発現している細胞は、被験者、好ましくはヒトの被験者、における病理的状態を診断する種々の方法において使用される。
【００８３】
本発明が意図する病理的状態には、腫瘍、及び病原体、例えば細菌、寄生虫、真菌や、ウイルス等による感染が含まれる。
【００８４】
本願で使用される「異常な発現」という表現は、正常な細胞では存在しない発現、又は正常な細胞では有意に低いレベルで存在する発現を意味する。本発明においては、「異常な発現」はさらに、正常な細胞の表面には提示されない抗原性エピトープを生じる、蛋白質の異常な処理を意味するのに使用することができる。
【００８５】
一の態様において本発明は、被験者においてペプチド/HLA複合体異常な発現により特徴づけられる病的状態を、当該複合体異常に発現している細胞の存在を検出することにより診断する方法を提供する。
【００８６】
別の態様において本発明は、被験者において本発明のペプチド/HLA複合体異常に発現している細胞の存在を、当該複合体に特異的な単離されたCTLクローンを使用して検出する方法を提供する。
【００８７】
本発明によれば、異常であると疑われる細胞を含む試料を、被験者、例えば組織バイオプシーより得る。この試料を次に本発明のCTLクローンと接触させる。異常な細胞の存在は、標準アッセイ、例えば51Ｃｒ放出、IFN-γ分泌、又はTNF産生を使用して、CTLクローンの活性(即ち、CTL応答)を測定することにより決定できる。
【００８８】
別の態様において本発明は、被験者において、本発明の単離されたペプチド/HLA複合体に特異的なCTL細胞を検出する方法を提供する。より具体的には、被験者より血液試料を確保し、そして特異的ペプチド/HLA複合体を発現している細胞と接触させる。当該複合体に特異的なCTL細胞の存在は、上述のいずれかの方法、例えば特異的ペプチド/HLA複合体を発現している細胞の溶解であって、標準的な51Ｃｒ放出アッセイで測定可能なものにより検出できる。
【００８９】
更にペプチド/HLA複合体に特異的なCTLの頻度は、限界希釈分析、又は四量体アッセイにより評価できる。正常な個人と比較すると、個人の中のペプチド/HLA複合体に特異的なCTLの頻度の増加は、当該複合体の異常な発現により特徴づけられる病的状態の指標となる。従って本発明は、ペプチド/HLA複合体に特異的なCTLの増大した頻度を検出することにより、当該ペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴づけられる病的状態を診断する方法を意図している。
【００９０】
本発明の更なる態様においては、単離されたCTLクローン、単離された抗原性ペプチド、本発明のペプチド/ＨＬＡ複合体を発現している細胞は、被験者、好ましくはヒトの被験者における病的状態を治療する種々の方法において使用される。
【００９１】
「治療する」という表現は、病的状態を軽減又は阻害すること、例えば、免疫応答を惹起することなどにより、腫瘍の増殖又は転移を阻害すること、腫瘍の大きさを低減すること、又は病原体の感染の症状を軽減させることを意味する。
【００９２】
一の態様においては、本発明の単離されたCTLクローンは、治療養生法又は養子免疫伝達において、当該CTLクローンにより特異的に認識されるペプチド/HLA複合体の異常な発現により特徴付けられる病的状態に苦しむ被験者に対して、投与することができる。養子免疫伝達については、Greenberg (1986) J. Immunol. 136(5): 1917; Riddeel et al. (1992) Science 257: 238；Lynch et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1403;及びKast et al. (1989) Cell 59: 603の教示事項を参照されたし。CTLは、当該抗原を異常発現している細胞を溶解することにより、問題となっている病的状態、例えば腫瘍、及び寄生虫やウイルスによる感染を緩和又は治療することができる。
【００９３】
別の態様において本発明は、当該単離されたペプチド、又はペプチド/HLA複合体を、被験者へ投与することにより、ペプチド/HLA複合体の異常発現により特徴づけられる病的状態に苦しむ被験者を治療する方法を提供する。病的状態は、例えば投与されたペプチド又はペプチド/HLA複合体に起因して惹起された特定の免疫応答により緩和することができる。
【００９４】
本発明の別の態様においては、ペプチド/HLA複合体の異常発現により特徴付けられる病的状態に苦しむ被験者は、当該被験者より抗原提示細胞を得て、当該細胞を、ペプチド/HLA複合体の細胞表面での提示に影響するように修飾し、次いで当該「ロードされた」細胞を当該被験者へ再灌流することにより治療できる。当該修飾は、当該単離された抗原提示細胞を、いずれかの適切な発現ベクターであってペプチド又は完全長の蛋白質をコードしているもので形質移入するか、又は当該細胞に問題となっているペプチドを、例えばNestler et al. (Nature Medicine 4: 328-332, 1998)に記載されているローディング方法に従ってロードすることにより達成できる。
【００９５】
治療目的の場合、単離されたCTLクローン、ペプチド又はペプチド/HLA複合体を、被験者に対して単独で、又は他の適切な物質、例えばサイトカイン、アジュバントや薬学的担体と組み合わせて投与することができる。CTL細胞、ペプチド、ペプチド/HLA複合体、又は当該複合体を発現している細胞の量は、被験者の状態に応じて決定できる。
【００９６】
単離されたCTL及びペプチド/HLA複合体の、診断的及び治療的使用については、Thonpson et al. (1995) PNAS 92: 5845; Altman et al. (1996) Science 274: 94-96; Dunbar et al. (1998) Current Biology 8: 413-416; Greenberg et al. (1986) J. Immunol. 136: 1917;及びKast et al. (1989) Cell 59: 603-614を参照されたし。
【００９７】
本発明は更に、以下の実施例により例示される。
【００９８】
本願中において言及した全ての出版物は、参照により本願に取り込む。本願において採用した用語及び表現は、記載のために使用されるものであり、限定のためではなく、そしてそのような用語及び表現の使用は、種々の修飾が本発明の範囲内において可能であると認識しつつ、本願の部分に示されて、且つ記載されている特徴の何れの等価物を除外すること意図するものではない。
【００９９】
【実施例】
実施例１
組み換えエルジニア属の産生および組み換えエルジニア属を用いたＥＢＶ-形質転換Ｂ細胞のターゲッティング
株、プラスミドおよび増殖条件
エンテロコリチカ菌(Y.enterocolitica)株Ｅ４０（ｐＹＶ４０）、Ｅ４０（ｐＹＶ４０）の同系アンピシリン感受性誘導体であるＭＲＳ４０（ｐＹＶ４０）、およびこれらの種々の非極性ミュータント（Soryら (1995), Proc.Natl Acad. Sci.USA 92:11998-12002）。プラスミドは表３に列挙されている。バクテリアをブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）（Difco, Detroit, Michigan）において増殖させた。一晩予備培養した後、バクテリアを新鮮なＢＨＩに１／２０に希釈し、室温で３０分間増殖させ、Ｙｏｐビルロン(virulon)の合成を感染前に３７℃で１５０分間インキュベーションすることによって誘導した。
【０１００】
ポリミュータントエルジニア属株の構成
ｙｏｐＨＯＰＥＭポリミュータント株を構成するために、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＭおよびｙｏｐＰ遺伝子を、連続的に、自殺ベクターｐＭＲＳ１０１およびｐＫＮＧ１０１を用いて、ＭＲＳ４０株におけるアレル交換によりノックアウトした。K.Kanigaら.(1991) "A wide-host range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica" Gene 109: 137-141およびM.R.Sarkerら.(1997)"An improved version of suicide vector pKNG101 for gene replacement in Gram-negative bacteria" Mol. Microbiol.23:409-411参照。種々の欠失が表２の“自殺ベクターとミューテーター”欄に記載されている。ＹｏｐＥ遺伝子を、ミューテーターｐＰＷ５２を用いて最初に変異し（P.Wattiauら.(1993) "SycE, a chaperone-like protein of Yersinia enterocolitica involved in the secretion of YopE" Mol. Microbiol. 8:123-131参照）、株ＭＲＳ４０（ｐＡＢ４０５２）を与えた。この株における、ミューテーターｐＡＢ３１を用いたＹｏｐＨ遺伝子のミューテーション（S.D.Millsら(1997) "Yersinia enterocolitica induces apoptosis in Macrophages by a process requiring functional type III secretion and translocation mechanisms and involving Yop, presumably acting as an effector protein" Proc. Natl.Acad.Sci.USA 94:12638-12643参照）は、ダブルｙｏｐＥＨミュータントＭＲＳ４０（ｐＡＢ４０４）を与えた。次いで、トリプルｙｏｐＥＨＯミュータントＭＲＳ４０（ｐＡＢ４０５）が、ミューテーターｐＡＢ３４を用いたアレル交換により得られた（S.D.Millsら,1997参照）。次いで、ＹｏｐＰ遺伝子を、ミューテーターｐＭＳＫ７を用いて変異させ（S.D.Millsら,(1997)参照）、ｙｏｐＥＨＯＰミュータントＭＲＳ４０（ｐＭＳＫ４６）を誘導した。最後に、ｙｏｐＨＯＰＥＭ株ＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）を、ｙｏｐＭミューテーターｐＡＢ３８を用いたアレル交換により得た(S.D.Millsら,1997参照)。
【０１０１】
【表３】
0004722289.tif 000004
【０１０２】
ＹｏｐＥ１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１を含む組み換えエルジニア属の産生
ＭＡＧＥ−Ａ１タンパクをコードする配列を、切断されたＹｏｐＥ、ＹｏｐＥの最初の１３０アミノ酸を含むＹｏｐＥ１３０をコードする配列を用いてフレーム内に挿入した。このプラスミドは、図１に図式的に記載されている。
【０１０３】
ＭＡＧＥ−Ａ１のオープンリーディングフレームを、鋳型としてｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化されたＭＡＧＥ−Ａ１ ｃＤＮＡ（Invitrogen, Carlsbad, California）を用いてＰＣＲにより増幅した。上流プライマーである、AAACTGCAGATGTCTCTTGAGCAGAGGAGTC（配列番号３３）は、ＰｓｔＩ部位が先にあるＭＡＧＥ−Ａ１のオープンリーディングフレームの最初のヌクレオチドからなる。下流プライマーであるAAACTGCAGTCAGACTCCCTCTTCCTCCTC（配列番号３４）は、ＰｓｔＩ部位が後にあるＭＡＧＥ−Ａ１のオープンリーディングフレームの最後のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる。ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで切断し、ベクターｐＭＳ１１１のＰｓｔＩ部位において切断されたＹｏｐＥを用いてフレーム内に挿入し（Soryら (1994) Molecular Microbiology 14:583-594）、プラスミドＹｏｐＥ１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１またはｐＭＳ１１１−ＭＡＧＥ−Ａ１を得た。
【０１０４】
ｐＭＳ１１１−ＭＡＧＥ−Ａ１（またはＹｏｐＥ１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１）を、バクテリア株ＤＨ５ Ｆ’ＩＱにおいてエレクトロポレーションした。一部のクローンから、ＤＮＡを抽出し、陽性組み換えクローンのＤＮＡをバクテリア株ＳＭ１０においてエレクトロポレーションした。エルジニア属ＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）においてＳＭ１０からｐＭＳ１１１を可動化した後に、組み換えクローンを、ナリジキシン酸、亜ヒ酸ナトリウムおよびクロラムフェニコールを添加した寒天含有培地上で選択した。ＭＲＳ４０は、アンピシリンに感受性のＥ４０の同系誘導体である（Soryら (1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11998-12002参照）。
【０１０５】
ＹｏｐＥ１３０−ＭＡＧＥ−Ａ４を含有する組み換えエルジニアの産生
ＭＡＧＥ−Ａ４タンパクをコードする配列を、切断されたＹｏｐＥ、ＹｏｐＥの最初の１３０アミノ酸を含むＹｏｐＥ（１−１３０）をコードする配列に、フレーム内において連結させた。ＭＡＧＥ−Ａ４のオープンリーディングフレームを、鋳型として、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen）にクローン化されたＭＡＧＥ−Ａ４ ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅した。上流プライマーであるAAAAACTGCAGATGTCTTCTGAGCAGAAGAGT（配列番号３５）は、ＰｓｔＩ部位が先にあるＭＡＧＥ−Ａ４のオープンリーディングフレームの最初のヌクレオチドからなる。下流プライマーであるAAAAAATCGATTCAGACTCCCTCTTCCTC（配列番号３６）は、ＣｌａＩ部位が後にあるＭＡＧＥ−Ａ４のオープンリーディングフレームの最後のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる。ＰＣＲを３０サイクルにわたって行った（９４℃で１分、５５℃で２分、および７２℃で２分）。ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＣｌａＩで切断し、ベクターｐＭＳ６２１のＰｓｔＩ−ＣｌａＩ部位において切断されたＹｏｐＥを用いてフレーム内に挿入した。プラスミドｐＭＳ６２１−ＭＡＧＥ−Ａ４を、エレクトロポレーションによりバクテリア株ＤＨ５αＦ’ＩＱにトランスフォームした。陽性クローンを、バクテリアコロニーにおけるＰＣＲにより検出し、陽性組み換えクローンのＤＮＡを抽出し、エレクトロポレーションによりバクテリア株ＳＭ１０にトランスフォームした。ポリミュータントエルジニア属ＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）にＳＭ１０からｐＭＳ６２１−ＭＡＧＥ−Ａ４を可動化した後に、組み換えクローンを、ナリジキシン酸、m-亜ヒ酸ナトリウムおよびクロラムフェニコールを添加した寒天含有培地上で選択した。
【０１０６】
組み換えエルジニア属−ＭＡＧＥ−Ａ３の産生
エルジニア属−ＭＡＧＥ−Ａ３（aa147-314）
切断されたＭＡＧＥ−Ａ３をコードする配列を、鋳型として、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化されたＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅した。上流プライマーであるＰＶＢ１５７は、5'-AA CTGCAG TTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGC-3'（配列番号５０）であり、ＰｓｔＩ部位（太字）と２つのＡが先にあるＭＡＧＥ−Ａ３のオープンリーディングフレームのヌクレオチド４３９−４６１からなる（開始コドンＡＴＧが１−３）。下流プライマーＰＶＢ１３９である5'-CC ATCGAT TCACTCTTCCCCCTCTCTCAA-3'（配列番号５１）は、ＣｌａＩ部位（太字）と２つのＣが先にあるＭＡＧＥ−Ａ３のオープンリーディングフレームの最後のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる。ＰＣＲを３０サイクルにわたって行った（９４℃で１分、６２℃で２分、および７２℃で２分）。ＰＣＲ産物を、上記ＭＡＧＥ−Ａ４について記載したように処理した。
【０１０７】
エルジニア属−ＭＡＧＥ−Ａ３の構成（aa1-199）
ＭＡＧＥ−Ａ３タンパクの最初の１９９アミノ酸をコードする配列を得るために、プライマーを以下のように設計した。すなわち、上流プライマーＰＶＢ１７２は、5'-ACCAGAGTCATC CTGCAG ATGCCTCTTGAG-3'（配列番号５２）であり、ＰｓｔＩ部位（太字）が先にあるＭＡＧＥ−Ａ３のオープンリーディングフレームの開始コドン（下線）と重なるヌクレオチドからなる。下流プライマーＰＶＢ１７３は、5'-GCCTGCCTTGGG ATCGAT TCACATGATCTGATT-3'（配列番号５３）であり、ＭＡＧＥ−Ａ３のオープンリーディングフレームのヌクレオチド５７７−６００に相補的なヌクレオチドからなり、かつ、ＣｌａＩ部位（太字）を含む。ＰＣＲを３０サイクルにわたって行った（９４℃で１分、６５℃で２分、および７２℃で２分）。ＰＣＲ産物を、ＭＡＧＥ−Ａ４について上述したように処理した。
【０１０８】
組み換えエルジニア属を用いたＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞のターゲッティング
ｐＭＳ１１１−ＭＡＧＥ−Ａ１を含むエルジニア属ＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）を用いたＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の感染を以下のように行った。別の組み換えエルジニア属を用いたＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の感染を、本質的に同様の方法を用いて行った。
【０１０９】
ｐＭＳ１１１−ＭＡＧＥ−Ａ１を含むエルジニア属ＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）の一つのコロニーを、ナリジキシン酸（３５μｇ／ｍｌ）、m-亜ヒ酸ナトリウム（１ｍＭ）およびクロラムフェニコール（１２μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地で２８℃で一晩増殖させた。一晩培養物を新鮮な培地に希釈し、約２時間２８℃で新鮮な培養物を増幅した後の６００ｎｍにおけるＯＤ（光学密度）０．２を得た。このバクテリアを０．９％のＮａＣｌで洗浄し、０．９％のＮａＣｌの１ｍｌ当たり１０８バクテリアとなるように再懸濁し、ここで、１に等しいＯＤ６００を与える培養物が１ｍｌ当たり５ｘ１０８バクテリアを含むと推定した。照射されたＥＢＶ−Ｂ細胞（１００Ｇｙ）を、抗生物質を含まず、１０％のＦＣＳおよびＡＡＧ（L-アルギニン（１１６ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ-アスパラギン（３６ｍｇ／ｍｌ）およびL-グルタミン（２１６ｍｇ／ｍｌ））を添加したＲＰＭＩの３．８ｍｌ中に１０６となるように再懸濁した。次いで、２００μｌのバクテリア懸濁液を添加した。感染から２時間後、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を次の二時間加え、最後に、細胞を、刺激細胞として用いる前に三回洗浄した。
【０１１０】
ネガティブコントロールとして、同じ細胞を、切断されたＹｏｐＥ、すなわちＹｏｐＥ１３０のみをコードするプラスミド、ｐＭＳ６２１を含むエルジニア属ＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）を用いて感染させた。
【０１１１】
組み換えエルジニア−ＭＡＧＥ−Ａ１を用いて感染したＥＢＶ−Ｂ細胞は、ＭＺ２−ＣＴＬ８２／３０によって認識された。ＭＺ２−ＣＴＬ８２／３０は、ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドであるEADPTGHSY（配列番号１）に特異的であり、これはＨＬＡ−Ａ１によって示されている（米国特許第５３４２７７４号）。５０００のＭＺ２−ＣＴＬ８２／３０細胞を、Iscoveの完全培地の１００μｌの最終量においてエルジニア属を含む各マイクロウェルに添加した［培養培地は、１０％ヒト血清、L-アルギニン（１１６ｍｇ／ｍｌ）、L-アスパラギン（３６ｍｇ／ｍｌ）、L-グルタミン（２１６ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）およびゲンタマイシン（１５μｇ／ｍｌ）が添加されている］。一晩インキュベーションした後、共培養物の上清におけるＩＦＮ−ガンマ（活性化の際にＣＴＬによって産生される）の存在を標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した（Biosource, Fleurus, Belgium）。図２Ａは、かかる工程を図式的に示す。
【０１１２】
図２Ｂに示されているように、ＹｏｐＥ１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１をコードするエルジニア属と感染したＨＬＡ−Ａ１＋Ｂ細胞は、ＣＴＬ８２／３０によって認識されるが、一方、コントロールプラスミドＹｏｐＥ１３０と感染した同じ細胞は認識されなかった。バクテリアの最適濃度は、約マイクロウェル当たり１００００００である。
【０１１３】
実施例２
組み換えワクシニアＷＲウイルスの産生
ワクシニア（ｖＰ１１７０）の親のＷＲ株は、２８２６ｂｐの親ベクターｐＫＩＬＧＰＴを含んでいた（Virogenetics, Troy, New York）。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの後に配置されたＭＡＧＥ−Ａ１をコードする配列は、ｐＫＩＬＧＰＴベクターにクローン化され、ドナープラスミドＭＡＷ０３５を生じた。同様のＭＡＧＥ−Ａ４ドナープラスミドベクターは、ＭＡＧＥ−Ａ４ ｃＤＮＡでＭＡＧＥ−Ａ１ ｃＤＮＡを置換することによって構成した。ＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡを、Ｐｓｔ１とＸｂａＩを用いて切断し、平滑末端とし、挿入物をゲル精製し、ＰｓＣ１１ベクターのＳｍａＩ部位にリゲートした。ＰｓＣ１１ベクターについては、Chakrabatiら(1985) Mol.Cell Biol.5:34-3-3409を参照。
【０１１４】
ドナープラスミドをワクシニア株ＷＲのゲノムＤＮＡを含むＣＥＦ細胞にトランスフェクションし、in vivo組み換えにより、組み換えワクシニアウイルスＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ１、ＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ４およびＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ３をそれぞれ得て、ＢｒｄＵおよびＸ-ｇａｌで選択した。この方法は、例えば、Perkinsら(1989) J.Virol.63:3829-3936に見られる。
【０１１５】
実施例３
組み換えＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１ウイルスの産生
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの後に配置されたＭＡＧＥ−Ａ１コード配列を、ＰＵＣ８をベースとするベクターにクローン化し、ドナープラスミドＭＡＷ０３６を生じた。
【０１１６】
組み換えＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１ウイルスを、ドナープラスミドＭＡＷ０３６を用い、例えば、Current Protocols in Molecular Cloning (Ausubelら, John Wiley & Sons, New York)およびFerrariら(Blood 90:2406-2416, 1997)に記載されている周知の方法に従って生じた。
【０１１７】
組み換えカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３スプリット（簡便のために、“ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３”とも称する）は、ＭＡＧＥ−Ａ３の二つの切断された重複フラグメント、すなわち一方のフラグメントはアミノ酸１−１９６にわたり、他方のフラグメントはアミノ酸１４７−１９９にわたる、を示した。組み換えウイルスにおいて、各フラグメントは、別個の発現カセットにおいて、それぞれワクシニアウイルスＨ６プロモーターの制御下に含まれ、かつ、両方のカセットがＡＬＶＡＣゲノムのＣ３部位に挿入された。
【０１１８】
ｖＣＰ１５６３組み換え体を以下のようにして産生した。ＭＡＧＥ−Ａ３（１−１９６）ＤＮＡフラグメントを産生し、鋳型としてプラスミドｐＴＺ１８Ｒ（全長のＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡを含む）を用いて、標準的なＰＣＲ法によってワクシニアＨ６プロモーターに連結した。ＭＡＧＥ−Ａ３（１４７−１９９）ＤＮＡフラグメントを産生し、同様にＨ６プロモーターに連結した。これら二つのフラグメントをプラスミドにサブクローン化し、カセットをＣ３挿入部位からＡＬＶＡＣ ＤＮＡに隣接させた。プラスミドにおけるこれらの成分の構成は以下の通りである：ＡＬＶＡＣ Ｃ３左隣接アーム、ＭＡＧＥ−Ａ３（１４７−２９９）／Ｈ６、ＭＡＧＥ−Ａ３（１−１９６）／Ｈ６、ＡＬＶＡＣ Ｃ３右隣接アーム。このＭＡＧＥ−Ａ３（１−１９６）と（１４７−２９９）フラグメント発現カセットを含むＡＬＶＡＣ Ｃ３部位ドナープラスミドをｐＣ３ＭＡＧＥ３スプリットと称した。
【０１１９】
ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３組み換え体を、以下の標準的な方法に従って、ｐＣ３ＭＡＧＥ３スプリットドナープラスミドと、ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡとの間のin vivo組み換えによって産生した。組み換えウイルスを、ＭＡＧＥ−３−特異的ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションすることによって選別し、プラークを精製した。得られたＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３組み換え体は、実験室名ｖＣＰ１５６３とされた。ＭＡＧＥ−３−特異的抗血清を用いた発現分析は、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３（ｖＣＰ１５６３）で感染した細胞におけるＭＡＧＥ−Ａ３（１−１９６）および（１４７−２９９）ポリペプチドの発現を確認した。
【０１２０】
実施例４
組み換えアデノウイルスの産生
組み換えアデノウイルスの構成については、プラスミドｐＡｄ−ＣＭＶＩｃｐＡ−ＭＡＧＥ−Ａ４（ＣＭＶプロモーターの制御下にＭＡＧＥ−Ａ４ ｃＤＮＡを含む）が、ベクターｐＡｄ−ＣＭＶＩｃｐＡ（Celia GARCIAおよびThierry RAGOT, URA CNRS 1301によって供給）のＮｏｔＩ部位にＭＡＧＥ−Ａ４完全ｃＤＮＡを挿入することによって得られた。
【０１２１】
組み換えアデノウイルスＡｄ−ＭＡＧＥ−Ａ４は、ｐＡｄ−ＣＭＶＩｃｐＡ−ＭＡＧＥ−Ａ４とＡｄ−βｇａｌゲノムＤＮＡとの間に、細胞系統２９３におけるin vivo相同的組み換えによって産生された。簡便に述べると、２９３細胞はＸｍｎＩで直線化された５μｇのプラスミドｐＡｄ−ＣＭＶＩｃｐＡ−ＭＡＧＥ−Ａ４および５μｇのアデノ−βｇａｌ ＤＮＡの大きなＣｌａＩフラグメントを用いて共トランスフェクションした（Stratford-Perricaudetら(1992) J.Clin.Invest., 90:626-630および仏国特許第９６０３２０７号）。組み換えアデノウイルスをプラーク精製し、トランスジーンの存在をアデノウイルスＤＮＡの制限分析によって評価した。組み換えアデノウイルスを、２９３細胞において増殖させ、ダブル塩化セシウム密度遠心によって精製した。このウイルスストックを液体窒素中に１０％のグリセロールの分注量において貯蔵し、２９３細胞を用いたプラークアッセイによって力価測定した。
【０１２２】
組み換えアデノウイルスＡｄ−ＭＡＧＥ−Ａ３を、ＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡがλｇｔ１０組み換えクローンから誘導されたことを除いて、上記と本質的に同じ方法に従って調製した。
【０１２３】
実施例５
組み換えレトロウイルスと細胞系統の感染
Ｍ１−ＣＳＭレトロウイルスベクターは、ＬＴＲの制御の下に、全長のＭＡＧＥ−Ａ１タンパクを、そして、ＳＶ４０プロモーターによって操作されるヒト低親和性神経成長因子レセプター（△ＬＮＧＦｒ）の切断された形態コードする（Mavilio Fら, Blood 83:1988-1997, 1994）。ＥＢＶ−Ｂ細胞またはＰＨＡ−活性化Ｔ細胞を、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｍ１−ＣＳＭベクターを産生する照射されたパッケージング細胞系統と共培養することによって形質導入した。７２時間後、リンパ球を回収し、新鮮な培地に接種した。感染細胞のパーセントを、４８時間後に、ｍＡｂ２０．４（ATCC, Rockville,MD,USA）を用いて、ＬＮＧＦｒ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。ＬＮＧＦｒ陽性細胞を、ラット抗-マウスＩｇＧ１−被覆ビーズ（Dynabeads M-450,DYNAL A.S.N012 Oslo,Norway）を用いた磁気細胞選別により精製した。
【０１２４】
実施例６
材料と方法
細胞系統および培地
エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞（以下、ＥＢＶ−Ｂ細胞と称する）を、標準的な方法に従って得た。ＥＢＶ−Ｂ細胞とメラノーマ細胞系統とを、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（GIBCO BRL）、０．２４ｍＭ L-アスパラギン、０．５５ｍＭ L-アルギニン、１．５ｍＭ L-グルタミン（ＡＡＧ）、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加したIscoveの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（GIBCO BRL, Baitherburg,MD,USA）において培養した。ＨｅｌａおよびＣＯＳ−７細胞を、１０％ ＦＣＳを添加したＨ１６培地（GIBCO BRL）に維持した。
【０１２５】
サイトカイン
ヒト組換えＩＬ−２を、CHIRON BV(Amsterdam, Netherlands)またはEUROCETUS(Amsterdam, Netherlands)から購入、もしくはBIOGEN(Geneva,Switzerland)によって提供された。ヒト組換えＩＬ−７をGENZYME(Cambridge,MA)から購入した。ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦを、SANDOZ(Leucomax, Sandoz Pharma, Basel, Switzerland)またはSCHERING PLOUGH(Brinny,Ireland)から購入した。ヒト組み換えＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１２は、本発明者らによって調製された。
【０１２６】
ヒト血液の処理
末梢血液を、標準バフィコート調製物として、地方の血液バンク（非ガン患者、すなわちヘモクロマトーシス患者）から入手した。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をLymphoprep(NYCOMED PHARMA,Oslo,Norway)で遠心することによって単離した。血小板によるＰＢＭＣの汚染を最小化するために、調製物を、室温で１０００ｒｐｍで２０分間最初に遠心した。ほとんどの血小板を含む上の２０−２５ｍｌを除いた後に、そのチューブを室温で１５００ｒｐｍで２０分間遠心した。ＰＢＭＣを、２-アミノエチル-イソチオウロニウム(isothiouronium)（SIGMA, St.Louis, MO,USA）で処理したヒツジの赤血球(BIO MERIEUX, Marcy-l'Etoile, France)を用いてロゼッティングすることによりＴ細胞を奪った。ロゼット化したＴ細胞をＮＨ４Ｃｌ（１６０ｍＭ）で処理して、ヒツジの赤血球を溶解し、洗浄した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、磁気マイクロビーズ（MILTENYI BIOTECH,Germany）に結合した抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いて陽性選別し、かつ、磁石を介して分類することによって単離した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球を凍結し、最初の培養の開始前日に溶かし、２．５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した、L-アスパラギン（０．２４ｍＭ）、L-アルギニン（０．５５ｍＭ）、L-グルタミン（１．５ｍＭ）、１０％ ヒト血清を含むIscove培地（以下、完全Iscove培地と称する）において、一晩培養した。
【０１２７】
リンパ球が奪われたＰＢＭＣを、凍結するか、または樹状細胞培養のために直ちに用いた。細胞を、L-アスパラギン（０．２４ｍＭ）、L-アルギニン（０．５５ｍＭ）、L-グルタミン（１．５ｍＭ）および１０％ 胎児ウシ血清を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（GIBCO BRL）（以下、完全ＲＰＭＩ培地と称する）において、２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で、培養フラスコ(Falcon,BECTON DICKINSON LABWARE,Franklin Lakes, USA)において３７℃で１−２時間付着させた。未付着の細胞を捨て、付着細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中のＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。実施例７および８における実験については、培養は、培地の量の１／３を除いて、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新鮮培地を添加することによって２日目と４日目に補給させ、６日目または７日目に、未付着細胞の集団を富んだ樹状細胞の源として用いた。実施例９の実験については、培地の量の１／３を除いて、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新鮮培地を添加することによって２日目に補給させ、４日目に凍結させ、各刺激の前の日に、樹状細胞を溶解させ、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４と１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む完全培地において一晩増殖させた。実施例１０−１１における実験については、培養は、培地の量の１／２または１／３を除いて、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新鮮培地を添加することによって２日目と４日目に補給させ、５日目または７日目に、未付着細胞の集団を富んだ樹状細胞の源として用いた。
【０１２８】
インターフェロンγ産生アッセイ
５０００のターゲット細胞を、９６ウェルの丸底プレートにおいて、ウェル当たり１００μｌの２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した完全Iscove培地において、２０００のＣＴＬと一晩培養した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生を、ＥＬＩＳＡ（Biosource）によって５０μｌの上清において測定した。
【０１２９】
ＨＬＡ−クラスＩ分子をコードするｃＤＮＡ
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１コード配列を、細胞系統ＢＢ４９のｃＤＮＡライブラリーから得て、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ(INVITROGEN)にクローン化した。ＨＬＡ−Ａ３コード配列を、細胞系統ＬＢ３３のｃＤＮＡライブラリーから単離し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３(INVITROGEN)にクローン化した。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０２コード配列を、細胞系統ＬＢ３３からＲＴ−ＰＣＲによって単離し、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化した。ＨＬＡ−Ｂ＊４００１２（Ｂ６０）コード配列を、細胞系統ＨＡ７−ＲＣＣからＲＴ−ＰＣＲによって誘導し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローン化した。ＨＬＡ−Ｃｗ３コード配列を発現ベクターｐＣＲ３にクローン化した。ＨＬＡ−Ｃｗ５をＲＴ−ＰＣＲによって細胞系統ＬＢ３７３から単離し、ｐｃＤＮＡ３にクローン化した。ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１、Ｂ＊４００２（Ｂ６１）、Ｃｗ＊０２０２２およびＣｗ＊０７０１コード配列を、鋳型としてＬＢ１１１８−ＥＢＶ−Ｂ細胞のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＨＬＡ−Ｂ＊５３０１コード配列を、鋳型として親のＬＢ１１１８のＥＢＶ−Ｂ細胞のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｂ４０セグメントを、実施例１２および１３に記載しているように単離した。ＰＣＲ産物を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローン化した。ＤＮＡを組み換えクローンから抽出し、ジデオキシ鎖終結法（ThermosequenaseＴＭ サイクル配列決定キット, Amersham）によって部分的にセンスおよび部分的にアンチセンス鎖において配列決定した。
【０１３０】
ペプチド認識アッセイ
一時的ＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを用いて固相においてペプチドを合成し、質量分析法を用いて特徴決定した。分析ＨＰＬＣによれば、全てのペプチドが＞８０％の純度であった。凍結乾燥されたペプチドをＤＭＳＯに溶かし、−２０℃で貯蔵した。ターゲット細胞をＮａ（５１Ｃｒ）Ｏ４でラベルし、洗浄し、ペプチドの存在下で１５分間インキュベートした。ＣＴＬクローンを、エフェクター：ターゲット比を５：１〜１０：１となるように添加した。クロム放出を、３７℃で４時間インキュベーションした後に測定した。
【０１３１】
実施例７
細胞融解Ｔリンパ球に対するＨＬＡ−Ｃｗ３分子により示されたＭＡＧＥ−Ａ１誘導ペプチド
ＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＣＴＬクローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２の単離
ドナーＬＢ１１３７由来の自己樹状細胞（ＨＬＡ−Ａ２ Ａ３ Ｂ４４０２ Ｂ６０ Ｃｗ３ Ｃｗ５）を、５％ＣＯ２下で、３７℃で、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩにおいて、感染度(multiplicity of infection)３０で、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染させた。２時間後、感染した樹状細胞を洗浄した。in vitro刺激については、１５００００のＣＤ８＋Ｔリンパ球と３００００の感染した樹状細胞とを、マイクロウェルにおいて、L-アスパラギン（０．２４ｍＭ）、L-アルギニン（０．５５ｍＭ）、L-グルタミン（１．５ｍＭ）、１０％ ヒト血清を含む２００μｌのIscove培地（以下、完全Iscove培地と称する）であり、さらに、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地中で共培養した。ＣＤ８＋リンパ球を、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と新鮮に感染した自己樹状細胞と週毎に再刺激し、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全Iscove培地中で増殖させた。
【０１３２】
数回刺激した後、各ミクロ培養の分注量を、自己ターゲット細胞の特異的溶解について試験した。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を、感染度２０を用いて、親のワクシニアＷＲ（バッチＬＶＡＲ）またはＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物（ｖＰ１２６７）と二時間感染させ、Ｎａ（５１Ｃｒ）Ｏ４でラベルした。その後、ＥＢＶ−Ｂ細胞（標的細胞）を洗浄し、エフェクター：ターゲット比が約４０：１となるようにレスポンダー細胞に添加した。未標識のＫ５６２細胞も、ナチュラルキラー活性をブロックするために添加した（Ｖ底マイクロウェル当たり５ｘ１０４）。クロム放出を、３７℃で４時間インキュベーションした後に測定した。ここのミクロ培養を、各ターゲットについて二回ずつ試験した。
【０１３３】
陽性のミクロ培養を、刺激細胞としてＹｏｐＥ１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１タンパクを発現する組み換えエルジニア属と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を用い、かつ、フィーダー細胞として同種異系のＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ）を用いて、限界希釈法によってクローン化した。この培養を７日目に同様に再刺激し、０．５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−ＨＡ１６（Murex）および５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した完全Iscove培地中で、同種異系のＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ）と週毎に再刺激することによって培養中に維持した。再刺激から３日後に、クローンを洗浄して、培地のＰＨＡ−ＨＡ１６を除いた。このクローンを、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物と感染させた自己ＥＢＶ−Ｂ細胞の特異的溶解について試験した。クローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２が陽性であることを見出し（図３ａ）、次の実験に用いた。
【０１３４】
ＭＡＧＥ−Ａ１エピトープは、ＨＬＡ−Ｃｗ３分子によってＣＴＬに提示される
ドナーＬＢ１１３７は、上述したように多数の種々のＨＬＡ分子を発現するので、どれがＣＴＬ ＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２によって認識される抗原を提示するかを調べるために、各ＨＬＡを試験した。
【０１３５】
ＣＯＳ細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ１のｃＤＮＡと、６つのＨＬＡ−クラスＩ分子の一つをコードするプラスミドを用いて、トランスフェクションした。要約すると、マイクロウェルに分配された１．５ｘ１０４のＣＯＳ細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ１ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡＩの５０ｎｇと、ドナーＬＢ１１３７によって発現された６つのＨＬＡ−クラスＩ分子の一つをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３の５０ｎｇと共に、１μｌのリポフェクタミン試薬（Gibco BRL）を用いて、コトランスフェクションした。ＣＯＳ細胞を、トランスフェクション混合物中８％のＣＯ２かつ３７℃で５時間インキュベートし、２００μｌの培養培地を添加した。一晩培養した後、トランスフェクタントを、クローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２によるＩＦＮ−γの産生を刺激する能力について試験した。要約すると、１５００のＣＴＬを、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００μｌのIscove完全培地の最終量にトランスフェクションした細胞を含む各マイクロウェルに添加した。２４時間後、５０μｌの上清をＷＥＨＩバイオアッセイにおいてＩＦＮ−γ含量について試験した。このアッセイは、ＭＴＴ比色分析においてＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞におけるＩＦＮ−γの細胞毒性効果を測定する。ＨＬＡ−Ｃｗ３とＭＡＧＥ−Ａ１の両方とトランスフェクションした細胞のみが、ＣＴＬクローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２を刺激して、ＩＦＮ−γを生じた（図３ｂ）。ＭＡＧＥ−Ａ１またはＨＬＡ−Ｃｗ３のみとトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、ＣＴＬクローンを刺激しなかった。
【０１３６】
抗原性ペプチドとＣＴＬアッセイ
クローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２によって認識されたＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを同定するために、ＭＡＧＥ−Ａ１タンパクの一部に対応するペプチド（１６アミノ酸）を合成し、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞に加え、認識を試験した。ペプチドを、一時的ＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを用いて固相において合成した。凍結乾燥されたペプチドを、ＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、１０ｍＭ酢酸中に２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、−２０℃で貯蔵した。
【０１３７】
１０００の５１Ｃｒラベル化ターゲット細胞を、室温で２０分間９６ウェルミクロプレート（１００μｌ／ウェル）において１０μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートした後に、１００００のＣＴＬを含む１００μｌの培地を添加するクロム放出アッセイにおいて、ペプチドを試験した。このアッセイを、３７℃で、８％ＣＯ２において４時間インキュベーションした後に終了させた。
【０１３８】
ペプチドDGREHSAYGEPRKLLT（ＭＡＧＥ−Ａ１２２５−２４０）（配列番号３７）とインキュベートした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞が、ＣＴＬ ＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２によって認識された（図３ｃ）。この長いペプチドは、９アミノ酸ペプチドSAYGEPRKL（ＭＡＧＥ−Ａ１２３０−２３８）（配列番号２）を含み、このペプチドは、ＨＬＡ−Ｃｗ３に適したアンカー残基、すなわち位置３のＹおよびＣ末端のＬを含む。DGREHSAYGEPRKLLT（配列番号３７）を、“http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html”から入手できるソフトウェアを用いてＨＬＡ−Ｃｗ３結合ペプチドの予測のためにスクリーニングした。ペプチドSAYGEPRKL（ＭＡＧＥ−Ａ１２３０−２３８）（配列番号２）は、ＨＬＡ−Ｃｗ３に対する結合に関して最も高いスコアを有していた。それは、エフェクター：ターゲット比が１０：１である細胞毒性アッセイにおいて、ＣＴＬＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２によって認識された（図３ｃ）。
【０１３９】
ＭＡＧＥ−Ａ１を発現するＨＬＡ−Ｃｗ３陽性腫瘍細胞のＣＴＬクローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２による認識
ＨＬＡ−Ｃｗ３およびＭＡＧＥ−Ａ１を発現する腫瘍細胞系統によるＣＴＬ ＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２の活性化を、ＩＦＮ−γ産生アッセイにおいて試験した。ＣＴＬクローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２は、ＭＡＧＥ−Ａ１を発現するＨＬＡ−Ｃｗ３陽性腫瘍細胞系統ＬＢ１７−ＭＥＬを認識した（図３ｄ）。メラノーマ細胞系統Ｍｉ６６５／２Ｅ＋クローン２（ＭＡＧＥ−Ａ１のオープンリーディングフレームを含むゲノムフラグメントを用いてトランスフェクションされた（米国特許第５３４２７７４号に記載））も、クローンＬＢ１１３７ ４６２／Ｆ３．２によって認識されたが、親細胞系統Ｍｉ６６５／２は認識されなかった。
【０１４０】
細胞溶解Ｔリンパ球に対するＨＬＡ−Ｂ５３０１分子により示されたＭＡＧＥ−Ａ１誘導ペプチド
ＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１の単離
ドナーＬＢ１８０１由来の自己樹状細胞（ＨＬＡ−Ａ２０１、Ａ２８、Ｂ４４０１、Ｂ５３０１、Ｃｗ０４、Ｃｗ０５０１）を、５％ＣＯ２下で、３７℃で、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩにおいて、感染度(multiplicity of infection)３０で、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物と感染させた。２時間後、感染した樹状細胞を洗浄した。in vitro刺激については、１５００００のＣＤ８＋Ｔリンパ球と３００００の感染した樹状細胞とを、丸底マイクロウェルにおいて、L-アスパラギン（０．２４ｍＭ）、L-アルギニン（０．５５ｍＭ）、L-グルタミン（１．５ｍＭ）、１０％ ヒト血清を含む２００μｌのIscove培地（以下、完全Iscove培地と称する）であり、さらに、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地中で共培養した。ＣＤ８＋リンパ球を、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物と新鮮に感染した自己樹状細胞と週毎に再刺激し、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全Iscove培地中で増殖させた。
【０１４１】
自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を、感染度２０を用いて、親のワクシニアＷＲ（ｖＰ１１７０）または組み換えワクシニアＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ１（ｖＰ１１８８）と二時間感染させ、Ｎａ（５１Ｃｒ）Ｏ４でラベルした。その後、ターゲット細胞を洗浄し、エフェクター：ターゲット比が約４０：１となるようにレスポンダー細胞に添加した。未標識のＫ５６２細胞も、ナチュラルキラー活性をブロックするために添加した（Ｖ底マイクロウェル当たり５ｘ１０４）。クロム放出を、３７℃で４時間インキュベーションした後に測定した。個々のミクロ培養を、各ターゲットについて二回ずつ試験した。
【０１４２】
ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を特異的に溶解する細胞を含むミクロ培養を、刺激細胞としてＹｏｐＥ１−１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１を発現するエルジニア属と予め感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を用い、かつ、フィーダー細胞として同種異系のＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ）を用いて、限界希釈法によってクローン化した。ＣＴＬクローンを、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した完全Iscove培地中で、週毎に再刺激することによって培養中に維持した。このクローンを、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物と感染させた自己ＥＢＶ−Ｂ細胞の特異的溶解について試験した。クローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１が陽性であることを見出し（図４ａ）、次の実験に用いた。ＣＴＬを、フィーダー細胞としてＬＧ２−ＥＢＶで、あるいは、精製されたフィトヘマグルチン(phytohaemagglutin)（ＰＨＡ−ＨＡ１６；ＭＵＲＥＸ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）またはエルジニア属−ＹｏｐＥ１−１３０−ＭＡＧＥ−Ａ１と予め感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で、週毎に再刺激した。
【０１４３】
抗原性ペプチドとＣＴＬアッセイ
クローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１によって認識されたＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを同定するために、ＭＡＧＥ−Ａ１タンパクの一部に対応するペプチド（１６アミノ酸）を合成し、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞に加え、認識を試験した。ペプチドを、一時的ＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを用いて固相において合成した。凍結乾燥されたペプチドを、ＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、１０ｍＭ酢酸中に２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、−２０℃で貯蔵した。１０００の５１Ｃｒラベル化ターゲット細胞を、室温で１５分間、Ｖ底ミクロプレートにおいて、５μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートした後に、５０００のＣＴＬを含む同量を添加するクロム放出アッセイにおいて、ペプチドを試験した。このアッセイを、３７℃で、８％ＣＯ２において４時間インキュベーションした後に終了させた。ペプチドQVPDSDPARYEFLWGP（ＭＡＧＥ−Ａ１ ２５３−２６８）（配列番号３８）およびSDPARYEFLWGPRALA（ＭＡＧＥ−Ａ１ ２５７−２７２）（配列番号３９）が陽性を示した。
【０１４４】
ＨＬＡ提示分子の同定
どのＨＬＡ分子が、ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１に両方の１６マーペプチドを提示したかを知るために、ペプチドを、ドナーＬＢ１８０１とＨＬＡ分子を共有する種々のドナー由来のＥＢＶ−Ｂ細胞をターゲット細胞として用いたクロム放出アッセイにおいて試験した。クローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１は、自己細胞によって提示された場合にのみペプチドを認識できた（表４）。ＨＬＡ−Ｂ５３０１分子を発現するＥＢＶ−Ｂ細胞を一つも試験しなかったので、ドナーＬＢ１８０１のＨＬＡ−Ｂ５３０１をコードするｃＤＮＡを単離した。
【０１４５】
ＨＬＡ−Ｂ５３０１コード配列を、鋳型として、ＬＢ１８０１−ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローン化した（Invitrogen BV, the Netherlands）。ＤＮＡを、組み換えクローンから抽出し、ＨＬＡ−Ｂ５３０１をコードする配列であることをチェックするために、部分的にセンスおよび部分的にアンチセンス鎖について配列決定した。ＨＬＡ−Ｂ５３０１の配列は、MasonとPasham (1998), Tissue Antigens 51:417-466により記載されている。
【０１４６】
ＣＯＳ−７細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ１のｃＤＮＡと、ＨＬＡ−Ｂ５３０１分子をコードするプラスミドを用いて、トランスフェクションした。要約すると、マイクロウェルに分配された１．５ｘ１０４のＣＯＳ−７細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ１ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡＩの１００ｎｇと、ドナーＬＢ１８０１のＨＬＡ−Ｂ５３０１分子をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３の１００ｎｇと共に、１μｌのリポフェクタミン（Gibco BRL）を用いて、コトランスフェクションした。ＣＯＳ−７細胞を、８％のＣＯ２かつ３７℃で２４時間インキュベートした。これらのトランスフェクタントを、クローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１によるＴＮＦの産生を刺激する能力について試験した。要約すると、１５００のＣＴＬを、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００ｍｌのIscove完全培地の最終量において、トランスフェクタントを含む各マイクロウェルに添加した。２４時間後、上清を回収し、そのＴＮＦ含量を、標準ＭＴＴ比色分析においてＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞における細胞毒性効果を試験することによって調べた。ＨＬＡ−Ｂ５３とＭＡＧＥ−Ａ１の両方とトランスフェクションした細胞が、ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１を刺激して、ＴＮＦを生じた（図４ｂ）。ＭＡＧＥ−Ａ１またはＨＬＡ−Ｂ５３のみとトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞は、ＣＴＬクローンを刺激しなかった。
【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
表４：ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを適用した種々のＥＢＶ−Ｂ細胞（ターゲット細胞）のＣＴＬ ＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１による溶解
ＥＢＶ−Ｂ細胞を、５１Ｃｒラベル化し、５マイクログラムのペプチドSDPARYEFLWGPRALA（配列番号３９）の存在（不在）下で５／１のエフェクター／ターゲット細胞比においてＣＴＬとインキュベートした。クロム放出を４時間後に測定した。
【０１４９】
抗原性ペプチドの同定
クローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ７．１１によって認識される最も短い合成ペプチドの配列を同定するために、エフェクターターゲット比が１０であり、かつ、ペプチドの最終濃度が５μｇ／ｍｌである条件でのクロム放出において、ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドSDPARYEFLWGPRALA（ＭＡＧＥ−Ａ１ ２５７−２７２）（配列番号３９）またはＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドGSNPARYEFLWGPRAL（ＭＡＧＥ−Ａ４  ２６４−２７９）（配列番号４０）を添加した、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞のＣＴＬによる溶解を比較した。ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドが認識されたが、ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドは認識されなかった。次いで、１０マーのペプチドSDPARYEFLW（配列番号４１）および９マーのペプチドDPARYEFLW（配列番号４２）を合成し、エフェクター-ターゲット比が５における細胞毒性アッセイにおいて試験した。両方のペプチドが認識された。次いで、短いペプチドを、エフェクター-ターゲット比を１０にして、異なる濃度で試験した（図４ｃ）。半全溶解(Half-maximal lysis)が、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間で得られた。
【０１５０】
実施例９
細胞溶解Ｔリンパ球に対するＨＬＡ−Ａ２分子により示されたＭＡＧＥ−Ａ４誘導ペプチド
ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＣＴＬクローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３の単離
ドナーＬＢ１１３７由来の自己樹状細胞（ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ｂ４４０２、−Ｂ６０、−Ｃｗ３、−Ｃｗ５）を、５％ＣＯ２下で、３７℃で、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩにおいて、感染度２００で、Ａｄ−ＭＡＧＥ−Ａ４構成物と感染させた。２時間後、感染した樹状細胞を洗浄した。in vitro刺激については、１５００００のＣＤ８＋Ｔリンパ球と３００００の感染した樹状細胞とを、マイクロウェルにおいて、L-アスパラギン（０．２４ｍＭ）、L-アルギニン（０．５５ｍＭ）、L-グルタミン（１．５ｍＭ）、１０％ ヒト血清を含む２００μｌのIscove培地（以下、完全Iscove培地と称する）であり、さらに、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地中で共培養した。ＣＤ８＋リンパ球を、Ａｄ−ＭＡＧＥ−Ａ４構成物と新鮮に感染した自己樹状細胞と週毎に再刺激し、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全Iscove培地中で増殖させた。これらの細胞を、以下のアッセイにおいてレスポンダー細胞として試験した。
【０１５１】
自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を、感染度２０を用いて、親のワクシニアＷＲ親（バッチｖＰ１１７０またはバッチＬ ＶＡＲ）または組み換えワクシニアＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ４（バッチｖＰ１５４５）と二時間感染させ、Ｎａ（５１Ｃｒ）Ｏ４でラベルした。これらのターゲット細胞を洗浄し、エフェクター：ターゲット比が約４０：１となるようにレスポンダー細胞に添加した。未標識のＫ５６２細胞も、ナチュラルキラー活性をブロックするために添加した（Ｖ底マイクロウェル当たり５ｘ１０４）。クロム放出を、３７℃で４時間インキュベーションした後に測定した。個々のミクロ培養を、各ターゲットについて二回ずつ試験した。
【０１５２】
ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ４構成物と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を特異的に溶解する細胞を含むミクロ培養を、刺激細胞として、ＹｏｐＥ１−１３０−ＭＡＧＥ−Ａ４を発現する組み換えエルジニア属と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を用い、かつ、フィーダー細胞として同種異系のＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ）を用いて、限界希釈法によってクローン化した。ＥＢＶ−Ｂ細胞のエルジニア属ＹｏｐＥ１−１３０−ＭＡＧＥ−Ａ４との感染は、以下のように行った：ｐＭＳ６２１−ＭＡＧＥ−Ａ４を含むエルジニアＭＲＳ４０（ｐＡＢＬ４０３）の一つのコロニー（ＹｏｐＥ１−１３０−ＭＡＧＥ−Ａ４）を、ナリジキシン酸、ｍ−亜砒酸ナトリウムおよびクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地中で２８℃で一晩増殖させた。次いで、この培養から、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．２である新鮮な培養を２８℃で約２時間増幅させた。次いで、バクテリアを０．９％のＮａＣｌで洗浄し、０．９％のＮａＣｌの１ｍｌ当たり１０８バクテリアとなるように再懸濁した。照射されたＥＢＶ−Ｂ細胞を、１０％のＦＣＳおよびL-アルギニン（１１６ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ-アスパラギン（３６ｍｇ／ｍｌ）およびL-グルタミン（２１６ｍｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０に感染度２０として感染させた。感染から２時間後、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を次の二時間加え、最後に細胞を三回洗浄した。ＣＴＬクローンを、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した完全Iscove培地中で、エルジニア属−ＹｏｐＥ１−１３０−ＭＡＧＥ−Ａ４感染ＥＢＶ−Ｂ細胞、ＭＡＧＥ−Ａ４を発現したＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞系統ＱＵＡＲ（ＬＢ１７５１−ＭＥＬ）、またはＰＨＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、週毎に再刺激することによって培養中に維持した。このクローンを、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ４構成物と感染させた自己ＥＢＶ−Ｂ細胞の特異的溶解について試験した。クローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３が陽性であることを見出し（図５ａ）、次の実験に用いた。
【０１５３】
ＭＡＧＥ−Ａ４エピトープは、ＨＬＡ−Ａ２分子によってＣＴＬに提示される
ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ４構成物と感染したＥＢＶ−Ｂ細胞のＣＴＬクローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３による溶解は、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体の添加により阻害されたが、抗ＨＬＡ−Ａ３または抗ＨＬＡ−Ｂ、Ｃモノクローナル抗体の添加によっては阻害されなかった。これは、ＭＡＧＥ−Ａ４エピトープがＨＬＡ−Ａ２分子により提示されることを示す。
【０１５４】
ＣＯＳ細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ４のｃＤＮＡと、ＨＬＡ−Ａ２分子をコードするプラスミドを用いて、トランスフェクションした。要約すると、マイクロウェルに分配された１．５ｘ１０４のＣＯＳ細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ４ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡＩの５０ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ２分子をコードするゲノムＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐの５０ｎｇ、および１μｌのＤＭＲＩＥＣ（Gibco BRL）を用いて、コトランスフェクションした。ＣＯＳ細胞を、８％のＣＯ２かつ３７℃で２４時間インキュベートした。これらのトランスフェクタントを、クローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３によるＴＮＦの産生を刺激する能力について試験した。要約すると、２０００のＣＴＬを、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００μｌのIscove完全培地の全体量に、トランスフェクタントを含むマイクロウェルに添加した。２４時間後、上清を回収して、そのＴＮＦ含量を、標準ＭＴＴ比色分析においてＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞における細胞毒性効果を試験することによって調べた。ＨＬＡ−Ａ２とＭＡＧＥ−Ａ４の両方とトランスフェクションした細胞が、ＣＴＬクローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３を刺激して、ＴＮＦを生じた（図５ｂ）。ＭＡＧＥ−Ａ４またはＨＬＡ−Ａ２のみとトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、ＣＴＬクローンを刺激しなかった。
【０１５５】
抗原性ペプチドの測定
クローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３によって認識されたＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドを同定するために、ＰＣＲ反応を、鋳型としてＭＡＧＥ−Ａ４ ｃＤＮＡを用い、かつ、ＭＡＧＥ−Ａ４のオープンリーディングフレームの最初のヌクレオチドからなる上流プライマーと、ＭＡＧＥ−Ａ４のオープンリーディングフレームにおいて互いに約１００−１２０ｂｐ離れた８つの下流プライマー（ＡＳ１〜ＡＳ８）（図６）を用いて行った。ＰＣＲを３０サイクルにわたって行った（９４℃で１分、６３℃で２分、かつ７２℃で３分）。これは、異なる長さのＭＡＧＥ−Ａ４の８フラグメントを増幅し（ＭＡＧＥ−Ａ４（１）からＭＡＧＥ−Ａ４（８））、長いもの（ＭＡＧＥ−Ａ４（１））は、ＭＡＧＥ−Ａ４の完全なオープンリーディングフレームを含む。ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターにリゲートし、組み換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ細胞にトランスフォームした（Topo TAクローニングキット、Invitrogen）。コロニーをＰＣＲで分析し、陽性クローンのＤＮＡを抽出し、ＨＬＡ−Ａ２分子をコードするプラスミドと共にＨｅＬａ細胞をトランスフェクションするために用いた。要約すると、マイクロウェルに分配された２ｘ１０４のＨｅＬａ細胞を、５０ｎｇのＭＡＧＥ−４Ａフラグメントを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ、５０ｎｇのＨＬＡ−Ａ２分子をコードするゲノムＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、および１μｌのリポフェクタミン（Gibco BRL）を用いてコトランスフェクションした。ＨｅＬａ細胞を３７℃で８％のＣＯ２において２４時間インキュベートした。次いで、これらのトランスフェクタントを、上述したように、クローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３によるＴＮＦの産生を刺激できる能力について調べた。挿入物Ｓ−ＡＳ１およびＳ−ＡＳ２を用いたトランスフェクションは陽性であったが、他の構成物を用いたトランスフェクションは陰性であった。これは、クローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３によって認識されるエピトープをコードする、１３０ｂｐのＭＡＧＥ−４Ａフラグメント：
TGATGGGAGGGAGCACACTGTCTATGGGGAGCCCAGGAAACTGCTCACCCAAGATTG
GGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTACCCGGCAGTAATCCTGCGCGCTA
TGAGTTCCTGTGGGGT（配列番号４３）
の同定を可能にした。
【０１５６】
この領域によってコードされるＭＡＧＥ−Ａ４タンパクの推定されるフラグメントの配列を、“http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html”から入手できるソフトウェアを用いてＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの予測のためにスクリーニングした。ペプチドGVYDGREHTV（配列番号４４）（ＭＡＧＥ−Ａ４２３０−２３９）は、最も高いスコアを有していた。それを合成し、エフェクター：ターゲット比が１０：１である細胞毒性アッセイにおいて試験した。ペプチドGVYDGREHTV（ＭＡＧＥ−Ａ４２３０−２３９）（配列番号４４）は、自己ターゲット細胞を敏感にして、クローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３によって溶解することが見出された（図５ｃ）。
【０１５７】
ＭＡＧＥ−Ａ４を発現するＨＬＡ−Ａ２細胞のＣＴＬクローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３による認識
図５ｄに示したように、ＣＴＬクローンＬＢ１１３７ Ｈ４．１３は、ＭＡＧＥ−Ａ４を発現するＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞系統ＱＵＡＲ（ＬＢ１７５１−ＭＥＬ）を溶解することができた。
【０１５８】
実施例１０
ＣＴＬクローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１に対するＨＬＡ−Ｃｗ２によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ１ペプチド
ＣＴＬクローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１の単離
ドナーＬＢ１１１８由来の樹状細胞（３ｘ１０６／ｍｌ）（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、Ａ３、Ｂ＊０８０１、Ｂ＊４００２、Ｃｗ＊０２０２２、Ｃｗ＊０７０１）を、５％ＣＯ２下で、３７℃で、ＡＡＧと１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩにおいて、感染度３０で、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染させた。２時間後、感染した樹状細胞を洗浄した。１５００００の自己ＣＤ８＋Ｔリンパ球と３００００の感染した樹状細胞とを、マイクロウェルにおいて、２００μｌの完全Iscove培地で共培養し、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ＣＤ８＋リンパ球を、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と新鮮に感染した自己樹状細胞と７日目と１４日目に再刺激し、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全Iscove培地中で増殖させた。
【０１５９】
増殖するＣＤ８＋Ｔ細胞を含むミクロ培養を、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１（ｖＰ１１８８）と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を溶解する能力について２１日目に評価した。親のワクシニア（ｖＰ１１７０）と感染したＥＢＶ−Ｂ細胞をネガティブコントロールとして使用した。感染したＥＢＶ−Ｂ細胞（ターゲット細胞）を洗浄し、エフェクター：ターゲット比が約４０：１となるようにレスポンダー細胞に添加した。未標識のＫ５６２細胞も、ナチュラルキラー活性をブロックするために添加した（Ｖ底マイクロウェル当たり５ｘ１０４）。クロム放出を、３７℃で４時間インキュベーションした後に測定した。個々のミクロ培養を、各ターゲットについて二回ずつ試験した。最初の実験では、抗ＭＡＧＥ−Ａ１反応性が、９６の内の３つのミクロ培養に検出された。１３％のミクロ培養が、未感染ターゲットではなく、ワクシニアまたはワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１のいずれかと感染したターゲットを溶解するレスポンダー細胞を含んでいた。この結果は、ＡＬＶＡＣおよびワクシニアベクターが、ＣＴＬにより認識される抗原を共有することを示す。第二の実験では、２つのミクロ培養が、抗ＭＡＧＥ−Ａ１反応性において陽性を記録した。
【０１６０】
陽性ミクロ培養（すなわち、ワクシニアＭＡＧＥ−Ａ１構成物と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を認識するもの）を、刺激細胞として、ＭＡＧＥ−Ａ１をコードするレトロウイルスを用いてトランスデュースされた自己ＰＨＡ−活性化Ｔ細胞、または、同じレトロウイルスを用いてトランスデュースされた自己ＥＢＶ−Ｂ細胞のいずれかを用いて限界希釈することによってクローン化した（９６ウェルプレートにおいてウェル当たり５ｘ１０３から１０４細胞）。同種異系のＥＢＶ−Ｂ細胞（９６ウェルプレートにおいてウェル当たり５ｘ１０３から１０４のＬＧ２−ＥＢＶ−Ｂ細胞）を、フィーダー細胞として用いた。ＣＴＬクローンを、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１構成物と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞の特異的溶解について試験した。確立されたＣＴＬクローンを、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）および０．５μｇ／ｍｌの精製されたＰＨＡ（刺激細胞の代わり）を添加した完全ＩＭＤＭ中で維持し、異種同系のＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて週毎に再刺激することによって継体した（２４ウェルプレートにおいてウェル当たり１．５ｘ１０６のＬＧ２−ＥＢＶ−Ｂ細胞）。
【０１６１】
クローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１を、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞（図７Ａ）、または、ＭＡＧＥ−Ａ１をコードするレトロウイルスを用いてトランスデユースされたＥＢＶ−Ｂを認識する陽性クローンとして同定した。
【０１６２】
ペプチドおよび提示分子の同定
ＣＴＬクローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１によりＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを提示するＨＬＡ分子を同定するために、ＣＯＳ細胞を、推定されるＨＬＡ提示分子の一つをコードするｃＤＮＡと共に、ＭＡＧＥ−Ａ１ ｃＤＮＡを用いてトランスフェクションした。次いで、これらのトランスフェクションされた細胞を、ＣＴＬクローンを刺激してＴＮＦを産生する能力について試験した。ＣＴＬクローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１は、ＭＡＧＥ−Ａ１およびＨＬＡ−Ｃｗ２を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ細胞による刺激によりＴＮＦを産生した（図７Ｂ）。このＣＴＬクローンによって認識されたＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを同定するために、８アミノ酸が重複する１２アミノ酸の一組のＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドをスクリーニングした。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を、１μＭの濃度でこれらの各ペプチドとインキュベートし、クロム放出アッセイにおいてＣＴＬによる認識について試験した。ペプチドASAFPTTINFTR（ＭＡＧＥ−Ａ１  ６１−７２）（配列番号４５）は陽性であったが、１６アミノ酸ペプチドSPQGASAFPTTINFTR（ＭＡＧＥ−Ａ１ ５７−７２）（配列番号４６）は陰性であった。ＨＬＡ−Ｃｗ２分子におけるペプチドを固定する残基について情報を利用できないので、多数の短いペプチドを試験した。ペプチドSAFPTTINF（ＭＡＧＥ−Ａ１ ６２−７０）（配列番号４７）が、自己ターゲット細胞を敏感にして、ＣＴＬクローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１により溶解する、より短いペプチドであることが見出された。半全溶解が、〜０．１ｎＭに得られた（図７Ｃ）。抗原の自然なプロセッシングは、ＭＡＧＥ−Ａ１を発現するＨＬＡ−Ｃｗ２腫瘍細胞系統のＣＴＬクローンＬＢ１１１８ ４６６／Ｄ３．３１による溶解によって示された（図７Ｄ）。
【０１６３】
実施例１１
ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ８．３３に対するＨＬＡ−Ａ２８により示されたＭＡＧＥ−Ａ１ペプチド
樹状細胞を、ドナーＬＢ１８０１から誘導した（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、Ａ２８、Ｂ＊４４０１、Ｂ＊５３０１、Ｃｗ４、Ｃｗ＊０５０１）。ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ８．３３を、実施例１０と本質的に同じ方法に従って単離した。
【０１６４】
要約すると、血液単核細胞から誘導された未熟な樹状細胞を、ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染させ、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の存在下で自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するために用いた。レスポンダー細胞を、自己樹状細胞で週に一度再刺激し、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下でＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染させた。レスポンダー細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ１をコードするワクシニアウイルス（ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１）と感染した自己ＥＢＶ−形質転換Ｂ（ＥＢＶ−Ｂ）細胞においてその溶解活性について２８日目に試験した。
【０１６５】
陽性ミクロ培養を、刺激細胞としてエルジニア−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染したＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて限界希釈した。ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ８．３３は、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を溶解した（図８Ａ）。ＣＴＬクローンＬＢ１８０１ ４５６／Ｈ８．３３は、ＨＬＡ−Ａ２８およびＭＡＧＥ−Ａ１を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞による刺激によりＴＮＦを生じた（図８Ｂ）。ペプチドEVYDGREHSA（ＭＡＧＥ−Ａ１ ２２２−２３１）（配列番号４８）は、〜０．３ｎＭのターゲット細胞の半全溶解を生じた（図８Ｃ）。ＭＡＧＥ−Ａ１とＨＬＡ−Ａ２８を発現する腫瘍細胞系統がＣＴＬによって溶解されたが、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染した細胞を用いて得られる溶解よりも低かった（図８Ｃ）。
【０１６６】
実施例１２
ＣＴＬに対するＨＬＡ−Ｂ４０により示されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド
ヒト血液の処理
ドナーＬＢ１８４１由来の血液サンプル（ＨＬＡ−Ａ３、−Ｂ３５、−Ｂ４０、Ｃｗ３、−Ｃｗ４）を、以下の事項を除いて実施例６の記載と同様に処理した。  １．ＰＢＭＣを含むインターフェースを回収し、残りの血小板を除くために、２ｍＭのＥＤＴＡを含む冷たいリン酸バッファー溶液において３回（またはそれ以上）洗浄した。
２．単核細胞誘導樹状細胞（ＤＣ）を６日目に凍結した。刺激を与える日に、ＤＣを溶かし、５００の感染度（ＭＯＩ(multiplicity of infection)）において、ＭＡＧＥ−Ａ３をコードする組み換えアデノウイルスと感染させた。
【０１６７】
ＭＡＧＥ−Ａ３に特異的なＣＴＬクローンの単離
ドナーＬＢ １８４１の血液サンプルから得られた樹状細胞をＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３と感染させ、実施例７と本質的に同じ方法に従って自己ＣＤ８＋細胞と共培養した。
【０１６８】
数回刺激した後、ミクロ培養を、ＥＢＶ−Ｂターゲット細胞の感染に用いられる前の３０秒間にわたってワクシニアサンプルを超音波処理することを除いて、実施例７と本質的に同じ方法に従って自己ターゲット細胞の特異的溶解について試験した。
【０１６９】
ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ３と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を特異的に溶解する細胞を含むと同定されたミクロ培養５２６／Ｆ７を、以下のスキームに従って、刺激細胞として、感染度３０で、組み換えＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３（ｖＣＰ１５６３）（ＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３サンプルも使用前に３０秒間超音波処理した）またはＰＨＡと感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて、限界希釈することによってクローン化した。
第一週：刺激因子＝５０ＵのＩＬ−２／ｍｌ、２．５ｎｇのＩＬ−１２／ｍｌおよび５ＵのＩＬ−４／ｍｌを添加した完全ＩＭＤＭ培地中のＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３（ｖＣＰ１５６３）感染ＥＢＶ−Ｂ細胞；
第二週：刺激因子＝５０ＵのＩＬ−２／ｍｌを添加した完全ＩＭＤＭ培地中のＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ３（ｖＣＰ１５６３）感染ＥＢＶ−Ｂ細胞；
第三週：５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した完全ＩＭＤＭ培地中のＰＨＡ（０．５μｇ／ｍｌ）；
第四週：５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７＋ゲンタマイシン（１５μｇ／ｍｌ）＋ＭＲＡ０．５ｇ／ｍｌ（ＩＣＮより）を添加した完全ＩＭＤＭ培地中のＰＨＡ（０．５μｇ／ｍｌ）；
第五および六週：刺激因子＝５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、５Ｕ／ｍｌのＩＬ−４＋ゲンタマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を添加した完全ＩＭＤＭ培地中の、エルジニア−ＭＡＧＥ−Ａ３（ａａ１４７−３１４）と感染したＥＢＶ−Ｂ細胞およびエルジニア−ＭＡＧＥ−Ａ３（ａａ１−１９９）と感染したＥＢＶ−Ｂ細胞；
第七週とその後の各週：５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、５Ｕ／ｍｌのＩＬ−４＋ゲンタマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を添加した完全ＩＭＤＭ培地中のＰＨＡ（０．２μｇ／ｍｌ）。
ＣＴＬクローンを、週毎の再刺激によって培養中に維持した。
【０１７０】
このクローンを、ワクシニア−ＭＡＧＥ−Ａ３構成物と感染した、あるいはネガティブコントロールとして親のワクシニアと感染した、自己ＥＢＶ−不死化Ｂ細胞の特異的溶解について試験した。クローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１が陽性であることを見出し（図９Ａ）、以下の実験に使用した。
【０１７１】
ＭＡＧＥ−Ａ３エピトープは、ＨＬＡ−Ｂ４０によりＣＴＬ ＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１に示される
ＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１によって認識されるＭＡＧＥ−Ａ３エピトープを示すＨＬＡ分子を同定するために、ＣＯＳ細胞を、推定されるＨＬＡ提示分子をコードするｃＤＮＡと共にＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡとトランスフェクションした。要約すると、マイクロウェルに分配された１．５ｘ１０４のＣＯＳ細胞を、５０ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＭＡＧＥ−Ａ３、５０ｎｇのＨＬＡ分子のコード配列を含むプラスミド、および１μｌのリポフェクタミン（Gibco BRL）とコトランスフェクションした。ＨＬＡコード配列を、種々の個人から単離した；特に、ＨＬＡ−Ｂ４０ ｃＤＮＡを、鋳型として腫瘍細胞系統ＨＡ−７−ＲＣＣ由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって得た。このＰＣＲ産物ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（InVitrogen）に挿入した。ＣＯＳ細胞を、３７℃かつ８％のＣＯ２において２４時間インキュベートした。これらのトランスフェクタントを、クローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１によるＴＮＦの産生を刺激する能力について試験した。要約すると、２５００のＣＴＬを、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００μｌのIscove完全培地の全体量において、トランスフェクタントを含むマイクロウェルに添加した。２４時間後、上清を回収し、そのＴＮＦ含量を、標準ＭＴＴ比色分析においてＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞における上清の細胞毒性効果を試験することによって調べた。ＨＬＡ−Ｂ４０とＭＡＧＥ−Ａ３の両方とトランスフェクションした細胞が、ＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１を刺激して、ＴＮＦを生じた（図９ｂ）。ＭＡＧＥ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ４０のみとトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、ＣＴＬクローンを刺激しなかった。
【０１７２】
抗原性ペプチドの同定
ＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１によって認識されるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを同定するために、１２アミノ酸が重複し、かつ、完全なＭＡＧＥ−Ａ３タンパク配列をカバーする１６アミノ酸の一組のペプチドをスクリーニングした。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞をこれらの各ペプチドと１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートし、ＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１による認識について、５：１のエフェクター：ターゲット細胞比でクロム放出アッセイにおいて試験した。ペプチドAALSRKVAELVHFLLL（配列番号５４）は陽性であった。このペプチドの配列を、“http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html”から入手できるソフトウェアを用いてＨＬＡ−Ｂ４０結合ペプチドの予測のためにスクリーニングした。ペプチドAELVHFLLL（ＭＡＧＥ−Ａ３ １１４−１２２）（配列番号５５）は、最も高いスコアを有していた。ＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１を用いて細胞毒性アッセイにおいて試験し、〜７ｎＭの自己ＥＢＶ−Ｂターゲット細胞の半全溶解を生じた（図９Ｃ）。
【０１７３】
ＭＡＧＥ−Ａ３を発現するＨＬＡ−Ｂ４０細胞のＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１による認識
ＣＴＬクローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１も、例えばＬＢ−４３−ＭＥＬのようなＨＬＡ−Ｂ４０陽性患者から得られたＭＡＧＥ−Ａ３を発現するメラノーマ細胞系統を溶解することができる（図９Ｄ）。一部のメラノーマ細胞、例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＳＫ−３１−ＭＥＬは、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現レベルがこれらの細胞に適切であるように見えるが、クローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１によって溶解されない。ペプチドパルス化細胞も、ＣＴＬ溶解に敏感ではない。溶解が欠如することが、これらのメラノーマ細胞におけるＨＬＡ発現のダウンレギュレーションによると思われる。なぜなら、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のＩＦＮ−γを用いた処理が、クローンＬＢ１８４１ ５２６／Ｆ７．１によるこれらの細胞の溶解を増大させたからである（ＩＦＮ−γは、一部の細胞においてＨＬＡ発現をアップレギュレートすることが知られている）。
【０１７４】
実施例１３
細胞溶解性Ｔリンパ球に対するＨＬＡ−Ｂ７分子により示されたＭＡＧＥ−Ａ１ペプチド
ヒト血液の処理
ドナーＬＢ１８０３の血液サンプル（ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３２、Ｂ７、−Ｂ６０）を、実施例１２と同様に処理した。
【０１７５】
ＭＡＧＥ−Ａ１に特異的なＣＴＬクローンの単離
ドナーＬＢ １８０３の血液サンプルから得られた樹状細胞をＡＬＶＡＣ−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染させ、培養培地に１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したことを除いて、実施例７と本質的に同じ方法に従って自己ＣＤ８＋細胞と共培養した。
【０１７６】
数回刺激した後、ミクロ培養を、ＥＢＶ−Ｂターゲット細胞の感染に用いられる前の３０秒間にわたってワクシニアサンプルを超音波処理することを除いて、実施例７と本質的に同じ方法に従って自己ターゲット細胞の特異的溶解について試験した。
【０１７７】
組み換えワクシニア（ＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ１）と感染した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を特異的に溶解する細胞を含むと同定されたミクロ培養４３８／Ｇ８を、最初の二週間の刺激に関して、刺激細胞としてエルジニア−ＭＡＧＥ−Ａ１と感染した照射自己ＥＢＶ−Ｂ細胞、フィーダー細胞として照射ＬＧ２−ＥＢＶ、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）およびゲンタマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を用いて、限界希釈によりクローン化した。ＣＴＬクローンを、ＰＨＡ（０．５μｇ／ｍｌ）、フィーダー細胞およびＩＬ−２で週毎に再刺激することによって培養に維持した。
【０１７８】
このクローンを、組み換えワクシニア（ＷＲ−ＭＡＧＥ−Ａ１）と感染した、あるいはネガティブコントロールとして親のワクシニアと感染した、自己ＥＢＶ−不死化Ｂ細胞の特異的溶解について試験した。クローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４が陽性であることを見出し（図１０Ａ）、以下の実験に使用した。
【０１７９】
ＭＡＧＥ−Ａ１エピトープは、ＨＬＡ−Ｂ７分子によりＣＴＬに示される
ドナーＬＢ１８０３は、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３２、−Ｂ７、−Ｂ６０に分類される。ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４によって認識されるＭＡＧＥ−Ａ１エピトープを示すＨＬＡ分子を同定するために、ＣＯＳ−７細胞を、推定されるＨＬＡ提示分子をコードするｃＤＮＡと共にＭＡＧＥ−Ａ１ ｃＤＮＡとトランスフェクションした。要約すると、マイクロウェルに分配された１．５ｘ１０４のＣＯＳ−７細胞を、５０ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＭＡＧＥ−Ａ１、５０ｎｇのＨＬＡ分子のコード配列を含むプラスミド、および１μｌのリポフェクタミン（Gibco BRL）とコトランスフェクションした。ＨＬＡコード配列を、種々の個人から単離した；特に、ＨＬＡ−Ｂ７ ｃＤＮＡを、鋳型として腫瘍細胞系統ＬＢ２３−ＳＡＲ由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって得た。このＰＣＲ産物をｐｃＤＳＲalphaに挿入した。トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞を、３７℃かつ８％のＣＯ２において２４時間インキュベートした。これらのトランスフェクタントを、クローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４によるＴＮＦの産生を刺激する能力について試験した。要約すると、２０００のＣＴＬを、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００μｌのIscove完全培地の全体量において、トランスフェクタントを含むマイクロウェルに添加した。２４時間後、上清を回収し、そのＴＮＦ含量を、標準ＭＴＴ比色分析においてＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞における上清の細胞毒性効果を試験することによって調べた。ＨＬＡ−Ｂ７とＭＡＧＥ−Ａ１の両方とトランスフェクションした細胞が、ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４を刺激して、ＴＮＦを生じた（図１０Ｂ）。ＨＬＡ−Ｂ７、および、ＭＡＧＥ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ４、−Ａ６、−Ａ８、−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ１１、−Ａ１２、−Ｂ１、−Ｂ２または−Ｃ２のいずれかとトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞は、ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４を刺激してＴＮＦを産生できなかった。
【０１８０】
抗原性ペプチドの同定
ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４によって認識されるＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを同定するために、８アミノ酸が重複し、かつ、完全なＭＡＧＥ−Ａ１タンパク配列をカバーする１２アミノ酸の一組のペプチドをスクリーニングした。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞をこれらの各ペプチドと２μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートし、ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４による認識について、２０：１のエフェクター：ターゲット細胞比でクロム放出アッセイにおいて試験した。ペプチドRVRFFFPSLREA（ＭＡＧＥ−Ａ１ ２８９−３００）（配列番号５６）は陽性であった。このペプチドの配列を、“http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html”から入手できるソフトウェアを用いてＨＬＡ−Ｂ７結合ペプチドについてスクリーニングした。ペプチドRVRFFFPSL（ＭＡＧＥ−Ａ１ ２８９−２９７）（配列番号５７）は、最も高いスコアを有していた。ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４を用いて細胞毒性アッセイにおいて試験し（Ｅ／Ｔ比は２０：１）、〜２０ｎＭの自己ＥＢＶ−Ｂターゲット細胞の半全溶解を生じた（図１０Ｄ）。
【０１８１】
ＭＡＧＥ−Ａ１を発現するＨＬＡ−Ｂ７細胞のＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４による認識
ＣＴＬクローンＬＢ１８０３ ４８３／Ｇ８．４も、ＭＡＧＥ−Ａ１を発現するＨＬＡ−Ｂ７メラノーマ細胞系統ＭＥ２７５クローン２を溶解することができる（図１０Ｄ）。メラノーマ細胞系統ＭＥ１９０ＤＡも、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γと７２時間処理した後のみではあるが、溶解された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  発現ベクターpMS111-MAGE-A1 (YopE130 -A1）のプラスミドマップを示す。
【図２】  組換エルシニアと混合したEBV-形質転換済ヒトＢ細胞 (HLA- A1)で、CTL 82/30を刺激する方法の手順；(B）は、活性化CTLにより放出されたIFNの定量を示す。
【図３】  HLA-Cw3により提示される抗原性ペプチドMAGE-A1の、CTLクローンLB1137 462/F3.2による特異的認識を示す。
【図４】  HLA-Cw3により提示される抗原性ペプチドMAGE-A1の、CTLクローンLB1801 456/H7.11 による特異的認識を示す。
【図５】  HLA-A2により提示される抗原性ペプチドMAGE-A4の、CTLクローンLB1137 H4.13 による特異的認識を示す。
【図６】  MAGE-A4核酸配列(配列番号: 49)、及び実施例９に記載のようにＰＣＲで使用されるプライマーを示す。
【図７】  HLA-Cw2からCTLクローンLB1118 466/D3. 31へ提示されるMAGE-A1を示す。
（A）ワクシニア-MAGE-A1に感染した自己EBV細胞のCTLクローンLB1118 466/D3.31による溶解。標的細胞は、MOIを20にして２時間感染し、51Ｃｒで標識し、そしてCTLクローンLB1118 466/D3.31と4 時間インキュベートした。親のワクシニアで感染させた標的を陰性対象として使用した。
（Ｂ）MAGE-A1のｃＤＮＡ及びHLA-Cw2をコードするｃＤＮＡで一過性に形質移入したCＯＳ-7細胞による、CTLクローンLB1118 466/D3.31の刺激。形質移入の１日後、1500の CTL クローン LB1118 466/D3.31 を、1.5x104の形質移入済COS-7細胞が含まれるマイクロウェルに添加した。TNF産生は、一晩の共培養後に、上清の毒性を、WEHI-164クローン13のTNF-感受性細胞で試験して推定した。
（Ｃ）合成ペプチドSAFPTTINF（配列番号: 47) (MAGE-A1 62- 70)でインキュベートした自己EBV-Ｂ細胞の、CTL クローンLB1118 466/D3.31による溶解。標的を52Ｃｒで標識し、CTLと４時間、エフェクター対標的比を5：1として、表示の濃度のペプチド存在下でインキュベーションした。
（Ｄ）CTLクローンLB1118 466/D3.31による、HLA-Cw2腫瘍細胞株の溶解。標的細胞を51Ｃｒで標識し、そして種々のエフェクター対標的比でCTL クローン LB1118 466/D3. 31と４時間インキュベートした。
【図８】  HLA-A28からCTLクローンLB1801 456/H8.33へ提示されるMAGE-A1ペプチド を示す。
（A）ワクシニア-MAGE-A1で感染した自己EBV-Ｂ細胞の、CTLクローンLB1801 456/H8. 33による溶解。標的細胞を、ＭＯＩを２０にして2時間感染させ、51Crで標識し、そしてCTL クローンLB1801 456/H8.33と4時間インキュベートした。親のワクシニアで感染させた標的を、陰性対照として使用した。
（Ｂ）MAGE-A1のｃＤＮＡ及びHLA-A28をコードするｃＤＮＡで形質移入したＣＯＳ-７細胞による、CTLクローンLB1801 456/H8.33の刺激。形質移入１日後、1500の CTLクローンLB1801 456/H8.33を、1. 5x104の形質移入済COS-7細胞が含まれるマイクロウェルへ添加した。TNF産生は、 一晩の共培養後に、上清の毒性を、WEHI-164クローン13のTNF-感受性細胞で試験して推定した。
（Ｃ）合成ペプチド EVFDGREHSA（配列番号: 48) （MAGE-A1222-231)とインキュベートした自己EBV-Ｂ細胞の、CTLクローンLB1801 456/H8.33による溶解。標的を51Ｃｒで標識し、そしてCTL クローンLB1801 456/H8. 33と４時間、エフェクター対標的比を5:1として、表示の濃度のペプチド存在下でインキュベートした。
（Ｄ）CTLクローンLB1801 456/H8.33による、HLA-A28メラノーマ株の溶解。標的細胞を51Ｃｒで標識し、CTLクローンLB1801 456/H8. 33と、種々のエフェクター対標的比で4 時間インキュベーションした。
【図９】  MAGE-A3ペプチドは、CTL クローンLB1841 526/F7.1へ、HLA-B40により提示される。
（Ａ）CTLクローンLB1841 526/F7.1による、ワクシニア-MAGE-A3に感染した自己EBV-Ｂ細胞の溶解。
（Ｂ）MAGE-A3のcDNA及び表示のHLA分子をコードするｃＤＮＡで一過性に形質移入したCOS-7細胞による、CTLクローンLB1841 526/F7.1の溶解。
（Ｃ）CTL クローンLB1841 526/F7.1による、合成ペプチドAELVHFLLL (配列番号 : 55）（MAGE-A3 114-122)とインキュベートした自己EBV-Ｂ細胞の溶解。
（Ｄ）CTLクローンLB1841 526/F7.1による、HLA-B40メラノーマ細胞の溶解。
【図１０】  MAGE-A1ペプチドは、CTLクローンLB1803 483/G8. 4へ、HLA-B7により提示される。
（Ａ）CTLクローンLB1803 483/G8.4による、ワクシニアの-MAGE-A1で感染した自己EBV-Ｂ細胞の溶解。
（Ｂ）MAGE-A1のｃＤＮＡ及び表示のHLA分子をコードするｃＤＮＡ で一過性形質移入されたCOS細胞による、CTLクローンLB1803 483/G8. 4の刺激。
（Ｃ）合成ペプチドRVRFFFPSL (配列番号 : 5)（MAGE-A1 289-297)とインキュベーションした自己EBV-Ｂ細胞の、CTL クローンLB1803 483/G8. 4による溶解。
（Ｄ）CTLクローンLB1803 483/G8.4による、HLA-B7メラノーマの溶解。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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