(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に金属含有粒子が固定されている化学センサ素子の製造方法であって、
金属含有粒子及び誘電体粒子を分散させた分散液を調整する工程と、
前記分散液を基板に接触せしめて、前記金属含有粒子と前記誘電体粒子を前記基板上に固定する工程と、
前記基板上に固定された金属含有粒子と誘電体粒子とを前記分散液から分離する工程と、
前記基板上に固定された誘電体粒子を除去する工程、
を有する化学センサ素子の製造方法。
【請求項２】
前記金属含有粒子は、直径が１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、前記誘電体粒子は、直径が１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の化学センサ素子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学センサ素子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、金属微粒子に抗体あるいは抗原を吸着させておき、その抗原あるいは抗体と抗原抗体反応させ、局在表面プラズモン共鳴を利用してその前後の変化を見る測定方法が知られている。例えば、特許文献１には、局在表面プラズモン共鳴をラマンスペクトル及びラマン錯乱光強度により検出する方法が開示されている。この方法では、金属微粒子の微粒子表面に予め抗体を吸着させたものに測定対象物質の抗原を添加し、抗原抗体反応を起こさせて免疫複合体を形成させた状態のラマンスペクトルから、生成した免疫複合体を同定することができる。さらに、免疫複合体が吸着した金属微粒子表面のラマン散乱光強度から添加した目的物質の定量を行なうことができることが開示されている。
【０００３】
一方、本発明に応用可能であるバイオセンサは、生体や生体分子の持つ優れた生体分子認識能を利用した計測デバイスであり、近年、医療分野のみならず、環境や食料品等への幅広い応用が期待されている。
【０００４】
一般的に、バイオセンサは、測定対象とする物質（以下、標的物質と記載）を認識、捕捉する捕捉体と、その時発生する物理的、化学的な変化を検知し、電気信号、光信号等の検出可能な信号へ変換する検出素子と、から構成される。生体内には、互いに親和性のある物質の組み合わせとして、例えば酵素−基質、抗原−抗体、ＤＮＡ−ＤＮＡ等がある。バイオセンサではこれらの組み合わせの一方を基材に配置もしくは担持し、捕捉体成分として用いることによって、もう一方の物質を選択的に計測できるという原理を利用している。また、検出素子としては、酸素電極、過酸化水素電極、イオン電極、ＩＳＦＥＴ、サーミスタなど様々な形式のものが提案されており、最近ではナノグラム程度の質量変化が検知できる水晶振動子やＳＡＷ素子などが使われる場合もある。
【０００５】
局在表面プラズモン共鳴を利用した測定法は、蛍光色素などの標識分子が必要でないためアッセイの構成が簡単であること、また、金属微粒子表面への吸着反応の過程を直接リアルタイム・モニタリングできること、などの特長を有している。そのため、局在表面プラズモン共鳴を利用した測定法は、各種のアッセイへの適用が期待されている。そのような例として、抗原抗体反応の特異性を利用したイムノ・アッセイ等のアフィニティ・アッセイなどが挙げられる。
【０００６】
特許文献２には、アフィニティ・アッセイに効果的に利用できるセンサ素子として、基板上に複数の金属微粒子が固定されており、これらの金属微粒子のプラズモン共鳴を用いて媒質の屈折率を検出する局在プラズモン共鳴センサが開示されている。
【特許文献１】特開平７−１４６２９５号公報
【特許文献２】特許第３４５２８３７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、基板上に金属微粒子が固定された構成の局在表面プラズモン共鳴を利用するセンサ素子では、基板上に金属含有微粒子を固定してセンサ素子を作製する工程において、洗浄あるいは乾燥させる際に金属含有微粒子間で凝集したり、あるいは極端に不均一な密度で基板に配置される場合がある。また、上記センサ素子を用いたアッセイ検出時の洗浄あるいは乾燥の際にも金属含有微粒子間で凝集する場合がある。その結果、センサとしての検出感度が著しく低下する場合がある。すなわち、上述の金属含有粒子間の凝集にかかる問題は、局在表面プラズモン共鳴を利用した測定法の用途拡大への大きな課題である。
【０００８】
また、金属含有粒子の濃度を高くするとより凝集しやすくなるという傾向がある。その結果、基板上に金属含有粒子を高密度に配置するこが困難な場合があった。
【０００９】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、その目的は、局在表面プラズモン共鳴を利用した十分な検出感度を得られる化学センサ素子、及びそのような化学センサ素子の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、基板上に金属含有粒子が固定されている化学センサ素子の製造方法であって、金属含有粒子及び誘電体粒子を分散させた分散液を調整する工程と、
前記分散液を基板に接触せしめて、前記金属含有粒子と前記誘電体粒子を前記基板上に固定する工程と、
前記基板上に固定された金属含有粒子と誘電体粒子とを前記分散液から分離する工程と、
前記基板上に固定された誘電体粒子を除去する工程、
を有する化学センサ素子の製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、金属含有粒子と誘電体粒子を混合して基板に固定することにより、金属含有粒子間同士の凝集を軽減させ、かつ金属含有粒子が均一な密度に制御された状態で基板上に配置されることが可能となる。その結果、本発明にかかる化学センサ素子は十分な検出感度を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明に含まれる各態様について詳細に説明する。
（化学センサ素子構成）
本発明にかかる化学センサ素子は、基板と金属含有粒子と誘電体粒子とを備え、この２種の粒子が基板上に配置されている。金属含有粒子は、好ましくは、均一な密度で基板上に配置されることが好ましい。
【００１４】
この化学センサ素子は、局在表面プラズモン共鳴法を用い、液状検体の特性を検出することが可能である。液状検体の特性の検出は、化学センサ素子に固定された金属含有粒子周辺の屈折率を検出することで行なう。よって、特定の物質（標的物質）と特異的に親和性を有する物質（標的物質捕捉体）を金属含有粒子に固定したセンサ素子を用いると、液状検体に含まれる特定の物質（標的物質）を金属含有粒子表面に保持することで、金属含有粒子表面の屈折率が変化する。すなわち、本発明にかかる化学センサ素子は液状検体に含まれる特定の物質（標的物質）の検出に好適に用いることができる。
【００１５】
金属含有粒子の直径は、局在プラズモン共鳴を起こし、かつ分散液中に金属含有粒子が分散することが可能である範囲で選択でき、好ましくは１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である。
【００１６】
金属含有粒子に含まれる金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、及びこれらの２種以上からなる合金を挙げることができ、金属含有層は、これらの１種以上を含むことができる。これらの金属で構成される粒子は局在表面プラズモン共鳴を起こす。また、金属含有粒子に含まれる金属以外の材料としては、例えば、シリカなどの無機材料、あるいはポリスチレンなどの有機材料が挙げられる。
【００１７】
誘電体粒子の直径は、分散液中に誘電体粒子が分散することが可能である範囲で選択でき、好ましくは１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である。
【００１８】
誘電体粒子に利用できる材料としては、非導電性材料からなるものであればどのようなものでもよく、例えば、シリカ、ポリスチレン、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）などが挙げられる。
【００１９】
金属含有粒子と誘電体粒子の直径は異なっていてもよい。すなわち、図１のように金属含有粒子の直径より誘電体粒子の直径が大きくてもよい。粒子の分散液除去の際、誘電体粒子が存在することにより、金属含有粒子同士の凝集を防ぐことができる。
【００２０】
また、図２のように金属含有粒子の直径より誘電体粒子の直径が小さくてもよい。この場合、液状検体中に含まれる分子が金属含有粒子に接触しやすい。
【００２１】
化学センサ素子に用いることを考えると、金属含有粒子の直径および誘電体粒子の直径は１ｎｍ以上であることが好ましい。また、金属含有粒子と誘電体粒子を容易に分散させるためには、それらの直径は１０００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００２２】
基板の材料としては、光学的に透明な、ガラス基板、石英基板、ポリカーボネートやポリスチレンなどの樹脂基板などを用いることができる。すなわち、局在表面プラズモン共鳴法による検出を可能とする基板であればよい。
【００２３】
光学的に透明な基板としては、測定に使用する波長において、吸光度が３０％以下であることが好ましい。
【００２４】
基板表面は、金属含有粒子との親和性を高くする、あるいは金属含有粒子および誘電体粒子の表面に化学修飾された官能基と共有結合を形成するために、官能基で修飾してあってもよい。基板表面を修飾する官能基としては、例えばアミノ基、チオール基、カルボキシル基等が挙げられる。
【００２５】
本発明の化学センサ素子を標的物質の検出に用いる場合、化学センサ素子は、標的物質と特異的な親和性を有する標的物質捕捉体を有し、この標的物質捕捉体が金属含有粒子の表面に固定されている構成であるものを好適に用いることができる。
（化学センサ素子の製造方法）
上記の構成の化学センサ素子の製造方法を説明する。
【００２６】
本発明にかかる化学センサ素子の製造方法は、金属含有粒子及び誘電体粒子を分散させた分散液を調整する工程と、前記分散液を基板に接触せしめて、前記金属含有粒子と前記誘電体粒子を前記基板上に固定する工程と、前記基板上に固定された金属含有粒子と誘電体粒子とを前記分散液から分離する工程と、を有する。
【００２７】
金属含有粒子及び誘電体粒子を分散させる分散媒としては水を好適に用いることができる。また、ＤＭＦなどの有機溶媒を分散媒として用いてもよい。
【００２８】
分散液中の２種の粒子は、それぞれ均一に分散している必要がある。金属含有粒子を分散液中に分散させるためには、金属含有粒子の直径が１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。誘電体粒子を分散液中に分散させるためには、誘電体粒子の直径が１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。また、２種の粒子を分散液中において分散させるために、界面活性剤などを分散液に添加、ｐＨの調整などをしてもよい。界面活性剤としては例えばＴｗｅｅｎ２０を挙げることができる。また、金属含有粒子の表面が金で構成される場合は、分散を促進させるための成分としてクエン酸を好適に用いることができる。
【００２９】
また、基板上に配置する前の分散液中において、金属含有粒子は分散状態にしておく。
【００３０】
金属含有粒子の基板への配置密度は、分散液中の金属含有粒子の濃度、または誘電体粒子の濃度により調整することができる。例えば粒子を基板上に配置する際に分散液中の金属含有粒子の濃度を下げる、誘電体粒子の濃度を上げる、または金属含有粒子の濃度を下げかつ誘電体粒子の濃度を上げる、ことにより金属含有粒子の基板上での配置密度を下げることが可能となる。また、粒子を基板上に配置する際に分散液中の金属含有粒子の濃度を上げる、誘電体粒子の濃度を下げる、または金属含有粒子の濃度を上げかつ誘電体粒子の濃度を下げる、ことにより金属含有粒子の基板上での配置密度を上げることができる。すなわち、図３のように基板上の金属含有粒子の配置密度が高い場合から、図４のように配置密度が低い場合まで、金属含有粒子の配置密度を制御することができる。このように配置密度を制御することにより化学センサ素子の検出感度を向上させることが可能となる。
【００３１】
基板に固定された金属含有粒子と誘電体粒子とを分散液から分離するとは、分散液から基板を取り出す、あるいは分散液と基板を接触させる容器より分散液を除く等の操作により、分散液と基板との接触を断つことである。
【００３２】
分散液から分離された基板には洗浄および乾燥を適宜おこなう。
【００３３】
本発明にかかる化学センサ素子の製造方法は、上記の製造方法で金属含有粒子及び誘電体粒子を基板上に固定した後に、誘電体粒子を除去する工程、を更に有してもよい。誘電体粒子を除去する方法としては、プラズマアッシングを好適に用いることができるが、これに限定されない。プラズマアッシングにより分解可能な誘電体粒子の材料としては例えば、ポリスチレンなどの有機材料が挙げられる。
【００３４】
金属含有粒子に標的物質捕捉体を固定する方法は、標的物質捕捉体の捕捉能を損なわない方法であればいずれの方法でもよく、例えば、標的物質捕捉体がチオール基、ジスルフィド基、アミノ基等の金属と親和性の良い官能基を有する場合は直接固定することができる。または、カップリング剤を介して固定してもよく、例えば、金属粒子の表面が金であり、標的物質捕捉体がアミノ基と親和性のある官能基を有する場合、両末端にアミノ基とチオール基を有するアミノエタンチオールを用いることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）
基板として、アミノ基修飾されたポリスチレン（住友ベークライト社製）、金属含有粒子として直径１００ｎｍの金微粒子（ＢＢＩ社製）、誘電体粒子として直径１００ｎｍのカルボキシル基修飾されたポリスチレンビーズ（テクノケミカル社製）を用いる。
【００３６】
金微粒子（５．６×１０9個／ｍｌ）及びポリスチレンビーズ（５．６×１０9個／ｍｌ）を含む分散液を純水で調整する。基板を分散液中に浸し、２４時間静置し、微粒子を基板上に配置する。配置後、基板を純水で洗浄し、洗浄後、窒素ブローにて乾燥させる。これを化学センサ素子として用いる。また、金微粒子濃度を５．６×１０8個／ｍｌ以上５．６×１０9個／ｍｌ以下の範囲、ポリスチレンビーズ濃度を５．６×１０8個／ｍｌ以上５．６×１０9個／ｍｌ以下の範囲で変化させた場合においても化学センサ素子を製造することができる。
（実施例２）
基板として、アミノ基修飾された石英ガラス（信越化学社製）、金属含有粒子として直径１００ｎｍの金微粒子（ＢＢＩ社製）、誘電体粒子として直径１００ｎｍのカルボキシル基修飾されたポリスチレンビーズ（テクノケミカル社製）を用いる。
【００３７】
金微粒子（５．６×１０9個／ｍｌ）及びポリスチレンビーズ（５．６×１０9個／ｍｌ）を含む分散液を純水で調整する。基板を分散液中に浸し、２４時間静置し、粒子を基板上に配置する。配置後、基板を純水で洗浄し、洗浄後、窒素ブローにて乾燥させる。乾燥後、プラズマアッシングによりポリスチレンビーズを除去する。これを化学センサ素子として用いる（図５）。また、金微粒子濃度を５．６×１０8個／ｍｌ以上５．６×１０9個／ｍｌ以下の範囲、ポリスチレンビーズ濃度を５．６×１０8個／ｍｌ以上５．６×１０9個／ｍｌ以下の範囲で変化させた場合においても化学センサ素子を製造することができる。
（比較例１）
基板として、アミノ基修飾されたポリスチレン（住友ベークライト社製）、金属含有粒子として直径１００ｎｍの金微粒子（ＢＢＩ社製）を用いている。
【００３８】
金微粒子（５．６×１０9個／ｍｌ）の分散液を純水で調整する。基板を分散液中に浸し、２４時間静置し、微粒子を基板上に配置する。配置後、基板を純水で洗浄し、洗浄後、窒素ブローにて乾燥させる。この場合、半数程度の化学センサ素子において、金微粒子同士での凝集が生じ、金微粒子が凝集した化学センサ素子は、検出感度が著しく低下する。金微粒子の凝集は目視による色の変化、光学顕微鏡あるいはＳＥＭなどを用いた観察により確認することができる。
（実施例３）
実施例１、実施例２及び比較例１で作製できる化学センサ素子を用いて以下のように液状検体中に存在する標的物質を検出することができる。
【００３９】
金微粒子の表面に捕捉能を付与するため、本実施例で用いる標的物質捕捉体である抗ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体を金表面に固定する方法を示す。本実施例の金属含有粒子の材質である金と親和性の高いチオール基を持つ、１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄのエタノール溶液中に素子上を浸漬し、前記構造体表面を修飾する。これにより、構造体表面にカルボキシル基が露出される。その状態で、Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（同仁化学研究所社製）水溶液と１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学研究所社製）水溶液中に同様に素子を浸漬する。これにより、構造体表面にスクシンイミド基が露出される。さらに、ストレプトアビジンを結合させることにより、金表面がストレプトアビジンで修飾される。このストレプトアビジンにビオチン化した抗ＡＦＰ抗体を固定させる。
【００４０】
以下の操作により、特異的に検体中のＡＦＰ濃度を測定することができる。
（１）化学センサ素子に標的物質であるＡＦＰを含んだ検体を接触させ、ＡＦＰを金微粒子上に捕捉させる。
（２）検体を除去し、リン酸緩衝液を用いて、金微粒子を洗浄する。
（３）最後にリン酸緩衝液を金微粒子に接触させ、金微粒子の吸収スペクトルを測定する。
【００４１】
吸収スペクトルについて反応前と反応後を比較すると、図６に１例を示すように、特異的な抗原抗体反応によって標的物質が検出素子表面に結合することで吸収スペクトルがシフトする。ここで、吸収スペクトルのピーク強度、あるいはピーク波長のシフト量とＡＦＰ濃度の相関は、あらかじめ既知のＡＦＰコントロール溶液により求められており、濃度未知の検体の微量ＡＦＰ濃度を求めることができる。
【００４２】
実施例１及び２の化学センサ素子においてはＡＦＰ濃度を求めることができるが、比較例３の金微粒子が凝集した化学センサ素子においてはＡＦＰ濃度を求めることができない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の実施の形態における化学センサ素子の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の実施の形態における化学センサ素子の一例を示す模式図である。
【図３】本発明の実施の形態における化学センサ素子の一例を示す模式図である。
【図４】本発明の実施の形態における化学センサ素子の一例を示す模式図である。
【図５】実施例２の化学センサ素子を示す摸式図である。
【図６】実施例３の検出スペクトル（吸収スペクトル）の変化の一例である。
【符号の説明】
【００４４】
１  基板
２  金属含有粒子
３  誘電体粒子
４  石英ガラス
５  金微粒子
【図１】
0004810304.tif 000002
【図２】
0004810304.tif 000003
【図３】
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【図４】
0004810304.tif 000005
【図５】
0004810304.tif 000006
【図６】
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