(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コイ血液から赤血球を単離し、赤血球から赤血球膜を調製した後に、Lithium3,5-Diiodosalicylate又は、Lithium
Dodecyl Sulfateの２つの群からなるリチウム塩と、フェノール及びストレプトマイシン水溶液を用いることによって、グリコホリンを抽出・精製し、更にグリコホリン中の結合糖鎖を遊離させ、精製することを特徴とするコイグリコホリン及び結合糖鎖の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性オリゴ糖、およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの赤血球は無核であり、溶血などの操作で比較的簡単に血球膜が単離できる。そのため生体膜の材料としてよく研究が行われているが、哺乳類以外の鳥類や魚類の赤血球膜の研究は非常に少ない。その理由としてこれらの赤血球は有核であり、赤血球膜から核を除去する操作が困難を伴うからである。ヒトの赤血球膜中の糖タンパク質であるグリコホリンは１９６０年代から研究されているが、哺乳類以外では鳥類で若干行われたにすぎず、しかも検出が困難であるとされている。
【０００３】
魚類の場合は上述の理由と血液採取の困難さから、殆ど行われていないが、唯一ドイツMax-Planck研究所のRudloff博士のグループがニジマス血球膜中の糖タンパク質であるバンド３の研究を行っている。しかしながら、グリコホリンは検出が困難であったため、その存在は知られていなかった。ヒトグリコホリンは、病原性ウィルスの受容体、レクチンへの接着能など生体防御機能や血液型決定基などの種々の生理活性を有していると云われている。本発明者は、もし魚類赤血球膜にもグリコホリン様の物質が存在すれば、ヒトグリコホリンと同様の生理機能を持つ可能性があり、魚病の防止や抗生物質に頼らない新規な薬物の開発にもつながるのではないかと考えた。
【０００４】
特に、食の安全性やプロバイオティクスが注目されている現在において、抗生物質などの人工的な合成抗菌剤を用いて薬物残留の問題を引き起こすよりも、生体内由来の抗生物質が開発できれば問題解決につながると思われる。
古来より、コイの血液は日本の民間療法でも用いられており、何らかの生体防御機能が期待できる（例えば、特開2002-308789）。
【特許文献１】特開２００２−３０８７８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、コイ血液からの作用本体の分離精製については、従来には全く試みられていなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、コイ血液中から分離精製された抗菌活性物質を提供すること、及びその精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
【０００６】
本発明者は、鋭意検討に基づき、コイ赤血球膜に存在するグリコホリン及びその結合糖鎖を分離精製することに成功し、加えて、グリコホリン及びグリコホリンに含まれる多糖類に抗菌活性があることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明者は、コイ赤血球膜の調製を試み、コイの赤血球膜の調製法を確立した。ついで、コイ赤血球膜中の膜構成タンパク質をSDS-PAGEで検出したところ、主要な膜構成タンパク質の分子量および含有量はほぼヒトと同様であることを確認した。
次に、赤血球膜から糖タンパク質を検出したところ、コイ赤血球膜にはヒトと同様グリコホリンが存在していた。コイにおける主要なグリコホリンは電気泳動上でバンド３とほぼ同様の移動度を示したことから、これらのグリコホリンは移動度で観るとヒトグリコホリンＡの２量体(PAS-1)に相当すると判断した。
【０００７】
ここでコイでは主要なグリコホリンが１種類のみ検出されたこと、またコイの血液採取が比較的容易であること、さらに日本の民間療法でも古来からコイの血液が用いられており何らかの生体防御機能が期待できると考え、コイ血液中のグリコホリンの抽出・単離およびその生理活性探索を試みた。
そこで、単離されたコイグリコホリンの血液型活性を検討し、更に糖鎖に含まれているシアル酸の同定および中性糖・アミノ糖の分析を行い、併せて糖鎖の単離・精製を行った。また、コイグリコホリンを用いて魚病性細菌を含む数種の細菌と反応させ、相互作用を凝集反応や電子顕微鏡で観察した。さらに、グリコホリンや糖鎖画分を用いて、感受性ディスク法で抗菌活性を検討した。
【０００８】
こうして、上記課題を解決するための抗菌性オリゴ糖には、ＧａｌＮＡｃと、Ｇａｌと、Ｇｌｃと、Ｆｕｃと、シアル酸であるＮＧＮＡとを含むオリゴ糖がある。
ＧａｌＮＡｃとは、Ｎ−アセチルガラクトサミンを意味しており、ムチン型糖鎖（Ｏ結合型糖鎖（O-linked
sugar chain））として、タンパク質のセリン(Ser)又はスレオニン(Thr)に結合することができる。
Ｇａｌとはガラクトースを、Ｇｌｃとはグルコースを、Ｆｕｃとはフコースを、ＮＧＮＡとはシアル酸の一種であるＮ−グリコリルノイラミン酸をそれぞれ意味する。
ヒトグリコホリンは、血液型活性を有するが抗菌活性は知られていない。しかしながら、本発明者の検討によれば、驚くべきことに、コイ赤血球膜に含まれるグリコホリンには、弱い血液型活性とともに、グリコホリンに結合している糖鎖由来の抗菌活性があることが確認された。この抗菌オリゴ糖に含まれる糖類としては、上記５種類のものである。
【０００９】
上記５種類の糖類の結合順序、結合位置については、特に拘らないが、ＧａｌＮＡｃとＧａｌとが結合し、更にＧａｌ側にＧｌｃとＦｕｃが結合していることが好ましい。ＧａｌＮＡｃは、ムチン型糖鎖を構成する際に、四種類のコア構造（コアＩ〜コアＩＶ）を取ることが知られている。本発明の抗菌性多糖類は、このうちのコアＩ構造（Ｇａｌ→ＧａｌＮＡｃ→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）によって、タンパク質と結合していることが明らかとなった。このため、ＧａｌＮＡｃとＧａｌとが結合し、Ｇａｌ側にＧｌｃとＦｕｃとＮＧＮＡとが結合するという構造を取ることが好ましい。更に、ＮＧＮＡは、最外位置に配置することから、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−（Ｇｌｃ，Ｆｕｃ）−ＮＧＮＡ、又は  ＮＧＮＡ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−（Ｇｌｃ，Ｆｕｃ）という構造が好ましい。
【００１０】
本発明は、コイグリコホリン及び結合糖鎖の精製方法であって、コイ全血から赤血球を単離し、赤血球膜を調製した後に、リチウム塩とフェノール更には核酸除去剤を用いることによって、グリコホリンを精製し、更にグリコホリン中の結合糖鎖をグリコホリンから遊離させ、得られたオリゴ糖を脱塩・精製することを特徴とする。
リチウム塩には、例えば、Lithium 3,5-Diiodosalicylate（LIS）、Lithium
Dodecyl Sulfate（LDS）などが例示されるが、これらの中でLithium 3,5-Diiodosalicylate(LIS)を用いることが好ましい。赤血球膜中のタンパク質を可溶化した後に、フェノール処理を施すことでグリコホリンを抽出することができる。さらにストレプトマイシン水溶液を用いて、混在した核酸を除去し、グリコホリンを精製することができる。
このように本発明によれば、従来には単離精製することが困難であったコイグリコホリン及び、コイグリコホリンから遊離した抗菌性オリゴ糖を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【実施例】
【００１２】
＜実施例１：コイ赤血球の単離＞
供試魚として、三重県津市の活魚店より購入した平均体重約1,000gのコイ(Cyprinus carpio)を用いた。赤血球の単離精製には、ファルマシア（Pharmacia）製Ficoll-Paqueを用いた。また、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Dithiothreitol(DTT)、Coomassie brilliant blue R-250はフルカ（Fluka）製、Bromophenol blue(BPB)、SDS電気泳動用分子量標品は Sigma製、他の試薬は全て和光純薬工業製の生化学用または特級を用いた。
【００１３】
水槽に飼育しているコイ(約1,000g)を200 ppm のMS-222(m-aminobenzoic acid ethyl-ester methanesulfonate)溶液に5分間薬浴させた後、ヘパリン処理をしたシリンジを用いて背部動脈より血液を採取した。得られた血液約 30 ml(5匹分)を直ちに魚類リンゲル液(145 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mM MgSO4,10 mM KCl, 10 mM Hepes, 5 mM Glucose, pH 7.9)で等倍に希釈した後、Ficoll-Paque に重層し、400 x gで 40分間 室温で遠心分離した。上層および中層に存在する血漿および白血球を除去し、下層の赤血球のみを採取した。得られた赤血球を魚類リンゲル液に再度懸濁し、700 x g で 5 分間の遠心分離を行い洗浄した。この操作を3回繰り返した。
【００１４】
＜実施例２：赤血球から赤血球膜の調製＞
以下の操作は特記しない限り、全て 4℃で行った。前節で得られた赤血球を 15〜20倍量の氷冷水に攪拌しながら加え、溶血させた。溶血液に最終濃度 0.15 mM になるように PMSF(phenylmethansulfonyl fluoride)を添加し、氷冷しながら 5分間放置した。さらに Potter 型ホモジナイザーでホモジナイズ（10往復）した後、緩衝液 A (12.5 mM MgCl2 および 15 mM EDTA含有, 75 mM Tris-HCl緩衝液, pH 7.5)を等量加え、さらに最終濃度0.15 mMになるように PMSFを添加した。次に血球懸濁液を 40,000 x g で 25分間遠心し、得られた沈殿に 2倍希釈した緩衝液 A および PMSFを加えて同様にホモジナイズした後、スイング式ローターを用いて 1,400 x g で 2分間遠心分離した。
【００１５】
上澄液を回収した後、沈殿を同様の方法でホモジナイズし、遠心分離を行った。この操作を3回繰り返し、核酸を除去した。 4回の操作で得られた上澄液を集め、40,000 x g で 25分間 遠心分離した。得られた沈殿を分取して 50 mlの緩衝液 A に懸濁後、ホモジナイズした。さらに懸濁液 約25 mlを 20 mlのショ糖層(10 mM Tris-HCl緩衝液、40%ショ糖および 10 mM MgCl2含有、pH 7.5)に重層し、スイング式ローターを用いて 2,000 x g で 15分間 遠心分離した。上層および中層を採取した後、40,000 x g で 25分間 遠心分離を行った。得られた沈殿を緩衝液 B (2 mM EDTA含有、20 mM Tris-HCl 緩衝液、PH 7.5)で懸濁し、これを赤血球膜調製液として -80℃で保存した。
【００１６】
＜実施例３：赤血球膜からグリコホリンの抽出＞
コイ赤血球膜からLIS-フェノール法に従ってグリコホリンを抽出した。すなわち、実施例２で得られた赤血球膜調製液
約50 mlに 0.3 M Lithium 3,5-Diiodosalicylate(LIS)含有 0.05 M Tris-HCl 緩衝液、pH7.5 を、タンパク質量が約25 mg/ml となるように加えて懸濁した後、ホモジナイズ(10往復)し、室温で5〜10分間 攪拌した。懸濁液に2倍量の蒸留水を加え、さらに 4℃で30分間 攪拌した。以下の操作は全て4℃で行った。
懸濁液を 45,000 x g で 90分間 遠心分離し、得られた上澄液に 等量の 50%(w/w)フェノール水溶液を加え、15分間激しく振盪した。振盪後、4,000 x g で60分間 遠心分離し、中間層が混入しないように上層を採取し、蒸留水に対して 24時間以上透析した。透析内液を凍結乾燥した後、氷冷した 100%エタノールを加え、1〜2時間 攪拌した。生じた懸濁物を 18,000 x gで20分間 遠心分離して採取し、得られた沈殿に100%エタノールを添加した。攪拌後、18,000 x gで20分間の遠心分離を行い、エタノールを除去した。同様の洗浄操作を再度繰り返し、得られた沈殿を少量の蒸留水で溶解した。次に残存する核酸を除去するため、5%硫酸ストレプトマイシン溶液を数滴添加後再度遠心分離して上澄液を採取し、蒸留水に対して一晩以上透析した。透析内液中に生じた沈殿を 10,000 x gで30分間 遠心分離して除去し、上澄液をグリコホリン標品とした。
【００１７】
＜実施例４：電気泳動法＞
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法については、試料調製液には4% SDS, 20% Glycerol, 160mM DTT, 0.2mg/ml BPB, 25mM Tris-HCl, pH6.8を用い、泳動条件として 0.1% SDSを含む 8.5% スラブゲルを用い、通電 15 mAで行った。また、タンパク質の染色は Coomassie brilliant blue R-250 (CBB)を用い、糖タンパク質の染色は PAS（Periodic acid Schiff stain）染色を行った。
【００１８】
＜実施例５：各種定量法＞
タンパク質は Lowry法に従って測定した。標準物質として牛血清アルブミンを用いた。シアル酸の定量は、過ヨウ素酸-レソルシノール法を用い、反応後 630 nmの吸光度を測定した。標準物質として、NANA(N-アセチルノイラミン酸)を用いた。中性糖の測定は、フェノール硫酸法を用いた。
【００１９】
＜実施例６：アミノ酸分析＞
グリコホリンのアミノ酸組成を、Moore と Stein のニンヒドリン分解法に従い、ATTO MLC-203型 アミノ酸自動分析機を用いて分析した。タンパク質の加水分解は 6N HCl(低沸点)を用い、110℃ 24時間加熱で行った。標準物質として アミノ酸混合標準液H型(和光)を用いた。
【００２０】
＜実施例７：シアル酸の分取・同定＞
コイグリコホリン 160μg に 1 mlの 0.01 N HClを加えて N2ガス下で80℃ 50分間反応させ、シアル酸を遊離させた。反応液を 1M 酢酸を用いて氷冷下で中和した後、水に対して24時間透析を行った。得られた透析外液を Dowex 1 x 8カラムに負荷した後、1.1M ギ酸塩緩衝液、pH 4.6で溶出させた。溶出液を減圧乾固により濃縮し、薄層クロマトグラフィーで展開した。薄層は Kieselgel 60 (Merk製)を用い、展開溶媒は n-プロパノール：水；7 : 3(v/v)、発色剤はオルシノール試薬を用いた。
【００２１】
NGNA(N-グリコリルノイラミン酸)の呈色反応は以下の方法で行った。減圧乾固した遊離シアル酸に 1 mlの 1 N H2SO4を加え、60分間 湯煎を行った。反応溶液に活性炭を加えて脱色および夾雑物を除去した後 ろ過し、ろ液を蒸留水で 10 mlに定容した。その内から 0.1 ml 採取し、2.0 mlの Eegriwe 試薬( 10 mg 2,7-dihydroxy-naphthalene/ 100 ml H2SO4)を添加し、よく混合した後 20分間 湯煎を行った。赤紫色の呈色を 530 nm の吸光度で測定した。
HPLCでのシアル酸同定は以下の方法で行った。カラムは Sugar-Pak Pb(7.8 x 300 mm)およびガードカラムを用い、移動相はMilli-Q水、流速は 0.5 ml/min、カラム温度は 80℃とし、検出器はWatersの464型電気化学検出器（インテグレーテッドアンペロメトリーモード）を用いた。各ステップにおける印加電圧と接続時間は、E1=50mv(T1=0.330msec), E2=600mv(T2=0.166msec), E3=-800mv(T3=0.166msec)で行った。
【００２２】
＜実施例８：アミノ糖の分取・同定＞
グリコホリン糖鎖中のアミノ糖の分取は、Boasの方法を用いて行った。タンパク質量 約0.8mgのグリコホリンに 2.5M トリフルオロ酢酸 1 mlを加えて溶封後、100℃ 6.5時間 加水分解を行った。反応液を減圧乾固後、蒸留水を加えて再度減圧乾固し、酢酸臭がなくなるまで上記の操作を繰り返した。得られた残査に蒸留水600μlを加えて溶解し、Dowex 50 x 2(H＋)陽イオン交換樹脂カラム(1.0 x 25 cm)に負荷した。カラム体積の3倍量の蒸留水でカラムを洗浄した後、30 mlの 2N HClでヘキソサミンを溶出した。溶出液を塩酸臭がなくなるまで減圧乾固を繰り返した後、蒸留水に溶解して Elson- Morgan 法でヘキソサミンを定量した。さらに得られたヘキソサミン溶液をエタノール(精密分析用)で洗浄後、薄層クロマトグラフィーで展開した。薄層は Kieselgel 60 (Merk製)を用い、展開溶媒は n-ブタノール：酢酸：水；８：８：１(v/v)、発色剤はジフェニルアミン-アニリン-リン酸試薬を用いた。
【００２３】
＜実施例９：免疫活性測定法、或いは血液型活性測定法＞
グリコホリンの抗原性（血液型活性）を検出するために二重拡散法を用いた。支持体には 1.2% (w/v)アガロースおよび 0.9% NaCl含有、0.02M Tris-HCl, pH 6.0を用い、37℃で 48時間保温した。抗血清には抗Ｍ血清(ウサギ由来)、抗Ｓ血清、抗ｓ血清(ヒト由来)を用いた(オーソ・ダイアグノスティック・システムズ製)。沈降線の観察には0.1% CBB染色を行い、肉眼で観察した。コイ赤血球を用いた凝集試験は載せガラス法を用いた。魚類生理食塩(1.7% NaCl, 1mM Tris-HCl,pH 8.0)で赤血球を懸濁し、700 x g で5分間遠心分離を行って洗浄した。この操作を 3回繰り返した。10% 赤血球浮遊液になるように魚類生理食塩水を赤血球に加えて調製した後、抗血清を1滴載せたプレパラートに同赤血球浮遊液を 1滴添加し、攪拌棒でよく混和した後 顕微鏡を用いて凝集を観察した。
【００２４】
＜実施例１０：レクチンとの相互作用＞
グリコホリン中の糖鎖の構造を推定するため、レクチンカラムを用いて吸着試験を行った。レクチンカラムはレクチン-アガロース セット-ＩおよびII(生化学工業)を用いた。また、ABA(ホーネンコーポレーション製)とホルミルセルロファイン(生化学工業製)を用いてABAカラムを作製し、同様の吸着試験を行った。溶出液からのグリコホリンの検出はシアル酸量を過ヨウ素酸-レソルシノール法で測定することにより行った。
【００２５】
＜実施例１１：各種細菌およびウィルスとコイグリコホリンの相互作用＞
各種細菌およびウィルスとコイグリコホリンの相互作用を観察するため、上記＜実施例９：免疫活性測定法＞と同様の凝集試験を行った。使用した菌はコイなどで発病する立鱗病、赤斑病、鰭赤病などの原因菌である Aeromonas hydrophila ATCC 7966(東大医科研微生物株保存施設)、ウナギのパラコロ病の原因菌であるEdwardsiella tarda SU226、ビブリオ病の原因菌である Vibrio anguillarum ATCC19264(両菌とも東京水産大学の廣野育生博士より分与)、さらにグラム陽性菌の Micrococcus luteus ATCC9341(研究室保存株)を用いた。また、魚病性ウィルスとして三重大学の宮田雅人博士より分与されたIPN(VR-299)を用いた。コイグリコホリンまたはコイ赤血球を各供試菌・ウィルス懸濁液に滴下して、顕微鏡で凝集反応を判定した。
【００２６】
さらに、電子顕微鏡を用いて相互作用を観察した。供試した細菌は、V.anguillarum およびグラム陽性菌の M. luteusとした。V. anguillarum にグリコホリンを添加した供試液はグルタールアルデヒドで固定し、ポリ-L-リジン処理したカバーグラスに吸着させた。さらに等張リン酸緩衝液(PBS; phosphate buffered saline)で洗浄後、エタノールを用いて脱水した。酢酸イソアミルで置換後、臨界点乾燥装置(日立 HCP-2型)で乾燥させ、イオンスパッタリング装置(JEOL JFC-1100型)を用いて白金パラジウムをコーティングし、走査型電子顕微鏡(SEM)で観察を行った。走査型電子顕微鏡はJSM-T200型(JEOL)を用いた。
M. luteus にグリコホリンを添加した供試液は、ポリカチオン処理を行ったカーボンプレートに吸着させた。グルタールアルデヒドで固定した後 PBSで洗浄を行い、さらに四酸化オスミウムで 後固定を行った。次にPBSで洗浄後、導電染色を行い、ついでPBSで洗浄を行った後 エタノールを用いて脱水した。脱水以降の操作はV. anguillarumと同様の方法で行った。走査型電子顕微鏡は S-4000(日立)を用いた。
【００２７】
＜実施例１２：グリコホリンから糖鎖の遊離と調製＞
グリコホリンに結合している糖鎖を調製するため、β-脱離を行った。すなわち、グリコホリン約 500μgに 1N NaBH4(0.4N NaOH 含有)を 50μl加え、N2ガス存在下の暗室で 48時間 37℃で反応を行った。その後 氷冷下で 1 M 酢酸を用いて中和した。得られた反応液を 減圧乾固したした後、メタノール5 ml(HPLC grade)を添加して再度減圧乾固を行った。この操作を 4回繰り返した。得られた残査を少量の蒸留水に溶かした後、5 mlの 95%エタノールを添加し、2,500 x gで 10分間遠心分離した。採取した上澄液を減圧乾固し、残査に 5 mlの Milli-Q 水を加えて溶解した後、再度減圧乾固した。得られた残査に 5 mlの Milli-Q 水を加えて溶解した。この溶液を遊離糖鎖溶液とし、HPLCに供した。
【００２８】
＜実施例１３：遊離糖鎖の分画＞
糖鎖の分画はGlyco-Pak DEAE カラム（Waters）を用いた HPLC法で行った。移動相は 10 mM Tris-HCl, pH 7.6を用い、流速は 0.6 ml/min、カラム温度は室温とした。遊離糖鎖溶液 50μlをカラムに注入した後カラムを移動相で洗浄し、100 mM NaClを含む同移動相を用いて勾配 5 mM/min で塩濃度勾配溶出を行った。検出は Waters 486型 UV検出器を用い、波長 205 nmで行った。
また、遊離糖鎖サンプルについては、以下のように脱塩・精製処理を行った。予めMilliQ水で膨潤させたグラファイトカーボンカートリッジ（CARBOGRAPH 300mg/6mL, ジーエルサイエンス製）に、４mlの0.1% TFA含有80%アセトニトリルを負荷した後、MilliQ水で充分に洗浄した。ついで2.5%重炭酸アンモニウム含有45%アセトニトリルを4ml負荷し、MilliQ水で充分に洗浄した後、0.1% TFA含有80%アセトニトリル4ml負荷して再度MilliQ水で充分に洗浄した。次に凍結乾燥を行った糖鎖試料に1.0% NaClを加えて溶解し、糖鎖濃度が12-30μg/mlになるように調整した。この試料液をカートリッジに負荷した。
MilliQ水でカートリッジを充分に洗浄した後、40mlの2.5%重炭酸アンモニウム含有45%アセトニトリルで糖鎖を溶出させた。溶出画分を集め、減圧乾固を行った。
【００２９】
＜実施例１４：糖鎖中の中性糖測定＞
実施例１３で得られた遊離糖鎖画分を Sephadex G-25カラムを用いて部分脱塩した。減圧乾固した後 200μlの水に溶解し、5M トリフルオロ酢酸 200μlを加えた。封管した後 100℃で 6時間加水分解を行った。反応液を減圧乾固した後 Milli-Q水を少量加えて減圧乾固を繰り返し、トリフルオロ酢酸を完全に除去した。減圧乾固後 Milli-Q水に溶解し、Dowex 50 x 8(H＋)陽イオン交換樹脂カラムおよび Dowex 1 x 8(CO32-)陰イオン交換樹脂カラムに連続的に素通りさせた。素通り画分を集めた後濃縮し、HPLCに供した。カラムは CarboPac PA10カラム（DIONEX）、移動相は 5 mM NaOH、流速は 1.0 ml/min、カラム温度は室温とし、検出器はDIONEXのED40型電気化学検出器（インテグレーテッドアンペロメトリーモード）を用いた。
各ステップにおける印加電圧と接続時間は、E1 = 100mv (T1 = 0.20 msec), E2 = -2,000 mv (T2=0.02msec), E3=-600mv(T3=0.01msec)で行った。標準溶液としてグルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、フコース(Fuc)およびキシロース(Xyl)各500μg/l水溶液を等量混合したものを用いた。
＜実施例１５：グリコホリンの抗菌活性測定＞
グリコホリンの抗菌活性を、次の菌株を用いて測定した。Edwardsiella tarda（E. tarda） SU 226、及び Vibrio anguillarum （V. anguillarum）ATCC 19264は、東京水産大学の廣野育生博士より分譲された。Bacillus Subtilis （B. subtilis） ATCC 6633は、愛知県水産試験場より分譲された。Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) ATCC 7966は東京大学医科学研究所微生物株保存施設より分譲された。Micrococcus luteus (M. luteus) ATCC 9341は本発明者が保存する菌株を使用した。
細菌は、保存培養（ハートインフージョン「ニッスイ」寒天培地）から同液体培地に移植し、20℃で１日間培養して菌液を調製した。基層寒天平板培地上に供試菌株が105-7細胞/mlになるように混入した同組成の寒天培地を重層して二重寒天平板培地を作成し、30分間放置した。平板上に供試液を添加したディスク（ADVANTEC TOYO, Thick 8 mm）をのせて20℃で保温し、2-3日後に出現した発育阻止帯の直径を測定した。各細菌には、以下の平板培地を用いた。B.subtilis および M.luteus には、感性ディスク用培地-Ｎ「ニッスイ」を、E.tardaには、1%マンニトール含有SS寒天培地「ニッスイ」を、A.hydrophilaには、ハートインフージョンブイヨン「ニッスイ」寒天培地を、V.anguillarum には1.5% NaCl含有ハートインフージョンブイヨン「ニッスイ」寒天培地をそれぞれ用いた。
【００３０】
＜結果と考察＞
＜コイおよびニジマス赤血球膜とヒト赤血球膜との比較＞
実施例１の方法により、コイから血液を採取し、赤血球を単離した後、得られた赤血球から赤血球膜を MichelとRudloffの方法を改変した実施例２の方法で調製した。コイ血液 30 mlあたり、タンパク質量 約90 mgの赤血球膜を調製した。
次に、得られたコイ赤血球膜を SDSによって可溶化してSDS-電気泳動を行い、CBB染色を行った。結果を図１に示した。ヒト赤血球膜と比較してみると、赤血球膜中に含まれる主要タンパク質はコイではバンド 4.1および 4.2の含量に若干の差異が認められたが、ほぼヒト赤血球膜の泳動パターンと一致した結果となった。ヒトで主要な膜タンパク質である バンド３ や、骨格タンパク質であるバンド1,2 やバンド 5,6,7など、ヒトと対応するタンパク質が検出された。コイのバンド３ はヒトと同様に主要な膜タンパク質として検出され、泳動上の分子量は 約105kDa でヒト(95 kDa)とほぼ同様の結果となった。この結果より、スペクトリンやアンキリン、アクチンおよびバンド３などの赤血球膜の形状を構成するタンパク質はコイとヒトでは差異がない事が示された。
【００３１】
一方、コイ赤血球膜をSDS-電気泳動後、PAS染色した結果、CBB染色で バンド３が検出された位置付近に主要な糖タンパク質のバンドが検出された。コイの主要な糖タンパク質のバンドが示す分子量は約112 kDaであり、主要なバンドの上部にあるバンドは 約203 kDaであった。ヒトの主要なグリコホリンであるグリコホリンＡは、２量体としてコイの主要なグリコホリンが検出された位置とほぼ同じ位置に検出された。SDS-電気泳動の挙動で観ると、コイのグリコホリンはヒトグリコホリンＡに相当するものと考えられたが、ヒトのように低分子域に出現する他のグリコホリンは検出されなかった。
【００３２】
＜コイ赤血球膜からのグリコホリン抽出＞
実施例２の方法に従って調製したコイ赤血球膜より、LIS-フェノール法とストレプトマイシン処理を用いてコイのグリコホリンを抽出した（実施例３）。コイ血液 20mlあたりグリコホリンはタンパク質量で 約270μg得られた。
SDS-電気泳動を行った結果、CBB染色で一本のバンドが検出された位置とPAS染色でバンドが検出された位置が一致した事から、コイグリコホリンは糖タンパク質として単離されたと判断した。PAS染色での主要なバンドの上部に検出されたバンドは、二次元電気泳動およびHPLCを用いたゲルろ過クロマトグラフィーの結果により(データ未掲載)、主要なバンドとして出現した糖タンパク質の２量体であると判断した。以上の結果より、コイ赤血球膜中には主要なグリコホリンが１種類のみ存在すると思われるが、ヒトグリコホリンＡのように通常２量体として存在しているかどうかは確認できなかった。
【００３３】
＜コイグリコホリンのアミノ酸組成＞
コイグリコホリンのアミノ酸組成の結果を表１に示す。コイグリコホリンのアミノ酸組成は、プロリン、リジンの割合が多かったが、報告されているヒトグリコホリン（J. Azuma et al., J.Biochem 73, 1127(1973)）との差異はあまり認められなかった。
【表１】
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【００３４】
＜コイグリコホリン中のシアル酸同定＞
コイグリコホリンに含まれるシアル酸を実施例７に述べた方法で同定を行った。薄層クロマトグラフィーでのスポットの Rf値が NGNA(N-グリコリルノイラミン酸)と一致し（図２、NGNAの呈色反応でも陽性になり、さらにSugar Pack Pbを用いた結果もNGNAと保持時間が一致した事から(図３)、グリコホリンに含まれる主要なシアル酸は NGNAであると判断した。ヒトグリコホリンに含まれるシアル酸は NANAであり、ヒトグリコホリンとは含有シアル酸の種類で異なっていた。
コイの赤血球膜の構成タンパク質やグリコホリンのタンパク質は、ヒトと比較して大きな差異は認められず、コイグリコホリンの糖鎖の構成に差異が認められた。
【００３５】
＜コイグリコホリン中のアミノ糖の同定＞
コイグリコホリンに含まれるアミノ糖を実施例６で述べた方法で同定をおこなった。薄層クロマトグラフィーでのスポットの Rf値が ガラクトサミンと一致した（図４）。アミノ糖は加水分解時にN-アセチル基が遊離するため、グリコホリンの結合糖鎖に含まれるアミノ糖はN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)と推定した。
【００３６】
＜コイグリコホリンの血液型活性＞
単離したコイグリコホリンの生理活性として MN型および Ss型の抗原性を実施例９に述べた方法で検討した。その結果、抗Ｎ血清を用いた支持体に明確な沈降線が観察された（図５）。さらに抗Ｎ血清とコイ赤血球を用いた反応で、顕微鏡下において部分凝集が観察されたことからコイグリコホリンは弱い抗Ｎ活性を有すると推察した。しかしながら、ヒトグリコホリンで観察される他の血液型活性は確認できなかった。さらに、遊離糖鎖画分(実施例１２参照)のみでは抗Ｎ活性は確認できず、沈降線も検出されなかった。ヒトのMN型決定基でも、糖鎖とそのタンパク質結合部分が活性を持つとされており、コイも糖鎖のみでは血液型活性は確認できなかった。
【００３７】
＜レクチンとの相互作用＞
レクチンとの吸着試験の結果を図６〜図８に示した。ABAカラムに吸着する事から、O-グリコシド型糖鎖であり、コアＩ構造(Gal→GalNAc→Ser/Thr)を持っていると推定された。さらに PHA L4および E4に吸着しない事から、コイグリコホリンには N-グリコシド型糖鎖は含まれていないと推定した。PNAに吸着せず、WGAに吸着する事から、シアル酸が含まれており、RCAＩに吸着することから、非還元末端の一部にGalかシアル酸が存在すると推定された。また、ConA, LCA および UEAに吸着する結果より、糖鎖には αGlcと Fucが含まれると推定した。
【００３８】
＜各種細菌およびウィルスとコイグリコホリンの相互作用＞
単離したコイグリコホリンと各種細菌およびウィルスの相互作用を検討するため、実施例１１に記載の方法を用いて凝集反応を行った。供試したA. hydrophila, E. tarda, V.anguillarum, M. luteus および魚病ウィルスであるIPNにおいて凝集反応は見られず、またコイ赤血球への吸着能も確認できなかった。
V. anguillarum および M. luteus とグリコホリンの反応をＳＥＭで観察した結果、共にグリコホリン添加のものとコントロールで差異が認められた（図９）。
V. anguillarumでは菌体には変化がなかったが（図９（Ａ）及び（Ｂ））、鞭毛に球状の物質(直径約 80〜150 nm)が吸着しており、また M. luteusでは菌体の表面が球状の物質によって覆われているように観察された（図９（Ｃ）及び（Ｄ））。
【００３９】
＜遊離糖鎖の分画＞
コイグリコホリンに含まれる糖鎖はβ-脱離によって遊離した事から、O-グリコシド結合でタンパク質部分と結合していると判断した。さらに、HPLCを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、遊離糖鎖は２つのピークとして検出された（図１０）。シアリルオリゴ糖のスタンダード(N-アセチルノイラミン酸、オリゴマーキット：マルキン醤油製)で解析した結果(データ未掲載)、ピーク１はシアル酸が１つ結合した糖鎖であり、ピーク２はシアル酸が２つ結合した糖鎖であった。しかし、205 nmの吸光度は糖以外の感受性も高く、画分中の糖含量はピーク１の方が高い結果となった。
【００４０】
＜糖鎖中の中性糖測定＞
HPLCで分取した画分ピーク１およびピーク２を実施例１４に従って加水分解を行い、中性糖を調製した。それぞれの中性糖画分をHPLCと電気化学検出器を用いて分析した結果、ピーク１およびピーク２とも Fuc、Galおよび Glcが検出された（図１１）。GalとGluの中間にあるピークは、3,6-Anhydro-D-galactoseの標品(Sigma)を用いた分析やスサビノリ細胞壁の分析(データ未掲載)により、Galが加水分解時に脱水されて形成された3,6-Anhydro- D-galactoseであると判断した。上記試験の結果より、結合糖鎖は O-グリコシド型糖鎖であり、コアＩ構造(Gal→βGalNAc→Ser/Thr)を持ち、さらにαGlcとFucが含まれると推定されたが、それを裏付ける結果となった。
＜グリコホリンの抗菌活性＞
図１２及び図１３には、グリコホリンの抗菌活性を確認したときのディスクの写真図を示した。なお、図１２は透過光にて観察したもの、図１３は反射光にて観察したものである。
図１２は、E.tardaに対するグリコホリンの抗菌活性を測定した結果である。写真中の符号は、ディスク中に添加した物質を意味しており、それぞれ（ａ）コイ赤血球膜（5 mg protein / disc)、（ｂ）ストレプトマイシン処理を施していないグリコホリン（17 μg protein /disc）、（ｃ）グリコホリン画分（15 μg protein / disc）、（ｄ）コイグリコホリンからの炭水化物画分（4 μg / disc）、（ｅ）ＨＰＬＣによって分取した糖鎖画分（Ｐ−１）（0.3μg / disc）である。（ａ）〜（ｅ）のいずれにおいても、中央のディスクの周囲には、E.tarda の増殖を阻止する円（阻止円）が観察された。特に、グリコホリン画分（ｃ）のみならず、その糖鎖画分（ｅ）にも抗菌活性が認められた。
図１３は、各種細菌に対するコイグリコホリンの抗菌活性を測定した結果である。写真中の符号は、（ａ）B. subtilis に対して、ストレプトマイシン処理を施さないグリコホリン（17μg protein / disc）をディスクに添加したもの、（ｂ）B. subtilis に対して、グリコホリン（15 μg protein/ disc）をディスクに添加したもの、（ｃ）A. hydrophila に対して、ストレプトマイシン処理を施さないグリコホリン（17 μg protein / disc）をディスクに添加したもの、（ｄ）A. hydrophila に対して、グリコホリン（15 μg protein /disc）をディスクに添加したもの、（ｅ）M. luteus に対して、グリコホリン(15 μg protein / disc）をディスクに添加したもの、及び（ｆ）V.anguillarum に対して、グリコホリン(15 μg protein / disc）をディスクに添加したものである。（ａ）〜（ｆ）のいずれにおいても、グリコホリンは阻止円を形成したとこから、広いスペクトルの抗菌活性を備えていることが示唆された。
なお、ピーク２及びシアル酸が欠如したオリゴ糖では抗菌活性は示されなかった（データ未掲載）。
【００４１】
＜まとめ＞
ヒトグリコホリンはMN式やSs式血液型決定基を有し、さらにインフルエンザウィルスやマラリア、センダイウィルスなどの受容体として生体防御機能など種々の生理活性を有している。このグリコホリンが魚類にも存在すれば様々な生理機能、特に生体防御機能を持つと思われ、魚類のグリコホリンでの可能性を探索した。
赤血球膜を可溶化した後のSDS-電気泳動による分析の結果、コイやニジマスの赤血球膜にもヒトと同様にグリコホリンが存在するのが確認された。しかしながら、コイの場合はヒトと比較して検出し難く、種類も１種のみ確認された。コイグリコホリン中のタンパク質のアミノ酸組成は、ヒトグリコホリンと比較して大きな差異は認められなかったが、タンパク質に結合している糖鎖に含まれるシアル酸はヒトとは異なりNGNAであった。グリコホリン中のシアル酸がNANAでなく、NGNAであるという報告は、ウマ、ニホンサルなどでなされており、また魚類ではニジマスやシロザケ、ヤマメの卵にNGNAが含まれている事が報告されている。
【００４２】
ヒトグリコホリンＡで存在するMN式血液型活性を、コイグリコホリンで検討したところ、コイは弱い抗Ｎ活性を有した。しかしながら、ヒトグリコホリンで観察される他の血液型活性は確認できなかった。次いでレクチンとの作用を検討した結果、かなり多様なレクチンと結合する事から、コイグリコホリン中の結合糖鎖はヒトとは構成糖や構造上の差異があると推定された。
単離したコイグリコホリンと各種細菌およびウィルスの相互作用を検討したが、凝集反応は観察されなかった。しかしながら、電子顕微鏡観察では多数の球状物質がグラム陰性菌では鞭毛に、グラム陽性菌では菌体に吸着しているように観察された。
さらに、感受性ディスク試験の結果、グリコホリンの糖鎖部分が抗菌活性を有することが確認された。このことより、電子顕微鏡下で観察された多数の球状物質は、グリコホリンのタンパク質部分が疎水結合によって凝集したグリコホリン多量体であり、この表面を糖鎖が覆い、これにグラム陰性菌では鞭毛が、またグラム陽性菌では菌体が吸着することにより、抗菌活性が生じたと推定された。
【００４３】
このように本実施形態によれば、コイグリコホリン及び、そのグリコホリンから遊離した抗菌性オリゴ糖を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】コイ赤血球膜をＳＤＳで可溶化して、ＳＤＳ−電気泳動を行ったときのゲルの写真図である。レーン１〜レーン５はＣＢＢ染色してタンパク質を検出した結果であり、レーン６及び７はＰＡＳ染色して糖タンパク質を検出した結果である。レーン１及びレーン５は、分子量マーカであり、ミオシン（２０５ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、フォスフォリラーゼｂ（９７ｋＤａ）、ウシアルブミン（６６ｋＤａ）、卵アルブミン（４５ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を含む。また、レーン２はヒト赤血球膜、レーン３及びレーン６はコイ赤血球膜、レーン４及びレーン７は単離コイグリコホリンを電気泳動したものである。なお、レーン２及びレーン３に示した番号は、ヒト赤血球膜において同定されているタンパク質である。
【図２】コイグリコホリン中のシアル酸を薄層クロマトグラフィーにかけた結果を示す写真図である。図中、ＮＡＮＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（N-acetylneuraminic acid）を、ＮＧＮＡは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（N-glycorylneuraminic acid）を、ＧＰは、コイグリコホリン中のシアル酸（sialic acid from glycophorin）をそれぞれ意味している。
【００４５】
【図３】Sugar Pack Pb カラムを用いて、シアル酸のクロマトグラフィを実施したときの結果を示すチャートである。（ａ）NGNA 及び NANA を含む標準溶液の結果、（ｂ）コイグリコホリン中のシアル酸の結果である。
【図４】コイグリコホリン中のヘキソサミンを薄層クロマトグラフィーにかけた結果を示す写真図である。図中、ＧｌｕＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）を、ＧａｌＮＡｃは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（N-acetylgalactosamine）を、ＧＰは、グリコホリン中のヘキソサミン（hexosamine from glycophorin）をそれぞれ意味している。なお、写真の関係で必ずしも明瞭ではないが、ＧＰには、ガラクトサミン（Galactosamine）と同じ位置にバンドが確認された。
【００４６】
【図５】コイグリコホリンの免疫活性測定（二重拡散法）を行ったときの結果を示す写真図である。中心のウエルには、（Ｎ）抗Ｎ血清（ウサギ）、（Ｍ）抗Ｍ血清（ウサギ）、（Ｓ）抗Ｓ血清（ヒト）、（ｓ）抗ｓ血清（ヒト）が含まれている。外側のウエルには、コイグリコホリンが、１２時の位置から始まって時計回りに２倍希釈列で含まれている。
【図６】レクチンカラムにおけるコイグリコホリンの挙動を示すグラフである。グラフは、それぞれＡＢＡ−Ｉ（Ａ）、ＰＨＡ−Ｌ4（Ｂ）、及びＰＨＡ−Ｅ4（Ｃ）レクチンカラムを用いたときのものである。図中の矢印は、溶出液を変更した時点を示す。
【図７】レクチンカラムにおけるコイグリコホリンの挙動を示すグラフである。グラフは、それぞれＰＮＡ（Ｄ）、ＷＧＡ（Ｅ）、及びＲＣＡ120（Ｆ）レクチンカラムを用いたときのものである。図中の矢印は、溶出液を変更した時点を示す。
【００４７】
【図８】レクチンカラムにおけるコイグリコホリンの挙動を示すグラフである。グラフは、それぞれＣｏｎＡ（Ｇ）、ＬＣＡ（Ｈ）、及びＵＥＡ−Ｉ（Ｉ）レクチンカラムを用いたときのものである。図中の矢印は、溶出液を変更した時点を示す。
【図９】V. anguillarum （（Ａ）コントロール、（Ｂ）コイグリコホリン添加）、及びM. luteus （（Ｃ）コントロール、（Ｄ）コイグリコホリン添加）とグリコホリンの反応をＳＥＭで観察したときの写真図である。
【図１０】コイグリコホリンに含まれる遊離糖鎖をＨＰＬＣで分析したときのチャート及び、分析条件を示す図である。
【図１１】ＨＰＬＣによる画分ピーク１及び２を加水分解し、ＨＰＬＣと電気化学検出器とを用いた分析した結果を示すチャートである。ピーク１（上図）及びピーク２（下図）のいずれにおいても、Ｆｕｃ、Ｇａｌ、及びＧｌｃが検出された。
【図１２】E.tarda に対して、コイグリコホリンまたは、それに含まれる多糖類が示す抗菌活性を評価したときのディスクの様子を示す写真図である。
【図１３】各種細菌に対して、コイグリコホリンが示す抗菌活性を評価したときのディスクの様子を示す写真図である。
【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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