(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）各々のタンパク質がＮ末端又はＣ末端の何れかにおいてマーカー部分によりタグ付加されたタンパク質をコードする複数のcDNA分子を提供すること；
（b）個々のタグ付加されたタンパク質を、空間的に分離されたフォーマットで発現させること；
（c）各々のタグ付加されたタンパク質を、空間的に規定されたフォーマットで精製、固定して、タンパク質アレイを固体支持体上に作成し、ここで、前記精製および固定の両方においてタグと固体支持体との間の特異的な相互作用を使用すること
を備えたタンパク質アレイを作成する方法。
【請求項２】
前記マーカー部分が、
（a）ヘキサヒスチジンタグ；
（b）完全なタンパク質又はタンパク質ドメイン；
（c）抗体のエピトープ；
（d）ビオチン類似物；および
（e）マルトース結合タンパク質ドメイン
からなる群より選択されるペプチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー部分が、翻訳後修飾されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記翻訳後修飾が、ビオチンまたは脂質分子の付加を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タグ付加されたタンパク質が、正しく折り畳まれ、機能を維持している、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タグ付加されたタンパク質が、完全長である、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
タグ付加されたタンパク質をコードする前記cDNA分子が、前記１以上のDNA分子に存在する開始コドンの直後または停止コドンの直前の何れかに、マーカー部分をコードする追加の公知のDNA配列を挿入することを含む、以下の工程を備えた方法により作成される、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法：
（a）前記１以上のDNA分子から入れ子状態の欠失物のセットを作成する工程；
（b）入れ子状態の欠失物のセットに、オリゴヌクレオチドの第一または第二のセットをアニーリングし、ライゲートする工程；ここで、
（i）3つの可能な停止コドンの一または複数の配列または相補配列は、オリゴヌクレオチドの第一のセットの混合物の中に提示され、
（ii）3つの主要な開始コドンの一または複数の配列または相補配列は、オリゴヌクレオチドの第二のセットの混合物の中に提示され、
（c）オリゴヌクレオチドの第一または第二のセットに相補的になるように選択されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたプライマー伸張反応により、ライゲート産物を特異的に増幅する工程。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、１以上のテスト化合物を、前記タンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記１以上の化合物の結合を測定し、これにより前記１以上の化合物を生物学的活性についてスクリーニングする工程とを更に備えた方法。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、１以上のタンパク質、例えば、細胞表面受容体を、前記タンパク質アレイと接触させる工程と、前記１以上の特異的なタンパク質の、前記アレイの前記タンパク質との結合を測定し、これにより１以上のタンパク質を特異的なタンパク質−タンパク質相互作用についてスクリーニングする工程とを更に備えた方法。
【請求項１０】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、１以上の核酸プローブを、前記タンパク質アレイと接触させる工程と、前記プローブの、前記アレイ中の前記タンパク質への結合を測定し、これにより１以上のタンパク質を特異的なタンパク質−核酸相互作用についてスクリーニングする工程とを更に備えた方法。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記タンパク質アレイ中の１以上のタンパク質が抗体ライブラリー中の少なくとも１つの抗体に結合するように、前記タンパク質アレイを、抗体ライブラリーと接触させる工程と、結合していない全ての抗体を除去する工程と；前記タンパク質アレイ中のタンパク質に結合した抗体を固定化し、これにより抗体アレイを作成する工程とを更に備えた方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質発現アレイを作成する新規方法、及び迅速なスクリーニングにおけるこのようなアレイの使用に関する。
【０００２】
ゲノムマッピング計画は、治療の標的を発見するプロセスとそれを用いた薬物を発見するプロセスとに革命を与えている。新規な治療の標的が同定されると、既存の化学物質ライブラリー及びコンビナトリアル化学物質ライブラリーの高速大量スクリーニングによって、これらの標的に対して活性な多くのリード化合物の候補が提示されるであろう。初期の臨床検査においてでさえ、全てのリード化合物を追求するのが不経済であることは明確であろう。しかしながら、今のところ、生物中に存在する全てのタンパク質に対する、それらが有し得る活性のプロフィールに関してこのようなリード化合物を評価するための迅速な方法は存在しない。もし利用できるのであれば、このような方法は、全てのリード化合物が有し得る毒性学的プロフィールを、初期の段階で評価することを可能とし、この情報によって、何れの化合物を追跡し、何れの化合物を除外すべきかを決定するプロセスが著しく促進されるであろう。
【０００３】
製薬業界には、既存の薬物（既に市場に出回っているものとまだ開発中のものの両者）の標的を全て同定して、これにより、それらの作用機序を決定したいという補完的な需要が存在する。規制当局は、現在、作用機序についての知識が極めて重要であると考えていることが益々明らかとなっているので、このような情報が得られれば、新規薬物に対する規制当局の承認を得る工程が大幅に容易となるであろう。さらに、この種の情報によれば、改良された第２世代の薬物をデザインすることが可能となろう。これは、薬物の多くは、おそらくは薬物又はその代謝物が望ましくない標的に結合することによって生じる副作用を少なくとも僅かには有しているためである。改良された薬物をデザインするために必要な基準を確定するためには、これらの標的タンパク質が全て同定される必要がある。しかしながら、現在ところ、この情報を得るための簡易な方法は存在せず、単に作用の標的が分からないために、多くの何百万ドルもの薬物候補が不成功により断念している。
【０００４】
タンパク質−タンパク質相互作用は、内的ストレスと外的ストレスの両者に対する細胞応答を支配する上で、極めて重要であると益々認識されるようになっている。それ故、特異的なタンパク質−タンパク質相互作用は、感染症やその他の病状における薬物を介した処置に対する標的の候補となる。現在のところ、酵母ツーハイブリッドアッセイが、タンパク質−タンパク質相互作用を評価するための唯一の信頼できる方法であるが、この種のインビボアッセイは、非高速大量フォーマットにおいてでさえ、タンパク質−タンパク質相互作用の特異的なアゴニスト又はアンタゴニストの同定には、余り適さないであろう。機能的プロテオーム発現アレイ、すなわち「プロテオームチップ」によれば、タンパク質−タンパク質相互作用の特異性、及び任意の薬物を介した効果の特異性をインビトロフォーマットで決定することが可能となるであろう。それ故、この研究分野に革命を与えるために、プロテオームアレイは莫大な可能性を有しているといえるだろう。
【０００５】
機能的プロテオームアレイを作成し得る１つの方法は、特定のプロテオーム中に発現されている全てのタンパク質を各別にクローニングし、発現し、精製し、固定化することである。しかしながら、ゲノム全体の配列データの利用可能性についての考慮とともに、まず考慮すべき重要な事柄は、目的とするゲノムの絶対的なサイズである。これらの点について説明すると、典型的な細菌のゲノムは約５Ｍｂｐであり、今のところ、完全に配列が決定されたのは少数であり（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、真菌のゲノムは典型的には約４０Ｍｂｐ、哺乳類のゲノムは３Ｇｂｐであり、植物のゲノムは約１０Ｇｂｐである。現在、ヒトゲノムの配列決定は２００３年頃に完結すると推測されているが、この情報のうちどの程度が公共的なドメインに置かれるかは、大いに疑問とされねばならない。明らかに、代表的なモデル生物以外の全てのゲノムが、現実的な時間枠内に入手できるようになると予想するのは完全に非現実的であり、機能的なプロテオミクスの展望から、モデル動物の価値は限られたものである。それ故、原理的には、この４年以内に、ヒトゲノム中の約１０万の各遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからクローニングするためのプライマーをデザインし、合成することが可能となるかもしれないが、実際には、たとえ必要な配列データが入手できるとしても、これは極めて費用がかかり（プライマーの費用だけで、数百万ドルにのぼるであろう）、且つ著しく手間のかかる工程となろう。
【０００６】
しかし、完全な配列データが得られないであろう製薬に適した生物はどうなるのであろうか？  機能的プロテオミクスからこれらを全く無視することはできないとして、何が代替物となるのであろうか。発現ｃＤＮＡライブラリーは、原理的には、タンパク質のアレイを作成するために非特異的な固定化とともに使用することができるが、非特異的な固定化は、通常、タンパク質の折り畳みが破壊されるために、機能の喪失を伴うという事実によって、この技術は、著しく制限される。さらに、宿主の細胞タンパク質が固定化されると、少なくともＳ／Ｎ比が顕著に減少し、最悪の場合には、明確な結果が得られなくなってしまう。それ故、各タンパク質が特異的に固定化され、機能に影響を与えることなく、且つ全ゲノム配列についての知識を要せずに、共通のモチーフ又はタグを介して精製される機能的プロテオームアレイを作ることができれば、機能的プロテオミクスの分野に莫大な進歩を与えるであろう。
【０００７】
本発明者らは、対応する遺伝子のＤＮＡ配列を予め知ることを必要とせずに、プロテオーム中の各タンパク質内の所定位置に共通のマーカーを付加させ得る方法を提供することによって、上記の課題を解決する新規アプローチを開発するに至った。この「タグ」は、続いて、その後の固定化及び精製操作に対して共通性と特異性を与えるために使用することができ、これにより、続いて、所定のプロテオームから得られた何千ものタンパク質がディスプレーされた空間的に規律されたアレイの作成が可能となる。
【０００８】
ここで考慮すべき重要なことは、「タグ」を正確な場所に置くことである。もし前記タグが、何れかの遺伝子の不確定でランダムな位置にインフレームに挿入されれば、得られたタグ付加されたタンパク質は、不確定な態様で末端切断されると思われるので、多くの場合には、正しい折り畳みと機能が破壊されるであろう。ここに記載した方法は、各完全長のタグが付加されたタンパク質が正しく折り畳まれ、このため、アレイ中に特異的に固定化したときに機能が保持されるように、何れかの特定の遺伝子の開始コドンの直後又は停止コドンの直前に前記タグを挿入することによって、この課題を回避する。
【０００９】
前記アレイ中の各タンパク質は完全に機能的であるはずなので、その後、アレイは、薬物の標的及び他の生物学的に関連する分子を同定するために直接スクリーニングすることができる。前記アレイが空間的に規定されていることによって、各タンパク質の表現型を直接その遺伝子型に関連付けて、「ヒット」を同定することが可能となるであろう。
【００１０】
このように、第１の側面において、本発明は、各々Ｎ末端又はＣ末端の何れかにマーカー部分が付加された完全長のタンパク質として、１以上のタンパク質をクローニングし、発現することを備えたタンパク質アレイを作成する方法を提供する。
【００１１】
前記マーカー部分は、ペプチド配列、例えばヘキサヒスチジンタグ、抗体のエピトープ、又はビオチン類似物（ｂｉｏｔｉｎ  ｍｉｍｉｃ）、又は実際に完全なタンパク質、又はタンパク質ドメイン、例えばマルトース結合タンパク質ドメインの何れであってもよい。前記マーカー部分自体は、例えば、ビオチン又は脂質分子を付加することによって、翻訳後に修飾することができる。好ましい態様では、前記マーカー部分は、「タグ付加された」タンパク質の精製も可能とするであろう。
【００１２】
このように、本発明の方法は、各遺伝子の配列についてのいかなる知見にも依拠しない態様で、１つのポットで、ｃＤＮＡライブラリーの全てのメンバーを特異的に修飾することを可能とする。代わりに、本発明の方法は、全ての遺伝子中に存在する共通の開始又は停止コドンに基づいている。前記修飾は、必要に応じて、配列公知の付加すべきさらなるＤＮＡを、各ｃＤＮＡの開始コドンの直後か、又は停止コドンの直前の何れかに、インフレームで正確に挿入するという形態でなされるであろう。
【００１３】
前記付加すべきＤＮＡは、各ｃＤＮＡの産物と同じリーディングフレーム中に存在するであろう公知のマーカー部分をコードするであろう。本発明の方法によって作成された各遺伝的に修飾されたｃＤＮＡは、このため、ここでは、そのＮ又はＣ末端の何れかに正確に融合された共通部分である「タグ」、例えばポリペプチドを有する各タンパク質をコードすることになろう。ｃＤＮＡライブラリーの全てのメンバーは、正確に同じように修飾されると思われるので、前記ｃＤＮＡライブラリーによってコードされる全てのタンパク質は、最終的な結果としては、この段階では、それらのＮ又はＣ末端の何れかに共通部分が付加されることになるだろう。
【００１４】
一般的に、前記ｃＤＮＡライブラリーから発現される前記タンパク質は「タグ付加」され、容易に同定し、単離することができるであろう。一度精製されると、タンパク質は、例えば、マイクロアレイに付着させることができる。付着は、タグ自体を通じて、あるいはタンパク質に最初に付着された別の部分を通じて行うことができる。
【００１５】
本明細書に記載された方法によって形成されたアレイは、本発明の第２の側面を成す。このようなアレイは、通常は、固相支持体上に固定された、「タグ付加された」タンパク質の発現ライブラリーを備える。当業者であれば、アレイの分野において、固相支持体たり得る幅広い支持体が一般的に使用されており、これらの「基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」を何れも、本発明のアレイの製造に使用できることが理解できるであろう。
【００１６】
本明細書に記載されているように、本発明の方法は、あるプロテオーム中の全タンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れかに特異的にタグを付加することを可能とする。タンパク質の中にはＮ末端の伸長が許容され得ないものも、Ｃ末端の伸長が許容され得ないものもあるが、殆どのタンパク質は、このような伸長の何れかを許容するであろう。しかしながら、完全長の、修飾されていないｃＤＮＡとして、又はランダムで殆ど不可避的に末端切断された、あるタンパク質パートナーへの融合物として遺伝子をクローニングするので、既存のライブラリークローニング法は、この課題を全く解決することができない。
【００１７】
後者に比べて、本方法によれば、例えば、所望のペプチドパートナーへの融合物として、正確な、完全長のｃＤＮＡライブラリーを作成することが可能となる。前者に比べて、本明細書に記載したアレイ中にタンパク質を固定化する方法は、非特異的な相互作用よりも、特異的な相互作用を介し、これらの特異的な相互作用が、各ｃＤＮＡの末端に付加されたタグの機能である。さらに、本明細書に記載された方法は、正確な折り畳みと翻訳後修飾を通じて機能の維持を補助するために細菌でない宿主生物で発現された、精製、固定化されたタンパク質をスクリーニングするために使用することができるのに対して、ファージディスプレー又はλ−ｃＤＮＡライブラリーのような既存の方法は、誤った折り畳みか、又は不正確な翻訳後修飾の何れかのために、多くの真核細胞のタンパク質が非機能的な形態で合成される細菌宿主に限定される。
【００１８】
本発明の方法は、大きく３つの主たる領域に分けることができる広い範囲にわたるインビトロでの使用可能性を有している。これらは、タンパク質−リガンド相互作用の研究、タンパク質−タンパク質相互作用の研究、及びタンパク質−ＤＮＡ相互作用の研究である。
【００１９】
タンパク質−リガンド相互作用
本明細書に記載した方法は、ある新規な化学物質とあるプロテオーム中の全タンパク質間の相互作用を迅速に描出することが可能であろう。これは、単に、逆高速大量スクリーニングと考え得る様々なストリンジェンシーで、ＮＣＥを用いて適切なプロテオームのアレイをプロービングすることによって達成され得る。このようなスクリーニングから読み取られた情報は、多くの場面（そのうちの幾つかは以下に記載されている）ですぐに役立つであろう。
【００２０】
細胞又は完全な生物体に対して化合物のライブラリーを検査する高速大量スクリーニングプログラムは、しばしば、スクリーニング前にその標的を知ることなしに、表現型の変化をもたらす手がかりを同定する。しかしながら、その後の一次標的の同定は、極めて手間のかかるプロセスであり得る。当該種に対する機能的プロテオームアレイを作り出した後、リード化合物がプロテオーム中の何れのタンパク質を標的としているかを同定するために、リード化合物を用いてこのアレイをスクリーニングすることができると思われるので、本発明の方法は、この種の問題にそのまま適用することができる。タンパク質−リガンド相互作用を同定するためのこの大規模並列アプローチは、ＮＣＥの一次標的の決定を大幅にスピードアップさせ、且つ簡易化し、同じく重要であり得るより弱い二次的な相互作用の同定も可能にするであろう。さらに、本方法は、種の交叉反応性という問題にも直接適用できるので、例えば、ヒトのプロテオーム中の全タンパク質との相互作用について、例えば、抗真菌化合物の候補を迅速に評価することが可能となる。この種の情報は、リード化合物のその後のいかなる最適化においても、極めて有用であることが分かるであろう。
【００２１】
高速大量スクリーニング法は、現在、それ自身以前に治療の標的の候補として同定されたあるタンパク質に結合する小分子の迅速な同定を可能にする。しかしながら、これらの方法は、あるリード化合物を追跡するかどうかを決定する上である相互作用がどの程度選択的であるかを知ることが重要であり得るにもかかわらず、この問いに応えるものではない。優れた者であれば単一のタンパク質を標的とする化合物は、多数の関連する、又は無関係なタンパク質にも遭遇する化合物よりも副作用が少ないと思われると主張するであろう。
【００２２】
第３相臨床試験までは上手く進めたが、それらの主要な機序が不明であるために、規制当局の承認を勝ち得ることができない化合物の例が多数存在する。抗鬱薬であるミアンセリンとトラザドン、及びファイザーの抗関節炎薬テニダップは、この例であり、それぞれ、何億ドルもの投資に対する見返りが全く得られていない。本明細書に記載された方法は、このような薬物の主要な標的を発見し、続いて作用機序が明らかになれば、非常に高価な臨床試験データが、既に規制当局の承認のために使用できるようになるので、このような失敗に終わった薬物を復活させるのに使用することができるであろう。
【００２３】
全ての既存の薬物は、多かれ少なかれ、副作用を有しているが、この例として、それ以外の面では魅力的な抗分裂病薬であるクロザピンである。このような副作用が由来する分子を決定することができれば、これによって、最小限の副作用と最適な主作用が組み合わされた未来の創薬のデザインが大きく促進されるであろう。化合物とプロテオーム中の全てのタンパク質との相互作用のプロフィールを作成する上で、異常な２次的相互作用が同定され、続いて、既知の副作用と関連しているかという見地から、これらを評価することができるので、本明細書に記載した方法は、ここでも、このような課題に直接適用することができる。
【００２４】
本発明の方法は、一般的な阻害剤を備えたプロテオームアレイをスクリーニングすることによって、セリンプロテアーゼのようなタンパク質ファミリーを同定するためにも使用することができる。続いて、これによって、さらに集中したリード化合物のスクリーニングのために、その後、例えば、全てのヒトのセリンプロテアーゼ、あるいは、全てのキナーゼ、又は全てのｐ４５０酵素をディスプレーするバイオチップを開発することが可能となるであろう。例えば、ｐ４５０チップによって媒介された水酸化は、代謝プロセスの最初の段階であることが多く、薬物応答における患者間の変動の主たる原因の１つであると考えられるので、ｐ４５０バイオチップは、あるリード化合物が代謝されたかどうかを評価するのに有用であろう。現に、現在の薬物デザインの最終目標の１つは、第１に代謝されない化合物を作成することであり、この場合にも、ｐ４５０チップは、顕著な有用性を有し得るであろう。
【００２５】
タンパク質−タンパク質相互作用
タンパク質−タンパク質相互作用及び多タンパク質複合体は、細胞生物学において、特に重要である。例えば、シグナル伝達経路は、一般的に、細胞表面の受容体と外部のリガンドとの相互作用によって開始され、この後、タンパク質−タンパク質相互作用のカスケードが続き、最終的に特定遺伝子の活性化をもたらす。各タンパク質−タンパク質相互作用は、特定のリガンドの存在に依存し得、あるいは特定のリガンドによって遮断され得るが、多タンパク質複合体の中には、リガンド依存性の態様でのみ形成されるものもあるだろう。
【００２６】
何千もの新しいタンパク質−タンパク質相互作用は、ツーハイブリッド手法を用いて同定されてきた。本明細書に記載された方法は、このような方法の限界を克服し、相互作用するパートナーのみならず、各相互作用の相対的な強度を明らかにするために、各標識されたタンパク質を用いてプロテオームアレイをスクリーニングするために使用することができる。本方法は、多タンパク質複合体の成分を同定し、さらには、それらの集合がどこでリガンド依存性であるのかを明らかにするためにも使用できる。
【００２７】
新規タンパク質−タンパク質相互作用を明らかにする上での、このような本方法の使用例は、病状に関与していると考えられているある細胞表面受容体の細胞質ドメインのシグナル伝達パートナーの同定であろう。このようなタンパク質−タンパク質相互作用は、治療の標的の候補を直ちに示しすかもしれないので、このようなシグナル伝達パートナーの同定は、製薬の展望と直接関連するであろう。
【００２８】
タンパク質−ＤＮＡ相互作用
ヒトのゲノム中の全遺伝子のおよそ１０％が転写因子をコードすると推測されているが、現在のところ、これらのうちの僅かな割合しか同定されていない。ＤＮＡエンハンサー要素への特異的な転写因子の結合（しばしば、外的な刺激に応答して起こる）は、エンハンセオソーム（ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ）複合体の形成に不可欠であり、該複合体が、続いて、遺伝子発現のスイッチをオンにする。遺伝子の発現が、原理的に、薬物の投与によって影響を受け得る様々な点が存在する。薬物は、細胞表面受容体へのタンパク質又は小分子の結合を遮断し、これによって、最初からシグナル伝達カスケードを遮断し得る；薬物はタンパク質−タンパク質相互作用を遮断するか、又はシグナル伝達カスケード中の酵素活性を阻害し得る；あるいは、薬物は、エンハンセオソーム複合体中の特異的なタンパク質−ＤＮＡ又はタンパク質−タンパク質相互作用の形成を遮断し得る。ここでの例としては、転写因子ＮＦ−κＢは、免疫及び炎症反応、肢の発育、敗血性ショック、喘息、並びにＨＩＶプロペプチドの産生にわたる様々な細胞のプロセスに関与している。ＮＦ−κＢの活性化における細胞内シグナル伝達カスケードの大部分は、これらのプロセス全てに共通なので、処置のための実用的な標的とはならない。それ故、前記反応間の差は、最初のリガンド−受容体相互作用か、又は特異的なエンハンセオソーム複合体の形成の何れかに存する。ＮＦ−κＢは、少なくとも１４の異なるエンハンサー要素とエンハンセオソーム複合体に結合することが知られているので、治療のための標的の候補となる。しかしながら、各エンハンセオソーム複合体の描出には、関与する各ＤＮＡ結合タンパク質の数とそれらの互いのタンパク質−タンパク質総合作用に関する知見が必要である。本方法は、これらの問題の何れをも直接解決するために使用することができる。プロテオームアレイは、新規ＤＮＡ結合タンパク質を同定するための特異的なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、プロテオームアレイは、特定の転写因子のトランス活性化ドメインを用いてスクリーニングして、それと相互作用する他のタンパク質を同定することができる。このようなスクリーニングの相互相関によって、特定のエンハンセオソーム複合体の新規成分を同定することが可能となるはずである。
【００２９】
本発明の方法によって作成されたタンパク質アレイは、アレイ中にディスプレイされた各タンパク質を認識する分子の選択も可能にするであろう。好ましい態様では、選択された分子は、抗体又は抗体様タンパク質であり、ファージ上若しくはリボソーム上にディスプレイされ、又はコードしているｍＲＮＡに共有結合しているであろう。
【００３０】
このように、ファージにディスプレイされた抗体ライブラリーは、アレイ中の各固定化されたタンパク質に適用し、結合していない抗体は洗浄によって除去することができる。続いて、選択されたファージは回収して、通常の操作に従って、細菌を感染するために使用することができる。ファージに感染した細菌は、続いて、さらなるラウンドの選択用の前記選択した抗体をディスプレイするファージ粒子を産生するか、又は直接使用するための可溶性抗体断片を産生することができる。本明細書において、「抗体」又は「抗体断片」という語は、マウス、ヒト、ラクダ、又はその他の生物に由来する単一鎖のＦｖｓ、ＦＡＢ断片、各軽鎖又は重鎖断片を意味する。
【００３１】
好ましい態様では、前記タンパク質アレイは、選択工程後に、各ウェル（ここで、細菌細胞は前記選択したファージに感染するであろう）に適切の細菌細胞を加えることによってファージ粒子が回収できるように、マイクロウェルフォーマットの中に存在させ得るであろう。続いて、前記アレイ中の各固定化されたタンパク質に対して選択された抗体断片の物理的な分離を維持しながら、各ウェルに増殖培養液を加えて、感染した前記細菌を増殖させ、抗体断片を発現させることができる。所望であれば、感染した前記細菌によって産生された新規ファージ粒子は、続くラウンドの選択で使用することができる。このような操作は、現在では、単一の精製され、且つ固定化されたタンパク質に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体断片を選択するための一般的な操作である。実際に、その後、前記元のタンパク質アレイは、その他は標準的なインビトロ抗体選択法を用いて、大量に並行して、正しく折り畳まれた何千ものタンパク質に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体断片を作成することが可能であろう。
【００３２】
元のアレイの各ウェルから得た前記選択され、可溶性に発現された抗体断片は、新しいアレイの各位置の中に存在する抗体断片が、前記元のアレイ中の単一の決まった位置に固定化されたタンパク質に対して選択されるように、それ自体を、新しい空間的に規定されたアレイの中に固定化することができる。このように作成された抗体のアレイは、可溶性抗体断片の固定化の前に行われた選択のラウンド回数に応じて、各位置にポリクローナル又はモノクローナル抗体断片の何れかを含有するであろう。
【００３３】
このような抗体のアレイは、関連するプロテオームのディファレンシャル発現モニタリングのために、粗細胞又は組織可溶化液の各タンパク質を捕捉することを含む多数の潜在的な用途を有するであろう。あるいは、抗体によって捕捉されたタンパク質は、リガンド−結合機能について直接スクリーニングされ得る。一般的に、あるモノクローナル抗体は、タンパク質の機能を遮断するように標的タンパク質に結合し得るが、別のモノクローナル抗体は機能を遮断せずに結合し得る。大規模並列アプローチでは、プロテオーム中の全てのタンパク質に対する全てのモノクローナル抗体が機能に影響を与えずに結合する能力を各別に評価することは明らかに非現実的である。しかしながら、プロテオーム中の全てのタンパク質に対する一群のポリクローナル抗体は、機能に影響を与えずに結合する所望の能力を有する各抗体を含有しているかもしれず、さらには、あるタンパク質の全ての翻訳後修飾を認識する各抗体を含有している可能性がある。このため、一般的には、既述のごとく作成したモノクローナル抗体のアレイよりもポリクローナル抗体のアレイの方が、捕捉されたタンパク質の機能について直接スクリーニングするのに有利であろう。
【００３４】
元のタンパク質アレイと比べて、本明細書に記載した方法によって作成した抗体アレイは、アレイ上に固定化された全てのタンパク質が、類似の条件下で安定であるであろうという利点を有するだろう。粗細胞又は組織可溶化液から捕捉された前記タンパク質は組換え体ではなく、天然に発現されているものであろう。さらに、前記捕捉されたタンパク質は、前記粗細胞又は組織可溶化液からの捕捉後に、直接、機能又はリガンド結合などについてスクリーニングすることができ、これは機能の維持を補助するはずである。
【００３５】
このように、さらなる側面では、本発明は、
（１）１以上の化合物の生物学的活性をスクリーニングする方法であって、前記１以上の化合物を、本明細書に記載のタンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記１以上の化合物の結合を測定する工程とを備えた方法；
（２）１以上のタンパク質の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用をスクリーニングする方法であって、前記１以上のタンパク質、例えば、細胞表面受容体を、本明細書に記載のアレイと接触させる工程と、前記１以上の特異的なタンパク質の前記アレイの前記タンパク質との結合を測定する工程とを備えた方法；
（３）１以上のタンパク質の特異的なタンパク質−核酸相互作用をスクリーニングする方法であって、前記１以上の核酸プローブを、本明細書に記載のアレイと接触させる工程と、前記プローブの前記アレイ中の前記タンパク質への結合を測定する工程とを備えた方法；
（４）化合物、タンパク質、又は核酸の迅速なスクリーニングにおける本明細書に記載のアレイの使用；
（５）アレイ中の各タンパク質を認識する分子のスクリーニングにおける本明細書に記載のアレイの使用であって、前記分子が好ましくは抗体である使用；
（６）抗体アレイを作成する方法であって、タンパク質アレイ中の１以上のタンパク質が抗体ライブラリー中の少なくとも１つの抗体に結合するように、本明細書に記載のタンパク質アレイを、抗体ライブラリーと接触させることと、結合していない全ての抗体を除去することと；前記タンパク質アレイ中のタンパク質に結合した抗体の固定化とを備えた方法：及び
（７）タンパク質の機能又は存在量をスクリーニングする方法であって、本明細書に記載の抗体アレイを１以上のタンパク質の混合物と接触させる工程を備えた方法を提供する。
【００３６】
方法（１）、（２）、（３）、及び（６）は、まず、１以上の本発明の方法によるアレイを提供する工程を含んでもよい。
【００３７】
本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加えれば、互いの側面に当てはまる。
【００３８】
ここで、以下の例を参照しながら本発明を記載するが、本例は、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【００３９】
例１
（ａ）ベクターの構築（図１ａ参照）
我々は、プロモーター配列のすぐ下流のＮｃｏＩ部位中にクローニングされた遺伝子発現を誘導するための強力なハイブリッドプロモーター（Ｐｔｒｃ）を含有するｐＵＣ１９に由来するベクターｐＭＭ１０６Ｈを構築した。我々は、ＮｃｏＩ部位と下流のＨｐａＩ部位の間にあるスタッファー断片（ｓｔｕｆｆｅｒ  ｆｒｇｍｅｎｔ）として、６７６ｂｐのナンセンスＤＮＡ配列を挿入した。ＨｐａＩは平滑断端切断酵素であり、読み取り枠が前記平滑断端の最初の塩基上にあれば、前記下流のＤＮＡがポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンペプチドをコードするように、ベクターを切除するように配置されている。ヘキサヒスチジンタグの後には、アンバー停止コドン（ＴＡＧ）があり、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が続いている。ｐＭＭ１０６Ｈ中にＮｃｏＩ／平滑断端断片としてクローニングされた遺伝子は、クローニングの間にＨｐａＩ部位に正しい読み取り枠が作出されたときにのみ、ＨｉｓタグとＧＦＰへの融合体をもたらす。ここでは、ＧＦＰは、Ｈｉｓタグを発現するクローンの可視的なスクリーニングを促進するためにレポーター遺伝子として使用されるが、ＧＦＰは、正しいコンフォメーションに折り畳まれたときだけ活性となるので、融合タンパク質の正しい折り畳みの指標も与える。前記アンバー停止コドンは、緑のコロニーを可視化するための少量の完全長融合タンパク質をもたらすであろうが、融合タンパク質の多くはＨｉｓタグの直後で終結すると思われるので、その後固定化と酵素アッセイに使用することができる。ｐＭＭ１０６Ｈの構築は配列決定によって確認された。
【００４０】
我々は、まず、プライマー「ＧＴＳｆｗｄ２」（５’−ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＧＧ−３’）及び「ＧＳＴＨｉｎｄＩＩＩ」（５’−ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  Ｇ−３’）を用いて、標準的な条件下で、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子をｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からＰＣＲ増幅することによって第２のベクターｐＧＳＴＮを構築した。これらのプライマーは、ＧＳＴの開始コドンにＮｃｏＩ制限部位を導入し、ＧＳＴの２番目の残基をセリンからアラニンに変異させ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が続くＧＳＴ遺伝子の３’にある多重クローニング部位の中に停止コドンを導入する。続いて、標準的な条件下で、ｐＧＳＴＮを作成するために予めＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、前記ＰＣＲ産物をクローニングした。
【００４１】
（ｂ）タグを付加する前の遺伝子のＰＣＲ増幅及びエキソヌクレアーゼ消化（図１ｂ参照）
我々は、それぞれ、ベクターの開始コドンの１５６ｂｐ上流及び停止コドンの８４ｂｐ下流に結合するベクター特異的な特注プライマー「ＳＴフォワード」（５’−ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  Ｇ−３’）と「ＳＴリバース」（５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  Ｔ−３’）によるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記構築物ｐＧＳＴＮからＧＳＴ遺伝子を増幅した。４つの別個の１００μＬの反応中で、３０サイクルのＰＣＲ（９４℃１分；５７℃１分；７２℃２分）を行った。各ＰＣＲ反応は、約２０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、及び２．５ユニットのＰｗｏポリメラーゼを含有していた。各ＰＣＲ反応は、標準的な緩衝液（ｌＯｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８．８、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０％  ＤＭＳＯ）中で行った。続いて、４つのＰＣＲ反応は、それぞれ、以下のような、標準的でないデオキシヌクレオチド三リン酸ミックスも含有していた。
【００４２】
反応１）  ２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、１５０μＭ  ｄＧＴＰ、５０μＭ  α−Ｓ−ｄＧＴＰ；
反応２）  ２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、２０ＯμＭ  ｄＧＴＰ、１５０μＭ  ｄＣＴＰ、５０μＭ  α−Ｓ−ｄＣＴＰ；
反応３）  ２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、１５０μＭ  ｄＴＴＰ、５０μＭ  α−Ｓ−ｄＴＴＰ；
反応４）  ２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、２０ＯμＭ  ｄＣＴＰ、１５０μＭ  ｄＡＴＰ、５０μＭ  α−Ｓ−ｄＡＴＰ。
【００４３】
それぞれの特異的なＰＣＲミックスに単一のα−チオデオキシヌクレオチド三リン酸を含有させると、前記特異的な最終ＰＣＲ産物中に適切なα−Ｓ−ｄＮＴＰをランダムであるが統計的に取り込ませる。続いて、前記４つの各ＰＣＲミックスをプールし、標準的な条件下で、ＱＩＡクイックＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、制限酵素ＡａｔＩＩで完全に消化した。得られた約１０００ｂｐのＰＣＲ産物を続いてゲル精製した。
【００４４】
続いて、５０μＬの反応液中において、３７℃で４５分間、３７５ユニットのエキソンクレアーゼＩＩＩとともに、５μｇの前記消化したＰＣＲ産物をインキュベートした。ＥｘｏＩＩＩ消化は、標準的な反応緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８．０、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン）中で行った。これらの条件は、ＥｘｏＩＩＩによる消化は確実に完結させる。続いて、７５℃まで１５分間加熱することによって、酵素を不活化する。ＥｘｏＩＩＩ消化の産物は、ＰＣＲ産物の３’末端から得られた欠失物の入れ子状態のセット（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）である。ＡａｔＩＩによる制限は、その後エキソヌクレアーゼＩＩＩ活性に対して抵抗する３’突出部を残すので、ＰＣＲ産物の５’末端は、消化から保護される。
【００４５】
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、α−チオ含有ヌクレオチドを加水分解することができない非前進性の３’から５’へのエキソヌクレアーゼなので、本プロトコールでは、ＥｘｏＩＩＩがα−チオ−デオキシヌクレオチド塩基に達する毎に、進行するＰＣＲ産物の陥凹した３’末端の切断が停止する。このため、初期の段階に各α−Ｓ−ｄＮＴＰがランダムに取り込まれる結果として、最終的には、欠失物の入れ子状態のセットが得られる。元のＰＣＲ増幅で使用したｄＮＴＰに対するα−Ｓ−ｄＮＴＰの比率は、入れ子状態の欠失のエンベロープが、元の完全長ＰＣＲ産物より約１００ｂｐ短いものを中心とする４００ｂｐのサイズのウインドウに及ぶように、経験的に決定した。我々は、ＥｘｏＩＩＩミックスの一部を取り、マング・ビーンのヌクレアーゼで入れ子状態の欠失を処理することによって、これを確認した。このプロセスによって、５’及び３’突出部が除去されて、平滑断端産物が得られ、続いて、１００ｂｐのＤＮＡラダーを標準として用いて、１％のアガロース／ＴＢＥゲル上で該産物のサイズを決定した。
【００４６】
明らかに、上記の操作において、入れ子状態の３’が陥凹した欠失物の必要なセットを作成するために、多くの異なる３’から５’へのヌクレアーゼ活性を使用することができる；これらには、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｅ．ＣｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
（Ｃ）タグを導入するための特異的な連結とＰＣＲ増幅（図１ｃ参照）
約２５倍モル過剰の「オリゴミックス」の存在下で、５μＬのＥｘｏＩＩＩ反応ミックスをＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中に希釈した。前記「オリゴミックス」は、２つの異なるオリゴヌクレオチドプールのうちの何れか１つからなる。第１のプール、「オリゴミックスＡ」は、３つの可能な各停止コドンが５’末端に提示され、直後に縮重塩基が続く１２のオリゴヌクレオチドを含有している。各オリゴの残りの領域は、１２のケース全てにおいて同じであり、３’末端にプライマー「ＬＢＭ２」に対する相補的な制限配列（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’）が続いた２つのＩＩＳ型制限酵素部位（ＳａｐＩ及びＢｐｍＩ）以外は、効果的にランダムな配列である。１２のオリゴの配列は以下のとおりである。
【００４８】
【表１】
0004730804.tif 000002
【００４９】
第２のプール「オリゴミックスＢ」は、３組のオリゴヌクレオチドからなり、それぞれは、５’末端に存在する３つの停止コドンのうち１つを有し、その直後に６つの縮重した残基が続いている。各オリゴの残りの領域は、３つの組全てで同じであり、２つのＩＩＳ型制限酵素部位（ＢｐｍＩとＢｓｅＲＩ）を含有し、３’末端にプライマー「ＬＭＢ２」に対する相補的な認識配列が続いている。３組のオリゴの配列は以下のとおりである。
【００５０】
【表２】
0004730804.tif 000003
【００５１】
ＥｘｏＩＩＩミックス＋オリゴミックスＡ又はオリゴミックスＢの何れかを、１６℃で３０分間アニールした後、４００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼを加え、その後１６℃で一晩反応液をインキュベートした。標準条件下で、ＱＩＡクイック  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて連結産物を精製し、プライマー「ＳＴフォワード」と「ＬＭＢ２」により、Ｐｗｏポリメラーゼを用いる標準的なＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。３０サイクルのＰＣＲ（９４℃、１分；５７℃１分；７２℃２分）を実施して、１０００ｂｐに及ぶＰＣＲ産物を生成させた。
【００５２】
オリゴミックスＡとオリゴミックスＢは何れも、前の工程で実施された二重鎖のうちの１つの鎖のＥｘｏＩＩＩによる加水分解によって露出された元のテンプレートの一本鎖ＤＮＡ領域に拮抗的にアニールすることができる。アニーリングに続いて、何れかのオリゴとテンプレートとの間で上手く連結が起こるためには、オリゴがその５’末端で絶対的な相補性をもってアニールし、さらに、前記二重鎖テンプレートの陥凹した３’残基が、特異的にアニールされたオリゴの５’残基と直接隣接していることを要する。新しく連結されたオリゴに結合する第１のプライマーと二重鎖テンプレートの５’末端に結合する第２のプライマーを用いたＰＣＲは、その後、このような連結を受けた二重鎖のみを選択的且つ特異的に増幅する。オリゴミックスＡ中の前記１２の各オリゴの５’末端は、停止コドンに対応するので、図１ｃに示されているように、このミックス中に含まれる１２のオリゴのうち、その５’末端に、ＧＳＴの第１のインフレーム停止コドンと該停止コドンのすぐ３’にある塩基とを含む４つの塩基対認識配列に対して絶対的な相補性を有する１つだけがアニールすることができる。残りの１１のオリゴは、それらの５’末端において、前記欠失物の入れ子状態のセットの内部の別の場所に完全にアニールし得るが、これら他の特異的なアニーリング現象は、ＧＳＴ遺伝子中のアウトオブフレームの停止コドン又は最初のインフレーム停止コドンの下流にある停止コドンでしか起こらない。新しくアニールしたオリゴがどこで、二重鎖テンプレートの３’陥凹した残基に直接隣接していても、連結が起こり得る。この段階のＰＣＲは、それ故、正確な、完全長の遺伝子のみならず、末端切断され、且つ伸長された産物のセットも増幅するであろう。オリゴミックスＢ中のオリゴは、同様に反応すると予想される。前記プール中の前記３組の各オリゴの５’末端は、停止コドンに対応し、効果的にランダムである６つの残基が続く。それ故、前記プールは、停止コドンと次の６つの残基が目的の遺伝子の下流にある残基と完全にマッチする１つの順列を含有するであろう。４と比べて、９つのヌクレオチド上に相補部分が伸長しているので、このオリゴは、１２のオリゴのプールから得られた対応するオリゴより高い特異性で結合するであろう。
【００５３】
オリゴミックスＡとオリゴミックスＢとの理論的な差は、各オリゴの５’末端にある停止コドンの直後にある配列中に存在する。オリゴミックスＡでは、単一の縮重する塩基の後にはナンセンスであるが、決まった単一のＤＮＡ配列が続いているので、この決まった領域は、各オリゴの５’末端での４つのデザインされた塩基対の相互作用を超えて、意図的にではないが塩基対の相補性をさらに与えることによって、何れかの特定の遺伝子内の各「停止」コドン（インフレームであるとアウトオブフレームであるとを問わない）を優先するように、オリゴミックスのアニーリングを偏らせることができる。アニーリング中の何れの偏りも、各停止コドン（インフレームであるとアウトオブフレームであるとを問わない）の特異的な切り出しと置換が起こったクローンに対する偏りの下流に現れ得る。このような異なる停止コドンにおける修飾の頻度の偏りは、望ましくないかもしれないので、オリゴミックスＢは、以下のように、これを回避するためにデザインされている。各遺伝子又はライブラリー内の停止コドンは何れも、そのすぐ後に、確定しているが、未知の配列が続いているであろう。３つの停止コドンは全て、オリゴミックスＢの中に提示されており、遺伝子又はライブラリー内の何れの停止コドンに対しても、前記停止コドンとその正確な下流の配列と正確にマッチするオリゴがオリゴミックスＢの中に１つ存在し、全体で９塩基対の相補性が得られるように、それぞれは、全ての可能なヘキサヌクレオチド配列（すなわち、ランダムヘキサマー配列によって）が直後に続いている。これは全ての停止コドンについて当てはまると思われるので、オリゴミックスＢは、それ故、オリゴミックスＡで起こり得るこの種の偏りからは、何れも解放されるはずである。
【００５４】
我々は、前記オリゴミックスのＥｘｏＩＩＩ消化、アニーリング、及び連結、並びに特異的なＰＣＲ増幅の全プロセスが、高度に再現性を有することを見出した。この操作における対照として、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、又は何れかのオリゴミックスのうち何れか１つを省略すると、ＰＣＲ産物が全く得られないことを示した。このことは、このプロセスが高度に選択的であることを示している。
【００５５】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、異なる特異性を示し得る多数の異なるＤＮＡリガーゼ、例えば、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、又はＴｓｃ  ＤＮＡリガーゼによって置き換え得ることも理解できるであろう。
【００５６】
（ｄ）操作の変形
明らかに、上記の操作において、３’陥凹した欠失物の必要な入れ子状態のセットを作成するために、多数の異なる３’から５’へのヌクレアーゼ活性を使用することができる。これらには、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５７】
停止コドン又は開始コドンが正確に除去された完全長の挿入物を作成するための前記元の操作に対する明確な変形には、コード配列を包含するＰＣＲ産物中に、５’が陥凹した欠失物の入れ子状態のセットを製造することが含まれる。これは、λエキソヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソンクレアーゼのようなヌクレアーゼを用いて行うことができるであろう。このように、例えば、前記元のＰＣＲ産物は、５’から３’方向にｄｓＤＮＡの１つの鎖からヌクレオチドを除去するλエキソヌクレアーゼを用いて消化することができる。前記酵素は、５’リン酸基のみを基質として認識するので、２つの鎖のうち１つは、最初のＰＣＲ増幅において適切なプライマーの末端に５’水酸基を取り込むことによって保護され得る。欠失物の入れ子状態のセットは、このように、５’が陥凹した末端を残すように反対鎖が消化されることを除き、エキソヌクレアーゼＩＩＩについて上記したように作成することができる。続いて、停止コドンの相補部分が前記オリゴの３’末端に存在し、すぐ直前に６つのランダム化された残基が先行し、その前にＩＩＳ型制限部位をコードする所定配列が先行するオリゴの混合物を、前記露出した１本鎖領域にアニールすることができる。前記混合物からの１つのオリゴは、各露出された停止コドンに特異的にアニールし、５’から３’の方向にポリメライズするＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩに対するプライマーとした働き、その５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性で、その前にある鎖を消化するであろう。この新しい二重鎖ＤＮＡ断片は、続いて、元のＰＣＲ産物の５’末端に結合するプライマーと新しくアニール、伸長されたオリゴに特異的に結合するプライマーとを用いて、特異的に増幅することができる。この操作では、前記アニールされたオリゴの３’末端は、二重鎖テンプレートの５’が陥凹した残基に直接隣接することを要しない。前記混合物からのオリゴは、ランダムなヘキサマープライミングと類似した態様で、前記露出した１本鎖ＤＮＡテンプレート上の任意の相補領域にアニールすることができるが、重要なことに、鎖の伸長は、３’末端が絶対的な相補性をもってアニールし、前記混合物中のオリゴの３’末端が停止コドンのみに相補的であるようにデザインされている場合だけに起こるであろう。このように、オリゴの３’末端が一致する停止コドンに特異的に結合するときだけ、プライマーの伸長とその後のＰＣＲ増幅が起こるであろう。アウトオブフレームの停止コドンと目的の遺伝子の真の停止コドンの下流にあるコドンへの結合も起こり、正確な完全長の遺伝子のみならず、一群の末端切断され、伸長された産物のＰＣＲ増幅が得られる。
【００５８】
（ｅ）ＰＣＲ産物のクローニングと分析（図１ｄ参照）
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、サイズが８００〜１０００ｂｐにわたるＰＣＲ産物（約５μｇ）を精製した後、ＩＩＳ型制限酵素ＢｐｍＩを用いて完全に消化した。この酵素は、一方の鎖中に存在するその認識配列から離れた１４の塩基と他方の鎖上の１６ｂｐを遠隔的だが特異的に切断して、３’陥凹した末端を残す。このため、この制限修飾は、前記ＰＣＲ産物から停止コドン（前記「オリゴミックス」から各オリゴの５’末端は、前の工程において、ここにアニールし、適切に連結される）を特異的に切り出す。
【００５９】
続いて、マング・ビーンヌクレアーゼを用いて、標準的な条件下で、前記消化された産物の陥凹した３’末端を除去し、ＰＣＲ産物の３’末端に平滑断端を作出する。標準的な条件下で、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡを精製し、続いて、制限酵素ＮｃｏＩを用いて完全に消化した。続いて、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１％アガロース／ＴＢＥゲル上で、８００ｂｐ〜１０００ｂｐにわたる制限ＤＮＡ断片を精製した。制限酵素ＮｃｏＩとＨｐａＩでベクターｐＭＭ１０６Ｈ（３μｇ）を完全に消化し、２８７０ｂｐの骨格断片をゲルで精製した。続いて、標準的な条件下で、ベクターＤＮＡと制限ＰＣＲ産物を互いに連結させ、連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換した後、これを回収し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢプレート上に播種した。
【００６０】
このクローニング操作は、前工程で得られたＰＣＲ産物の完全なセットに対して行った。しかしながら、最初のインフレーム停止コドンへのオリゴの特異的なアニーリングと連結に由来するＰＣＲ産物のみが、この操作を介したクローニング工程後に、ヘキサヒスチジンタグとＧＦＰへのインフレーム融合物を生じることができるはずである。このようにしてクローニングされた他の全てのＰＣＲ産物は、ヘキサヒスチジンタグとＧＦＰへのアウトオブフレーム融合物を誘導するにすぎないはずである。ＰＣＲ産物の平滑断端の、ベクターの平滑断端への連結が、下流ベクターＤＮＡの読み取り枠の翻訳が切り出された停止コドンの元の読み取り枠によって指示される遺伝的融合物もたらすので、このようなことが起こる。もし、停止コドンがＧＳＴ遺伝子に関してアウトオブフレームであれば、新しく付加されたヘキサヒスチジンをコードする配列も、ＧＳＴ遺伝子に対してアウトオブフレームになるものと思われるが、停止コドンがＧＳＴに関してインフレームであれば、新しく付加されたヘキサヒスチジンをコードする配列もＧＳＴ遺伝子に関してインフレームとなるであろう。しかしながら、特異的に切り出された停止コドンがＧＳＴの最初のインフレーム停止コドンであったＰＣＲ産物のみが、前記ＤＮＡが転写、翻訳されるときに、ヘキサヒスチジン（とＧＦＰ）が付加されたＧＳＴ融合タンパク質を生じ得る。上記特異的工程全体から生じ得る唯一のヘキサヒスチジン（とＧＦＰ）が付加されたタンパク質は、それ故、必ず、ポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンへの完全長のＧＳＴ融合物であろう。
【００６１】
上述したクローニング操作から得られたコロニーは、緑色の蛍光のコロニーを同定するために、３６５ｎｍで可視化された。９０のコロニー（白と緑の両者）をランダムに選んで、レプリカプレーティングを行い、抗Ｈｉｓタグと抗ＧＳＴ抗体を用いた標準的な条件下でコロニーウェスタンブロットによって分析した。抗Ｈｉｓタグ抗体は、ヘキサヒスチジンが付加されたタンパク質を発現するコロニーに結合するだけであると思われるので、ウェスタンブロットは、ヘキサヒスチジンタグへのインフレーム融合物を発現するコロニーの数についての直接的な情報を与える。これに対して、抗ＧＳＴ抗体は、ＧＳＴタンパク質のＣ末端付近に結合するので、完全長又はほぼ完全長のＧＳＴタンパク質を発現するコロニーのみを認識する。我々は、抗Ｈｉｓタグと抗ＧＳＴ抗体の両者によって陽性に認識されたタンパク質を含有するコロニーを同定した。これらのコロニーからのＤＮＡを増幅、精製、及び配列決定した。配列決定データによって、完全長のＧＳＴへの２つの完全なインフレーム融合物（すなわち、元のＧＳＴ遺伝子の最初のインフレーム停止コドンが特異的に切り出され、インフレームのポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンタグによって置き換えられたクローン）の存在が確認された。この操作全体を介して我々が取得した修飾の成功率は、それ故、約２．２％である。両陽性クローンは、十分な量の完全長のＧＳＴ−ヘキサヒスチジン−ＧＦＰ融合物が発現されるために、長波長の紫外光に暴露すると、緑の蛍光を発することが見出された。それ故、さらなる全ての実験において、ウェスタンブロットによるさらなる分析のためには、緑の蛍光を発するコロニーのみを選択した。我々は、約７０〜８０％の緑の蛍光を発するコロニーが、抗Ｈｉｓタグ抗体によって認識されるタンパク質を発現することを見出した。残りの２０〜３０％のケースでは、おそらくは、クローニングされた挿入物によって導入された偽リボソーム結合部位の助けによって、ヘキサヒスチジンタグとは独立に、ＧＦＰ遺伝子の最初のＡＴＧから翻訳が開始している。
【００６２】
我々は、抗Ｈｉｓタグと抗ＧＳＴ抗体の両者によって認識されるタンパク質を発現している緑の蛍光を発するコロニーからプラスミドＤＮＡを増幅、精製、配列決定した。オリゴミックスＡとオリゴミックスＢの両者を用いて調製した挿入物に関しては、修飾の成功率は、全ての緑のコロニーの約２５％であることが分かった。それ故、ＧＦＰ遺伝子をインフレーム融合物に対するマーカーとして使用すると、正しいクローンを検出する効率が約１０倍増加する。
【００６３】
マング・ビーンヌクレアーゼは、異なる特異性を示すかもしれない多数の異なる１本鎖ヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼ又はＲＮａｓｅＴによって置き換えることができ、適切な位置に置かれた多数の異なるＩＩＳ型制限酵素、例えばＳａｐＩを、ＢｐｍＩの代わりに使用し得ることも理解できるであろう。
【００６４】
（ｆ）タグ付加されたタンパク質の固定化と機能的な分析（図１ｅ参照）
上記の方法によって作成された完全長のヘキサヒスチジンが付加されたＧＳＴプラスミドのうちの１つで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換した。１０ｍＬの液体培地中において、中期対数期まで、単一のカルベニシリン耐性コロニーを増殖させた後、１００μＭのＩＰＴＧを補充して、ヘキサヒスチジンが付加されたＧＳＴの発現を誘導する。さらに４時間増殖させた後、細胞を採集し、凍結融解／リゾチームによって溶解した。粗可溶化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予想されたサイズ（２７ｋＤａ）の過剰発現したタンパク質（全可溶性タンパク質の約２０％を占めた）とともに、アンバーの抑制によって生じた少量の５４ｋＤａのＧＳＴ−ヘキサヒスチジン−ＧＦＰ融合物を示した。続いて、粗可溶化液（５００μＬ；１００μｇ）をニッケル−ＮＴＡ磁気ビーズ（５０μＬ；結合能１５μｇのヘキサヒスチジンが付加されたタンパク質）と混合し、磁場の下での沈降によって前記ビーズを回収した。上清を捨て、ビーズを洗浄した後、各１ｍＭのグルタチオンと１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを含有するグルタチオンＳトランスフェラーゼアッセイ緩衝液中に再懸濁した。３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、室温で３０分後に終末点のアッセイデータを集めた。この波長は、ＧＳＴによって触媒される反応の産物のλｍａｘに相当する。
【００６５】
対照として、親ベクター（ｐＭＭ１０６Ｈ）又は無関係のＨｉｓ付加タンパク質（アラニンラセマーゼ）をコードするプラスミドの何れかを含有するＤＨ５αの培養物を平行して増殖、誘導、採集、溶解し、アッセイした。ＧＳＴ活性は、Ｈｉｓを付加されたＧＳＴを含有する粗可溶化液と混合されたビーズ上のみに検出され、明らかに、観察されたＧＳＴ活性が、固定化されたＨｉｓ付加ＧＳＴから特異的に得られたものであり、さらに、該タンパク質が特異的に固定化されたときに、活性を保持していることが実証された。
【００６６】
酵素アッセイの完了後に、１００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液を添加することによって、磁気ビーズからタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。これによって、陽性活性のアッセイ結果が得られたサンプルが、グルタチオンＳトランスフェラーゼに対して予想された正確なサイズ（２７ｋＤａ）の単一の固定化されたタンパク質を含有することが示され、このため、前記ビーズ上に観察された活性が、この組み換えＨｉｓ付加タンパク質のみによることが確認された。
【００６７】
例２
（ａ）２つの異なるタグを用いたＧＳＴの修飾、固定化、及びアッセイ
ヘキサヒスチジンタグによるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの修飾について例１で記載した操作に従って、我々は、該操作が、加えたタグの正確な性状の影響を受けないことを実証した。
【００６８】
まず、６７６ｂｐのＮｃｏＩ／ＨｐａＩナンセンスＤＮＡスタッファー断片が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｄｈＡ遺伝子に由来する３００ｂｐのＮｃｏＩ／ＨｐａＩ断片に置き換えられ、ヘキサヒスチジンタグがＦＬＡＧペプチド（エピトープタグ）とＳｔｒｅｐＩＩタグ（ストレプトアビジンに特異的に、且つ高い親和性で結合する）の何れかによって置き換えられていることを除いて、ｐＭＭ１０６Ｈと同一である２つのさらなるベクターを構築した。これらのベクターは、それぞれ、ｐＭＭ１０４Ｆ及びｐＭＭ１０４Ｓと表記された。ＮｃｏＩとＨｐａＩを用いて、これらのベクター（それぞれ３μｇ）を別々に完全消化し、２８７０ｂｐの骨格断片をゲル精製し、例１に記載したようにオリゴミックスＡから生じたＧＳＴ断片に連結した。抗ＦＬＡＧ及び抗ＧＳＴ抗体の組み合わせを使用した後、配列決定し、ＦＬＡＧタグへの前記完全長のＧＳＴ遺伝子の完全なインフレーム融合物を含有するクローンを同定した。同様に、抗ＧＳＴ抗体とストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体の組み合わせを用いた後、配列決定し、ＳｔｒｅｐＩＩタグへの前記完全長のＧＳＴ遺伝子の完全なインフレーム融合物を含有するクローンが同定された。何れの例においても、完全長のインフレーム融合物が見出される頻度は、例１で決定したものと同じ（実験誤差の範囲内）であった。
【００６９】
固定化基材が、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体をコートした９６ウェルのプレートとストレプトアビジンコートされた磁気ビーズであることを除き、実質的に例１に記載されているように、これらのクローンを固定化実験で使用した。例１における如く、我々は、これらのタグを介した融合タンパク質の特異的な固定化を実証することができ、さらに、我々は、ＦＬＡＧ又はＳｔｒｅｐタグの何れかを介して固定化したときに、ＧＳＴ融合物がその活性を保持することを示すことができた。
【００７０】
例３
（ａ）ヘキサヒスチジンタグを用いた別のタンパク質の修飾
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼについて例１に記載した操作に従って、我々は、この操作が、扱っている正確な遺伝子の影響を受けないことを実証した。
【００７１】
このように、ヒト転写因子ＮＦ−κＢ  ｐ５０をコードするプラスミドから開始し、特に明記されていなければ、例１に記載されている操作（オリゴミックスＡを用いる）に正確に従って、我々は、最初のインフレーム停止コドンが特異的に切り出され、ポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンタグをコードするＤＮＡへのインフレーム融合物によって置き換えられているようにＮＦ−κＢ  ｐ５０が修飾されることを実証することができた。抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたコロニーウェスタンブロットによって、ヘキサヒスチジンが付加されたタンパク質を発現するクローンの同定が可能となった。これらのコロニーからのＤＮＡを増幅、精製、配列決定した。配列データによって、幾つかのクローンは、完全長のＮＦ−κＢへの完全なインフレーム融合物（すなわち、前記停止コドンが特異的に切り出され、インフレームヘキサヒスチジンタグによって置き換えられたクローン）をコードすることが確認された。ＮＦ−κＢ  ｐ５０のケースで、完全長のインフレーム融合物が見出される頻度は１．１％であり、ＧＳＴについて例１で決定したものと近く、実験誤差の範囲内にある。
【００７２】
（ｂ）ヘキサヒスチジンが付加されたＮＦ−κＢ  ｐ５０の固定化と機能分析  上記方法によって作成した完全長のヘキサヒスチジンが付加されたＮＦ−κＢプラスミドのうちの１つで、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換した。１０ｍＬの液体培地中において、中期対数期まで、単一のカルベニシリン耐性コロニーを増殖させた後、１００μＭのＩＰＴＧを補充して、ヘキサヒスチジンが付加されたＮＦ−κＢ  ｐ５０の発現を誘導する。さらに４時間増殖させた後、細胞を採集し、音波処理によって溶解した。粗可溶化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予想されたサイズ（３８ｋＤａ）の過剰発現したタンパク質（全可溶性タンパク質の約５％を占めた）とともに、アンバーの抑制によって生じた少量の６５ｋＤａのＮＦ−κＢ  ｐ５０−ヘキサヒスチジン−ＧＦＰ融合物を示した。
【００７３】
【表３】
0004730804.tif 000004
【００７４】
標準的な条件下で３末端トランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、二重鎖オリゴヌクレオチド「κＢモチーフ」（ＮＦ−κＢ  ｐ５０に対するパリンドローム結合部位を含有する）の３’塩基をジゴキシゲニンで標識した。
【００７５】
５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝化された生理的食塩水ｐＨ７．５）中でのリゾチーム／凍結溶解法を用いて、タンパク質溶解物を調製した。各クローンからの可溶性タンパク質溶解物２００μＬをＮｉ−ＮＴＡコートしたマイクロウェルに加え、室温で４５分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、ＰＢＳＴ（０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ）でウェルを３回洗浄して、結合していないタンパク質を全て除去した。ＤＮＡ結合緩衝液（５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、７５ｍＭ  ＫＣｌ）を用いて、１分の浸漬時間で、ウェルを３回洗浄した。３’ジゴキシゲニンを標識したκＢモチーフ（２ｐｍｏｌ）を、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）非特異的ＤＮＡを含有するＤＮＡ結合緩衝液２００μＬ中にウェルに加えた。さらに３０分インキュベートした後、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、２５ｍＭ  ＫＣｌで３回ウェルを洗浄することによって、結合していないＤＮＡを除去した。抗ジゴキシゲニン抗体−アルカリホスファターゼ接合体を、０．２％のウシ血清アルブミンが補充された「抗体希釈緩衝液」（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、２５ｍＭ  ＫＣｌ）の中に、１５０ｍＵ／ｍＬになるように希釈した。続いて、希釈した抗体（２００μＬ）をマイクロウェルに加えた。室温で３０分間放置した後、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が補充された「抗体希釈緩衝液」（３×３５０μＬ）でマイクロウェルを洗浄することによって、結合していない抗体を除去した。続いて、アルカリホスファターゼの基質である２５０μＭのｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を含有する２００μＬの緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）をウェルに加え、室温で一晩反応を進行させ、その後、各ウェル中の黄色の呈色（産物の形成に相当する、ｐ−ニトロフェノール）を４０５ｎｍで定量した。基質ｐＮＰＰの加水分解のバックグラウンド速度は低いので、ウェル中に黄色が出現することから、直ちに、陽性のアッセイ結果が明らかとなった。
このアッセイの対照として、我々は、粗可溶化液、又は標識されたオリゴヌクレオチド、又は抗体の何れかを省略し、又は２０倍過剰の未標識の二重鎖オリゴを加え、又は粗可溶化液を含有するヘキサヒスチジンが付加されたＮＦ−κＢ  ｐ５０を、同じベクターのバックグラウンド中でヘキサヒスチジンが付加されたＧＳＴを発現しているＤＨ５α細胞から得た等量の粗細胞可溶化液で置き換えた。
【００７６】
このアッセイでは、ＮＦ−κＢ  ｐ５０は、まず、特異的な結合部位を介して標識されたオリゴヌクレオチドに結合する。続いて、ヘキサヒスチジンタグを介して、マイクロウェル中に該タンパク質−ＤＮＡ複合体を固定化し、全ての結合していない標識されたオリゴとともに、（前記標識されたオリゴと粗可溶化液中に存在する他のＤＮＡ結合タンパク質との複合体を含む）他の全てのタンパク質を洗浄除去した。抗体−接合体は前記オリゴ上の標識を認識するが、ヘキサヒスチジンが付加されたタンパク質を認識しないので、タグを介してＮＦ−κＢ  ｐ５０を固定化したときに、ＮＦ−κＢ  ｐ５０−ＤＮＡ相互作用が維持されれば、アッセイ中の陽性シグナルのみを観察することができる。この相互作用が維持されなければ、前記オリゴは、洗浄工程の間に失われ、色の変化は観察されないであろう。
【００７７】
我々は、黄色の産物は、ヘキサヒスチジンが付加されたＮＦ−κＢ  ｐ５０粗可溶化液とジゴキシゲニン標識されたオリゴヌクレオチドを含有するマイクロウェル中のみで検出されことを見出し、これに抗ジゴキシゲニン抗体−アルカリホスファターゼ接合体を添加した。これにより、観察された色の変化は、固定化されたＮＦ−κＢ  ｐ５０オリゴヌクレオチド複合体から特異的に得られたものであり、さらに、特異的な固定化のときに、ＮＦ−κＢ  ｐ５０が活性を保持していることが実証された。
【００７８】
例４
停止コドンが正確に除去された完全長の遺伝子又はｃＤＮＡを作成するための別の操作は、コード配列を包含するＰＣＲ産物において、５’が陥凹した欠失物の鎖特異的な入れ子状態のセットを作成することが含まれる。これは、λエキソヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、又はＴ７遺伝子６エキソンクレアーゼのようなヌクレアーゼを用いて行うことができるであろう。このように、例えば、前記元のＰＣＲ産物は、任意の５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼを用いて行うことができるであろう。５’が陥凹した欠失物の入れ子状態のセットが一度作成されると、オリゴミックスは、露出した１本鎖領域にアニールすることができる。該オリゴミックスは、各停止コドンの相補部分が３’末端に存在し、すぐ直前に６つのランダムな残基が先行し、その前にＩＩＳ型制限部位をコードする所定配列とプライマー「ＬＢＭ２」（例１参照）に対する相補性認識配列が先行する１群のオリゴからなる。このため、前記オリゴ群の配列は、以下のとおりである。
【００７９】
【表４】
0004730804.tif 000005
【００８０】
前記混合物からの１つのオリゴは、センス鎖上に露出された各停止コドンに特異的にアニールし、Ｔａｑポリメラーゼのように、又はＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのような５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性のように何れかの鎖を置き換える活性を有するＤＮＡポリメラーゼに対するプライマーとなるであろう。新しく生じた二重鎖ＤＮＡ断片は、続いて、元のＰＣＲ産物の５’末端に結合するプライマーと新しくアニール、伸長されたオリゴに特異的に結合するプライマーとを用いて、特異的に増幅することができる。この操作では、前記アニールされたオリゴの３’末端は、二重鎖テンプレートの５’が陥凹した残基に直接隣接することを要しない。前記混合物からのオリゴは、ランダムなヘキサマープライミングと類似した態様で、前記露出した１本鎖ＤＮＡテンプレート上の任意の相補領域にアニールすることができるが、重要なことに、鎖の伸長は、３’末端が絶対的な相補性をもってアニールする場合だけに起こるであろう。前記混合物中のオリゴの３’末端は、停止コドンに相補的であるようにデザインされているので、オリゴの３’末端が一致する停止コドンに特異的に結合するときだけ、プライマーの伸長とその後のＰＣＲ増幅が起こるであろう。アウトオブフレームの停止コドンと目的の遺伝子の真の停止コドンの下流にあるコドンへの結合も起こり、正確な完全長の遺伝子のみならず、一群の末端切断され、伸長された産物のＰＣＲ増幅が得られる。しかしながら、これらは、ペプチドタグへのインフレーム融合物を生じないと思われるので、続く工程で容易にスクリーニングすることができる。
【００８１】
記載のごとく５’欠失物の入れ子状態のセットに対してアニーリングと伸長操作を行うことは、全コード領域を包含する完全に１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対してアニーリングと伸長操作を行うことに比べて、著しい利点を有する。これは、伸長の前に、プライマーが特異的にアニールすることができる部位の数が、前記欠失物の入れ子状態のセットの２本鎖部分の存在によって大きく制限されることによるものである。欠失物の入れ子状態のセットの１本鎖部分は、主として、前記遺伝子の３’未翻訳領域を包含し、これは、コード配列の外にある停止コドンを優先して、さらにはより長い伸長産物を優先して、前記伸長産物に強く偏らせる効果を有するであろう。これらの因子は、最初のインフレーム停止コドンが操作全体によって特異的に除去される頻度を著しく増加させるように作用するであろう。実際に、我々は、完全に１本鎖のコード領域テンプレートを用いて、以下の工程（ｂ）に記載したオリゴをアニールし、伸長することを試みたが、我々は、その実験からは、正しく修飾された完全長のクローンを何ら同定できなかった。これに対して、以下に詳述されている操作の結果は、アニーリングと伸長工程のためのテンプレートとして５’欠失物の入れ子状態のセットの使用が、コード配列の最初のインフレーム停止コドンの特異的な除去を促進して、ポリペプチドタグへの完全長のインフレーム融合物を得る上で効果的且つ効率的であることを明らかに実証している。
【００８２】
（ａ）タグ付加に先立つ遺伝子のＰＣＲ増幅とエキソヌクレアーゼ消化
このように、我々は、前記増幅において、ここでは「ＳＴリバース」プライマーが５’リン酸化されていることを除いて、正確に、例１の工程（ａ）と（ｂ）に記載されているように、まずＧＳＴ遺伝子の最初のＰＣＲ増幅を行った。続いて、２．５ユニットのλエキソヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｓｔｒａｎｄａｓｅキット）を用い、標準的な反応緩衝液（６７ｍＭ  グリシン−ＫＯＨ  ｐＨ９．４、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン）中において、精製されたＰＣＲ産物を３７℃で４０分間消化した。続いて、１５分間７５℃に加熱することによって該酵素を不活性化した。λエキソヌクレアーゼ酵素は、５’リン酸基のみを基質として認識するので、センス鎖は消化から保護され、それ故、消化産物は、前記ＰＣＲ産物のアンチセンス鎖の５’末端から得られる欠失物の入れ子状態のセットである。
【００８３】
（ｂ）タグを導入するための特異的な連結、伸長、及び増幅
２５０μＭのｄＮＴＰと約２５倍モル過剰の下記の縮重オリゴ群の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ反応緩衝液中に、５μＬのλエキソヌクレアーゼ反応ミックスを希釈した。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
消化された断片とオリゴを３７℃で３０分間アニールした後、５ユニットのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩを加え、その後３７℃で３時間反応液をインキュベートした。標準的な条件下で、ＱＩＡクイック  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて伸長産物を精製し、プライマー「ＳＴフォワード」と「ＬＭＢ２」により、Ｐｗｏポリメラーゼを用いる標準的なＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。３０サイクルのＰＣＲ（９４℃、１分；５７℃１分；７２℃２分）を実施して、１０００ｂｐに及ぶＰＣＲ産物を生成させた。
【００８６】
上記操作から生じたＰＣＲ産物を消化し、例１の工程（ｅ）で記載されているベクターｐＭＭ１０６Ｈ中にクローニングした。クローニング操作から得られたコロニーを３６５ｎｍで可視化して、緑の蛍光を発するコロニーを同定した。７３のこのようなコロニーを選択し、レプリカプレーティングを行い、抗Ｈｉｓタグと抗ＧＳＴ抗体を用いた標準的な条件下でコロニーウェスタンブロットによって分析した。緑の蛍光を発するコロニーのうち５８％が、抗Ｈｉｓタグと抗ＧＳＴ抗体の両者によって陽性に認識されるタンパク質を発現していた。抗Ｈｉｓと抗ＧＳＴの両者に陽性であった１５のコロニーからのＤＮＡを増幅、精製、配列決定した。配列決定データによって、完全長のＧＳＴへの１０個の完全なインフレーム融合物（すなわち、元のＧＳＴ遺伝子の最初のインフレーム停止コドンが特異的に切り出され、インフレームのポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンタグによって置き換えられたクローン）の存在が確認された。この操作全体を介して我々が取得した修飾の成功率は、それ故、緑の蛍光を発するコロニーの総数の３９％である。
【００８７】
例５
（ａ）１１の遺伝子のプールから得られたあるタンパク質の同定
我々は、下表に列記された１１の異なる遺伝子のプールに特定されていることを除き、正確に例１に記載されているように前記操作を適用した。我々は、アレイ中の各位置が、該操作の結果として付加されたタグを通じて固定化された単一の組換えタンパク質に対応するように、得られた特異的に修飾されたタンパク質のアレイを作成した。続いて、我々は、機能的アッセイによって該アレイをスクリーニングし、前記プールの各タンパク質成分を首尾良く同定した。
【００８８】
【表６】
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【００８９】
とりわけ、ｃＤＮＡライブラリーで遭遇する状況を模倣するために、まず、１１の遺伝子を全て、同じｐＴｒｃＨｉｓＡベクター骨格の中にサブクローニングした。例１に記載されたプライマー「ＳＴフォワード」と「ＳＴリバース」は、ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター骨格内にコードされた遺伝子を増幅するための万能プライマーとなるようにデザインした。
プライマー「ＳＴフォワード」は、以下のように、多数の制限部位をコードするようにデザインされた。
【００９０】
【表７】
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【００９１】
このように、エキソヌクレアーゼを保護するための３’突出部を作成する目的で、制限酵素ＡａｔＩＩかＳｆｉＩのうち何れかを使用することができる。修飾操作の最後に定方向のクローニングを行う目的で、本例では、統計的にはライブラリー中をより高い頻度で切断すると思われるので、ここで使用したタグベクターｐＭＭ１０６Ｈ中のＮｃｏＩクローニング部位と適合する粘着末端を作出し、本プール中の１１の何れの遺伝子の内部も切断しないので、我々はＢｓｐＨＩを使用することを選択した。明らかに、原則的としては、タグベクターがプロモーターの下流にある均等なクローニング部位を含有していれば、制限部位をコードする任意のプライマーを使用することができる。ＳｆｉＩは、８ｂｐの認識配列を有し、このため、ある遺伝子内のＳｆｉＩ部位のランダムな発生頻度が、ＢｓｐＨＩのような６ｂｐ認識配列の頻度（１／４０９６）と比べてずっと低い（１／６．５×１０４）ので、より大きなライブラリーフォーマットにおいてこの点で著しい利点を有するであろう。
【００９２】
タグベクターｐＭＭ１０６Ｈは「ＡＴＧ」ベクターである、すなわち、５’クローニング部位（ＮｃｏＩ）が、ネイティブタンパク質を発現するためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の下流に位置するＡＴＧ開始コドンと重なっている。しかしながら、ここに記載した操作では、我々は、開始コドンに共通の制限部位を有するクローニングされた遺伝子には頼らない。代わりに、我々は、単に、クローニングされた遺伝子自体によって翻訳の開始に必要なシグナルが提供されるように、ｍＲＮＡを生成するための転写を開始するベクターにコードされたプロモーターに頼っている。このように、この例では、元のプール中の全ての遺伝子は、ＡＴＧに位置するクローニング部位の存在又は不存在にかかわらず、ＲＢＳが直前に存在する開始コドンを有する。プライマー「ＳＴフォワード」は、１１の最初のクローン全てで、ＲＢＳの上流に結合するので、制限部位をコードする何れかのプライマーを用いたその後の修飾後クローニングは、それらの元のＲＢＳとＡＴＧとともに、タグベクターの中に新しく修飾された遺伝子を導入し、このため、翻訳の開始が確実となるであろう。ｃＤＮＡライブラリーフォーマットでは、全ての完全長のｃＤＮＡが、真核細胞の翻訳開始シグナルを含有するそれ自身の５’未翻訳領域（ＵＴＲ）を有すると思われる点で、同じ状況が当てはまる。続いて、この場合に適切な翻訳の開始を得るためには、転写開始シグナルをこのようにもう一度与える真核細胞ベクターの中に、その５’ＵＴＲとともに、修飾されたｃＤＮＡをクローニングすることのみが必要である。それ故、この例で使用したプライマーと均等な万能ＰＣＲプライマー群を使用することができる。
【００９３】
以下の修飾を用いて、例１で記載したように修飾操作を実施した。プライマー「ＳＴフォワード」と「ＳＴリバース」を用いる最初のＰＣＲ増幅のテンプレートとして、１１の遺伝子全ての等モルのプールを使用し、その後、ＳｆｉＩ酵素は８ｂｐの認識配列を有し、１１の遺伝子のうち何れの遺伝子の内部も切断しないので、ＳｆｉＩで断片を消化して５’末端を保護した。アニーリング工程では、オリゴミックスＡ（例１参照）を使用した。第２のＰＣＲ増幅後に、修飾された断片を２つのポットに分け、これをＢｐｍＩとＳａｐＩで別個に消化した。統計的には、何れのライブラリー中の遺伝子も、僅かな割合で、ＳａｐＩ部位（７ｂｐ認識配列；ランダムな発生確率＝１／１６，３８４）又はＢｐｍＩ部位（６ｂｐ認識配列；ランダムな発生確率＝１／４，０９６）の何れかを含有していると思われるが、両者を含有する割合はずっと少ないであろう（ランダムな発生確率＝１／６．７×１０７）。２つのＩＩ型制限酵素は、このように、任意のある完全長の遺伝子の特異的な修飾が、その遺伝子内の１又は他の制限部位の存在によって除外されないことを効果的に確実にするために、別個に使用した。
【００９４】
続いて、マング・ビーンヌクレーゼによる処理及びＢｓｐＨＩによる消化のために、前記２つのポットからの消化された断片をプールした。得られた断片を４つの異なるサイズ範囲に、ゲルで精製し、より小さな挿入物が優先的に連結されるのを避けるために、ベクターｐＭＭ１０６Ｈ（それ自身、ＮｃｏＩとＨｐａＩで完全に消化され、ゲルで精製された）に別々に連結した。ＵＶ光（３６５ｎｍ）下で、形質転換された細胞を可視化し、ウェスタンブロットによる分析のために、肉眼で、緑の蛍光を発するコロニーを選別した。形質転換されたコロニーの総数の約３０％が緑の蛍光を発し、そのうち、７３％が、抗Ｈｉｓタグ抗体によって認識されるタンパク質を発現していた。深い９６ウェルのブロック中の液体培地１．５ｍＬの中に、１９０の緑のＨｉｓ陽性コロニーを植え付け、一晩増殖させた。遠心によって細胞を採集し、凍結融解／リゾチームによって溶解した。続いて、ニッケルＮＴＡでコートされた９６ウェルプレートの各ウェルに粗可溶化液を加え、洗浄によって未結合のタンパク質を除去して、Ｈｉｓ付加された組換えタンパク質をウェルに固定化した。続いて、例２に記載したアッセイを用いて固定化したタンパク質のＮＦ−κＢ活性をアッセイし、黄色の呈色の出現によって、陽性の「ヒット」を含有するウェルを同定した。３つのクローンが、陽性の「κＢ―モチーフ」ＤＮＡ結合活性を示した。該陽性のクローンのさらなる性質決定によって、１つのクローンが、予想通り、ヘキサヒスチジンタグへのＮＦ−κＢ  ｐ５０遺伝子の正確な完全長インフレーム融合物をコードすることが示された。残りの２つのクローンは、結合親和性はより低いが、ＮＦ−κＢ  ｐ５０として同じＤＮＡ結合特異性を共有することが知られている関連するＤＮＡ結合タンパク質をコードすることが分かった。
【００９５】
それ故、本結果は、この操作によって作成されたアレイの機能的な検査により、特異的な相互作用とこれより弱いが特異的且つ生物学的に関連した相互作用の両者を同定できることを実証している。我々は、それ故、マイクロウェルフォーマットで機能的なタンパク質のアレイを作るためにこの操作を使用し、これらのアレイを用いて、我々は、特異的なタンパク質−リガンド相互作用に基づいて、小さなプールから、各タンパク質を同定することに成功した。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  ベクターｐＭＭ１０６Ｈの構築を示す図。
【図１ｂ】  タグ付加に先立つ、一例の遺伝子（ＧＳＴ）のＰＣＲ増幅とエキソヌクレアーゼによる消化の詳細を示す図。
【図１ｃ】  タグを導入するための特異的な連結とＰＣＲ増幅の詳細を示す図。
【図１ｄ】  ＰＣＲ産物のクローニングの詳細を示す図。
【図１ｅ】  ＧＳＴによって触媒された、グルタチオンと１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンとの間の反応を示す図。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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