(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする又は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸からなる、予後良好な神経芽細胞腫のマーカー。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする又は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸からなる、神経芽細胞腫の予後診断薬。
【請求項３】
神経芽細胞腫の予後の良好か不良かを判定するための、臨床サンプルから配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする又は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＢＮＩＰ２の一部が高いホモロジーを有する、新規ヒトＢＭＣＣ１タンパク質及び新規ヒトＢＭＣＣ１遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（腫瘍形成と遺伝子）
個々の腫瘍にはそれぞれの個性があり、発がんの基本的な原理は同じであっても、その生物学的特性は必ずしも同じではない。近年、がんの分子生物学や分子遺伝学が急速に進歩し、発がんやいわゆる腫瘍細胞のバイオロジーが遺伝子レベルで説明できるようになってきた。
【０００３】
（神経芽細胞腫）
神経芽細胞腫は末梢交感神経系細胞に由来する交感神経節細胞と副腎髄質細胞から発生する小児癌である。この交感神経系細胞は発生初期の神経堤細胞が腹側へ遊走し、いわいる交感神経節が形成される場所で分化成熟したものである。その一部の細胞はさらに副腎部へ遊走し、先に形成されつつある副腎皮質を貫通して髄質部に達し、そこで髄質を形成する。神経堤細胞はほかの末梢神経細胞の起源ともなっており、後根神経節（知覚神経）、皮膚の色素細胞、甲状腺Ｃ細胞、肺細胞の一部、腸管神経節細胞などへ分化する。
【０００４】
（神経芽細胞腫の予後）
神経芽細胞腫は多彩な臨床像を示すことが特徴である（中川原：神経芽腫の発生とその分子機構  小児内科３０、１４３  １９９８）。例えば、１歳未満で発症する神経芽細胞腫は非常に予後が良く、大部分が分化や細胞死（アポトーシス）を起こして自然退縮する。現在、広く実施されている生後６か月時の尿のマススクリーニングで陽性となる神経芽細胞腫の多くは、この自然退縮を起こしやすいものに属する。一方、１歳以上で発症する神経芽細胞腫は悪性度が高く、多くの場合、治療に抵抗して患児を死に至らしめる。１歳以上の悪性度の高い神経芽細胞腫は体細胞突然変異（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が起こり、モノクローナルであるのに対し、自然退縮する神経芽細胞腫では生殖細胞突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）のみの遺伝子変異でとどまっているとの仮説もある（Ｋｎｕｄｓｏｎ  ＡＧ等：Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ＩＶ-Ｓ：Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０２、  １２５４  （１９８０））。
【０００５】
（神経芽細胞腫の予後を推定する遺伝子）
最近の分子生物学的研究の進展により、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の高親和性レセプターであるＴｒｋＡの発現が分化と細胞死の制御に深くかかわっていることが明らかとなってきた（Ｎａｋａｇａｗａｒａ  Ａ．  Ｔｈｅ  ＮＧＦ  ｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｍｅｄ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，  １１３  （１９９８））。Ｔｒｋは神経栄養因子の高親和性受容体で、膜貫通型受容体であり、Ｔｒｋ−Ａ、Ｂ、Ｃの３つが主なものである。
【０００６】
Ｔｒｋファミリー受容体は、中枢神経及び末梢神経系において、特異的な神経細胞の分化と生存維持に重要な役割を果たしている（中川原等：神経芽細胞腫におけるニューロトロフィン受容体の発現と予後  小児外科  ２９：４２５−４３２、１９９７）。腫瘍細胞の生存や分化はＴｒｋチロシンキナーゼやＲｅｔチロシンキナーゼからのシグナルで制御されている。なかでも、ＴｒｋＡ受容体の役割は最も重要で、予後良好な神経芽細胞腫ではＴｒｋＡの発現が著しく高く、これからのシグナルが腫瘍細胞の生存・分化、または細胞死（アポトーシス）を強く制御している。一方、予後不良神経芽細胞腫では、ＴｒｋＡの発現が著しく抑えられており、これに代わってＴｒｋＢあるいはＲｅｔからのシグナルが生存の促進という形で腫瘍の進展を助長している。
【０００７】
また、神経の癌遺伝子であるＮ-ｍｙｃの増幅が神経芽細胞腫の予後に関連していることが明らかになってきた（中川原：脳・神経腫瘍の多段階発癌  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６４，３６６  （１９９９））。この遺伝子は神経芽細胞腫で初めてクローニングされたが、正常細胞や予後良好な神経芽細胞腫では通常１倍体当たり１つしか存在しないのに対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅されるのが見つかった。
【０００８】
しかしながら、現在までに神経芽細胞腫に発現されている癌遺伝子はＮ−ｍｙｃ以外に知られておらず、その予後の良不良に関する遺伝子情報に関してもＮ−ｍｙｃとＴｒｋＡ以外についてはほとんど知られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、神経芽細胞腫の予後良不良に関係する遺伝子の塩基配列を明らかにし、その遺伝子情報及び前記遺伝子の転写産物であるタンパク質の機能に関する情報を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト神経芽細胞腫の予後を検定し、予後良好及び予後不良の臨床組織の各々からｃＤＮＡライブラリーを作製することに成功した。この２種類のｃＤＮＡライブラリーから各々約２４００クローンをクローニングし、神経芽細胞腫の予後の良不良によって分類した。
【００１１】
さらに本発明者らは、分類された遺伝子のうち、神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強している遺伝子を見いだし、その一つをＢＭＣＣ１と名付けた。
【００１２】
すなわち、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質又はその塩である。
【００１３】
ここで、本発明のタンパク質は、前記タンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。また、本発明のタンパク質又はその塩は、前記アミノ酸配列を有し、且つ、アポトーシス誘導活性を有することが好ましい。
【００１４】
また、本発明の核酸は、前記タンパク質または前記タンパク質の部分ペプチドをコードすることを特徴とする核酸である。
【００１５】
さらに、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有することを特徴とする核酸である。
【００１６】
ここで、本発明の核酸は、前記核酸と、若しくは相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする単離された核酸であってもよい。また、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の一部からなる核酸であってもよい。
【００１７】
さらに、本発明の核酸は、予後良好及び不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強していることを特徴とする前記核酸であることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明における「核酸」という用語は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または誘導された活性なＤＮＡもしくはＲＮＡでありうるポリヌクレオチドを指し、好ましくは、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡをいう。
【００１９】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸断片が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７-９．６２および１１．４５-１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００２０】
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
【００２１】
本願における「単離された」とは、組換えＤＮＡ技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。
【００２２】
本明細書でいう「予後良好」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、Ｎ−ｍｙｃその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が低いと判断される。本発明の好適な実施の形態では、病期１または２、発症年齢が１歳未満、手術後５年以上再発なく生存し、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められないものを予後良好としたが、このような特定の例には限定されない。また、本明細書で使用する「予後不良」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められる状態を指し、Ｎ−ｍｙｃその他腫瘍マーカーから判断して、悪性度が高いと判断されるものである。本発明の好適な実施の形態では、病期４、発症年齢が１歳以上、手術後３年以内に死亡、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められたものを予後不良としたが、このような特定の例には限定されない。
【００２３】
本発明の新規ヒトＢＭＣＣ１遺伝子及びタンパク質は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織より見出されたものであり、かかる遺伝子及びタンパク質は以下のような特徴を有する。
【００２４】
本発明のヒトＢＭＣＣ１タンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。ここで、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、この場合、本発明のタンパク質は、前記アミノ酸配列を有し、且つ、アポトーシス誘導活性を有することが好ましい。ここで、「アポトーシス誘導活性」とは、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を誘導する活性と定義され、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層の微絨毛の消失、細胞質の凝集等を引き起こすことが特徴である。
【００２５】
また、本発明には本発明のタンパク質の塩も包含される。このような塩としては特に制限はないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩が好ましい。
【００２６】
また、多くのタンパク質には糖鎖が付加され、アミノ酸を１若しくは複数変換することにより糖鎖の付加を調節することができる。従って、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の付加を調節されたタンパク質も本発明のタンパク質に包含される。
【００２７】
また、本発明のヒトＢＭＣＣ１タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸も本発明に含まれる。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有することを意味するため、本発明の核酸には配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列からなる核酸をも包含される。
【００２８】
本発明のヒトＢＭＣＣ１遺伝子は配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する。
【００２９】
また、本発明の核酸は、前記配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよく、この条件を満たす限りにおいてはその塩基配列は特に制限されない。さらに、本発明の核酸には前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に相補的な塩基配列を有する核酸も包含され、具体的には、例えば、前記配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸又は前記核酸に相補的な塩基配列を有する核酸の塩基のいくつかに欠失、置換、挿入、付加がある核酸が挙げられる。ここで、欠失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い欠失、置換、挿入、付加も含む。
【００３０】
さらに、本発明の核酸は、前記塩基のいくつかに欠失、置換、挿入、付加がある核酸であり、且つ、前記核酸がコードするタンパク質がアポトーシス誘導活性を有することが好ましい。ここで、「アポトーシス誘導活性」とは、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を誘導する活性と定義され、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層の微絨毛の消失、細胞質の凝集等を引き起こすことが特徴である。
【００３１】
本発明者らは、ＢＭＣＣ１遺伝子及びタンパク質の構造解析の結果から、ＢＭＣＣ１のアミノ酸配列は２７２４アミノ酸からなり、その一部のアミノ酸配列が、Ｂｃｌ-２／Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＢＮＩＰ２）の一部である３１４アミノ酸と約５７％のホモロジーを有することを見出している。また、本発明者らは、ＢＭＣＣ１がＣｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ領域、膜貫通領域、核移行性シグナル領域を有していることを見出している。
【００３２】
ここで、前記Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質及びＢＮＩＰについて説明する。
【００３３】
（Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質）
Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質は、アデノウイルスのＥ１Ｂ遺伝子にコードされているタンパク質である。この遺伝子に変異を持つアデノウイルスは、宿主に強い細胞障害を起こし、ＤＮＡの分解を誘発することが知られている（Ｗｈｉｔｅ  Ｅ等：Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １Ｂ  １９、０００−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２（２）、４１０−４１９（１９８４））。この細胞障害はアデノウイルス感染細胞で最初に発現するＥ１Ａタンパク質によって誘導されるアポトーシスであり、Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ蛋タンパク質によってこのアポトーシスは抑制されることが報告されている（Ｗｈｉｔｅ  Ｅ等：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅ１Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５（６）、２９６８−２９７８（１９９１））。また、その後の研究から、Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質が機能的にＢｃｌ−２と相同であるとの報告がなされている（Ｒａｏ  Ｌ等：Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ  ａｎｄＢｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１６）、７７４２−７７４６（１９９２））。
【００３４】
（ＢＮＩＰの構造と機能）
一方、Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質と結合するタンパク質としてＢｃｌ-２／Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＮＩＰ）が同定されている（Ｂｏｙｄ  ＪＭ等：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  ７９（２）、３４１−３５１（１９９４））。ＢＮＩＰはＥ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質やＢｃｌ-２と相互作用し、アポトーシスを抑制している可能性が示唆された。このようなＢＮＩＰは現在までに３種類が同定されている。その一つであるＢＮＩＰ１は、Ｃ末端に膜貫通領域を持ち、ミトコンドリア、核膜、小胞体に局在している。また、ＢＮＩＰ１はＢＨ３領域を有し、アポトーシスを誘導したり、Ｂｃｌ−ＸＬとヘテロ２量体を形成することが報告されている。
【００３５】
ＢＮＩＰ２は核膜、小胞体に局在し、神経芽細胞腫の細胞株であるＳＫ−ＥＲ３においてエストロゲンによる発現の抑制や、ラット胎児脳の成熟過程において一過性に発現が高くなる現象が報告されている。また最近、ＢＮＩＰ２がＳｍａｌｌ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｒｅｃｕｌｅの一つであるＣｄｃ４２とＧＴＰａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｃｄｃ４２（Ｃｄｃ４２ＧＡＰ）に結合し、Ｃｄｃ４２を介するシグナル伝達に関与していることが示唆されているのみならず、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅによってリン酸化されＣｄｃ４２やＣｄｃ４２ＧＡＰへの結合が阻害されるとの報告がなされている（Ｌｏｗ  ＢＣ等：Ｔｈｅ  ＢＮＩＰ−２  ａｎｄ  Ｃｄｃ４２ＧＡＰ  ｈｏｍｏｌｏｇｙｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＢＮＩＰ−２  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｄｃ４２ＧＡＰ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５（４８）、３７７４２−３７７５１（２０００））。
【００３６】
また、ＢＮＩＰ３は、ＢＨ３領域を持ったアポトーシス誘導型のタンパク質であり、Ｃ末端に膜貫通領域を持ち、ミトコンドリアに局在していることが知られている（Ｙａｓｕｄａ  Ｍ等：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ−１９Ｋ／Ｂｃｌ−２  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＮＩＰ３  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ＢＨ３  ｄｏｍｅｉｎ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３（２０）、１２４１５−１２４２１（１９９８））。さらに、ＢＮＩＰ３は長時間ｈｙｐｏｘｉａ条件下に曝すと強く誘導されるとの報告もある。
【００３７】
一方、予後良好な神経芽細胞腫には頻繁にアポトーシスが観察され、またＢＭＣＣ１とＢＮＩＰ２との重複部分の相同性を考慮するとＢＭＣＣ１はアポトーシス誘導に直接的に関与しうる機能を有することが推測される。
【００３８】
さらに、ＢＭＣＣ１遺伝子は予後良好な遺伝子において特異的に増強され、分化した細胞に特異的に発現していることから、神経芽細胞腫の予後を良好に向かわせる機能を有する可能性が極めて高い。
【００３９】
以上、本発明のヒトＢＭＣＣ１遺伝子及びタンパク質について説明したが、以下に前記遺伝子及びタンパク質に関連する様々な情報を得ることを可能とする実施形態について説明する。
【００４０】
（１）  ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用することによって、あらゆる組織、細胞等において発現しているＢＭＣＣ１遺伝子を検出することが可能である。また、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用し様々な腫瘍、正常組織における遺伝子発現を調べることで、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現の分布を同定することも可能である。
【００４１】
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション法自身については特に限定されない。好適な方法としては、例えばノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレイ法等が挙げられる。
【００４２】
前記ハイブリダイゼーションの１つの応用例として、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をノザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い、検定したサンプル中においてｍＲＮＡの長さを測定することや、遺伝子発現を定量的に検出することが可能である。
【００４３】
また本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をサザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いる場合は、検定したサンプルのゲノムＤＮＡ中の、当該塩基配列の有無を検出することが可能である。
【００４４】
また、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）のプローブとして用いることで、遺伝子の染色体上の位置を同定することも可能である。
【００４５】
また、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）のプローブとして用いることでその遺伝子の発現の組織分布を同定することも可能である。
【００４６】
本発明の塩基配列をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する場合は、少なくとも２０個の塩基長が必要であり、本発明にかかる塩基配列の一部であって、２０個以上の連続した塩基からなる核酸が好ましく用いられる。より好ましくは４０個以上の連続した塩基からなる核酸が用いられ、特に好ましくは、６０個以上の連続した塩基からなる核酸が用いられる。
【００４７】
当業者には、核酸プローブ技法は周知であり、個々の長さの本発明によるプローブと目的とするポリヌクレオチドとの適当なハイブリダイズ条件は容易に決定される。種々の長さを含むプローブに対し至適なハイブリダイズ条件を得るためのこのような操作は当業者では周知であり、例えばサンブルックら、「分子クローニング：実験手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー  （１９８９）」を参照して行うことができる。
【００４８】
好ましくは、本発明のプローブは、容易に検出されるように標識して用いることができる。検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによって検出され得るいかなる種類、部分であってもよい。通常使用される検出可能な標識は、例えば、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、35Ｓ等などの放射性標識である。ビオチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、化学的及び酵素的手段等によって、ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込むことができる。ビオチン標識されたプローブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光標識剤、酵素、金コロイド複合体等などの標識手段を使用したハイブリダイゼーションの後検出される。核酸はタンパク質と結合させることによって標識してもよい。放射性又は蛍光ヒストン一本鎖結合タンパク質に架橋された核酸を使用してもよい。
【００４９】
（２）ＰＣＲに用いるプライマー
遺伝子を検出する方法には他にも、開示された塩基配列の任意の配列をプライマーとしてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を行うことにより可能である。例えば、検定したいサンプルからＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は当業者にとって周知の方法によって行われるが、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社）、遺伝子病入門（高久史麿著：南江堂）を参照して行うことができる。
【００５０】
本発明の遺伝子配列をＰＣＲ用プライマーとして使用する場合は、１０個から６０個の塩基長が必要であり、本発明の塩基配列の一部であって、１０個から６０個の連続した塩基がある核酸が好ましく用いられる。より好ましくは、１５個から３０個の塩基を有するものが用いられる。また一般的には、プライマー配列中のＧＣ含量が４０％から６０％であることが好ましい。さらに増幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差が少ないことが望まれる。またプライマーの３’末端でアニールせず、プライマー内で２次構造をとらない塩基配列を有することが望ましい。
【００５１】
（３）核酸配列のスクリーニング
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部を使用することによって様々な組織や細胞で発現している遺伝子発現の分布を検出することが可能である。例えば、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用することによって、遺伝子発現の分布を検出することが可能である。
【００５２】
また、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を用いても遺伝子発現の分布を検出することが可能である。すなわち本発明により開示された塩基配列の一部、または全部を直接チップ、アレイ上に張り付けことが出来る。そこに細胞から抽出したＲＮＡを蛍光物質などでラベルし、ハイブリダイズさせ、その遺伝子がどの様な細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは本発明により開示された塩基配列の一部、または全部を用いたＰＣＲの反応物であっても良い。
【００５３】
（５）腫瘍の予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカー
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用し、試料細胞中の遺伝子発現の増強の有無を調べることにより、予後同定が可能である。遺伝子発現の増強の有無を調べるには、例えば本発明により開示された塩基配列の任意の配列とハイブリダイズし得る塩基配列（プローブ）を使用する全ての方法が提供される。すなわち試料細胞中にプローブ配列とハイブリダイズする核酸の量が増強する場合、予後が良好であると診断することが可能である。またＰＣＲのプライマーとして使用する場合は、例えば、検定したいサンプルからＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。
【００５４】
（６）アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の別の実施形態として、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列が提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明の遺伝子に対応するＲＮＡに結合して、それによりＲＮＡの合成を阻止することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列は容易に調製できる。
【００５５】
（７）遺伝子治療
本発明の別の実施形態として、遺伝子治療に用いられる治療用遺伝子をコードする核酸配列が提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明の遺伝子をコードする核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子を発現させ、例えば癌の遺伝子治療に用いることができる。以下に前記ベクター及び前記発現プロモーターについて説明する。
【００５６】
１．ベクター
導入されうるウイルスベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスをもとに作製できる。このようなベクターは、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであってもよい。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウイルスの核酸配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２  ２６３−（１９９６））。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。さらに遺伝子導入系としてはエレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能である。
【００５７】
２．発現プロモーター
さらに、薬物遺伝子に用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく何でも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター；アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター；ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター；テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターが挙げられる。
【００５８】
（８）医薬品
本発明の別の実施形態として、医薬品に用いられる治療用タンパク質及びペプチドが提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明のタンパク質及びペプチドを任意の調製法にて調製し、任意の投与法、投与量にて用いることで、例えば抗癌剤、癌転移抑制剤に用いることができる。
【００５９】
１． 調製法
本発明の医薬品は、例えば上記に示すような治療用にデザインされた薬物遺伝子を含む組換えウイルスベクターとして調製される。より具体的に言えば、ＢＭＣＣ１遺伝子を含む組換えウイルスベクターを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで調製できる。また任意に製造されたＢＭＣＣ１タンパク質を同様に水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで調製することも可能である。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加しても調製可能である。
【００６０】
２．投与法、投与量
本発明の医薬品の生体への投与の方法については特に制限はない。例えば非経口的投与、例えば注射投与することにより好ましく実施できる。本発明の医薬品の使用量は、その使用方法、使用目的等により異なり、当業者は容易に適宜選択最適化することが可能である。例えば、注射投与して用いる場合には、１日量約０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましくは、１日量約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【００６１】
（９）抗体、アンチセンス、リボザイム、ＴＦＯ
本発明の別の実施形態として、本発明により開示されるタンパク質の活性を抑制する抗体、及び本発明により開示される遺伝子の発現を抑制するアンチセンス、リボザイム、ＴＦＯ等の塩基配列が提供される。本発明を実施する際に考慮されるように、本発明のアンチセンス、リボザイム、ＴＦＯをコードする核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子を発現させ、例えば初代培養細胞の株化や癌のモデル動物作製に用いることができる。
【００６２】
（１０）遺伝子改変動物
本発明の別の実施形態として、本発明により開示される遺伝子の発現をノックアウトする核酸配列、及びノックアウト動物（ノックアウトマウス等）が提供される。また、前記遺伝子を強制発現したトランスジェニック動物（トランスジェニックマウス等）、遺伝子に点変異や欠失等の任意の変異を導入した変異遺伝子が導入された遺伝子改変動物等が提供される。このような遺伝子改変動物は、例えば癌のモデル動物作製に用いることができる。
【００６３】
以上説明したように、本発明のＢＭＣＣ１遺伝子若しくはタンパク質又はこれらから得られる情報を利用することにより、臨床組織からＢＭＣＣ１遺伝子を検出することが可能となり、神経芽細胞腫の予後の量悪の診断が可能となる。また、前記遺伝子若しくはタンパク質又はこれらから得られる情報を利用することにより、予後同定の方法及び前記方法に使用可能な腫瘍マーカーを設計することが可能となる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
実施例１
（神経芽細胞腫の臨床組織）
神経芽細胞腫の臨床組織は摘出後直ちに−８０℃にて冷凍し保存した。得られたサンプルについて予後の検定を以下の指標をもとに行った。
予後良好：
・病期１または２
・発症年齢が１歳未満
・手術後５年以上再発なく生存
・ＭＹＣＮの増幅なし
予後不良：
・病期４
・発症年齢が１歳以上
・手術後３年以内に死亡
・ＭＹＣＮ増幅あり
このうちＭＹＣＮ増幅は以下のように確認した。得られた臨床組織を剃刀で細かく切断し、５ｍｌのＴＥＮバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣＬ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を加え良くホモジナイズした。この混合液に７５０μｌのＳＤＳ（１０％）、１２５μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、軽く混和し５０℃で８時間放置した。その後、フェノール・クロロホルム処理を行い、最後にエタノール沈殿により、ゲノムＤＮＡを精製した。５μｇの得られたゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社製）で完全に消化し、ＭＹＣＮのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ等：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）によりＭＹＣＮ増幅を調べた。
【００６６】
実施例２
（ヒト由来癌細胞株）
ヒト由来の癌細胞株として、以下の細胞株を用いた。
神経芽細胞腫由来細胞株（ＭＹＣＮ増幅有り）
ＳＹ５Ｙ
ＮＢ６９
ＳＫ−Ｎ−ＡＳ
ＯＡＮ
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ
神経芽細胞腫由来細胞株（ＭＹＣＮ増幅無し）
ＲＩＳＡ
ＧＯＴＯ  Ｐ３
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ
ＣＨＰ９０１
ＮＧＰ
ＲＴＢＭ１
ＩＭＲ３２
ＮＭＢ
ＬＡＮ５
ＴＧＷ
ＣＨＰ１３４
ＫＣＮ
他の組織由来癌細胞株
ＯＳＴ（骨肉腫）
ＳＡＯＳ−２（骨肉腫）
ＮＯＳ−１（骨肉腫）
ＲＭＳ−ＭＫ（横紋筋肉腫）
ＡＳＰＳ−ＫＹ（巣状軟部肉腫）
ＣＯＬＯ３２０（結腸腺癌）
ＳＷ４８０（結腸腺癌）
ＬＯＶＯ（結腸腺癌）
ＨｅｐＧ２（肝癌）
ＭＢ４５３（乳癌）
ＭＢ２３１（乳癌）
Ｇ３６１（悪性黒色腫）
Ｇ３２ＴＧ（悪性黒色腫）
Ａ８７５（悪性黒色腫）
ＴＴＣ２（甲状腺癌）
ＫＡＴＯ３（胃癌）
ＥＣＧ・１０（食道癌）
ＡＳＰＣ−１（転移性膵臓腺癌）
Ａ５４９（肺癌）
ＮＴ２（奇形腫）
ＨｅＬａ（子宮頚部癌）。
【００６７】
ＨｅＬａを除く全ての癌細胞株は１０％のＦＢＳ、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ-１６４０培地で培養した。ＨｅＬａ細胞は１０％のＦＢＳ、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した。またＨｅＬａを含む全ての癌細胞株は、３７℃、５％ＣＯ2濃度条件下にてインキュベートすることにより培養した。
【００６８】
実施例３
（神経芽細胞腫臨床組織からのトータルＲＮＡの抽出）
ヒト神経芽細胞腫臨床組織からのトータルＲＮＡの抽出はＴｏｔａｌ  ＲＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。抽出したトータルＲＮＡはフェノール・クロロホルムで精製した後、濃度を決定した。
【００６９】
実施例４
（癌細胞株からのトータルＲＮＡの抽出）
癌細胞株からのトータルＲＮＡの抽出は一般的なグアニジン処理にて行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ等：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）。抽出したＲＮＡはフェノール・クロロホルムで精製した後、濃度を決定した。
【００７０】
実施例５
（ｃＤＮＡライブラリーの調製）
実施例３において神経芽細胞腫の臨床組織より調製したトータルＲＮＡからオリゴキャッピング法（Ｓｕｇａｎｏ  Ｓ等：Ｇｅｎｅ１３８（１-２）：１７１-１７４（１９９４））を用いてｃＤＮＡライブラリーを調製した。得られたｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＴＯＰ−１０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトランスフォーメーションした。
【００７１】
実施例６
（ｃＤＮＡの両末端シークエンスの解析）
実施例５にて調製した大腸菌よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を用いてｃＤＮＡの両末端のシークエンスを決定した。すなわち、６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、８μｌのプレミックス（キット付属品）、３．２ｐｍｏｌのプライマーを混合し滅菌蒸留水で合計２０μｌになるように調製した。この混合液を９６℃で２分間変性させた後、９６℃、１０秒間・５０℃、５秒間・６０℃、４分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返し反応を行った。その後エタノール沈殿で精製した。変性条件下でポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、配列解析を行った。解析にはＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用いた。
【００７２】
実施例７
（データベースを用いたホモロジー検索）
実施例６にて両末端シークエンスの解析が終了したｃＤＮＡサンプルについてインターネットを介したＤＮＡ配列のホモロジー検索を行った。検索にはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＵＳＡ）のＢＬＡＳＴを用いた。ホモロジー検索の結果、ｃＤＮＡサンプルの一つであるｎｂｌａ２１９はヒト９番染色体上のゲノムシークエンス（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＬ１６１６２５）と高い相同性を示した。
【００７３】
実施例８
（ｎｂｌａ２１９の全長クローニング）
実施例７にて得られたゲノム配列について、遺伝子転写配列をＧＥＮＥＳＣＡＮ（Ｂｕｒｇｅ  Ｃ等：１９９７、１９９８）及びＦＧＥＮＥＳＨ（Ｓａｌａｍｏｖ  ＡＡ等：１９９９）を用いて予測した。予測された配列をもとにｎｂｌａ２１９の全長を以下の方法でクローニングした。
【００７４】
すなわち、予後良好神経芽細胞腫臨床組織から抽出した１５μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。逆転写した２μｌのｃＤＮＡに５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０×ｒＴａｑバッファー（宝酒造社製）、１μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑ（宝酒造社製）を混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間・５８℃、１５秒間・７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で２０分間放置しＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲで増幅したバンドをｐＧＥＭ-Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、一般的手法（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．等：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３-５４６７．（１９７７））を用いて塩基配列を決定した。解析にはＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用いた。塩基配列は全て両鎖とも解析した。
【００７５】
また、前記プライマーとして、以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
ＦＷ１：５'ＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣ３'（配列番号３）
ＦＷ２：５'ＡＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＣ３'（配列番号４）
ＦＷ３：５'ＡＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＣＴＡＧＡＡＣＴＧ３'（配列番号５）
ＦＷ４：５'ＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＧＡＧＡＴ３'（配列番号６）
ＦＷ５：５'ＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＧ３'（配列番号７）
ＦＷ６：５'ＣＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡ３'（配列番号８）
ＦＷ７：５'ＡＴＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣ３'（配列番号９）
ＦＷ８：５'ＧＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＴＣ３'（配列番号１０）
ＦＷ９：５'ＴＡＡＧＧＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣ３'（配列番号１１）
ＦＷ１０：５'ＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＴ３'（配列番号１２）
ＦＷ１１：５'ＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡ３'（配列番号１３）
ＦＷ１２：５'ＴＡＡＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧ３'（配列番号１４）
ＦＷ１３：５'ＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡ３'（配列番号１５）
ＦＷ１４：５'ＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣ３'（配列番号１６）
ＦＷ１５：５'ＣＣＡＧＣＴＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＣ３'（配列番号１７）
ＦＷ１６：５'ＣＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡ３'（配列番号１８）
ＦＷ１７：５'ＣＡＣＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧ３'（配列番号１９）
ＦＷ１８：５'ＡＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣ３'（配列番号２０）
ＦＷ１９：５'ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧ３'（配列番号２１）
ＦＷ２０：５'ＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧ３'（配列番号２２）
ＦＷ２１：５'ＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＴ３'（配列番号２３）
ＦＷ２２：５'ＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＡＧＴＧＡＧ３'（配列番号２４）
ＦＷ２３：５'ＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＣ３'（配列番号２５）
ＦＷ２４：５'ＡＡＴＡＴＡＣＧＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡ３'（配列番号２６）
ＦＷ２５：５'ＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＣＧＧＴＴ３'（配列番号２７）
ＲＶ１：５'ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＣＡＴＧＴＴ３'（配列番号２８）
ＲＶ２：５'ＧＡＧＣＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＡ３'（配列番号２９）
ＲＶ３：５'ＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧ３'（配列番号３０）
ＲＶ４：５'ＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＡＣ３'（配列番号３１）
ＲＶ５：５'ＡＴＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＴＣ３'（配列番号３２）
ＲＶ６：５'ＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴ３'（配列番号３３）
ＲＶ７：５'ＣＴＣＣＴＡＣＣＧＧＣＡＡＡＴＡＡＡＣＧ３'（配列番号３４）
ＲＶ８：５'ＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡ３'（配列番号３５）
ＲＶ９：５'ＧＴＣＣＡＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＡＴＣ３'（配列番号３６）
ＲＶ１０：５'ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴ３'（配列番号３７）
ＲＶ１１：５'ＡＡＣＣＧＴＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＧ３'（配列番号３８）
ＲＶ１２：５'ＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧ３'（配列番号３９）
ＲＶ１３：５'ＡＴＡＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＴＣＡＣＡＧＣ３'（配列番号４０）
ＲＶ１４：５'ＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴ３'（配列番号４１）
ＲＶ１５：５'ＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧ３'（配列番号４２）
ＲＶ１６：５'ＧＧＣＡＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＧＴＡＣ３'（配列番号４３）
ＲＶ１７：５'ＴＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＣＴＡＡＧＧＧ３'（配列番号４４）
【００７６】
実施例９
（ＢＭＣＣ１全長シークエンスの登録）
実施例８で得られたＢＭＣＣ１の遺伝子配列をＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬに登録した。受理番号はＡＢ０５０１９７である。
【００７７】
実施例１０
（ノザンハイブリダイゼーション）
２５μｇのトータルＲＮＡを１％のアガロースゲルを用いて変性条件下で電気泳動を行った。電気泳動したトータルＲＮＡはアガロースゲルからキャピラリー法によりナイロンメンブレンにトランスファーした。ヒトＢＭＣＣ１の塩基配列から約１．５ｋｂのプローブを設計しノザンハイブリダイゼーションを行った。最終的な洗浄は０．１×ＳＳＣ、０．１％  Ｎ-ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎｅで６５℃、３０分間行った。用いたプローブの塩基配列（配列番号４５）を以下に示す。また、得られた結果を図１に示す。
ＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＴＧＴＴＧＡＣＧＴＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＡＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＴＡＧＧＴＡＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＣＣＴＡＧＡＴＧＡＡＴＣＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＣＣＴＡＡＧＣＡＧＡＴＡＧＧＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＴＡＧＣＴＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＴＡＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＧＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＧＧＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＴＣＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＧＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＡＧＡＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＴＡＧＡＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＡＧＣＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣ
【００７８】
実施例１１
（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
全ての半定量的ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法により行った。
（逆転写（ＲＴ）反応）
抽出した５μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
（ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ反応はｒＴａｑ（宝酒造社製）を用いて行った。逆転写した２μｌのｃＤＮＡ、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０×ｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間・５８℃、１５秒間・７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で２０分間放置しＰＣＲ反応を行った。ＢＭＣＣ１のプライマーは以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
ＦＷ：５'ＣＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡ３'（配列番号４６）
ＲＶ：５'ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＣＡＴＧＴＴ３'（配列番号４７）
【００７９】
また陽性対照としてＧＡＰＤＨを用いた。プライマーを以下に示す
ＦＷ：５'ＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＣ３'（配列番号４８）
ＲＶ：５'ＧＴＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＣ３'（配列番号４９）
【００８０】
実施例１２
（半定量的ＰＣＲによる予後良好神経芽細胞腫臨床組織依存的遺伝子発現量の測定）
実施例３にて得られた予後良好・不良神経芽細胞腫のトータルＲＮＡについて、実施例１１に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。この反応液を２．５％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が予後良好神経芽細胞腫臨床組織に特異的であることが確認された。結果を図２に示す。なお、図２中、各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１〜１６：予後良好神経芽細胞腫臨床サンプルにおけるヒトＢＭＣＣ１の発現
レーン１７〜３２：予後不良神経芽細胞腫臨床サンプルにおけるヒトＢＭＣＣ１の発現
レーン３３〜４８：予後良好神経芽細胞腫臨床サンプルにおけるＧＡＰＤＨの発現
レーン４９〜６４：予後不良神経芽細胞腫臨床サンプルにおけるＧＡＰＤＨの発現。
【００８１】
実施例１３
（半定量的ＰＣＲによる組織依存的遺伝子発現量の測定）
ヒト正常組織のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて実施例１１に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。この反応液を２．５％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、ＢＭＣＣ１遺伝子発現の分布はヒト正常組織によって組織特異性があることが確認された。結果を図３に示す。
【００８２】
実施例１４
（半定量的ＰＣＲによる癌細胞株依存的遺伝子発現量の測定）
実施例４にて得られたヒト癌細胞株のトータルＲＮＡについて、実施例１１に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。この反応液を２．５％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、ＢＭＣＣ１遺伝子発現の分布は癌細胞株によって組織特異性があることが確認された。結果を図４に示す。
【００８３】
実施例１５
（半定量的ＰＣＲによる細胞分化依存的遺伝子発現量の測定）
神経細胞への分化、アポトーシスを誘導する試薬として広く使用されているレチノイン酸を用いて以下の実験を行った。ＣＨＰ１３４細胞を１×１０6の細胞数で直径１０ｃｍのディッシュにまき、１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦと最終的に５μＭになるようにレチノイン酸（シグマ社製）を添加した無血清培地で培養した。７日間インキュベートした後、実施例４に示した条件で細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、実施例１１に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。この反応液を２．５％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が分化した細胞に特異的に増強されることが確認された。結果を図５に示す。なお、図５中、各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：無処理、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン２：レチノイン酸添加５日後、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン３：レチノイン酸添加７日後、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン４：レチノイン酸及びＧＤＮＦ添加５日後、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン５：レチノイン酸及びＧＤＮＦ添加７日後、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン６：無処理、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン７：レチノイン酸添加５日後、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン８：レチノイン酸添加７日後、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン９：レチノイン酸及びＧＤＮＦ添加５日後、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン１０：レチノイン酸及びＧＤＮＦ添加７日後、ＧＡＰＤＨの発現を測定。
【００８４】
実施例１６
（半定量的ＰＣＲによる細胞周期依存的遺伝子発現量の測定）
ＢＭＣＣ１遺伝子の塩基配列の一部から、ＰＣＲプライマーを合成し、ＨｅＬａ細胞を用いて細胞周期特異的な遺伝子発現量を比較定量した。ＨｅＬａ細胞はそれぞれ以下のように処理を行ったものを用いた。
（１）無処理
（２）４００μＭのｍｉｍｏｓｉｎｅで１８時間処理し６５％の細胞がＧ１期の状態
（３）２ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅで２０時間処理し１００％の細胞がＳ期の状態
（４）０．６μｇ／ｍｌのＮｏｃｏｄａｚｏｌｅで１８時間処理し８５％の細胞がＧ２／Ｍ期の状態
以上４種類のＨｅＬａ細胞より実施例４に示した条件でトータルＲＮＡを抽出し、実施例１１に示した条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。この反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現がＧ１期に特異的に増強されることが確認された。結果を図６に示す。なお、図６中、各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：Ｇ１期、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン２：Ｓ期、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン３：Ｇ２／Ｍ期、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン４：無処理、ＢＭＣＣ１の発現を測定
レーン５：Ｇ１期、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン６：Ｓ期、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン７：Ｇ２／Ｍ期、ＧＡＰＤＨの発現を測定
レーン８：無処理、ＧＡＰＤＨの発現を測定。
【００８５】
実施例１７
（定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる神経芽細胞腫臨床組織依存的遺伝子発現量の測定）
（神経芽細胞腫臨床組織の分類）
神経芽細胞腫の臨床組織を以下の項目について分類した。
発症年齢：１才未満（１群）、１歳以上（２群）
病期：１又は２又は４ｓ（１群）、３又は４（２群）
マススクリーニング：陽性（１群）、陰性（２群）
ＭＹＣＮの増幅：増幅無し（１群）、増幅有り（２群）
ＴｒｋＡの発現：高発現（１群）、低発現（２群）
発症部位：副腎以外（１群）、副腎（２群）
予後：生存（１群）、死亡（２群）
なお、いずれの項目においても１群が予後良好、２群が予後不良の指標になる事が知られている。
【００８６】
分類した臨床サンプルについて、ヒトＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
（逆転写（ＲＴ）反応）
神経芽細胞腫の臨床組織の１５μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【００８７】
（ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ反応は７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行った。２μｌのｃＤＮＡ、終濃度３００ｎＭのプライマー、終濃度２０８ｎＭのプローブ、２．５μｌの１×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を混合し滅菌蒸留水で２５μｌとした。この混合液を５０℃で２分間放置し、さらに９５℃で１０分間変性させた後、９５℃、１５秒間・６０℃、１分間を１サイクルとして４０サイクル繰り返しＰＣＲ反応を行った。ヒトＢＭＣＣ１遺伝子のプライマー及びプローブは以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
ＦＷ：５'ＧＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＡ３'（配列番号５０）
ＲＶ：５'ＴＴＡＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＴＡＧＴＡＴＣＣＴＣ３'（配列番号５１）
ｐｒｏｂｅ：５'ＦＡＭ−ＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＧ−ＴＡＭＲＡ３'（配列番号５２）
【００８８】
また陽性対照としてＧＡＰＤＨを用いた。プライマー及びプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）として、以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
ＦＷ：５'ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ３'（配列番号５３）
ＲＶ：５'ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ３'（配列番号５４）
Ｐｒｏｂｅ：５'ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ３'（配列番号５５）
【００８９】
ＢＭＣＣ１の定量は、あらかじめ濃度を測定したＢＭＣＣ１を含むプラスミドとＧＡＰＤＨとの比較において算定した。いずれの場合も１群でＢＭＣＣ１は高い発現を示した。結果を表１に示す。
【００９０】
【表１】
0004723133.tif 000002
【００９１】
実施例１８
（ＢＭＣＣ１タンパク質の構造解析）
ＢＭＣＣ１タンパク質の構造をＰＳＯＲＴ  ＩＩ（Ｎａｋａｉ  Ｋ等：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２４（１）：３４−３６（１９９９））、ＳＯＰＭ（Ｇｅｏｕｒｊｏｎ  Ｃ等：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７（２）：１５７−１６４（１９９４））、ＴＭ  ｐｒｅｄ（Ｇｅｏｕｒｊｏｎ  Ｃ等：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７（２）：１５７−１６４（１９９４））を用いて解析を行った。得られた結果から推測されるＢＭＣＣ１タンパク質の構造の模式図を図７に示す。
【００９２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のヒトＢＭＣＣ１遺伝子及びタンパク質によれば、神経芽細胞腫の予後良不良に関係する遺伝子の塩基配列を明らかにし、その遺伝子情報及び前記遺伝子の転写産物であるタンパク質の機能に関する情報を提供することが可能となる。
【００９３】
【配列表】
0004723133.tif 000003
0004723133.tif 000004
0004723133.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】予後良好神経芽細胞腫の臨床サンプルにおけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーションで確認した結果を示す電気泳動写真である。
【図２】半定量的ＰＣＲによる予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫の臨床サンプルにおけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】半定量的ＰＣＲによる正常ヒト組織におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】半定量的ＰＣＲによるヒト癌細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図５】半定量的ＰＣＲによるＨｅＬａ細胞の分化状態におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図６】半定量的ＰＣＲによるＨｅＬａ細胞の各細胞周期におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図７】ＰＳＯＲＴ２を用いてＢＭＣＣ１、ＢＮＩＰ２及びＣｄｃ４２ＧＡＰ−ＢＣＨのドメイン構造を予測した模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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