(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列であって配列番号32記載の配列を含む前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生およびTat系により分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記シグナルペプチド領域が配列番号28〜30記載のいずれかの配列、または、前記配列において１〜２個のアミノ酸の置換を含みコリネ型細菌においてTat系依存シグナルペプチドとして機能するアミノ配列、を含む、前記方法。
【請求項２】
5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列であって配列番号32記載の配列を含む前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生およびTat系により分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記シグナルペプチド領域が配列番号６記載のアミノ酸配列または前記配列において１〜２個のアミノ酸の置換を含みコリネ型細菌においてTat系依存シグナルペプチドとして機能するアミノ配列、を含む、前記方法。
【請求項３】
5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列であって配列番号32記載の配列を含む前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生およびTat系により分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記シグナルペプチド領域が配列番号８記載のアミノ酸配列または前記配列において１〜２個のアミノ酸の置換を含みコリネ型細菌においてTat系依存シグナルペプチドとして機能するアミノ配列、を含む、前記方法。
【請求項４】
異種タンパク質がプロテイングルタミナーゼである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
異種タンパク質がイソマルトデキストラナーゼである請求項１〜３のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
コリネ型細菌が、tat系分泌装置をコードする１以上の遺伝子が増幅された株である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA、tatB、tatC及びtatEからなる群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種タンパク質を、コリネ型細菌で分泌生産させる方法に関する。特に、本発明は、産業上有用な酵素や生理活性タンパク質を含む異種タンパク質をコリネ型細菌で分泌生産させる方法に関する。【０００２】
（背景技術）
コリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジンを始めとするＬ−アミノ酸、核酸生産菌として発酵工業上、非常に有用な細菌である。また、コリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やBacillus属細菌と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が簡略化、省略化できることであり、また糖、アンモニアや無機塩等のシンプルな培地で早く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れており、異種タンパク生産においても非常に有用な細菌であると考えられている。【０００３】
コリネ型細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産する方法として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼやリパーゼの分泌[米国特許第4965197号, J.Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)]及び、サチライシン等のプロテアーゼの分泌[Appl.Environ.Microbiol., 61, 1610-1613(1995)]、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質の分泌 [特表平6-502548]、コリネ型細菌を利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌[Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)]、変異型分泌装置を利用したタンパク質の分泌方法[特開平11-169182]、トランスグルタミナーゼの分泌生産法[Appl. Environ. Microbiol., 69, 358-366(2003)]、変異株を利用したトランスグルタミナーゼの分泌生産法[WO02/81694]等がある。タンパク質の蓄積量でみると、バチルス・ズブチリス由来のサチライシン遺伝子(aprE)のプロモーター、リボソーム結合部位及びシグナルペプチドの配列を利用してディケロバクター・ノドサス（Dichelobacter nodosus）由来のアルカリ性プロテアーゼの遺伝子をC. glutamicum において発現させ、約2.5mg/mlの蓄積を認めた例[Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)]、また、トランスグルタミナーゼの分泌については、最大930mg/Lという分泌蓄積が確認されている[WO 02/81694]。【０００４】
これまでに知られているコリネ型細菌のタンパク質分泌経路は、Sec系といわれる経路である。Sec系は、細胞膜上に存在し、タンパク質分泌のチャンネルとして働くSecY[特開平6-169780]、SecE[特開平6-277073]、SecG[特開平11-169182]及び、タンパク質透過のための駆動力供給として機能するSecA[特開平7-107981]を主成分とするコンポーネントより構成されている。この系はエシェリヒア・コリやバチルス・ズブチリス等の原核生物から、酵母、カビ、そしてヒト等の真核生物に至るまで幅広く存在し、最も主要で且つ一般的なタンパク質分泌経路である。
しかしながら、コリネ型細菌に於いてSec系による分泌生産が困難なタンパク質も存在することが知られている。そのような例には、イソマルトデキストラナーゼやプロテイントランスグルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質が含まれる。【０００５】
近年になって、Sec系とは全く異なるタンパク質分泌経路が植物細胞の葉緑体のチラコイド膜において見出された[EMBO J., 14, 2715-2722（1995）]。この経路を通して分泌されるタンパク質のシグナル配列にはアルギニン−アルギニンの配列が共通して存在しており[EMBO J., 14, 2715-2722（1995）]、そのことよりTat系[Twin-Arginine Translocation system]と呼ばれる様になった。その後、このTat系が大腸菌レダクトオキシダーゼ、硝酸還元酵素(nitrate reductase)やバチルス・ズブチルスのリポ酸合成酵素（Lipoic acid synthetase）や、ホスホジエステラーゼ（phosphodiesterase）のようなアルギニン-アルギニンの共通配列のシグナル配列を持つタンパク質の分泌に特異的に関与していることが明らかになった[Science, 278, 1467-1470 (1997) ,米国特許第6022952号,米国特許第6335178号] [J. Biol. Chem., 275, 41350-41357,国際公開パンフレットWO 02/22667] 。
また、Sec系ではタンパク質が高次構造形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが特徴的である[J Biol Chem25;273(52):34868-74(1998)]。【０００６】
コリネ型細菌でもTat系コンポーネントをコードする遺伝子と相同性の高い遺伝として、tatA(GENEBANK cg103060 1571065-1571382),tatB(GENEBANK cg103060 1167110-1167580),tatC (GENEBANK cg103060 1569929-1570873) tatE(gi|41223046|emb|CAF18991.1| )が存在することが明らかになっているが、これらの機能は知られておらず、コリネ型細菌においてTat系−経路によってタンパク質分泌が行われているかどうか明らかでなかった。
また、エシェリヒア・コリにおいてはTat系分泌装置をコードする遺伝子tatA、tatB、tatCを発現するプラスミドを導入することにより、Tat経路におけるペリプラズムへの分泌量の向上が認められた例があるが、その蓄積量は５−１０mg/Lであり、産業上実用的なレベルには達していない。[Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:279-284.(2003) ]【０００７】
（発明の開示）
本発明は、コリネ型細菌において、タンパク質分泌経路の一つであるSec系を利用したのでは分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質を効率的に菌体外に分泌（分泌生産）させる方法を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明は、タンパク質分泌経路の一つであるSec系を利用したのでは分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質をコリネ型細菌において産生させ、かつ、効率的に菌体外に分泌（分泌生産）させることによって、異種タンパク質を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。【０００８】
本発明者らはコリネ型細菌におけるタンパク質分泌経路の仕組みについて着目し、これまでに知られていたSec系とは異なるタンパク質分泌経路であるTat系がコリネ型細菌で機能することを見いだした。より具体的には、本発明者らは、コリネ型細菌のタンパク質分泌経路であるTat系を構成すると考えられるタンパク質をコードする遺伝子を欠損させることにより、これまで分泌されていたタンパク質が分泌されなくなる現象を見いだし、Tat系がコリネ型細菌に於いても機能していることを確認した。さらに本発明者らは、Tat系依存的なシグナル配列を見いだし、これをコードする配列の下流に、これまでのタンパク質分泌経路であるSec系では分泌させることが困難であった目的タンパク質遺伝子配列を結合した発現構築物をコリネ型細菌に導入し、得られた形質転換コリネ型細菌を培養することにより、目的タンパク質を効率よく分泌させることが可能であることを見出した。本発明者らは、コリネ型細菌において新規に見出されたタンパク質分泌経路であるTat系を利用することにより、従来のタンパク質分泌経路であるSec系分泌経路によっては分泌させることが困難であった異種タンパク質、例えばイソマルトテキストラナーゼやプロテイングルタミナーゼを効率よく分泌させ得ることを見出し、本発明を完成させた。また、さらにコリネ型細菌において、Tat系分泌装置をコードする遺伝子を増幅することによりTat系を利用して分泌可能なタンパク質の分泌量を向上させ得ることを見出した。【０００９】
本発明は、5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生および分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法である。
より具体的には、本発明は、上記方法において、Tat系依存シグナルペプチドが配列番号３１または３２記載の配列を含む、異種タンパク質の製造方法である。
更に具体的には、本発明は、上記方法において、Tat系依存シグナルペプチドが配列番号２８〜３０のいずれかの配列を含む、異種タンパク質の製造方法である。
特に、本発明は、上記方法において、Tat系依存シグナルペプチドがイソマルトデキストラナーゼのシグナルペプチドまたはトリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼのシグナルペプチドである、異種タンパク質の製造方法である。
さらに具体的には、本発明は、上記方法において、上記イソマルトデキストラナーゼのTat系依存シグナルペプチドが配列番号６記載のアミノ酸配列を有する、または、トリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼのシグナルペプチドが配列番号８記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、異種タンパク質の製造方法である。【００１０】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の方法においては、コリネ型細菌が宿主ベクター系として用いられ、コリネ型細菌のTat系依存シグナルペプチドの下流に分泌させる目的タンパク質の遺伝子を結合した発現構築物が作製され、これがコリネ型細菌内に導入され、発現され、目的タンパク質が菌体外に分泌される。
なお、本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいい、最終的にそのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、菌体表層に存在している場合も含む。【００１１】
分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、成熟型タンパク質になることが知られている。すなわち、一般に、プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。また、本明細書において、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体のＮ末端に存在し、かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とはそのようなタンパク質前駆体から切り取られるペプチドをいう。一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断される。このようなシグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した配列上の特徴を有するが、ある生物種で分泌機能を示すシグナルペプチドが他の生物種においても必ずしも分泌機能を発揮するということではない。【００１２】
本明細書において、シグナルペプチドおよびプロ部分の両方を有するタンパク質、すなわち、一次翻訳産物を「プレプロタンパク質」と称することがあり、また、シグナルペプチドを有しないがプロ部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」と称することがある。プロタンパク質のプロ部分は「プロ構造部」または単に「プロ構造」と称することもあり、本明細書においてタンパク質の「プロ構造部／プロ構造」とタンパク質の「プロ部分」とは互換的に使用される。プレプロタンパク質またはプレタンパク質において、そのシグナルペプチドは異なるタンパク質に由来する場合であっても、目的タンパク質に天然に存在するシグナルペプチドであってもよいが、使用する宿主の分泌型タンパク質に由来することが好ましい。あるいは、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。さらに本発明の目的に使用し得るシグナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を一部含んでいてもよい。シグナルペプチドが異なるタンパク質に由来する場合はプレプロタンパク質を特に「異種融合プレプロタンパク質」と称することもある。
例えば、タンパク質がプロテイングルタミナーゼの場合は、それぞれ「プレプロプロテイングルタミナーゼ」、「プロプロテイングルタミナーゼ」および「異種融合プレプロプロテイングルタミナーゼ」と称される。また、「プロ部分を切断した」タンパク質とは、ペプチド結合を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも１以上のアミノ酸を除去したタンパク質をいい、そのＮ末端領域が天然の成熟型タンパク質のものと完全に一致するタンパク質、および、そのタンパク質の活性を有する限り、天然のタンパク質に比較してＮ末端にプロ部分に由来する1以上の余分のアミノ酸を有するものおよび天然の成熟型タンパク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。【００１３】
本発明において、「Tat系」とは、「ツイン・アルギニン移行経路」（Twin-arginine-translocation-pathway）とも呼ばれる経路であり、シグナルペプチド中に保存されたアルギニン-アルギニンの保存領域を認識して、TatA、B、C、Eを含む膜タンパクにより、タンパク質を分泌する機構または経路を意味する。また、「Tat系分泌装置」とはTatA、B、C、Eを含む膜タンパクを指す。これらのTatA、B、C、Eは細胞膜に存在する膜貫通型タンパク質であり、これらが複合体となり細胞膜上にタンパク質が透過するためのポアを形成していると考えられている。また、タンパク質が透過する際のTatA、B、C、E詳細な高次構造および機能については研究途上である。C.glutamicumATCC13869におけるTatAをコードする遺伝子とTatCをコードする遺伝子は非常に近傍に位置している。TatAをコードする遺伝子配列とその５'上流域、さらにTatCをコードする遺伝子配列を配列番号３８に記載した。また、TatAのアミノ酸配列を配列番号４６に、TatCのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。TatBをコードする遺伝子配列とその５'上流域を配列番号４１、TatBのアミノ酸配列を配列番号４７に、TatEをコードする遺伝子配列を配列番号４８、TatE のアミノ酸配列４９に示した。TatAとTatEは非常に相同性が高くE.coliにおいてはTatAとTatEはその機能を相補できることが知られている[EMBO J. 1;17(13):3640-50(1998).]。
本発明で用いるコリネ型細菌において、増幅されていても良いTat系分泌装置は、アミノ酸配列の一部欠損または一部付加した場合、また、C.glutamicum由来のTat系分泌装置に限らずコリネ型細菌において機能し得るいずれのTat系分泌装置をも含む。【００１４】
この系による分泌シグナルは「Tat系依存シグナルペプチド」（「ツイン・アルギニン・シグナルペプチド」（Twin-arginine signal peptide）とも呼ばれる）を有している。「Tat系依存シグナルペプチド」とは、Tat系によって認識されるシグナルペプチドで、アルギニン-アルギニンの保存領域が存在している。「Tat系依存シグナルペプチド」としては、大腸菌のトリメチルアミンN-オキシドレダクターゼ(TorA)、大腸菌のSufI(suppressor of ftsI；ftsIサプレッサー)、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のPhoD(ホスホジエステラーゼ)、LipA 、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）由来のイソマルトデキストラナーゼ(IMD)等のシグナルペプチドが挙げられる。これらのシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
TorAシグナルペプチド:MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号８）
SufIシグナルペプチド:MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA  （配列番号28）
PhoDシグナルペプチド:MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS  （配列番号29）
LipAシグナルペプチド:MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH  （配列番号30）
IMDシグナルペプチド: MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA  （配列番号６）【００１５】
なお、本明細書において、TorAシグナルペプチド、SufIシグナルペプチド、PhoDシグナルペプチド、LipAシグナルペプチド又はIMDシグナルペプチドという場合は、それぞれ、前記配列番号８、28、29、30又は６を有するペプチドのほか、各配列において、1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するペプチドも含まれる。ここで、「数個」とは、これらのTat系依存シグナルペプチドにおけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、通常１〜７個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個程度である。また、配列番号８、28、29、30又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する相同性が、通常８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであってもよい。
このような置換、欠失、挿入又は付加を有するシグナルペプチドをコードする核酸配列は、大腸菌、バチルス・ズブチリス、アルスロバクター・グロビフォルミスの変種、自然突然変異株又は人為突然変異株、アルスロバクター・グロビフォルミス以外のアルスロバクター属微生物やバチルス・ズブチリス以外のバチルス属微生物から取得され得る。また、置換、欠失、付加又は挿入を有するTat系依存シグナルペプチドをコードする核酸配列は、配列番号８、28、29、30又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するTat系依存シグナルペプチドをコードする核酸をインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。これらの突然変異処理は、当業者に周知の方法によって行うことができる。
上記のような置換、欠失、挿入又は付加は、後述するコンセンサスモチーフが保持されるような保存的変異である。保存的変異は、代表的には保存的置換である。これらのシグナルペプチドの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。【００１６】
「Tat系依存シグナルペプチド」においては、コンセンサスモチーフとしてS/T-R-R-X-F-L-K（配列番号31）やR-R-X-#-#-(#:疎水性残基)（配列番号32）の疎水性領域が保存されている。但し、これらのコンセンサスモチーフが保存されている場合であっても、さらに分泌されるタンパク質によっても影響を受ける。例えば、Bacillus subtilisのWprA, WapA のシグナルペプチドは ツイン・アルギニンモチーフ（Twin-arginine motif）を持っているがそれらはTat系ではなく、SRP/Sec 系に依存して分泌されることが明らかにされている（Biochem Biophys Res Commun. 2003 Apr 25; 304(1): 48-54）。Tat系で分泌可能なタンパク質の例には、大腸菌由来のTorAおよびSufI、バチルス・ズブチリス由来のPhoD、バチルス・ズブチリス由来のLipAが含まれるが、これらに限定されない。特に、コリネ型細菌においてTat系を利用して分泌可能なタンパク質の例には、イソマルトデキストラナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、トランスグルタミナーゼ等の各種酵素が挙げられる。具体的には、アルスロバクター・グロビフォルミスT6(NRRL B-4425,IMA12103)由来イソマルトデキストラナーゼ、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するイソマルトデキストラナーゼ、クリセオバクテリウム・プロテオリチカム（Chryseobacterium proteolyticum）由来プロテイングルタミナーゼ、好ましくは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するプロテイングルタミナーゼ、GFP（緑色蛍光タンパク質）、WO 02/81694記載のストレプトマイセス・モバラエンス（Streptoverticillium  mobaraense）由来トランスグルタミナーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。Arthrobacter globiformis T6株は、Northern Utilization Research and Development Divisionに登録番号NRRL B-4425として登録されている。Chryseobacterium roteollyticumは、FERM BP-3523として、平成12年11月8日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号305-8566）に寄託されている。【００１７】
イソマルトデキストラナーゼは、デキストラン等からイソマルトースを効率よく生産する酵素である。本酵素をデキストラン等に作用させて得られるイソマルトースは、抗う蝕性を有する効果（特開昭58-76063号参照）、及びヒトの腸内有用細菌であるビフィズス菌の増殖効果を有する効果（特開昭61-22777号参照）があり、産業上有用な酵素である。プロテイングルタミナーゼは、グルタミナーゼとして機能する酵素で、タンパク質を低分子化せず、タンパク質中に存在するグルタミン残基に直接作用し、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず、脱アミド作用を有する面で非常に有用である（特開2001-218590）。GFPは、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein; GFP)で他のタンパク質に融合させて細胞に導入すると細胞内の任意の場所に蛍光を作りだすことが出来るため、in vivoで特定の構造体を蛍光ラベルするのに威力を発揮し、多く研究に用いられている。これらの酵素は、従来のSec系では分泌されず、Tat系を利用することによって初めて分泌可能となる。但し本発明によって効率よく製造されるタンパク質はこれらの酵素に限られずコリネ型細菌においてTat系を利用して分泌されるタンパク質であればいずれでもよい。【００１８】
本発明に言うコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981))、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでに異種タンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やBacillus属細菌と比べて本来的に菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合にその精製過程が簡略化、省略化できること、また糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが含まれる。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。【００１９】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム、
コリネバクテリウム・カルナエ、
コリネバクテリウム・グルタミカム、
コリネバクテリウム・リリウム、
コリネバクテリウム・メラセコーラ、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、
コリネバクテリウム・ハーキュリス、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム、
ブレビバクテリウム・フラバム、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、
ブレビバクテリウム・ロゼウム、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、
ブレビバクテリウム・アルバム、
ブレビバクテリウム・セリヌム、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム。【００２０】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511、
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991、
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060、
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990、
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965、
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)、
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020、
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872、
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111、
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354。【００２１】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載され、この番号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)（昭和59年３月２６日原寄託）（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号305-8566）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高いため、宿主菌として好適である(WO 02/081694参照)。
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2）破壊株であるC. glutamicum YDK010株が挙げられる（国際公開パンフレット  WO 01/23591）。【００２２】
本発明に使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、およびコリネ型細菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。目的タンパク質は、Ｎ末端にプロ構造部を有していてもよい。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、コリネ型細菌中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってよい。そのような例には、PAM330(特開昭58-067699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 （特開2000-262288号公報）が含まれる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記大腸菌用ベクターに挿入すると、大腸菌及びコリネ型細菌の両方で複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することが出来る。また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。【００２３】
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えばtacプロモーター等の大腸菌（E.coli）由来のプロモーターであってもよい。その中で、tacプロモーター等の強力なプロモーターがより好ましい。コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のPS1、PS2、SlpAの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子の各プロモーターが挙げられる。【００２４】
本発明で使用するシグナルペプチドはコリネ型細菌の菌体内で機能し得るTat系依存シグナルペプチドであれば特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るどのようなTat系依存シグナルペプチドも使用することができる。したがって、異種由来の、例えば大腸菌やバチルス・ズブチリス由来のTat系依存シグナルペプチドも、コリネ型細菌の菌体内で機能し得る限り、本発明に使用することができる。シグナルペプチドには、それが由来する分泌性タンパク質のN末端アミノ酸配列の一部が付加されていてもよい。シグナル配列は、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。これらのシグナルペプチドを使用する場合、目的とするタンパク質をコードする遺伝子は、シグナルペプチドをコードする遺伝子の3'-末端側に接続し、かつ、上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置する。【００２５】
本発明によって生産および分泌し得る有用タンパク質は、前述したTat系依存シグナルペプチドをコードする核酸配列と同一の遺伝子構築物中に含まれうる核酸によりコードされるタンパク質であれば、元来Tat系で分泌されるタンパク質であるかSec系で分泌されるタンパク質であるかを問わず、動植物や微生物由来の菌体内タンパク質を含むタンパク質全般が含まれる。本発明によって分泌生産できるタンパク質の例には、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼおよびキチナーゼが含まれる。特に、従来のSEC系で分泌不可能であったタンパク質は、本発明によって生産および分泌させるために適している。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および／または、望みの活性を得るために改変することができ、それらには１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれる。必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。改変技術、遺伝子のクローニング技術、生産されたタンパク質の検出技術を含む、このような一般的な分子生物学的手法は当業者によく知られたものであり、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)、F.M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)、PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press等を参照することができる。【００２６】
本発明に使用し得る遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070)(1989))等を使用することができる。【００２７】
また、本発明においては、コリネ型細菌は、tat系分泌装置が増幅された株、即ち、tat系分泌装置を構成するTatA、B、C、Eを含む膜タンパクが増幅された株であっても良い。このようなコリネ型細菌は、親株のtat系分泌装置をコードする遺伝子である、tatA、tatB、tatC、tatEを含む遺伝子群のいずれか１種又は２種以上の発現量を増強することにより得られる。【００２８】
これらのtat系分泌装置をコードする遺伝子である、tatA、tatB、tatC、tatEを含む遺伝子（以下いずれかを指して「tat遺伝子」ということもある。）の発現量の増強は、tat遺伝子群のいずれか１種又は２種以上のコピー数を高めることによって達成される。例えば、tatAを含む遺伝子をコードする断片や、tatAとtatBを連結した遺伝子をコードする断片を、コリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを上述のようなコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。この際用いられるベクターは、前述の遺伝子構築物のために使用できるベクターと同様である。また、コピー数の上昇は、Tat系分泌装置をコードする遺伝子を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。コリネ型細菌の染色体DNA上にtat遺伝子を複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、tat遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平2-109985号、特開平７−１０７９７６号、Vertes,A.A., Asai,Y., Inui,M., Kobayashi,M., Kurusu,Y. and Yukawa,H. :Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)）。染色体上にtat遺伝子が転移したことの確認は、tat遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。【００２９】
また、tat系分泌装置の発現を上昇させる手段として上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のtat遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、tat遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変することによっても達成される。(Hamilton et al,; Journal of Bacterology171:4617-4622) 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。tat遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。発現調節配列の置換は、例えば、上述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。【００３０】
得られた遺伝子導入形質転換体は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、形質転換体は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るため、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用することができる。培養はpH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行えばよく、培養期間は１〜７日間程度でよい。このような条件下で形質転換体を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され、効率よく菌体外に分泌される。【００３１】
本発明によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。本発明によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用しても良い。
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。【００３２】
（実施例）
実施例１．Arthrobacter globiformis（A. globiformis）由来のイソマルトデキストラナーゼのシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
（１−１）  C.glutamicumによるイソマルトデキストラナーゼのシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドの構築
A. globiformis T6株由来イソマルトデキストラナーゼ(EC.3.2.1.94; 1,6-α-D-グルカンイソマルトデキストラナーゼ；1,6-α-D-glucan isomalto-dextranase)遺伝子の配列は既に決定されている[Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)]。この配列を参考にして、配列番号１１（5’-ATGATGAACCTGTCCCGCCG-3'）と配列番号１２（5’-CGCGGATCCCTGAGGGCGGGAAC-3'）に示した配列を有するプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)]調製したA. globiformisの染色体DNAを鋳型としてイソマルトデキストラナーゼをコードする領域をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号１２の配列は制限酵素BamHIの認識配列を含んでいる。
また、上述のpPKSPTG1（WO 01/23591記載）を鋳型として、プロモーターおよびシグナル配列をコードする領域を、配列番号１４（5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'）、配列番号１６（5’- GGCGGGACAGGTTCATCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAA -3’）に示したプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。配列番号１６に示した配列は、イソマルトデキストラナーゼのシグナル配列のN末端側をコードする配列を含んでいる。【００３３】
配列番号１１及び１２に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物と、配列番号１４と１６に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物とを混合し、これらを鋳型として配列番号１２と配列番号１４に示したプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施した。このPCR産物を制限酵素ScaIとBamHIにより消化した後、アガロースゲル電気泳動により約2.5kbのDNA断片を回収し、この断片をpPKSPTG1（WO 01/23591記載）のScaI-BamHI領域に挿入して、イソマルトデキストラナーゼ発現プラスミドpPKI-IMDを構築した。構築したプラスミドに挿入された遺伝子の配列は、ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（PEアプライドバイオシステムズ社製）とDNAシークエンサー377A（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。塩基配列決定の結果、得られたイソマルトデキストラナーゼ遺伝子配列は報告されている配列と一部異なっていることが判明した。新たに決定されたイソマルトデキストラナーゼ遺伝子の配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示した。【００３４】
（１−２）Corynebacterium glutamicum（C.glutamicum）によるIMDシグナル配列を用いたIMDの分泌
構築したプラスミドpPKI-IMDを用いてC.glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性株AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2）破壊株であるC.glutamicum YDK010株（特許WO 01/23591記載）に形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEは12.5%のゲル（第一化薬製）を用い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク質のバンドを検出した。その結果、予想される分子量である約65kDaのバンドを検出した。さらに逆相クロマトグラフィー分析によりタンパク質の定量を行った結果、タンパク質濃度は約120mg/lであることが示された。また、Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)に記載の方法に従いイソマルトデキストラナーゼの酵素活性を測定し、得られたタンパク質が実際にイソマルトデキストラナーゼの酵素活性を有していることを確認した。
また、分泌されたイソマルトデキストラナーゼのN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーで解析を行った。その結果、配列番号２に示したアミノ酸配列の３１番目のAlaから始まるイソマルトデキストラナーゼが分泌されていることが確認できた。従ってシグナル配列領域は、配列番号５（ヌクレオチド配列）及び６（アミノ酸配列）に示した配列であることが確認された。【００３５】
（参考例Ａ）
Corynebacterium ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
（A−１）A. globiformis T6(NRRL B-4425,IMA12103)由来イソマルトデキストラナーゼ遺伝子の取得
配列番号１１と配列番号１２に示した配列を有するプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)]に従って調製したA. globiformisの染色体DNAからイソマルトデキストラナーゼをコードする領域をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号１２の配列は制限酵素BamHIの認識配列を含んでいる。
次にPCR法にて増幅したDNA断片を鋳型として、配列番号１３（5'-GTCCCCGTCACGGCCGCGCC-3'）と配列番号１２に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、シグナル配列を除いた成熟型イソマルトデキストラナーゼをコードする領域を増幅した。【００３６】
（A−２）C.glutamicumによるSlpAシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドの構築
WO 01/23591記載のプラスミドpPKSPTG1を鋳型とし、プロモーターおよびシグナル配列をコードする領域を、配列番号１４、配列番号１５（5’- CCCGGGCGGGCGGTGACGGCGGTGGCTGCCGTTGCCACAGGTGCGG -3’）に示した配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。鋳型としたプラスミドpPKSPTG1はC. glutamicum由来の細胞表層タンパク質であるPS2のプロモーター、C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列をコードする領域、およびS. mobaraenseに由来するプロトランスグルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。前述のPCRにより、このプラスミド中のPS2プロモーター及びSlpAシグナル配列をコードする領域を含む断片が増幅される。なお、配列番号１５に示したプライマーは、成熟型イソマルトデキストラナーゼのN末端側アミノ酸領域をコードする配列を含んでいる。
次に（A-１）において配列番号１３と配列番号１２に示した配列を有するプライマーを用いて増幅したPCR産物と、配列番号１４と配列番号１５に示した配列を有するプライマーにより増幅したPCR産物とを混合し、これらを鋳型として配列番号１４と配列番号１２に示した配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを行い、PS2プロモーターおよびSlpAのシグナルペプチド配列と成熟型イソマルトデキストラナーゼとの融合遺伝子を増幅した。このPCR産物を制限酵素ScaIとBamHIにより消化した後、アガロースゲル電気泳動により約2.5kbのDNA断片を回収し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入して成熟型イソマルトデキストラナーゼの発現プラスミドpPKSIMDを構築した。【００３７】
（A−３）C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を用いてのIMDの分泌
構築したプラスミドpPKSIMDを用いてC.glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性株AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2）破壊株であるC.glutamicum YDK010株（WO 01/23591記載）を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地（酵母エキストラクト10g、トリプトン10g、グルコース５g、NaCl ５g、寒天 15g、水で1Lにする）で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを12.5％のゲル（第一化薬製）を用いて行い、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色してタンパク質を検出した。その結果、非常に微量の約65kDaのバンドを検出した。さらに逆相クロマトグラフィー分析によりタンパク質の定量を行った結果、濃度は約10mg/lであることが示された。これは、Arthrobacter globiformis由来のIMDのシグナル配列を用いた場合と比べ、タンパク分泌量が低下していたことを示す。逆相クロマトグラフィーの条件は、以下に記載したとおりである。
カラム：protein C4 214TP5410（Vydac社製）、
溶出条件：24-80% アセトニトリル  リニアグラジエント/0.1％Tトリフルオロ酢酸、
流速：1.0ml/min
また、Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)に記載の方法に従いイソマルトデキストラナーゼの酵素活性を測定し、分泌されたタンパク質が実際にイソマルトデキストラナーゼ活性を有していることを確認した。【００３８】
実施例２．Arthrobacter globiformisに由来するIMDシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現
（２−１）Chryseobacterium proteolyticum由来プロテイングルタミナーゼ遺伝子の取得
Chryseobacterium proteolyticum株由来プロテイングルタミナーゼ(EC.3.5.1)遺伝子の配列はすでに決定されている[Eur.J.Biochem. 268. 1410-1421(2001)]。この配列を参考にして、Corynebacterium  glutamicumにおいて使用頻度の高いコドンへの変換を行い配列番号３に示した遺伝子配列を構築した。この配列はプロテイングルタミナーゼのシグナル配列（プレ部分）とプロ部分および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。この全遺伝子配列を合成により作製した。
構築した配列番号３の遺伝子配列情報に基づいて、配列番号１７（5’-CATGAAGAACCTTTTCCTGTC-3’）と配列番号１８（5’-GTAAAAGGATCCATTAATTAAAATCC-3’）に示した配列のプライマーを合成した。配列番号１７に示したプライマーはプロテイングルタミナーゼのシグナル配列のN末端配列を含んでおり、配列番号１８に示したプライマーは成熟型プロテイングルタミナーゼのC末端とBamHIの認識配列を含んでいる。配列番号３に示した配列を有するDNAを鋳型として配列番号１７と配列番号１８に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロテイングルタミナーゼのプロ部分および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。このPCR断片を特開平9-070291記載のpVC7のSmaI部位に挿入した後E.coli JM109のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。プロテイングルタミナーゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、プラスミドを回収した。このプラスミドにクローン化された断片の塩基配列を決定し、配列番号３に示した配列と一致することを確認した。【００３９】
（２−２）IMDシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現プラスミドの構築
実施例1（1−１）に記載したIMD発現プラスミドpPKI-IMDを鋳型として、プロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号１４、配列番号２１（5’-CCTGGTTGCCGTTGGAATCGGCCTGGGCGGAGCCTGCC- 3’）に示した配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。増幅した領域はPS2プロモーターおよびIMDシグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。なお、配列番号２１に示した配列は、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域の5'末端の配列を含んでいる。次にプロテイングルタミナーゼがクローン化されているプラスミドを鋳型として、配列番号２０（5’-GATTCCAACGGCAACCAGGA-3’）と配列番号１８の配列を有するプライマーを用いたPCRにより、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域を増幅した。さらに、配列番号１４、配列番号２１の配列を有するプライマーを用いて得られたPCR産物と、配列番号２０および配列番号１８の配列を有するプライマーを用いて得られたPCR産物とを１：１で混合し、これらを鋳型とし、配列番号１４と配列番号１８に示した配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施することにより、PS2プロモーター領域およびIMDシグナル配列と、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼをコードする遺伝子との融合遺伝子を増幅した。このクロスオーバーPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動により約1.6kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2（宝酒造社製）を用いて回収し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKI-PPGを構築した。構築したプラスミドに挿入されている遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築されていることを確認した。【００４０】
（２−３）C.glutamicumによるIMDシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドｐPKI-PPGを用いてC.glutamicum由来の変異株YSｒ株より取得したYDK010株（国際公開パンフレットWO01/23591記載）に形質転換し、実施例１（１−３）と同様に25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地（で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20％のグラジエントゲル（第一化薬製）を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク質染色を実施した。その結果、予想される分子量である約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。逆相HPLCの条件は、以下に記載したとおりである。
カラムCAPCELL PAK C18 SG300 4.6ｘ150mm(SISEIDO製)  
溶出条件：32-48% アセトニトリル  リニアグラジエント/0.1％Tトリフルオロ酢酸(15min)、流速：1.0ml/min
さらに、培養上清をウルトラフリー（ミリポア製）により脱塩濃縮処理を行った後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45(国際公開パンフレットWO 01/23591に記載)により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特開2000-50887記載の方法により測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることを確認した。【００４１】
（参考例Ｂ）
C.ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を用いたChryseobacterium proteolyticum由来プロテイングルタミナーゼの分泌発現
（B−１）Chryseobacterium proteolyticum由来プロテイングルタミナーゼ遺伝子の取得
Chryseobacterium proteolyticum株由来プロテイングルタミナーゼ(EC.3.5.1)遺伝子の配列[Eur.J.Biochem. 268. 1410-1421(2001)]を参考にして、Corynebacterium glutamicumにおいて使用頻度の高いコドンへの変換を行い、配列番号３に示した配列を導いた。この配列はプロテイングルタミナーゼのシグナル配列領域（プレ部分）、プロ領域および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。この全遺伝子配列を含む核酸分子を合成により作製した。
作製した配列番号３の遺伝子配列の情報をもとに配列番号１７と配列番号１８の配列を有するプライマーを合成した。配列番号１７の配列を有するプライマーはプロテイングルタミナーゼのシグナル配列のN末端配列を含んでおり、配列番号１８の配列を有するプライマーは成熟型プロテイングルタミナーゼのC末端とBamHIの認識配列を含んでいる。配列番号３に示した配列を有するDNAを鋳型として配列番号１７と配列番号１８に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロテイングルタミナーゼのプロ部分と成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。このPCR断片を特開平9-070291記載のpVC7のSmaI部位に挿入した後、E.coli JM109のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。プロテイングルタミナーゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収した。プラスミドにクローン化されている断片の塩基配列を決定し、配列番号３に示した配列と一致することを確認した。【００４２】
（B−２）C.glutamicumによるSlpAシグナル配列を用いたプロテイングルタミナーゼの分泌発現プラスミドの構築
特許WO01―23591記載のプラスミドpPKSPTG1を鋳型として、プロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号１４、配列番号１９（5’-TCCTGGTTGCCGTTGGAATCTGCCGTTGCCACAGGTGCGG-3’）を用いてPCRを行うことにより増幅した。増幅した領域はPS2プロモーターおよびSlpAシグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。なお、配列番号１９に示した配列は、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域の5'末端の配列を含んでいる。【００４３】
次に参考例Ｂ−１で得たプロテイングルタミナーゼがクローン化されているプラスミドを鋳型として、配列番号２０と配列番号１８を用いてPCRを行い、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域を増幅した。さらに、配列番号１４、配列番号１９に示した配列を有するプライマーを用いて得られたPCR産物と、配列番号２０と配列番号１８に示した配列を有するプライマーを用いて得られたPCR産物を１：１で混合し、これらを鋳型とし、配列番号１４と配列番号１８に示した配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施することにより、PS2プロモーター領域を含む配列およびSlpAシグナル配列と、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼをコードする遺伝子との融合遺伝子を増幅した。このクロスオーバーPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動により約1.6kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2（宝酒造社製）を用いて回収し、特開平9-322774記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKS-PPGを構築した。構築したプラスミドに挿入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築されていることが確認された。【００４４】
（B−３）C.glutamicumによるSlpAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドpPKS-PPGを用いてC.glutamicum由来の変異株より取得したYDK010株（特許WO01/23591記載）を形質転換し、実施例１（1-3）と同様に25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを12.5％のゲル（第一化薬製）を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色および蛍光色素SYPRO Orange（Molecular Probes社）によりタンパク染色を実施した。その結果、いずれの染色方法においても、予想される分子量付近にバンドを検出することはできなかった。【００４５】
実施例３．大腸菌（E.coli）に由来するTorA（トリメチルアミンN-オキシドレダクターゼ）シグナル配列を用いたプロテイングルタミナーゼの分泌発現
（３−１）大腸菌に由来するTorAシグナルペプチドをコードする遺伝子の取得
大腸菌に由来するTorAシグナルペプチドを含むTorA遺伝子の配列は既に決定されている(Mol. Microbiol. 11:1169-1179 (1994))。この配列を参考にして、配列番号２２（5’-ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGG-3’）と配列番号２３（5’-CCGGATCCTGGTCATGATTTCACCTG-3’）に示したプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]）調製した大腸菌W3110株の染色体DNAを鋳型として、TorAをコードする領域およびその上流にあるシグナル配列を含む領域をPCR法にて増幅した。PCR反応はPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従って行った。なお、配列番号２３の配列は制限酵素BamHIの認識配列を含んでいる。TorAのシグナル配列をコードするDNA配列を配列番号７に示す。【００４６】
（３−２）TorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ(PPG)の分泌発現プラスミドの構築
国際公開パンフレットWO01/23591記載のプラスミドpPKSPTG1を鋳型としてプロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号１４、配列番号２４（5’-AAGAGATCGTTATTGTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG-3’）に示す配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。配列番号２４の配列は、TorAシグナルペプチドをコードする遺伝子の5'末端の配列を含んでいる。次にこのPCR産物、並びに、実施例３-1で得た、配列番号２２と配列番号２３に示す配列を有するプライマーにより増幅されたTorAをコードする遺伝子配列およびその上流にあるシグナル配列を含む領域を含むPCR産物とを１：１で混合し、これらを鋳型とし、配列番号１４と配列番号２３に示した配列を有するプライマーによりクロスオーバーPCRを実施した。これによりPS2プロモーター領域を含む配列、TorAシグナル配列、およびTorAをコードする配列を含む融合遺伝子が増幅された。このクロスオーバーPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動により約3.1kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2（宝酒造社製）を用いて回収し、特開平9-322774記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプラスミドpPKT-TorAを得た。このプラスミドに挿入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築されていることが確認された。このプラスミドを鋳型とし、配列番号１４と配列番号２５（5’-GATTTCCTGGTTGCCGTTGGAATCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG- 3’）に示す配列を有すプライマーを用いて、PS2のプロモーター領域およびTorAシグナルペプチドをコードする領域を含む部分をPCRにより増幅した。このPCR産物と実施例２（２-２）と同様に、配列番号２０と配列番号１８に示す配列を有するプライマーを用いたPCRにより、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。これらのPCR産物を１：１で混合し、それらを鋳型とし、配列番号１４と配列番号１８に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施した。
このPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動を実施し、約3.1kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2（宝酒造社製）を用いて回収し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプラスミドpPKT-PPGを得た。プラスミド中の挿入配列の塩基配列を決定し、予想される融合遺伝子ができていることが確認された。【００４７】
（３−３）C.glutamicumによるTorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌
構築したプラスミドpPKT-PPGを用いてC.glutamicum由来の変異株C. glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性株AJ12036株より取得したYDK010株（特許WO 01/23591記載）を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20％のグラジエントゲル（第一化薬製）を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。
さらに、同様に実施例２（２-２）と同様に培養上清をウルトラフリー（ミリポア製）により処理した後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特許開2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。
なお、プロ構造付きのプロテイングルタミナーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。【００４８】
実施例４．TatC欠損株の作製
（４−１）コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036由来tatC遺伝子破壊株の作製
上述のIMDのシグナル配列を連結したイソマルトデキストラナーゼ、および、TorAのシグナル配列を連結したプロテイングルタミナーゼがそれぞれTat系によって分泌されているかどうかを検討した。
これまでにコリネ型細菌のtat系遺伝子ホモログとして、tatA(GENEBANK cg103060 1571065-1571382)、tatB(GENEBANK cg103060 1167110-1167580)、tatC(GENEBANK cg103060 1569929-1570873)、tatE(gi 41223046 emb CAF18991.1)が存在することが明らかになっているがこれらの機能は明らかになっていない。
従ってtat遺伝子を破壊することによって、上述の実施例で分泌を確認した酵素がtat系で分泌されているかどうかを確認することとした。【００４９】
以下の様に相同性組換え法を利用してYDK010株のTatC欠損株を取得した。
斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta., 72, 619(1963)]に従って調製したCorynebacterium glutamicum ATCC13869の染色体DNAを鋳型として、配列番号２６（5’-ggcggtaccgttaagcgccctcggcgagttatct-3’）と配列番号２７（5’-gcctctagactagagcacgtcaccgaagtcggcg-3’）に示す配列を有するプライマーの組み合わせを用いてPCRを行なった。
この断片をKpnIとXbaIで消化し、プラスミドpHM1519由来の温度感受性プラスミドベクターであるpHS4（米国特許第5,616,480号）のKpnI-XbaI部位に挿入し、pHStatCを構築した。プラスミドpHS4で形質転換された大腸菌AJ12570はFERM BP-3523として、平成２年１０月１１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号305-8566）に寄託されている。
次にpHStatCをNdeIとScaIで消化し、約70bpのDNA断片を除去してtatC遺伝子内部領域を欠損させ、再環状化させプラスミドpHSΔtatCを構築した。このプラスミドをYDK010株にエレクトロポレーションにより導入し、日本国特許第2763054号に記載した相同組換え法によりtatC遺伝子欠損株、YDK011株を取得した。【００５０】
（４−２）  TatC欠損株における分泌発現
（４−２−１）SlpAに由来するシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ(IMD)分泌発現プラスミドpPKS-IMDおよび、IMDシグナル配列を用いたIMD分泌発現プラスミドpPKI-IMDによる形質転換株におけるIMD分泌の比較
参考例Aにおいて作製C.ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を有するイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドpPKS-IMDで上述のTatC欠損株を転換形質し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択することによりYDK011/pPKS-IMD株を取得した。また、同様にして、実施例１で作製したIMDシグナル配列を有するIMD分泌発現プラスミドpPKI-IMDを用いて、TatC欠損株YDK011株を形質転換し、YDK011/pPKI-IMD株を取得した。取得した両株を各々MM培地中、30℃にて48時間培養し、培養上清中のIMD分泌量の比較を行った。両株の各々の培養上清10μlをSDS-PAGEにかけて分析し、SYPRO Orange（Molecular Probes社）を用いてタンパク染色した。その結果、YDK011/pPKS-IMD株の培養上清についてはIMDの分子量付近に非常に弱いバンドが検出されたが、YDK011/pPKI-IMD株の培養上清については、IMDの分子量付近にバンドが検出されなかった。【００５１】
（４−２−２）IMDシグナル配列を用いたプロテイングルタミナーゼ分泌発現プラスミドpPKI-PPGおよびTorAシグナル配列を用いたプロテイングルタミナーゼ分泌発現プラスミドpPKT-PPGによる形質転換株におけるプロテイングルタミナーゼ分泌の比較
実施例２で作製したIMDシグナル配列を含むIMD分泌発現プラスミドpPKI-PPGでTatC欠損株YDK011株を形質転換し、YDK011/pPKI-PPG株を取得した。さらに、大腸菌由来Tat系シグナルであるTorAシグナルを含むプロテイングルタミナーゼ(PPG)発現プラスミドpPKT-PPG（実施例３）でTatC欠損株であるYDK011株を形質転換してYDK011/pPKT-PPG株を取得した。取得した形質転換株を最少液体培地中、30℃にて48時間培養し、培養上清中のPPG分泌量を分析した。【００５２】
YDK011/pPKI-PPG株およびYDK011/pPKT-PPG株の培養上清各10μlをSDS-PAGEにかけ、SYPRO  Orangeにおいてタンパク染色した。その結果、YDK011/pPKI-PPG株およびYDK011/pPKT-PPG株のいずれの培養上清中にも、分子量35kDa付近にPPGのバンドを検出できなかった。
次に、プロテイングルタミナーゼをウサギに免疫して抗プロテイングルタミナーゼポリクローナル抗体を作製した。このポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、実施例２及び３で作製したYDK010/pPKI-PPG株およびYDK010/pPKT-PPG株のどちらの培養上清中にもバンドが検出されたが、一方、YDK011/pPKI-PPG株、およびYDK011/pPKT-PPG株のどちらの培養上清中にもPPGのバンドは検出されなかった。さらに培養後のそれぞれの菌体を超音波で破砕し、菌体内のタンパクについてSDS-PAGE分析を実施した。培養上清について行ったように、各形質転換菌株の菌体内のタンパクについてもウエスタンブロッティングを実施した結果、YDK011/pPKI-PPG株およびYDK011/pPKT-PPG株由来の菌体破砕物に関して、いずれも分子量35kDa付近にPPGのバンドが検出された。【００５３】
IMDシグナルおよびTorAシグナルを用いた場合には、正常TatCを有する各形質転換株の培養上清中にはPPGまたはIMDタンパク質が分泌されるが、各形質転換TatC欠損株の培養上清中にはPPGタンパク質またはIMDタンパク質が分泌されなかったという上述の結果は、IMDシグナルおよびTorAシグナルがTat経路によるIMDまたはPPGの分泌に関与することを示している。【００５４】
実施例５．Corynebacterium glutamicum ATCC13869におけるプロテイングルタミナーゼの分泌発現
（５−１）TorAシグナル配列を用いた、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼのC.glutamicumからの分泌
実施例３（３−２）で構築したプラスミドpPKT-PPGを用いてC. glutamicum ATCC13869、およびC. glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性変異株AJ12036株より取得したYDK010株（WO 01―23591記載）を形質転換し、実施例１（１−３）と同様に25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した両菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20%のグラジエントゲル（第一化薬製）を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、どちらの菌株の培養上清中にも、予想される分子量約35kDaの位置にバンドが検出された。それぞれの培養上清100μlを逆相HPLCによりタンパク質濃度を分析した結果、pPKT-PPGを保持するC. glutamicum YDK010株の培養上清中のタンパク質濃度は約20mg/lであり、同じpPKT-PPGを保持するC. glutamicum ATCC13869株の培養上清中のタンパク質濃度は約70mg/lであった。
さらに、同様に実施例２（２-２）と同様に培養上清をウルトラフリー（ミリポア製）により処理した後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したプロテイングルタミナーゼの活性を特許開2000-50887記載の方法によって測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることを確認した。【００５５】
実施例６．Tat系分泌装置の増幅によるE.coliに由来するTorAシグナル配列を用いたプロテイングルタミナーゼ分泌量に及ぼす効果
（１）TatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumのTatCをコードする遺伝子配列の５'上流域にTatAをコードする遺伝子が存在する。そのtatA遺伝子の上流のプロモーター領域を含む遺伝子配列をPCR法において増幅した。斎藤、三浦らの方法により調整したC.glutamicumATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号３３（5’-GCTTGATCATTCCTTTAAGG- 3）と配列番号３４（5’-ATGTGCTCAACAATGGACATGTGGTCTACTCCAAATTCAC- 3’）に示した配列のプライマーを用いた。配列番号３４はtatCの５’末端の配列を含んでいる。またTatCをコードする遺伝子を増幅するためC.glutamicumATCC13032におけるtatCの遺伝子配列（配列番号３５）を参考に、プライマー配列番号３６（5’-ATGTCCATTGTTGAGCACATC- 3’）と配列番号３７（5’-CTAGAGCACGTCACCGAAGT- 3’）を作成しPCR法にて増幅した。さらに、配列番号３３と配列番号３４により増幅したPCR産物と、配列番号３６と配列番号３７を用いて増幅したPCR 産物を１：１で混合して鋳型とし配列番号３３と配列番号３７によりクロスオーバーPCRを行なってtatAのプロモーター領域とTatCをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅させた。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動により、約１．８ｋｂのDNA断片を回収した、回収したDNA断片を特開平９−０７０２９１記載のプラスミドpVC7のSmaI部位に挿入することによって、TatC発現プラスミドpVtatCを構築した。構築したプラスミドは実施例１と同様の方法で挿入部分の塩基配列を確認した。【００５６】
（２）  TatAおよびTatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号３３と配列番号３７に示した配列のプライマーを用いてTatAをコードする遺伝子配列とその５‘上流域、さらにTatCをコードする遺伝子配列を含んだ領域をPCR法により増幅した。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動により、約2．4ｋｂのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を特開平9-070291記載のプラスミドpVC7のSmaI部位に挿入することによって、TatAおよびTatC発現プラスミドpVtatACを構築した。構築したプラスミドは実施例１と同様の方法で挿入した遺伝子の塩基配列を確認した。その結果、tatAの塩基配列はC.glutamicumATCC13032におけるtatAの予測配列と若干異なっていることが判明した。このTatAをコードする遺伝子配列とその５‘上流域、さらにTatCをコードする遺伝子配列を配列番号３８に記載した。【００５７】
（３）TatA、TatBおよびTatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumATCC13032で予想されているTatBをコードする遺伝子配列を含む領域とさらにその5’上流域を、下記の配列番号３９（5’-GAGGCGCTGCCTGAAGATTA- 3’）と配列番号４０（5’-GACAGGTGAAGAGGTCAAGG- 3’）に示した配列のプライマーを用いたPCR法により増幅した。増幅したPCR産物をアガロースゲル電気泳動により、約１．7ｋｂのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を特開平９−０７０２９１記載のプラスミドpVC7のSmaI部位に挿入することによって、TatB発現プラスミドpVtatBを構築した。構築したプラスミドは実施例１と同様の方法で挿入したDNA断片の塩基配列を確認した。TatBをコードする遺伝子配列とさらにその5’上流域の遺伝子配列を配列番号４１に記載した。このTatB発現プラスミドpVtatBを制限酵素KpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動により約１．５kbのDNA断片を回収した。このDNA 断片はtatBのプロモーター領域とTatBをコードする遺伝子配列を含んでいる。この断片を実施例６(２)で作製したプラスミドpVtatACのKpnI部位に挿入することによりTatA、TatBおよびTatCを発現するプラスミドpVtatABCを構築した。【００５８】
（４）Tat系分泌装置増幅株によるプロテイングルタミナーゼ分泌発現
C.glutamicumATCC13869に実施例３（３−２）で作製したプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PPGにより形質転換した菌株13869/pPKT-PPGを作製した。さらに上記のプラスミドpVtatC、pVtatAC、pVtatABC各々により形質転換し、カナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むCM2G寒天培地において生育する菌株を選択し、13869/pPKT-PPG/pVtatC、13869/pPKT-PPG /pVtatAC、13869/pPKT-PPG /pVtatABCを得た。これらの株をカナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むMM培地において30℃48時間培養した。培養終了後の培養上清10μlを実施例２（２−３）に記載した方法でSDS-PAGEによる分析を実施した結果、Tat系分泌装置を増幅した13869/pPKT-PPG/pVtatC、13869/pPKT-PPG/pVtatAC、13869/pPKT-PPG/pVtatABCは、Tat系分泌装置増幅前の菌株13869/pPKT-PPGに比較し著しい分泌量の増加を認めた。それぞれの上清を逆相HPLCにおいて実施例２に記載した条件により分析した結果、13869/pPKT-PPGに対し13869/pPKT-PPG/pVtatC、および13869/pPKT-PPG/pVtatACで約3倍、13869/pPKT-PPG/pVtatABCで約10倍の分泌量向上が認められた。【００５９】
実施例７．Tat系分泌装置増幅によるArthrobactor  globiformisに由来するIMDシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌量に及ぼす効果
（１）Arthrobactor  globiformisに由来するIMDシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌発現プラスミドの作製
実施例１により作製したIMDシグナルを用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドpPKI-IMDを鋳型とし、配列番号14と配列番号４２（5’-GTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGGCCTGGGCGGAGCCTGC- 3’）に示した配列のプライマーにより、IMDシグナル配列とその５'上流域のCspBプロモーターを含んだ領域を増幅した。配列番号４２はIMDシグナル配列のC末端側をコードする遺伝子配列とトランスグルタミナーゼのプロ配列のN末端側をコードする配列を含んでいる。またpPKSPTG1（WO-01/23591記載）を鋳型とし配列番号４３（5'-GACAATGGCGCGGGGGAAG- 3' ）と配列番号４４（5'-GACAATGGCGCGGGGGAAG- 3’）に示した配列のプライマーを用いてPCRを行ない、プロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子配列を増幅した。配列番号14と配列番号４２に示した配列のプライマーにより増幅されたPCR産物と、配列番号４３と配列番号４４に示した配列のプライマーにより増幅されたPCR産物を1：1で混合して鋳型とし、配列番号14と配列番号４４に示した配列のプライマーを用いたクロスオーバーPCRを行ない、CspBプロモーターとIMDシグナルとプロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅した。このPCR産物を制限酵素ScaIおよびEcoO65Iにおいて切断し、アガロースゲル電気泳動において約700bpの遺伝子断片を回収した。この回収したDNA断片をpPKSPTG1（WO-01/23591記載）のScaI-EcoO65I領域に挿入することによりプロ構造付きトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKI-PTG1を作製した。作製したプラスミドの塩基配列は実施例1に記載の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。【００６０】
（２）Tat系分泌装置増幅株によるIMDシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌発現
(1)で作製したプラスミドpPKI-PTG1によりC.glutamicumATCC13869を形質転換した菌株13869/pPKIPTG1を作製した。この菌株をさらに実施例６（３）で作製したTat分泌装置TatA、TatBおよびTatC発現プラスミpVtatABCにより形質転換後、カナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むCM2G寒天培地において生育する菌株を選択し、Tat系分泌装置増幅株13869/pPKI-PTG1/pVtatABCを得た。
13869/pPKI-PTG1と13869/pPKI-PTG1/pVtatABCをカナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むMM培地において30℃にて48時間培養した。培養終了後、培養上清を実施例２(２−３)に記載した方法でSDS-PAGEを実施した結果、2256/pPKI-PTG1に比較し2256/pPKI-PTG1/pVtatABCでプロ構造付きトランスグルタミナーゼの分泌量の増加が確認された。さらに培養上清を参考例A-3に記載した条件において逆相HPLCで定量した結果、Tat系分泌装置増幅株において分泌量は約7倍であった。【００６１】
実施例８．Tat系分泌装置増幅によるE.coliに由来するTorAシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌量に及ぼす効果
（１）E.coliに由来するTorAシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌発現プラスミドの構築
実施例３（３−２）により作製したTorAシグナルを用いたプロテイングルタミナーゼ分泌発現プラスミドpPKT-PPGを鋳型とし、配列番号14と配列番号４５（5’-CTTCCCCCGCGCCATTGTCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG- 3' ）に示した配列のプライマーにより、TorAシグナル配列とその５'上流域のCspBプロモーターを含んだ領域を増幅した。配列番号４５に記載の配列はTorAシグナル配列のC末端側をコードする遺伝子配列とトランスグルタミナーゼのプロ配列のN末端側をコードする配列を含んでいる。またpPKSPTG1（WO-01/23591記載）を鋳型とし、配列番号４３と配列番号４４に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子配列を増幅した。配列番号14と配列番号４５に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物と、配列番号４３と配列番号４４に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物を1:1で混合して鋳型とし、配列番号14と配列番号４４に示した配列のプライマーによりクロスオーバーPCRを行ない、CspBプロモーターとTorAシグナルとプロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅した。このPCR産物をScaIおよびEcoO65Iにおいて切断し、アガロースゲル電気泳動において約700bpの遺伝子断片を回収した。この回収したDNA断片をpPKSPTG1（WO-01/23591記載）のScaI-EcoO65I領域に挿入することによりプロ構造付きトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PTG1を作製した。作製したプラスミドの塩基配列は前述の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。【００６２】
（２）Tat系分泌装置増幅株によるTorAシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌発現
実施例８(1)で作製したプラスミドpPKT-PTG1によりC.glutamicumATCC13869を形質転換した菌株13869/pPKTPTG1を作製した。この菌株をさらに実施例８で作製したTat分泌装置TatA、TatBおよびTatC発現プラスミドpVtatABCにより形質転換後、カナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むCM2G寒天培地において生育する菌株を選択し、Tat系分泌装置増幅株13869/pPKTPTG1/pVtatABCを得た。
13869/pPKT-PTG1と13869/pPKT-PTG1/pVtatABCをカナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むMM培地において30℃で48時間培養した。培養終了後、培養上清10μlを実施例２(２−３)に記載した方法でSDS-PAGEを実施した結果、13869/pPKT-PTG1に比較し13869/pPKT-PTG1/pVtatABCでプロ構造付きトランスグルタミナーゼの増加が確認された。また、培養上清を参考例A-3に記載したのと同条件の逆相HPLCで定量した結果、Tat系分泌装置増幅株において分泌量は約40倍であった。【００６３】
実施例９．TorAシグナル配列を用いたプロテイングルタミナーゼの分泌におけるプロ配列C末端の変更
（１）プロテイングルタミナーゼのプロ配列C末端の変更
実施例３及び５において活性が確認されたプロテイングルタミナーゼのN末端アミノ酸配列を解析したところ、天然型プロテイングルタミナーゼと比較して2アミノ酸が付加した配列（NKLASV）であった。そこで、天然型プロテイングルタミナーゼのN末端配列と同じ配列にもつようにプロ配列の切断が行われるよう、プロ配列のC末端配列の変更を行った。天然型プロテイングルタミナーゼのプロ配列のC末端は“QTNK”であるが、SAM-P45で切断されやすいと予想される“FGPK”、subtilisinを主成分とするアルカラーゼ(Novozymes)で切断されやすいと予想される“FGPF”、“FAPF”、“FAPY”、“AHAY”、“AHAL”、“AAPF”、“AAPY”、“AAPM”に変更した。“FGPK”への変更は、配列番号５０（CTT GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号５１（TTC GGC CCC AAG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）に示す配列を有するプライマーを用いた。配列番号５０の配列は、プロ配列部分を増幅するためのプライマー、配列番号５１の配列は、成熟体部分を増幅するためのプライマーである。実施例３（３−２）にて構築したプラスミドpPKT-PPGを鋳型として、配列番号２０と配列番号５０に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼのプロ配列部分を、配列番号５１と配列番号１８に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼの成熟体部分をそれぞれ増幅した。さらに、これらのPCR産物を１：１で混合し、これらを鋳型として配列番号２０と配列番号１８に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施することにより、プロ配列C末端がFGPKに変更されたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子を増幅した。【００６４】
このクロスオーバーPCR産物をpUC18のSmaＩサイトにクローニングし(pUCPPG(FGPK))、塩基配列の確認を行ったところ、pro配列が変更されていた。次に、pPKT-PPGのAatII-BstPＩ断片(大)とpUCPPG(FGPK)のAatII-BstPＩ断片(小)を連結して、pPKT-PPG(FGPK)を構築した。同様に、“FGPF”への変更は配列番号５２（GAA GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号５３（ TTC GGC CCC TTC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“FAPF”への変更は配列番号５４ （GAA GGG CGC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号５５（TTC GCG CCC TTC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“FAPY”への変更は配列番号５６（GTA GGG CGC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号５７（TTC GCG CCC TAC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“AHAY”への変更は配列番号５８（GTA CGC GTG CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号５９（GCG CAC GCG TAC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“AHAL”への変更は配列番号６０（ CAA CGC GTG CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号６１（GCG CAC GCG TTG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“AAPF”への変更は配列番号６２（GAA GGG CGC CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号６３（GCG GCG CCC TTC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“AAPY”への変更は配列番号６４ （GTA GGG CGC CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号６５ （GCG GCG CCC TAC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）、“AAPM”への変更は配列番号６６（CAT GGG CGC CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG）と配列番号６７（GCG GCG CCC ATG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT）に示す配列を有するプライマーを用いた。配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６の配列は、プロ配列部分を増幅するためのプライマー、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７の配列は、成熟体部分を増幅するためのプライマーである。実施例３（３−２）にて構築したプラスミドpPKT-PPGを鋳型として、配列番号２０と配列番号５２に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼのプロ配列部分を、配列番号５３と配列番号１８に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼの成熟体部分をそれぞれ増幅した。さらに、これらのPCR産物を１：１で混合し、これらを鋳型として配列番号２０と配列番号１８に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施することにより、プロ配列C末端がFGPFに変更されたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子を増幅した。このクロスオーバーPCR産物をpUC18のSmaＩサイトにクローニングし(pUCPPG(FGPF))、塩基配列の確認を行ったところ、pro配列が変更されていた。次に、pPKT-PPGのAatII-BstPＩ断片(大)とpUCPPG(FGPF)のAatII-BstPＩ断片(小)を連結して、pPKT-PPG(FGPF)を構築した。同様の手順で、pPKT-PPG(FAPF)、pPKT-PPG(FAPY)、pPKT-PPG(AHAY)、pPKT-PPG(AHAL)、pPKT-PPG(AAPF)、pPKT-PPG(AAPY)、pPKT-PPG(AAPM)を構築した。【００６５】
（２）プロ配列C末端を“FGPK”に変更したプロテイングルタミナーゼの分泌発現
構築したプラスミドpPKT-PPG(FGPK)を用いて、C. glutamicum ATCC13869を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20％のグラジエントゲル（第一化薬製）を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。
さらに、同様に実施例２（２-２）と同様に培養上清をウルトラフリー（ミリポア製）により処理した後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特許開2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。また、成熟化したタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析した結果、天然型と同じLASVであることが確認された。更に、成熟化を行う際の酵素として、trypsinやプロテアーゼM（天野エンザイム）を用いた場合にも、天然型と同じN末端を生じることが確認された。【００６６】
（３）プロ配列C末端を変更したプロテイングルタミナーゼの分泌発現とアルカラーゼによる成熟化
構築したプラスミドpPKT-PPG(FGPF)、pPKT-PPG(FAPF)、pPKT-PPG(FAPY)、pPKT-PPG(AHAY)、pPKT-PPG(AHAL)、pPKT-PPG(AAPF)、pPKT-PPG(AAPY)、pPKT-PPG(AAPM) を用いて、それぞれC. glutamicum ATCC13869を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した各菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20％のグラジエントゲル（第一化薬製）を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。
さらに、同様に実施例２（２-２）と同様に培養上清をウルトラフリー（ミリポア製）により処理した後、subtilisin（Sigma）またはアルカラーゼ（Novozymes）により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特許開2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。また、成熟化したタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析した結果、天然型と同じLASVであることが確認された。【００６７】
本発明により、コリネ型細菌においてタンパク質分泌経路であるSec系では分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質、例えば、イソマルトテキストラナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、を効率的に生産および菌体外に分泌（分泌生産）させることができる。すわなち、本発明によって、Sec系分泌経路によっては、分泌生産が困難であった異種タンパク質を効率的に製造する方法が提供される。
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（配列表フリーテキスト）
配列番号１１〜２７、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２〜４５、５０〜６７：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
0004730302000001.app