(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式Iで表されることを特徴とする化合物。
【化１】
0004771564.tif 000007
式中、R１が、
(a)-（C１-C5）アルキルアリール、又は
(b)（（C1-C5）アルキルN＋）（CH3）3であり、
X−はCl-、I-、Br-から選ばれるハライド対イオンであり、
R2、R4は水素であり、
R3は-CH(R5)2であって、R5は分枝鎖状または直鎖状の（C10-C20）アルキル、モノ不飽和（C10-C20）アルケニル、ポリ不飽和（C10-C20）アルケニルから選択される。
【請求項２】
式中、R1が(CH2)4−N+(CH3)3であり、R3が（C18H35）2CHであることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、真核細胞に高分子を導入し得る新規化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
DNA、蛋白質などを包含する高分子の真核細胞への導入は、例えば輸送ビヒクルによるなど種々の方法で行なうことができる。ビヒクルは、例えばエンドサイトーシスによって分子を細胞内に導入する。ビヒクルは、輸送しようとする分子を結合するだけでなく、例えば包み込むこともある。後者の場合、ビヒクルはベシクルと呼ばれる。既知のベシクルは二層の燐脂質よりなるリポソームである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
リポソームは、例えば薬剤を細胞に導入するために用いられるが、イン・ビボ、イン・ビトロの両者において、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれるようであった（Nandi, P.K. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:16722; Heath, T.D. (1987) Methods Enzymol. 149:111)。これは、細胞に取り込まれる物質の大部分が最終的にリポソーム器官に見られ、そこで分解されることを意味している。このことは、特に細胞質あるいは核で作用する物質には明らかに非常に不利である。
【０００４】
導入しようとする物質が親水性である場合、その物質をリポソームに導入するのは難しく、大部分は水相に残留する。このことは、特にプローブや多くの薬剤のような高価な物質の場合には明らかに不利である。
【０００５】
細胞内に導入しようとする物質がエンドサイトーシスにより終焉するのを防止するために、フゾ原燐脂質を輸送ビヒクルとして用いようと試みられた。フゾ原燐脂質を用いると、フゾ原燐脂質より形成されたベシクルが細胞膜と融合し、その内容物を細胞内に導入するはずである。しかし、フゾ原燐脂質は、細胞膜と融合しないで相互に溶け込む傾向が強く、そのような試みはあまり成功しないことがわかった (Fonteijn, T.A.A, Ph.D. Thesis [1992]) 。
【０００６】
細胞内に分子を導入する最も重要な適用例の１つは、（真核) 細胞への DNAやRNA のトランスフェクションである。トランスフェクションは、遺伝子および蛋白質の機能と調節についての研究のためだけでなく、微生物、植物および動物の遺伝子修飾にも用いられている。DNA マイクロインジェクション、無機塩あるいはポリカチオンとの DNA共沈、リポソーム内への DNA包み込み、および化学的または物理的手段の補助により細胞膜を透過性にすることを包含する、細胞内への DNAの導入を可能にする人工的手法が多数ある。
【０００７】
より最近の技術に、カチオン性両親媒性分子を輸送ビヒクルとして用いるものがある。最もよく知られている両親媒性物質の１つは、第四級アンモニュウム両親媒性物質DOTMA (N-[1-(2,3- ジオレオイルオキシ) プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド) であり、この物質はジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン(DOPE)と組み合わせてリポフェクチン（商標）という名称で市販されている。これら両分子は脂質 (類似体) であり、リポソームを構成し、負に帯電した核酸と複合体を形成する。このリポソームは形質膜と合して核酸を細胞内に導入すると思われるが、これはエンドサイトーシスによっても行なわれるものであり、正確なメカニズムはまだ知られていない。リポフェクチン（商標）を用いた時のトランスフェクション効率は、従来の燐酸カルシウム沈殿法を含むその他の既知の系に対して30倍向上される。しかし、リポフェクチン（商標）の欠点は毒性を有することであり、イン・ビボで用いるのが困難ないし不可能なことである。そのため、他のよりよいトランスフェクション法がなお求められている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸や、蛋白質や薬剤を包含するその他の高分子を細胞内に導入するに高い効率の得られる新規カチオン性両親媒性分子を提供することを目的とする。
【０００９】
この目的は、請求項１記載の本発明化合物によって達成される。好適な化合物は請求項２の化合物である。
【００１０】
SAINT-2/DOPEによれば、蛋白質、特にゲロニン(gelonine,30KD) を細胞内に導入し得ることも分かった。他の種類の細胞、特にベビーハムスター腎 (BHK)細胞にトランスフェクトできる。リポフェクチン（商標）では BHK細胞にトランスフェクト不可能である。 BHK細胞に対してSAINT-2/DOPEを使用すると、COS-7 細胞に対してリポフェクチン（商標）を使用する時よりもよい結果が得られる。
【００１１】
本発明の両親媒性化合物は周知の方法で製造できる。その合成方法は後に実施例を挙げて説明する。
本発明の両親媒性化合物は種々、適用可能である。
【００１２】
核酸やその誘導体の細胞内への輸送は、トランスフェクションにとって重要である。トランスフェクションの目的は、例えば、蛋白質を生成させること、またリサーチを行なうことである。また、必要に応じストレプトアビジンで標識するか、あるいは放射標識してトランスフェクトされた核酸を、そのままハイブリッド形成に用いることができる。より高度な適用例は、例えばアンチセンスストランドによる遺伝子の封鎖のように、遺伝子の発現に影響を与えることにある。さらに、遺伝子の発現を刺激することもできる。さらに、欠失した遺伝子を置換することもできる。後者の二つの適用例は遺伝子療法にことに重要である。
【００１３】
本発明の化合物の利点は、既知の輸送ビヒクルと比較してずっと低い無毒な濃度で使用し得ることである。本発明の化合物は、免疫的反応も生起しないであろうと思われる。
【００１４】
DNA 及び／または RNAを細胞内に導入する場合、本発明化合物と核酸を一定の比で混合しなければならない。DOTMAなどの既知の両親媒性物質については、最適両親媒性物質濃度がある(Felgner P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413) 。一定量を越えた場合も、トランスフェクション効率が低下する。これは本発明の化合物についても同様である。
【００１５】
本発明のカチオン性両親媒性化合物は、特にゲロニンなどの負に帯電した蛋白質を細胞内に輸送するためにも使用できる。
また本発明の両親媒性化合物は、細胞増殖抑止剤のような物質を輸送するのにも使用できる。ことに親油性細胞増殖抑止剤は、本発明の化合物と相互作用して非常に効率的に細胞内に導入される。
【００１６】
本発明の好適な態様においては、輸送ビヒクルを特定の部位へ意図的に移送することができる。その場合、両親媒性化合物を、組み込んだ物質が活性を示すべき部位の近傍のエピトープに導かれる抗体のような標的分子と混合する。抗体は、両親媒性化合物と結合させるのがよいが、例えばスペーサを介して、輸送しようとする物質に結合させてもよい。細胞膜を通した DNAあるいはその他の高分子のトランスロケ-ションを促進するために、本発明の化合物を燐脂質にまた相互に混合してもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは一例にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
実施例
実施例１
合成方法
一般構造式
【００１９】
【化５】
0004771564.tif 000002
【００２０】
で示される化合物はその置換基によって多数の群に分類される。その内の４群の化合物の合成方法を以下に例示する。
【００２１】
1.  4-置換N-アルキルピリジニウム塩
1.1.  1-メチル-4-(1-オクタデシルノナデシル) ピリジニウムクロリドの合成
この化合物は、E.J.R. Sudholterの博士論文（グロニンゲン大学、37頁、1981年）に記載された以下の反応式１にしたがって合成する。
【００２２】
反応式１
【００２３】
【化６】
0004771564.tif 000003
【００２４】
1.2.  1-メチル-4-(19- シス, シス- ヘプタトリチアコンタ-9,28-ジエニル) ピリジニウムクロリド(SAINT-2) の合成
反応式２に反応の順序を示す。
【００２５】
反応式２
【００２６】
【化７】
0004771564.tif 000004
【００２７】
この合成は窒素雰囲気下で行った。ジイソプロピルアミン2.226g (0.022 モル) を乾燥ジエチルエーテル15mlに溶解し、この溶液にn-ヘキサン中13.8ml (1.6M) のn-ブチルリチウムを0 ℃で滴下し、得られた混合物を10分間攪拌した。この混合物を -20℃でジエチルエーテル10ml中の4-ピコリン0.931g (0.01モル) に滴下し、さらに30分攪拌した。反応混合物の色は深い橙色になった。次いでジエチルエーテル5ml 中のヨウ化オレイル(85%シス)7.567g(0.020 モル) を一度で加えた。攪拌しながら温度を 0℃に上げた。その後、この混合物を室温で一夜攪拌した。翌日、反応混合物にジエチルエーテル 100mlを加え、次いでH2O を40ml加えた。有機層を分離し、H2O 30mlで３回洗浄した。このエーテル層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物 (5.9g) は粘稠な褐色の油状物であり、この油状物を中性Al2O3100g のカラムで精製した (2 〜3 回) 。溶離液としてn-ヘキサン／ジエチルエーテル(8:2) 混液を用いた。4-(19-シス, シス- ヘプタトリチアコンタ-9,28-ジエニル) ピリジン4.32g(0.0073モル) が得られた (中間体1b2、収率73%)。
【００２８】
NMR データ：1H NMR(CDCl3): δ 0.89(t,6H); 1.27(鎖,52H); 2.0(m,8H); 2.43( tr,1H); 5,34(m,4H); 7.06(d,JH,H=6Hz,2H); 8.49(d,JH,H=6Hz,2H). 13C NMR: δ 14.0(CH3); 22.6; 27.1; 27.3; 29.1; 29.2; 29.4; 29.5; 29.6; 29.7; 31.8; 36.1 (CH2-鎖); 45.5(CH); 123.1(CH) 129.7(CH); 129.8(CH); 149.5(CH); 155.3(C) .
【００２９】
中間体１ 1.527g (0.0025 モル) をアセトン10mlに溶解し、次いでヨウ化メチル2ml を加え、得られた混合物を 3時間沸騰させた。溶媒を蒸発させた後、淡黄褐色の粘稠な油状物が収量0.8g (中間体1b1 、収率97%)で得られた。
【００３０】
NMR データ：1H NMR(CDCl3): δ 0.85(t,6H); 1.23(鎖,44H); 1.55(m,4H); 1.73 (m,4H); 2.00(m,8H); 2.77(m,1H); 4.7(2,3H); 5.31(m,4H); 7.74(d,JH,H=6.7Hz,2H); 9.31(d,JH,H=6.7Hz,2H). 13C NMR: δ 13.9(CH3); 22.4; 26.9; 27.2; 28.9; 29.1; 29.3; 29.4; 29.5; 31.6;: 35.4(CH2- 鎖); 46.4(CH); 48.3(N-CH3);126.8(CH); 129.5(CH); 129.7(CH); 144.9(CH); 167.1(C).
【００３１】
中間体２ 0.4g(0.00054 モル) をメタノール 3mlに溶解し、この溶液をダウエックスカラム(1*8,200〜400 メッシュ,Cl-型) においてメタノールで溶離した。化合物1bを粘稠な油状物として収量0.319g (0.00049 モル,92%) で得た。
【００３２】
NMR データ：1H NMR(CDCl3): δ 0.87(t,6H); 1.26(CH2-鎖,44H); 1.57(m,4H);1.75(m,4H); 2.00(m,8H); 2.77(m,1H); 4.77(s,3H); 5.32(m,4H); 7.15(d,JH,H=6.2Hz,2H); 9.50(d,JH,H=6.2Hz,2H).
【００３３】
1.3.  1-(1- ブチル-N,N,N- トリメチルアンモニウム)-4-(17-トリチアコンタニル) ピリジニウムクロリド
この化合物は下記の反応式３にしたがって合成した。
【００３４】
反応式３：
【００３５】
【化８】
0004771564.tif 000005
【００３６】
2.  3,5-二置換-N- アルキルピリジニウム塩
下記の反応式４による一般合成法はSudholter の文献 (上記参照) とWang etal. のJ. Org. Chem. 42, 1286 (1977) に記載されていたものである。
【００３７】
反応式４
【００３８】
【化９】
0004771564.tif 000006
【００３９】
2.1.  1-メチル-3,5- ジカルボ-N- オクタデシルオキシ) ピリジニウムクロリド
この化合物は反応式４にしたがって合成した。
NMR データ：1H NMR(CDCl3): δ 0.85(t,6H); 1.30(鎖,64H); 4.40(t,4H); 5.03 (s,3H); 9.20(t,1H); 10.00(d,2H) .
【００４０】
3.  4-置換-N- アルキルピリジニウム塩
この合成法はF.J.A. Hundscheid and J.B.F.N. EngbertsによりJ. Org. Chem. 49, 3088 (1984) に記載されたものである。
3.1.  1-メチル-4((-n- ヘキサデシルオキシ) カルボニル) ピリジニウムヨージド
この化合物の合成法と特性はHandscheidとEngberts (上記参照) によって記載されている。
【００４１】
NMR データ：1H NMR(CDCl3): δ 0.9(t,3H); 1.25(m,28H); 4.35(t,2H); 4.70(s ,3H); 8.35(d,2H); 9.35(d,2H).
【００４２】
4.  4-置換-N- アラルキルピリジニウム塩
4.1.  1-(3- フェニル-1- プロピル)-4-n-ドデシルピリジニウムヨージド
この化合物は、 1- ヨード-3- フェニルプロパン 2.26g (9.2 ミリモル) と4-n-ドデシルピリジン 2.57g(10.0 ミリモル) の乾燥アセトン35ml中混合物を16時間沸騰させることにより合成した。溶媒を蒸発させ、残留した黄色の固形物を THF／エーテルから再結晶させた。収量は3.06g(6.2 ミリモル）、融点79.0〜80.0℃である。
【００４３】
NMR データ：1H NMR(CDCl3): δ 0.83(t,3H); 1.21(鎖,20H); 1.61(m,2H); 2.36 (m,2H); 2.78(m,2H); 4.89(t,2H); 7.05-7.20(m,5H); 7.73(d,2H); 9.30(d,2H).
【００４４】
実施例２
単ラメラ小胞（ベシクル）の形成
適当量の脂質を N2(g)中で乾燥させた。複数の物質を組合せる場合には、各物質を混合してから乾燥させる。その後、得られた脂質フィルム層を減圧下にさらに乾燥させる。次いで、この脂質を適当量の水に懸濁し、渦状に攪拌した後、溶液が澄明になるまで音波処理する。
【００４５】
実施例３
本発明化合物による真核細胞へのトランスフェクション
DNA と実施例２で調製した単ラメラ小胞を Hepes緩衝塩水 (HBS, pH7.4; ともに0.5ml)に入れて混合する。 DNA／両親媒性化合物複合体が直接生成する。代表的なトランスフェクション試験では、 DNA 1μg と両親媒性化合物SAINT-2 (1-メチル-4-(19- シス, シス- ヘプタトリチアコンタジエニル-9-28)ピリジニウムクロリド)7.5〜10μg 、あるいは DNA 1μg と全両親媒性化合物(SAINT-2/DOPE 1: 1) 10 〜15μg を用いる。
【００４６】
6ウエルプレート中70〜80%生長の細胞を HBS 1mlで２回洗浄し、その後 DNA／両親媒性物質複合体を 1ウエル当り 1ml加えた。この細胞を37℃で 4時間インキュベートし、その後 10%ウシ胎児血清 (FCS)を補足したDulbecco改良イーグル培地(DMEM) 1mlを加えた。37℃で16時間インキュベート後、培地を、10%FCSを加えた新しいDMEM 2mlと交換した。さらに37℃で28時間インキュベートした後、細胞を集めた。細胞を燐酸塩緩衝塩水 (PBS)で２回洗浄し、lx溶解緩衝液(Promega)300μl 中に掻き取った。掻き取った細胞を56℃で10分間インキュベートした後、室温で 2分間最高速度で遠心分離した。上澄液について酵素試験(CAT検定) と蛋白質試験(Lowry) を行なった。
【００４７】
細胞抽出物100 μl を14C-クロラムフェニコール (25mCi/l) 3μl 、N-ブチリル- CoA (2mg/ml)5 μl および0.25 Mトリス HCL(pH 8.0) 17 μl とともに37℃で90分間インキュベートした。混合キシレン (Aldrich) 0.3mlを加えて反応を止めた。この試料を30秒間渦攪拌した後、室温で 3分間最高速度で遠心分離した。有機相を0.25M トリス HCL 0.1mlで再び抽出し、30秒間攪拌し、 3分間遠心分離した。有機相 0.2mlに計数液 4mlを加えて放射活性を測定した。
【００４８】
この新規両親媒性物質(SAINT-2とSAINT/DOPE) でのCOS-7 細胞のトランスフェクションは、DOTMA/DOPEベシクルでのトランスフェクションより８倍効率がよいことが分かった (図１参照) 。
【００４９】
この新規両親媒性物質を用いて、BHK 細胞などを包含するその他の細胞種をもトランスフェクトできるようであった (図２) 。この新しい両親媒性物質で安定したトランスフェクションが行われる時には、COS-7 細胞の42〜45% にトランスフェクトできるようであった。DOTMA-DOPEベシクルでは平均25〜29% の細胞がトランスフェクトされる。
【００５０】
実施例４
真核細胞への蛋白質の輸送
合成両親媒性物質 SAINT-2は、DOPEと組み合わせて、蛋白質を細胞内に輸送するのに好適な薬物である。SAINT-2/DOPEを担体とする蛋白質インターナリゼーションの効率は、ゲロニン蛋白を用いることによりモニターできる。取り込まれたゲロニンは細胞の蛋白質合成を特異的に阻害するので、その阻害が細胞内に入ったゲロニンの量の直接の目安となる。合成薬物たる両親媒性物質 SAINT-2とDOPEで構成された単ラメラ小胞は、浴音波処理によって得られる。ゲロニンは、その原液(2mg/ml)を HBS中の所定濃度(0〜20μM)のSAINT-2/DOPAに加える。
【００５１】
12ウエルプレートで成長させたCV-1細胞を HBSで三回洗浄し、その後、この細胞を上記のようにして得た HBS中の両親媒性物質／ゲロニン複合体とともに37℃で 1時間インキュベートする。その後、この細胞を HBSで３回洗浄する。
【００５２】
ゲロニンによる蛋白質合成の阻害は、上記のように処理した細胞への放射標識メチオニンの取り込みを測定することにより追跡される。これは細胞を、1 μCi35S-メチオニンとともに30分間インキュベートすることにより行なう。その後、細胞を PBSで３回洗浄し、最後に10%TCA中に掻き取る。このようにして得られた細胞リゼートを10%TCAで３回洗浄し、細胞リゼート中に存在する放射性メチオニンの量をシンチレーションカウンタにより測定する。
【００５３】
CV-1細胞を両親媒性物質／ゲロニン複合体とともにインキュベートすると、同細胞を合成両親媒性物質のみとインキュベートした対照試験と比較して、蛋白質合成に強い阻害が見られる。5 μM SAINT-2 ／DOPEと1.6 μM ゲロニンの濃度で、蛋白質合成が 50%阻害された。
【００５４】
実施例５
毒性試験
DOTMA-DOPEと比較した場合の本発明化合物 SAINT-2の毒性を調べるために、COS-7 細胞を種々の濃度の両脂質試料とともにインキュベートする。残留した蛋白質含量を生存細胞の量の目安とする。
【００５５】
脂質71μM に始まるDOTMA-DOPEについては、蛋白質含量に 2から1mg/mlへの減少が見られた。90μM から始まるSAINT-2 には、2 から1.75 mg/mlへの減少が見られた。
【００５６】
このことは、 SAINT-2がDOTMA-DOPEより明らかに低毒性であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々の両親媒性物質を用いたＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションを示したグラフである。
【図２】種々の両親媒性物質を用いたＢＫ細胞ヘのトランスフェクションを示したグラフである。
【図３】ベシクル仲介トランスフェクションとＣａＰ仲介トランスフェクションとを対比して示したグラフである。
【図１】
0004771564.tif 000008
【図２】
0004771564.tif 000009
【図３】
0004771564.tif 000010