(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水晶板の両側に電極を備えた水晶振動子に接触する物質の物性を、前記水晶振動子の周波数変動に基づいて測定する方法であって、前記電極間に電圧を印可した際の水晶振動子のＮ倍波（Ｎ＝１，３，５、・・・（Ｎ＝２ｎ＋１））のうちの少なくとも２つの異なる周波数の変化量の差に基づいて、各周波数による共振点付近のコンダクタンスの最大値の１／２を与える周波数Ｆ1，Ｆ2（Ｆ1＜Ｆ2）を用いて、前記物質の物性を測定することを特徴とする水晶振動子を用いた測定方法。
【請求項２】
前記各周波数のＦ2の変化量（ΔＦ2）の差と、前記各周波数のＦ1，Ｆ2の差の変化量（Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２）の差とから、前記物質の質量負荷、粘性負荷及び粘弾性負荷のいずれかを残りの負荷から分離して測定することを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
請求項２に記載の測定方法を使用する測定装置であって、前記各周波数のＦ2の変化量（ΔＦ2）の差と、前記各周波数のＦ1，Ｆ2の差の変化量（Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２）の差とをそれぞれグラフ表示することを特徴とする測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水晶振動子を使用した測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡやタンパク質等の生体物質の相互作用や抗原抗体反応を利用した測定等にＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）が広く使われている。
しかしながら、従来のＱＣＭの場合、共振周波数ＦSの変化を測定することにより、水晶振動子への物質の結合量を測定していたが、共振周波数ＦSは、質量負荷以外にも、物質の粘性の変化、粘弾性の変化の影響も受けることがあり、これらの３つ要素について、分離して測定することができなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、質量負荷、粘性負荷及び粘弾性負荷のうちの何れかを残りの負荷から分離して測定し、測定対象となる物質の物性の正確な測定をできるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するために、本発明者は、鋭意検討の結果、下記の知見を得た。
Ｍartinの伝送理論（V.E.Granstaff,S.J.Martin,J.Appl.Phys. 1994,75,1319）から、粘弾性を有する物質が液中で水晶振動子に付着した場合のインピーダンスＺの変化は、式（１）で表される。式中、ωは角周波数、ηは液体の粘性、ρは液体の密度、ｈは膜厚、Ｇはコンダクタンス、Ｇ'は貯蔵弾性率、Ｇ"は損失弾性率である。
【数１】
0004669749.tif 000002
式（１）から、共振周波数ＦSの変化は、式（２）の通りとなる。
【数２】
0004669749.tif 000003
前記共振周波数ＦsとなるコンダクタンスをＧとして、その半分１／２Ｇのときの周波数Ｆ1，Ｆ2（Ｆ1＜Ｆ2）となる（図１）。この半値周波数（Ｆ1−Ｆ2）／２の変化量は、式（３）で表される。
【数３】
0004669749.tif 000004
また、一方の周波数Ｆ2の変化は、Ｆs＝（Ｆ1＋Ｆ2）／２の関係から式（４）で表される。
【数４】
0004669749.tif 000005
ここで膜の粘弾性のモデルであるvoightモデルＧ＝Ｇ'＋ｉＧ"＝μ＋ｉωηを、式中のＧ'とＧ"に適用した場合、式（４）と式（３）は次式の通りとなる。
【数５】
0004669749.tif 000006
【数６】
0004669749.tif 000007
ここで、
【数７】
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として（Ｃは変数である。）、Ｎ倍のオーバートーン（ここでは、Ｎ＝３，５、・・・）に拡張する（ωを基本波とするとＮωがＮ倍波の角周波数となる）と、式（５）及び式（６）は、次式の通りとなる。尚、Ｆ1NとＦ2Nは、Ｎ倍のオーバートーンで振動させた場合の周波数（Ｆ1とＦ2）である。
【数８】
0004669749.tif 000009
【数９】
0004669749.tif 000010
オーバートーンの質量負荷による周波数変化は、基本波の質量負荷による周波数変化量のＮ倍の変化を示すため、式（７）を利用して、例えば、基本波による質量負荷の変化量（ΔＦ21）と３倍波による質量負荷の変化量（ΔＦ23／３）の差、即ち、（ΔＦ21−ΔＦ23／３）を求めると式（９）の通りとなる。
また、オーバートーンの粘性負荷による周波数変化は、基本波の粘性負荷による周波数変化量の√Ｎ倍の変化を示すため、式（８）を利用して、例えば、基本波と３倍波における周波数変化量（Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２）の差、即ち、（（Ｆ11−Ｆ21）／２）−（（Ｆ13−Ｆ23）／２√３））を求めると式（１０）の通りとなる。
【数１０】
0004669749.tif 000011
【数１１】
0004669749.tif 000012
式（９）において、測定系が質量負荷のみで成り立っている場合には、右辺の値は、理論的には０となるが、粘弾性項１を含む場合には、右辺の値が粘弾性項１の値となる。
また、式（１０）においても、測定系が粘性負荷のみで成り立っている場合には、右辺の値は、理論的には０となるが、粘弾性項２を含む場合は、右辺の値が粘弾性項２の値となる。
【０００５】
ここで式（９）と式（１０）の左辺は測定値であるので（９）／（１０）は変数Ｃのみの式となり、Ｃを求めることができる。
Ｃが決まると、式（９）より、
【数１２】
0004669749.tif 000013
の項が得られ、式（７）の質量負荷項が求められ、それを式（５）に代入することにより粘弾性項１も求められる。同様に式（８）の粘性負荷項も求めることができ、この値を式（６）に代入することにより粘弾性項２も求めることができる。従って、式（５）の粘弾性項１及び質量負荷が得ることができる。また、同様に式（６）の粘性負荷及び粘弾性項２も求めることができる。
【０００６】
以上により、基本波と３倍波で質量負荷、粘性負荷、粘弾性項１、粘弾性項２の分離を行ったが、図２に示すように、Ｎ倍波（Ｎ＝１，３，５、・・・（Ｎ＝２ｎ＋１））のうちの少なくとも２つの組み合わせを使用することができ、例えば、３倍波と５倍波の周波数変化量、更には、基本波と５倍波の周波数変化量及び３倍波と７倍波の周波数変化量等の複数の組み合わせで測定することができる。尚、複数の組の周波数変化量を測定する場合には、各組で得られた周波数変化量の平均を求めることによりそれぞれの値の誤差を小さくすることが可能となる。また、３組以上の場合は最小２乗法を用いることも可能である。
また、粘弾性のモデルにはこの例ではvoightモデルを用いたが、MaxwellモデルＧ＝Ｇ'＋ｉＧ"＝μ＋iηやその他のモデルを適用することも可能である。
【０００７】
上記知見に基づき、本発明の測定方法は、請求項１に記載の通り、水晶板の両側に電極を備えた水晶振動子に接触する物質の物性を、前記水晶振動子の周波数変動に基づいて測定する方法であって、前記電極間に電圧を印可した際の水晶振動子のＮ倍波（Ｎ＝１，３，５、・・・（Ｎ＝２ｎ＋１））のうちの少なくとも２つの異なる周波数の変化量の差に基づいて、各周波数による共振点付近のコンダクタンスの最大値の１／２を与える周波数Ｆ1，Ｆ2（Ｆ1＜Ｆ2）を用いて、前記物質の物性を測定することを特徴とする。
また、請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の測定方法において、前記各周波数のＦ2の変化量（ΔＦ2）の差と、前記各周波数のＦ1，Ｆ2の差の変化量（Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２）の差とから、前記物質の質量負荷、粘性負荷及び粘弾性負荷のいずれかを残りの負荷から分離して測定することを特徴とする。
本発明の測定装置は、請求項３に記載の通り、請求項２に記載の測定方法を使用する測定装置であって、前記各周波数のＦ2の変化量（ΔＦ2）の差と、前記各周波数のＦ1，Ｆ2の差の変化量（Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２）の差とをそれぞれグラフ表示することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、水晶振動子を使用した測定において、測定対象となる物質の質量負荷、粘性負荷及び粘弾性負荷のうちの少なくとも１つを残りの負荷から分離して測定することができるので、測定対象となる物質の正確な測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明では、Ｎ倍波（Ｎ＝１，３，５、・・・２ｎ＋１）のうちの少なくとも２つの周波数を使用するものである。尚、Ｎ倍波による共振周波数には、Ｎ倍波の共振周波数以外にも、Ｎ倍波の共振周波数の近傍の周波数も含まれ、例えば、±５００ｋＨｚ程度の範囲をスキャンすることまで含まれる。
【００１０】
また、周波数変化の測定に関しては、振動子が直列共振状態にあるときのコンダクタンスＧの半分の大きさの半値コンダクタンスを与える半値周波数Ｆ1，Ｆ2（Ｆ1＜Ｆ2）を使用する。
【００１１】
以下、図面を参照して、本発明の一実施の形態について説明する。尚、本発明は、この実施の形態に制限されるものではない。
図３において、符号１は、本発明の一実施の形態であるバイオセンサー装置を示すものである。
このバイオセンサー装置１は、センサー部２と、ネットワークアナライザ３と、コンピュータ４とを有している。センサー部２及びネットワークアナライザ３の間と、ネットワークアナライザ３及びコンピュータ４の間とには、それぞれケーブル５、６を介して接続されている。また、センサー部２は、水晶振動子を備えている。
【００１２】
センサー部２に備えられる水晶振動子は、図４（ａ）、（ｂ）にその平面図と断面図とをそれぞれ示すように、円形状に形成された石英製の結晶板８の表面側と裏面側とにそれぞれ第一の金電極９ａと第二の金電極１０ａと備えている。尚、図示される金電極９ａ、１０ａは、円形状に構成され、それぞれにリード線９ｂ、１０ｂが連接されている。裏面側の第二の金電極１０ａは、図４（ｂ）に示すように樹脂カバー１１により被覆されており、水晶振動子７を溶液中に入れた状態でも、裏面側の第二の金電極１０ａが溶液に曝されず、発振できるように構成されている。他方、表面側の第一の金電極９ａ表面には、特定の成分と反応し、その成分を吸着するように構成された反応材１２が配置されており、測定時に試料溶液と接触することになる。
【００１３】
また、ネットワークアナライザ３は、図５に示すように、信号供給回路１３と測定回路１４とを有している。
信号供給回路１３は、周波数を変化させながら交流の入力信号を出力することができるように構成されている。
測定回路１４は、水晶振動子７の出力信号や、信号供給回路１３から出力される入力信号に基づいて、水晶振動子７の共振周波数や位相等の電気的特性を測定して、コンピュータ４に出力することができるように構成されている。
【００１４】
コンピュータ４は、測定された水晶振動子７の周波数特性等の電気的特性に基づいて、試料溶液中の成分の反応速度などを求め、成分の分析をすることができるように構成されている。
【００１５】
上述した構成のバイオセンサー装置１により、例えば、血液等試料溶液中の特定成分と、水晶振動子７の表面に配置された反応材１２との反応状態を分析する手順について以下に説明する。
【００１６】
まず、図６に示すように、水晶振動子７を底部に備えた円筒形状のセル１５内に試料溶液８を注入し、水晶振動子７が試料溶液８中に浸漬された状態で、ネットワークアナライザ３を起動し、コンピュータ４から制御信号を出力する。出力された制御信号に基づいて、信号供給回路１３から出力された入力信号が、ケーブル５を介してセンサー部２に出力される。
【００１７】
水晶振動子７に信号供給回路１３から入力信号が供給されると、入力信号が供給された水晶振動子７は、入力信号に応じて出力信号を出力する。出力信号は、図５に示すように、ケーブル５を介してネットワークアナライザ３に出力され、ネットワークアナライザ３内の測定回路１４に入力される。そして、測定回路１４は、入力信号が供給された水晶振動子７の出力信号の信号強度（ここでは、発振周波数の振幅に相当する）を検出する。
【００１８】
前記信号供給回路１３は、入力信号の周波数を所定の周波数範囲内で変化させ、測定回路１４は、入力信号の周波数が変化するごとに、出力信号の信号強度を検出する。その結果、入力信号の周波数と、出力信号の信号強度との関係を求める。
このようにして、測定回路１４は、水晶振動子７の共振周波数を測定し、求められた水晶振動子７の共振周波数は、ケーブル６を介してコンピュータ４に出力される。そして、所定時間が経過後に、コンピュータ４は、信号の供給を停止する。
【００１９】
本実施の形態では、以上の測定をまず、水晶振動子７の基本波により行い、基本波による共振周波数を決定する。そして、測定された共振周波数に基づいて、Ｎ倍の共振周波数を使用して上記基本波による測定と同様の測定を行う。
そして、上記説明した方法により、測定対象となる物質の物性である、質量負荷、粘弾性負荷及び粘性負荷の少なくとも何れかを測定する。
また、本装置は、コンピュータ４のディスプレイに、前記各周波数間のＦ2の変化量（ΔＦ2）の差と、前記各周波数間のＦ1，Ｆ2の差の変化量（Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２）の差とをそれぞれグラフ表示する。
【実施例】
【００２０】
次に、本発明の一実施例について説明する。
バッファー液（生化学用緩衝液であり、主な含有物はＮａＣｌやＫＣｌ等である）で満たされたセル内に、共振周波数２７ＭＨｚの水晶振動子を浸漬し、そこへ、アビジン、３０merＢ-ＤＮＡ、３０merＣ-ＤＮＡを順に結合させた。
その際に、水晶振動子を基本波（２７ＭＨｚ）と３倍のオーバートーン（８１ＭＨｚ）で振動させた場合のコンダクタンスＧの半値Ｇ／２を与える周波数Ｆ1とＦ2を用いて、それぞれのΔＦ2の変化量とΔ（Ｆ1−Ｆ2）／２の変化量とを測定した(図７)。
Δ（Ｆ1−Ｆ2）／２の値が大きく変化する場合には、上記式（６）より、粘性変化及び粘弾性変化が大きく変化していることを示すことから、Ｂ-ＤＮＡを添加した場合には、粘性変化及び粘弾性変化が大きいことがわかる。
図８は、ΔＦ2の変化量とΔ（Ｆ1−Ｆ2）／２の変化量を、voightモデルに適用して上記式（５）及び式（６）に基づいて計算した結果であり、図９は、Maxwellモデルで計算した結果である。
この結果から、添加物の物性である粘性変化及び粘弾性変化を質量付加から分離して測定できることがわかる。また、水晶振動子の金電極表面にアビジンが結合する場合と、Ｂ-ＤＮＡにＣ-ＤＮＡが結合する場合とを比べると、質量負荷に比べて大きな粘弾性の変化はないが、アビジンにＢ-ＤＮＡが結合する場合には、粘弾性による周波数変化量の割合が他の結合に比べて大きい、即ち、大きな粘弾性変化が生じることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、ＤＮＡやタンパク質等の生体物質の相互作用や抗原抗体反応を利用した測定等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】共振周波数とコンダクタンスとの関係を示すグラフ
【図２】基本波とＮ倍波のコンダクタンスの関係を示すグラフ
【図３】本発明の一実施の形態であるバイオセンサー装置の説明図
【図４】同装置の水晶振動子の平面図（ａ）、同断面図（ｂ）
【図５】同装置構成の説明図
【図６】バイオセンサー装置のセルの説明図
【図７】本発明の一実施例の測定結果を示すグラフ
【図８】同実施例の他の測定結果を示すグラフ
【図９】同実施例の他の測定結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００２３】
１      バイオセンサー装置
２      センサー部
３      ネットワークアナライザ
４      コンピュータ
５      ケーブル
６      ケーブル
７      水晶振動子
８      円形状の結晶板
９ａ    第一の金電極
１０ａ  第二の金電極
１１    樹脂カバー
１２    反応材
１３    信号供給回路
１４    測定回路
１５    セル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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