(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成糖がグルコースでα−１，４結合のみで構成され、重合度が３〜５の６位結合リン酸化糖の６位結合リン酸基を特異的に脱リン酸化するホスファターゼであって、アスペルギルス  ニガーＫＵ−８株（生工研寄託Ｐ−１６２４８）あるいはその培養物から得られ、以下の酵素化学的性質：
（１）作用至適ｐＨ：ｐＨ１．５〜３．０；
（２）ｐＨ安定性；ｐＨ２〜１０の範囲で安定；
（３）作用至適温度；６０℃；
（４）温度安定性：５０℃まで安定；および
（５）分子量：モノマーとして約６６，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
を有する、ホスファターゼ。
【請求項２】
３位結合リン酸化糖アルコールの製造法であって、３位結合リン酸化糖および６位結合リン酸化糖を含有するリン酸化糖溶液に請求項１に記載のホスファターゼを添加して反応させて、該６位結合リン酸化糖の６位結合リン酸基を選択的に脱リン酸化すること、ならびに得られた３位結合リン酸化糖の還元末端を還元して３位結合リン酸化糖アルコールを得ることを特徴とする、製造法。
【請求項３】
３位結合リン酸化糖アルコールの製造法であって、３位結合リン酸化糖および６位結合リン酸化糖を含有するリン酸化糖溶液に請求項１に記載のホスファターゼと、糖化型α−アミラーゼ、ネオプルラナーゼおよびグルコアミラーゼからなる群より選択される酵素とを組み合わせて作用させて、該６位結合リン酸化糖の６位結合リン酸基を選択的に脱リン酸化すること、ならびに得られた３位結合リン酸化糖の還元末端を還元して３位結合リン酸化糖アルコールを得ることを特徴とする、製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（産業上の利用分野）
本発明は、グルカンとリン酸がエステル結合している糖類（本発明においてリン酸化糖と略す）のグルコース残基の６位と３位に結合しているリン酸基のうち、６位のリン酸基を特異的に脱リン酸化するホスファターゼＫＵ−８（以下本酵素と呼ぶ）、および本酵素を用いる、リン酸が結合している部位が構成グルコース分子の３位ばかりの少糖および多糖（以下、３位リン酸化糖と称する）の製法ならびにその３位リン酸化糖に関する。また、本発明はリン酸化糖のグルコース残基の６位と３位の結合リン酸基のうち、３位の結合リン酸基のみ脱リン酸化する処理、本処理を用いるリン酸が結合している部位が構成グルコース分子の６位ばかりの少糖および多糖（以下、６位リン酸化糖と称する）の製法ならびにその６位リン酸化糖に関する。さらに、本発明は３位あるいは６位リン酸化糖の還元末端が還元され糖アルコールとなったリン酸化糖アルコール（以下、３位あるいは６位リン酸化糖アルコールと称する）、３位あるいは６位リン酸化糖とタンパク質またはペプチドとの複合体であるリン酸化糖誘導体、もしくは３位あるいは６位リン酸化糖あるいはリン酸化糖誘導体とアルカリ土類金属あるいは鉄との結合体であるリン酸化糖誘導体に関する。
【０００２】
これらの３位あるいは６位リン酸化糖あるいはリン酸化糖誘導体は、カルシウムなどのアルカリ土類金属または、鉄の沈殿阻害効果（以下、可溶化という）、あるいはカルシウムなどの吸収促進作用を有している。さらに、３位あるいは６位リン酸化糖は難消化性であり、低カロリーであると同時に整腸作用も期待できる。従って、本発明は、食品、飲料、飼料、あるいは肥料に含まれるまたは含有させたカルシウムなどのアルカリ土類金属、または、鉄の生体への吸収を促進させることによって、あるいは、難消化性糖を摂取することによって、ヒトや動物の健康を増進して各種の疾患を予防する原料、飲食用組成物、食品添加用組成物、医薬品用組成物あるいは飼料の原料または組成物として有用である。
【０００３】
また、本発明品は食品のもつ甘みをさわやかな甘みに変えたり、塩味を増強したりする味質改善効果もあり、本効果を期待して食品へも有効に添加し得る。本発明はまた、植物へのカルシウムの吸収を促進して、植物あるいは果樹の日持ちを向上させる肥料の原料や組成物に関する。さらに、本発明品は、虫歯の予防効果を有しており、詳細には食品、飲料、飼料はもとより、練り歯磨き、マウスウオッシュ、トローチなどの口腔用組成物にも添加され得る。本発明は、種々のスケール、特にカルシウム系およびマグネシウム系スケールの発生を防止または抑制し得るスケール防止剤として使用され得る。また、この金属キレート作用およびｐＨ緩衝作用、保湿作用を有しており、シャンプー、リンス等の洗髪用組成物はもとより化粧品、整髪用組成物としても有用である。
【０００４】
尚、リン酸化糖を用いた製品において、その製造過程あるいは保存過程においてアミノカルボニル反応による褐変現象が生じることが好ましくない場合には、還元末端を還元したリン酸化糖アルコールを用いるとこれを避けることができる。
【背景技術】
【０００５】
（従来の技術）
植物が貯蔵する澱粉の多くには、澱粉を構成するグルコースに一部リン酸がエステル結合している。澱粉中のリン酸含有量としては微量であるがゼロではなく、とりわけ芋類の澱粉には比較的多く、中でも馬鈴薯澱粉はリン酸基を多く含んでおり、リン酸含有量の非常に高い品種も存在している（非特許文献１）。馬鈴薯澱粉中ではこれを構成するグルコース残基にリン酸基が比較的多くエステル結合していることが知られており、その９９％以上が６位あるいは３位に結合していることが知られている。（非特許文献２）。このような澱粉をアミラーゼなどの澱粉分解酵素を用いて分解する場合、澱粉構造中のリン酸基がエステル結合したグルコース残基の近傍には酵素は作用できず、この部分はリン酸化された少糖の形で未分解のまま残ることが知られている。釜阪らのリン酸化糖に関する技術（特許文献１）はこのような特性を生かし、糖質分解酵素を巧みに利用し効率的な製造法を確立したものであり、以下に要約したように食品およびその周辺用途への新しい利用技術を確立したものであった。
【０００６】
食品から摂取すべき栄養素の中で、ミネラルは、生体の機能を維持するために欠くことができない。しかし、このミネラルは現在の食生活においては不足しがちで、このため健康上への影響が問題となっている。例えば、１日のカルシウムの平均摂取量は栄養所要量の６００ｍｇに達していない（厚生省、平成９年度国民栄養調査）。カルシウムは容易に無機リン酸と結合し不溶性の沈殿を形成しやすく、特にカルシウムの吸収部位である腸管内は微アルカリ性になっており、このカルシウムの不溶化が促進されるために吸収されにくいわけである。さらにカルシウムは骨や歯などに多く存在し、生体での需要が高いことも事実であり、カルシウムの不足は骨粗鬆症等の各種疾患の発症につながることもわかっている（非特許文献３）。また、同様に鉄やマグネシウムについてもその吸収率の悪さが知られており、カルシウムと同様に、摂取不足は各種疾患に関わっている（非特許文献４）。特に成長期の子供や妊婦において、摂取量の不足は問題である。さらに、今日、ダイエットや偏食の問題も大きく、嗜好食品においてもカルシウムと同様に鉄やマグネシウムの有効な生体への吸収を考慮した食品が期待され、これらのバランスのよい摂取方法の開発は重要な課題である。
【０００７】
畜産業界では生産性の向上のためから、ブロイラー、豚などは、急激な成長が求められるため、骨の発育が追いつかずに脚弱、奇形などの問題が起こっている。カルシウムは特に、骨、卵殻質改善、牛乳のカルシウム強化、鰻の骨曲がり防止などの目的で補給されているが、カルシウムの利用率が悪いことが大きな問題となっている。また、真珠等の養殖においてもカルシウムの十分な補給が商品の品質を左右することが知られている。植物にとってもカルシウムは重要な要素であり、ＥＤＴＡ−カルシウムなどのキレートカルシウムの投与によって、細胞壁の強化あるいはエチレンガスの発生抑制等の作用による老化抑制効果および日持ち性の向上が知られている（非特許文献５）。
【０００８】
カルシウムが腸管内において不溶化しないようにすことにより、腸管から効率よく吸収させることを目的として、カルシウムと化合物を形成する能力のある物質が開発され利用されている。例えば、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）を飲料または、食品に添加する技術（特許文献２、特許文献３）、クエン酸カルシウム・リンゴ酸カルシウム複合体のカルシウム可溶化効果（特許文献４）ペクチン酸カルシウムの骨強度増強作用（特許文献５）等が知られている。これらの化合物は、一部食品にもすでに利用されている。しかし、用途によっては使用に制限があり、必ずしも満足のゆくものではない。例えば、カゼインホスホペプチドは比較的よく食品に利用されているが、乳タンパク質の酵素処理によって製造されているために大変高価であるとともに、精製度の低いものは苦みを呈しており利用が制限される問題がある。また、クエン酸カルシウム・リンゴ酸カルシウム複合体についても酸味を呈しており利用には制限が生じている。
【０００９】
このような背景から、釜阪らは馬鈴薯澱粉よりリン酸化糖を調製し、食品への利用を行っている（特許文献１）。このリン酸化糖は、安価であり、無味無臭であるためにその利用範囲の広さが期待されている。また、虫歯予防効果、難消化性糖としての作用も期待されており用途の広さも注目されている。
【００１０】
しかし、この画期的な素材も、３位あるいは６位リン酸化糖が混在しており、３位リン酸化糖あるいは６位リン酸化糖のみをとりだすことはできなかった。３位リン酸化糖および６位リン酸化糖はその結合安定性等の相違から、違う挙動を示すことが予想されるためそれらを分離することが望まれている。これは３位結合リン酸と６位結合リン酸の性質の差を研究するための基質を得て研究を発展させるうえでも望まれる。また、それぞれの結合型リン含量の簡便な定量方法も、開発利用に当たって望まれている。
【００１１】
一方、リン酸エステルの脱リン酸化を行うホスファターゼに関する研究自体は古くから行われている。例えば、Ｓｈｉｍａｄａらの報告（非特許文献６）やＺｙｌａらの報告（非特許文献７）やＺｙｌａの報告（非特許文献８）にアスペルギルス  ニガー由来の酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）に関する内容が記載されている。また、例えばＦａｕｌｋｅｒの報告（非特許文献９）にはグルコース−１−リン酸に特異的なグルコース−１−ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．１０）が報告されており、水島の報告（非特許文献１０）にはグルコース−６−リン酸に作用するグルコース−６−ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．９）が報告されている。
【００１２】
このように、単糖のリン酸化物のリン酸基の結合位置によって作用の異なるホスファターゼについては報告がされている。しかし、単糖以外のリン酸化糖におけるリン酸基の結合位置の違いを認識するホスファターゼについては過去全く報告はない。さらに単糖、少糖、多糖を問わず、３位結合リン酸と６位結合リン酸の結合のうちの一方のみを選択的に脱リン酸化するホスファターゼは知られていない。また、いくつかの市販されているホスファターゼ（小麦胚、牛乳、牛前立腺および大腸菌由来）においてもリン酸化糖におけるリン酸基の結合位置の違いを認識して選択的に脱リン酸化するものは見いだされていない。
【００１３】
ところで、馬鈴薯澱粉中のエステル結合リン酸基の約６０〜７０％はグルコース残基の６位に、３０〜４０％は３位に、それぞれ結合しているといわれている（非特許文献１１）。だが３位のみあるいは６位のみのリン酸化されたリン酸化糖を分取したという報告はこれまでなされていない。
【００１４】
現在にいたるまで、このようなリン酸化少糖あるいはリン酸化多糖の中から３位あるいは６位リン酸化糖のみを分画する方法は報告されていない。ただし、リン酸化少糖については本発明者が、リン酸化少糖溶液を適当な液体クロマトグラフィー、例えばＨｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＡＥＣ、ダイオネックス  ＤＸ−３００、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１００カラム、ダイオネックス社製）やＨＰＬＣ（ダイソーパックＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰカラム）などを用いてごく少量ずつ多大な時間と労力をかけて分画する方法をこのたび開発した。しかし、この方法では、大量調製は現実的には極めて困難である。
【００１５】
グルコース残基の１位リン酸結合と６位リン酸結合の性質については多少たりとも研究されているが、３位リン酸結合の性質については研究が進んでいない。これはひとえに、単糖のリン酸化物のグルコース−１−リン酸およびグルコース−６−リン酸は試薬としても発売されているが、３位にリン酸が結合した糖は単糖、少糖を問わずその標品を得ることができなかったためと考えられる。その意味でも、３位のみリン酸化された糖の標品が効率よく得られることが待たれていた。また、６位リン酸結合の糖質として、グルコース−６−リン酸について、従来より研究がなされてきたが、６位のみリン酸化されたリン酸化少糖類、リン酸化多糖類についての報告はない。
【００１６】
さらには前述の通り、３位あるいは６位結合型糖質の分離は困難であり、それぞれの分別定量分析法も望まれていた。
【００１７】
また、虫歯と俗称される齲蝕は歯周病とともにヒトが歯を失う二大原因の一つであり、その発症に様々な因子が複雑に関わりあう多因子制の疾患である。しかし、完全なる予防方法が未だに存在しない疾患の一つでもある（非特許文献１２）。また、虫歯になり難い糖類も多く開発されてきており、食品に応用されている。例えば、糖アルコール、カップリングシュガー、パラチノース等である（非特許文献１３）。これらは、虫歯の原因菌に資化されず酸を生成しないことを特徴としている。しかし実際の甘味食品では味質のよさで砂糖などに及ばないため単独で使われることは少なく、結局砂糖やグルコースと併用されるため、酸が生成し、齲蝕を回避できなかった。
【特許文献１】特開平８−１０４６９６号公報
【特許文献２】特開平３−２４０４７０号公報
【特許文献３】特開平５−２８４９３９号公報
【特許文献４】特開昭５６−９７２４８号公報
【特許文献５】特開平６−７１１６号公報
【非特許文献１】矢木敏博ら、澱粉科学、２０巻、５１頁、１９７３年
【非特許文献２】Ｔａｋｅｄａ  ＆  Ｈｉｚｕｋｕｒｉ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０２巻  ３２１−３２７頁、１９８２年
【非特許文献３】江澤郁子、日本栄養食糧学会誌、４９巻、２４７〜２５７頁、１９９６年
【非特許文献４】Ｒ．Ｄ．Ｂａｙｎｅｓ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｕｔｒ．、１０巻、１３３−１３８頁、１９９０年
【非特許文献５】田中ら、Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．、６１巻、１８３−１９０頁、１９９２年
【非特許文献６】Ｓｈｉｍａｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  ４８０巻  ４１７−４２７頁、１９７７年
【非特許文献７】Ｚｙｌａら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．４９巻  ３１５頁、１９８９年
【非特許文献８】Ｚｙｌａ、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９巻  １１７−１１９頁、１９９３年
【非特許文献９】Ｆａｕｌｋｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ６０巻  ５９０−５９６頁、１９９５年
【非特許文献１０】水島、蛋白  核酸  酵素  ２２巻  １５２４−１５２９頁、１９７７年
【非特許文献１１】Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ、２２巻  ３３８−３４３頁、１９７０年
【非特許文献１２】西沢俊樹、ＦｏｏｄＳｔｙｌｅ２１、１巻、５０−５５頁、１９９７年
【非特許文献１３】岡田茂孝、歯界展望、９０巻、８８９−８９１頁、１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、リン酸化糖のリン酸基の結合位置を認識してグルコース残基の６位に結合したリン酸基を脱リン酸化し、３位に結合したリン酸基に作用しない新規なホスファターゼを提供し、さらにリン酸化糖から本酵素を用いることによって効率よく容易に３位リン酸化糖を得る方法を提供すること、またリン酸化糖に希酸溶液を用いた加熱処理を行って効率よく容易に６位リン酸化糖を得る方法を提供することを目的とする。
【００１９】
なお、本特許にいうリン酸化少糖とは、各種澱粉に対して澱粉分解酵素である液化型α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）等のアミラーゼを１種、あるいは２種以上作用させたのちに得られるα−１，４−グルカンのうち、α−１，４結合した２〜１０個のグルコースからなり、さらに該グルカンの１つ以上のグルコース残基の６位または３位にリン酸基が少なくとも１個エステル結合している少糖のことをいう。これらのアミラーゼをさらに高濃度、長時間作用させ、分取すれば、最終的に２から５個のグルコースがα−１，４結合し、ひとつ以上のリン酸基が結合した少糖を得ることができる。
【００２０】
また、先のリン酸化糖に糖転移酵素であるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．１９）を作用させることで、７から１２個のグルコースがα−１，４結合し、二つ以上のリン酸基が結合した少糖および多糖を得ることができる。
【００２１】
本特許にいうリン酸化多糖とは、各種澱粉およびその分解物をはじめとした、１１個以上のグルコースがα−１，４結合あるいはα−１，６結合した多糖類で１個以上のリン酸基がグルコース残基の３位または６位にエステル結合したものをいう。
【００２２】
そして、熱に不安定な３位リン酸化糖を除き、６位リン酸化糖単品を提供することで、食品、飲料、飼料製造工程中あるいは薬品、化粧品、口腔用組成物等の製造工程中における結合リンの安定性を向上させ、遊離無機リン酸の含量を低減させた製品の提供を目的とする。また、その逆に、糖質とリン酸の結合様式の研究用試薬などの用途に使用可能な３位リン酸化糖のみの提供も目的とする。さらに、３位あるいは６位のみのリン酸化糖の製造技術を用いて、それぞれの含量を簡便に定量分析することも目的とする。ことに、通常緩衝液としてもっともよく用いられるリン酸緩衝液中ではリン酸イオンが存在することにより、リン酸化糖からリン酸基を遊離させ生成した無機リン酸を定量するという手法はとれないが、本願においてはこの課題を克服し、リン酸化糖中のリン酸含量を測定することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
リン酸結合部位が３位と６位のものが混在しているリン酸化少糖またはリン酸化多糖に、リン酸化糖のリン酸基の結合位置を認識してグルコース残基の６位に結合したリン酸基のみ脱リン酸化する新規なホスファターゼを作用させる。あるいは、上記リン酸化少糖またはリン酸化多糖を希酸、好ましくは酢酸溶液中で加熱処理する。前者の処理によって、リン酸化少糖またはリン酸化多糖の６位に結合したリン酸基のみ切断される。後者の処理によっては３位に結合したリン酸基のみ切断される。これにより得られた３位、あるいは６位リン酸化糖を精製する手段は、デキストリンの分子量により膜透析、あるいは各種のイオン交換クロマトグラフィー（たとえば富士紡績株式会社製のキトパールによる陰イオン交換クロマトグラフィー）、電気透析装置（たとえば旭化成製のマイクロアシライザー）等を用いれば比較的容易であり、大量生産も可能である。
【００２４】
３位リン酸化糖製造に使用する菌株はアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が好適である。
【００２５】
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）α−１，４結合のみで構成され、重合度が２から１０、望ましくは３から５で１個以上のグルコース残基の３位にリン酸基が結合しているリン酸化糖。
（項目２）リン酸基が非還元末端側から２個目のグルコース残基の３位に結合した、重合度が３ないし５である項目１のリン酸化糖。
（項目３）構成糖がグルコースでα−１，４結合およびα−１，６結合のみで構成され、重合度が２以上の少糖あるいは多糖で１個以上のグルコース残基の６位にリン酸基が結合しているリン酸化糖。
（項目４）重合度が２から１０、望ましくは２から５である項目３のリン酸化糖。
（項目５）項目１から４に記載のいずれかのリン酸化糖の還元末端が還元され糖アルコールとなっていることを特徴とするリン酸化糖アルコール。
（項目６）項目１から４に記載のいずれかのリン酸化糖とタンパク質あるいはペプチドとが結合していることを特徴とする、リン酸化糖誘導体。
（項目７）項目１から４に記載のいずれかのリン酸化糖または項目５に記載のリン酸化糖アルコールあるいは項目６に記載のリン酸化糖誘導体がアルカリ土類金属または鉄と結合していることを特徴とする、リン酸化糖誘導体。
（項目８）構成糖がグルコースでα−１，４結合のみで構成され、重合度が２から１０の糖でグルコース残基の６位と３位にリン酸基を有するリン酸化糖に対し、６位の結合リン酸基に選択的に作用するホスファターゼ。
（項目９）アスペルギルス  ニガーあるいはその培養物から得られる、項目８に記載のホスファターゼ。
（項目１０）アスペルギルス  ニガーＫＵ−８株（生工研寄託Ｐ−１６２４８）あるいはその培養物から得られる、項目８記載のホスファターゼＫＵ−８。
（項目１１）ホスファターゼを用いることを特徴とする項目１または２のいずれかのリン酸化糖の製造法。
（項目１２）構成糖がグルコースでα−１，４結合のみで構成され、重合度が２以上の少糖に項目８記載のホスファターゼのみ、あるいは糖化型α−アミラーゼあるいはネオプルラナーゼ、グルコアミラーゼを組み合わせて作用させることによって得られることを特徴とする、項目１、２のいずれかに記載のリン酸化糖の製造法。
（項目１３）０．７規定以下の酢酸あるいは０．５Ｍ濃度以下の乳酸あるいはクエン酸を作用させ加熱することによって得られることを特徴とする、項目３あるいは４のいずれかに記載のリン酸化糖の製造法。
（項目１４）０．７規定以下の酢酸あるいは０．５Ｍ濃度以下の乳酸あるいはクエン酸を作用させ、加熱すること、あるいはこれに糖化型α−アミラーゼあるいはネオプルラナーゼまたはグルコアミラーゼを組み合わせて作用させることを特徴とする、項目４に記載のリン酸化糖の製造法。
（項目１５）項目１１から１４に記載のいずれかのリン酸化糖の製造法に還元末端の還元工程を併用することを特徴とするリン酸化糖アルコールの製造法。
（項目１６）項目１から４のいずれかに記載のリン酸化糖に糖転移酵素を作用させることを特徴とする、リン酸化糖の製造法。
（項目１７）前記糖転移酵素がシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである、項目１６に記載のリン酸化糖の製造法。
（項目１８）項目１から４のいずれかに記載のリン酸化糖、または項目５に記載のリン酸化糖アルコール、あるいは項目６あるいは７に記載のリン酸化糖誘導体を含有することを特徴とする食品、飲料、味質改善剤、飼料、口腔衛生用組成物、洗浄用組成物、化粧品、整髪料、育毛剤および洗髪用組成物。
（項目１９）項目１１から１４に記載のいずれかのリン酸化糖の製造法を単独で、あるいは２つ以上組み合せて用いることを特徴とする、リン酸化糖の結合リン酸含量の定量法。
（項目２０）項目１１から１４に記載のいずれか１種、または２つ以上を組み合わせたリン酸化糖の製造法とアルカリホスファターゼ処理あるいは灰化分析法をそれぞれ組み合わせることを特徴とする、リン酸化糖の結合リン酸含量の定量法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
１．３位リン酸化糖製造に用いる酵素の製造
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＵ−８を培地に培養する。培地の栄養源は、本菌株が良好に生育して目的の酵素を順調に生産するならば特に限定するものではない。炭素源としてはグルコース、シュークロース、マルトース、コーンスターチ、デキストリンなどを挙げることができ、また、窒素源としてはポリペプトン、カゼイン、酵母エキスなどを挙げることができる。また、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオンなどの無機塩類や各種ビタミン類を使用することが出来る。
【００２７】
培養は振とう培養もしくは通気撹袢培養などの好気条件下で、培地をｐＨ３〜８の範囲、好ましくはｐＨ４〜７の範囲に調整し、培養温度は１０℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃程度で１〜１０日間、好ましくは２〜７日間程度培養する。培養後、本酵素は培養物から採取される。
【００２８】
このようにして得られた培養物から菌体を回収し、破砕後、水や緩衝液などを用いて抽出を行い、固形分を除去して培養抽出液を得る。このようにして得られた培養抽出液からホスファターゼを精製し、本発明のホスファターゼを得る。培養抽出液からホスファターゼを精製するためには、例えば硫安塩析処理、フェニルセファロースカラム（ファルマシア社製）による疎水クロマトグラフィー処理、Ｑ−セファロースあるいはソース−Ｑカラム（ともにファルマシア社製）によるイオン交換クロマトグラフィー処理、スーパーデックス  Ｇ−２００カラム（ファルマシア社製）によるゲルろ過クロマトグラフィー処理、ＴＳＫゲル  スーパーＱ−５ＰＷカラム（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー処理などのいずれかを必要に応じて組み合わせた処理を行い、必要に応じて凍結乾燥処理を行い、高純度に精製したホスファターゼを得る。
【００２９】
２．ホスファターゼＫＵ−８の作用
種々のリン酸エステルやピロリン酸およびポリリン酸を加水分解することにより脱リン酸化する。３位リン酸化糖と６位リン酸化糖が混在していれば６位リン酸化糖の６位結合リン酸基を特異的に脱リン酸化する。リン酸化少糖のみならず、グルコースの結合が一部α−１，６結合であるリン酸化多糖に対しても、６位結合リン酸基を特異的に脱リン酸化する性質を有すると見られる。
【００３０】
３．ホスファターゼＫＵ−８の酵素化学的諸性質
（１）作用至適ｐＨ
本酵素の作用至適ｐＨは図１に示すようにｐＨ１．５〜３．０である。
（２）ｐＨ安定性
本酵素を各ｐＨで３７℃、１時間処理したのちにおいても図２に示すようにｐＨ２〜１０の範囲で安定であった。
（３）作用至適温度
本酵素の作用至適温度は図３に示すように６０℃である。
（４）温度安定性
図４に示す各温度での３０分間処理後の残存活性より５０℃まで安定であるといえる。
（５）分子量
モノマーとして約６６，０００ダルトンである（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）。ゲルろ過法による分子量は約２６０，０００ダルトンのテトラマーである。
（６）酵素活性測定法
【００３１】
ホスファターゼ活性は次のようにして測定される。
【００３２】
それぞれ３７℃に保った酵素液１２５μｌ、２００ｍＭのグリシン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）２５０μｌおよび２０ｍＭのグルコース−６−リン酸溶液（２００ｍＭのグリシン−塩酸緩衝溶液でｐＨ２．０に調整する）１２５μｌを混合し、３７℃で１５分間反応させる。この反応液に１０規定の過塩素酸５０μｌ、１０規定の過塩素酸を４％含有する２０ｍＭのバナジン酸アンモニウム溶液１５０μｌ、３．５３％のモリブデン酸アンモニウム溶液３００μｌを添加して撹拌し室温で３０分間放置する。この溶液の４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、活性を求めた。標準物質としてリン酸一カリウムを用いた。
【００３３】
ホスファターゼ活性の１単位は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのリンを遊離させる酵素量とする。
【００３４】
４．３位リン酸化糖の製造方法（１）
膨潤させた馬鈴薯澱粉にα−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）を十分に作用させた後、生じた中性糖を除去して調整したリン酸化糖溶液（以下、馬鈴薯リン酸化糖溶液と称す）に、本酵素を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によってリン酸化糖の６位結合リン酸基は脱リン酸化される。デキストリンの分子量により膜透析、あるいは電気透析で３位リン酸化糖を精製することができる。なお、これら３位リン酸化糖を製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００３５】
５．３位リン酸化糖の製造方法（２）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、本酵素を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によってリン酸化糖の６位結合リン酸基は脱リン酸化される。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースといった中性オリゴ糖のほかに非還元末端より２個めのグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトテトラオース、リン酸化マルトペンタオースといった３位リン酸化糖が生成する。この生成した中性オリゴ糖と３位リン酸化糖を、各種のイオン交換クロマトグラフィー、例えばキトパール（富士紡績株式会社製）などの陰イオン交換樹脂を用いて、あるいは電気透析により分画することにより、上記３位リン酸化糖を製造することができる。なお、これら３位リン酸化糖を製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００３６】
６．３位リン酸化糖の製造方法（３）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、本酵素および糖化型α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によって、グルコースとマルトースを主体とする中性糖と、マルトトリオースの中央のグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースとが生成される。この生成した中性糖とリン酸化マルトトリオースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することにより中央のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースを製造することができる。なお本酵素と糖化型α−アミラーゼを作用させる順序は問わない。また、上記のリン酸化マルトテトラオースを製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００３７】
７．３位リン酸化糖の製造方法（４）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、本酵素とネオプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３５）を適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によって、グルコースとマルトースを主体とする中性糖と、マルトテトラオースの非還元末端側から２個目のグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトテトラオースとが生成する。この生成した中性糖とリン酸化マルトテトラオースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することにより上記のリン酸化マルトテトラオースを製造することができる。なお本酵素とネオプルラナーゼを作用させる順序は問わない。また、リン酸化マルトテトラオースを製造するために用いる本酵素は必ずしも単一に精製したものである必要はなく、培養抽出液を粗酵素液として用いることも可能である。
【００３８】
８．６位リン酸化糖の製造方法（１）
市販デキストリン溶液に、弱酸の溶液、望ましくは希酢酸を添加して加熱処理する。希酸の種類は酢酸には限らず、乳酸、クエン酸も好適に用いられる。ただ酸の作用が強すぎるとグルコース同士の結合も切断されてしまうので、リン酸化糖の３位結合リン酸、６位結合リン酸、グルコースのα−１，４結合およびα−１，６結合のうち、３位結合リン酸のみを切断するような弱酸の種類と濃度と反応温度と反応時間を設定するべきである。例えば０．０５−０．７規定の酢酸で３０分以上煮沸もしくは８０−１００℃で加熱することによって６位リン酸化多糖を製造することができる。乳酸、クエン酸を用いる時も、０．０５Ｍから０．５Ｍ程度の濃度で同じく加熱処理することで、６位リン酸化多糖を製造することができる。デキストリンの分子量により膜透析、あるいは電気透析で６位リン酸化糖を精製することができる。
【００３９】
９．６位リン酸化糖の製造方法（２）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、弱酸の溶液、好ましくは希酢酸を添加して加熱処理する。希酸の種類は酢酸には限らず、乳酸、クエン酸も好適に用いられる。ただ酸の作用が強すぎるとグルコース同士の結合も切断されてしまうので、リン酸化糖の３位結合リン酸、６位結合リン酸、グルコースのα−１，４結合およびα−１，６結合のうち、３位結合リン酸のみを切断するような弱酸の種類と濃度と反応温度と反応時間を設定するべきである。例えば０．１−０．７規定の酢酸で３０分以上煮沸もしくは８０−１００℃で加熱することによってリン酸化糖の３位結合リン酸基は脱リン酸化される。乳酸、クエン酸を用いる時も、０．０５Ｍから０．５Ｍ程度の濃度で同じく加熱処理することで、６位リン酸化糖を製造することができる。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースといった中性オリゴ糖のほかにグルコース残基の６位にリン酸基が結合したリン酸化マルトトリオース、リン酸化マルトテトラオース、リン酸化マルトペンタオースといった６位リン酸化糖が生成する。この生成した中性オリゴ糖と６位リン酸化糖を、各種のイオン交換クロマトグラフィー、例えばキトパール（富士紡績株式会社製）などの陰イオン交換樹脂を用いて、あるいは電気透析により分画することにより、上記６位リン酸化糖を製造することができる。またグルコアミラーゼを併用することで、中性糖は全てグルコースに変化し、エタノール沈殿法や活性炭カラム等の簡便な方法でも６位リン酸化糖のみを容易に得ることができる。
【００４０】
１０．６位リン酸化糖の製造方法（３）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、希酸加熱処理を行う前後に糖化型α−アミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼを適当量添加して３７℃で反応させる。この反応によって、グルコースを主体とする中性糖のほかに前者では、マルトトリオースまたはマルトテトラオースのひとつのグルコース残基の６位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトテトラオースが、後者ではリン酸化マルトトリオースのみが生成する。この生成した中性糖とリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトテトラオースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することによりグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトテトラオースを製造することができる。なお酸加熱処理と糖化型α−アミラーゼ処理あるいはネオプルラナーゼ処理の順序は問わない。しかし、糖化型α−アミラーゼあるいはネオプルラナーゼを作用させる際には、ｐＨ等を本酵素の好適な条件に設定することが望ましい。
【００４１】
１１．６位リン酸化糖の製造方法（４）
馬鈴薯リン酸化糖溶液に、希酸加熱処理を行う前後に糖化型α−アミラーゼとグルコアミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼとグルコアミラーゼを適当量添加して３７℃で十分に反応させる。この反応によって、グルコースとマルトースを主体とする中性糖のほかに、前者ではマルトトリオースあるいはマルトースのひとつのグルコース残基の６位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトースが生成する。後者ではリン酸化マルトースのみが生成する。この生成した中性糖とリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトースを、各種のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは電気透析を用いて分画することによりグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースおよびリン酸化マルトースを製造することができる。なお酸加熱処理と糖化型α−アミラーゼとグルコアミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼとグルコアミラーゼを作用させる順序は問わない。しかし、糖化型α−アミラーゼとグルコアミラーゼ、あるいはネオプルラナーゼとグルコアミラーゼを作用させる際には、本酵素の好適な条件に設定することが望ましい。
【００４２】
以上のようにリン酸化糖は馬鈴薯澱粉より調製できるが、特に原料澱粉を限定するものではない。馬鈴薯澱粉以外にも、キャッサバ澱粉、米澱粉、食用カンナ澱粉等の植物由来の結合リン含有澱粉が好適に用いられるし、化学的にリン酸化した澱粉も好適に用いることが可能である。
【００４３】
本発明のリン酸化糖からは、リン酸化糖の誘導体のひとつである、タンパク質あるいはペプチドとの複合体を製造することができる。糖質のタンパク質とのメイラード反応を利用した複合体の作成は古くから行われてきた。このメイラード反応は、通常の食品調理中にも起こる反応であり、反応産物は生体への安全性がきわめて高い。その反応は、糖質の還元末端がタンパク質のアミノ基に脱水縮合することによって起こる。多糖の場合はタンパク質１分子に糖１から２分子が結合し、単糖の場合はほとんどのタンパク質のアミノ基に糖が結合することが可能である（加藤ら、Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ編集、１６章、２１３−２２９頁、１９９１年）。また、その機能として、タンパク質の熱安定性およびｐＨ安定性の向上、乳化特性の付与、あるいは水に不溶性のタンパク質の可溶化などが報告されている（加藤ら、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、３９巻、１０５３−１０５６頁、１９９１年）。最近、グルコース−６−リン酸をタンパク質に結合させること（青木ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８巻、１７２７−１７２８頁、１９９４年）により、あるいは馬鈴薯澱粉由来リン酸化オリゴ糖を結合させることによりカルシウム可溶化効果が得られること（特開平８−１０４６９６）も判った。しかし、単糖は反応性が高く、タンパク質の変性も起こりやすい欠陥があり、リン酸化オリゴ糖も３位と６位リン酸化糖の混合物であり、各純品での報告は全く行われていない。オリゴ糖の場合反応が緩やかに進み、単糖に比べタンパク質への副反応が少なく、タンパク質に有機リガンドを結合させ得る方法として優れた方法である。用いるタンパク質としては特に問わないが、安価に入手でき、食品として安全なものが望ましい。このようなタンパク質としては、例えば、卵白アルブミン、小麦タンパク質、大豆タンパク質などが挙げられる。それらを加水分解したペプチドもまた好適に用いられる。
【００４４】
また、一般に糖アルコールは、原料糖をニッケルの触媒下、高温、高圧で水素添加する方法によって製造されている。実験室レベルでは、室温で１時間程度、水素化ホウ素ナトリウムと共存させることで、簡単に作成しうる。本発明のリン酸化糖も同様の常識的な処理によってリン酸化糖アルコールに変化させ得る。この反応によってリン酸エステル結合がはずれることはない。また、本発明のリン酸化糖の製造法と組み合わせることで、３位あるいは６位リン酸化糖アルコールを作成しうる。こうして得たリン酸化糖アルコールは、アミノカルボニル反応を起こさず、つまり、食品における褐変を引き起こし難いと考えられる。
【００４５】
本発明のリン酸化糖により、肥料、飼料、医薬品、または食品の摂取におけるカルシウムの吸収を促進し得る。またリン酸化糖がカルシウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属や鉄、亜鉛などの微量金属元素とも化合物または錯体を形成し、それらの生体への吸収を促進することが可能となる。従って、これらのミネラル不足に起因する骨粗鬆症循環器疾患（糸川嘉則・吉田政彦偏、Ｍｇと循環器疾患、メディカルトリビューン、１９８６年）などの各種疾患の予防も期待できる。さらに今日、ダイエットや偏食の問題が大きく、嗜好食品においてもカルシウムと同様に鉄およびマグネシウムの有効な生体への吸収を考慮した製品が期待される。本発明のリン酸化糖またはその誘導体は、安全であり、難消化性であり、低カロリーである。このリン酸化糖にはまた、多くのオリゴ糖に報告されているような保湿作用、ビフィズス菌増殖作用、整腸作用、脂質改善作用、血圧低下作用、および免疫賦活作用等も期待できる（日高ら、日本農芸化学雑誌、６１巻、９１５−９２３頁、１９８７年）（酒井重男、月刊フードケミカル、４巻、８１−８８頁、１９９５年）。さらに、鉄との錯体を形成し、この錯体には抗酸化作用も期待できる。この金属キレート作用による活性酸素の生成抑制効果は、生体においては、発ガンや老化といったものを抑制する効果があることも知られている（Ｅ．Ｇｒａｆら、Ｃａｎｃｅｒ、５６巻、７１７−７１８頁、１９８５年）（寺尾純二、栄養と健康のサイエンス、４巻、２１−２５頁、１９９６年）。また、従来、これらの目的で既に食品に用いられている糖質、フラボン類（ファイトケミカルズ分科会調査報告書、フード・フォーラム・つくば・ファイトケミカルズ分科会編、１９９８年）、ポリフェノール類（近藤、Ｌａｎｃｅｔ、３４４巻、１１５２頁、１９９４年）等との併用においても相乗効果が期待できる。
【００４６】
さらに、本発明のリン酸化糖は齲蝕の原因であるミュータンス菌（岡橋ら、微生物、４巻、２０９−２１７頁、１９８８）の栄養源にならず、酸や非水溶性のグルカンを生成しない糖質である。従って、歯垢が生じず、歯の脱灰も生じない。むしろ、カルシウムとの親和性の高さを考慮に入れると歯の再石灰化も期待される（松久保ら、口腔衛生学会雑誌、４６巻、４４２−４４３頁、１９９６年）。その上に、本リン酸化糖は緩衝作用を有し、ｐＨの低下を防ぐ効果がある。したがって、例え、砂糖やグルコースが共存しており、ミュータンス菌等の虫歯菌による酸発酵が生じてもｐＨの低下を防ぎ虫歯の発生を抑制する効果がある。この効果は、齲蝕になり難い糖質との併用や、齲蝕予防効果のあるフッ素（菅原ら、口腔衛生学会雑誌、４６巻、６３２−６３３頁、１９９６年）等との併用により相乗作用によって、さらに虫歯に有効であることが期待できる。このことにより、リン酸化糖はほとんどすべての飲食用組成物または食品添加物用組成物に使用することが可能である。この飲食用組成物とは、ヒトの食品、動物あるいは養魚貝用の飼料、ペットフードを総称する。すなわち、コーヒー、コーラ、紅茶、日本茶、烏龍茶、ジュース、加工乳、スポーツドリンク、栄養ドリンク、スープなどの液体および粉末の飲料類、パン、クッキー、クラッカー、ビスケット、ケーキ、ピザ、パイなどのベーカリー類、スパゲティー、マカロニなどのパスタ類、うどん、そば、ラーメンなどの麺類、ソース、醤油、ケチャップ、たれ、だしの素、シチューの素、カレーの素、麺類のつゆ、ドレッシング、マヨネーズ等の調味料類、ガム、キャラメル、キャンデー、チョコレート等の菓子類、おかき、ポテトチップス、スナック等のスナック菓子類、アイスクリーム、シャーベット等の冷菓、クリーム、チーズ、粉乳、練乳、乳飲料等の乳製品、ゼリー、プリン、ムース、ヨーグルト等の洋菓子類、饅頭、ういろう、もち、おはぎ、団子等の和菓子類、カレー、シチュー、ハヤシ、スープ、どんぶり等のレトルト食品もしくは缶詰め食品、ハム、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎり、等の冷凍食品および冷蔵食品、ちくわ、かまぼこ等の水産加工食品、弁当のご飯、寿司などの米飯類にも効果的に利用できる。さらに、乳児用ミルク、離乳食、ベビーフード、ペットフード、動物用飼料、スポーツ飲料、整腸剤、風邪薬、栄養補給食品や飲料等の医薬品、練り歯磨き、マウスウオッシュ、トローチ等の口腔用組成物にも好適に添加され得る。また、ｐＨ調整作用や金属を吸着する作用等は、先の用途以外に、シャンプー、リンス等の洗髪用組成物や整髪用組成物等の化粧品にも好適に利用することができる。
【００４７】
本発明のリン酸化糖は、カルシウム、鉄、マグネシウム等が含まれる飲み薬、入浴剤などの薬剤にも使用されうる。
【００４８】
また、本発明実施に用いる酸性ホスファターゼを用いることで、６位結合リンのみを遊離することから、６位結合リン酸含量を無機リン酸の定量方法あるいは中性糖をグルコアミラーゼを用いてグルコースにまで分解してグルコースの定量分析を行うことによって、例え３位結合リンが存在しても簡便に定量分析できる。無機リン酸あるいはグルコースの定量分析法は、特に限定するものではないが、前者はバナド−モリブデン酸法（板谷、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ、１４、３６１−３６６頁、１９６６年）等が好適に用いられるし、後者はグルコースオキシダーゼ法（生物化学実験法１、学会出版センター、１４３−１５０頁、１９９０年）等が好適に用いられる。同様に、本発明のリン酸化糖の酸処理を行えば、３位結合リンのみを遊離することから、３位結合含量を無機リン酸の定量方法を用いて、あるいは中性糖をグルコアミラーゼを用いてグルコースにまで分解してグルコースの定量分析を行うことによって、例え６位結合リンが存在しても簡便に定量分析できる。また、このように遊離する無機リン量をグルコース量として定量することによって、試料溶液中にあらかじめリン酸塩が存在していたとしても容易に遊離する無機リン量を定量しうる。もちろん、リンを遊離せずに残存するリン酸化糖を液体クロマトグラフィーを用いても分析できる。
【００４９】
具体的には、馬鈴薯リン酸化糖溶液に、さらに、糖化型α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ネオプルラナーゼを十分に作用させることで、マルトトリオースの中央のグルコース残基の３位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトトリオースとマルトースの非還元末端のグルコース残基の６位にリン酸基が１個結合したリン酸化マルトースの２種を含む溶液が得られる。この溶液を試料溶液Ａとする。試料溶液Ａに本発明の酸性ホスファターゼを適当量添加して３７℃で十分に反応させて得た溶液（試料溶液Ｂと称す）の遊離リン酸含量を定量することでグルコース残基の６位結合リン酸含量が測定できる。あるいは、試料溶液Ｂにグルコアミラーゼを十分に作用させると、脱リン酸化されたマルトースにはグルコアミラーゼは作用し得るためにグルコースが生じる。この生じたグルコース含量を定量すること（遊離リン含量は、生じたグルコース含量の１／２量）で、例え溶液中にリン酸塩が存在しても生成した遊離リン酸含量を測定できる。
【００５０】
また、試料溶液Ａに、終濃度０．３５Ｎになるように酢酸を添加し、１００℃で８時間処理した溶液（試料溶液Ｃと称す）の遊離リン酸含量を定量することでグルコース残基の３位結合リン酸含量が測定できる。あるいは、試料溶液Ｃにグルコアミラーゼを十分に作用させると、脱リン酸化されたマルトトライオースにはグルコアミラーゼは作用し得るためにグルコースが生じる。この生じたグルコース含量を定量すること（遊離リン含量は、生じたグルコース含量の１／３量）で、例え溶液中にリン酸塩が存在しても生成した遊離リン酸含量を測定できる。以上の操作によって、馬鈴薯澱粉中の３位および６位の結合リン酸含量の両方が測定し得る。さらに、試料溶液Ａを湿式あるいは乾式灰化すれば、全結合リン酸が遊離してくる。これによって、３位あるいは６位リン酸含量の一方を定量しておくだけでもう一方の含量は算出し得る。あるいは、試料溶液Ａをアルカリホスファターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来）を十分に作用させることでも全結合リン酸含量が定量し得る。
【００５１】
これらの定量分析法を適宜組み合わせることによって、各種起源の澱粉中の３位あるいは６位リン酸化糖の存在比率も簡単に算出できるようになった。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
０．１％ポリリン酸、０．５％グルコース、０．１％イーストエキス、０．５％ポリペプトン、０．１％塩化ナトリウム、０．１％塩化カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００２％硫酸第一鉄を含有する培地（ｐＨ６．５に調製する）５００ｍｌを、２０００ｍｌ容の坂口フラスコにいれ、ＫＵ−８菌株を接種し、３７℃で４日間振とう培養した。菌体をろ紙（アドバンテック  ＮＯ．２）ろ過によって回収・集菌し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５に調製、以下本実施例においてＡ緩衝液と称する）を約１０倍容加えて懸濁し、超音波による破砕を行って破砕液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間）にかけて培養抽出液を得た。この抽出液に対して８０％飽和になるように硫酸アンモニウム（硫安）を添加し、一晩冷蔵放置した。これを遠心分離（１８，０００ｒｐｍ、３０分間）にかけて得られた上清を、８０％飽和硫安を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５に調製、以下本実施例においてＢ緩衝液と称する）で平衡化したフェニルセファロースカラム（２６×１００ｍｍ、ファルマシア社製）による疎水クロマトグラフィーにかけて酵素を吸着させた。ついで１００％Ｂ緩衝液、５０％Ｂ緩衝液、０％Ｂ緩衝液（＝１００％Ａ緩衝液）の順でステップワイズ溶出を行った。本酵素活性を示す画分（０％Ｂ緩衝液のところに相当する）を回収し、Ａ緩衝液を用いて一晩透析した。得られた透析内液を、Ａ緩衝液で平衡化したＱ−セファロースあるいはソース−Ｑカラム（ともに１０×８０ｍｍ、ファルマシア社製）によるイオン交換クロマトグラフィーにかけて酵素を吸着させた。ついでＡ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０〜３００ｍＭに直線的に増加させることによりグラジエント溶出を行った。本酵素活性を示す画分（塩化ナトリウム濃度が５０〜２００ｍＭのところに相当する）をＡ緩衝液に対して一晩透析を行った。得られた透析内液を、Ａ緩衝液で平衡化したＴＳＫゲルスーパーＱ−５ＰＷカラム（８×７５ｍｍ、東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィーにかけて酵素を吸着させた。ついでＡ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０〜３００ｍＭに直線的に増加させることによりグラジエント溶出を行い、本酵素の活性画分（塩化ナトリウム濃度が５０〜２００ｍＭのところに相当する）を得た。この活性画分を、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むＡ緩衝液で平衡化したスーパーデックスＧ−２００カラム（１６×２００ｍｍ、ファルマシア社製）によるゲルろ過クロマトグラフィーにかけて、本酵素の精製画分（１８０Ｕ／ｍｇ蛋白）を得た。この実施例によって精製したホスファターゼＫＵ−８を「本酵素」と記載し、実施例２から４に用いる。この精製画分はポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと単一のバンドを示し、電気泳動的に単一の物質であることが示された。
【００５３】
（実施例２）
１％馬鈴薯澱粉溶液に３５Ｕのα−アミラーゼ（上田化学、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）を５０℃で３０分間作用させたのち、２Ｕのプルラナーゼ（林原生物化学研究所、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来）と６Ｕのグルコアミラーゼ（東洋紡、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．由来）を同時に４０℃で２０時間作用させた。なお以下の実施例において、各種アミラーゼ酵素の活性は１分間に１μｍｏｌのグルコシル結合を切断する活性を１Ｕと定義する。５分間煮沸することによって酵素反応を停止し、この溶液から陰イオン交換樹脂（キトパールＢＣＷ２５０１）により中性糖を除去した後、脱塩、凍結乾燥することにより重合度３〜５のリン酸化少糖の混合粉末物を得た。次いで、２００ｍＭグリシン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）２００μｌ、重合度３〜５のリン酸化糖混合物の３％溶液（２００ｍＭグリシン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）で調製）２００μｌに、実施例１に記載の本酵素溶液２００μｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液をＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図５に示す。ＨＰＡＥＣによる分析は１００ｍＭの水酸化ナトリウムを基本溶液として１Ｍ酢酸ナトリウム濃度を上昇させることによって行われ得る。検出はパルスドアンペロメトリー（ダイオネックス社製）を用いて行われ得る。本酵素によりリン酸化糖の６位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中のマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースといった中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースとリン酸化マルトペンタオースの混合粉末物を得た。
【００５４】
（実施例３）
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００μｌ、実施例２に記載のリン酸化少糖の３％溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製）２００μｌに、本酵素溶液１００μｌと３０Ｕ／ｍｌの糖化型α−アミラーゼ（ナガセ生化学、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）溶液１００μｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図６に示す。本酵素によりリン酸化糖の６位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースの粉末物を得た。
【００５５】
（実施例４）
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００μｌ、実施例２に記載のリン酸化少糖の３％溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製）２００μｌに、本酵素溶液１００μｌと３０Ｕ／ｍｌのネオプルラナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｋｕｒｉｋｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３，６１４７−６１５２（１９９１））溶液１００μｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図７に示す。本酵素によりリン酸化糖の６位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースの粉末物を得た。
【００５６】
（実施例５）
０．３５規定酢酸溶液に実施例２に記載のリン酸化少糖を添加して１％溶液１ｍｌを作成し、１００℃で８時間反応させる。反応終了後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図８に示す。この反応によりリン酸化糖の３位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース、リン酸化マルトテトラオースおよびリン酸化マルトペンタオースの混合粉末物を得た。
【００５７】
（実施例６）
０．３５規定酢酸溶液に実施例２に示したリン酸化少糖を添加して１％溶液１ｍｌを作成し、１００℃で８時間反応させる。反応終了後、１規定の水酸化ナトリウム溶液で中和し、糖化型α−アミラーゼ溶液およびグルコアミラーゼ溶液各１０μｌを添加して３７℃で１６時間反応させる。その後、反応液を実施例１と同様にＨＰＡＥＣで分析した。その結果を図９に示す。この反応によりリン酸化糖の３位結合リン酸が脱リン酸される。脱リン酸により生じた反応液中の中性糖をキトパールを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去したのち、脱塩、凍結乾燥することにより１個のグルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースとリン酸化マルトースの混合粉末物を得た。
【００５８】
（実施例７）
５％のショ糖溶液を対照とし、これに０．５％のリン酸化糖を添加した試料溶液１）について甘味の変化を官能検査により調べた。評価は対照を０として、試料溶液がさわやかに感じる度合いを「さわやかでない」を−２、「さわやかである」を２として−２から２までの５段階で実施した。その結果、表１の１）に示すように０．５％リン酸化糖を添加した試料溶液では１２人中１０人がプラスの評価を出し、ショ糖の甘味をより好適に改善する効果が認められた。
【００５９】
（実施例８）
５％の食塩溶液を対照とし、これに０．５％のリン酸化糖を添加した試料溶液２）について塩味の変化を官能検査により調べた。評価は対照を０として、試料溶液の塩味の強弱を「弱い」を−２、「強い」を２とする５段階で実施した。その結果、表１の２）に示すように０．５％リン酸化糖を添加した試料溶液では１２人中８人がプラスの評価を出し、塩味を増強する効果が認められた。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
（実施例９）
２００ｍＭグリシン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）２ｍｌ、重合度３〜５のリン酸化糖混合物の３％溶液（２００ｍＭグリシン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）で調製）２ｍｌに、実施例１に記載の本酵素溶液２ｍｌを添加して３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応液のうち１ｍｌを用いて、本酵素の作用により６位リン酸化糖から生じた無機リン酸酸量をバナド・モリブデン酸法により測定し、残り５ｍｌを１００℃で８時間処理したのち、生じた６位リン酸化糖由来の無機リン酸量を同様に定量した。その結果を表２に示す。このようにリン酸化糖のリン酸基の３位および６位の結合割合を簡便に推測できた。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
（実施例１０）
実施例２から６で得たリン酸化糖１％溶液１ｍｌに対して、２０Ｕのシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（天野製薬製、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来）を添加し、５０℃で４８時間反応させた。反応溶液は５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で行った。そして、沸騰湯浴中で５分間処理することで反応停止した。各反応液２μｌを用いて薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ製、シリカゲルプレート）で分析した。展開溶媒は、エタノール：酢酸：脱塩水＝７０：２：３０を用いて、室温で１回展開した。展開後、プレートを乾燥し、硫酸：メタノール＝１：１溶液を噴霧し、１３０℃のオーブンで３分間焼成した。その結果、図１０に示したようにリン酸化マルトペンタオースの基質において明らかに転移反応が確認され、分子内に複数個のリン酸基を有する３位リン酸化糖あるいは６位リン酸化糖が生成していた。
【００６４】
（実施例１１）
実施例３と６のリン酸化マルトトライオースの２ｍＭ溶液６０μｌに対して、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に溶解させた３％の水素化ホウ素ナトリウム溶液５μｌを添加した。本溶液を４０℃で１時間処理した。本処理後、０．７Ｎ塩酸溶液中で１００℃、４時間処理した。本酸加水分解処理溶液中の生じたソルビトール、グルコース、グルコース−６−リン酸をそれぞれ分析定量した。ソルビトール、グルコース、グルコース−６−リン酸は、それぞれＭａｎｎｅｒｓらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１７巻、１０９−１１４頁、１９７１年）、Ｍｉｗａらの方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，、３７巻、５３８−５４０頁、１９７２年）、Ｈｉｚｕｋｕｒｉらの方法（Ｓｔａｒｃｈ，２２巻、３３８−３４３頁、１９７０年）で定量した。その結果、表３に示したように、分子内にもとのリン酸化マルトトライオースと等モルのソルビトールが検出され、リン酸化糖アルコールの生成が確認された。つまり、３位リン酸化マルトトライトールと６位リン酸化マルトトライトールが生成していた。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
Ａ．グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトライオース
Ｂ．グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトライオース
表の数値は１モルのリン酸化マルトトライオースから生成したモル数
【００６７】
（実施例１２）
カルシウム、鉄、マグネシウムとの複合体形成能力については、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いる釜阪らのリン酸化糖に関する特許願（特開平８−１０４６９６）に記載の方法に基づいて実施した。結果、実施例２から６あるいは実施例１０、１１で得られたリン酸化糖が、中性ｐＨ以上において、カルシウム、鉄、マグネシウムと結合することで、リン酸化糖単独時よりも高分子側に溶出され、複合体を形成していることが確認できた。
【００６８】
（実施例１３）
カルシウム、マグネシウムおよび鉄等の金属の可溶化効果については、カルシウムリン酸沈殿阻害効果測定方法として、釜阪らのリン酸化糖に関する特許願（特開平８−１０４６９６）に記載の方法に基づいて実施した。結果、実施例２から６あるいは実施例１０，１１で得られたリン酸化糖についてカルシウム、マグネシウムおよび鉄等の金属の可溶化効果があるとの結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１はｐＨ２における本酵素活性を１００％としたときの相対活性と、ｐＨとの関係を示した図である。
【図２】図２はｐＨ９で６０分間処理した後の残存活性を１００％としたときの各ｐＨにおける相対残存活性と、ｐＨとの関係を示した図である。用いた緩衝液；グリシン−塩酸緩衝液（○；ｐＨ１．２−３．０）、酢酸緩衝液（●；ｐＨ３．０−６．０）、ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（△；ｐＨ６．０−７．０）、トリス−塩酸緩衝液（▲；ｐＨ７．０−９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（◇；ｐＨ９．０−１０．６）。
【図３】図３は６０℃における本酵素活性を１００％としたときの相対活性と、温度との関係を示した図である。
【図４】図４は４℃で３０分間処理した後の残存活性を１００％としたときの各温度における相対残存活性と、温度との関係を示した図である。
【図５】本酵素によるリン酸化少糖への作用を示す。図５−９の記号の説明：Ｇ３；マルトトリオースＧ４；マルトテトラオースＧ５；マルトペンタオースＨ；グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースＪ；グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースＫ；グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトペンタオースＬ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオースＭ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースＮ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトペンタオースＰ；グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトース
【図６】本酵素と糖化型α−アミラーゼによるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図７】本酵素とネオプルラナーゼによるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図８】酢酸加熱処理によるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図９】酢酸加熱処理と糖化型α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼによるリン酸化少糖類への作用を示す。
【図１０】糖転移酵素であるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによるリン酸化糖への転移作用を示す。図の説明：１、  グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース；２、  グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース；３、  グルコース残基の６位がリン酸化されたリン酸化マルトペンタオース；４、  グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトトリオース；５、  グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオース；６、  グルコース残基の３位がリン酸化されたリン酸化マルトテトラオースＭ１、グルコース，標準マルトオリゴ等（Ｇ２−Ｇ６）、グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−２リン酸、各１．５％、１μｌＭ２、結合リン酸基を１個有するリン酸化マルトトライオースからマルトペンタオースまでの混合物（ＰＯ−１）、結合リン酸基を２個有するマルトペンタオースからマルトオクタオースまでの混合物（ＰＯ−２）、各１．５％、１μｌ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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