(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出すべき抗原と結合する抗体が一面に固定された非磁性の反応容器と、
該反応容器を移動させる機構と、
前記反応容器内に、前記検出すべき抗原に結合する磁気微粒子で標識された抗体が含まれた溶液状態の試料を注入したときの前記試料からの磁気信号を測定するための磁気センサと、
該磁気センサの周辺に作用する磁気雑音を遮蔽するための磁気シールドと、
前記非磁性の反応容器に固定された抗体と結合した前記試料の抗原に結合している前記試料の抗体を標識している磁気微粒子による第１の磁化の総和の磁化方向と、前記非磁性の反応容器に固定された抗体と結合していない前記試料の抗原に結合している前記試料の抗体を標識している磁気微粒子および前記試料の抗体を標識しているのみの磁気微粒子による第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構と、
前記磁気センサの信号を処理する手段と、
を有することを特徴とする磁気的免疫検査装置。
【請求項２】
前記磁気センサが超伝導量子干渉素子によるものである請求項１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項３】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を作用させるものである請求項１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項４】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を作用させるものである請求項２に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項５】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に平行方向の磁場を作用させるものである請求項１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項６】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に平行方向の磁場を作用させるものである請求項２に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項７】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を遮るための磁気シールドである請求項１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項８】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を遮るための磁気シールドである請求項２に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項９】
前記磁気シールドが両側面が開口した筒型の磁性材で構成されている請求項７に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１０】
前記磁気シールドが両側面が開口した筒型の磁性材で構成されている請求項８に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１１】
検出すべき抗原と結合する抗体が一面に固定された非磁性の反応容器と、
該反応容器を移動させる機構と、
前記反応容器内に、前記検出すべき抗原に結合する磁気微粒子で標識された抗体が含まれた溶液状態の試料を注入したときの前記試料からの磁気信号を測定するための磁気センサと、
該磁気センサの周辺に作用する磁気雑音を遮蔽するための磁気シールドと、
前記非磁性の反応容器に固定された抗体と結合した前記試料の抗原に結合している前記試料の抗体を標識している磁気微粒子による第１の磁化の総和の磁化方向と、前記非磁性の反応容器に固定された抗体と結合していない前記試料の抗原に結合している前記試料の抗体を標識している磁気微粒子および前記試料の抗体を標識しているのみの磁気微粒子による第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構と、
前記磁気センサの信号を処理する手段と、
を有する磁気的免疫検査装置において、
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構は、第２の磁化の総和の磁化の強度を計測の事前に評価して設定されるものであることを特徴とする磁気的免疫検査装置。
【請求項１２】
前記磁気センサが超伝導量子干渉素子によるものである請求項１１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１３】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を作用させるものである請求項１１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１４】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を作用させるものである請求項１２に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１５】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に平行方向の磁場を作用させるものである請求項１１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１６】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に平行方向の磁場を作用させるものである請求項１２に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１７】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を遮るための磁気シールドである請求項１１に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１８】
前記第１の磁化の総和の磁化方向と、第２の磁化の総和の磁化方向を直交させる機構が、前記磁気センサの磁気を検出するためのコイルの面に垂直方向の磁場を遮るための磁気シールドである請求項１２に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項１９】
前記磁気シールドが両側面が開口した筒型の磁性材で構成されている請求項１７に記載の磁気的免疫検査装置。
【請求項２０】
前記磁気シールドが両側面が開口した筒型の磁性材で構成されている請求項１８に記載の磁気的免疫検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は磁性微粒子を用いた種々のタンパク質（免疫グロブリン、腫瘍マーカ、ホルモンなど）、病原菌、がん細胞、ＤＮＡ、環境有害物質等の分析装置に関し、特に超電導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ：Superconducting QUantum Interference Device）を使用した磁気的免疫検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫反応によって種々の病原菌、がん細胞、ＤＮＡ、環境有害物質等の検査対象を高感度に検出する要求が高まっており、そのための免疫検査装置の開発が盛んに行われている。免疫検査の一般的な方法として、検出対象とする抗原に選択的に結合する検出用抗体を蛍光酵素等の光学マーカで標識して、抗原−抗体の結合反応を光学マーカからの光信号を検出し、抗原の種類及び量を検出する光学的方法がある。しかし、光学的方法では、検出感度が十分ではなく、また、未結合の光学マーカを洗い流す工程（洗浄工程）が必要であった。
【０００３】
光学的方法を上回る検出感度を得るために、近年、磁気微粒子とＳＱＵＩＤ磁気センサを用い、抗原抗体反応を検出する磁気的方法が提案されている。この磁気的方法では、磁気微粒子で磁気的に標識された抗体（以下、磁気マーカという）を、非常に高感度なＳＱＵＩＤ磁気センサを用いて検出する。
【０００４】
磁気マーカを検出する方法については、
（１）磁化率の測定、
（２）磁気緩和の測定、および
（３）残留磁気の測定、
に基づく方法が提案されている。以下、（１）〜（３）について説明する。
【０００５】
（１）磁化率を測定する方法：
ＳＱＵＩＤ磁気センサの磁束検出方向と直角な方向から、磁気マーカを磁化させる直流磁界を印加し、ＳＱＵＩＤ磁気センサの磁束検出領域内を移動する磁気マーカより生じた磁界の変化を測定している（例えば、特許文献１）。あるいは、磁気マーカに対して交流磁界を印加し、その信号をＳＱＵＩＤ磁気センサを用いて抗原抗体反応を検出している（例えば、特許文献２）。
【０００６】
（２）磁気緩和を測定する方法：
磁気マーカへの１ｍＴのパルス磁界印加直後から１秒後までの磁気緩和を測定している。測定は未結合の磁気マーカが共存する溶液中で行なっており、結合した磁気マーカを検出している（例えば、非特許文献１、非特許文献２）。あるいは、液相及び固相中の被検体を磁気緩和測定により定量的に検出する方法、磁気緩和測定での検出のための化合物、並びに分析及び免疫マグネトグラフィーにおけるそれらの使用に関する報告がある（例えば、特許文献３）。
【０００７】
（３）残留磁気を測定する方法：
磁気微粒子のサイズが大きくなると、磁気微粒子の残留磁気は緩和しなくなる。ＳＱＵＩＤ磁気センサから離れた場所で磁気マーカに０．１Ｔ程度の磁界を印加し、磁気マーカに残留磁化を発生させる。この後に、試料を乗せた基板を移動し残留磁化をＳＱＵＩＤ磁気センサで測定する（例えば、特許文献４、非特許文献４）。
【０００８】
一般的な免疫検査で行われているように、未結合の磁気マーカを除去するための洗浄工程の後に測定することもできるが、溶液中で未結合の磁気微粒子はブラウン運動によりランダムに運動するので、洗浄工程なしで測定することも可能である（例えば、非特許文献５）。この場合、検査時間短縮や装置の簡略化が可能などのメリットがある。
【０００９】
以下、抗原抗体反応を検出する磁気的方法に関する具体例を説明しておく（例えば、特許文献４）。
【００１０】
図１（ａ）−（ｅ）は、抗原抗体反応を用いた従来技術の磁気的免疫検査方法の手順例として洗浄工程なしで残留磁気を測定する方法を模式的に説明する図である。
【００１１】
図１（ａ）に示すように、前処理として、まず試料容器１の底面１ａに検出対象である抗原と結合する抗体２を固定する。以下これを固定抗体という。次に、壁面への非特異吸着を防止するためブロッキング剤３を入れ、容器内面をブロッキング剤３で覆う。このようにして得られた試料容器１に定量すべき物質が含まれた試料５を注入すると、試料に含まれる抗原６は、図１（ｂ）に示すように、抗原抗体反応により固定抗体２と結合する。次に、試料容器に抗原６と結合する磁気マーカを含む溶液を注入すると、図１（ｃ）に示すように、一部の磁気マーカ７ａは固定抗体２に結合している抗原６ａに抗原抗体反応によって結合する。また、一部の磁気マーカ７ｂは固定抗体２と結合していない溶液中の抗原６ｂと結合する。抗原に結合していない未結合の磁気マーカ７ｃと溶液中の抗原６ｂと結合した磁気マーカ７ｂは溶液中をブラウン運動によってランダムに動く。
【００１２】
この状態で、試料に外部磁場を、図１（ｄ）に示す矢印の方向に印加すると、すべての磁気マーカは印加された磁場の方向に磁化される。図の矢印は磁化の方向を示す。残留磁気を有する磁性微粒子を含む磁気マーカを使用すると、磁場がなくなっても残留磁気が残る。
【００１３】
しかし、図１（ｅ）に示すように印加磁場がなくなると、未結合の磁気マーカ７ｃと溶液中の抗原６ｂと結合した磁気マーカ７ｂは溶液中をブラウン運動によってランダムに動くため、磁化の方向もランダムになり、これらの磁気マーカからの磁気信号は相互に打ち消し、正味の磁気信号を発生しない。即ち、未結合の磁気マーカを洗浄によって除去する必要がない。一方、固定抗体２に結合している抗原６ａと結合した磁気マーカ７ａはブラウン運動を起こさないため、印加磁場がなくなっても、磁化された方向に残留磁気を保持しており、固定抗体２に結合している抗原６ａの量に比例した磁気信号が発生する。固定抗体２に結合している抗原６ａの量は、試料に含まれる抗原の量に依存するため、この磁気信号を高感度のＳＱＵＩＤ磁気センサで検出することによって、調べたい抗原の量を測定できる。
【００１４】
光学マーカを用いた免疫検査では洗浄工程が必須であることを考慮すると、この洗浄工程が不要であるという特徴は、磁気マーカを用いた免疫検査における長所の１つである。
【００１５】
【特許文献１】特開２００１−３３４５５号公報
【特許文献２】特開２００１−１３３４５８号公報
【特許文献３】特表平１０−５１３５５１号公報
【特許文献４】特開２００５―２５７４２５号公報
【特許文献５】特表平１１−５０８０３１号公報
【非特許文献１】Y. R. Chemla, et al.: Proc. National Acad. Sciences of U.S.A. 97, 14268 (2000)
【非特許文献２】A. Haller, et al.: IEEE Trans. Appl. Supercond. 11, 1371 (2001)
【非特許文献３】R. Kotitz, et al.: IEEE Trans. Appl. Supercond. 7, 3678(1997)
【非特許文献４】K. Enpuku, et al.: IEEE Trans. Appl. Supercond. 13, 371 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
磁気緩和あるいは残留磁気を測定する磁気的免疫検査の長所である洗浄工程なしでの分析を行うためには、未結合の磁気マーカが溶液中でブラウン運動することで、各磁気マーカの残留磁気の方向がランダムになる必要がある。この場合、未結合の磁気マーカ７ｃからの磁気信号は互いにうち消すため溶液全体からは磁気信号が検出されない（図１（ｅ））。しかし、発明者らが行った実験の結果では、磁気シールド内部に残留する磁場により、その磁場の方向に未結合の磁気マーカが配向するため、溶液から未結合の磁気マーカの磁気信号が発生することがわかった。磁気シールドにより試料およびセンサの周辺に残留している磁場は低減されているが、完全にゼロ磁界を達成することは困難であった。
【００１７】
完全に磁場が遮蔽され、ブラウン運動が十分に起きている場合と残留磁場がある場合の磁気マーカの状態を図２（ａ），（ｂ）に模式的に示す。完全に磁場が遮蔽された場合、図２（ａ）に示すように、ブラウン運動により各微粒子がランダムに運動するため、各磁気マーカの磁化は互いにうち消しマクロな磁気信号は発生しない。磁気マーカ１１の近辺に表示されている矢印１０はそれぞれの磁気マーカ１１が保持している磁化の方向を示す。しかし、図２（ｂ）に示すように残留磁場があると、その方向にバイアスがかかるため、完全にランダムにならない。残留磁場の大きさにより配向の度合いが異なるが、残留磁場の方向に揃う傾向がある。そのため、残留磁場の方向にマクロな磁気信号が発生する。固定された磁気マーカを測定したい場合、この未結合マーカからの磁気信号はバックグラウンド信号（ノイズ）となるため、Ｓ／Ｎ比の低下、最低検出量の増加（分解能の低下）となる。
【００１８】
密閉性の高い多重構造の磁気シールドを用いることで、必要なレベルまで残留磁界を低減できたとしても、装置コストの低減や試料交換などの操作性を考えると、なるべく簡易な磁気シールドの使用が望まれる。
【００１９】
そこで、本発明の目的は、磁気シールドで低減できずに残留した磁場の影響を容易に除去できる方法を提供し、未結合マーカからの信号の影響を十分に低減した高感度な磁気的免疫検査装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、固定抗体と結合した磁気マーカの磁化方向と未結合磁気マーカの磁化方向を互いに直交させることで、上記課題を解決できることを見いだした。
【００２１】
図３を参照して、ＳＱＵＩＤマグネトメータの下を磁性体試料が通過した場合に、ＳＱＵＩＤに検出される磁気信号波形を説明する。検出コイルのコイル面はｘ−ｙ平面に配置されているものとし、磁性体試料はｘ−ｙ平面と平行に検出コイルの真下をｘ方向に通過するものとする。図３では、検出コイルと磁性体試料との位置関係と磁性体試料の移動方向とをｘ−ｙ平面図とｘ−ｚ平面図とで示し、磁性体試料の磁化方向による検出コイルの磁気信号のｘ位置依存性を示す。（ａ），（ｂ），（ｃ）は、それぞれ、磁性体試料がｘ方向，ｙ方向，ｚ方向に磁化されている場合を示している。
【００２２】
磁性体試料がｘ方向に磁化されている場合、磁性体試料がＳＱＵＩＤに近づくにつれて、磁性体試料から発生する磁束が下から上にＳＱＵＩＤの検出コイル部分に鎖交し始めるため、ＳＱＵＩＤが磁束を検出し、ＳＱＵＩＤの出力信号が変化する。試料が検出コイルの丁度中心にくると、試料から出た磁束が下から上に検出コイルに鎖交するが、同時に試料に戻る同じ量の磁束が上から下に検出コイルを鎖交するためＳＱＵＩＤの出力信号はゼロとなる。さらに、試料が移動しＳＱＵＩＤから遠ざかると、磁性体試料からの磁束が上から下にＳＱＵＩＤの検出コイル部分に鎖交するため、出力信号はマイナス方向に変化する。さらに遠ざかると信号は再びゼロとなる。この波形はセンサの直上のｘ位置を原点とすると、原点対称となっている。なお、磁気信号の極性は、磁化の極性、ＳＱＵＩＤ検出コイルの極性により変化するため、得られる波形が上下逆方向となる場合がある。
【００２３】
次に、磁性体試料がｙ方向に磁化されている場合、磁性体試料がＳＱＵＩＤに近づくにつれて、磁性体試料から発生する磁束が一方からＳＱＵＩＤに入った磁束がＳＱＵＩＤの他方から出る形になり、この場合はＳＱＵＩＤに鎖交する正味の磁気信号がないことになり、出力信号はつねにゼロである。
【００２４】
最後に、磁性体試料がｚ方向に磁化されている場合、磁性体試料がＳＱＵＩＤに近づくにつれて、磁性体試料から発生する磁束が上から下にＳＱＵＩＤに鎖交し始めるため、ＳＱＵＩＤが磁束を検出し、ＳＱＵＩＤの出力信号が変化する。試料が検出コイルの丁度真下にくると、下から上に磁束が検出コイルに鎖交するするためＳＱＵＩＤの出力信号は逆方向に極大を示す。さらに、試料が移動しＳＱＵＩＤから遠ざかると、再び磁束が上から下にＳＱＵＩＤに鎖交するため、元の方向に出力信号が発生する。
【００２５】
上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の各場合の磁気信号を見ると容易に分るように、（ａ）の場合は、検出コイルの中心点を境として磁気信号が原点対称中心となっている。したがって、信号が得られた後に、原点を境として、x方向に信号を区分して、それぞれの信号の差を取れば、原点の片側の信号の振幅が２倍となった信号が得られる。これに対して（ｃ）の場合は、原点を通る縦軸に対して対称に変化する信号であるので、同様な処理をすると、信号はゼロとなる。一方、信号の和を取る処理をすれば、（ａ）の場合は、信号はゼロとなるのに対して、（ｃ）の場合は２倍の振幅を持つものとなる。
【００２６】
したがって、計測したい信号がどちら磁化方向となっているかに応じて加算または減産の処理をすることにより、所望の信号を得ることができる。
【００２７】
したがって、測定すべき固定された磁気マーカを、ｘあるいはｚ方向に磁化し、ノイズとなる溶液中の未結合磁気マーカの磁化方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交するように制御すれば、得られる波形は対称性が異なる２つの波形、すなわち、固定されたマーカの波形と溶液中のマーカの波形の和となる。この測定波形から、対称性の違いを利用して固定されたマーカの波形を得ることは容易にできる。
【００２８】
溶液中の磁気マーカの磁化の方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交するように制御するためには、試料測定位置近傍の残留磁界のうち、固定された磁気マーカの磁化方向成分をゼロにすることで実現できる。また別の方法として、マーカの磁化方向と直交する方向に磁界を加え、溶液中の未結合磁気マーカの磁化の方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交するように制御することでも実現できる。特に、図３に示した例からわかるように、溶液中の未結合磁気マーカの磁化の方向をｙ方向に制御すれば、ｙ方向に磁化した磁気マーカからの磁気信号はＳＱＵＩＤによって検出されないので、信号分離を行う必要がない。さらに別の方法としては、シールド内の残留磁場の方向が固定された磁気マーカの磁化方向と直交する方向になるような構造の磁気シールドを使用することでも、溶液中の未結合磁気マーカの磁化の方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交する方向に配向できる。また、これらの方法は組み合わせて用いることも可能である。
【００２９】
図４は、ＳＱＵＩＤマグネトメータに代えて、１次微分平面型検出コイルを有するＳＱＵＩＤグラジオメータを使用し、この上を磁性体試料が通過した場合に、ＳＱＵＩＤに検出される信号波形を示す。図４では、ｘ−ｚ平面図は省略した。図４でも、検出コイルのコイル面はｘ−ｙ平面に配置されているものとし、磁性体試料はｘ−ｙ平面と平行に検出コイルの直下をｘ方向に通過するものとする。検出コイルに垂直な方向をｚ、試料の移動方向をｘ、ｘとｚに垂直な方向をｙとする。図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と同様、磁性体試料がｘ，ｙ，ｚ方向に磁化されている場合を示している。検出コイルの微分方向はｘ方向であり、図の検出コイルの実線部分と点線部分は検出コイルの極性が逆であることを示している。磁性体試料がｘ方向、ｙ方向、ｚ方向に磁化されている場合のＳＱＵＩＤに検出される信号波形は、図３とは異なり、縦軸対称、ゼロ、原点対称となる。図３に示したマグネトメータの場合と同様に、ｘ方向に磁化した試料と、ｚ方向に磁化した試料によるＳＱＵＩＤに検出される信号波形は対称性が異なるため、容易に分離することができる。やはり、ｙ方向に磁化した試料からの磁気信号はそもそも検出されないので、分離する必要がない。
【００３０】
したがって、マグネトメータの場合と同様に、溶液中の磁気マーカの磁化の方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交するように制御するために、試料測定位置近傍の残留磁界のうち、固定された磁気マーカの磁化方向成分をゼロにすることで実現できる。あるいは別の方法として、磁気マーカの磁化方向と直交する方向に磁界を加え、溶液中の未結合磁気マーカの磁化の方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交するように制御することでも実現できる。さらに別の方法としては、シールド内の残留磁場の方向が固定された磁気マーカの磁化方向と直交する方向になるような構造の磁気シールドを使用することでも、溶液中の未結合磁気マーカの磁化の方向を固定された磁気マーカの磁化方向と直交する方向に配向できる。また、これらの方法は組み合わせて用いることも可能である。
【００３１】
さらに高次のグラジオメータや検出コイルの形状や構成が異なる場合であっても、試料の磁化方向により、対称性の異なる信号波形が得られれば、本発明の方法で目的の信号波形を得ることができる。
【００３２】
全方向の直流磁界を磁気シールドによりゼロにすることは、困難であるが、本発明のように一方向の磁場を制御することは容易に実現可能である。例えば、ＳＱＵＩＤ磁気センサ近傍に補正用コイルを設け、補正用コイルに流す直流電流を調整することで測定位置近傍に残留する磁場の一方向成分をキャンセルすることができる。また、溶液中の固定されていない磁気マーカの磁化の方向を、固定された磁気マーカの磁化方向と垂直になるように制御することも比較的容易に実現できる。例えば、永久磁石あるいはコイルを配置し、磁界を印加することで溶液中の固定されていない磁気マーカの磁化の方向を制御可能である。また、シールド内の残留磁場の方向を制御することも容易に実現できる。例えば、円筒型の磁気シールドの場合、円筒の中心軸方向のシールド率が中心軸方向に垂直な方向よりも低いため、円筒型の磁気シールドの中心部では中心軸方向の磁界を残すことができる。
【００３３】
さらに上記方法を組み合わせて、本発明の試料測定位置近傍に残留する直流磁場を測定対象の磁気微粒子の磁化方向と垂直な方向に制御することが可能である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、残留磁界により溶液状態の磁気マーカから磁気信号が発生する場合でも、容易に固定された磁気マーカとの信号分離が可能となるため、溶液状態の磁気マーカから磁気信号の影響を除去し、高感度な免疫検査が可能となる。また、本発明により、高感度な免疫検査を実現するために必要であった、多重の密閉性の良い磁気シールドが不要となり、装置コストの低減、操作性の向上が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（実施例１）
以下の説明では、残留磁気信号を有する磁気微粒子で標識された抗体（磁気マーカ）を使用し、１次微分の平面型ＳＱＵＩＤグラジオメータで検査試薬と反応した試料からの磁気信号を検出する磁気的免疫検査装置を例に、本発明の実施例を説明する。以下の開示は、本発明の一実施例にすぎず、本発明の技術範囲を何ら限定するものではない。
【００３６】
図５は本発明の実施例１の免疫検査装置の構成を示す断面図である。環境磁気雑音のＳＱＵＩＤへの入力を低減するために、ＳＱＵＩＤを冷却するための冷却容器（外槽２１、断熱真空層２２および内槽２３よりなる）は電磁シールド１９および磁気シールド３０、３１によって囲まれている。電磁シールド１９はアルミニウムなど電気抵抗が低い金属材料で構成されており、磁気シールド３０、３１は、パーマロイ等の高透磁率材料から構成されている。磁気シールド３０の一部には試料容器７１を挿入するための切欠き穴３８が形成されている。
【００３７】
試料容器７１は非磁性の円盤型試料台３２に、固定ネジ３３により回転軸３５に固定されている。図６に試料容器７１の一例の平面図を示す。容器は樹脂などの非磁性材料で作製されている。容器７１は円形で、外周部に１２カ所の円錐台の形状の窪み部分７０があり、中央には装置に固定するための穴７２が開いている。窪み部分の底面の直径は５ｍｍである。
【００３８】
試料容器の窪み部分７０に磁気マーカを含む試料１４が入れられている。試料台３２は回転機構３４に接続された回転軸３５によって回転する。回転機構３４は、移動ステージ３６、３７上で３次元方向に移動可能に保持されている。移動ステージ３６、３７上での回転機構３５の移動により、試料容器７１の一部が切り欠き穴３１を通って、磁気シールド３０の内部へ移動され、窪み部分７０の底面とサファイヤウインドウ２９が近接するように位置調整される。試料容器の窪み部分７０は、図１で説明したように、底面に検出対象である抗原と結合する抗体２が固定され、周りの壁面がブロッキング剤３で覆われている。
【００３９】
試料１４とＳＱＵＩＤ２８の検出コイルとの距離を小さくし、試料から発生する磁気信号の検出感度及び空間分解能を高くするために、サファイヤウインドウ２９の下部にＳＱＵＩＤ２８の検出コイルが配置されている。試料容器７１が回転することで、複数の試料１４が順次、ＳＱＵＩＤ２８の検出コイルの上を通過し、そのときの磁気信号が計測される。サファイヤウインドウ２９は非磁性の円筒部品１７に固定されており、上下方向に位置合わせが可能である。この円筒部品１７に残留磁場補正のための補正用コイル１６が巻かれており、このコイルに電流を流すことでＳＱＵＩＤの検出コイルに対して垂直方向の補正磁場を印加できる。補正用コイル１６の中心軸はＳＱＵＩＤの検出コイルの中心を通る。ここでは、単純な構造のソレノイドコイルを使用したが、より均一な磁場分布が得られるヘルムホルツコイルやその他の形状のコイルを使用することもできる。すなわち、ＳＱＵＩＤ上の試料検出位置の磁界を補正できれば本発明の効果を得ることができる。
【００４０】
ＳＱＵＩＤ２８は冷却容器の断熱真空層２２に配置され、熱伝導率の高い銅ロッド２６及びサファイアロッド１３を介して液体窒素２４により間接的に冷却されている。冷却容器の外槽２１、内槽２３は、ＳＵＳやＦＲＰ等の非磁性材料で構成される。ＳＱＵＩＤ２８と銅ロッド２６との間にサファイアロッド１３を介することにより、銅ロッド２６から発生する磁気雑音の影響を低減する効果がある。
【００４１】
実施例１の免疫検査装置ではＳＱＵＩＤ２８として、高温超電導ＳＱＵＩＤグラジオメータを使用した。図７は高温超電導ＳＱＵＩＤグラジオメータの構成を模式的に示す平面図である。検出コイル６２及びＳＱＵＩＤリング６４は、ＳｒＴｉＯ３やＭｇＯ等の単結晶を結晶方位をずらしてバイクリスタル接合面６１で張り合わされた構造のバイクリスタル基板６０上に形成されたＹＢａ２Ｃｕ３Ｏｘ等の高温超電導材料を加工することで作製した。ＳＱＵＩＤリング６４は、バイクリスタル基板６０に形成されたバイクリスタル接合面６１を横切っており、バイクリスタル接合面６１上に形成された超電導薄膜に粒界ジョセフソン結合６５が形成されている。その結果、ＳＱＵＩＤリング６４には２カ所の粒界ジョセフソン結合６５が形成される。今回使用したＳＱＵＩＤでは、１枚の基板上に同じ検出コイルと結合した２つのＳＱＵＩＤリング６４，６４’が形成されており、そのうち特性が良い方のＳＱＵＩＤを使用した。
【００４２】
検出コイル６２は、一辺が５ｍｍの２つのループを持つ８の字型の微分コイルを構成しており、検出コイル６２に磁束が入力すると、２つのループの各ループに生じる誘導電流の差分量が検出コイルの中央部分６６を経由してＳＱＵＩＤリング６４、６４’に流れる。この電流が磁束として検出される。フィードバックコイル６７，６７’は、検出コイル６２のうち片方のループを囲むように基板６０上にパターニングされ形成されている。２つのフィードバックコイル６７，６７’の内、片方を使用した。配線の接続が必要なところには超電導薄膜の上に、金の配線パッド６３，６３’および６８，６８’がパターニングされている。配線パッド６３はＳＱＵＩＤリング６４と電気接続されており、配線パッド６８はフィードバックコイル６７と電気接続されている。
【００４３】
試料容器は図７（ａ）の矢印方向６９に沿って、ＳＱＵＩＤの上を通過する。なお試料は容器底面に対して垂直方向に磁化されており、この磁化方向は検出コイル面に垂直な方向である。したがって、固定された磁気マーカからの磁気信号とＳＱＵＩＤの関係、および得られる磁気信号波形は図４（ｃ）に対応する。
【００４４】
実施例１では、総ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）の検出を行った。図８に使用した検査プロトコルを示す。まず、ステップ８１で非磁性反応容器７１の窪み部分７０の底面に１次抗体（抗ＩｇＥ抗体）を固定させた。実施例１では、固定抗体を反応容器に直接固定した場合について述べるが、ポリマービーズやセルロース糸など数ミクロン以上のサイズがあり測定中に大きく動かない固体に固定抗体を結合させ、それらを非磁性反応容器７１の窪み部分７０に入れることでも同様な測定を行うことができる。
【００４５】
抗体を固定した後、ステップ８２でＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いてブロッキング処理を行った。洗浄後、ステップ８３でＩｇＥを含むテスト試料を入れ、固定された抗ＩｇＥ抗体とＩｇＥの反応を行った。テスト試料には１００ｐｇのＩｇＥを含む５０μｌのＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）溶液を使用した。またリファレンスとしてＩｇＥを含まない５０μｌのＰＢＳ溶液もリファレンス試料として使用した。３０分後、ステップ８４で、その上から磁気マーカを入れ、ＩｇＥと磁気マーカの反応を行った。実施例１では、ポリマーでコーティングされた直径２５ｎｍのＦｅ３Ｏ４（マグネタイト）微粒子の表面に抗ＩｇＥ抗体が結合された構造の磁気マーカを使用した。さらに、３０分後、ステップ８５で、反応容器底面を永久磁石（ネオジウム磁石、直径３０ｍｍ、表面磁束密度４００ｍＴ）に１分間乗せ、図３、図４で説明したｚ方向の磁化を行った。磁化後の試料容器を測定装置に装着し、ステップ８６で、試料から発生する磁気信号を計測した。ここで、各ステップにおける条件は、各ステップの脇に付記した。
【００４６】
図９に（ａ）ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料から得られた磁気信号波形と（ｂ）ＩｇＥを含まないレファレンス試料から得られた磁気信号波形を示す。ゼロ磁場環境ではブラウン運動により正味の磁気信号が発生しないはずのリファレンス試料からも磁気信号が発生しており、磁気シールドでは遮蔽しきれない磁場が測定試料位置近傍に残っていることを示している。２つの波形の変化量はほぼ等しく、０．２ｍΦ０の差しかなかった。レファレンス試料のばらつきが１ｍΦ０以上あったため、このデータでは１００ｐｇのＩｇＥを検出することは困難であった。
【００４７】
図１０に、補償コイル１６に電流を流して測定した場合のレファレンス試料の磁気信号波形を示す。補償コイル１６の電流の増加に伴い、徐々に波形が左右対称に近づく。コイルに２００μＡの電流を流した時に、左右対称な波形が得られた。さらに補償コイル１６の電流を増加させると、レファレンス試料の磁気信号波形の左右対称からのずれは軸を中心に反転したものとなった。
【００４８】
補償コイル１６の電流が２００μＡのときの磁気信号波形は図４に示す（ａ）の磁気信号波形であることから、補償コイル１６によりｚ方向の磁場がキャンセルされたことがわかる。この時、補償コイルにより試料近傍に印加された磁場は約５０ｎＴであった。
【００４９】
本発明の補償コイル１６により印加する磁界は地磁気よりも弱い。このため、補償コイル１６の磁場により固定された磁気マーカの磁気微粒子内部の磁化の方向は変化しない。一方、溶液中の磁気マーカの磁気微粒子内部の磁化の方向はやはり変化しないが、溶液中の磁気マーカは磁気マーカ全体が磁場に合わせて回転するため、本発明の効果が得られる。
【００５０】
図１１（ａ）、（ｂ）に、補償コイル１６に２００μＡの電流を流した状態で測定した（ａ）ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料から得られた磁気信号波形と（ｂ）ＩｇＥを含まないレファレンス試料から得られた磁気信号波形を示す。この状態では、０．９ｍΦ０の差が得られた。次に、補償コイル１６の効果により溶液中の磁気マーカの磁気信号波形が左右対称であるため、対称な信号成分を除去し非対称成分たけを抽出することを試みた。
【００５１】
図１１（ａ）、（ｂ）の波形から反応容器中心位置に対して左右対称な成分を除去した波形を図１２（ａ）、（ｂ）に示す。この処理は、先に、図３、図４に関して説明した減算処理によって実施できる。図１２（ａ）から分るように、ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料では振幅５ｍΦ０の明瞭な信号が得られているのに対して、図１２（ｂ）のように、レファレンス試料では最大振幅が１．３ｍΦ０の不明瞭な波形となっており、溶液中の未結合磁気マーカの影響をほぼ除去できている。このように、実施例１では、補正コイル１６の効果を事前に評価して、適切な電流で使用することで、溶液中の未結合磁気マーカに含まれる微少量の固定された磁気マーカを測定することができた。
【００５２】
（実施例２）
実施例２では、残留磁気信号を有する磁気微粒子で標識された抗体を使用し、１次微分の平面型ＳＱＵＩＤグラジオメータで検査試薬と反応した試料からの磁気信号を検出する磁気的免疫検査装置を例に説明する。
【００５３】
図１３は実施例２の免疫検査装置の構成を示す断面図である。図５に示した実施例１で使用した装置の補正用コイル１６の代わりに、永久磁石１８と磁石の位置調整機構２０を取り付けた。この永久磁石１８により測定位置に固定された磁気マーカの磁化方向（z方向）と垂直方向の磁界を印加できる。その他の構成は、実施例１と同じである。
【００５４】
この装置を使用し、実施例１と同じ試料を測定した。試料の作製方法は実施例１と同じである。なお、試料測定位置に印加される磁場としては、１ｎＴから１００μＴ程度であり、最適な磁場は磁気マーカの特性や残留している磁界の大きさに依存する。したがって、実施例１と同様に、磁場の強度を異にする永久磁石によって磁気信号波形を評価し、最適な磁場強度を持つ永久磁石とすることが必要である。なお、ここでは、永久磁石の中では比較的弱いゴム磁石を使用したが、もちろん電磁石を使用することも可能である。
【００５５】
実施例２で印加する磁界は地磁気よりも弱い。このため、永久磁石１８の磁場により固定された磁気マーカの磁気微粒子内部の磁化の方向は変化しない。一方、溶液中の磁気マーカの磁気微粒子内部の磁化の方向はやはり変化しないが、溶液中の磁気マーカは磁気マーカ全体が回転するため、印加磁界の方向に配向し、本発明の効果が得られる。
【００５６】
図１４（ａ）に、ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料から得られた磁気信号波形を、（ｂ）にＩｇＥを含まないレファレンス試料から得られた磁気信号波形を示す。レファレンス試料の磁気信号の変化量は、図９（ｂ）のレファレンス試料の波形に比べ、１／１０となっている。これは、永久磁石１８によるｙ方向の磁界により、溶液中の磁気マーカがｙ方向に配向したため、ＳＱＵＩＤ２８の検出コイルに検出される磁気信号であるｘおよびｚ方向に配向した磁気マーカが減少したためと考えられる。その結果、図１４（ａ）、（ｂ）に示すようにＩｇＥを１００ｐｇ含む試料とレファレンス試料を明瞭に区別できており、本発明の効果を確認できた。
【００５７】
（実施例３）
実施例３では、残留磁気信号を有する磁気微粒子で標識された抗体を使用し、１次微分の平面型ＳＱＵＩＤグラジオメータで検査試薬と反応した試料からの磁気信号を検出する磁気的免疫検査装置を説明する。
【００５８】
図１５に使用した装置の模式図を示す。長さ１ｍ、内径４０ｃｍの円筒型磁気シールド４３と、長さ９０ｃｍ，内径３０ｃｍの円筒型磁気シールド４４からなる２重の円筒磁気シールドを使用した。シールド材４３，４４には厚さ２ｍｍのパーマロイを使用した。試料容器４５は８×１２配列の９６穴非磁性反応容器を使用した。測定位置が磁気シールドの中心となるように、試料容器４５は試料容器ホルダー４７に支持されており、試料容器４５は３軸移動機構４８により任意の試料が測定位置に移動可能である。ＳＱＵＩＤ４１は、図７で示した構造のグラジオメータを使用した。
【００５９】
ＳＱＵＩＤ４１はパルス菅冷凍機４９により、サファイアロッド５０を介して冷却されている。低温部分は真空断熱容器４２の中に納められ、ＳＱＵＩＤは６５−８０Ｋの範囲で±０．１Ｋの変動幅で温度制御可能な構造となっている。グラジオメータの検出コイルの長手方向と試料容器ホルダー４７のｘ軸方向が一致するように配置した。試料容器４５には、抗体を固定し、試料４６は、目的の物質と結合した磁気マーカと未結合の磁気マーカなどを含む溶液試料であり、あらかじめ磁化した後に試料容器４５に封入した。
【００６０】
試料容器４５全体を移動させることで、９６穴の各試料をＳＱＵＩＤ上の測定位置に対してｘ方向に移動させ、その時の磁気信号変化を測定した。１列（１２試料）の測定時間は０．１秒から数秒であるが、試料をＳＱＵＩＤ上で往復させることで複数回の測定を行い、加算平均を求めた。列の１つ（１２試料）の測定がおわると、試料容器４５全体をｙ方向に列の１つの幅だけ移動させ、移動後の列について同様に測定することができる。
【００６１】
図１６にＩｇＥを１００ｐｇ含む試料から得られた磁気信号波形（実線）とＩｇＥを含まないリファレンス試料から得られた磁気信号波形（点線）を示す。ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料は約６ｍΦ０の磁気信号の変動を検出できている。レファレンス試料に比べ約４倍の変動幅が得られた。これは、円筒型磁気シールド内に残留するｙ方向の磁界により、溶液中の磁気マーカがｙ方向に配向したため、ＳＱＵＩＤに検出される磁気信号である、ｘおよびｚ方向に配向した磁気マーカが減少したためと考えられる。
【００６２】
説明した各実施例では、アレルギーに関連した抗体の一種であるＩｇＥの検出に付いて述べたが、本発明はＩｇＥだけでなく、一般の免疫検査装置が対象とする物質、例えば各種のホルモン、サイトカイン、腫瘍マーカなどの生体物質の検査やダイオキシンなど環境有害物質などの検査にも適用できることはいうまでもない。また、ここで説明した実施例では、固定抗体を使用したサンドイッチ法を例に説明したが、一般的な免疫検査において用いられている、競合法、ブリッジ法などにも適用できる。また、磁気マーカの種類に関してもマグネタイト以外の磁性体を使用した場合でも本発明の効果は有効である。また、磁気センサとしては、高温超伝導ＳＱＵＩＤ以外に、低温超伝導体（例えばＮｂやＭｇＢ２など）のＳＱＵＩＤや光ポンピング磁束計、誘導コイル、フラックスゲート磁束計、プロトン磁束計などの高感度な磁気センサを使用した場合でも、本発明の効果は有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】従来技術の磁気的免疫検査方法の手順例を示す図である。
【図２】完全に磁場が遮蔽された場合と残留磁場がある場合の磁気マーカの状態を説明する図である。
【図３】マグネトメータを使用した場合の試料の磁化方向と検出される磁気信号波形の関係を説明する図である。
【図４】１次微分平面型グラジオメータを使用した場合の試料の磁化方向と検出される磁気信号波形の関係を説明する図である。
【図５】実施例１で使用した本発明の補正用コイルを有する免疫検査装置の構成例を示す図である。
【図６】実施例１で使用した試料容器の模式図を示す図である。
【図７】本発明の実施例で使用した高温超電導ＳＱＵＩＤグラジオメータの構造を説明する図である。
【図８】実施例で使用した検査プロトコルを示す図である。
【図９】補正用コイルに電流を流さずに測定した、（ａ）ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料および（ｂ）ＩｇＥを含まないリファレンス試料から得られた磁気信号波形を示す図である。
【図１０】リファレンス試料の磁気信号波形の補正用コイル電流依存性を示す図である。
【図１１】補正用コイルに２００μＡの電流を流して測定した、（ａ）ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料および（ｂ）ＩｇＥを含まないリファレンス試料から得られた磁気信号波形を示す図である。
【図１２】補正用コイルに２００μＡの電流を流して測定した磁気信号波形から左右対称な成分を除去した（ａ）はＩｇＥを１００ｐｇ含む試料、（ｂ）はＩｇＥを含まないレファレンス試料の波形を示す図である。
【図１３】実施例２で使用した免疫検査装置の構成例を示す図である。
【図１４】実施例２で得られた（ａ）ＩｇＥを１００ｐｇ含む試料から得られた磁気信号波形と（ｂ）ＩｇＥを含まないレファレンス試料から得られた磁気信号波形を示す図である。
【図１５】実施例３で使用した免疫検査装置の構成例を示す図である。
【図１６】実施例３で得られたＩｇＥを１００ｐｇ含む試料（実線）とＩｇＥを含まないレファレンス試料（波線）の磁気信号波形を示す図である。
【符号の説明】
【００６４】
１…試料容器、１ａ…試料容器の底面、２…固定抗体、３…ブロッキング剤、５…試料、６…抗原、６ａ…固定抗体に結合している抗原、７…磁気マーカ、７ａ…固定抗体に結合している抗原に結合した磁気マーカ、７ｂ…固定抗体と結合していない溶液中の抗原と結合した磁気マーカ、７ｃ…未結合の磁気マーカ、１０…磁気マーカ、１１…磁気マーカの磁化方向を示す矢印、１３…サファイアロッド、１４…試料、１６…補正用コイル、１７…円筒部品、１８…永久磁石、１９…電磁シールド、２０…磁石の位置調整機構、２１…外槽、２２…断熱真空層、２３…内槽、２４…液体窒素、２５…銅の丸棒、２６…銅ロッド、２８…ＳＱＵＩＤ、３０…磁気シールド、３１…磁気シールド、３２…試料台、３３…固定ネジ、３４…回転機構、３５…回転軸、３６…移動ステージ（垂直方向）、３７…移動ステージ（水平方向）、３８…切欠き穴、４１…ＳＱＵＩＤ、４２…真空断熱容器、４３…円筒型磁気シールド、４４…円筒型磁気シールド、４５…試料容器、４６…試料、４７…試料容器ホルダー、４８…３軸移動機構、４９…パルス管冷凍機、５０…サファイアロッド、６０…バイクリスタル基板、６１…バイクリスタル接合面、６２…検出コイル、６３…配線パッド、６４…ＳＱＵＩＤリング、６５…粒界ジョセフソン結合、６６…検出コイルの中央部分、６７…フィードバックコイル、６８…配線パッド（フィードバックコイル用）、７０…窪み部分、７１…試料容器、７２…固定するための穴。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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