(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）のうち、少なくとも１種の微生物を油含有土壌に添加することを特徴とする油含有土壌の浄化方法。
【請求項２】
Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）を油含有土壌に添加する、請求項１記載の油含有土壌の浄化方法。
【請求項３】
油含有土壌が、原油、重油、軽油、灯油、ガソリン、潤滑油、切削油、作動油、圧延油、絶縁油、エンジンオイル、ギアオイル、グリースから選ばれる鉱油類を含有するものである、請求項２記載の油含有土壌の浄化方法。
【請求項４】
鉱油類が、炭素数Ｃ１２〜Ｃ２８の油分を含有するものである、請求項３記載の油含有土壌の浄化方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の方法に用いられる、Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）のうち、少なくとも１種の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いて油含有土壌を浄化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油含有土壌の浄化方法には、土壌洗浄、熱脱着・熱分解、バイオレメディエーションなどの技術が存在する。これらのうち、バイオレメディエーションは、微生物により有害物質を二酸化炭素や水などの無害な物質に分解する技術であり、土着微生物を栄養塩や空気（酸素）などで活性化させ有害物質を分解させる方法（バイオスティミュレーション）と有害物質の分解に有効な微生物を選定・添加する方法（バイオオーグメンテーション）の２つに大別される。
【０００３】
バイオオーグメンテーションに適用可能な微生物としては、例えば、特許文献１や特許文献２などに種々記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−４６７５６号公報
【特許文献２】特開平１１−２６６８５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオオーグメンテーションの実用化にあたっては、使用する微生物が周辺環境への影響がなく安全性の高いことが要求される。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その課題は、外来の微生物を用いて油含有土壌を浄化する新規の方法およびそれに用いる微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）を単離し、これらがいずれも鉱油類を含む油含有土壌に対して分解能力に優れることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕  Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）のうち、少なくとも１種の微生物を油含有土壌に添加することを特徴とする油含有土壌の浄化方法、
〔２〕  Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）を油含有土壌に添加する、前記〔１〕記載の油含有土壌の浄化方法、
〔３〕  油含有土壌が、原油、重油、軽油、灯油、ガソリン、潤滑油、切削油、作動油、圧延油、絶縁油、エンジンオイル、ギアオイル、グリースから選ばれる鉱油類を含有するものである、前記〔２〕記載の油含有土壌の浄化方法、
〔４〕  鉱油類が、炭素数Ｃ１２〜Ｃ２８の油分を含有するものである、前記〔３〕記載の油含有土壌の浄化方法、
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載の方法に用いられる、Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）のうち、少なくとも１種の微生物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、鉱油類を含む油含有土壌を効率的に浄化する方法およびそれに用いる微生物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係る油含有土壌の浄化方法は、上述したように、Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）のうち、少なくとも１種の微生物を油含有土壌に添加することを特徴とする。
【００１１】
本発明において「油含有土壌」とは、原油、重油、軽油、灯油、ガソリン、潤滑油、切削油、作動油、圧延油、絶縁油、エンジンオイル、ギアオイル、グリースなどの石油または石油を原料とする有機物（以下、これらをまとめて「鉱油類」という）を含む土壌をいい、例えば、石油により汚染された海岸の砂および土壌、石油により汚染された工場やガソリンスタンドの跡地の土壌、石油により汚染された廃棄物最終処分場の土壌、及び油田等の天然の状態で石油を含有する土壌を含むものである。
【００１２】
本発明においては、上記「油含有土壌」の中でも、炭素数Ｃ６〜Ｃ４４の油分（以下、「Ｃ６〜Ｃ４４成分」と略記する。他の炭素数の油分を表記するときも同様とする）を含有する油含有土壌、特にＣ１２〜Ｃ２８を主成分として含有する油含有土壌をより効率的に浄化することができる。なお、Ｃ１２〜Ｃ２８成分は軽油、重油等の主成分である。また、本発明において「浄化」とは、残留油分、油臭及び油膜の低減又は除去を意味する。
【００１３】
本発明に適用可能な微生物は、Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）およびRhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）のうち、少なくとも１種である。上記３種の微生物は、油田や油汚染土壌を分離源とし、重油を唯一の炭素源とした集積培養を経た後、寒天培地よりコロニーを単離することにより得られる。これら３種の単離菌の菌学的性質は表１及び表２に記載の通りである。
【００１４】
図１〜図３は、上記３種の単離菌とその近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子塩基配列に基づいて作成した系統樹である。Novosphingobium sp. No.2株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６）（図１において、「No.2」と表記）はNovosphingobium属細菌との相同性が高く、最近縁種であるNovosphingobium capsulatumとの相同性が９８％であることから、Novosphingobium sp. No.2株はNovosphingobium capsulatumと同種または異種ながらも非常に近い性質をもつ菌であると考えられる。
【００１５】
また、Pseudomonas sp. No.5株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７）（図２において、「No.5」と表記）はPseudomonas属細菌との相同性が高く、最近縁種であるPseudomonas citronellolisとの相同性が９９％であることから、Pseudomonas sp. No.5株はPseudomonas citronellolisと同種または異種ながらも非常に近い性質をもつ菌であると考えられる。
【００１６】
さらに、Rhodococcus sp. No.10株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８）（図３において、「No.10」と表記）はRhodococcus属細菌との相同性が高く、最近縁種であるRhodococcus erythropolisとの相同性が９９％であることから、Rhodococcus sp. No.10株はRhodococcus erythropolisと同種または異種ながらも非常に近い性質をもつ菌であると考えられる。
【００１７】
上記３種の単離菌をそれぞれ単独でＣ６〜Ｃ４４成分を含有する油含有土壌に添加すると、該土壌中の油分が効率的に分解される。また、上記３種の単離菌全てをＣ６〜Ｃ４４成分を含有する油含有土壌に添加すると、それぞれを単独で添加したときと比べて、上記土壌中の油分がさらに効率的に分解される。すなわち、上記３種の単離菌を全て油含有土壌に添加した場合、油分の分解効率について相乗効果を発揮する。
【００１８】
本発明において、上記単離菌を油含有土壌に「添加する」とは、上記単離菌を油含有土壌と接触させることをいい、上記単離菌を油含有土壌に添加する手段の他、例えば、投入する、供給する、散布する、土壌中に注入する等の方法も含む概念である。
【００１９】
油含有土壌の浄化を効率良く進めるためには、上記単離菌の好適な増殖条件となるように、上記単離菌を油含有土壌に添加すること以外に、例えば、該土壌を撹拌したり、栄養塩類を添加したり、該土壌に水分を添加したり、土壌に注入する場合には併せて空気も注入するなどして、該土壌中の酸素供給濃度、温度、水分、塩類濃度などを適宜調整することが好ましい。
【００２０】
上記単離菌は、油含有土壌中の油分のうち、特にＣ１２〜Ｃ２８成分をより効率的に分解することができる。したがって、軽油や重油等を主成分とする油含有土壌に対して上記単離菌を添加すれば、本発明の効果が最も発揮される。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、以下において、「％」は、特にことわりのない限り、重量％を示す。
【００２２】
１．微生物の単離
１−１．  単離菌１（Novosphingobium sp. No.2株）の単離
単離菌１は、新潟県柏崎市の油田を分離源とし、重油を唯一の炭素源とした集積培養を経た後、寒天培地よりコロニーを単離することにより得られた。単離菌１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を比較した結果（図１参照）、単離菌１（図１において、「No.2」と表記）は、Novosphingobium属細菌との相同性が高く、最近縁種はNovosphingobium capsulatumであった（相同性９８％）。以上の結果より、単離菌１はNovosphingobium属に属する細菌であることを確認した。単離菌１はNovosphingobium sp. No.2株と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６６として寄託されている。
【００２３】
１−２．  単離菌２（Pseudomonas sp. No.5株）の単離
単離菌２は、新潟県北蒲原郡の油田を分離源とし、重油を唯一の炭素源とした集積培養を経た後、寒天培地よりコロニーを単離することにより得られた。単離菌２の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を比較した結果（図２参照）、単離菌２（図２において「No.5」と表記）は、Pseudomonas 属細菌との相同性が高く、最近縁種はPseudomonas citronellolisであった（相同性９９％）。以上の結果より、単離菌２はPseudomonas属に属する細菌であることを確認した。単離菌２はPseudomonas sp. No.5株と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６７として寄託されている。
【００２４】
１−３．  単離菌３（Rhodococcus sp. No.10株）の単離
単離菌３は、神奈川県川崎市の土壌を分離源とし、重油を唯一の炭素源とした集積培養を経た後、寒天培地よりコロニーを単離することにより得られた。単離菌３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を比較した結果（図３参照）、単離菌３（図３において「No.10」と表記）は、Rhodococcus 属細菌との相同性が高く、最近縁種はRhodococcus erythropolisであった（相同性９９％）。以上の結果より、単離菌３はRhodococcus属に属する細菌であることを確認した。単離菌３はRhodococcus sp. No.10株と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２１５６８として寄託されている。
【００２５】
２．単離菌１〜３の菌学的性質
AP120NE及びATB BET（ともに bioMerieux社）を用いて単離菌１〜３の保持酵素、同化性及び抗生物質感受性を調べた。結果を表１及び表２に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
【表２】
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【００２８】
３．油分分解試験（実施例１〜４、比較例１）
油分濃度（Ｃ６〜Ｃ４４の全成分濃度）０．４３〜０．４９％の油含有土壌に上記で単離したNovosphingobium sp. No.2株（単離菌１）、Pseudomonas sp. No.5株（単離菌２）、Rhodococcus sp. No.10株（単離菌３）のうち、１種または３種を投入し、水分と栄養塩を供給し、上記土壌中の油分濃度の経時変化を調べた。油分濃度は、赤外分光分析法（ＩＲ法）により定量した（実施例１〜４）。
【００２９】
下記に具体的試験方法、菌の投入量、栄養塩の種類、添加量を示す。
（１）試験方法：某地油汚染土壌０．７ｋｇ（油分濃度０．４３〜０．４９％）をアルミバット（縦４０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ５ｃｍ）中に四角錘台状に盛り上げ、含水比が常に１５％に保たれるよう、適宜加水した。
（２）試験温度：室内、２０℃
（３）菌株の投入量：単離菌１〜３のうち、１種のみを投入する場合は、各菌株をそれぞれ２×１０６cell／ｇ（乾土）で投入した。上記３種の単離菌を混合投入する場合は、各菌株をそれぞれ０．６７×１０６cell／ｇ（乾土）（合計２×１０６cell／ｇ（乾土））ずつ投入した。
（４）栄養塩類の種類：窒素（硫安）、リン（過リン酸石灰）
（５）栄養塩類の添加量：窒素２５０ｐｐｍ、リン５０ｐｐｍ
（６）油分濃度の測定日：試験開始時、５、８、１４日後
【００３０】
比較例１として、上記単離菌を投入しないこと以外は、上記と同様の方法で上記土壌中の油分濃度の経時変化を調べた。結果を表３および図４に示す。
【００３１】
【表３】
0004836206.tif 000004
【００３２】
表３及び図４の結果から、単一の単離菌を投入した実施例１〜３のいずれも、比較例１に比べて油分濃度の低減率が大きく、油分の分解が促進されることが分かった。このことから、上記土壌中に存在する土着菌のみの分解に比べて、単離菌１〜３を加えた方が油分の分解能力に優れているといえる。
また、単離菌１〜３を全て投入した実施例４は、実施例１〜３に比べて油分濃度の低減率が大きく、油分の分解がさらに促進されることが分かった。具体的には、実施例４では、油分の低減率が、８日後で約３０％であり、１４日後で約４３％であった。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
表４は、本試験で使用した油含有土壌について、試験６ヶ月前に測定した全石油系炭化水素（ＴＰＨ）分析による組成分析結果である。表４によれば、本試験の６ヶ月前の油分濃度（表４の「全炭化水素量」を参照）は０．６９％であり、表３の試験開始時の油分濃度（表３の「初期値」を参照）が０．４３〜０．４９％であるから、本試験を行うまでの６ヶ月の間に油分濃度が約０．２％減少している。これは、まず炭素数が少ないＣ６〜Ｃ１２成分が分解され、続いてＣ１２〜Ｃ２８成分が一部分解されたことによるものと推定される。したがって、本試験に使用した油含有土壌中に存在する油分のうち、主成分はＣ１２〜Ｃ２８成分であり、油分全体の約９５％であると考えられる。
【００３５】
そうすると、上記の試験結果から、本試験で使用した単離菌１〜３は、いずれも油分のうち、特にＣ１２〜Ｃ２８成分の分解能力に優れた微生物（油分解菌）であるということがいえる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、鉱油類を含有する油含有土壌、特にＣ１２〜Ｃ２８成分を含有する油含有土壌をより効率的に浄化する方法およびそれに用いる微生物として広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】単離菌１とその近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列に基づく系統樹。
【図２】単離菌２とその近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列に基づく系統樹。
【図３】単離菌３とその近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列に基づく系統樹。
【図４】各種菌株投入による油分分解試験結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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