(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する食欲抑制剤。
【請求項２】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
【請求項３】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
【請求項４】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
【請求項５】
配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
【請求項６】
配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
【請求項７】
一定時間経過後に食欲が抑制される、請求項１から６の何れかに記載の薬剤。
【請求項８】
さらに速効性の食欲抑制薬を配合することにより長時間食欲抑制効果を維持することができる、請求項１から７の何れかに記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、脳内のポリペプチドＮＰＸの新規用途に関する。より詳細には、本発明は、脳内のポリペプチドＮＰＸを用いた食欲抑制剤に関する。さらに本発明は、ＮＰＸ又はＮＰＸとその受容体であるＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質を用いた肥満症および摂食障害の予防・治療薬のスクリーニング方法及び該スクリーニング方法によって得られる物質に関する。
【背景技術】  近年、食欲の調節機構が、食行動異常を呈する疾患の著しい増加に伴い注目されている。このような疾患としては、拒食症および過食症などの摂食障害や過食を呈する肥満症などが挙げられる。
摂食障害は神経性食欲不振症（ａｎｏｒｅｘｉａ  ｎｅｒｖｏｓａ；ＡＮ）および神経性過食症（ｂｕｌｉｍｉａ  ｎｅｒｖｏｓａ；ＢＮ）とに分類される。ＡＮは身体像の障害、強いやせ願望や肥満恐怖などのため不食や摂食制限をきたす結果、著しいやせと種々の精神身体症状を生じる症候群である。一方、ＢＮは強迫的に多量の食物を摂取し続け自制困難な過食のエピソードを繰り返しては、嘔吐や下剤の乱用により体重増加を防ぐという症候群である。その際、嘔吐や下剤の乱用ができずに肥満に至ることもある。
また、アメリカでは５９％が臨床的に肥満症であるとされている（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５）。
このように、抗肥満薬および摂食障害治療薬は非常に大きなマーケットとなっており、本症の好発年齢帯である思春期から青年期の女性では摂食障害は精神分裂病、神経症に次いで第３位となっている。
これらの障害の病因としてストレス、やせ礼賛などの社会的・心理的要因が挙げられる。例えば、肥満症患者にストレステストを施行してみると正常体重者の約２倍の異常者がいることが報告されている。また、絶食しているのにもかかわらず空腹感を感じなくなったり、大量の食物摂取後であるのにもかかわらず満腹感を感じなくなったりなど摂食行動の中枢性制御機構の機能異常が考えられている。
摂食行動の制御機構として視床下部を中心とした神経回路網の形成が示唆されている。視床下部は孤束核や背側迷走神経運動核の内臓機能調節系、前頭前野や扁桃体の認知−行動制御系および大脳基底核や運動野の運動調節−出力系と神経回路網を形成し、これらの情報を統合して、摂食行動制御において中心的役割を果たしている。すなわち、血中グルコース、レプチンなど末梢からの液性シグナル、消化管からの神経性シグナル（迷走神経）、さらに、上位中枢からの神経性シグナル（セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリンなど）は視床下部において統合され食行動として発現される。これまで、食行動における分子レベルでの検討はグルコース感受性ニューロンなど神経核の同定などが中心で物質レベルでの解明には至らなかった。近年、レプチンの発見により摂食行動の物質レベルでの解明が急速に進み、それに伴って、視床下部における神経ペプチドがその中心的役割を果たす調節因子として注目されてきている。
摂食に関与する神経ペプチド類として、ａｇｏｕｔｉ関連タンパク、ＮＰＹ、ガラニンおよびオレキシン（食欲亢進）、レプチン、メラノコルチン、ＣＲＦ、オキシトシンおよびコレシストキニンなど（食欲抑制）が知られている。これらの神経ペプチドは視床下部において生成・分泌され、視床下部摂食中枢に存在するそれらの受容体に結合することにより作用すると考えられている。さらに、最近、それぞれの神経ペプチドの摂食に関与する受容体サブタイプが同定・単離され創薬ターゲットとして台頭してきた。それらの代表的なものとしてＹ１およびＹ５受容体（ＮＰＹ受容体）、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３受容体（ガラニン受容体）、ＯＸ１およびＯＸ２受容体（オレキシン受容体）、レプチン受容体、ＭＣ４受容体（ａｇｏｕｔｉ関連タンパク、メラノコルチン受容体）、ＣＲＦ２受容体およびＣＲＦ結合タンパク質（ＣＲＦ受容体）などが挙げられ、受容体作用薬および拮抗薬の開発が行われている。
ヒト脳由来の受容体蛋白質は、上記の他にも多数発見されている。しかし、これらの受容体の多くは、そのリガンドが同定されていないため、どのような生理作用に関与しているかは全く知られていない。そのような受容体蛋白質の一つとしてＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体が知られている（ＷＯ２００１／１６３１６号）。
近年、ＮＰＸがＨＥＫ２９３細胞に発現させたＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質と高い結合親和性を有することが明らかとなり、ＮＰＸがＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質のリガンドであることが示された。ＮＰＸはヒトゲノム配列から機能未知の蛋白質をコードすると予測された遺伝子から合成されたペプチドで、Ｃ末端がアミド化されたＲＦアミドファミリーに属する。ＮＰＸ前駆体からプロセッシングされ、Ｃ末端のアルギニン−フェニルアラニンのモチーフから、Ｃ末端がアミド化されることが予測されている。脳内に多く分布し、視床下部にも多く分布しているペプチドであることが報告されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．３０，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊｕｌｙ  ２５，ｐｐ．２７６５２−２７６５７，２００３）。
しかしながら、これまでＮＰＸの摂食行動との関連については全く報告されていない。
また、これまで肥満症の治療には、本国においてはマジンドール（アミンポンプ阻害剤）のみが食欲抑制薬として承認されている。アメリカ合衆国においてはＳＳＲＩなどの抗うつ薬が処方されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｖｏｌ．５９，Ｓｕｐｐｌ  １５，ｐｐ．２８−３４，１９９８）。現在、肥満症患者に対してレプチン投与する臨床試験が進行中である。さらに摂食障害患者には抗うつ薬および抗不安薬が処方されている。
これらの予防または治療薬はいずれも投与後１時間以内にその効果を発揮するものであるが、投与後３時間以上経過後にその効果を発揮し、長時間維持することができるものについての報告はない。さらに、摂食行動にターゲットを当て、これに特異的に作用する化合物についての報告は何もない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ＮＰＸと病態との関連を明らかにするとともに、ＮＰＸを直接、又はスクリーニングに用いることによって、今までにない新規な作用機序を有する医薬品を開発することである。
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＮＰＸが投与後一定時間経過後に強力な食欲抑制作用を示すことを見出した。さらにＮＰＸとＮＰＸ受容体であるＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質の結合を調節する化合物が肥満症または摂食障害の予防・治療薬として有効であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する食欲抑制剤。
（２）  配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
（３）  配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
（４）  配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
（５）  配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
（６）  配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
（７）  一定時間経過後に食欲が抑制される、（１）から（６）の何れかに記載の薬剤。
（８）  さらに速効性の食欲抑制薬を配合することにより長時間食欲抑制効果を維持することができる、（１）から（７）の何れかに記載の薬剤。
（９）  下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドの有効量を投与することを含む、食欲抑制方法、並びに肥満症または摂食障害の予防または治療方法。
（ｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド：
（１０）  食欲抑制剤、あるいは肥満症または摂食障害の予防または治療剤を製造するための、下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドの使用。
（ｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド：
（１１）  下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドを用いることを特徴とする、該ペプチドの活性を促進または阻害することにより一定時間後に食欲を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法。
（ｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド：
（１２）  さらに、下記の（ｉｖ）から（ｖｉ）の何れかに記載の蛋白質または該蛋白質の部分ペプチドを用いる、（１１）に記載のスクリーニング方法。
（ｉｖ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｖ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１１）に記載の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質；
（ｖｉ）配列番号：６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ（１１）に記載の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質：
（１３）  配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを用いることを特徴とする、下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドの発現を促進または阻害することにより一定時間経過後に食欲を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法。
（ｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド：
（１４）  （１１）から（１３）の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質を含有する、食欲抑制剤。
（１５）  （１１）から（１３）の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質を含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
（１６）  （１１）から（１３）の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質の有効量を投与することを含む、食欲抑制方法、並びに肥満症または摂食障害の予防または治療方法。
（１７）  食欲抑制剤、あるいは肥満症または摂食障害の予防または治療剤を製造するための、（１１）から（１３）の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質の使用。
（１８）  配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアゴニストを含有する食欲抑制剤。
（１９）  配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアンタゴニストを含有する食欲促進剤。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例におけるマウスの摂餌量の測定結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書でいう「ＮＰＸ」、「ＮＰＸ前駆体」及び「ＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質」は公知のペプチド又は蛋白質である。ＮＰＸ、ＮＰＸ前駆体及びＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号：１、３及び５に、ＤＮＡ配列をそれぞれ配列表の配列番号：２、４及び６に記載する。
（Ａ）本発明の薬剤
本発明の食欲抑制剤、並びに肥満症または摂食障害の予防または治療剤においては、
（ｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド：
の何れかを有効成分として使用する。
本発明で言う「配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列」におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、配列番号：１又は３で表されるペプチドの機能が保持される限り制限はないが、通常、配列番号：１又は３で表されるペプチドと相同性が約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上のペプチドである。アミノ酸の変異数は一般的には１〜１０個であり、好ましくは１〜８個であり、より好ましくは１〜５個程度であり、特に好ましくは１〜３個である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。本発明においてもこのような保存性の高いアミノ酸置換を有するペプチドを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドである。ここで機能的に同等なペプチドとは、受容体との結合活性や受容体発現細胞に対する細胞刺激性等の生物学的特性が同等であり、かつ、配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと同様な食欲抑制作用を有することを意味する。
本発明で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば塩濃度が約１９ｍＭ〜４０ｍＭで、温度がホルムアミドを添加していない場合は６５〜７５℃、５０％ホルムアミド存在下では３５〜４５℃の条件下、サザンハイプリダイゼーションを行った場合に、ハイブリダイズする程度をいう。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明で言う「一定時間経過後」とは、投与対象、投与方法等により異なるが、通常、投与後２時間以上、より好ましくは５時間以上経過することを意味し、「速効性」とは、投与対象、投与方法等により異なるが、通常、投与後１時間以内、より好ましくは３０分以内にその効果を発揮することを意味する。
本発明で言う「長時間食欲抑制効果を維持する」とは、速効性の食欲抑制薬および本発明の食欲抑制剤をそれぞれ単独で投与した場合に比べて食欲抑制効果がより長く持続していることを意味し、通常２時間以上、好ましくは５時間以上、さらには１０時間以上持続することが好ましい。
本発明で言う「ペプチド」とは、未修飾のペプチドのみならず、機能的に同等な全てのペプチドも含むことを意味し、例えば、ペプチドの塩、並びにアミド化またはエステル化されたペプチドでもよい。
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）または塩基（例えば、アルカリ金属）等との塩が挙げられるが、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
本発明で用いるペプチドとしては、ヒトやそれ以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、サル等）に由来する天然のペプチドを使用することができる。本発明で用いるペプチドは、ヒト又はそれ以外の哺乳動物の細胞または組織から当業者であれば通常行いうる精製方法を用いることにより製造することができる。例えば、ヒトやそれ以外の哺乳動物の細胞または組織をホモジナイズし、酸などで抽出後、イオン交換クロマトグラフィー等を利用することにより調製することが可能である。
あるいは、本発明で用いるペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することもできる。ペプチド合成におけるアミノ基等の保護基および縮合反応の縮合剤は公知のものを使用できる。固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うことにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導入及び脱離方法についても当業者に公知である。固相合成や液相合成は、例えば、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、矢島治明および榊原俊平、２０５、（１９７７年）等に記載の方法に従って行うこともできる。
さらにまた、通常の遺伝子組み換え手法に従って、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えベクターを作製した後、該ベクターにより宿主（例えば、哺乳細胞や昆虫細胞等の適当な宿主細胞）を形質転換して形質転換体を作製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のペプチドを組み換えペプチドとして分離・精製することができる。組み換えペプチドの調製は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １６．１−１６．９等に記載の方法に従って行うことができる。
本発明で用いるペプチドは、生体内に存在する内因性のリガンド若しくはそれと機能的に同等なペプチドであるので、安全で低毒性な食欲抑制剤、あるいは肥満症または摂食障害の予防または治療剤として使用することができる。特に投与後一定時間経過後にその効力を発揮することから、公知の速効性の食欲抑制剤（例えば、マジンドール、ＭＴＩＩ（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ））と組み合わせることで、その効果を長時間維持することが可能である。
本発明においては、上記のペプチドをそのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。ペプチドを医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤などの注射剤とすることができる。
ペプチドの投与方法は経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。
ペプチドの投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、肥満患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与する場合は、例えば、肥満患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射することができる。
さらに、本発明によれば、配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアゴニストを含有する食欲抑制剤、並びに配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアンタゴニストを含有する食欲促進剤が提供される。本明細書上記した通り、配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは食欲抑制効果を有することから食欲抑制剤として有用である。従って、同様の食欲抑制効果を有する、該ペプチドに対するレセプターのアゴニストもまた食欲抑制剤として有用である。さらに、該ペプチドに対するレセプターのアンタゴニストは、配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが有する食欲抑制効果とは反対の食欲促進効果を有するものであり、食欲促進剤として有用である。配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストの種類は特に限定されず、例えば、ペプチド、ペプチド模倣体又は低分子化合物などでもよい。上記したアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、本明細書に記載のスクリーニング方法により選択することができる。なお、上記したアゴニスト又はアンタゴニストを食欲抑制剤又は食欲促進剤として使用する場合の投与形態、投与方法、投与量などは、ペプチドについて本明細書上記した場合に準じて選択することができる。
（Ｂ）本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、食欲を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法に関するものであり、下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドを用いることを特徴とする。
（ｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号：２又は４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド：
本発明のスクリーニング方法では、さらに、下記の（ｉｖ）から（ｖｉ）の何れかに記載の蛋白質または該蛋白質の部分ペプチドを用いることもできる。
（ｉｖ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｖ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質；
（ｖｉ）配列番号：６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ上記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質：
本発明で言う「配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列」におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、配列番号：５で表されるペプチドの機能が保持される限り制限はないが、通常、配列番号：５で表されるペプチドと相同性が約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは９９％以上のペプチドである。アミノ酸の変異数は一般的には１〜２０個であり、好ましくは１〜１０個であり、より好ましくは１〜７個程度であり、特に好ましくは１〜５個である。また、アミノ酸置換の具体例としては、本明細書中上記した保存性の高い置換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質である。ここで機能的に同等な蛋白質とは、リガンドとの結合活性やシグナル情報伝達作用等の生物学的特性が同等であることを意味する。
本発明で言う「結合活性を有する蛋白質」とは、測定方法や測定条件等により異なるが、例えば、上記ペプチドとの結合活性をＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス）を用いて測定した場合のＥＣ５０値が１．０〜１５．０ｎＭとなるような蛋白質を意味する。
本発明で言う「蛋白質」とは、天然型の蛋白質のみならず、機能的に同等な全ての蛋白質も含まれることを意味し、さらにそれらの塩やアミド化またはエステル化されたものであってもよい。
また、本発明で言う「部分ペプチド」としては、上記の蛋白質のうち、何れかの蛋白質の部分ペプチドであればよいが、特に本発明の蛋白質の細胞膜外部分であって、かつ、受容体結合活性を有するものが好ましい。
本発明で用いる上記した蛋白質または該蛋白質の部分ペプチドとしては、ヒトやそれ以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、サル等）に由来する天然の蛋白質を使用してもよいが、本明細書中上記した通り、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成してもよいし、遺伝子組み換え手法に従って作製してもよい。
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、［１］本発明のペプチドと受容体蛋白質又はその部分ペプチドとの結合活性を向上させる化合物のスクリーニング方法、並びに［２］本発明のペプチド又はその前駆体の発現量を向上させる化合物のスクリーニング方法を挙げることができる。このようなスクリーニング方法によって、食欲を抑制または促進する物質を選択することができる。
本発明のペプチドと受容体蛋白質との結合活性を向上させる物質のスクリーニング方法の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の方法が挙げられる。
（ａ）（ｉ）試験物質の存在下で本発明のペプチドとその受容体蛋白質を接触させ、該ペプチドと受容体蛋白質の結合活性を測定し、（ｉｉ）試験物質の非存在下での結合活性と比較して、（ｉ）での結合活性を向上または低下させる物質を選択する工程を含むスクリーニング方法。このとき結合活性を向上させる物質であれば、食欲抑制効果を有する候補物質とすることができ、低下させる物質であれば、食欲促進効果を有するの候補物質とすることができる。
（ｂ）（ｉ）試験物質の存在下で本発明のペプチドとその受容体蛋白質を接触させ、該受容体蛋白質を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを侭進する活性または抑制する活性など）の結合活性を測定し、（ｉｉ）試験物質の非存在下での細胞刺激活性と比較して、（ｉ）での結合活性を向上または低下させる物質を選択する工程を含むスクリーニング方法。このとき細胞刺激活性を向上させる物質であれば、食欲抑制効果を有する候補物質とすることができ、低下させる物質であれば、食欲促進効果を有する候補物質とすることができる。
本発明のペプチド又はその前駆体の発現量を向上させる化合物のスクリーニング方法として、具体的には、（ｉ）試験物質の存在下で本発明のペプチド発現細胞又は組織を培養し、本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定し、（ｉｉ）試験物質の非存在下でのｍＲＮＡ量と比較して、（ｉ）でのｍＲＮＡ量を向上または低下させる物質を選択する工程を含むスクリーニング方法が挙げられる。このときｍＲＮＡ量を向上させる物質であれば、食欲抑制効果を有する候補物質とすることができ、低下させる物質であれば、食欲促進効果を有する候補物質とすることができる。
上記の通り、本発明で得られた知見を利用することにより、食欲を抑制又は促進する物質、特に投与後一定時間経過後にその効力を発揮する物質のスクリーニングを行うことが可能である。
本発明のスクリーニング方法に供される試験物質としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が用いられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。またペプチドライブラリーや化合物ライブラリー等を用いることもできる。
被験物質による食欲を抑制又は促進させる効果は、公知の方法を用いて確認することができる。例えば肥満症又は摂食障害モデル動物（例えば、マウス）にスクリーニングで得られた物質を経口的に又は非経口的に投与し、該モデル動物の摂餌量を測定することにより確認することができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、食欲を抑制又は促進する効果を有するので、安全で低毒性な治療・予防などの医薬として使用することができる。特に投与後一定時間経過後にその効力を発揮することができるものあるので、公知の速効性の治療・予防薬（例えば、マジンドール、ＭＴＩＩ（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ））と組み合わせることで肥満症や摂食障害の予防又は治療薬として、その効果を長時間維持することが可能である。
得られた物質が塩を形成する場合には、その塩を医薬として使用することもできる。塩としては、生理学的に許容される無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）または塩基（例えば、アルカリ金属）等との塩が挙げられるが、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
上記した食欲を抑制する効果を有する物質は、そのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて該物質を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。該物質を医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤などの注射剤とすることができる。
該物質の投与方法は経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。
該物質の投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、肥満患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与する場合は、例えば、肥満患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射することができる。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】  夜間摂餌に対するＮＰＸの抑制作用を検討した。
ＩＣＲ系マウス雄（汎用系統である当マウスは日本チャールスリバーより購入した）を３匹／ケージで飼育し、各群５ケージづつに分けて、披検物質投与群のマウスには、所定量のＮＰＸ（固相合成法により合成）あるいは陽性対照薬としてメラノコルチン−４受容体作動薬のＭＴＩＩを０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水に溶かして調製した被検物質を、また、被検物質無投与対象群のマウスには０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水をそれぞれ脳室内に投与した。投与の際、マウスをｈａｌｏｔｈａｎｅで軽麻酔し、ハミルトン注射器に２７ゲージの針を付け、注射針を正中線から２ｍｍ外側部と、耳の基部の前方を通って引かれた線の交点に頭蓋骨から垂直に突き刺し、脳室内に薬液を注入した。投与用量は５μｌとした。マウスは１２時間の明期／暗期サイクル（午前７時ライト点灯）で飼育し、投与は午後７時前後に行った。投与１５分後から、マウスには餌と水を自由に摂取させ、餌供給後、１、２、５、１２、２３、２５および２６時間後の摂食量を測定した。なお、被検物質投与による絶食誘発摂食亢進抑制作用に有無は被検物質無投与対照群のマウスの摂食量との比較により行った。餌供与開始直後から１、２、５、１２、２３、２５および２６時間後の各群のマウスの摂餌量は、図１に示した。
図１中の記号＊はＤｕｎｎｅｔｔ検定（母平均について対照群と処理群の対比較のみを同時に検定するための多重比較法）により有意差検定を行った時、Ｐ＜０．０５でリン酸緩衝化生理食塩水群と比較して有意な差があることを示す。記号＊＊はＤｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った時、Ｐ＜０．０１でリン酸緩衝化生理食塩水群と比較して有意な差があることを示す。
図１に示した結果から明らかな通り、ＭＴＩＩを投与した場合、投与１時間以内に摂餌量が有意に抑制され、５時間経過後にその効果が徐々に減少していることがわかる。ＮＰＸの３ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌを投与した場合は、投与後２時間まででは、摂餌量を抑制する効果は見られず、５時間経過後には摂餌量が有意に抑制され、１２時間後もその効果が持続していることがわかる。
【産業上の利用可能性】  本発明のペプチドＮＰＸは肥満症または神経性過食症の予防・治療薬として有用である。特に一定時間経過後にその効果が発揮されることから、公知の速効性の肥満症や過食症の予防・治療薬と組み合わせることで長時間効果の持続することが可能である。さらに本発明のスクリーニング方法で得られる化合物は肥満症又は摂食障害の予防・治療薬として有用である。
【図１】
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【配列表】
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