(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチラス属に属する微生物に由来する、かつ、以下の（１）〜（５）の特徴を有するイヌリン合成酵素；
（１）スクロースに作用してイヌリンを生成するが、ケストース、マルトース、ラクトース、トレハロース、セロビオースには作用しない；
（２）Ｎ末端アミノ酸配列が配列番号１で表わされる；
（３）分子量 ：４５，０００〜５０，０００；
（４）至適温度 ：４０〜５０℃；
（５）至適ｐＨ ：７〜８（４５℃）。
【請求項２】
前記バチラス属に属する微生物がバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４５０）である、請求項１記載のイヌリン合成酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載のイヌリン合成酵素、該酵素を産生する微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物をスクロースに接触させてイヌリンを生成することを特徴とする、イヌリンの製造方法。
【請求項４】
前記微生物がバチラス属に属する微生物である、請求項３記載のイヌリンの製造方法。
【請求項５】
前記バチラス属に属する微生物がバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４５０）である、請求項４記載のイヌリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規イヌリン合成酵素およびそれを用いたイヌリンの製造方法に関する。
背景技術
イヌリンとは多糖類の一種で、広く自然界に分布しており、ダリア、キクイモ、オグルマなどのキク科植物の塊茎やチコリの根などにコロイド状で存在している。その性質は、澱粉とは異なり、温水に溶け、その構造はスクロースのフラクトース側にＤ−フラクトフラノースがβ−（２→１）結合で脱水重合したものである。分子量は、フラクトースの鎖長により異なり、植物由来のイヌリンは、分子量の異なる化合物の集合体といえる。その平均重合度に関しては生物学辞典（岩波書店．第２版（１９７８））によれば３２〜３４、理化学辞典（岩波書店．第３版（１９７９））によれば約３０、生化学辞典（東京化学同人，第１版（１９８５））によれば分子量約５０００、Ｗ．ｐｒａｚｎｉｋらの文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３４８，１８７−１９７（１９８５））によれば、その重合度は植物の種類によって多少の差異がみられるものの平均分子量は２２８２−１７０００という記載があり、その分子サイズは一定の範囲内に限定されている。
イヌリンは難消化性の食物繊維であるためダイエタリーファイバーとして着目されており、さらにビフィズス菌の増殖効果などがあるため、近年の健康志向ブームとあいまって需要は伸びつつある。
従来、イヌリンは主として海外で生産されている。海外では、ダリア、チコリ、キクイモといった植物を栽培してその根茎からの搾汁液を乾燥することにより製造され、一般的な食材として利用されている。一方、わが国においてはそれらの植物の商業的栽培が困難であるため、イヌリンは製造されていない。
そのため、イヌリンの入手は輸入に頼らざるを得ず、価格も国産の類似機能を有する物質よりも高価であり、産業利用上問題があるといえる。また、植物由来のイヌリンは、抽出原料が植物であるがゆえに収量が作柄によって左右され、その上収穫後直ちに抽出を行わなければ自己消化などによりイヌリン含量が目減りするといった問題点を有する。さらに、植物由来のイヌリンの場合、フラクトース鎖長がまばらであるため精製が極めて困難となっている。このため、現在利用できる植物由来のイヌリンは、様々な鎖長のイヌリンが含まれている溶液を原料として大雑把に分画した後、噴霧乾燥して商品化したものである。従って、イヌリンとしての純度は高くても、鎖長といった点からすれば均一性に欠けるといった課題が残されている。
一方、上記のようなイヌリンを抽出し得る高等植物には当然のことながらイヌリンを生成する酵素が含まれており、そのような植物から抽出して得られた酵素を使用してスクロースからイヌリンを生成することは既にＭ．Ｌｕｓｃｈｅｒらによって明らかにされている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ３８５，３９（１９９６））。そのメカニズムは、スクロース同士のフラクトシル転移を行うスクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＳＳＴ）と、重合度３以上のフラクタン同士の転移を行うβ−（２→１）フラクタン：β−（２→１）フラクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＦＴ）という２種の酵素の共同作用によるというものである。
しかしながら、植物体より酵素を大量に調製するのはかなりの時間と労力を要するが故に、工業規模での利用は現実的ではない。
また、植物由来のイヌリン以外にも、微生物の酵素を作用させてイヌリン類似物を製造する方法がこれまでに報告されている。
例えば、１９２０年にＮ．Ｋｏｐｅｌｏｆｆらにより、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）の分生胞子がインベルターゼ活性を有し、スクロースからレバンタイプのフラクタンを生成することが報告され（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１７１（１９２０））、後にＪ．Ｒ．Ｌｏｅｗｅｎｂｅｒｇらにより、この多糖がフラクトースのβ−（２→１）結合からなるイヌリンタイプの構造を有していることが明らかにされた（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３，６４３，（１９５７））。
その後、１９７３年にＧ．Ｋａｗａｉらは、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）の分生胞子をスクロースとともに反応させるとポリフラクタンおよびオリゴフラクタンの生成が認められたこと、高等植物由来のイヌリンのようにβ−（２→１）結合からなる直鎖状ポリフラクタンではあるが、末端にグルコースが存在せず、分子の大きさも高等植物由来のイヌリンよりもはるかに大きい２０００万程度であることを報告した（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，（９），２１１１，（１９７３））。
さらに、中久喜氏らは、スクロースをアスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）の菌体で処理し、オリゴフラクタンと高分子フラクタンを得る方法について提案した。生成したフラクタンの構造は末端にグルコースを有する、フラクトースがβ−（２→１）結合した直鎖状ポリフラクタンではあったが、この場合のオリゴフラクタンは重合度が５以下のものであり、一方、高分子フラクタンは分子量が１．８×１０５〜１．４×１０７の範囲のものであったと記載している（特開昭６１−１８７７９７）。
原田らもアスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）の分生胞子を使用してスクロースからポリフラクタンを製造する方法について提案したが、この場合のポリフラクタンの分子量は１０００万程度であったと記載している（特開平５−３０８８８５）。
日高らはスクロースにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属あるいはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の生産するフラクトシルトランスフェラーゼを作用させ、β−（２→１）結合した直鎖状フラクタンを製造する方法を提案した（特願昭５５−４０１９３）。しかしながら、この場合に生成するフラクタンは、スクロースにフラクトースが１〜４分子結合したオリゴ糖であって、分子の大きさといった点でイヌリンとは別のものとされている。
さらに、虫歯の原因菌とされているストレプトコッカス・ミュータンス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の中にもイヌリンの類似物を生成する酵素を生産するものがあることをＲｏｓｅｌｌらが報告した（Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，Ｂ２８，５８９）。しかし、そのイヌリン類似物は分子量が２０００万とイヌリンに比べかなり巨大な分子であり、さらにはβ−（２→１）結合の直鎖にβ−（２→６）結合が含まれているといった点でイヌリンとは異なっていた。
上記したように、これまでに微生物由来の酵素を用いて製造された物質は、その性質が先に記載した植物由来のイヌリンとは大きく異なる（植物由来のイヌリンと比較してその分子が巨大である、あるいは結合形式が異なる等）ため、イヌリンとは区別してイヌリン型ポリフラクタンと呼ばれている。
従って、現在のところ、微生物由来の酵素を利用するイヌリン製造技術は確立されていないといえる。
発明の開示
本発明は、高純度で一定した品質のイヌリンを効率よく、大量に生産する手段を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物、特にバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が上記課題を解決し得る酵素を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
（ｉ）すなわち、本発明は、以下の作用および基質特異性を有することを特徴とするイヌリン合成酵素である；
作用および基質特異性：スクロースに作用してイヌリンを生成するが、ケストース、マルトース、ラクトース、トレハロース、セロビオースには作用しない。
（ｉｉ）また本発明は、前記イヌリン合成酵素が微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物から得ることができるものである、上記（ｉ）のイヌリン合成酵素である。
（ｉｉｉ）さらに本発明は、前記微生物がバチラス属に属する微生物である、上記（ｉｉ）のイヌリン合成酵素である。
（ｉｖ）また本発明は、前記バチラス属に属する微生物がバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）である、上記（ｉｉｉ）のイヌリン合成酵素である。
（ｖ）さらにまた本発明は、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つのイヌリン合成酵素であって、そのＮ末端アミノ酸配列が配列番号１で表わされるものである、前記イヌリン合成酵素である。
（ｖｉ）また本発明は、上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれか１つのイヌリン合成酵素、該酵素を産生する微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物をスクロースに接触させてイヌリンを生成することを特徴とする、イヌリンの製造方法である。
（ｖｉｉ）さらにまた本発明は、前記微生物がバチラス属に属する微生物である、上記（ｖｉ）のイヌリンの製造方法である。
（ｖｉｉｉ）また本発明は、前記バチラス属に属する微生物がバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）である、上記（ｖｉｉ）のイヌリンの製造方法である。
以下に本発明の方法を詳細に説明する。
本発明のイヌリン合成酵素は、スクロースに作用してイヌリンを生成するが、ケストース、マルトース、ラクトース、トレハロース、セロビオースには作用しないという作用および基質特異性を有することを特徴とするイヌリン合成酵素である（前記（ｉ）のイヌリン合成酵素）。
上記の作用および基質特異性は、後記の実施例１に記載したようにして決定されたものである。
植物由来の酵素は、前述の通り、２種の酵素の共同作用によってスクロースからイヌリンを生成することが知られている。すなわち、第一段階として２分子のスクロースから１分子のケストース（３糖）を生成する酵素の作用があり、第二段階としてこれら同士をさらに重合させる酵素の作用によってスクロースからイヌリンが生成されるというものである。
一方、本発明のイヌリン合成酵素は、スクロースからケストースの遊離が著しく乏しい上に、上記したように本発明の酵素をケストースに作用させてもイヌリンの生成が認められないことより、既存の植物由来の酵素とはスクロースに対する作用形式が本質的に異なるものと判断される。したがって本発明の酵素はこれまでに知られるものがない、スクロースからイヌリンを直接合成する新規な酵素である。
また、本発明のイヌリン合成酵素は、下記の理化学的性質を有する；
分子量    ：４５，０００〜５０，０００
至適温度  ：４０〜５０℃
熱安定性  ：４５℃を越えると徐々に失活し始め、５０℃で７０％、６０℃
で４０％の残存活性を示す。
至適ｐＨ  ：７〜８（４５℃）
ｐＨ安定性：ｐＨ６以上で安定。
上記各性質は、以下に記載の手法によって決定されたものである。
分子量：本明細書中実施例１（後述）で調製した精製酵素標品、およびマーカータンパク質としてバイオラド社の標準タンパク質（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ）；分子量６７０，０００、Ｇａｍｍｅｒｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ）；分子量１５８，０００、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ｃｈｉｃｋｅｎ）；分子量４４，０００、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（ｈｏｒｓｅ）；分子量１７，０００）を用いて、セファクリルＳ−３００のカラムを使用したファーストプロテイン液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）のゲル濾過法により本発明のイヌリン合成酵素の分子量を測定した。
至適温度：精製酵素標品（同上）を使用し、各温度（３７，４５，５０，６０，７０℃；ｐＨ７）で酵素をスクロース溶液と反応させた後、反応液中に生成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法により定量して単位時間当たりのグルコース生成量から活性をみた（データを図１に示す）。また、図１から、上記条件下で該酵素の失活が最小限に抑制され、かつ酵素反応が速やかに進む温度は４５℃であることがわかる。尚、上記グルコースオキシダーゼ法においては、１単位（ｕｎｉｔ）の酵素活性は１分間に１μｍｏｌｅのグルコースを生成させる酵素量とした。
熱安定性：精製酵素標品（同上）を各温度（３７，４５，５０，６０，７０℃；ｐＨ７）で３０分間熱処理した酵素をスクロース溶液と反応させ、反応液中に生成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法により定量して単位時間当たりのグルコース生成量から活性をみた（データを図３に示す）。
至適ｐＨ：精製酵素標品（同上）を各ｐＨ（４．２，５．０，６．０，７．０，８．０，８．９）でスクロース溶液と反応させた後（３７℃）、反応液中に生成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法により定量して単位時間当たりのグルコース生成量から活性をみた（データを図２に示す）。
ｐＨ安定性：精製酵素標品（同上）を各ｐＨ（４．２，５．０，６．０，７．０，８．０，８．９）に調製し、これを４℃にて２４時間放置した後にスクロース溶液と反応させ（３７℃）、反応液中に生成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法により定量して単位時間当たりのグルコース生成量から活性をみた（データを図４に示す）。
さらに、本発明のイヌリン合成酵素は、そのアミノ酸配列を後述の実施例１に記載した通りに解析した場合、そのＮ末端に部分アミノ酸配列：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号１）を有する。
従って、本発明のイヌリン合成酵素は、例えば前記部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を決定し、この塩基配列を元に適当なプライマーを設計・合成してＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、本発明のイヌリン合成酵素をコードする全塩基配列が決定された後は、例えばその全遺伝子配列をクローニングし、これを公知の遺伝子工学的手法を用いて発現させることにより本発明のイヌリン合成酵素を得ることができる。あるいは、該酵素を産生する微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物から採取することもできる（前記（ｉｉ）のイヌリン合成酵素）。
前記微生物は、本発明のイヌリン合成酵素を産生するものであれば特に限定されるものではなく、公知の菌株、または新たに土壌・海水等から分離した菌株であってもよい。あるいは、それらの菌株に変異処理（例えば、紫外線照射、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ））等を施すことによりその酵素のイヌリン生成能を向上させた変異株菌体であってもよい。
具体的には、例えば、バチラス属に属する微生物（前記（ｉｉｉ）のイヌリン合成酵素）、特にバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）（ブダペスト条約に基づき、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に国際寄託されている。原寄託日：２０００年（平成１２年）６月１４日）を挙げることができる（前記（ｉｖ）のイヌリン合成酵素）。
このバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）は、本発明者らにより新たに自然界より分離された菌株であり、以下の菌学的性質を元にバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻（１９８６）に従って検討した結果、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌株であると同定されたものである；
バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）の菌学的性質
（ａ）形態
１）細胞の形および大きさ：桿菌、１×２〜３μｍ
２）運動性：有り
３）胞子：形成する
４）グラム染色性：不定
（ｂ）培地における生育状態
１）コロニー形態：円形、周縁波状、低凸状、光沢、クリーム
（ｃ）生理学的性質
１）カタラーゼ：陽性
２）オキシダーゼ：陽性
３）ゼラチンの加水分解：陰性
４）生育温度２５−３７℃、５０℃以上では生育しない
５）酸素に対する態度：好気性（嫌気条件下でも生育できる）
６）糖類から酸の生成（＋：酸産生、−：酸産生せず）
フルクトース        ＋
グルコース          ＋
キシロース          −
スクロース          ＋
ラクトース          ＋
マルトース          ＋
トレハロース        ＋
マンノース          ＋
メリビオース        ＋
イヌリン            ＋
セロビオース        ＋
マンニトール        −
グリセロール        −
７）硝酸塩の還元：還元しない
８）β−ガラクトシダーゼ：陽性
９）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
１０）リシンデカルボキシラーゼ：陰性
１１）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性
１２）クエン酸の利用性：陰性
１３）硫化水素の生成：陰性
１４）ウレアーゼ：陰性
１５）トリプトファンデアミナーゼ：陰性
１６）インドール産生：陰性
１７）アセトイン産生：陰性
１８）ゼラチナーゼ：陰性
１９）カゼインの加水分解：陰性
２０）馬尿酸塩の加水分解：陰性
２１）澱粉の加水分解：陽性
培養菌体とは、適切な条件下で培養された前記微生物を意味し、生菌であっても凍結乾燥されていてもよく、あるいはまたアセトンパウダー等の形態であってもよい。
培養菌体の処理物とは、本発明の酵素をその機能を失うことなく採取できるものであれば特に限定されないが、例えば、上記培養菌体の破砕物、菌体抽出液、固定化菌体等を意味する。
培養菌体の破砕物および菌体抽出液とは、該菌体を公知の破砕方法、例えば超音波破砕法、ダイノミル破砕法、フレンチプレス破砕法により破砕して得られる物質および抽出液等を意味する。また、固定化菌体とは、公知の固定化法、例えば包括法、担体結合法で前記菌体を固定化し、必要に応じて架橋したものを意味する。包括法としては、例えば、カラギーナンやアルギン酸等の天然高分子を用いる方法が挙げられる。
本発明のイヌリン合成酵素を微生物の培養液から採取する場合、例えば、次のようにして実施することができる；
微生物の培養
まず、前記微生物を適切な条件下で培養する。
前記微生物を培養するために適した培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有するがこれらに限定されるものでなはく、その他必要に応じて、アミノ酸、ビタミン等の通常の培養に用いられる栄養源も適宜用いることができる。
培地に添加する炭素源としては、当分野で公知の炭素源、例えば、スクロース、グルコース、フラクトース、マルトースなどの糖質を用いることができる。しかしながら、微生物としてバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ〜１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）を使用する場合は、スクロースを主炭素源とした液体培地を用いることが最も好ましく、それにより本発明のイヌリン合成酵素の活性を向上させることができる。これらの炭素源は、適当な濃度（例えば、０．５〜５．０％）で、単独または混合して使用することができる。また、これらの炭素源は、単離・精製された形態であっても他のものに含有された形態であってもよく、例えばスクロースを炭素源とする場合、スクロース精製物の代わりにスクロース粗糖または廃糖蜜等のスクロース含有物を用いてもよい。
培地に添加する窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー等の有機窒素源のほか、硫酸、硝酸、リン酸のアンモニウム塩などの無機窒素源を単独または混合して用いることができるが、これらに限定されない。
無機塩類としては、例えば、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄等の硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩等をそれぞれ単独でまたは組み合わせて用いることができるが、これらに限定されない。
上記の組成を有する培地のｐＨは、ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７〜８である
前記微生物の培養は、振とう培養またはジャー・ファーメンターを用いて通気条件下で行うことができる。培養温度は２５℃〜３７℃の範囲が好ましい。また、培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間であればよく、５〜９６時間、好ましくは１５〜７２時間である。
本発明のイヌリン合成酵素の採取
本発明のイヌリン合成酵素の採取は、その酵素活性が主として上記微生物（培養菌体）の培養上清中に認められるため、例えば、その培養液を採取することにより実施することができる。
培養液の採取は、公知の固液分離法、例えば、培養液を遠心分離する方法、あるいは膜濾過により分離する方法などを用いて実施することができるが、これらに限定されない。
上記の通りにして採取された本発明のイヌリン合成酵素は、前記培養液等の液状形態で粗酵素液としてそのまま後述の本発明のイヌリンの製造方法に用いることも可能であるが、好ましくは濃縮して使用する。
濃縮方法としては、当業者に公知の手法、例えばアセトン、イソプロパノールによる溶媒沈殿法、硫安分画法、膜濃縮法などが用いられるが、これらに限定されない。
さらに、上記酵素液を公知の方法により固定化することもできる。固定化方法としては、例えばイオン交換体への結合法、樹脂や膜などとの共有結合・吸着法・高分子物質を用いた包括法などが用いられるがこれらに限定されない。
また、本発明のイヌリン合成酵素は、粗酵素（例えば、上記の粗酵素液）のまま使用することもできるが、当業者に公知の方法、例えば市販の樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等によってさらに精製することもできる。
上記樹脂としては、例えば、東ソー株式会社製のＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥトヨパール６５０、トヨパールＨＷ５５、ファルマシア製のセファクリルＳ−３００を用いることができる。
具体的には、本発明のイヌリン合成酵素の採取および精製は、実施例１に記載したようにして実施することができる。
また、本発明のイヌリンの製造方法は、前記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのイヌリン合成酵素、該酵素を産生する微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物をスクロースに接触させてイヌリンを生成することを特徴とする（前記（ｖｉ）のイヌリンの製造方法）。
「スクロースに接触させる」とは、具体的には、スクロースを含有する糖液に前記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのイヌリン合成酵素、該酵素を産生する微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物を添加し、これらが反応液中でスクロースを基質としてイヌリンを生成しうる条件下で反応させることを意味する。これにより、生成されたイヌリンを含有する反応液を得ることができる。
前記微生物は、上記本発明のイヌリン合成酵素についての説明において既に記載したものと同様の意味を有する。
本発明のイヌリンの製造方法に使用し得る「微生物の培養液」には、既に詳細に記載したように、培養液そのもの（粗酵素液）、あるいは濃縮、固定化、精製された形態のものが含まれる。
また、本発明のイヌリンの製造方法に使用し得る「培養菌体」には、既に記載したように、生菌そのまま、凍結乾燥されたもの、さらにはアセトンパウダー等の形態のものが含まれる。
さらに、本発明のイヌリンの製造方法に使用し得る「培養菌体の処理物」には、既に記載したように、例えば、上記培養菌体の破砕物、菌体抽出液、固定化菌体等が含まれる。培養菌体の破砕物および菌体抽出液とは、該菌体を公知の破砕方法、例えば超音波破砕法、ダイノミル破砕法、フレンチプレス破砕法により破砕して得られる物質および抽出液等を意味し、これを粗酵素液として用いることもできる。また、固定化菌体とは、公知の固定化法、例えば包括法、担体結合法で前記菌体を固定化し、必要に応じて架橋したものを意味する。包括法としては、例えば、カラギーナンやアルギン酸等の天然高分子を用いる方法が挙げられる。
前記糖液中の適切なスクロースの濃度は、例えば、３〜６８％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜６０％（ｗ／ｗ）とする。糖液中に含め得るその他の成分については、上記本発明のイヌリン合成酵素を説明する際に定義したものと同様である。
反応に用いる本発明のイヌリン合成酵素、または該酵素を産生する微生物の培養液または培養菌体もしくはその処理物の濃度は、反応液中のスクロース（基質）を十分に利用しうる濃度、例えば、スクロース４０〜６０％（ｗ／ｗ）の場合、イヌリン合成酵素の活性が０．４−２０ｕｎｉｔ／ｍＬ反応液となる濃度とすることが好ましい。
スクロースを基質としてイヌリンを生成するのに適切な条件としては、例えば、２０〜７０℃の反応温度、好ましくは４０〜５０℃の反応温度、またｐＨ６〜８の範囲の反応液を用いることが好ましい。さらに、該反応液のｐＨを保つためにリン酸緩衝液を用いることもできる。反応時間は本発明のイヌリン合成酵素の使用量により適宜変更することができるが、０．１〜１００時間、好ましくは０．５〜７２時間とする。
反応液中に生成されたイヌリンは、公知の方法に従い精製することができる。
精製は、例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂あるいは活性炭等で精製し、これを減圧濃縮あるいは逆浸透膜によって濃縮し、次いで冷却してイヌリンの結晶を得ることにより実施することができる。あるいはまた、反応液にエタノールなどの有機溶媒を添加することにより、イヌリンを沈殿させて回収することも可能であるが、これらに限定されない。
また、４０℃に達しない温度で反応を行った場合、反応生産物であるイヌリンが反応液に溶解し切れずに反応中に析出する場合があるが、その場合は、結晶を通常の固液分離法により回収することも可能である。
具体的には、本明細書中実施例２および３に記載したようにして、本発明のイヌリンの製造方法を実施することができる。
本発明のイヌリンの製造方法を用いることにより、平均重合度が８〜２０である、すなわち従来の植物由来のイヌリンに比べて分子量の分布がシャープである（すなわち、一定の品質を有する）という特徴を有するイヌリンを得ることができる。
本発明のイヌリン合成酵素を使用することにより、安価なスクロースを原料として一定の品質を有するイヌリンを効率よく大量に製造することができるが、イヌリンやフラクタンを原料として製造される物質も、本酵素と併用することによってスクロースからの直接的製造が可能となるのはいうまでもなく、当業者であれば容易に類推できることである。
イヌリンやフラクタンを原料として製造される物質としては、例えば、イヌロオリゴ糖、フラクトースの環状二糖（ジフラクトースアンヒドリド）やシクロイヌロオリゴ糖（サイクロフラクタン）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０００年第１９５２４５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕  本発明のイヌリン合成酵素の作用および基質特異性
本発明のイヌリン合成酵素が、既存の植物由来の酵素と異なり、新規であるということを確かめる手段として、本酵素をケストースに作用させてイヌリンが生成するのかどうかを調べた。また、本酵素の基質特異性を調べるため、スクロース以外の２糖類としてラクトース、トレハロース、マルトース、セロビオースについても本酵素を作用させ、イヌリンが生成するかどうか調べた。
（本発明のイヌリン合成酵素の精製酵素標品の調製）
バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）を、スクロース０．５〜２％（ｗ／ｖ）、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、リン酸２カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％を含むｐＨ７〜８の液体培地にて３０℃で２日間振とう培養した。次に、その培養上清に固形の硫酸アンモニウムを加え、７０％飽和で沈殿する画分を遠心分離機を使用して集めた。そして、この沈殿物をｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、透析チューブに入れた後、同緩衝液で十分に透析して本発明の酵素の粗酵素液を得た。次いで、常法に従って東ソー株式会社製のＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥトヨパール６５０、トヨパールＨＷ５５、ファルマシア製のセファクリルＳ−３００を使用して該粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、本発明のイヌリン合成酵素を精製した。これを精製酵素標品とし、次の操作に用いた。
（精製酵素標品の部分アミノ酸配列の解析）
前記精製酵素標品のＮ末端アミノ酸配列を、以下の操作に従って決定した。
まず、前記精製酵素標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％）を常法に従って行った後、ＰＶＤＦ膜にトランスファーしてクマシーブリリアントブルーにて染色した。次に、５０ｋＤａの目的バンド部分の膜を切り出して充分に水洗し、この切り出し膜を０．５％ポリビニルピロリドンにて１時間処理した。さらにその膜を充分に水洗した後、Ｎ末端アミノ酸配列の分析をＨＰ  Ｇ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ヒューレットパッカード社）により行った。
その結果、前記精製酵素標品のＮ末端アミノ酸配列は、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号１）であった。
（イヌリンの生成反応）
上記各基質の１００ｍＭ溶液を調製し、これに０．７４ｕ／ｍＬの上記精製酵素標品を等量加え、３７℃で１７時間反応させた後、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣ条件
カラム：信和化工  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｎ（８×３００ｍｍ）
溶媒  ：  水
流速  ：  ０．５ｍＬ／分
温度  ：５０℃
検出器：  示差屈折計
その結果、本発明の酵素が作用してイヌリンを生成させた基質はスクロースのみであり、それ以外の２糖類には全く作用しなかった。ケストースに対しては、９０％以上がそのまま残存し、主生成物はニストースであり、イヌリンは生成しなかった。
〔実施例２〕  微生物の培養に適切な炭素源の決定
本発明のイヌリン合成酵素を微生物から採取する際、どのような炭素源を用いて該微生物を培養することが好ましいかを調べるため、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）を用いて以下の実験を行った。
（粗酵素液の調製）
ペプトン１％、酵母エキス０．５％、麦芽エキス０．３％、リン酸カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％を含むｐＨ８の培地に下記表１に示す各種炭素源を２％添加し、常法に従って調製滅菌し、この培地にバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）を１白金耳ずつ接種した。これを３０℃で２日間振とう培養し、培養上清に含まれる本発明のイヌリン合成酵素の活性を測定した。
（酵素活性の測定）
４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させた２０％のスクロース溶液０．２ｍＬに、上記培養上清（酵素液）０．２ｍＬを加え、３７℃で１２０分間反応後、５分間煮沸して反応を停止させた。反応により生成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法により測定した。これは、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）がスクロースをグルコースとフラクトースに分解するインベルターゼ活性をほとんど含まず、スクロースを基質とした酵素反応によってイヌリンを生成する際にグルコースを副生するためである。尚、１単位（ｕｎｉｔ）の酵素活性は１分間に１μｍｏｌｅのグルコースを生成させる酵素量とした。結果を表１に示す。
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表１から明らかなように、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）は炭素源としてスクロースあるいはそれを含有した素材（廃糖蜜）を使用した際に活性が高かった。
〔実施例３〕  イヌリンの製造
（１）粗酵素液の調製
スクロース２％，ペプトン１％，酵母エキス０．５％，麦芽エキス０．３％，リン酸カリウム０．２％，硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％を含むｐＨ８の培地を常法に従って調製滅菌し、この培地にバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．２１７Ｃ−１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５０）を１白金耳ずつ接種した。３０℃で２日間振とう培養し、遠心分離により除菌した培養上清を得た。
この培養上清中に含まれる酵素について実施例１と同様にして酵素活性を測定したところ、０．８ｕ／ｍＬであった。
この培養上清に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、これを以降の酵素液として使用した。このときの酵素の活性は１６ｕ／ｍＬであった。
（２）粗酵素液を用いたイヌリンの生成反応
２ｇのスクロースを４４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２．７５ｍＬに溶解し、これに上記（１）で得られた酵素液を０．２５ｍＬ添加し、３７℃にて反応を行った。その後、反応液の一部を上記実施例１と同様の条件でＨＰＬＣにより分析した。
その結果を図５に示した。図から明らかなように、上記酵素液をスクロースに作用させることによってイヌリンが生成した。また、反応生成物は時間経過とともに増加し、およそ３日で平衡に達し、スクロースからの収率は約５０％であった。
（３）反応産物の同定
上記（２）で得られた反応液中に著量析出したイヌリン結晶を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分）により回収した。
次いで固形分で約５％となるように水で溶解した後、３倍容のエタノールを加えることによって沈殿させ、結晶を洗浄した。この操作を２回繰り返し、最終的に得られた沈殿を凍結乾燥して重量を測定したところ３５０ｍｇであった。
本試料について上記（２）と同様にしてＨＰＬＣを行ったところ、純度は９８．８％であった。以下、得られた結晶について各種の同定・確認試験を行った。（ａ）核磁気共鳴吸収（ＮＭＲ）
上記で得られた結晶のほかに、市販のイヌリン（商品名ＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＨＰ  ：ＯＲＡＦＴＩ社製）を標準として、さらに参考例としてβ−（２→６）結合を有するＳｅｒｒａｔｉａ Ｌｅｖａｎｉｃｕｍ由来のレバン（和光純薬製）についても同様に解析を行った。ＮＭＲ機器としてＪＥＯＬ  ｌａｍｂｄａ−５００  ＦＴ−ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ５００ＭＨｚの分光計を用い、重水中で測定した。
これらそれぞれについて得られた１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図６に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７にまとめて示す。これらを比較した結果、前記結晶はイヌリンと同一のピークパターンを示した。
（ｂ）ＨＰＬＣによる分子量の推定
前記結晶を下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、分子量の推定を行った。なお、標準試料としてはＯＲＡＦＴＩ社製のＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＨＰ（平均重合度２３）とＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＳＴ（平均重合度１０）を用いた。検量線を作製して算出したところ、ＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＨＰの保持時間は１７．２３分、ＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＳＴの保持時間は１７．７５分であり、前記結晶物質の保持時間は１７．３９分であった。これより、前記結晶物質の平均重合度は１８であると推定された。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）
溶媒  ：  水
流速  ：  ０．５ｍＬ／分
温度  ：  ５０℃
検出器：  示差屈折計
（ｃ）イヌリナーゼ消化試験
前記結晶に市販のイヌリナーゼ（商品名フラクトザイムＬ：ＮＯＶＯ社製）を作用させた後の反応液について、実施例１と同様の条件でＨＰＬＣ分析を行ったところ、前記結晶はグルコースとフラクトースに完全に分解されており、その生成比率は１：１７であった。これにより該結晶の平均重合度は１８と推定された。
（ｄ）マススペクトル
前記結晶の分子量をマススペクトルにより測定した結果、該結晶の平均重合度は１７〜１８であることがわかった。
上記（ａ）〜（ｄ）の結果から、スクロースを原料として得られた前記結晶はイヌリンであると判定された。
〔実施例４〕
（１）粗酵素の調製
実施例３（１）と同一の条件下で培養を行い、酵素活性が０．６ｕ／ｍＬの粗酵素液を調製した。
（２）粗酵素を用いたイヌリンの生成反応
８０ｇのスクロースに２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２０ｍＬ、粗酵素液１００ｍＬを加えて溶解し、攪拌条件下（１４７ｒｐｍ）で３７℃，４日間の反応を行った。
次に、反応液を実施例１と同様の条件でＨＰＬＣ分析した。反応生成物は時間経過とともに増加し、３日ないし４日で平衡に達した。なお、スクロースからの収率は約３７．５％であった。
（３）反応産物の同定
上記（２）で得られた反応液を、逆浸透膜を用いて約２倍に濃縮し、４℃で冷却することによりイヌリン結晶を析出させた。これを遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分）により固液分離し、沈殿部分を回収し、実施例２（２）と同様に凍結乾燥して重量を測定したところ５ｇであった。本試料のＨＰＬＣ（実施例１と同様の条件）における純度は９９．６％であった。以下、得られた結晶について実施例３（３）と同様に各種の同定・確認試験を行った。
（ａ）核磁気共鳴吸収（ＮＭＲ）
前記結晶はイヌリンと同一のピークパターンを示した。ＮＭＲ機器として、ＪＥＯＬ  ｌａｍｂｄａ−５００  ＦＴ−ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ５００ＭＨｚの分光計を用い、重水中で測定した。
（ｂ）ＨＰＬＣによる分子量の推定
前記結晶を実施例３（３）に示したＨＰＬＣ条件で数回分析を行い、分子量の推定を行った。その結果、ＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＨＰの保持時間は１７．２３分、ＲＡＦＴＩＬＩＮＥ  ＳＴの保持時間は１７．７５分であり、前記結晶物質の保持時間は１７．５９分、１７．７０分、１７．７８分および１７．８２分であった。これより、該結晶物質の平均重合度は８〜１４であると推定された。
（ｃ）マススペクトル
前記結晶の分子量をマススペクトルにより測定した結果、該結晶の平均重合度は１３〜１４であることがわかった。
上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の結果から、スクロースを原料として得られた該物質はイヌリンであると判定された。
本明細書中で引用した全ての文献は、そのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、効率よくかつ工業的にも生産可能な方法で、大量に高純度で一定の品質を有するイヌリンを製造するための新規イヌリン合成酵素、およびそれを用いたイヌリンの製造方法が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のイヌリン合成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図２は、本発明のイヌリン合成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図３は、本発明のイヌリン合成酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
図４は、本発明のイヌリン合成酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
図５は、実施例３の反応におけるイヌリン生成の経時変化を示す図である。
図６は、実施例３の各物質についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。ａに反応生成物、ｂに市販イヌリン、ｃに試薬レバン（和光純薬製）についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図７は、実施例３の各物質についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。ａに反応生成物、ｂに市販イヌリン、ｃに試薬レバン（和光純薬製）についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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