(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性、ウレアーゼ活性抑制、胃内定着抑制、ＩＬ−８生成抑制の能力を有するラクトバシルスアシドフィルスＨＹ２１７７（Lactobacillus acidophilus HY2177) ＫＣＣＭ１１１５４Ｐ菌株。
【請求項２】
ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性、ウレアーゼ活性抑制、胃内定着抑制、ＩＬ−８生成抑制の能力を有するラクトバシルスカセイＨＹ２７４３（Lactobacillus casei HY2743) ＫＣＣＭ１１１５５Ｐ菌株。
【請求項３】
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ２１７７（Lactobacillus acidophilus HY2177) ＫＣＣＭ１１１５４Ｐ菌株を有効成分とする胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍に効能がある乳酸菌製剤。
【請求項４】
ラクトバシルスカセイＨＹ２７４３（Lactobacillus casei HY2743) ＫＣＣＭ１１１５５Ｐ菌株を有効成分とする胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍に効能がある乳酸菌製剤。
【請求項５】
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ２１７７（Lactobacillus acidophilus HY2177) ＫＣＣＭ１１１５４Ｐ菌株を有効成分とする胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍に効能がある発酵乳。
【請求項６】
ラクトバシルスカセイＨＹ２７４３(Lactobacillus casei HY2743) ＫＣＣＭ１１１５５Ｐ菌株を有効成分とする胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍に効能がある発酵乳。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は胃潰瘍の原因菌として知られた抗菌活性を有するラクトバシルスアシドフィルス（アシドフィルス菌）ＨＹ  ２１７７、ラクトバシルスカセイ（カセイ菌）ＨＹ  ２７４３及びそれを用いた乳酸菌製剤と発酵乳に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、慢性胃炎、十二指腸疾病と密接に関連があるものとして知られたヘリコバクターピロリは、１９８３年ウォレンとマーシャルが患者の胃幽門から分離して報告した（Ｊ．Ｒ．Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｊ．Ｍａｒｓｈａｌｌ：Ｌａｎｃｅｔ、１２７３〜１２７５、１９８８）。前記ヘリコバクターピロリは胃粘膜上皮細胞間接合部で棲息しながら慢性胃潰瘍を誘発するグラム陰性肝菌で、胃粘膜で湾曲型又はＳ字形の肝菌として観察され、その大きさは０．４〜１．２５μｍ程度である。ヘリコバクターピロリの最も特異な生化学的特性は尿素をアンモニアと二酸化炭素に分解する酵素、ウレアアミドヒドロラーゼであるウレアーゼの非常に強い生産能があることである。したがって、前記ヘリコバクターピロリは、胃粘膜の血漿滲出液又は組織液内の尿素を分解して菌体周囲をアルカリ性にすることで、胃内の強酸を中和させるものと知られている。
【０００３】
前記ヘリコバクターピロリの他の特徴は、菌体の一側面又は両側面に膜で取り囲まれた鞭毛（ｆｌａｇｅｌｌａ）が一つずつ又は糸塊として存在しているため、ねっとりした環境でも移動できることである。ヘリコバクターピロリの運動性は大腸菌が動けない粘度を有する粘液より約２０倍以上の粘液でも動けるものと知られている。このような特性のため、サリチル酸塩（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）又はエタノールのような化合物以外では浸透しにくい胃粘液層を貫いて入ることができ、粘液内でも自由に移動しながら胃上皮細胞の接合部に容易に付着できるものと知られている。
【０００４】
ヘリコバクターピロリの正確な汚染経路又は伝染源については未だに正確に証明されてはいないが、経口的方法により伝達、感染されるものと推定されている。また、成人のおよそ８０％程度がこの菌に感染されているが、臨床症状を示していないし、いずれかの発病促進因子の影響により慢性的な胃潰瘍、十二指腸潰瘍を誘発するものと知られている。この胃潰瘍、胃炎、十二指腸潰瘍の治療薬としては、シメチジン、ラニチジン、ファモチジンなどのＨ2受容体拮抗薬、オメプラゾールなどのプロトンポンプ阻害薬などがある。これらは治療効果は高いが、主として胃酸分泌抑制に対する薬理作用を持っているため、再発率も高い。これは、ヘリコバクターピロリを直接除去していないためであると推定されている。
【０００５】
次いで、１９９４年２月米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）では、ヘリコバクターピロリ感染患者に初期又は再発の有無にかかわらず、胃酸分泌抑制剤に加えて抗菌剤治療を勧告している。また、ヘリコバクターピロリの除菌が消化性潰瘍の新たな治療法として台頭している。更に、最近にはビスマス製剤、アモキシシリン、メトロニダゾール又はビスマス製剤、テトラサイクリン、メトロニダゾールを消化性潰瘍患者に同時に投与する三重療法により８０％内外の治療効果を得たという報告がある。
【０００６】
しかし、前記抗生物質治療は、一般の感染症の治療に使用される抗生物質より多くの量が処方され、投与期間もたいてい長期間であるため、新たな耐性菌株が現れる危険性が高く、副作用の発生可能性も内在する。
【０００７】
したがって、最近では、抗生物質に代わって天然素材又は乳酸菌を用いるヘリコバクターピロリの除菌が試験されている。タバク（Ｔａｂａｋ）などはタイム（Ｔｈｙｍｅ）から（Ｊ．ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｇｙ，１９９６，８０，６６７〜６７２）、ディカー（Ｄｉｋｅｒ）とハセリック（Ｈａｓｃｅｌｉｋ）は茶からヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を報告し（Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１９，２９９〜３００）、ミドロ（Ｍｉｄｏｌｏ）などは乳酸菌から（Ｊ．  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９５，７９，４７５〜４７９）、バチア（Ｂｈａｔｉａ）などはラクトバシルスアシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）からヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を確認した（Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，Ｏｃｔ．，２３２８〜２３３０）。ネスラーはラクトバシルスアシドフィルス菌株をヘリコバクターピロリ除菌のための抗胃炎薬、抗潰瘍薬に用いたが（ＪＰ  ９４−９８７８２）、バゾリ（Ｂａｚｚｏｌｉ）などは２０人を対象とした臨床実験でネスラーのラクトバシルスアシドフィルスを８週間にわたり長期投与した結果、ヘリコバクターピロリの除菌に有効な結果が得られなかったと報告した（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９２，１０２，Ａ３８）。ワカモト製薬株式会社はプロバイオティックスとしてラクトバシルスサリバリウスとラクトバシルスブレビス（乳酸短杆菌）を抗胃炎薬、抗潰瘍薬及び発酵食品の有効成分に用いた（ＪＰ９７−２４１１７３）。
【０００８】
しかし、前記特許の場合は、胃内定着性と胃炎発生メカニズムのインターロイキン−８生成抑制による結果で、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性又はウレアーゼ活性抑制などヘリコバクターピロリに対する直接的な除菌効果にはアプローチできない問題点があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記問題点に鑑みてなされたもので、本発明の目的は、胃炎、胃潰瘍の原因菌として知られたヘリコバクターピロリに対する抗菌活性、ウレアーゼ活性抑制、胃内定着抑制、インターロイキン−８生成抑制の能力を有する乳酸菌を提供し、これを有効成分とする胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍の予防薬と治療薬を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明のヘリコバクターピロリに対して抗菌活性を有するラクトバシルスアシドフィルスＨＹ２１７７、ラクトバシルスカセイＨＹ２７４３及びそれを用いる製剤は、人間から分離、保存されているラクトバシルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属の乳酸菌のうち、韓国の胃潰瘍患者から分離したヘリコバクターピロリＫＳ  ５１菌株に対する抗菌活性を有する乳酸菌を選択し、前記選択された乳酸菌に対してヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性抑制能力と胃内定着性抑制能力を有する乳酸菌を再選択し、ヘリコバクターピロリによる胃炎発生メカニズムに関係するインターロイキン−８の生成抑制能力を比較測定して最終的に選択したものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
本発明者らは人間から分離、保存していたラクトバシルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属の乳酸菌のうち、韓国の胃潰瘍患者から分離したヘリコバクターピロリＫＳ  ５１菌株に対する抗菌活性を有する乳酸菌を選択した。この乳酸菌に対してヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性抑制能力と胃内定着性抑制能力を有する乳酸菌を再選択した。そして、ヘリコバクターピロリによる胃炎発生メカニズムに関係するインターロイキン−８の生成抑制能力を比較測定し、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＹ  ２１７７，  寄託機関：韓国種菌協会，寄託番号：ＫＦＣＣ  １１１４２号，  寄託年月日：２０００．２．１１．）とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＨＹ  ２７４３，寄託機関：韓国種菌協会，寄託番号：ＫＦＣＣ  １１１４３，寄託年月日：２０００．２．１１．）を最終的に選択した。
【００１３】
菌株特性
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３をＭＲＳ培地に３７℃で２４時間培養したときの生理学的特性を下記の表１に示した。
【００１４】
【表１】
0004730634.tif 000002
【００１５】
抗菌活性
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を１２％脱脂粉乳に０．１％接種し３７℃で２４時間培養した後、抑制環方法によりヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を測定した。その結果、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７はおよそ１８．９±１．５ｍｍの抑制環、ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３はおよそ１４．２±１．０ｍｍの抑制環を現することから、ほかの乳酸菌に比べヘリコバクターピロリに対する抗菌活性が高い（後述する実施例１参照）。
【００１６】
また、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の混合培養はヘリコバクターピロリに対する抗菌活性が単独培養に比べて抗菌活性があるため、相乗効果をもたらすことを確認した（後述する実施例６参照）。
【００１７】
ヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を１２％脱脂粉乳に０．１％接種し３７℃で２４時間培養した後、ΔｐＨ方法によりヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果を測定した。ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３がヘリコバクターピロリウレアーゼ活性をおよそ９０％程度抑制することが示された（後述する実施例２参照）。
【００１８】
ヘリコバクターピロリの胃内定着抑制効果
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を１２％脱脂粉乳に０．１％接種し３７℃で２４時間培養した。ヘリコバクターピロリが胃上皮細胞であるＡＧＳ細胞に定着するとき、この乳酸菌培養液の定着抑制効果を予防及び治療の側面で測定した。予防の側面でＡＧＳ細胞に乳酸菌をまず投与した後、ヘリコバクターピロリを感染させた場合、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３が７０％以上の定着抑制率を示した。治療の側面において、ＡＧＳ細胞にヘリコバクターピロリをまず感染させ、乳酸菌を投与した場合は、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３が５０％以上の定着抑制率を示した（後述する実施例３参照）。
【００１９】
ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるインターロイキン−８生成抑制効果
ヘリコバクターピロリの感染により誘導、生成されるインターロイキン−８に対し、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の抑制効果をエリザ法（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）で測定した。その結果、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３がヘリコバクターピロリとともに培養された場合は、ヘリコバクターピロリ感染により誘導、生成されるＩＬ−８の量をおよそ８５％と９０％以上抑制することが示された（後述する実施例４参照）。
【００２０】
動物実験によるヘリコバクターピロリ感染抑制効果確認
ヘリコバクターピロリ感染に対する乳酸菌の予防及び治療効果を４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスで確認した。その結果、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３をまず投与してヘリコバクターピロリの感染を予防した場合、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７菌株は生菌数とウレアーゼ活性の測定結果、それぞれ９３％と９０％の予防率を示した。ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の場合は、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果ともに９０％の予防率を示した。
【００２１】
また、ヘリコバクターピロリをまず感染させた後、選択された乳酸菌を投与した治療の側面において、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７を投与した場合、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果はそれぞれ８７％と８３％の治療率を示した。ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を投与して感染されたヘリコバクターピロリを除菌した場合は、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果はそれぞれ８３％と７７％の治療効果を確認した。
【００２２】
したがって、ヘリコバクターピロリの感染に対してラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を使用すると、高い予防と治療効果が得られることを確認した。
【００２３】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。しかし、つぎの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で当業者により通常の変化が可能であるのはもちろんである。
【００２４】
実施例１
ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を有する乳酸菌の分離
成長剤と発酵乳に使用される乳酸菌を対象としてヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を比較した。乳酸菌のヘリコバクターピロリに対する抗菌活性の測定にはシリンダ法（ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用した。乳酸菌は１２％スキムミルクに１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種して３７℃で２４時間培養した。まず、板当たり四つのシリンダを設け、シリンダの外側にブルセラ寒天を２５ｍｌずつ注ぎ凝固させた。１０９ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクターピロリをブルセラブロスに懸濁し、３ｍｌのブルセラソフト寒天に１７０μｌずつ加えた。ヘリコバクターピロリを加えたブルセラソフト寒天を予め製作した培地に注いだ後、３７℃のＣ０2培養器で凝固させた。シリンダを除去し、ホールに乳酸菌培養液１７０μｌを加えた。３７℃のＣ０2培養器で２４〜４８時間培養した後、現れた抑制環の大きさを測定、比較した。この際に、シリンダは直径８．１ｍｍのものを使用した。
【００２５】
下記の表２に示すように、ラクトバシルスの場合は、菌株によって違うが、殆どの菌株がヘリコバクターピロリに対して抗菌活性を持っていることが確認された。しかし、ビフィドバクテリウム属とエンテロコッカス属（連鎖球菌属）の場合は抗菌活性が示されなかった。ラクトバシルスのなかでは、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７が１８．９±１．５、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１８５が１５．６±１．７、ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３が１４．２±１．０、ラクトバシルスプランタルムＨＹ  ２２０７が１３．８±０．９の抑制環を示した。したがって、ヘリコバクターピロリに対して優れた抗菌活性を表す乳酸菌株としてラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１８５、ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３、ラクトバシルスプランタルム  ＨＹ  ２２０７を選択した。
【００２６】
【表２】
0004730634.tif 000003
【００２７】
実施例２
ヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果
抗菌活性により選択した４菌株の乳酸菌を対象としてヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果を測定した。ヘリコバクターピロリをブルセラ寒天で２日間培養した後、２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、４℃で６分間超音波破砕した。１１０×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を収集してヘリコバクターピロリ粗−ウレアーゼとして使用した。乳酸菌は１２％スキムミルクに１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種して３７℃で２４時間培養した。乳酸菌のヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制能の比較はまず１３．６ｍｌのウレアブロスに１．６ｍｌの乳酸菌培養液を添加した後、ｐＨを６．５に補正した。これに８００μｌのウレアーゼを添加し、室温で２時間反応させながら３０分間隔でｐＨの変化を確認した。
【００２８】
選択された乳酸菌等に対してヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制の効果を測定して図１に示した。ここで使用したヘリコバクターピロリ粗−ウレアーゼの蛋白質の含量は０．５２〜０．６１ｍｇ／ｍｌ程度であった。選択された乳酸菌のヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制の効果を測定した結果、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３のみがヘリコバクターピロリウレアーゼ活性も抑制することが示された。図１に示すように、対照群が反応２時間後にｐＨ８．７程度とウレアーゼ活性によるｐＨが高くなるに対し、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３がウレアーゼに添加された場合は、反応２時間後にもｐＨが６．７程度を維持していた。したがって、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３によりヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性がおよそ９０％程度抑制されることが確認された。
【００２９】
実施例３
ＡＧＳ細胞を用いたヘリコバクターピロリ胃内定着抑制の効果
ヘリコバクターピロリに対して抗菌活性効果を示した乳酸菌４菌株に対してヘリコバクターピロリの胃内定着抑制の効果をつぎのように予防と治療の観点で確認した。乳酸菌は１２％スキムミルクに１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種して３７℃で２４時間培養した後、実験に使用した。まず、予防効果は、ＡＧＳ細胞（１０５細胞／ウエル）を６培地に付着させ、乳酸菌培養液とＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地を入れ３時間反応させた。ヘリコバクターピロリを培地当たり１０６細胞接種して１時間付着させ、板シェーカーを用いて３回洗浄した後、滅菌蒸留水１ｍｌを入れ１時間反応させた。細胞を収集して遠心分離した細胞ペレットにウレアブロス１ｍｌを入れ３７℃で１時間反応させた後、吸光度（５６０ｎｍ）を測定した。治療効果は、ＡＧＳ細胞（１０５細胞／ウエル）を６培地に付着させ、ヘリコバクターピロリを培地当り１０６細胞接種し３時間付着させた。乳酸菌培養液とＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地を入れ、１時間反応させ、板シェーカーにて３回洗浄した後、滅菌蒸留水１ｍｌを入れて１時間反応させた。細胞を収集して遠心分離した細胞ペレットにウレアブロス１ｍｌを入れ、３７℃で１時間反応させ、吸光度（５６０ｎｍ）を測定した。この際に、対照群としては１２％スキムミルクを使用した。
【００３０】
図２に示すように、予防の側面において、乳酸菌がまず投与された場合は、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３のみが７０％以上のヘリコバクターピロリ定着抑制効果を示し、また、ヘリコバクターピロリが感染された後乳酸菌が投与された治療的側面においても、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３のみが５０％以上の定着抑制効果を示した。したがって、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３のみがヘリコバクターピロリに対する抗菌活性、ウレアーゼ活性抑制、胃内定着抑制に対する能力を持っていることを確認した。
【００３１】
実施例４
ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるインターロイキン−８生成抑制効果
ヘリコバクターピロリの感染により誘導された胃上皮細胞でのインターロイキン−８の生成に対してラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の生成抑制効果を測定した。
【００３２】
ヘリコバクターピロリを１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３とともに４℃、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。それぞれの細胞ペレットを１ｍｌのハンクス液  Ｆ１２培地に懸濁し、各懸濁液の少量を取り１：５０に希釈した後、６６０ｎｍで懸濁度を測定して菌濃度実験条件に合わせた。
【００３３】
細胞集団＝１６．９５×Ａ６６０×（希釈因子）×１０８／ｍｌ
ヘリコバクターピロリ＝１．０８４×１６．９５×５０×１０８＝９．１８×１０８
ラクトバシルス＝１．４０８×１６．９５×５０×１０８＝９．１８×１０８各培地は下記の４群に分け２回繰り返して処理した。Ａ群はＡＧＳ細胞のみを培養した群であり、Ｂ群はＡＧＳ細胞にラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３のみを、Ｃ群はＡＧＳ細胞にヘリコバクターピロリのみを処理した。Ｄ群はラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３懸濁液１００μｌを添加して７．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌとなるようにし、１時間後にヘリコバクターピロリ懸濁液１００μｌを同じ濃度で再び添加した。全ての群に対し、培養液からそれぞれ０、６、１２、２４、３６、４８時間にサンプルを取り、エリザ法（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）で測定した。
【００３４】
Ａ：対照群
Ｂ：ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７（ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３）処理群
Ｃ：ヘリコバクターピロリ処理群
Ｄ：ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７（ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３）＋ヘリコバクターピロリ処理群
１）サンプリング
板培地（Ｐｌａｔｅ  ｗｅｌｌ）内の培地を収集した後、４℃、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液をエッペンドルフチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅ）に移した後、−７０℃で貯蔵した。
【００３５】
２）標準溶液
ＲＤ５Ｐ（５×）２．０ｍｌを蒸留水で５倍に希釈した後、５．０ｍｌを取り、ＩＬ−８標準溶液バイアルに添加して２，０００ｐｇ／ｍｌのストック（ｓｔｏｃｋ）を製造した。２倍希釈により８濃度の１００μｌ標準溶液を準備した。
【００３６】
３）分析（Ａｓｓａｙ）
分析希釈液（ＲＤ１−８）１００μｌを板培地に入れ、５０μｌのサンプルと標準溶液を添加した。  共溶液（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）１００μｌを加えた後、常温で２時間半の間振動を与えた。板を４００μｌの洗浄緩衝液で６回洗浄し、これに試薬Ａと試薬Ｂをそれぞれ１：１で混ぜ合わせた基質溶液２００μｌを添加した。板を３０分間定置した後、色変化を観察しつつ４９２ｎｍで吸光度を観察した。
【００３７】
ヘリコバクターピロリが胃粘膜の上皮細胞と相互作用するとき、多様なサイトカインの生成を促進することになり、このなかでもＩＬ−８の生成（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）が最も著しく表れる。そして、ＩＬ−８は胃炎の直接的な原因となる好中球又はマクロファージまで誘導することになる。したがって、ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるＩＬ−８の生成を抑制することが胃炎発生を抑制するための１方法となり得る。図３ａ及び図３ｂに示すように、ヘリコバクターピロリの感染有無によって、生成されたＩＬ−８の量に大きな違いを示した。ヘリコバクターピロリがない培養試料では、１０時間経過後にもＩＬ−８の生成が殆どないが、ヘリコバクターピロリ感染菌は２，４００〜３，０００ｐｇ／ｍｌ水準のＩＬ−８の生成が観察された。しかし、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７又はラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３がヘリコバクターピロリとともに培養された場合は、ヘリコバクターピロリの感染によるＩＬ−８の生成量が４００〜７００ｐｇ／ｍｌに減少することを確認した。したがって、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３がヘリコバクターピロリの感染により誘導、生成されるＩＬ−８の量をおよそ８５％と９０％以上それぞれ抑制することが理解された。
【００３８】
実施例５
動物実験によるヘリコバクターピロリ感染の予防、治療効果の確認
ヘリコバクターピロリの感染に対する乳酸菌の予防と治療効果をマウスにより確認した。実験に使用されたＢＡＬＢ／ｃマウスはマウスの胃腸管内に存在してウレアーゼ活性を示すヘリコバクターフェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ）が存在しないものだけを選別して使用した。使用したＢＡＬＢ／ｃマウスは４週齢の雌性で、各群当たり３０匹を使用し、２５℃、５０％湿度、ＳＰＦ条件の下に飼育しながら実験した。この際に、陰性対照群としては、ヘリコバクターピロリ懸濁液の代わりに７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液のみを０．５ｍｌずつ経口投与した１５匹のマウスを使用し、陽性対照群としては、ヘリコバクターピロリを７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度に懸濁して経口投与した１５匹のマウスを使用した。
【００３９】
１）予防効果
マウスにラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を飲用水とともにそれぞれ一日に２〜５×１０１０細胞で１４日間投与した後、７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に懸濁した２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクターピロリ菌液を２日間マウス当たり０．５ｍｌずつ６回にわたり感染させた。感染６週後、各実験群の胃を摘出し、胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性の有無を測定することで、ヘリコバクターピロリ感染に対する予防効果を確認した。
【００４０】
２）治療効果
ヘリコバクターピロリを７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度に懸濁し、この菌液を２日間マウスに０．５ｍｌずつ６回にわたり感染させた。ヘリコバクターピロリがマウスの胃内に完全に定着した感染６週後、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を飲用水とともにそれぞれ一日に２〜５×１０１０細胞で３週間投与した。投与後、各実験群の胃を摘出し、胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性を測定することで、ヘリコバクターピロリ感染に対する治療効果を確認した。
【００４１】
３）胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性の測定
摘出した胃組織は、胃内固形分を除去した後、迅速に２等分して１／２は１０％馬血清の添加されたブルセラブロスに浸漬させ、均質化してブルセラ寒天板に分散させておいた。板は湿度の高い１０％ＣＯ2培養器で３７℃で５〜７日間培養した後、現れたコロニーを確認してヘリコバクターピロリの存在の有無を確認する。残りの１／２はウレアブロスに浸漬させ、湿度の高い１０％ＣＯ2培養器で３７℃で５日間培養しつつ色の変化を観察してヘリコバクターピロリの存在の有無を判断した。
【００４２】
ヘリコバクターピロリの感染に対するラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の予防と治療効果を表３に示した。陰性対照群の場合、感染６週後にもヘリコバクターピロリが全く感染していないし、一方陽性対照群の場合は、感染６週後に１００％ヘリコバクターピロリ感染率を示した。しかし、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３をまず投与してヘリコバクターピロリの感染を予防した場合、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７菌株は生菌水とウレアーゼ活性の測定結果、それぞれ９３％と９０％の予防率を示した。ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の場合は、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果共に９０％の予防率を示した。
【００４３】
また、ヘリコバクターピロリをまず感染させた後、選択された乳酸菌を投与した治療の側面において、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７を投与した場合、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果、それぞれ８７％と８３％の治療率を示した。ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を投与して、感染されたヘリコバクターピロリを除菌した場合は、生菌数とウレアーゼ活性の測定結果、それぞれ８３％と７７％の治療効果を確認した。
【００４４】
したがって、ヘリコバクターピロリの感染に対してラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を使用すると、高い予防、治療効果が得られることを確認した。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
実施例６
菌株混合培養による抗菌活性の相乗効果
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の混合培養による抗菌活性の相乗効果をつぎのように確認した。１２％スキムミルクにラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を０．１％ずつ接種し３７℃で２４時間混合培養した後、培養液によるヘリコバクターピロリの抗菌活性を実施例１と同じシリンダ方法で確認した。そして、各菌株を１２％スキムミルクに０．０５％接種し３７℃で２４時間単独培養液を対照群として使用し、実験は３回繰り返し実施した。
【００４７】
図４に示すように、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の単独培養時、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性はそれぞれ１８．７±０．７と１５．３±１．１と表れた。これに対し、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の混合培養によるヘリコバクターピロリに対する抗菌活性は１９．０±０．８と表れた。その結果、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性において、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の混合培養が単独培養に比べて相乗効果をもたらすことが分かった。
【００４８】
実施例７
発酵乳製造
脱脂粉乳から無脂乳固形分含量を８〜２０重量％に調節した原料乳を７２〜７５℃で１５秒間殺菌した。殺菌された原料乳を一定温度まで冷却させた後、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３を１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種して、ｐＨ４〜５となるまで培養した。培養の完了後、培養液を冷却させた。一方、果汁濃縮液０．１〜５０重量％、食餌繊維０．１〜２０重量％、ブドウ糖０．５〜３０重量％、オリゴ糖０．１〜１５重量％、カルシウム０．００１〜１０重量％、ビタミン０．０００１〜５重量％などを溶かしてシロップを製造した。こうして製造されたシロップを殺菌してから冷却し、前記培養液と一定の割合で混合、撹拌して均質化させた後、容器に包装して発酵乳を製造した。こうして製造された発酵乳は、官能検査の結果、風味、物性、全体的な味において良好な結果を示した。
【００４９】
実施例８
乳酸菌菌沫の製造
ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３をＭＲＳブロスに１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種し３７℃で１８〜２４時間ｐＨ−調節発酵（ｐＨ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を実施した。ｐＨ調節は３０％ＮａＯＨを中和剤としてｐＨ５．７±０．２で実施した。培養完了後、４℃で１０，０００×ｇで遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体は５％スキムミルクに２．５％乳漿、５％スクロースが含有された保護剤と同量で混合された後、凍結乾燥機により粉末化した。こうして製造されたラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の乾燥菌沫はすべて１×１０１１ｃｆｕ／ｇ以上の生菌数を示した。
【００５０】
実施例９
乳酸菌製剤の製造
実施例７で製造した乳酸菌菌沫から乳酸菌食品、整腸剤などの乳酸菌製剤を製造した。ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の乾燥菌沫２０重量％にオリゴ糖１０重量％、無水ブドウ糖２０重量％、結晶果糖５重量％、ビタミンＣ２重量％、果物粉末香５重量％、アロエ５重量％、食餌繊維１５重量％、車前子（オオバコの種子）の皮１８重量％を混合してスティック又は瓶に一定量分株して包装した。こうして製造された乳酸菌製剤は５×１０８ｃｆｕ／ｇ以上の生菌数を維持した。
【００５１】
【発明の効果】
以上の実施例から分かるように、本発明によるヘリコバクターピロリに対して抗菌活性を有するラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７、ラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３及びそれを用いる乳酸菌製剤と発酵乳は胃炎、胃潰瘍の原因菌として知られたヘリコバクターピロリに対して抗菌活性、ウレアーゼ活性抑制、胃内定着抑制、インターロイキン−８生成抑制能力を有する効果があり、ひいてはこれを用いて発酵乳、乳酸菌食品、整腸薬などの製品に製造して摂取する場合、ヘリコバクターピロリの感染による胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍の予防と治療が可能な効果を有する。
【００５２】
また、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３をともに用いた場合は、抗菌活性において有機的な相乗効果、つまりシナージー効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３によるヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制率の比較結果を示すグラフ。
【図２】  ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３のヘリコバクターピロリ胃内定着抑制を示すグラフ。
【図３】  図３ａ及び図３ｂはそれぞれヘリコバクターピロリ感染により誘導されるインターロイキン−８生成に対するラクトバシルスアシドフィルスＨＹ
２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の抑制効果を示すグラフ。
【図４】  ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性において、ラクトバシルスアシドフィルスＨＹ  ２１７７とラクトバシルスカセイＨＹ  ２７４３の混合培養による相乗効果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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