(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を包含する、単離された標的哺乳類細胞の核内染色体ＤＮＡに核酸セグメントを組み込む方法。
In vitroで構築されたＭｕ転位複合体であって、ＭｕＡトランスポザーゼ(i)および該ＭｕＡトランスポザーゼにより認識され結合された一対のＭｕ末端配列と、該一対のＭｕ末端配列の間に挟まれた挿入配列とからなるトランスポゾンセグメント(ii)を含むＭｕ転位複合体を標的哺乳類細胞中にエレクトロポレーションにより送達して、該トランスポゾンセグメントを標的細胞の核内染色体ＤＮＡへ転位により組み込む工程。
【請求項２】
該核酸セグメントを、標的細胞の核内染色体ＤＮＡのランダムな位置またはほぼランダムな位置に組み込むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該標的細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該標的細胞がマウス細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該挿入配列が、哺乳類細胞において選択可能なマーカーを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該Ｍｕ転位複合体の標的細胞中への送達を、該Ｍｕ転位複合体の濃縮画分を用いて行なうことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該標的細胞を、核内染色体ＤＮＡへの転位を促進する条件下でインキュベートする工程をさらに包含する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
下記の工程を包含する、標的哺乳類細胞のプールから挿入変異体ライブラリーを構築する方法。
ａ）In vitroで構築されたＭｕ転位複合体であって、ＭｕＡトランスポザーゼ(i)および該ＭｕＡトランスポザーゼにより認識され結合された一対のＭｕ末端配列と、該一対のＭｕ末端配列の間に挟まれた、選択可能なマーカーを含む挿入配列とからなるトランスポゾンセグメント(ii)を含むＭｕ転位複合体を標的哺乳類細胞中にエレクトロポレーションにより送達して、該トランスポゾンセグメントを標的細胞の核内染色体ＤＮＡへ転位により組み込む工程。
ｂ）選択可能なマーカーを含有する細胞をスクリーニングする工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学、特に、ＭｕファージのＤＮＡ転位複合体（DNA transposition complex of bacteriophage Mu）の用途に関する。具体的には、本発明は、真核細胞（eukaryotic cells）のための遺伝子導入システムであって、in vitroで構築されたＭｕ転位複合体（in vitro assembled Mu transposition complexes）を標的細胞に導入するシステムを提供する。細胞内で、この複合体はトランスポゾン構築物（transposon construct）の細胞核酸への組込みを容易に仲介する。本発明はさらに、真核細胞のゲノムに挿入変異を生じさせるためのキットを提供する。このキットは、例えば、挿入変異体ライブラリーの構築に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学をうまく応用するためには、ほとんどすべての場合において、標的細胞に核酸を効率的に導入することが必須要件である。多様な種類の細胞に核酸を導入することにより、生体における遺伝子機能の研究や、外来遺伝子の発現や、細胞機能（例えばタンパク質の発現）の調節を行うための手段が提供される。安定に導入された挿入物は配列決定計画（sequencing projects）においてプライマーの結合部位としても用いることができる。原則として、核酸導入は一過性のもの（transient）と安定なもの（stable）に分類することができる。前者の場合、導入された遺伝物質は最終的には標的細胞から消失する。一過性遺伝子導入（Transient gene transfer）では、典型的に、宿主細胞中で複製しないプラスミド構築物（plasmid constructions）を用いる。哺乳類細胞中で複製するベクター分子はまれであり、実質的には、ウイルスレプリコンを含むものに限られる（つまり、プラスミドでは利用できない）。そのため、多くの場合、一過性導入法は哺乳類細胞に対する唯一の直接的な遺伝子導入法である。他の種類の細胞（例えば、細菌および下等真核生物（酵母など））に関しては、複製するプラスミドが利用可能であり、したがって、一過性発現は何らかの利点が想定される特定の状況（例えば、条件付き発現）においてのみ必要とされる。
【０００３】
多くの場合、安定な遺伝子導入が好ましい選択である。細菌および下等真核生物に関しては、細胞中で複製するプラスミドが利用可能である。したがって、これらのＤＮＡ分子は遺伝子送達ベヒクルとして用いることができる。しかし、これらのプラスミドのコピー数は、典型的に１または２を超えるので、導入された遺伝子の量が大幅に増加する。細菌と酵母に典型的に用いられるプラスミドは数十または数百コピーで存在する。通常の場合と比較して遺伝子量が増加すると、多くの実験系において、アーチファクト（artefactual）を含む実験結果、あるいは少なくとも偏った実験結果が生じる原因となり得る。したがって、（半数体ゲノム（haploid genome）ごとに）単一コピー遺伝子の導入が可能な状況を作ることが有益である。
【０００４】
一般的に、単一コピー遺伝子の安定導入は、導入されたＤＮＡを標的細胞の染色体ＤＮＡに挿入することができれば達成し得る。従来、染色体ＤＮＡへの挿入は、種々の組換え反応を用いて達成されてきた。細菌においては、相同的組換えおよび部位特異的組換えの両者が広く用いられており、まだあまり特徴付けがされていない「非正統的」組換えが用いられる場合もある。方法の選択は、典型的には、ランダム変異と標的変異のどちらが要求されるかによる。これらの方法には、細菌種のうちの亜型に用いられる比較的特異的な（trivial）ものも含まれるが、汎用の方法がより望ましい。
【０００５】
組換え反応は、ＤＮＡを真核細胞の染色体ＤＮＡ中に安定に導入するのに用いることもできる。相同組換え反応および部位特異的組換え反応は標的組込み（targeted integration）を生じ、「非正統的」組換えは非標的事象（non-targeted events）を生じる。転位による組換え（transpositional recombination）の利用は、パン酵母である Saccharomyces cerevisiae（Ji et al., 1993）および分裂酵母である Schizosaccharomyces pombe（Behrens et al., 2000）について報告されている。これらの方法はトランスポゾンがその細胞自身の内部から発生するin vivo での転位を用いる。これらの方法では、適切に修飾されたトランスポゾンを、所与の細胞中で産生されたトランスポザーゼタンパク質と組み合わせて用いる。細胞中でトランスポザーゼタンパク質が産生される類似のシステムが、その他の真核生物に関しても利用可能である。典型的な例としては、ショウジョウバエとゼブラフィッシュが挙げられる（Rubin and Spradling, 1982 および Raz et al., 1997）。
【０００６】
In vivo での転位機構の発現に基づく転位システムは、比較的容易に用いることがきるが、種々の理由により、遺伝子導入の最適な選択肢ではない。例えば、効率だけでなく宿主域にも制限がある場合や、標的部位の選択が最適でない場合がある。ウイルスシステム、特にレトロウイルス挿入法は、動物細胞ゲノムへの挿入を行なうために用いられてきた。この方法にも不都合な性質がいくつかある。例えば、ウイルスによってコードされたタンパク質への免疫応答が誘発される可能性がある。また、一般的に、安全で効率的なウイルスベクターを構築したり、用途に応じたパッケージング細胞系を構築することは、必ずしも容易ではない。したがって、真核細胞に関しても、汎用の非ウイルス性ＤＮＡランダム挿入法（random non-viral DNA insertion strategy）が望ましいと考えられる。In vitroで構築された転位複合体の細胞中への導入は１つの選択肢となりうる。In vitroで構築されたＤＮＡ転位複合体の利用は、最も用途の広い遺伝子導入システムの１つとなる可能性が高い。近年、細菌細胞に関するそのようなシステムが報告されており、そのシステムは転位によるＤＮＡ組換え（米国特許第6,159,736号および第6,294,385号）に基づく化学反応を利用する。効率的なシステムによって、細胞の様々な側面を研究するための種々の方法に用いることができる変異体のプールが提供されることが期待される。これら変異体のプールは全ゲノムに関する研究（即ち、機能的ゲノム学）に必須である。しかし、in vitroで構築されたＤＮＡ転位複合体が真核細胞に導入された場合、特にその複合体の構成成分が原核生物に由来する場合、該ＤＮＡ転位複合体が真核細胞中で機能するかどうかを従来の知見から予想することは不可能である。原核細胞と真核細胞との違い、特に、後者における核膜の存在と、真核細胞のゲノムＤＮＡがクロマチン構造中に収められていることが、原核細胞由来のシステム（prokaryotic system）が機能するのを妨げる可能性が考えられる。さらに、転位複合体の安定性および触媒活性を考慮すると、真核細胞中の条件は原核細胞のそれとは大きく異なる可能性が考えられる。さらに、その他の未知の制限システムが、入り込んでくるＤＮＡに対抗し、構築された転位複合体が組込みのための機能を発揮する前に、非特異的プロテアーゼにより破壊されてしまうことも考えられる。たとえ転位反応によってトランスポゾンがゲノムに組込まれたとしても、その結果として生じる５ｂｐの一本鎖領域（single stranded regions）（および、場合によっては４ｎｔの隣接ＤＮＡフラップ（4-nt flanking DNA flaps））が、宿主によって修正される必要がある。したがって、真核細胞内の転位複合体の安定性と効率は、米国特許第6,159,736号および第6,294,385号に開示されている細菌細胞での結果から予想することができないのは明らかである。ゆえに、今日まで従来技術においては、in vitroで構築された転位複合体を高等生物（即ち真核生物）の細胞への核酸導入に一般的に用いることができるという旨は示されていない。
【０００７】
Ｍｕファージは、ＤＮＡ転位機構を用いて自己のゲノムを複製し、最もよく特徴付けられた可動遺伝因子のひとつである（Mizuuchi, 1992 および Chaconas et al., 1996）。本発明者らは、近年開発されたＭｕファージ由来のin vitro 転位システム（Haapa et al., 1999a）を本発明に用いた。転位の化学的工程はＭｕ転位複合体の内部で生じる。Ｍｕ転位複合体は、まず、トランスポゾン末端の特異的結合部位に最初に結合する４つのＭｕＡトランスポザーゼタンパク質（MuA transposase protein）分子から構築される。５０ｂｐのＭｕ右末端ＤＮＡセグメントは、これらの結合部位を２個有する（この結合部位はそれぞれＲ１およびＲ２（それぞれ２２ｂｐ）と呼ばれる（Savilahti et al., 1995））。ＭｕＡモノマーがそれぞれ２個ずつ結合しているトランスポゾンの両末端が合わさり、構造変化によって転位複合体が形成される。その後、Ｍｕの転位は、該転位複合体（即ち、「ＤＮＡ転位複合体」または「トランスポソソーム（transpososome）」とも呼ばれるタンパク質−ＤＮＡ複合体（Mizuuchi, 1992 および Savilahti et al., 1995））によって進行する。このような複合体の機能上のコア（functional core）は、四量体であるＭｕＡトランスポザーゼタンパク質およびＭｕＡ結合部位を有するＭｕ−トランスポゾン由来ＤＮＡ末端セグメント（即ち、ＭｕＡに認識されたトランスポゾン末端配列）から構築されている。そのコア複合体（core complexes）が形成されると、二価の金属イオンに依存する条件下で、いかなる標的ＤＮＡとも反応し、そしてＭｕ末端セグメントを標的に挿入することができる（Savilahti et al., 1995）。Ｍｕ転位の顕著な特徴は、５ｂｐの標的部位の重複（target site duplication）が生じることである（Allet, 1979 および Kahmann and Kamp, 1979）。
【０００８】
最も単純なケースでは、ＭｕＡトランスポザーゼタンパク質および短い５０ｂｐのＭｕ右末端（Ｒ−末端）断片のみが、転位複合体の構築と機能に必要とされる高分子成分である（Savilahti et al., 1995 および Savilahti and Mizuuchi, 1996）。同様に、２つのＲ−末端配列が、より長いＤＮＡ分子において逆方向末端反復配列として配置されている場合、転位複合体はトランスポゾン末端同士が対合する（synapsing）ことにより形成される。Ｍｕ ＤＮＡのin vitroでの転位反応における標的ＤＮＡは線状、開環状、またはスーパーコイル状でもよい（Haapa et al., 1999a）。
【０００９】
今日まで、Ｍｕのin vitroでの転位に基づく方法は、ＤＮＡの配列決定（Haapa et al., 1999a および Butterfield et al., 2002）、遺伝子ターゲティングのためのＤＮＡ構築物の作成（Vilen et al., 2001）およびプラスミドとウイルス（ＨＩＶ）ゲノムＤＮＡ領域の機能分析（Haapa et al., 1999b および Laurent et al., 2000）などの種々の分子生物学の用途に効率的に用いられてきた。また、ジャガイモウイルスＡおよびバクテリオファージ ＰＲＤ１の全ウイルスゲノムに関する機能的ゲノム研究は、Ｍｕのin vitroでの転位に基づく手法を用いて行われている（Kekarainen et al., 2002 および Vilen et al., 2003）。さらに、ペンタペプチド挿入変異法（pentapeptide insertion mutagenesis method）が報告されている（Taira et al., 1999）。近年、細菌ゲノムのための挿入変異法であって、in vitroで構築された機能的トランスポソソームをエレクトロポレーションにより種々の細菌細胞に送達することによる方法が開発された（Lamberg et al., 2002）。
【００１０】
E. coli は、Ｍｕファージの自然宿主である。In vitroであらかじめ構築された転位複合体を細菌細胞中にエレクトロポレートし、それによってトランスポゾン構築物をゲノム中に組み込むことができるということが、E. coliを用いて初めて示された（Lamberg et al., 2002）。また、Ｍｕトランスポソソームは、トランスポゾンを、試験した３種の他のグラム陰性細菌、具体的には Salmonella enterica （以前は S. typhimurium として知られていた）、Erwinia carotovara および Yersinia enterocolitica に組み込むことができた（Lamberg et al., 2002）。上記４つの細菌種のそれぞれにおいて、組み込まれたトランスポゾンは、Ｍｕ転位の顕著な特徴である重複した５ｂｐの標的部位で挟まれていた。よって、ＤＮＡ転位化学反応（DNA transposition chemistry）によって組込みが生じたことが確認された。
【００１１】
発明の概要 
本発明者らは、in vitroで構築されたＭｕファージＤＮＡ転位複合体を用いた真核細胞のための遺伝子導入システムを開発した。適切な選択可能なマーカーと目的遺伝子とを含み、ＭｕＡトランスポザーゼタンパク質の結合に必要なＤＮＡ配列因子に挟まれた線状ＤＮＡ分子を作成する。このようなＤＮＡ分子をＭｕＡタンパク質とインキューベートすることによりＤＮＡ転位複合体、即ちトランスポソソームを得る。このトランスポソソームは、エレクトロポレーションまたはその他の関連する方法により真核細胞中に送達することができる。本発明の方法はＭｕトランスポゾンの、真核生物への遺伝子送達ベヒクルとしての利用可能性を拡大する。
【００１２】
１つの態様においては、本発明は下記の工程を包含する、標的真核細胞の細胞核酸に核酸セグメントを組み込む方法を提供する。
ＭｕＡトランスポザーゼ（i）および該ＭｕＡトランスポザーゼにより認識され結合された一対のＭｕ末端配列と、該一対のＭｕ末端配列の間に挟まれた挿入配列とからなるトランスポゾンセグメント（ii）を含むＭｕ転位複合体を、該トランスポゾンセグメントの細胞核酸への組込みを可能にする条件下で、標的真核細胞（eukaryotic target cell）中に送達する工程。
【００１３】
他の１つの態様においては、本発明は下記の工程を包含する、標的真核細胞のプールから挿入変異体ライブラリーを構築する方法を提供する。
ａ）ＭｕＡトランスポザーゼ（i）および該ＭｕＡトランスポザーゼにより認識され結合された一対のＭｕ末端配列と、該一対のＭｕ末端配列の間に挟まれた、選択可能なマーカーを含む挿入配列とからなるトランスポゾンセグメント（ii）を含むＭｕ転位複合体を、該トランスポゾンセグメントの細胞核酸への組込みを可能にする条件下で、標的真核細胞中に送達する工程。
ｂ）選択可能なマーカーを含有する細胞をスクリーニングする工程。
【００１４】
他の１つの態様においては、本発明は核酸セグメントを標的真核細胞の細胞核酸に組み込むためのキットを提供する。
【００１５】
「トランスポゾン」という用語は、本願明細書においては、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素によって認識され、転位可能な機能的核酸−タンパク質複合体（functional nucleic acid-protein complex）（即ちトランスポソソーム）の必須成分である核酸セグメントを指す。Ｍｕシステムにおいて転位可能な最小の核酸−タンパク質複合体は、４個のＭｕＡトランスポザーゼタンパク質分子およびＭｕＡと相互作用可能な１対のＭｕ末端配列を有する１個のトランスポゾンからなる。
【００１６】
「トランスポザーゼ」という用語は、本願明細書においては、転位可能な機能的核酸−タンパク質複合体の必須成分であって、転位を媒介する酵素を指す。「トランスポザーゼ」という用語はまた、レトロトランスポゾン由来またはレトロウイルス由来のインテグラーゼも指す。
【００１７】
「転位」という表現は、本願明細書においては、トランスポゾンが、自己を標的核酸に挿入する反応を指す。転位反応における必須成分はトランスポゾン、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素、そして機能的転位複合体の形成に必要なその他の成分である。本発明の遺伝子送達方法および原料は、in vitroにおけるＭｕ転位（Haapa et al., 1999ab および Savilahti et al., 1995）の原理を採用した。
【００１８】
「トランスポゾン末端配列」という用語は、本願明細書においては、トランスポゾンの両末端の保存されたヌクレオチド配列を指す。トランスポゾン末端配列は転位に関してトランスポゾンの識別に関与する。
【００１９】
「トランスポゾン結合配列」という用語は、本願明細書においては、トランスポゾン末端配列中に保存されたヌクレオチド配列であって、トランスポザーゼが転位を媒介する際に特異的に結合する配列を指す。
【００２０】
発明の詳細な説明 
In vitroで構築された転位複合体は安定であるが、Ｍｇ2+または他の二価陽イオンを欠く条件下では触媒活性を示さない（Savilahti et al., 1995 および Savilahti and Mizuuchi, 1996）。転位複合体を細菌細胞へエレクトロポレートで導入した後、これらの複合体は、細胞中で機能性を保ち、Ｍｇ2+イオンと出会うことにより転位化学反応（transposition chemistry）に関して活性化され、トランスポゾンの宿主染色体ＤＮＡ中への組込みを促進する（Lamberg et al., 2002）。In vitroであらかじめ構築されたトランスポソソームは、in vivoにおける組込み工程に特別な宿主補因子（host cofactors）を必要としない（Lamberg et al., 2002）。重要なのは、細胞中に一度導入されてゲノムに組み込まれると、挿入されたＤＮＡはＭｕＡを発現しない細胞中で安定した状態を保つことである（Lamberg et al., 2002）。
【００２１】
In vitroで構築されたトランスポソソームを用いたＭｕ転位システムが高等生物に関しても機能するかどうかを調べるために、本発明者らはトランスポゾン（抗生物質耐性マーカーをＭｕ末端に連結した）を作成し、複合体を構築した。この複合体について、転位方法と酵母細胞またはマウス細胞にエレクトロポレートした後の標的部位の選択を試験した。上記のトランスポゾンは、重複した５ｂｐの標的部位に挟まれてゲノムに組み込まれた。これは真正なＤＮＡ転位反応が生じたことを示している。このような結果は、驚くべきことに、真核細胞における条件下でＭｕ ＤＮＡの組込みが可能であることを示す。注目すべきは、核膜、ＤＮＡ結合タンパク質、あるいはＤＮＡの修飾またはコンホメーションが、組込みを妨げなかったことである。さらに、Ｍｕ複合体の構造と触媒活性は、繰り返し行われた濃縮工程の後でさえも保持された。これは真核生物へのＭｕ転位の方法の利用可能性を拡大する。このシステムの利点は、目的とする生物の転位機構の発現システムを作り出す必要がないことである。
【００２２】
本発明は、下記の工程を包含する、単離された標的真核細胞またはそのような細胞の一群（例えば、組織サンプルまたは組織培養物）の細胞核酸に核酸セグメントを組み込む方法を提供する。
In vitroで構築されたＭｕ転位複合体であって、ＭｕＡトランスポザーゼ(i)および該ＭｕＡトランスポザーゼにより認識され結合された一対のＭｕ末端配列と、該一対のＭｕ末端配列の間に挟まれた挿入配列とからなるトランスポゾンセグメント(ii)を含むＭｕ転位複合体を、該トランスポゾンセグメントの細胞核酸への組込みを可能にする条件下で、標的真核細胞中に送達する工程。
【００２３】
この方法に用いるために、Savilahti et al., 1995 および Savilahti and Mizuuchi, 1996に開示されているように、安定だがＭｇ2+を欠く条件下では触媒活性のないＭｕ転位複合体をin vitroで構築することができる。原則として、Ｍｇ2+を含有しないものであれば、いかなる標準的な生理的緩衝液も上記の不活性Ｍｕ転位複合体の構築に好適である。しかし、in vitroトランスポソソーム構築反応液（in vitro transpososome assembly reaction）は、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．０）、５０％（ｖ／ｖ） グリセロール、０．０２５％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５５ｎＭ トランスポゾンＤＮＡ断片および２４５ｎＭ ＭｕＡを含むことが好ましい。上記反応液の体積は、例えば、２０または８０マイクロリットルである。上記反応液を約３０℃で０．５〜４時間、好ましくは２時間インキュベートする。細胞へ送達するのに十分な量の転位複合体を得るために、構築反応を数回行い、その構築反応混合物（assembly reaction）を濃縮、脱塩する。酵母の形質転換には、転位複合体の最終濃度は構築反応混合物の少なくとも１０倍であることが好ましく、マウス細胞のトランスフェクションには、少なくとも２０倍であること好ましい。濃縮工程は遠心濾過ユニットを用いて行うことが好ましい。または、遠心分離または沈殿（例えば、ＰＥＧまたはその他の種類の沈殿剤を用いる）によって行うこともできる。
【００２４】
この方法においては、転位複合体の標的真核細胞中への送達を、該転位複合体の濃縮画分を用いて行なう。好ましい送達方法は、エレクトロポレーションである。Ｍｕ転位複合体の細菌細胞中へのエレクトロポレーションは Lamberg et al., 2002 に開示されている。しかし、Lamberg et al.の方法は、複合体を真核細胞へ導入するのには直接採用することはできない。本願実施例に示すように、Sands and Hasty （1997）に記載されるマウス胚幹（ＥＳ）細胞のエレクトロポレーションの手順は、本発明の方法において用いることができる。真核細胞に関する他の種々のＤＮＡ導入方法が知られており、当業者はそれらの方法を、本発明の方法を実施するために容易に用いることができる（例えば、「微生物のエレクトロポレーション プロトコール（Electroporation Protocols for Microorganisms）」、Jac A. Nickoloff 編、分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）、第４７巻、Humana Press、ニュージャージー州トトワ、1995；「動物細胞のエレクトロポレーションと電気的細胞融合プロトコール（Animal Cell Electroporation and Electrofusion Protocols）」、Jac A. Nickoloff1 編、分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）、第４８巻、Humana Press、ニュージャージー州トトワ、1995 および 「植物細胞のエレクトロポレーションと電気細胞融合プロトコール（Plant cell Electroporation and Electrofusion Protocols）、Jac A. Nickoloff 編、分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）、第５５巻、Humana Press、ニュージャージー州トトワ、1995を参照されたい）。公知のＤＮＡ送達方法には、針や注射器を用いた直接注入、リポソームの利用、および種々のトランスフェクション促進添加剤の利用も含まれる。粒子衝撃法（particle bombardment）などの物理的方法も可能である。
【００２５】
標的細胞の細胞核酸への転位は、エレクトロポレーションの直後、その他の介入をせずとも起こると考えられる。しかし、転位を促進し、またエレクトロポレーションに起因するストレスを緩和するために、プレート培養、またはその他の後に続く工程の前に、該細胞を室温〜３０℃で、１０分間〜４８時間、またはそれ以上、適切な培地でインキュベートすることもできる。標的細胞の細胞核酸に、単一の挿入が生じることが好ましい。
【００２６】
本発明の方法で用いる標的真核細胞はヒト細胞、動物（好ましくは哺乳類）細胞、植物細胞、真菌細胞または酵母細胞である。動物細胞は、マウス（Mus musculus）、ラット（Rattus norvegicus）、Xenopus、フグまたはゼブラフィッシュなどの脊椎動物の細胞、あるいはDrosophila melanogaster や Caenorhabditis elegans などの無脊椎動物の細胞が好ましい。植物細胞は、Arabidopsis thaliana、タバコまたはイネの細胞が好ましい。酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae または Schizosaccharomyces pombeの細胞が好ましい。
【００２７】
Ｍｕ末端配列の間の挿入配列は、好ましくは、選択可能なマーカーと、遺伝子構築物またはプロモータートラップ構築物またはエンハンサートラップ構築物（gene or promoter trap or enhancer trap constructions）、ならびにタンパク質を発現している配列またはＲＮＡを産生している配列を包含する。上記の構築物により、遺伝子標識、機能的ゲノム学または遺伝子治療において本発明の方法を用いることが可能となる。
【００２８】
上記の「選択可能なマーカー」という用語は、トランスポゾンによって細胞に導入される遺伝子であって、トランスポゾンを内包する細胞が所定の生育環境において生長または生存するための能力を改変し、該選択可能なマーカーを欠く類似の細胞との違いを出す遺伝子を指す。本発明で用いるトランスポゾンの核酸は、選択可能なポジティブマーカー（positive selectable marker）を含むことが好ましい。選択可能なポジティブマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）は、該選択可能なポジティブマーカーを欠く場合には宿主の生長を阻害または殺してしまう作用物質の存在下で、宿主の生長と生存を可能にする産物をコードする。挿入配列は、さらにレポーター遺伝子を含んでもよく、該レポーター遺伝子は、免疫学的、化学的、生化学的、生物学的または機械的アッセイで、発現の検出および／または定量が可能な産物をコードするいかなる遺伝子でもよい。レポーター遺伝子の産物は、例えば、以下の属性のうちの１つを有する：蛍光性（例えば、緑色蛍光タンパク質）、酵素活性（例えば、ルシフェラーゼやlacZ/β-ガラクトシダーゼ）、毒性（例えば、リシン）または別の分子によって特異的に結合される能力（例えば、ビオチン）。真核細胞においてマーカーとレポーター遺伝を用いることは当業界では公知である。
【００２９】
In vitroで構築されたＭｕ転移複合体を用いるシステム（in vitro Mu system）の標的部位の選択はランダム、またはほぼランダムであることが知られているため、本発明の方法の１つの好ましい態様では、核酸セグメントを、標的細胞の細胞核酸のランダムな位置またはほぼランダムな位置に組み込む。しかし、場合によっては転位のターゲティングは有益となりうる。したがって本発明の方法の他の１つの好ましい態様では、核酸セグメントを、標的細胞の細胞核酸の標的位置に組み込む。この方法は、転位複合体またはトランスポゾン中の両Ｍｕ末端の間のＤＮＡ領域に、核酸レベルまたはタンパク質レベルのターゲティングシグナルを付加することで達成できる。該ターゲティングシグナルは、特定のヌクレオチド配列に効率的に結合または会合し、それによってターゲティングを促進することが知られている核酸、タンパク質またはペプチドであることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法の１つの具体的な態様では、修飾されたＭｕＡトランスポザーゼを用いる。ＭｕＡトランスポザーゼは、例えば、欠失、挿入または点変異によって修飾することができる。修飾されたＭｕＡトランスポザーゼは、未修飾のＭｕＡとは異なる触媒活性または特異性を有していてもよい。
【００３１】
本発明の他の１つの態様は、下記の工程を包含する、標的真核細胞のプールから挿入変異体ライブラリーを構築する方法である。
ａ）In vitroで構築されたＭｕ転位複合体であって、ＭｕＡトランスポザーゼ(i)および該ＭｕＡトランスポザーゼにより認識され結合された一対のＭｕ末端配列と、該一対のＭｕ末端配列の間に挟まれた、選択可能なマーカーを含む挿入配列とからなるトランスポゾンセグメント(ii)を含むＭｕ転位複合体を、該トランスポゾンセグメントの細胞核酸への組込みを可能にする条件下で、標的真核細胞中に送達する工程。
ｂ）選択可能なマーカーを含有する細胞をスクリーニングする工程。
【００３２】
上記の方法において、当業者は種々のスクリーニング技術を容易に利用することができる。スクリーニング工程は、例えば、配列分析、核酸ハイブリダイゼーション、プライマー伸長または抗体結合を含む方法によって行うことができる。これらの方法は当業界で周知である（例えば、分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、Ausubel et al.編、John Wiley & Sons、1992を参照）。本発明の方法に従って構築されたライブラリーは、転位後の遺伝子型の変化または表現型の変化に関するスクリーニングも行うことができる。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、核酸セグメントを標的真核細胞の細胞核酸に組み込むためのキットである。該キットは真核細胞において選択可能なマーカーを有するトランスポゾンセグメントを含むＭｕ転位複合体の濃縮画分を包含する。該複合体は、他のタンパク質や遺伝物質などを含まない実質的に純粋な調製物として提供されることが好ましい。
【００３４】
発明の背景を明らかにするため、特に、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本願明細書で言及した出版物とその他の資料は、言及によってその内容が本願明細書に組み込まれているものである。以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
実施例
材料と方法 
菌株、細胞系および培地
細菌の形質転換にEschericia coli DH5α を用いた。細菌をＬＢ培地またはＬＢ寒天プレートで３７℃で生育した。プラスミドの選択と維持のために、次の濃度で抗生物質を用いた：アンピシリン １００〜１５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン １０〜２５μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール １０μｇ／ｍｌ。酵母の形質転換には、Saccharomyces cerevisiae FY1679株（MATa/MATα ura3-52/ura 3-52 his3Δ200/HIS3 leu2Δ1/LEU2 trp1Δ63/TRP1 GAL2/GAL2; Winston et al., 1995）およびその半数体の誘導体（haploid derivative）であるFY-3（MATa HIS LEU TRP ura3-52）を用いた。酵母は、ＹＰＤ培地（１％ 酵母抽出物、２％ ペプトンおよび２％ グルコース）または最小培地（０．６７％ 酵母ニトロゲンベースおよび２％ グルコース）で生育した。形質転換体（transformants）の選択のため、酵母細胞を２００μｇ／ｍｌのG418（ジェネティシン（geneticin）、Sigma製）を含有するＹＰＤプレート上で生育した。
【００３６】
マウスAB2.2−プライム胚幹（ＥＳ）細胞（AB2.2-Prime embryonic stem (ES) cells）（Lexicon Genetics, Inc.製）を増殖させるのに必要な手順は、Sands and Hasty （1997）に記載されている。端的に言うと、未分化のAB2.2−プライムＥＳ細胞を、１５％ウシ胎児血清（Hyclone製）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco製）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Gibco製）、１００μＭ β−メルカプトエタノールおよび非必須アミノ酸（Gibco製）、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Gibco製）および１，０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ（Chemicon製）を添加したＤＭＥＭ（Gibco製）からなるＥＳ培地中の０．１％ ゼラチン（Sigma製）被覆組織培養プレートで生育した。
【００３７】
HeLa S3細胞（ATCC # CCL-2.2）を１０％ウシ胎児血清（Gibco Invitrogen製）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco Invitrogen製）、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン（Gibco Invitrogen製）および５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Gibco Invitrogen製）を添加したＭＥＭからなる細胞培地で生育した。
【００３８】
タンパク質と試薬
ＭｕＡトランスポザーゼ（ＭｕＡ）、プロテイナーゼＫ、仔牛腸由来アルカリホスファターゼ（calf intestinal alkaline phosphatase）（ＣＩＰ）およびCamR エントランスポゾン（Entranceposon）（ＴＧＳ 鋳型生成システム（Template Generation System））はフィンランド国、エスポー、Finnzymesより入手した。制限酵素とプラスミドpUC19はNew England Biolabsより入手した。クレノウ酵素はPromegaより入手した。酵素は供給業者の推奨するものを用いた。ウシ血清アルブミンはSigmaより入手した。[α-32P]dCTP（１，０００〜３，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はAmersham Biosciencesより入手した。
【００３９】
KanMX4−Ｍｕトランスポゾンの構築
KanMX4 セレクターモジュール（kanMX4 selector module）（１．４ｋｂ）をpFA6-kanMX4（Wach et al., 1994）から、EcoRI + BglIIでの二重消化によって切断し、pUC ミニori領域（pUC miniorigin）とＭｕ末端を含む０．７５ｋｂのベクターにライゲートし、kanMX4−ＭｕプラスミドであるpHTH1を作成した。プラスミドＤＮＡをPlasmid Maxi Kit（QIAGEN製）を用いて単離した。KanMX4 モジュール中に変異がないことを確認するために、ドナーＤＮＡとしてCamR エントランスポゾン、そしてプライマー Muc1とMuc2を有する標的ＤＮＡとして、プラスミドpHTH1を用いてin vitroでの転位反応を行った後、挿入物の配列決定をした。
【００４０】
酵母構築物（yeast constructs）の配列決定のためのプライマーは、Muc1：5’GCTCTCCCCGTGGAGGTAAT-3’（配列番号１）およびMuc2：5’TTCCGTCACAGGTATTTATTCGGT-3’（配列番号２）である。
【００４１】
本発明者らはまた、アウトクローニング（outcloning）を容易にするために、両Ｍｕ末端の間に細菌のレプリコンを挟んでトランスポゾンを構築した。SphIを有するプラスミド pACYC184（Rose, 1988）からp15A レプリコンを切り出し、クレノウ酵素で平滑化し、EcoRI切断末端がふさがっているpHTH1にライゲートし、kanMX4−P15A−Ｍｕプラスミド、即ちpHTH4を作製した。
【００４２】
Ｍｕ／LoxP-Kan／Neo トランスポゾンの構築
細菌プロモーター、SV40 ori領域（origin of replication）、SV40初期プロモーター、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子および単純ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ ポリアデニル化シグナル配列（Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signals）を含むネオマイシン耐性カセット（neomycin-resistance cassette）を、pIRES2-EGFPプラスミド（Clontech製）からＰＣＲで作製した。LoxP部位とＭｕ末端配列とを標準的なＰＣＲに基づく手法で導入した後、構築物をBglII断片としてpUC19由来のベクターバックボーンにクローニングした。得られた構築物（pALH28）をＤＮＡ配列決定で確認した。
【００４３】
トランスポソソームの構築および濃縮
上記で構築したトランスポゾン（kanMX4−Ｍｕ（１．５ｋｂ）、kanMX4−p15A−Ｍｕ（２．３ｋｂ）およびＭｕ／LoxP-Kan／Neo（２．１ｋｂ））を、BglIIでの消化により、それぞれのキャリアーであるプラスミド（pHTH1、pHTH4およびpALH28）から単離する。単離されたＤＮＡ断片を、公知の方法（Haapa et al., 1999a）でクロマトグラフィーによって精製した。
【００４４】
標準in vitro トランスポソソーム構築反応液（２０μｌまたは８０μｌ）は、５５ｎＭ トランスポゾンＤＮＡ断片、２４５ｎＭ ＭｕＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、５０％（ｖ／ｖ） グリセロール、０．０２５％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。該反応液を３０℃で２時間反応させた。反応を数回行い得られた反応混合物から、Centricon concentrator（Amicon）を用いて、製造者の説明書に従って複合体を濃縮、脱塩し、さらに水で１回洗浄した。酵母の形質転換のためには、転位複合体の最終濃度を約１０倍とし、マウス細胞のトランスフェクションのためには、転位複合体の最終濃度を約２０倍とする。
【００４５】
エレクトロコンピテントな細菌細胞と酵母細胞
標準的なクローニング用のエレクトロコンピテント細菌細胞を公知の方法（Lamberg et al., 2002）で調製して用いた。エレクトロコンピテントな S. cerevisiae細胞を以下のように生育した。一晩培養した定常期の培養物（overnight stationary phase culture）を新鮮なＹＰＤ（１％ 酵母抽出物、２％ ペプトンおよび２％ グルコース）で１：１０，０００に希釈し、吸光度Ａ600が０．７〜１．２になるまで生育した。細胞ペレットを遠心分離（５，０００ｒｐｍ）で回収し、１／４体積（1/4 volume）の０．１Ｍ リチウムアセテート、１０mＭ ジチオスレイトール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ （ＬｉＡｃ／ＤＴＴ／ＴＥ）に懸濁し、室温で１時間インキュベートした。再度ペレット化した細胞を氷水で洗浄し、遠心分離で再度回収した。続いて、再度回収したペレットを、最初の体積の１／１０の体積（1/10 of the original volume）の氷冷した１Ｍ ソルビトールに再懸濁した。遠心分離の後、ペレットを氷冷した１Ｍ ソルビトールに懸濁し、最初の培養物濃度の〜２００倍の濃度にした。細胞懸濁液を１００μｌずつエレクトロポレーションに用いた。受容能の状態（competence status）を判定するため、トランスポソソームまたはプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に添加した混合物を氷上で５分間インキュベートした。その後該混合物を０．２ｃｍのキュベットに移し、Bio-Rad Genepulser II を用いて、１．５ｋＶ（倍数体のFY1679）または２．０ｋＶ（半数体のFY-3）、２５μＦ、２００オームでパルスをかけてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを行った後、１ｍｌのＹＰＤを添加し、培養物を３０℃で０〜４時間インキュベートした。続いて、細胞を２００μｇ／ｍｌのG418を含有するＹＰＤプレートでプレート培養した。酵母株の受容能は、対照プラスミドであるpYC2/CT（URA3, CEN6/ARSH4, ampR, pUC ori、Invitrogen製）のエレクトロポレーションと最小プレート培地上でのプレート培養と比較して評価した。
【００４６】
マウスＥＳ細胞のトランスフェクションおよびコロニーの単離
マウスAB2.2−プライム胚幹（ＥＳ）細胞のエレクトロポレーションの手順は、Sands and Hasty （1997）に記載されている。端的に言うと、AB2.2−プライムＥＳ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１１×１０6細胞／ｍｌの濃度で回収した。２．２〜２．３μｇのトランスポゾン複合体または線状化したＤＮＡ（linearized DNA）を０．４ｃｍのエレクトロポレーション用キュベットに添加した。１回のエレクトロポレーション毎に、０．９ｍｌのＥＳ細胞懸濁液（約１０×１０6細胞）をトランスポソソームまたは線状ＤＮＡと混合した。Bio-Rad製Gene PulserとCapacitance Extenderとを用いて、２５０Ｖ、５００μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、細胞を室温で１０分間放置し、ゼラチン被覆プレートでプレート培養した。エレクトロポレートされたＥＳ細胞を、上記の条件で２４〜４８時間培養した。その後、トランスポゾン挿入物を選択するため、最終濃度１５０μｇ／ｍｌとなるようにG418（Gibco製）を添加した。１０日後、トランスフェクトされたＥＳ細胞のコロニーを選択してピックアップし、個々のコロニーを、９６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートの別々のウェル中で、上記の条件を用いて培養した。
【００４７】
HeLa細胞のトランスフェクションおよびコロニーの単離
HeLa細胞を、基本的にＡＴＣＣの説明書に従ってエレクトロポレートした。端的に言うと、HeLa細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１．８×１０6細胞／ｍｌの濃度で回収した。２〜２．３μｇのトランスポゾン複合体または線状化したトランスポゾンＤＮＡを０．４ｃｍのエレクトロポレーション用キュベットに添加した。１回のエレクトロポレーション毎に、０．９ｍｌのHeLa細胞懸濁液（約１．６×１０6細胞）をトランスポソソームまたは線状ＤＮＡと混合して用いた。Bio-Rad製Gene PulserとCapacitance Extenderとを用いて、２５０Ｖ、５００μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、細胞を室温で１０分間放置した後プレート培養した。エレクトロポレートされたHeLa細胞を、上記の条件で６０時間培養した。その後、トランスポゾン挿入物を選択するため、最終濃度４００μｇ／ｍｌとなるようにG418（Gibco Invitrogen製）を添加した。１０〜１１日後、トランスフェクトされたHeLa細胞のコロニーを選択してピックアップし、個々のコロニーを、まず９６ウェルプレートの別々のウェル中で、次に２４ウェルプレートまたは６ウェルプレート、そして１０ｃｍプレートに移し、上記の条件を用いて培養した。
【００４８】
ゲノムＤＮＡの単離
酵母    ジェネティシン耐性酵母の各クローンのゲノムＤＮＡを、QIAGEN製ゲノムＤＮＡ単離キット（Genomic DNA Isolation kit）を用いて、あるいはSherman et al., 1981に従って単離した。
【００４９】
マウスＥＳ細胞    ゲノムＤＮＡを、Miller et al.（1988）によって開発された方法に実質的に従って、ＥＳ細胞から単離した。ＥＳ細胞を、２４ウェルプレートの個々のウェル中の培養物から回収し、５００μｌのプロテイナーゼＫ消化用緩衝液（proteinase K digestion buffer）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳおよび２００μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）に懸濁した。プロテイナーゼＫによる処理を、５５℃で８〜１６時間行った。プロテイナーゼＫによる処理に続き、１５０μｌの６Ｍ ＮａＣｌを添加し、マイクロ遠心機（microcentrifuge）（３０分、１３Ｋ）で遠心分離した。上清を回収し、エタノールで沈殿させてＤＮＡペレットを得て、７０％ エタノールで洗浄し、風乾した。得られたＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。
【００５０】
HeLa細胞    ゲノムＤＮＡを、Miller et al.（1988）によって開発された方法に実質的に従って、HeLa細胞から単離した。HeLa細胞を、３枚の１０ｃｍプレートから回収し、１５ｍｌのプロテイナーゼＫ消化用緩衝液（proteinase K digestion buffer）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳおよび２００〜４００μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）に懸濁した。プロテイナーゼＫによる処理を、５５℃で１６〜４８時間、あるいは全ての細胞が見えなくなるまで行う。ＲＮアーゼを２２〜５０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で８〜２４時間インキュベートした。ＲＮアーゼによる処理に続き、４．５ｍｌの６Ｍ ＮａＣｌを添加し、遠心分離（ＳＳ−３４、１１．６〜１４Ｋ、２０〜３０分、４℃）を行った。上清を回収し、エタノールで沈殿させてＤＮＡペレットを得て、７０％エタノールで洗浄し、風乾した。得られたＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。
【００５１】
サザンブロット
酵母    ＤＮＡを適切な酵素で消化した。得られたＤＮＡ断片を、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター（Hybond N+ membrane）（Amersham製）にブロットした。[α-32P]dCTP−標識（ランダムプライムド（Random Primed）、Roche製）kanMX4（BglII-EcoRI断片）をプローブとして用いて、サザンハイブダイゼーションを行った。
【００５２】
マウスＥＳ細胞    ＤＮＡのサザンブロット ハイブリダイゼーションを標準的な方法（Sambrook, et al., 1989）で行った。１０〜１５μｇの野生型およびトランスフェクトされたAB2.2−プライムＥＳ細胞ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡをナイロンフィルター（Hybond N+、Amersham製）に転写し、ＵＶ（Stratalinker、Statagene製）で固定した。挿入されたＤＮＡを[α-32P]dCTP−標識（RediprimeII、Amersham製）ＤＮＡプローブ（Ｍｕ／LoxP-Kan／Neo BamHI断片）で視覚化した。１．５×ＳＳＰＥ、１０％ ＰＥＧ ６０００、７％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ 変性ニシン精子ＤＮＡを含む液中で、ハイブリダイゼーションを６５℃で１６時間行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを６５℃で、２×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ中で５分間、２回洗浄し、１５分間、１回洗浄した。そして、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で、６５℃で１０〜１５分間、１回または２回洗浄した。フィルターをフジ製ホスホイメージャー用スクリーン（Fuji phosphoimager screen）に８〜１６時間曝し、フジＢＡＳホスホイメージャー（FujiBAS phosphoimager）で処理した。
【００５３】
HeLa細胞    サザンブロット ハイブリダイゼーションを標準的な方法（Sambrook, et al., 1989）で行った。１０μｇの野生型およびトランスフェクトされたHeLa細胞ＤＮＡをNheI + SpeIで消化し、０．８％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡをナイロンフィルター（Hybond N+、Amersham製）に転写し、ＵＶ（Stratalinker、Statagene製）で固定した。挿入されたトランスポゾンＤＮＡを[α-32P]dCTP−標識（RediprimeII、Amersham製）ＤＮＡプローブ（Ｍｕ／LoxP-Kan／Neo トランスポゾン）で視覚化した。１．５×ＳＳＰＥ、１０％ ＰＥＧ ６０００、７％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ 変性ニシン精子ＤＮＡを含む液中で、ハイブリダイゼーションを６５℃で１６時間行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ中で、６５℃で２０〜４０分間、３回洗浄し、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で、６５℃で２０〜４０分間、３回洗浄した。フィルターをフジ製ホスホイメージャー用スクリーンに８〜１６時間曝し、フジＢＡＳホスホイメージャーで処理した。
【００５４】
標的部位の重複（target site duplication）の判定
クローニング    酵母ゲノムＤＮＡをBamHI + BglII、SalI+ XhoIまたはPvuIIで消化し、染色体ＤＮＡ隣接領域（chromosomal DNA flanks）に挿入されたトランスポゾンを有する断片を作製する。次いでこれらの断片をBamHI、SalIまたはSmaIでそれぞれ開裂させたpUC19にクローニングして、カナマイシン耐性およびアンピシリン耐性についての選択性を与えた。別な方法としては、kanMX4-p15AでトランスフェクトしたクローンをBamHI + BglIIで開裂させ、ライゲート、エレクトロポレートし、トランスポゾンを有する断片によって生じる耐性により選択する。トランスポゾン境界領域のＤＮＡ配列（DNA sequences of transposon borders）を、トランスポゾン特異的プライマーであるSeq AおよびSeq MXを用いて、これらのプラスミドから判定した。ＳＧＤ（Saccharomyces Genome Database）サーバー（http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/）またはＳＤＳＣバイオロジーワークベンチ（SDSC Biology WorkBench）サーバー（http://workbench.sdsc.edu/）でのＢＬＡＳＴサーチを用いて、遺伝子位置（Genomic locations）を同定した。
【００５５】
クローニングされた酵母挿入物の末端の配列を決定するためのプライマーは、Seq A: 5’ATCAGCGGCCGCGATCC-3’（配列番号：３）およびSeq MX 4: 5'’（配列番号：４）である。
【００５６】
ＰＣＲ増幅    ２μｇの酵母ゲノムＤＮＡをBamHI + BglIIまたはNheI + SpeIで消化した。２μＭ アダプタープライマー１（WAP-1）を、相補的な２μＭ アダプタープライマー２（WAP-2*）、３（WAP-3*）または４（WAP-4*）と共にアニーリングすることによって部分的に二本鎖構造を有する特異的アダプターを作製した。WAP-2*、WAP-3*およびWAP-4*プライマーの３’ＯＨ基を第一級アミン基でブロッキングし、５’末端をリン酸化する。BamHI + BglIIによって生じた制限断片（２００ｎｇ）を、プライマーであるWAP-1とWAP-2*とをアニーリングすることによって作製した２２ｎｇのアダプターにライゲートし、一方、NheI + SpeIによって生じた制限断片をWAP-1とWAP-3*とをアニーリングすることによって作製した２２ｎｇのアダプターにライゲートした。ライゲーション反応物の１／５を鋳型として用いて２０μｌでＰＣＲ増幅を行い、プライマーであるWalker-1およびTEFterm-1またはWalker-1およびTEFprom-1を有する、アダプターとトランスポゾンとに挟まれたＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、４分を３０サイクル行なった。２μｌの１００倍希釈した一次ＰＣＲ産物（primary PCR products）を鋳型として用いて、その際、BamHI + BglII断片から得たＰＣＲ産物に対してはWalker-2およびTEFterm-2あるいはWalker-2およびTEFprom-2をプライマーとして用い、そしてNheI + SpeI断片から得たＰＣＲ産物に対してはWalker-3およびTEFterm-2あるいはWalker-3およびTEFprom-2をプライマーとして用いて、ネスティッドＰＣＲ（Nested PCR）を５０μｌで行った。ＰＣＲの条件は上記と同様である。配列決定プライマーであるMu-2を用いて、増幅したネスティッドＰＣＲ産物の配列決定をした。
【００５７】
１μｇのマウスゲノムＤＮＡをBglII + BclI または NheI + SpeIで消化した。部分的に二本鎖構造を有する特異的アダプターを酵母の場合と同様に作製した。BclI + BglIIによって生じた制限断片（４００ｎｇ）を、プライマーであるWAP-1とWAP-2*とをアニーリングすることによって作製した４４ｎｇのアダプターにライゲートし、一方、NheI + SpeIによって生じた制限断片（２００ｎｇ）を、プライマーであるWAP-1およびWAP-3*をアニーリングすることによって作製した２２ｎｇのアダプターにライゲートした。それぞれ、ライゲーション反応物の１／４または１／５を鋳型として用いて２０μｌでＰＣＲ増幅を行い、プライマーであるWalker-1およびHSP430またはWalker-1およびHSP431を有する、アダプターとトランスポゾンに挟まれたＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、４分を３０サイクル行なった。２μｌの８０倍または１００倍希釈した一次ＰＣＲ産物を鋳型として用い、その際、BclI + BglII断片から得たＰＣＲ産物に対してはWalker-2およびHSP429あるいはWalker-2およびHSP432をプライマーとして用い、そしてNheI + SpeI断片から得たＰＣＲ産物に対してはWalker-3およびHSP429あるいはWalker-3およびHSP432をプライマーとして用いて、ネスティッドＰＣＲを５０μｌで行った。ＰＣＲの条件は上記と同様である。配列決定プライマーであるMu-2を用いて、増幅したネスティッドＰＣＲ産物の配列決定をした。
【００５８】
ＰＣＲに基づく検出のためのプライマー：
WAP-1          CTAATACCACTCACATAGGGCGGCCGCCCGGGC （配列番号：５）
WAP-2*         GATCGCCCGGGCG-NH2 （配列番号：６）
WAP-3*         CTAGGCCCGGGCG-NH2 （配列番号：７）
WAP-4*         AATTGCCCGGGCG-NH2 （配列番号：８）
【００５９】
Walker-1        CTAATACCACTCACATAGGG （配列番号：９）
Walker-2        GGGCGGCCGCCCGGGCGATC （配列番号：１０）
Walker-3        GGGCGGCCGCCCGGGCCTAG （配列番号：１１）
Walker-4        GGGCGGCCGCCCGGGCAATT （配列番号：１２）
TEFterm-1       CTGTCGATTCGATACTAACG （配列番号：１３）
TEFterm-2       CTCTAGATGATCAGCGGCCGCGATCCG （配列番号：１４）
TEFprom-1       TGTCAAGGAGGGTATTCTGG （配列番号：１５）
TEFprom-2       GGTGACCCGGCGGGGACGAGGC （配列番号：１６）
Mu-2            GATCCGTTTTCGCATTTATCGTG （配列番号：１７）
【００６０】
HSP429          GGCCGCATCGATAAGCTTGGGCTGCAGG （配列番号：１８）
HSP430          ACATTGGGTGGAAACATTCC （配列番号：１９）
HSP431          CCAAGTTCGGGTGAAGGC （配列番号：２０）
HSP432          CCCCGGGCGAGTCTAGGGCCGC （配列番号：２１）
【００６１】
HeLa細胞    HeLa細胞ゲノムＤＮＡをBamHI + BclIで消化し、染色体ＤＮＡ隣接領域（chromosomal DNA flanks）に挿入されたトランスポゾンを有する断片を作製する。次いでこれらの断片を、BamHIで開裂させたpUC19にクローニングして、カナマイシン耐性およびアンピシリン耐性についての選択性を与えた。トランスポゾン境界領域のＤＮＡ配列を、トランスポゾン特異的プライマーであるHSP430およびHSP431を用いて、これらのプラスミドから判定した。ヒトゲノムアセンブリであるＮＣＢＩ ３４に基づく、アンサンブル ヒトゲノム ブラウザ リリース ２０．３４ｃ．１（Ensembl Human Genome Browser Release 20.34c.1）のＳＳＡＨＡサーチを用いて、遺伝子位置を同定した。
【００６２】
結果 
トランスポゾン構築物（Transposon construction）とその細胞への導入
Ｍｕ転位システムが真核生物にも機能するかどうかを調べるため、本発明者らは、Tn903由来kanR遺伝子およびAshbya gossypiiのTEF遺伝子の翻訳調節配列をＭｕ末端の間に含有するkanMX4−Ｍｕトランスポゾンを構築し（図１）、その際、細菌p15AレプリコンをＭｕ末端の間にさらに有するものと有さないものを構築した（図２Ａ）。本発明者らは、ＭｕＡタンパク質をkanMX4−Ｍｕトランスポゾンと共にインキュベートすることによるＭｕトランスポソソームの構築を研究し、アガロースゲル電気泳動によって安定なタンパク質−ＤＮＡ複合体を検出した（図３）。kanMX4−ＭｕトランスポゾンとkanMX−p15A−Ｍｕトランスポゾンを用いた反応では、いくつかのタンパク質−ＤＮＡ複合体のバンドが得られたが、該バンドは、ＳＤＳの存在下でサンプルをロードした場合には消失した。これは、該複合体においては、非共有結合性のタンパク質−ＤＮＡ相互作用のみが関与していることを示している。構築反応液の一部を、ＭｕＡトランスポザーゼと共に、またはＭｕＡトランスポザーゼなしで、Saccharomyces cerevisiae 細胞中にエレクトロポレートし、該酵母をジェネティシン耐性について評価した。酵母株の受容能を、対照プラスミドであるpYC2/CTのエレクトロポレーションと比較して評価した。トランスポソソームの酵母へのエレクトロポレーションの効率は、プラスミドの場合の効率より、約３桁低い（表１）。この結果は、細菌に関する過去の結果（Lamberg et al., 2002）と一致する。検出可能なタンパク質−ＤＮＡ複合体を含むサンプルのみがジェネティシン耐性コロニーを形成した。
【００６３】
マウスの実験用として、本発明者らは、細菌プロモーターおよび真核細胞プロモーター、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子および単純ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ ポリアデニル化シグナル配列を含むＭｕ／loxP-Kan／Neoトランスポゾンを構築した（図２Ｂ）。トランスポソソームを用いたマウスＥＳ細胞へのトランスフェクションにより、ＤＮＡ１μｇあたり１，７２０個のG418耐性コロニーを得、線状の対照ＤＮＡ（linear control）では、ＤＮＡ１μｇあたり３３０個のコロニーを得た。したがって、トランスポソソームを用いたトランスフェクションによって、ＤＮＡ １μｇあたり、５倍を越える耐性コロニーが得られた。ＤＮＡを導入しなかった対照細胞は耐性コロニーを形成しなかった。
【００６４】
HeLa細胞に関しては、トランスポソソームを用いたトランスフェクションによって、ＤＮＡ１μｇあたり約１０3個の耐性コロニーを得、線状の対照ＤＮＡでは、ＤＮＡ１μｇあたり約１０1個の耐性コロニーを得た。したがって、トランスフェクタントの生成において、トランスポソソームは極めて効率的であった。トランスポゾンを導入しなかった対照細胞は耐性コロニーを形成しなかった。
【００６５】
トランスポゾンのゲノムへの組込み
サザンブロット分析法を用いて、トランスポゾンＤＮＡがジェネティシン耐性コロニーのゲノムＤＮＡ中に挿入されているかどうかを調べることができる。真正なＭｕ転位の場合、トランスポゾンを切断しない酵素によるゲノムＤＮＡの消化によって、トランスポゾンプローブとハイブリダイズする１個の断片が得られ、また、トランスポゾンを１回切断する酵素による消化によって２個の断片が得られる。１７個のkanMX4−Ｍｕトランスポゾン組込み酵母クローンからゲノムＤＮＡを単離し、トランスポゾン配列を切断しないBamHI + BglIIで消化、あるいはトランスポゾン配列を１回切断するHindIIIで消化し、kanMX4断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションで分析した。１５個の単離物（isolates）は、BamHI + BglIIで消化すると、明確だがゲル移動度（gel mobility）の異なる単一のバンドを示し（図４Ａ）、HindIIIで消化すると２本のバンド（図４Ｂ）を示した。受容株であるFY1679由来の対照ＤＮＡはこの分析において検出可能なバンドを示さなかった。２個の単離物（Ｇ５およびＧ１４）は、BamHI + BglIIで消化した後、いくつかのハイブリダイズする断片を生じ、これは、複数のトランスポゾンの組込みの可能性を示唆している。しかし、複数のトランスポゾンが組込みまれている場合、BamHI + BglIIでの消化後には検出される断片量の倍増が予想されるが、これらの２つの単離物をHindIIIで消化した後、断片の量は倍増せず、３個の断片が得られた。単離物Ｇ５およびＧ１４のHindIII断片の大きさ（４．３、２．４および１．３ｋｂ）およびBamHI + BglII消化におけるバンドパターンは、トランスポゾンが酵母の２μプラスミドに組込まれたことを示す（これを確認するためには、下記の配列決定の結果を参照されたい）。半数体FY-3株の１７個のG418−耐性単離物由来のゲノムＤＮＡを、XhoI + SalI（トランスポゾンを切断しない）およびPstI（トランスポゾンを１回切断する）で消化した後、同様の方法で分析した。１３個の単離物は、XhoI + SalIで消化した後１つのバンドを示し、PstIで消化した後は２つのバンドを示し、これは単一の組込みを示す。４個の単離物は、F1679株の単離物Ｇ５およびＧ１４と類似のバンドパターンを示し、これは２μプラスミドへの組込みを示す（結果は示さない）。これらのデータは試験したクローンの大部分において、トランスポゾンＤＮＡの単一コピーが酵母染色体中に組込まれたことを示す。その他のクローンにおいては、エピソーム内に単一の組込みが検出された。
【００６６】
７個のマウスＥＳ細胞クローンをサザンブロット法により分析した。該クローンの染色体ＤＮＡを、トランスポゾンのほぼ全体をゲノムから切り離すBamHIで消化した。試験した全てのクローンは、対照として用いたBamHI消化pALH28と同じ位置にバンドを示した。バンドの強度は、試験した全てのクローンおよびゲノムサンプルと同じ分子量の対照ＤＮＡについて類似していた。これは、各ゲノム中にトランスポゾンが１コピーのみ組込まれたことを示す。
【００６７】
HeLa細胞について、サザンブロット分析法を用いて、G418耐性コロニーのゲノム中にトランスポゾンが挿入されたことを確認した。トランスポゾンを切断しない制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを消化すると、トランスポゾンプローブとハイブリダイズする１つの断片が生じる。７個のHeLa細胞トランスフェクタントクローンをサザンブロット法で分析した結果を、図６に示す。該クローンの染色体ＤＮＡをトランスポゾンを切断しないNheI + SpeIで消化した。各クローンから単一のバンドが検出され、これはそれぞれのゲノムにトランスポゾンＤＮＡの単一コピーが組込まれたことを示す。
【００６８】
染色体における挿入の位置
酵母    Ｍｕトランスポゾンは標的ＤＮＡにほぼランダムに組込まれる（Haapa-Paananen et al., 2002）。トランスポゾンの挿入位置と分布を調べるために、本発明者らは１００個以上の酵母形質転換体（yeast transformants）からトランスポゾン−ゲノムＤＮＡ境界領域（transposon-genomic DNA borders）をクローニングし、トランスポゾン特異的プライマー（Seq A + Seq MX4）を用いてトランスポゾンの両側の挿入部位の配列決定を行った。挿入部位の正確なマッピングは、ＢＬＡＳＴを用いてＳＧＤデータベースと比較することにより可能であった。本発明者らは、酵母の全ゲノム配列決定（Winston et al., 1995）に用いられたFY1679株を用いて、正しいマッピングを確実なものとした。酵母の１６本の染色体上の１４０個の組込みの全分布を図５Ａに示す。全ての染色体は少なくとも１回ヒットした。ＯＲＦおよび遺伝子間領域の両方にトランスポゾンの挿入が見られた（表２）。ゲノムへの組込みのリストを表３に示す。半数体ゲノムにおいては、必須遺伝子上の組込みは、細胞が生存不能になってしまうため当然行われなかった。ＸＩＩ染色体上には、まさにトランスポゾン組込みの「ホットスポット」があるように見えるが、これはアーチファクトである。なぜなら、この「ホットスポット」は、リボソームＲＮＡをコードする、およそ９ｋｂの領域にあるからである（図５Ｂ）。この座はＸＩＩ染色体中で、一列に並んで（tandemly）１００〜２００回繰り返される。この領域においては、組込みはランダムに分布している。図５Ａの染色体は、ＳＧＤに従って描かれたが、ＳＧＤは１〜２ＭｂのＤＮＡからなる酵母ゲノムにおいて実際には１００〜２００コピー存在するこの繰り返し領域が２コピーしか示されていない（酵母ゲノムの配列決定が系統的に行われた時に、ｒＤＮＡ反復配列は２個しか配列決定されなかった）。ｔＲＮＡ遺伝子から１ｋｂ未満の距離で確認された挿入は９個だけであり、これは、Ｍｕ−トランスポゾンの組込みがＴｙ１〜Ｔｙ４エレメントの組込みとは異なることを示す。染色体の末端に最も近い組込みは６．３ｋｂであり、テロメアを好むＴｙ５エレメントとの違いを示した。挿入の平均間隔は１３５ｋｂであり、ライブラリーとして全ゲノムをカバーするとはいいがたいものであった。しかし、その分布は、挿入がランダムであることを十分示していた。
【００６９】
マウス    配列決定されたトランスポゾン−ゲノムＤＮＡ境界領域を、アンサンブル マウスゲノムサーバー（Ensembl Mouse Genome Server）を用いて、マウスゲノムアセンブリ ｖ ３（Mouse Genome Assembly v 3）と比較した。クローン RGC57は、第３染色体に組込まれたトランスポゾンを有し、該トランスポゾンはENSMUSESTG00000010433およびENSMUSESTG00000010426の両者の最後のイントロンに位置する59433906〜59433910の部分が重複していた。配列決定により、組込まれたトランスポゾンの両側にこの５ｂｐの配列の存在（標的部位の重複）が示された。
【００７０】
HeLa細胞    本発明者らは、３個のトランスフェクタントからトランスポゾン−ゲノムＤＮＡ境界領域をクローニングし、トランスポゾン特異的プライマー（HSP430およびHSP431）を用いて、トランスポゾンの両側の挿入部位の配列決定を行った。これらの組込みについて表５に示す。これら３個のトランスフェクタントは全て重複した５ｂｐの標的部位をトランスポゾンの両側に有する、完全なトランスポゾン末端を有していた。
【００７１】
酵母２μプラスミドへのトランスポゾンの組込み
大方のS. cerevisiae株は内因性の２μプラスミドを有する。この酵母２μプラスミドは、S. cerevisiae中に、６０〜１００コピー／細胞で染色体外に存在する、６，３１８ｂｐの環状種である。該プラスミドの分子は、標準的なヌクレオソームフェージング（standard nucleosome phasing）によって、ミニ染色体として核の中に存在する（Livingston and Hahne, 1979；Nelson and Fangman, 1979；およびTaketo et al., 1980）。
【００７２】
倍数体のFY1679株については、１３１個のクローンのうち、２３個（１７．６％）のクローンにおいて、トランスポゾンが２μプラスミド中に組込まれており、１０８個（８２．４％）のクローンにおいて、トランスポゾンが染色体中に組込まれていた。半数体のFY-3株については、４９個のクローンのうち、４個（８．２％）において、トランスポゾンが２μプラスミド中に組込まれており、４５個（９１．８％）においてトランスポゾンが染色体中に組込まれていた。
【００７３】
トランスポゾン標的部位
真正なＭｕ転位は、組込まれたトランスポゾンを挟む重複した５ｂｐの標的部位を生成する（Haapa et al., 1999b）。FY1679株では、１２１個のクローン（１２２個中；９９．２％）において、また、半数体のFY-3株では、４２個のクローン（４６個中；９１．３％）において、トランスポゾンは重複した標的部位で挟まれており、この結果により組込みの大部分がＤＮＡ転位化学反応によるものであることが確認された。５ｂｐの重複したコンセンサス配列（5’-N-Y-G/C-R-N-3’）が、in vivo および in vitroの転位反応の両方で観察されたが、最も好ましい五量体は5’-C-Y-G/C-R-G-3’である（Mizuuchi and Mizuuchi, 1993; Haapa-Paananen et at., 2002 および Butterfield et al., 2002）。この研究において、重複した五量体におけるヌクレオチドの分布は、過去の結果と一致するものであった（表４）。
【００７４】
【表１】
0004809213.tif 000002
【００７５】
【表２】
0004809213.tif 000003
【００７６】
【表３】
0004809213.tif 000004
0004809213.tif 000005
0004809213.tif 000006
【００７７】
【表４】
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【００７８】
【表５】
0004809213.tif 000008
【００７９】
参考文献 
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【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】四量体であるＭｕＡトランスポザーゼおよびミニＭｕトランスポゾン（mini-Mu transposon）からなるin vitroで構築されたＭｕ転位複合体による、ミニＭｕトランスポゾン（Mini-Mu transposon）の、酵母染色体またはプラスミドＤＮＡへのin vivoでの組込み。
【図２】本研究において用いる、適切な制限部位を有するＭｕトランスポゾンの概略図。図２Ａ：２つの酵母トランスポゾンは、５０ｂｐのＭｕ右末端配列の間に組込まれたTEF プロモーター（PTEF）、kan マーカー遺伝子およびTEF ターミネーター（TTEF）を含む。kanMX4−p15A−Ｍｕトランスポゾンは、さらにp15Aレプリコンを含む。短い矢印は、アウトクローンされた隣接配列（out-cloned flanking sequences）の配列決定に用いるプライマーの結合部位を表す。末端のBglII部位を用いてトランスポゾンをベクタープラスミドバックボーンから切り出す。図２Ｂ：マウスＥＳ細胞のトランスフェクションに用いるＭｕ／LoxP-Kan／Neoトランスポゾン。該トランスポゾンは、２つのＭｕ右末端配列と２つのLoxP配列に挟まれたkan/neoマーカー遺伝子を含む。kan/neoマーカーは、「材料と方法」の項目で説明したように原核生物と真核生物のプロモーターとターミネーターを含む。
【図３】アガロースゲル電気泳動で分析した、KanMX4−Ｍｕ（１．５ｋｂ）およびKanMX4−p15A−Ｍｕ（２．３ｋｂ）を基質（substrate）として有するＭｕ転位複合体の形成。基質ＤＮＡをＭｕＡと共にまたはＭｕＡなしでインキュベートし、その反応産物をＳＤＳの存在下または非存在下で分析した。サンプルを８７ｍｇ／ｍｌのへパリンおよび８７ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する２％アガロースゲル上で電気泳動した。
【図４】酵母ゲノム中への挿入物のサザンブロット分析。転位複合体を酵母細胞へエレクトロポレートして得た１７個のジェネティシン耐性 F1679 クローンのゲノムＤＮＡをBamHI + Bgl II（図４Ａ）またはHindIII（図４Ｂ）で消化し、kanMX4 ＤＮＡをプローブとして用いて検出した。レーン１〜１７：トランスポゾン挿入変異体（transposon insertion mutants）、Ｃ：負の対照として、原株であるS. cerevisiae FY1679受容株のゲノムＤＮＡ、Ｐ：正の対照として、kanMX4−Ｍｕトランスポゾンを含む線状化したプラスミドＤＮＡ、Ｍ：分子量マーカー。プラスミド断片の大きさを左側に示す。
【図５】酵母染色体上のkanMX4−Ｍｕ組込み部位の分布（図５Ａ）および第１２染色体上のｒＤＮＡ繰返し領域（図５Ｂ）。図５Ａ中の楕円は各染色体の動原体を示す。倍数体のFY1679株中の組込み部位をバーで示し、半数体のFY-3株中の組込み部位を塗りつぶした円の付いたバーで示す。酵母ゲノムＤＮＡを示す線の上部には、kan遺伝子を含みワトソン鎖方向に挿入されたトランスポゾンが示されており、線の下部には、クリック鎖方向に挿入されたトランスポゾンが示されている。
【図６】トランスポゾン複合体を用いてトランスフェクトしたHeLaクローンのサザンブロット分析。レーン１： 次のバンドを有するマーカー（１０ｋｂ、８ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂおよび２．５ｋｂ。）。  レーン２： HeLaゲノムＤＮＡ。  レーン３： 精製したＭｕ／LoxP-Kan／Neoトランスポゾン（約２．１ｋｂ）と混合したHeLaゲノムＤＮＡ。  以下のレーン４〜１０はHeLAクローンである。レーン４： RGC13、レーン５： RGC14、レーン６： RGC15、レーン７： RGC16、レーン８： RGC23、レーン９： RGC24、レーン１０： RGC26。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１〜２１：
人工的な配列の説明： オリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
0004809213.tif 000009
【図２Ａ】
0004809213.tif 000010
【図２Ｂ】
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【図３】
0004809213.tif 000012
【図４】
0004809213.tif 000013
【図５Ａ】
0004809213.tif 000014
【図５Ｂ】
0004809213.tif 000015
【図６】
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【配列表】
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