(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式［１］
【化１】
0004722325.tif 000013
または、下記構造式[２]
【化２】
0004722325.tif 000014
で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２】
下記構造式［１］
【化３】
0004722325.tif 000015
で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするアデニル酸シクラーゼ２型選択的活性化剤。
【請求項３】
請求項２記載の構造式［１］で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする呼吸器作用薬。
【請求項４】
請求項２記載の構造式［１］で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする気管支拡張薬。
【請求項５】
下記一般式［４］
【化４】
0004722325.tif 000016
［式中、Ｒ１は−ＮＨＯＨ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、又は−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨを示す］、または下記一般式[５]
【化５】
0004722325.tif 000017
［式中、Ｒ２はメチル基、又は３−ピリジル基を示す］で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするアデニル酸シクラーゼ３型選択的活性化剤。
【請求項６】
請求項５記載の一般式［４］または一般式[５]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする嗅覚改善薬。
【請求項７】
請求項５記載の一般式［４］または一般式[５]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする高脂血症、糖尿病、または高インスリン血症治療薬。
【請求項８】
請求項５記載の一般式［４］または一般式[５]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする褐色脂肪細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フォルスコリン誘導体のサブタイプ選択的アデニル酸シクラーゼ活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アデニル酸シクラーゼは、主にβ受容体からの刺激により活性化され、ATPを基質としてcAMPを産生する酵素である。１９８９年に初めてクローニングされて以来、９種類のサブタイプが見いだされているが、サブタイプの組織分布が著明に異なることが最近明らかになった。例えば、気管にはアデニル酸シクラーゼ２型が多く分布し、また嗅覚や褐色脂肪細胞にはアデニル酸シクラーゼ３型多く分布していることが明らかにされている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８０巻、２９７項（１９９７年）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４４巻、１６９項（１９９２年））。
【０００３】
β２受容体を活性化する薬剤は、呼吸器疾患の治療薬として世界的に広く認知されている薬剤である。その作用機序はβ２受容体を介して間接的にアデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内ｃＡＭＰ量を調節することによる。その優れた臨床効果から積極的使用が推奨されており、例えば喘息の発作時、または発作予防に欠くことのできない薬剤である。しかし、β２受容体は呼吸器以外にも広く分布しており、また薬剤のβ１受容体とβ２受容体との選択性の低さから様々な副作用を発現が知られており、その使用が制限されている。例えば、循環器系には頻脈を、筋肉系には振戦を起こすことが明らかになっている。さらに、最近ゲノムサイエンスの進展から様々な遺伝子多系が明らかになりつつあるが、β２受容体にもその存在が明らかになっており、薬剤耐性や不応答性が問題となっている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００巻、３１８４項（１９９７年））。このことから、気管に多く存在するアデニル酸シクラーゼ２型選択的活性化薬を創製することにより、β２受容体の組織特異性が低いことによるβ２受容体活性化薬の副作用が改善でき、高い気管選択性を持つ呼吸器作用剤（気管支喘息、閉塞性肺疾患治療薬）を医療現場に供給することが出来る。
【０００４】
また、アデニル酸シクラーゼ３型に関してはその生理作用について、嗅覚や褐色脂肪細胞に存在することから、嗅覚の機能や脂質、糖質の代謝等に関与していると考えられる。よって、その選択的刺激剤は嗅覚異常に対する治療薬、脂質代謝異常（高脂血症）または糖質代謝異常（糖尿病、高インスリン血症）に対する治療薬として期待される。
【０００５】
アデニル酸シクラーゼのサブタイプ選択的活性化剤については、戸谷らによる報告がある。つまり、アデニル酸シクラーゼの活性化剤として知られている植物由来の天然物であるフォルスコリンの側鎖部分を修飾することにより、５型選択的な活性化剤の創製に成功している（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、３０巻、９７項（１９９８年））。また、海老名らは、アデニル酸シクラーゼをタンパク質分解酵素で処理することにより、２型の活性が向上することを報告している（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４０１巻、２２３項（１９９７年））。しかし、前者は２型、または３型の活性化剤については記載がなく、また後者については医薬品としての開発を考えた場合困難を伴うことは明らかである。よって、現在までアデニル酸シクラーゼ２型、または３型を選択的に活性化する薬剤の報告例はないが、医療上の有用性が高いアデニル酸シクラーゼ２型または３型を選択的に活性化する薬剤の提供は強く望まれている。
一方、フォルスコリン誘導体は、１９７７年にその化学構造が明らかにされて以来種々の誘導体が合成され、その生理作用が調べられているが、その標的酵素であるアデニル酸シクラーゼをサブタイプ選択的に活性化する化合物に関する報告は前記戸谷らによるものしかない。
【０００６】
下記構造式[３]
【化７】
0004722325.tif 000002
【０００７】
で表される化合物は、特定のサブタイプ（１型）に対してのみ活性を測定している報告があるが、サブタイプ選択性やその用途については記載がない（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３４巻、３２０４項（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｐｈｒａｍａｃｏｌ．、５０巻、２９９項（１９９６））。
【０００８】
また、下記一般式[４]
【化８】
0004722325.tif 000003
［式中、Ｒ１は−ＮＨＯＨ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、又は−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨを示す］、
【０００９】
及び構造式[６]
【化９】
0004722325.tif 000004
【００１０】
で表される化合物は、順にＪ．Ｐｈｒａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２５６巻、６２１項（１９９１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３９巻、２７４５項（１９９６）、ＷＯ８８０５０４７、ＥＰ３１１０３２、ＥＰ４９２０１４６、ＥＰ３１８８５１に記載がされている。しかし、用途としては心臓作用、強心作用、高血圧、眼圧低下、緑内障、喘息、乾癬等が記載されているが、アデニル酸シクラーゼ３型、及びそれが関与する疾患については記載がない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ２型または３型選択的活性化剤を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、フォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容されうる塩がアデニル酸シクラーゼ２型または３型を選択的に活性化することを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の(１)から（８）に関するものである。
【００１３】
（１）下記構造式［１］
【化１０】
0004722325.tif 000005
【００１４】
または、下記構造式[２]
【化１１】
0004722325.tif 000006
で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【００１５】
（２）下記構造式［１］
【化１２】
0004722325.tif 000007
【００１６】
または構造式[３]
【化１３】
0004722325.tif 000008
で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするアデニル酸シクラーゼ２型選択的活性化剤。
【００１７】
（３）２項記載の構造式［１］または構造式[３]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする呼吸器作用薬。
（４）２項記載の構造式［１］または構造式[３]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする気管支拡張薬。
【００１８】
（５）下記一般式［４］
【化１４】
0004722325.tif 000009
［式中、Ｒ１は−ＮＨＯＨ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、又は−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨを示す］、または下記一般式[５]
【００１９】
【化１５】
0004722325.tif 000010
［式中、Ｒ２はメチル基、または３−ピリジル基を示す］で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするアデニル酸シクラーゼ３型選択的活性化剤。
【００２０】
（６）５項記載の一般式［４］または一般式[５]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする嗅覚改善薬。
（７）５項記載の一般式［４］または一般式[５]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする高脂血症、糖尿病、または高インスリン血症治療薬。
（８）５項記載の一般式［４］または一般式[５]で表されるフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする褐色脂肪細胞活性化剤。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物には立体異性体が存在するが、本発明はこれらの異性体すべてを包含する。例えば、光学活性体、ジアステレマー及びラセミ体等はすべて本発明に含まれる。
【００２２】
本願で示す具体的な化合物として以下のような化合物が挙げられる。
化合物ａ．６−（４−アクリロイルブチリル）フォルスコリン（構造式［１］）
化合物ｂ．５，６−デヒドロ−６−デヒドロキシ−７−デアセチル−７−ニコチノイルフォルスコリン（一般式[５]に含まれる）
化合物ｃ．６−｛（２−イソチオシアニト）エチルアミノカルボニル｝フォルスコリン（構造式[３]）
化合物ｄ．７−デアセチル−７−ヒドロキサミルフォルスコリン（一般式［４］に含まれる）
化合物ｅ．７−デアセチル−７−（アリルアミノカルボニル）フォルスコリン（一般式［４］に含まれる）
化合物ｆ．７−デアセチル−７−[{２−（２−ヒドロキシエチルオキシ）エチル}アミノカルボニル]フォルスコリン（一般式［４］に含まれる）
化合物ｇ．７−デアセチル−７−｛（２−ヒドロキシエチル）アミノカルボニル｝フォルスコリン（一般式［４］に含まれる）
化合物ｈ．５，６−デヒドロ−６−デヒドロキシフォルスコリン（一般式[５]に含まれる）
【００２３】
次に本発明化合物の入手方法について説明する。
まず、本発明記載の化合物のうち、公知の化合物は先に記した文献や特許に記載の方法で製造することが出来る。
構造式[１]の化合物は、次のような製造工程で合成することが出来る。
【００２４】
【化１６】
0004722325.tif 000011
【００２５】
化合物７は文献既知の化合物であり、例えばＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１巻、１８７２項（１９８８）に記載の方法で製造することが出来る．化合物７に４−アクロイル酪酸を定法どおりエステル化することにより、化合物８を製造することができる。エステル化の手法としては、縮合剤、例えばＤＣＣやＷＳＣに必要に応じて縮合活性化剤、例えばＤＭＡＰやＨＯＢｔを作用させたり、カルボン酸部分を化学的に活性化し、それに化合物７を作用させる方法が用いられる。活性化の方法としては、酸塩化物、酸無水物、イミダゾイル体、活性エステル等への変換が可能である。化合物８は、アルカリ条件に供することによりアシル転位を発生させ、化合物９を製造することが出来る。化合物９をアセチル化剤、例えば塩化アセチルや無水酢酸を、ピリジン等の塩基存在下反応させることにより、化合物１０を製造できる。化合物１０は、その保護基であるＴＢＳ基を、酸性条件下、またはフッ素を含んだ試薬、例えばテトラブチルアンモニウムフルオリドを作用させることにより、目的の化合物１に導くことが出来る。
構造式[２]の化合物は、次のように製造することが出来る。
【００２６】
【化１７】
0004722325.tif 000012
【００２７】
化合物１１は、ＥＰ４６８４４４に記載の製造法によって容易に製造することが出来る。化合物２は、化合物１１にニコチン酸を定法どおりエステル化することにより得られる。エステル化の手法としては、縮合剤、例えばＤＣＣやＷＳＣに必要に応じて縮合活性化剤、例えばＤＭＡＰやＨＯＢｔを作用させたり、カルボン酸部分を化学的に活性化し、それに化合物１１を作用させる方法等が挙げられる。カルボン酸部分の活性化の方法としては、酸ハロゲン化物、酸無水物、イミダゾールのＮ−アシル誘導体、その他の活性エステル等への変換が可能である。
【００２８】
本発明における薬理学的に許容しうる塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、酢酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
【００２９】
本発明においては、アデニル酸シクラーゼ２型選択的活性化薬を創製することにより、β２受容体の組織特異性が低いことによるβ２受容体活性化薬の副作用が改善でき、高い気管選択性を持つ呼吸器作用剤（気管支喘息、閉塞性肺疾患治療薬）を医療現場に供給することが出来る。
また、アデニル酸シクラーゼ３型に関してはその生理作用について、嗅覚の機能や脂質、糖質の代謝等に関与していると考えられ、その選択的刺激剤は嗅覚異常に対する治療薬、脂質代謝異常（高脂血症）または糖質代謝異常（糖尿病、高インスリン血症）に対する治療薬として期待される。
【００３０】
本発明の化合物またはその薬理学的に許容される塩が医薬として用いられる場合には、単独または担体、賦形剤、希釈剤、溶解補助剤、安定化剤等の製薬上許容し得る添加剤と混合して用いることができる。賦形剤の種類は特に制限はないが、例えば、ショ糖、乳糖、マンニトール及びソルビトールのような糖類、セルロース類、またはリン酸カルシウムのような充填剤が使用できる。
本発明の剤形としては、経口剤または非経口剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤、吸入剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤等が挙げられるが、好ましい剤形としては経口剤である。
製剤中の本発明化合物またはその薬理学的に許容される塩の含量は製剤により異なるが、通常０．１〜１００重量％であることが好ましい。投与量は患者の年令、性別、体重、症状、治療目的等により決定されるが、投与量は一般に０．００１〜５０００ｍｇ／ｋｇ／日程度である。
【００３１】
次に、本発明について実施例として化合物の製造例および試験例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
実施例１
１−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−７−デアセチル−７−（４−アクリロイル）ブチリルフォルスコリン（化合物８）の製造
１−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−７−デアセチルフォルスコリン（化合物７）（４８３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、４−アクリロイル酪酸（１４２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（９ｍｌ）に溶解し、ＤＣＣ（３１０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチル（３０ｍｌ）を加えろ過し、ろ液を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００ｍｌ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（５０：１））に供し、化合物８を３５２ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）得た。
【００３２】
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ＴＭＳ）
０．０１（３Ｈ、ｓ）、０．１４（３Ｈ、ｓ）、０．８７（９Ｈ、ｓ）、１．０３（３Ｈ、ｓ）、１．１０（１Ｈ、ｍ）、１．２５（３Ｈ、ｓ）、１．２９（３Ｈ、ｓ）、１．４０（１Ｈ、ｍ）、１．４６（３Ｈ、ｓ）、１．６５（３Ｈ、ｓ）、１．６８（１Ｈ、ｍ）、２．０−２．２（４Ｈ、ｍ）、２．３３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ）、２．４７（２Ｈ、ｍ）、２．７２（２Ｈ、ｍ）、３．２５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ）、４．４７（１Ｈ、ｍ）、４．５９（１Ｈ、ｍ）、４．８８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１１Ｈｚ）、５．１５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１７Ｈｚ）、５．５３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ）、５．８４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、９Ｈｚ）、６．００（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１Ｈｚ、１７Ｈｚ）、６．２４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１８Ｈｚ）、６．３４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１８Ｈｚ）。
【００３３】
実施例２
６−（４−アクリロイルブチリル）フォルスコリン（化合物１（化合物ａ））の製造
１−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−７−デアセチル−７−（４−アクリロイル）ブチリルフォルスコリン（化合物８）（３５２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４．８ｍｌ）、水（１ｍｌ）に溶解し、１規定水酸化ナトリウム水溶液（１ｍｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。１０％クエン酸水溶液で中和の後減圧濃縮し、水（２ｍｌ）、酢酸エチル（２０ｍｌ）で３回抽出した。得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄の後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（９０ｍｌ、ヘキサン−酢酸エチル（２：１））で精製し化合物９を得た。引き続き、化合物９（８２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３ｍｌ）に溶解し、氷冷下塩化アセチル（３９μｌ、０．５２ｍｍｏｌ）、ピリジン（７７μｌ、０．９８ｍｍｏｌ）を加えアセチル化を行った。反応はＴＬＣでチェックを行い、反応終了後、クロロホルム（１５ｍｌ）を加え、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮後、残渣をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解し、１Ｍ−テトラヒドロアンモニウムフルオリド（０．４ｍｌ）を加え、２０分間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、酢酸エチル（１０ｍｌ）を加え、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０ｍｌ、ヘキサン−酢酸エチル（２：１））に供し、化合物１を２１．３ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）得た。
【００３４】
ＭＳ（ＦＡＢ、ＰＯＳ）
ｍ／ｚ  ５３５[Ｍ＋Ｈ]＋、５５７[Ｍ＋Ｎａ]＋。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ＴＭＳ）
０．９６（３Ｈ、ｓ）、１．０３（３Ｈ、ｓ）、１．３５（３Ｈ、ｓ）、１．４３（３Ｈ、ｓ）、１．６３（３Ｈ、ｓ）、２．０２（３Ｈ、ｓ）、１．１−２．２（５Ｈ、ｍ）、２．０５（２Ｈ、ｍ）、２．３８（２Ｈ、ｍ）、２．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１７Ｈｚ）、２．７２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０２（１Ｈ、ｂｒｓ）、３．２２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１７Ｈｚ）、４．６２（１Ｈ、ｂｒｓ）、４．９８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１１Ｈｚ）、５．２６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１７Ｈｚ）、５．５４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ）、５．８５（２Ｈ、ｍ）、５．９５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１Ｈｚ、１７Ｈｚ）、６．１３（１Ｈ、ｂｒｓ）、６．２５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１８Ｈｚ）、６．３５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、１８Ｈｚ）。
【００３５】
実施例３
５，６−デヒドロ−６−デヒドロキシ−７−デアセチル−７−ニコチノイルフォルスコリン（化合物２（化合物ｂ））の製造
５，６−デヒドロ−６−デヒドロキシ−７−デアセチルフォルスコリン（化合物１１）（１８．７ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、ニコチン酸（７．１ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１４．２ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．６ｍｇ、０．００５３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１ｍｌ）に溶解し、室温で１時間２０分攪拌した。反応液を減圧濃縮した後に残渣に酢酸エチル（５ｍｌ）を加え懸濁とし、ろ過を行った。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和塩化ナトリウム水溶液の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥の後減圧濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０ｍｌ、ヘキサン−酢酸エチル（１：１））に供し、１２．１ｍｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）の化合物２を得た。
【００３６】
ＭＳ（ＦＡＢ、ＰＯＳ）
ｍ／ｚ  ４５６[Ｍ＋Ｈ]＋。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ＴＭＳ）
１．１９（６Ｈ、ｓ）、１．３４（３Ｈ、ｓ）、１．３７（３Ｈ、ｓ）、１．７１（３Ｈ、ｓ）、１．０−２．０（３Ｈ、ｍ）、２．２４（１Ｈ、ｍ）、２．６４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ）、３．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ）、４．８１（１Ｈ、ｂｒｄ、Ｊ＝２Ｈｚ）、５．０３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１１Ｈｚ）、５．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１７Ｈｚ）、５．５５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ）、５．９５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１Ｈｚ、１７Ｈｚ）、６．２２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．３９（１Ｈ、ｂｒｓ）、７．４３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、８Ｈｚ）、８．３７（１Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈｚ）、８．７９（１Ｈ、ｂｒｄ）、９．２８（１Ｈ、ｂｒｓ）。
【００３７】
実施例４  アデニル酸シクラーゼ活性測定
アデニル酸シクラーゼ活性測定は以下のように行った。
まず、酵素を含む膜たんぱく質の調製を行った。
それぞれのアデニル酸シクラーゼサブタイプのｃＤＮＡは、２型はファインスタインの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１０１７３項（１９９１年））、３型はバカライヤーの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０巻、１４０３項（１９９０年））、５型は石川の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、１３５５３項（１９９２年））を参考にして調製した。それぞれの遺伝子をｐＢｌｕＢａｃベクターにサブクローニングした。組換えシャトルベクターは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵細胞ホモジネート由来の昆虫のセルラインであるハイファイブ細胞にトランスフェクションした。次いで、このプラークを川部の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、２４９０６項（１９９４年））で精製した。ハイファイブ細胞をバキュロウイルスベクターを用いて感染させ、６％ウシ胎児血清を含有するＩｎｓｅｃｔ−ＸＰＲＥＳＳ培地中２７度の条件下で３日間培養した。培養したハイファイブ細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩液で２回洗浄し、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＥＧＴＡ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＥＤＴＡ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ジチオスレイトール（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、シュークロース（２００ｍＭ）、及び１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−Ｌ−２−ヘプタノン（２０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１０μｇ／ｍｌ）、フェニルメチルスルフォニルフルオライド（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、卵白トリプシンインヒビター（５０Ｕ／ｍｌ）、及びアプロチニン（２μｇ／ｍｌ）を含んだタンパク質分解酵素阻害剤混液を加えた緩衝液中でホモジナイズした。その細胞をソニケーターで破壊し、５００×Ｇの遠心分離を４度の条件下１０分間行った。次いで上清を１０万×Ｇ、４度の条件下で４０分間遠心分離した。残った残渣を先述の緩衝液（但しＥＤＴＡを除く）に再び懸濁して−８０度で使用時まで保存した。
【００３８】
酵素活性測定は、以前に報告された方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２３８巻、３１項（１９９４年））を一部変更して以下の方法で行った。
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０、２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ＡＴＰ（０．１ｍＭ、３２Ｐで標識されたＡＴＰを１，０００,０００ｃｐｍ含む）、ｃＡＭＰ（０．１ｍＭ）、クレアチンリン酸（１ｍＭ）、クレアチンホスホキナーゼ（８Ｕ／ｍｌ）、膜たんぱく質（４μｇ）、及び各試験化合物（５０μＭ）を、最終容量が１００μｌとなるように調製した。反応は３０度の条件下２０分間行い、１０μｌの氷冷した２．２規定ＨＣｌを加え反応を停止した。反応中に生成した３２Ｐで標識されたｃＡＭＰは、酸性アルミナカラムを用いて分離し、放射線強度はシンチレーションカウンターで測定した。
以下に活性測定の結果を表１として記す。各々の酵素活性化作用は、フォルスコリンの活性を１００として表した。この結果、試験化合物のフォルスコリン誘導体は、アデニル酸シクラーゼ２型または３型の選択的活性化作用を有すことが明らかとなった。
【００３９】
【表１】
試験化合物           ２型         ３型         ５型
フォルスコリン       １００       １００       １００
化合物ａ             １１７       ５９．２     ２２．９
化合物ｂ             ８８．４     ２７２       ７７．８
化合物ｃ             １７０       ５１．３     ３８．０
化合物ｄ             １０８       ２２１       ９４．４
化合物ｅ             ９１．５     １６２       ８０．６
化合物ｆ             ６７．２     １２３       ７３．３
化合物ｇ             ８４．２     １７７       ９０．６
化合物ｈ             ７３．２     １４５       ６１．４
【００４０】
【発明の効果】
本発明により得られたフォルスコリン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩が、アデニル酸シクラーゼ２型または３型の選択的活性化剤であることを見いだした。よって、本発明記載の化合物またはその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含有する薬剤組成物は呼吸器作用薬等として有用であることが示された。