(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
STAT６ノックアウト・非ヒト動物に被検薬物を投与して、被検薬物の肥満および肥満関連疾病に対する活性を評価する方法。
【請求項２】
肥満および肥満関連疾病がII型糖尿病を合併した肥満である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
II型糖尿病がインスリン抵抗性糖尿病である請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
非ヒト動物がげっ歯類動物である請求項１に記載の評価方法。
【請求項５】
げっ歯類動物がマウスである請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
非ヒト動物として雄を使用する請求項１〜５のいずれかに記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、STAT６またはその関連物質を有効成分とすることを特徴とする肥満および肥満関連疾病の治療薬並びにその評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肥満（症）は種々の疾病の誘因となることから大きな社会問題としてクローズアップされている。肥満が誘因となる疾病としては、糖尿病、高血圧、高脂血症、腎症および動脈硬化症など国民生活に多大な影響を及ぼす疾病が挙げられることから、これら疾病の予防・治療のために肥満を治療するための治療薬が求められている。
糖尿病はI型（インシュリン依存型糖尿病）とII型（インシュリン非依存型糖尿病）に大別されるが糖尿病患者の９割以上はII型に分類される。II型糖尿病はI型糖尿病（若年性発症）と違い一般に中高年者に肥満を伴って発症する。このように糖尿病の大半を占めるII型糖尿病の発症因子として最も重要なものが肥満であり、この肥満の割合が現在の社会環境下においては増加してきており、これに伴ってII型糖尿病患者がふえてきている。また、II型糖尿病患者のうちかなりの部分がインスリン抵抗性糖尿病に移行する。
【０００３】
肥満の分子メカニズムの解明が進められた結果、肥満治療薬開発のアプローチとして脂肪細胞が分泌する肥満調節因子のレプチン(leptin)が作用するシグナル伝達経路も注目され、レプチンを肥満治療薬として開発する試みも行われた。
しかし、レプチン投与によりレプチン抵抗性が出現することなどからレプチンそのものを肥満治療薬とすることは難しいことが明らかにされ、むしろ、レプチンが作用するシグナル伝達経路を活性化する作用を有し、レプチン抵抗性を生じさせない毛様体神経栄養因子(CNTF)が注目されてきている。また、レプチンの下流因子であるニューロペプチドY(NPY)およびメラノコルチン(MC)4受容体なども注目されている。
【０００４】
レプチンはSTAT3、STAT5およびSTAT6で活性化されると報告されたが[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93，6231-6235(1996)]、その後、STAT6ノックアウト・マウスがレプチンノックアウトマウス(ob/obマウス)やレプチンレセプターノックアウトマウス(db/dbマウス)で見られる急激な肥満にならないことからレプチンのシグナル伝達系において少なくともSTAT６は重要な役割を果していないことが判明した［Immunity．７，1-11(1997)］。
サイトカインのシグナル伝達経路において発見されたJAK-STAT経路を形成するSTATファミリーはSTAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5bおよびSTAT6の7種類が現在報告されており、これらSTATファミリーの生理的な役割がノックアウト・マウスを用いて解明されてきている。
すなわち、STAT6のノックアウト・マウスにより、STAT6はインターロイキン４（IL-4）およびインターロイキン13（IL-13）のシグナル伝達経路に深く関与していることが明らかとされた［Immunity.７，1-11(1997)］。しかしながら、STAT6のノックアウト・マウスが肥満になり、その結果、II型糖尿病を発症することについては知られていなかった。むしろ上述したようにSTAT6ノックアウト・マウスは肥満にならないと報告されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、肥満および肥満関連疾病の治療に用いられる新規な薬剤並びにその評価方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、STAT6ノックアウト・マウスを長期間観察したところ従来の知見とは相違してSTAT6ノックアウト・マウスが加齢に伴い肥満になり、その結果、II型糖尿病を発症することを見い出した。またSTAT6ノックアウト・マウスで血中インスリン値の上昇、膵臓のランゲルハンス島の肥大が出現しておりインスリン抵抗性II型糖尿病を発症していることを見出した。
また、上記においてSTAT6ノックアウト・マウスと正常マウスとの間で摂餌量に差が認められなかった。このことは当該肥満が過食によってもたらされた結果ではないことを示しており、レプチンによって摂食行動がコントロールされていると考えられることから、STAT6ノックアウト・マウスにおいてレプチンのシグナル伝達系は正常に作動していることが確認された。
【０００７】
本発明者は、上記知見に基づいてSTAT6のシグナル伝達系に作用するサイトカインのノックアウト・マウスを作成し、種々検討した結果、IL-13およびSTAT6のシグナルモレキュールが肥満に深く関与していることを確かめて本発明を完成させた。
また、本発明者は、上記知見に基づきSTAT６ノックアウト・非ヒト動物に被検薬物を投与して、被検薬物の肥満および肥満関連疾病に対する活性を評価することにより当該疾病に有効な薬物の評価を行うことができると考え、当該STAT６ノックアウト・非ヒト動物を用いる当該疾病治療薬の評価方法を完成した。
すなわち、本発明は、STAT６またはその関連物質を有効成分とすることを特徴とする肥満および肥満関連疾病治療薬並びにその評価方法に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるSTAT６およびその関連物質としては、STAT６の作用を活性化することができる物質、すなわち、IL-13からSTAT6のシグナル伝達経路を亢進することができる物質であれば特に限定されない。
本発明に用いられるSTAT６およびその関連物質として例えばSTAT６（蛋白質）、IL-13（蛋白質）およびIL-13受容体（蛋白質）が挙げられる。
本発明に用いられるSTAT６、IL-13およびIL-13受容体としてはそれぞれヒトのSTAT６、IL-13およびIL-13受容体が好適に使用される。
本発明に用いられるSTAT６は公知であり、例えば、Molecular and Cellular Biology,vol．15,No.6,3336-3343(1995)に記載されている方法にしたがって調製することができる。
【０００９】
本発明に用いられるIL-13も公知であり、例えば、公表特許公報平１１−５０５２４７号公報および文献［Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.90，3735-3739(1993)］に記載されている方法にしたがって調製することができる。
本発明に用いられるIL-13受容体もまた公知であり、例えば、公表特許公報平１１−５１１０２８号公報に記載されている方法にしたがって調製することができる。
本発明に用いられるIL-13受容体としてはIL-13受容体αおよびIL-13受容体βのいずれであっても良い。これら受容体についても、上記公表特許公報平１１−５１１０２８号公報に記載されている。また、当該公報にはIL-13受容体の配列に対応する精製ポリペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントが記載されているが本発明にはいずれもSTAT６の関連物質として用いることができる。
【００１０】
本発明の肥満および肥満関連疾病治療薬は、上述したSTAT６またはその関連物質を有効成分として使用し、適宜、医薬添加物を加えて常法により、注射剤、坐剤、舌下錠、吸入剤または埋め込み型製剤等種々の製剤形態に調製することによって製造することができる。
例えば、注射剤は、常法によって製造することができ、STAT６またはその関連物質に、マンニト−ル、塩化ナトリウム、グルコ−ス、ソルビット、グリセロ−ル、キシリト−ル、フルクト−ス、マルト−ス、マンノ−ス等の等張化剤、亜硫酸ナトリウム、アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコ−ル、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤等を適宜添加して製造することができる。
注射剤は、用時溶解用の凍結乾燥製剤とすることもできる。凍結乾燥製剤は、常法によって製造することができ、適宜、上記、等張化剤、安定化剤、保存剤等を製剤中に添加することができる。
本発明の肥満および肥満関連疾病治療薬は、上記製剤により経口または非経口投与することができる。
【００１１】
本発明の肥満および肥満関連疾病治療薬の投与量は、本発明に用いられるSTAT６またはその関連物質の種類、投与経路、患者の性別、病態、年齢、体重などによってもそれぞれ異なるが、通常、１日当たり0.1ｍｇから500ｍｇであり、これを１度にまたは２〜３回に分けて適宜投与する。
また、本発明に包含される肥満および肥満関連疾病に対する被検薬物の評価方法は、STAT６ノックアウト・非ヒト動物に被検薬物を適宜投与して、被検薬物の肥満および肥満関連疾病に対する活性を評価することにより行うことができる。
本発明の評価方法は、II型糖尿病を合併した肥満なかでも特にインスリン抵抗性糖尿病を合併した肥満に対し有効な薬物を評価するのに好適に用いられる。
本発明の評価方法に用いられるSTAT６ノックアウト・非ヒト動物としてはマウス、ラット等のげっ歯類が当該動物の作成の容易さおよび取扱いの簡便さから好ましい。なかでも特にマウスが好ましい。また、当該非ヒト動物としては、いずれも雄を使用することが好ましい（後記試験例参照）。
本発明の評価方法は、具体的には以下のようにして行うことができる。
すなわち、後記試験例１のようにして調製される当該疾病を発症するSTAT６ノックアウト・非ヒト動物（試験例１においてはマウス）に対し、被検薬物を適宜投与し、被検薬物投与後の体重増加並びに糖負荷試験による糖代謝異常に対する被検薬物の作用効果を（薬物非投与群と）比較検討することにより行うことができる。
【００１２】
【実施例】
以下に、試験例および実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
試験例１
：STAT6のノックアウト・マウスにおける肥満およびII型糖尿病の発症の証明(1)試験方法：
C57BL/6(B6)系STAT6ノックアウト(STAT6 KO)・マウス（雌雄各群4匹）を47週令まで飼育し、経時的に体重を計測し、文献[DIABETES,VOL.,31No.9,749-753(1982)]記載の方法にしたがって糖負荷試験（IPGTT：Intraperitoneal Glucose Tolerance Test）を行った。
すなわち、糖負荷試験は6-9時間絶食後、腹腔内にグルコース[1mg/体重(g)]を投与し、投与０、30および60分後に採血し、得られた血中サンプルのグルコース濃度をグルコース−オキシダーゼ法により測定することによって行った。
また、対照群として、B6系正常マウス（雌雄各群５匹）について上記試験を同様に行った。
STAT6ノックアウト・マウスはB6由来のES細胞を用い文献（Nature 380,627-630,1996）記載の方法で調製したものを使用した。
(2)試験結果：
結果を表１に示した。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
表1から明らかなようにSTAT6ノックアウト・マウスは対照群（正常群）と比較して肥満になり、その結果、加齢に伴い肥満、空腹時血糖の著明な上昇、糖負荷異常、尿糖等の症状を持つII型糖尿病を発症することが確かめられた。
特に、この症状はSTAT6ノックアウト・マウスの雄に顕著に認められた。
すなわち、STAT6ノックアウト・マウスの雄群は8週令で肥満出現、12週令で糖負荷異常、30週令で空腹時血糖の著明な上昇を認めた。他方STAT6ノックアウト・マウスの雌群は30週令でも糖代謝は正常であり、40週令で軽度の糖負荷異常が認められた。この事実より性差おそらく性ホルモンが肥満出現、糖負荷異常、糖尿病発症に関与していることが示唆された。
【００１５】
また、上記試験において１５週令雄の正常マウス、STAT6ノックアウト・マウスの摂食量を３日間測定した。摂食量は正常マウスで2.60±0.33 g/mouse/day, STAT6ノックアウト・マウスでは2.72±0.27 g/mouse/dayとSTAT6ノックアウト・マウスと正常マウスとの間で摂餌量に差が認められなかった。このことは当該肥満が過食によってもたらされた結果ではないことを示しており、レプチンによって摂食行動がコントロールされていると考えられることから、STAT6ノックアウト・マウスにおいては、レプチンによる摂食行動のシグナル伝達系は正常に作動していることが確認された。
その上、STAT6ノックアウト・マウスは正常マウスと比較し血中インスリン値が加齢に伴い上昇した。特に、この症状はSTAT6ノックアウト・マウスの雄に顕著に認められた（表２）。また、STAT6ノックアウト・マウスで膵臓のランゲルハンス島の肥大も確認した。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
以上の結果より高齢のSTAT6ノックアウト・マウスで発症したII型糖尿病はインスリン抵抗性を持つ、つまりインスリン抵抗性糖尿病であることが判明した。これらのことからインスリン抵抗性糖尿病発症にはSTAT6のシグナル伝達経路が深く関与していることが証明された。
【００１８】
更に上記試験結果をふまえ、STAT6のシグナル伝達経路に関連すると推測されるIL-4のノックアウト・マウス、IL-13のノックアウト・マウスおよびIL-4とIL-13のダブルノックアウト・マウスを夫々作成し、上記と同様の試験を行ったところ、IL-4ノックアウト・マウスにおいては肥満が認められず、IL-13のノックアウト・マウスおよびIL-4とIL-13のダブルノックアウト・マウスに肥満もしくは肥満の傾向が認められた。また、この場合もSTAT6ノックアウト・マウスと同様に雄に肥満および糖代謝異常が認められた。しかしながら、雌には有意な肥満および糖代謝異常が認められなかった。
上記において用いられたIL-4のノックアウト・マウス、IL-13のノックアウト・マウスおよびIL-4とIL-13のダブルノックアウト・マウスは、夫々、文献［J Exp Med, 184,1651-1661,1996, J Exp Med, 189, 1565-1572,1999］に記載の方法によって作成した。
【００１９】
以上のことから肥満にはIL-13からSTAT6のシグナル伝達経路が深く関与していることが証明された。しかし、このシグナル伝達経路には性差のあることが認められた。
したがって、IL-13からSTAT6のシグナル伝達経路を亢進させることによって肥満を改善し、ひいては肥満が誘因となって発症する糖尿病、腎症、網膜症、神経症、高血圧、高脂血症および動脈硬化症などに対し予防および/または治療効果がもたらされるものと考えられる。特に、STAT6のシグナル伝達経路を亢進させることは、II型糖尿病なかでもインスリン抵抗性糖尿病を合併した肥満に対して有用であると考えられる。
【００２０】
実施例１
注射剤：
ヒトIL-13が溶解しているＰＢＳ（1mg/ml）を濾過滅菌した後、１アンプルに５ｍｌずつ分注することにより、ヒトIL-13を含有する注射剤（５ｍｇ／アンプル）が調製される。
【００２１】
実施例２
注射剤：
ヒトIL-13の受容体が溶解しているＰＢＳ（1mg/ml）を濾過滅菌した後、１アンプルに５ｍｌずつ分注することにより、ヒトIL-13の受容体を含有する注射剤（５ｍｇ／アンプル）が調製される。
【００２２】
実施例３
注射剤：
ヒトSTAT6が溶解しているＰＢＳ（1mg/ml）を濾過滅菌した後、１アンプルに５ｍｌずつ分注することにより、ヒトSTAT6を含有する注射剤（５ｍｇ／アンプル）が調製される。
【００２３】
実施例４
注射剤：
５％（W/V）グルコース含有生理食塩液にヒトIL-13（1mg/ml）を溶解し、濾過滅菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、ついで、凍結乾燥することにより、ヒトIL-13を含有する凍結乾燥注射剤（１ｍｇ／バイアル瓶）が調製される。
【００２４】
実施例５
注射剤：
５％（W/V）グルコース含有生理食塩液にヒトIL-13の受容体（1mg/ml）を溶解し、濾過滅菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、ついで、凍結乾燥することにより、ヒトIL-13の受容体を含有する凍結乾燥注射剤（１ｍｇ／バイアル瓶）が調製される。
【００２５】
実施例６
注射剤：
５％（W/V）グルコース含有生理食塩液にヒトSTAT6（1mg/ml）を溶解し、濾過滅菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、ついで、凍結乾燥することにより、ヒトSTAT6を含有する凍結乾燥注射剤（１ｍｇ／バイアル瓶）が調製される。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の肥満および肥満関連疾病治療薬は、肥満に深く関与することが本発明者によって証明されたIL-13からSTAT6のシグナル伝達経路、すなわち、IL-13のIL-13受容体への結合に伴い、当該受容体の細胞内領域に会合しているJAK1が活性化され、次いで、活性化されたJAK1によってチロシンリン酸化された転写因子STAT6が核へ移行して特異的な遺伝子の転写誘導を発現するシグナル伝達経路、を亢進させることによって肥満を改善し、ひいては肥満が誘因となって発症する糖尿病、腎症、網膜症、神経症、高血圧、高脂血症および動脈硬化症などに対し予防および/または治療効果をもたらす。とくに本発明の肥満および肥満関連疾病治療薬はII型糖尿病、特に、インスリン抵抗性糖尿病を合併した肥満に対して有用である。
また、本発明に包含される肥満および肥満関連疾病に対する被検薬物の評価方法は、特に、インスリン抵抗性糖尿病を合併した肥満に対して有効性を示す薬物を的確に評価できることから、当該疾病に対し有効な薬物を被検薬物のなかからスクリーニングすることができる。