(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを用いた全反射照明法に適用される照明装置において、
前記対物レンズを介して入射される入射光の全反射後に、前記対物レンズを介して戻される戻り光の光路に、該戻り光を遮蔽する遮蔽手段を挿脱可能に設けたことを特徴とする照明装置。
【請求項２】
前記遮蔽手段は、前記対物レンズの後ろ開口部に配置されることを特徴とする請求項１記載の照明装置。
【請求項３】
前記遮蔽手段は、前記戻り光の光路に対して挿脱可能な遮蔽部分を有することを特徴とする請求項１または２記載の照明装置。
【請求項４】
前記遮蔽手段は、電気的な動作により前記戻り光に対する透過率を変化させることを特徴とする請求項１または２記載の照明装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、対物レンズを用いた全反射照明法に適用される照明装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、蛍光顕微鏡、フォントＳＴＭ（ＮＳＯＭ）、微小ガラス針によるナノメートル計測法などのミクロの次元や領域を対称とするものの照明方法として、全反射照明が知られている。
【０００３】
この全反射照明は、全反射したガラス表面から試料溶液側にしみ出す光であるエバネッセント光（深さ１００ｎｍ程度）を使ってガラス表面近傍のみを局部的に照明するもので、エバネッセント光が“波長より小さい寸法の領域に局在し、自由空間を伝搬しない”という特性を利用することにより、バックグランド・ノイズ（散乱光など）が極めて低く、例えば、蛍光色素１分子のような観察にも有効であるとされている。
【０００４】
ところで、このような全反射照明には、プリズムを使用する方法と、対物レンズを使用する方法があるが、このうちの対物レンズを使用する方法では、開口数（ＮＡ）が下記の式を満たす対物レンズを使用することにより全反射照明が可能であり、油浸対物レンズで高い開口数を有するもが使われている。
【０００５】
ＮＡ＞ｎ      ただし、ＮＡ：対物レンズの開口数、ｎ：試料溶液の屈折率
しかし、このような対物レンズを使用する方法では、対物レンズ内で光が散乱しないように照明光を入射することが重要であり、このため、例えば特開平９−１５９９２２号公報に開示されるように、照明光を対物レンズの後ろ側焦点（瞳位置）で集光するように入射させるようにしたものがあり、この場合、照明光の入射位置の微妙な調整をするのに、カバーガラス表面で全反射した後に同一光路を通ってくる戻り光の形状や強弱を観察して調整の良否を確認するようにしている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような全反射照明に対物レンズを使用した方法では、適切な調整が行われた照明光は、カバーガラス裏面で全反射した後、同一光路を通って照明装置まで戻るようになり、この時、蛍光染色された試料は、試料面にしみ出したエバネッセント光が届く範囲でのみ蛍光が発光し、バックグラウンドの少ない蛍光像が対物レンズを通して観察されるようになる。
【０００７】
この場合、通常の蛍光観察においては、励起光が観察側に来ないようにするため、色フィルタや波長選択性のミラーなどが用いられているが、レーザ光を用いた全反射照明についても、試料からの蛍光のみ観察光学系に届かせるため、レーザ光の波長に合わせたダイクロイックミラーとして、蛍光のみを透過するような光学特性のものが使用されている。
【０００８】
ところが、通常の蛍光観察の場合、観察光学系に戻る励起光は、試料面あるいはその他の光学素子によって散乱された励起光のみであるのに対し、全反射照明においては、照明光に用いたレーザ光が試料面で全反射され、ほとんど損失なしに戻り光として観察光学系に戻ってくるため、全反射照明による蛍光観察に用いられるダイクロイックミラーやバリアフィルタの光学素子には、戻り光に対する反射率の高いものが要求され、このため、これら光学素子として、特別な遮断特性を有するものが必要となり、価格的に高価になるという問題があった。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、戻り光を確実に遮蔽できる、価格的にも安価な照明装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、対物レンズを用いた全反射照明法に適用される照明装置において、前記対物レンズを介して入射される入射光の全反射後に、前記対物レンズを介して戻される戻り光の光路に、該戻り光を遮蔽する遮蔽手段を挿脱可能に設けたことを特徴としている。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記遮蔽手段は、前記対物レンズの後ろ開口部に配置されることを特徴としている。
【００１２】
請求項３記載の発明は、請求項１又は２記載の発明において、前記遮蔽手段は、前記戻り光の光路に対し挿脱可能な遮蔽部分を有することを特徴としている。
【００１３】
請求項４記載の発明は、請求項１又は２記載の発明において、前記遮蔽手段は、電気的な動作により前記戻り光に対する透過率を変化させることを特徴としている。
【００１４】
この結果、本発明によれば、戻り光の光路上に位置される観察光学系の各光学素子として、通常の観察系で用いるものと同程度の遮蔽特性を有するものを使用することができる。
【００１５】
また、電気的な動作により戻り光に対する透過率を変化させる遮蔽手段を用いることで、振動を嫌う標本の観察を行う場合に有利になる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１７】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される対物レンズを用いた全反射照明法を採用した倒立型の落射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。
【００１８】
図において、１は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体１は、一般的な倒立型の落射蛍光顕微鏡と同様に、照明部２、ダイクロイックミラー３、対物レンズ４、光学フィルタ５および撮像素子（ＣＣＤカメラなど）６を有しており、それぞれの光軸を一致させて配置されている。
【００１９】
照明部２は、所定波長のレーザ光を発する照射光源２０１と集光レンズ２０２を有するもので、照射光源２０１からのレーザ光を集光レンズ２０２を介してダイクロイックミラー３に入射させるようにしている。
【００２０】
ダイクロイックミラー３は、照射光源２０１からの所定波長のレーザ光を反射するとともに、後述する蛍光の波長を透過するように調整されており、照射光源２０１のレーザ光を反射し、入射光（励起光）７１として対物レンズ４を透過して標本９に照射させるようにしている。
【００２１】
対物レンズ４は、上述したＮＡ＞ｎの条件を満たした高い開口数を有する油浸対物レンズからなるものである。また、標本９は、対物レンズ４の上方に位置される顕微鏡本体１の図示しないステージに載置されたガラス基板８上にオイル１０を介在して配置されている。この場合、標本９は、オイル１０およびガラス基板８を介して対物レンズ４の焦点位置に位置されている。
【００２２】
そして、入射光（励起光）７１の励起により、標本９から発せられる微弱な蛍光７２は、ダイクロイックミラー３を透過され、光学フィルタ５に入射される。
この場合、光学フィルタ５は、ダイクロイックミラー３などとともに観察光学系を構成するもので、光の波長を選択的に通すことができるようにしている。ここでは、入射光（励起光）７１の波長の光を遮断し、蛍光の波長の光のみを通過させるものが用いられ、標本９からの蛍光７２は、光学フィルタ５を通過され、蛍光像として撮像素子６により撮像されるようになっている。
【００２３】
一方、入射光７１として対物レンズ４に入射されるレーザ光は、ガラス基板８で全反射され、標本９側にエバネッセント場を生成した後、対物レンズ４の中心軸に対して入射光（励起光）７１と軸対称な対物レンズ４の瞳位置で焦点を結び、戻り光７３として観察光学系に向けて戻っていく。
【００２４】
この場合、この戻り光７３の光路には、遮蔽手段として遮蔽板１１が配置されている。この遮蔽板１１は、戻り光７３が観察光学系に戻るのを阻止するためのものであるが、遮蔽板１１が常に光路上に挿入された状態では、入射光７１がガラス基板８で全反射する条件を満たすための各光学素子の調整が難しくなるので、戻り光７３の光路に対して挿脱可能になっている。また、遮蔽板１１は、観察の際に、蛍光光量を損失させないために、図２（ａ）に示すように入射光（励起光）７１の断面形状１１１を覆える大きさの遮蔽部分１１２を有するのが理想で、この遮蔽部分１１２の位置としては、全体光路の光軸中心に対して断面形状１１１で示す入射光（励起光）７１と対称な位置になっている。
【００２５】
また、このような遮蔽板１１の配置場所は、戻り光７３は拡散光で対物レンズ４からダイクロイックミラー３に向かって広がっていくので対物レンズ４の瞳位置にするのが理想であるが、通常対物レンズ４の瞳位置は、レンズ内部になるので、対物レンズ４の後ろ側開口部に設定されている。具体的には、微分干渉法でダハプリズムを入れるために設けられた位置に挿入するのが実用的である。
【００２６】
なお、遮蔽板１１としては、蛍光像の明るさに問題がなければ、図２（ｂ）に示すように遮蔽部分１１３を光路断面の半分を覆うような形状としてもよい。
【００２７】
このようにすれば、入射光（励起光）７１の位置が多少動いても図示左半分の部分に入射していれば、戻り光７３を遮蔽することができる。
【００２８】
また、図２（ｃ）に示すように遮蔽板１１の一部を遮蔽部分１１４に形成するとともに、遮蔽板１１全体を回転機構により回転させるようにしてもよい。こうすれば、光路への挿脱による遮蔽でなく、遮蔽板１１の回転による戻り光７３の遮蔽を実現できる。この場合、遮蔽板１１の回転駆動にモータなどの電気的な駆動手段が用いられることにより、観察に対して顕微鏡に手を振れることなく、調整と観察を切替えることができる。
【００２９】
従って、このようにすれば、対物レンズ４とダイクロイックミラー３との間に遮蔽板１１を挿脱可能に設け、ガラス基板８で全反射されて戻されて来る戻り光７３を遮蔽できるようにしたので、戻り光７３の光路上に位置される観察光学系のダイクロイックミラー３および光学フィルタ５などの各光学素子として、通常の観察系で用いるものと同程度の遮蔽特性を有するものを使用することができるようになり、従来の特別な遮断特性を有するものを必要とするものと比べ、価格的に安価にできる。
【００３０】
（第２の実施の形態）
図３は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３１】
この場合、第１の実施の形態では、遮蔽手段として遮蔽板１１の不透明な遮蔽部分を入射光路に対して出し入れするようにしたが、この第２の実施の形態では、遮蔽板１１に代えて電気的な刺激により戻り光７３に対する透過率を変化させることができる液晶シャッタ１２を設けるようにしている。この場合、液晶シャッタ１２は、図示しない外部駆動回路によりオンオフ可能になっていて、このオンオフ動作により戻り光の透過と遮蔽を選択可能にしている。
【００３２】
従って、このようにすれば、液晶シャッタ１２は、動作の際に振動を一切発生しないので、振動を嫌う標本の観察を行う場合に有利である。
【００３３】
なお、上述した実施の形態では、一貫して蛍光顕微鏡に適用した例について述べたが、対物レンズを使用した全反射照明を必要とするものならば、例えば、フォトトンネル顕微鏡などの他への適用も可能である。
【００３４】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、観察光学系への戻り光を確実に遮蔽でき、価格的に安価にできる照明装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態に用いられる遮蔽部材の形状を光軸方向から投影した図。
【図３】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…顕微鏡本体
２…照明部
２０１…照射光源
２０２…集光レンズ
３…ダイクロイックミラー
４…対物レンズ
５…光学フィルタ
６…撮像素子
７１…入射光
７２…蛍光
７３…戻り光
８…ガラス基板
９…標本
１０…オイル
１１…遮蔽板
１１１…断面形状
１１２、１１３、１１４…遮蔽部分
１２…液晶シャッタ
【図１】
0004724278.tif 000002
【図２】
0004724278.tif 000003
【図３】
0004724278.tif 000004