(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中に複数の中空の繊維（３）が互いに並行に配置され、その各多孔質の壁（３ａ）が開口（４）を画定した、ハウジング（２）を有し、上記中空の繊維の複数の平行な開口（４）からなる内部通路（Ａ）と、上記繊維と上記ハウジングの間で利用可能な容積に対応する外部通路（Ｂ）とを有し、希釈状態で大きさの異なる複数の微生物を含む大量の初期液体試料を処理して、濃縮状態で初期液体試料と同じ組成からなる微生物を含む少量の最終液体試料を得るために用いられる、濾過手段の使用において、上記手段が用いられるときには、少なくとも一つの濃縮工程が行われ、その中では、
ａ．  単一の濾過手段が使用され、
ｂ．  上記濾過手段は、前面モードで使用され、
ｃ．  繊維の多孔質の壁（３ａ）の遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生物を保持するように決定され、
そして、不連続的に、
ｄ．  濾過段階では、初期液体試料がすべて上記濾過手段の内部通路（Ａ）を介して導入され、濾過液は、上記濾過手段の外部通路（Ｂ）を介して除去され、濃縮液は、液体試料が導入された通路を介して蓄積され、
ｅ．  収集段階では、試料がすべて通過した後、上記一方の通路から上記他方の通路への上記濾過手段（１）を通る液体試料の通過を停止し、濃縮液から出口液体試料を得、
ｆ．  逆流洗浄段階の間、微生物のない液体の流れを、上記一方の通路から上記他方の通路へ循環させる、
ことを特徴とする濾過手段の使用方法。
【請求項２】
中に複数の中空の繊維（３）が互いに並行に配置され、その各多孔質の壁（３ａ）は、開口（４）画定した、ハウジング（２）を有し、上記中空の繊維の複数の平行な開口（４）からなる内部通路（Ａ）と、上記繊維と上記ハウジングの間で利用可能な容積に対応する外部通路（Ｂ）とを有し、希釈状態で大きさの異なる複数の微生物を含む大量の液体試料を処理して、濃縮状態で初期液体試料と同じ組成からなる微生物を含む少量の最終液体試料を得るために用いられる、濾過手段の使用において、上記手段が用いられるときには、少なくとも一つの濃縮工程が行われ、その中では、
ａ．  単一の濾過手段が使用され、
ｂ．  上記濾過手段は、前面モードで使用され、
ｃ．  繊維の多孔質の壁（３ａ）の遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生物を保持するように決定され、
そして、不連続的に、
ｄ．  濾過段階では、初期液体試料がすべて上記濾過手段の外部通路（Ｂ）を介して導入され、濾過液は、上記濾過手段の内部通路（Ａ）を介して除去され、濃縮液は、液体試料が導入された通路を介して蓄積され、
ｅ．  収集段階では、試料がすべて通過した後、上記一方の通路から上記他方の通路への上記濾過手段（１）を通る所期液体試料の通過を停止し、濃縮液から出口液体試料を得る、
ことを特徴とする濾過手段の使用方法。
【請求項３】
濾過段階（ｄ）と収集段階（e）の間、外部通路は、空にされ得るか、空気で加圧され得ることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項４】
上記収集段階（e）は、濃縮液の重力による流れおよび／または、加圧空気の内部通路内への通過によって行われることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項５】
上記濾過段階（d）の間、初期液体試料は、内部通路の入口への送り出しおよび／または、上記内部通路の出口での吸引によって循環することを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項６】
逆流洗浄段階の間、微生物のない液体の流れを、上記一方の通路から上記他方の通路へ循環させることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項７】
上記濾過段階（d）と上記収集段階（e）の間、外部通路は、部分的または完全に空にされることを特徴とする請求項２〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
最終液体試料は、外部通路内での濃縮液溶離によって得られることを特徴とする請求項２、６、および７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項９】
上記濾過段階（ｄ）は、初期液体試料の事前濾過なしに行われることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１０】
上記濾過手段は、超濾過手段であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
上記濾過手段の繊維は、有機膜からなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１２】
上記濾過手段の繊維は、酢酸セルロース、エチルセルロース、ポリエーテル・スルフォン、またはポリアクリロにトリルでつくられる有機膜であることを特徴とする請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１３】
上記濾過手段の繊維は、セラミックスからなる無機膜であることを特徴とする請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
上記濾過手段の中空の繊維は、両端がそれぞれ樹脂の中に埋め込まれ、内部通路（Ａ）と外部通路（Ｂ）との間および、上記濾過手段と外部との間を、いかなる汚染物質も通過するのを防ぐことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１５】
上記濾過手段の大きさおよび濾過段階の時間は、初期試料の量と得られる濃縮液の量の比率が、少なくとも50に等しく、好ましくは150と500の間になるように定められることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
少なくとも二つの連続する液体試料濃縮工程が行われ、これら二つの工程は、請求項１に記載の濾過手段を使用して行われ、第一の濃縮工程の終わりに得られた濃縮液が、第二の濃縮工程のための初期液体試料を構成することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１７】
液体試料に少なくとも二つの連続する処理が行われ、これらの処理の少なくとも一つは、請求項１に記載の濃縮工程であり、第一の処理の終わりに得られた濃縮液が、第二の処理のための初期液体試料を構成することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１８】
上記濾過手段の寸法および処理の実施時間は、初期試料量と最終試料量の間の比率が、少なくとも5000に等しく、好ましくは15,000から100,000の間となるように定められることを特徴とする請求項１６または１７に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、希釈状態で大きさの異なる複数の微生物（ウイルス、バクテリア、寄生虫）および各種有機および無機高分子を含む大量の試料を処理して、濃縮された状態でとくに汚染物質の同じ相対的混合物を含む少量の液体試料を得るため必要とするような、液体媒質中に存在する汚染物質の分析の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
このような汚染物質とくに微生物の集積体および分析用の少量の試料は、微生物生化学的および生物学的分析方法、とくに例えば多重検出などの免疫検定方法や分子生物学的手法を用いる場合に、必要となるものである。
【０００３】
例えば吸着法を用いて微生物とくにウイルスを分離濃縮する手段は、公知である。しかし、これらの手段では、それらが微生物の生存能力を保証するものでないことに加えて、上に述べたような分析法で使用できる量の試料を得ることができない。
【０００４】
液体媒質中の微生物を収集するために用いられる他の手段では、濾過方法および一種類のみの微生物の分析が求められるが、常に定量的な分析結果が得られるものではない。
【０００５】
バクテリアおよび寄生虫の場合には、規格化された方法では、種によって異なるが、0.2μmから1μmの範囲の大きさの多孔性の平坦な膜を使用することが望ましい。
【０００６】
例えば、とくにフランス国特許明細書FR-B-2693474から、公知の方法で一つ以上の膜を使用してウイルス程度の大きさの微生物を分離できるようにし、同時に微生物の生存能力を保障する接線限外濾過にもとづく手法も知られている。
【０００７】
しかし、最終液体試料の量に関する必要性から、この手法を生化学的または生物学的分析法で分析する試料を作製するために使用することはできない。
【０００８】
オータキ等（Wat.  Sci.  Tecch.  37、10,107-116,1998）から、精密濾過膜の性能を確認するために、中空繊維を用いた限外濾過装置を連続正接モードで使用し、供給液、濾過液、および濃縮液からそれぞれ試料を回収することによって周期的に得られる回収物を分析することも知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
正接モードの濾過および限界濾過手段の使用には、膜での正接速度を維持して懸濁液内の粒子を濾過するようにし、同時に使用されている膜がすぐに詰まるのを避けるために濃縮液のすべてまたは一部を再循環させることのできる回路の存在が必要となる（レオス・Ｊ・ジーマン、アンドリュー・Ｌ・ジドニー、マーセル・デッカー「精密濾過および限外濾過  −  原理および応用」、ニューヨーク  −  バーゼル  −  香港、1996  “Microfiltration  and Ultrafiltration − Principles and Applications” Leoa J. Zeman, Andrew L. Zydney, Marcel Dekker, Inc.New York − Basle − Hong Kong 1996）。
【００１０】
濾過された流体の再循環は、長い濾過時間が必要となり、とくに、最終的に得られる量に影響することなく濃縮物および微生物の一部を回収するために余分の量が必要となる。
【００１１】
これらの手法では、配管機構の大きさおよび壁に残存する微生物を抽出するために必要な溶離液の量の大きさ、から大量の濃縮液が用いられ、また、濾過時間が長くなる。そのため、これらの手法は分析に少量を必要とし、また例えば飲料水あるいは人が消費する目的の他の流体の汚染に関する疑問に答えるために、迅速に結果が得られるような分析手段には使用できない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、濾過手段を使用するにあたって、大量あるいは予め定められた量の初期液試料から、微生物の生存能力を保障しながら、同時に、微生物の生化学的および生物学的分析方法、とくに例えば多重検出などの免疫検定方法や分子生物学的手法を実施可能な、充分に少量の分析試料を得ることができるようにすることである。
【００１３】
本発明にしたがって使用される濾過手段は、前面モードで中空の繊維を用いる限外濾過の手法に基づくものである。
【００１４】
前面モード（frontal mode）とは、正接モード（tangental mode）と異なり、初期液試料が濾過手段を通過する任意の単流路であって、それは同じ試料の少なくとも一部が濾過手段の入口に循環して、戻ることのないような単流路を意味すると理解すべきものである。
【００１５】
この前面モードの限外濾過手段を使用することによって、単流路内で長くとも一時間程度の時間内に試料を濃縮して少量の濃縮液を得、同時に、微生物の生存能力、多重収集、および100％に近い収量を保障することができる。
【００１６】
「多重収集」という表現は、最終試料から、初期試料中に存在するほぼすべての異なる種類または種の微生物を収集することが可能であることを意味すると理解すべきものである。
【００１７】
上に述べたような高い収量が得られるのは、他の装置と異なり、例えば再循環用配管機構などの補助的配管機構が存在するため、また中空の繊維の全長に沿った多孔部の信頼性のために、無駄となる量がないためである。
【００１８】
【実施例】
使用される濾過手段の諸特徴は、添付の図面を参照して以下に行う説明から明らかとなろう。
【００１９】
上記濾過手段は、中に複数の中空の繊維（３）が互いに並行に配置されたハウジング（２）を有し、その各多孔質の壁（３ａ）は、開口（４）画定し、したがって、上記手段は、上記中空の繊維の複数の平行な開口（４）からなる内部通路（Ａ）および上記繊維と上記ハウジングの間で利用可能な容積に対応する外部通路（Ｂ）を有する。
【００２０】
本発明によると、この手段は、希釈状態で大きさの異なる複数の微生物を含む大量の初期液体試料を処理して、濃縮状態で同じ組成の微生物を含む少量の最終液体試料を得るために用いられる。
【００２１】
この手段が用いられるときには、少なくとも一つの濃縮工程が行われ、その中では、
ａ）単一の濾過手段が使用され、
ｂ）上記濾過手段は、前面モードで使用され、
ｃ）繊維の多孔質の壁（３ａ）の遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生物を保持するように不連続に決定され、
ｄ）濾過段階では、初期液体試料がすべて上記濾過手段の一方の通路（Ａ，Ｂ）を介して導入され、濾過液は、上記濾過手段の他方の通路を介して除去され、濃縮液は、液体試料が導入された通路を介して蓄積され、
ｅ）収集段階では、試料がすべて通過した後、上記一方の通路から上記他方の通路への上記濾過手段（１）を通る所期液体試料の通過を停止し、濃縮液から出口液体試料を得る。
【００２２】
濃縮液によって形成される出口液体試料は、単純に重力を利用する、圧縮気体を用いる、または上記濾過手段を物理的に攪拌することによって収集できるが、ＴＷＥＥＮ２０型洗剤および／またはＢＳＡ（牛血清アルブミン）型表面活性剤を含むＰＢＳ型の食塩溶液（例：  NaCl 120ミリモル、KCL 2.7mモル、NaH2PO4  10ミリモル）を用いた微生物の場合には、任意の物質を用いた溶離によっても収集することも可能である。
【００２３】
本発明の他の一実施例にあっては、濃縮液で形成された出口液体試料は、第二の濃縮工程を施し、この第二の濃縮工程で得られた試料が初期液体試料として用いられる。
【００２４】
中空の繊維（３ａ）の壁は，上に述べたような多孔質の中空の繊維の製造が可能な任意の材料、例えば酢酸セルロース、エチルセルロース、ポリエーテル・スルフォン、またはポリアクリロにトリルなどの有機膜あるいはセラミックなどの無機膜などを用いてつくることができる。
【００２５】
上記繊維の多孔質の壁（３ａ）に関する遮断閾値は、初期試料の最も小さい微生物を保持するように決定される。したがって、限外濾過の領域では、10ないし100nmの孔の多孔質の繊維が用いられ、濃縮液は、ウイルスを含めてウイルスの大きさ以上のすべての微生物を含むことになるが、とくに検出すべき粒子の大きさが10nm以下の場合には、ナノメートルの領域用として1ないし10nmの多孔質の繊維が用いられる。
【００２６】
本発明の一実施例にあっては、初期試料が導入される通路は、内部通路（Ａ）であり、出口試料が抽出される通路は、外部通路（Ｂ）である。したがって、微生物は、繊維の内部に蓄積されて濃縮液が形成され、濾過液は、繊維とハウジング（Ｂ）の間で利用可能な容積の中の繊維の外部に沿って通過する。
例えば10ないし100リットルの量の回収された水の試料からなる処理すべき試料は、弁（Ｃ）を介してモジュールの中空の繊維の中に導入され、蠕動ポンプ、または弁（Ｄ）および（Ｆ）を閉じたままにして、弁（Ｅ）によって濾過液側で低圧を生じさせるなど、他の手段を用いて行われる吸引によって搬送される。
【００２７】
処理されるべき全量がモジュールを通過したとき、ポンプを停止させ、弁（Ｃ）を閉じて試料源から切断する。
【００２８】
次に、例えば弁（Ｅ）を開いた後例えば圧縮空気で0.5バールに加圧するなどしてモジュールを大気圧下において、例えば弁（Ｆ）を介して濾過液を除去してハウジングを空にし、その後に弁（Ｅ）を再び閉じる。
【００２９】
濃縮液の収集は、弁（Ｄ）を介して行うが、最初は弁（Ｃ）を開いて重力を利用し、最後は弁（Ｃ）を閉じて繊維の中に圧縮空気を注入して行う。
【００３０】
別の一実施例にあっては、初期試料が導入される通路は、外部通路（Ｂ）であり、出口試料が抽出される通路は、内部通路（Ａ）である。したがって、微生物は、繊維とハウジングの間で利用可能な容積内の繊維の外部に蓄積されて濃縮液を形成し、濾過液は、除去されるべき繊維の内部に沿って通過する。
【００３１】
例えば10ないし100リットルの体積の回収された水の試料からなる処理すべき試料は、弁（Ｅ）を介してハウジング内に導入され、蠕動ポンプで行われる吸引によって低圧を生じさせ、または例えば弁（Ｃ）を閉じたままにして弁（Ｄ）によって中空の繊維の内部の濾過液側で低圧を生じさせることによって搬送される。
【００３２】
処理されるべき全量がモジュールを通過したとき、ポンプを、作動させ続け、弁（Ｅ）を試料源から遮断し、モジュールのハウジングの中に収容されている濃縮液の量を減らす。量は、完全に減らしてもあるいは一部を減らしてもよい。
【００３３】
所定の濃縮液の濃度レベルに達したら、ポンプを停止させ、弁（Ｄ）を他のすべての弁とともに閉じる。
【００３４】
溶離液をハウジングの中に導入し、次にモジュールを攪拌し、その後に弁（Ｆ）を介して濃縮液または溶離液を収集し、弁（Ｂ）を介して弁（Ｅ）を介して圧縮空気を注入して終わることも可能である。
【００３５】
吸着現象を制限するために、繊維を例えばＴＷＥＥＮ２０型洗剤および／またはＢＳＡ（牛血清アルブミン）型表面活性剤で予め処理しておくこともできる。
【００３６】
一実施例にあっては、濾過段階（Ｃ）は、分析すべき流体の懸濁物質に応じて、初期液体試料の事前濾過なしに行うことができる。
【００３７】
内部通路（Ａ）を介して導入する方法の場合には、濃縮液の濃度は、濾過手段の大きさと直接関係する。外部通路（Ｂ）を介して導入する場合には、上記濃縮液の量は、上記濾過手段の大きさではなく、ハウジングの中に残された量および／またはハウジングの中に導入された溶離液の量に依存する。
【００３８】
濾過手段は、濾過時間を二十分と一時間の間として、初期試料の量と得られる濃縮液の量の比が、少なくとも50に等しく、好ましくは150と500の間になるような大きさとされる。
【００３９】
用途によって許される場合には、モジュールは、逆流洗浄した後または例えば酵素の処理に用いられるような50 ppm塩素溶液などの浄化剤で処理した後、再使用することができる。
【００４０】
逆流洗浄するために使用できる方法は、試料が内部通路（Ａ）または外部通路（Ｂ）のいずれを介して導入されるかに応じて二つあり、洗浄水は、分析用試料導入の流れに抗して導入される。
【００４１】
試料が導入される通路が、弁（Ｃ）を通る内部通路（Ａ）である場合には、逆流を浴びせることは、水の供給源と弁（Ｆ）の間に配置された蠕動ポンプなどの給水手段を用い、上記弁を介して本管の水を導入することによって行われる。この場合、弁（Ｄ）は、閉じられ、弁（Ｅ）は、一時的に開いたままにしておく。
【００４２】
ハウジングが一杯になって、弁（Ｅ）を閉じると、水は、強制的に繊維の内部に沿って流され、弁（Ｃ）または（Ｄ）を通って流れていくことになる。
【００４３】
試料が導入される通路が、外部通路（Ｂ）である場合には、逆流洗浄することは、弁（Ｄ）を介して本管の水を導入することによって行われる。この場合、弁（Ｅ）および（Ｆ）は、閉じられる。
【００４４】
繊維が水で一杯になったら、すなわち、弁（Ｃ）から流れる水の中に気泡が見られないようになったら、この弁を閉じて、水を、強制的にハウジングの中の繊維の外部をまわって流し、弁（Ｅ）または弁（Ｆ）を通って流れていくことになる。
【００４５】
モジュールは、一回のみ使用するものと想定されている。さらに、最初に、例えばガンマ線殺菌処理によってモジュールを消毒することが想定されている。
【００４６】
他の一実施例にあっては、シールの必要のないモジュールを使用することができる。それによって、外部の汚染（例えば周囲の空気などモジュール外部の流体による）の危険を避けることができ、また、汚染物質がシールを横切って濃縮液から濾過液に入り込むのを避けることができる。密閉は、図１に示すように、繊維の両端をそれぞれ樹脂の中に埋め込み、いかなる汚染物質も漏れ出すのを防ぐようにして行う。シールのあるモジュールでは、このようなことができない。
【００４７】
他の一実施例にあっては、採用する分析方法で使用できる量の濃縮液を得るために、得られた濃縮液に第二の濃縮工程を施す。
【００４８】
この第二の濃縮工程では、使用する濾過手段は第一の濃縮工程で使用されるものと同じ構成のものでもよいが、濃縮液の初期の量と所定量の間の比にもとづいて計算されたよりも、少ない量のものとする。
【００４９】
処理される量が、1 mlの百分の一程度であるので、例えばミリポア社からセントリコン−プラス８０の商品名で市販されている装置など遠心分離法を用いた濾過装置などの公知の手段を使用することができる。
【００５０】
これらの濾過手段では、初期試料量と最終試料量の間の比が、少なくとも5000に等しく、好ましくは15,000から100,000の間となるように、その大きさおよび処理時間が選ばれる。
【００５１】
したがって、本発明にもとづく濾過手段を使用すれば、多重収集および多量の分析用液体中に存在する微生物の100％に近い収量が可能となり、微生物の生存能力を保障し、長くとも一時間程度の時間でこの多重収集を行うことができ、例えば連続健康監視のための要件を満たし、とくに免疫検定法や分子生物学的手法などの生化学的、または生物学的分析方法で使用することが可能な量の分析用濃縮液を得ることができるなどの効果が得られる。
【００５２】
以下、例によって本発明にもとづく濾過手段の使用を説明するが、本発明の範囲が、これらの例によって限定されるものではない。
【００５３】
例１
器具および方法
中空の酢酸セルロース繊維でつくられた濾過面積1 m2濾過手段を使用する。
【００５４】
ＭＳ２バクテリオファージでドーピングした本管の水50リットルからなる試料を、内部通路を介して導入する。
【００５５】
濃縮液は、重力および圧力を利用して収集する。
【００５６】
濃縮液を、バクテリオファージの生存能力および感染能力の双方を定量的に（試料の順次10倍希釈の後）または性質的に（ＭＳ２感応性培養バクテリアの感染による生物学的拡大）も測定するリーシス・プラーク法を用いて分析する。
【００５７】
順序
水道水の試料のドーピングおよびタンク内への回収に先立って、接種材料を超音波で処理し、ウイルスの粒子を分解した。
【００５８】
チオ硫酸ナトリウム20mg/ｌ（ＴＭ（Merck  106516））、すなわち50ｌに1g、を加えた後、試料をＭＳ２でドーピングした。
【００５９】
濾過を一回行い、次にハウジングを空にし、密閉し、空気圧（0.5 b）のもとに置いた。次に、重力を用いて濃縮液を収集する。次に、圧縮空気（0.5 b）を繊維の中に注入して繊維の中に残っていた濃縮液の最後の数ミリリットルまで収集する。
【００６０】
濃縮液を予め超音波で処理し、大腸菌（E Coli）感応性リーシス・プラーク技術を用いて計算を行った。
【００６１】
接種材料の調製
0004792590.tif 000002
ＳＰＷ  ＝  塩ペプトン水
ＰＦＵ  ＝  斑（プラーク）形成単位（感染性ウイルス単位）
Ｉ10x   ＝  ｍｌあたり10x のＰＦＵを含む接種材料
【００６２】
濾過
ＳＴＳで中和した水道水50リットルを濾過し、ハウジングを空にした後、一つのブランク＝ブランク１（Ｂ１）を構成する濃縮液を収集する。
【００６３】
膜を逆流洗浄した後、ＳＴＳで中和した水道水50リットルを濾過し、ハウジングを空にした後、一つのブランク＝ブランク２（Ｂ２）を構成する濃縮液を収集した。膜を逆流洗浄した後、水道水50リットルをＳＴＳで中和する。
【００６４】
15分間待機した後、1リットルを引き出してタンク用の接種材料を希釈する。
【００６５】
1リットルに希釈したＩ10（10ＰＦＵ）1 mｌを用いてドーピングを行う。
【００６６】
一回の濾過の後、濃縮液を収集する（Ｃ10）。
【００６７】
逆流洗浄を行う。
【００６８】
この例では、逆流洗浄は、少なくとも20リットルの水で行う。
【００６９】
上の順序を繰り返し、Ｉ104（104ＰＦＵ）1 mｌでドーピングする。濾過の間の濾過液の試料の回収によって、試料（Ｆ）が得られた。濾過の終わりに、濃縮液を収集する（Ｃ104）。
【００７０】
Ｂ１の100mｌをＩ104（104ＰＦＵ）でドーピングすることによって、ドーピングしたブランク・コントロール試料（ＢＤ104）を得る。
【００７１】
分析
―  Ｉ100、Ｉ10、Ｉ1、Ｃ104、ＢＤ104の定量滴定。
【００７２】
各純粋な試料のアリコート（一部）と接種材料を試験管の中にいれ、希釈を行う前に超音波で処理する。
【００７３】
リーシス・プラーク技術（lysis plaque technique）を用い、以下の順序で感染性粒子の数を数える。
【００７４】
融解した（44℃）柔らかいトップ・アガール（寒天）（Top  Agar）（0.95％）2mｌをウイルス懸濁液1mｌおよび指数増殖期の培養物E.coli Hfr 0.3mｌと混ぜ合わせた。これらの組み合わせは、手早くしかも静かに混ぜ合わせた後、ペトリ皿の中の栄養素を含む硬い寒天の全表面に上に注ぐ。37℃で培養した後、翌日にリーシス・プラークを読み取る。
【００７５】
得られた結果
0004792590.tif 000003
【００７６】
例えば、Ｃ104  10-1は、104ＰＦＵでドーピングした試料から得られた濃縮液の1/10の希釈液を指す。
【００７７】
0004792590.tif 000004
【００７８】
定性試験
Ｉ104（正のコントロール＝Ｔ+）、Ｆ（1  50mｌ  試料）、Ｂ２（6×50 mｌ  ＋  全試料を覆うための残量）、  Ｃ10（6×50 mｌ  ＋  全試料を覆うための残量）上でのファージの存在または不在の検出。
【００７９】
試料一分量を二倍に濃縮した栄養素の液体培地と混ぜ合わせた。37℃で30分間培養した後、指数増殖期の培養物E.coli Hfrを接種した。37℃で一晩培養した後（ウイルス増殖期）、指数培養物E.coli Hfrをすべてペトリ皿の中の栄養素の寒天の上に塗り付け、乾燥させた。ウイルス拡大液体培地の滴を入れ、37℃で少なくとも６時間培養する。
【００８０】
滴を入れたポイントでリーシス・プラークの多少の融合が生じることによって、感染性粒子の存在が明らかとなる。
【００８１】
感染性粒子が存在しない場合には、E.coli Hfrの成長によって、滴を沈殿した場所で細胞の厚い層が生成される。
【００８２】
0004792590.tif 000005
Ｎ＝陰性；  Ｐ＝陽性；  ｎａ＝適用不能
【００８３】
結果の解釈
ブランク（Ｂ２）は、感染性のバクテリオファージを含んでいない。したがって、モジュールは、事前にＭＳ２で汚染されておらず、後で行われた10ＰＦＵの濃縮は、有効である。
【００８４】
104ＰＦＵの濃縮中に採取された濾過液の試料（50ml）は、検出可能なＭＳ２を含んでいない。したがって、膜は、直径25nmのこのウイルスを効果的に保持する。
【００８５】
Ｃ10の中で四つの感染性の単位が検出された。したがって、検出閾値は、10ＰＦＵよりも低い。
【００８６】
実際の収量（すなわち、接種材料の測定タイター：C/Iに関係する）は、特定の収集方法がない場合（攪拌なし、溶離なし）には104ＰＦＵのドーピングに関して60％である。これは、測定が、バクテリオファージの感染性に関するものであるために、生存能力を考慮したものである。
【００８７】
比率Ｃ／ＢＤは、実際の収量にきわめて近い。このことは、濃縮液による干渉がないことを示している。
【００８８】
例２
器具および方法
中空の酢酸セルロース繊維でつくられた濾過面積0.6m2の濾過手段を使用する。
【００８９】
寄生虫クリプトスポリジウム・パルヴムの接合子嚢でドーピングした本管の水50リットルからなる試料を、外部通路を介して導入する。
【００９０】
濃縮液は、重力および圧力を利用した攪拌および収集によって収集する。
ダイナル抗リプトスポリジウム・ダイナビーズ・キット、ref.730.01（接合子嚢の一体性の尊重）を用いたＩＭＳ−ＩＦＡ：免疫磁気分離 − 免疫蛍光検定法（米国環境保護庁出版の規格法1622 - EPA-EPA-821-R-99-001参照のこと）を使用して分析を行う。
【００９１】
順序
水道水をタンク内に入れ、チオ硫酸ナトリウム20mg/ｌ（ＳＴＳ（Merck 106516））、すなわち50ｌに1g、を加える。
【００９２】
試料をC・parvumの接合子嚢でドーピングする。
【００９３】
ハウジングを部分的に空にし、モジュールを攪拌してハウジング内に残された液体の力で繊維の外表面上のすべての接合子嚢を収集した後、重力を用い、次に圧縮空気（0.5 b）をハウジングの中に注入して濃縮液を収集する。
【００９４】
ＩＭＳ−ＩＦＡを用いて接合子嚢のストックおよび濃縮液のストックの計算を行う。
【００９５】
濾過
方法
ＳＴＳで中和した水道水50リットルを濾過し、ハウジングを空にした後、一つのブランク（Ｂ１）を構成する濃縮液を収集した。この濾過の後に、膜を逆流洗浄する。
【００９６】
次に、水道水50リットルをＳＴＳで中和し、さらに接合子嚢のストック（すなわち約10の接合子嚢）のＩ10希釈液でドーピングする。
【００９７】
濾過の後、ハウジングを空にし、濃縮液を収集した。（Ｃ10）15分待機した後、1リットルを引き出してタンク用の接種材料を希釈する。
【００９８】
1リットルに希釈したＩ10（10ＰＦＵ）1mｌを用いてドーピングする。
【００９９】
一回の濾過の後、濃縮液を収集する（Ｃ10）。
【０１００】
この濾過の後、少なくとも10リットルの水で逆流洗浄する。
【０１０１】
上の順序を繰り返し、Ｉ100（約100の接合子嚢）でドーピングを行い、濃縮液Ｃ100を生成し、次にＩ1000（約1000の接合子嚢）でドーピングを行って濃縮液Ｃ1000を得る。
【０１０２】
分析
―  ＩＭＳ−ＩＦＡを用いたＩ10、Ｉ100、Ｉ1000、Ｂ，Ｃ10、Ｃ100、Ｃ1000の計算。
【０１０３】
結果
0004792590.tif 000006
【０１０４】
接種材料に関する測定値よりも高いＣ10およびＣ100に関する結果は、驚くにはあたらない。顕微鏡での接合子嚢を計算するためのサンプリングは、同一の試料から得られた計算値を乗算してみるとわかるように、必然的に変動をともなうものである。この現象は、接合子嚢が稀な場合により顕著になる。
【０１０５】
したがって、Ｃ10およびＣ100に関しては、濾過の後の値の大きさが一定であると考えるべきである。
【０１０６】
Ｃ1000に関しては、収量を議論することができる。
【０１０７】
結果の解釈
外部通路による濾過法は、接合子嚢100以下の感度を有する。
接合子嚢1000の接種材料では、得られる収量は、最適化なしで70％である。
【０１０８】
例３
用いた順序および方法は、濾過手段を除いて例１で用いたものと同じである。
【０１０９】
中空の酢酸セルロース繊維でつくられた濾過面積0.6m2の濾過手段を使用して濾過を行う。
【０１１０】
試料は、ＭＳ２バクテリオファージでドーピングした本管の水50リットルからなるものである。上記試料を、内部通路（Ａ）を介して導入する。
【０１１１】
濃縮液は、重力および圧力を利用して収集する。
【０１１２】
ブランク（Ｂ１）を一つだけを作製し、1，10、100ＰＦＵで連続してドーピングを行う。
【０１１３】
例１の場合と同様に、分析は、リーシス・プラーク技術によって行った。
【０１１４】
上に述べた濾過作業で得られた濃縮液を濾過する第二の工程を以下に述べる順序で行った。
【０１１５】
ブランク（Ｂ１）濃縮液および各ファージ濃縮液（Ｃ１1、Ｃ１10、Ｃ１100）、すなわち各約230mｌ、をそれぞれ三つの等しい部分（70-80mｌ）に分け、三つの市販のセントリコン−プラス80モジュール（ミリポア ref. UFC5LGC08）で第二回目の濃縮液を行う。
【０１１６】
このようにして得られた各ドーピング用の三つの濃縮液Ｃ２（＜1mｌ）を混ぜ合わせ、リーシス・プラークによる定量滴定で分析した。濃縮液Ｂ１から得た三つのブランク（Ｂ２）に関しても、同じ順序で行った。
【０１１７】
結果
−  接種材料の滴定：  Ｉ100  ＝  144ＰＦＵ（例１と同様に全平均）；
−  第二回目の濾過の後に得られた濃縮液の滴定；
0004792590.tif 000007
【０１１８】
例えば、Ｃ１1は、1ＰＦＵでドーピングした初期試料を濃縮する第二の工程の終わりで得られた三つの濃縮液の混合物を指す。
【０１１９】
結果の解釈
まとめて行った二つの濃縮工程によって、50リットルの試料の量が3mｌ以下に減少した。感応性は、1ＰＦＵに近かった。
【０１２０】
もちろん、本発明は、ここで図面および図表を参照して説明する実施例に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に入るすべての他の実施例を含むものである（とくに、試料を濃縮するために用いられる膜の性質および特徴に関して）。
【０１２１】
例４
器具および方法
第一の濾過段階のためには中空の酢酸セルロース繊維でつくられた0.12m2の濾過手段を使用し、第二の濾過段階のためには使い捨てのVivace1170（サートリアス・ヴィヴァサイエンシス  ref. VS6002）を使用する。
【０１２２】
試料は、寄生虫クリプトスポリジウム・パルヴムの300の接合子嚢および大腸菌の300のＣＦＵで同時にドーピングした30リットルの本管の水で作製する。
【０１２３】
濃縮
水道水をタンク内に入れ、チオ硫酸ナトリウム20mg/ｌ（Merck 106516）、すなわち30ｌに0.6ｇ、を加える。
【０１２４】
試料をC.parvumE.Coli細胞の接合子嚢でドーピングする。
【０１２５】
段階1：  30リットルから70mｌへ
外路通路を使用して濾過を行った。
【０１２６】
ハウジングを部分的に空にし、モジュールを攪拌した後、圧縮空気（0.5 b）をハウジングの中に注入して微生物を含む滞留液約35mｌを収集した。
【０１２７】
閉じられた内部コンパートメントの中にドーピングされていない中和された本管の水を注入によって繊維を通してハウジング内に再導入し（約35mｌ）、前と同じように攪拌と収集を行う。
【０１２８】
二つの収集された試料の化合物70mｌが、滞留物Ｒ１を構成した。
【０１２９】
段階２：  70mｌから300マイクロリットルへ
使い捨てVivace1170の中で、滞留物Ｒ１に供給業者の指示通りに25℃で1000Ｇの遠心力を10分間加えて濃縮を行った。収集効果を改善するため、濾過室内で1mｌの濾過液を濃縮液に加え、次に濾過要素を高速で短時間「渦巻かせた」。以前と同じ条件下でさらに遠心作業を行った結果、最大で300マイクロリットルまで再濃縮することができた。これによって、最終滞留物Ｒ２が生成された。
【０１３０】
三回このような結果を得て三つの滞留物Ｒ２を並行的に生成した。
【０１３１】
分析：
Ｃ．ｐａｒｖｕｍの探索
接合子嚢のストックおよび滞留物の一部を、ＩＭＳ（免疫磁気分離  −  ダイナル抗リプトスポリジウム・ダイナビーズ・キット、ref.730.01）およびそれに続くＩＦＡ（免疫蛍光検定）で計算した（方法1622参照）。
【０１３２】
滞留物の一部を、下記の順序で、ＩＭＳ（上を参照のこと）およびそれに続くＰＣＲで分析した。
【０１３３】
−  ＩＭＳからビーズ／接合子嚢の複合物を10μｌの超純無菌水＋10μｌの水中50％ Chelex 100の中に取り込んだ。
−  95℃で2分間  ／  −80℃で2分間の熱ショックを5回あたえた。
−  遠心によって濃縮液ペレットにした。
−  増幅ミックス（ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、牛の血清アルブミン：10pg/μｌ、dNTP：200pモル／μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：50U、プライマーＢＢ−３およびＢＢ−４：各1pモル/μｌ、超純水を加えて50μｌとしたもの）30μｌを加えた。
【０１３４】
プライマーＢＢ−３およびＢＢ−４は、Balatbat A.B.他、J.Clin.Microbiol.1996,34,1769-1772に記載されている。
【０１３５】
−  次のようなＰＣＲプログラムを行う：  94℃で5分間、［94℃で30秒澗、60℃で45秒間、72℃で1分間］を40サイクル、次に72℃で5分間。
−  臭化エチジウムの存在下で2％のアガローゼを含む電気泳動ゲル上でＰＣＲ反応物10μｌを泳動させる。
【０１３６】
Ｅ．ｃｏｌｉの探索
培養物E.coliと滞留物の一部を「コリラート１８ｈ」法を用い、ＩＤＥＸＸの供給業者の勧告にしたがって計算した。この方法は、大腸菌のベータ−グルクロニダーゼの活動の検出をベースにしたものである。
【０１３７】
以下の順序で、ベータ−グルクロニダーゼに関する遺伝情報を指定したｕｉｄＡ遺伝子に対して行った入れ子式ＰＣＲによって滞留物の一部を分析する。
【０１３８】
−  濃縮液の一部を膜で濾過する（ミリポア、直径13mm、デュラポアＧＶＷＰ０１３  ００による孔0.2μm）。
−  上記膜を0.2mｌのＰＣＲ管の中に挿入する。
−  熱ショックによって細胞をライズ（lyze）させる。（85℃  1分間／氷  1分間  を6サイクル）
− プライマーＵ２７０およびＬ１０５４を用いたリーシス管の中での最初の増幅。
Ｕ２７０：  ５‘−ｇｇＴ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  Ｃｇｇ  ＣＡＡ  Ａｇ−３’
Ｌ１０５４：  ５‘−ＴＴＡ  ＡＡｇ  ＣＣｇ  ＡＣＡ  ｇＣＡ  ｇＣＡ  ｇＴ−３’
【０１３９】
膜を入れたＰＣＲ管の中に配置された増幅ミックス（Amplification mix）（150μｌ）：  ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、ｄＮＴＰ：200pモル/μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：1.5Ｕ、プライマー：各1pモル/μｌ、超純水を加えて150μｌとしたもの。
【０１４０】
ＰＣＲプログラム：  95℃で10分間、［94℃で1分間、60℃で1分間］を30サイクル、次に4℃に保持。
【０１４１】
−  得られたアンプリコン（amplicons）を超純水で100倍に希釈し、この希釈液1μｌをプライマーＶａｌ７５４およびＶａｌ９００とともに第二回の増幅用の基質として使用する（入れ子式ＰＣＲとして公知）。
Ｖａｌ７５４：  ５‘−ＡＡＡ  ＡＣｇ  ｇＣＡ  ＡｇＡ  ＡＡＡ  ＡｇＣ  Ａｇ−３
Ｖａｌ９００：  ５‘Ａｃｇ  ＣｇＴ  ｇｇＴ  ＴＡＣ  ＡｇＴ  ＣＣＴ  ｇＣｇ−３’
【０１４２】
新しい管の中に配置された増幅ミックス（50μｌ）：  ＰＣＲバッファー、MgCl2：1.5mM、ｄＮＴＰ：200pモル/μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：0.5Ｕ、プライマー：各1pモル/μｌ、超純水を加えて50μｌとしたもの。
【０１４３】
ＰＣＲプログラムは、前と同じ。
【０１４４】
− 臭化エチジウムの存在下で2％のアガローゼを含む電気泳動ゲル上でＰＣＲ反応物10μｌを泳動させる。
【０１４５】
滞留物Ｒ２の処理
滞留物を各100マイクロリットルの三つの部分：Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃに分割する。
【０１４６】
部分Ｒ２ａをさらに二つに分割した：その50μｌを、「コリラート１８ｈ」法（E.coli計算）を用いて処理し、他の50μｌをＩＭＳ−ＩＦＡ（C.parvum計算用）で処理した。
【０１４７】
部分Ｒ２ｂをｕｉｄＡ入れ子式ＰＣＲ（E.coliの分子検出）で分析したが、その前に二つに分割した：その50μｌを、直接分析し、他の50μｌにはE.coli遺伝子ＤＮＡを添加した（抑制試験）。
【０１４８】
Ｒ２ｃをＩＭＳ−ＩＦＡ（C.parvumの分子検出）で分析したが、その前に二つに分割した：その50μｌを、直接分析し、他の50μｌにはC.parvum遺伝子ＤＮＡを添加する（抑制試験）。
【０１４９】
ＰＣＲは、各々が、陰性のコントロール（標的ＤＮＡなし、滞留物なし）および陽性のコントロール（標的ＤＮＡあり、滞留物なし）を有する。
【０１５０】
アンプリコン（amplicons）は、すべて、臭化エチジウムの存在下、アガローゼ・ゲルの上で電気泳動によって観察される。
【０１５１】
結果
各地点は、三回再生成された。下の表では、繰り返しで得られた結果は、記号「／」で分けて示されている。
【０１５２】
0004792590.tif 000008
【０１５３】
結果の解釈
濃縮液中でコリラートによって検出されたE.coliの細胞の数が少ないのは、この試験が酵素の活動の検出をベースにしたものであるため、濃縮中にバクテリアが経験したストレスあるいは死亡によるものと説明できる。
【０１５４】
ｕｉｄＡ  ＰＣＲは、三回の繰り返しで陽性であった。このことは、5リットルの中の50のバクテリア、すなわち1リットルあたり5のバクテリアが、全体としてこの方法を繰り返しても感応性を保持していることを示している。
【０１５５】
論理的には、抑制制御のために一部分にバクテリアＤＮＡを付加すると、陽性の反応が得られる。C.parvumの場合には、個体群法（ＩＭＳ−ＩＦＡ）によって、理論的予想値より有意に低い計算が得られた。分子生物学にもとづく他の実験で、10リットル中一つの接合子嚢の収集を繰り返すことができることが示されているので（この特許出願の中には開示されていないデータ）、この場合も、若干の接合子嚢が、濾過装置の中に保持されずに濃縮中に悪い影響を受けたと考えることができる。
【０１５６】
ところで、ＩＭＳ−ＰＣＲは、三回の繰り返しで陽性であった。このことは、5リットルの中の50のバクテリア、すなわち1リットルあたり5のバクテリアの感応性がきわめて低いことを示している。
【０１５７】
結論
この例は、二つの工程を一つにまとめた濃縮装置および分子生物学的方法を用いてバクテリアと寄生虫でドーピングした同じ水の試料を使用することの有効性を示している。
【符号の説明】
２    ハウジング
３    繊維
３ａ  壁
４    開口
Ａ    内部通路
Ｂ    外部通路
Ｃ    弁
Ｄ    弁
Ｅ    弁
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明にもとづく濾過手段の縦断面略図である。
【図２】  図１の濾過手段の拡大断面図である。図面中の繊維の大きさは、本発明を理解しやすくするために、意図的に誇張して拡大されている。
【図１】
0004792590.tif 000009
【図２】
0004792590.tif 000010