(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害する分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験分子の存在下で第１の細胞または第１の細胞群と、第２の細胞または第２の細胞群とを共培養すること、ここで、第１の細胞において標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性は第２の細胞より高く、標的遺伝子によりコードされるタンパク質は、第１の細胞と第２の細胞の適応性に対して正に寄与するものであり、さらに第１の細胞は第２の細胞では発現されないレポーター遺伝子を含みかつそれを発現しており、そして、第１の細胞および第２の細胞は同種かつ同型の細胞であり、共培養開始時の第１の細胞の数の、第２の細胞の数に対する割合が１倍よりも少ない；および、
（ｂ）レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量を測定すること、ここで、試験分子の非存在下での共培養の場合と比較してレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が増大していることが、試験分子が標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害することを示し、
ここにおいて、
（ｉ）第１の細胞において標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現および活性のレベルが野生型の該レベルであり、かつ第２の細胞における前記発現または活性のレベルがより低いこと、あるいは、（ｉｉ）第１の細胞における標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現および活性のレベルが野生型の発現または活性のレベルより高く、かつ第２の細胞における前記発現または活性のレベルが野生型の発現または活性のレベルであること、
を含む上記方法。
【請求項２】
第１の細胞において標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現および活性のレベルが野生型の該レベルであり、かつ第２の細胞における前記発現または活性のレベルがより低いことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の細胞における標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現および活性のレベルが野生型の発現または活性のレベルより高く、かつ第２の細胞における前記発現または活性のレベルが野生型の発現または活性のレベルであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第２の細胞における標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性のレベルの低減が、二倍体細胞の標的遺伝子の１コピーを欠失させるか、または標的遺伝子の変異により達成されていることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
第２の細胞における標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性のレベルの低減が、標的遺伝子の細胞経路の構成要素のドミナントネガティブ型を発現させることにより達成されることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
第２の細胞における標的遺伝子もしくは標的遺伝子によりコードされるタンパク質の該レベルの低減が、標的遺伝子をコードするＲＮＡの活性または量を低減させることにより達成されることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
第２の細胞における標的遺伝子をコードするＲＮＡの活性または量が、リボザイム、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡまたはアプタマーを用いる手段により低減されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１の細胞と第２の細胞を１：１０の割合で共培養することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の細胞と第２の細胞を１：１００の割合で共培養することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の細胞と第２の細胞を１：１０００の割合で共培養することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の細胞と第２の細胞を１：１００００の割合で共培養することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害する分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験分子の存在下で第１の細胞または第１の細胞群と、２種以上の第２の細胞または第２の細胞群とを共培養すること、ここで、それぞれの第２の細胞または第２の細胞群における別個の標的遺伝子またはその標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性が第１の細胞より高く、それぞれの標的遺伝子は、第１の細胞および第２の細胞または第２の細胞群の適応性に影響するものであり、さらにそれぞれの第２の細胞または第２の細胞群は第１の細胞または第１の細胞群では発現されないレポーター遺伝子を含みかつそれを発現しており、そして、第１の細胞と第２の細胞または第２の細胞群とは同種かつ同型の細胞であり；および、
（ｂ）第２の細胞または第２の細胞群のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量を測定すること、ここで、レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が、試験分子が標的遺伝子を阻害するか否かの指標となり、
ここにおいて、
（ｉ）各標的遺伝子が、第１の細胞および第２の細胞または第２の細胞群の適応性に正に寄与するものであり、共培養開始時の第１の細胞の数のそれぞれの第２の細胞または第２の細胞群の数に対する割合は１倍よりも少なく、そして、試験分子の非存在下での共培養の場合と比較して少なくとも１種のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が増大していることが、試験分子が１種以上の標的遺伝子を阻害することを示すこと、あるいは、（ｉｉ）各標的遺伝子が、第１の細胞および第２の細胞または第２の細胞群の適応性に負に寄与するものであり、開始時の第１の細胞の数のそれぞれの第２の細胞または第２の細胞群の数に対する割合は１倍よりも高く、そして、試験分子の非存在下での共培養の場合と比較して少なくとも１種のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が減少していないことが、試験分子が１種以上の標的遺伝子を阻害することを示すこと、
を含む上記方法。
【請求項１３】
各標的遺伝子が、第１の細胞および第２の細胞または第２の細胞群の適応性に正に寄与するものであり、共培養開始時の第１の細胞の数のそれぞれの第２の細胞または第２の細胞群の数に対する割合は１倍よりも少なく、そして、試験分子の非存在下での共培養の場合と比較して少なくとも１種のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が増大していることが、試験分子が１種以上の標的遺伝子を阻害することを示すことを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
各標的遺伝子が、第１の細胞および第２の細胞または第２の細胞群の適応性に負に寄与するものであり、開始時の第１の細胞の数のそれぞれの第２の細胞または第２の細胞群の数に対する割合は１倍よりも高く、そして、試験分子の非存在下での共培養の場合と比較して少なくとも１種のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が減少していないことが、試験分子が１種以上の標的遺伝子を阻害することを示すことを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種の第２の細胞または第２の細胞群における少なくとも１種の標的遺伝子の発現レベルの増加が、遺伝子組換え技法により該少なくとも１種の第２の細胞または第２の細胞群で標的遺伝子を発現させることにより達成されることを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子組換え技法により標的遺伝子をプラスミドから発現させることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子組換え技法により標的遺伝子を染色体から発現させることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
上記第２の細胞または第２の細胞群における少なくとも１種の標的遺伝子の活性レベルの増加が、該標的遺伝子によりコードされるタンパク質の構成的活性型を発現させることにより達成されることを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
各第２の細胞または第２の細胞群が同じレポーター遺伝子を発現することを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）で、レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が有意に増加している共培養物を再スクリーニングし、レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が増大している第２の細胞または第２の細胞群を検出することをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
再スクリーニングが上記共培養物由来の核酸にポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
再スクリーニングが上記共培養物由来の細胞を栄養要求性培地上で選択的に増殖させることを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
各第２の細胞または第２の細胞群が１つのレポーター遺伝子および異種の標的遺伝子を含む核酸で形質転換されることを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）少なくとも１種のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量を増大させる試験分子の存在下で、第１の細胞または第１の細胞群と、１種の第２の細胞または第２の細胞群とを共培養すること；および、（ｂ）第２の細胞または第２の細胞群のレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量を測定すること、ここで、該レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が増大していることが、第２の細胞または第２の細胞群により発現される標的遺伝子によりコードされるタンパク質を試験分子が阻害することを示す、を含む、各第２の細胞または第２の細胞群についての再スクリーニングを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
各第２の細胞または第２の細胞群が異種のレポーター遺伝子を発現することを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
異種のレポーター遺伝子それぞれが異なる生物発光分子、化学発光分子または蛍光分子をコードし、かつ異種のレポーター遺伝子それぞれによりコードされるタンパク質の活性または量を測定することが、該分子の生物発光、化学発光または蛍光を測定することを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
各第２の細胞が第１の細胞に対して１：１００の割合であるを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
各第２の細胞が第１の細胞に対して１：１０００の割合であるを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
各第２の細胞が第１の細胞に対して１：１００００の割合であるを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
該分子は、第１の標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害するが第２の機能的に類似する遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害せず、ここで、第２の細胞は該第２の遺伝子をより高いレベルで発現しており、該標的遺伝子によりコードされるタンパク質と上記機能的に類似する遺伝子によりコードされるタンパク質は双方とも、第１の細胞および第２の細胞の適応性に正に寄与するものであり、並びに該レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量の増加が、試験分子が標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害するが上記機能的に類似する遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害しないことを示す、を含む請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
上記機能的に類似する遺伝子が異種生物由来の標的遺伝子相同体であることを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
上記機能的に類似する遺伝子が同種生物に由来するタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
上記タンパク質が標的遺伝子によりコードされるタンパク質のアイソザイムであることを特徴とする、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
上記タンパク質が標的遺伝子によりコードされるタンパク質のスプライシング変異体であることを特徴とする、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
上記タンパク質が標的遺伝子によりコードされるタンパク質の点突然変異体であることを特徴とする、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
標的遺伝子または機能的に類似する遺伝子の遺伝子発現レベルの増加が、遺伝子組換え技法により該遺伝子を発現させることにより達成されることを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子組換え技法により標的遺伝子または機能的に類似する遺伝子をプラスミドから発現させることを特徴とする、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子組換え技法により標的遺伝子または機能的に類似する遺伝子を染色体から発現させることを特徴とする、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
第１の細胞と第２の細胞を１：１の割合で共培養することを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
第１の細胞または細胞群と第２の細胞または細胞群を１：１００の割合で共培養することを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
第１の細胞または細胞群と第２の細胞または細胞群を１：１０００の割合で共培養することを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
第１の細胞がレポーター遺伝子と標的遺伝子とを含む核酸で形質転換されていることを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
第１および第２の細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１、９乃至１１、１２、２７乃至３０、４０または４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
第１の細胞群と第２の細胞群を共培養すること、および該第１および第２の細胞群は、互いに同種の２個体の多細胞生物であることを特徴とする、請求項１、８、３０、及び３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４５】
上記種が線虫であることを特徴とする、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
レポーター遺伝子、少なくとも１種のレポーター遺伝子、または異種のレポーター遺伝子それぞれは、生物発光分子、化学発光分子または蛍光分子をコードし、かつ該レポーター遺伝子又はレポーター遺伝子類によりコードされるタンパク質の活性または量を測定することが、該分子の生物発光、化学発光または蛍光を測定することを含む、請求項１、１２、２５又は３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
蛍光分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体であることを特徴とする、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
蛍光分子が、蛍光の波長が改変されているかもしくは蛍光が増強されているか、またはその両方であるＧＦＰ変異体であることを特徴とする、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＧＦＰ変異体が青色ＧＦＰであることを特徴とする、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
蛍光分子が赤色蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
蛍光分子が黄色蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
レポーター遺伝子、少なくとも１種のレポーター遺伝子、または各異種のレポーター遺伝子それぞれは、酵素をコードすることを特徴とする、請求項１、１２、又は３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
酵素がβガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
レポーター遺伝子、少なくとも１種のレポーター遺伝子、または各異種のレポーター遺伝子それぞれは、受容体をコードすることを特徴とする、請求項１、１２、２５又は３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５５】
レポーター遺伝子、少なくとも１種のレポーター遺伝子、または各異種のレポーター遺伝子それぞれは、輸送体をコードすることを特徴とする、請求項１、１２、２５又は３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５６】
レポーター遺伝子、少なくとも１種のレポーター遺伝子、または各異種のレポーター遺伝子それぞれは、エピトープを含むタンパク質またはペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１、１２、２５又は３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５７】
レポーター遺伝子が、ＣＤ４、ｍｙｃ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはヘキサヒスチジンからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
レポーター遺伝子および標的遺伝子が一緒になって融合遺伝子となっており、該融合遺伝子がレポーター遺伝子及び標的遺伝子によりコードされる融合タンパク質のインフレームで融合物をコードすることを特徴とする、請求項５６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、1999年12月3日に出願された米国特許出願第09/454,889号について優先権を主張する。米国特許出願第09/454,889号は1998年12月15日に出願された米国特許出願第09/213,120号の一部継続出願である。また、米国特許出願第09/213,120号は1998年6月2日に出願された国際特許出願第PCT/US98/11415号の継続出願である。各出願は参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は、細胞または組織の増殖、成長または生存に影響を与える特定のタンパク質または細胞内経路を標的化して阻害する薬物などの分子をスクリーニングする方法に関する。該方法は共培養（co-culture）アッセイに基づいており、細菌、酵母、線虫（C. elegans）、ならびに、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞などの培養細胞に適用できる。
【０００３】
2. 発明の背景
2.1 共培養アッセイ
共培養実験は細胞の適応性(fitness)に寄与する遺伝子を同定するのに広く用いられている。Giaeverら（1999, Nat. Genet. 21: 278-283）は最近、阻害剤の存在下で増殖させたとき、異なる遺伝子型を有する細胞の大きなプールから適応性に僅かな違いがある細胞を同定できることを示した。改変された適応性に関わる遺伝子型は二倍体細胞におけるヘテロ突然変異であった。このように、この技術は、ある遺伝子の１コピーと２コピーの間の違いに起因する適応性の変化を同定できるほど高感度である。
【０００４】
2.2 薬物標的の同定
薬物標的タンパク質の細胞中での過剰発現は薬物に対する抵抗性を細胞に与える。標的遺伝子の過剰発現により与えられた抵抗性は、発現プラスミドライブラリーで形質転換した酵母集団を、ツニカマイシン、コンパクチンまたはエチオニンにたいして抵抗性を有するようになった酵母コロニーについてスクリーニングするための基盤として利用されている (Rineら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750-6754; Launhardtら, 1998, Yeast 14: 935-942)。コロニーが薬物による処理後に成長できる能力を有していることは、該コロニーに取り込まれたプラスミドが該薬物に対する抵抗性を与えるタンパク質の発現を指令していることを示している。すなわち、そのタンパク質が該薬物の標的である。
【０００５】
2.3 薬物の発見方法
薬物開発のための標的の同定は成功する見込みの低い困難な過程である。そのために、特定の細胞内経路を調節する新規薬物および新規療法の新しい開発方法に対する要望が当業者間にはある。本発明は、そのような標的経路を特異的に阻害するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。特定の細胞内標的の阻害剤を同定するための伝統的な方法は、典型的には、酵素の生化学的活性または受容体へのリガンドの結合を直接に測定できるin vitroアッセイを含む。阻害剤を同定するためのその他の方法は、特定の過程がテスト化合物により細胞内で調節されたときにアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる正常な細胞中のレポーター遺伝子を利用する。これらのアプローチは医薬品のリード化合物を同定するのに利用され成功を収めてきたものの、数千〜数十万の化学化合物または天然物をスクリーニングするのまでに、相当なリードタイムおよび労力が必要である。
【０００６】
同様に、新しい抗生物質がどうしても必要である。過去半世紀間の抗生物質の広範な使用により、現在使用されているほとんど全ての抗生物質に抵抗性のある細菌株が出現した。増加している抗生物質抵抗性菌株と闘うために、新しい抗生物質の迅速かつ効率的な製造方法の開発が早急に求められている (Chopraら, 1997, Antimicrob. Agents Chemother., 37: 1563-1571; Cohen, 1992, Science, 257: 1050-1055; Kunin, 1993, Ann. Intern. Med., 118: 557-561; Neu, 1992, Science, 257: 1064-1073; Tenover & Hughes, 1996, JAMA, 275: 300-304)。
【０００７】
抗生物質開発のための伝統的なアプローチはこうした要求に応えられていない。一般的に行われているアプローチには、既存の抗生物質を化学的に修飾してより強力な製剤を作り出すものが含まれる。他のアプローチには、既知の抗生物質の抵抗性の機構を標的化する化合物をスクリーニングすることが含まれる。そしてそのような化合物は既知の抗生物質の効率を高めるためにその抗生物質とともに使用される。これらのアプローチは幾らかは成功する。しかし研究が大掛かりであり、しかも、そのような薬物は既存の抗生物質と同じ細菌の過程を標的としていることが多いため、以前に作られた抗生物質と同様に、直ちに抵抗に遭う可能性がある。第２のアプローチは、化合物を細菌の増殖を阻害する能力について集団スクリーニング（mass screening）することを含む。微生物学的アッセイを用いて、天然物および半合成薬品または合成薬品を、標的病原体を殺すまたはその増殖を阻止する能力についてスクリーニングする。少なくとも初期においては、このアプローチは簡便であり比較的安価でありかつ化合物の大きなライブラリーを迅速に試験できるという利点を有している。しかしながら、そのようなスクリーニングから得られたリード化合物の候補は、受容者に対する毒性を試験しなければならない。さらにまた、そのようなスクリーニングは結果指向的であって機構に関しては盲目的であるために、薬物の作用機構を正確に理解し細胞中でのその標的を同定するためにはさらに研究を行わねばならない。
【０００８】
大腸菌、ヒリコバクター・ピロリおよびクラミジア・トラコーマチスなどの幾つかの病原性微生物のゲノムが最近配列決定されている (Blattnerら, 1997, Science 277: 1453; Tombら, 1997, Nature, 388: 539-547)。これらの細菌の全タンパク質をコードする遺伝子配列が利用できるようになったことで、細菌のゲノムを分子レベルで理解し取り扱うための新しい機会が与えられた。多くの遺伝子が増殖、生存または病原性に必須であることが知られているか、または推測されている。そのような遺伝子は新規の抗生物質をスクリーニングする際の理想的な標的である。
【０００９】
本発明は、共培養法を用いて特定のタンパク質を標的化する薬物または抗生物質の特定のためのスクリーニング方法を提供する。
【００１０】
本明細書中で参照文献を引用または考察していることを、そのようなものが本発明にとっての先行技術であると認識しているものと解釈しないで頂きたい。
【００１１】
3. 発明の概要
本発明は、細胞の適応性に影響を与える標的遺伝子がコードするタンパク質の発現または活性を阻害する分子をスクリーニングするための方法を提供する。該方法は第1細胞と第2細胞とを共培養することを含んでおり、ここで、第1細胞は第2細胞よりも標的遺伝子がコードするタンパク質（「標的タンパク質」）の発現がより多くまたは活性がより高く、第1細胞は第2細胞中では実質的に発現されないレポーター遺伝子をさらに含みかつ発現し、第1細胞と第2細胞とは種および細胞型が同じであり、上記標的タンパク質が第1細胞および第2細胞の適応性に影響を与え、第1細胞は第2細胞中では実質的に発現されないレポーター遺伝子をさらに含みかつ発現し、第1細胞と第2細胞とは種および細胞型が同じであり、また当該スクリーニング方法はレポーター遺伝子がコードするタンパク質の活性または量を測定することを含んでおり、ここで、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の活性または量はテスト分子が標的遺伝子を阻害するかどうかを指し示す。
【００１２】
ある特定の実施形態においては、第1細胞および第2細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞および植物細胞からなる群から選択される。
【００１３】
その他の実施形態においては、第1細胞および第2細胞は、細胞の群、例えば種が同じ個々の多細胞生物であり得る。好ましい実施形態においては、種は線虫 である。
【００１４】
ある実施形態においては、第1細胞は標的タンパク質の発現または活性が野生型と同レベルであり、第2細胞は標的タンパク質の発現または活性のレベルが、野生型の発現または活性のレベルと比較してより低い。その他の実施形態においては、第1細胞は標的タンパク質の発現または活性のレベルが、野生型の発現または活性のレベルと比較してより高く、第2細胞は標的遺伝子の発現または活性が野生型と同レベルである。その他の実施形態においては、第1細胞は標的タンパク質の発現または活性のレベルが、野生型の発現または活性のレベルと比較してより高く、第2細胞は標的タンパク質の発現または活性のレベルが、野生型の発現または活性のレベルと比較してより低い。
【００１５】
標的タンパク質の発現または活性のレベルの低下は、二倍体細胞における標的遺伝子の１コピーもしくは標的遺伝子を突然変異させてその活性を低下させることにより、標的遺伝子の細胞内経路の一成分の優性阻害型の発現により、または、標的遺伝子がコードするRNAの活性または量を低下させることにより実現できる。標的遺伝子がコードされるRNAの活性または量は、たとえばリボザイム、アンチセンス核酸、二本鎖RNAまたはアプタマーなどの手段により低下させることができる。
【００１６】
ある特定の実施形態においては、標的遺伝子の発現のレベルは、プラスミドまたは染色体からの標的遺伝子の組換え発現により高めることができる。標的遺伝子の活性のレベルはまた、標的遺伝子の構造的に活性な形態での発現により高めることができる。
【００１７】
ある実施形態においては、本発明のレポーター遺伝子は、エピトープ、受容体、トランスポーター、tRNA、rRNAまたは生物発光分子、化学発光分子もしくは蛍光分子を含む、酵素、タンパク質またはペプチドをコードする。特定の実施形態においては、蛍光分子はGFPまたはその突然変異体である。好ましい実施形態においては、蛍光分子は、改変された蛍光波長、高められた蛍光またはそれら両方を有する突然変異体GFPである。ある特定の実施形態においては、突然変異体GDPは青色GFPである。別の実施形態においては、蛍光分子は赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質である。
【００１８】
ある特定の実施形態においては、第1細胞と第2細胞を、はじめに（共培養の確立時に）1:1、1:10、1:100、1:1000または1:10000の比で共培養する。
【００１９】
ある特定の実施形態においては、本発明のスクリーニングは「多重化されている」。すなわち、1ラウンドのスクリーニングを用いて複数の標的遺伝子の阻害剤を同定する。そのような実施形態においては、スクリーニングは第1細胞と２種以上の第2細胞とを共培養することを含んでおり、ここで、上記第2細胞はそれぞれ異なった標的遺伝子の発現または活性が第1細胞よりも高められており、ここで各標的遺伝子は第1細胞および第2細胞の適応性に正に寄与しており、上記第2細胞はそれぞれ上記第1細胞中では実質的に発現されないレポーター遺伝子を更に含みかつ発現し、そして、上記第1細胞と第2細胞とは種および細胞型が同じであり、また該スクリーニングは、共培養物をテスト分子に曝露して第1細胞と2種以上の第2細胞との間で該分子に対する感受性が異なるかどうかを、上記第2細胞中でレポーター遺伝子がコードするタンパク質の活性または量を測定することでレポーター遺伝子活性を有する細胞の比の増加を検出することによって、確認することを含んでおり、ここでレポーター遺伝子活性のこの増加はテスト分子が1以上の標的分子を阻害することを示している。
【００２０】
多重化のある形態においては、第2細胞は同じレポーター遺伝子を含みかつ発現する。レポーター活性が顕著に増加した共培養物中で、どの第2細胞が高められたレポーター活性を有しているのかを確認するために、2ラウンド目のスクリーニングまたは再スクリーニングを行う。再スクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、栄養要求性増殖選択、または本発明の方法に従った共培養法を伴う。他の多重化の形態では、各第2細胞は異なるレポーター遺伝子を含みかつ発現する。
【００２１】
ある特定の実施形態においては、本発明のスクリーニングを用いて、細胞の適応性に正に寄与する第一の標的遺伝子がコードするタンパク質を阻害するが、機能が同じ第二の標的遺伝子がコードするタンパク質は阻害しない分子を同定する。機能が同じ標的遺伝子は、別の種由来の標的遺伝子の相同体であってよく、または、同じ種由来の関連タンパク質をコードしてもよい。そのような関連タンパク質にはイソ酵素、スプライス変異体または点突然変異体が含まれるが、それらに限定されるものではない。そのような方法には、第1細胞と第2細胞とを共培養することが含まれ、ここで第1細胞は標的タンパク質を高められたレベルで発現し、第2細胞は機能が同じ遺伝子がコードするタンパク質を高レベルで発現し、上記標的遺伝子と機能が同じ遺伝子はともに第1細胞および第2細胞の適応性に正に寄与し、第1細胞は上記第2細胞中では実質的に発現されないレポーター遺伝子を更に含みかつ発現し、第1細胞と第2細胞は種および細胞型が同じであり、また当該方法にはテスト分子に共培養物を暴露し、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の活性または量を測定することが含まれ、ここでレポーター遺伝子活性の増加はテスト分子が標的遺伝子を阻害するが機能が同じ遺伝子を阻害しないことを示している。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法は、標的遺伝子の機能を失わせる薬物に対するリード候補物質である化合物を同定する。ある遺伝子の機能の特異的な欠損が治療上望ましい例や、機能の欠損が、例えば低コレステロールレベル、癌などを含む疾患にとって望ましい表現型となる例は数多い。例えば、COX2、癌遺伝子、コレステロール合成酵素などに特異的な阻害剤が望ましいといえる。
【００２３】
さらに本発明は、１以上の容器に第1細胞と第2細胞とを含むキットを提供し、ここで、第1細胞は第2細胞よりも標的遺伝子の発現が多くまたは活性が高く、第1細胞は第2細胞中では実質的に発現されない生物発光分子、化学発光分子または蛍光分子をコードするレポーター遺伝子を更に含みかつ発現し、また第1細胞と第2細胞とは種および細胞型が同じである。
【００２４】
さらに本発明は、第1細胞と第2細胞とを含むアッセイ系を提供し、ここで、第1細胞は第2細胞よりも標的遺伝子の発現が多くまたは活性が高く、第1細胞は第2細胞中では実質的に発現されない生物発光分子、化学発光分子または蛍光分子をコードするレポーター遺伝子を更に含みかつ発現し、また第1細胞と第2細胞とは種および細胞型が同じである。
【００２５】
5.発明の説明
本発明は、特定の細胞の遺伝子産物の活性を阻害する分子をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、該阻害によって宿主細胞または生物の適応性の低下または増大をもたらすことを特徴とする。該方法は、共培養アッセイに基づくものであり、２種の細胞即ち２種の細胞集団を一緒に培養することを必要とし、そのそれぞれは、同種かつ同一の細胞の集団であり、実質的には、標的とした遺伝子または該遺伝子がコードするタンパク質の発現または活性およびレポーター遺伝子の存在または不在のみが異なるものである。
【００２６】
特定の実施形態では、限定はされないが哺乳動物および昆虫細胞を含む、培養細胞に該スクリーニングを適用する。他の実施形態では、線虫などの多細胞生物に該スクリーニングを適用する。さらに他の実施形態では、単細胞生物に該スクリーニングを適用する。好ましい実施形態では、単細胞生物は、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae)である。他の好ましい実施形態では、単細胞生物は細菌などの微生物である。
【００２７】
本発明の共培養アッセイでは、標的とする遺伝子は、スクリーニングに使用される細胞または生物の適応性に影響を与えるものである。特定の実施形態では、標的遺伝子はスクリーニングに用いる細胞または生物の適応性に正に寄与する。標的タンパク質（標的遺伝子によりコードされる）は通常適応性には必要ではなく、例えば標的遺伝子と重複する他の遺伝子の突然変異などにより、該標的タンパク質が適応性に寄与するか、好ましくは不可欠となるように細胞または生物を遺伝子操作することができる（下記第７節参照のこと）。過剰発現または発現の低下のいずれかとなる標的遺伝子の発現の操作は、スクリーニングの材料として用いられるように細胞または生物の生存活性を実質的に損なわないようにすべきである。操作により標的遺伝子または該遺伝子がコードするタンパク質を阻害する分子に対して宿主を感作させることにより、操作した遺伝子を含む細胞または生物が該分子への暴露に応答して、操作していない遺伝子を含む細胞または生物とは増殖速度が異なるようにする。
【００２８】
特定の１実施形態では、標的遺伝子によりコードされるタンパク質が細胞の適応性に正に寄与し（例えば、細胞の必須遺伝子である）、かつ第１の細胞を共培養の開始時の培養物中では明らかに少数になるようにする（共培養物の第１の細胞の第２の細胞に対する割合を低くする）。共培養物を試験分子の存在下で培養した際のレポーター遺伝子の活性の指標となるシグナルの増加が、該分子が標的タンパク質の発現または活性を阻害することを示す。
【００２９】
したがって、本発明の方法は、特定のタンパク質の阻害剤を検出する、標的化容量抑制（Targeted dosage suppression;以下本明細書中ではTDSと称する）スクリーニングと呼ばれるスクリーニングを提供する。特定のタンパク質は、「標的タンパク質」と呼ばれ、「標的遺伝子」によりコードされる。本発明により提供されるTDSスクリーニングは、最少の設定時間で任意の種の任意の標的遺伝子に容易に適用することができる。対象の標的遺伝子は、阻害された場合、必ず適応性または増殖速度を低減させるという決まりがあるだけである。該TDSスクリーニングは、適度な短い世代時間（好ましくは48時間以下）を有する遺伝子発現が制御可能である任意の細胞型または生物に適用可能である。薬剤として使用するための阻害化合物を特定するのに加えて、本方法は標的タンパク質の機能を阻害するタンパク質または他の分子の同定に用いることができる。
【００３０】
本明細書中に記載の該TDS法は、特定の阻害剤を特定する手段としての共培養（競合増殖）実験の感度とともに、標的遺伝子を過剰発現する細胞に付与された薬物耐性も利点とする。
【００３１】
本発明のTDS法によると、１種の細胞がその共培養物の相手方より、その阻害剤を探している標的タンパク質を高レベルで発現しているか、または標的タンパク質の活性が高いか、またはこの両方である。１種の細胞は、細胞内の標的タンパク質の発現レベルまたは活性レベルがより高いことにより、標的タンパク質を過剰発現すると言われる。好ましくは、もう一方の細胞（即ち共培養物の相手方）は、標的遺伝子の発現または活性およびレポーター遺伝子の発現における相違以外は、過剰発現する細胞と同型である。即ち、対照のポイントは、野生型の発現ではなく共培養の相手方における発現となる。この手法の原理は、阻害分子の標的をコードする遺伝子が１方の細胞において他方の細胞より高レベルで発現されているかまたはその活性がより高い場合、細胞の特定の分子に対する耐性が増加するということに基づいている。例えば、発現の増加は、標的遺伝子の発現率の増加、標的遺伝子のコピー数（遺伝子量）の増加、または共培養の相手方における標的遺伝子の発現率もしくはコピー数の減少、またはこれらの組み合わせによりもたらされうる。それぞれの場合において、細胞または生物が発現する標的タンパク質の数が多ければ多いほど、対応する阻害剤に対する耐性が高くなる（Clewellら、1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1720-1724; Schimkeら、1978, Science 202: 1051-1055）。あるいは、該タンパク質の活性がより高い標的細胞を得ることは、共培養物の相手方におけるこの標的タンパク質の阻害剤または変異型タンパク質を発現させることにより達成することもできる。
【００３２】
TDS方の第２の要素には、標的遺伝子を過剰発現しない、または発現抑制されている実質的に同種の細胞（「デコイ」細胞）の過剰量と、標的遺伝子を過剰発現する細胞（「標的」細胞）とを混合することを含む。かかるスクリーニング法の特徴は、２種の型の細胞の相対的な適応性を識別する共培養実験の非常に優れた解像度を利用することである。標的遺伝子が標的細胞の適応性に正に寄与する場合、標的細胞およびデコイ細胞は、標的細胞中に標的遺伝子の阻害剤が存在すると増殖し、標的細胞は、デコイ細胞に比べて耐性または適応性の増大を示す。該混合物の培養の際、標的細胞のデコイ細胞に対する比率は、該集団のメンバーにおいて独占的にならない場合でも優勢となるまで増加する。
【００３３】
阻害剤の存在下で増殖させた細胞集団においてデコイ細胞から標的細胞を識別する手段としては、標的細胞に、検出の容易なマーカーまたはレポーター遺伝子（GFPなど）を含有させる。したがって、好ましい実施形態では、標的細胞は標的遺伝子とGFPの両方を非常に高レベルで発現する。デコイ細胞はGFPを発現しない。種々のモジュレーター候補物質の存在下で細胞混合物を培養した後、蛍光について細胞を評価する。標的細胞に増殖の差をもたらす分子を、紫外波長の光により手動で、または蛍光を検出および/もしくは測定できる他の装置で容易に検出することができる。
【００３４】
該標的細胞または生物からのレポーター遺伝子の脱落による擬陽性でないことを確実にするためには、標的細胞とデコイ細胞とのゲノムを混合しないこと、またはレポーター遺伝子が標的遺伝子の過剰発現に密接に（遺伝的に）関連していることが必要である。これは、例えば、酵母では、標的細胞およびデコイ細胞の遺伝物質が隔離させたままになるように、接合欠損株を用いることにより達成することができる。あるいは、標的遺伝子がプラスミドから発現される場合は、同じプラスミドからレポーター遺伝子も発現されるように遺伝子操作する。当業者であれば、同様の成果を得るための他の手段も判るであろう。
【００３５】
標的遺伝子が細胞の適応性に正に寄与する実施形態では、ポジティブなヒット（hit）が、標的遺伝子の発現が阻害剤候補物に対する耐性を与えたことを示すので、TDSスクリーニングは、極めて特異的である。この結果は、化合物が標的タンパク質または機能的に関連するタンパク質もしくは標的の下流で機能するタンパク質を阻害したことを示すはずである。化合物を分解するようなポンプまたはタンパク質の過剰発現もまた、耐性を付与し、擬陽性をもたらす場合がある。しかし、このような場合は、多数の異なる化合物に対して耐性となるので、容易に特定されるであろう。稀な場合として、阻害剤に対する耐性はマーカー遺伝子の共発現により付与される場合が想定されうる。マーカー遺伝子がGFPである場合、GFPは細胞に生理的な顕著な影響を与えないことが実証されていないので、この可能性はないと考えられる。
【００３６】
他の特定の実施形態では、標的遺伝子によりコードされるタンパク質は細胞の適応性に負に寄与するものとし（例えば、その過剰発現が過剰発現による致死性などの増殖障害をもたらすなど）、第１の細胞は開始時には共培養物中に明らかに大多数とする（共培養物は第１の細胞の割合が第２の細胞に対して高くなるように調製する）。試験分子の存在下で共培養物を培養する場合、共培養物を開始時に調製した時と少なくとも同様に高い蛍光シグナルを検出すると、該分子が標的遺伝子のコードするタンパク質の発現または活性を阻害するということを示す（下記の第5.8節参照）。
【００３７】
細胞の遺伝的背景は、標的遺伝子が第２の細胞に比べて第１の細胞において過剰発現される場合、細胞の適応性に正または負のどちらかに寄与するように遺伝子操作して、本発明のアッセイを用いることができるようにすることができる。
【００３８】
本明細書中に記載のTDSスクリーニングは、下記第5.9節に記載するように、デコイ細胞と複数の標的細胞を共培養することにより複数の標的遺伝子の阻害剤を同時にスクリーニングするために開発することもできる。第5.9節には、関連はあるが同一ではない標的タンパク質の阻害剤を同定するTDS法の変法も記載している。
【００３９】
本発明のある実施形態では、標的遺伝子は、細胞の適応性に正または負のいずれかに寄与する生物学的経路の構成要素であるタンパク質をコードする。本明細書中で用いる場合、生物学的経路とは、細胞の構成成分（例えばｍRNA分子種の量などのRNA分子種の量、またはmRNA由来のcDNAの量などのDNA分子種の量；本明細書中で用いる場合、「細胞の構成成分」という用語は、ミトコンドリア、リソゾームなどの公知の細胞器官を指すという意図ではない）の集団であって、その中の他の１種以上の細胞構成成分によって何らかの生物学的な機序により該集団内の各細胞器官それぞれが影響されるという関連のある集団を意味する。ある実施形態では、生物学的経路は、シグナル伝達または制御経路である。シグナル伝達および制御経路は典型的には、一次的または媒介的なシグナル分子、ならびに通常はこれらの経路に特徴的なシグナルまたは制御カスケードに関与するタンパク質を含む。シグナル伝達経路では、受容体に対するシグナル分子の結合は媒介的シグナル分子の量に直接的に影響を与え、かつ、経路中のタンパク質のリン酸化程度など（または他の修飾）に間接的に影響する。これらの作用の両方とも、ついで、例えば、細胞の転写状態に影響するなどの、シグナルにより開始される細胞プロセスの鍵となるエフェクターである細胞内タンパク質の活性に影響を与える。例えば細胞周期の磁気および発生を制御している制御経路も同様である。ここで、複数の（しばしば進行中の）細胞内の現象が一時的に制御され（フィードバック制御を用いる場合が多い）、染色体分裂を伴う細胞分裂のような明確な現象を起こす。この制御は、経路の機能の結果として起こるものであり、リン酸化または他の調節のそれぞれの程度に対するタンパク質の相互作用により媒介される場合が多い。標的タンパク質として用いるのに適切な構成成分を含む他の生物学的経路には、限定はされないが、テロメアーゼ関連経路、接合経路、細胞周期経路、細胞分裂経路、細胞修復経路、低分子合成経路、タンパク質合成系路、DNA合成経路、RNA合成系路、DNA修復経路、ストレス応答経路、細胞骨格経路、ステロイド系経路、受容体媒介性シグナル伝達経路、転写経路、翻訳経路、免疫応答経路、熱ショック経路、運動性経路、分泌経路、エンドサイトーシス経路、タンパク質選別経路、ファゴサイトーシス経路、光合成経路、排出経路、電気応答経路、圧力応答経路、タンパク質修飾経路、低分子応答経路、毒性分子応答経路、形質転換経路などがある。特に、本明細書中に記載の発明は、第６節のerg11経路によるもの、第７節のras細胞シグナル伝達経路によるものを例示している。他にも、標的タンパク質の選択に適した公知の制御経路は、環境の変動に得面すると細胞内代謝レベルを最適に維持しようとする。解明されている機序によって操作できる他の細胞経路の例はよく知られているので、当業者には容易に判るであろう。
【００４０】
5.1  定義および基本的技術
他に定義されていない場合、本明細書中に用いる全ての技術および化学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者に通常理解されるとおりの意味である。本発明の実施は、他に指示がない場合、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学および免疫学の従来技術を用いる。Maniatisら、1982、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Sambrookら、1989, Molecular Clonining: A Laboratory Manual (COld Spring Harbor, New York: Cold Sprig Harbor Laboratory Press); Ausubelら、1992, Current Protocols in Molecular Biology (New York; John Wiley & Sons); GuthrieおよびFink, 1991, Methods Enzymol. 194:1-863参照のこと。
【００４１】
細胞または生物の適応性：特定の細胞の増殖能、即ち、生存活性または細胞が増殖するための能力である。例えば、競合的な増殖環境では、所定の期間における細胞の分裂の総数により測定することが好ましい。細胞周期の期間または細胞死の頻度が減少している場合、適応性が増大しているという。逆に、細胞周期の期間または細胞死の頻度が増大している場合、適応性が低下しているという。
【００４２】
標的遺伝子：阻害剤を探索する対象の遺伝子である。標的遺伝子は標的細胞で過剰発現され、かつ/またはデコイ細胞で抑制発現される。標的遺伝子によりコードされるタンパク質が「標的タンパク質」である。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「標的タンパク質」という用語は、機能的タンパク質の断片、野生型タンパク質より活性が増大または低減された（しかし、デコイ細胞における標的タンパク質の活性よりは依然として高い）該タンパク質の変異型（例えば、該タンパク質の構成的活性型）、機能的に活性なミューテイン、または標的タンパク質の誘導体を指す。標的タンパク質はまた、融合タンパク質（例えば、エピトープタグまたはレポータータンパク質との）として発現させることもできる。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、「機能的断片」という用語は、タンパク質の機能的活性（限定はされないが、生物学的活性；例えば、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異をレスキューする能力など）を維持しているアミノ酸配列の任意の一部分である。
【００４５】
「ミューテイン」ポリペプチドとは、元のタンパク質または野生型タンパク質のアミノ酸配列に比較して１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含有する配列を有するポリペプチドのことである。ミューテインは、野生型タンパク質に対して、少なくとも５０％の配列相同性、好ましくは６０％の配列相同性、さらに好ましくは７０％の配列相同性を有する。最も好ましいミューテインは、野生型タンパク質に対して、８０％、９０％、または９５％の配列相同性を有する。この配列相同性は、GapまたはBestfitなどの一般的な配列解析アルゴリズムの任意のものにより測定される。
【００４６】
タンパク質の「誘導体」とは、ポリペプチドまたはその断片であって、一次構造的配列において実質的に相同性を有するが、例えば、in vivoの生化学的修飾（例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、種々の酵素的修飾、または保存的置換などが挙げられるが限定はされない）を含むものを指す。当業者にはこれらの修飾は容易に判るであろう。
【００４７】
「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合を介して異種アミノ酸配列に結合しているポリペプチドを含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２種以上の異なるタンパク質に由来する所望の機能的エレメントを２種以上含有するように構築することができるため有用である。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を遺伝子組換え技法により構築することによって作成され、該融合タンパク質を発現させることができる。
【００４８】
5.2.  酵母の方法
具体的な実施形態において、適応性に正に寄与するS. cerevisiae遺伝子は、様々な治療、獣医学および農業の場面において用いることができる抗真菌剤、除草剤および殺虫剤、ならびに抗細胞増殖剤の設計または発見のための標的を提供する。
【００４９】
本発明の一実施形態において、本発明の標的遺伝子は、細胞の適応性に正に寄与する任意の遺伝子である。好適な実施形態において、標的遺伝子は必須遺伝子である。「必須」の語は、細胞または生体の適応、成長または生存のために、その機能が必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。例として、「必須」の語は、S. cerevisiaeに関して使用される場合は、栄養成長のためにその機能が必要とされる産物をコードする遺伝子を示し得る。標的遺伝子としてうまく使用することができる酵母必須遺伝子の例は、下記節６に記載するように、erg11である。公知の必須遺伝子酵母のリストは、酵母ゲノムプロジェクトの成果を通じて確実に増えてきている。例えば、erg11以外のクロモソームVII必須遺伝子は、s10p、gpa11、mas2、thr1、ppa1、erg7、gar1、cdc12、msh1、prp8、cdc23、erg9、およびsch9を含むが、これらに限定されるわけではない（U. Washington Yeast Genome Project; http://genome.wustl.edu/gsc/yeast/chromosome8ORFs.html）。完全にアップデートされた公知の酵母必須遺伝子のリストを得るためには、Saccharomycesゲノム削除プロジェクト（http://sequence-www.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html）を参照のこと。
【００５０】
S. cerevisiae必須遺伝子は、富栄養培地上の酵母栄養成長を妨げる遺伝子の完全な機能欠失変異（ノックアウト）によって同定することができる。しかし、完全な機能欠失変異が、酵母の必須遺伝子を同定する唯一の方法ではない。必須遺伝子はまた、遺伝子の非完全欠失対立遺伝子によって同定することもできる。非完全欠失対立遺伝子は十分に生物化学活性が減少したタンパク質をコードし、該タンパク質は、酵母に要求される必須機能を満たすには不十分であるため酵母の栄養成長が阻害される。例えば、非完全欠失対立遺伝子は、酵素の活性部位において、点突然変異を有する対立遺伝子であり得る。最終的に、酵母中には、同じ機能または重複する機能をもつタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子のファミリーの複数のコピーが存在するように、ゲノムにおいて余剰およびまたは重複していることのみにより、必須でない多くの遺伝子が存在する。このような遺伝子は、例えば、余剰または重複した遺伝子の欠失または突然変異による遺伝子操作によって必須のものとすることができる。通常は必須ではないが、必須とすることができる遺伝子の例は、下記節７に記載するrce1である。
【００５１】
本発明の方法にしたがった標的遺伝子として有用な酵母遺伝子のもう一つのカテゴリーは、欠失すると緩成長表現型をもつものである。クロモソームVIII緩成長遺伝子の例として、mrp4、myo1、ste12およびeno2が含まれるが、これらに限定されるわけではない。（U. Washington Yeast Genome Project; http://genome.wustl.edu/gsc/yeast/chromosome8ORFs.html）。
【００５２】
S. cerevisiae標的遺伝子は、多くの異なったカテゴリーに属する標的の阻害剤を同定するために用いることができる。植物および／または哺乳動物の相同体を有しないS. cerevisiaeの標的遺伝子は、高度に特異的な抗真菌剤をスクリーニングするために用いることができる。代替的に、昆虫または植物の相同体を有するS. cerevisiaeの標的遺伝子は、それぞれ殺虫剤および除草剤のスクリーニングに用いることができる。最後に、哺乳動物の相同体を有するS. cerevisiaeの標的遺伝子は、例えば乾せん症、血管形成術後の再狭窄の予防、良性および悪性腫瘍の治療において使用することができる抗細胞増殖剤のスクリーニングにおける標的として用いることができる。これらの群は、相互に排他的ではない。例えば、細胞の適応性に正に寄与するS. cerevisiaeの遺伝子は、植物の相同体を有するが、哺乳動物の相同体を有しない。遺伝子（またはその遺伝子がコードするタンパク質）を、哺乳動物に対する抗真菌剤となり得るものを同定するための標的遺伝子ならびに哺乳動物に安全な除草剤を単離するための標的として使用することができる。同様に、S. cerevisiaeの遺伝子は、植物、昆虫または哺乳動物の相同体を有するが、除草剤、殺虫剤および哺乳動物の抗細胞増殖剤の設計または発見のための標的として使用することができる。
【００５３】
このようにして、S. cerevisiae遺伝子と他の生物由来の遺伝子との間の共通点および相違点を、スクリーニングの設計に利用することができる。例えば、標的遺伝子をヒトまたは哺乳動物用の抗真菌剤の同定に利用する場合、標的遺伝子は、ヒトまた非ヒト哺乳動物の相同体を有しないことが好ましい。標的遺伝子が農業用抗真菌剤の同定に利用される場合、植物の相同体を有しないことが好ましい。哺乳動物または植物の遺伝子が、S. cerevisiae標的遺伝子がコードするタンパク質と相同のタンパク質をコードしない場合、本発明の方法により同定される標的の阻害剤は、高度に真菌特異的である可能性がある。代わりに、標的遺伝子または経路が哺乳動物または植物タンパク質といくらかの相同性を示した場合は、本発明にしたがった新しい抗真菌剤のスクリーニングを設計し、酵母標的とこれと相同の哺乳動物または植物のタンパク質との間の相違を利用して、特異的な抗真菌剤を製造することができる。
【００５４】
本発明は、S. cerevisiaeと植物または昆虫との間で相同のS. cerevisiaeの標的遺伝子を阻害する分子をスクリーニングすることにより、新規な除草剤および殺虫剤を同定する方法を提供する。このような遺伝子は、配列類似を示すだけでなく、しばしば機能の類似も示す。例えば、S. cerevisiae遺伝子が、S. cerevisiaeの適応性に正に寄与し、かつ昆虫または植物の遺伝子と相同性がある場合、相同的な昆虫または植物遺伝子は、昆虫または植物の成長にとっても同様に重要であるという可能性が高い。このように、昆虫または植物の遺伝子と相同性をもち、同じ機能をもつことが知られている遺伝子を改変することにより感度を高められたS. cerevisiaeを使用するスクリーニングで同定された分子は、殺虫剤または除草剤として使用することができる。このスクリーニング方法の利点は、一定の特異的標的と相互作用するように設計された殺虫剤または除草剤が、毒性の副作用をほとんどもたないか、または害虫による抵抗性の獲得を促す傾向が少ないことである。
【００５５】
本発明は、哺乳動物、特にヒトのための、新規な抗細胞増殖薬を同定する方法を提供する。上記のように、S. cerevisiae由来の遺伝子は、しばしばヒトを含む他の真核細胞生物に相同体を有する。このため、スクリーニングの目的が哺乳動物の抗細胞増殖剤として使用するための分子を同定することである場合は、スクリーニングの目的で感度を高めた標的遺伝子は、哺乳動物の細胞増殖または適応性のためにも重要である哺乳動物の遺伝子の相同体である。あるいは、酵母標的遺伝子は、哺乳動物の対応する遺伝子にとってかわることが可能であるし、または組み合わせて使用することが可能である。標的化された抗細胞増殖薬は、細胞増殖を抑制するため現在入手できる薬よりも有効でありうるし、または現在入手できる薬物と一緒に使用することができる。
【００５６】
本発明のこの実施形態は、S. cerevisiaeを用いて例示されるが、この方法は、多くの他の真菌属を用いて実施することができる。真菌属として、アスペルギルス（Aspergillus）、カンジダ（Candida）、ニューロスポラ(Neurospora)、シプトコッカス(Cyptococcus)およびトリコダーマ(Trichoderma)のようなヒトの病原体を含む。さらに、フーサリウム(Fusarium)のような植物病原体も同様に標的化することができる。多数の遺伝子ならびにS. cerevisiaeを除くこれらのいくつかの真菌のゲノムの一部は、クローニングされており、これらの真菌類において遺伝子を破壊する方法もまた、公知である。
【００５７】
5.2.1  酵母変異株の構築方法
本発明のいくつかの実施形態において、酵母変異は、特に特異的阻害剤分子に対してデコイ細胞が特異的に高感度となるように作られている。酵母の遺伝子を破壊し、または突然変異させることによる当技術分野で公知の方法が多くある。一実施形態において、完全な遺伝子および遺伝子のいずれの部分も発現しない完全欠失対立遺伝子が作られる。他の実施形態において、例えば、遺伝子機能が十分でない一部分だけの遺伝子を含む欠失対立遺伝子を作ることができる。欠失対立遺伝子は、突然変異ｍRNA転写産物の翻訳が早まって終わるように、ナンセンスコドンを遺伝子の配列に挿入することにより構築できる。対立遺伝子はまた、独立して、または組み合わせて、点突然変異を含んでなることができるが、この対立遺伝子は、遺伝子の機能が減少しているか、または破壊されている。このような方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００５８】
遺伝子の条件対立遺伝子をつくるための様々なストラテジーがある。概括的にいうと、対立遺伝子は機能または発現について条件付けることができる。機能についての条件対立遺伝子の例として、例えばミスフォールディングのためまたは局所化できないために、遺伝子産物がある温度（すなわち許容温度）では機能するが、異なった温度（すなわち非許容の温度）では機能しないという温度感受性突然変異がある。当業者であれば、一つだけ、またはいくつかの改変されたヌクレオチドをもち得るが、不活性または温度感受性タンパク質をコードする突然変異対立遺伝子を作ることができる。温度感受性突然変異酵母細胞は、許容温度において機能的タンパク質を発現するが、非許容温度では機能的タンパク質を発現しない。
【００５９】
条件付きで発現する対立遺伝子の例は、調節されたプロモーターが遺伝子の発現を制御するキメラ遺伝子である。ある条件下において遺伝子が発現し、他の条件下では発現しない。遺伝子の内因性プロモーターを、一定の条件下においてのみ活性化され得る非相同性のプロモーターまたは改変されたプロモーターと置換または改変することができる。これらの条件付き突然変異体は、規定された実験条件下でのみ発現する。これらの方法はすべて、当技術分野において公知である。例えば、Stark, 1998年, Methods in Microbiology 26:83〜100; Garfinkelら, 1998年, Methods in Microbiology 26:101〜118;およびLawrence & Rothstein, 1991年, Methods in Enzymology 194:281〜301を参照。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、遺伝子は遺伝子の破壊または突然変異なしに、発現を減少させることができる。例えば、遺伝子の発現は、調節または構造プロモーターの制御下において、アンチセンス分子で酵母を形質転換することにより、減少させることができる（Nasrら、1995年, Molecular＆ General Genetics 249:51〜57）。このようなアンチセンス構造は、誘導性プロモーターに機能可能に連結して構築され、条件対立遺伝子の機能を研究するために、S. cerevisiaeに導入されるか（Naseら、前掲）、または細胞の摂動として作用する。
【００６１】
遺伝子発現はまた、相同的組換えにより、目的の遺伝子中、またはその隣に配列を挿入することによっても減少させることが可能であり、配列は分解のためにｍRNAまたはタンパク質を標的とする。例えば、ユビキチン融合タンパク質がつくられるように、ユビキチンをコードする構築物を導入することができる。このタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、短い半減期をもつ傾向がある。例えば、Johnsonら,1992年, EMBO J.11:497〜505参照。
【００６２】
好適な形式において、遺伝子の残余機能を確実になくすために、標的遺伝子を完全に破壊する。「古典的」方法またはPCRに基づいた方法により遺伝子を破壊することができる。遺伝子ノックアウトの「古典的」方法は、Rothstein, 1991年に記載されている。しかし、いくつかの実施形態においては、より速くかつ労力がかからない、PCRに基づいた欠失方法を用いることが好ましい。
【００６３】
5.2.2  酵母の発現系
本発明は、TDSスクリーニングにおいて標的細胞として使用するための、組換え手段により標的遺伝子を過剰発現する酵母細胞を提供する。本発明はまた、TDSスクリーニングにおいてデコイ細胞として使用するための、標的遺伝子を過少発現する酵母細胞を提供する。
【００６４】
好適な実施例において、標的遺伝子は、遺伝子の発現レベルを調節することができるように、誘導可能な方法で過剰発現される。出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeに用いるために入手することができるいくつかの公知の調節可能な発現系のいずれも、本発明に適合し得る（Mumbergら, 1994年, Nucl. Acids Res. 22:5767〜5768）。通常、遺伝子発現は、調節可能な外因性プロモーターにより染色体上において置換される、調節すべき遺伝子のプロモーターによって、転写制御により調節される。酵母において、最も一般的に使用される調節可能なプロモーターは、GAL1プロモーターである（Johnstonら,1984年, Mol Cell. Biol, 8:1440〜1448）。GAL1プロモーターは、増殖培地において、グルコースが存在することにより強度に抑制され、グルコース存在量の減少およびガラクトースの存在により、段階的に、徐々に高レベルの発現に切り替えられる。GAL1プロモーターは、通常、目的とする遺伝子に対し、5〜100倍の範囲の発現制御を可能とする。
【００６５】
その他の頻繁に使用されるプロモーター系は、これは、増殖培地において、メチオニンの不在下で誘導されるMET25プロモーター（Kerjanら, 1986, Nucl. Acids. Res. 14:7861〜7871）、銅により誘導されるCUP1プロモーター（Mascorro-Gallardoら, 1996年, Gene 172:169〜170）、グルコースの存在下で抑制されるCYC1プロモーター（GuarenteおよびPtashne, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2199〜2203）、およびチアミンにより調節され得るPHO5（Meyhackら, 1982年, EMBO J 1:675〜680）を含む。これらのプロモーター系はすべて、増殖培地における調節部分の量を除除に増加させることにより、遺伝子発現の調節を徐々に増加させて調節できる。
【００６６】
上記した発現系の不利な点は、プロモーター活性の調節が（例えば炭素源の変化、特定のアミノ酸の除去により影響を受ける。）、しばしば他の遺伝子の発現レベルを独立して変えるような、細胞生理学におけるその他の変化を引き起こすことである。近年開発された酵母用系であるTet系は、この問題を大きく軽減する（Gariら, 1997年, Yeast 13:837〜848）。哺乳動物の発現系から採用されるTetプロモーター（Gossenら, 1995年, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547〜5551）は、抗生物質であるテトラサイクリンまたは構造的に関連する化合物であるドキシサイクリンの濃度によって調節される。このように、ドキシシクリンの不在下において、プロモーターは高レベルの発現を誘導し、高レベルのドキシサイクリンを添加すると、プロモーター活性の抑制が上昇する。中程度のレベルの遺伝子発現は、中程度のレベルの薬物の添加により、定常状態で達成することができる。さらに、プロモーター活性を最大に抑制するドキシサイクリンのレベル（10μg／ml）は、野生型酵母細胞の増殖率に対し、有意な影響を及ぼさない（Gariら, 1997年, Yeast 13:837〜848）。
【００６７】
改変された実施形態において、標的遺伝子は、構成プロモーターの調節下において、過剰発現する。適当な構成プロモーターは、PGK遺伝子（3-ホスホグリセラートキナーゼ；Hitzemanら, 1983年, Science 219:620〜）、GAPDH（グリセアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ）をコードするTDH遺伝子（Holland and Holland, 1979年, J. Biol Chem. 254:9839〜9845）、TEF1遺伝子（延長因子1; Cottrelleら, 1985年, J. Biol Chem. 260:3090〜3096）、およびMFα1（α性フェロモン先駆体; Inokuchiら, 1987年, Mol. Cell. Biol. 7:3185〜3193）を含むが、これに制限されるわけではない。
【００６８】
標的を標識するためのレポーター遺伝子もまた、この節において説明した方法によって発現する。
【００６９】
いくつかの特定の実施形態において、上述したような発現系は、使用のために、対応する内因性遺伝子および／または遺伝子活性の欠失した細胞または生物体（例えば、内因性遺伝子が破壊されたか、または欠失した細胞）に導入される。組換え遺伝子を使用して、活性の減少した突然変異標的タンパク質またはその断片を発現させてデコイ細胞を作成するか、または野生型の活性をもつかまたはより高度の活性を有する標的タンパク質もしくはその機能的断片を発現させて標的細胞を作成できる。活性が高められたかまたは弱められたタンパク質突然変異体のクラスの例は、下記節５．２．４に記載する。
【００７０】
5.2.3.  タンパク質量の改変方法
本発明は、標的タンパク質量が高い酵母標的細胞、および標的タンパク質量が低い酵母デコイ細胞を提供する。
【００７１】
タンパク質量を改変する方法としては、特に、タンパク質分解速度を改変する方法、および(天然型標的タンパク質種の活性の量に影響するタンパク質に結合する)抗体を使用する方法が挙げられる。タンパク質種の分解速度を高める(または低くする)ことにより、その種の量が低く(高く)なる。高い温度および/または特定の薬剤に対する曝露に応じて標的タンパク質の分解速度を制御可能に高める当該分野で公知の方法を、本発明において採用してもよい。例えば、そのような方法の１つは、高温度(例えば37℃)では高速タンパク質分解を促進する分解シグナルを露出し、低温度(例えば23℃)では潜伏して高速分解させないＮ末端タンパク質断片である、熱誘導型または薬剤誘導型Ｎ末端デグロンを採用する(Dohmenら, 1994, Science 263:1273-1276)。このようなデグロンの例として、Arg-DHFRtsがあり、これはＮ末端ValがArgで置換され、66位のProがLeuで置換されたマウスジヒドロ葉酸レダクターゼの変異体である。本方法によれば、例えば、標的タンパク質Ｐをコードする遺伝子を、当該分野で公知の標準的な遺伝子ターゲッティング方法により(Lodishら, 1995, Molecular Biology of the Cell, Chpt. 8, New York：W.H. Freeman and Co.)、融合タンパク質Ub-Arg-DHFRts-P(“Ub”はユビキチンを指す)をコードする遺伝子と置換する。Ｎ末端ユビキチンを、翻訳後に、Ｎ末端デグロン(degron)に曝露させて高速切断する。低温度においては、Arg-DHFRtsに内在するリシンは露出されず、融合タンパク質のユビキチン化は生じず、分解は遅く、活性標的タンパク質レベルは高い。高温度(メトトレキセートの非存在下)においては、Arg-DHFRtsに内在するリシンが露出し、融合タンパク質のユビキチン化が生じ、分解は速く、活性標的タンパク質レベルは低い。分解の熱活性化は、メトトレキセートの露出により制御可能にブロックされる。本方法は、薬剤および温度変化などの他の誘導性因子に関与する他のＮ末端デグロンに適応可能である。
【００７２】
標的タンパク質量、および直接または間接的にそれらの活性も、抗体を中和させることにより低くしたり、抗体を活性化させることにより高くしたりできる。
【００７３】
抗体は、様々な様式で細胞に導入することができる。好適な実施形態では、抗体をコードするハイブリドーマmRNAを細胞中で形質転換させることにより、抗体を細胞に導入する(Burkeら, 1984, Cell 36:847-858)。別の技術では、組換え抗体を様々な非リンパ球細胞型中で操作および異所性発現させ、標的タンパク質と結合させて、標的タンパク質活性をブロックさせることができる(Bioccaら, 1995, Trends in Cell Biology 5:248-252)。抗体の発現は、Tetプロモーターなどの制御可能プロモーターの制御下にあることが好ましい。第一のステップは、標的タンパク質に適した特異性を有する特定のモノクローナル抗体の選択である(以下参照)。次いで、選択された抗体の様々な領域をコードする配列を、例えば全抗体(免疫グロブリン)、Fabフラグメント、Fvフラグメント、一本鎖Fvフラグメント(ペプチドリンカーにより一体化したＶＨおよびＶＬ領域)(“ScFv”フラグメント)、ダイアボディ(diabodies)(異なる特異性を有する２つの関連ScFvフラグメント)などを含む様々な遺伝子操作抗体フォーマットにクローニングできる(Haydenら, 1997, Current Opinion in Immunology 9:210-212)。様々なフォーマットの細胞内発現された抗体を、様々な公知の細胞内リーダー配列との融合体として発現させることにより、細胞画分(例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなど)に標的化させることができる(Bradburyら, 1995, Antibody Engineering, vol. 2, Borrebaeck編, IRL Press, pp 295-361)。特に、ScFvフォーマットは、細胞質ターゲッティングに特に適していると思われる。
【００７４】
標的タンパク質を指向するモノクローナル抗体の調製のためには、培養中の連続(continuous)細胞系により抗体分子の生成をもたらすあらゆる技術が使用できる。このような技術としては、元々KohlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術(1975, Nature 256:495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96に掲載)が挙げられるがこれらに限定されない。本発明によれば、ヒトハイブリドーマを使用して(Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 80:2026-2030)、またはヒトＢ細胞をEBVウイルスでin vitro形質転換することにより(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96に掲載)、ヒト抗体を使用および得ることができる。実際、本発明によれば、標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子、および適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」を生成するために開発された技術(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608；Takedaら, 1985, Nature 314:452-454)が使用できる(このような抗体は本発明の範囲内にある)。マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有するヒト化抗体、およびヒト枠組み構造領域も使用できる。
【００７５】
さらに、モノクローナル抗体が都合よい場合には、ファージディスプレイ技術を用いて大きい抗体ライブラリーからこれらを代替的に選択できる(Marksら, 1992, J. Biol. Chem. 267:16007-16010)。この技術を使用して、1012までの異なる抗体のライブラリーが、fd繊維状ファージの表面上で発現されて、モノクローナル抗体の選択のために利用可能な抗体の「シングルポット(single pot)」in vitro免疫系が作成されている(Griffithsら, 1994, EMBO J. 13:3245-3260)。このようなライブラリーからの抗体の選択は、当該分野で公知の技術により行うことができ、ファージを固定化標的タンパク質に接触させること、標的に結合したファージを選択およびクローニングすること、ならびに抗体可変領域をコードする配列を所望の抗体フォーマットを発現する適切なベクターにサブクローニングすることを含む。
【００７６】
本発明によれば、一本鎖抗体の生成について記載された技術(米国特許第4,946,778号および同第5,359,046号)を適応させて、標的タンパク質に特異的な一本鎖抗体を生成できる。本発明の別の実施形態は、Fab発現ライブラリーの構築について記載された技術(Huseら, 1989, Science 246:1275-1281)を利用して、標的タンパク質に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの高速かつ簡潔な同定を可能にする。
【００７７】
抗体を生成する際に、所望の抗体についてのスクリーニングは、例えばELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)などの当該分野で公知の技術により達成できる。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するために、生成されたハイブリドーマまたはファージディスプレイ抗体ライブラリーを、標的タンパク質に結合する抗体についてアッセイしてもよい。
【００７８】
5.2.4.  タンパク質活性の改変方法
本発明は、標的タンパク質活性が高い酵母標的細胞、および標的タンパク質活性が低い酵母デコイ細胞を提供する。
【００７９】
タンパク質活性を直接改変する方法としては、特に、突然変異(例えば、温度感受性突然変異、ドミナントネガティブ型突然変異)、機能的突然変異の獲得(例えば、構成的に活性なタンパク質を生じるようなもの)、特定の薬剤、リン酸またはアセチル基などの化学部分の添加、もしくはこのような化学部分の添加を模倣するアミノ酸置換、および抗体の使用が挙げられる。
【００８０】
ドミナントネガティブ型突然変異は、細胞内で発現されると標的化タンパク質種の活性を破壊するような、内因性遺伝子または変異体組換え遺伝子に対する突然変異である。標的化タンパク質の構造および活性に応じて、その標的の活性を破壊するドミナントネガティブ型突然変異を構築するための適切な戦略の選択を導く一般規則が存在する(Hershkowitz, 1987, Nature 329:219-222)。活性単量体形態の場合、不活性形態の過剰発現により、標的タンパク質の正味の活性を有意に低くするのに十分な程度の天然物質またはリガンドに対する競合が生じ得る。このような過剰発現は、例えば、活性の高いプロモーター(好ましくは制御可能または誘導可能なプロモーター)を変異体遺伝子と会合させることにより達成できる。あるいはまた、活性部位残基を変化させて、標的リガンドと事実上不可逆的な会合を生じさせることができる。これは、特定のチロシンキナーゼを用いて、活性部位セリン残基を注意深く置換することによりで達成できる(Perlmutterら, 1996, Current Opinion in Immunology 8:285-290)。
【００８１】
活性多量体形態の場合、いくつかの戦略により、有意ネガティブ突然変異の選択を導くことができる。多量体活性は、多量体会合ドメインに結合して、多量体形成を妨害する外因性タンパク質断片をコードする遺伝子の発現により、制御可能に低減することができる。あるいはまた、特定の種類の不活性タンパク質ユニットの制御可能な過剰発現により、野生型活性ユニットを不活性多量体につなぎ留めて(tie up)、多量体活性を低減することができる(Nockaら, 1990, EMBO J. 9:1805-1813)。例えば、二量体DNA結合タンパク質の場合、DNA結合ドメインをDNA結合ユニットから削除、または活性化ユニットから活性化ドメインを削除できる。また、この場合、DNA結合ドメインユニットは、ドメインが活性化ユニットと会合を生じることなく発現され得る。そのために、DNA結合部位は、発現の活性化の可能性なしに、つなぎ留められる。ある特定の種類のユニットが活性の間に通常コンホーメンション変化する場合、生じる複合体は、固定(rigid)ユニットの発現により不活性化され得る。さらなる例として、細胞運動性、細胞分裂プロセス、細胞設計などの細胞メカニズムに関与するタンパク質は、典型的に、２、３種類の多数のサブユニットの会合から構成される。これらの構造は、構造的欠陥を有する単量体ユニットを２、３含むことによる破壊に対して感受性が高いことが多い。このような変異体単量体は、関連するタンパク質活性を破壊し、細胞中で制御可能に発現され得る。
【００８２】
ドミナントネガティブ型突然変異に加えて、温度(または他の外因性要因)に対して感受性を有するかまたは構造的に活性な変異体標的タンパク質は、当該分野で周知の突然変異誘発およびスクリーニング手順により見つけることができる。
【００８３】
また、当業者は、標的タンパク質と結合して阻害する抗体の発現を別のドミナントネガティブ型戦略として採用できることを理解するであろう。
【００８４】
5.3.  哺乳動物および昆虫細胞方法論
本発明のTDSスクリーニングはまた、培養された哺乳動物および昆虫細胞とも使用できる。適応性に正に寄与する培養細胞の遺伝子は、様々な治療的、獣医学的、および農業的環境において使用できる抗増殖剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、および殺虫剤の設計または発見のための標的を提供できる。
【００８５】
必須遺伝子を含む(ただし、それらに限定されない)培養哺乳動物細胞の適応性に正に寄与する遺伝子を、抗増殖剤(例えば、乾癬の治療、血管形成後の再狭窄の予防、ならびに良性および悪性腫瘍において使用できるものなど)についてのスクリーニングの標的として使用できる。培養哺乳動物細胞はまた、(ａ)過剰活性または異常活性が疾患または障害に寄与する標的遺伝子を同定し、(ｂ)培養細胞の適応性を前記標的遺伝子の活性に依存させることができる場合に、薬剤についてスクリーニングするために使用して、ヒト障害または疾患を治療できる。
【００８６】
培養された昆虫細胞(必須遺伝子を含むがそれらに限定されない)の適応性に正に寄与する遺伝子を使用して、２つの有用なクラスの標的の阻害剤を同定できる。昆虫および哺乳動物間で保存されない標的遺伝子、または哺乳動物相同体を有さない標的遺伝子を、殺虫剤についてのスクリーニングにおいて標的として使用できる。逆に、哺乳動物相同体を保存した標的昆虫遺伝子を使用して、培養哺乳動物細胞について記載されるように抗増殖剤についてスクリーニングできる。
【００８７】
本発明は、選択された標的遺伝子が、TDSスクリーニングにおけるデコイ細胞として使用されるために抑制発現されている哺乳動物および昆虫細胞を提供する。このような抑制発現は、１つの細胞または生物における発現または活性のレベルが同時培養のパートナーと比べて低いことを指す。抑制発現は、以下に記載するように、標的タンパク質をコードするRNAのレベルを低下させること、または標的タンパク質自体の活性のレベルを低下させることにより達成できる。
【００８８】
5.3.1. RNA量または活性を低減させる方法
組織培養物における抑制発現は、標的タンパク質をコードするmRNAの量または活性を低減させることにより最も良好に達成される。RNA量および活性の低減方法は、現在、リボザイム、アンチセンス種、およびRNAアプタマーの３つのクラスに分類される(Goodら, 1997, Gene Therapy 4:45-54)。これらの実体に対する細胞の制御可能な曝露により、RNA量の制御可能な摂動が可能になる。
【００８９】
リボザイムは、RNA切断反応を触媒できるRNAである（Cech, 1987, Science 236:1532-1539；1990年10月4日に発行されたPCT国際公報WO 90/11364；Sarverら, 1990, Science 247:1222-1225)。「ヘアピン」および「ハンマーヘッド」RNAリボザイムを設計して、特定の標的mRNAを特異的に切断できる。リボザイム活性を有する短いRNA分子の設計についての規則は確立されており、これにより、他のRNA分子を高度に配列特異的な手法で切断でき、かつ事実上全ての種類のRNAに対して標的化できる(Haseloffら, 1988, Nature 334:585-591；Koizumiら, 1988, FEBS Lett. 228:228-230；Koizumiら, 1988, FEBS Lett. 239:285-288)。標的遺伝子の抑制発現のためのリボザイム法は、細胞などにおいてこのような小さいRNAリボザイム分子の発現を誘導することなどを伴う(GrassiおよびMarini, 1996, Annals of Medicine 28:499-510；Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15:287-299)。
【００９０】
リボザイムは、mRNAを切断するのに触媒上有効な程度に十分な数でin vivoで常套的に発現されて、細胞中のmRNA量を改変できる（Cottonら, 1989, EMBO J. 8:3861-3866)。特に、前記規則により設計され、例えば標準的ホスホロアミダイト化学作用により合成されたリボザイムコードDNA配列を、tRNAをコードする遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位にライゲートさせて、その後、当該分野における常套方法により目的の細胞中で形質転換および発現させ得る。この構築物には、誘導可能プロモーター(例えば、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント)も導入して、リボザイム発現が選択的に制御できるようにすることが好ましい。tDNA遺伝子(すなわち、tRNAをコードする遺伝子)は、それらのサイズの小ささ、転写率の高さ、および異なる種類の組織における遍在(ubiquitous)発現により、この適用において有用である。従って、リボザイムは、事実上あらゆるmRNA配列を切断できるように常套的に設計されて、そのようなリボザイム配列をコードするDNAで細胞を常套的に形質転換して、制御可能かつ触媒上有効な量のリボザイムが発現されるようにできる。従って、細胞中の事実上あらゆるRNA種の量も摂動させることができる。
【００９１】
別の実施形態では、標的RNA(好適mRNA)種の活性、特にその翻訳速度を、アンチセンス核酸の制御可能な適用により制御可能に阻害できる。本明細書でいう「アンチセンス」核酸は、コードおよび/または非コード領域に対するいくらかの配列相補性の効力により、標的RNAの配列特異的(例えば非ポリＡ)部分(例えばその翻訳開始領域)にハイブリダイズできる核酸を指す。本発明のアンチセンス核酸は、標的RNAの翻訳を摂動するのに十分な程度の制御可能な数の外因性の導入配列の転写により、細胞内で生成される。
【００９２】
アンチセンス核酸は、少なくとも６つのヌクレオチドから約200のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明のアンチセンス核酸は、標的RNA種の少なくとも一部に対して相補的な配列を含む。ただし、絶対相補性は好ましいが、必須ではない。本明細書でいう「RNAの少なくとも一部に対して相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズするのに十分な程度の相補性を有して、安定した二重らせんを形成する配列を意味し、二本鎖アンチセンス核酸の場合には二重らせんDNAの鎖の一本をテストしてもよいし、または三重らせん(triplex)形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズ核酸が長ければ長いほど、標的RNAとの塩基ミスマッチを多く含み、それでもなお安定した二重らせん(または場合によっては三重らせん)を形成する。当業者は、標準的な手順を使用してミスマッチの許容の度合いを確認して、ハイブリダイズした複合体の融点を決定できる。標的RNAの翻訳を阻害するのに有効なアンチセンス核酸の量は、標準的なアッセイ技術により決定できる。
【００９３】
本発明のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により、制御可能に細胞内発現される。例えば、ベクターをin vivo導入して、細胞に取込み、その細胞中で、ベクターまたはその一部が転写されて、本発明のアンチセンス核酸(RNA)を生成する。このようなベクターは、アンチセンス核酸をコードする配列を含み得る。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを生成する限り、染色体外(episomal)のままでも、または染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野において標準的な遺伝子組換え技法により構築できる。ベクターは、哺乳動物および昆虫細胞における複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルス、または当該分野で公知の他のものであってもよい。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、目的の細胞において作用することが当該分野で知られている任意のプロモーターにより行うことができる。このようなプロモーターは誘導可能または構成的であり得る。プロモーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの制御された発現を得るために、外因性部分の投与により制御可能または誘導可能であることが最も好ましい。このような制御可能プロモーターとしては、Tetプロモーター、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’側長末端繰返し配列(3’long termial repeat)に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９４】
従って、アンチセンス核酸は事実上あらゆるmRNA配列を標的化するように設計でき、このようなアンチセンス配列をコードする核酸で細胞を常套的に形質転換して、有効かつ制御可能な量のアンチセンス核酸を発現させる。従って、細胞中の事実上いかなるRNA種の翻訳も、制御可能に摂動できる。
【００９５】
最後に、別の実施形態では、RNAアプタマーを、細胞に導入または細胞中で発現できる。RNAアプタマーは、タンパク質に対する特異的RNAリガンドであり、例えば、それらの翻訳を特異的に阻害できるTatおよびRev RNA(Goodら, 1997, Gene Therapy 4:45-54)がある。
【００９６】
5.3.2.  タンパク質量の改変方法
本発明は、標的タンパク質量が高い哺乳動物および昆虫標的培養細胞、ならびに標的タンパク質量が低い哺乳動物および昆虫デコイ培養細胞を提供する。哺乳動物または昆虫培養細胞における標的タンパク質量の改変方法は、本質的に、前記5.2.3.節で酵母について記載したように達成される。
【００９７】
Ｎ末端デグロンを用いて哺乳動物および昆虫培養細胞におけるタンパク質量を低減するためには、デグロンの選択に注意し、細胞成長に適合した温度において機能的であることを確実にする。
【００９８】
5.3.3.  タンパク質活性の改変方法
本発明は、標的タンパク質活性が高い哺乳動物および昆虫標的培養細胞、ならびに標的タンパク質活性が低い哺乳動物および昆虫デコイ培養細胞を提供する。哺乳動物または昆虫培養細胞における標的タンパク質活性の改変方法は、本質的に、前記5.2.4.節で酵母について記載したように達成される。
【００９９】
5.3.4.  細胞培養物過剰発現系
哺乳動物および昆虫培養細胞においては、いくつかの遺伝子過剰発現手段が利用できる(Spencer, 1996, Trends Genet. 12:181-187)。例えば、前記5.2.2.節に記載したように、Tet系は、ドキシサイクリンの添加により転写を抑制する元の形態である「順方向」系、およびドキシサイクリンの添加により転写を刺激する新しい「逆方向」系の両方で広く使用されている(Gossenら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551；Hoffmannら, 1997, Nucl. Acids. Res. 25:1078-1079；Hofmannら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5185-5190；Paulusら, 1996, Journal of Virology 70:62-67)。哺乳動物細胞において一般的に使用されている別の制御可能なプロモーター系は、Evansおよびその共同研究者らにより開発された、培養細胞に添加されるムリステロン(muristerone)のレベルにより発現が制御されるエクジソン誘導可能系である(Noら, 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:3346-3351)。また、発現は、Schreiber、Crabtree、および共同研究者らにより開発された「化学誘導型二量体化(CID)」系(Belshawら, 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:4604-4607；Spencer, 1996, Trends Genet. 12:181-187)、ならびに同様の制御可能遺伝子発現系(例えば、元は酵母で開発されたものなど)を用いてモジュレートされ得る。この系においては、目的の遺伝子をCID応答プロモーターの制御下におき、２つの異なるハイブリッドタンパク質(一方は、FKBP12に融合したDNA結合ドメインから構成され、FK506に結合する)を発現する細胞中でトランスフェクトさせる。他方のハイブリッドタンパク質は、同じくFKBP12に融合した転写活性化ドメインを含む。CID誘導型分子は、FK1012、すなわちDNA結合および転写活性化ハイブリッドタンパク質の両方に同時に結合可能なホモダイマーバージョンのFK506である。FK1012の段階的な存在下(graded presence)では、制御される遺伝子の段階的な転写(graded transcription)が活性化される。
【０１００】
構成的または誘導可能な発現の他のモードについて、使用できるプロモーターとしては、以下のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：すなわち、SV40初期プロモーター領域(BenoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’側長末端繰返し配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)、ならびにヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子の調節配列(Foecking, M.およびHofstetter, H., 1986, Gene 45:101-105；米国特許第5,168,062号)。
【０１０１】
上記細胞培養物発現系のそれぞれについては、当業者に広く知られているように、選択したプロモーターの制御下に標的遺伝子をおき、この構築物を抗生物質耐性遺伝子とともに含むプラスミドを、培養哺乳動物または昆虫細胞中でトランスフェクトさせる。一般的に、プラスミドDNAはゲノムに組み込まれ、薬剤耐性コロニーを調節遺伝子の適切な発現について選択およびスクリーニングする。あるいはまた、調節遺伝子を、プラスミド複製に必要なエプスタイン-バーウイルスの成分を含むpCEP4(Invitrogen, Inc.)などのエピソームプラスミドに挿入してもよい。
【０１０２】
好適な実施形態では、プロモーターに作用可能に結合したレポーター遺伝子は、標的遺伝子を含むプラスミド上に存在する。デコイ細胞を生成するために、標的遺伝子インサートを含まないか、または変異体プロモーターを有する同様のプラスミドを使用できる。
【０１０３】
5.4.  線虫(C.elegans)の方法
本発明は、細胞および/または生物適応性に正または負に寄与する遺伝子を阻害する分子を本発明の方法により同定および特徴決定するのに使用できる線虫株を提供する。このような線虫は、標的虫類における標的タンパク質発現または活性レベルがデコイ虫類と比べて高いことにより特徴決定される。
【０１０４】
適応性に寄与する線虫遺伝子は、該遺伝子が哺乳動物相同体を保存している場合には、高増殖(hyperproliferation)の哺乳動物疾患または障害の治療に使用するための抗増殖剤を同定するために使用できる。このような遺伝子はまた、該遺伝子が(ａ)過剰活性または異常発現により疾患に寄与することが知られている場合、および(ｂ)虫類株の適応性を遺伝子の活性に依存させることができる場合には、ヒトを含む他の哺乳動物の障害または疾患を治療するための薬剤についてスクリーニングするために使用できる。例えば、遺伝子が、緩和型(mildtype)虫類の適応性に寄与しない場合、機能的に重複する遺伝子において突然変異を有する虫類株を生成して、TDSスクリーニングに使用できる。
【０１０５】
標的遺伝子発現の高いレベルは、標的虫類中での標的遺伝子の過剰発現、デコイ虫類中での標的遺伝子の(例えば、不活性化による)抑制発現、野生型動物と異なる発生時時点でのデコイ株中での標的の発現、例えば細胞適応性のために標的遺伝子が必要な時点における標的遺伝子の発現の消失であり得る。
【０１０６】
本発明は、標的および/またはデコイ株として、遺伝子操作された線虫を提供する。株は上記したような：(ａ)標的遺伝子における欠失もしくは挿入；(ｂ)標的遺伝子に由来する妨害RNA；および/または(ｃ)このような遺伝子の野生型もしくは変異体形態の発現のための導入遺伝子を含み得る。
【０１０７】
ある種類の株における特定の実施形態では、追加遺伝子としておよびミニジーンまたは大きいゲノム断片として、核酸が、外因性または内因性プロモーターエレメントの調節下で、虫類のゲノムに組換え導入されている。核酸は、標的遺伝子の量的サプレッサーまたはドミナントネガティブ型変異体をコードして、TDSスクリーニングのためのデコイ株を生成できる。逆に、核酸は、野生型標的タンパク質をコードして過剰発現を生じて、TDSスクリーニングのための標的株を生成してもよい。
【０１０８】
標的遺伝子の発現が全ての組織で確実に操作されることが好ましい。なぜなら、テスト化合物により生じる成長モジュレーションは特定の細胞型または組織を介して仲介され得るからである。
【０１０９】
本発明はさらに、TDSスクリーニングにおいてデコイ株として使用するための、突然変異または不活性化された遺伝子(例えば化学またはＸ線突然変異誘発により生成)を有する動物を提供する。
【０１１０】
多くの線虫類と同様に、線虫は両性である。それらの生殖は、通常同じ個体から生じる精子による卵母細胞の受精により生じる。いずれにせよ、標的およびデコイ虫類系統を混合し、増殖させた場合、２つの虫類系統間で有性生殖が生じる。標的およびデコイ系統は、標的およびレポーター遺伝子を除いて同質遺伝子系統であることが好ましいが、標的遺伝子または標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現の活性、およびレポーター遺伝子の有無においてのみ実質的に異なる任意の２つの系統であり得る。従って、レポーター遺伝子が標的遺伝子に遺伝的に結合している限り、ミニ染色体または導入遺伝子の分離パターンは重要でない。全動物におけるTDSスクリーニングの成功のための唯一の重要な要素は：１)標的遺伝子が標的動物中の特定の化合物に対する感受性を授与する能力；および２)検出のためのレポーター遺伝子の簡易性および信頼性である。この２つの要因は、例えば、適切なスクリーニング条件を対照分子(例えば標的遺伝子の既知の阻害剤)を使用して識別することで、大規模スクリーニングを実施する前のパイロットスクリーニングにより評価できる。
【０１１１】
デコイ虫類と比較して標的虫類における標的遺伝子の発現が高い線虫株の作成方法を以下に記載する。発現改変方法は、当業者に公知のあらゆる方法を含む。具体的な例としては、EMS化学突然変異、Tc1トランスポゾン突然変異誘発、二本鎖RNA妨害、および導入遺伝子仲介型ミス発現(mis-expression)が挙げられるがこれらに限定されない。トランスジェニック動物の作成において、異種(例えば非天然型)プロモーターを使用して導入遺伝子発現を引き起こすことが好ましい。
【０１１２】
スクリーニングの目的のために、拡散法、取込み(ingestion)、マイクロ注入、または粒子銃での撃込みにより、テスト化合物を線虫に導入してもよい。好適な実施形態では、テスト化合物は、虫類培地に広げられて取り込まれる。
【０１１３】
5.4.1 EMS化学的欠失突然変異誘発
本発明は標的遺伝子の活性が低下したデコイ虫類（worm）を提供し、好ましくは標的の虫類が標的遺伝子もしくは標的遺伝子をコードするタンパク質ならびに野生型発現または活性に比較して活性が高い場合、TDSスクリーニングにおける感度を増大させるためのものである。特定の実施形態において、そのようなデコイ株は突然変異を起こした標的遺伝子を含む。特定の実施形態において、化学的欠失変異誘発は線虫の標的遺伝子発現の低下を起こすために用いられる。好ましい実施形態において、該化学的突然変異原はエチルメタンスルフォン酸塩（EMS）である。あるデコイ株は、標的遺伝子の全欠失対立遺伝子（null allele）であるEMS欠失変異体に対するヘテロ接合体、またはEMS欠失突然変異体に対するヘテロ接合体もしくはホモ接合体で、標的遺伝子における部分的機能喪失対立遺伝子、例えばハイポモルフである。
【０１１４】
EMSは一般的に線虫の対象の遺伝子において、機能喪失突然変異を作出するための化学的突然変異原として用いられる。EMSによって誘導される突然変異の約1.3％は小さな欠失である。本節で記載される方法により、およそ95％の確率で対象の欠失が4×106個のEMS-突然変異誘発ゲノムのスクリーニングにより特定される。つまり、本手順は数百万の突然変異誘発線虫のライブラリーの作出を含み、それらは96ウェルプレートの小さなプールに分配されており、各々のプールはおよそ400の一倍体ゲノムから構成されている。各々のプールの一部を、突然変異誘発線虫類由来のゲノムDNAの対応するライブラリーを作出するために用いる。DNAライブラリーはPCRアッセイによりスクリーニングされ、対象の欠失したゲノムを有するプールを特定し、所望の欠失を有する突然変異誘発虫類を突然変異誘発動物の対応するプールから回収する。しかしEMSは欠失を起こすための好ましい突然変異原ではあるが、またかなりの欠失の産出力を提供する他の突然変異原を用いることも可能であり、これは、X線、ガンマ線、ジエポキシブタン、紫外線光を伴うホルムアルデヒドおよびトリメチルソラレンなどである。
【０１１５】
線虫類は当業者に周知のあらゆる手順を用いてEMSによって突然変異を誘発されてもよく、それはSulstonおよびHodgkin（1988, Methods, pp.587-606, The Nematode Caenorhabditis elegans中, Wood, 監修, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）により記載された手順などである。例えば、変異原への曝露の後、線虫類をペトリ皿に載せ、１〜２日間インキュベートし、胚を次亜塩素酸処理によって単離する（同上）。胚を孵化させ、一晩インキュベートした後にL1幼虫を集める。該幼虫をペトリ皿に平均密度が1プレート当たり200個体になるように入れ、5〜7日間ちょうど餓死するまでインキュベートする。線虫類のサンプルを滅菌水溶液で洗浄することにより各々のプレートから集め、かつ各々のプレートから洗い出した線虫を96ウェルプレートの１つのウエルに入れる。等量の溶解バッファー（100mM KCl、20mM Tris-HCl pH8.3、5mM MgCl2、0.9％Nonidet P-40、0.9％ Tween-20、0.02％ゼラチン、および400μg/mlプロテイナーゼK）を加えることにより虫類を溶解し、次に-80℃で15分間、60℃で3時間、および95℃で15〜30分間インキュベートする。さらなる解析までDNA含有溶解物を-80℃でプレートを保存してとっておく。各々のプレートの生きた線虫類はラック中の試験管に分注して、生きた動物の入った試験管の物理的な配置は96ウェルプレート中の対応するDNA溶解物の配置と同じになるようにして、-80℃で保存する。
【０１１６】
さらなる例として、次にプーリング法を利用してDNA溶解物の効果的なPCRスクリーニングを行うことができる。プールは各々の96ウェルプレートからプレート中のウエルの各々の列を含む8ウエルから得た10μlの溶解物を混合することにより作製される。各列にプールされた溶解物はPCRでのスクリーニングに用いられる。PCRプライマーを設計して各々の対象の座位が約1.5〜12kb離れるようにし、座位のサイズによっては、前記の手順（Plasterk, 1995, Methods in Cell Biology 48:59-80を参照）に従って標的遺伝子の完全なコード領域を包含する欠失を検出できるようにした。各々の領域には、ネステッドPCR法を行うための２組のプライマー対を選択して、外部対は一回目のPCRに用いかつ内部対は２回目PCRに用いるようにした。二回目のPCRを行うことで反応におけるより高い特異性を達成させる。二回目のPCRの産物は1％アガロースゲル電気泳動により分析可能であり、可能性のある欠失産物が生じたかどうかを調べる。
【０１１７】
5.4.2 Tc1トランスポゾン挿入突然変異誘発
あるいはまた、線虫における標的遺伝子発現の改変は、転移性因子（トランスポゾン）Tc1を用いた突然変異誘発により達成され得る。転移性因子の標的遺伝子への挿入は結果として標的遺伝子機能を不活性化し得る。突然変異誘発遺伝子背景において高いコピー数のTc1転移性因子を含む株（例えば、転移性因子の移動が多い株）にて開始し、およそ3,000個の独立した培養物を含むTc1ライブラリーを前記のように作出する（同上）。該ライブラリーから対象の領域におけるTc1挿入についてスクリーニングする、該スクリーニングにはTc1配列に特異的なプライマーの１組および遺伝子特異的プライマーの１組を用いたポリメラーゼ連鎖反応を利用する。Tc1はイントロン内に挿入し易い傾向を示すため、転移性因子の不正確な削除のために挿入動物の個体群の二次スクリーニングを行う必要があることもあり、これは結果として対象の遺伝子の一部または全ての欠失をもたらし得る（一般的に、1〜2kbのゲノム配列が欠失される）。Tc1欠失のスクリーニングを行い、欠失動物を既述のEMSスクリーニングと同じ方法で回収する。
【０１１８】
5.4.3  二本鎖RNA干渉
標的遺伝子を抑制発現する線虫株は、特定された遺伝子のコード領域由来の二本鎖RNAsの干渉特性を基にした方法を用いて作出され得る（Fireら, 1998, Nature 391:806-811を参照）。この方法において、線虫標的遺伝子の実質的な一部に由来するセンスおよびアンチセンスRNAsは、T3およびT7ファージRNAポリメラーゼに対する向かい合ったプロモーターの間に挿入されている標的遺伝子のcDNAクローンを含むファージミドDNA鋳型から、または標的遺伝子のコード領域から増幅したPCR産物からin vitroで合成され、この際のPCR反応に用いるプライマーはファージT3およびT7プロモーターの添加によって改変される。生じたセンスおよびアンチセンスRNAsを注入バッファー中でアニールさせかつ二本鎖RNAを線虫両性個体の中に注入する。注入された両性個体の子孫を対象の形質に対して調べる。他の方法もまた、一本鎖アンチセンスDNAまたはRNA種を上記のように用いて線虫類の突然変異形質を作出するために利用され得る。しかし、線虫類において一本鎖法は二本鎖RNA干渉の方法より効果が劣るであろう（GuoおよびKemphues, 1995, Cell 81:611-620を参照、またはFire, 1991, Development 113:503-514を参照）。
【０１１９】
5.4.4  トランスジーンを介した標的遺伝子の過剰発現
本発明は、該線虫はTDSスクリーニングに用いる標的遺伝子を過剰発現する線虫の標的株を提供する。標的遺伝子過剰発現を制御するために用いることができるプロモーターは、あらゆる組織で発現するための、SV40初期プロモーター領域（BenoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3’末端反復配列を含むプロモータ（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）、ヒトサイトメガロウイルスの調節配列（Foecking,M.およびHofstetter, H., 1986, Gene 45:101-105、米国特許第5,168,062号）を含むが、これらに限定されない。標的遺伝子の鋳型誘導性発現は熱ショック遺伝子プロモーターhsp 16-2およびhsp 16-41によって制御され得る。
【０１２０】
特定の実施形態において、構成的プロモーターなまたは熱ショック誘導性プロモーターで機能的に標的および／またはレポーター遺伝子と連結しているものを含む遺伝子融合体が形質転換ベクターに組み込む。該形質転換ベクターはまたrol-6などの優性の選択マーカーを含む。マイクロインジェクションのための手順はFireらの方法（1986, EMBO J. 5:2673-2680）に従って行うのが好ましい。標的株として用いるためのトランスジェニック動物は、ローラー形質を示すものとして特定される。該デコイ株は優性の選択マーカーを含むが標的またはレポーター遺伝子を含まないベクターで虫類を形質転換することにより作製される。
【０１２１】
5.5  細菌の方法
本発明は、それを阻害することにより細胞の適合能または生存能が低下するタンパク質、または他の実施形態においてそれを阻害することにより細胞の適合能または生存能が増大するタンパク質を過剰発現させるように改変された細菌細胞を提供する。このような細菌細胞は、本出願に記載されるTDS法に従って用いられる。
【０１２２】
阻害剤を探索しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または機能的に活性なアナログもしくは断片または他のその誘導体は、適切な発現ビヒクル（例えば挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な因子を含むプラスミド）の中に挿入され得る。必要な転写および翻訳シグナルは、本来の遺伝子および／またはその隣接領域から供給され得る。あるいは、発現ビヒクルは、DNAの操作の技術分野において周知の方法の多様性の１つを用いて、機能的なプロモーターを有する操作可能な読み取り枠（reading phase）に所望のタンパク質を適切な翻訳開始およびターミネーションシグナルと共にコードする構成的DNA配列を挿入することにより構築される。一般的にはSambrookら, 1989, Molecular Biology, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、Ausubelら, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, New York, NYを参照されたい。これらの方法はin vitro組換えDNAおよび合成技術ならびにin vivo組換え（遺伝子組換え）を含んでもよい。
【０１２３】
本発明のある特定の実施形態において、標的タンパク質の発現ビヒクルはプラスミドである。適切なプラスミドの多くは当業者に周知でありかつ市販のものを入手可能であり、本発明の組換え構築物の作出のために用いられる。
【０１２４】
このような市販のプラスミドは、例えばpKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）およびGEM 1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）を含む。これらpBR322「基本構造（backbone）」部は、適切なプロモーターおよび構成的配列と組み合わせることで発現させる。pBR322は低コピー数プラスミドであると考えられている。もし高レベルの発現が所望であれば、プラスミドを高コピー数プラスミドにすることが可能であり、例えばpUC基本構造のプラスミドである。PUCプラスミドはpUC19（Yanish-Perronら, 1985, Gene 33:103）およびpBluescript（Stratagene）を含むが、これに限定されない。
【０１２５】
他の発現プラスミドで本発明の方法と共に用いられてもよいものは、pBs、ファージスクリプト、PhiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（以上Stratagene）、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（以上Pharmacia）およびGEM 1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）を含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
本発明はまた、タンパク質のコード配列のトランスポゾンによる染色体組込みを介して標的タンパク質を過剰発現する細菌を提供する。標的タンパク質をコードする核酸がトランスポゾンカセット内に構築され得る限り、当技術分野で周知のあらゆるトランスポゾンプラスミドを本発明の方法において用いてもよい。例えば、本発明はトランスポゾンプラスミドを提供し、これはトランスポゾンまたはミニトランスポゾンおよびMCSを含む。
【０１２７】
本発明のある実施形態において、本発明のプラスミドはトランスポゾンプラスミドであり、即ち、標的タンパク質をコードする配列が挿入されたトランスポゾンを含む。トランスポゾンプラスミドはトランスポゾンカセットを含み、このカセットは細菌ゲノム内に組み込まれることになる。したがって、標的タンパク質もしくは活性断片またはそのアナログをコードする核酸がトランスポゾンカセットの中に挿入される。従って、トランスポゾンの挿入は細菌ゲノム内に該カセットを組み込む。コード配列は機能し得る形でプロモーターに連結され、またはプロモーターのない状態になり得る。後者の場合、標的タンパク質の発現は細菌ゲノムに挿入されたトランスポゾンの位置にあるプロモーターによって駆動される。トランスポゾン挿入物を有する細菌のコロニーは、本発明の要求に適合する発現レベルによってスクリーニングされる。
【０１２８】
ある実施形態において、トランスポゾンに加え、トランスポゾンプラスミドはトランスポゾンの逆方向反復配列の外側にトランスポザーゼ遺伝子を含み、トランスポゾンを伴うことなく細菌ゲノムへのトランスポゾンの挿入を触媒するようにし、安定したトランスポゾン挿入物を有する細菌株を作出するようにする。
【０１２９】
本発明によって使用されるトランスポゾンは、Tn7、Tn9、Tn10およびTn5を含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、トランスポゾンプラスミドはpBR322（ATCC）であり、アンピシリン耐性遺伝子をTn10挿入因子および標的タンパク質をコードする核酸の外側に有し、かつ随意にレポータータンパク質が２つのTn10挿入因子の間に挿入される（例えばトランスポゾンカセット内に）。
【０１３０】
１つの実施形態において、プラスミドを適切に操作し、かつ該プラスミドがコードするアンピシリン耐性特性を用いて所望の構築物を持つそれらのクローンを選択した後、抗生物質選択物を除き、染色体トランスポゾン挿入を有する株を本発明の方法に従ったスクリーニングによって選択する。
【０１３１】
好ましい実施形態において、トランスポゾンによる染色体への組込みを選択するためのトランスポゾンプラスミドは、トランスポゾンの削除および組み込みのためのトランスポザーゼ遺伝子を含み、細菌株から欠失されてきた選択遺伝子に対応するコード配列ならびにリボソーム結合部位および野生型遺伝子のターミネーターを含むがプロモーターを欠損し、ならびにプラスミド内に標的タンパク質および任意のレポーター遺伝子をコードする核酸を組み込むためのユニークな制限部位を含むマルチクローニングサイト（MCS）を含む。
【０１３２】
さらに別の実施形態において、発現ビヒクルは染色体該プラスミドであり、これは抗生物質選択の必要性がなくても安定であり、即ち自己維持的である。例えば、本発明の１つの実施形態において、プラスミド選択系は細菌に欠損した機能を提供することにより維持され、かつそれを基にして該機能を有するそれらの細菌はそれらの機能を有さないものの損失によって選択され得る。１つの実施形態において、本発明の細菌は栄養要求性突然変異株であり、かつ該発現プラスミドは突然変異または欠損した生合成系酵素機能を提供する。発現プラスミドを含む細菌は、所望の細胞（即ち、発現プラスミドを有するもの）のみが代謝可能な、栄養素を欠く増殖培地上で細胞を増殖させることにより選択され得る。
【０１３３】
本発明の他の実施形態において、発現ビヒクルはλベクターであり、より特殊なものでは溶原性λベクターである。ある特定の実施形態において、λベクターを含む細菌宿主はさらに30℃では機能するが37℃ではしない温度感受性λレプレッサーを含む。その結果、該細菌宿主は標的タンパク質を発現することなく30℃で増殖および操作可能となる。TDSスクリーニングを行う場合、細胞は37℃で増殖させ、その温度ではλリプレッサーは不活性され、標的タンパク質の発現および場合によってはレポーター遺伝子も活性化される。
【０１３４】
標的タンパク質をコードする核酸配列の発現は、２番目の核酸配列によって制御され、該タンパク質を組換えDNA分子で形質転換された細菌内で発現させるようにすることができる。標的タンパク質の発現は当技術分野で周知のあらゆるプロモーター／エンハンサー因子によって調節されてよい。プロモーター／エンハンサーは同種（例えば元から備わっているもの）であってもまたは異種（例えば元から備わっているもの以外のもの）であってもよい。標的タンパク質の発現を調節するために用いることができるプロモーターおよび細菌内の任意のレポーター遺伝子は、β-ラクタナーゼプロモーター（Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）またはlacプロモーター（DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25、Scientific American, 1980, 242:74-94）などの原核生物性プロモーターを含むがこれらに限定されない。他のプロモーターで本発明に包含されるものはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、λPLおよびtrcなどがあるがこれらに限定されない。
【０１３５】
一度プラスミドを、標的タンパク質のコード配列を含むように構築して細菌内に導入して標的細胞を生産させると、標的タンパク質発現は当技術分野で周知のあらゆる方法によりアッセイされ得るが、それは生物学的活性、酵素活性、ノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析を含むがこれらに限定されない（Sambrookら, 1989, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY、Ausubelら, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, New York, NYを参照）。
【０１３６】
本発明の方法を成功させるために、レポーター遺伝子および標的タンパク質をコードする核酸は密接に関連していなければならない。これはいくつかの手段のうちのいかなる１つによって達成してもよく、１つのプラスミドから両方のコード配列を発現することを含むか、または両方の細菌ゲノムに組み込まれたコード配列を有するものである。全ての実施形態において、レポーター遺伝子の発現はスクリーニング条件下では恒常的である。
【０１３７】
本発明の標的細胞が改変した細菌細胞である場合、その細菌細胞は（a）プラスミドまたはゲノム外トランスポゾン由来の標的タンパク質を発現するもの、または（b）細菌染色体に組み込まれた標的タンパク質をコードする配列のさらなるコピーを有するもの、さらにデコイ細胞は（a）標的タンパク質のための発現ビヒクルがプラスミドまたはゲノム外のトランスポゾンである場合、同じ遺伝子型の細菌細胞またはさもなくば実質的に異ならない細菌細胞で「空の」プラスミドを有するもの、または（b）標的タンパク質をコードする核酸が染色体に組み込まれていた場合、同じ遺伝子型の細菌細胞またはさもなくば実質的に異ならない細菌細胞でゲノムが標的タンパク質に対するコード配列のさらなるコピーを欠くものおよびレポーター遺伝子の実質的な発現を欠くものである。
【０１３８】
5.6  植物の方法
本発明のTDSスクリーニングはまた植物細胞を用いても行われ得る。本発明は、それが阻害されると細胞適合性または生存性が低下または増大するタンパク質を過剰発現するように改変された標的植物細胞を提供する。本発明はさらに、阻害されると細胞適合性または生存性が低下または増大するタンパク質を抑制発現するように改変されたデコイ植物を提供する。多様な植物発現系が本発明のTDS法を行うために利用できる。典型的な植物種はあらゆる双子葉植物種、単子葉植物種、裸子植物、低維管束または無維管束植物(あらゆる穀物作物または他の農業的に重要な作物を含む)から選択できる。そのような植物は、アルファルファ、シロイヌナズナ、アスパラガス、オオムギ、キャベツ、ニンジン、セロリ、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、アマ、レタス、セイヨウアブラナ、洋ナシ、エンドウ、ペチュニア、ポプラ、ジャガイモ、コメ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、コムギおよびシロツメクサを含むがこれらに限定されない。
【０１３９】
組換え法による植物細胞内の標的遺伝子の過剰発現は以下の方法の１つによって達成され得り、この方法は当業者に周知である（例えばPlant Biotechnology, 1989, Kung & Arntzen, 編集, Butterworth Publishers, 第1, 2節を参照、これらの節は全体を本明細書に組み込むものとする）。標的細胞を作出するために効果的に用いられる形質転換方法の実施例は、葉片(leaf disc)または他の植物組織のアグロバクテリウム媒介形質転換またはDNAのマイクロインジェクションによる植物細胞への直接導入、植物細胞プロトプラストへのDNAのエレクトロポレーション、リポソームまたはスフィロプラスト融合、微粒子銃、および適切に処理された植物ウイルスによる植物細胞または組織のトランスフェクションを含むがこれらに限定されない。
【０１４０】
植物組織培養法で本発明を実施するために使われ得るものは当業者に周知である（例えば、Dixon, 1985, Plant Cell Culture: A Practical Approach, IRL Pressを参照）。それらの組織培養法で本発明を実施するために効果的に用いられてもよいものは、植物プロトプラストおよび細胞懸濁液、形質転換因子の処理された株を含む培地上での葉片および他の植物組織の滅菌培養増殖物（該株は、例えばアグロバクテリウムまたは植物ウイルス株である）ならびにプロトプラスト、細胞懸濁液およびカルス組織から再生した形質転換植物体を含む。
【０１４１】
植物形質転換方法はさらにDaveyら, Plant Mol. Biol. 13:273-285ならびにGrierson & Covey（1988, Plant Molecular Biology, 第２版, Blackie & Sons Ltd, Glasgow, Scotland、Chapman & Hallにより合衆国にて出版, New York）の第９節に記載される。一般的および特殊化された植物培養方法は、細胞培養物から突然変異体を単離するための方法を含み、Handbook of Plant Cell Culture, 第１巻, 1983, Macmillan Publishing Company, New York, Evans, Sharp, AmmiratoおよびYamada監修の 第１〜６、１０，１４および１５節にも見られる。大規模植物細胞培養を成功させるためのさらなる研究は、Taticekら, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:165-174およびScragg, 1992, Curr. Opin. Biotechnol. 3:105-109により記載される。
【０１４２】
Wullemsら（1986, Handbook of Plant Cell Culture, 第４巻, Macmillan Publishing Company, New York, Evans, SharpおよびAmmirato監修）はアグロバクテリウムTiプラスミドを介した植物形質転換における詳細なプロトコルを提供する。エレクトロポレーションを介した形質転換は、Bates, 1999, Methods Mol. Biol. 111:359-366により記載される。単子葉植物で著しく外来DNAの取り込みに耐性であるものには、ゲミニウイルスを組換え遺伝子発現のために用いることが可能である（Stanley, 1993, Curr. Opin. Genet. Devel. 3:91-96を参照）。
【０１４３】
上記のthe Handbook of Plant Cell Cultureに提供されているものの他に植物突然変異体を特定する方法は、Waldenら, 1994, Plant Mol. Biol. 26:1521-1528およびLangridge, 1994, Bioessays 16:775-778により記載される。
【０１４４】
発現構築物および形質転換ベクターを構築するための方法は、標準的なin vitro遺伝子組換えおよび操作を含む。例えば、WeissbachおよびWeissbach, 1988, Methods For Plant Molecular Biology, Academic Press, 第２６〜２８節を参照されたい。
【０１４５】
標的および／またはレポーター遺伝子を含む植物細胞発現構築物に用いることができる調節因子はプロモーターを含み、これらは植物細胞とは異種または同種のどちらでもよい。該プロモーターは植物プロモーターまたは非植物プロモーターであってもよく、これは植物細胞または植物において連結された配列の高い転写レベルを駆動することが可能なものであればよい。本発明の実施に効果的に用いることができる植物プロモーターの非限定的な例としては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S、rbcS、クロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーター、AdhI、NOSおよびHMG2が含まれる。
【０１４６】
５．７  レポーター遺伝子
本発明の標的細胞を標識するために用いるレポーター遺伝子は、当技術分野で周知のあらゆるレポーター遺伝子から選択され得る。１つの実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードする遺伝子、生物発光タンパク質、化学発光タンパク質、酵素（例えば、細菌lacZタンパク質またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT））、受容体、輸送タンパク質またはイオンチャネル（嚢胞性繊維症輸送タンパク質など）、またはタンパク質で免疫学的に検出可能なエピトープまたは他の結合部分（例えば、CD4細胞表面抗原、myc、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）またはヘキサヒスチジン）であり得る。
【０１４７】
特定の実施形態において、レポーター遺伝子は輸送タンパク質またはレポーターチャネルをコードしている。レポーター遺伝子活性は、イオンおよび／または分子を細胞膜を通して輸送する機能である。レポーター遺伝子活性がイオンの流動の増加を生む場合、該活性は電気物理学的に（例えば、Na+、K+、Cl-イオン）または該イオンに結合する色素（例えばCa++イオン）を用いて測定され得る。
【０１４８】
好ましい実施形態において、lacZがレポーター遺伝子として用いられる。β-ガラクトシダーゼ活性はいくつかの方法のうちの１つにより測定され得る。共培養細胞が酵母または細菌細胞である場合、フィルターβ-ガラクトシダーゼアッセイがBreedenおよび共同研究者のプロトコル（BreedenおよびNasmyth, 1985, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50:643-650）の変法として行うことが可能である。酵母または細菌共培養物をWhatman紙の上にドットブロットすると、β-ガラクトシダーゼ活性に対して陽性のドットは青色になる。他には、酵母または細菌を、β-ガラクトシダーゼ基質のX-galを含む指示薬含有培地で増殖させることができる。酵母における定量的β-ガラクトシダーゼアッセイは、ConeyおよびRoeder（ConeyおよびRoeder, 1988, Mol. Cell. Biol. 8:4009-4017）により既に記載されているように行うことが可能である。化学蛍光β-ガラクトシダーゼアッセイは、β-ガラクトシダーゼの検出のためのGalacto-LightおよびGalacto-Light Plus 化学蛍光レポーターアッセイシステム（Tropix社）をその使用説明書に従って用いることで行うことが可能である。蛍光性β-ガラクトシダーゼアッセイはFluoReporter lacZ／ガラクトシダーゼ定量キット（Molecular Probes）をその使用説明書に従って用いることで行うことが可能である。培養細胞または線虫を用いた共培養アッセイには、培地に基質を加えることでin situにおける酵素活性を調べることによりβ-ガラクトシダーゼ活性を検出することができ、これはBreedenおよび共同研究者のプロトコル（BreedenおよびNasmyth, 1985, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50:643-650）の変法である。
【０１４９】
最も好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光分子（例えばホタルルシフェラーゼ）をコードする。該実施形態の好ましい方法において、レポーター遺伝子にコードされるタンパク質はオワンクラゲ（Aequorea victoria）由来のGFPまたはその突然変異体である。GFPは自然発生的なコード配列、または哺乳動物細胞系でスクリーニングする場合は適切なヒトのコドン使用頻度（米国特許第5,874,304号）に改変されたコード配列によりコードされ得る。突然変異誘発をコード配列内に導入して蛍光波長または強度またはその両方が改変されたGFP突然変異体を作製してもよい。このような突然変異はほとんどが、タンパク質の色素団を形成する65〜67残基付近にある。本発明の方法に従ってレポーター遺伝子として用いるために有効なGFP突然変異体の例は、米国特許第5,777,079号および5,804,387号ならびに国際公開公報WO97/11094に見出され得る。実施形態の別の好ましい方法において、GFP突然変異体は青色GFPである。青色GFPの例はHeimおよびTsien（1996, Curr. Biol. 6:178-82）によって記載される。実施形態のさらに別の好ましい方法において、蛍光タンパク質は、近年サンゴ礁において発見された黄色または赤色-橙色発色体である（Matzら, 1999, Nature Biotechnol. 17:969-973）。
【０１５０】
１つの実施形態において、本発明のレポーターは標的タンパク質との融合タンパク質として発現され得る。
【０１５１】
レポーター遺伝子発現を調節するために選ばれたプロモーターは、レポーター遺伝子を発現させる細胞または生物の種類に依存する。各々の生物に適切なプロモーターは、前記の第５．２．２、５．３．４および５．４．４節に記載される。
【０１５２】
５．８  細胞適合性に対して負に寄与する標的遺伝子の使用
上記のように、本発明の１つの実施形態において、標的タンパク質は標的細胞の適合性に対して正に寄与する。しかし、代わりの実施形態において、この節で述べるが、標的タンパク質は標的細胞の適合性に対して負に寄与する（例えば過剰発現致死性を提供する）。多様な遺伝子背景の細胞（例えば欠失ライブラリー）を、所望の標的遺伝子の過剰発現が細胞の適合性に対して負に寄与する細胞株または最適な（最も感受性の高い）細胞株を特定するために調べることができる。
【０１５３】
このような実施形態において、本発明は、標的遺伝子にコードされるタンパク質の活性または発現を阻害する分子をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、試験分子存在下で第1の細胞または第1の細胞群および第２の細胞または第２の細胞群とを共培養すること、ここで、第1の細胞において標的遺伝子または標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性が第２の細胞より高く、さらに第1の細胞は第２の細胞では実質的に発現しないレポーター遺伝子を含みかつそれを発現しており、そして、共培養開始時の第1の細胞の数の第2の細胞の数に対する割合が1倍よりも多い；および、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量を測定すること、ここで、試験分子の非存在下での共培養の場合と比較してレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または量が減少していないことが、試験分子が標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性または発現を阻害することを示す、を含む。このような共培養スクリーニングは、予め選択された遺伝子、好ましくはヒト遺伝子に対する阻害剤を特定し得る。該スクリーニングは標的遺伝子の過剰発現によって起こる適合性欠損を回復させる阻害剤を特定する。標的遺伝子の過剰発現が標的細胞において増殖欠陥を起こす場合、該標的タンパク質を標的とする阻害剤が増殖欠陥を回復させるであろう。Iconix Pharmaceuticals社という会社が最近、標的遺伝子の過剰発現によって起こる増殖欠陥の回復に基づいたヒトを標的にした阻害剤をスクリーニングしている。http://www.iconixpharm.com/scitech.library.htmlを参照されたい。
【０１５４】
本発明はIconix Pharmaceuticals社によって用いられる技術を２つの重要な方法において改良したものであり、それらは、
１）バーコード化された欠失株の大きな集団を用いた競合増殖実験を用いて、多様なヒト遺伝子の過剰発現致死形質に対する感受性を増した遺伝的背景を特定することができること、
２）共培養アッセイは、酵母において過剰発現致死形質を回復する阻害剤によって起こる増殖速度における微妙な違いを特定するための、かなり感受性が高くかつ強力な方法を提供すること、である。
【０１５５】
この実施形態は以下の１１節の実施例の方法により説明される。
【０１５６】
標的遺伝子の過剰発現に比べて細胞の適合性に負に寄与する本発明の実施形態を、標的遺伝子が細胞の適合性に対して正に寄与する実施形態について本明細書に記載されたような方法で多重化(multiplexed)することも可能である（例えば、５．９．１節、「多重スクリーニング」を参照）。
【０１５７】
5.9. TDS法の変法
本発明は、本明細書中に記載されるTDS法の変法を提供する。１つの実施形態において、このような変法は、「多重化（multiplexing）」による大規模な標的化スクリーニング（すなわち多数の標的遺伝子の阻害剤の同時スクリーニング）を提供する。他の実施形態において、このような変法は、機能的に類似する標的遺伝子ではなく１つの標的遺伝子の阻害剤の差別的標的化スクリーニングを提供する。
【０１５８】
5.9.1.  多重スクリーニング
本発明のある好適な実施形態において、TDSスクリーニングは、より効率的且つ経済的なスクリーニングのために多重化される。多重化は、各々が異なる標的遺伝子を過剰発現する２以上の標的株を用いることを必然的に意味する。対応するデコイ細胞（decoy cell）は野生型細胞である。多重スクリーニングでは、全ての標的細胞からのレポーター遺伝子活性が組み合わさって高いノイズ：シグナル比を生成することがないように、注意しなければならない。
【０１５９】
標的細胞は、同じレポーター遺伝子または異なるレポーター遺伝子を発現することができる。細胞が同じレポーター遺伝子を発現する場合、２度目のスクリーニングを行って、レポーター遺伝子活性レベルが有意に増加した共培養物において、前記増加したレポーター遺伝子活性の原因がどの標的細胞であるかを同定する、すなわち共培養物の処理に使用したところレポーター遺伝子活性の増加をもたらした薬物の標的遺伝子がどれであるかを決定する。第２のスクリーニングは、様々な方法を用いて行うことができる。１つの非限定的な例において、各共培養物がデコイ株およびたった１つの標的細胞または標的細胞の部分集団を含む第２のスクリーニングに、非多重TDSスクリーニングが用いられる。あるいは、第２のスクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、より好ましくは定量的PCR（各組換え標的細胞に対して特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる）を用いて行うことができる。この実施形態の好適な様式では、PCR反応のセットにおいて該共培養物のアリコートを鋳型として使用し、各反応毎に標的遺伝子の１つを保有するプラスミドおよびそのプラスミドにより保有される標的遺伝子に特異的な１対のプライマーを使用する。好ましくは、これらのプライマーは、多重スクリーニングの標的遺伝子の存在について試験する各PCR反応が異なるアンプリコンサイズを生産し、所与のサイズのPCR産物の存在もしくは不在または得られたPCR産物の割合が、どの標的遺伝子が増幅されたかを示すものとなるように、設計される。さらに他の非限定的な例において、第２のスクリーニングは、レポーター遺伝子活性が増加したこれらの標的細胞から主に構成される共培養物を、（異なる標的細胞が異なる栄養要求性必要条件を有する場合に）選択増殖培地上で増殖することによって、実行することができる。例えば、酵母標的細胞等の各々は異なる栄養素（生合成）経路が不足しており、そして第２のスクリーニングは、様々な培地（各々はこれらの標的細胞のいずれかの1つの増殖に必要なある栄養素を欠いている）上に共培養物のアリコートをプレーティングすることを必然的に伴う。このように、レポーター活性の増加の供給源となる標的細胞の同定は、どの培地プレートの酵母コロニーが少ないまたは無いか、に基づいて行うことができる。
【０１６０】
異なる標的遺伝子を発現する多重アッセイにおける標的細胞は、場合により、それぞれ異なるレポーター遺伝子を発現することができる。あるいは、第２スクリーニング工程を容易にするために、標的細胞を複数のプール（各々のプールは異なるレポーター遺伝子を発現する）に分ける。さらに他の実施形態において、標的細胞は、レポーター遺伝子活性が増加した標的細胞を即時に同定するためのレポーター遺伝子コードを生成するためにレポーター遺伝子の非同一の組合せを発現する。この実施形態の好適な様式において、各標的細胞は、GFP、ブルーGFP、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質のうちの１以上からなるユニークな組合せを発現する。
【０１６１】
5.9.2.  種特異的およびアイソフォーム特異的スクリーニング
本発明のある好適な実施形態において、TDSスクリーニングは、標的細胞により発現される標的タンパク質を阻害するが、対応するデコイ細胞において発現される機能的に類似するタンパク質を阻害しない分子を同定するために使用される。このような実施形態において、標的タンパク質は標的細胞の適応性に正に寄与する。
【０１６２】
本明細書中において、標的遺伝子に「機能的に類似する」遺伝子またはタンパク質とは、それぞれ標的遺伝子またはタンパク質の機能低下の全てまたは一部をレスキューする能力を有する遺伝子またはタンパク質を指す。
【０１６３】
特定の実施形態において、標的タンパク質を差別的に阻害するが他の機能的に類似するタンパク質を阻害しない分子を同定するためのTDSスクリーニングは、標的細胞およびデコイ細胞を共培養することを含み、該標的細胞はデコイ細胞に比べて、（a）細胞の適応性に正に寄与する標的遺伝子、または（b）該標的遺伝子にコードされるタンパク質、の発現量もしくは活性が高く、該デコイ細胞は、標的細胞に比べて、機能的に類似する遺伝子または前記機能的に類似する遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量もしくは活性が高いことを特徴とする。したがって、基本的なTDSスクリーニングと同様に、この改変されたスクリーニングは、共培養物を試験分子または試験分子のパネルに曝露した後、該試験分子での処理によって、該標的細胞により発現されたレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性もしくは量における有意な増大が生じるか否かを検出することを必然的に伴う。増大した場合、その試験分子は、機能的に類似するタンパク質を阻害しない標的タンパク質の阻害剤であることを示す。
【０１６４】
１つの実施形態において、機能的に類似する遺伝子は、標的遺伝子と同じ種の部分的または完全に重複した遺伝子（redundant gene）であってもよい。他の実施形態において、機能的に類似する遺伝子は、標的タンパク質と類似した活性を有するタンパク質（標的タンパク質と同じまたは異なる細胞もしくは組織型中で発現され得るイソ酵素等）をコードすることができる。
【０１６５】
このようなTDSスクリーニングの変法は、病気を引き起こす標的遺伝子を阻害したいが関連遺伝子（例えば、異なる組織中で発現され、それを阻害すると望ましくない副作用を引き起こすイソ酵素等）を阻害したくない場合に実施することができる。このようなスクリーニングの例としては、標的細胞中におけるCOX2の発現およびデコイ細胞中におけるCOX1の発現を含意するだろう。COX1は、いたるところで発現されるシクロオキシゲナーゼであって、非ステロイド系抗炎症剤（NSAIDS）の投与により消化管中でそれが阻害されると吐き気を引き起こすが、NSAIDSの抗炎症性鎮痛作用はCOX2活性の阻害によって媒介される。（例えばMasferrerら, 1996, Gastroenterol. Clin. North Am. 25:363-372を参照されたい）。このように、本発明の方法によりCOX2に特異的な阻害剤を同定することにより、COX2を標的とするが、COX1阻害の副作用をもたらさない鎮痛剤の開発を可能にすることができる。
【０１６６】
他の実施形態において、機能的に類似する遺伝子は、他の種に由来する標的遺伝子の相同体であってもよい。この実施形態は、種に特異的な阻害分子をスクリーニングするために用いることができる。例えば、スクリーニングの目的がヒト等の哺乳動物の治療のための抗真菌剤を同定することである場合、デコイ細胞が、標的細胞内での標的遺伝子発現のレベルに匹敵するまたはこれより高いレベルで該遺伝子の哺乳動物相同体を発現する限り、哺乳動物相同体を有する標的遺伝子を用いて標的細胞を生成することができる。スクリーニングの目的が、ヒトに対して安全な殺虫剤を同定することである場合、標的細胞が昆虫遺伝子を過剰発現し、且つデコイ細胞が匹敵するもしくはより高いレベルでヒト相同体を過剰発現する限り、その標的遺伝子は、ヒト相同体を有する昆虫遺伝子であってもよい。
【０１６７】
さらに他の実施形態において、機能的に類似する遺伝子は、該標的遺伝子もしくは該標的遺伝子が由来する遺伝子によりコードされる選択的スプライシングされたDNAによりコードされるタンパク質をコードすることができる。例えば、標的遺伝子がcDNAに由来する場合、それが由来する遺伝子とは、対応するゲノム配列であろう。さらに他の実施形態において、機能的に類似する遺伝子は、例えば、標的にしたいこれらのアミノ酸中にアミノ酸置換を有する突然変異標的タンパク質またはTSDスクリーニングによって標的にしたい特定のドメインに欠失を有する突然変異標的タンパク質をコードすることができる。
【０１６８】
5.10. TDSスクリーニングのための微生物
本発明の方法により同定された抗生物質化合物（すなわち微生物中において、その微生物の適応性に正に寄与する遺伝子を阻害する化合物）を用いて、動物（ヒト、伴侶動物（例えばイヌやネコなど）、家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタおよびウマ等）、実験動物（例えばマウス、ラットおよびウサギ等）、ならびに捕獲動物や野生動物等を含む）中において、このような細菌により引き起こされる感染病を治療することができる。
【０１６９】
ある実施形態において、本発明のTDSスクリーニングは、その疾患を引き起こす細菌または微生物の標的遺伝子を阻害する分子を同定することにより、細菌および他の微生物により引き起こされる疾患の治療用薬物発見に向けられる。このような微生物としては、ブドウ球菌属（例えばS. aureus）、連鎖球菌属（例えばS. pneumoniae、S. pyrogens、S. faecalis、S. viridans）等のグラム陽性球菌、バチルス属（例えばB. anthracis）、コリネバクテリウム属（例えばC. diphtheriae）、リステリア属（例えばL. monocytogenes）等のグラム陽性桿菌、ナイセリア属（例えばN. gonorrhoeae、N. Meningitidis）等のグラム陰性球菌、ヘモフィルス属（例えばH. influenzae）、パスツレラ属（例えばP. multocida）、プロテウス属（例えばP. mirabilis）、サルモネラ属（例えばS. typhi murium）、赤痢菌属種、エシェリキア属（例えば大腸菌）、クレブシエラ属（例えばK. pneumoniae）、セラチア属（例えばS. marcescens）、エルジニア属（例えばY. pestis）、プロビデンシア属種、エンテロバクター属種、．バクテロイデス属（例えばfragilis）、アシネトバクター属種、カンピロバクター属（例えばC. jejuni）、シュードモナス属（例えばP. aeruginosa）、ボルデテラ属（例えばB. pertussis）、ブルセラ属種、フランシセラ属(Fracisella)（例えばF. tularensis）、クロストリジア（例えばC. perfriugens）、ヘリコバクター属（例えばH. pylori）、ビブリオ属（例えばV. cholerae）、マイコプラスマ属（例えばM. pneumoniae）、レジオネラ属（例えばL. pneumophila）、スピロヘータ（例えばTreponema、LeptospiraおよびBorrelia）、ミコバクテリア（例えばM. tuberculosis）、ノカルジア属（例えばN. asteroides）、クラミジア属（例えばC. trachomatis）およびリケッチア属(Richkettsia)種等のグラム陰性桿菌が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７０】
5.11.  キットおよびアッセイシステム
また、本発明は、本発明のスクリーニング方法を実行するためのキットも提供する。このようなキットは、１以上の容器の中に、標的細胞の精製集団と、同じ種および細胞型のデコイ細胞の精製集団とを含むものであって、該標的細胞は、デコイ細胞に比べて標的遺伝子または該標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量または活性が高いことを特徴とし、デコイ細胞中では実質的に発現されない生物発光分子、化学発光分子または蛍光分子をコードするレポーター遺伝子をさらに含み且つそれを発現する。
【０１７１】
１つの実施形態において、標的細胞およびデコイ細胞は、細菌細胞、酵母細胞、培養した昆虫細胞、培養した哺乳動物細胞または培養した植物細胞である。他の実施形態において、蛍光分子は、GFP、またはその突然変異体であって蛍光波長が改変されたか、蛍光が増強された、またはその両方の特性を有するものである。
【０１７２】
他の実施形態において、該キットは、第１の標的細胞およびデコイ細胞のほかに、該デコイ細胞および第１の標的細胞に比べて第２の標的遺伝子または該第２の標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量または活性が高い少なくとも１つの第２の標的細胞を更に含み、またさらに、該デコイ細胞もしくは該第１の標的細胞中では実質的に発現されない生物発光分子、化学発光分子または蛍光分子をコードするレポーター遺伝子を含み且つ発現する。
【０１７３】
他の実施形態において、該キットは、スクリーニング工程中に対照分子として機能する、標的遺伝子または該標的遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害することが分かっている分子を更に含む。
【０１７４】
場合により、本発明のスクリーニング方法を実行するために提供された細胞を使用するための使用説明書が含まれる。
【０１７５】
また、TSDスクリーニングで用いられる共培養物を含む本発明のアッセイシステムも提供される。
【０１７６】
5.12.  医薬への応用
本発明の方法によって、特定の標的遺伝子に対して阻害活性を有すると同定される分子は、薬物開発のための候補リード化合物である。リード化合物は、それが指向される特定の状態に対するその効力やその副作用等についてアッセイすることができる。リード化合物は、例えば誘導体化等により化学的に修飾して活性および特異性を改良することができる。
【０１７７】
本発明のある実施形態において、リード化合物は、細胞増殖が増大する障害（例えば新生物形成の変化、悪性腫瘍、異常増殖的変化（化生および異形成等）または他の高増殖性障害等を含むがこれらに限定されない）を標的とする。治療は予防的なものであっても治療的なものであっても良い。
【０１７８】
同様に、潜在的な抗真菌剤化合物を異種宿主細胞系（例えばヒト細胞）中で試験し、これらが増殖または他の細胞機能に大きな影響を及ぼさないことを証明することができる。例えば、潜在的な抗真菌剤化合物を哺乳動物のGenome Reporter Matrix系中で用い、該化合物が遺伝子の転写を悪い方向に（例えば望ましくない方向に）変化させないことを確かめることができる。同様に、潜在的な抗増殖性化合物を試験して、これらが増殖以外の機能に悪影響を及ぼさないことを確かめることができる。また、潜在的な除草剤化合物および殺虫剤化合物も、哺乳動物（好ましくはヒト）細胞系（Genome Reporter Matrix系等）中における潜在的な副作用、細胞機能に対する潜在的な副作用について試験することができる。もちろん、遺伝子転写におけるある種の変化は避けられないことであり、これらの多くは患者や宿主生物にとって有害なものではないだろう。先に記載したように、リード化合物を同定したら、これらの化合物を合理的な薬物設計および他の標準的な製薬技法により更に改良することができる。最終的に、化合物は有効な抗生物質、抗真菌剤、抗増殖薬、除草剤および殺虫剤として使用することができる。
【０１７９】
ヒトおよび動物に対する応用性（すなわちヒト治療または獣医学的治療）を有する本発明の化合物は、医薬組成物として製剤化し、特定の疾患または障害を治療するのに有効な量でin vivoで投与することができる。所与の用途に適した医薬製剤および治療上有効な用量レジメント（dose regiment）の決定は、例えば患者の状態や体重、所望の治療の程度およびその治療に対する患者の耐性を考慮して当業者が決めることである。ヒトまたは動物への本発明の化合物（単離精製した形態、これらの塩、またはその製薬上許容される誘導体を含む）の投与は、任意の従来認可された投与様式を用いて行うことができる。
【０１８０】
本発明の方法により同定された分子を含む医薬組成物は、細菌性もしくは真菌性疾患または増殖性障害を治療するために、植物、ヒトまたは動物等の被験体に投与することができる。本発明の医薬組成物により治療しようとするこのような動物としては、サルおよび他の霊長類、イヌ、ネコ、フェレット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ等を含む（ただしこれらに限定されない）非ヒト哺乳動物や、鳥類が挙げられる。
【０１８１】
本発明の方法により同定される抗真菌剤はさらに、有効量の該抗真菌剤を含む細胞培養培地中で哺乳動物および非哺乳動物細胞(例えば、昆虫細胞)をインキュベートすることによって、組織培養中で増殖しているこのような細胞の、真菌（例えば酵母等）による混入を防ぐために、用いても良い。
【０１８２】
本発明のスクリーニング方法を実施するための他の実施形態は当業者に自明であり、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。特に、添付の特許請求の範囲は、スクリーニングモデルとしての他のタイプの細胞または生物、レポーター遺伝子、標的遺伝子およびレポーター遺伝子を過剰発現および過小発現するための方法、標的化スクリーニングにより同定しようとする分子のクラス、スクリーニング方法の変法等を含むことが意図される。
【０１８３】
以下の実施例は例として挙げられるものであり、限定的なものではない。
【０１８４】
6.  サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)における正常な増殖に必須である標的の阻害剤の同定
この実施例は、TSD法および標的遺伝子としてerg11を用いた酵母中での薬物スクリーニングのための共培養の実行可能性を示す一連の実験について記載する。
【０１８５】
6.1.  酵母におけるTDSアッセイのノイズに対するシグナル比の決定
デコイ細胞はABY11（MATa、ura3-1Δleu2-1Δ）であった。標的細胞は、酵母DDR2プロモーター由来のGFPを発現するプラスミド（pDW415）を保有するABY11であった。新しく増殖した酵母細胞をYM培地+2％カザミノ酸（YM-Cas）中に再懸濁した。培養物密度は、Shimadzu BioSpec1601分光光度計で600nmでの培養物の吸光度を読み取ることにより決定した。以下の換算係数（1 O.D.600ユニット＝1.5×107細胞/ml）を用いて細胞密度を計算した。
【０１８６】
一定の合計数（5×107細胞/ml）で96ウェルプレートのウェルに細胞を分注した（YM培地+2％カザミノ酸中全量225μl）。細胞混合物の組成は、100％標的細胞〜100％デコイ細胞まで様々なものを使用した。培養物が発する蛍光量をMolecular Dynamics Vistra Fluorlmagerで定量した。細胞増殖を避けるために、混合物を調製した直後にプレートの画像を撮った。
【０１８７】
細胞混合物が発する蛍光量は、希釈係数に関して直線の関係ではなかった（図１）。デコイ：標的の希釈比が約10を超えると、細胞混合物の検出可能な蛍光出力はバックグラウンドに近づいた。標的細胞が細胞集団の10％を超える濃度で存在した場合、混合物の蛍光出力は有意に増大した。この結果は、デコイ：標的比が10以上であると、共培養アッセイが成功することを示唆した。換言すると、集団中における標的細胞の相対量を10％を超えるまで増加させる薬物候補を試験した場合、大きな蛍光シグナルが得られるだろう。
【０１８８】
6.2.  酵母におけるTDSアッセイの感度の決定
TDSアッセイの感度は、標的細胞とデコイ細胞の増殖率の差、ならびに混合物が飽和（酵母の場合は約3×107細胞/ml）に達する前に経験しうる集団倍化の回数により決定した。集団倍化の回数は、培養物の体積および出発細胞の数によって決定される。例えば、1025細胞（1000個はデコイ細胞で25個は標的細胞）を接種した200μlの培地は、約13回の集団倍化後に飽和に達するだろう。表１は、標的細胞とデコイ細胞との増殖率の差がTDSアッセイの結果にどのような影響を及ぼすかを表す。計算は、飽和状態（3×107細胞/ml）になるまで増殖させた1025個の細胞を接種した200μlの培地に基づく。これらの数は、TDSアッセイにおいて検出可能なシグナルを生成するには、標的細胞とデコイ細胞との増殖率において50％の差が必要であることを示唆する。このアッセイの感度は、集団倍化の回数を増大させることにより向上させることができる。これは、培養物の体積を増大することによって、または新鮮な薬物含有培地を加えることにより培養物を希釈することによって、行うことができる。
【０１８９】
【表１】
0004718082.tif 000002
表１ TDSアッセイの感度。計算は、異なる200μlの培地に、飽和状態（3×107細胞/ml）にまで増殖させた1025細胞（1000個はデコイ細胞で25個は標的細胞）を接種した理論的実験に基づく。標的細胞の倍化時間を100分間に一定に保ち、一方デコイ細胞の倍化時間は100〜1000分の様々な時間とした。異なる共培養実験の各々についての「開始時」および「最終時」の標的：デコイ比を挙げる。予測の「ノイズに対するシグナル」は、図１の混合実験から得たデータに基づくものであった。これは、増殖率における50％以上の差が検出可能な蛍光シグナルを生成することを示す。
【０１９０】
6.3.  クロトリマゾールを用いた試験的調査
最適アッセイ条件を決定するために、様々な標的：デコイ比を、異なる濃度のクロトリマゾールの存在下にて試験した（図２）。クロトリマゾールは、ERG11遺伝子産物、ラノステロール14α-デメチラーゼ、ステロール生合成酵素を阻害する抗真菌剤化合物である（GeorgopapadakouおよびWalsh, 1996, Antimicrob Agents Chemother 40:279-291）。標的細胞ABY676は２つのプラスミドpAB98およびpAB99を保有し、これらはそれぞれ高レベルのGFPおよびERG11を発現する。デコイ細胞ABY674は２つの対照ベクターYEplac195およびYEplac112を保有する。
【０１９１】
標的細胞およびデコイ細胞を1：10、1：100および1：1000の割合で、様々な濃度のクロトリマゾールの存在下にて混合した。さらに、細胞の合計数を連続希釈により変えた。細胞合計数は図２Aの上部のパネルに示す。細胞を各ウェル中の体積225μl のYM-Cas培地中で混合した。30℃にて88時間インキュベートした後、各ウェルからの蛍光を測定した。蛍光値をその培地のバックグラウンド蛍光に対して補正し、対応する薬物で処理しなかったものからの蛍光シグナルに対する倍数増加として表した。
【０１９２】
細胞増殖の量は、Molecular Devices Spectra Max250プレート分光光度計で600nmにて光学密度を測定することにより決定した（図２B）。プレートの蛍光画像（これは蛍光シグナルの定量についての起源として役立った）も表す（図２C）。
【０１９３】
この実験により、共培養物が、クロトリマゾールの大きな濃度範囲にわたって大きなノイズに対するシグナル比を生じたことが分かった。また蛍光シグナルは、全ての３つのデコイ：標的比において、および全てのバリエーションの合計細胞数／ウェルにおいて、薬物処理しなかったものよりも有意に大きかった。より具体的には、1：10および1：100の標的：デコイ比は、ウェルあたり最も高い密度の細胞において、0.2〜5.6μg/mlから有意なシグナルを生じた。これらの割合の細胞の連続希釈物は、0.2〜2.8μg/mlクロトリマゾールにおいて、有意な蛍光シグナルを生じた。蛍光が増加しなかったウェルのO.D.600値は、これらの条件下において、クロトリマゾールが標的細胞およびデコイ細胞の両方の増殖を阻害したことを示した。1：1000の標的：デコイ比からの蛍光シグナルは、各細胞密度において0.2〜5.6μg/mlクロトリマゾールにて有意な蛍光シグナルを生じた。クロトリマゾールを用いたこの試験的調査から得たこれらの結果は、この方法が順応性のある確固としたものであり、伝統的な細胞ベースの薬物スクリーニング方法論よりも有意な利点を有する可能性があることを示す。
【０１９４】
6.4.  酵母におけるTDSアッセイの特異性の決定
TDSアッセイの特異性を決定するために、560種の化合物からなる化学ライブラリーを、図２に記載したのと同じ株を用いてスクリーニングした。MicroSourceライブラリーは、560種の一般的薬物のコレクションである。Erg11pの既知の阻害剤である４つのアゾール化合物、ミコナゾール、スルコナゾール、ケトコナゾール、およびクロトリマゾールがこのライブラリーの中に集められている。この共培養のために選択された条件は、体積225μl中に25個の標的細胞および25,000個のデコイ細胞（標的：デコイ比が1：1000）であった。これらの条件で、図２に示す最大範囲の薬物にわたり最も大きなノイズに対するシグナル比が得られた。
【０１９５】
標的細胞およびデコイ細胞の一晩培養物をYM培地+2％カザミノ酸中で増殖して、両方のエピソームプラスミド（episomal plasmid）を選択しつづけた。標的細胞およびデコイ細胞の両方を含む１つの大きなバッチの新しい培地（YM-Cas）を調製した。この培養物を1×105細胞/mlにまで希釈し、96ウェルプレートに分注した。次に、Microsourceライブラリーから得た薬物を２種類の濃度の培地（つまり5μg/ml+1% DMSOと0.5μg/ml+0.1% DMSO）に加えた。プレートを30℃にてインキュベートした。蛍光およびO.D.600測定を10日間毎日２回ずつ行った。
【０１９６】
共培養物から薬物処理しなかったものよりも有意に大きな蛍光シグナルを生じた４つの薬物だけが、該４つの既知のアゾールErg11p阻害剤であった（図３）。両方の濃度のクロトリマゾールに曝露した共培養物は、有意な蛍光シグナルを生じた。5μg/ml濃度のミコナゾールおよびスルコナゾールは、増殖を激しく阻害したので陽性シグナルを生じなかったが、低濃度（0.5μg/ml）の両薬物は、有意な陽性シグナルを生じた。これに対し、高濃度のケトコナゾールは有意なシグナルを生成したが、低濃度では増殖を阻害することも陽性シグナルを生じることもなかった。
【０１９７】
このライブラリーの中の５種の化合物は、両濃度において増殖を激しく阻害した。これらは、塩化セチルピリジニウム、塩酸ジクロニン、塩酸エフェドリン、ホウ酸フェニル水銀、およびチメロソル（thimerosol）を含んでいた。このコレクション中の２種の化合物、カルセイン(calcein)および塩酸アクリフラビイウム（acriflaviium）は蛍光性が著しく高かったために、これらの化合物を評価することはできなかった。
【０１９８】
この実験は、この薬物スクリーニング法の２つの重要な態様を示している。まず、このアッセイにおいて偽陽性は検出されなかった。560種の化合物（各々はある種の中で生物学的活性を有する）のうち、４つの陽性シグナルのみが、Erg11pを阻害することがわかっている薬物からのものであった。このアッセイの第２の特徴は、目的とする任意の標的にこのアッセイを適合させることが簡単であることである。唯一特に必要なことは、標的遺伝子が、高レベルで発現された場合に、対応する阻害剤に対する耐性を付与することである。
【０１９９】
このアッセイの１つの限界は、候補薬物の濃度に対するその感度である。例えば、該４種のアゾールのうちの３種だけは、試験した２つの濃度の一方のみにおいて陽性シグナルを生じた。この限界は、２つの方法のうちの１つにおいて克服することができるであろう。化合物ライブラリーは多重濃度でスクリーニングすることができる。このアプローチのストラテジーは、標的細胞とデコイ細胞の増殖率に有意な差がある少なくとも１つの濃度を見つけ出すことである。第２のより好ましいアプローチは、スクリーニングする前に酵母中におけるその化合物の最小阻害濃度（MIC）値に基づいて該化合物ライブラリーを正規化することである。この場合、いずれの重要な細胞機能を阻害しなかった化合物をスクリーニングから除外するだろう。次に、得られた正規化ライブラリーを最小数の濃度でスクリーニングすることができるであろう。
【０２００】
7.  感受性を高めたデコイ細胞を用いたTDSアッセイの感度の増加
TDSの感度は、標的株とデコイ株の増殖率の差により決定される。アッセイの感度を増加する１つの方法は、予め選択した標的に関して感受性が増大したデコイ細胞を用いることである。これは、デコイ細胞中の標的遺伝子の量を２コピーから１コピーに減少することにより行うことができる。Gaieverらは、幾つかの異なるヘテロ接合体が対応する薬物に対する感受性が増大していることを示した（Gaiever, G Nat. Genet. 21:278-283）。例えば、erg11/ERG11ヘテロ接合体は、フルコナゾールに対する感受性が増大していることが示された。従って、erg11/ERG11ヘテロ接合体は、スクリーニングの感度を増すために、第6.3節で記載したTDSアッセイにおけるデコイに使用することができる。他のタイプの薬物に対する感受性を高める突然変異（例えば標的遺伝子における点突然変異）をデコイ細胞中に導入してTDSスクリーニングの感度を増すこともできる。
【０２０１】
幾つかの場合、標的遺伝子は試験細胞または生物の生存能力または正常な増殖にとって必須ではない。例えば、酵母のRCE1遺伝子は、Ras2pタンパク質のタンパク質分解成熟に必要であり、新規の癌標的となり得る（Boyartchukら, 1997, Science 275:1796-1800）。にもかかわらず、RCE1遺伝子の欠失によっては明らかな増殖欠陥が起きない。
【０２０２】
酵母ゲノムに、Rcelp機能が細胞の適応性に有意にプラスの影響を及ぼし得るような状況を作り出すことができる幾つかの僅かな修飾を行うことができる。ras2-23対立遺伝子は、２つの酵母RAS遺伝子のうちの一方における温度感受性突然変異である（Mitsuzawaら, 1989, Genetics 123:739-748）。この突然変異をras1突然変異と一緒に保有する細胞は、30℃では増殖できるが37℃では増殖できない。34℃では、ras2-23対立遺伝子を保有する酵母の増殖は、Rcelpに依存する（Boyartchukら, 1997, Science 275:1796-1800）。
【０２０３】
TDSスクリーニングは、以下の細胞を構築することによってRcelpの阻害剤を同定するために設定することができる。標的細胞は、RAS1およびRAS2における機能低下突然変異を保有するであろう。標的細胞はRAS2の代わりにras2-23対立遺伝子を保有するであろう。さらに標的細胞は、高レベルでRCE1およびGFPを発現する組換え構築物も保有するであろう。デコイ細胞は、RCE1およびGFPを発現する該組換え構築物以外は標的細胞と同質遺伝子型であろう。
【０２０４】
rce1突然変異細胞は明白な表現型を保有しないので、Rce1pの阻害剤は野生型細胞の増殖を阻害しないと思われる。しかし、本実施例で記載される標的細胞およびデコイ細胞の増殖は、Rcelp機能に依存するだろう。Rce1pの阻害剤の存在下において、標的細胞はデコイ細胞よりも薬物に対してより耐性があり、その結果、その集団の中の優勢メンバーとなり、発光する蛍光を評価することにより簡単に検出することができる。
【０２０５】
8.  哺乳動物細胞中における標的に対する阻害剤の同定
TDSスクリーニングは、哺乳動物細胞系に適用することができる。チャイニーズハムスター卵巣細胞内でのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（DHFR）の増幅は、メトトレキセートへの耐性を付与することが示されている（Assarafら, 1989, J. Biol. Chem. 264:18326-18334）。DHFR阻害剤のTDSスクリーニングを行うために、DHFR遺伝子を過剰発現している細胞系の中にGFPトランスジーンを導入して、標的細胞を生成する。この標的細胞を野生型デコイ細胞（GFP無し、標準DHFRレベル）と1：1000の割合で混合し、この混合物を異なる化合物の存在下で増殖する。検出可能レベルの緑色蛍光を発する培養物は、推定DHFR阻害剤の存在下で増殖されたものであろう。
【０２０６】
9.  線虫Caenorhabditis elegans中における標的に対する阻害剤の同定
β-チューブリン（ben-1遺伝子座によりコードされるタンパク質）およびミニ染色体上のGFPを過剰発現するC. elegansの株を、構成的プロモーター（例えば解糖系プロモーターなど）の制御下でこれら２つのタンパク質のコード領域を保有する構築物をマイクロインジェクションすることにより、構築する。このマイクロインジェクションしたワームの子孫であって該トランスジーンが生殖細胞系に伝播されたものを選択して標的株を生成する。デコイ株は親世代の非注入株である。試験化合物のプールを培地プレート上に広げ、このプレートにデコイ株および標的株の各々から得た１つのワームを加える。一つのプレートを陽性対照としてベンゾイミダゾールで処理する。ベンゾイミダゾールは、ドミナントben-1突然変異を有するワームではなく、野生型ワームにおいて麻痺を誘導して該野生型ワームの適応性を低くすることが知られているからである（Driscollら, 1989, J. Cell Biol. 109:2993-3003）。プレートを48時間の世代時間の間インキュベートしたままにする。プレートを調べて、どの化合物のプールが非蛍光ワームに対して蛍光ワームの割合を増加させたかを決定する。β-チューブリン活性の真の阻害剤を同定するまで、連続的により少数の試験化合物を含む試験プールを同様に試験する。
【０２０７】
10.  微生物におけるTDSスクリーニングの実施
短い世代時間および遺伝子ツール（genetic tool）が利用可能であることにより、微生物はTDSスクリーニングに理想的に適している。例えば、TDSスクリーニングは、ある化合物が抗生物質活性を有するか否かを同定するために使用することができる。非限定的な例において、TDSスクリーニングは、Mycobacterium tuberculosis（結核病の病原菌）等のマイコバクテリアの新規な増殖阻害剤を同定するために使用することができる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）代謝経路は、該生物の増殖に必須であることが示されたので、抗マイコバクテリア物質の標的である。例えば、薬物イソニアジドは、マイコバクテリアの増殖を阻害する（概要については例えばMieselら, 1998, Novartis Found. Symp. 217:209-221を参照されたい）。イソニアジドの標的遺伝子は、2-トランス-エノイル-アシルキャリアータンパク質のNAD-特異的還元（脂肪酸合成において必要な工程）を触媒するinhA（酵素イソニコチン酸ヒドラジドをコードする遺伝子）である。inhA遺伝子を過剰発現するマイコバクテリアはイソニアジドに対して耐性がある。このような過剰発現は、実験室で生成することもできるし（Banerjeeら, 1994, Science 263:227-230）、またM. tuberculosisの臨床耐性株（clinically resistant strain）における天然のものでも良い（Rouseら, 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:2472-2477）。このように、NAD関連経路は、抗結核活性を有する分子を同定するためのTDSスクリーニングにとって有用な標的経路である。inhA遺伝子産物はこのようなスクリーニングにおいて標的として使用することができるが、臨床株がそれに対して耐性を持たない関連遺伝子または遺伝子産物を阻害する薬物を同定することが好ましい。このような遺伝子の１つは、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（QAPRTase）であり、これは、NADの生合成に必要な酵素である（Sharmaら, 1998, Structure 6:1587-1599）。
【０２０８】
TDSスクリーニングは、NADの阻害剤を同定するために以下のように使用される。M. tuberculosis（または関連するマイコバクテリア）の選択された株を、QAPRTaseを発現する高コピーのアンピシリン-選択可能発現プラスミド（M. tuberculosisゲノムからPCR増幅することができる）（Genbank登録番号Z95586）およびGFPで、構成的プロモーターの制御下で形質転換することにより、標的細胞を生成する。親株をこのプラスミドの空の対照物で形質転換することにより、デコイ細胞を生成する。次に、標的細胞およびデコイ細胞を1：1000の割合で混合し、96ウェルマイクロタイタープレートに、合計で約10,0001細胞（アンピシリン濃度125μg/mlのLB培地225μl中）を分注する。Microsourceライブラリーからの薬物を個別にウェルに加える。各プレート中の少なくとも１つのウェルには薬物を入れず、ノイズに対するシグナル比測定のための陰性対照とする。培養物を37℃にて48時間増殖し、2時間毎に蛍光測定および光学密度測定を行った。QAPRTase経路を特異的に阻害する化合物は、化合物を入れたこれらの培養物の蛍光において検出可能な増加をもたらすが、対照培養物の蛍光には検出可能な増加をもたらさない。
【０２０９】
11.  細胞適応性に負に寄与する標的遺伝子を用いた酵母におけるTDSスクリーニング
以下は、細胞適応性に負に寄与する標的遺伝子を用いた酵母におけるTDSスクリーニングについて記載する。
【０２１０】
ステップ１. 目的のヒト遺伝子を過剰発現プラスミド中にクローニングする。
【０２１１】
ステップ２. 酵母株中にプラスミドを形質転換し、過剰発現により適応性が低下する（増殖率が低下する）か否かを決定する。過剰発現による致死性の幾つかの例は文献に記載されている。幾つかの場合では、所望の過剰発現により低下した適応性表現型を得るために、特定の遺伝学的背景が必要である場合がある。全ての可能な遺伝学的背景を迅速にスクリーニングするために、バーコードを付けた酵母欠失株の集団中に過剰発現プラスミドを形質転換することができる。ヒト遺伝子の過剰発現により特異的に影響を受ける欠失突然変異体は、競合増殖実験中にその集団から枯渇するだろう。過剰発現構築物に対して最も大きな感受性を有する欠失株を、共培養スクリーニングにおける標的株として使用する。
【０２１２】
ステップ３. ヒト過剰発現プラスミドを含む酵母細胞を、GFPを過剰発現している第２のプラスミドで形質転換する。得られた株は共培養スクリーニングにおいて標的となるだろう。
【０２１３】
ステップ４. ２つの空のプラスミドを同質遺伝子型酵母株中に形質転換することにより、デコイ株を生成する。
【０２１４】
ステップ５. 1000：1の割合で標的株およびデコイ株を混合し、これらの細胞を96ウェルプレート中に分注する。このとき各ウェルは異なる阻害剤とともに200μlの培地を含む。
【０２１５】
ステップ６. 該混合物を飽和状態になるまで増殖させ、各ウェルの最終蛍光レベルを測定する。この共培養アッセイの結果として考えられるのは、以下の３つである：
１. 阻害剤は標的株およびデコイ株の両方の増殖を遮断する。最終培養物は、非常に低い蛍光シグナルを有するだろう。
２. 阻害剤はデコイ細胞または標的細胞のいずれの増殖率にも影響を及ぼさない。この場合、デコイ株は、ゆっくりと増殖する標的株との競合に勝ち（out-compete）、最終的な飽和培養物は低い蛍光シグナルを有するだろう。
３. 阻害剤は、過剰発現されたヒトタンパク質を特異的に標的とする。これにより、過剰発現致死性表現型をレスキューし、標的を正常な増殖率で増殖させる。標的株はデコイ株に比べて1000：1の割合で始まるので、この割合は最終飽和培養物中において維持されるだろう。最終的な結果は非常に高い蛍光シグナルとなるだろう。
【０２１６】
有用な参考文献として、例えばEspinetら, January 11, 1995, Yeast 1:25-32；Linら, November 13, 1992, Genetics 3:665-:673を参照されたい。
【０２１７】
本発明の範囲は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されたもの以外にも、本発明の様々な改変が、これまでの説明および添付の図面を見れば当業者には自明であろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０２１８】
本明細書中には様々な刊行物が引用されており、これらの開示はそれらの全体において参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、デコイ細胞：標的細胞の比の関数としての蛍光強度。実験は96ウェルプレートにて行った結果である。各ウェルには0.2mlの培地中の合計107個の酵母細胞が含まれていた。標的細胞はGFPを過剰発現し、一方でデコイ細胞は対照ベクターを取り込んでいる。培地の蛍光強度は、Molecular Dynamics Vistra FluorImager 内で、前培養をせずに測定した。蛍光は、各ウェルについての蛍光単位／ピクセルの平均値で表す。挿入図は、デコイ酵母細胞または標的酵母細胞の純粋培養物（107個細胞）についての蛍光値を示す。
【図２】  図２Aは、クロトリマゾールの存在下で増殖させたERG11-標的とデコイとの共培養物のシグナル-ノイズ比である。培養物はさまざまな標的細胞：デコイ細胞の比で調製した（列）。それぞれの比はまた、種々のウェルあたりの総細胞数にて調製した。その数は上部に示す。ERG11遺伝子産物を阻害するクロトリマゾールは連続希釈して導入した（行）。クロトリマゾールの濃度を表の左側に示す。各ウェル中の培地の量は0.225mlであった。プレートは30℃で88時間インキュベートした。蛍光シグナルは、培地対照プレートの蛍光値を、テストプレートの各ウェルの蛍光値から差し引くことにより決定した。シグナル-ノイズ比は、これら補正された値を最下列の薬物を含まないウェルでの対応する値で割ることにより決定した。
図２Bは、増殖後の各ウェルにおける共培養物のOD600値である。
図２Cは、元プレートの蛍光画像である。
【図３】  化学物質ライブラリーのERG11-標的共培養物スクリーニングの結果。ERG11遺伝子およびGFPを過剰発現する標的酵母細胞とデコイ細胞とを1:1000の比で混合し、96ウェルプレートに分注した。各ウェルには、2％カザミノ酸を含む0.225mlのYM培地中の25個の標的細胞および25,000個のデコイ細胞が含まれていた。MicroSource（商標）ライブラリーからの560の一般的な薬物を、最終濃度が5μg/mlまたは0.5μg/mlで１％DMSOとなるように各ウェルに入れた。プレートを30℃で10日間インキュベートした。４つの陽性ヒットを示している４つの代表的なプレートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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