(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式III:
【化１】
0004689274.tif 000046
（式中、C'は１個の水素原子が結合した不斉炭素を表す）
の化合物または医薬的に許容し得るその塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容し得る賦形剤を含有する、動物における肝臓の癌、直腸の癌、または肝臓のウイルス感染症を処置するための医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容し得る賦形剤を含有する、動物における肝臓の癌または直腸の癌の医学的な処置または外科的な処置後のそれらの癌の再発を予防するための医薬組成物。
【請求項４】
該動物は癌が存在しない、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該動物は癌から寛解中であり、そして該医薬組成物は癌の更なる発生を防止する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該肝臓の癌が肝細胞癌腫である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
該直腸の癌が結腸大腸癌腫である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容し得る賦形剤を含有する、シタラビンの肝臓特異度の治療指数を増大するための、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
更に腫瘍細胞崩壊性薬剤を含む、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該腫瘍細胞崩壊性薬剤が、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ミリプラチン、テモゾロマイド、チオテパ、メルファラン、イホスファミド、シクロホスファミド、クロラムブシル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、バルルビシン、ダクチノマイシン、ゲムシタビン、フロキシウリジン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、チオグアニン、メトトレキセート、マイトマイシン、エトポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ネダプラチン、カルムスチン、ドキシフルリジン、クラドリビン、フルダラビン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザトキシン、カンプトテシン、ルルトテカン、カンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ピラルビシン、ヌロカルジノスタチン、カリーチアマイシン、エスペラミシン、およびルロテカからなる群から選ばれる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物および腫瘍細胞崩壊性薬剤の組み合わせを含有する、動物における肝臓の癌または直腸の癌を処置するための剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物および腫瘍細胞崩壊性薬剤の組み合わせを含有する、動物における肝臓の癌または直腸の癌の医学的な処置または外科的な処置後のそれらの癌の再発を予防するための剤。
【請求項１３】
該肝臓の癌が肝細胞癌腫である、請求項１１または１２に記載の剤。
【請求項１４】
該直腸の癌が結腸大腸癌腫である、請求項１１または１２に記載の剤。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物および腫瘍細胞崩壊性薬剤の組み合わせを含有する、シタラビンの肝臓特異度の治療指数を増大するための、請求項１１または１２に記載の剤。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物および腫瘍細胞崩壊性薬剤を、動物に同時にまたは連続して投与する、請求項１１または１２に記載の剤。
【請求項１７】
該腫瘍細胞崩壊性薬剤が、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ミリプラチン、テモゾロマイド、チオテパ、メルファラン、イホスファミド、シクロホスファミド、クロラムブシル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、バルルビシン、ダクチノマイシン、ゲムシタビン、フロキシウリジン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、チオグアニン、メトトレキセート、マイトマイシン、エトポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ネダプラチン、カルムスチン、ドキシフルリジン、クラドリビン、フルダラビン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザトキシン、カンプトテシン、ルルトテカン、カンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ピラルビシン、ヌロカルジノスタチン、カリーチアマイシン、エスペラミシン、およびルロテカからなる群から選ばれる、請求項１１または１２に記載の剤。
【請求項１８】
式III:
【化２】
0004689274.tif 000047
（式中、C'は１個の水素原子が結合した不斉炭素を表す）
の化合物または医薬的に許容し得るその塩、および抗ウイルス剤の組み合わせを含有する、動物における肝臓のウイルス感染症を処置するための剤。
【請求項１９】
抗ウイルス剤および式IIIの化合物を別々に投与する、請求項１８に記載の剤。
【請求項２０】
抗ウイルス剤および式IIIの化合物を同時に投与する、請求項１８に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮出願番号60/423,259（2002年10月31日出願）、および米国仮出願番号60/423,211（2002年10月31日出願）（これらは、本明細書の一部を構成する）の利益を主張する。
【０００２】
(技術分野)
本発明は、１,３−プロパン−１−アリールジオールの新規シタラビン・モノホスフェート（アラＣＭＰ）環状ジエステル、並びにそれらの製造法およびそれらの使用法に関する。より具体的には、本発明は、シス立体化学を有する１,３−プロパン−１−(４−ピリジル)ジオールのシタラビン・モノホスフェート（アラＣＭＰ）環状ジエステルの分野に関する。
【０００３】
（背景技術）
本発明の背景技術の以下の記載は、本発明を理解するのを助けるために提示するものであるが、しかし、このものが本発明にとっての先行技術であるとかあるいは先行技術を記載するものであることを認めるものではない。全ての刊行物は、本明細書の一部を構成する。
【０００４】
アラＣはデオキシシチジンのアナログであって、このものはヌクレオシド運搬体によって細胞中に運搬され、そしてヌクレオシドおよびヌクレオチドキナーゼによって活性代謝産物であるアラＣトリホスフェート（アラＣＴＰ）にリン酸化される。そのものは、急性非リンパ球性白血病を処置するのに使用される最も成功した薬剤の１つであるが、そのものは、必要なヌクレオシドキナーゼは肝臓中で低レベルで発現するという理由で、肝細胞癌腫（「ＨＣＣ」）に対する処置において効果的ではない（Arnerらによる、Pharmacol. Ther. 67(2):155-86, (1995）；Ruiz van Haperenらによる、Semin. Oncol. 22 Suppl 11(4): 35-41, (1995)）。しかしながら、該キナーゼは毒性の標的器官（例えば、骨髄）中ではなお非常に発現し、このことにより、関連する用量−限定の毒性を生じる。アラＣの環状プロドラッグは、より高濃度のアラＣＴＰをＣＹＰ３Ａ４発現性の肝臓およびＨＣＣ細胞へ特異的に運搬することによって、肝臓中でのアラＣの有効性を改善する能力を与える。モノホスフェートとしてのアラＣ、アラＣＭＰの運搬は、デオキシシチジンキナーゼ、デオキシシチジンデアミナーゼに限定してバイパスされ、そして正常および耐性の両方の腫瘍細胞における活性を運ぶことが期待される。従って、１,３−プロパンジオールのアラＣＭＰ環状ジエステルは、アラＣと比較して肝臓中の抗腫瘍活性を増大し、肝臓造血性系外に対する毒性が低下し、アラＣと比較して肝臓中の抗腫瘍活性を増大し、このことにより、ヒトにおいて見られる用量−限定骨髄抑制を生じることが期待される（米国第6,312,662号を参照）。
【０００５】
肝炎および肝臓癌は、用量−限定の肝臓外の副作用または化学療法剤の標的組織への不十分な運搬が原因で、現行の治療法を用いて処置するのは未だ乏しい。現在の方法における制限としては例えば、薬物をロードする能力、製造の複雑さ、および接合体および受容体の下方調節の性質が挙げられる。従って、薬剤（例えば、アラＣ）を肝臓に運搬する方法に対する要求がなお存在する。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、１,３−プロパン−１−アリールジオールのシタラビン・モノホスフェート（アラＣＭＰ）環状ジエステル、並びにそれらの製造法および使用法に関する。より具体的には、本発明はシス立体化学を有する１,３−プロパン−１−(４−ピリジル)ジオールのシタラビン・モノホスフェート（アラＣＭＰ）環状ジエステルの分野に関する。
【０００７】
本発明の１態様は、式Ｉ：
【化１】
0004689274.tif 000002
［式中、
ＭおよびＶは互いにシスであって、そしてＭＨはシタラビンであり；
該シタラビンの５'酸素はリンと結合し；
Ｖは、４−ピリジルである］
で示される化合物、並びにそれらの医薬的に許容し得るプロドラッグおよびその塩に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は式ＩＩＩ：
【化２】
0004689274.tif 000003
で示される化合物、並びにそれらの医薬的に許容し得る塩およびそのプロドラッグに関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、式ＩＩＩ：
【化３】
0004689274.tif 000004
［式中、
シタラビンの５'酸素はリンと結合する］
で示される化合物の製造方法に関し、該方法は式ＩＶ：
【化４】
0004689274.tif 000005
［式中、
Ｌは、クロロおよび４−ニトロフェノキシからなる群から選ばれる］
で示されるリン酸化試薬と場合により保護されたシタラビンとのカップリングを含む。
【００１０】
（定義）
本発明に従いおよび本明細書で使用する通り、特に断らない限り、以下の用語は以下の意味で定義する。
【００１１】
用語「シス」立体化学は、６員環上のＶ基およびＭ基の位置の関係を意味する。以下の式は、シス立体化学を示す。
【化５】
0004689274.tif 000006
【００１２】
別のシス立体化学は、上記の面に位置するＶおよびＭを有する。以下の式は、このシス立体化学を示す。
【化６】
0004689274.tif 000007
【００１３】
用語「Ｓ−立体配置」、「Ｓ−異性体」および「Ｓ−プロドラッグ」は、炭素Ｃ'の絶対配置Ｓを意味する。以下の式は、Ｓ−立体化学を示す。
【化７】
0004689274.tif 000008
【００１４】
用語「Ｒ−立体配置」、Ｒ−異性体」および「Ｒ−プロドラッグ」は、炭素Ｃ'の絶対配置Ｒを意味する。以下の式は、Ｒ−立体化学を示す。
【化８】
0004689274.tif 000009
【００１５】
用語「％エナンチオマー過剰率（％ｅｅ）」は、光学純度を意味する。そのものは、以下の式：
【化９】
0004689274.tif 000010
を用いることによって得る。ここで、[Ｒ]はＲ異性体の量であって、そして［Ｓ］はＳ異性体の量である。本式は、Ｒが優位な異性体である％ｅｅを与える。
【００１６】
用語「不斉(stereogenic)中心」とは、以下を意味する。
【００１７】
「ｄ．ｅ．」は、ジアステレオマー過剰率を意味する。そのものは、以下の式：
【化１０】
0004689274.tif 000011
を用いて得た。
【００１８】
用語「ジアステレオ異性体」とは、同じ置換基を有し、そして同じタイプの化学反応を受ける２つ以上の不斉中心を有する化合物を意味し、ここで、該ジアステレオマーは異なる物理的な性質、空間中に異なる相対的な位置を占める置換基を有し、そして異なる生物学的な性質を有する。
【００１９】
用語「ラセミ」とは、光学的に活性でない、分子のエナンチオ的な分子形態の等量から構成される化合物または混合物を意味する。
【００２０】
用語「エナンチオマー」とは、分子構造が互いに鏡像関係を有する分子の対のいずれかを意味する。
【００２１】
用語「ハロゲン」とは、クロリド、ブロミド、ヨードまたはフルオリドを意味する。
【００２２】
用語「アルキル」とは、直鎖、分枝および環状の基を含む飽和の脂肪族基を意味する。適当なアルキル基は、メチル、エチル、イソプロピルおよびシクロプロピルを含む。
【００２３】
用語「アリール」とは、５〜６個の環内原子を有する芳香族基を意味する。適当なアリール基は、フェニル、フラニル、ピリジル、およびチエニルを含む。アリール基は、置換され得る。
【００２４】
用語「アリールオキシ」とは、アリール−Ｏ−基を意味する。
【００２５】
本明細書中で有機のラジカルまたは化合物のそれぞれに関連する用語「低級」とは、例えば１０以上、好ましくは６以上、有利には１〜４個の炭素原子と定義する。該基は、直鎖、分枝または環状であり得る。
【００２６】
用語「場合により置換された」または「置換された」とは、１〜２個の置換基によって置換されたアリール基を含み、該置換基は独立して、低級アルキル、低級アリールおよびハロゲンからなる群から選ばれる。好ましくはこれらの置換基は、ハロゲンからなる群から選ばれる。
【００２７】
用語「医薬的に許容し得る塩」とは、本発明の化合物、および有機または無機の酸または塩基との組み合わせから誘導される式Ｉの化合物およびそのプロドラッグの塩を含む。適当な酸とは、酢酸、アジピン酸、ベンゼンスルホン酸、(＋)−７,７−ジエチル−２−オキソビシクロ[２.２.１]ヘプタン−１−メタンスルホン酸、クエン酸、１,２−エタンジスルホン酸、ドデシルスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸(glucoheptonic acid)、グルコン酸、グルコロン酸(glucoronic acid)、馬尿酸、塩酸・ヘミエタノール酸、ＨＢｒ、ＨＣｌ、ＨＩ、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、臭化メチル酸、メチル硫酸、２−ナフタレンスルホン酸、硝酸、オレイン酸、４,４’−メチレンビス[３−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボン酸]、リン酸、ポリガラクツロン酸(polygalacturonic acid)、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、スルホサリチル酸、タンニン酸、酒石酸、テレフタル酸、およびｐ−トルエンスルホン酸を含む。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「プロドラッグ」とは、生物学的な系に投与した場合に、同時化学反応、酵素触媒化学反応および／または代謝化学反応、または各々の組み合わせの結果として生物学的に活性な化合物を与える、いずれかのＭ化合物を意味する。標準的なプロドラッグは、インビボで切断する、薬物に伴う官能基（例えば、ＨＯ−、ＨＳ−、ＨＯＯＣ−、Ｒ２Ｎ−）と結合した基を用いて生成する。標準的なプロドラッグとしては例えば、カルボン酸エステルを含むが、これに限定されない。ここで、該基はアルキル、アリール、アラルキル、アシルオキシアルキル、アルコキシカルボニルオキシアルキル、並びにヒドロキシル、チオールおよびアミンのエステルであって、ここで結合する該基はアシル基、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、ホスフェートまたはスルフェートである。例示する基は典型的なものであって、排他的なものでなく、そして当業者は他の公知の多数のプロドラッグを製造することができる。式Ｉの化合物の該プロドラッグは、本発明の範囲内にある。プロドラッグは、いくつかの形態の化学的変換を受けて、生物学的に活性であるかまたは生物学的に活性な化合物の前駆体である化合物を与えるに違いない。ある場合には、該プロドラッグは生物学的に活性であり、通常薬物自身よりも低く、そして経口バイオアベイラビリティ、薬力学的な半減期などの改善によって、薬物の有効性または安全性を改善するのに役立つ。該生物学的に活性な化合物としては例えば、抗癌剤および抗ウイルス剤を含む。シタラビンのあるプロドラッグ、例えばＮ４−アシル化シタラビン（Wechterらによる、J. Med. Chem. 19(8), 1013 (1976)）（ここで、該アシル基はパルミトイルまたはベハノイル(behanoyl)である）は、脂溶性および膜輸送を増大させ、並びにシチジンデアミナーゼによる脱アミノ化を低下させることが知られる。Ｎ４−における他の基はまた、例えばアルキリデン（すなわち、イミノ基）が想定される。これらの基はインビボで除去されて、シタラビンの４−アミノ基を生成する。同様なプロドラッグを、本発明のプロドラッグに包含する。
【００２９】
用語「環状１',３'−プロパンエステル」、「環状−１,３−プロパンエステル」、「環状１',３'−プロパニルエステル」、および「環状−１,３−プロパニルエステル」とは、以下の式：
【化１１】
0004689274.tif 000012
を意味する。
【００３０】
用語「４−ピリジル」、「ピリジン−４−イル」および「４−ピリジニル」とは、
以下の式：
【化１２】
0004689274.tif 000013
を意味する。
【００３１】
用語「５’酸素」とは、以下の式：
【化１３】
0004689274.tif 000014
中の酸素を意味する。
【００３２】
用語「Ｎ−含有ヘテロアリール溶媒」とは、環内原子として１〜３個の窒素および４＜ｐｋａ＜６を有するヘテロアリール基、並びに非Ｎ−含有へテロアリール溶媒との混合物を意味する。
【００３３】
用語「Ｎ−ヒドロキシ−窒素−含有ヘテロアリール」とは、ヒドロキシ基が窒素原子と結合したＮ−含有ヘテロアリールを意味する。例えば、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールが挙げられる。
【００３４】
用語「Ｎ−含有ヘテロアリール」とは、環内原子として１〜３個の窒素を有し、そして炭素原子によって結合したヘテロアリール基を意味する。
【００３５】
用語「電子吸引基」は当該分野において認識されており、そしてこのものは、隣接原子から価電子を引き抜く置換基の傾向を意味し、すなわち、該置換基は隣接原子について電気的陰性である。電子−吸引能力のレベルの定量化は、ハメットシグマ（σ）定数によって示される。このよく知られる定数は、多数の刊行物、例えばJ. MarchによるAdvanced Orgamic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977編), 頁251-259中に記載されている。該ハメット定数値は通常、電子供与基に対しては陰性であって（ＮＨ２の場合には、σｐ＝−０．６６）、そして電子吸引基に対しては陽性であって（ニトロ基の場合には、σｐ＝０．７８）、ここで、σｐはパラ置換を意味する。典型的な電子吸引基としては例えば、ニトロ、ケトン、アルデヒド、スルホニル、トリフルオロメチル、−ＣＮ、クロリドなどを含む。
【００３６】
用語「脱離基」とは、反応中に切断される場合に、該反応中に結合に供されるリンを含まない基質分子の一部を意味する。
【００３７】
用語「Ｐ４５０」とは、チトクロームＰ−４５０を意味する。Ｐ４５０酵素は、肝臓およびこれらの酵素を含有する他の組織中で大量に見られる。特定のＰ４５０イソ酵素は本発明の環状ホスホネートを酸化することに関係し、その結果、遊離ホスホネートまたはホスフェートが最終的に生成する。Ｐ４５０酵素は、全ての哺乳動物の組織および細胞中に見られる。
【００３８】
用語「Ｐ４５０−発現組織」とは、肝臓、並びに本発明の環状プロドラッグを酸化することが発見されたＣＹＰ３Ａ４イソ酵素またはいずれか他のＰ４５０イソ酵素を含む似た組織および細胞を意味する。DeWaziersらによる（J. Pharm. Exp. Ther.、253、387-394 (1990)）によれば、ＣＹＰ３Ａ４は、ヒトにおいて以下の組織中に存在する（このことは、免疫ブロットおよび／または酵素測定によって測定する）。
【表１】
0004689274.tif 000015
【００３９】
用語「Ｐ４５０−発現組織の疾患」とは、Ｐ４５０発現組織の機能が損なわれ、その結果、該組織がそれらの代謝機能をもはや発揮することができない、疾患を意味する。このものは、生化学的な最終製品における過剰産生または減少のいずれかを生じ得る。これらの疾患としては例えば、肝臓の疾患、例えば原発性もしくは転移性の肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）、肝臓線維症、または肝硬変：肝臓に関与し得る疾患を含み得るが、このものはまた、他のＰ４５０−発現組織を含み得て、そして原発性もしくは転移性の結腸直腸癌、高脂血症、糖尿病、並びにウイルスおよび寄生虫の感染症を含み得る。
【００４０】
用語「場合により保護されたシタラビン」とは、シタラビンの２’および３’ヒドロキシル基、並びに４−窒素基の標準的な保護基による保護を意味する。
【００４１】
用語「増大(enhancing)」とは、特定の性質を増大しまたは改善することを意味する。
【００４２】
用語「エンリッチ(enriching)」とは、反応によって産生するある異性体の量が増大することを意味する。
【００４３】
用語「同時に投与する」とは、別の薬物の投与と同時期またはほぼ同時期に薬物を投与することを意味する。投与は、相互に３０分以内であることが好ましい。
【００４４】
用語「治療学的な指標」（「ＴＩ」）とは、望まない応答（例えば、死亡、毒性の指標となるマーカーの上昇、および／または薬理学的な副作用）を与える用量と比べて治療学的に有利な応答を与える、薬物またはプロドラッグの用量の比率を意味する。
【００４５】
用語「寛解」とは、疾患の症状の激しさの緩和または軽減を意味する。
【００４６】
用語「癌が存在しない」とは、いずれかの組織または器官における悪性新生生物（癌）または転移の存在を示す証拠のないことを意味する。
【００４７】
以下のよく知られる化学品は、本明細書および特許請求の範囲において、以下の通り呼ばれる。略語および一般名をも提示する。
【００４８】
ＣＨ２Ｃｌ２：ジクロロメタンまたはメチレンクロリド；
ＤＣＭ：ジクロロメタンまたは塩化メチレン；
(−)−ＤＩＰ−Ｃｌ：(−)−β−クロロジイソピノカンフェイルボラン(campheylborane)；
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；
ＤＭＰＵ：１,３−ジエチル−３,４,５,６−テトラヒドロ−２(１Ｈ)−ピリミジノン；
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；
ＨＣｌ：塩酸；
ＫＩ：ヨウ化カリウム；
ＭｇＳＯ４：硫酸マグネシウム；
ＭＴＢＥ：ｔ−ブチルメチルエーテル；
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム；
ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム；
Ｐ４５０：チトクロームＰ−４５０；
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＴＢＤＭＳＣｌ：ＴＢＳＣｌ：ｔ−ブチルジメチルクロロシラン；
ＴＢＳ：ＴＢＤＭＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル；
ＴＥＡ：トリエチルアミン；
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；
ＴＭＳＣｌ：クロロトリメチルシラン；
5'-O-シス-[4-(4-ピリジル)-1,3,2-ジオキサホスホリン-2-オキソ-2-イル]-シトシン-β-D-アラビノフラノシド：2(1H)-ピリミジノン,4-アミノ-1-[5-O-シス-[2-オキシド-4-(4-ピリジニル)-1,3,2-ジオキサホスホリナン-2-イル]-β-D-アラビノフラノシル]。
【００４９】
以下のよく知られる薬物は、本明細書および特許請求の範囲中で以下の通り呼ばれる。略語および一般名をも提示する。
シタラビン：１−(β−Ｄ−アラビノフラノシル)シトシン：アラＣ。
【００５０】
（発明の詳細な記載）
本発明は、５’−Ｏ−シス−[４−(４−ピリジル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド化合物、および肝臓の疾患を処置する際のそれらの使用の発見に関する。１態様において、肝臓の疾患は、肝臓のウイルス感染症および癌からなる群から選ばれる。別の態様において、肝臓の癌は肝細胞癌腫である。第２の態様において、肝臓の癌は結腸直腸の癌腫である。１態様において、５'−Ｏ−シス−[４−(４−ピリジル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド化合物の異性体は、炭素Ｃ’がＳ立体配置を有する異性体である。別の態様において、本発明はまた、５’−Ｏ−シス−[４−(４−ピリジル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド化合物の合成方法に関する。本発明の方法は、アラＣＭＰの環状リン酸ジエステルの両方のシス−立体異性体の合成に関する。１態様において、該シタラビンリン酸ジエステルの該シス−異性体は、Ｃ’炭素上にＳ−立体配置を有するシタラビンリン酸ジエステルの該シス−異性体である。
【００５１】
肝臓癌を治癒するのに有効であることが分かっている方法は非常に少ない。腫瘍が非常に十分に画定されそして非常に少ない数％の患者において、外科的な切除、寒冷剥離術(cryoablation)およびエタノール注射は、患者を治癒する際に有効性が限られることが分かった。しかしながら、これらの方法を受けている大部分の患者は癌の再発を受けることで終わる。別の態様において、本発明はまた医学的なまたは外科的な処置を受けている患者におけるＰ４５０発現腫瘍における癌の再発を防止することに関する。
【００５２】
本発明の別の態様において、本発明の好ましいプロドラッグを用いて転移性癌を処置する。１態様において、転移性癌は、結腸直腸癌由来の２次的な癌から選ばれる。
【００５３】
（再発性癌の処置方法）
肝細胞癌腫患者は、様々な技術（例えば、超音波検査、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、核磁気共鳴画像法、血管造影法、およびバイオプシーを含む）を用いて同定されそして追跡される。アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルは診断時に使用され、そしてこのものは、特に高い初期ＡＦＰレベルを有する患者において、抗腫瘍活性のよい指標であり得る。これらの技術は、処置の選択肢および患者の適格性を決定する際に有用であることが多い。処置の選択肢としては例えば、同所肝臓移植術（ＯＬＴ）、外科的な切除、様々な薬剤（アルコールを含む）の経皮注射、寒冷療法、動脈内化学療法、経カテーテル的肝動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）、全身化学療法、放射線療法、免疫療法、およびホルモン療法を含む。＜１ｃｍである腫瘍は通常、診断することができない。外科的な方法（ＯＬＴまたは外科的な切除）を受けている患者は、該操作後に腫瘍の観察可能な証拠が全く見られないこともあり得る。同様に、非外科的な処置（例えば、切除療法（エタノール、マイクロ波、高周波））およびＴＡＣＥを受けている患者もまた、腫瘍の大きさの有意な低下を示し、また腫瘍がないことを示すこともあり得る。患者はまた、マイクロスフェア（イットリウム−９０で放射線標識化したマイクロガラスベッド）、薬物運搬ビヒクル（例えば、腫瘍に外部磁石を位置させることができる、鉄から構成される微粒子）、化学療法薬剤（例えば、ゲル剤としてのシスプラチン）の直接的な注射、ＨＣＣ腫瘍を標的とする薬剤（例えば、ドキソルビシン）、およびエタノール切断における化学薬剤（ドキソルビシンに似たもの）の使用により処置し得る。他の化学療法薬剤はまた、潜在的な初期の全身性療法処置（例えば、抗血管新生作用薬剤、チミジル酸合成酵素インヒビター（チミタグ(thymitaq)）、チューブリン重合インヒビター（例えば、Ｔ６７）、様々なトポイソメラーゼＩインヒビター（例えば、テカン(tecan)クラス由来の薬物（例えば、エキサテカン））、様々な薬物の組み合わせ（例えば、シスプラチン、インターフェロン、アドリアミシナン(adriamycinan)および５−ＦＵの組み合わせを含む）としても見られる。
【００５４】
ＨＣＣの全ての処置は、癌の再発の高い発生率に関連する。再発性の癌は、１つ以上の理由のために生じ得る。例えば、手術の時に存在する２次的な肝内転移は、それらの大きさの理由（＜１ｃｍ）で検出されないことが多い。門脈または肝静脈の侵襲を有する患者は予後が乏しく、これは腫瘍が他の肝臓葉に播種し得る理由である。これらの小転移は大きさが増大し、増殖し、そして本発明のプロドラッグに対して特に感受性である。再発性疾患を生じ得る２次的な因子は、原発腫瘍の不完全な腫瘍の摘除または切除から生じる。第３の因子は、「新しい」プライマリー(primaries)に対する高い危険率を肝臓にもたらし得る肝臓の環境（硬化性のウイルス感染症）に関連し、そのうちのいくつかは処置の時に存在するが、検出されない。
【００５５】
再発性癌を予防しまたは遅延させるために、本発明のプロドラッグは、上記の処置の前、その間、またはその後に使用することを想定する。該処置は、ＨＣＣ患者に本発明のプロドラッグを１〜２年の期間をかけて１〜１０サイクルで、好ましくは３〜６サイクルで投与することを含む。サイクルは、腫瘍の増殖を遅らせたりまたは予防するのに有効であることがわかった処置期間を包含する。本発明の１態様において、該処置は、７〜１４日間、続いて少なくとも１４日間の薬物なしの期間の連続的な注入（１サイクル）を包含する。患者を、経時で追跡する。プロドラッグは癌不在の時間を増大し、生存時間を増大し、および／または生活の質を改善する。
【００５６】
（白血病の処置方法）
シタラビンは、様々な白血病を処置するのに用いられる。典型的には、シタラビンは、用量が１００〜２００ｍｇ／ｍ２／日で、７日までの連続的な注射によって、続くシタラビン誘発性の骨髄抑制の結果としての数週間の薬物なしの期間によって、投与される。典型的には、３以上のサイクルを用いて、白血病の患者を処置する。高用量の投与様式はまた、様々な理由で使用される（例えば、３ｇ／ｍ２）。全体の高い薬物レベルは、シタラビンの速い代謝のために必要であり、このものは主に、不活性代謝産物であるアラＵへのアラＣの脱アミノ化を包含する。長期の運搬は、細胞周期依存性の腫瘍退縮剤（例えば、シタラビン）を用いて癌を処置するのに最適であると考えられる。シタラビンは、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する能力および／またはその結果としてのＤＮＡポリメラーゼ触媒化取り込み後の増大するＤＮＡ鎖の連鎖停止反応(chain termination)のいずれかによる、ＤＮＡ合成を阻害する能力によって、少なくともいくらか有効である。ＤＮＡ合成のインヒビターとして、アラＣは、細胞周期のＳ−期の間に最大の細胞毒性効果を有する。このことはおそらく、ＤＮＡ中へのその取り込みの必要性、およびＳ−期中でのタンパク同化酵素のより大きな活性が理由であろう。結果として、アラＣへの細胞の曝露期間は、細胞の殺生と直接的に相関する。この理由は、より長時間の曝露期間により、それらがＳ−期を通過するにつれて、アラＣがより大きなパーセントの細胞のＤＮＡ中に取り込まれることが可能となるからであろう。
【００５７】
より高用量のアラＣまたは長時間で処置した患者は、様々なアラＣ関連毒性の危険が存在する。加えて、患者はシタラビン毒性（例えば、肝臓損傷患者、老人）が特に危険であり得る。毒性は、骨髄抑制、胃腸管上皮性潰瘍形成、肝内胆汁鬱帯および膵炎、小脳および大脳の機能不全、並びに結膜炎を含む。
【００５８】
本発明のプロドラッグは、これらの用量−限定毒性のいくつかを低下させることが想定される。特に、プロドラッグ活性化後の肝臓中で産生されそして肝臓から放出されるアラＣは、より低い毒性を有する抗白血病活性を得るための方法を提供する。毒性（例えば、小脳および大脳の機能不全、および結膜炎）を生じ得るより高いピークレベルを達成することなく、本発明のプロドラッグを用いて定常状態レベルを達成することができる。該プロドラッグはまた、注射部位関連の有害な事象を軽減するシタラビンを投与する方法を提供する。プロドラッグからのシタラビンの持続的な放出は、連続的な注入から静脈内ボーラス剤または短期注入、s. c.、i. m.経口などへの投与様式を変えることができる。骨髄抑制は、なお治療に関連し得る。様々な機構を用いて、プロドラッグの骨髄抑制活性の影響を軽減することができ、例えば休薬、骨髄移植、または骨髄球性造血性細胞活性化を増大する薬剤（例えば、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エポエチン）を含む。
【００５９】
（治療学的な指標の増大）
いくつかの毒性はまた、ほとんど全ての抗癌剤に関連する。１次的なまたは２次的な肝臓癌の処置の間にこれらの毒性を軽減する努力において、薬剤は、肝臓の薬物曝露を増大するために、門脈動脈中に直接的に投与されることがある。腫瘍細胞崩壊性薬剤は典型的に有意な副作用と関連するという理由で、局所的な投与により、より大きな肝臓取り込みが可能となり、その結果肝臓外毒性を軽減することができる。肝臓の取り込みを更に増大させるために、塞栓化学療法が肝動脈薬物注入と組み合わせて使用されることがある。本発明におけるプロドラッグの高い肝臓の特異度は、全身性の副作用が新規なプロドラッグ方法によって同様に最少となるであろうことを示唆する。
【００６０】
その上、１次的なおよび２次的な肝臓癌は、化学療法および放射線療法の両方に対して特に耐性である。該耐性についての機構は完全に理解されていないが、肝臓遺伝子産物の増大（これは、速い代謝および／または化学療法薬剤の搬出を生じる）から生じ得る。加えて、通常生体内異物代謝および細胞毒性中間体の生成に関連する肝臓は複数の保護的な機構を有する性質を備え、その結果、これらの中間体からの損傷は最少となる。例えば、グルタチオンの細胞内濃度は他の組織と比べて肝臓中で非常に高く、その結果、このことはおそらく、タンパク質およびＤＮＡをアルキル化することができる中間体は速い細胞内反応によって解毒されることとなる。結果として、これらの機構のために肝臓は化学療法剤に対して耐性であり得て、従って成功するのに腫瘍細胞崩壊性薬剤の正常な濃度よりもより高いことを必要とする。より高い肝臓濃度はより高い用量の該薬剤を必要とし、このことは通常肝臓外毒性を生じる。
【００６１】
本発明のプロドラッグは、シタラビンの治療学的な指標（「ＴＩ」）を有意に増大させる。多くの場合に、該ＴＩの増大は、高い肝臓特異度の結果である。例えば、シタラビンは、キナーゼの低レベルのために、肝臓中でのリン酸化が乏しい。しかしながら、該キナーゼはなお毒性の標的器官（例えば、骨髄）中で高く発現し、このことにより、関連する用量−限定毒性を生じる。従って、より高濃度のアラＣＴＰをＣＹＰ３Ａ４発現の肝臓およびＨＣＣ細胞に特異的に運搬することによって、アラＣの環状プロドラッグは、肝臓中でのアラＣの有効性を改善する潜在能力を与える。
【００６２】
プロドラッグ切断の高い肝臓特異度は、プロドラッグ切断の副生成物もまた肝臓中で主に産生されることを意味する。従って、副生成物は副生成物の毒性を排除するかまたは最少とするかのいずれかである速い解毒反応を受けることが多いという理由で、副生成物に関連する毒性は最小となる。例えば、副生成物と化合物および／または肝細胞中に存在するタンパク質との間の反応（例えば、グルタチオン、およびプロドラッグの破壊によって生成するα,β−不飽和オレフィン）。その上、肝臓中に存在する酵素はまた更に、該副生成物を非毒性化合物に変換することができる（例えば、ヒドロキシピリジンの酸化および／または硫酸化、あるいはα,β−不飽和ケトンの還元など）。加えて、反応性の基およびα,β−不飽和カルボニル含有化合物（このものは、プロドラッグの破壊によって生成する）との間の環化反応に関与する細胞内反応は、副生成物の毒性を最小とすることができる。
【００６３】
該プロドラッグの細胞毒性は、Ｐ４５０活性（例えば、ＣＹＰ３Ａ４活性）を欠くセルラインを用いて、容易に評価する。
【００６４】
ＴＩの増大はまた、親薬剤の等価な用量と比べて、より多量の生物学的に活性な薬剤を肝臓に運搬することによって達成することができる。生物学的に活性な薬剤の肝臓中レベルの増大は、プロドラッグを、Ｐ４５０活性（例えば、ＣＹＰ３Ａ４活性）を誘発する薬剤（例えば、リファンピシン、グルココルチコイド、フェノバルビタール、エリスロマイシン）と一緒に投与することによって達成される。
【００６５】
（プロドラッグの安定性の改善方法）
生物学的な系中の化合物の安定性は、シタラビンに似た細胞毒性薬剤のプロドラッグの開発にとって重要である。例えば、血漿中に存在する酵素に対する安定性の欠落は、標的ＣＹＰ３Ａ４発現組織の代わりに血漿中での活性化合物の破壊を生じ、そして結果としてプロドラッグ戦略によって達成されることが望まれるＴＩを低下する。同様に、水性媒質中での内因的な安定性の欠如は、血漿中だけでなく、いずれかの器官中での該プロドラッグの破壊を生じるが、該プロドラッグはＴＩ中に分配され、再びＴＩは低下し得る。加えて、安定性の欠如は、該活性化合物の最終的な製剤化をより困難とするので（特に、該プロドラッグを非経口的に使用する場合）、薬物の開発が損なわれ得る。１態様において、本発明はアラＣＭＰのプロドラッグの全安定性を改善するために、アラＣＭＰの１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールプロドラッグの使用に関する。１態様において、アラＣＭＰのプロドラッグは、アラＣＭＰのシス−(４−ピリジル)プロドラッグである。別の態様において、アラＣＭＰのプロドラッグは炭素Ｃ’がＳ立体配置を有するアラＣＭＰのシス−(４−ピリジル)プロドラッグである。
【００６６】
該プロドラッグの安定性は、生物学的な液（例えば、血漿）、およびいくつかのｐＨおよび異なる緩衝化剤を用いて緩衝化された溶液中での該プロドラッグの破壊を追跡することによって、容易に測定される。
【００６７】
（薬力学的な半減期の改善）
シタラビンの薬力学的な半減期は、長時間にわたって該薬物を与える能力およびある場合には該プロドラッグのより長時間の薬物動態学的な半減期の両方の結果として、新規なプロドラッグの方法論によって延長することができる。両方の性質は、治療学的な薬物レベルを長時間にわたって維持することができ、その結果薬力学的な半減期を改善することができる。該薬力学的な半減期は、該代謝または排除の経路による妨害、続く親薬剤によって延長され得る。ある薬剤の場合には、本発明のプロドラッグは、代謝または排除の経路、続いて親薬剤によって妨害され得て、その結果動物において長時間存在することができる。例えば、シタラビンは、シチジンをウリジンに変換する代謝性酵素シチジンデアミナーゼについての基質であって、例えばシタラビンはアラビノフラノシル−ウラシルに変換される。しかしながら、アラＣＭＰのプロドラッグはこの酵素にとって基質ではなく、その結果として、シタラビンの直接的な投与と比較して、シタラビンのより長い薬力学的な半減期を生じる。
【００６８】
ホスフェート薬剤の一般的な排出経路は、腎臓、およびアニオン性化合物を認識するトランスポーターによる。循環からのホスフェート含有薬物の完全な排出は、薬物投与後のほんの数分で起こることが多い。本発明のプロドラッグは、肝臓および似た組織中での酸化および加水分解後までに負電荷を除くことによって、薬物の排出を遅らせる。
【００６９】
（製剤）
本発明の化合物は、総１日用量で約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇで投与する。最も好ましい用量範囲は、約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。該用量は、多数回に分けた用量として投与することができ、これは便利である。
【００７０】
他の抗ウイルス剤または腫瘍細胞崩壊性薬剤と組み合わせて使用する場合には、本発明の化合物は、１日用量としてまたは１日用量の適当な画分（例えば、ビッド(bid)）として投与することができる。該プロドラッグの投与は、他の抗ウイルス剤もしくは腫瘍細胞崩壊性薬剤を投与する時もしくはほぼその近く、または異なる時間に行なうことができる。本発明の化合物は多剤投与様式で使用することができ、このことは組み合わせまたは「カクテル」療法としても知られる。ここで、多剤は一緒に投与することができ、同時期もしくは異なる時間間隔で別々に投与することができ、または連続して投与することができる。本発明の化合物は、別の薬剤による処置期間後に、別の薬剤を用いる療法期間中に投与することができ、治療学的な投与様式の一部として投与することができ、あるいは処置プログラムにおける別の薬剤による療法の前に投与することができる。
【００７１】
本発明のプロドラッグは、更に有効性を増大しおよび／またはシタラビン関連毒性を軽減するために、様々な薬剤と組み合わせることができる。該療法の有効性を増大するであろう様々な組み合わせを想定することができる。癌に対して有効であることが知られる薬剤との組み合わせは転移を処置するのを助けることができ、このことにより、肝臓を避け、そしてプロドラッグ療法に対して応答しない。該薬剤は、よく知られる化学療法薬剤の群から選ばれる薬剤を含む。例えば、ＤＮＡ合成のインヒビター（ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、新生ピリミジン経路のインヒビター（例えば、チミジル酸合成酵素インヒビター、ジヒドロオロト酸脱水素酵素インヒビター、アスラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼインヒビター）、葉酸代謝拮抗剤（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素インヒビター、フォリポリグルタミン酸(folypolyglutamate)合成酵素インヒビター、プリン生合成のインヒビター（イノシン５’−モノホスフェートデヒドロゲナーゼインヒビター、グリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼインヒビター、リボヌクレシドジホスフェート還元酵素インヒビター、ポリアミン生合成のインヒビター（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、スペルミジン／スペルミンのＮ−アセチルトランスフェラーゼのインヒビター）、抗腫瘍性抗生物質、植物性アルカロイド、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、白金ベース薬剤、抗血管新生作用薬剤、チューブリンポリメラーゼインヒビターなどを含む。
【００７２】
本発明のプロドラッグとの組み合わせに適当である様々なよく知られる薬物クラスが想定され、このものとしては例えばエピポドフィロトキシン、カンプトテシン、アントラサイクリン、アントラピラゾール、コンブレタスタチンアナログ、エンジイン抗生物質、およびタキサンを含む。
【００７３】
本発明の１態様において、エトポシド、テニポシド、ＮＫ−６１１、ＧＬ−３３１、およびアザトキシン(azatoxin)を含めたエピポドフィロトキシンが好ましい。１態様において、エピポドフィロトキシンはエトポシドおよびテニポシドが挙げられる。１態様において、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ルルトテカン(Lurtotecan)（ＧＩ １４７２１１）、９−アミノカンプトテシン、ＧＧ−２１１、ＤＸ−８９５１Ｆ、ＳＫＦ １０７８７４、およびＳＫＦ １０８０２５を含むカンプトテシンが好ましい。別の態様において、カンプトテシンは、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ルルトテカン、および９−アミノカンプトテシンを含む。別の態様において、カンプトテシンは、トポテカンおよびイリノテカンを含む。１態様において、タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、およびＦＣＥ−２８１６１を含む。別の態様において、タキサンは、パクリタキセルを含む。１態様において、コンブレタスタチンとしては例えば、コンブレタスタチンＡ−４、および報告されている(Ｓ,Ｓ)ジオキソランアナログ（Bioorg. Med. Chem. Lett. 88: 1997-2000 (1998））を含む。１態様において、アントラピラゾールは例えば、ミトキサントロン、ピロキサントロン(piroxantrone)、およびロソキサントロン(Losoxantrone)を含む。１態様において、アントラサイクリンは例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、プリカマイシン、バルルビシン、ダクチノマイシン、およびエピルビシンを含む。別の態様において、アントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、およびイダルビシンが挙げられる。別の態様において、アントラサイクリンとしてはピラルビシンおよびドキソルビシンを含む。１態様において、エンジイン抗生物質としては例えば、ネオカルジノスタチン、カリーチアマイシン、およびエスペラマイシン(esperamicin)を含む。別の態様において、エンジイン抗生物質としては例えば、ネオカルチノスタチン、カリーチアマイシン、およびダイネミシンを含む。１態様において、ＤＮＡ損傷薬剤、例えばアルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、アジリジン）、ニトロソ尿素、および金属錯体を使用する。１態様において、マイトマイシンが好ましい。１態様において、白金錯体としては、シスプラチン、ネダプラチン、ミリプラチン、およびカルボプラチンを含む。１態様において、アルキル化剤としては例えば、シクロホスファミド、イホスファミドを含む。１態様において、ニトロソ尿素としては例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、テモゾロマイドを含む。本発明の１つの好ましい態様において、細胞周期依存性インヒビターが好ましく、例えば５−ＦＵ、ドキソフルリジン、ゲムシタビン、クラドリビン、フルダラビンを含む。１態様において、葉酸代謝拮抗剤としては例えば、メトトレキセートを含む。別の態様において、本発明のプロドラッグと組み合わせて有用な腫瘍細胞崩壊性薬剤としては例えば、ブスルファン、チオテパ、メルファラン、およびルロテカを含む。
【００７４】
１態様において、シタラビンと相乗的に作用する薬剤を使用する。これらの薬剤としては例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、メルカプトプリン、チオグアニン、メトトレキセート、６−チオグアニン、および３−デアザウリジン(3-deazauridine)）を含む。
【００７５】
別の態様において、本発明のプロドラッグは、細胞周期の進行をＳ−期にまで刺激することが知られる薬剤と組み合わせて、その結果そのものを本発明のプロドラッグに対してより感受性とする。
【００７６】
別の態様において、本発明のプロドラッグは、アポトーシスを刺激することが知られる薬剤と組み合わせる。該薬剤としては例えば、カスパーゼ−３−インヒビターを含む。
【００７７】
該組み合わせ療法は、宿主に該薬剤を別々にまたは同時のいずれかで投与することを包含する。１態様において、該プロドラッグを腫瘍細胞崩壊性薬剤と同時に投与する。該薬剤は、同じビヒクルでまたは別々に投与することができる。両方の薬剤は、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）または他の経路（例えば、経口、直腸、鼻腔、局所、膣、および経皮を含む）によって投与することができる。１態様において、両方の薬剤を、同じカプセル剤または別々の丸剤としてのいずれかで同時に投与する。別の態様において、両方の薬剤は食餌の時間中（摂食の直前または摂食の直後）に投与する。別の態様において、該薬物の組み合わせは別々の時期に投与する。１態様において、薬剤投与は、該サイクル療法の期間内であるが、時期で分ける。別の態様において、薬剤は対薬剤(partner drug)の休薬日中に投与する。
【００７８】
腫瘍細胞崩壊性薬剤または抗ウイルス剤、および本発明の化合物は、別々に投与することができ、または同時に投与することができる。適当な腫瘍細胞崩壊性薬剤としては例えば、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ミリプラチン、テモゾロマイド、チオテパ、メルファラン、イホスファミド、シクロホスファミド、クロラムブシル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、バルルビシン、ダクチノマイシン、ゲムシタビン、フロキシウリジン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、チオグアニン、メトトレキセート、マイトマイシン、エトポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ネダプラチン、カルムスチン、ドキシフルリジン、クラドリビン、フルダラビン、アザトキシン(azatoxin)、カンプトテシン、ルルトテカン(lurtotecan)、９−アミノカンプトテシン、ピラルビシン(pirarubin)、ネオカルチノスタチン、カリーチアマイシン、エスペラミシン、およびルロテカ(luroteca)を含む。
【００７９】
本発明の目的のために、該化合物は、様々な方法（例えば、経口、非経口を含む）によって、吸入用スプレー剤によって、または医薬的に許容し得る担体、調節剤およびビヒクルを含有する製剤で局所的にもしくは直腸的に、投与することができる。本明細書中で使用する用語「非経口」とは例えば、様々な注入方法を用いる皮下、静脈内、筋肉内、および動脈内の注射を含む。本明細書中で使用する動脈内および静脈内の注射としては例えば、カテーテルを用いる投与を含む。静脈内投与が、通常好ましい。
【００８０】
医薬的に許容し得る塩としては例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、ベシレート、ブロミド、カムシレート(camsylate)、クロリド、クエン酸塩、エジシレート(edisylate)、エストレート(estolate)、フマル酸塩、グルセプタン酸塩(gluceptate)、グルコン酸塩、グルコラナン酸(glucoranate)、馬尿酸塩、ヒクレート(hyclate)、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、マレイン酸塩、メシレート、臭化メチル塩、硫酸メチル塩、ナプシレート(napsylate)、硝酸塩、オレイン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩(polygalacturonate)、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テルフタル酸塩、トシレート、およびトリエチオダイド(triethiodide)を含む。
【００８１】
該活性成分を含有する医薬組成物は、意図する投与方法に適当ないずれかの形態であり得る。経口使用に使用する場合には、例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤(lozenges)、水性もしくは油性の懸濁剤、分散可能な散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤を製造することはできる。経口的な使用を意図する組成物は、医薬組成物の製造について当該分野に知られるいずれかの方法に従って製造することができ、そして該組成物は、口に合う製剤を得るために１つ以上の薬剤（例えば、甘味剤、芳香剤、着色剤、および保存剤を含む）を含み得る。錠剤の製剤に適当である、非毒性の医薬的に許容し得る賦形剤と混合した活性成分を含有する錠剤は、許容され得る。これらの賦形剤としては例えば、不活性な希釈剤（例えば、カルシウムもしくはナトリウムの炭酸塩、ラクトース、カルシウムもしくはナトリウムのリン酸塩）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、穀物デンプン、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシア）；および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であり得る。錠剤はコーティングしなくてもよく、あるいは公知の技術（例えば、マイクロカプセル化を含む）によってコーティングすることができ、胃腸管中での崩壊および吸収を遅延させて、その結果長時間にわたる徐放作用を得ることができる。例えば、時間遅延物質（例えば、グリセリル・モノステアリン酸、またはグリセリル・ジステアリン酸）を単独でまたはワックスと一緒に使用することができる。
【００８２】
経口使用のための製剤はまた、硬カプセル剤（ここでは、活性成分は不活性な固体希釈剤（例えば、リン酸カルシウムまたはカオリン）と一緒に混合する）として、または軟カプセル剤（ここでは、活性成分は水もしくは油性媒質（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油）と一緒に混合する）として供することもできる。
【００８３】
本発明の水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適当な賦形剤と混合して活性物質を含む。該賦形剤としては例えば、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアガム）、および崩壊剤または湿潤剤（例えば、天然のホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸（例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸）との縮合生成物、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコール（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）との縮合生成物、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレイン酸塩）との縮合生成物を含む。該水性懸濁剤はまた、１つ以上の保存剤（例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート）、１つ以上の着色剤、１つ以上の芳香剤、および１つ以上の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含み得る。
【００８４】
油性の懸濁剤は、該活性成分を、植物油（例えば、アラチド(arachid)油、オリーブ油、ごま油、または、やし油）、または鉱油（例えば、流動パラフィン）中で懸濁することによって製剤化することができる。該経口懸濁剤は、粘稠剤（例えば、蜜蝋、硬(hard)パラフィン、またはセチルアルコール）を含み得る。甘味剤（例えば、上記のもの）および芳香剤を加えて、口当たりのよい経口製剤を得ることができる。これらの組成物は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）を加えることによって保存することができる。
【００８５】
水を加えることによる水性懸濁剤の製造に適当な本発明の分散可能な散剤および顆粒剤は、該活性成分を分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、および１つ以上の保存剤と混合して得る。適当な分散剤、湿潤剤および懸濁化剤は、上記に開示するものによって例示される。別の賦形剤（例えば、甘味剤、芳香剤、および着色剤）をもまた存在し得る。
【００８６】
本発明の医薬組成物はまた、油中水滴乳剤の形態であり得る。該油層は、植物油（例えば、オリーブ油、またはアラチド油）、鉱油（例えば、流動パラフィン）、またはこれらの混合物であり得る。適当な乳化剤としては例えば、天然ガム（例えば、アカシアガム、およびトラガカントガム）、天然のホスファチジド（例えば、大豆レシチン）、脂肪酸およびヘキシトール(hexitol)無水物由来のエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタン・モノオレイン酸）、およびこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレイン酸）を含み得る。該乳剤はまた、甘味剤および芳香剤を含み得る。
【００８７】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤（例えば、グリセリン、ソルビトール、またはスクロース）と一緒に製剤化することができる。該製剤はまた、粘滑剤、保存剤、芳香剤、または着色剤を含み得る。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、減菌注射可能な製剤の形態（例えば、減菌注射可能な水性または油性の懸濁剤）であり得る。この懸濁剤は、上記の適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、当該分野における通常の知識に従って製剤化することができる。該減菌注射可能な製剤はまた、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の減菌注射可能な液剤または懸濁剤（例えば、１,３−ブタン−ジオール中の液剤）であり得たり、または凍結乾燥した散剤として製造することができる。使用することができる許容し得るビヒクルおよび溶媒としては、水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、減菌キャリアオイル(fixed oil)は通常、溶媒または懸濁化媒質として使用することができる。この目的のために、いずれかの無刺激性(bland)のキャリアオイルを使用することができ、例えば合成モノ−またはジ−グリセリドを含む。加えて、脂肪酸（例えば、オレイン酸）は同様に、注射剤の製造において使用することができる。
【００８９】
１回投与形態を得るために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置する宿主および投与の様式に応じて変わる。例えば、ヒトに経口投与することを意図する時間放出製剤は、適当で且つ便利な量の担体物質と一緒に成型する、活性物質の２０〜２０００μｍｏｌ（約１０〜１０００ｍｇ）を含み得て、これは全組成物の約５〜約９５％にまで変えることができる。投与のための容易に測定可能な量を与える医薬組成物を製造することが好ましい。例えば、静脈注入を意図する水性液剤は、溶液のミリリットル当たり活性成分の約０．０５〜約５０μｍｏｌ（約０．０２５〜２５ｍｇ）を含むべきであって、その結果、約３０ｍＬ／時間の割合である適当な容量の注入が生じ得る。
【００９０】
上記の通り、経口投与に適当な本発明の製剤は、別個の単位、例えばカプセル、サッシェ、錠剤（各々は、予め決めた量の活性成分を含有する）；散剤もしくは顆粒剤；水性もしくは非水性の液体中の液剤もしくは懸濁剤として；または、水中油滴液体乳剤もしくは油中水滴液剤乳剤として供することができる。該活性成分はまた、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤として投与することができる。
【００９１】
錠剤は、場合により１つ以上の補助成分と一緒に、圧縮または成型によって製造することができる。圧縮錠剤は、流動形態の活性成分を適当な機械中で圧縮することによって製造する。該流動形態の活性成分としては、例えば散剤または顆粒剤が挙げられ、これらは場合により、結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、または崩壊剤と一緒に混合する。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤を用いて湿らせた粉末状化合物の混合物を適当な機械中で成型することによって製造することができる。該錠剤は場合によりコーティングまたはスコアすることができ、そしてこれは該活性成分の遅いかまたはコントロールされた放出を得るために、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で用いて製剤化して、所望する放出プロファイルを得ることができる。錠剤は場合により腸溶性コーティングを用いて供することができて、胃以外の腸の部分中での放出を得ることができる。このことは、該化合物が酸加水分解に対して感受性である場合には、式Ｉの化合物の場合に有利である。
【００９２】
口中での局所投与に適当な製剤としては例えば、芳香基材（通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガント）中に活性成分を含有するトローチ剤；不活性な基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に活性成分を含有するパステル剤；および、適当な液体担体中に活性成分を含有する洗口剤を含む。
【００９３】
直腸投与のための製剤は、例えばココアバターまたはサリチル酸を含有する適当な基材を用いて坐剤として供することができる。
【００９４】
膣投与に適当な製剤は、活性成分に加えて、適当であると当該分野において知られる担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、発泡剤またはスプレー剤として供することができる。
【００９５】
非経口投与に適当な製剤としては例えば、水性および非水性の等張性の減菌注射液剤を含み、このものは抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤、および溶質（このものは、該製剤を目的のレシピエントの血液と等張とする）；並びに、水性および非水性の減菌懸濁剤（このものは、懸濁化剤および増粘剤を含み得る）を含む。該製剤は、１回用量または複数回用量の封した容器（例えば、アンプル剤、およびバイアル）中で供することができ、そしてこのものはフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができ、これは使用する直前に、減菌液体担体（例えば、注射用の水）を加えることを要するのみである。注射可能な液剤および懸濁剤は、上記の種類の減菌性の散剤、顆粒剤および錠剤から製造することができる。
【００９６】
非経口投与に適当な製剤は、留置(indwelling)ポンプまたは病院用バッグ(hospital bag)によって連続注入様式で投与することができる。連続的な注射は、外部のポンプによる注射を含む。該注射は、ＨｉｃｋｍａｎもしくはＰＩＣＣ、または製剤を非経口もしくは静脈内のいずれかで投与するためのいずれかの他の適当な方法を用いて、行なうことができる。
【００９７】
好ましい１回投与製剤は、薬物の１日用量もしくは単位、１日サブ用量、またはそれらの適当な画分を含有する製剤である。
【００９８】
しかしながら、いずれかのある患者にとっての具体的な用量レべルは、様々な因子（例えば、使用する具体的な化合物の活性；処置する個体の年齢、体重、通常の健康、性別および食餌；投与の時間および経路；分泌の速度；これまでに投与されてきた他の薬剤；並びに、治療を受けているある疾患の激しさ）に依存すると理解すべきであり、このことは、当該分野の当業者によって十分に理解される。
【００９９】
（本発明によって製造される化合物）
本発明によって製造される化合物および中間体は、式Ｉ：
【化１４】
0004689274.tif 000016
［式中
ＭおよびＶは互いにシスであって、そしてＭＨはシタラビンであり；
該シタラビンの５’酸素はリンと結合し；
Ｖは４−ピリジルである］
によって示される６員の環状リン酸ジエステルプロドラッグ、並びにその医薬的に許容し得るプロドラッグおよびその塩である。
【０１００】
本発明の別の態様は、式ＩＩ：
【化１５】
0004689274.tif 000017
［式中、
ＭＨは５’ヒドロキシル位置における酸素原子によって式ＩＩ中のリンと結合し；
Ｖは、４−ピリジルである］
によって示される化合物、またはその医薬的に許容し得るプロドラッグもしくはその塩である。
【０１０１】
本発明の別の態様は、式ＩＩＩ：
【化１６】
0004689274.tif 000018
によって示される化合物、またはその医薬的に許容し得るプロドラッグもしくはその塩である。
【０１０２】
１．０．リン酸化試薬の合成：
１,３−ジオールを製造するための様々な合成方法が知られる。これらの適当な方法は２つのタイプに分類され、以下の通りである：１）ラセミの１−(アリール)−プロパン−１,３−ジオールの合成；２）エナンチオリッチな(enantioenriched)１−(アリール)−プロパン−１,３−ジオールの合成。
【０１０３】
１．１．ラセミの１−(アリール)−プロパン−１,３−ジオールの合成：
１,３−ジヒドロキシ化合物は、刊行物からのいくつかのよく知られる方法によって製造することができる。置換された芳香族アルデヒドを利用して、酢酸アルキルのリチウムエノレートの付加、続いてエステル還元によってラセミの１−(アリール)プロパン−１,３−ジオールを合成する（経路Ａ）（Turner, J. Org. Chem. 55: 4744 (1990)）。別法として、１−ヒドロキシプロパン−３−アールへのアリールグルニャール付加はまた、１−(アリール置換)プロパン−１,３−ジオールを与える（経路Ｂ）。本方法により、様々な置換されたアリールハライドの１−(アリール置換)−１,３−プロパンジオールへの変換が可能となる（Coppiらによる、J. Org. Chem. 53: 911 (1988)）。アリールハライドはまた、１,３−ジオキサ−４−エンのヘックカップリング反応、続く還元および加水分解によって、１−置換プロパンジオールを合成することができる（Sakamotoらによる、Tetrahedron Lett. 33: 6845 (1992)）。ピリジル、キノリン、イソキノリンプロパン−３−オール誘導体は、Ｎ−オキシド形成、続く無水酢酸条件下での転位によって、１−置換−１,３−ジオールへ酸素化することができる（Yamamotoらによる、Tetrahedron 37: 1871 (1981)）。様々な芳香族アルデヒドをまた、ビニルグリニャール付加、続くハイドロボレーション反応によって、１−置換−１,３−ジオールに変換することができる（経路Ｄ）。
【化１７】
0004689274.tif 000019
【０１０４】
１．２  エナンチオリッチな１−(アリール)−プロパン−１,３−ジオールの合成：
化学的なまたは酵素学的な薬剤による第２級アルコールの分離のための様々な公知の方法が、ジオールエナンチオマーの製造に使用することができる（Haradaらによる、Tetrahedron Lett. 28: 4843 (1987)）。３−アリール−３−オキソ−プロピオン酸またはエステルの遷移金属触媒水素添加は、ベータヒドロキシ酸またはエステルのＲまたはＳ−異性対を高エナンチオ純度で製造するための効率の良い方法である（Comprehensive Asymmetric Catalysis, Jacobsen, E. N., Pfaltz, A., Yamamoto, H. (編), Springer, (1999)；Asymmetric Catalysis in organic Synthesis, Noyori, R., John Wiley, (1994)）。これらのベータヒドロキシ酸またはエステル生成物は更に還元して、必要とされる１−(アリール)−プロパン−１,３−ジオールを高ｅｅで得ることができる（経路Ａ）。高圧水素添加または水素移動反応のためのβ−ケト酸またはエステルの基質を、様々な方法、例えば、塩基の存在下でのアセトフェノンと炭酸ジメチルとの縮合によって（Chuらによる、J. Het Chem. 22: 1033 (1985)）、エステル縮合によって（Turnerらによる、J. Org. Chem. 54: 4229 (1989）、またはアリールハライドから（Kobayashiらによる、Tetrahedron Lett. 27: 4745 (1986)）製造することができる。別方法として、高エナンチオ純度の１,３−ジオールを、β−ヒドロキシエチルアリールケトン誘導体またはβ−ケト酸誘導体のエナンチオ選択的なボラン還元によって得ることができる（経路Ｂ）（Ramachandranらによる、Tetrahedron Lett. 38: 761 (1997)）。別の方法において、商業的に入手可能なシンナミルアルコールを、触媒的な不斉エポキシ化条件下でエポキシアルコールに変換することができる。これらのエポキシアルコールはＲｅｄ−Ａｌによって還元されて、高ｅｅを有する１,３−ジオールを与える（経路Ｃ）（Gaoらによる、J. Org. Chem. 53: 4081 (1980)）。エナンチオ選択的なアルドール縮合は、芳香族アルデヒドから出発する、高いｅｅを有する１,３−酸素化官能基の合成についての別に十分に記載されている方法である（経路Ｄ）（Mukaiyama, Org. React. 28: 203 (1982)）。
【化１８】
0004689274.tif 000020
【０１０５】
本発明の目的のために、該中間体ケトエステルを、式Ａで示される４−アセチルピリジンから製造する。Ｃ’は、本発明によって製造される最終化合物におけるメチン炭素不斉中心である炭素と同一である。
【化１９】
0004689274.tif 000021
【０１０６】
式Ａの化合物は炭酸ジメチルと反応させて、オキソ−プロパン酸メチルエステルを得る。該不斉中心は、Noyori（Fujiiらによる、J. Am. Chem. Soc. 118(10): 2521-2 (1996)）の水素移動方法を用いて導入する。該オキシ−プロパン酸エステルは、エナンチオリッチなルテニウム触媒（１０）の存在下でヒドロキシエステル中間体に還元して、このものは更に水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元して、以下の式Ｂ：
【化２０】
0004689274.tif 000022
で示されるエナンチオリッチな１,３−プロパンジオールを得る。
【０１０７】
炭素Ｃ’上の不斉中心は本製法の段階において確立され、そして該エナンチオマー過剰率は該製法の残りの期間中、保たれた。
【０１０８】
１．３．リン酸化試薬の合成
本発明の別の態様は、式Ｃ：
【化２１】
0004689274.tif 000023
［式中、
Ｌは、ハロゲン、１〜３個の電子吸引基によって置換されたアリールオキシ基からなる群から選ばれる脱離基である］
で示されるリン酸化剤の製造である。
【０１０９】
基Ｌおよび４−ピリジルは、互いにトランスである。
【０１１０】
式Ｃの化合物はいずれかのラセミであり、炭素Ｃ’上にＳ立体配置を有するか、または炭素Ｃ’上にＲ立体配置を有する。
【０１１１】
式Ｃのリン酸化試薬の一般的な合成は、１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールを式Ｃｌ２Ｐ(Ｏ)−Ｌのホスホロジクロリデートと反応させることによって達成する。１態様において、脱離基Ｌは、ハロゲンおよび１〜３個の電子吸引基によって置換されたアリールオキシ基である。別の態様において、脱離基は、ハロゲン（例えば、クロロまたはブロモ）および置換されたアリールオキシ基（例えば、クロロフェノキシ、ジクロロフェノキシ、またはニトロフェノキシ）である。別の態様において、脱離基は、クロロ、４−クロロフェノキシ、３,５−ジクロロフェノキシ、２−４−ジクロロフェノキシ、および４−ニトロフェノキシが挙げられる。Ｌがアリールオキシであるホスホロジクロリデートは、置換フェノールをオキシ塩化リンと反応させることによって製造する（Rathoreらによる、Indian J. Chem B 32 (10), 1066 (1993)）。
【０１１２】
エナンチオリッチな活性化リン酸化剤は、エナンチオリッチな１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールを塩基の存在下で式Ｌ−Ｐ(Ｏ)Ｃｌ２のホスホロジクロリデートを用いてリン酸化することによって製造する（Ferroniらによる、J. Org. Chem. 64 (13), 4943 (1999)）。１態様において、添加の順序は、選択した溶媒中での該ホスホロジクロリデートの溶液への該ジオールおよび該塩基の溶液の添加を含む。別の態様において、該ジオールおよび該塩基の溶液、および同じ溶媒または異なる溶媒中での該ホスホロジクロリデート含有の別溶液を、該選択した溶媒に同時に加える。別の態様において、該ジオールの溶液を該ホスフェート試薬の溶液に加え、続いて塩基を添加する。該ジオールのリン酸化のための典型的な溶媒は極性非プロトン性溶媒であって、このものはホスホロジクロリデートとの低い反応性を有し、そして該ジオールまたは該ホスホロジクロリデートを溶解する。１態様において、リン酸化反応を行なうための溶媒は、ジクロロメタン、ＴＨＦ、アセトニトリル、ピリジン、テトラアルキルウレア、トリアルキルホスフェート、またはヘキサアルキルホスホラミデートが挙げられる。別の態様において、該溶媒は、ジクロロメタン、ＴＨＦ、アセトニトリル、ピリジン、ＤＭＰＵ、ＤＭＥＵ、テトラメチルウレア、リン酸トリメチル、またはヘキサメチルホスホラミデートが挙げられる。該反応温度は、特に該反応の最初の相の間（これは、発熱反応である）に低温を保って、試薬の完全性を保存する。１態様において、温度を室温以下、−２０℃〜１０℃の間に保つ。１態様において、該発熱をコントロール下におき、該反応温度をゆっくりと室温まで昇温させて、該リン酸化試薬の生成を完全とする。別の態様において、該試薬の完全性を保つために該反応の完結まで、該温度を同じに保つ。リン原子の不斉性質のために、上記の反応条件下での該ホスホロジクロリデートの該ジオールとの反応は、シスおよびトランス異性体の混合物を与え、該シス異性体がわずかに有利である。典型的なシス／トランスの比率は、５０／５０〜６０／４０の範囲に及ぶ。該シスおよびトランス異性体は、カラムクロマトグラフィーおよび／または結晶化の組み合わせによって分離する。本発明の１態様において、我々は、４−ニトロフェノキシリン酸化試薬の単離シス−異性体を４−ニトロフェノールの塩と一緒に加熱する場合に、単離した該リン酸化試薬の＞８５％がトランス−異性体であることを見出した。更に、該エンリッチを達成するのに、該混合物の前単離は全く必要でないことが分かった。例えば、該フェノール−脱離基の塩を該粗反応混合物に添加することにより（ここで、該ジオールのアリールオキシリン酸化試薬を得る）、リン酸化試薬の単離混合物について増強を行なう場合に得られるのと同じ比率で、式Ｃのトランス−異性体の増強を伴って発生する。同様に、式Ｃ（Ｌ＝Ｃｌである）の化合物のシスおよびトランスのホスホロクロリデートの等モル混合物を加熱する場合に、該トランス異性体だけを単離することができる。該フェノキシド塩は、対応するフェノールを塩基（トリアルキルアミン、窒素含有へテロ環、またはナトリウムが好ましい）と反応させることによって生成する。１態様におい��、塩基はトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ＤＡＢＣＯ、ＤＢＵ、水素化ナトリウム、またはアルカリ金属が挙げられる。別の態様において、塩基はトリエチルアミン、ＤＢＵ、または該フェノキシドのナトリウム塩である。該エンリッチ工程は室温で行なうことができるが、通常は反応時間を減少するために加熱し、４０℃〜７０℃の範囲内であることが好ましい。該アリールオキシリン酸化試薬の変換は該対応するフェノキシドの塩の添加を要するが、好ましい塩基との該ホスホロクロリデートそのものの生成は２当量のクロリドイオンを生成するので、可溶なクロリド塩の更なる使用を要しない。１態様において、該ジオールのリン酸化の完結後に、次いで該反応混合物を加熱して（４０℃〜７０℃の範囲内が好ましい）、該シス異性体を該トランス異性体に完全に変換する。別の態様において、該温度は試薬の添加に用いるのと同じ温度を保つ。
【０１１３】
エナンチオリッチなジオールからのエナンチオリッチなリン酸化剤の製造のためには、炭素Ｃ’上のキラリティーの保存が重要である。部分的なラセミ化は１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールを用いた場合に観察され、ここで、該ジオールの最初の９８％ｅｅは、単離トランス−リン酸化試薬の場合には、上記の条件を用いて＜８５％にまで低下した。本発明の１態様において、Ｎ−含有ヘテロアリール溶媒の使用は、該トランス−リン酸化剤の光学純度を９５％ｅｅ以上に保つことを発見した。１態様において、Ｎ−含有ヘテロアリール溶媒は、場合により置換されたピリジン、キノリン、およびピラジンである。別の態様において、Ｎ−含有ヘテロアリール溶媒は場合により置換されたピリジンである。別の態様において、該Ｎ−含有ヘテロアリール溶媒はピリジンである。本発明の他の態様において、該ホスホロジクロリデートまたはオキシ塩化リンの添加前にエナンチオリッチな１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールの塩の生成、および続く塩の添加がＣ’炭素のエピマー化を防止し、Ｎ−含有ヘテロアリール溶媒の使用を必要としないことを発見した。１態様において、１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールの塩は、１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールをｐｋａ＜２を有する有機酸または鉱酸と反応させることによって製造する。別の態様において、塩はｐｋａ＜１を有する鉱酸である。別の態様において、塩は塩酸塩および臭化水素酸塩である。該シスおよびトランス異性体は、カラムクロマトグラフィーおよび／または結晶化の組み合わせによって分離する。しかしながら、エンリッチ工程を行なった後に、該トランス−異性体の単離は、＞９５％のトランス−異性体およびｅｅが＞９５％である大きな純度のリン酸化試薬を非常に容易に得た。１態様において、該トランス−リン酸化試薬を単離する。別の態様において、該リン酸化試薬を溶液中に保ち、そしてこのものを精製することなく、ヌクレオシドのリン酸化のために使用する。該リン原子の相対的な立体配置は、３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルの比較によって測定する。エクアトリアルなホスホリルオキシ部分（トランス−異性体）の化学シフトは、アキシャル異性体（シス−異性体）の値よりもより高磁場である（Verkadeらによる、J. Org. Chem. 42, 1549 (1977)）。
【０１１４】
２．０  アラＣＭＰのシス−プロドラッグの合成
式Ｉのシス−プロドラッグの合成の場合には、該プロドラッグ部分は該合成の異なる段階で導入することができる。該環状ホスフェートは、様々な反応条件に対するこれらの基の一般的な反応性のために、より遅い段階で導入されることが最も多い。該合成はまた、保護または非保護のシタラビンを用いることによって進めることもできる。該シス−プロドラッグの単一立体異性体は、該ジアステレオ異性体をカラムクロマトグラフィーおよび／または結晶化の組み合わせによる分離によるか、あるいはエナンチオリッチなリン酸化剤を用いるエナンチオ特異的な合成によるかのいずれかによって製造することができる。
【０１１５】
２．１  シタラビンの保護
アラＣ（Merck Index 11th Edition, 2790番号）およびそのアナログの様々な製造法は刊行物中に記載されており（例えば、米国特許第3,116,282号；Shenらによる、J. Org. Chem. 30: 835-838 (1965)；Hessler, J. Org. Chem. 41(10): 1828-1831(1976)）、そしてこれは当該分野の当業者にとって知られる。
【０１１６】
シタラビンはまた商業源から入手することができ、例えばShanghai Freeman International Trading Co., Brantford, Sigma, Fluka, and Sunray Pharmaceuticalsを含むが、これに限定されない。
【０１１７】
保護シタラビンのリン酸化についての一般的な方法は、適当に保護されたシタラビン中間体を塩基と反応させ、そして該得られたアルコキシドを該リン酸化試薬と反応させることによって達成される。該保護されたシタラビンは、ヌクレオシドの保護について記載の多数の方法の１つを用いて、当業者によって製造することができる（Greene T. W.による、Protective Groups in Origaic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1999)）。該ヌクレオシドは、リン酸化工程を妨害しまたは位置異性体を誘導し得るヌクレオシド上の残りのヒドロキシルおよび他の官能基をすべて保護しながら、該リン酸基を加える該５’−ヒドロキシル基を曝露させるような様式で保護する。１態様において、選ばれる保護基は強塩基に耐性であって、例えばエーテルおよびシリルエーテルが挙げられる。別の態様において、該保護基は場合により置換されたＭＯＭエーテル、ＭＥＭエーテル、およびトリアルキルシリルエーテルである。別の態様において、該保護基はｔ−ブチルジメチルシリルエーテルである。更なる保護は、いずれかの酸性プロトンを除くためにシタラビンの４−窒素をマスクすることを包含する。１態様において、選ばれるＮ−保護基は、ジアルキルホルムアミジン、モノおよびジアルキルイミン、モノおよびジアリールイミンの群から選ばれる。１態様において、該Ｎ−保護基はジアルキルホルムアミジン、モノ−アルキルイミン、およびモノアリールイミンからなる群から選ばれる。１態様において、該モノ−アルキルイミンはベンジルイミンであって、そして該モノ−アリールイミンはフェニルイミンである。別の態様において、該Ｎ−保護基は、ジエチルホルムアミジンおよびジエチルホルムアミジンの群から選ばれる対称ジアルキルホルムアミジンである。
【０１１８】
１態様において、シタラビンの保護は、以下の４工程の方法によって達成される。シタラビンは、ＤＭＰＵ中で塩化ベンソイルを用いて処理して、ベンゾエートエステルを得る。該エステルをｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドと一緒に加熱して、ジシリルおよびモノシリルの化合物の混合物を得る。該粗混合物をエタノール性ヒドラジンを用いて処理して、該エステルを切断する。水性ワークアップおよび塩酸塩としての精製により、単一物として目的の２’,３’−ジシリルシタラビンを与える。このものは、ジメチルホルムアミドジメチルアセタールと一緒に混合して、式Ｄ：
【化２２】
0004689274.tif 000024
中に示す通り、保護されたシタラビンホルムアミジン化合物を与える。
【０１１９】
２．２  保護されたシタラビンのリン酸化
適当に保護されたシタラビンにおける曝露されたアルコキシド基のヒドロキシル基の生成は、塩基に感受性でない非プロトン性溶媒（例えば、ＴＨＦ、ジアルキルおよび環状ホルムアミド、エーテル、トルエン、およびそれらの溶媒の混合物）中で塩基を用いて達成する。１態様において、該溶媒は、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＥＦ、Ｎ−メチルピロリジン、ＴＨＦ、およびそれらの溶媒の混合物である。
【０１２０】
多数の異なる塩基を、環状および非環式のリン酸化剤を用いる、ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド化合物のリン酸化のために使用する。例えば、トリアルキルアミン（例えば、トリエチルアミン（Roodsariらによる、J. Org. Chem. 64(21), 7727 (1999)）またはジイソプロピルエチルアミン（Meekらによる、J. Am. Chem. Soc. 110(7), 2317 (1988)）；窒素含有へテロ環アミン（例えば、ピリジン（Hoeflerらによる、Tetrahedron 56(11), 1485 (2000)）、Ｎ−メチルイミダゾール（Vankayalapatiらによる、J. Chem.. Soc. Perk T 1 14, 2187 (2000)）、１,２,４−トリアゾール（Takakuらによる、Chem. Lett. (5) 699 (1986)）またはイミダゾール（Dyatkinaらによる、Tetrahedron Lett. 35(13), 1961 (1994)）；有機金属塩基（例えば、カリウムｔ−ブトキシド（Postelらによる、J. Carbohyd. Chem. 19(2), 171 (2000)）、ブチルリチウム（Torneiroらによる、J. Org. Chem. 62(18), 6344 (1997)）、ｔ−ブチルマグネシウムクロリド（Hayakawaらによる、Tetrahedron Lett. 28(20), 2259 (1987)）またはＬＤＡ（Aleksiukらによる、J. Chem. Soc. Chem. Comm. (1)11 (1993)）；無機塩基（例えば、フッ化セシウム（Takakuらによる、Nippon Kagaku Kaishi (10), 1968 (1985)）、水素化ナトリウム（Hanaokaらによる、Heterocycles, 23(11), 2927) (1985)）、ヨウ化ナトリウム（Strombergらによる、J. Nucleos. Nucleot. 6(5), 815 (1987)）、ヨウ素（Strombergらによる、J. Nucleos. Nucleot. 6(5), 815 (1987)）または水酸化ナトリウム（Attanasiらによる、Phosphorus Sulfur 35(1-2), 63 (1988)）；金属（例えば、銅（Bhatiaらによる、Tetrahedron Lett. 28(3), 271 (1987)）である。しかしながら、式Ｃのリン酸化試薬のカップリング反応が上記の方法を用いて達成される場合に、該リンキラル中心上で反応およびラセミ化が全くないことが観察された。特に、反応が全くないことが、対応する環状ホスフェートを高収率で得るために、置換された環状リン酸化試薬と一緒にこれまでに使用された塩基の場合に観察され、例えば水素化ナトリウム（Thuongらによる、Bull. Soc. Chim. Fr. 667 (1974)）、ピリジン（Ayral-Kaloustianらによる、Carbohydr. Res. 187 (1991)）、ブチルリチウム（Hulstらによる、Tetrahedron Lett. 1,339 (1993))、ＤＢＵ（Mercklingらによる、Tetrahedron Lett. 2217 (1996)）、トリエチルアミン（Hadvaryらによる、Helv. Chim. Acta 69(8), 1862 (1986)）、Ｎ−メチルイミダゾール（Ｌｉらによる、Tetrahedron Lett. 6615 (2001)）またはナトリウムメトキシド（Gorensteinらによる、J. Am. Chem. Soc. 5077 (1980)）が挙げられる。本発明の１態様において、グリニャール試薬の使用により、リン中心の最少のエピマー化でリン酸化が促進されることを見出した。１態様において、グリニャール試薬は、アルキルおよびアリールのグリニャールである。別の態様において、グリニャール試薬は、ｔ−ブチルマグネシウムハライドおよびフェニルマグネシウムハライドである。別の態様において、グリニャール試薬は、ｔ−ブチルマグネシウムハライドおよびフェニルマグネネシウムハライドである。別の態様において、グリニャール試薬は、ｔ−ブチルマグネシウムクロリドおよびフェニルマグネシウムクロリドである。
【０１２１】
本発明の別の態様において、マグネシウムアルコキシドを用いて、シタラビンの５’−アルコキシドマグネシウムを得る。１態様において、マグネシウムアルコキシドは、Ｍｇ(Ｏ−ｔ−Ｂｕ)２およびＭｇ(Ｏ−ｉＰｒ)２からなる群から選ばれる。
【０１２２】
本発明の別の態様において、ルイス酸を上記の塩基の１つを用いて製造した５’−アルコキシドの溶液に加えて、該アルコキシドのカルボカチオンを交換するかおよび／または該生成するアルコキドとリン酸化剤との反応性を調節するかのいずれかを行なうことができる。ルイス酸の例としては、アルカリ塩、希土類塩、または遷移金属塩を含む。１態様において、ルイス酸は、マグネシウム塩、カルシウム塩、セシウム塩、アルミニウム塩、またはセリウム塩である。別の態様において、ルイス酸は、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、およびヨウ化マグネシウムである。
【０１２３】
１態様において、式Ｉの化合物の合成のための反応条件は、第１にグリニャール試薬または他の塩基の１つを用いる該アルコキシドの生成、続いてマグネシウム塩の添加、第２に該ヌクレオシドの溶液への、式Ｃのリン酸化試薬の溶液（通常、同じ溶媒中であるが、必ずしもその必要はない）としてかまたは固体としての直接的な付加を包含する。別の態様において、該アルコキシの溶液を、リン酸化試薬の溶液に加える。１態様において、塩基を用いる該アルコキシドの生成は、−７８℃〜４０℃の範囲から選ばれる。１態様において、温度は−２０℃〜２５℃の範囲から選ばれる。別の態様において、リン酸化工程のための温度は、−１０℃〜７０℃の範囲から選ばれる。別の態様において、温度は１０℃〜４０℃の範囲から選ばれる。
【０１２４】
次いで、上記で得られた保護されたプロドラッグについて、当該分野の当業者にとって知られる多数の方法の１つを用いて脱保護工程を行なって、全ての保護基を除去し（Greene T.W.による、Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1999)）、そしてこのものは該リン酸塩プロドラッグの安定性と適合し得る。１態様において、脱保護試薬としては、存在する場合には例えば、シリル保護基を除去するためのフルオリド塩、酸反応活性な保護基（例えば、シリルおよび／またはケタールおよびＮ−保護基）を除去するための鉱酸または有機酸を含む。別の態様において、脱保護試薬としてはＴＢＡＦ、塩酸溶液、およびＴＦＡ水溶液である。別の態様において、該脱保護試薬は塩酸である。最終的なプロドラッグ、並びに全ての中間体の単離および精製は、カラムクロマトグラフィーおよび／またが結晶化の組み合わせによって達成されて、式Ｉの化合物を得る。
【０１２５】
別の態様において、本発明は式Ｉの化合物の単一異性体を合成する方法を提供する。該環状ホスフェート試薬におけるＣ’上の不斉中心の存在のために、この炭素原子は２つの異なる配向（すなわち、ＲまたはＳ）を有することができる。例えば、該式Ｃのトランス−ホスフェート試薬はＳ−トランスまたはＲ−トランスの立体配置のいずれかとして存在し得て、これらの２個の試薬はエナンチオマーである。従って、ラセミのジオールからのリン酸化剤の合成により、Ｒ−トランスおよびＳ−トランスの異性体のラセミ混合物を得る。加えて、シタラビンはキラルであるので、ラセミのトランス−ホスフェート試薬を用いるこのヌクレオシドのリン酸化は、式Ｉの２個のジアステレオマーのシス−プロドラッグの混合物を与える。これらの化合物は、カラムクロマトグラフィーおよび／または結晶化の組み合わせによって分離することができる。別法として、シタラビンのアルコキシドをエナンチオリッチなトランス−ホスフェート試薬を用いてリン酸化することにより、単一のシス−プロドッグを得る。例えば、式Ｂのジオールから製造されるＣ’−Ｓ−トランス−ホスフェート試薬の反応により、式ＩＩＩのＣ’−Ｓ−シス−プロドラッグを得て、一方でＣ’−Ｓ−トランス−ホスフェート試薬を用いる反応により、Ｃ’−シス−プロドラッグを得る。
【０１２６】
別の態様において、該トランス−ホスフェート試薬とのシタラビンの反応の速度と比較して、該シス−ホスフェート試薬の該トランス−ホスフェート試薬へのエピマーの割合に応じて、シス−リン酸化試薬はなおシタラビンのシス−プロドラッグを与えることを見出した。該態様において、該シス−リン酸化試薬はトランス−ホスフェート試薬にエピマー化され、少量のプロドラッグの生成によって得られる該脱離基の微量を伴う。次いで、シタラビンはインシチュで得られる該トランス−ホスフェート試薬と反応させることにより、該シス−プロドラッグを得る。別の態様において、シタラビンはリン酸化試薬の粗混合物と反応させて、シス−プロドラッグを得る。１態様において、該リン酸化試薬の粗混合物は、トランス−異性体がリッチである。別の態様において、該リン酸化試薬はエンリッチ工程なしで使用する。
【０１２７】
２．３．非保護シタラビンのリン酸化
別法として、シタラビンのプロドラッグは、１級ヒドロキシル基を選択的にリン酸化すル反応条件を用いて前保護なしで合成することができる。塩化アシルを用いるヌクレオシド（例えば、アラＣ）の選択的な５’−アシル化は十分に確立されている（Gishらによる、J. Med. Chem. 14, 1159 (1971)）。しかしながら、リン酸化剤はより反応性であると考えられるので、それらは低い位置選択性および低収率、並びに反応中に使用する溶媒（ＤＭＦ）との反応を生じるであろう。本発明の１態様において、我々は式Ｃのリン酸化剤と非保護シタラビンとの反応により、式Ｉの５’−シス−ホスフェートプロドラッグを高い収率、位置選択性および立体選択性で与える。１態様において、該単離したリン酸化剤をシタラビンの溶液に加える。別の態様において、シタラビンを該リン酸化試薬の溶液に加える。同様に、式ＢのＳ−ジオールから製造されるＳ−トランス−リン酸化試薬の反応により、式ＩＩＩのＳ−シス−プロドラッグを得て、その一方で該Ｒ−トランス−リン酸化試薬により、該Ｒ−シス−プロドラッグを得る。通常の溶媒中での非保護ヌクレオシドの低い溶解度および該溶媒とリン酸化試薬との潜在的な反応性のために、該リン酸化試薬との低い反応性を有する強い誘電率を有する溶媒が必要である。該溶媒としては例えば、テトラアルキルウレアである。１態様において、溶媒は、ＤＭＰＵ、テトラメチルウレア、ＤＭＥＵ、リン酸トリメチル、またはヘキサメチルホスホラミデートである。
【０１２８】
実施例
実施例１．３−オキソ−３−(ピリジン−４−イル)−プロパン酸メチルの製造（１）
【化２３】
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５０Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、加熱用マントルおよび窒素導入菅を供えた。該フラスコをＴＨＦ（８Ｌ）およびカリウムｔ−ブトキシド（５ｋｇ、４４．６ｍｏｌ）で満たし、続いて更なるＴＨＦ（１８Ｌ）で満たした。温度の上昇を伴って４−アセチルピリジン（２．５ｋｇ、２０．６ｍｏｌ）を加え、続いて炭酸ジメチル（３．７５Ｌ、４４．５ｍｏｌ）を加えた。両方を添加後に、該混合物の温度は４０℃以上となった。該反応混合物を２．５時間加熱することなく撹拌し、その間に該温度は平均温度が約５５℃まで上昇した。該混合物は５７〜６０℃まで３時間加熱した。該反応を薄層クロマトグラフィー精製（ＴＬＣ）によって追跡した。該加熱を止め、そして該混合物をゆっくりと終夜（１５時間）冷却した。次いで、該混合物を４５ｃｍブフナーろうとを用いてろ過した。該固体であるケトエステルのカリウムエノレートを５０Ｌフラスコに戻し、そして酢酸水溶液（水（１５Ｌ）中の酢酸（３Ｌ））を用いて希釈した。この酸性混合物をｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）（１×１６Ｌ、１×１２Ｌ）を用いて抽出した。該有機層を合わせて、炭酸ナトリウム水溶液（Ｎａ２ＣＯ３）（水（１２．５Ｌ）中の１７５０ｇ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３）（８Ｌ）およびブライン（８Ｌ）を用いて洗浄した。硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４)（５００ｇ）を用いて該合わせた有機層を終夜（１５時間）乾燥した。該乾燥した有機溶液をろ過し、該溶媒を回転蒸発によって除去して、塊（６．４ｋｇ）を得た。該物質は、該溶媒の約半分を除去後に沈降し始めた。得られた懸濁液を氷浴中で２時間撹拌しながら冷却した。該固体をろ過によって集め、ＭＴＢＥ（５００ｍＬ）を用いて洗浄し、真空オーブン中、２０℃で１５時間乾燥して、淡黄色固体のケトエステル１（２４２５ｇ、６０％収率）を得た。
【０１２９】
該ＭＴＢＥの母液を約１Ｌにまで濃縮した。該得られた懸濁液を氷浴中で約１時間冷却した。該固体をろ過によって集め、ＭＴＢＥ（２×１５０ｍＬ）を用いて洗浄し、そしてこのものを真空オーブン中で乾燥して、第２のクロップ（２４０ｇ、６％）を得た。
ＴＬＣ条件：反応混合物を、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０プレート（２．５×７．５ｃｍ、２５０ミクロン；ＵＶランプ；ＴＨＦ／ヘキサン（１：２）溶媒）を用いて追跡した。出発物質のＲｆ＝０．２５；生成物のＲｆ＝０．３。
【０１３０】
実施例２．(Ｓ)(−)３−ヒドロキシ−３−(ピリジン−４−イル)−プロパン酸メチルの製造（２）
【化２４】
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２２Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、サーモウェル／温度計、滴下ろうと（１Ｌ）および冷却容器（空）を備えた。該フラスコを窒素でフラッシュし、ギ酸（８７７ｇ）で満たし、そして氷浴を用いて冷却した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（７５５ｇ）を該滴下ろうとに満たし、そして該撹拌したギ酸に５０分間の時間をかけてゆっくりと加えた。穏やかな発泡を伴う発熱反応が存在し、これは添加の終わりに向けて消失した。添加が完結後に、該冷浴を除き、そして該反応溶液をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５．０Ｌ）を用いて希釈した。該ケトエステル１（２６４８ｇ）を１回で加え、続いて吸熱反応中に更なるＤＭＦ（０．５Ｌ）を加えた。該ケトエステル１が不溶である時点では、約５℃への温度の低下が存在した。該フラスコに加熱用マントルを備え、そして撹拌混合物を徐々に１６℃まで加熱して、全ての固体を溶解させた。該キラルなルテニウム触媒（１８．８ｇ）（１０）を１回で加え、そして撹拌混合物を５５℃まで１時間かけて加熱した。得られた暗溶液をを５５℃で１６時間撹拌した。ＴＬＣは、該反応が完結したことを決定するのに使用した。該溶媒を減圧下で蒸発して（高真空下、浴温度＝６０℃でBuchi R152ロータリーエバポレーターを使用）、褐色油状物（３５７４ｇ）を得た。該油状物をジクロロメタン（１．０Ｌ）中に溶解し、そしてこのものを５galの固定(stationary)分液ろうとに移した。該暗溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３．０Ｌ）を用いて洗浄し、次いで該水相をジクロロメタン（３．０Ｌ）を用いて抽出し直した。該合わせたジクロロメタン抽出物をＭｇＳＯ４（３００ｇ）を用いて乾燥し、ろ過し、そして減圧下で濃縮して褐色油状物（理論量の１２５％、1H NMRによればＤＭＦを含む）（３３６２ｇ）を得た。本実施例および以下の実施例についての1H-NMR分析は、VARIAN GEMINI-200MHz分光計を用いて行なった。該試料を示す溶媒中に溶解し、そして化学シフトは残留溶媒を基準とした。
ＴＬＣ条件：該反応混合物を、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０プレート（２．５×７．５ｃｍ、２５０ミクロン；ＵＶランプ：５％ＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨ：出発物質のＲｆ＝０．４４；生成物のＲｆ＝０．１５）を用いて追跡した。
1H NMR (CDCl3): δ 2.73 (d, 2H, J = 1.5Hz), 3.73 (s, 3H), 4.35 (s, 1H), 5.11-5.19 (m, 1H), 7.31 (d, 2H, J = 6.6Hz), 8.53 (d, 2H, J = 6.0Hz)。
ｅ．ｅ．＝８７％Ｓ異性体（ＨＰＬＣによって決定）。
ＨＰＬＣ条件:
カラム：キラルパックＡＤ、０．４６×２５ｃｍ；移動相＝エタノール：ヘキサン（１０：９０）のアイソクラチック；流速＝１．５ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ；２５４ｎＭでのＵＶ検出；ｒ．ｔ．：Ｒ−ヒドロキシエステル＝１９．９分；Ｓ−ヒドロキシエステル＝２１．７分。
【０１３１】
実施例３．Ｓ−(−)−１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールの製造（３）
【化２５】
0004689274.tif 000027
２２Ｌの４つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、サーモウェル／温度計、滴下ろうと（２Ｌ）、冷却器および冷却容器（空）を備えた。該フラスコを窒素でフラッシュし、そして水素化ホウ素ナトリウム（４１９ｇ）および１−ブタノール（９．０Ｌ）で連続して満たした。粗ヒドロキシエステル(２)を１−ブタノール（１．０Ｌ、溶液の総容量＝３．２Ｌ）中に溶解した。該ヒドロキシエステル溶液の４分の１（８００ｍＬ）を該撹拌した水素化ホウ素ナトリウムのスラリーに９０分間かけてゆっくりと加えた。温度は１９℃〜３２℃まで上昇し、そして穏やかなオフガスが生じた。該混合物を４５分間撹拌し、そして温度は３６℃でピークとなった。第２の該ヒドロキシエステル溶液の４分の１を４５分間かけてゆっくりと加え、温度は３６℃〜５２℃まで上昇した。該混合物を２０分間撹拌し、そして該温度は５７℃でピークとなった。該混合物を氷浴を用いて４０℃まで冷却し、そして該第３の該ヒドロキシエステル溶液の４分の１を４５分間かけて加えた。再び、温度は３８℃〜５１℃までの上昇を示した。該混合物を２０分間撹拌し、温度は５７℃でピークとなった。該混合物を３８℃まで冷却し、そして最後の該ヒドロキシエステル溶液の４分の１を２５分間かけて加え、この時点では明らかな発熱反応は全く存在しなかった。該混合物を温度が４５℃で４０分間撹拌し、次いで該フラスコに加熱用マントルを備え、そして撹拌混合物を２．５時間かけて８０℃まで加熱した。該混合物を８０〜８５℃で３時間撹拌した。該混合物を周囲温度まで１２時間かけて徐々に冷却した。該反応混合物を炭酸カリウム水溶液（２０重量％、５．２Ｌ）を用いてクエンチし、そして該混合物を１０分間撹拌した。該相を分離し、該ブタノール相を炭酸カリウム水溶液（２０重量％、２．６Ｌ）および塩化ナトリウム溶液（１５重量％、１．３Ｌ）を用いて洗浄した。該溶媒を減圧下で除去して（高真空、浴温度＝６０℃でBuchi R152ロータリーエバポレーターを使用）、黄色半固体を得た。アセトニトリル（３Ｌ）を、エバポレーターフラスコに入れ、そして該溶媒を減圧下で蒸発した。再びアセトニトリル（９Ｌ）を該エバポレーターフラスコに入れ、そして該スラリーを６０℃（浴温度＝６５℃、常圧）で１５分間撹拌した（ロータリーエバポレーターを用いて回転）。該熱スラリーを、ＳｉＯ２（セライト５２１）のろ過剤を通してろ過した（アセトニトリル（１Ｌ）中のスラリー（２５０ｇ）を２４ｃｍブフナーろうと上に予め充填した）。該ろ液を減圧下でいくらか濃縮し（４Ｌの蒸留物を集めた）、そして得られたスラリーを該ロータリーエバポレーターを用いて常圧で加熱して、全ての固体を溶解させた（浴温度＝６５℃）。該熱源を止め、そして得られた溶液をロータリーエバポレーターを用いて１６時間撹拌し、周囲温度まで徐々に冷却した。得られた混合物をろ過し、そして該集めた固体をアセトニトリル（２×２００ｍＬ）を用いて洗浄し、そして一定の重量まで乾燥して（−３０Ｈｇ、５５℃、４時間）、淡黄色固体（３．４３６ｇ、３９％）を得た。
融点＝９８−１００℃。
ｅ．ｅ．＝９８％Ｓ異性体（ＨＰＬＣによって決定）。
ＨＰＬＣ条件：カラム：キラルパックＡＤ、０．４６×２５ｃｍ；移動相＝エタノール＊ヘキサン（１０：９０）のアイソクラチック；流速＝１．５ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２５４ｎＭでＵＶ検出；ｒ．ｔ．：Ｒジオール＝１２．７分；Ｓジオール＝１４分。
【０１３２】
実施例４．(４Ｓ)−(−)−トランス−４−(４−ピリジル)−２−(４−ニトロフェノキシ)−２−オキソ−１,３,２−ジオキサホスホリナン（４）の製造
【化２６】
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磁気スターラーおよび窒素導入菅を供えた１Ｌ丸底フラスコを、ジオール３（１００ｇ、０．６５ｍｏｌ）およびピリジン（５００ｍＬ）で満たした。ジオール３が完全に溶解するまで、該混合物を室温で激しく撹拌した。３の溶解度はＴＥＡによって低下する。別の３Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、熱電対、１Ｌ滴下ろうと、および窒素導入菅を備えた。この容器を４−ニトロフェニルホスホロジクロリデート（１６６．４ｇ、０．６５ｍｏｌ）で満たし、このものを氷浴中に置き、次いでピリジン（５００ｍＬ）を滴下ろうとを用いて導入した。得られた混合物を氷浴温度で１５分間撹拌した。
【０１３３】
３を完全に溶解した後に（０．５時間）、ＴＥＡ（１９０ｍＬ、１．３６ｍｏｌ）を加え、そしてわずかに濁った黄褐色溶液を３Ｌフラスコ上の滴下ろうとに移し、そしてこのものを該冷ジクロリデート溶液に２時間４０分かけて加えた。該反応は発熱し、そして該反応温度が６℃を超えないように滴下速度を保った。添加が完結後に、該氷浴を室温の水浴で置き換え、そして撹拌を３時間続けた。
【０１３４】
この期間中、別の３Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、熱電対、２５０ｍＬ滴下ろうと、および窒素導入菅を備えた。次いで、このフラスコを水素化ナトリウム（１５ｇ、０．３８ｍｏｌ）およびＴＨＦ（１００ｍＬ）で満たし、そして滴下ろうとをＴＨＦ（１００ｍＬ）中の４−ニトロフェノール（６７．５ｇ、０．４９ｍｏｌ）溶液で満たした。次いで、該フラスコを氷浴中に置き、そして該ニトロフェノール溶液を該水素化ナトリウムの冷懸濁液にゆっくりと加えた。該ニトロフェノールの添加の間、４０℃以下の温度を保った。気体の発生の休止は、添加が完結したことを示す。得られた明橙色懸濁液を室温で１時間撹拌した。
【０１３５】
該ジオール(３)−ジクロリデート反応がＨＰＬＣによって完結したと判断した後に、該暗懸濁液について真空ろ過を行なった。該ガラス製品およびろ過ケーキ（ＴＥＡ−ＨＣｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）を用いてすすぎ、そして該ろ液およびすすぎ液を合わせて、橙色のナトリウム４−ニトロフェノキシド懸濁液にそそいだ。次いで、得られた混合物を４０℃で４時間加熱し、そしてシス／トランスの平衡をＨＰＬＣによって追跡した。加熱用マントルを除き、そして該反応液を室温で撹拌した。該粗反応混合物をろ過剤であるＳｉＯ２（セライト521、０．５インチ）を用いてろ過し、そして該ガラス製品およびセライトをジクロロメタン（２００ｍＬ）を用いてすすいだ。該ろ液およびすすぎ液を合わせて３０〜３５℃で減圧下（油圧ポンプ）、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた濃厚の黒色発泡性のタールを、１．０Ｍ塩酸（１．５Ｌ）および酢酸エチル（８００ｍＬ）中に溶解し、このものを４Ｌ分液ろうとに移し、そして相分離した。該酢酸エチル相を１．０Ｍ塩酸の更なる３００ｍＬ部を用いて洗浄した。ジクロロメタン（７５０ｍＬ）を該合わせた水層に加え、そして該混合物を激しく撹拌しながら、そのものを固体の炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨが７〜８の間にまで注意深く中和した。該溶液を４Ｌ分液ろうとに再び移し、そして相分離した。該水層をジクロロメタン（７５０ｍＬ）を用いて抽出し、そして該有機層を合わせて硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、ろ過し、そして乾固するまで濃縮した。該得られた乾燥残渣をイソプロパノール（２００ｍＬ）中のスラリーとして撹拌し、そしてろ過してリン酸塩４（１９０ｇ）を得た。
【０１３６】
粗４をジクロロメタン（６００ｍＬ）中に溶解し、活性炭（Darco）（１０ｇ）の存在下で１０分間撹拌し、そしてＳｉＯ２（セライト５２１、０．５インチ）を用いてろ過した。該フラスコおよびセライトをジクロロメタン（１５０ｍＬ）を用いてすすぎ、そして該ろ液およびすすぎ液を合わせて再び乾固するまで濃縮した。得られた固体を粉砕し、イソプロパノール（２００ｍＬ）中のスラリーとして５０℃で撹拌した。１時間後に、該スラリーを室温まで冷却し、引き続いてこのものをろ過のために氷浴温度まで冷却した。該固体を真空オーブン中、５５℃で１６時間乾燥して、ベージュ色固体のリン酸塩４（１５４．６ｇ、７０％）を得た。
ｍ．ｐ．＝１４０−１４２℃。
比旋光度＝−８０．３５０°（ｃ＝１．０、ＭｅＯＨ）。
ＨＰＬＣ条件：カラム：キラルパックＡＤ、０．４６×２５ｃｍ；移動相＝２−プロパノール：ヘキサン（５０：５０）のアイソクラチック；流速＝１．０ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２５４ｎｍでＵＶ検出；ｒ．ｔ．＝６．６分、９９＋％  トランス。
ｅ．ｅ．＝９９＋％。
1H NMR（DMSO-d6）: δ 2.23-2.29 (m, 2H), 4.56-4.71 (m, 2H), 5.88-5.95 (m, 1H), 7.44 (d, 2H, J = 5.8Hz), 7.59 (d, 2H, J = 9.2Hz), 8.34 (d, 2H, J = 9.4Hz), 8.63 (d, 2H J = 5.8Hz)。
【０１３７】
実施例５．５’−Ｏ−ベンゾイルシタラビン（５）の製造
【化２７】
0004689274.tif 000029
１２Ｌの４つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、熱電対および窒素導入菅を備えた。該容器をシタラビン（５００ｇ、２．０６ｍｏｌ）およびＤＭＰＵ（１Ｌ）で満たし、これにより濃厚であるが撹拌可能な溶液を得た。ジオキサン中のＨＣｌ溶液（６１７ｍＬ、２．４７ｍｏｌ）を１回で加え、温度が５２℃まで上昇した。該混合物を２時間撹拌し、そして２７℃まで冷却した。塩化ベンゾイル（５７８ｇ、４．１１ｍｏｌ）を加え、そして該混合物を周囲温度で２２時間撹拌し、最初の３０分間、温度は３４℃まで上昇した。２．５時間後に、温度は２５℃まで低下した。水（２．５Ｌ）を加え、そして該混合物を３０分間撹拌し、温度は３７℃まで上昇した。得られた層を分離し、そして該水層をジクロロメタン（２×１Ｌ）を用いて抽出した。該有機層を合わせて１０％（容量比）の塩酸（２×５００ｍＬ）を用いて抽出した。該水層を合わせて１２Ｌフラスコに満たし、水（１．５Ｌ）を用いて希釈し、そして氷浴中で冷却した。該ｐＨを、３０％（重量比）のＮａＯＨ水溶液（８５０ｍＬ）を加えることによって、１０にまで調節した。３０分間添加の中和の間、温度は１４〜２１℃まで上昇した。沈降物の生成はｐＨ３で生じ始めた。氷浴中で放置後、得られた濃厚な懸濁液を８時間撹拌した。該固体を２４ｃｍのブフナー中に集めた。該ケーキを水（２Ｌ）を用いて洗浄し、そしてこのものを該ろうと中で終夜いくらか乾燥した。得られた固体物質を７０℃で１８時間真空オーブン中で乾燥して、５’−Ｏ−ベンゾイルシタラビン（５）（６５９ｇ、９２％収率）を得た。カールフィッシャーによって測定される該水含有量は非常に高く、そして該物質を再結晶した。１２Ｌフラスコを（５）、メタノール（５Ｌ）およびエタノール（３Ｌ）で満たし、そしてこの混合物は撹拌後に濃厚となった。該混合物を加熱還流して、透明な黄色溶液を得た。該混合物を常圧で蒸留して、蒸留物（２Ｌ）を集めた。エタノール（２Ｌ）を加え、そして１Ｌ以上を集めるまで、蒸留を続けた。該蒸留の最後では、温度は７９℃であった。加熱を止め、そして該混合物を２１℃まで冷却し、そして１９時間撹拌した。該固体をろ過によって集めて、エタノール（１Ｌ）を用いて洗浄し、そして７０℃で真空オーブン中で３６時間乾燥して、白色結晶性固体の化合物５（５０８ｇ、７１％）を得た。
ＨＰＬＣ条件：カラム：Zorbax Eclipse XDB-C8；溶媒Ａ＝５％アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；溶媒Ｂ＝８０％アセトニトリル／水；勾配；流速＝１．０ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２７０ｎｍでのＵＶ検出；ｒ．ｔ．＝４．３分。
【０１３８】
実施例６．５’−Ｏ−ベンゾイル−２’，３’−ジ−Ｏ−ＴＢＳ−シタラビン（６）の製造：
【化２８】
0004689274.tif 000030
１２Ｌの４つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、熱電対、冷却器および窒素導入菅を備えた。該フラスコを、ピリジン（７０３ｍＬ、８．６４ｍｏｌ）、ＤＭＦ（１Ｌ）および（５）で満たした。該混合物を５分間撹拌した。化合物（５）を溶媒に添加することにより、溶解が容易となる。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＳＣｌ）を加え、続いてＤＭＦ（５００ｍＬ）を加えた。該混合物を９３℃±１℃で４４時間加熱し、時々ＨＰＬＣによって追跡した。該混合物を５１℃まで冷却し、そしてメタノール（２５０ｍＬ）を加えて、未反応のＴＢＳＣｌをクエンチした。水（２Ｌ）を加えた後に、該混合物を４．５時間撹拌した。更に４０分間撹拌後に、該混合物を酢酸エチル（２Ｌ）を用いて抽出した。該上層の有機層を１０％塩酸（２×２Ｌ）、７％ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２Ｌ）および１０％ＮａＣｌ水溶液（２Ｌ）を用いて洗浄した。該有機層をＭｇＳＯ４を用いて乾燥し、そしてろ過した。該溶媒をロータリーエバポレーターを用いて除去して、濃厚な黒色油状物の粗（６）（重量１．３ｋｇ）を得た。該物質を更に精製することなく、次の反応に使用した。
ＨＰＬＣ条件：カラム：Zorbax Eclipse XDB-C8；溶媒Ａ＝５％アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；溶媒Ｂ＝８０％アセトニトリル／水；勾配；流速＝１．０ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２７０ｎｍでＵＶ検出；ｒ．ｔ．。ジ−シリル＝１０．１分；ｒ．ｔ．。モノシリル＝６．９分。
【０１３９】
実施例７．２’,３’−ジ−Ｏ−ＴＢＳ−シタラビン・塩酸（７）の製造
【化２９】
0004689274.tif 000031
１２Ｌの４つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、頂部に窒素バブラーを有する冷却器、熱電対および加熱用マントルを備えた。該フラスコをエタノール（２．３Ｌ）中の粗（６）の溶液およびヒドラジン（１８５ｇ、５．７６ｍｏｌ）で満たした。該混合物を、ＨＰＬＣによって追跡しながら、８０℃で１５時間加熱した。該加熱用マントルを除去し、そして該混合物を２時間かけて３５℃まで冷却した。該暗冷却溶液を１５％ＮＨ４Ｃｌ溶液（４Ｌ）中にそそぎ、そして酢酸エチル（４Ｌ）を用いて抽出した。該有機相を１５％ＮＨ４Ｃｌ溶液（２Ｌ）を用いて洗浄し、次いでロータリーエバポレーターを用いて蒸発させて、濃厚な油状物を得た。該残渣をアセトニトリル（３Ｌ）中に溶解し、そしてこのものを大きな分液ろうとに移した。水（３Ｌ）中のＨＣｌの１０％溶液を加え、そして該混合物を５分間撹拌した。得られた濁った溶液をヘキサン（２×３Ｌ）を用いて抽出した。ヘキサン抽出後に、該２相は透明となった。（７）を含有する下層の水相／アセトニトリル相をロータリーエバポレーターを用いて濃縮して、蒸留物（３Ｌ）を集めた。水（３Ｌ）を加え、そして蒸留を続けて、約５００ｍＬの更なる溶媒を除去した。沈降物の生成は２Ｌを除去後に生成し始め、濃厚なスラリーが蒸留を止めた後に残った。該固体を２４ｃｍのブフナーろうと中でろ過によって集め、そして該ケーキを５％容量比のアセトニトリル／水（２×１Ｌ）を用いて洗浄した。該湿った固体（２．６ｋｇ）を１２Ｌのフラスコに移し、そして５％のアセトニトリル／水（６Ｌ）と一緒に４５分間撹拌した。該固体をろ過によって集めて（ゆっくりと）、水洗し（１Ｌ）、そして真空オーブン中、６５℃で４６時間乾燥して、６４４ｇ（８８％収率）を得た。純度はＨＰＬＣおよび1H NMR（DMSO-d6）によって決定した。該粗物質を１２Ｌフラスコに満たした。酢酸エチル（４Ｌ）を加え、そして該混合物を１時間加熱還流し、次いで１時間還流を保った。該混合物を３時間かけて２５℃まで冷却した。得られた固体（７）をろ過によって集めて、酢酸エチルを用いて洗浄し、そして真空オーブン中、６５℃で２４時間乾燥して、オフホワイト色固体（３３５ｇ、４６％）を得た。
【０１４０】
該母液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて中和し、そして相分離した。該有機層をブラインを用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥し、そしてロータリーエバポレーターを用いて蒸発させて、濃厚な褐色油状物（２８３ｇ）を得た。該物質について、シリカゲルクロマトグラフィー精製（１．１ｋｇ）（２％ＭｅＯＨ／ジクロロメタン、次いで１５％ＭｅＯＨ／ジクロロメタンを用いて溶出）を行なった。きれいな生成物を含有する画分を集めて、そして該溶媒を蒸発させた。得られた残渣２’,３’−ジ−Ｏ−ＴＢＳシタラビン遊離塩基を終夜真空乾燥して、琥珀色アモルファス固体（１７１ｇ）を得た。
ＨＰＬＣ条件：カラム：Zorbax Eclipse XDB-C8；溶媒Ａ＝５％アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；溶媒Ｂ＝８０％アセトニトリル／水；勾配；流速＝１．０ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２７０ｎｍでのＵＶ検出；ｒ．ｔ．＝７．４分。
【０１４１】
実施例８．２’,３’−ジ−Ｏ−ＴＢＳ−シタラビン−Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミジン（８）の製造：
【化３０】
0004689274.tif 000032
オーバーヘッドスターラーを備えた１２Ｌの４つ口フラスコを、（７）（３３３ｇ、０．６６ｍｏｌ）およびトルエン（２Ｌ）で満たした。水（２Ｌ）中のＮａＨＣＯ３（１１０ｇ、１．３１ｍｏｌ）溶液を加え、そして該混合物を１５分間激しく撹拌した。大量の固体がなお存在し、その結果酢酸エチル（２Ｌ）を加えた。５分以内に、全ての物質はｐＨが８で溶解した。相分離し、そして該有機相を１０％ＮａＣｌ水溶液（１．５Ｌ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥し、そしてろ過した。該溶媒をロータリーエバポレーターを用いて除去して、白色発泡体の遊離塩基（重量３９８ｇ、理論量の１３０％）を得た。
【０１４２】
該２’,３’−ジ−Ｏ−ＴＢＳ−シタラビン・遊離塩基（実施例７のクロマトグラフィー精製由来）を、ロータリーエバポレーターフラスコ中で上記の製造由来の遊離塩基に加えた。トルエン（２Ｌ）を加え、そして該混合物を５０℃で１時間加熱して、透明な褐色溶液を得た。該溶液を１２Ｌの４つ口フラスコに移した。トルエン（４００ｍＬ）を用いて、ロータリーエバポレーターフラスコをすすいだ。ＤＭＦ・ジメチルアセタール（１５８ｇ、１．３２ｍｏｌ）を加え、そして該混合物を２０℃で２１時間撹拌し、そして該反応液をＴＬＣによって追跡した。該溶媒をロータリーエバポレーターを用いて除去して、濃厚な油状物を得た。ヘキサン（１Ｌ）を加え、次いで真空下で除去した。該物質をロータリーエバポレーターを用いて６０℃で２時間乾燥したが、なお粘着性油状物が残った。ヘキサン（２Ｌ）およびジクロロメタン（２Ｌ）を該残渣に加え、そして該混合物を５０℃で撹拌して、透明な褐色溶液を得た。該混合物を常圧で蒸留し、蒸留物（２Ｌ）を集めた。該混合物をわずかに冷却し、そして残りの溶媒を真空下で蒸発した。該残渣をロータリーエバポレーターを用いて１５時間乾燥して、硬い発泡体を得た。該物質をフラスコの側面で粉砕し、得られた流動性固体を２５℃で２４時間真空乾燥して、黄褐色固体の化合物８（５２７．６ｇ、９８％）を得た。
ＴＬＣ条件：該反応混合物を、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０プレート（２．５×７．５ｃｍ、２５０ミクロン；ＵＶランプ：１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２；出発物質のＲｆ＝０．４；生成物のＲｆ＝０．７）を用いて追跡した。
1H NMR（DMSO-d6）：δ -0.27 (s, 3H), -0.02 (s, 3H). 0.11 (s, 6H), 0.74 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 3.02 (s, 3H), 3.16 (s,3H), 3.5１-3.69 (m, 2H), 3.80-3.85 (m, 1H), 4.05-4.08 (m, 2H), 4.95-5.03 (m, 1H), 5.93-6.01 (m, 2H), 7.67 (d, 1H, J=7.2Hz), 8.62 (s, 1H)。
【０１４３】
実施例９．２(１Ｈ)−ピリミジノン,４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（９）の製造
【化３１】
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１２Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、サーモウェル／温度計、滴下ろうと（１Ｌ）および冷浴を備えた。該フラスコを窒素でフラッシュし、そして、保護されたヌクレオシド８（２５０ｇ、０．４７ｍｏｌ）およびＴＨＦ（２．５Ｌ）で満たした。該撹拌溶液を４℃まで冷却し（氷浴）、そしてｔ−ブチルマグネシウムクロリド溶液（６１７ｍＬ、０．６２）を１時間かけてゆっくりと加え、温度を８℃以下に保った。添加が完結後に、該溶液を氷浴温度で１．２５時間撹拌した。該ホスフェート試薬（４）(２６２ｇ、０．７８ｍｏｌ）を１回で加え、そして該冷浴を除いた。得られた混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。該反応液を塩化アンモニウム溶液（２０重量％、２．５Ｌ）を用いてクエンチし、そして酢酸エチル（２．５Ｌ）を用いて希釈した。該混合物を５分間撹拌して全ての残渣を溶解し、そして相分離した。該水層を酢酸エチル（１．１Ｌ）を用いて抽出し直し、そして該有機相を合わせて塩化ナトリウム溶液（１５重量％、１．６Ｌ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４（２６０ｇ）を用いて乾燥し、ろ過し、そして減圧下で濃縮して、暗橙色スラッジ（５２６ｇ）を得て、このものについてＨＰＬＣ（以下のＨＰＬＣ条件を参照）分析を行なった。
【０１４４】
１２Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、サーモウェル／温度計、塩基トラップ／バブラーを有する冷却器、および加熱用マントルを備えた。該フラスコを、メタノール溶液である該粗スラッジ（２．５Ｌ）およびＨＣｌ−ジオキサン溶液（７９０ｍＬ、３．１６ｍｏｌ）で満たした。ＨＰＬＣ（以下のＨＰＬＣ条件Ｂを参照）によって追跡しながら、該撹拌橙色溶液を５０℃まで加熱し、そして５０〜５５℃で１６時間撹拌した。該溶媒を減圧下で蒸発させて、濃厚な橙色タールを得た。該蒸発用フラスコ（１Ｌ）にオーバーヘッドスターラー／軸受アセンブリ(bearing assembly)を備えて、そして該タールを水（８００ｍＬ）および酢酸エチル（８００ｍＬ）の間で分配した。固体の炭酸水素ナトリウムを２〜５ｇ毎に加え、そして該オフガスが止まるまで撹拌し、そして該水相のｐＨを７とした（広い範囲のｐＨ紙）。該相を分離し、該水相を酢酸エチル（８００ｍＬ）を用いて抽出し直した。該水相をろ過し、そして該水をエタノールとの共沸蒸留によって減圧下で蒸発して（４×４００ｍＬのエタノール、続いてエタノールを加えることによって行なう）、水を徐々にエタノールで置き換えながら、褐色の油状物／固体の混合物（４４５ｇ）を得た。エタノール（７００ｍＬ）を加え、そして該スラリーを周囲温度で２時間撹拌した（オーバーヘッドスターラー）。
【０１４５】
９．１．得られた混合物をろ過し、そして該集めた固体をエタノール（２×５０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして一定の重量（−３０Ｈｇ、５５℃、２時間）にまで乾燥して、不定量のＮａＣｌを含むベージュ色固体（１９９ｇ）を得た。この固体物質を、マグネチックスターラーを備えた１Ｌの丸底フラスコに移した。水（２００ｍＬ）を加え、そして該混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。該混合物をろ過し、そして該集めた固体（９）を水洗し（２×２５ｍＬ）、そして一定の重量まで（−３０Ｈｇ、５０℃、１６時間）乾燥した。回収＝約１０％のＮａＣｌを含有するベージュ色粉末（９）（１０９ｇ）。
【０１４６】
９．２．上記由来のエタノールろ液を減圧下で濃縮して、濃厚な褐色タールを得た。該タールを加温しながらメタノール（２００ｍＬ）中に溶解し、そして得られた濃厚な溶液を周囲温度で１６時間撹拌した。沈降物が生成した。該混合物をろ過し、そして該集めた固体（９）をメタノール（２×２５ｍＬ）を用いて洗浄し、そして一定の重量（−３０Ｈｇ、５５℃、１６時間）にまで乾燥した。回収＝オフホワイト色固体（６．２２ｇ）。
【０１４７】
本実施例由来の生成物（９）は、２個の別個のワークアップの流れ（９．１および９．２）から単離した。
【０１４８】
９．３．２(１Ｈ)−ピリミジノン、４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（９）の精製
【化３２】
0004689274.tif 000034
２Ｌの３つ口丸底フラスコにオーバーヘッドスターラーを備え、そしてこのものを別個のワークアップの流れ由来の粗（９）を合わせたもの、および水（６５０ｍＬ）で満たした。該スラリーを撹拌し、該固体が溶解するまで濃塩酸を数回にわけて加えた（３４ｍＬが必要であり、広範囲のｐＨ紙によれば、ｐＨ＝３である）。最初にＨＣｌ（２０ｍｌ）を素早く加え、そして残りを５×２ｍＬ、および４×１ｍＬの部で加えた。該橙色溶液をろ過し、そしてこのものを該フラスコに再び満たした。固体の炭酸水素ナトリウム（３６ｇ）を２〜３ｇで数回に分けて滴下し、該混合物のｐＨを６〜７とした（広範囲のｐＨ紙）。該混合物を、オフガスが止まるまで撹拌した。得られた混合物を周囲温度で２時間撹拌し、次いでろ過した。該集めた固体を水洗し（２×２５ｍＬ）、そして一定の重量にまで乾燥して（−３０Ｈｇ、５５℃、１６時間）、黄色−ベージュ色顆粒状固体の２(１Ｈ)−ピリミジノン,４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（１３３．０ｇ、３９．７％）を得た。
元素分析（Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ８Ｐとして計算）計算値：Ｃ，４６．０９；Ｈ，４．８５；Ｎ，１２．６５。実測値：Ｃ，４５．８８；Ｈ，４．７２；Ｎ，１２．５８。
ＨＰＬＣ条件：カラム：連結した以下のカラムの２個：Agilent, Zorbax Eclipse XDB-C8, ４．６×２５０ｍｍ，５μｍ；溶媒Ａ＝２０ｍｍの１１％アセトニトリル／水中のリン酸ナトリウム緩衝液；溶媒Ｂ＝脱イオン水中の５０％アセトニトリル；逆相；流速＝１．０ｍＬ／分；注入用量＝１０μＬ、ＵＶ検出（２１０ｎｍ）、カラム温度＝３０℃；ｒ．ｔ．＝１．３４分（Ｓ異性体）；ｒ．ｔ．＝１４．１分（Ｒ異性体）。
1H NMR (DMSO-d６): δ: 2.15-2.27 (m, 2H), 3.90-3.97 (m, 3H), 4.24-4.58 (m, 4H), 5.58 (d, 1H, J = 7.4Hz), 5.62-5.65 (m, 2H), 5.71-5.79 (m, 1H), 6.10 (d, 1H, J = 3.6Hz), 7.08 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.42 (d, 2H, J = 5.8Hz), 7.48 (d, 1H, J = 7.4Hz), 8.59 (d, 2H, J = 6.0Hz)。
ＨＰＬＣ条件Ａ：
カラム：キラルパックＡＤ、０．４６×２５ｃｍ；移動相＝エタノール：ヘキサン（１０：９０）のアイソクラチック；流速＝１．５ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２５４ｎｍでＵＶ検出。
ｒ．ｔ．＝１８．９分。
ＨＰＬＣ条件Ｂ：
カラム：Bondclone 10, C18、３００×３．９ｍｍ；溶媒Ａ：１０％アセトニトリル／２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）、溶媒Ｂ：アセトニトリル；勾配；流速＝１．４ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２６０ｎｍでのＵＶ検出。ｒ．ｔ．５．８分。
【０１４９】
実施例１０．キラルルテニウム触媒（１０）の製造
【化３３】
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３Ｌの３つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラーおよびサーモウェル／温度計を備えた。該フラスコを窒素でフラッシュし、そしてルテニウム複合体（３２．０ｇ）、(１Ｓ,２Ｓ)−(＋)−Ｎ−ｐ−トシル−１，２−ジフェニルエチレンジアミン（３８．２４ｇ）およびイソプロパノール（１．０Ｌ）で満たした。トリエチルアミン（３０．０ｍＬ）を該撹拌スラリーに加え、そして該内容物を８０℃まで１時間加熱した。該橙色混合物を８０℃で１時間撹拌し、次いで加熱用マントルを除去し、そして該撹拌混合物を周囲温度まで４５分間かけて冷却した。該溶媒を減圧下で蒸発させて、暗橙色固体を得た。エタノール（３２０ｍＬ）を加え、そして該撹拌スラリーを５０℃まで加熱した。該混合物を５０℃で１５分間撹拌し、次いでこのものを周囲温度まで３０分かけて徐々に冷却した。該混合物を氷浴温度で更に３０分間撹拌し、次いでろ過した。該集めた固体をメタノール（２×１５ｍＬ）を用いて洗浄し、次いで一定の重量にまで乾燥して（−３０Ｈｇ、５０℃、１時間）、橙色固体の触媒（５３．１ｇ、８０％収率）を得た。
【０１５０】
実施例１１．該ジオールの塩酸塩を用いる、(４Ｓ)−(−)−(Ｓ)−(−)−(４−ピリジル)−２−(４−ニトロフェノキシ)−２−オキソ−１,３,２−ジオキサホスホリナン（４）の製造
【化３４】
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１リットルの３つ口丸底フラスコに、メカニカルスターラー、滴下ろうと、温度計およびＮ２導入菅を備えた。該フラスコを、Ｓ−(−)−１−(ピリジン−４−イル)−プロパン−１,３−ジオール（２５ｇ、１６３．４ｍｍｏｌ）および酢酸エチル（２５０ｍＬ）で満たし、そして得られた懸濁液を４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン溶液（４３ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ）を用いて１５分間かけてゆっくりと処理した。室温で３０分間撹拌後に、４−ニトロフェニルホスホロジクロリデート（４１．８１ｇ、１６３．４ｍｍｏｌ）を固体として、Ｎ２の正の流れ下でできるだけ早く加えた。該反応混合物の最初の温度を、ドライアイス−アセトンの冷浴の助けで−１０℃にまで調節した。酢酸エチル（１００ｍＬ）中のトリエチルアミン（５７．７６ｇ、７９ｍＬ、５７２ｍｍｏｌ）溶液を、反応温度を５℃以下に保ちながら加えた。該トリエチルアミン溶液の完全な添加の３０分後に、該冷浴を除き、そして該反応混合物を室温で１時間撹拌した。該反応混合物をろ過してトリエチルアミン−塩酸の塩を除去して、このものをろ液がわずかな吸収のみを示すまで、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）を用いて洗浄した。該ろ液を減圧下で蒸発して、容量を１５０〜１７５ｍＬにまで減少させた。４−ニトロフェノール（７．５ｇ、５４．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９ｍＬ）を該濃縮溶液に加えて、そして得られた橙色反応混合物を室温で２４時間撹拌した。該反応混合物中に生成した該固体をろ過によって集め、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）およびメチルｔ−ブチルエーテル（２５ｍＬ）を用いて洗浄し、そして５５℃で真空乾燥して、該目的物（３１．９６ｇ、５８．４％）を得た。実施例４と同じ分析データ。
【０１５１】
実施例１２．(４Ｓ)−(−)−トランス−(４−ピリジル)−２−クロロ−２−オキソ−１,３,２−ジオキサホスホリナン（１１）の製造
【化３５】
0004689274.tif 000037
マグネチックスターラーバーを備えたオーブン乾燥した２５０ｍＬ丸底フラスコを、Ｓ−(−)−１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオール（３．４９ｇ）、続いてアセトニトリル（６０ｍＬ）で満たした。該不均一な混合物を室温で１５分間撹拌し、次いでこのものをジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌ溶液（５．７ｍＬ）を用いて５分間かけてゆっくりと処理した。室温で１時間撹拌後に、該反応混合物を、ＰＯＣｌ３（２．１６ｍＬ）を用いてシリンジによって１回で処理した。別の２５ｍＬフラスコ中で、ＤＡＢＣＯ（２．６８ｇ）を窒素下でアセトニトリル（１５ｍＬ）中に溶解し、そしてこのものを該反応混合物にシリンジまたは滴下ろうとによって５分間かけて移した。ＤＡＢＣＯ溶液の添加の最後に、わずかな発熱（＋１０℃）を観察した。該反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し、その後にこのものは不均一のままであった。該反応混合物の少量の試料を抜き出し、そして乾燥Ｎ２のジェットを用いて素早く蒸発させ、そして該残渣をＤＭＳＯ−ｄ６中に溶解して、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析を行なった。
1H NMR（DMSO-d6, Varian Gemini 200 MHz)：C'-プロトン：トランス−異性体  5.85-5.75 (d, 1H)。
【０１５２】
実施例１３．２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２R,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（９）
【化３６】
0004689274.tif 000038
方法Ａ：
磁気撹拌バーを備えたオーブン乾燥した２５０ｍＬ丸底フラスコを、シタラビン−ＨＣｌ（３．３５ｇ）およびＤＭＰＵ（６．０ｍＬ）で満たした。このフラスコ中に、実施例１２由来の反応混合物を直接にろ過し、そしてＤＡＢＣＯ−ＨＣｌ塩をアセトニトリル（１×１５ｍＬ）と一緒に素早く洗浄した。揮発物をアスピレーター真空下でロータリーエバポレーターを用いて（浴温度は３５℃以下である）除去した。該残留油状物を簡単に高真空下に保ち、そして室温で４８時間撹拌した。該反応混合物をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）を用いて処理し、そして室温で２時間撹拌した。該反応混合物のｐＨを、メタノール中の２５重量％のＮａＯＭｅ溶液を用いて７．０にまで調節した（約１３ｍＬを必要とした）。この段階で、該反応混合物は濁った。該反応プロファイルの完全さを確かめるために、ＨＰＬＣを行なった。該反応混合物を乾固するまで蒸発させ、そして該残渣を室温で３０分間ジクロロメタン（５０ｍＬ）と一緒に撹拌した。該沈降物をろ過によって集めて、ジクロロメタン（１×２０ｍＬ）を用いて洗浄し、このものを該フラスコに再び移し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）を用いて１５分間かけて再び撹拌して、そしてろ過した。該固体をエタノール（２００ｍＬ）と一緒に１〜２時間撹拌し、ろ過し、そしてエタノール（２×１０ｍＬ）を用いて洗浄した。該ろ液を乾固するまで蒸発させて、白色固体（４．９０ｇ）を得た。この固体をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）中に溶解し、そして室温で終夜撹拌して固体を得て、このものをろ過によって集めて、水洗し（２×３ｍＬ）、そして真空オーブン中で乾燥して化合物９（１．３８ｇ、２６％）を得た。
【０１５３】
方法Ｂ：
工程Ａ：シタラビン・塩酸の製造
オーバーヘッドスターラーおよび熱電対を備えた５Ｌの３つ口フラスコを、シタラビン（５００ｇ、２．０６ｍｏｌ）およびメタノール（２．０Ｌ）で満たした。該懸濁液を２℃まで冷却した。ＨＣｌガスをバブルして非常に濃厚な混合物を得て、２５℃まで発熱した。該懸濁液をメタノール（０．５Ｌ）を用いて希釈して、撹拌を容易とした。ＨＣｌ（総量が１０８ｇ、２．９６ｍｏｌ）を加えた。該混合物を２０℃で４時間撹拌し、次いでろ過して該固体を集めた。該固体をＭＴＢＥ（３×２５０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして真空オーブン中、７０℃で乾燥して、綿状の白色固体のシタラビン・塩酸（５５５ｇ、９６％収率）を得た。
【０１５４】
工程Ｂ：５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドの製造
１Ｌのジャケットの(jacketed)シリンダー状反応容器に、オーバーヘッドスターラー、熱電対および２個の更なるろうと（６０ｍＬおよび１２５ｍＬ）を備えた。該反応容器を窒素でフラッシュし、そしてＤＭＰＵ（１８８ｍＬ、１９５．８ｇ）で満たした。該撹拌液体を−１６℃まで冷却した（Julabo F32冷蔵室／サーキュレータ）。
【０１５５】
ジオール溶液：２５０ｍＬ丸底フラスコに、磁気撹拌バーおよび温度計を備えた。該フラスコを、Ｓ−(−)−１−(ピリジン−４−イル)−１,３−プロパンジオール（５０．０ｇ）、ＤＭＰＵ（６２．５ｍＬ、６４．５ｇ）およびピリジン（２５．８ｇ）で満たし、次いでこのものを窒素雰囲気下に置いた。該撹拌内容物を４０℃まで加熱し（水浴）、そして全ての固体が溶解するまで（１０分間）、４０〜４２℃で撹拌した。得られた淡橙色溶液を２２℃まで冷却し、次いでこのものを１２５ｍＬの滴下ろうと（容量＝１２７ｍＬ）に満たした。
【０１５６】
ＰＯＣｌ３溶液：１２５ｍＬ三角フラスコを、アセトニトリル（２２．９ｇ）およびオキシ塩化リン（５０．０ｇ）で満たした。十分に撹拌後に、該無色溶液を６０ｍＬ滴下ろうと（容量＝６０ｍＬ）に移した。
【０１５７】
該２個の溶液を、１Ｌ反応容器に温度を−１１℃以下に保ちながら、２．６時間かけて同時に加えた。添加が完結後に、該粘性の淡橙色溶液を、温度を−１１℃〜−１７℃の間に保ちながら１時間撹拌した。該反応溶液の試料を抜き出し、そして反応の完結をＨＰＬＣによって調べた（一部を環状リン酸に加水分解して、次いでこのものをＨＰＬＣによって分析する）。シタラビン・塩酸（６０．９ｇ）を加えた。得られた混合物を１時間かけて５℃まで昇温させ、そして８７時間、４〜６℃で撹拌した。得られた粘性の反応溶液をＨＰＬＣ分析のために毎日採取した。該撹拌反応溶液をＮａＯＨ溶液（１３重量／容量％）を用いて、温度を２０℃以下に保つような速度でゆっくりとクエンチし、該溶液のｐＨは５．０に達した（ＮａＯＨ溶液（２９０ｍＬ）を要する）。ジクロロメタン（４５０ｍＬ）を加え、そして該二層混合物を１５〜２０℃で３０分間撹拌した。撹拌を止め、そして該混合物を３０分間放置した。下層の有機層を分離した。該上層の水層をジクロロメタン（４５０ｍＬ、３０分間の撹拌、３０分間の放置）を用いて２回以上抽出した（注５）。該反応容器にｐＨプローブをフィットさせ、そしてＮａＯＨ溶液（１３重量／容量％）を１０分間かけて加えて、ｐＨを７．０とした（ＮａＯＨ溶液（６８ｍＬ）を要する）。温度を２０℃以下に保つために、冷却（５℃）を該ジャケットに適用した。得られた溶液を周囲温度で２０時間撹拌し、次いでこのものを５℃にまで５時間かけて冷却した（注６）。得られた混合物をろ過し、そして集めた固体を水洗し（２×１００ｍＬ）、そして一定の重量にまで乾燥した（−３０Ｈｇ、６０℃、１８時間）。回収＝淡黄色の微細な顆粒状固体（４６．６ｇ、４８％収率）。
ホスホロクロリデート合成のためのＨＰＬＣ：
カラム：Zorbax Eclipse XDB-C8, ４．６×２５０ｍｍ、５μｍ粒子サイズ；溶媒Ａ＝１１％アセトニトリル／水中の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；溶媒Ｂ＝脱イオン水中の５０％アセトニトリル（勾配１００％Ａ〜１００％Ｂ、１５分間）；流速＝１．０ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２５０ｎｍでのＵＶ検出、カラム温度＝３０℃。ｒ．ｔ．＝４．３分。
【０１５８】
５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドのＨＰＬＣ：
カラム：Inertsil ODS-3、４．６×１５０ｍｍ、３μｍ粒子サイズ；溶媒Ａ＝５％アセトニトリル／水中の２０ｍＭのリン酸アンモニウム緩衝液；溶媒Ｂ＝アセトニトリル（勾配（時間（単位：分）；％Ｂ／Ａ％）：０／０、３０／１０、４０／４０、４０．１／０、５０／０）、流速＝１．０ｍＬ／分；注入容量＝５０μＬ、２１０ｎｍでのＵＶ検出、カラム温度＝３０℃±５℃。ｒ．ｔ．＝１５．７分。
【０１５９】
工程Ｃ：５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドの精製
方法１：オーバーヘッドスターラー、温度計、滴下ろうとおよびｐＨプローブを備えた１Ｌの３つ口フラスコを、粗５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（８０ｇ、０．１８ｍｏｌ）および脱イオン水（２５６ｍＬ）で満たした。該混合物のｐＨを５．１６とした。硫酸、３．０Ｍ（６０．６ｍＬ、０．１８ｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。１０℃の冷浴を用いて、温度を１９〜２２℃の間に保った。わずかに濁った黄色溶液を得た。該溶液を０．４５μｍのナイロン膜フィルター（直径４７ｍｍ）を用いてろ過した。該フラスコおよびフィルターを、水（４０ｍＬ）を用いてすすいだ。該ろ液および洗浄液を１Ｌフラスコに戻し、そしてｐＨを３Ｍ  ＮａＯＨ（１５５ｍＬ）および３Ｍ硫酸を加えることによって６．５に調節した。沈降物の生成は、ｐＨが５．１の時に始まることを観察した。該混合物を２．５時間撹拌し、次いでろ過して該固体を集めた。該フラスコおよびろ過ケーキを水洗し（２×８０ｍＬ）、そして真空オーブン中で終夜乾燥して（−３０Ｈｇ、６０℃、１８時間）、粗い淡黄色固体の５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（７３．４ｇ、９２％収率）を得た。
【０１６０】
方法２：オーバーヘッドスターラー、熱電対、滴下ろうとおよびｐＨプローブを備えた２５０ｍＬ３つ口フラスコを、粗５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（１６ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）および脱イオン水（５０ｍＬ）で満たした。温度を２２℃以下に保ちながら、硫酸（３．０Ｍ）を滴下してｐＨを２．５とした（１２ｍＬ、３６．３ｍｍｏｌ）。メタノール（１６０ｍＬ）を２０分間かけて加えて、白色沈降物を得た。該懸濁液を２０℃で１．５時間撹拌し、次いでろ過して該固体を集めた。該固体をメタノール（２×２５ｍＬ）を用いて洗浄し、そして真空オーブン中で乾燥して（−３０Ｈｇ、６０℃、１．５時間）、硫酸塩（１８．８９ｇ）を得た。
【０１６１】
該固体を、オーバーヘッドスターラーおよびｐＨプローブを備えた２５０ｍＬの３つ口フラスコに満たした。水（１８０ｍＬ）を加え、そして該混合物を１０分間撹拌して、全ての固体を溶解させた（ｐＨ＝２．７）。リン酸ナトリウム・モノ塩基性モノ水和物（０．２５ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を加え、そして該混合物を５分間撹拌した。該溶液をセライトを用いてろ過した。該ろ液を該フラスコに戻し、そして１３％（重量／容量）のＮａＯＨ水溶液を加えて、ｐＨを７．１とした。該懸濁液を２０℃で３時間撹拌した。該固体をろ過によって集めて、水洗し（２×１５ｍＬ）、そして真空オーブン中で一定の重量になるまで乾燥して（−３０Ｈｇ、６０℃、１６時間）、オフホワイト色顆粒状固体の５’−Ｏ−シス−[４−(Ｓ)−(ピリジン−４−イル)−１,３,２−ジオキサホスホリン−２−オキソ−２−イル]−シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（１３．５５ｇ、８５％収率）を得た。
【０１６２】
実施例１４：Ｒ−(＋)−１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオールの製造
実施例１０の触媒１０のエナンチオマーを用いる、実施例３に示すＲ−(＋)−１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオール
融点＝９８−１００℃。
ｅ．ｅ．＝９８％  Ｒ異性体（ＨＰＬＣによって決定）。
ＨＰＬＣ条件：カラム：キラルパックＡＤ、０．４６×２５ｃｍ；移動相＝エタノール：ヘキサン（１０：９０）のアイソクラチック；流速＝１．５ｍＬ／分；注入容量＝１０μＬ、２５４ｎｍでＵＶ検出；ｒ．ｔ．：Ｒジオール＝１２．７分；Ｓジオール＝１４分。
【０１６３】
実施例１５．(４Ｒ)−(＋)−(４−ピリジル)−２−(４−ニトロフェノキシ)−２−オキソ−１,３,２−ジオキサホスホリナンの製造（１２）の製造
【化３７】
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ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の４−ニトロフェニルホスホロジクロリデート(phosphorodichloridate)（９．２ｇ、３６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に０℃で、ピリジン（７．９ｍＬ、９８ｍｍｏｌ）を３０分間かけてゆっくりと加えた。該反応混合物を０℃で５分間撹拌し、そしてこのものをＴＨＦ（３００ｍＬ）中のＲ−(＋)−１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオール（９５．８％ｅｅ、５ｇ、３２．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１５．６ｍＬ、１１４ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で１．５時間かけてゆっくりと加えた。該反応混合物を室温まで昇温させ、そして２．５時間撹拌した。ナトリウム−４−ニトロフェノキシド（１８．１７ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を加え、そして該不均一な橙色反応混合物を４０℃で４．５時間加熱した。該反応混合物を０℃まで冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液（２５０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして相分離した。該有機物を飽和塩化アンモニウム水溶液（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、そして該合わせた水性洗浄液をジクロロメタン（１００ｍＬ）を用いて抽出し直した。該合わせた有機抽出物を０．３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ×４）を用いて洗浄し、そして硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。該ろ過溶液を減圧下で濃縮して油状物を得て、このものを放置すると結晶化した。該黄色固体を２−プロパノール（１００ｍＬ）から再結晶させて、白色固体の目的のトランス−リン酸塩（１２）（９５％ｅｅ、−[α]Ｄ２０  ＋７４．２（ｃ１．０、ＭｅＯＨ））を得た。
ＴＬＣ条件：ユニプレートシリカゲル、２５０ミクロン；移動相＝３／２のアセトン／ヘキサン；ジオール：Ｒｆ＝０．２、トランス−リン酸塩：Ｒｆ＝０．６、シス−リン酸塩：Ｒｆ＝０．５。
シス／トランス異性化のためのＨＰＬＣ条件：カラム＝Zorbax Rx-C18（４．６×２５０ｍｍ）；移動相＝３５％アセトニトリル／６５％、２０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．９５；流速＝０．５ｍＬ／分；検出＝ＵＶ２５０ｎｍ；保持時間：シス−異性体＝９．３９分、トランス−異性体＝０．１１分。
ｅｅ決定のためのＨＰＬＣ条件：カラム＝キラルパックＡＤ；移動相＝２−プロパノール−ヘキサン（１：１）；流速＝１．０ｍＬ／分；検出＝２５４ｎｍでのＵＶ；保持時間（単位：分）：トランス−リン酸塩＝７．０２。
【０１６４】
実施例１６．２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｓ,４Ｒ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（１３）の製造
【化３８】
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１６．１．リン酸化工程
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の化合物８（２．４ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔ−ＢｕＭｇＣｌ溶液（１Ｍ  ＴＨＦ溶液、６ｍＬ、６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。３０分後に、Ｒ−トランス−ホスフェート１２（１．８４ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、そして該反応混合物を室温で１６時間撹拌した。該反応液を０℃まで冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液を用いてクエンチし、そして酢酸エチル（５０ｍＬ×２）を用いて抽出した。有機層を合わせて硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。該粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトンを用いて溶出）によって精製して、オフホワイト色固体の保護されたプロドラッグ（２．１９ｇ、６６％、ｍｐ：１４２．０−１４５．０℃）を得た。
ＴＬＣ条件：ユニプレートシリカゲル、２５０ミクロン；移動相＝アセトン、トランス−リン酸塩：Ｒｆ＝０．６、保護されたアラ−Ｃ：Ｒｆ＝０．２。
【０１６５】
１６．２．脱保護工程
７０％ＴＦＡ（２０ｍＬ）中の上記由来の該保護されたプロドラッグの撹拌溶液を６０℃で１６時間加熱し、そして該溶媒を減圧下で除去した。該残渣にメタノール（３０ｍＬ）を加え、そして該混合物を炭酸ナトリウムを用いてわずかに塩基性とした。該濁った溶液を硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、ろ過した。該溶媒を減圧下で除去し、そして該粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール−アセトン（１：１）を使用）によって精製して、オフホワイト色固体の目的のプロドラッグ（１３）（１．０６ｇ、８０％、９８％ｄｅ、ｍｐ：１７８．０−１８０．０℃）を得た。
ＴＬＣ条件：ユニプレートシリカゲル、２５０ミクロン；移動相＝アセトン−メタノール（１：１）、保護されたアラ−Ｃ：Ｒｆ＝０．７、生成物：Ｒｆ＝０．３。
ＨＰＬＣ条件：カラム＝Zorbax Eclipse×DB-C8、４．６×１５０ｍｍ；移動相＝２０ｍＭ  リン酸緩衝液／５％アセトニトリル−水；流速＝１．０ｍＬ／分；検出＝２１０ｎｍでＵＶ；保持時間（分）：生成物＝１０．６０。
【０１６６】
実施例１７：２(１Ｈ)−ピリミジノン、４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]・(＋)−カンファースルホン酸塩の製造
(＋)−カンファースルホン酸（２３２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、メタノール（８ｍＬ）中の２(１Ｈ)−ピリミジノン、４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（９、４００ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。該得られた透明な無色溶液を室温で２時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。該残留白色発泡体を酢酸エチルを用いてトリチュレートし、そして減圧下で濃縮した。該残渣を酢酸エチル中に懸濁し、そして加熱還流した。１時間冷却後に、該固体をろ過によって集めて、酢酸エチルを用いてすすぎ、真空下で５０℃で終夜乾燥して、白色固体の標題化合物（５６２ｍｇ）を得た。ｍ．ｐ．１９３℃（分解）。元素分析（Robertson Microlit）（Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ８Ｐ・Ｃ１０Ｈ１６Ｏ４Ｓ・Ｈ２Ｏとして計算）計算値：C, 46.95; H, 5.69; N, 8.11。実測値：C, 47.22; H, 5.51; N, 7.81。
【０１６７】
実施例１８：２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]・マレイン酸塩の製造
マレイン酸（１．１当量）を用いて、実施例１７と同じ方法を用いた。
ｍ．ｐ．１４０℃（分解）。元素分析（Robertson Microlit）（Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ８Ｐ・Ｃ４Ｈ４Ｏ４・Ｈ２Ｏ・０．５Ｃ４Ｈ８Ｏ２として計算）：計算値：C, 44.67; H, 5.05; N, 9.06。実測値：C, 44.58; H, 4.61; N, 8.48。
【０１６８】
実施例１９．２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]・硫酸水素塩の製造
硫酸（８９ｍｇ、０９１ｍｍｏｌ）を、メタノール（８ｍＬ）中の２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]の懸濁液（９．４００ｍｇ、０９１ｍｍｏｌ）に加えた。該流動性の固体は粘着性となり、そして該フラスコの側面に付着した。該混合物を１５分間灌流し、室温まで冷却し、そして該固体を該フラスコの側面でスクラップした。ｒｔで３時間撹拌後に、該白色流動性の固体をろ過によって集めて、メタノールを用いてすすぎ、２０℃で真空乾燥して標題化合物（４２８ｍｇ）を得た。ｍ．ｐ．１５８℃（分解）。元素分析（Robertson Microlit）（Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ８Ｐ・Ｈ２ＳＯ４・２Ｈ２Ｏとして計算）計算値：C, 35.54; H, 4.74; N, 9.75。実測値：C, 35.50; H, 4.73; N, 9.51。
【０１６９】
実施例２０：２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]・塩酸塩の製造
１Ｎ塩酸（２２８μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）を、フラスコ中の２(１Ｈ)−ピリミジノン,−４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（９、１００．６ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）に加えた。水（５ｍＬ）およびメタノール（５ｍＬ）をいくらか可溶な固体に加え、そして該混合物を音波処理した。該透明な無色溶液を、０．４５μｍのシリンジフィルター（これは、メタノールを用いてすすぐ）を用いてろ過した。該合わせたろ液を減圧下で濃縮した。該残渣をアセトニトリル（２×１０ｍＬ）と一緒に共沸させた。該残渣をアセトニトリルおよびメタノールの混合物（１／１、１０ｍＬ）中に溶解し、そして乾固するまで濃縮した。該白色粉末を２０℃で真空乾燥して、標題化合物（７８ｍｇ）を得た。
ｍ．ｐ．＞２００℃。元素分析（Robertson Microlit）（Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ８Ｐ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏとして計算）計算値：C, 42.03; H, 4.77; N, 11.53; Cl, 7.30。実測値：C, 41.70; H, 4.84; N, 11.68; Cl, 7.45。
【０１７０】
実施例２１：２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]・Ｌ−酒石酸塩の製造
Ｌ−酒石酸の０．１Ｎ水溶液を用いて、実施例２０と同じ方法を用いた。
ｍ．ｐ．＞２００℃。元素分析（Robertson Microlit）（Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ８Ｐ・Ｃ４Ｈ６Ｏ６・Ｈ２Ｏ・０．１Ｃ２Ｈ３Ｎとして計算）計算値：C = 41.57; H ＝ 4.82; N ＝ 9.38；実測値：C ＝ 41.32; H ＝ 5.03; N ＝ 9.69。
【０１７１】
実施例２２：ラセミのトランス−４−(４−ピリジル)−２−(４−ニトロフェノキシ)−２−オキソ−１,３,２−ジオキサホスホリナンの製造
ＴＨＦ中のラセミの１−(４−ピリジル)−１,３−プロパンジオール（４ｇ、２６．１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１２ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）溶液を、ＴＨＦ中の４−ニトロフェニル−ホスホロジクロリデート（７．３５ｇ、２８．７ｍｍｏｌ）溶液に加えた。室温で終夜撹拌後に、４−ニトロフェノキシドナトリウム（１０ｇ、７１．８ｍｍｏｌ）を加え、そして該反応混合物を５０℃で４時間加熱した。該冷却反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液を用いてクエンチし、そして酢酸エチルを用いて抽出した（３×）。該合わせた有機抽出物を飽和塩化ナトリウムを用いて洗浄し、そして硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。該ろ過溶液を減圧下で濃縮し、そして得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／エタノール（９５／５）を使用）によって精製した。
1H NMR (CDCl3, Varian Gemini 200 MHz): C'-プロトン：シス−異性体  5.6-5.8 (m, 1H)；トランス−異性体  5.5-5.69 (m, 1H)。
ＴＬＣ条件：ユニプレートシリカゲル、２５０ミクロン；移動相＝３／２のアセトン／ヘキサン；ジオール：Ｒｆ＝０．２、トランス−リン酸塩：Ｒｆ＝０．６、シス−リン酸塩：Ｒｆ＝０．５。
シス／トランス異性化についてのＨＰＬＣ条件：カラム＝Zorbax Rx-C18（４．６×２５０ｍｍ）；移動相＝３５％アセトニトリル／６５％  ２０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．９５；流速＝０．５ｍＬ／分；検出＝２５０ｎｍでＵＶ；保持時間：シス−異性体＝９．３９分、トランス−異性体＝１０．１１分。
【０１７２】
実施例２３．２(１Ｈ)−ピリミジノン、４−アミノ−１−[５−Ｏ−シス−[２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]の製造
２３．１．リン酸化工程
ラセミのトランス−４−(４−ピリジル)−２−(４−ニトロフェノキシ)−２−オキソ−１,３,２−ジオキサホスホリナンを用いて、実施例１６．１と同じように行なった。
ＴＬＣ条件：ユニプレートシリカゲル、２５０ミクロン；移動相＝アセトン、トランス−リン酸塩：Ｒｆ＝０．６、保護されたアラ−Ｃ：Ｒｆ＝０．２。
【０１７３】
２３．２．脱保護工程
実施例１６．２と同様に行なった。
ＴＬＣ条件：ユニプレートシリカゲル、２５０ミクロン；移動相＝アセトン−メタノール（１：１）、保護されたアラ−Ｃ：Ｒｆ＝０．７、生成物：Ｒｆ＝０．３。
【０１７４】
本発明の方法の使用の実施例は以下のものを含む。これらの実施例は典型例であって、本発明の方法はこれらの実施例に単に限定されるものではないと理解される。
【０１７５】
明確さおよび簡便さの目的で、以下の実施例中、２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｒ,４Ｓ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキソホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（９）を化合物Ａと呼ぶ。２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−[(２Ｓ,４Ｒ)−２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]（１３）を化合物Ｂと呼ぶ。そして、実施例２３由来の２(１Ｈ)−ピリミジノン，４−アミノ−１−[５−Ｏ−シス−[２−オキシド−４−(４−ピリジニル)−１,３,２−ジオキサホスホリナン−２−イル]−β−Ｄ−アラビノフラノシル]を化合物Ｃと呼ぶ。
【０１７６】
生物学的な実施例
実施例Ａ：ヒト肝臓ミクロソーム中の酵素動力学
ヒト肝臓ミクロソームによる化合物Ａおよび化合物ＢのアラＣＭＰへの活性化を測定して、ヒト肝臓組織における活性化を比較した。ＣＹＰ３Ａ４の特異度は薬理学的なインヒビターを用いて評価した。
【０１７７】
方法：
化合物Ａおよび化合物Ｂは、ヒト肝臓ミクロソーム（In Vitro Technologies (IVT), カタログ番号X00821、ロット番号RQX、５０ドナーの混合−性のプール）の２ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（Sigma、カタログ番号P3786、ロット番号62H0619）、ｐＨ７．４、および１ｍＭのＮＡＤＰＨ（Calbiochem、カタログ番号481973、ロット番号B38806）を含有する混合物と一緒に５分間インキュベートした。反応混合物を、ＮＡＤＰＨの非存在下でエッペンドルフサーマルミキサー５４３６（７００ｒｐｍ）中、３７℃で２分間プレインキュベートして、次いで、ＮＡＤＰＨを１ｍＭの最終濃度で加えることによって開始した。５分後に、該反応液をメタノール（１１２．５μＬ）を用いてクエンチし、試料をエッペンドルフ微量遠心菅中（１４,０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離し、そして上清液（１５０μＬ）を穏やかに加熱して蒸発させて、乾固させた。試料を、イオン対緩衝液（１０ｍＭ  リン酸カリウム、Fisher、カタログ番号P286-1、ロット番号9152328A、５０ｍＭの水酸化テトラブチルアンモニウム、Aldrich、カタログ番号17,878-0、ロット番号07030KO、ｐＨをリン酸（〜３．３ｍＬ／Ｌ）で４．５に調節する、水中８５％、Chempure、カタログ番号831-621、ロット番号M224KBRR）（６０μＬ）中に再懸濁し、渦巻き、〜３０秒間音波処理し、そして〜１０秒間、１４,０００ｐｍでスパンした。
【０１７８】
アラＣＭＰへの活性化を定量化するために、試料を逆相ＨＰＬＣ（Hewlett Packard 1100）によって分析した。各試料（５０μＬ）を、Alltech C-18 EPSガードカラム（カタログ番号32607、７．５ｍｍ×４．６ｍｍ）を有するAgilent C18 Zorbax SB-AQ逆相カラム（カタログ番号883975-914、５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）上に注入した。試料を、イオン対緩衝液（上記を参照）を用いて流速が１ｍＬ／分で、カラム温度が４０℃、および試料の温度が４℃でロードした。アラＣＭＰを、〜７分でイソクラチックに溶出し、続いて７０％メタノールで２分間洗浄した。流出は、２７２ｎｍでのＵＶ吸収によって追跡した。
【０１７９】
阻害研究は、０．１μＭ〜１００μＭのトロレアンドマイシン(troleandomycin)（ＴＡＯ；Sigma T-6514、ロット番号81K1655）または０．０１μＭ〜１０μＭのケトコナゾール（KTZ；Research Biochemicals International、カタログ番号K105、ロット番号SJG-597A）と一緒にプレインキュベートすることによって実施した。ＴＡＯおよびＫＴＺの両方をメタノール中に溶解し、従って、コントロールを含有する全ての試料は最終濃度が１％（容量比）のメタノールを含む。ＴＡＯを用いた阻害研究の場合には、該ミクロソームを、基質の非存在下、３７℃で３０分間、ＴＡＯと一緒にプレインキュベートした。反応（１００μＬの容量）は、基質（１０００μＭの化合物Ａまたは１０００μＭの化合物Ｂ、および１ｍＭのＮＡＤＰＨの新鮮なアリコート）の付加によって開始した。ケトコナゾールはこのプレインキュベート方法を必要としないが、基質の添加の時に、該反応混合物にケトコナゾールを添加することによって、上記の通り反応を行なった。
【０１８０】
動力学パラメータは、平均値±標準偏差値として報告する（ｎ＝２または３の別個の実験）。ミカエリス−メンテン式、速度＝Ｖ最大値[Ｓ]／[Ｓ]＋Ｋｍを用いて、シグマプロット(Sigma Plot)からの酵素動力学モジュールｖ.１．１（SPSS社製）を用いてＶ最大値およびＫｍを算出した。固有クリアランスは、Ｖ最大値をＫｍで割ることによって得た。阻害研究についてのＩＣ５０値は、平均値±標準偏差値（ｎ＝２または３の別個の実験）として表すＩＣ５０値を用いた半値(half-maximal)内挿によって決定した。Ｋｉは、Cheng and Prusoffの式、Ｋｉ＝ＩＣ５０／１＋[基質]／Ｋｍによって決定した。
【０１８１】
結果：
ヒト肝臓ミクロソームロット番号RQX（表１）を用いた場合に、化合物Ａは、化合物Ｂよりも２．６倍の高い固有クリアランスを有した。
表１．ヒト肝臓ミクロソーム中の化合物Ａおよび化合物Ｂの活性化の動力学パラメータ
【表２】
0004689274.tif 000041
【０１８２】
化合物Ａおよび化合物Ｂの活性化はＴＡＯによって阻害され、化合物Ａおよび化合物Ｂのそれぞれについて、ＩＣ５０値は０．９±０．１μＭおよび０．７±０．４μＭであった。化合物Ａの活性化の完全な阻害（９９％）は、１００μＭのＴＡＯの場合に観察された。化合物Ｂを用いて被験した最大のＴＡＯ濃度は１０μＭであって、これは７３±２％の阻害を与えた。ＴＡＯのＫｉ値は、化合物Ａおよび化合物Ｂの場合に同じであって、それぞれ０．５±０．１μＭおよび０．５±０．３μＭであった。
【０１８３】
ＴＡＯの場合と同様に、ＫＴＺは化合物Ａおよび化合物Ｂの活性化を阻害した。ＩＣ５０値は、ＴＡＯの場合の値よりも低かった：化合物Ａおよび化合物Ｂの両方の場合に０．２±０．１μＭであった（表２）。また、１０μＭのＫＴＺの場合には、９６±３％および８９±１％の最大阻害が、化合物Ａおよび化合物Ｂの活性化のそれぞれについて観察された。Ｋｉ値は、化合物Ａの場合に０．１±０．０３μＭであって、そして化合物Ｂの場合に０．１±０．０５μＭであった。
表２．ヒト肝臓ミクロソーム中での活性化のＴＡＯおよびＫＴＺ阻害
【表３】
0004689274.tif 000042
【０１８４】
結論：
化合物Ａおよび化合物Ｂは、ヒト肝臓ミクロソームによってアラＣＭＰに活性化された。化合物Ａは、化合物Ｂよりも２．６倍以上の速度で活性化される。ＫＴＺおよびＴＡＯ阻害はプロドラッグの活性化を阻害し、このことはそのものがＣＹＰ３Ａ４によって媒介されることを示唆する。
【０１８５】
実施例Ｂ：１回用量の肝臓レベル
インビボでのプロドラッグの活性化は、マウスへのボーラス剤の腹腔内投与後に測定した。
【０１８６】
方法：
正常な非−絶食の雄性スイスウェブスター(Swiss Webster)マウス（２５〜３５ｇの体重、ハーランスプラグドーレイ(Harlan Sprague Dawley)、Indianapolis, IN）に、化合物Ａまたは化合物Ｂをそれぞれ、１００ｍｇ／ｋｇのアラＣのモル当量に対応する１８９および１９２ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。注射後の特定の時間に、マウスに麻酔をかけ、そして心臓穿刺によって採血した。全肝臓を取り出し、そして液体窒素中でスナップ−フローズンし(snap-frozen)、そしてこのものを３倍容量の１０％（容量比）過塩素酸（ＰＣＡ）中でPolytronホモジナイザーＰＴ１０／３５（Brinkmann Instruments, Westbury, NY）を用いてホモジナイズした。５分間遠心分離（２,５００×ｇ）後に、上清（１ｍＬ）を、３Ｍ  ＫＯＨ／３Ｍ  ＫＨＣＯ３を用いて中和し、そして十分に混合した。次いで、試料を５分間遠心分離し、そして得られた上清液を過ヨウ素酸を用いて処理して、アラＣＴＰ検出を妨害し得る内在性のリボヌクレオチドを除去した。このために、１００μＬの組織抽出物を、０．５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI、ロット番号08009 BU)（４μＬ）および１．８Ｍのメチルアミン（Aldrich、ロット番号04526 DQ）、ｐＨ５．５）（１０μＬ）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。該反応を、１Ｍ  Ｌ−ラムノース（Aldrich、ロット番号06801 JS）（２μＬ）を添加することによって停止させた。得られた試料を、以下に記載する通りＨＰＬＣによって分析した。
【０１８７】
骨髄中アラＣＴＰを測定するために、該骨髄試料を、大腿骨の骨髄腔から生理食塩水（１．２ｍＬ）を用いて、予め秤量したエッペンドルフチューブ中にフラッシュした。２０〜３０秒間遠心分離し（エッペンドルフ微量遠心菅、１４,０００ｒｐｍ）、そして該上清を除去した後に、１２倍容量の３％ＰＣＡ（容量比）を骨髄細胞ペレットに加えた。次いで、該ペレットが十分に溶解するまで、試料を渦巻き、そして上記の通り１０分間遠心分離した。抽出した上清（９０μＬ）を、１Ｍ  ＫＯＨ／１Ｍ  ＫＨＣＯ３（３０μＬ）を用いてｐＨ７〜８にまで中和し、そして再び遠心分離した。得られた上清を上記の通り過ヨウ素酸処理を行なった。
【０１８８】
肝臓および骨髄中アラＣＴＰレベルは、イオン交換相ＨＰＬＣ（Hewlett Packard 1050）（これは、Whatman Partisil 5 SAX（５μＭ、４．６×２５０ｍｍ）カラムを使用）によって測定した。試料（５０μＬ）を、７０％の１０ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液および３０％の１Ｍリン酸アンモニウム緩衝液（共に、ｐＨ３．５であって、６％エタノールを含有する）中のカラムに注入した。ヌクレオシドトリホスフェートを、８０％までの直線勾配の１Ｍリン酸アンモニウム（ｐＨ３．５）／６％エタノール緩衝液を用いて流速が１２５ｍＬ／分で該カラムから溶出させた。アラＣＴＰは、ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）によって検出し、そして通常１２〜１３分間の間で溶出させた。中和およびその後にＨＰＬＣ試料を調製する前に、公知の量のアラＣＭＰをコントロールの肝臓または骨髄由来のＰＣＡ抽出物中に加えることによって、標準曲線を作った。
【０１８９】
血漿を得るために、血液をヘパリン処置した微量収集チューブに移し、そしてこのものをエッペンドルフ微量遠心菅中、１４,０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。得られた血漿を集めて、ドライアイス上に置き、そして引き続いて−２０℃で保存した。分析の日に、アセトニトリル（１ｍＬ）を血漿（１００μＬ）に加えることによって、タンパク質を沈降させた。１０分間遠心分離（エッペンドルフ微量遠心菅、１４,０００ｒｐｍ）後に、該上清を取り出し、そしてこのものをSavant SpeedVac Plus SC110A中で乾燥した。試料を移動相緩衝液（２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５）（１１０μＬ）を用いて再構築し、５分間音波処理し、そして３０秒間遠心分離した。上清を逆相ＨＰＬＣ（Hewlett Packard 1090）（これは、Alltech C18カラム（５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を備える）によって分析した。移動相の緩衝液中の試料（５０μＬ）を注入後に、該アセトニトリル濃度を１０分間かけて１０％にまで、次いで１５分間かけて５０％にまで増大させた。アラＣおよびプロドラッグについての溶出時間は、それぞれ約３分および約１９分であった。アラＣおよびプロドラッグは２８０ｎｍでの吸収によって検出し、そして上記の通り加工処理したスパイク(spiked)血漿試料を用いて得られた標準曲線を用いて定量化した。
【０１９０】
結果は、平均値の平均値±標準誤差として表す。データを、適宜、個々の時点での比較のために、ＡＮＯＶＡ、続いてTukey HSD post-hoc試験の繰り返し測定によって分析した。０．０５以下のｐ−値は、総計学的に有意であると考えられる。図面中の点線は、示すＨＰＬＣ方法を用いるＬＯＱ（定量限界）を示す。
【０１９１】
結果：
化合物Ａおよび化合物Ｂは肝臓中で高レベルのアラＣＴＰを発生し（図１ａ）、このものは注射の６０分後に化合物Ａおよび化合物Ｂについてそれぞれ、６９．８９±６．３７および２７．００±４．０４ｎｍｏｌでピークに達した。化合物Ａは、４時間の時点を除く全ての時点で、化合物Ｂよりもより高い肝臓中アラＣＴＰレベルを、有意に（ｐ＜０．０５）産生した。血漿中プロドラッグレベルは、化合物Ａおよび化合物Ｂの場合に同じであった（ｐ＜０．０１；図１ｂ）。血漿中アラＣレベルは化合物Ａを投与したマウスにおいてより大きく（０．５、１および２時間についてｐ＜０．０１；図１ｃ）、これは血漿中プロドラッグレベルよりも肝臓中アラＣＴＰとより相関する。このことは、血漿中アラＣが血漿中のプロドラッグの分解よりもむしろ肝臓中アラＣＴＰから誘導され得ることを示唆する。骨髄中アラＣＴＰは全ての試料について定量レベル以下（３ｎｍｏｌ／ｇ）であって、このことは、肝臓がよい標的であることを示唆する。
【０１９２】
結論：
化合物Ａおよび化合物Ｂの両方は、ボーラス剤を腹腔内注射によって投与する場合に、肝臓中のアラＣＴＰの有意なレベルを生じる。化合物Ａは、化合物Ｂよりも約２倍以上の肝臓中アラＣＴＰレベルを生じる。アラＣＴＰは、いずれかの化合物を用いて処置した動物の骨髄中では検出されなかった。血漿中プロドラッグレベルは両方のプロドラッグの場合に同じであったが、血漿中アラＣレベルは化合物Ａの場合に約２倍よりも大きかった。肝臓中アラＣＴＰレベルに対する血漿中アラＣレベルの相関に基づくと、血漿中アラＣは、アラＣＴＰのアラＣへの脱リン酸化、および肝臓細胞から血漿中へのアラＣの漏出によっておそらく、肝臓中アラＣＴＰから生成すると予想される。
【０１９３】
実施例Ｃ：連続的な静脈内注入によって運搬する場合の肝臓中アラＣＴＰ
プロドラッグのアラＣＴＰへの活性化および肝臓中アラＣＴＰレベルの保持は、連続的な静脈内注入による薬物運搬のために備えたラットにおいて測定された。
【０１９４】
方法：
雄性シモンセンアラビノ(Simonsen Albino)ラット（Sprague Dawley由来、Simonsen Laboratories, Inc.、Gilroy、CA）を、１．９３ｍＬ当たり、ケタミン（１５０ｍｇ）（「ベタミン(Vetamine)」、１００ｍｇ／ｍＬ、Phoenix Scientific, Inc.、St. Joseph、MD）、キシラジン（１０ｍｇ）（１００ｍｇ／ｍＬ、The Butler Company、Columbus、OH）、およびモルヒネ（５ｍｇ）（１５ｍｇ／ｍＬ、Marsam Pharmaceuticals, Inc.、Cherry Hill、NJ）を含有するアナスセティック・ミックスを用いて腹腔内注射（０．２５ｍＬ）で麻酔をかけた。生理食塩水を充填した平滑末端化させた(blunt)を用いてＰＥ−５０チューブカテーテル（Intramedic、Becton Dickinson、Sparks、MD）を頚静脈中に挿入し、肩甲骨の間に外在化(exteriorized)し、そしてスイベル−テザーコンスタント注入システム(swivel-tethering constant infusion system)（Lomir Biomedical, Inc.、Malone、NY、およびHarvard Apparatus, Inc.、South Natick、MA）に連結した。該チューブをヘパリン処理生理食塩水で充填しそして封し、そして該動物を１〜７日間回復(recover)させた。備えた動物を以下の注入プロトコール中に参加させた：
【表４】
0004689274.tif 000043
【０１９５】
注入の様々な期間後に、該動物に上記の通りアナスセティック・ミックスのカテーテル内注射によって麻酔をかけた。血液試料を、ヘパリンコーティングした３ｃｃシリンジに連結させた２３ガーゼニードルを用いた心臓穿刺によって得た。肝臓試料を切除し、そしてフリーズクランプ(freeze-clamp)を用いて液体窒素中でスナップ−フローズンし、そして実施例Ｂに記載する通り加工処理した。試料を、実施例Ｂに記載する通り、肝臓中アラＣＴＰについて分析した。血漿および骨髄試料を集めて、そして実施例Ｂに記載する通り、血漿中プロドラッグ、血漿中アラＣ、および骨髄中アラＣＴＰのレベルについて分析した。
【０１９６】
結果：
化合物Ａを２００ｍｇ／ｋｇ／２４時間で連続注入することにより、４時間までに定常状態の肝臓中アラＣＴＰレベルが得られ（１２．８４±１．５０ｎｍｏｌ／ｇ）、そして残りの４４時間、平均１３±１ｎｍｏｌ／ｇを保った（図２ａ）。全ての３化合物についての血漿中プロドラッグレベルは、４８時間の処置の期間中、同じであって、３０〜６０μＭの範囲であった。生成する化合物Ｂおよび化合物Ｃは、化合物Ａよりも肝臓中のアラＣＴＰが低かった。これらの研究は独立して実施し；従って、あり得る実験上の変動についてコントロールした。化合物Ａを化合物Ｂの研究における動物の１群に投与した。注入の４時間後に測定した、それらの動物の肝臓中アラＣＴＰレベルは、化合物Ａについての４８時間研究における同じ時点で得られるレベルと同じであって、そして血漿中プロドラッグレベルは該２化合物について同一であった。このことは、肝臓中アラＣＴＰレベルの差違は、薬物動態学におけるわずかに差違に起因するものではないことを示唆する。骨髄中アラＣＴＰは、全ての試料中において定量レベル以下（３ｎｍｏｌ／ｇ）であった。
【０１９７】
肝臓中アラＣＴＰレベルの用量反応性は、化合物Ｂを１００または５０ｍｇ／ｋｇ／２４時間で２４時間かけて注入するか、あるいは化合物Ａを１４４ｍｇ／ｋｇ／２４時間で４時間かけて注入することによって試験した。図２ｂに示す通り、肝臓中のアラＣＴＰレベルは、両方のプロドラッグに対して用量−応答性であった。
【０１９８】
結論：
化合物Ａ、ＢまたはＣの連続注入により、肝臓中のアラＣＴＰレベルは有意となり、そして保持された。化合物Ａの投与により、化合物Ｂまたは化合物Ｃの場合よりも大きい肝臓中アラＣＴＰを生じ、血漿中プロドラッグレベルは同じであった。このことは、差違が薬物動態学よりもむしろ活性化速度における差違によるものであることを示唆する。
【０１９９】
実施例Ｄ：肝臓標的化
これらのＣＹＰ３Ａ−活性化プロドラッグによるアラＣＴＰ運搬の肝臓特異度は、肝臓中アラＣＴＰレベルを他の器官中の活性代謝産物と比較することによって、インビボで測定した。特に、骨髄がシタラビンの毒性の標的器官であるという理由で、骨髄に対する肝臓標的化を評価した。
【０２００】
方法：
実施例ＢおよびＣに記載する通り、組織分布研究をマウスおよびラットにおいて実施した。これらの研究において、肝臓、血漿および骨髄の試料は、肝臓標的化を評価するために剖検で得た。同様な研究を親化合物であるシタラビンを用いて実施して、肝臓標的化薬剤としての有用性を示す。
【０２０１】
結果は、平均値の平均値±標準誤差として表す。適宜、ＡＵＣは０時から研究の最後の時点までを算出した。各化合物についての肝臓標的化指標（ＬＴＩｓ）は、肝臓中アラＣＴＰのＡＵＣを血漿中アラＣ（血漿中ＬＴＩ）についてのＡＵＣまたは骨髄中アラＣＴＰについてのＡＵＣ（骨髄中ＬＴＩ）で割ることによって算出した。連続注入の研究の場合には、定常状態のアラＣＴＰレベルを、定常状態の血漿中アラＣレベルで割った。
【０２０２】
結果：
実施例Ｂに記載する通り、化合物Ａ、化合物Ｂまたは化合物Ｃをマウスまたはラットに投与する場合に、高レベルのアラＣＴＰを肝臓中で検出した。表３は、ボーラス剤の腹膜内注射研究におけるピークレベルおよびＡＵＣをまとめる。骨髄中アラＣＴＰは、全ての研究において定量レベル以下（３ｎｍｏｌ／ｇ）であって、このことは良好な肝臓標的化を示唆する。それに対して、高レベル（１９ｎｍｏｌ／ｇ）のアラＣＴＰは、１００ｍｇ／ｋｇのシタラビンを同様な様式で投与する場合に、骨髄中で検出される。骨髄が該化合物をアラＣＭＰに直接的に活性化するという証拠はなく；いずれかのあり得るアラＣＴＰは、おそらく血漿から採取されるアラＣの活性化から誘導され、そして骨髄中でアラＣＴＰにリン酸化される。アラＣは、これらの動物における血漿中で検出され、そして全ての研究において、肝臓中アラＣＴＰレベルと相関することを示す。表３中に示す通り、血漿中アラＣのＡＵＣ値は、化合物Ａまたは化合物Ｂの腹腔内投与後のマウスおよびラットにおいて３〜２２μＭ＊時間の範囲である。実験期間中、血漿中アラＣ曝露に対する肝臓中アラＣＴＰの比率を測定することによる肝臓標的化指標（ＬＴＩ）の見積もりは、末梢の曝露に対して肝臓へのアラＣＴＰの標的化が１９．２〜２７倍であることを示唆する。これらの値は、シタラビンの場合のＬＴＩよりも１００倍以上に大きかった。定常状態の値は、化合物Ａ、化合物Ｂまたは化合物Ｃが連続的に静脈内注入によって運搬される場合に、同様に比較することができる（表４）。これらの研究における該ＬＴＩは５〜＞１２の範囲であり、これはシタラビンを１０以上の用量で投与した場合のＬＴＩよりも１０００倍以上である。
表３：シタラビンの４−ピリジル（化合物Ａ、化合物Ｂ）ヘップダイレクト(HepDirect)プロドラッグのインビボマウス肝臓標的化。化合物は、１回腹腔内注射を用いて１００ｍｇ（シタラビン当量）／ｋｇで投与した。
【表５】
0004689274.tif 000044
表４：ラットにおけるシタラビンの４−ピリジル（化合物Ａ、化合物Ｂ、または化合物Ｃ）ヘップダイレクトプロドラッグの連続注入。プロドラッグは、連続的な静脈内注入によって、用量を２００ｍｇ（シタラビン当量）／ｋｇ／日で投与した。＊アラＣは、２０００ｍｇ／ｋｇ／日で与えた。
【表６】
0004689274.tif 000045
【０２０３】
結論：
化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃは、アラＣＴＰを肝臓へ有効に標的化し、これにより、腹腔内投与した場合に〜２０倍だけまたは連続的な静脈内注入によって投与した場合に〜１０倍だけ、末梢性曝露を低下する。該標的化は、アラＣの１００〜１０００倍の改善を意味する。
【０２０４】
実施例Ｅ：水安定性
化合物の水安定性は、ｐＨおよび緩衝濃度の関数として測定した。
【０２０５】
方法：
化合物Ａおよび化合物Ｂは、ストック溶液として５００μＭ（０．２３ｍｇ／ｍＬ）で水に溶解した。希釈溶液（５０μＭ）を、フィッシャーサイエンティフィック(Fisher Scientific)ドライバスインキュベーター（カタログ番号11-718-2）中、３７℃でインキュベートし、そして試料を２４時間毎に集め、そしてこのものを−８０℃で保存した。血漿試料（１００μＬ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）を用いてクエンチした。全ての血漿試料を集めた後に、試料を解凍し、エッペンドルフ微量遠心菅（１４,０００ｒｐｍ）中で１０分間遠心分離し、そして上清（１ｍＬ）を取り出し、そして穏やかに加熱しながら（〜３７℃）、２または３時間乾固するまで蒸発させた。試料を、ＨＰＬＣ注入前に、移動相緩衝液（１２０μＬ）中に再懸濁した。
【０２０６】
試料を、ＨＰ１０９０またはＨＰ１１００（Hewlett Packard）ＨＰＬＣ（このものは、Alltech Econosphereカラム、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号70065）およびC-18 Alltech Econosphereガードカラム（７．５ｍｍ×４．６ｍｍ（カタログ番号96121）を使用する）を用いて分析した。試料をメタノール勾配（０％を５分間、次いでこのものを１０分で１０％、２０分で３０％、および２５分で６０％にまで増大する）を用いて溶出した。該カラムを、次の注射前の１０分間、０％メタノール中で平衡とした。流速は、カラム温度が４０℃の場合に１ｍＬ／分とした。プロドラッグを約１９．５分で溶出し、そしてこのものを２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって追跡した。水性条件でのプロドラッグの場合には、メタノール勾配が以下の通りである（０％を５分間、１０分間で１０％に、２０分で３０％にまで増大させ、そしてプロドラッグを２０分溶出した）以外は、同じ方法を用いた。
【０２０７】
結果：
化合物Ａおよび化合物Ｂの両方は水溶液中で全く安定であって、そのものは、１０ｍＭリン酸カリウム（Ｐｉ）（ｐＨ７．４）および１０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）中でｔ９０は＞６日であった。化合物Ａの安定性はまた、１００ｍＭ  Ｐｉ（ｐＨ７．４）中で＞６日間であるが、化合物Ｂの安定性はこの緩衝液中でわずかに劣り、ｔ９０は４日間であった。両方の化合物の安定性は、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）中で低下し、化合物Ａおよび化合物Ｂについてそれぞれ、ｔ９０は２日間および１．７日間と算出された。
【０２０８】
結論：
４−ピリジルプロドラッグの安定性は全く良いが、しかし化合物はより高い緩衝液の強度を有する低いｐＨではわずかに安定性が劣る。
【０２０９】
実施例Ｆ：溶解度
化合物Ａおよび化合物Ｂの溶解度を様々な条件下で測定して、インビボ投与のための可能な製剤を同定する。
【０２１０】
方法：
化合物Ａおよび化合物Ｂの溶解度は、０．５Ｍ  Ｐｉ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍクエン酸（ｐＨ７．０）および０．５Ｍクエン酸（ｐＨ４．０）の緩衝液中で評価した。該３個の緩衝液系の各々の場合に、化合物Ａおよび化合物Ｂの飽和溶液は以下の通り調製した。化合物Ａ（３０ｍｇ）および化合物Ｂ（１５０ｍｇ）の標的を別個の４ｃｃ透明なガラスバイアルに移し、そして緩衝液（１．０ｍＬ）を各バイアルに加えた。得られたバイアルを封し、そしてこのものを２５℃で最少で２４時間回す(tumbling)ことによって平衡化させた。インキュベート期間の最後に、溶液中でないプロドラッグを、０．４５μｍの細孔サイズのナイロンシリンジフィルターを用いたろ過によって該試料から取り出した。これらの希釈した該試料は、実施例ＥのＨＰＬＣ方法によってアッセイした。
【０２１１】
結果：
化合物Ａの溶解度は、ｐＨ８の緩衝液中では２．９ｍｇ／ｍＬであって、ｐＨ７．０の場合には２．６ｍｇ／ｍＬであり、そしてｐＨ４．０の場合には４５．８ｍｇ／ｍＬであった。化合物Ｂの溶解度は、ｐＨ８の緩衝液中では１０．２ｍｇ／ｍＬであって、ｐＨ７．０の場合には９．０ｍｇ／ｍＬであり、そしてｐＨ４．０の場合には９４．６ｍｇ／ｍＬであった。
【０２１２】
結論：
化合物Ａおよび化合物Ｂの両方は中性のｐＨ溶液中ではかなり可溶であって、化合物Ｂの溶解度は化合物Ａの溶解度を超える。両方の化合物の溶解度は、ｐＨが４以下で調製した場合には、実質的に増大する。
【０２１３】
実施例Ｇ：血漿中の安定性
血漿中の化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃの安定性を、該化合物はインビボで安定であるかどうかを試験するために、６日間かけて測定した。
【０２１４】
方法：
抗凝固剤であるヘパリンを含有する雄性および雌性のプールしたヒト血漿（Bioreclamation Inc.、HIckville、NY、カタログ番号HMPLNAHP、ロット番号BRH02236）について、全ての血漿アリコートのｐＨは８．３であった。化合物Ａおよび化合物Ｂを、ストック溶液として５００μＭ（０．２３ｍｇ／ｍＬ）で水に溶解し、血漿試料中に５０μＭにまで希釈し、そしてフィッシャーサイエンティフィックドライバスインキュベーター（カタログ番号11-718-2）中、３７℃でインキュベートし、そして試料を２４時間毎に集め、そしてこのものを−８０℃で保存した。試料（１００μＬ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）を用いてクエンチした。全ての試料を集めた後に、試料を解凍し、エッペンドルフ微量遠心菅中で１０分間遠心分離し（１４,０００ｒｐｍ）、そして上清（１ｍＬ）を取り出して、そしてこのものを穏やかに加熱しながら（〜３７℃）、２または３時間蒸発させて乾固させた。試料をＨＰＬＣ分析前に、移動相緩衝液（１２０μＬ）中に再懸濁した。血漿試料の場合には、試料（４０μＬまたは５０μＬ）を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）（フィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号P261-1、様々なロット番号）と一緒に、実施例Ｅに記載するカラム上に注入した。全ての他のＨＰＬＣ分析を、実施例Ｅに記載する通り実施した。
【０２１５】
結果：
３７℃でのヒト血漿中のｔ1/2は、全ての化合物について６±１／２日であった。
【０２１６】
結論：
ヒト血漿中での半減期が１日以上である場合に、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃは、インビボでの有意な分解を受けるとは予想されない。
【０２１７】
実施例Ｈ：ラットの急性毒性
用量が２０００ｍｇ／ｋｇ／２４時間での化合物Ａの耐性および安全性を、連続的な静脈内注入の２４時間後に評価した。
【０２１８】
方法：
雄性および雌性のシモンセン(Simonsen)ラットを、実施例Ｃに記載する通り連続注入のために用意した。処置の日に、該ラットを一定の注入テザーにフックし、そしてこのものを食物および水を自由に与えた。３匹の雄性および３匹の雌性のラットを、流速が２．０８ｍＬ／ｋｇ／時間を用いて、用量が２０００ｍｇ／ｋｇ／２４時間の化合物Ａを用いて処置した。化合物Ａは水に４２．５ｍｇ／ｍＬで溶解し、そして該ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌを用いて４にまで調節した。該モル浸透圧濃度は、５Ｍ  ＮａＣｌを用いて〜３００ｍＯｓｍでまで調節した。コントロールとして、２匹の雄性ラットについて、同じ期間、ｐＨ４の生理食塩水を注入した。該ラットの外見および素質(disposition)は常に追跡し、そしてそれらの挙動を該研究日に、１〜３時間毎に記録した。
【０２１９】
該動物を、１００％酸素中に５％イソフルラン（Abbot Laboratories, NDC 0074-3292-02）を有するフルオテック(Fluotec)３気化器を介して供給されるチャンバー中で流速が毎分１．５〜２リットルで麻酔をかけた。血液試料は、ヘパリンコーティングした３ｃｃシリンジに連結させた２３ガーゼニードルを用いる心臓穿刺によって、静脈内注入の間に得た。各動物由来の血液を、Ｋ２−ＥＤＴＡ含有のマイクロテイナーチューブ（Becton Dickinson、36/5974）と、血清用のゲル分離剤（Becton Dickinson、36/5956）および血漿収集用のリチウムヘパリン（Becton Dickinson、36/5958）を有するマイクロテイナーチューブとの間で分けた。可能ならば、尿を３ｃｃシリンジに連結させた２３ガーゼニードルを用いて、膀胱から取り出した。組織試料を、以下の順序：肝臓、腎臓、小腸、膀胱および骨髄、で集めた。小腸は、十二指腸、空腸および回腸由来の試料である３個の等しい部分に分けて；糞便は、平滑末端化鉗子(blunt forceps)を用いて圧を静かにスライドさせることによって、手動で取り出した。各組織から、一部を組織学のために１０％緩衝化ホルマリン中に置いた。有核骨髄細胞を測定するために、該骨髄試料を大腿の骨髄腔から１ｍＬのＰＢＳ（ｗ／ｏ  Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋）を用いてフラッシュし、激しくトリチュレートしそして渦巻いて、細胞を分離した。
【０２２０】
細胞をカウントする場合には、ＥＤＴＡ処理した血液（５０μＬ）またはＰＢＳ懸濁した骨髄フラッシュ(flush)を、１Ｍ酢酸中の０．１９ｍｇ／ｍＬのクリスタルバイオレット（Sigma番号C-1658、ロット番号112H3660）を含有する核染色溶液のそれぞれ４５０μＬまたは９５０μＬと一緒に混合し、そして室温で少なくとも５分間インキュベートした。簡単に渦巻いた後に、該混合物のアリコート（１０μＬ）を血球計数器中に置いて、そして細胞をニコン光学顕微鏡−２を用いてカウントした。該血液試料を４０×の対物レンズ下でカウントして、単核細胞（リンパ球および単球）および多形核細胞（ＰＭＮ、好中球、好酸球、および好塩基球のタイプの顆粒球を含む）の数を評価した。有核骨髄細胞を、１０×対物レンズ下でカウントした。
【０２２１】
赤血球および血小板の数、ヘモグロビン、並びにヘマトクリットを含めた血液学分析のために、ＥＤＴＡ処理した血液試料をLabCorp（San Diego、CA）に提出した。血清化学分析をまた、LabCorpによって実施した。処置したマウス由来の組織検体をコードし、そしてヘマトキシリン−エオシン染色の組織切片の調製および組織病理学の評価のために、Comparative Biosciences（Mountain View、CA）に輸送(ship)した。
【０２２２】
結果：
高用量の場合に、化合物Ａは十分に耐性であって、そして薬物処置、ビヒクル処置、または非処置のコントロール動物の間で有意な行動の差違は全くなかった。剖検の場合に、全ての灌流動物の胃は空であるが、他の相違は全く観察されなかったことを記す。体重および食物の消費は、注入プロトコールの前またはその間には測定しなかった。
【０２２３】
血液、骨髄および組織の切片を、多数のパラメータについて評価した。１つの関心は、高レベルの化合物Ａに曝露後の肝毒性についてのポテンシャル、または該製剤に関係する明白な毒性であった。上記の通り、明白な毒性は、２４時間の処置の間には全く見られなかった。全ての血清化学および血液学のパラメータは通常、正常な範囲内であった。いくつかの試料は公知の刊行物と比較して、顕著な異常値を生じるが、それらは非処置コントロールとは相違しないか、または毒物学的に関連すると考えられないかのいずれかである。評価された全ての血清パラメータのうちで、血清中トリグリセリドレベルだけが正常な範囲外であった。
【０２２４】
血液中の単核細胞、ＰＭＮおよび骨髄の計数を測定して、血液学に及ぼす可能な急性効果について試験した。我々は、この短期間での有意または著しい差違を予期しなかった。実際に、非処置、ビヒクル処置、または薬物処置の動物の間での血液中単核細胞またはＰＭＮ細胞における差違は全く検出されなかった。有核骨髄細胞もまた、ビヒクル処置および薬物処置の動物の間で相違しなかった。
【０２２５】
肝臓、腎臓、小腸（十二指腸、空腸、回腸）および膀胱由来の組織試料を全て、病理学者によって評価した。いずれかの試料における有意な組織病理学的な発見は、全くないことを記す。
【０２２６】
結論：
高用量での連続的な静脈内注入によって少なくとも最初に２４時間投与する場合に、化合物Ａはラットによって十分に耐性であった。
【０２２７】
実施例Ｉ：マウスの５日間の安全性の薬理学
親化合物であるアラＣの安全性と相対的な化合物Ｃの安全性を、正常な雄性マウスにおける５−日間の繰り返し用量研究において評価した。
【０２２８】
方法：
アラＣを、シグマケミカル社（St. Louis、MO、カタログ番号C1768、ロット番号39H5962）から購入した。化合物ＣおよびアラＣを、減菌生理食塩水に溶解した。ストック溶液を、予め秤量した薬物から毎日調製した。最大濃度以外の全ての濃度は、ストック溶液を更に減菌生理食塩水を用いて希釈することによって調製した。すぐに使用しないいずれの薬物も冷蔵し、そして２４時間以内に使用した。全てのプロドラッグを、シタラビンモル当量（ＣＥ）で投与した。
【０２２９】
雄性ＮＩＨスイスウェブスターマウス（２５〜３３ｇの体重、ハーランスプラグドーレイ、Indianapolis、IN）に、化合物Ｃ、アラＣまたはビヒクルを動物施設ライトサイクル(vivarium light cycle)の開始約３〜４時間後に、０〜４日間、１日に１回、化合物Ｃ、アラＣ、ビヒクルを腹腔内注射した。化合物Ｃについての用量は、１０００、３００、１００および３０ｍｇ／ｋｇのヌクレオシド当量／日であって（これは、１８４８、５５４、１８５、および５５．４ｍｇ／ｋｇ／日と等しい）、一方でアラＣは１００、３０、１０、および３ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。該ビヒクルは生理食塩水であった。体重は、化合物の投与の直前０〜４日、および殺す５日前に記録した。全てのマウスを、ハロタン麻酔薬下での全失血、および続く頚部の脱臼によって、５日目に（最後の腹腔内投与の２３〜２５時間後）殺した。各動物からの血液を、実施例Ｈに記載する通り、血液化学および血液学のパラメータについて分析した。肝臓を切除し、そして中性の緩衝化１０％ホルマリン中に固定化し、１ｍＬ  ＰＢＳ（このものは、カルシウムおよびマグネシウムを有しない）を用いて骨髄を右大腿からフラッシュし、そして有核細胞の計数を実施例Ｈの通り測定した。
【０２３０】
ＥＤＴＡ処理した血液試料を、赤血球、血小板の数、ヘモグロビン、およびヘマトクリットを含む血液学分析のために、LabCorp（LabCorp、San Diego、CA）に提示した。血清化学分析はまた、LabCorpによって実施した。ビヒクル、１００ｍｇ／ｋｇのアラＣまたは１０００ｍｇ／ｋｇＣＥの化合物Ｃを用いて処理した組織標本をコードし、そしてヘマトキシリン／エオシン染色の組織標本の調製および組織病理学の評価のために、Comparative Biosciences（Mountain View、CA）にホルマリン中で輸送した。組織病理学研究についての標本コードは、化合物Ｃの１０００ｍｇ／ｋｇ／日の場合に１〜７番、アラＣの１００ｍｇ／ｋｇ／日の場合に３３〜４０番、および生理食塩水ビヒクルの場合に６５〜７２番とした。
【０２３１】
結果は、用量群当たり５〜８の動物について、平均値±標準偏差として表す。選択した血液学パラメータの場合には、各動物についてのデータをまた、該ビヒクル群の平均値の％して提示した。統計学分析は、一元配置分散分析(one-way ANOVA)、続いてダネットのポストホック試験(Dunnett'spost-hoc test)によって、コントロール群および複数の用量群の間の差違について実施した。０．０５以下のｐ値は、統計学的に有意であると考えた。
【０２３２】
結果：
マウスに、化合物ＣまたはアラＣを様々な用量で５日間腹腔内注射し、そして最初の投与の２４時間後に殺した。行動および通常の外見から判断して、明らかな病気になったマウスは全くいなかった。アラＣは最大の用量で、体重の徐々に且つ統計学的に有意な低下を誘発するが（図３ａ、１００ｍｇ／ｋｇ／日）、化合物Ｃは最大用量（１０００ｍｇ／ｋｇ／日のヌクレオシド当量）の場合でさえも、有意な効果を全く有しなかった（図３ｂ）。
【０２３３】
３０および１００ｍｇ／ｋｇ／日の場合には、アラＣは有核骨髄細胞、循環性ＰＭＮ、単核細胞、および血小板の数を有意に減少させた（図４）。最大用量のアラＣの場合には、骨髄細胞充実性は、ビヒクル処置動物の場合の１１％にまで低下した。３０倍の高用量の化合物Ｃ（１０００ｍｇ／ｋｇ／日のヌクレオシド当量）が、有核骨髄細胞の数を減少させるのに必要であった（図４ａ）。いずれの用量においてもアラＣと対比して、化合物Ｃは、ＰＭＮ、単核細胞、または血小板の数には影響を及ぼさなかった（図４ｂ〜ｄ）。
【０２３４】
アラＣおよび化合物Ｃは赤血球パラメータに有意に影響を及ぼすが、１０倍異なる用量である。アラＣは２つの最大用量である３０および１００ｍｇ／ｋｇ／日の場合に、赤血球数、ヘマトクリット、およびヘモグロビンを有意に低下させた。ヘマトクリットのわずかな低下がまた、１０ｍｇ／ｋｇ／日のアラＣの場合に観察された。化合物Ｃは同様に、これらのパラメータに影響を及ぼすが、１０倍の高用量である。
【０２３５】
血清化学分析は、ほとんどの基質がいずれの化合物によっても影響を受けないことを示した。特に、肝臓機能の試験パラメータ（ビリルビン、ＡＳＴ、およびＡＬＴ）は、ビヒクル、アラＣ、または化合物Ｃを用いて処置した動物において同じであった。アルカリ性ホスファターゼは、最大用量のアラＣの場合にのみ、有意に低下した。アルブミンおよびＢＵＮは、全ての処置の場合には変わらなかった。クレアチニンおよびグルコースは、最大用量（１００ｍｇ／ｋｇ／日）の場合にアラＣによって低下した。グルコースはまた、３０ｍｇ／ｋｇ／日のアラＣおよび１０００ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｃによって低下した。グルコースに対する化合物Ｃのわずかではあるが有意な影響は、いずれかの血清化学パラメータにおいて観察される化合物Ｃの唯一の効果である。
【０２３６】
Comparative Biosciencesの組織病理学者は、ビヒクルまたは１００ｍｇ／ｋｇのアラＣまたは１０００ｍｇ／ｋｇＣＥの化合物Ｃを用いて処置したマウス由来のホルマリン固定の肝臓、腎臓および小腸の標本を評価し、そしていずれの標本においても毒物学的に関連した組織病理学的な変化は全くないことを見出した。
【０２３７】
結論：
化合物Ｃは、有核骨髄細胞、末梢ＰＭＮ、および単核細胞を含めた血液学的指標の観点において、５−日繰り返し用量処置プロトコールの場合には、アラＣよりも３０倍以上、安全であった。化合物Ｃ、またはその親化合物であるアラＣのいずれの場合にも、肝毒性は全く観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１ａ】図１ａは、化合物Ａおよび化合物Ｂを雄性ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスに１００ｍｇ／ｋｇ  ＣＥの用量で１回腹腔内ボーラス注射によって時間０で投与する場合の、肝臓中のアラＣＴＰのレベルを示す図面である。
【図１ｂ】図１ｂは、化合物Ａおよび化合物Ｂを雄性ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスに１００ｍｇ／ｋｇ  ＣＥの用量で１回腹腔内ボーラス注射によって時間０で投与する場合の、血漿中のプロドラッグのレベルを示す図面である。
【図１ｃ】図１ｃは、化合物Ａおよび化合物Ｂを雄性ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスに１００ｍｇ／ｋｇ  ＣＥの用量で１回腹腔内ボーラス注射によって時間０で投与する場合の、血漿中のアラＣのレベルを示す図面である。
【図２ａ】図２ａは、化合物Ａ、化合物Ｂ、または化合物Ｃを連続的な静脈内注入によって投与後の、肝臓中のアラＣＴＰのレベルを示す図面である。
【図２ｂ】図２ｂは、化合物Ａまたは化合物Ｂを用いて処置後の、肝臓中アラＣＴＰの用量応答を示す図面である。
【図３ａ】図３ａは、用量が３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ  ＣＥのアラＣを用いて毎日のＩＰ注射によって５日間処置したマウスにおける、時間関数としての初期体重の％として表した体重を示す図面である。
【図３ｂ】図３ｂは、用量が３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ  ＣＥの化合物Ｃを用いて毎日のＩＰ注射によって５日間処置したマウスにおける、時間関数としての初期体重の％として表した体重を示す図面である。
【図４ａ】図４ａは、有核骨髄細胞の場合の、生理食塩水ビヒクルに対する、アラＣまたは化合物Ｃを用いて５日間処置後の血液学指標を示す図面である。
【図４ｂ】図４ｂは、末梢血多核細胞（ＰＭＮ）の場合の、生理食塩水ビヒクルに対する、アラＣまたは化合物Ｃを用いて５日間処置後の血液学指標を示す図面である。
【図４ｃ】図４ｃは、末梢血単核細胞の場合の、生理食塩水ビヒクルに対する、アラＣまたは化合物Ｃを用いて５日間処置後の血液学指標を示す図面である。
【図４ｄ】図４ｄは、血小板の場合の、生理食塩水ビヒクルに対する、アラＣまたは化合物Ｃを用いて５日間処置後の血液学指標を示す図面である。
【図１ａ】
0004689274.tif 000048
【図１ｂ】
0004689274.tif 000049
【図１ｃ】
0004689274.tif 000050
【図２ａ】
0004689274.tif 000051
【図２ｂ】
0004689274.tif 000052
【図３ａ】
0004689274.tif 000053
【図３ｂ】
0004689274.tif 000054
【図４ａ】
0004689274.tif 000055
【図４ｂ】
0004689274.tif 000056
【図４ｃ】
0004689274.tif 000057
【図４ｄ】
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