(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Th1−介在炎症性疾患のリスクの上昇またはTh2−介在炎症性疾患のリスクの上昇に寄与する要因を有する個人の性状解析方法であって、
(a) 配列番号１として提供されるTCF-1遺伝子の883位に存在するヌクレオチドについて該個人の遺伝子型を決定し；
(b) 工程(a)で得られた結果に基づいて患者を分類する、ここで、Ａ対立遺伝子の存在は、Th1−介在炎症性疾患のリスクの上昇に寄与する要因であり、Ｃ対立遺伝子の存在は、Th2−介在炎症性疾患のリスクの上昇に寄与する要因である
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
Th1−介在炎症性疾患のリスクの上昇に寄与する要因を有する個人の性状を解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該Th1−介在炎症性疾患が１型糖尿病または多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Th2−介在炎症性疾患のリスクの上昇に寄与する要因を有する個人の性状を解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該Th2−介在炎症性疾患がアレルギー性喘息またはアトピーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子型の決定が、
(a) サンプルからの核酸に、883位を含む領域中のＡ対立遺伝子またはＣ対立遺伝子である対立遺伝子に正確に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを、該対立遺伝子が存在する時にのみハイブリダイゼーションが起きる条件下で、接触させ；そして
(b) ハイブリダイゼーションが起きるかどうかを検出して、該対立遺伝子の存在を示す、
ことを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドプローブが、KW196（配列番号８）またはKW118（配列番号９）の群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子型の決定が、
(a) サンプルからの核酸に、Ａ対立遺伝子またはＣ対立遺伝子である対立遺伝子に特異的な対立遺伝子特異的プライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーのセットを、該対立遺伝子が存在する時にのみ該対立遺伝子特異的プライマーを使用して増幅が起きる条件下で、接触させ；そして
(b) 増幅が起きるかどうかを検出して、該対立遺伝子の存在を示す、
ことを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該対立遺伝子特異的プライマーが、GZ351B（配列番号４）またはGZ374B（配列番号５）である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学と分子生物学の分野に関する。さらに詳しくは本発明は、Th1−介在またはTh2−介在炎症性疾患を発症するリスクに関連し得るTCF-1遺伝子座中のヌクレオチド配列の変化を検出するための方法と試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
CD4+ Ｔリンパ球は、分泌されるサイトカインのパターンに基づいて、２つの機能的に明確なサブセットに分類されている。Tヘルパー1型（Th1）と呼ぶ１つのサブセットは、活性化されるとインターロイキン2（IL-2）、IL-12、腫瘍壊死因子（TNF）、リンフォトキシン（LT）、およびインターフェロンガンマ（IFN-γ）を分泌し、主に細胞性免疫（例えば、遅延型過敏症）に関与する。Tヘルパー2型（Th2）と呼ぶ第２のサブセットは、活性化されるとIL-4、IL-5、IL-6、IL-9、およびIL-13を分泌し、主に細胞外防御機構に関与する。Th2-型リンパ球を刺激するとリンホカインが分泌され、これはB細胞を誘導して抗体を産生させ、好酸球とIgE産生を増加させ、その結果肥満細胞が増加し、ヒスタミンが放出され、炎症反応が起きる。Th1とTh2の役割は、Peltz, 1991, Immunological Reviews 123: 23-35（これは参照により本明細書に組み込まれる）の総説に記載されている。
【０００３】
抗原に対する免疫学的応答は、リンホカイン産生の明確なパターンにより、Th1またはTh2エフェクター細胞への、CD4+ Tヘルパー前駆細胞（Th0）の選択的分化が介在する。リンホカインサブセットの分泌はさらに、Th0からTh1またはTh2エフェクター細胞への分化において、制御機能を提供する。例えばTh2細胞により産生されるリンホカイン（IL-4）は、Th2細胞への分化を促進し、かつTh1細胞への分化を阻害する。逆にTh1細胞により産生されるリンホカイン（IL-12とIFN-γ）は、Th1細胞への分化を促進し、かつTh2細胞への分化を阻害し、B細胞への直接作用によりIgE合成を抑制する。サブセット特異的リンホカインの相互的制御作用が、Th1またはTh2応答の分極に関与する。
【０００４】
ヒトのT細胞は、いくつかの慢性炎症性またはアレルギー性疾患の病因に関与する抗原に応答して活性化されると、Th1またはTh2型細胞に特徴的なリンホカイン産生の選択的パターンを示す。いくつかの自己免疫疾患（例えば、1型糖尿病または多発性硬化症（MS））は、優勢なTh1応答に関係するとされている。リンホカイン発現のTh1様パターンは、慢性ライム関節炎患者から単離されたアレルゲン特異的T細胞中に、かつ結核様らい患者で見られる。これに対してリンホカイン発現のTh2様パターンは、アトピー性患者から単離されたアレルゲン特異的T細胞で見られる。アトピーと喘息の特徴の多く（特に、IgE合成）は、Th2細胞から分泌されるサイトカインの協同作用に帰因する。
【０００５】
Th1またはTh2 T細胞サブセットの選択的不均衡または不適当な活性化は、いくつかの慢性炎症性またはアレルギー性疾患の病因にとって最も重要である。病原体またはアレルゲンに対するあるの人の免疫応答が疾患を起こすのに、他の人の免疫応答では防御的応答であるのはなぜかについては、いまだに不明である。しかし、ある個人が病原体またはアレルゲンへの暴露に応答して炎症性またはアレルギー性疾患を発症する確率は、応答を支配するCD4+ T細胞の型により決定され得る。免疫介在疾患は、細胞応答がTh1またはTh2モードで病理的に固定されると発症する。ウイルス感染を除去または解決する能力は、Th2応答ではなくTh1応答を反映するかも知れない。
【０００６】
T細胞分化の遺伝的に決定された相違は、抗原に対するT細胞応答の性質を決定し、従って病原的または非病原的帰結をもたらすかどうかを決定する。T細胞分化の制御はまだ解明されていないが、T細胞分化を制御する遺伝子のカスケード様システムの多くの成分が同定されている。T細胞特異的転写因子TCF-1（現在は、正式にTCF-7と呼ばれる）は、T細胞分化を制御する遺伝子のシステムの１つの成分である。TCF-1遺伝子がクローン化されており、配列と構造が開示されている（van der Weteringら、1992, J. Biol. Chem. 367(12): 8530-8536; van der Weteringら、1996, Molecular and Cellular Biology 16(3): 745-7852を参照； いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、TCF-1遺伝子のエキソン2中の新たに発見されたヌクレオチド配列多型と、配列変異体(sequence variant)とTh1−介在およびTh2−介在炎症性疾患との関係に関する。存在する対立遺伝子配列変異体を同定すると、免疫系が一因である疾患（例えば、炎症性疾患）のリスクに従って個人を性状解析するのを補助する免疫系に関する情報が得られる。
【０００８】
TCF-1遺伝子のヌクレオチド883位に存在するヌクレオチドが異なる２つの対立遺伝子配列変異体が同定されている。本発明の１つの態様は、ヌクレオチド883位に存在する配列変異体についての遺伝子型決定に関する。
【０００９】
TCF-1対立遺伝子の相違は、Th1−介在またはTh2−介在炎症性疾患の生じやすさに関連しているようである。TCF-1は、T細胞分化を制御する遺伝子の系の成分であり、T細胞分化の遺伝的に決定された相違は、抗原に対するT細胞応答の性質を決定し、従って病原的または非病原的帰結があるかどうかを決定し得るため、TCF-1遺伝子中の対立遺伝子の相違は、T細胞分化に影響を与え得る。TCF-1対立遺伝子の差と、Th1−介在またはTh2−介在炎症性疾患の生じやすさとの関係は、TCF-1対立遺伝子の差が、Th1−またはTh2−型応答の傾向を決定する要因かも知れないことを示唆する。対立遺伝子の１つが、抗原に応答したTh1型応答の傾向の上昇と関係しており、一方他の対立遺伝子は、Th2型応答の傾向の上昇と関係しているかも知れない。すなわち本発明の遺伝子型決定法は、Th1応答またはTh2応答で抗原に応答する相対的傾向に従う個人の分類に関係し得る要因に関する情報を提供する。
【００１０】
上記したように、個人が、病原体またはアレルゲンへの暴露に応答して炎症性またはアレルギー性疾患を発症する可能性は、T細胞応答の性質により決定され得る。Th1応答またはTh2応答で抗原に応答する個人の傾向に関する情報を提供することにより、本発明は、Th1−またはTh2−介在疾患の個人の相対的リスクの分類に関連し得る個人の免疫系に関する情報を提供する。すなわち、本発明の遺伝子型決定法は、Th1−またはTh2−介在疾患に対するリスクが上昇しているとして、個人を分類することに関連する要因に関する情報を提供する。
【００１１】
具体的な実施形態において本発明の遺伝子型決定法は、特定のTh1−介在疾患（例えば、多発性硬化症と1型糖尿病）またはTh2−介在疾患（例えば、喘息とアトピー）に対する個人のリスクを評価するのに有用な情報を提供し得る。少なくとも１つの「A」対立遺伝子を有する個人は、Th1−介在疾患のリスクに寄与する要因を有する。少なくとも１つの「C」対立遺伝子を有する個人は、Th2−介在疾患のリスクに寄与する要因を有する。
【００１２】
TCF-1は、T細胞分化を制御する遺伝子の複雑な系の１つの成分であり、多くの他の遺伝子が免疫応答に関与しているため、免疫応答に対するTCF-1遺伝子型は、T細胞応答の性質およびTh1−またはTh2−介在疾患の可能性を決定する多くの成分の１つである。従ってTCF-1遺伝子座の作用は小さいと予測される。他の要因（例えば、個人のHLA遺伝子型）が、ある場合にはTCF-1遺伝子型の作用を隠す支配的な作用を示し得る。例えば、特定のHLA遺伝子型が、1型糖尿病の生じやすさに対して大きな作用を有することが知られている（Nobleら、1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 1134-1148、参照により本明細書に組み込まれる）。TCF-1遺伝子型は、リスクの上昇も低下も示さないHLA遺伝子型を有する個人の中の1型糖尿病に対する素因の指標として有益な可能性がある。そのような支配的な影響は、他の免疫性疾患で見られ、個人の同様の分類が、そのような場合に有用な可能性がある。さらに、免疫系応答関連疾患に関係する対立遺伝子頻度は、集団毎に異なり、従って集団は免疫系関連疾患について異なるリスクを示すため、TCF-1遺伝子型の影響はすべての集団で明らかではないと予測される。TCF-1遺伝子型の寄与はそれ自身比較的小さいかも知れないが、TCF-1遺伝子座の遺伝子型決定は、Th1−またはTh2−介在疾患に対する個人の素因を性状解析するのに有用な情報を与えるであろう。TCF-1遺伝子型情報は、遺伝子座からの遺伝子型情報と組合せると、特に有用となり得る。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヌクレオチド883位中に存在する配列変異体について遺伝子型決定するための好適な方法、試薬、およびキットを提供する。遺伝子型は、単一のヌクレオチド多型部位に存在するヌクレオチドを同定可能な任意の方法を使用して、決定することができる。使用される具体的な方法は、本発明の決定的に重要な面ではない。多くの適当な方法を以下に説明する。
【００１４】
本発明の好適な実施形態において遺伝子型決定は、何らかの変異体配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して行われる。プローブハイブリダイゼーション領域を包含するTCF-1遺伝子の領域は、好ましくはプローブハイブリダイゼーションの前、または同時に増幅される。変異体配列の１つに特異的なオリゴヌクレオチドは、多型部位を包含する遺伝子の領域中のTCF-1遺伝子のいずれかの鎖に正確にまたは実質的に相補的であり、変異体配列の１つに多型部位で正確に相補的である。プローブに基づくアッセイは、当該分野で公知である。
【００１５】
あるいは遺伝子型決定は、対立遺伝子特異的増幅または伸長反応を使用して行われ、ここで、標的変異体配列が存在する場合のみプライマー伸長を支持する対立遺伝子特異的プライマーが使用される。典型的には、対立遺伝子特異的プライマーは、3'末端ヌクレオチドが多型位置で整列するように、TCF-1遺伝子とハイブリダイズする。対立遺伝子特異的増幅反応と対立遺伝子特異的伸長反応は、当該分野で公知である。
【００１６】
本発明の別の態様は、既知の標的配列を提供するために反応物中に加えられる増幅プライマー、検出プローブ、または陽性対照配列として有用なオリゴヌクレオチドに関する。陽性対照配列として使用するために、オリゴヌクレオチドは好ましくは、プラスミドのようなDNAベクター中に含有される。配列特異的増幅または検出で使用するために、オリゴヌクレオチドは好ましくは、約10〜約35ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは約15〜約35ヌクレオチドの長さである。
【００１７】
本発明の別の態様は、TCF-1遺伝子のヌクレオチド883位に存在する配列変異体について遺伝子型決定するのに有用なキットに関する。これらのキットは種々の形を取ることができるが、各場合に、本発明の遺伝子型決定法を実施するための１つ以上の試薬（例えば、配列変異体の１つに特異的なオリゴヌクレオチド）を含有する。キットはまた、１つ以上の増幅試薬（例えば、プライマー、ポリメラーゼ、緩衝液、およびヌクレオチド三リン酸）を含有してもよい。
【００１８】
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００１９】
「TCF-1遺伝子」という用語は、T細胞特異的転写因子タンパク質をコードする核酸配列、特にGenBankから受け入れ番号X63901で入手でき図1に示す遺伝子配列、およびその対立遺伝子変異体を意味する。本明細書において遺伝子のヌクレオチド配列は、エキソンとよぶコード領域と、イントロンと呼ぶ介在する非コード領域の両方を包含する。
【００２０】
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のヌクレオチド配列変異体を意味する。
【００２１】
本明細書において「Ｃ対立遺伝子」とは、図1に示すTCF-1遺伝子鎖のヌクレオチド883位である多型位置に、シトシンを含有する配列変異体を意味する。本明細書において「Ａ対立遺伝子」とは、図1に示すTCF-1遺伝子鎖のヌクレオチド883位に、アデノシンを含有する配列変異体を意味する。２本鎖型では、各対立遺伝子の相補鎖が、多型位置で相補的な塩基を含有することは明らかであろう。
【００２２】
「遺伝子型」という用語は、個人のまたはサンプル中の遺伝子の対立遺伝子の種類を意味する。本明細書において、個人の遺伝子型と、個人のサンプルの遺伝子型とは区別されない。典型的には、遺伝子型は二倍体細胞のサンプルから決定されるが、半数体細胞（例えば、精子細胞）のサンプルから決定することもできる。
【００２３】
本明細書において「多型性」および「多型」という用語は、集団中に特定のゲノム配列の２つまたはそれ以上の変異体が見つかる状態を意味する。多型領域または多型部位とは、変異体を区別するヌクレオチドの相違が生じる核酸の領域を意味する。
【００２４】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、および検出されるエルオリゴマー断片を意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含む）、およびプリンまたはピリミジン塩基のNグリコシドである任意の他のポリヌクレオチド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基の総称である。「核酸」と「オリゴヌクレオチド」の間に長さの差はなく、これらは同義的に使用される。これらの用語は、分子の１次構造についてのみ言及する。すなわちこれらの用語は、２本鎖および１本鎖DNA、ならびに２本鎖および１本鎖RNAとDNA/RNAハイブリッドを含む。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、任意の適当な方法により調製され、例えば、適当な配列のクローニングと制限処理、およびNarangら、1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99のホスホトリエステル法、Brownら、1981, Meth. Enzymol. 68: 109-151のホスホジエステル法、Beaucageら、1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第4,458,066号の固相支持体法（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）のような方法による直接化学合成がある。合成法の総説は、Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187（参照により本明細書に組み込まれる）に提供される。オリゴヌクレオチドは典型的には、例えば、PE Biosystems (Foster City, CA)およびPharmacia (Piscataway, NJ)から市販されている試薬と装置を使用して合成される。DNAベクター中にオリゴヌクレオチド（例えば、陽性対照標的配列として使用されるもの）を取り込む方法は、当該分野で公知であり、本明細書で引用された文献に記載されている。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基対合による２つの１本鎖核酸による２本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補的な核酸鎖の間、または小さいミスマッチの領域を含む核酸鎖の間で起きる。本明細書において「実質的に相補的」という用語は、小さいミスマッチの領域を除いて相補的な配列を意味し、ここでミスマッチヌクレオチドの総数は、約15〜約35ヌクレオチドの長さについて約3つ以下である。正確に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、「ストリンジェントな」または「配列特異的」ハイブリダイゼーション条件と呼ぶ。実質的に相補的な核酸の安定な２本鎖は、ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件下で得られる。核酸技術の当業者は、多くの変数（例えば、オリゴヌクレオチドの長さと塩基対濃度、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の頻度）を経験的に考慮して、２本鎖安定性を決定することができる。２本鎖安定性を計算するコンピューターソフトウェアが、National Bioscience, Inc. (Plymouth, MN)から市販されており、OLIGOバージョン5の参照マニュアルが、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドが正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする、ストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知である（例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれる）。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が違えば異なるであろう。一般にストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびpHで、特異的な配列について熱融解温度（Tm）より約５℃低いように選択される。Tmは、塩基対の50％が解離する温度（一定のイオン強度とpHで）である。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩くすると、配列のミスマッチが許容され、許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適切な調整により制御される。
【００２８】
「プローブ」という用語は、適当な条件下で標的核酸に選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、標的配列と正確にまたは実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」を含有し、多型部位で標的配列に正確に相補的であろう。充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブを使用して行われるハイブリダイゼーションアッセイは、特異的標的配列の選択的検出を可能にする。配列中の単一のヌクレオチドの違いを区別するためのハイブリダイゼーションアッセイで使用するために、プローブとハイブリダイズする領域は好ましくは、約10〜約35ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは約15〜約35ヌクレオチドの長さである。当該分野で公知のハイブリダイゼーションの安定性に影響を与える修飾塩基または塩基類似体の使用は、同等の安定性で、より短いまたは長いプローブを使用することを可能にする。当業者は一般に、あるプローブの完全な相補体がプローブとして同等に有用であることを理解するであろう。プローブオリゴヌクレオチドは、正確にハイブリダイズする領域からなるか、またはプローブの検出または固定化を可能にするさらなる特徴を有してもよいが、これは、ハイブリダイズする領域のハイブリダイゼーション特徴を大きく変化させるものではない。例えばプローブとハイブリダイズする領域は、ポリ-T「テイル」と結合してもよく、これは、逆ドットブロットアッセイで使用するための固相支持体にプローブを固定化するために使用される。
【００２９】
「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち適当な緩衝液中の４つの異なるヌクレオチド三リン酸と重合のための物質（すなわち、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下かつ適当な温度での、DNA合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは、１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、標的配列と正確にまたは実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」（好ましくは約15〜約35ヌクレオチドの長さ）を含有する。プライマーオリゴヌクレオチドは、正確にハイブリダイズ領域から構成されるか、または増幅産物の検出、固定化、または操作を可能にするがプライマーの基本的な性質（DNA合成の開始点として作用する性質）を変化させない追加の特徴を含有してもよい。例えば、増幅産物のクローニングを促進するために、制限酵素切断部位を含有する短い核酸配列が、プライマーの5'末端に結合してもよい。
【００３０】
本明細書において「対立遺伝子特異的」プライマーとは、プライマーの3'末端が、対立遺伝子を規定する多型部位（すなわち、TCF-1  Ａ対立遺伝子とＣ対立遺伝子についての883位）と整列し、多型位置で対立遺伝子の１つに正確に相補的であるように、標的配列にハイブリダイズするプライマーである。このプライマーは、3'末端で正確に相補的な対立遺伝子に「特異的」である。一般に、プライマー伸長（これは、プライマーの3'末端で起きる）は、プライマーの3'末端でのミスマッチにより阻害される。対立遺伝子特異的プライマーは、正確に相補的な対立遺伝子にハイブリダイズすると、伸長可能である。しかし同じプライマーが、他の対立遺伝子にハイブリダイズすると、ハイブリダイゼーション２本鎖中のプライマーの3'末端でのミスマッチのために、伸長できない。従って対立遺伝子特異的プライマーの使用は、増幅産物が形成されるかどうかに基づいて、対立遺伝子の区別を可能にする。
【００３１】
「標的領域」という用語は、解析すべき核酸領域であり、通常多型領域を含む。
【００３２】
分子生物学および核酸化学の従来法（これらは、当業者の技術の範囲内である）は、文献に充分記載されている。例えばSambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編、1984)：Nucleic Acid Hybridization (B.D. HamesとS.J. Higgins編、1984)；シリーズ、Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；およびシリーズ、Current Protocols in Human Genetics (Dracopoliら編、1984、４ヶ月毎に更新、John Wiley & Sons, Inc.)（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本明細書（上記および下記）に記載のすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
〔TCF-1遺伝子ヌクレオチド配列〕
TCF-1遺伝子の完全なＣ対立遺伝子のヌクレオチド配列は、受け入れ番号X63901でGenBankから入手でき、配列番号１として下記表１に5'から3'方向に示す。新に発見された単一のヌクレオチド多型は883位（強調して示してある）で起きる。Ａ対立遺伝子を規定する配列変異体は、配列番号１中に存在する「C」を「A」でこの位置で置換することからなる。この位置のCからAへの置換は、コードされたアミノ酸のプロリンからスレオニンへの変化に対応する。
【００３４】
表１には核酸の１つの鎖のみを示してあるが、配列番号１は、２本鎖のゲノム核酸の領域を規定し、かつ提供された情報により両方の鎖の配列が充分特定されることは、当業者には認識されるであろう。
【００３５】
【表１】
表１
配列番号１
0004846130.tif 000002
0004846130.tif 000003
【００３６】
遺伝子型決定法
本発明の方法において、サンプル中に存在する対立遺伝子は、多型部位（配列番号１のヌクレオチド883位）に存在するヌクレオチドを同定することにより同定される。個体のTCF-1遺伝子型を決めるために、TCF-1核酸を含有する任意のタイプの組織を使用しうる。単一のヌクレオチド多型に存在するヌクレオチドを同定するために、多くの方法が当該分野で公知である。遺伝子型を同定するために使用される特定の方法は、本発明の決定的に重要な態様ではない。性能、コストおよび便利さを考慮すると特定の方法が好ましいものになるが、存在するヌクレオチドを同定することができるあらゆる方法が、遺伝子型の同定に必要な情報を提供しうることは明らかである。好適な遺伝子型決定法には、DNA配列決定、対立遺伝子特異的増幅、または増幅した核酸のプローブに基づく検出がある。
【００３７】
TCF-1対立遺伝子は、例えば当該分野で周知のチェーンターミネーター法（Sangerら、1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467、これは参照により本明細書に組み込まれる）のようなDNA配列決定法により同定することができる。一実施形態では、多型部位を包含する遺伝子の部分配列が増幅され、適当なプラスミド中にクローン化されて次に配列決定されるか、または直接配列決定される。PCRに基づく配列決定は、米国特許第5,075,216号；Brow、PCR Protocols, 1990 (Innisら編、Academic Press, San Diego)、第24章中；およびGyllensten、PCR Technology, 1989 (Erlich編、Stockton Press, New York）、第５章中（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。典型的には、配列決定は、自動DNAシーケンサーの１つを使用して行われ、これらは、例えば PE Biosystems (Foster City, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), Genomyx Corp. (Foster City, CA), LI-COR Biotech (Lincloln, NE), GeneSys technologies (Sauk City, WI)、およびVisable Genetics, Inc. (Toronto, Canada)から市販されている。
【００３８】
TCF-1対立遺伝子は、増幅に基づく遺伝子型決定法を使用して同定することができる。標的核酸中の単一の塩基の変化を検出可能なアッセイで使用できる多くの核酸増幅法が記載されている。好適な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であり、これは当該分野で公知であり、米国特許第4,683,195号、4,683,202号、および4,965,188号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。PCRの方法と用途を記載する多くの文献の例は、PCR Applications, 1999 (Innisら編, Academic Press, San Diego）；PCR Strategies, 1995 (Innisら編, Academic Press, San Diego）；PCR Protocols, 1990 (Innisら編, Academic Press, San Diego）；および PCR Technology, 1989 (Erlich編、Stockton Press, New York)（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）中にある。販売業者、例えば PE Biosystems (Foster City, CA)は、PCR試薬を販売し、PCRプロトコールを公表している。
【００３９】
他の適当な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（WuおよびWallace 1988, Genomics 4: 560-569）、鎖置換アッセイ（Walkerら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396, Walkerら、1992, Nucleic Acids Res. 20: 1691-1696および米国特許第5,455,166号）、ならびにいくつかの転写に基づく増幅系があり、これには、米国特許第5,437,990号、5,409,818号、および5,399,491号に記載されている方法、転写増幅系（TAS）（Kwohら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177）、および自律的配列複製（3SR）（Guatelliら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878およびWO92/08800）（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）がある。あるいは、検出できるレベルまでプローブを増幅する方法、例えばQβ−レプリカーゼ増幅法（KramerおよびLizardi、1989, Nature 339: 401-402、およびLomeliら、1989, Clin. Chem. 35: 1826-1831、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）を使用することができる。既知の増幅法の総説は、AbramsonおよびMyers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41-47（これは参照により本明細書に組み込まれる）で提供される。
【００４０】
遺伝子型決定はまた、TCF-1 mRNAを検出することにより行われる。RNAの増幅は、まず例えばウイルス逆転写酵素を使用して標的RNAを逆転写し、次に得られるcDNAを、米国特許第5,310,652号、5,322,770号、5,561,058号、5,641,864号および5,693,517号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載のような、組合せ高温逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用して行うことができる（MyersおよびSigua、1995、PCR Strategies（前掲）中、第５章）。
【００４１】
TCF-1対立遺伝子は、対立遺伝子特異的増幅またはプライマー伸長法を使用して同定することができるが、これらの方法は、DNAポリメラーゼがプライマーを伸長する能力に及ぼす末端プライマーミスマッチの阻害作用に基づいている。対立遺伝子特異的増幅に基づく方法または伸長に基づく方法を使用して対立遺伝子配列を検出するために、3'末端ヌクレオチドが多型位置でハイブリダイズするように、TCF-1遺伝子に相補的なプライマーを選択する。同定すべき対立遺伝子が存在する場合、プライマーは、3'末端で標的配列と一致し、プライマーが伸長される。他の対立遺伝子のみが存在する場合には、プライマーは標的配列に対して3'ミスマッチを有し、プライマー伸長が排除されるかまたは大幅に低下する。対立遺伝子特異的増幅に基づく方法または伸長に基づく方法は、例えば米国特許第5,137,806号、5,595,890号、5,639,611号、および米国特許第4,851,331号に記載されている（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子型決定の好適な対立遺伝子特異的増幅に基づく方法は、実施例で説明する。
【００４２】
あるいは、配列特異的増幅は、多型部位を包含し、１つの対立遺伝子に完全に相補的な領域にハイブリダイズするプライマーを使用して、プライマーと完全に一致した対立遺伝子との間でのみ安定なハイブリダイゼーション２本鎖が形成される条件を選択することにより行われる。そのような方法は、ミスマッチ対立遺伝子へのプライマーの部分的ハイブリダイゼーションを排除することが困難であり、その結果好ましくない増幅産物が生成されるため、あまり好ましいものではない。これに対して、3'末端ミスマッチの存在に基づく方法は、プライマーが両方の対立遺伝子にハイブリダイズする場合であっても対立遺伝子を区別する。
【００４３】
対立遺伝子特異的増幅に基づく遺伝子型決定法を使用すると、対立遺伝子の同定には、増幅した標的配列の有無の検出が必要なだけである。増幅した標的配列の検出法は、当該分野で公知である。例えば核酸の存在を検出するために、ゲル電気泳動（Sambrookら、1989、前掲、を参照）、および上記のプローブハイブリダイゼーションアッセイが広く使用されている。
【００４４】
増幅した核酸の生成が、反応混合物中の２本鎖DNAの総量の増加をモニターすることにより検出される、別のプローブのない方法（本明細書中、動力学的PCR法と呼ぶ）が、Higuchiら、1992, Bio/Technology 10: 413-417；Higuchiら、1993, Bio/Technology 11: 1026-1030；HiguchiおよびWatson、PCR Applications（前掲）第16章中；米国特許第5,994,056号；および欧州特許公報第487,218号および512,334号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。２本鎖標的DNAの検出は、臭化エチジウム（EtBr）と他のDNA結合色素が２本鎖DNAに結合した時に提示される蛍光の上昇に依存する。標的配列の合成から生じる２本鎖DNAの増加によって、２本鎖DNAに結合する色素の量が上昇し、同時に蛍光の検出可能な上昇がある。動力学的PCR法を使用する遺伝子型決定のために、各増幅が特定の対立遺伝子の存在を示すように、対立遺伝子の１つに特異的な一対のプライマーを使用して増幅反応を行う。２つの増幅（１つはＡ対立遺伝子に特異的なプライマーを使用して、もう１つはＣ対立遺伝子に特異的なプライマーを使用する）を実施することにより、サンプルの遺伝子型を決定することができる。
【００４５】
好適な対立遺伝子特異的増幅に基づく方法は、実施例で説明され、ここでは１つの反応で複数の対立遺伝子特異的プライマーが使用される。プライマーは、対立遺伝子から生成される増幅産物がサイズにより検出可能であるように、選択される。すなわち増幅産物のゲル分析により単一の増幅反応を使用して、単一のサンプル中で両方の対立遺伝子を同定することができる。
【００４６】
相補性の程度が異なるプローブとTCF-1対立遺伝子との間で形成されるハイブリダイゼーション２本鎖の安定性の差異に依存するプローブに基づく方法を使用して、対立遺伝子を同定することができる。充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、プローブと標的対立遺伝子配列との間でのみ安定な２本鎖が形成される。安定なハイブリダイゼーション２本鎖の存在は、多くの公知の方法のうち任意の方法を使用して検出することができる。一般に、検出を容易にするためにハイブリダイゼーションの前に核酸を増幅することが好ましい。しかし、増幅しなくても充分な核酸が得られるなら、これは必ずしも必要ではない。
【００４７】
一実施形態において、多型部位に存在するヌクレオチドは、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下で、多型部位を包含する領域中のTCF-1対立遺伝子の１つに完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ハイブリダイゼーションすることにより同定される。多型部位での１つのミスマッチがハイブリダイゼーション２本鎖を充分に不安定化し、その結果これが事実上形成されないように、プローブがハイブリダイズする配列と配列特異的ハイブリダイゼーション条件が選択される。すなわち配列特異的ハイブリダイゼーション条件下で、プローブと完全に相補的な対立遺伝子配列との間でのみ、安定な２本鎖が形成される。すなわち、約10〜約35ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約35ヌクレオチド長で、多型部位を包含する領域中の対立遺伝子配列に完全に相補的なオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。
【００４８】
別の実施形態において、多型部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を包含する領域中のTCF-1対立遺伝子の１つに実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、および多型部位で対立遺伝子に完全に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより同定される。非多型部位に存在するミスマッチは、両方の対立遺伝子配列とのミスマッチであるため、標的対立遺伝子配列と形成される２本鎖および対応する非標的対立遺伝子配列と形成される２本鎖中のミスマッチの数の差は、標的対立遺伝子配列に完全に相補的なオリゴヌクレオチドを使用する時と同じである。この実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、標的配列と安定な２本鎖を形成することを可能にするように充分に緩和され、一方非標的配列との安定な２本鎖の形成を排除するように充分なストリンジェンシーが維持される。このような充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、プローブと標的対立遺伝子との間でのみ安定な２本鎖が形成される。すなわち、約10〜約35ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約35ヌクレオチド長で、多型部位を包含する領域中で対立遺伝子配列に実質的に相補的で、かつ多型部位で対立遺伝子配列に完全に相補的なオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。
【００４９】
ハイブリダイゼーション条件の最適化が限定されるアッセイフォーマットでは、完全ではなく実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用が好ましい。例えば典型的な複数標的固定化プローブアッセイフォーマットでは、各標的のプローブは、単一の固相支持体上に固定化される。ハイブリダイゼーションは、固相支持体を標的DNA含有溶液と接触させることにより、同時に行われる。すべてのハイブリダイゼーションは同一の条件下で行われるため、ハイブリダイゼーション条件は、各プローブについて別々に最適化することができない。アッセイフォーマットがハイブリダイゼーション条件の調整を可能としない場合は、２本鎖安定性を調整するために、プローブへのミスマッチの取り込みを使用することができる。２本鎖安定性に及ぼす特定の導入したミスマッチの影響は公知であり、２本鎖安定性は、上記したようにルーチン法で予測し経験的に決定することができる。
【００５０】
配列番号１の標的領域に実質的もしくは完全に相補的なハイブリダイズ領域、または配列番号１の相補体（ここで、標的領域は多型部位を包含し、多型部位において２つの対立遺伝子配列のうちの１つに対し完全に相補的である）を含有する、本発明のプローブに基づく方法での使用に適したプローブは、本明細書に記載および当該分野で公知の指針を使用して選択することができる。同様に、プローブの正確なサイズと配列に依存する適当なハイブリダイゼーション条件は、本明細書に記載および当該分野で公知の指針を使用して経験的に選択することができる。配列中の単一の塩基対の相違を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの使用は、例えばConnerら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278-282、および米国特許第5,468,613号と第5,604,099号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５１】
完全に一致したハイブリダイゼーション２本鎖と単一の塩基がミスマッチしたハイブリダイゼーション２本鎖との安定性の比例的変化は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド長に依存する。短いプローブ配列で形成される２本鎖は、ミスマッチの存在により比例的にさらに不安定化される。実際、約15〜約35ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドは、配列特異的検出に好ましい。さらに、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端は、熱エネルギーにより連続的ランダム解離と再アニーリングを受けるため、片方の末端のミスマッチは、内部で起きるミスマッチよりもハイブリダイゼーション２本鎖を不安定化する作用が小さい。好ましくは、標的配列中の単一の塩基対の変化を区別するために、多型部位がプローブの内部領域に存在するように、標的配列とハイブリダイズするプローブ配列が選択される。
【００５２】
配列番号１にハイブリダイズするプローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリダイズ領域（すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションに関与するプローブの部分）に適用される。プローブは、追加の核酸配列（例えば、プローブを固定化するのに使用されるポリTテイル）に、プローブのハイブリダイゼーション特性を著しく変化させることなく、結合しうる。当業者は、本方法での使用のために、標的配列に相補的ではなく、従ってハイブリダイゼーションに関与しない追加の核酸配列に結合したプローブは、非結合プローブと実質的に同等であることを理解するであろう。
【００５３】
TCF-1遺伝子型を決定するためのプローブに基づく方法の好適な実施形態において、多型部位を包含するTCF-1遺伝子からの核酸配列を増幅し、充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブにハイブリダイズする。存在するTCF-1対立遺伝子は、増幅した標的配列へのプローブの結合パターンにより推測される。この実施形態では、プローブハイブリダイゼーションによる分析に充分な核酸を提供するために、増幅が行われる。すなわち、サンプル中に存在する対立遺伝子には無関係に、多型部位を包含するTCF-1遺伝子の領域が増幅されるように、プライマーが設計される。対立遺伝子非依存性増幅は、TCF-1遺伝子の保存されている領域にハイブリダイズするプライマーを使用して行われる。TCF-1遺伝子配列は高度に保存されており、配列番号１からルーチン法で、適当な対立遺伝子非依存性プライマーを選択することができる。当業者は、典型的には増幅系の実験的最適化が有用であることを認識するであろう。
【００５４】
サンプル中のプローブと標的核酸配列との間で形成されるハイブリッドを検出するための適当なアッセイフォーマットは当該分野で公知であり、固定化標的（ドットブロット）フォーマットおよび固定化プローブ（逆ドットブロットまたはラインブロット）アッセイフォーマットが挙げられる。ドットブロットおよび逆ドットブロットアッセイフォーマットは、米国特許第5,310,893号、5,451,512号、5,468,613号、および5,604,099号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５５】
ドットブロットフォーマットでは、増幅した標的DNAは固相支持体（例えば、ナイロン膜）上に固定化される。膜−標的複合体を、適当なハイブリダイゼーション条件下で標識プローブとインキュベートし、ハイブリダイズしないプローブを適当なストリンジェンシー条件下で洗浄して除去し、結合プローブの存在について膜をモニターする。好適なドットブロット検出アッセイを、実施例で説明する。
【００５６】
逆ドットブロット（またはラインブロット）フォーマットでは、プローブは固相支持体（例えば、ナイロン膜またはマイクロタイタープレート）上に固定化される。標的DNAは、典型的には増幅中に標識プライマーを取り込むことにより標識する。プライマーの１つまたは両方を標識することができる。膜−プローブ複合体を、標識した増幅標的DNAと、適当なハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、ハイブリダイズしない標的DNAを適当なストリンジェンシー条件下で洗浄して除去し、結合標的DNAの存在について膜をモニターする。好適な逆ドットブロット検出アッセイを、実施例で説明する。
【００５７】
プローブに基づく遺伝子型決定は、米国特許第5,210,015号、5,487,972号、および5,804,375号、そしてHollandら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のような、「TaqMan」または「5'-ヌクレアーゼアッセイ」を使用して行うことができる。TaqManアッセイでは、増幅過程で反応混合物に、増幅領域内でハイブリダイズする標識検出プローブを加える。プローブは、プローブがDNA合成のプライマーとして作用するのを防ぐように修飾される。増幅は、5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ（例えば、Tth DNAポリメラーゼ）を使用して行われる。増幅の各合成工程中に、伸長されているプライマーの下流の標的核酸とハイブリダイズする任意のプローブが、DNAポリメラーゼの5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。すなわち新しい標的鎖の合成はまた、プローブの分解を引き起こし、分解産物の蓄積は、標的配列の合成の尺度となる。
【００５８】
分解産物を検出するのに適した任意の方法を、TaqManアッセイに使用することができる。好適な方法では、検出プローブは２つの蛍光色素で標識され、そのうち１つは、他の色素の蛍光をクエンチングングすることができる。色素はプローブに結合され、好ましくは、プローブが非ハイブリダイズ状態の時にのクエンチングが起きるように、かつDNAポリメラーゼの5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が２つの色素の間で起きるように、１つは5'末端に、そして他の１つは内部の部位に結合される。増幅により色素の間のプローブが切断され、同時にクエンチングがなくなり、最初にクエンチングされた色素から観察される蛍光が増大する。分解産物の蓄積は、反応の蛍光の増大を測定することによりモニターする。米国特許第5,491,063号と5,571,673号（両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）は、増幅と同時に起きるプローブの分解を検出するための代替法を記載している。
【００５９】
TaqManアッセイは、プローブが増幅産物の存在を検出するためにのみ使用されるように、対立遺伝子特異的増幅プライマーと共に使用される。このようなアッセイは、上記の動力学的PCRに基づく方法について記載したように行われる。あるいは、TaqManアッセイは、標的特異的プローブと共に使用することができる。
【００６０】
上記アッセイフォーマットは典型的には、ハイブリッド２本鎖の検出を容易にするために標識オリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な標識物を取り込むことにより標識される。有用な標識物には、32P、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（ELISAで通常に使用されるようなもの）、ビオチン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が生成されるハプテンとタンパク質が挙げられる。本発明の標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合成するための上記技術を使用して合成かつ標識しうる。例えばドットブロットアッセイは、LevensonおよびChang、1989、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, San Diego)、99-112頁（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ビオチンで標識したプローブを使用して行われる。固定化した標的DNAとビオチン化プローブとの配列特異的条件下におけるハイブリダイゼーションを行った後、まずビオチンをアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（A-HRP）またはストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP）に結合させ、次にこれを、HRPがクロモゲンの色の変化を触媒する反応を行って検出することにより、結合したままのプローブが検出される。
【００６１】
遺伝子型決定で使用可能な種々の他の方法が記載されている。例えばTCF-1対立遺伝子は、ゲル電気泳動で測定される移動度の変化により同定することができる。典型的には、多型部位を包含するTCF-1対立遺伝子の小さい領域を増幅し、増幅産物をゲル電気泳動で分析する。あるいは、制限酵素で消化して対立遺伝子の断片を作成し、多型部位を包含する断片をゲル電気泳動で分析する。DNA中の単一のヌクレオチド変化を同定するためのゲルに基づく方法は、Sheffieldら、PCR Protocols, 1990 (Innisら編、Academic Press, San Diego）、第26章（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００６２】
移動度の差は、核酸配列中のヌクレオチド類似体を多型部位に選択的に取り込むことにより増大することができる。米国特許第4,879,214号（参照により本明細書に組み込まれる）は、プライマー伸長に基づく方法（ここでは、鋳型として対立遺伝子の１つを使用して形成された伸長産物が類似体を取り込むような、ヌクレオチド類似体が包含される）を記載している。この類似体は、伸長産物の移動度を変化させるように選択され、これは、異なる対立遺伝子から形成される伸長産物の区別を容易にするものである。
【００６３】
多型位置におけるヌクレオチド類似体の選択的取り込みを使用して、１つの対立遺伝子からの伸長産物をヌクレアーゼ分解に対して耐性にすることができる。米国特許第4,656,127号（参照により本明細書に組み込まれる）は、プローブの3'末端が分析される位置に隣接するように、標識DNAプローブが標的核酸にハイブリダイズする方法を記載している。ヌクレオチド類似体（例えば、チオヌクレオチド）は、鋳型として対立遺伝子の１つだけを使用して類似体が取り込まれ、他の対立遺伝子が鋳型として存在するなら取り込まれないように、伸長反応に含まれる。伸長プローブは、ヌクレオチド類似体が取り込まれるなら、エキソヌクレアーゼIIIによる切断に対して耐性である。すなわちエキソヌクレアーゼIIIによる処理後の非消化標識プローブの存在は、特異的対立遺伝子の存在を示す。
【００６４】
本発明のどのオリゴヌクレオチドが、サンプル中のTCF-1対立遺伝子配列に選択的にハイブリダイズするかを決定する方法に関係なく、型決定方法の主要な特徴は、存在する変異体配列を検出することによる、サンプル中に存在するTCF-1対立遺伝子の同定に関係する。
【００６５】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための有用な成分を含むキット、容器ユニットに関する。有用なキットは、TCF-1対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。場合によっては、適当な支持体膜に検出プローブが固定されていてもよい。このキットはまた、多型部位を包含するTCF-1遺伝子座の領域を増幅するための増幅プライマーを含有しうる（そのようなプライマーは本発明の好適な実施形態において有用であるため）。あるいは、有用なキットは、TCF-1対立遺伝子の特異的増幅のための対立遺伝子特異的プライマーを含むプライマーセットを含有してもよい。キットの他の任意成分には、本明細書に記載の遺伝子型決定法で使用される追加の試薬を含む。例えばキットは、プライマー伸長産物の合成を触媒する物質、基質ヌクレオシド三リン酸、核酸を標識および／または検出するための手段（例えば、標識物がビオチンの場合、アビジン−酵素コンジュゲート、および酵素基質、およびクロモゲン）、増幅またはハイブリダイゼーション反応のための適当なバッファー、および本法を実施するための説明書を、さらに含有していてもよい。
【００６６】
【実施例】
以下に示す本発明の実施例は、例示の目的のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲内の本発明の多くの実施形態は、当業者には、前述の本文および以下の実施例を読めば明白となろう。
【００６７】
〔実施例１〕
遺伝子型決定プロトコール
TCF-1対立遺伝子の配列特異的増幅に基づく同定
ヒトサンプルの遺伝子型は、883位に存在するヌクレオチドに基づく対立遺伝子を識別するプライマーを用いて、配列特異的増幅法により決定することができる。以下のプロトコールにおいて、遺伝子型は、存在する対立遺伝子に応じて異なる長さの断片を増幅するプライマーを用いて生成される増幅産物のパターンを分析することにより決定される。
【００６８】
増幅プライマー
増幅は、４つのプライマー（そのうち２つは上流プライマーであり、そしてそのうち２つは下流プライマーである）を用いて行われる。好ましいプライマーの配列は、5'から3'の方向で以下に示す。
【００６９】
【表２】
0004846130.tif 000004
上流プライマーLS045B（配列番号3）および下流プライマーGZ348B（配列番号6）は、単一ヌクレオチド多型にわたる領域とハイブリダイズする。これら２つのプライマーを用いる増幅によって、多型位置に存在するヌクレオチドに無関係に311塩基対（bp）の産物の合成が起きる。
【００７０】
プライマーGZ374B（配列番号5）は、3'末端ヌクレオチドが多型部位883位にハイブリダイズするようにTCF-1配列にハイブリダイズする下流プライマーである。プライマーGZ374B（配列番号5）は、Ｃ対立遺伝子と完全に相補的であり、従ってＡ対立遺伝子に関して3'末端ミスマッチを有する。適切な条件下では、後述するように、Ｃ対立遺伝子がサンプル中に存在する場合にのみ増幅産物が生成される。Ｃ対立遺伝子がサンプル中に存在する場合には、プライマーLS045B（配列番号3）およびGZ374B（配列番号5）を用いる増幅により、268bpのヌクレオチド産物の増幅が起きる。
【００７１】
プライマーGZ351B（配列番号4）は、3'末端ヌクレオチドが多型部位883位にハイブリダイズするようにTCF-1配列にハイブリダイズする上流プライマーである。プライマーGZ351B（配列番号4）は、Ａ対立遺伝子と完全に相補的であり、従ってＣ対立遺伝子に関して3'末端ミスマッチを有する。適切な条件下では、後述するように、Ａ対立遺伝子がサンプル中に存在する場合にのみ増幅産物が生成される。プライマーGZ351B（配列番号4）およびGZ348B（配列番号6）を用いる増幅により、Ａ対立遺伝子がサンプル中に存在する場合にのみ、73bpの産物の増幅が起きる。
【００７２】
プライマーGZ346B（配列番号2）は、上記の対合においてプライマーLS045B（配列番号3）の代わりに使用することができる代替の上流プライマーである。
【００７３】
上記プライマー（配列番号３〜６）を用いて、可能性のある遺伝子型の増幅により生成される産物は、識別可能である。可能性のある増幅結果は、以下の表に示す。
【００７４】
【表３】
0004846130.tif 000005
増幅
PCR増幅は、以下の試薬を含む25〜100μlの総反応容量で行われる：
0.2〜1ng/μl精製ヒトゲノムDNA
各0.2μMの4つのプライマー
800μM 総dNTP（各200μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP）
60mM KCl
12mM トリス−塩酸, pH 8.3
2.4mM MgCl2
0.05〜0.1単位/μl AmpliTaq GoldTM DNAポリメラーゼ＊
＊Hoffmann-La Rocheにより開発および製造され、PE Biosystems（Foster City, CA）から市販されている。
【００７５】
増幅は、以下に示す特異的な温度サイクルプロフィールを用いて、GeneAmp（登録商標）PCR System 9600サーマルサイクラー（PE Biosystems, Foster City, CA）で行われる。
【００７６】
0004846130.tif 000006
ゲル電気泳動による検出
増幅されたDNAは、増幅産物のサイズを決定するためにアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画される。0.5×TBE（0.045M トリス−ホウ酸および0.001M EDTA二ナトリウム）中の3% NuSieve/1.0% アガロースゲルランニングバッファーが使用される（あるいは、電気泳動後に染色が行われる）。電気泳動は、100ボルトで約1時間行われる。DNAの臭化エチジウム染色されたバンドが、UV照射を用いて視覚化される。
【００７７】
〔実施例２〕
遺伝子型決定プロトコール
TCF-1対立遺伝子のプローブに基づく同定
本実施例は、他の遺伝子型決定法を説明する。多型部位を包含するTCF-1遺伝子の領域が増幅されて、存在するヌクレオチドがプローブハイブリダイゼーションにより同定される。プローブ検出は、固定化標的（ドット−ブロット）フォーマット、または固定化プローブ（逆ドット−ブロットまたはラインブロット）フォーマットのいずれかを用いて行われる。
【００７８】
増幅プライマー
883位の多型部位を包含する配列番号1のヌクレオチド847〜939に対応するTCF-1遺伝子の領域の増幅は、以下に示す上流プライマーRR328B（配列番号7）を、下流プライマーGZ348B（配列番号6）と一緒に使用して行われる。上流プライマー配列は、5'-3'方向で示す。
【００７９】
RR328B    （配列番号7）    TACTCCGCCTTCAATCTGCTCA
固定化プローブ検出フォーマットで使用するためには、後述するように、プローブに相補的な鎖に組み込まれるプライマーは、5'リン酸に結合したビオチンで標識され、これが検出を容易にする。5'リン酸にビオチン標識が結合するオリゴヌクレオチドを合成するための試薬は、Clonetech（Palo Alto, CA）およびGlenn Research（Sterling, VA）から市販されている。好ましい試薬は、ClonetechのBiotin-ONである。
【００８０】
増幅
PCR増幅は、以下の試薬を含む25〜100μlの総反応容量で行われる：
0.2ng/μl精製ヒトゲノムDNA
0.2μM各プライマー
800μM 総dNTP（各200μMのdATP、dTTP、dCTP、dGTP）
50mM KCl
10mM トリス−塩酸, pH 8.3
1mM MgCl2
0.05単位/μl AmpliTaq GoldTM DNAポリメラーゼ＊
＊Hoffmann-La Rocheにより開発および製造され、PE Biosystems（Foster City, CA）から市販されている。
【００８１】
増幅は、以下に示す特異的な温度サイクルプロフィールを用いて、GeneAmp(登録商標)PCR System 9600サーマルサイクラー（PE Biosystems, Foster City, CA）で行われる。
【００８２】
0004846130.tif 000007
検出プローブ
増幅TCF-1核酸に存在する対立遺伝子配列変異体を同定するために使用される好ましいプローブは、以下に記載される。プローブは、5'-3'方向で示す。
【００８３】
C−対立遺伝子プローブ：
KW196（配列番号8）ATTACCCACCCCCCTCGGGA
A−対立遺伝子プローブ：
KW118（配列番号9）CCGAGGTGGGTGGGTAAT
プローブハイブリダイゼーションアッセイ、固定化標的フォーマット
固定化標的フォーマットでは、以下に記載するように一部の増幅核酸が変性され、ナイロンフィルターに適用され、そして固定化される。次にハイブリダイゼーションを起こさせるように、フィルターを標識プローブを含む溶液に浸漬する。未結合プローブは、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下で洗浄することにより除去され、固定化核酸に結合したままであるプローブが検出される。アッセイの詳細は、以下に記載する。
【００８４】
以下に記載する固定化標的検出フォーマットで使用するために、プローブは、検出を容易にするために西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識される。HRP−標識オリゴヌクレオチドの合成は、参照により本明細書に組み込まれる、LevensonおよびChang, PCR Protocols, 1990,（Innisら編, Academic Press, San Diego）の第13章に記載されている。
【００８５】
増幅産物を変性するために、10μlの増幅産物を、4.5μlの0.5M EDTA（pH 8.0）、7.2μlの5N NaOH、および78.3μlのH2Oよりなる90μlの変性溶液に加える。混合物は、変性が完了するまで室温で10分間インキュベートする。
【００８６】
ナイロンフィルター（BioDyneTM Bナイロンフィルター、Pall Corp., Glen Cove, NY）をH2Oに5〜10分間浸漬し、さらに200μlのH2Oで洗浄することにより調製する。100μl変性サンプル混合物は、減圧下にて、ドット−ブロットマニホールド（Bio-DotTM、Bio Rad, Richmond, CA）を用いてナイロン膜に適用する。次に各ウェルを、200μlの0.4N NaOHで洗浄し、次に2×SSCで簡単に洗浄して、液体の貯留が残らなくなるまで空気乾燥する。固定化DNAは、StratalinkerTM（Stratagene, La Jolla, CA）UV光ボックスを用いて（「自動架橋」の設定で）500mJ/cm2の流束の紫外線照射によりナイロンフィルターに架橋される。
【００８７】
ハイブリダイゼーションは、2μM HRP標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファー（5×SSPE、0.5% SDS、ここで20×SSPEは、NaOHでpH 7.4に調整した3.6M NaCl、0.2M NaH2PO4・H2O、20mM EDTAである）中で行われる。フィルターは、55℃で25〜30分間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、過剰なプローブのほとんどを除去するために、室温で洗浄バッファー（2.5×SSPE、0.1% SDS）中で洗浄する。ストリンジェントな洗浄は、洗浄バッファー中で55℃で12分間振盪水浴中で行われる。ストリンジェントな洗浄の配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、標的配列に完全に相補的なプローブのみが結合したまま残ることを確実にする。
【００８８】
固定化増幅産物に結合したままのHRP標識プローブは、以下のとおり視覚化される。発色溶液は、100mlのクエン酸バッファー（0.1Mクエン酸ナトリウム、pH 5.0）、5ml 3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン（TMB）溶液（Fluka, Milwaukee, WIの2mg/ml TMB粉末を100% EtOHに溶解したもの）、および100μlの3%過酸化水素を混合することにより調製する。フィルターは、最初に100mMクエン酸ナトリウム（pH 5.0）中で5分間洗浄し、次に暗所で室温にて10分間穏やかに撹拌しながら発色溶液中でインキュベートする。当初無色であるTMBが、過酸化水素の存在下でプローブ結合HRPにより着色沈殿物に変換される。発色したフィルターは、水中で数分間洗浄して直ちに写真撮影する。
【００８９】
プローブハイブリダイゼーションアッセイ、固定化プローブフォーマット
固定化プローブフォーマットでは、プローブは、ハイブリダイゼーションで使用する前に固体支持体に固定化する。プローブ−支持体複合体を、ハイブリダイゼーションを起こさせるように、変性増幅核酸を含む溶液に浸漬させる。未結合核酸を、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下で洗浄することにより除去し、固定化プローブに結合したままの核酸を検出する。検出は、上記ドット−ブロットアッセイで使用したものと同じ呈色反応を用いて行われる。アッセイの詳細を以下に記載する。
【００９０】
以下に記載の固定化プローブ検出フォーマットで使用するために、ある成分をプローブの5'リン酸に結合して固体支持体への固定化の助力とする。好ましくは、本質的にTungら, 1991, Bioconjugate Chem. 2: 464-465（参照により本明細書に組み入れる）に記載するように、ウシ血清アルブミン（BSA）を5'リン酸に結合する。あるいは、参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,451,512号に記載するように、ポリ−Tテールを5'末端に付加する。
【００９１】
プローブは、Linear StriperとMultispense2000TMコントローラー（IVEK, N. Springfield, VT）を用いて、線状フォーマットでナイロン膜のシートに適用される。プローブ力価、2μMのKW196（配列番号8）および1.75μM KW118（配列番号9）は、対立遺伝子変異体の間のシグナルバランスを達成するように選択される。各シートは、幅0.35と0.5cmの間のストリップに切断する。増幅産物を変性するために、20μlの増幅産物（50μl反応液に基づく）を20μlの変性溶液（1.6% NaOH）に加え、変性が終了するまで室温で10分間インキュベートする。
【００９２】
変性増幅産物（40μl）を、3mlのハイブリダイゼーション緩衝液（4×SSPE、0.5% SDS）と膜ストリップを含む型決定トレーのウェルに加える。回転水浴中でハイブリダイゼーションを55℃で15分間進行させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を吸引し、ストリップを穏やかに前後に揺り動かすことにより、ストリップを3ml温洗浄緩衝液（2×SSPE、0.5% SDS）中で洗浄し、洗浄緩衝液を吸引する。洗浄後、ストリップは、回転水浴中で、3ml酵素コンジュゲート溶液（3.3mlハイブリダイゼーション緩衝液および12μlのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP））中で55℃で5分間インキュベートする。次にストリップを上述のように洗浄緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液中で55℃で12分間インキュベート（厳密な洗浄）し、最後に再び洗浄緩衝液で洗浄する。
【００９３】
固定化増幅産物に結合したままのHRP−標識化標的核酸は、以下のとおり視覚化される。ストリップは、最初に0.1Mクエン酸ナトリウム（pH 5.0）中で5分間洗浄し、次に暗所で室温で8〜10分間穏やかに振とうしながら発色溶液（上述）中でインキュベートする。当初無色であるTMBが、過酸化水素の存在下で標的−結合HRPにより着色沈殿物に変換される。発色したストリップは、水中で数分間洗浄して直ちに写真撮影する。
【００９４】
〔実施例３〕
Ａ対立遺伝子の存在
４つの異なる集団からの個人サンプルを、Ａ対立遺伝子の存在に関してスクリーニングした。サンプリングした集団は、47人のアフリカ系アメリカ人、47人の米国のコーカソイド、47人の米国のヒスパニック、および47人の日本人であった。
【００９５】
遺伝子型決定は、本質的には上記実施例１に記載される対立遺伝子特異的増幅法を用いて行った。実施例１に記載されるプロトコールは、実際に使用されるアッセイの改良法を表す。改良は、増幅および検出効率に関して行ったが、アッセイ法の定性的な結果に変更しなかった。
【００９６】
結果は、188サンプル中19サンプルがＡ対立遺伝子を含むことを示した：２人のアフリカ系アメリカ人、11人の米国のコーカソイド、6人の米国のヒスパニック、および0人の日本人由来のサンプルである。
【００９７】
〔実施例４〕
フィリピン人サンプル中のＡ対立遺伝子の存在頻度
フィリピン人200人からのサンプルは、実施例２に記載のプローブに基づく方法（固定化プローブフォーマット）を用いて遺伝子型決定した。この集団からの全ての個人は、Ｃ対立遺伝子に関してホモ接合性であった。
【００９８】
この集団にＡ対立遺伝子が存在しないことは、１型糖尿病の発生が、コーカソイド集団よりもフィリピン人で低い理由を説明する助けとなりうる。
【００９９】
〔実施例５〕
１型糖尿病との関連
TCF-1遺伝子型決定は、１型糖尿病に罹患した２人の子孫を含んでいたために確認した282人のコーカソイド家族に関して行った。全ての個人のTCF-1遺伝子型を決定した。TCF-1遺伝子型決定は、実施例１に記載する対立遺伝子特異的増幅に基づく遺伝子型決定法を用いて行った。確認の基礎となった罹患した２人の兄弟における564人の子孫（282家族それぞれに２人の兄弟）に加えて、26人の他の罹患した子供がいた。これらの家族には270人の非罹患の子孫がいた。
【０１００】
家族に基づくサンプルは、１型糖尿病の家族の細胞株の保管所であるHuman Biological Data Interchange（HBDI）から精製ゲノムDNAとして提供された。本試験で使用する全てのHBDI家族は、罹患していない親と少なくとも２人の罹患した兄弟の核家族である。これらのサンプルは、Nobleら, 1996, Am. J. Hum. Genet. 59:1134-1148（参照により本明細書に組み入れる）にさらに記載されている。
【０１０１】
HLA遺伝子型は、１型糖尿病のリスクに対して、遺伝子型に応じて上昇または下降で有意に影響を及ぼすことが知られている。詳細には、HLA DR遺伝子型のDR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302（以下DR3/DR4と呼ぶ）を有する個人は、１型糖尿病に関して最も高いリスクを持つと考えられている（Nobleら, 1996, Am. J. Hum. Genet. 59:1134-1148を参照のこと、これは参照により本明細書に組み入れる）。これらの高リスクの個人は、約1/15の確率で１型糖尿病に罹患している。１型糖尿病への罹患しやすさに及ぼすこの遺伝子型の強力な影響のため、DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302遺伝子型の存在により、TCF-1対立遺伝子変異体からの寄与が目立たなかったのであろう。
【０１０２】
これらの家族内のメンバーはまた、HLA DRB1およびDQB1遺伝子座で遺伝子型決定された。罹患した２人の兄弟のうち、90家族では両方の兄弟がDR3/DR4遺伝子型を有する。144家族では罹患した兄弟のどちらもDR3/4遺伝子型を有していない。残りの48家族では罹患した２人の一方だけがDR3/4遺伝子型を有する。
【０１０３】
統計学的方法
以下の節に記載するように、関連のいくつかの統計学的検定を行った。同じ家族のメンバーは、特に遺伝的影響の対立仮説が真であるならば、独立の観察ではない。従って、有意性を評価するための解析を通じてブーツストラップ法を使用した。１次サンプリング単位である、家族の標準的ノンパラメトリックな再サンプリングは、ソフトウェアパッケージSPlus（MathSoft, Cambridge, MA）中のルーチンを用いて行った。各統計のために、1000のブーツストラップサンプルを使用した。信頼区間は、最も単純なパーセンタイル法に基づいた。p値は、帰無仮説下のパラメーターの値を排除する最も広い信頼区間を見い出すことにより求めた。1−αがこの区間の信頼水準であれば、対応する両側p値はαである。例えば、90%信頼区間は、p値 0.10 に相当する。
【０１０４】
親
282家族のそれぞれに関して親の遺伝子型、対立遺伝子頻度、および遺伝子型頻度を以下の表に示す：
【表４】
0004846130.tif 000008
【０１０５】
対立遺伝子頻度は、1128個（282家族のそれぞれに２人の親、各親に２個の対立遺伝子）の親の対立遺伝子の中のＡ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子の数に基づいて計算した。
【表５】
0004846130.tif 000009
【０１０６】
親の中の遺伝子型頻度は、Hardy-Weinberg平衡（HWE）を仮定して期待される遺伝子型頻度と比較した。データは、明らかに期待頻度に一致している。
【表６】
0004846130.tif 000010
【０１０７】
Hardy-Weinberg平衡（HWE）
HWEは、以下に示す遺伝する対立遺伝子と遺伝しない対立遺伝子の表を調べて、行と列の独立性を検定することによっても検定した。TDT解析（後述）では情報が得られないホモ接合性の親を含む全ての親をこの解析に含めた。罹患した子供のみを使用する。
【表７】
0004846130.tif 000011
【０１０８】
PATおよびPAUを、それぞれＡ対立遺伝子が遺伝する確率、および遺伝しない確率と仮定する。Ｃ対立遺伝子に関して同様な用語を定義する。確率比：
（PATPCU）／（PAUPCT）
は、遺伝する対立遺伝子と遺伝しない対立遺伝子の依存性の尺度となる。
【０１０９】
見て判るように、カウントは帰無期待値に非常に近い。このことは、TCF-1遺伝子座でのHWEを支持する。同じ家族からの子供の独立性を仮定するp値は、0.88である。この場合、子供の依存性を正しく説明するためのブーツストラップ解析は行わなかった。ブーツストラップは、この場合、有意性の水準をさらに低下させるはずである。
【０１１０】
TCF-1とDRB1の間の関連
DRB1遺伝子座とTCF-1の間の一般集団における関連に関する検定を行った。関連は、これらの遺伝子座に関する集団の層別の存在を示し、これは残りの解析に影響し得る。さらに、集団がランダムに交配するならば、非連鎖遺伝子座の下で、一世代を越えて関連を維持することは不可能である。この場合、特定のDRB1−TCF-1の組合せに向かうかまたはこれに逆らう継続的な選択圧力が存在する場合にのみ、２つの遺伝子座の間の関連は維持されるであろう。
【０１１１】
関連は以下のように検定した。罹患個人それぞれに遺伝しないハプロタイプを観察した。これらの遺伝しないハプロタイプは、集団からのランダムサンプルとして調べることができる（HWE下）。ＡおよびＣを、２つのTCF-1対立遺伝子とする。３、４およびＸを、DRB1の血清学的群とする（ここで、Ｘは、最初の２つ以外の任意の血清学的群である）。AXを、ハプロタイプＡおよびＸの確率とする。NAXを、このようなハプロタイプの数とする。他のハプロタイプに関して同様の量を定義する。Ｘが与えられる時のＡの確率は、（NAX／NCX）により推定することができる。確率比（A3／C3）／（AX／CX）は、（NA3NCX）／（NC3NAX）により推定することができる。同様の推定が、４対Ｘおよび４対３に当てはまる。２つの遺伝子座の間に関連がなければ、３つ全ての確率比は、１に等しくなるであろう。
【０１１２】
データを下記表に示す。表において、３が与えられる時のＡとＸが与えられる時のＡとの確率比は、３対Ｘと略書きする；他の比に関して類似の略書きを利用する。確率比の有意性は、ブーツストラップ解析を用いて推定した。この解析は、TCF-1とDRB1の間に関連がないことを証明した。このことは、遺伝不均衡検定（transmission disequilibrium test）（TDT）における２つの遺伝子座の間のいずれかの関連が、リスクに対するこれらの影響における２つの遺伝子座の間の相互作用によることを意味する。
【表８】
0004846130.tif 000012
【０１１３】
本アプローチは、その罹患状態が確認された個人の罹患していない兄弟には妥当ではない。罹患していない兄弟は、その罹患した兄弟と同じハプロタイプを持っていない場合がある。従って、非罹患者に遺伝しないハプロタイプは、一般集団よりも高リスクのハプロタイプを含む可能性が高い。罹患していない兄弟は確認スキームで考慮されていないため、罹患した子供には逆は真ではない。各子供の確認が、その兄弟の疾患状態にも依存するため、罹患した兄弟には、非関連からの偽の離脱の傾向が出現することもあろう。この効果は、偽陽性を引き起こすが、ここでは明白ではない。
【０１１４】
性の影響
母親、父親および子孫におけるTCF-1遺伝子型分布を以下の表に示す。
【表９】
0004846130.tif 000013
【０１１５】
性関連効果の非存在下では、母親と父親は同じ分布を有することが期待される。父親と同じ母親の分布に関するカイ二乗統計量は、5.08でp値が0.08である。第１列のデータがあまりないため、カイ二乗検定も、第２および第３列だけで行った。これは、統計量2.71でp値0.10であった。このことは、父親よりも母親により多くのＡ対立遺伝子が存在するか、または対立遺伝子を母親から受け取るとＡのリスクがより大きいことを示唆している。そして確認スキームは、サンプル中のＡを持つ母親の数を増加させるであろう。
【０１１６】
HWEの下で、この効果はまた、罹患した子供に遺伝しない対立遺伝子を調べることにより解析することができる。遺伝しない対立遺伝子の型に関して、母親由来または父親由来に対する確率比は、（Am・Cp）／（Cm・Ap）［ここで、Amは、母親由来の遺伝しないＡ対立遺伝子の数であり、Apは、父親由来の遺伝しないＡ対立遺伝子の数であり、そしてＣ対立遺伝子に関する他の表示は同様に定義する］である。この確率比は、女性におけるＡの集団全体の相対頻度の尺度である。
【表１０】
0004846130.tif 000014
【０１１７】
確率比が1よりも大きいという事実は、女性が男性よりも高頻度にＡ対立遺伝子を持つことを示している。この作用は、非DR3/DR4の子供の母親で強く現れており、彼女らは恐らくDRB1 3または4対立遺伝子を持つことは平均的に少ないであろう。少なくとも２人の罹患した子供が各家族にいるため、この検定にはわずかなバイアスが存在する。後述するように、この結果に反して、サンプル中の男性がＡ対立遺伝子を持つ可能性を上げるリスクは、父親に帰すると考えられる。
【０１１８】
遺伝するＡ対立遺伝子が母親由来であるか父親由来であるかに関する確率比はまた、以下の表に示すように、ヘテロ接合性の親からの対立遺伝子の遺伝からも計算した。罹患および非罹患子孫への遺伝は、別々に計算した。
【表１１】
0004846130.tif 000015
【表１２】
0004846130.tif 000016
【０１１９】
ヘテロ接合性の親から罹患子孫への遺伝から計算した確率比は１よりも小さく、このことは、ヘテロ接合性の男性が、ヘテロ接合性の女性よりも高頻度にＡを遺伝することを示している。これは、ヘテロ接合性の親だけに基づくため、この作用を男女の遺伝子型分布の差のせいにすることはできない。DR3/DR4と非DR3/DR4の間のこの作用にはほとんど差が見られないが、確実な証拠はない。非罹患者の遺伝には目に見える差はないが、データがほとんどない。
【０１２０】
TCF-1対立遺伝子の遺伝
対立遺伝子の作用を検出する1つの方法は、対立遺伝子の遺伝速度を解析することである。対立遺伝子が疾患状態に関連しないならば、Ａ対立遺伝子とＣ対立遺伝子は、例えば、ヘテロ接合性の親から罹患子孫に50：50の比で遺伝すると予測される。遺伝速度の偏差は、対立遺伝子と疾患状態との関連を示す。
【０１２１】
いくつかの統計学的検定法が、対立遺伝子の遺伝速度の偏差を解析するために提案されている。例えば、遺伝不均衡検定（TDT）が、Spielmanら, 1993, Am. J. Hum. Genet. 52: 506-516；EwensとSpielman, 1995, Am. J. Hum. Genet. 57: 455-464；およびEwensとSpielman, 1999, Supplement 20 in Current Protocols in Human Genetics（Dracopoliら編, 1984（年に4回更新）, John Wiley & Sons, Inc.）（それぞれ、参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。特に、Speilmanら（1993）では、2人の罹患子孫を含む家族に適用できるTDTの統計的性質が考察された。
【０１２２】
本件において、解析は、Ｃ対立遺伝子の遺伝に対するＡ対立遺伝子の比に基づいて行った。この比A／Cは、罹患していない親による罹患した２人の確認により少し歪んでいるが、相対リスクの尺度となる。ブーツストラップ解析を使用して有意性を評価した。A／CとA／（A＋C）の間に1：1の対応があるため、遺伝の比の使用はＡ遺伝の割合に基づく解析と同等である。
【０１２３】
最初のケースでは、子孫の疾患状態、子孫のHLA遺伝子型、および遺伝した対立遺伝子の母親由来／父親由来により定義されるサブグループに関して、相対リスクを計算した。以下の表で使用する略語は、af＝罹患子孫；un＝非罹患子孫；34＝DR3/DR4子孫遺伝子型；n34＝非DR3/DR4子孫遺伝子型；m＝母親由来；およびp＝父親由来である。
【表１３】
0004846130.tif 000017
唯一の明白な有意な結果は、罹患DR3/DR4および非DR3/DR4の父親に関するものである。非罹患非DR3/DR4の母親に関する結果は、僅かに示唆的である。
【０１２４】
以下の表に示するように、上記カテゴリーの組合せにより定義するサブグループに基づいて、相対リスクを計算した。
【表１４】
0004846130.tif 000018
父親から罹患子孫へのＡ対立遺伝子の遺伝の増加は、有意性が高い。また、罹患者の数人の父親を含む他の群に関しても、わずかな有意性がある。罹患者の父親では、相対リスクは1.64であると推定される。これは、罹患した兄弟の２人の一方であるリスクを表す。また、数字が他の罹患した子供も含むことに注意されたい。
【０１２５】
罹患者の中の、非DR3/DR4の中の、および父親からの遺伝は、全て「いくらか有意」から「非常に有意」の範囲にある。父親からの遺伝は、最も有意な結果を有する。遺伝の増加は、罹患者の父親だけに孤立していると考えられる。非罹患者に遺伝したＡの僅かな上昇は偶然によるものであろう。
【０１２６】
分配リスク
連鎖の作用と関連の作用を分配して、TCF-1遺伝子座が１型糖尿病に原因として関係しているかどうか、または原因として関係するいくつかの他の遺伝子座との連鎖不均衡にあるかどうかを決定するために、以下の解析を行った。この解析は、51人のヘテロ接合性の父親と対応する罹患した２人の兄弟に基づく。他の罹患子孫は含めなかった。
【０１２７】
AA、AC、およびCCを、ヘテロ接合性の父親が、Ａ対立遺伝子を両方の兄弟に、Ａ対立遺伝子を一方の兄弟にまたＣ対立遺伝子をもう一方の兄弟に、あるいはＣ対立遺伝子を両方の兄弟に遺伝する頻度をそれぞれ表すものとする。遺伝的影響がないならば、期待される遺伝頻度は、0.25 AA、0.5 AC、および0.25 CCである。観察される遺伝頻度は、19.25 AA、25 ACおよび6.75 CCであった。親の遺伝子型によって、どちらの対立遺伝子をどちらの親が遺伝したかの明白な決定ができなかった場合、その事象の確率に基づいて小数の遺伝頻度が割り当てられたため、観察される数は全てが整数ではない。例えば、両方の兄弟がＡ対立遺伝子を父親から受けたか、または同等な確率で、一方の兄弟がＡ対立遺伝子を父親から、そして一方が母親から受けた家族は、ヘテロ接合性の父親がＡ対立遺伝子を両方の兄弟、AAに遺伝する、計算される頻度に0.5寄与するであろう。
【０１２８】
遺伝的影響の尺度である以下の比を考える：
AA／CC、AC／CC、AC／AA、（AA・CC）／（AC・AC）および（AA＋CC）／AC
AA／CCは、TCF-1遺伝子座、またはTCF-1と連鎖不均衡にある遺伝子座のどちらに起因するものであり得る、Ａ対立遺伝子の相対リスクの尺度である。AC／CCは、Ａ対立遺伝子を有する兄弟(罹患した兄弟とは対立遺伝子を共有しない)の、Ｃ対立遺伝子を有する兄弟(罹患した兄弟と対立遺伝子を共有する)と比較した相対リスクの尺度である。（AA・CC）／AC2は、TCF-1対立遺伝子が知られた後の、連鎖による相対リスクの尺度である。これら後者２つの比は、TCF-1が原因遺伝子座であるかどうかに関する知見を提供する。（AA＋CC）／ACは、非IBDと比較した、同祖的（identical by descent）（IBD）対立遺伝子を有する兄弟の相対リスクの尺度である。
【０１２９】
ｐを対立遺伝子Ａに関連するリスクとし、ｒを対立遺伝子Ｃに関連するリスクとする。これらのリスクは、対立遺伝子自体によるか、または連鎖遺伝子座での原因対立遺伝子との連鎖不均衡によるものであり得る。TCF-1遺伝子型が既に知られているとすれば、ｓを、TCF-1でその共有対立遺伝子のために２人の兄弟に付加されるリスクとする。tを、対立遺伝子を共有しない２人に付加されるリスクとする。遺伝する対立遺伝子を仮定すれば、AA対へのリスクは、p2sであり、AC対へはprtであり、そしてCC対へはr2sである。
【０１３０】
遺伝的影響の尺度となる以下の表に示すいくつかの比を用いて、種々のリスクの相対値を検定した。比の期待値(これも以下の表に与えられる)は、AA対、AC対、およびCC対のリスクについて上記の値で計算することができる。これらの統計量の結果の限度は、以下の表の種々の仮説に基づいて予測することができる。予測可能であるとき、これらの統計量に対する限度は、次の表に示すものである。
【表１５】
0004846130.tif 000019
【表１６】
0004846130.tif 000020
２つの原因遺伝子座があるとき（仮説DとE）、二者択一の方向は、２つの遺伝子座の相対リスク、連鎖の程度、および遺伝子座の間の連鎖不均衡の程度と方向に依存する。
【０１３１】
以下は、TCF-1データから計算した結果である。
【表１７】
0004846130.tif 000021
AA／CCは、帰無仮説下で期待するよりも高いが、これは、TCF-1遺伝子座を通しての、またはTCF-1と連鎖不均衡にある遺伝子座を通しての、リスクとＡ対立遺伝子との明確な関連を示している。AC／CCは、帰無仮説下で期待されるよりも高いが、これは、そのＡ対立遺伝子を有する兄弟(罹患した兄弟と対立遺伝子を共有しない)が、Ｃ対立遺伝子を有する兄弟(罹患した兄弟と対立遺伝子を共有する)よりも高リスクであることを示している。このことは、TCF-1が実際に原因遺伝子座であることを示唆する。AC／AAは、帰無仮説下で期待されるよりも低いが、これは同祖的（IBD）Aが、非IBD Cよりもリスクが高いことを示す前の結果と一致している。（AA・CC）／AC2は、帰無仮説下の期待値よりもわずかに低いが、これは、TCF-1対立遺伝子が知られた後は、連鎖により付加されるリスクがないことを示している。これらの結果は、TCF-1に加えてであってもTCF-1の代わりであっても、連鎖した原因遺伝子座が他に存在しないことと一致している。（AA＋CC）／ACは、IBD状態対非IBD状態のリスクの尺度である。これは、帰無仮説下で期待するよりもわずかに高いが、帰無仮説と一致している。
【０１３２】
（AA＋CC）／ACとAA／CCの値を解いて、Cに対するAの相対リスクの推定値（＝p／r）を見つけることができる。Sを統計量（AA＋CC）／ACの値とする。次にp／rの推定値は、
0004846130.tif 000022
である。TをAA／CCの観察された値とする。そして、p／rのもう1つの推定値は
0004846130.tif 000023
である。
【０１３３】
Sに基づくＣ対立遺伝子に対するＡ対立遺伝子の相対リスクの推定値は、1.33であり；Tに基づく推定値は、1.69である。両方の推定値は、Ａ対立遺伝子に関連するリスクのわずかな上昇を示唆する。Sから誘導されるp／rに関する80、90、および95%信頼区間の上限は、2.45、2.80および3.70である。下限は評価できないが、区間は１を含む。Tに基づくp／rに関する信頼区間は、AA／CCに関する表に記載の区間の平方根をとることにより見い出すことができる。上限は、Sに基づく区間とかなり一致するが、下限は、１の帰無値を含まない。信頼区間は、相対リスクがほぼ３である可能性を含むが、その確率は低い。
【０１３４】
結論
上記解析に基づいて、以下の結論を導き出した。
【０１３５】
1.一般集団におけるTCF-1の分布
（a）TCF-1遺伝子座にHardy-Weinberg不均衡の証拠はない。
（b）TCF-1とDRB1 03、04、およびX血清学的群の間の関連の証拠はない。
（c）女性は、男性よりも高頻度に対立遺伝子Ａを持つと考えられる。
2.TCF-1に関連する１型糖尿病のリスク
（a）全体的に、ヘテロ接合性の親は、対立遺伝子Ｃよりも高頻度に対立遺伝子Ａをその罹患した子供に遺伝するが、これは、疾患状態とＡ対立遺伝子の関連を示している。
（b）罹患した子供の罹患していない兄弟に対するＡ対立遺伝子の遺伝の増加は、統計的に有意でなく、かつほとんど偶然によるものである。
（c）ヘテロ接合性の男性は、恐らく子供のDRB1 3/4状態には関わりなく、対立遺伝子Ａをその罹患子供に、対立遺伝子Ｃを遺伝するよりも高頻度に遺伝するが、これは、疾患状態との親由来のＡ対立遺伝子の関連を示している。
（d）ヘテロ接合性の女性は、両方の対立遺伝子をその罹患子供に同等の割合で遺伝する。
（e）限定した証拠に基づき、罹患した子供のヘテロ接合性の父母は、その非罹患子孫に、両方の対立遺伝子を同等の割合で遺伝する。
【０１３６】
3.TCF-1からのリスク対他の近接遺伝子座からのリスク
（a）ヘテロ接合性の父親は、罹患した２人の兄弟の両方のメンバーに、対立遺伝子Ａを対立遺伝子Ｃを遺伝するよりも高頻度に遺伝するが、このことは、対立遺伝子Ａに関連するリスクの上昇を確認している。
（b）罹患した２人の兄弟のヘテロ接合性の父親は、両方の対立遺伝子（すなわち、１つのＡと１つのＣ）を、２コピーの対立遺伝子Ｃを遺伝する頻度の２倍を超えて遺伝し、これは、偶然より高い頻度である。このことは、対立遺伝子Ａを受けることからのリスクが、罹患した自分の兄弟と同じ対立遺伝子を受けることからのリスクよりも高いことを示唆しており、TCF-1がリスク誘導性遺伝子座であることを支持する。
（c）罹患した２人の兄弟のヘテロ接合性の父親は、両方の対立遺伝子を、２コピーの対立遺伝子Ａを遺伝する頻度の２倍未満で遺伝し、これは、偶然によるよりも頻度が低く、3.a.および3.b.の結果と一致している。
（d）対立遺伝子Ａにより寄与されるリスクを超えて、罹患した兄弟との同祖性により付加されるリスクはなく、これは、TCFに連結する他のリスク関連遺伝子座が存在しないことに一致している。
（e）父親からＣ対立遺伝子の代わりにＡ対立遺伝子を受けることによる相対リスクを、２つの異なる尺度を用いてそれぞれ1.33および1.69と推定した。正確には、測定されるリスクは、１型糖尿病に罹患し、かつ同時に１型糖尿病の兄弟を有するリスクである。信頼区間は、データが1.2〜ほぼ３の範囲の相対リスク値と適合することを示唆している。
【０１３７】
全体的にデータは、父親からTCF-1 Ａ対立遺伝子を受ける子供で、１型糖尿病のリスクがわずかに上昇することとよく一致している。このリスクの上昇は、恐らくDRB1 3/4状態には依存しない。母親からＡ対立遺伝子を受けるときは、付加されるリスクはないと考えられる。データは、TCF-1に連結する他のリスク関連遺伝子座は存在しないことを示している。一般集団中の女性は、男性よりもTCF-1 Ａ対立遺伝子を高頻度に有すると考えられる。
【０１３８】
次に全てのサンプルを、実施例２に記載する逆ライン−ブロット法を用いて再度型決定した。1つのサンプルを除いて、両方のプロトコールにより、一致する遺伝子型が得られた。1つの矛盾した結果は、実際の型決定の誤りではなくサンプルの取り違いから生じたと考えられる。このさらなる解析中に、少数の当初決定した遺伝子型が、正しいものであったが、コンピュータデータベースに間違えて記録されたことが発見された。上述の統計的解析は、入力したデータを使用して行った。データ入力の誤りは少なかったため、統計的結論が妥当なままであることは明白である。
【０１３９】
〔実施例６〕
メキシコ系アメリカ人家族における１型糖尿病との関連
（予備試験結果）
１型糖尿病に罹患した子孫を含む63のメキシコ系アメリカ人家族を、実質的に前実施例の記載の通りに解析した。全てのTCF-1遺伝子型決定は、実施例１に記載の対立遺伝子特異的増幅に基づく遺伝子型決定法を用いて行った。サンプルの大きさが有意に小さいため、これらの結果は、予備試験として考える必要がある。
【表１８】
0004846130.tif 000024
【表１９】
0004846130.tif 000025
遺伝の割合は、AC, CC親の21人の罹患子孫の遺伝子型から決定した。期待される遺伝子型および観察された遺伝子型を、計算した遺伝の割合と一緒に以下に示す。AC遺伝子型の頻度は、Ａ対立遺伝子の遺伝の割合を提供し、そしてCC遺伝子型の頻度は、Ｃ対立遺伝子の遺伝の割合を提供する。
【０１４０】
【表２０】
0004846130.tif 000026
上記結果は、統計的に有意ではないが、前記実施例の大規模試験で観察された傾向とは反対の傾向を示唆するかもしれない。これは、試験する集団の違いを反映している可能性がある。しかし、遺伝子型決定された罹患兄弟の数が少ないため（全部で21人）、結果は統計的アーチファクトである可能性が高い。
【０１４１】
前記実施例における結果は、TCF-1遺伝子型の影響は小さく、影響を明白に決定するためには大きな試験集団を要することを示している。さらに、影響は、HLA遺伝子型のより顕著な影響によりマスクされるかもしれない。本試験は、前記実施例で行ったように、HLA遺伝子型による層別を可能にするほど十分に大きくなかった。示唆された傾向の検証には、より顕著に大きな試験集団を必要とすることが予測されよう。
【０１４２】
〔実施例７〕
多発性硬化症との関連
TCF-1遺伝子型決定は、多発性硬化症（MS）に罹患した１人の子孫を含むため、確認した２グループの家族からの個人について行った。第１のグループは、180家族からなり、そのほとんどはコーカソイドであるが、他の人種の家族も含んでいた。第２のグループは、74のヒスパニック家族からなっていた。罹患子供と非罹患両親のTCF-1遺伝子型決定は、実施例２に記載のプローブに基づく遺伝子型決定法を用いて行った。親の遺伝子型の分布およびＡ対立遺伝子の頻度、f(A)を、以下の表に示す。
【０１４３】
【表２１】
0004846130.tif 000027
TCF-1対立遺伝子の遺伝：グループ1
対立遺伝子の遺伝の割合は、有用な家族、すなわち、少なくとも１人のヘテロ接合性の親がいる家族だけを考慮することにより解析した。グループ１の中では、家族のうち53家族が、１人のヘテロ接合性の親と１人のホモ接合性の親を含む。これらの家族において、ヘテロ接合性の親から遺伝した53個の有用な対立遺伝子の中から、遺伝したＡ対立遺伝子の数をカウントした；ホモ接合性の親から遺伝した53個の対立遺伝子は、情報価値がなく、考慮されない。11家族では、両親がヘテロ接合性である。これらの家族において、両親から11人の子孫に遺伝した22個の対立遺伝子の中から、Ａ対立遺伝子の数をカウントした。両方の場合に、遺伝的影響がないという帰無仮説の下で、Ａ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子は、期待される比率50：50を生じる同等な確率で遺伝するであろう。遺伝の割合における偏差は、対立遺伝子と疾患状態の関連を示す。偏差の有意性は、カイ二乗検定を用いて解析した。さらに、帰無仮説の下では、対立遺伝子の遺伝は、Ａ対立遺伝子を遺伝する確率0.5で二項分布しているため、正確な確率を決定することができる。少なくとも観察するのと同様に大きい、遺伝の割合における偏差の確率
確率｛｜X−μ｜≧｜f(A)−μ｜｝
（ここで、f(A)は、Ａの遺伝の観察頻度であり、そしてμは、f(A)の期待値である）を計算し、これは帰無仮説の標準的両側検定に対応する。
【０１４４】
グループ1の180家族のうち64の有用な家族からの対立遺伝子の遺伝データを以下の表に示す。
【０１４５】
【表２２】
0004846130.tif 000028
全体で75対立遺伝子の遺伝事象の中で、Ａ対立遺伝子は47回遺伝され、そしてＣ対立遺伝子は28回遺伝した。帰無仮説の下での対立遺伝子の遺伝の期待値は、各対立遺伝子について37.5であろう。有意性のカイ二乗検定によるP値は0.028であった。二項分布から直接得られる少なくとも観察するのと同様に大きい、遺伝の割合における偏差を観察する確率は、両側のP値0.037を与えた。結果は、罹患子孫へのＡ対立遺伝子の遺伝の上昇が統計的に有意であることを示す。
【０１４６】
HLA遺伝子型との関連
HLA DRB1*1501-DQB1*0602ハプロタイプ（「DR15」）は、MSの罹病率の上昇と関連していることが知られている（例えば、Oksenbergら, 1993, JAMA 270: 2362-2369を参照のこと、これは参照により本明細書に組み込まれる）。これら２つの遺伝子座TCF-1とHLAの対立遺伝子が相互作用してMS罹病率を決定するかどうかを求めるために、HLA遺伝子型を決定し、子孫のHLA遺伝子型に基づいてデータを層別した。有用な家族の64人の子孫のうち、33人はDR15であり、31人はDR15ではなかった。
【０１４７】
グループ１の家族から選択される、子孫がDR15遺伝子型を有する、有用な33家族からの対立遺伝子の遺伝データを、以下の表に示す。
【０１４８】
【表２３】
0004846130.tif 000029
DR15子孫に遺伝する40個の対立遺伝子のうち、25個はＡ対立遺伝子であり、15個はＣ対立遺伝子であった。遺伝的影響がないという帰無仮説の下では、期待される遺伝は、それぞれ20個であろう。
【０１４９】
グループ１の家族から選択される子孫がDR15遺伝子型を持たなかった、有用な31家族からの対立遺伝子の遺伝データを、以下の表に示す。
【０１５０】
【表２４】
0004846130.tif 000030
非−DR15子孫に遺伝した35個の対立遺伝子のうち、22個はＡ対立遺伝子であり、13個はＣ対立遺伝子であった。遺伝的影響がないという帰無仮説の下では、期待する遺伝は、それぞれ17.5個であろう。
【０１５１】
一般に、Zの値により条件づけられるWの確率がWの確率（無条件）に等しいならば、ランダム変数WおよびZは独立である。確率の推定値として観察された頻度を用いると、Ａ対立遺伝子とDR15遺伝子型の影響が独立であることは明らかである。詳細には、子孫がDR15であることを仮定したＡ対立遺伝子の遺伝の条件付き頻度（25／40＝0.625）は、Ａ対立遺伝子の遺伝の無条件頻度（47／75＝0.627）と事実上同一である。同様に、子孫がDR15ではないことを仮定した遺伝の条件付き頻度（22／35＝0.629）は、遺伝の無条件頻度と事実上同一である。これらの結果は、TCF-1とDR15遺伝子型の影響が独立であることを示す。この結論は、TCF-1とDR15遺伝子型の独立性に関する有意性のカイ二乗検定により支持される（0.97というP値が得られる）（以下の2×2表を参照のこと）。
【０１５２】
【表２５】
0004846130.tif 000031
TCF-1対立遺伝子の遺伝：グループ１および２
グループ２は、Spanish系の有用なMS単一の74家族からなる。これらの家族は、TCF-1だけに関して型決定した。対立遺伝子の遺伝データは、以下の表に示す。
【０１５３】
【表２６】
0004846130.tif 000032
少数であるため、データはグループ１のデータと合わせて、対立遺伝子の遺伝の割合は、上述のように解析した。合わせて全体で103個の対立遺伝子の遺伝（28個はグループ２家族から、そして75個はグループ１家族から）が観察された。
帰無仮説の下では、遺伝するＡ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子の期待される数は、それぞれ51.5個であろう。これに対して、63個のＡ対立遺伝子が遺伝され、40個のＣ対立遺伝子が遺伝した。有意性のカイ二乗検定により、0.023というP値が得られた。少なくとも観察されたものと同様に大きい、二項分布から計算された遺伝の割合の偏差を観察する確率は、両側のP値が0.030であった。結果は、グループ１だけから得られるデータと一致しており、MSとのＡ対立遺伝子の統計的に有意な関連を示す。
【０１５４】
〔実施例８〕
喘息およびアトピーとの関係
本例は、TCF-1遺伝子型と、喘息およびアトピーの関係の研究結果を説明する。
【０１５５】
喘息は肺の気道の炎症性疾患であり、典型的には医師の診断により確定される。喘息に関連するのは、非特異的気管支過剰応答性である。気管支応答性は典型的には、気管支収縮物質（例えば、メタコリン）に対する空気流の用量応答により測定される。
【０１５６】
アレルゲンに対する免疫反応により引き起こされるアトピー（しばしばアレルギーと同義に使用される）は、アレルゲンに対するIgE応答が強いことが特徴である。アトピーは典型的には、臨床的に皮膚のプリック試験により確定され、これは、血清中のアレルゲン特異的IgEの存在、総血清IgEの上昇、または血液中の好酸球の存在により、アレルゲン特異的IgEの存在を示す。
【０１５７】
喘息はしばしばアトピーと関係しているが、喘息は、単一の疾患であることは少ない。多くの小児喘息患者はまたアトピー性である。これに対して、成人発症型喘息は、アトピーとは関係しないことが多く、はっきり定義されていない。さらにアトピー患者は、反応するアレルゲンが異なり、喘息と気管支過剰応答性は、ハウスダストダニ抗原に対するアレルギーに関係するが、植物の花粉は無関係である。
【０１５８】
喘息とアトピーは、遺伝的ベースがあり、中程度の作用を有するいくつかの遺伝子により影響されやすいことが知られている。喘息のような疾患は、遺伝子機能を排除するのではなく、機能をわずかに変化させる遺伝子中の対立遺伝子変異体による可能性がある。しかし遺伝的ベースはまだ解明されていない。
【０１５９】
被験者
２つのパネルの家族を調べた。パネルAは、喘息または鼻炎を有する家族により確認されている66の核家系と５つの拡大家系からの447人のイギリス人からなっていた。パネルBは、ランダム集団サンプルから同定された、各二人以上のアトピー性兄弟姉妹がいる88の核家系からの401人のオーストラリア人からなっていた。これらのパネルは、Moffatら、1994, Lancet 343: 1597-1600（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。集団と測定した形質が、Danielsら, 1996, Nature 383(19): 247-250（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１６０】
臨床データ
分析した変数を以下の表に示す。
【０１６１】
【表２７】
0004846130.tif 000033
上記変数は、正に相関している。両方の群で、アトピー、lige、dige、iger、pstiおよびrastiは、強く正に相関している（lige digeとigerは、定義が関係している）。これらの変数と、喘息および笛音との相関はあまり強くない。上記したように、喘息は正確には規定されておらず、複数の病因を有し、アトピー状態とは関係のない疾患を含む。これが、IgEレベルを測定する変数との高い相関の原因かも知れず、さらにアトピー状態に直接関係しているかも知れない。
【０１６２】
遺伝子型決定
各個人の遺伝子型は、基本的に実施例１に記載のように決定したが、様々なサーマルサイクラーを使用するアッセイを最適化するために、反応条件を若干変更した。実施例１に記載のアッセイと実際に使用した条件との差は、増幅および検出効率に影響を与えたかも知れないが、アッセイの定性的結果を変化させることはないであろう。
【０１６３】
解析
データは、遺伝的影響の大きさより影響の存在を検出するために解析した。遺伝的影響が存在しないことは、TCF-1遺伝子座も連関遺伝子座も、表現型変数や家族の確認につながる他の特徴に直接影響を与えないことを示す。
【０１６４】
TCF-1対立遺伝子と1型糖尿病との関係の解析について上記した方法と類似のTDT（遺伝不均衡試験）法を使用した。ヘテロ接合性の親から子へのすべての有益な対立遺伝子遺伝（ここで、子-親トリオのすべての３人について有用な遺伝子型が提供された）を、TDTに使用した。家系の構造と親のヘテロ接合性に従って、遺伝的作用の帰無仮説では、これらの有用な遺伝の結果は大体非依存性であった。一般に、サンプルは、大サンプル統計結果を使用するのに充分大きいようであった。
【０１６５】
不連続変数（喘息、笛音、およびアトピー）については、比率の正確度検定からp-値を得た。IgE応答の種々の測定値を含む連続変数については、ｔ検定とWilcoxon順位和検定を使用して、Ａ対立遺伝子を受けた子供の連続的変数値とＣ対立遺伝子を受けた子供の値とを比較した。ヘテロ接合性の親を有する子供だけを含めた。
【０１６６】
結果
1.イギリスデータ：
イギリスのデータは、17家系の47人の有用な子−親トリオを含有した。これらのうち、３人はヘテロ接合性の両親を有し、28人はヘテロ接合性の父親のみを有し、16人はヘテロ接合性の母親のみを有した。遺伝子型分布を以下に示す。
【０１６７】
【表２８】
0004846130.tif 000034
これらの家族は、遺伝子型分布で男女間の明確な差を示さない。
【０１６８】
不連続変数
病状により分類されるヘテロ接合性の親から子への対立遺伝子遺伝を、以下の表に示す。数（＃）と比率（％）の両方を示す。父親と母親から遺伝した対立遺伝子を別々に示す。「すべての」分類について、子供を、いずれかのヘテロ接合性の親がＡ対立遺伝子を遺伝したなら、Ａ対立遺伝子を受けたとした。これは、２つの数が同じ子を意味することは無いため、各数が独立であるという利点を有する。（ヘテロ接合性の親を有する子供は２回数えていない）。その結果、父親と母親により遺伝された対立遺伝子の数は、「すべての」分類における数まで合計していない。
【０１６９】
【表２９】
0004846130.tif 000035
すべてのp-値は正確である。遺伝が父親、母親、または両方の親からでも、Ａ対立遺伝子の遺伝と子供の喘息またはアトピー状態との有意な関係は観察されなかった。
【０１７０】
連続変数
連続変数についてのｔ検定とWilcoxon順位和検定からのp-値を以下に示す。Wilcoxon順位和検定からのp-値をカッコ内に示す。両方の検定で、IgEレベルとＡ対立遺伝子対Ｃ対立遺伝子の遺伝の関係を測定した。すべての場合で、変数の大きいほうの値は、Ｃ対立遺伝子の遺伝に関連していた。
【０１７１】
【表３０】
0004846130.tif 000036
データは、いくつかの変数が、母親によって遺伝された対立遺伝子より、父親によって遺伝された対立遺伝子に関係していることを示唆する。rastiを除くすべての変数について、父親についてのp-値は母親についてのp-値より小さかった（より有意であった）。興味深いことに、「すべての」分類のp-値は、わずかではあるが、父親と母親についての別々のp-値より小さかった。母親ではなく父親について差があった時は、母親を含めると作用が希釈されるため、父親のp-値より「すべての」p-値が高いことが予測できるであろう。ここでは、そうではない。一般に、このデータは、母親により遺伝される対立遺伝子と比較して、父親により遺伝される対立遺伝子と強い関係があることを示唆する。
【０１７２】
２．オーストラリア人データ：
オーストラリア人試験集団は、88の家系の76の有用なトリオを含有した。このうち、９人はヘテロ接合性の両親を有し、27人は、ヘテロ接合性の父親を有し、40人はヘテロ接合性の母親のみを有した。遺伝子型分布を以下に示す。
【０１７３】
【表３１】
0004846130.tif 000037
不連続変数
オーストラリア人集団で考慮された分類疾患の変数は、喘息、笛音、およびアトピーである。ヘテロ接合性の親からの対立遺伝子遺伝を、以下の表に要約する。数（＃）と比率（％）の両方を示す。「すべて」の分類は、上記イギリス人データについて定義されたものと同じである。
【０１７４】
【表３２】
0004846130.tif 000038
連続変数
連続変数についてのｔ検定とWilcoxon順位和検定からのp-値を以下に示す。Wilcoxon順位和検定からのp-値をカッコ内に示す。両方の検定で、IgEレベルとＡ対立遺伝子対Ｃ対立遺伝子の遺伝の関係を測定した。すべての場合で、変数の大きいほうの値は、Ｃ対立遺伝子の遺伝に関連していた。
【０１７５】
【表３３】
0004846130.tif 000039
データは、いくつかの変数と、遺伝した対立遺伝子との関係を示唆する。pstiとrastiについて母親と父親の両方において、p-値はわずかに有意である。lige、dige、およびigerについて、父親についてのp-値は小さかった。
【０１７６】
３．群別データ：
不連続データ
遺伝した対立遺伝子とアトピーとの関係を、組合せたデータを使用してさらに解析した。結果を以下に示す。
【０１７７】
【表３４】
0004846130.tif 000040
上記したように、各集団（アトピーを含む）の不連続変数についてのデータは遺伝的作用の欠如と一致し、一方連続変数についてのデータは、遺伝的作用を示唆する。連続変数は、IgE応答に関連し、個人をアトピー性として分類するのに使用した。組合せデータ中でも遺伝的作用が観察されないことは、実際に遺伝的作用がないというより、研究集団中のヘテロ接合性の親の非アトピー性の子供の数が小さいことによるかも知れない。連続変数を解析するのに使用した方法は、この範疇の個人の小さい数にあまり影響を受けず、従って、遺伝的作用を同定するのにより大きな力を有する可能性が高い。
【０１７８】
連続変数
組合せデータからの連続変数についてのｔ検定とWilcoxon順位和検定からのp-値を以下に示す。Wilcoxon順位和検定からのp-値をカッコ内に示す。両方の検定で、IgEレベルとＡ対立遺伝子対Ｃ対立遺伝子の遺伝の関係を測定した。すべての場合で、変数の大きいほうの値は、Ｃ対立遺伝子の遺伝に関連していた。
【０１７９】
【表３５】
0004846130.tif 000041
組合せデータは、TCF-1対立遺伝子と変数値に有意な関係があることを示す。データは、pstiとrastiの両方の性について有意な作用を示唆する。またlige、dige、およびigerについて、父親から遺伝した対立遺伝子については有意な作用があるが、母親から遺伝した対立遺伝子については作用がない。
【０１８０】
結論：
イギリス人のデータは、喘息とアトピーの有無に寄与する遺伝的作用は無いことと一致するようである。データは、連続変数により測定したIgE応答の特定の尺度に及ぼす遺伝的作用を示唆する。データは、pstiとrastiの両方について両性のヘテロ接合性の親から遺伝した対立遺伝子の間と、lige、digeおよびigerについてのヘテロ接合性の父親から遺伝した対立遺伝子の間に関係があることを示唆する。
【０１８１】
オーストラリア人データのパターンは、イギリス人のデータと似ている。データは、喘息、笛音、およびアトピーの有無に寄与する遺伝的作用が無いことと一致するようである。データは、IgE応答の特定の尺度に及ぼす遺伝的作用を示唆する。pstiとrastiについて両性のヘテロ接合性の親から遺伝した対立遺伝子の間と、lige、digeおよびigerについてのヘテロ接合性の父親から遺伝した対立遺伝子の間に有意な関係があることを示唆する。
【０１８２】
各集団で見られる傾向は、組合せデータによってより強く示される。別々の集団データのように、組合せデータも、アトピーの有無に寄与する遺伝的作用は無いことと一致するようである。しかし組合せデータは、遺伝したTCF-1対立遺伝子とIgE応答の具体的な測定値に有意な関係があることをより強く示す。組合せデータは、pstiとrastiの両方について両性のヘテロ接合性の親から遺伝した対立遺伝子の間と、lige、digeおよびigerについてヘテロ接合性の父親から遺伝した対立遺伝子の間に有意な関係があることを示唆する。この関係は、Ｃ対立遺伝子と上昇したIgE応答の間である。
【０１８３】
上記したように、喘息は正確には規定されておらず、複数の病因を有し、アトピー状態とは関係のない疾患を含む。TCF-1はIgE産生に影響を与える経路の一部であるため、TCF-1対立遺伝子の作用は、Th2−介在炎症性疾患（例えば、アトピーと喘息）でのみ明らかになり、対立遺伝子作用は、他の型の喘息中ではあまり役割を果たさない。本明細書に記載のデータ（本明細書で不正確に定義したように、喘息に及ぼす作用がないことが明らかであるが、TCF-1対立遺伝子とIgE応答との関係を示す）は、この仮説と一致する。
【０１８４】
TCF-1対立遺伝子とIgE応答との有意な関係は、TCF-1遺伝子座での遺伝子型決定が、アトピー性喘息および他のTh2−介在炎症性疾患の生じやすさを性状解析するのに有用な情報を提供することを示す。特にデータは、父親のＣ対立遺伝子を受けた個人は、IgE応答の上昇を示す可能性があり、個人はTh2−介在疾患が上昇するリスクがあることを示すかも知れない。
【０１８５】
一般に喘息と炎症性疾患の遺伝的ベースは複雑で未だにほとんど未知であるため、Th2−介在疾患の可能性に影響を与える追加の遺伝子座が同定されることが予測される。TCF-1遺伝子型は、Th2−介在疾患と関係があると決定された１つ以上の遺伝子座で遺伝子型情報と組合せるとより有用であることが予測される。
【０１８６】
【配列表】
0004846130.tif 000042
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【０１８７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２〜７：プライマー
配列番号８および９：プローブ