(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子修飾された植物を生産する方法であって、
(a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる少なくとも一つの植物細胞を用意する工程、
(b)少なくとも一つの前記植物細胞に
(i)リプレッサー結合部位に作動可能に連結されている、植物細胞にとって致死的な活性を有する遺伝子産物をコードする抑制可能な致死遺伝子、および
(ii)前記リプレッサー結合部位に結合することによって前記致死遺伝子の遺伝子産物の活性を抑制することができる遺伝子産物をコードするリプレッサー遺伝子
を導入する工程、
(c)少なくとも一つの前記植物細胞から複数の完全な植物体を再生する工程、ならびに
(d)遺伝子修飾された植物内における前記リプレッサー遺伝子および前記抑制可能致死遺伝子の組み込みおよびこれら相互の独立した隔離を決定することにより、前記複数の完全な植物体の少なくとも一つから得られるか、またはその子孫である遺伝子修飾された植物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記導入工程が、前記抑制可能致死遺伝子を第一のベクター構築物中に用意し、前記リプレッサー遺伝子を第二のベクター構築物中に用意することをさらに含んでなり、前記選択工程の前に前記複数の完全な植物体の少なくとも２つの植物を交雑する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抑制可能致死遺伝子を含んでなる前記第一のベクター構築物が、前記抑制可能致死遺伝子に結合した条件致死遺伝子をさらに含んでなり、該条件致死遺伝子が、遺伝子修飾された植物に化学的または生理学的ストレスが加えられたときに該植物の細胞にとって致死的な遺伝子産物をコードするように構成されたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リプレッサー遺伝子および前記抑制可能致死遺伝子の相互の独立した隔離の決定が、遺伝子修飾された前記植物の植物細胞の染色体対の向き合った姉妹染色体上に前記リプレッサー遺伝子と前記抑制可能致死遺伝子がそれぞれ配置されていることを決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記導入工程が、前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子を単一のベクター構築物の部分として用意することを含んでなり、独立した隔離が部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼを用いることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
(a)前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子の少なくとも一つの転写制御のために組織特異的プロモーターを用意する工程、および
(b)前記リプレッサー遺伝子の転写制御のために誘導性プロモーターを用意する工程、
のうちの少なくとも一つをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組織特異的プロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
目的とする形質をコードする遺伝子を第一のベクター構築物中の前記抑制可能致死遺伝子に連結することをさらに含んでなり、前記導入工程が、前記第一のベクター構築物を少なくとも一つの前記植物細胞に導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数の完全な植物体を再生する前記工程が、前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子についてホモ接合性である少なくとも一つの植物体を再生することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子についてホモ接合性である少なくとも一つの前記植物体と、前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子についてホモ接合性である第二の植物体とを交雑して、遺伝子修飾された前記植物を生産する工程をさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異種生殖細胞質の遺伝子移入または異系交雑の際に発現される少なくとも一つの抑制可能致死遺伝子を有する、遺伝子修飾された植物を生産する方法であって、
(a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞を用意する工程、
(b)前記植物細胞に
(i)種子特異的プロモーターによって転写制御されている抑制可能致死遺伝子であって、植物細胞にとって致死的な活性を有する遺伝子産物をコードする、抑制可能致死遺伝子、
(ii)前記抑制可能致死遺伝子と作動可能に連結されているオペレーター配列、
(iii)前記オペレーター配列に結合することにより前記抑制可能致死遺伝子の遺伝子産物の活性を抑制することができる遺伝子産物をコードする細菌リプレッサー遺伝子、および
(iv)前記抑制可能致死遺伝子に連結された、目的とする形質をコードする少なくとも一つの遺伝子
を導入する工程、
(c)前記植物細胞から完全な植物体を再生する工程、
(d)前記リプレッサー遺伝子および前記抑制可能致死遺伝子の組み込みおよびこれら相互の独立した隔離を決定することにより、前記完全な植物体から得られるか、またはその子孫である遺伝子修飾された植物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１３】
(a)リプレッサー結合部位に作動可能に連結されている、植物細胞にとって致死的な活性を有する遺伝子産物をコードする、抑制可能致死遺伝子、および
(b)前記リプレッサー結合部位に結合することによって前記抑制可能致死遺伝子の遺伝子産物の活性を抑制することができる遺伝子産物をコードするリプレッサー遺伝子
を含んでなる、遺伝子修飾された植物またはその子孫であって、
前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子が前記植物のゲノム中に安定して組み込まれており、相互に独立して隔離されている、遺伝子修飾された植物またはその子孫。
【請求項１４】
前記抑制可能致死遺伝子に結合した、遺伝子修飾された植物に化学的または生理学的ストレスが加えられたときに該植物の細胞にとって致死的な遺伝子産物をコードする条件致死遺伝子をさらに含んでなる、請求項１３に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項１５】
前記リプレッサー遺伝子と前記抑制可能致死遺伝子が、遺伝子修飾された前記植物の染色体対の向き合った姉妹染色体上にそれぞれ配置されている、請求項１３に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項１６】
前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子が単一のベクター構築物の部分として前記植物中に導入されてなり、前記単一のベクター構築物が、前記リプレッサー遺伝子と前記抑制可能致死遺伝子の相互に独立した隔離を可能とする少なくとも一つの部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼを含むものである、請求項１３に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項１７】
(a)前記抑制可能致死遺伝子および前記リプレッサー遺伝子の少なくとも一つの転写制御のための組織特異的プロモーター、ならびに
(b)前記リプレッサー遺伝子の転写制御のための誘導性プロモーター
のうちの少なくとも一つをさらに含んでなる、請求項１３に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項１８】
前記組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項１７に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項１９】
前記組織特異的プロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項１７に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項２０】
前記抑制可能致死遺伝子が、目的とする形質をコードする遺伝子に連結されている、請求項１３に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項２１】
前記抑制可能致死遺伝子が、種子特異的プロモーターによって転写制御されており、
リプレッサー遺伝子が、前記リプレッサー結合部位に結合することにより前記抑制可能致死遺伝子を抑制することができる遺伝子産物をコードする細菌リプレッサー遺伝子を含み、そして、
目的とする形質をコードする少なくとも一つの遺伝子が前記抑制可能致死遺伝子に連結されている、請求項１３に記載の遺伝子修飾された植物。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された植物またはその子孫を生育地から除去する方法であって、前記抑制可能致死遺伝子の抑制を解除する物質またはストレスを前記植物に適用することを含んでなる、方法。
【請求項２３】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された植物またはその子孫を生育地から除去する方法であって、前記リプレッサー遺伝子の発現を阻害することを含んでなり、これにより前記抑制可能致死遺伝子の抑制が解除される、方法。
【請求項２４】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された植物またはその子孫を生育地から除去する方法であって、前記抑制可能致死遺伝子の抑制を解除する外部からの物質または化学的もしくは生理学的ストレスを前記植物に適用することを含んでなる、方法。
【請求項２５】
請求項１４に記載の遺伝子修飾された植物またはその子孫を生育地から除去する方法であって、化学的または生理学的ストレスを前記植物に適用することを含んでなり、これにより、遺伝子修飾された前記植物の細胞に致死的な前記遺伝子産物が発現する、方法。
【請求項２６】
前記抑制可能致死遺伝子が目的とする形質をコードする遺伝子に連結されている、請求項１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
組換えＤＮＡ研究から誘導された新規な形質を含む多種多様な植物が増加することにより、環境的および商業的関心が持たれるようになってきている。これらの関心は、新規な形質が天然または培養個体群において性的和合性植物への受粉によって広がる可能性に起因する。
【０００２】
遺伝技術、および特に組換えＤＮＡ技術によって付与された新規かつ変更された形質を有する植物は、いまや農作物バイオテクノロジー産業の礎石と見なされている。現在、組織培養、ソマトクローン変異(somatoclonal variation)または突然変異並びに遺伝子工学によって得られた新規形質を有する多数の農作物植物が、実地試験および商業的公開の第一段階に至っている。これらの植物には、一年ベースで成長した通常の作物だけでなく、新規形質を含んでなり多年生である樹木または灌木のような他の植物もある。
【０００３】
最近の農作物品種には、特定の形質を付与する個々の遺伝子、および通常の植物の品種改良によって収集した遺伝子の組合わせの両方が含まれる。従って、さらに多数の新規形質が開発されて最新の作物品種に組込まれるため、特定の作物品種、栽培品種または品種改良系統の遺伝子組成など、遺伝子組成を保存する手段を有することが重要である。特に重要なものは、通常はその作物には見られない形質を有する作物、例えば新規な油、ミールまたは他の成分を生産する植物、または特別な化合物を生産するように修飾された植物の保存である。さらに、リグニン濃度を変更したもの、昆虫耐性および真菌耐性、並びに除草剤耐性のような新規形質を有する樹木のような多年生植物が生産されている。
【０００４】
新規形質は、通常の品種改良または遺伝子操作によって植物に導入される。しかしながら、今日までのところは、いずれの経路によっても、生殖細胞質純度の保持または新規形質の持続性または潜在的拡散の制御に日常的に用いることができる特性は得られない。現在用いられているベクターおよび遺伝子組成物は、典型的には２つの重要な問題、すなわち(1)形質転換した作物植物または極上品種が他の商業的生産物を汚染することの防止、または緊密に関連した栽培品種または植物種由来の異種生殖細胞質の遺伝子移入の防止などの商業的問題、および(2)非農業的環境から問題の遺伝子を獲得した形質転換作物植物または関連種の除去のような環境的問題を扱っていない。さらに、現在用いられている形質転換法では、受粉によって媒介される異系交雑による他の栽培品種または（野生型または培養された）関連種への遺伝子の導入を減少させる手段は得られない。
【０００５】
新規形質を有する多くの作物を使用することの唯一最大の直接的危険性は、同一作物種の商業的生産中における汚染の危険性である。油糧種子ナタネまたはカノーラ(Brassica napus)のような作物種が雑草となり、または野生の雑草性近縁生物と雑種形成する危険性は、特に大きな生産面積がある場合には、カノーラの他の商業生産物との交雑がほぼ確実であることに比べれば大きくはない。以前は、これは幾つかの理由から農家および商業的加工業者にとって大した問題ではなかった。第一に、品種改良の目的はカノーラ作物について比較的均一であり、第二に、少数の栽培品種だけで農家が栽培した総エーカー数の９０〜１００％に上り、第三に、極上の種類の伝統的な方法で栽培された高エルカ酸工業油の栽培品種だけは、物理的に隔離されて栽培されてきたからである。従って、高エルカ酸を付与する遺伝子を有する食用品質のカノーラ品種の交雑汚染は、重要な問題とはならなかった。
【０００６】
最近、さらなる独特な品種が出回っている。これらには、除草剤耐性を付与する組換え遺伝子を有する品種、および高オレイン酸のような脂肪酸プロフィールに変異を有する通常の栽培によって開発された品種がある。カノーラ種子を生産して収穫し、磨砕および加工する際の種子の純度が、いまや問題となってきている。油に異なる特性（例えば、高ラウリン酸含量）を付与する多数のさらなる組換え遺伝子を有するカノーラの改質が切迫しており、また、医薬のような異種タンパク質の製造装置として植物が用いられるため、重大な産業上の交雑汚染の可能性が予想される。
【０００７】
これらの問題は、アブラナ属の油糧種子の他に、多くの作物についても存在する。トウモロコシでは、除草剤耐性、昆虫耐性および改質された最終生産物（例えば、澱粉、油、粉末）の多様性へ注目度が増加しているため、多くの異なる形質がトウモロコシ作物に組み入れられることが明確に示唆される。幾つかのトウモロコシ品種は、湿式製粉もしくは飼料、または薬理学的に重要なタンパク質の生産のような限定された用途に用いられるので、本流からこれらの特定の種類を隔離する問題もある。トウモロコシの花粉が時にはかなりの距離を移動し得ることを考慮すれば、受粉を制御する遺伝学的手段は極めて有利である。
【０００８】
同様に、多年生植物がそれらの野生型近縁生物へ接近していることも問題である。例えば、昆虫耐性を発現するトランスジェニック樹木は、野生種の樹木と交雑して昆虫耐性を発現する雑種を作製する可能性がある。農園のような管理された条件下では、昆虫耐性は環境に対してそれ程大きな影響力を持たない。しかしながら、昆虫耐性形質が天然の森林個体群に広がると、重大な生態学的問題が生じる可能性がある。昆虫個体群は森林系における食物連鎖の一部であり、昆虫のレベルが減少すると、トリの在来種であることが多い捕食生物の個体群が崩壊する可能性がある。従って、未管理系については、環境上の重要性を有することがある遺伝子の広がりを制御することが極めて望ましい目標である。
【０００９】
現在用いられている、花粉トラップとして働くボーダーロウ(border rows)と組み合わせた物理的隔離は、研究中および開発中のトランスジェニック植物を格納するために採用されている。しかしながら、この方法は、広汎な栽培には実用的でない。さらに、様々なトランスジェニックタイプの数が増加し、それらの生産および分布が増加すると、汚染の可能性は急激に増加する。この問題は、近来油糧種子ナタネ産業について大きな関心を集めており、多数の様々な組換えおよび特別の遺伝子型が市場に登場するにつれて、他の主要作物（例えば、トウモロコシ）についても一層大きな問題となるであろう。
【００１０】
商業的作物生産物の間における交雑汚染の他に、商業上または医薬上重要な異種タンパク質生産のためのビヒクルとして用いられる作物が広がる可能性も重要である。これらの新規タンパク質産物は、食用および輸出用の植物を汚染する可能性がある。個々のトランスジェニック系の同一性を保存し、意図しない汚染を減少させようとする生産基準を実行することができるが、結局は遺伝子が他の栽培品種へ流出することとなる。例えば除草剤耐性によって、容易には確認することができずかつ特有の形態も伝えない遺伝子の潜在的広がりは、未だ当局や産業界によって検討されていない。
【００１１】
環境や他の商業的栽培品種への導入遺伝子の広がりを制御する方法は、異種生殖細胞質の、同一性が保存された商業品種への遺伝子移入の防止にも有用である。ここで、「異種生殖細胞質」とは、同一性が保存された栽培品種の形質の完全な相補物を含まない任意の生殖細胞質として定義される。従って、異種生殖細胞質としては、作物の性的和合性の野生型類縁種および他の商業的品種の両方を挙げることができる。商業的生産が意図される新規形質を有する植物の数が増加しているため、種子生産および一次産品の汚染を防止する方法により、生殖細胞質純度および同一性保存を保持するための重要な手段が提供される。
【００１２】
一例としては、大豆、トウモロコシおよびカノーラのような油糧種子作物の植物油生産性を変更する多くの酵素が試験されている。これらの植物種は、食用に適さない短鎖または長鎖の工業用脂肪酸、並びに食用油の生産に用いられてきた。改質油分種子は、油分改質遺伝子を有する花粉を確保し、食用油品質種子を汚染しないように単離しなければならないので、これにより種子生産産業における問題点が増大する。多数の作物について種子生産で日常的に実施されている隔離距離は、必要な水準の純度を確保するのに十分ではないことがある。作物植物を用いて医薬活性化合物のような特殊な産物を生産する場合には、生殖細胞質の僅かな汚染であっても極めて望ましくない。
【００１３】
カノーラのような油糧種子作物は、典型的には収穫前に種子を粉砕する。これにより、翌年にかなりの数の自生植物が生じ、交雑および発生する作物に対する花粉の直接的影響（キセニア効果）によってその後の商業的生産物を汚染する可能性がある。さらに、将来の植え付けのために農家が確保して散布しておいた種子も、汚染の問題に影響を与える可能性がある。
【００１４】
多年生植物については、樹木の寿命が長く、土地固有の野生類縁種が存在することにより別の問題が起きる。ある種の樹木は開花までに多くの年月がかかり、多くの年月にわたって継続することができ、かつ風による広範な受粉に特に適している多量の花粉を生産する。従って、トランスジェニック樹木は特殊な問題を引起し、野生類縁種への遺伝子の流れを制御する機構を必要とすることがある。
【００１５】
幾つかの新規な種類の作物は、野生類縁腫との雑種形成によって天然の生態系を侵食することがある。この問題や関連の問題は、詳細に討議されてきている（例えば、カリフォルニア大学、農業生物学における危険性アセスメント：国際会議議事録、１９９０年、Casper, R., & Landsman, J., 1992, 遺伝子修飾植物および微生物の屋外試験の生物学的安全性の成績。遺伝子修飾植物および微生物の屋外試験の生物学的安全性に関する第二回国際シンポジウム議事録、１９９２年、ゴスラー、ドイツ、Dale, P. et al., 1992, トランスジェニック植物の野外放出。英国作物保護会議。ブライトン作物保護会議：有害生物および疾病、第Ｉ、IIおよびIII巻。遺伝子修飾植物および微生物の屋外試験の生物学的安全性の成績についての第三回国際シンポジウム議事録、１９９４年、モンデレー、カリフォルニア、D.D. Jones, 1994）。
【００１６】
これまでに行われたこれらの研究および実験成績の総意は、導入遺伝子の野生類縁種への潜在的広がりの程度は種および環境条件によって著しく異なるという考察を支持している。類縁種との交雑は起こらないと思われる種もあれば、その可能性のある種もある(Raybould & Grey, J. Applied Ecology, 30: 199-219, 1993)。多くの作物は極めて特殊化されており、非競合的栽培に適しているので、それら自体が重大な環境上の危険とは一般には考えられない(Dale et al., Plant Breeding, 111: 1-22, 1993, Fishlock, D., PROSAMOレポート(PROSAMO Report), 政府化学者の実験室により公表、クイーンズロード、テッディングトン、ミドルセックス、英国 TW11 0LY）。例えば、ウイルス組換えおよび広汎な宿主範囲による新規ウイルスの発生の潜在的可能性を有するウイルスコートタンパク質遺伝子の封入は現在のところは知られていない(Gal S., et al., Virology, 187:525-533; Grimsley, N., et al., EMBO Journal, 5:641-646, 1986; Lecoq, H., et al., Molec. Plant Microbe Interact., 6:403-406, 1993; Tepfer, M., Biotechnology, 11:11251132, 1993)。従って、この種の遺伝子の潜在的流出を制限し、またはこのような遺伝子を含む植物を選択的に除去する方法が必要である。
【００１７】
組換えＤＮＡによって導入された新規形質を含む植物を特異的に除去しまたは同定する方法の開発が試みられてきた。例えば、条件致死遺伝子、すなわち一定条件下で植物細胞を死滅させる遺伝子の使用が、特定の組換えＤＮＡを含む植物細胞を選択的に殺す手段として示唆されている。最近は、植物で条件的に致命的になる遺伝子の開発が報告されている（例えば、ＷＯ９４／０３６１９号明細書）。しかしながら、これらの遺伝子を用いる方法は、致死表現型の発現を誘発する物質の適用に限定されている。広汎な農業での実施については、これらの方法は非常に制限されている。
【００１８】
条件致死遺伝子の一例は、「遺伝子２」または「癌遺伝子２」と通常呼ばれているAgrobacterium Tiプラスミド由来の癌遺伝子である。この遺伝子は、本質的に植物ホルモン活性を持たない化合物であるインドールアセタミドを加水分解して活性なオーキシン植物ホルモンであるインドール酢酸を形成する酵素であるインドールアセタミドヒドロラーゼ（ＩＡＭＨ）をコードする。この酵素ＩＡＭＨは、ナフタレンアセタミドなど、多数のインドールアミド基質を加水分解して、周知の合成植物成長調節因子であるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を生産することができる。異常植物(roguing plants)についてのＩＡＭＨ遺伝子の使用は、Jorgensonによって報告されている（米国特許第５，１８０，８７３号明細書）。この方法は、条件致死遺伝子を有する植物を識別するためにＮＡＭを適用する必要がある。
【００１９】
他の酵素を、条件致死遺伝子として用いることもできる。これらの酵素としては、毒性のない物質を毒素に転換するために直接作用する酵素、例えば、毒性のない２−アミノ−４−メトキシ−酪酸（メトキシニン）を毒性のあるメトキシビニルグリシンに転換する酵素メトキシニンデヒドロゲナーゼ(Margraff, R., et al., 1980, Experimentia, 36: 846)、毒性のない２−アミノ−４−メトキシ−酪酸を毒性のある２−アミノ−４−［２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル］−トランス−３−酪酸（リゾビトキシン）に転換する酵素リゾビトキシンシンターゼ(Owens, L.D., et al., 1973, Weed Science, 21: 63-66)、不活性な除草剤誘導体Ｌ−Ｎ−アセチル−ホスフィノトリシンを活性な植物毒性化合物ホスフィノトリシンに特異的に転換する作用を行うデアシラーゼ酵素（Bartsch, K. and Schultz, A., 欧州特許第６１７１２１号明細書）、および除草剤グリフォセートの不活性なエステル誘導体を加水分解して活性な除草剤を形成することができる酵素ホスホネートモノエステルヒドロラーゼ（Dotson, S.B. and Kishore, G.M., 1993, 米国特許第５，２５４，８０１号明細書）が挙げられる。他の条件致死遺伝子は、致死遺伝子から遺伝子工学により作成することができる。環境または生理的条件に応答してのみ発現する致死遺伝子は、これらの条件下で致死的である。例えば、致死活性をコードする遺伝子を、特異的な化学的誘導または人工的または天然に存在する生理学的ストレスに応答して誘導されるプロモーターの制御下に置くことができる。このやり方では、致死遺伝子活性の発現は、インデューサーの存在を条件とする。
【００２０】
毒性のない物質に作用してこの物質を毒性物質に転換する条件致死遺伝子の発現は、典型的には総てのまたはほとんどの細胞の種類で発現する構成的プロモーターまたは一定の細胞の種類でまたは所定の発生段階で発現する発生制御プロモーター(developmentally regulated promoter)であるプロモーターによって調節される。十分なレベルの発現を行う任意のプロモーターを用いることができる。しかしながら、実際には、長期間にわたり高レベルの発現を行うプロモーターが、望ましくない植物を除去するための最善の機会を提供する。
【００２１】
致死表現型を誘導するために薬品を用いる必要があるため、条件致死遺伝子の有用性が減少している。薬品の広汎な適用は非実用的であり、別の環境問題を引起すことがある。従って、現在報告されている条件致死遺伝子の使用は、致死表現型を発現させるための介在を必要とするため、一般的適用については理想的なものではない。
【００２２】
抑制致死遺伝子を用いて雑種作物の残存率を制限する可能性が、最近Oliver et al.によって示唆されている（特許出願ＷＯ９６／０４３９３号明細書）。この系では、致死遺伝子の発現は特異的リプレッサータンパク質に結合する遺伝子要素によって遮断される。リプレッサータンパク質は、典型的には細菌のリプレッサー遺伝子の産物である。リプレッサータンパク質に結合する遺伝子要素は、遮断配列(blocking sequence)と呼ばれ、ＤＮＡリコンビナーゼ酵素（例えば、ＣＲＥ酵素）によって認識されるＤＮＡ配列をも含んでなるように構築する。上記の遮断された致死遺伝子を含む植物を、ＤＮＡリコンビナーゼ遺伝子を含んでなる植物と交雑させる。致死遺伝子またはリコンビナーゼ酵素（または両方）を、植物発生の特定の段階（例えば、種子胚）でのみ発現することができる調節要素によって制御する。その結果、生成するＦ１雑種植物におけるリコンビナーゼ機能によって特異的遮断配列が除去され、致死遺伝子が活性化されて、Ｆ２植物が生成しなくなる。特に、この機構は、新規形質を有する生殖細胞質異系交雑も異種生殖細胞質の遺伝子移入も制御することができない。この方法は、自家または開放(open-)受粉品種には適用されない。従って、この方法は、Ｆ１雑種種子への使用（例えば、移植）を制限する手段としてのみ用いられる。
【００２３】
選択可能マーカーのような形質転換体を得るのに用いられる組換えＤＮＡ配列を除去する方法が開発されている。トランスポザーゼまたはリコンビナーゼを用いてトランスジェニック作物植物から選択された組換え配列を除去することは、米国特許第５，４８２，８５２号明細書（生物学的に安全な形質転換系、Yoder and Lassner）に記載されている。この発明には、ベクターおよびマーカー遺伝子配列をトランスポゾンに封入することによってこれらを除去する方法が記載されている。従って、これらの配列は、この植物をトランスポザーゼ機能を有する植物と交雑することによって除去される。
【００２４】
しかしながら、公表された方法では、交雑受粉による関連品種の汚染の問題については全く検討されていない。当該技術分野でも、関連花粉、特に（複数の）遺伝子形質を欠いていることを除き同一品種からの花粉を用いる受粉による異種生殖細胞質の遺伝子移入を防止する手段は提供されていない。
【００２５】
従って、異系交雑および遺伝子移入を介在なしに制限する方法が、新規形質および新規形質を有する作物の管理および制御に必要である。商業作物の交雑汚染を制御する機構も必要である。このような機構は、樹木、灌木およびブドウの木のような多年生作物の管理にも必要である。特に、介在を必要とせずに機能する任意の機構が、多年生作物に極めて適している。本発明は、これらの要望に応じる方法および遺伝子組成物を記載する。
【００２６】
【発明の概要】
本発明は、組換えＤＮＡを含む植物によって生産される花粉による意図しない異系交雑から生じる同一種または関連種の他の栽培品種における遺伝子の広がりおよび残存率を遮断する方法および組換えＤＮＡ組成物を含んでなる。さらに、本発明によれば、異種生殖細胞質の遺伝子移入は自殖個体群では確実に除去される。
【００２７】
本発明は、組換えＤＮＡを含む植物に新規特徴を付与する新規な組換えＤＮＡ構築物に関する。この特徴は、組換えＤＮＡの完全な相補物を含む植物でのみ生育可能な種子を形成させることができる。さらに、本発明は、組換えＤＮＡの完全な相補物を含まない植物では致死的である形質の発現によって所定の個体群内の生殖細胞質または遺伝子形質を確実に有性単離する手段も提供する。本発明によれば、トランスジェニック植物によって受精するが組換えＤＮＡを持たない植物は、生育可能な種子を形成することができない。
【００２８】
この新規な遺伝子構築物は、植物に形態学的に明確なまたは容易に検出される表現型を付与しない。それらは、意図しない有性交雑が起こるときにのみ発現されるサイレント遺伝子を含んでなる。意図しない交雑により、致死形質が発現し、望ましくない植物細胞は除去される。従って、本発明は、性的和合性種との異系交雑による生育可能な種子の形成を制限する。新規なＤＮＡ構築物は、この構築物を欠いている性的和合性種からの花粉による交雑受粉からの形質の遺伝子移入を効果的に減少させる手段も提供する。
【００２９】
本発明は、特定の栽培品種または品種改良系が異種生殖細胞質によって汚染されず、または他の栽培品種および品種改良系を汚染しないことを確保するＤＮＡ構築物中でコードされる遺伝的形質を提供する。これにより、トランスジェニック植物を遺伝学的に単離するための好都合な手段が提供される。新規なＤＮＡ構築物は、種子生産および野外での一次産品の生産の際に生殖細胞質純度を確保する手段として用いることができ、また開放受粉および雑種作物品種のいずれでも用いることができる。
【００３０】
新規なＤＮＡ構築物を新規な作物学的または表現型形質をコードするＤＮＡ分子に結合することによって、新規な作物学的または表現型形質はそれが導入された遺伝子型の外側では持続しないようにする。本発明のこの側面は、新規な作物学的または表現型形質を有する作物または食物育種法によって開発された通常の形質の独特な組合わせを有する作物の管理に有用である。
【００３１】
一態様では、本発明は２種類のＤＮＡ構築物を含んでなる遺伝子系を提供する。一つのＤＮＡ構築物は、活性であるときには細胞を死滅させ、かつリプレッサー遺伝子を含んでなり、このリプレッサー遺伝子が抑制可能な優性致死遺伝子から独立して隔離されている遺伝子座に配置されている第二のＤＮＡ構築物を含む植物細胞では、その発現が抑制される優性抑制可能致死遺伝子を含んでなる。このリプレッサー遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、致死遺伝子活性の直接的阻害剤、または致死表現型を阻害することができるＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡであることができるリプレッサー分子をコードする。
【００３２】
図１は、本発明のこの態様で用いることができる遺伝子構築物を示している。
【００３３】
好ましい態様では、優性抑制可能致死遺伝子は種子特異的プロモーターによって制御され、リプレッサー分子をコードする遺伝子は抑制可能優性致死遺伝子から独立して隔離されている遺伝子座に配置される。抑制可能優性致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子は、いずれもホモ接合状態である。自家受粉は、この遺伝子の組合わせを保持する。
【００３４】
もう一つの好ましい態様では、ＤＮＡ構築物は、抑制可能致死遺伝子に結合した条件致死遺伝子をも含んでなる。条件致死遺伝子は化学的または生理学的ストレスを加えて活性化し、必要な場合には環境から組み換えＤＮＡを含む植物または細胞を完全に除去する手段を確保することができる。従って、抑制可能致死遺伝子を含む自家受粉細胞をも、条件致死遺伝子によって個体群から選択的に除去することができる。
【００３５】
さらに好ましい態様では、条件致死遺伝子に結合した抑制可能致死遺伝子を、さらに新規形質をコードする遺伝子に結合する。第二のＤＮＡ構築物は、抑制可能致死遺伝子の活性を遮断することができるリプレッサーをコードする遺伝子を含んでなる。別々のＤＮＡ構築物が、同一細胞に導入される。新規な形質を抑制可能致死遺伝子に結合させることによって、新規な形質は、有性交雑による遺伝子導入(transfer)によって関連種では持続することができなくなる。
【００３６】
さらにもう一つの態様では、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物は、植物細胞に導入される単一の組換えＤＮＡ分子中にある。単一の組換えＤＮＡ分子は、さらに部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼによって認識される配列を含む。リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ活性によって、挿入された組換えＤＮＡからリプレッサー遺伝子が除去される。この態様の要素として、リプレッサー遺伝子が独立して隔離された遺伝子座に再度組込まれ、特に相同染色体対の対向染色体上の同じ遺伝子座に再度組込まれる。この態様の範囲内で用いることができるＤＮＡ構築物を、図２に示す。
【００３７】
もう一つの好ましい態様では、２種類の抑制可能致死遺伝子とこれらの抑制可能致死遺伝子に対する２種類の機能的に異なるリプレッサーを含んでなるＤＮＡ構築物が植物細胞に導入される。これらの遺伝子は、好ましくは、図３に示すように、第一の抑制可能致死遺伝子が第二の抑制可能致死遺伝子を抑制することができるリプレッサーに結合し、第二の抑制可能致死遺伝子が第一の抑制遺伝子を抑制することができるリプレッサーに結合するように配置される。場合によっては、構築物は、植物細胞に導入される単一の組換えＤＮＡ分子を含んでなる。単一の組換えＤＮＡ分子は、部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼであって、その活性によって組換えＤＮＡから第一の抑制可能致死遺伝子と第二の抑制可能致死遺伝子とが除去されるものによって認識される配列を含んでいる。この任意態様の要素として、第一の抑制可能致死遺伝子と、結合した第二のリプレッサー遺伝子とが独立して隔離されている遺伝子座に再度組込まれる植物が選択される。
【００３８】
上記の態様は、独立して隔離されている遺伝子座にＤＮＡ構築物をランダムに挿入することに依存している。しかしながら、幾つかの応用については、組換えＤＮＡを特異的遺伝子座に導入する手段が望ましいことがある。従って、本発明は、組換えＤＮＡを特定の遺伝子座へ標的設定する方法を提供する。
【００３９】
植物ゲノムで予め確立された遺伝子座に組換えＤＮＡを導入するための部位特異的リコンビナーゼの使用を考察する。部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列を、標準的形質転換手続きによって植物ゲノムに挿入する。植物を、自家受粉および葯または単離した小胞子培養物の選択のような既知の方法によって標的ＤＮＡ配列についてホモ接合性とする。あるいは、上記挿入配列についてホモ接合性の植物を、半数体細胞または組織の形質転換に続いて染色体倍加によって直接作製することができる。
【００４０】
植物で発現可能な適当なリコンビナーゼを、形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔などの数種類の方法のいずれかによって標的ＤＮＡ配列にホモ接合性の植物細胞に挿入する。次いで、植物細胞を、抑制可能致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物で独立して再形質転換する。これらのＤＮＡ構築物を部位特異的リコンビナーゼ認識配列を含むように修飾して、ＤＮＡ構築物を予め存在しているリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列に挿入することができるようにする。従って、第一の抑制可能致死遺伝子または第一のリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物を含む植物系が回収される。この系を交雑することによって、相同染色体対の対向染色体上の同じ遺伝子座に導入されたＤＮＡ構築物（抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー）を含む植物を回収することができる。
【００４１】
従って、部位特異的挿入法は、抑制可能致死遺伝子と、幾つかの態様では優性条件致死遺伝子とを含んでなるＤＮＡ構築物の調製を含んでなる。この方法は、致死遺伝子と同時にまたは独立して挿入することができるリプレッサー遺伝子の調製をも含んでなる。抑制可能致死遺伝子を、好都合には挿入された抑制可能致死遺伝子から独立して隔離されている染色体部位に配置されたリプレッサー遺伝子によってコードされるリプレッサーによって抑制する。植物ゲノム中の特定の部位、特に特異的リコンビナーゼ認識部位を挿入した部位にリプレッサーおよび抑制可能致死遺伝子を標的設定する手段として部位特異的組換えを用いることは、本発明の方法の範囲内にある。本発明のこの態様で用いることができるＤＮＡ構築物および工程の一例を、図４に示す。
【００４２】
本発明は、開放受粉作物での単純な自家受粉によってトランスジェニック植物の遺伝学的純度を保持することができる方法および組成物を提供する。いかなる介在も不要である。本発明は、さらに組換えＤＮＡを含む植物の好都合な調製、増殖および管理の方法を提供する。遺伝子組成物が、開放受粉および雑種植物生産系で使用する目的で提供される。Brassica napus油糧種子のような開放受粉作物で用いられる方法の使用を図５に示し、トウモロコシのような雑種作物で用いられる方法の使用を図６に示す。
【００４３】
花粉の生産の際には、抑制可能致死遺伝子は、上記の遺伝子機構に従ってリプレッサー遺伝子から隔離されている。従って、任意の異系交雑した植物（すなわち、抑制可能致死遺伝子を有する花粉を不注意によって受け取った植物）は生育可能な種子を形成することができないのであり、これは、新たに形成した種子は致死遺伝子の発現を抑制するリプレッサーを含まないからである。致死遺伝子は自家受粉した植物では抑制されるのであり、これは、これらの植物は致死およびリプレッサー遺伝子を両方とも保持しているからである。抑制可能致死遺伝子に結合した条件致死遺伝子をも含んでなる態様については、これらの遺伝子を含む植物は化学的または生理学的ストレスを加えて条件致死遺伝子を活性化することによって除去することができる。
【００４４】
本発明は、交雑による遺伝子導入の危険性が実質的に減少したまたはゼロの組換え植物を生産するための方法および組成物を提供する。幾つかの態様では、廉価で環境に優しい薬品を加えることによって植物を生育部位から安全かつ特異的に除去することができる。
【００４５】
本発明は、交雑受粉または自生植物種子による同一種の他の商業的生産の汚染の可能性を回避しなければならない大規模な農業および産業上の用途の作物植物の生産に極めて適している。本発明は、さらに他の生育地の侵食によって環境破壊を引起すことがありまたは野生の雑草類縁種と交雑することによってその導入遺伝子を広げることがある組換え植物の安全使用および環境保護の機構を提供する。
【００４６】
本発明は、特に同一種の他の商業生産を汚染する危険性なしに異種タンパク質生産者としての作物植物の生産法を提供する。
【００４７】
本発明は、さらに商業的植物品種への異種生殖細胞質の遺伝子移入を制御しかつ導入遺伝子を含んでなる系統の遺伝学的純度を保持する手段を提供する。これらの遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物を新規形質遺伝学に結合してまたは結合することなく用いて、種子生産または一次産品の生産中に遺伝学的純度を確保する手段を提供することができることが注目される。
【００４８】
自家不和合性作物のような幾つかの作物については、本発明は自家不和合性による雑種種子生産を改良する。本発明のこの特定の態様では、自家不和合性の雌性親を、抑制可能致死遺伝子を有するがリプレッサー遺伝子は持たないように改質する。この雌性系は、生育可能な種子を形成することができない。この自家不和合性の雌性親をリプレッサー遺伝子を有する花粉と交雑すると、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子とをいずれも有する生育可能な雑種種子を生産する。昆虫耐性のような新規形質を抑制可能致死遺伝子と結合することによって、関連種での形質の伝播および残存も防止される。
【００４９】
自家不和合性作物で抑制可能致死遺伝子を用いることによって、商業的種子生産でしばしば見られる雌性親での自家不和合性の崩壊の問題が除去される。この崩壊の問題は、雑種種子の自家受粉種子汚染を生じる。抑制可能致死遺伝子を用いることによって、自家受粉種子はリプレッサーを欠いておりかつ自家不和合性であるので雌性親では不可能である。雌性系を保持するための好都合な手段（例えば、所定条件下での誘導可能なリプレッサーの使用）を用いて、雌性親の数を増加することができる。あるいは、この系をクローニングによって増殖させることができる。自家不和合性を解決するための現在用いられている機構としては、高二酸化炭素および他のストレス処理が挙げられる。自家不和合性を解決するのに用いたのと同一条件下で誘導可能なプロモーターを用いることは、雌性親の種子生産を増加するための特に好都合な手段を提供するので、本発明の範囲内にある。この方法は、自家不和合性が一般に適用されるアブラナ属の野菜作物の生産に特に有用である。
【００５０】
下記の用語は、本発明の範囲内で定義され、用いられる。
【００５１】
異種生殖細胞質：個々の作物植物または品種の特有の遺伝学的性質の一部ではない遺伝子、または遺伝子または遺伝形質の組合せ。
【００５２】
遮断または「ブロック」：リプレッサーによる致死遺伝子活性の抑制。遮断としては、リプレッサーの特異的ＤＮＡ配列への結合、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの一次ＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写体への結合、抑制因子の致死遺伝子産物への結合、例えば毒性を有するリボヌクレアーゼまたは毒性を有するプロテアーゼへのＲＮアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の結合によるＲＮＡ転写の防止が挙げられる。致死表現型の発現を防止する任意の方法は、致死表現型を「遮断する」ものと考えることができる。
【００５３】
条件致死遺伝子：植物細胞を薬品感受性にする表現型を植物細胞に付与する遺伝学であり、上記薬品は遺伝学的または化学的性質のものでよく、上記感受性は究極的には植物細胞を死滅させる。
【００５４】
構成的プロモーター：実質的に総ての植物細胞、組織および器官で遺伝子発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００５５】
脱抑制致死遺伝子：機能的リプレッサーが存在しないため致死表現型を発現する致死遺伝子。
【００５６】
遺伝子：転写終結シグナルをも含んでなるプロモーターの制御下で被転写領域を含んでなるＤＮＡ発現カセット。
【００５７】
誘導性プロモーター：化学、物理または環境インデューサーに応答して遺伝子発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００５８】
遺伝子移入：種子を形成するための花粉ドナーであることを意図しない植物からの通常は花粉による有性交雑による遺伝子または複数の遺伝子の望ましくない移動。
【００５９】
致死遺伝子：植物細胞で発現するとき、究極的には植物細胞を死滅させる遺伝子。
【００６０】
致死遺伝子活性：植物細胞を死滅させる遺伝子活性。致死遺伝子活性は単一遺伝子によるものであることができ、または２個以上の遺伝子の組合せ発現の結果であることもできる。
【００６１】
癌遺伝子：Agrobacterium sp.による影響を受けやすい植物の感染の結果として腫瘍形成または異常植物生長に関与する酵素をコードする遺伝子。既知の癌遺伝子としては、TiプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域のtmrおよびtms座を含んでなるものが挙げられる。
【００６２】
異系交雑：ある遺伝子型の植物からの花粉の異なる遺伝子型の性的和合性植物への移動。異系交雑は、通例は花粉の意図しない移動を記載するのに用いられるが、幾つか植物種、特に自家不和合性の植物種では、異系交雑は不和合性植物の個体群内の正常な受粉の結果を表すのにも用いられる。
【００６３】
プロモーター：植物細胞で遺伝子発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００６４】
リプレッサー：遺伝子産物の活性または遺伝子の発現を特異的に遮断することができる遺伝子産物。リプレッサーはタンパク質、ＲＮＡ、またはリプレッサー遺伝子産物の活性によって生産される特異的物質であることができる。
【００６５】
リプレッサー結合部位：リプレッサーによって特異的に認識されるＤＮＡ配列であり、上記認識により、上記リプレッサー結合部位を含む遺伝子の発現が阻害される。幾つかの態様では、リプレッサー結合部位はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡによって認識されるＲＮＡ配列を表すこともできる。
【００６６】
リプレッサー遺伝子：機能的リプレッサーを発現することができるＤＮＡ発現カセット。
【００６７】
抑制された致死遺伝子：遺伝子活性の結果である致死表現型がリプレッサーの存在によって遮断される致死遺伝子。
【００６８】
抑制可能致死遺伝子：致死遺伝子であって、その発現を特異的リプレッサー分子の作用によって阻害することができるもの。
【００６９】
リプレッサーに対して応答性：致死遺伝子または致死遺伝子産物であって、その致死活性が致死遺伝子活性のリプレッサーの存在に応答して阻害されるもの。
【００７０】
自家受粉：種子または生殖構造を形成する自家受粉。
【００７１】
組織特異的プロモーター：特定の植物細胞、器官または組織でのみ実質的な遺伝子発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００７２】
被転写領域：プロモーターの制御下で転写されるＤＮＡ配列。上記ＤＮＡ配列は、タンパク質に翻訳することができるＲＮＡをコードすることができ、または遺伝学の発現を特異的に阻害しまたは防止することができるＲＮＡをコードすることができる。
【００７３】
転写終結配列：転写の終結を定義するＤＮＡ配列。
【００７４】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、トランスジェニック植物を生産する新規手段についての方法および組成物であって、上記植物由来の花粉を介して他の栽培品種または関連種への組換え遺伝子の導入および残存率が実質的に減少していることを特徴とするものが提供される。また、この方法は、生殖細胞質の異系交雑を制限し、さらに性的和合性植物種においても異種生殖細胞質の遺伝子移入を制限するＤＮＡ構築物を有する自家受粉植物系を生産することができる。
【００７５】
従って、この方法は、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子とを含んでなる組換え分子を含む生殖細胞質の遺伝子単離および同一性保存を提供する。この方法は、さらに化学薬品の適用または植物を生理学的ストレスに暴露することによる任意の生長部位から組換え植物を除去する手段を可能にする。
【００７６】
第一の態様では、本発明は、
I.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、細胞にとって有害または破壊的であって、細胞を死滅させおよび究極的には全植物体を死滅させる生成物をコードするＤＮＡ配列（致死遺伝子）を含んでなる第一のＤＮＡ発現カセットを調製する。致死遺伝子の発現を、適当なプロモーター、好ましくは種子特異的プロモーターによって調節する。上記致死遺伝子構築物は、さらにリプレッサーに応答性のＤＮＡ要素を含んでなり、致死遺伝子活性の発現は上記リプレッサー分子の存在下では遮断される。目的とする形質（新規形質）をコードする遺伝子を致死遺伝子に結合することができる；
II.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、第一のＤＮＡ発現カセットに含まれる致死遺伝子活性の発現を遮断することができるリプレッサー分子をコードするリプレッサー遺伝子を含んでなる第二のＤＮＡ発現カセットを調製する。リプレッサー遺伝子の発現を、植物細胞で活性なプロモーター、好ましくは総ての植物細胞で発現するプロモーター、さらに好ましくは致死遺伝子の発現を阻害するのに十分なレベルおよび時間で発現するプロモーターによって調節する；および
III.)(I)および(II)で記載した組換えＤＮＡを形質転換することができる植物細胞に挿入し、この細胞を完全な植物体に再生し、減数分裂の際に(I)および(II)のＤＮＡが独立して調和している植物ゲノムの位置に(I)および(II)のＤＮＡを含む植物を回収する；
ことを含んでなる方法を提供する。
【００７７】
「新規形質」をコードする遺伝子は、目的とする任意の組換えタンパク質またはペプチドであることができる。典型的には、この「新規形質」は商業的関心のある異種タンパク質、または除草剤耐性のような作物学的に有用な形質を付与しているタンパク質である。リプレッサーを欠いている自生または栽培された性的和合性植物との交雑による新規形質の導入は、致死表現型が種子に現れるため限定されており、新規形質遺伝子を受け取った種子は発育不全となる。致死遺伝子活性は単一のコード生成物または協同的に作用する２個以上の独立した遺伝子産物を含んでなり、致死表現型を発現することができることも考えられる。
【００７８】
減数分裂の際に抑制致死ＤＮＡおよびリプレッサー構築物の通常は「隔離(segregation)」と呼ばれる独立した分類を最大にするため、組換えＤＮＡ分子を異なる染色体上に配置する。形質転換の標準的方法では、組換えＤＮＡは植物ゲノム中にランダムに挿入されることが知られており、従って、大部分の植物では、組換えＤＮＡは異なる染色体に配置されることが予想される。遺伝子の独立した分類および挿入ＤＮＡの配置は、簡単な周知の方法によって決定される。
【００７９】
異なる染色体に配置された抑制致死およびリプレッサー構築物を有する植物の種子増加は、植物が２種類の組換えＤＮＡ構築物についてホモ接合性であるとすれば、分離して単純な自家受粉によって行うことができる。このようなホモ接合性植物は、一次形質転換体の自家受粉によって、または形質転換手続きを二倍体組織で行う場合には葯または小胞体培養によって得ることができる。あるいは、このような植物は、小胞体または他の半数体細胞の形質転換に続いて染色体倍加によって直接得ることができる。抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーのいずれにとってもホモ接合性の植物系は抑制可能致死遺伝子またはリプレッサーを含んでなる同系の形質転換植物系を交雑することによって得ることができることは当業者には明らかである。あるいは、葯培養および有性交雑のような単純な組織培養法の組合せを用いて、両方の挿入されたＤＮＡにホモ接合性である植物を回収することもできる。
【００８０】
上記のホモ接合性植物は、開放受粉作物として商業的規模で生育させることができる。このような植物の非組換えの性的和合性植物への異系交雑では、組換え形質についてヘテロ接合性の植物の第一世代が得られる。異系交雑植物の次世代では、減数分裂の際に遺伝子が独立して隔離され、新規形質を発現する植物の発生率が急激に減少する。さらに、この方法の変法であって、抑制致死−新規形質構築体がさらに条件致死遺伝子も含んでなるものも考えられる。このような遺伝子構築物を含んでなる植物は、必要な場合には、致死表現型を活性化することによって、例えば薬剤噴霧によって除去することができる。
【００８１】
上記のホモ接合性植物は、雑種種子を形成することができる受粉制御系をも含んでなるときには、雑種作物として商業的規模で生育させることができる。このような受粉制御系は、細胞質雄性不稔性、自家不和合性および遺伝子雄性不稔性のような既知の種類の雄性不稔系のいずれかであることができる。さらに、雄性不稔性は、幾つかの種では機械的手段によって達成することができ、または花粉を特異的に殺す薬剤（花粉発育破壊剤）の投与によって得ることもできる。適当な系の選択は、個々の作物種によって変化する。このような方法は、植物栽培に熟練した者には周知である。抑制致死およびリプレッサー組換え遺伝子構築物についてホモ接合性の植物を雑種交雑における雄性または雌性親として使用すると、組換えＤＮＡ構築物についてヘテロ接合性の雑種種子が得られる。Ｆ２および次世代におけるこれらの構築物を隔離すると、導入した新規な組換え形質を含んでなる植物は急激に減少する。
【００８２】
組換えＤＮＡのランダム挿入では、幾つかの場合に、相同染色体対の対向染色体上で上記組換えＤＮＡが組込まれる。このような事象の発生頻度は、所定の植物の遺伝子構成を含んでなる染色体対の数によって変化し、染色体対の数が少ない植物で最大頻度で起こる。組換えＤＮＡ構築物の様々な数の相同染色体対への導入は、減数分裂の際に抑制致死−新規およびリプレッサー構築物の隔離が直ちにかつ完全に起こり、交差による組換えが起こらなかった場合にはこれらの構築物を含む植物が異系交雑の結果として形成されないという利点を有する。本発明のこの特別な変法は、目的とする形質（例えば、ホルモンまたは他の医薬活性分子の生産）を厳密に制御する必要がある場合には組換え作物の開発に特に適している。
【００８３】
組換えＤＮＡ構築物を様々な数のホモ接合性染色体対に挿入した植物の種子増加は、抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーに関して植物細胞が本質的にヘテロ接合性であり、致死表現型が確実に抑制されるようにすることが必要である。これは、抑制可能致死遺伝子を特異的薬剤に対する耐性を付与した選択可能なマーカー遺伝子に結合することによって容易に達成することができる。特異的組換え形質を有する植物の維持および選択に除草剤耐性遺伝子を使用することは、文献に詳しく報告されており、本発明で用いることができる。野外レベルの耐性を付与した任意の遺伝子を用いることができる。ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するホスホトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子のような選択された遺伝子を、形質転換の際に選択に用いることも可能である。上記の遺伝子構築物を含んでなる植物を自家受粉し、種子を野外条件下で生育し、除草剤を噴霧する。抑制−致死的新規形質についてホモ接合性の植物（２５％）は、リプレッサーの非存在下で致死遺伝子の作用によって枯れる。リプレッサー遺伝子についてホモ接合性の植物（２５％）は、除草剤の作用によって枯れる。対照的に、抑制致死−新規遺伝子とリプレッサー遺伝子を両方とも含む植物（５０％）は、影響を受けない。新規形質遺伝子を抑制可能致死遺伝子に結合することによって、新規形質遺伝子は任意の意図しない性的和合性種への花粉の不注意による導入によって生育可能な種子を形成することができなくなる。従って、意図しない植物個体群における新規形質の残存率は完全に限定される。
【００８４】
幾つかの応用については、２種類の抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子構築物を用いる場合には、新規形質の広がりの制御が最適である。
【００８５】
本発明のこの態様によれば、２種類の抑制可能致死遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物の新規な生産手段についての方法および組成物が提供される。トランスジェニック植物の異系交雑によって生じる組換えＤＮＡを含んでなる総ての植物は、環境から速やかに除去される。第一の抑制可能致死遺伝子構築物は致死遺伝子であり、第二の抑制可能致死遺伝子および場合によっては目的とする新規形質をコードする遺伝子の発現を遮断するリプレッサー遺伝子を含んでなる。第二の抑制可能致死遺伝子構築物は、第二の致死遺伝子および第一の抑制可能致死遺伝子の発現を遮断するリプレッサー遺伝子を含んでなる。これらの遺伝子構築物を含む細胞は、２種類のリプレッサー分子を生産し、従って、いずれの致死遺伝子も抑制状態のままである。減数分裂の際に遺伝子構築物を隔離すると、リプレッサーおよび致死遺伝子が分離され、本来２種類の抑制可能致死遺伝子を含む植物由来の任意の組換えＤＮＡを含む総ての植物を最終的に死滅させる。
【００８６】
従って、本発明のもう一つの態様では、トランスジェニック植物の新規な生産手段の方法であって、
I.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、第一の致死遺伝子を含んでなる第一のＤＮＡ発現カセットを調製する。第一の致死遺伝子の発現を、適当なプロモーター、好ましくは種子特異的プロモーターによって調節する。この第一の致死遺伝子発現カセットは、第一のリプレッサー応答性部位を含み、第一のリプレッサー分子によって致死遺伝子の発現を阻害することができる。場合によっては、第一のＤＮＡ発現カセットに、優性条件致死遺伝子、および第一のリプレッサー分子とは機能的に異なり第二の致死遺伝子の発現を阻害することができる第二のリプレッサーをコードする第二のリプレッサー遺伝子を含んでなる第四のＤＮＡ発現カセットを含んでなる第三のＤＮＡ発現カセットが結合している。新規形質をコードする遺伝子も包含されることがある；
II.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、第一のＤＮＡ発現カセットに含まれる致死遺伝子の発現を阻害することができる第一のリプレッサー分子をコードする第一のリプレッサー遺伝子を含んでなる第二のＤＮＡ発現カセットを調製する。第二のＤＮＡ発現カセットには、第二の抑制可能致死遺伝子を含んでなり、その発現が第四のＤＮＡカセットに含まれている第二のリプレッサー分子によって抑制される第四のＤＮＡ発現カセットが結合している；
および
III.)(I)および(II)で記載した組換えＤＮＡを形質転換することができる植物細胞に挿入し、この細胞を完全な植物体に再生し、減数分裂および異系交雑の際に(I)および(II)のＤＮＡが隔離されている植物ゲノムの位置に(I)および(II)のＤＮＡを含む植物を回収する；
ことを含んでなる方法が提供される。
【００８７】
第一、第三または第四のＤＮＡカセットは、商業的または作物学的に興味深い組換えタンパク質またはペプチドなどこれらに限定されない新規形質をコードする遺伝子に結合することができる。生成するトランスジェニック植物は、自生または栽培された優性の和合性植物で持続する能力が実質的に減少した形質を有する。これは、後者の植物がリプレッサーを欠いているからである。従って、結合によって生じるあらゆる種子は致死遺伝子を発現し、発育不全となる。従って、意図しない遺伝子型（すなわち、完全な組換えＤＮＡ相補物を含まない）における(I)または(II)の組換えＤＮＡの持続は阻害される。第一の(I)組換えＤＮＡを含む植物は、条件致死マーカー遺伝子を用いることによって識別することもできる。
【００８８】
致死遺伝子活性は、単一のコードされた産物または２種類の独立した遺伝子産物であって、協同的に作用して致死表現型を発現するものを含んでなることができる。さらに、条件致死遺伝子は、上記抑制可能致死遺伝子と共同して致死表現型を発現しまたは直接作用して致死表現型を発現させることができる外部から加えられた物質に応答して作用することができる生成物を含んでなることがある。
【００８９】
上記の態様は、減数分裂の際に隔離される遺伝子座に２種類の組換えＤＮＡを配置するための形質転換工程中のＤＮＡのランダム挿入に依存している。これは、単一交雑および子孫の分析の結果として、または植物育種家によって実施される任意の手法を用いる挿入されたＤＮＡのマッピングによって達成される。このようにして、所望な遺伝子の組合せが得られる。
【００９０】
しかしながら、総ての必要とされるＤＮＡ発現カセットを単一分子内に同時に導入した後、トランスポザーゼを用いて所望な（複数の）カセットを置き換えることは、本発明の範囲内にある。特異的転位は、トランスポザーゼのような組換え酵素によって認識されるＤＮＡ配列の適当な組合せおよび配置を提供することによって生じることができる。
【００９１】
既知のトランスポゾンおよび関連トランスポザーゼ活性としては、トウモロコシ由来のAc/DsおよびEn/Spm要素（例えば、Federoff, N., トウモロコシ転位要素(Maize Transposable Elements): Berg, D.E.およびHowe, M.M.（監修）移動性ＤＮＡ(Mobile DNA), pp. 375-411, 米国微生物学会, ワシントン, コロンビア特別区, １９８９年を参照）、キンギョソウ属由来のTam-1およびTam-3（例えば、Sommer et al., Antirrhinum majusの転位要素(Transposable Elements of Antirrhinum majus): 植物転位要素(Plant Transposable Elements), O. Nelson監修, Plenum Press, ニューヨーク, pp. 227-235, １９８８年を参照）、タバコ由来のTnt-1(Pouteau, S. et al., Mol. Gen. Genet., 228: 233-239, 1991)、ペチュニア由来のTph-1(Gerats, A.G.M. et al., The Plant Cell, 2: 1121-1128, 1991)、およびジャガイモ由来のTst-1(Koster-Topfer, et al., Plant Mol. Biol., 14: 239-247, 1990)が挙げられる。
【００９２】
幾つかのトランスポゾンは、本発明で特に用いられる転位特性を有することがある。例えば、Ds要素は、同一染色体上の比較的短い距離にわたって転位する傾向がある(Dooner and Belachew, Genetics, 122: 447-457, 1989; Dooner et al., The Plant Cell, 3: 473-482, 1991; Jones et al., The Plant Cell, 2: 701-707, 1990; Osborne et al., Genetics, 129: 833-844, 1991, Rommens et al., Plant Molecular Biology, 20: 61-70, 1992)。このような転位パターンは、転位したリプレッサーを抑制可能致死遺伝子を有する染色体対の対向染色体上の部位に転位する場合の遺伝子組合せの回収を促進する。
【００９３】
従って、特異的トランスポザーゼ酵素用いてリプレッサー遺伝子を抑制可能致死遺伝子から独立して隔離されている遺伝子座に移動させることは、下記のようにして提供される。
【００９４】
ＤＮＡ構築物を、第一の抑制可能致死遺伝子の他にこの第一の抑制可能致死遺伝子に結合したリプレッサー遺伝子を含むように改質する。リプレッサー遺伝子を、さらにトランスポザーゼ酵素によって認識される特異的ＤＮＡ配列を３′および５′末端に有することによって改質する。認識配列を、リプレッサー遺伝子がトランスポザーゼによって切り取ることができるようなやり方で配置する。トランスポザーゼは、さらに切り取ったリプレッサー遺伝子をゲノムのランダム位置に再挿入してリプレッサー遺伝子が第一の抑制可能致死遺伝子から独立して隔離されるようにすることを触媒する。
【００９５】
トランスポザーゼ酵素を植物細胞に一時的に導入し、または誘導性プロモーターによって制御して、転位が誘導されるようにすることができる。あるいは、トランスポザーゼを、活性トランスポザーゼを発現するように改質された同系またはほぼ同系の植物系との単純な優性交雑によって導入することができる。
【００９６】
あるいは、２種類の抑制された致死遺伝子および２種類の独立リプレッサーを用いる態様については、下記の方法が提供される。
【００９７】
ＤＮＡ構築物を、第二のリプレッサーに結合した第一の抑制可能致死遺伝子の他に第一のリプレッサーに結合した第二の抑制可能致死遺伝子を含むように改質する。第二の抑制可能致死遺伝子および第一のリプレッサーを互いに結合させ、トランスポザーゼ酵素によって認識される特異的ＤＮＡ配列によって３′および５′末端で結合する。認識配列を、結合した第二の抑制可能致死遺伝子−第一のリプレッサー遺伝子配列をトランスポザーゼ酵素によって切り取ることができるようなやり方で配置する。トランスポザーゼは、さらに切り取った遺伝子配列をゲノム中のランダム位置に再挿入して、結合した第二の抑制可能致死遺伝子−第一のリプレッサー遺伝子配列が結合した第一の抑制可能致死遺伝子−第二のリプレッサー遺伝子配列から独立して隔離されるようにすることを触媒する。
【００９８】
トランスポザーゼ活性は、導入したＤＮＡの一過性発現、トランスポザーゼ酵素の直接的注入、またはさらに好ましくは活性トランスポザーゼを発現するように改質された同系またはほぼ同系の植物系との単純な優性交雑などの任意の手段によって導入することができる。
【００９９】
単純な交雑および選択によって、両方の抑制可能致死遺伝子を含むがトランスポザーゼ酵素を含まない植物系を選択することができる。トランスポザーゼ酵素を容易に同定できるマーカー遺伝子へ結合することによって、所望な遺伝子の組合せの選択を促進することができる。所望な組合せは、染色体対の対向娘染色体上に抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を含んでなる。
【０１００】
部位特異的組換え配列を用いてリプレッサーおよび抑制可能致死遺伝子の部位特異的挿入を行うことは、本発明の範囲内にある。多くの部位特異的リコンビナーゼが、文献に記載されている(Kilby et al., Trends in Genetics, 9(12): 413-418, 1993)。３種類のリコンビナーゼ系であるZygosaccharomyces rouxiiのpSR1プラスミドによってコードされたRとして同定された活性、Saccharomyces cerevisiae由来の２μmの円形プラスミドによってコードされたFLPリコンビナーゼ、およびファージP1由来のCre-loxが広汎に用いられている。これらのリコンビナーゼ系の総ては、異種宿主で機能することが示されている。例えば、Rはタバコ細胞で働くことが示されている(Onouchi et al., Nucl. Acids Res., 19(23): 6373-6378, 1991)。FLPは、タバコおよびシロイヌナズナで機能を有することが示されており(Kilby et al., The Plant Jour., 8(5): 637-652, 1995)、Cre-loxはタバコで機能することが示されている(Russell et al., Mol. Gen. Genet., 234: 49-59, 1992; Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990; Dale and Ow, Gene, 91: 79-85, 1990; Dale and Ow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10558-10562, 1991; Haaren and Ow, Plant Molecular Biology, 23: 525-533, 1993)。導入したＤＮＡを、部位特異的リコンビナーゼの組込み機能を用いて特異的に定義された遺伝子座に標的設定することは、本発明の範囲内にある。
【０１０１】
高等細胞で相同組換えを指定する目的で部位特異的リコンビナーゼを用いることは、詳細に報告されている。例えば、Fukishige and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7905-7909, 1992)は、Cre-lox相同組換え系を用いて、ＤＮＡを哺乳類細胞中の予め定義した遺伝子座に導入することに成功したことを示した。この実例では、コード配列の５′末端のlox配列を含むように改質したプロモーターを欠いた抗生物質耐性遺伝子を、チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入した。細胞を、lox配列を有するプロモーターおよび一過性発現を行ったCreリコンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いて電気穿孔によって再形質転換した。用いた条件下では、Cre酵素の発現により、染色体上に配置されたプロモーターを欠いた抗生物質耐性遺伝子のlox部位と機能的抗生物質耐性遺伝子を形成する導入されたプロモーター配列のlox部位との間の相同組換えが触媒された。著者らは、導入した配列の効率的かつ正確なターゲッティングを示し、分析を行った５６系列の５４はlox配列間のCre触媒部位特異的相同組換えのため、ＤＮＡの予想された単一コピー挿入に相当した。
【０１０２】
Cre-lox系を用いることによるＤＮＡの特異的切り取り、欠失、または挿入は、植物で例示されている(Dale and Ow, Gene, 91: 79-85, 1995)。正確な事象は、loxＤＮＡ配列の配置によって制御される。シスでは、lox配列はCreリコンビナーゼを指定して上記配列がフランクしたＤＮＡを欠失（同方向のlox配列）または反転（逆方向のlox配列）させ、トランスでは、lox配列が相同組換え事象を指定し、組換えＤＮＡを挿入することができる。従って、本発明では、lox配列は最初に植物細胞のゲノムに導入して、完全な植物体に再生することができる。lox配列は「アンカー」またはリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列として働き、次いで抑制された致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子またはそれらの組合せを含んでなる組換えＤＮＡ構築物を導入することができる。上記のlox配列は最適に改質し、不活性であるがある配列をlox部位に挿入することによって活性化することができる選択マーカーをも含んでなるようにすることができる。植物細胞に、プロモーターを欠きlox配列に結合したマーカー遺伝子を挿入することは本発明の範囲内にある。次いで、標的lox部位に挿入されるＤＮＡを改質して、lox部位を含むプロモーターを含み、ＤＮＡの挿入によってプロモーターがプロモーターを欠くマーカー遺伝子に結合し、これによってマーカー遺伝子が活性化されるようにする。Creリコンビナーゼ遺伝子をＤＮＡインサートと同時に植物に導入して、相同組換えによる組換えＤＮＡの標的lox部位への挿入によりCre遺伝子の発現を終わらせるようにすることができる。
【０１０３】
本発明によれば、植物への組換えＤＮＡの部位特異的挿入は、
形質転換可能な植物のゲノムに部位特異的リコンビナーゼによって認識されるＤＮＡ配列（すなわち、リコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列）を含んでなるＤＮＡ構築物を挿入し、上記配列を含む植物を回収することを含んでなる。次に、形質転換植物を自家受粉および選択によって、または葯または小胞体培養によって上記のようなリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列についてホモ接合性にする。
【０１０４】
次いで、ホモ接合性植物を、下記のもので独立して形質転換する。
I.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、(1)部位特異的リコンビナーゼによって認識し、使用し、特異的ＤＮＡ配列で上記ＤＮＡを挿入することができる配列、および(2)抑制可能致死遺伝子を含んでなる第一のＤＮＡ発現カセット。抑制可能致死遺伝子の発現は、適当なプロモーター、好ましくは種子特異的プロモーターによって調節される。新規タンパク質または形質をコードする遺伝子を、上記の第一の発現カセットの一部として包含させることができる；そして  II.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、(1)部位特異的リコンビナーゼによって認識し、使用し、特異的ＤＮＡ配列で上記ＤＮＡを挿入することができる配列、および(2)第一のＤＮＡ発現カセットに含まれる致死遺伝子活性の発現を遮断することができるリプレッサー分子をコードするリプレッサー遺伝子を含んでなる第二のＤＮＡ発現カセット。リプレッサー遺伝子の発現は、植物細胞で機能し得るプロモーター、好ましくは総ての植物細胞で機能するプロモーター、さらに好ましくは致死遺伝子の発現を阻害するのに十分なレベルおよび時間で機能するプロモーターによって調節される。
【０１０５】
形質転換の後、上記の(I)または(II)で定義した配列をゲノムに組込んだ植物を回収する。リコンビナーゼ機能を、トランスでまたは予め存在するリコンビナーゼ遺伝子を活性化することによって植物に導入し、上記(I)または(II)に記載のＤＮＡを切り取り、リコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列にそれらを再挿入する。再挿入したリコンビナーゼＤＮＡを含む植物を回収する。これらの植物は、同一の遺伝子座に抑制可能致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子を含むこととなる。
【０１０６】
有性交雑を、抑制可能致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子を含む植物の間で行う。これらの有性交雑から、相同染色体対の対向染色体上の同一の遺伝子座にある抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を両方とも含む植物を選択する。
【０１０７】
本発明の幾つかの態様については、リコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列をも含んでなるリコンビナーゼ酵素をコードするＤＮＡで植物細胞を最初に形質転換するのが好ましいことがある。リコンビナーゼ遺伝子は、構成的または組織特異的プロモーター、または発現を良好に調節することができるプロモーターで制御し、遺伝子の発現およびそれに続く抑制された致死およびリプレッサー遺伝子の部位特異的組込みを特定の時間に誘導することができるようにすることができる。
【０１０８】
本発明のもう一つの態様では、上記の第一および第二のＤＮＡ発現カセットの他に、優性条件致死遺伝子を含んでなり、条件致死遺伝子を含む植物を化学薬剤に暴露することによって殺すことができる第三のＤＮＡ発現カセットを含む組換え植物を生産する新規手段の方法および組成物が提供される。好ましくは、条件致死遺伝子は、第一のＤＮＡ発現カセットに結合している。
【０１０９】
上記の結合した第一および第三のＤＮＡカセットを含んでなるＤＮＡ構築物は、さらに新規なタンパク質または形質をコードする標的遺伝子を含んでなることができる。このような新規形質は、自生のまたは栽培された優性和合性植物と交雑することによって形質を導入した遺伝子型の外側には導入することはできない。これらの植物はリプレッサーを欠いているので、結合(union)によって生じる種子は生育不能である。新規形質を含む植物は、条件致死マーカー遺伝子を用いて識別することもできる。従って、偶然によってリプレッサー遺伝子を受け取った可能性のある植物個体群でも、条件致死遺伝子を用いてリプレッサーと抑制された致死遺伝子を両方とも含んでなる可能性がある植物を除去することができる。
【０１１０】
条件致死遺伝子は、上記の抑制された致死遺伝子と共同作用して致死表現型を発現し、または機能を発揮させることができる外部から加えた物質に応じて作用して致死表現型を発現させることができる生成物を含んでなることができることも注目される。
【０１１１】
上記の態様では、隔離は、新規形質または生殖細胞質が意図しない個体群に残存しまたは広がるのを制限する目的で用いられる。
【０１１２】
本発明の最も基本的な形態では、目的とする形質に結合した抑制可能致死遺伝子をリプレッサー遺伝子から隔離することによって、交雑受粉による意図しない個体群で目的とする形質を含んでなる生育可能な種子の形成が遮断される。典型的な農業条件下では、目的とする形質が種子特異的プロモーターの制御下で抑制可能致死遺伝子に結合している場合には、目的としない植物または植物個体群中の形質の残存は自家受粉を行うことができる植物では世代当たり７５％だけ速やかに低下する。この予言モデルでは、抑制可能致死遺伝子とリプレッサーとを含んでなる植物によって交雑受粉した目的としない植物個体群のＦ５世代までには、目的としない個体群の抑制可能致死遺伝子に結合した目的とする形質の残存率はゼロに近づく。２種類の単純な遺伝子モデルである、主として自家受粉性である植物、例えばBrassica napus、および主として自家不和合性である植物、例えばBrassica rapaについてのモデルを示す。
【０１１３】
自家受粉植物での系についての単純な遺伝子モデル
SL＝目的とする遺伝子に結合した種子特異的プロモーターによって制御されている抑制可能致死遺伝子。
R＝リプレッサー。
ホモ接合性抑制可能種子致死、
リプレッサー植物の遺伝子型：    SL/SL,    R/R
未形質転換の野生型植物と交雑：   -/-,     -/-
半接合体系を含んでなる
半接合性野生型植物個体群を生成。SL/-,     R/-
この野生型植物個体群が自家受粉植物個体群である場合には、下記の子孫を生じる：
自家受粉半接合性植物の理論的子孫分析
【０１１４】
【表１】
0004642239.tif 000002
個体群でのSL形質に結合した遺伝子の残存率        植物：有り   なし
11/16はSL/SL, R/Rホモ接合性                        .0625    .0000
6, 7, 10 3/16は種子致死形質のみを有し、生殖
行き止まりである                                   .0000    .1875
4, 13 2/16はホモ接合性リプレッサー、ヘテロ接合性
SLを有し、種子の半数だけがSL遺伝子を有する         .0625    .0625
2, 5 2/16はホモ接合性SL、半接合性Rを有し、
種子の半数のみが残存する                           .0625    .0625
11, 12, 15, 16 4/16はSL遺伝子を持たない            .0000    .2500
2/16はSLについて半接合性であり、Rについて
ホモ接合性であり、これはSL遺伝子の半数が失われる
ことを表している                                   .0625 .0625
総計                                               .2500    .7500
【０１１５】
従って、SL遺伝子に結合した形質の損失は、自家受粉個体群では世代当たり７５％である。これは、種子におけるSLの発現を有する形質の損失に基づいている。
【０１１６】
しかしながら、半接合性植物が大部分が異系交雑（または自家不和合性）植物であるときには、SL形質に結合した遺伝子の残存率はかなり低くなる。これを下記に示す。
【０１１７】
異系交雑植物での系についての単純な遺伝子モデル
ホモ接合性抑制種子致死、リプレッサー植物の遺伝子型：  SL/SL,   R/R
未形質転換の野生型植物と交雑：                         -/-,    -/-
半接合体系を含んでなる半接合性野生型植物個体群を生成。SL/-,    R/-
自家受粉半接合性植物の理論的子孫分析
【０１１８】
【表２】
0004642239.tif 000003
個体群でのSL形質に結合した遺伝子の残存率         植物：有り    なし
1, 5, 9, 13 4/16はSL/-, R/-半接合性であり、個体群の
７５％だけがSLとRの組合せを有することが
期待される（4/16 x .75)                            .0625    .1875
2, 6, 10, 14 4/16は種子致死形質のみを有し、生殖
行き止まりである                                   .0000    .2500
3, 7, 11, 15 4/16はSL遺伝子を持たない              .0000    .2500
4/16はRについて半接合性であり、SL遺伝子を持たない  .0000 .2500
総計                                               .0625    .9375
【０１１９】
従って、主として異系交雑である植物個体群は、世代当たり９３．７３％の割合でSL形質に結合した遺伝子を速やかに喪失する。
【０１２０】
これらのモデルから、SL形質は、未管理個体群（すなわち、抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーの組合せが維持されていない個体群）における抑制可能致死遺伝子に結合した目的とする形質をコードする遺伝子の維持には選択上の不利益が生じる。未管理個体群としては、性的和合性の野生種並びに性的和合性の栽培種を挙げることができることに留意すべきである。
【０１２１】
一態様では、抑制可能致死遺伝子は種子特異的プロモーターによって発現される。これは、独立して形質転換した抑制致死およびリプレッサー系の有性交雑を考慮している。抑制致死系を雌性親として用いることによって、リプレッサー遺伝子の導入から誘導される種子のみが形成され、種子致死形質が完全に抑制されることが確かめられる。抑制が不完全であり、従って商業的価値が限定されている種子では、種子の発育停止が起こる。従って、この態様の方法により、通常の交雑により最も有用な遺伝子組成物を選択するための好都合な手段が得られる。
【０１２２】
種子特異的プロモーターも、致死形質の調節について構成的プロモーターと比較して幾らかの利点を有する。第一に、種子致死形質を含む植物は、下記のようにしてリプレッサー遺伝子を導入した後に容易にホモ接合系に転換することができる。リプレッサーおよび抑制種子致死遺伝子の有性導入（または同時導入）によって形成された種子から生育した植物に、葯または単離した小胞体培養を施して、ホモ接合性植物系を直接回収することができる。あるいは、交雑およびホモ接合系の選択などの通常の方法を用いて、適当な植物系を回収することができる。
【０１２３】
幾つかの場合には、商業目的の最終生成物または植物系は、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子との半接合性の組合せであることができる。本発明の一態様によれば、自家不和合性を用いて自家不和合性作物における雑種種子の生産を改良する方法が提供される。現在用いられている雑種種子生産の方法では、２種類の自家不和合系であって、一方が「雌性」親として作用し、他方が「雄性」親として機能するものを用いることが多い。理想的条件下では、雌性親で形成した種子は、自家不和合性であるが雌性親と和合性である雄性親による受粉の結果として形成される雑種種子である。しかしながら、このような系は、雌性親での自家受粉を生じる自家不和合性の不注意による崩壊により汚染されやすい。従って、雌性親で種子特異的プロモーターの制御下で抑制可能致死遺伝子を使用すると、種子致死形質が自家受粉した種子で発現するので、自家受粉種子の形成が遮断される。雄性親系の花粉によりリプレッサー遺伝子を提供することにより、抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を有する生育可能な雑種種子を形成することができる。
【０１２４】
雌性親は、クローン増殖によって増加させることができる。あるいは、ある種の物理的または化学的処理によって自家不和合性を解決することができるので、これらの条件に応答する誘導リプレッサー遺伝子の使用が有利である。これらの条件の幾つかは野外で自然に起きることがあり、本発明の実施には大して重要ではないが、アブラナ種での自家不和合性を解決することが知られている塩ストレスまたは高濃度の二酸化炭素のような幾つかの条件を用いることができる。あるいは、一定条件下でのみ活性であるリプレッサー（例えば、特定の物質の存在下でＤＮＡ配列に結合するリプレッサー）を雌性親の種子を増加するのに用いることができる。多くのこのようなリプレッサーは、当該技術分野で見出すことができる。上記のように、様々な手段を用いて、所望なときに雌性親を増加させることができる。雑種交雑の最終産物は、雌性親由来の抑制可能致死遺伝子と雄性親由来のリプレッサー遺伝子とを有する種子であることが注目される。上記の種子は、さらに上記抑制可能致死遺伝子に結合した新規形質を含んでなることもできる。
【０１２５】
本発明に関して、細胞の致死遺伝子の産物の蓄積を効果的に遮断する任意の機構は抑制を含んでなる。このような機構としては、上記致死遺伝子のプロモーター中で特異的「リプレッサータンパク質または因子」の「オペレーター」のＤＮＡ領域への結合を挙げることができる。当該技術分野における例としては、細菌リプレッサーおよび関連ＤＮＡ結合領域（オペレーターＤＮＡ）、例えばLac Zリプレッサー、tetリプレッサー、LacR、GutR、DeoR、FucRおよびGlpRなどの細菌系で糖の異化作用を調節するリプレッサータンパク質のクラス(van Rooijen, R.J. and de Vos, W.M., J. Biol. Chem., 265: 18499-18503, 1990)、またはアグロシノピンの生合成および接合伝達を調節するaccRとして知られているAgrobacterimリプレッサー(Bodman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 643-647, 1992)が挙げられるが、これらに限定されない。酵母のような真菌または任意の他の生物で見出されるものなどの他のリプレッサーの供給源を用いることができる。本発明によれば、リプレッサーは植物プロモーターの領域にある特異的ＤＮＡ配列に結合することができ、この結合は上記改質プロモーターの制御下でＤＮＡ配列の発現を実質的に阻害することができる。
【０１２６】
植物細胞における異種遺伝子の最適発現にはある種の修飾が必要なことがあることが理解されている。典型的には、これらの修飾としては、通常の植物コドン優先を反映するためのコード配列の変更、植物転写または翻訳機構によって余り認識されない配列の除去、翻訳エンハンサーまたは安定化配列の付加、および上記遺伝子によってコードされるタンパク質が正確に区分されるようにする局在化シグナルをコードするＤＮＡ配列の付加が挙げられる。従って、細菌性の幾つかのリプレッサーについては、これらの修飾が抑制遺伝子の完全な抑制を考慮してリプレッサーを十分なレベルで発現させるのに必要であることがある。
【０１２７】
特異的ＤＮＡ配列に強力に結合するように改質された他のＤＮＡ結合タンパク質、いわゆる「トランスドミネーター(transdominators)」を、リプレッサーとして用いることもできる。他のリプレッサーとしては、致死遺伝子に指定されたアンチセンスＲＮＡ、または致死遺伝子の産物の特異的阻害剤が挙げられる。一例は、植物細胞で発現するときには毒性を有するリボヌクレアーゼバルナーゼの特異的阻害剤である「バルスター(Barstar)」である。
【０１２８】
致死遺伝子のダウンレギュレーションは、致死表現型の共抑制に関与する導入遺伝子の隔離によって致死表現型が回復される限り、共抑制の使用によって幾つかの場合に行うことができると考えられている。従って、本発明に関する抑制は、致死表現型の発現を可逆的に阻害する任意の機構を含んでなる。
【０１２９】
上記抑制可能致死遺伝子をコードするＤＮＡは、さらに上記致死遺伝子の発現を調節するプロモーター領域を含んでなる。好ましい態様は種子特異的プロモーターを含んでなるが、他のプロモーターが考えられる。上記のプロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターであることができ、特異的リプレッサータンパク質を結合して、このリプレッサータンパク質の存在下では上記致死遺伝子の転写が遮断されるようにするオペレーター配列（リプレッサー結合配列）を含んでなることができる。プロモーターの選択は当業者には明らかであろうし、特に本発明を用いようとする植物種で発現することが知られているプロモーターであろう。
【０１３０】
本発明のもう一つの態様によれば、条件致死遺伝子を含む組換え植物を生産して、この遺伝子と組換えＤＮＡ分子を含む植物を化学薬品に暴露することによって枯らすことができるようにする新規な手段の方法および組成物が提供される。化学薬品は、他の植物には効果を持たない。この機構は、花粉によって媒介される異系交雑を介して同一種および関連種の他の栽培品種へ組換えＤＮＡが広がるのを完全に排除する。条件致死遺伝子は当該技術分野で報告されており、毒性のない物質に直接作用してこの物質を毒性のある物質に転換する遺伝子が本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１３１】
条件致死遺伝子は、外部から加えられた物質または人工的または自然に誘導される生理学的ストレスによって抑制解除することができる抑制可能致死遺伝子のみを含んでなることもできる。従って、一つの具体的態様では、条件致死遺伝子はＤＮＡ結合タンパク質の結合によって抑制される致死遺伝子活性を有する。抑制は、結合を破壊する特異的物質によって高めることができる。例えば、細菌性tetリプレッサーであって、オペレーター配列へのその結合がテトラサイクリンによって遮断されるものが挙げられる。この場合には、隔離によって異系交雑または遺伝子移入の際の致死遺伝子活性が抑制解除され、この遺伝子をさらに条件致死遺伝子として用いて、組換えＤＮＡ構築物を含む植物をテトラサイクリンへ暴露することによってこの植物を除去することができる。
【０１３２】
さらに、致死遺伝子活性の抑制解除は、リプレッサー遺伝子の発現を阻害することによって行うこともできると考えられる。例えば、リプレッサー遺伝子の発現を阻害することができるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを用いることができる。このような「アンチ−リプレッサー」遺伝子を誘導性プロモーターによって制御するのが好ましい。本発明の範囲内で用いることができる誘導性プロモーターの一例としては、トウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST II)遺伝子の２７kDサブユニットのプロモーター（ＰＣＴ／ＧＢ９０／００１１０号明細書）のような単純な薬剤、またはPR-1a、PR-1b、PR-1c、PR-1、PR-Q、PR-Sまたはキュウリキチナーゼ遺伝子プロモーターのようなPRプロモーター、または酸性または塩基性タバコβ−１，３−グルカナーゼプロモーターによって誘導可能なものが挙げられる。これらおよび関連プロモーターを誘導することができる多数の薬剤が、欧州特許第８９／１０３８８８．７号明細書に記載されている。
【０１３３】
新規形質をコードする標的遺伝子の花粉に媒介される移動の制限は、減数分裂の後に花粉中でリプレッサー遺伝子から離れて隔離されている抑制可能致死遺伝子への標的遺伝子の結合を伴う。制御または抑制要素をコードする組換えＤＮＡから致死遺伝子を隔離した後に、抑制致死表現型が活性化される。従って、標的遺伝子の目的としない雄性和合性植物への導入が排除される。抑制された致死遺伝子の発現を制御する目的で種子特異的プロモーターを用いると、リプレッサーの非存在下で種子で発現する形質遺伝子および致死遺伝子を有する花粉を用いる交雑受粉から生じる生育不能な種子が得られる。種子特異的プロモーターを用いて抑制可能致死遺伝子の発現を制限することによって、組換え植物上に種子セットを確保する花粉を生産することもできる。
【０１３４】
抑制可能致死遺伝子に結合した形質遺伝子と独立して隔離されているリプレッサー遺伝子とを含む総ての組換えＤＮＡ分子の花粉によって媒介される移動を制限するには、第一のリプレッサー遺伝子の成分として第二の抑制可能致死遺伝子の封入を必要とする。この機構では、減数分裂の際に独立して隔離されている組換え遺伝子がいずれも致死遺伝子を有しているが、それぞれの致死遺伝子は別個のリプレッサーによって抑制される。従って、標的遺伝子に結合した種子特異的致死表現型は独立して隔離されている相当するリプレッサー遺伝子によって抑制され、上記の独立して隔離されているリプレッサー遺伝子に結合している第二の抑制可能致死遺伝子の発現は形質遺伝子に結合している第二のリプレッサー遺伝子によって抑制される。従って、植物は、２種類の抑制可能致死遺伝子を有し、それぞれが機能的に異なるリプレッサーによって制御されている。従って、一方、他方または両方の致死遺伝子は、減数分裂および異系交雑の後に抑制解除される。その結果、異種生殖細胞質の異系交雑または遺伝子移入によって形成された種子細胞は生育不能である。
【０１３５】
形質転換によって導入された商業的に興味深い形質の発現は、致死または条件致死表現型を調節するプロモーターと同一であるかまたは異なっていてもよい構成的、誘導または発生制御プロモーターによって調節することができる。プロモーターの選択は、所定の商業的用途に関して変化する。
【０１３６】
商業的に興味深い形質が植物細胞から単離される異種タンパク質の生産である本発明の具体的態様については、種子の発生において機能する発生上調節されたプロモーターは論理的選択である。多くの様々な種類の細胞、組織および発生上調節されたプロモーターが文献に記載されており、これから商業的に興味深い形質に適するものを選択することができる。さらに、本発明の具体的態様で用いることができる新規プロモーターを発見して特性決定するための方法は、周知である。
【０１３７】
新規形質をコードするＤＮＡは、改質油、トウモロコシ粉、澱粉、または他の種子成分のような検出可能な表現型を生じる遺伝子であることができる。あるいは、除草剤耐性、または昆虫または有害生物耐性のような特定の作物学的形質を付与する遺伝子であることもできる。この遺伝子は、検出可能な表現型を付与しないタンパク質、または薬学上または産業上有用な活性を有するタンパク質をコードすることもできる。新規形質をコードするＤＮＡは、形質によって多数の様々なプロモーターの制御下で発現することができる。多数の方法を用いて新規形質を発現させることができることは、当業者には明らかである。
【０１３８】
商業上興味深い組換え標的タンパク質を植物種子に生産し、これから回収する本発明の好ましい態様については、第一の発現カセットは植物種子の発生において特異的に発現させることができる転写および翻訳調節領域を含んでなる組換えＤＮＡ配列と、さらに具体的には種子胚またはトリグリセリドを保管できる他の種子組織、および油体(oil-body)にターゲッティングするのに十分な油体特異的タンパク質の部分、商業上興味深い標的タンパク質、および植物で機能する転写および翻訳終止領域を含んでなるキメラペプチドまたはタンパク質をコードする第二の組換えＤＮＡ配列を包含する。キメラペプチドまたはタンパク質は、油体特異的部分と商業上興味深い標的タンパク質を結合し、化学的または酵素的手段によって特異的に開裂することができるペプチド配列を含んでなることもできる。
【０１３９】
ＤＮＡ発現カセットは、転写および翻訳調節領域、および標的、リプレッサーおよび致死遺伝子をコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡ配列が多重クローニング部位によって結合され、代替標的、リプレッサーおよび致死ＤＮＡ配列の好都合な置換を考慮するように構築することができる。
【０１４０】
本発明の好ましい態様としては、抑制可能致死遺伝子活性はAgrobacteriumのTiまたはRiプラスミド由来の癌遺伝子１および２である。これら２個の組み合わせた遺伝子の活性により、ＩＡＡの生産および植物細胞死を生じる。
【０１４１】
癌遺伝子１は、植物細胞に普通に見られるアミノ酸であるトリプトファンをインドールアセタミドに転換する酵素インドールアセタミドシンターゼ（ＩＡＭＳ）をコードする。癌遺伝子１の機能、すなわちトリプトファン（総ての植物細胞中に含まれる内生アミノ酸）のインドールアセタミドへの転換は、VanOnckelen et al., FEBS lett., 198, 357-360, 1986に記載されている。
【０１４２】
癌遺伝子２は、インドールアセタミドをインドール酢酸に転換する酵素インドールアセタミドヒドロラーゼ（ＩＡＭＨ）をコードする。遺伝子２の機能、すなわちインドールアセタミドをインドール酢酸に転換する能力は、Tomashow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5071-5075, 1984およびSchroder et al., Eur. J. Biochem., 138, 387-391, 1984によって立証された。具体的には、癌遺伝子２は癌遺伝子１と協奏的に、細菌細胞には見られるが植物細胞には見られない経路によりトリプトファンから植物生長調節因子であるインドール酢酸の合成を準備する。関連癌遺伝子の活性は、A. rhizogenes, A. vitis (Canaday, J. et al., Mol. Gen. Genet., 235: 292-303, 1992)およびPseudomonas savastanoi (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6522-6526, 1985)で見出されている。
【０１４３】
癌遺伝子の好ましい用途は、植物細胞で普通に見られる物質を過剰生産し、かつジフテリア毒素Ａ鎖のような毒素、バルナーゼのようなリボヌクレアーゼ、およびリシンおよび関連毒素のようなリボソーム阻害タンパク質と関連した致死活性とは異なり、遺伝子活性の抑制は絶対的である必要はない天然に見られる活性であるという既知の事実に基づいている。低水準の発現を上回ると、リシンのような強力な細胞毒性薬剤の細胞当たり１分子であっても、細胞死を生じることができることが示唆されている。本発明の範囲内でこのような強力な毒素を用いるために、抑制された致死表現型の抑制が完全である必要があり、機能的分析法によってこの抑制の水準に達成するための様々な方法が用いられることが注目される。
【０１４４】
ＤＮＡ結合タンパク質またはリプレッサー、または毒素活性の特異的阻害剤（例えば、バルナーゼおよびバルスター）の使用のような本完全な抑制は発明の範囲内で容易に達成することができるが、生長調節因子を過剰発現する致死遺伝子活性の使用では、本発明の範囲内で多数の異なる抑制機構を用いる機会が提供される。好ましくは、遺伝子１、または遺伝学１と遺伝子２とに標的設定した致死遺伝子の発現のアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム阻害；好ましくは遺伝子１に対する相同配列をコードする遺伝子を用いる共抑制；または過剰ＩＡＡを代謝または接合することができる酵素の発現が挙げられる。このような酵素活性は、当該技術分野で知られている。
【０１４５】
遺伝子２についての物質であるインドールアセタミドは、通常は植物細胞によって生産されない。インドールアセタミドの転換の他に、遺伝子２は、強力なオーキシン類似体であるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を形成する合成薬剤であるナフタレンアセタミドなど他のインドールアミドを代謝することもできる。遺伝子２産物ＩＡＭＨを発現する植物細胞にＮＡＭ（ナフタレンアセタミド）を適用すると、致死濃度のＮＡＡを生産する。従って、癌遺伝子２は、条件致死遺伝子として機能することができる。しかしながら、本発明の範囲内では、癌遺伝子１および２は、優先的に致死遺伝子活性を含んでなる。
【０１４６】
ＩＡＭＳをＩＡＭＨと組み合わせて両者を使用することは、雑種種子生産法において花粉を選択的に除去する手段として記載されている（米国特許第５，４２６，０４１号明細書）。組換え非天然癌遺伝子２のみを核をコードした雄性不稔性にランダムに結合した条件致死遺伝子として使用することができることは、望ましくない導入遺伝子植物を除去するための同じ組換え癌遺伝子２の使用（米国特許第５，１８０，８７３号明細書）と同様に示唆されている。しかしながら、癌遺伝子１の活性なしで癌遺伝子２のみを用いると、致死遺伝子活性を生じることはできない。さらに、癌遺伝子２を導入遺伝子植物を除去する方法として用いるには、化学薬剤を適用して組み換えＤＮＡを含む細胞を選択的に除去する必要がある。
【０１４７】
対照的に、本発明は、介在の必要なしに異種ＤＮＡを不注意によって受け取った植物を本質的に除去する。この方法は、さらに植物細胞に自然に見られる化合物の過剰発現を用いて、環境の安全性を確保する致死表現型を付与する。従って、本発明は、癌遺伝子１および２を用いて本発明を実施するときに条件致死表現型も提供する。特に、未修飾の天然癌遺伝子２を用いる。
【０１４８】
癌遺伝子１および２の他に、癌遺伝子４の使用も考えられる。Agrobacterium sp.のTiプラスミドの癌遺伝子４は、もう一つの天然の植物生長調節因子であるサイトキニンを合成することができる酵素イソペンチルトランスフォーミング  コードする。サイトキニンの過剰発現により、細胞死を生じることができ、従って本発明の範囲内の致死遺伝子活性である。Agrobacterium sp.が感染した後の植物上のクラウンゴール腫瘍の生長は、癌遺伝子１および２と癌遺伝子４の組合せ活性によるサイトキニンとオーキシンの両方の過剰発現から生じるものと考えられる。
【０１４９】
癌遺伝子１および２と癌遺伝子４の両方の活性を抑制して用いることは、本発明の範囲内にある。これは、両方の致死遺伝子活性を抑制する必要がある。抑制解除により、生長調節因子が過剰発現し、植物細胞の正常な活性が破壊され、従って種子を生産しまたは再生する能力が遮断される。従って、（複数の）癌遺伝子に結合した形質または生殖細胞質は、抑制解除した状態に固執することはできない。
【０１５０】
癌遺伝子１、２および４は、総ての天然遺伝子の一つを修飾する必要なしに抑制することができるとも考えられる。種子特異的抑制可能致死遺伝子を使用しない応用については、癌遺伝子の天然プロモーターを用いて、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムのようなリプレッサー分子と組み合わせ、癌遺伝子の発現を阻害することができる。
【０１５１】
癌遺伝子を用いることができるが、本発明の方法はそれらによって限定されない。致死および条件致死表現型を付与する様々な遺伝子を本発明の範囲内で用いることができ、上記方法は癌遺伝子に限定されない。従って、植物細胞の適正な機能および／または生長、および発生を阻害することができるあらゆる遺伝子は致死遺伝子であると考えられる。
【０１５２】
致死遺伝子の活性を機能的に抑制する多数の方法が報告されている。しかしながら、当該技術分野でさらに多数の方法が記載されているので、本発明は上記の抑制法によって限定されない。本発明の範囲内で様々な抑制法を用いることができることは、当業者には明らかである。
【０１５３】
細胞の形質転換および形質転換細胞の回収を行うあらゆる方法（例えば、Agrobacteriumによって伝達されるＤＮＡ導入またはバイオリスティック(biolistic)法) を用いて、本発明の範囲内でＤＮＡ構築物を導入することができる。本発明は、形質転換の方法によって変化しない。さらに、抑制可能致死遺伝子またはリプレッサーの様々な植物系への導入は、組換えＤＮＡを同時にまたは段階的に挿入することによって実施することもできることが注目される。あるいは、単純有性交雑によって抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子の所望な組合せを得ることができる。遺伝子構築物を有性不和合性の近縁生物に導入しようとする場合には、広汎な交雑および／または胚救出(embryo rescue)のような組織培養法を用いることができる。当業者に知られている様々な手法を用いて、本発明の範囲内で最大の有用性を提供する抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子の組合せを誘導することができる。
【０１５４】
下記の例は、この方法を例示する目的で示すものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【０１５５】
例１：Agrobacterium Ti−プラスミドpTi15955からの癌遺伝子１および２の単離
癌遺伝子を単離するため、下記の工程を用いた。癌遺伝子１(p202)および癌遺伝子２(p101)をコードするＤＮＡを包含する米国特許第５，４２８，１４７号明細書に詳細に記載されているサブクローンp101およびp202を、遺伝子の供給源として用いる。遺伝子を分離するため、好都合な制限部位を導入するためのＰＣＲと天然遺伝子断片のサブクローニングとの組合せを用いて、植物形質転換ベクターに好都合に挿入することができる癌遺伝子を誘導する。
【０１５６】
天然の癌遺伝子２を単離するため、下記の方法を用いる。癌遺伝子２の天然プロモーターを含む５′領域を、下記のプライマーを用いるプラスミドp101のＰＣＲ増幅によって単離する。
【化１】
0004642239.tif 000004
【０１５７】
G2P1はSph 1部位（肉太活字）およびXba I部位（下線部）を含み、pTi15955の公表された配列におけるヌクレオチド５８０８〜５７８５の相補物に相当する。G2P2はNco 1部位（肉太活字）を含み、pTi15955の公表された配列におけるヌクレオチド５２８５〜５３０９に相当する。G2P1およびG2P2を使用すると、天然の癌遺伝子２の５′領域を表す５２３bpの断片を生じ、プロモーターの５′末端のSph 1およびXba Iを含むように修飾したプロモーターを包含する。
【０１５８】
天然のターミネーター構造を包含する癌遺伝子２の３′領域を単離するため、２種類のＰＣＲプライマーを用いる。使用した第一のプライマーは、
【化２】
0004642239.tif 000005
である。
【０１５９】
G2P3はHind III部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド３３９６〜３３７１の相補物に相当する。G2P4はSph 1部位（肉太活字）およびBam H1部位（下線部）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド３２３７〜３２６４に相当する。G2P3およびG2P4を用いると、天然の癌遺伝子２の３′末端の一部を表す１６４bpの断片を生じる。
【０１６０】
プラスミドp101をNco IおよびHind IIIで消化して、コード領域のほとんどを包含する癌遺伝子２の約１８９５bpの断片を生成する。天然の癌遺伝子２の５′末端の５２３bpの断片をNco Iで消化して、１８９５bp断片のNco I部位に連結し、遺伝子の１６４bpの３′末端をHind IIIで消化し、1895bp断片のHind III部位に連結する。次に、再構築した天然の癌遺伝子２をSph 1で消化し、共通のクローニングベクターpGEM-4Z（Promega、ラホーヤ、カリフォルニア）のSph 1部位にサブクローニングする。このベクターはpG2と呼ばれる。ＤＮＡシークエンシングを用いて、天然の癌遺伝子２の真正のＤＮＡ配列に相当するこの再構築したＤＮＡの組成を検証した。
【０１６１】
癌遺伝子１の単離は、好都合な制限部位を導入するためのＰＣＲと天然遺伝子断片のサブクローニングの組合せを用いる。必要な断片を単離するため、下記の方法を用いる。コード領域の５′末端に、好都合な制限部位を下記の２種類のプライマーを用いるＰＣＲによって導入する。
【化３】
0004642239.tif 000006
【０１６２】
G1P1はCla 1部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド５７５５〜５７７５に相当する。G1P2はBgl II部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド６０２８〜６０１０の相補物に相当する。G1P1およびG1P2を用いて、コード領域の５′末端におけるCla 1部位を含むように修飾されている癌遺伝子１の２７３bp断片を増幅する。
【０１６３】
癌遺伝子１のコード領域の３′断片を単離するため、２種類のプライマーを用いてコード領域の３′末端に好都合な制限部位を導入する。
【化４】
0004642239.tif 000007
【０１６４】
G1P3はEco RV部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド７３５０〜７３７２に相当する。G1P4はCla 1部位（肉太活字）およびSac 1部位（下線部）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド８０７６〜８０５６に相当する。G1P3およびG1P4を用いて、癌遺伝子１のコード領域の３′末端を表す７３２bpの断片を生じる。
【０１６５】
癌遺伝子１の完全なコード領域を再構築するため、プラスミドp202をBgl IIで消化し、癌遺伝子１の部分コード領域を包含する１６９７bpの断片を単離する。この断片の５′末端に、２７３bpのＰＣＲ断片を加え、Bgl IIで消化し、コード領域の５′末端Cla I部位を含むように修飾された部分癌遺伝子１を生成する。全癌遺伝子１を再構築するため、３′配列を表す７２６bpのＰＣＲ断片をBam HIおよびSac 1で消化し、生成する断片を１６９７bpの断片の３′末端のBam HI部位に連結し、コード領域の５′および３′末端にCla 1部位とコード領域の３′末端にSac 1部位を有する再構築癌遺伝子１を生成する。これらの断片は、ベクターpBluescript (Promega、ラホーラ、カリフォルニア）内に含まれている。生成するプラスミドは、pG1と呼ばれる。ＤＮＡシークエンシングを用いて、天然の癌遺伝子１の真正のＤＮＡ配列に相当するこの再構成したＤＮＡの組成を立証した。
【０１６６】
pG1およびpG2の構築に用いた工程の図解表現を、図７ａおよび７ｂに示す。
【０１６７】
例２：細菌リプレッサー結合部位を用いるファゼオリンプロモーターの構築
この例では、テトラサイクリン（tet）オペレーターＤＮＡをファゼオリンプロモーターに導入する。tetオペレーター配列をファゼオリンプロモーター配列に挿入するため、ＰＣＲを用いて天然のTATAボックスのＤＮＡ配列５′およびtetオペレーター配列の３種類のコピーを含む合成ＤＮＡ配列に相当するプロモーターの領域を単離する。TATAボックスをプロモーターのＰＣＲ断片に連結して、tetオペレーター配列の３種類のコピーを含む再構築したファゼオリンプロモーターを形成する。これを行う手段は下記の通りであり、図８に示されている。
【０１６８】
ファゼオリン遺伝子のプロモーター領域（Slightom, J.L., Sun, S.M. and Hall, T.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1897-1901, 1983に記載）を、Dr. G. Cardineau （Mycogen Plant Sciences、サンディエゴ、カリフォルニア）の厚意により提供を受けたベクターpAGM 219を用いるＰＣＲによって単離する。プラスミドpAGM 219はファゼオリン遺伝子のプロモーター領域の約１６００塩基対とファゼオリン遺伝子の天然の終結領域を含む。TATAボックスに対するプロモーター５′の領域を、tetオペレーターＤＮＡおよびTATAボックスを含んでなる合成ＤＮＡ配列の付加に備えて、ＰＣＲによって単離した。
【０１６９】
用いた第一のＰＣＲプライマーを作成し、天然のプロモーター配列にヌクレオチド配列のマイナー変さらによってCsp45 1部位を導入した。このプライマーの配列を下記に示す。
【化５】
0004642239.tif 000008
【０１７０】
Csp45 1制限部位は、肉太活字で示す。ＰＣＲに用いた第二のプライマーは、下記の配列を有する。
【化６】
0004642239.tif 000009
【０１７１】
Xho 1部位は、肉太活字で示す。これらのプライマーを用いて得たＰＣＲ生成物はpPHASと呼ばれ、λゲノムクローンAG-λPVPh177.4 (λ177.4)のファゼオリンプロモーターのＤＮＡ配列のヌクレオチド１２８〜８３３に相当する(Slightom, J.L., Sun, S.M. and Hall, T.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1897-1901, 1983)。合成tetオペレーター配列を、合成二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ生成物のCsp45 1部位に連結することによってこの断片に加えた。合成オペレーターＤＮＡ配列は、この配列の３′末端にCla 1部位も有する。合成ＤＮＡの最上部の鎖は、下記の配列を有する。
【化７】
0004642239.tif 000010
【０１７２】
これは、３コピーのオペレーターＤＮＡ（肉太活字）、TATAボックス（下線部）、５′末端のCsp45 1部位（斜体および下線部）、および３′末のCal 1部位（斜体および下線部）を含んでなる。下記の配列を有する下部の鎖断片を用いる。
【化８】
0004642239.tif 000011
【０１７３】
これは、配列番号９に相補的鎖を含んでなり、肉太活字で同定されているCla 1付着末端を含む。二本鎖ＤＮＡは「最上部」ＤＮＡと呼ばれ、Csp45 1およびCla 1切断pPHASに連結され、挿入された「最上部」ＤＮＡを含むクローンを選択する。このベクターは、pPHAStet1と呼ばれる。ＤＮＡシークエンシングを用いて、この再構築したＤＮＡの組成を立証した。
【０１７４】
例３：活性な癌遺伝子２に結合した改質した抑制ファゼオリンプロモーターの制御下で癌遺伝子１を含んでなる植物形質転換ベクターの構築
この例では、２種類の遺伝子である癌遺伝子１（改質ファミリープロモーターによって制御）および天然の癌遺伝子２の組合せ活性から生じる抑制可能致死遺伝子活性を含んでなる植物形質転換ベクターの形成を説明する。発現を行うと、このベクターの２種類の癌遺伝子により過剰のＩＡＡが形成され、致死遺伝子活性が発現した植物細胞を殺す。このベクターを構築するために、下記の工程を用いる。
【０１７５】
プラスミドpPHAStet1およびpG1をCla 1で消化し、癌遺伝子１のコード領域をpPHAStet1のCla 1部位に挿入して、ベクターpPG-1を生産させる。Pst 1部位に末端を有する約１４００ヌクレオチドに及ぶSac I部位を含んでなるタンパク質終結コドンTGAの３６bp下流で出発するヌクレオチド配列を含んでなるプラスミドpAGM 219に含まれるファゼオリンターミネーターをさらに改質して、Sac 1部位の位置にPst 1部位を導入した。この修飾により、全ターミネーター配列を、約１４００bpのPst 1断片としてpAGM 219から切り取ることができる。この１４００bpのターミネーター断片をpPG-1のPst 1部位に挿入してpPG-2を形成し、これは３種類のtetオペレーターＤＮＡ配列、癌遺伝子１のコード領域、およびファゼオリンターミネーター配列を含むように改質したファゼオリンプロモーターを含んでなる。
【０１７６】
天然癌遺伝子２を含むpG2のSph 1断片を、pPG-2のユニークSph 1部位に挿入して、ベクターpGG-1を形成する。ベクターpGG-1をXba 1で消化して、３種類のtetオペレーターＤＮＡ配列、癌遺伝子１のコード領域、およびファゼオリンターミネーター配列、および天然の癌遺伝子２をそれ自身のプロモーターの制御下で含むように改質したファゼオリンプロモーター含んでなる全インサートを切り取る。このXba I断片を、植物形質転換ベクターBinterのXba I部位に挿入する。
【０１７７】
植物形質転換ベクターBinterは、下記の方法でnosターミネーター断片が挿入された広く用いられている植物形質転換ベクターBin 19 (Clontech、パロアルト、カリフォルニア）を含んでなる。ベクターpBI 221 (Clontech)に含まれるnosターミネーターを最初にSac I - Eco RI断片として単離し、Sac IおよびEco RI部位でpGEM-4Zにクローニングした。このプラスミドpGEMterをHind IIIおよびEco RIで消化して、nosターミネーターおよび全ポリリンカーを除き、Hind III - Eco RIで消化したBin 19に挿入した。このベクターは、Binterと呼ばれる。
【０１７８】
３種類のtetオペレーターＤＮＡ配列、癌遺伝子１のコード領域、およびファゼオリンターミネーター配列、および天然の癌遺伝子２をそれ自身のプロモーターの制御下で含むように改質したファゼオリンプロモーター含んでなるXba I断片を含むBinterは、pGG-2と呼ばれる。pGG-2の構築に用いた工程を、図９に示す。
【０１７９】
例４：改質ファゼオリンプロモーターの制御下で抑制種子致死遺伝子を導入するための植物の形質転換
この例では、タバコ植物を、標準的Agrobacterium依存性形質転換を用いてベクターpGG-2で形質転換し、抑制種子致死遺伝子活性を含んでなる植物を得る。得られた植物を温室で生育し、開花させた。自家受粉した種子並びに野生型タバコを用いる相互交雑から誘導される種子を集めた。抑制種子致死遺伝子を有するがリプレッサーを持たないタバコ植物は、発芽分析から生育可能ではないと判定される種子を形成する。これを、図１０および１１に示す。図１０では、種子致死ベクターを含んでなるタバコ種子と野生型タバコ種子の発芽の光学顕微鏡写真を比較する。種子は表面殺菌して、塩基性培地で培養した。種子を発芽させた。野生型種子を「WT」の印を付け、種子致死遺伝子を含んでなる種子を「SL」として同定した。性状に発芽した野生型種子は、正常な子葉と真の第一葉を有していた。「SL」苗木は肥厚した子葉を有し、真の第一葉を欠いており、カルスおよび過剰に根の多い表現型などのオーキシン過剰生産の典型的な徴候を示した。正常な苗木または「WT」苗木が種子致死構築物を欠いている証拠を提供するため、同一形質転換体からの種子をカナマイシンを含むまたは含まない培地で培養した。カナマイシン含有培地で発芽した後、総ての正常な苗木は白くなって枯れ、これらは種子致死構築物を含まず（すなわち、pGG-2形質転換ベクターでカナマイシン遺伝子に結合している）、従ってカナマイシン感受性であることを示していた。これを、図１１に示す。この実験では、「-kan」の印を付けたプレートは、致死およびカナマイシンを含まない培地で発芽した種子からの野生型タバコ苗木の種子の混合物を示している。「+kan」のラベルを付けたプレートでは、致死および野生型の種子の種子を同様に採取したものをカナマイシン３００μg/mlの存在下で発芽させた。種子致死表現型は、いずれのプレートでも見られ、種子致死苗木は過剰の根、肥厚した子葉を有し、真の第一葉を欠いている。カナマイシンを含まないプレートでは、野生型種子は正常な苗木を生産し、カナマイシンを含むプレートでは野生型植物は生長できず、苗木は白くなって最終的には枯れた。種子致死苗木の総ては、正常な苗木を形成することはできなかったが、緑のままであった。従って、種子致死表現型は、種子致死遺伝子の存在に依存している。相互交雑の結果に基づいて、種子致死表現型を花粉によって伝達することができることも明らかである。従って、種子致死表現型は種子に現れるだけであり、植物の他の組織には影響を及ぼさない。
【０１８０】
例５：抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子の植物系への導入
この例の最初の部分では、改質ファゼオリンプロモーターの制御下で抑制可能致死遺伝子を有するタバコ植物を、35Sプロモーターの制御下でtetリプレッサーをコードする遺伝子で予め形質転換し、挿入されるリプレッサー遺伝子とホモ接合性であるタバコとの交雑における雌性親として用いる。植物は、表現型的に正常である（図１２）。図１２では、植物Ａは抑制種子致死遺伝子を含む植物であり、植物Ｂはリプレッサー遺伝子を含む植物であり、植物Ｃは植物ＡおよびＢの交雑によって誘導された植物であり、植物Ｄは野生型のタバコ植物である。植物は総てが正確に同一年齢ではないことに留意すべきであり、これらの植物は繁殖によって保持した。この写真は、抑制種子致死遺伝子を有する植物は表現型的に正常であることを示すために提供されている。植物Ｃゆらいの種子を回収し、カナマイシンの存在下で発芽させ、抑制可能致死遺伝子を含む種子を選択する。生育可能な種子（すなわち、性状に発芽する種子）は、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子のコピーを両方とも含む。抑制可能致死遺伝子とリプレッサーの存在についてのＰＣＲ分析により、遺伝子型を確認した。表現型は、発芽分析によって評価した。有意な数の独立して形質転換した系を得て、上記の方法で分析した。これらの独立して形質転換した植物のほとんどは、完全に発芽することができない種子から、発芽するが過剰の根、肥厚した子葉を有し、真の第一葉を欠いている異常苗木を生じる種子までの範囲の種子致死表現型を示した。表１は、これらの様々な植物の代表的試料を用いて行った一連の交雑からのデータ一覧を含んでいる。同定した植物を種子致死遺伝子（第２欄で「SL」と略記）の存在について試験し、第３欄で種子の生長可能性について評価し、標記リプレッサー系（第４欄で「R」と略記）と交雑させ、これらの植物から集めた種子を発芽分析によって分析し（第５欄に示す）、植物組織をリプレッサーおよび種子致死遺伝子の存在について分析した。この分析により、種子致死遺伝子のリプレッサーによる抑制により、生育可能な種子を形成することができることを明らかにされた。生育可能な種子は性状に発芽し、抑制種子致死遺伝子とリプレッサーとを含むことが分かった。
【０１８１】
【表３】
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【０１８２】
抑制種子致死遺伝子を含む植物系を、リプレッサー遺伝子を含む植物系と交雑した。抑制種子致死遺伝子を含む元の植物系とリプレッサー系と交雑した植物由来の植物系の分離種子個体群を、土壌で発芽させた。種子致死遺伝子を含む植物から誘導される種子の分離個体群内では、種子致死遺伝子を持たない分離物のみが生長することが分かった。種子致死遺伝子を有する植物は回収されず、リプレッサーが存在しない場合には、種子致死遺伝子型を有する種子から生育可能な植物を形成することはできないことが分かった。しかしながら、リプレッサーとの交雑の種子からは、正常な植物が回収された。これらの正常な植物は、種子致死およびリプレッサー遺伝子をいずれも有していた。これは、種子致死表現型は正常な生育条件下で抑制できることを示している。種子致死遺伝子とリプレッサー遺伝子が野生型植物との交雑の後に分離されると、種子致死表現型が再度出現し、抑制が分離によって喪失してしまったことを示唆している。従って、これらの一連の実験は、この方法が遺伝子モデルに基づいて予想されたように作用することを示している。
【０１８３】
上記の例から、抑制種子致死遺伝子とリプレッサーを含んでなる遺伝子の組合せの誘導は、当業者の通常の技術範囲内にあることは明らかである。この方法に対する様々な修飾、例えばホモ接合系の誘導体形成、様々な交雑処理、または植物系を再形質転換して抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーを組み合わせることも、当業者には明らかであり、完全に理解されている。
【０１８４】
例６：ホモ接合性植物系の生産
上記の例５で得た植物は、本発明の方法の有用性を示しており、多種多様な同様な工程を異なる作物で用いることができることが理解される。本発明の遺伝子組合せを油糧種子Brassica napusのような作物で行う方法を例示するものとして、この例では、この方法を葯培養と組み合わせて用いて、ホモ接合性植物系を速やかに得ることを説明する。この例では、第一工程はBrassica napus植物を、好ましくはGUS遺伝子のような容易に同定可能なマーカー遺伝子に結合した抑制可能致死遺伝子を有する組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって種子致死形質を有する植物を得ることである。抑制可能致死遺伝子の単一コピーで形質転換した植物の一次形質転換体の個体群から、種子致死形質が発現し、従って、植物が、自家受粉種子のGUSスクリーニングによって同定された遺伝子構築物を有する種子を全く生産することができない植物を同定する。次に、このような植物に葯培養を施して、この植物を自家受粉種子を生産できない二重ハプロイド植物に転換する。この植物は抑制可能致死遺伝子についてホモ接合性である。
【０１８５】
種子致死表現型を抑制できるリプレッサー含有植物を誘導するため、Brassica napus、好ましくは同一植物品種をリプレッサーＤＮＡを有する組換えＤＮＡ構築物で形質転換する。上記のリプレッサーＤＮＡを含む植物の個体群を選択する。リプレッサー含有植物のこの個体群を雄性親として用いて、種子致死形質を発現する植物に交雑する。交雑した種子の回収率を単純化するため、交雑の際に雌性親を除雄するのが好ましい。上記交雑の結果として生産した生育可能な種子は、抑制可能致死遺伝子と種子致死表現型を抑制できるリプレッサー遺伝子を含んでいなければならない。それぞれの個々の交雑からの種子を回収し、生育させる。この植物の個体群から、完全に自家受粉セットが可能でありかつ抑制致死種子形質を有する個々の植物を選択する。リプレッサー遺伝子を欠いている他の品種に交雑受粉すると、このような植物は上記の抑制された致死遺伝子に結合したGUS活性について陽性である種子を実質的に生産することができない。
【０１８６】
このような方法により、交雑を極めて効率的に制限し、完全な自家受粉種子セット能力を保持する遺伝子組合せを選択することができる。最も好ましい遺伝子組合せは、減数分裂の際に最も効果的に隔離される遺伝子座に挿入されたＤＮＡを含む植物であるので、挿入したＤＮＡの詳細なマッピングを行う必要はない。この植物系からの種子抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子のみを含むように改質された元の出発品種である。しかしながら、上記植物系は、抑制可能致死遺伝子に関連した形質または複数の形質を実質的に導入することはできない。
【０１８７】
雑種Brassica napusのような抑制された致死遺伝子とリプレッサーを有する雑種作物を生産するために、本発明の方法の改質法を提供して、親系を生産させる。抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子を組み合わせるための最も明白な方法は、雑種種子の生産の際である。従って、このようにして生産される雑種種子は抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子の遺伝子組成物を有することとなる。
【０１８８】
この遺伝子組成物を生産させるため、雄性親の種子を増加させる手段を提供する。この方法としては、抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子と誘導性プロモーターの盛業かでリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子による植物の形質転換が挙げられる。好ましくは、遺伝子同士を結合させ、さらに新規な形質を有することができる。プロモーターの誘導により、抑制された致死遺伝子および誘導リプレッサー遺伝子について植物をホモ接合性とする。得られた植物種子は、雑種交雑における雄性親として働くことができる。種子はインデューサーの存在下で増加する。
【０１８９】
上記雑種交雑における雌性親は、植物をリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子で形質転換し、植物をリプレッサー遺伝子についてホモ接合性とし、自家受粉および自家受粉−種子形成させ、この植物を雑種交雑における雌性親として使用することによって生産される。
【０１９０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子が独立して隔離された遺伝子座に配置されている略図。「新規形質」という用語は、結合した組換えＤＮＡ、または１個以上の形質の組合せを含んでなる特異的遺伝子型を表す。PRO 1は、抑制可能致死遺伝子の発現を制御するプロモーターを表し、種子特異的プロモーターが好ましい。リプレッサー遺伝子の十分な発現により、致死表現型の発現が防止される。
【図２】  致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を両方とも含んでなるＤＮＡ構築物。リプレッサー遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼの子葉によって新規な染色体上の遺伝子座に特異的に標的設定される。トランスポザーゼまたはリコンビナーゼ認識配列により、活性リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ酵素の存在下でリプレッサー遺伝子を、抑制可能致死遺伝子から独立して隔離されている遺伝子座に再配置することができる。
【図３】  ２個の抑制可能致死遺伝子と２個の独立したリプレッサー遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ構築物。新規な形質または複数の形質を、一方または両方に、または抑制可能致死遺伝子に結合させることができる。リプレッサー遺伝子は機能的に異なっており、すなわち独立して作用する。抑制可能致死遺伝子は、同一または異なる抑制可能致死遺伝子活性をコードすることができる。PRO 1およびPRO 2は同一または異なるプロモーターであることができ、種子特異的プロモーターが好ましい。
【図４】  リプレッサーと致死遺伝子が相同染色体対の対向染色体上に配置されている抑制可能致死遺伝子を植物の生産の略図。部位特異的リコンビナーゼは、リプレッサーおよび致死遺伝子構築物を相同染色体対の対向娘染色体に標的設定する。「標的リコンビナーゼ配列」は、さらに、構築物を挿入することによって活性化される不活性な選択マーカーを含んでなることができる。
この略図により、エリート親系を、標的リコンビナーゼ配列で形質転換する。半接合性植物が回収され、ホモ接合性状態に転換される。植物を、抑制可能致死遺伝子または（複数の）リコンビナーゼ標的配列がフランクしたリプレッサー遺伝子で再形質転換する。ランダムに組込まれたSLまたはRを含んでなる植物を回収する。次に、リコンビナーゼ機能を用いて、SLまたはRを特異的に切り取り、小敵染色体対上にある標的リコンビナーゼ配列に挿入する。SLおよびRを含む植物を回収する。
【図５】  自家受粉作物における抑制可能致死遺伝子の使用。条件致死遺伝子は、場合によって用いる。
この図では、組換えＤＮＡ１は、抑制種子致死（SL）および他の組織で条件致死（CL）である。組換えＤＮＡ２は、リプレッサーである。
【図６】  雑種作物における抑制可能致死遺伝子法の使用。条件致死遺伝子は、場合によって用いる。
この図では、組換えＤＮＡ１は、抑制種子致死（SL）および他の組織で条件致死（CL）であり、誘導リプレッサー（IndR）も含む。組換えＤＮＡ２は、非致死リプレッサー（R）である。
【図７】  Agrobacterium tumifaciens株ATCC 15955のTiプラスミドpTi15955由来の致死遺伝子である癌遺伝子２（図７ａ）および１（図７ｂ）の単離。
【図８】  種子特異的プロモーターである、ファゼオリンプロモーターであって、細菌性リプレッサー結合部位を含むように改質したものの構築。この改質プロモーターを含むベクターは、pPHAStet1である。
【図９】  1)細菌リプレッサー結合部位を含むように改質したファゼオリンプロモーターの制御下にあるAgrobacterium tumifaciens Ti プラスミドpTi15955の癌遺伝子１（図９ａ）、および2)その天然プロモーターの制御下にある条件致死遺伝子である癌遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターの構築。
【図１０】  抑制種子致死遺伝子を含みリプレッサー遺伝子（種子致死またはSL表現型）を含まない種子と比較した野生型（WT）種子の発芽。
【図１１】  野生型苗木、並びに選択的および非選択的条件下で発芽した抑制種子致死遺伝子を含む植物の隔離個体群の苗木。
【図１２】  抑制種子致死遺伝子を含む植物(A)、リプレッサー遺伝子を含む植物(B)、抑制種子致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を含む植物(C)、および野生型植物(D)の比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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