(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質中の毒性化合物の検出方法であって、ここに該毒性化合物が２，５−ジクロロフェノール、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、ｐ−ノニルフェノール、２,４,５−トリクロロフェノール、Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、マラソン、エチレンビス（ジチオカルバメート）マンガン、塩化ニッケル（ＩＩ）、重クロム酸カリウム、フェノールおよびジメチルスルホオキシドよりなる群から選択され、
（１）該被験物質を、ポリヌクレオチドでまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した酵母細胞に接触させ、ここに、該ポリヌクレオチドはマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した配列番号:３
で示される酵母ＹＯＲ３８２Ｗ遺伝子からのプロモーターを含み、ついで
（２）該マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出する
ことを含む該検出方法。
【請求項２】
該ｍＲＮＡの発現をマーカータンパク質の発現によって確認する請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
該ｍＲＮＡの発現をノザンブロッティングによって検出する請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
ｍＲＮＡを逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅し、ついでｍＲＮＡの発現を検出する請求項１記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は生物学的方法を用いた毒性化合物の検出方法に関する。本発明はまた該検出方法に用いるポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞にも関する。
背景技術
環境庁により昭和４９年から平成１０年度までの２４年間にわたり毎年行われている化学物質環境追跡調査結果によれば、今まで調査した７７５種類の化学物質のうち、約４０％の物質が環境中に放出されている。一方、わが国において現在、工業的に生産されている化学物質は約５万種類とされ、その生産量、種類は年々増加している。また、塩素による水処理、焼却処理等により非意図的に生成された化学物質が環境を汚染することが知られている。これらの事実から、環境中に蓄積されている化学物質は多数あると予測されるが、これら全てを個々に調査することはきわめて困難である。
従来のバイオアッセイ（生物材料を用いてその応答性から有害性を評価する手法）は主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としており、環境中の化学物質による毒性の評価はできるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因するかを判断することはできない。亜硝酸生成細菌または硝酸精製細菌の活性により評価する方法（特開平０６−１２３７０５号公報、特開２０００−２０６０８７号号公報）、鉄バクテリアの活性により評価する方法（特開平１１−３７９６９号公報）が提案されており、水質安全モニタ（富士電機）のような製品が販売されている。また、国外では、発光微生物の発光強度により評価する製品（ＭＩＣＲＯＴＯＸ、ａｚｕｒ社、アメリカ；ＬＵＭＩＳ、ｄｒｌａｎｇｅ社、ドイツ）が市販されている。しかし、これらはいずれも従来型のバイオアッセイ法の延長であり、毒性化学物質に関する詳細な情報は得られない。
わが国の化学物質のリスク管理は、新たな汚染が見出されるたびに化学物質の見直しが行われ、さらに規制と自主規制を組み合わせる体制の整備がすすめられている。しかし、トリハロメタンやダイオキシンに代表されるような有害化学物質の非意図的生成および環境放出など、複雑化、多様化する現状に即座に対応する体制は整っていない。また、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」における毒性評価法である動物実験はコストや時間がかかり国際的に受け入れ難くなっている。このように、管理体制についての問題は常に議論されるが、それを解決する具体的な手段が無いことから課題の解決には至っていない。従って、環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が要望されている。
発明の開示
本発明者は毒性物質が特定の酵母遺伝子のプロモーターを活性化し、該プロモーターに作動可能に連結したマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドからｍＲＮＡの転写を誘導することを発見して本発明を完成させた。
即ち本発明は先ず、以下の群から選択される酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドに関する。
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これら酵母遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列は公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Ｍｕｎｉｃｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、米国のＳＧＤ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）に開示されており、インターネットを介して知ることができる。また、プロモーター配列についても公共のデータベース（ＳＣＰＤ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に開示されている。
上記酵母遺伝子のプロモーターばかりでなく、上記酵母遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子のプロモーターも使用できる。ここに「酵母遺伝子に相同性を有する遺伝子」とは、酵母遺伝子の塩基配列に５０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子であって、該酵母遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を言う。
上記遺伝子のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結してポリヌクレオチド構築物を得る。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は当業者によく知られている（例えばＲ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理  原書第５版，培風館，ｐｐ１３８−１６５，ｐｐ．２３４−２６３，２０００を参照）。
マーカータンパク質の例としてはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）
（Ｈｅｉｍ，Ｒ，Ｃｕｂｉｔｔ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７３，６６３−６６４；Ｈｅｉｍ，Ｒ．，Ｐｒａｓｈｅｒ  ＤＣ．ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１，１２５０１−１２５０４；Ｗａｒｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈａｚｅｒｉｇｇ，Ｔ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ６３９，４００−４０３；Ｙｏｕｖａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌ−Ｂｅｙｅｒｌｅ，Ｍ．Ｅ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４  １２１９−１２２０；Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．，Ｔｕ，Ｙ．，Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｗａｒｄ，Ｗ．Ｗ．ａｎｄ  Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，８０２−８０５）、β−ガラクトシダーゼ（Ｃａｎｅｓｔｒｏ  Ｃ，Ａｌｂａｌａｔ  Ｒ，Ｅｓｃｒｉｖａ  Ｈ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ  Ｒ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｍｐｈｉｏｘｕｓ：ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ  ２００１  Ｍａｒ  ２１１（３）：１５４−６）、ルシフェラーゼ（Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２００２  Ｊｕｎ；７６（５−６）：２５７−６１、Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＵＶ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｓｓａｙ．Ｓｃｈｒｅｕｒｓ  Ｒ，Ｌａｎｓｅｒ  Ｐ，Ｓｅｉｎｅｎ  Ｗ，Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  Ｂ．）、及びアセチルトランスフェラーゼ（Ｊ  Ｒｅｃｅｐｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｆｅｂ；２１（１）：７１−８４，Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｚｈａｎｇ  Ｓ，Ｌｕ  Ｊ，Ｉｙａｍａ  Ｋ，Ｌｏ  ＳＣ，Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ．）を挙げることができる。  本発明は上記ポリヌクレオチド構築物を含むベクターにも関する。
酵母遺伝子のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドは、公共のデータベースから知られる上記酵母遺伝子の塩基配列を基に、必要と思われる部分を複写するプライマーを設計し、酵母ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法で増幅することによって得る。また、目的とする細胞において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質の塩基配列を挿入する。先に作成したプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを、マーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより、目的とするベクターが得られる。
本発明は上記ベクターで形質転換した宿主細胞にも関する。用いる宿主細胞としてはヒト細胞が好ましいのは当然であるが、マウスその他哺乳類の細胞でも良い。また、環境中の毒性評価という面から、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞でも可能である。また、培養が容易であることから微生物の細胞を用いることも好ましい。また、本法は酵母細胞の遺伝子を基にしていること、また酵母の生育は塩濃度その他の環境試料において変動する条件に左右されないことから、好ましい細胞は酵母細胞である。細胞を形質転換する方法はよく知られている（例えば、Ｋａｉｓｅｒ  Ｃ，Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｓ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ａ：Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  １９９４  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ．１３３−１３４，１９９４を参照）。またベクターを用いなくとも当該酵母遺伝子のコード領域をマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で置換することによっても目的は達せられる。上記ポリヌクレオチド構築物を細胞に直接導入することも可能であり、その方法も周知である。
本発明は、
（１）被験物質を、上記の形質転換した細胞と接触させ、
（２）マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出すること、
を含む被験物質中の毒性化合物の検出方法にも関する。
被験物質を、細胞と接触させる場合は、例えば形質転換した細胞をその細胞を培養するに適した条件下で液体培養し、その培養液に直接被験物質を添加する方法により行う。
次にマーカータンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定する。マーカータンパク質の発現量を測定は、細胞を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定すれば良い。例えばマーカー蛋白質がＧＦＰの場合は、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、細胞を粉砕せずに蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による観察および画像処理、フローサイトメトリーによる計測、さらにエバネッセント光などを用いた検出方法が可能である。
ｍＲＮＡの発現は、１）ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック  改定第２版、羊土社、２０００，ｐｐ２９９−３０１）により検出するか、２）逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊  Ｔｉｐｓシリーズ  改定ＰＣＲ  Ｔｉｐｓ，秀潤社、１９９９，ｐｐ２５−４３）等によって検出することができる。
ノーザンブロット法の手順はＲＮＡを電気泳動して、そのパターンをフィルターに移しとり、アイソトープで標識した特異的な標識プローブとハイブリダイゼーションをさせることで、標本中のｍＲＮＡの存在と量、およびその長さを解析する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、まずＲＮＡを逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてｃＤＮＡに逆転社し、次にこのｃＤＮＡを出発材料として特定のプライマーセットと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、目的のＲＮＡの存在をそのｃＤＮＡの増幅という形で、検出定量化する方法である。
本発明の方法により検出できる毒性物質は特に限定がないが例えば、Ｎａ２Ａｓ、ＣｄＣｌ２、ＨｇＣｌ２、ＰｂＣｌ２、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２，４，５−トリクロロフェノール、γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、２，４，５，６−テトラクロロ−１，３−ベンゼンジカルボニトリル、テトラメチルチウラムジスルフィド、エチレンビス（ジチオカルバメート）亜鉛、８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド、ジンジャオール、アクロレイン、ジメチルスルホオキシド、ラウンドアップ（登録商標、除草剤）（Ｎ−（ホスホメチル）グリシナートアンモニウム４１．０％、界面活性剤５９．０％）、ドデシルベンゾスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、シアン化カリウム、ベンゾ（ａ）ピレン、ホルムアルデヒド、ビスフェノールＡ，２，５−ジクロロフェノール、塩化メチル水銀、ｐ−ノニルフェノール、ペンタクロロフェノール、塩化ニッケル（ＩＩ）、重クロム酸カリウム、トリフェニルスズクロライド、フェノール、Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバマート、ヘキサクロロフェン、トリクロサン、硫酸銅等を含む。
２つ以上の細胞、即ち異なる酵母遺伝子のプロモーターにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した２つ以上の細胞を用いて、それぞれについて上記方法を行なうと毒性物質を更に特定することができる。例えば以下の実施例で示すように酵母遺伝子プロモーターとしてＹＬＬ０５７Ｃのものを用いると２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩が検出可能であり、酵母遺伝子としてＹＬＲ３０３Ｗを用いると２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩、ベンゾ（ａ）ピレン、ホルムアルデヒド、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、水銀塩が検出可能である。従って、例えば、酵母遺伝子としてＹＬＲ３０３Ｗを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されるが、酵母遺伝子としてＹＬＬ０５７Ｃを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されないなら毒性物質はベンゾ（ａ）ピレン、水銀塩、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン又はホルムアルデヒドと特定される。またいずれの酵母遺伝子を用いた場合にもマーカータンパク質の発現が誘導されるなら毒性物質は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、又は青酸若しくはその塩と特定される。
以下に本発明を実施例により更に説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例
実施例１
毒性物質の検出のためいかなる酵母遺伝子が有用であるかを調べるため以下の実験を行った。
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ（α  ＳＵＣ２ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｐ２  ＣＵＰ１））を２５℃で培養した。対数増殖期に以下の細胞に対して毒性を有する化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。化学物質の濃度は酵母の生育を阻害するが死滅には至らないような濃度を選択した。
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培養終了後遠心して集菌した。これに酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｔａｋａｒａ）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；カタログ番号１８０６４−０１４，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを取りこませて標識ｃＤＮＡを得た。
この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解し、酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ研究所製）に滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。このＤＮＡチップの蛍光強度をスキャナーで読み取り、化学物質を添加しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量として表１〜９に示した。なおこれらの表中、最右欄の「強度」はコントロール細胞における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を全遺伝子の発現量の平均値で割った値である。コントロールのｍＲＮＡ発現量が小さく、化学物質を添加した場合のｍＲＮＡ発現量が大きい遺伝子が毒性物質の検出に特に有用である。
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0004836403.tif 000094
機能未知の酵母遺伝子２４００のうち約７００が重金属、農薬、界面活性剤等の毒性を有する化学物質いずれかによりｍＲＮＡの発現が誘導され（表１）、ミトコンドリア局在タンパク質遺伝子１６７（表２）、遺伝子修復系タンパク質遺伝子５２（表３）、エネルギー系タンパク質遺伝子１６１（表４）、トランスポート促進タンパク質遺伝子１４２（表５）、ストレスタンパク質遺伝子９０（表６）、代謝系たんぱく質遺伝子１４２（表７）、脱毒性蛋白質遺伝子６０（表８）、その他のカテゴリーに属する遺伝子５０７（表９）のｍＲＮＡの発現が毒性を有する化学物質のいずれかにより誘導されることが示される。ここで、化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量が２倍以上のものを有意とした。
このように毒性物質が存在すると特定の酵母遺伝子の発現が誘導されるのは、毒性物質が該遺伝子のプロモーターを活性化することによると考えられる。そこで本発明者は、酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチド配列を含むベクターを調製し、該ベクターで酵母細胞を形質転換した。このような細胞を用いると、発現するマーカータンパク質を検出することにより、毒性物質の検出を簡便に行うことができる（以下このような検出を「プロモーターアッセイ」と呼ぶことがある）。以下の実施例にはそのようなベクターの調製、該ベクターを用いる酵母細胞の形質転換、形質転換した細胞による毒性物質の検出を示す。
プロモーターアッセイ法はｍＲＮＡの細胞内の変動をマーカー遺伝子の発現レベルに置き換えて，遺伝子発現量を非破壊で測定する方法である。化学物質を検出するために選択した遺伝子は化学物質不存在下においても発現しており，従ってマーカータンパク質も化学物質不存在下においても存在する。本発明の方法は被検試料を付加した時の酵母遺伝子の挙動をマーカータンパク質の発現量の変化によって計測し，毒性化学物質の存在およびその種類を推定するものである。このため，化学物質不存在下においてはマーカータンパク質の産生が少ない方が望ましく，また化学物質存在下においてマーカータンパク質の産生が多い方が望ましい。このため，プロモーターアッセイにおける酵母遺伝子の選択にあたっては，強度（コントロール細胞における遺伝子の発現量／全遺伝子の発現量の平均値）が、好ましくは１．５以下、より好ましくは１以下、さらに好ましくは０．５以下であり、発現倍率（化学物質存在下の発現ｍＲＮＡ／化学物質不存在下の発現ｍＲＮＡ）が好ましくは３以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上であるものを選択する。
実施例２
酵母遺伝子ＹＫＬ０７１ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＩマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
0004836403.tif 000095
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
0004836403.tif 000096
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔ  ｎｏ：Ｖ８２５−２０，Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理  原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターｐＱＢＩ  ６３（Ｃａｔ  ｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅの中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクター作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＫＬ０７１ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号１）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次にこのプラスミドベクターで酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０μＬを添加する。
４）３００μｌずつ分注し１０μｌの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００μｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞は、ＳＣ−ＹＫＬ０７１ｗ−ｐＱＢＩと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている（受託日：平成１４年８月１９日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１６１）。
実施例３
酵母遺伝子ＹＣＲ１０２ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーは、プライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＩマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
0004836403.tif 000097
であり、ロウワープライマーの塩基配列は
0004836403.tif 000098
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔ  Ｎｏ：Ｖ８２５−２０，Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理  原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターｐＱＢＩ  ６３（Ｃａｔ  ｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅの中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクター作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＣＲ１０２ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号２）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次にこのプラスミドベクターで酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０ｕＬを添加する。
４）３００ｍｌずつ分注し１０ｕｌの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００ｍｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
組み込みの確認は選択培地（ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育した酵母のコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞をＳＣ−ＹＣＲ１０２ｃ−ｐＱＢＩと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている（受託日：平成１４年８月１９日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１５９）。
実施例４
酵母遺伝子ＹＯＲ３８２ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＩマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
0004836403.tif 000099
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
0004836403.tif 000100
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔ  ｎｏ：Ｖ８２５−２０，Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理  原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターｐＱＢＩ  ６３（Ｃａｔ  ｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅの中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクター作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＯＲ３８２ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次にこのプラスミドベクターで酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０μＬを添加する。
４）３００μｌずつ分注し１０μｌの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００μｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞は、ＳＣ−ＹＯＲ３８２Ｗ−ｐＱＢＩと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている（受託日：平成１４年８月１９日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１６０）。
実施例５
酵母遺伝子ＹＬＬ０５７ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＩマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
0004836403.tif 000101
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
0004836403.tif 000102
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔ  ｎｏ：Ｖ８２５−２０，Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理  原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターｐＱＢＩ  ６３（Ｃａｔ  ｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅの中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクター作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＬ０５７ｃのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号４）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次にこのプラスミドベクターで酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０μＬを添加する。
４）３００μｌずつ分注し１０μｌの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００μｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞は、ＳＣ−ＹＬＬ０５７Ｃ−ｐＱＢＩと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成１３年７月２７日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４３９）。その後、国際寄託へ移管された（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１５８、国際寄託への変更日：平成１４年８月１９日）。
実施例６
酵母遺伝子ＹＬＲ３０３ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーは、プライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＩマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
0004836403.tif 000103
であり、ロウワープライマーの塩基配列は
0004836403.tif 000104
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔ  Ｎｏ：Ｖ８２５−２０，Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理  原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）はベクターｐＱＢＩ  ６３（Ｃａｔ  ｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅの中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクター作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＲ３０３ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号５）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次にこのプラスミドベクターで酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０ｕＬを添加する。
４）３００ｍｌずつ分注し１０ｕｌの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００ｍｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
組み込みの確認は選択培地（ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育した酵母のコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
形質転換した酵母細胞をＳＣ−ＹＬＲ３０３Ｗ−ｐＱＢＩと命名し、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成１３年７月２７日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４３８）。その後、国際寄託へ移管された（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１５７、国際寄託への変更日：平成１４年８月１９日）。
実施例７
実施例２で製造した細胞ＳＣ−ＹＫＬ０７１Ｗ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）中で酵母細胞ＳＣ−ＹＫＬ０７１Ｗ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１０に示す。
0004836403.tif 000105
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テトラメチルチウラムジスルフィドの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
実施例８
実施例３で製造した細胞ＳＣ−ＹＣＲ１０２Ｃ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）中でＳＣ−ＹＣＲ１０２Ｃ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１１に示す。
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テトラメチルチウラムジスルフィドの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
実施例９
実施例４で製造した細胞ＳＣ−ＹＯＲ３８２Ｗ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）中でＳＣ−ＹＯＲ３８２Ｗ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１２に示す。
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２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、ｐ−ノニルフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、マラソン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、塩化ニッケル（ＩＩ）、重クロム酸カリウム、フェノール、ジメチルスルホキシドの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
実施例１０
実施例５で製造した細胞ＳＣ−ＹＬＬ０５７Ｃ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）中で酵母細胞ＳＣ−ＹＬＬ０５７Ｃ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１３に示す。
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２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸ナトリウム、塩化カドミウム、シアン化カリウムの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
実施例１１
実施例６で製造した細胞ＳＣ−ＹＣＲ３０３Ｗ−ｐＱＢＩを以下の化合物の１つと接触させた。ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ０９１９−１５）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）中でＳＣ−ＹＬＲ３０３Ｗ−ｐＱＢＩを２５℃で培養した。対数増殖期に細胞に対して毒性を有する以下の化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。
（１）ベンゾ（ａ）ピレン、（２）ビスフェノールＡ、（３）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、（４）２，５−ジクロロフェノール、（５）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、（６）ホルムアルデヒド、（７）塩化メチル水銀、（８）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、（９）ｐ−ノニルフェノール、（１０）ペンタクロロフェノール、（１１）亜ヒ酸ナトリウム、（１２）テトラメチルチウラムジスルフィド、（１３）トリブチルスズクロライド、（１４）２，４，５−トリクロロフェノール、（１５）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）、（１６）パラコート、（１７）塩化カドミウム、（１８）γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、（１９）マラソン、（２０）エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、（２１）塩化ニッケル（ＩＩ）、（２２）重クロム酸カリウム、（２３）トリフェニルスズクロライド、（２４）フェノール、（２５）Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバマート、（２６）ヘキサクロロフェン、（２７）トリクロサン、（２８）塩化水銀（ＩＩ）、（２９）硫酸銅（ＩＩ）、（３０）シアン化カリウム（３１）ジメチルスルホキシド
接触後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。対照区の蛍光光度分布の範囲を定め、これ以上の蛍光を有する細胞数が１％未満のものを蛍光検出無しとして“−”、１％以上２％未満を“＋”、２％を超えるものを蛍光検出有りとして“＋＋”とした。結果を表１４に示す。
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ベンゾ（ａ）ピレン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ホルムアルデヒド、亜ヒ酸ナトリウム、塩化カドミウム、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、塩化水銀（ＩＩ）、シアン化カリウムの場合にＧＦＰの発現が誘導されることがわかる。
【配列表】
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