(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式：
【化１】
0004846104.tif 000015
（式中、Ｒ１は、水酸基またはケトン基[(＞Ｃ)＝Ｏ；ここで、＞ＣＯの炭素原子は母体構造の炭素骨格に含まれる]であり、ここで、Ｒ１が水酸基の場合、Ｒ２はヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはメチル基であり、またはＲ１がケトン基の場合、Ｒ２はヒドロキシメチル基またはカルボキシル基である。）で表される少なくとも１つのトリテルペン成分からなる一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項２】
経口剤である請求項１記載の一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項３】
外用剤である請求項１記載の一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項４】
外用剤が、軟膏剤、テープ剤、バップ剤またはクリーム剤である請求項３記載の一酸化窒素産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一酸化窒素産生抑制剤、さらに詳しくは、アレルギー性疾患、慢性関節リウマチ、炎症性疾患の予防または治療に有用な有効成分としてトリテルペン成分を含有する一酸化窒素産生抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一酸化窒素（ＮＯ）は、哺乳類の細胞内において、Ｌ−アルギニンからＮＯ合成酵素（nitric oxide synthetase、ＮＯＳ）の触媒作用によって産生される。ここで、ＮＯＳは、非誘導型（constitutive ＮＯＳ、ｃＮＯＳ）と誘導型（inducible ＮＯＳ、ｉＮＯＳ）に分類される。ｃＮＯＳは、血管内皮細胞や胃粘膜細胞において恒常的に低濃度のＮＯの産生を触媒作用し、他方、ｉＮＯＳの発現量は、マクロファージや好中球などの炎症に関与する細胞、肝細胞や血管平滑筋において、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、サイトカインまたは病原体などの刺激によって活性化されて多量のＮＯを産生する。
例えば、生体内のマクロファージが病原体からの刺激を受けると、ｉＮＯＳの発現量が増加し、Ｌ−アルギニンからのＮＯ産生を促進する。産生されたＮＯは、腫瘍細胞のミトコンドリア系内の電子伝達系酵素に作用してその活性を阻害したり（免疫応答調節作用）、感染に対しての殺菌能力を有している。生体内でのＮＯの他の有効な作用としては、血管弛緩により血圧を低下させたり、あるいは多核白血球や血小板の接着を阻止して血小板の凝集を妨ぐことが挙げられる。
【０００３】
しかしながら、腎炎、肝障害や潰瘍性大腸炎、または慢性関節リウマチ、更にはアレルギー性疾患等の炎症性疾患によって、マクロファージから高濃度のＮＯが産生されると、ＮＯによって周辺組織が傷害され、自己免疫現象と類似の症状が発現することがあり、それにより別の疾患の発症を促進することがある。例えば、敗血症を患っている場合には、大量のＮＯの産生により心筋収縮力によるショック症状（敗血症性ショック）が引き起こされることもある。
【０００４】
ＮＯの過剰産生による組織や細胞の傷害または更なる疾患の発現もしくは促進を防ぐため、ＮＯが有効な濃度で生体内に存在するようにＮＯの産生を抑制する必要がある。そのため、ＮＯの産生に関与するＮＯＳの作用を阻害するＮＯＳ阻害剤や、ＮＯ産生抑制剤の開発が進められている。
実験室レベルで使用される代表的なＮＯＳ阻害剤（基質競合剤）としては、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）やＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）等のＬ−アルギニン誘導体（ここで、ＮＧは、グアニジノ基のＮ原子にニトロ基などが付いていることを表す。）が挙げられ、これらの構造式はいずれも基質であるＬ−アルギニンの構造式と類似している。ｉＮＯＳ誘導阻害剤としては、コルチコステロイドやセリンおよびシステイン・プロテアーゼ阻害剤等があり、あるいは天然起源のｉＮＯＳ誘導阻害に基づくＮＯ産生抑制作用を有する化合物として、月桂樹由来セスキテルペンのcostunolideやdehydrocostus lactone〔Matsuda H., Kageura T., Toguchida I., Ueda H., Morikawa T., Yoshikawa M., Life Sciences, 66巻, p. 2151−2157 （2000年）〕、ルバーブ由来スチルベンのrhapontigenin、piceatannol、resveratrol〔Matsuda H., Kageura T., Morikawa T., Toguchida I., Harima S., Yoshikawa M., Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 10巻, p. 323−327（2000年）〕、タクシャ由来トリテルペンのalisol F〔Matsuda H., Kageura T., Toguchida I., Murakami T., Kishi A., Yoshikawa M., Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 9巻, p. 3081−3086（1999年）〕等も報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し安全性の高い（すなわち、副作用の少ない）ＮＯ産生抑制剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＮＯ産生抑制活性を指標に、天然植物からの有効成分のスクリーニングを行った結果、スリランカやインドに自生するカンラン科 (Burceraceae)の潅木Balsamodendron mukul HOOK.に含有される（特に、この植物から得られる樹脂“Myrrha（ミルラ）”に含有される）５種の新規トリテルペンがいずれも強いＮＯ産生抑制活性を有することを見出した。
すなわち、本発明は、構造式：
【化２】
0004846104.tif 000002
（式中、Ｒ１は、水酸基またはケトン基[(＞Ｃ)＝Ｏ；ここで、＞ＣＯの炭素原子は母体構造の炭素骨格に含まれる]であり、ここで、Ｒ１が水酸基の場合、Ｒ２はヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはメチル基であり、またはＲ１がケトン基の場合、Ｒ２はヒドロキシメチル基またはカルボキシル基である。）
で表されるトリテルペン成分を有効成分として含有する一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤である。本発明において特徴的なこれらトリテルペン成分はいずれも、最も好ましくは、Myrrhaの有機溶媒（好ましくはアルコール系溶媒）抽出エキスから単離される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のＮＯ産生抑制剤において、有効成分であるトリテルペン成分は、カンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.からの有機溶媒抽出エキスに含有されることを特徴とする。本発明において、前記トリテルペン成分を含有する抽出エキスは、Balsamodendron mukul HOOK.のどの部分（例えば、葉、根など）を原料として用いてもよく、例えば、幹から得られる樹脂“myrrha（ミルラ）”をアルコール系溶媒で抽出したエキス等であり得る。
【０００８】
ここで、myrrhaは、アフリカ東部から東南アジアに至る広い地域に自生するカンラン科の潅木から得られる樹脂をいい、芳香性が強く、苦味があり、収斂性を有し、古代エジプトにおいてはミイラの防腐剤として使用されていた。また、中国では一般に没薬（モツヤク）と呼ばれ、健胃、通経、強壮に効用を有する生薬として内用されていたが、日本においては、口腔内の炎症の予防や治療のためのうがい薬や歯磨きとして、あるいは香料工業用原料として使用されている。
【０００９】
本発明のＮＯ産生抑制剤は、カンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.からの有機溶媒抽出エキス、特に好ましくは”myrrha（ミルラ）”からの有機溶媒抽出エキスを有効成分として含有する。有効成分は、具体的には、この有機溶媒抽出エキスから単離される新規トリテルペン５種（myrrhanol A、ＢおよびＣおよびmyrrhanone AおよびＢ）であるが、必要に応じて、有機溶媒抽出エキスのまま使用することも可能である。
【００１０】
以降の実施例では、カンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.の幹から得られる樹脂”myrrha”から有機溶媒抽出エキスを抽出する方法を詳細に説明するが、ここでは、基本的な抽出方法を説明する。先ず、粉砕したBalsamodendron mukul HOOK.（葉、根、myrrha等）に抽出用有機溶媒を加えて、使用する溶媒の沸点付近まで加熱した後、濾過し、濾別される残渣を前記有機溶媒で再度抽出し、濾過した後、得られる濾液を減圧濃縮することを含む。抽出に適した有機溶媒は、溶媒は、例えば、炭素数１〜６の低級アルコール、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、石油エーテルなどのようなアルコール、エーテル、エステルおよび飽和および不飽和の環式炭化水素（ここで、環は、アルキル基などで置換されていても、非置換であってもよい）から選択され、最も好ましくはメタノールを使用する。次に、こうして得られる有機溶媒抽出エキスに、水および酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を分離し、これを減圧濃縮することにより、酢酸エチル移行エキスを得る。また、残りの水層からも水移行エキスを得る。
本発明において、酢酸エチル移行エキスからは、カラムクロマトグラフィー法などを用いることにより、新規トリテルペン成分としてのmyrrhanol ＡおよびＣおよびmyrrhanone Aがそれぞれ分離でき、他方、水移行エキスからは、同様にして、新規トリテルペン成分としてのmyrrhanol Ｂおよびmyrrhanone Ｂがそれぞれ分離できる。
【００１１】
本発明のＮＯ産生抑制剤は、有効成分として、前記有機溶媒抽出エキスをそのままの形態で含有するか、または有機溶媒抽出エキスより単離される新規トリテルペン成分少なくとも１つを含有する。本発明において、前記エキスまたはトリテルペン成分は、ＮＯ産生抑制剤の全重量に対し、好ましくは0.1〜50重量％、より好ましくは３〜10重量％の量で含有されるが、この量は、ＮＯ産生抑制剤が適用される対象の年齢や体重により適宜変化してよい。
【００１２】
ＮＯ産生抑制剤は、より好ましくは経口剤または外用剤として提供される。そのため、本発明のＮＯ産生抑制剤は、提供される形態に応じて前記有効成分以外に、医薬分野において常用される既知の他の化合物、または例えば、粉末、固形剤、液剤に成型するのに必要な化合物を適宜包含されてよい。そのような化合物の具体例としては、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
【００１３】
ＮＯ産生抑制剤は、外用剤として提供される場合、例えば、軟膏剤、テープ剤、バップ剤またはクリーム剤であってよい。
【００１４】
対象へのＮＯ産生抑制剤の適用（または投与）量は、成人に対し、１日0.01〜２ｇであり、この１日分の適用量は、１〜３回に分けて使用することができる。
【００１５】
【実施例】
以下の実施例および製造例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例および製造例に限定されるものではない。
実施例１
Myrrha成分の単離
本発明のＮＯ産生抑制剤に有効性成分として含有される新規トリテルペン５種をそれぞれ、インド産myrrhaを原料として、以下の方法により単離した。
粉砕したmyrrha（1.85ｋｇ）にメタノール（７Ｌ）を加えて、80℃で３時間抽出した。これをろ過後、残渣をメタノールでさらに２回抽出した後、ろ液を合わせ、40℃以下で減圧濃縮・乾固してメタノール抽出エキス（105ｇ、5.7％）を得た。メタノール抽出エキスに水（２Ｌ）を加えて充分にエキスを分散させた後、酢酸エチル（３Ｌ）を加えてよく振盪した。酢酸エチル層を分離し、そこへ水（２Ｌ）を加えて分散させた後、酢酸エチル（３Ｌ）を加えて振盪する操作をさらに２回行った後、酢酸エチル層を分離し、減圧濃縮することにより、酢酸エチル移行部エキス（34ｇ、1.8％）を得た。他方、酢酸エチル層の分離により残った水層も同様に減圧濃縮を行い、水移行部エキス（63ｇ、3.4％）を得た。
【００１６】
酢酸エチル移行部を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（３：１およびその後１：１）、クロロホルム：メタノール（10：１）、およびメタノールを溶離液として順次用いて溶出して、メタノールフラクションＡ１〜Ａ10に分画した。
メタノールフラクションＡ２（1.1ｇ、0.06％）を、逆相ＯＤＳカラム[メタノール：水（80：20およびその後90：10）]で精製後、更に逆相ＨＰＬＣ[メタノール：水（90：10）]で精製することにより、myrrhanol Ｃ（156ｍｇ、0.0084％）を得た。
メタノールフラクションＡ４（4.5ｇ、0.24％）についても、メタノールフラクションＡ２と同様の精製操作を行って、myrrhanone Ａ（479ｍｇ、0.026％）を得た。メタノールフラクションＡ5（3.6ｇ、0.20％）を、逆相ＯＤＳカラム[メタノール：水（70：30およびその後80：20）]で精製した後、更に逆相ＨＰＬＣ[メタノール：水（85：15）]で精製を行って、myrrhanol Ａ（665ｍｇ、0.036％）を得た。
【００１７】
水移行部をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、クロロホルム：メタノール（▲１▼50：1、▲２▼20：1および▲３▼10：1の順）およびその後メタノールで順次溶出することにより、水フラクションＢ１〜Ｂ８に分画した。
水フラクションＢ３（2.2ｇ、0.12％）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[溶離液として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２：１）およびその後メタノールを使用]、逆相ＨＰＬＣ[移動相として、メタノール：水（85：15）を使用]、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[溶離液として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（2：1およびその後1：1）およびその後メタノールを使用]に順次付すことにより、精製し、myrrhanone Ｂ（247ｍｇ、0.013％）を得た。
水フラクションＢ４（1.7ｇ、0.094％）は、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー [溶離液として、メタノール：水（▲１▼70：30、▲２▼80：20および▲３▼90：10の順）およびその後メタノールを使用]、逆相ＨＰＬＣ[移動相として、メタノール：水（90：10）を使用]、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（2：1およびその後1：1）およびその後メタノールを使用]に順次付すことにより、精製し、myrrhanol Ｂ(46ｍｇ、0.0025％) を得た。
【００１８】
ここで、myrrhaからは、既知トリテルペンとしてmyrrhanone Ｃ[(８Ｒ)-3-オキソ-8-ヒドロキシ-ポリポーダ−１３Ｅ,１７Ｅ,２１-トリエン]が既に単離されており、その絶対構造も以下の通りであると判明している[Marner F. J., Freyer A.およびLex J.著、Phytochemistry, 30, 3709〜3712頁(1991年)参照]。
【化３】
0004846104.tif 000003
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第１位炭素から付された炭素番号を表す。
【００１９】
単離された各種新規トリテルペンは、化学構造を同定するために各種試験（旋光度測定、ＦＡＢ−ＭＳ測定、ＩＲ測定、１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲ測定）に付した。以下、各種試験結果をまとめる。
【００２０】
（１）myrrhanol A
[α]Ｄ２７＋12.2°(ｃ＝1.0, MeOH)
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：計算値m/z 483.3814(M+Na)＋、実測値；483.3830
ＦＡＢ−ＭＳ：m/z  483  (M+Na)＋
ＩＲ（フィルム）：3432、1462、1387、1046ｃｍ−１
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、500ＭＨｚ）δ：0.75 (1H, s, 24-H), 0.79 (1H, s, 25-H), 0.98 (1H, s, 23-H), 1.02 (1H, t-like, 9-H), 1.13 (1H, s, 26-H), 1.60 (1H, s, 27-H), 1.60 (1H, s, 28-H), 1.65 (1H, s, 29-H), 3.21 (1H, dd, J=4.9, 11.6 Hz, 3-H), 3.96 (1H, s, 30-H), 5.12 (1H, dd, J=5.8, 6.7 Hz, 17-H), 5.16 (1H, dd-like, 13-H), 5.38 (1H, dd-like, 21-H)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、125ＭＨｚ）δｃ：13.7 (29-C), 15.4 (24-C), 15.5 (25-C), 16.0 (28-C), 16.2 (27-C), 20.2 (6-C), 23.7 (26-C), 25.5 (11-C), 26.1 (20-C), 26.5 (16-C), 27.0 (2-C), 28.1 (23-C), 31.3 (12-C), 37.9 (1-C), 38.8 (4-C), 38.8 (10-C), 39.3 (19-C), 39.6 (15-C), 44.3 (7-C), 55.0 (5-C), 61.1 (9-C), 68.6 (30-C), 73.9 (8-C), 78.6 (3-C), 124.5 (17-C), 125.1 (13-C), 125.7 (21-C), 134.6 (18-C), 134.7 (22-C), 135.0 (14-C)
【００２１】
上記結果より、myrrhanol Aは正の旋光性を示す無色油状物質として単離され、ＦＡＢ−ＭＳおよび高分解能ＦＡＢ−ＭＳにより、分子式Ｃ３０Ｈ５２Ｏ３を有する化合物であることが明らかとなった。
１Ｈ−ＮＭＲ測定結果（位相検波ＮＯＥＳＹスペクトルデータ）では、３位プロトンと２３位メチルプロトン、５位プロトンと３位、９位プロトン、２５位メチルプロトンと２４位、２６位メチルプロトン、２１位プロトンと３０位メチレンプロトン間にそれぞれ相関が観測された。更には、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、２７位、２８位および２９位メチル基が高磁場シフト[δｃ  １６.２(Ｃ-27)、１６.０(Ｃ-28)、１３.７(Ｃ-29)]していることから、myrrhanol Aの相対立体配置は５位、９位プロトン、２３位メチル基および８位水酸基がα配置、２４位、２５位および２６位メチル基および３位水酸基がβ配置、および１３−１４位間、１７−１８位間、２１−２２位間のジオメトリーがＥ配置であることが判明した。さらに、絶対構造については改良Mosher法を適用することで決定した。すなわち、myrrhanol Aを、1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）と4-ジメチル-アミノピリジン（ＤＭＡＰ）との存在下、Ｒ体およびＳ体のα-メトキシ-α-トリフルオロメチルフェニル酢酸（ＲおよびＳ−ＭＴＰＡ）で処理し、Ｒ−およびＳ−ＭＴＰＡエステル体に誘導した。
そして、これらの化学シフトの差[Δδ＝δＳ−δＲ]が、３位水酸基を境にして２３位および２４位メチルプロトンで正に、他方、１位、２位プロトンおよび２５位メチルプロトンで負に観測されたことから、myrrhanol Ａの３位はＳ配置であること見出した。
【００２２】
以上の検討結果より、myrrhanol Ａは、３Ｓ、５Ｒ、８Ｒ、９Ｒ、１０Ｓ、１３Ｅ、１７Ｅ、２１Ｅ配置の、以下の化学構造を有する化合物であると決定された。
【化４】
0004846104.tif 000004
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第１位炭素から付された炭素番号を表す。
【００２３】
（２）myrrhanol Ｂ
旋光度 [α]Ｄ２８＋10.6°(c=1.0、MeOH)
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：計算値m/z 497.3607(M+Na)＋、実測値；497.3602
ＦＡＢ−ＭＳ：m/z  497  (M+Na)＋
ＩＲ（フィルム）：3453, 1654, 1466, 1387, 1124 cm−１
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、500ＭＨｚ）δ：0.76 (1H, s, 24-H), 0.80 (1H, s, 25-H), 0.99 (1H, s, 23-H), 1.05 (1H, t-like, 9-H), 1.15 (1H, s, 26-H), 1.59 (1H, s, 27-H), 1.59 (1H, s, 28-H), 1.81 (1H, s, 29-H), 3.23 (1H, dd, J=4.8, 10.9 Hz, 3-H), 5.10 (1H, dd, J=6.9, 13.4 Hz, 13-H), 5.10 (1H, dd, J=6.9, 13.4 Hz, 17-H), 5.38 (1H, dd, J=5.8, 7.4 Hz, 21-H)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δｃ：12.2 (29-C), 15.4 (24-C), 15.6 (25-C), 15.9 (28-C), 16.2 (27-C), 20.3 (6-C), 23.7 (26-C), 25.7 (11-C), 26.1 (16-C), 27.0 (20-C), 27.1 (2-C), 28.2 (23-C), 31.5 (12-C), 37.9 (15-C), 38.0 (1-C), 38.8 (4-C), 38.8 (10-C), 39.4 (19-C), 44.2 (7-C), 55.0 (5-C), 61.3 (9-C), 74.6 (8-C), 78.8 (3-C), 125.2 (13-C), 125.2 (17-C), 125.3 (22-C), 133.3 (14-C), 134.3 (18-C), 143.8 (21-C), 171.7 (30-C)
【００２４】
myrrhanol Ｂは、正の旋光性を有する無色油状物質として単離され、ＦＡＢ−ＭＳおよび高分解能ＦＡＢ−ＭＳの解析結果から分子式Ｃ３０Ｈ５２Ｏ４を有する化合物であると決定された。
myrrhanol Ｂの１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータをmyrrhanol Ａと比較すると、側鎖部分を除くデータが非常に類似していた。しかしながら、myrrhanol Ａで認められたヒドロキシメチル基に由来するシグナルが消失し、新たにカルボキシル基に由来するシグナルが認められた。さらにＨＭＢＣスペクトルでは、２１位と３０位、２９位と２１位、２９位と２２位、２９位と３０位のプロトン−カーボン間に相関が観測されたことから、myrrhanol Ｂは、myrrhanol Ａの３０位ヒドロキシル基がカルボキシル基になった構造であることが明らかになった。
さらに、myrrhanol Ｂの絶対配置の決定は、メチル化後、改良Mosher法を適用してmyrrhanone Ｃへ化学誘導することにより、myrrhanone Ｃと同一の配置であることを確認した。これにより決定されたmyrrhanol Ｂの化学式を以下に示す。
【化５】
0004846104.tif 000005
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第１位炭素から付された炭素番号を表す。
【００２５】
（３）myrrhanol Ｃ
旋光度 [α]Ｄ２８＋14.6°(c=1.0、MeOH)
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：計算値m/z 467.3865(M+Na)＋、実測値；467.3878
ＦＡＢ−ＭＳ：m/z  497  (M+Na)＋
ＩＲ（フィルム）：3453, 1658, 1456, 1387, 1048 cm-1
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、500ＭＨｚ）δ：0.76 (1H, s, 24-H), 0.80 (1H, s, 25-H), 0.99 (1H, s, 23-H), 1.02 (1H, t-like, 9-H), 1.13 (1H, s, 26-H), 1.60 (1H, s, 27-H), 1.60 (1H, s, 28-H), 1.61 (1H, s, 30-H), 1.68 (1H, s, 29-H), 3.21 (1H, dd, J=5.0, 10.9 Hz, 3-H), 5.11 (1H, dd-like, 13-H), 5.11 (1H, dd-like, 17-H), 5.17 (1H, dd-like, 21-H)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δｃ：15.4 (24-C), 15.5 (25-C), 16.0 (28-C), 16.2 (27-C), 17.7 (29-C), 20.2 (6-C), 23.7 (26-C), 25.6 (11-C), 25.7 (30-C), 26.6 (16-C), 26.7 (20-C), 27.1 (2-C), 28.1 (23-C), 31.3 (12-C), 37.8 (1-C), 38.8 (4-C), 38.8 (10-C), 39.7 (15-C), 39.7 (19-C), 44.3 (7-C), 55.0 (5-C), 61.2 (9-C), 73.9 (8-C), 78.7 (3-C), 124.2 (17-C), 124.9 (13-C), 124.9 (21-C), 131.2 (22-C), 134.9 (18-C), 135.2 (14-C)
【００２６】
myrrhanolＣも、myrrhanol ＡおよびＢと同様に、正の旋光性を有する無色油状物質として単離され、ＦＡＢ−ＭＳおよび高分解能ＦＡＢ−ＭＳの解析結果から分子式Ｃ３０Ｈ５２Ｏ２を有する化合物であると決定された。また、myrrhanol Ｃは、１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータをmyrrhanol Ａと比較すると、myrrhanol Ａで認められたヒドロキシメチル基に由来するシグナルが消失し、代わりにメチル基に由来するシグナルが認められた。
さらに、ＨＭＢＣスペクトルでは、２１位と３０位、２９位と２１位、２９位と２２位、２９位と３０位のプロトン−カーボン間に相関が観測されたことから、myrrhanol Ｃは、myrrhanol Ａの３０位ヒドロキシル基がメチル基になった構造であることが明らかになった。
myrrhanol Ｃの絶対配置は、絶対構造既知のmyrrhanone Ｃの３０位ヒドロキシル基をメチル基に還元する化学誘導により、myrrhanone Ｃと同一の配置であることを確認することにより決定した。決定されたmyrrhanol Ｃの化学式を以下に示す。
【化６】
0004846104.tif 000006
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第１位炭素から付された炭素番号を表す。
【００２７】
（４）myrrhanone A
旋光度 [α]Ｄ２７＋11.9°(c=1.0、MeOH)
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：計算値m/z 481.3658(M+Na)＋、実測値；481.3669
ＦＡＢ−ＭＳ：m/z  481  (M+Na)＋
ＩＲ（フィルム）：3453, 1650, 1456, 1387, 1080 cm-1
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、500ＭＨｚ）δ：0.95 (1H, s, 25-H), 1.02 (1H, s, 24-H), 1.09 (1H, s, 23-H), 1.13 (1H, t, J=4.0 Hz, 9-H), 1.19 (1H, s, 26-H), 1.60 (1H, s, 27-H), 1.60 (1H, s, 28-H), 1.65 (1H, s, 29-H), 3.96 (1H, s, 30-H), 5.12 (1H, dd-like, 17-H), 5.16 (1H, dd-like, 13-H), 5.39 (1H, dd-like, 21-H)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δｃ：13.7 (29-C), 15.5 (25-C), 16.0 (28-C), 16.2 (27-C), 21.3 (6-C), 21.3 (24-C), 23.7 (26-C), 25.8 (11-C), 26.1 (20-C), 26.3 (2-C), 26.3 (23-C), 26.5 (16-C), 31.2 (12-C), 38.3 (1-C), 38.5 (10-C), 39.3 (19-C), 39.6 (15-C), 43.7 (7-C), 47.4 (4-C), 55.1 (5-C), 60.3 (9-C), 68.6 (30-C), 73.6 (8-C), 124.4 (17-C), 124.8 (13-C), 125.7 (21-C), 134.6 (18-C), 134.6 (22-C), 135.1 (14-C), 217.0 (3-C)
【００２８】
myrrhanone Ａは、無色油状の物質として単離され、ＦＡＢ−ＭＳおよび高分解能ＦＡＢ−ＭＳ、１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータをおよびＨＭＢＣスペクトルデータの解析結果から分子式Ｃ３０Ｈ５０Ｏ３で表される化合物であると決定された。
さらに、得られたmyrrhanone ＡをＮａＢＨ４を用いて還元してmyrrhanol Ａに化学誘導し、これらが同一の配置であることを確認することにより、myrrhanone Ａの絶対構造を決定した。決定されたmyrrhanone Ａの化学式を以下に示す。
【化７】
0004846104.tif 000007
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第１位炭素から付された炭素番号を表す。
【００２９】
（５）myrrhanone B
旋光度 [α]Ｄ２７＋13.5°(c=1.0、MeOH)
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：計算値m/z 495.3450(M+Na)＋、実測値；495.3461
ＦＡＢ−ＭＳ：m/z  495  (M+Na)＋
ＩＲ（フィルム）：3432, 1699, 1654, 1456, 1387, 1080 cm−１
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、500ＭＨｚ）δ：1.02 (1H, s, 24-H), 0.80 (1H, s, 25-H), 1.09 (1H, s, 23-H), 1.16 (1H, t, J=4.0 Hz, 9-H), 1.21 (1H, s, 26-H), 1.61 (1H, s, 27-H), 1.59 (1H, s, 28-H), 1.82 (1H, s, 29-H), 5.13 (1H, dd-like, 17-H), 5.13 (1H, dd-like, 13-H), 5.38 (1H, t, J=5.9 Hz, 21-H)
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δｃ：12.0 (29-C), 14.7 (25-C), 15.8 (28-C), 16.0 (27-C), 21.2 (6-C), 21.2 (24-C), 23.4 (26-C), 25.7 (11-C), 26.1 (2-C), 26.2 (23-C), 27.0 (16-C), 31.2 (12-C), 33.8 (20-C), 37.9 (15-C), 38.1 (1-C), 38.4 (10-C), 39.3 (19-C), 43.4 (7-C), 47.4 (4-C), 55.0 (5-C), 60.2 (9-C), 74.0 (8-C), 124.9 (17-C), 125.2 (13-C), 127.1 (22-C), 133.4 (14-C), 134.6 (18-C), 144.0 (21-C), 172.2 (30-C), 216.9 (3-C)
【００３０】
myrrhanone Ｂは、無色油状の物質として単離され、ＦＡＢ−ＭＳおよび高分解能ＦＡＢ−ＭＳ、１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータをおよびＨＭＢＣスペクトルデータの解析結果から分子式Ｃ３０Ｈ５０Ｏ３で表される化合物であると決定された。
myrrhanone Ｂの絶対構造は、myrrhanone Ａについての記載と同様にしてＮａＢＨ４を用いて還元し、myrrhanol Ｂに誘導できることを確認することにより決定した。決定されたmyrrhanone Ｂの化学式を以下に示す。
【００３１】
【化８】
0004846104.tif 000008
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第１位炭素から付された炭素番号を表す。
【００３２】
実施例３
ＮＯ産生抑制活性の評価
本発明における有効成分である各新規トリテルペン（myrrhanol A、ＢおよびＣおよびmyrrhanone AおよびＢ）について、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激によるマウス腹腔内マクロファージからのＮＯ産生に対する抑制効果を検討した。
ddy系雄性マウスの腹腔より得た滲出細胞を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン100単位／ｍＬ、ストレプトマイシン100μｇ／ｍＬを含むRPMI-1640培地に5×10６個／ｍＬになるようにサスペンドし、96穴培養プレートに100μＬずつ播種した。37℃、５％ＣＯ２条件下で1時間培養後、非付着性の細胞を培地ごと除去した。ここに、本発明の新規トリテルペンをそれぞれ10μＭ、30μＭおよび100μＭとLPS 10μｇ／ｍＬとを含む新しい培地を100μＬずつ添加して20時間培養後、培地中に産生されたＮＯをグリース法により定量した。
【表１】
表１：リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激による一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制効果
0004846104.tif 000009
上記表１中、各結果はそれぞれ平均値±標準誤差で表し、また各結果の末尾の符号「**」は、Dunnettの多重比較検定による対照との有意差：ｐが０.０１未満であったことを表す。
【００３３】
表１の結果より、いずれのトリテルペンもＮＯ産生抑制活性を有し、特にmyrrhanol Aの活性が最も強いことが判明した。
【００３４】
以下に、本発明の新規トリテルペンを含有する一酸化窒素産生抑制剤を例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例１：ドリンク剤の製造
【００３５】
0004846104.tif 000010
〔製法〕
処方に従って上記の成分を蒸留水800 mlに溶解し、蒸留水を加えて全量1000 ｍＬとした後、0.22μｍの滅菌フィルターで滅菌し、100ｍＬずつ褐色びんに無菌充填して、１剤あたり10ｍｇのmyrrhanol Aを含有するドリンク剤を得た。
【００３６】
製造例２：軟膏剤の製造
0004846104.tif 000011
〔製法〕
上記全組成を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を調製した。
【００３７】
製造例３：テープ剤の製造
0004846104.tif 000012
〔製法〕
上記全組成を加熱攪拌したものをテープ状に展延して調製した。
【００３８】
製造例４：バップ剤の製造
0004846104.tif 000013
〔製法〕
上記全組成を練合したものを、基布上に展延して調製した。
【００３９】
製造例５：クリーム剤の製造
0004846104.tif 000014
〔製法〕
上記全組成を混和してクリーム剤を調製した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤は、有効成分としてカンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.からの有機溶媒抽出エキス、特にこの植物の幹より得られる樹脂“myrrha（ミルラ）”からの有機溶媒抽出エキスに含有される新規トリテルペン成分を含有する。このトリテルペン成分は、天然植物起源であることから、入手が容易で、さらには生体に対する安全性も高い。
本発明のＮＯ産生抑制剤は、上記抽出エキスから単離される新規トリテルペン成分少なくとも１つを有効成分として含有することにより、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激によるマウス腹腔内マクロファージからのＮＯ産生に対し、優れた抑制効果を発現し、特にmyrrhanol Aの活性が最も強い。
本発明では、このＮＯ産生抑制剤を、経口剤または外用剤の形態で適宜対象に適用（投与）できる。