(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである機能的に活性なエンドスタチンを作動可能にコードし、かつ発現するレンチウイルスベクターを有効成分とする、眼球血管新生に罹患した個体の脈絡膜血管新生の割合を改善または低下させる医薬であって、該個体に眼内注射または眼内投与することにより使用される、医薬。
【請求項２】
レンチウイルスベクター中のエンドスタチンコード核酸が配列番号２に示す配列を含む、請求項１の医薬。
【請求項３】
眼球血管新生が黄斑変性症によって引き起こされている、請求項１の医薬。
【請求項４】
網膜下投与のための、請求項１の医薬。
【請求項５】
硝子体内投与のための、請求項１の医薬。
【請求項６】
レンチウイルスベクターがウシ免疫不全ウイルスベクターである、請求項１の医薬。
【請求項７】
網膜下投与のための、請求項６の医薬。
【請求項８】
硝子体内投与のための、請求項６の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、眼球血管新生の予防および治療処置のための方法に関する。この発明はまた、眼球血管新生の処置において使用し得る、ベクター、より特にレトロウイルスベクターに関する。
【０００２】
発明の背景
眼球血管新生は、過去には首尾良く処置されていない。目の前部の組織（すなわち角膜、虹彩、および小柱網）の血管新生および、目の後部の状態、例えば網膜、網膜下、黄斑、および視神経頭血管新生を含む他の状態を、本発明の方法の適用によって予防および処置できる。本方法は、血管新生の緩解のために提供することを含む、眼球血管新生を予防および処置するのに有用である。
【０００３】
発明の要約
本発明は、個体における眼球血管新生の処置のための方法であって、眼球血管新生に罹患する個体における、個体の眼組織のエンドスタチンのインビボ濃度の、眼球血管新生阻害有効量への増加を実施することを含む方法を提供し、ここでエンドスタチンは、インビボの抗眼球血管新生活性を有する。
【０００４】
好ましい側面では、エンドスタチンはエンドスタチンの活性フラグメントである。
更なる側面では、本発明の方法で使用されるエンドスタチンは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。さらなる好ましい側面では、エンドスタチンは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチドフラグメント、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体、または配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体である。そのような活性フラグメントおよび変異体の例は、例えば引用によりその全体をここに含める米国特許６１７４８６１に示される。
【０００５】
さらなる好ましい側面では、本発明は、個体における眼球血管新生の処置のための方法であって、眼球血管新生に罹患する個体において、個体の眼組織のエンドスタチンのインビボ濃度の、眼球血管新生阻害有効量への増加を実施することを含む方法を提供し、ここで該増加は、個体へ外生エンドスタチンを投与することによって実施する。
【０００６】
さらなる好ましい側面では、本発明は、個体の眼球血管新生の処置のための方法であって、眼球血管新生に罹患する個体において、個体の眼組織におけるエンドスタチンのインビボ濃度の、眼球血管新生阻害有効量への増加を実施することを含む方法を指向し、ここでエンドスタチンはインビボで抗眼球血管新生活性を有し、ここで該増加は、個体内で生産されるべきエンドスタチンを生じさせることによって実施される。
【０００７】
より好ましい側面では、該増加は、エンドスタチンをコードする核酸を含むウイルスベクターの有効量を、個体に投与することによって実施される。最も好ましい側面では、該ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択され、そして眼内に投与される。
【０００８】
さらなる好ましい側面では、本発明は、個体における眼球血管新生の処置のための方法であって、眼球血管新生を罹患する個体において、個体の眼組織のエンドスタチンのインビボ濃度の、眼球血管新生阻害有効量への増加を実施することを含む方法を指向し、ここでエンドスタチンはインビボで抗眼球血管新生活性を有し、ここで該増加は、少なくとも１つのマイクロカプセルを個体内にインプラントすることによって実施し、ここで該マイクロカプセルはエンドスタチンを分泌するセルを含む。
【０００９】
発明の詳細な記載
エンドスタチンは、腫瘍血管形成および成長を阻害すると見出された、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの切断産物である。インターフェロンα２ａはまた、腫瘍血管形成を阻止し、そして血管腫の緩解を生じるが、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に効果がない。したがって、腫瘍血管形成の阻害剤は、眼球血管新生を必ずしも阻害しない。本発明は、個体の眼組織におけるエンドスタチンのインビボ濃度を、眼球血管新生阻害有効量に増加させることは、眼球血管新生の処置において有効であるという、驚くべきかつ予測できない発見を叙述する。
【００１０】
よって、本発明は、眼球血管新生、例えばＣＮＶの予防または治療的処置のための方法を提供する。「処置」は、予防および治療的処置を含む。「予防」によって、全部または一部における、眼球血管新生に対する保護を意味する。「治療」によって眼球血管新生それ自体の緩解、およびさらなる眼球血管新生に対する、全部または一部における、保護を意味する。本発明はとくに、黄斑変性症、例えば年齢関連性黄班変性症による脈絡膜血管新生の処置において有用である。しかし、本発明の方法はまた、眼球血管新生の他の型であって、例えばレーザー光凝固術または光力学的治療で処置された、処置されている、または処置されるであろう、持続性および再発性脈絡膜血管新生を含むもの処置において、および存在する脈絡膜血管新生の外科的除去後の存続または再発する脈絡膜血管新生の処置において有用である。
【００１１】
加えて、本方法は、ヒストプラズマ症および病的近視のための脈絡膜血管新生並びに網膜色素線条、前部虚血性視神経症、細菌性心内膜炎、Best病、birdshot網膜脈絡膜病、脈絡膜血管腫、脈絡膜母斑、脈絡膜非潅流、脈絡膜骨腫、脈絡膜破裂、先天性脈絡膜欠如、慢性網膜剥離、網膜の欠損、ドルーゼ、内因性カンジダ眼内炎、網膜色素上皮の過剰乳頭状過誤腫、黄色斑眼底、特発性、黄斑円孔、悪性黒色腫、膜増殖性糸球体腎炎（ＩＩ型）、金属性眼内異物、朝顔円盤症候群、多発性一過性白点症候群（ＭＥＷＤＳ）、鋸状炎の血管新生、手術顕微鏡熱傷、視神経頭小窩、光凝固術、斑点状内部脈絡膜症、風疹、類肉腫症、蛇行性または地図状脈絡膜症、網膜下排液、傾斜性椎間板症候群、トキソプラズマ網脈絡膜炎、結核、またはVogt-Koyanagi-Harada症候群からとりわけ生じる脈絡膜血管新生の処置において有用である。
【００１２】
本発明の方法で処置できる眼球血管新生の他の型は、糖尿病性網膜症、非糖尿病性網膜症、枝静脈閉塞、中枢網膜静脈閉塞、未成熟幼児の網膜症、虹彩ルベオシス、新生血管緑内障、perifoveal網膜血管拡張症、鎌状細胞網膜症、Eale病、網膜脈管炎、Von Hippel Lindau病、放射線網膜症、網膜凍傷、色素性網膜症、網脈絡膜欠損症、単純ヘルペス角膜炎、角膜潰瘍、角膜移植、pterigiaまたは外傷による角膜血管新生である。
【００１３】
本発明は、眼球血管新生に罹患する個体の眼球血管新生の処置のための方法であって、眼球血管新生に罹患する個体の眼血管組織におけるエンドスタチンの量の、目血管新生阻害有効量への増加を実施することを含む方法を指向する。
【００１４】
ここで使用するように、エンドスタチンの「眼球血管新生阻害有効量」は、１）眼球血管新生の緩解（すなわち眼球血管新生の量の減少）；２）眼球血管新生の阻害；または３）眼球血管新生の割合の減少のいずれかまたはすべてを生じる、エンドスタチンのその量である。
【００１５】
用語「エンドスタチンをコードするＤＮＡ配列」は、ここで使用するように、完全長エンドスタチンまたはエンドスタチンの活性フラグメント、誘導体または類似体をコードするＤＮＡを意味し、例えばそのようなＤＮＡは、完全長エンドスタチンをコードする完全長遺伝子、または途切れ遺伝子またはエンドスタチン活性を有するそのようなエンドスタチンのフラグメントまたは誘導体またはアナログをコードする突然変異遺伝子であり得る。用語「ＤＮＡ配列」は、一般に、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびより具体的に、隣接ペントースの３’および５’炭素の間で、互いにホスホジエステル結合によって接続されたデオキシリボヌクレオチドの線形連を言及する。
【００１６】
こうして、１実施態様では、本発明は、エンドスタチン、またはエンドスタチン活性を有するそのフラグメント、誘導体または類似体をコードするＤＮＡ配列を指向する。
エンドスタチンおよびそのフラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列は、引用によりここに全体が含まれる米国特許５８５４２０５に示され、記載される。
【００１７】
用語「エンドスタチン」は、それぞれ非還元性および還元性ゲル電気泳動によって定量されるような、好ましくは１８ｋＤａないし２０ｋＤａのオキサであるタンパク質を言及する。用語「エンドスタチン」はまた、１８ｋＤａないし２０ｋＤａタンパク質の活性前駆体形態を含む。完全長ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。完全長ヒトエンドスタチンをコードする核酸配列を配列番号２に示す。マウスエンドスタチン、加えてマウスＩｇカッパリーダー配列のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。マウスＩｇカッパリーダー配列を有するマウスエンドスタチンをコードする核酸配列は、配列番号４にしめす。
【００１８】
用語エンドスタチンはまた１８ｋＤａないし２０ｋＤａタンパク質のフラグメントおよび修飾タンパク質およびペプチドであって、実質的に類似するアミノ酸配列を有し、かつ内皮細胞の増殖を阻害できるものを含む。例えば、アミノ酸のサイレント置換であって、構造的または化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換が顕著には、該タンパク質の構造、コンホメーション、または活性を変化させないものは、当業界で周知である。そのようなサイレント置換は、添付クレームの範囲内に含むことを意図する。
【００１９】
用語「エンドスタチン」が短縮されたポリペプチドであって、１または２以上のアミノ酸が完全長エンドスタチン（すなわち配列番号１のポリペプチド）のいずれかまたは両方の末端から、または該タンパク質の内部領域から除去されているが、なお得られる分子が内皮細胞増殖を阻害および／または眼球血管新生を処置するのに有効のままであるものを含むことが認識される。そのような短縮化ポリペプチドは、ここに「フラグメント」として言及する。用語「エンドスタチン」はまた、延長化タンパク質またはペプチドであって、エンドスタチンのいずれかまたは両方の末端に、１または２以上のアミノ酸が付加されるが、なお得られる分子は内皮増殖阻害活性を保持するものを含む。例えば第１位置にチロシンを付加されたそのような分子は、例えば１２５Ｉを使用して標識するために有用である。他の放射性同位体での標識は、エンドスタチンレセプターを含む標的細胞を破壊するための分子手段を提供することにおいて有用であり得る。「ターゲティング」分子、例えばリシンでの標識は、エンドスタチンレセプターで細胞を破壊するための機構を提供し得る。延長化エンドスタチンポリペプチドまたは共有的に修飾されたエンドスタチンポリペプチドは集合的に、ここに「エンドスタチン」の誘導体として言及する。
【００２０】
「実質的な配列相同性」は、エンドスタチンアナログ配列中のアミノ酸残基配列とエンドスタチンのそれとの間の少なくとも近似的に７０％相同性、好ましくは少なくとも近似的に８０％相同性、より好ましくは少なくとも近似的に９０％相同性を意味する。
【００２１】
また用語エンドスタチンの定義には、エンドスタチンタンパク質の修飾物とそのペプチドフラグメントが含まれる。そのような修飾物は、天然に存在するアミノ酸の、特定の部位での、限定しないが天然または非天然存在アミノ酸を含む他の分子での置換を含む。そのような置換は、エンドスタチンの生物活性を修飾し、そして生物学的または薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストを生産し得る。そのような修飾されたポリペプチドは、ここに「変異体」として言及する。抗腫瘍および／または抗血管形成効果を有することが示されたエンドスタチンの変異体、誘導体およびフラグメントは、既知で、そして、例えば引用によりその全体をここに含める公開国際特許出願番号ＷＯ００６７７７１、ＷＯ００６３２４９、ＷＯ９９３１６１６、ＷＯ９９２９８５５およびＷＯ９９４８９２４に報告された。そのようなエンドスタチンの変異体、誘導体およびフラグメントはまた、本発明の方法において有用である。
【００２２】
本発明のプラクチスにおいて有用なポリペプチドは、慣行医薬製剤を使用する処置の必要な個体へ送達できる。
【００２３】
本発明の追加的実施態様は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、医薬組成物の、前議論の治療的効果のいずれかのための投与に関する。そのような医薬組成物は、エンドスタチン、例えばエンドスタチン、またはエンドスタチンへの抗イディオタイプ抗体、またはエンドスタチンのミメチックからなり得る。組成物を単独または少なくとも１の他の剤、例えば安定剤化合物と組み合わせて投与し得、これを限定しないが、生食水、緩衝生食水、デキストロース、および水を含む任意の滅菌、生物両立可能薬学的担体において投与し得る。組成物を、患者に単独で、または他の剤、薬物またはホルモンと組みあわせて投与し得る。
【００２４】
本発明に包含される医薬生物を、限定しないが経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、骨髄内、鞘内、空洞内、経皮、皮下、腹膜内、鼻内、経腸、局所、舌下または直腸を含む任意の数の経路に投与し得る。
【００２５】
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む好適な薬学的に許容される担体であって、活性化合物の、薬学的に使用できる調製品ヘの加工を容易化するものを含み得る。製剤および投与のための技術についてのさらなる詳細は、RemingtonのPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, Pa)の最近版に見出し得る。
【００２６】
経口使用のための薬学的調製品は、活性化合物の、固体賦形剤との組み合わせ、所望により得られる混合物を粉砕すること、および望まれれば好適な補助剤の添加後、顆粒の混合物の加工で取得し、錠剤またはドラジェーコアを取得できる。好適な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物からのスターチ；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース；アラビアまたはトラガカントを含むガム；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンを含む。要すれば、崩壊または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加し得る。
【００２７】
ドラジェーコアを、好適な被覆、例えばアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタニウム、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る濃縮糖溶液と組み合わせて使用し得る。染料または色素を、製品同定のためまたは活性化合物の量、すなわち用量の特徴づけのため錠剤またはドラジェー被覆に添加し得る。
【００２８】
経口的に使用し得る薬学的調製品は、ゼラチンから作成のプッシュフィットカプセル、並びにゼラチンから作成されたソフト、シールされたカプセル、および被覆、例えばグリセロールまたはソルビトールを含む。プッシュフィットカプセルは、充填剤または結合剤、例えばラクトースまたはデンプン、滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および所望により安定剤と混合された活性成分を含み得る。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、好適な液体、例えば油脂、液体、または安定剤を有するまたは有しない液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。
【００２９】
非経腸投与に好適な薬学的製剤を、水溶液において、好ましくは生理学的両立可能緩衝液、例えばHank溶液、Ringer溶液または生理学的緩衝性生食水中に処方し得る。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含み得る。追加的に、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製し得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、油脂例えばごま油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリドまたはリポソームを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーはまた、送達のため使用し得る。所望により、懸濁液はまた、好適な安定剤または化合物の可溶性を増加させる剤を含み得、高度に濃縮された溶液の調製を可能とする。
【００３０】
局所または経鼻投与のため、貫通されるべき特定の障壁のため適当な浸透剤を、製剤中に使用し得る。そのような浸透剤は一般に、当業界で既知である。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、当業界既知態様で製造し得、例えば慣行混合、溶解、顆粒形成、ドラジェー作成、乳化、カプセル化、エントラッピング、または凍結乾燥工程による。
【００３２】
医薬組成物は、塩として提供し得、そして限定しないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸と形成し得る。塩は、水性または他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりもより可溶性である傾向にある。他の場合には、好ましい調製品は、以下のいずれかまたは全部を含み得る凍結乾燥粉末であり得る：１−５０ｍＭのヒスチジン、０．１％−２％のスクロース、および２−７％のマンニトール、ｐＨ範囲は４．５ないし５．５であり、使用前に緩衝液と合わせる。
【００３３】
医薬組成物を調製した後、これらは適当な容器中に配置し、そして指摘条件の処置のためラベルをつけることができる。エンドスタチンの投与のために、そのようなラベル付加は、投与の量、頻度および方法を含むだろう。
【００３４】
本発明の使用のため好適な医薬組成物は、組成物であって、ここで活性成分が、意図された目的を達成する有効量で含まれるものを含む。有効用量の決定は、当業者能力のよく範囲内である。
【００３５】
活性剤の治療的有効用量は当初に、例えば内皮細胞の細胞培養アッセイ、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタ動物モデルで評価し得る。動物モデルをまた使用し、投与の適当濃度範囲および経路を決定し得る。そのような情報を次いで使用し、ヒト投与のためのの有用用量および経路を決定し得る。
【００３６】
治療的有効用量は、例えばエンドスタチン、またはそのフラグメント、エンドスタチンへの抗体、エンドスタチンのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の活性成分の量であって症状または状態を緩解するものに言及する。治療的効験および毒性は、細胞培養または実験動物において標準的薬学的手法、例えばＥＤ５０（集団の５０％が治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死用量）において決定し得る。毒性および治療的効果の間の用量比率は、治療的指数であり、そして比率、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現し得る。大きい治療的指数を示す医薬組成物は、好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から取得されたデータを、ヒト使用のための投与の範囲を処方するにおいて使用する。そのような組成物に含まれる用量は好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与の経路に依存するこの範囲内で変化する。
【００３７】
正確な用量は、処置を要する対象に関連する要因の観点から実施者によって決定される。用量および投与は調節され、活性部分の十分なレベルを提供しまたは望まれる効果を維持する。考慮し得る要因は、疾患状態、対象の全般健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物組み合わせ、反応感受性、および治療ヘの耐性および応答を含む。長期作用医薬組成物を３ないし４日、毎週、または2週間ごとに1回、特定製剤の半減期およびクリアランスに依存して投与し得る。
【００３８】
通常の、例えば、外生的に生産されたエンドスタチンを投与するとき、の量は、投与の経路および方法に依存して、１日あたり約０．１ないし約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは1日あたり２．５ないし２０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。特定の用量および送達の方法についての案内は、文献に提供され、当業界の実務家に一般に利用可能である。当業者は、種々の製剤を、タンパク質またはそれらの阻害剤についてよりも、ヌクレオチドについて使用する。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的である。ミクロスフェア、ナノスフェアおよびインプラントを含む種々の生物分解可能および生物両立可能ポリマー性マトリクスが、本発明の実施化で有用である。
【００３９】
ミクロスフェアは、活性薬物を含む微球形粒子である。これらは、粒子のサイズによって、第1にナノスフェアと区別される；ミクロスフェアは、近似的に１０００μｍより小さい直径を有し、一方ナノスフェアは下位ミクロン性（＜１μｍ）である。ミクロスフェアシステムは、均質モノリシックミクロスフェアであって、薬物がポリマー性マトリクス中に均質に溶解または分散されているものか、リザーバー型ミクロスフェアであって、薬物がポリマー性マトリクスル膜シェルによって取り囲まれているものを含む。モノリシックおよびリザーバーシステムはまた、組み合わせ得る。例えば、活性薬物を、リザーバー型ミクロスフェア中のポリマー表面内に分散または、その上に吸着し得る。
【００４０】
生物分解可能ポリマーは、純度が種々の天然または合成材料からなることができる。天然ポリマーは、ポリペプチドおよびタンパク質（例えばアルブミン、フィブリノーゲン、ゼラチン、コラーゲン）、多糖類（例えばヒアルロン酸、スターチ、キトサン）およびウイルスエンベロープおよび生存細胞（例えばエリスロサイト、フィブロブラスト、ミオブラスト）を含む。天然材料は、ミクロカプセル化工程中に架橋化を要し、これはポリマーおよび包埋された薬物の変性につながる。結果として、合成ポリマーは、最も普通に使用される。頻繁に使用される合成ポリマーは、ポリ（−ヒドロキシ）酸、例えばポリ酢酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシ酪酸（butryic acid)、およびコポリ（乳／グリコール）酸（ＰＬＧＡ）を含む。これらの化合物は、生物両立可能であり、免疫原性を欠き、そしてそれらを容易に成形するのを可能とする物理的特性を有する（生物侵食速度を制御するため）。
【００４１】
コロイド性微粒子担体はまた、エンドスタチンを送達するため本発明の方法で使用できる。リポソームは、好ましいコロイド性ビヒクルであり、そして親水性および疎水性医薬の両方のための担体として作用し得るリン脂質二層からなる。リポソームを、例えば天然脂質、荷電リン脂質、およびコレステロールから作成できる。両親性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG)のリポソーム表面上への添加は、リポソームのクリアランスをおそめることができる。
【００４２】
ＰＥＧで修飾されたエンドスタチンの投与はまた、本発明の範囲内である。ＰＥＧは、化学的に活性化し得る、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシドサブユニットの反復からなるポリマーである。ＰＥＧ分子は、ある数の異なる配置で入る。ＰＥＧ鎖は、１または2以上のＰＥＧ鎖がリンカー例えばリジンまたはトリアジンと結合される、線形または分枝構造を含み得る。ＰＥＧを、好ましくは共有的に、単一部位または多重部位でエンドスタチンに付着し得る。分枝鎖ＰＥＧは、単一または直鎖ＰＥＧよりもより少ない部位で付着するから、分枝ＰＥＧは本来の分子の生物的活性を、多重小直鎖ＰＥＧの付着よりもより妨害しそうになく、そして好ましい。タンパク質の経口投与のため好適な医薬組成物は、例えば、引用により全体を含ませる、米国特許５００８１１４、５５０５９６２、５６４１５１５、５６８１８１１、５７００４８６、５７６６６３３、５７９２４５１、５８５３７４８、５９７２３８７、５９７６５６９およｂ６０５１５６１に記載される。
【００４３】
エンドスタチンを、処置の必要な個体に、遺伝子治療法を使用して送達できる。当業界で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかを、本発明にしたがって試用できる。例示的方法は、以下に記載する。
【００４４】
好ましい側面では、治療は、好適な宿主で、エンドスタチンまたはそのフラグメントまたはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部であるエンドスタチンコード核酸
を含む。特に、そのような核酸は、ポリペプチドコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有し、該プロモーターは誘導可能または構成的であり、そして所望により組織特異的である。さらなる特定の実施態様では、核酸分子であって、ポリペプチドコード配列および任意の他の望まれる配列が、ゲノムの望まれる部位で相同的組換えを促進し、こうして望まれる核酸の染色体内発現を提供する領域によって隣接される、核酸分子を使用する。
【００４５】
エンドスタチンコード核酸の、患者内への送達は、患者が直接的に核酸または核酸を有するベクターに曝露される場合に直接的、または細胞がインビトロで核酸で最初に形質転換され、次いで患者にインプラントされる場合に間接的であり得る。これら２つのアプローチは、インビボまたはエキソビボ遺伝子治療についてそれぞれ既知である。
【００４６】
特異的実施態様では、エンドスタチンコード核酸を直接的にインビボ投与し、ここでそれは発現され、コードされた産物を生産する。これは任意の多くの、当業界で既知の方法によって、例えば適当な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、そしてそれを投与し、その結果それは細胞内となることによって、例えば欠損または減衰レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用する感染によって（例えば米国特許４９８０２８６および以下に述べる他参照）、またははだかＤＮＡのディレクトインジェクションによって（例えばBlezinger et al., Nature Biotechnology, 17, 343-348(1999)参照）または微粒子ボンバードメント（例えばa gene gun; Biolistic, Dupont参照)、または脂質での被覆または細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤、リポソーム、微粒子またはマイクロカプセル内カプセル化（例えばChen et al., Cancer Research, 59,3308-3312(1999)参照）、またはそれを、核へ移入することが知られるペプチドへの連結して投与することによって、またはそれを、レセプター介在エンドサイトーシスへのリガンド対象へ連結して投与することによって（例えばすべて引用によりここに含める米国特許５１６６３２０；５７２８３９９；５８７４２９７；６０３０９５４参照）（これらを使用し、レセプターを特異的に発現する標的細胞型をターゲティングすることのできる）等によって達成する。別の実施態様では、核酸−リガンド複合体であって、リガンドが紡錘生成ウイルスペプチドを含み、エンドソームを破壊するものを形成でき、該核酸がリポソーム分解を回避するのを可能とする。なおさらなる実施態様において、核酸を、特異的レセプターをターゲティングさせることによって、細胞特異的取りこみおよび発現のためインビボでターゲティングさせる（例えばＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６、ＷＯ９３／１４１８８およびＷＯ９３／２０２２１参照）。代替的に、核酸を、細胞内的に導入し、相同的組換えによって、発現のため宿主細胞ＤＮＡ内に取りこませるのができる（例えば米国特許５４１３９２３；５４１６２６０および５５７４２０５参照）。
【００４７】
特異的実施態様では、エンドスタチンコード核酸を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる（例えば米国特許５２１９７４０；５６０４０９０および５８３４１８２参照）。これらのレトロウイルスベクターを修飾し、ウイルスゲノムのパーケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要ないレトロウイルス配列を欠失させた。遺伝子治療で使用すべきエンドスタチンコード核酸を、ベクターにクローン化し、遺伝子の患者への送達を容易化する。
【００４８】
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できるウイルスベクターのもうひとつの型である。アデノウイルスゲノムは、近似的に３６キロ塩基対の線形、二本鎖ＤＮＡ分子である。ウイルスゲノムのそれぞれの末端は、逆末端反復（またはＩＴＲ）として知られる短い配列を有し、これはウイルス複製に必要である。よく特徴付けられたアデノウイルスの分子遺伝学は、それを遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターにする。ウイルスゲノムの部分は、外来起源のＤＮＡで置換できる。加えて、組換えアデノウイルスは、構造的に安定であり、そして再構成されるウイルスは、徹底的な増幅後、観察されない。
【００４９】
アデノウイルスは、遺伝子を呼吸上皮へ送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、天然に、呼吸上皮に感染し、ここでこれらは温和な疾患を生じる。アデノウイルスに基づく送達システムの他の標的は、肝臓細胞、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得る利点を有する。アデノウイルスに基づく遺伝子治療を実行する方法は、例えば、すべて引用によりここに含める米国特許５８２４５４４、５８６８０４０、５８７１７２２、５８８０１０２、５８８２８７７、５８８５８０８、５９３２２１０、５９８１２２５、５９９４１０６、５９９４１３２５９９４１３４、６００１５５７および６０３３８８４３に記載される。
【００５０】
特異的実施態様では、アデノウイルスベクターを使用して遺伝子治療の目的のため導入されるべき核酸は、コード領域に作動可能に連結された誘導可能プロモーターを含み、その結果核酸の発現は、転写の適当なインヂューサーの存在または不存在を制御することによって制御可能である。
【００５１】
ゲノムエレメントの、アデノウイルスベクターヘの取りこみは、エンドスタチンをコードするＤＮＡ配列の増強された発現を提供し得る。こうして、本発明の別の側面にしたがって、少なくとも１つの、エンドスタチンをコードするＤＮＡ配列、およびそのようなＤＮＡ配列の発現に影響する、少なくとも１つのゲノムエレメントを含むアデノウイルスベクターを提供する。用語「ゲノムエレメント」を、以前定義したように使用する。そのようなゲノムエレメントは、限定しないが、イントロン、５’非翻訳領域、および３’非翻訳領域、およびイントロンと３’と５’非翻訳領域の一部を含む。アデノウイルスベクターを前記のようでありうる。ＤＮＡ配列を制御するプロモーターを、ここに記載のものから、そして当業界で周知のものから選択し得る。
【００５２】
感染性だが、複製欠損性のウイルス粒子からなるベクターであって、エンドスタチンをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むものを、宿主の脈絡膜血管新生を処置する有効量で宿主にインビボで投与する。該宿主は、ヒトおよび非ヒト霊長類宿主を含む哺乳動物宿主であり得る。
【００５３】
アデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に、血液の１００００００ｎｇ／ｍｌまたは血液の１ｍｇ／ｍｌまでのエンドスタチンレベルを提供するのに有効な量で哺乳動物宿主に投与し得る。アデノウイルスベクターを、１００００００ｎｇ／ｍｌまでのエンドスタチンのレベルを提供するのに有効な量で、哺乳動物宿主に投与し得るが、いくつかのエンドスタチン、例えば、本発明のアデノウイルスベクターで形質導入された哺乳動物細胞によって発現されるとき、エンドスタチンが、非哺乳動物細胞、例えば酵母細胞または細菌細胞、例えばE. coli細胞によって発現されるエンドスタチンよりも有意により活性（約１０００倍より活性）であることが見出された。こうして、望まれる抗血管新生効果を達成するために、アデノウイルスベクターを哺乳動物宿主に投与することによって、哺乳動物に酵母または細菌によって発現されるエンドスタチンの有意により大きいレベルを提供するのに対して、一般に哺乳動物宿主により低いレベルのエンドスタチンを提供できる。
【００５４】
ある実施態様では、哺乳動物宿主に投与するとき、アデノウイルスベクターを、宿主で見出されるエンドスタチンの基本レベルの約２ないし２０倍であるエンドスタチンレベルを提供するのに有効な量で投与する。一般に、そのような実施態様において、アデノウイルスベクターを少なくとも血液の約３００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３００ｎｇ／ｍｌないし約３０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌないし約１５００ｎｇ／ｍｌのレベルの活性ポリペプチドの発現を提供するのに有効な量で哺乳動物宿主に投与する。
【００５５】
さらなる実施態様では、ウイルスベクターを、約１０８プラーク形成単位ないし約１０１４プラーク形成単位、好ましくは約１０８プラーク形成単位ないし約１０１１プラーク形成単位、より好ましくは約１０９プラーク形成単位ないし約１０１０プラーク形成単位の量で投与する。前記量のアデノウイルスベクターは好ましい。
【００５６】
感染性ベクター粒子を、全身的に、例えば静脈内投与によって（例えば末梢静脈注射）投与できまたは門静脈を介して胆管へ、筋肉内、腹腔内、または鼻内に投与できる。代替的に、感染性ベクター粒子を、局所的に、例えば眼内注射によって投与できる。そのような注射は眼の前または後の室に、房水または硝子体液内にできる。代替的に、注射を網膜下、例えば、網膜後方に、アリコートの注射（例えばアリコートあたり１ないし１０マイクロリットル）のベクター含有溶液の注射によって、その溶液が吸収され、そして感染性ベクター粒子が眼組織の局所細胞へ感染し、そして活性ポリペプチドを生産することができる。そのような投与は、単一注射、同じ日に投与される多重注射、何週間または何ヶ月の期間にわたって投与される単一注射、または何週間または何ヶ月の期間にわたって投与される多重注射であり得る。
【００５７】
ベクター粒子を、患者への投与に好適な、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与し得る。担体は液体担体（例えば生食水溶液）または固体担体、例えばマイクロキャリアービーズであり得る。
【００５８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をまた、遺伝子治療での使用のため提唱し、腫瘍のエンドスタチン遺伝子治療を含む（例えばNguyen et al., Cancer Research, 58, 5673-5677(1998)参照）。ＡＡＶを生産、利用する方法は、例えば引用により全体を含ませる米国特許５１７３４１４、５２５２４７９、５５５２３１１、５６５８７８５、５７６３４１６、５７７３２８９、５８４３７４２、５８６９０４０、５９４２４９６および５９４８６７５に記載される。
【００５９】
遺伝子治療の別のアプローチは、組織培養で細胞へ遺伝子を移入することに関係し、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクションまたはウイルス感染のような方法による。通常は、移入の方法は、選択マーカーを細胞へ送達することを含む。細胞を次いで、移入される遺伝子取りこみ、そして発現する細胞を単離する選択下に置く。これらの細胞を次いで、患者に送達する。
【００６０】
この実施態様では、核酸を、得られる組換え細胞のインビボでの投与に先立ち細胞へ導入する。そのような導入を、限定しないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体介在遺伝子移入、マイクロセル介在遺伝子移入、スフェロプラスト融合等を含む当業界既知の任意の方法によって実施できる。多くの技法は、外来遺伝子の、細胞ヘの導入のために当業界で既知であり、そして本発明にしたがって使用する。ただし、レシピエント細胞の必要な発達および生理学的機能が破壊されないことを条件とする。技法は、細胞への核酸の安定な移入を提供すべきであり、その結果核酸は細胞によって発現され、好ましくは遺伝され、そしてその細胞後代によって発現される。べつの実施態様では、細胞中で、通常は発現されない、または細胞によって低いレベルで発現される外生遺伝子を、内生遺伝子に強いプロモーターに作動可能に連結し、こうして細胞に内生遺伝子を高いレベルで発現するのを提供し、細胞によってエンドスタチンの合成および分泌をもたらすことによって達成できる。
【００６１】
そのような細胞（すなわち内生または外生遺伝子または核酸からの高レベルのタンパク質を生産するもの）の生産または投与のための方法は、とりわけ米国特許５６４１６７０、５７３３７６１、５９６８５０２、６０４８７２９、６０５４２８８、６０６３６３０および６１８７３０５に記載されている。好ましい実施態様では、エンドスタチン生産細胞は、マイクロカプセル化形態で、例えばアルギン酸ナトリウムまたはカルシウムアルギネートポリＬ−リジンアルギネートにマイククロカプセル化された細胞の形態で送達する（例えばRead et al., Nature Biotechnology 19, 29-34(Jan 2001)およびJoki et al., Nature Biotechnology 19, 35-39(Jan 2001)参照）。マイクロカプセル化された細胞を、目に、または細胞によって生産されるエンドスタチンがもっとも急速に対象の血液流、例えば肝臓にはいる部位に接近してインプラントできる。使用のため想起される細胞の量は、望まれる効果、患者の状態等に依存し、そして当業者によって決定できる。
【００６２】
核酸が、遺伝子治療の目的のため導入されることのできる細胞は、望まれる、利用可能な細胞型を包含し、そして限定しないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；血液細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨大核細胞、顆粒球；種々の幹または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、例えば骨髄、へその緒血液、末梢血液、胎児血液等から取得されるものを含む。
好ましい実施態様では、遺伝子治療のため使用される細胞は、患者の自己由来である。
【００６３】
組換え細胞が遺伝子治療で使用される実施態様では、エンドスタチンをコードする核酸を、細胞に導入し、その結果それは、細胞またはそれらの後代によって発現可能である。具体的実施態様では、幹または前駆細胞を使用する。任意の幹および／または前駆細胞であって、インビトロで単離および維持できるものを潜在的に、本発明のこの実施態様にしたがって使用できる。そのような幹細胞は限定しないが、造血幹細胞（ＨＳＣ）、上皮組織、例えば皮膚および消化管の内層の幹細胞、胚性心筋細胞、肝幹細胞（例えばＷＯ９４／０８５９８参照）および神経幹細胞を含む。
【００６４】
上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチン生成細胞を、既知の手法によって組織例えば皮膚および消化管の内層から取得できる。層化された内皮組織、例えば皮膚では、更新は、始原層、基底膜内に最も近い層内で幹細胞の有糸分裂によって起こる。消化管の内層内の幹細胞は、この組織の急速な更新速度を提供する。患者またはドナーの皮膚または消化管の内層から取得されたＥＳＣまたはケラチン生成細胞は、組織培養で成長できる。もしＥＳＣがドナーから提供されるならば、宿主対移植片反応性の抑制の方法は（例えば温和な免疫抑制を促進する、放射、薬物または抗体投与）また使用できる。
【００６５】
造血幹細胞（ＨＳＣ）について、ＨＳＣのインビトロの単離、増殖、および維持のため提供する任意の技法を、本発明の実施態様で使用できる。これが達成され得る技法は、（ａ）未来の宿主、またはドナーから単離される骨髄細胞からのＨＳＣ培養の単離および確立、または（ｂ）同種または異種性でありうる、以前確立された長期ＨＳＣ培養の使用を含む。非自己移植ＨＳＣを好ましくは、未来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法と組み合わせて使用する。本発明の特定の実施態様では、ヒト骨髄を、針吸引によって後部腸骨稜から取得できる（例えばKodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384参照）。ＨＳＣを、高度に富化されたまたは実質的に純粋な形態で作成できる。この富化を、長期培養の前、中または後に達成でき、そして当業界既知方法によって実施できる。骨髄細胞の長期培養は、例えば修飾Dexter細胞培養技法（Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335）またはWitlock-Witte培養技法（Witlock and Witte, 1982, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:3608-3612）を使用して確立および維持できる。
【００６６】
本明細所で言及した、すべての特許、刊行物、（公開特許出願を含む）、およびデータベース受託番号および寄託受託番号の開示を、それらの全体の引用によって、あたかもそれぞれのそのような個々の特許、刊行物およびデータベース受託番号、および寄託受託番号は、引用によってふくまれる具体的におよび個々に指摘されているのと同じ程度に具体的に含ませる。
【００６７】
しかし、本発明の範囲は、前記の具体的実施態様に限定されないことが理解される。本発明を、特定に記載される他に実施化し得、そしてなお添付クレームの範囲内であり得る。
【００６８】
実施例１
アデノウイルスベクターの生成：方法１
マウスエンドスタチン（ｍＥｎｄｏ）ｃＤＮＡをGenome Systems(St. Louis, MO)からのマウスコラーゲンＸＶＩＩＩクローンＩＤ７４８９８７からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、プライマー５’― actggtgacg cggcccatac tcatcaggac tttcagcc―３’（配列番号６）および５’― aagggctatc gatctagctg gcagaggcct at―３’（配列番号７）で増幅する（５９８ｂｐのＦ１フラグメント）。マウス免疫グロブリンｋ鎖リーダー配列（Ｉｇ−ｋリーダー）を、ｐＳｅｃＴａｇ２（InVitrogen, Carlsbad, CA)から、プライマー５’― cactgcttac tggcttatcg―３’（配列番号８）および５’― ctgatgagta tgggccgcgt caccagtgg―３’（配列番号９）でＰＣＲ増幅する（１４７ｂｐのＦ２フラグメント）。ＰＣＲをＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）で、以下の条件下３５サイクル実施する：９５℃熱開始３分間、９５℃変性１分間、５５℃アニーリング１分間、および７２℃伸長２分間。ＤＮＡフラグメントをゲル精製する。ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏキメラＤＮＡ（７１８ｂｐ）を、テンプレートとして前記の生成したＦ１およびＦ２  ＤＮＡフラグメントでのＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長によって生成し、マウスＩｇ−ｋリーダー配列およびマウスエンドスタチンｃＤＮＡをアセンブルする。ＰＣＲをプライマー５’― cactgcttac tggcttatcg―３’（配列番号８）および５’― aagggctatc gatctagctg gcagaggcct at―３’（配列番号１０）で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、実施する。ＰＣＲを、以下の条件下で３５サイクル稼動する：９５℃熱開始３分間、９５℃変性１分間、６０℃アニーリング１分間、および７２℃伸長２分間。
【００６９】
ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒアデノウイルスシャトルプラスミドを、７１８ｂｐのｓｉｇ−ｍＥｎｄｏキメラＤＮＡを、アデノウイルスシャトルプラスミド、ｐＡｖＦ０ｌｘｒのＮｈｅＩおよびＣｌａＩ部位（これはＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの下流かつシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化信号の下流である）に挿入することによって構築する。ＡｓｃＩおよびＮｈｅｌ消化したシミアンサイトメガロウイルス（ｓＣＭＶ）プロモーターフラグメントを、ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｃ（これはその他はｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒに同一である）のＲＳＶプロモーターで置換する。両シャトルプラスミドは、ＬｏｘＰ部位を、Ｃｒｅ／ｌｏｘ介在組換えのために含む。ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒおよびｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｃアデノウイルスプラスミドの導入遺伝子の配列を、直接的配列決定分析によって確認する。
【００７０】
ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏキメラをコードする組換えＡｖ３ｍＥｎｄｏ（Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ３欠失している）を、２つのプラスミド、ｐＳＱ３およびｐＡｍＥｎｄｏＬｘｒのＣｒｅ／Ｉｏｘ介在組換えによって生成する。ｐＳＱ３プラスミドは、ｌｏｘＰ部位次いで、左末端逆方向反復（ＩＴＲ）からＥ１ａの末端ヘの領域の欠失したＡｖ３ゲノムを含む。ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒおよびｐＳＱはそれぞれ、ＮｏｔＩおよびＣｌａＩ制限酵素で最初に線形化する。一過性トランスフェクションを、２９３細胞（６ウェルプレートのウェルあたり４ｘ１０５細胞）で、リン酸カルシウム哺乳動物トランスフェクションシステム（Promega, Madison, WI）を使用して実施する。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈降物を、４．８ｍｇの線形化ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒ、１２ｍｇの線形化ｐＳＱ３、６ｍｇのｐｃｍｖＣｒｅ、および６ｍｇのｐｃｍｖＥ２ａで、１．８ｍｌの総体積で調製する。０．６ｍｌのリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物を、それぞれのウェルに添加する。２９３細胞を、３７℃で１６時間、カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とインキュベートする。沈殿物を除去し、そして細胞をリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ）で洗浄する。１５日のトランスフェクション後、細胞病理学的効果（ＣＯＥ）を観察する。細胞および培地を次いで、そうはによって収集する。粗ウイルス溶解物を、凍結および融解の５サイクルによって調製する。
【００７１】
Ａｖ３ｍＥｎｄｏベクターを、５％のＦＢＳを含むＲｉｃｈｔｅｒのＣＭ中で０．３ｍＭのデキサメタゾンとＳ８細胞中で、ＣＰＥが観察されるまで再増幅する。アデノウイルスベクター力価（ミリリットルあたりの粒子）および生物学的力価（ミリリットルあたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ））を記載のように決定する（Mittereder et al., 1996）。ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｓｉｇ−ｍＥｎｄｏを含む組換えＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏを、ｐＳＱ３およびｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｃのＣｒｅ／ｌｏｘ介在組変えによって同じ態様で生成する。精製Ａｖ３ｍＥｎｄｏ、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏおよびコントロールＡｖ３ＮｕｌＩの正確なゲノム構造を、制限消化およびサザンブロット分析によって確認する。Ａｖ３ｍＥｎｄｏおよびＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏのｓｅｅｄｌｏｔを確認し、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）について陰性であるのを確認する。
【００７２】
Ａｖ３ｍＥｎｄｏで形質転換されたＳ８細胞からの上清は、２０ｋＤａタンパク質、これはエンドスタチンの予測された大きさであり、これは潜在的に、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ１６５誘導移動を阻害するものを含み、そしてＥＬＩＳＡは１０６Ａｖ３ｍＥｎｄｏが形質導入するＨｅｐ３Ｂ細胞が２４時間あたり１−２μｇのマウスエンドスタチンを分泌することを実証する。
【００７３】
アデノウイルスベクターの生成：方法２
マウスｃＤＮＡを、スナップ凍結した２週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）肝臓からのＲＮＡを単離することによって（RNeasy Mini kit; Qiagen, Valencia, CA）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）で処理することによって、取得する。マウスエンドスタチン遺伝子を、ＴＡクローニングベクター（Invitrongen, Carlsbad, CA）に、ＰＣＲによって、プライマーセンス５’― gatctctaga ccaccatgca tactcatcag gactt―３’（配列番号１１）およびアンチセンス５’― actggagaaa gaggtttatc tagctactag―３’（配列番号１２）を使用してクローニングする。１８アミノ酸Ｅ３／１９Ｋシグナル配列ＭＲＹＭＩＬＧＬＬＡＬＡＡＶＣＳＡＡ（配列番号１３）を、ＰＣＲによって、エンドスタチンから上流に、プライマーセンス５’― gatctctaga ccaccatgag gtacatgatt ttaggcttgc tcgcccttgc ggcagtctgc agcgcggccc atactcatac tcatcaggac tttcag―３’（配列番号１４）およびアンチセンス（前記）を使用して挿入する。プラスミドＤＮＡを、ＤＨ５細胞(Life Technologies)において増幅し、そしてシグナル配列−マウスエンドスタチン（ｓｓ−ｍＥｎｄｏ）配列を、確認する（ABI Prism 310自働配列決定機；PE Applied Biosystems, Foster City, CA）。
【００７４】
ｓｓ−ｍＥｎｄｏ構築物を、ＥｃｏＲＩで消化し、そして平滑末端ライゲーションによって、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ．１の多重クローニング部位にクローニングする。得られたプラスミドを、５Ｅ１Ａ／Ｂを欠失したＡｄ２で組換え、そして使用して２９３細胞を感染させる（American Type Culture Collection, Mannassas, VA）。プラークＤＮＡを、プロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出、およびエタノール沈降を使用して抽出し、そしてＰＣＲによってｓｓ−ｍＥｎｄｏについてスクリーニングする。得られたウイルス、Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを、２９３細胞において増幅する。類似戦略を使用し、β−ｇａｌ（Ａｄ−β−ｇａｌ）およびホタルルシフェラーゼ（Ａｄ−ｌｕｃ）の遺伝子を含むコントロール組変えウイルスを創出する。ウイルスを、２９３細胞において標準的プラーク形成アッセイを使用して滴定する。細胞を、１０％ＦＣＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタミシン、０．５μｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ、および４ｍＭのグルタミンを有する、ＤＭＥＭからなる、完全培地中で成長させる（Biofluids, Rockville, MD）。細胞を、０．１ないし１００の範囲のＭＯＩｓで（１．０ｍｌの完全倍地中の１０６細胞あたり１０５ないし１０８ｐｆｕ）Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ、Ａｄ−ｌｕｃ、またはウイルスなしに感染させ、そして３７℃で２４時間インキュベートする。上清を２ｘｇで５分間遠心分離し、そして競合的ＥＩＡ（Cytummune Sciences, College Park, MD）を使用して、製造者の指示にしたがってエンドスタチンについてアッセイする。２９３細胞上清を、セルロースカラム（Centricon YM-10; Millipore, Bedford, MA）で１０倍に濃縮し、そしてウェスタンブロッティング（NuPAGE; Novex, San Diego, CA）によって、５７０ｎｇ／ｍｌウサギ抗マウスエンドスタチンポリクローナルＩｇＧ抗体（Cytimmune Sciencesのギフト）を使用して分析する。マウスカラムアデノカルシノマ細胞株ＭＣ３８（Sugery Branch, National Cancer Institute）の、アデノウイルス感染ヘの感受性を、前期のＡｄ−β−ｇａｌに細胞を感染させそして標準的キット（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を使用してβ−ｇａｌについて２４時間後にアッセイすることによって試験する。マウス肝細胞株ＮＭｕＬｉ（AmericanType Cluture Collection）の、Ａｄ−β−ｇａｌ感染への感受性を、陽性コントロールとして使用する。
【００７５】
アデノウイルスベクターの生成：方法３
ＢＡＬＢ／ｃマウスからの肝臓組織をホモゲナイズし、そして総ＲＮＡを抽出する（RNeasy kit; Qiagen, Chatsworth, CA）。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーでの逆転写ＰＣＲ（SuperScriptII; Life Technologies, Grand Island, NY）によって増幅する。完全長マウスエンドスタチンｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、ＣｌａＩリンカーを有するセンスプライマー、５’― atcgatcata ctcatcagga ctttcagcc―３’（配列番号１５）；ＮｏｔＩリンカーを有するアンチセンスプライマー５’― gcggccgcct atttggagaa agaggtcat―３’（配列番号１６）を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene)にサブクローン化するために達成する。ラットインスリンリーダー配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを、エンドスタチン遺伝子の前にクローン化する。配列確認後、ラットインスリンリーダー−エンドスタチンｃＤＮＡを、組換えアデノウイルス（ＡＤＳ）シャトルベクターｐＡＤＶ．ｈＥＦ１−α（ヒト伸長因子１−α）に、組換えアデノウイルスのレスキューのため、Bautista, D.S.et al., （1991)Virology 182, 578-196によって記載のようにクローン化する。ウイルス粒子を、吸収（Ａ２６０）によって測定し、そしてプラーク形成単位を、２９３細胞において標準的アガロースオーバーレイアッセイによって決定する。ＡＤＶ．ｈＶＥＧＦ１６５の構築のためのｃＤＮＡを、ヒトへそ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から単離したＲＮＡの逆転写ＰＣＲによって取得する。ＪＣおよびＬＬＣ細胞株を、American Type Culture Collectionから取得する。細胞を、ＰＰＭＩ培地１６４０（ＪＣ）およびＤＭＥＭ（ＬＬＣ）で培養する。すべての培地を、１０％ＦＢＳ、０．２ｍＭグルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補足する。ＨＵＶＥＣをへそのおから、２０分間室温で、コラゲナーゼＩＶ型（Sigma）かん流（Ｈａｎｋｓの平衡塩溶液０．２％）によって単離する。細胞をついで、コラーゲン被覆下（ＰＢＳ中１％）プレート上で、２０％のＦＢＳ、０．２ｍＭのグルタミン、１％のペニシリン／ステレプとマイシン、および１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ中で培養する。
【００７６】
実施例２：マウスへの遺伝子移入およびＣＮＶの誘導
ウイルスベクターを、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾部静脈に注射する。マウスに、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ（ｎ＝１８）またはＡｖ３ｍＮｕｌｌ（ｎ＝１７）の２ｘ１０１１粒子またはＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏまたはａｖ３ＣｓＮｕｌｌの６ｘ１０１０粒子を注射する。ウイルスベクター注射５日後、マウスを塩酸ケタミンで麻酔し、（１００ｍｇ／ｋｇ体重）、瞳孔を１％トロピカミドで拡張させ、そしてTobe, et al., J. Pathol. 153, 1641-1646(1998)によって以前記載されたように、クリプトンレーザー光凝固術を使用し、各マウスの各眼の３つの位置でＢｒｕｃｈの膜を破裂させる。簡単には、クリプトンレーザー光凝固術（１００μｍスポットサイズ、０．１秒期間、１２０ｍＷ）は、Coherent Model 920 Photocoagulatorのスリットランプ送達システムを使用してそしてコンタクトレンズとして手持ちカバースライドを使用して送達する。熱傷を、視神経から２−３ディスク直径の、９、１２および３時の位置で実施する。レーザーの時の蒸発バブルの生産であって、Ｂｒｕｃｈの膜の破裂を示すものは、ＣＮＶを取得することにおいて重要なファクターであり、だからバブルが生産された熱傷のみを、研究に含める。バブルは、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおいて１熱傷およびＡｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスで３熱傷について生産されない。Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射されたマウスの１の目の角膜は、レーザーの使用を妨げる角膜傷跡を有し、その眼は使用しない。
【００７７】
実施例３：レーザー誘導ＣＮＶ病変の測定
レーザー処置の２週間後、ＣＮＶ病変のサイズを、２つの異なる技法、Seo, et al., Amer. J. Pathol. 154,1743-1753(1999)によって以前報告されたような一連切片上のＣＮＶ積算面積の測定、またはEdelman et al., Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41 S834(2000)によって記載されたような脈絡膜フラットマウントにおけるＣＮＶの面積の測定のいずれかによって評価する。Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスについて、１０匹マウスを、フラットマウント技法によっておよび８匹を一連切片によって、評価し、Ａｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスについて、１０マウスをフラットマウント技法によって、および７匹を一連切片によて評価する。
【００７８】
フラットマウント技法のために使用したマウスを麻酔し、そしてTobe, et al., Invest Ophthalmol. Vis Sci. 39, 180-8(1998)によって以前記載されたように、５０ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン標識デキストラン（２ｘ１０６平均ｍｗ、Sigma, St.Louis, MO）を含む１ｍｌのリン酸緩衝生食水でかん流する。眼を除去し、そして１時間１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定化する。角膜およびレンズを除去し、そして網膜全体を注意深く、アイカップから切除する。放射状の切断物（４−７、平均６こ）を、アイカップの縁からｋ赤道に作成し、そしてアイカップを、強膜を上にかつ脈絡膜を下にしてAquamount中にフラットマウントする。フラットマウントを、蛍光顕微鏡によって試験し、そして画像を３CCDカラービデオカメラおよびフレームグラバーを使用してデジタル化する。Image-Pro Plusを使用し、それぞれの総血管結合組織傷跡に対応する、熱傷に付随する過度蛍光の総面積を測定する。
【００７９】
Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスについて、全部で１９の目を評価し（１の目は、予め存在する角膜傷跡を有し、レーザー処置を予め除外する）そしてバブルを付随しなかった１の傷があり、その結果５６病変を測定する。Ａｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスについて、全部で２０目を評価し、そしてなぜならバブルを付随しなかった３熱傷があるからであり、５７病変を測定する。それぞれの目内の面積を平均し、そしてログ変換後、一般化評価等式（ＧＥＥ）で回帰分析を実施する。この分析は、それぞれのマウスの右および左目の間の相関について調節する。
【００８０】
一連切片上のＣＮＶの積算面積を測定するため使用したマウスを、レーザー処置２週間後に殺し、そして目を急速に除去し、そして最適切断温度包埋化合物（ＯＣＴ；Miles Diagnostics, Elkhart, IN）で凍結する。凍結した一連切片（１０μｍ）を、それぞれの熱傷の全体程度を通して切断し、そしてビオチニル化グリフォニアシンプリシフォリアレクチンＢ４（GSA, Vector Laboratories, Burlingame, CA）で組織化学的に染色し、これは血管細胞に選択的に結合する。スライドをメタノール／Ｈ２Ｏ２中で１０分間４℃でインキュベートし０．０５Ｍトリス緩衝生食水ｐＨ７．６（ＴＢＳ）で洗浄し、そして１０％通常ブタ血清中で３０分間インキュベートする。スライドを室温で２時間、ビオチニル化ＧＳＡとインキュベートし、０．０５ＭのＴＢＳですすいだ後、これらをアビジン結合ペルオキシダーゼ（Vector Laboratories)と、４５分間室温でインキュベートする。０．０５ＭのＴＢＳで１０分間洗浄後、スライドをHistomark Red(Kirkegaard and Perry)とインキュベートし、メラニンと区別可能な赤色反応産物を得る。いくつかのスライドを、Contrast Blue(Kirkegarrd and Perry)でカウンター染色する。
【００８１】
定量的評価を実施するため、ＧＳＡ染色した切片を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡で試験し、そして画像を３ＣＣＤカラービデオカメラおよびフレームグラバーを使用してデジタル化する。Image-Pro Plusソフトウェアを使用し、線ひきし、そして網膜下空間のＧＳＡ染色された血管の面積を測定する。それぞれの病変について、面積測定を、すべての切片について作成し、ここに病変オ幾つかが現れ、一緒に加え、積算面積測定を与える。それぞれの目内測定物を平均し、そしてＧＥＥでの回帰分析を実施する。
【００８２】
当初の実験において、Ｂｕｒｕｃｈの膜のレーザー誘導性破裂の部位のＣＮＶの量を、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスおよびＡｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスにおいて比較する。ＣＮＶの量を、２つの異なる技法によって評価する；脈絡膜フラットマウント上のフルオレセイン標識したデキストランによってかん流されたＣＮＶの面積の測定、および全病変にわたる一連切片上のＣＮＶの面積の測定。脈絡膜フラットマウント中のレーザー誘導性ＣＮＶの面積は、注射しないまたはＡｖ３Ｎｕｌｌを注射したマウスと比較して、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスでより少ないようである。目視比較によって見られる相違は、処置群についてマスクされた調査者によって実施される画像分析によって確認し、これはＡｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおけるかん流ＣＮＶ病変の平均面積が、Ａｖ３Ｎｕｌｌ注射したコントロールのそれよりも、有意により小さいことを示した（表１）。
【００８３】
【表１】
0004689144.tif 000002
【００８４】
ＣＮＶ病変を通した一連切片化はまた、Ａｖ３Ｎｕｌｌを注射したマウスと比較したとき、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおけるより小さい病変を示した。それぞれの一連切片のＣＮＶの面積を一緒に加えることによって取得したＣＮＶの積算面積は、これは３次元のサイズを評価するのだがこれは、Ａｖ３Ｎｕｌｌ注射したマウスと比較して、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスのＢｒｕｃｈの膜の葉列の部位で、有意に少ないＣＮＶがあることを確認した（表１）。両方の測定技法は非常に類似の情報を提供するから、脈絡膜フラットマウントのみを次の実験に使用する。
【００８５】
エンドスタチン血清レベルと、ＣＮＶの面積の間の負の相関がある。エンドスタチンの血清レベルは、ベクターの静脈内注射の４−７日後が最適である。マウスのある群に、Ａｖ３Ｅｎｄｏ、Ａｖ３ＣＥｎｄｏＡｖ３ＮｕｌｌまたはＡｖ３ＣｓＮｕｌｌを注射する。レーザー処置を、第４日に実施し、そして血清を注射の７日後に取得する。ベクター群およびエンドスタチンレベルについて調査者はマスクされ、ＣＮＶの面積を、レーザー光凝固術の１４日後に、脈絡膜フラットマウント上で測定する。Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏを注射したマウスは、注射しないマウスまたはＡｖ３ＣｓＮｕｌｌを注射したものよりもより少ないＣＮＶを有するようである。画像分析は、ＣＮＶ病変の面積が、コントロールと比較して、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏまたはＡｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおいて有意に小さいことを確認する（表２）。
【００８６】
【表２】
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＊ベクターなしコントロールとの相違について；＊＊対応するｎｕｌｌベクターコントロールとの相違について。
ＣＮＶ病変の平均面積対それぞれのマウスにおけるエンドスタチン血清レベルのプロットは、強い負の相関を示し、ｒ＝−０．６６である。
【００８７】
実施例４：エンドスタチンの、目および肝臓における発現の分析
アデノウイルスベクターの全身性投与が目の顕著な形質導入を生じるか決定するため、マウスのある群にＡｖ３ｎＢｇを注射する。このベクターは、ＲＳＶプロモーターからβガラクトシダーゼを発現する。５日後、マウスを殺し、そしてβガラクトシダーゼ活性を、目および肝臓のホモジネートにおいて、化学発光アッセイを使用して測定する。肝臓および目を、マウスからの除去に続き、スナップ凍結する。アッセイの日に、肝臓または目を細胞溶解緩衝液（４０：１ｖ／ｖ  １ｘReporter Lysis Buffer(Promega, Madison WI）：Protease Inhibitor Cocktail(Sigma, St.Louis MO))においてホモジナイズする。タンパク質含量を、Bradford Assay(Bioad, Hercules CA)によって決定する。βガラクトシダーゼ活性を、Galacto-Lightシステム(Tropix, Bedford MA)を使用いて決定する。
【００８８】
ベクターを受容したマウスの肝臓において、βガラクトシダーゼ活性のレベルは、非注射コントロールより近似的に１０００倍より高く、一方目では、この酵素活性のレベルはベクター注射とコントロール動物の間で類似である。この酵素を発現するアデノウイルスの投与に続いて目で検出可能βガラクトシダーゼ活性の不存在は、エンドスタチンベクターの静脈内注射後の抗血管形成効果が、局所的に生産されるエンドスタチンよりもむしろ全身的に生産されるためであることを示唆する。
【００８９】
実施例５：ＡＶ３ＭＥＮＤＯを注射したマウスの、ＡＶ３ＣＳＭＥＮＤＯを注射したものとの比較
マウスに、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ（ｎ＝１０）またはＡｖ３ｍＮｕｌｌ（ｎ＝９）の２ｘ１０１１粒子を尾部静脈に注射し、そしてこれらにＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏ（ｎ＝１１）またはＡｖ３ＣｓｍＮｕｌｌ（ｎ＝１１）の６ｘ１０１０粒子を注射する。注射なしコントロール群（ｎ＝１１）をまた含める。注射４日後、Ｂｕｒｃｈの膜を、前記のようなそれぞれのマウスのそれぞれの目の３場所にレーザーで破裂させる。注射７日後、血液をそれぞれのマウスの尾部静脈から引き出し、そして血清をＥＬＩＳＡのため−８０℃で貯蔵する。注射１８日後、およびレーザの１４日後、ＣＮＶの面積を、前記のように脈絡膜フラットマウント上で評価する。
【００９０】
エンドスタチン血清レベルを、製造者の指示にしたがって、マウスエンドスタチン酵素連結インムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット(ACCUCYTEマウスエンドスタチン：CytImmune Sciences, College Park, MD)で決定する。
【００９１】
第２ベクター構築物、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏの特徴づけは、その血管内注射が、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ粒子（２ｘ１０１１ｐｆｕ）の最大寛容用量を注射したマウスのレベルと比較して、近似的に１０倍より高い最大エンドスタチンレベルを生じることを実証した。エンドスタチンの血清レベルは、注射なしまたはｎｕｌｌベクター注射のコントロールよりも、Ａｖ３ｍＥｎｄｏおよびＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏ注射したマウスよりも有意により高い。マウスのエンドスタチンの基本レベルは、約３０ないし１５０ｎｇ／血清のｍｌの間であることが見出される。
【００９２】
こうして、ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏ発現がＲｏｕｓ肉種ウイルスプロモーターによって駆動される構築物を注射するマウスは、ｎｕｌｌウイルスを注射するマウスよりも、エンドスタチンの中程度に高い血清レベル、そしてＢｕｒｕｃｈの膜のレーザー誘導破裂の部位の有意により小さいＣＮＶ病変を有する。ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏがシミアンサイトメガロウイルスプロモーターによって駆動される構築物を注射するマウスは、おおむね１０倍より高いエンドスタチン血清レベルを有し、そしてほとんど完全な阻害である、有意により小さいＣＮｖを有する。
【００９３】
実施例６：ヒトエンドスタチンをコードする組換えアデノウイルスベクターの生成
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡを、ヒトα（ＸＶＩＩＩ）コラーゲンのｃＤＮＡからＰＣＲ増幅する。ヒト肝臓ｃＤＮＡを、ヒト肝臓ポリＡ  ＲＮＡ（Clonetech, Palo Alto, CA)から、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって生成する。逆転写を、プライマー５’― tttttttttc agtgtaaaag gtc―３’（配列番号１７）で、Perkin Elmer RT-PCRキット（Perin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して、以下の条件の１サイクルを使用して実施する：室温１０分間、４２℃逆転写３分間、９９℃変性５分間、５℃冷却５分間、およびｃＤＮＡがエタノール沈降し再懸濁するまで４℃保持。７９０ｂｐヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントを、調製したｃＤＮＡから、プライマー５’― cagatgacat cctggccag―３’（配列番号１８）および５’― ctatacagga aagtatggca gc―３’（配列番号１９）を使用して増幅するＰＣＲを、以下の条件で３５サイクル実施する：９５℃熱開始３分間、８０℃３分間、次いでｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）の添加、９５℃変性１分間、５５℃アニーリング１分間、および７２℃伸長３分間。７９０ｂｐヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントをゲル精製しそして、アニーリング温度５８℃を使用することのほか記載のように再増幅する。７９０ｂｐヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントを、ゲル精製し、そしてPCR-Script Cloning Kits(Stratagene)を製造者の手法にしたがって使用してPCR-Script Amp SK+にクローニングし、pcrhend 1を生成する。pcrhend 1プラスミドのヒトエンドスタチンｃDNA領域を、Geneti Therapy, Inc. Gaithersburg, MDにおけるGene Therapy Core Technologies Molecular Core Laboratoryによって直接的配列決定で確認する。
【００９４】
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントを、以下の手法にしたがってヒトＢＭ４０基底（basement）タンパク質リーダーとアセンブルする。ＢＭ４０基底タンパク質リーダーを、２片の合成オリゴヌクレオチド、５’― gccaagcttc catgagggcc tggatcttct ttctcctttg cctggccggg agggctctgg cagcccctca gcaagaagcg ctcgctcaca gccaccgcga cttccagccg gtgctcca―３’（センス）（配列番号２０）および５’― ccaggtggag caccggctgg aagtcgcggt ggctgtgagc gagcgcttct tgctgagggg ctgccagagc cctcccggcc aggcaaagga gaaagaagat ccaggccctc atggaagctt ggc―３’（アンチセンス）（配列番号２１）のアニーリング、次いでＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｅｘＡ１消化によって生成する。消化したＢＭ４０基底タンパク質リーダーを、pcrhend 1のＨｉｎｄＩＩＩとＳｅｘＡ１部位にクローニングし、ｐＢｍｐｃｒｈｅｎプラスミドを生成する。ｐＢｍｐｃｒｈｅｎプラスミドの完全ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏ領域を、直接的配列決定分析で確認する。
【００９５】
アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡＶ１ｂｕｍｈｅｎｄ１ｘを、以下の手法において、ｐＡｖＦ９Ｌｘｒアデノウイルスシャトルプラスミドにおいて、ｓｉｇ−Ｅｎｄｏ第ＩＸ因子（Ｆ９）含有配列の、ｓｉｇ−Ｅｎｄｏ含有配列での置換によって生成する。ｓｉｇ−Ｅｎｄｏ配列を含む８００ｂｐフラグメントを、ＳａｃＩ消化次いでクレノー充填およびＳａｌＩ消化によってｐＢｍｐｃｒｈｅｎから生成する。ｐＡｖＦ９Ｌｘｒプラスミドを、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、次いでクレノー充填およびＳａｌＩ制限酵素で消化し、Ｆ９含有配列を除去する。２つの消化したフラグメントを、ゲル精製し、そしてライゲートしｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘを生成する。
【００９６】
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲヒト肝臓ポリＡ  ＲＮＡからのヒトα１（ＸＶＩＩＩ）コラーゲンのｃＤＮＡのＣ末端から生成する。ヒトＢＭ４０基底タンパク質リーダーを、２片の合成オリゴヌクレオチドから生成する。アニーリングしたヒトＢＭ４０基底タンパク質リーダーを、ヒトエンドスタチンｃＤＮＡの５’側にクローニングし、ヒトエンドスタチンの分Ｐツのためのｓｉｇ−ｈＥｎｄｏを生成する。ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラＤＮＡを、アデノウイルスシャトルプラスミド、ｐＡｖＦ９ｌｘｒにクローニングし、ｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘを創出する（図１２Ａ）。完全ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラ配列を、自働配列決定分析によって確認する。
【００９７】
ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラタンパク質をコードする組換えＡｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘ（Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ３欠失した）を、以下の手法にしたがって「Quick Cre/Lox two plasmid system」によって生成する。プラスミドｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘおよびｐＳＱ３を、最初にそれぞれＮｏｔＩおよびＣｌａＩ制限酵素によって線形化する。Ｓ８細胞を、LipofectAMINE PLUS Reagent(Life Technologies, Rockville, MD)を使用するウェルあたり４ｘ１０５  Ｓ８細胞で実施する一過性トランスフェクションの２４時間前に、０．３μＭのデキサメタゾンで予備処理する。リポフェクタミン複合体化ＤＮＡを、１μｇの線形化ｐＳＱ３、０．５μｇのｐＣｒｅ、および０．５μｇの線形化ｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘ、および６μｌのリポフェクタミンで、製造者（Life Technologies）の指示にしたがって調製する。Ｓ８細胞を、リポフェクタミン複合体化ＤＮＡと、３７℃４．５次間インキュベートする。リポフェクタイミン複合体化ＤＮＡを除去し、そして該細胞をＰＢＳで洗浄する。トランスフェクトしたＳ８細胞を、細胞病理学的効果が観察されるまで、３７℃で５％ＣＯ２と培養する。細胞および培地を、そうはによって収集する。粗ウイルス細胞溶解物を、凍結および融解の５サイクルによって調製する。Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘを、細胞病理学的効果が観察されるまで、５％ＦＭＳを含むＲｉｃｈｅｒのＣＭ培地中で、０．３μＭのデキサメタゾンとＳ８細胞中で再増幅する。
【００９８】
Ａｖ３ｂｈｅｎｄｌｘ介在ヒトエンドスタチン発現および分泌を、ベクター形質導入Ｓ８細胞において特徴付ける
Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘに感染した細胞の上清タンパク質、すなわちヒトエンドスタチンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。それぞれの２０μｇの上清タンパク質を、４ないし１２％線形勾配予め成形したゲル上で分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ポリビニリデンフルオリド膜に移す。膜をクマシーブルーＲ−２５０で染色する。ヒトエンドスタチンの正確なサイズに対応する２０ｋＤａタンパク質バンドを、膜ブロットから切除し、そしてＮ末端タンパク質配列決定分析に付す。３つの主要な分泌タンパク質のタンパク質配列を決定し、５０％が追加的アミノ酸残基ＡＰＱＱＥＡＬＡ（配列番号５）を有するヒトエンドスタチンのアミノ酸配列を含み、２５％は残基ＬＡを含み、そして２５％がヒトＢＭ４０基底タンパク質シグナルペプチドからの残基を含まない。２０ｋＤａのタンパク質は、Ａｖ３Ｎｕｌｌ細胞からの上清タンパク質には見出されない。結果は、Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘで形質導入されたＳ８細胞が、ヒトエンドスタチンを発現し、そしてそれがヒトＢＭ４０基底タンパク質シグナルペプチドから加工された後、分泌することを実証する。
【００９９】
実施例７：ＢＩＶベクターでの網膜色素上皮細胞のインビボ形質導入
ｅＧＦＰをコードするウシ免疫不全ウイルス性（ＢＩＶ）ベクターを、３つの成分システムから生成し（引用によりここに全体を含める、公開国際特許出願ＷＯ０１４４４５８に記載される）、そして網膜下注射を介してマウスの目に注射する（５ｘ１０５形質導入単位／眼あたり）。目組織を収集し、切片化し、そして注射の１週間ないし１０日の範囲の異なる時点の、ｅＧＦＰ発現について試験する。切片か組織を直接的に、ｅＧＦＰ発現について免疫蛍光顕微鏡によって試験し、または免疫組織化学的染色で検出する。網膜色素上皮（ＲＯＥ）細胞の顕著な部分を、ｅＧＦＰ発現によって指摘されるようなＢＶＩベクターによって形質導入し、免疫組織化学的染色および免疫蛍光の両方によって検出する。
【０１００】
実施例８：インビボの眼球血管新生の、ＢＩＶベクター介在抗血管形成遺伝子発現による阻害
O'Reilly et al., Cell;88(2)277-85(1997)にしたがって調製したマウスエンドスタチンをコードするＢＩＶベクターを、Doxycyclinと注射するとマウス光受容体細胞から血管内皮成長因子を発現するトランスジェニックマウス(IRBP/rtTA-TRE/VEGF tgMICE）の網膜下注射を介して投与する。ＢＩＶベクターを、左目をベクターの投与のないコントロールとして供しつつ、マウス右目に注射する。ベクター注射３週間後、０．５ｍｇ／ｍｌのDoxycyclinをトランスジェニックマウスのための飲料水中に配置する。Docycyclin誘導性ＶＥＧＦ発現が、フルオレセインアンギオグラフの試験によってトランスジェニックマウスの左目上に重症血管新生を引き起こすことを見出す。ＶＥＧＦ誘導性血管新生は完全に、同じ動物の右目のＢＩＶベクター介在エンドスタチン発現によって阻止される。
【０１０１】
実施例９：目におけるＧＵＴＬＥＳＳアデノウイルスベクター介在の調節されたエンドスタチン発現は、マウスにおけるＶＥＧＦ誘導性ＢＲＢ分解の有意な防止という結果になる
アデノウイルスベクター送達システムを使用するインビボのエンドスタチンの調節された発現を、Xu et al., Molecular Therapy; 3:262(2001)によって記載された方法にしたがって達成する。この調節システムは、２つの要素、誘導可能転写因子、およびマウスエンドスタチンの発現を駆動する応答性プロモーターからなる。転写因子は、タモキシフェンに応答性である修飾されたヒトエストロゲンリガンド結合ドメイン、独特なシステイン２−ヒスチジン２亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフ、およびＶＰからの最小トランス活性化ドメインからなる。応答性プロモーターは、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）によって認識されるＤＮＡ配列の６反復およびエンドスタチンをコードするＤＮＡからなる。タモキシフェンの存在下、この転写因子は、最小プロモーターに連結された独特な標的拡散配列からの転写を活性化する。インビトロで留守フェラーゼレポーターで評価するとき、タモキシフェンは、２５０倍まで発現を誘導する。このシステムを、２つのｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクターに取りこませ、これらはすべてのウイルスコード領域を欠く。１のベクターは転写因子をコードし、および第２はエンドスタチンをコードする核酸の転写を駆動する標的プロモーターをコードする。該２ベクターをマウスに注射し、これは効率的肝臓形質導入という結果となる。タモキシフェンの、マウスヘの投与は、エンドスタチンの誘導可能発現という結果となり、２０μｇ．ｍｌまでの極度に高い血漿レベルをもたらす。タモキシフェン誘導は、２ヶ月期間にわたり４回達成する。タモキシフェンの不存在下、エンドスタチンのバックグラウンドレベルを観察する。
【０１０２】
このベクターシステムを、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）発現が網膜血管新生を引き起こす、トランスジェニックマウスモデルを使用して、マウス目で使用する。具体的には、トランスジェニックマウス(IRBP/rtTA-TRE/VEGFtgMICE)は、Doxycyclinを注射するとマウス光受容体からＶＩＧＦを発現する。０．５ｍｇ／ｍｌのDoxycyclinはを、トランスジェニックマウスのため飲料水中に配置する。Doxycyclin誘導性ＶＥＧＦ発現は、タモキシフェンの存在下、導入遺伝子（ＡＧＶｎｕｌｌ）を含まないｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクターで処置したトランスジェニックマウスのコントロール目中の重症血管新生という結果となる。しかし、２つのｇｕｔｌｅｓｓベクター（ＡＶＧｅｎｄ）の混合物の網膜下注射を介して処置したマウスは、タモキシフェンの存在下、ＢＲＢの分解の有意な減少を示す。これらの結果は、調節されたエンドスタチン発現の有意な抗血管形成活性を実証する。
【配列表】
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