(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化血液凝固第ＶＩＩ因子及び血液凝固第Ｘ因子を組み合わせて主たる有効成分とする血液凝固障害に伴う出血症状の予防・治療用医薬組成物。
【請求項２】
血液凝固障害が、血液凝固因子欠損に起因する血液凝固障害である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
血液凝固障害が、血液凝固因子に対するインヒビター(抗体)を有することに起因して止血障害を呈する血液凝固障害である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
１μｇ／ｍｌ以上の濃度の活性化血液凝固第ＶＩＩ因子及び２０μｇ／ｍｌ以上の濃度の血液凝固第Ｘ因子を有効成分とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、血液に由来する成分を主たる有効成分とする医薬品に関する。詳細には、血液凝固障害、例えば血液凝固因子異常(欠損も含む)、特に血液凝固因子に対するインヒビターを有することにより止血障害を呈する患者の止血管理に用いられる医薬品に関する。より詳細には、活性化血液凝固第ＶＩＩ因子(以下、ＦＶＩＩａと称することがある)及び血液凝固第Ｘ因子(以下、ＦＸと称することがある)を主たる有効成分とする、血液凝固障害に伴う出血症状の予防・治療用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
止血反応は、極めて重要な生体の防御機構の一つあり、一般的に、血管損傷部位への血小板の粘着・凝集による一次止血と、可溶性のフィブリノーゲンが不溶性のフィブリンへ転換されて血管損傷部位をふさぐ二次止血に大別される。二次止血の過程は各種の血液凝固因子及び補助因子による血液凝固カスケードとして知られる一連の連続的な反応に基づいており、内因系凝固と外因系凝固の二つの経路からなる(図１参照のこと)。従って、この血液凝固カスケード中の因子が欠損または正常に機能しないと、血液凝固が妨げられ、出血症状を呈することがある。その多くは遺伝的素因に基づく場合が多く、先天性凝固因子障害によって引き起こされる代表的な疾患として、第ＶＩＩＩ因子が欠損した血友病Ａ、第ＩＸ因子が欠損した血友病Ｂがよく知られている。
【０００３】
これら血友病患者の治療には、欠損因子の補充を目的として第ＶＩＩＩ因子あるいは第ＩＸ因子を含む濃縮製剤が開発され、止血管理に使用されており、これを補充療法という。しかし、その結果、第ＶＩＩＩ因子あるいは第ＩＸ因子に対する抗体(これは、通常インヒビターと呼ばれる)が患者の約２〜２４％に発生することが知られており(Thromb Haemost 67:600-602(1992), Int J Hematol 62:175-181(1995), Lancet 339(8793):594-598(1992), Blood 83:2428-2435(1994))、これは補充療法における最も深刻な副作用の一つである。インヒビターが発生すると、従来の補充療法は効果がなくなり、患者の止血管理は困難をきわめる。また、血友病のような遺伝的な素因がない場合でも、自然発生的または自己免疫疾患的にインヒビターが発現することが多数報告されている(Thromb Haemost 45:200-203(1981))。
【０００４】
現在インヒビターを有する患者の治療には主に以下の方法が用いられている。
(ａ)中和療法：
インヒビターを凌駕するような高投与量の濃縮製剤を投与することでインヒビターを中和し、さらに止血に必要な因子の補充を行なう。
(ｂ)バイパス療法：
第ＶＩＩＩ因子や第ＩＸ因子は共に内因系凝固に関与する因子であるので、内因系を介さない、即ちバイパスする外因系凝固により止血する。外因系凝固能を高めるため、ＡＰＣＣと呼ばれる活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤やＦＶＩＩａ製剤の投与が行なわれている。
(ｃ)免疫寛容療法：
大量の濃縮製剤を連日投与することにより、インヒビター産生能を免疫学的に疲弊させて、抗体の消失を図る。
しかしながら、前記方法は各々幾つかの欠点をかかえている。即ち、(ａ)中和療法はインヒビター価の低い患者に対しては有効であるが、ハイリスポンダーと呼ばれる高いインヒビター価を有する患者に対しては無効である。(ｂ)バイパス療法におけるＡＰＣＣは心筋梗塞(Am J Med 85:245-249(1988))やＤＩＣ(Thromb Haemost 48:339-340(1982))の副作用が報告されており安全性に問題がある。一方、その安全性の高さからインヒビター患者の止血管理で最も汎用されているＦＶＩＩａ製剤は、ＦＶＩＩａの生体半減期が短いため頻回投与が必要であり(Transfus Med Rev 7:78-83(1993))、経済的な面も含め患者に多大な負担を負わせることになっている。また、その有効性も充分とは言えない。(ｃ)免疫寛容療法は限られた患者においてのみ有効であり、且つ患者の経済的負担が大きい。このように、現状ではインヒビター患者に対する種々の止血管理方法は充分なものとはいえず、より安全で、効果が高く、止血管理が容易な製剤が切望されている。
【０００５】
なお、従来技術として、特開平７−１４５０７２〜１４５０７５により開示されている「血液凝固因子阻害因子処理のための水性組成物」は従来のＡＰＣＣ製剤における活性化の程度を規定しているだけであり、その本質を極めていない。また、特開平９−１１０７１５により示されている「血液凝固疾患を治療するための医薬組成物とその製造法」も、従来のＡＰＣＣ中のＦＶＩＩａ含量を増加させることにより治療効果を期待している点に特徴を有するが、単独で治療効果が確認されているＦＶＩＩａをＡＰＣＣに加えただけであり、同様になお課題を残すものである。
【０００６】
【発明の構成】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を鑑み、本発明者らは血液凝固障害に伴う出血症状に対する予防・治療剤を開発するべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＦＶＩＩａとＦＸを組み合わせてなる医薬組成物が、血液凝固障害を原因とする止血障害の予防・治療剤として非常に有効であることを初めて見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。特に、本願発明によってもたらされる組成物の優れた点として、▲１▼ＡＰＣＣ製剤の副作用を引き起こしている原因物質としての可能性の高いＦＩＩ、ＦＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ及びリン脂質等を実質的に含まないため安全性が極めて高い。また、▲２▼ＦＶＩＩａ製剤の欠点であった頻回投与の必要がなくなり、さらにその止血効果もＦＶＩＩａよりも優れている。即ち、安全で、効果が高く、止血管理が容易な、待ち望まれていた医薬組成物と言うことができる。また、ＦＩＩ及びＦＩＸ等をほとんど含まないという点で従来のＡＰＣＣ製剤と異なり、ＦＸを含む点でＦＶＩＩａ製剤とも異なる。
【０００７】
本願発明の医薬組成物の主たる成分の前駆体であるＦＶＩＩは４０６残基のアミノ酸からなる分子量約５０,０００を有するビタミンＫ依存性凝固因子であり、血漿中には約０.５μｇ／ｍｌ含まれる。ＦＶＩＩは分子内のＡｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３結合が加水分解されることにより酵素活性を持つ二本鎖のＦＶＩＩａとなる。ＦＶＩＩａは組織因子とともにカルシウムイオン存在下でＦＩＸ及びＦＸを活性化する。従って、外因系凝固経路において非常に重要な位置を占めている物質とみなすことができる。
【０００８】
一方、ＦＸは４４８残基のアミノ酸からなる分子量約５９,０００のビタミンＫ依存性凝固因子であり、血漿中には５〜１０μｇ／ｍｌ含まれる。ＦＸは、カルシウムイオン存在下でＦＶＩＩａ／組織因子複合体により活性化されるか(外因系凝固経路)、あるいは、活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子、カルシウムイオン及びリン脂質存在下で活性化血液凝固第ＩＸ因子により活性化されて(内因系凝固経路)、活性化血液凝固第Ｘ因子(以下、ＦＸａと称することがある)となり、酵素活性を発揮するようになる。ＦＸａは活性化血液凝固第Ｖ因子、カルシウムイオン及びリン脂質存在下で、プロトロンビンをトロンビンに活性化し、その結果フィブリン形成を引き起こす。
【０００９】
本願発明に使用されるＦＶＩＩａ及びＦＸを製造する方法は特に限定されることなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組換え技術により作製する方法などによって製造することができる。
血液由来のＦＶＩＩａの製法としては、例えば、特開平３−１５５７９７、特開平１０−０５９８６６及び特開平１０−０５９８６７に示される方法がある。また、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってＦＶＩＩを精製した後、他の血漿蛋白質、例えば活性化血液凝固第ＸＩＩ因子、ＦＸａなどによりＦＶＩＩａに活性化する方法がある。得られるＦＶＩＩａは、その安全性を確保するために、ＦＩＩ、ＦＩＩａ、ＦＩＸ及びＦＩＸａを可能な限り伴わない方が好ましい。
【００１０】
血液由来のＦＸの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＸモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってＦＸを精製する方法がある。前記と同様、得られるＦＸはその安全性を確保するために、ＦＩＩ、ＦＩＩａ、ＦＩＸ及びＦＩＸａを可能な限り伴わない方が好ましい。
【００１１】
上述の方法で調製されたＦＶＩＩａまたはＦＸの活性を最大限に維持するために、それぞれ好適な安定化剤と共に凍結乾燥して保存することができるし、ＦＶＩＩａ溶液またはＦＸ溶液をそれぞれ凍結し保存することも可能である。さらには、ＦＶＩＩａまたはＦＸを好適な安定化剤と共に好適な濃度で混合し、凍結乾燥して保存することができるし、混合溶液を凍結し保存することも可能である。本願発明では、かかる有効成分としてＦＶＩＩａ、ＦＸを含む組成物と、公知の適当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で血液凝固障害を原因とする止血障害に対する予防・治療用製剤とすることができる。当該製剤の投与対象は、血液凝固障害によって引き起こされる止血障害のある患者であれば特に限定されることはない。
【００１２】
ＦＶＩＩａ及びＦＸの有効投与量は、例えば投与対象者の年齢、症状及び重症度などにより変動するが、５μｇ／体重(ｋｇ)〜１６０μｇ／体重(ｋｇ)のＦＶＩＩａ及び５０μｇ／体重(ｋｇ)〜１６,００μｇ／体重(ｋｇ)のＦＸで止血効果が期待出来る。投与方法は単回投与(Ｂｏｌｕｓ)あるいは点滴の静脈内投与が最適である。本願発明の予防・治療用製剤は、ＦＶＩＩａ及びＦＸを組み合わせて主成分とすることを好適な実施態様とするが、ＦＶＩＩａとＦＸの投与は間隔が充分短ければ、個別に投与することも可能であり、同様に本願発明の効果を発揮する。
【００１３】
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。
【００１４】
実施例１
(本願発明組成物のＡＰＴＴ測定による評価)
活性化部分トロンボプラスチン時間(以下、ＡＰＴＴと称することがある)は、ＡＰＴＴ試薬を用いて測定される内因系スクリーニング検査法である。具体的には、被検血漿にＡＰＴＴ試薬とカルシウムイオンを添加しフィブリンが形成されるまでの内因性凝固の酵素反応を総合的に測定するもので、特に、血友病ＡまたはＢに代表される内因系凝固因子の量的ないし質的異常、または内因系凝固因子に対するインヒビターの存在などによりＡＰＴＴは延長する。正常値は３０〜４０秒であり、その延長の度合は量的ないし質的異常を示している内因系凝固因子の凝固活性に依存し、一般に重篤な臨床症状を示す血友病(インヒビターも含む)では極度に延長する。齋藤らが報告したＦＶＩＩａ製剤の臨床評価結果によると(Jpn J Thromb Hemost 5(3):158-172(1994))、インヒビターを有する血友病患者１２人のＡＰＴＴは１２２.０±１８.７秒(平均±ＳＤ)に延長していたが、遺伝子組換えＦＶＩＩａ投与２０分後には８２.９±２１.６秒に低下した。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてもＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ等の各種欠乏血漿にＦＶＩＩａを添加すると、ＡＰＴＴが有意に短縮することが報告されている(Thromb Res 56:603-609(1989))。
本実験は上記事実に基づき、血友病患者様血漿として第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿または第ＩＸ因子欠乏血漿(いずれも、デイドベーリングマールブルグ社製)を用い、ＦＶＩＩａ、ＦＸ及びＦＩＩによるＡＰＴＴの短縮効果を評価した。ＡＰＴＴ試薬としては、Ａｃｔｉｎ(商品名)(デイドベーリングマールブルグ社製)を使用した。評価したＦＶＩＩａ等成分の濃度は、ＦＶＩＩａ：終濃度０〜４μｇ／ｍｌ血漿、ＦＸ：終濃度０〜８０μｇ／ｍｌ血漿(正常ヒト血漿中の濃度：約１０μｇ／ｍｌ血漿)、ＦＩＩ：終濃度０〜４００μｇ／ｍｌ血漿(正常ヒト血漿中の濃度：約１００μｇ／ｍｌ血漿)とした。結果を図２〜図６に示す。図２〜図４は、ＦＶＩＩａ、ＦＸ、ＦＩＩの各々の各欠乏血漿のＡＰＴＴへの濃度依存的な影響を表したもので、図５及び図６は、ＦＶＩＩａ及びＦＸの組み合わせによる各欠乏血漿のＡＰＴＴへの協同的影響を示したものである。
ＦＶＩＩａあるいはＦＸはともに各欠乏血漿のＡＰＴＴを濃度依存的に短縮させたが、ＦＩＩは各欠乏血漿のＡＰＴＴをほとんど短縮させないことが判明した。また、各欠乏血漿にＦＶＩＩａ及びＦＸを組み合わせ、終濃度それぞれ０〜１μｇ／ｍｌ血漿及び０〜４０μｇ／ｍｌ血漿で同時に添加してＡＰＴＴの短縮効果を調べた。ＦＶＩＩａ及びＦＸの濃度がより高い方がＡＰＴＴをより短縮させる傾向を示した。また、ＦＶＩＩａまたはＦＸ単独の効果に比較して、それら成分が組み合わされて同時に存在した場合、顕著な協同作用を示すことが認められた。
【００１５】
実施例２
(本願発明組成物のトロンボエラストログラフィーによる評価)
トロンボエラストログラフィー(thrombelastgraphy：以下、ＴＥＧと称することがある)は、血液凝固過程における弾性変化を測定するもので、血液凝固障害の種類により特有なパターンを示し、血液としての凝固能力を測定するために使用される。即ち、血友病または内因系凝固因子に対するインヒビター等が存在する状態では、血液凝固が阻害されＴＥＧパターンは異常を示す。数値的には、ＴＥＧパラメーターである反応時間(ｒ)及びｒ＋Ｋ(Ｋ：凝固時間)が変動し、正常ヒト血液の場合ｒは１０〜１５分、Ｋは６〜８分、ｒ＋Ｋは１６〜２３分であるが、血友病等では正常値を外れ、著明な延長をきたす。吉岡らの報告(Haemostasis 26(suppl 1):143-149(1996))によると、血友病Ａインヒビター患者にＦＶＩＩａ製剤を投与すると、それまで延長していたｒ(６０分以上)及びｒ＋Ｋ(８０分以上)が正常状態に近づき、生体内におけるＦＶＩＩａ濃度の低下に応じてｒ及びｒ＋Ｋが再び延長する。このことは、ＴＥＧ測定が血液としての凝固能力を測定するために有用な方法であることを示す。
前記原理に基づき、ヒト血液に抗ヒトＦＩＸヤギ抗体を添加することにより血友病Ｂインヒビター様血液を作製したところ、ｒは１２０分以上、ｒ＋Ｋは測定不可能な程度まで極度に延長した。この血友病Ｂインヒビター様血液にＦＶＩＩａ及びＦＸをそれぞれ０.１２５〜１μｇ／ｍｌ血液及び２.５〜２０μｇ／ｍｌ血液の濃度で添加した場合、ＦＶＩＩａ及びＦＸの濃度依存的にｒ及びｒ＋Ｋが短縮し、血友病Ｂインヒビター様血液として失われていた血液凝固能力がＦＶＩＩａ及びＦＸにより改善されることが示された。結果を図７及び図８に示す。
【００１６】
実施例３
(動物モデルを用いた本願発明組成物の評価)
本実験は、抗ヒトＦＩＸヤギ抗体をカニクイサルに投与して作製される血友病ＢインヒビターモデルがＡＰＴＴの延長、出血時間の延長、ＴＥＧパラメーターであるｒ(反応時間)とｒ＋Ｋ(Ｋ：凝固時間)の著明な延長及びｍａ(最大振幅)の縮小を示すことを利用して実施した。
カニクイサルに急速静注及び点滴静注により抗ヒトＦＩＸヤギ抗体を投与して血友病Ｂインヒビターモデルを作製し、ＦＶＩＩａ単独投与(８０μｇ／ｋｇ)とＦＶＩＩａ及びＦＸを組み合わせた投与(各々８０μｇ／ｋｇ及び８００μｇ／ｋｇ)による治療効果を、１)ＡＰＴＴ、2)出血時間、3)ＴＥＧを測定して比較した。結果を各々、図９、図１０及び図１１〜図１２に示した。
ＡＰＴＴは薬液(ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩａ及びＦＸ)投与前と比較して、ともに薬液投与により短縮し、その短縮効果はＦＶＩＩａ及びＦＸの同時投与がより優れていた。
出血時間測定は以下の方法により測定した。カニクイサルの尾の根本から１５ｃｍ付近を、尾と平行方向に、動静脈を避けてSimplate II R(Organon Teknika)でカットした。この際、blood pressure cuffを尾の根本に捲いて、４０ｍｍＨｇの圧力下で２回ずつカットし測定した(一次出血時間)。滲み出てくる血液は、傷口に触れないようにろ紙で吸い取った。次に二次出血時間として、一次止血後、傷口を綿角で３回擦り、傷口からの再出血を一次出血と同様に測定した。通常、一次出血時間は主として血小板による一次止血反応を反映することが知られており、事実、抗ヒトＦＩＸヤギ抗体を投与しても正常時と比較してやや延長した程度であり、顕著な延長は観察されなかった。一方、二次出血時間は抗ヒトＦＩＸヤギ抗体の投与により著明に延長し、ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩａ及びＦＸの同時投与により短縮した。しかし、その治療効果を比較すると、ＦＶＩＩａ単独投与よりもＦＶＩＩａ及びＦＸを組み合わせた同時投与の方がより正常状態近くに改善しており、薬液による出血傾向是正効果もより長時間持続した。
ＴＥＧパラメーターもｒ及びｒ＋Ｋにおいて、ＦＶＩＩａ単独投与に比べてＦＶＩＩａ及びＦＸの同時投与がより正常状態近くに改善しており、治療効果の持続性も優れていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】内因系凝固と外因系凝固の二つの経路の血液凝固カスケードを示す図である。
【図２】ＦＶＩＩＩ欠乏血漿またはＦＩＸ欠乏血漿のＡＰＴＴに対するＦＶＩＩａの影響を示す図である。
【図３】ＦＶＩＩＩ欠乏血漿またはＦＩＸ欠乏血漿のＡＰＴＴに対するＦＸの影響を示す図である。
【図４】ＦＶＩＩＩ欠乏血漿またはＦＩＸ欠乏血漿のＡＰＴＴに対するＦＩＩの影響を示す図である。
【図５】ＦＶＩＩＩ欠乏血漿のＡＰＴＴに対するＦＶＩＩａ及びＦＸの協同的影響を示す図である。
【図６】ＦＩＸ欠乏血漿のＡＰＴＴに対するＦＶＩＩａ及びＦＸの協同的影響を示す図である。
【図７】血友病Ｂインヒビター様血液のＴＥＧパラメーターｒ(反応時間)に対するＦＶＩＩａ＋ＦＸの効果を示す図である。
【図８】血友病Ｂインヒビター様血液のＴＥＧパラメーターｒ＋Ｋ(反応時間＋凝固時間)に対するＦＶＩＩａ＋ＦＸの効果を示す図である。
【図９】血友病Ｂインヒビター動物モデルのＡＰＴＴにおけるＦＶＩＩａ単独投与とＦＶＩＩａ＋ＦＸ投与の比較を示す図である。
【図１０】血友病Ｂインヒビター動物モデルの二次出血時間におけるＦＶＩＩａ単独投与とＦＶＩＩａ＋ＦＸ投与の比較を示す図である。
【図１１】血友病Ｂインヒビター動物モデルのＴＥＧパラメーターｒ(反応時間)に対するＦＶＩＩａ単独投与とＦＶＩＩａ＋ＦＸ投与の比較を示す図である。
【図１２】血友病Ｂインヒビター動物モデルのＴＥＧパラメーターｒ＋Ｋ(反応時間＋凝固時間)に対するＦＶＩＩａ単独投与とＦＶＩＩａ＋ＦＸ投与の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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