(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（３）で示されるケラタン硫酸オリゴ糖、又は式（４）で表されるケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体を有効成分とする、ＩＬ−１２産生抑制剤。
Gal(6S)β1-4GlcNAc  式（３）
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6Sは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを、β１−４はβ１，４グリコシド結合をそれぞれ表す）
【化１】
0004676049.tif 000006
（式中、Ｘ1〜Ｘ5は、それぞれ独立して、水素原子またはアシル基であり、Ｘ1〜Ｘ5の少なくとも一つはアシル基であり、Ｙは水素原子またはＳＯ3 Ｍであり、Ｍは、それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい１価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、波線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位を示す。）
【請求項２】
Ｘ1〜Ｘ5がいずれも炭素数１〜１０のアシル基であり、Ｍがアルカリ金属であることを特徴とする請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
下記式（１）又は（２）で示されるケラタン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、ＩＬ−１２産生抑制剤。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)  式（１）
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)                            式（２）
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6Sは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを、β１−４はβ１，４グリコシド結合を、β１−３はβ１，３グリコシド結合をそれぞれ表す）
【請求項４】
下記式（４）で示される、ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体。
【化２】
0004676049.tif 000007
（式中、Ｘ1〜Ｘ5は、それぞれ独立して、水素原子またはアシル基であり、Ｘ1〜Ｘ5の少なくとも一つはアシル基であり、Ｙは水素原子またはＳＯ3 Ｍであり、Ｍは、それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい１価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、波線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位を示す。）
【請求項５】
Ｘ1〜Ｘ5がいずれも炭素数１〜１０のアシル基であり、Ｍがアルカリ金属であることを特徴とする請求項４記載の誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生抑制剤およびＩＬ−１２産生抑制剤の有効成分として有用なケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−１２は、３５ｋＤおよび４０ｋＤの二つのポリペプチド鎖が結合してなる７０ｋＤの糖タンパク質（ｐ７０）からなるサイトカインであり、生体の免疫機能の調節において中心的役割を果たしていることが知られている（笠倉新平編、「サイトカイン」、第２版改定新版、第207〜225頁、株式会社日本医学館発行、1997年6月29日）。
【０００３】
ＩＬ−１２は、ヘルパーＴ細胞のＴヘルパー１細胞サブセット（Ｔｈ１）の分化誘導に働くため、Ｔｈ１の活性化が関連する自己免疫疾患では、病態の進行に促進的に働くことが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＩＬ−１２の産生を効果的に抑制できるＩＬ−１２産生抑制剤を提供することを目的とする。
また本発明は、ＩＬ−１２産生抑制剤の有効成分を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ケラタン硫酸オリゴ糖およびその誘導体にＩＬ−１２産生を抑制する作用があることを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、ケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を有効成分とする、ＩＬ−１２産生抑制剤（以下、本発明抑制剤ともいう）を提供する。
【０００７】
本発明抑制剤におけるケラタン硫酸オリゴ糖は、好ましくは、下記式で表される二糖のいずれかを繰返し構成単位として少なくとも１単位以上含む。
Gal(6S)-GlcNAc(6S)  および  Gal(6S)-GlcNAc
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6-O-硫酸エステルとなっていることを、-はグリコシド結合をそれぞれ表す）
【０００８】
さらに好ましくは、ケラタン硫酸オリゴ糖は、下記式(1)〜(3)で表されるものから選ばれるものである。
【０００９】
【化４】
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)  式(1)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)                             式(2)
Gal(6S)β1-4GlcNAc                                 式(3)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6-O-硫酸エステルとなっていることを、β1-4はβ1,4グリコシド結合を、β1-3はβ1,3グリコシド結合をそれぞれ表す）
【００１０】
本発明抑制剤において、ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体は、好ましくは、ヒドロキシル基におけるアシル化誘導体であり、より好ましくは、式(4)で示されるものである。
【００１１】
【化５】
0004676049.tif 000002
（式中、Ｘ1〜Ｘ5は、それぞれ独立して、水素原子またはアシル基であり、Ｘ1〜Ｘ5の少なくとも一つはアシル基であり、Ｙは水素原子またはＳＯ3Ｍであり、Ｍは、それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい１価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、波線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位を示す。）
【００１２】
一般式(4)において、好ましくは、Ｘ1〜Ｘ5がいずれも炭素数１〜１０のアシル基であり、Ｍがアルカリ金属である。
【００１３】
また本発明は、上記一般式(4)で示される、ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体（以下、本発明誘導体ともいう）を提供する。
【００１４】
本発明誘導体は、好ましくは、一般式(4)において、Ｘ1〜Ｘ5がいずれも炭素数１〜１０のアシル基であり、Ｍはアルカリ金属である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明抑制剤において用いる「ケラタン硫酸オリゴ糖」は、ケラタン硫酸の基本構造（ガラクトース残基またはガラクトース−６−Ｏ−硫酸残基と、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸残基とが交互にグリコシド結合した構造）を少なくとも含む二糖以上のオリゴ糖である限りにおいて特に限定されない。ケラタン硫酸オリゴ糖は、例えばケラタン硫酸を分解して得られる生成物であってもよく、また例えばＮ−アセチルラクトサミンが２単位以上結合してなるオリゴ糖等を硫酸化して得られる生成物であってもよい。
【００１６】
このようなケラタン硫酸オリゴ糖の中でも、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖（ケラタン硫酸由来のオリゴ糖）が好ましく、ケラタン硫酸をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素で分解して得られる分解生成物がより好ましい。
【００１７】
なお、このケラタン硫酸オリゴ糖は、シアル酸残基及び／又はフコース残基を含んでいてもよい。通常には、シアル酸残基は、α２，３又はα２，６グリコシド結合でガラクトース残基に結合し、フコース残基は、α１，３グリコシド結合でＮ−アセチルグルコサミン残基に結合する。
【００１８】
通常には、ケラタン硫酸オリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を還元末端に有する二〜十糖のオリゴ糖であり、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基は硫酸化されていてもされていなくてもよく、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基は硫酸化されているものがより好ましい。
【００１９】
さらに好ましくは、ケラタン硫酸オリゴ糖は、Gal(6S)-GlcNAc(6S)またはGal(6S)-GlcNAc（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6-O-硫酸エステルとなっていることを、-はグリコシド結合をそれぞれ表す）で表される二糖を繰返し構成単位として少なくとも１単位以上含むケラタン硫酸オリゴ糖である。
【００２０】
さらに好ましくは、前記ケラタン硫酸オリゴ糖は、式(1)で表されるオリゴ糖（以下、Ｌ４Ｌ４ともいう）、式(2)で表されるオリゴ糖（以下、Ｌ４ともいう）及び式(3)で表されるオリゴ糖（以下、Ｌ３ともいう）から選ばれる。
【００２１】
【化６】
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)  式(1)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)                             式(2)
Gal(6S)β1-4GlcNAc                                 式(3)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6-O-硫酸エステルとなっていることを、β1-4はβ1,4グリコシド結合を、β1-3はβ1,3グリコシド結合をそれぞれ表す）
【００２２】
本発明に用いられるケラタン硫酸オリゴ糖は、電離した状態のもの、プロトンが付加した構造のものを包含する。またケラタン硫酸オリゴ糖の薬学的に許容される塩も包含する。
【００２３】
本明細書において、ケラタン硫酸オリゴ糖の「誘導体」とは、通常には、ケラタン硫酸オリゴ糖のヒドロキシル基の水素原子の少なくとも一つ（好ましくは全ヒドロキシル基の１０％以上）が、アシル基、好ましくはＯ−アシル基により置換されたもの（部分または完全Ｏ−アシル化誘導体）であり、その薬学的に許容される塩も包含する。
【００２４】
薬学的に許容される塩とは、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
ケラタン硫酸オリゴ糖のヒドロキシル基の水素原子を置換するアシル基は、好ましくは炭素数１〜１０のアシル基、より好ましくは炭素数１〜１０の脂肪族又は芳香族のアシル基、すなわちヘテロ原子を含むこともあるアルカノイル基又はアロイル基であり、その例としては、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、プロピオニル、ｎ−ブチリル、（Ｅ）−２−メチルブテノイル、イソブチリル、ペンタノイル、ベンゾイル、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾイル、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾイル、２，４，６−トリメチルベンゾイル、ｐ−トルオイル、ｐ−アニソイル、ｐ−クロロベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイルなどの基が挙げられる。ケラタン硫酸オリゴ糖が複数のアシル基を有する場合には、それらのアシル基は互いに同一でも異なっていてもよい。
【００２６】
ケラタン硫酸オリゴ糖の還元末端糖の１位のヒドロキシル基の水素原子がアシル基により置換されている場合、そのＯ−アシル基の配位は、α−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位のいずれでもよいが、α−グリコシド配位であることが好ましい。
【００２７】
アシル化されたケラタン硫酸オリゴ糖は、有機溶媒、脂質に対する溶解性の向上、生体膜透過性の増大、経口投与した場合の消化管吸収量の増大等の利点を有する。
【００２８】
本発明抑制剤において、ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体は、好ましくは、上記式(4)で示されるものである。なお、上記式(4)においてＭは、それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい１価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、電離している場合は、スルホン酸基はマイナスイオンの状態になる。さらに好ましくは、Ｘ1〜Ｘ5のすべてがアセチル基である。特に好ましいものは、下記式(5)で示される誘導体である。
【００２９】
【化７】
0004676049.tif 000003
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｙは水素原子又はＳＯ3Ｎａ、波線で示した結合は、α−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位を示す。）
【００３０】
本発明抑制剤中に含有されるケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体は、単一の種からなっていても、混合物であってもよい。例えば上記式(5)中の波線で示した部分がα−グリコシド配位である物質の精製品であってもよく、β−グリコシド配位である物質の精製品であってもよく、これらの混合物であってもよい。
【００３１】
本発明に使用されるケラタン硫酸オリゴ糖は、例えばケラタン硫酸、好ましくは高硫酸化ケラタン硫酸の緩衝溶液にエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素、例えばバチルス属細菌由来のケラタナーゼ（II）（特開平２−５７１８２号公報）、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株由来のケラタン硫酸分解酵素（国際公開第WO96/16166号）を作用させて分解した後、得られた分解物を分画することにより得ることができる。得られたオリゴ糖は通常の分離精製方法、例えば、エタノール沈殿、ゲル濾過および陰イオン交換クロマトグラフィーにより、目的のオリゴ糖を分離精製することができる。このような製造方法の例は、国際公開第WO96/16973号に記載されている。なお、原料となるケラタン硫酸は、主としてガラクトースまたはガラクトース−６−Ｏ−硫酸とＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸との二糖の繰り返し構造で構成され、動物種および器官などによって硫酸含量が異なっているが、通常はサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の軟骨、骨や角膜などの生原料から製造されるものを用いることができる。
【００３２】
原料として使用されるケラタン硫酸は、通常入手できるものであればよく、特に限定されないが、構成糖であるガラクトース残基が硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸（構成二糖あたり１．５〜２分子の硫酸基を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタンポリ硫酸ということもある）を用いることが好ましい。また、ガラクトース残基の硫酸基の位置として、６位が好ましい。このような高硫酸化ケラタン硫酸は、たとえば、サメなどの軟骨魚類のプロテオグリカンから取得できる。また、市販されているものを使用することもできる。
【００３３】
また、このようにして得られたケラタン硫酸オリゴ糖の硫酸基含量を、糖鎖の公知の脱硫酸化法や硫酸化法によって適宜調整したものを、本発明に使用されるケラタン硫酸オリゴ糖として用いてもよい。
【００３４】
ケラタン硫酸オリゴ糖のヒドロキシル基の水素原子のアシル基による置換は、糖のヒドロキシル基の保護のために通常に行われるアシル化方法に従って行うことができる。例えば、導入すべきアシル基の反応性誘導体（アシル基に対応するカルボン酸の無水物（例えば、アセチル基を導入する場合は、無水酢酸、プロパノイル基を導入する場合は、無水プロピオン酸）、ハロゲン化物など）と、適当な反応溶媒（ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、水、およびこれらの混合物など）中でケラタン硫酸オリゴ糖を常法によって反応させることによってアシル基を導入することができる。必要に応じて、ピリジン等の塩基触媒の存在下で反応させることもできる。
【００３５】
必要により、アシル化の程度を調整してもよく、この調整は、上記のアシル化方法において部分的にアシル化を行うか、または、アシル化されたケラタン硫酸オリゴ糖からアシル基を部分的に除去することによって行うことができる。
【００３６】
アシル基の除去は、メタノール性アンモニア、濃アンモニア水、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いて加水分解することによって行うことができる。得られた誘導体は、逆相高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【００３７】
本発明抑制剤の有効成分であるケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体は、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を含まないものであることが好ましい。
【００３８】
本発明抑制剤は、ＩＬ−１２産生を抑制するのに有効であるので、ＩＬ−１２産生の抑制を目的とする限り、適用可能な疾患は限定されない。ＩＬ−１２産生の抑制が有効な疾患の例としては、ＩＬ−１２がその病勢の進行に促進的に働く、Ｔｈ１の活性化が病因となる疾患がある。このような疾患として、具体的には、接触性皮膚炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、アレルギー性脳脊髄膜炎、インスリン依存性糖尿病、糖尿病、橋本氏病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、サルコイドーシス、乾癬、リポ多糖誘発肝壊死、半月体形成性腎炎、全身性エリテマトーデスなどが挙げられる。従って本発明抑制剤は、これらの疾患の処置剤としての思想も包含する。
【００３９】
本発明抑制剤は、純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的として適用することができる。
【００４０】
本発明においては、対象となる疾患の性質や進行状況、投与方法などに応じて、任意の剤形を適宜選択することができる。
【００４１】
すなわち、本発明抑制剤は注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入などにより投与することができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
【００４２】
本発明抑制剤中の有効成分であるケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体の配合量ならびに本発明抑制剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重、年齢、性別等に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、ケラタン硫酸オリゴ糖の臨床量としては成人１日１回あたり５０〜５０００mgが例示される。
【００４３】
なお本発明抑制剤の有効成分であるケラタン硫酸オリゴ糖の安全性については、国際公開第WO96/16973号において示されており、またその誘導体についても後述の実施例から安全性が推定される。
【００４４】
【実施例】
以下に本発明を、実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００４５】
【実施例１】
Ｌ４のアセチル化物の合成
Ｌ４の二ナトリウム塩（WO96/16973に記載の方法で製造したもの）を脱イオン水に溶解し、カチオン交換樹脂(Dowex 50W-X4、H+-form；ダウケミカル製)カラムに通して酸遊離型とし、直ちに氷冷した。これに対して、引き続き氷冷下におき、10倍脱イオン水希釈した水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを1.1倍 Ｌ４-硫酸基当量滴下した。約１時間攪拌後、溶液を低温下にて減圧濃縮し、Sephadex-LH20カラム(ファルマシア社)に通して粗精製後、水溶液から凍結乾燥し、Ｌ４−ジ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）塩を得た。
【００４６】
乾燥したＬ４−ジ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）塩を100mg/mlの濃度でピリジンに溶解し、室温にて攪拌しながら無水酢酸(L4-総ヒドロキシル基量に対して1.5倍当量)を滴下して添加した。室温にて２４時間攪拌後、溶媒を低温下で減圧留去し、メタノール／ジエチルエーテル溶媒系にて繰り返し再沈殿して粗Ｌ４アセチル化物−ジ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）塩を得た。これを陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(LiChroprep NH2；メルク社製)にてナトリウム塩に交換し、引き続きゲル濾過クロマトグラフィー(Cellulofine GCL-25；生化学工業株式会社販売)にて精製後凍結乾燥して、式(5)で示されるＬ４のペンタ−Ｏ−アセチル化物（以下、AcL4ともいう）を、α−グリコシド配位体とβ−グリコシド配位体の混合物として得た。またα-グリコシド配位体とβ-グリコシド配位体の分離は陰イオン交換クロマトグラフィー(LiChroprep RP-18；メルク社製)で行い、α−グリコシド配位体を取得した。AcL4（α−グリコシド配位体）の1H-NMRスペクトルおよび13C-NMR（DEPT）スペクトルを以下に示す。
【００４７】
1H-NMRスペクトル
1H-NMR（400MHz、D2O、TSP（δH＝0.00ppm））
δH＝1.97ppm（s,3H,COCH3）、2.02（s,3H,COCH3）、2.17（s,3H,COCH3）、2.18（s,3H,COCH3）、2.217（s,3H,COCH3）、2.220（s,3H,COCH3）、4.07-4.17（m,4H,H-4A,H-5A,H-6B,H-6'B）、4.22-4.28（m,3H,H-5B,H-6A,H-6'A）、4.40-4.44（dd,1H,H-2A）、4.91-4.93（d,1H,H-1B）、5.00-5.04（dd,1H,H-2B）、5.20-5.23（dd,1H,H-3B）、5.26-5.31（dd,1H,H-3A）、5.485-5.493（d,1H,H-4B）、6.09-6.10（d,1H,H-1A）
【００４８】
13C-NMR（DEPT）スペクトル
13C-NMR（100MHz、D2O、TSP（δC＝0.00ppm））
δC＝22.86ppm（2C,OCOCH3）、23.04（OCOCH3）、23.08（OCOCH3）、23.43（OCOCH3）、24.47（NHCOCH3）、53.09（C-2A）、67.98（C-6B）、68.36（C-6A）、70.61（C-4B）、72.62（C-2B）、73.34（C-5B）、73.56（2C,C-3A,C-5A）、74.27（C-3B）、77.80（C-4A）、93.38（C-1A）、102.96（C-1B）
【００４９】
なお、上記データ中、「A」はＮ−アセチルグルコサミン残基を、「B」はガラクトース残基を示す。
【００５０】
Amberlite IR-120カラム（シグマ社）を0.1M HClで洗浄した後、蒸留水で平衡化した。蒸留水50mlに溶解した５ｇのＬ４をカラムにアプライし、蒸留水で溶出した。15mlずつ分取した溶出画分のpHを測定し、酸性を示す画分を集めた。ピリジンを加えてpH 6.5に調整し、ロータリーエバポレーターで過剰のピリジンを除去した後、凍結乾燥した。
【００５１】
以下の実施例で用いたＬ４（二ナトリウム塩）およびＬ４Ｌ４（四ナトリウム塩）はいずれも国際公開第WO96/16973号に記載の方法で製造したものを用いた。また、Ｌ３（一ナトリウム塩）は以下の方法で製造したものを用いた。
【００５２】
Ｌ４のジピリジニウム塩５ｇを塩化アセチルとメタノールの混合溶液中で反応させ、脱硫酸化した。反応後の溶液を蒸留水で平衡化したムロマックカラム（室町化学工業）(3×21cm)にアプライした。0 Ｍ(1L)から2.0 Ｍ(1L)のNaCl濃度勾配をカラムに負荷し、溶出液を16mlずつ分取した。溶出画分のヘキソース含量を測定し、部分脱硫酸化Ｌ４の溶出位置を確認した。
【００５３】
部分脱硫酸化Ｌ４を含む画分を集めて減圧濃縮し、蒸留水で平衡化したSephadex G-10カラム（アマシャムファルマシアバイオテク）により脱塩した。脱塩標品を凍結乾燥した後、β-ガラクトシダーゼ（生化学工業株式会社）45単位を含む100mMのクエン酸リン酸緩衝液に溶解させ、37℃で45時間保温することにより、混入するGalβ1-4GlcNAc(6S)を分解した。
【００５４】
反応溶液を蒸留水で平衡化したムロマックカラム(3×32cm)にアプライした。0 M (1L)から1.5 M(1L)のNaCl濃度勾配をカラムに負荷し、溶出液を19mlずつ分取した。溶出画分のヘキソース含量を測定し、Ｌ３の溶出位置を確認した。
【００５５】
Ｌ３を含む画分を集めて減圧濃縮し、Sephadex G-10カラムにより脱塩した。脱塩したＬ３溶液は、Dowex 59wx4カラム（ダウケミカル）を用いてナトリウム塩に交換し、再びムロマックカラム（2.2×52cm）にアプライした。0 M(1L)〜0.75 M(1L)のNaCl濃度勾配をカラムに負荷し、溶出液を15mlずつ分取した。溶出画分をキャピラリー電気泳動で分析し、Ｌ３の溶出位置を確認した。
【００５６】
Ｌ３を含む画分を集め、電気透析装置（Micro Acilyzer、旭化成工業株式会社）によりNaClを除去した後、5mlに減圧濃縮した。濃縮溶液は400μl（Ｌ３約20mg）ずつ数回に分けて、３ＭNaClで平衡化した高速液体クロマトグラフィーDAISO Pakカラム（ダイソー）(2×50cm)にアプライした後、３ＭNaClで溶出した。
【００５７】
Ｌ３を含む溶出画分を分取して減圧濃縮し、蒸留水で平衡化したSephadex G-10カラム（2.2×114cm）により脱塩し、再び減圧濃縮した。濃縮溶液を分子量カット１万の限外ろ過膜でろ過してエンドトキシンを除去した後、凍結乾燥して、以下の実施例で用いた。
【００５８】
【実施例２】
Ｌ４の投与による血漿ＩＬ−１２の減少
血漿ＩＬ−１２量を、Ｌ４で処置したまたは処置しないＭＲＬ lpr/lprマウスを用いて調べた。ＭＲＬ lpr/lprマウス由来のマクロファージは顕著にＩＬ−１２を産生することが知られており、また、その血清ＩＬ−１２量は高い（J. Exp. Med., 183, pp.1447-1459(1996)）。
【００５９】
ＭＲＬ lpr/lpr系マウス、並びに、正常コントロールとしてＣ５７ＢＬ／６系マウスおよびＩＣＲ系マウスを日本チャールスリバー株式会社から入手し、数週間予備飼育を行った後、群分けを行った。眼窩静脈叢より採血し、血漿中クレアチニン値（ＣＲＥ）を第一の指標として、その平均値および標準偏差が群間で差がないように割り付けた。また、血漿中尿素窒素値（ＢＵＮ）、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）および体重についてもなるべく群間で差がないように割り付けた。
群構成は以下の通りとした。
【００６０】
【表１】
0004676049.tif 000004
【００６１】
試験物質の投与は群分けの翌日から行った。蒸留水に試験物質を所定の投与濃度で溶解し、この溶液を投与した。投与回数および期間は３回／週の間歇投与で４週間（計１２回）とした。
【００６２】
経口投与は、滅菌済の1 mlディスポーザブル注射筒および滅菌済み経口ゾンデを用いて常法により行った。経鼻投与は、マイクロピペットおよび滅菌済みのチップを用いて常法により行った。
観察および測定は以下のように行った。
【００６３】
（１）一般状態
投与開始から剖検までの２９日間の観察期間中、毎日、１日１回以上、一般状態および死亡状況について観察した。
【００６４】
（２）体重
群分け時、投与開始日および投与開始日より１週間毎に測定した。
【００６５】
（３）血液学的検査
多項目自動血球計数装置（Sysmex K-2000; 東亜医用電子）を用い、白血球数（ＷＢＣ）を、群分け時および剖検前日に眼窩静脈叢から採血し測定した。
【００６６】
（４）剖検
最終観察終了時に剖検し、主要諸器官について異常の有無を肉眼的に観察した。また、肝臓、腎臓、脾臓、腸間膜・頸部リンパ節の重量を測定した。途中死亡例についても同様に剖検した。
【００６７】
（５）血中サイトカイン
群分け時および剖検前日に眼窩静脈叢から採血し、ＩＬ−１２の血漿中濃度を、IL-12 p70 ELISAキット（Endogen,Inc.）を用いて測定した。
【００６８】
上記で得られた測定値については、平均値および標準偏差を算出し、ウィリアムズの多重比較検定法によって、統計学的有意性を検討した。
結果は以下の通りであった。
【００６９】
（１）一般状態
変化は認められなかった。
【００７０】
（２）体重
いずれの群においても順調な推移が認められた。
【００７１】
（３）血液学的検査
低用量のＬ４投与群で、ＷＢＣの有意な増加抑制が認められた。群１、２、３および４の剖検前日の結果を図１に示す。図中、＊はｐ＜０．０５の水準で有意であることを示す。
【００７２】
（４）剖検
異常は認められなかった。器官重量にも有意な相違は認められなかった。
【００７３】
（５）血中サイトカイン
Ｌ４投与群においてＩＬ−１２の増加抑制が認められた。群１、２、３および５の剖検前日の結果を図２に示す。図中、＊および＊＊は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。なお群５(C57BL/6)は、正常なマウスのレベルを示すものである。
【００７４】
この結果から、Ｌ４はＩＬ−１２産生を抑制する作用を有することが示された。
【００７５】
【実施例３】
Ｌ４アセチル化物の投与による効果
９週齢のＭＲＬ lpr/lpr系マウス、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスおよびＩＣＲ系マウスを日本チャールスリバー株式会社から入手した。予備飼育期間を６週間とし、群構成は以下の通りとした。
【００７６】
【表２】
0004676049.tif 000005
【００７７】
蒸留水に試験物質を所定の投与濃度で溶解し、この溶液を投与した。投与回数および期間は３回／週の間歇投与で６週間（計１９回）とした。観察は投与開始から剖検までの４５日間とした。他の条件・方法等は実施例２と同様とした。
結果は以下の通りであった。
【００７８】
（１）一般状態
変化は認められなかった。
【００７９】
（２）体重
いずれの群においても順調な推移が認められた。
【００８０】
（３）血液学的検査
Ｌ４経鼻投与群、およびＬ４アセチル化物投与群で、ＷＢＣの増加抑制が認められた。群１〜６の剖検前日の結果を図３に示す。図中、＊はｐ＜０．０５の水準で有意であることを示す。
【００８１】
（４）血液生化学的検査
臨床化学自動分析装置（COBAS MIRA S; 日本ロシュ）を用いて、血漿中クレアチニン値（ＣＲＥ）および血漿中尿素窒素値（ＢＵＮ）について群分け時および剖検前日に眼窩静脈叢から採血し測定した。
【００８２】
その結果、低用量のＬ４アセチル化物投与群及びＬ４投与群で、ＣＲＥおよびＢＵＮの有意な低下が認められた。群１〜６の剖検前日の結果を図４に示す。図中、＊および＊＊は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。
【００８３】
この結果から、Ｌ４、Ｌ４アセチル化物は、腎疾患（例えば腎炎（糸球体腎炎等）、腎症（ループス腎症等））の治療剤、予防剤としても有用であることが示された。
【００８４】
（５）剖検
異常は認められなかった。器官重量にも有意な相違は認められなかった。
【００８５】
（６）血中サイトカイン
Ｌ４経鼻投与群においてＩＬ−１２の増加抑制が認められた。群１、５および６の剖検前日の結果を図５に示す。図中、＊＊は、ｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。
【００８６】
この結果からも、Ｌ４はＩＬ−１２産生を抑制する作用を有することが確認された。
【００８７】
【実施例４】
マクロファージにおけるＬ４処理によるＩＬ−１２  ｐ７０産生の減少
８〜３９週齢のＭＲＬ lpr/lpr系マウスの腹腔に５〜７ｍｌの氷冷ハンクス液を注入し、５分後に回収することにより常在性腹腔細胞を採取した。採取した細胞を、９６穴平底プレートで、ＲＰＭＩ培地により、３７℃、５％ＣＯ2の条件下一晩培養した。培養後、浮遊細胞を除き、付着細胞を腹腔マクロファージとして実験に用いた。
【００８８】
リポ多糖（ＬＰＳ）（List Biological Laboratories, Inc.）により細胞を２４時間処理することでＩＬ−１２産生を刺激した。細胞培養上清のＩＬ−１２のｐ７０の濃度を、IL-12 p70 ELISAキット（Endogen,Inc.）を用いて測定することにより、ＩＬ−１２の産生を評価した。測定値については、平均値および標準偏差を算出し、特にことわらない限りウィリアムズの多重比較検定法によって統計学的有意性の検討を行った。
実験は以下の通りである。
【００８９】
（１）ＬＰＳおよびＬ４で同時に処理
種々の濃度のＬ４およびＬＰＳ（100 ng/ml）を含む培地中で２４時間刺激し、ＩＬ−１２産生を評価した。
【００９０】
（２）予めＬＰＳで刺激した後にＬ４で処理
100 ng/mlのＬＰＳで、０、２または６時間マクロファージを処理した後、1000 ng/mlのＬ４を含む新しい培地または新しい培地のみ（Ｌ４(-)）に交換し（これにより前処理により産生されたＩＬ−１２が除かれる）、培地交換の２４時間後にＩＬ−１２産生を評価した。
【００９１】
（３）予めＬ４で処理した後にＬＰＳで刺激
先ず、種々の濃度のＬ４によりマクロファージを２４時間処理した後、100 ng/mlのＬＰＳを含む培地に交換し、培地交換の２４時間後にＩＬ−１２産生を評価した。
【００９２】
ＬＰＳおよびＬ４で同時に処理した場合の結果を図６に示す。Ｌ４は100 ng/mlのＬＰＳで刺激した群において用量依存的なＩＬ−１２産生の抑制効果を示した。この結果は、８週齢のマウスを用いても３９週齢のマウスを用いても同様であった（図６）。また、別の系のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系マウス）を用いても同様であった（図７）。図６及び図７において、＊および＊＊はそれぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。
【００９３】
予めＬＰＳで刺激した後、Ｌ４で処理した場合の結果を図８に示す。図中、＃は検出不能であること、＊はスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５の水準で有意であることを示す。ＬＰＳで２時間および６時間の前処理を行ったマクロファージでも、Ｌ４によるＩＬ−１２産生の抑制が認められた。
【００９４】
これらの結果から、ＬＰＳによる刺激の後であっても、Ｌ４がＩＬ−１２産生を抑制できることが示された。
【００９５】
予めＬ４で処理した後にＬＰＳで刺激した場合の結果を図９に示す。図中、＊はｐ＜０．０５の水準で有意であることを示す。Ｌ４の前処理によりＩＬ−１２産生が抑制されることが明らかである。高用量（100 ng/ml以上）では、ほぼ完全にＩＬ−１２産生が抑制された。また、正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系マウス）を用いても（但し、Ｌ４による前処理を３６時間とした）同様であった（図１０）。図１０中、＊はｐ＜０．０５の水準で有意であることを示す。
【００９６】
1000 ng/mlのＬ４で２４時間前処理したマクロファージまたはＬ４で前処理しないマクロファージを、100 ng/mlのＬＰＳで２４時間処理した場合（Ｌ４前処理）のＩＬ−１２産生と、1000 ng/mlのＬ４と共に、または、Ｌ４なしで100 ng/mlのＬＰＳで処理した場合（同時処理）のＩＬ−１２産生とを比較した。結果を図１１に示す。図１１中、＊および＊＊はスチューデントのｔ検定においてそれぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。
【００９７】
図１１のデータから、同時投与に比して、Ｌ４前処理の方がより効率的にＩＬ−１２産生を抑制していること分かる。
【００９８】
また、Ｌ４Ｌ４（四ナトリウム塩）をＬ４の代わりに用いても同様の結果が得られた。種々の濃度のＬ４Ｌ４の存在下、100 ng/mlのＬＰＳで２４時間刺激した結果を図１２に示す。
【００９９】
【実施例５】
慢性関節リウマチ患者の滑膜細胞におけるＬ４処理によるＩＬ−１２  ｐ７０産生の減少
ヒト慢性関節リウマチ患者から採取した滑膜細胞を、500ng/mlのＬＰＳ、50単位/mlのリコンビナント マウスインターフェロン(IFN)-γ(recombinant mouse IFN-γ)および10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地(SIGMA社)に1x106個/mlとなるように懸濁し、細胞液を調製した。
【０１００】
９６穴平底プレートに上記細胞液100μlを添加し、さらにＲＰＭＩ１６４０培地中の、最終濃度の２倍となるように濃度を調整したＬ４溶液を100μl添加し、37℃、５％ ＣＯ2の条件下で２４時間培養した。
【０１０１】
その後、プレートを遠心して培養上清を回収し、上清中のIL-12濃度を前記と同様に測定した。結果を図１３に示す。
【０１０２】
図１３から、Ｌ４の添加によってＩＬ−１２の産生が抑制される傾向が見られ、1000ng/mlのＬ４によって滑膜細胞のＩＬ−１２産生は約１／２となった。
【０１０３】
【実施例６】
マクロファージにおけるＬ３処理によるＩＬ−１２  ｐ４０産生の減少
C3H/HeNマウス腹腔中に、氷冷したリン酸緩衝生理食塩液(PBS)を注入した。マウスの腹部をマッサージした後、PBSを回収して遠心してマクロファージを得た。得られたマクロファージを、200ng/mlのＬＰＳ、２単位/mlのリコンビナント マウスインターフェロン(IFN)-γ(recombinant mouse IFN-γ)および10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地(SIGMA社)に1x106個/mlとなるように懸濁し、細胞液を調製した。
【０１０４】
９６穴平底プレートに上記細胞液100μlを添加し、さらにＲＰＭＩ１６４０培地中の、最終濃度の２倍となるように濃度を調整したＬ３溶液を100μl添加し、37℃、５％ ＣＯ2の条件下で２４時間培養した。
【０１０５】
その後、プレートを遠心して培養上清を回収し、上清中のIL-12濃度を前記と同様に測定した。結果を図１５に示す。
【０１０６】
図１５から明らかな通り、Ｌ３は用量依存的にマクロファージのＩＬ−１２産生を抑制した。
【０１０７】
実施例２〜６のデータから、ケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体がＩＬ−１２産生を抑制できることが明らかである。特に、予め投与しておくことで、その後のＩＬ−１２産生を抑制できること（予防効果があること）が明らかである。
【０１０８】
【発明の効果】
ＩＬ−１２産生抑制剤は、生体の免疫機能の調節におけるＩＬ−１２の役割を研究するための研究用試薬として有用である。また、ＩＬ−１２がその病勢の進行に促進的に働く疾患の治療や予防のための医薬として使用できる。本発明のＩＬ−１２産生抑制剤は、天然物由来の物質を素材としており、その安全性も高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血中の白血球（ＷＢＣ）数を示す。
【図２】  Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血漿中のＩＬ−１２量を示す。
【図３】  Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血中のＷＢＣ数を示す。
【図４】  Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血漿ＣＲＥおよびＢＵＮ量を示す。
【図５】  Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血漿中のＩＬ−１２量を示す。
【図６】  ８週齢および３９週齢のＭＲＬマウス由来の腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図７】  Ｃ５７ＢＬ６／７マウス由来の腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図８】  ＭＲＬマウス由来の腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図９】  ＭＲＬマウス由来腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図１０】  Ｃ５７ＢＬ６／７マウス由来腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図１１】  ＭＲＬマウス由来腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図１２】  ＭＲＬマウス由来腹腔マクロファージにおける、Ｌ４Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図１３】  ヒト慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞における、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。
【図１４】  C3H/HeNマウス由来腹腔マクロファージにおける、Ｌ３のＩＬ−１２産生抑制効果を示す。
【図１】
0004676049.tif 000008
【図２】
0004676049.tif 000009
【図３】
0004676049.tif 000010
【図４】
0004676049.tif 000011
【図５】
0004676049.tif 000012
【図６】
0004676049.tif 000013
【図７】
0004676049.tif 000014
【図８】
0004676049.tif 000015
【図９】
0004676049.tif 000016
【図１０】
0004676049.tif 000017
【図１１】
0004676049.tif 000018
【図１２】
0004676049.tif 000019
【図１３】
0004676049.tif 000020
【図１４】
0004676049.tif 000021