(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体触媒を用いて化合物を複数の反応槽内で連続的に製造する方法において、反応槽間での上流側反応槽の温度よりも下流側反応槽の温度の方を５℃以上高くし、生体触媒を上流の反応槽に添加し下流の反応槽から抜き取る化合物の製造方法であって、反応槽中で触媒が反応液の流れに対して並行に流れ、生体触媒が微生物菌体、又はその処理物である、生体触媒による生産性を向上させる製造方法。
【請求項２】
製造される化合物が、アミド化合物である請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項３】
製造される化合物が、アクリルアミド、ニコチンアミド、5-シアノバレロアミドである請求項２記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体触媒を用いて化合物を製造する方法に関する。
背景技術
菌体、固定化菌体または固定化酵素等の生体触媒（以下生体触媒と記すことがある）は、反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生物が少ないことによる反応生成物の純度が高いこと、また反応条件が穏和であるため反応性に富んだものの製造も安定して出来ること等の利点があるため、近年多くの化合物の製造に用いられている。
しかしながら生体触媒は反応中に触媒活性の低下（失活）を引き起こす。その為、単位触媒量当たりの化合物の生成量即ち触媒の生産性（以後、単に生産性と呼ぶ）を向上させるために失活を抑制する方法が検討されてきた。例えば、反応を氷点から１５℃の低温で行う方法（特公昭５６−３８１１８号公報）、複数の供給口から低濃度の基質を連続的に供給する方法（特公昭５７−１２３４号公報）、微生物またはその処理物を有機溶媒で処理する方法（特開平５−３０８９８０号公報）、高級不飽和脂肪酸存在下で反応を行う方法（特開平７−２６５０９０号公報）、菌体をグルタルアルデヒド等で架橋処理する方法（特開平７−２６５０９１号公報、同８−１５４６９１号公報）等がある。
発明の開示
しかしこれらの方法のみでは触媒の生産性は充分ではなく、その結果化合物製造時の触媒使用量が少なくないため、化合物の製造原価を高めてしまうのみならず、廃触媒も多くその処理方法が問題となっている。
したがって本発明は、より効率よく生体触媒を利用する、すなわち触媒の生産性を向上させることで、化合物製造時の触媒比例費を低減せしめかつ廃棄物の少ない、すなわち低コストで効率的、低環境負荷型の化合物製造方法を提供することを目的とする。
通常、生体触媒を用いて化合物を製造するには、失活を抑制するためにより低温で反応を行う事が好ましい。しかしながら本発明者らが、鋭意検討を行ったところ反応槽内での触媒の流れの下流側の反応槽の温度を上流側よりも上昇させた方が触媒の生産性が向上することを見出し、本発明に至った。さらに、反応が発熱反応である場合には反応槽の除熱量を減少させるだけという、操作的にも経済的にも安易な方法にて本発明を達成できることを見出した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  生体触媒を用いて化合物を１個又は複数の反応槽内で連続的に製造する方法において、反応槽内又は反応槽間での上流側反応温度よりも下流側反応温度の方を高くすることを特徴とする化合物の製造方法、
（２）  反応槽内又は反応槽間での上流側反応温度よりも下流側反応温度の方を１℃以上高くすることを特徴とする（１）の製造方法、
（３）  反応槽内又は反応槽間での上流側反応温度よりも下流側反応温度の方を５℃以上高くすることを特徴とする（１）の製造方法、
（４）  生体触媒が、微生物菌体、又はその処理物である（１）から（３）のいずれかの化合物の製造方法、
（５）  製造される化合物が、アミド化合物である（４）の化合物の製造方法、
（６）  製造される化合物が、アクリルアミド、ニコチンアミド、５−シアノバレロアミドである（５）の化合物の製造方法、及び
（７）  反応槽中で触媒が、反応液の流れに対して並行に流れる（１）から（６）のいずれかの化合物の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体触媒を用いて化合物を反応槽で連続的に製造する方法に適用される。生体触媒を用いて化合物を反応槽で連続的に製造する方法とは、生化学反応器（酵素反応器）及び生物反応器（微生物反応器）を含むバイオリアクターを用いての化合物製造方法をいい、攪拌槽型、固定層型、流動層型、移動層型等の種々の形式のリアクターを用いて実施することができる。この際、化合物を製造する反応は反応槽内で行われ、反応槽を１つだけ有するものもあり、又は複数の反応槽を有するものもある。反応槽は、２つ以上の複数個用いた方が、温度制御や触媒置換のし易さ等の操作性の向上、および反応効率の向上等の点から好ましい。
本発明で使用される生体触媒には、目的とする反応を触媒する酵素を含有する動物細胞、植物細胞、細胞小器官、菌体（生菌体又は死菌体）もしくはその処理物が包含される。処理物としては、細胞から抽出された粗酵素又は精製酵素、さらに動物細胞、植物細胞、細胞小器官、菌体（生菌体又は死菌体）又は酵素自体を包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものが包含される。生体触媒として用いる菌体として、例えばロドコッカス・ロドクロウス  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、シュードモナス・クロロラフィス  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ等の微生物の菌体が挙げられ、酵素としてこれらの微生物が産生するニトリルヒドラターゼが挙げられる。ここで包括法とは菌体又は酵素を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法であり、架橋法とは酵素を２個又はそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法であり、担体結合法とは水不溶性の担体に酵素を結合させる方法である。固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等がある。
菌体を固定化する方法のうち、包括固定化法は菌体濃度の高い固定化菌体が得られるため、工業的に多く用いられている。例えば、アクリルアミドおよび／またはアクリルアミドの誘導体を包括固定化用モノマーとして用いられている例が、特公昭５８−３５０７８号公報や特開平７−２０３９６４号公報に示されている。本発明の製造される化合物は、生体触媒の作用で製造できる化合物であれば特に限定されない。例えば、アルコール類やアミド類などの汎用化学品や、アミノ酸や抗生物質・生理活性物質などの食品・香粧品・医薬品あるいはその原材料や中間体などがある。特に、汎用化学品の製造においては、経済性の観点から触媒の使用量を減らすことが重要かつ不可欠であるため、本発明は汎用化学品の生体触媒での製造において好ましく、具体的には、現在生体触媒を用いて大量に製造されている汎用化学品であるアミド化合物の製造においてより好ましい。アミド化合物として、例えばアクリルアミド、ニコチンアミド、５−シアノバレロアミドが挙げられる。
本発明の連続的に製造する方法とは、原料化合物を反応槽内に連続的あるいは断続的に添加しつつ、反応槽内の反応液を全量抜き取ることなく、連続的あるいは断続的に反応液を抜き取りつつ製造する方法である。すなわち、定期的に反応液を全量抜き取って製造する、いわゆる回分反応や半回分反応（バッチあるいはセミバッチ反応）での製造ではないことを意味する。本発明の生体触媒を用いて化合物を連続的に製造する反応様式には、固定層、移動層、流動層、撹拌槽等を用いて行う様式が考えられる。いずれの様式においても、本発明で用いる反応槽は、ジャケット、冷却若しくは加温コイル、外部循環冷却装置若しくは外部循環加温装置等の冷却若しくは加温装置が装備されているか、又は反応器全体若しくは一部を恒温槽中に入れるなどの方法によって、冷却又は加温が行えるようにしたものを用いるのが望ましい。また、反応槽の間に熱交換器を挿入することも可能である。
このような様式においては、何れの場合でも生体触媒は経時的に失活するため、生体触媒を連続的あるいは断続的に反応槽内に添加し、同時に反応槽から抜き出していく必要がある。このため、連続的に製造する方法においては生体触媒にある一定の流れ、即ち上流側から下流側への流れが生ずることになる。本発明の上流側とは反応槽内に触媒が添加される側であり、下流側とはその反対に触媒が抜き取られる側をいう。
反応の様式ごとに、より具体的に説明すると、固定層の場合には多槽の固定層を用いて疑似移動層として使用する（メリーゴーランド方式で使用する）ことが前提であり、流動層や撹拌槽の場合には多槽連続であることが前提である。この場合の上流側の反応槽とは複数の反応槽のうち触媒が添加される側に位置する反応槽であり下流側の反応槽とは触媒が反応系から抜き取られる側に位置する反応槽である。また、１つの反応槽内で反応液の流れに伴い生体触媒が移動していく移動層の場合には、上流側とは触媒が添加されるいわゆる反応槽入り口付近であり、下流側とは触媒が反応系から抜き取られるいわゆる反応槽出口付近である。なお、ここでいう移動層は、流通管形反応槽による反応様式も含有する。
従って、反応槽内での触媒の流れの上流側反応温度よりも下流側反応温度の方を高くするとは、以上述べてきた触媒の下流側の反応温度の方を上流側の温度より高くすることを意味する。具体的には、多槽を用いる連続様式においては、複数の槽の中で一番下流側に位置する反応槽の温度を一番上流に位置する反応槽の温度よりも高くすることを意味する。例えば４槽の反応槽をつないだ場合、１槽目より４槽目の反応槽の温度を高くすることを意味する。また、移動槽等の単槽を用いる連続様式においては反応槽出口に近い部分の温度を反応槽入り口に近い部分の温度より高くすることを意味する。ここで反応温度が高いとは、計測できる範囲で高いことが確認できることであり、０．１℃以上高いことである。本発明をより効果的にするためには、１℃以上高いことが好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましい。また、反応温度は、反応に使用する触媒の安定性等を考慮して適宜、選択される。
本発明においては、触媒の流れが、反応液の流れに対して並行であることが好ましく、触媒の流れが、反応液の流れに対して並行であることとは反応液と触媒の流れが同じ方向であることを意味する。このように、触媒が反応液と同じ方向に流れると反応が発熱反応である場合において、除熱量を調節するだけで反応温度を上げる事ができ、容易に触媒の反応槽内での流れの上流側反応温度よりも下流側反応温度の方を高くすることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１
（１）生体触媒の調製
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウス  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ１株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８７年９月１８日に寄託されている）を、グルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％（何れも質量％）を含む培地（ｐＨ７．０）により３０℃で好気的に培養した。これを遠心分離機および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、集菌洗浄して菌体懸濁液（乾燥菌体１５質量％）を得た。
（２）３−シアノピリジンからニコチンアミドへの反応
内容積１Ｌのジャケット付セパラブルフラスコを４槽直列に繋いだ。第１槽目に１５％の３−シアノピリジンを溶解させた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を２００ｍｌ／ｈｒの流速で、菌体懸濁液を０．３ｍｌ／ｈｒの流速で連続的に添加し、攪拌しつつ、第１槽目から第４槽目の反応槽の温度が各々３０、３０、３２、３５℃となるようにジャケットの冷却水（２０℃）を用いて反応温度を制御しつつ、反応を行った。
３日後、第４槽目から流出してくる反応液を、液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ−８０Ａ（ＧＬサイエンス社製、溶離液：５％アセトニトリル１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、検出：２００ｎｍ）で分析したところ、３−シアノピリジンは検出されず約１７％のニコチンアミドが検出された。
比較例１
実施例１で作成した菌体懸濁液を用いて、反応温度を４槽全槽３０℃とした以外は、実施例１と同様に反応させた。
３日後同様に第４槽目から流出してくる反応液を、液体クロマトグラフィーで分析したところ、ニコチンアミドは１６％しか生成しておらずまた未反応の３−シアノピリジンが約１％検出された。
比較例２
実施例１で作成した菌体懸濁液を用いて、反応温度を４槽全槽３５℃とした以外は、実施例１と同様に反応させた。
３日後同様に第４槽目から流出してくる反応液を、液体クロマトグラフィーで分析したところ、ニコチンアミドは１５％しか生成しておらずまた未反応の３−シアノピリジンが２％程度検出された。
実施例２
（１）生体触媒の調製
ニトリルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス・クロロラフィス  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８７として独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８１年１１月１６日に寄託されている）を、ショ糖１．０％、メタクリロニトリル０．５％、ペプトン０．３％、リン酸２水素１カリウム０．１％、リン酸１水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．１％、酵母エキス０．３％、硫酸第１鉄０．００１％（何れも質量％）を含む培地（ｐＨ７．５）により２５℃で好気的に培養した。これを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄して菌体懸濁液（乾燥菌体１２質量％）を得た。
一方、アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミド及び２−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミドが、それぞれ３０、１、４質量％となるようにモノマー混合水溶液を調製した。
続いて、菌体懸濁液、モノマー水溶液、１０質量％のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン水溶液を、１０質量％の過硫酸アンモニウム水溶液、各々５、２、０．１、０．１Ｌ／ｈｒで順々にラインミキシングして重合させた後、約１ｍｍ角の粒子に裁断し固定化菌体粒子を得た。この固定化菌体粒子を、流動化させつつ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて通液洗浄し、固定化菌体触媒とした（本触媒中、乾燥菌体質量は約８％となる）。
（２）固定化菌体触媒によるアクリロニトリルからアクリルアミドへの反応
実施例１同様の装置に、各反応槽からの反応液出口に金網をつけて、各反応層から固定化菌体触媒が流出しないようにした。各反応層に５０ｇの固定化菌体触媒を添加した。第１槽目に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を１５５ｍｌ／ｈｒで、アクリロニトリル２５ｇ／ｈｒで連続的に添加し、２槽目にはアクリロニトリルのみ２０ｇ／ｈｒで連続的に添加し、各槽とも攪拌しつつ、第１槽目から第４槽目の反応槽の温度が各々１０、１０、１２、１５℃となるようにジャケットの冷却水（５℃）を用いて反応温度を制御した。また１日に１回、反応槽内の触媒を置換していく目的で第４槽目から触媒６ｇを金網にて抜き出した。また各々６ｇづつ３槽目から４槽目に、２槽目から３槽目に、１槽目から２槽目に触媒を移動させた後、第１槽目に６ｇの触媒を追加していくことにより、連続的にアクリルアミド製造反応を行った。
第４槽目から流出してくる反応液を、１日１回ガスクロマトグラフィー（カラム：ＰｒａＰａｋ−ＰＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、１ｍ、１８０℃、キャリアガス：窒素、検出器：ＦＩＤ）により測定した。約３ヶ月間の運転中、約３０％のアクリルアミドが検出されるのみで、未反応のアクリロニトリルは検出されなかった。
比較例３
実施例２で作成した固定化菌体触媒を用いて、反応温度を４槽全槽１０℃とした以外は、実施例２と同様に反応させた。
約１．５ヶ月後より第４槽目から流出してくる反応液中に未反応のアクリロニトリルが残存し始め、アクリルアミド製品の品質が低下してきた。そこで触媒の添加抜き取り量を一日８ｇとしたところ、再び未反応のアクリロニトリルが検出されないようになってきた。
産業上の利用可能性
本発明により、化合物製造時の生体触媒の使用量を容易に減少することができ、その結果、化合物製造時の触媒比例費を低減せしめかつ廃棄物の少ない、すなわち低コストで効率的、低環境負荷型の化合物製造方法を提供することができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。