(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）１つまたはそれ以上の標的ＤＮＡ配列のそれぞれをベクターの挿入部位に挿入したものを用意し；
ii）標的ＤＮＡを含有するベクターのそれぞれを増幅し、それらをプールし；
iii）標的ＤＮＡを含有するベクターのプールを選択可能なトランスポゾンに曝し、ここで選択可能なトランスポゾンは標的ＤＮＡを含有するベクターに実質的に任意の部位で組み込まれて、標的ＤＮＡおよびトランスポゾン含有ベクターのプールを形成し；
iv）標的ＤＮＡおよびトランスポゾン含有ベクターのプールで細胞を形質転換させ、単離し、代表的な数の個々の形質転換体を選択条件下で培養物へ増殖させ；
ｖ）各培養物からのＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、ここでこのポリメラーゼ連鎖反応は、ベクター配列の挿入部位の３′末端において相補的な１対のプライマーを用いるものであり、そしてベクター配列の全長コピーを効率的に作製するのに十分な各反応サイクル中の伸長時間を有するが、その時間は、トランスポゾンが挿入されたベクター配列の全長のコピーを効率的に作製するには短かすぎるものとし;
vi）各ポリメラーゼ連鎖反応において製造されたＤＮＡの量を測定し；そして
vii）実質的な量のＤＮＡを製造するポリメラーゼ連鎖反応に対応するこれらの培養物から標的ＤＮＡを含有するベクターのトランスポゾン隣接領域をシークエンシングすること
の工程からなる、平行して進行するＤＮＡのトランスポゾンで仲介されたシークエンシング方法。
【請求項２】
工程ｉ）〜vii）の１つまたはそれ以上が自動化されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各ポリメラーゼ連鎖反応において製造されたＤＮＡの量を測定する工程が、ｄｓＤＮＡに選択的な蛍光染料をポリメラーゼ連鎖反応の産物に加え、そして得られた蛍光の量を測定することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｉ）〜vii）の１つまたはそれ以上が自動化されたものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｄｓＤＮＡに選択的な蛍光染料は、PICOGREEN（登録商標）およびビスベンズイミド染料からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｄｓＤＮＡに選択的な蛍光染料がPICOGREEN（登録商標）である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ベクターおよびトランスポゾンが異なる選択マーカーを担持するものである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
トランスポゾンが少なくとも３kbである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
トランスポゾンが少なくとも４kbである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
トランスポゾンがGPS−Apra−２μｍ−URA3である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トランスポゾンが少なくとも５kbである請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
トランスポゾンがベクターの長さと等しいか、またはより長いものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
トランスポゾンがベクターの長さの少なくとも約５／４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トランスポゾンが約５kbであり、ベクターが約４kbである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トランスポゾンがベクターの長さの少なくとも約５／３である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
トランスポゾンが約５kbであり、ベクターが約３kbである請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【本発明の分野】
本発明は、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の、トランスポゾン仲介マルチプレックスシークエンシングの自動化方法に関する。さらに本発明は、特にこのような自動化された方法における効率の増加に関するもので、ここで効率の増加は、シークエンシング前にトランスポゾンがベクター配列に組み込まれている構築物をスクリーニングで排除することによって得られる。これは、興味のあるＤＮＡ断片の代わりにベクターをシークエンシングする反応を実施することで時間および資材の無駄を防ぐものである。
【０００２】
【発明の背景】
この１０年にゲノムおよび発現配列タグ（EST）シークエンシングから得られた情報に由来する膨大な富は、代表的な全長ｃＤＮＡをクローン化するための労力に著しく貢献する。ヒトおよびマウス由来のゲノムシークエンシングプロジェクトは、近い未来において完了すると予期されているが、これらの種のトランスクリプトームは、長い間不明瞭なままである。この複雑さは、完全に確実に予測できるものであり、ゲノム配列からのｍＲＮＡのスプライシングプログラムは、全長ｃＤＮＡの配列を得ることに焦点を当てたさらなるゲノム研究に駆り立てた。さらに、全長ｃＤＮＡシークエンシングの試みもまた、クローニングのために用いられるｃＤＮＡの増幅を含む方法の後に、ｃＤＮＡ配列の確認が必要とされる。このシナリオは、薬剤発見の試みのための標的遺伝子を確認することに焦点を当てたゲノムセンターにおいて特に流行っている。明らかに、膨大な費用と尽力を使い果たした後に、単に標的遺伝子のコーディング配列が不正確であるという理由で推定の標的について確認方法を欠くというのは無意味であろう。それゆえに、ゲノムセンターにおいて、多数の全長クローンを迅速に、安く、そして正確に配列決定するためのアプローチが必要とされる。この目的のために、本発明者はトランスポゾンにより促進されたマルチプレックスシークエンシング（TEMS）と呼ばれる、新規且つ集積された高いスループットの方法を開発した。
【０００３】
この２０年間に、プラスミドへの大きな挿入物をシークエンシングする多くの方法が開発されている。しかし、これらの方法の多くが、扱い難く、高いスループットの、自動化システムに移すことができなかった。プライマーウォーキングによるシークエンシングは、遅く、高価であり、そしてプライマーがほとんど特徴付けられていない領域における配列に対して設計されているので、しばしば失敗する。同様に、標的クローンの末端からのエキソヌクレアーゼ消化によってクローンのコレクションを作製することによるシークエンシングは、時間がかかり、クローン特異的で、鋳型ＤＮＡの純度および完全性に対して非常に敏感である。さらに、このアプローチを用いた成功率は、非常に変わりやすい。クローンのショットガンシークエンシングは、高いスループットの方法であるが、各クローンから挿入物を単離し、次いで広範で多様な種類の方法によって作製されたより小さい断片を再度クローニングすることが必要である。さらに、制限消化を用いるショットガンライブラリーはクローニングのバイアス、および続くＤＮＡ配列データのランダムではない分布を生じる。
【０００４】
トランスポゾンで仲介されるシークエンシングは、標的ＤＮＡ配列を含有する多数のベクターをプールして、各末端でシークエンシングプライマーを有するトランスポゾンをその構築物にランダムに挿入することによって行うことができる。Devine, S. E., Boeke, J. E. (1994) Efficient integration of artificial transposons into plasmid targets in vitro : a useful tool for DNA mapping, sequencing and genetic analysis, Nucleic Acids Research, pp. 3765-3772、またはKimmel, B., M. J. Palazzola, C. Martin, J. D. Boeke, and S. E. Devine, 1997, Transposon-mediated DNA sequencingを参照せよ。ゲノム解析においては、この方法の詳細に関しては、A laboratory manual (E Green、B. Birren、R. MyersおよびP. Hieter編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.を参照せよ。伝統的に、この方法は、クローニングおよびトランスポゾン挿入段階のために異なる宿主株を介してプラスミドを移動することを要するのでわずらわしい。しかし、最近、いくつかの商業分子生物学製品の製造販売元は、改良型トランスポゾン（即ちTn5など）のランダム挿入を利用するインビトロのトランスポジション系を開発している。あいにく、これらの系のいくつかは、擬陽性の高いバックグラウンドという結果になり、ポリメラーゼ連鎖反応（“PCR”）による陽性クローンのスクリーニング方法を用いるのが困難である。本発明者は、これらのトランスポゾンをベースとしたシークエンシング方法のいくつかを用いて、New England Biolabs社製改良型インビトロＧＰＳ−１トランスポジションシステムに伴なうこれらの難点のいずれも経験しなかった。それにもかかわらず、トランスポゾン挿入物を、興味のある標的ＤＮＡに排他的に向けることはできず、ベクター中に高頻度に現れるのである。この問題を解決し、トランスポゾンが促進するシークエンシング効率の増加のための努力の結果、本発明者は、ユニーク且つ高いスループットの方法、いわゆるトランスポゾンで促進されたマルチプレックスシークエンシング（TEMS）法を開発した。
【０００５】
従って、本発明の目的は、高いスループット且つ効率が良く、低廉なDNA断片をシークエンシングする方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、高いスループットで、効率が良く、低廉な、生成される非標的ＤＮＡ配列の量を最小にする、トランスポゾンで仲介された方法を提供することである。
さらに本発明の別の目的は、標的ＤＮＡ配列に挿入されたトランスポゾンを有する所望の構築物と、他の場所に挿入されたトランスポゾンを有する所望でない構築物とを識別するための、ＰＣＲをベースとしたスクリーニング方法を提供することである。
【０００６】
【発明の概要】
本発明は、次に述べる方法を提供することによって上記の目的に合致するもので、この方法はさらなる便宜のために自動化され得るものである。複数の標的ＤＮＡ配列は、ベクターに各々クローン化され、プールされ、そして各末端にシークエンシングプライマーを有する選択可能なトランスポゾンは標的ＤＮＡを含有するベクターにランダムに挿入される。次に、選択された、トランスポゾンおよび標的ＤＮＡ配列を含有するベクターは、ＰＣＲ反応を用いて個別にスクリーニングされて、標的ＤＮＡ配列上に位置するトランスポゾンを有するベクターを同定する。ＰＣＲ反応はベクター配列の各末端に位置するプライマーを用い、ＰＣＲポリメラーゼが、該ベクターの長さを有する製造物を効率的に製造するための十分な伸長時間を提供するために最適化されるが、ＰＣＲポリメラーゼが、該ベクター＋トランスポゾンの長さを有する製造物を効率的に産生するためには不十分な伸長時間を提供するようにされる。それ故に、有意な量のＰＣＲ産物は、該ベクター中にではなくてＤＮＡ標的配列中にトランスポゾンを含有するベクターのみ製造される。各ＰＣＲ反応に対して有意な量のPCR産物が存在するか、または存在しないかは、二重らせんＤＮＡ（“dsDNA"）に対して選択的な定量的蛍光染料を使用することにより迅速に測定可能である。次いで、プレスクリーンにおいて有意なＰＣＲ産物によって確認されるベクターは、トランスポゾンの各末端にあるシークエンシングプライマーを用いて個別にシークエンシングされ、各標的ＤＮＡ配列に読み出される。個々のシークエンシング反応の生の（raw）標的ＤＮＡ配列は、プール中の各標的ＤＮＡの全長配列を決定するために組み合わせることができる。
【０００７】
クローンを平行処理することによって、反応がセットアップされシークエンシングされる速さが非常に増大する。さらに、本方法は、任意の特定のベクターに依存することなく、また任意の再クローニング段階を要しない。全体効率のために最も重要なことは、ベクター骨格のシークエンシングは、スクリーニング工程を用いることによって最小限になるか、あるいは消去されることである。本方法の各段階の自動化は、自動化ＤＮＡシークエンシングの当業者においてそれらに適した技術を用いて容易に達成されることができる。
【０００８】
定義
本明細書においては下記のように用いられる。即ち、
「ベクター」とは、細胞中で複製する任意のＤＮＡ構築物であって、未知のＤＮＡ配列が挿入され得る挿入部位を有するものである。
ベクターまたはトランスポゾンに関して、「選択可能である」ということは、ベクターまたはトランスポゾンがベクターまたはトランスポゾンを用いて形質転換された細胞を識別するため使用され得る表現型を有することを意味する。好ましくは、表現型は、形質転換されていない細胞が生き残れない条件にて形質転換された細胞を生き残らせることができるものである。
【０００９】
「標的ＤＮＡ」または「標的ＤＮＡ配列」とは、方法の操作者がシークエンシングを望む既知または未知の配列のＤＮＡ分子である。
「個々の形質転換体の代表的な数」とは、プール中の各標的ＤＮＡについて標的ＤＮＡ中の各塩基の独立したシークエンシング試験を所望の数提供するのに十分な数の、標的ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入物を含む形質転換体が存在することを確実にする、最小数の個々の形質転換体である。
【００１０】
ＰＣＲ産物に関する「実質的な量のｄｓＤＮＡ」とは、予定される閾値を超える量のｄｓＤＮＡである。予定された閾値は、ベクター配列の外側または内側にトランスポゾンを含むことが知られている数種の構築物を用いたＰＣＲ反応中で見出されたＰＣＲ産物の多様性を評価することによって同定され得る。
【００１１】
【好ましい実施態様の詳細な記述】
本発明は、平行的に、多数の標的ＤＮＡをシークエンシングするための効率的な自動化が可能な方法を提供するものである。本方法において、各標的ＤＮＡ配列は、選択ベクター中、好ましくはプラスミド中に、ベクター配列中の同一の挿入部位にて挿入される。全ての標的ＤＮＡは同じベクター中に挿入されるか、または異なるベクターが用いられる場合には、１セットのプライマ−がＰＣＲ反応によって全てのベクターを増幅するために使用され得るように、各ベクターは実質的に同じサイズであり、挿入部位の周りに同一の配列を有することが重要である。
【００１２】
多数の標的ＤＮＡ配列のそれぞれを含有するベクターは、各標的ＤＮＡ配列の長さに基づいた割合でプールされるので、そのプールには各標的ＤＮＡ配列の各kbの実質的に等しい量を含有する。プールに含まれる各ベクターの割合は、各標的ＤＮＡ配列の長さを測定し（例えば、アガロースゲルにおける標準サイズのマーカーに対する電気泳動によって）、そして該ベクター中の標的ＤＮＡ配列の長さの全てのkbに対する１セットの量の各ベクターを加えることによって決定されることができる。
【００１３】
次に、標的ＤＮＡ含有ベクターに選択可能なトランスポゾンをランダムに挿入するために、トランスポゾン挿入反応をそのプール内で実施する。この工程は伝統的なin vivoのトランスポゾン挿入により実施され得るが、２種以上のタイプの細胞を介してプラスミドを移動させることを必要とする。in vitroのトランスポゾン挿入反応は、より簡単且つより速い。トランスポゾンは選択マーカーを有し、ベクターの大きさであるｄｓＤＮＡ 断片を効率的に増加させるが、ベクター＋トランスポゾンの大きさのｄｓＤＮＡ断片を顕著に増加させないことを確立するためのＰＣＲ条件を可能にするのに充分な大きさでなければならない。好ましくは、トランスポゾンはベクターの長さとほとんど同じであるか、またはベクターの長さより長い。最も好ましくは、トランスポゾンはベクターの長さと等しいか、または５／４よりも大きい。特に好ましくは、トランスポゾンはベクターの長さと等しいか、またはベクターの長さの５／３より大きい。ここでベクターは、バクテリアのプラスミドであって、トランスポゾンは好ましくは少なくとも約３kbであり、最も好ましくは少なくとも約４kbであり、さらに特に好ましくは約５kbより大きいまたは約５kbである。
【００１４】
次いでトランスポゾン挿入反応からのベクターのプールを細胞を形質転換することに用い、トランスポゾン選択条件下で、形質転換体を培養する。選択された形質転換体を単離し、培養物に増殖させる。培養物中で増殖して単離された形質転換体の数は、プール中の標的ＤＮＡ配列の数およびサイズに依存する。十分な形質転換体を、各標的ＤＮＡ配列について、単離された形質転換体が、標的ＤＮＡ配列における各塩基および全ての塩基の数倍の独立した配列決定を提供するのに、特に標的ＤＮＡ配列中へのトランスポゾンの個々の挿入物を十分含むことを確実にするため、単離し、そして増殖しなければならない。エラーの予防を確実にするために、当業者は、しばしば配列データの６倍の領域を得ようとするが、多かれ少なかれ状況の利点として選ばれるものでありうる。６倍の領域を得ようとする場合、サム（thumb）の一般則では１８クローンが、この領域を得るのにヌクレオチド１kbごとに実際にシークエンシングされるために必要とされる。しかし、実際に１８クローンをシークエンシングするために、非常に大きな数の形質転換体が単離され、増殖されねばならない。なぜなら、トランスポゾンは、全ての場合において標的ＤＮＡに結合するわけではないが、標的ＤＮＡ含有ベクター全体にわたってランダムに挿入されるからである。それ故に、数字の１８は、トランスポゾンが標的ＤＮＡ配列中に挿入される可能性によって増加する。故に、プール内に存在する各標的ＤＮＡ配列の６倍の配列決定領域を得るためには、単離されるべき形質転換体の数は、kb×18×比率（ベクターのサイズ）／（標的ＤＮＡ配列決定のサイズ）における標的ＤＮＡ配列の長さに等しい。
【００１５】
次いで選択された形質転換体由来の各培養物は、そのＤＮＡに関してＰＣＲ反応を実施する。ＰＣＲ反応にはベクター配列の挿入部位の３′末端に相補的なプライマーを用い、そのプライマーはベクター配列全体の大きさを有する断片のＰＣＲ増幅を可能にする。ＰＣＲ反応の反応条件は、ベクターの長さを有する断片を効率的に産生するのに最適化されているが、ベクター＋トランスポゾンの長さを有する断片を効率的に産生しない。本発明による任意の特定のベクターおよびトランスポゾンの組合わせに関するＰＣＲ条件の最適化は、Kimmel, B.、M. J. Palazzola、C. Martin、J. D. BoekeおよびS. E. Devine、1997, Optimizing PCR assays "Methods for Improving PCR, Detecting and Characterizing PCR products Protocol for Detecting and Characterizing PCR products. ゲノム分析においては、“A. laboratory manual”(E. Green, B. Birren, R. MyersおよびP. Hieter編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.; 並びに Cha, R. S. およびThilly, W. G.（1995）:“PCR Primer”, Dieffenbach, C. W. and Dveksler, G. S.(編), CSH Press, New Yorkのような参照によって導かれるように、慣用の実験によって当業者によって決定されることができる。ポリメラーゼの選択は、反応を最適化する助けになり得るけれども、ＰＣＲに用いられる特定のＤＮＡポリメラーゼは本方法に限定されるものではない。一般的に、伸長温度および／またはＰＣＲ反応の時間は、ベクター＋トランスポゾンの大きさである産物の所望の除去を達成する。最適化のデモンストレーションについては、実施例２を参照されたい。
【００１６】
次に、各ＰＣＲ反応において産生された産物の量を、好ましくは光学的に測定する。光学的な測定はｄｓＤＮＡとヌクレオチドを識別する任意の方法によって実施され得るが、好ましくはｄｓＤＮＡに対する特異的な蛍光染料を用いて実施される。ｄｓＤＮＡ特異的染料には、ビスベンズイミド染料であるHoechst 33528およびPICOGREEN(R)を含むMolecular Probes, Inc（Eugene, Oregon）社製のシアニン色素がある。PICOGREEN(R)が、ｄｓＤＮＡに対する感受性および選択性のために好ましい。蛍光の測定値は、有意な量のｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物が存在するかどうかを測定するため、予定された閾値と比較される。蛍光の閾値レベルは、単離された形質転換体をスクリーニングするのに用いたものと同じＰＣＲ条件下にて、ベクター単独の大きさ、およびベクター＋トランスポゾンの大きさを有するポジテイブコントロールおよびネガテイブコントロールのＰＣＲ鋳型を用いて実験的に設定される。
【００１７】
実質的な量のｄｓＤＮＡを産生しなかったＰＣＲ反応に対応する形質転換体は配列決定されない。なぜなら、それらはベクター配列中にトランスポゾンを含有するからである。実質的な量のｄｓＤＮＡを産生するＰＣＲ反応に対応する形質転換体には、標的ＤＮＡ配列内にトランスポゾンを含み、配列決定される。２つのシークエンシング反応は、トランスポゾン近傍の標的ＤＮＡ配列の配列を読むために、トランスポゾンの各末端由来のプライマーを用いて、各形質転換体に対して実施される。本シークエンシング反応は、当業者の誰もが実施可能である。
【００１８】
一旦配列データがＰＣＲスクリーニングをパスした全ての形質転換体から回収されると、その配列は標的ＤＮＡ配列のプールにある全ての個々のメンバーに集められる。これは、当該分野で公知のコンピュータ配列分析法によって完了され得、的確な方法は本発明に限定されない。
【００１９】
即時の本方法の利点には、速さ、効率およびその工程を自動化する能力が含まれる。特に、即時の本方法は、ベクター配列中に挿入されたトランスポゾンを有し、そして配列決定した場合には主にベクター配列を生じる非生産的な形質転換体の除去を可能にするクイックＰＣＲ法を提供する。このＰＣＲスクリーニング法は、速く、自動化することができ、そしてそのサイズを決定するためのアガロースゲルの泳動といった、ＰＣＲ産物の任意の単離を必要としない。標的ＤＮＡのプールの使用は、各標的ＤＮＡ配列について必要とするのではなく、単回のトランスポゾン反応および単回の形質転換の実施を可能とする。
【００２０】
【実施例】
実施例１
高いスループットのスクリーニング方法に適したトランスポゾンの選択
New England Biolabs社製のオリジナルのトランスポゾン
New England Biolabs（32 Tozer Road, Beverly, MA 01915）（“NEB”）社製のゲノムプライミングシステムキットは、当初は、標的ＤＮＡ中にランダムに挿入されるトランスポゾンがかなりの正確さで完全にその標的を配列決定できる効率的な方法であるということを証明するのに用いられた。そのキットにより、カナマイシン耐性遺伝子を含有する２つのトランスポゾンのうちの１が与えられた。しかし、カナマイシンは、ごく普通の耐性マーカーであり、標的ＤＮＡ配列がカナマイシン選択可能なベクターに既にクローン化された場合には、異なるトランスポゾンまたは標的ＤＮＡ配列の再クローニングのいずれかが必要とされる。そのキットは、クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカーを含む他のトランスポゾンを提供するけれども、それもまたごく普通である。それ故に、トランスポゾンは、さらなるクローニング段階をさけ、各標的ＤＮＡのための正確なトランスポゾンを選択する際のヒューマン・エラーを減少するために、珍しい耐性マーカー（例えばアプラマイシン）を含むよう改変されるべきである。GPS−Apraトランスポゾン（図２）は、NEB pGPS１トランスポゾンを改変することによって構築された。
【００２１】
改変されたトランスポゾンであるGPS−Apraを用いたスクリーニング方法
最初の実験は、スクリーニング方法がトランスポゾンに対して選択された形質転換体から、ベクター中ではなく、標的ＤＮＡ配列中にトランスポゾンを含んでいる形質転換体を同定することを示した。これは、ベクター配列の無駄な配列決定を除外することによってコストを減少させる。元のNEB pGPS １トランスポゾンは、各末端にプライミング部位を有し、標的ＤＮＡ中に任意に挿入される約1.7kbのトランスポゾンを有する2.614kbであった。相補的なM13Fおよび相補的なM13Rプライマーを用いた3.0kbのベクターをＰＣＲによって増幅することにより、２つの異なったＰＣＲ産物がスラブゲル上で可視化され得る。ベクターは3.0kbであるので、3.0kbのＰＣＲ産物は、トランスポゾンが標的ＤＮＡ配列中にあることを示している。4.7kbのＰＣＲ産物はトランスポゾン(1.7kb)を含有するベクター（3.0kb）である。それ故に、標的ＤＮＡ配列中にトランスポゾンを含むクローンは、ゲル上の3.0kbのＰＣＲ産物の存在によって同定されることができる。
【００２２】
挿入物内にトランスポゾンを含むクローンの同定を実証するために、コロニーはトランスポゾン反応の後に形質転換体から選択され、選択のためのアプラマイシンおよびプラスミド抗生物質の両方の抗生物質を含む培地に植菌される。培養物を一晩増殖させて、ＰＣＲは９６ウェルプレート中のＰＣＲカクテルに約１μlの培養物をどさっとおとすことによって次の日実施される。ＰＣＲ カクテルにはPE社（PE社 761 Main Avenue、Norwalk、CT 06859）社製のAmplitaq酵素および試薬が含まれる。ＰＣＲに対する条件は、標準｛95℃で５分間、（95℃で30秒、54℃で１分間、72℃で６分間、30サイクル）、72℃で１分間、4度で維持｝であった。サイクル完了（平均2.5時間）後、標準的なサイズのゲルにおいてＰＣＲ反応物50μlのうちの８μlを用いてゲル電気泳動が実施された。トランスポゾンを有しないベクター配列由来のＰＣＲ産物と、トランスポゾンを含むベクター配列由来のＰＣＲ産物間には、明確に検出可能なサイズの違いが存在した。
【００２３】
しかし、シークエンシング反応についての高いスループットを維持するために、電気泳動は、一度に何百ものサンプルをのせることのできる大きなゲル上で実施しなければならなかった。これらの大きなゲルにおいて、３kbおよび4.7kbの断片における差異は、自動化されたシステムで再現可能に検出することは困難である。また、ゲル電気泳動は実に時間がかかり、高いスループットの方法のスクリーニングを実施する際の妨げにもなり得るものであった。
【００２４】
他の高いスループットの方法を探してみると、再現可能で時間のかからないものとしてｄｓＤＮＡの蛍光検出が確立された。PICOGREEN(R)アッセイは特に便利であるようである。しかし、ｄｓＤＮＡの蛍光検出法では異なるサイズの断片を識別することはできないので、ＰＣＲ反応が任意のＰＣＲ産物の存在または非存在によって標的ＤＮＡ含有ベクター内におけるトランスポゾンの位置を示すように改変されなければならなかった。標的ＤＮＡ配列中のトランスポゾンを有するクローンのみが、ｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物を生産する場合、次にPICOGREEN(R) ｄｓＤＮＡ染料が、所望のクローンのみに高レベルで蛍光を発する。ベクター中にトランスポゾンを含むウェルは著しいｄｓＤＮＡ産物を増幅しない上に、低いレベルの蛍光を発する。所望のクローンおよび所望でないクローンとの間の蛍光を区別するレベルは、既知のサンプルを使用することによって測定可能である。
【００２５】
多様なＰＣＲ条件が、伸長温度を低くすることによって試験されるが、4.7kbのバンドは擬陽性が増加することなく、一貫して脱落しない。トランスポゾンは、そのサイズを非常に大きくするために再度改変され得る場合には、次いでＰＣＲ条件が、上方のトランスポゾン含有バンドを一貫して脱落するように開発されることができ、それによって擬陽性率が減少する。ネガティブ方向においてトランスポゾン反応に影響しない大きな「スタッファー（stuffer）」遺伝子が求められた。URA３遺伝子を有する酵母２μｍプラスミドは、基準のサイズに合い、また将来において酵母の実験において用いられ得る。それ故に、GPS−Apra−２μｍ−URA3トランスポゾンプラスミド（図３）が、約5.0kbのトランスポゾンを含む、全長6.1kbで構築された。ＰＣＲ条件はベクター内にトランスポゾンを有するクローンをうまく脱落させるように改変され、トランスポゾン反応には影響しなかった。実施例２を参照されたい。
【００２６】
実施例２
擬陰性および擬陽性の結果を減少するためのＰＣＲ条件の最適化
基盤となるＰＣＲ概念
このスクリーニングは、完全なベクターＤＮＡの3.9kbpの断片を増幅するために特別に最適化されたPCRサイクル条件を基盤とする。この場合には、ベクターはInvitrogen社（1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA 92008）製 PCR4 Blunt TOPOであった。ベクターが挿入された5kbpのトランスポゾンを有する場合には、そのサイズは8.9kbpまで増大し、それが余りにも大きいので、最適化されたＰＣＲ条件下では増幅できない。
クローンのベクター部分を増幅するために選択されたプライマー配列は、ユニバーサルプライマーであるM13F（−20）およびM13Rの相補的配列である。その配列は下記の通りである。5′-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3′および5′-CATGGTCATAGCTGTT-3′。図１にこの増幅を説明する。
【００２７】
３８４−ウェルフォーマットの開発の背景
多数のクローンを含むプールからのトランスポゾン反応をスクリーニングするために、迅速かつコスト効率のよいスクリーニング方法を開発することが必要とされた。最初の開発の試みは96−ウェルプロトコールを基盤としていた。384−ウェルプレートに変えるために、全ての試薬の容量は、より小さいウェル容量に適合するように等分した。しかしこれらの条件は、観察されていたＰＣＲの失敗の多さから決して理想的ではないことが証明された。このフォーマットに対して、よりエラーに強いＰＣＲの試薬および条件に対する調査に取りかかった。広範な酵素および熱サイクル条件を試験した実験の結果を次章に記述する。
【００２８】
３８４ウェルＰＣＲ最適化方法
ポリメラーゼ選択
いくつかの製造業社から購入された多様なＰＣＲキットの迅速なスクリーニングを行い、96−ウェルフォーマットに使用されてきたPE 社製AmpliTaqポリメラーゼに対して、384ウェルについての代わりのものを決定した。キットごとに次のものが試験された。即ち、Clontech's Advantage cDNA PCRキット、Epicentre's Failsafe PCRシステム、およびTakara社製の３種類のキットである、LA Taq、 Ex Taq、およびZ−Taqである(Clontech Laboratories Inc.の住所は1020 East Meadow Circle Palo Alto, CA 94303-4230であり、Epicentre Technologiesの住所は1402 Emil Street, Madison, WI 53713であり、 そして宝酒造株式会社のバイオメデイカルグループの商業住所は〒520-2193日本国滋賀県大津市瀬田3-4-1である。)。試験されたサンプルは、プールされた３０の標的ＤＮＡを示した。それらをStratagene社（11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037）製のpBluescript SK−（3.0 kb）にクローン化した。培養時間は、384ウェルフォーマットで20時間であった。予備データに基づき、Z−taqシステムは、ＴＥＭＳのような高スループットのシステムにおける使用に理想的である、それが持つ特徴に起因して購入され、酵素として選択された。サンプルのＰＣＲ産物が泳動された、染色された泳動ゲルを示す図４を参照されたい。
【００２９】
試薬の最適化
また、ＰＣＲスクリーニングの反応にかかるコストを減少させることが望ましい。以下に示される表２に、結果を妥協して処理することなく、多様な試薬のそれぞれを少なくできる量を試験するために実施された多様な実験を要約する。
【００３０】
【表１】
0004807921.tif 000002
【００３１】
上記の実験に基づいて、次の最適化反応用カクテルミックス(１サンプル当り)を決定した。
ddH2O：17.875μL
10×Z−Taq緩衝液：2.5μL
dNTP混合物：1.5μL
鋳型DNA:１μL（Nalge Nunc International社（75 Panorama Creek Drive, Rochester, NY 14625）によって製造されたKerplunker No.96/384およびPin Replicator No.250520/250393を用いて沈殿される）
Z−Taq DNAポリメラーゼ: 0.125μL (0.3125単位)
cM13f（５pmol／μL）: １μL
cM13r（5pmol／μL）: １μL
【００３２】
サーモサイクラー条件の最適化
使用された当初のサーモサイクリング条件は、(株)宝酒造の文献で見出された推薦に基づくものであった。これらの条件は、
１．変性：98℃で５秒間
２．アニール：55℃で10秒間
３．伸長：72℃で60秒間（15.4秒／kb）
４．１へ、30回繰り返す。
５．ＰＣＲ反応が評価されるまで４℃。
【００３３】
これらの条件を用いた結果を図２に示す。そのデータから、アニーリングの温度を試験のために低くし、反応特異性を減少させ、こうして増幅される陽性の数を増加させるべきである。次の実験には、アニーリング温度が52℃まで低下された。これは、全ての反応結果を補うものであるが、15.4秒／kbpの伸長時間を用いてトランスポゾン挿入物を含むベクターを増幅させる結果になることが発見された。pBluescript SK（−）を含む標的ＤＮＡにおけるトランスポゾン挿入後選択され、384ウェルプレートのウェル中で20時間培養して得られた47個の形質転換体からのＰＣＲ産物を泳動したものである、染色された電気泳動ゲルを示す図５を参照されたい。トランスポゾンを含有するベクターの増幅産物と思われる、９kbpのバンドの出現は、過剰な伸長時間の結果である。
【００３４】
さらに、48℃および68℃の間のアニーリング温度の勾配は、52℃が、このＰＣＲに使用するのにまさに最適な温度であることを実証するため試験された。同じ実験において、サイクルの数もまた試験された。30、35、40、および45サイクルが試験された。その実験の結果から、バックグラウンドのノイズを避けるために、サイクル数は低いままであることが必要であるとわかった。48℃〜68℃の勾配から、52℃のアニーリング温度が最適として再確認された。この温度は非特異的になるほど低すぎず、ＰＣＲが失敗する温度である56℃に達する危険性があるほど高くない。これらの結果が図６に示され、染色された電気泳動ゲルの図であって、それぞれ表される産物が25μlのＰＣＲカクテル容量を有する384ウェルフォーマットにおいて、2.5ng／ウェルで、コントロールであるpBluescript SK（−）ベクターの増幅を示す。上記のデータに基づき、サーモサイクリング条件が、次のサイクルを用いて最適に実施するために測定された。
１．変性: 98℃、５秒間
２．アニール: 52℃、10秒間
３．伸長: 72℃、30秒 (7.7秒／kb)
４．１へ、35回繰り返す。
５．ＰＣＲ反応を評価するまで４℃。
【００３５】
蒸発が、384−ウェルプレートにおける問題であることが見出されたので、MJ Research（590 Lincoln Street、Waltham、MA 02451）社製のゴム製の「Ｐ」シールが、サーモサイクリングが始まる前にシールされたプレート上に取り付けられた。これに沿って、そして製造者が推奨するとおりに、フタの温度を85℃に設定した。
【００３６】
下記に示される表３に、最適化工程中に試験された多様なＰＣＲサーモサイクリング条件の要約を提供する。
【表２】
0004807921.tif 000003
【００３７】
ｄｓＤＮＡ 定量化試薬PICOGREEN(R)を使用した陽性クローンのスクリーニング
ゲル電気泳動の労働集約的作業を回避するために、TEMS PCRスクリーニングは、ｄｓＤＮＡ定量化試薬であるPICOGREEN(R)を使用する。PICOGREEN(R)は、１×TEバッファーにて150倍の実用の希釈率まで希釈した。この希釈は最適であると分かったが、製造業社のプロトコールにおいて推奨される200倍希釈よりわずかに濃縮されたものである。
【００３８】
１ウェルに付き150倍希釈したPICOGREEN(R) 25μlをRobbins Scientific社（1250 Elko Drive, Sunnyvale, CA 940892213）製Robbins Hydra 96 デイスペンサーを用いて黒い384ウェルのプレートに等分した。次いで各PCR反応のウェルに付き５μlを、再度Hydraデイスペンサーを使用してPICOGREEN(R)に添加した。次にプレートを直に分子ダイナミクスジェミニ蛍光プレートリーダー（Molecular Dynamics Gemini Fluorescence Plate Reader）に置き、次いでその蛍光シグナルが測定される前に、そのプレートを１０秒間混合した。
そのアッセイはスクリーニングとして働くので、陽性および陰性ウェル間の蛍光シグナルにおいて明白な違いを有するはずである。1.3、2.5、５および10μLのＰＣＲ産物の量を、バックグラウンドに対する陽性シグナルの最大のアッセイ範囲を測定するために試験した。25μL PICOGREEN(R)中に５μLのＰＣＲ産物が使用するために最適な条件であることを示す結果を、表４に示す。
【００３９】
【表３】
0004807921.tif 000004
【００４０】
次に、蛍光リーダーによって生じた出力シグナルは、ヒストグラムデイスプレイにエクスポートされ、陽性クローンのカットオフの値は棒グラフから与えられる。現在の条件を用いて、カットオフは一般的に1000〜1500に減少する。
【００４１】
Genesis RSP 150 TECANロボット工学ステーション（robotics station）（TECAN U. S. INC., P. O. Box 13953, Research Triangle Park, NC 27709）は、標的DNA配列中にトランスポゾンを有するものとしてスクリーニングすることによって同定されたクローン由来の細胞を含む96−デイープウェルプレートを生成するのに使用された。各陽性クローンからの細胞をウェルの１つにおいてSuper brothおよび適当な抗生物質（２重選択）中においた。これらのプレートを培養し、次いで培養物を自動化シークエンシングに供した。
【００４２】
３８４−ウェルプレートの最適化ＰＣＲスクリーニング技術の実施例
Q−Botを使用して、クローンを含むトランスポゾンのコロニーを、１ウェル当りSuperbroth＋適当な抗生物質を65μl含むGenetix 384ウェルの浅いウェルプレートに選びとった。加湿された37℃のインキュベータに19〜22時間プレートを置いた。滅菌50％グリセロールをMultidrop 384 115V 液体デイスペンサー (Labsystems Inc., 8 East Forge Parkway, Franklin MA 02038)を用いて増殖プレートに１ウェル当り25μl等分した。鋳型としてグリセロールプレートを用い、次のレシピを用いてＰＣＲを設定した。
ddH2O: 17.875μL
10×Z−Taqバッファー: 2.5μL
dNTP混合物: 1.5μL
鋳型DNA* : １μL (Kerplunker、ピン−ツールを用いる)
Z−Taq DNAポリメラーゼ: 0.125μL (0.3125単位)
cM13f (５pmol／μL) : １μL
cM13r (５pmol／μL): １μL
* Kerplunkerが滅菌されたことを確実にするために、70％エタノール中で貯蔵し、使用前に火炎滅菌する。
【００４３】
ＰＣＲ反応プレートをサーモサイクラー上に置き、次のサイクルを開始する:
１．変性: 98℃で５秒間
２．アニール: 52℃で10秒間
３．伸長: 72℃で30秒間(7.7秒／kb)
４．１へ、35回繰り返す。
５．ＰＣＲ反応が評価されるまで４℃。
総サイクリング時間：１時間18分30秒
【００４４】
反応の進行中に、PICOGREEN(R)試薬を室温で解凍する。１×TＥバッファーで150倍希釈したPICOGREEN(R)を準備する。384−ウェルプレートにつき10mlを用意する。全ての384−ウェルブラックプレートに１ウェルにつきRobbins Hydraを用いて25μL分注する。Robbins Hydraを用いて、ＰＣＲ反応物をPICOGREEN(R)プレートに１ウェルに付き５μL分配する。すぐに蛍光プレートリーダーにプレートを置き、10秒間振とうすることによって混合する。蛍光シグナルのデータをフロッピーディスクにエクスポートする。エクセルマクロにデータをインポートし、閾値として1500を用いて陽性クローンの再配列リストを作成する。ＰＣＲスクリーニングから得られた最終PICOGREEN(R)データの例は図７を参照されたい。TECANロボットの再配列リストを開けて、Superbrothおよび適当な抗生物質を含む96−ウェルの深いウェルプレートに、グリセロールストックプレートからクローンを再配列する。プレートをインキュベートした後、それらの培養物は自動化された方法で配列決定される。
【００４５】
実施例３
ベクターPCR4Blunt−TOPOにおける未知の配列のトランスポゾンにより促進されたマルチプレックスシークエンシング
トランスポゾン反応
トランスポゾン反応は、New England BioLabs社製のゲノムプライミングシステム（GPS）キットを用いて実施した。キット中の全ての成分はトランスポゾンGPS１を除いて使用した。使用されたトランスポゾンは、GPS１の改変型であった。２つの改変型が作製された。ある変異体において、現存する耐性マーカーであるpGPS−Apraは、アプラマイシン耐性遺伝子によって置換されたものである。これは耐性マーカーにかかわらず任意のベクターを配列決定するために使用され得ることを確実にするため実施された。他の変異体において、酵母の２μｍ複製起点を含むpGPS−Apra−Y2μｍ「スタッファー」領域は、トランスポゾンにクローン化され、そのサイズを５kbまで増加する（図６）。この改変は、ベクター骨格への転位を排除することによって、その工程の効率を改善する目的で作製された。その反応物は、DH10B E. coliコンピテント細胞にエレクトロポーレーション法によって形質転換され、トランスポゾンを持つクローンを選択するために、適切な抗生物質（アプラマイシン（100μg／ml）／カナマイシン（50μg／ml））を含有するLuria-Bertani（1.0％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキストラクト、1.0％ NaCl、pH 7.0）の寒天プレート上に播種された。増殖時間は20〜22時間である。
【００４６】
ＴＥＭＳ(トランスポゾンにより促進されたマルチプレックスシークエンシング)
ＴＥＭＳを実施した全ての標的ＤＮＡ配列の大きさは、Not Iを用いた標的ＤＮＡ含有ベクターの制限消化によって評価された。同じベクター骨格中に含まれる多様なサイズの標的ＤＮＡ配列を含むプラスミドのセットがプールされた。等モルの濃度は、プールする前に各標的ＤＮＡ配列に対して計算された。単一の鋳型としてプールされたＤＮＡの鋳型を処理するトランスポゾン反応が、実施された。各標的ＤＮＡ配列の各塩基の６倍の領域について、各標的ＤＮＡ配列の大きさの合計に、１kbの配列につき１８クローンである本発明者らの標準係数を乗じて、配列に対してランダムに選択されたクローンの数を決定した。ベクターの大きさの合計および標的ＤＮＡ配列の大きさの合計に基づいて、トランスポゾン挿入の位置の可能性が計算された。この係数×６倍の領域に対するクローンの数は、何個のクローンをランダムに選択し、ＰＣＲスクリーニング法に付したらよいかということを決定する。
【００４７】
算出された数のコロニーを選択し、96ウェルまたは384ウェルの培養プレートに適当な抗生物質を含有するSuperbroth（バクトトリプトン、イーストエキストラクト、NaCl、NaOH）の培地に植菌した。これらの培養プレートは、培養プレート（96／384ウェル）のフォーマットによって18〜22時間、振とうせずに一晩培養した。グリセロールストックは、プレートの一次貯蔵用に作製された。50％グリセロールを直接プレートに添加し、混合した。これにより−80℃にて無期限に貯蔵することができる。
【００４８】
ベクター挿入物のPCRによる排除
スクリーニングのためのクローンのベクター部分を増幅するために選択されたプライマー配列は、ユニバーサルプライマーM13F(−20)およびM13Rの相補配列であった。その配列は次のとおりである。即ち、5′-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3′および5′-CATGGTCATAGCTGTT-3′である。培養物のＰＣＲは、次の条件で組み立てられた。即ち、鋳型を約１μLずつピンレプリケーターツール（pin replicator tool）を用いて分取されたPCR反応試薬調製物に入れた。96−ウェルフォーマットに対する10×ＰＣＲ緩衝液組成物は、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ w/vゼラチンである。各反応には、５ピコモルのフォワードプライマーおよび５ピコモルのリバースプライマーを使用した。反応中のｄＮＴＰ濃度は、最終濃度2.5mMであった。各反応に添加されるＴａｑポリメラーゼの量は、0.1単位であった。全ての反応が総容量50μlで実施された。384−ウェルフォーマットＰＣＲは、Panvera社（545 Science Drive, Madison, WI 53711）から得たTaKaRa Z−Taqキットを用いて25μlの合計容量で実施された。このキットは、Z−taqポリメラーゼ(2.5単位／μL)、30mM濃度のMg2+を含有する10×Z−Taqバッファー、およびｄＮＴＰ混合物(各2.5mM)からなる。サーモサイクラーはヒートリッド（MJ Research）を使用して運転された。このＰＣＲサイクルは短い伸長時間によりトランスポゾンのないベクターのみ増幅するように設計されたものである。後に蛍光分析がプレート上で直接行えるように、黒のＰＣＲプレートが使用された。
【００４９】
PICOGREEN(R)を用いた解析条件
ＰＣＲの完了時に、25μlのPICOGREEN(R)をＰＣＲプレートに添加した。１×TE（Tris‐酢酸、EDTA）バッファーでPICOGREEN(R)ストックを200倍に希釈した50μｌ容量の液を、10μlのＰＣＲ反応物と混合した。そのプレートをスペクトロフルオロメーターで読み、ここでその分子を480nmで励起し、そのシグナルを540nmで放射させた。予め決定された閾値以上である蛍光発光するＰＣＲ産物は、配列決定される陽性クローンであった。その閾値は、ベクター中か、またはベクターへの挿入物中のいずれかのトランスポゾンを含む既知の構築物を用いて実験的に測定された。陽性クローンを選別し、TECANロボットアーム（TECAN robotic
arm）によって、アレイに好適なフォーマットに圧縮した。グリセロールストックは、Superbroth (バクトトリプトン、イーストエキストラクト、NaCl、５N NaOH)および好適な抗生物質の1.5mlを含有する96ディープウェルプレートに植菌された。これらの培養物を24時間培養し、次いで培養物由来の標的ＤＮＡをトランスポゾンの両末端にあるプライマーを用いて配列決定した。
【００５０】
シークエンスアセンブリー
Phred ソフトウェアを用いて、生の（raw）配列のベクターのトリミングおよび塩基の呼出しの後に、配列をPhrapソフトウェアを用いて整理した（Brent Ewing, LaDeana Hillier, Michael C. Wendl, and Phil Green.“Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment.”1998. Genome Research 8: 175-185.およびBrent Ewing and Phil Green“Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.”1998. Genome Research 8:186-194を参照せよ）。そのアセンブリーは、consed (consed: A Graphical Tool for Sequence Finishing Gordon et al 1998 を参照のこと)を用いて精査された。完了の基準は、高い品質であって、完全長遺伝子の６倍の領域である。配列10kbあたりの予測されたエラーの割合は、0.1よりも小さくあるべきである。これらの基準に適合しない場合には、プライマーは標的ＤＮＡ配列におけるエラーしやすい部位のプライマーウオーキングシークエンシングのための鋳型に沿って選択される。プライマーウォーキングシークエンシングは、必要とされるシークエンシングの容量に従って、ABI 310シークエンサーか、またはABI 3700を使用した高いスループットのシークエンシングのいずれかを用いて実施され、そしてこれらの配列は実質的にそのアセンブリーに付加される。BLAST分析は特に既知の遺伝子と比較するために実施される（Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J.（1990）“Basic local alignment search tool.”J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W. & States, D. J. （1993）“Identification of protein coding regions by database similarity search.”Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T. L., Tatusov, R. L. & Zhang, J. (1996)“Applications of network BLAST server”Meth. Enzymol. 266: 131-141 ; Altschul, S. F., Madden, T. L., Schauffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 ; and Zhang, J. & Madden, T. L. (1997)"Power BLAST : A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation"Genome Res. 7: 649-656を参照せよ）。生成された配列の全長は、Sequencherと呼ばれる他のアセンブリープログラムにインポートされる（Cash, H., Clark, B., Galt, J., Garb, C., Goebel III, C. J., & Singer, J.  Sequencher User Guide "The complete Software Solution for Sequencing DNA". Gene Codes Corporation. 1999.）。このプログラムを用いれば、変更がたとえあるとしても、フレームシフトを引き起こさなかったことを確実にするために、オープンリーデイングフレームを可視化することが容易である。
【００５１】
前記の実施例は、単に例示および説明をするのみであって本発明を限定するものではないと理解される。特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲を離れることなく、多様な改変が、上記の実施態様に対して当業者によってなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＴＥＭＳの工程のダイヤグラムである。
【図２】  GPS−Apraトランスポゾンベクターの配列を示す。
【図３】  GPS−Apra−2μｍ−URA3トランスポゾンベクターの配列を示す。
【図４】  トランスポゾン含有ベクターおよび標的ＤＮＡ含有ベクターのベクター部分を倍数化する様々なポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応の産物を示すために染色された電気泳動ゲルの写真である。
【図５】  約９kbの産物を消去するには長すぎる伸長時間を有するＰＣＲ反応の産物を示すために染色された電気泳動ゲルの写真である。
【図６】  様々な伸長温度および異なった数のサイクルにおけるＰＣＲ反応の産物を示すために染色された電気泳動ゲルの写真である。
【図７】  ＰＣＲ反応の産物を示すため染色された電気泳動ゲルの写真、並びに同じＰＣＲ反応についてのPICOGREEN(R)の結果の表である。
【図１】
0004807921.tif 000005
【図２】
0004807921.tif 000006
【図３】
0004807921.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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