(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー配合物からつくられる製品において、前記製品が、
（ａ）５以下の親水性−親油性バランス数を有し水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素少なくとも１つを有する非水溶性非イオン性界面活性剤、および、
（ｂ）母材ポリマー、
を含み、
前記製品が水溶液中で有機物質の前記製品の表面に結合する能力を低減でき、前記製品表面のタンパク質結合レベルが80ng/cm2未満であることを特徴とする製品。
【請求項２】
前記非水溶性非イオン性界面活性剤が、モノオレイン酸ソルビトール、トリステアリン酸ソルビトール、トリオレイン酸ソルビトール、モノステアリン酸ソルビトール、ポリ酸化エチレンステアリルエーテル、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル、及びポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド・ブロック共重合体からなる群より選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項記載の製品。
【請求項３】
前記母材ポリマーが、エチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスチレン−ブタジエン共重合体、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリアミド及びその共重合体、ポリウレタン、ポリエステル及びその共重合体、並びにフルオロポリマー類からなる群より選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の製品。
【請求項４】
前記製品が実験器具を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第３項いずれか１項記載の製品。
【請求項５】
水溶液中で有機物質が疎水性表面に結合する能力を低減させることのできるポリマー配合物を製造する方法において、前記方法が、
（ａ）５以下の親水性−親油性バランス数を有し水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素少なくとも１つを有する非水溶性非イオン性界面活性剤を母材ポリマーと十分に混合して配合物とし、
（ｂ）前記配合物を溶融し、
（ｃ）前記非水溶性非イオン性界面活性剤が前記母材ポリマー基体の表面に剪断により移動するように、前記配合物を剪断条件におく、
各工程を含み、
前記母材ポリマーの表面におけるタンパク質結合レベルが80ng/cm2未満であることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記配合物が押出または射出成形プロセスにより剪断条件におかれることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
請求の範囲第５項記載の方法に従って作成された親水性表面を含むことを特徴とする製品。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤が吹き出した表面を含み、前記非イオン性界面活性剤は（ｉ）５以下の親水性−親油性バランス数及び（ii）水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素少なくとも１つを有し、母材ポリマーを含むことを特徴とする製品であって、
該製品表面のタンパク質結合レベルが80ng/cm2未満であることを特徴とする製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疎水性表面（例えば、ポリマー表面）への有機物質（例えばペプチド、タンパク質、核酸、及び細胞）の結合を低減するための方法に関する。本発明はまた前記低結合性表面を有する製品（例えば実験器具）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチド、タンパク質、核酸、及び細胞のような生物学的物質は、プラスチックあるいはその他の疎水性材料でつくられた遠心分離管及びピペットのような容器に溜まったり移行したりすることがよくある。生物学的化合物が前記容器表面に吸着及び／または結合することが普通に見られる。このことは、水溶液中である程度の疎水性を示す有機物質、例えばアクリジン化合物、ＰＣＢ類等についても同じである。
【０００３】
多くの用途に対してそのような結合は望ましくない。例えば、前記結合は酵素及び抗体のような貴重な物質の損失を生じ、有機物質の計量分配において、特に少量の場合に、偏差を生じさせる。疎水性表面へのタンパク質、細胞、及び血小板の結合はまた様々な血液取扱手順において問題となる。
【０００４】
これらの理由の結果として、タンパク質及びその他の有機化合物の疎水性表面への結合を低減するための方法を提供することに多大の努力がなされてきた。試みられた手段及び方法の例は、キャルドウェル（Ｃａｌｄｗｅｌｌ）等の米国特許第５，５１６，７０３号；ディング（Ｄｉｎｇ）等の国際特許公開第９４／０３５４４号明細書；“Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”誌、第１３巻（１９９２年）６８２〜６９２ページの、アミジ（Ａｍｉｊｉ）等；米国ニューヨーク市、プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）社発行、ジェイ・アンドレイド（Ｊ．Ａｎｄｒａｄｅ）編「生物医学用ポリマーの表面及び界面形態」、第２巻（１９８５年）１〜８０ページの、ジェイ・アンドレイドによる‘タンパク質吸着の原理’；“Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒ．ＳｃｉＥｎｇ．”誌、第５７巻（１９８７年）６１３〜６１７ページの、リー（Ｌｅｅ）等；“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”誌、第２３巻（１９８９年）３５１〜３６８ページの、リー（Ｌｅｅ）等；“Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”誌、第１１巻（１９９０年）４５５〜４６４ページの、リー（Ｌｅｅ）等；“Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．”誌、第２０巻（１９９５年）１０４３〜１０７９ページの、リー（Ｌｅｅ）等；“ＡＳＡＩＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ”誌、第６巻（１９８３年）６０〜６４ページの、メリル（Ｍｅｒｒｉｌｌ）等；“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”誌、第２０巻（１９８６年）１０３５〜１０４７ページの、オカノ（Ｏｋａｎｏ）等；“Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．”誌、第１巻（１９８９年）４３〜６２ページの、オッケマ（Ｏｋｋｅｍａ）等；“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”誌、第８７巻（１９８７年）６６７〜６７５ページの、オーエンス（Ｏｗｅｎｓ）等：“Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．”誌、第６巻（１９９４年）９１〜１０９ページの、ラビノウ（Ｒａｂｉｎｏｗ）等；“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”誌、第８０巻（１９９３年）２６５〜２７４ページの、シュロイェン（Ｓｃｈｒｏｅｎ）等；“Ｊ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｓｃｉ．
Ｔｅｃｈｎｏｌ．”誌、第６巻（１９９２年）９９５〜１００９ページの、シュー（Ｓｈｅｕ）等；“Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ”誌、第１５巻（１９８３年）６４９〜６５６ページの、シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）等；“Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ”誌、第２７巻（１９８４年）２１２〜２１８ページの、スロー（Ｔｈｕｒｏｗ）等、に見ることができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
低結合性表面を作成する技法が成功するために満たすべき基準には：１）十分低い結合レベル；２）実質的な永続性；３）使用の容易性；及び４）低コストがある。本発明の目的は、これらの基準の全てを満たす低結合性表面を作成する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定の被膜材及び特定のプロセス工程の組合せにより上記基準を達成するものであり、前記被膜材及び工程のいずれもが本技法の成功にとって不可欠である。
【０００７】
本発明で用いられる前記特定の材料は、水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素、例えば親水末端基を有し、５以下の親水性−親油性バランス数（ＨＬＢ数）を有する、非イオン性界面活性剤である。ここで“非イオン性界面活性剤”という用語は、水溶液への溶解度が異なる、構造が同じではない２種の基を含む分子という古典的定義に従って用いられる。米国ニューヨーク州ニューヨーク、ジョンワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）社発行、“Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，第３版（１９８３年）第２２巻、３３２ページを参照されたい。
【０００８】
以下で与えられる例に示されるように、‘５’以下のＨＬＢ数が永続性のある低結合性表面を達成するために不可欠である。非イオン性界面活性剤は、以前にも低結合性表面の作成への使用が研究されたが（上掲の参考文献を参照されたい）、５以下のＨＬＢ数の重要性が以前は認識されていなかった。本発明が示すように、ＨＬＢ数が５より大きいとタンパク質結合は実質的に抑制されないかあるいは一時的にしか抑制されないが、一方５以下であればタンパク質結合を長期間抑制することができる。
【０００９】
本発明に用いられる特定の方法の１つは、溶剤中で表面（基板）に非イオン性界面活性剤を塗布し、次いで表面（基板）を乾燥させて溶剤を除去し、よって前記界面活性剤を表面に直接接触させて表面と結合させる工程を含む。前記表面は完全に乾燥されることが望ましい。前記塗布及び乾燥工程は、有機溶剤による中間洗浄工程なしに行われなければならない。
【００１０】
実施例７及び８に示されるように、前記乾燥工程は永続性のある低結合性表面を得る上で不可欠である。この工程がないと、前記非イオン性界面活性剤は水溶液により疎水性表面から取り除かれ、前記表面は低結合特性を失ってしまう。界面活性剤の上記除去は、５以下のＨＬＢ数を有する非イオン性界面活性剤を用いたとしてもおこる。しかし、いったん前記被膜が表面に乾燥被着されれば、被膜は事実上永続的になり、水溶液との接触により取り除かれることは実質的にない。このことは、当該技術が必要とする低結合性表面は水溶液とともに使用されるので、本発明の重要な利点である。
【００１１】
前記乾燥工程に先だつ有機溶剤によるいかなる洗浄も避けることが、本発明の実施に用いられる前記非イオン性界面活性剤の低ＨＬＢ数を考えると重要である。低ＨＬＢ数のため非イオン性界面活性剤は実質的に有機溶剤可溶になるので、有機溶剤による洗浄は実質的に前記界面活性剤を全て表面から取り除き、よって界面活性剤はその低結合化機能を発揮できなくなる。
【００１２】
上掲の参考文献に、５以下のＨＬＢ数を有する非イオン性界面活性剤を用いることを開示するか、示唆するか、あるいはいかなる形であれ、上記プロセス工程の重要性を認識しているものはない。特に、スロー等及びシュロイェン等の文献はいずれも、ＨＬＢ数が５以下の非イオン性界面活性剤を少なくとも１種使用している。とりわけ、スロー等の望ましい界面活性剤ジェナポル（Ｇｅｎａｐｏｌ）ＰＦ−１０は、シュロイェン等のＬ−９２と同様にＨＬＢ数が５以下である。スロー等がジェナポルＰＦ−１０はラテックス粒子へのインシュリンの吸着を防止すると報告する一方で、シュロイェン等はＬ−９２がポリプロピレン半透膜へのリパーゼの吸着を防止しないと報告している。重要なことは、いずれの文献も前記非イオン性界面活性剤の疎水性表面への乾燥被着を記述しておらず、よって実用品に求められる実質的な永続性をもつ低結合性表面を作成できていない。
【００１３】
シュー等も低ＨＬＢ数を有する非イオン性界面活性剤（すなわちプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）  １２１，１２２，及び１２７）を使用しているが、これらの界面活性剤を疎水性表面、すなわち低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）に結合させるため複雑なアルゴン・グロー放電を用いている。ある実験において、シュー等は前記グロー放電処理を省略し、代わりに前記界面活性剤を単にＬＤＰＥに塗布してクロロホルムで洗浄した（シュー等の文献、図２参照）。前記条件の下で、シュー等は非処理のＬＤＰＥと比較してタンパク質結合の低減は見られないと報告した（シュー等の文献、１００６ページ参照）。前記結論から見て、本発明で示されるように低ＨＬＢ界面活性剤をグロー放電処理を必要とせずに低結合性表面の作成にうまく使用できることに、シュー等が気づいていなかったことは明らかである。
【００１４】
本発明の前記方法の工程、すなわち溶剤中での界面活性剤の塗布及びこれに続く前記溶剤の乾燥除去は、明らかに実行が容易である。前記方法はまた、低結合性表面を得るには極めて低濃度の界面活性剤しか必要としないので、費用もかからない。例えば、コストが約１（米国）ドルの界面活性剤１ポンドで、約５，０００平方フィート（４６５平方メートル）の疎水性表面に１ミクロン厚の被膜を施すことができる。よって本発明は、低結合性表面を作成するための実用プロセスに関する上記４基準のそれぞれを満足する。すなわち本発明は、実質的に永続的な低結合性表面をつくるための、低コストで容易に用い得る手順を提供する。
【００１５】
ある実施の形態において、本発明はより簡便、より低費用で実施できる。本実施の形態においては、低結合性表面はそのような表面をもつはずの成形品の形成と同時に作られる。特に、本実施の形態に従えば、上記の特性、すなわち５以下のＨＬＢ数及び水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素を有する界面活性剤が、前記成形品をつくるために用いられる金型に、例えば前記金型の成形面の少なくとも１つに前記界面活性剤の溶液を吹付けることにより、塗布される。本発明に従えば、前記処理を施した金型を用いて成形品をつくると、十分な量の界面活性剤が前記金型から成形品表面に移って、低結合性表面が作成される。前記金型には成形品が作られるたびに界面活性剤が吹付けられるが、吹付回数を少なくしたければそうすることもできる。上記の後形成手順と同様に、本成形時形成手順も低結合性表面作成のための実用プロセスに関する前記基準の全てを満たす。
【００１６】
さらにある実施の形態においては、ＨＬＢ数が１０以下の界面活性剤を成形に先だち多種類の熱可塑性ポリマー基材と配合できることがわかった。十分な数の低ＨＬＢ数分子が成形プロセス中に、“吹出し”とよばれる過程により前記表面に移動して低結合性表面を生じさせる。
【００１７】
本実施の形態に用いられる方法は、非水溶性非イオン性界面活性剤を母材ポリマーと十分に混合して配合物とし、前記配合物を溶融し、前記配合物を剪断状態にして前記非イオン性界面活性剤を剪断によりポリマー基板表面に移動させる。例えば、押出機が前記材料の混合に使用され、射出成形機が前記ポリマー配合物を完成品にするために用いられる。いったん非イオン性界面活性剤がポリマー表面に移行すると、界面活性剤分子の親水性要素がポリマー表面から水溶液に伸び出す。得られる製品は界面活性剤で被覆された製品と変わらない非結合特性を示す。前記配合方法を使用することの利点は、前記乾燥工程及び塗布工程を排除でき、従ってさらにコスト低減がはかれることにある。
【００１８】
ディング等は、ポリマー基板に低タンパク質結合性表面をつくるための水溶性ポリマーを含むポリマー配合物の使用を開示している。しかしディング等は、前記ポリマー配合物へのＨＬＢ数が１０以下の非イオン性非水溶性界面活性剤の添加は開示していない。
【００１９】
本発明の特に有益な用途は、タンパク質がつきにくい表面を有する実験器具の製造にある。本発明に従う低結合性表面を提供し得る種類の製品の例には、あらゆる形状、大きさ、及び等級の容器、多ウエル分割滴定板、ピペット、ピペット吸い口、半透膜、試薬容器、貯蔵容器、チューブ等がある。いったん低結合性表面が備えられてしまえば、前記製品はガンマ線滅菌のような通常の手法を用いて滅菌することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
これまで述べてきたように、本発明はＨＬＢ数が５以下（ポリマー配合物に用いる場合は１０以下）で水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素を有する非イオン性界面活性剤による疎水性基板上への低結合性表面の形成に関する。ＨＬＢ数及び特定の界面活性剤に対してＨＬＢ数がいかにして定められるかについての論考は、例えば“ＨＬＢ体系”と題するアイ・シー・アイ・サーファクタンツ（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）社の刊行物、特にその“乳化剤のＨＬＢ決定法”  （米国デラウエア州ウイルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、アイ・シー・アイ・アメリカズ社（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．）（１９９２年））という題の第７章に見ることができる。
【００２１】
本発明の実施に用いられる非イオン性界面活性剤は、必要な低結合性表面を与えるために、水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素を有する必要がある。いかなる特定の動作理論にもしばられるつもりはないが、前記親水性要素は、水和され疎水性表面から伸び出すと、疎水性区を有する分子、例えばタンパク質が容易には侵入できない水性境界層をつくり、よって前記分子が前記疎水性表面に結合することを防止すると考えられる。多くの場合、本発明の実施に用いられる非イオン性界面活性剤分子は、水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素が両端に連結した中央疎水性区を有する。一端にのみ親水性要素が連結した疎水性区を有する分子の場合もある。その他の形状を有する界面活性剤分子を使用したければ、それが水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素を少なくとも１つ有していれば当然使用できる。極端な場合、前記親水性要素はポリプロピレンオキシドで達成された低結合化に示されるように、ヒドロキシル基のような単純なものであってよい（以下の実施例６参照）ことに注意されたい。
【００２２】
１つまたはそれ以上の前記親水性要素の存在は、界面活性剤分子は通常ゼロよりい大きいＨＬＢ数を有すること、すなわちある程度の親水性を有することを意味する。（前記ポリプロピレンオキシドの場合には、ＨＬＢ数は事実上ゼロに近く、０．５より小さいことに注意されたい。）しかし、実質的に永続的な低結合性表面を達成するためにはＨＬＢ数は５以下でなければならないから、前記分子の親水性はその親油性より十分小さい。一般に、ＨＬＢ数が２．５より小さい非イオン性界面活性剤が本発明の実施に望ましい。
【００２３】
現在知られており、また引き続き開発されている、多種多様な非イオン性界面活性剤を本発明の実施に用いることができる。適当な界面活性剤の例には、アルキルアルコールエトキシレート類、アルキルエステルエトキシレート類、ソルビトールアルキルエステル類、グリセロールアルキルエステル類、及びエチレンオキシド−プロピレンオキシド・ブロック共重合体類がある。前に述べたように、ポリプロピレンオキシドも本発明の実施に用いることができる。前記ポリプロピレンオキシドの平均分子量は約１，０００ないし約１５，０００の範囲にあることが望ましい。枝分かれ及び星形ポリマーのような、ポリプロピレンオキシド誘導体も本発明の実施に用いることができる。
【００２４】
前記及びその他の適当な界面活性剤は、米国デラウエア州ウイルミントンのアイ・シー・アイ・アメリカズ社；米国ニュージャージー州パーシッパニ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｉ）のバスフ社（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）；米国コネチカット州グリーンウィッチ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ）のウィトコ社（Ｗｉｔｃｏ  Ｃｏｒｐ．）；及び米国ペンシルバニア州アンブラ（Ａｍｂｌｅｒ）ーのヘンケル社（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む、多くの製造業者から入手することができる。非イオン性界面活性剤を混合して本発明の実施に用いたければ、混合する界面活性剤のそれぞれのＨＬＢ数が５より小さければ用いることができる。多種にわたる市販非イオン性界面活性剤のリストは、米国ニュージャージー州グレンロック（Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ）のマニュファクチャリング・コンフェクショナー出版社（Ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）出版の“マッキュチェオンの乳化剤及び洗浄剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ‘ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）”北米版、に見ることができる。本発明で使用することが望ましい非イオン性界面活性剤は、プルロニック（登録商標）Ｌ−１２１である。
【００２５】
各種の疎水性表面を、本発明に従って低結合性にすることができる。ここで用いられるように、処理前と処理後のタンパク質結合の比が約０．５より小さく、望ましくは０．３より小さければ、表面は低結合化されたと見なされる。同様に、処理された表面が低タンパク質結合特性を、少なくとも約２回の室温水洗、望ましくは約６回のやはり室温水洗後にも保持していれば、表面処理は実質的に永続的であると見なされる。ここで用いられる前記水洗は、少なくとも６０秒継続して行われる。
【００２６】
本発明が有益な種類のポリマー表面の例には、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリメチルペンテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体（例えばスチレン−アクリロニトリル共重合体（ＳＡＮ）及びアクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体（ＡＢＳ））、ポリプロピレン共重合体、フルオロポリマー類、ポリアミド類、シリコーン樹脂、及びシリコーン樹脂、炭化水素、及びフルオロカーボン・エラストマー類を含むエラストマー類がある。その他の材料も、前記界面活性剤が結合し得る疎水性表面をもっていれば、処理できる。
【００２７】
非イオン性界面活性剤は前記界面活性剤と溶剤を含む塗布溶液の形態で疎水性表面に塗布される。界面活性剤のＨＬＢ数が小さいことから、前記溶剤は一般に有機溶剤、有機溶剤間混合液、あるいは水と１種またはそれ以上の相溶性有機溶剤との混合液、例えば水−アルコール混合液である。前記乾燥工程を楽にするためには、前記溶剤は容易に蒸発し得るものでなければならない。主として水からなる溶剤は、使いたければ使うことができるが、望ましくはない。水が主成分の溶剤は蒸発が比較的緩慢であり、前記界面活性剤のＨＬＢ数が小さいことから、凝集の問題が生じ得る。また金型への吹付けに用いられる場合、金型が閉じられ溶融ポリマーが射出されるまでに蒸発しなかった水があれば、おそらく完成品に欠陥が生じるであろう。
【００２８】
前記塗布溶液内の界面活性剤濃度は、用途に応じて極めて広い範囲で変えることができる。使いやすい濃度は、約０．０１比重量％から約１．０比重量％の範囲にある。実験器具の後形成被膜に適した濃度は約０．１比重量％である。より高いあるいは低い濃度も、もちろん使いたければ使うことができる。
【００２９】
前記塗布溶液は、例えば吹付け、浸漬、ブラシ塗布等を含む、種々の技法を用いて疎水性表面に塗布し得る。少量の界面活性剤で大面積を処理することができる。従って、疎水性表面１平方ミリメートルあたりに塗布される塗布溶液の体積は極めて小さくなり、例えば界面活性剤濃度が約０．１比重量％の塗布溶液では１ｃｍ2あたり約２ないし２０マイクロリットルである。単位面積あたりの界面活性剤量並びに対応する塗布溶液濃度及び塗布速度は、結合性を必要なだけ低減できたかどうかを決定するために疎水性表面をもつ試験片で実験することにより、いかなる特定用途に対しても容易に決定することができる。
【００３０】
前記塗布溶液の乾燥は、大気圧において室温で行うことができる。より高温あるいは低温も、使いたければ使うことができる。より高温（５０〜７０℃）では、時には前記表面の被膜をより一様にすることが容易になることがわかった。高速乾燥が必要であれば、減圧して行うこともできる。いかなる乾燥手順が用いられようとも、溶剤を十分除去し、非イオン性界面活性剤が疎水性表面と結合できるように直接表面に接触できるようにすることが必要である。前記結合がおこったかどうかは、水溶液で前記被覆面を繰り返し洗浄することにより容易に試験できる。前記洗浄後にも表面が非結合特性を保持していれば必要とする結合が得られているし、保持していなければ前記被覆表面をより完全に乾燥することが必要である。
【００３１】
前述したように、本発明の非イオン性界面活性剤は、完成品に塗布するだけでなく、前記成形品の成形に用いられる金型に塗布することもできる。本実施の形態に従えば、非イオン性界面活性剤を含む溶液が前記金型表面の全てまたは一部に吹付けられ、金型が閉じられ、溶融ポリマーが金型内に射出されて冷却され、金型が開けられ、成形品が金型から取りだされる。金型塗布に用いられる前記溶液は、上述の塗布溶液と同じ組成でよい。本発明に従えば、十分な界面活性剤が前記ポリマー表面に移り、実質的に永続的な非結合性表面をつくることがわかった。金型への界面舌性剤の塗布は吹付けが望ましいが、その他の例えばブラシ塗布法を用いることもできる。金型に離型剤を塗布するために用いられる種類の器具を、界面活性剤の塗布に用いることができる。
【００３２】
成形に先だつ非イオン性界面活性剤の配合物への添加による非結合性表面の作成においては、イオン性界面活性剤分子が基材ポリマー中に５％配合される。前記母体ポリマーに添加されるべき非イオン性界面活性剤の所要量は、分子によって異なるが、いずれにせよ、望ましくは０．１０〜１０．０（比重量）％、さらに望ましくは０．５〜５．０％の範囲にある。染料、顔料、安定化剤、強化剤等のようなその他の添加剤を、ある所望の特性を有する完成品をつくるために前記配合物に加えてもよいことに注意されたい。
【００３３】
本発明を以下の例によりさらに詳しく説明するが、いかなる意味でもその説明に限定するつもりはない。前記例に共通な材料及び方法は以下の通りである。
【００３４】
材料及び方法
表１４は、例で用いた非イオン性界面活性剤をそのＨＬＢ数及び該当する市販商品名とともに表わしている。
【００３５】
別に示した場合を除いて、前記非イオン性界面活性剤をイソプロパノール中の０．１（比重量）％溶液として試験する疎水性表面に塗布した。被験表面を前記溶液の薄層で被覆するのに十分な量の塗布溶液（例えば標準的な２４−ウエル滴定板のウエルあたり２５μｌの溶液）を用いた。前記溶液を吹付けにより表面に塗布した場合もあれば、溶液を表面に（前記ウエル内に）注いだ場合にもある。別に示した場合を除いて、被覆試料は前記イソプロパノールを蒸発させるために、空気循環炉内で７０℃、３０分間の乾燥を行ったか、あるいは室温で一晩おいて乾燥した。
【００３６】
いくつかの例では、タンパク質結合をコロイド状金による染色法を用いて測定した。本方法によると、コロイド状金は結合タンパク質に静電的に付着し、５５０ナノメートルの波長の吸光度を測定することにより検出される。本目的のため、バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社のコロイド状金総タンパク質染色（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ）を、ケンブリッジ・テクノロジーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社のプレート・リーダー（Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（７５２０番）による吸光度測定とともに用いた。
【００３７】
当該技術では一般にわかっているように、低結合性表面であるための上限は約５０〜８０ｎｇ／ｃｍ2である。比較のために述べれば、非処理のポリスチレンあるいはポリプロピレンで示されるような中結合性では約２００〜４００ｎｇ／ｃｍ2であり、プラズマ酸化されガンマ線滅菌されたポリスチレンあるいはポリプロピレン表面で示されるような高結合性では約４００〜８００ｎｇ／ｃｍ2である。
【００３８】
表のいくつかで用いられている“ＮＡ”及び“ＮＤ”という表示は、それぞれ“該当せず”及び“検出されず”を意味する。表示“ＰＳ”は、ポリスチレンを意味する。表示“Ｍ．Ｗ．”は、平均分子量を意味する。
【００３９】
【実施例】
実施例１
タンパク質結合低減の放射線による測定
本実施例は、非イオン性界面活性剤が疎水性表面へのタンパク質の結合を低減できることを放射計計測により示す。
【００４０】
疎水性表面には、高結合性ポリスチレン（コーニング・コスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）２５８１番）及び中結合性ポリスチレン（コーニング・コスター２５８７番）からなる平底微小滴定板を用いた。コバルト６０（１．５Ｍｒａｄ）を用いたガンマ線滅菌の有無について試験を行った。
【００４１】
本実施例で用いた非イオン性界面活性剤は表１に示してある。前記界面活性剤を、材料と方法の項で述べたようにして被験滴定板に塗布し、続けて上記滅菌を行った。
【００４２】
タンパク質結合の水準は、放射標識タンパク質、すなわちデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）／ＮＥＮから購入した（ヤギ−抗ハツカネズミ）125Ｉ−ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を用いて測定した。ｐＨ９．２の炭酸ナトリウム緩衝液中の非標識ＩｇＧを125Ｉ−ＩｇＧでスパイクして、試験溶液中の標識ＩｇＧと非放射性ＩｇＧの最終濃度を１０μｇ／ｍｌとした。
【００４３】
前記タンパク質溶液のアリコート、０．１ミリリットルを前記被験微小滴定板から取り外した８−ウエル分割滴定板のウエルに入れた４重標本を作成した。前記ウエルは揺動させながら４℃で一晩定温放置した。上澄みをウエルから除去し、次いで０．２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで前記ウエルを乾燥し、結合ＩｇＧの総数を決定するためにそれぞれの放射を計数した。結合総数の決定後、前記ウエルを０．２ｍｌのＰＢＳ−ツイーン（０．０５％）混合溶液内で揺動させながら室温で２時間定温放置した。ウエルから上澄みを取り除き、次いで０．２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。前記ウエルを乾燥し、密接に結合したＩｇＧを決定するためにそれぞれの放射を計数した。
【００４４】
非処理の高結合性及び中結合性滴定板を対照標準として用いた。ＢＳＡタンパク質被膜を界面活性剤被膜の代わりに用いた比較実験も行った。ＢＳＡを前記ウエルの壁に予備吸着させ、次いで洗浄して余分なＢＳＡを除去した。次いで上述の放射標識ＩｇＧを用いて試験を行った。
【００４５】
放射標識測定は、（米国マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）の）バイオモレキュラー・アッセイズ（ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓａｙｓ）で二重盲検法により行った。微小ウェルあたりのＩｇＧ結合値は、容積０．１ｍｌに対する表面積０．９４ｃｍ2を用いてｎｇ／ｃｍ2値に換算した。
【００４６】
表１に示すように、試験した非イオン性界面活性剤では、前記２種の対照標準及びＢＳＡ実験と比較してタンパク質結合の実質的な低減が得られ、全てではないが多くの場合滅菌後の結合はかなり多いが、それでも対照標準よりかなり減少した。
【００４７】
実施例２
タンパク質結合低減の酵素による測定
本実施例は、非イオン性界面活性剤が疎水性表面へのタンパク質の結合を低減できることを酵素計測により示す。
【００４８】
本実施例で用いた非イオン性界面活性剤は表２に示してある。材料及び方法の項で述べたようにして中結合性ポリスチレン滴定板（コーニング・コスター２５８７番）を前記界面活性剤で被覆した。中結合性ポリスチレン滴定板（コーニング・コスター２５８７番）及び高結合性ポリスチレン滴定板（コーニング・コスター２５８１番）を対照標準として用いた。
【００４９】
本実施例で用いた試薬は：
（ａ）ＨＲＰ−ヤギ抗ハツカネズミＩｇＧ：キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、カタログ番号０７４−１８０６。保管溶液：０．５ｍｇ／ｍｌ；作業濃度：０．０４μｇ／ｍｌ。前記作業濃度は、ｐＨ７．４のＰＢＳ２５ｍｌあたり保管溶液１１μｌを加えて作業原液（ＷＳ）をつくり、次いで１：６（すなわちＷＳ１０ｍｌ＋ｐＨ７．４のＰＢＳ５０ｍｌ）に希釈して得た；
（ｂ）リン酸緩衝食塩水：シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、１０００−３。緩衝液作成：Ｈ2Ｏ２リットルあたりＰＢＳ２袋；
（ｃ）２０倍濃縮洗浄液：キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ社、カタログ番号５０−６３−０１。洗浄濃度：１Ｍ（Ｈ2Ｏ３８００ｍｌ＋濃縮洗浄液２００ｍｌ）；
（ｄ）ＡＢＴＳ過酸化物基質及び過酸化物溶液Ｂ：キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ社、カタログ番号５０−６４−０２及び５０−６５−０２。
【００５０】
（ｅ）ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：シグマ社、カタログ番号Ｌ−４５０９。停止液：１％ＳＤＳ（Ｈ2Ｏ１リットルあたりＳＤＳ１０ｇ）；
とした。
【００５１】
用いた手順は：
（１）濃度０．０４μｇ／ｍｌのＨＲＰ−ヤギ抗ハツカネズミＩｇＧを被験ウェルにウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間定温放置した；
（２）次いで前記ウェルを前記１Ｍ洗浄液で５回洗浄した。各洗浄は５分間の浸漬及びその後の上澄み除去とした；
（３）基質（ＡＢＴＳ３０ｍｌ＋Ｈ2Ｏ３０ｍｌ）を被験ウェルに１ウェルあたり１００μｌ加え、暗所に室温で１５分間定温放置した；
（４）被験ウェルに停止液（１％ＳＤＳ）を１ウェルあたり１００μｌ加えた；
（５）次いで前記滴定板を揺動し、波長４０５ｎｍで測定した。
【００５２】
（６）結合の低減は、段階（５）で測定した吸光度を非イオン性界面活性剤の処理をしていないが段階（１）から（５）の処理はした高結合性ポリスチレン滴定板について測定した吸光度と比較して決定した。
【００５３】
表２に示すように、非イオン性界面活性剤により結合酵素量をかなり低減することができ、最大低減量は９５％より多かった。
【００５４】
実施例３
コロイド状金染色法によるタンパク質結合低減の測定
本実施例は、非イオン性界面活性剤が疎水性表面へのタンパク質の結合を低減できることをコロイド状金染色法により示す。
【００５５】
本実施例で使用した非イオン性界面活性剤は表３に示してある。材料及び方法の項で述べたようにして中結合性ポリスチレン滴定板（コーニング・コスター２５８７番）を前記界面活性剤で被覆した。
【００５６】
前記被験滴定板は以下の手順によりＩｇＧ定温放置を行なった：０．１０ＭのＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．４）に作業濃度１０μｇ／ｍｌのウマＩｇＧ（ピアース・ラボ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｂｓ））０．１ｍｌを各ウェルに加え、揺動台上で３０分間定温放置し、純水でリンスした。前記滴定板を（ウェルあたり０．３ｍｌで）一晩金染色し、純水でリンスし、空気乾燥し、波長５５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５７】
表３に示すように、非イオン性界面活性剤により明らかに、低タンパク質結合レベル、すなわち金染色法では検出できないレベルが得られた。
【００５８】
実施例４
タンパク質結合低減はｐＨに依存しない
本実施例は、非イオン性界面活性剤が広いｐＨ範囲にわたってタンパク質の結合を抑制できることを示す。
【００５９】
本実施例で使用した非イオン性界面活性剤は表４に示してある。材料及び方法の項で述べたようにして２４−ウェル・ポリスチレン滴定板（コーニング・コスター９４４７番）を被覆した。
【００６０】
ＢＳＡタンパク質（ウシ血清アルブミン、分画Ｖ：シグマ社）を、０．１０Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．６）、０．１０ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）、及び０．１０ＭのＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．４）中１０μｇ／ｍｌで用意した。各被覆滴定板のウェルを、被覆していない対照標準とともに、各タンパク質溶液０．５０ｍｌでアリコートした。前記試料は３重標本とした。
【００６１】
前記滴定板を２３℃で３０分間、揺動台の上に置いた。次いで前記タンパク質溶液を被験滴定板から流し出し、ウェルを純水で３回リンスした。次いで、コロイド状金染色液１．０ｍｌを各ウェルに加えた（材料及び方法の項参照）。前記滴定板を揺動台上に一晩置き、純水で３回リンスし、空気乾燥した。次いでケンブリッジ・テクノロジーズ・プレート・リーダーを用いて波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６２】
表４に示すように、前記非イオン性界面活性剤は、広いｐＨ範囲でタンパク質結合の防止に有効であった。
【００６３】
実施例５
細胞付着の低減
本実施例は、非イオン性界面活性剤が細胞付着を低減できることを示す。
【００６４】
用いた手順は次の通りである：材料及び方法の項で述べた手順に従って、２４−ウェル・ポリスチレン滴定板を表５に挙げてある非イオン性界面活性剤で被覆した。非被覆滴定板を対照標準として用いた。比較のために、アクリルアミド被膜を共有結合的に張りつけた滴定板（コーニング・コスター２５００番）及びステアリン酸で被覆した滴定板も試験した。前記ステアリン酸被覆は、０．１（比重量）％溶液をやはり用いて、非イオン性界面活性剤被覆と同様にして施した。
【００６５】
前記滴定板を１．５Ｍｒａｄのガンマ線で滅菌し、次いでウェル毎に５％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有する完全培地１ｍｌに５．６×１０4個のＭＤＣＫ細胞を接種した。５％ＣＯ2雰囲気、３７℃で２日間の定温放置を行った。前記滴定板は固定され着色して、細胞付着が認められた。これに続き、前記ウェルをコロイド状金法を用いて染色し、結合タンパク質を検出した。目視検査のみを行った。表５に示すように、本発明の様々な非イオン性界面活性剤により結合細胞の低減及び／またはタンパク質結合の低減が達成された。
【００６６】
血清中に懸濁した細胞を用いた実験も行った。本実験の細胞にはＭＤＣＫ細胞を用いた。表５に用いたものと同じ界面活性剤を用いた。非イオン性界面活性剤で処理した表面での前記細胞の結合の低減がやはり認められた。
【００６７】
実施例６
水溶液中に伸び出すことができる親水性要素の必要性
本実施例は、低結合性表面の作成に用いられる非イオン性界面活性剤が水溶液中に伸び出すことのできる親水性要素をもたなければならないことを示す。
【００６８】
非イオン性界面活性剤は、両端のそれぞれにつけられた疎水性区及び親水性区、あるいは両端に親水性区がつけられた中央疎水性区、あるいは両端に疎水性区がつけられた中央親水性区を含む、種々の構造を有している。前記３種類の分子は同じＨＬＢをもつことができるが、初めの２種は少なくとも１つの親水末端基を有する一方、第３の種類は中央に親水性区をもち、疎水末端基を有する。
【００６９】
材料及び方法の項で述べられた手法を用いて、表６に挙げられている非イオン性界面活性剤の低結合性表面作成能力を試験した。疎水性被験表面としてポリスチレンを用い、ＩｇＧ／金染色を検定に用いた。
【００７０】
表６に示すように、同様のＨＬＢ数に対して、親水末端基を少なくとも１つ有する界面活性剤を被覆した表面はタンパク質結合の抑制に有効であるが、一方親水末端基をもたない界面活性剤で被覆した表面はタンパク質結合の抑制には効果がない。水溶液中に伸び出すことができる親水性要素の必要性は、本データから明らかである。
【００７１】
本発明での使用に適する界面活性剤は親水末端基を有する必要はなく、１つまたはそれ以上の親水基が疎水性主鎖の長さ方向でどこかにつけられ、前記１つまたはそれ以上の親水基が水溶液中に伸び出すことができればよいことに注意しなければならない。
【００７２】
実施例７
界面活性剤被覆表面の乾燥が耐久性の鍵を握る
本実施例は、耐久性のある低結合性表面を得るための界面活性剤被覆表面の乾燥の臨界性を示す。さらに詳しくは、本実施例における実験の目的は、ポリマー表面に吸収された非イオン性界面活性剤分子が耐久性のある被膜を形成するのは水溶液にさらされている間か、それとも前記表面に乾燥被着した後のみであるかを決定することであった。
【００７３】
２４−ウェル滴定板を以下のようにして２重に用意した：非イオン性界面活性剤を０．５（比重量）％含むＨ2Ｏ／イソプロパノール（比重量９０／１０）３ｍｌでそれぞれのウェルを満たした。用いた界面活性剤は表７に挙げられている。
【００７４】
前記２重被験滴定板を揺動台上で３０分間、室温で定温放置し、次いで空にした。前記滴定板の１つを折り取り線で分割し、次いで室温で１時間乾燥した。次いで純水で５回リンスした。第２の滴定板は乾燥せず、その代わり直ちに純水で５回リンスした。タンパク質結合について前記滴定板を試験するために、次いで（ウマ）ＩｇＧを１０μｇ／ｍｌ含むＰＢＳ緩衝液０．５ｍｌで各ウェルを満たし、室温で３０分間揺動台上に定温放置した。次いで前記試験滴定板を純水でリンスし、コロイド状金で一晩染色した。
【００７５】
結果を表７に示す。本データにより、耐久被膜をつくるには前記界面活性剤分子を前記試験滴定板に乾燥被着させることが必要であることが明らかに示されている。
【００７６】
本データはまた、低ＨＬＢ数を有する界面活性剤を用いることの重要性も示している。
【００７７】
実施例８
非イオン性界面活性剤水溶液にさらした表面のリンス効果
本実施例は、前記乾燥工程が耐久性の鍵を握るが、低結合性表面を得るには必要ではないことを示す。
【００７８】
コーニング・コスター社により製造された中結合性（カタログ番号２５８７）及び高結合性（カタログ番号２５８１）９６−ウェル・ポリスチレン滴定板（８−ウェル分割滴定板）を次のように用いた。非イオン性界面活性剤を０．１（比重量）％含むＨ2Ｏ／イソプロパノール（比重量９５／５）０．３ｍｌで分割滴定板２列の各ウェルを満たした。試験した界面活性剤は表８に挙げられている。前記分割滴定板を室温で３０分間揺動台上に定温放置した。次いで前記分割滴定板を空にし、折り取り分割した。
【００７９】
１つの高結合性滴定板及び１つの中結合性滴定板を含む第１の組の分割滴定板のはリンスせず、やはり１つの高結合性滴定板及び１つの中結合性滴定板を含む第２の組の分割滴定板は純水で５回リンスした。本手順後直ちに各ウェルをＧＡＭ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（ヤギ−抗ハツカネズミＩｇＧ−ワサビダイコン過酸化酵素標識抗体；米国メリーランド州ゲイテルスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のキルケガード・アンド・ペリー社、カタログ番号０７４−１８０６）を１０μｇ／ｍｌ含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）０．１０ｍｌで各ウェルをアリコートした。前記分割滴定板を揺動台上に１時間室温で定温放置した。次いで前記分割滴定板を、ツイーン−２０を０．０２％含有するＰＢＳ緩衝液によるリンス、及びそれに続くＨ2Ｏによるポストリンスを５回繰り返した。
【００８０】
結合した抗体はＡＢＴＳ基質試薬キット（キルケガード・アンド・ペリー社、カタログ番号５０−６２−０１）を用いた測色法で測定した。ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ溶液０．１０ｍｌを各ウェルに加えた。前記結合抗体を担体とした過酸化酵素を介してＡＢＴＳがＨ2Ｏと反応するにつれて青色を呈してくる。波長４０５ｎｍにおける吸光度をケンブリッジ・テクノロジーズ・プレート・リーダー７５２０番で測定した。
【００８１】
前記分割滴定板にＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ溶液を加えてからほぼ２分後に測定した吸光度データを、表８に示す。本吸光度データは：（１）乾燥前のリンスは非イオン性界面活性剤を前記分割滴定板から除去し、よって前記非イオン性界面活性剤が低結合性表面をつくれなくする；及び（２）リンスで洗い落とされなければ、乾燥しなくとも前記界面活性剤は低結合性表面を与える；ことを示している。
【００８２】
実施例９
水洗による被膜の耐久性の測定
本実施例はポリスチレン上の非イオン性界面活性剤被膜の耐久性に対するＨＬＢ数の効果を示す。
【００８３】
本実施例で用いた非イオン性界面活性剤は表９に示してある。２４−ウェル・ポリスチレン滴定板（コーニング・コスター９４４７番）を材料及び方法の項で述べたようにして前記界面活性剤で被覆した。
【００８４】
被験滴定板の前記ウェルに純水を（ウェルあたり３．０ｍｌ）加え、続いて前記滴定板を揺動台上におくことにより耐久性を試験した。前記純水処理回数とともに、揺動台上の時間及び温度も表９に示してある。それぞれの滴定板のタンパク質結合特性は、それぞれのウェルについて、ＩｇＧを１０μｇ／ｍｌで含む０．１ＭのＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ＝９．４）０．５ｍｌからなるタンパク質溶液を用いて測定した。前記タンパク質溶液を揺動台上におかれた前記滴定板とともに２３℃、３０分間定温放置し、続いて前記滴定板をＨ2Ｏで３回（各回３ｍｌ）リンスした。揺動台上２３℃の一晩定温放置により染色し、純水でリンスし、室温で乾燥して、波長５５０ｎｍで測定した。
【００８５】
表９に示すように、ＨＬＢ数が１．０，１．８，２．０，４．３，及び４．７の界面活性剤は耐久性を有していたが、ＨＬＢ数が６．７及びそれ以上の界面活性剤は耐久性がなかった。
【００８６】
実施例１０
タンパク質溶液洗浄による被膜の耐久性の測定
本実施例はポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、及びＰＶＤＦ（ポリ弗化ビニリデン）共重合体上の非イオン性界面活性剤被膜の耐久性に対するＨＬＢ数の効果を示す。
【００８７】
本実施例で用いた非イオン性界面活性剤は表１０に示してある。用いた手順は以下の通りである。射出成形滴定板（９６−ウェル構成）はポリスチレン（スタイロン（ＳＴＹＲＯＮ）、ダウ（Ｄｏｗ）社、６８５Ｄ）、ポリプロピレン（エクソン（Ｅｘｘｏｎ）社，９３７４）、ポリメチルメタクリレート（エイト・ハース（ＡＴＯ  ＨＡＡＳ）社）、及びカイナー・フレックス（ＫＹＮＡＲ  ＦＬＥＸ）２８００，ＰＶＤＦ共重合体（エイト・ハース社）でつくられたものを用いた。各ウェルをＩｇＧ（ウマ標準、ピアース社）を１０μｇ／ｍｌで含む０．０１ＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）０．１０ｍｌでアリコートし、次いで２３℃で３０分間揺動台上においた。次いで前記タンパク質溶液をウェルから流し出し、未使用のタンパク質溶液を各ウェルにアリコートした。前記手順を全６回繰り返した。次いで前記滴定板を純水で３回（各回３ｍｌ）リンスした。コロイド状金染色剤を各ウェルに加え（ウェルあたり０．３ｍｌ）、滴定板を一晩揺動台上においた。次いで滴定板を純水で３回リンスし、乾燥させて、ケンブリッジ・テクノロジーズ・プレート・リーダーを用いて波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００８８】
表１０に示すように、耐久性のある低結合性表面の区切りはＨＬＢ数５にある。ＨＬＢ数が５より十分大きな非イオン性界面活性剤では多数回洗浄手順後にかなりの結合を示し、ＨＬＢ数が６ないしやや小さい界面活性剤では若干の結合量を示し、またＨＬＢ数が５より小さい界面活性剤（すなわちＨＬＢ数が１．０，２．０，および４．３の界面活性剤）には実質的に結合がない。タンパク質を吸着した表面は、金染色を裸眼で容易に見ることができる。また非耐久性被膜は、繰返しリンスにより前記被膜が除去されるまで“しみのような”タンパク質結合をつくることがよくある。このような被膜では、１つのウェル内であっても大きなばらつきが見られる。
【００８９】
ＩｇＧリンスの代わりに、ＢＳＡタンパク質の繰返しリンスあるいは単なる純水の繰返しリンスを同じ手順で用いた場合にも、表１０に報告した結果と同様な結果が得られた。
【００９０】
実施例１１
過剰タンパク質の存在における被膜の安定性
本実施例は、ＨＬＢ数が小さい非イオン性界面活性剤で被覆した疎水性表面の低結合特性が大量のタンパク質にさらしても破壊されないことを示す。
【００９１】
本実施例では以下の手順を用いた。材料及び方法の項で述べたようにして、イソプロパノールに０．１０（比重量）％のモノオレイン酸ソルビトールを加えた溶液の２５μｌのアリコートを用いて２４−ウェル・ポリスチレン滴定板を被覆した。前記モノオレイン酸ソルビトールの被覆量の計算値は１０μｇ／ｃｍ2であった。前記滴定板の各ウェルを、ＢＳＡタンパク質（ピアース社）を２ｍｇ／ｍｌで含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）１．０ｍｌにさらした。滴定板を室温で３０分間揺動台上に定温放置した後、前記ウェルを空にした。前記タンパク質暴露過程を全６回繰り返した。次いで前記滴定板を純水で３回リンスし、コロイド状金染色法で一晩染色した。次いで滴定板を純水でリンスし、乾燥した後、各ウェルについてケンブリッジ・テクノロジーズ・プレート・リーダーを用いて波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９２】
表１１に示すように、大量の過剰タンパク質が存在しても、（ファン・デル・ワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）力によってのみタンパク質を物理的に吸着し、保持すると考えられる）前記低結合性被膜の耐久性は維持されていた。
【００９３】
プルロニックＬ−１２１及びＬ−１２２を用いて同様の実験を行い、同様の低タンパク質結合の結果を得た。
【００９４】
実施例１２
毒性
低結合性表面を効果的につくることに加えて、非イオン性界面活性剤は一般に毒性が低い。
【００９５】
表１２は種々の非イオン性界面活性剤のＬＤ50（半数致死量）値（グラム／Ｋｇ：クマネズミについて）を示す。比較のために、鉱油、ＮａＣｌ（食塩）、及びＡｓ2Ｏ3のＬＤ50値も本表に含めてある。本データから非イオン性界面活性剤の低毒性は明らかである。
【００９６】
ＭＤＣＫ細胞を用いて細胞毒性の実験を行った。試験した非イオン性界面活性剤はプルロニックＬ−１２１，Ｌ−１２２；並びにスパン（Ｓｐａｎ）８０及び８５；並びにブリー（Ｂｒｉｊ）３０，７２及び９３とした。前記分子を０．１（比重量）％イソプロパノール溶液として２４−ウェル滴定板（コーニング・コスター２５８２０番）に被覆した。非処理のポリスチレン及び通常の組織培養処理をしたポリスチレン２４−ウェル滴定板（コーニング・コスター２５８２０番）を対照標準として用いた。全滴定板にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％含有するＤＭＥＭ完全培地をウェルあたり２ｍｌ入れて、３７℃で４８時間定温放置した。本定温放置は、ありうるいかなる毒性化合物をも前記被覆表面から細胞成長血清中に抜き出すために行った。次いで前記ＦＢＳ溶液を組織培養処理したポリスチレンに移し、各ウェルにウェルあたり約２×１０4個のＭＤＣＫ細胞を接種し、次いで３７℃でＣＯ2５％雰囲気中、７２時間定温放置した。次いで細胞をグラム・クリスタルバイオレット（Ｇｒａｍ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ）で染色した。全てのウェルに、正常な細胞形態をもった融合性細胞成長が生じていた。
【００９７】
実施例１３
酵素活性低下の軽減
本実施例は、非イオン性界面活性剤で被覆した容器に保管された酵素は、非被覆の容器内に保管された場合よりも活性低下が小さいことを示す。本実験にはコーニング・コスター社の中結合性（２５８７番）及び高結合性（２５８１番）ポリスチレン微小滴定板を用いた。材料及び方法の項で述べた手法を用いて、中結合性滴定板をモノオレイン酸ソルビトール及びＰＥＯ（２）（ポリ酸化エチレン（２））モノオレイン酸で被覆した；詳しくは、使用前に前記界面活性剤の０．１（比重量）％イソプロパノール溶液で被覆し、続いて２４時間乾燥した。
【００９８】
ワサビダイコン過酸化酵素（ＨＲＰ）はシグマ社から購入した。０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）にＨＲＰを２０ｎｇ／ｍｌ加えた溶液を用意した。被覆した滴定板、非被覆中結合性滴定板、及び非被覆高結合性滴定板の８−ウェル分割滴定板の６つのウェルに０．１ｍｌのアリコートを入れた。
【００９９】
ある試料は定温放置せず、ある試料は９０分間予備定温放置した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）過酸化基質系（キルケガード・アンド・ペリー社）を各ウェルに加え、波長４０５ｎｍの吸光度の時間変化をケンブリッジ・テクノロジーズ・マイクロプレート・リーダー７５２０番を用いて測定した。
【０１００】
結果は以下の通りであった：
（１）予備定温放置していない試料に前記ＴＭＢ溶液を加えると、４種類の表面（すなわち２種の界面活性剤被覆表面、非被覆中結合性表面、及び非被覆高結合性表面）の全てにおいて酵素活性は実験誤差の範囲内で同等であった。
【０１０１】
（２）９０分間の定温放置を行った非被覆の高結合性及び中結合性滴定板では、酵素活性がそれぞれ約６０％及び約９０％低下した。
【０１０２】
（３）９０分間の定温放置を行った被覆滴定板のいずれにおいても活性低下は実質的にゼロであった。
【０１０３】
ポリスチレン滴定板の代わりにポリプロピレン滴定板を用いた場合にも同様の結果が見られた。
【０１０４】
本実験は全液検定であり、見られた効果はタンパク質（酵素）の物理的な直接損失ではなく、むしろ生物学的活性の低下であることに注意しなければならない。
【０１０５】
実施例１４
本実施例は、本発明の非イオン性界面活性剤を用いた低結合性表面を有する半透膜の作成を説明する。
【０１０６】
本実験は０．４５ミクロンＰＶＤＦ半透膜を用いて行った。前記半透膜を以下の非イオン性界面活性剤の０．１（比重量）％イソプロパノール溶液に２回浸漬することにより被覆した：モノオレイン酸ソルビトール、プルロニック（登録商標）Ｌ−１２１、プルロニック（登録商標）Ｌ−１２２、及びプルロニック（登録商標）Ｐ−１２３。前記２回の浸漬被覆のそれぞれの後で前記半透膜を室温乾燥した。前記被覆半透膜を、ＩｇＧを１０μｇ／ｍｌで含む０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）とともに軌道運動振盪機で室温３５分間、低温放置した。次いで前記半透膜を清浄な板の上で３回水洗した。前記水洗は前記振盪機上でそれぞれ５分間行った。続いて、やはり振盪機上で前記半透膜を金で一晩染色した。非被覆ＰＶＤＦ半透膜を対照標準に用いた。
【０１０７】
プルロニック（登録商標）界面活性剤被覆にはタンパク質結合は実質的に見られなかった。モノオレイン酸ソルビトール界面活性剤被覆は、非被覆ＰＶＤＦと同等レベルのタンパク質結合を示すことがわかった。いかなる特定の動作理論に束縛されるつもりはないが、モノオレイン酸ソルビトールで得られた結果は、この分子の親水性末端の長さが短い（すなわちほぼ５Å）であることに関係していると考えられる。比較のために示すと、プルロニック（登録商標）Ｌ−１２１、プルロニック（登録商標）Ｌ−１２２、及びプルロニック（登録商標）Ｐ−１２３界面活性剤のは親水性末端の長さは、それぞれほぼ１６，３６，及び６１Åである。
【０１０８】
細孔寸法がより小さく、従って表面積がより大きな半透膜を被覆する場合には、本発明の他の用途に比べて、低結合性表面の形成に、界面活性剤の親水性末端の長さがより重要な役割を果たしていると考えられる。
【０１０９】
実施例１５
被覆成形
本発明の被覆成形態様を２４−ウェル・ポリスチレン滴定板の成形により試験した。モノオレイン酸ソルビトールのイソプロパノール溶液を、非イオン性界面活性剤として濃度０．０１（比重量）％及び０．１（比重量）％で用いた。濃度０．０１％の溶液は完成品上に１分子層より薄い界面活性剤被膜をつくると推定され、一方濃度０．１％の溶液は約７分子層の被膜をつくると推定された。前記界面活性剤を、金型を一様に被覆するに十分な微細液滴の噴霧をつくる、クラウン（Ｃｒｏｗｎ）吹付機（米国イリノイ州ヘブロン（Ｈｅｂｒｏｎ）のクラウン・インダストリアル・プロダクツ（Ｃｒｏｗｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）社，カタログ番号８０１１）を用いて、前記界面活性剤を金型に塗布した。成形品のそれぞれをつくる前に前記金型に吹付けた。
【０１１０】
０．１％溶液では、得られた完成品は欠陥がなく、ＩｇＧタンパク質及びコロイド状金染色による試験で実質的にタンパク質結合がないことを示した。濃度が０．０１％の場合は、凝集領域及びタンパク質が結合した欠損領域が見られた。
【０１１１】
０．１％を越える濃度、すなわち２％までの範囲の濃度でも試験を行い、うまく作用することがわかった。
【０１１２】
モノステアリン酸グリセロールの１％イソプロパノール溶液を用いて、同様の実験を行った。成形品はやはり低タンパク質結合を示した。しかし、１５〜２５％の曇りが見られ、この曇りにより前記成形品は非被覆成形品（曇り：３〜５％）より透明度が下がった。一方、トリステアリン酸ソルビトールの０．０１％イソプロパノール溶液による被覆の場合は、成形品の曇りは非被覆成形品と同等レベル、すなわち３〜５％であった。モノステアリン酸エチレングリコール１％溶液及びトリオレイン酸ソルビトール１％溶液の場合にも、同様に曇りの少ない、すなわち曇りが３〜５％という結果が得られた。モノステアリン酸グリセロール１％溶液の場合に見られた曇りは、使用した吹付機が界面活性剤で金型を完全に被覆するに十分な微細液滴の噴霧をつくれなかったためと考えられる。
【０１１３】
被覆金型プロセスで用いた界面活性剤で被覆したポリスチレンの試験片も、タンパク質結合の低減を示した。
【０１１４】
実施例１６
ポリマー配合
非イオン性界面活性剤を含有する配合物から成形したポリマー表面の結合効果を示すために、数種の低結合性分子と母材ポリマーを配合し、続いて成形した。２軸スクリュー押出機を用いて基材ポリマーに低結合性非イオン性界面活性剤分子を（表１３に特記した例を除き）５％配合し、次いで射出成形して３５ｍｍ径のシャーレ形状にした。ＢＳＡ及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を試験タンパク質とした。タンパク質結合は上述のコロイド状金染色法を用いて測定した。ポリプロピレンとＥＶＡの配合の場合は、銀増感剤（米国ミズリー州セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ））のシグマ・ケミカル社、キット番号ＳＥ−１００）を用いた。
【０１１５】
必要な低ＨＬＢ数（≦１０）をもつ非イオン性界面活性剤のいずれもが各基材ポリマー表面に移って顕著な非結合効果をつくりだすことができたとは限らなかったが、本実施例では、十分な数の配合物で多くの低ＨＬＢ非イオン性界面活性剤が前記ポリマー表面に実際に吹出していることを表わす所望の非結合性を示すことがわかった。必要なＨＬＢ数を有する分子の中に、何種かのポリマーで、他の分子は表面に吹出すにも関わらず、吹出さない分子があることの理由は、完全にはわかっていない。しかし、本発明の本実施の形態を実施する上で上記の理由がわかっている必要はない。
【０１１６】
本配合に用いた基材すなわち母材ポリマーは、エチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスチレンーブタジエン共重合体、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリアミド及びその共重合体、ポリウレタン、ポリエステル及びその共重合体、並びにフルオロポリマー類を含む群から選んだ。
【０１１７】
表１３に示すように、モノオレイン酸ソルビトール（ＨＬＢ＝４．３），ＰＥＯステアリルアルコール（ＨＬＢ＝４．７）及びＰＥＯオレイルアルコール（ＨＬＢ＝４．９）のようなＨＬＢ数が１０より小さい非イオン性界面活性剤では、ポリプロピレンまたはＥＶＡにおいて、検出可能なＢＳＡまたはＦＢＳタンパク質結合はないという結果を得た。対照的に、配合内に界面活性剤をもたない基材ポリマーには容易にタンパク質が結合した。さらに、ＨＬＢ数が１０より大きい界面活性剤を配合した場合はかなりのタンパク質結合が見られ、ある場合には、前記基材ポリマーのみの場合よりもタンパク質結合が多くなっていた。
【０１１８】
前記配合物は、ライスツリッツ（Ｌｅｉｓｔｒｉｔｚ）３４−ｍｍ２軸スクリュー押出機で、区分温度を２００〜２４０℃に設定し、供給量を１時間あたり１０〜５０ポンドとして混合した。前記配合物の３５ｍｍ径シャーレへの射出成形は、バッテンフェルド（Ｂａｔｔｅｎｆｅｌｄ）２５トン成形機で、区分温度を２００〜２５０℃に設定して行った。
【０１１９】
本発明の望ましいあるいはその他の実施の形態を本明細書に述べたが、以下の請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することのないさらなる実施の形態があることは、当業者にとって当然である。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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