(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ｘ−Ｙ−Ｚ［式中、Ｘは天然又は非天然のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；Ｙは−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、もしくはこれらの基の任意の組み合わせからなる連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式（Ｉ´）：
【化１】
0004676654.tif 000032
（式中、Ｒ1は下記の２価の基を示し：
【化２】
0004676654.tif 000033
Ｒ2は下記の置換アルキル基を示し：
【化３】
0004676654.tif 000034
Ｒ3、及びＲ4はメチル基を示し；Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、及びＶ6は水素原子又は無置換の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、ハロゲン原子、メチルオキシ基及びメチルチオ基からなる群より選択される置換基を示し；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7は無置換のメチン基を示し；Ｗは酸素原子、硫黄原子、又は−Ｃ(ＣＨ3)(ＣＨ3)を示し；Ｑは窒素原子を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１を示す）で表される１価の基、下記の一般式（II´）：
【化４】
0004676654.tif 000035
（式中、Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは上記定義と同義であり；Ｖ8は水素原子又は炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、ハロゲン原子、メチルオキシ基及びメチルチオ基からなる群より選択される置換基を示す）で表される１価の基、又は下記の一般式（III´）：
【化５】
0004676654.tif 000036
（式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは上記定義と同義である）で表される１価の基である］で表される蛍光ヌクレオチド。
【請求項２】
Ｚが一般式（I´）で表される１価の基である請求項１に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項３】
Ｚが一般式（II´）で表される１価の基である請求項１に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項４】
Ｖ1、及びＶ3が水素原子であり、Ｗが−Ｃ(ＣＨ3)(ＣＨ3)である請求項３に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項５】
Ｘが（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）からなる群から選ばれるヌクレオチド、；及び（２）上記の（１）に記載のヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチドの残基である請求項１から４のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項６】
Ｙがアミノアリル基である請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチド。
【請求項７】
核酸合成酵素、鋳型核酸、及び請求項１から６のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチドを用いて核酸合成反応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の製造方法。
【請求項８】
核酸合成反応が逆転写反応、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ法、及びニックトランスレーション法からなる群から選ばれる１又は２以上の反応である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブ又はプライマー。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸プローブ又はプライマーからなる核酸検出用試薬。
【請求項１１】
病気の診断に用いるための請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
核酸検出用キットであって、（１）請求項１から６のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含むキット。
【請求項１３】
下記の一般式（Ｉ）：
【化６】
0004676654.tif 000037
（式中、Ｒ1は下記いずれかの置換アルキル基を示し：
【化７】
0004676654.tif 000038
Ｒ2は下記の置換アルキル基を示し：
【化８】
0004676654.tif 000039
Ｒ3、及びＲ4はメチル基を示し；Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、及びＶ6は水素原子又は無置換の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、ハロゲン原子、メチルオキシ基及びメチルチオ基からなる群より選択される置換基を示し；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7は無置換のメチン基を示し；Ｗは酸素原子、硫黄原子、又は−Ｃ(ＣＨ3)(ＣＨ3)を示し；Ｑは窒素原子を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１を示す）で表されるアザメチン色素。
【請求項１４】
下記の一般式（II）：
【化９】
0004676654.tif 000040
（式中、Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは請求項１３に記載の定義と同義であり；Ｖ8は水素原子又は炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、ハロゲン原子、メチルオキシ基及びメチルチオ基からなる群より選択される置換基を示す）で表されるアザメチン色素。
【請求項１５】
下記の一般式（III）：
【化１０】
0004676654.tif 000041
（式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは請求項１３に記載の定義と同義である）で表されるアザメチン色素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光標識試薬として有用なアザメチン化合物及びそれを含む蛍光ヌクレオチド並びにその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
相同核酸配列の検出のために最も多く用いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成である。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさせる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、その２本鎖をプローブの標識により検出する。
【０００３】
従来より核酸をプローブとして用いる場合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの有無はオートラジオグラフィーにより検出されていた。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープを利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有するため、一定期間しか用いることができないという問題点もあった。
【０００４】
上記理由から、より簡便な方法として非放射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プローブをビオチン分子（欧州特許第６３８７９号明細書）又はジゴキシゲニン分子（欧州特許公開第３２４４７４Ａ１号）を用いて標識する方法が知られている。標識核酸プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼーションを行った後、形成された２本鎖核酸の中にはビオチン分子又はジゴキシゲニン分子が存在する。ハイブリダイゼーション後、これらに対して（ストレプト）アビジン−マーカー酵素複合体又はジゴキシゲニンへの抗ジゴキシゲニン抗体−マーカー酵素複合体を結合することによって、プローブがハイブリダイゼーションした核酸を検出することができる。しかしながら、このような酵素を用いた検出法は、感度や特異性の面で十分なものではなかった。
【０００５】
また、上記方法以外にも、蛍光色素で標的物質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試薬に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率を有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていることなどが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えばブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
【０００６】
分子吸光係数の高い色素としては、例えば米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journal of Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載されたバルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知られているが、これらは水に溶けにくく、また溶解しても加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の分子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生じ、そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。また、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されているシアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を導入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑制した優れた色素であるが、蛍光量子収率が充分に高いとは言えず、またスルホン酸基の導入により色素の合成が困難になるという問題点があった。このような状況から、蛍光が強い特性に加えて、水溶性が高く安定で凝集による蛍光消光が起こらない蛍光色素の開発が求められていた。
【０００７】
蛍光が強いその他の色素骨格として、英国特許第８７０，７５３号明細書に記載されたアザインドレニンシアニン色素の例があるが、該特許には水溶性、凝集性、水溶液安定性等、蛍光標識試薬に必須の特性に関する記載が無く、さらには標的物質と共有結合を生じさせる反応性置換基を導入した例も記載されていないことから、このアザインドレニンシアニン色素の蛍光標識試薬としての適性は全く未知であった。また、特開平４−３５８１４３号公報、同３−１３５５５３号公報、同１−２８０７５０号公報、欧州特許第３４１９５８号公報には、アザインドレニンシアニンを写真用途に適用した例が示されているが、これらはアザインドレニンシアニンの吸収特性を利用したものであり、発光特性に着目してそれらを積極的に利用したものではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、核酸の標識のために有用な新規な蛍光ヌクレオチドを提供することにあり、より具体的には、上記の従来技術の問題点を回避可能な蛍光ヌクレオチドを提供することを課題としている。本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、蛍光標識試薬として最近開発されたアザアメチン化合物を用いてヌクレオチドとの複合体を形成し、その複合体を用いて核酸を標識及び検出すると、核酸への取り込み率及び検出の際の蛍光強度が優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、式：Ｘ−Ｙ−Ｚ
［式中、Ｘは天然又は非天然のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式（Ｉ）：
【化４】
0004676654.tif 000002
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4はそれぞれ独立に置換もしくは無置換のアルキル基を示し、Ｒ3及びＲ4は互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよく；Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、及びＶ6は水素原子又は置換基を示し、Ｖ1とＶ2、Ｖ2とＶ3、Ｖ4とＶ5、及び／又はＶ5とＶ6は互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよく；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を示し；Ｗは酸素原子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は−Ｎ(Ｒ5)−、（Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基を示す）を示し；Ｑは窒素原子又は−Ｃ(Ｖ7)−（Ｖ7は水素原子又は一価の置換基を示し、Ｖ6と互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で表される化合物；
下記の一般式（II）：
【化５】
0004676654.tif 000003
（式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは上記定義と同義であり；Ｖ8は水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｗが−Ｎ(Ｒ5)−又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−の場合にはＶ8はＷ上の置換基と連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい）で表される化合物；又は
下記の一般式（III）：
【化６】
0004676654.tif 000004
（式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは上記定義と同義であり；Ｅは窒素原子又は−Ｃ(Ｒ6)＝（Ｒ6は水素原子又は一価の置換基を示す）を示し；Ｖ9は水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｖ9はＲ6と連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい）で表される化合物
から誘導される１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表される蛍光ヌクレオチドを提供するものである。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがＹ中の活性エステル基（該活性エステル基はアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオール基と共有結合し得る）で置換されたアルキル基である上記の蛍光ヌクレオチド；Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがＹ中のカルボキシル基で置換されたアルキル基である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＸがヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基である上記の蛍光ヌクレオチドが提供される。
【００１１】
より好ましい態様によれば、Ｘが
（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）からなる群から選ばれるヌクレオチド、
（２）上記の（１）に記載のヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチド；及び
（３）上記の（１）及び（２）に記載のヌクレオチドから誘導されるヌクレオチド誘導体
からなる群から選ばれるヌクレオチド又はその誘導体の残基である上記の蛍光ヌクレオチド；Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、又はこれらの基の任意の組み合わせからなるなる連結基（該連結基上の水素原子は他の置換基で置換されていてもよい）である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＹがアミノアリル基である上記の蛍光ヌクレオチドが提供される。
【００１２】
別の観点からは、核酸合成酵素、鋳型核酸、及び上記の蛍光ヌクレオチドを用いて核酸合成反応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の製造方法が本発明により提供される。この方法の好ましい態様によれば、核酸合成反応が逆転写反応、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ法、及びニックトランスレーション法からなる群から選ばれる１又は２以上の反応である上記の方法が提供される。
【００１３】
さらに別の観点からは、上記の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブ又はプライマー；上記の核酸プローブ又はプライマーからなる核酸検出用試薬；病気の診断に用いるための上記の核酸検出用試薬；及び核酸検出用キットであって、（１）上記の蛍光ヌクレオチド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含むキットが提供される。
【００１４】
また、本発明により、上記の一般式（Ｉ）で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は酸素原子である上記アザメチン色素、およびＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−であり、Ｙが窒素原子である上記アザメチン色素）；上記の一般式（II）で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は硫黄原子である上記アザメチン色素）；及び上記の一般式（III）で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが酸素原子である上記アザメチン色素）が提供される。また、一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるアザメチン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つが被標識化合物と共有結合し得る反応性基で置換されたアルキル基であるアザメチン色素；一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるアザメチン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つが活性エステル基（該活性エステル基は被標識化合物中のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と共有結合し得る）で置換されたアルキル基である上記のアザメチン色素；及び、一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるアザメチン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがカルボキシル基で置換されたアルキル基である上記のアザメチン色素が提供される。
【００１５】
さらに、上記の蛍光ヌクレオチドの製造のための上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（III）で表される化合物の使用；上記の核酸プローブ又はプライマーの製造のための上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（III）で表される化合物の使用；上記の核酸検出用試薬の製造のための上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（III）で表される化合物の使用；及び病気の診断方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から採取された生体試料に上記の核酸検出用試薬を接触させる工程を含む方法が本発明により提供される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
Ｘが示す天然又は非天然のヌクレオチドとしては、例えば、（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）で表されるヌクレオチド、（２）前記ヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオチド、及び前記ヌクレオチドに対応するジデオキシヌクレオチド、並びに（３）前記（１）及び（２）に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導体などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。天然又は非天然のヌクレオチドの具体例としては、例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ、又はこれらの誘導体などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
オリゴヌクレオチドとしては、例えば、上記のヌクレオチド又はその誘導体が１から５０個程度、好ましくは１から３０個程度、さらに好ましくは１から２０個程度重合したオリゴヌクレオチドを挙げることができ、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも相違していてもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチド又はその誘導体が多数重合した重合体であり、その大きさ（長さ）は特に限定されないが、例えば塩基数として数ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細書で用いる蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が上記したようなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドである場合の全てを包含し、最も広義に解釈しなければならない。
【００１８】
Ｘはヌクレオチド残基中の塩基部分でＹと結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成分と結合する９位以外であれば特に制限されない。例えば、プリン塩基がアデニンの場合には２位又は８位で結合することができ、あるいは６位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができる。プリン塩基がグアニンの場合には１位又は８位で結合することができ、あるいは２位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができる。ピリミジン塩基中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成分と結合する１位以外であれば特に限定されない。例えばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位又は６位で結合することができ、あるいは４位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができ、ピリミジン塩基がチミンの場合には３位又は６位で結合することができ、あるいは５位に存在するメチル基で連結基Ｙと結合することができる。また、ピリミジン塩基がウラシルの場合には３位、５位又は６位で連結基Ｙと結合することができる。
【００１９】
上記式中、Ｙは２価の連結基又は単結合を示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの性質、例えば蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定性、水溶性、核酸への取込み率、又は蛍光強度などに大きな影響をもたらさない限り、特に限定されない。当業者はＸで表されるヌクレオチド部分とＺで表される蛍光化合物部分とを連結するために適した２価の連結基を適宜選択することができる。連結基Ｙとしては、例えば、−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−又はこれらの組み合わせからなる連結基を挙げることができ、これらの連結基上の１個又は２個以上の水素原子は他の置換基で置換されていてもよい。連結基の主鎖の炭素数は特に限定されないが、一般的には１から５０、好ましくは１から２０、より好ましくは１から１０、特に好ましくは１から５程度である。
【００２０】
Ｚは上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（III）で表されるアザメチン色素から誘導される１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する。
【００２１】
一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）において、Ｒ1及びＲ2は互いに同一でも異なっていてもよく、好ましくは炭素原子数が１から２０のアルキル基を示す。アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい（本明細書において、他のアルキル基、又はアルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分についても同様である）。例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、ブチル基、シクロヘキシル基などを挙げることができる。上記のアルキル基は任意の位置に置換基を有していてもよい。アルキル基上の置換基は特に制限はないが、色素を抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、DNAフラグメント、RNAフラグメント、誘導DNAフラグメント、誘導RNAフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然から合成脂質、合成薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒子、重合体膜等を含む物質上に共有結合、イオン結合、水素結合等により標識するための反応性置換基が導入されていることが好ましい。
【００２２】
反応性置換基の種類は特に限定されないが、例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジニル基等である。その他の置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、炭素原子数が１から８程度のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６から２０程度のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基など）、炭素原子数が２から１０程度のアルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、炭素原子数６から２０程度のアリーロキシカルボニル基（例えば、フェノキシカルボニル基など）、炭素原子数が２から１０程度のアシル基（例えば、アセチル基、ピバロイル基など）、炭素原子数が２から８程度のアシルオキシ基（例えば、アセチルオキシ基、ベンゾイルオキシ基など）、炭素原子数が２から８程度のアシルアミノ基（例えば、アセチルアミノ基など）、炭素原子数１から８程度のスルホニル基（例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基など）、炭素原子数が１から２０程度のスルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル基、エタンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基など）、炭素原子数が１から８程度のスルホニルアミノ基（例えば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数が１から１０程度のカルバモイル基（例えば、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイル基など）、炭素原子数が１から２０程度の置換アミノ基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベンジルアミノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基など）、
【００２３】
炭素数２から１０程度のスルファモイル基（例えば、メチルスルファモイル基、エチルスルファモイル基、ピペリジノスルファモイル基など）、炭素原子数が０から１５程度のアンモニウム基（例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基など）、炭素原子数が０から１５程度のヒドラジノ基（例えば、トリメチルヒドラジノ基など）、炭素原子数が１から１５程度のウレイド基（例えば、ウレイド基、N,N-ジメチルウレイド基など）、炭素原子数が１から１５程度のイミド基（例えば、スクシンイミド基など）、炭素原子数が１から２０程度のアルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６から２０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチルフェニルチオ基、p-クロロフェニルチオ基、２−ピリジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素原子数が１から２０程度の置換又は無置換のヘテロ環基（例えば、ピリジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、フリル基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−ピラジル基など）、炭素原子数が２から１８程度の不飽和炭化水素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘキセニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、炭素原子数が６から２０程度のアリール基（例えば、フェニル基、４−スルホフェニル基、２，５−ジスルホフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナフチル基など）、炭素原子数が１から２０程度のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙げられる。
【００２４】
Ｒ1及びＲ2として、カルボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原子数１から１０のアルキル基が好ましく、さらに好ましくはカルボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原子数１から６のアルキル基、あるいはスルホ基、カルボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、又はマレイミジル基が置換した炭素原子数７から２０のアリールアルキル基である。
【００２５】
一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）において、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は好ましくは炭素原子数が１から２０のアルキル基であり、アルキル基上の任意の位置にＲ1及びＲ2で例示した置換基を有していてもよい。また、Ｒ3とＲ4は互いに連結して飽和の炭素環を形成してもよい。Ｒ3、Ｒ4及びＲ5としては炭素原子数1から６のアルキル基が好ましく、さらに好ましくは炭素原子数１から３のアルキル基である。
【００２６】
一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）中のＶ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9は同一又は異なって水素原子又は一価の置換基を表わす。 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9で表わされる置換基は特に制限はないが、Ｒ1及びＲ2でアルキル基上の置換基として例示したものが挙げられる。
【００２７】
Ｖ1とＶ2、Ｖ2とＶ3、Ｖ4とＶ5、Ｖ5とＶ6、及び／又はＶ6とＶ7はそれぞれ互いに連結して、例えば５員、６員又は７員の飽和又は不飽和の環を形成してもよい。上記の不飽和環は酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子等の任意のヘテロ原子を１個又は２個以上含んでいてもよい。形成される環の任意の位置には、Ｒ1及びＲ2でアルキル基上の置換基として例示した置換基（以下、この置換基を「例示置換基」と呼ぶ。）が１個又は２個以上置換していてもよい。
【００２８】
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9としては、炭素数１から６のアルキル基（該アルキル基上の任意の位置に例示置換基が１個又は２個以上存在していてもよい）、炭素数６から２０のアリール基（アリール基上の任意の位置に例示置換基が１個又は２個以上存在していてもよい）、ハロゲン原子、炭素数１から１０のチオアルキル基、炭素数１から１０のアルキルスルホン基、ホスホン酸基、カルボキシル基、炭素数1から１０のアルコキシ基、シアノ基、置換アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジニル基を挙げることができる。さらに好ましくは、ハロゲン原子、カルボキシル基、ホスホン酸基のほか、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、又はホスホン酸基が置換した炭素数６から２０のアリール基、カルボキシル基又はスルホ基が置換した炭素数１から１０のアルコキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基、又はホスホン酸基が置換した炭素数１から１０のアルキルチオ基を挙げることができる。
【００２９】
一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）中のＬ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を表わす。置換基としては例えば、置換又は無置換の炭素原子数１から１５、好ましくは炭素原子数１から１０、特に好ましくは炭素原子数１から５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、カルボキシエチル基など）、置換又は無置換の炭素原子数６から３０、好ましくは炭素原子数６から２０、さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール基（例えば、フェニル基、o-カルボキシフェニル基など）、置換又は無置換の炭素原子数３から２０、好ましくは炭素原子数４から１５、さらに好ましくは炭素原子数６から１０の複素環基（例えば、N,N−ジメチルバルビツール酸基など）、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素など）、炭素原子数１から２０、好ましくは１から１５、さらに好ましくは１から１０のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、炭素原子数０から２０、好ましくは炭素原子数２から１５、さらに好ましくは炭素原子数４から１５のアミノ基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、N-メチル-N-フェニルアミノ基、N-メチルピペラジノ基など）、炭素原子数１から１５、好ましくは炭素原子数１から１０、さらに好ましくは炭素数１から８のアルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６から２０、好ましくは炭素原子数６から１８、さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチルチオ基など）等が挙げられる。ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に０又は１を示す。ｓが０であり、ｔ及びｕが１である場合、又はｓ及びｔが０であり、ｕが１である場合が好ましい。
【００３０】
Ｍは対イオンを表わす。Ｍは陽イオンでも陰イオンでもよく、陽イオンとしてはナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジニウムイオンなどの有機イオンが挙げられる。陰イオンは無機陰イオンあるいは有機陰イオンのいずれであってもよく、ハロゲン陰イオン（例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど）、置換アリールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸イオン、p-クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、アリールジスルホン酸イオン（例えば、1,3-ベンゼンジスルホン酸イオン、1,5-ナフタレンジスルホン酸イオンなど）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオンなど）、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンなどが挙げられる。また、Ｍは水素イオンでもよい。陽イオンとして、好ましくはアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホン酸イオンを挙げることができ、さらに好ましくはアルカリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホン酸イオンを挙げることができる。ｍは分子の電荷を中和するのに必要な数を表わす。
【００３１】
一般式（Ｉ）において、Ｗとしては酸素原子、硫黄原子、又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素原子及び−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−がさらに好ましい。一般式（II）において、Ｗとしては硫黄原子又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−がさらに好ましい。一般式（III）において、Ｗとしては酸素原子又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素原子がより好ましい。一般式（III）におけるＥは窒素原子又は−Ｃ(Ｒ6)＝を表し、Ｒ6は水素原子又は置換基を示す。Ｒ6で表される置換基としては上記の「例示置換基」が挙げられる。Ｒ6はＶ9と連結して飽和又は不飽和の環を形成している場合が好ましい。さらに好ましくは、下記一般式（IV）に示したごとく、ベンゾイソオキサゾール環を形成する場合である。
【００３２】
【化７】
0004676654.tif 000005
（Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは上記定義と同義であり、Ｖ11、Ｖ12、Ｖ13、Ｖ14としてはＶ1からＶ9について例示したものが挙げられ、好ましい態様もＶ1からＶ9と同様である。）
【００３３】
一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一般式（III）で表される化合物は置換基の種類に応じて１以上の不斉炭素を有する場合があるが、光学異性体やジアステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の混合物、ラセミ体などのいずれの場合も本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一般式（III）で表される化合物は水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３４】
上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一般式（III）で表される化合物の好ましい例を以下に示すが、本発明の範囲は下記の具体的化合物によって限定されることはない。
【００３５】
【化８】
0004676654.tif 000006
【００３６】
【化９】
0004676654.tif 000007
【００３７】
【化１０】
0004676654.tif 000008
【００３８】
【化１１】
0004676654.tif 000009
【００３９】
【化１２】
0004676654.tif 000010
【００４０】
【化１３】
0004676654.tif 000011
【００４１】
【化１４】
0004676654.tif 000012
【００４２】
【化１５】
0004676654.tif 000013
【００４３】
【化１６】
0004676654.tif 000014
【００４４】
【化１７】
0004676654.tif 000015
【００４５】
【化１８】
0004676654.tif 000016
【００４６】
本明細書の実施例に代表的化合物の製造方法を具体的に示したので、当業者は下記の実施例の具体的説明を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬などを適宜選択し、必要に応じて実施例に記載した方法に修飾ないし改変を加えることによって、上記一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）に包含される任意の化合物を製造することが可能である。もっとも、上記一般式Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物の製造方法は特に限定されず、いかなる方法により製造したものも本発明で使用できることは言うまでもない。
【００４７】
上記一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物は、本発明の蛍光ヌクレオチドにおいて蛍光標識成分として使用される。ヌクレオチドに一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物を蛍光標識として導入するための手法は種々知られており、当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用することが可能である。例えば、ヌクレオチド中のアミノ基、水酸基などの官能基と一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物中のカルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換基をイオン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、あるいはヌクレオチドの一部に連結基を導入するなどの化学修飾を行った後に一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）の化合物を反応させればよい。反応後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロマトグラフィー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術により精製することができる。
【００４８】
本発明はさらに、本発明の蛍光ヌクレオチドの利用にも関する。すなわち、本発明の蛍光ヌクレオチドは核酸の検出のために利用することができる。本発明の蛍光ヌクレオチドを核酸の検出などのＤＮＡ解析に用いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ruth, DNA, 3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライマーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることができる。すなわち、本発明により、核酸合成酵素と鋳型核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の調製方法が提供される。
【００４９】
本発明の方法において用いられる核酸合成酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵素、TaqＤＮＡポリメラーゼなど任意のＤＮＡポリメラーゼを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はターミナルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。鋳型核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。天然由来のＤＮＡ又はＲＮＡのほか、組み換えＤＮＡ又はＲＮＡあるいは化学合成ＤＮＡ又はＲＮＡなどの非天然型ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい（本明細書において「核酸」と言う場合にも同様である）。核酸合成反応は、例えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチド混合物、本発明の蛍光ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を用いて、酵素反応に適した条件下（塩濃度、ｐＨ、温度などの条件を含む）において行うことができる。このような核酸合成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じて、使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択することができる。
【００５０】
本発明の蛍光ヌクレオチドを用いて種々の手段により核酸を標識することができる。ランダムプライム法はＤＮＡを標識するための一つ方法であり、任意の組み合わせのヘキサヌクレオチド配列の混合物をプライマー（ランダムプライマー）として使用し、このランダムプライマーを標識すべき核酸にハイブリダイゼーションさせる工程を含む。このランダムプライマーの3'-OH末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKlenow酵素などのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼを用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラーゼの基質である４種のデオキシリボヌクレオチドが相補鎖中に挿入される。これらのデオキシリボヌクレオチドの少なくとも１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることにより、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的ＤＮＡが合成される。
【００５１】
ランダムプライマーの代わりに、特異的配列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いることができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合成は特異的プライマーの3'-OH末端から開始される。ランダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡが合成される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれることにより、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成される。
【００５２】
ニックトランスレーション法は、ＤＮアーゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。ＤＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌクレオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシドを切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個を遊離している3'-OH末端の隣接に挿入する。この過程を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動していく。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオチドを含めることによって、ニックトランスレーション法を用いて蛍光ＤＮＡを合成することができる。
【００５３】
２本鎖又は１本鎖ＤＮＡの３’末端を標識する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを3'-OH末端に結合する酵素であるターミナルトランスフェラーゼを用いることができる。ターミナルトランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要とする。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトランスフェラーゼの基質として用いることによって、3'-OH末端で伸長された蛍光標識核酸を合成することができる。
【００５４】
逆転写反応法は１本鎖ＲＮＡから相補的ＤＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオリゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分にアニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプライマーの3'-OH末端から出発して合成される。このＤＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチドが酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチドをその中に添加しておくことによって逆転写反応中に蛍光ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、蛍光標識ＤＮＡが合成される。
【００５５】
ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素を用いて、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを挙げることができる。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又はＴ７プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合成のための酵素であり、基質としての４種類のリボヌクレオチドが使用される。基質の一つとして本発明の蛍光ヌクレオチドを使用することによって、蛍光標識されたＲＮＡを合成することができる。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸を合成することもできる。ＰＣＲでは、生物試料中の検出すべき核酸は１本鎖に変性され、２種のプライマーがこの一本鎖核酸にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラーゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)及び酵素基質としてのデオキシリボヌクレオチドにより伸長反応を行う。プライマーの3'-OH末端から出発して相補的ＤＮＡが合成され、二本鎖ＤＮＡが形成される。この工程を繰り返すことにより、試料中に含まれる検出すべきＤＮＡを増幅することができる。TaqＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の際に、基質の一つとして本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識された増幅核酸が得られる。
【００５７】
上記のようにして調製された、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度を測定することにより容易に検出することができる。
【００５８】
本発明の蛍光ヌクレオチドは遺伝子プローブの標識のために用いることができ、該プローブは核酸検出用の試薬、とりわけヒトを含む哺乳類動物の病気を診断するための診断薬として有用である。本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたプローブを核酸検出用の試薬又は診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することができる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態の試薬を調製することができる。試薬の形態及びその製造方法は、当業者が適宜選択可能である。上記の診断薬はヒトを含む哺乳類動物に経口的又は非経口的に投与することもできるが、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採取された血液、尿、唾液などの生体試料を上記診断薬に接触させることにより、遺伝子異常を伴う疾患の診断などが可能になる。
【００５９】
本発明の蛍光ヌクレオチドは、上記した核酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一緒に、核酸検出用キットの形態で供給することもできる。キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応じて適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び緩衝液に加えて、必要に応じて１種類以上（好ましくは４種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、精製水などをキットに含めてもよい。ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異的プライマーなどのプライマーをキットに含めることもできる。
【００６０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
合成例１：化合物Ｉ−１の合成
化合物Ｉ−１は以下に示すルートにより合成した。
【化１９】
0004676654.tif 000017
【００６１】
（化合物Ｉ−１ｃの合成）
化合物Ｉ−１ｄ(1.6 g, 10 mmol)に6-ブロモヘキサン酸エチル(2.4 g, 10.8 mmol)を加えて１３０℃にて３０分反応させた。本反応では目的部位の以外のヘテロ環窒素原子（インドール環部分）へのアルキル化も進行するが、反応液に反応後酢酸エチル(50 ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じるオイル成分をデカンテーションにより分離させることにより目的とするピリジン環窒素４級化生成物である化合物Ｉ−１ｃのみを分離することができた。
収量：2.7g、収率：70％
mass(posi):303
【００６２】
（化合物Ｉ−１ｂ（アニル体）の合成）
化合物Ｉ−１ｄ(1.6 g, 10 mmol)をジメチルホルムアミド（5 ml）に溶解させ、プロパンサルトン(1.2 g, 10 mmol)を加えて１００℃にて２時間反応させた。反応液に酢酸エチル(50 ml)を加えて得られた固体(2.8 g)をろ過により取り出した。この固体全量に無水酢酸(10 ml)とN,N'-ジフェニルホルムアミジン(3.9 g, 20 mmol)を加えて１００℃にて３０分反応させた。反応液に反応後酢酸エチル(50 ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じるオイル成分をデカンテーションにより分離させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより化合物Ｉ−１ｂ（アニル体）を単離した。
収量：1.5g、収率：40％
mass(posi):385
【００６３】
（化合物Ｉ−１ａの合成）
化合物Ｉ−１ｂ(0.39 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｃ(0.38 g, 1 mmol)をDMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応液に酢酸エチル(50 ml)を加えると結晶が析出した。その粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により精製し、化合物Ｉ−１ａを得た。
mass(posi):594
吸収極大（メタノール）：557nm
分子吸光係数：81000
【００６４】
（化合物Ｉ−１の合成）
前記化合物Ｉ−１ａ全量をメタノール(10 ml)に溶解し、５%水酸化リチウム水溶液(5 ml)を加えて室温で2時間反応させた。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10 ml)を加えた後メタノールを減圧濃縮すると化合物Ｉ−１の粗結晶が析出した。粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により脱塩し、化合物Ｉ−１を得た。
収量：0.20g、収率：35%（I-1bより）
mass(posi):566
吸収極大（メタノール）：557nm
分子吸光係数：82000
【００６５】
合成例２：化合物Ｉ−２〜化合物Ｉ−５の合成
化合物Ｉ−２、化合物Ｉ−３、化合物Ｉ−４、化合物Ｉ−５は化合物Ｉ−１の合成法に準じて合成した。表１にそれぞれのメタノール中での吸収特性を示す。
【００６６】
【表１】
0004676654.tif 000018
【００６７】
合成例３：化合物Ｉ−６の合成
化合物Ｉ−１(0.57 g, 1 mmol)をDMF(5 ml)に溶解させ、ピリジン(0.5 ml)とN,N'-ジスクシンイミジルカーボネート(1.0 g)を加えて40℃で4時間反応させた。反応液に酢酸エチル(50 ml)を加え、生じるオイルをデカンテーションにより分離した。オイルをジエチルエーテルから結晶化させ、化合物I-６を得た。
収量：0.5g、収率：74%
mass(posi)：663
吸収極大（メタノール）：557nm
分子吸光係数：88000
【００６８】
化合物Ｉ−７から化合物Ｉ−９も対応するカルボン酸から化合物Ｉ−６の方法に準じて合成した。生成物の構造は全てマススペクトルによって同定した。
【００６９】
合成例４：化合物Ｉ−１０〜化合物Ｉ−１３の合成
ベンゾオキサゾール、インドレニン、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾールから公知の方法で誘導されるアニル体と化合物Ｉ−１ｃから化合物Ｉ−１ａ、Ｉ−１及びＩ−６の合成法に準じて化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３を合成した。化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３の合成ではアニル体合成の最適条件が異なっていたため、表２にアニル体合成条件の詳細を示す。また、表３に化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３のメタノール中での吸収特性を示す。
【００７０】
【化２０】
0004676654.tif 000019
【００７１】
【表２】
0004676654.tif 000020
【００７２】
【表３】
0004676654.tif 000021
【００７３】
合成例５：化合物Ｉ−１４の合成
化合物Ｉ−１ｄ(1.6 g, 10 mmol)をジメチルホルムアミド（5 ml）に溶解させ、プロパンサルトン(1.2 g, 10 mmol)を加えて１００℃にて２時間反応させた。反応液に酢酸エチル(50 ml)を加えて得られた固体(2.8 g)をろ過により取り出した。この固体全量に無水酢酸(10 ml)と3-アニリノ−アクリルアルデヒドフェニルイミン(4.4 g, 20 mmol)を加えて１００℃にて３０分反応させた。反応液に酢酸エチル(50 ml) を加えて生じるオイルをデカンテーションにより分離した。続いて、化合物Ｉ−１ｃ(2.7 g, 7 mmol)、ジメチルホルムアミド(10 ml)、トリエチルアミン(1 ml)、無水酢酸(1 ml)を加え、６0℃にて1時間加熱した。反応液に酢酸エチル(50 ml) を加えて生じる粗結晶を取り出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して化合物Ｉ−１４のエチルエステル体を得た。次に、エチルエステル体の全量をI-1で行ったエステル加水分解の条件に付し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して化合物Ｉ−１４を得た。
収量：0.5g、収率：8％（化合物Ｉ−ｄより）
mass(posi):608
吸収極大（メタノール）：639nm
分子吸光係数：90000
【００７４】
合成例６：化合物Ｉ−１５〜化合物Ｉ−１８の合成
化合物Ｉ−１５、化合物Ｉ−１６、化合物Ｉ−１７、及び化合物Ｉ−１８は化合物Ｉ−１４の製造方法に準じて合成した。色素構造はマススペクトルおよび吸収スペクトルで確認した。
【００７５】
合成例７：化合物Ｉ−１９〜化合物Ｉ−２３の合成
化合物Ｉ−１４の合成において使用した3-アニリノ−アクリルアルデヒドフェニルイミンをグルタコンアルデヒドジアニル誘導体に置き換えて化合物Ｉ−１４と同様の条件で表題の化合物を合成した。ただし、化合物Ｉ−２２の合成では最終工程のエステル加水分解において色素分解が認められたため低収率であった。
【００７６】
合成例８：化合物II−１の合成
化合物II−１は下記のルートで合成した。
【化２１】
0004676654.tif 000022
【００７７】
化合物II−１ａ(12.4 g, 0.1 mol)とプロパンサルトン(12.2 g, 0.1 mol)をトルエン30 mlに溶解し、4時間加熱還流を行って反応液に析出する４級塩をろ取した（定量的）。その全量にアセトニトリル(100 ml)、 N,N'-ジフェニルホルムアミジン(19.6 g, 0.1 mol)、無水酢酸(10.2 g, 0.1 mol)を加え、４時間加熱還流を行ってアニル体（収率９６％）を得た。 アニル体(0.35 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｃ(0.38 g, 1 mmol)をDMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応液に酢酸エチル(50 ml)を加えるとエチルエステル体の結晶が析出した。そのエチルエステル体をクロロホルムとメタノールの混合溶媒から再結晶した。次にメタノール(10 ml)と５%水酸化リチウム水溶液(5 ml)によりエステル加水分解を行い（室温、２時間）、メタノールより再結晶を行って化合物II−１を得た。
mass(posi):530
吸収極大（メタノール）：561nm
分子吸光係数：125000
【００７８】
合成例９：化合物II−２〜化合物II−１７の合成
化合物II−２から化合物II−１７はこれまでに例示した方法に準じて合成した。色素構造はマススペクトルおよび吸収スペクトルで確認した。表４に各化合物のメタノール中での吸収特性を示す。
【００７９】
【表４】
0004676654.tif 000023
【００８０】
合成例１０：化合物III−１の合成
上記に示した化合物II−１の合成において、出発原料のII−１ａを3-メチル-ベンゾ[d]イソオキサゾールに置き換えることで化合物II−１と同様の反応条件により化合物III−１を得た。
mass(posi):636
吸収極大（メタノール）：549nm
分子吸光係数：145000
【００８１】
合成例１１：化合物III−３の合成
Can.J.Chem., 66, 1405-1409 (1988)に記載の方法に従い、3-メチル-ベンゾ[d]イソチアゾールを合成し、III−１と同様に合成した。
mass(nega):747
吸収極大（メタノール）：555nm
分子吸光係数：145000
【００８２】
合成例１２：化合物III−５の合成
上記に示した化合物II−１の合成において、出発原料のII−１ａをAldrich社製２−メチル−１−ピロリンに置き換えることで化合物II−１と同様の反応条件により化合物III−５を得た。
mass(posi):586
吸収極大（メタノール）：520nm
分子吸光係数：110000
【００８３】
（蛍光強度の比較）
本発明の色素の励起波長と蛍光強度を下記に示す従来の色素と比較した。溶媒はメタノールを用い、色素濃度は1.0×10-6Mとした。測定は島津製作所製分光蛍光光度計RF-5300PCを使用した。結果を表５から表７に示す。表から明らかなように、本発明の色素は蛍光強度が強く、特に表５及び表６に示した色素においては従来色素と際立った差を有していることがわかる。
【００８４】
【化２２】
0004676654.tif 000024
【００８５】
【表５】
0004676654.tif 000025
【００８６】
【表６】
0004676654.tif 000026
【００８７】
【表７】
0004676654.tif 000027
【００８８】
実施例１：化合物I-1-dUTP結合体の合成
5 mg(2.5部)の化合物Ｉ−１を0.1Mの MES緩衝液2mlに溶解し、WSC塩酸塩3.66mg(5部)及びSulfo-NHS  4.20mg(5部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、アミノアリル-dUTP(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ  120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN  Ultrapack  ODS-S-40B)により精製し純度95%の目的物を得た(収率71%)。
MS分析値：M-  1072
【００８９】
【化２３】
0004676654.tif 000028
【００９０】
実施例２：化合物Ｉ-14-dUTP結合体の合成
5.5 mg(2.5部)の化合物Ｉ−１４を200μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩3.1 mg (5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、2 mlの0.1M  MESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ  120A)を充填したカラムに吸着させ、45%メタノール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN  Ultrapack  ODS-S-40B)により精製し純度94%の目的物を得た(収率68%)。
MS分析値：M-  1098
【００９１】
実施例３：化合物II-1-dUTP結合体の合成
6.00 mg(2.5部)の化合物II-1を200μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS  3.55 mg(5部)を加え室温で30分間攪拌した。これに、2 mlの0.1M  MESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma) 2.2 mgを添加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μlを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、50%メタノール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN  Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度92%の目的物を得た(収率74%)。
MS分析値：M-  1036
【００９２】
実施例４：化合物II-12-dUTP結合体の合成
3.27 mg(1.0部)の化合物II-12を200μlのDMSOに溶解し、これに2 mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、40%メタノール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN  Ultrapack  ODS-S-40B)により精製し純度95%の目的物を得た。(収率77%)
MS分析値：M-  1062
【００９３】
実施例５：化合物III-1-dUTP結合体の合成
1.00 mg(1.0部)の化合物III-1を300μlの0.1M MESに溶解し、これに0.25 mg（0.4部）のアミノアリル-dUTP(Sigma)を加え、さらに1M炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）３００μｌを添加して室温で一晩反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μlを加え反応を停止させた後、中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN  Ultrapack  ODS-S-40B)により精製し純度90%の目的物を得た。(収率62%)
MS分析値：M-  1044
【００９４】
実施例６：化合物III-7-dUTP結合体の合成
1.00 mg(1.0部)の化合物III-7を300μlの0.1M MESに溶解し、これに0.66 mg（1.0部）のアミノアリル-dUTP(Sigma)を加え、さらに1M炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）３００μｌを添加して室温で一晩反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN  Ultrapack  ODS-S-40B)により精製し純度96%の目的物を得た。(収率44%)
MS分析値：M-  1070
【００９５】
使用例１：転写反応を用いた蛍光標識ＤＮＡプローブの作製
ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Clontech社）（０．５μｇ）およびオリゴｄＴプライマー（ｄＴ18-21、 Gibco BRL）（０．５μｇ）を混合し、７０℃で１０分間加熱した後、氷上で急冷した。この混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Gibco BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、ｄＧＴＰ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄＴＴＰ（２００μＭ）、実施例１で得た化合物Ｉ-1-dUTP結合体（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素(Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰＣ処理水（全量２０μｌになる量）を添加し、４２℃で２時間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨを添加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反応の停止とｍＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物Ｉ-1-dUTP結合体などを除去して精製した。
【００９６】
比較用として、化合物Ｉ-1-dUTP結合体の代わりに色素（Ｃｙ３）で標識した比較用の蛍光ヌクレオチド（Cy3-AP3-dUTP；Amersham pharmacia biotech）を使用して上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精製した。精製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム製)でスキャンした。その結果、本発明の化合物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、２６０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量を測定し、それらの結果から計算した取り込み率及びプローブ１μＭ当たりの蛍光強度を計算した。これらの結果を表８に示す。表８から分かるように、本発明の化合物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
【００９７】
【表８】
0004676654.tif 000029
【００９８】
使用例２：ＰＣＲ法による蛍光色素ラベル化ＤＮＡプローブの作製
ＰＣＲ反応液の組成：
鋳型ＤＮＡ：１０ｐｇ
プライマー１および２：各０．５μＭ
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ：各２００μＭ
ｄＴＴＰ：各１５０μＭ
化合物II-1-dUTP結合体またはCy3-AP3-dUTP：５０μＭ
Pyrobest DNA polymerase （ＴＡＫＡＲＡ）：０．５ｕｎｉｔ
減菌水：全量で２０μｌ（注：鋳型ＤＮＡとしては、PCR-ScriptTMＳＫ（＋）（STRATAGENE社）にα-2-HS-グリコプロテイン遺伝子を組み込んだものを使用し、プライマー１および２の配列は各々配列表１および２に示す）
【００９９】
上記組成液をＰＣＲ反応液として使用し、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０サイクル行い、ＰＣＲ反応を行った。反応液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の蛍光ヌクレオチドなどを除去し、生成物を精製した。精製後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム製)でスキャンした。その結果、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、２６０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量を測定し、それらの結果から計算した取り込み率及びプローブ１μＭ当たりの蛍光強度を計算した。これらの結果を表９に示す。表９から分かるように、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
【０１００】
【表９】
0004676654.tif 000030
【０１０１】
【発明の効果】
本発明の蛍光ヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の際の取り込み率および取り込み後の蛍光強度に優れており、核酸の標識物質として有用である。
【配列表】
0004676654.tif 000031