(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ＲＮＡを検出する方法であって。
（ａ）当該標的ＲＮＡと相補的な配列を含んで成るＤＮＡプライマーを含んで成るアレイを準備し；
（ｂ）当該プライマーとＲＮＡ試料とを、当該プライマーと標的ＲＮＡとの間の特異的なハイブリダイゼーションを促進する条件下で接触させ；
（ｃ）プライマー−ＲＮＡヘテロ二本鎖と熱安定性逆転写酵素とを、当該ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を可能にする条件であって、検出可能な標識が当該ｃＤＮＡ内に取り込まれるような条件下でインキュベートし；そして
（ｄ）前記熱安定性逆転写酵素により合成された新生ｃＤＮＡ鎖内に取り込まれた検出可能な標識を検出すること、を含んで成り、更に、（ｃ）と（ｄ）の間で少なくとも２サイクルのハイブリダイゼーションと逆転写を、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖の融点より高い温度を含んで成る条件下で実施すること、を含んでなり、ここで、前記ｃＤＮＡにおける標識の存在が、試料中の標的ＲＮＡの存在を示唆する、方法。
【請求項２】
（ｅ）試料細胞中の標的ＲＮＡの存在又は不在を、参照細胞のものと比較すること、
を更に含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｅ）試料細胞中の標的ＲＮＡのレベルを決定し、そして参照細胞におけるレベルと比較すること、を更に含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多数のＤＮＡプライマーが試料中の多数の標的ＲＮＡを検出するのに準備され、ここで、各プライマーが異なる標的ＲＮＡ分子と相補的であり、そして各プライマーが固形の支持体上の別個の且つ同定可能な位置にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検出可能な標識が、放射標識された分子、蛍光分子、及び色素生産性分子、から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
検出可能な標識が修飾されたヌクレオチド内に取り込まれ、更に、当該修飾されたヌクレオチドが鎖終結ヌクレオチドではない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
検出可能な標識が、放射性標識されたｄＮＴＰ、フルオロ−ｄＮＴＰ、ビオチン化されたｄＮＴＰ又はジゴキシゲニン−ｄＮＴＰのうちの少なくとも１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検出可能な標識が、新生のポリヌクレオチド内に取り込まれた第二の標識と結合する分子と複合される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アレイが少なくとも１００〜少なくとも１，０００，０００のプライマーを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アレイが、少なくとも１，０００のプライマーを含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料が細胞由来であり、且つ少なくとも１つの標的ＲＮＡの存在が、感染、病状、病状に対する素因、発生上の状態、物理的状態、化学的状態及び生物学的状態、から成る群から選択される状態を示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試料が細胞由来であり、且つ少なくとも１つの標的ＲＮＡの不在が、感染、病状、病状に対する素因、発生上の状態、物理的状態、化学的状態及び生物学的状態、から成る群から選択される状態を示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
プライマーが基板上に固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
プライマーが、当該プライマーの３’末端が遊離するように、共有結合により基板上に固定されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
共有結合が、シッフ塩基、光開裂可能な結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、及び選択的に放出可能な結合、から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
プライマーが、当該プライマーの３’末端が遊離するように非共有結合的なカップリングにより基板上に固定されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
非共有結合的なカップリングが、静電的相互作用、水素結合、抗体−抗原カップリング、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインＡ−ＩｇＧ抗体Ｆcフラグメント相互作用、及びストレプトアビジン／プロテインＡキメラ、から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
基板が、プラスチック、セラミック、ナイロン、ポリエステル、金属、樹脂、ゲル、メンブレン、ニトロセルロース膜、板、ビーズ、薄膜、ガラス、シリンダー、タグ付きビーズ、磁気ビーズ、光ファイバー、及び繊維織物、から成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡ試料が生物学的供給源から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＮＡ試料が生物学的供給源からの単離後に増幅される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＮＡ試料がin vitroでの転写によって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＮＡ試料が少なくとも１つの発現調節ＲＮＡを含んで成る。請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
プライマーがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｅ）in situで実施されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡ鎖を増幅させること、を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＲ反応が、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、又は熱安定性逆転写酵素を用いて実施される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸生物学の分野に関する。具体的には、本発明は、マイクロアレイ上での核酸の検出の分野に関する。更に具体的には、本発明は、逆転写を用いたマイクロアレイ上での特定のＲＮＡの検出、に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の生細胞における遺伝子発現パターンは、その現状に特有のものである。細胞の状態又は型におけるほぼ全ての差異は、１又は複数の遺伝子のＲＮＡレベルの差異に反映される。特徴付けられていない遺伝子の発現パターの比較は、それらの機能に対する手がかりを提供することがある。何百又は何千の遺伝子の発現のハイスループット解析は、（ａ）複合的な遺伝子疾患の同定、（ｂ）病原体（例えばウイルス及び細菌、酵母及び原生動物等の微生物）の解析及び検出、（ｃ）組織と病状との間での、経時的な、ディファレンシャルな遺伝子発現の解析、及び（ｄ）創薬及び毒物学研究、において役立つことがある。例えば、ある遺伝子の発現レベルの増大又は低下は、発ガン遺伝子が腫瘍形成のポジティブな制御因子であり、一方、腫瘍抑制遺伝子が腫瘍形成のネガティブな制御因子であるように、ガンの生物学と相関している(Marshall, Cell, 64: 313-326 (1991); Weinberg, Science, 254: 1138-1146 (1991))。しかしながら、少量のそのような発現した遺伝子材料の検出は、生物学的研究及び臨床的診断における大きな課題である。
【０００３】
異なる生物学的供給源における遺伝子発現レベルを検出し、そして比較するための多数の方法が当業界で知られている。そのようなＲＮＡレベルの検出のための１つの標準的な方法はノーザンブロットである。この技術において、ＲＮＡは試料から抽出され、そしてＲＮＡ解析に適した種々のゲルのうちのいずれかに添加され、これらは続いて、標準的な方法に従い（例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2nd ed. 1989)を参照のこと）、サイズごとにＲＮＡを分離する試験にかけられる。続いてゲルをブロッティングし（上記Sambrookに記載の通り）、そして注目のＲＮＡの検出のためにプローブとハイブリダイズする。ノーザンブロットは診断目的では滅多に使用されず；それらは主に研究目的で使用される。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイ技術の近年の発展は、多数の標的分子の大規模アッセイを単一の固相支持体上で実施することを可能にしている。米国特許第５，８３７，８３２号（Chee et al.)及び関連特許出願には、試料中の特定の核酸配列のハイブリダイゼーション及び検出のためのオリゴヌクレオチドのアレイの固定が記載されている。注目の標的ポリヌクレオチドはＤＮＡチップとハイブリダイズし、そして特定の配列の変化が、標的ポリヌクレオチドの優先度及び別々のプローブ位置でのハイブリダイゼーションの程度に基づき検出される。アレイの１つの重要な用途は、ディファレンシャルな遺伝子発現の解析におけるものであり、ここで、異なる細胞、しばしば注目の細胞とコントロールの細胞、における遺伝子発現が比較され、そして各細胞間の遺伝子発現のあらゆる差異が同定される。そのような情報は、既知の環境における特定の細胞又は組織の型において発現する遺伝子の型の同定にとって有用である。アレイの経済学は、多数の遺伝子についての転写事象の迅速な検出のために高密度なデザインのマイクロアレイ用プラットホームを提供する。
【０００５】
典型的には、注目の試料由来のＲＮＡは、標識されたｃＤＮＡを得るために逆転写にかけられる。米国特許第６，４１０，２２９号(Lockhart et al.)を参照のこと。ｃＤＮＡは、続いて、既知の順番でチップ又はほかの表面上にアレイされた既知の配列のオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡとハイブリダイズされる。標識されたｃＤＮＡがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの位置は、当該ｃＤＮＡの配列情報を提供し、一方、標識されてハイブリダイズされたＲＮＡ又はｃＤＮＡの量は、注目のＲＮＡ又はｃＤＮＡマイクロアレイの推定上の相対的表示を提供する。Schena, et al. Science 270:467-470 (1995)を参照のこと。例えば、ヒトのガンにおける遺伝子発現パターンを解析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用は、DeRisi等により説明されている(Nature Genetics 14:457-460 (1996))。
【０００６】
米国特許第５，８８８，８１９号(Goelet, et al.)は、注目の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する方法であって、注目の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するための核酸鋳型依存性プライマーの少なくとも２つの異なるターミネーターの使用を包含する方法を開示する。この方法は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰの不在下での標識されたターミネーターの使用を包含するので、前記プライマー多くとも１個のヌクレオチドが伸長されうる。
【０００７】
米国特許第６，３５２，８２９号(Chenchik et al.)は、２又はそれ以上の生理学的供給源間のＲＮＡプロファイルの差異を解析する方法であって、各供給源由来のＲＮＡと代表的な数の遺伝子特異的プライマーとを接触させ、そして次に標識ｃＤＮＡの結果として生じた亜集団をオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズすることにより解析する方法を開示している。
【０００８】
現在のハイブリダイゼーションベースの配列変異アッセイには複数の問題が伴い、その結果、それらの利用が制限されている。Hacia (1999) Nature Genetics Supp. 21: 42-47を参照のこと。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイの精度は乏しいままである。あらゆる２つの配列に適用される同一の実験アプローチは、非常に異なる精度を伴う結果を生成することがある。マイクロアレイ解析の制限には、更に、小容量及び少量のマイクロアレイ検出にのみ利用可能な核酸を検出するという困難性が含まれる。核酸ハイブリダイゼーションに基づくあらゆる技術のように、マイクロアレイハイブリダイゼーションの感度は、利用可能な標的核酸の数、すなわち遺伝子発現の存在量により大きく制限される。
【０００９】
現在、これらの制限は、核酸の標的に対して付着される標識シグナル（例えば、蛍光タグ）を増幅し、そして／あるいは検出することによりある程度まで克服されている。これらの方法の弱点は、標的ＲＮＡを検出するために、それは最初に、通常標識されたｃＤＮＡへの変換を介して標識されなければならないということである。ＲＮＡの標識方法は高価で時間がかかり、そして標識の効率の配列特異的な差異に起因して特定のｍＲＮＡの相対的な存在量についての検出結果を変化させるようである。マイクロアレイ上で１又は複数の標的ＲＮＡを検出するより効率的で感度の良い方法を開発することは当業界で重大な利点である。
【００１０】
ある方法において、逆転写は天然のヌクレオチドの存在下で実施され、そして生じたＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に対する抗体によって直接検出される。米国特許第６，２２７，５７９号(Lazar et al.)は、各プライマーが注目のＲＮＡ分子に特有である、逆転写プライマーのアレイが逆転写酵素を用いてＲＮＡを逆転写するのに使用される注目の標的ＲＮＡ分子を、（それらを標識することなく）注目の標的ＲＮＡ分子を検出する方法を記載している。抗二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡ分子ハイブリッド抗体が、固相上で当該ハイブリッドを検出するために使用される。捕獲又は検出のためのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体は、Kitawaga, Y. and Stollar, B. D., Mol. Immunology 19:413-420 (1982)の方法により、又は米国特許第4,732,847号(Stuart et al.)に記載の方法に従い調製される。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの検出がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド特異的抗体の使用によって実施されるので、この方法における使用のための逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ機能を欠くように仕立てられなければならない。
【００１１】
好ましくは、抗ハイブリッド抗体の標識は、酵素、蛍光分子又はビオチン−アビジン複合体であり、そして非放射性である。当該標識は、続いて当業界で周知な常用の手段、例えばカロリメーター、ルミノメーター、又は蛍光検出器により検出されうる。
【００１２】
感度の増大又は精度の上昇に伴い、何百何千ものＲＮＡ標識の迅速なハイスループット解析の必要性が存在している。標的ＲＮＡの標識に関連する欠点を回避することにより、遺伝子発現レベルの検出の効率及び精度を向上させる必要性が存在している。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の要約
本発明は、常用のハイブリダイゼーションベースのアプローチと比較した場合に、より高い感度、より良い精度及びより少ない時間消費での遺伝子発現の検出方法を提供する。
【００１４】
本発明は、注目のＲＮＡ分子を検出する方法であって、注目の特定ＲＮＡ分子に対し比類なく相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、そのようなＲＮＡを逆転写酵素又は逆転写酵素活性を有する任意な酵素で逆転写するためのプライマーとして使用される方法、に関する。
【００１５】
１つの側面において、本発明は、試料中の標的ＲＮＡの逆転写伸長産物に検出可能な標識を取り込むことにより標的ＲＮＡを標識又は変換する必要性を排除する。
【００１６】
１つの側面において、本発明は、より短いプライマーを逆転写酵素反応に用いることにより検出精度を増強する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、特注の逆転写酵素（ＲＴ）を用いる必要性を排除し、そしてＲＮアーゼＨ型ヌクレアーゼ活性を欠く、又は欠かない逆転写酵素を用いて使用されうる。
【００１８】
本発明の１つの側面において、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法であって、（ａ）標的ＲＮＡと相補的な配列を含んで成るＤＮＡプライマーを含んで成るアレイを準備し；（ｂ）当該プライマーとＲＮＡ試料とを、当該プライマーと標的ＲＮＡとの間の特異的なハイブリダイゼーションを促進する条件下で接触させ：（ｃ）プライマー−ＲＮＡヘテロ二本鎖と逆転写酵素とを、当該ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を可能にする条件であって、検出可能な標識が当該ｃＤＮＡ内に取り込まれるような条件下でインキュベートし；そして（ｄ）逆転写酵素により合成された新生ｃＤＮＡ鎖内に取り込まれた検出可能な標識を検出すること、を含んで成り、ここで、当該ｃＤＮＡにおける標識の存在が、試料中の標的ＲＮＡの存在を示唆する、方法、を提供する。当該方法は更に、（ｅ）試料細胞中の標的ＲＮＡの存在又は不在を、参照細胞のものと比較することを含んでもよい。別の態様において、当該方法は、（ｅ）試料細胞中の標的ＲＮＡのレベルを決定し、そして参照細胞におけるレベルと比較すること、を含んで成る。
【００１９】
１つの態様において、多数のＤＮＡプライマーが試料中の多数の標的ＲＮＡを検出するのに準備され、ここで、各プライマーは異なる標的ＲＮＡ分子と相補的であり、そして各プライマーは固形の支持体上の別個の且つ同定可能な位置にある。
【００２０】
１つの態様において、検出可能な標識は、放射標識された分子、蛍光分子、及び色素生産性分子、から成る群から選択される。別の態様において、検出可能な標識は、新生のポリヌクレオチド内に取り込まれた第二の標識と結合する分子と複合される。
【００２１】
１つの態様において、当該試料は細胞由来であり、そして少なくとも１つの標的ＲＮＡの存在又は不在は、感染、病状、病状に対する素因、発生上の状態、物理的状態、化学的状態及び生物学的状態、から成る群から選択される状態を示唆する。
【００２２】
別の態様において、前記プライマーは、当該プライマーの３’末端が遊離するように、共有結合により基板上に固定される。当該共有結合は、シッフ塩基、光開裂可能な結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、及び選択的に放出可能な結合、から成る群から選択されうる。１つの態様において、当該プライマーは、当該プライマーの３’末端が遊離するように、非共有結合的なカップリングにより基板上に固定される。非共有結合的なカップリングは、静電的相互作用、水素結合、抗体−抗原カップリング、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインＡ−ＩｇＧ抗体Ｆcフラグメント相互作用、及びストレプトアビジン／プロテインＡキメラ、から成る群から選択されうる。
【００２３】
１つの態様において、基板は、プラスチック、セラミック、ナイロン、ポリエステル、金属、樹脂、ゲル、メンブレン、ニトロセルロース膜、板、ビーズ、薄膜、ガラス、シリンダー、タグ付きビーズ、磁気ビーズ、光ファイバー、及び繊維織物、から成る群から選択される。
【００２４】
本発明の複数の側面において、ＲＮＡ試料は生物学的供給源から単離され、ＲＮＡ試料は生物学的供給源からの単離後に増幅されることがあり、ＲＮＡ試料はin vitroでの転写によって調製され、そしてＲＮＡ試料は少なくとも１つの発現調節ＲＮＡを含んで成る。
【００２５】
１つの態様において、プライマーは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選択されるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターについての配列を含んで成る。
【００２６】
１つの態様において、前記方法は更に、（ｅ）特にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、又は熱安定性逆転写酵素を用いてin situで実施されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡ鎖を増幅させること、を含んで成る。
【００２７】
１つの態様において、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法であって、（ａ）標的ＲＮＡの配列と相補的な配列を含んで成る少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含んで成るマイクロアレイを準備し；（ｂ）当該マクロアレイとＲＮＡ試料とを、前記プライマーと前記標的ＲＮＡとの間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ；（ｃ）プライマー−ＲＮＡヘテロ二本鎖と逆転写酵素とを、当該ＲＮＡＮのｃＤＮＡへの転写を可能にする条件下でインキュベートし；そして（ｄ）前記逆転写酵素によって合成されたｃＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖を検出すること、を含んで成り、ここで、ｃＤＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖の存在が、試料中の標的ＲＮＡの存在を示唆し、ここで、当該検出はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対する抗体によって媒介されない、方法を提供する。幾つかの態様において、検出可能な標識は、新生ポリヌクレオチドに結合する分子と複合される。１つの態様において、この方法は更に、（ｅ）熱安定性逆転写酵素を準備し；そして（ｆ）多サイクルのプライマー伸長反応を、温度が各サイクルの間ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融点を超している条件下で実施すること、を含んで成る。
【００２８】
１つの態様において、ｃＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖は二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合する検出可能な試薬によって検出され、ここで、当該検出可能な試薬が、インターカレート化合物、ポリヌクレオチド二本鎖依存性蛍光消光化合物、ＤＡＰＩ、臭化エチジウム、チアゾールオレンジ、ビス−ベンズイミド及びアクリジンオレンジ、から成る群から選択されてもよい。別の態様において、検出可能な試薬は、当該試薬に結合する第二の検出可能分子によって間接的に検出可能である。
【００２９】
本発明は更に、試料中の標的ＲＮＡを検出するための方法であって：（ａ）当該標的ＲＮＡと相補的な配列を含んで成るＤＮＡプライマーを含んで成るアレイを準備し；（ｂ）当該プライマーとＲＮＡ試料とを、当該プライマーと標的ＲＮＡとの間の特異的なハイブリダイゼーションを促進する条件下で接触させ；（ｃ）プライマー−ＲＮＡヘテロ二本鎖と熱安定性逆転写酵素とを、当該ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を可能にして検出可能標識が当該ｃＤＮＡ内に取り込まれるような条件下でインキュベートし；（ｄ）少なくとも２サイクルのハイブリダイゼーションと逆転写を、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖の融点より高い温度を含んで成る条件下で実施し；そして（ｅ）前記逆転写酵素によって合成された新生ｃＤＮＡ鎖内に取り込まれた検出可能標識を検出すること、を含んで成り、ここで、前記ｃＤＮＡにおける前記標識の存在が試料中の標的ＲＮＡの存在を示唆する、方法、を提供する。
【００３０】
この方法の幾つかの態様において、ハイブリダイゼーションと逆転写の段階はＲＮアーゼＨ阻害剤の存在下で実施され、あるいは熱安定性逆転写酵素がＲＮアーゼＨ機能を欠いている。
【００３１】
参照配列と比較した場合の標的ポリヌクレオチドの配列変異を同定するためのキットであって、ａ）固相支持体上に固定された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアレイであって、各オリゴヌクレオチドプライマーが、標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含んで成るよう選択され、そしてアレイの同定可能な且つ別個の領域を占めるアレイ；ｂ）当該アレイ上での逆転写反応に適した試薬；及びｃ）当該アレイ上での新生ｃＤＮＡ鎖を検出するための検出手段、を含んで成るキットが提供される。当該キットは更に、逆転写反応の間に新生ｃＤＮＡ鎖内に取り込まれる検出可能標識を含んで成ることもある。
【００３２】
本発明の方法は、相対的に小さいプライマーの特異的なハイブリダイゼーションに基づいた相対的に大きなシグナルの検出を可能にする。プローブハイブリダイゼーションを包含する検出方法と比較して、この方法は、検出の特異性の増大を可能にする。当該方法はまた、標的ＲＮＡの標識の事前の標識を回避する。開示した方法において利用される逆転写プライマーは相対的により短く、そしてそれ故に非特異的ハイブリダイゼーションの影響をほとんど受けない。開示した方法によって生じる特異性及びシグナルは、熱安定性逆転写酵素を用い、そして多サイクルの、高温、例えばプライマーと標的ＲＮＡとの間のハイブリッドの融点付近の温度での逆転写を実施することによって更に増大することができる。
【００３３】
本発明の詳細な説明
本発明は、注目のＲＮＡ分子の検出方法であって、注目の特定ＲＮＡ分子と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、逆転写活性を有する酵素でそのようなＲＮＡを逆転写するためのプライマーとして使用される方法、に関する。伸長されたプライマーは、直接的又は間接的に標識され、そして適切な手段によって検出される。当該方法の態様の概略図を図１Ａ〜１Ｄに示す。支持体上の別個の部位に付着される３’末端を有するプライマー／プローブのアレイを提示する（図１Ａ）。当該アレイは、当該プライマー／プローブと相補的な標的ＲＮＡがハイブリダイゼーションにより当該アレイ上に固定されるようにＲＮＡ試料と接触される（図１Ｂ）。固定化された標的ＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーとして前記プライマー／プローブを用い、検出可能に標識されたデオキシリボヌクレオチドの存在下で逆転写される（図１Ｃ）。ＲＮアーゼ活性による標的ＲＮＡのその後の分解は、それぞれ別個の部位で生成する検出可能シグナルに影響を及ぼさない（図１Ｄ）。
【００３４】
注目の標的ＲＮＡ配列を含む試料は、混合された核酸の集団、例えば組織由来ｍＲＮＡ抽出物、in vitro転写アッセイの最終産物、既定量のコントロールＲＮＡ等からなることがある。
【００３５】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、注目の核酸配列とハイブリダイズするよう設計され、且つアレイの別個の領域を占める各プライマーにより、マイクロアレイフォーマットの固相支持体に固定化される。固相支持体上のマイクロアレイは、最大約１，０００，０００個のプライマーを含んで成ることがある。そのようなものとして、当該方法は最大約１，０００，０００個の異なる標的ＲＮＡ配列を検出するのに有用である。多くの利用にとって、前記固相上に存在しうる群の数に下限がないことは明らかであるが、群数が多いことが望ましい。
【００３６】
標的ＲＮＡの逆転写から生じる固定化されたｃＤＮＡは、種々の方法で直接的に検出されうる。最初に、逆転写は、逆転写の間に合成されたｃＤＮＡ内に取り込むことができる修飾されたヌクレオチドの存在下で実施されうる。例えば、当該ヌクレオチドは、放射標識し、又は蛍光発生色素又は色素生産性色素を取り込むことによって直接的にタグを付けられる。そのようなヌクレオチドは、転写終結因子の存在下での、アレイされたプライマーからの逆転写を包含する方法と比較して、ＲＮＡ鋳型に沿った検出可能新生ｃＤＮＡの伸長を可能にする。
【００３７】
この方法は、逆転写がより短いプライマーで達成することができ、且つ非特異的なミスプライミングの影響をほとんど受けないので、プローブハイブリダイゼーションを包含する現状の方法よりも大きな検出特異性を提供する。
【００３８】
Ａ．定義
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのポリマー形式のヌクレオチドである。この用語は、この分子の一次構造だけを意味する。従って、この用語は、二本鎖−及び一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、それは既知の型の修飾、例えば当業界で知られている標識、メチル化、「キャップ」、１又は複数の天然ヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるもの、ペンダント部分を含むもの、例えば、（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等を含む）タンパク質を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）によるもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結（例えば、アルファ−アノマー核酸等）によるもの、並びに修飾されていない形式のポリヌクレオチドによるものである。
【００３９】
用語「プライマー」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドに対して相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた場合、相補鎖に沿ったポリヌクレオチド合成の開始地点として働くことができるオリゴヌクレオチドを意味する。前記条件には、４つのヌクレオチド三リン酸及びヌクレオシドアナログ並びに１又は複数の重合化用物質、例えばＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素の、適切な緩衝液（「緩衝液」には、補因子であるか、あるいはｐＨ，イオン強度等に影響を及ぼす物質(substituent)が含まれる）中で且つ適当な温度での存在、が含まれる。プライマーは、ポリメラーゼのための物質の存在下で伸長産物の合成をプライミングするほど十分に長くなければならない。典型的なプライマーは、少なくとも約５ヌクレオチドの長さの、標的配列と実質的に相補的な配列を含むが、やや長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは約１５〜２６ヌクレオチドを含むが、より長いプライマー、最大３５ヌクレオチドもまた利用されうる。
【００４０】
プライマーは、標的配列、すなわち検出されるべき特定配列であって、これにアニーリングできるものと実質的に相補的な配列を常に含む。プライマーは、任意に、プロモーター配列も含む。用語「プロモーター配列」は、認識された配列と結合し、且つＲＮＡ転写産物が産生される転写過程を開始するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される一本鎖核酸配列を定義する。原理上、開始配列を認識することができる既知の利用可能なポリメラーゼが存在している、あらゆるプロモーター配列を用いることができる。既知の有用なプロモーターは、幾つかのバクテリオファージポリメラーゼ、例えばバクテリオファージＴ３、Ｔ７又はＳＰ６によって特異的に認識されるものである。本発明の態様において、プライマーはまたプローブの役割を果たし、これは典型的には基板上に固定されており、これに標的ＲＮＡがハイブリダイズする。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「タグ」、「配列タグ」又は「プライマータグ配列」は、内部にタグを有する一群のポリヌクレオチドを同定する役割を果たす、特定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。同一の生物学的供給源に由来するポリヌクレオチドは、その後の解析においてポリヌクレオチドがその元の供給源に従い同定されうるように、特定の配列タグで共有結合的にタグを付される。当該配列タグはまた、核酸増幅反応のプライマーとしての役割も果たす。
【００４２】
「マイクロアレイ」は、好ましくは別個の領域の、それぞれが既定の面積を有する、線形(linear)又は二次元アレイであって、固相の支持体表面上に形成されるアレイである。マイクロアレイ上の別個の領域の密度は、単一の固相支持体の表面上で検出されうるポリヌクレオチドの総数により決定され、好ましくは少なくとも約５０／ｃｍ2、更に好ましくは少なくとも約１００／ｃｍ2、より更に好ましくは少なくとも約５００／ｃｍ2、そしてまた更に好ましくは少なくとも約１，０００／ｃｍ2である。本明細書で使用する場合、ＤＮＡマイクロアレイは、標的ポリヌクレオチドを増幅又はクローン化するのに使用するチップ又は他の表面上に据えられたオリゴヌクレオチドプライマーのアレイである。アレイにおけるそれぞれの特定のプライマー群の位置が分かっているので、標的ポリヌクレオチドの同一性は、マイクロアレイにおける特定の位置とのそれらの結合に基づいて決定されうる。
【００４３】
「リンカー」は、制限部位を含む合成オリゴデオキシリボヌクレオチドである。リンカーは、その後のベクター分子内へのＤＮＡフラグメントのクローニングに使用されうる制限部位を作り出すために、当該ＤＮＡフラグメントの末端に平滑末端でライゲーションされうる。
【００４４】
用語「標識」は、アッセイ試料における標的ポリヌクレオチドの存在を示唆する検出可能シグナルを産生することが可能な組成物を意味する。適当な標識には、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁気粒子、生物発光部分等が含まれる。そのようなものとして、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、又は任意な他の適切な手段、によって検出可能な任意の組成物である。用語「標識」は、検出可能な物理学的特性を有する任意の化学的な基又は部分あるいは化学的な基又は部分に検出可能な物理的特性を示させることができる任意の化合物、例えば検出可能な産物への基質の変換を触媒する酵素を意味する。用語「標識」はまた、特定の物理学的特性の発現を阻害する化合物を包含する。標識はまた、結合する対のメンバーである化合物であってもよく、これらのその他のメンバーは検出可能な物理学的特性を有する。
【００４５】
用語「支持体」は、常用の支持体、例えばビーズ、粒子、ディップスティック、ファイバー、フィルター、メンブレン及びシラン又はケイ酸塩の支持体、例えばスライドガラス、を意味する。
【００４６】
用語「増幅する」は、例えば、追加の標的分子、又は標的様分子、又は標的分子と相補的な分子、であって、試料中の標的分子の存在が原因で作り出される分子、を含みうる増幅産物を作り出すことを意味するよう広い意味で使用される。標的が核酸である状況において、増幅産物は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼあるいは逆転写酵素により酵素的に作ることができる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「生物学的試料」は、個体から単離される組織又は体液、限定しないが、例えば血液、血漿、血液、髄液、リンパ液、皮膚の外側の部分、呼吸器、腸管、及び泌尿生殖器、涙、唾液、乳汁、細胞（限定しないが、血球を含む）、腫瘍、器官、の試料、更にはin vitroでの細胞培養成分の試料、を意味する。
【００４８】
用語「生物学的供給源」は、本明細書で使用する場合、標的ポリヌクレオチドの由来となる供給源を意味する。当該供給源は、上述のような、限定しないが細胞、組織又は体液を含む、任意の「試料」形態のものであってもよい。「異なる生物学的供給源」とは、同一の個体の異なる細胞／組織／器官、あるいは同一の種の異なる個体由来の細胞／組織／器官、あるいは異なる種由来の細胞／組織／器官、を意味することがある。
【００４９】
Ａ．標的ＲＮＡ
使用するＲＮＡ鋳型は、通常、注目の生物学的供給源から精製される。最初のｍＲＮＡ試料は、単細胞生物、例えば酵母を含む生理学的供給源、真核生物供給源、又は植物及び動物、特に哺乳類を含む多細胞生物、並びに当該哺乳類由来の器官、組織及び細胞を含む多細胞生物、任意の体液（例えば、血液、尿、唾液、痰、胃液等）、培養細胞、生検、又は他の組織調製物に由来してもよい。細胞、組織、器官及び生体自体から核酸を単離するためのプロトコールは、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されており、これは引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。そのような方法は、典型的に、１又は複数の組織／細胞のホモジェナイゼーション、核酸／タンパク質抽出、クロマトグラフィー、遠心、親和性結合等に対し元の生物学的供給源をかけることを包含する。当該方法はまた、事前のＲＮＡ単離無しに、細胞全体の可溶化物に対しても実施されうる。Klebe, R. J. et al. (1996) BioTechniques 21, 1094. 当該方法はまた、in vitroで転写されたＲＮＡ、並びにＴ３、Ｔ７、ＳＰ６又はＱβ  ＲＮＡポリメラーゼで転写されたＲＮＡ、に対しても実施されうる。
【００５０】
開示した方法は、試料中に存在しうる１又は複数の特定のＲＮＡ分子、例えば異なる生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、植物、及び動物）由来のＲＮＡ、あるいは感染、病状、又は病状に対する素因を示唆するＲＮＡ、の存在を検出するために使用することができる。当該方法はまた、微生物のクラス又は関連する病態の群を検出するために使用することができる。
【００５１】
当該方法はまた、増幅された標的ＲＮＡと共に使用することもできる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順は、プロモーター配列を、当該ＰＣＲ反応に使用するプライマーのうちの１つに取り込み、そして次に、複数のサイクルのＰＣＲ手順による増幅の後、一本鎖ＲＮＡの転写のための鋳型として二本鎖ＤＮＡを用いることによって、ＲＮＡ転写と組み合わされた(Murakawa et al. DNA 7:827-295 (1988)を参照のこと)。このＰＣＲとin vitro転写（ＩＶＴ）との組み合わせは、フィデリティーを損なうことなく少ない出発数の細胞から比較的多量のＲＮＡを生成することを可能にし、これは米国特許第６，２７１，００２号(Linsley et al.)に記載されており、これは引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。核酸配列を増幅させる他の方法も商業的に利用可能である。これらの方法には、Wu, D. Y and Wallace, R. B, Genomics 4:560-569 (1989) and Barringer, K. J., et al., Gene 89:117-122 (1990)で説明されているライゲーション増幅反応（ＬＣＲ）；Kwoh, D. Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177 (1989)で説明されている転写ベースの増幅反応；配列開始反応(Sequence Initiation Reaction, SIR)、連続増幅反応(continuous amplification reaction(CAR))ＲＮＡ（米国特許第５，９８１，１７９号を参照のこと）、が含まれる。それぞれの場合において、増幅産物はＲＮＡであり、あるいは増幅過程の間ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを取り込むことによってＲＮＡに変換されうる。このＲＮＡは続いて、本発明の方法によって検出される。
【００５２】
Ｂ．オリゴヌクレオチドプライマーのアレイ
１．プライマーの選択
本発明は、固定され且つ分離されたオリゴヌクレオチドプライマー群を含んで成る、調製済みの固相支持体を提供する。当該プライマーは、例えば、標準的なＰＣＲプライマー選択プログラム、例えばマサチューセッツ工科大（ＭＩＴ）のＰｒｉｍｅｒ３を用いて選択され、あるいは設計されうる。本発明に従うプライマーの態様において、それらは「捕獲プローブ」として使用され、そして、このために、生物学的試料中に含まれる標的核酸を捕獲するために基板上に固定される。本発明に従うプライマー／プローブは、逆転写産物の伸長を可能にする遊離３’末端を有する必要がある。好ましい態様において、プライマー／プローブは５’末端を介して基板に固定される。
【００５３】
固相支持体は、最大１，０００，０００以上のプライマーが既定のパターンに従い別個の領域に固定されうる領域を提供する。調製済みの固相支持体は、当該支持体上の任意な所定の位置にある当該プライマー又はプライマー対の関連する文書記録又は電子記録を有することがあり、そしてその結果、固定化された標的の支持体上での位置も同様に同定されうる。好ましくは、プライマーの量（すなわちプライマー分子数又はプライマー濃度）は、所定の固相支持体上でそれぞれ与えられた位置でほぼ同じであろう（例えば、ＤＮＡマイクロアレイフォーマットにおいて、最大約１，０００，０００の標的ポリヌクレオチドを増幅又は検出するのに１０、１００、１０００〜１０，０００、１００，０００、最大約１，０００，０００のプライマーを有する）。
【００５４】
固相支持体は、検出されうるポリヌクレオチドに基づき、特定の用途のためのプライマー配列により調製されうる。当該オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅される標的ポリヌクレオチドの配列及び質を特に考慮して、特定の逆転写酵素に適した任意の長さのものであってもよい。一例として、当該プライマーは、約４〜約１００ヌクレオチドの長さであってもよく、態様によっては１０、２０又は３０ヌクレオチドの長さであり、そして他の態様においては４〜３０ヌクレオチドの長さである。当該プライマーは、第一鎖のｃＤＮＡ合成にとって十分な条件下で。標識された核酸の生成の間に相補的な鋳型配列に対し、当業者に知られている条件下でハイブリダイズするほど十分特異的である。プライマー配列と、それらが標識された核酸の生成の間にハイブリダイズするそれらの相補的な鋳型（標的ＲＮＡ）配列とのミスマッチ数は、ＦＡＳＴＡ（デフォルト設定）で決定した場合、概して１５％を超えず、通常１０％を超えず、そして好ましくは５％を超えない。本発明の核酸プライマーは、核酸塩基の若干の欠失、付加及び／又は置換を、そのような変化が得られる収率又は生成物にかなりの程度まで悪影響を及ぼさない範囲まで含むことがある。
【００５５】
オリゴヌクレオチドプライマーは、通常核酸において見られる天然の複素環塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニン及びグアニン）、並びに修飾塩基及び塩基類似体を含んでもよい。標的配列に対する前記プライマーのハイブリダイゼーションに適合するあらゆる修飾塩基又は塩基類似体が本発明の実施において有用である。
【００５６】
当該プライマーの糖又はグリコシド部分は、デオキシリボース、リボース、及び／又はこれらの糖の修飾型、例えば２’−Ｏ−アルキルリボースを含んで成ることもある。好ましい態様において、糖部分は２’−デオキシリボースであるが、プライマーの標的配列にハイブリダイズする能力に適合するあらゆる糖部分を使用することができる。
【００５７】
１つの態様において、プライマーのヌクレオシド単位は、当業界で周知なように、ホスホジエステルバックボーンにより連結される。追加の態様において、ヌクレオチド間の連鎖は、限定しないが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルファミン酸塩（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号）及びポリアミド（すなわち、ペプチド核酸）を含む、プライマーの特異的ハイブリダイゼーションに適合する、当業者に知られている任意の連鎖を含む。ペプチド核酸は、Nielsen et al. (1991) Science 254: 1497-1500；米国特許第５，７１４，３３１号、及びNielsen (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10:71-75に記載されている。
【００５８】
幾つかの態様において、プライマーはキメラ分子であってもよく、すなわち、複数の型の塩基又は糖のサブユニットを含んでもよく、そして／あるいは連鎖は同一のプライマーにおいて複数の型のものであってもよい。プライマーは、当業界で知られているように、その標的配列に対するハイブリダイゼーションを容易にするための部分、例えばインターカレーター及び／又はマイナーグルーブ結合物質を含んで成ることもある。
【００５９】
塩基、糖、及びヌクレオシド、及びヌクレオシド間のバックボーンの変更、及びプライマー上の任意のペンダント基の存在は、配列特異的な形式でその標的配列と結合するプライマーの能力に適合するものである。多数の構造的修飾であって、知られており、且つ発展されうるものは、これらの制限の範囲内で可能である。更に、プライマーを形成する種々の複素環塩基、糖、ヌクレオシド及びヌクレオチドの調製、並びに特定の予め決定された配列のオリゴヌクレオチドの調製のための合成方法は当業界で十分発展しており、そして周知である。オリゴヌクレオチド合成にとって好ましい方法は、米国特許第５，４１９，９６６号の教示に立脚している。
【００６０】
オリゴヌクレオチドプライマーは、特定の操作、例えばＰＣＲ、増幅された標的ポリヌクレオチドの単離等を補助し、そして容易にするであろう任意の特別な追加の部分又は配列により設計されることがある。例えば、プライマーは、標的配列に対して相補的なもの以外の配列を含んで成ることもある。そのような配列は、通常、当該プライマーにおいて標的相補配列の上流（すなわち５’側）である。例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含んで成る配列（いわゆる「リンカー」又は「アダプター」）は、プライマー内で、標的相補配列の上流に存在する場合、増幅産物のクローニング及びその後の操作を容易にする。プライマー内での包含にとって有用な他の配列には、配列決定プライマーに対して相補的なもの及びバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを特定するためのもの、が含まれる。態様によっては、プローブは部分的に一本鎖で且つ部分的に二本鎖であってもよく、ここで、当該一本鎖領域は標的ＲＮＡ配列と相補的であり、且つ当該二本鎖領域は追加の特徴、例えば制限部位、又はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含んで成るものである。
【００６１】
有利には、本発明に従うプローブは、シグナル増幅を可能にするような構造的特徴であって、例えば、Urdea et al. (Nucleic Acids Symp. Ser., 24:197-200 (1991)又は欧州特許ＥＰ−０２２５，８０７に記載の分枝鎖ＤＮＡプローブのようなものを有することがある。
【００６２】
本発明の１つの側面において、マイクロアレイプライマーは、標的ポリヌクレオチド内の注目する全領域を網羅するよう規定される。好ましくは、プライマーは、標的ＲＮＡの５’末端から多少距離が離れた下流の領域と相補的な配列を有するよう設計される。当該距離は、検出可能な標識を組み込む必要性、あるいはハイブリダイズしたプライマーと離れて逆転写された新生ＤＮＡ鎖の検出を可能にする必要性により決定される。多数のプライマーが、標的ＲＮＡにおける多型及び／又は二次構造、データの重複等を説明すべく、特定の標的ＲＮＡのために設計されうる。多数の標的ポリヌクレオチドが本発明に従い検出されうる場合、特定の標的ポリヌクレオチドに相当するそれぞれのプライマー又はプライマー群は、マイクロアレイの別個の領域内に配置される。
【００６３】
プローブは、溶液中、例えばウェル内又はマイクロトレイの表面上にあってもよく、あるいは固形の支持体に付着されていてもよい。使用されうる固形の支持体材料の例には、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル及びメンブレンが含まれる。有用な固形の支持体の型には、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーションチップ、メンブレン、結晶、セラミック及び自己集合単層が含まれる。好ましい態様は、二次元又は三次元マトリックス、例えば多数のプローブ結合部位を有するゲル又はハイブリダイゼーションチップを含んで成る(Pevzner et al., J. Biomol. Struc. & Dyn. 9:399-410, 1991; Maskos and Southern, Nuc. Acids Res. 20:1679-84, 1992)。ハイブリダイゼーションチップは、その後標的核酸とハイブリダイズされる非常に大きなプローブアレイを構築するために使用されうる。当該チップのハイブリダイゼーションパターンの解析は、標的ヌクレオチド配列の同定を補助することがある。パターンは人の手で又はコンピューターで解析されることがあるが、ハイブリダイゼーションによる位置的な配列決定自体がコンピューター解析及び自動化に役立つ。配列再構築のために開発されているアルゴリズム及びソフトウェアは、本明細書に記載の方法に応用可能である(R. Drmanac et al., J. Biomol. Struc. & Dyn. 5:1085-1102, 1991; P. A. Pevzner, J. Biomol. Struc. & Dyn. 7:63-73, 1989)。
【００６４】
２．固相支持体へのプローブのカップリング
核酸プローブは、共有結合により、例えばカップリング剤を用いた複合により、又は、共有結合又は非共有結合、例えば静電的相互作用、水素結合、抗体−抗原カップリングにより、あるいはそれらの組み合わせにより固形の支持体に付着されうる。付着の後、プローブの３’末端は、逆転写反応の間伸長のために遊離のままでなければならない。典型的なカップリング剤には、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインＡ−ＩｇＧ抗体Ｆcフラグメント相互作用、及びストレプトアビジン／プロテインＡキメラ(T. Sano and C. R. Cantor, Bio/Technology 9:1378-81 (1991))、あるいはこれらの物質の誘導体又は組み合わせが含まれる。核酸は、光開裂可能な結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合又はこれらの種々の結合の組み合わせにより固形支持体に付着されうる。アレイはまた、選択的に放出可能な結合、例えば、４，４’−ジメトキシトリチル又はその誘導体により固形支持体に付着されうる。有用であることが明らかとなっている誘導体には、３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル３又は４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−クロロメチル−安息香酸、及びこれらの酸の塩が含まれる。
【００６５】
好ましい態様において、ＤＮＡプローブは、ガラス表面に対し共有結合的に付着した第一級アルデヒド基を含む基板を用いたシッフ塩基反応により５’末端で付着する(ArrayIt(TM) SuperAldehyde Substrate, TeleChem International Inc., Sunnyvale, Calif.)。５’−アミノリンカーは、オリゴヌクレオチド合成の間に直接的にオリゴヌクレオチドを修飾することによりオリゴヌクレオチドプローブと共有結合的に付着する。表面化学に適した５’−アミノ修飾の例には、ＮＨ2（ＣＨ2）6リンカー、光開裂可能Ｃ６アミノ−モディファイヤー、及びＰＣアミノ−モディファイヤーホスホルアミド(Glen Research Corp., Sterling, Va.)が含まれる。５’−アミノリンカーは、チップ表面上のアルデヒド基とのシッフ塩基反応を介して、シリル化されたスライドに対するアミノ含有ＤＮＡの選択的な結合を可能にする。ＤＮＡ上の第一級アミノリンカーは、基板上のアルデヒド基と反応して共有結合を形成する。付着は、シッフ塩基形成へと導く脱水反応（低湿度での乾燥）によって安定化される。特異的且つ共有結合的な５’末端の付着は、遺伝子発現及び遺伝子型同定の利用のために、高度に安定しており、且つ許容される付着を提供する。５’末端による付着は、プローブの３’末端を、逆転写酵素による伸長のために遊離したままにする。
【００６６】
結合は、可逆性であるか又は強力な会合が必須であろう場合には永久なものであってもよい。尚、プローブは、アレイのプローブと固形支持体との間のスペーサー部分を介して固形支持体に付着させてもよい。有用なスペーサーには、他の又は追加のカップリングパートナーに結合するための、あるいは固形支持体に対する付着を開裂可能にするための、上述のようなカップリング剤が含まれる。
【００６７】
開裂可能な付着は、プローブと固形支持体との間に開裂可能な化学的部分、例えばオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴアクリルアミド、オリゴエチレングリセロール、約６〜２０炭素原子のアルキル鎖、及びそれらの組み合わせ、によって作り出すことができる。これらの部分は、添加される化学物質、電磁放射線又は酵素により開裂されうる。酵素により開裂可能な付着の例には、プロテアーゼにより開裂されうるペプチド結合及びヌクレアーゼにより開裂されうるホスホジエステル結合が含まれる。β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び他の還元剤のような化学物質はジスルフィド結合を開裂させる。有用であると思われる他の物質には、酸化剤、水和剤及び他の選択的に活性な化合物が含まれる。電磁放射線、例えば紫外線、赤外線及び可視光は、光開裂可能な結合を開裂する。付着は可逆性であってもよい、これには例えば熱処理又は酵素処理、あるいは可逆性の化学的又は磁気的付着を用いる。放出及び再付着は、例えば、磁場又は電場を用いて実施されうる。
【００６８】
本発明の固相支持体は、ヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び合成を補助するのに適した任意の固形材料及び構造のものでもよい。好ましくは、固相支持体は、プライマーを固定することができ、且つ逆転写酵素反応を実施することができる少なくとも１つの実質的に硬質な表面を含んで成る。固形支持体は、例えば、ガラス、合成ポリマー、プラスチック、硬くメッシュのないナイロン又はセラミックから生成されてもよい。他の適当な固形支持体材料は既知であり、そして当業者にとって容易に利用可能である。固形支持体のサイズは、ＤＮＡマイクロアレイ技術にとって有用な、標準的なマイクロアレイのサイズのものでよく、そして当該サイズは、本発明の反応を実施するために使用されうる特定の機械に適合するよう仕立てられうる。
【００６９】
ポリヌクレオチドマイクロアレイ因子が安定して会合する基盤は、種々の材料、例えばプラスチック、セラミック、金属、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメラート(polypropylfumerate)、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸、から作製されうる。基板は、二次元又は三次元の形態であってもよく、例えばゲル、メンブレン、薄膜、ガラス、プレート、シリンダー、ビーズ、磁気ビーズ、光ファイバー、及び繊維織物等であってもよい。アレイの好ましい形態は三次元アレイである。好ましい三次元アレイは、タグ付きビーズの一群である。それぞれのタグ付きビーズは、これに異なるプライマーを付着させている。タグは、シグナル伝達手段、例えば色(Luminex, Illumina)及び電磁場(Pharmaseq)によって検出可能であり、そしてタグ付きビーズ上のシグナルは、遠隔からでも検出可能である（例えば、光ファイバーを用いる）。
【００７０】
アレイは、任意の常用な方法論に従い、例えば、ポリヌクレオチドマイクロアレイ因子を予め形成させ、そして次にそれらを表面と安定的に会合させて製造されうる。多数の異なるアレイ配置及びそれらの製造方法が当業者に知られており、そして米国特許第５，４４５，９３４号（フォトリゾグラフィーによるin situ合成）、米国特許第５，５３２，１２８号（電気的分布の差異による固相検出）；米国特許第５，３８４，２６１号（機械的に方向付けられた流路によるin situ合成）；及び米国特許第５，７００，６３７号（スポッティング、プリンティング又はカップリングによる合成）において開示されており、これらの開示は、引用によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【００７１】
固形支持体は、液体を含む容器中に供されていてもよく、あるいはその一部であってもよい。例えば、固形支持体は、当該支持体上で逆転写反応を含むことができるように、固形支持体の縁に沿って密封を作り出す側面を有するチャンバー内に据えられることがある。具体例において、当該チャンバーは、逆転写反応混合物が支持体上に留まることを保証し、そして更には当該プライマーを供するのに有用な全表面を生成するために、長方形の支持体の各側面に壁を有してもよい。
【００７２】
逆転写プライマーは、当該プライマー用の固形支持体（基板）に、捕獲され(Synen et al. Nucleic Acids Res. 14:5037 (1986))、接着され、又は共有結合的にカップリング（例えば、シッフ塩基形成によるもの）されてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、固形支持体上の特定の位置にオリゴヌクレオチドを固着し(fix)、固定し(immobilize)、供し、そして／あるいは適用するのに利用可能な任意の手段を用いて、固形支持体表面に貼り付けられ(affixed)、固定され、供され、そして／あるいは適用される。例えば、フォトリゾグラフィー(Affymetrix, Santa Clara, CA)は、引用により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９１９，５２３号、米国特許第５，８３７，８３２号、米国特許第５，８３１，０７０号及び米国特許第５，７７０，７２２号、に記載のような、チップ又は固形支持体の特定の位置にオリゴヌクレオチドプライマーを適用するために使用されうる。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、Brown及びShalonの米国特許第５，８０７，５２２号（１９９８）に記載のような固形支持体に適用されうる。更に、プライマーは、ロボットシステム、例えばGenetic MicroSystems (Woburn, MA)、GeneMachines (San Carlos, CA)又はCartesian Technologies (Irvine, CA)により製造されているものを用いて固形支持体に適用されうる。
【００７３】
あるいは、独特の遺伝子特異的配列及び標準的な配列を含んで成るポリヌクレオチドマイクロアレイ因子は、化学的カップリング手順及びインクジェット利用装置を用いて、引用によってその全体が本明細書に組み入れられるＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６(Baldeschweiler et al.)に記載のように基板の表面上で合成されうる。別の側面において、ドット（又はスロット）ブロット類似の「グリッド(gridded)」アレイは、ｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、基板表面に対して、真空系、熱、ＵＶ、機械的又は化学的な結合手順を用いて配列させ、そして連結させるために使用されうる。アレイは、手作業で、又は利用可能な機器（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（任意の適当な固形支持体）、及び機械（ロボット系の器具を含む）を用いることによって製造されることもあり、そして例えば、８，２４，９６，３８４，１５３６又は６１４４のオリゴヌクレオチド、あるいは市販の器具類の効率的な使用に適する２〜１００万の間のその他の多数のオリゴヌクレオチドを含むことがある。
【００７４】
ビーズをＤＮＡにカップリングさせるための別の方法は、ビーズに付着したリガンド結合分子に当該ＤＮＡの末端を付着させた特定のリガンドを使用する。可能性のあるリガンド結合パートナーの対には、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、又は種々の抗体／抗原の対、例えば、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体が含まれる(Smith et al., "Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA Molecules by Using Magnetic Beads," Science 258:1122-1126 (1992))。
【００７５】
支持体に対するＤＮＡの共有結合的な化学的付着は、当該ＤＮＡ上の５’−リン酸を、コーティングされたミクロスフェアに対し、ホスホアミド酸結合を介して連結させるために用いる標準的なカップリング剤によって達成されうる。固形状の基板に対するオリゴヌクレオチドの固定方法は十分に確立されている。Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026 (1994)を参照のこと。オリゴヌクレオチドを固形状の基板に対して付着させる好ましい方法は、Guo et al., Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994)に記載されている。固定は、in situ ＤＮＡ合成(Maskos and Southern, Nucleic Acids Research, 20:1679-1684 (1992))によって、又は化学合成されたオリゴヌクレオチドの共有結合的な付着(Guo et al.,上記)のいずれかによって、ロボットによるアレイ技術と組み合わせて達成されうる。
【００７６】
３）発現レベルの調節
発現レベルの調節は、生物学的試料中の構成的に発現した遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。発現レベルの調節は、細胞の全体的な健康及び代謝活性について調節するよう設計される。発現レベルの調節と標的核酸の発現レベルとの共変動は、遺伝子の発現レベルにおいて測定される変化又は変動が、その遺伝子の転写率に起因するのか、又は細胞の健康の一般的な変動に起因するのかを示唆する。従って、例えば、細胞が不健康であるか、又は必須の代謝物を欠いている場合、活性な標的遺伝子及び構成的に発現する遺伝子の両方の発現レベルが低下すると予測される。その逆も真である。従って、発現レベル調節遺伝子と標的遺伝子の両方の発現レベルが同時に低下又は増大するような場合、その変化は、概して細胞の代謝活性の変化によると思われ、そして標的遺伝子のディファレンシャルな発現によるものではないと思われる。反対に、標的遺伝子及び発現レベル調節遺伝子の発現レベルが同時に変動しない場合、標的遺伝子の発現レベルの変動は、その遺伝子の発現の差異に起因し、そして細胞の代謝活性の全体的な変動には起因しない。
【００７７】
事実上あらゆる構成的に発現する遺伝子が、発現レベルの調節に適した標的を提供する。典型的に、発現レベル調節プローブは、構成的に発現する「ハウスキーピング遺伝子」、例えば限定しないが、ベータアクチン遺伝子、トランスフェリン受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のサブ配列に相補的な配列を有する。
【００７８】
本発明の目的のため、標的ポリヌクレオチドはＲＮＡである。標的ポリヌクレオチドの例には、限定しないが、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ及びウイルスＲＮＡが含まれる。ｍＲＮＡ標的ポリヌクレオチドは、逆転写酵素によって媒介される増幅のための鋳型として直接的に使用されうる。それぞれの固定されたプライマー部位から派生する鎖の伸長の完了の後、ハイブリダイズしたＲＮＡの鋳型鎖は、例えばＲＮアーゼＨにより、固相支持体に貼り付けられた新生の相補的ＤＮＡ鎖を残して破壊されうる。第二のプライマー（特異的か又は普遍的なもの）は、液相中に存在する場合、第一の新生ｃＤＮＡ鎖は別の新生鎖を合成する鋳型としての役割を果たし、それによりそれぞれの固定されたプライマー部位で二本鎖新生ＤＮＡ分子を形成し、又は２つの固定されたプライマーに結合する。
【００７９】
本発明の多数の標的ポリヌクレオチドは、１つの単一の生物学的供給源、又は、その代わりに、多数の生物学的供給源、例えば異なる種又は組織に由来してもよい。例えば、健康な固体から単離された標的ポリヌクレオチド集団は、注目の疾患を有する患者から単離された別の標的ポリヌクレオチド集団との１つの逆転写酵素反応において、上文で詳述したような当業界で知られている検出方法により２つの供給源の増幅産物の識別を可能にするであろう条件下で混合されうる。従って、本発明は、標的ポリヌクレオチドの異種間の比較解析に使用されうる。
【００８０】
検出可能標識
標的ＲＮＡの検出は、プライマー／プローブに対するハイブリダイゼーションによりアレイ中の部位上で捕獲された標的ＲＮＡの逆転写によって生成したポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを検出することにより実施される。逆転写されたｃＤＮＡ第一鎖は、プライマー／プローブの伸長によって形成され、そして伸長されたｃＤＮＡ鎖は、放射性同位体、化学発光化合物、重金属原子、分光学的マーカー、磁気マーカー、連結された酵素、蛍光標識等で標識されうる。１つの態様において、ｄＮＴＰは、合成されたｃＤＮＡ鎖が標識されるように標識される。標識された部分は、シグナル産生系のメンバーを含んで成り、そしてその結果、直接的に又はシグナル産生系の１又は複数の追加のメンバーと組み合わせて、検出可能である。直接的に検出可能な標識の例には、通常共有結合により、ヌクレオチドモノマー内に取り込まれた同位体及び蛍光部分が含まれる。注目の同位体標識には、32Ｐ，33Ｐ，35Ｓ，3Ｈ，14Ｃ，125Ｉ等が含まれ、そして非同位体標識には、ビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデスオキシウリジン、フルオレセイン等が含まれる。標識は、当業界で周知の手順、例えば非同位体的方法による直接的又は間接的に検出可能なマーカーにより、例えば質量分析標識、蛍光色素又は酵素を介して、あるいは核酸フラグメントを免疫化学的に検出可能にする種々の化学的修飾により、あるいは他の親和性反応により導入されうる。
【００８１】
注目の蛍光部分又は標識には、クマリン及びその誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン；bodipy色素、例えばBodipy FL、Cascade blue；フルオレセイン及びその誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン；ローダミン色素、例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン及びエリスロシン(erythrosin)；シアニン色素、例えばＣｙ３及びＣｙ５；ランタニドイオンの大環状錯体、例えば、quantum dye（商標）；及び蛍光エネルギー転移色素、例えばチアゾールオレンジ−エチジウムへテロダイマー、ＴＯＴＡＢ、等が含まれる。蛍光標識は、色素を有しているヌクレオチドとして直接的に導入されうるか、あるいは取り込まれたビオチンを含むヌクレオチドに対し色素−ストレプトアビジン複合体を用いて増幅後に結合されうる。蛍光定量的な標識の場合、前記方法は、典型的に励起の最大値付近の光のインプットを使用し、そして発光の最大値付近（±約１０ナノメーターが多くの場合に許容される）のものを集める。レーザーを用いると、励起は励起の最大値から離れて生じることがある。態様によっては、蛍光標識は、２５０ｎｍ超の波長、好ましくは約３５０ｎｍ超の波長の光を吸収し、且つ当該吸収波長より高い約１０ｎｍの波長の蛍光を発するよう選択される。蛍光標識は、例えば、フルオレセイン（４８８ｎｍの吸収最大値）、ジクロロフルオレセイン（５２５ｎｍの吸収最大値）、ヘキサクロロフルオレセイン（５２９ｎｍの吸収最大値）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）（５３０ｎｍの吸収最大値）、ＲＯＸ（５５０ｎｍの吸収最大値）、テトラメチルローダミン（５５０ｎｍの吸収最大値）、ローダミンＸ（５７５ｎｍの吸収最大値）、Ｃｙ２（商標）（５０５ｎｍの吸収最大値）、Ｃｙ３（商標）（５５０ｎｍの吸収最大値）、Ｃｙ５（商標）（６５０ｎｍの吸収最大値）、Ｃｙ７（商標）（７５０ｎｍの吸収最大値）、ＩＲＤ４０（７８５ｎｍの吸収最大値）、等であってもよい。Smith et al. (1986) Nature 321: 647-649を参照のこと。逆転写産物を標識するのに有用なヌクレオシド又はヌクレオチドの蛍光複合体は米国特許第６，３４０，７６７号(Bazin et al.)に記載されており、これは引用によって本明細書に組み入れられれる。
【００８２】
標識はまた、シグナル産生系のメンバーであって、検出可能なシグナルを提供するために前記系の１又は複数の追加のメンバーと協調して働くものであってもよい。そのような標識の例示としては、特定の結合対のメンバー、例えばリガンド、例えばビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価の陽イオン、キレート剤のグループ等であり、ここで、当該メンバーはシグナル産生系の追加のメンバーに特異的に結合し、ここで、追加のメンバーは、直接的又は間接的に検出可能なシグナル、例えば、蛍光部分と複合した抗体、又は基質を色素生産性産物に変換することができる酵素的部分、アルカリホスファターゼ複合型抗体、を提供する。標識は、続いて、Coutlee, et al., J. Clin. Microbiol. 27:1002-1007 (1989)に記載のように比色分析又は化学発光によって検出される。１つの態様において、結合型のアルカリホスファターゼは、Lumi-Phos（商標）S30試薬(Lumigen, Detroit, Mich)のような試薬による化学発光により、E/Lumina（商標）照度計(Source Scientific Systems, Inc., Garden Grove, Calif.)を用いて検出される。各ＲＮＡ試料につき、１つが同一の標識で標識されたｃＤＮＡを生成する。
【００８３】
特に有用な標識は、酵素、酵素基質、フルオロフォア、放射性同位体化合物、発色団、磁気応答性の化合物、抗体エピトープ含有化合物、ハプテン等である。例えば、標識は、熱量測定によるものであっても(calorimetric)、放射性、化学発光、酵素的又は蛍光性のものであってもよい。例えば、SYBR Green II(Molecular Probes Co., Ltd.)は、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ鋳型の分解後の一本鎖ＤＮＡの検出に有用なことがある。他の一般的に使用される色素には、臭化エチジウム、チアゾールオレンジ、ビス−ベンズイミド(Hoechst 33258, Hoechst AG)及びアクリジンオレンジが含まれる。
【００８４】
標識はまた、リンカーを介して間接的に付着されうる。本発明の実施において有用なリンカーは、結合性のリガンドの核酸に対しての効率的な結合及びそれらに付着する標識の機能を促進するよう特異的に設計される。リンカーの使用は、米国特許第４，５８２，７８９号及び第５，０２６，８４０号に一般的に説明されている。
【００８５】
標的ＲＮＡの検出
標的及びプローブは、ポリヌクレオチドプローブを固定する方法であって：固形支持体表面と安定して会合するプローブとポリヌクレオチド標的とを組み合わせる段階であって、ここで、当該プローブと標的は相補的な鎖を含んで成り、当該プローブと標的とがハイブリダイズし、そして標的ＲＮＡがそれにより固定化される条件下で組み合わせる段階；ハイブリダイズしたプローブを逆転写酵素で伸長させる段階、及び逆転写産物を検出する段階、を含んで成る方法、において使用される。
【００８６】
特定の態様において、当該方法は更に、固定されたプローブを、熱安定性逆転写酵素を用いて増幅させる段階、を含んで成る。別の特定の態様において、当該方法は更に固定されたプローブを増幅し、そして次にその結果として増幅されたプローブを検出する段階、を含んで成る。
【００８７】
適当なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、そしてManiatis等（上記）によりＷＯ９５／２１９４４において概説されている。インキュベーション条件は、正確な相補的マッチ又は種々のやや低度の相補性で生じるよう調節される。プライムしたＲＮＡの逆転写を介した第一鎖のｃＤＮＡ合成に必要な種々の試薬及び緩衝液は、限定しないが、Sigma, Life Technologies, Amersham, Boehringer-Mannheimを含む種々の供給源から商業的に購入されうる。第一鎖の合成に適した緩衝液は、緩衝化物質、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ−Ｋであって、典型的に１０〜１００μＭに及び、且つ６〜９のｐＨ範囲を支持する濃度のもの；０〜２００ｍＭの濃度の一価の塩、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ等；１〜１０ｍＭの濃度の二価の塩、例えばＭｇＣｌ2、Ｍｇ（ＯＡｃ）2、ＭｎＣｌ2、ＺｎＣｌ2等；及び追加成分、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、洗剤、アルブミン、グリセロール等、を含んで成る。試薬混合物の条件は、効率的な第一鎖の合成を促進するために選択される。典型的には、プライマーセットは最初に、５０℃〜９５℃にわたる上昇した温度でＲＮＡ試料と組み合わされ、これに０〜６０℃への温度低下が続く。このことは、当該プライマーが、試料中のそれらの対応するＲＮＡと特異的にアニーリングすることを保証する。アニーリング段階の後、プライムされたＲＮＡは、プライムしたＲＮＡの逆転写及び第一鎖の合成を促進するのに十分な条件ｄＮＴＰ及び逆転写酵素と組み合わされる。検出可能な標識は、第一鎖ｃＤＮＡに取り込まれる。態様によっては、スキャナーが検出又は可視化に使用され、蛍光又は使用する任意な他の検出可能標識のレベル及びパターンが決定される。検出系は、別個の配列全てについてのハイブリダイゼーションの不在、存在、及び量を同時に測定するために使用されうる。
【００８８】
ハイブリダイゼーションパターンの検出又は可視化において、核酸プローブに対する標識の強度又はシグナル値、及びスタンダードの配列プローブ由来の異なる標識の強度又はシグナル値が得られる。スタンダードの配列に相当する強度又はシグナル値は、当該実験におけるハイブリダイゼーションの総量又は単価を表し、且つコントロールの役割を果たす。マイクロアレイの各因子についてのシグナルは測定され、そして前記単価と比較される。スタンダードの標的に由来するシグナルは因子特異的なコントロールとなり、これに対しプローブからのシグナルが較正され、そして数値的に調節されうる。従って、本発明はマイクロアレイの各因子に対する定量的情報を提供する。本発明の別の利点は、１又は複数のプローブ配列及びスタンダードの配列に対する標的配列のハイブリダイゼーションが競合的でなく、それにより結果のノイズが低下することがである。
【００８９】
ハイブリダイゼーションパターンは、ハイブリダイゼーションパターンを生成させるためにアレイと接触された試料中の核酸の遺伝的プロファイル、並びに、標識された核酸の由来となった生理学的供給源、についての定量的情報を決定するために使用されうる。このデータは、試料の核酸の由来となった生理学的供給源についての情報、例えば生理学的供給源である組織又は細胞において発現する遺伝子の型、並びに各遺伝子の、特に定量的観点における発現レベル、を提供する。
【００９０】
本発明の方法は、２又はそれ以上の生理学的供給源由来の核酸試料を比較して、パターン間の差異を同定且つ定量し、それにより比較される生理学的供給源における特定の遺伝子のディファレンシャルな発現についての情報を提供する。従って、本発明の方法は、罹患組織及び正常組織の解析、異なる組織又は副次的な組織(subtissue)の型の解析等のためのディファレンシャルな遺伝子発現アッセイにおける用途を見出す。従って、このデータは、試料間の配列の突然変異、変異体、又は多型についての大規模な相関研究について使用されうる。
【００９１】
別の態様において、スタンダードのポリヌクレオチド配列は、調節された化学量論により別個のポリヌクレオチドを含む試料中にドープされる。スタンダードの配列及び別個のポリヌクレオチドは、その結果共有結合的に付着しない。スタンダードの配列、好ましくはマイクロアレイ因子の配列とは異なる配列を有するものは、既知の量で存在し、そして、その結果その後の解析における較正物質として使用することができる。当該方法において、マイクロアレイの製作における使用のためのポリヌクレオチド含有試料は、スタンダードの配列でスパイクされる。スタンダードの配列は、基準化のコントロールとしての役割を果たす。遺伝子及びスタンダードの配列由来のポリヌクレオチドを含む試料は、続いてマイクロアレイ上に蒸着され、標識された試料及び別々に標識されたスタンダードのプローブとハイブリダイズされ、そして上述のようにハイブリダイゼーションパターンが解析される。
【００９２】
逆転写が適切な標識試薬の存在下で完了した後、標識された標的のポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上の独自のプライマー位置のそれぞれで検出されうる。標識された標的ポリヌクレオチドの検出は、標識された配列を検出するために使用される標準的な方法であって、例えば増幅され、又は新規に合成されたＤＮＡ鎖内に取り込まれた標識を検出することを含む方法によって実施されうる。従って、例えば、蛍光標識又は放射性標識は直接的に検出されうる。他の標識技術は、鎖の合成の間にＤＮＡ内に取り込まれるビオチン又はジゴキシゲニンのような標識が、標識されているか又は標識された分子自体に結合することができる抗体又は他の結合分子（例えば、アビジン、ストレプトアビジン）によって検出される、例えば、標識された分子は、蛍光分子（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド及びローダミン）と複合しているか、又は酵素で活性化可能な分子と複合した抗ストレプトアビジン抗体又は抗ジゴキシゲニン抗体であってもよい。新規に合成された分子上の標識がどのようなものであっても、そして当該標識がＤＮＡ内で直接的に存在していようが、あるいはＤＮＡに結合する（又はＤＮＡに結合する分子に結合する）分子に複合されていようが、当該標識（例えば、蛍光、酵素、化学発光、測熱によるもの）は、標識に依存してレーザースキャナー又はＣＣＤカメラ、あるいはＸ線フィルムによって、あるいは特定の標識を検出するための任意な他の適切な手段によって検出されうる。
【００９３】
標的ＲＮＡは、標識されたヌクレオチド（例えば直接的な標識のためのｄＮＴＰ蛍光標識；間接的な標識のためのｄＮＴＰ−ビオチン又はｄＴＮＰ−ジゴキシゲニン）を用いることによって検出され、これらはこの過程の間に逆転写されたＤＮＡ内に取り込まれる。間接的に標識されたＤＮＡの場合、検出は蛍光又は他の酵素と複合されたストレプトアビジン又は抗ジゴキシゲニン抗体によって実施される。この方法は、ＲＮＡ標的の新規に逆転写された相補体に取り込まれた標識を検出することによる標的の検出を利用する。この目的のために、重合化されるようにＤＮＡ内に取り込まれうるあらゆる標識を使用することができ、例えば、上述し、且つ当業界で知られているようなフルオロ−ｄＮＴＰ、ビオチン−ｄＮＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＮＴＰである。溶液中１又は複数のプライマーを用いて実施される逆転写は、伸長されたプライマーを検出することにより固形支持体上の位置にある増幅された標的を検出するための選択肢を提供する。従って、複数のプライマーが使用される場合、異なる供給源由来の標的鎖は固形支持体上で別々に検出されうる。
【００９４】
ディファレンシャルな発現系において、異なる生物学的供給源から誘導される逆転写産物は、増幅鎖をそれらの起源に基づいて別々に標識することにより検出されうる。１つの側面において、標識は、ディファレンシャルな発現の比較についての全体的な感度が増強されるように、逆転写の間に新生鎖内に取り込まれる。
【００９５】
ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の検出
プライマーに対するハイブリダイゼーションによりマイクロアレイ上に固定された標的ＲＮＡの逆転写により生成された産物は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖である。好ましくは、ＲＮアーゼＨネガティブな逆転写酵素の使用は、生じたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを安定化させる。蛍光技術も核酸ハイブリッドの検出のために知られている。米国特許第５，６９１，１４６号は、標的核酸配列とハイブリダイズしない限り蛍光消光している蛍光ハイブリダイゼーションプローブの使用を記載している。米国特許第５，７２３，５９１号は、標的核酸配列に対してハイブリダイズするまで、あるいは当該プローブが消化するまで蛍光消光している蛍光ハイブリダイゼーションプローブを記載している。
【００９６】
以下の引用文献は、ＤＮＡにインターカレートする蛍光二量体及びそれらの物理的特性を記載している：Gaugain et al., Biochemistry 17, 5071-5078, 1978; Gaugain et al., Biochemistry 17, 5078-5088, 1978; Markovits et al., Anal. Biochemistry 94, 259-269, 1979; Markovits, Biochemistry 22, 3231-3237, 1983; 及びMarkovits et al., Nucleic Acids Res. 13, 3773-3788, 1985。核酸への種々のインターカレート化合物のインターカレートは、Berman and Young, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. (1986) 10:87-224に概説されている。色素とＤＮＡ又はＲＮＡとの電気泳動上での臭化エチジウムの保持は、Angemuller and Sayavedra-Soto, Biotechniques 8, 36, 1990 and Rosen and villa-Komaroff, Focus 12, 23, 1990に記載されている。
【００９７】
用途が見出されている多環式化合物には、フェナントリジン、アクリジン、ポルフィリン、フェニルインドール、及びビスベンズイミドが含まれる。用途が見出されているこれらの化合物の誘導体には、ビス−（３，８−ジアミノ−６−ヒドロキシ−６−フェニル−５，６−ジヒドロフェナントリジン、ジ−（７−ヒドロピリドカルバゾール）、テトラアクリジニルアミン、ヘキサ−アクリジニルアミン、チアゾールオレンジニ量体、５−（１１−（２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアクリジニル）−（４，８−ジアザウンデシル）−３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナン−トリジニウムクロリド等が含まれる。
【００９８】
化合物はアルキレンポリアミンから調製することができ、ここで、当該アルキレン基は、２〜１０、通常２〜６の炭素原子のものであり、且つハロアルキル又は擬ハロアルキル(pseudohaloalkyl)で置換された蛍光多環式化合物、例えばフェナントリジン又はアクリジン、であり、これらは第三級又は第四級アミノ基の提供のために、置換されることもあり、又は置換されないこともある。前記アミノ基は、任意な常用のアルキル化剤により、蛍光化合物との反応前又は反応後のいずれかに第四級化されることがあり、あるいは最初に第三級としてアルキルアミンを用いて調製されることもあり、ここで、当該アルキル基は約１〜６、通常１〜３の炭素原子のものであろう。化合物の例示としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”，−ペンタメチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（３，８−ジアミノ−６−ヒドロキシ−６−フェニル−５，６−ジヒドロフェナントリジン）がある。
【００９９】
ヘテロ二本鎖は、別の分子に対する結合手段を提供するはずである。これは、標識が用いられる様式に依存して、広範な方法で達成することができる。例えば、ヘテロ二本鎖は、、ビオチンと複合したヌクレオチド、１又は複数のビオチンを含むことがあり、ここで、当該ビオチンは、アビジン又はストレプトアビジン（以降いずれも「アビジン」として言及する）に結合する。ビオチンは、手順、条件等に依存して、ヌクレオチドにつき１個のビオチンから、ヌクレオチドの０．１％へと変化することがある。あるいは、任意の分子が用いられることもあり、特に、注目の試料中で遭遇しそうにない小有機分子（約２ｋＤ未満）であって、これと特異的に結合する特異的な受容体又は抗体、特にモノクローナル抗体、を有するものである。従って、チロキシン、副腎皮質ステロイド、エストロゲン、レチノイン酸、マンノース等もそのような分子と特異的に結合するタンパク質と共に使用されうる。あるいは、抗体が製造されている合成分子、例えば２，４−ジニトロフェニル、バルビツール酸塩、ホスファチジルコリン等も用いられることがある。これらの分子は、内部又は末端のヌクレオチドに連結することによって、常用の自動的手段に従い合成されるＤＮＡの合成の間に含まれることがあり、あるいは、利用可能なヒドロキシル又はアミノ基のいずれかに連結することによってＤＮＡの合成後に添加されることがある。
【０１００】
本発明に従い二本鎖核酸の濃度を更に測定するために、前記の物質は４’、６−ジアミノ−−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）、チアゾールオレンジ、ビスベンズアミド（Hoechst 33258、Hoechst AGの製品）及びアクリジンオレンジであってもよい。尚、ＳＹＢＲグリーンＩ(Molecular Probes Co., Ltd.)も含まれる。
【０１０１】
ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕによる増幅
本発明の１つの態様において、逆転写によって生成するｃＤＮＡ鎖は、ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕによって更に増幅される。ＰＣＲのために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施に必要な試薬と混合された適切な標的ポリヌクレオチドを含んで成る反応混合物は、固形の支持体上にそれぞれ固定されたｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと接触して据えられる。適切な標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ鋳型の逆転写によって生成する一本鎖ｃＤＮＡ、又は、ＰＣＲ増幅が逆転写検出反応と連結される場合にはｍＲＮＡ試料、であってもよい。反応混合物は、標的の鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖の合成を容易にするために酵素、例えばポリメラーゼを含む。適当なポリメラーゼには、熱安定性ポリメラーゼ酵素、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び熱安定性逆転写酵素が含まれる。反応混合物はまた、ポリメラーゼ連鎖反応の間に、増幅産物がＰＲＣＲ後に固形の支持体上で検出されるように新生鎖内に取り込むことができる標識分子を含むことがある。当該標識は、当業界で周知の方法に従い、直接又は間接的に検出されうる。
【０１０２】
ＰＣＲを実施するための試薬がマイクロアレイ上に固定されたプライマーと接触した後、当該マイクロアレイは、例えば自動化されたシステム、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ機器を用いて、ＰＣＲが行われるのを容易にする条件下に据えられる。ＰＣＲ手順の反応条件は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ機器のマニュアルにより推奨されているようなものであってもよく、そして、使用する鋳型の性質又はプライマーと鋳型のハイブリダイゼーションで予想されるあらゆる他の困難性を考慮して適宜変更されうる。温度及びサイクル数は、プライマーの選択及び鋳型配列、及び任意な他の関連因子、を考慮して、推奨されているように、そして必要に応じて選択されうる。マイクロアレイ上でのｉｎ  ｓｉｔｕ型のＰＣＲ反応は、本質的に、例えばEmbretson et al, Nature 362:359-362 (1993); Gosden et al, BioTechniques 15(1):78-80 (1993); Heniford et al Nuc. Acid Res. 21(14):3159-3166 (1993); Long et al, Histochemistry 99:151-162 (1993); Nuovo et al, PCR Methods and Applications 2(4):305-312 (1993); Patterson et al Science 260:976-979 (1993)に記載のように実施されうる。
【０１０３】
検出キット
更に提供されるものとして、本発明を実施するためのキットがあり、当該キットには、プライマー−プローブ因子が別個のヌクレオチド配列及びスタンダードのポリヌクレオチド配列を含むように製作された１又は複数のマイクロアレイ、当該スタンダードの配列に対する標識されたスタンダードの相補体、及び対象の方法を実施するための教材、が含まれる。当該キットは更に、対象の発明の遺伝子発現を実施するのに必要な１又は複数の追加の成分を含んでもよく、ここで、そのような追加の成分には、酵素、例えばポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等が含まれる。当該キットは、例えば他の方法では固形の支持体上で検出することが困難な多数の標的ポリヌクレオチドを検出するための材料及び試薬を含んでもよい。当該キットは、例えば固形の支持体、標的ポリヌクレオチドの特異的集合のためのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ連鎖反応試薬及び成分、例えば、ＤＮＡ合成のための酵素、標識材料、並びに洗浄のための緩衝液及び試薬、を含んでもよい。当該キットはまた、固形の支持体上で特異的な標的を増幅するための当該キットの使用のための説明書を含むことがある。当該キットが、固形の支持体上にプライマーセットが既に固定されている調製済みの固形の支持体を含む場合、そのような固形の支持体は、消費者が検出することを望む標的ポリヌクレオチドに依存して、個々のキットについて特注されてもよい。当該固形の支持体は、当該固形の支持体上の指定された位置に貼り付けられたプライマーを提供する。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：細胞からの標的ＲＮＡの単離
細胞はしばしば、後期の対数増殖期に収集される。ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン法(Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem. 162(1): 156-159 (1987))によって単離される。ＲＮＡ単離後、核酸はエタノール沈殿される。沈殿物は遠心によりペレット化され、そして水で再溶解される。再溶解された核酸は、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩ(Boehringer Mannheim, Inc.)を用いて、取扱説明書に従い消化され、続いてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で有機抽出され、そしてエタノールで再沈殿される。
【０１０５】
ＤＮアーゼＩ処理したＲＮＡは、続いて遠心によりペレット化され、そして水に再溶解される。溶液中のＲＮＡの純度及び濃度は、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長での光学密度を決定することにより推定される(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989))。当該ＲＮＡの少ないアリコートを、ゲル電気泳動により、３％ホルムアルデヒドゲルにおいて、ＭＯＰＳ緩衝液(Sambrook et al.,上記)を用いて分離し、それにより、濃度の推定を確認し、そしてリボソームＲＮＡが無傷であったか否かを決定する。このＲＮＡを全細胞ＲＮＡと称する。
【０１０６】
実施例２：シッフ塩基形成による基板に対するプローブの付着
SuperAldehyde（Arraylt（商標））表面に対して一本鎖核酸及び二本鎖核酸をプリントし、そして付着させるためのプロトコールは、基板表面上で反応性アルデヒドとシッフ塩基共有結合を形成する第一級アミンで修飾されたＤＮＡを使用し：（１）最初に、Ｃ６アミノ修飾(Glen Research)が各オリゴヌクレオチドの５’末端に付着し；（２）アミノ連結ＤＮＡを１倍Micro-Spotting Solution Plus (TeleChem)中で再懸濁し；（３）アミノ連結ＤＮＡをSuperAldehyde基板（Arraylt（商標））上にStealth Micro-Spotting Pin (TeleChem)を用いてプリントし；（４）基板を１２時間室温（〜２５℃）、３０％の相対湿度で乾燥させ；（５）基板を２回０．２％ＳＤＳ中で２分間室温で激しく振とうしながらすすいで結合しなかったＤＮＡを除去し；（６）基板を２回脱イオン水中で２分間室温で激しく振とうしながらすすぎ；（７）基板を９５〜１００℃の脱イオン水中に２分間移し、ＤＮＡを変性させ；（８）基板を室温で〜５分間冷却させ；（９）基板を水素化ホウ素ナトリウム溶液で５分間室温で処理して、遊離アルデヒドを減らし（水素化ホウ素ナトリウム溶液を調製するためには、１．５ｇのＮａＢＨ4(Sigma)を４５０ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、続いて１３３ｍｌの１００％エタノールを添加して泡立ちを減らし、そして使用直前に調製する）；（１０）基板を３回０．２％ＳＤＳ中で１分間それぞれ室温ですすぎ；（１１）基板を１回脱イオン水中で１分間室温ですすぎ；（１２）プリントされた基板を５００ｘｇで１分間の遠心により乾燥させる。処理された基板は、適切な条件下で保存した場合、１年間室温で安定である。プリントされたマイクロアレイは、続いて標的ＲＮＡ試料と反応させられる。マイクロアレイ反応は、カバースリップ１ｃｍ2あたり２．０μｌの体積でガラスのカバースリップのもと最も良く実施される。核酸のハイブリダイゼーション反応のために、緩衝液は典型的に５ｘＳＳＣ又は６ｘＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳを含み、且つ標的及びプローブの性質に依存して３７℃〜６５℃で実施される。
【０１０７】
実施例３：マイクロアレイ上での逆転写
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）は、第一鎖ｃＤＮＡの合成段階に使用される。適当なＤＮＡポリメラーゼの例には、好熱性細菌、古細菌、レトロウイルス、酵母、ニューロスポラ、ショウジョウバエ、霊長類及びげっ歯類を含む生物由来のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１０８】
全細胞ＲＮＡを用いて実施される研究は、LiangとPardeeのディファレンシャルディスプレープロトコール(Science, 257:967-970 (1992))に従う。態様によっては、それらは、非同位体逆転写酵素反応産物の検出のために５’ビオチン化プライマーを用いることにより修飾される。これらの研究において、０．２μｇの全細胞ＲＮＡが、本発明によるアンカープライマー／プローブを用いた逆転写のためにプライムされる。逆転写は、２００ユニットのＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）の逆転写酵素(GIBCO/BRL)を用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、１μＭのアンカープライマー及び１Ｕ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤の存在下で実施される。反応混合物を室温で１０分間、続いて３７℃で５０分間インキュベートする。逆転写後、酵素は６５℃に１０分間加熱することにより変性される。
【０１０９】
逆転写酵素は、相補ＤＮＡ鎖を合成するためにＤＮＡプライマー及びＲＮＡ鋳型を必要とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。長いｃＤＮＡ鎖の合成の場合、標準的な逆転写酵素（ＲＴ）の迅速なプロセッシブ(processive)活性が、必要とする長さを生成するのに必須である。プロセッシブなＲＴ酵素は、ｃＤＮＡの第一鎖へのＲＮＡの逆転写を実施する酵素である。伝統的には、そのようなＲＴ酵素には、ＭＭＬＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ及び様々なそれ以外のものが含まれる。更に最近では、より低温域であっても、完全長ｃＤＮＡの産生が優れている幾つかのプロセッシブな酵素が開発されている。例えば、ＭＭＬＶ遺伝子は、内因性ＲＮアーゼＨ活性を排除するために突然変異されており、そしてSuperscript RT(Gibco-BRL)と称されるこの修飾された酵素は、完全長ｃＤＮＡの産生に優れている。Superscript（商標）ＩＩ  ＲＮアーゼＨ-逆転写酵素（米国特許第５，２４４，７９７号。これは引用によって本明細書に組み入れられる）は、モロニーマウス白血病ウイルスのpol遺伝子を含むＥ．コリからほぼ均質になるまで精製される。当該酵素は第一鎖を合成するために使用され、そして一般的に、他の逆転写酵素と比べてより高収率のｃＤＮＡ及びより完全長の産物をもたらす。ＭｏＭＬＶ  ＲＴは、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素よりも弱い固有のＲＮアーゼＨ活性を有する。ＡＭＶ逆転写酵素は、高温（４２〜５０℃）で活性を有する。ＲＮアーゼＨ活性を欠く逆転写酵素は態様によって好ましいことがあるが、本発明の方法は、ＲＮアーゼＨ-逆転写酵素を必要としない。
【０１１０】
実施例４：熱安定性ＲＴを用いた逆転写
本発明の１つの態様において、熱安定性逆転写酵素（ＲＴ）は、一連の変性及び再生段階を通じて検出可能な一群のリニア増幅に使用される。更に、熱安定性ポリメラーゼの使用は、高温で逆転写を起こしてＲＮＡの二次構造の効果を軽減させ、そしてそれにより追加の検出可能標識の取り込みを可能にする。
【０１１１】
熱安定性ＲＴ酵素は、種々の起源から発生している。米国特許第６，４０６，８９１号(Legerski)を参照のこと。熱安定性酵素とは、標準的なＲＴ酵素で使用されるものより高い温度で、ｃＤＮＡの第一鎖へのＲＮＡの逆転写を実施する酵素である。約５５℃〜約９０℃に及ぶ温度の最適条件を有する多数のＲＴ酵素が存在している。例えば、RetroAmp（商標）は７０℃以上の温度で働く。
【０１１２】
Retrotherm（商標）RT (Epicentre technologies)は、同じ条件下でＲＮＡ−及びＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有し、そしてＲＮアーゼＨ活性を有さない。RetroAmp（商標）RT DNAポリメラーゼ(Epicentre technologies)は、高性能な熱安定性酵素である。Thermoscript（商標）(Gibco-BRL)は、ＲＴ−ＰＣＲを改善するための高温でのｃＤＮＡ合成にとって有用であることが証明されているトリ逆転写酵素である。GeneAmp熱安定性rTth逆転写酵素(Perkin-Elmer)は、高温（６０〜７０℃）でのｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を触媒し、そしてその後同じ組換え熱安定性酵素であるrTthＤＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡを増幅する。
【０１１３】
熱安定性ポリメラーゼの使用は、高温で逆転写を起こしてＲＮＡの二次構造の効果を軽減させる。RetroAmp（商標）は、MasterAmp（商標）と称される１０ｘＰＣＲエンハンサー（ベタインを含む）を含む市販品として入手可能である。MasterAmp１０ｘＰＣＲエンハンサーにおけるベタイン（トリメチルグリシン）の存在はその後多数の標的配列、特に高いＧ＋Ｃ含量又は二次構造を含むものの収率及び特異性を向上させる。ベタインは、Ｇ＋Ｃリッチ領域の融点をＡ＋Ｔ（Ｕ）リッチ領域と更に類似の温度にまで低下させる。これは、ポリメラーゼの停止を制限する二本鎖領域の不安定化を招き、それにより完全長産物の収率を増大させる。尚、ベタインはまた、熱変性からＤＮＡポリメラーゼを保護することにより当該過程を増強させうる。
【０１１４】
典型的に逆転写反応において、５０μｌの反応液が氷上で２つの別個の２５μｌのプレミックスとして構築され、そしてＲＮＡ試料の分解を最小化するために、逆転写段階直前に一緒にされる。一方のプレミックスには、ｄＮＴＰ、プライマー、及びＲＮＡ鋳型が含まれる。他方のプレミックスには、それ以外の全ての反応成分が含まれる。反応液には、３．０ｍＭのＭｇＣｌ2を含んで成る１ｘＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１ｘMasterAmp PCRエンハンサー、０．５ｍＭのＭｎＳＯ4、４００μｍの各ｄＮＴＰ、１２．５ｐｍｏｌの各プライマー、１００ｎｇの全ＲＮＡ鋳型、及び２．５ユニットのRetroAmp（商標）RT DNAポリメラーゼ、を含む。スタンダードの反応液は、第一鎖のｃＤＮＡ合成のために２０分間６０℃でインキュベートされる。アニーリング温度は、使用するプライマー対に依存して変化する：典型的に試料は９２℃で３０秒間変性され、６０℃で３０〜６０秒間アニーリングされ、そして７２℃で６０秒間伸長される。態様によっては、逆転写されたＤＮＡは、２０〜３５サイクルのＰＣＲ増幅にかけられることがある。例えば、ＲＴ不活性の後、ＲＮＡはＲＮアーゼＨにより分解される。続いてＰＣＲが実施され、ここで、２０μｌのｃＤＮＡ反応混合物が５０μｌのＰＣＲ混合物に添加され、そして２分間９４℃でインキュベートされる。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間、５５〜６０℃で３０秒間、そして６８〜７２℃で１〜１５分間の３５サイクルを包含した。この方法に使用したポリメラーゼはPlatinum Taq（商標）及びeLONGase（商標）である。
【０１１５】
GeneAmp熱安定性rTth逆転写酵素(Perkin-Elmer)がＲＮＡ鋳型を７０℃で効率的に逆転写する能力は本発明で有用であり、これは、その二次構造が高温の反応温度で不安定なためである。高温で逆転写を実施する更なる利点であるプライマーハイブリダイゼーションの特異性、そしてその後のrTthＤＮＡポリメラーゼによる伸長、延いては当該反応の感度、が増大する。
【０１１６】
実施例５：マイクロチップ上での逆転写の間の標識
ハイブリダイゼーションは、約１２，０００個の特徴を含むHO5（商標）マイクロアレイチップ(Mergen Ltd., San Leandro, Calif.)上で実施された。それぞれの特徴は、長さがそれぞれ３０ヌクレオチドであり且つ特異的なＲＮＡ鎖と相補的な配列とハイブリダイズするよう設計された均一なオリゴヌクレオチド群である。これらの３０量体はチップと離して合成され、そして末端アミン基を有する炭化水素リンカーがオリゴヌクレオチドの５’末端に付着された。オリゴヌクレオチドは、その結果、オリゴヌクレオチドの５’末端を介して形成したシッフ塩基によって基板上のアルデヒド基と共有結合的に付着し、逆転写酵素によるプライマー伸長に利用可能なように３’末端を遊離させている。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、天然の「センス」ＲＮＡ鎖にハイブリダイズすることができるような相補的「アンチセンス」鎖の配列を含んで成る。
【０１１７】
センス及びアンチセンスのコピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）転写物は、Riboprobe Combination System T3/T7 (Promega)を取扱説明書の条件に従い使用することにより、直鎖化されたｃＤＮＡ鋳型から合成した。マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドは、安定で更に特異的な二本鎖が３０℃のハイブリダイゼーション温度で形成するのに適当な環境を提供する５５０μｌの標準的な緩衝液中で、ヒト卵巣ガン（ＯＶＣ）細胞系由来の１μｇのｃＲＮＡとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、一晩３０℃で実施した。ｃＲＮＡは、天然ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）と相補的な配列を含んで成り、そして分子生物学業界に精通している者になじみのある標準的な手順（Sambrook et al., 上記を参照のこと）を用いて生成された。好ましい態様において、マイクロアレイがセンス鎖と相補的なオリゴヌクレオチドから構成される場合、ｍＲＮＡは予めｃＲＮＡに変換することなくマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションに直接使用されうる。
【０１１８】
ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイは、６０ｒｐｍで定期的に振とうしながら、予熱した洗浄溶液中で、以下のスケジュールに従い洗浄された：
２．０ｘＳＳＣ＋０．１％  ＳＤＳ  ４２℃  １０分間  ２回
０．２ｘＳＳＣ                    ３７℃  １０分間
０．１ｘＳＳＣ                    ３７℃  １０分間
【０１１９】
逆転写（ＲＴ）反応は：
４μｌの５ｘＲＴ緩衝液
２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）
２μｌのＡＭＶ逆転写酵素
１μｌの１０ｍＭ  ｄＡＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ｄＧＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ｄＴＴＰ
６μｌの１ｍＭ  ｄＣＴＰ
３μｌの１ｍＭビオチン−１４−ｄＣＴＰ
を含んで成る反応混合物中、アレイ上で実施された。
【０１２０】
異なる態様において、ビオチン−１４−ｄＣＴＰの量は所望の感度により変化することがある。反応混合物をアレイに適用し、続いてこれをカバースリップで覆い、そして４２℃で１時間湿度チャンバー内でインキュベートした。アレイは、オービタルシェーカー上で５０ｒｐｍで定期的に回転させながら、ミルクベースのブロッキング緩衝液中で、３０分間室温でブロッキングした。ストレプトアビジン溶液をアレイに適用し、そして、オービタルシェーカー上で定期的に回転させながら、４℃で３０分間インキュベートした。アレイをリンゴ酸とTween-20（商標）の溶液（標準的な洗浄緩衝液）中で３回それぞれ１５分間室温で洗浄した。アレイは、オービタルシェーカー上で４℃で３０分間穏やかに回転させながら抗ストレプトアビジン抗体−Ｃｙ３溶液と一緒にインキュベートした。リンゴ酸とTween-20（商標）の緩衝液による洗浄は複数回繰り返された。アレイは続いて乾燥され、そしてＣｙ３についてスキャンされた。遺伝子発現プロファイルの視覚化を図２Ｂに示す。
【０１２１】
比較のために、２０μｇのビオチン化したヒト卵巣ガン（ＯＶＣ）細胞系ＲＮＡを標準的な手順で単離し、そして第一のｃＤＮＡ鎖をポリＴ−Ｔ７プライマー及び逆転写酵素を用いて形成させた。ｃＤＮＡ鎖は、続いて、Roche Diagnosticsから市販されているキットを用いて二本鎖ｃＤＮＡを作り出すための鋳型として使用された。ビオチンで標識されたプローブは、ビオチン−１４−ｄＣＴＰの存在下でのＴ７を用いたin vitro転写により生成した。ビオチン化されたＲＮＡを同一のアレイとハイブリダイズさせ、そして遺伝子発現プロファイルを標準的な手順により視覚化した（図２Ａ）。
【０１２２】
両方の方法についての結果を例示している、代表的なサブグリッド（３２個のうちの１つ）を図２Ａ−２Ｂに示す。グリッド上で矢印により示したものは、表１に従い使用したテストオリゴヌクレオチドとネガティブコントロールのオリゴヌクレオチドから生じたシグナルである。図２Ａ及び２Ｂから理解できる通り、結果は比較可能なものであり、そしてあらゆる見かけ上の差異が感度の差異に起因すると思われる。
【０１２３】
【表１】
0004718181.tif 000002
【０１２４】
実施例６：熱安定性逆転写を用いた多サイクルの標識
ハイブリダイゼーションは、約１２，０００個の特徴を含むHO5（商標）マイクロアレイチップ(Mergen Ltd., San Leandro, Calif.)上で実施される。それぞれの特徴は、長さがそれぞれ３０ヌクレオチドであり且つ特異的なＲＮＡ鎖と相補的な配列とハイブリダイズするよう設計された均一なオリゴヌクレオチド群である。これらの３０量体はチップと離して合成され、そして末端アミン基を有する炭化水素リンカーがオリゴヌクレオチドの５’末端に付着される。オリゴヌクレオチドは、その結果、オリゴヌクレオチドの５’末端を介して形成したシッフ塩基によって基板上のアルデヒド基と共有結合的に付着し、逆転写酵素によるプライマー伸長に利用可能なように３’末端を遊離させる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、天然の「センス」ＲＮＡ鎖にハイブリダイズすることができるような相補的「アンチセンス」鎖の配列を含んで成る。
【０１２５】
センス及びアンチセンスのコピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）転写物は、Riboprobe Combination System T3/T7 (Promega)を取扱説明書の特定された条件に従い使用することにより、直鎖化されたｃＤＮＡ鋳型から合成する。マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドは、安定で更に特異的な二本鎖が３０℃のハイブリダイゼーション温度で形成するのに適当な環境を提供する５５０μｌの標準的な緩衝液中で、ヒト卵巣ガン（ＯＶＣ）細胞系由来の１μｇのｃＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、一晩３０℃で実施する。好ましい態様において、マイクロアレイがセンス鎖と相補的なオリゴヌクレオチドから構成される場合、ｍＲＮＡは予めｃＲＮＡに変換することなくマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションに直接使用されうる。
【０１２６】
ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイは、６０ｒｐｍで定期的に振とうしながら、予熱した洗浄溶液中で、以下のスケジュールに従い洗浄される：
２．０ｘＳＳＣ＋０．１％  ＳＤＳ  ４２℃  １０分間  ２回
０．２ｘＳＳＣ                    ３７℃  １０分間
０．１ｘＳＳＣ                    ３７℃  １０分間
【０１２７】
逆転写（ＲＴ）反応は：
４μｌの５ｘＲＴ緩衝液
２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）
２μｌのRetroAmp（商標）熱安定性ＲＴ(Epicentre; 又はＡＭＶ  ＲＴ)
１μｌの１０ｍＭ  ｄＡＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ｄＧＴＰ
１μｌの１０ｍＭ  ｄＴＴＰ
６μｌの１ｍＭ  ｄＣＴＰ
３μｌの１ｍＭビオチン−１４−ｄＣＴＰ
を含んで成る反応混合物中、アレイ上で実施される。
【０１２８】
異なる態様において、ビオチン−１４−ｄＣＴＰの量は所望の感度により変化することがある。反応混合物をアレイに適用し、続いてこれをカバースリップで覆い、そして４２℃で１時間湿度チャンバー内でインキュベートする。
【０１２９】
２又はそれ以上のサイクルの以下のプロトコールを実施してアッセイの感度を増大させる：
（ａ）９４℃で２分間維持し；
（ｂ）４℃で５分間維持し；そして
（ｃ）４２℃で６０分間維持する。
【０１３０】
ＡＭＶ逆転写酵素が開始反応で使用される場合、酵素（ＡＭＶＲＴ）を段階（ｂ）と（ｃ）の間で補充してもよい。好ましくは、熱安定性ＲＴがこのアッセイで使用される。態様によっては、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えばRNasin（商標））が反応混合物に添加され、あるいはＲＮアーゼを欠いた熱安定性逆転写酵素が当該工程の間ＲＮＡ鋳型の安定性を増大させるために使用される。アレイは、オービタルシェーカー上で５０ｒｐｍで定期的に回転させながら、ミルクベースのブロッキング緩衝液中で、３０分間室温でブロッキングする。ストレプトアビジン溶液をアレイに適用し、そして、オービタルシェーカー上で定期的に回転させながら、４℃で３０分間インキュベートする。アレイをリンゴ酸とTween-20（商標）の溶液（標準的な洗浄緩衝液）中で３回それぞれ１５分間室温で洗浄する。アレイは、オービタルシェーカー上で４℃で３０分間穏やかに回転させながら抗ストレプトアビジン抗体−Ｃｙ３溶液と一緒にインキュベートする。リンゴ酸とTween-20（商標）の緩衝液による洗浄は複数回繰り返される。アレイは続いて乾燥され、そしてＣｙ３についてスキャンされる。
【０１３１】
態様によっては、GeneAmp熱安定性rTth逆転写酵素(Perkin-Elmer)が高温（６０〜７０℃）でのｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を触媒するために使用され、そして適切なプライマー（例えばオリゴｄＴ）の添加に続いて、同じ組換え熱安定性酵素であるrTthＤＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡ鎖が増幅される。
【０１３２】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願が、全ての目的のためにそれらの全体が引用によって当該明細書に組み入れられる。
【０１３３】
本発明は好ましい態様及びその実施例を参照して記載したが、本発明の範囲はそれらの記載した態様のみに限定されない。当業者に自明なように、上述の発明に対する修飾及び適合は、特許請求の範囲によって規定され且つ拘束される本発明の精神及び範囲を逸脱することなくなされうる。
【０１３４】
前述したものは主に例示目的で提供される。当業者にとっては、本明細書に記載した本発明の作業条件、材料、手順の段階及び他のパラメーターが本発明の精神及び範囲を逸脱することなく種々の方法で更に修飾され、あるいは置換されうることは容易に理解されるであろう。従って、本発明の先の説明は、限定として解されるべきではなく、単なる例示として解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、本発明に従う態様の概略図を表す。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、標識された標的ＲＮＡ（図２Ａ）及び標識が逆転写の間に導入されるプライマー−プローブの標識された伸長を用いてのマイクロアレイ上での遺伝子発現プロファイルの視覚化を表す。
【図１】
0004718181.tif 000003
【図２】
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