(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも96重量％のＮ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸の二ナトリウム塩を含む、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸；及び
（ｂ）サケカルシトニン；
を含む組成物の、動物にサケカルシトニンを経口投与するための医薬の調製のための使用。
【請求項２】
前記動物がヒトである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（ａ）少なくとも90重量％のＮ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸の二ナトリウム塩を含む、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸；及び
（ｂ）カルシトニン；
を含む組成物の、動物にカルシトニンを経口投与するための医薬の調製のための使用。
【請求項４】
前記動物がヒトである請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９９年４月５日出願の米国特許出願第６０／１２７，７５４号、２０００年３月１日出願の米国特許出願第６０／１８６，１４３号、２０００年３月１日出願の米国特許出願第６０／１８６，１４２号、および２０００年３月２１日出願の米国特許出願第６０／１９１，２８６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、活性剤を送達するためのＮ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸、Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸、またはＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸などの送達剤の二ナトリウム塩、二ナトリウム塩のエタノール溶媒和物、および二ナトリウム塩の一水和物、ならびにそれらを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国特許第５，７７３，６４７号および第５，８６６，５３６号は、ヘパリンおよびカルシトニンなどの活性剤を、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸（5-CNAC）、Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸（SNAD）、およびＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（SNAC）などの修飾アミノ酸と共に経口で送達するための組成物を開示している。ヘパリンおよびカルシトニンなどの活性剤を含有する現行の市販製剤の多くは、経口経路以外の経路によって送達される。経口で送達される製剤は通常、他の経路によるよりも投与し易く、患者のコンプライアンスを改善する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヘパリンおよびカルシトニンなどの活性剤を経口で投与するためには医薬品製剤の改良が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者他は、特定の送達剤の二ナトリウム塩が、対応する一ナトリウム塩に比べて驚くほど大きな、活性剤を送達するための有効性を有していることを発見した。さらに、発明者らは、これらの送達剤の二ナトリウム塩が、エタノールとの溶媒和物および水との水和物を形成することを発見した。送達剤は、式：
【化１】
0004642435.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は独立に、水素、−ＯＨ、−ＮＲ6Ｒ7、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、またはＣ1〜Ｃ4アルコキシであり、  Ｒ5は、置換もしくは非置換のＣ2〜Ｃ16アルキレン、置換もしくは非置換のＣ2〜Ｃ16アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ1〜Ｃ12アルキル（アリーレン）、または置換もしくは非置換のアリール（Ｃ1〜Ｃ12アルキレン）であり、  Ｒ6およびＲ7は独立に、水素、酸素、またはＣ1〜Ｃ4アルキルである］
を有する。本発明の水和物および溶媒和物はまた、対応するそれらの一ナトリウム塩および遊離酸に比べて驚くほど大きな、ヘパリンおよびカルシトニンなどの活性剤を送達するための有効性を有している。
【０００６】
本発明は、上式の送達剤の二ナトリウム塩のメタノール、エタノール、プロパノール、プロピレングリコールなどのアルコール溶媒和物、および他のヒドロキシル（hydroxylic）溶媒和物を提供する。好ましい一実施形態によれば、アルコール溶媒和物はエタノール溶媒和物である。本発明はまた、上式の送達剤の二ナトリウム塩の一水和物などの水和物を提供する。好ましい送達剤には、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸（5-CNAC）、Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸（SNAD）、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（SNAC）、８−（Ｎ−２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイル）アミノカプリル酸（米国特許第５，７７３，６４７号の化合物６７として示される）、およびＮ−（９−（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノノナン酸（又は９−サリチロイルアミノノナン酸）（米国特許第５，７７３，６４７号の化合物３５として示される）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
本発明はまた、本発明のエタノール溶媒和物を乾燥することによる本発明の二ナトリウム塩の調製方法を提供する。好ましい実施形態によれば、後述の方法によってエタノール溶媒和物を調製する。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、本発明のエタノール溶媒和物を調製する方法である。この方法は、上式の送達剤をエタノールに溶かして送達剤／エタノール溶液を生成すること、（ｂ）送達剤／エタノール溶液と、塩を含むモル過剰のナトリウムとを反応させてエタノール溶媒和物を生成することを含む。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明の水和物を調製する方法である。この方法は、（ａ）送達剤の二ナトリウム塩のエタノール溶媒和物を得ること、（ｂ）溶媒和物を乾燥して無水二ナトリウム塩を生成すること、および（ｃ）無水二ナトリウム塩を水和して水和物を生成することを含む。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態は、送達剤の二ナトリウム塩を含む組成物である。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明の少なくとも１つの二ナトリウム塩、エタノール溶媒和物、または水和物、および少なくとも１つの活性剤を含む組成物である。好ましい活性剤には、ヘパリンおよびカルシトニンが含まれるがこれらに限定されるものではない。組成物は、経口投与単位形態などの投与単位形態に製剤化することができる。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、活性剤を、それを必要とする動物に投与する方法であって、本発明の組成物を動物に投与することを含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いる「置換された」という用語には、ハロゲン、ヒドロキシド、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、およびＣ1〜Ｃ4アルコキシといった置換基のいずれか１つまたは任意の組合せによる置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
「アルキル」、「アルコキシ」、「アルキレン」、「アルケニレン」、「アルキル（アリーレン）」、および「アリール（アルキレン）」という用語にはそれぞれ、直線および分枝のアルキル、アルコキシ、アルキレン、アルケニレン、アルキル（アリーレン）、およびアリール（アルキレン）基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
二ナトリウム塩
二ナトリウム塩は、当技術分野で知られている方法によりエタノールを蒸発させるか乾燥することによってエタノール溶媒和物から調製し、無水二ナトリウム塩を生成することができる。乾燥は一般的に、約８０から約１２０、好ましくは約８５から９０、最も好ましくは約８５℃の温度で行う。乾燥工程は通常、２６″Ｈｇ以上の圧力で行う。無水二ナトリウム塩は一般的に、無水二ナトリウム塩の全重量を１００％として、エタノール約５重量％未満、好ましくはエタノール約２重量％未満を含有する。
【００１６】
送達剤の二ナトリウム塩はまた、水中で送達剤のスラリーを作り、２モル当量の水性水酸化ナトリウム、ナトリウムアルコキシドなどを加えることによって調製することができる。適当なナトリウムアルコキシドには、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、およびそれらの組合せがふくまれるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
二ナトリウム塩を調製するさらに別の方法は、送達剤を１モル当量の水酸化ナトリウムと反応させて送達剤の一ナトリウム塩を生成し、次いでさらに１モル当量の水酸化ナトリウムを加えて二ナトリウム塩を得るものである。
【００１８】
二ナトリウム塩は、二ナトリウム塩を含有する溶液を真空蒸留によって濃縮し、濃厚なペーストにすることにより固体として単離することができる。このペーストを真空オーブン中で乾燥し、固体として送達剤の二ナトリウム塩を得ることができる。この固体は、二ナトリウム塩の水溶液をスプレー乾燥することによっても単離するすることができる。
【００１９】
送達剤は、米国特許第５，７７３，６４７号および第５，８６６，５３６号にそれぞれ記載されている方法などの当技術分野で知られている方法によって調製することができる。
【００２０】
本発明の別の態様は、組成物中の送達剤およびその塩の全重量を１００％として、送達剤の二ナトリウム塩を少なくとも約２０重量％、好ましくは少なくとも約６０重量％を含む組成物である。一実施形態によれば、組成物は、組成物中の送達剤およびその塩の全重量を１００％として、送達剤の二ナトリウム塩を少なくとも約１０、３０、４０、５０、７０、または８０重量％含む。組成物は、組成物中の送達剤およびその塩の全重量を１００％として、送達剤の二ナトリウム塩を少なくとも約９０重量％含むことがより好ましい。
【００２１】
組成物は、実質的に純粋な送達剤の二ナトリウム塩を含むことがより好ましい。本明細書で用いる「実質的に純粋な」という用語は、組成物中の送達剤およびその塩の全重量を１００％として、組成物中の送達剤の約４重量％未満、好ましくは約２重量％未満が二ナトリウム塩でないことを意味する。
【００２２】
エタノール溶媒和物
本明細書で用いる「エタノール溶媒和物」という用語には、エタノール溶媒の分子またはイオンと送達剤の二ナトリウム塩の分子またはイオンとの分子またはイオン複合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。エタノール溶媒和物は通常、送達剤の二ナトリウム塩の１分子当たり約１個のエタノール分子またはイオンを含有する。
【００２３】
送達剤の二ナトリウム塩のエタノール溶媒和物は、以下のように調製することができる。送達剤をエタノールに溶かす。通常、送達剤のそれぞれ１グラムをエタノール約１から約５０ｍＬ、好ましくはエタノール約２から約１０ｍＬに溶かす。次いで、送達剤／エタノール溶液を、送達剤に対してモル過剰の、塩を含有する一ナトリウムなどの塩を含有するナトリウム、すなわち送達剤の１モル当たりナトリウム陽イオンが１モルより多くあるナトリウムと反応させる。この反応でエタノール溶媒和物が得られる。塩を含有する適当な一ナトリウムには、水酸化ナトリウム；ナトリウムメトキシドおよびナトリウムエトキシドなどのナトリウムアルコキシド；およびそのいずれの組合せもふくまれるが、これらに限定されるものではない。塩を含有する一ナトリウムを少なくとも約２モル当量、すなわち送達剤の１モル当たりナトリウム陽イオンが少なくとも約２モルある一ナトリウムをエタノール溶液に加えることが好ましい。反応は一般的に、周囲温度などの混合物の還流温度またはそれ以下の温度で行う。
【００２４】
次いで、当技術分野で知られている方法によってエタノール溶媒和物を回収することができる。例えば、送達剤／エタノール溶液に水酸化ナトリウムを添加して得られるスラリーを、大気圧蒸留によって濃縮することができる。次いで、濃縮したスラリーを冷却し、ろ過によって固体生成物を回収する。ろ過ケーキ、すなわちろ液を真空乾燥してエタノール溶媒和物を得ることができる。
【００２５】
水和物
本明細書で用いる「水和物」という用語には、（ｉ）分子の形で結合する水を含有する物質および（ｉｉ）結晶水を１または複数分子含有する結晶性物質または遊離水を含有する結晶性材料が含まれるが、これらに限定されるものではない。二ナトリウム塩の水和物を含有する組成物は、組成物中の二ナトリウム塩の水和物の全重量を１００％として、二ナトリウム塩の一水和物を好ましくは少なくとも約８０重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、最も好ましくは約９５重量％含む。好ましい実施形態によれば、組成物は、組成物中の二ナトリウム塩の水和物の全重量を１００％として、二ナトリウム塩の一水和物を少なくとも約９８重量％含有する。
【００２６】
水和物は、前述のようにエタノールを乾燥して無水二ナトリウム塩を生成し、無水二ナトリウム塩を水和することによって調製することができる。二ナトリウム塩の一水和物を生成することが好ましい。無水二ナトリウム塩は極めて吸湿性であるため、大気中の水分に曝されると水和物が生成する。水和工程は一般的に、ほぼ周囲温度から約５０℃の温度で、相対湿度が少なくとも約５０％の環境中で行う。水和工程は、ほぼ周囲温度から約３０℃で行うことが好ましい。例えば、４０℃および相対湿度７５％で水和工程を行うことができる。あるいは、無水二ナトリウム塩を水蒸気で水和することができる。
【００２７】
好ましい一実施形態によれば、乾燥および水和工程はオーブン中で行う。両工程が終了するまでは、材料を大気に曝さないことが好ましい。
【００２８】
二ナトリウム塩、エタノール溶媒和物、および水和物組成物ならびに投与単位形態
本発明はまた、医薬品組成物などの組成物であって、本発明の少なくとも１つの二ナトリウム塩、エタノール溶媒和物、または水和物および少なくとも１つの活性剤を含む組成物を提供する。本発明の組成物は通常、送達に有効な量の１つまたは複数の本発明の二ナトリウム塩、エタノール溶媒和物、および／または水和物、すなわち所望の効果のために活性剤を送達するのに十分な量の二ナトリウム塩、エタノール溶媒和物、および／または水和物を含有する。
【００２９】
本発明で使用するのに適当な活性剤には、生物学的活性剤および化学的活性剤が含まれ、殺虫剤、製薬剤、および治療剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
例えば、本発明で使用するのに適当な生物学的または化学的活性剤には、タンパク質；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；多糖類、特にムコ多糖の混合物；炭水化物；脂質；他の有機化合物；および特に、それら単独では胃腸粘膜を通過せず（または投与量の一部のみが通過し）、かつ／または胃腸管における酸および酵素によって化学切断されやすい化合物；またはそれらの任意の組合せがふくまれるが、これらの限定されるものではない。
【００３１】
それ以外の例には、合成、天然またはその組換え体を含む、ヒト成長ホルモン（hGH）、組換えヒト成長ホルモン（rhGH）、ウシ成長ホルモン、およびブタ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；α、β、およびγ−インターフェロンを含むインターフェロン；インターロイキン−１；インターロイキン−２；ブタ、ウシ、ヒト、およびヒト組換えを含み、任意にナトリウム、亜鉛、カルシウムおよびアンモニウムを含む対イオンを有するインスリン；IGF-1を含むインスリン様増殖因子；非分画ヘパリン、ヘパリノイド、デルマタン、コンドロイチン、低分子量ヘパリン、極低分子量ヘパリンおよび超低分子量ヘパリンを含むヘパリン；サケ、ウナギ、ブタ、およびヒトを含むカルシトニン；エリトロポエチン；心房性ナトリウム利尿因子；抗原；モノクローナル抗体；ソマトスタチン；プロテアーゼ阻害剤；副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン；オキシトシン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；ろ胞刺激ホルモン；グルコセレブロシダーゼ；トロンボポエチン；フィルグラスチム；プロスタグランジン；シクロスポリン；バソプレッシン；クロモリンナトリウム（ナトリウムまたは二ナトリウムクロモグリケート（chromoglycate））；バンコマイシン；デスフェリオキサミン（desferrioxamine）（DFO）；その断片を含む副甲状腺ホルモン（PTH）；抗真菌剤を含む抗菌剤；ビタミン；これらの化合物の類縁体、断片、模倣体またはポリエチレングリコール（PEG）修飾誘導体；またはそれらの任意の組合せがふくまれるが、これらに限定されるものではない。好ましい活性剤には、ヘパリンおよびカルシトニンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
組成物中の活性剤の量は、意図する目的を達成するのに有効な量である。組成物中の量は通常、薬理学的、生物学的、治療上、または化学的に有効な量である。しかしながら、複数の組成物を投与する場合には、その量より少ない量にするすることができる。すなわち、累積的な単位で全有効量を投与することができる。活性剤の量はまた、組成物が活性剤を持続放出する場合には、薬理学的、生物学的、治療上、または化学的に有効な量を超えることができる。このような組成物は通常、組成物に長期間にわたって薬理学的、生物学的、治療上、または化学的に有効な量の活性剤を放出させる持続放出コーティングを有する。
【００３３】
使用される活性剤の全量は、当業者に知られている方法によって決定することができる。しかしながら、本組成物は、従来の組成物に比べてより効率よく活性剤を送達できるため、従来の投与単位形態または送達系で使用する量よりも少ない量の活性剤を対象に投与し、同一の血液濃度および／または治療効果を得ることができる。
【００３４】
好ましい一実施形態によれば、組成物は、送達剤の二ナトリウム塩およびカルシトニンを含む。送達剤は5-CNACであることが好ましい。一般的に、5-CNACの二ナトリウム塩に対するカルシトニンの重量比は、組成物が投与される動物によって異なる。例えば、ヒトに投与される組成物の場合には、重量比は約１：３００から約１：７００であり、約１：５００であることが好ましい。霊長類の場合には、重量比は一般的に、約１：１００から約１：５００である。
【００３５】
本発明の組成物は、液体の形であっても固体の形であってもよい。本発明の二ナトリウム塩および／または水和物を含有する組成物は、固体形であることが好ましい。組成物はさらに、pH調整剤、保存剤、香料（flavorant）、味マスキング剤、芳香、湿潤剤、等張化剤（tonicifier）、着色剤、界面活性剤、可塑剤、潤滑剤、投与ビヒクル（dosing vehicle）、可溶化剤、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、またはこれらの任意の組合せを含む添加剤を含むがこれらに限定されない。適当な投与ビヒクルには、水、リン酸緩衝液、１，２−プロパンジオール、エタノール、オリーブ油、２５％水性プロピレングリコール、およびこれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されるものではない。他の添加物には、リン酸緩衝塩、クエン酸、グリコール、および他の分散化剤が含まれる。溶液には、安定化添加物を、好ましくは約０．１から２０％（ｗ／ｖ）の濃度で組み入れることができる。
【００３６】
組成物はまた、アクチノニンまたはエピアクチノニンおよびその誘導体などの１つまたは複数の酵素阻害剤を含むことができる。他の酵素阻害剤には、アプロチニン（トラジロール）およびボーマン−バークインヒビターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の組成物は、二ナトリウム塩、水和物、および／またはエタノール溶媒和物、活性剤、および任意に添加物を乾燥混合するか溶液中で混合することによって調製することができる。混合物は、溶液に成分を分散させるのを助けるために緩やかに加熱、かつ／または冷却することができる。
【００３８】
本発明の組成物は、当技術分野で知られている方法により、投与単位形態、具体的には経口投与単位形態に製剤化することができ、これらはカプセル剤、錠剤、ならびに散剤などの粒剤および小袋を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
好ましい一実施形態によれば、投与単位形態は、本発明の少なくとも１つの二ナトリウム塩、エタノール溶媒和物、または水和物、および少なくとも１つの活性剤の凍結乾燥された混合物を含む固体投与単位形態である。
【００４０】
「凍結乾燥された混合物」という用語には、迅速な凍結および脱水によって乾燥した形で調製された混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。脱水は通常、混合物を凍結し、真空中で行う。凍結乾燥された混合物は一般的に、実質的に水を含まず、混合物の全重量を１００％として、水４重量％未満を含有することが好ましい。
【００４１】
このような固体投与単位形態は、（ａ）１つまたは複数の送達剤および１つまたは複数の活性剤を含む溶液を得ること、（ｂ）溶液を凍結乾燥して凍結乾燥された混合物を得ること、および（ｃ）凍結乾燥された混合物で固体投与単位形態を調製することによって調製することができる。
【００４２】
送達剤および活性剤を溶液中で混ぜると、工程（ａ）における溶液を生成することができる。この溶液は、当技術分野で知られているいかなる方法によっても凍結乾燥することができる。凍結乾燥された混合物は、当技術分野で知られているいかなる方法によっても投与単位形態中に組み入れることができる。
【００４３】
本発明の組成物および投与単位形態を投与し、ニワトリなどの鳥類；齧歯類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、霊長類、および特にヒトなどの哺乳類；昆虫類を含むが、これらに限定されない、投与を必要とするいかなる動物にも活性剤を送達することができる。組成物および投与単位形態は、経口、鼻腔内、舌下、十二指腸内、皮下、口腔、結腸内、直腸、膣内、粘膜、肺、経皮、皮内、非経口、静脈内、筋肉内または眼内経路によって投与することができる。組成物および投与単位形態は、経口で投与することが好ましい。
【００４４】
以下の実施例は、限定することなく本発明について記載することを意図している。
【実施例】
【００４５】
実施例１
Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸（5-CNAC）の調製  清浄で乾燥した２００ガロンのグラスライニング反応器に、乾燥アセトニトリル１７８Ｌを加えた。撹拌機を１００〜１２５ｒｐｍに設定し、反応器内容物を約９℃まで冷却した。Leominster, MAのPolycarbon Industriesから市販されている５−クロロサリチルアミド７４ｋｇを反応器に充填し、充填口を閉じた。乾燥ピリジン４７Ｌを反応器に充填した。得られたスラリーを約９℃まで冷却した。反応器の冷却器を冷却し、塔頂留出バルブを全還流に設定した。２時間にわたり、バッチ温度を１４℃に維持しながら、クロロギ酸エチル４９．７ｋｇを２００ガロンの反応器に充填した。クロロギ酸エチルは、０．１％のホスゲンを含有することがあり、水とは極めて反応性である。反応は極めて発熱的であり、反応温度を下げるためにプロセス 冷却装置を使用する必要がある。
【００４６】
クロロギ酸エチルの添加が終了したら、反応器内容物を１０〜１４℃で３０分間撹拌した。次いで、反応器内容物を約２５分間にわたって約８５℃まで加熱し、すべての留出物を受器に集めた。反応器内容物を約６時間８５〜９４℃に保ち、蒸留されたすべての材料を受器に集めた。反応混合物を試料採取し、HPLCによって変換（＞９０％）をモニターした。変換は、６時間後に９９．９％であることが分かった。反応器内容物を１時間かけて約１９℃まで冷却した。脱イオン水１３４Ｌを反応器に充填した。直ちに沈殿が生成した。反応器内容物を約５℃まで冷却し、約１０．５時間撹拌した。生成物が溶液から結晶化し続けた。反応器スラリーを遠心分離した。脱イオン水５５Ｌを２００ガロンのグラスライニング反応器に充填し、遠心分離された湿ったケーキを洗浄した。完全真空（２８″Ｈｇ）中、約５８℃で約１９．５時間、中間体を乾燥した。収量は、６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン８２．６ｋｇであった。この中間体は、水に曝されないように包装して保存した。
【００４７】
以下の調製では、蒸留水を加える時点までは、工程中において水は絶対に容認できない。乾燥ジメチルアセトアミド２２２Ｌを乾燥した２００ガロンのグラスライニング反応器に充填した。反応器の撹拌機は、１００〜１２５ｒｐｍに設定した。冷却器を冷却し、反応器塔頂留出バルブを蒸留に設定した。乾燥した無水炭酸ナトリウム４１．６ｋｇを反応器に充填し、反応器の充填口を閉じた。いくらかガスが発生しわずかに発熱反応であるため、注意した。乾燥した６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン７７．５ｋｇを反応器に充填した。急いで、乾燥した８−ブロモオクタン酸エチル８８ｋｇを反応器に充填した。反応を２２〜２４インチの真空まで真空にし、反応器温度を６５〜７５℃まで上げた。反応器温度を維持し、内容物の発泡に注意した。反応器混合物を試料採取し、ガスクロマトグラフィによって反応器混合物中のブロモエステルの消失をモニターすることにより変換をモニターした。反応は、約７時間後に完了した（０．６％のブロモエステルが認められた）。真空を遮断し、反応器内容物を４５〜５０℃まで冷却した。内容物を遠心分離し、ろ液を第二の２００ガロングラスライニング反応器に送った。エタノール１１９Ｌ（０．５％トルエンで変性させた２００プルーフ）を第一の２００ガロン反応器に充填し、約４５℃まで温めた。ろ過ケーキを温かいエタノールで洗浄し、洗浄液を第二の２００ガロン反応器中の反応混合物に充填した。
【００４８】
第二の２００ガロン反応器で撹拌機の運転を始めた。反応器内容物を約２９℃まで冷却した。水がバッチ中に直接落ちるようにして、第二の反応器に蒸留水１２０Ｌをゆっくりと充填した。反応器内容物を約８℃まで冷却した。中間体が溶液から現れ、約９．５時間保った。得られたスラリーを遠心分離した。エタノール７０Ｌを反応器に充填し、８℃まで冷却し、遠心分離ケーキを洗浄した。湿ったケーキを、紙で裏打ちしたドラムの内部に置いた二重ポリエチレン袋に降ろした。収量は、８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチル１２３．５ｋｇであった。
【００４９】
USP精製水４００Ｌおよび水酸化ナトリウムペレット４５．４ｋｇを２００ガロンのグラスライニング反応器に充填し、撹拌機を１００〜１２５ｒｐｍに設定した。８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチルの湿ったケーキ１２３．５ｋｇを反応器に充填した。充填口を閉じた。冷却水を冷却器に通し、反応器塔頂留出バルブを大気圧蒸留に設定した。反応器内容物を約９８℃まで加熱し、HPLCにより変換をモニターした。当初（約４０分）反応器は約６８℃で還流したが、蒸留によってエタノールが除去されるにつれて（約３時間にわたり）、反応器温度は約９８℃まで上昇した。HPLCによって測定すると、出発材料は約４時間で消失した。反応器内容物を約２７℃まで冷却した。USP精製水１５０Ｌを隣接する２００ガロングラスライニング反応器に充填し、撹拌機を１００〜１２５ｒｐｍに設定した。濃塩酸（１２Ｍ）１０４Ｌを反応器に充填し、約２４℃まで冷却した。ケン化された反応混合物を２００ガロングラスライニング反応器にゆっくりと（約５時間にわたり）充填した。二酸化炭素発生のため、材料（４５Ｌおよび４５Ｌ）を２つの反応器（それぞれ２００ガロン）に分けた。生成物が溶液から沈殿した。５０％水酸化ナトリウム溶液（水２Ｌ、水酸化ナトリウム２ｋｇ）で反応混合物をpH 2.0〜4.0に調整した。反応器内容物を約９〜１５℃まで冷却した。約９時間にわたり溶液から中間体が結晶化した。反応器スラリーを遠心分離して中間体を分離した。USP精製水５０Ｌを２００ガロングラスライニング反応器に充填し、このすすぎ液を用いて遠心分離した湿ったケーキを洗浄した。湿ったケーキは、プラスチックドラムの内部に置かれた二重ポリエチレン袋に降ろした。Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸を、約６８℃で約３８時間、真空中（２７″Ｈｇ）で乾燥した。乾燥したケーキは、上端に乾燥剤の袋が置かれた５５−ガロンのスチール製の裏打ちしていないオープンヘッドドラムの内部に置かれた二重ポリエチレン袋に降ろした。乾燥単離収量は、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸８１ｋｇであった。
【００５０】
実施例２
Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸二ナトリウムの調製
【００５１】
【化２】
0004642435.tif 000003
【００５２】
２２Ｌ、パイレックス（登録商標）ガラス、五つ口、丸底フラスコに、頭上式撹拌機、熱電対温度読み取り、および加熱マントルを備え付けた。Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸２６０２．３ｇおよび水４０００ｍＬをフラスコに充填した。撹拌したこのスラリーに、水２０００ｍＬに溶かした水酸化ナトリウム６６０ｇの溶液を加えた。混合物を約５５℃まで加熱すると、大部分の固体が溶けた。わずかに濁った溶液をワットマン＃１ろ紙に通して熱ろ過し、不溶の微粒子を除去した。ろ液を大きな実験室用ロータリーエバポレーターのポットフラスコに移した。ロータリーエバポレーターは、約６０℃の浴温および６０ｍｍＨｇの圧力で操作した。ロータリーエバポレーターのポットフラスコ中に固体の塊が得られるまで、二ナトリウム塩溶液から水を除去した。真空を開放し、ロータリーエバポレーターからポットフラスコを取り外した。ポットフラスコからトレーに固体をすくい取った。次いで、これらのトレーを真空オーブン中に置き、約６０℃で約４８時間、完全真空中で固体を乾燥した。乾燥した固体は、固体がすべて３５メッシュのふるいを通過するまで実験室用摩砕機に通した。摩砕し、ふるいにかけたＮ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノオクタン酸二ナトリウム塩をトレーに入れ、乾燥用オーブン中に戻した。約４５℃の完全真空中で乾燥を続けると、乾燥粉末として所望の生成物２９５７．１ｇが得られた。
【００５３】
塩酸で生成物を滴定すると、塩酸約２当量を消費する２つの変曲点が得られた。ＣＨＮ分析：理論値（水４．９重量％を補正）Ｃ４７．８９％、Ｈ５．３７％、Ｎ３．７２％、Ｎａ１２．２２％；実測値Ｃ４７．６９％、Ｈ５．２３％、Ｎ３．４５％、Ｎａ１１．７９％。
【００５４】
実施例３
Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸一ナトリウムの調製  ２２Ｌ、パイレックス（登録商標）ガラス、五つ口、丸底フラスコに、頭上式撹拌機、熱電対温度読み取り、および加熱マントルを備え付けた。Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノオクタン酸２０９９．７ｇおよび水６０００ｍＬをフラスコに充填した。このスラリーに、水２０００ｍＬに溶かした水酸化ナトリウム２６５ｇの溶液を加えた。混合物を約８０℃まで加熱して大部分の固体を溶かした。不溶の材料をフラスコの底に沈下させ、上澄みをデカントした。得られた混合物を大きな実験室用ロータリーエバポレーターのポットフラスコに移した。ロータリーエバポレーターは、約６０℃の浴温および約７０ｍｍＨｇの圧力で操作した。ロータリーエバポレーターのポットフラスコ中に固体の塊が得られるまで、二ナトリウム塩混合物から水を除去した。真空を開放し、ロータリーエバポレーターからポットフラスコを取り外した。ポットフラスコからトレーに固体をすくい取った。次いで、これらのトレーを真空オーブン中に置き、約６０℃で約４８時間、完全真空中で固体を乾燥した。乾燥した固体は、固体がすべて３５メッシュのふるいを通過するまで実験室用摩砕機に通した。摩砕し、ふるいにかけたＮ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノオクタン酸二ナトリウム塩をトレーに入れ、乾燥用オーブン中に戻した。完全真空中で乾燥を続けると、乾燥粉末として所望の生成物２１６１．７ｇが得られた。
【００５５】
塩酸で生成物を滴定すると、塩酸約１モル当量を消費する単一の変曲点が得られた。ＣＨＮ分析：理論値（水１．１４重量％を補正）Ｃ５３．０５％、Ｈ５．７７％、Ｎ４．１２％、Ｎａ６．７７％；実測値Ｃ５２．５７％、Ｈ５．５６％、Ｎ４．０６％、Ｎａ６．５０％。
【００５６】
実施例４
5-CNACの二ナトリウムおよび一ナトリウム塩を、以下のようにアカゲサルに投与した。１群６匹のサルには二ナトリウム塩を含有する１個のカプセルを投与し、第二群の６匹のサルには、一ナトリウム塩を含有する１個のカプセルを投与した。それぞれのカプセルは、5-CNAC（一または二ナトリウム塩）４００ｍｇおよびサケカルシトニン（sCT）８００μｇを硬ゼラチンカプセルに手で詰めることによって調製した。
【００５７】
投与に先立って、アカゲサルを一夜絶食させ、試験期間は、完全に意識があるままで椅子に拘束した。ガバージュ（Gavage）管によりカプセルと、続いて水１０ｍｌを投与した。
【００５８】
血液試料は、投与１５、３０、および４５分後、および１、１．５、２、３、４、５、および６時間後に採取した。sCTの血漿濃度をラジオイムノアッセイにより測定した。それぞれの投与群における６匹のサルの結果をそれぞれの時点について平均しプロットした。最大平均血漿カルシトニン濃度および曲線下面積（AUC）を下表１に報告する。
【００５９】
【表１】
0004642435.tif 000004
【００６０】
実施例５
Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸は、適当な出発材料を用い実施例１に記載の方法によって調製した。
【００６１】
実施例６
Ｎ−サリチロイル−１０−アミノデカン酸二ナトリウムエタノール溶媒和物の調製
【００６２】
【化３】
0004642435.tif 000005
【００６３】
１Ｌ、パイレックス（登録商標）ガラス、四つ口、丸底フラスコに、頭上式撹拌機、還流冷却器、熱電対温度読み取り、および加熱マントルを備え付けた。フラスコに乾燥窒素を充填し、以下の反応は乾燥窒素の雰囲気中で行った。Ｎ−サリチロイル−１０−アミノデカン酸１００ｇおよび無水エタノール５００ｍＬをフラスコに充填した。撹拌しながら約４０℃までこのスラリーを加熱し、すべての固体を溶かした。反応器に添加ロートを取り付け、無水エタノールに溶かした１１．２重量％の水酸化ナトリウム２３２．５ｇを充填した。水酸化ナトリウム溶液は、１５分にわたって撹拌した反応混合物に加えた。反応器から還流冷却器を取り外し、蒸留ヘッドおよび受器に付け替えた。留出物約３９５ｇが集まるまで大気圧で反応混合物を蒸留した。この蒸留の間に、反応混合物は、濃厚なスラリーになった。反応混合物を室温まで冷却させた。濃厚な混合物を半融ガラスロートに移し、真空ろ過によって固体を回収した。エタノールで湿ったケーキを４５℃の真空オーブン中に置き、完全真空中で一定の重量まで乾燥した。乾燥した材料の重量は、約１２４．６ｇであった。
【００６４】
塩酸で生成物を滴定すると、塩酸約２モル当量を消費する２つの変曲点が得られた。ＣＨＮ分析：理論値（水０．４７重量％を補正）Ｃ５７．１５％、Ｈ７．３７％、Ｎ３．５１％、Ｎａ１１．５１％；実測値Ｃ５７．３０％、Ｈ７．３２％、Ｎ３．４７％、Ｎａ１１．２０％。
【００６５】
実施例７
Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸二ナトリウムエタノール溶媒和物の調製
【００６６】
【化４】
0004642435.tif 000006
【００６７】
１２Ｌ、パイレックス（登録商標）ガラス、四つ口、丸底フラスコに、頭上式撹拌機、熱電対温度読み取り、還流冷却器および加熱マントルを備え付けた。フラスコに乾燥窒素をパージし、以下の反応は乾燥窒素の雰囲気中で行った。Ｎ−（５−クロロ−サリチロイル）−８−アミノオクタン酸１０００ｇおよび無水エタノール３０００ｍＬをフラスコに充填した。撹拌しながら約５５℃までこのスラリーを加熱すると、わずかに濁った溶液が得られた。次いで、無水エタノールに溶かした１１．２重量％の水酸化ナトリウム２２７６ｇをできるだけ素早く反応器に充填した。わずかな発熱反応が反応器中の温度を約６４℃まで上昇させ、沈殿が生成し始めた。反応器から還流冷却器を取り外し、反応器を蒸留に設定した。反応混合物をさらに３時間にわたって蒸留すると、留出物約２５６６ｇが得られた。ポットスラリーを室温までゆっくりと冷却させた。スラリー中の生成物固体を半融ガラスロートによる真空ろ過によって固体を回収するとエタノールで湿ったケーキ１３９０ｇが得られた。この湿ったケーキをガラストレイに移して、真空オーブン中に置いた。このケーキを約４５℃および完全真空中で一定の重量まで乾燥した。乾燥した生成物の重量は、約１０９４．７ｇであった。
【００６８】
塩酸で生成物を滴定すると、塩酸約２モル当量を消費する２つの変曲点が得られた。ＣＨＮ分析：理論値（水０重量％を補正）Ｃ５０．５６％、Ｈ５．９９％、Ｎ３．４７％、Ｎａ１１．３９％；実測値Ｃ５０．２４％、Ｈ５．７４％、Ｎ３．５０％（Ｎａは測定しなかった）。
【００６９】
実施例８
Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸一ナトリウムの調製
２２Ｌ、パイレックス（登録商標）ガラス、五つ口、丸底フラスコに、頭上式撹拌機、熱電対温度読み取り、および加熱マントルを備え付けた。Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸８０１．８ｇおよび水６０００ｍＬをフラスコに充填し撹拌した。このスラリーに水３０００ｍＬに溶かした水酸化ナトリウム１０４ｇを加えた。混合物を約６３℃まで加熱し、大部分の固体を溶かした。わずかに濁った得られた混合物を、大きな実験室用ロータリーエバポレーターのポットフラスコに移した。ロータリーエバポレーターのポットフラスコ中に固体の塊が得られるまで、一ナトリウム塩混合物から水を除去した。真空を開放し、ロータリーエバポレーターからポットフラスコを取り外した。ポットフラスコからトレーに固体をすくい取った。次いで、これらのトレーを真空オーブン中に置き、約８０℃で約４８時間、完全真空中で固体を乾燥した。乾燥した固体は、所望の一ナトリウム塩であると確認された。乾燥した材料の重量は、８２２．４ｇであった。
【００７０】
塩酸で生成物を滴定すると、塩酸約１モル当量を消費する１つの変曲点が得られた。ＣＨＮ分析：理論値（水０．５４９重量％を補正）Ｃ６１．６５％、Ｈ７．３７％、Ｎ４．２３％、Ｎａ６．９４％；実測値Ｃ６１．７２％、Ｈ７．３８％、Ｎ３．９３％、Ｎａ６．６１％。
【００７１】
実施例９
Ｎ−サリチロイル−１０−アミノデカン酸二ナトリウムエタノール溶媒和物／ヘパリンカプセルの調製
Ｎ−サリチロイル−１０−アミノデカン酸（SNAD）二ナトリウムエタノール溶媒和物を２０メッシュのふるいで選別した。選別したSNAD二ナトリウムエタノール溶媒和物７．７７ｇを量り分け、乳鉢に移した。Waunakee, WIのScientific Protein Laboratories, Inc.から市販されているヘパリンナトリウム、USP（１８２単位／ｍｇ）１．３５ｇを量り分け、乳鉢中のSNAD二ナトリウムエタノール溶媒和物に加えた。スパチュラで粉末を混ぜた。混ぜた粉末を、East Stroudsburg, PAのPatterson-Kelly Co.から市販されている１パイントＶ型混合機シェルに移し、約５分間混ぜた。
【００７２】
Fairfield, NJ のTorpac Inc.から市販されている０サイズ硬ゼラチンカプセルをそれぞれ、SNAD二ナトリウムエタノール溶媒和物／ヘパリン粉末約２９７〜３０４ｍｇにより手で満たした。それぞれのカプセル中の平均粉末重量は約３００．４ｍｇで、カプセルの平均全重量（すなわち、粉末を含めたカプセルの重量）は、約３８７．２５ｍｇであった。それぞれのカプセルは、SNAD二ナトリウムエタノール溶媒和物約２５９．０１ｍｇおよびヘパリン約４５．０ｍｇを含有していた。
【００７３】
実施例１０
SNAD一ナトリウム／ヘパリン錠剤の調製
SNAD一ナトリウム／ヘパリン錠剤は以下の通りに調製した。SNADは、３５メッシュのふるいで選別した。SNAD１５０．３ｇ、ヘパリンナトリウムUSP（Waunakee, WIのScientific Protein Laboratories, Inc.から市販されている）２７．３３ｇ、Avicel（商標） PH-101（Newark, DEのFMA Corporationから市販されている）１１２．４３ｇ、Ac-Di-Sol（商標）（FMA Corporationから市販されている）６．０ｇ、およびタルク（New Brunswick, NJのSpectrum Chemicals）２．２６５ｇを量り分け、East Stroudsburg, PAのPatterson-Kellyから市販されている２クオートＶ型混合機シェルに移し、約５分間混ぜ合わせた。Sumerset, NJのKorsch America Incから市販されているEK-O錠剤プレスを用い、得られた混合物をスラッグに圧縮した。得られたスラッグを粉砕し、２０メッシュのふるいをとおしてふるいにかけると顆粒が生成した。顆粒にタルク３．９４ｇおよびAc-Di-Sol５．２５ｇを加え、２クオートＶ型混合機シェルに移し、約５分間混ぜた。Ｖ型混合機中の顆粒にステアリン酸マグネシウム２．７２ｇを加え、さらに３分間混ぜた。EK-O錠剤プレスを用い、得られた製剤を錠剤にした。錠剤の平均重量は、３２０．８３ｍｇであった。
【００７４】
実施例１１
体重約３．０ｋｇの４匹のカニクイマカーク（cynomolgus macaque）サル（雄２匹、雌２匹）にそれぞれ、上記実施例９で調製したカプセル２個を投与した。それぞれのサルへの投与量は、SNAD二ナトリウムエタノール溶媒和物約１５０ｍｇ／ｋｇおよびヘパリン約３０ｍｇ／ｋｇであった。
【００７５】
それぞれの動物にカプセルを投与するための投与プロトコルは以下の通りである。投与に先立って（および投与後２時間）一夜動物を絶食させた。投与期間を通じて水は自由に与え、投与前の一夜および投与期間を通じてジュース４００ｍｌを動物に与えた。動物は吊り包帯で拘束した。カプセルは、コックド（coked）プランジャーおよび分離したゴムチップの付いた、カプセルを収容するプラスチックのツールである「ピルガン（pill gun）」内に入れた。ピルガンを動物の食道に挿入した。ピルガンのプランジャーを押し、ゴムチップから食道へカプセルを押し出した。次いで、ピルガンを引き抜いた。動物の口は閉じたままにして逆浸透水約５ｍｌを側面から口内に投与し、燕下反射を誘発した。動物の喉を擦って燕下反射をさらに誘発した。
【００７６】
血液試料（約１．３ｍｌ）は、適切な静脈（大腿静脈、上腕静脈、または伏在静脈）から投与前、投与１０、２０、３０、４０および５０分後、ならびに１、１．５、２、３、４および６時間後に採取した。血液試料は、約０．１０６Ｍクエン酸溶液約０．１３ｍｌと共に管に採取した。血液を加え、１．３ｍｌのラインまで管を満たした。次いで、湿式アイスペンディング（wet ice pending）遠心分離上に管を置いた。２４４０ｒｃｆ（約３６８０ｒｐｍ）で１５分間、血液試料を遠心分離し、冷蔵した（２〜８℃）。得られた血漿を２つのアリコートに分け、分析するまでドライアイス上または冷凍保存した（約−７０℃）。
【００７７】
分析法
血漿ヘパリン濃度は、Durham, NCのOrganon Teknika Corporationから市販されている抗Xa因子アッセイCHROMOSTRATE（商標）ヘパリン抗Ｘａアッセイを用いて測定した。動物の結果は、それぞれの時点について平均した。最高平均値は、投与約１時間後に達し、１．５４±０．１７ＩＵ／ｍＬであった。
【００７８】
比較実施例１１Ａ
実施例１１の手順を、SNAD二ナトリウム塩エタノール溶媒和物のカプセルの代わりに実施例１０で調製したSNAD一ナトリウム塩の錠剤で繰り返した。約４．０ｋｇのサルにそれぞれ、２個の錠剤を投与した。投与量は、SNAD（遊離酸当量）１５０ｍｇ／ｋｇおよびヘパリン３０ｍｇ／ｋｇであった。最高平均血漿ヘパリン濃度は、投与約２時間後に達し、０．２３±０．１９ＩＵ／ｍＬであった。
【００７９】
実施例１２
Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（SNAC）一ナトリウム塩の調製
SNACの遊離酸（すなわち、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸）は、適当な出発材料を用いて実施例１の方法によって調製した。
【００８０】
清浄な３００ガロン反応器に、０．５％トルエンで変性されたエタノール３２１Ｌを充填した。撹拌しながら、SNACの遊離酸１０９ｋｇ（乾燥）を加えた。反応器を２８℃まで加熱し、２５℃以上の温度に維持した。精製水、USP３４Ｌおよび水酸化ナトリウム１５．７８ｋｇの溶液を調製し、２４℃まで冷却し、１５分にわたり撹拌した反応器に加え、２５〜３５℃に反応温度を保った。混合物をさらに１５分間撹拌した。
【００８１】
隣接する反応器に、０．５％トルエンで変性されたエタノール３２１Ｌを充填した。循環器を用いて反応器を２８℃まで加熱した。第一の反応器の溶液を、３０分間にわたり第二の反応器に加え、２５℃以上に温度を保った。内容物を撹拌し、ヘプタン４１８Ｌを加えた。反応混合物を１０℃まで冷却し、遠心分離し、次いでヘプタン６０Ｌで洗浄した。生成物を集め、Stokesオーブン中８２℃および２６″Ｈｇ真空中で約６５時間（週末にわたり）乾燥した。SNAC一ナトリウム（すなわち、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸一ナトリウム塩）１０７．５ｋｇが回収された。
【００８２】
実施例１３
SNAC二ナトリウム塩の調製
SNACの遊離酸（すなわち、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸）は、以下の通りに調製した。実施例１２で調製したSNAC一ナトリウムを水に溶かした１当量の濃塩酸で酸性化し、撹拌した。次いで溶液を真空ろ過し、真空乾燥すると、遊離酸が得られた。
【００８３】
SNACの遊離酸１００ｇを２リットル四つ口丸底フラスコに量り入れ、無水エタノール５００ｍｌを加えた。温度を約４０℃に設定し、固体を溶液に入れた。エタノールに溶かした１１．２％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液２５５．７ｇを、１５分にわたって添加ロートによって加えると、温度は約８２℃まで上昇した。約１．５時間にわたり、約７６〜７９℃の塔頂温度でエタノール３８３．１ｇを留去した。窒素中で反応混合物を室温まで冷却させ、約２時間保ち、粗いロートを通して真空ろ過し、固体を回収した。ろ過ケーキをろ液で洗浄し、蒸発皿に移し、デシケーター中に一夜、室温で完全真空まで引いた。ピンク色の固体としてSNAC二ナトリウム塩エタノール溶媒和物９０．５ｇ（６８％）が回収された。融点＞２００℃（用いた機器の限界）。HPLCの記録は、１００面積％を示した。NMRは所望の生成物を示した。ＣＨＮ（Ｃ17Ｈ25ＮＯ5Ｎａ2・０．１２６５Ｈ2Ｏとして）計算値：Ｃ５４．９４、Ｈ６．８５、Ｎ３．７７、Ｎａ１２．３７；実測値Ｃ５５．０４、Ｈ６．５６、Ｎ３．８９、Ｎａ１２．３４。
【００８４】
SNACの二ナトリウム塩一水和物は、上記で製造したエタノール溶媒和物を８０℃の完全真空中で２２．７５時間乾燥し、空気に開放して室温で冷却し、一水和物を生成することによって製造した。一水和物の構造は、元素分析：Ｃ15Ｈ19ＮＯ4Ｎａ2・０．１２７Ｈ2Ｏとして計算値：Ｃ、５３．０１；Ｈ、６．１８；Ｎ、４．１２；Ｎａ、１３．５３；実測値：Ｃ、５３．０１；Ｈ、６．１０；Ｎ、３．８８；Ｎａ、１３．０８；および1HNMR（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：ｄ  １２．３５（１Ｈ、ｓ）、７．５５（１Ｈ、ｄｄ）、６．８（１Ｈ、ｄｔ）、６．２５（１Ｈ、ｄｄ）、６．００（１Ｈ、ｄｔ）、３．２（２Ｈ、ｑ）、１．９（２Ｈ、ｔ）、１．４５（４Ｈ、ｂｑ）、１．２５（６Ｈ、ｂｍ）によって確認した。融点＞２５０℃（用いた機器の限界）。
【００８５】
実施例１４
SNAD一ナトリウム塩の調製
SNADの遊離酸は、適当な出発材料を用いて実施例１に記載の方法によって調製した。
【００８６】
０．５％トルエンで変性させたエタノール２０６ＬおよびSNAD３３．８７ｋｇを反応器に充填し、１時間撹拌し、フィルタープレスを通して送った。Lompoc, CAのCelite Corporationから市販されているセライト（珪藻土）１．７ｋｇを反応器に加えた。反応器の内容物をフィルタープレスに通して送り、別の容器に溶液を保持した。脱イオン水５ガロンで反応器をすすいだ。脱イオン水１２Ｌ中でNaOH４．５ｋｇから製造した水酸化ナトリウム（NaOH）溶液と一緒に溶液を反応器に再導入した。反応器内容物を３０分間撹拌し、高温で真空ストリッピングを行うことにより溶媒３０ガロンを除去した。反応器内容物を６０℃まで冷却し、次いで激しく撹拌しながらそれぞれヘプタン６５ガロンが入った２つの１００ガロンタンクに注加した。撹拌を２時間続けた。溶液を遠心分離し、遠心脱水したヘプタン１５ガロンで洗浄し、２６″Ｈｇ中４５℃で２４時間、オーブン中で乾燥し、次いでFitzmill粉砕機（Elmhurst, ILのFitzpatrick Companyから市販されている）を通して送った。わずかに黄褐色の粉末としてSNADの一ナトリウム塩３２ｋｇが回収された（融点１９０〜１９２℃、HPLCによる純度９９．３％、分子量：３２９．３７）。滴定は、SNADの一ナトリウム塩約９６％および二ナトリウム塩約４％を示した。
【００８７】
実施例１５
SNAD二ナトリウム塩の調製
SNADの遊離酸（Ｎ−（１０−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）デカン酸）は、適当な出発材料を用いて実施例１に記載の方法によって調製した。
【００８８】
SNADの遊離酸１００ｇを１リットル四つ口丸底フラスコに量り入れた。無水エタノール５００ｍｌをフラスコに充填した。温度を約４０℃に設定し、固体を溶解させた。薄いオレンジ色の溶液が得られた。エタノールに溶かした１１．２（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液２３２．５ｇを、１５分にわたって添加ロートによって加えると、温度は約８２℃まで上昇した。約３時間にわたり、約７５〜７９℃の塔頂温度でエタノール３９７．８ｇを留去した。窒素中で一夜、反応混合物を室温まで冷却させた。得られたスラリーを、粗いロートを通して真空ろ過し、固体を回収し、ろ過ケーキをろ液で洗浄した。湿ったろ過ケーキを蒸発皿に移し、完全真空中で一夜、５０℃オーブン中に置いた。淡いピンク色の固体としてSNAD二ナトリウム塩エタノール溶媒和物１２４．５５ｇ（９６％）が回収された。融点＞２００℃（用いた機器の限界）。HPLCの記録は、１００面積％を示した。NMRは所望の生成物を示した。ＣＨＮ（Ｃ19Ｈ29ＮＯ5Ｎａ2として）計算値：Ｃ５７．４２、Ｈ７．３５、Ｎ３．５２、Ｎａ１１．５７；実測値：Ｃ５７．３７、Ｈ７．３５、Ｎ３．４１、Ｎａ１１．６３。
【００８９】
SNADの二ナトリウム塩一水和物は、上記で製造したエタノール溶媒和物を約８０℃の完全真空中で１９時間乾燥し、空気に開放して室温で溶液を冷却して一水和物を生成することによって製造した。水和物の構造は、元素分析：Ｃ17Ｈ23ＮＯ4Ｎａ2・Ｈ2Ｏとして計算値：Ｃ、５５．２８；Ｈ、６．８２；Ｎ、３．７９；Ｎａ、１２．４５；実測値：Ｃ、５６．０３；Ｈ、６．６７；Ｎ、３．６７；Ｎａ、１２．２０；および1HNMR（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｄ  １２．３５（１Ｈ、ｓ）、７．６（１Ｈ、ｄｄ）、６．８（１Ｈ、ｄｔ）、６．２５（１Ｈ、ｄｄ）、６．００（１Ｈ、ｄｔ）、３．２（２Ｈ、ｑ）、２．０（２Ｈ、ｔ）、１．９（２Ｈ、ｔ）、１．４５（４Ｈ、ｂｔ）、１．２５（１０Ｈ、ｂｍ）によって確認した。融点＞２５０℃（用いた機器の限界）。
【００９０】
実施例１６
ヘパリンの経口送達
ヘパリンナトリウムUSPおよび一ナトリウムあるいは二ナトリウム塩形の送達剤化合物SNACを含有する経口（PO）用強制投与溶液は、水で調製した。送達剤化合物およびヘパリン（１６６．９ＩＵ／ｍｇ）を乾燥粉末としてボルテックスすることによって混ぜた。この乾燥混合物を水に溶かし、約３７℃でボルテックスし超音波処理すると、透明な溶液が生成した。pHは調製しなかった。最終体積を約１０．０ｍｌに調整した。最終の送達剤化合物投与量、ヘパリン投与量および投与体積量を下表２に列挙する。
【００９１】
典型的な投与および試料採取プロトコルは以下の通りとした。体重２７５〜３５０ｇの雄性Sprague-Dawley系ラットを２４時間絶食させ、投与直前および麻酔を維持する必要に応じて再び、ケタミン塩酸塩（約８８ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内麻酔した。１０匹のラットからなる投与群に投与溶液の１つを投与した。１１ｃｍのRusch８フレンチカテーテルをピペットチップのついた１ｍｌ注射器に改造した。カテーテルを通して溶液を引くことによって投与溶液で注射器を満たし、次いで拭って乾燥した。切歯を通過し管から１ｃｍ離れた食道にカテーテルを置いた。注射器のピストンを押すことによって溶液を投与した。
【００９２】
投与０．２５、０．５、１．０および１．５時間後に心臓穿刺によりクエン酸処理の血液を採取した。ヘパリン吸収は、Henry, J.B., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia, PA, W.B. Saunders (1979)の方法に従い、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）によって測定した凝固時間の増加によって検証した。予備試験では約２０秒のベースライン値を示した。それぞれの時点についてそれぞれの群の動物による結果を平均し、最高APTT値（秒で）を下表２に報告する。ヘパリン吸収はまた、Durham, NCのOrganon Teknika Corporationから市販されている抗Xa因子アッセイCHROMOSTRATE（登録商標）ヘパリン抗Ｘaアッセイによって測定される血漿ヘパリンの増加によっても検証した。ベースライン値は約ゼロＩＵ／ｍｌである。それぞれの時点についてそれぞれの群の動物による血漿ヘパリン濃度を平均し、プロットした。これらの平均血漿ヘパリン濃度の最高を下表２に報告する。
【００９３】
【表２】
0004642435.tif 000007
【００９４】
実施例１７
低分子量ヘパリン（LMWH）の経口送達
低分子量ヘパリン（LMWH）および一ナトリウムあるいは二ナトリウム塩形の送達剤化合物SNADを含有する経口（PO）用投与組成物は、水で調製した。送達剤化合物およびModena, ItalyのOpocrinから市販されているLMWH（パルナパリン、９１ＩＵ／ｍｇ、平均分子量約５，０００）を乾燥粉末としてボルテックスすることによって混ぜた。この乾燥混合物を水に溶かし、約３７℃でボルテックスし超音波処理すると、透明な溶液が生成した。pHは調製しなかった。最終体積を約１０．０ｍｌに調整した。最終の送達剤化合物投与量、LMWH投与量および投与体積量を下表３に列挙する。
【００９５】
投与は、上記実施例１６で記載したように行った。
【００９６】
投与０．５、１．０、２．０、３．０および４．０時間後に心臓穿刺によりクエン酸処理の血液を採取した。ヘパリン吸収は、Durham, NCのOrganon Teknika Corporationから市販されている抗Xa因子アッセイCHROMOSTRATE（登録商標）ヘパリン抗Ｘａアッセイによって測定される血漿ヘパリンの増加によって検証した。ベースライン値は前もって測定し、約ゼロＩＵ／ｍｌであることが分かった。それぞれの時点についてそれぞれの群の動物による血漿ヘパリン濃度を平均し、プロットした。これらの平均血漿ヘパリン濃度の最高を下表３に報告する。
【００９７】
【表３】
0004642435.tif 000008
【００９８】
実施例１８
Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸（5-CNAC）の調製
窒素雰囲気中で５−クロロサリチルアミド（２８０ｇ、１．６ｍｏｌ）およびアセトニトリル（６７０ｍｌ）を５リットル、四つ口、丸底フラスコに入れ、撹拌した。２５分間にわたり混合物にピリジン（１６１．３ｇ、２．０ｍｏｌ）を加えた。反応容器を氷／水浴内に置き、クロロギ酸エチルの少量ずつの添加を開始した。この添加を１時間にわたって続けた。添加が終了したら氷／水浴を取り外し、反応混合物を室温にした。反応混合物を室温でさらに１時間撹拌させ、大気圧で蒸留するために反応容器の構成を変更した。続く蒸留で、塔頂温度７８℃の留出物２５７．２ｇが得られた。フラスコ中に残った反応混合物に脱イオン水５００ｍｌを加え、得られたスラリーを真空ろ過した。ろ過ケーキを脱イオン水２００ｍｌで洗浄し、真空中室温で一夜乾燥させた。乾燥後、６−クロロカルサラム（carsalam）３１３．６ｇ（９７．３％）が単離された。これと同じ方法を用い追加のバッチを製造すると、６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン４４．５ｇが得られた。
【００９９】
６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン（３２３．１ｇ、１．６ｍｏｌ）およびジメチルアセトアミド（９７０ｍｌ）が入った５リットル、四つ口、丸底フラスコに炭酸ナトリウム（１９４．０ｇ、１．８ｍｏｌ）を加えた。撹拌した反応混合物に８−ブロモオクタン酸エチル（４５９．０ｇ、１．８ｍｏｌ）を一度に加えた。反応容器の大気圧を５５０ｍｍＨｇまで低下させ、反応混合物の加熱を開始した。７０℃に約５時間、反応温度を維持し、加熱および真空を中止した。反応混合物を一夜、室温まで冷却させた。反応混合物を真空ろ過し、ろ過ケーキをエチルアルコール（５２５ｍｌ）で洗浄した。撹拌したろ液に脱イオン水（５２５ｍｌ）をゆっくり加えると、白色の固体が沈殿した。反応容器の回りに氷／水浴を置き、スラリーを５℃まで冷却した。この温度で約１５分間撹拌した後、真空ろ過によって固体を回収し、ろ過ケーキを最初にエタノール（３００ｍｌ）で、次いでヘプタン（４００ｍｌ）で洗浄した。真空中室温で一夜乾燥後、８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチル５９８．４ｇ（９９．５％）が得られた。これと同じ方法により、追加の８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチル６６．６ｇを製造した。
【０１００】
８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチル（６４１ｇ、１．７ｍｏｌ）およびエチルアルコール（３２００ｍｌ）を２２リットル、五つ口フラスコに加えた。別の５リットルフラスコで、水酸化ナトリウム（NaOH）（２８８．５ｇ、７．２ｍｏｌ）を脱イオン水（３８５０ｍｌ）に溶かした。２２リットルフラスコに入った反応混合物にこの混合物を加えた。温度が４０℃まで上昇するのが認められた。反応混合物の加熱を開始し、反応温度が５０℃まで上昇するとすべての固体が反応混合物中に溶けるのが認められた。反応混合物中の温度を５０℃に１．５時間維持した。次いで、反応フラスコを真空蒸留のために組み立てた。蒸気温度５５℃（１０ｍｍＨｇ）で留出物２２００ｍｌが集まったら、蒸留を中止した。次いで、反応フラスコを氷／水浴内に置き、４５分にわたって濃塩酸（ＨＣｌ）（７５２ｍｌ）を加えた。この添加中、反応混合物がやや濃厚になるのが認められ、反応混合物の撹拌を助けるために追加の脱イオン水４リットルを加えた。次いで、反応混合物を真空ろ過し、ろ過ケーキを脱イオン水３リットルで洗浄した。室温で真空中乾燥すると、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸４５６．７ｇ（８３．５％）が単離された。
【０１０１】
実施例１９
サケカルシトニン（sCT）および5-CNACナトリウム塩の凍結乾燥
5-CNACナトリウム塩の調製
5-CNACのパーセント純度は以下の通り測定した。5-CNACの遊離酸０．９９６４ｇをメタノール４０ｍｌに定量的に溶かした。固体が溶けたら、この溶液に蒸留水２ｍｌを加えた。コンピュータ制御ビュレット（Reno, NVのHamiltonから市販されているHamilton自動ビュレット）を用い、０．３３Ｎ水酸化ナトリウムで、メタノール中、溶液を滴定した。ガラス電極（South Plainfield, NJのVWR Scientificから市販されているコンピュータ制御Orion型525A pHメーター）を用い、溶液のpHをモニターした。溶液は、磁気撹拌機で撹拌した。
【０１０２】
第二のpH変曲点に達する滴定剤の体積は、１８．８０ｍｌであった。変曲点は、pHプロットの二次導関数がプラスからマイナスに変化する２つのデータポイント間の内挿法によって決定され、pH 11.3にあった。遊離酸の純度は、以下の式を用いて計算した：
％純度＝（１００×（滴定剤の体積（ｍｌ））×規定度×分子量）／（１０００×当量×試料重量）
上式で、規定度は水酸化ナトリウムの規定度、分子量は、5-CNAC遊離酸の分子量（３１３．７８）、当量は、遊離酸の当量（二塩基であるからこの場合は２）、試料重量は、滴定される遊離酸試料の重量である。
【０１０３】
純度は９７．０％であることが分かった。
【０１０４】
5-CNAC粉末９．３４５８ｇを量り分けた。遊離酸に対する水酸化ナトリウムのモル比が１．６であるのに必要な０．３３Ｎ水酸化ナトリウムの量は、以下の式を用いて計算した。
NaOHの体積（ｍｌ）＝（遊離酸重量×（％純度）×１０００×１．６）／（３１３．７８×１００×規定度）
上式で、遊離酸重量は、製剤化された試料中の遊離酸の重量、％純度は、5-CNACのパーセンテージ純度、規定度は、水酸化ナトリウムの規定度、NaOHの体積は、必要な水酸化ナトリウムの量である。
【０１０５】
5-CNACおよび０．３３Ｎ水酸化ナトリウム（NaOH）１５３．３ｍｌをパイレックス（登録商標）瓶中で混ぜた。得られたスラリーを、水蒸気浴中で６０〜８０℃まで温めた。時々撹拌すると約１５分で温かいスラリーが透明な溶液になった。溶液を室温まで冷却した。この溶液のpHは8.1であった。
【０１０６】
sCT／5-CNACナトリウム塩溶液の調製
5-CNACナトリウム塩の水溶液を、１５０ｍｌCorningろ過器（VWR Scientific Product, S. Plainfield, NJから市販されている）上の無菌、０．４５ミクロン酢酸セルロース、低タンパク結合膜を通してろ過した。溶液のpHは、約8.3であった。
【０１０７】
−７０℃で保存されていた乾燥サケカルシトニン（sCT）を室温にした。次に、sCT１８．６９２ｍｇを量り分け、穏やかに撹拌しながら、pH約5の０．１Ｍリン酸一ナトリウム緩衝溶液１０ｍｌに溶かした。
【０１０８】
泡立ったりボルテックスしないように注意して穏やかに撹拌しながら、5-CNACナトリウム塩溶液にsCT溶液を加えた。
【０１０９】
sCT／5-CNACナトリウム塩溶液の凍結乾燥
凍結乾燥器（Gardiner, NYのThe Virtis CompanyからのGenesis 25 LL-800）の棚は、約−４５℃で予め冷凍した。
【０１１０】
sCT／5-CNACナトリウム塩溶液約２６０ｍｌを３０ｃｍ×１８ｃｍステンレススチールトレーに加えると、厚さ約０．４８ｃｍのケーキが得られた。４個の清浄で、乾燥した熱電対プローブチップを、プローブチップが中央の溶液表面に触れるように溶液内に挿入した。プローブは、トレーの側面にクリップで固定し、予冷した棚の上にトレーを載せた。
【０１１１】
表４に示すサイクルのためにゲル浸透クロマトグラフ（GPC2）をプログラムした。
【０１１２】
【表４】
0004642435.tif 000009
【０１１３】
凍結乾燥中に圧力は、３５０から４５ｍｔｏｒｒまで変化した。凍結乾燥サイクルが終了したら、システムサイクルを終了し、システム真空を解放した。棚からトレーを注意深く取り外し、凍結乾燥された粉末を、VWR Sceintificから市販されている琥珀色のHDPE NALGENE（登録商標）瓶に移した。
【０１１４】
上記の凍結乾燥サイクルを用い、水分含量が約３％の粉末を得た。必要に応じ、Greenwood, SCのWarner Lamber Co.の１部門であるCapsugelから市販されている硬ゼラチンカプセル（サイズ0EL/CS）にこの粉末を手で詰めた。満たされたカプセルおよび凍結乾燥粉末は、乾燥剤と共に密封容器に保存した。
【０１１５】
実施例２０
非凍結乾燥sCT／5-CNACナトリウム塩溶液の調製
無水酢酸（５６．８１ｍｌ、６１．４７ｇ、０．６０２６ｍｏｌ）、5-クロロサリチル酸（１００．００ｇ、０．５７９４ｍｏｌ）、およびキシレン（２００ｍｌ）を、磁気撹拌棒、温度計、および冷却器のあるディーン−スタークトラップを備え付けた５００ｍｌ、三つ口フラスコに加えた。フラスコを加熱還流すると、１００℃近辺で反応混合物は黄色の透明な溶液になった。大部分の揮発性有機物（キシレンおよび酢酸）はディーン−スタークトラップに蒸留された（１３５〜１４６℃）。さらに１時間蒸留を続けると、その間にポット温度は１９０℃までゆっくりと上昇し、留出物は、他の溶媒を超える留出物の流れも遅くなった。溶媒約２５０ｍｌを集めた。残渣を１００℃以下に冷却し、ジオキサンを加えた。
【０１１６】
２Ｎ水酸化ナトリウム（２２２．８５ｍｌ、０．４４５７ｍｏｌ）および８−アミノカプリル酸（７０．９６ｇ、０．４４５７ｍｏｌ）溶液を、オリゴ（５−クロロサリチル酸）（０．５７９４ｍｏｌ）のジオキサン溶液に加えた。反応混合物を５．５時間、９０℃まで加熱し、次いで一夜止め、朝に加熱還流を再開した（反応を再開した後、HPLCによって反応をモニターするとその時点で反応が終了していたことが分かった）。反応混合物を４０℃まで冷却した。ジオキサンを真空中でストリップした。残渣を2N水酸化ナトリウムに取り、酸性にした。材料は固化しなかった。次いで、材料を酢酸エチルに取り、抽出し（２×１００ｍｌ）、過剰のジオキサンを除去した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中で濃縮した。容易にろ過される固体をろ過によって集めた。残りの材料は、2N NaOHに取った。pHを4.3に調整すると、出発材料から生成物が選択的に分離した。pH 4.3で１回、固体をろ過し、エタノールおよび水の１：１混合物で再結晶した。不溶の材料は、熱ろ過でまず除いた。集めたすべての固体を合わせ、エタノールおよび水の混合物から再結晶すると、白色の固体として遊離酸生成物５２．０６ｇが得られた。
【０１１７】
ナトリウム塩溶液は、0.2N NaOH溶液を用い、実施例１９に記載の方法に従って調製した。パーセント純度は、5-CNAC０．５０３８ｇおよび0.2N NaOH１６．０６ｍｌを用いて１００％と計算された。ナトリウム塩溶液は、前述のように0.2N NaOH２５０ｍｌおよび5-CNAC９．４５８５ｇを用いて調製した。０．４５ミクロンろ過器を通して溶液をろ過した。
【０１１８】
実施例２１
ラットにおけるsCT／5-CNACナトリウム塩の経口送達
体重２００〜２５０ｇの雄性Sprague-Dawley系ラットを２４時間絶食させ、投与１５分前にケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）およびクロロプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。以下のうちの１つをラットに投与した：
（４ａ）実施例１９におけるように調製した凍結乾燥粉末１３ｍｇのカプセル１個を、カプセルを流し落とすための水０．５ｍｌと共に経口で；
（４ｂ）実施例１９で調製した凍結乾燥粉末の再構成水溶液１．０ｍｌ／ｋｇを経口で；
（４ｃ）実施例２０で調製した5-CNACナトリウム塩の「新たな（fresh）」非凍結乾燥水溶液１．０ｍｌ／ｋｇを経口で；または
（４ｄ）sCT５ｍｇ／ｋｇを皮下で。
【０１１９】
投与（４ａ）、（４ｂ）および（４ｃ）は、5-CNACナトリウム塩５０ｍｇ／ｋｇおよびsCT１００ｍｇ／ｋｇを含んでいた。（４ａ）の投与量はおよそであり、その理由は、動物の平均体重２５０ｇに基づいて決められた粉末量で満たしたカプセル１個を動物に投与したが、動物の実際の体重は異なるためである。このことは、カプセルを投与する以後の全実施例にもあてはまる。
【０１２０】
（４ｂ）の再構成した溶液は、実施例１９で調製した凍結乾燥粉末１５０ｍｇを水３ｍｌ中で混ぜることによって調製した。再構成溶液は、１．０ｍｌ／ｋｇで投与した。
【０１２１】
（４ｃ）の「新たな」溶液は、水３ｍｌに溶かした実施例２０で調製した5-CNACナトリウム塩１５０ｍｇとsCT保存溶液（HClおよびNaOHでpHを4に調製した０．１Ｍリン酸緩衝液中で調製された２０００ｍｌ／ｍｌ）１５０ｍｌを用い、非凍結乾燥材料から調製した。この「新たな」溶液の最終濃度は、5-CNACナトリウム塩５０ｍｇ／ｍｌおよびsCT１００ｍｇ／ｍｌであり、１．０ｍｌ／ｋｇを投与した。
【０１２２】
皮下投与は、水１ｍｌにsCT２ｍｇを溶かすことによって調製した。この溶液５ｍＬを水９９５ｍＬに加えた。この溶液を０．５ｍｌ／ｋｇで投与した。
【０１２３】
血液試料は、尾動脈から連続的に採取した。血清sCTは、EIAキット（Peninsula Laboratories, Inc., San Carlos, CAからのKit # EIAS-6003）でテストし、キットの標準プロトコルを以下の通り修正することによって測定した：暗所で振とうしながら２時間、５０ｍｌのペプチド抗体と共にインキュベートし、プレートを洗浄し、血清を加えペプチドをビオチニル化して緩衝液４ｍｌで希釈し、暗所で一夜振とうした。下表５に結果を示す。
【０１２４】
【表５】
0004642435.tif 000010
【０１２５】
実施例２２
ラットにおけるsCT／5-CNACナトリウム塩の経口送達
実施例２１に記載の方法に従い、以下のうちの１つをラットに投与した：
（５ａ）凍結乾燥粉末１３ｍｇのカプセル１個を、カプセルを流し落とすための水１ｍｌと共に経口で；
（５ｂ）凍結乾燥粉末６．５ｍｇのカプセル１個を、カプセルを流し落とすための水１ｍｌと共に経口で；
（５ｃ）凍結乾燥粉末３．２５ｍｇのカプセル１個を、カプセルを流し落とすための水１ｍｌと共に経口で；または
（５ｄ）sCT５ｍｇ／ｋｇを皮下で。
【０１２６】
送達剤およびsCTのおおよその量、ならびに結果を、下表６に示す。
【０１２７】
【表６】
0004642435.tif 000011
【０１２８】
実施例２３
Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸の調製
６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン（実施例１８と同様に調製）（５０ｇ、０．２５３２ｍｏｌ）およびジメチルアセトアミド（７５ｍｌ）が入って５００ｍｌ、三つ口、丸底フラスコに炭酸ナトリウム（３０ｇ、０．２８３５ｍｏｌ）を加え撹拌した。撹拌した反応混合物に４−ブロモ酪酸メチル（４５．８３ｇ、０．２５３２ｍｏｌ）を一度に加え、反応混合物の加熱を開始した。７０℃に反応温度を維持し、一夜加熱した。加熱を中止し、反応混合物を室温まで冷却させた。
【０１２９】
反応混合物を真空ろ過し、ろ過ケーキをエチルアルコールで洗浄した。ろ過ケーキおよびろ液をHPLCでモニターし、生成物の場所を判断した。大部分の生成物はろ液中に洗い入れたが、一部の生成物は依然としてろ過ケーキ中に存在した。生成物を回収して最終収量を上げるため、ろ過ケーキを処理した。初めに多量の水、次いで酢酸エチルでろ過ケーキを洗浄した。ろ過ケーキの洗浄液を分離し、次に酢酸エチル層を水で２回、食塩水で１回洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥し、分離して真空中で濃縮すると、さらに固体が回収された（固体Ｂ）。前に分離したろ液に水を加えると、固体が沈殿した。これらの固体を分離した（固体Ａ）。固体ＡおよびＢを合わせ、丸底フラスコに移し、ろ液に2N NaOHを加え、撹拌しながら加熱を始めた。HPLCにより反応をモニターし反応が終了する時間を判断した。反応を２５℃まで冷却し、一夜撹拌し、真空中で濃縮して過剰のエタノールを除去した。反応容器の回りに氷／水浴を置き、スラリーを酸性にした。真空ろ過によって固体を回収し、ろ過ケーキを水で洗浄し、乾燥してNMR分析に送った。
【０１３０】
固体を分離し、再結晶するためにエルレンマイヤーフラスコに移した。メタノール／水で固体を再結晶した。固体が生成し、ブフナーロート中に洗浄した。ろ液中に固体がさらに沈殿し、回収した。再結晶後に回収された最初の固体は、メチルエステルを形成していた。すべての固体を合わせ、2N NaOHを加え、遊離酸に戻すために再び加熱還流した。HPLCで測定し、エステルが消失したら、混合物を約4.7のpHまで酸性とし、固体を生成させた。
【０１３１】
ろ過によって固体を分離し、すべての固体と合わせ、１．５：１．０の比のメタノール−水を用いて再結晶した。白色の固体が一夜に沈殿し、分離して乾燥すると、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸２３．４８ｇが収率３６％で得られた。
【０１３２】
ろ過ケーキ中に生成物が残るのを避けるためには、ろ過ケーキをまず過剰のエチルアルコールで洗浄しなければならないことが後に判明した。その時点からは、ろ液および2N NaOHを撹拌しながら加熱し、２５℃まで冷却して真空中で濃縮し、過剰のエタノールを除去することができた。氷／水浴中でスラリを、pH 4.7の酸性にした。真空ろ過によって固体を回収し、ろ過ケーキを水で洗浄した。次いで、固体を分離し、再結晶した。
【０１３３】
実施例２４
sCT／Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸ナトリウム塩の凍結乾燥
実施例１９の手順に従い、sCT／Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸ナトリウム塩の凍結乾燥粉末を調製し、カプセルに詰めた。実施例２３で調製したＮ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸１０．５２８ｇを水１５０ｍｌに溶かした。10N NaOH４．７２ｍｌを加えた。sCT２１．０５６６ｍｇをリン酸緩衝液１０ｍｌに溶かし、送達剤溶液にsCT／リン酸緩衝液混合物を加えた。水を加えて体積を２５０ｍｌにした。
【０１３４】
実施例２５
ラットにおけるsCT／Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸ナトリウム塩の経口送達
EIAキットの標準プロトコルに従ったことを除いては実施例２１の方法に従い、下表７に示すＮ−（５−クロロサリチロイル）−４−アミノ酪酸ナトリウム塩およびsCTのおおよその量で、凍結乾燥粉末１３ｍｇのカプセル１個を、カプセルを流し落とすための水０．５ｍｌと共に経口でラットに投与した。結果も表７に示す。
【０１３５】
【表７】
0004642435.tif 000012
【０１３６】
実施例２６
錠剤化用5-CNACの調製
清浄で乾燥した２００ガロンのグラスライニング反応器に、乾燥アセトニトリル１７８Ｌを加えた。撹拌機を１００〜１２５ＲＰＭに設定し、反応器内容物を約９℃まで冷却した。Leominster, MAのPolycarbon Industriesから市販されている５−クロロサリチルアミド７４ｋｇを反応器に充填し、充填口を閉じた。乾燥ピリジン４７Ｌを反応器に充填した。進める前にスラリーを約９℃まで冷却した。反応器の冷却器を冷却し、塔頂留出バルブを全還流に設定した。２時間にわたり、バッチ温度を１４℃に維持しながら、クロロギ酸エチル４９．７ｋｇを２００ガロンの反応器に充填した。クロロギ酸エチルはホスゲン０．１％を含有することがあり、水とは極めて反応性であることに注意すること。反応は極めて発熱的であり、反応温度を下げるためにプロセス冷却装置を使用する必要がある。クロロギ酸エチルの添加が終了したら、反応器内容物を１０〜１４℃で３０分間撹拌した。次いで、反応器内容物を約２５分間にわたって約８５℃まで加熱し、すべての留出物を受器に集めた。反応器内容物を約６時間８５〜９４℃に保ち、蒸留されたすべての材料を受器に集めた。反応混合物を試料採取し、HPLCによって変換（＞９０％）をモニターした。変換は、６時間後に９９．９％であることが分かった。反応器内容物を１時間にわたり約１９℃まで冷却した。脱イオン水１３４Ｌを反応器に充填した。直ちに沈殿が生成した。反応器内容物を約５℃まで冷却し、約１０．５時間撹拌した。生成物が溶液から結晶化し続けた。反応器スラリーを遠心分離した。脱イオン水５５Ｌを２００ガロンのグラスライニング反応器に充填し、遠心分離された湿ったケーキを洗浄した。完全真空（２８″Ｈｇ）中、５８℃で約１９．５時間、中間体を乾燥した。収量は、６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン８２．６ｋｇであった。この中間体は、水に曝されないように包装して保存した。
【０１３７】
以下の調製では、蒸留水を加える時点までは、工程中において水は絶対に容認できない。
【０１３８】
乾燥ジメチルアセトアミド２２２Ｌを乾燥した２００ガロンのグラスライニング反応器に充填した。反応器の撹拌機は、１００〜１２５ＲＰＭに設定した。冷却器を冷却し、反応器塔頂留出バルブを蒸留に設定した。乾燥した無水炭酸ナトリウム４１．６ｋｇを反応器に充填し、反応器の充填口を閉じた。いくらかガスが発生しわずかに発熱反応であるため、注意した。乾燥した６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン７７．５ｋｇを反応器に充填した。急いで、乾燥した８−ブロモオクタン酸エチル８８ｋｇを反応器に充填した。２２〜２４インチの真空をかけ、反応器温度を６５〜７５℃まで上げた。反応器温度を維持し、内容物の発泡に注意した。反応器混合物を試料採取し、ガスクロマトグラフィ（GC）によって反応混合物中のブロモエステルの消失をモニターすることにより変換をモニターした。反応は、７時間後に完了した（０．６％のブロモエステルが認められた）。真空を遮断し、反応器内容物を４５〜５０℃まで冷却した。内容物を遠心分離し、ろ液を第二の２００ガロングラスライニング反応器に送った。エタノール１１９Ｌ（０．５％トルエンで変性させた２００プルーフ）を第一の２００ガロン反応器に充填し、約４５℃まで温め、ろ過ケーキを温かいエタノールで洗浄し、第二の２００ガロン反応器中の反応混合物に加えた。第二の２００ガロン反応器でかき混ぜ機の運転を始めた。反応器内容物を約２９℃まで冷却した。水がバッチ中に直接落ちるようにして、第二の反応器に蒸留水１２０Ｌをゆっくりと充填した。反応器内容物を約８℃まで冷却した。中間体が溶液から現れ、９．５時間保った。得られたスラリーを遠心分離した。エタノール７０Ｌを反応器に充填し、８℃まで冷却し、遠心分離ケーキを洗浄した。湿ったケーキを、紙で裏打ちしたドラムの内部に置いた二重ポリエチレン袋に降ろした。収量は、８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチル１２３．５ｋｇであった。
【０１３９】
USP精製水４００Ｌおよび水酸化ナトリウムペレット４５．４ｋｇを２００ガロンのグラスライニング反応器に充填し、撹拌機を１００〜１２５ＲＰＭに設定した。８−（６−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオニル）オクタン酸エチルの湿ったケーキ１２３．５ｋｇを反応器に充填した。充填口を閉じた。冷却水を冷却器に通し、反応器塔頂留出バルブを大気圧蒸留に設定した。反応器内容物を約９８℃まで加熱し、HPLCにより変換をモニターした。当初（約４０分）反応器は約６８℃で還流したが、蒸留によってエタノールが除去されるにつれて、反応器温度は約９８℃まで上昇した。HPLCによって判明したように、出発材料は約４時間で消失した。反応器内容物を約２７℃まで冷却
した。USP精製水１５０Ｌを隣接する２００ガロングラスライニング反応器に充填し、撹拌機を１００〜１２５ＲＰＭに設定した。濃塩酸（１２Ｍ）１０４Ｌを反応器に充填し、約２４℃まで冷却した。ケン化された反応混合物を２００ガロングラスライニング反応器にゆっくりと（約５時間にわたり）充填した。二酸化炭素発生のため、材料（４５Ｌおよび４５Ｌ）を２つの反応器（それぞれ２００ガロン）に分けた。生成物が溶液から沈殿した。５０％NaOH溶液（水２Ｌ、NaOH２ｋｇ）で反応混合物をpH 2.0〜4.0に調整した。反応器内容物を約９〜１５℃まで冷却した。約９時間にわたり溶液から中間体が結晶化した。反応器スラリーを遠心分離して中間体を分離した。USP精製水５０Ｌを２００ガロングラスライニング反応器に充填し、このすすぎ液を用いて遠心分離した湿ったケーキを洗浄した。湿ったケーキは、プラスチックドラムの内部に置かれた二重ポリエチレン袋に降ろした。Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸を、約６８℃で約３８時間、真空（２７″Ｈｇ）で乾燥した。乾燥したケーキは、上端に乾燥剤の袋が置かれた５５−ガロンのスチール製の裏打ちしていないオープンヘッドドラムの内部に置かれた二重ポリエチレン袋に降ろした。Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸の乾燥単離収量は、８１ｋｇであった。
【０１４０】
実施例２７
sCT／錠剤化用5-CNACナトリウム塩の凍結乾燥
実施例１９の方法を用い、実施例２６で調製した5-CNAC２００ｍｇを用いて凍結乾燥粉末を調製した。NaOH溶液は、水２０００ｍｌに１００％NaOH４２ｇを溶かすことによって製造した。スラリを室温で撹拌し、０．４５ミクロンのろ過器で真空ろ過した。5-CNACナトリウム塩を含有する溶液のpHは、約8.6であった。sCT２００ｍｇを用いた。
【０１４１】
実施例２８
sCT／5-CNACナトリウム塩錠剤の調製
実施例２７で調製した凍結乾燥粉末の錠剤は、以下のように調製した。
【０１４２】
錠剤圧縮には、Wabash, IndianaのCarverから市販されている機器を備えたCarverプレス（Ｃ型）を用いた。用いるダイ（die）は、直径０．２４５″とした。トップポンチ（punch）は、フラットフェース、はす縁（bevel-edged）で直径０．２４５″とし、ボトムポンチは、フラットフェース、刻み目つき（scored）、はす縁で直径０．２４５″とした。プレスは、上部および下部ポンチ力ならびに上部ポンチの変位を測定することができる。直接圧縮の処方は、下表８に示すように設計した。
【０１４３】
【表８】
0004642435.tif 000013
【０１４４】
AC-DI-SOL（登録商標）は、クロスカルメロースナトリウム（NF, PH.Eur., JPE）であり、Philadelphia, PAのFMC Corporation, Pharmaceutical Divisionから市販されている。  CAB-O-SIL（登録商標）は、フュームドシリカであり、Cabot Corporation, Tuscola, ILから市販されている。
【０１４５】
Ac-Di-Sol（登録商標）およびCab-O-Sil（登録商標）を秤量し、混合瓶に移した。次いで、瓶を密閉し、毎分２５回転（RPM）に設定された持続放出装置の腕に固定した。装置を５分間回転させて混ぜた。次いで、5-CNAC／sCTの凍結乾燥粉末をAC-DI-SOL（登録商標）／CAB-O-SIL（登録商標）混合物に、それぞれの添加の後に２分混合しながら幾何学的に加えた。次いで、上記混合物にステアリン酸マグネシウムを加え、混合を５分間続けた。
【０１４６】
次いで、上記粉末約１０３ｍｇを下部ポンチの入ったダイに移した。上部ポンチを用いてダイ中に粉末を押しつけた。上部ポンチを挿入し、ポンチダイ組立品をプレス上に載せた。次いで圧縮を行った。上部ポンチを用い、ダイから錠剤を押し出した。
【０１４７】
実施例２９
ラットにおけるsCT／5-CNACナトリウム塩の経口送達−錠剤
実施例２８で調製した錠剤を粉末にし、１３ｍｇ／カプセルでカプセルに手で詰めた。実施例２７で調製した非錠剤化、凍結乾燥粉末を、１３ｍｇ／カプセルでカプセルに手で詰めた。カプセルを流し落とすための水１ｍｌと共にカプセルを投与した。
【０１４８】
改良版の代わりにEIAキットの標準プロトコルに従ったことを除いては実施例２１の手順に従い、下表９に示す5-CNACナトリウム塩およびsCTのおおよその量で、カプセル１個を、カプセルを流し落とすための水１ｍｌと一緒にラットに経口投与した。結果も表９に示す。
【０１４９】
【表９】
0004642435.tif 000014
【０１５０】
実施例３０
5-CNACの調製
5-CNACは、実験室環境において実施例２６と同様の条件で製造した。
【０１５１】
実施例３１
sCT／5-CNACナトリウム塩の凍結乾燥
実施例３０で調製した5-CNACを、実施例１９と同様にsCT、0.2N NaOH４８５ｍｌおよび5-CNAC１９．００７２ｇと共に水蒸気浴中で凍結乾燥粉末に製剤化した。最終体積は５０５ｍｌとした。5-CNAC１８７、１３８、７４および１６０ｍｌからそれぞれ、sCT２８、４８、４０および３６０ｍｇと共に４つの別々のバッチを調製した。5-CNACナトリウム塩の推定量はそれぞれ、７、５、２．５および４．５ｇであった。
【０１５２】
実施例３２
ラットにおけるsCT／5-CNACナトリウム塩の経口送達
改良版の代わりにEIAキットの標準プロトコルに従ったことを除いては実施例２１の方法に従い、実施例３１で調製した４つのバッチのうちの１つを用い、凍結乾燥粉末１３ｍｇのカプセル１個を、カプセルを流し落とすための水１ｍｌと一緒にラットに経口投与した。5-CNACおよびsCTのおおよその量を下表１０に示す。結果を表１０に示す。
【０１５３】
【表１０】
0004642435.tif 000015
【０１５４】
前述の特許、公報、出願、および試験方法のすべてを参照により本明細書に組み込む。上記の詳細な説明に鑑み、本件の多くの変形形態が当業者に暗示されるであろう。このような明白な変形形態はすべて、添付する特許請求の範囲の特許を受ける範囲に含まれる。