(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次なる構造：
（ＮＣＲＤ）−Ｌｉｎｋｅｒ−（ＣＣＲＤ）
上記において、
ＮＣＲＤは、(i)配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(ii)配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１〜８個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチド、又は、(iii)配列番号３で表わされるアミノ酸配列と95％以上のアミノ酸残基の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチドで、
ＣＣＲＤは、(i)配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(ii)配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜２１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチド、又は、(iii)配列番号４で表わされるアミノ酸配列と95％以上のアミノ酸残基の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチドで、
Ｌｉｎｋｅｒは、任意の２個のアミノ酸からなるペプチド又はArg  Ile  Proの配列からなるペプチドである
で表されるタンパク質で、天然型ガレクチン９の糖鎖認識活性を保持しており、かつ、天然型ガレクチン９と比較してリンクペプチドがプロテアーゼに対して安定であることを特徴とするタンパク質又はその塩。
【請求項２】
次なる構造：
（ＮＣＲＤ）−Ｌｉｎｋｅｒ−（ＣＣＲＤ）
上記において、
ＮＣＲＤは、(i)配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(ii)配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１〜７個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチド、又は、(iii)配列番号３で表わされるアミノ酸配列と95％以上のアミノ酸残基の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチドで、
ＣＣＲＤは、(i)配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(ii)配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜７個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチド、又は、(iii)配列番号４で表わされるアミノ酸配列と95％以上のアミノ酸残基の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチドで、
Ｌｉｎｋｅｒは、任意の２個のアミノ酸からなるペプチド又はArg  Ile  Proの配列からなるペプチドである
で表されるタンパク質で、天然型ガレクチン９の糖鎖認識活性を保持しており、かつ、天然型ガレクチン９と比較してリンクペプチドがプロテアーゼに対して安定であることを特徴とするタンパク質又はその塩。
【請求項３】
次なる構造：
（ＮＣＲＤ）−Ｌｉｎｋｅｒ−（ＣＣＲＤ）
上記において、
ＮＣＲＤは、(i)配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、(ii)配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、５位のGlyがSer又はLysで置換、88位のLysがArgで置換、及び、135位のSerがPheで置換からなる群から選択されたアミノ酸置換の少なくとも一つのなされたアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチドで、
ＣＣＲＤは、(i)配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(ii)配列番号４で表わされるアミノ酸配列において、61位のProがLeuで置換、及び、104位のGluがGlyで置換からなる群から選択されたアミノ酸置換の少なくとも一つのなされたアミノ酸配列からなり且つ糖結合能を有するポリペプチドで、
Ｌｉｎｋｅｒは、任意の２個のアミノ酸からなるペプチド又はArg  Ile  Proの配列からなるペプチドである
で表されるタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質又はその塩。
【請求項４】
ガレクチン９と比較してプロテアーゼによる分解に抵抗性であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質又はその塩。
【請求項５】
Ｌｉｎｋｅｒが、His  Met又はArg  Ile  Proのアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質又はその塩。
【請求項６】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質又はその塩。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸。
【請求項８】
ＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の核酸を含有していることを特徴とする組換えベクター。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の核酸に加えて標識タンパク質及び／又はペプチドをコードする塩基配列を含有していることを特徴とする請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項７若しくは８に記載の核酸又は請求項９若しくは１０に記載の組換えベクターを保有することを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
形質転換体宿主細胞が原核細胞又は真核細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする免疫調節剤。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項１５】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする自己免疫疾患用剤。
【請求項１６】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項１７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項１８】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする疼痛緩和剤。
【請求項１９】
請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７又は８に記載の核酸、請求項９又は１０に記載の組換えベクター及び請求項１１又は１２に記載の形質転換体からなる群から選択された少なくとも一つを有効成分として含有することを特徴とする骨再生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ガレクチン９改変体（変異体）タンパク質及びその用途に関する。本発明は、特に、リンク領域が改変されたガレクチン９及びそれを利用する生化学、臨床検査、医療並びに医薬応用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の糖鎖とそれに結合するタンパク質とが哺乳動物の生体において生理的現象及び進化・成長に伴う現象、そして様々な病気などにおいて多種多様な役割や機能を果たしていることを示している証拠が見つかってきている。生体にはβ−ガラクトシド構造を持った糖鎖を特異的に認識する動物レクチンが存在していることが見出されており、こうしたレクチン類のグループであるガレクチンとしては、これまでに少なくとも14種の遺伝子が同定されている。ガレクチンファミリーは、その構造から三つのサブグループ、すなわち、プロト型(prototype)、キメラ型(chimera)、そしてタンデムリピート型(tandem repeat)に分類されているが、その生体内での機能はほとんどわかっていない。特に、糖鎖認識ドメインを二個有するタンデムリピート型ガレクチンについては研究の歴史も浅く、その標的となる生体内の糖鎖（受容体）が明らかにされていないため、その機能は未解明である。ところでガレクチンは細胞表面の複雑な糖鎖を認識するタンパク質を探索していて見出されたなどの経緯から、細胞の接着、細胞間の情報伝達、細胞の活性化などに関与するといった機能を有すると予想されており注目を集めている。さらに、そうした機能の他、別の重要な様々な機能を有していると予想させるような研究成果も得られつつある。
【０００３】
タンデムリピート型ガレクチンの一つであるガレクチン９は、ヒトにおいては、最初、ホジキンス病の患者の自己抗原（autoantigen）として同定され(非特許文献１及び２)、免疫細胞間の相互作用に重要な働きを果たしているのではないかと想像されていたものであった。マウスのガレクチン９は、ガレクチン類の糖鎖認識ドメインにおいて保存性が高いことが認められている配列を基に設計されたディジェネレイテッドプライマーを使用した5'-RACE PCRによりマウス腎臓のcDNAライブラリーからクローン化されている（非特許文献３）。抗原で刺激されたヒトＴ細胞は in vivo 及びin vitro で好酸球遊走因子であるエカレクチン(ecalectin)を産生していることが発見され、さらにそのエカレクチンはそれまでに知られていた他の好酸球遊走因子類とは構造的に異なっているが、ガレクチンファミリーに属するとしてよい、β−ガラクトシド構造を持った糖鎖に対する結合親和性を有していた。ヒトＴ細胞由来白血病細胞株より得られたmRNAよりエカレクチンをクローニングすることに成功した結果、エカレクチンはガレクチン９のバリアントの一つであり、ガレクチン９とエカレクチンは同一物質である(非特許文献４)ことが確かめられている。
【０００４】
野生型ガレクチン９としては、現在、L 型ガレクチン９(galectin-9 long isoform or long type galectin-9: Gal-9L)、M 型ガレクチン９(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9: Gal-9M)及びS 型ガレクチン９(galectin-9 short isoform or short type galectin-9: Gal-9S)が報告されている。いずれのガレクチン９も、二つの糖鎖認識部位(糖認識ドメイン, carbohydrate recognition domain: CRD)とそれらをつなぐリンクペプチド領域からなっており、L型ガレクチン９は最も長いリンクペプチド領域を保有し、該リンクペプチド領域により N端ドメイン（NCRD）と C端ドメイン(CCRD）とが連結されたもので、一方、S 型ガレクチン９は最も短いリンクペプチド領域を保有しているもので、M 型ガレクチン９は両者の中間の長さのリンクペプチド領域を保有しているもので、一般的には、前記二者よりは広く生体内組織や細胞に存在していることが見出されるものであることが知られている。さらにヒト細胞や組織からクローニングされるガレクチン９遺伝子の間では、遺伝的多型現象の存在を示す証拠も認められてきている。
【０００５】
野生型ガレクチン９は二つの糖認識部位(CRD)とそれらをつなぐリンク領域からなり、大腸菌を宿主として生産されたリコンビナント体ガレクチン９は、腫瘍細胞に対する直接作用（腫瘍細胞の細胞間接着とアポトーシスを誘導する活性）と免疫系を介した作用によって、癌の転移抑制と退縮を誘導することが示唆されている。また、ガレクチン９は非活性化リンパ球には作用せず、活性化Ｔ細胞、特に過剰免疫反応の原因となるＣＤ４陽性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することも明らかにされている。さらに、リウマチにおいて関節の変形等に関与する滑膜細胞に対し強力なアポトーシス誘導能を持つことも明らかとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】
Sahin, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11810-11813 (1995)
【非特許文献２】
Tureci, O. et al., J. Biol. Chem., 272(10), 6416-6422 (1997)
【非特許文献３】
Wada, J. et al., J. Biol. Chem., 272(9), 6078-6086 (1997)
【非特許文献４】
Matsumoto, R. et al., J. Biol. Chem., 273(27), 16976-16984 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
こうしたガレクチン９の多面的な作用を利用することにより、癌治療、難治性の自己免疫疾患（リウマチを含む）、アレルギー疾患を治療する等が期待されている。しかしながら、リコンビナント体ガレクチン９は二つのCRDをつなぐリンク領域がプロテアーゼに対して感受性が高いため、きわめて容易に酵素消化されてしまい、上記活性が失われる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、鋭意研究を進めた結果、ガレクチン９の有する糖鎖認識活性を保持しつつプロテアーゼに対してより安定な分子構造を探索し、ガレクチン９の二つのCRDをつなぐリンク領域を改変することにより、上記したような活性に悪影響を及ぼすことを避けつつ、安定性を高めた改変分子を得ることに成功して、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
（１）  ガレクチン９又はそれと実質的に同等の活性を有するタンパク質のリンクペプチド又はその近傍領域が改変されていることを特徴とするタンパク質又はその塩。
（２）  改変がガレクチン９又はそれと実質的に同等の活性を有するタンパク質のリンクペプチド又はその近傍領域のアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ガレクチン９と比較して少なくともリンクペプチドに対する分解感受性の改質されていることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質又はその塩。
（３）  ガレクチン９と実質的に同等の活性を有するタンパク質が、ガレクチン９のアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有するものであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のタンパク質又はその塩。
（４）  (1)ガレクチン９のN末端側の糖鎖認識領域(NCRD)又はそれと実質的に同等の活性を有するポリペプタイドと(2)ガレクチン９のC末端側の糖鎖認識領域(CCRD)又はそれと実質的に同等の活性を有するポリペプタイドとを、(3)ガレクチン９のリンクペプチドのアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる改変リンクペプチドを介して結合してあることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか一記載のタンパク質又はその塩。
（５）  (1)配列番号3で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプタイド又はそれと実質的に同等の活性を有し且つ配列番号3で表わされるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプタイドあるいは配列番号3で表わされるアミノ酸配列のうち少なくとも1〜8個のアミノ酸残基を欠失、置換若しくは付加せしめてあるアミノ酸配列を有するポリペプタイドと(2) 配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプタイド又はそれと実質的に同等の活性を有し且つ配列番号4で表わされるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプタイドあるいは配列番号4で表わされるアミノ酸配列のうち少なくとも1〜21個のアミノ酸残基を欠失、置換若しくは付加せしめてあるアミノ酸配列を有するポリペプタイドとを、(3)配列番号7〜9のいずれか一で表わされるアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失（ただし、配列番号7において1〜32及び1〜44の欠失、並びに配列番号8において1〜12の欠失を除く）、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる改変リンクペプチドを介して結合してあることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか一記載のタンパク質又はその塩。
【００１０】
（６）  上記（１）〜（５）のいずれか一記載のタンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする核酸。
（７）  ポリヌクレオチドであることを特徴とする上記（６）記載の核酸。
（８）  DNA又はRNAであることを特徴とする上記（６）又は（７）記載の核酸。
（９）  上記（６）〜（８）のいずれか一記載の核酸を含有していることを特徴とする組換えベクター。
（１０）  上記（６）〜（８）のいずれか一記載の核酸に加えて標識タンパク質及び／又はペプチドをコードする塩基配列を含有していることを特徴とする請求項９記載の組換えベクター。
（１１）  上記（６）〜（８）のいずれか一記載の核酸又は上記（９）又は（１０）記載の組換えベクターを保有することを特徴とする形質転換体。
（１２）  形質転換体宿主細胞が原核細胞又は真核細胞であることを特徴とする上記（１１）記載の形質転換体。
【００１１】
（１３）  上記（１）〜５のいずれか一記載のタンパク質、上記（６）〜（８）のいずれか一記載の核酸、上記（９）又は（１０）記載の組換えベクター及び上記（１１）又は（１２）記載記載の形質転換体からなる群から選択されたものを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（１４）  免疫調節剤であることを特徴とする上記（１３）記載の医薬。
（１５）  抗腫瘍薬であることを特徴とする上記（１３）記載の医薬。
（１６）  脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞ガン、膵液腺ガン、歯肉ガン、舌ガン、口唇ガン、上咽頭ガン、中咽頭ガン、下咽頭ガン、喉頭ガン、甲状腺ガン、副甲状腺ガン、肺ガン、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道ガン、胃ガン、大腸ガン、胆管ガン、胆嚢ガン、膵臓ガン、肝ガン、腎臓のガン、膀胱ガン、前立腺ガン、陰茎ガン、精巣腫瘍、副腎のガン、子宮頸ガン、子宮体ガン、膣ガン、外陰ガン、卵巣ガン、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳ガン、皮膚ガン、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどを包含するガンおよび肉腫からなる群から選択された腫瘍に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする上記（１５）記載の医薬。
【００１２】
（１７）  下記の疾患あるいは病気、又は病的な症状に対するものであることを特徴とする上記（１３）記載の医薬：
(A) 炎症性疾患であり、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等からなる群から選択されたもの；
(B) 急性および慢性疾患であり、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎、急性縦隔炎を含む肺の疾患、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎を含む肺以外の他の臓器の疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎を含む炎症等からなる群から選択されたもの；
(C) 神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）、ガンや炎症に伴う痛みからなる群から選択されたもの；
(D) アレルギー性炎症疾患であり、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等からなる群から選択されたもの；
(E) 自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）であり、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、Goodpasture症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等からなる群から選択されたもの；
(F) 感染症であり、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患、あるいはヒトに感染症をもたらす病原体に起因する疾患で病原体が、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物からなる群から選択されたもので、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）を含むものから選択されたもの；
(G) 皮膚科領域の疾患であり、i)皮膚感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む皮膚炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症を有する皮膚疾患、ii)美容皮膚科関連の障害あるいは老化で、a)メラニン代謝調節（美白）、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節に関わる皮膚科領域の疾患（老化を含む）から選択されたもの；
(H) 生活習慣病であり、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などを含むものから選択されたもの；
(I) 正常細菌叢の維持に関わる異常；
(J) アミロイドーシス、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などを含むものから選択されたもの；
(K) 脳、神経領域における炎症反応、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展に伴い生じる炎症、統合失調症；
(L) 痛風；
(M) 骨粗鬆症；又は
(N) 間質性肺炎。
（１８）  上記（１）〜（５）のいずれか一記載のタンパク質、上記（６）〜（８）のいずれか一記載の核酸、上記（９）又は（１０）記載の組換えベクター及び上記（１１）又は（１２）記載の形質転換体からなる群から選択されたものを有効成分として含有することを特徴とする分析又は検査試薬。
【発明の効果】
【００１３】
ガレクチン９に関して得られたガレクチン９改変体は、野生型に比較してプロテアーゼに対して安定化されているので、ガレクチン９が有している生体内での機能の解明に利用可能であり、腫瘍化細胞の制御、免疫調節、さらにはアレルギーや炎症のコントロールなど様々な生体反応の制御・調節に果たしているガレクチン９の機能・活性を研究するのに使用できる。また、当該ガレクチン９改変体及びその関連物質は、臨床応用、分子生物学的応用、生化学応用、医学的応用における試薬並びに活性剤として有望である。
【００１４】
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】  図１は、ガレクチン９改変体(G9NC(null))発現ベクターの構築方法を示す。
【図２】  図２は、ガレクチン９改変体(G9NC(null))発現物及び精製処理物の電気泳動写真を示す。
【図３】  図３は、野生型ガレクチン９(G9(M))とガレクチン９改変体(G9NC(null))との間でプロテアーゼに対する耐性を比較した結果を示す。精製標品につき、存在する大腸菌プロテアーゼに対する耐性を調べた。図は、電気泳動写真を示す。
【図４】  図４は、野生型ガレクチン９(G9(S))とガレクチン９改変体(G9NC(null))との間でプロテアーゼに対する耐性を比較した結果を示す。マトッリクスメタロプロテアーゼ-3(MMP-3)に対する耐性を調べた。図は、電気泳動写真を示す。
【図５】  図５は、野生型ガレクチン９(G9(S))とガレクチン９改変体(G9NC(null))との間でプロテアーゼに対する耐性を比較した結果を示す。エラスターゼ(elastase)に対する耐性を調べた。図は、電気泳動写真を示す。
【図６】  図６は、野生型ガレクチン９(G9(S))とガレクチン９改変体(G9NC(null))との間で生物活性を比較した結果を示す。MOLT-4細胞に対するアポトーシス誘導活性(DNAラダー形成)を調べた。図は、電気泳動写真を示す。
【図７】  図７は、野生型ガレクチン９(G9(S))とガレクチン９改変体(G9NC(null))との間で生物活性を比較した結果を示す。末梢血好酸球に対するECA活性を調べた。
【図８】  図８は、ガレクチン９ESTクローンをBLAST配列検索して異なったソースからの各クローンの配列を比較した結果を示す。検索で各クローンは、97−99％の相同性（同一性）を示す。5, 88, 135, 238, 281の位置での変異を示す。
【図９】  図９は、ザイモザンは胸膜炎を誘発するが、ガレクチン９改変体(h-gal9NC(null))単独では、炎症を誘発しないことを示す。
【図１０】  図１０は、ザイモザン誘導胸膜炎モデルにおけるガレクチン９改変体(h-gal9NC(null))の効果を調べた結果を示す。
【図１１】  図１１は、PMA誘導皮膚炎（ステロイド感受性モデル）におけるガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１２】  図１２は、アラキドン酸誘導皮膚炎（ステロイド非感受性モデル）におけるガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１３】  図１３は、カプサイシン誘導皮膚炎モデルにおけるガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１４】  図１４は、DNFB誘導接触皮膚炎モデルにおけるガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１５】  図１５は、DNFB誘導接触皮膚炎モデルにおけるガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１６】  図１６は、FITC誘導アトピー性皮膚炎モデルにおけるガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１７】  図１７は、蕁麻疹モデルに対するガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１８】  図１８は、蕁麻疹モデルに対するガレクチン９改変体(Gal-9= G9NC(null)) の効果を調べた結果を示す。
【図１９】  図１９は、関節炎モデルに対するガレクチン９改変体(h-gal9NC(null))の効果を調べた結果を示す。
【図２０】  図２０は、皮下移植モデルにおけるガレクチン9改変体の腫瘍細胞増殖抑制効果、すなわち、抗腫瘍活性（抗癌効果）測定の結果を示す。上段はコントロール群を、下段はガレクチン9改変体投与群（５週までいかなる腫瘍も見られない）を示す。
【図２１】  図２１は、皮下移植モデルにおけるガレクチン9改変体の腫瘍細胞増殖抑制効果、すなわち、抗腫瘍活性（抗癌効果）測定の結果で、組織病理解析の組織写真を示す。LLC+ガレクチン9改変体(Gal9)投与（下段）の場合の５週での皮膚を示している。肉眼的に白色調。
【図２２】  図２２は、ガレクチン9改変体（安定化ガレクチン9）の培養腫瘍細胞(Meth A細胞, 24 h)におけるアポトーシス（細胞障害活性）誘導の結果を示す。
【図２３】  図２３は、ガレクチン9改変体（安定化ガレクチン9）の培養腫瘍細胞(B16/F10細胞, 24 h)におけるアポトーシス（細胞障害活性）誘導の結果を示す。
【図２４】  図２４は、動物の生存曲線で、Meth A細胞による癌性腹膜炎モデルにおいて、ガレクチン9改変体が抗腫瘍効果を有することを示している。
【図２５】  図２５は、Meth A細胞による癌性腹膜炎モデルにおいて、ガレクチン9改変体(Gal9)非投与群（上段）と投与群（下段）とでマウスの状態を示す写真を示す。
【図２６】  図２６は、動物の生存曲線で、B16/F10細胞による癌性腹膜炎モデルにおいて、ガレクチン9改変体が抗腫瘍効果を有することを示している。
【図２７】  図２７は、B16/F10細胞（メラノーマ）による癌性腹膜炎モデルマウスの状態をガレクチン9改変体(Gal-9)投与群と非投与群とで対比して内臓組織（第14日目）写真を示す。
【図２８】  図２８は、ガレクチン9改変体（安定化ガレクチン9）の免疫細胞に及ぼす影響を調べた結果を示す。B16/F10腹腔内浸潤細胞(24 h)の解析の結果である。
【図２９】  図２９は、ガレクチン9改変体（安定化ガレクチン9）による接着阻害実験の結果を示す。B16/F10細胞(1 h)の解析の結果である。図中、Collagen type IはI型コラーゲン、Collagen type IVはIV型コラーゲン、Lamininはラミニン、Fibronectinはフィブロネクチン、Vitronectinはビトロネクチンを示す。
【図３０】  図３０は、ダニ抗原誘発喘息モデルにおけるガレクチン9改変体(Gal-9)及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。
【図３１】  図３１は、ダニ抗原誘発喘息モデルにおけるガレクチン9改変体(Gal-9)及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。BALF中に存在する各細胞数を示してある。
【図３２】  図３２は、ダニ抗原誘発喘息モデルにおけるガレクチン9改変体(Gal-9) の作用効果を測定した結果（気管支周囲組織の写真）を示す。
【図３３】  図３３は、OVA誘発喘息モデル（マウス）におけるガレクチン9改変体(Gal-9)及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。
【図３４】  図３４は、OVA誘発喘息モデル（マウス）におけるガレクチン9改変体(Gal-9)及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。BALF中に存在する各細胞数を示してある。
【図３５】  図３５は、OVA誘発喘息モデル(モルモット)における即時型喘息（IAR）・遅延型喘息（LAR）に対するガレクチン9改変体（gal-9)の及ぼす作用を示す。
【図３６】  図３６は、OVA誘発喘息モデル(モルモット)におけるガレクチン9改変体(Gal-9)の作用効果を測定した結果を示す。BALF中に存在する各細胞数を示してある。
【図３７】  図３７は、自己免疫性溶血性貧血モデル（マウス）におけるガレクチン9改変体(Gal-9)の作用効果を測定した結果（ヘマトクリット(%)）を示す。
【図３８】  図３８は、アルツス(Arthus)反応（血管炎）モデル（マウス）におけるガレクチン9改変体(Gal-9) 及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。
【図３９】  図３９は、ARDSモデル（マウス）におけるガレクチン9改変体(Gal-9)及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。
【図４０】  図４０は、ARDSモデル（マウス）におけるガレクチン9改変体(Gal-9)及びデキサメサゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を示す。BALF中に存在する各細胞数を示してある。
【図４１】  図４１は、カプサイシン誘導炎症モデルにおけるガレクチン9改変体(Gal-9)(静注投与)の作用効果を測定した結果を示す。
【図４２】  図４２は、ガレクチン9改変体(Gal-9)による破骨細胞形成に及ぼす効果を試験した結果を示す。抑制効果があることが明らかである。
【図４３】  図４３は、ガレクチン9改変体(gal-9)刺激による単球のアポトーシス誘導(M-CSF存在下) を試験した結果を示す。
【図４４】  図４４は、ガレクチン9改変体(gal-9)刺激によるヒト骨芽細胞増殖に及ぼす効果を試験した結果を示す。
【図４５】  図４５は、ガレクチン9改変体(Galectin-9)刺激(8 hr)によるヒト骨芽細胞分化マーカーの発現に及ぼす効果を試験した結果を示す。
【図４６】  図４６は、生存率を示し、ガレクチン9改変体の間質性肺炎モデルへの作用を試験した結果を示す。
【図４７】  図４７は、ガレクチン9改変体の間質性肺炎モデルへの作用を試験した結果を示す。Day14での生存例の肺組織（HE染色、写真）を示す。
【図４８】  図４８は、動物の生存曲線で、LLC細胞(アポトーシス(+))による癌性腹膜炎モデルにおいて、ガレクチン9改変体が抗腫瘍効果を有することを示している。
【図４９】  図４９は、B16/F10 細胞を使用してがん転移モデルへのガレクチン9改変体の作用を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図５０】  図５０は、B16/F10 細胞を使用してがん転移モデルへのガレクチン9改変体(G9NC(null))の作用を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図５１】  図５１は、カラゲニン誘発炎症モデルにおけるガレクチン9改変体(gal-9)(静脈内(i.v.)投与)の作用効果を測定した結果を示す。
【図５２】  図５２は、カラゲニン誘発炎症モデルにおけるポジティブコントロールとしてのデキサメタゾン(Dex.)の作用効果を測定した結果を、比較するために示す。
【図５３】  図５３は、リウマチ（RA）関節滑膜におけるガレクチン-９の発現を免疫組織染色を使用して調べた染色組織の結果を示す。
【図５４】  図５４は、ガレクチン-9によるリウマチ（RA）関節滑膜細胞のアポトーシス誘導活性を調べた光学顕微鏡観察の結果を示す。
【図５５】  図５５は、ガレクチン-9によるリウマチ（RA）関節滑膜細胞のアポトーシス誘導活性をPI法で測定した結果を示す。
【図５６】  図５６は、ガレクチンによるリウマチ（RA）滑膜細胞のアポトーシス誘導活性を調べた結果を示す。
【図５７】  図５７は、ガレクチンによるリウマチ（RA）滑膜細胞の増殖抑制活性を調べた結果を示す。
【図５８】  図５８は、アジュバント関節炎モデルにおけるガレクチン-9改変体の作用（機械刺激による痛みの抑制）を調べた結果を示す。
【図５９】  図５９は、アジュバント関節炎モデルにおける作用（機械刺激による痛みの抑制）を調べた結果（ポジティブコントロールとしてのインドメタシンの作用）を、比較するために示す。
【図６０】  図６０は、カラゲニン誘発急性炎症モデルにおけるガレクチン-9改変体の作用（機械刺激による痛みの抑制）を調べた結果を示す。
【図６１】  図６１は、カラゲニン誘発急性炎症モデルにおける作用（機械刺激による痛みの抑制）を調べた結果（ポジティブコントロールとしてのデキサメタゾンの作用）を、比較するために示す。
【図６２】  図６２は、ヒト関節液中におけるガレクチン-９改変体の安定性を調べた結果（SDS-PAGE）を示す。
【図６３】  図６３は、関節炎モデル（抗体カクテル惹起モデル）におけるガレクチン-9改変体(安定化ガレクチン-9)の作用を調べた結果（i.v.投与）を示す。
【図６４】  図６４は、関節炎モデル（コラーゲン関節炎モデル）におけるガレクチン-9改変体(安定化ガレクチン-9)の作用を調べた結果（i.p.投与）を示す。
【図６５】  図６５は、関節炎モデル（コラーゲン関節炎モデル）におけるガレクチン-9改変体(安定化ガレクチン-9)の作用を調べた結果（i. v.投与）を示す。
【図６６】  図６６は、アジュバント関節炎モデルにおけるガレクチン-9改変体の作用を調べた結果（i. v.投与）を示す。
【図６７】  図６７は、アジュバント関節炎モデルにおける作用を調べた結果（ポジティブコントロールとしてのインドメタシンの作用）を、比較するために示す。
【図６８】  図６８は、ラットCIA（コラーゲン感作）モデルにおけるガレクチン-9改変体の作用を調べた結果（i. v.投与）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
これまでに公表された研究および係属中の特許出願を参考にしており、その内容は本明細書の開示の中に含められる。
【００１７】
「ガレクチン９改変体」とは、ガレクチン９の糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性又はそれと類似した活性（本活性のうちには定性的な活性及び／又は定量的な活性が含まれてよい）を提供する物質をいう。ガレクチン９は、特定の細胞に対してアポトーシス誘導活性を有するが、本ガレクチン９改変体は野生型ガレクチン９が有するアポトーシス誘導活性あるいはそれと類縁の活性を有するものであってよく、ガレクチン９が有する生物活性が改変又は修飾されているものであってよいし、ある場合には好ましい。本発明で特に好ましいガレクチン９改変体とは、生物活性を有する試薬として、臨床検査の分野、分析の分野、あるいは医学又は医薬などの分野で、野生型ガレクチン９よりは好ましい性質を示すものを指す。
【００１８】
ガレクチン９改変体は、例えば、ガレクチン９又はそれと実質的に同等の活性を有するタンパク質のリンクペプチド又はその近傍領域が改変されているタンパク質又はその塩、ガレクチン９又はそれと実質的に同等の活性を有するタンパク質のリンクペプチド又はその近傍領域のアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ガレクチン９と比較して少なくともリンクペプチドに対する分解感受性が改質されているといった改変の施されたタンパク質又はその塩、ガレクチン９と実質的に同等の活性を有するタンパク質であって且つガレクチン９のアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性、又は少なくとも75％以上の相同性、又は少なくとも80％以上の相同性、又は少なくとも85％以上の相同性、又は少なくとも90％以上の相同性、又は少なくとも95％以上の相同性を有するタンパク質又はその塩、(1)ガレクチン９のN末端側の糖鎖認識領域(NCRD)又はそれと実質的に同等の活性を有するポリペプタイドと(2)ガレクチン９のC末端側の糖鎖認識領域(CCRD)又はそれと実質的に同等の活性を有するポリペプタイドとを、(3)ガレクチン９のリンクペプチドのアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる改変リンクペプチドを介して結合してあるタンパク質又はその塩などであってよい。
【００１９】
ところで、ガレクチン９は、J. Biol. Chem., 272 (10): pp. 6416-6422 (1997)において、ホジキン病患者の脾臓から調製したcDNAに新規ガレクチンを発見し、これをガレクチン９と名付けてその報告がなされるとともに、ホジキン病腫瘍での配列変異をさけるため健常人の末梢血から調製したcDNAで配列の再確認をし、最終的にガレクチン９の配列を決定して、該文献の第6418頁のFIG. 1にその配列が表示されている。一方、ガレクチン９に関しては、さらに、J. Biol. Chem., 273 (27): pp. 16976-16984 (1998)において、好酸球遊走因子を生産するT細胞株、STO-2から調製したcDNAより遊走因子Ecalectin（エカレクチン）を単離したが、それは先に報告のあった上記ガレクチン９との相同性が高いけれども、アミノ酸配列ポジションで5, 88, 135, 238, 281番目のアミノ酸に違いが見られることがしめされており、該文献の第16983頁のFig. 8にエカレクチンの配列が記載され、さらにそこでは、エカレクチンはガレクチン９のバリアントと推測されている。
【００２０】
また、J. Biol. Chem., 275 (12): pp. 8355-8360 (2000)において、Jurkat T-cellから調製したcDNAよりガレクチン９を単離し、リコンビナント（組換え）蛋白質を作製しているが、このガレクチン９組換え蛋白質は好酸球遊走活性を示したので、平島らはJurkat T-cellに由来する配列を持つガレクチン９を今後研究に用いることとし、そこではアミノ酸配列ポジションで5, 88, 135, 238, 281番目のアミノ酸には、それぞれGly, Lys, Ser,Pro, Gluが当てはまり、上記の松本ら(J. Biol. Chem., 273 (27): pp. 16976-16984 (1998))が報告したエカレクチンとは5番目のアミノ酸がSerとGlyという点で異なるが、好酸球遊走活性には差異がないこと、また、17個のESTデータベースに登録されているガレクチン９の配列（部分配列を含む）を照会してみても5, 88, 135, 238, 281番目のアミノ酸にはそれぞれGly, Lys, Ser, Pro, Gluが当てはまるのが妥当であると考えられることが記載されており、該文献の第8359頁のTable IIにガレクチン９の変異が記載されている（図８参照）。図８において、Gly (G), Lys (K), Ser (S), Pro (P), Glu (E)である。
【００２１】
J. Biol. Chem., 272 (9): pp. 6078-6086 (1997)（非特許文献３）においては、アミノ酸配列の類似性から２つの糖認識部位(CRD)とそれらをつなぐリンク領域の26アミノ酸（ガレクチン9Mタイプについて）が決定されている（同文献のFig. 1を参照）。すなわち、配列番号5に示されているアミノ酸配列でみてみると、C端側の糖鎖認識領域(CCRD)はMet175から始まるとされている。そしてこれに基づいて、NCBIデータベースのAccession Number NP 033665においてヒトガレクチン９のCRDとリンク領域が登録されている。一方、J. Biol. Chem., 273 (5): pp. 2954-2960 (1998)においては、ガレクチン４及び６の報告がなされ、この中ではCRDとリンク領域の設定がアミノ酸配列、遺伝子配列に基づき決定されており、それが同文献の第2956頁のFig. 2に示されているが、この設定をガレクチン９に反映した場合、前者(J. Biol. Chem., 272 (9): pp. 6079-6086 (1997)) の設定とは、リンク領域とC端側のCRDにおいて異なるものである。すなわち、配列番号5に示されているアミノ酸配列でみてみると、CCRDはPhe195から始まることになる。
【００２２】
本発明者等のグループは、エクソンによるスプライシングの境界がGln148-Pro149間、Ile160-Thr161間、Ser177-Thr178間にあるというように非特許文献３における設定より３アミノ酸分C端側に存在していることを考慮に入れるとともに、C端側のCRDの糖結合能についての検討、すなわち、配列番号5に示されているアミノ酸配列でみて、Thr178から始まる全長のCCRDを発現させた場合はラクトース結合能があり、さらに6アミノ酸の削除（配列Met184から始まるCCRD断片）、12アミノ酸の削除（Ala190から始まるCCRD断片）をしてもラクトース結合能があったが、22アミノ酸を削除（Leu200から始まるCCRD断片）すると大腸菌において発現がなかったことから、配列番号5に示されているアミノ酸配列でみて、CCRDはPhe195から始まるとの設定がより厳正であると考察できることも考え併せて、C端側のCRDとして配列番号5に示されているアミノ酸配列のThr178〜Thr323のものとした。ガレクチン９のN端側のCRD (NCRD)については、配列番号5に示されているアミノ酸配列でみて、Gln148までの全長のNCRDを発現させた場合はラクトース結合能があったが、９アミノ酸を削除（配列Met1〜Ser139のNCRD断片）ではタンパク質の発現はあるけれどもラクトース結合能がみられなくなることより、N端側のCRDとして配列番号5に示されているアミノ酸配列のMet1〜Gln148のものとした。
【００２３】
好ましい態様では、ガレクチン９改変体は、例えば、(1)ガレクチン９のNCRDとして配列番号3に示されているアミノ酸配列又はその配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたもの、あるいは、配列番号3に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも70％以上の相同性、又は少なくとも75％以上の相同性、又は少なくとも80％以上の相同性、又は少なくとも85％以上の相同性、又は少なくとも90％以上の相同性、又は少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、ラクトース結合能を有するものであって、(2)ガレクチン９のCCRDとして配列番号4に示されているアミノ酸配列又はその配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたもの、あるいは、配列番号4に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも70％以上の相同性、又は少なくとも75％以上の相同性、又は少なくとも80％以上の相同性、又は少なくとも85％以上の相同性、又は少なくとも90％以上の相同性、又は少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、ラクトース結合能を有するものであって、(3)上記(1)と(2)を結合しているリンク領域として配列番号9に示されているアミノ酸配列又はその配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたもので、好ましくはマトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク分解酵素に対してネイティブなガレクチン９より安定化されているものが挙げられる。当該リンク領域(3)としては、配列番号9に示されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜2個、好ましくは3〜4個、さらに好ましくは5〜6個、さらに好ましくは7〜8個、特には１〜9個など）欠けている欠失類縁体、該アミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜9個、好ましくは1〜8個、さらに好ましくは１〜6個、さらに好ましくは１〜4個、特には１〜2個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜60個、好ましくは１〜40個、さらに好ましくは１〜20個、さらに好ましくは１〜10個、特には１〜5個など）のアミノ酸残基（ただし、配列番号7及び8に示されているアミノ酸配列のうち配列番号9に示されているアミノ酸配列を除いた部分で示されるものは除く）が付加されている付加類縁体も包含する。代表的な場合、当該リンク領域(3)としては、配列番号9に示されているアミノ酸配列をHM, RIP, 又は任意の２アミノ酸の配列で置換したものなどが挙げられる。アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、ポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないものであることもできるし、ある場合には好ましい変化を与えるものであることができる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつア���ノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００２４】
また、当該リンク領域(3)としては、配列番号7又は8に示されているアミノ酸配列を、配列番号9に示されているアミノ酸配列部分を除いて、HM, RIP, 又は任意の２アミノ酸の配列で置換したもの, 配列番号7又は8に示されているアミノ酸配列のうち配列番号9に示されているアミノ酸配列部分を除いてそのうちの６アミノ酸を残して、それ以外の残基を削除したものなどが挙げられる。また、当該リンク領域(3)としては、配列番号7又は8に示されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基（ただし、例えば、配列番号9に示されているアミノ酸配列部分を除いて、あるいは、配列番号7の場合、配列番号8に示されているアミノ酸配列部分を除いてよい）が１個以上（例えば、１〜5個、好ましくは3〜10個、さらに好ましくは5〜15個、さらに好ましくは7〜20個、特には１〜32個など）欠けている欠失類縁体、該アミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜9個、好ましくは1〜8個、さらに好ましくは１〜6個、さらに好ましくは１〜4個、特には１〜2個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜60個、好ましくは１〜40個、さらに好ましくは１〜20個、さらに好ましくは１〜10個、特には１〜5個など）のアミノ酸残基（ただし、配列番号7及び8に示されているアミノ酸配列のうち配列番号9に示されているアミノ酸配列を除いた部分で示されるものは除く）が付加されている付加類縁体も包含する。
【００２５】
天然のヒトガレクチン９タンパク質の特徴であるドメイン構造あるいは糖結合能が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明のペプチドあるいはポリペプチドは天然のヒトガレクチン９タンパク質と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のものと実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。本発明のヒト由来のタンパク質（又はペプチドあるいはポリペプチド）は、例えば、WO 02/37114 A1の配列表のSEQ ID NO:1 〜3 から成る群から選ばれたアミノ酸配列に対し、60% 、場合によっては70% より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好ましくはそれに対し、80% あるいは90% 以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。本発明のヒト由来のタンパク質の一部のものとは、該ヒト由来のタンパク質の一部のペプチド（すなわち、該タンパク質の部分ペプチド）であって、本発明の、ガレクチン９タンパク質と実質的に同等な活性を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、該ヒトガレクチン９の構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは20個以上、さらに好ましくは50個以上、より好ましくは70個以上、もっと好ましくは100 個以上、ある場合には200 個以上のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられ、好ましくはそれらは連続したアミノ酸残基に対応するものであるか、あるいは、例えば、該WO 02/37114 A1の配列表のSEQ ID NO:1 〜3 のいずれか一で示されるアミノ酸配列のうち対応する領域に対する相同性に関して、上記と同様の相同性を有するものが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、「実質的に同等」とはタンパク質の活性、例えば、所定の細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、免疫調節活性、糖鎖結合活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などの活性が、同等 (例えば、約 0.001〜約1000倍、好ましくは約0.01〜約100 倍、より好ましくは約 0.1〜約20倍、さらに好ましくは約 0.5〜約2 倍) であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
【００２７】
「ガレクチン９改変体ポリペプチド」とは、野生型ガレクチン９の天然の配列の改変体、その誘導体、類似体（アナログ）、フラグメント、キメラ体、および変異体を含むものである。当該ポリペプチドは、宿主細胞において発現するように意図され且つ特定のガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするように設計された組換えで産生されたポリヌクレオチド配列によってコードされているものを含む。
【００２８】
「ガレクチン９改変体治療剤」とは、ガレクチン９改変体をコードするポリヌクレオチド（ガレクチン９改変体ポリヌクレオチド）またはガレクチン９改変体ポリペプチド配列に由来する分子、このようなガレクチン９改変体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体、変異体、類似体、キメラ体、フラグメントなどのうちの少なくとも一つを含むものを指している。ポリヌクレオチドであるガレクチン９改変体治療剤とは、一般的には、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードする配列であって且つ宿主細胞で組換え技術で発現することができるものを含んでいる。さらに、ガレクチン９改変体治療剤は、ガレクチン９活性のアゴニストであってもよい。他のガレクチン９改変体治療剤としては、ガレクチン９改変体を供与するもの、ガレクチン９改変体の有する活性を有し且つガレクチン９活性の欠如あるいは不足に関連する疾患・病気・異常な症状を予防及び／又は治療する効果を生じるガレクチン９活性のモデュレーターを含んでいてよい。ガレクチン９活性のモデュレーターとしては、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または低分子であってよい。
【００２９】
本明細書で使用の用語「診断剤」とは、本発明における診断において使用する１つまたはそれ以上のその診断行為に寄与するような任意の薬剤をいう。これらものの診断への使用は、ガレクチン９産生細胞の存在を決定するための方法あるいはガレクチン９結合性物質を提示する細胞の存在を決定するための方法を含むものであってよい。診断剤としては、例えば、ガレクチン９改変体ムテインをコードするDNA、安定化ガレクチン９改変体ムテイン、および該安定化ガレクチン９改変体ムテインを有する細胞または細胞ホモジュネートからなる群から選択されたものを含有するものが挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用の用語「治療剤」とは、本発明における治療において使用する１つまたはそれ以上のその治療行為を達成するかまたは達成するのに寄与する任意の薬剤であってよい。例えば、治療剤がガレクチン９改変体ポリペプチドを発現するように設計されたポリヌクレオチドである場合、その薬剤は、哺乳動物に投与されそして細胞で発現することができるポリヌクレオチドである。この場合、薬剤の活性形熊は、発現されたポリペプチドである。
【００３１】
ガレクチン９改変体治療剤は、ガレクチン９改変体の生物活性を有する治療剤、または天然のガレクチン９よりも長く特定の糖鎖に対して結合している活性を有するポリペプチド、マトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク分解酵素に対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのようなガレクチン９改変体に由来する治療剤である。該治療剤は、単独で、あるいは他の薬剤（例えば、ガレクチン９改変体の投与と共に使用され且つ特定の腫瘍あるいは自己免疫などに対するその他の公知の処置法に使用されるような薬物、あるいは哺乳動物でのガレクチン９改変体の発現を容易に行いうるような遺伝子送達ビヒクルなど) と組み合わせて、その治療目的を達成する。例えば、該治療剤は、他の目的のために開発されたガレクチン９改変体を含むものであってよく、さらには、ガレクチン９のアゴニスト、ガレクチン９活性を修飾又は調節する薬物を含むものであってよく、例えば、有機低分子化合物又は物質、ペプチド、ペプチド様化合物又は物質、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ガレクチン９改変体ポリペプチド、プロテアーゼに対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体のキメラ体あるいは変異体などを発現し且つ形質転換された細胞であってよい。
【００３２】
本明細書で「配合治療剤」とは、一緒に投与した場合にそれらの別々の効果を生じるといった、いくつかの成分またはいくつかの薬剤を含有する治療組成物を指しており、それらは疾患などを処置するために一緒に投与された場合に相乗効果を生じるようなものを指してよい。好ましくは、配合治療剤中のいくつかの成分またはいくつかの薬剤のそれぞれにより得られる別々の作用効果は、より大きな治療効果、例えば、腫瘍の消失あるいは正常化、自己免疫疾患からの回復および長期生存が得られるようにそれを組み合わせることができるのである。配合治療剤を投与して得られる効果の例としては、短期での症状の回復と長期投与の後に得られる症状の回復との組み合わせとか、患者における特定の型の細胞のそれぞれに対する自己免疫応答を減少せしめるといったような効果の組み合わせが挙げられる。本発明の配合治療剤の例としては、ガレクチン９改変体をコードするポリヌクレオチドとIFN類, IL-2などのサイトカイン類の少なくとも一つをコードするポリヌクレオチドを含んでいる遺伝子送達ビヒクルを投与するためのものなどが挙げられる。別の例としては、２つの遺伝子送達ベクターを使用することもでき、例えば、１つはガレクチン９改変体を発現するもので、他方はサイトカイン類の少なくとも一つを発現するためのものであってよい。さらに、標的細胞においてアポトーシスを誘導するためのガレクチン９改変体の投与を見越してアップレギュレートするために、IFN類, IL-2など、あるいはIFN-γなどを発現する遺伝子送達ビヒクルを投与することもできる。種々の治療剤は、それを同時に供与することもできるし、例えば、治療を効率化するよう、必要に応じて個々の薬剤の１つまたはすべてを繰り返し投与するものであってよく、同一の薬学的に許容される担体中に入れて投与することもできる。
【００３３】
「遺伝子送達ビヒクル」とは、細胞におけるポリペプチドの発現のためのコード配列を細胞へ送達することを容易になし得るようにする成分をいう。該細胞は、インビボ遺伝子治療におけるように哺乳動物の体内に存在していてもよいし、エキソビボ遺伝子治療におけるようにトランスフェクション処理のために一旦哺乳動物から取り出され、ポリペプチドが発現するように哺乳動物に戻されたものであってよい。遺伝子送達ビヒクルは、細胞への遺伝子送達を達成することのできるような任意の成分またはビヒクルであってよく、例えば、リポソーム、粒子、ベクターなどであってよい。遺伝子送達ビヒクルとしては、組換えビヒクル（例えば、組換えウイルスベクター) 、核酸ベクター（例えば、プラスミド) 、ネイキッド核酸分子（例えば、遺伝子) 、核酸分子上の負電荷を中和し且つ核酸分子を折り畳んだ分子として凝集せしめることのできるようなポリカチオン分子と複合体化されている核酸分子、リポソームと結合した核酸（米国特許第5,166,320号明細書;第5,547,932 号明細書; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7851, 1987) などが挙げられる。該遺伝子送達ビヒクルは、プロデューサー細胞のような特定の真核生物細胞を包含していてよく、これらは宿主細胞に１つ以上の所望の特性を生物学的に有している核酸分子を送達することができるといったものである。所望の特性とは、以下に論議するように、例えば、タンパク質、酵素、あるいは抗体などのような所望物質を発現する能力及び／又は生物学的活性を提供する能力を含んでいてよい。すなわち、遺伝子送達ビヒクルによって運ばれる核酸分子が、所望の物質を発現することを必要とせずに、それ自体活性な薬剤であってもよい。このような生物学的活性の１つの例は、遺伝子治療においてみられるものである。遺伝子治療では、ある種の遺伝子を不活性化し、当該遺伝子に指示される産物が作り出されるのを遮断し、送達された核酸分子が特異的に発現するようにした遺伝子に組込むものである。遺伝子送達ビヒクルとは、１つまたは複数の目的の配列または遺伝子が発現するように指示することのできる集合体（アセンブリ）を指している。
【００３４】
遺伝子送達ビヒクルは、一般的には、プロモーターエレメントを含んでおり、そしてポリアデニル化を指示するシグナルを含んでいてよい。さらに、遺伝子送達ビヒクルは、１つまたは複数の目的の配列または遺伝子に、転写された場合に作動し得るように連結されており、翻訳開始配列として作用する配列を含んでいる。また、遺伝子送達ビヒクルは、Neo、SV2Neo、TK、ハイグロマイシン、ブレオマイシン（フレオマイシン）、ピューロマイシン、ヒスチジノール、DHFRなどのような選択可能マーカー、１つ以上の制限酵素部位および翻訳終結配列を含んでいてよい。本発明で使用される場合、遺伝子送達ビヒクルとは、ウイルスベクター (Jolly, Cancer Gen. Therapy, 1: 51-64, 1994)、核酸ベクター、ネイキッドDNA、リポソームDNA、コスミド、細菌、特定の真核生物細胞（プロデューサー細胞を含む；米国特許第6,333,195 号明細書参照) のような組換えビヒクルを包含していてよい。
【００３５】
「生物学的活性」とは、特異的な活性を保持している分子を指す場合に使用される。例えば、生物学的に活性なガレクチン９改変体ポリペプチドは、ガレクチン９の糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性又はそれと実質的に同等な性質の活性を有し且つマトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク分解酵素に対してネイティブなガレクチン９より定性的及び／又は定量的に安定化されている能力を保持し、例えば、ガレクチン９が保有する抗腫瘍活性あるいはアポトーシスを導くアポトーシス経路を活性化する活性を示す。
【００３６】
本明細書で使用の用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」とは、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコードするRNAまたはDNA、さらにはDNA:RNA ハイブリッドなどの分子をいう。本明細書で使用の「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコードするRNAまたはDNA、さらにはDNA:RNA ハイブリッドなどのいずれかをいう。ポリヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイムを含んでいてよく、また遺伝子の3'または5'非翻訳領域のような配列、遺伝子のイントロン、遺伝子のコード領域を構成していないといった遺伝子の他の領域を含んでいてよい。DNAやRNAは、一本鎖または二本鎖であってよい。合成核酸や合成ポリヌクレオチドには、化学的に合成された核酸配列を有するものも含まれてよく、さらに変性に対する抵抗性を分子に与えるために化学的に部分改変しておくこともできる。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 増幅、相補的DNAもしくはRNAを使用しての組換え発現などによって製造できるし、あるいは化学合成によって生成させることもできる。
【００３７】
本明細書中用語「発現制御配列」や「調節配列」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に影響を与え、転写や翻訳のためのシグナルを含むといった発現に影響を及ぼすような１つまたはそれ以上の成分を含んでおり且つ当該分野で使用されている配列をいう。本発明のポリペプチドの発現に適している発現制御配列は、ポリペプチドが発現されるべき宿主系によってそれは異なる。
【００３８】
本発明の「ポリペプチド」としては、ガレクチン９改変体ポリペプチドを含むものであれば如何なるものであってもよく、成熟タンパク質を含むガレクチン９改変体タンパク質の任意の部分が挙げられ、さらにその短縮型、改変体、対立遺伝子体、アナログ、誘導体などが挙げられる。改変体としては、関連タンパク質と同じ遺伝子から発現されるスプライスされた改変体から誘導されたものであってよい。他に特に指示がない限り、このようなポリペプチドは、例えば、特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった親和結合性あるいは特異的パートナーへの結合活性などの当該ガレクチン９タンパク質が有する生物活性のうちの１つ又はそれ以上の生物活性を有するものである。本「ポリペプチド」なる用語は、特定の長さの遺伝子産物に限定するものではない。ヒトに由来するまたはヒト以外の供給源に由来することに拘らず、ガレクチン９のN末端側糖鎖認識部位(NCRD)及びC末端側糖鎖認識部位(CCRD)に関して標的タンパク質または成熟タンパク質と同一である、あるいは少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、および最も好ましくは90％、さらには95％の相同性を有しているポリペプチドは、本ポリペプチドのこの定義内に含まれる。したがって、対立遺伝子に基づく改変体、並びにアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む遺伝子産物の改変体も含まれてよい。アミノ酸の置換は、アミノ酸の保存性の置換、あるいはグリコシル化部位、リン酸化部位、アセチル化部位などを改変するようなアミノ酸の置換、あるいは機能に必要ではないシステイン残基の位置を改変して折り畳みパターンを変えるといったもの、さらに必須アミノ酸残基でないものを取り除くといったような置換であってよい。アミノ酸の保存性の置換とは、一般的には、電荷、疎水性／親水性、及び／又は置換されるアミノ酸の立体的なサイズ（大きさ）を保存するような置換であり、例えば、Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、およびPhe/Trp/Tyrなどといった群のメンバー間での置換が保存性の置換である。
【００３９】
アナログとは、標的タンパク質様の活性を有するものであり、ペプチド様のものとして広く知られているペプチド模倣物質の一つあるいはそれ以上を有しているペプチドなどが挙げられる。本定義のうちには、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然型アミノ酸などを含む) を含んでいるポリペプチド、置換された連結部を有するポリペプチド、天然に存在するような変異および天然には存在しないような変異といったような当該技術分野で公知のその他の改変・修飾が含まれる。
【００４０】
本明細書で用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド発現の後改変されているもの、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ミリストイル化などされているものであってもよい。
【００４１】
本明細書で用語「ネイキッドDNA」とは、哺乳動物での発現のために哺乳動物へ投与されるポリヌクレオチドDNAを指していてよい。ポリヌクレオチドとしては、例えば、コード配列であってよく、ポリヌクレオチドDNAは、一旦DNAが細胞内に入るとコード配列が容易に発現するように発現制御配列に直接的または間接的に結合しているものであってよい。間接的な結合とは、哺乳動物細胞でのDNAの発現を容易にする目的で調節領域とコード配列を結合するためとか、他の配列を組み込むのを容易にするなどのため、リンカーまたはスペーサーを介して２つのポリヌクレオチド領域を一緒に結合することを含んでいてよい。
【００４２】
本明細書で「ベクター」とは、１つ又は複数の目的の配列または遺伝子の発現を指示することのできる集合体（アセンブリ）を指している。ベクターは、転写プロモーター／エンハンサー、１または複数の遺伝子座を規定しているエレメント、さらにはオールターナティブ・スプライシング、核RNA輸送、メッセンジャーの翻訳後に起こる修飾、あるいはタンパク質の転写後に起こる修飾などといった過程を指示又は制御している他の遺伝子が発現するのを制御しているその他のエレメントを任意に含んでいなければならない。
【００４３】
さらに、ベクターは、転写される場合に、１つ又はそれ以上の目的の配列または遺伝子に作動可能に連結され、且つ翻訳開始配列として作用するような配列を含まなければならない。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化を指示するシグナル、Neo、TK、ハイグロマイシン、ブレオマイシン（フレオマイシン）、ヒスチジノール、DHFRなどのような選択マーカー、１つ又はそれ以上の制限部位および翻訳終結配列を含んでいてよい。さらに、ベクターがレトロウイルス中に配置される場合、ベクターは、パッケージングシグナル、長末端反復配列（LTR) 、そして、もしそれが無いなら、使用されるレトロウイルスに適したプラス鎖やマイナス鎖のプライマー結合部位を含まなければならない。
【００４４】
「組織特異的プロモーター」とは、限定された数の組織タイプあるいは細胞タイプにおいて優先的に活性であるようなものであって、転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座を規定しているエレメント、あるいは上記したように遺伝子発現を制御するその他のエレメントを指している。このような組織特異的プロモーターの代表的例としては、例えば、PEPCKプロモーター、HER2/neuプロモーター、カゼインプロモーター、IgGプロモーター、絨毛性胚抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、αフェトプロテインプロモーター、アセチルコリンレセプタープロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、αまたはβグロビンプロモーター、Ｔ細胞レセプタープロモーター、オステオカルシンプロモーターなどが挙げられる。
【００４５】
「事象特異的プロモーター」とは、転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座を規定しているエレメント、または上記したように遺伝子発現を制御するその他のエレメントであって且つこれらの転写活性が細胞性刺激に対する応答の際に変化するようなものを指している。このような事象特異的プロモーターの代表的例としては、チミジンキナーゼもしくはチミジレートシンターゼプロモーター、αもしくはβインターフェロンプロモーター、さらにホルモン（天然ホルモン、合成ホルモン、または他の非宿主生物からのホルモンのいずれか、例えば、昆虫ホルモンなど) の存在に応答するプロモーターなどが挙げられる。
【００４６】
用語「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」とは、１つより多くのタンパク質または１つより多くのタンパク質の部分を含む１つのポリペプチドの発現を生じるようなベクターを使用しての発現で産生されるものであり且つベクターまたは連続した結合中の１つより多くの異種コード配列を組換え発現せしめて得られるタンパク質またはポリペプチドを指している。最も好ましくは、融合タンパク質は、それを構築するのに使用された由来タンパク質又はポリペプチドが有していた生物学的活性のうちの少なくとも１つを保持しているポリペプチド単位をもっており、好ましくは、別々のタンパク質の部分を組み合わせることによってシグナルポリペプチドを形成し、相乗的に改良された生物学的活性を生ぜしめているものが含まれる。生成される融合タンパク質としては、発現された場合に機能を有するポリペプチドを有するもの、発現された場合に機能を有さないペプチドを有するものが挙げられる。該発現された場合に機能を有さないペプチドとしては、好ましくは活性を有するポリペプチドを発現するために役立つものが挙げられる。本発明に有用な融合タンパク質の例としては、治療のためあるいは検知又は測定のため、さらには分析又は分離や精製のためといった利用の観点からのいくつかの利点を有している遺伝子操作された任意のガレクチン９改変体融合ポリペプチドが挙げられる。
【００４７】
用語「キメラ」または「キメラタンパク質」は、融合タンパク質または融合ポリペプチドと等価な意味を有すると考えてよい。「キメラ分子」は、融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド融合分子であってよい。キメラは、連結されたDNAコード配列から構築され、そして細胞系で発現されるか、またはベクターでもって投与して動物においてインビボ発現することができる。例えば、ガレクチン９改変体を含むキメラまたは融合タンパク質は、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療プロトコルで投与することができる。
【００４８】
本明細書で「患者」とは、生きている生物で任意の治療又は予防処置可能なものをさしてよく、真核生物または原核生物を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、患者である真核生物としては、脊椎動物や無脊椎動物であってよい。したがって、例えば、患者は、魚、鳥、蠕虫、昆虫、哺乳動物、爬虫類、両生類、菌類、植物であってよく、好ましくは哺乳動物である。咄乳動物としては、例えば、ヒトが挙げられる。
【００４９】
本発明のガレクチン９改変体治療剤及び／又は診断剤の一般的製造および使用法を以下説明する。１つの態様では、本発明は、ガレクチン９が保有する生理活性又は生物活性の不足又は欠如に起因する疾患・病気・異常状態を処置する技術を提供する。該処置技術としては、例えば、ガレクチン９改変体治療剤を提供する工程及び／又は当該疾患などを有する哺乳動物に有効量のガレクチン９改変体治療剤を投与する工程などが挙げられる。ガレクチン９改変体は、悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、悪性腫瘍細胞に対してのアポトーシス誘導活性、悪性腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性（抗ガン活性）、活性化T細胞のアポトーシス誘導活性、特にCD4陽性T細胞のアポトーシス誘導活性、免疫調節活性、抗炎症作用、抗アレルギー作用を発揮することから、抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として期待できるものである。該処置技術は、活性化Ｔ細胞が顕著な自己免疫疾患を処置する方法を包含する。「自己免疫疾患」、および「自己免疫」とはすべて、哺乳動物での自己免疫によって特徴づけられる障害（これは、自己成分に対する免疫系の応答である)をいう。自己免疫応答は、臨床的兆候を現す症状に進展し得るものである。厳密にいえば、移植拒絶は自己免疫反応ではないが、患者が症状的に細胞、組織、または器官を置換したりあるいは移植するといった外科手術を受ける場合、同種移植を受ける体というものは、外来移植に対して免疫学的に反応するものである。種の１つのメンバーから他の種への、細胞、組織、または器官の同種移植中に、受容体（レシピエント）では移植された細胞、組織、または器官を拒絶するのに十分な免疫応答が生じる場合では、「移植拒絶」が起こるのである。
【００５０】
本発明の方法および治療剤によって処置することができる「腫瘍」の例としては、悪性腫瘍が含まれていてよく、例えば、転移をする腫瘍は悪性腫瘍で、一般的にその悪性腫瘍は上皮性と非上皮性のものがあるとされ、ある場合には、ガン、肉腫、白血病などに区分して考えられることもあるが、単に「ガン」と呼んだ場合、一般人では悪性腫瘍を指すことが多い。本明細書で「ガン」とは、広い意味で解釈してよく、単に上皮性の悪性腫瘍と解釈すべきではない。本明細書において「ガン」とは、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍（腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む）を包含していてよく、皮膚ガン（メラノーマを含めてよい）、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、睾丸悪性腫瘍、前立腺ガン、膀胱ガン、腎ガン、甲状腺ガン、咽頭・喉頭ガン、舌ガン、上顎ガン、食道ガン、胃ガン、結腸・直腸ガン、肺・気管支ガン、肝ガン（肝細胞癌、肝内胆管ガンを含む）、肝外胆管・胆嚢ガン、膵臓ガン、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脳腫瘍（メニンギオーマ、グリオーマ、アストロサイトーマなどを含む）等が挙げられるが、これらに限定されることなく、本発明のガレクチン９改変体を使用することで好ましい結果が得られるもの、さらには当該ガレクチン９改変体が関与して何らかの生理的又は生物学的な応答が得られるものは含まれてよいと理解されるべきである。
【００５１】
本発明の方法および治療剤によって処置することができる「自己免疫疾患」の例としては、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、グッドパスチャー(Goodpasture)症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、抗コラーゲン抗体による強皮症（schleroderma)、複合化結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自発性不妊症、糸球体腎炎、水疱性類天庖瘡、アドレナリン作用性薬物耐性、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫ベースの内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後遺症（post-myocardial infarction)、心臓穿孔症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫ベースの喘息、自己免疫ベースの炎症性反応、肉芽腫症障害、強直性（alkylizing)脊椎炎、連鎖球菌感染後(poststreptococcal)糸球体腎炎、自己免疫溶血性貧血、脳炎、リンパ腫に対する二次的自己免疫反応、変性障害、萎縮性障害などが挙げられる。レセプター自己免疫を表す自己免疫疾患としては、例えば、グレーブス病、重症筋無力症、インスリン耐性症などが挙げられる。アドレナリン性薬物耐性の自己免疫疾患としては、例えば、喘息および嚢胞性線維症などが挙げられる。
【００５２】
本発明における他の自己免疫疾患としては、例えば、動物モデルが存在するものが挙げられ、例えば、シェーグレン症候群（自己免疫涙腺炎(dacryodentis)または免疫媒介唾液腺炎)、自己免疫心筋炎、原発性胆汁性肝硬変（PBC)、炎症性心臓病、水銀誘導性腎自己免疫、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病またはIDD)、胸腺切除術後自己免疫、中枢神経系（CNS)脱髄障害、CNS狼瘡、睡眠発作、免疫媒介PNS障害、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、ブドウ膜炎、髄質嚢胞性線維症、自己免疫溶血性疾患、自己免疫脈管炎、卵巣自己免疫疾患、ト強皮症（scheroderma)などが挙げられる。中枢神経系（CNS)脱髄障害によって特徴づけられる自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症（MS)などが挙げられる。末梢神経系（PNS)自己免疫疾患は、例えば、ギヤン−バレー症候群（GBS)であってよい。
【００５３】
ガレクチン９改変体治療剤としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子の有機化合物、ペプチド、またはペプチド様化合物又は物質などが挙げられる。また、ガレクチン９改変体治療剤は、ガレクチン９改変体ポリペプチド、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ガレクチン９改変体ポリペプチドの一部を含む融合ポリペプチド、当該ガレクチン９改変体ポリペプチドの一部を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ガレクチン９改変体ポリペプチドの生物学的に活性なペプチド誘導体、ガレクチン９改変体ポリペプチドに由来する生物学的に活性なペプチド様化合物又は物質、またはガレクチン９改変体活性を有しており且つガレクチン９改変体の構造を模倣している低分子の有機化合物（例えば、アゴニストを含めてよい）などが含まれていてよい。ガレクチン９改変体ポリペプチドは、ガレクチン９改変体ポリペプチド改変体、ガレクチン９改変体ポリペプチド誘導体、変異したガレクチン９改変体ポリペプチド、または短縮型ガレクチン９改変体ポリペプチドのような生物学的に活性なガレクチン９改変体ポリペプチドであってよい。ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ガレクチン９のN端側CRD全長並びにC端側CRD全長を持っている改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ガレクチン９改変体ポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする配列、ガレクチン９改変体ポリペプチドに由来する生物学的に活性なペプチドをコードする配列、可溶性ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードする配列などであってよい。本発明の別の実施態様は、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを有する組成物である。
【００５４】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸（ポリヌクレオチド）や所定のペプチド（ポリペプチド）を構築したり取得すること、また単離・配列決定したり、組換え体を作製したりできる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術（組換えDNA技術を含む)としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition) ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); M. J. Gait (Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press （1984); B. D. Hames and S. J. Higgins (Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford, UK (1985); B. D.Hames and S. J. Higgins (Ed), Transcription and Translation: A Practical Approach (Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK (1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (2nd Edition), John Wiley & Sons, New York (1988); J. H. Miller and M. P. Calos (Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1987); R. J. Mayer and J. H. Walker (Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987); R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification: Principles and Practice (2nd Edition, 1987 & 3rd Edition, 1993), Springer-Verlag、N.Y.; D. M. Weir and C. C. Blackwell (Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vol.1, 2, 3 and 4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1986); L. A. Herzenberg et al. (Ed), Weir's Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, 2, 3 and 4, Blackwell Science Ltd. (1997); R. W. Ellis (Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemann, London (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる (それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 〔以下、これら全てを「遺伝子組換え技術」という）。
【００５５】
本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出することができる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press,New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215: 403 (1990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
【００５６】
本明細書中、「ポリメラーゼ連鎖反応」あるいは「ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(polymerase chain reaction)」又は「PCR」とは、一般的に、米国特許第 4,683,195号明細書などに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、PCR 法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、PCR 法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用することができる。5'端側のプライマーとしては、少なくとも開始コドンを含有するか、あるいは該開始コドンを含めて増幅できるように選択し、また3'端側のプライマーとしては、少なくともストップコドンを含有するか、あるいは該ストップコドンを含めて増幅できるように選択することが好ましい。プライマーは、好ましくは 5個以上の塩基、さらに好ましくは10個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは18〜25個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５７】
PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki,et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００５８】
PCR 反応は、代表的な場合には、例えば鋳型（例えば、mRNAを鋳型にして合成されたDNA; 1st strand DNA)と該遺伝子に基づいてデザインされたプライマーとを、10×反応緩衝液 (Taq DNA ポリメラーゼに添付されている) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リン酸dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、Taq DNA ポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus社などの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なPCR サイクル条件下にそのサイクルを25〜60回繰り返すが、増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。PCR サイクル条件としては、例えば、変性90〜95℃ 5〜100 秒、アニーリング40〜60℃ 5〜150 秒、伸長65〜75℃ 30 〜300 秒のサイクル、好ましくは変性 94 ℃ 15 秒、アニーリング 58 ℃ 15 秒、伸長 72 ℃ 45 秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるPCR 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライマーと鋳型DNA とのハイブリッドのTm値に応じて変えることが好ましい。伸長反応の時間は、通常1000bpの鎖長当たり1 分程度がおおよその目安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。
【００５９】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (1989) に記載されているような既知の方法、例えば、フォスフォトリエステル法、フォスフォジエステル法、フォスファイト法、フォスフォアミダイト法、フォスフォネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよいし、場合によっては、マーカーの付された塩基を含有していてよい。
【００６０】
所定の核酸を同定したりするには、ハイブリダイゼーション技術を利用することができる。該ハイブリダイゼーションは、上記「遺伝子組換え技術」を開示する文献記載の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、DNA などの核酸を含有しているサンプルをナイロンフィルターなどの膜を含めた担体に転写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した後、その担体（例えば、膜など）に転写せしめられたものを、必要に応じ変成させた標識プローブDNA 断片と、ハイブリダイゼーション用緩衝液中で反応させて行われる。
【００６１】
ハイブリダイゼーション処理は、普通約35〜約80℃、より好適には約50〜約65℃で、約15分間〜約36時間、より好適には約1〜約24時間行われるが、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション処理は、約55℃で約18時間行われる。ハイブリダイゼーション用緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、Rapid hybridization buffer（Amersham社）などを用いることができる。転写した担体（例えば、膜など）の変成処理としては、アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また担体（例えば、膜など）の固定化処理としては、普通約40〜約 100℃、より好適には約70〜約90℃で、約15分間〜約24時間、より好適には約1〜約4時間ベーキングすることにより行われるが、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例えば、フィルターなどの担体を約80℃で約2 時間ベーキングすることにより固定化が行われる。転写した担体（例えば、膜など）の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば1M NaCl 、1mM EDTAおよび 0.1％ sodium dodecyl sulfate (SDS) 含有 50mM Tris-HC1緩衝液，pH8.0 などで洗うことにより行うことができる。ナイロンフィルターなどの膜を含めた担体としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができる。
【００６２】
上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、0.5M NaOH および1.5M NaCl を含有する液などを挙げることができ、中和液としては、例えば、1.5M NaCl 含有0.5M Tris−HCl 緩衝液，pH8.0 などを挙げることができ、緩衝液としては、例えば、 2×SSPE（0.36M NaCl、20mM NaH2PO4および2mM EDTA）などを挙げることができる。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に応じて転写した担体（例えば、膜など）はプレハイブリダイゼーション処理することが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［50％ formamide、 5×Denhardt's溶液（0.2 ％ウシ血清アルブミン、0.2 ％ polyvinyl pyrrolidone）、 5×SSPE、0.1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性サケ精子DNA］などに浸し、約35〜約50℃、好ましくは約42℃で、約 4〜約24時間、好ましくは約 6〜約8 時間反応させることにより行うことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができる。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブDNA 断片の変性は、例えば、約70〜約100 ℃、好ましくは約100 ℃で、約1〜約60分間、好ましくは約 5分間加熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜約50mM、好ましくは約19〜約40mM、より好ましくは約19〜約20mMで、温度については約35〜約85℃、好ましくは約50〜約70℃、より好ましくは約60〜約65℃の条件を示す。
【００６３】
ハイブリダイゼーション完了後、フィルターなどの担体を十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーション反応をした標識プローブDNA 断片以外の標識プローブを取り除くなどしてから検出処理をすることができる。フィルターなどの担体の洗浄処理は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うことができ、例えば、0.1 ％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15M NaCl、15mM クエン酸）溶液などで洗うことにより実施できる。ハイブリダイズした核酸は、代表的にはオートラジオグラフィーにより検出することができるが、当該分野で用いられる方法の中から適宜選択して検出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する核酸バンドを、適切な緩衝液、例えば、SM溶液(100mM NaCl および10mM MgSO4含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.5 ）などに懸濁し、ついでこの懸濁液を適度に希釈して、所定の核酸を単離・精製、そしてさらなる増幅処理にかけることができる。本明細書で「高い相同性」といった場合当該対象配列の長さにもよるが、例えば 50%以上、さらには60% 以上、好ましくは70% 以上、さらに好ましくは80% 以上、そして特定の場合には95% 以上で、特に好ましくは97% 以上であってよい。該「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェントな条件で問題の配列を有するものにハイブリダイズするものであってよく、例えば当該塩基配列のうちの連続した５個以上の塩基配列、好ましくは10個以上の塩基配列、より好ましくは15個以上の塩基配列、さらに好ましくは20個以上の塩基配列とハイブリダイズし、当該ポリペプチドと実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものなどが挙げられる。核酸は、化学合成によって得ることも可能である。その場合断片を化学合成し、それらを酵素により結合することによってもよい。
【００６４】
ハイブリダイゼーション処理により遺伝子ライブラリーやcDNAライブラリーなどを含めた核酸サンプルから目的核酸をスクリーニングする処理は、繰り返して行うことができる。クローニングされているヒト由来のcDNAライブラリー、例えば種々のヒト由来の組織あるいは培養細胞（特には、ヒトの腎臓、脳、松果体、下垂体後葉、神経細胞、網膜、網膜血管細胞、網膜神経細胞、胸腺、血管、内皮細胞、血管平滑筋細胞、血液細胞、マクロファージ、リンパ球、精巣、卵巣、子宮、腸、心臓、肝臓、膵臓、小腸、大腸、歯肉関連細胞、皮膚関連細胞、糸球体細胞、尿細管細胞、結合組織細胞などの組織・細胞、さらには各種腫瘍組織、ガン細胞等）cDNAライブラリーを使用できる。さらに鋳型などとして用いるcDNAライブラリーは、市販の種々の組織由来cDNAライブラリーを直接使用することもでき、例えばStratagene社, Invitrogen社, Clontech社などから市販されたcDNAライブラリーを用いることができる。典型的な例では、ヒト組織・細胞から調製した遺伝子ライブラリー、例えばヒトP1 artificial chromosome  ゲノミックライブラリー(Human Genome Mapping Resource Center)、ヒト組織cDNAライブラリー (例えば、Clontech社などから入手可能) を用いることができる。種々のヒト組織あるいは培養細胞等から構築されたヒトゲノミック DNAライブラリーあるいはヒト由来cDNAライブラリーをプローブを使用してスクリーニングできる。プローブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライム DNAラベリングキット (Boehringer Mannheim社) などを使用して行うことができる。例えば、random-primingキット (Pharmacia LKB社, Uppsala)などを使用して、プローブ用DNAを[α-32P]dCTP (Amersham社)などで標識し、放射活性を持つプローブを得ることができる。
【００６５】
所定の核酸を保有する、ファージ粒子、組換えプラスミド、組換えベクターなどは、当該分野で普通に使用される方法でそれを精製分離することができ、例えば、グリセロールグラジエント超遠心分離法（Molecular Cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989）、電気泳動法などにより精製することができる。ファージ粒子などからは、当該分野で普通に使用される方法でDNA を精製分離することができ、例えば、得られたファージなどをTM溶液（10mM MgSO4含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8 ）などに懸濁し、DNase I およびRNase A などで処理後、20mM EDTA 、50μg/ml Proteinase K 及び0.5 ％SDS 混合液などを加え、約65℃、約1 時間保温した後、これをフェノール抽出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりDNA を沈殿させ、次に得られたDNA を70％エタノールで洗浄後乾燥し、TE溶液（10mM EDTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝液、pH8.0 ）に溶解するなどして得られる。また、目的としているDNA は、サブクローニングなどにより大量に得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて行うことができる。こうしたサブクローニングにより得られたDNA も、上記と同様にして遠心分離、フェノール抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離できる。
【００６６】
本明細書において、得られたPCR産物などの核酸(DNAを含む)は、通常 1〜2% アガロースゲル電気泳動にかけて、特異なバンドとしてゲルから切り出し、例えば、gene clean kit (Bio 101)などの市販の抽出キットを用いて抽出する。抽出されたDNA は適当な制限酵素で切断し、必要に応じ精製処理したり、さらには必要に応じ5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン酸化した後、pUC18 などのpUC 系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲーションし、適当なコンピテント細胞を形質転換する。クローニングされたPCR 産物はその塩基配列を解析される。PCR 産物のクローニングには、例えば、p-Direct (Clontech社), pCR-ScriptTM SK(+) (Stratagene社), pGEM-T (Promega社), pAmpTM (Gibco-BRL社) などの市販のプラスミドベクターを用いることが出来る。宿主細胞の形質転換をするには、例えばファージベクターを使用したり、カルシウム法、ルビジウム／カルシウム法、カルシウム／マンガン法、TFB 高効率法、FSB 凍結コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレクトロポレーションなど当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができる（D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983 など）。目的とするDNA を単離するためには、逆転写PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR) 、RACE (rapid amplification of cDNA ends) を適用することが出来る。RACEは、例えば、M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols" (M. A. Frohman, "a guide to methods and applications"), pp.28-38, Academic Press, New York (1990) などに記載された方法に従って行うことができる。
【００６７】
DNAは、必要に応じてクローニングでき、例えば、プラスミド、λファージ、コスミド、P1ファージ、Ｆ因子、YACなどが利用できる。好ましくはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばCharon 4A, Charon 21A, λgt10, λgt11, λDASHII, λFIXII, λEMBL3, λZAPIITM (Stratagene社)などが利用できる。また、得られたDNAを、下記で詳しく説明するような適当なベクター、例えば、プラスミドpEX, pMAMneo, pKG5などのベクターに組込み、下記で詳しく説明するような適当な宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、CHO 細胞、COS 細胞などで発現させることができる。また、該DNA 断片は、そのままあるいは適当な制御配列を付加したDNA 断片として、または適当なベクターに組込み、そして動物に導入して、所定の遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作成することができる。動物としては、哺乳動物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシなどが挙げられる。好ましくは、マウスなどの動物の受精卵に該DNA 断片を導入して、トランスジェニック動物を作成することができる。所定の遺伝子産物の確認を、当該外来遺伝子をトランスフェクションした、293T細胞、COS-1 細胞などのそれに適した動物細胞などを用いて行うことができる。
【００６８】
外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例えば、F. L. Graham et al., Virology, 52: 456, 1973など）、DEAE-デキストラン法（例えば、D. Warden et al., J. Gen. Virol., 3: 371, 1968など）、エレクトロポレーション法（例えば、E. Neumann et al., EMBO J, 1: 841, 1982 など）、マイクロインジェクション法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法などが挙げられる。こうして所定の遺伝子をトランスフェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、それを解析することもできる。
【００６９】
所定の遺伝子など（本発明で得られたDNA など）を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、293T細胞、CHO 細胞、COS 細胞等の真核細胞宿主、Sf21等の昆虫細胞宿主）中で該DNA が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。もちろん、市販のキットや試薬に添付のものから選んで使用することもできる。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適に修飾されたコドンが含まれていることができるし、制限酵素部位が設けられていることもできるし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための発現制御配列、調節配列など、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに有用な配列（ハイブリドタンパク質や融合タンパク質をコードするものも含む）等を含んでいることができる。好ましくは、適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とするプラスミドでは、トリプトファンプロモーター(trp) 、ラクトースプロモーター(lac) 、トリプトファン・ラクトースプロモーター(tac) 、リポプロテインプロモーター(lpp) 、λファージ PL プロモーター等を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、SV40レートプロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTR プロモーター、CMV プロモーター、SRαプロモーター等を、酵母を宿主とするプラスミドでは、GAL1、GAL10 プロモーター等を使用し得る。さらにCYC1, HIS3, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, EN0, TP1, AOX1等の制御系を使用することもできる。
【００７０】
所望ポリペプチドをコードするDNA のトランスクリプションを促進するためエンハンサーをベクターに挿入することができ、そうしたエンハンサーとしてはプロモーターに働いてトランスクリプションを促進する作用を持つ、通常約10〜100 bpの cis作用を持つエレメントのものが挙げられる。多くのエンハンサーが、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α- フェトプロテイン、インシュリンなどの哺乳動物遺伝子から知られている。代表的には、真核細胞感染性ウイルスから得られるエンハンサーが好適に使用でき、例えばレプリケーションオリジンのレート領域にあるSV40エンハンサー (100-270 bp), サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー, ポリオーマのレプリケーションオリジンのレート領域にあるエンハンサー, アデノウイルスのエンハンサーなどの例が挙げられる。また、必要に応じて、宿主にあったシグナル配列を付加することもでき、それらは当業者によく知られているものを使用できる。
【００７１】
大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えばpBR322、pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KSTM (Stratagene社) などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、例えばpAS, pKK223 (Pharmacia社), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invitrogen社) なども挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミドとしては、例えばSV40ベクター、ポリオーマ・ウイルスベクター、ワクシニア・ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ、具体的にはpcD, pcD-SRα, CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5 (Stratagene社) などが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとしては、YIp型ベクター、YEp型ベクター、YRp型ベクター、YCp型ベクターなどが挙げられ、例えばpGPD-2などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌K12 株に由来するものが挙げられ、例えばNM533, XL1-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, B834株由来としては、BL21(DE3)pLysSなどが挙げられる。細菌における発現系として、例えば、Chang et al., Nature (1978) 275: 615; Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544; Goeddel et al., Nucleic Acid Res., (1980) 8: 4057; EP 36,776, 米国特許第4,551,433号明細書; deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21−25; Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269などの記載を参照できる。宿主細胞が酵母の場合、例えば Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces 株, Candida, Trichoderma reesia, その他の酵母株などが挙げられる。酵母における発現系として、例えば、Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet (1986) 202: 302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze et al., J. Basic Micr Biol. (1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; 米国特許第4,837,148号明細書, 同第4,929,555号明細書; Beach and Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284−289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205−221; Yalton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470−1474; Kelly and Hynes, EMBO J., (1985) 4: 475479; EP 244,234; WO 91/00357などに記載されているものを参照できる。
【００７２】
宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミドリザル線維芽細胞由来のCOS-7 細胞、COS-1細胞、CV-1細胞、ヒト腎細胞由来 293細胞、ヒト表皮細胞由来A431細胞、ヒト結腸由来 205細胞、マウス線維芽細胞由来のCOP 細胞、MOP細胞、WOP細胞、チャイニーズ・ハムスター細胞由来のCHO細胞、CHO DHFR-細胞、ヒトHeLa細胞、マウス細胞由来C127細胞、マウス細胞由来NIH 3T3細胞、マウスL細胞、9BHK、HL60、U937、HaK 、Jurkat細胞、その他の形質転換されて得られたセルライン、通常の二倍体細胞、インビトロの一次培養組織から誘導された細胞株などが挙げられる。哺乳動物発現は、例えば、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761； Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79: 6777； Boshart et al., Cell (1985) 41: 521; 米国特許第4,399,216号明細書; Ham and Wallace, Methods in Enzymology (1979) 58: 44; Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255; 米国特許第4,767,704号明細書; 同第4,657,866号明細書; 同第4,927,762号明細書; 同第4,560,655号明細書; WO 90/103430; WO 87/00195; 米国特許第RE 30,985号明細書などに記載されているものを参照できる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体病ウイルス (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) 、それに由来するものあるいはその他の適切なものをベクターとし、Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (fruitfly), カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばBM-N細胞などを用いることが挙げられる (例えば、Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47-55 (1988); Setlow, J. K. et al. (eds.), Genetic Engineering, Vol. 8, pp.277-279, Plenum Publishing, 1986; Maeda et al., Nature, 315, pp.592-594 (1985))。昆虫における異種遺伝子の発現については、例えば、米国特許第4,745,051号明細書; Friesen et al. (1986), "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", The Molecular Biology of Baculoviruses (W. Doerfler (Ed)); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al., J. Gen. Virol., (1988) 69: 765−776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177; Carbonell et al., Gene（1988) 73: 409; Maeda et al., Nature, (1985) 315: 592-594; Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82: 8404; Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273; Martin et al., DNA (1988) 7: 99などに記載されているものを参照できる。さらに、多数のバキュロウイルス株および改変体並びに宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞については、例えば、Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47-55; Miller et al., Generic Engeneering (Setlow, J. K. et al. (Ed)) Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986) pp. 277-279; Maeda et al., Nature (1985) 315: 592−594などに記載されているものを参照できる。
【００７３】
Agrobacterium tumefaciensなどを利用して、植物細胞を宿主細胞として使用することも可能であり、それに適するベクターと共に、それらは当該分野で広く知られている。本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、DNA 断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素であるDNA 修飾・分解酵素、DNA ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Roberts, Nucleic Acids Res., 13: r165, 1985; S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. Macelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991などに記載のものが挙げられる。
【００７４】
本発明に従い、ポリペプチド（又はタンパク質）をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクローニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する細胞株を得ることができる。例えば、宿主細胞として動物細胞を用いた形質転換体において、dhfr遺伝子を選択マーカーとして利用した場合、MTX 濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、本発明のポリペプチドをコードするDNA を増幅させ、より高い発現を得られる細胞株を得ることができる。本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、目的物を生成、蓄積せしめることができる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母などを宿主としている形質転換体は、液体培地を好適に使用することができる。培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。また、必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル  アクリル酸のような薬剤を加えることができる。培地のpHは約５〜約８が望ましい。
【００７５】
培養は、例えば大腸菌では通常約15〜約45℃で約３〜約75時間行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜約20％の胎児牛血清を含むMEM 培地、PRMI1640培地、DMEM培地などが用いられる。pHは約６〜約８であるのが好ましい。培養は通常約30〜約40℃で約15〜約72時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。所定の遺伝子産物を発現している形質転換体はそのまま利用可能であるが、その細胞ホモジュネートとしても利用できるが、所定の遺伝子産物を単離して用いることもできる。上記培養細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトン X-100（商品名）、ツウィーン-20 （商品名）などの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
【００７６】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。該リガンドとしては、特異的認識をするモノクローナル抗体を含めた抗体又はそのフラグメント、レクチン、糖、結合ペアーの一方などが挙げられる。例えば、イムノ・アフィニティー・クロマトグラフィー、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００７７】
さらに得られた本発明のポリペプチド（又はタンパク質）は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。本発明のポリペプチドは、C 末端が通常カルボキシル基(-COOH) またはカルボキシレート (-COO- ) であるが、C 末端がアミド(-CONH2)またはエステル(-COOR) であってもよい。ここでエステルにおけるR としては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルもしくはn-ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8 シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12 アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル-C1-2 アルキル基などのC7-14 アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC 末端のエステルなどが用いられる。
【００７８】
さらに、本発明のポリペプチド（又はタンパク質）には、上記したポリペプチドにおいて、N 末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ1-5 アルキル−カルボニル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、N 端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH 、-COOH 、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００７９】
さらに、本発明に係わる遺伝子の塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、所定のポリペプチドのアミノ酸配列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するポリペプチドを製造することができる。こうした変異・変換・修飾法としては、例えば日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 II 」、p105（広瀬進）、東京化学同人(1986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、p233（広瀬進）、東京化学同人(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983); J. A. Wells et al., Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York （1987); A. R. Oliphant et al., Gene, 44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法) (Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), カセット変異導入法 (cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985), 制限部位選択変異導入法 (restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986),アラニン・スキャンニング法 (Cunningham & Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989), PCR 変異導入法, Kunkel法, dNTP[αS]法（Eckstein),亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００８０】
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合ポリペプチド（融合タンパク質）として発現させ、生体内あるいは生体外で、所望のポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合ポリペプチドはその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合ポリペプチドとしては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β-ガラクトシダーゼ（β-gal) 、マルトース結合タンパク (MBP), グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)、チオレドキシン(TRX)又は Cre Recombinaseのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、ポリヒスチジン(poly-His)又はポリヒスチジン-グリシン(poly-His-Gly)タグ、また該エピトープタグとしては、例えば AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha.11, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma-Aldrich), Omni-probe, S-probe, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-G などが挙げられる (Field et al., Molecular and Cellular Biology, 8: pp.2159-2165 (1988); Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: pp.3610-3616 (1985); Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): pp.547-553 (1990); Hopp et al., BioTechnology, 6: pp.1204-1210 (1988); Martin et al., Science, 255: pp.192-194 (1992); Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: pp.15163-15166 (1991); Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp.6393-6397 (1990) など) 。酵母を利用した two-hybrid 法も利用できる。
【００８１】
さらに融合ポリペプチドとしては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付されたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のBiotin Avi Tag、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ (Aequorea victorea)などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質(green fluorescent protein: GFP)、それを改変した変異体(GFPバリアント) 、例えば、EGFP (Enhanced-humanized GFP), rsGFP (red-shift GFP), 黄色螢光タンパク質 (yellow fluorescent protein: YFP), 緑色螢光タンパク質 (green fluorescent protein: GFP),藍色螢光タンパク質 (cyan fluorescent protein: CFP), 青色螢光タンパク質 (blue fluorescent protein: BFP), ウミシイタケ (Renilla reniformis) 由来のGFP などが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−GFP とバイオイメージング、羊土社 (2000年))。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。こうした融合ポリペプチドの発現及び精製は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００８２】
得られたタンパク質（ペプチドあるいはポリペプチドを包含していてよい）は、それを酵素免疫測定法など知られた手法で、適当な担体あるいは固相に結合せしめて固相化することができる。固相化タンパク質、固相化ペプチドは、便利に結合アッセイや物質のスクリーニングに使用できる。
【００８３】
ポリペプチドやタンパク質の構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質 VII、タンパク質工学」、東京化学同人(1993)を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。また下記するようにその生物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれてよい。該修飾・改変のうちには、脱アミノ化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、リン酸化、硫酸化、メチル化などのアルキル化、アセチル化などのアシル化、エステル化、アミド化、開環、閉環、グリコシル化、含有糖鎖の種類を違うものに変えること、含有糖鎖の数を増減すること、脂質結合、D-体アミノ酸残基への置換などであってもよい。それらの方法は、当該分野で知られている（例えば、T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, pp.79-86 W.H. Freeman & Co., San Francisco, USA (1983) 等) 。
【００８４】
本発明のガレクチン９改変体を利用して、当該ガレクチン９の所定の生物学的活性などの機能（例えば、細胞傷害活性、アポトーシス誘導活性、グルココルチコイドと類縁した活性、悪性細胞の転移を抑制する活性など）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩をスクリーニングすることができる。このことは該スクリーニング試薬の提供も意味する。かくして、本発明で解明の当該ガレクチン９タンパク質などのポリペプチド、その一部のペプチド又はそれらの塩の示す活性を用いた、様々な物質に関し、本発明の当該ガレクチン９タンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などの示す生物学的活性などの所定の機能を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩のスクリーニング方法も提供される。
該スクリーニングでは、例えば(i) ガレクチン９改変体タンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩（該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいてもよい、以下同様）などに適当な試験試料を接触させた場合と、(ii)本発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などに問題の試験試料の存在しない場合との比較を行う。具体的には、上記スクリーニングでは、当該生物学的活性（例えば、各ガレクチン９タンパク質と生体成分との間の相互作用に関連した活性など）を測定して、比較する。
【００８５】
該スクリーニング系には、測定に便利となるよう適当な検知用基質を存在せしめてもよい。該基質としては、測定に有効に利用できるものであれば何れのものであってよい。例えば、公知の基質として知られているものの中から選んで用いることができるが、好ましくは合成された化合物などを使用できる。基質は、そのまま使用できるが、好ましくはフルオレッセインなどの蛍光、酵素や放射性物質で標識したものを使用できる。
【００８６】
試験試料としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、細胞抽出物などが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例には、好ましくは抗ガレクチン抗体、酵素阻害剤、サイトカイン、各種インヒビター活性を有する化合物、特には合成化合物などを含んでいてよい。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該スクリーニングは、通常の結合活性あるいは酵素活性の測定法に準じて実施することができ、例えば当該分野で公知の方法などを参考にして行うことができる。また、各種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を使用したり、そこで説明した操作等に準じて行うことができる。使用ペプチドなどは、活性化剤で処理したり、その前駆体あるいは潜在型のものを活性型のものに予め変換しておくこともできる。測定は通常Tris-HCl緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応に悪影響を与えないような緩衝液等の中で、例えば、pH約４〜約10 (好ましくは、pH約６〜約８）において行うことができる。これら個々のスクリーニングにあたっては、それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該ガレクチン９タンパク質あるいはそれと実質的に同等な活性を有するポリペプチドあるいはペプチドに関連した測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、Methods in Enzymology, Academic Press社(USA)発行)など参照〕。また、アポトーシス誘導活性測定法などは、田沼靖一監修、「細胞工学別冊：実験プロトコールシリーズ、アポトーシス実験プロトコール」株式会社秀潤社、1995年１月20日（第１版第２刷）などを参考にできるし、市販の測定キットなどを使用できる。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法又はスクリーニングキットを用いて得られる化合物又はその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の機能を促進あるいは阻害する化合物である。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容される塩などが挙げられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００８８】
本発明の活性成分〔例えば、(a) 当該ガレクチン９改変体ポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩、それに関連するペプチド等、(b) 該当該ガレクチン９改変体あるいはその関連ポリペプチドをコードするDNA などの核酸等、(c) 該ガレクチン９タンパク質の問題の活性を制御する化合物（当該ガレクチン９タンパク質の細胞傷害活性、アポトーシス誘導活性、正常細胞には悪影響を与えないで所定の効能を果たす活性などを促進したりあるいは抑制・阻害するなどの現象、あるいは組織あるいはタンパク質の変質・過剰生産あるいは分解現象といった生物学的活性を促進あるいは抑制及び／又は阻害する化合物）またはその塩、当該タンパク質産生を制御する化合物またはその塩、(d) 本発明を使用して見出された活性物質など〕を医薬として用いる場合、通常単独或いは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。好ましくは、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含される）によってもよい。
【００８９】
また、本発明の活性成分は、各種医薬、例えば抗腫瘍剤（抗ガン剤）、腫瘍移転阻害剤、血栓形成阻害剤、関節破壊治療剤、鎮痛剤、消炎剤、免疫調節剤及び／又は免疫抑制剤と配合して使用することもでき、それらは、有利な働きを持つものであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知られたものの中から選択することができる。
【００９０】
そして、非経口的な投与形態としては、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することができる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製剤などが挙げられ、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、凍結乾燥製剤、ゲル調製品等が挙げられる。
【００９１】
医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本発明のタンパク質等を混和することによって、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造することができる。
【００９２】
非経口的使用に適した製剤としては、活性成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル液、生理食塩液のような担体、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる形に調製する。
【００９３】
注射用の水性液としては、例えば生理食塩液、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液などが挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノールなど）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート 80 TM, HCO-50など）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【００９４】
非経口投与には、界面活性剤及びその他の薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えずに、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化される。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤としては、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、例えばピーナッツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が挙げられる。例えば、この注射剤は、通常本発明化合物を0.1 〜10重量％程度含有するように調製されることができる。
【００９５】
局所的、例えば口腔、又は直腸的使用に適した製剤としては、例えば洗口剤、歯磨き剤、口腔噴霧剤、吸入剤、軟膏剤、歯科充填剤、歯科コーティング剤、歯科ペースト剤、坐剤等が挙げられる。洗口剤、その他歯科用剤としては、薬理的に許容される担体を用いて慣用の方法により調製される。口腔噴霧剤、吸入剤としては、本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担体とともにエアゾール又はネブライザー用の溶液に溶解させるかあるいは、吸入用微粉末として歯などへ投与できる。軟膏剤は、通常使用される基剤、例えば、軟膏基剤（白色ワセリン、パラフィン、オリーブ油、マクロゴール400 、マクロゴール軟膏など）等を添加し、慣用の方法により調製される。
【００９６】
歯、皮膚への局所塗布用の薬品は、適切に殺菌した水または非水賦形剤の溶液または懸濁液に調剤することができる。添加剤としては、例えば亜硫酸水素ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムのような緩衝剤；酢酸または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウムまたはクロロヘキシジンのような殺菌および抗真菌剤を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が挙げられる。
【００９７】
坐剤は、当該分野において周知の担体、好ましくは非刺激性の適当な補形剤、例えばポリエチレングリコール類、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等の、好ましくは常温では固体であるが腸管の温度では液体で直腸内で融解し薬物を放出するものなどを使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発明化合物を0.1 〜95重量％程度含有するように調製される。使用する賦形剤および濃度によって薬品は、賦形剤に懸濁させるかまたは溶解させることができる。局部麻酔剤、防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、賦形剤に溶解可能である。 経口的使用に適した製剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、トローチのような固形組成物や、液剤、シロップ剤、懸濁剤のような液状組成物等が挙げられる。製剤調製する際は、当該分野で知られた製剤補助剤などを用いる。錠剤及び丸剤はさらにエンテリックコーティングされて製造されることもできる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
【００９８】
また、活性成分がタンパク質やポリペプチドである場合、ポリエチレングリコール（PEG)は、哺乳動物中で極めて毒性が低いことから、それを結合させることは特に有用である。また、PEG を結合せしめると、異種性化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少せしめることができる場合がある。該化合物は、マイクロカプセル装置の中に入れて与えてもよい。PEG のようなポリマーは、アミノ末端のアミノ酸のα-アミノ基、リジン側鎖のε-アミノ基、アスパラギン酸又はグルタミン酸側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端のアミノ酸のα-カルボキシル基、又はある種のアスパラギン、セリン又はトレオニン残基に付着したグリコシル鎖の活性化された誘導体に、簡便に付着させることができる。
【００９９】
タンパク質との直接的な反応に適した多くの活性化された形態のPEG が知られている。タンパク質のアミノ基と反応させるのに有用なPEG 試薬としては、カルボン酸、カルボネート誘導体の活性エステル、特に、脱離基がN-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェノール、イミダゾール、又は1-ヒドロキシ-2-ニトロベンゼン-4-スルフォネートであるものが挙げられる。同様に、アミノヒドラジン又はヒドラジド基を含有するPEG 試薬は、タンパク質中の過ヨウ素酸酸化によって生成したアルデヒドとの反応に有用である。
【０１００】
本発明の診断および治療は、哺乳動物が示しているかもしれない特定の自己免疫などの疾患・病気、ガンなどの悪性腫瘍を含めた腫瘍、アレルギー疾患、炎症などに関して適切であるように、当該哺乳動物を診断することによってその実施が開始される。診断はまた、処置の進行をモニターするため、および、例えば、行われている治療における投与量または投与回数のようなパラメータ一を変えるか否かを判断するために、治療手順として治療の間継続されることができる。ガレクチン９改変体治療薬の投与についての適切性を決定することを助けることができるような診断手法としては、哺乳動物におけるガレクチン９の発現レベルの分析、および自己免疫の部位から離れたリンパ球などの細胞と自己免疫の部位に近接するリンパ球などの細胞との間のこれらのレベルの比較などが挙げられる。処置されるべき哺乳動物の自己免疫疾患などの疾患・病気、ガンなどの悪性腫瘍を含めた腫瘍、アレルギー疾患、炎症などは、細胞内のガレクチン９抗原を検出することによってモニターされることができる。このモニタリングは、哺乳動物由来のサンプルをガレクチン９特異的抗体と接触させ、そしてサンプルとの抗体の結合を検出することを含んでいてよい。
【０１０１】
遺伝子治療用ビヒクルは、哺乳動物における発現のために哺乳動物に送達されるべき本発明の治療薬たるコード配列（例えば、ガレクチン９改変体コード配列）を含んでいる構築物（コンストラクト、construct)を送達するためのもの、あるいは、ガレクチン９改変体の全てもしくは部分であって且つ送達のためのものである核酸配列をも含んでいる該構築物を送達するためのものであって、局所的または全身的のいずれかの方法で投与されることのできるものである。これらの構築物は、インビボまたはエキソビボの形で、ウイルスベクターによるアプローチまたは非ウイルスベクター形式でのアプローチを利用することのできるものである。このようなコード配列を発現するには、内因性の哺乳動物プローモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することにより行うことができる。インビボでのコード配列の発現は、構築的になされるか、または調節されて行われるかのいずれかである。ガレクチン９改変体が哺乳動物において発現される場合、可溶性のガレクチン９改変体として発現されることができるし、ある場合には前駆体型ガレクチン９改変体として発現されることもできる。これらの両方においてまたはそのいずれかにおいて、それらは、例えば、全てのガレクチン９改変体、またはガレクチン９改変体の生物学的に活性な部分、バリアント、誘導体、もしくは融合体などであってよい。
【０１０２】
本発明は、所要のガレクチン９改変体の核酸配列を発現することのできる遺伝子送達ビヒクルを提供する。遺伝子送達ビヒクルとしては、好ましくは、ウイルスベクターが挙げられ、より好ましくは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、またはアルファウイルスなどのウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターとしては、さらに、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、トガウイルスなどのウイルスベクターも挙げられる。当該遺伝子送達ビヒクルに関しては、一般には、D. Jolly, Cancer Gene Therapy, 1(1): 51-64 (1994); O. Kimura et al., Human Gene Therapy, 5: 845-852 (1994); S. Connelly et al., Human Gene Therapy, 6: 185-193 (1995); M.G. Kaplitt et al., Nature Genetics, 8: 148-153 (1994)などを参照することができる。
【０１０３】
レトロウイルスベクターは、当該分野でよく知られており、例えば、B型、C型、およびD型レトロウイルス、xenotropicレトロウイルス（例えば、NZB-X1, NZB-X2, NZB9.1 (R. R. O'Neill, J. Virol., 53: 100-106 (1985)参照)など）、polytropicレトロウイルス（例えば、MCF, MCF-MLV (M. Kelly, J. Virol., 45: 291-298 (1983) 参照)など）、スプマウイルス、レンチウイルスなど（R.L.Weiss et al. (Eds.), RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1985参照）を含む任意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であろう。
【０１０４】
遺伝子治療レトロウイルスベクターの一部は、異なっているレトロウイルス由来のものであってよい。例えば、レトロベクターのLTRはネズミザルコーマウイルス由来のものであってよいし、tRNA結合部位はラウスザルコーマウイルス由来のものであってよいし、パッケージングシグナルはネズミ白血病ウイルス由来のものであってよいし、第二鎖合成オリジンはトリ白血症ウイルス由来のものであってよい。これらの組換えレトロウイルスベクターは、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって形質導入可能なレトロウイルスベクター粒子を形成せしめるのに使用することができる（米国特許第5,591,624号明細書参照）。レトロウイルスベクターは、インテグラーゼという目的DNAを宿主細胞のDNA中に部位特異的に組み込む能力をを有する組み込み酵素をレトロウイルス粒子内に持つようにすることで構築することができる。組換えウイルスベクターとしては、複製能欠損組換えウイルスであることが好ましい。
【０１０５】
上記のレトロウイルスベクターとの使用に適しているパッケージング細胞株としては、当該分野でよく知られたものが挙げられ、また、容易に調製されることができる（米国特許第6,013,517号明細書, WO 92/05266参照）。当該パッケージング細胞株は、組換えベクター粒子を産生するためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株, vector cell line: VCL)を作製するのに使用することができる。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト血清中で不活化することがないようにして、ヒトの親細胞（例えば、HT1080細胞）またはミンクの親細胞株から作製される。
【０１０６】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築に好ましいレトロウイルスとしては、トリ白血症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、ネズミザルコーマウイルス、網細内皮症ウイルス、ラウスザルコーマウイルスなどが挙げられる。ネズミ白血病ウイルスとして特に好ましいものとしては、例えば、4070Aおよび1504A (Hartley & Rowe, J. Virol., 19: 19-25 (1976))、Abelson (ATCC No. VR-999)、Friend (ATCC No. VR-245)、Graffi, Gross (ATCC No. VR-590)、Kirsten、ハーベイザルコーマウイルス並びにRauscher (ATCC No. VR-998)、及びモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC No. VR-190)などが挙げられる。
【０１０７】
このようなレトロウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Rockville, Maryland, USA)のような寄託機関または保存機関から入手可能であるか、あるいは、一般に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離することができる。
【０１０８】
本発明で使用可能な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、GB 2200651, EP 0415731, EP 0345242, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03662, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 93/10218, WO 91/02805、米国特許第5,219,740号明細書、同第4,405,712号明細書、同第4,861,719号明細書、同第4,980,289号明細書、同第4,777,127号明細書、同第5,591,624号明細書、Vile, Cancer Res, 53: 3860-3864 (1993), Vile, Cancer Res, 53: 962-967 (1993), Ra, Cancer Res, 53: 83-88 (1993), Takamiya, J Neurosci Res, 33: 493-503 (1992), Baba, J Neurosurg, 79: 729-735 (1993), Mann, Cell 33: 153 (1983), Cane, Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6349 (1984), Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990)などに記載されたものが挙げられる。
【０１０９】
ヒトのアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、本発明で使用可能であり、例えば、Berkne, Biotechniques, 6: 616 (1988); Rosenfeld, Science, 252: 431 (1991); WO 93/07283; WO 93/06223; WO 93/07282などを参照することができる。本発明で使用可能な既知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、上記の参考文献に記載されているものや、例えば、WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; WO 95/00655; WO 95/27071; WO 95/29993; WO 95/34671; WO 96/05320; WO 94/08026; WO 94/11506; WO 93/06223; WO 94/24299; WO 95/14102; WO 95/24297; WO 95/02697; WO 94/28152; WO 94/24299; WO 95/09241; WO 95/25807; WO 95/05835; WO 94/18922; WO 95/09654などに記載されているものが挙げられる。また、Curiel, Human Gene Therapy, 3: 147-154 (1992)に記載されているように死んでいるアデノウイルスに連結されたDNAを投与することによってもよい。
【０１１０】
また、本発明の遺伝子送達ビヒクルとしては、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。このようなベクターのうち本発明での使用のための好ましい例としては、WO 93/09239に開示されているような、AAV-2に基づいたベクターが挙げられる。最も好ましいAAVベクターとしては、２つのAAVの逆末端反復配列を含むものである。このものは、天然のD配列がヌクレオチド置換によって改変されており、その結果、少なくとも５つの天然型のヌクレオチドおよび18個までの天然型ヌクレオチド（好ましくは、少なくとも10個の天然型ヌクレオチドおよび18個までの天然型ヌクレオチド、最も好ましくは、10個の天然型ヌクレオチド) が維持されているものであり、D配列の残りのヌクレオチドは欠失しているかまたは非天然型のヌクレオチドで置換されているものである。AAV逆末端反復領域の天然型のD配列は、各AAV逆末端反復配列中に20個の連続するヌクレオチドを有する配列（すなわち、各末端に１つの配列が存在するもの) であり、このものはHP形成には関与してはいない。非天然型の置換されたヌクレオチドは、同じ部位で天然型のD配列中に見出されるヌクレオチドとは異なっている任意のヌクレオチドであってよい。他の使用可能なAAVベクターの例としては、pWP-19、pWN-1などが挙げられる（Nahreini, Gene, 124: 257-262 (1993))。このようなAAVベクターの別の例としては、psub201などが挙げられる(Samulski, J. Virol., 61: 3096 (1987))。別のAAVベクターの例としては、Double-D ITRベクターなどが挙げられる。Double-D ITRを作製する方法は、米国特許第5,478,745号明細書に開示されている。またそれに加えて、AAVベクターは、例えば、米国特許第4,797,368号明細書、同第5,139,941号明細書、同第5,474,935号明細書、WO 94/288157号などに開示のものが挙げられる。本発明で利用可能なAAVベクターの別の例としては、SSV9AFABTKneoが挙げられ、このものは、AFPエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含んでおり、さらに肝臓で優先的に発現せしめることに向けられたものである。その構造並びに作製方法は、Su, Human Gene Therapy, 7: 463-470 (1996)に開示されている。別のAAV遺伝子治療ベクターとしては、米国特許第5,354,678号明細書、同第 5,173,414号明細書、同第 5,139,941号明細書、同第 5,252,479号明細書などに記載されているものが挙げられる。
【０１１１】
本発明の遺伝子治療ベクターは、ヘルペスベクターであってもよい。主なヘルペスベクターの好ましい例としては、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含んでいる単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号明細書およびEP 0176170に開示されるベクター) が挙げられる。さらなる単純ヘルペスウイルスベクターの例としては、WO 95/04139などに開示されるHFEM/ICP6-LacZ, Geller, Sclence, 241: 1667-1669 (1988)、WO 90/09441、WO 92/07945などに記載されるpHSVlac, Fink, Human Gene Therapy, 3: 11-19 (1992)に記載されるHSV Us3::pgC-lacZ、EP 0453242 Aに記載されるHSV7134, 2RH 105およびGAL4、寄託番号ATCC VR-977およびATCC VR-260としてATCCに寄託されているベクターなどが挙げられる。
【０１１２】
本発明においては、アルファウイルス遺伝子治療ベクターを使用することもできる。好ましいアルファウイルスベクターとしては、シンドビスウイルスベクター、トガウイルス、Semliki Forestウイルス(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)、Middlebergウイルス(ATCC VR-370)、Ross Riverウイルス(ATCC VR-373; ATCC VR-1246)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532)、米国特許第5,091,309号、同第5,217,879号、およびWO 92/10578に記載されるベクターなどが挙げられる。また、使用可能なアルファウイルスベクターとしては、米国特許第5,091,309号明細書、同第5,217,879号明細書、同第5,843,723号明細書、同第6,376,236 号明細書、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994などに記載されるものも挙げられる。このようなアルファウイルスは、ATCC (Rockville, Maryland, USA)のような寄託機関または保存機関から入手可能であるか、あるいは、一般に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離することができる。好ましくは、細胞傷害性が低減せしめられているアルファウイルスベクターを使用することができる（米国特許第6,391,632号明細書参照) 。
【０１１３】
DNAベクター系（例えば、真核生物階層型発現系(eukarytic layered expression system)など)は、本発明のガレクチン９改変体の核酸を発現するために有用である。真核生物階層型発現系の詳細については、WO 95/07994を参照することができる。好ましくは、本発明の真核生物階層型発現系としては、アルファウイルスベクターに由来するものが挙げられ、好ましくは、シンドビスウイルスベクターに由来するものが挙げられる。
【０１１４】
本発明での使用に適した他のウイルスベクターとしては、ポリオウイルス（例えば、ATCC VR-58, Evans, Nature, 339: 385 (1989), Sabin, J. Biol. Standardization, 1: 115 (1973)などに記載されているウイルスなど);ライノウイルス（例えば、ATCC VR-1110およびArnold, J. Cell Biochem, L401-405 (1990)に記載されるウイルスなど);ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスなど) またはワクシニアウイルス（例えば、ATCC VR-111, ATCC VR-2010など、Fisher-Hoch, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 317(1989), Flexner, Ann NY Acad Sci, 569: 86 (1989), Flexner, Vaccine, 8: 17 (1990)、米国特許第4,603,112号明細書及び同第4,769,330号明細書、並びにWO 89/01973に記載されるウイルスなど); SV40ウイルス（例えば、ATCC VR-305およびMulligan, Nature, 277: 108 (1979)およびMadzak, J. Gen. Vir, 73: 1533(1992)に記載されるウイルスなど);インフルエンザウイルス（例えば、ATCC VR-797など)、米国特許第5,166,057号明細書、Enami, Proc Natl Acad Sci USA, 87: 3802-3805(1990), Enami & Palese, J Virol, 65: 2711-2713 (1991), Luytjes, Cell, 59: 110 (1989), McMicheal., N E J Med, 309: 13 (1983), Yap, Nature, 273: 238 (1978)、及びNature, 277: 108(1979)などに記載されているような逆遺伝学技術を用いて作製された組換えインフルエンザウイルス；EP 0386882、Ruchschacher, J. Vir., 66: 2731 (1992)などに記載されているヒト免疫不全症ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ATCC VR-67, VR-1247 並びにEP 0440219に記載されているウイルスなど) ；アウラウイルス（例えば、ATCC VR-368など) ；ベバルウイルス（例えば、ATCC VR-600およびATCC VR-1240など) ；Cabassouウイルス（例えば、ATCC VR-922 など) ；チクングニヤウイルス（例えば、ATCC VR-64, ATCC VR-1241など); Fort Morganウイルス（例えば、ATCC VR-924など) ；ゲタウイルス（例えば、ATCC VR-369, ATCC VR-1243など); Kyzylagachウイルス（例えば、ATCC VR-927など);マヤロウイルス（例えば、ATCCVR-66など);ムカンボウイルス（例えば、ATCC VR-580, ATCC VR-1244など) ; ヌヅムウイルス（例えば、ATCC VR-371など);ピクスナウイルス（例えば、ATCC VR-372, ATCC VR-1245など); Tonateウイルス（例えば、ATCCVR-925など);トリニティウイルス（例えば、ATCC VR-469など);ユナウイルス（例えば、ATCC VR-374など);ワトロアウイルス（例えば、ATCC VR-926など); Y-62-33ウイルス（例えば、ATCC VR-375など) ；O'Nyongウイルス、東部脳炎ウイルス（例えば、ATCC VR-65, ATCC VR-1242など);西部脳炎ウイルス（例えば、ATCC VR-70, ATCC VR-125L, ATCC VR-622, ATCC VR-1252など);コロナウイルス（例えば、ATCC VR-740, Hamre, Proc Soc Exp Biol Med, 121: 190 (1966)に記載されるウイルス) に由来するベクターなどが挙げられる。
【０１１５】
本発明の組成物を細胞へ送達するのは、上述のウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体も使用することができるが、そうしたものとしては、例えば、核酸発現ベクター、死んでいるアデノウイルスのみに連結されたポリカチオン性コンプレックスDNA（例えば、Curiel, Hum Gene Ther, 3: 147-154 (1992)参照) 、リガンド連結DNA（例えば、Wu, J Biol Chem, 64: 16985-16987 (1989) 参照) 、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第6,013,517号明細書、同第6,015,686号明細書など参照)、光重合されたヒドロゲル物質沈殿物、米国特許第5,149,655号明細書に記載されているような携帯型遺伝子導入パーティクルガン、WO 92/11033に記載される電離放射線法、核電荷中和法、または細胞膜との融合法などが挙げられる。さらなる手法としては、Philip, Mol Cell Biol, 14: 2411-2418 (1994), Woffendin, Proc Natl Acad Sci USA, 91: 1581-585 (1994)に記載されているものなどが挙げられる。
【０１１６】
粒子媒介遺伝子転移技術も使用することができ、配列は、高レベル発現のための慣用の制御配列を含む通常のベクターに挿入され、次いで合成遺伝子転移分子（例えば、細胞標的リガンド（例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)に記載されているようなアシアロムコイド、Hucked, Biochem Pharmacol, 40: 253-263 (1990)に記載されているようなインシュリン、Plank, Bioconjugate Chem, 3: 533-539 (1992)に記載されているようなガラクトース、ラクトース、またはトランスフェリンなど) に連結された、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのようなポリマー性DNA結合カチオン) とインキュベートされる。
【０１１７】
ネイキッドDNAも使用することができ、例えば、ネイキッドDNAの導入方法としては、WO 90/11092および米国特許第5,580,859号明細書に記載されるものなどが挙げられる。取り込み効率は、生分解性ラテックスビーズを用いて改善することができる。DNAコートラテックスビーズは、該ビーズがエンドサイトーシスされた後に効率的に細胞に輸送される。この方法は、疎水性を増大させて、それによりエンドソーム破裂およびDNAの細胞質への放出を容易にするようなビーズ処理によりさらに改善されることができる。
【０１１８】
遺伝子送達ビヒクルとして作用することのできるようなリポソームは、米国特許第5,422,120号明細書、WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/144445およびEP 524,968に記載されている。非ウイルス的送達法において、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための通常の制御配列を含む慣用的なベクターに挿入されることができ、次いで合成遺伝子導入分子とインキュベートされることができる。該合成遺伝子導入分子としては、例えば、細胞標的リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インシュリン、ガラクトース、ラクトース、トランスフェリンなど) に連結されたポリマー性DNA結合カチオンが挙げられる。ポリマー性DNA結合カチオンとしては、例えば、ポリリジン、プロタミン、アルブミンなどが挙げられる。他の送達系としては、種々の組織特異的または偏在的に活性なプロモーター制御下の遺伝子を含むDNAをカプセル化するためのリポソームを使用するものが挙げられる。使用に適した非ウイルス的送達法としては、機械的送達系（例えば、Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(24): 11581-11585 (1994)に記載されている手法)も挙げられる。
【０１１９】
さらに、コード配列およびこのような発現の産物は、光重合されたヒドロゲル物質の沈殿により送達することができる。コード配列を送達するのに使用されることのできる遺伝子送達の他の方法としては、例えば、米国特許第5,149,655号明細書に記載される携帯型遺伝子導入パーティクルガンを使用するもの、WO 92/11033に記載されているような導入される遺伝子を活性化するために電離放射線の使用するものなどが挙げられる。
【０１２０】
リポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルの例としては、米国特許第5,422,120号明細書および同第4,762,915明細書、WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445, EP 0524968, Stryer, Biochemistry, 236-240 (1975), W. H. Freeman et al., Biochem Biophys Acta, 600: 1 (1980), Bayer, Biochem Biophys Acta, 550: 464 (1979), Rivnay, Meth Enzymol, 149: 119 (1987), Wang, Proc Natl Acad Sci USA, 84: 7851 (1987), Plant, Anal Biochem, 176: 420 (1989)などに記載されるものが挙げられる。
【０１２１】
本発明は、ガンなどの悪性腫瘍を含む腫瘍、アレルギー性疾患、炎症、免疫異常、活性化リンパ球（特には活性化Ｔ細胞が挙げられ、また活性化Ｂ細胞を含んでいてもよい) を含む自己免疫疾患などの疾患や病気に悩む哺乳動物を、ガレクチン９改変体またはガレクチン９改変体由来治療剤（例えば、治療活性成分としてガレクチン９改変体ポリペプチドもしくは哺乳動物における発現のためのガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどを含む組成物)の投与により処置する方法を開示するものである。本発明の方法および組成物により処置されることのできる自己免疫疾患としては、任意の自己免疫疾患または移植拒絶（例えば、本明細書中に列挙される自己免疫疾患を含むが、それらに限定されない) が挙げられる。
【０１２２】
ガレクチン９改変体は、例えば、組換え技術で発現されたポリペプチド、またはガレクチン９改変体ポリペプチドの改変体、その誘導体、もしくはその融合タンパク質として投与されることができ、哺乳動物に局所的または全身的な形態のいずれかにより送達されることができるものである。ガレクチン９改変体、ガレクチン９改変体の誘導体もしくは改変体、またはガレクチン９改変体融合体をコードする核酸(DNA、RNAなど)は、遺伝子治療プロトコルにおいて、哺乳動物における発現のための調節領域を含むネイキッドプラスミドDNAとして、または哺乳動物における発現のためのウイルスベクターで投与されることができる。発現のためのガレクチン９改変体ポリペプチドの送達は、送達を容易になし得るような薬学的に許容される担体を用いて達成することができる。自己免疫疾患を有する哺乳動物をガレクチン９改変体由来治療剤で処置して、自己免疫疾患の改善もしくは寛解、または自己免疫に起因する臨床徴候が無くなるようにできる。
【０１２３】
本発明は、本発明に開示のものがどのように働くかという理論に限定されないが、自己認識を引き起こし、続いて自己免疫を傷害する活性化Ｔ細胞などによりそれが決定されよう。ガレクチン９改変体を発現するか、もしくはガレクチン９改変体を発現させることにより、またはガレクチン９改変体由来治療剤を投与することにより、問題の活性化リンパ球は、利用可能にされているガレクチン９改変体の影響を受けて、優先的に標的化されアポトーシスを受ける。ガレクチン９改変体ポリペプチドまたはガレクチン９改変体由来治療剤は、自己免疫を示している領域（例えば、治療がなされている特定の自己免疫疾患を特徴付けているような局在領域) に投与されることができる。これにより、投与されたガレクチン９改変体、さらにはその他の治療剤と、その領域の細胞で発現されている標的物を有している活性化Ｔ細胞などとの間の接触が最適化される。従って、該領域の細胞は、遺伝子送達ビヒクルの助けをかりて、該領域に投与されたガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するにあたっての良好な候補であるのである。かくして、本発明を種々に変更したり、適用して、ガレクチン９改変体ポリペプチドを発現するように操作されて、活性化Ｔ細胞などによる攻撃下にある細胞において発現がなされるようにすることができる。移植拒絶の場合には、多くの細胞タイプの細胞表面上でユビキタスに発現されるタンパク質を結合することのできる分子の結合部と融合しているガレクチン９改変体ポリペプチドが挙げられる。該結合部分は、例えば、ヘパリンであってもよいし、そして結合する細胞表面上の分子は、グリコサミノグリカンであってもよい。また該結合部分は、任意の選択された細胞表面抗原に特異的な単鎖抗体の結合ドメインであることもできる。
【０１２４】
本発明に関し、ガンなどの悪性腫瘍細胞を含む腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を得たり、抗アレルギー作用を得たり、抗炎症作用を得たり、免疫異常を正常化せしめたり、活性化リンパ球（特には活性化Ｔ細胞を含んでいてもよい) に対してアポトーシスを誘導せしめる場合も、上記自己免疫の場合と同様に理解されるべきである。
【０１２５】
本明細書中で使用する「投与」または「投与する」とは、治療剤または治療剤の配合物を哺乳動物に送達するプロセスをいう。投与プロセスは、治療剤（単数または複数の治療剤) および所望の効果により変えることができる。投与は、例えば、非経口的送達または経口的送達など、治療剤に適した任意の手段により達成することができる。非経口的送達としては、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内送達、器官組織への注射、粘膜、肺、局所的、またはカテーテルによる送達などが挙げられる。経口的手段は口を経由してなされるものであり、例えば、錠剤またはその他の胃腸経由の送達手段（飲用可能な液体を含む) を使用するなどして行われる。粘膜経由の送達としては、例えば、鼻腔内送達などが挙げられる。肺経由の送達としては、薬剤の吸入させることであってよい。投与は、一般的に、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライドコンジュゲート、リポソーム、リピッドなど) を用いた送達によりなされてよい。遺伝子治療プロトコルとは、哺乳動物において転写物またはポリペプチドとして発現された場合に治療目的を達成することができるといったポリヌクレオチドを治療剤として投与しているものと考えてよい場合を包含するものであり、そこでは非経口的送達手段および経口的送達手段のいずれをも適用されることができる。このような投与手段は、処置される疾患に適しているように選択される。例えば、疾患が器官ベースである場合、送達は局所的であることができ、例えば、疾患が全身的である場合、送達は全身的であってよい。併用投与とは、ある患者に加えられている治療において１つあるいはそれ以上の治療剤を投与することをいっている。治療剤は、同じ薬学的担体を用いて投与されることができるし、または異なる担体を用いて投与されることもできる。それらは、同じまたは異なる投与手段により投与されることもできる。薬剤は、同じ型の薬剤であっても、または異なる型の薬剤であってよく、例えば、異なる型としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または低分子のものが挙げられる。投与時間は、正確に同じ時間であってもよいし、１つの治療剤は、別の薬剤の前または後に投与されてもよい。従って、併用投与は、同時であってもよいし、連続的であってもよい。治療剤を所定の組合せとするための正確なプロトコルは、薬剤およびその他の考慮の中で処置される状態を考慮して決定される。
【０１２６】
用語「インビボ投与」とは、哺乳動物における発現のため、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを患者（例えば、哺乳動物) に投与することをいう。特に、直接的なインビボ投与としては、細胞を哺乳動物から取り出すことなく、哺乳動物細胞をコード配列でトランスフェクトすることが挙げられる。従って、直接的インビボ投与としては、患者細胞で発現が生ずるように、自己免疫疾患に悩む領域に目的のポリペプチドをコードするDNAを直接注射することが挙げられる。
【０１２７】
用語「エクスビボ投与」とは、細胞を患者（例えば、哺乳動物) から取り出した後、細胞（例えば、自己免疫攻撃下にある細胞集団に由来する細胞) をトランスフェクト処理することをいう。トランスフェクション後、細胞は哺乳動物に戻される。エクスビボ投与は、細胞を哺乳動物から取り出し、必要に応じて形質転換されるべき細胞（すなわち、自己免疫機構による攻撃下の細胞) を選択し、選択された細胞を複製不可能にし、選択された細胞を発現のための遺伝子（すなわち、ガレクチン９改変体) をコードするポリヌクレオチド（発現を容易にするための調節領域をも含んでいるもの) で形質転換し、ガレクチン９改変体発現のために形質転換された細胞を患者に戻すことにより達成される。
【０１２８】
治療的に有効な量としては、所望の治療結果を生じるような量のことをいう。例えば、所望の治療効果が自己免疫からの寛解である場合、治療的に有効な量とは、寛解を容易にするような量をさす。治療的に有用な量とは、例えば、数日または数週間の投与を含むような投薬プロトコルにおいて投与されるような量であってよい。治療効果が、例えば、自己免疫疾患の徴候が出現している間に、哺乳動物の自己免疫応答の影響を低減せしめるものである場合、哺乳動物においてこれを達成するための薬剤の有効量とは、自己免疫の徴候の低減をもたらすような量をいう。
【０１２９】
用語「薬学的に許容される担体」とは、治療剤（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子、ペプチド性物質、ペプチドなど) を投与するための担体を指しており、それ自体が組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導せず、そして問題とされるような毒性がなくてそれを投与することができるような任意の薬学的に許容される担体をいう。本発明の別の態様では、薬学的に許容される担体または希釈剤と組合せて上記のような組換えウイルスベクターを含んでいる薬学的組成物が提供される。このような薬学的組成物は、液体溶液の形態のものであってよく、投与前に溶液に懸濁されることのできるような固体形態（例えば、凍結乾燥された固体) のものとして調製されていてよい。さらに、組成物は、表面へ投与したり、注射したり、経口投与したり、直腸投与したりするのに適した担体または希釈剤を用いて調製されることができる。薬学的に許容される担体または希釈剤は、使用される投与量および濃度でそれを受け取る者に対して実質的に無毒であるものである。注射可能な溶液のための担体または希釈剤の代表的な例としては、水、等張生理食塩水溶液（好ましくは、生理学的pHに緩衝化されているもので、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水などが挙げられる) 、マンニトール、デキストロース、グリセロール、エタノール、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなど) が挙げられる。特に好ましい組成物としては、10mg/mlマンニトール、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、および150mM NaCl中にベクターまたは組換えウイルスを含むものが挙げられる。この場合、組換えベクターは約１mgの物質を示すものであってよく、高分子物質が１％未満で、総物質量（水を含む) の1/100,000未満であってよい。この組成物は、少なくとも６ヶ月間約20℃で安定である。
【０１３０】
本発明の薬学的組成物は、細胞分裂を刺激する因子を含んでいてよく、よってリコンビナントレトロウイルスベクターを取込んだり、組込むことを刺激する因子を含んでいてよい。組換えウイルスの保存法は、米国特許第5,792,643号明細書に記載されているものを参照できる。
【０１３１】
本発明で提供される治療法を遂行するための治療剤の全ては、治療薬用の薬学的に許容される担体を含んでいる適切な薬学的組成物に入れることができる。治療薬のための薬学担体は、同じものであってもよく、またそれぞれの治療薬で異なっていてもよい。適した担体としては、大きくてゆっくりと代謝される巨大分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、粒子中の不活性ウイルスなど) であってよい。このような担体は、当業者に周知である。
【０１３２】
薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など)；有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など))が挙げられ、それらは該組成物に入れられて使用されることができる。薬学的に許容される賦形剤については、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J., USA, 1991)を参照できる。治療組成物中の薬学的に許容される担体としては、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの液体が挙げられる。助剤としては、例えば、湿潤剤、乳化剤などが挙げられ、pH緩衝化物質などをこのようなビヒクル中に入れてあることもできる。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして注射可能なように調製される；注射前に液体ビヒクルを使用して液体または懸濁物とされるのに適した固体形態のものもそれを調製することができる。薬学的に許容される担体の定義内にはリポソームも含まれる。
【０１３３】
薬学的に許容される担体または希釈剤と組合せて、組換えレトロウイルスまたは上記のベクター構築物のうちの１つを有するウイルスを含んでいる薬学的組成物も提供できる。該組成物は、液体溶液または投与前に溶液に懸濁される固体形態のもの（例えば、凍結乾燥されたもの) のいずれかとして調製することができる。さらに、該組成物は、表面に投与したり、注射したり、経口投与したり、直腸投与したりするのに適した担体または希釈剤を用いて調製することもできる。
薬学的に許容される担体または希釈剤としては、使用される投与量および濃度でそれを受け取る者（レピシエント）に対して無毒であるものである。注射可能な溶液のための担体または希釈剤の代表的な例としては、水、等張生理食塩水溶液（好ましくは、生理学的pHで緩衝化されているものが挙げられ、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、Tris緩衝生理食塩水などである) 、マンニトール、デキストロース、グリセロール、エタノール、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン) などが挙げられる。ベクターまたは組換えウイルスは、10mg/mlマンニトール、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、および150mM NaClを含有しているといった薬学的組成物に入れて送達することができる。この場合、組換えベクターは約1gの物質であって、高分子物質の１％未満で、総物質量（水を含む) の1/100,000未満であってよい。該組成物は、少なくとも６ヶ月間20℃で安定であろう。
【０１３４】
薬学的に許容される担体または希釈剤は、液体溶液または投与前に溶液に懸濁することのできる固体形態のもの（例えば、凍結乾燥されたもの) のいずれかの形態の組成物とすることができるように遺伝子送達ビヒクルと組み合わされることができる。２つ以上の遺伝子送達ビヒクルは、代表的には、伝統的な直接の経路（例えば、頬／舌下、直腸、経口、経鼻、局所（例えば、経皮および眼など) 、膣、肺、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼内、鼻腔内、または静脈内) を介して、あるいは間接的に投与されることができる。
【０１３５】
本発明の治療薬は、任意に、例えば、哺乳動物における発現のためのポリヌクレオチドを含んでいてよく, 該治療薬は、当該分野で公知の方法に従って腸溶性錠剤やカプセル剤などに製剤化されることができる。これらは、以下の特許：例えば、米国特許第4,853,230号明細書、EP 225,189、AU 9,224,296、AU 9,230,801、およびWO 92144,52などを参照することができる。このようなカプセルは、経口的に投与されて、腸を標的とすることができる。経口投与後１〜４日で、例えば、ポリペプチドの発現がなされているか否か、あるいは、例えば、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現阻害が起こっているか否かを、当該タンパク質に対する抗体を使用することなどにより血漿および血液を測定して決定することができる。
【０１３６】
遺伝子送達ビヒクルは、例えば、米国特許第4,411,648号明細書、同第5,222,936号明細書、同第5,286,254号明細書、WO 94/05369などに記載されるように、例えば、注射、パーティクルガン、局所的投与、非経口投与、吸入、またはイオン導入送達などにより哺乳動物に導入されることができる。
【０１３７】
治療組成物または治療剤は、ガンなどの悪性腫瘍を含む腫瘍、アレルギー症、炎症、免疫異常、自己免疫疾患を改善することができるような他の治療剤、あるいはガレクチン９改変体治療剤の投与で得られる治療上の利益を増強することができるような他の治療剤と共に投与されてもよい。例えば、アレルギー反応を治療するための投与の場合、粘膜、鼻、気管支、肺などの組織に存在する細胞で発現するようにガレクチン９改変体ポリヌクレオチドのエアロゾルを投与してもよく、有利には、例えば、アレルギー反応が静まるまでの間、毎日数回、鼻用スプレーまたはエアロゾルスプレーによって反復投与することもできる。
【０１３８】
遺伝子送達ビヒクルは、哺乳動物の単一部位または複数部位に直接的に投与することができ、例えば、直接注射により投与することができる。遺伝子送達ビヒクルは、エクスビボにより形質導入された標的細胞を使用して投与されることもできる。本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルの投与に適切な薬学的組成物（例えば、種々の賦形剤を含む) を提供する。
【０１３９】
ガレクチン９改変体ポリペプチド、その改変体 、誘導体、アナログ、変異体、あるいはキメラの発現を指示するベクター構築物を、ガンなどの悪性腫瘍を含む腫瘍部位、アレルギーを示す部位、炎症部位、免疫異常を示す部位、自己免疫を示す部位（例えば、膵臓、腎臓、肝臓、関節、脳、脊髄液、皮膚、あるいは身体の他の領域もしくは器官) に直接的に投与することができる。ベクター構築物を直接的に投与するために、本発明の範囲内で種々の方法を使用することができる。例えば、ある領域のために働いている動脈が同定されたなら、ベクターを当該部位に直接的に送達するためにこのような動脈に注射することができる。同様に、例えば、ベクター構築物を含んでいる局所用薬剤組成物を適用することにより、ベクター構築物を皮膚表面に直接的に投与することができる。
【０１４０】
直接投与において、ガレクチン９改変体治療剤およびその他の抗自己免疫薬剤を含んでいる配合治療剤を一緒に投与することができる。併用投与はそれを同時になすことができ、例えば、同じベクター中に薬剤をコードするポリヌクレオチドを置いたり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、その他の薬物であるか否かを問わず、薬剤を同じ薬剤組成物中に入れたり、あるいはほぼ同じ時間に、ほぼ同じ位置に注射することができる別々の薬剤組成物の中に薬剤を入れてそれを投与することにより達成することができる。併用投与を同時に行わない場合（例えば、プロドラッグアクチベーターを投与した後にプロドラッグを投与するような場合) 、第２番目の薬剤は、治療目的に適したように、直接注射により投与してよい。従って、例えば、プロドラッグを投与するような場合、プロドラッグはプロドラッグアクチベーターと同じ部位に投与されよう。よって、併用投与プロトコルとしては、治療目的を達成するための投与の組み合わせを含んでいてよい。さらに、併用投与は、必要な場合、後から投与することを含んでいてよい（例えば、ガレクチン９改変体をインビボで直接注射して投与する処理を反復するといったようなものが挙げられる) 。
【０１４１】
本発明においては、取り出された細胞は、同じ動物あるいは別の同種異系の動物もしくは哺乳動物に戻すことができるということは理解されるべきである。このような場合、一般的には、組織適合性がその動物で合致していることが好ましい（必ずしもそうとは限らないが、例えば、Yamamoto et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 7: 911-922 (1991); Yamamoto et al., Journal of Virology, 67: 601-605 (1993) 参照) 。
【０１４２】
患者の種々の部位から細胞を取り出すことができる。さらに、本発明の他の実施態様では、例えば、皮膚由来の細胞（皮膚繊維芽細胞など) または血液由来の細胞（例えば、末梢血白血球など) にベクター構築物を入れることができる。所望であれば、細胞の特定の画分（例えば、Ｔ細胞部分集合または幹細胞など) を血液から特異的に取り出すことができる（例えば、WO 91/16116参照) 。次いで、任意の上記の技術を利用して取り出された細胞とベクター構築物とを接触せしめ、続いてその細胞を温血動物に（好ましくは、自己免疫を示す領域の付近へまたは付近内に) 戻すことができる。
【０１４３】
一旦、例えば、哺乳動物などの患者について診断がなされれば、ガレクチン９改変体治療剤を与えたり、処置される特定の疾患・病気（例えば、腫瘍、アレルギー、自己免疫疾患など）に適した手法および用量でそれを哺乳動物に投与したり、治療剤の連続投与または投与の修正につきその必要性を決定するために哺乳動物はモニターされるなどといったことを含めた本発明の実施がなされる。本発明において実施とは、処置される疾患を同定し、標的遺伝子治療を適用することが可能な有望細胞型または身体領域を決定することからなっていてもよい。ガレクチン９改変体ポリヌクレオチド（哺乳動物における発現のための調節領域を有するプラスミド、または発現のためのウイルスベクターを含んでいてよい) を構築し、いくつかの哺乳動物細胞を取り出し、ガレクチン９改変体をコードするポリヌクレオチドでもってトランスフェクト処理され、そしてガレクチン９改変体発現のために哺乳動物に入れることがなされる。あるいは、ポリヌクレオチドは、例えば、疾患が明白な領域において発現するよう、哺乳動物に投与することができる。
【０１４４】
従って、例えば、悪性腫瘍細胞の場合、ガレクチン９改変体を用いてインビボあるいはエキソビボで患部組織又は臓器などの当該腫瘍細胞をトランスフェクト処理することができる。また、例えば、慢性関節炎リウマチの場合、ガレクチン９改変体を用いてエキソビボで関節液から得られた細胞をトランスフェクトすることができる。
【０１４５】
例えば、多発性硬化症処置において、影響を受ける脳領域へガレクチン９改変体を注射することができるし、自己免疫反応型の活性化Ｔ細胞などの攻撃下にある細胞でのガレクチン９改変体発現を容易にするようにすることもできる。また、一例として、多発性硬化症の場合、ガレクチン９改変体DNAは哺乳動物脳に局所的に注射することができ、脊髄液に由来する細胞を取り出し、それをガレクチン９改変体DNAでトランスフェクト処理し、脊髄領域に戻すことができる。さらに別の例としては、シェーグレン症候群を有する哺乳動物を処置するために、この疾患の標的器官として、注射によるガレクチン９改変体ポリペプチド投与に適したものが選択されてよい。また、シェーグレン症候群を患う哺乳動物に関し、罹患器官（例えば、腎臓など) を同定し、ガレクチン９改変体DNAを該器官に直接投与することもできるし、さらに器官に由来する細胞を取り出し、トランスフェクト処理され、次に哺乳動物のそれらの細胞でガレクチン９改変体が発現するように身体に戻すことができる。
【０１４６】
例えば、移植拒絶を予防する場合、移植を受ける動物は、外来の細胞、外来の組織、または外来の器官を攻撃するような活性化患者細胞を殺すため、ガレクチン９改変体治療剤を局在的もしくは全身的に投与されることができるし、患者身体内で器官を一旦保護するために、移植の直前に器官外表面上の細胞においてガレクチン９改変体ポリペプチドが発現するようにすることもできる。移植を受けた者の免疫系が外来細胞、外来組織、または外来器官に順応するまでの間、ガレクチン９改変体治療剤を連続して投与することが必要とされるであろう。
ガレクチン９改変体治療剤は、天然のガレクチン９に類似して作用することが期待される。従って、アポトーシス反応を引き起こすためにそれを使用することができる。従って、臨床医は、アポトーシスを達成するために、発現されるかさもなければ哺乳動物に投与される必要があるガレクチン９改変体の量を化学量論的に知ることができよう。本発明の他の態様では、本明細書中で開示されるベクター構築物は、さらなる非ベクター由来遺伝子の発現を指示することもできる。例えば、ガレクチン９改変体を投与すると共に適用されるプロドラッグ系は、遺伝子治療のための安全な機構として作用するし、併用治療剤として作用することもできる。
【０１４７】
プロドラッグアクチベーターをガレクチン９改変体と共にベクターにおいて発現させて、安全な機構を確保したものであってもよい。該活性化系が止められるべきと決定されると、プロドラッグが投与され、当該プロドラッグアクチベーターを活性化せしめる。こうした処置により、臨床医に遺伝子治療している間の制御手段を与えることになる。プロドラッグアクチベーター／プロドラッグ系は、哺乳動物（そこでは、例えば、自己免疫がガレクチン９改変体発現により悪化せしめられているような場合) においてトランスフェクト細胞を不活化するために有用である。プロドラッグアクチベーター／プロドラッグ系は、該系により提供されるプロドラッグ活性化を用いての細胞傷害作用をなすように、組合せ治療をしたり、治療剤に併用投与したりして使うことができる。
【０１４８】
プロドラッグアクチベーターおよびプロドラッグと共に、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む治療は免疫調節性のものであってよい。免疫調節性とは、性質または効力が因子の非存在下で起こった免疫応答とは異なる免疫応答を引き起こす因子の使用を指すもので、該因子は免疫応答に関与する１つ以上の細胞により製造されものであっても、細胞に外因的に添加されものであってよい。応答の性質または効力は、当業者に公知の種々のアッセイ（例えば、細胞増殖（例えば、3Hチミジンの取り込み) を測定するインビトロアッセイおよびインビトロ細胞傷害アッセイ（例えば、51Cr放出を測定する) を含む) により測定することができる（Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses, 7: 645-655 (1991) 参照) 。免疫調節因子としては、インビボおよびエキソビボの両方で活性であるものである。このような因子の代表的な例は、サイトカイン（例えば、インターロイキン2, 4, 6, 12および15)、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、GM-CSF、G-CSF、ならびに腫瘍壊死因子(TNF)などが挙げられる。他の免疫調節因子としては、例えば、CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHCクラスＩ分子, MHCクラスII分子、β2-マクログロブリン、シャペロン、そのアナログなどが挙げられる。しかし、遺伝子送達ビヒクルが、サイトカインである免疫調節補因子を発現しない場合、このサイトカインは上記の組成物中に含まれていてよいし、上記の組成物とは別々に（同時にまたは後で) 投与することができる。要するに、このような実施態様では、免疫調節補因子は、好ましくは、当該分野で知られている標準的なプロトコルおよび投与量に従って投与される。例えば、αインターフェロンは、２〜４ヶ月間、100〜500万単位/日の投与量で投与されることができ、そしてIL-2は、２〜12週間、１〜３回/日、10,000〜100,000単位/kg体重の投与量で投与することができる。γインターフェロンは、例えば、ガレクチン９改変体投与でより効果的な治療を達成するために、活性化Ｔ細胞において問題遺伝子の発現をアップレギュレートするために２〜12週間、２〜３回/週、150,000〜1,500,000単位の投与量で投与することができる。
【０１４９】
併用治療剤においては、プロドラッグアクチベーターは、そのためのベクターから発現することもできるし、ガレクチン９改変体ポリペプチドと同じベクターから発現することもできる。いずれかのベクター系（単一ベクターまたは２つのベクター) を、インビボまたはエキソビボ手段により投与することができる。自己免疫治療において、例えば、プロドラッグアクチベーターの添加は、ガレクチン９改変体により達成される効果を支持する免疫調節効果をさらに促進し、そしてさらにプロドラッグ添加は、トランスフェクト細胞の殺傷を活性化することができる。
【０１５０】
シャペロン分子は、ポリヌクレオチド治療薬の投与前、投与と同時に、または投与後に投与されることができ、そしてシャペロン分子は、例えば、熱ショックタンパク質（例えば、hsp70) であってよい。さらに、哺乳動物において発現されるポリヌクレオチドは、例えば、所望の標的細胞だけのポリヌクレオチド発現を確実にする目的のための、誘導プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター) に連結することができる。さらに、ポリヌクレオチドを組織に効果的に送達する目的のために、ポリヌクレオチドは、その組織の細胞ゲノムへの組込みに適したヌクレオチド配列に隣接していることができる。
【０１５１】
本発明のこの態様のためにおよび多くの態様のために、ヒトを処置する有効性は、所定の自己免疫疾患の動物モデルにおいて最初に試験することができる。このような現存する動物モデルとしては、例えば、シェーグレン症候群（自己免疫涙腺炎または免疫媒介唾液腺炎) 、自己免疫心筋炎、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、炎症性心疾患、水銀誘導性腎臓自己免疫、インスリン依存性糖尿病（I型糖尿病またはIDD) 、胸腺摘出後自己免疫、中枢神経系(CNS)脱髄障害、CNS狼瘡、ナルコレプシー、重症筋無力症（MG) 、グレーヴズ病、免疫媒介PNS障害、変形性関節症、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎、髄質嚢胞性線維症、自己免疫溶血性疾患、自己免疫脈管炎、卵巣自己免疫疾患、およびヒト強皮症(schleroderma)などをふくむ自己免疫疾患の動物モデルが挙げられる。
【０１５２】
複数の遺伝子送達ビヒクルを、動物または植物に投与することができる。好ましい実施態様において、動物は温血動物であり、さらに好ましくは、マウス、ニワトリ、ウシ、ブタ、ペット（例えば、ネコおよびイヌ) 、ウマ、およびヒトからなる群より選択される。ポリペプチド治療薬（例えば、ガレクチン９改変体または他のサイトカイン) について、投与量は、約５〜50μg/kg哺乳動物体重、また約50μg/kg〜約５mg/kg、また約100〜500μg/kg哺乳動物体重、および約200〜約250μg/kgの範囲であってよい。
【０１５３】
ポリペプチド治療薬（例えば、天然または変異体のガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなど) 関しては、組織を標的とした投与では、患者（例えば、哺乳動物) におけるポリヌクレオチド発現に応じて、コード配列または非コード配列の発現可能構築物を含むベクターを次のように投与できる: 局所的投与の遺伝子治療プロトコルでは、約100ng〜約200mg DNA、あるいは約500ng〜約50mg DNA、または約１μg〜約2mg DNA、あるいは約５μg DNA 〜約500μg DNA 、そして遺伝子治療プロトコルにおける局所投与の間では、約20μg 〜約100μg の範囲、そして例えば、注射あたりまたは投与あたり約500μg の用量で投与することができる。より多くの発現が所望される場合では、組織のより広い領域にわたって、より多くの量のDNAまたは同じ量のDNAが連続投与プロトコルに従い再投与されようし、例えば、腫瘍部位の異なる近接または密接した組織部分へいくつか投与され、そうしたことは陽性の治療結果をもたらすために必要とされよう。
【０１５４】
低分子治療薬の投与について、低分子の効力に応じて、投与量を変えることができる。非常に強力なインヒビターでは、その投与量は、哺乳動物キログラムあたりの量で示せば、例えば、約１μg/kg〜約500mg/kg、あるいは約100μg/kg〜約5mg/kg、又は約１μg/kg〜約50μg/kg、あるいは例えば、約10μg/kgの範囲で十分である。ペプチドおよびペプトイドの投与では、効力はまた投与量により変わり、約１μg/kg〜約500mg/kg哺乳動物体重、および約100μg/kg〜約５mg/kg、および約１μg/kg〜約50μg/kgの範囲であってよい。そして通常の用量は約10μg/kgであってよい。
【０１５５】
本発明の活性成分は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
【０１５６】
医薬品製造にあたっては、その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十四改正  日本薬局方解説書、平成13年６月27日発行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬  尚  他編  医薬品の開発12巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２年10月15日発行、株式会社廣川書店；同、医薬品の開発12巻（製剤素材〔II〕）平成２年10月28日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して適用することができる。
【０１５７】
本発明の活性成分は、本明細書で説明している、(a) ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチドなど、(b) ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、(c) ガレクチン９改変体技術を利用して見出された因子など、(d) ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチド遺伝子送達ビヒクルなどが挙げられ、それらはヒトガレクチン９が正常細胞には傷害活性を示さず、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すという性状、腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するが、正常細胞にはアポトーシスを誘導しないという性状、悪性細胞の転移性を抑制するという性状、活性化された免疫細胞、特には活性化したCD4陽性T細胞のアポトーシスを誘導する活性（これに対しレスティングT細胞、特にCD4陽性T細胞（ヘルパーT細胞）のアポトーシス誘導はそれを誘導しないという性状）などを利用する上で有用であり、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤、副腎皮質ステロイドホルモンと同様な活性を利用する薬剤として有望である。
【０１５８】
本発明の活性成分、例えば、ガレクチン９改変体（特にはG9NC(null)）を使用して確認された生物活性効果より、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体（特にはG9NC(null)）は、次に示すような病的症状並びに疾患に対して有用な生物活性を示すと考えられる。
【０１５９】
炎症性疾患には、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等がある。
【０１６０】
急性および慢性疾患としては、肺炎では、例えば、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎や急性縦隔炎などが挙げられ、さらにその他の臓器の炎症、例えば、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎などの種々の急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、また急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症などや、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、種々の中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸など、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎など、種々様々な炎症が含まれる。
【０１６１】
また神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）にも効果が認められている。例えば、実施例８により、ガレクチン9がカプサイシン誘導神経性皮膚炎症モデルにおいて、その炎症反応に対する強い抑制効果が認められた。カプサイシンは末梢神経を刺激することにより、神経性炎症や痛みを引き起こす物質である。カプサイシンは、知覚神経C線維末端に貯蔵されている神経ペプチドであるサブスタンスPの遊離刺激作用を有する。サブスタンスPは肥満細胞からヒスタミンを遊離させる作用を有し、その結果血管が拡張され、浮腫が生じる。また、遊離されたヒスタミンにより知覚神経が刺激を受け、C線維末端からサブスタンスPが放出され、その周囲の肥満細胞に作用し、更にヒスタミンを遊離させるという増強サイクルが成立する。ガレクチンはこの病態形成の抑制作用を有する。
【０１６２】
さらに、カプサイシンは、感覚神経終末の痛み受容センサーであるカプサイシン受容体（バニロイドレセプター）に結合し、痛みを引き起こす。痛みは化学的刺激（酸など）、熱刺激（熱湯など）や過剰な機械的刺激（打撲など）によって感覚神経終末が活性化されることによって引き起こされ、カプサイシン受容体はこのような刺激による痛みにも関与している。そこで、ガレクチン9がカプサイシン受容体による神経終末の活性化を抑制することが示唆され、ガンや炎症に伴う痛みの軽減等、鎮痛作用への可能性も期待できる。
【０１６３】
アレルギー性炎症疾患には、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等が挙げられる。
【０１６４】
また、自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）には、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、グッドパスチャー症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等がある。
【０１６５】
感染症は、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患の総称である。なお、感染症については、監修：町並陸生、編集：秦順一、坂本穆彦、「標準病理学（第2版）」、医学書院、2002年3月15日発行を参考にすることができる。ヒトに感染症をもたらす病原体には、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物がある。各病原体がもたらす主な疾患には、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）が挙げられる。
【０１６６】
ガンおよび肉腫については、脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞ガン、膵液腺ガン、歯肉ガン、舌ガン、口唇ガン、上咽頭ガン、中咽頭ガン、下咽頭ガン、喉頭ガン、甲状腺ガン、副甲状腺ガン、肺ガン、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道ガン、胃ガン、大腸ガン、胆管ガン、胆嚢ガン、膵臓ガン、肝ガン、腎臓のガン、膀胱ガン、前立腺ガン、陰茎ガン、精巣腫瘍、副腎のガン、子宮頸ガン、子宮体ガン、膣ガン、外陰ガン、卵巣ガン、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳ガン、皮膚ガン、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどが挙げられる。
【０１６７】
皮膚科領域にも適用でき、例えば、1)皮膚疾患には、感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症がある。また、2)美容皮膚科関連としては、
a)メラニン代謝調節（美白）・・・ガレクチン９遺伝子導入メラノーマ細胞は黒色調から白色に変化。皮膚基底細胞層にガレクチン９陽性細胞あり。
b)毛髪成長（発毛）の調節・・・毛根部にガレクチン９発現あり、時期的に異なる。ガレクチン９遺伝子導入マウスの毛髪の成長はミュータントガレクチン９遺伝子導入マウスに比して極めて良好。
ｃ)コラーゲン産生調節など・・・線維芽細胞は種々の刺激にてガレクチン９発現、線維結合織にガレクチン９陽性の部分あり。
【０１６８】
生活習慣病については、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などが挙げられる。生活習慣病動脈硬化症の病態形成に関与する細胞の一つである泡沫細胞にgal9陽性細胞と陰性細胞が存在することが明らかになった。このことより動脈硬化症の病態にはgal9の関与が示唆され、それを制御することで治療や予防することが可能となることが否定できない。高血圧では動物実験モデルにて高血圧発症の際にガレクチン９が尿細管や糸球体の発現が増強することからガレクチン９発現を制御したり、ガレクチン９を投与することによって治療できる可能性が高い。
【０１６９】
また、正常細菌叢の維持にも適用でき、例えば、gal9は腸管の上皮に正常においても強く発現されており、また悪玉細菌叢を投与した際には、腸管上皮及びマクロファージなどの炎症細胞におけるガレクチン９の発現が増強する。このことから消化管における正常細菌叢の維持にガレクチン９が関与していることが強く示唆される。
【０１７０】
さらに、アミロイドーシスに適用でき、例えば、アミロイドーシスを認める部分でのマクロファージでは、ガレクチン９発現を示すマクロファージの存在がある。ガレクチン９によってアミロイド沈着を制御できる可能性がある。
【０１７１】
アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などにも有用と考えられ、例えば、アルツハイマー病患者の脳において変性した神経細胞はガレクチン９陽性所見を示す。よって、治療および診断に用いることが出来る可能性がある。また、骨粗鬆症では、ガレクチン９には、骨吸収は抑制し骨形成は促進する可能性が考えられる。このような作用は、骨代謝の面から考えると理想的な薬剤と考えられる。
【０１７２】
また、脳、神経領域においても有用で、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展は、炎症細胞の湿潤を伴い、スーパーオキサイド産生等が起こり、悪化する。その炎症をガレクチン９並びにガレクチン９改変体が制御することが期待できる。炎症、免疫系の変化が原因となる脱骨髄性疾患として、例えば多発性硬化症などがある。変性疾患として、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病なども挙げられる。また、統合失調症は何らかの炎症性の変化が原因と言われている。すなわち、EPA（エイコサペンタエン酸）は脳で炎症反応の制御や神経細胞膜の形成に用いられる。統合失調症患者では細胞膜中のEPAやその他の必須脂肪酸が枯渇していることを示す研究例がある。
【０１７３】
痛風に対してもガレクチン９並びにガレクチン９改変体が有用と期待できる。尿酸結晶の組織沈着に対する痛みの強い急性炎症に対してもガレクチン９並びにガレクチン９改変体がそれを制御することが期待できる。
【０１７４】
喘息は可逆性の気道閉塞（喘息発作）を来たす呼吸器疾患で、抗原特異的（アレルゲン）あるいは非特異的（感染、冷気など）な刺激に対する気道の反応性が亢進している状態を指している。近年、喘息の気道には発作のない安定期にも好酸球、Ｔリンパ球、及び肥満細胞を主体とした炎症が存在することが証明され、現在、喘息の本体は慢性の気管支炎であると考えられている。また、小児喘息の多くはアトピー素因(IgE産生)との関連が強いが（アトピー型喘息）、成人喘息ではIgEの関与が証明できないものが約半数に認められる（非アトピー型喘息）。喘息予防・管理ガイドライン（1998年厚生省研究班）が作成され、喘息治療は急性発作と慢性気道炎症の二つに分けて行われている。発作治療薬としては、気管支拡張薬（β2刺激薬、アミノフィリン）が第一選択薬として用いられているが、中等症以上の発作ではこれらの薬剤では不十分で、ステロイド薬の大量全身投与が行われる。ステロイド薬は副作用が大きく、特に、消化性潰瘍、高血圧、高血糖、精神症状等が重大で、長期に使用すれば、感染症、副腎抑制、骨粗鬆症などが問題となってくる。また、合併症を伴う場合は、ステロイドの使用は危険を伴う。副作用が少なく、ステロイドと同等の効果を持つ薬剤の開発が求められている。長期的な管理薬として慢性気道炎症の治療には抗炎症薬が主体となっているが、なかでも吸入ステロイド薬の使用が推奨されている。該ステロイド薬を長期に大量に使用した場合、副腎抑制、骨粗鬆症、気道感染などの副作用が出現する可能性は否定できない。また、吸入薬は正確な吸入手技が要求され、内服薬に比較してコンプライアンスという点で劣っている。中等症以上の喘息では、吸入ステロイド薬に加えて、吸入β2刺激薬、ロイコトリエン拮抗薬あるいは徐放性テオフィリン薬の併用が推奨されている。重症例ではステロイドの全身投与が余儀なくされている。こうした薬剤に代わる薬剤の開発が求められている。
【０１７５】
喘息の病態形成において、Ｔリンパ球、好酸球の肺組織及び気道への浸潤が重要な役割を果たすことが知られている。一方、ガレクチン９は、細胞のアポトーシスを誘導する機能を有し、活性化Ｔ細胞及び好酸球のアポトーシスを誘導する。こうしたことを踏まえ、本発明でガレクチン９改変体などを使用した研究から、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体が喘息における気道炎症を改善（抑制）する活性を有することが明らかになった。
【０１７６】
さらに、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体は、骨芽細胞増殖と分化の増強及び破骨細胞分化抑制活性を有しており、骨粗鬆症の予防及び／又は治療、ステロイド長期投与で問題となる副作用の一つ、骨生育抑制に対しても有効であると考えられる。
【０１７７】
ガレクチン９並びにガレクチン９改変体は、リンパ球に対する作用においてステロイドとは異なり、活性化リンパ球特異的な抑制作用を示し、ステロイドに比して副作用、例えば、免疫抑制が少ないことが期待できる。また、ステロイドに存在しない接着分子の機能抑制及び神経性炎症の抑制作用も有し、喘息治療、例えば、発作治療薬として有望である。またステロイドの副作用を軽減することも可能と思われる。
【実施例】
【０１７８】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
【０１７９】
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 及び D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); PCR 法を使用する場合には、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
【０１８０】
〔実施例１〕
(A) ガレクチン９改変体発現ベクターの構築
発現ベクターの作製には、
(1) Jurkat細胞のpoly(A)+RNA画分から調製したcDNA
(2) pET-11aベクター（STRATAGENE）
(3) PCR用プライマー：
【０１８１】
G9NCRD1: CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG 配列番号10
G9NCRD6: CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG 配列番号11
G9CCRD5: CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG 配列番号12
G9CCRD6: CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG 配列番号13
を使用した。
【０１８２】
Jurkat細胞（T 細胞由来細胞) は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より入手した。セルラインは、10% FCS を添加したRPMI-1640 培地（Sigma 、セントルイス、米国）中で 5% CO2 の条件下37℃で維持した。Jurkat 細胞からのtotal RNA の抽出は、次のようにして行った。すなわち、10% FBSを含むRPMI-1640培地を用いて培養したJurkat細胞を遠心して集める。10 mlのPBSで細胞を２度洗浄する。洗浄した細胞の沈殿に、細胞2 x 108個あたり15 mlのISOGEN（商品名：ニッポンジーン）を加え、マニュアル（ニッポンジーン）に従ってtotal RNAを抽出する。total RNAからのpoly(A)+RNAの精製とcDNA合成は、次のようにして行った。すなわち、Jurkat細胞から抽出したtotal RNAを、1 mg/mlの濃度になるようDEPC処理水に溶解する。PolyATtract mRNA Isolation System（商品名：Promega）を用い、マニュアルに従ってtotal RNAからpoly(A)+RNAを精製する。精製したpoly(A)+RNAを5 μg/20 μlの濃度になるようDEPC処理水に溶解する。
【０１８３】
First-Strand cDNA Synthesis Kit（商品名：Amersham Biosciences）を用い、マニュアルに従って5μgのpoly(A)+RNAからcDNAを合成する（プライマーにはNot I-d(T)18を使用する）。
【０１８４】
次に、図１に示す手順でpET-11aベクターのNdeI-BamHI siteにガレクチン９のN-末端側糖鎖結合ドメイン（N-terminal carbohydrate recognition domain, NCRD）とC-末端側糖鎖結合ドメイン（CCRD ）を挿入し、リンカーペプチドを欠く改変型ガレクチン９（G9NC(null)）の発現ベクターを作製した。まず、ガレクチン９cDNAからそれぞれ(1) ヒトガレクチン９のC-末端側CRDに対応するcDNAと(2)ヒトガレクチン９のN-末端側CRDに対応するcDNAを取得した。すなわち、cDNAからPCR用プライマー：G9CCRD5 + G9CCRD6を用いてヒトガレクチン９のC-末端側CRDに対応するcDNA（G9CCRD）を増幅した。G9CCRDを制限酵素（NdeI + BamHI）で切断した後、同じ制限酵素で処理したpET-11aベクターに挿入してpET-G9CCRDを得た。PCRは、KOD DNA polymerase kit (TOYOBO Code No.KOD-101)を使用して行った。PCR Reaction mixture（ dNTP mix, 25mM MgCl2, 10×Buffer, KOD DNA polymerase(0.05u), プライマー及び鋳型cDNA）を以下のようなPCRのサイクルの条件で反応させた：94℃で2分処理した後、サイクル（98℃で15秒、次に65℃で2秒、そして74℃で30秒処理）を25回行い、最後に4℃で反応を停止した。PCR増幅された断片のベクターへの挿入は、Ligation high kit(TOYOBO Code No.LGK-101)を使用して行った。反応は、インサート：ベクターのモル比を約5：1で混合し、その総DNA溶液（体積）量の1/2（体積）量の試薬Ligation highを加えて混合して行った。16℃で16時間（O/N）反応させることで挿入した。
【０１８５】
一方、該ガレクチン９cDNAからPCR用プライマー：G9NCRD1 + G9NCRD6を用いてヒトガレクチン９のN-末端側CRDに対応するcDNA（G9NCRD）を増幅した。G9NCRDを制限酵素（NdeI）で切断した後、得られた断片を同じ制限酵素（NdeI）で処理し、さらに脱リン酸化したpET-G9CCRDに挿入してpET-G9NC(null)を得た。PCR増幅並びにベクターへの組み込みは上記と同様にして行った。pET-G9NC(null)は、ヒトのM 型ガレクチン９の第149番目のProから第177番目のSerまでの29個のアミノ酸配列をHis-Met配列に置き換えたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。すなわち、配列番号1で示される塩基配列を持つものであり、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
【０１８６】
(B) ガレクチン９改変体組換え蛋白質の発現及び精製
上記工程(A)で得られた発現用プラスミドベクターpET-G9NC(null)を大腸菌（BL21(DE3)）に導入した。導入は、エレクトロポレーション法により行った。すなわち、competent BL21(DE3)とプラスミドベクター水溶液を混合し、1.8kVの電圧でのエレクトロポレーション法によりトランスフェクションを行った。
【０１８７】
組換え蛋白質の発現は、大腸菌を 2%(w/v)グルコース及び100 μg/mlアンピシリン含有2×YT培地中で培養し、600nm での吸光度が 0.7 に達した時点で0.1 Mイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを添加（最終濃度、0.1 mM）して、組換え蛋白質の発現を誘導して行った。20℃で18時間培養した後、遠心により菌体を集め、10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF に懸濁した。懸濁液を10分間音波処理した後、10%(w/v) Triton X-100 を加え（最終濃度、1% ）4 ℃で30分間撹拌した。15,000×g で30分間遠心し、得られた上清液中の組換えタンパク質を、ラクトース-アガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１８８】
結果、純度の高い標品が比較的高い収率で得られた。得られた組換え蛋白質の電気泳動の結果を図２に示す。SDS-PAGE条件は次の通りである: Gel, Acrylamide-BIS (12% gel),電気泳動用バッファ, 25 mM Tris-192 mM グリシン-0.1% SDS, 泳動条件, 180V, 45 min., 染色, CBB, 60℃/30 min. 電気泳動サンプルは、Strata CleanTM Resin (Stratagene)に吸着させ、1×sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, Ph6.8, 2%(w/v) SDS, 5%(W/V) 2-ME, Glycerol)で0.2 mg/mlに調整し、98℃/3 min.の熱処理後レーンあたり約2μgのタンパク量で電気泳動をした。
【０１８９】
精製されたG9NC(null)は、4℃で９０日間以上安定に保存することができた。一方、野生型のガレクチン９（M-type、G9(M)）は、同じ保存条件で２週間以内に大部分が分解された（図３参照）。この分解は、精製ガレクチン標品に含まれる大腸菌由来のプロテアーゼによるものと考えられる。
【０１９０】
〔実施例２〕
ヒト組織中に存在するプロテアーゼに対する感受性を、野生型のガレクチン９（S-type、G9(S)：最も短いリンカーペプチドを持つアイソフォーム）とG9NC(null) で比較した。PBSに溶解したガレクチンに1/100（重量比）の matrix metalloproteinase-3（MMP-3）あるいはelastaseを加え37℃で保温した。いずれの場合もG9(S)は1〜2時間で大部分が分解されたのに対して、G9NC(null)は2時間後においても全く分解を受けていなかった（図４及び５参照）。
【０１９１】
〔実施例３〕
ガレクチン９の生物活性に与える変異導入の効果を調べるために、MOLT-4細胞（ヒト Tcell leukemia 由来細胞株）に対するアポトーシス誘導活性および末梢血好酸球に対する遊走活性(eosinophil chemoattractant activity、ECA activity)を検討した。
【０１９２】
(a) 細胞培養物
MOLT-4（T 細胞）は、ATCCより入手した。セルラインは、10% FCS を添加したRPMI-1640 培地（Sigma 、セントルイス、米国）中で 5% CO2 の条件下37℃で維持した。Gal-9 の活性を阻害するためには、培養用培地には30mMのラクトースを添加することができる。コントロールとして同じ濃度のスクロースを用いた。
【０１９３】
(b) アポトーシス  アッセイ
(1) PIによる細胞周期(apoptosis) 解析(PI法)
アポトーシス誘導処理された細胞を、４℃５分間1000 rpmで遠心処理した後、細胞ペレットを PBS (300 μl)に再浮遊させ、ボルテックスしながら、細胞浮遊液に100%冷エタノール (700 μl)を徐々に添加して、終濃度70% エタノールとなるようにする。４℃で30分間インキュベート処理して細胞を固定し、次にPBS (1 ml)を加えて４℃５分間1000 rpmで遠心処理した後、細胞ペレットを PBS (440 μl)に再浮遊させる。細胞を2.5 mg/ml のリボヌクレアーゼＡ(10 μl;終濃度50μg/ml, Sigma、セントルイス、ミズリー州、米国）と共に37℃で30分間インキュベーション処理し、次いで2.5 mg/ml のヨウ化プロピジウム(4μl; PI,終濃度20μg/ml, Sigma)と共に４℃10分間暗闇中インキュベーション処理をした。ナイロンメッシュを通して集塊となった細胞を除いたのち、細胞をPBS でメスアップして、染色細胞をフローサイトメトリー（Sandstrom, K. et al., J Immunol Methods, 240: 55 (2000) 及びZhang L. et al., Cancer Lett, 142: 129 (1999))によって解析した。
【０１９４】
(2) TUNEL (TdT-mediated 標識dUTP nick end labeling)法
DNAの断片化によって生じた末端に、DNA末端にヌクレオチドを付加する酵素(TdT; ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ)でもって、ラベルしたヌクレオチド(dUTP-biotinあるいはFITC-dUTPなど)を組み込んで、アポトーシスの顕著な特徴である細胞核DNAの断片化を検出する。実験には、MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct (MBL、名古屋、日本）を使用した。キット業者による指示に従って、実験を次のように行った。すなわち、アポトーシス誘導をした細胞（約２×105 個/サンプル)を0.2% FSA含有PBS で洗い、次に4%パラホルムアルデヒド(0.1 M NaH2PO4, pH7.4 中)を加えて４℃30分間固定化した後、0.2% FSA含有PBS で洗った。細胞ペレットに70% 冷エタノールを添加して−20℃30分間インキュベーション処理し、透過性を亢進せしめた。0.2% FSA含有PBS で洗った後、細胞ペレットにTdT 反応液(TdT、FITC-dUTP 及びTdT バッファの混合物) を加え、撹拌後37℃で１時間インキュベーション処理し、0.2% FSA含有PBS で洗った後0.2% FSA含有PBS に再浮遊させてから、染色細胞をフローサイトメトリーによって解析した。
【０１９５】
(c) T細胞解析
24ウェルプレートを各ウェルあたり３μg/mlの抗CD3抗体 (Immunotech, Marseille、仏国) のTBS 液(pH8.0) で４℃一晩インキュベーション処理した後、抗CD3抗体液を除き、ウェルをPBS で洗滌して、抗CD3抗体でコートしたウェルプレートを得た。
【０１９６】
ヘパリン加血液から単核白血球細胞分画をHISTOPAQUE (登録商標、SIGMA)を使用して単離した。次に、CD4陽性単離キット(CD4-positive isolation kit; DYNAL, Oslo, ノルウェー国) 及びDynabeads（登録商標）M-450 CD8 (DYNAL, Oslo, ノルウェー国）を使用して、キット製造業者が記載しているようにして、CD4陽性T細胞及びCD8 陽性T細胞をそれぞれ単離した。T細胞を活性化するためには、CD4陽性T細胞又はCD8 陽性T細胞を10%FCS含有RPMI-1640に 1×106 個/ml とした細胞を、20〜24時間37℃で抗CD3抗体でコートされたプレート上で5%CO2インキュベーター中インキュベーション処理し、次にリコンビナントガレクチン９（野生型G9(S)あるいは改変体G9NC(null)）と一緒に37℃で5%CO2インキュベーター中インキュベーション処理をした。次に、上記(b)と同様にしてアポトーシス・アッセイを行った。すなわち、細胞を37℃で50μg/mlのPI(Sigma) と共に暗所で10分間インキュベーション処理をした。染色細胞をフローサイトメトリー（Sandstrom, K. et al., J Immunol Methods, 240: 55 (2000) 及びZhang L. et al., Cancer Lett, 142: 129 (1999))によって解析した。
【０１９７】
非活性化（レスティング）T 細胞についても、リコンビナントガレクチン９（野生型G9(S)あるいは改変体G9NC(null)）と一緒に37℃で5%CO2インキュベーター中インキュベーション処理をした後、上記と同様にしてアポトーシス・アッセイを行った。
【０１９８】
(d) 結果
アポトーシスに伴うDNAの断片化をアガロースゲル電気泳動とFACSにより検討した結果、いずれの方法を用いた場合でも、G9NC(null)はG9(S)と同等あるいはそれ以上のアポトーシス誘導活性を保持していることが示された（図６, 表１）。チェンバー法によりECA活性を調べた結果、G9NC(null)はG9(S)と比較してより高い活性を示した（図7）。
【０１９９】
【表１】
0004792390.tif 000002
【０２００】
表１は、野生型ガレクチン９（G9（S）)とガレクチン９改変体(G9NC(null))との間で生物活性を比較した結果を示すもので、MOLT-4細胞に対するアポトーシス誘導活性(FACS分析)を調べたものである。
【０２０１】
〔実施例４〕
〔１．リウマチ（RA）関節滑膜におけるガレクチン-９の発現〕
〔方法〕
患者組織はアメリカリウマチ学会 (ACR)の分類基準を満たすRA患者滑膜組織標本使用した。患者の組織標本の免疫組織染色は以下の方法で行った。標本切片の調製は、次のように行った。(1)脱パラフィン：キシレン3回（各10分），100％アルコール・90％アルコール・75％アルコール（各2分）。(2)マイクロウェーブ(MW)処理：10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)を用時調製する。あらかじめMW照射し沸騰させた緩衝液中に切片を浸し，MW照射する（500w電子レンジの場合5分x3回，計15分）。室温に20分間放置し，ゆっくり冷ます。(3)内因性ペルオキシダーゼの不活化：0.3％過酸化水素・メタノールを用時調製し、30分間浸ける。PBS洗浄  5分x 3回。5％BSAをパスツールピペットで4滴かけてブロッキング。湿潤箱  1時間  室温。
【０２０２】
標本切片の上から一次抗体もしくはコントロール抗体をパスツールで6滴かける。湿潤箱  overnight  4℃。翌日，PBS洗浄  5分x 3回。ペルオキシダーゼ標識二次抗体(DACO Envision+)を6滴かける。湿潤箱  1時間  室温。PBS洗浄  5分x 3回。
【０２０３】
DAB（3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride）試薬による発色：DAB試薬を用時調製する。切片を浸けて3分間発色させる。直ちに水道水で発色反応を止める。核染色  マイヤーヘマトキシリン  20秒。直ちに流水洗浄  15分。脱水，透徹，封入。75％アルコール・90％アルコール・100％アルコール（各2分），キシレン3回（各3分）。
【０２０４】
〔結果〕
結果を図５３に示す。ガレクチン-９は滑膜細胞およびリンパ濾胞周囲の細胞群やろ胞内の樹枝状血管の内皮細胞に選択的に発現が認められる。OA（変形関節症）ではガレクチン-９陽性細胞はほとんど認められない（図５３参照）。ガレクチン９は、RA滑膜組織増殖の本態である滑膜細胞やリンパ系細胞，さらに新生血管に強く誘導される分子である。一方、ガレクチン-１は滑膜細胞や血管周囲細胞に、ガレクチン-３はRA滑膜構成細胞全般に検出される。
【０２０５】
〔２．ガレクチン-9による滑膜細胞のアポトーシス誘導活性〕
〔方法〕
関節破壊の原因となる滑膜細胞に対するガレクチン-9の作用を検討した。滑膜は、リウマチ患者の滑膜組織を無菌的に採取し、細胞を分離、培養した。1〜2回の継代の後、実験に使用した。本実験の組織は67才女性、右膝RAであった。滑膜細胞を播種後、一晩(overnight)培養した。接着を確認後、rhGal-9(hG9NC(null), rhGal-9S, rhGal-9M)を最終濃度0, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0μMになるように添加した。72時間培養後に光顕にて観察、さらに細胞を回収し、PI法にてアポトーシス(apoptosis)誘導活性を測定した。アポトーシス誘導活性の測定は実施例３と同様にして実施した。
【０２０６】
〔結果〕
光学顕微鏡観察の結果を、図５４に示す。PI法によるアポトーシス誘導活性の測定結果を、図５５に示す。
ガレクチン-9改変体(Gal-9(NC-Null))は、天然型ガレクチン-9（Gal-9(M), Gal-9(S)）よりアポトーシス誘導活性が強い。すべてのリコンビナントにおいて濃度依存性にアポトーシス誘導活性が認められた。このアポトーシス誘導活性はラクトース(30 mM）により阻害されたが、スクロース（30mM）では影響を受けなかった。
【０２０７】
〔３．ガレクチンによる滑膜細胞のアポトーシス誘導活性と増殖抑制活性の比較〕
〔方法〕
滑膜細胞に対するヒトガレクチン（Gal-1, Gal-3, Gal-8(M), Gal-9NC(null)）の作用を検討した。
【０２０８】
滑膜は、リウマチ患者の滑膜組織を無菌的に採取し、細胞を分離、培養した。1〜2度の継代の後、一晩(overnight)で播種した滑膜細胞の接着を確認後、ヒトガレクチン（Gal-1, Gal-3, Gal-8(M), Gal-9NC(null)）を最終濃度0,0.01, 0.03,  0.1, 0.3, 1.0μMになるように添加した。24時間培養後に細胞を回収し、PI法にてapoptosis誘導活性を測定した。滑膜細胞の増殖抑制効果はヒトガレクチンが最終濃度0, 0.03,  0.1, 0.3, 1.0μMになるように96ウェルプレートの各ウェルに添加し、48時間培養する。培養後プレート内をPBSで洗浄し、cell counting kit-F（同仁化学、cat.no.343-07743）を用いて、強い蛍光（λex=490nm、λem=515nm）を発する生細胞数を蛍光プレートリーダにて、測定した。
【０２０９】
〔結果〕
アポトーシス誘導活性測定の結果を、図５６に示し、滑膜細胞の増殖抑制活性を測定した結果を、図５７（図中、hGalectin 1はリコンビナントヒトガレクチン１を、hGalectin 3はリコンビナントヒトガレクチン３を、hGalectin 8(M)はリコンビナントヒトガレクチン8Mを、hGalectin 9はhGal-9NC nullを示す）に示す。滑膜細胞の増殖を抑制することは、リウマチ治療において非常に重要である。
【０２１０】
ガレクチン-９改変体（hGal-9NC null）は、増殖した滑膜細胞のアポトーシスを誘導し、滑膜細胞の増殖を抑制するので、抗リウマチ薬として有用である。他のガレクチンにはこのような作用は認められない。
【０２１１】
種々の炎症疾患、即ち急性・慢性、アレルギー、免疫系疾患のマウスモデルにおいてガレクチン9改変体h-G9NC(null)の効果を調べた。
この結果、ガレクチン9改変体は、種々の炎症の抑制または増強作用を有すること、さらに種々のサイトカイン産生の制御作用を有することから、炎症反応を制御することができることが示唆された。その実施例を記載する。
【０２１２】
以下の実施例〔実施例５〜１２〕において、G9NC(null)〔gal9NC(null)、h-gal9NC(null)、hG9NC(null)又はh-G9NC(null): ヒト・ヌル・ガレクチン９(human null galectin-9)〕は、ガルファーマ（株）（香川県、日本）の研究所製造のものである。デキサメサゾン(dexamethasone; dexamethasone 21-phosphate disodium salt, シグマアルドリッチ(Sigma-Aldrich)社, MO, 米国）は、供給業者より入手した。
【０２１３】
〔実施例５〕
〔ザイモザン誘導胸膜炎モデル〕
まず、マウスをジエチルエーテル（和光純薬）で麻酔し、G9NC(null) 〔又はh-gal9NC(null)〕 100μg、ザイモザン（シグマアルドリッチ社）100μg、デキサメサゾン（シグマアルドリッチ社）30mg/kgを単独あるいは混合してマウスの胸腔内に注射した。コントロールにはPBSを用いた。４時間後、マウスにネンブタール注射液（商品名：ペントバルビタール、大日本製薬株式会社）をPBSで10倍希釈したものを0.2から0.3ml腹腔内に注射して麻酔した後、開腹して腹部大動脈より採血し血液サンプルとした。その後、脱血して安楽死させ、胸腔内をPBS(1ml)で２回洗浄して、胸腔洗浄液サンプルとして回収した。
【０２１４】
血液サンプルは、常温にて静置後5000rpm、10min遠心し、上清を血清サンプルとして回収し、凍結保存した。胸腔洗浄液サンプルは、チュルク液にてtotal cell numberをカウントした。カウント後、一部をサイトスピンにかけ、風乾し、ディフクイック（国際試薬株式会社）またはメイグリンワルド液（武藤化学株式会社）とギムザ液（メルクジャパン株式会社）にて染色、鏡検し、総細胞数200個中の好中球、好酸球、マクロファージ、リンパ球、その他肥満細胞などをカウントした。結果を図９及び図１０に示す。
【０２１５】
〔実施例６〕
〔PMA誘導皮膚炎モデル〕
フォルボール 12-ミリステート 13-アセテート(phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA, シグマアルドリッチ社, MO, 米国）は、供給業者より入手した。動物への投与には、ビヒクル（担体, Vehicle）のPBS(-)に化合物を懸濁して、すべての実験に使用した（以下の実施例においても同様である）。
【０２１６】
SLC（静岡県、日本）よりBalb/cマウス（７週齢）を購入した。動物は、餌並びに水を自由に摂取可能とし、12時間 昼/夜のリズムの標準的な条件下に保たれた。すべての動物は、国際的なガイドライン並びに我が国の法律に従って人による世話を受けた（以下の実施例においても同様である）。
【０２１７】
マウスの耳に浮腫を次のようにして誘導せしめる。15mgのフォルボール 12-ミリステート 13-アセテート(PMA)を30mlのアセトンに溶解し、各マウス（BALB/c, ♀, 7〜8週齢, SPF, SLC社）の右耳の内側並びに外側の表面に適用した。コントロールとしてアセトンを左耳に適用した。
【０２１８】
G9NC(null)、デキサメサゾン、あるいはビヒクルをPMA適用の30分前にi.p. (0.345 ml/head)投与した。PMA適用の後、0, 3, 6, 8及び24時間目に耳の厚さを較正厚みゲージ（calibrated thickness gauge; ミツトヨ(Mitsutoyo)、東京、日本）を用いてエーテル麻酔下に測定した。
【０２１９】
耳浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0及びL0はそれぞれ実験開始時(0h)の右耳の厚み及び左耳の厚みを示し、R及びLはそれぞれの時点での厚みの値を表す。
【０２２０】
データの統計処理は次のように行った。特にことわらない限り、データは平均値±SEMで示した。データセットの統計差はtwo-way ANOVAを使用して解析し、グループ間の差異は市販の統計ソフト（GraphPad Software, Inc., San Diego, 米国）を用いてBonferroni post-testにより評価した。＜0.05のP値のものは統計的に有意なものとされる。詳細は図のところに示してある（以下の実施例においても同様である）。結果を図１１に示す。
【０２２１】
〔実施例７〕
〔アラキドン酸誘導皮膚炎モデル〕
アラキドン酸（AA, シグマアルドリッチ社, MO, 米国）は、供給業者より入手した。他は実施例６と同様である。
【０２２２】
マウスの耳に浮腫を次のようにして誘導せしめる。750mgのアラキドン酸（AA)を30mlのアセトンに溶解し、各マウス（BALB/c, ♀, 7〜8週齢, SPF, SLC社）の右耳の内側並びに外側の表面に適用した。コントロールとしてアセトンを左耳に適用した。
【０２２３】
G9NC(null)、デキサメサゾン、あるいはビヒクルをAA適用の30分前にi.p. (0.345 ml/head)投与した。AA適用の後、0, 1, 3及び6時間目に耳の厚さを較正厚みゲージ（calibrated thickness gauge; ミツトヨ(Mitsutoyo)、東京、日本）を用いてエーテル麻酔下に測定した。耳浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0及びL0はそれぞれ実験開始時(0 h)の右耳の厚み及び左耳の厚みを示し、R及びLはそれぞれの時点での厚みの値を表す。データの統計処理は実施例６と同様にして行った。結果を図１２に示す。
【０２２４】
〔実施例８〕
〔カプサイシン誘導皮膚炎モデル〕
シプロヘプタジン（cyproheptadine, シグマアルドリッチ社, MO, 米国）及びカプサイシン（capsaicin, ナカライ社, 東京, 日本）は、各供給業者より入手した。他は実施例６と同様である。
【０２２５】
マウスの耳に浮腫を次のようにして誘導せしめる。500mgのカプサイシンを30mlのアセトン／オリーブ油(容量比=4/1)に溶解し、各マウス（BALB/c, ♀, 7〜8週齢, SPF, SLC社）の右耳の内側並びに外側の表面に適用した。コントロールとしてアセトン／オリーブ油を左耳に適用した。
【０２２６】
G9NC(null)、デキサメサゾン、シプロヘプタジンあるいはビヒクルをカプサイシン適用の30分前にi.p. (0.345 ml/head)投与した。カプサイシン適用の後、0, 0.5, 1及び2時間目に耳の厚さを較正厚みゲージ（calibrated thickness gauge; ミツトヨ(Mitsutoyo)、東京、日本）を用いてエーテル麻酔下に測定した。耳浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0及びL0はそれぞれ実験開始時(0 h)の右耳の厚み及び左耳の厚みを示し、R及びLはそれぞれの時点での厚みの値を表す。データの統計処理は実施例６と同様にして行った。結果を図１３に示す。
【０２２７】
〔実施例９〕
〔DNFB誘導接触皮膚炎モデル〕
ジニトロフルオロベンゼン（dinitro-fluoro-benzene (DNFB), シグマアルドリッチ社, MO, 米国）は、供給業者より入手した。他は実施例６と同様である。
マウスの耳に浮腫を次のようにして誘導せしめる。７日前(day -7)あるいは６日前(day-6)に0.5%のジニトロフルオロベンゼン（DNFB)含有アセトン／オリーブ油(容量比=4/1)液(30ml)を、各マウスの毛剃りした腹部に適用し、感作して遅延型過敏症(DTH)誘起の浮腫モデルとした。実験開始日(day 0)に0.3%のDNFB含有アセトン／オリーブ油(容量比=4/1)液(30ml)を各マウスの右耳の内側並びに外側の表面に局所適用し誘発せしめた。コントロールとしてアセトン／オリーブ油を左耳に適用した。
【０２２８】
G9NC(null)、デキサメサゾン、あるいはビヒクルをDNFB誘発の７日前(day -7)から実験開始日(day 0)まで、そしてDNFB誘発24時間後または48時間後に、i.p. (0.345 ml/head)投与した。DNFB誘発の後、0, 24, 48及び72時間目に耳の厚さを較正厚みゲージ（calibrated thickness gauge; ミツトヨ(Mitsutoyo)、東京、日本）を用いてエーテル麻酔下に測定した。耳浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0及びL0はそれぞれ実験開始時(0 h)の右耳の厚み及び左耳の厚みを示し、R及びLはそれぞれの時点での厚みの値を表す。データの統計処理は実施例６と同様にして行った。結果を図１４及び１５に示す。
【０２２９】
〔実施例１０〕
〔FITC誘導アトピー性皮膚炎モデル〕
フルオレッセインイソチオシアネ−ト（fluorescein isothiocyanate (FITC), シグマアルドリッチ社, MO, 米国）は、供給業者より入手した。他は実施例６と同様である。
【０２３０】
マウスの耳に浮腫を次のようにして誘導せしめる。７日前(day -7)あるいは６日前(day-6)に0.5%のフルオレッセインイソチオシアネ−ト（FITC)含有アセトン／ジブチルフタレ−ト(容量比=1/1)溶液(400ml)を、各マウスの毛剃りした腹部に適用し、感作してFITC誘起の浮腫モデルとした。実験開始日(day 0)に0.5%のFITC含有アセトン／ジブチルフタレ−ト(容量比=1/1)溶液(30ml)を各マウスの右耳の内側並びに外側の表面に局所適用し誘発せしめた。コントロールとしてアセトン／ジブチルフタレ−トを左耳に適用した。
【０２３１】
G9NC(null)、デキサメサゾン、あるいはビヒクルをFITC誘発の30分前、そしてFITC誘発24時間後または48時間後に、i.p. (0.41 ml/head)投与した。FITC誘発の後、0, 24, 48及び72時間目に耳の厚さを較正厚みゲージ（calibrated thickness gauge; ミツトヨ(Mitsutoyo)、東京、日本）を用いてエーテル麻酔下に測定した。耳浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0及びL0はそれぞれ実験開始時(0 h)の右耳の厚み及び左耳の厚みを示し、R及びLはそれぞれの時点での厚みの値を表す。データの統計処理は実施例６と同様にして行った。結果を図１６に示す。
【０２３２】
〔実施例１１〕
〔蕁麻疹モデル〕
抗DNP IgE （anti-DNP IgE (SPE7), シグマアルドリッチ社, MO, 米国）及びジニトロフルオロベンゼン（dinitro-fluoro-benzene (DNFB), シグマアルドリッチ社, MO, 米国）は、各供給業者より入手した。他は実施例６と同様である。
【０２３３】
マウスの耳に浮腫を次のようにして誘導せしめる。１日前(day -1)に抗DNP IgE (5 mg/マウス)含有PBS(-)液を、i.v.注射して感作し、２相性皮膚反応モデルとした。実験開始日(day 0)に0.15%のDNFB含有アセトン／オリーブ油(容量比=4/1)液(30ml)を、各マウスの右耳の内側並びに外側の表面に局所適用し誘発せしめた。コントロールとしてアセトン／オリーブ油を左耳に適用した。
【０２３４】
G9NC(null)、デキサメサゾン、あるいはビヒクルをDNFB誘発の30分前に、i.p. (0.345 ml/head)投与した。DNFB誘発の後、0, 1, 2, 4, 8及び24時間目に耳の厚さを較正厚みゲージ（calibrated thickness gauge; ミツトヨ(Mitsutoyo)、東京、日本）を用いてエーテル麻酔下に測定した。耳浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0及びL0はそれぞれ実験開始時(0 h)の右耳の厚み及び左耳の厚みを示し、R及びLはそれぞれの時点での厚みの値を表す。データの統計処理は実施例６と同様にして行った。結果を図１７及び１８に示す。
【０２３５】
〔実施例１２〕
〔関節炎モデル〕
DBA/1J雌性マウス（7週齢）を用い、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル（Chondrex社、No.62100）を動物の尾静脈に2 mg/0.5 ml/body投与した。その3日後に5μgのLPS（SIGMA, L6511）と各濃度のh-Gal9NC(null)を予め混和したサンプル100μLを動物の腹腔内に投与した。サンプル投与後、1日1回左右前後肢の関節の腫脹を測定し、スコア化を行った。結果を図１９に示す。
【０２３６】
急性炎症モデルとして、代表的なザイモザン誘導胸膜炎モデル（実施例５）とLPS誘導腹膜炎モデルにおけるh-G9NC(null)の効果を調べた。ザイモザン誘導胸膜炎モデルにおいて、h-G9NC(null)100μgの腹腔内投与により胸膜炎の抑制効果が認められた。尚、h-G9NC(null)は単独では、特にマウスに影響は及ぼさない。他に、カラゲナン、fMLP誘導胸膜炎モデルにおいてもh-G9NC(null)は影響を与えている。
【０２３７】
また、LPS誘導腹膜炎モデルにおいて、h-G9NC(null)により、炎症時に誘導される血清中のサイトカイン（IFN-γやIL-4、IL-12、IL-10等）産生に変化が認められている。たとえば、マウス腹腔にLPSとh-G9NCを同時投与後、6時間、12時間、24時間後にマウス眼窩から採血し、その血清中のIFN-γ値を測定したところ、LPS単独投与群では、炎症時に誘導されるIFN-γの一過性の上昇が認められたが、h-G9NC(null)同時投与群ではIFN-γの上昇（誘導）がh-G9NC(null)の投与量に依存して抑制された。このことより、h-G9NC(null)がサイトカイン産生を調節し、これにより炎症の調節が行えることが示唆された。
【０２３８】
更に、ステロイド感受性（PMA誘導）およびステロイド非感受性（アラキドン酸誘導）炎症モデル（実施例６及び７）およびカプサイシン誘導炎症モデル（実施例８）においても、h-G9NC(null)の抑制効果が認められた。
【０２３９】
アレルギー性炎症として、DNFB誘導接触皮膚炎モデル、FITC誘導アトピー性皮膚炎モデル、抗DNPモノクローナルIgE抗体感作蕁麻疹モデルにおけるh-G9NC(null)の効果を調べた。例えば、実施例９のDNFB誘導接触皮膚炎モデルにおいて、h-G9NC(null)を腹腔内投与し、耳介浮腫を指標とした皮膚反応で効果を調べた。その結果、h-G9NC(null)の1、10、100μgにより、抑制効果が認められ、またデキサメサゾン投与で生ずる顕著な体重減少は認められなかった。実施例１０のFITC誘導アトピー性皮膚炎モデルにおいて、h-G9NC(null)の腹腔内投与により、惹起相においてh-G9NC(null)の効果が認められた。さらに、実施例１１の抗DNPモノクローナルIgE抗体感作蕁麻疹モデルマウスにh-G9NC(null)の 1、10、100μgをそれぞれ腹腔内投与したところ、抗原塗布（DNFB）による二層性皮膚反応が抑制された。
【０２４０】
自己免疫疾患モデルの一つとして、抗体カクテル誘発関節炎に対するh-G9NC(null)の実施例を記す。アジュバント関節炎、コラーゲン関節モデル等にも、h-G9NC(null)は影響を及ぼしている。例えば、実施例１２では、h-G9NC(null) 1μgにおいても、抑制が認められた。
【０２４１】
〔実施例１３〕
ガレクチン9改変体の腫瘍細胞におけるアポトーシス（細胞障害活性）誘導〕
〔実験方法〕
RPMI (SIGMA) 10 % FBS (JRH) に懸濁した各細胞を96well プレート (FALCON) に3×103個/90μL入れ、24時間培養(37℃、5 % CO2) 後、ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))を最終濃度が0.03〜1μMになるように添加(10μl)し、24時間培養する。培養後、WST-1試薬（Roche, 1 644 807）10μLを各ウェルに添加し、37℃、5 % CO2条件下で2〜4時間反応後、プレートリーダーにて、450nmの吸光度を測定した。各腫瘍細胞におけるアポトーシス（細胞障害活性）誘導評価はViability(%)=[（検体の吸光度-Blank）]/（陰性対照の吸光度-Blank）]ｘ100で行った。
使用した腫瘍細胞を、表２に示す。
【０２４２】
【表２】
0004792390.tif 000003
【０２４３】
表２中、「Cell name」は、細胞名を、「Animal」は当該腫瘍細胞の由来動物種を、「1μM killing」は、1μMのガレクチン9改変体添加時のkilling (%)を、「Tissue」は、当該細胞の由来組織・器官部位を示している。
【０２４４】
〔結果〕
培養細胞におけるガレクチン9改変体(h-G9NC(null))によるアポトーシス（細胞障害活性）誘導測定の結果を、表２に示す。この結果、ガレクチン9改変体は、
１）血球系腫瘍に効果的
２）悪性黒色種や線維肉腫などの非上皮性悪性腫瘍にも有効
３）胃癌、膵臓癌、肺癌などの上皮性悪性腫瘍にも有効
であると判断された。
【０２４５】
〔実施例１４〕
〔ガレクチン9改変体の皮下移植モデルにおける抗腫瘍活性（抗癌効果）〕
〔実験方法〕
標的腫瘍細胞としてLLC細胞を使用した。培養された細胞（1ｘ106個/100μL）をガレクチン9改変体（h-G9NC(null), 100μg/100μL）または生理食塩水100μLと37℃で1時間反応させた後、C57BL6マウスの背中に皮下注射した。腫瘍径（長軸、短軸）を測定した。
【０２４６】
また、移植5週後の投与皮膚部位（腫瘍）を切り取り、10％中性に緩衝化されたホルムアルデヒド溶液で組織病理検査用サンプルを固定化した後、パラフィン包埋組織を切片とし、HE試薬で染色した。
【０２４７】
〔結果〕
図２０に、皮下移植モデルにおけるガレクチン9改変体の腫瘍細胞増殖抑制効果、すなわち、抗腫瘍活性（抗癌効果）測定の結果を示す。また、図２１には、組織病理解析により抗腫瘍活性（抗癌効果）を調べた結果を示す。図中、Gal9(n)及びGal9は、ガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）を、5Wは5週を示している。
【０２４８】
ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))存在下にLLCを培養したものでは、位相差顕微鏡下で明らかな癌細胞の形態変化が観察された。この時、ガレクチン9改変体は用量依存性にLLCの生細胞数を減少し（MTT assay）、DNA合成能の低下（3H-Thymidine取り込み能）、培養上清中のLDH放出量の亢進、を誘導した。ガレクチン9改変体によるこれらの抗腫瘍効果は、ヒト肺癌細胞株H226（扁平上皮癌）、A549（腺癌）、Ｈ69（小細胞癌）でも同様に確認された。一方、ガレクチン9改変体存在下でLLCのAnnexin V発現量は有意に増加した。
【０２４９】
一方、LLCをガレクチン9改変体共存下に同系統マウスC57BL6の皮下に接種すると腫瘍は生着せず、接種後5週の時点でコントロール群と明らかな差がみられた。マウス生存率は、ガレクチン9改変体存在下で有意に改善した。ガレクチン9改変体は癌細胞にアポトーシスを誘導し、抗腫瘍効果を発揮することが判明した。
ヒト小細胞肺癌細胞株H69細胞をヌードマウスに静注することによる肺癌の多臓器転移モデルにおいて、ガレクチン9改変体の腹腔投与により転移抑制効果も認められている。
【０２５０】
〔実施例１５〕
〔ガレクチン9改変体の培養腫瘍細胞におけるアポトーシス（細胞障害活性）誘導〕
〔実験方法〕
(1) Meth A細胞のアポトーシス
RPMI (SIGMA) 10 % FBS (JRH) に懸濁したMeth Aを96well プレート (FALCON) に4×104個/90μl 入れ、同時にガレクチン9改変体(h-G9NC(null))を1〜30μg/ml (10μl) 添加し、24時間培養 (37℃、5 % CO2) する。24時間後、細胞をPBS(-) 200μlで1回洗浄し、Annexin v Binding Buffer (BD PharMingen)に懸濁し、Annexin V-PE (BD PharMingen)と7-Amino-actinomycin Dを添加し、暗中、室温で15分間反応させ、FACS calibur (Becton,Dickinson)で解析した。
【０２５１】
(2) B16/F10細胞のアポトーシス
RPMI (SIGMA) 10 % FBS (JRH) に懸濁したB16/F10を96well プレート (FALCON) に1×104個/90μl 入れ、24時間培養(37℃、5 % CO2) 後、ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))を最終濃度が1〜30μg/mlになるように添加(10μl)し、24時間培養する。その24時間後、細胞をPBS (-) 200μlで1回洗浄し、0.05 % Trypsin EDTA (GIBCO) で処理した後、培養液で1回洗浄し、さらにPBS(-)で洗浄する。その後、Annexin V Binding Buffer (BD PharMingen) に懸濁し、Annexin V-PE (BD PharMingen) と7-Amino-actinomycin を添加し、暗中、室温で15分間反応させ、FACS calibur (Becton,Dickinson) で解析した。
【０２５２】
〔結果〕
図２２及び図２３に結果を示す。図２２は、ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))によるMeth A細胞のアポトーシス誘導解析の結果である。図２３は、ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))によるB16/F10細胞のアポトーシス誘導解析の結果である。
【０２５３】
〔実施例１６〕
〔ガレクチン9改変体の癌性腹膜炎モデルにおける抗腫瘍活性（抗癌効果）〕
〔実験方法〕
(1) Meth A細胞: PBS(-)で調製した細胞（5×105個/100μL）をBALB/cマウス（SLC,6週齢の雌、n=3）の腹腔に接種した。
【０２５４】
ガレクチン9改変体（h-G9NC(null), 100μg/300μL）は腹腔内に細胞接種後18日まで連日投与を行った。投与を開始する時期で1）MethA細胞接種後直後、2）3日後、3）7日後、4）10日後の4群（n=10）に分け、生存率を比較した。
【０２５５】
(2) B16/F10細胞: 細胞（5×105個/100μL）をC57/BL6マウス（SLC,6週齢の雌）の腹腔内に接種した。接種後直ぐに各濃度のガレクチン9改変体（h-G9NC(null), 10、30、100μg/300μL）を腹腔内投与、14日間連日投与を行った。生存率を比較した。接種後14日に臓器を観察した。
【０２５６】
〔結果〕
図２４〜２７及び４８に結果を示す。図２４は、生存曲線で、Meth A細胞による癌性腹膜炎モデルにおいて、ガレクチン9改変体が抗腫瘍効果を有することを示している。図２５には、ガレクチン9改変体(Gal9)非投与群（上段）と投与群（下段）とでマウスの状態を示す写真を示す。図２６は、生存曲線で、B16/F10細胞による癌性腹膜炎モデルにおいて、ガレクチン9改変体が抗腫瘍効果を有することを示している。図２７には、B16/F10細胞による癌性腹膜炎モデルマウスの状態をガレクチン9改変体(Gal-9)投与群と非投与群とで対比して内臓組織写真を示す。図４８は、LLC細胞（1×106個）を腹腔内(i.p.)接種せしめられたマウスに、毎日、ガレクチン9改変体（h-G9NC(null), 100μg/マウス）または担体(vehicle)をi.p.投与した結果を示す（Day 0から連日投与、各群７匹のマウス）。マウス癌性腹膜炎モデル（MethA、B16/F10細胞、LLC細胞）においてG9NC(null)（i.p.）投与（癌細胞接種時に同時投与および癌細胞接種後投与）による延命効果が認められている。
【０２５７】
Meth A細胞、LLC細胞はガレクチン9改変体によりアポトーシスを誘導される細胞である。しかしB16/F10細胞はガレクチン9改変体によりアポトーシスは誘導されない。
【０２５８】
B16/F10細胞の場合、ガレクチン9改変体は癌細胞と細胞外基質との結合を濃度依存性に阻害することが明らかになった。さらにB16/F10細胞による癌性腹膜炎モデルにおいて、G9NC(null)投与群ではコントロール群に比べて、腹腔液中のNK,NKT細胞が増加していた。B16/F10メラノーマ細胞は安定化ガレクチン９によるアポトーシス耐性であるが、生存率改善とメラノーマ細胞の腹壁への接着の抑制が確認されている。癌性腹膜炎モデルにおけるガレクチン9改変体の抗腫瘍効果は、腫瘍細胞の細胞外基質への接着抑制すなわち炎症細胞の浸潤抑制効果、NK、NKT細胞等の免疫担当細胞の関与も示唆された。
【０２５９】
〔実施例１７〕
〔B16/F10腹腔内浸潤細胞の解析〕
〔実験方法〕
PBS(-) に懸濁したB16/F10を5×105個/200μl、C57/BL6マウス (SCL) の腹腔に移植するのと同時にガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）を30μg/300μl 腹腔投与し、24時間後、腹腔細胞を採取し、PBS(-)に懸濁する。精製抗マウスCD16/CD32(2.4G2) (BD PharMingen) で、4℃，5分、反応させた後、それぞれの抗体［PE抗マウスCD122 (TM-β-1) (BD PharMingen)、FITC抗マウスTCR β-chain (H57-597) (BD PharMingen)、PE抗マウスCD11b (M1/70) (BD PharMingen)、APC-標識抗マウスCD11c (HL3) (BD PharMingen)、APC抗マウスCD8a (BD PharMingen) 、FITC抗マウスCD4 (BD PharMingen)］で4℃、30分反応させ、FACS calibur (Becton,Dickinson) で解析した。
【０２６０】
〔結果〕
図２８に結果を示す。PBS投与群に比べて、ガレクチン9改変体投与群（30μg）では腹腔洗浄液中にNK/NKT細胞等の免疫に関与する細胞の動員が認められた。
【０２６１】
〔実施例１８〕
〔ガレクチン9改変体によるB16/F10細胞の接着阻害活性〕
〔実験方法〕
I型コラーゲン、IV型コラーゲン(collagen type I, IV), ラミニン(laminin), フィブロネクチン(fibronectin), ビトロネクチン(vitronectin)がコートされた96 wellプレート (CHEMICON) にガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）を最終濃度1〜30μg/mlになるように10μlずつそれぞれ入れておき、そのプレートにRPMI (SIGMA) 0.02 % BSA (Wako) で懸濁したB16/F10を4×104個/well (90μl) ずつ播種し、１時間インキュベート (37℃、5 % CO2) する。１時間後、上清を取り除き、PBS（-）200μlで２回洗浄した後、RPMI 0.02 % BSAを90μlとWST-1 (Roche) を10μl入れ、2〜3時間インキュベートする。最後にプレートリーダーを用いて、450〜600の吸光度を測定し、接着率(Adherence, %) = [(検体の吸光度-Blank／(陰性対照の吸光度-Blank))×100で、計算する。
【０２６２】
〔結果〕
図２９に結果を示す。B16/F10細胞と各細胞外基質（I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン）との結合はガレクチン9改変体（図では安定化ガレクチンと記載）により阻害された。その阻害作用はガレクチン9改変体の濃度依存的に認められた。
【０２６３】
次に、ガレクチン９改変体による炎症に対する生物活性を調べた。炎症として、I型に分類される炎症である気管支喘息、II型に分類される炎症である自己免疫性溶血性貧血、そしてIII型に分類される炎症であるアルツス(Arthus)反応（血管炎）に対する、ガレクチン9改変体の活性を調べた。
【０２６４】
〔実施例１９〕
〔ダニ抗原誘発喘息モデル（Der f -induced AHR model）〕
〔実験方法〕
デキサメサゾン(デキサメサゾン21-フォスフェート・二ナトリウム塩、 Sigma, MO, 米国), メタコリン(methacholine (MCh), Sigma, MO, USA) 及び アレルギー誘発性抽出物混合ダニ抗原(Allergenic Extract mixed Insects MITE : コナヒョウヒダニ(D. Farinae, Der f))は、そこに示された供給業者から入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。
【０２６５】
Balb/c マウス (7週齢)をSLC (静岡, 日本)より購入した。動物は適宜餌や水を自由に摂取できるようにして12時間毎に昼夜となるリズムの標準的な状態で飼育した。すべての動物は国際的なガイドライン並びに国内法に従い人の手により管理された。
マウスにおける喘息性過敏反応(Asthmatic Hypersensitive Response: AHR)の誘導は次のようにして行った。
【０２６６】
メタコリンと好酸球浸潤に対する気道過敏性をマウスの気道組織に誘起するため、雄のマウスを感作した後、上記ダニ抗原(Der f)をアレルゲンとして使用して誘発処理した。Der f (0.5 mg/ml)でもって0.05 mlずつ、0日目、7日目及び20日目に、鼻腔内(i.n.)投与することによりマウスを免疫し、次にネブライザーを使用して1 %エアゾールとされたDer fで30分間処理して惹起せしめられた。コントロール群の動物は、0日目、7日目及び20日目に、鼻腔内(i.n.)経由で通常のPBS (0.05 ml)の投与を受け、次にネブライザーを使用してPBSでもって30分間処理せしめられた。
【０２６７】
ガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）及びデキサメサゾンの作用効果を調べるために、Der fによる誘発前及びDer fによる誘発後に、マウスにガレクチン9改変体（h-G9NC(null)100 μg/410 μl(in PBS)/ body、あるいはデキサメサゾン3 mg/200 μl(in PBS)/kg（体重）を、それぞれ腹腔内(i.p.)投与した。
【０２６８】
サンプルとして気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid: BAL fluid）を各動物より採取した。無拘束呼吸機能解析装置(unrestrained whole body plethysmograph; PULMOS-I; M.I.P.S, 大阪, 日本)により拘束していない意識を有しているマウスの全肺気流量を測定した。比毎分の気流量、換気量、呼吸の頻度、そして比気道抵抗(specific airway resistance: sRAW)を求めるために、マウスを収容しているチャンバーと対照用チャンバーとの間の圧の差を用いた。気道抵抗は、次元のないパラメーターで、呼吸サイクル中のマウスの全肺呼吸量の関数である。エアゾールにしたPBS（基礎測定値として）あるいはMCh(6-25 mg/ml)でもってマウスを2分間処理し、測定を行って、噴霧療法処理した後100回の呼吸の平均値を求めた。懸濁している細胞の数(cells/ ml）をTurk's液で染色して血球計(hemocytometer)でもって測定し、サイトスピン(cytospin)調製物を得て、Giemsa-May-Grunwald溶液を使用して形態的な特徴付けを行って細胞の差異を測定した。各スライド上、200-500個の白血球を数えた。
【０２６９】
〔結果〕
図３０、３１及び３２に結果を示す。図中、それぞれの値は７匹の動物の平均±S.E.を示している。統計上の差異は、one-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異はDunnett's Multiple Comparison Test を使用して評価した（＊p<0.05, ＊＊p<0.01, ＊＊＊p<0.001）。図３０より、h-G9NC(null)〔Gal-9〕投与で気道過敏性の亢進が改善することが明らかである。図３１より、h-G9NC(null)〔Gal-9〕投与でBALF中への好酸球浸潤を抑制することが明らかである。図３２より、h-G9NC(null)〔Gal-9〕投与で気管支周囲の炎症細胞浸潤を抑制することが明らかである。かくしてガレクチン９により、炎症細胞の気道への浸潤を抑制することで気道過敏性が改善することが示唆される。
【０２７０】
〔実施例２０〕
〔OVA誘発喘息モデル(OVA -induced AHR model)〕
〔実験方法〕
動物として、マウス及びモルモットを使用した。卵白アルブミン(Ovalbumin (OVA), Sigma, MO, 米国)、メトピロン(metopyrone, Sigma, MO, 米国)、メピラミン(mepyramine, Sigma, MO, 米国)をそこに示された供給業者から入手した。他の化合物は実施例１９と同様にして入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。Balb/c マウス (7週齢)はSLC (静岡, 日本)より、そしてモルモット(5週齢)はKudou Co. Ltd （熊本, 日本) より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。
【０２７１】
マウスにおけるAHRの誘導は次のようにして行った。
メタコリンと好酸球浸潤に対する気道過敏性をマウスの気道組織に誘起するため、雄のマウスを感作した後、上記OVAをアレルゲンとして使用して誘発処理した。硫酸アルミニウムカリウムと複合体を形成しているOVA (0.5 mg/ml)でもって0.2 mlずつ、0日目及び14日目に、腹腔内(i.p.)投与することによりマウスを免疫した。14日目、18日目及び22日目に、普通の食塩水で希釈したペントバルビタール(5.0 mg/ml)の0.2-0.3 mlでマウスを麻酔した。OVA感作群の動物のすべては、14日目、18日目及び22日目に、鼻腔内(i.n.)経由で0.05 mlの普通の食塩水中の2.0 mg/mlのOVAを投与された。コントロール群の動物は、0日目及び14日目に、腹腔内(i.p.)経由で硫酸アルミニウムカリウムの入った通常のPBSの投与を受け、次に14日目、18日目及び22日目に、鼻腔内(i.n.)経由で通常のPBS (0.05 ml)の投与を受けた。
【０２７２】
ガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）及びデキサメサゾンの作用効果を調べるために、OVAによる誘発前及びOVAによる誘発後0, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 及び 22日目に、マウスにガレクチン9改変体（h-G9NC(null) 100 μg/410 μl(in PBS)/ body、あるいはデキサメサゾン3 mg/200 μl(in PBS)/kg（体重）を、それぞれ腹腔内(i.p.)投与した。
【０２７３】
サンプルとしてBAL液を各動物より採取した。気圧式呼吸機能解析装置(whole body barometric plethysmograph; Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT)により拘束していない意識を有しているマウスの全肺気流量を測定した。該装置では、高くなったポーズ(Pause(Penh))として知られている呼吸のパターンの変化として測定がなされ、それは気道抵抗と相関し、気道抵抗をモニターするのに使用した。エアゾールにしたPBS（基礎測定値として）あるいはMCh(3-50 mg/ml)でもってマウスを2分間処理し、測定を行って、MCh噴霧療法処理した後100回の呼吸の平均値を求めた。懸濁している細胞の数(cells/ ml）をTurk's液で染色して血球計でもって測定し、サイトスピン調製物を得て、Giemsa-May-Grunwald溶液を使用して形態的な特徴付けを行って細胞の差異を測定した。各スライド上、200-500個の白血球を数えた。
【０２７４】
モルモットにおけるAHRの誘導は次のようにして行った。
抗原と好酸球浸潤に対する即時型気道過敏性(IAR)並びに遅延型気道過敏性(LAR)を気道組織に誘起するため、雄のモルモットを感作した後、上記OVAをアレルゲンとして使用して誘発処理した。オムロン超音波式ネブライザ(Omron NE-U17 nebulizer, 立石電気（株）、東京、日本)を使用し、0〜7日目に、モルモットに10分間1% OVAの食塩水液のエアゾールで感作を行った。アナフラキシーショックを避けるために動物のすべては、感作処理30分前及び誘発処理30分前には、メピラミン(10 mg/kg)を投与された。
【０２７５】
ガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）の作用効果を調べるために、OVAによる誘発前及びOVAによる誘発後に、モルモットにガレクチン9改変体（h-G9NC(null)) 1 μg/4 ml(in PBS)/ bodyを腹腔内(i.p.)投与した。
サンプルとしてBAL液を各動物より採取した。
【０２７６】
最初の感作後３日目に、ボディチャンバーから離れている口鼻式マスクを備えた全身式呼吸機能解析チャンバー(PULMOS-I; M.I.P.S, 大阪, 日本)に動物を置いて、Agrawal's 法に従い比気道コンダクタンス(SGaw) を測定した。気流量とボックス容量の変化との関係（これはボックス圧の変化から計算される）は、ボックス容量の変化とを気流量とx-y にプロットした傾斜（スロープ）として決定できる。５回の呼吸サイクルにおけるスロープの平均を、SGawを計算するのに用いた。
【０２７７】
OVAによる誘発の前に10 mg/kgのメトピロンをモルモットに腹腔内(i.p.)投与し、次にオムロン超音波式ネブライザ(Omron NE-U17 nebulizer, 立石電気（株）、東京、日本)を使用し、2% OVAの食塩水液のエアゾールに5分間、3 l/minの流速でもってモルモットは処理された。そして、抗原処理の1 min前及び抗原処理の後2, 4, 5, 6, 7, 8 そして23時間目にSGawの変化をモニターし、測定を行って、それぞれの時点の後の100回の呼吸の平均値を求めた。各SGaw値は免疫チャレンジの前に得られた値と比較され、SGawにおける変化パーセントとして表された。懸濁している細胞の数(cells/ ml）をTurk's液で染色して血球計でもって測定し、サイトスピン調製物を得て、Giemsa-May-Grunwald溶液を使用して形態的な特徴付けを行って細胞の差異を測定した。各スライド上、500個の白血球を数えた。
【０２７８】
〔結果〕
図３３及び３４にマウスにおける結果、そして図３５及び３６にモルモットにおける結果を示す。図中、それぞれの値は７匹（図３３）、５〜７匹（図３４）、７又は８匹（図３５及び図３６）の動物の平均±S.E.を示している。統計上の差異は、one-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異はDunnett's Multiple Comparison Test を使用して評価した（＊p<0.05, ＊＊p<0.01, ＊＊＊p<0.001）。
【０２７９】
図３３は、気道過敏性をガレクチン9改変体（h-G9NC(null))が改善する作用を有することを示す。図３４は、BALF中の好酸球の浸潤をガレクチン9改変体（h-G9NC(null))が抑制することを示す。
【０２８０】
図３５は、即時型喘息（IAR）・遅延型喘息（LAR）に対するガレクチン9改変体（h-G9NC(null))の及ぼす作用を示す。結果、ガレクチン9改変体投与群では、IARおよびLAR、いずれも対照群と比較して有意な差が認められた。つまり、抑制効果が認められた。
【０２８１】
図３６は、気道内炎症性細胞浸潤に対するガレクチン9改変体（h-G9NC(null))の及ぼす作用を示す。結果、ガレクチン9改変体投与群では、対照群と比較して総細胞数および好酸球に対して有意な差が認められた。他の細胞においても浸潤抑制傾向が見られている。
【０２８２】
ガレクチン9改変体は1mg/bodyの用量で抗原感作および惹起前に腹腔内投与することにより能動感作モルモットの抗原惹起即時型・遅延型喘息反応および気道内細胞浸潤を抑制する可能性が示唆された。
【０２８３】
〔実施例２１〕
〔自己免疫性溶血性貧血（RαMRC Ab-induced AIHA model）〕
〔実験方法〕
シクロフォスファミド(cyclophosphamide (CY), Sigma, MO, 米国)、アザチオプリン(azathioprine (AZ), Sigma, MO, 米国)、メトトレキサート(methotrexate (MTX), Sigma, MO, 米国)ウサギの抗マウス赤血球抗体(RαMRC Ab)をそこに示された供給業者からそれぞれ入手した。他の化合物は実施例１９と同様にして入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle, V)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。Balb/c マウス (7週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。
【０２８４】
マウスにおける自己免疫性溶血性貧血(AIHA) の誘導は次のようにして行った。
ウサギのαMRBC自己抗体をマウスに静脈内(i.v.)投与して溶血性貧血を誘導した。ウサギのαMRBC自己抗体の注射の30分前及び該自己抗体の注射の後1〜4日目に、ガレクチン9改変体（h-G9NC(null))、デキサメサゾン、その他の薬物、あるいは担体(vehicle)を腹腔内(i.p., 0.345ml/head))に投与した。
ヘバリン処理されたマイクロヘマトクリットキャピラリーチューブ中に血液サンプルを採取し、遠心機で5分間12,000 rpmで遠心した。遠心後直接パックされているRBCsのパーセントをみてヘマトクリットを決定した。
【０２８５】
統計的な解析は次のようにして行った。
特に断らない場合には、データは平均値±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してDunnett's Multiple Comparison Test でもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０２８６】
〔結果〕
図３７に結果を示す。ガレクチン9改変体投与群では、発症抑制傾向が認められた。図中、それぞれの値は５〜６匹の動物の平均値±SEMを示している（＊p<0.05, ＊＊p<0.01）。
【０２８７】
〔実施例２２〕
〔Arthus 反応（血管炎）〕
〔実験方法〕
免疫複合体誘発２相皮膚反応(Arthus 反応)に及ぼすガレクチン9改変体の作用効果を調べた。
【０２８８】
抗OVA IgG は供給業者から入手した。他の化合物は実施例２０と同様にして入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。Balb/c マウス (7週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。
【０２８９】
マウスにおける耳介浮腫の誘導は次のようにして行った。
２相皮膚反応モデルのマウスの右耳に抗OVA IgG (50 μg/マウス)を皮内(i.d.)投与して感作し、そしてすぐに1% OVAのPBSを200 μl静脈内(i.v.)に投与した。
ガレクチン9改変体（h-G9NC(null))、デキサメサゾン、あるいは担体(vehicle)を、OVAの注射30分前及びOVAの注射の後5時間して、腹腔内(i.p., 0.345ml/head))に投与した。OVAの注射の後0, 2, 4, 8 及び 24時間して耳の厚さを、較正厚みゲージ(Mitsutoyo, 東京, 日本)を使用してエーテル麻酔下測定した。
【０２８０】
耳介浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0は実験開始時(0 h)の右耳の厚み、そしてL0は実験開始時(0 h)の左耳の厚みを表し、Rはそれぞれの時点で得られた右耳の厚み、そしてLは左耳の厚みを表す。
【０２９１】
統計的な解析は次のようにして行った。
特に断らない場合には、データは平均値±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０２９２】
〔結果〕
図３８に結果を示す。ガレクチン9改変体投与群では、発症抑制傾向が認められる。図中、それぞれの値は５〜６匹の動物の平均値±SEMを示している（＊p<0.05, ＊＊p<0.01）。
【０２９３】
〔実施例２３〕
〔ARDSモデル（LPS-induced ARDS model）〕
〔実験方法〕
リポポリサッカライド(lipopolysaccharide, LPS, Sigma, MO, USA) をそこに示された供給業者からそれぞれ入手した。他の化合物は実施例１９と同様にして入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。Balb/c マウス (7週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。
【０２９４】
マウスにおけるARDSの誘導は次のようにして行った。
マウスの気道組織に呼吸困難症及び好中酸球の浸潤を惹起するため、肺傷害モデルとしてLPSを使用して雄のマウスを処置した。マウスは、LPS (0.6 mg/ml, 0.05-ml容量)の経鼻(i.n.)投与を受けた。コントロール群は、同じルートで通常のPBS (0.05 ml)の投与を受けた。
【０２９５】
ガレクチン9改変体（h-G9NC(null)）及びデキサメサゾンの作用効果を調べるために、LPSによる誘発30分前及びLPSによる誘発後6時間して、マウスにガレクチン9改変体（h-G9NC(null) 100 μg/410 μl(in PBS)/ bodyを、あるいはデキサメサゾン1〜10 mg/200 μl(in PBS)/kg（体重）を、それぞれ腹腔内(i.p.)投与した。
【０２９６】
気圧式呼吸機能解析装置(whole body barometric plethysmography; Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT)及び無拘束呼吸機能解析装置(unrestrained whole body plethysmograph; PULMOS-I; M.I.P.S, 大阪, 日本)により、LPSによる誘発の1時間前及び24時間後にマウスの肺の機能(pen h 値及び換気量)を解析した。
【０２９７】
肺の機能を解析した後、サンプルとしてBAL液を各動物より採取した。
無拘束呼吸機能解析装置により拘束していない意識を有しているマウスの全肺気流量を測定した。毎分の気流量、換気量、呼吸の頻度、pen h値、そして比気道抵抗(sRAW)を求めるために、マウスを収容しているチャンバーと対照用チャンバーとの間の圧の差を用いた。気道抵抗は、次元のないパラメーターで、呼吸サイクル中のマウスの全肺呼吸量の関数である。
【０２９８】
懸濁している細胞の数(cells/ ml）をTurk's液で染色して血球計でもって測定し、サイトスピン調製物を得て、Giemsa-May-Grunwald溶液を使用して形態的な特徴付けを行って細胞の差異を測定した。各スライド上、200-500個の白血球を数えた。
【０２９９】
統計的な解析は次のようにして行った。
特に断らない場合には、データは平均値±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAあるいはtwo-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してDunnett's Multiple Comparison Test 又はBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０３００】
〔結果〕
図３９及び図４０に結果を示す。図中、それぞれの値は５〜６匹の動物の平均値±SEMを示している。統計上の差異は、one-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異はDunnett's Multiple Comparison Test を使用して評価した（＊p<0.05, ＊＊p<0.01, ＊＊＊p<0.001）。図３９は、気道過敏性に対するガレクチン9改変体（h-G9NC(null))の及ぼす作用を示す。そこでは改善が認められた。図４０は、BALF中の好中球の浸潤をガレクチン9改変体（h-G9NC(null))が抑制していることを示している。
【０３０１】
〔実施例２４〕
〔カプサイシン誘導炎症モデル〕
〔実験方法〕
シプロヘプタジン(cyproheptadine, Sigma, MO, USA)及びカプサイシン(capsaicin, Nakarai, Tokyo, Japan) をそこに示された供給業者からそれぞれ入手した。他の化合物は実施例１９と同様にして入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。Balb/c マウス (7週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。
【０３０２】
マウスにおける耳介浮腫の誘導は次のようにして行った。
500 μgのカプサイシンをアセトン/オリーブ油(4/1, 30 μl)に溶解し、各マウス(BALB/c, ♀, 7-8週齢, SPF, SLC Inc.)の右耳の内側表面と外側表面に適用した。アセトン/オリーブ油を左耳にコントロールとして適用した。ガレクチン9改変体（h-G9NC(null))、デキサメサゾン、シプロヘプタジン、あるいは担体(vehicle)を、カプサイシンの投与30分前に腹腔内(i.p., 0.345ml/head)に、そして10分前に静脈内に投与した。カプサイシンの投与後0, 0.5, 1 及び2 時間して耳の厚さを、較正厚みゲージ(Mitsutoyo, 東京, 日本)を使用してエーテル麻酔下測定した。
【０３０３】
耳介浮腫を(R-L)-(R0-L0)で表した。ここで、R0は実験開始時(0 h)の右耳の厚み、そしてL0は実験開始時(0 h)の左耳の厚みを表し、Rはそれぞれの時点で得られた右耳の厚み、そしてLは左耳の厚みを表す。
【０３０４】
統計的な解析は次のようにして行った。
特に断らない場合には、データは平均値±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０３０５】
図４１に結果を示す。ガレクチン9改変体投与群(静注投与)では、発症抑制が認められる。図中、それぞれの値は５〜６匹の動物の平均値±SEMを示している。統計上の差異は、two-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異はDunnett's Multiple Comparison Test を使用して評価した（＊p<0.05, ＊＊p<0.01, ＊＊＊p<0.001）。ガレクチン9改変体により神経性、炎症性に起因する痛みの抑制が期待される。
【０３０６】
〔実施例２５〕
〔ガレクチン9改変体の骨吸収および骨形成への作用〕
〔実験方法〕
１．骨吸収
（破骨細胞形成）
RANKL(50ng/ml)とM-CSF(50ng/ml)存在下で末梢血単核球（1x105cells）を9日間培養し、ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))添加（0.1〜10nM）/非添加群でTRAP陽性多核細胞数（破骨細胞）を比較した。h-G9NC(null)は濃度依存性にTRAP陽性多核細胞（破骨細胞）の形成を抑制した。ここでは、h-G9NC(null)を、単にgal-9と記載することもある。
【０３０７】
得られた結果を図４２に示す。
コントロール群(cont.): 500±13.2cells/wellで、ガレクチン９改変体投与群(h−G9NC（null）, 0.1nM): 451±7.6 cells/well、(h-G9NC(null), 1.0nM): 151±12.5cells/well、(h−G9NC（null）, 10nM): 29±14.0cells/wellであった。
【０３０８】
２．骨形成
（骨芽細胞増殖）
ヒト骨芽細胞（96穴プレートに細胞を2×103/wellで播種、over night後h-G9NC(null)刺激を加え、0時間、24時間、48時間に観察）の増殖に対するh-G9NC(null)(0.1〜100nM)の影響をTetra color-1 assayを用いて吸光度により検討した。
【０３０９】
得られた結果を図４４に示す。ガレクチン9改変体は骨芽細胞の増殖を濃度依存性に誘導し、それはラクトースにより阻害された。ガレクチン9改変体は骨芽細胞の増殖を濃度依存性に誘導し、またラクトース（30mM）により阻害できた。吸光度はコントロールでは0.21±0.01、h-G9NC(null)(0.1nM)では 0.22±0.01、h-G9NC(null)(1.0nM)では 0.24±0.01、h-G9NC(null)(10nM)では 0.25±0.01、h-G9NC(null)(100nM)では 0.26±0.02が24時間の値で、48時間後はコントロールでは 0.22±0.01、h-G9NC(null)(0.1nM)では 0.23±0.01、h-G9NC(null)(1.0nM)では 0.26±0.01、h-G9NC(null)(10nM)では 0.27±0.01、h-G9NC(null)(100nM)では 0.31±0.04 であった。
【０３１０】
（骨芽細胞分化）
ヒト骨芽細胞（6穴プレートに10%FCS/DMEMにて1×105cells/wellで播種、24時間インキュベート後、1%FCS/DMEMにover nightでスタベーションしgal-9刺激を加え、8時間後に測定）の分化に対するガレクチン9改変体(h-G9NC(null))(100nM)の影響を細胞内ALPとosteocalcinをフローサイトメーターにて検討した。
【０３１１】
得られた結果を図４５に示す。ガレクチン9改変体は骨芽細胞における骨形成マーカーであるALP、Osteocalcinの発現を誘導した。ALPは無刺激に比べ400molecules/cell、osteocalcinについては無刺激に比べ800 molecules/cell増加した。また、骨芽細胞にh-G9NC(null)添加（10nM）し28日間培養すると、非添加群に比しALP染色およびvon kossa染色が促進された。
【０３１２】
以上の試験より、ガレクチン9改変体添加後６時間で単核球の凝集が起こっていた。そしてガレクチン9改変体は濃度依存性にTRAP陽性多核細胞の形成を抑制した。ガレクチン9改変体は骨芽細胞の増殖を濃度依存性に誘導した。ガレクチン9改変体は骨芽細胞におけるALP、Osteocalcinの発現を誘導する。
【０３１３】
以上の結果より、ガレクチン9改変体やネイティブなガレクチン9は骨吸収には抑制的に、骨形成には促進的に作用する可能性が示唆され、骨形成促進作用を持つ薬剤として閉経後骨粗鬆症への治療応用への可能性が考えられた。
【０３１４】
〔実施例２６〕
〔ガレクチン9改変体の間質性肺炎モデルへの作用〕
〔実験方法〕
間質性肺炎モデルとしてマウスを使用した。C57BL/6マウス（♀６週齢、使用時７〜８週齢、20匹）を参考文献：Blood 2002; 99:1289-98及びAm J Respir Crit Care Med 2003;168:1075-83に従い処理して、間質性肺炎を誘導した。rhIL-2(PeproTech, 5μg x 10匹x ２群 x 14日= 1400μg = 1.4 mg)及びrmIL-18(MBL, 0.2μg x 10匹x ２群x 14日 = 56μg)を使用した。
【０３１５】
サンプル群としてはコントロール群及びガレクチン9改変体(Gal-9)投与群を用意した。
(1)コントロール群（マウス10匹）
マウス1匹当り、毎日IL-2 5μg+IL-18 0.2μgを、day 0〜13連日腹腔内投与する。コントロールとして、マウス1匹当り、毎日PBS 200μlを、day 0〜13連日腹腔内投与する。
(2)Gal-9投与群（マウス10匹）
マウス1匹当り、毎日IL-2 5μg+IL-18 0.2μgを、day 0〜13連日腹腔内投与する。ガレクチン9改変体(h-G9NC(null))は、マウス1匹当り、100μg/300μl PBSを作成しday 0よりday 13まで連日腹腔内投与する。麻酔はいずれもネンブタール腹腔内投与で行う。
【０３１６】
効果判定の指標は第一に生存率とし、day 14まで生存し得た例については肺組織を調べた。
マウスサンプリングは次のように行った：
途中死亡例については死亡時に解剖し肺組織採取
day 14までの生存例についてはエーテル麻酔→眼窩より採血→頸椎脱臼→開胸→肺組織採取。
このモデルにおけるrhGal-9null腹腔内投与の効果を検討した。rhGal-9null投与群と非投与群それぞれのDay14での生存率を効果判定の基準とし、さらにDay 14での組織像を比較した。
【０３１７】
得られた結果を図４６及び４７に示す。図４６は生存率を示している。Day14での生存率では非投与群で30%（10匹中３匹生存）に対し、h-G9NC(null)(Gal-9)投与群では90%（10匹中９匹生存）であり、ガレクチン9改変体(h-G9NC(null):Gal-9)投与による生存率の改善がみられた。
【０３１８】
図４７はDay14での生存例の肺組織（HE染色、写真）を示す。非投与群では生存例でも、広範かつ強度の細胞浸潤をともなう肺間質の肥厚がみられた。ガレクチン9改変体(h-G9NC(null):Gal-9)投与群では間質の肥厚、細胞浸潤とも軽度で、正常組織の残存が多く見られた。よって、本モデルにおいてガレクチン9(Gal-9)は発症抑制の効果があることが示された。本試験では体重変化を見たが、非投与群では死亡例、生存例とも有意な体重変化は認められなかった。
【０３１９】
〔実施例２７〕
〔がん転移モデルへの活性〕
〔実験方法〕
B16/F10 細胞を使用してがん転移モデルへのガレクチン9改変体の作用を調べた。
細胞（5×105個/200μL）をC57/BL6マウス（SLC,6週齢の雌）の尾静脈に接種した。接種後直ぐにガレクチン9改変体(h-G9NC(null)、「Gal-9」と略記;100μg/300μL）もしくはPBS（各N=15）を尾静脈に投与、11日間連日投与（投与回数12回）を行った。投与後12日目に解剖し肺の結節数をカウントした。
【０３２０】
図４９に試験した結果（モデル動物の肺の外観）を示す。図５０に肺の結節数をカウントした結果を示す。ガレクチン９改変体投与群(Gal-9群)とPBS投与群(PBS群)で比較して、ガレクチン９改変体による転移抑制効果が認められた。肺の結節数の比較では、各群の平均結節数はガレクチン9改変体投与群(Gal-9) 231.3±20.87、PBS投与群(PBS) 122.1±13.61となりP<0.0001で有意性が認められ、ガレクチン9改変体によるがんの転移を抑制する効果が認められた。
【０３２１】
〔実施例２８〕
〔カラゲニン誘発炎症モデル： Carrageenan-inducedラットPaw Edema〕
カラゲニン(carrageenan, Izushi kagaku, Japan)は、その供給業者より入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。雌のLewisラット(5週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。ガレクチン9改変体の作用効果を調べるために、カラゲニン注射の10分前に、ラットにガレクチン9改変体（h-G9NC(null)、「gal-9」と略記; 30-300 μg/body (in PBS)を静脈内(i.v.)投与した。ポジティブコントロールとしてデキサメタゾン(Dex.)を3mg/kg、7mg/kg投与した。
【０３２２】
〔カラゲニン足蹠浮腫〕
Sugishita et al. (1981)の方法に従って、ラットにおけるカラゲニン誘発足蹠浮腫試験を行ってガレクチン9改変体（human null galectin-9, h-G9NC(null))の抗炎症活性を調べた。右後足の足裏にカラゲニン(0.15 ml; 1% w/v in saline)を注射する10分前に薬剤化合物(30, 100 and 300μg/body)あるいは担体(vehicle: PBS)を静脈内(i.v.)に投与した。浮腫を誘導した後、水銀置換型呼吸機能解析装置(mercury displacement plethysmography； Muromachi, Tokyo, Japan)を使用して-1, 2, 4, 6, 24, 48 及び 72 hでのカラゲニン注射した側の足とそれとは異なる側の足（右後足に食塩水液(saline)を注射）との容積を測定した。足の体積の変化を-1 hとそれぞれの時間との間の差異として計算した。カラゲニンにより誘導された浮腫を、カラゲニン注射した側の足とそれとは異なる側の足との間での差異としてそれぞれの動物に関して表した。
【０３２３】
統計的な解析は次のようにして行った。
特に断らない場合には、データは平均値(mean)±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAあるいはtwo-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してDunnett's Multiple Comparison Test又はBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０３２４】
〔結果〕
結果を図５１（ガレクチン9改変体）及び図５２（デキサメタゾン）に示す。ガレクチン-9改変体は、30μg/mouseでも発症の抑制効果が認められた。
【０３２５】
〔実施例２９〕
１．アジュバント関節炎モデルにおけるガレクチン-9改変体の鎮痛作用
〔方法〕
〔機械刺激による痛み
（Randall-Selitto test=垂直加圧による痛覚閾値の測定）〕
ミコバクテリウム・ブチリクム(Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, MI, USA) は、その供給業者より入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。雌のLewisラット(5週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。ガレクチン9改変体の作用効果を調べるために、アジュバントの注射の前後の0 to 22日において、ラットにガレクチン9改変体（h-G9NC(null)、「Gal-9」と略記) 30-300 μg/body (in PBS)を静脈内(i.v.)投与した。ポジティブコントロールとしてインドメタシン(Indo)を3 mg/kg投与した。
【０３２６】
〔アジュバント関節炎〕
雌のLewisラット(5週齢)の体重を測定し、尾にしるしを付けて、９匹の動物からなる群に分けた。アジュバントの注射の前に(day 0)、体重と両方の後足の足蹠の容積を記録した。次に、それぞれのラットの右後足にアジュバントを注射した。アジュバントを注射しなかった群を正常コントロール群 (normal age-matched controls (sham))とした。アジュバントの注射後の異なった日それぞれで、ラットを犠牲にする前に各群のラットの体重と足の容積を記録した。
【０３２７】
〔アジュバントのプロトコル〕
ミコバクテリウム・ブチリクム(Mycobacterium butyricum）を乳鉢中ですりつぶしてアジュバントを調製し、オイルと混ぜて、最終濃度10 mg/mlとした。27-ゲージの0.5-インチの針を使用してラットの右の後足の足裏に0.2 mlのアジュバントを注射した。
【０３２８】
〔機械的刺激による痛みの解析〕
Randall及びSelittoの手法を改変して、ガレクチン9改変体（human null galectin-9, h-G9NC(null))が、外からの押圧に対する急性炎症組織あるいは非炎症組織での末梢性の過敏症を軽減するといった鎮痛活性があるか否かを調べた。すなわち、雌のLewisラット(5週齢)の右後足にフロイントの完全アジュバント(Complete Freund's Adjuvant)をs.c.注射して、急性及び慢性の炎症を誘発した。アジュバントの注射の２日前及びアジュバントの注射の５日後に、外からの押圧に対する急性炎症組織あるいは非炎症組織での末梢性の過敏症をRandall及びSelittoテストにより測定し、そして25日目(days 25)までモニターした(1 time/week)。観察者がコントロールしながらデジタル式フォースゲージ(Imada, aichi, Japan)でもって炎症している側の足蹠及びそれとは異なる側の非炎症の足蹠の両方に外からの押圧を徐々にかけた(0-200 g)。痛覚閾値(pain threshold)を動物が最初に痛みを感じている兆候を示した時の圧と定義した。該兆候とは、指が延びたとき及び／又は足を引っ込めたり、泣き声を発した最初の時によって示されるものである。
【０３２９】
統計的な解析は、実施例２８と同様にして行った。すなわち、特に断らない場合には、データは平均値(mean)±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAあるいはtwo-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してDunnett's Multiple Comparison Test又はBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０３３０】
〔結果〕
結果を図５８（ガレクチン9改変体, Gal-9）及び図５９（インドメタシン）に示す。図中、それぞれの値は各示されているポイントでの動物（図５８：8-9匹(n=8-9)、図５９：９匹(n=9)）の平均値±SEMを示している。統計上の差異は、two-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異はBonferroni Post-Testを使用して評価した（＊p<0.05, ＊＊p<0.01, ＊＊＊p<0.001）。ガレクチン-9改変体を投与すると濃度依存性に炎症をおこしている部位のみではなく炎症を起こしていない部位に関しても痛覚刺激に対する閾値が上昇する(図６６ Left参照)。すなわちガレクチン-9改変体は全身性に痛覚の閾値を上げる。
【０３３１】
2.  カラゲニン誘発急性炎症モデル：Carrageenan-induced Paw Edema in rats
〔方法〕
カラゲニン(carrageenan, Izushi kagaku, Japan)は、その供給業者より入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。雌のLewisラット(5週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。ガレクチン9改変体の作用効果を調べるために、カラゲニン注射の10分前に、ラットにガレクチン9改変体（h-G9NC(null)、「gal-9」と略記; 30-300 μg/body (in PBS)を静脈内(i.v.)投与した。ポジティブコントロールとしてデキサメタゾン(Dex)を3mg/kg、7mg/kg投与した。
【０３３２】
〔機械的刺激による痛みの解析〕
Randall及びSelittoの手法を改変して、ガレクチン9改変体（human null galectin-9, h-G9NC(null))が、外からの押圧に対する急性炎症組織あるいは非炎症組織での末梢性の過敏症を軽減するといった鎮痛活性があるか否かを調べた。すなわち、雌のLewisラット(5週齢)の右後足にカラゲニンをs.c.注射して、急性及び慢性の炎症を誘発した。カラゲニンの注射の１日前及びカラゲニン注射の後６時間後に、外からの押圧に対する急性炎症組織あるいは非炎症組織での末梢性の過敏症をRandall及びSelittoテストにより測定し、そして75 hまでモニターした(1 time/day)。観察者がコントロールしながらデジタル式フォースゲージ(Imada, aichi, Japan)でもって炎症している側の足蹠及びそれとは異なる側の非炎症の足蹠の両方に外からの押圧を徐々にかけた(0-200 g)。痛覚閾値を動物が最初に痛みを感じている兆候を示した時の圧と定義した。該兆候とは、指が延びたとき及び／又は足を引っ込めたり、泣き声を発した最初の時によって示されるものである。
【０３３３】
統計的な解析は、実施例２８と同様にして行った。すなわち、特に断らない場合には、データは平均値(mean)±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAあるいはtwo-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してDunnett's Multiple Comparison Test又はBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０３３４】
〔結果〕
結果を図６０（ガレクチン9改変体, gal-9）及び図６１（デキサメタゾン）に示す。図中、それぞれの値は各示されているポイントで９匹(n=9)の動物の平均値±SEMを示している。統計上の差異は、two-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異はBonferroni Post-Testを使用して評価した（＊p<0.05, ＊＊p<0.01, ＊＊＊p<0.001）。ガレクチン-9改変体を投与すると濃度依存性に炎症をおこしている部位のみではなく炎症を起こしていない部位に関しても痛覚刺激に対する閾値が上昇する。すなわちガレクチン-9改変体は全身性に痛覚の閾値を上げる。
【０３３５】
〔実施例３０〕
〔ヒト関節液中におけるガレクチン-９改変体の安定性〕
反応条件
ヒトリウマチ関節液標本              160μL
G9NC(null) or G9(S)  (5μL in PBS)   40μL
すなわち、80%関節液中でガレクチン-9を37℃で24時間あるいは96時間（途中6、24、48、72時間でサンプリング）インキュベート
SDS処理とウエスタンブロット
サンプル                  4.5μL
H2O                      40.5μL
Sample buffer（4x, + 2-ME）  15μL
SDS-PAGEは12.5%（10μL/lane）。
【０３３６】
結果を図６２に示す。プロテアーゼ活性の高い関節液中でもガレクチン-9改変体〔G9NC(null)〕は、ガレクチン-9S〔G9(S)〕より安定であることが明らかになった。
【０３３７】
〔実施例３１〕
〔関節炎モデル〕
1.  抗体カクテル惹起モデル：ガレクチン-9改変体（i.v.投与）
〔方法〕
DBA/1J雌性マウス（7〜8週齢）を用い、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル（Chondrex社、No.62100）を動物の尾静脈に2 mg/0.5 mL/body投与する。その3日後に50μg/0.2mLのLPS（SIGMA, L6511）を腹腔内に投与した。さらにガレクチン-9改変体(h-Gal9NC(null)、「Gal-9」と略記)を30μg/200μLを動物の尾静脈に投与した。実験群はPBS投与群とh-Gal9NC(null)投与群として、Day0（LPS投与日）1回投与群とDay0から連日投与群（Day10まで、投与回数11回）の計3群で行った。各群は1日1回左右前後肢の関節の腫脹を測定し、スコア化を行った。
【０３３８】
〔結果〕
結果を図６３に示す。抗体カクテル投与後、LPSで関節炎を惹起する。関節炎は、ガレクチン９改変体の i.v.投与でも抑制された。また1回投与でも発症の抑制効果が認められた。
【０３３９】
2-1.  CIA（コラーゲン感作）モデル：ガレクチン-9改変体（i.p.投与）
〔方法〕
Bovine Collagen type II (BCII: コンドレックス社 cat no 2002-1)をcomplete adjuvant (CFA：Difco cat no 263810)に溶解、エマルジョンを作製しマウス(DBA/1J 7〜8週齢、雌）の尾根部に100μLずつ皮内注射する（BCII 0.1mg/100μL/mouse）。感作21日後にブースター注射を行い、四肢を週3回スコアリングする。ブースター後、直ちにガレクチン-9改変体(「Gal-9」と略記; 30 μg/mouse)もしくはPBSを腹腔内に投与し、以後連日投与を行った。
マウススコアリング（関節炎所見）は各マウスの四肢を複数人で観察し、四肢の合計点数を算出（最高16点）し、平均スコアを算出する。
【０３４０】
(1)指が1本腫脹            ：1点
(2)指が2本以上腫脹        ：2点
(3)手（足）の甲まで腫脹    ：3点
(4)激しい腫脹、変形        ：4点
【０３４１】
〔結果〕
結果を図６４に示す。ガレクチン-9改変体により発症抑制効果が認められた。
【０３４２】
2-2.  CIA（コラーゲン感作）モデル：ガレクチン-9改変体（i.v.投与）
〔方法〕
Bovine Collagen type II (BCII: コンドレックス社 cat no 2002-1)を予めMycobacterium Tuberculosas H37 Ra,desiccated.(H37 Ra：Difco)を加えたimcomplete Freund's Adjuvant(IFA：Difco)と溶解、エマルジョンを作製しマウス(DBA/1J 7〜8週齢、雌）の尾根部に100μLずつ皮内注射する（BCII 0.2mg/H37 Ra 0.2mg/100μL/mouse）。感作21日後にブースター注射を行い、四肢を週3回スコアリングする。マウススコアリング（関節炎所見）は各マウスの四肢を複数人で観察し、四肢の合計点数を算出（最高16点）し、平均スコアを算出する。
【０３４３】
ブースター後、直ちにガレクチン-9改変体(Gal-9と略記; 30 μg/mouse：N=15)もしくはPBS(N=10)を尾静脈内に投与し、以後28日間連日投与を行った。
参考文献：Enhancement of collagen-induced arthritis in mice genetically deficient in extracellular superoxide dismutase.  Ross AD, Banda NK, Muggli M, Arend WP. Arthritis Rheum. 2004 Nov;50(11):3702-11.
【０３４４】
〔結果〕
結果を図６５に示す。ガレクチン-9改変体のi.v.投与においても発症の抑制が認められた。
【０３４５】
3.  アジュバント関節炎(AIA)モデル：ガレクチン-9改変体（i.v.投与）
〔方法〕
ミコバクテリウム・ブチリクム(Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, MI, USA) は、その供給業者より入手した。動物への投与のためには、すべての実験で担体(vehicle)としてPBS(-)を使用し、化合物をそれに懸濁して行った。雌のLewisラット(5週齢)はSLC (静岡, 日本)より購入し、実施例１９と同様にして飼育した。ガレクチン9改変体の作用効果を調べるために、アジュバントの注射の前後の0 to 22日において、ラットにガレクチン9改変体（h-G9NC(null)、Gal-9と略記; 30-300 μg/body (in PBS)を静脈内(i.v.)投与した。
【０３４６】
〔アジュバント関節炎〕
雌のLewisラット(5週齢)の体重を測定し、尾にしるしを付けて、９匹の動物からなる群に分けた。アジュバントの注射の前に(day 0)、体重と両方の後足の足蹠の容積を記録した。次に、それぞれのラットの右後足にアジュバントを注射した。アジュバントを注射しなかった群を正常コントロール群 (normal age-matched controls (sham))とした。アジュバントの注射後の異なった日それぞれで、ラットを犠牲にする前に各群のラットの体重と足の容積を記録した。
【０３４７】
〔足の容積〕
足の容積を水銀置換型呼吸機能解析装置(mercury displacement plethysmography； Muromachi, Tokyo, Japan)を使用して測定した。足の容積の変化をday 0とそれぞれの日との間の差異として計算した。
【０３４８】
〔臨床上の評価〕
各足の関節炎の程度を、前肢あるいは後肢の、1.指節骨関節及び指、2.甲部又は掌、3.くるぶし関節又はリスト部について、次のように0〜3のスケールに分けて評価した： 0, 何らの紅斑も腫張なし; 1, 軽度の紅斑又は腫張;  2, くるぶし関節又はリスト部の中程度の紅斑又は腫張; 3, 重度の紅斑又は腫張。
異なるラット群で、病状スコア付けを行った。等級化された足蹠関節炎のスコアの和をとって、各ラットの毎日の関節炎スコアのトータルを取得した。
【０３４９】
〔アジュバントのプロトコル〕
ミコバクテリウム・ブチリクム(Mycobacterium butyricum）を乳鉢中ですりつぶしてアジュバントを調製し、オイルと混ぜて、最終濃度10 mg/mlとした。27-ゲージの0.5-インチの針を使用してラットの右の後足の足裏に0.2 mlのアジュバントを注射した。
【０３５０】
統計的な解析は、実施例２８と同様にして行った。すなわち、特に断らない場合には、データは平均値(mean)±SEMで示してある。データセットの統計上の差異は、one-way ANOVAあるいはtwo-way ANOVAを使用して解析した。そしてグループ間の差異は市販の統計ソフト(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)を使用してDunnett's Multiple Comparison Test又はBonferroni Post-Testでもって評価した。P値の<0.05は、統計的に有意であると考えられる。
【０３５１】
〔結果〕
結果を図６６（ガレクチン9改変体, Gal-9）及び図６７（インドメタシン, Indo）に示す。アジュバント関節炎は主として自然免疫とT細胞が関与した獲得免疫による炎症である。ガレクチン-9改変体はどちらの炎症も抑制するが、主として獲得免疫による炎症を強く抑制する。尚、体重の増減はインドメタシン投与群およびガレクチン-9改変体投与群では同様な傾向を示した。
【０３５２】
〔実施例３２〕
〔ラットCIA（コラーゲン感作）モデル：ガレクチン-9改変体（i.v.投与）〕
〔方法〕
ウシ タイプIIコラーゲン(コラーゲン技術研修会)をimcomplete Freund's Adjuvant (IFA：Difco)に溶解、エマルジョンを作製しラット(DA/Slc 11週齢:日本エスエルシー)の背部皮膚内に500μLずつ皮内注射（コラーゲン 50μg/500μL/mouse）して一次感作する。その1週間後に同コラーゲンエマルジョン液（コラーゲン 50μg/500μL/mouse）を動物の尾根部に投与し、二次感作した。四肢を週3回スコアリングする。ブースター後、直ちにガレクチン-9改変体(null human galectin-9=h-G9NC(null); 3,10,30 μg/1 mL/mouse)、陰性対照物質であるPBS(1 mL/mouse)を静脈内に、陽性対照物質のプレドニゾロン(3mg/10mL/kg: SIGMA)は経口投与を、毎日１回、38日までの32日間行う。
【０３５３】
コラーゲン一次感作日（0日）、一次感作後7, 15, 18, 22, 26, 30, 35及び39日に左右後肢の足容積を測定し、次式に従い浮腫率（%）を算出する。
【０３５４】
浮腫率(swelling)（％）＝［感作後の足蹠容積（mL）−感作前の足蹠容積（mL）］/［感作前の足蹠容積（mL）］x100
【０３５５】
統計学的処理は次のように行った。左右後肢の加算を個体値とした、浮腫率（％）の平均値及び標準誤差で表す。PBS群とプレドニゾロン群との間でF検定により等分散性を検定し、等分散の場合にはStudentのt検定を、不等分散の場合にはAspin-Wechのt検定を行う。次にPBS群とガレクチン９改変体群との間でBartlet検定により等分散性を検定し、等分散性の場合にはパラメトリックDunnett's testを、不等分散性の場合にはノンパラメトリックDunnett's testを行う。いずれも有意水準は5%未満（p<0.05）を有意とし、5%未満および1%未満（p<0.01）とに分けて表示する。得られた結果を図６８及び表３に示す。表３中、それぞれの値は平均値±SEMを示している。＃＃：コントロールからの有意の差異（15, 18, 22 Day: Studentのt検定、＊p<0.05, ＊＊p<0.01：コントロールからの有意の差異（18, 22 Day: パラメトリックDunnett's test; 15 Day: ノンパラメトリックDunnett's test）。ガレクチン９改変体により発症の抑制が認められた。
【０３５６】
【表３】
0004792390.tif 000004
【０３５７】
本ガレクチン９改変体（安定化ガレクチン９、例えば、h-G9NC(null)など）は、次のような生物活性：
腫瘍細胞の凝集・・・・・・多くの腫瘍細胞での凝集効果
接着阻害・・・・・・・・・細胞外マトリックスへの接着阻害効果
アポトーシス、細胞傷害・・多くの腫瘍細胞でアポトーシス誘導
樹状細胞(DC)の活性化・・・DC分化誘導
ＮＫ、ＮＫＴ活性化・・・・動員促進
痛みの抑制・・・・・・・・カプサイシンによる痛みの抑制
から期待される抗腫瘍効果を示す。
【０３５８】
本発明者等のグループは、乳がん組織におけるガレクチン９の発現を検討し、ガレクチン９陽性例では遠隔転移頻度が低いことを確認した。そして、現在、転移予知診断キットの開発を進めている (Clin Cancer Res, 2005 in press, Galectin-9 as a prognostic factor with anti-metastatic potential in breast cancer)。そして、ガレクチン９遺伝子導入ヒト乳がん細胞株がインビトロで高い凝集性を示し、ヌードマウス体内でも同様の凝集性を示すことも確認した。また、血球系悪性腫瘍を含め、多くの細胞系に対する細胞障害活性がそれに認められ、その多くはアポトーシスの誘導によることも確認されている(Int J Cancer.2002 20;99(6):809-816, Possible role of galectin-9 in cell aggregation and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance; J immunol. 2003 1;170(7d):3631-3636, Galectin-9 induces apoptosis through the carcium-calpain-caspase-1 pathway)。さらに、ガレクチン９投与局所にはNK/NKT細胞、Mφ系細胞などの動員が認められ、細胞性がん免疫機構誘導の可能性が示唆されている。
【０３５９】
以上のことから、安定化ガレクチン９（本発明のガレクチン９改変体、例えば、h-G9NC(null)など）は白血病などの血球系悪性腫瘍、術後の遊離がん細胞に対する殺細胞効果、がん細胞の凝集・がん細胞の血管壁接着や他の組織への浸潤を阻害することで転移抑制、癌性腹膜炎発症の抑制効果、さらに腫瘍周辺部位へのエフェクター細胞の動員による腫瘍免疫活性の亢進など効果を有すること、さらにはより好ましい作用効果が期待でき、副作用の少ない新規抗がん物質となることが期待される。
【０３６０】
現在開発中の生物製剤（モノクローナル抗体など）は、免疫細胞表面分子、細胞内機能分子や炎症性サイトカインを標的としている。すなわち阻害効果をもって薬理作用とする薬剤である。一方、本安定化ガレクチン９分子製剤は、滑膜細胞や活性化Ｔ細胞のアポトーシス誘導と骨破壊の抑制作用により、生体が本来持っている免疫調節作用、抗炎症作用や骨・軟骨組織の再生も期待される、抗サイトカイン療法などとまったく発想の異なる新しい開発アプローチである。痛みは関節リウマチの主要所見で、上記実施例で使用しているカプサイシンは神経性炎症における炎症性疼痛を惹起する重要なメディエーターであり、安定化ガレクチン９はカプサイシン塗布による耳介腫脹を抑制する。すなわち、副作用の少ない新たな全身性自己免疫疾患の治療薬として期待される。本安定化ガレクチン９は新規作用機作による副作用の少ない抗リウマチ剤になりうる。本安定化ガレクチン９は、炎症抑制と関節組織の修復、痛みの抑制といった臨床効果上の特徴を有し、(1)活性化T細胞のアポトーシスの誘導、(2)滑膜細胞のアポトーシス、(3)アラキドン酸カスケード、(4)骨破壊抑制などといったメカニズムを期待できてリウマチ治療薬として有望である。実際、関節炎 (CIA、抗体カクテル）モデルにおける発症抑制が確認されているのである。
【産業上の利用可能性】
【０３６１】
ガレクチン９改変体は、野生型のものよりも酵素に対して抵抗性があることから、ガレクチン９が示す多面的な作用・機能を有効利用するのに役立つ。野生型ガレクチン９は、腫瘍に対する直接作用（腫瘍細胞の細胞間接着とアポトーシスを誘導する活性）、免疫系を介した作用により、ガンの転移抑制と退縮を誘導することが示唆されているが、本ガレクチン９改変体は、同様な活性を示すより有利な活性物質、例えば、抗腫瘍薬などとして期待できる。野生型ガレクチン９は、非活性化リンパ球には作用せず、活性化T細胞、特に過剰免疫反応の原因となるCD4陽性T細胞のアポトーシスを誘導することから、本ガレクチン９改変体は、同様な活性を示すより有利な活性物質、例えば、抗炎症薬、抗アレルギー薬、骨粗しょう症薬として期待できる。野生型ガレクチン９は、リウマチにおいて関節の変形等に関与する滑膜細胞に対して強力なアポトーシス誘導能を持つことが明らかであるから、本ガレクチン９改変体は、同様な活性を示すより有利な活性物質として期待できる。このようにガン治療薬や難治性の自己免疫疾患（リウマチを含む）、アレルギー疾患、炎症疾患、骨代謝に関わる疾患に対する治療薬の開発・ガレクチン９の機能解明・研究開発に利用できる。
【０３６２】
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表フリーテキスト】
【０３６３】
SEQ ID NO: 1, Description of Artificial Sequence: Polynucleotide for galectin-9 mutein, G9NC(null)
SEQ ID NO: 2, Description of Artificial Sequence: Polynucleotide for galectin-9 mutein
SEQ ID NO: 5, galectin-9 medium isoform
SEQ ID NO: 10, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 11, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 12, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 13, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
【図１】
0004792390.tif 000005
【図２】
0004792390.tif 000006
【図３】
0004792390.tif 000007
【図４】
0004792390.tif 000008
【図５】
0004792390.tif 000009
【図６】
0004792390.tif 000010
【図７】
0004792390.tif 000011
【図８】
0004792390.tif 000012
【図９】
0004792390.tif 000013
【図１０】
0004792390.tif 000014
【図１１】
0004792390.tif 000015
【図１２】
0004792390.tif 000016
【図１３】
0004792390.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
0004792390.tif 000019
【図１６】
0004792390.tif 000020
【図１７】
0004792390.tif 000021
【図１８】
0004792390.tif 000022
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
0004792390.tif 000033
【図３０】
0004792390.tif 000034
【図３１】
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【図３２】
0004792390.tif 000036
【図３３】
0004792390.tif 000037
【図３４】
0004792390.tif 000038
【図３５】
0004792390.tif 000039
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
0004792390.tif 000046
【図４３】
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【図４４】
0004792390.tif 000048
【図４５】
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【図４６】
0004792390.tif 000050
【図４７】
0004792390.tif 000051
【図４８】
0004792390.tif 000052
【図４９】
0004792390.tif 000053
【図５０】
0004792390.tif 000054
【図５１】
0004792390.tif 000055
【図５２】
0004792390.tif 000056
【図５３】
0004792390.tif 000057
【図５４】
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【図５５】
0004792390.tif 000059
【図５６】
0004792390.tif 000060
【図５７】
0004792390.tif 000061
【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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