(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腺癌細胞系統２３１３２（ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０１）上に存在するが、正常細胞上には存在しないグリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質の少なくとも一断片を有する単離された糖タンパク質であって、前記グリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動において約８２ｋＤの見掛けの分子量を示し、かつ前記グリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質の前記断片が、腫瘍特異的なＮ−結合した糖構造を含む単離された糖タンパク質。
【請求項２】
腺癌細胞系統２３１３２（ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０１）上に存在するが、正常細胞上には存在しないグリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質の少なくとも一断片を有する単離された糖タンパク質であって、前記グリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動において約８２ｋＤの見掛けの分子量を示し、かつ前記グリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質の前記断片が、腫瘍特異的なＮ−結合した糖構造を含み、かつ前記断片の前記腫瘍特異的なＮ結合した糖構造に特異的に結合する抗体が、結合後に前記グリコシル化されたヒトのＣＤ５５タンパク質を発現する細胞のアポトーシスを誘導する単離された糖タンパク質。
【請求項３】
膜調製物をヒトの腺癌細胞系統２３１３２（ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０１）の細胞から製造し、かつその調製物から糖タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーによって得る、請求項１又は２記載の単離された糖タンパク質の生産方法。
【請求項４】
物質と糖タンパク質との結合能力を測定する試験法における、請求項１又は２記載の単離された糖タンパク質の使用。
【請求項５】
糖構造との結合能力を測定する、請求項４記載の使用。
【請求項６】
腫瘍細胞において、試験される物質のアポトーシス誘導能力を測定する、請求項４または５記載の使用。
【請求項７】
糖タンパク質ＣＤ５５に媒介されるチロシンリン酸化カスケードを誘導する、試験される物質の能力を測定する、請求項４から６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
単離された糖タンパク質を、単離形において、細胞抽出物、膜調製物として使用する、請求項４から７までのいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
特異的に腫瘍細胞に結合可能な物質を同定するための、請求項４から８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
腫瘍診断および／または腫瘍治療のための薬剤の同定のための、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
試験される物質が薬理学的に認容性である、請求項４から１０までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
試験される物質を、ペプチド、ペプチド様作用物、抗体、抗体断片および抗体誘導体から選択する、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
前記の糖構造への前記の抗体の結合がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の分解を誘導しない、請求項２記載の糖タンパク質。
【請求項１４】
請求項２記載の単離された糖タンパク質であって、前記糖構造への前記の抗体の結合がサイトケラチン１８の分解をもたらすことを特徴とする糖タンパク質。
【請求項１５】
請求項２記載の単離された糖タンパク質であって、前記糖構造への前記の抗体の結合がｃ−ｍｙｃ発現の増大をもたらすことを特徴とする糖タンパク質。
【請求項１６】
請求項２記載の単離された糖タンパク質であって、前記糖構造への前記の抗体の結合がトポイソメラーゼＩＩα発現の低下をもたらすことを特徴とする糖タンパク質。
【請求項１７】
請求項２記載の単離された糖タンパク質であって、前記糖構造への前記の抗体の結合が細胞内Ｃａ2+濃度の増大をもたらすことを特徴とする糖タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤を得るための物質ならびに方法に関する。
【０００２】
胃癌は世界で最も頻発する癌の種類である。ラウレン（Lauren）の“胃癌の２種類の組織学的主要型”（Lauren "The two histological main types of gastric carcinoma", Acta Path Microbiol Scand; 64:331-49）によれば、これらは組織学的にび漫性腺癌および腸腺癌に分類される。腸胃癌（intestinale Magenkarzinoma）はしばしば慢性胃炎Ｂ、特に腸上皮異形成を併発し、これらは形成不全変化および胃癌の前駆症状としてみなされる。前記の両方の種類間の差異は、び漫性の癌を有する患者がしばしば血液型Ａに属することにあり、そこから癌の危険性における遺伝因子の影響を推測できるが、環境因子、例えばヘリコバクターピロリ感染が、場合によっては腸型の発癌に関して重要である。西洋人において胃腺癌の頻度の減少が確認されているが、それに対して東洋人においてはその発生が増加している。
【０００３】
今までは治療は胃切除及びリンパ節切除に制限されていたが、なお芳しくない予後に基づき必要に応じて新規の付随する治療が存在する。免疫学的な研究によって、免疫系が悪性細胞を効果的に撲滅できない場合にも、細胞性及び体液性の活性を測定できるが、腫瘍細胞を撲滅させるには不十分であることが示された。効果の大きい試みは今では患者の免疫応答に由来する抗体を単離し、好適に増やし、かつ治療用に使用することである。このように肺癌、食道癌および大腸癌を有する患者に由来する抗体を単離し、これからヒトのモノクローナル抗体を得る。該抗体は腫瘍細胞の分化および増殖に直接作用するが、これらは別の腫瘍細胞または健康な細胞と相互作用するという問題を伴う。
【０００４】
ヒトのモノクローナルＳＣ−１抗体は胃癌細胞においてアポトーシスを引き起こすことが知られている（Vollmer et al., Cancer 49(1989), 2471-2476）。該抗体はび漫性型の腺癌の殆ど全てと反応し、かつ腸型の腺癌の約２０％と反応する（Vollmer et al., Cancer 76(1995), 550-558; Vollmer et al., Cancer 79(1997), 443-440）。臨床的検査において、抗体ＳＣ−１は腫瘍特異的退縮及びアポトーシスを初期の胃癌において正常な組織に対して毒性の交差反応性を伴わずに誘導できることが見いだされた（Vollmers et al., Oncol. Rep. 5(1998), 549-552）。
【０００５】
アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、ＤＮＡの断片化、細胞の萎縮及び小胞体の膨張、引き続きの細胞の断片化及び膜小胞、いわゆるアポトーシス小体による細胞の自殺を導く。細胞死の生理学的な形のアポトーシスは壊死の場合のような炎症プロセスおよび組織損傷を伴わずに不必要な細胞を迅速かつ完全に除去することを保証する。病理学的条件下で、アポトーシスは悪性細胞、例えば前癌細胞の除去にも役立つ。アポトーシスは非常に様々な刺激によって、例えば細胞毒性のＴ−リンパ球またはサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子、グルココルチコイド及び抗体によってもでさえも引き起こされる。アポトーシスは真核細胞死の最もよくある原因であり、かつ胚発生、変態及び組織萎縮において生じる。細胞表面のアポトーシス性受容体、例えばＮＧＦ／ＴＮＦ−ファミリーのそれぞれは主にリンパ球上に発現するが、種々の別の細胞型においても見られ、そのため該受容体は癌治療のために適当でない。特にインビボ試験においてこれらの受容体のためのリガンド及び抗体は肝障害を引き起こす。従ってアポトーシス性機能を有する腫瘍特異的受容体は特に重要である。
【０００６】
モノクローナル抗体ＳＣ−１の細胞受容体は今まで知られていなかった。本発明に導く調査の範囲において、前記の細胞受容体を同定することができる。しかしながら同定は困難であるとされていた。一方モノクローナル抗体ＳＣ−１はウェスタンブロット分析において、厳密に規定されたストリンジェントな条件下にのみそれらの受容体と反応する。他方では、変性人工産物によって引き起こされる、一連の他のタンパク質との非特異的反応が見られる。
【０００７】
抗体ＳＣ−１の細胞受容体は腫瘍細胞、特に胃癌細胞に特異的なタンパク質のイソ型ＣＤ５５／ＤＡＦであり（Medof et al., J. Exp. Med. 160(1984), 1558-1578; Caras et al., Nature 325(1987), 545-549; Bjorge et al., Int. J. Cancer 70(1997), 14-25）、これは正常な組織中には出現しない。前記のイソ型の特異的受容体特性はタンパク質主鎖とＮ−結合を介して結合した特定の糖構造に基づく。腫瘍特異的受容体をスクリーニング法において特異的な結合パートナーの同定のために使用することができる。受容体への特定の結合パートナーは本発明の意味では、腫瘍特異的な糖構造に選択的に結合するが、正常な細胞に存在するＣＤ５５／ＤＡＦの糖構造に著しく結合せず、有利にはアポトーシス誘導能力を有するような物質である。これらの特異的な結合パートナーはアポトーシス誘導および／または腫瘍撲滅のための治療剤の製造ならびに診断薬の製造のために使用することができる。
【０００８】
ＣＤ５５／ＤＡＦタンパク質の腫瘍特異的なＮ−結合した糖構造への抗体ＳＣ−１の結合は３種のタンパク質のチロシンリン酸化及びカスパーゼ−３及びカスパーゼ−８の活性化を誘導する。更に抗体ＳＣ−１によって誘導されるアポトーシスは腫瘍細胞表面上で腫瘍特異的にＮ−グリコシル化されたＣＤ５５／ＤＡＦの提示を一時的に高める。その高められた提示は高められた発現及び高められたグリコシル化によって惹起することができる。引き続き細胞膜の腫瘍特異的にＮ−グリコシル化されたＣＤ５５／ＤＡＦタンパク質はエンドサイトーシスによって消失する。更にサイトケラチン（Cytokeratin）１８の分解、ｃ−ｍｙｃの高められた発現及びトポイソメラーゼＩＩαの発現の低下ひいては少なくとも部分的な細胞周期停止が観察される。ＳＣ−１によって誘導されるアポトーシス性プロセスはポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の高められた分解をもたらさない。更に細胞内のＣａ２＋プールから遊離される細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が見られる。Ｃａ２＋遊離の阻害はＳＣ−１によって誘導されるアポトーシスを阻害する。
【０００９】
本発明の第１の態様はＣＤ５５／ＤＡＦ、特に膜結合しているイソ型ＤＡＦ−Ｂのアミノ酸一次構造の少なくとも一断片および腫瘍細胞に特異的な糖構造、特にモノクローナル抗体ＳＣ−１と反応するような糖構造を有する糖タンパク質に関する。例えばヒトの腺癌細胞系統２３１３２（ＤＳＭ ＡＣＣ２０１）または別のヒトの腺癌細胞系統、例えば３０５１（ＤＳＭ ＡＣＣ２７０）または２９５７（ＤＳＭ ＡＣＣ２４０）または胃腺癌患者の初期腫瘍細胞から得られる糖タンパク質はＳＤＳ−ゲル電気泳動（還元条件下での）において約８２ｋＤの見掛けの分子量を有する。この８２ｋＤのタンパク質の他に本発明は、欠失、挿入および／または置換をアミノ酸一次構造に有するが、天然のタンパク質に類似の、すなわち腫瘍特異的かつ有利には抗体ＳＣ−１と反応性の糖構造を有する変異体にも関する。
【００１０】
本発明による糖タンパク質は、所望の糖構造を有するタンパク質を発現する細胞、例えばヒトの腺癌細胞系統２３１３２または別のヒトの腺癌細胞系統から膜調製物を製造し、そこから糖タンパク質をクロマトグラフィー法、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーによって獲得することで得ることができる。膜調製物の製造は、有利には低張バッファー中での細胞溶解、超音波処理および引き続いての細胞核の分離によって実施する。膜調製物は残りの抽出物から遠心分離によって単離でき、かつクロマトグラフィー法によって更に精製することができる。
【００１１】
腫瘍特異的なＣＤ５５／ＤＡＦ−糖タンパク質は、腫瘍特異的な糖タンパク質、特にその糖構造への物質の結合力を規定する試験法において使用することができる。該試験法は大量スクリーニング（Hochdurchsatz）法として自動化することができる。そのために、糖タンパク質を単離形で、細胞抽出物として、特に膜調製物としてか、または完全な細胞の形もしくは、特にヒトの腺癌細胞系統２３１３２または別のヒトの腺癌細胞系統の１つの形で、またはＣＤ５５遺伝子で形質転換させた正確な糖構造を有するタンパク質を産出可能な異種真核細胞、例えばホニュウ類細胞の形で使用することができる。試験される物質の、正常なヒトの細胞または細胞系統から得られる非腫瘍のＣＤ５５／ＤＡＦ糖タンパク質への結合をコントロールとして検査してよい。選択的に腫瘍特異的な糖タンパク質に結合する物質は治療薬および／または診断薬の製造のために適当である。
【００１２】
有利には更に、特に腫瘍細胞における試験される物質のアポトーシス誘導能力および／またはＣＤ５５／ＤＡＦに媒介されるリン酸化カスケードの誘導能力を規定する。アポトーシスの誘導は形態学的な細胞調査、アポトーシス試験法、例えば付着試験（Vollmers et al., Cell 40(1985), 547-557）、ケラチン１の断片化及びＤＮＡ断片化又は増殖試験、例えばＭＴＴ−増殖試験によって実施できる。選択的にカスパーゼ活性、例えばカスパーゼ−８および／またはカスパーゼ−３の活性の測定または細胞内の遊離カルシウム濃度の測定を実施してもよい。選択的に腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する物質は抗腫瘍作用物質として使用できる。リン酸化カスケードの誘導はリン含有基、例えばホスホチロシン基および／またはホスホセリン基に特異的な抗体の使用によって実施できる。
【００１３】
目的に応じて、薬理学的に認容性の物質を試験する。このために、低分子量の薬理学的作用物質、特にペプチド、ペプチド様作用物、抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または組み換え抗体、抗体断片または抗体誘導体が挙げられる。ＣＤ５５／ＤＡＦ−受容体のリガンドのための他の例はアプタマー（NexStar Pharmaceuticals, 2860 Wilderness Place, Boulder, Colorado 80301, USA）およびシュピーゲルマー（Spiegelmer）（Noxxon Pharma, Gustav-Meyer-Allee 25, 13355 Berlin）である。特に有利には、例えば組み換え抗体、例えばＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞（Plueckthun, Bio/Technology 9(1991), 545-551 およびそこに挙げられる文献部分）または真核宿主細胞（Reff, Curr. Opinion Biotech. 4(1993), 573-576およびTrill et al., Curr. Opinion Biotech 6 (1995), 553-560またはそこに挙げられる文献部分）で産生できるような単鎖のｓｃＦｖ−抗体である。更に有利にはヒトの抗体、すなわち例えば癌患者の人体中で産生されるようなヒトの定常ドメインを有する抗体またはキメラ抗体および人化抗体であり、これらにおいては本来の存在する非ヒトの定常ドメインおよび／またはフレームワーク領域は相応のヒトの領域と交換されている。抗体断片のための例はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片またはＦａｂ′断片であり、例えばこれらは抗体のタンパク質分解によって得られる。抗体誘導体には、例えば抗体と標識基および／またはエフェクター基、例えば毒性物質、例えばコレラトキシンまたはシュードモナスエキソトキシンＡまたは放射活性物質との複合体が挙げられる。
【００１４】
本発明の更なる態様は、本発明による腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦに特異的に結合する物質（既に知られたモノクローナル抗体ＳＣ−１以外）をアポトーシス誘導剤の製造のため、および／または抗腫瘍剤の製造のため、および／または腫瘍診断のための薬剤の製造のために使用することである。本願の意図する腫瘍特異的または腫瘍選択的な結合は、有利には物質が免疫組織化学的検出において腫瘍細胞と反応するが、他の細胞とは著しく反応しないことを意味する。本願の意図するアポトーシス誘導は、アポトーシス率の増大を意味する、すなわちアポトーシス細胞の割合が増殖細胞に対する物質での処理後に未処理よりも高い、有利には５０％より高いことを意味する。未処理での自発的なアポトーシス率は明らかに１０％以下であり、その際、増殖細胞の検出は抗原Ｋｉ６７を介して実施できる。
【００１５】
なお本発明の更なる態様は、アポトーシスを誘導する薬剤および／または抗腫瘍剤の製造方法および／または腫瘍診断のための薬剤の製造方法であり、その際、潜在的に作用を有する物質を本発明による糖タンパク質に特異的に結合する能力に関して試験し、かつ試験結果が陽性の場合には該物質を医薬品への使用に適当な投与形に場合により慣用の助剤及び賦形剤と一緒に変換させる。
【００１６】
適当な医薬品投与形は作用物質を治療的有効量で、特に抗腫瘍作用量で含有する。患者に投与される用量および治療期間は疾患の種類及び重度に依存する。抗体を投与するための適当な用量は、例えばレダーマン他（Ledermann et al.(Int. J. Cancer 47(1991), 659-664）及びバグシャーベ他（Bagshawe et al.(Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4(1991), 915-922）に記載されている。
【００１７】
作用物質を単独、または他の作用物質と組み合わせて同時にか、または連続的に投与してもよい。医薬品組成物は作用物質の他に医薬品に慣用の物質を含有していてよい。該組成物は、例えば経口、経鼻、肺または注入によって投与してよい。経口的に投与される組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤または液剤の形で存在していてよい。注入によって投与可能な組成物は通常、非経口的に投与可能な水溶液または懸濁液の形である。
【００１８】
更に本発明は腫瘍の撲滅のための方法に関し、その際、患者、特にヒトの患者に、本発明による糖タンパク質に特異的に結合可能な、モノクローナル抗体ＳＣ−１以外の物質の抗腫瘍作用量を投与する。
【００１９】
腫瘍特異的なＣＤ５５／ＤＡＦタンパク質のための結合パートナーは診断目的のため、例えば腫瘍イメージングのために使用することができる。腫瘍イメージのための適当な方法は、例えばシュタインシュトレッサー他（Steinstraesser et al.(Clinical Diagnosis and Laboratory Medicine 2(1989),1-11）に記載されている。このために、結合パートナーは有利には標識基、例えば放射活性標識基または蛍光性標識基との複合体の形で使用される。選択的に、複合されていない結合パートナーを試験されるべき試料とインキュベートし、引き続き二次結合試薬で染色してもよい。
【００２０】
従って本発明の対象は腫瘍の診断のための方法であり、その際、試験される試料、例えば体液または組織試料または患者を腫瘍特異的なＣＤ５５／ＤＡＦ糖タンパク質に結合可能な物質と接触させて、試料または患者内における糖タンパク質の存在、局在および／または量を検出する。
【００２１】
なお本発明の対象は、特異的に腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦが結合する物質を、リン酸化カスケードの作動のために使用することである。なお本発明の更なる対象は特異的に腫瘍の糖タンパク質のＣＤ５５／ＤＡＦに結合する物質を、細胞表面上での腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦの提示を高められたグリコシル化および／または発現によって一時的に高めるために使用することである。引き続き細胞表面の腫瘍特異的な糖タンパク質は消失する。なお本発明による更なる対象は選択的に腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦに結合する物質を、細胞内のカルシウム含有量の増大のために使用することである。特異的に腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦに結合する物質は細胞周期停止のための薬剤としても使用することができる。また最後に本発明は、特異的に腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦに結合する物質をＰＡＲＰの分解を含まないアポトーシスプロセスの誘導のために使用することにも関する。これらの物質は場合により標識基および／またはエフェクター基との複合体として使用してよい。
【００２２】
なお本発明の更なる対象は特異的に腫瘍の糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦに結合する物質、特に抗体ＳＣ−１を休止している（ruhende）腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導のために使用することである。この所見は発明者の知識状態によれば、今まで依然として腫瘍選択的物質に関しては知られていなかった。
【００２３】
腫瘍特異的糖タンパク質ＣＤ５５／ＤＡＦに結合する物質は、有利には複数の、すなわち少なくとも２つのＣＤ５５／ＤＡＦのための結合部位を有する。例えばこれらの物質は３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上の結合部位を有するので、結合の際には細胞に常設の腫瘍特異的ＣＤ５５／ＤＡＦに架橋が生じる。複数の結合部位を有する物質を得るために、結合分子は場合により架橋してよい。架橋は、例えば化学結合、例えば二官能性のリンカー分子または高親和性の相互作用、例えばストレプトアビジン／ビオチンを介して行われる。またＣＤ５５／ＤＡＦ結合分子が、例えば抗体、例えば既に複数の結合部位を有するＩｇＧまたはＩｇＭである場合に、例えば抗ＩｇＧ抗体または抗ＩｇＭ抗体を介する架橋によってアポトーシス誘導の改善がなおも達成できる。架橋された抗体の使用は従って有利である。
【００２４】
細胞系統２３１３２はドイツ細胞バンクＧｍｂＨ（ブラウンシュバイク）から整理番号ＤＳＭ ＡＣＣ２０１として入手できる。
【００２５】
更に本発明を以下の実施例及び図面によって詳説する。
【００２６】
図１：抗体ＳＣ−１と反応性の抗原の同定。
【００２７】
ａ：胃癌細胞系統２３１３２の膜抽出物からのＳＣ−１抗原の精製
ｂ：ＳＣ−１抗原として同定される８２ｋＤタンパク質のナノエレクトロスプレー−タンデム−質量分析による配列決定
図２：ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によるＧＰＩアンカーの分解のＳＣ−１染色への影響。ＳＣ−１（ａ）及び抗ＥＭＡ（ｃ）で染色された細胞系統２３１３２の未処理の胃癌細胞；ＳＣ−１（ｂ）及び抗ＥＭＡ（ｄ）で染色されたＰＩ−ＰＬＣで処理された細胞。（４００×拡大）
図３：胃癌細胞における抗体ＳＣ−１でのＭＴＴ試験の結果。コントロール：未処理の細胞；ＳＣ−１：ＳＣ−１で処理された細胞；ＳＣ−１，ＰＩＰＬＣ：ホスホリパーゼで処理し、引き続きＳＣ−１で処理された細胞。
【００２８】
図４：ＣＤ５５−アンチセンスベクターを一過性トランスフェクションさせた細胞の分析結果。コントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞はＳＣ−１（ａ）及び抗ＣＥＡ（ｃ）によって正常な染色パターンを示す。アンチセンスベクターをトランスフェクションさせた細胞ではＳＣ−１による染色が減少し（ｂ）、一方で抗ＣＥＡ（ｄ）による染色の変化は確認できなかった。
【００２９】
図５：クレノウ断片化試験（Klenow fragmentierungstest）の結果。トランスフェクションさせた細胞は、ポジティブコントロール（ｆ）と比較してＳＣ−１（ｅ）による誘導の不在下にはアポトーシスを示さない。ＳＣ−１でのインキュベーションの後にコントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞はアポトーシスを示し（ｇ）、一方でＣＤ５５アンチセンスベクターをトランスフェクションさせた多くの細胞はアポトーシスに対して耐性である（ｈ）。
【００３０】
図６：ＳＣ−１で誘導されたアポトーシスの定量的測定。コントロールベクター及びＣＤ５５アンチセンスベクターをトランスフェクションさせた細胞をＳＣ−１とインキュベートし、かつ細胞のサイトスピンをクレノウＤＮＡ断片化キット（Klenow DNA Fragmentierungskit）で染色する。アポトーシス細胞のパーセント数を２人の異なる人物からアポトーシス陽性細胞及びアポトーシス陰性細胞の計数によって、それぞれ約５００個の細胞を有する３つの異なる領域において測定した。
【００３１】
図７：抗体ＳＣ−１の結合における脱グリコシル化の作用。
【００３２】
ａ：バッファーとインキュベートし、かつＳＣ−１で染色された腫瘍細胞；
ｂ：Ｎ−グルコシダーゼ及びＳＣ−１とインキュベートされた細胞；
ｃ：バッファー及び抗ＣＤ５５とインキュベートされた細胞並びに
ｄ：Ｎ−グルコシダーゼ及び抗ＣＤ５５とインキュベートされた腫瘍細胞。
【００３３】
図８：胃癌細胞系統２３１３２におけるＳＣ−１によるＭＴＴ試験の結果。
【００３４】
ａ：ＳＣ−１価測定；
ｂ：ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体とのＳＣ−１の架橋。
【００３５】
図９：ＳＣ−１での細胞系統２３１３２の誘導後の細胞内カルシウム濃度の変化。１の時点でＳＣ−１もしくはコントロール抗体の添加を実施した。２の時点では、細胞をリンガー液で洗浄した。
【００３６】
図１０：ＳＣ−１での誘導後のカスパーゼ３及びカスパーゼ８の発現パターン及び活性パターン。
【００３７】
ａ：カスパーゼ３及びカスパーゼ８のウェスタンブロット分析。タンパク質分解に基づくカスパーゼ３の活性化はｐ２０分解生成物の発生によって確認できる。
【００３８】
ｂ：カスパーゼ８の活性測定の結果。カスパーゼ８活性の４倍の増大はアポトーシス誘導の２０時間後に見られた。
【００３９】
図１１：アポトーシス誘導後の細胞系統２３１３２のリン酸化パターン。
【００４０】
ａ：約１１０ｋＤ及び６０ｋＤの分子量を有するタンパク質中のチロシン残基の迅速なリン酸化並びに約３５ｋＤを有するタンパク質中のセリン残基の脱リン酸化はＳＣ−１でのアポトーシスの誘導後に見られた。
【００４１】
ｂ：７５ｋＤのタンパク質におけるチロシン残基のリン酸化の増加はアポトーシスの誘導により１０分後に最大値が見られた。
【００４２】
図１２：ｐ５３の発現分析及び突然変異分析。
【００４３】
ａ：ＳＣ−１によるアポトーシス誘導の５分後に、ｍＲＮＡ濃度の激しい増大が見られ、一方でｐ５３タンパク質の高濃度は変化せずに留まった。
【００４４】
ｂ：ｐ５３の配列分析は、ＡｒｇからＨｉｓにアミノ酸が変換されたコドン２７３の突然変異を示した。
【００４５】
図１３：ｐ２１の発現分析。
【００４６】
アポトーシスの誘導後に、ｐ２１のｍＲＮＡ濃度の増加が見られる。
【００４７】
図１４：ＳＣ−１で誘導された細胞のウェスタンブロット分析。
【００４８】
ａ：ＣＤ５５／ＤＡＦ発現（ＳＣ−１による染色）
ｂ：ＰＡＲＰの分解（抗ＰＡＲＰ抗体での染色）
ｃ：細胞性増殖のためのマーカーとしての抗トポイソメラーゼＩＩα抗体での染色
ｄ：ｃ−ｍｙｃ発現（抗ｃ−ｍｙｃ抗体での染色）
図１５：カスパーゼ３阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの、ＳＣ−１で誘導されるアポトーシスへの作用。
【００４９】
図１６：初期腫瘍への抗体ＳＣ−１の投与によって生じるインサイチュー核染色法（in situ Kernanfaerbung）による腫瘍特異的アポトーシスの検出。
【００５０】
図１７：初期腫瘍への抗体ＳＣ−１の投与の作用。
【００５１】
ａ：ＳＣ−１の投与前の生検試料（アポトーシスに関するインサイチュー染色）
ｂ：ＳＣ−１の投与後の初期腫瘍（アポトーシスに関するインサイチュー染色）
ｃ：ＳＣ−１の投与前の生検（組織学的退縮分析）
ｄ：ＳＣ−１の投与後の初期腫瘍（組織学的退縮分析）。
【００５２】
実施例
１．  材料及び方法
１．１  細胞培養
全ての試験のために、樹立された胃腺癌系統２３１３２（Vollmers et al., Virchows Arch. B. Zell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 63(1993), 335-343）を使用した。これらの細胞を１０％ウシ胎仔血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（両者とも１％）を有するＰＲＭＩ−１６４０中で集密状態に達しない（subkonfluenz）まで培養した。記載の試験法のために、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、かつ燐酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で使用前に２回洗浄した。ヒトのハイブリドーマ細胞系統ＳＣ−１を、例えばフォルマーズ他（Vollmers et al）によって記載されるように（Cancer Res. 49(1989), 2471-2476）製造し、かつ培養した。
【００５３】
１．２  抗体ＳＣ−１の精製
ヒトのモノクローナル抗体ＳＣ−１を大量培養からカチオン交換クロマトグラフィーを使用し、引き続きフォルマーズ他によって記載されるようなゲル濾過（Oncology Reports 5 81998), 35-40）を使用することで精製した。
【００５４】
１．３  ＳＣ−１受容体の精製
膜タンパク質の調製のために、収穫された細胞を低張バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、かつ５分間ソニケーションした。細胞核を遠心分離（１００００ｇ、１０分間）によってペレット化した。膜を遠心分離（３０分間、１０００００ｇ）によってペレット化し、膜溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン及び１％のトライトンＸ−１００（Triton X-100））中に再懸濁した。全ての溶液にＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒ）プロテアーゼ阻害剤（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ）を添加した。
【００５５】
抗原の精製をＦＰＬＣユニット（ファルマシア、フライブルク、ドイツ）を使用してカラムクロマトグラフィーによって実施した。サイズ排除クロマトグラフィーのためにファルマシアのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＸＫ１６／６０）にバッファーＡ（１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトライトンＸ−１００）中の５ｍｇの膜タンパク質調製物を負荷した。カラム溶離液を分別し、ウェスタンブロット分析で抗体ＳＣ−１との反応に関して調査した。陽性のフラクションをバッファーＡを使用してＭｏｎｏＱカラム上に負荷した。結合するタンパク質を線形グラジエントでバッファーＢ（１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトライトンＸ−１００）を使用して分別し、かつＳＤＳポリアクリルアミド−ゲル電気泳動及びクーマシーによる染色もしくはウェスタンブロット分析によって調査した。陽性のバンドをゲルから切り出し、配列決定した。
【００５６】
１．４  ＳＣ−１での誘導後の細胞溶解物の調製
細胞系統２３１３２を１００ｍｍの細胞培養シャーレ上で集密状態に達しないまで培養した。抗体ＳＣ−１を３０μｇ／ｍｌの最終濃度でそれぞれ規定の期間の間で添加した。次いで培養プレートをＰＢＳで１回洗浄し、かつ細胞をＳＤＳバッファー（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭのジチオトレイトール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセリン）で直接溶解させた。細胞残留物をゴムスクレーパーで収集した。
【００５７】
１．５  ゲル電気泳動及びブロット
還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミド−ゲル電気泳動並びにタンパク質のウェスタンブロッティングをフォルマーズ他によって記載されるような標準的プロトコール（Cancer 79(1997), 433-440）を使用して実施した。ニトロセルロースメンブレンをＰＢＳを使用して０．１％のＴｗｅｅｎ−２０及び２％の脱脂乳粉末又は３％のウシ血清アルブミン（リン酸化の測定のため）の添加下にブロッキングし、引き続き１時間、一次抗体とインキュベートした。抗体は以下の希釈で使用した。ＳＣ−１（ヒト）１０μｇ／ｍｌもしくは１５μｇ／ｍｌ；抗カスパーゼ３もしくは抗カスパーゼ８（ヤギ）（SantaCruz、ハイデルベルク、ドイツ）５μｇ／ｍｌ、ストレプトアビジン 抗ホスホチロシン複合体（クローンＰＴ６６）１：２００００及びストレプトアビジン 抗ホスホセリン複合体（クローンＰＳＲ−４５）１：３００００（シグマ、ミュンヘン、ドイツ）、マウス抗トポイソメラーゼＩＩα抗体１：１０００（Neomakers、Baesweiler、ドイツ）、抗ｃ−ｍｙｃ抗体１：１０００（SantaCruz、ハイデルベルク、ドイツ）及び抗ＰＡＲＰ抗体１：１０００（Pharmingen, ハイデルベルク、ドイツ）。二次抗体のペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヒトＩｇＭ複合体またはウサギ抗ヤギ抗体（Dianova、ハンブルク、ドイツ）及びペルオキシダーゼを複合させたエクストラアビジン（Extravidin）（シグマ）をピエルセ（Pierce）のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光キット（SuperSignal Chemilumineszenzkit）（KMF, St. Augustin、ドイツ）を使用して検出した。
【００５８】
１．６  タンパク質配列決定
見掛けの分子量８２ｋＤを有するタンパク質バンドを一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単離し、かつクーマシーによる染色によって可視化させた。ｐ８２のバンドをゲル中でトリプシン（ベーリンガー・マンハイム、非変性、配列決定品質）でシェフチェンコ他（Shevchenko et al）に記載のように分解した（Anal. Chem. 68(1996), 850-858）。分離されなかったトリプシンのペプチドをナノエレクトロスプレー−タンデム−質量分析によってウィルム他（Nature 379 (1996), 466-469）に記載のように配列決定した。配列決定は、ＡＰＩ ＩＩＩ三連四極子質量分析計（PE Sciex, Ontario, Kanada）上で実施した。ペプチド断片の配列をタンデム−マススペクトロスコピーのデータを使用して組み立て、かつデータベース調査によってそれぞれのタンパク質を割り当てた。
【００５９】
１．７  ＲＴ−ＰＣＲ
腫瘍細胞２３１３２の全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成をＭ−ＭＬＶの逆転写酵素（Gibco BRL, Eggenstein、ドイツ）の使用下に５μｇの全ＲＮＡを使用して製造者の指定に従って実施した。ＰＣＲ反応を１．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｐＭのプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（MBI Fermentas, St. Leon-Rot、ドイツ）を有する２５μｌの反応用量で実施した。
【００６０】
以下のＰＣＲ産物が生成した：
ＣＤ５５（配列領域３８２〜１０２２からの６４０ｂｐ断片）、ｐ５３断片１（配列領域９１〜９４０からの８５０ｂｐ断片）、ｐ５３断片２（配列領域４９２〜１２９４からの８００ｂｐ）。
【００６１】
１．８  クローニング手順
ＰＣＲ産物をアガロースゲルからＪｅｔｓｏｒｂゲル抽出キット（Genomed, Bad Oeynhausen、ドイツ）を使用して精製した。ＰＣＲ断片のクローニングをｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）クローニングキット（Stratagene、ハイデルベルク、ドイツ）を使用して実施した。
【００６２】
アンチセンス−ベクターｐＨＯＯＫ２−ＣＤ５５−ａｎｔｉのクローニングをＣＤ５５−ＰＣＲ産物のＰｆｕポリメラーゼによる平滑化及びＳｍａＩで切断された発現ベクターｐＨＯＯＫ２（Invitrogen, Leek, Niederlande）中にクローニングすることによって実施した。ＰＣＭＶ−プロモーターのコントロール下にアンチセンス方向の挿入を有するクローンをアンチセンス試験のために選択した。
【００６３】
１．９  ＤＮＡ配列決定
８個の陽性クローンをダイデオキシターミネーションサイクル配列決定キット（DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit）（Applied BioSystems Incl., Weiterstadt, Deutschland）を使用して配列決定し、自動ＤＮＡシークエンサーであるＡＢＩＰｒｉｓｍ３７３を使用して分析した。両ストランドをＴ３プライマー及びＴ７プライマーを使用して配列決定した。配列をコンピュータプログラムＤＮＡＳＩＳ及びＢＬＡＳＴを使用して分析した。
【００６４】
１．１０  トランスフェクション
トランスフェクション試験のために、２〜５×１０７個の剥離した細胞をトリス緩衝食塩溶液（ＴＢＳ）中で洗浄し、かつ４００μｌのＴＢＳ中に再懸濁した。１０μｇのプラスミドＤＮＡの添加後に、細胞を２４０Ｖ、９６０ｎＦでバイオラド（ミュンヘン、ドイツ）のエレクトポレーション装置を使用してパルスを印加した。５×１０５個のトランスフェクションされた細胞を６０ｍｍの細胞培養シャーレ上に播種し、前記のように２４時間インキュベートした。アポトーシスを増殖培地に５０μｇ／ｍｌの精製されたＳＣ−１抗体を添加することによって誘導した。２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、かつサイトスピンの製造のために使用した。
【００６５】
１．１１  ホスホリパーゼ試験
剥離され、かつ欠失した細胞（deletieren Zell）にＲＰＭＩ−１６４０を添加して再懸濁し、３７℃で９０分間インキュベートした。回復期間の後に、２０ｍＵ／ｍｌのＰＩ−ＰＬＣ（ベーリンガー・マンハイム）を添加し、細胞を更に６０分間インキュベートした。最後に細胞を洗浄し、かつサイトスピンの製造のために使用した。
【００６６】
１．１２  グリコシダーゼ試験
剥離しかつ洗浄した細胞を、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁し、１時間氷上でインキュベートし、次いで計数し、サイトスピンを製造した。空気乾燥後に、サイトスピン調製物をアセトンで固定し（１０分間）、洗浄し、かつ２０μＵ／ｍｌのＯ−グリコシダーゼ又は５ｍＵ／ｍｌのＮ−グリコシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム）と３７℃で４時間インキュベートした。
【００６７】
１．１３  免疫組織化学的染色
以下の抗体を免疫組織化学的染色のために使用した：精製された抗体ＳＣ−１、抗ＣＥＡ抗体（ＤＡＫＯ、ハンブルク、ドイツ）、抗ＥＭＡ抗体（Loxo, Dossenheim、ドイツ）及び抗ＣＤ５５抗体（Biozol, Eiching、ドイツ）。サイトスピン調製物のアセトン固定及び染色をフォルマーズ他によって記載されるように実施した（Hum. Antibodies Hybridomas7(1996), 37-41）。
【００６８】
アポトーシス細胞の免疫組織化学的染色のために集密状態に達しないまで培養した細胞を精製した抗体ＳＣ−１（５０μｇ／ｍｌに希釈）と完全増殖培地中で９６時間までインキュベートした。付着した細胞及び剥離された細胞を収集し、遠心分離し、完全増殖培地に再懸濁した。細胞を計数した後に、サイトスピン調製物を製造し、かつ室温で一晩乾燥させた。インビボでのサイトケラチン１８の分解検査はＳＣ−１での処理前の患者の生検並びに処理後の組織切片及び胃切除術からフォルマーズ他によって記載されるように引用した（Oncol. Rep. 5(1998), 549-552）。
【００６９】
サイトスピンを燐酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中のウシ血清アルブミン（１５ｍｇ／ｍｌ）で３０分間ブロッキングした。引き続きＳＣ−１上清、Ｍ３０ＣｙｔｏＤｅａｔｈ抗体（Roche Biochemicals、マンハイム、ドイツ）またはマウス抗サイトケラチン１８抗体（ＤＡＫＯ、ハンブルク、ドイツ）と１：１５希釈してインキュベートを１時間実施した。引き続きＰＢＳ中で３０分間洗浄し、次いでペルオキシダーゼ標識されたウサギ抗マウス複合体又はウサギ抗ヒト複合体（ＤＡＫＯ）と１：２５で希釈してインキュベートを実施した。ＰＢＳでの洗浄の３０分後に、ジアミノベンジジン（０．０５％）及び過酸化水素（０．０２％）で３分間室温で染色を実施した。反応を水道水で停止させ、かつ組織切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【００７０】
１．１４  アポトーシス試験
サイトスピン調製物（５０００細胞／対物支持体）をアセトンで固定し、次いでＴＢＳで洗浄した。引き続きこれらをＦｒａｇＥ１−クレノウＤＮＡ断片化キット（FragE1-Klenow DNA Fragmentierungskit）（Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden、ドイツ）で製造者の指示に従って染色した。
【００７１】
アポトーシスの検出のためのＥＬＩＳＡをＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｒ）キット（Roche Biochemicals）を使用して製造者の指示に従って実施した。
【００７２】
１．１５  ＭＴＴ試験
胃癌細胞に対する抗体ＳＣ−１のアポトーシス活性の測定のためのＭＴＴ増殖試験（Carmichael et al., Cancer Res. 47(1987), 936-942）をフォルマーズ他（Cancer 76(1995), 550-558）に記載のように実施した。細胞増殖の測定をミトコンドリアヒドロキシラーゼ試験（Mitochondrialen Hydroxylase Test）（Mossmann, J. Immunol. Meth. 65(1983), 55-63）によって実施した。ＳＣ−１で誘導された細胞及びＳＣ−１で誘導されていないコントロールの吸収からアポトーシス細胞のパーセント割合を測定した（Vercammen et al., J. Exp. Med. 188(1998), 919-930）。
【００７３】
１．１６  カスパーゼ３及びカスパーゼ８試験
カスパーゼ８及びカスパーゼ３の活性化をＡｐｏＡｌｅｒｔＴＭカスパーゼ蛍光試験キット（ApoAlertＴＭ Caspase Fluorezenz Testkit）（Clontech、ハイデルベルク、ドイツ）で測定した。このために、１×１０６個の細胞を４０μｇ／ｍｌのＳＣ−１で７もしくは２０時間インキュベートした。次いで細胞を収集し、細胞溶解バッファー中に再懸濁し、かつカスパーゼ活性を製造者の指示に従って測定した。
【００７４】
１．１７  細胞内の遊離カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの測定
細胞内の遊離カルシウム濃度の測定を、カルシウム感受性色素Ｆｕｒａ−２−ＡＭを使用して、グリキーヴィックズ他（Grykiewicz et al）によって記載されるように測定した（J. Biol. Chem. 260(1985), 3440-3450）。このために細胞をＦｕｒａ−２−ＡＭで最終濃度５×１０-６Ｍを有するリンガー液（１２２．５ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で１５分間インキュベートした。すすぎ後に、対物支持体をＡｘｉｏｖｅｒｔ１００ＴＶ顕微鏡（４００倍の拡大）を使用して検査した。蛍光シグナルを５００ｎｍにおいて３３４ｎｍと３８０ｎｍの間で交互に変化する励起波長で１００Ｗキセノン灯及びフィルタ交換装置（ツァイス、ドイツ）を使用して測定した。細胞内の遊離カルシウム濃度をグリキーヴィック他（前記）の方法によって２２５ナノモル／ｌの解離定数を想定して計算した。最大及び最小の蛍光比（Ｒｍａｘ及びＲｍｉｎ）を較正溶液の添加後に測定した。Ｒｍａｘを３ｍＭのＣａ２＋及び１０-６Ｍのロノマイシン（lonomycin）を有するリンガー液を添加することによって測定した。Ｒｍｉｎを、３ｍＭのＥＧＴＡ及び１０-６Ｍのロノマイシンを有するＣａ２＋不含のリンガー液の存在下に測定した。
【００７５】
１．１８  細胞内カルシウム遊離の阻害
細胞をリン酸緩衝食塩溶液で１回洗浄し、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を有さないカルシウム不含のＤＭＥＭ培地中で２４時間洗浄した。次いで精製されたＳＣ−１抗体を４０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。コントロールとしてＳＣ−１を使用しない同一の細胞を使用した。細胞を給湿インキュベーター中で更に２４時間または４８時間インキュベートし、次いで３％のグルタルアルデヒドで固定した。細胞培養プレートを次いで光学顕微鏡で形態学的変化を調査した。
【００７６】
２．  結果
２．１  ＳＣ−１受容体ＣＤ５５の精製
低塩条件下（１００ｍＭのＮａＣｌ）で製造された胃癌細胞２３１３２の全細胞溶解物からの抽出物のウェスタンブロット分析において、抗体ＳＣ−１は約５０ｋＤの相対分子量を有するタンパク質と反応した。厳密性（１ＭのＮａＣｌ）の変更及び膜調製物の使用下に約７０ｋＤ及び約８２ｋＤを有する他のタンパク質を検出できた（図１ａ、レーン１）。これらのタンパク質を膜調製物から単離し、かつ連続的なサイズ排除クロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した（図１ａ、レーン２、レーン３）。これらの分子をＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切り出し、配列決定した。
【００７７】
５０ｋＤのタンパク質はジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ−アクセッション番号．Ｌ３７４１８）として同定され、かつ７０ｋＤのタンパク質はヒトのループスｐ７０自己抗原（Ｇｅｎｂａｎｋ−アクセッション番号．Ｊ０４６１１）として同定された。これらのタンパク質は細胞質性抗原もしくは核性抗原である。抗体ＳＣ−１は免疫組織化学的調査において細胞表面抗原のみと結合するので、反応性は恐らくウェスタンブロット分析の間のタンパク質変性に基づく非特異的結合に起因する。
【００７８】
８２ｋＤのタンパク質はＣＤ５５（ＤＡＦ、Ｇｅｎｂａｎｋ−アクセッション番号．Ｍ３１５１６、図１ｂ、断片１及び断片２）として同定された。ＣＤ５５はヒトに、２種の遺伝的に規定されたイソ型（分泌型ＤＡＦ−Ａ及び膜結合型ＤＡＦ−Ｂ）で存在し、これらは分化スプライスング（differentielles Spleissen）によって生じる（Caras et al., Nature 325(1987), 545-549）。ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、細胞系統２３１３２は膜結合型ＤＡＦ−Ｂイソ型のみを発現することが確認された。
【００７９】
２．２  ホスホリパーゼ処理
免疫組織学的調査により、かつＭＴＴ増殖試験において、ＳＣ−１の結合におけるグリコシドホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの分解の影響を分析した。このためにＧＰＩアンカーを、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）とのインキュベーションによって分解した。ＰＩ−ＰＬＣで処理された細胞及び未処理の細胞のサイトスピンを免疫組織学的にＳＣ−１、抗ＣＤ５５及び抗ＥＭＡ（上皮膜抗原）によって染色した。未処理の細胞との比較（図２ａ）はＰＩ−ＰＬＣで処理された細胞及びＳＣ−１で染色された細胞（図２ｂ）における染色強度の損失を示している。抗ＥＭＡ（図２ｃ、２ｄ）による染色において、染色の差異は見られず、それに基づいてＰＩ−ＰＬＣ処理がＧＰＩアンカーされていない膜タンパク質に作用を有さないことが示された。ＭＴＴ試験においては、ホスホリパーゼＣでの細胞の処理はアポトーシス細胞の著しい減少（ｐ≦０．０５）をもたらす（図３）。
【００８０】
２．３  アンチセンス−ＣＤ５５のＲＮＡでのトランスフェクション
細胞系統２３１３２をＣＤ５５アンチセンスベクター ｐＨＯＯＫ２−ＣＤ５５ａｎｔｉを使用し、かつコントロールベクターｐＨＯＯＫ２を使用してエレクトロポレーションによって一過性トランスフェクションさせた。まず、トランスフェクションさせた細胞のサイトスピンを免疫組織化学的にＳＣ−１、抗ＣＤ５５及び抗ＣＥＡ（癌胎児抗原）で染色した。コントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞はＳＣ−１及びＣＥＡによって強い染色を示した（図４ａ、図４ｃ）。ＣＤ５５アンチセンスベクターで染色された細胞において、ＳＣ−１によって殆ど染色は見られなかった（図４ｂ）。抗ＣＥＡ抗体での染色は、ＣＥＡ（ＧＰＩアンカーされているものも）の発現パターンがアンチセンスベクターをトランスフェクションすることによって影響されないことを示した。従ってＣＤ５５の発現は特異的にアンチセンスＲＮＡの発現に基づいて低下する。
【００８１】
アンチセンスＣＤ５５のＲＮＡの発現がＳＣ−１によって誘導されるアポトーシスを阻害するかどうかを分析するために、細胞をトランスフェクションの１日後に３０μｇ／ｍｌのＳＣ−１を使用し、かつ使用せずに、２４時間インキュベートした。アンチセンスベクター及びコントロールベクターをトランスフェクションした細胞のサイトスピンを、アポトーシスによって誘導されるＤＮＡ断片化の検出のためにＦｒａｇＥ１ Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ断片化キットを使用して染色した。両者のプラスミドで処理したトランスフェクションされていない細胞は殆ど自発的にアポトーシスを示さないが（図５ｅ）、ＳＣ−１とのインキュベーション後に、ＣＤ５５アンチセンスベクターをトランスフェクションさせた細胞（図５ｇ）のアポトーシスにおいてコントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞（図５ｈ）と比較して明らかに低下が見られた。
【００８２】
定量的な測定は、トランスフェクションされた２３１３２細胞における自発的なアポトーシスが６％の頻度で生じるが、一方でＳＣ−１でのインキュベーション後にはコントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞の８５％がアポトーシスを示すことを指示している。このアポトーシス反応はＣＤ５５アンチセンスベクターでのトランスフェクションによって２１％にまで減少する（図６）。
【００８３】
２．４  グリコシダーゼ処理
細胞系統２３１３２へのＳＣ−１の結合へのタンパク質脱グリコシル化の影響は、免疫組織化学的染色の前にサイトスピン調製物をＯ−グリコシダーゼ及びＮ−グリコシダーゼとインキュベートすることによって調査した。細胞のＮ−グリコシダーゼでの処理はＳＣ−１染色の著しい低下をもたらすが（図７ｂ）、一方でＳＣＲ３領域中のタンパク質成分を認識する抗ＣＤ５５での染色はタンパク質脱グリコシル化によって影響を受けない（図７ｄ）。リン酸バッファーとのインキュベーション及びＯ−グリコシダーゼでの処理はＳＣ−１結合に作用を有さない。これは、ＳＣ−１の特異性がＮ−結合した糖残基に局在化し、プライマータンパク質配列には局在化する必要がないことを示している。
【００８４】
２．５  ＣＤ５５／ＳＣ−１の架橋
細胞をＳＣ−１の量を増加させて２４時間インキュベートし、ＳＣ−１の最適なアポトーシス活性を測定した（図８ａ）。次いで架橋を４０μｇ／ｍｌのＳＣ−１の濃度でウサギ抗ヒトＩｇＭと実施した。４８時間のインキュベーション後に、ＳＣ−１とインキュベートしたコントロール細胞より４７％高い割合の死細胞が見られた（図８ｂ）。
【００８５】
２．６  カルシウム含有量
ＳＣ−１によって誘導されたアポトーシスがカルシウム含有量の変化を伴うかどうかを調査するために、細胞系統２３１３２の細胞内カルシウム濃度をＳＣ−１及びコントロール抗体（非特異的なヒトのＩｇＭ）での誘導の後に測定した。ＳＣ−１抗体の添加の約１分後に細胞内カルシウム濃度の著しい増加が見られるが、一方でコントロール抗体は影響を及ぼさない（図９）。
【００８６】
２．７  カスパーゼ活性
ウェスタンブロット分析によって、カスパーゼ３及びカスパーゼ８は細胞系統２３１３２のＳＣ−１での誘導後に前記のように調節されることが判明した（図１０ａ）。カスパーゼの活性化を引き起こすタンパク質分解は、カスパーゼ３に関しては分解生成物ｐ２０の同定によって証明された（図１０ａ）。カスパーゼ８においては、ＳＣ−１での誘導の２０時間後に４倍の活性の増大が見られ、アポトーシスプロセスにおけるカスパーゼの実質的な関与を指示している（図１０ｂ）。
【００８７】
特異的なカスパーゼ３阻害剤ＡＣ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（Alexis Biochemical, Gruenberg、ドイツ）の添加によって、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｒ） Ｋｉｔで測定して意想外にも濃度の増大に伴ってアポトーシスが増加することが示された。
【００８８】
２．８  タンパク質リン酸化
４０μｇ／ｍｌのＳＣ−１抗体での細胞の誘導後のリン酸化パターンは細胞質抽出物及び膜抽出物のウェスタンブロット分析によって調査した。この場合、アポトーシスの誘導の３０〜６０秒後に１１０ｋＤ及び６０ｋＤのタンパク質の早期のチロシンリン酸化が見られた（図１１）。６０ｋＤのタンパク質は細胞質中には見られないが、一方で１１０ｋＤのタンパク質は細胞質においても膜抽出物においても検出できた。更に細胞質の７５ｋＤタンパク質の緩慢なチロシンリン酸化は１０分後に最大で見られ、かつ３５ｋＤタンパク質のセリンリン酸化の完全な消失は誘導の１０分後に見られた。
【００８９】
２．９  ｐ５３の発現及び配列決定
ＳＣ−１によって誘導されたアポトーシスにおけるｐ５３の役割を調査するために、ｍＲＮＡの頻度をＲＴ−ＰＣＲによって、かつ遺伝子産物の頻度をウェスタンブロット分析によって誘導後に測定した。その場合、ｍＲＮＡ濃度の明らかな増大が見られた。しかしながらタンパク質レベルでは、ｐ５３遺伝子産物の一定かつ著しく変化していない高い濃度が見られた（図１２ａ）。
【００９０】
特異的プライマーによりｃＤＮＡから２つのｐ５３断片を増幅し、ＰＣＲ断片をクローニングし、かつ８個のクローンを配列決定することによって、細胞系統２３１３２中のｐ５３のＤＮＡ配列を決定した。エキソン８にまたがる挿入を有する全てのクローンはコドン２７３に突然変異を有し、これはアルギニンからヒスチジンへのアミノ酸交換をもたらした（図１２ｂ）。これはしばしば胃腺癌で生じる主なネガティブ突然変異である。
【００９１】
２．１０  ｐ２１の発現
タンパク質ｐ２１はｐ５３の発現に関連する分子である。ＳＣ−１での処理後の胃癌細胞系統２３１３２におけるｐ２１の発現の試験は５分後に増大をもたらし、引き続き６０分後に低下をもたらした（図１３）。
【００９２】
２．１１  アポトーシスの誘導後のＣＤ５５／ＤＡＦの発現
５０μｇ／ｍｌのＳＣ−１によるアポトーシスの誘導後のＣＤ５５／ＤＡＦの発現パターンはサイトスピン調製物を抗体ＳＣ−１で免疫組織化学的に染色することによって調査した。誘導されていない細胞は抗体ＳＣ−１によって軽微の膜染色を示すが、ＳＣ−１で誘導された細胞はアポトーシスの誘導の１２時間後に強い膜染色を示す。このことは、細胞に抗体が結合した後に細胞表面上にＣＤ５５／ＤＡＦの提示が増加することを示している。この膜染色は４８時間後に消失し、拡散した細胞質性の染色が確認できた。この染色は９６時間後にもより減少した強度で見られる。ＣＤ５５／ＤＡＦの発現の増加は、ＳＣ−１誘導後のアポトーシス細胞の膜抽出物でのウェスタンブロット分析において見られた。誘導されていない細胞においてはＣＤ５５／ＤＡＦは検出できないが、ＣＤ５５／ＤＡＦの発現は誘導の１時間〜６時間後に増大する。２４時間後にＣＤ５５／ＤＡＦの発現は低下するが、誘導されていない細胞よりも依然として高い（図１４ａ）。
【００９３】
２．１２  サイトケラチン１８の分解
アポトーシス細胞の分解はサイトケラチン１８のタンパク質分解を伴う。ＳＣ−１に誘導されるアポトーシス後の細胞系統２３１３２並びに腫瘍切除の４８時間前に２０ｍｇのＳＣ−１で処理された患者の初期腫瘍におけるサイトケラチン１８の分解を調査した。Ｍ３０ Ｃｙｔｏ Ｄｅａｔｈ染色はアポトーシスの誘導なしに少数のアポトーシス細胞を示すが、アポトーシス細胞の総数は９６時間まで増加する。
【００９４】
２．１３  ＳＣ−１アポトーシスの分子分析
免疫組織化学的染色と一致して、生化学的分析はＣＤ５５／ＤＡＦ分子の増加を示し、引き続きＳＣ−１とのインキュベーションの２４時間後に軽微な減少を示した（図１４ａ）。ＰＡＲＰの分解はウェスタンブロット分析によって、ＳＣ−１に誘導される細胞からの全細胞抽出物及びマウス抗ＰＡＲＰ抗体を使用して調査した。５つの独立試験においてＰＡＲＰの分解は見られず、これは８５ｋＤの分解生成物（Lezebnik et al., Nature 371(1994), 346-347）の生成によって検出できた（図１４ｂ）。
【００９５】
アポトーシス誘導後の細胞周期の変化を調査するために、トポイソメラーゼＩＩαの発現をウェスタンブロット分析によって測定した。トポイソメラーゼＩＩαは細胞周期における重要な酵素であり、これはＤＮＡ複製の際に関係する（Watt und Hickson, Biochem. J. 303(1994), 681-695）。ＳＣ−１に誘導されるアポトーシス後のトポイソメラーゼＩＩαの発現の低下は従って、少なくとも一部の細胞に関する細胞周期停止を示している（図１４ｃ）。
【００９６】
転写因子ｃ−ｍｙｃは種々のアポトーシスプロセスに関与し、かつトランスフェクションによって細胞にアポトーシスを誘導することができる（Evan et al., Cell 69(1992), 119-128）。ＳＣ−１に誘導されるアポトーシス後のｃ−ｍｙｃの発現パターンの調査によって、アポトーシス誘導の１５分後に高められた発現がもたらされ、引き続き４時間後に低下がもたらされる（図１４ｄ）。
【００９７】
２．１４  アポトーシスへの、細胞外及び細胞内のカルシウム濃度の低下の作用
Ｃａ２＋イオンが細胞培養培地から摂取されるか、または細胞内のＣａ２＋レザバーから遊離するかどうかを調査した。Ｃａ２＋が培養培地から摂取されるかを測定するために、細胞を血清不含ＤＭＥＭ培地及びＣａ２＋不含のＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートした。次いで精製したＳＣ−１抗体を４０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、更に２４時間インキュベートした。これらの細胞を次いで３％のグルタルアルデヒド中で固定し、回転式光学顕微鏡（umgedrehtes Lichtmikroskop）で調査した。コントロール細胞（ＳＣ−１で誘導されない）と比較してＳＣ−１で誘導される細胞は、ＳＣ−１でＲＰＭＩ培地中において１０％のＦＣＳの添加下にインキュベートされた細胞に匹敵するアポトーシスを特徴付ける形態学的変化を示した。
【００９８】
細胞内Ｃａ２＋レザバーからのＣａ２＋の影響は、５０μＭの細胞透過性キレート剤ＢＡＰＴＡ（Alexis Biochemicals, Gruenberg、ドイツ）で細胞（血清不含のＤＭＥＭ培地中で培養した）を５時間インキュベートすることによって調査した。これらの細胞を４０μｇ／ｍｌの精製ＳＣ−１と２４時間インキュベートした。細胞形態学で識別可能な変化は認められず、アポトーシスが誘導されていないことが示された。ＥＬＩＳＡによっても、ＢＡＰＴＡによって作用するアポトーシスの阻害が見られた。
【００９９】
２．１５  初期腫瘍におけるアポトーシスの検出
胃癌患者への抗体ＳＣ−１の投与は、インサイチュー核染色法によって検出されるように明らかに識別可能な腫瘍細胞特異的アポトーシスをもたらした（図１６）。ＳＣ−１の投与前に採取された腫瘍生検ではアポトーシスが見られない（図１７ａ）か、もしくは退縮のない無傷の腫瘍の存在（図１７ｃ）が見られ、初期腫瘍はＳＣ−１の投与後に著しいアポトーシス（図１７ｂ）もしくは激しい退縮（図１７ｄ）を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１のａは胃癌細胞系統２３１３２の膜抽出物からのＳＣ−１抗原の精製の際の泳動図を示している。図１のｂはＳＣ−１抗原として同定される８２ｋＤタンパク質のナノエレクトロスプレー−タンデム−質量分析による配列決定データを示している。
【図２】  図２はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によるＧＰＩアンカーの分解のＳＣ−１染色への影響を表す図であり、それぞれＳＣ−１（ａ）及び抗ＥＭＡ（ｃ）で染色された細胞系統２３１３２の未処理の胃癌細胞；ＳＣ−１（ｂ）及び抗ＥＭＡ（ｄ）で染色されたＰＩ−ＰＬＣで処理された細胞に関するものである（４００×拡大）。
【図３】  図３は胃癌細胞における抗体ＳＣ−１でのＭＴＴ試験の結果を示すグラフであり、それぞれコントロールは未処理の細胞を表し、ＳＣ−１はＳＣ−１で処理された細胞を表し、ＳＣ−１，ＰＩＰＬＣはホスホリパーゼで処理し、引き続きＳＣ−１で処理された細胞を表す。
【図４】  図４はＣＤ５５−アンチセンスベクターを一過性トランスフェクションさせた細胞の分析結果を表す図であり、コントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞におけるＳＣ−１（ａ）及び抗ＣＥＡ（ｃ）による染色パターンを示し、かつアンチセンスベクターをトランスフェクションさせた細胞でのＳＣ−１（ｂ）による染色及び抗ＣＥＡ（ｄ）による染色パターンを示している。
【図５】  図５はクレノウ断片化試験の結果を表す図であり、それぞれポジティブコントロール（ｆ）、ＳＣ−１（ｅ）による誘導の不在下のトランスフェクションされた細胞、ＳＣ−１でのインキュベーションの後にコントロールベクターをトランスフェクションさせた細胞（ｇ）ならびにＣＤ５５アンチセンスベクターをトランスフェクションさせた細胞（ｈ）を示している。
【図６】  図６はＳＣ−１によって誘導されたアポトーシスの定量的測定を表すグラフである。
【図７】  図７は抗体ＳＣ−１の結合における脱グリコシル化の作用を表す図であり、それぞれａはバッファーとインキュベートし、かつＳＣ−１で染色された腫瘍細胞、ｂはＮ−グルコシダーゼ及びＳＣ−１とインキュベートされた細胞、ｃはバッファー及び抗ＣＤ５５とインキュベートされた細胞、かつｄはＮ−グルコシダーゼ及び抗ＣＤ５５とインキュベートされた腫瘍細胞を示している。
【図８】  図８は胃癌細胞系統２３１３２におけるＳＣ−１によるＭＴＴ試験の結果を表すグラフであり、それぞれａはＳＣ−１価測定、ｂはウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体とのＳＣ−１の架橋を示している。
【図９】  図９はＳＣ−１での細胞系統２３１３２の誘導後の細胞内カルシウム濃度の変化を表すグラフである。
【図１０】  図１０はＳＣ−１での誘導後のカスパーゼ３及びカスパーゼ８の発現パターン及び活性パターンを示し、それぞれａはカスパーゼ３及びカスパーゼ８のウェスタンブロット分析の図であり、ｂはカスパーゼ８の活性測定の結果を表すグラフである。
【図１１】  図１１はアポトーシス誘導後の細胞系統２３１３２のリン酸化パターンを示す泳動図である。
【図１２】  図１２はｐ５３の発現分析及び突然変異分析を示す図である。
【図１３】  図１３はｐ２１の発現分析を表す泳動図である。
【図１４】  図１４はＳＣ−１により誘導された細胞のウェスタンブロット分析を表す図である。
【図１５】  図１５はカスパーゼ３阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの、ＳＣ−１により誘導されるアポトーシスへの作用を表すグラフである。
【図１６】  図１６は初期腫瘍への抗体ＳＣ−１の投与によって生じるインサイチュー核染色法による腫瘍特異的アポトーシスの検出を表す図である。
【図１７】  図１７：初期腫瘍への抗体ＳＣ−１の投与の作用を示し、それぞれａはＳＣ−１の投与前の生検試料、ｂはＳＣ−１の投与後の初期腫瘍、ｃはＳＣ−１の投与前の生検、ｄはＳＣ−１の投与後の初期腫瘍を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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