(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＩ）で表される修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジン：
【化１】
0004676148.tif 000007
（式（ＩＩ）中、Ｘは炭素原子又は窒素原子を示し、Ａ１からＡ７は同一又は異なり、水素、炭素数１から６のアルキル基、１から７個のハロゲンを有する炭素数１から３のハロゲン化アルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、窒素原子上に炭素数１から６の同一若しくは異なるアルキル基を二つ有するジアルキルアミノ基、アミノ基、シアノ基、又はニトロ基を表し、Ｙは水素原子、ハロゲン、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基、シアノ基、又はアシルアミノ基を表す。）を、全ての塩基と同等の安定性を有する塩基対を形成するユニバーサル塩基として核酸オリゴマーに導入することから成る、該核酸オリゴマーを含む二重鎖を安定化させる方法。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）におけるＡ１からＡ７が水素である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
一般式（ＩＩ）中のＹにおけるアルキル部分が炭素数１ないし３である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）におけるＹが水素である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジンが下記の構造式：
【化２】
0004676148.tif 000008
で表される、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジンにおける３‘水酸基がホスホロアミダイト化された化合物を用いて核酸オリゴマーに導入する、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ホスホロアミダイト基が一般式（ＩＶ）：−Ｐ（ＯＲ３）Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）
（式中、Ｒ３は２−シアノエチル基、４−ニトロフェニルエチル基、Ｎ−（トリフロオロアセチル）アミノブチル基、又は、４−［Ｎ−メチルーＮ−（２，２，２、−トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル基から選択されるリン酸基の保護基であり、Ｒ４及びＲ５はアルキル基、又はアリール基である）で示される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リン酸基の保護基が２−シアノエチル基である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ４及びＲ５は炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基、フェニル基、又はナフチル基である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ４及びＲ５はイソプロピル基である、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）中に導入することにより、相補鎖との二重鎖を相補塩基によらず安定にすることができる修飾シチジンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ユニバーサル塩基は、相補塩基に依存しない二重鎖安定性を与えるものである。現在知られているユニバーサル塩基は、相補塩基によって変わらず二重鎖にほぼ一定の安定性を与えるが安定化効果自体が低くなってしまうものや、高い安定性を誇るが導入されたオリゴヌクレオチドの水溶性の点から実用化には適さないものなどがあり、実用化に向く理想的なユニバーサル塩基は未だ得られていない。
【０００３】
例えば、従来の修飾シトシン塩基は、ＤＮＡオリゴマー中でＤＮＡ二重鎖を形成した際に、グアニン塩基とはワトソンクリック塩基対、その他の塩基とはミスマッチ塩基対を形成する。
【０００４】
【非特許文献１】Nichols,R.; Andres, P.C.; Zhang, P.; Bergstome, D.E. Nature, 1994, 369, 492-493
【非特許文献２】Bergstome,D.E.; Zhang, P.; Toma, P.H.; Andrews, P.; Nichols, R.; J. Am. Chem. Soc., 1995,117, 1201
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記課題を解決し、相補塩基に依らない高い二重鎖安定化効果と導入したオリゴヌクレオチドの水溶性を有し、理想的なユニバーサル塩基として機能を有する修飾シチジンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）で表される修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジン：
【化１】
0004676148.tif 000002
【０００７】
（式（Ｉ）中、Ｚは芳香族性置換基を表し、Ｙは水素原子、ハロゲン、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基、シアノ基、又は、アシルアミノ基を表す。）に係る。
【０００８】
更に、本発明は、かかる修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジンにおける３‘水酸基がホスホロアミダイト化された化合物、及び、修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジンを含む、ＤＮＡオリゴマー又はＲＮＡオリゴマー等の核酸オリゴマーに係る。
【発明の効果】
【０００９】
従来の修飾シトシン塩基は、ＤＮＡオリゴマー中でDNA二重鎖を形成した際に、グアニン塩基とはワトソンクリック塩基対を形成するので高いTm値を得ることができた。ところがその他の核酸塩基とはミスマッチ塩基対を形成する為、そのTm値は大幅に低下した。本発明はミスマッチ塩基対であるアデニン、シトシン、グアニン塩基が修飾核酸の相補鎖に組み込まれた二重鎖DNAオリゴマーを合成した場合においても安定な二重鎖を形成する。
これは芳香族性置換基を導入した４−N−カルバモイルシチジンをＤＮＡオリゴマーに組み込むことで、修飾シトシンと相補的位置にある塩基を二重鎖構造外に追い出し、芳香環と相補鎖核酸塩基の隣接塩基とのスタッキングにより安定な二重鎖が組まれてためと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明化合物におけるＺは当業者に公知の任意の芳香族性置換基であるが、特に、フェニル基、ナフチル基、ピレニル基、キノリル基、及びそれらの誘導体から成る群から選択されるものが好ましい。ここで、誘導体とは、各芳香族基の任意の位置において当業者に公知の任意の置換基で修飾されているような化合物を意味する。
【００１１】
本発明化合物の一態様として、以下の一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジンを挙げることが出来る。
【００１２】
【化２】
0004676148.tif 000003
【００１３】
【化３】
0004676148.tif 000004
【００１４】
（式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）中、Ｘは炭素原子又は窒素原子を示し、Ａ１からＡ７は同一又は異なって、水素、炭素数１から６のアルキル基、１から７個のハロゲンを有する炭素数１から３のハロゲン化アルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、窒素原子上に炭素数１から６の同一若しくは異なるアルキル基を二つ有するジアルキルアミノ基、アミノ基、シアノ基、又はニトロ基を表し、Ｙは水素原子、ハロゲン、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基、シアノ基、又は、アシルアミノ基を表す。）
【００１５】
ここで、一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）におけるＡ１からＡ７の好ましい一例は水素であり、Ｙは水素又は水酸基が好ましく、又、Ｙにおける各置換基のアルキル部分が炭素数１ないし３であることが好ましい。
【００１６】
本発明の修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジン、その３‘水酸基がホスホロアミダイト化された化合物、及び、修飾４−Ｎ−カルバモイルシチジンを含む核酸オリゴマーは、本明細書の記載を参照し、当該技術分野における技術常識に基づけば、当業者であれば容易に調製することができる。
【００１７】
具体的には、ホスホロアミダイト基が一般式（ＩＶ）：−Ｐ（ＯＲ３）Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）  
（式中、Ｒ３はリン酸基の保護基であり、Ｒ４及びＲ５はアルキル基、又はアリール基である）で示される。リン酸基の保護基としては、２−シアノエチル基、４−ニトロフェニルエチル基、Ｎ−（トリフロオロアセチル）アミノブチル基、又は、４−［Ｎ−メチルーＮ−（２，２，２、−トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル基を挙げることが出来、２−シアノエチル基が好適である。Ｒ４及びＲ５の好適例は炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基、フェニル基、又はナフチル基であり、特に、イソプロピル基が好ましい。又、３‘水酸基がホスホロアミダイト化される場合には、その５‘水酸基が４−メトキシトリチル基又は４，４’
−ジメトキシトリチル基等の保護基で保護されていることが好ましい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００１９】
実施例１：４−Ｎ−ナフチルカルバモイルデオキシシチジン（ｄＣｎｐｈｃｍ）の合成
【００２０】
【化４】
0004676148.tif 000005
【００２１】
デオキシシチジン塩酸塩（２．６３７ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンを用いて３回共沸したのち、無水ピリジン（３０ｍｌ）に懸濁し、トリメチルシリルクロリド（３，１５８ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。撹拌後、ジクロロメタン（７０ｍｌ）とクロロギ酸フェニル（１．５０６ｍｌ，１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分撹拌する。水を加えて反応を停止させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）で３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を減圧下留去し、ピリジン（１００ｍｌ）に溶解させ、１−アミノナフタレン（１．１１７ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１．５時間撹拌した。室温に戻し、濃アンモニア水１００ｍｌを加え３時間撹拌した後、減圧下、アンモニアを留去した。クロロホルム１００ｍｌ、水２００ｍｌを加え、撹拌することで標的化合物を析出させ、濾過操作によりこれを得た。（２．５３７ｇ，６４％）
【００２２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、２７０ＭＨｚ）２．０３−２．１２（１Ｈ、ｍ）、２．２７−２．３６（１Ｈ、ｍ）、３．５８−３．６３（２Ｈ、ｍ）、３．８４−３．８８（１Ｈ、ｍ）、４．２２−４．２３（１Ｈ、ｍ）、５．０６（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．０ＭＨｚ）、５．２７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．３ＭＨｚ）、６．１８（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．３ＭＨｚ）、６．２８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６ＭＨｚ）、７．４６−７．７０（４Ｈ、ｍ）、７．９３−８．０８（１Ｈ、ｍ）、８．２２−８．３１（２Ｈ、ｍ）、８．３９−８．４２（１Ｈ、ｍ）、１０．５（１Ｈ、ｓ）、１２．５（１Ｈ、ｓ）
【００２３】
実施例２：４−Ｎ−ナフチルカルバモイルデオキシシチジンを含む核酸オリゴマーの合成
CPG固相担体に結合したチミジン（０．１μｍｏｌ）に対し、チミジンホスホロアミダイトユニット又は４Ｎ−ナフチルデオキシシチジンホスホロアミダイトユニットを用いて、ABI DNA/RNA synthesizer 392 を用いてＤＮＡ鎖を伸長した。合成後に固相担体を取り出し、濃アンモニア水で一晩放置後、Ｃ１８逆相カートリッジを用いたＤＭＴｒオン精製を行い、凍結乾燥して目的物である、５’-TTTCTCXTTCTCT-３’ （X=４−Ｎ−ナフチルカルバモイルデオキシシチジン）を得た。質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）［Ｍ＋Ｈ］Calcd.:3985.7,
Found:3986.5
【００２４】
実施例３：４−Ｎ−ナフチルカルバモイルデオキシシチジンンの塩基対形成能
実施例２の生成物とその相補的塩基配列を有するＤＮＡ（３’-AAAGAGYAAGAGA-５’ Y=G,C,A,T）を１０ｍＭリン酸緩衝液、１M NaClに各々２μｍｏｌ／Ｌの濃度で混合し、２６０ｎｍの波長の吸光度の温度依存性を測定してＵＶ−融解曲線温度Ｔｍ値（℃）を測定した。その結果、ｄＣｎｐｈｃｍは全ての塩基と同等の安定性を有する塩基対を形成するユニバーサル塩基としての性質を示すことが明らかとなった。これらの結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0004676148.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の修飾４−Ｎ−ナフチルカルバモイルシチジンのユニバーサル塩基としての性質は、アンチセンス法や遺伝子解析などのプローブとしてだけではなく、あらゆる研究や診断に有効であると思われる。
【００２７】
従って、本発明はＤＮＡ中に存在するSNPs部位などの特定の塩基を二重鎖外に露出させることで、SNPs解析、遺伝子診断、遺伝子修復、及び精密塩基認識技術などに幅広く応用することができる。