(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌において形態を促進させる方法であって、
繊維状形態を呈する天然の真菌に比較して沈殿形態を呈する天然真菌において特異に発現される遺伝子コード領域に相補なアンチセンス配置の配列を含む組換えポリヌクレオチド配列を用意するが、上記相補配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の全体に対して相補性であり；
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を当該組換えポリヌクレオチドにより形質転換し；
アンチセンス配置の配列を転写することにより遺伝子コード配列転写産物にハイブリダイズするのに十分な長さの転写産物を生成させて翻訳を遮断し；そして
組換えポリヌクレオチドの発現により生成される転写産物を利用して遺伝子コード領域の発現を抑圧するが、当該抑圧はその天然形態の真菌により予測され得る沈殿形態を促進すること
を含む方法。
【請求項２】
真菌を利用したバイオプロセスを増強する方法であって、
プロモーターに作動可能に連結された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の全体に対して相補性のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子によりアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を形質転換することにより生成された形質転換真菌を用意するが、ポリヌクレオチド配列はアンチセンス配置であり；
ポリヌクレオチド配列を転写することによりポリヌクレオチド転写物を生成し；そして
当該転写物をｍＲＮＡにハイブリダイズさせることにより遺伝子発現を抑圧し、かつ沈殿形態を促進させるが、当該沈殿形態は、形質転換された真菌の繊維状形態を利用するバイオプロセスに比較して、バイオプロセスを増強し、そしてバイオプロセスはクエン酸の生産を含むこと
を含む方法。
【請求項３】
真菌において形態を促進させる方法であって、
繊維状形態を呈する天然の真菌に比較して沈殿形態を呈する天然真菌において特異に発現される遺伝子コード領域に相補なアンチセンス配置の配列を含む組換えポリヌクレオチド配列を用意するが、上記相補配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、６、８、１２、１６、１８、２２、２４、２８、３３、３６及び３７の何れか一つの全体に対して相補性であり；
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を当該組換えポリヌクレオチドにより形質転換し；
アンチセンス配置の配列を転写することにより遺伝子コード配列転写産物にハイブリダイズするのに十分な長さの転写産物を生成させて翻訳を遮断し；そして
組換えポリヌクレオチドの発現により生成される転写産物を利用して遺伝子コード領域の発現を抑圧するが、当該抑圧はその天然形態の真菌により予測され得る沈殿形態を促進すること
を含む方法。
【請求項４】
真菌を利用したバイオプロセスを増強する方法であって、
プロモーターに作動可能に連結された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、６、８、１２、１６、１８、２２、２４、２８、３３、３６及び３７の何れか一つの全体に対して相補性のポリヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子によりアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を形質転換することにより生成された形質転換真菌を用意するが、ポリヌクレオチド配列はアンチセンス配置であり；
ポリヌクレオチド配列を転写することによりポリヌクレオチド転写物を生成し；そして
当該転写物をｍＲＮＡにハイブリダイズさせることにより遺伝子発現を抑圧し、かつ沈殿形態又は繊維状形態を促進させるが、促進された形態は、形質転換された真菌の相対する繊維状形態又は沈殿形態を利用するバイオプロセスに比較して、バイオプロセスを増強すること
を含む方法。
【請求項５】
促進される形態が繊維状形態である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
促進される形態が沈殿形態である、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
本発明は、真菌において形態を促進する、単離されたポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド構築物及び方法に関する。
発明の背景
真菌は、多数の市販されている有用な製品の生産のための利用が増加しつつある。「繊維状」真菌として知られる種類の真菌は、現在、代謝物、例えば抗生物質（ペニシリン及びセファロスポリン、例えば）、及び有機酸（クエン酸及びフマル酸、例えば）の工業規模の生産に用いられる。繊維状真菌はさらに酵素、例えばプロテアーゼ及びリパーゼの工業生産に有用である。
【０００２】
所望の化合物の生産のための繊維状真菌種の利用は、しばしば、真菌の液内培養の生育を含む。繊維状真菌は液内培養において多数の形態を呈し得るが、そのうちの一つは繊維状形態である。培養物中の真菌が繊維状形態を呈する場合、繊維状の生育が培養培地の粘度を増加させ得る。増加した粘度は、培養物の大量の移動及び通気特性に影響し、バイオリアクターにおいて混合された問題を引き起こし、そして典型的には低下した生産性を伴い得る。
【０００３】
或いは、「繊維状」真菌は沈殿物の形態を呈し得る。繊維状形態を呈する真菌の培養とは対照的に、沈殿物の形態を呈する真菌の培養物の粘度は相対的に低く、そして培養物の混合及び通気に利用される力は少なくて済み得る。多くの製品、例えばクエン酸、イタコン酸、スタチン、ペニシリン、及び様々な酵素に関して、繊維状形態を呈する真菌との比較の上で、沈殿形態を呈する真菌を利用することにより、生産性を増強することができる。
【０００４】
真菌において形態を促進させる方法を開発すること及び生産性を最大にするために培養において真菌により呈される形態を左右するか又は制御する方法を開発することが望まれる。
発明の概要
一つの側面において、本発明は、繊維状形態を呈する天然の真菌との比較の上で、沈殿形態を呈する天然の真菌中で特異に（differentially）発現される単離されたポリヌクレオチド分子を包含する。
【０００５】
一つの側面において、本発明は、真菌を利用するバイオプロセスを増強する方法を包含する。組換えポリヌクレオチド分子により真菌を形質転換することにより、形質転換された真菌が生成される。当該組換えポリヌクレオチド分子は、プロモーターに作動可能に連結された単離されたポリヌクレオチド配列を含む。当該ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを発現することにより、沈殿物の形態を促進させる。形質転換された真菌の沈殿物の形態は、形態転換された真菌の繊維状形態を利用するバイオプロセスと比較すると、バイオプロセスを増強する。
【０００６】
一つの側面において、本発明は、真菌の形態を促進し、そしてバイオプロセスの生産性を増強する方法を包含する。真菌は、遺伝子配列の相補なアンチセンスに配列されたポリヌクレオチド配列により形質転換される。当該ポリヌクレオチド配列の転写産物はｍＲＮＡにハイブリダイズして、それにより当該遺伝子の発現を抑圧する。遺伝子の抑圧は、形態を促進させて、別の真菌の形態におけるバイオプロセスに比較して、バイオプロセスを増強する。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、天然の真菌において特異な発現を有することができるポリヌクレオチドを包含する。本記載のためには、ポリヌクレオチド配列の「発現」なる用語は、転写と翻訳の組み合わされたプロセスを意味し得るか、又は組み合わされた転写及び翻訳のプロセスの一部を意味し得る。用語「特異な発現（differential expression）」は、発現の２つ又はそれ以上の特異なレベルを意味し得るか、又は第２の例における発現の存在に比較した第１の例の発現の不在を意味し得る。
【０００７】
本発明は、天然の真菌により呈された特異な形態にて特異に発現されたポリヌクレオチド配列を含み得る、単離されたポリヌクレオチド分子を含む。本記載のためには、用語「天然」は、遺伝子操作されなかった生物を意味し得る。用語「単離された」は、天然に生じる分子、例えばそれを生産した生物から回収されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味し得るか、又は別に合成分子を意味し得る。
【０００８】
本発明による単離されたポリヌクレオチド分子は、沈殿形態を呈する真菌の、当該真菌の繊維状形態にての低レベルの発現又は発現の不在に比較して増加した発現を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。或いは、本発明によるポリヌクレオチド分子は、天然真菌の繊維状形態における、沈殿形態にての低レベルの発現又は発現の不在に比較して増加した発現を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。
【０００９】
本発明により包含される単離されたポリヌクレオチドは、繊維状形態及び沈殿形態を呈することができるあらゆる源の真菌から単離され得る。源の真菌は特定の種の真菌に限定されず、３つの主要な真菌群のいずれかのメンバーであり得る。担子菌鋼（Basidiomycetes）群の例示のメンバーは、ファネロキーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）である。子嚢菌鋼（Ascomycetes）及び不完全な真菌の例示のメンバーは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、エメリセラ・ニジュランス（Emericella nidulans）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、ペニシリウム・クリソジェナム（Penicillium chrysogenum）、及びトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）を含む。接合菌鋼（Zygomycetes）群の例示のメンバーはリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）及びリゾパス・オリゼー（Rhizopus oryzae）を含む。
【００１０】
本発明により包含される例示の単離されたポリヌクレオチド分子は、天然アスペルギルス・ニガーの繊維状形態において天然アスペルギルス・ニガーの沈殿形態に比較して特異に発現されたアスペルギルス・ニガーから単離されたポリヌクレオチド配列を含み得る。特異に発現されたポリヌクレオチド配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，８，１２，１６，１８，２２，２４，２６，２８，３３，３６及び３７の何れかに示される配列を含み得るか、又はそれらの配列のいずれかに相補な配列を含み得る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，８，１２，１６，１８，２２，２４，２６，２８，３３，３６及び３７に示されるポリヌクレオチド配列の各々は、以下に論じられる方法に従い製造される完全長のｃＤＮＡ分子から決定された配列に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：３６及び３７は完全長のｃＤＮＡから決定された部分配列である。本明細書にて論じられる単離方法及び技術は例示であること、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド分子を生成するために多数の慣用の技術が利用可能であることは、認識されるべきである。
【００１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，８，１２，１６，１８，２２，２４，２６，２８，３３，３６及び３７に示されるポリヌクレオチド配列を含む完全長のｃＤＮＡ分子は、アスペルギルス・ニガー株ＡＴＣＣ１１４１４から、サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション技術（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．６０２５−６０３０．１９９６）を、ＰＣＲ−ＳＥＬＥＣＴ（商標）ｃＤＮＡサブトラクションキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に利用して、得ることができる。２つのサプレッションサブトラクティブｃＤＮＡライブラリーが構築される。第１のｃＤＮＡライブラリーは、沈殿タイプの形態を呈するアスペルギルス・ニガーから得たｃＤＮＡをテスターとして、そして繊維状形態を呈するアスペルギルス・ニガーから得たｃＤＮＡをドライバーとして利用することにより、構築される。ドライバー／テスター比は、サブトラクションキットマニュアルに示唆された比よりも３倍に増加させる。
【００１２】
第２のサプレッションサブトラクティブｃＤＮＡライブラリーは、繊維状形態を呈するアスペルギルス・ニガーから得たｃＤＮＡをテスターとして、そして沈殿形態を呈するアスペルギルス・ニガーから得たｃＤＮＡをドライバーとして利用することにより、創製される。第１のｃＤＮＡプールを第１ライブラリーから生成し、そして第２ｃＤＮＡライブラリーを第２ライブラリーから生成する。沈殿形態において特異に存在するか又は増強される特異に発現されるｃＤＮＡを、第１ｃＤＮＡプールをプローブとして利用するハイブリダイゼーション及び第２のｃＤＮＡプールをプローブとして利用する個別のハイブリダイゼーションにより、第１ｃＤＮＡライブラリーから単離する。アスペルギルス・ニガーの繊維状形態に対して増強されたか又は特異なｃＤＮＡの単離は、第１ｃＤＮＡプール及び第２ｃＤＮＡプールをプローブとして利用することにより第２ｃＤＮＡライブラリーを別個にハイブリダイゼーションすることにより達成する。
【００１３】
サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションにより単離される特異に発現されるｃＤＮＡのセグメントを、ＤＮＡ配列決定のために選択する。当該セグメントの配列決定は、Ｔ７−２プライマーによる単一通過配列決定を利用して実施される。サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションにより単離されたＤＮＡ断片を使用して、完全長のｃＤＮＡｓの単離のための利用のために、遺伝子特異的プライマーの対をデザインする。
【００１４】
完全長のｃＤＮＡの単離は、マラソンｃＤＮＡ増幅キット及びＡＤＶＡＮＴＡＧＥ（登録商標）、ｃＤＮＡポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を利用して達成される。サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションクローンからデザインされた遺伝子特異的プライマーは、ｃＤＮＡエンドＰＣＲ（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）の迅速な増幅を実施するために利用される。火炎長のｃＤＮＡｓの配列を慣用の自動化ＤＮＡ配列決定法を用いて決定する。
【００１５】
１２の完全長ｃＤＮＡクローン及び２つの部分長ｃＤＮＡクローンを生成して、上で論じた方法により配列決定する。結果の配列を以下に提示する。Ｂａｌｕ−４のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に示され；Ｂａｌｕ−４２のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４に示され；Ｂｒｓａ−２５のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６に示され；Ｂｒｓａ−４３のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：８に示され；Ｂｒｓａ−４７のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２に示され；Ｂｒｓａ−１０９のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６に示され；Ｂｒｓａ−１１８のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１８に示され；Ａｒｓａ−７のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２２に示され；Ａｒｓａ−４８のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２４に示され；Ａ−３７のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２６に示され；Ａ−９０のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２８に示され；Ａｒｓａ−４３のｃＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３３に示され；Ａｒｓａ−１０のｃＤＮＡの部分配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３６に示され；そしてＡｒｓａ−２７のｃＤＮＡの部分配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３７に示される。
【００１６】
上記の１４の決定されたポリヌクレオチド配列の各々のアミノ酸配列は、公知の遺伝コードを利用して予測される。ホモロジー検索はＢＬＡＳＴＰを利用して実施され、予測されたアミノ酸配列とＮＣＢＩ非重複のジェンバンクのＣＤＳ中の配列の間でホモロジーを調査する。全てのホモロジー検索は、Ｅ＝０．００５の閾値Ｅ値を利用して処理される。従って、各ＢＬＡＳＴホモロジー検索の結果（以下に論じられる）は、この最初の閾値に基づく。
【００１７】
ノーザンブロット分析を利用して、１４のｃＤＮＡクローンの各々に相当する天然のアスペルギルス・ニガー内の遺伝子の発現レベルを分析する。繊維状形態を呈するアスペルギルス・ニガーによる各遺伝子の発現を、沈殿形態を呈するアスペルギルス・ニガー内の同じ遺伝子の発現と比較する。発現分析のために、アスペルギルス・ニガーを最初に約１２部／１００万（ｐｐｂ）Ｍｎ２＋より低いか又は等しいものを含む培養培地中で１２時間生育させる。生育の最初の１２時間の後に、培養物を半分に２分し、最初の半分を低Ｍｎ２＋濃度（約１２ｐｐｂよりも低いか又は等しい）にし、そして別の半分を約１０００ｐｐｂのＭｎ２＋（又は幾つかの場合には約１５ｐｐｂ  Ｍｎ２＋より高いか又は等しい最終濃度に）の最終濃度にする。アスペルギルス・ニガーはＭｎ２＋の濃度に極度に敏感であり得る。約１２ｐｐｂの濃度か又はそれより低いＭｎ２＋濃度においては、天然のアスペルギルス・ニガーは沈殿形態を呈し、約１２ｐｐｂの濃度か又はそれより高いＭｎ２＋濃度においては、天然のアスペルギルス・ニガーは繊維状形態を呈する。本記載を単純化するため、培養物を半分に２分する点（最初の生育の１２時間後）をタイムゼロ（ｔ＝０）と呼び得る。さらに、上記１２ｐｐｂの最終濃度までのＭｎ２＋の添加は繊維状形態を促進し、そしてＭｎ２＋の添加は繊維状誘導と呼ぶことができる。
【００１８】
培養サンプルを、非誘導培養物（沈殿形態）及び誘導培養物（繊維状形態）の両方から、タイムゼロ後２０、４０、６０及び１２０分目に回収する。サンプルを遠心分離することにより、培養沈殿物を形成させ、液体窒素により凍結させ、そして以後の全ＲＮＡ抽出のために−８０℃に保存する。
【００１９】
全ＲＮＡは、慣用の方法を利用して凍結した培養沈殿物から単離することができる。慣用のゲル電気泳動技術及び続くブロッティング膜への転写による全ＲＮＡサンプルのサイズ分画の後に、各時間点において回収された全ＲＮＡサンプルを、単離されたサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションｃＤＮＡ断片を無作為にプライミングするか又は制限エンドヌクレアーゼにより消化した完全長のｃＤＮＡの断片を無作為にプライミングすることにより合成されたプローブのハイブリダイゼーションを用いて分析する。プローブ合成は［３２Ｐ］−α−ｄＣＴＰの取り込みを含む。ノーザンブロットのハイブリダイゼーションの結果は、ブロットをｘ線フィルムに暴露することにより、可視化することができる。
【００２０】
図１は、Ｂａｌｕ−４のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に相当するアスペルギルス・ニガー遺伝子の発現のノーザンブロット分析のｘ線フィルム暴露を示す。増加するハイブリダイゼーションは、沈殿形態において生成されるｍＲＮＡに比較して（レーン１−３）、繊維状培養物から採取されたｍＲＮＡサンプルにおいて（レーン４、５及び６）、明らかであった。１５マイクログラム（μｇ）の全ＲＮＡを各レーンに用いた。利用されたＲＮＡサンプルは、出発ｔ＝０沈殿培養のｔ＝２０分（レーン１）、ｔ＝４０分（レーン）及びｔ＝１２０分（レーン３）；及び誘導後の繊維状培養ｔ＝２０分（レーン４）、ｔ＝４０（レーン５）及びｔ＝１２０分（レーン６）から得られる。各レーンに使用された全ＲＮＡ及び以下に考察されるノーザンブロットの各々のレーンの同定は、図１に示されたのと同じである。図１に示される結果は、Ｂａｌｕ−４が天然アスペルギルス・ニガーにおいては異なって発現され、増加された発現レベルが繊維状形態において検出される。
【００２１】
Ｂａｌｕ−４の演繹されたアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２０に示す。Ｂａｌｕ−４のアミノ酸配列はＢａｌｕ−４のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１）から予測される。図２に示すとおり、ＢＬＡＳＴＰを利用したアミノ酸配列ホモロジー検索は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２（上の配列）がエメリセラ・ニジュランスのＧ−プロテインのベータサブユニットのアミノ酸配列であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３（下の配列）と９７％の同一性を有することを示す。配列同一性の位置を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：（上）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３（下）の間の対応する同一アミノ酸の記号の位置により示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３の中間に示された記号「＋」は、保存されたアミノ酸の相違を示す。本発明のために、保存されたアミノ酸の相違又は保存されたアミノ酸の置換は、類似に化学特性を有する別のアミノ酸による一つのアミノ酸の置換を意味し得る。さらに、用語「ホモロジー」は、いくつかの例において、同一又は保存されたアミノ酸を意味する。
【００２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３の対応する位置の間のオープンスペースの出現は、２つの並べられた配列の間の非保存アミノ酸相違を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３と相対的に最少の同一性を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２の３つのセクションをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：３０，３１及び３２に示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２のアミノ酸２８−４９に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２のアミノ酸１９４−２０９に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２のアミノ酸２６０−２８８に相当する。
【００２３】
図３は、Ｂａｌｕ−４２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４に対応する点天然遺伝子の発現のノーザンブロット分析の結果を示す。繊維状形態のＢａｌｕ−４２に対応するｍＲＮＡの検出の増加は、Ｂａｌｕ−４２が、天然アスペルギルス・ニガーの沈殿形態に比較して、繊維状においては発現が増加して異なって発現されることを示す。
【００２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：５はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４から予測されたＢａｌｕ−４２のアミノ酸配列に相当する。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：５と検索されたデータベースの如何なる配列の間にもホモロジーを同定することができない。
【００２５】
図４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６に示すＢｒｓａ−２５のｃＤＮＡに相当する天然遺伝子の発現のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ｂｒｓａ−２５が、沈殿形態に比較して、天然のアスペルギルス・ニガーの繊維状形態においては発現が増加して異なって発現されることを示す。
【００２６】
Ｂｒｓａ−２５  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６の予測されたアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７に示す。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７と検索されたデータベースの如何なる配列の間にもホモロジーを同定することができない。
【００２７】
図５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：８に示すＢｒｓａ−４３のｃＤＮＡに相当する天然遺伝子の発現のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ｂｒｓａ−４３が、沈殿形態に比較して、天然のアスペルギルス・ニガーの繊維状形態においては発現が増加して異なって発現されることを示す。
【００２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：８から予測されたＢｒｓａ−４３のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：９に示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：９のアミノ酸２９−５９４に相当する。図６は、ヒトトリペプチジルペプチダーゼＩ前駆体（リソソームペプスタチン非感受性プロテアーゼ）のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１１と３１％同一性を有するＢｒｓａ−４３  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０（上の配列）のＢＬＡＳＴＰアラインメント及び比較を示す。配列の間の同一性及びホモロジーの表示は、図２に関して上で考察されたとおりである。
【００２９】
図７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２に示されたｃＤＮＡ配列に相当する天然Ｂｒｓａ−４７遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ｂｒｓａ−４７が異なって発現され；アスペルギルス・ニガーの沈殿形態に比較して、繊維状形態においては増加した発現レベルが明らかであることを示す。
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２から演繹されたＢｒｓａ−４７のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３に示される。図８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３のアミノ酸２６−５３０に相当するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４（上の配列）のＢＬＡＳＴＰホモロジー検索結果を示す。ＢＬＡＳＴＰの結果は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４がセサマム・インディカム（Sesamum indicum）からのＭｙｏ−イノシトール１−ホスフェートシンターゼのアミノ酸配列と５６％の同一性を有することを示す。
【００３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６に示されるｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＢｒｓａ−１０９遺伝子の発現のノーザンブロット分析を示す。結果は、Ｂｒｓａ−１０９遺伝子が異なって発現され、沈殿形態に比較して、繊維状形態においては増加した発現が検出されることを示す。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１６から予測されたＢｒｓａ−１０９のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１７に示す。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１９と検索されたデータベースの如何なる配列の間にもホモロジーを同定することができない。
【００３３】
図１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１８に示されたｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＢｒｓａ−１１８遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ｂｒｓａ−１１８遺伝子が異なって発現され、沈殿形態に比較して、繊維状形態においては増加した発現が検出されることを示す。
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１８から予測されたＢｒｓａ−１１８のアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１９において示す。図１１は、Ｂｒｓａ−１１８のＢＬＡＳＴＰホモロジー検索の結果を示す。結果は、Ｂｒｓａ−１１８の予測されたアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２０（上の配列）が、ニューロスポラ・クラッサからの推定のヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２１（下の配列）と６６％の同一性を有することを示す。
【００３５】
図１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２２に示されたｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡｒｓａ−７遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａｒｓａ−７遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現レベルであることを示す。
【００３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２２から予測されたＡｒｓａ−７のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２３において示す。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索の結果は、Ａｒｓａ−７の予測されたアミノ酸配列とのホモロジーを有する如何なる配列も同定できなかった。
【００３７】
図１３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２４に示されたｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡｒｓａ−４８遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａｒｓａ−４８遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現レベルであることを示す。
【００３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２４から予測されたＡｒｓａ−４８のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２５において示す。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索の結果は、Ａｒｓａ−４８の予測されたアミノ酸配列とのホモロジーを有する如何なる配列も同定できなかった。
【００３９】
図１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２６に示されたｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡ−３７遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａ−３７遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現が生じることを示す。
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２６から予測されたＡ−３７のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２７において示す。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索の結果は、Ａ−３７の予測されたアミノ酸配列とのホモロジーを有する如何なる配列も同定できなかった。
【００４１】
図１５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２８に示されたｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡ−９０遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａ−９０遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現が生じることを示す。
【００４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２８から予測されたＡ−９０のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２９において示す。ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索の結果は、Ａ−９０の予測されたアミノ酸配列とのホモロジーを有する如何なる配列も同定できなかった。
【００４３】
図１６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示すｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡｒｓａ−４３遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａｒｓａ−４３遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現が生じることを示す。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３３から予測されたＡｒｓａ−４３のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３４において示す。図１７は、Ａｒｓａ−４３のＢＬＡＳＴＰホモロジー検索の結果を示す。結果は、Ａｒｓａ−４３の予測されたアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３４（上の配列）が、アスペルギルス・ニジュランスからのポリユビキチン蛋白質のアミノ酸配列，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３５（下の配列）と９６％の同一性を有することを示す。
【００４５】
図１８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６に示すｃＤＮＡ部分配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡｒｓａ−１０遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａｒｓａ−１０遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現を伴う。ホモロジー検索は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３６と検索されたデータベース中の他のポリヌクレオチド配列の間に如何なるホモロジーも検出できない。
【００４６】
図１９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示すｃＤＮＡ部分配列に相当する天然アスペルギルス・ニガーのＡｒｓａ−２７遺伝子のノーザンブロット分析の結果を示す。結果は、Ａｒｓａ−４３遺伝子が異なって発現され、繊維状形態の発現レベルに比較して、沈殿形態においては増加した発現を伴う。ホモロジー検索は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３７と検索されたデータベース中の他のポリヌクレオチド配列の間に如何なるホモロジーも検出できない。
【００４７】
図２０及び２１を参照すると、様々なアスペルギルス・ニガーの遺伝子の異なる発現のバー−チャート比較を示す。図２０は、遺伝子Ｂａｌｕ−４，Ｂｒｓａ−２５，Ｂｒｓａ−４３，Ｂｒｓａ−４７，Ｂｒｓａ−１０９及びＢｒｓａ−１１８の転写レベルを示し、繊維状のアスペルギルス・ニガーにおいて増加した発現を示す。図２１は、遺伝子Ａｒｓａ−７，Ａｒｓａ−１０，Ａｒｓａ−２７，Ａ−３７，Ａｒｓａ−４３，及びＡｒｓａ９０の転写レベルをレベルを示し、アスペルギルス・ニガーの沈殿形態において増加した発現を示す。
【００４８】
追加の発現分析は、ｔ＝０後５日まで成長させた培養物を利用する（上で定義したとおり）。図２２を参照すると、沈殿条件にて生育させたアスペルギルス・ニガーにおける転写レベルに比較して（パネルＡ）、繊維状条件にて生育させたアスペルギルス・ニガーにおいて（パネルＢ）、遺伝子遺伝子Ｂａｌｕ−４，Ｂｒｓａ−２５，Ｂｒｓａ−４３，Ｂｒｓａ−４７，Ｂｒｓａ−１０９及びＢｒｓａ−１１８の転写レベルが増加したことを示す。図２３を参照すると、繊維状条件にて生育させたアスペルギルス・ニガーにおける転写レベルに比較して（パネルＢ）、沈殿条件にて生育させたアスペルギルス・ニガーにおいて（パネルＡ）、遺伝子Ａｒｓａ−７，Ａｒｓａ−１０，Ａｒｓａ−２７，Ａ−３７，Ａｒｓａ−４３，及びＡｒｓａ−９０の転写レベルが増加したことを示す。
【００４９】
特定の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：２，５，７，９，１３，１７，１９，２３，２５，２７，２９及び３４の何れかに示されるアミノ酸配列及びそれらの機能上の均等物を含む単離されたポリペプチド分子を包含する。本発明のためには、機能上の均等物なる用語は、非末端削除ポリペプチド、非置換ポリペプチドに比較して、実質上均等な機能特性及び／又は生物学特性を有するアミノ酸配列の、末端削除バージョン又は保存された置換バージョンを意味し得る。当業者には理解されるとおり、配列表に示されたアミノ酸配列を末端削除するか又は保存アミノ酸置換を導入するためには慣用の方法を利用することができる。本発明の単離されたポリペプチドを生成するために利用できる慣用の方法が利用可能である。
【００５０】
上で論じられた単離されたポリヌクレオチド分子に加えて、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：２，５，７，９，１３，１７，１９，２３，２５，２７，２９及び３４の何れかに示されるアミノ酸配列をコードするか又はそれらのアミノ酸配列の機能上の均等物をコードする別のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：３６及び３７及び機能上の均等物、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：３６及び３７によりコードされるアミノ酸配列をコードする別のポリヌクレオチド配列も包含する。当業者には理解されるとおり、遺伝コードの縮重性質のため、結果のアミノ酸配列に影響することなくポリヌクレオチド配列に様々な修飾を導入することができる。
【００５１】
様々な組換えポリヌクレオチド構築物が本発明に包含される。特定の態様において、本発明による組換えポリヌクレオチド構築物は、上で論じられた単離されたポリヌクレオチド配列の何れかを含み得る。本明細書にて論じられたポリヌクレオチド配列の何れかの全部又は一部を、プロモーターに連結することができ、好ましくは、プロモーターに作動可能に連結され得る。組換えポリヌクレオチド構築物を形成するためのポリヌクレオチドのプロモーターへの作動な連結は、ポリヌクレオチド配列の発現をプロモーターにより制御可能とさせ得る。或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，８，１２，１６，１８，２２，２４，２６，２８，３３，３６及び３７の何れか一つの示される配列の少なくとも一部に相補な配列を利用することにより、組換えポリヌクレオチドを形成させることができるか、又はアンチセンス配置にて取り込ませることができる。
【００５２】
特定の側面において、上記相補配列は、サプレッションハイブリダイゼーションを可能にさせるのに十分長い相補配列の一部を含み得る（下で論じられる）。３０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列の利用を意図するが、サプレッションハイブリダイゼーションは３０ヌクレオチドより長いか又は３０ヌクレオチドに等しい長さを有する一つ又は複数のポリヌクレオチドの利用を、典型的には含み得る。従って、発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，８，１２，１６，１８，２２，２４，２６，２８，３３，３６及び３７の何れか一つに示される配列の何れかの断片及び相補断片を含むポリヌクレオチド配列を包含する。そのような断片は、好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチドの長さの、相当する配列又は相補配列を含み得る。
【００５３】
発明は、上で論じられた単離されたポリヌクレオチド配列の何れかを含むベクターも包含する。本発明により包含されるベクターは、特定の種類のベクターに限定されず、例えば、プラスミド、コスミッド又はウイルスベクターであり得る。本発明によるベクターは、論じられた単離ポリヌクレオチド分子を一つ又は複数、宿主細胞に導入するのに利用することができる。宿主細胞は特定の種類の細胞に限定されず、例えば、細菌、真菌、又は高等真核細胞であり得る。さらに、本発明により包含されるベクターは、クローニングベクター、発現ベクター及び／又は組込み型ベクターであり得る。
【００５４】
発明は、上で論じられた単離ポリヌクレオチド分子の何れかを含むように形質転換された、形質転換宿主細胞及び細胞培養物も包含する。単離されたポリヌクレオチドを所望の宿主細胞に導入するための慣用の形質転換技術を利用することができる。
【００５５】
本発明は、真菌において形態を促進させる方法を包含する。真菌において形態を促進させるプロセスは、図２４のフローチャートに関して記載される。最初の工程１００において、単離されたポリヌクレオチドが用意される。工程１００からの単離されたポリヌクレオチドは、上で論じられた単離ポリヌクレオチドの何れかを含み得る。
【００５６】
工程１００からの単離ポリヌクレオチドを用いて、工程１１０にて組換えポリヌクレオチドを形成させることができる。上で論じられたとおり、組換えポリヌクレオチドの形成は、プロモーターを単離されたポリヌクレオチド配列と作動可能なように連結することを含み得る。さらに、組換えヌクレオチド工程１１０の形成は、工程１２０において真菌を形質転換するのに利用可能なベクターの形成を含み得る。形成転換工程１２０において利用可能な真菌は多数存在する。好ましくは、形質転換される真菌は、繊維状形態を呈することができ、且つ沈殿形態を呈することもあらに可能である。工程１２０のための例示の真菌は、例えば、源の真菌に関して上で論じられた真菌の何れかであり得る。
【００５７】
形質転換工程１２０の後に、上記組換えポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが工程１３０において形質転換された真菌から発現され得る。工程１３０の発現は、真菌の特定の形態を促進することができる。発現により促進される特定の形態は、工程１００において用意された単離されたポリヌクレオチドの配列により決定され得る。例えば、繊維状形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：２，５，７，９，１３，１７，１９，２３，２５，２７，２９及び３４の何れかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを又はそれらの機能上均等物をコードする単離されたポリヌクレオチドを用意することにより促進され得る。或いは、沈殿形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：２３，２５，２７，２９，及び３４の何れか一に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：３６又は３７又はその機能上の均等物によりコードされるアミノ酸配列をコードする、工程１００の単離されたポリヌクレオチドを用意することにより促進され得る。
【００５８】
本発明の別の態様において、アンチセンス配置の相補配列を含む組換えポリヌクレオチド（上で論じられた）を形質転換工程１２０に利用することができる。抑圧工程１４０においては、上記アンチセンスＲＮＡの転写から生成されるＲＮＡが天然ｍＲＮＡとＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成して、それによりＲＮＡ分解を促進し、及び／又はｍＲＮＡの翻訳を阻害又は遮断し得る。従って、工程１２０において導入された組換えアンチセンス構築物は所望の形態を促進するために相補遺伝子の発現を抑圧又は遮断することができる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，８，１２，１６又は１８の何れかの断片又は全体に相補な配列を含むポリヌクレオチド構築物が工程１２０において導入され得る。工程１４０においては、アンチセンス相補配列から生成された転写物を、遺伝子Ｂａｌｕ−４，Ｂｒｓａ−２５，Ｂｒｓａ−４３，Ｂｒｓａ−４７，Ｂｒｓａ−１０９又はＢｒｓａ−１１８から転写されたｍＲＮＡにそれぞれハイブリダイズさせることができ、そして相当する蛋白質産物の生成を阻害又は遮断することができる。本発明に従う方法によるＢａｌｕ−４，Ｂｒｓａ−２５，Ｂｒｓａ−４３，Ｂｒｓａ−４７，Ｂｒｓａ−１０９又はＢｒｓａ−１１８の一つ又は複数の抑圧は、形質転換宿主において沈殿形態を促進することができる。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：２２，２４，２６，２８，３３，３６，及び３７の何れかの断片又は全体に相補な一つ又は複数の配列を含むポリヌクレオチドを工程１２０において導入でき、相当する遺伝子Ａｒｓａ−７，Ａｒｓａ−１０，Ａｒｓａ−２７，Ａ−３７，Ａｒｓａ−４３，及びＡｒｓａ９０の発現を阻害又は遮断することができる。本発明に従う方法による工程１４０においての遺伝子Ａｒｓａ−７，Ａｒｓａ−１０，Ａｒｓａ−２７，Ａ−３７，Ａｒｓａ−４３，及びＡｒｓａ９０の一つ又は複数の抑圧は、形質転換された宿主において繊維状形態を促進することができる。
【００５９】
図２４に示すプロセスは工程１００において単一の単離ポリヌクレオチドを用意することに関して論じられたが、発明は上で論じられた二つ又はそれより多い単離ポリヌクレオチド配列を用意することを包含することは、認識されるべきである。さらに、発現されたときに少なくとも一つの提供された単離ポリヌクレオチドが沈殿形態を促進することができ、且つ発現されたときに他の一つの用意された単離ポリヌクレオチドが繊維状形態を促進し得るように、工程１００において単離されたポリヌクレオチド配列が用意され得ることは、認識されるべきである。工程１１０において異なる誘導可能なプロモーターに異なる単離ポリヌクレオチドを作動可能なように連結し、且つ工程１２０における形質転換のために複数の組換えポリヌクレオチドを使用することにより、工程１３０又は１４０において発現を誘導することにより、繊維状形態又は沈殿形態の何れかを選択的に促進することが可能であり得る。
【００６０】
特定の真菌の形態の利用は真菌の培養においてバイオプロセスを増強し得るから、真菌において特定の形態を促進することは有利であり得る。例えば、沈殿形態の真菌の利用は、様々なバイオプロセス、例えば、ヘミセルラーゼを発現すること、セルラーゼを発現すること、リグナーゼを発現すること、バイオマスをアルコールに変換すること、有機酸を生成すること、グルコアミラーゼを生成すること、ペニシリンを生成すること、及びロバスタチンを生成することを増強することができる。或いは、繊維状真菌の培養物の利用は、フマル酸生成又はペプチド酵素の生成のようなバイオプロセスを増強し得る。
【００６１】
図２４に示されたプロセスは、形質転換された真菌を生成すること及び他には同一の条件下での非形質転換真菌培養物に比較して形質転換された真菌を含む培養物において所望の生成物の生成を増強するために利用され得る形質転換された真菌において沈殿形態を促進させるために利用可能である。或いは、上記プロセスは、形質転換された真菌を生成するため及び形質転換された真菌において繊維状形態を促進するために利用することができる。促進された繊維状形態は、、他には実質上同一の条件下での非形質転換培養物に比較して、形質転換された真菌を含む培養物において想うの生成物の生成を増強することができる。
【００６２】
発明は上で論じられた形態促進構築物と共に、興味のある一つ又は複数の蛋白質をコードする一つ又は複数のポリヌクレオチドを同時導入することも意図する。興味のある蛋白質は、宿主に対して天然であるか又は異なる真菌又は非真菌種からであり得る。興味のある蛋白質が、第１の形態において、第２の形態に比較して増加した発現及び／又は活性を有する場合、同時導入された形態促進構築物は、好ましくは第１の形態を促進することができる。興味のある蛋白質は培養物から回収され得る蛋白質であってよいか、又は所望の生成物又は化合物を生成するバイオプロセスに関与する蛋白質であり得る。
【００６３】
実施例
実施例１：ＤＮＡの単離及び機能分析の一般法
エシェリヒアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α及びＪＭ１０９をクローニング実験の宿主として使用する。サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）による形態に関連する遺伝子の単離のために、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））に記載された修飾された酸−フェノールグアニジウムイソチオシアネート抽出法に従い、アスペルギルス・ニガーから全ＲＮＡを単離した。ＳＳＨは、製造者により記載されたとおりに、ＰＣＲ−ＳＥＬＥＣＴＴＭｃＤＮＡサブトラクションキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）を利用して実施したが、試験されたテスターに比例してドライバーのｃＤＮＡの量を第１のハイブリダイゼーション及び第２のハイブリダイゼーションの各々に関して三重にした。
【００６４】
ＳＳＨ  ｃＤＮＡライブラリーの別のスクリーニングにより、形態に関連するクローンを同定する。２つのオリゴヌクレオチドを、各々の新規に単離されたクローン配列に対してデザインする。ｃＤＮＡの迅速な増幅及びＰＣＲ（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）を実施することにより、各ｃＤＮＡクローンの５’末端及び３’末端を単離する。
【００６５】
真菌の形質転換は、ｐＡＮ７−１（Ｐｕｎｔ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：４４７−５７（１９９２））中のＢｇｌ  ＩＩ／Ｘｂａ  Ｉ  ｐＧｐｄＡ−ｈｐｈ−ＴｔｒｐＣ断片を二元ベクター（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｇｅｌｖｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｅｒｏｌａｎｄｓ（１９８８），ｐｐ  Ａ３／１−１９）に挿入して利用することにより達成する。ｐＧＡ４８２に基づく構築物のアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＡＧＬ０への導入は、凍結及び乾燥方法（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８４：５７４５−５７４９（１９８７））を利用して行う。プラスミドを、形質転換されたアグロバクテリウム・チュメファシエンスから単離し、様々な制限酵素により消化し、そしてアガロースゲル電気泳動を利用して分析することにより形質転換を確認する。真菌の形質転換は、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：８３９−４２（１９９８）に記載されたとおりに実施する。少なくとも１５の独立の形質転換された真菌が選択され、そして２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン及び２５０μｇ／ｍｌのセフォタキシンを各々のトランスジェニック事象に関して含む寒天最小培地上で生育させる。
【００６６】
実施例２：アンチセンス発現を用いた形態の促進
以下の一つ：Ｂａｌｕ−４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４）；Ｂｒｓａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６）；Ｂｒｓａ−１１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１８）；Ａｒｓａ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２２）；Ａ−３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２６）；及びＡ−９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２８）に相補なポリヌクレオチド配列を含むように、個々のトランス遺伝子発現ベクターを構築する。相補配列を、アスペルギルス・ニジュランスのホスホグリセラルデヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモーター及びアスペルギルス・ニジュランスのｔｒｐＣターミネーターの制御下にてアンチセンス配置にて上記ベクター中に取り込む。構築されたベクターを別個に、アグロバクテリウム・チュメファシエンス媒介形質転換を利用してアスペルギルス・ニガーに導入する。アンチセンス配列を取り込まない二元ベクターの形質転換により対照のアスペルギルス・ニガーを用意する。
【００６７】
図２５を参照すると、同一条件下で培養された対照のアスペルギルス・ニガーとの比較において、アンチセンスＢｒｓａ−４２，Ｂｒｓａ−２５及びＢｒａ−１１８（右）を発現するトランスジェニックなアスペルギルス・ニガーにおいて沈殿形態の促進を示す。図２６は、同一条件下で培養された対照のアスペルギルス・ニガーとの比較において、アンチセンスＡｒｓａ−７，Ａ−３７及びＡ−９０（右）を発現するトランスジェニックなアスペルギルス・ニガーにおいて繊維状形態の促進を示す。
【００６８】
実施例３：形態増強されたバイオ生産
アンチセンス相補Ｂａｌｕ−４２（株２８０５）又はＢｒｓａ−１１８（株２８０８）を含むトランスジェニックなアスペルギルス・ニガーを実施例１のとおりに調製する。各株の複数の別個の形質転換された培養物及び複数の対照培養物（上記のとおりに調製）を３０℃において約５０時間生育させた。図２６を参照すると、パネルＡは、形質転換された株２８０５（Ｂａｌｕ−４２）及び２８０８（Ｂｒｓａ−１１８）の個々の培養物及び対照のアスペルギルス・ニガーのクエン酸の生産を示す。パネルＢは、対照の培養物に比較した、株２８０５及び２８０８の培養物の平均のクエン酸の生産を示す。
【００６９】
結果は、本発明の方法及び配列を利用することにより真菌において形態を促進することが可能なことを示す。発明の方法論による形態の促進は、蛋白質の生産を増強するため、及び／又は、トランスジェニックな真菌を利用するバイオプロセスを増強するために、使用することができる。
【００７０】
規則に従い、発明は多かれ少なかれ構造上の特徴及び方法論上の特徴に特異な用語にて記載されてきた。しかしながら、示され且つ記載された特定の特徴に発明を限定されるべきではなく、何故ならば、本明細書に開示された手段は発明を有効にするのに好ましい形態を含むからである。発明は、よって、均等の原理に従い適切に解釈された請求の範囲の正確な範囲内でその形態又は修飾の何れかにて請求される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
本発明の好ましい態様は以下において以下の図面を参照することにより記載される。
【図１】図１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたＢａｌｕ−４のｃＤＮＡ配列に相当する天然Ａ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図２】図２は、アスペルギルス・ニガーのＢａｌｕ−４の演繹されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２（上の配列）と、エメリセラ・ニジュランスのＧ−プロテインのベータサブユニットのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３（下の配列）、のアラインメント及び比較を示す。
【図３】図３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されたＢａｌｕ−４２のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図４】図４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されたＢｒｓａ−２５のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図５】図５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されたＢｒｓａ−４３のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図６】図６は、アスペルギルス・ニガーのＢｒｓａ−４３の演繹されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１０（上の配列）と、ホモ・サピエンスのリソソームペプスタチン非感受性プロテアーゼのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１１（下の配列）、のアラインメント及び比較を示す。
【図７】図７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されたＢｒｓａ−４７のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図８】図８は、アスペルギルス・ニガーのＢｒｓａ−４７の演繹されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１４（上の配列）と、セサマム・インディカムのミオ−イノシトール１−リン酸合成酵素のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１５（下の配列）、のアラインメント及び比較を示す。
【図９】図９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されたＢｒｓａ−１０９のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１０】図１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されたＢｒｓａ−１１８のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１１】図１１は、アスペルギルス・ニガーのＢｒｓａ−１１８の演繹されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２０（上の配列）と、セサマム・インディカムのミオ−イノシトール１−リン酸合成酵素のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２１（下の配列）、のアラインメント及び比較を示す。
【図１２】図１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示されたＡｒｓａ−７のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１３】図１３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示されたＡｒｓａ−４８のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１４】図１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に示されたＡ−３７のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１５】図１５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に示されたＡ−９０のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１６】図１６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示されたＡｒｓａ−４３のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１７】図１７は、アスペルギルス・ニガーのＡｒｓａ−４３の演繹されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３４（上の配列）と、アスペルギルス・ニジュランスのポリユビキチン蛋白質のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３５（下の配列）、のアラインメント及び比較を示す。
【図１８】図１８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６に示されたＡｒｓａ−１０のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図１９】図１９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されたＡｒｓａ−２７のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。レーン１、２及び３は沈殿物の形態の転写レベルを反映する。繊維状形態の転写レベルは、繊維状形態を誘導してから２０分後（レーン４）、４０分後（レーン５）及び１２０分後（レーン６）を示す。
【図２０】図２０は、Ｂａｌｕ−４，Ｂｒｓａ−２５，Ｂｒｓａ−４３，Ｂｒｓａ−４７，Ｂｒｓａ−１０９，及びＢｒｓａ−１１８遺伝子の各々に関して、天然のアスペルギルス・ニガーの沈殿形態（左）に比較した、繊維状形態（右）の増強された発現レベルの比較を示す。
【図２１】図２１は、Ａｒｓａ−７，Ａｒｓａ−１０，Ａｒｓａ−２７，Ａ−２７，Ａｒｓａ−４３及びＡ−９０遺伝子の各々に関して、天然のアスペルギルス・ニガーの沈殿形態（左）に比較した、繊維状形態（右）の増強された発現レベルの比較を示す。
【図２２】図２２は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１，４，６，１２，１６及び１８に示されるＢａｌｕ−４，Ｂａｌｕ−４２，Ｂｒｓａ−２５，Ｂｒｓａ−４７，Ｂｒｓａｓ−１０９，及びＢｒｓａ−１１８のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。パネル（Ａ）は、１０ｐｐｂ  Ｍｎ２＋中で生育させた天然アスペルギルス・ニガー遺伝子（沈殿形態）中の１４時間（レーン１）、２４時間（レーン２）、４８時間（レーン３）、７２時間（レーン４）、９６時間（レーン５）及び１２０時間（レーン６）における転写レベルを示す。パネル（Ｂ）は、１０００ｐｐｂ  Ｍｎ２＋中で生育させた天然アスペルギルス・ニガー遺伝子（繊維状形態）中の１時間（レーン１）、２時間（レーン２）、２４時間（レーン３）、３６時間（レーン４）、７２時間（レーン５）及び１０８時間（レーン６）における転写レベルを示す。
【図２３】図２３は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：２２，２４，２６及び２８に示されるＡｒｓａ−７，Ａ−３７，Ａｒｓａ−４８，及びＡｒｓａ−９０のｃＤＮＡ配列に相当する天然アスペルギルス・ニガー遺伝子の転写レベルのノーザンブロット分析の結果を示す。パネル（Ａ）は、１０ｐｐｂ  Ｍｎ２＋中で生育させた天然アスペルギルス・ニガー遺伝子（沈殿形態）中の１４時間（レーン１）、２４時間（レーン２）、４８時間（レーン３）、７２時間（レーン４）、９６時間（レーン５）及び１２０時間（レーン６）における転写レベルを示す。パネル（Ｂ）は、１０００ｐｐｂ  Ｍｎ２＋中で生育させた天然アスペルギルス・ニガー遺伝子（繊維状形態）中の１時間（レーン１）、２時間（レーン２）、２４時間（レーン３）、３６時間（レーン４）、７２時間（レーン５）及び１０８時間（レーン６）における転写レベルを示す。
【図２４】図２４は、本発明の特定の側面を例示するフローチャートダイアグラムである。
【図２５】図２５は、Ｂａｌｕ−４２（パネルＡ）、Ｂｒｓａ−２５（パネルＢ）及びＢｒｓａ−１１８（パネルＣ）に相補なアンチセンスに配列されたポリヌクレオチド配列により形質転換されたアスペルギルス・ニガーの抑圧の結果を示す。各パネルは、１５ｐｐｂのＭｎ２＋培地中で生育された、対照のアスペルギルス・ニガー（左）及び対応するアンチセンスＤＮＡ構築物を含む形質転換されたアスペルギルス・ニガー（右）の形態を比較する。
【図２６】図２６は、Ａｒｓａ−７（パネルＡ）、Ａ−３７（パネルＢ）及びＡ−９０（パネルＣ）に相補なアンチセンスに配列されたポリヌクレオチド配列により形質転換されたアスペルギルス・ニガーの抑圧の結果を示す。各パネルは、１２ｐｐｂのＭｎ２＋培地中で生育された、対照のアスペルギルス・ニガー（左）及び形質転換されたアスペルギルス・ニガー（右）の形態を比較する。
【図２７】図２７は、対照のアスペルギルス・ニガー及びＢａｌｕ−４２（株２８０５）に相補又はＢｒｓａ−１１８（株２８０８）に相補なアンチセンスに配列されたポリヌクレオチド配列を含む形質転換されたアスペルギルス・ニガーのクエン酸の生産を示す。パネル（Ａ）は、個々の形質転換実験の測定されたクエン酸の生産を示す。パネル（Ｂ）はパネル（Ａ）において描写されたデータの平均化された値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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