(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt1812がcであるか否か若しくはｔであるか否か、及びnt1809がgであるか否か若しくはtであるか否か、並びにnt1984がaであるか否かを調べることを含む、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプがAaとAeのいずれであるかを判別する方法。
【請求項２】
3'末端がnt1812又はnt1809になるように設定したセンスプライマーを用い、nt1989よりも下流の部位までの断片をPCRにより増幅し、次いで、得られた増幅断片について、BglIIを用いるRFLPを行なう請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記センスプライマーは、3'末端がnt1812であり、サブタイプAeの部分配列を有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
3'末端がnt1812又はnt1809になるように設定したセンスプライマーから成るＢ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプ判別用プライマー。
【請求項５】
3'末端がnt1812であり、サブタイプAeの部分配列を有する請求項４記載のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプがAaとAeのいずれであるかを判別する方法及びそれに用いられるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)は、世界、とりわけアジア及びアフリカ諸国において、劇症肝炎、肝硬変及び肝細胞癌(HCC)のような急性及び慢性の肝疾患の最も重要な原因の１つである。AないしHに分類されるHBV(HBV/AないしHBV/H)８種類のジェノタイプは、約3200ヌクレオチド(nt)の全塩基配列の8%を超えるジェノタイプ間の相違により識別される（非特許文献２、１８、１９、２２）。これらのジェノタイプは、異なる地理的分布、ウイルス学的特徴及び臨床症状を有している（非特許文献１５、１７）。さらに、同一のジェノタイプのHBV単離物の間でも、ウイルス学的特徴が異なることもある。
【０００３】
最近、アジア諸国において、HBVのジェノタイプＢの２つのサブタイプ、すなわち、Ba(aはアジアを意味する）及びBj(jは日本を意味する）が報告され（非特許文献２４）、HBV/Baに感染した患者とHBV/Bjに感染した患者の間には臨床的な相違が認められつつある（非特許文献１、２５）。
【０００４】
同様に、ジェノタイプＡのサブタイプも報告され、サハラ砂漠以南のアフリカ諸国ではA'と呼ばれる（非特許文献４）。プレS2/S領域（非特許文献４）及び完全なゲノム（非特許文献１３）の両方の系統学的分析により、南アフリカからの多数のHBV単離物は、このサブタイプA'と群を成すことがわかった。このサブグループは、マラウイからのHBV単離物中にもまた見出された（非特許文献２６）。アフリカ諸国における、そのほとんどがサブタイプA'であるジェノタイプAは、HBV DNAの血清濃度が低く、血清中の肝炎B e抗原(HBeAg)の頻度も低く（非特許文献１１、１２）、また、アフリカではHCCを引き起こす能力が高い。一方、ジェノタイプＡの残りに属する単離物に感染した、ヨーロッパ諸国及び米国に広く分布するHBVキャリアは、他の群に比べ、長期間の追跡の間、セロコンバージョン後の緩解が持続し、肝疾患に関連して死亡する率が低い（非特許文献６、２１、２９）。
【０００５】
アメリカ、日本、インド、南アフリカＨＢＶ  40例の421塩基 (ＨＢＶ；nt 1631-2051)を決定し、既存配列を加えて、系統学的に解析（6-パラメーター、ネイバージョイニング法）され、ブートストラップ法にて分かれた株がそれぞれ、HBV/Aa、HBV/Aeと分類された。基本となるHBVジェノタイプＡの配列が非特許文献３０(GenBank Accession No. AB014370) （配列表の配列番号１）に記載されており、T1809, T1812, T1862, H1888, A1951, C1978, G1984, A1990, T1996, A1999, G2017のSNPsを有するものがAaである。従って、HBVのジェノタイプＡのサブタイプがAaかAeかの判別は、少なくともnt 1631-2051の領域の全塩基配列を決定することにより確実に行うことができる。しかしながら、この領域の全塩基配列を決定することは手間もコストもかかり、多数の検体について所定の時間内にサブタイプを決定する臨床検査においては、より簡便にサブタイプを決定できる方法が望まれる。
【０００６】
【非特許文献１】Akuta, N., F. Suzuki, M. Kobayashi, A. Tsubota, Y. Suzuki, T. Hosaka, T. Someya, S. Saitoh, Y. Arase, K. Ikeda, and H. Kumada. 2003. The influence of hepatitis B virus genotype on the development of lamivudine resistance during long-term treatment. J Hepatol 38:315-21.
【非特許文献２】2.Arauz-Ruiz, P., H. Norder, B. H. Robertson, and L. O. Magnius. 2002. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. J Gen Virol 83:2059-73.
【非特許文献３】Botha, J. F., M. J. Ritchie, G M. Dusheiko, H. W. Mouton, and M. C. Kew. 1984. Hepatitis B virus carrier state in black children in Ovamboland: role of perinatal and horizontal infection. Lancet 1:1210-2.
【非特許文献４】Bowyer, S. M., L. van Staden, M. C. Kew, and J. G Sim. 1997. A unique segment of the hepatitis B virus group A genotype identified in isolates from South Africa. J Gen Virol 78 ( Pt 7):1719-29.
【非特許文献５】Dusheiko, G. M., S. M. Bowyer, A. Paterson, E. Song, A. Dibisceglie, and M. C. Kew. 1985. Clinical and serological events accompanying changes in hepatitis B viral replication: case reports. Liver 5:77-83.
【非特許文献６】Erhardt, A., U. Reineke, D. Blondin, W. H. Gerlich, O. Adams, T. Heintges, C. Niederau, and D. Haussinger. 2000. Mutations of the core promoter and response to interferon treatment in chronic replicative hepatitis B. Hepatology 31:716-25.
【非特許文献７】Fattovich, G`, G Giustina, S. W. Schalm, S. Hadziyannis, J. Sanchez-Tapias, P. Almasio, E. Christensen, K. Krogsgaard, F. Degos, M. Carneiro de Moura, and et al. 1995. Occurrence of hepatocellular carcinoma and decompensation in western European patients with cirrhosis type B. The EUROHEP Study Group on Hepatitis B Virus and Cirrhosis. Hepatology 21:77-82.
【非特許文献８】Felsentein, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-91.
【非特許文献９】Gojobori, T., K. Ishii, and M. Nei. 1982. Estimation of average number of nucleotide substitutions when the rate of substitution varies with nucleotide. J Mol Evol 18:414-23.
【非特許文献１０】Kew, M. C., and P. Macerollo. 1988. Effect of age on the etiologic role of the hepatitis B virus in hepatocellular carcinoma in blacks. Gastroenterology 94:439-42.
【非特許文献１１】Kramvis, A., S. Bukofzer, M. C. Kew, and E. Song. 1997. Nucleic acid sequence analysis of the precore region of hepatitis B virus from sera of southern African black adult carriers of the virus. Hepatology 25:235-40.
【非特許文献１２】Kramvis, A., M. C. Kew, and S. Bukofzer. 1998. Hepatitis B virus precore mutants in serum and liver of Southern African Blacks with hepatocellular carcinoma. J Hepatol 28:132-41.
【非特許文献１３】Kramvis, A., L. Weitzmann, W. K. Owiredu, and M. C. Kew. 2002. Analysis of the complete genome of subgroup A' hepatitis B virus isolates from South Africa. J Gen Virol 83:835-9.
【非特許文献１４】Lee, W. M. 1997. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 337:1733-45.
【非特許文献１５】Lindh, M., A. S. Andersson, and A. Gusdal. 1997. Genotypes, nt 1858 variants, and geographic origin of hepatitis B virus--large-scale analysis using a new genotyping method. J Infect Dis 175:1285-93.
【非特許文献１６】Lok, A. S., E. J. Heathcote, and J. H. Hoofnagle. 2001. Management of hepatitis B: 2000--summary of a workshop. Gastroenterology 120:1828-53.
【非特許文献１７】Magnius, L. 0., and H. Norder. 1995. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. Intervirology 38:24-34.
【非特許文献１８】Norder, H., A. M. Courouce, and L. O. Magnius. 1994. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes. Virology 198:489-503.
【非特許文献１９】Okamoto, H., F. Tsuda, H. Sakugawa, R. I. Sastrosoewignjo, M. Imai, Y. Miyakawa, and M. Mayumi. 1988. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. J Gen Virol 69 ( Pt 10):2575-83.
【非特許文献２０】Saitou, N., and M. Nei. 1987. The neighbor joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4:406-25.
【非特許文献２１】Sanchez-Tapias, J. M., J. Costa, A. Mas, M. Bruguera, and J. Rodes. 2002. Influence of hepatitis B virus genotype on the long-term outcome of chronic hepatitis B in western patients. Gastroenterology 123:1848-56.
【非特許文献２２】Stuyver, L., S. De Gendt, C. Van Geyt, F. Zoulim, M. Fried, R. F. Schinazi, and R. Rossau. 2000. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. J Gen Virol 81:67-74.
【非特許文献２３】Sugauchi, F, M. Mizokami, E. Orito, T. Ohno, H. Kato, S. Suzuki, Y. Kimura, R. Ueda, L. A. Butterworth, and W. C. Cooksley. 2001. A novel variant genotype C of hepatitis B virus identified in isolates from Australian Aborigines: complete genome sequence and phylogenetic relatedness. J Gen Virol 82:883-92.
【非特許文献２４】Sugauchi, F., E. Orito, T. Ichida, H. Kato, H. Sakugawa, S. Kakumu, T. Ishida, A. Chutaputti, C. L. Lai, R. Ueda, Y. Miyakawa, and M. Mizokami. 2002. Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype C over the precore region plus the core gene. J Virol 76:5985-92.
【非特許文献２５】Sugauchi, F., E. Orito, T. Ichida, H. Kato, H. Sakugawa, S. Kakumu, T. Ishida, A. Chutaputti, C. L. Lai, R. G Gish, R. Ueda, Y. Miyakawa, and M. Mizokami. 2003. Epidemiologic and virologic characteristics of hepatitis B virus genotype B having the recombination with genotype C. Gastroenterology 124:925-32.
【非特許文献２６】Sugauchi, F., E. Orito, H. Kato, S. Suzuki, S. Kawakita, Y. Sakamoto, K. Fukushima, T. Akiba, N. Yoshihara, R. Ueda, and M. Mizokami. 2003. Genotype, serotype, and phylogenetic characterization of the complete genome sequence of hepatitis B virus isolates from Malawian chronic carriers of the virus. J Med Virol 69:33-40.
【非特許文献２７】Usuda, S., H. Okamoto, H. Iwanari, K. Baba, F. Tsuda, Y. Miyakawa, and M. Mayumi. 1999. Serological detection of hepatitis B virus genotypes by ELISA with monoclonal antibodies to type-specific epitopes in the preS2-region product. J Virol Methods 80:97-112.
【非特許文献２８】Usuda, S., H. Okamoto, T. Tanaka, K. Kidd-Ljunggren, P. V. Holland, Y. Miyakawa, and M. Mayumi. 2000. Differentiation of hepatitis B virus genotypes D and E by ELISA using monoclonal antibodies to epitopes on the preS2-region product. J Virol Methods 87:81-9.
【非特許文献２９】Zhang, X., F. Zoulim, F. Habersetzer, S. Xiong, and C. Trepo. 1996. Analysis of hepatitis B virus genotypes and pre-core region variability during interferon treatment of HBe antigen negative chronic hepatitis B. J Med Virol 48:8-16.
【非特許文献３０】Takahashi,K., Akahane,Y., Hino,K., Ohta,Y. and Mishiro,S.   Hepatitis B virus genomic sequence in the circulation of hepatocellular carcinoma patients: comparative analysis of 40 full-length isolates.  Arch. Virol. 143 (12), 2313-2326 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、簡便かつ正確にＢ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプがAaとAeのいずれであるかを判別できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプAeでは、ほとんどの場合、nt1809がgでnt1812がcであるのに対し、サブタイプAaでは、ほとんどの場合、nt1809がtでnt1812がtであることを見出し、これを利用してサブタイプがAaかAeかを簡便に判別できることに想到し、さらに、これに加えて、nt1984がaであるか否かを調べることによりサブタイプがAaかAeかを100%正確に判別できることも見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のnt1812がcであるか否か若しくはｔであるか否か、及びnt1809がgであるか否か若しくはtであるか否か、並びにnt1984がaであるか否かを調べることを含む、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプがAaとAeのいずれであるかを判別する方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法に加え、3'末端がnt1812又はnt1809になるように設定したセンスプライマーから成るＢ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプ判別用プライマーを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡便かつ正確にＢ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプがAaとAeのいずれであるかを判別できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
下記実施例において具体的に記載されている通り、Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプＡのサブタイプAeでは、ほとんどの場合、nt1809がgでnt1812がcであるのに対し、サブタイプAaでは、ほとんどの場合、nt1809がtでnt1812がtである。本発明は、この新知見に基づく。なお、HBVのジェノタイプＡの遺伝子中の塩基の位置の特定は、既に確立されている。位置特定のための基本となる塩基配列は、例えば非特許文献３０(GenBank Accession No. AB014370) （配列表の配列番号１）に記載されている。本発明における、nt1812及びnt1809並びにnt1984の位置も、この配列の第１番目の塩基をnt1とする、この分野において確立されている基準に従うものである。
【００１２】
nt1812がcであるか否か若しくはｔであるか否かは、この部位を含む領域の塩基配列を決定することにより調べることができる。また、nt1812が3'末端になるようにプライマーを設定し、そのプライマーを一方のプライマーとして用いてPCRを行い、増幅が起きるか否かを調べることにより行うことができ、こちらの方が簡便であるので好ましい。周知の通り、プライマーは、3'末端にミスマッチがある場合には、それ以上鎖の伸長は進まない。プライマーは、センスプライマーであってもアンチセンスプライマーであってもよいが、後で詳述するように増幅断片中のnt1984を調べることができるようにするために、センスプライマーであることが好ましい。また、プライマーは、HBV/Aeの場合に増幅が起きるように設定することもできるし、HBV/Aaの場合に増幅が起きるように設定することもできる。もっとも、図1-1(a)に示されるように、HBV/Aaでは、nt1809とnt1812の間にSNPを有するものがあるので、このようなSNPが存在しないHBV/Aeで増幅が起きるように設定することが、１種類のセンスプライマーを用いてより正確に判別を行うことができるので好ましい。
【００１３】
また、HBV/Aeにおいては、nt1809はgであるのに対し、HBV/Aaにおいては、nt1812がtの場合、nt1809もtであるから、nt1809がgであるか否か若しくはtであるか否かを調べることによってもHBV/AaとHBV/Aeの判別を行うことができる。nt1809がgであるか否か若しくはtであるか否かは、nt1812の場合と同様、この部位を含む領域の塩基配列を決定することにより調べることができる。また、nt1809が3'末端になるようにプライマーを設定し、そのプライマーを一方のプライマーとして用いてPCRを行い、増幅が起きるか否かを調べることにより行うことができ、こちらの方が簡便であるので好ましい。プライマーは、センスプライマーであってもアンチセンスプライマーであってもよいが、後で詳述するように増幅断片中のnt1984を調べることができるようにするために、センスプライマーであることが好ましい。また、プライマーは、HBV/Aeの場合に増幅が起きるように設定することもできるし、HBV/Aaの場合に増幅が起きるように設定することもできる。
【００１４】
型判別のために、nt1812とnt1809のいずれのSNPを用いてもよいが、これらの部位は近接しているので、両方の部位を同時に利用するのが正確さを高める上で好ましい。そして、上記のように、HBV/Aeで増幅が起きるようにセンスプライマーを設定することが好ましいので、結局、下記実施例に具体的に記載する通り、nt1812を3'末端とし、HBV/Aeの部分配列を有するセンスプライマーを用いてPCRを行なうことが最も好ましい。なお、HBV/Aeのこの領域の部分配列は図1-1及び図1-2に記載されているし、全配列が記載されている配列番号１にも当然記載されている。プライマーのサイズは、特に限定されないが、通常、15bpないし50bp程度、好ましくは20bpないし35bp程度である。
【００１５】
センスプライマーにより型判別を行なう場合、アンチセンスプライマーは、後で詳述するように増幅断片中のnt1984を調べることができるようにするために、nt1984よりも下流に設定することが好ましい。下記実施例では、アンチセンスプライマーをnt2072-nt2052の領域に設定しているが、これに限定されるものではなく、HBV/AeでもHBV/Aaでも増幅が起きるものであれば、他の領域に設定したものであってもよい。
【００１６】
PCRによる増幅は、１段階で行なってもよいが、感度をより高めるために、下記実施例に具体的に記載するように、第１段階のPCRでより広い範囲の領域を増幅し、得られた増幅産物を鋳型として、その中に含まれる領域を第２段階のPCRで増幅してもよい(nested PCR)。この場合、第２段階のPCRに用いるプライマーは両方とも、第１段階のPCRに用いるプライマーと異なるものであってもよいし、一方のみ異なるプライマーを用い、他方は第１段階のPCRで用いたプライマーと同じものを用いてもよい(hemi-nested PCR、下記実施例参照）。さらに、正確性を期すために、下記実施例に具体的に記載するように、HBV/AであればサブタイプがAaでもAeでも増幅が起きるプライマーを用いて別途PCRを行ない、検体がHBV/Aであることを確認してもよい。このようなプライマーとしては、例えば、下記実施例で用いたような、nt1808を3'末端とするセンスプライマーを用いる方法を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、HBV/AaとHBV/Aeで配列がほぼ一致している領域であれば他の領域に設定したものであってもよい。なお、プライマーは、3'末端にミスマッチがなければ、途中に１塩基程度のミスマッチがあっても増幅は起きるので、途中に１塩基程度のSNPが存在する領域にプライマーを設定することも可能である。
【００１７】
上記の方法により、ほぼ正確にHBV/AaとHBV/Aeとを判別することができるが、図1-1及び図1-2に示すように、HBV/Aaの中にはnt1809及びnt1812がHBV/Aeと同じ塩基であるものが少数（図1-1及び図1-2では１例）存在する。このため、上記方法では、完全に正確には型判別を行なうことができない。そこで、正確性を完全なものにするために、nt1984がaか否かをさらに調べることが好ましい。nt1984がaか否かを調べることは、この部分の塩基配列を調べることによっても行うことができるが、HBV/Aeでは、nt1984からnt1989がagatctであって、制限酵素BglII部位になっているので、BglIIを用いたRFLPにより決定することもでき、こちらの方が簡便であるので好ましい。この場合、上記の通りにPCRで増幅した増幅断片に対してRFLPを行なうこと、すなわち、PCR-RFLPを行なうことが簡便かつ高感度で好ましい。
【００１８】
PCR-RFLP自体は周知の手法である。すなわち、調べようとする部位（すなわち、nt1984）を含む増幅産物を所定の制限酵素（すなわち、BglII)で消化し、消化後のＤＮＡ断片のサイズを電気泳動等により調べる。制限酵素による切断が起きた場合と起きなかった場合では、生じる断片の数もサイズも異なるので、それに基づいて切断が起きたか否か、ひいては目的の位置の塩基がaか否かを知ることができる。すなわち、nt1984がaか否かを調べるためには、nt1984を含む領域をPCRにより増幅し、増幅産物をBglIIで消化し、消化物を電気泳動にかける。BglIIによる切断が起きなかった場合、すなわち、サブタイプAaの場合には、増幅断片は切断されないので、増幅断片のサイズを有する１個の断片が検出される。一方、BglIIによる切断が起きた場合、すなわち、サブタイプAeの場合には、増幅断片が切断されるので、切断されたサイズの２個の断片が検出される。
【００１９】
増幅領域は、切断が起きた場合に生じる２個の断片が、それぞれ電気泳動で明瞭に検出できるサイズ、好ましくは、小さい方の断片が１bp以上、さらに好ましくは20bp以上となるように設定する。また、生じる２個の断片のサイズの差が、電気泳動で明瞭に検出できるように、好ましくは、１bp以上、さらに好ましくは20bp以上になるように設定する。増幅領域のサイズの上限は特にないが、あまりに大きいとPCRの時間もコストもかかり、また、それによる利点もないので、好ましくは、1000bp以下である。
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
１．  材料と方法
(1)  血清試料
４カ国のキャリアから採取した４０例のHBV/A陽性血清試料（日本、米国、インド及び南アフリカから各１０検体）を用いて、RFLP分析と組み合わせたHBV/Aサブタイプ特異的PCRの特異性及び感度を試験した。
【００２２】
この方法を実際に試験するために、ProMedDx Inc.(米国カリフォルニア州）により集められた、HBsAg陽性の有償ドナーからの３３３例の血清を用いた。３３３検体のうち、１３９検体がHBV/Aに属していた。HCV感染検体及びHIV感染検体並びに患者の民族が不明な検体を除外すると、３８名のアフリカ−アメリカ人、１６名のアジア人、２４名の白色人種及び３１名のラテンアメリカ人からの合計１０９検体が得られ、これらを試験に用いた。対照のために、南アフリカからの黒人のHBVキャリアからの３２例のHBV/A単離物を用いた。
【００２３】
(2)  HBVジェノタイプの血清学的測定
b, m, k, s及びuと命名された、プレS2領域内のエピトープ（非特許文献２７、２８）に対応する５種類のモノクローナル抗体(mAb)を利用する市販のキット(HBV Genotypes EIA（商品名）、Institute of Immunology製）を用い、これらの検体のジェノタイプがHBV/Aであることを血清学的に確認した。
【００２４】
(3)  HBV DNAの検出及びクローニング
DNAは、各血清100μLから、QIAamp DNA Blood Mini Kit(商品名、ドイツ国HildenのQiagen Inc.製）を用いて抽出した。HBVゲノム配列中のX及びプレコア／コア領域を公知の方法（非特許文献23）により増幅した。すなわち、hemi-nested PCRの第1段階のPCRは、センスプライマーとしてHB7F: 5'-gag acc acc gtg aac gcc ca-3' [nt1611-1630]及びHBIR-2: 5'-ata ggg gca ttg gtc t-3' [nt2314-2229]を用い、96℃で5分間変性させた後、94℃、1分間の変性工程、60℃、1分間のアニーリング工程及び72℃、1分間の伸長工程（最終サイクルのみさらに5分間）から成るサイクルを、96-穴サイクラー(GeneAmp 9600(商品名)、米国NorwalkのPerkin-Elmer Cetus社製）中で４０回繰り返した。第2段階のPCRは、第1段階と同じセンスプライマー(HB7F)を用い、アンチセンスプライマーとしてHB7R-2: 5'-cct gag tgc tgt atg gtg agg-3'[nt2072-2052]を用いて第1段階と同じ条件下で35サイクル行なった。増幅産物を3％アガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、紫外光下で観察した。
【００２５】
増幅の特異性を確認するために、ABI 3100 DNA自動シーケンサー内でPrism Big Dye (商品名、米国カリフォルニア州Foster CityのApplied Biosystems社製）を用いてPCR産物の塩基配列を直接決定した。HBV/Aa及びHBV/Ae単離物の陽性対照のために、第2段階のPCR産物を、TOPO TAクローニングベクター(商品名、米国カリフォルニア州CarlsbadのInVirogen Corp製）にクローニングした。大腸菌DH5α細胞(東京のTaKaRa Shuzo社製）中でプラスミドを増幅し、Qiagen法により精製した。
【００２６】
(4)  分子進化分析
HBV/Aサブタイプを判別するために系統樹を作成した。本実施例で増幅した４０の単離物の421塩基(nt1631-2051)を、DDBJ/EMBL/GenBank DNAデータベースから得た１０例のHBV/Ae及び６例のHBV/Aa単離物の２４配列と共に整列させて分析した。コンピュータープログラムHepatitis Virus Database Server (http://hvd.med.nagoya-cu.ac.jp/index.html)を用い、部位当りの塩基置換数及び単離物間の遺伝的距離を６パラメーター法（非特許文献9）により見積もり、これらの値に基づき、隣接結合 (neighbor-joining (N-J)樹を作成した（非特許文献20）。系統樹の信頼性を確認するために、ブートストラップリサンプリング検定（非特許文献８）を1000回行なった。
【００２７】
(5)  RFLP分析と組み合わせたHBV/Aサブタイプ特異的PCR
HBV Genotypes EIA（商品名）を用いてジェノタイプを血清学的に決定した後、新たに開発した、RFLP分析と組み合わせたHBV/Aサブタイプ特異的PCRに基づく新規なHBV/Aサブタイプ判別分析をHBV/A単離物に適用した。hemi-nested PCRの第1段階は、センスプライマーHB7FとアンチセンスプライマーHB7R-2を用い、96℃で５分間変性後、94℃、1分間の変性工程、60℃、1分間のアニーリング工程及び72℃、1分間の伸長工程（最終サイクルのみさらに5分間）から成るサイクルを、96-穴サイクラー中で４０回繰り返した。第2段階のPCRは、セット１又はセット２のプライマーセットを用い、94℃、45秒間の変性工程、62℃、45秒間のアニーリング工程及び72℃、45秒間の伸長工程（最終サイクルのみさらに5分間）から成るサイクルを40回繰り返すことにより行なった。プライマーセット１は、保存されたX領域内に設定した、HBV/Aであることを確認するためのセンスプライマーHBxA: 5'-att ggt ctg cgc acc a-3'[nt1793-1803]（図1-1(a)）とアンチセンスプライマーHB7R-2のセットである。プライマーセット２は、3'末端にHBV/Ae特異的な配列を有するHBV/Ae特異的なセンスプライマーであるHBxAe: 5'-att ggt ctg cgc acc agg ac-3'[nt1793-1812] （図1-1(a)参照）とアンチセンスプライマーHB7R-2のセットである。例外的な単離物を判別するために、もう１つのサブタイプ特異的制限部位（図1-2(b))を利用し、PCR分析と、BglIIを用いたRFLP分析とを組み合わせた。制限酵素による消化は、セット２で増幅した増幅産物である282塩基対(bp)の増幅断片5μLを用い、これを10単位の制限酵素BglII(米国マサチューセッツ州のNew England BioLabs社製）で３時間消化することにより行なった。消化したPCR産物は、3%アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色した。RFLPパターンは紫外光下で調べた。HBV/Ae由来の増幅物は2個の断片に切断され(221bpと61bp)、HBV/Aa由来の増幅物は切断されなかった。
【００２８】
(6)  統計学的解析
イエーツの補正を伴うカイ二乗検定を用いて、民族群間のHBV/Aサブタイプの差異を評価した。p値が0.05未満の場合に有意差有りと判断した。
【００２９】
２．  結果
(1)  HBV/Aの分子進化分析
４カ国からの４０検体と、DDBJ/EMBL/GenBank DNAデータベースから得た、HBV/BないしHBV/Hを包含する２４種の配列を整列させ、HBV X/プレコア/コア領域内の系統樹を作成した（図２）。米国及び日本からの全ての２０例のHBV/A単離物は、HBV/Aeであることが確認され、インド及び南アフリカからの全ての２０例の単離物は、高いブートストラップ値をもってHBV/Aaに分類された。
【００３０】
(2)  HBV/A単離物の整列
図1-1及び図1-2は、プライマーのサブタイプ特異的領域内（図1-1(a))と、BglII RFLP部位(図1-2(b))に対応するコア領域内の、上記した配列のうちの５６例の配列と、ガンビア又はインドからの４例の短い配列とを整列させたものである。ほとんど全てのHBV/Ae単離物は、nt1809がgであり、nt1812がcである(g1809/c1812)パターンを有していた。一方、HBV/Aa単離物は、t1809/t1812であった。これらの２種類のSNPsを利用し、センスプライマーがHBV/AeとHBV/Aaとを判別できるように設定し、２セットのhemi-nested PCRを開発した。利用可能な配列をデータベースから調べるうちに、例外に気付いた。少数のHBV/Aa単離物は、g1809/c1812を有しており、このためはじめはHBV/Aeに分類された。これらの例外的な単離物を判別するために、HBV/AaとHBV/Aeとを判別できるSNPを含む、HBVゲノムの異なる領域中の、BglIIを用いるRFLP分析を開発した。制限酵素BglIIは、塩基配列a/gatct(nt1984-1989)を認識する（図1-2(b))ので、HBV/Ae単離物は221bpの断片と61bpの断片に切断され、HBV/Aa単離物は切断されなかった(282 bp断片）。さらに、a1984である非典型的なHBV/Aaがデータベース中に見出された。しかしながら、これらはその塩基配列パターン(t1809又はa1809/t1812)の故に、先のPCRにより除外される。
【００３１】
(3)   RFLP分析と組み合わせたHBV/Aサブタイプ特異的PCRの感度
新たに開発したPCR分析の、HBV/AaとHBV/Aeを判別する感度を、既知のコピー数のHBV/Aeクローン及びHBV/Aaクローンの両者を含む１０倍低減希釈系列を用いて評価した。プライマーHBxAeを用いるサブタイプ特異的PCRは、1ml当たり102コピーの、g1809/c1812を有する単離物を検出することができ、t1809/t1812を有するHBV/Aa単離物は増幅されなかった。一方、プライマーHBxAを用いるPCRは、HBV/Ae及びHBV/Aaの両者を検出することができ、その検出限界は1 ml当たり102コピーであった。
【００３２】
(4)   RFLP分析と組み合わせたHBV/Aサブタイプ特異的PCRに基づくHBV/Aのサブタイプ判別のための戦略
図３(a)は、サブタイプ特異的PCR及びそれに続くRFLP分析に基づくHBV/Aのサブタイプ判別の最終戦略を示す。「HBV/Ae特異プライマー」と命名したセンスプライマーHBxAe又は「HBV/A確認プライマー」と命名したセンスプライマーHBxAを用いた２セットの第２段階PCRと、BglIIを用いるRFLP分析との組み合わせにより、HBV/AeとHBV/Aaとを明確に判別することができた。すなわち、いずれのセットのPCRプライマーを用いた場合でも増幅産物が検出され、かつ、増幅断片がRFLPにおいて切断されなかった場合（図3 (b))には、該単離物はHBV/Aaに分類した。一方、いずれのセットのPCRプライマーを用いた場合でも増幅産物が検出され、かつ、増幅断片がRFLPにおいてBglIIにより切断された場合には、単離物はHBV/Aeに属していた。プライマーHBxAを用いた場合にのみ増幅が起き、HBxAeを用いた場合に増幅が起きなかったものもHBV/Aaと認めた（図3(b))。
【００３３】
(5)  米国からの試料に対するHBV/Aサブタイプ判別の適用
この分析方法の実用性を確認するために、ELISAによりHBV/Aであることがわかっている、米国における１０９例の有償ドナーの血清から得たHBV単離物に対して、上記サブタイプ判別分析を行なった。１０９検体のうち、７９検体がHBV/Aeに分類され、３０検体がHBV/Aaに分類された。図4(a)に示すように、アフリカ−アメリカ人からの単離物の84%、白色人種からの単離物の83%、及びラテンアメリカ人からの単離物の74%がHBV/Aeであり、一方、アジア人からの単離物の75%がHBV/Aaであった。このことは、アジア人におけるHBV/Aaの頻度が他の群よりも有意に高いことを示唆している。対照試験として、サブタイプAaが主たる型であることが知られている（非特許文献４、１３）、南アフリカからの３２例のHBV/A血清に対して上記サブタイプ判別方法を適用した。HBV単離物の94%がHBV/Aaに属することが確認され（図4(b))、先の実験（非特許文献４、１３）による知見が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法は、HBVジェノタイプＡのサブタイプがAaかAeかを簡便かつ正確に判別できる方法であり、該判別に有用である。サブタイプAaとAeでは、上記の通り臨床症状が異なるので、サブタイプがAaかAeかを判別することは、肝疾患の治療や進行の予防に有用である。また、サブタイプAaとAeでは、地域的な分布が異なるので、サブタイプがAaかAeかを判別することは、感染経路の特定にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−１】本発明の方法において調べるnt1812の近傍の塩基配列(a)及びセンスプライマーの設定領域(a)をHBV/AeとHBV/Aaに分けて示す図である。
【図１−２】本発明の方法において調べるnt1894の近傍の塩基配列(b)及びBglII部位(b)をHBV/AeとHBV/Aaに分けて示す図である。
【図２】HBVジェノタイプＡの系統樹を示す図である。
【図３】本発明の好ましい態様及びそれによる型判別方法を説明するための図(a)及びBglIIを用いたPCR-RFLPにおける、BglII消化後の断片の電気泳動パターンをサブタイプごとに示す電気泳動写真(b)である。
【図４】各民族におけるHBV/AaとHBV/Aeの頻度を示す図である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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