(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号４のアミノ酸２０−８３８に少なくとも９５％同一性を持つポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、前記組成物が哺乳類に投与される時に肺炎連鎖球菌に結合する抗体の産生を引き出すのに有効な量で薬理許容担体に存在する、組成物。
【請求項２】
前記パーセント同一性が少なくとも９７％である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列識別番号４のアミノ酸配列を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが少なくとも２個のコイルドコイル領域を含む請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが少なくとも５個のヒスチジン三つ組領域を含む請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが少なくとも２個のコイルドコイル領域と少なくとも５個のヒスチジン三つ組領域を含む請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と前記配列識別番号４のアミノ酸配列との間のいずれかの可変性がコイルドコイル領域またはヒスチジン三つ組領域以外のアミノ酸残基でのみ生じる請求項１記載の組成物。
【請求項８】
図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＤのアミノ酸に少なくとも９５％同一性を持つポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、前記組成物が哺乳類に投与される時に肺炎連鎖球菌に結合する抗体の産生を引き出すのに有効な量で薬理許容担体に存在する、組成物。
【請求項９】
前記パーセント同一性が少なくとも９７％である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＤのアミノ酸配列を含む請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが少なくとも２個のコイルドコイル領域を含む請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが少なくとも５個のヒスチジン三つ組領域を含む請求項８記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが少なくとも２個のコイルドコイル領域と少なくとも５個のヒスチジン三つ組領域を含む請求項８記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と前記図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のアミノ酸配列との間のいずれかの可変性がコイルドコイル領域またはヒスチジン三つ組領域以外のアミノ酸残基でのみ生じる請求項８記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが残基２０のシスティンで開始するＰｈｔＤタンパク質の少なくとも８１９アミノ酸残基である請求項８記載の組成物。
【請求項１６】
図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＤのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一性を持つアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが肺炎連鎖球菌に結合する抗体に結合する単離ポリペプチド。
【請求項１７】
前記パーセント同一性が少なくとも９７％である請求項１６記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＤのアミノ酸配列である請求項１６記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
組成物が哺乳類に投与される時に肺炎球菌感染を予防し、肺炎球菌感染に結合する抗体の産生を引き出すのに有効な量で薬理許容担体に前記ポリペプチドを含有する前記組成物を調製するための、請求項１６乃至１８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドの使用。
【請求項２０】
第１および第２ポリペプチドを含む組成物であって、前記第１ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＤのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列を含み、前記第１および第２ポリペプチドは、肺炎連鎖球菌に結合する抗体の産生を引き出すのに有効な量で薬理許容担体に存在する、組成物。
【請求項２１】
前記パーセント同一性が少なくとも９７％である請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１ポリペプチドが、配列識別番号４のアミノ酸残基２０−８３８のアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
前記第２ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＥに少なくとも９５％同一性を持つアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２４】
前記第２ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＥのアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２５】
前記第２ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＡに少なくとも９５％同一性を持つアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２６】
前記第２ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＡのアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２７】
前記第２ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＢに少なくとも９５％同一性を持つアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２８】
前記第２ポリペプチドが図６（ａ）、６（ｂ）、および６（ｃ）のＰｈｔＢのアミノ酸配列を含む請求項２０記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本出願は１９９８年１２月２１日に受理された合衆国暫定特許出願番号第６０／１１３，０４８号に基づくものであり、それはここでその全体を本出願に組み込まれている。
【０００２】
本発明は一般に細菌抗原とその用途、例えば免疫応答を刺激するためヒトおよび動物の免疫原薬としての細菌抗原とその用途に関する。より特異的には、これは病原体肺炎連鎖球菌の広範な血清型による感染からワクチン受容体を保護する抗体の産生を刺激する機構として、肺炎連鎖球菌から得られる少なくとも１個の保存ヒスチジン三つ組残基（ＨｘｘＨｘＨ）と少なくとも１個のへリックス形成ポリペプチドより成るポリペプチドでの哺乳類へのワクチン接種に関する。更に、本発明はそのような肺炎球菌感染の診断と処置に関連する診断と受動免疫療法に有用なポリペプチドに対する抗体に関する。
【０００３】
特殊な見地において、本発明は肺炎球菌細菌により生じる中耳、鼻咽頭、肺、気管支の各野、血液、脳脊髄液、その他の感染などの肺炎球菌感染の予防と処置に関する。
【０００４】
【背景技術】
肺炎連鎖球菌はグラム陽性細菌であり、それは動物およびヒトの侵襲性感染症、例えば敗血症、髄膜炎、中耳炎、大葉性肺炎などでの主要な作因となる（トゥオマネン他、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３２２巻、１２８０〜１２８４ページ（１９９５年））。感染過程の一部として、肺炎球菌はレクチン状のやり方で真核細胞炭水化物との結合により、上部および下部気道の非炎症性ヒト上皮細胞と容易に結合する（カンデル他、マイクロビアル・パソロジー、１７巻、３６１〜３７４ページ（１９９４年））。結合細菌の侵襲性肺炎球菌感染への変換は炎症性因子の局所生成を伴い、それは上皮細胞を活性化してその表面で受容体の数と型を変化させる（カンデル他、ネイチャー、３７７巻、４３５〜４３８ページ（１９９５年））。明らかにそのような一つの受容体である血小板活性因子（ＰＡＦ，パフ）は肺炎球菌により係合され、また非常に短時間（分単位）の間に肺炎球菌は強力に高められた粘着性と組織の侵襲を示す。ある可溶性受容体類似体は肺炎球菌感染の進行を防ぐことが示された（イダンパーン−ヘイキーラ他、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシーズ、１７６巻、７０４〜７１２ページ（１９９７年））。数多くの各種の他のタンパク質が肺炎連鎖球菌の病原性に関連してきていることが示唆されてきている。広範な種類の肺炎連鎖球菌に対する予防を提供するワクチンとしてこのようなポリペプチドを利用するために肺炎連鎖球菌の各種菌株から共同のエピトープを持つポリペプチドを同定する必要が存在する。
【０００５】
【発明の開示】
本発明にしたがって、肺炎連鎖球菌から得たポリペプチドおよびまたは前記ポリペプチドの変異体およびまたはそのようなポリペプチドの活性断片を含むワクチンおよびワクチン組成物が提供される。
【０００６】
ここで定義される活性断片はヒスチジン三つ組残基およびまたはそのようなペプチドのコイルドコイル（高次コイル、多段コイル）領域を含む。
【０００７】
配列を引用するときに「パーセント同一性」または「同一パーセント」という用語は、配列が、比較される配列の整列（アラインメント）からの請求されまたは説明される配列（比較配列）を説明または請求された配列（基準配列）と比較されることを意味する。パーセント同一性は以下のように定義される。
【０００８】
パーセント同一性＝［１−（Ｃ／Ｒ）］１００
ここでＣは、比較配列と基準配列の間の整列の全長にわたり基準配列と比較配列の間の数の差の数であり、ここで（ｉ）比較配列の整列塩基またはアミノ酸を持たない基準配列の各塩基またはアミノ酸、（ii）基準配列の各ギャップおよび（iii）比較配列の整列塩基またはアミノ酸とは異なる基準配列の各整列塩基またはアミノ酸、のそれぞれは差異であり、またＲは、同じく塩基またはアミノ酸として計数される基準配列で創り出された、いずれかのギャップを持つ比較配列との整列の全長にわたる基準配列の塩基またはアミノ酸の数である。
【０００９】
前記の計算されたパーセント同一性がほぼ同じまたはより大きい比較配列と基準配列の間に整列が存在するならば、比較配列以上の特定最小パーセント同一性は、ここで計算されたパーセント同一性が特定パーセント同一性よりも少ないようにたとえ整列が存在するとしても基準配列に対する特定の最小パーセント同一性を持つ。
【００１０】
ポリペプチドおよびまたはポリヌクレオチドに関して本発明のコンテキストにおける「分離された」という用語は、物質がもとの環境（例えば、それが自然に生じる場合は自然環境）から移動されることを意味する。例えば、生体に存在する自然発生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されることはなく、自然系にある共存物質のいくらかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが分離される。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることができるし、およびまたはポリヌクレオチドまたはポリペプチドは一つの組成物の一部でもあり得るし、更にまたそのようなベクターまたは組成物が自然環境の一部ではないものとして分離される。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは望ましくは分離形態で提供され、また望ましくは均質化のために精製される。
【００１１】
【発明の概要】
本発明の一つの見地に従って、一般に一つの組成物の形態でワクチンが提供され、それは（ｉ）配列識別番号４のアミノ酸１−８１９より成るポリペプチド配列、または（ii）配列識別番号６のアミノ酸１−４６０より成るポリペプチド配列、あるいは前者の活性断片のいずれかと少なくとも９０％同一である少なくとも１個のポリペプチドを含む。
【００１２】
本発明のもう一つの見地に従って、一般に一つの組成物の形態でワクチンが提供され、それは（ｉ）配列識別番号８のアミノ酸１−８００より成るポリペプチド、または（ii）配列識別番号１０のアミノ酸１−８００より成るポリペプチド、に少なくとも９０％同一であるポリペプチドの活性断片を含む。
【００１３】
「活性断片」という用語は１個もしくはそれ以上のヒスチジン三つ組残基およびまたは１個もしくはそれ以上のコイルドコイル領域を含む断片を意味する。「ヒスチジン三つ組残基」は配列ＨｘｘＨｘＨを持つポリペプチドの部分であり、ここでＨはヒスチジンでありｘはヒスチジン以外のアミノ酸である。
【００１４】
コイルドコイル領域は「コイルズ」アルゴリズムにより予言された領域である。：ルーパス，Ａ．，ファンダイク，Ｍ．，ストック，Ｊ．（１９９１年）タンパク質配列からのコイルドコイルを予言する，サイエンス，２５２巻：１１６２−１１６４ページ。
【００１５】
一つの実施例に従って、活性断片は１個もしくはそれ以上のヒスチジン三つ組み残基と適用できるポリペプチド配列の少なくとも１個のコイルドコイル領域の両方を含む。も一つの実施例に従って、活性断片は少なくとも２個のヒスチジン三つ組残基を含む。
【００１６】
も一つの実施例では、少なくとも１個のヒスチジン三つ組残基または適用でるポリペプチドの少なくとも１個のコイルドコイル領域を含む活性断片は、適用できるポリペプチドの少なくとも約１０％と適用できるポリペプチドの少なくとも約８５％を含む。
【００１７】
配列識別番号４のポリペプチドは下記の５個のヒスチジン三つ組残基を含む。
【００１８】
アミノ酸  83-88,207-212,315-320,560-565,644-649
配列識別番号６のポリペプチドは下記の５個のヒスチジン三つ組残基を含む。
【００１９】
アミノ酸  83-88,205-210,309-314,396-401,461-469
更に配列識別番号４のポリペプチドは２個のコイルドコイル領域（アミノ酸１３９−１５９とアミノ酸７６９−７９１）を含み、また配列識別番号６のポリペプチドは１個のコイルドコイル領域（アミノ酸１３９−１７２）を含む。
【００２０】
配列識別番号８のポリペプチドは下記の領域を含む。
【００２１】
ＨｘｘＨｘＨ:アミノ酸82-87,208-213,328-333,569-574,653-658
コイルドコイル：アミノ酸137-164,425-453,481-512,743-770
本発明の更なる見地に従って、前記のワクチンは肺炎連鎖球菌により生じる感染を予防しまたは処置する目的で投与される。
【００２２】
本発明に従ってワクチン、またはワクチン組成物は１個もしくはそれ以上の前記ポリペプチドまたはその活性断片を含む。１個以上のポリペプチドまたは活性断片を使用する時には、このような２個もしくはそれ以上のポリペプチドおよびまたは活性断片は２個もしくはそれ以上のポリペプチドまたは活性断片の物理的混合物または融合物として使用できる。融合断片または融合ポリペプチドは例えば組み換え技術によりまたは前もって調合されたポリペプチドまたは活性断片を融合する適切なリンカーの使用により産生することができる。
【００２３】
本発明の実施例では（ａ），（ｉ）配列識別番号４のアミノ酸１乃至８１９より成るポリペプチド配列、または（ｉｉ）配列識別番号６のアミノ酸１−４６０より成るポリペプチド配列、に少なくとも９５％と同一または少なくとも９７％同一あるいは１００％同一であるポリペプチド、もしくは（ｂ）（ａ）のポリペプチドの活性断片が提供される。
【００２４】
ポリペプチドが配列識別番号４または配列識別番号６の成熟ポリペプチド、あるいは本発明の活性断片のいずれかよりなるポリペプチドの変異体である場合には、ポリペプチドまたは断片での変異は一般にこれらの領域の１個以上でも行われるけれどもヒスチジン三つ組残基とコイルドコイル領域以外の部分にある。
【００２５】
多くの場合、ポリペプチドまたは活性断片での変異は、他の置換も本発明の範囲内にあるが保存アミノ酸置換である。
【００２６】
本発明に従って、ポリペプチド変異体は１個またはそれ以上のアミノ酸が置換され、およびまたは欠失され、およびまたは挿入されている変異体を含むポリペプチド変異体である。
【００２７】
も一つの見地において、本発明は本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの活性断片に対する抗体から形成される受動免疫ワクチンに関する。このような受動免疫ワクチンは患者の肺炎球菌感染を予防し、およびまたは処置するために利用することができる。このように、本発明の更なる見地に従って、ワクチンは本発明の合成または組換えポリペプチドあるいはそのようなポリペプチドに対する抗体から産生できる。
【００２８】
更にも一つの見地において、本発明は肺炎球菌により生じる疾病の予防およびまたは処置で前に説明したように、本発明のポリペプチドに対する１個またはそれ以上の（モノクローナル、ポリクローナルまたは血清）抗体を使用する方法に関する。とりわけ、本発明は肺炎連鎖球菌により生じる感染性疾病の予防およびまたは処置のための方法に関する。更にまた望ましい見地において、本発明は本発明のワクチンを利用することによりヒトの中耳炎、鼻咽頭感染症、気管支感染症、その他の予防およびまたは処置のための方法に関する。
【００２９】
一般にワクチンは水溶液または懸濁液の形態で注射可能医薬品として調製される。オイルベースのワクチンも吸入剤などで公知である。使用の前に溶解または懸濁される固体形態のものも調合される。活性成分に融和性であり薬剤用途で許容できる薬理担体が一般に加えられる。このような担体の例は、必ずしもそれに限定されないが、水、食塩水、デキストロース、またはグリセロールを含む。担体を組合わせたものも使用できる。
【００３０】
ワクチン組成物は、ｐＨを安定するために、またワクチンの効率を改良するのに役立ち得るアジュバント、湿潤剤、または乳化剤として機能するために更に追加の物質を取り込むことができる。
【００３１】
ワクチンは一般に非経口投与用として調合され、皮下または筋肉内に注射される。このようなワクチンは従来公知の方法を使用して坐薬としてまたは経口投与用に調合することができる。
【００３２】
病原菌に免疫を与えるのに十分なワクチン量は当業者にとって公知の方法により決定される。この量はワクチン受容体の特徴と必要とされる免疫水準に基づいて決定されるであろう。典型的には、投与されるワクチン量は熟練し医師の判断で決定されるであろう。ワクチンが皮下または筋肉内注射で投与される場合には、５０乃至５００μｇの範囲の精製タンパク質が与えられる。
【００３３】
本発明はワクチンに向けられ、ここで本発明のポリペプチドまたは活性断片はポリペプチドまたは活性断片をコード化するポリヌクレオチドの形態で送達または投与され、これによりポリヌクレオチドまたは活性断片が生体内で産生される。ポリヌクレオチドは適切な発現ベクターに含まれる薬理許容担体と組合わせられる。
【００３４】
加えて、本発明のポリヌクレオチドは、受動免疫原で使用のため、診断試薬として使用のため、またアフィニティクロマトグラフィなどの他の工程で試薬として使用のために抗体の産生を刺激する免疫原として使用できる。
【００３５】
も一つの見地において、本発明は前に記載した本発明のポリヌクレオチドと活性断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態にあり、このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり、一本鎖の場合にはコーディング鎖または非コーディング鎖（アンチセンス鎖）である。
【００３６】
本発明のも一つの見地に従って、
（Ａ）（ｉ）配列識別番号４のアミノ酸１−８１９より成るポリペプチド、（ｉｉ）配列識別番号６のアミノ酸１−４６０より成るポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一である分離ポリヌクレオチド、または
（Ｂ）活性ポリヌクレオチド断片をコード化する（Ａ）のポリヌクレオチドの断片、または
（Ｃ）（ｉ）配列識別番号８のアミノ酸１乃至８００より成るポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列識別番号１０のアミノ酸１乃至８００より成るポリヌクレオチド、の活性断片をコード化するポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド、
が提供される。
【００３７】
特異的実施例において、ポリヌクレオチドはこのようなポリヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であり、望ましくは９７％同一であり、また更には１００％同一でさえある。
【００３８】
「ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド」はポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコーディングおよびまたは非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
本発明はさらにポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの自然発生対立変異体またはポリヌクレオチドの非自然発生変異体であることもある。変異体は１個またはそれ以上の塩基が置換され、欠失しまたは挿入される変異体を含む。このようなコーディングポリヌクレオチドへの補体は同じまたは類似のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを分離するのに利用される。とりわけ、このような手順は、多数の免疫区域を含む「連鎖」ポリヌクレオチドワクチンの産生に特に有用な肺炎連鎖球菌の異なった血清型からのポリペプチドの自然免疫原部分を得るのに有用である。
【００４０】
配列識別番号５は配列識別番号４のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの代表的な例であり、また配列識別番号７は配列識別番号６のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの代表的な例である。配列識別番号９は配列識別番号８のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの代表的な例であり、また配列識別番号１１は配列識別番号１０のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの代表的な例である。遺伝子コードの既知の縮重の結果として、配列識別番号４、配列識別番号６、配列識別番号８、配列識別番号１０のポリペプチドをコード化する他のポリヌクレオチドはここでの教示から当業者にとっては当然明らかであるに違いない。
【００４１】
前記の免疫原ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に対し骨組みに融合したコーディング配列を持つ。マーカー配列は、例えば細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するためにｐＱＥ−９ベクターで供給されるヘキサヒスチジンｔａｇであり、あるいは例えば、哺乳類宿主、例えばＣＯＳ−７細胞が使用される時には赤血球凝集素（ＨＡ）ｔａｇであることもできる。ＨＡｔａｇはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに対応する（ウイルソン，Ｉ．，他．細胞，３７巻，７６７ページ（１９８４年））。
【００４２】
本発明はまた本発明のポリペプチドの１個またはそれ以上をコード化するポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、組み換え手法により分離され事実上免疫原的に純粋な形態でこのような免疫原ポリペプチドの産生に関する。
【００４３】
宿主細胞は本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドより成るベクターで遺伝子操作（形質導入または形質転換もしくは形質移入）される。ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態にある。操作された宿主細胞はプロモーターを活性化し、形質転換株を選択し、あるいはこのようなポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを増幅するのに適したように修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨおよびその他の培養条件は発現のために選択された宿主細胞でこれまでに使用されたものであり、当業者にとっては明らかなものであろう。
【００４４】
ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、例えば痘疹、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病の組合わせから誘導されるベクターを含む。しかし他の何れかのベクターでもそれが宿主内で複製可能で生存可能である限り使用されるであろう。
【００４５】
適切なＤＮＡ配列は各種の手順によりベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は従来公知の技術による手順で適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順およびその他は当業者の範囲内にあるものと見做される。
【００４６】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成に向うように適切な発現制御配列（プロモーター）と操作的に結合される。このようなプロモーターの代表的な例として言及されるのは、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ（エシェリキア属、大腸菌）、ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムＰLプロモーターおよび原核または真核細胞あるいはそのウイルスで遺伝子の発現を制御することで公知の他のプロモーターである。発現ベクターは更に翻訳開始のためのリボソーム結合部位と転写終結因子を含む。ベクターはまた発現を増幅するための適切な配列を含むことかできる。
【００４７】
加えて、発現ベクターは、例えば真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、あるいは大腸菌でのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの形質転換宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する１個またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を望ましくは含む。
【００４８】
前記の適切なＤＮＡ配列、同じく適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは宿主タンパク質を発現できるように適切な宿主を形質転換するために採用される。
【００４９】
適切な宿主の代表的な例として言及されるのは、大腸菌，ストレプトミセス属、ネズミチフス菌などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ，ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫などの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞などである。適切な宿主の選択はここでの教示から当業者の範囲にあるものと見做される。
【００５０】
より詳細には、本発明は更に広範に前記されているように、１個またはそれ以上の配列より成る組換え構築物を含む。構築物はプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターより成り、それに対して本発明の配列が前向きまたは後向き配向で挿入された。本実施例の望ましい見地において、構築物は更に例えば配列に操作可能に結合されたプロモーターを含む調節配列より成る。多数の適切なベクターとプロモーターは当業者にとって公知であり、商業的に利用できる。下記のベクターが例として提供される。細菌系：ｐＱＥ７０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ−９（キャージェン，インコーポレイテッド），ｐｂｓ，ｐＤ１０，ファージスクリプト，ｐｓｉＸ１７４，ピーブルースクリプトＳＫ，ｐｂｓｋｓ，ｐＮＨ８Ａ，ｐＮＨ１６ａ，ｐＮＨ１８Ａ，ｐＮＨ４６Ａ（ストラータジーン）；ｐｔｒｃ９９ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（ファルマチア）。真核生物系：ｐＷＬＮＥＯ，ｐＳＶ２ＣＡＴ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴ１，ｐＳＧ（ストラータジーン），ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（ファルマチア）。しかしいずれか他のプラスミドまたはベクターでも、それが宿主内で複製可能であり生存可能である限り使用できる。
【００５１】
プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコール転換酵素）ベクターまたは他のベクターを選択マーカーと共に使用していずれか望ましい遺伝子から選択できる。２個の適切なベクターはｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７である。特に指定された細菌プロモーターはｌａｃ１，ｌａｃＺ，Ｔ３，Ｔ７，ｇｐｔ，ラムダＰR，ＰLおよびＴＲＰを含む。真核生物プロモーターはＣＭＶ即時初期（プロモーター）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（プロモーター）、初期および後期ＳＶ４０（プロモーター）、レトロウイルスからのＬＴＲｓ（プロモーター）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉ（プロモーター）を含む。適切なベクターとプロモーターの選択は、従来の技術の水準内に十分ある。
【００５２】
更なる実施例において、本発明は前記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は高次の真核細胞、例えば哺乳類細胞、または低次の原核細胞、例えば細菌細胞なでどあり得る。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン法、または電気穿孔法などにより実施することができる（デービス，Ｌ．，ディブナー，Ｍ．，バッティ，Ｉ．，分子生物学での基本的方法（１９８６年））。
【００５３】
宿主細胞での構築物は組換え配列によりコード化される遺伝子生産物を産生する従来のやり方で使用することができる。選択肢として本発明のポリペプチドは従来のペプチド合成装置で合成により産生することができる。
【００５４】
成熟タンパク質は適切なプロモーターの制御の下で哺乳類細胞、酵母、細菌、または他の細胞内で発現することができる。無細胞翻訳系も本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡｓを用いてこのようなタンパク質を産生するために使用することができる。原核生物および真核生物宿主で使用される適切なクローニングおよび発現ベクターはサムブルック他、分子クローニング：実験マニュアル，第２版、コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年）に記載されており、その開示はここで引用文献として組み込まれている。
【００５５】
より高次の真核生物による本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写はエンハンサー配列をベクターに挿入することで増加する。エンハンサーはＤＮＡのシス作用領域であり、通常約１０乃至３００塩基対で転写を増加するためにプロモーターに作用する。その側は塩基対１００乃至２７０の複製起点の後期側にあるＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなどを含む。
【００５６】
一般に、組換え発現ベクターは複製起点と宿主細胞の形質転換を可能にする選択的マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子とサッカロミセス・セレビシエ（ビール酵母菌等）ＴＲＰ１遺伝子、および下流構造配列の直接転写に対して高次に発現された遺伝子から誘導されたプロモーターを含む。このようなプロモーターは解糖酵素をコード化するオペロン、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などから誘導することができる。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列で適切な相で組立てられる。選択肢として、異種配列は望ましい特性、例えば発現された組換え産物の安定性または簡素化された精製を付与するＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコード化することができる。
【００５７】
細菌用として有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと共に操作可能読み取り相で適切な翻訳開始終結コドンと一緒に望ましいタンパク質をコード化する構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは１個またはそれ以上の表現型選択マーカーと、ベクターの保存を確実なものとしまた望ましければ宿主内で増幅を提供する複製起点より成るであろう。形質転換のために適した原核生物宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプミセス属、ブドウ球菌層など各種のもの、また選択の対象として選ばれるものなどを含む。
【００５８】
代表的でしかし限定されない例して、細菌用としての有用な発現ベクターは公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素より成る商業的に利用可能なプラスミドから誘導される選択マーカーと複製起点より成ることができる。このような商業的ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（ファルマチア・ファイン・ケミカルズ，ウプサラ，スエーデン）とＧＥＭ１（プロメガ・バイオテック，マジソン，ウィスコンシン，アメリカ合衆国）を含む。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」切片は適切なプロモーターと発現される構築配列と結合される。
【００５９】
適切な宿主菌株の形質転換と宿主菌株の適当な細胞密度への成長に続き、選択されたプロモーターが適当な手段（温度シフトまたは化学的誘導）により導入され、細胞は追加の期間培養される。
【００６０】
細胞は典型的には遠心分離で収穫され、物理的化学的手段で分離され、生成粗抽出物は更なる精製のために保持される。
【００６１】
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は凍結融解反復、音波破砕、フレンチプレス、機械的破砕、あるいは細胞溶解剤の使用などを含む何らかの都合のよい方法により破砕することができ、このような方法は当業者にとっては公知である。しかし望ましいものは本発明のポリペプチドを分泌し培養培地からポリペプチドの回収を可能にする宿主細胞である。
【００６２】
各種の哺乳類細胞培養系もまた組換えタンパク質を発現するために使用できる。哺乳類発現系の例はグラズマン，細胞，２３巻，１７５ページ（１９８１年）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合性ベクターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ヒーラおよびＢＨＫ細胞系などを含む。哺乳類発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターとエンハンサーおよびいずれかの必要なリボーム結合部位、ポリアデニル化部位，スプライス供与体と受容体部位、転写終結配列、ならびに５′フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライスから誘導されるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は必要とされる非転写遺伝要素の提供するのに使用できる。
【００６３】
ポリペプチドは十分公知のタンパク質回収精製方法により組換え細胞培養物から回収されおよびまたは精製することができる。このような方法は硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む。必要に応じて、成熟タンパク質の配置を完成するため、タンパク質のリフォールディング（構造復元）段階を使用することができる。この点に関し、分子シャペロンがこのようなリフォールディング手順で使用される。最後に、高速流体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終的精製段階で使用できる。
【００６４】
本発明の免疫原として有用なポリペプチドは自然精製産物または化学合成手順の産物、あるいは原核生物または真核生物宿主（例えば培養で微生物、酵母、高次の植物、昆虫および哺乳類などの細胞によるもの）からの組換え技術により産生される。組換え産生手順で採用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化され、また非グリコシル化される。
【００６５】
個別に発現されたポリペプチドの分離の手順は従来公知の組換え発現／分離方法で分離される。このような分離の典型的な例はタンパク質構造の部分として発現されるタンパク質の保存領域またはＨｉｓ  ｔａｇあるいは切断リーダーまたは尾部に対する抗体を利用する。
【００６６】
ポリペプチド、その断片または他の誘導体、あるいはその類似体、またはそれらを発現する細胞はその抗体を産生するための免疫原として使用することができる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗体であり、あるいはモノクローナル抗体である。本発明は更にキメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断片、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を含む。従来技術で公知の各種技術はこのような抗体および断片の産生に使用することができる。
【００６７】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成された抗体はポリペプチドの動物への直接注射により得ることができる。
【００６８】
モノクローナル抗体の調製に関して、連続細胞系培養物により産生される抗体を提供する技術はいずれも使用することができる。その例はハイブリドーマ技術（ケーラーとミルシュタイン、１９７５年、ネイチャー、２５６巻：４９５−４９７ページ）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズボー他、１９８３年、今日の免疫学、４巻：７２ページ）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール、他、１９８５年、モノクローナル抗体と癌治療、所収、アラン・Ｒ・リス，インコーポレイテッド、７７−９６ページ）を含む。
【００６９】
一本鎖抗体の産生を記載した技術（合衆国特許第４，９４６，７７８号）としては本発明の免疫原ポリペプチドに対する一本鎖抗体の産生に適合させることができる。
【００７０】
本発明は下記の実施例に関連して更に説明されるであろう。しかし、発明の範囲はそれにより限定されるものではない。
【００７１】
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１
抗Ｓｐ３６での能動保護
Ａ．Ｓｐ３６のクローニング、発現、および精製
増幅の標的として使用されるゲノムＤＮＡがゲノム配列に使用されたのと同じ菌株である肺炎連鎖球菌ノルウェー菌株（４血清型）から分離された。Ｓｐ３６遺伝子の完全な配列（配列識別番号９）、およびその予想アミノ酸配列（配列識別番号８）はここに添付された配列表で与えられている。予想アミノ酸配列が疎水性リーダー配列に続きＩＩ型シグナルペプチダーゼのコンセンサス配列（ＬｘｘＣ．ｘの両方は典型的に小さいアミノ酸を表す）に類似の配列（ＬＳＶＣ）を含むことが注目された。プライマー（配列識別番号１−３として表示されたもの）はＳｐ３６遺伝子を増幅し、またヒスチジンで標識されたタンパク質がニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる精製のためのシグナル配列を欠いているためにＳｐ３６のｐＱＥ１０へのクローニングと発現を可能にするように設計された。配列識別番号１および３により増幅された断片のクローニングはＳｐ３６ノアミノ酸２乃至８００を含むタンパク質に帰着するであろう。配列識別番号２および３により増幅された断片のクローニングはＳｐ３６のアミノ酸７乃至８００を含むタンパク質に帰着するであろう（アミノ酸数は配列識別番号８を引用する）。
【００７２】
Ｂ．Ｓｐ３６ワクチン投与での能動保護
図１Ａ−１Ｃで示される３種の実験のそれぞれにおいて、（３Ｈ／ＨｅＪマウス（グループ毎１０匹）がＳｐ３６タンパク質（５０μｌの完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）に乳化された５０μｌのＰＢＳに１５μｇ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）で免疫化された。１０匹のシャム免疫化マウスのグループがアジュバントと共にＰＢＳを受けた。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）での１５μｇのタンパク質の第２免疫が４週後に投与された。シャムグループはＩＦＡでのＰＢＳを受けた。血液が３，６，９週に（眼窩側方での瀉血で）引き出された。また各グループからの血清がエリザによる抗Ｓｐ３６抗体の分析のために貯留された。マウスは約５００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌ＳＪ２菌株（６Ｂ血清型、テネシー、メンフィス、セントジュード、チルドレンズ・リサーチ・ホスピタル、Ｐ．フリンにより提供されたもの）の腹腔内注射により１０週で攻撃された。予備実験では、この菌株のＬＤ50は約１０ＣＦＵであると決定された。マウスは１４日間の生存が観察された。
【００７３】
図１Ａ−１Ｃで示された３種の実験は組換えＳｐ３６の微妙に異なった調合物が使用された。図１Ａと１Ｂで示された実験は、いずれもアミノ酸２０−８１５を含むＳｐ３６を使用したが、異なったバッチのタンパク質が２種の実験で使用された。図１Ｃで示された実験は、アミノ酸２５−８１５を含むＳｐ３６を使用した。
【００７４】
図１Ａで示された実験では、Ｓｐ３６（第１バッチ）で免疫化された１０匹のマウスから収集された９週の血清が１：４，０９６，０００の端点エリザ力価を有していた。シャム免疫化マウスからの血清には抗Ｓｐ３６抗体は検出されなかった。Ｓｐ３６タンパク質で免疫化されたマウスの１００％が１４日間の攻撃（肺炎球菌の５２０ＣＦＵ）に生存した。シャム免疫化マウスでは８０％が４日までで死に、残りは生存した。
【００７５】
図１Ｂで示された実験では、Ｓｐ３６（第２バッチ）で免疫化された１０匹のマウスから収集された９週の血清が＞１：４，０９６，０００の端点エリザ力価を有していた。シャム免疫化マウスからの血清には抗Ｓｐ３６抗体は検出されなかった。Ｓｐ３６タンパク質で免疫化されたマウスの１００％が１４日間の攻撃（肺炎球菌の５１０ＣＦＵ）に生存した。シャム免疫化マウスでは８０％が４日までで死に、またその全てが９日までに死んだ。
【００７６】
図１Ｃで示された実験では、Ｓｐ３６（アミノ酸２５−８１５を含むもの）で免疫化された１０匹のマウスから収集された９個の血清が１：４，０９６，０００の端点エリザ力価を有していた。シャム免疫化マウスからの血清には抗Ｓｐ３６抗体は検出されなかった。Ｓｐ３６タンパク質で免疫化されたマウスの１００％が１４日間の攻撃（肺炎球菌の５１０ＣＦＵ）に生存した。シャム免疫化マウスでは９０％が４日までに死に、またそのすべてが１２日までに死んだ。これらのデータは、組換えＳｐ３６タンパク質でのマウスの免疫化が全身肺炎球菌感染と死に対して保護できる応答を引き出すことを示している。この保護は菌株特異的ではなかった。組換え肺炎球菌タンパク質は４血清型菌株からクローンされ、一方攻撃は異種菌株ＳＪ２（６Ｂ血清型）のものであった。
【００７７】
実施例２
抗Ｓｐ３６抗血清での受動保護
Ａ．ラビット免疫血清の発生
免疫前血清の収集に続き、一匹のニュージーランドホワイトラビットがＣＦＡ内でＳｐ３６（アミノ酸２０−８１５を含むもの）の２５０μｇで免疫化された。このラビットは２９日と５０日にＩＦＡ内で１２５μｇのＳｐ３６の２個の抗体補助刺激剤（ブースト）を受け、３９日と６０日に瀉血された。第２のラビットは対照抗原である大腸菌ＦｉｍＣで免疫化された。
【００７８】
Ｂ．マウス内での受動保護
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（グループ当り１０匹）が、ラビット血清１００μｌの２回の腹腔内注射で免疫化された。最初の注射は肺炎連鎖球菌ＳＪ２菌株の１７２ｃｆｕで攻撃される２４時間前に投与され、また第２の注射は攻撃の４時間後に与えられた。図２は肺炎球菌の２種の異なる菌株での感染後のマウスの生存％を示す。
【００７９】
図２ＡはＳＪ２菌株（図２Ａ）の１７２ｃｆｕで注射されたマウスの内、Ｓｐ３６タンパク質に対して応答して産生されたラビット免疫血清で免疫化されたマウスの１００％が２１日の観察期間生存した。対照血清（抗ＦｉｍＣ）で免疫化されたマウスの内、８０％が８日までに死に、９０％が１２日までに死んだ。図１２ＢはＥＦ６７９６菌株８６２ｃｆｕを注射したマウスの内、Ｓｐ３６タンパク質に対して応答して産生されたラビット免疫血清で免疫化されたマウスの９０％が８日の観察期間生存した。（免疫化の前にラビットから収集された）対照血清を与えたものの内、９０％は８日までに死んだ。
【００８０】
これらのデータは、Ｓｐ３６での免疫化から生じる肺炎球菌感染に対する保護が抗体媒介され、何故ならマウスは超免疫ラビットからの血清の受動移動により保護できることを示している。前に記載のマウス能動攻撃実験で見られるように、４血清型菌株からクローンされた組換えＳｐ３６タンパク質に対して向けられた血清は異種菌株での攻撃に対して保護的であった。
【００８１】
実施例３
肺炎連鎖球菌の菌株内でのＳｐ３６の保存
Ａ．ウェスタンブロット法
この実験で使用された２３個の肺炎球菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；メリーランド，ロックビル）から入手したもので多価肺炎球菌ワクチンでの２３個の血清型のそれぞれの１個の分離物を含む。全細胞溶解産物に対して、肺炎球菌は酵母抽出物（メーン、デトロイト、ジフコ）０．５％を含むドット−ヒューイット肉汁２ｍｌ内で３７℃で中対数相（６２０ｎｍでの光学密度、０．４乃至０．６）に成長した。細菌は遠心分離で収穫され、２回水で洗浄された。ペレットは２００ｍｌの細胞溶解緩衝液（ドデシル硫酸ナトリウム０．０１％、クエン酸ナトリウム０．１５Ｍ、デオキシコール酸ナトリウム０．１％）に再懸濁され３７℃で３０分保温され、次いで、等量の２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム０．３Ｍ、クエン酸ナトリウム０．０３Ｍ）で稀釈された。溶解産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分離され、ニトロセルロース膜（カリフォルニア，ハーキュリーズ，バイオ−ラド・ラボラトリーズ）に移され、また標準ウェスタンブロット手順で抗体でプローブされた。（実施例１記載の通り）Ｓｐ３６で免疫化された１０匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスからの血清が貯留され、１：３０００の稀釈で使用された。結合抗体はエイマシャム，インコーポレイテッド（マサチューセッツ，ケンブリッジ）の化学発光キットを用いてペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗マウスＩｇＧで検出された。
【００８２】
マウス抗Ｓｐ３６血清は（図３で示されるように）、試験された２３個肺炎球菌溶解産物すべてで９７キロダルトンと１００キロダルトンの明白な分子量を持つ２個の主帯域を検出した。肺炎連鎖球菌血清型１、５、１７Ｆおよび２２Ｆから得られたＳｐ３６シグナルは低く、これはＳｐ３６発現の水準がこれらの菌株で減少しているか、もしくはこれらの菌株でのＳｐ３６が抗原として異なっているかのいずれかを示している。
【００８３】
これらのデータは、Ｓｐ３６が現在の多糖類ワクチンで代表される２３個の肺炎球菌血清型の菌株の間で抗原的に保存されていることを示している。
【００８４】
Ｂ．サザンブロット法
ゲノムＤＮＡが前節でリストされた２３個の肺炎球菌菌株のそれぞれから、また１個のＳＪ２菌株から調製された。ＤＮＡはＰｖｕＩＩとＢａｍＨＩで消化され、アガロースゲルで電気泳動されナイロン膜に移された。プローブがノルウェー４型ＤＮＡ（実施例１のもの）からのＳｐ３６遺伝子を増幅し、またエイマシャムからのキットを用いてランダムプライマー法でフルオレセインを用いて増幅断片を標識することにより調製された。雑種形成、洗浄、およびフィルムの露出はエマルシャムから提供されたプロトコルに指示された通り実効された。図４は、２４個の菌株それぞれからのＤＮＡで雑種形成されたＳｐ３６プローブが研究されたことを示している。「Ｍ」で標識されたレーンは分子量マーカーとしてＨｉｎｄＩＩＩで消化されフルオレセインで標識されたラムダファージからのＤＮＡを含んでいた。
【００８５】
実施例４
ヒトにおけるＳｐ３６の免疫原性
ヒト肺炎球菌感染の間Ｓｐ３６が免疫原性であるかどうかを確認するために、培養証明された肺炎球菌菌血症の患者からの血清が組換えＳｐ３６タンパク質を含むウェスタンブロット法で使用された。図５で示される実験において（１乃至５として示される）５人の患者からの血清が１：３０００稀釈され、全長Ｓｐ３６、Ｓｐ３６のＮ末端半分（プロリン豊富領域に先行するもの）、またはＳｐ３６のＣ末端半分（プロリン豊富領域に続くもの）を含むプローブブロットに使用された。Ａ（急性）と標識されたレーンは肺炎球菌感染の診断後すぐに収集された血清でプローブされた。レーンＣ（回復期）は最初の血清収集１ヶ月後（患者１，２，および３）もしくは８日後（患者４および５）に収集された血清でプローブされた。患者２，３および５では、Ｓｐ３６での回復期血清の反応性は対応する急性（患者）血清の反応性よりも強かった。急性と回復期の血清間の差異はタンパク質のＣ末端半分での反応性で特に顕著であった。
【００８６】
追加の実験（図示されてはいない）では、肺炎球菌感染での２３患者からの回復期血清は全長Ｓｐ３６での反応性を個別に検査された。２３血清中２０はウェスタンブロットでＳｐ３６を結合することが発見された。
【００８７】
これらの実験は、Ｓｐ３６がヒト免疫系により認識されることを示し、またＳｐ３６タンパク質に結合できる抗体がヒトでの自然の肺炎連鎖球菌感染の間に産生され得ることを示唆する。患者は多種多様の肺炎球菌菌で感染されたために、これらのデータは更にＳｐ３６が抗原として保存されることを示している。
【００８８】
実施例５
表１は各種配列の間のパーセント同一性を提供する。
【００８９】
レーザージーンのメガラインプログラムを使用するＰｈｔＡ，ＰｈｔＢ，ＰｈｔＤ，およびＰｈｔＥの予想されたアミノ酸配列の整列は、各Ｃ末端での実質的な開散（分岐）と共に強いＮ末端相同性を示した。同じ遺伝子のヌクレオチド配列の整列は図７で示される。アミノ酸とヌクレオチド配列は、リップマン−ピアソン組状整列での同一性加重法を使って比較され、ここで適合する残基数が適合残基数プラス非適合残基数プラスギャップ内残基数で除される。下記の表（１）では、配列の各対の間のパーセント同一性は対応する行と列の交差部で示される。
【００９０】
【表１】
0004689044.tif 000002
【００９１】
実施例６
ＰｈｔＤワクチン投与での能動保護
Ｎ４菌株から誘導される組換えＰｈｔＤで免疫化されたマウスは強力な抗体力価（２，０４８，０００乃至４，０９６，０００にわたる相互端点力価）を生成した。ＰｈｔＤで免疫化されたマウスは３種の異種菌株、すなわちＳＪ２（６Ｂ血清型；テネシー、メンフィス、セントジュード・チルドレンズ・リサーチ・ホスピタル、Ｐ．フリンにより提供されたもの）、ＥＦ６７９６（６Ａ血清型）またはＥＦ５６６８（４血清型；いずれもバーミンガム、ユニバーシティ・オブ・アラバマ、Ｄ．ブライルにより提供された菌株）のいずれかでの腹腔内注射後に死に対して保護された。図８（パネルＡ）で示される実験では、シャム免疫マウスの１０匹すべては有毒肺炎球菌（ＳＪ２菌株）での攻撃１０日後以内に死に、一方ＰｈｔＤ免疫化マウスの８０パーセントは１５日の観察期間生存した。ＰｈｔＤでの免疫化はまた６Ａ血清型菌株、ＥＦ６７９６（パネルＢ）および４血清型菌株、ＥＦ５６６８（パネルＣ）に対して保護された。図８（パネルＢ）で示された実験では、シャム免疫化マウスの１０匹すべてが有毒肺炎球菌（ＥＦ６７９６菌株）での攻撃７日後以内に死に、一方ＰｈｔＤ免疫化マウスの９０パーセントが１５日の観察期間生存した。図８（パネルＣ）で示された実験では、シャム免疫化マウスの１０匹すべてが有毒肺炎球菌（ＥＦ５６６８菌株）との攻撃６日後以内に死んだが、一方ＰｈｔＤで免疫化された９匹のマウスは１５日の観察期間生存した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−１ＣはそれぞれＳｐ３６の異なる調合物を使用する３個の実験の結果を報告する。その結果は肺炎球菌菌株ノルウェー４血清型から誘導された組換えＳｐ３６での能動免疫化が異種菌株ＳＪ２（６Ｂ血清型）を用いる肺炎球菌敗血症のモデルでマウスを死から保護できることを示す。示された３種の実験それぞれにおいて、Ｓｐ３６で免疫化されたマウスの１００パーセントが肺炎球菌約５００ｃｆｕでの攻撃後１４日の観察期間生存し、一方（ＰＢＳとアジュバントを注射された）シャム免疫化マウスの８０乃至１００パーセントが同じ期間に死んだ。
【図２】  図２Ａ−２Ｂはノルウェー型から誘導されるＳｐ３６に対して応答して産生されたラビット抗血清の受動投与が２個の異種菌株を用いる肺炎球菌敗血症のモデルでマウスを死から保護できたことを示す。図２ＡはＳｐ３６抗血清で免疫化されたマウスの１００パーセントがＳＪ２菌株（６Ｂ血清型）の１７２ｃｆｕでの攻撃後２１日の観察期間生存したことを示す。対照血清（ラビット抗ＦｉｍＣ）で免疫されたマウスの８０パーセントは８日までに死に、また９０パーセントが１２日までに死んだ。図２ＢはＳｐ３６抗血清で免疫化されたマウスの９０パーセントがＥＦ３７９６菌株（６Ａ血清型）の８６２ｃｆｕでの攻撃後８日の観察期間生存した。（免疫化の前に収集された）対照血清で免疫化されたマウスの９０％は５日までに死んだ。
【図３】  異種菌株のＳｐ３６と反応するためにノルウェー４型菌株から誘導された組換えＳｐ３６に対して応答して産生された抗血清の能力を示すウェスタンブロットである。全細胞溶解産物はＳｐ３６に対するマウス抗血清でイムノブロッティングされた。Ｓｐ３６タンパク質を表す帯域は試験された２３個の肺炎連鎖球菌菌株すべてで検出され、それは現在の多糖類ワクチンで代表される２３個の肺炎球菌血清型のそれぞれからの分離物を含んでいた。
【図４】  ノルウェー４型からのＳｐ３６遺伝子が２４個の他の肺炎球菌菌株からのゲノムＤＮＡで雑種形成することを示すサザンブロットであり、これら全ての菌株で類似の配列の存在を示している。
【図５】  患者の血清とＳｐ３６との反応性を示すウェスタンブロットである。Ｓｐ３６（パネルＡの全長，パネルＢのＮ末端半分，あるいはパネルＣのＣ末端半分のいずれか）はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で電気泳動され、ニトロセルロースに移された。病気の発症直後（急性血清、レーンＡ）または８日乃至３０日後（回復期血清，レーンＣ）に収集された患者血清がブロットをプローブするために使用された。患者２，３，５では、回復期血清は対応する急性血清が反応したより以上にＳｐ３６とより強く反応した。
【図６ａ】  ４個の関連肺炎球菌タンパク質、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号８）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１０）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号４）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号６）のアミノ酸整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最も最大化するために導入されたギャップを示す。適合するアミノ酸残基はボックスされる。
【図６ｂ】  ４個の関連肺炎球菌タンパク質、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号８）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１０）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号４）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号６）のアミノ酸整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最も最大化するために導入されたギャップを示す。適合するアミノ酸残基はボックスされる。
【図６ｃ】  ４個の関連肺炎球菌タンパク質、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号８）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１０）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号４）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号６）のアミノ酸整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最も最大化するために導入されたギャップを示す。適合するアミノ酸残基はボックスされる。
【図７ａ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｂ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｃ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｄ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｅ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｆ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｇ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図７ｈ】  ４個の関連肺炎球菌遺伝子、すなわちそれぞれＳｐ３６Ａ（ＰｈｔＡ；配列識別番号９）、Ｓｐ３６Ｂ（ＰｈｔＢ；配列識別番号１１）、Ｓｐ３６Ｄ（ＰｈｔＤ；配列識別番号５）、Ｓｐ３６Ｅ（ＰｈｔＥ；配列識別番号７）のヌクレオチド整列比較である。配列内でのダッシュは配列類似性を最大化するために導入されたギャップを示す。
【図８】  ＰｈｔＤ組換えタンパク質でのマウスの免疫化の結果を示し、それは致死的敗血症からの保護に導く。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（パネルＡおよびＢ）またはＢａｌｂ／ｃＢｙＪ（パネルＣ）マウスはＰｈｔＤタンパク質（完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）５０μｌで乳化されたＰＢＳ５０μｌ内の１５μｇ）で皮下で免疫化された。保護実験で使用された組換えＰｈｔＤタンパク質は８１９アミノ酸残基より成り、システィン（残基２０）で出発していた。１０匹のシャム免疫マウスのグループはアジュバントと共にＰＢＳを受けた。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いた１５μｇのタンパク質の第２免疫化は３週後に投与された。シャムグループはＩＦＡと共にＰＢＳを受けた。血液は７週に（眼窩側方での瀉血で）引き出された。また各グループからの血清はエリザによる抗ＰｈｔＤ抗体の分析のために貯留された。マウスは約５５０ｃｆｕの肺炎連鎖球菌ＳＪ２菌株、６Ｂ血清型（パネルＡ）、８５０ｃｆｕのＥＦ６７９６菌株、６Ａ血清型（パネルＢ）、または４５０ｃｆｕのＥＦ５６６８菌株、４血清型（パネルＣ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で８週に攻撃された。予備実験では、ＳＪ２とＥＦ６７９６菌株に対するＬＤ50は両菌株とも約１０ｃｆｕであると決定された。ＥＦ５６６８菌株に対するＬＤ50は＜５ｃｆｕであると決定された。生存が以後１５日間のコースにわたりすべてのグループで決定された。データは実験グループ当り１０匹のマウスの全体に対する生存のパーセントとして提示される。組換えＰｈｔ免疫化マウスをシャム免疫化マウスと比較する統計分析のために２個のサンプルのログ−ランクテストが使用された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【図８】
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