(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）所定の領域に無作為に現れる特定の種の病原性細菌株を十分な数（ｎ）単離すること、
ｂ）ａ）で述べた前記細菌株の少なくとも１種に特異的なバクテリオファージ株を十分な数単離すること、
ｃ）単離された各細菌株に対する単離されたバクテリオファージ株の溶菌活性を測定し、単離された全細菌株数に対する所定のファージによって溶菌された細菌株数の割合である値ｐを推定すること、
ｄ）得られたｐの値について、ｎが以下の条件を満たすか否かを試験すること、
【数１】
0004723807.tif 000087
［式中、ｑ＝１−ｐであり、
ｄは、０．１以下の定数であり、
ｚ１−αは、０．９５以上の信頼因子１−αに応じた正規分布の確率変数である］
ｅ）ｄ）に記載された基準を満たし、２／ｎ以上のｐ値を有するバクテリオファージ株を選択することを特徴とする多価バクテリオファージ株を得る方法。
【請求項２】
ステップａ）で単離する細菌株は薬剤耐性株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｄ）において、ｄは１０％ｐ以下の定数である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｅ）において、ｄ）に記載された基準を満たし、０．５以上のｐ値を有するバクテリオファージ株を選択する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）において、孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに通すことにより、環境に由来するサンプルからバクテリオファージ株を単離し、得られた濾液に培地を加えて所定の種の細菌株のブロス培養液と混ぜ、３７℃で１時間インキュベートし、懸濁液の一部を取り出して固体培地が入ったプレートに塗布し、３７℃で２から２４時間インキュベートし、個々の溶菌斑の周辺培地サンプルを単離し、所定の種の細菌株のブロス培養液に移し、培養液が明るくなるまでインキュベートし、ライセートを孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに通すことによってバクテリオファージ株を得る、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）において、前記固体培地の接種および前記溶菌斑の再単離を５回繰り返す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）において、検討中の細菌株を固体培地上に接種し、その上にステップｂ）で得られたバクテリオファージの一部を移し、３７℃の温度で４時間インキュベートした後、２〜２４時間の間４℃の温度で放置した後、少なくとも個々の溶菌斑の出現によってバクテリオファージ株の溶菌活性を測定する、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
病原性細菌株がスタフィロコッカスまたはシュードモナス属である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップｅ）で選択された多価バクテリオファージ株が、ポーランドで単離されたスタフィロコッカス属の薬剤耐性細菌株に特異的であり、この株が、Ｓ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００１）、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ３（ＰＣＭ  Ｆ／００００３）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）、Ｓ５（ＰＣＭ  Ｆ／００００５）、Ｓ６（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）またはＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤耐性細菌株が、ムコビシドーシス患者に現れ、前記バクテリオファージ株が、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）またはＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｅ）で選択された多価バクテリオファージ株が、ポーランドで単離されたシュードモナス属の薬剤耐性細菌株に特異的であり、このバクテリオファージ株が、Ｐ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００８）、Ｐ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００９）、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ４（ＰＣＭ  Ｆ／０００１１）、Ｐ５（ＰＣＭ  Ｆ／０００１２）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）、Ｐ７（ＰＣＭ  Ｆ／０００１４）、Ｐ８（ＰＣＭ  Ｆ／０００１５）、Ｐ９（ＰＣＭ  Ｆ／０００１６）、Ｐ１０（ＰＣＭ  Ｆ／０００１７）、Ｐ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）、Ｐ１２（ＰＣＭ  Ｆ／０００１９）、Ｐ１３（ＰＣＭ  Ｆ／０００２０）、Ｐ１４（ＰＣＭ  Ｆ／０００２１）、Ｐ１５（ＰＣＭ  Ｆ／０００２２）、Ｐ１６（ＰＣＭ  Ｆ／０００２３）、Ｐ１７（ＰＣＭ  Ｆ／０００２４）、Ｐ１８（ＰＣＭ  Ｆ／０００２５）、Ｐ１９（ＰＣＭ  Ｆ／０００２６）、またはＰ２０（ＰＣＭ  Ｆ／０００２７）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤耐性細菌株が、ムコビシドーシス患者に現れ、前記バクテリオファージ株が、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）またはＰ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バクテリオファージを含有する混合物をセルロースまたは少なくとも部分的にエステル化したその誘導体を含有する基材と接触させ、次いで内毒素またはその他の不純物を除去する溶液で洗浄した後、精製されたバクテリオファージを溶出することによる、ライセートの精製をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
水、非解離物質の溶液、または濃度０．１Ｍ以下の食塩水によって内毒素またはその他の不純物の溶出を行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
水、非解離物質の溶液、または濃度０．１Ｍ以下の緩衝された食塩水によって内毒素またはその他の不純物の溶出を行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非解離物質の溶液、または任意の緩衝液、または濃度０．０５Ｍ以上の食塩水によってバクテリオファージの溶出を行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
非解離物質の溶液、または任意の緩衝液、または濃度０．０５Ｍ以上の緩衝された食塩水によってバクテリオファージの溶出を行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
有機溶媒を含有する塩の水溶液を用いて内毒素およびバクテリオファージの溶出を行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、イソプロパノールおよびアセトンを含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
有機または無機酸で部分的にエステル化されたセルロースを基材として用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
酢酸、硝酸、硫酸またはリン酸で部分的にエステル化されたセルロースを使用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
グルコース分子の０．０１から５％がエステル化されたセルロースを使用することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
グルコース分子の０．２５から１％がエステル化されたセルロースを使用することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ムコビシドーシス患者に発生する感染の治療または予防に使用され、スタフィロコッカス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株として、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）およびＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）のうち少なくとも１種のバクテリオファージ株を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項２５】
ムコビシドーシス患者に発生する感染の治療または予防に使用され、シュードモナス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株として、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）およびＰ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）の中から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項２６】
スタフィロコッカス属の細菌によって引き起こされ、ムコビシドーシス患者に発生する感染を治療または予防するための医薬品の製造における、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）およびＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）の中から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株の使用。
【請求項２７】
シュードモナス属の細菌によって引き起こされ、ムコビシドーシス患者に発生する感染を治療または予防するための医薬品の製造における、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）およびＰ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）の中から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株の使用。
【請求項２８】
ポーランドで単離されたスタフィロコッカス属の薬剤耐性細菌株に対して特異的である、Ｓ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００１）、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ３（ＰＣＭ  Ｆ／００００３）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）、Ｓ５（ＰＣＭ  Ｆ／００００５）、Ｓ６（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）またはＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）の中から選択される多価バクテリオファージ株。
【請求項２９】
ポーランドで単離されたシュードモナス属の薬剤耐性細菌株に特異的である、Ｐ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００８）、Ｐ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００９）、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ４（ＰＣＭ  Ｆ／０００１１）、Ｐ５（ＰＣＭ  Ｆ／０００１２）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）、Ｐ７（ＰＣＭ  Ｆ／０００１４）、Ｐ８（ＰＣＭ  Ｆ／０００１５）、Ｐ９（ＰＣＭ  Ｆ／０００１６）、Ｐ１０（ＰＣＭ  Ｆ／０００１７）、Ｐ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）、Ｐ１２（ＰＣＭ  Ｆ／０００１９）、Ｐ１３（ＰＣＭ  Ｆ／０００２０）、Ｐ１４（ＰＣＭ  Ｆ／０００２１）、Ｐ１５（ＰＣＭ  Ｆ／０００２２）、Ｐ１６（ＰＣＭ  Ｆ／０００２３）、Ｐ１７（ＰＣＭ  Ｆ／０００２４）、Ｐ１８（ＰＣＭ  Ｆ／０００２５）、Ｐ１９（ＰＣＭ  Ｆ／０００２６）、またはＰ２０（ＰＣＭ  Ｆ／０００２７）の中から選択される多価バクテリオファージ株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価株のバクテリオファージ、それらを得る方法、および細菌感染、特に薬剤耐性菌感染の治療におけるそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージ（ファージ）は、その生活環が細菌細胞だけとかかわり合いを持つ多様なグループのウイルスである。バクテリオファージの特徴は、溶原性または溶菌性の生活環である。抗菌薬として、溶菌性バクテリオファージは特に有用であり、感受性のある細菌細胞に感染した後、バクテリオファージは細菌細胞内で複製され、（溶菌による）細菌細胞の完全破壊、および次の細菌細胞を攻撃しかつ破壊する新たなファージの放出をもたらす。このプロセスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのどちらでも起こり得る。
【０００３】
バクテリオファージの本質的特性の１つは、よく知られている溶菌活性の高い特異性である。この特徴は、例えば、様々な細菌の菌種決定（ファージ型別）に利用されている（例えば、ＧＢ２２８５６８４、ＵＳ５８２４４６８およびＳＵ５４３２６０特許明細書、ならびに国際特許公開ＷＯ０１００７８６およびＷＯ０１０９３７０を参照）。その他に知られているバクテリオファージの用途には、分子生物学、例えば、特異的タンパク質の発現および選択（例えば、ＵＳ６０２７９３０特許明細書）、ならびに滅菌および洗浄媒体（例えば、ＥＰ０４１４３０４、ＥＰ０２９０２９５およびＧＢ２２５３８５９特許明細書、ならびに国際特許公開ＷＯ９８０８９４４およびＷＯ９００３１２２）におけるツールとしての有用性が含まれる。修飾ファージは、ワクチンの生成で使用される（例えば、ＷＯ９５０５４５４）。バクテリオファージ由来のある種のタンパク質も使用される（例えば、ＥＰ０５１０９０７、ＵＳ５４７０５７３、ＷＯ９６０７３２９）。バクテリオファージを単離し、ファージ調製物を得る方法はよく知られており、絶えず改良されている（例えば、ＧＢ８２９２６６、ＣＳ１９２２１２、ＲＵ２１０９０５５）。
【０００４】
ファージ療法は、グルジア共和国トビリシ所在の細菌学・ウイルス学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）において第二次世界大戦以後大規模に用いられてきた。そこでは、細菌感染の治療および予防に様々なファージ調製物のバンクが使用される。
【０００５】
入手可能なデータにより、ファージ療法の高い有効性が示されている。同様の研究が、２５年間にわたりポーランドで行われてきた。ブロツラフ所在のポーランド科学アカデミー（Ｐｏｌｉｓｈ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の免疫学・実験治療研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）のバクテリオファージ研究室（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）では、薬剤耐性菌および抗生物質に感受性のない細菌によって引き起こされる感染症の治療にファージ療法が用いられている（Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｌｏｐｅｋ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、３１巻、２９３ページ、１９８１年；Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｌｏｐｅｋ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、３１巻、２６７ページ、１９８３年；Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｌｏｐｅｋ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、３２巻、３１７ページ、１９８４年；Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｌｏｐｅｋ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、３３巻、２１９ページ、１９８５年；Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｌｏｐｅｋ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、３３巻、２４１ページ、１９８５年；Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｌｏｐｅｋ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、３５巻、５６９ページ、１９８７年；Ｂｅａｔａ  Ｗｅｂｅｒ−Ｄａｂｒｏｗｓｋａ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、４８巻、３１〜３７ページ、２０００年；Ｂｅａｔａ  Ｗｅｂｅｒ−Ｄａｂｒｏｗｓｋａ他、Ａｒｃｈｉｖｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ  ｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｉａｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、４８巻、５４７〜５５１ページ、２０００年を参照）。この１４年間に様々な組織および器官の化膿性感染症患者１４７３例について行われたファージ療法は、ファージ療法の高い有効性を示している。
【０００６】
疾患症状の完全な寛解および健康回復は１２８９例で認められた。少なくとも約１２例で、ファージ療法が生死にかかわる感染を排除する唯一の可能性であったことを強調しておかなければならない。この療法は別々の患者に施された。この療法は：
ａ）患者から得た材料から単離した細菌株の増殖および同定、
ｂ）特定のファージに対する菌株の感受性の測定および菌株に対して最も高い溶菌活性を示しているファージの選択、
ｃ）多数のファージ粒子を含むファージ・ライセートの調製。
ｄ）治療用の滅菌ファージ調製物の生成からなっていた。
【０００７】
この手順は、かなりのコストがかかり、骨が折れかつ多大な時間を要する。時には、研究材料を得た時点から完成した治療用の滅菌ファージ調製物が利用可能になるまで７〜１０日が経過する。このような遅滞は、一部の疾患状態には長すぎる。今まで使用されてきた手順を用いてファージ療法を大規模に行うことはできない。
【０００８】
ムコビシドーシスを伴う感染症には独特の問題がある。ムコビシドーシスは、粘液分泌腺の機能障害からなる遺伝性全身疾患であり、患者を慢性気管支疾患および肺疾患にかかりやすくする。分泌される粘液は粘度が高くかつ粘着性であり、自然の経路（咳嗽）による排泄が困難となる。気管支における粘液の蓄積および残存ならびに粘液排除の障害は、細菌感染に都合のよい条件を生み出し、慢性気管支炎および肺炎をもたらす。ムコビシドーシスを伴う感染症を引き起こす最も恐ろしい病原体は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）およびシュードノマス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ）属の細菌である。これらの微生物により持続的に再発する感染症は、呼吸器系における重篤な病的変化および早死につながる。２５年以上生存する患者はあまりいない。利用可能な抗生物質によるこのような感染症の治療は、特に過去数年間に深刻な治療上の問題を世界中で引き起こしている。細菌株の大部分が、最後の手段の抗生物質であるバンコマイシンを含めたすべての抗生物質に対して耐性を示すため、これらの感染症の抗生物質治療が次第に有効でなくなってきている。したがって、難治性および極めて危険な細菌感染を治療するための代替治療法を医療に導入する差し迫った必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
過去数年、最後の手段の抗生物質であるバンコマイシンを含めたすべての抗生物質に耐性である細菌株の大規模な広がりが見られている。この結果、これらの薬剤耐性菌に誘起される細菌感染の抗生物質による治療は効果がない。この状況は、劇的な治療上の問題を生じてきた。したがって、難治性細菌感染を治療するための代替治療法を医療に導入するという差し迫った必要性がある。
【００１０】
上記の目的に鑑み、本発明は、どの場合にも個別のファージ選択の必要なしに、細菌感染の治療において保証された有効性を持つ調製物を生成する際に用いることができる多価ファージ株を得る方法を練ることである。この実情に鑑み、本発明の目的は、高純度、特に内毒素を含有しないファージ調製物を得ることを可能にする方法を提示することである。
【００１１】
本発明の具体的な目的は、どの場合にも個別のファージ選択の必要なしにムコビシドーシスに関連する細菌感染の治療において効果的に用いることのできる多価ファージ調製物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、多価バクテリオファージ株を得る方法であって、
ａ）所定の領域に無作為に現れる所定の属の細菌病原体の様々な菌株を十分な数（ｎ）蓄積すること（単離した細菌株は薬剤耐性であることが好ましい）、
ｂ）前記属の細菌株の少なくとも１種に特異的な様々なバクテリオファージ株を十分な数蓄積すること、
ｃ）蓄積された各細菌株に対する蓄積されたバクテリオファージ株の溶菌活性を測定し、次いで、蓄積された全細菌株数に対する所定のファージによって溶菌された細菌株数の割合である値ｐを算出すること、
ｄ）得られたｐの値について、ｎが以下の条件を満たすか否かを試験すること、
【００１３】
【数２】
0004723807.tif 000002
［式中、ｑ＝１−ｐであり、
ｄは、０．１以下、好ましくは１０％ｐ以下の定数であり、
ｚ１−αは、０．９５以上の信頼因子１−αに応じた正規分布の確率変数である］
ｅ）ｄ）で定義した基準を満たし、２／ｎ以上、好ましくは０．５以上のｐ値を有するバクテリオファージ株を選択することによる方法を提供する。
【００１４】
所定の領域内に存在する病原性細菌株の集団について、単離した各バクテリオファージの溶菌活性の範囲を測定する。この目的で、無作為に選択した薬剤耐性菌株の十分に大きなコレクションを蓄積しなければならない。ｎ株（記載の実施例において、ｎは、ポーランドで単離された薬剤耐性株のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）について、それぞれ８４５および８８０であった）の集団サイズである確立した大きな細菌サンプルを参照して成功した頻度を算出するか、菌株の総数に対する所定のファージで溶菌された菌株数の割合を検討する。この頻度を成功の確率ｐと見なす。したがって、失敗の確率はｑ＝１−ｐである。
【００１５】
所定の属（例えば、シュードモナスまたはスタフィロコッカス）の菌株の一般集団の代表と見なすことができるようにサンプルサイズｎを選択することが不可欠である。この目的で、代表であるべきサンプルについて以下の基準を定める。
Ｐ（｜ν−ｐ｜＜ｄ）＝Ｐ（−ｄ＜ν−ｐ＜ｄ）＝１−α
【００１６】
サンプル頻度νと成功の確率ｐとの差の絶対値が前もって割り当てた値ｄ未満である確率は１−αであり、これは信頼水準１−αと一致する。１−αの値は、通常０．９５または０．９８に設定される。
【００１７】
サンプル数ｎは以下の条件を満たすべきである。
【００１８】
【数３】
0004723807.tif 000003
［式中、ｚ１−αは、正規分布の確率変数である］
１−α＝０．９５の場合にはｚ１−α＝１．９６であり、１−α＝０．９８の場合にはｚ１−α＝２．３３である。
【００１９】
この基準および特徴が明らかにされたファージについて得られた頻度の値ｐに基づき、ｄおよび信頼範囲１−αに妥当な値を割り当てることにより、所定のファージについて溶菌活性の範囲を測定するのに使用する大きさｎを確認し、割り当てたｄおよび１−αの値により、このｎについて得られた溶菌活性が所定の属の細菌株の一般的集団に関して正しいと見なしてよいのか否かを確認することが可能である。
【００２０】
バクテリオファージの株は、環境に由来するサンプルからステップｂ）において、孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに通し、濾液に培地を加え、所定の属の細菌のブロス培養液と混ぜ、約３７℃で約１時間インキュベートし、懸濁液の一部を取り出し、固体培地が入ったプレート上に塗布し、約３７℃で２〜２４時間インキュベートし、個々の溶菌斑（ｂａｌｄ  ｓｐｏｔ）の周辺培地サンプルを単離し、所定の属の細菌のブロス培養液にそれを移し、培養液が透明になるまでインキュベートし、ライセートを孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに通すことによってバクテリオファージ調製物を得ることによって単離することが好ましく、固体培地の接種および溶菌斑の再単離を５回繰り返すことが好ましい。
【００２１】
ステップｃ）における細菌株を固体培地上に接種し、ステップｂ）で得られたバクテリオファージ調製物の一部をその上に置き、約３７℃で約４時間インキュベートした後、約２〜２４時間約４℃に温度を設定し、少なくとも個々の溶菌斑の出現によってバクテリオファージ株の溶菌活性を証明することが好ましい。
【００２２】
バクテリオファージを含有する混合物をセルロースまたは部分的にエステル化したその誘導体を含有する基材と接触させ、次いで不純物、特に内毒素を除去する溶液で洗浄した後、精製されたバクテリオファージを洗い流すことにより、特に内毒素に関してライセートのさらなる精製を行うことが可能である。内毒素は、水、非解離物質の溶液、または濃度０．１Ｍ以下の場合によっては緩衝された食塩水で効率的に溶出することができる。また、バクテリオファージ分画は、非解離物質の溶液、または任意の緩衝液、または濃度０．０５Ｍ以上の場合によっては緩衝された食塩水で効率的に溶出することができる。また、内毒素およびバクテリオファージの溶出は−２５℃〜＋１００℃の温度において行う。内毒素およびバクテリオファージの溶出は、有機溶媒を含有する食塩水溶液を用いて行うことが好ましい。有機溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、イソプロパノールおよびアセトンよりなる群から選択されることが最良であり、基材としては、有機または無機酸で部分的にエステル化されたセルロースを用いることができる。酢酸、硝酸、硫酸またはリン酸で部分的にエステル化されたセルロースの基材を使用してもよく、特に、グルコース分子の０．０１〜５％、好ましくは０．２５〜１％、より好ましくはグルコース分子の０．５〜１％がエステル化されたセルロースを基材として使用してもよい。
【００２３】
病原性細菌株はスタフィロコッカスまたはシュードモナス属であることが好ましい。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、細菌病原体によって引き起こされる感染を治療または予防するための医薬品であって、有効成分および可能な薬学的に許容される担体を含有し、有効成分が所定の属の細菌に特異的であり、本発明の方法を用いて得られる多価バクテリオファージ株からなるような医薬品である。
【００２５】
本発明によれば、医薬品は、スタフィロコッカス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株としてＳ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００１）、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ３（ＰＣＭ  Ｆ／００００３）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）、Ｓ５（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）、Ｓ６（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）およびＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）から選択されるバクテリオファージのうち少なくとも１種の株、好ましくはファージＳ１、Ｓ２、およびＳ４またはＳ５を含有するという特徴を有することができる。本発明の一態様に従って生成されるこの医薬品は、ムコビシドーシスを患った人で発生する感染の治療または予防に役立ち、スタフィロコッカス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株として、Ｆ／００００２、Ｆ／００００４およびＦ／００００７から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株を含有する。
【００２６】
本発明によれば、医薬品は、シュードモナス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株としてＰ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００８）、Ｐ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００９）、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ４（ＰＣＭ  Ｆ／０００１１）、Ｐ５（ＰＣＭ  Ｆ／０００１２）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）、Ｐ７（ＰＣＭ  Ｆ／０００１４）、Ｐ８（ＰＣＭ  Ｆ／０００１５）、Ｐ９（ＰＣＭ  Ｆ／０００１６）、Ｐ１０（ＰＣＭ  Ｆ／０００１７）、Ｐ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）、Ｐ１２（ＰＣＭ  Ｆ／０００１９）、Ｐ１３（ＰＣＭ  Ｆ／０００２０）、Ｐ１４（ＰＣＭ  Ｆ／０００２１）、Ｐ１５（ＰＣＭ  Ｆ／０００２２）、Ｐ１６（ＰＣＭ  Ｆ／０００２３）、Ｐ１７（ＰＣＭ  Ｆ／０００２４）、Ｐ１８（ＰＣＭ  Ｆ／０００２５）、Ｐ１９（ＰＣＭ  Ｆ／０００２６）、およびＰ２０（ＰＣＭ  Ｆ／０００２７、好ましくはファージＰ７、Ｐ２０およびＰ６から選択されるバクテリオファージのうち少なくとも１種の株）を含有するという特徴を有するべきである。本発明のある態様に従って生成されるこの医薬品は、ムコビシドーシスを患っている人で発生する感染の治療または予防に役立ち、シュードモナス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株として、Ｆ／０００１０、Ｆ／０００１３およびＦ／０００１８から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株を含有する。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法に従って得られる多価バクテリオファージ株の、細菌病原体によって引き起こされる細菌感染を治療または予防するための医薬品の開発への応用である。
【００２８】
スタフィロコッカス属の細菌によって引き起こされる感染を治療または予防するための医薬品を生成するには、Ｓ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００１）、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ３（ＰＣＭ  Ｆ／００００３）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）、Ｓ５（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）、Ｓ６（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）およびＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）の中から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株、好ましくはファージＳ１、Ｓ２、およびＳ４またはＳ５を用いるのが有利である。ムコビシドーシスを患っている人でスタフィロコッカス属の細菌によって引き起こされる感染症を治療または予防するための医薬品を創生するには、Ｆ／００００２、Ｆ／００００４およびＦ／００００７から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株を用いるのが有利である。
【００２９】
また、シュードモナス属の細菌によって引き起こされる感染を治療または予防するための医薬品を創生するには、Ｐ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００８）、Ｐ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００９）、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ４（ＰＣＭ  Ｆ／０００１１）、Ｐ５（ＰＣＭ  Ｆ／０００１２）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）、Ｐ７（ＰＣＭ  Ｆ／０００１４）、Ｐ８（ＰＣＭ  Ｆ／０００１５）、Ｐ９（ＰＣＭ  Ｆ／０００１６）、Ｐ１０（ＰＣＭ  Ｆ／０００１７）、Ｐ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）、Ｐ１２（ＰＣＭ  Ｆ／０００１９）、Ｐ１３（ＰＣＭ  Ｆ／０００２０）、Ｐ１４（ＰＣＭ  Ｆ／０００２１）、Ｐ１５（ＰＣＭ  Ｆ／０００２２）、Ｐ１６（ＰＣＭ  Ｆ／０００２３）、Ｐ１７（ＰＣＭ  Ｆ／０００２４）、Ｐ１８（ＰＣＭ  Ｆ／０００２５）、Ｐ１９（ＰＣＭ  Ｆ／０００２６）、およびＰ２０（ＰＣＭ  Ｆ／０００２７）、好ましくはファージＰ７、Ｐ２０およびＰ６の中から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株を用いるのが有利である。ムコビシドーシスを患っている人でシュードモナス属の細菌によって引き起こされる感染症を治療または予防するための医薬品を創生するには、Ｆ／０００１０、Ｆ／０００１３およびＦ／０００１８から選択される少なくとも１種のバクテリオファージ株を用いるのが有利である。
【００３０】
本発明の他の目的は、Ｓ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００１）、Ｓ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００２）、Ｓ３（ＰＣＭ  Ｆ／００００３）、Ｓ４（ＰＣＭ  Ｆ／００００４）、Ｓ５（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）、Ｓ６（ＰＣＭ  Ｆ／００００６）およびＳ７（ＰＣＭ  Ｆ／００００７）の中から、好ましくはファージＳ１、Ｓ２、Ｓ４およびＳ５の中から選択される、スタフィロコッカス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株である。
【００３１】
本発明の目的は、Ｐ１（ＰＣＭ  Ｆ／００００８）、Ｐ２（ＰＣＭ  Ｆ／００００９）、Ｐ３（ＰＣＭ  Ｆ／０００１０）、Ｐ４（ＰＣＭ  Ｆ／０００１１）、Ｐ５（ＰＣＭ  Ｆ／０００１２）、Ｐ６（ＰＣＭ  Ｆ／０００１３）、Ｐ７（ＰＣＭ  Ｆ／０００１４）、Ｐ８（ＰＣＭ  Ｆ／０００１５）、Ｐ９（ＰＣＭ  Ｆ／０００１６）、Ｐ１０（ＰＣＭ  Ｆ／０００１７）、Ｐ１１（ＰＣＭ  Ｆ／０００１８）、Ｐ１２（ＰＣＭ  Ｆ／０００１９）、Ｐ１３（ＰＣＭ  Ｆ／０００２０）、Ｐ１４（ＰＣＭ  Ｆ／０００２１）、Ｐ１５（ＰＣＭ  Ｆ／０００２２）、Ｐ１６（ＰＣＭ  Ｆ／０００２３）、Ｐ１７（ＰＣＭ  Ｆ／０００２４）、Ｐ１８（ＰＣＭ  Ｆ／０００２５）、Ｐ１９（ＰＣＭ  Ｆ／０００２６）、およびＰ２０（ＰＣＭ  Ｆ／０００２７）の中から、好ましくはファージＰ７、Ｐ２０およびＰ６の中から選択される、シュードモナス属の細菌に特異的な多価バクテリオファージ株でもある。
【００３２】
ヒトにおける細菌感染において最も頻繁な病因的要素である細菌種に対して活性なファージの発明者自身のコレクションを研究に使用した。記載の実施例は、特にムコビシドーシスを患っている患者に見られるそのメチシリン耐性株を含むブドウ状球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）の菌株、および緑膿菌（シュードモナス・エルギノーザ）に対して溶菌的に作用する多価バクテリオファージに関する。これらの種は、今日高い死亡率の原因となっている重度な感染症の原因である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によって得られる多価ファージを含有する多価ファージ調製物を治療に導入することは、抗生物質による治療に感受性のない細菌感染との闘いにおける大きな進歩である。この新技術はある種の経済的利点とも関連している。材料コストの著しい軽減が可能となり、検査用の材料収集から治療用のファージ調製物を得るまでの時間が短縮される。このおかげで、個々のファージ調製物の生成を患者が待ち受けるのではなく、ファージ調製物が患者を待ち受けることとなる。
【００３４】
本発明の方法によって得られるいくつかの多価ファージで構成される多様な溶菌性ファージ調製物は、細菌感染の治療における用途という観点から極めて重要な利点をもたらす。細菌集団では、バクテリオファージに抵抗性の型が約１×１０−７の頻度で現れることがよく知られている。２種のファージが存在すると、このような突然変異の頻度は約１×１０−１４であり、３種のファージでは約１×１０−２１に過ぎない。このような手筈により、ファージに対して抵抗性の細菌株の問題は実際上存在しない。
【００３５】
多価ファージで構成される実施例の医薬品の高い適用性は特別強調するに値する。一般的な医療に用いてもよく、脅威的な細菌感染に対処する有効な手段となる。また、外用の医薬品の調製において本発明に従って得られるファージを利用し、例えば、皮膚感染症の治療および予防において用いることも可能である。本発明に従って得られるファージ・ライセートの経口投与により、将来起こりうる細菌感染に対する抵抗性が高められることが見いだされている。
【００３６】
ある場合には、抗生物質治療と併せてファージ療法を使用することができる。
【００３７】
多価ファージ調製物は、細菌感染の治療で用いられた場合、極めて有効であることが分かった。特に、ムコビシドーシス患者における感染症の治療および敗血症の治療（治癒率８８％）において有効性が観察された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の本質をより良く理解するため、実施例により以下に説明する。
【実施例１】
【００３９】
バクテリオファージの単離
スタフィロコッカスとシュードモナス用のバクテリオファージを市営下水から単離した。細菌を捕捉するがバクテリオファージを通過させる孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに下水を通した。生じた濾液から、濃縮液体培地を加え、濾液の様々な希釈液を細菌（スタフィロコッカス・アウレウスまたはシュードモナス・エルギノーザ）の若いブロス培養液と混ぜた。サンプルを３７℃で１時間インキュベートした後、各サンプルから懸濁液０．２ｍｌをピペットで抜き取り、ガラス棒を用いて寒天培地を含むプレート上に塗布し、３７℃で終夜インキュベートした。若い細菌培養液を含有する濾液の適切な希釈液を接種したプレート上に求められているファージが存在する場合には、細菌の一様な（不透明な）増殖およびそれとは別の透明で小さな領域、いわゆる溶菌斑が観察され、これには通常数百万個のファージ粒子が含まれる。白金耳を用いて個々の溶菌斑とそれを取り囲む寒天とを一緒に切り取り、次いで細菌の新鮮なブロス培養液に移し、培養液が透明になるまでインキュベートした。ライセート中に残っている細菌をすべて阻止する孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに通した後、濾液にはバクテリオファージのみが含まれていた。寒天培地上に、得られたファージの様々な希釈液をそれぞれの細菌と一緒に接種し、溶菌斑の再単離を５回行い、純系のファージが得られた。
【実施例２】
【００４０】
スタフィロコッカス・アウレウス株に特異的なバクテリオファージ微生物に対するスタフィロコッカス・アウレウスの感受性の測定
感受性は、Ｗａｈｌに記載されている培地を用いて測定した。この培地を入れたプレートを温度３７℃で３０分間乾燥し、振盪によって混ぜたスタフィロコッカス・アウレウスの若い４時間ブロス培養液で覆い、過剰の懸濁液をピペットで除去し、３７℃において３０分間再乾燥した。１枚のプレートを６個の区域に分割し、６種類の異なるが特異的なバクテリオファージに対して、検討中の菌株の感受性を測定した。バクテリオファージの１／１０希釈液１滴を各区域の表面に置いた。オーブン中３７℃で約４時間プレートをインキュベートした後、翌日まで冷蔵庫中に置いた。所定のファージに対する菌株の感受性が高い場合には、細菌増殖により一様に覆われた培地上のファージが導入された場所に透明な領域が見られ、これらは細菌細胞の完全破壊（溶菌）の結果である。個々の溶菌斑の出現は、菌株の感受性が低いことを示している。
【実施例３】
【００４１】
シュードモナスの菌株に特異的なバクテリオファージ微生物に対するシュードモナス菌株の感受性の測定
感受性を測定する方法は、実施例２に記載した方法と同様であった。ただし、この場合、保存培地はリン酸緩衝液を添加した寒天とし、ファージを沈着させたプレートのインキュベーション時間は５時間とした。
【実施例４】
【００４２】
スタフィロコッカスおよびシュードモナス菌株に関して最も広範囲な活性スペクトルを有するファージの選択−多価ファージ株の入手
実施例１に記載の方法に従ってバクテリオファージを単離した。ポーランド全土から単離されたスタフィロコッカスの様々な菌種について８４５の薬剤耐性臨床菌株の、スタフィロコッカスに特異的なバクテリオファージのコレクションに由来するファージに対する感受性、およびシュードモナスの様々な菌種について８８０の薬剤耐性臨床菌株の、シュードモナスに特異的なバクテリオファージのコレクションに由来するファージに対する感受性を測定した。
【００４３】
それぞれのファージに対する両菌株グループの感受性を分析することにより予想外に高活性かつ広範囲な溶菌作用スペクトルのファージを選択することができた。これらのファージを表１および２に示す。
【００４４】
【表１】
0004723807.tif 000004
【００４５】
【表２】
0004723807.tif 000005
【００４６】
特定のファージについて得られたｐ値が、細菌のそれぞれの属の一般集団について正しいか否かを判定するため、ファージＳ１〜Ｓ７およびＰ１〜Ｐ２０についての結果を統計分析にかけた。結果を図１および２に示す。大部分のバクテリオファージについてのｎの計算値は、研究サンプルの細菌株数を下回り、ポーランドに見られる臨床菌株に関して溶菌スペクトルの範囲は少なくとも正しいことを示唆している。これらの結果を考慮すると、表１および２に列挙したファージは、本発明に関しては多価ファージと見なすことができる。
【００４７】
予想外にも、スタフィロコッカス用ファージの場合、最も活性のある７種のうち３種、すなわちＳ１、Ｓ２およびＳ４またはＳ５が、検討したスタフィロコッカス菌株の９５％に溶菌活性を示した。また、シュードモナス用に選択した２１種のファージのうち３種、すなわちＰ７、Ｐ２０およびＰ６は、検討したシュードモナス菌株の８７％に溶菌活性を示した。
【００４８】
また、ムコビシドーシスを患っている患者を、本発明の本質で定義する「細菌感染の出現の所定領域」と見なすことができる。この患者グループで見られる病原体の検討では、１３７の細菌株を使用し、このうち８４株はシュードモナスと、５３株はスタフィロコッカス・アウレウスと同定された。菌株はすべて、ポーランド全土のムコビシドーシス患者に由来する材料から単離した。ファージに対するシュードモナスおよびスタフィロコッカス・アウレウスの菌株の感受性を分析し、最も高い溶菌活性および最も広範囲な作用を有するファージを選択することができた。予想外にも、シュードモナス用のファージの場合、２１種の活性ファージのうち３種、すなわちＦ／０００１０、Ｆ／００１３およびＦ／０００１８は、シュードモナス菌株の７５％に溶菌活性を示した（成功確率については図３を参照。ファージ３＝Ｆ／０００１０、ファージ６＝Ｆ／０００１３およびファージ１１＝Ｆ／０００１８）。スタフィロコッカス用に選択したファージの中で、３種、すなわちＦ／００００２、Ｆ／００００４およびＦ／００００７は、スタフィロコッカス菌株の９８％に溶菌活性を示した（成功確率については図４を参照。ファージ１＝Ｆ／００００２、ファージ３＝Ｆ／００００４およびファージ４＝Ｆ／００００７）。
【実施例５】
【００４９】
スタフィロコッカスに対するファージおよびグラム陰性菌に対するファージの複製、ファージ・ライセートの入手
グルコースで補足されたブロス培地中のスタフィロコッカス・アウレウスの若い４時間培養液（対数期）に約５％のファージ・ライセートを加えた。振盪により試験管または瓶を混ぜ、３７℃３時間インキュベートした。透明培養液（溶菌）になった後、翌日までサンプルを冷蔵した。ライセートを孔径０．２〜０．４μｍの膜フィルターに通し、残っている未溶解細菌細胞をすべて除去した。Ｇｒａｔｉａの二層法により、生ファージ粒子の濃度を測定した。ファージ・ライセートを加えないでインキュベートした培養液を対照とした。
【００５０】
グラム陰性菌（シュードモナス）に対するファージの複製。ペプトン水を用いてシュードモナスに対するファージを複製した。シュードモナス・エルギノーザの若い４時間培養液に５％のファージ・ライセートを加え、振盪により試験管または瓶を混ぜ、サンプルを３７℃で５時間インキュベートした。培養液が透明になった後、翌日まで冷蔵庫中にサンプルを放置した後、上記の孔径の膜フィルターに通した。Ｇｒａｔｉａの方法により、ライセート中の生ファージ粒子数を測定した。
【００５１】
滅菌ブロス・ファージ・ライセートは持続的な溶菌活性を示す。冷蔵した場合は、数年、ある場合には１０年以上にわたり活力を維持する。
【実施例６】
【００５２】
多価ファージ調製物の生成および用途
実施例４における広範囲溶菌活性スペクトルを有する選択されたファージ、またはそれらの濃縮したもしくはさらに精製した形（次の実施例を参照）に由来する、実施例５に記載の方法によって得られる滅菌ブロス・ライセートが多価ファージ医薬品の調製に役立った。
【００５３】
スタフィロコッカスに対する例示的な多価ファージ調製物は、ファージＳ１、Ｓ２およびＳ４またはＳ５の様々な量のライセート、またはそれらのライセートの誘導体を含有する混合物である。ムコビシドーシス患者においてスタフィロコッカスに起因する感染症には、ファージＦ／００００２、Ｆ／００００４およびＦ／００００７からの調製物を使用するべきである。
【００５４】
シュードモナスに対する例示的な多価ファージ調製物は、ファージＰ７、Ｐ２０およびＰ６の様々な量のライセート、またはそれらのライセートの誘導体を含有する混合物である。ムコビシドーシス患者においてシュードモナスに起因する感染には、ファージＦ／０００１０、Ｆ／０００１３およびＦ／０００１８からの調製物を使用するべきである。
【００５５】
医薬品は、胃液を予め中和した後（例えば、リン酸アルミニウム・ゲル（Ｇｅｌ  Ａｌｕｍｉｎｉ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃｉ）、精製ソーダまたヴィシー水（Ｖｉｃｈｙ  ｗａｔｅｒ）による）食事の３０分前に、ライセート１０ｍｌに相当する量を１日３回経口投与する。創傷上に調製物を直接塗布する場合には、２４時間にわたり３回行うべきである。局所塗布では、ファージの不活性化につながることがあるため、消毒薬で創傷を洗浄するべきでない。必要ならば、滅菌培地または０．９％ＮａＣｌ生理的溶液で創傷を洗浄してもよい。
【００５６】
ある場合には、抗生物質治療と併せてファージ療法を使用することができる。
【００５７】
細菌感染の治療に用いた多価ファージ調製物は、高い有効性を示した。ムコビシドーシス患者における敗血症の治療（治癒率８８％）および感染の治療で特に有効性が観察された。
【実施例７】
【００５８】
バクテリオファージ調製物のさらなる精製、バクテリオファージを含有する混合物からの内毒素の除去
いくつかの医療用途では、または投与の方法（例えば、静脈内）のために、高純度、特に細菌内毒素がまったくないバクテリオファージ調製物が要求される。本発明の方法に従い、セルロース、好ましくはそのエステル化誘導体を含有する基材に対するバクテリオファージの親和性を用いた。本実施例では、低レベルのエステル化（８μモル／ゲル１ｍｌ）によって特徴付けられている市販のセルロース硫酸化誘導体を用いた。基材を用いてバクテリオファージを含有する混合物から内毒素を除去する。基材を洗浄し、内毒素を除去した後、精製の次のステップは、吸着したバクテリオファージの溶出である。
【００５９】
セルロースの硫酸化誘導体を含有する基材１ｍｌを滅菌クロマトグラフ・カラムに入れた。７０％エタノールに浸したガラス綿でカラムの下部を塞ぐことにより、カラムから基材が流出するのを防いだ。
【００６０】
以下の溶出緩衝液を調製した。
緩衝液Ｉ：０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．６；
緩衝液ＩＩ：１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．６。
【００６１】
溶出液の組成物中に入れる塩は１４５℃で１時間焼いた。
【００６２】
溶液は、発熱物質を含まない蒸留水を用いて調製した。
【００６３】
クロマトグラフィ前に、５ｍｌの緩衝液Ｉ、次いで５ｍｌの緩衝液ＩＩで洗浄したクロマトグラフ・カラムに基材１ｍｌを充填した。
【００６４】
１０ｍｌの緩衝液Ｉで洗浄することにより実際のクロマトグラフィ用にカラムを調製した。
【００６５】
濃縮バクテリオファージ・ライセートＰｓＰＣＭ  Ｆ／０００１８のセファロース４Ｂ上の分子ふるい手順で得られる大分子分画を用いることにより内毒素の除去を行った。
【００６６】
セルロースの硫酸化誘導体を含有する基材１ｍｌが入ったクロマトグラフ・カラムにバクテリオファージ混合物０．２ｍｌを移した。分画容積０．２ｍｌを採用した。第一分画は緩衝液Ｉ  ３ｍｌで溶出した。これらの条件下で、結合していない内毒素はカラムから流出された。第二分画は緩衝液ＩＩで溶出した。分画ＩＩは精製バクテリオファージを含んでいた。
【００６７】
分画中の内毒素の単位についての結果
セルロースの硫酸化誘導体を含有する基材上のカラムクロマトグラフィにかけた材料は、１ｍｌ当たり内毒素２５００単位を含んでいた。緩衝液Ｉで溶出した分画は、１ｍｌ当たり内毒素６００〜１０００単位を含み、緩衝液ＩＩで溶出した分画は、内毒素を含まない（１ｍｌ当たり約１単位）バクテリオファージを含んでいた。
【００６８】
バクテリオファージ調製物中の内毒素の含量は、米国、チャールストン所在の、チャールス・リバー・エンドセーフ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ）社のゲル法を用いて測定した。
【００６９】
【表３】
0004723807.tif 000006
【００７０】
【表４−１】
0004723807.tif 000007
【００７１】
【表４−２】
0004723807.tif 000008
【００７２】
【表５】
0004723807.tif 000009
【００７３】
【表６−１】
0004723807.tif 000010
【００７４】
【表６−２】
0004723807.tif 000011
【００７５】
【表７】
0004723807.tif 000012
【００７６】
【表８−１】
0004723807.tif 000013
【００７７】
【表８−２】
0004723807.tif 000014
【００７８】
【表９】
0004723807.tif 000015
【００７９】
【表１０−１】
0004723807.tif 000016
【００８０】
【表１０−２】
0004723807.tif 000017
【００８１】
【表１１】
0004723807.tif 000018
【００８２】
【表１２−１】
0004723807.tif 000019
【００８３】
【表１２−２】
0004723807.tif 000020
【００８４】
【表１３】
0004723807.tif 000021
【００８５】
【表１４−１】
0004723807.tif 000022
【００８６】
【表１４−２】
0004723807.tif 000023
【００８７】
【表１５】
0004723807.tif 000024
【００８８】
【表１６−１】
0004723807.tif 000025
【００８９】
【表１６−２】
0004723807.tif 000026
【００９０】
【表１７】
0004723807.tif 000027
【００９１】
【表１８−１】
0004723807.tif 000028
【００９２】
【表１８−２】
0004723807.tif 000029
【００９３】
【表１９】
0004723807.tif 000030
【００９４】
【表２０−１】
0004723807.tif 000031
【００９５】
【表２０−２】
0004723807.tif 000032
【００９６】
【表２１】
0004723807.tif 000033
【００９７】
【表２２−１】
0004723807.tif 000034
【００９８】
【表２２−２】
0004723807.tif 000035
【００９９】
【表２３】
0004723807.tif 000036
【０１００】
【表２４−１】
0004723807.tif 000037
【０１０１】
【表２４−２】
0004723807.tif 000038
【０１０２】
【表２５】
0004723807.tif 000039
【０１０３】
【表２６−１】
0004723807.tif 000040
【０１０４】
【表２６−２】
0004723807.tif 000041
【０１０５】
【表２７】
0004723807.tif 000042
【０１０６】
【表２８−１】
0004723807.tif 000043
【０１０７】
【表２８−２】
0004723807.tif 000044
【０１０８】
【表２９】
0004723807.tif 000045
【０１０９】
【表３０−１】
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【０１１０】
【表３０−２】
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【０１１１】
【表３１】
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【０１１２】
【表３２−１】
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【０１１３】
【表３２−２】
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【０１１４】
【表３３】
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【０１１５】
【表３４−１】
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【０１１６】
【表３４−２】
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【０１１７】
【表３５】
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【０１１８】
【表３６−１】
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【０１１９】
【表３６−２】
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【０１２０】
【表３７】
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【０１２１】
【表３８−１】
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【０１２２】
【表３８−２】
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【０１２３】
【表３９】
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【０１２４】
【表４０−１】
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【０１２５】
【表４０−２】
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【０１２６】
【表４１】
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【０１２７】
【表４２−１】
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【０１２８】
【表４２−２】
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【０１２９】
【表４３】
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【０１３０】
【表４４−１】
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【０１３１】
【表４４−２】
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【０１３２】
【表４５】
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【０１３３】
【表４６−１】
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【０１３４】
【表４６−２】
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【０１３５】
【表４７】
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【０１３６】
【表４８−１】
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【０１３７】
【表４８−２】
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【０１３８】
【表４９】
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【０１３９】
【表５０−１】
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【０１４０】
【表５０−２】
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【０１４１】
【表５１】
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【０１４２】
【表５２−１】
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【０１４３】
【表５２−２】
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【０１４４】
【表５３】
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【０１４５】
【表５４−１】
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【０１４６】
【表５４−２】
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【０１４７】
【表５５】
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【０１４８】
【表５６−１】
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【０１４９】
【表５６−２】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ファージＳ１〜Ｓ７について得られた統計値の分析結果を示す図である。
【図２】ファージＰ１〜Ｐ２０について得られた統計値の分析結果を示す図である。
【図３】ムコビシドーシス患者から単離したスタフィロコッカス属に属する細菌株に関して選択されたファージ株の有効性についての統計分析の結果を示す図である。
【図４】ムコビシドーシス患者から単離したシュードモナス属に属する細菌株に関して選択されたファージ株の有効性についての統計分析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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