(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（C2GnT3と命名）であって、UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの酵素活性、及び配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項２】
前記UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、配列番号：２の残基３９〜４５３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記核酸はDNAである、請求項１又は２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記DNAはcDNAである、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記DNAはゲノムDNAである、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸から構成される核酸ベクター。
【請求項７】
前記C2GnT3をコードする核酸は転写調節エレメントに操作可能的に連結している、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
前記細胞は前記ベクターによって安定にトランスフェクトされている、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞はUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性を有するC2GnT3を産生する、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞は細菌、酵母、昆虫、鳥類および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞はSf9である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞はCHOである、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸によりコードされるUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（C2GnT3と命名）を製造する方法であって、
（i）宿主細胞に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項６又は７に記載のベクターを導入し、
（ii）宿主細胞をヒトC2GnT3の発現に適当な条件下に増殖させ、
（iii）宿主細胞によって産生されたC2GnT3を単離すること
を含む、上記方法。
【請求項１５】
UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性を有する前記C2GnT3は、
（i）配列番号：2に掲げた配列を有するポリペプチド；
（ii）配列番号：2に掲げたアミノ酸39〜453から構成されるポリペプチド；
（iii）配列番号：2に掲げた少なくともアミノ酸39〜453が第二の配列とインフレームに融合したものからなる融合ポリペプチドであって、該第二の配列は親和性リガンドを含む、融合ポリペプチド；および
（iv）前記N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する上記いずれかの変異体
からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの酵素活性を有する単離されたUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（C2GnT3と命名）ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ポリペプチド。
【請求項１７】
UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性を有し、かつ、配列番号：2の残基３９〜４５３のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１４又は１５に記載の方法によって製造されたポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のC2GnT3に対して特異的な抗体。
【請求項２０】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列又は少なくとも20ヌクレオチドを含むその部分を含むプローブ。
【請求項２１】
細胞フリーまたは細胞ベースのアッセイにおいて、UDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（C2GnT3と命名）の酵素活性を阻害または刺激する能力について1または2種以上の物質をスクリーニングする方法であって、
（i）請求項１６〜１８に記載のC2GnT3ポリペプチドもしくは請求項１５に記載の方法によって産生されるC2GnT3ポリペプチド、または請求項８〜１３のいずれか一項に記載のC2GnT3ポリペプチドを組換えにより発現する細胞を、上記酵素活性の検出に適当なアッセイ条件下に、化合物、組成物、C2GnT3ポリペプチドに対する抗体および抗体フラグメント、アンチセンス配列を有するポリヌクレオチドならびにリボザイムヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選択される物質と接触させ、
（ii）上記酵素活性がそれにより1または2種以上の物質によって阻害または刺激されるか否かを測定すること
を含む、上記方法。
【請求項２２】
1または2種以上の物質はコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドと会合する物質を同定する方法であって、
（i）前記ポリペプチドと会合できる可能性のある少なくとも1種の物質と前記ポリペプチドとを、前記物質と前記ポリペプチドとの間の会合を可能にする条件下で反応させる工程、
（ii）前記物質と会合した前記ポリペプチドを除去または検出する工程であって、会合した前記ポリペプチドと前記物質の検出は前記物質が前記ポリペプチドと会合することを指示する工程
を含む、上記方法。
【請求項２４】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドのUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性を修飾する能力について化合物を検出する方法であって、
（i）既知の濃度の前記ポリペプチドとそのポリペプチドと会合するドナー基質又はアクセプター基質とを含む反応混合物、および試験化合物を、該ドナー基質又はアクセプター基質と前記ポリペプチドの間の複合体形成を可能にする条件下で調製すること、
（ii）既知の濃度の前記ポリペプチドとそのポリペプチドと会合するドナー基質又はアクセプター基質とを含む対照反応混合物を、該ドナー基質又はアクセプター基質と前記ポリペプチドの間の複合体形成を可能にする条件下で調製すること、
（iii）前記複合体の形成を検出し、前記複合体が該対照反応混合物において形成され、かつ該反応混合物において形成されないものであるか否かを評価し、前記複合体が該対照反応混合物において形成され、かつ該反応混合物において形成されない場合は、前記試験化合物が、該ドナー基質又はアクセプター基質と前記ポリペプチドの間の相互作用を妨害し、従って前記ポリペプチドのUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチル-ガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性を修飾する能力を有するものであることを指し示すものである、こと
を含む、上記方法。
【請求項２５】
生物学的サンプル中のUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチルガラクトサミン-α-R β1, 6 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（C2GnT3と命名）ポリペプチドをコードする核酸を検出する方法であって、
（i）請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸を生物学的サンプルの核酸にハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を形成させ、
（ii）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程
を含み、
ハイブリダイゼーション複合体の存在は生物学的サンプル中における前記ポリペプチドをコードする核酸の存在と相関する、
上記方法。
【請求項２６】
生物学的サンプルの核酸はハイブリダイゼーション工程の前にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の酵素的に活性なポリペプチドと活性化されたGlcNAcおよびアクセプターを含む反応混合物を接触させることを含むオリゴサッカライドの製造方法であって、
該アクセプターは、配列Galβ1, 3GalNAcを含む、
上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般的に、遊離オリゴサッカライドとしてまたはタンパク質およびグリコ脂質に共有結合して見出されるグリカンの生合成に関する。さらに詳しくは、本発明はコア1およびコア3型のO-グリカンにおける2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ガラクトサミン（GalNAc）のC6のヒドロキシ基にN-アセチルグルコサミンを付加してコア2およびコア4型を形成するUDP-N-アセチルグルコサミン：N-アセチルガラクトサミン-β1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（コア-β1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）をコードする核酸ファミリーに関する。以前にこのファミリーの2つのメンバーが同定され、C2GnT1およびC2GnT2と命名されている。
【０００２】
本発明はさらに詳しくは、C2GnT3と命名されたO-グリカンβ1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのこのファミリーの第三のメンバーをコードする遺伝子、C2GnT3をコードするDNAに対するプローブ、C2GnT3をコードするDNAを含むDNA構築体、C2GnT3を産生するための組換えプラスミドおよび組換え方法、C2GnT3の発現のために細胞を安定にトランスフォームまたはトランスフェクトする組換え方法、C2GnT3の生物活性を阻害もしくは刺激する能力を有する物質の同定方法、ならびに患者におけるDNA多型の同定方法に関する。それから本出願が優先権を主張する1999年8月24日付出願の米国仮特許出願60/150,488には、この新規なコア2 β6GlcNAc-トランスフェラーゼのアイソフォームが同定され、C2GnTIIと命名されている。C2GnTIIの名称はその化学文献（14）に従ってC2GnT3の名称に改名された。
【０００３】
（発明の背景）
O-連結タンパク質のグリコシル化には、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼのファミリーがセリンまたはスレオニン残基へのN-アセチルガラクトサミンの付加を触媒する最初の段階が包含される（1）。O-グリカン鎖の更なるアッセンブリーには数個の連続したまたは交互の生合成反応が包含される。すなわち、i）UDP-Gal：GalNAcα-R β1, 3Gal-トランスフェラーゼ活性による単純なムチン型コア1構造の形成；ii）UDP-GalNAc：Galβ1, 3GalNAcα-Rβ1, 6Glc NAc-トランスフェラーゼ活性によるコア1の複合型コア2構造への変換；iii）UDP-GlcNAc：GalNAcα β1, 3GlcNAc-トランスフェラーゼ活性による複合ムチン型コア3の直接形成；およびiv） UDP-GlcNAc：GlcNAcβ1, 3GalNAcα-R β1, 6Glc-Nac-トランスフェラーゼ活性によるコア3のコア4への変換である。β-1, 6GlcNAc分枝の形成（反応iiおよびiv）は、分化および悪性形質変換に際して産生される構造を招くO-連結タンパク質グリコシル化の鍵となる制御現象と考えられる（2〜6）。たとえば、O-グリカンにおけるGlcNAcβ1, 6GalNAc分枝形成の増大は、T-細胞活性化時、白血病の発生時、ならびにウイスコット・アルドリッチ症候群およびAIDSのような免疫不全について証明されている（7, 8）。コア2分枝形成は腫瘍の進行および転移において重要な役割を果たしているものと思われる（9）。これに反し、多くの癌では、正常な細胞型に見出される複合型O-グリカンから、T（トムセン・フリードリッチ抗原；Galβ1, 3GalNAcα1-R）, Tn（GalNAcα1-R）, およびシアロシル-Tn（NeuAcα2-6GalNAcα1-R）のような未成熟過程の単純ムチン型O-グリカンへの変化を示している（10）。この分子基盤は乳癌で広範に検討され、この場合コア2 β6GlcNAc-トランスフェラーゼの特異的な下方調整がムチンMUN1上の複合型O-グリカンの観察される欠損に関与する（6）ことが示されている。O-グリカンコアアッセンブリーは、したがってコア-β1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびシアリル-Tおよびシアリル-Tnを形成するシアリルトランスフェラーゼの発現におけるレベルの逆変化によって制御されていると考えられる。
【０００４】
興味あることに、腫瘍の転移の可能性はコア2β6GlcNAc-トランスフェラーゼ活性の発現の増大に相関した（5）。コア2β6GlcNAc-トランスフェラーゼの増加は、シアリル-Lexを有するポリN-アセチルラクトサミン鎖のレベルの増大を伴い、これはセレクチン仲介接着を変化させることによる腫瘍の転移に寄与するものと考えられる（4, 11）。O-グリカンコアアッセンブリーのコントロールは鍵酵素活性の発現によって調整されるが、翻訳後修飾、トポロジー、または基質に対する競合を包含する後生因子もこの過程に関与するものと思われる（11）。
【０００５】
T-細胞の表面炭水化物における変化が発生および活性化時に同定されている。コア2型のO-グリカン分枝は胸腺皮質の未成熟胸腺細胞に限定されるが、成熟髄質胸腺細胞の表面上にはもはや暴露されることはない（17）。T-細胞表面タンパク質上のコア2構造は、胸腺細胞-胸腺上皮相互作用に与るS-型レクチンガレクチン-1に対するリガンドである（18）。
【０００６】
胸腺細胞表面からのコア2構造の消失はガレクチン-1によって仲介される制御されたアポトーシスの本質であることが見出された（19）。
【０００７】
コア2 β6GlcNAc-トランスフェラーゼ活性は１以上の酵素アイソフォームによって維持されている。最初のコア2 β6GlcNAc-トランスフェラーゼアイソフォームは最初、血液細胞の発生および分化に重要な酵素として同定され、白血球型またはL-型（C2GnT-L）と命名された。C2GnT-Lをコードする遺伝子はヒト前骨髄球白血病細胞系HL-60のcDNAライブラリーから発現クローニングによりクローニングされた（13）。この遺伝子は、現在ではC2GnT1と改名されている（14）。C2GnT1配列をヒト発現配列タッグデータベースのBLAST分析のためのプローブとして使用し、第二のコア2 β6GlcNAc-トランスフェラーゼアイソフォームをコードする同種遺伝子が同定され、C2/4GnT（15）およびC2GnT-M（16）と命名された。この遺伝子は、現在ではC2GnT3と改名されている（14）。
【０００８】
C2GnT1は白血球およびリンパ系組織においてコア2セレクチンリガンドの合成を制御すると予測されたが、マウスにおけるC2GnT1の欠損はセレクチンリガンド産生の部分的に低下を示したのみで、リンパ球のホーミング性に有意な変化は認められなかった（Ellies, L． G． ら, 1988, Immunity 9: 881-890）。これらの結果の説明には、一つの可能性として、付加的なコア2β6GlcNAc-トランスフェラーゼの発現が考えられる。C2GnT2はその発現パターンが粘液分泌臓器に限られていること（15, 16）から候補とは思われない。
【０００９】
したがって本技術分野においては、まだ同定されていないUDP-N-アセチルグルコサミン：ガラクトース-β1, 3-N-アセチルガラクトサミン-α-R（GlcNAc−GalNAc）β1,6N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの検出およびこのような酵素をコードする遺伝子の一次構造を同定する必要性がある。本発明は、この必要性に合致するものであり、さらに他の関連する利点を提供する。
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、ヒトUDP-N-アセチルグルコサミン：N-アセチルガラクトサミンβ1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ3（C2GnT3）をコードする単離核酸を、cDNAおよびゲノムDNAを含めて提供する。C2GnT3はC2GnT1に匹敵するアクセプター基質特異性を有する（14）。C2GnT3をコードする完全なヌクレオチド配列は配列番号：1および図１に掲げる。
【００１１】
1または2以上のヌクレオチドにおける変異は、天然の対立遺伝子変異による集団内での個体中に存在することがある。このような核酸変異はそのすべてが本発明の範囲内に包含される。DNA配列の多型も起こる可能性があり、C2GnT3ポリペプチドのアミノ酸配列に変化を招来する。これらのアミノ酸多型も本発明の範囲内に包含される。さらに、種間変異、すなわち異なる種の間に自然に存在するヌクレオチド配列の変異も本発明の範囲に包含される。
【００１２】
コア2 β6GlcNAc-トランスフェラーゼ中、C2GnT3は胸腺においては支配的なアイソフォームであるように思われる（14）。したがって、C2GnT3は胸腺細胞の発生ならびにT-細胞の成熟およびホーミング時に重要な機能を有するものと考えられる（14）。C2GnT3酵素活性を阻害または刺激する能力を有する物質の同定は、したがって、関連する疾患の診断および治療の両目的での可能性を有する。
【００１３】
C2GnT3をコードする遺伝子へのアクセスは、オリゴサッカライド、グリコタンパク質およびグリコスフィンゴ脂質上のコア2ベースO-グリカン修飾の形成に使用するためのグリコシルトランスフェラーゼの製造を可能にする。この酵素はたとえば、特定の酵素的、免疫学的または他の生物学的および／または物理的性質を有する適当にグリコシル化されたグリコ接合体を製造するために、コア2ベースO-グリカンのこれらまたは他の基質への合成付加を要求する医薬または他の商業的応用に使用することができる。
【００１４】
一態様においては、本発明は図１に掲げたヌクレオチド1〜1362のヌクレオチド配列またはその配列保存性もしくは機能保存性変異体を含む単離された核酸を包含する。また、図１に掲げた配列を有する核酸もしくはそのフラグメント、またはその配列保存性もしくは機能保存性変異体とハイブリダイズ可能な単離核酸、好ましくは中程度の緊縮条件下、最も好ましくは高緊縮条件下にC2GnT3配列とハイブリダイズ可能な核酸を提供する。一実施態様においては、DNA配列は図１に示すアミノ酸配列のメチオニン（アミノ酸番号1）からセリン（アミノ酸番号453）までをコードする。他の実施態様においては、DNA配列は図１に掲げるアミノ酸配列のプロリン（アミノ酸番号39）からセリン（アミノ酸番号453）までの配列を含むアミノ酸配列をコードする。
【００１５】
関連した態様においては、本発明はC2GnT3 DNA配列を含む核酸ベクターを提供する。これらにはC2GnT3 DNA配列が、ポリアデニル化配列を伴いまたは伴わないで転写調節エレメントに操作可能的に連結したベクターを包含するが、これらに限定されるものではない。これらのベクターを含む細胞も提供される。細胞は一過性にまたは安定な発現細胞に限定されるものではない。C2GnT3-由来のDNA配列を含むウイルスも、バクテリオファージを含めて提供される。本発明はまた、C2GnT3ポリペプチドの製造方法も包含する。細胞ベースの方法には、それらに限定されるものではないが、宿主細胞にC2GnT3をコードする単離DNA分子またはC2GnT3をコードするDNA配列を含むDNA構築体を導入し、宿主細胞をC2GnT3の発現に適当な条件下に増殖させ、宿主細胞によって産生されたC2GnT3を単離することを含む方法が包含される。新たにC2GnT3の安定な発現を示す宿主細胞を発生させる方法は、宿主細胞にC2GnT3をコードする単離DNA分子もしくは酵素的に活性なそのフラグメント（たとえば、図１に掲げた配列のアミノ酸39〜453を含むポリペプチド）、またはC2GnT3をコードするDNA配列を含むDNA構築体もしくは酵素的に活性なそのフラグメントを導入し、宿主細胞を適当なメジウム中で宿主細胞を選択して増殖させ、C2GnT3を発現する安定にトランスフェクトされた細胞を同定することを含む。安定にトランスフェクトされた細胞は、触媒としてまたは適当なグリコシル化を有するペプチドもしくはタンパク質の組換え製造に使用するC2GnT3酵素の製造に使用できる。たとえば、上述の安定なトランスフェクションによってそれらのグリコシル化パターンが修飾された真核細胞は、正常細胞であれ疾患細胞であれ、またはこのような細胞の成分は、グリコペプチドおよびグリコタンパク質の特異的グリコ型、たとえばワクチンのための免疫原を送達するために使用することができる。
【００１６】
さらに他の態様においては、本発明は単離されたC2GnT3ポリペプチドを提供する。これらにはそれらに限定されるものではないが、図１に掲げた配列を有するポリペプチド、図１に掲げたアミノ酸39〜453の配列を有するポリペプチド、および図１に掲げたアミノ酸少なくとも39〜453が第二の配列とインフレームに融合してなる融合ポリペプチドが包含される。上記第二の配列は、融合タンパク質中のC2GnT3酵素活性の維持に適合性のある任意の配列とすることができる。適当な第二の配列には、それらに限定されるものではないが、親和性リガンドまたは反応性の基を含む配列を包含する。
【００１７】
関連する態様においては、C2GnT3の酵素活性を阻害または刺激する能力を有する物質を同定するための方法が開示される。そのインヒビターまたはスティミュレーターの可能性をスクリーニングするためにC2GnT3を利用するアッセイが本発明に包含される。さらに、そのインヒビターまたはスティミュレーターの構造ベースの設計にC2GnT3を用いる方法も本発明の一態様である。このような設計は、C2GnT3ポリペプチドの三次元構造を決定し、ドナーおよび／またはアクセプター基質の結合部位と思われる三次元構造を分析し、予測される結合部位を導入する分子を合成し、その分子の阻害または刺激活性を定量する各工程を含んだであろう。
【００１８】
本発明の他の態様においては、たとえば患者の血液細胞から単離されたゲノムDNAを用いてC2GnT3遺伝子のコード領域における突然変異をスクリーニングする方法が開示される。一実施態様においては、その方法は、患者からDNAを単離し、そのコードエキソンをPCR増幅し、増幅されたエキソンDNAフラグメントのDNA配列を決定し、ついで疾患に伴うC2GnT3遺伝子の構造的欠損の可能性をそれから確立することを含む。
【００１９】
本発明の一態様によれば、本発明の核酸分子およびポリペプチドの存在を決定することによるC2GnT3仲介状態の診断およびモニタリングのための方法および製品（すなわち、キット）が提供される。
【００２０】
さらにまた、本発明は、本発明のC2GnT3ポリペプチドの生物学的活性を修飾する能力について、試験化合物を評価する方法を提供する。たとえば、C2GnT3ポリペプチドの触媒活性を阻害もしくは増強する物質を評価することができる。「修飾」の語は本発明のポリペプチドの生物学的活性を変化または変更させることを意味する。修飾はポリペプチド活性の上昇もしくは低下、特性の変更または生物学的、機能的もしくは免疫学的性質における任意の他の変化である。
【００２１】
本発明のポリペプチドの生物学的活性を修飾する化合物はまた、本発明の方法を用いて、生物学的サンプル、組織および細胞中の本発明の核酸分子またはポリペプチドの発現パターンおよび発現レベルをその化合物の存在下および不存在下で比較して同定することができる。
【００２２】
本発明の一実施態様においては、本発明のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性について化合物をスクリーニングする方法が提供される。この方法はa）上記ポリペプチドを含有するサンプルを化合物と、上記ポリペプチドのアンタゴニスト活性が検出できる条件下に接触させ、ついでb）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する工程を含む。
【００２３】
C2GnT3核酸調節配列（たとえば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ネガティブモジュレーター配列）と相互作用する化合物または物質（たとえば、ポリペプチド）を同定する方法も意図される。
【００２４】
核酸、ポリペプチド、ならびに本発明の方法を用いて同定される物質および化合物は、本発明のC2GnT3ポリペプチドの生物学的活性を修飾するために使用することが可能であり、それらはC2GnT3によって仲介される状態、たとえば癌を含む増殖性疾患、および胸腺関連障害の処置に使用することができる。したがって、核酸、ポリペプチド、物質および化合物はこれらの状態の1または2以上に罹患している個体に投与するための組成物に製剤化される。それ故、本発明はまた、ポリペプチド、核酸分子または本発明の方法を用いて同定された物質もしくは化合物の1または2以上、および医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物に関する。本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含むこれらの状態を処置または予防するための方法も提供される。
【００２５】
他の態様においては、本発明は、胸腺に向けられた遺伝子ベースの治療薬の製造に必要な手段を提供する。これらの治療薬は、適当なベクター中に配置されるC2GnT3核酸の調節配列を含む本発明の核酸のすべてまたは部分から構成されるポリヌクレオチドの形態とするか、さらにより直接的な方法によって標的細胞に送達される。
【００２６】
新規なC2GnT3およびそれをコードする核酸が提供され、したがって本発明はさらに、オリゴサッカライドの製造方法を提供する。特定の実施態様においては、本発明はドナー基質およびアクセプター基質を含む反応混合物を本発明のC2GnT3の存在下に接触させることによるオリゴサッカライドの製造法に関する。
【００２７】
本発明の更なる態様によれば、科学的研究に関連したインビトロの目的、DNAの合成およびベクターの製造のためにポリペプチドまたは核酸分子を利用する方法が提供される。
【００２８】
本発明のこれらの態様および他の態様は以下の詳細な説明および図面を参照すれば明確になるものと確信する。
【００２９】
（図面の簡単な記載）
図１はC2GnT3遺伝子のDNA配列（受入番号 #AF132035）およびC2GnT3の推定アミノ酸配列を記載する。アミノ酸配列は一文字コードで示す。膜貫通ドメインの候補を示す疎水性セグメントには二重下線を付す。N-グリコシル化の４つのコンセンサスモチーフは星印によって指示する。
【００３０】
図２はヒトC2GnT3（受入番号 #AF132035）、ヒトC2GnT2（以前にはC2/4GnTと命名された；受入番号 #AF038650）、ヒトC2GnT1（以前にはC2GnT-Lと命名された；受入番号 #97347）およびヒトIGnT（受入番号 #Z19550）の例示である。導入されたギャップはハイフンとして示し、アラインされた同一の残基は四角で囲む（全配列同一は黒色で、３つの配列の同一は暗灰色で、2つの配列の同一は明灰色で囲む）。膜貫通ドメインの候補は四角で囲む。保存されたシステインは星印で指示する。１つの保存されたN-グリコシル化部位は白丸で指示する。
【００３１】
図３は、健康なヒト成人および胎児組織のノーザンブロット分析を示す。パネルA：ヒトmRNAマスターブロット（Clontech）についての負荷パターン。列Hにおけるドットは100 ng（H1〜H7）または500 ng（H8）のコントロールDNAまたはRNAを含有する。パネルB：C2GnT3の可溶性発現フラグメントに相当する32P-標識C2GnT3プローブを用いるマスターブロット発現分析のオートラジオグラム（塩基ペア115〜1359）。パネルC：多重ヒト組織ノーザンブロット（Clontech からのMTN II）をパネルBに記載のようにプローブした。
【００３２】
図４は、ヒト血液細胞分画中C2GnT3発現のPCR分析を示す。ヒトC2GnT3（C2GnT3）またはGAPDH（G3PDH）に特異的なプライマーでのPCR増幅は正規化ヒト血液細胞cDNAパネル（ClontechからのMTC）上で31サイクル実施した。
【００３３】
図５は、C2GnT3遺伝子のコードエキソンを増幅するために使用できる順行および逆行PCRプライマーの模式的表示である。プライマーTSHC119およびTSHC123の配列も示す。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用されたすべての特許出願、特許および参考文献は、引用によりその全体が本明細書に導入される。混乱する場合は、定義を含めて本発明の記述が支配する意図である。
【００３５】
定義
1．本明細書に用いられる「核酸」または「ポリヌクレオチド」の語は、任意の長さのプリン-およびピリミジン-含有ポリマー、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシヌクレオチドのいずれかまたは混合ポリリボ-ポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。これには単一鎖または二重鎖分子、すなわちDNA-DNA, DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリド、ならびにアミノ酸骨格に塩基を接合することによって形成される「タンパク質核酸」（PNA）が包含される。これにはまた、修飾塩基を含む核酸も包含される（下記参照）。
【００３６】
2．本明細書において用いられる「相補性DNAまたはcDNA」の語は、mRNA鋳型中に存在する配列から酵素的に合成されたDNA分子もしくは配列、またはこのようなDNA分子のクローンを意味する。「DNA構築体」は、他の場合には天然に存在しない様式で結合または配列したDNAのセグメントを含有するように修飾された一本鎖または二本鎖いずれかのDNA分子またはこのような分子のクローンである。非限定的な例としては、イントロンをもたないcDNAまたはDNAが外来性DNA配列に隣接してまたはその内部に挿入されている。
【００３７】
3．プラスミド、またはより一般的には、ベクターは、宿主細胞中に挿入された場合、その複製のために提供される遺伝子情報を含むDNA構築体である。プラスミドは一般に宿主細胞中で発現される少なくとも1個の遺伝子配列、ならびにこのような遺伝子の発現を促進する配列、たとえばプロモーターおよび転写開始部位を含有する。それは線状であっても、環状分子に閉環していてもよい。
【００３８】
4．核酸は、1個の核酸の少なくとも一本の鎖が所定の緊縮条件下に他の核酸にアニーリングできる場合、互いに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションの緊縮度はたとえばa）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が実施される温度、およびb）ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液のイオン強度と極性（たとえば、ホルムアミド）、ならびに他のパラメーターによって決定される。ハイブリダイゼーションには2つの核酸が実質的に相補性の配列を含有することがハイブリダイゼーションの緊縮度に応じて要求されるが、ミスマッチにも耐えられる。典型的には、高緊縮度（たとえば0．5×SSCの水溶液中、65℃）における2つの配列のハイブリダイゼーションは、配列がそれらの全体の配列にわたってある程度高い相補性を示すことを要求する。中等度の緊縮度（たとえば2×SSCの水溶液中、65℃）および低緊縮度（たとえば2×SSCの水溶液中、55℃）条件はハイブリダイゼーション配列の間に相当する全体的に低い相補性を要求する（1×SSCは0．15 M NaCl, 0．015 M クエン酸Naである）。
【００３９】
5．本明細書において使用される「単離された」核酸またはポリヌクレオチドはその元の環境（たとえば、それが天然に存在するものであれば、その天然環境）から移動される成分を意味する。単離された核酸またはポリヌクレオチドはそれが元来伴っていた細胞性成分を約50％未満、好ましくは約75％未満、さらに好ましくは約90％未満含んでいる。
【００４０】
6．「プローブ」は、標的領域における配列とプローブにおける少なくとも1個の配列の相補性により、標的領域中における配列とハイブリド構造を形成する核酸を意味する。
【００４１】
7．指定された配列に「由来する」核酸は、指定され配列の領域に相当する核酸配列を意味する。これには、その配列に相同または相補性の配列、ならびに「配列保存性変異体」および「機能保存性配列変異体」の配列を包含する。配列保存性変異体とは、与えられたコドン位置における1または2以上のヌクレオチドの変化がその位置にコードされたアミノ酸の変更を生じない変異体である。C2GnT3の機能保存性変異体とは、ポリペプチド中の与えられたアミノ酸残基がネイティブなポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび酵素活性（基質特異性を含む）を変化させることなく変更された変異体であり、これらの変化にはそれらに限定されるものではないが、アミノ酸の類似の物理化学的性質（たとえば、酸性、塩基性、疎水性等）を有するアミノ酸による置換が包含される。
【００４２】
8．「ドナー基質」とは、たとえばコア-β1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによって認識され、トランスフェラーゼ反応のN-アセチルグルコサミニル残基として寄与する分子である。C2GnT3では、ドナー基質はUDP-N-アセチルグルコサミンである。「アクセプター基質」は、たとえばN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにより認識される分子、好ましくはサッカライドまたはオリゴサッカライドであり、トランスフェラーゼによって触媒される修飾の標的、すなわちN-アセチルグルコサミニル残基を受ける標的である。C2GnT3のアクセプター基質には、それらに限定されるものではないが、オリゴサッカライド、グリコタンパク質、O-連結コア-1-グリコペプチド、およびGalβ1, 3GalNAcまたはGlcNAcβ1, 3GalNAc配列を含むグリコスフィンゴ脂質が包含される。
【００４３】
9．本発明によれば、慣用の分子生物学、微生物学、および本技術分野の技能内の組換えDNA技術が使用される。このような技術は文献に完全に説明されている。たとえば、Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd．Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N．Y; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D．N．Glover ed, 1985; Oligonucleotide Synthesis, M．J．Gait ed, 1984; Nucleic Acid Hybridization, B.D．Hames & S.J．Higgins eds, 1985; Transcription and Translation, B.D．Hames & S.J．Higgins eds, 1984; Animal Cell Culture, R．I．Freshney ed, 1986; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; and B．Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984 参照。
【００４４】
10．「配列類似性」または「配列同一性」の語は2またはそれ以上のアミノ酸または核酸配列の間の関係を意味し、配列の比較によって決定される。この関係は「相同」として一般に知られている。本技術分野における同一性は、また、アミノ酸または核酸配列の、その場合に応じてこのような配列の鎖間のマッチによって決定される配列の相関程度を意味する。同一性および類似性はいずれも簡単に計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M．ed, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W．ed, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M．and Griffin, H.G．eds, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, New York, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M．and Devereux, S．eds, M．Stockton Press, New York, 1991）。2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の間における同一性および類似性を測定する現存の方法には多くの方法があり、この両者の語は熟練者には周知である（Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, New York, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M．& Devereux, J．eds, M．Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H．and Lipman, D., SIAM J．Applied Math．48: 1073, 1988）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性を決定する方法はコンピュータープログラムに分類される。2つの配列間における同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラムには、それらに限定されるものではないが、GCGプログラムパッケージ（20）、BLASTP, BLASTNおよびFASTA（21）が包含される。同一性または類似性はDayhoffら（Methods in Enzymology 91: 524- 545, 1983）のアラインメントアルゴリズムを用いても決定することができる。
【００４５】
本発明の核酸は、好ましくは本明細書に引用した好ましいコンピュータープログラムを用いた実質的な配列同一性、たとえば配列番号：1および図１に示す配列と40％, 45％, 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, または90％以上の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％, 96％, 97％, 98％, または99％の配列同一性を有する。
【００４６】
11．本発明のポリペプチドにはまた、本明細書に記載されたC2GnT3ポリペプチドの同族体および／またはそれらの先端切断部も包含される。このような同族体には、そのアミノ酸配列が選ばれたハイブリダイゼーション条件下（とくに緊縮ハイブリダイゼーション条件下におけるハイブリダイゼーション条件についての本明細書の議論参照）においてC2GnT3ポリペプチドを得るために使用したプローブとハイブリダイズする他の種からのC2GnT3ポリペプチド領域のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドが包含される。これらの同族体は一般にC2GnT3ポリペプチドに特徴的な同一の領域を有する。配列番号：2ならびに図１および2に示すアミノ酸配列と、少なくとも40％の同一性もしくは少なくとも60％の類似性、好ましくは少なくとも60〜65％の同一性もしくは少なくとも80〜85％の類似性、さらに好ましくは70〜80％の同一性もしくは少なくとも90〜95％の類似性、最も好ましくは少なくとも95％の同一性もしくは少なくとも99％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドはC2GnT3ポリペプチドの同族体であると推定される。アミノ酸配列類似性または同一性％は本明細書に記載の方法、好ましくは本明細書に記載のコンピュータープログラムを用いて計算される。
【００４７】
C2GnT3の同定およびクローニング
本発明は、UDP-N-アセチルグルコサミン：N-アセチルガラクトサミンβ1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ3（C2GnT3）をコードする単離DNA分子を、ゲノムDNAおよびcDNAを含めて提供する。
【００４８】
C2GnT3はゲノムサーベイ配列（GSS）の分析によって同定され、ヒト包皮線維芽細胞ライブラリーから得られるゲノムクローンに基づいてクローン化された。クローニング戦略は簡単に要約すれば次の通りである。すなわち1）GSSクローンCIT-HSP-2288B17.TF（GSS GenBank 受入番号AQ005888）の単離および配列決定；2）GSS配列情報に由来する、TSHC96およびTSHC101と命名されたオリゴヌクレオチドの合成；3）ゲノムP1クローンGS22597 #844/B1の同定、クローニングおよび配列決定；4）C2GnT3に相当する新規なcDNA配列の同定；5）ヒト胸腺ポリA-mRNAを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により得られるcDNAクローンの確認的配列決定；6）発現構築体の構築；7）Sf9（Spodoptera frugiperda）細胞中C2GnT3をコードするcDNAの発現である。さらに特定すれば、哺乳類UDP-N-アセチルグルコサミン：β-N-アセチルガラクトサミンβ1, 6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼファミリーの新規な第三のメンバーをコードする代表的なDNA分子の単離は以下に記載の次の操作に包含される。
【００４９】
C2/4GnT（C2GnT2）に対するDNA同族体の同定
データベースの検索を、ヒトC2/4GnT（C2GnT2）配列（13）について、The National Center for Biotechnology Information, USAのGSSデータベースでBLASTnおよびtBLASTnアルゴリズムを用いて実施した。BLASTnアルゴリズムは疑義ある遺伝子（同一性≧95％）を表すクローンの同定に使用し、tBLASTnは同一ではないが類似のGSS配列の同定に使用した。50〜90％のヌクレオチド配列同一性を有するGSSは疑義ある配列とは異なるものとみなした。数個の明らかに短い配列モチーフおよび同じ空間にアレンジされたシステイン残基を有する2つのGSSクローンを更なる配列分析のために選択した。
【００５０】
ヒトC2GnT3のクローニング
C2/4GnT（C2GnT2）に対する同族体候補に由来するGSSクローンCIT-HSP- 2288B17.TF（GSS GeneBank受入番号AQ005888）はResearch Genetics Inc, USAから入手した。このクローンの配列決定からC2/4GnT（C2GnT2）に対して有意な配列類似性を有する部分的なオープンリーディングフレームが明らかにされた。ヒトC2GnT-L（C2GnT2）, C2/4GnT（C2GnT2）およびウシ同族体のコード領域が以前に１つのエキソン中に組織化されて見出されている（22, 15）。C2GnT3 GSSから入手できる3'配列は不完全であるが、単一エキソン中に存在するように思われ、オープンリーディングフレームの失われた3'部分が、ゲノムP1クローンの配列決定により得られた。P1クローンは、ヒト包皮ゲノムライブラリー（DuPont Merck Pharmaceutical Co．ヒト包皮線維芽細胞P1ライブラリー）から、プライマーペアTSHC96（5'-GGTTTCACCGTCTCCAACATA-3', 配列番号：3）およびTSHC101（5'-TCGTAAGGCACCTGATACTT-3', 配列番号：6）によるスクリーニングで得られた。
【００５１】
C2GnT3の１つのゲノムクローン、GS22597 #844/ B1はGenome Systems Inc．から入手した。P1ファージからのDNAはGenome Systems Inc．によって推薦されたようにして調製された。C2GnT3 遺伝子の全コード配列はそのクローン中に表れ、自動化シーケンサー（ABI377, Perkin-Elmer）を用いて完全に配列決定された。確認的な配列決定はヒト胸腺ポリA-mRNAからのcDNA上、センスプライマーTSHC99（5'-CGAGGATCCAGAATGAAGATATTCAAATGTTA-3', 配列番号：4）およびアンチセンスプライマーTSHC121（5'-AGCGAATTCTTACTAT CATGATGTGGTAGTG-3', 配列番号：9）でPCR（95℃で10秒間, 31サイクル；55℃で15秒間および68℃で2分30秒間）によって得られたcDNAクローンについて実施した。組成配列はSwiss Institute for Experimental Cancer Research （ISREC）においてTMpred-アルゴリズムによって予測されたII型ドメイン構造を有する453アミノ酸の候補タンパク質をコードする1359塩基ペアのオープンリーディングフレームを含有した（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form．html.）。
【００５２】
C2GnT3の発現
C2GnT3のアミノ酸残基39〜453をコードするように設計された発現構築体は、P1 DNA, ならびにそれぞれBamHIおよびEcoRI制限部位を有するプライマーペア、TSHC100（5'-CGAGGATCCGCAAAAAGACATTTACTTGGTT-3', 配列番号：5）およびTSHC121（5'-AGCGAATTCTTACTATCATGATGTGGTAGTG-3', 配列番号：9）を用いるPCRによって調製した（図２）。PCR産物をpAcGP67A（PharMingen）のBamHIおよびEcoRI部位の間にクローン化し、挿入体を完全に配列決定した。pAcGP67-C2GnT3-solを以前に記載されたようにBaculo- Gold（登録商標）DNA（PharMingen）でコトランスフェクトした（23）。組換えバキュロウイルスは、血清含有メジウム中で増殖させたSf9細胞内で2回連続的に増幅させたのちに得られ、ウイルスの力価は24-ウエル中で酵素活性をモニタリングする滴定により評価した。pAcGP67-C2GnT3-solにSf9-細胞によるトランスフェクションは、非感染細胞または対照構築体で感染させた細胞に比較して、GlcNAc-トランスフェラーゼ活性の著しい上昇を生じた。C2GnT3はO-連結コア1（Galβ1, 3GalNAcα1-R）のジサッカライド誘導体で有意な活性を示した。これに反し、コア3構造（GlcNAcβ1,3GalNAcα1-R）、ラクト-N-ネオテトラオースならびにGlcNAcβ1, 3Gal-Meにはアクセプター基質としての活性は認められず、C2GnT3はコア4GnTおよびIGnT-活性をもたないことを示している。さらに、α-D-GalNAc-1-p-ニトロフェニルで活性は検出することができず、C2GnT3はコア6（GlcNAcβ1,6GalNAcα1-R）を形成しないことが指示された（表1）。酵素活性の基質阻害は20 mMのコア1-p-ニトロフェニルまでのアクセプターの高い濃度では認められなかった。C2GnT3はUDP-GlcNAcに対し厳密なドナー基質特異性を示すが、UDP-GalまたはUDP-GalNAcでは活性は検出できなかった（データは示していない）。
表1：C2GnT3およびC2GnT1の基質特異性

基質                                        C2GnT3a         C2GnT1    
2 mM  10mM    2 mM  10 mM     
nmol/h/mg        nmol/h/mg
β-D-Gal-(1,3)-α-D-GalNAc               6.6    14.3      9.6    19.0
β-D-Gal-(1,3)-α-D-GalNAc-1-p-Nph      18.1    26.1     16.2    23.6
β-D-G1cNAc-(1,3)-α-D-GalNAc-p-Nph     <0.1    <0.1     <0.1    <0.1
α-D-GalNAc-1-p-Nph                      <0.1    <0.1    <0.1    <0.1
D-GalNAc                                 <0.1    <0.1     <0.1    <0.1
Lacto-N-neo-tetraose                     <0.1    <0.1     <0.1    <0.1
β-D-G1cNAc-(1, 3)-β-D-Gal-1-Me         <0.1    <0.1     <0.1    <0.1  
a酵素ソースは感染High Five（登録商標）細胞の部分精製メジウムである（「実験操作」の項参照）。バックグランド値は非感染細胞または関係のない構築体で感染させた細胞での値を差し引いて得られた。bMe: メチル, Nph: ニトロフェニル
【００５３】
対照にはpAcGP67-GalNAc-T3-solを包含させた（24）。カイネティック性はHigh Five（登録商標）細胞に発現した部分精製酵素で測定した。部分精製は、Amberlite IRA-95, DEAE-SephacrylおよびSP-Sepharose上連続クロマトグラフィーにより、ほぼ記載に従い実施した（25; 25）。
【００５４】
ヒト臓器のノーザンブロット分析
50例の健康なヒト成人および胎児臓器（Clontech）からのmRNAを含有するヒトRNAマスターブロットならびにヒト多重組織ノーザンブロット（MTNII, Clontechより）をC2GnT3の可溶性フラグメント（塩基ペア115〜1359）に相当する32P-標識プローブによりプローブした。オートラジオグラフィー分析は、C2GnT3のリンパ系臓器および胃腸管の臓器における卓越した発現と、胸腺に認められる高い転写レベルおよびPBL, リンパ節、胃、膵臓および小腸における低いレベルを示した（図３Aおよび3B）。単一の転写体のサイズは約5.5キロベースであり、これはヒトC2GnT1の３つの転写体の最大転写体サイズ5.4キロベースに相関する（図３C）。C2GnT1の多重転写体は、3'-UTRの長さに影響するポリアデニル化シグナルの異なる使用によって生じることが示唆される（13）。
【００５５】
本発明のC2GnT3酵素はO-グリコシル化能力を発揮することを示し、これはC2GnT3遺伝子がインビボでも正しい／完全なO-グリコシル化に必須であると解釈された。不十分な酵素もしくは酵素の完全な欠損を招くC2GnT3遺伝子における構造的な欠陥は、したがって、正常なC2GnT3遺伝子を有する細胞または生物体にみられるようなO-グリコシル化によってカバーされないタンパク質／ペプチドに細胞または生物体を曝すことになる。構造的欠陥の可能性があるコードエキソンを走査する方法は以下の実施例5に記載する。同様な方法はC2GnT3遺伝子のプロモーター領域を包含する非コード領域における欠陥の特性を明らかにするためにも使用することができた。
【００５６】
DNA, ベクターおよび宿主細胞
本発明の実施に際しては、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学における多くの慣用の技術が使用される。このような技術は周知であり、たとえばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd．Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D．N．Glover ed); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M．J．Gait ed); Nucleic Acid Hybridization, 1985 (Hames & Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames &  Higgins eds); Animal Cell Culture, 1986 (R．I．Freshney ed); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press);  Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J．H．Miller and M．P．Calos eds, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology Vol．154 and Vol．155 (それぞれWu and Grossman およびWu eds); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1987 (Mayer and Waler eds, Academic Press, London); Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.) and Handbook of Experimental Immunology, 1986, Volumes I-IV (Weir and Blackwell eds) に完全に説明されている。
【００５７】
本発明は、図１に掲げたように本明細書に開示された核酸配列のすべてまたは一部を含む単離された核酸フラグメントを包含する。フラグメントは少なくとも長さ約8ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも長さ約12ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも長さ約15〜20ヌクレオチドである。本発明はさらに、2×SSC, 55℃の緊縮条件下図１に掲げた配列にハイブリダイズできる単離された核酸、好ましくは2×SSC, 65℃, 最も好ましくは0.5×SSC, 65℃ でハイブリダイズできる核酸を包含する。
【００５８】
核酸は細胞から直接単離することができる。別法として、化学的に合成した鎖またはゲノム材料のいずれかを鋳型として用い、本発明の核酸をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により製造することができる。PCRに使用されるプライマーは本明細書に提供される配列情報を用いて合成することが可能であり、所望により組換え発現用に与えられたベクターへの導入を容易にするため、さらに適当な新しい制限部位が導入されるように設計することができる。
【００５９】
本発明の核酸には天然のヒト調節配列を隣接配置してもよく、また異種配列たとえばプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'- および 3'-非コード領域等と随伴させることができる。核酸配列また、本技術分野で周知の多くの手段により修飾することができる。このような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、1もしくは2以上の天然に存在するヌクレオチドの同族体による置換、ヌクレオチド間修飾、たとえば非荷電結合による修飾（たとえば、メチル、ホスホネート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）および荷電結合による修飾（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）がある。核酸は1または2以上の付加的に共有結合した残基たとえばタンパク質（たとえばヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）、インターカニュレーター（たとえば、アクリジン、ソラレン等）、キレーター(たとえば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属等)、およびアルキレーターが包含される。核酸はメチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合を形成させることにより誘導体化することができる。さらに、本発明の核酸配列は、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供できる標識によって修飾することができる。標識の例には放射性同位元素、蛍光分子、ビオチン等が包含される。
【００６０】
本発明によれば、有用なプローブは図１に掲げた配列からの全もしくは部分配列またはそれらの配列保存性もしくは機能保存性変異体、またはそれらの相補体から構成され、上述のように標識された長さ少なくとも8ヌクレオチドのプローブ配列を含む。
【００６１】
本発明はまた、開示された配列またはその誘導体もしくはフラグメントを含む核酸ベクターを提供する。プラスミドおよび真菌ベクターを含めて多数のベクターが様々な真核および原核宿主細胞における複製および／または発現のために記載されていて、遺伝子療法ならびに単純なクローニングまたはタンパク質発現に使用することができる。
【００６２】
組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニングもしくは発現のための1もしくは2以上の複製システム、宿主中における選択のための1もしくは2以上のマーカーたとえば抗生物質抵抗性および1もしくは2以上の発現カセットを包含する。挿入されるコード配列は標準方法により合成されるか、天然のソースから単離されるか、またはハイブリド等として調製される。コード配列の転写調節エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列へのリゲーションは既知の方法により達成される。適当な宿主細胞は、エレクトロポレーション、CaCl2仲介DNA取り込み、カビ感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたは他の確立された方法を含む任意の適当な方法により適宜、トランスフォーム／トランスフェクト／インフェクトすることができる。
【００６３】
適当な宿主細胞には、細菌、古細菌、カビ、とくに酵母、ならびに植物および動物細胞、特に、哺乳動物細胞が包含される。とくに興味があるのは、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Neurospora spec., SF9 細胞, C129 細胞, 293 細胞およびCHO細胞, COS細胞, HeLa 細胞、および不死化哺乳動物骨髄およびリンパ細胞系である。好ましい複製システムには、M13, ColE1, 2μ, ARS, SV40, バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス等が包含される。多数の転写開始および停止調節領域が単離され、様々な宿主における異種タンパク質の転写および翻訳における有効性が示されている。これらの領域、単離方法、操作様式等の例は本技術分野において周知である。適当な発現条件下には、宿主細胞は組換えによって産生されるC2GnT3由来ペプチドおよびポリペプチドのソースとして使用することができる。
【００６４】
ベクターはまた、C2GnT3コード部分に操作性に連結された転写調節エレメント（すなわち、プロモーター）を包含するのが有利である。プロモーターには任意にオペレーター部分および／またはリボソーム結合部位を含有する。大腸菌に適合する細菌プロモーターの非限定的な例には、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター；ラクトースプロモーター；トリプトファン（trp）プロモーター；アラビノースBADオペロンプロモーター；ラムダ由来P1プロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位；ならびにtrpおよびlac UV5プロモーターの配列に由来するハイブリドtacプロモーターが包含される。酵母プロモーターの非限定的な例には3-ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター、ガラクトキナーゼ（GAL1）プロモーター、ガラクトエピメラーゼ（GAL10）プロモーター、メタロチオネイン（CUP）プロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）プロモーターが包含される。哺乳動物細胞に適当なプロモーターには、それらに限定されるものではないが、ウイルスプロモーターたとえばシミアンウイルス40（SV40）、サル肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）およびウシパピローマウイルス（BPV）からのプロモーターが包含される。哺乳動物細胞にはまた、ターミネーター配列およびポリA付加配列が要求され、発現を増大させるエンハンサー配列も包含される。遺伝子の増幅を生じる配列も望ましい。さらに、それらに限定されるものではないが細菌、酵母および動物からの組換え産物の分泌を促進する配列、たとえば分泌シグナル配列および／またはプロホルモンプロ領域配列も包含される。これらの配列は本技術分野で周知である。
【００６５】
野生型または変異ポリペプチドをコードする核酸はまた、組換え現象によって細胞中に導入することもできる。たとえば、このような配列を細胞内に導入すると、内因性遺伝子の部位またはその遺伝子に対し実質的な主体性を有する配列に相同組換えが行われる。非相同組換えのような他の組換えに基づく方法、または相同組換えによる内因性遺伝子の欠失を使用することもできる。
【００６６】
本発明の核酸は、たとえば、他の種または関連生物体におけるC2GnT3の検出のプローブとして、およびペプチドまたはポリペプチドの組換え製造用の鋳型として使用される。これらのおよび他の本発明の実施態様は以下に、さらに詳細に記述する。
【００６７】
ポリペプチドおよび抗体
本発明は開示されたDNA配列によってコードされる単離ペプチドおよびポリペプチドを包含する。ペプチドは好ましくは少なくとも5残基の長さを有する。
【００６８】
タンパク質コード配列を含む核酸は、無傷の細胞または細胞を含まない翻訳システム中でポリペプチドの組換え発現に向けて使用することができる。所望により、与えられた宿主生物においてより効率的な発現のために設計された既知の遺伝子コードは、所望のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドの合成に使用できる。このような合成には、ホスホロアミダイト法（26, 27）または他のよく知られた方法を使用することができる。得られたオリゴヌクレオチドは適当なベクターに挿入し、適合性のある宿主生物中で発現させることができる。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、開示された配列の機能保存性変異体を含めて、ネイティブなもしくは異種の生物体または細胞（それらに限定されるものではないがたとえば細菌、カビ、昆虫、植物および哺乳動物細胞を含む）から単離され、タンパク質コード配列は細胞中に導入され、発現される。さらに、ポリペプチドは組換え融合タンパク質の部分として使用できる。
【００７０】
ポリペプチドの精製方法は本技術分野において周知であり、それらに限定されるものではないが、プレパラティブ不連続ゲル電気泳動、等電点電気泳動、HPLC,逆相HPLC, ゲルろ過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、および向流分布が包含される。一部の目的では、組換え体システム内でタンパク質の精製を促進する付加的タグ配列、それらに限定されるものではないが、たとえばポリヒスチジン配列を含むポリペプチドを産生させることが好ましい。ポリペプチドはついで宿主細胞の粗製溶解物から、適当な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーによって精製することができる。別法として、タンパク質またはそれに由来するペプチドに対して産生された抗体を精製試薬として使用することもできる。他の精製方法も可能である。
【００７１】
本発明にはまた、ポリペプチドの誘導体および同族体が包含される。一部の目的では、ペプチドをコードする核酸配列は、機能的に均等な分子を提供する置換、付加または欠失、すなわち機能性変異体に変換することができる。たとえば、その配列内の1または2以上のアミノ酸残基は、他の類似の性質を有するアミノ酸、たとえば陽性に荷電したアミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）；陰性に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）；極性中性アミノ酸；および非極性アミノ酸によって置換することができる。
【００７２】
単離されたポリペプチドは、たとえばリン酸化、硫酸化、アシル化または他のタンパク質修飾によって修飾することができる。それらは、直接または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを提供できる標識、それらに限定されるものではないが、放射性同位元素および蛍光成分を含む標識で修飾することができる。
【００７３】
本発明は、C2GnT3に由来する免疫原成分を特異的に認識する抗体を包含する。このような抗体はC2GnT3の検出および精製のための試薬として使用できる。
【００７４】
本発明によるC2GnT3特異的抗体にはポリクローナルおよびモノクローナル抗体が包含される。抗体は動物宿主にC2GnT3成分による免疫を誘発し、または免疫細胞のインビトロ免疫処置によって形成される。抗体を誘発するために用いられる免疫原成分はヒト細胞から単離されるかまたは組換えシステム中で産生させる。抗体はまた、適当な抗体コードDNAでプログラムされた組換えシステムで製造することもできる。別法として、抗体は精製された重鎖および軽鎖の生化学的再構築によって構築することもできる。抗体にはハイブリド抗体（すなわち2セットの重鎖／軽鎖の組み合わせを含有する。それぞれ異なる抗原を認識する）、キメラ抗体（すなわち、重鎖、軽鎖または両者が融合タンパク質である）、および一価の抗体（すなわち、重鎖／軽鎖複合体が第二の重鎖の定常領域に結合してなる）が包含される。また、抗体のFab'およびF(ab)2を含むFabフラグメントが包含される。上記タイプの抗体および誘導体の製造方法はすべて本技術分野でよく知られている。たとえば、ポリクローナル抗血清の製造および処理技術はMayer & Walker, 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londonに開示されている。
【００７５】
本発明の抗体は標準方法により、それらに限定されるものではないが、プレパラティブディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、HPLC, 逆相HPLC, ゲルろ過、イオン交換および分配クロマトグラフィーおよび向流分布を含む方法により精製することができる。抗体の精製方法は、たとえばin The Art of Antibody Purifi cation, 1989, Amicon Division, W．R．Grace & Co．に開示されている。一般的なタンパク質の精製方法は in Protein Purification : Principles and Practice, R．K．Scopes, Ed, 1987, Springer-Verlag, New York, NY に記載されている。
【００７６】
抗C2GnT3抗体は、標識されていなくても標準方法によって標識されていても、イムノアッセイのベースとして使用することができる。用いられる特定の標識は使用されるイムノアッセイのタイプに依存する。使用できる標識の例には、それらに限定されるものではないが、放射性標識たとえば32P, 125I, 3Hおよび13C；蛍光標識たとえばフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、デンシルおよびウンベリフェロン； 化学ルミネセンスたとえばルシフェラーゼおよび2,3-ジヒドロキシフタラジンジオン；および酵素たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼが包含される。
【００７７】
抗体は既知の方法により、このような標識のタグを付すことができる。たとえば、カップリング剤たとえばアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジン等が抗体に蛍光、化学ルミネセンスまたは酵素標識をタグするために使用することができる。一般的な方法は本技術分野において周知であり、たとえばChan (Ed,), 1987, Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Inc, Orland, FL に記載されている。
【００７８】
本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体の応用
本発明の核酸分子、C2GnT3ポリペプチド、および抗体は、本発明のポリペプチドの発現もしくは活性の変化を伴う状態または本発明の核酸もしくはポリペプチドの修飾を要求する状態、たとえば胸腺関連障害および増殖性障害（たとえば癌）の予後および診断的評価、およびこのような状態の素因を有する対象の同定に使用することができる（下記参照）。本発明の核酸分子およびポリペプチドの検出方法は、ポリペプチドおよび核酸の検出および局在によってこのような状態のモニターに使用することができる。本明細書に記載の方法が、本発明のポリペプチドの発生的発現に関する研究に使用され、したがってそのポリペプチドの役割への更なる洞察を提供できることは本技術分野の熟練者には自明であろう。本発明の適用にはまた、本発明のポリペプチドの生物学的活性を修飾する物質または化合物の同定方法が包含される（下記参照）。本発明のポリペプチドの修飾を要求する状態の処置のためには、それらの物質、化合物、抗体等が使用される(下記参照)。
【００７９】
診断方法
本発明の核酸またはポリペプチドの修飾を要求する状態（たとえば、胸腺関連障害および癌）の診断および予後評価、ならびにこのような状態の素因を有する対象の同定には様々な方法を使用することができる。このような方法では、たとえば本発明の核酸およびそれらのフラグメント、ならびに本発明のポリペプチドに向けられた抗体がそれらのペプチドフラグメントを含めて利用される。とくに核酸および抗体が、（1）C2GnT3突然変異体の存在の検出、または非障害状態に比較してC2GnT3 mRNAの発現上昇もしくは発現低下の検出、またはこのような状態に向けられたある種の状態もしくは感受性を矯正するC2GnT3転写体の別のスプライシング型についての定性的もしくは定量的検出、（2）非障害状態に比較して本発明のポリペプチドのアバンダンスにおける上昇もしくは低下、または障害状態もしくは障害状態への進行を矯正する修飾された（たとえば、完全長より短い）本発明のポリペプチドの存在いずれかの検出に使用される。
【００８０】
本明細書に記載された方法は、本明細書に記載された少なくとも1種の特異的な核酸または抗体を含む予めパッケージされた診断キットを用いて実施され、これらはたとえば、臨床的なセッティングにおいて、患者のスクリーニングおよび診断のために、ならびに障害を発生する素因を示している個体のスクリーニングおよび同定に慣用的に使用される。
【００８１】
核酸ベースの検出技術およびペプチド検出技術は以下に記述する。本発明の方法を用いて分析されるサンプルには、C2GnT3核酸の発現が既知のもしくは疑われるサンプルまたは本発明のポリペプチドを含有するサンプルが包含される。この方法はそれらに限定されるものではないが、細胞培養液中でインキュベートされた細胞の溶解物、細胞から単離された染色体（たとえば、分裂中期染色体のスプレッド）、ゲノムDNA（溶液中またはサザン分析のための固体支持体に結合）、RNA（溶液中またはノーザン分析のための固体支持体に結合）、cDNA（溶液中または固体支持体に結合）、細胞または組織からの抽出液、および生物学的液体たとえば血清、尿、血液およびCSFを含む生物学的サンプルについて実施される。サンプルは患者または培養液に由来する。
【００８２】
本発明の核酸分子の検出方法
本発明の核酸分子は、本技術分野の熟練者に、生物学的材料中における本発明の核酸配列の検出に使用するためのヌクレオチドプローブの構築を可能にする。適当なプローブにはC2GnT3ポリペプチド（配列番号：1参照）の領域からの少なくとも5連続アミノ酸をコードする核酸配列に基づく核酸分子、さらに好ましくは15〜50ヌクレオチド、最も好ましくは15〜30ヌクレオチドに基づく核酸配列を包含する。ヌクレオチドプローブは、適当なシグナルを提供し、十分な半減期を有する放射性標識のような検出可能な物質たとえば32P, 3H, 14C等で標識される。使用できる他の検出可能な物質には、特異的に標識された抗体を認識できる抗体、蛍光化合物、酵素、標識された抗原に特異的な抗体、ルミネセンス化合物が包含される。適当な標識は、検出されるヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションおよび結合率ならびにハイブリダイゼーションに利用できるヌクレオチドの量に関して選択される。標識されたプローブは、Sambrookら, 1989, Molecular Manual (2nded.) に一般的に記載されたように固体支持体たとえばニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜上、核酸にハイブリダイズされる。核酸プローブはC2GnT3遺伝子、好ましくはヒト細胞中C2GnT3遺伝子の検出に使用される。ヌクレオチドプローブはまた、たとえば胸腺関連障害および癌の診断および予後に、ならびにこれら状態の進行のモニタリング、または治療的処置のモニタリングにも使用される。
【００８３】
プローブはC2GnT3遺伝子を検出するハイブリダイゼーション技術に使用することができる。その技術は一般的に、患者または他の細胞性ソースから本発明のプローブにより核酸中の相補性配列にプローブを特異的にアニーリングさせるのに好ましい条件下に得られる核酸 (たとえば組換えDNA分子、クローン化遺伝子) との接触およびインキュベーションが包含される。インキュベーション後、アニーリングしなかった核酸を除去し、プローブにハイブリダイズした核酸が存在すればこれを検出する。
【００８４】
本発明の核酸分子の検出には、増幅方法（たとえば、PCR）を用いる特定の遺伝子配列の増幅、ついで増幅された分子を、本技術分野の熟練者には周知の技術を使用する分析を包含してもよい。適当なプライマーは本技術分野の熟練者にはルーチンに設計することができる。たとえば、プライマーは市販のソフトウエアたとえばOLIGO 4.06 Primer Analysis software（National Bioscience, Plymouth, Minn.）または他の適当なプログラムを用いて、長さ約22〜30ヌクレオチド、GC含量約50%以上を有し、約60℃〜72℃の温度で鋳型にアニーリングするように設計される。
【００８５】
異常たとえば点突然変異、挿入、欠失、および染色体リアレンジメントを含むC2GnT3核酸構造の検出には生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにゲノムDNAを使用する。たとえば直接配列決定、一本鎖コンフォーメーション多型分析、ヘテロ二本鎖分析、変性勾配ゲル電気泳動、化学的ミスマッチ切断およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが利用される。
【００８６】
本技術分野の熟練者には周知のゲノタイピング技術を、C2GnT3遺伝子における突然変異にきわめて近接して存在する多型のタイピングに使用することができる。多型は突然変異を有する可能性がある家族中の個体を同定するために用いられる。多型がC2GnT3遺伝子の突然変異と連鎖不平衡を表す場合には、一般的集団において、突然変異をもつ可能性のある個体のスクリーニングにそれを使用することができる。使用される多型には、制限フラグメント長多型（RFLP）、一塩基多型（SNP）、および単純配列リピート多型（SSLP）が包含される。
【００８７】
本発明のプローブまたはプライマーはRFLPの直接的な同定に使用することができる。本発明のプローブまたはプライマーはさらに、ゲノムクローンたとえばYAC, BAC, PAC, コスミド、ファージまたはプラスミドの単離に使用することができる。クローン中のDNAは、ハイブリダイゼーションまたは配列決定操作を用いて、SSLPをスクリーニングできる。
【００８８】
本明細書に記載のハイブリダイゼーションおよび増幅技術はC2GnT3発現の定性的および定量的態様のアッセイに使用することができる。たとえばC2GnT3を発現することが周知の細胞タイプまたは組織からRNAを単離し、本明細書に記述するハイブリダイゼーション (たとえば、標準ノーザン分析) またはPCR技術を用いて試験する。この技術は正常または異常な別のスプライシングによると思われる転写サイズの差の検出に使用される。これらの技術は、完全長および／または疾患の徴候を表す個体に比較して、正常個体に検出される別のスプライス転写体のレベル間における定量的な差を検出するために使用される。
【００８９】
プライマーおよびプローブは、上述の方法において、インシトゥで、すなわち生検または切除により得られた患者組織の組織切片（固定および／または凍結）に直接使用される。
【００９０】
本発明の任意の核酸分子に由来するオリゴヌクレオチドまたはさらに長いフラグメントはマイクロアッセイにおける標的として使用できる。マイクロアッセイは遺伝子の長いメンバーの発現レベルのモニタリングならびに遺伝子変異体、突然変異および多型の同定を同時に行うために使用される。マイクロアッセイからの情報は、遺伝子機能の決定、障害の遺伝的基盤の理解、障害の素因の同定、障害の処置、障害の診断、ならびに治療剤の開発および活性のモニタリングに使用することができる。
【００９１】
マイクロアッセイのプレパレーション、使用および分析は本技術分野の熟練者にはよく知られている（たとえば、Brennan, T．M.ら, 1955, 米国特許 5,474,796; Schena ら, 1996, Proc．Natl．Acad．Sci．93: 10614-10619; Baldeschweilerら, 1995, PCT 出願WO95/251116; Shalon, D.ら, 1995, PCT出願WO95/35505; Heller, R．A.ら, 1997, Proc．Natl．Acad．Sci．94: 2150-2155; および Heller, M．J.ら, 米国特許 5,605,662 参照）。
【００９２】
ポリペプチドの検出方法
C2GnT3ポリペプチドと特異的に反応する抗体または酵素接合体もしくは標識誘導体のような誘導体は様々な生物学的材料中のC2GnT3ポリペプチドの検出に使用できる。それらは診断または予後診断試薬として使用することが可能であり、それらはC2GnT3ポリペプチドの発現レベルもしくは構造における異常および／またはそのポリペプチドの一時的、組織的、細胞性もしくは細胞下局在の異常の検出に使用できる。抗体はまた、インビトロで、胸腺関連障害または癌に対するそれらの効果を測定するために、治療的可能性のある化合物のスクリーニングに使用することができる。インビトロイムノアッセイはまた、特定の治療剤の評価またはモニタリングに使用できる。
【００９３】
本発明の抗体はまた、C2GnT3ポリペプチドを産生するように遺伝的に操作した細胞におけるC2GnT3ポリペプチドの発現レベルを測定するために、インビトロで使用できる。抗体はまた、特定の細胞現象または病的状態におけるそれらの役割を決定するため、ならびにこのような病的状態の診断および処置のため、サンプル中における本発明のポリペプチドの検出および定量に使用できる。
【００９４】
とくに、本発明の抗体は、たとえば細胞性または細胞下レベルにおける免疫組織化学的分析に、本発明のポリペプチドを検出するため、特定の細胞および組織ならびに特定の細胞下におけるその局在を決定するため、また発現レベルを定量するために使用される。
【００９５】
抗体は、本発明のポリペプチドの抗原決定基および抗体の間の結合相互作用に基づく既知の任意のイムノアッセイに使用することができる。このようなアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（たとえばELISA）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、ヘマグルチニンおよび組織化学試験がある。
【００９６】
光および電子顕微鏡を用いて抗原の局在を決定するための本技術分野において周知の細胞化学的技術は、本発明のポリペプチドを検出するために使用できる。一般に、本発明の抗体は検出可能な物質で標識し、検出可能な物質の存在に基づいて組織および細胞中に局在させる。ポリペプチドの標識には様々な方法が本技術分野で知られている。検出可能な物質の例には、それらに限定されるものではないが以下の物質が包含される。すなわち、放射性同位元素（たとえば、3H, 14C, 35S,125I, 131I）、蛍光標識（たとえば、FITC, ローダミン、ランタニドホスファー）、ルミネセンス標識たとえばルミノール、酵素標識（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチニル基（これは光学的または比色法で検出できるマークを施されたアビジンたとえばストレプトアビジン含有蛍光マーカーまたは酵素活性によって検出できる）、二次レポーター（たとえば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープが包含される。一部の実施態様においては、標識は立体障害の可能性を減らすために様々な長さのスペーサーアームを介して結合される。抗体はまた、電子顕微鏡で容易に可視化できる電子密度の濃い物質たとえばフェリンまたはコロイド状の金にカップリングさせてもよい。
【００９７】
抗体またはサンプルは、細胞、抗体等の固定化が可能な担体または支持体上に固定化することができる。たとえば、担体または支持体はニトロセルロース、ガラス、ポリアクリルアミド、ギャブロおよびマグネタイトとすることができる。支持体材料は、球状（たとえばビーズ）、円筒状（たとえば、試験管もしくはウエルの内部表面またはロッドの外部表面）、または平板（たとえば、シート、テストストリップ）を包含する任意の可能な形状を有する。一次抗原-抗体反応が本発明のポリペプチドに対して特異性を有する二次抗体の導入によって増幅される間接的な方法も使用できる。例としては、本発明のポリペプチドに対して特異性を有する抗体がウサギIgG抗体である場合には、二次抗体は上述のような検出可能な物質で標識されたヤギ抗-γ-グロブリンとすることができる。
【００９８】
放射活性標識が検出可能な物質として用いられる場合は、本発明のポリペプチドはラジオオートグラフィーによって局在を決定することができる。ラジオオートグラフィーの結果は、ラジオオートグラフ中の密度または粒子を各種の光学的方法によって測定または粒子のカウンティングにより定量することができる。
【００９９】
本発明のポリペプチドはまた、上述のようにC2GnT3活性のアッセイによって検出することができる。たとえば、サンプルをアクセプター基質およびドナー基質と、C2GnT3ポリペプチドがドナー基質をアクセプター基質に輸送してドナー基質-アクセプター基質複合体を生成する条件下に反応させる。
【０１００】
物質／化合物の同定または評価方法
本明細書に記載の方法は、C2GnT3ポリペプチドの発現または活性を妨害または増強する物質を含めて、C2GnT3ポリペプチドの発現または生物学的活性を修飾する物質および化合物を同定するために設計される。
【０１０１】
本発明の方法を用いて同定される物質および化合物には、それらに限定されるものではないが、ペプチド、たとえば可溶性ペプチドたとえばIg-テール融合ペプチド、D-および／またはL-コンフィギュレーションのアミノ酸から作成したランダムペプチドライブラリーおよびコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバー、ホスホペプチド（ランダムまたは部分分解の、指示されたホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む）、抗体 [たとえば、ポリクローナル、モノクローナル、人化、抗-イディオタイプ、キメラ、一本鎖抗体、フラグメント（たとえばFab, F (ab)2 および Fab 発現ライブラリーフラグメント、ならびにそれらのエピトープ結合フラグメント）]、ポリペプチド、核酸、炭水化物、および小有機または無機分子が包含される。物質または化合物は内因性の生理学的化合物でも、また天然もしくは合成化合物でもよい。
【０１０２】
C2GnT3ポリペプチドを修飾する物質は、C2GnT3ポリペプチドと会合するそれらの能力に基づいて同定することができる。したがって本発明はまた、C2GnT3ポリペプチドと会合する物質を同定する方法を提供する。本発明の方法を用いて同定された物質は、慣用技術により単離され、クローン化され、配列決定される。本発明のポリペプチドと会合する物質は、本発明のポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１０３】
「アゴニスト」の語はポリペプチドの量を増加させるか、またはポリペプチド活性の持続を延長する分子を意味する。「アンタゴニスト」の語は、ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を低下させる分子を意味する。アゴニストおよびアンタゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、または本発明のポリペプチドと会合する任意の他の分子が包含される。
【０１０４】
C2GnT3ポリペプチドと会合できる物質は、C2GnT3ポリペプチドを、C2GnT3ポリペプチドと会合する可能性のある試験物質と、会合可能な条件下で反応させて同定し、会合したC2GnT3ポリペプチドおよび物質を除去および／または検出する。物質-ポリペプチド複合体、遊離の物質、または非複合ポリペプチドはアッセイされる。物質-ポリペプチド複合体の形成を可能にする条件は、たとえば物質およびポリペプチドの性質および量のようなファクターに関して選択される。
【０１０５】
物質-ポリペプチド複合体、遊離物質または非複合ポリペプチドは、慣用の単離方法たとえば塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲルろ過、分画化、吸着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはこれらの組み合わせによって単離される。成分のアッセイを容易にするためには、本発明のポリペプチドもしくは物質に対する抗体、標識ポリペプチド、または標識物質が利用される。抗体、ポリペプチドまたは物質は、上述のように検出可能な物質によって標識することができる。
【０１０６】
C2GnT3ポリペプチド、または本発明の方法に使用される物質は不溶化することができる。たとえばポリペプチドまたは物質を適当な担体、たとえばアガロース、セルロース、デキストラン、Sephadex, Sepharose, カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ろ紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン-メチルビニル-エーテル-マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルク等に結合させることができる。担体は任意の形状たとえばチューブ、試験プレート、ビーズ、ディスク、球等とすることができる。不溶化ポリペプチドまたは物質は、その材料を適当な不溶性担体と、既知の化学的または物理学的方法たとえばシアノーゲンブロミドカップリングにより調製することができる。
【０１０７】
本発明はまた、化合物を、本発明のポリペプチドの生物学的活性を修飾する能力について、そのポリペプチドとそのポリペプチドと相互作用する物質（たとえば、ドナーもしくはアクセプター基質またはそれらの部分）との会合のアゴニストまたはアンタゴニスト（すなわち、エンハンサーまたはインヒビター）についてアッセイすることによって、評価する方法を意図する。化合物が本発明のポリペプチドおよびそのポリペプチドと会合する物質の会合におけるアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを評価する基本的方法では、物質-ポリペプチド複合体の形成を可能にする条件下、試験化合物の存在下に、ポリペプチドおよび物質を含有する反応混合物を調製する。試験化合物は混合物中に最初に添加してもよく、またポリペプチドと物質の添加後に加えてもよい。試験化合物を含まないかまたはプラセボを含む対照反応混合物も調製する。複合体の形成を検出し、対照反応においては、複合体は形成されるが反応混合物中では形成されない場合には、試験化合物がポリペプチドおよび物質の相互作用を妨害することを指示する。反応は液相で、またはポリペプチド、物質もしくは試験化合物を上述のように固定化して実施することができる。
【０１０８】
本発明の方法を用いてアッセイすることができるアゴニストおよびアンタゴニスト、すなわちインヒビターおよびエンハンサーは、1または2以上のポリペプチドまたは物質の相互作用部位、たとえば、アゴニスト結合部位、競合的アンタゴニスト結合部位、非競合的アンタゴニスト結合部位またはアロステリック部位に作用するものと考えられる。
【０１０９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドとポリペプチドと会合できる物質との相互作用のアゴニストの効果を阻害するアンタゴニストのスクリーニングを可能にする。したがって本発明は、本発明のポリペプチドと同じ相互作用部位で競合する化合物のアッセイに使用することができる。
【０１１０】
本発明のC2GnT3ポリペプチドを修飾する物質は、C2GnT3ポリペプチド活性の妨害または増強するそれらの能力に基づいて同定することができる。したがって本発明は、（a）C2GnT3ポリペプチドに対するアクセプター基質およびドナー基質を試験物質の存在下に反応させ、（b）アクセプター基質に輸送されたドナー基質の量を測定し、ついで（c）工程（a）および（b）を、試験化合物の不存在下に行い、物質がC2GnT3ポリペプチドによるアクセプターへの糖ドナーの輸送を妨害または増強するか否かを測定することを含む、C2GnT3ポリペプチドの活性を修飾するその能力について化合物を評価する方法を提供する。
【０１１１】
本発明の方法に使用するのに適当なアクセプター基質はサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、ポリペプチド、グリコポリペプチドまたはグリコ脂質であり、還元末端においてリンカーにより合成されるか天然に存在する構造のいずれか、たとえばアシアロ-ガラクト-フェツイングリコペプチドである。アクセプターは一般的に、β-D-ガラクトシル-1,3-N-アセチル-D-ガラクトサミニル-を含む。
【０１１２】
ドナー基質は、ヌクレオチド糖、ドリコール-ホスフェート糖またはドリコール-ピロホスフェート-オリゴサッカライド、たとえばウリジンジホスホ-N-アセチルグルコサミン（UDP- GlcNAc）またはその誘導体もしくは同族体である。C2GnT3ポリペプチドは天然のソースから得られるか、または上述のように組換え法を用いて製造される。
【０１１３】
アクセプターまたはドナー基質は上述のように、検出可能な物質で標識し、本発明のポリペプチドとアクセプターおよびドナーの相互作用を検出可能な変化とすることができる。検出可能な変化は、分光光度法、光学的方法、放射性測定方法、電位測定方法等で検出される。本発明のC2GnT3ポリペプチドの活性はまた、HPLCに基づく方法（Koendermanら, FEBS Lett．222: 42, 1987）または疎水性アグリコンに結合した合成オリゴサッカライドアクセプターを用いる方法（Palcicら, Glycoconjugate 5: 49, 1988; およびPierceら, Biochem．Biophys．Res．Comm．146: 679, 1987）により測定することもできる。
【０１１４】
C2GnT3ポリペプチドはアクセプターおよびドナー基質と、一方の成分が標識されているドナーからアクセプターにポリペプチドを輸送し、検出可能な変化を生じるのに効果的なpHおよび温度で反応させる。アクセプターおよびドナーをポリペプチドに効果的なpH範囲内のpHに維持するためには緩衝液の使用が好ましい。緩衝液、アクセプターおよびドナーはアッセイ組成物として使用することができる。他の化合物たとえばEDTAおよび界面活性剤をアッセイ組成物に添加することもできる。
【０１１５】
C2GnT3ポリペプチドを修飾する化合物を評価する本発明の方法を適用するために適当な試薬は、適当な容器にパッケージして必要な材料を提供する慣用のキットにパッケージすることができる。キットには、本発明の方法を実施するために有用な適当な支持体を包含させることもできる。
【０１１６】
C2GnT3ポリペプチドを修飾する物質はまた、そのポリペプチドを発現する固定化細胞を試験物質で処置し、細胞の形態をその物質の不存在下における細胞の形態および／またはそのポリペプチドを発現しない不死化細胞の形態と比較して同定することもできる。使用できる不死化細胞の例には、肺の上皮細胞系たとえば本発明の核酸を含有するベクターでトランスフェクトしたMvlLuまたはHEK 293（ヒト胚腎臓）が包含される。インヒビターの不存在下に、細胞は形態学的トランスフォーメーションの徴候（たとえば、線維芽細胞様形態、紡錘状形態および積載形態；細胞の下層への接着性の低下；単層培養における細胞と細胞の接触の低下；生存および増殖のための成長因子要求の低下；細胞は他の半固体メジウムの軟質アガール中で生育する；接触阻害の欠損および低血清高密度培養液中でのアポトーシスの増大；細胞運動性の上昇、および細胞外マトリックスへの侵入およびプロテアーゼの分泌）を示す。1または2以上の表現型を阻害する物質はインヒビターと考えることができる。
【０１１７】
C2GnT3ポリペプチドを阻害する物質は、そのポリペプチドを発現する細胞を試験物質で処置し、細胞に伴う複合体コア2ベースのO-連結構造（たとえば、反復Gal-[β]1-4GlcNAc [β]）をアッセイすることにより同定することができる。複合体コア2-ベースのO-連結構造は、その構造に結合する物質（たとえば抗体）を用いてアッセイすることができる。その物質で処置されたことがない細胞またはそのポリペプチドを発現しない細胞を対照として使用する。
【０１１８】
C2GnT3遺伝子の転写または翻訳を阻害する物質は、本発明の組換え分子たとえばレポーター遺伝子を含む発現ベクターで、試験物質の存在下に細胞をトランスフェクトし、C2GnT3ポリペプチドの発現レベル、またはレポーター遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現レベルを、その物質の存在しない核酸分子でトランスフェクトした対照細胞と比較することによって同定される。この方法は、C2GnT3遺伝子の転写および翻訳インヒビターの同定にも使用できる。
【０１１９】
組成物および処置
本明細書に記載した方法によって同定された物質または化合物、本発明のポリペプチド、核酸分子、および抗体はC2GnT3ポリペプチドの生物学的活性の修飾に使用することが可能であり、それらはC2GnT3ポリペプチドにより仲介される状態の処置に使用できる。とくに、それらはT-細胞の発生およびリンパ球ホーミングに使用することが可能で、また、胸腺関連障害の予防および処置に使用することができる。
【０１２０】
したがって、本発明は哺乳動物とくにヒトにおける様々な胸腺関連障害の診断および処置に有用である。このような障害には、以下の障害：腫瘍および癌、低血圧症、高血圧症、アトロフィー、胸腺肥大等が包含される。他の障害には、T-リンパ球の選択または活性の調節不全が包含され、またそれらに限定されるものではないが、自己免疫が関係する障害、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、敗血症、創傷治癒、作用における急性または慢性化、細胞性免疫、体液性免疫、TH1/TH2の不均衡等が包含される。
【０１２１】
本明細書に記載された方法で同定される物質または化合物、本発明の抗体、ポリペプチドおよび核酸分子は、腫瘍の予防および処置に有用である。腫瘍の転移は循環癌細胞の接着阻害によって阻害または防止される。本発明の物質、化合物等は、新生物の様々な形態、たとえば白血病、リンパ腫、メラノーマ、腺腫、肉腫および患者における固体組織の癌腫の処置にとくに有用である。とくに組成物は、悪性メラノーマ、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓、腎臓、胃、肺、直腸、乳房、大腸、胃、甲状腺、頸部、唾液腺、胆管、骨盤、縦隔膜、尿道、気管支原性、膀胱、食道および結腸の癌、後天性免疫不全症候群（AIDS）を有するHIV-感染患者に伴う癌の形態であるカポジ肉腫の処置に使用することができる。物質等は免疫系および胸腺の腫瘍およびこれらの腫瘍に由来する転移の防止および処置にとくに有用である。
【０１２２】
本明細書に記載された方法によって同定される物質または化合物、本発明の抗体、ポリペプチドまたは核酸分子は、T-細胞の活性化およびウイスコット・アルドリッチ症候群もしくはAIDSによる免疫不全の修飾、造血前駆細胞の成育の刺激、および／または患者の化学療法および放射線療法に対する保護の付与に使用することができる。
【０１２３】
したがって、物質、抗体および化合物はインビボにおける投与に適当な生物学的に適合性のある形態で患者に投与するための医薬組成物に製剤化される。インビボにおける投与に適当な生物学的に適合性があるの語は治療的効果がその価値において毒性作用に優ることを意味する。物質はヒトおよび動物を含む生存生物に投与される。本発明の医薬組成物の治療的に活性な量の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量および必要な期間で有効な量と定義される。たとえば、物質の治療的に活性な量は、疾患の状態、個体の年齢、性別および体重、ならびに個体に所望の応答を誘発する抗体の能力によって変動する。投与基準は至適治療応答を提供するように調整される。たとえば、1日数回に分割した用量を投与するか、または治療状況の要求によって指示されるように比較的、用量を減らしてもよい。
【０１２４】
活性物質は便利な方法により、たとえば注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮的適用、直腸内投与により投与される。投与経路に依存して、活性物質は、その化合物を不活性化する酵素、酸および他の天然条件から保護する材料でコートしてもよい。
【０１２５】
本明細書に記載の組成物は、患者に投与することができる医薬的に許容される組成物の製造にそれ自体既知の方法により、活性物質の有効量が医薬的に許容されるビヒクルと混合物中に混合されるように製造される。適当なビヒクルは、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA, 1985) に記載されている。このベースに基づき、組成物にはそれらに限定されるものではないが、物質または化合物を1または2以上の医薬的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と配合し、適当なpHを有し、生理学的液体と等張性にする緩衝溶液中に含有する溶液が包含される。
【０１２６】
医薬組成物が調製されたならば、それらを適当な容器に入れ、指示される状態の処置に関するラベルを付す。本発明のポリペプチドのインヒビターを投与するためには、このようなラベルに投与量、投与の頻度および投与様式を記載する。
【０１２７】
C2GnT3ポリペプチドもしくはその任意のフラグメントをコードする核酸、またはアンチセンス配列は、治療目的で使用することができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に対するアンチセンスは、ポリペプチドの合成を遮断する状況を作成する。とくに、細胞はC2GnT3ポリペプチドをコードする核酸分子に相補性の配列でトランスフォームされる。すなわち、アンチセンス配列はC2GnT3活性の修飾または遺伝子機能の調節のために使用される。センスまたはアンチセンスオリゴマーまたはより長いフラグメントは本発明のポリペプチドをコードする配列のコード領域または調節領域に沿う様々な位置から設計することができる。
【０１２８】
発現ベクターは、核酸配列を標的臓器、組織または細胞に送達させるための、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスもしくはワクシニアウイルスまたは各種細菌プラスミドから誘導することができる。C2GnT3ポリペプチドのアンチセンス核酸配列を発現するベクターは、本技術分野の熟練者には周知の技術を用いて構築することができる（たとえば、Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y．参照）。
【０１２９】
C2GnT3ポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子またはそのフラグメントを高レベルで発現する発現ベクターで細胞または組織をトランスフォームすることによって産生させることができる。このような構築体は細胞中に翻訳されないセンスまたはアンチセンス配列を導入するために使用できる。それらはDNAにインテグレートされなくても、ベクターはすべてのコピーが内因性ヌクレアーゼにより無力化されるまでRNA分子の転写を続ける。一過性の発現は、非複製ベクターによりまたは適当な複製エレメントがベクターシステムの部分であれば長時間（たとえば、1カ月またはそれ以上）持続する。
【０１３０】
遺伝子発現の修飾は、C2GnT3ポリペプチド遺伝子のコントロール領域すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンに対しアンチセンス分子、DNA, RNA または PNAを設計することにより達成される。好ましくは、アンチセンス分子は翻訳開始部位（たとえば、開始部位から位置−10と+10の間）から誘導されるオリゴヌクレオチドである。阻害はまた、トリプル-ヘリックス塩基ペアリング技術を用いても達成することができる。トリプルヘリックスは、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に開くダブルヘリックスの能力の阻害を生じる（Gee J Eら, 1994, In: Huber, B．E．& B．I．Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt．Kisco, N．Y．参照）。
【０１３１】
リボザイム、酵素性のRNA分子は、RNAの特異的な切断を触媒させるために使用する。リボザイムの作用にはリボザイム分子の相補性標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーション、ついでエンドヌクレオティックな切断を包含する。たとえば、ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明のポリペプチドをコードする配列のエンドヌクレオティックな切断を特異的かつ効率的に触媒するように操作することができる。
【０１３２】
RNA標的内の特異的リボソーム切断部位は、まず以下の配列すなわち、GUA, GUUおよびGUCを包含するリボザイム切断部位の標的分子を走査することにより同定される。標的遺伝子の切断部位の領域に相当する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを操作不能にする二次構造的特徴について評価する。標的候補の適性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する影響の受けやすさを試験することによって評価される。
【０１３３】
治療効果および毒性は、細胞培養または動物実験により、たとえばED50（50％の集団における治療有効用量）またはLD50（50％の集団における致死用量）を統計的に計算する標準の医薬的手続で決定することができる。治療係数は治療対毒性作用の用量比であり、ED50／LD50比として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。
【０１３４】
本発明はまたC2GnT3ポリペプチドの機能を研究する方法を提供する。C2Gn T3ポリペプチドの発現を欠くかまたはC2GnT3の発現を部分的に欠く細胞、組織および非ヒト動物は、C2GnT3遺伝子に特異的な欠失または挿入突然変異を有する本発明の組換え発現ベクターを用いて発生させることができる。組換え発現ベクターは、相同組換えによって内因性遺伝子を不活性化または変化させるために使用し、これによりC2GnT3欠損細胞、組織または動物が創製される。
【０１３５】
ヌル対立遺伝子は、胚性幹細胞のような細胞に欠失突然変異により発生させることができる。組換えC2GnT3遺伝子も、C2GnT3を不活性化する挿入突然変異を含むように操作することができる。このような構築体をついで、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インジェクション等の技術で、たとえば胚性幹細胞のような細胞に導入する。無傷のC2GnT3遺伝子を欠く細胞をついで、たとえばサザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたは本明細書に記載の方法を用いて本発明のポリペプチドの発現をアッセイすることにより同定することができる。このような細胞はついで、C2GnT3が欠損したトランスジェニック非ヒト動物の発生に使用される。突然変異の生殖細胞系への伝達は、たとえば胚性幹細胞を初期胚たとえば8細胞胚とインビトロで集合させることにより達成される。すなわち、得られた胚盤胞をレシピエントの雌に輸送し、得られた集合キメラの生殖細胞系伝達を行わせる。このような突然変異動物は、通常C2GnT3の発現に依存して、特異的な細胞集団、発生学的パターンおよびインビボ過程を定義するために使用される。
【０１３６】
本発明はしたがって、その全生殖細胞および体細胞は、C2GnT3ポリペプチドをコードする遺伝子が不活性化または変化した組換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。さらに本発明は、本発明のC2GnT3ポリペプチドを発現しないトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０１３７】
トランスジェニック非ヒト動物には、それらに限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ミクロブタ、ブタ、イヌ、ネコ、および非ヒト霊長類、好ましくはマウスが包含される。
【０１３８】
本発明はまた、C2GnT3ポリペプチド関連病態を軽減または阻害する物質を試験するためのモデルシステムを提供するトランスジェニック非ヒト動物アッセイシステムに関し、それは（a）その物質を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与し、（b）その物質を投与しなかった工程（a）のトランスジェニック非ヒト動物に比べてその物質がトランスジェニック非ヒト動物における病態を軽減または阻害したか否かを決定する。
【０１３９】
その物質は、本明細書に記載の障害および状態の処置に有用である。その物質はまた、本明細書に記載の医薬組成物中に添加することができる。
【０１４０】
本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドを発現する細胞の生存、成長、移動および／または分化を支持するために使用することができる。したがって、本発明のポリペプチドは、たとえば培養液中の細胞を支持するための補助剤として使用することができる。
【０１４１】
オリゴサッカライドの製造方法
本発明は、活性化されたドナー基質たとえばGlcNAcおよびアクセプター基質を含む反応混合物を本発明のポリペプチドの存在下に接触させることを含むオリゴサッカライドの製造方法に関する。
【０１４２】
オリゴサッカライドの製造方法に使用されるアクセプター基質の例には、サッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、グリコペプチド、グリコポリペプチド、または還元末端にリンカーで合成されるかもしくは天然に存在する構造のグリコ脂質、たとえばアシアロ-アガラクト-フェチュイングリコペプチドがある。活性化されたドナー基質は好ましくは、ヌクレオチド糖の部分であってもよいGlcNAc、又はドリコール-ホスフェート糖、若しくはドリコール-ピロホスフェートオリゴサッカライドである。
【０１４３】
本発明の実施態様においては、オリゴサッカライドは動物とくにヒトに対して非毒性な担体たとえばリピドイソプレノイドまたはポリイソプレノイドアルコール上で製造される。適当な担体の例はドリコールホスフェートである。オリゴサッカライドは、リピド担体からオリゴサッカライドの化学的除去が可能な不安定な結合を介して担体に結合させてもよい。別法では、オリゴサッカライドトランスフェラーゼを使用して、オリゴサッカライドをリピド担体からポリペプチドに輸送させることもできる。
【０１４４】
（実施例）
以下の実施例は本発明をさらに詳細に例示する意図であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１４５】
実施例１
A：GSSデータベース配列情報の分析によるC2GnT3に対するcDNA同族体の同定
データベースの検索は、ヒトC2/4GnT（C2GnT2）配列のコード配列について、The National Center for Biotechnology Information, USAのGSSデータベースに対するBLASTnおよびtBLASTnアルゴリズムを用いて実施した。BLASTnアルゴリズムは疑義ある遺伝子（同一性≧95％）を表すGSSの同定に使用し、tBLASTnは同一でないが、類似のGSS配列の同定に使用した。50〜90％のヌクレオチド配列同一性を有するGSSは、疑義ある配列とは異なるものとみなした。2つのGSSについて配列情報の複合は承認され、ヒトC2/4GnT（C2GnT2）配列に対する配列類似性を分析した。
【０１４６】
Ｂ：C2GnT3のクローニングおよび配列決定
C2/4GnT（C2GnT2）に対する同族体候補に由来するGSSクローンCIT-HSP- 2288B17.TF（GSS GeneBank受入番号AQ005888）はResearch Genetics Inc, USAから入手した。このクローンの配列決定からC2/4GnT（C2GnT2）に対して有意な配列類似性を有する部分的なオープンリーディングフレームが明らかにされた。ヒトC2GnT-L（C2GnT2）, C2/4GnT（C2GnT2）およびウシ同族体のコード領域が以前に１つのエキソン中に組織化されて見出されている（22, 15）。C2GnT3 GSSから入手できる3'配列は不完全であるが、単一エキソン中に存在するように思われ、オープンリーディングフレームの失われた3'部分が、ゲノムP1クローンの配列決定により得られた。P1クローンは、ヒト包皮ゲノムP1ライブラリー（DuPont Merck Pharmaceutical Co．ヒト包皮線維芽細胞P1ライブラリー）から、プライマーペアTSHC96（5'-GGTTTCACCGTCTCCAACATA-3', 配列番号：3）およびTSHC101（5'-TCGTAAGGCACCTGATACTT-3', 配列番号：6）によるスクリーニングで得られた。C2GnT3の１つのゲノムクローン、GS22597 #844/ B1はGenome Systems Inc., USA から入手した。P1ファージからのDNAはGenome Systems Inc．によって推薦されたようにして調製した。C2GnT3 遺伝子の全コード配列はそのクローン中に表れ、自動化シーケンサー（ABI377, Perkin-Elmer）を用いて完全に配列決定された。確認的な配列決定はヒト胸腺ポリA-mRNAからcDNA上センスプライマーTSHC99（5'-CGAG GATCCAGAATGAAGATATTCAAATGTTA-3', 配列番号：4）およびアンチセンスプライマーTSHC121（5'-AGCGAATTCTTACTATCATGATGTGGTAGTG-3', 配列番号：9）でPCR（95℃, 10秒間, 31サイクル；55で℃, 15秒間および68℃, 2分30秒間）によって得られたcDNAクローン上で実施した。組成配列はSwiss Institute for Experimental Cancer Research （ISREC）においてTMpred-アルゴリズムによって予測されたII型ドメイン構造を有する453アミノ酸の推定タンパク質をコードする1359塩基ペアのオープンリーディングフレームを含有した（http:// www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form．html.）。
【０１４７】
実施例２
Ａ：  Sf9細胞中C2GnT3の発現
C2GnT3のアミノ酸残基39〜453をコードするように設計された発現構築体は、P1 DNA, ならびにそれぞれBamHIおよびEcoRI制限部位を有するプライマーペア、TSHC100（5'-CGAGGATCCGCAAAAAGACATTTACTTGGTT-3', 配列番号：5）およびTSHC121（5'-AGCGAATTCTTACTATCATGATGTGGTAGTG-3', 配列番号：9）を用いるPCRによって調製した（図２）。PCR産物をpAcGP67A（PharMingen）のBamHIおよびEcoRI部位の間にクローン化し、挿入体を完全に配列決定した。pAcGP67-C2GnT3-solを以前に記載されたようにBaculo- Gold（登録商標）DNA（PharMingen）でコトランスフェクトした（23）。組換えバキュロウイルスは、血清含有メジウム中で増殖させたSf9-細胞内で2回連続的に増幅させたのちに得られ、ウイルスの力価は24-ウエル中プレートで酵素活性をモニタリングする滴定により評価した。pAcGP67-C2GnT3-solによるSf9-細胞のトランスフェクションは、非感染細胞または対照構築体で感染させた細胞に比較して、GlcNAc-トランスフェラーゼ活性の著しい上昇を生じた。
【０１４８】
B：C2GnT3活性の分析
100 mM MES (pH 6.5), 0.1％ Nonidet P-40, 150μL UDP-[14C]-GlcNAc (2,000 cpm/nmol) (Amersham Pharmacia Biotech) および指示された濃度のアクセプター基質（Sigma and Toronto Research Laboratories Ltd., 構造については表１参照）を含有する反応混合物 50μL 中、感染細胞からの培養上清を用いて標準アッセイを実施した。反応産物は、Dow AG1-X8上クロマトグラフィーによって定量した。
【０１４９】
実施例３
C2GnT3の制限臓器発現パターン
発現分析には、ヒトRNAマスターブロット（Clontech）を使用した。可溶性C2GnT3のcDNA-フラグメントをハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。プローブは [α32P]dATPおよびStrip-EZ DNA標識キット（Ambion）を用いてランダムプライマー標識した。製造業者（Clontech）のプロトコールに従い、膜を65℃で6時間プローブし、それぞれ65℃, 2×SSC, 1％ SDSで20分間5回およびそれぞれ55℃, 0.1×SSC, 0.5％ SDSで20分間2回洗浄した。ヒト多重組織ノーザンブロットMTN II（Clontech）は記載（24）のようにプローブし、それぞれ室温, 2×SSC, 0.1％ SDSで10分間2回；それぞれ55℃, 1×SSC, 0.1％ SDSで10分間2回；55℃, 0.1×SSC, 0.1％ SDSで10分間1回洗浄した。
【０１５０】
実施例４
末梢血液単核球におけるC2GnT3遺伝子発現の分析
休止および活性化ヒト血液細胞分画におけるC2GnT3発現のPCR分析は、プライマーペアTSHC118（5'-GAGTCAGTGTGGAATTGAATAC-3', 配列番号：7）およびTSHC126（5'-CAACAGTCTCCTCAACCCTG-3', 配列番号：11）を用いて実施した。ヒトC2GnT3（C2GnT3）またはGAPDH（G3PDH, 製造業者から供給）に特異的なプライマーによるPCR増幅は正規化ヒト血液細胞cDNAパネル（Clontech からのMTC）上、31サイクル実施した。C2GnT3転写体の発現はすべての末梢血液単核球（PBMC）分画で検出され、CD4およびCD8陽性T-リンパ球においてとくに高い発現レベルを示した（図４）。
【０１５１】
実施例５
C2GnT3遺伝子のDNA多型の分析
図５に記載したTSHC123（5'-GGGCAGCATTTGCCTAGTATG-3', 配列番号：10）およびTSHC119（5'-GATCTCTGATTTGGCTCAGTG-3', 配列番号：8）のようなプライマーペアをコードエキソンの個体配列をPCR増幅するために使用した。各PCR産物をサブクローニングし、適当な挿入体を含む10個のクローンの配列を決定し、各個体の両対立遺伝子が特徴づけられることを確認した。
【０１５２】
以上例示の目的で本発明の特定の実施態様をここに説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変が実施できることは以上から自明であろう。
【０１５３】
参考文献
0004642301.tif 000002
0004642301.tif 000003
0004642301.tif 000004
0004642301.tif 000005
0004642301.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はC2GnT3遺伝子のDNA配列（受入番号 #AF132035）およびC2GnT3の予測アミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は一文字コードで示す。膜貫通ドメインの候補を示す疎水性セグメントには二重下線を付す。N-グリコシル化の４つのコンセンサスモチーフは星印によって指示する。
【図２】  図２はヒトC2GnT3（受入番号 #AF132035）、ヒトC2GnT2（前にはC2/4GnTと命名された；受入番号 #AF038650）、ヒトC2GnT1（前にはC2GnT-Lと命名された；受入番号 #97347）およびヒトIGnT（受入番号 #Z19550）の例示である。導入されたギャップはハイフンとして示し、アラインされた同一の残基は、四角で囲む（全配列同一は黒色で、３つの配列の同一は暗灰色で、2つの配列の同一は明灰色で囲む）。膜貫通ドメインの候補は四角で囲む。保存されたシステインは星印で指示する。１つの保存されたN-グリコシル化部位は白丸で指示する。
【図３】  図３は、健康なヒト成人および胎児組織のノーザンブロット分析を示す。パネルA：ヒトmRNAマスターブロット（Clontech）についての負荷パターン。列Hにおけるドットは100 ng（H1〜H7）または500 ng（H8）のコントロールDNAまたはRNAを含有する。パネルB：C2GnT3の可溶性発現フラグメントに相当する32P-標識C2GnT3を用いるマスターブロット発現分析のオートラジオグラフ（塩基ペア115〜1359）。パネルC：多重ヒト組織ノーザンブロット（Clontech からのMTN II）をパネルBに記載のようにプローブした。
【図４】  図４は、ヒト血液細胞分画中C2GnT3発現のPCR分析を示す。ヒトC2GnT3（C2GnT3）またはGAPDH（G3PDH）に特異的なプライマーによるPCR増幅は正規化ヒト血液細胞cDNAパネル（ClontechからのMTC）上31サイクル実施した。
【図５】  図５は、C2GnT3遺伝子のコードエキソンを増幅するために使用できる順行および逆行PCRプライマーの模式的表示である。プライマーTSHC119およびTSHC123の配列も示す。
【配列表】
0004642301.tif 000007
0004642301.tif 000008
0004642301.tif 000009
0004642301.tif 000010
0004642301.tif 000011
0004642301.tif 000012
0004642301.tif 000013
0004642301.tif 000014
0004642301.tif 000015
0004642301.tif 000016
0004642301.tif 000017
0004642301.tif 000018
0004642301.tif 000019
0004642301.tif 000020
0004642301.tif 000021
0004642301.tif 000022
0004642301.tif 000023
0004642301.tif 000024
0004642301.tif 000025
0004642301.tif 000026
0004642301.tif 000027
【図１】
0004642301.tif 000028
【図２】
0004642301.tif 000029
【図３】
0004642301.tif 000030
【図４】
0004642301.tif 000031
【図５】
0004642301.tif 000032