(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母、単細胞または多細胞糸状真菌宿主細胞中で、キメラ酵素をコードする核酸を前記宿主細胞に発現させる工程を含む、糖タンパク質を生産する方法であって、上記キメラ酵素は、
（ａ）Ｄ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）  マンノシダーゼ１ＩΔ７４触媒ドメインを、Ｇｌｓ１−ｓ，Ｍｎｓ１−ｓ，Ｍｎｓ１−ｍ，Ｓ．Ｓｅｃ−ｓ，Ｓ．ｓｅｃ−ｍ，Ｓ．ｓｅｃ−ｌ，Ｐ．ｓｅｃ−ｓ，Ｐ−ｓｅｃ−ｍ，Ｍｎｎ９−ｓ，Ｖａｎ１−ｓ，Ｖａｎ１−ｍ，Ｖａｎ１−ｌ，Ａｎｐ１−ｓ，Ａｎｐ１−ｍ，Ａｎｐ１−ｌ，Ｈｏｃ１−ｓ，Ｈｏｃ１−ｍ，Ｈｏｃ１−ｌ，Ｍｎｎ１０−ｍ，Ｍｎｎ１１−ｓ，Ｍｎｔ１−ｍ，Ｊ３−ｍ，Ｋｔｒ１−ｓ，Ｋｔｒ２−ｓ，Ｇｎｔ１−ｓ，Ｇｎｔ１−ｍ，Ｇｎｔ１−ｌ，Ｍｎｎ２−ｓ，Ｍｎｎ２−ｍ，Ｍｎｎ２−ｌ，Ｍｎｎ５−ｍ，Ｍｎｎ１−ｓ，Ｍｎｎ１−ｍ，Ｍｎｎ１−ｌ，Ｍｎｎ６−ｓおよびＭｎｎ６−ｍからなる群より選択される細胞標的シグナルペプチドに融合させてなるもの、または、
（ｂ）Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）  マンノシダーゼ１ＩΔ１０８触媒ドメインを、Ｇｌｓ１−ｓ，Ｍｎｓ１−ｓ，Ｍｎｓ１−ｍ，Ｓ．Ｓｅｃ−ｓ，Ｓ．ｓｅｃ−ｍ，Ｓ．ｓｅｃ−ｌ，Ｐ．ｓｅｃ−ｓ，Ｖａｎ１−ｓ，Ｖａｎ１−ｍ，Ｖａｎ１−ｌ，Ａｎｐ１−ｓ，Ｈｏｃ１−ｍ，Ｍｎｎ１０−ｓ，Ｍｎｎ１０−ｍ，Ｍｎｎ１０−ｌ，Ｍｎｎ１１−ｓ，Ｍｎｔ１−ｓ，Ｍｎｔ１−ｍ，Ｍｎｔ１−ｌ，Ｄ２−ｓ，Ｄ２−ｍ，Ｄ９−ｍ，Ｊ３−ｍ，Ｋｔｒ２−ｓ，Ｇｎｔ１−ｓ，Ｇｎｔ１−ｍ，Ｍｎｎ２−ｓ，Ｍｎｎ２−ｍ，Ｍｎｎ２−ｌ，Ｍｎｎ５−ｓ，Ｍｎｎ５−ｍ，Ｙｕｒ１−ｌ，Ｍｎｎ１−ｓ，Ｍｎｎ１−ｍおよびＭｎｎ６−ｍからなる群より選択される細胞標的シグナルペプチドに融合させてなるものを含み、前記キメラ酵素は、インビボでＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質のＭａｎα−１，３結合および／またはＭａｎα−１，６結合の４０％以上を加水分解しうる、方法。
【請求項２】
糖タンパク質が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であるＮ-グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖タンパク質が、オリゴ糖分岐Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを含む前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインが、Ｍａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を含むオリゴ糖基質のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６双方の結合をインビボで加水分解することができる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴ糖基質がＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３  Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；およびＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３  Ｍａｎα１，６  Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎであることを特徴とする請求項１または４記載の方法。
【請求項６】
前記マンノシダーゼ活性が過剰発現される前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる前記請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マンノシダーゼ活性が５．０〜８．０のｐＨ最適値を有する前記請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインが宿主細胞のＥＲ、ゴルジ装置またはトランスゴルジネットワークのうちの少なくとも１つ内に局在化される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
さらに、宿主細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む前記請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびノイロスポラ・クロッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選択される前記請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該糖タンパク質が治療タンパク質である、前記請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療タンパク質はエリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性Ｉｇｅ受容体α−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄系先祖阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１−抗トリプシン、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、またはＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣを有するまたは有さないＧＬＰ−１（グルカゴン様タンパク質１）、ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、または可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国出願第１０／６１６，０８２号に対する優先権を主張し、この出願は、２０００年６月２８日に出願された米国仮出願第６０／２１４，３５８号、２０００年６月３０日に出願された米国仮出願第６０／２１５，６３８号、および２００１年３月３０日に出願された米国仮出願第６０／２７９，９９７号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を主張する、２００１年６月２７日に出願された米国出願第０９／８９２，５９１号の一部継続出願である、２００３年２月２０日に出願された米国出願第１０／３７１，８７７号の一部継続出願であり、これらの出願の各々が、その全体が、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、下等真核生物におけるタンパク質グリコシル化の分野、具体的には、Ｍａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６グリコシル結合の加水分解に対して基質特異性を有するマンノシダーゼ酵素の導入に関する。本発明は、さらに、マンノシダーゼ酵素、および加水分解の結果として生じたＮ−グリカンまたはＮ−グリカン含有中間体をコードする遺伝子を含む新規な宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（ヒトおよび下等真核生物におけるグリコシル化経路）
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは糖残基の結合、グリコシル化として知られるプロセスを含む。異なる生物は異なるグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、グリコシル化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される、宿主系に依存して異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、その場合でも、非常に非特異的方法でのみグリコシル化する（Ｍｏｅｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，１９９７  Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８（３）：１６９−１７５）。繊維状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マンノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高−マンノース」タイプのグリカンまたはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、さらにもう１つの方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのような高等真核生物においては、裸のオリゴ糖側鎖をトリミングして、いくつかのマンノース残基を除去し、典型的には、下等真核生物のＮ−グリカンでは見られないさらなる糖残基で延長される。例えば、Ｒ．Ｋ．Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，１９９９，３０，１９３−２００；Ｗ．Ｍａｒｔｉｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，２０，１１７１−１１７７；Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，１１１６−１１２１；Ｍ．Ｍａｌｉａｓｓａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，２６７，１６９−１７３；Ｊａｒｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，９：５２８−５３３；およびＭ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，９，Ｓ２９−Ｓ３５参照。
【０００４】
哺乳動物型のオリゴ糖構造の合成は、一連の系列的反応で開始し、当該タンパク質が宿主生物における分泌経路に沿って移動する間に、この系列において糖残基が付加および除去される。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分泌されたタンパク質の得られたグリコシル化パターンを決定する。かくして、下等真核生物宿主細胞で発現されたタンパク質の得られたグリコシル化パターンは、ヒトおよび他の哺乳動物のような高等真核生物で発現されたタンパク質のグリコシル化パターンとは実質的に異なる（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９）。典型的な真菌Ｎ−グリカンの構造を図１Ａに示す。
【０００５】
ヒトグリコシル化の初期の工程は、少なくとも２つの異なる相に分けることができる：（ｉ）脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜での系列的な一連の反応によって組み立てられ、（ｉｉ）該脂質からのこのオリゴ糖の移動は、ドリチルピロホスフェートでデノボ合成されたタンパク質に係留させる。特異的移動の部位は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって規定される（Ｇａｖｅｌ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，１９９０  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．３：４３３−４２）。グリコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらなるプロセシングは、裸の糖タンパク質が初期ゴルジ装置に移動する前にＥＲで起こり、そこで、さらなるマンノース残基はゴルジ特異的アルファ（α−１，２−）マンノシダーゼによって除去される。タンパク質がゴルジを通って進むにつれ、プロセシングは継続する。中間ゴルジにおいて、Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶ）、マンノシダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含めた多数の修飾酵素が特異的糖残基を付加および除去する。最後にはトランス−ゴルジ（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ）において、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）は糖タンパク質構造を生じ、これがゴルジから放出される。それは、糖タンパク質にそのヒト特徴を与えるのは、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび高度の末端シアル酸を含有する、ビ−、トリ−およびテトラ−アンテナ構造によって特徴付けられるこの構造である。典型的なヒトＮ−グリカンの構造を図１Ｂに示す。
【０００６】
ほとんど全ての真核生物において、糖タンパク質は共通する脂質−結合オリゴ糖前駆体Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ドリコール−ピロホスフェートに由来する。小胞体内では、ドリコールピロホスフェート結合オリゴ糖の合成およびプロセシングは全ての公知の真核生物の間で同一である。しかしながら、真菌細胞、例えば、酵母によるコアオリゴ糖のさらなるプロセシングは、一旦それがペプチドに移動し、ＥＲを去って、ゴルジに入れば、それが分泌経路に沿って移動するにつれヒトとは有意に異なり、いくつかのマンノース糖の付加を含む。
【０００７】
酵母においては、これらの工程は、順次にマンノース糖をコアオリゴ糖に加える、Ｏｃｈ１ｐ、Ｍｎｔ１ｐおよびＭｎｎ１ｐのようなゴルジに存在するマンノシル−トランスフェラーゼによって触媒される。得られた構造はヒト−様タンパク質の生産には望ましくなく、かくして、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除するのが望ましい。マンノシル−トランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は、致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖おいて低下したマンノース含有量を呈することが示されており、かくして、高等真核生物のオリゴ糖により密接に似ている。
【０００８】
（糖ヌクレオチド前駆体）
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および繊維状真菌で生産される糖タンパク質では見出されない。ヒトにおいては十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコース等）がサイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される（Ｓｏｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，１９８１  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；Ｓｏｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  １９８２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；Ｐｅｒｅｚ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  １９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３８：７０９−７１５）。
【０００９】
グリコシル移動反応は、典型的には、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸である副産物を生じる。一リン酸はアンティポートメカニズムによってヌクレオチド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸送することができるが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送されるに先立って、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、ヌクレオシド一リン酸および無機ホスフェートを生じなければならない。この反応は効果的なグリコシル化に重要であり；例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必要であることが判明している。しかしながら、そのＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに向けて９０％低下活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、典型的にはゴルジにおいてＵＤＰ−特異的ジホスファターゼ活性を欠く。というのは、それはゴルジ−ベースの糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、すなわち、ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加えることが判明している酵母は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、そのような酵素についての潜在的要件を示す（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの優れた阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジのルーメンにおいてグリコシル−トランスフェラーゼの阻害を妨げるのに重要であり得る（Ｋｈａｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ、Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４）：１４５６４−１４５６７；Ｂｅａｕｄｅｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ａｂｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ．２９２：３９７−４１３参照。
【００１０】
（区画化された酵素活性によるＮ−グリカンの順次のプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）は      ＥＲおよびゴルジ装置の内部（ルミナル）表面をライニングし、それにより、それがＥＲおよびゴルジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とする「触媒」表面を提供する。シス、メジアルおよびトランスのゴルジの多数区画ならびにトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）は、グリコシル化反応の順序だった系列が起こり得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはＴＧＮにおいてＥＲにおける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特異的炭水化物構造が合成され得るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラーゼに順次に暴露される。これらの酵素をその各オルガネラに保持し、係留する正確なメカニズムを明らかにするために多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、証拠は、ステム領域、膜にわたる領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して、酵素を個々のオルガネラの膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその座に局在化することを示唆する（例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｐ．Ａ．（１９９８）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０９，５１７−５３２参照）。
【００１１】
いくつかの場合において、これらの特異的相互作用は種をまたいで機能することが見出された。例えば、ラットからのα２，６−ＳＴ（該動物のトランス−ゴルジに局在化することが知られている酵素）の膜にわたるドメインは、酵母ゴルジにおいてやはりレポーター遺伝子（インベルターゼ）を局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。しかしながら、全長α２，６−ＳＴの一部としての非常に同一の膜にわたるドメインはＥＲに保持され、酵母のゴルジにさらには輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０（３）：８０９−１７）。ヒトからの全長ＧａｌＴは、高い転写レベルが示されているにも拘らず酵母では合成されない。対照的に、インベルターゼレポーターに融合された同一ヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低い生産レベルにも拘らず酵母ゴルジへの局在化を指令することができた。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者は、酵母マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＴ１）の２８アミノ酸、小胞体テイル、膜貫通領域およびステム領域の８つのアミノ酸を含む領域を、ヒトＧａｌＴの触媒領域へ融合させることは、活性なＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることを示した。他のガラクトシルトランスフェラーゼは特定のオルガネラに存在する酵素との相互作用に依拠するようである。なぜならば、その膜貫通領域の除去の後には、それは依然として適切に局在化できるからである。
【００１２】
グリコシル化酵素の不適切な局在化は、経路における酵素の適切な機能を妨げかねない。例えば、多数のα−１，２−マンノシダーゼを有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｅａｄｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｎｔｚ，２０００  Ｇｅｎｅ  ２５５（１）：２５−３４）は、ＧｎＴＩ活性の高い総じてのレベルにも拘らず、ウサギＧｎＴＩ遺伝子で形質転換した場合にＧｌｃＮＡｃをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加しない（Ｋａｌｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。ＧｎＴＩは、活発に発現されるものの、該酵素がその基質の双方：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび生産的Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質（全てのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が生産的というのではない；後記参照）と接触しないように不正確に局在化され得る。あるいは、宿主生物はゴルジにおいて適切なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供することができないか、または該酵素は適切に局在化されないかも知れないが、それにも拘らず、その新しい環境で不活性である。加えて、宿主細胞に存在するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、哺乳動物で見出されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とは構造が異なり得る。Ｍａｒａｓおよび共同研究者は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから得られたセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）からのＮ−グリカンの約３分の１がインビトロにてＡ．Ｓａｉｔｏｉ  １，２−マンノシダーゼよってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされ得ることを見出した。しかしながら、それらのＮ−グリカンの１％未満がＧｎＴＩに対する生産的基質として働くことができた。Ｍａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７。従って、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の単なる存在は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるインビボプロセシングを達成できることを保証しない。必要なのは、生産的なＧｎＴＩ−反応性Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の形成である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は細胞で生産され得るが（約２７モル％）、小さな割合のみがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る（約５％未満、Ｃｈｉｂａ  ＷＯ  ０１／１４５２２参照）。
【００１３】
今日、下等真核生物における特定の異種的に発現されたグリコシルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼが（１）十分に翻訳され、（２）触媒的に活性であり、または（３）分泌経路内で適切なオルガレラに局在化されるかを予測する信頼できる方法はない。これらの全ての３つは下等真核生物においてグリコシル化パターンに影響する必要があるので、現在利用できない、予測ツールの非存在下で酵素の所望の触媒機能および適切な保持を達成するためのシステム的なスキームが望まれる。
【００１４】
（治療糖タンパク質の生産）
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療タンパク質の推定７０％がグリコシル化され、かくして、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化できる生産システム（すなわち、宿主細胞）に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が（１）免疫原性、（２）薬物動態学特性、（３）トラフィッキングおよび（４）治療タンパク質の効率を決定することにおいて重要な役割を演じることを示している。かくして、製薬産業によるかなりの努力は、できる限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得るためのプロセスを開発することに向けられてきた。今日、ほとんどの糖タンパク質は哺乳動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパク質のシアル化（すなわち、シアル酸の末端添加）の程度を増強させるそのような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含むことができ、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性を改良することが知られている。別法として、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそのヌクレオチド糖（例えば、２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸）を用いるそのような糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改良することができる。
【００１５】
ほとんどの高等真核生物は、ヒトで見出されたのと類似のグリコシル化反応を行うが、前記宿主系で発現された組換えヒトタンパク質は不変的にその「天然」ヒトカウンターパートとは異なる（Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０（５）：４７７−４８６）。かくして、広範な開発研究が、これらの発現系で作られるタンパク質の「ヒト特性」を改良する方法を見出すことに向けられてきた。これは、醗酵条件の最適化、およびヒト様グリコ形態の形成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タンパク質発現宿主の遺伝的修飾を含む。Ｇｏｏｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１２）：１３４７−５５；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｇｏｏｃｈｅｅ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（５）：５４６−４９；Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．４８（８）：８７０−８０；Ｗｅｉｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１１）：１１１６−２１；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｂｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８；３７０−８０。全ての哺乳動物発現系に関する固有の問題は解決されていない。
【００１６】
（真核生物微生物を用いる糖タンパク質の生産）
小胞体におけるタンパク質に移動されたコアオリゴ糖構造は基本的には哺乳動物および下等真核生物で同一であるが、実質的な差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こるその後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、かなり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系よりも優れた注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための宿主としての下等真核生物の使用を妨げてきた。
【００１７】
内因性宿主グリコシル化経路を利用する酵母のような微生物宿主で生産された治療糖タンパク質は、哺乳動物細胞で生産されたものと構造的に異なり、典型的には、大いに低下した治療効果を示す。そのような糖タンパク質は、典型的には、ヒトにおいては免疫原性であり、投与の後にはインビボで低下した半減期（従って、低下した生物活性）を示す（Ｔａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，Ｓ２９−Ｓ３５）。ヒトおよび動物における特異的受容体（すなわち、マクロファージマンノース受容体）は末端マンノース残基を認識し、血流から外来性糖タンパク質の迅速なクリアランスを促進することができる。さらなる悪影響はタンパク質折畳、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルギー性の変化を含み得る。
【００１８】
酵母および繊維状真菌は、共に、細胞内および分泌された双方の組換えタンパク質の生産で首尾よく用いられてきた（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ  ２０００  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２４（ｌ）：４５−６６；Ｈａｒｋｋｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７（６）：５９６；Ｂｅｒｋａ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐｅｒｓ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３：１２１−ＢＩＯＴ；Ｓｖｅｔｉｎａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：２４５−２５１）。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，およびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのような種々の酵母は真核生物発現系として特に重要な役割を演じてきた。何故ならば、それらは、高い細胞密度まで増殖し、大量の組換えタンパク質を分泌できるからである。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａなどのような繊維状真菌は、産業スケールで糖タンパク質を効果的に生産するのに用いられてきた。しかしながら、前記したように、これらの真核生物微生物のいずれかにおいて発現される糖タンパク質は、動物におけるものとはＮ−グリカン構造が実質的に異なる。このことは、多くの治療糖タンパク質のための生産で宿主としての酵母または繊維状真菌の使用を妨げてきた。
【００１９】
酵母および真菌におけるグルコシリ化はヒトにおけるものと非常に異なるが、いくつかの共通する要素が共有されている。第一の工程、コアオリゴ糖構造の新成タンパク質への移動は酵母、真菌、植物およびヒトを含めた全ての真核生物で高度に保存されている（図１Ａおよび１Ｂを比較されたし）。しかしながら、コアオリゴ糖のその後のプロセシングは酵母においてかなり異なり、数個のマンノース糖の付加を含む。この工程は、ゴルジに存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１、等）によって触媒され、これはマンノース糖をコアオリゴ糖に順次に付加する。得られた構造は、ヒューマノイドタンパク質の生産には望ましくなく、かくして、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除することが望ましい。マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖において低下したマンノース含有量を呈することが示されている。また、マンノシルリン酸トランスフェラーゼのような他のオリゴ糖プロセシング酵素もまた、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに応じて排除しなければならない。望まない内因性グリコシル化反応を低下させた後、複合体Ｎ−グリカンの形成が宿主系でなされなければならない。これは、数個の酵素および糖ヌクレオチドトランスポーターの安定な発現を必要とする。さらに、成熟化するグリコシル化構造の順次のプロセシングが確実になるに、これらの酵素を局在化する必要がある。
【００２０】
哺乳動物治療剤として用いるのにより適した糖タンパク質を提供するために真核生物微生物のグリコシル化経路を修飾しようとするいくつかの努力がなされてきた。例えば、数個のグリコシルトランスフェラーゼが別々にクローン化され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌で発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１）：５３−８，Ｋａｌｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。しかしながら、ヒト細胞で作成されたものに似ているＮ−グリカンは得られなかった。
【００２１】
酵母は多様なマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１のような１，３−マンノシルトランスフェラーゼ；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｅｍｒ，１９９１  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２０７−２１８、１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギュレーター（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、ならびに内因性グリコシル化反応に関与するさらなる酵素を生産する。これらの遺伝子の多くは個々に欠失され、改変されたグリコシル化プロフィールを有する生きた生物を生起する。その例を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004792387.tif 000002
日本国特許出願第８−３３６３８７号は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１ホモログの欠失を開示している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＯＣＨ１は、マンノースをグリカン構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に付加してＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせる１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。次いで、３つの１，６マンノース残基を含むＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造はインビボにてさらなる１，２−、１，６−および１，３−マンノシルトランスフェラーゼに対する基質となり、これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特徴的であって、典型的には、Ｎ−グリカン当たり３０〜４０のマンノース残基を有し得る高マンノシル化糖タンパク質に導く。Ｏｃｈ１ｐは１，６マンノースのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コアへの移動を開始する故に、それは、しばしば、それをゴルジにおいて後に作用する他の１，６マンノシルトランスフェラーゼから区別するために「開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ」と呼ばれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１  ｍｎｎ１  ｍｎｎ４変異体株において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２でグリコシル化されたタンパク質が蓄積し、超マンノシル化は起こらない。しかしながら、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２はヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのような哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼに対する基質ではなく、従って、それ自身での、その変異体株の使用は、複雑なまたはハイブリッドグリコシル化パターンでの哺乳動物様タンパク質を生産するのに有用ではない。
【００２３】
Ａ．ｓａｉｔｏｉに由来する真菌マンノシダーゼを小胞体（ＥＲ）内へ操作することによって、（インビボにて５０％より高い高効率トリミングは未だ証明されていないが）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２異性体にトリミングすることができる。このアプローチの欠点は二倍にある：（１）形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が実際に（分泌され、細胞外部でマンノシダーゼによってさらに修飾されたというよりはむしろ）インビボで形成されたか否かは明確ではなく；そして（２）いずれかの形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、もし実際にインビボで形成されたならばＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるその後のＮ−グリカン修飾に対する生産的な基質である正しいイソ形態であるかは明らかでない（Ｍａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。
【００２４】
真菌宿主に由来するよりヒト様糖タンパク質を提供する目的で、米国特許５，８３４，２５１号は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉに由来するハイブリッド糖タンパク質を生産する方法を開示する。ハイブリッドＮ−グリカンはコアマンノース構造のＭａｎα１−６アーム上にマンノース残基のみ、およびＭａｎα１−３アーム上に１または２の複雑なアンテナを有する。この構造は有用性を有するが、該方法は、多数の酵素工程をインビトロで行わなければならず、これは、コスト高で時間を消費する不利を有する。単離された酵素は調製するのにコスト高であり、コスト高の基質（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を必要とする。また、該方法は所望のタンパク質上での複雑なグリカンの生成を可能としない。
【００２５】
（Ｎ−グリカントリミングに関与する細胞内マンノシダーゼ活性）
α−１，２−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物において複雑なＮ−グリカン形成のための主な中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングで必要である。以前の研究は、切形されたマウス、真菌およびヒトα−１，２−マンノシダーゼがメチロトロピック酵母Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミング活性を呈することができることを示した（Ｌａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９８  Ｏｃｔ；８（１０）：９８１−９５；Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９８  Ｊｕｎ；８（６）：５８５−９５，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０３（２−３）：１７３−８）。しかしながら、今日、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの分泌された糖タンパク質でのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在しない。
【００２６】
さらに、細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼの単なる存在は、それ自体、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への適切な細胞内トリミングを保証しない（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＤＥＬタグ化マンノシダーゼが一義的にＥＲに局在化され、実質的にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が欠失できないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）レポータータンパク質と共に共発現される、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ  ０２／００８５６  Ａ２参照。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲ，初期ゴルジおよびサイトゾルに局在化されたキメラα−１，２−マンノシダーゼ／Ｏｃｈ１ｐ膜貫通ドメイン融合はマンノシダーゼトリミング活性を有しない、Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６２９８−２６３０４も参照されたし）。従って、ＥＲまたはゴルジにおけるマンノシダーゼの単なる局在化は、その標的化されたオルガネラにおいて各酵素の活性を保証するには不十分である（また、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのα−１，２−マンノシダーゼが、細胞内に局在化しつつ、マンノシル化の程度を減少させるよりはむしろ増加させたことを示す、Ｍａｒｔｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０（１２）：１１７１−１１７７も参照されたし）。今日膜貫通局在化配列を用いる、酵母または真菌いずれかにおける活性な異種α−１，２−マンノシダーゼの細胞内の局在化を示す報告はない。
【００２７】
一次Ｎ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生することができる株を作成するのは有用であるが、ヒトグリカンにより近く似せるようにこれらの高マンノース前駆体構造をさらに修飾しようとするいずれの試みもさらなるインビボまたはインビトロ工程を必要とする。インビトロにて真菌および酵母からのグリカンをさらにヒト化する方法は米国特許第５，８３４，２５１号（前傾）に記載されている。もし、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をさらにインビボでヒト化すべきならば、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が、事実、細胞内で生じ、培地中でのマンノシダーゼ活性の生成物ではないことを保証しなければならない。酵母または真菌における複雑なＮ−グリカン形成は、細胞内で生じさせるべき高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を必要とする。なぜならば、細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンのみがインビボでハイブリッドおよび複雑なＮ−グリカンにプロセシングできるからである。加えて、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の大部分は、実際、ＧｎＴＩに対する基質であり、ハイブリッドおよび複雑なＮ−グリカンの形成を可能とすることを示さなければならない。
【００２８】
従って、非−ヒト真核生物宿主細胞、特に酵母および繊維状真菌においてヒト−様糖タンパク質構造へさらにプロセシングすることができる高細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含有量によって特徴付けられる糖タンパク質を生産するための方法に対する要望が存在する。
【００２９】
（クラス２マンノシダーゼ）
多数のクラス２マンノシダーゼ精製され特徴付けられている：マウスマンノシダーゼＩＩ、ヒトーマンノシダーゼＩＩおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａマンノシダーゼＩＩ（図２４はマンノシダーゼのクラスの系統発生樹を示す）。クラス２マンノシダーゼ酵素は一般にゴルジに局在化されたＮ−結合オリゴ糖上のα１，３およびα１，６マンノースグリコシド結合の加水分解を担う。少なくとも５つのタイプのクラス２マンノシダーゼが同定されている、すなわち：（１）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ；（２）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩｘ；（３）リソソームα−マンノシダーゼ；（４）サイトゾルα−マンノシダーゼ；および（５）マウスおよびブタの精子または精巣上体組織から特徴付けられた酵素。Ｍｏｒｅｍｅｎ  Ｋ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７３（２００２）２２５−２３５。
【００３０】
ヒト先天的赤血球造血不全貧血タイプＩＩは、マウスで示されたように、機能的α−マンノシダーゼＩＩ遺伝子欠如と関連付けられている。Ｃｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １９９７  Ｊｕｌ  １１；９０（１）：１５７−６７。この遺伝的欠陥は（陽性酸性化血清溶解テストでの遺伝的赤芽球多核性）ＨＥＭＰＡＳと呼ばれ、さらなる研究がα−マンノシダーゼＩＩの役割を調査中である。例えば、α−マンノシダーゼＩＩをコードする単一遺伝子の変異は、ヒト全身性エリテマトーデスと同様な全身性自己免疫疾患をもたらすことが示されている。Ｃｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１  ９８：１１４２−１１４７。
【００３１】
糖タンパク質形成における酵素活性の重要性はよく確立されている；しかしながら、治療糖タンパク質の生産のためのそのような活性の効果的な発現は下等真核生物細胞では達成されていない。
【００３２】
（１）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ
ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＥＣ．３．２．１．１１４）は、短いＮ−末端細胞質テイル、ストークセグメントによって大きなルミナルＣ−末端触媒部分に連結された単一−スパン膜貫通ドメインから構成される、サイズがほぼ１２５ｋＤａであるＩＩ型膜貫通タンパク質である。Ｍｏｒｅｍｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，６６５４−６６６２；Ｍｏｒｅｍｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０９４５−１０９５１。マンノシダーゼＩＩの機能は、分泌経路におけるＮ−グリカンのプロセシングに必須である。哺乳動物細胞においては、この特別な酵素は基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２上のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を加水分解することが確立されている。その後のＮ−グリカンプロセシングは他のグリコシル化酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ）によって触媒され、その基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−シアル酸）およびその各トランスポーターとの所望のグリコ形態を生じる。例えば、個々に引用してその全体が援用される。ＷＯ  ０２／００８７９参照。
【００３３】
ゴルジα−マンノシダーゼＩＩをコードする部分的クローンは、ラット肝臓λｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーから単離されている。Ｍｏｒｅｍｅｎ，ＫＷ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９  Ｊｕｌ；８６（１４）：５２７６−８０。マウスゴルジα−マンノシダーゼＩＩおよびヒトαマンノシダーゼＩＩもまた特徴付けられ、ＣＯＳ細胞で発現されている。Ｍｏｒｅｍｅｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ；１１５（６）：１５２１−３４。ゴルジαマンノシダーゼＩＩ酵素で行われた研究は、このクラスの酵素のＣ−末端ドメイン内でかなりの類似性があることを示している。加えて、基質特異性研究は、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ酵素によるα１，３および／またはα１，６グリコシド結合の加水分解は、オリゴ糖基質上の末端ＧｌｃＮＡｃを必要とすることを示す。
【００３４】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ゴルジα−マンノシダーゼＩＩはマウスゴルジα−マンノシダーゼＩＩ  ｃＤＮＡを用いて単離されており、他のα−マンノシダーゼからの領域に対するかなりの類似性を有することが示されている。Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １５４（１９９５）１８３−１８６。以前の研究は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびマウスのｃＤＮＡ配列が４１％同一性および６１％類似性のアミノ酸配列を翻訳することを示している。ＣＨＯＰ細胞（ポリオーマ大Ｔ−抗原を安定に発現するＣＨＯ細胞）におけるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａゴルジα−マンノシダーゼＩＩ配列の発現は活性であることが示されており、また、主としてゴルジ装置に局在化されることも示されている。Ｒａｂｏｕｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１９９９  Ｏｃｔ；１１２（Ｐｔ１９）：３３１９−３０。
【００３５】
（２）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩｘ
ヒトα−マンノシダーゼＩＩｘ（α−マンノシダーゼＩＩイソタイプ）をコードする遺伝子が特徴付けられている。Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２，４４６−４５３（１９９６）。α−マンノシダーゼＩＩｘ酵素の過剰発現はＣＨＯ細胞におけるＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２への変換を導く。Ｏｈ−ｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，１２８０−１２８８（２００１）。マンノシダーゼの二つのタイプ（ＩＩおよびＩＩｘ）はゴルジにおけるＮ−グリカンのプロセシングに密接に関連している。このゴルジα−マンノシダーゼＩＩｘはα−マンノシダーゼＩＩに対する６６％同一性を有し、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖のＭａｎα１，６およびＭａｎα１，３を加水分解する類似の触媒活性を有する。より最近の研究は、α−マンノシダーゼＩＩｘ−欠陥雄マウスにおける不妊性の明らかな表現型を明らかとした。Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００２  Ｄｅｃ  １９；１５７３（３）：３８２−７。一つの研究は、α−マンノシダーゼＩＩｘ−欠陥マウス精巣が、ＧｌｃＮＡｃ−末端複合体タイプのＮ−グリカンの低下したレベルを示したことを見出した。
【００３６】
（３）リソソームα−マンノシダーゼ
もう１つのタイプのクラス２のマンノシダーゼが、真核生物細胞のリソソームに見出されており、糖タンパク質の異化（分解）に関与する。中性ｐＨ最適値を有するゴルジマンノシダーゼＩＩ酵素とは異なり、リソソームマンノシダーゼＩＩは低いｐＨ最適値（ｐＨ４．５）を有し、広い天然基質特異性を有し、合成基質ｐ−ニトロフェニルーα−マンノシダーゼに向けて活性であり、スワインソニンによる阻害に対して感受性である。Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４，５５１−５６６；Ｍｏｒｅｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４，１１３−１２５。構造的には、リソソームα−マンノシダーゼは、ゴルジ酵素の細胞質テイル、膜貫通ドメイン、およびステム領域の代わりにＮ−末端シグナル配列を有する。Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７３（２００２）２２５−２３５。ヒトリソソームα−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）はクローン化されており、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現されている。Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６  Ｎｏｖ  ８：２７１（４５）：２８３４８−５８。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍに由来するリソソームα−マンノシダーゼおよびマウスゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（α１，３−／１．６−マンノシダーゼ活性を処理する糖タンパク質）の間のアミノ酸配列保存の領域に基づき、マウスリソソームα−マンノシダーゼをコードするｃＤＮＡをクローン化した。Ｍｅｒｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９７  Ａｕｇ  ２９；１３３６（２）：１３２−４６。リソソームα−マンノシダーゼにおける欠陥は、α−マンノシドーシスといわれるヒト遺伝病をもたらす。
【００３７】
（４）サイトゾルα−マンノシダーゼ
サイトゾルα−マンノシダーゼＩＩは他のクラス２マンノシダーゼとはあまり類似ではなく、触媒活性に対してＺｎ２＋よりもＣｏ２＋を好むようである。Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７３（２００２）２２５−２３５。リソソームα−マンノシダーゼＩＩのように、それは糖タンパク質の異化に関与する。サイトゾルα−マンノシダーゼＩＩは、タンパク質分解廃棄のために細胞質へレトロ−移動された（ｒｅｔｒｏ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ）ＥＲのルーメン中で不適切に折り畳まれた糖タンパク質を異化する。Ｄｕｖｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３５（１９９８）３８９−３９６；Ｇｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６（１９９６）７８７−７９２。構造的にはこの酵素は切断可能なシグナル配列または膜貫通ドメインを有しない。
【００３８】
クラス２マンノシダーゼの特徴を呈するさらなるマンノシダーゼは記載されているが、まだ配列整列による直接的比較のためにクローン化されていない。Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７３（２００２）２２５−２３５。
【００３９】
（クラスＩＩＩマンノシダーゼ）
例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へ変換する、オリゴ糖のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合のトリミングにやはり関与するクラスＩＩＩマンノシダーゼが最近クローン化され同定されている。今日、このクラスのタンパク質の二つのメンバーのみが知られている。同定された最初のメンバーは、古典的なゴルジマンノシダーゼＩＩ活性を欠くが、コアマンノース−１，３分岐でのＧｌｃＮＡｃの存在とは独立している、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を直接的にＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換する別のメカニズムを保有する貧血マウスに由来するものであった（Ｄ．Ｃｈｕｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １９９７  ９０：１５７−１６７）。このクラスＩＩＩマンノシダーゼは未だクローン化されるべきであるが、同様の活性を持つタンパク質はＳｆ９細胞からクローン化されている（Ｚ．Ｋａｗａｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１  ２７６（１９）：１６３３５−１６３４０）。クローン化し、特徴付けすべきクラスＩＩＩマンノシダーゼの唯一のメンバーは、鱗翅目昆虫細胞株Ｓｆ９起源である（Ｄ．Ｊａｒｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７  ７：１１３−１２７）。このＳｆ９ゴルジマンノシダーゼＩＩＩはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換し、そして、ゴルジマンノシダーゼＩＩとは異なり、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をプロセシングしない。このクラスのマンノシダーゼのユニークな特徴は、Ｍａｎα１，３／１，６活性を保有することに加えて、それがクラスＩゴルジマンノシダーゼのようにα−１，２マンノシダーゼ活性を保有することである。さらに、ゴルジマンノシダーゼＩ酵素のように、このＳｆ９マンノシダーゼＩＩＩはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２よりも効率的にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
Ｎ−グリカンをプロセシングすることにおけるマンノシダーゼ酵素活性の利用性を仮定すれば、オリゴ糖についてＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６に対する基質特異性を有する触媒的に活性なα−マンノシダーゼＩＩを発現する工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法を有することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
（発明の要旨）
本発明は、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生する方法を提供し、この方法は、クラス２マンノシダーゼ酵素またはクラスＩＩＩマンノシダーゼ酵素の触媒活性フラグメントを発現する工程を包含する。
【００４２】
本発明の１つの実施形態は、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法を提供し、この方法は、その細胞において、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは両方を含むオリゴ糖基質を、その基質の少なくとも１０％のＭａｎα１，３結合および／またはＭａｎα１，６結合がインビボで加水分解される程度まで加水分解し得るマンノシダーゼ酵素活性を発現する工程を包含する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、下等真核生物宿主細胞において所望のＮ−グリカンを産生するための方法を提供し、この方法は、その細胞において、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは両方を含むオリゴ糖基質をインビボで加水分解し得るマンノシダーゼ酵素活性を発現する工程を包含し、ここで、所望のＮ−グリカンは、宿主細胞内で少なくとも１０モル％の収率で産生される。
【００４４】
好ましくは、産生される所望のＮ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される。別の好ましい実施形態において、所望のＮ−グリカンは少なくともオリゴ糖分枝Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎを有するものとして特徴付けられる。糖タンパク質は、好ましくは、宿主細胞から単離される。なお別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ酵素活性は、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合を含むオリゴ糖基質のＭａｎα１，３結合およびＭａｎα１，６結合の両方をインビボで加水分解し得る。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、オリゴ糖基質は、Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎまたは高マンナンとして特徴付けられる。
【００４６】
好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、クラス２マンノシダーゼ活性として特徴付けられる。より好ましい実施形態において、クラス２マンノシダーゼ活性はＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；またはＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性を有する。なおより好ましい実施形態において、クラス２マンノシダーゼ活性は、高等真核生物宿主細胞のゴルジ装置に通常見出されるものである。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、クラスＩＩｘマンノシダーゼ活性として特徴付けられる。より好ましい実施形態において、クラスＩＩｘマンノシダーゼ活性はＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；またはＭａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性を有する。
【００４８】
さらに別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性はクラスＩＩＩマンノシダーゼ活性として特徴付けられる。より好ましい実施形態において、クラスＩＩＩマンノシダーゼ活性は（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；または高マンナンに対する基質特異性を有する。
【００４９】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、マンノシダーゼ活性は好ましくは過剰発現される。別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼは、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解し得る。本発明のマンノシダーゼ活性は、好ましくは、約５．０〜約８．０の最適ｐＨを有する。
【００５０】
別の実施形態において、マンノシダーゼ活性は宿主細胞の分泌経路内に局在化される。好ましくは、マンノシダーゼ活性は宿主細胞のＥＲ、ゴルジ装置またはトランスゴルジ網の少なくとも１つの内に局在化されたポリペプチドから発現される。
【００５１】
１つの好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、細胞標的シグナルペプチドに融合されたマンノシダーゼ触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸から発現される。より好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、宿主細胞に対して天然のマンノシダーゼ触媒ドメインをコードする配列を含む核酸から発現される。別のより好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、宿主細胞に対して異種であるマンノシダーゼ触媒ドメインをコードする配列を含む核酸から発現される。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ酵素活性は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マンノシダーゼＩＩからなる群より選択される。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、宿主細胞に対して天然の標的ペプチドをコードする配列を含む核酸から発現される。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、マンノシダーゼ触媒ドメインに対して異種である標的ペプチドをコードする配列を含む核酸から発現される。
【００５５】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される。より好ましい実施形態において、宿主細胞はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００５６】
本発明は、さらに、上記方法のうちの１つによって産生された糖タンパク質およびＮ−グリカンを提供する。好ましい実施形態において、糖タンパク質は治療用タンパク質である。より好ましい実施形態において、治療タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロンγ、インターフェロン−ω、および顆粒球−ＣＳＦ）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、およびヒトプロテインＣ）、可溶性ＩｇＥレセプターα−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、チマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管上皮成長因子−２、骨髄性前駆体阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−胎児タンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、ａｋａ  ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１  ｗ／およびｗ／ｏ  ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦレセプターＦｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）からなる群より選択される。
【００５７】
本発明は、さらに、少なくとも２つの異なる遺伝子構築物（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む核酸ライブラリーを提供し、ここで、少なくとも別の遺伝子構築物は、通常は関連しない細胞標的シグナルペプチドをコードする核酸フラグメントとインフレーム連結したマンノシダーゼクラス２、ＩＩｘまたはＩＩＩ触媒ドメインをコードする核酸フラグメントを含む。
【００５８】
好ましい実施形態において、マンノシダーゼ触媒ドメインはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マンノシダーゼＩＩからなる群より選択される。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、細胞標的化ペプチドをコードする核酸フラグメントは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＬＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２、Ｐｉｃｈｉａ  ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ  ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈｉａ  Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ  Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ  Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ６からなる群より選択される。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、発現制御配列に連結した上記ライブラリーのいずれか１つに由来する融合構築物を含むベクターを提供し、ここで、上記細胞標的シグナルペプチドはＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジ網の少なくとも１つに標的化される。より好ましい実施形態において、発現制御配列は誘導性または構成的である。なおより好ましい実施形態において、ベクターは、宿主細胞での発現の際に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで産生することに関与するマンノシダーゼ活性をコードする。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、上記ベクターの少なくとも１つを含む宿主細胞を提供する。より好ましい実施形態において、ベクターはｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６と称されるベクターの群から選択される。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、キメラポリペプチドを提供し、このキメラポリペプチドは、
標的化シグナルペプチドにインフレーム融合し、かつ下等真核生物宿主細胞における発現の際に、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは両方を含むオリゴ糖基質を、インビボで、基質のＭａｎα１，３結合および／またはＭａｎα１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解し得るマンノシダーゼ触媒ドメインを含む。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、キメラポリペプチドを提供し、このキメラポリペプチドは、
標的化シグナルペプチドにインフレーム融合し、かつ下等真核生物宿主細胞における発現の際に、インビボで、Ｍａｎα１，３グリコシド結合、Ｍａｎα１，６グリコシド結合またはＭａｎα１，２グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、基質のＭａｎα１，３結合、Ｍａｎα１，６結合またはＭａｎα１，２結合の検出可能な部位がインビボで加水分解される程度まで、加水分解し得るマンノシダーゼ触媒ドメインを含む。
【００６４】
本発明の別の実施形態は、上記キメラポリペプチドをコードする核酸、または上記キメラポリペプチドを含む宿主細胞を提供する。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、上記核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、上記宿主細胞で産生された糖タンパク質を提供する。より好ましい実施形態において、宿主細胞で産生されたＮ−グリカンが提供される。より好ましくは、糖タンパク質は一様性（ｕｎｉｆｏｒｍ）として特徴付けられる。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、保存領域である配列番号５〜配列番号１５からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはそれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００６８】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質化学および核酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
【００６９】
本発明の方法および技術は、一般には、他に示されない限り、当該分野で周知の従来法に従って、そして本明細書中に引用されかつ本明細書中にわたって議論される種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補遺）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋｕｒｔ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｏｉｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  Ｉ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  ＩＩ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書中に記載される分子生物学および細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、および医学および医薬化学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連する命名法、およびその実験室的手法および技術は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
【００７０】
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許文献および他の参考文献は、参考として援用される。
【００７１】
以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解されるべきである。
【００７２】
本明細書中で用いられる場合、用語「Ｎ−グリカン」はＮ−結合オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合したもの）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の一般的な五糖コアを有する（「Ｍａｎ」は、マンノースをいい；「Ｇｌｃ」は、グルコースをいい；そして「ＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルをいい；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンをいう）。Ｎ−グリカンに関して用いられる用語「トリマンノースコア」はまた、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に付加された周辺の糖（例えば、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝した成分に従って分類される（例えば、高マンノース、複合体またはハイブリット）。
【００７３】
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５以上のマンノース残基を有する。「複合体」型Ｎ−グリカンは、代表的には、１，３マンノースの結合手に結合した少なくとも別のＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースの結合手に結合した少なくとも別のＧｌｃＮＡｃを有する。複合体Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有し得、この残基は、必要に応じて、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで、「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸をいい、そして「Ａｃ」はアセチルをいう）で修飾される。複合体Ｎ−グリカンは、代表的には、例えば：ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃａ２−６ＧａｌＮＡｃａｌ−；ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃａｌ−；ＮｅｕＡｃａ２−３／６Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−；ＧｌｃＮＡｃａ１−４Ｇａｌｂ１−（ムチンのみ）；Ｆｕｃａ１−２Ｇａｌｂ１−（血液型Ｈ）のような、オリゴ糖で終わる少なくとも１つの分枝を有する。硫酸エステルはガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃ残基で生じ、リン酸エステルはマンノース残基で生じ得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）はＯ−アセチル化され得るか、またはＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換され得る。複合体Ｎ−グリカンはまた、「分枝している」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースの結合手の末端に少なくとも別のＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースの結合手に０またはそれ以上のマンノースを有する。
【００７４】
Ｎ−グリカンの産生に関して用いられる用語「優勢な」または「優勢に」とは、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって検出される主要なピークを表す構造をいう。
【００７５】
本明細書中で用いられる略語は、当該分野における共通の用法である（例えば、上記の糖の略語を参照のこと）。他の共通の略語としては、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）をいう「ＰＮＧａｓｅ」；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素をいう「ＧｌｃＮＡｃ  Ｔｒ」または「ＧｎＴ」；Ｎ−アセチルノイラミン酸をいう「ＮＡＮＡ」が挙げられる。
【００７６】
本明細書中で用いられる場合、「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」とは、３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンがそれに結合しているタンパク質、および合成糖タンパク質中間体（これもまた有用であり、さらにインビトロまたはインビボで操作され得る）を代替的にいう。好ましくは、本発明により産生される糖タンパク質は、少なくとも一時的には、少なくとも２０モル％、好ましくは２０〜３０モル％、より好ましくは３０〜４０モル％、さらにより好ましくは４０〜５０モル％、そしてさらに好ましくは５０〜１００モル％のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２中間体を含む。これは、例えば、本発明の宿主細胞を操作して、「優れた」、すなわちより効率的なグリコシル化酵素を発現することによって達成され得る。例えば、マンノシダーゼＩＩは、宿主細胞中の部位に存在する条件下で最適な活性を有するように選択され、ここで、タンパク質はグリコシル化され、好ましくは、活性が望まれる宿主細胞オルガネラに対して酵素を標的化することによって、宿主細胞中に導入される。
【００７７】
用語「酵素」とは、宿主細胞グリコシル化を変化させることに関連して用いられる場合、少なくとも１つの酵素活性を有する分子をいい、全長酵素、触媒活性フラグメント、キメラ、複合体などを含む。酵素の「触媒活性フラグメント」とは、検出可能なレベルの機能的（酵素的）活性を有するポリペプチドをいう。酵素活性は、その後のプロセシング酵素が、インビボで所望の糖形態の約５１％を産生する能力を有する場合、「実質的に細胞内」である。
【００７８】
下等真核生物宿主は、グリコシル化プロフィールと関連して本明細書中で用いられる場合、高マンノース含有Ｎ−グリカンを通常産生する任意の真核生物細胞をいい、従って、いくつかの動物細胞または植物細胞および最も代表的な下等真核生物細胞（単細胞および多細胞の真菌細胞および藻細胞が挙げられる）を包含することが意図される。
【００７９】
本明細書中で用いられる場合、用語「分泌経路」とは、種々のグリコシル化酵素の構築系をいい、この系に対して、脂質結合オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が順に曝露され、その後新生ポリペプチド鎖の分子が、細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置の区画へ流れる。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前に脂質結合グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙに対して「上流」にあるか、または「上流」で作用するといわれ；同様に、酵素Ｙは酵素Ｘから下流」にあるか、または「下流」に作用する。
【００８０】
本明細書中で用いられる場合、用語「標的化ペプチド」とは、細胞標的シグナルペプチドをコードするヌクレオチドまたはアミノ酸配列をいい、この細胞標的シグナルペプチドは、細胞下の位置（例えば、オルガネラ）に対する関連配列の局在化（または保持）を媒介する。
【００８１】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいう。該用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド間結合、または双方を含むＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含む。核酸はいずれのトポロジー的立体配座でもあり得る。例えば、核酸は一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐した、ヘアピンの、環状の、または南京錠様の立体配座であり得る。この用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のＤＮＡを含む。本発明の核酸分子はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および前記の合成形態および混合ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を共に含むことができる。当業者に容易に認識されるように、それらは化学的に改変されていても、生化学的に改変されていてもよく、あるいは非天然ヌクレオチド塩基を含んでいてもよいし、誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、アナログでの天然に存在するヌクレオチドの１以上の置換、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部位（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレーター、アルキレーターおよび改変された結合（例えば、α芳香族核酸等）のようなヌクレオチド間改変が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当該分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子の骨格中のリン酸結合に代えて置き換えるものを含む。
【００８２】
特記しない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その少なくとも一部が（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。その２つの間の選択は文脈によって指令される。例えば、もし核酸がプローブとして用いられれば、その２つの間の選択はプローブが所望の標的に対して相補的であるという要件によって指令される。
【００８３】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）は、その天然宿主細胞において天然ポリヌクレオチドに天然では伴う他の細胞構成要素、例えば、それに対して天然に会合するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列から実質的に分離されたものである。該用語は（１）その天然に存在する環境から取り出されてしまっている、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然でそこで見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない、（３）それに天然では結合していないポリヌクレオチドに操作可能に連結している、または（４）天然では起こらない核酸またはポリヌクレオチドを含む。用語「単離された」または「実質的に純粋な」は、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチドアナログに言及して用いることもできる。
【００８４】
しかしながら、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチドが、その天然の環境から物理的にそれ自体が取り出されてしまっていることは必ずしも必要としない。例えば、もし異種配列（例えば、内因性核酸配列に天然では隣接しない配列）が、この内因性核酸配列の発現が改変されるように、この内因性核酸配列に隣接して置かれるならば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は本明細書中では「単離された」とみなされる。その例として、非天然プロモーター配列は、この遺伝子が改変された発現パターンを有するように、ヒト細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターに代えて（例えば、相同組換えによって）置き換えることができる。この遺伝子は今や「単離された」ものとなっている。何故ならば、それは、天然ではそれに近接する配列の少なくともいくつかから分離されているからである。
【００８５】
また、もしそれが、ゲノム中の対応する核酸では天然に起こらないいずれかの改変を含めば、核酸は「単離された」と考えられる。例えば、もし内因性コード配列が、例えば、ヒト介入によって人工的に導入された挿入、欠失または点変異を含むならば、それは「単離された」と考えられる、「単離された核酸」としては、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物が挙げられる。さらに、「単離された核酸」は他の細胞物質を実質的に含まず、あるいは組換え技術によって生産された場合には培養培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００８６】
本明細書中で用いるように、参照核酸配列のフレーズ「縮重改変体」は、標準的な遺伝暗号に従い、翻訳されて参照核酸配列から翻訳されたのと同一なアミノ酸配列を供することができる核酸配列を含む。
【００８７】
核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」または「同一な」とは、最大対応性に対して整列させた場合に同一である、２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較の長さは少なくとも約６つのヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに用いることができる当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いてポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最良の重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０、本明細書中に参考として援用される）。例えば、核酸配列の間のパーセント配列同一性は、そのデフォルトパラメーター（スコアリングマトリックスのための６のワードサイズおよびＮＯＰＡＭ因子）でＦＡＳＴＡを用い、あるいは本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１で供されたそのデフォルトパラメーターでＧａｐを用いて決定することができる。
【００８８】
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはその断片に言及する場合、もう１つの核酸（またはその相補鎖）と、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列させた場合に、前記したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのようないずれかの周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００８９】
あるいは、核酸またはその断片がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、もう１つの核酸、もう１つの核酸のストランド、その相補鎖にハイブリダイズする場合に実施的な相同性または類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の関係では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的な領域の長さ、ハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数のような条件によって影響される。当業者であれば、どのようにしてこれらのパラメーターを変化させ、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するかを知っている。
【００９０】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドについての熱融解温度（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドについてのＴｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。本明細書中に参考として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲、頁９．５１参照。本明細書中での目的では、「高ストリンジェンシー条件」は、液相ハイブリダイゼーションでは、８〜１２時間の６５℃における６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳでの水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、続いての２０分間の６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよびパーセント同一性を含めた多数の因子に応じて異なる速度で起こることは当業者に認識される。
【００９１】
用語「変異した」は、核酸配列に適用する場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入され、欠失され、または変化され得ることを意味する。単一の改変は遺伝子座でなすことができ（点変異）、あるいは多数のヌクレオチドを単一遺伝子座において挿入し、欠失し、または変化させることができる。加えて、１以上の改変を、核酸配列内のいずれかの数の遺伝子座で行うことができる。核酸配列は、限定されるものではないが、「エラー−傾向ＰＣＲ」（点変異の高い率がＰＣＲ産物の全長に沿って得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行うプロセス；例えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，ｐｐ．１１−１５（１９８９）およびＣａｌｂｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．＆Ｊｏｙｃｅ  Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，２，ｐｐ．２８−３３（１９９２））；および「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発」（目的のいずれかのクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の生成を可能とするプロセス；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．＆Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，ｐｐ５３−５７（１９８８）参照）のような変異誘発技術を含めた当該分野で公知のいずれかの方法によって変異させることができる。
【００９２】
本明細書中で用いる用語「ベクター」は、それが結合したもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子をいうことを意図する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターはコスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここに、さらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結することができる（後により詳細に議論する）。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、従って、宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それに作動可能に連結されるゲノムの発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）という。
【００９３】
「作動可能に連結した」発現制御配列とは、発現制御配列が目的の遺伝子と連続して、目的の遺伝子を制御する結合、ならびにトランス、またはある距離を置いて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列をいう。
【００９４】
本明細書中で用いる用語「発現制御配列」とは、それに作動可能に連結したコード配列の発現に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような効果的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物の場合には、そのような制御配列としては、一般には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列が挙げられる。用語「制御配列」は、最小限、その配列が発現に必須である全ての構成要素を含むことを意図し、また、その配列が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
【００９５】
本明細書中で用いるように、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中へ組換えベクターのような核酸が導入されている細胞をいうことを意図する。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫をもいうことを意図する。ある種の改変は変異または環境の影響のいずれかに起因して、継続する世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でない可能性があるが、依然として、本明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は単離された細胞であってよく、あるいは培養で増殖された細胞系であってよく、あるいは生きた組織または生物中に存在する細胞であってもよい。
【００９６】
本明細書中で用いられる用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸未満の長さ、より典型的には約３０アミノ酸未満の長さのものをいう。本明細書中で用いられる該用語は、アナログ、ならびに構造および、かくして、生物学的機能を模倣するミメティックを含む。
【００９７】
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、天然に存在する、および天然に存在するものではないタンパク質、および断片、変異体、誘導体およびそのアナログを含む。ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、その各々が、１以上の区別される活性を有する多数の異なるドメインを含むことができる。
【００９８】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導の源により、（１）その天然状態でそれに伴う天然に会合した構成要素に関連しない、（２）それが天然で見出されない純度で存在する場合、純度を他の細胞物質の存在に関連して調整できる（例えば、同一種からの他のタンパク質はない）、（３）異なる種からの細胞によって発現された、または（４）天然で生じない（例えば、それは天然で見出されたポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは天然で見出されないアミノ酸アナログまたは誘導体、あるいは標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドである。かくして、化学的に合成された、またはそれが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたペプチドは、その天然に会合した構成要素から「単離」されている。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に会合した構成要素を実質的に含まないようにすることもできる。そのように定義されたように「単離された」は、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されてしまっていることを必ずしも必要としない。
【００９９】
本明細書中で用いる用語「ポリペプチド断片」とは、全長ポリペプチドと比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列における対応する位置と同一である連続配列である。断片は、典型的には少なくとも５、６、７、８，９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【０１００】
「改変された誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含む、あるいは天然ポリペプチドに見出されないアミノ酸を取り込んだポリペプチドまたはその断片をいう。そのような改変は、例えば、当業者に容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核種での標識、および種々の酵素的改変を含む。そのような目的で有用なポリペプチドを標識するための多様な方法、および多様な置換基または標識が当該分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈのような放射性同位体、標識抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗リガンドを含む。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合体化の容易性、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野で周知である。参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  １９９２，およびｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｔｏ  ２００２）参照。
【０１０１】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、天然または野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成または置換を含むポリペプチドをいう。ムテインはある位置における単一アミノ酸がもう１つのアミノ酸に変化されている１以上のアミノ酸点置換、１以上のアミノ酸が天然に存在するタンパク質の配列において、各々、挿入または欠失されている１以上の挿入および／もしくは欠失、ならびに／またはアミノ末端またはカルボキシ末端いずれかまたは双方におけるアミノ酸配列の切形を有することができる。ムテインは天然に存在するタンパク質と比較して、同一の生物学的活性を有することができるが、好ましくは異なる生物学的活性を有する。
【０１０２】
ムテインはその野生型対応物に対して少なくとも７０％の総じての配列相同性を有する。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の総じての配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態においては、ムテインは９５％の配列同一性、なおより好ましくは９７％、なおより好ましくは９８％、なおより好ましくは９９％の総じての配列同一性を呈する。配列相同性は、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔのようないずれかの一般的な配列分析アルゴリズムによって測定することができる。
【０１０３】
好ましいアミノ酸置換は（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変する、（４）結合親和性または酵素活性を改変する、および（５）そのようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を付与する、または改変するものである。
【０１０４】
本明細書中で用いるように、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は慣用的用法に従う。本明細書中に参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０の慣用的アミノ酸、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非慣用的アミノ酸のような立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた本発明のポリペプチド用の適当な構成要素であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチド表記においては、標準用法および約束に従い、左手方向はアミノ酸末端方向であって、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０１０５】
もしタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して「相同性」を有し、あるいはそれに対して「相同」である。あるいは、もし２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して相同性を有する（かくして、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して６０％の配列相同性を呈するものであり、より好ましくは７０％配列相同性である。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％配列相同性を呈する相同タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相同タンパク質は９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を呈する。本明細書中で用いるように、（特に、予測された構造類似性に関して）アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性は、機能において類似性を意味するものと解釈される。
【０１０６】
「相同な」がタンパク質またはペプチドに関連して用いられる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換だけ異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有するもう１つのアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が相互に保存的置換だけ異なる場合、パーセント配列同一性または相同性の程度は、置換の保存的性質につき修正するように上方に調整することができる。この調整をなす手段は当業者に周知である（例えば、本明細書に参考として援用される、Ｐｅａｒｓｏｎら，１９９４参照）。
【０１０７】
以下の６つの群は、各々、相互に代えての保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１０８】
パーセント配列同一性ともいうポリペプチドについての配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウエアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｕｒｅ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５参照。タンパク質分析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含めた、種々の置換、欠失および他の改変に帰属される相同性の尺度を用いて類似の配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧは「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔ  ｆｉｔ」のようなプログラムを含み、これは、デフォルトパラメーターを用いて異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドのような密接に関連するポリペプチドの間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１参照。
【０１０９】
阻害分子配列を、異なる生物からの非常に多数の配列を含むデータベースを比較する場合の好ましいアルゴリズムはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐについての好ましいパラメーターは：期待値：１０（デフォルト）：フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを拡大するためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードのサイズ１１：（デフォルト）；記載の番号：１００（デフォルト）：ペナルティマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【０１１０】
相同性について比較されたポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくても約２８残基、好ましくは約３５を超える。非常に多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列はＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１におけるプログラム）を用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリおよびサーチ配列の間の最良な重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０，本明細書中に参考として援用される）。例えば、アミノ酸配列の間のパーセント配列同一性は、本明細書中に参考として援用される、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（２のワードサイズおよびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用いて決定することができる。
【０１１１】
保存された領域に言及する用語「モチーフ」は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ），アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）として慣用的に知られ、タンパク質で通常見出されるアミノ酸残基を示す。
【０１１２】
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列にカップリングしたポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以上の所望の機能的エレメントを含むように構築することができるので有用である。融合タンパク質は目的のポリペプチドからの少なくとも１０の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームであるポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって、組換えにより生産することができる。別法として、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片をもう一つのタンパク質に架橋させることによって化学的に生産することができる。  
【０１１３】
本明細書中で用いる用語「領域」とは、生体分子の一次構造の物理的に連続する部分をいう。タンパク質の場合には、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義される。
【０１１４】
本明細書中で用いる用語「ドメイン」とは、生体分子の公知のまたは疑われる機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは領域またはその部分と共に広がることができ；ドメインは生体分子の区別される非連続領域を含むこともできる。タンパク質ドメインの例は、限定されるものではないが、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。
【０１１５】
本明細書中で用いるように、用語「分子」は、限定されるものではないが、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含めたいずれかの化合物を意味し、そのような化合物は天然または合成のものであり得る。
【０１１６】
他に定義しない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一な意味を有する。例示的な方法および材料は以下に記載するが、本明細書中に記載したのと同様なまたは同等な方法および材料も本発明の実施で用いることができ、それは当業者に明らかである。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の文献は本明細書にその全体が参考として援用される。矛盾がある場合、定義を含めた本明細書が優先する。材料、方法および例は説明のためだけのものであり、限定する意図のものではない。
【０１１７】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」または「を含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、いずれかの他の整数または整数の群を排除するものではないと理解される。
【０１１８】
（下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を天然では発現しない、またはそれを発現しないようにされている真核生物宿主細胞は出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な１以上の酵素、または他の因子を発現するように作製される。所望の宿主株は、一度に１つ以上の酵素を発現するように操作することができる。加えて、１以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本発明の宿主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素（例えば、異種細胞下標的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素断片を含むキメラ酵素）をコードする核酸分子のライブラリーを（例えば、酵素断片を含むサブ−ライブラリーと細胞下標的化配列との連結によって）創製し、最も最適な活性を持つ１以上の酵素を有する、またはほとんどの「ヒト様」糖タンパク質を生産する株は、ライブラリーの１以上のメンバーで標的宿主細胞を形質転換することによって選択することができる。
【０１１９】
特に、本明細書中に記載された方法は、それをさらに改変して複合体Ｎグリカンを得る目的で少なくとも一次的に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を高い収率でインビボで得るのを可能とする。下等真核生物のような宿主細胞において適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を適当な収率で得るための成功したスキームは、一般には、２つの平行したアプローチ：（１）もしあれば、内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性によって作製された高マンノース構造を低下させること、および（２）１、２−α−マンノースをマンノシダーゼによって除去して、さらに宿主細胞の内部で反応させて、複合体ヒト−様グリコ形態を形成することができる高レベルの適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を得ることを含む。
【０１２０】
従って、第一の工程は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の作用によってインビボＧｌｃＮＡｃを許容することができるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的前駆体構造を生産することができる真核生物宿主細胞（例えば、下等真核生物）の選択または創生を含む。一つの実施形態において、この方法は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに関して１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製し、またはそれを用いることを含む。好ましくは、宿主細胞は開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性（後記参照）が枯渇したものである。そのような宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するのに望ましくない高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を欠く。
【０１２１】
次いで、１以上の酵素活性を、そのような宿主に導入して、少なくとも３０モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ５」）炭水化物構造を有することによって特徴付けられる宿主細胞内でＮ−グリカンを生産する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合体Ｎ−グリカン形成に必要であり：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は少なくとも一時的には高い収率で（例えば、３０％の過剰にて）インビボで形成されなければならない。というのは、引き続いての哺乳動物様およびヒト様のグリコシル化反応はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはその誘導体を必要とするからである。
【０１２２】
この工程は、高い収率での、細胞内でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特定の異性体構造の形成も必要とする。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合体Ｎ−グリカン形成に必要であるが、その存在は決して十分ではない。これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩに対する基質として働くことができる、またはできない異なる異性体形態で起こり得るからである。殆どのグリコシル化反応は完全ではないので、特定のグリコシル化タンパク質は、一般に、その表面にある範囲の異なる炭水化物構造（すなわち、グリコ形態）を含む。かくして、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のような特定の構造の微量の（すなわち、５％未満の）単なる存在は、哺乳動物様またはヒト様糖タンパク質を生産するのにほとんど現実的な関連性はない。必要なのは、高い収率での（すなわち、３０％を超える）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ−許容Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体（図１Ｂ）の形成である。この中間体の形成は、目的のグリコシル化タンパク質（標的タンパク質）上の複合体Ｎ−グリカンの引き続いてのインビボでの合成を可能とするのに必要である。
【０１２３】
従って、選択された宿主細胞によって生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のいくつかまたは全ては、哺乳動物グリコシル化経路に沿って酵素活性に対する生産的基質でなければならず、例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性に対する基質としてインビボで働くことができ、それにより、宿主細胞においてヒト−様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成する。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞において生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは５０％以上は、インビボにてＧｎＴＩに対する生産的基質である。もし、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が１０％で生産され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が標的タンパク質上で２５％で生産されるならば、一次的に製造されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の合計量は３５％であることが理解される。なぜならば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産物だからである。は、
当業者は、天然から宿主細胞、例えば、インビボでかなりのレベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産する現存する真菌または他の下等真核生物を選択することができる。しかしながら、合計Ｎ−グリカンの１．８％過剰でインビボにてそのような構造を供することが示された下等真核生物は未だない（例えば、Ｍａｒａｓら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。あるいは、そのような宿主細胞は、インビボでＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生産するように遺伝子的に作製することができる。米国特許第５，５９５，９００号に記載されたもののような方法を用いて、目的の標的宿主細胞または生物における特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌクレオチドトランスポーターの不存在または存在を同定することができる。
【０１２４】
（望ましくない宿主細胞グリコシル化酵素の不活化）
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト−様Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用いられる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既に記載された多くのそのような変異体の一つで出発して作製することができるか、あるいはそれから得ることができる。かくして、選択された宿主細胞に応じて、非−ヒトグリコシル化反応の特徴であることが知られた酵素をコードする１つのまたは多数の遺伝子を欠失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は多数の下等真核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎａ等）において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを供する。これらの遺伝子はマンノシルトランスフェラーゼ、例えば、１，３マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１（Ｇｒａｈａｍ、１９９１）１，２マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレギュレーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅからのＭＮＮ４およびＭＮＮ６）および異常な、すなわち、非ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるようである。これらの遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシル化プロフィールを持つ生きた表現型を生起させる。その例は、表１（前記）に示される。
【０１２５】
必要な操作工程を例示するために本明細書中に記載したように、本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓの過マンノシル化−マイナス（ｏｃｈ１）変異体である。他の下等真核生物のようにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせるためにα−１，２−マンノシダーゼと共にＥＲ中にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造を保有する（図１Ａ）。数個のマンノシルトランスフェラーゼの作用を介して、次いで、この構造はマンナンとしても知られた過マンノシル化された構造（Ｍａｎ＞９ＧｌｃＮＡｃ２）に変換される。加えて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、マンノシルリン酸トランスフェラーゼの作用を介して、非末端リン酸基を炭水化物構造へ付加することができることが判明した。これは、マンノース糖の付加よりはむしろ除去に関係する、哺乳動物細胞で行われる反応とは異なる。存在するＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造を過マンノシル化する真核生物宿主細胞、例えば、真菌の能力を排除するのは特に重要である。これは、超マンノシル化しない宿主細胞につき選択し、またはそのような細胞を遺伝子工学により作製することによって達成することができる。
【０１２６】
超マンノシル化プロセスに関与した遺伝子は、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、同定されており、これらの遺伝子中に変異を作り出すことによって、「望ましくない」グリコ形態の生産を低下させることができる。そのような遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような他の下等真核生物で見出される現存のマンノシルトランスフェラーゼまたはそれらのレギュレーター（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４，ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）に対する相同性によって、あるいは宿主株を変異誘発し低下したマンノシル化を持つグリコシル化表現型につき選択することによって同定することができる。公知のマンノシルトランスフェラーゼおよびマンノシルリン酸トランスフェラーゼの間の相同性に基づき、ＰＣＲプライマー（その例は表２に示され、配列番号６０〜９１はプライマーの更なる例である）を設計することができるか、そのような酵素をコードする遺伝子または遺伝子断片をプローブとして用いて、標的または関連生物のＤＮＡライブラリーにおいてホモログを同定することができる。別法として、関連生物において特定のグリコシル化表現型を補うその能力によってバンノシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的ホモログを同定することができる。
【０１２７】
【表２】
0004792387.tif 000003
脚注：Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ、Ｎ＝ＧまたはＡまたはＴまたはＣ。
【０１２８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を得るためには、例えば、以下の工程を行う：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、上昇した温度では遅い成長者である。かくして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーで補うことによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＯＣＨ１の機能的ホモログを同定することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体は、例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能でありＲｅｓＧｅｎ、ａｎ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。上昇した温度において正常な増殖表現型を呈する変異体はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＤＮＡライブラリーで形質転換された後は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１ホモログを有するようである。そのようなライブラリーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分的に消化し、制限酵素を不活化した後、消化されたＤＮＡを、適合する制限酵素で消化されている適当なベクターに連結することによって作り出すことができる。
【０１２９】
適切なベクターとしては、例えば、Ｔｒｐ１マーカー（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．，およびＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２，１９−２７頁）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドであるｐＲＳ３１４、およびＵＲＡ３マーカー（Ｂｏｎｎｅａｕｄ，Ｎ．ら，１９９１，Ｙｅａｓｔ  ７，６０９−６１５頁）を含有する改変されたｐＵＣ１９に基づく高コピー（２μ）プラスミドであるｐＦＬ４４Ｓが挙げられる。そのようなベクターは学術研究者によって通常用いられ、同様なベクターは多数の異なる販売業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手可能である。さらなる例としては、ｐＹＥＳ／ＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２μ複製起点に基づく酵母発現プラスミド、またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのＹｅｐ２４クローニングビヒクルが挙げられる。
【０１３０】
染色体ＤＮＡおよびベクターの連結の後、ＤＮＡライブラリーを、特定の変異を持つＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に形質転換し、対応する表現型の修正につき選択することができる。野生型表現型を回復することができるＤＮＡフラグメントをサブクローニングし、配列決定した後、このフラグメントを用いて、当業者に周知のインビボ変異誘発および／または組換え技術を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１によってコードされた遺伝子産物の活性を排除することができる。
【０１３１】
あるいは、もし目的の特定の宿主細胞（例えば、真菌）の全ゲノム配列が知られているならば、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのようないくつかの情報源から入手可能な公に入手可能なＤＮＡデータベースを単に検索することによってそのような遺伝子を同定することができる。例えば、与えられたゲノム配列、または公知の１，６マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯＣＨ１）からの配列を含むデータベースを検索することによって、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードできる（必ずしも必要でない）そのような宿主細胞ゲノムにおいて高い相同性の遺伝子を同定することができる。しかしながら、核酸配列相同性単独は、同一の活性を有する酵素をコードするホモログを同定し、単離したことを証明するには十分ではない。今日まで、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１欠失が非常に重要な開始１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を排除することを示すデータは存在しない（Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０（１２）（Ｄｅｃ．１９９８）：１１７１−１１７７；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ０２／００８５６  Ａ２）。かくして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子ホモログがその機能を現実にコードすることを証明するデータはない。その証明はここに初めて提供される。
【０１３２】
いくつかのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンノシルトランスフェラーゼに対するホモログは、これらのアプローチを用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同定されている。相同な遺伝子は、しばしば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質のマンノシル化に関与する遺伝子に対して同様な機能を有し、かくして、それらの欠失を用いて、同様なグリコシル化経路を持つ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは、同様に、いずれかの他の宿主細胞、例えば、真菌、植物、昆虫または動物細胞においてグリコシル化パターンを操作することができる。
【０１３３】
遺伝子ノック−アウトの創製は、一旦与えられた標的遺伝子配列が決定されると、当該分野におけるよく確立された技術であり、当業者が行うことができる（例えば、Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，ｐ．２８１参照）。宿主生物の選択は、良好な形質転換および遺伝子破壊技術の入手可能性によって影響され得る。
【０１３４】
もしいくつかのマンノシルトランスフェラーゼがノックアウトされるべきであれば、例えば、ＡｌａｎｉおよびＫｌｅｃｋｎｅｒによって開発された方法（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６：５４１−５４５（１９８７））は、選択マーカー、例えば、酵母におけるＵＲＡ３マーカーの反復された使用を可能として、全ての望ましくない内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性を順次に排除することができる。この技術は他者によって改良されているが、基本的には、逆選択マーカーに隣接する２つの反復ＤＮＡ配列の使用への近接を含む。例えば、ＵＲＡ３をマーカーとして用いて、構築物を取り込んだ形質転換体の選択を確実とすることができる。ＵＲＡ３マーカーに直接反復物を隣接させることによって、まず、構築物を取り込み、かくして、標的遺伝子を破壊した形質転換体を選択することができる。形質転換体の単離、およびその特徴付けの後、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に対して抵抗性であるものにつき第二ラウンドにて逆選択することができる。５−ＦＯＡを含有するプレート上で生存することができるコロニーは、先に述べた反復を含む交差事象を介して再度ＵＲＡ３マーカーを失っている。このアプローチは、かくして、同一マーカーの反復された使用を可能とし、さらなるマーカーを必要とすることなく複数遺伝子の破壊を容易とする。他の選択マーカーおよび逆選択マーカーを持つもう一つの真核生物宿主細胞で用いるのに適合された遺伝子の順次の排除のための同様な技術も用いることができる。
【０１３５】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）またはマンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮＮ６、またはｌｂｄ変異体を相補する遺伝子）のような特定のマンノシルトランスフェラーゼ、またはレギュレーター（ＭＮＮ４）の排除は、この生物の操作された株の創製を可能とし、該株は主にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を合成し、これを用いて、より複雑なグリコ形態構造、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト細胞で生産されるものに似るようにグリコシル化パターンをさらに改変することができる。この方法の好ましい実施形態は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同様なまたは同一の生化学的機能を排除して、遺伝子的に変更されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株で生産された糖タンパク質のグリコシル化構造を改変するために生化学的グリコシル化活性をコードするＤＮＡ配列を利用する。
【０１３６】
本明細書中で例示したような酵母におけるグリコシル化経路を操作するのに用いられる方法は、引き続いての修飾のために好ましい基質を生産するために糸状菌で用いることができる。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒおよび他の糸状菌におけるグリコシル化経路を改変するための戦略は、酵母においてヒト様糖タンパク質を生産するのに、株を操作するための本明細書中に記載したのと同様なプロトコルを用いて開発することができる。１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性、例えば、ＫＴＲ／ＫＲＥホモログに関与する望まない遺伝子活性を改変または排除する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌は好ましい宿主である。なぜならば、それは１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くからであり、それゆえ、この宿主において超マンノシル化遺伝子活性、例えば、ＯＣＨ１は予測されない。対照的に、グリコシル化に関与する他の所望の活性（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ））は、本発明の標的化方法を用いて宿主に導入される。
【０１３７】
（減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作または選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、すなわちＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造のα−１，３アーム上で外部鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素の活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の操作または使用を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素はＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＯＣＨ１遺伝子の破壊の結果、Ｎ結合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を得るための従前のアプローチはＯＣＨ１の不活化を必要とした（例えば、Ｃｈｉｂａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−３０４参照）。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、（選択された宿主細胞に応じて）、任意であり得る。というのはＯｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために無傷のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を必要とするからである。かくして、７以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積する本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Ｏｃｈ１ｐに対する貧弱な基質であるような低グリコシル化Ｎ−グリカンを生産することができる（例えば、Ｎａｋａｙａｍａら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２（３）：５４７−５０参照）。
【０１３８】
ＯＣＨ１遺伝子は、記載されているように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（実施例１）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ（実施例９）からクローン化された。Ｋ．ｌａｃｔｉｓからのＯＣＨ１遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を配列番号３および配列番号４に記載する。遺伝子特異的プライマーを用いて、各クローンから構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＯＣＨ１遺伝子を欠失させた（各々、実施例１および９）。開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇し、かつＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造を有するＮ−グリカンを生産するように操作された宿主細胞は、それにより、得られた（例えば、実施例４および９参照）。
【０１３９】
かくして、もう１つの実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子（配列番号３）の少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含む、またはそれよりなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む）が提供される。また、さらに本明細書中で記載するように、本発明の上記核酸分子を含む、発現ベクターを含めた、ベクターも提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
【０１４０】
本発明は、さらに、ａｌｇ遺伝子活性（すなわち、非真菌宿主細胞における同等な酵素活性を含めたａｌｇ活性）が減少した、または枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製し、または用い、少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を宿主細胞に導入する方法を提供する。好ましい実施形態において、グリコシダーゼ活性は、宿主細胞内で１以上のマンノシダーゼ活性の発現を引き起こすことによって、例えば、宿主細胞において、マンノシダーゼ活性の活性化によって、またはマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって導入される。
【０１４１】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク質を生産する方法を提供し、ここで、糖タンパク質はトリマンノースコア構造に結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。
【０１４２】
（下等真核生物におけるクラス２マンノシダーゼの発現）
本発明は、加えて、触媒的に活性なクラス２マンノシダーゼ（ＥＣ．３．２．１．１１４）（そのホモログ、改変体、誘導体および触媒的に活性なフラグメント）をコードする遺伝子を発現させることによって、下等真核生物宿主細胞においてよりヒト様の糖タンパク質を作製する方法を提供する。
【０１４３】
当該分野における公知の技術を用い、遺伝子特異的プライマーは、マンノシダーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するために、クラス２マンノシダーゼ遺伝子（例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  α−マンノシダーゼＩＩ）の相同領域を相補するように設計される。
【０１４４】
クラス２マンノシダーゼをコードする核酸からの細胞における活性なクラス２マンノシダーゼの発現を介して、宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、よりヒト様の糖タンパク質を生産するように操作される（例えば、実施例１７〜２５参照）。
【０１４５】
本発明の１つの局面において、α−マンノシダーゼＩＩ酵素のライブラリーを構築することによって下等真核生物（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてヒト様糖タンパク質を生産する方法が提供される。好ましい実施形態において、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  α−マンノシダーゼＩＩ配列のサブ−ライブラリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ７７６５２）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ２標的化ペプチド配列のサブ−ライブラリーに融合させる。本発明のより好ましい実施形態において、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ  Δ７４／ＭＮＮ２を含む融合構築物を、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主に形質転換する。ここで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１と命名される、上記Ｎ−グリカン構造を有する下等真核生物においてヒト様糖タンパク質を作製する方法を開示するＣｈｏｉら，Ｐｒｏｓ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ａｐｒ  ２９；１００（９）：５０２２−７およびＷＯ  ０２／００８７９参照。
【０１４６】
もう１つの実施形態において、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ配列はラット、マウス、ヒト、虫、植物、および昆虫から選択される。そのような配列はＳｗｉｓｓｐｒｏｔおよびＧｅｎｂａｎｋのようなデータベースで入手できる。例えば、以下の遺伝子のための配列がＧｅｎｂａｎｋで見出された：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ＿１２１４９９）；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ＿０７３５９４）；Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ（ＡＫ１１６６８４）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ  （Ｘ７７６５２）；ヒトマンノシダーゼＩＩ（Ｕ３１５２０）；マウスマンノシダーゼＩＩ（Ｘ６１１７２）；ラットマンノシダーゼＩＩ（ＸＭ＿２１８８１６）；ヒトマンノシダーゼＩＩｘ（Ｄ５５６４９）；昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ（ＡＦ００５０３４）；ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ＿０００５２８）；およびヒトサイトゾルマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ＿００６７１５）（各々、図２５〜３５、配列番号４９〜５９）。高い配列類似性、ならびにＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６活性の存在のため、細胞質マンノシダーゼＩＩおよびリソソームマンノシダーゼＩＩを、本明細書中では、集合的にクラス２マンノシダーゼという。
【０１４７】
ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ活性を示す他のマンノシダーゼとしては、とりわけ、昆虫マンノシダーゼＩＩＩ（ＡＦ００５０３４）およびヒトマンノシダーゼＩＩｘ（Ｄ５５６４９）が挙げられる。それゆえ、これらのマンノシダーゼを用いて、触媒的活性な酵素のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを創製することもできる。
【０１４８】
本発明のもう１つの局面において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＬＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２、Ｐｉｃｈｉａ  ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ  ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈｉａ  Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ  Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ  Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１、およびＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ６よりなる群から選択される標的化ペプチド配列（リーダー）のサブ−ライブラリーを、触媒的に活性なマンノシダーゼＩＩドメインをコードする配列に融合させる。リーダー／触媒ドメインライブラリーの組合せを表１１（実施例１４）に示す。
【０１４９】
本発明によって作製されたゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物は、α１，３およびα１，６マンノシダーゼトリミング活性を示す。例えば、触媒的に活性なマンノシダーゼＩＩ融合構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２〜ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に存在するＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を切断する。もう１つの例において、触媒的に活性なマンノシダーゼＩＩｘ融合構築物は、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に存在するＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を切断する。
【０１５０】
（グリコシド結合のクラス２マンノシダーゼ加水分解）
本発明はまた、クラス２酵素の触媒的に活性なドメインがオリゴ糖、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造上のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６グリコシド結合を加水分解して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（下等真核生物におけるさらなるＮ−グリカンプロセシングのための所望の中間体）を生成するメカニズムを含む。最初の実施形態において、グリコシド結合の加水分解は順次に起こる。該酵素は少なくとも１つのグリコシド結合を加水分解し、立体配座的に回転して、他のグリコシド結合を加水分解する。第二の実施形態において、グリコシド結合の加水分解は同時に起こる。生じた中間体はさらなるゴルジプロセシングのための基質であり、ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴｓ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴｓ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴｓ）のような他のグリコシル化酵素は順次にそれを修飾して、所望のグリコ形態を生じ得る。図３６ＡはマンノシダーゼＩＩ経路を介して生産されたオリゴ糖中間体（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２）を示し、図３６ＢはマンノシダーゼＩＩｘ経路を介して生産されたオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を示す。
【０１５１】
（マンノシダーゼＩＩ酵素の保存された領域）
マンノシダーゼＩＩ酵素の保存された領域をコードする配列を発現するのは本発明の特徴である。本発明は、昆虫、哺乳動物、植物および虫を含めた種々の供給源からのマンノシダーゼＩＩ遺伝子の保存された領域を含む単離された核酸分子を提供する。
【０１５２】
マンノシダーゼＩＩ酵素をコードするいくつかの全長核酸配列は同定され、配列決定されている。マンノシダーゼＩＩ酵素配列は配列番号４９〜配列番号５９に記載されている。公知のマンノシダーゼＩＩ配列の整列（すなわち、他の昆虫、動物および植物の配列に対して整列させたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は、アミノ酸１４４〜１６６およびアミノ酸２２２〜２８５の間の高度に保存されたモチーフを示す（図２３）。従って、もう１つの局面において、本発明はクラス２マンノシダーゼ酵素活性をコードする核酸を宿主細胞に提供する方法に関し、ここで、該核酸は上記保存されたマンノシダーゼＩＩ領域を有することによって特徴付けられる。
【０１５３】
さらに、配列整列は、さらに、図２３に示されたように、アミノ酸３３８〜３４５およびアミノ酸３４６〜３６０の間のいくつかの高度に保存されたシステイン−システインジスルフィド架橋を明らかにする。これらのジスルフィド架橋は、例えば、タンパク質構造を維持することによって、基質の結合および認識に不可欠な役割を演じることができる。
【０１５４】
本発明はまた、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する２３アミノ酸残基よりなる第一のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフラグメントも提供する：
【０１５５】
【化１】
0004792387.tif 000004
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４５位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｅ、Ｑ、ＮおよびＹよりなる群から選択される。
【０１５６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４６位におけるアミノ酸残基はＶおよびＩよりなる群から選択される。
【０１５７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４７位におけるアミノ酸残基はＦ、Ｉ、ＨおよびＬよりなる群から選択される。
【０１５８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４８位におけるアミノ酸残基はＶ、Ｉ、ＬおよびＴよりなる群から選択される。
【０１５９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４９位におけるアミノ酸残基はＶ、Ｉ、ＬおよびＤよりなる群から選択される。
【０１６０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５０位におけるアミノ酸残基はＰおよびＲよりなる群から選択される。
【０１６１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５１位におけるアミノ酸残基はＨおよびＬよりなる群から選択される。
【０１６２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５２位におけるアミノ酸残基はＳ、ＴおよびＧよりなる群から選択される。
【０１６３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５３位におけるアミノ酸残基はＨおよびＥよりなる群から選択される。
【０１６４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５４位におけるアミノ酸残基はＮ、Ｃ、ＤおよびＲよりなる群から選択される。
【０１６５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５６位におけるアミノ酸残基はＰおよびＶよりなる群から選択される。
【０１６６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５７位におけるアミノ酸残基はＧおよびＲよりなる群から選択される。
【０１６７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５８位におけるアミノ酸残基はＷおよびＬよりなる群から選択される。
【０１６８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５９位におけるアミノ酸残基はＩ、Ｌ、ＫおよびＴよりなる群から選択される。
【０１６９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６０位におけるアミノ酸残基はＱ、Ｍ、ＫおよびＬよりなる群から選択される。
【０１７０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６１位におけるアミノ酸残基はＴおよびＹよりなる群から選択される。
【０１７１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６２位におけるアミノ酸残基はＦおよびＶよりなる群から選択される。
【０１７２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６３位におけるアミノ酸残基はＥ、ＤおよびＮよりなる群から選択される。
【０１７３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６４位におけるアミノ酸残基はＥ、Ｋ、Ｄ、Ｒ、ＱおよびＶよりなる群から選択される。
【０１７４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６５位におけるアミノ酸残基はＹおよびＡよりなる群から選択される。
【０１７５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６６位におけるアミノ酸残基はＹ、ＦおよびＣよりなる群から選択される。
【０１７６】
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する５７アミノ酸残基よりなる第二のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフラグメントを提供する：
【０１７７】
【化２】
0004792387.tif 000005
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２２位におけるアミノ酸残基はＥおよびＲよりなる群から選択される。
【０１７８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２３位におけるアミノ酸残基はＦ、ＩおよびＳよりなる群から選択される。
【０１７９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２４位におけるアミノ酸残基はＶ、Ａ、ＴおよびＦよりなる群から選択される。
【０１８０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２５位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｇ、ＮおよびＱよりなる群から選択される。
【０１８１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２６位におけるアミノ酸残基はＧおよびＡよりなる群から選択される。
【０１８２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２７位におけるアミノ酸残基はＧおよびＬよりなる群から選択される。
【０１８３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２８位におけるアミノ酸残基はＷおよびＹよりなる群から選択される。
【０１８４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２９位におけるアミノ酸残基はＶおよびＴよりなる群から選択される。
【０１８５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３０位におけるアミノ酸残基はＭおよびＡよりなる群から選択される。
【０１８６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３１位におけるアミノ酸残基はＰ、ＴおよびＮよりなる群から選択される。
【０１８７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３２位におけるアミノ酸残基はＤおよびＱよりなる群から選択される。
【０１８８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３３位におけるアミノ酸残基はＥおよびＭよりなる群から選択される。
【０１８９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３４位におけるアミノ酸残基はＡおよびＶよりなる群から選択される。
【０１９０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３５位におけるアミノ酸残基はＮ、Ｔ、ＣおよびＡよりなる群から選択される。
【０１９１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３６位におけるアミノ酸残基はＳ、Ａ、Ｐ、ＴおよびＶよりなる群から選択される。
【０１９２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３７位におけるアミノ酸残基はＨおよびＣよりなる群から選択される。
【０１９３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３８位におけるアミノ酸残基はＷ、Ｙ、ＩおよびＤよりなる群から選択される。
【０１９４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３９位におけるアミノ酸残基はＲ、Ｈ、Ｆ、Ｙ、ＧおよびＰよりなる群から選択される。
【０１９５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４０位におけるアミノ酸残基はＮ、ＳおよびＡよりなる群から選択される。
【０１９６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４１位におけるアミノ酸残基はＶ、Ｍ、Ｌ、ＩおよびＱよりなる群から選択される。
【０１９７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４２位におけるアミノ酸残基はＬ、Ｉ、ＶおよびＰよりなる群から選択される。
【０１９８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４３位におけるアミノ酸残基はＬ、Ｔ、Ｇ、ＤおよびＥよりなる群から選択される。
【０１９９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４４位におけるアミノ酸残基はＱ、ＥおよびＴよりなる群から選択される。
【０２００】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４５位におけるアミノ酸残基はＬ、ＭおよびＦよりなる群から選択される。
【０２０１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４６位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｆ、Ｉ、ＡおよびＰよりなる群から選択される。
【０２０２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４７位におけるアミノ酸残基はＥ、ＬおよびＶよりなる群から選択される。
【０２０３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４８位におけるアミノ酸残基はＧおよびＡよりなる群から選択される。
【０２０４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４９位におけるアミノ酸残基はＱ、Ｈ、Ｐ、Ｍ、ＮおよびＬよりなる群から選択される。
【０２０５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５０位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、ＲおよびＡよりなる群から選択される。
【０２０６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５１位におけるアミノ酸残基はＷ、Ｐ、ＦおよびＬよりなる群から選択される。
【０２０７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５２位におけるアミノ酸残基はＬ、Ｉ、ＶおよびＡよりなる群から選択される。
【０２０８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５３位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、ＮおよびＳよりなる群から選択される。
【０２０９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５４位におけるアミノ酸残基はＱ、Ｎ、Ｒ、Ｋ、ＤおよびＴよりなる群から選択される。
【０２１０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５５位におけるアミノ酸残基はＦ、Ｈ、ＮおよびＴよりなる群から選択される。
【０２１１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５６位におけるアミノ酸残基はＭ、Ｉ、ＬおよびＦよりなる群から選択される。
【０２１２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５７位におけるアミノ酸残基はＮおよびＧよりなる群から選択される。
【０２１３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５８位におけるアミノ酸残基はＶ、Ａ、ＧおよびＨよりなる群から選択される。
【０２１４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５９位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＧよりなる群から選択される。
【０２１５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６０位におけるアミノ酸残基はＰおよびＧよりなる群から選択される。
【０２１６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６１位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｑ、Ｒ、ＫおよびＥよりなる群から選択される。
【０２１７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６２位におけるアミノ酸残基はＡ、Ｓ、Ｎ、ＴおよびＶよりなる群から選択される。
【０２１８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６３位におけるアミノ酸残基はＳ、Ｈ、Ｇ、ＡおよびＱよりなる群から選択される。
【０２１９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６４位におけるアミノ酸残基はＷおよびＨよりなる群から選択される。
【０２２０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６５位におけるアミノ酸残基はＡ、Ｓ、ＨおよびＴよりなる群から選択される。
【０２２１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６６位におけるアミノ酸残基はＩおよびＶよりなる群から選択される。
【０２２２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６７位におけるアミノ酸残基はＤおよびＨよりなる群から選択される。
【０２２３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６８位におけるアミノ酸残基はＰおよびＡよりなる群から選択される。
【０２２４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６９位におけるアミノ酸残基はＦおよびＴよりなる群から選択される。
【０２２５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７１位におけるアミノ酸残基はＨ、ＬおよびＹよりなる群から選択される。
【０２２６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７２位におけるアミノ酸残基はＳ、Ｔ、ＧおよびＣよりなる群から選択される。
【０２２７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７３位におけるアミノ酸残基はＰ、Ｓ、Ａ、ＲおよびＨよりなる群から選択される。
【０２２８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７４位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｓ、ＥおよびＩよりなる群から選択される。
【０２２９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７５位におけるアミノ酸残基はＭ、Ｖ、ＱおよびＤよりなる群から選択される。
【０２３０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７６位におけるアミノ酸残基はＰ、ＡおよびＴよりなる群から選択される。
【０２３１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７７位におけるアミノ酸残基はＹ、Ｈ、ＳおよびＡよりなる群から選択される。
【０２３２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７８位におけるアミノ酸残基はＩ、ＬおよびＷよりなる群から選択される。
【０２３３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７９位におけるアミノ酸残基はＬおよびＦよりなる群から選択される。
【０２３４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８０位におけるアミノ酸残基はＱ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｄ、ＡおよびＷよりなる群から選択される。
【０２３５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８１位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｓ、Ｒ、ＱおよびＰよりなる群から選択される。
【０２３６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８２位におけるアミノ酸残基はＳ、ＡおよびＭよりなる群から選択される。
【０２３７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８３位におけるアミノ酸残基はＧ、ＮおよびＫよりなる群から選択される。
【０２３８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８４位におけるアミノ酸残基はＦ、ＩおよびＬよりなる群から選択される。
【０２３９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８５位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｔ、Ｓ、ＥおよびＤよりなる群から選択される。
【０２４０】
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する３３アミノ酸残基よりなる第三のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフラグメントも提供する：
【０２４１】
【化３】
0004792387.tif 000006
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２５位におけるアミノ酸残基はＨ、ＰおよびＳよりなる群から選択される。
【０２４２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２６位におけるアミノ酸残基はＭ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、ＴおよびＲよりなる群から選択される。
【０２４３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２７位におけるアミノ酸残基はＭ、Ｑ、ＡおよびＹよりなる群から選択される。
【０２４４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２８位におけるアミノ酸残基はＰおよびＤよりなる群から選択される。
【０２４５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２９位におけるアミノ酸残基はＦ、ＬおよびＧよりなる群から選択される。
【０２４６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３０位におけるアミノ酸残基はＹ、Ｄ、ＦおよびＬよりなる群から選択される。
【０２４７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３１位におけるアミノ酸残基はＳ、Ｉ、ＴおよびＹよりなる群から選択される。
【０２４８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３２位におけるアミノ酸残基はＹ、ＧおよびＳよりなる群から選択される。
【０２４９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３３位におけるアミノ酸残基はＤ、Ｓ、ＶおよびＲよりなる群から選択される。
【０２５０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３４位におけるアミノ酸残基はＩ、ＶおよびＬよりなる群から選択される。
【０２５１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３５位におけるアミノ酸残基はＰ、ＫおよびＱよりなる群から選択される。
【０２５２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３６位におけるアミノ酸残基はＨ、Ｓ、ＮおよびＥよりなる群から選択される。
【０２５３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３７位におけるアミノ酸残基はＴ、ＧおよびＦよりなる群から選択される。
【０２５４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３８位におけるアミノ酸残基はＣ、ＹおよびＡよりなる群から選択される。
【０２５５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３９位におけるアミノ酸残基はＧ、ＮおよびＣよりなる群から選択される。
【０２５６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４０位におけるアミノ酸残基はＰおよびＲよりなる群から選択される。
【０２５７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４１位におけるアミノ酸残基はＤ、Ｅ、Ｈ、ＰおよびＧよりなる群から選択される。
【０２５８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４２位におけるアミノ酸残基はＰ、ＲおよびＱよりなる群から選択される。
【０２５９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４３位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｓ、Ａ、ＮおよびＦよりなる群から選択される。
【０２６０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４４位におけるアミノ酸残基はＶ、ＩおよびＬよりなる群から選択される。
【０２６１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４５位におけるアミノ酸残基はＣおよびＰよりなる群から選択される。
【０２６２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４６位におけるアミノ酸残基はＣ、Ｌ、ＷおよびＶよりなる群から選択される。
【０２６３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４７位におけるアミノ酸残基はＱ、Ｓ、ＤおよびＧよりなる群から選択される。
【０２６４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４８位におけるアミノ酸残基はＦ、ＶおよびＧよりなる群から選択される。
【０２６５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４９位におけるアミノ酸残基はＤ、ＬおよびＴよりなる群から選択される。
【０２６６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５０位におけるアミノ酸残基はＦ、ＣおよびＷよりなる群から選択される。
【０２６７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５１位におけるアミノ酸残基はＲ、Ｋ、ＡおよびＶよりなる群から選択される。
【０２６８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５２位におけるアミノ酸残基はＲ、Ｋ、ＤおよびＥよりなる群から選択される。
【０２６９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５３位におけるアミノ酸残基はＭ、Ｌ、ＩおよびＱよりなる群から選択される。
【０２７０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５４位におけるアミノ酸残基はＧ、Ｐ、ＲおよびＤよりなる群から選択される。
【０２７１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５５位におけるアミノ酸残基はＳ、Ｅ、Ｇよりなる群から選択される。
【０２７２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５６位におけるアミノ酸残基はＦ、ＧおよびＮよりなる群から選択される。
【０２７３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５７位におけるアミノ酸残基はＧ、Ｒ、ＫおよびＬよりなる群から選択される。
【０２７４】
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する２８アミノ酸残基よりなる第四のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフラグメントを提供する：
【０２７５】
【化４】
0004792387.tif 000007
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８０位におけるアミノ酸残基はＬ、Ｍ、Ｉ、Ｋ、ＴおよびＹよりなる群から選択される。
【０２７６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８１位におけるアミノ酸残基はＬ、Ｉ、ＦおよびＣよりなる群から選択される。
【０２７７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８２位におけるアミノ酸残基はＶ、Ｙ、Ｌ、ＩおよびＳよりなる群から選択される。
【０２７８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８３位におけるアミノ酸残基はＤ、Ｅ、ＮおよびＫよりなる群から選択される。
【０２７９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８４位におけるアミノ酸残基はＱ、Ｅ、ＶおよびＦよりなる群から選択される。
【０２８０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８５位におけるアミノ酸残基はＷ、ＹおよびＡよりなる群から選択される。
【０２８１】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８６位におけるアミノ酸残基はＲ、Ｄ、ＴおよびＬよりなる群から選択される。
【０２８２】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８７位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｒ、ＡおよびＰよりなる群から選択される。
【０２８３】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８８位におけるアミノ酸残基はＫ、Ｉ、ＱおよびＤよりなる群から選択される。
【０２８４】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８９位におけるアミノ酸残基はＡ、Ｓ、ＧおよびＴよりなる群から選択される。
【０２８５】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９０位におけるアミノ酸残基はＥ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、ＳおよびＦよりなる群から選択される。
【０２８６】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９１位におけるアミノ酸残基はＬ、ＹおよびＧよりなる群から選択される。
【０２８７】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９２位におけるアミノ酸残基はＹ、ＦおよびＴよりなる群から選択される。
【０２８８】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９３位におけるアミノ酸残基はＲ、ＰおよびＳよりなる群から選択される。
【０２８９】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９４位におけるアミノ酸残基はＴ、Ｎ、Ｓ、ＨおよびＡよりなる群から選択される。
【０２９０】
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９５位におけるアミノ酸残基はＮ、Ｓ、Ｋ、ＤおよびＱよりなる群から選択される。
【０２９１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９６におけるアミノ酸残基はＶＴＨおよびＬよりなる群から選択される。
【０２９２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９７におけるアミノ酸残基はＬＩＶＴおよびＰよりなる群から選択される。
【０２９３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９８におけるアミノ酸残基はＬＦＶおよびＱよりなる群から選択される。
【０２９４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９９におけるアミノ酸残基はＩＱＶＡおよびＭよりなる群から選択される。
【０２９５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４００におけるアミノ酸残基はＰＩＴおよびＭよりなる群から選択される。
【０２９６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０１におけるアミノ酸残基はＬＭおよびＨよりなる群から選択される。
【０２９７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０３におけるアミノ酸残基はＤＳおよびＣよりなる群から選択される。
【０２９８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０４におけるアミノ酸残基はＤおよびＧよりなる群から選択される。
【０２９９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０５におけるアミノ酸残基はＦおよびＩよりなる群から選択される。
【０３００】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０６におけるアミノ酸残基はＲおよびＱよりなる群から選択される。
【０３０１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０７におけるアミノ酸残基はＦＹおよびＲよりなる群から選択される。
【０３０２】
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
４３８
Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ（配列番号：９）
を有する１２アミノ酸残基よりなる第五のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
【０３０３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４３８におけるアミノ酸残基はＱＫＬおよびＨよりなる群から選択される。
【０３０４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４３９におけるアミノ酸残基はＦおよびＹよりなる群から選択される。
【０３０５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４０におけるアミノ酸残基はＧＳおよびＰよりなる群から選択される。
【０３０６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４１におけるアミノ酸残基はＴおよびＰよりなる群から選択される。
【０３０７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４２におけるアミノ酸残基はＬＰおよびＧよりなる群から選択される。
【０３０８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４３におけるアミノ酸残基はＱＳＥＬＡおよびＤよりなる群から選択される。
【０３０９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４４におけるアミノ酸残基はＥＤＣおよびＳよりなる群から選択される。
【０３１０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４５におけるアミノ酸残基はＹおよびＦよりなる群から選択される。
【０３１１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４６におけるアミノ酸残基はＦＬおよびＧよりなる群から選択される。
【０３１２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４７におけるアミノ酸残基はＤＫＲＮＷおよびＭよりなる群から選択される。
【０３１３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４８におけるアミノ酸残基はＡＫＴＥおよびＱよりなる群から選択される。
【０３１４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４９におけるアミノ酸残基はＶＬＭおよびＧよりなる群から選択される。
【０３１５】
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
４６３
Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ（配列番号：１０）
を有する１４アミノ酸残基よりなる第六のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
【０３１６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６３におけるアミノ酸残基はＬＦおよびＫよりなる群から選択される。
【０３１７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６４におけるアミノ酸残基はＳＫＨおよびＤよりなる群から選択される。
【０３１８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６５におけるアミノ酸残基はＧＤおよびＶよりなる群から選択される。
【０３１９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６６におけるアミノ酸残基はＤおよびＡよりなる群から選択される。
【０３２０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６７におけるアミノ酸残基はＦおよびＮよりなる群から選択される。
【０３２１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６８におけるアミノ酸残基はＦおよびＮよりなる群から選択される。
【０３２２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６９におけるアミノ酸残基はＴＳＶＰおよびＲよりなる群から選択される。
【０３２３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７０におけるアミノ酸残基はＹおよびＤよりなる群から選択される。
【０３２４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７１におけるアミノ酸残基はＡＳおよびＫよりなる群から選択される。
【０３２５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７２におけるアミノ酸残基はＤおよびＧよりなる群から選択される。
【０３２６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７３におけるアミノ酸残基はＲＩおよびＧよりなる群から選択される。
【０３２７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７４におけるアミノ酸残基はＳＤＥＱＦＰおよびＡよりなる群から選択される。
【０３２８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７５におけるアミノ酸残基はＤＱＳＨおよびＮよりなる群から選択される。
【０３２９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７６におけるアミノ酸残基はＮＨＤＥおよびＱよりなる群から選択される。
【０３３０】
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
４７７
Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ（配列番号：１１）
を有する２０アミノ酸残基よりなる第７番目のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
【０３３１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７７におけるアミノ酸残基はＹおよびＦよりなる群から選択される。
【０３３２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７８におけるアミノ酸残基はＷおよびＧよりなる群から選択される。
【０３３３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７９におけるアミノ酸残基はＳＴおよびＦよりなる群から選択される。
【０３３４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８１におけるアミノ酸残基はＹおよびＤよりなる群から選択される。
【０３３５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８２におけるアミノ酸残基はＹＦおよびＧよりなる群から選択される。
【０３３６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８３におけるアミノ酸残基はＴＶＳおよびＧよりなる群から選択される。
【０３３７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８４におけるアミノ酸残基はＳＴおよびＧよりなる群から選択される。
【０３３８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８５におけるアミノ酸残基はＲおよびＧよりなる群から選択される。
【０３３９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８７におけるアミノ酸残基はＹＦＡおよびＴよりなる群から選択される。
【０３４０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８８におけるアミノ酸残基はＨＹＦＬおよびＱよりなる群から選択される。
【０３４１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８９におけるアミノ酸残基はＫおよびＴよりなる群から選択される。
【０３４２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９０におけるアミノ酸残基はＲＱＳＭＡおよびＩよりなる群から選択される。
【０３４３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９１におけるアミノ酸残基はＭＬＱＶおよびＹよりなる群から選択される。
【０３４４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９２におけるアミノ酸残基はＤＥおよびＡよりなる群から選択される。
【０３４５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９４におけるアミノ酸残基はＶＩＱおよびＬよりなる群から選択される。
【０３４６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９５におけるアミノ酸残基はＬＭＦＳおよびＫよりなる群から選択される。
【０３４７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９６におけるアミノ酸残基はＭＱＥＹおよびＲよりなる群から選択される。
【０３４８】
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
５２４
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ（配列番号：１２）
を有する２７アミノ酸残基よりなる第八のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
【０３４９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２４におけるアミノ酸残基はＡＬおよびＷよりなる群から選択される。
【０３５０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２５におけるアミノ酸残基はＲＮおよびＶよりなる群から選択される。
【０３５１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２６におけるアミノ酸残基はＲＱＥおよびＧよりなる群から選択される。
【０３５２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２７におけるアミノ酸残基はＥＡＴおよびＮよりなる群から選択される。
【０３５３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２８におけるアミノ酸残基はＬおよびＭよりなる群から選択される。
【０３５４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２９におけるアミノ酸残基はＳＧＡおよびＦよりなる群から選択される。
【０３５５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３０におけるアミノ酸残基はＬおよびＶよりなる群から選択される。
【０３５６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３１におけるアミノ酸残基はＦＬおよびＥよりなる群から選択される。
【０３５７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３２におけるアミノ酸残基はＱおよびＬよりなる群から選択される。
【０３５８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３４におけるアミノ酸残基はＨおよびＮよりなる群から選択される。
【０３５９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３５におけるアミノ酸残基はＤおよびＧよりなる群から選択される。
【０３６０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３６におけるアミノ酸残基はＧＡおよびＴよりなる群から選択される。
【０３６１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３７におけるアミノ酸残基はＩＶおよびＹよりなる群から選択される。
【０３６２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３８におけるアミノ酸残基はＴおよびＳよりなる群から選択される。
【０３６３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３９におけるアミノ酸残基はＧおよびＴよりなる群から選択される。
【０３６４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４０におけるアミノ酸残基はＴおよびＨよりなる群から選択される。
【０３６５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４１におけるアミノ酸残基はＡおよびＳよりなる群から選択される。
【０３６６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４２におけるアミノ酸残基はＫＲおよびＱよりなる群から選択される。
【０３６７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４３におけるアミノ酸残基はＴＤＥＳＱおよびＩよりなる群から選択される。
【０３６８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４４におけるアミノ酸残基はＨＡＷＹＳおよびＫよりなる群から選択される。
【０３６９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４５におけるアミノ酸残基はＶおよびＫよりなる群から選択される。
【０３７０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４６におけるアミノ酸残基はＶＭＡおよびＧよりなる群から選択される。
【０３７１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４７におけるアミノ酸残基はＶＬＱおよびＮよりなる群から選択される。
【０３７２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４８におけるアミノ酸残基はＤおよびＲよりなる群から選択される。
【０３７３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４９におけるアミノ酸残基はＹおよびＥよりなる群から選択される。
【０３７４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５５０におけるアミノ酸残基はＥＧＡおよびＣよりなる群から選択される。
【０３７５】
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
７８８
Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｌａ（配列番号：１３）
を有する１１アミノ酸残基よりなる第九のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
【０３７６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７８９におけるアミノ酸残基はＡおよびＷよりなる群から選択される。
【０３７７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９０におけるアミノ酸残基はＹおよびＤよりなる群から選択される。
【０３７８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９１におけるアミノ酸残基はＬＩおよびＶよりなる群から選択される。
【０３７９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９２におけるアミノ酸残基はＦおよびＭよりなる群から選択される。
【０３８０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９３におけるアミノ酸残基はＬＫＭＲおよびＤよりなる群から選択される。
【０３８１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９４におけるアミノ酸残基はＰおよびＹよりなる群から選択される。
【０３８２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９５におけるアミノ酸残基はＮＤＡおよびＨよりなる群から選択される。
【０３８３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９６におけるアミノ酸残基はＧＮＹＱおよびＬよりなる群から選択される。
【０３８４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９７におけるアミノ酸残基はＰＥＱＮおよびＤよりなる群から選択される。
【０３８５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９８におけるアミノ酸残基はＡＧＳＫおよびＴよりなる群から選択される。
【０３８６】
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
８６７
Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ（配列番号：１４）を有する１４アミノ酸残基よりなる第十アミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
【０３８７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８６７におけるアミノ酸残基はＦＴおよびＹよりなる群から選択される。
【０３８８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８６８におけるアミノ酸残基はＹＦＳおよびＥよりなる群から選択される。
【０３８９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８６９におけるアミノ酸残基はＴＩおよびＳよりなる群から選択される。
【０３９０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７０におけるアミノ酸残基はＤおよびＱよりなる群から選択される。
【０３９１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７１におけるアミノ酸残基はＬＴＱＳおよびＦよりなる群から選択される。
【０３９２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７２におけるアミノ酸残基はＮＳおよびＧよりなる群から選択される。
【０３９３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７３におけるアミノ酸残基はＧＴおよびＨよりなる群から選択される。
【０３９４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７４におけるアミノ酸残基はＬＭＦＡＹおよびＲよりなる群から選択される。
【０３９５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７５におけるアミノ酸残基はＱＲおよびＥよりなる群から選択される。
【０３９６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７６におけるアミノ酸残基はＦＭＶＩＹおよびＲよりなる群から選択される。
【０３９７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７７におけるアミノ酸残基はＩＱＳＬおよびＰよりなる群から選択される。
【０３９８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７８におけるアミノ酸残基はＫＰＲＥおよびＴよりなる群から選択される。
【０３９９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７９におけるアミノ酸残基はＲおよびＨよりなる群から選択される。
【０４００】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８８０におけるアミノ酸残基はＲＭＴＥＶおよびＹよりなる群から選択される。
【０４０１】
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
９０４
Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ（配列番号：１５）を有する６６アミノ酸残基よりなる第十一アミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
【０４０２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０４におけるアミノ酸残基はＮＴＱＥおよびＫよりなる群から選択される。
【０４０３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０５におけるアミノ酸残基はＴＲＫＨＳＱＭおよびＦよりなる群から選択される。
【０４０４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０６におけるアミノ酸残基はＲＱおよびＧよりなる群から選択される。
【０４０５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０７におけるアミノ酸残基はＬＭおよびＦよりなる群から選択される。
【０４０６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０８におけるアミノ酸残基はＴＳおよびＡよりなる群から選択される。
【０４０７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０９におけるアミノ酸残基はＬＩおよびＶよりなる群から選択される。
【０４０８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１０におけるアミノ酸残基はＬＨおよびＭよりなる群から選択される。
【０４０９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１１におけるアミノ酸残基はＴＳおよびＮよりなる群から選択される。
【０４１０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１２におけるアミノ酸残基はＧＡＲＮおよびＤよりなる群から選択される。
【０４１１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１３におけるアミノ酸残基はＱＨＲおよびＣよりなる群から選択される。
【０４１２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１４におけるアミノ酸残基はＰＡＳおよびＫよりなる群から選択される。
【０４１３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１５におけるアミノ酸残基はＬＱおよびＹよりなる群から選択される。
【０４１４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１７におけるアミノ酸残基はＧＶおよびＡよりなる群から選択される。
【０４１５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１８におけるアミノ酸残基はＳおよびＡよりなる群から選択される。
【０４１６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１９におけるアミノ酸残基はＳおよびＡよりなる群から選択される。
【０４１７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２０におけるアミノ酸残基はＬＭおよびＹよりなる群から選択される。
【０４１８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２１におけるアミノ酸残基はＡＳＧＫＥＲおよびＶよりなる群から選択される。
【０４１９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２２におけるアミノ酸残基はＳＮＤＥＰおよびＲよりなる群から選択される。
【０４２０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２４におけるアミノ酸残基はＥＱＷＲおよびＳよりなる群から選択される。
【０４２１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２５におけるアミノ酸残基はＬおよびＩよりなる群から選択される。
【０４２２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２６におけるアミノ酸残基はＥおよびＬよりなる群から選択される。
【０４２３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２７におけるアミノ酸残基はＩＶＬおよびＳよりなる群から選択される。
【０４２４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２８におけるアミノ酸残基はＭＩＦＶおよびＬよりなる群から選択される。
【０４２５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２９におけるアミノ酸残基はＱＬＭＶおよびＳよりなる群から選択される。
【０４２６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３０におけるアミノ酸残基はＤＨおよびＬよりなる群から選択される。
【０４２７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３１におけるアミノ酸残基はＲおよびＬよりなる群から選択される。
【０４２８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３３におけるアミノ酸残基はＬＴおよびＡよりなる群から選択される。
【０４２９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３４におけるアミノ酸残基はＡＳＭＶＬおよびＰよりなる群から選択される。
【０４３０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３５におけるアミノ酸残基はＳＱＲＹおよびＫよりなる群から選択される。
【０４３１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３６におけるアミノ酸残基はＤおよびＡよりなる群から選択される。
【０４３２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３７におけるアミノ酸残基はＤおよびＰよりなる群から選択される。
【０４３３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３８におけるアミノ酸残基はＥＮＧＦおよびＤよりなる群から選択される。
【０４３４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３９におけるアミノ酸残基はＲおよびＡよりなる群から選択される。
【０４３５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４０におけるアミノ酸残基はＧおよびＴよりなる群から選択される。
【０４３６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４１におけるアミノ酸残基はＬＶＩおよびＡよりなる群から選択される。
【０４３７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４２におけるアミノ酸残基はＧＱＥＳおよびＤよりなる群から選択される。
【０４３８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４３におけるアミノ酸残基はＱＥおよびＴよりなる群から選択される。
【０４３９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４４におけるアミノ酸残基はＧおよびＰよりなる群から選択される。
【０４４０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４５におけるアミノ酸残基はＶＬＩおよびＲよりなる群から選択される。
【０４４１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４６におけるアミノ酸残基はＬＲＫＨＱＭおよびＶよりなる群から選択される。
【０４４２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４７におけるアミノ酸残基はＤおよびＥよりなる群から選択される。
【０４４３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４８におけるアミノ酸残基はＮおよびＦよりなる群から選択される。
【０４４４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４９におけるアミノ酸残基はＫＬＲＧおよびＴよりなる群から選択される。
【０４４５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５０におけるアミノ酸残基はＰＲＩＡＳおよびＹよりなる群から選択される。
【０４４６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５１におけるアミノ酸残基はＶＴＭＧおよびＡよりなる群から選択される。
【０４４７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５２におけるアミノ酸残基はＬＶＣＡＰＴよりなる群から選択される。
【０４４８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５３におけるアミノ酸残基はＨＡＮＥＶＦＷおよびＭよりなる群から選択される。
【０４４９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５４におけるアミノ酸残基はＩＨＲＬＳＶＱおよびＰよりなる群から選択される。
【０４５０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５５におけるアミノ酸残基はＹＦＮＲおよびＨよりなる群から選択される。
【０４５１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５６におけるアミノ酸残基はＲＶＨＷＧおよびＫよりなる群から選択される。
【０４５２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５７におけるアミノ酸残基はＬＩＲおよびＧよりなる群から選択される。
【０４５３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５８におけるアミノ酸残基はＶＬＭＨおよびＳよりなる群から選択される。
【０４５４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５９におけるアミノ酸残基はＬＩＡＦよりなる群から選択される。
【０４５５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６０におけるアミノ酸残基はＥＶおよびＱよりなる群から選択される。
【０４５６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６１におけるアミノ酸残基はＫＰＲＳＬおよびＤよりなる群から選択される。
【０４５７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６２におけるアミノ酸残基はＶＭＲＷＮＬおよびＡよりなる群から選択される。
【０４５８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６３におけるアミノ酸残基はＮＳＴＩＰＤおよびＧよりなる群から選択される。
【０４５９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６４におけるアミノ酸残基はＮＳＬＶＡＧおよびＴよりなる群から選択される。
【０４６０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６５におけるアミノ酸残基はＣＳＭＧＶＩＱおよびＡよりなる群から選択される。
【０４６１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６６におけるアミノ酸残基はＶＳＮＡＴおよびＱよりなる群から選択される。
【０４６２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６７におけるアミノ酸残基はＲＧＰＭＴＡおよびＤよりなる群から選択される。
【０４６３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６８におけるアミノ酸残基はＰＮＥＫおよびＡよりなる群から選択される。
【０４６４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６９におけるアミノ酸残基はＳＫＶＥＡＫおよびＹよりなる群から選択される。
【０４６５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７０におけるアミノ酸残基はＫＱＥＳＲおよびＡよりなる群から選択される。
【０４６６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７１におけるアミノ酸残基はＬＥＱＤＫＮおよびＧよりなる群から選択される。
【０４６７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７２におけるアミノ酸残基はＨＥＳＫＴおよびＮよりなる群から選択される。
【０４６８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７３におけるアミノ酸残基はＰＲＳＫおよびＮよりなる群から選択される。
【０４６９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７４におけるアミノ酸残基はＡＶＴＬＰおよびＹよりなる群から選択される。
【０４７０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７５におけるアミノ酸残基はＧＳＡＲおよびＱよりなる群から選択される。
【０４７１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７６におけるアミノ酸残基はＹＦＮおよびＶよりなる群から選択される。
【０４７２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７７におけるアミノ酸残基はＬＨおよびＰよりなる群から選択される。
【０４７３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７８におけるアミノ酸残基はＴＳおよびＬよりなる群から選択される。
【０４７４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７９におけるアミノ酸残基はＳＨＬＭおよびＱよりなる群から選択される。
【０４７５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８０におけるアミノ酸残基はＡＶＬおよびＴよりなる群から選択される。
【０４７６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８１におけるアミノ酸残基はＡＧＳＶおよびＬよりなる群から選択される。
【０４７７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８２におけるアミノ酸残基はＨＹＤＬおよびＰよりなる群から選択される。
【０４７８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８３におけるアミノ酸残基はＫＬＭＩＱＹおよびＡよりなる群から選択される。
【０４７９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８４におけるアミノ酸残基はＡＴＳＩＬおよびＰよりなる群から選択される。
【０４８０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８５におけるアミノ酸残基はＳＴＧおよびＥよりなる群から選択される。
【０４８１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８６におけるアミノ酸残基はＱＷＭＳＡＲおよびＰよりなる群から選択される。
【０４８２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８７におけるアミノ酸残基はＳＹＦＬＥＨＭおよびＡよりなる群から選択される。
【０４８３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８８におけるアミノ酸残基はＬＭＦＶおよびＰよりなる群から選択される。
【０４８４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８９におけるアミノ酸残基はＬＨＮおよびＡよりなる群から選択される。
【０４８５】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９０におけるアミノ酸残基はＤＹＴＡおよびＨよりなる群から選択される。
【０４８６】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９１におけるアミノ酸残基はＰおよびＳよりなる群から選択される。
【０４８７】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９２におけるアミノ酸残基はＬＰＡＦＶＩＱおよびＷよりなる群から選択される。
【０４８８】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９３におけるアミノ酸残基はＤＶＬＩＲＮおよびＳよりなる群から選択される。
【０４８９】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９４におけるアミノ酸残基はＫＶＡＰおよびＴよりなる群から選択される。
【０４９０】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９５におけるアミノ酸残基はＦＭＬおよびＹよりなる群から選択される。
【０４９１】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９６におけるアミノ酸残基はＩＰＶＡＳおよびＬよりなる群から選択される。
【０４９２】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９７におけるアミノ酸残基はＦＧＶＬＮＡおよびＰよりなる群から選択される。
【０４９３】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９８におけるアミノ酸残基はＡＤＡＳＮＫおよびＧよりなる群から選択される。
【０４９４】
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９９におけるアミノ酸残基はＥＡＫＲＧＴおよびＳよりなる群から選択される。
【０４９５】
（下等真核生物におけるクラスＩＩＩマンノシダーゼの発現）
また、本発明は、Ｍａｎα１，２／Ｍａｎα１，３／Ｍａｎα１，６に対する基質特異性を有するマンノシダーゼが下等真核生物宿主に導入されることも提供する。
【０４９６】
１つの具体例において、Ｍａｎα１，２／Ｍａｎα１，３／Ｍａｎα１，６グリコシド結合を加水分解することができるクラスＩＩＩマンノシダーゼは下等真核生物宿主で発現される。インビボにてクラスＩＩＩマンノシダーゼを発現することによって、単独、あるいは他のＮ−グリカン修飾酵素と組合せて、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対する高マンノース構造の効果的なトリミングが宿主糖タンパク質で得られる。
【０４９７】
好ましい具体例において、Ｓｆ９マンノシダーゼＩＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｇｉ：２２４５５６７（Ｄ．Ｊａｒｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７  ７：１１３−１２７））が、構成的または誘導性プロモーターの制御下で酵母組込プラスミドにクローン化される（実施例２６参照）。クラスＩＩＩマンノシダーゼ活性の量は、細胞に対する有害な効果を制限しつつ最適化される。これはプロモーターの強度を改変することを含み、誘導性またはそうでなければ調節可能なプロモーターを用いてこれらのタンパク質の発現を最良に制御することも含み得る。
【０４９８】
野生型クラスＩＩＩマンノシダーゼを発現することに加え、クラスＩＩＩマンノシダーゼの修飾された形態を発現させて、細胞局在化および活性を増強させることができる。これは、本明細書中に記載するように、クラスＩＩＩマンノシダーゼの種々の長さの触媒ドメインを内因性酵母標的化領域に融合させることによって、本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーアプローチを介して達成される。
【０４９９】
（グリコシド結合のクラスＩＩＩマンノシダーゼ加水分解）
また、本発明の方法は、クラスＩＩＩ酵素の触媒的に活性なドメインが、オリゴ糖、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造上のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６および／またはＭａｎα１，２グリコシド結合を加水分解して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（下等真核生物におけるさらなるＮ−グリカンプロセシングのための所望の中間体）を生成させるメカニズムも含む。
【０５００】
第一の具体例において、グリコシド結合の加水分解は順次に起こる。酵素は少なくとも１つのグリコシド結合を加水分解し、立体配座的に回転して、他のグリコシド結合を加水分解する。
【０５０１】
第二の具体例において、Ｍａｎα１，６グリコシド結合およびＭａｎα１，３グリコシド結合の加水分解は同時に起こる。もう１つの具体例において、酵素はＭａｎα１，２グリコシド結合を特異的に加水分解する。生じた中間体はさらなるゴルジプロセシングのための基質であり、ここに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴｓ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴｓ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴｓ）のような他のグリコシル化酵素は順次にそれを修飾して、所望のグリコ形態を生じさせることができる。図３６Ｃは、マンノシダーゼＩＩＩ経路を介して生産されたオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を示す。
（本発明の宿主細胞）
本発明の好ましい宿主細胞は下等真核生物細胞、例えば、酵母、単細胞および多細胞または繊維状真菌である。しかしながら、広く種々の宿主細胞が本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従ってヒト様糖タンパク質を発現するように操作することができる。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク質を発現させることができる。当業者が認識するように、（ヒト細胞を含めた）任意の真核生物宿主細胞は本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、１以上のキメラタンパク質を発現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強される宿主細胞において、細胞下位置、例えば、オルガネラに標的化される。そのようなタンパク質は、好ましくは、必ずしもそうではないが、本明細書中で例示したように、タンパク質グリコシル化に関与する酵素である。いずれのタンパク質コード配列も標的化し、本明細書中に記載された方法を用い、真核生物宿主細胞において修飾された活性につき選択することができることが予測される。
【０５０２】
結合されたＮ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖タンパク質を生産することができる下等真核生物が特に有用である。何故ならば、（ａ）高度なマンノシル化を欠き（例えば、Ｎ−グリカン当たり８マンノースを超え、または特に３０〜４０マンノース）、それらはヒトにおいて低下した免疫原性を示し；および（ｂ）Ｎ−グリカンは、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によって（図１Ｂ；β１，２ＧｎＴＩ）、なおよりヒト様のグリコ形態を形成するためのさらなるグリコシル化反応のための基質である。収率はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンを持つ３０モル％より大、より好ましくは５０〜１００モル％糖タンパク質の収率が得られる。好ましい具体例において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の５０％を超えるものが、ＧｎＴＩ活性に対する基質であり、インビボにてそのような基質として働くことができることが示される。
【０５０３】
本発明の好ましい下等真核生物は、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａを含む。
【０５０４】
各上記実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で富化された宿主細胞を作製することに向けられる。これらの構造は望ましい。何故ならば、それらは、次いで、例えば、Ｍａｒａｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ、米国特許第５，８３４，２５１号の方法を用い、インビトロでの処理によってプロセシングすることができるからである。しかしながら、好ましい実施形態においては、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化された前駆体は−−グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩ）で−−インビトロでの少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応によって処理されて、ヒト−様Ｎ−グリカンを生じる。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化されたオリゴ糖前駆体は、好ましくは、Ｘが３、４または５であり、好ましくは３であるＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するものへと処理される。Ｘが３より大きなＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮ−グリカンは、例えば、適用可能であれば、α−１，３および／またはα−１，６マンノシダーゼ活性での処理によって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換することができる。グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含めたさらなるグリコシル化酵素の宿主細胞におけるエキソビボ処理によって、または異種発現によって修飾して、ヒト−様Ｎ−グリカンとなることができる。
【０５０５】
本発明に従って生産することができる好ましいヒト−様糖タンパク質は、７以下、または３以下のマンノシダーゼ残基を有するＮ−グリカンを含む；およびガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、およびフコースよりなる群から選択される１以上の糖を含むものを含む。
【０５０６】
下等真核生物宿主細胞が好ましいが、上記した特性を有する広く種々の宿主細胞は、本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、宿主細胞は、本発明に従ってヒト−様糖タンパク質を発現するように作製することができる。同様に、種々の非−ヒト哺乳動物宿主細胞は、本発明の方法を用い、よりヒト−様の糖タンパク質を発現するように改変することができる。適当な宿主細胞を作製することができるか、あるいは酵母において既に記載された多くのそのような変異体の１つを用いることができる。本明細書中で例示したように、本発明の好ましい宿主細胞はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける超マンノシル化−マイナス（ＯＣＨ１）変異体である。
【０５０７】
（複合体Ｎ−グリカンの形成）
複合体Ｎ−グリカン合成の形成は、それにより特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖構造に結合される順次のプロセスである。高等真核生物においては、これは、種々のプロセシング酵素に順次に暴露された基質を有することによって達成される。これらの酵素は、全プロセシングカスケード内のそれらの特定の位置において特異的反応を行う。この「組立てライン」はＥＲ、初期、メディアルおよび後期ゴルジ、およびトランスゴルジネットワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物のゴルジおよびＥＲにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよびトランスポーター）が発現され、これらのオルガネラへ、好ましくは、それらが、それらの環境ならびに経路における他の酵素に対して最も効果的に機能するような位置に特異的に標的化されなければならない。
【０５０８】
本明細書中で記載した方法の１つの目標は、産業醗酵プロセスにおいてよく行うことができる頑強なタンパク質生産株を達成することにあるので、複数遺伝子の宿主細胞染色体への組込みは注意深い計画を含む。上記したように、非−ヒトグリコシル化反応に特徴的であることが知られている酵素をコードする１以上の遺伝子は好ましくは欠失される。作製された細胞株を、所望の活性をコードするある範囲の異なる遺伝子で形質転換し、これらの遺伝子は安定に形質転換され、それにより、所望の活性が醗酵プロセスを通じて維持されるのを保証する。
【０５０９】
以下の酵素活性のいずれの組合せも、本発明の方法を用いて単一でまたは複数で宿主中へ作製することができる：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体に対するｓｙｎ−およびアンチポートトランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素。好ましくは、酵素活性を１以上の核酸分子に導入することができる（上記も参照）。核酸分子は単一でまたは複数で、例えば、本発明のコンビナトーリアルライブラリーのような核酸ライブラリーの意味で導入することができる。しかしながら、単一または複数酵素活性を、限定されるものではないが、タンパク質送達方法および／または本発明の核酸ライブラリーまたはコンビナトーリアルライブラリーを必ずしも用いることのない１以上の核酸分子の使用を含めたいずれかの方法で宿主細胞に導入することができる。
【０５１０】
（複合体Ｎ−グリカンを生産するためのグリコシルトランスフェラーゼの発現）
ＤＮＡ配列情報を用い、当業者はＧｎＴ活性をコードするＤＮＡ分子をクローン化することができる（例えば、実施例３）。当業者によく知られた標準的な技術を用い、ＧｎＴＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶをコードする（またはその触媒的に活性な断片をコードする）核酸分子を、本明細書中に記載されたように、プロモーター、および本発明の選択された宿主細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．のような真菌宿主において転写を駆動することができる他の発現制御配列の転写制御下にある適当な発現ベクターに挿入することができ、従って、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素の１以上を、ヒト−様複合体糖タンパク質の生産のために選択された宿主細胞で活発に発現させることができる（例えば、実施例８、１５、１７、１９）。
【０５１１】
数個の個々のグリコシルトランスフェラーゼがクローン化され、しかしながら、生物のグリコシル化パターンに対する「ヒト化」の所望の結果を証明することなく、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌において発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１）：５３−８；  Ｋａｌｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。そのようなグリコシルトランスフェラーゼの作用によって糖を許容するのに必要な炭水化物構造は十分な量で存在せず、それは複合体Ｎ−グリカン形成の欠如に最も寄与したようであると推測された。
【０５１２】
本発明の好ましい方法は、初期、メディアルまたは後期ゴルジ装置における、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（またはＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶＩのような他のＧｎＴｓおよび上記のいずれかの組合せ）のようなグリコシルトランスフェラーゼの機能的発現を提供し、ならびに（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現によって；後記参照）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を保証する。
【０５１３】
（糖ヌクレオチド前駆体をゴルジ装置に供するための方法）
ゴルジにおいて満足して機能するグリコシルトランスフェラーゼについては、酵素は、新成糖タンパク質に結合した糖部位の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖の十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース等）は、一般には、サイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される。
【０５１４】
下等真核生物のような非−ヒト宿主細胞においてこのプロセスを複製するためには、糖ヌクレオシド特異的トランスポーターがゴルジで発現されて、ヌクレオシド糖前駆体の適切なレベルが確保されなければならない（Ｓｏｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８１）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；  Ｓｏｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；  Ｐｅｒｅｚ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３８：７０９−７１５）。ヌクレオチド糖は、例えば、宿主微生物および糖ヌクレオチドトランスポーターをコードする外因性遺伝子において発現させることによって、適切な区画に供することができる。トランスポーター酵素の選択は、用いるべき外因性グリコシルトランスフェラーゼの性質によって影響される。例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを必要とするであろうし、フコシルトランスフェラーゼはＧＤＰ−フコーストランスポーターを必要とし、ガラクトシルトランスフェラーゼはＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを必要とし、シアリルトランスフェラーゼはＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを必要とするであろう。
【０５１５】
付加されたトランスポータータンパク質はヌクレオチド糖をサイトゾルからゴルジ装置へ運び、そこで、ヌクレオチド糖はグリコシルトランスフェラーゼによって反応して、例えば、Ｎ−グリカンを延長することができる。この反応はヌクレオシド二リン酸または一リン酸、例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰまたはＣＭＰを放出する。ヌクレオシド一リン酸は、アンチポードメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換においてゴルジから直接的に輸出することができる。しかしながら、ヌクレオシド二リン酸の蓄積は、グリコシルトランスフェラーゼのさらなる活性を阻害する。この反応は十分なグリコシル化に重要に見えるので、ヌクレオチド二リン酸をコードする遺伝子の発現されたコピーを供するのがしばしば望ましい。（適切にはＵＤＰまたはＧＤＰに特異的な）ジホスファターゼはジホスホのヌクレオシドを加水分解して、ヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じる。
【０５１６】
典型的には、哺乳動物起源である適当なトランスポーター酵素は後記する。そのような酵素は、本発明の方法を用い、選択された宿主細胞に作製することができる。
【０５１７】
もう１つの例において、α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼはガラクトース残基をヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおいてシアル酸でキャップを施し、糖タンパク質の成熟形態に導く（図１Ｂ）。このプロセシング工程を代謝的に作製された酵母または真菌へ再度作製することは、酵母の後期ゴルジにおいて、（１）α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性および（２）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給を必要とするであろう。後期ゴルジにおいて十分なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を得るためには、例えば、（例えば、ヒトからの）公知のシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、真菌における後期ゴルジに向けられなければならない（上記参照）。同様に、トランスポーターは、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の輸送を可能とするように作製されなければならない。現在、真菌が十分量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成し、またはそれをゴルジに輸送できることを示すものはない。その結果、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の適切な供給を確保するためには、真菌へのＣＭＰ−シアル酸の生産を代謝的に作製しなければならない。
【０５１８】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン
発現された配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性サーチを介して認識されたヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターのｃＤＮＡがクローン化されている（Ｉｓｈｉｄａ，１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）からのｃＤＮＡでの表現型修正によってクローン化された（Ｇｕｉｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１４）：７８８８−７８９２）。結果は、哺乳動物ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子が、発現され、酵母のゴルジ装置へ機能的に標的化されるべきタンパク質についての必要な情報の全てを有し、非常に異なるアミノ酸配列を持つ２つのタンパク質は同一ゴルジ膜内の同一溶質性を輸送することができることを示す（Ｇｅｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１４）：７８８８−７８９２）。  
【０５１９】
従って、例えば、（１）それによって形質転換された構築物が細胞中に維持される領域（例えば、複製起点、または染色体組込みを媒介する領域）、（２）ｕｒａ３またはＴ−ｕｒｆｌ３  （Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１（２）：３０６−１０）または他のよく特徴付けられた選択−マーカー（例えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、Ｓｈ  ｂｌｅ等）のような逆選択可能およびリサイクル可能マーカーを含めた、形質転換されている細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子、（３）（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓからの、（Ａｂｅｉｊｏｎ，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）、またはＨ．ｓａｐｉｅｌｓからの（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）  １２０（６）：１０７８−８）、および（４）上記した局在化／触媒ドメイン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーターを含むことができる核酸構築物によって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現を宿主細胞に取込むことができる。図８は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＢＰ−３においてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ＡＦ１０６０８０）の付加を示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、各々、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター無しのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター（ＰＢＰ−３）を持つＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｎ−グリカンプロフィールを比較する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＢＰ−３は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と合致する１４５７（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークを呈する。
【０５２０】
ＧＤＰ−フコース
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．ａｎｄ  Ｃ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  （Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ、１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００）によって同定され、精製されている。対応する遺伝子は同定されていないが、Ｎ−末端配列決定は、対応する遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブの設計で用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。
【０５２１】
ＵＤＰ−ガラクトース
２つの異種遺伝子、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅからのアルファ１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファ１，２  ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２（＋）、およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターをコードする（ｈＵＧＴ２）は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシル化およびＵＤＰ−ガラクトース輸送活性の間の修正は、アルファ１，２ＧａｌＴよりはむしろＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターの外因的供給がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける十分なガラクトシル化についての鍵となる役割を演じたことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ，  １９９９  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（２）：  １３３−１４１）。同様に、Ｓ．ｐｏｍｂｅからのＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターがクローン化された（Ｓｅｇａｗａ，１９９９  Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５１（３）：２９５−２９８）。
【０５２２】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸）
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）はクローン化され、Ｌｅｃ８  ＣＨＯ細胞で発現されている（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２６（５）：９４０−５０；  Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８（１）：１８７−９２）。マウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの機能的発現はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２６１６−９）。シアル酸はいくつかの真菌で見出されているが、選択された宿主系が十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給できるかは明らかでない。シアル酸は培地または、別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路いずれかに供給することができ、また宿主ゲノムに組込むこともできる。
【０５２３】
（ジホスファターゼの発現）
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸いずれかが糖ヌクレオチド前駆体から放出される。一リン酸はアンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホノヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）はホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなければならない。この反応は十分なグリコシル化で重要であるように見える。というのは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＧＤＰａｓｅはマンノシル化で重要であることが判明しているからである。しかしながら、この酵素はＵＤＰに向けての活性の１０％を有するに過ぎない（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵＤＰ−特異的ジホスファターゼ活性を有しない。というのは、それらはゴルジにおける糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加える酵母は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、さらに、そのような酵素についての要件を示唆する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの優れた阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジのルーメンにおけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるのに重要である。
【０５２４】
（組換えベクター）
種々の発現ベクターを用いて、本発明のヌクレオチド配列を発現することができる（例えば、実施例１３参照）。この配列は、宿主細胞の形質転換用の適当なベクター中の発現制御配列に操作可能に結合させることができる。１つの実施形態において、本発明の配列は、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＮｏｔＩ  ＡｓｃＩ  ＰａｃＩ制限部位カセット、ＣｙｃＩＩ転写ターミネーター、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１（Ａｍｐｒ）における発現用のｕｒａ３選択カセットを含むｐＪＮ３４８と命名されたベクターに操作可能に連結されている。
【０５２５】
好ましい実施形態において、ベクターは上記にて記載したようにマンノシダーゼＩＩ酵素の触媒的に活性な断片を含む。酵母および繊維状真菌で用いられる他の適当な発現ベクターは当該分野でよく知られている。
【０５２６】
（核酸分子からの標的化酵素活性を発現させることにより宿主においてＮ−グリカンを改変するための方法）
本発明は、さらに、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の生産のための酵素または複数酵素をコードする１以上の核酸分子を非−ヒト宿主細胞に取込む工程を含む、この細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生産に関与する１以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入する。本発明は、加えて、１以上のグリコシル化酵素または活性をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タンパク質を作製する方法に関する。好ましい酵素活性はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、宿主は、１つの活性の産物がもう１つの活性、例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する糖トランスポーター、例えば、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性の基質レベルを増加させる２以上の酵素活性を発現するように選択されるか、または作製される。もう１つの好ましい実施形態において、宿主は、引き続いてのグリコシル化反応を阻害することができる産物を除去する活性、例えば、ＵＤＰ−またはＧＤＰ−特異的ジホスファターゼ活性を発現するように選択されるかまたは作製される。
【０５２７】
本発明の好ましい方法は、宿主細胞において核酸分子からの１以上の酵素活性を発現させることを含み、酵素の触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチド、例えば、通常は触媒ドメインに連結またはそれに会合していない異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質を形成することによって、少なくとも１つの酵素活性を所望の細胞下位置（例えば、オルガネラ）へ標的化する工程を含む。融合タンパク質は、酵素（例えば、グリコシル化酵素）、またはその触媒的に活性な断片をコードする核酸断片へ同一翻訳リーディングフレームにて連結された（「イン−フレーム」）細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸断片を含む少なくとも１つの遺伝子構築物（「融合構築物」）によってコードされる。
【０５２８】
融合構築物またはタンパク質の標的化シグナルペプチド成分は、好ましくは、ＥＲまたはゴルジの膜−結合タンパク質、検索シグナル、タイプＩＩ膜タンパク質、タイプＩタンパク質、膜スパンニングヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来する。
【０５２９】
融合構築物またはタンパク質の触媒ドメイン成分は、好ましくは、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性に由来する。触媒ドメインは、好ましくは、酵素が局在化されたオルガネラにおける他の代表的な酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨユニット内にｐＨ最適値を有するか、あるいは５．１および８．０の間のｐＨにおいて最適活性を有する。好ましい実施形態において、触媒ドメインはＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩよりなる群から選択されるマンノシダーゼをコードする。
【０５３０】
（グリコシル化酵素の選択：ｐＨ最適値および細胞下位置）
本発明の１つの実施形態において、ヒト−様糖タンパク質は、標的化細胞下区画において他の酵素のｐＨ最適値と同様なｐＨ最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素を細胞の細胞下区画に導入することによって、非−ヒト真核生物宿主細胞において効率的に作製される。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよびゴルジ装置において活性はほとんどの酵素は、約６．５および７．５の間にあるｐＨ最適値を有する（表３参照）。タンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ＥＲおよびゴルジの内部ｐＨもまた約６〜８の範囲にある。しかしながら、真菌宿主における組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、ｐＨ５．０程度のｐＨ最適値を有する酵素を導入した（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０（１２）：１１７１−１１７７、およびＣｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６２９８−２６３０４）。ｐＨ７．０において、それらのマンノシダーゼのインビトロ決定活性はそれらの使用点、すなわち、Ｎ−グリカン上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の効果的なインビボ生産のための、ＥＲおよび初期ゴルジにおいて不十分な活性であるような１０％未満まで低下される。
【０５３１】
従って、本発明の好ましい実施形態は、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒ドメイン）、例えば、α−マンノシダーゼを宿主細胞における細胞下位置（例えば、オルガネラ）へ標的化し、そこで、酵素またはドメインのｐＨ最適値は、同一オルガネラに局在化された他の代表的なマーカー酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨユニット内にある。特異的オルガネラへ標的化されるべき酵素のｐＨ最適値は、同一オルガネラで見出された他の酵素のｐＨ最適値とマッチングさせて、得られた単位酵素当たりの活性を最大化すべきである。表３は、種々の源からのマンノシダーゼの活性およびそれらの各ｐＨ最適値をまとめる。表４は、それらの典型的な細胞下位置をまとめる。
【０５３２】
【表３】
0004792387.tif 000008
好ましい実施形態において、特定の酵素または触媒ドメインは、通常は酵素ドメインに会合していない細胞標的化シグナルペプチドを含むタンパク質をコードするキメラ融合構築物によって、宿主細胞中の細胞下位置に標的化される。好ましくは、酵素またはドメインは宿主細胞のＥＲ、初期、メディアルまたは後期ゴルジ、またはトランスゴルジ装置に標的化される。
【０５３３】
より好ましい実施形態において、標的化グリコシル化酵素はマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼである。特に好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、ＥＲまたはシスゴルジに標的化され、そこで、グリコシル化の初期反応が起こる。この方法は非−ヒト宿主細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産するのに有用であるが、この方法は、ヒト宿主細胞を含めたいずれかの真核生物宿主細胞において糖タンパク質の炭水化物プロフィールを修飾するのにより一般的には有用でもあることを認識されるであろう。
【０５３４】
宿主細胞分泌経路のある種のオルガネラにおいてタンパク質の滞留を媒介する標的化配列は周知であり、標的化配列および標的化された酵素の選択用のライブラリーに関して後により詳細に議論するように、科学文献および公のデータベースに記載されている。そのような細胞下標的化配列は、単独、または組合せて用いて、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒ドメイン）を宿主細胞、すなわち、そこで酵素が、ｐＨ最適値または他の同様な因子の存在に基づいて増強されたまたは最適な活性を有するであろうものにおける特定の細胞下位置に標的化することができる。
【０５３５】
高マンノース構造をトリミングして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置においてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせようと試みる場合、例えば、（１）十分に近いｐＨ最適値（すなわち、ｐＨ５．２およびｐＨ７．８の間）を有し、および（２）単独で、または協力し合って、ＧｎＴＩによるＧｌｃＮＡｃの引き続いての付加を許容するのに必要な特定の異性体Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を作り出すことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せを選択することができる。インビトロにてＧｎＴＩによってＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換することができる構造を作り出すことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せは、適当な選択を構成するであろう。この知識は、科学的文献から、あるいは実験的に得ることができる。
【０５３６】
例えば、潜在的マンノシダーゼがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ（２−アミノベンズアミド）をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＢに変換することができるかを判断することができ、次いで、得られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ構造がＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する基質として働いて、インビトロでＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えることができることを証明することができる。ヒトまたはマウス源からのマンノシダーゼＩＡは、例えば、適切な選択であろう（例えば、実施例４参照）。本明細書中に記載した例は、２−アミノベンズアミド標識Ｎ−結合オリゴマンノース、続いての、この判断をなすためのＨＰＬＣ分析を利用する。
【０５３７】
【表４−１】
0004792387.tif 000009
【０５３８】
【表４−２】
0004792387.tif 000010
従って、本発明に従って用いられるα−１，２−マンノシダーゼ酵素のようなグリコシル化酵素は、５．１および８．０の間のｐＨにおいて最適な活性を有する。好ましい実施形態において、この酵素は５．５および７．５の間のｐＨにおいて最適な活性を有する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼ酵素は、例えば、本発明の方法でよく働き、約５．５の見掛けのｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼは適当なｐＨ最適値を有する表３にリストしたもの、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＡ（ゴルジ）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＢ（ゴルジ）、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫細胞（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、マウスＩＢ（ゴルジ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓを含む。
【０５３９】
α−１，２−マンノシダーゼ酵素についてのｐＨ最適値を示す実験を実施例７に記載する。培地に遺漏するキメラ融合タンパク質ＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ３１）を種々のｐＨ範囲に付して、酵素の最適活性を決定した。実験の結果は、α−１，２−マンノシダーゼはその機能に対して約５．５の最適ｐＨを有することを示す（図１１）。
【０５４０】
好ましい実施形態において、単一のクローン化マンノシダーゼ遺伝子は宿主生物において発現される。しかしながら、いくつかの場合、数個の異なるマンノシダーゼ遺伝子、または１つの特定の遺伝子の数個のコピーを発現させて、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の適切な生産を達成するのが望ましいであろう。複数遺伝子を用いる場合、コードされたマンノシダーゼは、好ましくは、全て、約５．１〜約８．０、または特に約５．５および約７．５の間の好ましい範囲内にｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼ活性はマウス、ヒト、Ｌｅｐｉｂｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓまたはＡ．ｎｉｂｕｌａｎｓに由来するα−１，２−マンノシダーゼを含む。
【０５４１】
（コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを用いる宿主細胞グリコシル化のインビボ改変）
本発明のある種の方法は、好ましくは（必ずしも必要ではないが）、１以上の核酸ライブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトーリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパク質（例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素またはその触媒ドメイン）をコードする配列を含むことである。
【０５４２】
１つの実施形態において、コンビナトーリアル核酸ライブラリーは（ａ）異なる細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列；および（ｂ）標的化すべきポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。もう１つの実施形態において、コンビナトーリアル核酸ライブラリーは（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、および（ｂ）宿主細胞へ標的化すべきポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列を含む。後にさらに記載するように、（ａ）に由来する核酸配列、および（ｂ）に由来する核酸配列を連結させて、注目するポリペプチドドメインに機能的に連結した細胞標的化シグナルペプチドをコードする１以上の融合構築物を生じさせる。機能的結合の１つの例は、細胞標的化シグナルペプチドが同一翻訳リーディングフレームにて（「イン−フレーム」）注目するポリペプチドドメインに連結される場合である。
【０５４３】
好ましい実施形態において、コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーは、触媒酵素ドメインにイン−フレーム連結した細胞標的化シグナルペプチドを含む１以上の融合タンパク質を発現させる。コードされた融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ−グリカンの哺乳動物−またはヒト−様修飾に関与する酵素の触媒ドメインを含む。より好ましい実施形態において、触媒ドメインは、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および１以上の標的化シグナルペプチドにイン−フレームに連結した他のグリコシダーゼよりなる群から選択される酵素に由来する。酵素ドメインは宿主細胞に対して外因性および／または内因性であり得る。特に好ましいシグナルペプチドは、ＥＲからゴルジへの輸送を受けるタンパク質に通常は会合したものである。
【０５４４】
本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーは、哺乳動物Ｎ−グリカン修飾またはヒト−様Ｎ−グリカン修飾に関与するインビボ酵素を生産し、局在化するのに用いることができる。コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーの融合構築物は、コードされた酵素が、そこで、それが注目する糖タンパク質上で特定のＮ−グリカンを生産することに関与する宿主細胞のＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークに局在化されるように作製される。本発明のＮ−グリカン修飾酵素の局在化は、アンカリングメカニズムを介して、またはタンパク質−タンパク質相互作用を介して達成され、ここに、コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーから構築した局在化ペプチドは、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークのような分泌経路の所望のオルガネラに局在化される。
【０５４５】
十分に、かつヒト−様（複合体）グリコシル化反応によってさらなる修飾用の十分な量が生産される有用なＮ−グリカンの例はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。十分な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、インビボでのさらなるヒト−様プロセシングのために注目する糖タンパク質に必要とされる（例えば、３０モル％より大）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体は、さらなるＮ−グリカン修飾用の基質として用いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産することができる（図１Ｂ；上記参照）。従って、本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを用いて、引き続いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、または所望の複合体Ｎ−グリカンを適当な量で生産する酵素を生産することができる。
【０５４６】
本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを用いて生産された融合構築物のさらなる態様は、それらが、作製された宿主細胞において十分かつしばしば完全に近い細胞内Ｎ−グリカントリミング活性を可能とすることである。本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーによって生産された好ましい融合構築物はグリコシル化酵素、例えば、マンノシダーゼをコードし、これは、細胞内宿主細胞区画に効果的に局在化され、それにより、細胞外活性をほとんど好ましくは全く呈しない。マンノシダーゼ酵素をコードする本発明の好ましい融合構築物はＮ−グリカンが修飾される場所、すなわち、ＥＲおよびゴルジに局在化されることが示されている。本発明の融合酵素は分泌経路中のそのような特定のオルガネラに標的化され、そこでは、それらは局在化され、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンに作用して、注目する糖タンパク質上でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産する。
【０５４７】
本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーによって生産された酵素は、各々、図５および６に示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたＫ３またはＩＦＮ−βタンパク質につき示されたように、注目する糖タンパク質上でＮ−グリカンを修飾することができる（また、実施例２および４参照）。しかしながら、限定されるものではないが、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωのようなサイトカイン、および顆粒球−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子のような凝固因子、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄系先祖阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ  ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベータおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１  ｗ／およびｗ／ｏ  ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）を含めた他のタイプの糖タンパク質もこのようにしてグリコシル化することができるのが認識される。
【０５４８】
（融合構築物のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーの構築）
融合構築物のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーは、一般に、（例えば、Ｃ−末端欠失を作製することによって、天然タンパク質のＮ−末端ドメインに由来する１以上の細胞標的シグナルペプチド（「標的化ペプチド」）を特徴とする。しかしながら、いくつかの標的化ペプチドは天然タンパク質（例えば、ＳＥＣ１２）のＣ−末端に由来する。ＥＲまたはゴルジの膜−結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源として用いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）をコードする配列を有する。これらの領域はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび／または他の局在化されたタンパク質との比較（例えば、疎水性プロットの比較）によって認識可能である。
【０５４９】
標的化ペプチドはここではタイプＩＩ膜の一部に対して短い（ｓ）、中程度（ｍ）および長い（ｌ）として示される。短い（ｓ）と示された標的化ペプチド配列は膜−結合タンパク質の膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）に対応する。長い（ｌ）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）の長さに対応する。中程度（ｍ）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）の長さのほぼ半分に対応する。触媒ドメイン領域は、ここでは、その野生型グリコシル化酵素に対するヌクレオチド欠失の数によって示される。
【０５５０】
（サブライブラリー）
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝子または野生型遺伝子から直接組立てることができる。好ましい実施形態において、上記ＤＮＡライブラリーは、２以上のサブライブラリーの融合から組立てられる。サブライブラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン（例えば、グリコシル化活性を有するもの）をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製することが、可能である。
【０５５１】
（グリコシル化活性をコードする触媒ドメインサブライブラリー）
１つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。触媒ドメインは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。哺乳動物酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素は、全て有用であり、これは、最適温度および最適ｐＨに関して広いスペクトルの生化学特性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、そのいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードする断片を得る。内因性標的化配列を除去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座で発現させ得る。
【０５５２】
そのような触媒ドメインの選択は、その触媒ドメインが引き続いて活性であるべき特定の環境についての知識によって誘導され得る。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴルジにおいて活性であり、かつ後期ゴルジにおける宿主生物の全ての公知の酵素が特定のｐＨ最適値を有するか、あるいは後期ゴルジが特定のｐＨを有することが公知である場合、上記したように、そのｐＨにおいて十分な（好ましくは最大の）活性を示す触媒ドメインを、選択する。
【０５５３】
（標的化ペプチド配列サブライブラリー）
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、３つのカテゴリー：（１）一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜（腔膜）に係留させる、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）の一部またはステム領域の全てをコードする、Ｎ末端配列；（２）ＨＤＥＬテトラペプチド（配列番号１０５）またはＫＤＥＬテトラペプチド（配列番号１０６）のようなＣ末端で一般に見出される検索シグナル；および（３）ゴルジ中に局在化することが知られている種々のタンパク質（例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター）由来の膜貫通領域；に入る。
【０５５４】
最初の場合において、標的化ペプチドが種々のエレメント（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）からなる場合、上記ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよびステム領域の種々の部分が提示されるように設計される。従って、標的化ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実施形態は、ＥＲまたはゴルジの膜結合型タンパク質由来のｃｔ配列、ｔｍｄ配列および／またはｓｒ配列を含む。いくつかの場合、種々の長さのｓｒ配列を持つサブライブラリーを提供することが、望ましいものであり得る。これは、サイトゾル領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するプライマーを用い、かつステム領域の種々の部分に結合する一連の対向プライマーを使用するＰＣＲによって、達成され得る。
【０５５５】
標的化ペプチド配列のさらに他の有用な供給源としては、ＥＲまたはゴルジへと逆方向輸送されるタンパク質のＣ末端において代表的には見出される、検索シグナルペプチド（例えば、テトラペプチドＨＤＥＬ（配列番号１０５）またはＫＤＥＬ（配列番号１０６））が挙げられる。標的化ペプチド配列のさらに他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）表３に列挙した酵素、（ｃ）ゴルジに局在化される膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、および（ｄ）表５において言及される配列、が挙げられる。
【０５５６】
（表５  有用な区画標的化配列の供給源）
【０５５７】
【表５−１】
0004792387.tif 000011
【０５５８】
【表５−２】
0004792387.tif 000012
【０５５９】
【表５−３】
0004792387.tif 000013
いずれの場合においても、特定の酵素活性に適する標的化ペプチド配列を選択して、所望のグリコシル化反応の系列内で最適に機能することが、非常に好ましい。例えば、新生Ｎ−グリカンの末端シアル化（ヒトにおいて後期ゴルジで起こるプロセス）が可能な改変された宿主微生物を開発するにおいて、後期ゴルジタンパク質に由来する標的化ペプチド配列のサブライブラリーを利用することが、望ましい。同様に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えるようにα−１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングすることは、ヒトにおける複合体Ｎ−グリカン形成における初期工程である（図１Ｂ）。従って、この反応を、操作された宿主微生物のＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが、望ましい。ＥＲ滞留シグナルおよび初期ゴルジ滞留シグナルをコードするサブライブラリーが、使用される。
【０５６０】
次いで、一連の融合タンパク質構築物（すなわち、コンビナトリアルＤＮＡライブラリー）が、１つまたは一連の標的化ペプチド配列を、触媒ドメインをコードする１つまたは一連の配列に機能的に連結させることによって構築する。好ましい実施形態において、これは、標的化ペプチド配列（上記）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーを、グリコシル化酵素または触媒的に活性なその断片（後記参照）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーへとイン−フレーム連結することよって、達成される。
【０５６１】
得られたライブラリーは、標的化ペプチド配列を含有する融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。いくつかの場合、融合タンパク質のＮ末端に、あるいは他の場合にはＣ末端に、標的化ペプチド配列を提供することが、望ましい。いくつかの場合、標的化ペプチド配列は、酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入され得、但し、個々の折り畳まれたドメインのタンパク質構造は、破壊されないものとする。各タイプの融合タンパク質は、（段階的指向性様式または半ランダム様式にて）構築され、最適な構築物は、本発明の方法を用いて、宿主細胞の形質転換、および形質転換された細胞におけるグリコシル化パターンの特徴付けに基づいて、選択され得る。
【０５６２】
（さらなる配列多様性の生成）
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸（例えば、ＤＮＡライブラリー）が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも１つの形質転換体が、望まれる表現型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る（Ｒｏｍｅｒｏら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１５）：１１０７１−４）。従って、形質転換に先立ち、ＤＮＡライブラリーまたは構成サブライブラリーが、１つ以上の技術に供されて、さらなる配列多様性が生成され得る。例えば、１回以上の遺伝子シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じるための他の方法が、融合構築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得る。
【０５６３】
（発現制御配列）
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列（例えば、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必要であり得るような他の機能的配列）を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一般には好ましい。
【０５６４】
適切なベクター構成要素（例えば、選択マーカー、発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）および必要に応じて、宿主細胞における自律複製に必要な配列が、どの特定の宿主細胞が選択されるかの関数として選択される。特定の哺乳動物または下等真核生物宿主細胞で用いるための適切なベクター構成要素についての選択基準は、慣用的である。本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａが挙げられる。宿主がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、適切なプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＰ４０プロモーターが挙げられる。
【０５６５】
（選択マーカー）
少なくとも１つの選択マーカー（薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完するための遺伝子）を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、ＵＲＡ３遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＳＵＣ２遺伝子、Ｇ４１８遺伝子、ＢＬＡ遺伝子、またはＳＨ  ＢＬＥ遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物宿主細胞で用いるために利用可能である。
【０５６６】
（形質転換）
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、ＤＮＡ移入のための任意の簡便な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法、またはスフェロプラスト法）が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞において、従来の方法としては、粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養（例えば、酵母における発酵）に適した安定な株を生成するために、上記ＤＮＡライブラリー構築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、ＤＮＡライブラリーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規定された部位で起こる。
【０５６７】
特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体における望まれない遺伝子の部位中に組み込まれ、その遺伝子の破壊または欠失をもたらす。例えば、ＯＣＨ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子またはＭＮＮ４遺伝子の部位への組込みは、糖タンパク質の酵母超マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に関与する酵素の発現を妨げつつ、所望のライブラリーＤＮＡの発現を可能とする。他の実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、核酸分子、プラスミド、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター）、染色体を介して宿主中に導入され得、自律核酸分子としてか、または宿主ゲノム中への相同組み込みもしくはランダム組込みによって、導入され得る。いずれの場合においても、一般には、安定に形質転換された宿主生物の容易な選択を可能とするために、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を各ライブラリーＤＮＡ構築物とともに含ませることが、一般に望ましい。そのために、またはそれに抗して選択され得る再生可能なマーカー遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）は、特に適切である。
【０５６８】
（スクリーニングおよび選択プロセス）
ＤＮＡライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および／または除去工程によって行われ得る。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用いて、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上にタンパク質Ｎ−グリカンを提示する。
【０５６９】
細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞につき、例えば、または最高末端ＧｌｃＮＡｃ含有量にてタンパク質を分泌する細胞につき、スクリーニングし得る。そのようなスクリーニングは、染色手順のような目に見える方法、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体またはマーカー結合体化レクチン（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）に結合する能力、特異的レクチンが末端マンノース残基に結合する能力の低下、インビトロで放射性標識糖を取り込む能力、染料または荷電表面への改変された結合に基づいてスクリーニングされ得るか、あるいは発蛍光団標識レクチンまたは発蛍光団標識抗体と組み合せた蛍光支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを用いることによって達成され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
【０５７０】
従って、所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチンまたは抗体に細胞を暴露することによって、無傷細胞が、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニングされ得る。広汎な種類のオリゴ糖特異的レクチンは、（例えば、ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡから）商業的に入手可能である。あるいは、特異的ヒトＮ−グリカンに対する抗体または動物Ｎ−グリカンに対する抗体は、商業的に入手できるか、あるいは標準技術を用いて製造され得る。適切なレクチンまたは抗体は、レポーター分子（例えば、発色団、発蛍光団、放射性同位体、または発色性基質を有する酵素）に結合体化され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
【０５７１】
次いで、スクリーニングは、分析方法（例えば、分光測定法、蛍光比色法、蛍光活性化細胞ソーティング、またはシンチレーションカウンティング）を用いて実施され得る。他の場合には、形質転換された細胞からの単離された糖タンパク質またはＮ−グリカンを分析することが、必要であり得る。タンパク質単離は、当該分野で公知の技術によって行われ得る。好ましい実施形態において、レポータータンパク質が、培地に分泌され、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアフィニティークロマトグラフィー）によって精製される。単離されたＮ−グリカンが好ましい場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｄｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のような酵素を用いて、糖タンパク質からＮ−グリカンが切断され得る。次いで、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析法、または他の適切な手段によって、単離されたタンパク質またはＮ−グリカンが、分析され得る。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。好ましい実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて、切断されたＮ−グリカンが分析される。
【０５７２】
所望の形質転換体の選択に先立ち、望まない表現型を有する細胞の形質転換された集団を除去することが、望ましいものであり得る。例えば、その方法を用いて機能的マンノシダーゼ活性を細胞中に操作する場合、所望の形質転換体は、細胞糖タンパク質において、より低レベルのマンノースを有する。培地中のマンノースの致死的放射性同位体への形質転換された集団の暴露は、望まない表現型（すなわち、高レベルの取り込まれたマンノース）を有する形質転換体の集団を除去する（Ｈｕｆｆａｋｅｒ  ＴＣおよびＲｏｂｂｉｎｓ  ＰＷ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８３  Ｄｅｃ；８０（２４）：７４６６−７０）。あるいは、細胞傷害性レクチンまたは望ましくないＮ−グリカンに対する抗体を用いて、望まない表現型の形質転換集団を除去し得る（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ  ＰおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ  Ｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９７７  Ｊｕｌ；３（４）：３９１−４０５）。米国特許第５，５９５，９００号は、望まれる細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。この戦略を反復して行うと、下等真核生物において、より多くの複合グリカンの連続操作が可能となる。
【０５７３】
高度のヒト様Ｎ−グリカン中間体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をその表面に有する宿主細胞を検出するためには、例えば、インビトロ細胞アッセイにおいて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼによるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効果的な転移を可能とする形質転換体につき選択し得る。このスクリーニングは、寒天プレート上での選択圧下で形質転換されたライブラリーを保有する細胞を増殖させること、個々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移すことによって、実施され得る。細胞を増殖させた後、細胞は遠心分離され、細胞は、緩衝液中に再懸濁され、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩの添加の後、ＵＤＰの放出が、ＨＰＬＣまたはＵＤＰについての酵素連結アッセイによって、測定される。あるいは、放射性標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩを用い得、細胞を洗浄し得、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって放射性ＧｌｃＮＡｃの放出を探索し得る。これはすべて、手動により行っても、あるいは高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化されてもよい。第一のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを放出する形質転換体、または第二のアッセイにおいてより多くの放射性標識ＧｌｃＮＡｃを放出する形質転換体は、その表面により高い程度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し、従って、所望の表現型を構成すると予測される。同様なアッセイもまた、同様に、分泌タンパク質上のＮ−グリカンを見るように適合され得る。
【０５７４】
あるいは、形質転換細胞の表面上の改変されたグリコシル化パターンを明らかにし得る他の適切な任意のスクリーニング（例えば、レクチン結合アッセイ）を用い得る。この場合、末端マンノースに対して特異的なレクチンの結合減少は、適切な選択ツールであり得る。Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノースに特異的に結合し、これは、十分なマンノシダーゼＩＩ活性がゴルジに存在すれ場合には低下することが、予測される。また、高い末端マンノース含有量を含む細胞の除去を可能とするクロマトグラフィー分離工程を行うことによって、所望の形質転換体を富化し得る。この分離工程は、低い末端マンノース含有量を有する細胞よりも、高い末端マンノース含有量を持つ細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したＧａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて行う。
【０５７５】
加えて、異なる下等真核生物宿主において活性な炭水化物改変酵素の局在化についてのさらなる情報は科学文献にて入手可能となるので、そのような融合タンパク質構築物を直接作製し得る。例えば、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒは、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のマンノシルトランスフェラーゼ）の膜ドメインに融合され得、その触媒活性を保有しつつゴルジ装置に局在化され得ることが、公知である（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような知見を全体的戦略に直接的に組み込んで、そのような宿主から複合Ｎ−グリカンを取得し得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるいくつかのそのような遺伝子断片が同定されており、これらはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるグリコシルトランスフェラーゼに関連する。従って、これらは、その目的で使用され得る。
【０５７６】
（コンビナトリアルライブラリーからの融合構築物を用いる宿主細胞グリコシル化の改変）
好ましいコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築が、図２に模式的に示され、実施例４に記載される。その融合構築物は、多数のベクター（例えば、当該分野で周知の発現ベクター）に作動可能に連結され得る。広く種々のそのような融合構築物が、表６に示したような代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド／触媒ドメインの組合せは、本発明に従って、ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マンノシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用いるために組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチドのタイプに応じ、Ｎ−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有さないものであり得る（例えば、表７、実施例４）。
【０５７７】
（マンノシダーゼＩ融合構築物）
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の代表的な例は、ｐＦＢ８であり、これは、マウスα−マンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ６６７８７８７）の１８７Ｎ末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ１１６５５からのＳＥＣ１２の９８８〜１２９６ヌクレオチド）を有する。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＳＥＣ１２標的化ペプチド配列によってＥＲに局在化し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である（実施例４；図６Ｆおよび７Ｂ）。
【０５７８】
融合構築物ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９）は、細胞内マンノシダーゼトリミング活性を有する融合構築物の別の例である（実施例４；図５Ｄおよび８Ｂ）。融合構築物ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ８０）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である効率的な融合構築物のさらに別の例である。本発明によるこれらのマンノシダーゼ融合構築物および他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製することによって、当業者は、最適細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低い活性を持つかまたは活性を全く持たない構築物から区別し、そしてそれを選択し得る。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された少数のマンノシダーゼ融合構築物のみが、特に望ましいＮ−グリカンをインビボで生成し得るので、有利である。
【０５７９】
さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的であり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じさせ得るというわけではないことが、さらに理解されるべきである。従って、目的のタンパク質は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた宿主細胞に導入されて、目的のタンパク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され得る。当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生じさせて選択することが可能であり得る。
【０５８０】
さらに、局在化された活性なマンノシダーゼ触媒ドメイン（またはより一般的には、任意の酵素のドメイン）を示す他のそのような融合タンパク質は、実施例４に例示される技術および本明細書中に記載された技術のような技術を用いて、生成され得ることが、明らかである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成しそれを用いて、例えば、特定の宿主細胞中に導入された特定の発現ベクターにおける融合構築物のライブラリーからのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
【０５８１】
（グリコシルトランスフェラーゼ融合構築物）
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、本発明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性に由来する配列のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てられ、マーカー糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成につき選択された。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８）生じることが示された融合構築物（ｐＰＢ１０４）、が同定された（実施例８）。広く種々のそのようなＧｎＴＩ融合構築物を、組み立てた（実施例８、表１０）。標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示す他のそのような融合構築物は、実施例８に示すように生成され得ることが、当業者にとって明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物を用い、ＧｌｎＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
【０５８２】
マンノシダーゼ融合構築物につき上記したように、全ての標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、本明細書中に記載するように目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じるというわけではない。しかしながら、当業者は、本明細書中に記載したＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生成してそれを選択することが可能である。実施例８は、標的化ペプチドと、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を持つ糖タンパク質の生成に関与するＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物とを含む、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの好ましい実施形態を示す。
【０５８３】
（宿主細胞グリコシル化を改変するための多重融合構築物の使用）
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例において、レポータータンパク質（Ｋ３）を発現するＯＣＨ１欠失を持つＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質転換して、高マンノースＮ−グリカンをヒト様Ｎ−グリカンに変換した（実施例８）。まず、マンノシダーゼ融合構築物ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）を、１，６開始マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（すなわち、ｏｃｈ１欠失；実施例１）に形質転換した。第二に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ＡＦ１０６０８０）を含むｐＰＢ１０３を構築して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなる生成を増加させた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、図１０Ｂに示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を有意に増加させた。第３に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、この株に導入した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を「ＰＢＰ−３」という。
【０５８４】
上記した酵母株のような宿主細胞は、１以上の発現ベクターで順次に形質転換および／または共形質転換され得ることが、当業者によって理解される。また、形質転換の順番は、目的の糖タンパク質を生成するのに特には関係しないことも、理解される。当業者は、本明細書中に開示された手法の慣用的改変は、目的の糖タンパク質の生成において改良された結果を提供し得ることを認識する。
【０５８５】
特定の触媒ドメイン配列を持つ特定の標的化ペプチド配列を用いることの重要性は、本明細書中に記載された実験から容易に明らかになる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ヒト様糖タンパク質を生成するのに特に有用な、目的の糖タンパク質上でのＮ−グリカンの改変に関与する酵素融合物を構築するためのツールを提供する。（しかしながら、本発明のライブラリーおよび方法を用い、任意の酵素融合物が、選択され得る）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、図５Ｄおよび５Ｅに示されたように、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを持つＫ３を生じる。これは、図５ＣにおいてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検出されたように、親ＯＣＨ１欠失株のＫ３と比較して、切断されたグリカンに減少した分子質量を与える。
【０５８６】
同様に、同じアプローチを用いて、別の分泌型糖タンパク質（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を優勢に含むＩＦＮ−β）を生成した。このＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＰＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｐａｐａｃら．，１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４４５−４５４）によって除去し、図６Ａ〜６Ｆに示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに供した。１２５４（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークは、図６Ｅ（ｐＧＣ５）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）および図６Ｆ（ｐＦＢ８）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）において、ＩＦＮ−β上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を確認する。さらに、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）、ｐＰＢ１０４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８）およびｐＰＢ１０３（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ−３において、ハイブリッドＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された（図１０）。
【０５８７】
高度なマンノーストリミングで形質転換体を同定した後、さらなる実験を行って、マンノシダーゼ（トリミング）活性がインビボで起こり、これは、優勢には、増殖培地中での細胞外活性の結果ではないことを確認した（実施例６；図７〜９）。
【０５８８】
（ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物）
本発明の方法によって提供されるように、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩのコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、数個のマンノシダーゼＩＩ酵素の触媒ドメインを一群の細胞標的化ペプチドシグナルに融合させることによって、生成した（実施例１４）。得られた５００個を超えるコンビナトリアル融合構築物を、レポーターＫ３上で複合グリコシル化のヒト前駆体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  ＹＳＨ−１（実施例１７）を生成し得るＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に導入した。ほんの少数の株（約＜５％）のみが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へと定量的に変換し得た。これらの株を単離し、引き続いて、数百個のＧｎＴＩＩ／リーダーペプチド融合物のコンビナトリアルライブラリーで形質転換した。ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の存在についてのスクリーニングは、株ＹＳＨ−４４によって例示されるように、均一な複合グリカンを分泌することが可能である株の単離を可能とした（実施例１９）。
【０５８９】
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物の代表的な例は、ｐＫＤ５３であり、これは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ酸欠失物にインフレーム連結した短縮型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ２（ｓ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ３８０６９からのＭＮＮ２の１〜１０８ヌクレオチド）である。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ２（ｓ）／Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ  Δ７４という。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＭＮＮ２（ｓ）標的化ペプチド配列によってゴルジに局在化し、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成し得る（実施例１８）。
【０５９０】
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物の別の例は、ｐＫＤ１であり、これは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ酸欠失物にインフレーム連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＬＳ１（ｓ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ５３００８からのＧＬＳ１の  １〜１０２ヌクレオチド）である。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＬＳ１（ｓ）／Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４という。コードされた融合タンパク質は、マンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＧＬＳ１（ｓ）標的化ペプチド配列によってゴルジに局在化し、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成し得る（実施例２２）。
【０５９１】
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物の別の例は、ｐＫＤ５であり、これは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ酸欠失物にインフレーム連結された短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ３２９０６からのＭＮＳ１の１〜２４６ヌクレオチド）である。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ  Δ７４という。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＭＮＳ１（ｍ）標的化ペプチド配列によってゴルジに局在化し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビトロで生成し得る（実施例２３）。ＹＳＨ−２７に存在するＮ−グリカンの均一性とは異なり、図２１は、Ｎ−グリカンの不均一混合物がＹＳＨ−７４を生じたことを示す。しかしながら、このマンノシダーゼＩＩ酵素の見掛けの普通のトリミング活性は、図２３に示唆されるようなＭａｎα１，２付加物としての不均一性を示し、ここで、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ピークは、Ａ．ｓａｉｔｏｉ  α−１，２−マンノシダーゼでのＹＳＨ−７４の消化の後に出現する。本発明によりこれらのマンノシダーゼ融合構築物および他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成することによって、当業者は、最適な細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低い活性を有するかまたは全く活性を有さない構築物から区別してそれを選択し得る。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された少数のマンノシダーゼ融合構築物のみがインビボにて特に望ましいＮ−グリカンを生成し得るので、有利である。
【０５９２】
さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的であり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じ得るというわけではないことが、さらに理解されるべきである。図１８は、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーｐＫＤ１６（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ酸欠失物にインフレーム連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ３９１０７からのＭＮＮ９の１〜２７３ヌクレオチド）である）に由来するゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１において、見掛けの活性がないことを示す。従って、目的のタンパク質は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーで形質転換された宿主細胞に導入されて、目的のタンパク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され得る。当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生成してそれを選択し得る。
【０５９３】
（宿主細胞）
本発明をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主生物を用いて例示するが、酵母宿主および真菌宿主の他の種を含めた他の真核生物宿主細胞を、本明細書中に記載したように改変して、ヒト様糖タンパク質を生成し得ることが、当業者に理解されるべきである。望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子（例えば、ＯＣＨ１）の同定および破壊のための本明細書中に記載した技術は、他の酵母および真菌株のような他の真核生物宿主細胞におけるこれらおよび／または他の相同遺伝子または機能的に関連した遺伝子について適用可能であることが、理解される。実施例９に記載されたように、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１遺伝子が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓから欠失されて、１，２−マンノシダーゼによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと完全に変換されるＮ−グリカンに導く宿主細胞を操作した（図１２Ｃ）。
【０５９４】
ＭＮＮ１遺伝子を、実施例９に記載されたようにＫ．ｌａｃｔｉｓからクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列は、各々、配列番号１６および配列番号１７に示される。遺伝子特異的プライマーを用い、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＭＮＮ１遺伝子を欠失するように、構築物を操作した（実施例９）。ｏｃｈ１活性およびｍｎｎ１活性を除去した宿主細胞は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造を有するＮ−グリカンを生じる（例えば、図１０参照）。そのような宿主細胞は、例えば、本発明の方法およびライブラリーを用いてさらに操作して、哺乳動物様糖タンパク質またはヒト様糖タンパク質を生成され得る。
【０５９５】
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ１遺伝子（配列番号１６）の少なくとも４５ヌクレオチド残基、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド残基、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド残基、最も好ましくは７５のヌクレオチド残基以上を含む核酸配列を有する単離された核酸分子、またはそれらのヌクレオチド残基からなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそれらのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、断片、誘導体およびアナログを含む）が提供される。加えて、さらに本明細書中で記載するような、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞が、提供される。
【０５９６】
従って、本発明の別の局面は、ヒト細胞によって生成されるものと似ている改変されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を発現する、非ヒト真核生物宿主株に関する。従って、酵母細胞および真菌細胞以外の種における本発明の方法の実行が、企図され、これは本発明に含まれる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーを用いて、任意の真核生物宿主細胞系におけるグリコシル化経路を改変する構築物を選択し得ることが、企図される。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、植物、藻類および昆虫、ならびに他の真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む）で用いて、宿主細胞分泌経路に沿った望む位置において、タンパク質（グリコシル化酵素またはその触媒ドメインを含む）を局在化し得る。好ましくは、グリコシル化酵素または触媒ドメインなどは、宿主細胞分泌経路に沿って亜細胞位置に標的化され、その場所で、それらの酵素は、機能化膿であり、好ましくは、それらが最も効率的に機能するように設計または選択される。
【０５９７】
本発明の好ましい宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａが挙げられる。
【０５９８】
植物および昆虫細胞をまた、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用い、発現されたタンパク質のグリコシル化を改変するように作成し得る。さらに、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞におけるグリコシル化はまた、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用いて修飾され得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用いて、特定の酵素活性を最適化するか、あるいは哺乳動物宿主細胞において作成された種々のＮ−グリカンの相対的割合を修飾することが可能であり得る。
【０５９９】
本発明のこの実施形態に従った方法を用いて作用され得るグリコシル化に対する修飾の例は：（１）Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのマンノース残基をトリミングして、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを生じるように真核生物宿主細胞を操作する工程；（２）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加するように真核生物宿主細胞を操作する工程；（３）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）またはシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のような酵素を機能的に発現するように真核生物宿主細胞を操作する工程である。
【０６００】
この方法を反復することによって、徐々に複雑なグリコシル化経路を、下等真核生物微生物のような標的宿主に操作し得る。１つの好ましい実施形態において、宿主微生物は、グリコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーで２回以上形質転換する。所望の表現型の選択は、各ラウンドの形質転換の後に、あるいは、数回の形質転換が生じた後に行われ得る。複合グリコシル化経路はこのようにして迅速に操作され得る。
【０６０１】
（一連のグリコシル化反応）
好ましい具体例において、そのような標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーは、高等真核生物において、グリコシル化反応の一連の性質についての既存の情報を組み込むように設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、そのような反応を触媒する酵素をゴルジまたはＥＲの初期部分に標的化する工程を必要とする。例えば、マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングは、複合体Ｎ−グリカン形成における初期の工程である。タンパク質プロセシングはＥＲで開始され、次いで、初期、中間および後期ゴルジを通じて進行するので、この反応はＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが望ましい。従ってマンノシダーゼＩ局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、ＥＲおよび初期ゴルジ標的化シグナルをマンノシダーゼＩの触媒ドメインと対応させるよう試みられる。
【０６０２】
（組込み部位）
この遺伝子工学の試みの１つの最終的な目標は、産業醗酵プロセスにおいて首尾よく実行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体への複数遺伝子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換されて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならないであろう。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体についてのｓｙｎおよびアンチポートトランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素）のいずれかの組合せを真菌タンパク質発現宿主中に作製し得る。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような下等真核生物宿主細胞においてグリコシル化を修飾するための好ましい方法の例を表６に示す。
【０６０３】
（表６．下等真核生物微生物においてグリコシル化を修飾するためのいくつかの好ましい具実施形態）
【０６０４】
【表６−１】
0004792387.tif 000014
【０６０５】
【表６−２】
0004792387.tif 000015
下等真核生物のような宿主細胞への複合体Ｎ−グリカンの形成を操作するためのいずれかの戦略は特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性の除去ならびに付加の両方を含むので、包括的なスキームは、両方の要件を協調させる試みであろう。望ましくない酵素をコードする遺伝子は、望ましい遺伝子についての潜在的組込み部位として働く。例えば、１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性は、多くの既知の下等真核生物におけるグリコシル化の特徴である。α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化され、この遺伝子における変異は低下したマンノシル化と共に生存可能な表現型を生じる。従って、α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子の組込み用のプライミング標的である。同様に、その遺伝子座における遺伝子破壊事象に基づいて、（１）よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を改良し、（２）タンパク質を分泌する細胞の能力を改良し、（３）外来性タンパク質のタンパク質分解を低減させ、そして（４）その精製または醗酵プロセスを容易にするプロセスの他の特徴を改良することが期待されるある範囲の他の染色体組込み部位を選択し得る。
【０６０６】
（標的糖タンパク質）
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられる糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−６−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャイエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様に、グリカン側鎖への１以上のシアル酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タンパク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞（例えば、下等真核生物または哺乳動物）は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアル酸の程度を増加させるように遺伝的に操作され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼおよび適切な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増殖培地組成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用して、ヒト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る（Ｗｅｉｋｅｒｔら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７，１１１６−１１２１；Ｗｅｒｎｅｒら、（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ４８（８）：８７０−８８０；ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＧｏｏｃｈｅｅ（１９９４）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５４６−５４９；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８（４）：３７０−３８０）。モノクローナル抗体への特異的グリカン修飾（例えば、二分されたＧｌｃＮＡｃの付加）は、抗体依存性細胞傷害性を改良することが示されており（Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０）、これは、抗体または他の治療タンパク質の生成に望ましくあり得る。
【０６０７】
治療タンパク質は、代表的には、注射、経口、または肺もしくは他の手段によって投与される。本発明に従って生成され得る適した糖タンパク質の例としては、エリスロポエチン、サイトカイニン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω）、および顆粒球−ＣＦＳ、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子）、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン類、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻害因子１、オステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、αフェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、別名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１  ｗ／およびｗ／ｏ  ＦＣ（グルカゴン様プロテイン１）ＩＬ−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、別名可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０８】
（その後のグリコシルトランスフェラーゼ活性：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ）
本発明のさらなる局面において、ゴルジαマンノシダーゼ酵素によって産生された新しく形成されたグリカンは、その後のグリコシル化反応のための基質である。１つの実施形態において、ＧｎＴ  ＩＩ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび、必要に応じてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターは、ＧｌｃＮＡｃを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−３７で生産されたオリゴ糖の新しく形成されたＭａｎα１，６分枝をキャップして、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を形成する（実施例１９）。別の実施形態において、他のＧｎＴ（例えば、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ）は、一過性ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２基質と反応する。この基質は、今度は、ガラクトシルトランスフェラーゼのための基質となり（実施例２５）、そしてさらなるプロセシングがシアリルトランスフェラーゼを用いて生じる。
【０６０９】
以下の実施例は、本発明の組成物および方法を説明する。これらの実施例は限定するものとして解釈されるべきではなく：実施例は説明の目的のみのために含まれる。
【実施例】
【０６１０】
（実施例１）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１遺伝子のクローニングおよび破壊）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１配列（日本国特許出願公開番号８−３３６３８７号）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド
【０６１１】
【化５】
0004792387.tif 000016
（配列番号１８）および
【０６１２】
【化６】
0004792387.tif 000017
（配列番号１９）を用いて、推定α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードするＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐ  ＯＲＦを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ（Ｘ−３３株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から増幅した。その後、ＯＣＨ１遺伝子における内部オリゴヌクレオチド
【０６１３】
【化７】
0004792387.tif 000018
（配列番号２０）、およびライブラリー担持プラスミドλＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格における
【０６１４】
【化８】
0004792387.tif 000019
（配列番号２１）および
【０６１５】
【化９】
0004792387.tif 000020
（配列番号２２）オリゴヌクレオチドを用いて、ＯＣＨ１遺伝子のＯＲＦの２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリー（Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．ら、Ｙｅａｓｔ  １９９９  ５月；１５（７）：５６３−７２）から増幅した。得られた５０７５ｂｐフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。
【０６１６】
ＨＩＳ４抵抗性遺伝子でＯＣＨ１リーディングフレームを置換した遺伝子ノックアウト構築物を構築した後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換し、コロニーを３７℃における温度感受性についてスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、上昇した温度における成長が遅い。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを補完することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１の機能的ホモログを同定することができる。約２０の温度感受性株を、さらに、コロニーＰＣＲスクリーニングに供して、欠失したｏｃｈ１遺伝子でコロニーを同定した。数個のｏｃｈ１欠失を得た。
【０６１７】
ＰｉｃｈｉａＨＩＳ４遺伝子を保有するＯＣＨ１遺伝子カセットの２．１ｋｂ上流配列および１．５ｋｂ下流配列を有する直線化ｐＢＫ９．１を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＢＫ１［ＡＯＸ１遺伝子座においてヒトＩＦＮ−β遺伝子を保有するＧＳ１１５（ｈｉｓ４  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）］に形質転換して、野生型ＯＣＨ１遺伝子をノックアウトした。形質転換体の初期スクリーンニングは、ヒスチジンドロップ−アウト培地を用いて行い、その後、レプリカプレーティングを行って、温度感受性コロニーを選択した。２００のヒスチジン−陽性コロニーのうち２０が、３７℃における温度感受性表現型を示した。ＰｉｃｈｉａゲノムへのｐＢＫ９．１のランダムな組込みを除去するために、２０の温度−感受性単離体を、組込み部位の上流配列、およびＨＩＳ４  ＯＲＦに特異的なプライマーを用いてコロニーＰＣＲに供した。２０のコロニーのうち２つはｏｃｈ１障害性であり、サザンブロットおよびウェスタンブロットを用いてさらに分析し、これは、ｏｃｈ１ノック−アウト構築物による機能性ｏｃｈ１破壊を示す。２つの別々の制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩを用いてゲノムＤＮＡを消化して、ｏｃｈ１のノックアウトを確認し、オープンリーディングフレームにおける組込みを確認した。ウェスタンブロットは、４６．２ｋＤａにおいてＧＳ１１５野生型で生じた区別されるバンドを欠如するｏｃｈ１変異体を示した。
【０６１８】
（実施例２）
（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−含有ＩＦＮ−β前駆体を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのα―１，２−マンノシダーゼを用いた操作）
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングして、複合体Ｎ−グリカン形成のための必須の中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を得るのに必要である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび複合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的異性体は、ＧｎＴＩについての基質であってもなくてもよいからである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体は、ａｏｘプロモーターの制御下で分泌されるヒトインターフェロンβを発現するように操作される。ＤＮＡライブラリーは、ヒトマンノシダーゼＩＢ（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびＥＲ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築される。次いで、ＤＮＡライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体が各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インターフェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、９０％を超える分泌されたタンパク質はグリコシル化インターフェロンβである。
【０６１９】
上澄みを精製して、Ｃ１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去する。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現される所望の形質転換体は、親株のインターフェロンβと比較して低下した分子質量を有する、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを含むインターフェロンβを生成する。精製されたインターフェロンβはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、インターフェロンβの所望の形態を発現するコロニーを同定する。
【０６２０】
（実施例３）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩを発現するｏｃｈ１変異体株の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＨＣ１遺伝子の１２１５ｂｐのオープンリーディングフレームならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流をＰＣＲによって増幅し（ＷＯ  ０２／００８７９も参照のこと）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９、ＳｆｉＩ制限部位が隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子を含むプラスミドをＳｆｉＩで消化し、これを用いて、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９）を形質転換した。室温における１０日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに続き、１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したＵＲＡ＋クローンをコロニーＰＣＲに供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたＰＣＲパターンを呈した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。ヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ドメインをモデルタンパク質として用いた。Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏＲでマークしたプラスミドを株ＹＪＮ１５３に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株をＢＫ６４−１と命名した。
【０６２１】
ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）からの平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＤＥ１遺伝子（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、（２００１）Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９）を含むＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消化した平滑末端ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸにクローン化することによって、ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターをコードするＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子を含むプラスミドｐＰＢ１０３を構築した。このプラスミドをＥｃｏＮＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＢＫ６４−１に形質転換し、１つの株はＰＣＲ分析によりＭＮＮ２−２を含むと確認され、これをＰＢＰ１と命名した。
【０６２２】
ヒト、マウス、ハエ、虫および酵母源からの数個のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の触媒ドメインと融合させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの数個のＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのイン−フレーム融合物を含むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを作製した（例えば、ＷＯ  ０２／００８７９を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＩＳ４組込みベクターにおいて作製し、ＳａｌＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ１に形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から放出されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。１つの活性な選択された構築物は、１８７ヌクレオチドを失った、マウスα―１，２−マンノシダーゼＩＡ遺伝子（図３）のＮ−末端欠失と融合させた酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８−１２９６ヌクレオチド（Ｃ−末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ２と命名した。
【０６２３】
ヒト、虫、カエルおよびハエ源からのＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同じリーダーライブラリーのイン−フレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ  ０２／００８７９）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＲＧ４組込みベクターにおいて作製し、そして、ＡａｔＩＩで直線化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ２に形質転換し、Ｋ３から放出されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、最初の１５４ｂｐが失われた、ヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ９遺伝子の最初の１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ３と命名した。
【０６２４】
（実施例４）
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる優勢なＮ−グリカン構造としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
誘導性ＡＯＸＩプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体（実施例１および３を参照のこと）を作成した。ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）をモデルタンパク質として用いた。Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、Ｋ３をコードするＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化し、Ｃ−末端６−Ｈｉｓタグが得られた。Ｋ３のＮ−結合グリコシル化効率を改良する（Ｈａｙｅｓら、１９７５  Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１，６５１−６５５）ために、部位特異的変異誘発を用いてＰｒｏ４６をＳｅｒ４６で置き換えた。得られたプラスミドをｐＢＫ６４と命名した。ＰＣＲ構築物の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０６２５】
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、表６に従って、Ｃｏｐ  ＩＩ小胞、ＥＲ、および初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ６６７８７８７）およびＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ６７５４６１９）触媒ドメインとのイン−フレーム連結によって構築した。組み合わされたＤＮＡライブラリーを用いて、個々の融合構築物を生成し、次いで、これをＫ３発現宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体各々がＫ３ならびにライブラリーからの局在化シグナル／マンノシダーゼ融合遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が得られた。個々の形質転体を培養し、Ｋ３の産生を、メタノール含有培地への移動によって誘導した。これらの条件下で、誘導の２４時間後に、９０％を超える倍地中のタンパク質はＫ３であった。Ｋ３レポータータンパク質を上清から精製して、Ｎｉ―アフィニティークロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去した。アフィニティー精製に続き、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を脱塩し、後記するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に直接的に供するか、あるいはＮ−グリカンを後記するようなＰＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｎ−グリカンの放出）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供した（Ｍｉｅｌｅら、１９９７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，１５１−１５７）。
【０６２６】
このアプローチに続き、多様な組の形質転換体が得られた；いくつかはｏｃｈ１ノックアウト株と比較してＮ−グリカンの修飾を示さず；他のものは高度なマンノーストリミングを示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを有するＫ３を産生した。これは、親ｏｃｈ１欠失株のＫ３と比較して、糖タンパク質に対して低下した分子質量を付与し、この差はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって容易に検出された（図５）。表７は、相対的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生レベルを示す。
【０６２７】
（表７  Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対的レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
【０６２８】
【表７】
0004792387.tif 000021
（表８  Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの別のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
【０６２９】
【表８】
0004792387.tif 000022
標的化ペプチドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（長、中程度および短）（前出を参照のこと、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）におけるＭＮＳＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ３２９０６）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（９８８〜１１４０ヌクレオチド：短）および（９８８〜１２９６：中程度）におけるＳＥＣ１２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ１１６５５）から選択した。標的化ペプチド配列の大部分はＮ末端欠失であったが、ＳＥＣ１２のようないくつかの標的化ペプチド配列はＣ末端欠失であった。この実験で用いた触媒ドメインは、１８７アミノ酸Ｎ−末端欠失を含むマウスマンノシダーゼ１Ａ；および５８、９９および１７０アミノ酸欠失を含むマウスマンノシダーゼ１Ｂから選択した。本明細書中で使用される場合、（＋）の数は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対的レベルを示す。表示（−）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の明白な産生が無いことを示す。表示（＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の１０％未満の産生を示す。表示（＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約１０〜２０％の産生を示す。表示（＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約２０〜４０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約５０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の５０％を超える産生を示す。
【０６３０】
表９は、分泌されたＫ３レポーター糖タンパク質で検出されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の相対的な量を示す。１９のα−１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを３２の真菌ＥＲ、およびシス−ゴルジリーダーに融合させることによって作製されたコンビナトリアル遺伝子ライブラリーからの単一構築物で各々を形質転換することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｏｃｈ１）の６０８の異なる株を作製した。
【０６３１】
（表９）
【０６３２】
【表９】
0004792387.tif 000023
＊数個の融合構築物は試験しなかった。なぜなら、対応するプラスミドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへの形質転換の前にＥ．ｃｏｌｉ中で増殖し得なかったからである。
＋最高程度のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２トリミング（３０／５１）を有するクローンを、培地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分（２８／３０）は、上清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した（例えば図４Ｂ）。２つの構築物のみが倍地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２レベルを示した（例えば、図４Ｃ）。
【０６３３】
表７は、とりわけ、形質転換された宿主細胞がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示すＫ３糖タンパク質を作製することを可能にする２つの構築物ｐＦＢ８およびｐＧＣ５を示す。表８は、８０アミノ酸Ｎ−末端欠失を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｖａｎ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ８０）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ＣＡＡ９８１１４）にインフレーム連結したより好ましい構築物、ｐＢＣ１８−５、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２３６４２由来）を示す。この融合構築物はまた、図５Ｅに示すように、優勢なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する。このマンノシダーゼ融合構築物は、５０％を超えるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成することが示された（＋＋＋＋＋）。
【０６３４】
（コンビナトリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの作製：）
標的化ペプチドに融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの作製は、多数の生物からの種々の長さのＮ−末端欠失を含むマンノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−１，２−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以下の源：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍから得られたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかからＰＣＲ増幅した。各場合において、ＰＣＲ反応を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でＤＮＡをインキュベートした。例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを増幅するために、５’−プライマー
【０６３５】
【化１０】
0004792387.tif 000024
（配列番号２３）および３’−プライマー
【０６３６】
【化１１】
0004792387.tif 000025
（配列番号２４）をＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下でインキュベートし、循環パラメーター：９４℃で１分間（１サイクル）；９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間（３０サイクル）を用いるＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって推奨される条件下で増幅した。増幅に続いて、ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への連結の前に１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に７２℃にて５分間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されるように、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。クローン化されたＰＣＲ産物は、マンノシダーゼＯＲＦに特異的なプライマーを用いるＡＢＩ配列決定によって確認した。
【０６３７】
各マンノシダーゼの所望のＮ−末端短縮形を作製するために、各マンノシダーゼの完全なＯＲＦを、ＰＣＲ反応の後のラウンドでテンプレートとして用い、ここで、５’プライマーのアニーリング位置は所望の短縮形の５’末端に特異的であり、３’プライマーはＯＲＦの元来の３’末端に特異的なままであった。酵母発現ベクターへの短縮形マンノシダーゼフラグメントのサブクローニングを容易にするために、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位をそれぞれ、５’および３’末端において、各短縮産物に作成した。各マンノシダーゼＯＲＦについて作製されたＮ−末端短縮形の数および位置は、触媒ドメイン）（ＣＤ）に関して膜貫通（ＴＭ）領域の位置に依存した。例えば、ＴＭおよびＣＤの間に位置したステム領域が１５０ｂｐ未満である場合、そのタンパク質についての１つの短縮形のみが生じた。しかしながら、ステム領域が１５０ｂｐよりも長い場合、ステム領域の長さに応じて１以上の短縮形が作製された。
【０６３８】
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ６６７８７８７）についての短縮形をいかにして作製したかの例を本明細書に記載し、同様なアプローチを他のマンノシダーゼについて用いた。図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを示し、予測された膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを太字で強調した。この構造に基づいて、３つの５’プライマーを設計して（図３において下線を施したアニーリング位置）、Δ６５−、Δ１０５−およびΔ１８７−Ｎ−末端欠失を作製した。Δ６５Ｎ−末端欠失を例として用いた、使用された５’プライマーは、３’プライマー
【０６３９】
【化１２】
0004792387.tif 000026
（配列番号２６）（ＰａｃＩ制限部位は太字で強調する）と組み合わせた
【０６４０】
【化１３】
0004792387.tif 000027
（配列番号２５）（ＡｓｃＩ制限部位は太字で強調する）であった。これらのプライマーの両方を用いて、全長Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ１Ａ  ＯＲＦを増幅するための上記にて概説した条件下で１５６１ｂｐ断片を増幅した。さらに、全長ＯＲＦで得られた産物のように、短縮産物もまたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、ＴＯＰ１０に形質転換し、ＡＢＩ配列決定した。短縮マンノシダーゼ断片の配列を増幅し、確認した後に、得られたプラスミド、ｐＣＲ２．１−Δ６５ｍＭａｎｎＩＡを、３７℃にて１６時間、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中でＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。平行して、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）を同一酵素で消化し、上記のようにインキュベートした。消化後、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）骨格および短縮触媒ドメインの両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。コロニーＰＣＲを用いて、ｐＪＮ３４７−マウスマンノシダーゼＩＡΔ６５構築物の生成を確認した。
【０６４１】
酵母発現ベクターｐＪＮ３４７（図２Ｃ）において短縮α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのライブラリーを生成し、標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーの生成における残りの工程は、標的化ペプチド配列（図２）をイン−フレームクローン化することであった。ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ構築物（図２Ｄ）およびｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−標的化ペプチド構築物（図２Ｂ）両方を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩの存在下で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４中で３７℃において一晩インキュベートした。消化に続き、ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ骨格および標的化ペプチド領域の双方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。引き続いて、ｐＪＮ３４７−標的化ペプチド／マンノシダーゼ構築物をＡＢＩ配列決定して、生成された融合がイン−フレームであることを確認した。最終標的化ペプチド／α−１，２−マンノシダーゼライブラリーの推定サイズは、上記アプローチによって生成された１３００を超える構築物を含む。図２は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。
【０６４２】
（複数栄養要求性マーカーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１ノックアウト株の操作）
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の５’および３’領域についてのスペースホールダー（ｓｐａｃｅ  ｈｏｌｄｅｒ）としての、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｂｏｅｈｍら、Ｙｅａｓｔ  １９９９年５月；１５（７）：５６３−７２）のＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含むユニバーサルプラスミドの組を作製する工程を包含した。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｕｒａ−ブラスター（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６，５４１−５４５．１９８７）、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を有する発現カセットを含んだ。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋｂのフラグメントは、プライマー
【０６４３】
【化１４】
0004792387.tif 000028
（配列番号２７）および
【０６４４】
【化１５】
0004792387.tif 000029
（配列番号２８）、およびテンプレートとしてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ，ＳａｌＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマー
【０６４５】
【化１６】
0004792387.tif 000030
（配列番号２９）および
【０６４６】
【化１７】
0004792387.tif 000031
（配列番号３０）を用いて増幅されたＫＥＸ１−３’領域の０．８ｋｂのフラグメントを開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６２を作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｐＮＫＹ５１（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６，５４１−５４５．１９８７）の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを可能な双方の向きに挿入し、その結果、プラスミドｐＪＮ２６３（図４Ａ）およびｐＪＮ２８４（図４Ｂ）が得られた。
【０６４７】
発現カセットをクローニング部位としてのＮｏｔＩおよびＰａｃＩを用いて作製した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマー
【０６４８】
【化１８】
0004792387.tif 000032
（配列番号３１）および
【０６４９】
【化１９】
0004792387.tif 000033
（配列番号３２）およびテンプレートとしてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ部位にクローン化した（図４Ｂ）。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマー
【０６５０】
【化２０】
0004792387.tif 000034
（配列番号３３）および
【０６５１】
【化２１】
0004792387.tif 000035
（配列番号３４）およびテンプレートとしてのプラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅したＣＹＣ１転写ターミネーター領域（「ＴＴ」）を開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６１を作製した（図４Ｂ）。
【０６５２】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子についてのノックアウトプラスミドをｐＪＮ２６３をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化することによって作製し、プライマー
【０６５３】
【化２２】
0004792387.tif 000036
（配列番号３５）および
【０６５４】
【化２３】
0004792387.tif 000037
（配列番号３６）およびテンプレートとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用いて増幅したＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを開いた部位にクローン化した（図４Ｃ）。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで切断し、プライマー
【０６５５】
【化２４】
0004792387.tif 000038
（配列番号３７）および
【０６５６】
【化２５】
0004792387.tif 000039
（配列番号３８）を用いて生成したＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを挿入して、ｐＪＮ２９８を生成した（図４Ｃ）。プラスミドを同時に用いて新しい遺伝子を導入する可能性を可能とするために、ｐＪＮ２６１のＢａｍＨＩ発現カセット（図４Ｂ）をｐＪＮ２９８（図４Ｃ）の固有のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ２９９を作製した（図４Ｅ）。
【０６５７】
Ｌｕら、（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：１４１−１４６に記載されている同様な戦略を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｕｒａ３−ブラスターカセットを構築した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３の２．０ｋｂのＰｓｔＩ、ＳｐｅＩフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＰｓｔＩ，ＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＪＮ３０６を作製した（図４Ｄ）。次いで、ｌａｃＺオープンリーディングフレームの０．７ｋｂのＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ  ＤＮＡフラグメントをＳａｃＩ、ＳｍａＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ３０８を得た（図４Ｄ）。ＰｓｔＩでのｐＪＮ３０８（図４Ｄ）の消化、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼでの処理に続いて、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｌａｃＺ由来のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを挿入し、ｐＪＮ３１５を作製した（図４Ｄ）。ｌａｃＺ／ＵＲＡ３カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩでの消化によって放出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｐＪＮ２９９の骨格にクローン化した。得られたプラスミドをｐＪＮ３２９と命名した（図４Ｅ）。
【０６５８】
ｐＪＮ２６１（図４Ｆ）をＥｃｏＩＣＲＩで切断することによって、ＨＩＳ４でマークした発現プラスミドを作製した（図４Ｆ）。ＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断したプライマー
【０６５９】
【化２６】
0004792387.tif 000040
（配列番号３９）および
【０６６０】
【化２７】
0004792387.tif 000041
（配列番号４０）を用いて増幅し、次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＩＳ４遺伝子の２．７ｋｂのフラグメントを、次いで、開いた部位に連結した。このプラスミドをｐＪＮ３３７と命名した（図４Ｆ）。融合ライブラリーの構築に適した多重クローニング部位を有するプラスミドを構築するために、ｐＪＮ３３７をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、インビトロでアニーリングした２つのオリゴヌクレオチド
【０６６１】
【化２８】
0004792387.tif 000042
（配列番号４１）および
【０６６２】
【化２９】
0004792387.tif 000043
（配列番号４２）を開いた部位に連結し、ｐＪＮ３４７を作製した（図４Ｆ）。
【０６６３】
複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９をＳｆｉＩで消化し、これを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ２６３（２００１）１５９−１６９）をエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換に続いて、ＵＲＡドロップアウトプレートを室温で１０日間インキュベートした。１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。次いで、全ての１０００のクローンを２組のＵＲＡドロップアウトプレート上で画線培養した。１つの組を室温にてインキュベートし、他方、第二の組を３７℃でインキュベートした。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したクローンをコロニーＰＣＲに供して、正しいＯＣＨ１ノックアウトについて試験した。予測されたＰＣＲシグナル（約４．５ｋｂ）を示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。
【０６６４】
（実施例５）
（コンビナトーリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの特徴付け）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロニーＰＣＲによってスクリーニングした陽性形質転換体（実施例４）を、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロールよりなる増殖培地としての５０ｍｌのＢＭＧＹ緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてＯＤ６００ｎｍ２−６まで増殖し、その時点で、５ｍｌのＢＭＭＹ中での室温での２４時間のレポータータンパク質の誘導に先立ち、１０ｍｌのＢＭＭＹ（増殖培地としての１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５ビオチン、および１．５％メタノールよりなる  緩衝化メタノール−複合培地）で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、実施例３に記載したように分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表６中の標的化ペプチドを用い、ＥＲまたはゴルジいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を圧倒的に含有するグリカンに対してＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を圧倒的に含有するグリカンのトリミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカン構造を、図５Ｃおよび６ＣにおけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｏｃｈ１ノックアウトのそれと、図５Ｄ、５Ｅ、６Ｄ〜６Ｆに示したＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ構築物で形質転換された同株との間で比較する場合で明らかである。図５および６は、Ｐ．ｐａｓｔｉｒｉｓにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーから創製された構築物の発現を示す。ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９（図５Ｄおよび６Ｅ）の発現は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされた全てのグリカンのほぼ３０％を有するタンパク質を生じ、他方、ｐＦ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）（図６Ｆ）の発現はほぼ５０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じ、ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ８０）（図５Ｅ）の発現は７０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じた。
【０６６５】
（実施例６）
（アルファ−１，２−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング）
実施例４の新規な作製された株が、事実、インビボにて所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じたことを確認するために、細胞上澄みをマンノシダーゼ活性につきテストした（図７〜９参照）。後記した各構築物／宿主株については、ＨＰＬＣを１．０ｍｌ／分の流速にて、Ａｌｔｅｃｈの４．０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）  Ｅｃｏｎｏｓｉｌ−ＮＨ２樹脂（５μｍ）を用いて３０℃にて４０分間行った。図７および８において、標準的なＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の分解は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２二関連するピークを生じるように起こることが示された。図７において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］標準は２４．６１分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］は１８．５９分で溶出した。図８において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は２１．３７分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は１５．６７分で溶出した。図９において、標準Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］は２０．８８分で溶出することが示された。
【０６６６】
プラスミドｐＦＤ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、３０℃にてＢＭＧＹ中で約１０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心によって細胞を収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生産を誘導した。誘導から２４時間後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために除去し、残りを選択された可溶性Ｋ３の回収で用いた。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ  ＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析は図６Ｆに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。２−アミノベンズアミド−標識Ｎ−結合−型オリゴマンノース９（Ｍａｎ９−２−ＡＢ）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の商業的に入手可能な標準をＢＭＭＹ（図７Ａ）、上記アリコートからの上澄（図７Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ０２／００８５６  Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図７Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
【０６６７】
プラスミドｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を同様に増殖させ、アッセイした。細胞を室温にてＢＭＧＹ中で約１０のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を遠心によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３の生産を誘導した。誘導から２４時間後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収で用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ  ＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｄに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、図８Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ９−２−ＡＢ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の商業的に入手可能な標準をＢＭＭＹ（図８Ａ）、上記アリコートからの上澄（図８Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ０２／００８５６  Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図８Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
【０６６８】
Ｍａｎ９−２−ＡＢを基質として用い、インキュベーションの２４時間後に、マンノシダーゼ活性はｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）株消化物（図７Ｂ）およびｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）株消化物（図８Ｂ）の上澄に実質的に存在しないことは明らかであり、他方、陽性コントロール（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓから得られたＰ．ｒｅｅｓｅｉからの精製されたα−１，２−マンノシダーゼ）は、図７Ｃおよび８Ｃに示すように、同一条件下でＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への完全な変換に導く。これは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｐＧＣ５株；およびｐＦＢ８株におけるインビボマンノシダーゼトリミングを示す決定的なデータであり、これは、今日までに報告されているものとは区別可能に異なる（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ  ０２／００８５６  Ａ２）。
【０６６９】
図９は、さらに、マンノシダーゼ酵素の局在化および活性を立証する。ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１（ｍ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ８０）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓをＢＭＧＹ中で室温にて約１０のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を遠心によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導の後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収のために用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ  ＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３を得た。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｅに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、図９Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ８−２−ＡＢ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の商業的に入手可能な標準をＢＭＭＹ（図９Ａ）、上記アリコートｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ８０）からの上澄（図９Ｂ）、および異なる融合構築物ｐＤＤ２８−３（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）からの培地を含有するＢＭＭＹ（図９Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を決定した。図９Ｂは、陰性結果を呈する融合構築物ｐＤＤ２８−３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）と比較した細胞内マンノシダーゼ活性を示す（図９Ｃ）。
【０６７０】
（実施例７）
（作製されたα−１，２−マンノシダーゼのｐＨ最適アッセイ）
プラスミドｐＢＢ２７−２（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ３１）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を室温にてＢＭＧＹ中で約１７のＯＤ６００まで増殖させた。これらの細胞の約８０μＬを６００μＬのＢＭＧＹ中に接種し、一晩増殖させた。引き続いて、細胞を遠心によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生産を誘導した。インキュベーションの２４時間の後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄（ｐＨ６．４３）を得た。上澄をマンノシダーゼｐＨ最適アッセイのために取り出した。蛍光−標識Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を、種々のｐＨに調整された２０μＬの上澄に加え（図１１）、室温にて８時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  ＮＨ２  ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｎｅ，ＰＡ）を用いるＨＰＬＣによって試料を分析した。流速は４０分間で１．０ｍｌ／分であり、カラムは３０℃に維持した。３分間のイソクラフィック溶出（６８％Ａ：３２％Ｂ）の後、直線溶媒グラジエント（６８％Ａ：３２％Ｂ〜４０％Ａ：６０％Ｂ）を２７分間にわたって使用して、グリカン（１８）を溶出させた。溶媒Ａ（アセトニトリル）および溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）。カラムをランの間の２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化した。
【０６７１】
（実施例８）
（構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの作製）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性は、複合体およびハイブリッドＮ−グリカンの成熟化に必要である（米国特許第５，８３４，２５１号）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は単にマンノシダーゼＩＩによってトリミングでき、これは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるＮ−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−１，３マンノース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，  １９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １（５）：４５３−４６１）。従って、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓからのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ遺伝子の適当に標的化された触媒ドメイン；およびＫＴＲホモログであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｄ２、Ｄ９およびＪ３からのホモログに基づき、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ推定α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼからのＧＬＳ、ＭＮＳ、ＳＥＣ、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＡＮＰ１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＭＮＴ１、ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＹＵＲ１、ＭＮＮ１、およびＭＮＮ６からの局在化配列をコードするＤＮＡ断片を含むコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを調製した。図１０は、限定されるものではないが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＧｎＴＩからのＳＥＣおよびＯＣＨ１のような標的化ペプチド配列を含む（表６および表１０参照）。
【０６７２】
【表１０】
0004792387.tif 000044
標的化ペプチド配列はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（長、中程度および短）におけるＯＣＨ１（実施例４参照）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ短および中程度におけるＭＮＮ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ３９１０７）から選択した。触媒ドメインは、各々、３８および８６アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つヒトＧｎＴＩ、３５および６３アミノ酸欠失を持つＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１２）ＧｎＴＩならびに８８アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１４）ＧｎＴＩおよび３３および１０３アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＸ．ｌｅａｖｉｓ  ＧｎＴＩから選択された。
【０６７３】
最初の１５４ｂｐを欠く、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＭＧＡＴＩ、受託番号ＮＭ００２４０６）をコードする遺伝子の一部を、オリゴヌクレオチド
【０６７４】
【数１】
0004792387.tif 000045
および
【０６７５】
【数２】
0004792387.tif 000046
および鋳型としてのベクターｐＨＧ４．５（ＡＴＣＣ番号７９００３）を用いるＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化し、正しい配列を確認した。ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化に続き、切形ＧｎＴＩをプラスミドｐＪＮ３４６に挿入して、ｐＮＡを創製した。ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩでのｐＪＮ２７１の消化の後、１２０ｂｐインサートをｐＮＡに連結して、ＭＮＮ９膜貫通ドメインのＧｎＴＩとのイン−フレーム融合を作製し、ｐＮＡ１５を得た。
【０６７６】
宿主生物はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株であり、これは超マンノシル化を欠損し（例えば、ＯＣＨ１変異体）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供し（すなわち、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含み）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを供する（例えば、上記からのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７））。まず、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９）のＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３でＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｐＦＢ８を形質転換した。次いで、外因性または内因性ＧｎＴＩ／局在化遺伝子の組合せをコードする上記コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを形質転換し、コロニーを選択し、コロニーＰＣＲによってＧｎＴＩ構築物の存在につき分析した。我々の形質転換および組込み効率は、一般には、８０％を超え、ＰＣＲスクリーニングは、一旦頑強な形質転換パラメーターが確立されれば省略することができる。
【０６７７】
要約すれば、本発明の方法は、図１０Ｂに示すように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を高い収率で生産するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株を生じる。Ｎ−グリカンの少なくとも６０％はＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。今日、いずれかの酵母における分泌された可溶性糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形成を記載する報告は存在しない。本明細書中に提示した結果は、ＧｎＴＩ活性と共にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、１４５７（ｍ／ｚ）におけるピークによって確認される支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じることを示す（図１０Ｂ）。
【０６７８】
（株ＰＢＰ−３の構築）
Ｋ３を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（Δｏｃｈ１、ａｒｇ−、ａｄｅ−、ｈｉｓ−）を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）を、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第二に、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ酵素で消化されたｐＢＬＡＤＸ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９）にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＮ  ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第三に、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片としてｐＪＮ３３６にクローン化された遺伝子をコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ  Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換した。
【０６７９】
（実施例９）
（構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞の作製）
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子の同定および破壊
出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１遺伝子は、分泌されたタンパク質上のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６８（３５）：２６３３８−４５）。このマンノース移動は、一般には、Ｎ−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノシル化における鍵となる最初の工程として認識される（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３５）：２６３３８−２６３４５；  Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（７）：２５１１−１９；Ｍｏｒｉｎ−Ｇａｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｆｆｉｃ  １（１）：５６−６８．（Ｊａｎ  ２０００））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるこの遺伝子の欠失の結果、かなり短いＮ−グリカン構造がもたらされ、これは、上昇した温度においてこの典型的なポリマンノシル化または増殖欠陥を含まない（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（７）：２５１１−１９）。
【０６８０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯｃｈ１ｐ配列を、関連するが区別されるマンノシルトランスフェラーゼであるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ４９９８７）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  （Ｎｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５（３）：６３７−４５（Ｍａｒ  １９９７）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ  （ＰＥＮＤＥＮＴ  ＥＳＴデータベース）のＨｏｃ１タンパク質と共にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの公知のホモログと整列させた。Ｏｃｈ１ｐホモログの間では共通するが、Ｈｏｃ１ｐホモログからは区別される高相同性の領域を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２，１８５−１９２（１９８７））からのゲノムＤＮＡに対して向けられた縮重プライマーの対を設計した。プライマーＲＣＤ３３
【０６８１】
【数３】
0004792387.tif 000047
およびＲＣＤ３４
【０６８２】
【数４】
0004792387.tif 000048
でのＰＣＲ増幅の結果、３０２ｂｐ産物が得られ、これをクローン化し、配列決定し、予測された翻訳はＯｃｈ１タンパク質に対して高度な相同性を有することが示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｏｃｈ１ｐに対して＞５５％）。
【０６８３】
３０２ｂｐ  ＰＣＲ産物を用いて、高ストリンジェンシーでのＫ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザーンブロットをプローブした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，１９８９）。ハイブリダイゼーションは単一遺伝子と合致するパターンで観察され、これは、この３０２ｂｐセグメントがＫ．ｌａｃｔｉｓゲノムの一部に対応し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  （ＫｌＯＣＨ１）がこの遺伝子の単一コピーを含むことを示す。全ＫｌＯＣＨ１遺伝子をクローン化するために、サザーンブロットを用いて、ゲノム遺伝子座をマッピングした。従って、ゲノムＤＮＡを消化し、５．２ｋｂの範囲の断片をｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作ることによって、５．２ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片をクローン化した。このサブゲノムライブラリーをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローンをＲＣＤ３３／３４を用いるコロニーＰＣＲによってテストした。予測されたＫｌＯＣＨ１遺伝子を含む５．２ｋｂクローンを配列決定し、予測されたタンパク質をコードする１３６２ｂｐのオープンリーディングフレームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＯＣＨ１遺伝子と４６．５％同一である。５．２ｋｂ配列を用いて、ＰＣＲ重複方法を用い、ｏｃｈ１：：ＫＡＮＲ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを作製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ  ８）：２６０７−１５）。この欠失対立遺伝子を２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、Ｇ４１８抵抗性コロニーを選択した。これらのコロニーを双方のＰＣＲによって、および温度感受性につきスクリーニングして、ＯＣＨ１  ＯＲＦが欠失した株を得た。実験の結果は、変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株を示し、これは、種々の温度における増殖の分析、およびＰＮＧａｓｅ消化の後における分泌されたおよび細胞壁タンパク質のＮ−グリカン炭水化物分析によって特徴付けした。ｏｃｈ１変異は、株を３０℃では増殖させるが、３５℃では増殖させない温度感受性を付与した。図１２Ａは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびそれより高次のＮ−グリカンを生産する野生型Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【０６８４】
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ１遺伝子の同定、クローニングおよび破壊）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ１はゴルジα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼについての構造遺伝子である。ＭＮＮ１の産物は７６２−アミノ酸タイプＩＩ膜タンパク質である（Ｙｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９１（７）：２７２３−７．（１９９４））。ｍｎｎ１変異体から単離されたＮ−結合およびＯ−結合オリゴ糖双方はα−１，３−マンノース結合を欠く（Ｒａｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２４８（１３）：４６６０−６．（Ｊｕｌ１０，１９７３））。
【０６８５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭｎｎｌｐ配列を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ翻訳ゲノム配列（ＰＥＤＡＮＴ）をサーチした。Ｍｎｎｌｐに対して有意な類似性の推定タンパク質断片をコードする１つの４０５ｂｐのＤＮＡ配列を同定した。この配列の内部セグメントを、引き続いて、プライマーＫＭＮ１
【０６８６】
【数５】
0004792387.tif 000049
およびＫＭＮ２
【０６８７】
【数６】
0004792387.tif 000050
でＰＣＲ増幅し、これを用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザーンブロットをプローブした。サザーンハイブリダイゼーションデータに基づき、４．２Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、本明細書中に記載したように、サイズ−選択ライブラリーを作ることによってクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ１遺伝子を含む単一クローンを、プライマーＫＭＮ１（配列番号４７）およびＫＭＮ２（配列番号４８）を用いる全コロニーＰＣＲによって同定し、配列決定した。このクローン内で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ１遺伝子に３４％同一である予測されたタンパク質をコードする２２４１ｂｐ  ＯＲＦが同定された。ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ８）：２６０７−１５）を用い、ｍｎｎ１：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子の構築のためにプライマーを設計した。
【０６８８】
エレクトロポレーションによって、この破壊対立遺伝子をＫ．ｌａｃｔｉｓの株に形質転換し、ヌーセオトリシン抵抗性形質転換体を選択し、破壊対立遺伝子の相同挿入のためにＰＣＲ増幅した。変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株は、公知のレポーター遺伝子のＮ−グリカン炭水化物分析に付すことができる。
【０６８９】
図１２Ｂは、本明細書中に記載されたように、ＰＮＧａｓｅ消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに続いて観察されたＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠失株からのＮ−グリカンを示す。［ｄ］として示される１９０８（ｍ／ｚ）における支配的ピークはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の質量と合致する。
【０６９０】
グリコシル化を修飾するための方法で用いることができるさらなる方法および試薬は米国特許第５，９５５，４２２号、米国特許第４，７７５，６２２号、米国特許第６，０１７，７４３号、米国特許第４，９２５，７９６号、米国特許第５，７６６，９１０号、米国特許第５，８３４，２５１号、米国特許第５，９１０，５７０号、米国特許第５，８４９，９０４号、米国特許第５，９５５，３４７号、米国特許第５，９６２，２９４号、米国特許第５，１３５，８５４号、米国特許第４，９３５，３４９号、米国特許第５，７０７，８２８号および米国特許第５，０４７，３３５号のような文献に記載されている。適当な酵母発現系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤのような源から得ることができる。ベクターは種々の源から商業的に入手可能である。
【０６９１】
（実施例１０）
（株、培養条件および試薬）
以下の実施例では、以下の株、培養条件および試薬を用いた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  株ＴＯＰ１０またはＤＨ５αを組換えＤＮＡ作業で用いた。
【０６９２】
タンパク質発現は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロールよりなる増殖培地としての緩衝化グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）での９６−ウェルプレートフォーマットにて室温で行った。誘導培地は、ＢＭＧＹ中のグリセロールの代わりに１．５％メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）であった。
【０６９３】
制限および修飾酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からのものであった。
【０６９４】
オリゴヌクレオチドはＤａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  （Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＨ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から得た。
【０６９５】
（実施例１１）
（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生産するための発現ベクターのクローニングおよび創製）
制限および修飾酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からのものであった。シャトルベクターｐＶＭ２は、プライマーＶＪＭ１０４およびＶＪＭ１０６（各々、
【０６９６】
【数７】
0004792387.tif 000051
および
【０６９７】
【数８】
0004792387.tif 000052
導入された制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩは下線を施す）を用いる逆ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）  Ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）によってＰｕｃ１９から創製した。
【０６９８】
ロール−インプラスミドｂＪＮ２８５は、以下のようにして構築されたノック−インプラスミドｐＪＮ２６６の誘導体である。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡからのプライマーＫｅｘ５５
【０６９９】
【数９】
0004792387.tif 000053
およびＫｅｘ５３
【０７００】
【数１０】
0004792387.tif 000054
を用いるＰＣＲによって、ＰｐＫＥＸ１−５’領域の０．９−ｋｂ断片を増幅し、ＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化したｐＵＣ１９にクローン化した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマーＫｅｘ３５
【０７０１】
【数１１】
0004792387.tif 000055
およびＫｅｘ３３
【０７０２】
【数１２】
0004792387.tif 000056
を用いて増幅してあるＫＥＸ１−３’領域の０．８−ｋｂ断片を、同酵素で消化したｐＪＮ２６２にクローン化した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｐＮＫＹ５１（１）の３．８−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を２つの可能な向きの各々に挿入し、プラスミドｐＪＮ２６３およびｐＪＮ２６４を得た。ＮｏｔＩおよびＰａｃＩクローニング部位を持つ発現カセットを作り出すために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマーＧａｂ５
【０７０３】
【数１３】
0004792387.tif 000057
およびＧａｐ３
【０７０４】
【数１４】
0004792387.tif 000058
および鋳型としてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマーＣｙｓ５
【０７０５】
【数１５】
0004792387.tif 000059
およびＣｙｓ３
【０７０６】
【数１６】
0004792387.tif 000060
を用いてｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅してあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣ１転写ターミネーター領域を開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６１を得た。ＧＡＰＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットをＢａｍＨＩ消化によって放出し、ｐＪＮ２６３にクローン化して、プラスミドｐＪＮ２６５が得られ、あるいは（インサートの向きに応じて）ｐＪＮ２６４にクローン化して、プラスミドｐＪＮ２６６およびｐＪＮ２６７を得た。引き続いて、プラスミドｐＪＮ２６６をＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断して、ＵＲＡ−ブラスターカセットを放出し、プライマーＪＮＨＩＳ１
【０７０７】
【数１７】
0004792387.tif 000061
およびＪＮＨＩＳ２
【０７０８】
【数１８】
0004792387.tif 000062
を用いてｐＰＩＣ３．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅してある、ＰｐＨＩＳ４遺伝子を含むＮｇｏＭＩＶ−ＳｗａＩ断片を開いた部位にクローン化して、ｐＪＮ２８５を得た。
ｐＪＮ３４８発現ベクターはプラスミドｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ（２）に基づく。まず、ベクターｐＪＮ２６１からのＧＡＰＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットを含むＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断してあるｐＢＬＵＲＡ−ＳＸにクローン化して、プラスミドｐＪＮ３３８を得た。引き続いて、後者のプラスミドをＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、インビトロでアニーリングしてある２つのオリゴヌクレオチドＥｘｐｒＩ
【０７０９】
【数１９】
0004792387.tif 000063
およびＥｘｐｒ２
【０７１０】
【数２０】
0004792387.tif 000064
（制限部位ＡｓｃＩには下線を施す）を開いた部位に連結して、ｐＪＮ３４８を得た。
【０７１１】
ｐＰＢ１２４発現ベクターは、Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９によって記載されたｐＢＬＡＤＥ−ＳＸベクターに基づいて数工程で構築した。まず、（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ａｐｒ  ２９；１００（９）：５０２２−７）からのＧＡＰＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットを含むＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ消化後にｐＢＬＡＤＥ−ＳＸベクターにクローン化した。次に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＰＭＡ１
【０７１２】
【数２１】
0004792387.tif 000065
およびＰＭＡ２
【０７１３】
【数２２】
0004792387.tif 000066
プライマーで増幅したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＡ１遺伝子のプロモーターで置き換えた。次いで、得られたベクターをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ酵素で消化して、ベクターｐＡＧ２５（Ｇｏｌｄｓｔｉｎ  ａｎｄ  ＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｙｅａｓｔ．１９９９  Ｏｃｔ；１５（１４）：１５４１−５３）からのヌルセオトリシン抵抗性マーカーを含む平滑末端ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片で連結したフル−イン反応の後にＡＤＥ１マーカーを除去した。
【０７１４】
（実施例１２）
（局在化シグナル／マンノシダーゼＩ触媒ドメイン融合の創製）
マウスマンノシダーゼＩＡの増幅。マウスマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｎ ００８５４８，  Ｌａｌ  ＆  Ｍｏｒｅｍｅｎ  １９９４）の触媒ドメインをコードする遺伝子配列をマウス肝臓ｃＤＮＡ（ｃＬＯＮＴＥＣＨ）から増幅した。簡単に述べれば、順方向プライマーｍＭＩＡΔ１８７−ＡｓｃＩおよび逆方向プライマーｍＭＩＡ−ＰａｃＩ（各々、
【０７１５】
【数２３】
0004792387.tif 000067
および
【０７１６】
【数２４】
0004792387.tif 000068
；導入されたＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位には下線を施す）を用いて、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）で、マウス肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのマウスマンノシダーゼＩＡ  ＯＲＦのアミノ酸１８８〜６５５を増幅した。熱サイクリングで用いた条件は一分間の９４℃、１サイクル；３０秒間の９４℃、３０秒間の６８℃、３分間の７２℃、３０サイクルであった。引き続いて、１μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、反応物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートし、１．４Ｋｂ産物をｐＣＲ２．１に連結して、プラスミドｐＳＨ９を得た。Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認の後、ベクターｐＶＭ２へのサブクローニングに先立って、マウスマンノシダーゼＩＡを制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化し、同制限酵素で消化し、プラスミドｐＳＨ２１を得た。
【０７１７】
切形マウスマンノシダーゼＩＡの酵母ゴルジへの引き続いての局在化を容易とするために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｅｃ１２タンパク質の領域（膜貫通ドメインをコードするアミノ酸３３１〜４３２）を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡの存在下で、プライマーＳＣ１２５およびＳＣ１２２
【０７１８】
【数２５】
0004792387.tif 000069
および
【０７１９】
【数２６】
0004792387.tif 000070
；導入されたＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ制限部位には下線を施す）で増幅し、プラスミドｐＪＮ３０５を得た。Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認の後、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで消化されたＳｅｃ１２断片を、同酵素で消化されたｐＳＨ２１にサブクローンし、プラスミドｐＳＨ２９を得た。引き続いて、切形マウスマンノシダーゼＩＡと枠内のＳｅｃ１２断片をコードするｐＳＨ２９のＮｏｔＩ／ＰａｃＩ断片を、同酵素で消化したｐＪＮ２８５にサブクローンし、プラスミドｐＦＢ８を得た。
【０７２０】
（実施例１３）
（マンノシダーゼＩＩ構築物の創製）
アミノ酸７５〜１１０８をコードするショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７７６５２，  Ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  １９９５）の触媒ドメインを、５５℃にてアニーリングし、５分間延長することによって、上記で概説した熱サイクリング条件下でＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、ショウジョウバエ卵巣ｃＤＮＡから増幅した。順方向プライマーｄＭａｎｎＩＩΔ７４  ＡｓｃＩおよび逆方向プライマーｄＭａｎｎＩＩ  ＰａｃＩ（各々、
【０７２１】
【数２７】
0004792387.tif 000071
および
【０７２２】
【数２８】
0004792387.tif 000072
；導入されたＡｓｉＩおよびＰａｃＩ制限部位には下線を施す）を用いた。Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認に続き、プラスミドをｐＳＨ２１４と命名した。引き続いて、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化によって、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ断片をこのプラスミドから取り出し、同酵素で消化されたｐＪＮ３４８にサブクローンし、プラスミドｐＳＨ２２０を得た。
【０７２３】
切形ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩドメインのゴルジへの引き続いての局在化を容易とするために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２タンパク質の領域（膜貫通ドメインをコードするアミノ酸１〜３６）を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡの存在下で、プライマーＭｎｎ２５およびＭｎｎ２１（各々、
【０７２４】
【数２９】
0004792387.tif 000073
および
【０７２５】
【数３０】
0004792387.tif 000074
；導入されたＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ制限部位には下線を施す）で増幅し、プラスミドｐＪＮ２８１を得た。Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認の後、Ｍｎｎ２断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで消化し、同酵素で消化されたｐＳＨ２２０にサブクローンし、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインとＭｎｎ２局在化シグナルとのイン−フレーム融合が得られ、プラスミドｐＫＤ５３を得た。この作製されたショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインのｐＨ最適値は、実施例７に実質的に記載されたｐＨアッセイを用いてｐＨ６．２であると決定された。
【０７２６】
（実施例１４）
（マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインライブラリー）
活性を示すマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインおよびリーダーのライブラリーを表１１に以下に示す。本明細書中で用いるように、（＋）の数は％中性グリカンのＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２生産の相対的レベルを示す。表示（−）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の見掛けの生産がないことを示す。表示（＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の２０％未満の生産を示す。表示（＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の約２０〜３０％の生産を示す。表示（＋＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の約３０〜４０％の生産を示す。表示（＋＋＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の約４０〜５０％の生産を示す。表示（＋＋＋＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の５０％を超える生産を示す。表示（ＮＧ）は、融合構築物で形質転換されたいずれのコロニーからも見掛けのグリカンは検出されないことを示す。
【０７２７】
【表１１−１】
0004792387.tif 000075
【０７２８】
【表１１−２】
0004792387.tif 000076
【０７２９】
【表１１−３】
0004792387.tif 000077
【０７３０】
【表１１−４】
0004792387.tif 000078
（実施例１５）
（ＧｎＴＩＩ発現構築物の創製）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ９遺伝子のＮ−末端部分と融合したヒトＧｎＴＩ遺伝子を含むＧｎＴＩ発現ベクター（ｐＮＡ１５）の構築は従前に記載されている（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，  ２００３  Ａｐｒ  ２９；１００（９）：５０２２−７）。同様にして、ラットＧｎＴＩＩ遺伝子をクローン化した。ラットＧｎＴＩＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２１６６２）を、ＲＡＴ１
【０７３１】
【数３１】
0004792387.tif 000079
およびＲＡＴ２
【０７３２】
【数３２】
0004792387.tif 000080
プライマーにて、ラットｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＴａｋａｒａ  ＥＸ  ＴａｑＴＭポリメラーゼ（Ｐａｎｖｅｒａ）を用いてＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。鋳型としてこのベクターを用い、アミノ酸８８〜４４３をコードするＧｎＴＩＩのＡｓｉＩ−ＰａｃＩ断片をＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）およびプライマーＲＡＴ４４およびＲＡＴ１１（各々、
【０７３３】
【数３３】
0004792387.tif 000081
および
【０７３４】
【数３４】
0004792387.tif 000082
；導入されたＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位には下線を施す）で増幅した。配列決定による確認の後、次いで、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインを、ｐＢＰ１２４におけるＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片としてＰＭＡ１プロモーターの下流にクローン化した。最終工程において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２局在化シグナルをコードする遺伝子断片を、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ断片としてｐＪＮ２８１としてクローン化して、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインとのイン−フレーム融合を生じさせて、プラスミドｐＴＣ５３を得た。
【０７３５】
（実施例１６）
レポータータンパク質の発現、Ｎ−結合グリカンの精製および放出
アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下で、Ｋ３ドメインをモデル糖タンパク質として用い、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ａｐｒ  ２９；１００（９）：５０２２−７）に報告されているように、ヘキサヒスチジンタグを用いて精製した。グリカンを放出させ、従前に報告されている方法（Ｐａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４４５−４５４）の修飾によって、糖タンパク質から分離した。糖タンパク質を還元し、カルボキシメチル化した後、膜をブロックし、ウェルを水で３回洗浄した。タンパク質を、１ミリユニットのＮ−グルカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含有する３０μｌの１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ８．３の添加によって脱グリコシル化した。３７℃における１６時間のインキュベーションの後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固した。
【０７３６】
（タンパク質の精製）
クリングル３は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ  ２０００試料−取扱ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒａｎｃｈ  Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）にて９６−ウェルフォーマットを用いて精製した。クリングル３は、Ｃ−末端ヘキサ−ヒスチジンタグを用い、発現から精製した。ロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって供されたプロトコルの適合であった。簡単に述べれば、１５０ｕＬ（μＬ）の沈降した容量の樹脂を９６−ウェル溶解物−結合プレートのウェルに注ぎ、３容量の水で洗浄し、５容量の５０ｍＭ  ＮｉＳＯ４を充填し、３容量の結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ７．９）で洗浄した。タンパク質発現培地を３：２の培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ  ＰＯ４、１６ｍＭ  ＫＣｌ、８２２ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４）希釈し、カラムに負荷した。排出の後、カラムを１０容量の結合緩衝液および６容量の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）で洗浄し、タンパク質を６容量の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）で溶出させた。溶出した糖タンパク質を凍結乾燥によって蒸発固化させた。
【０７３７】
（Ｎ−結合グリカンの放出）
従前に報告されている方法（Ｐａｐａｃ，ｅｔ  ａｌ．Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４４５−４５４）の修飾によって、グリカンを放出させ、糖タンパク質から分離した。９６−ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐｍｅｍｂｒａｎ）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを１００ｕＬのメタノールで湿らせ、３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭトリス、３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６）で洗浄し、各添加の後に、温和な真空にて排出した。乾燥したタンパク質試料を３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液に溶解させ、１０ｕＬのＲＣＭ緩衝液を含有するウェルに移した。ウェルを排出させ、ＲＣＭ緩衝液で２回洗浄した。タンパク質を、３７℃における１時間の、ＲＣＭ緩衝液中の６０ｕＬの０．１Ｍ  ＤＴＴの希釈によって減少させた。ウェルを３００ｕＬの水で３回洗浄し、６０ｕＬの０．１Ｍヨードー酢酸の添加によって、室温にて暗所で３０分間カルボキシメチル化した。ウェルを水で３回洗浄し、室温にて１時間、１００ｕＬの水中の１％ＰＢＰ３６０の添加によって膜をブロックした。ウェルを排出し、３００ｕＬの水で３回洗浄し、１ミリユニットのＮ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含有する３０ｕＬの１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ８．３の添加によって脱グリコシル化した。３７℃における１６時間の後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固させた。
【０７３８】
ＭＡＬＤＩ／時間飛行（ＴＯＦ）質量分析
グリカンの分子量は、遅延抽出を用いるＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＰＲＯ直線ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。各ウェルからの乾燥したグリカンを１５μｌの水に溶解させ、０．５μｌをステンレス鋼で試料プレートにスポットし、０．５μｌのＳ−ＤＨＢマトリックス（１：１水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ中の９ｍｇ／ｍｌのジヒドロ安息香酸、１ｍｇ／ｍｌの５−メトキシサリチル酸）と混合し、乾燥させた。４ｎｓパルス時間でのパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）での照射によってイオンを発生させた。機器を、１２５ｎｓ遅延および２０ｋＶの加速電圧での遅延抽出モードにて操作した。グリッド電圧は９３．００％であり、ガイドワイヤー電圧は０．１％であり、内部圧力は５×１０−７トール未満であり、低質量ゲートは８７５Ｄａであった。スペクトルは１００〜２００レーザーパルスの合計から発生させ、５００ＭＨｚディジタイザーで獲得した。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を外部分子量標準として用いた。全てのスペクトルは陽性イオンモードの機器で発生させた。
【０７３９】
（雑：）
タンパク質はＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ  １９７０）に従ってＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離した。
【０７４０】
（実施例１７）
（酵母株ＹＳＨ−１（Δｏｃｈ１、α１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ）の創製）
以前に報告されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＫ６４（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ａｐｒ  ２９；１００（９）：５０２２−７）、ＯＣＨ１ノック−アウトを保有し、かつヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）を発現するトリプル栄養要求株（ＡＤＥ、ＡＲＧ、ＨＩＳ）を宿主株として用いた。ＢＫ６４を制限酵素ＥｃｏＮＩで線状化したプラスミドｐＰＢ１０３で形質転換して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターを宿主細胞に導入し、このようにして、株ＰＢＰ−１を得た。制限酵素ＥｃｏＮＩで線状化したプラスミドｐＦＢ８での形質転換によってマウスＭｎｓＩをこの株に導入し、株ＰＢＰ−２を得た。株ＰＢＰ−２から単離したタンパク質からのＫ３グリカンの分析は、存在する一次グリコ形態がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であったことを示した。
【０７４１】
引き続いて、ＰＢＰ−２を、制限酵素ＡａｔＩＩで線状化したヒトＧｎＴＩプラスミドｐＮＡ１５で形質転換し、株ＰＢＰ−３を得た。株ＰＢＰ−３で生産されたＫ３グリコ形態の分析は、ハイブリッドグリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は支配的構造であることを示した。ＵＲＡ３マーカーをＰＢＰ−３から回収するために、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ、ＢｉｏＶｅｃｔｒａ）およびウラシル（Ｂｏｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６（１９８４））を含有する最小培地での選択に先立って、この株をＹＰＤ中で増殖させた。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコ形態を生産する回収されたＵｒａ−マイナス株をＹＳＨ−１と命名した。株ＹＳＨ−１からのＮ−グリカンプロフィールを図１３に示し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６５ｍ／ｚにおいて支配的なピークを呈する。
【０７４２】
（実施例１８）
（酵母株ＹＳＨ−３７（マンノシダーゼＩＩを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の創製）
ＹＳＨ−１（実施例１７）を、制限酵素ＡｐａＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ２（ｓ）プラスミド（ｐＫＤ５３）で形質転換し、株ＹＳＨ−３７を得た。株ＹＳＨ−３７（図１４）で生産されたＫ３グリカン構造の分析は、１１４０ｍ／ｚにおける支配的グリコ形態が、１３０３ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］および他のグリコ形態ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６５ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭＡｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応することを示す。
【０７４３】
（実施例１９）
（酵母株ＹＳＨ−４４の創製）
株ＹＳＨ−３７（実施例１８）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したラットＧｎＴＩＩ／ＭＮＮ２（ｓ）リーダー、ｐＴＣ５３をコードするプラスミドで形質転換した。得られた株ＹＳＨ−４４は、陽性モードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］に対応する、１３５６ｍ／ｚにおける単一グリコ形態を有するＫ３  Ｎ−グリカンを生産した（図１５）。
【０７４４】
（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化）
従前に報告されている方法（Ｐａｐａｃ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４４５−４５４）の修飾によって、ＹＳＨ−４４からのグリカンを放出し、糖タンパク質から分離した。タンパク質を還元させ、カルボキシメチル化し、かつ膜をブロックした後、ウェルを水で３回洗浄した。タンパク質を、１ミリユニットのＮ−グルカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を含有する３０μｌの１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ８．３の添加によって脱グリコシル化した。３７℃における１６時間の消化の後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固させた。次いで、グリカンをｓＳＣ２１０Ａ  ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ，  Ｈａｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）で乾燥した。乾燥したグリカンを３７℃の５０ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ  ｐＨ５．０に一晩いれ、１ｍＵのヘキソース（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を加えた。グリカンを分析し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の質量に対応する９３３ｍ／ｚにおいて図１６に示した単一グリカンを含有することが示された。
【０７４５】
（実施例２０）
（見掛けのマンノシダーゼＩＩ活性を持たない酵母株の創製）
ＹＳＨ−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ９（ｍ）をコードするプラスミド、プラスミドｐＫＤ１６で形質転換した。得られた株は、陽性モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によると、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する１４６４ｍ／ｚにおいて単一のグリコ形態を生じた（図１８）。この株は、このようにして、少なくともＫ３レポーター糖タンパク質のグリコシル化に関しては、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（ｌ）融合構築物からの見掛けのマンノシダーゼＩＩ活性を発現しなかった。
【０７４６】
（実施例２１）
（マンノシダーゼＩＩ活性を有する酵母株の創製）
ＹＳＨ−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（１）をコードするプラスミド、プラスミド（ｐＫＤ６）で形質転換した。得られた株（図１９）で発現されたＫ３糖タンパク質のＮ−グリカンプロフィールは、Ｍａｌ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６４ｍ／ｚにおける支配的ピーク、および１１３９ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］および１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭＡｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］に対応する他のピークを呈した。得られた酵母株は、このようにして、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（１）融合構築物からのいくらかの検出可能なマンノシダーゼＩＩ活性を発現した。
【０７４７】
（実施例２２）
（マンノシダーゼＩＩ活性を有する酵母株ＹＳＨ−２７の創製）
ＹＳＨ−１は、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＬＳ１（ｓ）プラスミド（ｐＫＤ１）で形質転換した。得られた株ＹＳＨ−２７で発現されたＫ３糖タンパク質のＮ−グリカンプロフィールは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１３９ｍ／ｚにおいて支配的なピークを呈した（図２０）。得られた株ＹＳＨ−２７は、このようにして、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＬＳ１（ｓ）融合構築物からの有意なレベルのマンノシダーゼＩＩ活性を呈した。
【０７４８】
（実施例２３）
（酵母株ＹＳＨ−７４の創製（低マンノシダーゼＩＩ活性））
ＹＳＨ−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（ｍ）プラスミド（ｐＫＤ５）で形質転換した。得られた株ＹＳＨ−７４で発現されたＫ３糖タンパク質のＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４０ｍ／ｚにおける支配的なピーク、および１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６４ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する他のピークを呈した（図２１）。得られた株ＹＳＨ−７４は、少なくともＫ３レポーター糖タンパク質のグリコシル化に関しては、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（ｍ）融合構築物からのマンノシダーゼＩＩ活性の普通のレベルを発現した。ＹＳＨ−７４からのグリカンを、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４１ｍ／ｚで支配的ピークを呈するグリカンをもたらすＡ．ｓａｉｔｏｉ  α−１，２マンノシダーゼ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｅｖａｔｏ，ＣＡ）での消化によってさらに分析した。
【０７４９】
（実施例２４）
（マンノシダーゼアッセイ）
蛍光標識Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を２０μＬの上澄に添加し、室温にて３０時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  ＮＨ２  ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）でのＨＰＬＣによって分析した。流速は４０分間１．０ｍｌ／分であり、カラムを３０℃に維持した。３分間のイソクラティック溶出（６８％Ａ：３２％Ｂ）の後、直線溶媒グラジエント（６８％Ａ：３２％Ｂ〜４０％Ａ：６０％Ｂ）を２７分間にわたって使用して、グリカンを溶出させた（Ｔｕｒｃｏ，Ｓ．Ｊ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，２７８−２８３）。溶媒Ａ（アセトニトリル）および溶媒Ｂはギ酸アンモニウムの水溶液、５０ｍＭ、ｐＨ４．５であった。カラムをランの間２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化させた。
【０７５０】
（実施例２５）
（インビトロガラクトース移動）
株ＹＳＨ−４４から得られたＮ−結合グリカンＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をガラクトース移動に対する基質として用いた。２０ｍｇのこのグリカンを、３７℃にて１０〜２０時間、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５中の７５ｍｇ  ＵＤＰ−Ｇａｌおよび１０〜５０ｍＵのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ウシ乳、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共にインキュベートした。図１７は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１６６５ｍ／ｚにおけるユニ形態ピークを呈する陽性モードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。陰性コントロール、マイナスガラクトシルトランスフェラーゼは上記したように行い、基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へのグルコースの移動は示さなかった。
【０７５１】
（実施例２６）
（クラスＩＩＩマンノシダーゼの下等真核生物への導入）
昆虫Ｓｆ９細胞からのクラスＩＩＩマンノシダーゼ（Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７  ７：１１３−１２７）をコードするｃＤＮＡを、５’および３’末端に特異的なプライマーを用いて増幅した。引き続いて、ｃＤＮＡを酵母組込みプラスミドにサブクローンして、分泌されたレポータータンパク質のＮ−グリコシル化パターンに対するこのタンパク質の効果を調べた。多数の切形産物が生産されて、例えば実施例１４に記載されているように、異なる標的化リーダー断片を持つクラスＩＩＩマンノシダーゼ構築物のライブラリーを得た。所望の宿主株において単独で発現されることに加え、得られた融合タンパク質は他のグリコシル化修飾酵素と組み合わせて発現させて、所望のＮ−グリカン構造の生産を増強させる。
【０７５２】
Ｓｆ９マンノシダーゼは今日このクラスＩＩＩのただ１つのクローン化されたメンバーであるが、遺伝子およびＥＳＴは、このＯＲＦ、特に、触媒ドメイン（ＯＲＦの残基２７３〜２２４１）に対する有意な相同性を示す。ある範囲の温度およびｐＨ最適値を保有するクラスＩＩＩマンノシダーゼのライブラリーが創製される。今度は、これは、選択されたレポータータンパク質のグリコシル化パターンを修飾するにおいて最適に実行されて、酵母および繊維状真菌のような所望の宿主株で発現された場合に所望のＮ−グリカン構造を生産する１以上のクラスＩＩＩマンノシダーゼ融合構築物の選択を可能とするであろう。
【０７５３】
【表１２−１】
0004792387.tif 000083
【０７５４】
【表１２−２】
0004792387.tif 000084
【０７５５】
【表１２−３】
0004792387.tif 000085
【０７５６】
【表１２−４】
0004792387.tif 000086
【０７５７】
【表１２−５】
0004792387.tif 000087
【０７５８】
【表１２−６】
0004792387.tif 000088
【０７５９】
【表１２−７】
0004792387.tif 000089
【０７６０】
【表１２−８】
0004792387.tif 000090
【図面の簡単な説明】
【０７６１】
【図１Ａ】図１Ａは、代表的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、代表的なヒトＮ−グリコシル化経路の模式図である。
【図２】図２は、融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構成を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への、標的化ペプチドフラグメントの挿入を示す。図２Ｂは、制限部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する産生された標的化ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変されたｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への、触媒ドメイン領域の挿入を示す。図２Ｄは、制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを有する、産生された触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、標的化ペプチドサブライブラリーおよび触媒ドメインサブライブラリーから産生された１つの特定の融合構築物を示す。
【図３−１】図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号１）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号２）を示す。Ｎ−末端切断を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。
【図３−２】図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号１）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号２）を示す。Ｎ−末端切断を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図５Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］を示す。図５Ｂは、Ｋ３野生型から放出されたグリカンであるＰＮＧａｓｅを示す。示したＮ−グリカンは以下の通りである：Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］。図５Ｃは、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］の産生を生じるｏｃｈ１欠失を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、キメラα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のインビボトリミングの後の、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。優勢なＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と合致する１２５３の質量（ｍ／ｚ）を有するピークによって示される。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の産生を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図６Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］および標準物質としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ−β野生型から放出されたグリカンであるＰＮＧａｓｅを示す。図６Ｃは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］；Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］を産生するｏｃｈ１ノックアウト；およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の非産生を示す。図６Ｄは、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］〜Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］のうちで、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が相対的に少量であることを示す。図６Ｅは、ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ  Δ９９）によって産生された他のグリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対して、有意な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。図６Ｆは、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ  Δ１８７）による分泌糖タンパク質ＩＦＮ−βにおける、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の支配的産生を示す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と一致する１２５４の質量（ｍ／ｚ）を含むピークによって示される。
【図７】図７は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換されたΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露の後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。
【図８】図８は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。
【図９】図９は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）培地Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＤＤ２８−３で形質転換されたΔｏｃｈ１）の上清であり、これは、上清中の活性を示す（ポジティブコントロール）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のいくらかの産生を生じるが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の支配的産生を生じるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターなしに、ヒトＧｎＴＩで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の支配的産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩで形質転換された株（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。１４５７における質量（ｍ／ｚ）の単一の突出したピークは、図１０Ｂに示されるようにＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。
【図１１】図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたｐＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ  Δ３１）によってコードされた異種マンノシダーゼ酵素の最適ｐＨを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの無細胞抽出物から取り出されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む、野生型細胞から放出されたＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠失細胞から放出されたＮ−グリカンを示し、これは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としてのその同定と一致する１９０８における質量（ｍ／ｚ）の明瞭なピークを示す。図１２Ｃは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致するピークに対応するインビトロα−１，２−マンノシダーゼ消化後の、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１欠失細胞から放出されたＮ−グリカンを示す。
【図１３】図１３は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６５ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１（α−マンノシダーゼおよびＧｎＴＩで形質転換されたｏｃｈ１欠失変異体）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。
【図１４】図１４は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ２で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４０ｍ／ｚにおける支配的ピーク、ならびに１３０３ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６５ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する他のピークを示す。この株は、ＹＳＨ−３７と命名された。
【図１５】図１５は、ラットＧｎＴ  ＩＩ／ＭＮＮ２（ｓ）リーダーで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−３７において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応する１３５６ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。この株は、ＹＳＨ−４４と命名された。
【図１６】図１６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４において産生されたクリングル３糖タンパク質に由来するＮ−グリカン（図１５に示されたように産生されたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化後に、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の質量に対応する９３３ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。
【図１７】図１７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４で産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカン（図１５に示されたように産生されたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、インビトロでのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの添加後の、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１６６５ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。
【図１８】図１８は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ９（ｍ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６４ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。
【図１９】図１９は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（ｌ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６４ｍ／ｚにおける支配的ピーク、ならびに１１３９ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］および１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］に対応する他のピークを示す。
【図２０】図２０は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＬＳ１（ｓ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｌ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１３９ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。この株は、ＹＳＨ−２７と命名ｓれた。
【図２１】図２１は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＳ１（ｍ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４０ｍ／ｚにおける支配的ピーク、ならびに１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６４ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する他のピークを示す。この株は、ＹＳＨ−７４と命名された。
【図２２】図２２は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ／Ａ．ｓａｉｔｏｉα−１，２マンノシダーゼで消化されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−７４において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４１ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。
【図２３】図２３は、公知かつ仮想のマンノシダーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩｘおよびクラスＩＩＩマンノシダーゼ（出現する順序で、それぞれ、配列番号９６、９２、９３、９９、９８、９７、９４、９５、および１００〜１０２）のＢＬＡＳＴ配列比較を示す。
【図２４】図２４は、マンノシダーゼのクラスの系統樹を示す。
【図２５】図２５は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ １２１４９９）ヌクレオチド配列（配列番号４９）およびコードされたタンパク質（配列番号９５）を示す。
【図２６】図２６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ ０７３５９４）ヌクレオチド配列（配列番号５０）およびコードされたタンパク質（配列番号９２）を示す。
【図２７】図２７は、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ（ＡＫ１１６６８４）ヌクレオチド配列（配列番号５１）およびコードされたタンパク質（配列番号９４）を示す。
【図２８】図２８は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ（Ｘ７７６５２）ヌクレオチド配列（配列番号５２）およびコードされたタンパク質（配列番号９６）を示す。
【図２９】図２９は、ヒトマンノシダーゼＩＩ（Ｕ３１５２０）ヌクレオチド配列（配列番号５３）およびコードされたタンパク質（配列番号９７）を示す。
【図３０】図３０は、マウスマンノシダーゼＩＩ（Ｘ６１１７２）ヌクレオチド配列（配列番号５４）およびコードされたタンパク質（配列番号９８）を示す。
【図３１】図３１は、ラットマンノシダーゼＩＩ（ＸＭ ２１８８１６）ヌクレオチド配列（配列番号５５）およびコードされたタンパク質（配列番号９３）を示す。
【図３２】図３２は、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ（Ｄ５５６４９）ヌクレオチド配列（配列番号５６）およびコードされたタンパク質（配列番号９９）を示す。
【図３３】図３３は、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ（ＡＦ００５０３４）ヌクレオチド配列（配列番号５７）およびコードされたタンパク質（配列番号１００）を示す。
【図３４】図３４は、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ ０００５２８）ヌクレオチド配列（配列番号５８）およびコードされたタンパク質（配列番号１０１）を示す。
【図３５】図３５は、ヒト細胞質マンノシダーゼＩＩ（ＮＭ ００６７１５）ヌクレオチド配列（配列番号５９）およびコードされたタンパク質（配列番号１０２）を示す。
【図３６】図３６は、マンノシダーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩｘおよびマンノシダーゼＩＩＩ活性を用いて産生されたオリゴ糖中間体を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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