(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャビティおよびこのキャビティの底部に貫通孔を有したダイアフラムを設けたチップと、両面に電極を有するとともに前記チップを埋め込むための開口部を設けたプレートと、このプレートの前記開口部に前記チップを接着剤によって固定した細胞の電気生理反応を検出する細胞電気生理センサであって、前記キャビティの中を水で充填していることを特徴とする細胞電気生理センサ。
【請求項２】
プレートの開口部がプレートの第一面側の開口よりも前記第一面側と反対側にある第二面側の開口を小さい形状としていることを特徴とする請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
プレートの開口部が、第一面側において第一面側から第二面側にかけて小さくなるテーパ形状とし、且つその後前記第二面側へ前記第一面側に対して垂直に開通した形状としていることを特徴とする請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
プレートの第二面側の開口部の出口周縁部に、前記開口部の内側向きに突起物を設けたことを特徴とする請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
プレートよりもチップが厚く、前記プレートと前記チップの位置関係が前記プレートの第二面側を同一平面とし、前記第一面側において前記チップを突出させたことを特徴とする請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
キャビティの開口部に蓋を設けたことを特徴とする請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項７】
細胞の電気生理反応を検出する細胞電気生理センサの製造方法であって、
キャビティおよびこのキャビティの底部に設けたダイアフラムに貫通孔を設けたチップと、両面に電極を形成するとともに前記チップを埋め込むための開口部が設けられたプレートを準備する工程と、前記キャビティの内部に水を充填した後前記プレートの開口部に前記チップを仮載置する工程と、前記チップと前記プレートの隙間を接着剤によって固定する工程を含むことを特徴とする細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項８】
接着剤を塗布した後、速やかにプレートを水中に入れ、前記接着剤を水中で硬化させる請求項７に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項９】
接着剤を塗布した後、速やかにプレートを湿度１００％の雰囲気中にて前記接着剤を硬化させる請求項７に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１０】
接着剤の硬化中にキャビティの内部が乾燥しないように水を追加することを特徴とする請求項７に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１１】
チップのキャビティの内部に水を蓄積した状態にした後、前記キャビティを封止することを特徴とする請求項７に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１２】
接着剤として紫外線硬化型の接着剤を用いることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項１３】
接着剤として湿度硬化型の接着剤を用いることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項１４】
細胞の電気生理反応を検出する細胞電気生理センサの製造方法であって、
キャビティおよびこのキャビティの底部に設けたダイアフラムに貫通孔を設けたチップと、両面に電極を形成するとともに前記チップを埋め込むための開口部が設けられたプレートを準備する工程と、前記キャビティと反対側の面において、少なくとも前記貫通孔が存在する領域を水で濡らした状態で前記プレートの開口部に前記チップを仮載置する工程と、前記チップと前記プレートの隙間を接着剤によって固定する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
接着剤を塗布した後、速やかにプレートを水中に入れ、前記接着剤を水中で硬化させる請求項１４に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１６】
接着剤を塗布した後、速やかにプレートを湿度１００％の雰囲気中にて前記接着剤を硬化させる請求項１４に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１７】
接着剤の硬化中に、ダイアフラムの少なくとも貫通孔の存在する領域が乾燥しないように水を加えることを特徴とする請求項１４に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１８】
接着剤として紫外線硬化型の接着剤を用いることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１９】
接着剤として湿度硬化型の接着剤を用いることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の電気生理的活動を指標にして薬品候補物質をスクリーニングする方法としてパッチクランプ法が用いられている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら前記方法は１個の細胞にマイクロピペットの先端を高精度に吸着させるために高度な能力を必要とし、大量の薬品候補物質を高速でスクリーニングする用途には向いていない。
【０００４】
これに代わる方法として、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法はパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、基板上に細胞の保持手段を有しているため、細胞を高精度にマニピュレートする必要が無く、高速に測定することができる。
【０００５】
図１８は特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル５０の内部に培養液５８が入れられ、被験体細胞５５は基板５２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板５２に形成された窪み５１および開口部を介してこの窪み５１に連絡する貫通孔５３を備えた構成となっている。
【０００６】
さらに貫通孔５３の中にはセンサ手段である測定電極５４が配置されており、この電極５４は配線を経て信号検出部に連結されている。
【０００７】
そして、測定の際には被験体細胞５５を貫通孔５３から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞５５が窪み５１部分に密着保持される。このようにして被験体細胞５５の活動により発生する電気信号はウエル５０の内部の培養液５８へ漏れることなく、貫通孔５３に設けた測定電極５４によって検出される。
【非特許文献１】「細胞の分子生物学、第三版」、Ｇarland Ｐublishing Ｉnc.、Ｎew Ｙork、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２項、１９９５年、教育者
【特許文献１】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記従来の構成では、吸引ポンプなどにより細胞を保持する際には、窪みや貫通孔５３が非常に微小であるため、表面の親水性が小さい場合において、水の浸透が不均一となり、また気泡が窪みや貫通孔５３の周辺に付着しやすく細胞保持の阻害要因となり、細胞測定が行えなくなる場合があった。
【０００９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、測定の直前まで親水性を保持するとともに、細胞の保持部において細胞の密着度を高め、漏れ電流が少ない状態で細胞電気生理を測定できる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、キャビティおよびこのキャビティの底部に貫通孔を有したダイアフラムを設けたチップと、両面に電極を有するとともに前記チップを埋め込むための開口部を設けたプレート、このプレートの前記開口部に前記チップを接着剤によって固定した細胞の電気生理反応を検出する細胞電気生理センサであって、前記キャビティの中を水で充填した構成とするものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞が保持される部分となるチップの貫通孔周辺を、親水性を付与するための表面処理を行った後、水に濡らした状態でプレートに固定し、細胞測定を行うまでの間に貫通孔周辺の親水性を維持することによって、培養液の浸入を速やかに行うとともに細胞の保持部において細胞の密着度を高め、漏れ電流が少ない状態で細胞電気生理を測定できる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。
【００１３】
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成を示す斜視図であり、図２は図１のＡ−Ａ部における断面図である。
【００１４】
図１および図２において、チップ１はフレーム２と、フレーム２の厚さよりも薄いダイアフラム３とで囲まれたキャビティ４を有し、このキャビティ４の底部にあたるダイアフラム３には細胞を保持するための貫通孔５を有している。このフレーム２とダイアフラム３の材質はシリコンのほか、ガラス材を用いることができる。これらは微細加工技術を用いて小型化と高精度化を実現しながら作製することができる。
【００１５】
また、プレート６は第一面側７に電極９を有するとともに、第二面側８に電極１０を備え、さらにチップ１を固定するための開口部１１を有している。このプレート６の材質はガラスエポキシ、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンポリマーなどが好ましく、また電極９と電極１０はＡｇ、ＡｇＣｌ、Ｃｒ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｔｉ、Ｐｔなどの電極材料を用いることができる。
【００１６】
また、プレート６とチップ１の隙間は接着剤１２によって封止した状態となっている。
【００１７】
そして、細胞の保持を行う貫通孔５の付近の表面は親水性を維持しておくことが重要であり、ここではキャビティ４の内部に水１３を充填している。この水を充填しておくことによって、培養液１５の浸入を速やかに行うとともに細胞の保持部において細胞の密着度を高め、漏れ電流が少ない状態で細胞電気生理を測定できる細胞電気生理センサを提供することができる。
【００１８】
次に、この細胞電気生理センサを用いて物理化学変化を検出する手順について図３を用いて説明する。
【００１９】
まず始めに、測定を開始する直前に図２に示した水１３を除去した後、チップ１とプレート６の両面を培養液１５によって満たし、キャビティ４を加圧するか、もしくはダイアフラム３の外側から減圧すると培養液１５は貫通孔５からダイアフラム３の外側へ吐出する。
【００２０】
次に、図３に示すように細胞１４を培養液１５と共に投入し、キャビティ４を加圧するか、キャビティ４の反対側のダイアフラム３の外側から減圧すると、細胞１４と培養液１５は貫通孔５に引き込まれ、細胞１４はキャビティ４において貫通孔５を塞ぐように保持される。
【００２１】
このとき、従来の方法では貫通孔５が小さく、また貫通孔５の周辺の親水性が小さく気泡が残るなどして測定不良を起こすことがあるが、本実施の形態１における細胞電気生理センサは培養液１５が浸入しやすくなる構成となっており、速やかに、確実に、これらの動作を行うことができる。
【００２２】
その後、細胞１４への刺激となりうる行為を施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物、などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。
【００２３】
そして、細胞１４がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば細胞１４は細胞膜が保有するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。
【００２４】
この結果として、貫通孔５の内部の培養液１５のイオン濃度と細胞１４の細胞内液のイオン濃度とは変化するので、電極９及び電極１０によってその変化を検出することができる。
【００２５】
以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。
【００２６】
図４〜図７は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図である。
【００２７】
まず始めに、チップ１はシリコン基板あるいはガラス基板などを用いて貫通孔５、キャビティ４の順にドライエッチング技術を用いて加工したものである。
【００２８】
その後、チップ１の親水性を付与させる表面処理を行った後、図４に示したようにチップ１を水１３に浸した状態とする。一方、図５に示したようにプレート６はプレート６の第一面側７に電極９と第二面側８に電極１０を形成した後穴開けを行い、開口部１１を形成する。
【００２９】
そして、図６に示したようにキャビティ４に水１６が残るようにチップ１の外壁面の水１３を除去する。チップ１の外壁面の水１３を除去するのはチップ１とプレート６との間を接着剤１２で固定する際に接着剤１２を塗布する必要があるからである。
【００３０】
次に、図７に示したようにチップ１のキャビティ４がプレート６の第一面側７を向くように開口部１１に設置し、チップ１とプレート６の間の隙間を接着剤１２によって埋め、その後接着剤１２を硬化させることによって細胞電気生理センサの完成となる。
【００３１】
このような製造方法とすることによって、細胞１４が保持される部分となる貫通孔５の周辺のキャビティ４が常に水１６で濡れた状態であるため、親水性を付与するために表面処理した効果を維持した細胞電気生理センサを実現することができる。
【００３２】
また、接着剤１２を硬化させるときに、水１６が蒸発するときにはピペットなどを用いてキャビティ４の内部に水１６を追加充填することによって、常にキャビティ４の内部に水１６を充填しておくことが効果的である。
【００３３】
また、接着剤１２の塗布後に蓋を用いてキャビティ４を封止し、この状態でチップ１とプレート６の隙間を接着剤１２によって固定することによって、細胞が保持される部分となる貫通孔５の周辺のキャビティ４を乾燥させずに表面処理効果を維持した細胞電気生理センサを実現することができる。
【００３４】
この蓋の材料としてはシリコンゴム、ニトリルゴム、フッ素ゴム、アクリルゴムなどが考えられる。
【００３５】
また、図８は別の細胞電気生理センサの断面図を示しており、プレート１７の開口部１８が、第一面側２０の開口よりも第一面側２０の反対側にある第二面側２１の開口の方が小さい形状であることによって、チップ１を開口部１８に埋め込む際に開口部１８の内壁面がガイドとなりチップ１の挿入が容易となるだけでなく、第一面側２０の開口部１８が大きいため接着剤１９の塗布を容易にすることができる。そのため細胞電気生理センサの製造を効率よく行うことができる。
【００３６】
また、図９は他の細胞電気生理センサの断面図を示しており、プレート２２の開口部２３が、第一面側２５において第一面側２５から第二面側２６にかけて徐々に小さくなった形状となっており、その後第二面側２６へ第一面側２５に対して垂直に開通した状態であることによって、チップ１を開口部２３に埋め込む際に開口部２３の内壁面がガイドとなりチップ１の挿入が容易となるだけでなく、第一面側２５に対して開口部２３の垂直壁面２７があることによってチップ１を仮固定できるため接着剤２４の塗布が正確かつ容易となる。さらに第一面側２５の開口部２３が大きいため接着剤２４の塗布を容易とすることができる。そのため細胞電気生理センサの製造を効率よく行うことができる。
【００３７】
また、図１０はさらに他の細胞電気生理センサの断面図を示しており、プレート２８の第二面側３２の開口部２９の出口内周辺に開口部２９の内側向きに突起物３３を設けた構造とすることによって、チップ１を開口部２９に固定する際にチップ１が開口部２９から落下するのを防止できるだけでなく、接着剤３０を塗布した際に接着剤３０がプレート２８の第二面側３２からダイアフラム３に回り込み貫通孔５を塞ぐのを防止することができる。そのため細胞電気生理センサの製造を効率よく確実に行うことができる。
【００３８】
また、図１１はさらに他の細胞電気生理センサの断面図を示しており、プレート３４よりもチップ１が厚く、プレート３４とチップ１の位置関係がプレート３４の第二面側３８を面一とし、プレート３４の第一面側３７においてチップ１を突出させた構成とすることによって、接着剤３６を塗布する際に接着剤３６がキャビティ４へ入り込むのを防止できる。そのため細胞電気生理センサの製造を確実に行うことができる。
【００３９】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。
【００４０】
図１２は本実施の形態２における細胞電気生理センサおよびその製造方法を説明するための断面図である。本実施の形態２における基本的な構成は実施の形態１とほぼ同じであり、実施の形態１と大きく異なっている所は製造方法であり、チップ１とプレート６との間に接着剤１２を塗布するところまでは実施の形態１の図４、図５、図６および図７と同じである。
【００４１】
本実施の形態２における細胞電気生理センサおよびその製造方法は、図１２に示したように接着剤１２の硬化時にプレート６を水３９の中に入れて、水３９が存在した状態で接着剤１２を硬化させる製造方法である。このときの接着剤１２としては紫外線硬化型や湿度硬化型の接着剤を用いると良い。
【００４２】
実施の形態１では、接着剤１２の硬化中に水１６が空気４０と接しているところから水１６の蒸発が進行し、キャビティ４の内壁面の一部が乾燥することが起こりうるが、このような製造方法とすることによって、細胞が保持される部分となる貫通孔５の周辺のキャビティ４を全く乾燥させずに表面処理の効果を維持した細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。
【００４３】
また、水３９の代わりに、湿度１００％の雰囲気中にて接着剤１２の硬化を行うことによっても前記と同様の効果を発揮することができる。
【００４４】
このとき、接着剤１２としては湿度硬化型接着剤を用いるとよい。この製造方法とすることによって、細胞が保持される部分となる貫通孔５の周辺のキャビティ４を全く乾燥させずに表面処理の効果を維持した細胞電気生理センサを実現することができる。
【００４５】
（実施の形態３）
次に、実施の形態３における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。
【００４６】
図１３は本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサの断面図である。
【００４７】
チップ１とプレート６のそれぞれの構成と物理化学変化を検出する手順は実施の形態１と同じであるが、実施の形態１と大きく異なっているところはセンサの構成に違いがある。
【００４８】
本実施の形態３では図１３に示したように、細胞１４をキャビティ４の反対側にあたるダイアフラム３の上に載置して貫通孔５を塞ぐように保持させているところが大きく異なっている。そのため、キャビティ４を減圧しダイアフラム３の外側から加圧することで、細胞１４をダイアフラム３の上において貫通孔５を塞ぐように保持させることができる。
【００４９】
このとき、実施の形態１と同様に貫通孔５が小さく、また貫通孔５の周辺の親水性が小さいと浸入しにくいが、本発明の細胞電気生理センサは後に示す製造方法のため水が浸入しやすい構成を有しており、その後実施の形態１と同様に、細胞１４への刺激となりうる行為を施し、細胞１４が刺激に対して活発に反応する場合、電極９及び電極１０によってイオン濃度の変化を検出することができる。
【００５０】
以下にその製造方法を説明する。
【００５１】
図１４〜図１７は本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図である。
【００５２】
実施の形態１と同様に図１４に示したような表面処理した後の水４８に浸したチップ１と図１５に示したようなチップ１を埋め込むための開口部１１を有したプレート６を使用する。
【００５３】
まず、図１６に示したようにキャビティ４の反対側にあたるダイアフラム３の上部の少なくとも貫通孔５が存在する領域に水４９が残るようにチップ１の外壁面やキャビティ４の中の水４８を除去する。
【００５４】
次に、図１７に示したようにチップ１のダイアフラム３がプレート６の第一面側４６になるように開口部１１に載置し、チップ１とプレート６との間の隙間を接着剤１２によって埋め、その後接着剤１２を硬化させることによって完成となる。
【００５５】
このような製造方法とすることによって、細胞１４が保持される部分となるキャビティ４の反対側のダイアフラム３の上部の貫通孔５の周辺が常に水４９で濡れた状態であるため、親水性を付与する表面処理した効果を維持した細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。
【００５６】
また、プレート６の開口部１１が第一面側４６の開口よりも第一面側４６の反対側にある第二面側４７の開口の方が小さい形状であることによって、チップ１を開口部１１に埋め込む際に開口部１１の内壁面がガイドとなりチップ１の挿入が容易となるだけでなく、第一面側４６の開口部１１が大きいため接着剤１２の塗布を容易にすることができ、そのため細胞電気生理センサの製造を効率よく行うことができる。
【００５７】
また、プレート６の開口部１１が、第一面側４６において第一面側４６から第二面側４７にかけて徐々に小さくなった形状とし、その後第二面側４７へ第一面側４６に対して垂直に開通した形状であることによって、チップ１を開口部１１に埋め込む際に開口部１１の内壁面がガイドとなりチップ１の挿入が容易となるだけでなく、第一面側４６に対して開口部１１の垂直壁面があることによってチップ１を仮固定するための接着剤１２の塗布が正確かつ容易となる。さらに第一面側４６の開口部１１が大きいために接着剤１２の塗布を容易とすることができる。そのため細胞電気生理センサの製造を効率よく行うことができる。
【００５８】
また、プレート６の第二面側４７の開口部１１の出口内周辺に開口部１１の内側向きに突起物を設けた構造とすることによって、チップ１を開口部１１に固定する際にチップ１が開口部１１から落下するのを防止できる。そのため細胞電気生理センサの製造を効率よく確実に行うことができる。
【００５９】
また、プレート６よりもチップ１が厚く、プレート６とチップ１の位置関係がプレート６の第二面側４７を面一とし、プレート６の第一面側４６においてチップ１を突出させた構成とすることによって、接着剤１２を塗布する際に貫通孔５を塞いでしまうのを防止できる。そのため細胞電気生理センサの製造を確実に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびその製造方法は、親水性を付与する表面処理効果を、細胞測定を行うまでの間に失わずに効率よく製造する方法として、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサおよびその製造方法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図
【図２】同断面図
【図３】同断面図
【図４】同製造方法を説明するための断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同別の形態の細胞電気生理センサの断面図
【図９】同他の形態の細胞電気生理センサの断面図
【図１０】同他の形態の細胞電気生理センサの断面図
【図１１】同他の形態の細胞電気生理センサの断面図
【図１２】本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図
【図１３】本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサの断面図
【図１４】同製造方法を説明するための断面図
【図１５】同断面図
【図１６】同断面図
【図１７】同断面図
【図１８】従来の細胞外電位測定デバイスの断面図
【符号の説明】
【００６２】
１  チップ
２  フレーム
３  ダイアフラム
４  キャビティ
５  貫通孔
６  プレート
７  第一面側
８  第二面側
９  電極
１０  電極
１１  開口部
１２  接着剤
１３  水
１４  細胞
１５  培養液
１６  水
１７  プレート
１８  開口部
１９  接着剤
２０  第一面側
２１  第二面側
２２  プレート
２３  開口部
２４  接着剤
２５  第一面側
２６  第二面側
２７  垂直壁面
２８  プレート
２９  開口部
３０  接着剤
３１  第一面側
３２  第二面側
３３  突起物
３４  プレート
３５  開口部
３６  接着剤
３７  第一面側
３８  第二面側
３９  水
４０  空気
４６  第一面側
４７  第二面側
４８  水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0004661539.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0004661539.tif 000017
【図１７】
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【図１８】
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