(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列を有するムチンＧ４遺伝子の第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型を検出するためのプライマー又はプローブを含み、被験者が２７０９ｂｐのＳｓ多型（配列番号２１）を有する場合に、該被験者はびまん性汎細気管支炎の罹患リスクが低いと評価される、びまん性汎細気管支炎の罹患リスクを診断するためのキット。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列を有するムチンＧ４遺伝子の第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型を検出するためのプライマー又はプローブ、並びにムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型を検出するためのプライマー又はプローブ及びムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型を検出するためのプライマー又はプローブを含み、被験者が、４５９９ｂｐのＬ多型（配列番号１７）を有し、かつ配列番号１７に示される塩基配列の１８２７番目又は１８３８番目のＣ塩基の欠失である１塩基デリーション型多型、及び配列番号１７に示される塩基配列の３２１０番目〜３２２４番目のＡＣＣ５回反復配列における１つのＡＣＣ配列の欠失である３塩基デリーション型多型を有する場合に、該被験者はびまん性汎細気管支炎の罹患リスクが高いと評価される、びまん性汎細気管支炎の罹患リスクを診断するためのキット。
【請求項３】
ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型の検出用プライマーが、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットである、請求項１又は２に記載の診断キット。
【請求項４】
ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型の検出用プライマーが、配列番号２２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２又は３に記載の診断キット。
【請求項５】
ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型の検出用プライマーが、配列番号２３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の診断キット。
【請求項６】
診断対象がアジア人種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の診断キット。
【請求項７】
被験者から調製されたＤＮＡ又はＲＮＡを用いて、配列番号１に示される塩基配列を有するムチンＧ４遺伝子の第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型を検出し、該被験者が２７０９ｂｐのＳｓ多型（配列番号２１）を有する場合に、該被験者はびまん性汎細気管支炎の罹患リスクが低いと評価される、びまん性汎細気管支炎の罹患リスクを評価する方法。
【請求項８】
被験者から調製されたＤＮＡ又はＲＮＡを用いて、配列番号１に示される塩基配列を有するムチンＧ４遺伝子の第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型を検出し、該被験者が、４５９９ｂｐのＬ多型（配列番号１７）を有し、かつ配列番号１７に示される塩基配列の１８２７番目又は１８３８番目のＣ塩基の欠失である１塩基デリーション型多型、及び配列番号１７に示される塩基配列の３２１０番目〜３２２４番目のＡＣＣ５回反復配列における１つのＡＣＣ配列の欠失である３塩基デリーション型多型を有する場合に、該被験者はびまん性汎細気管支炎の罹患リスクが高いと評価される、びまん性汎細気管支炎の罹患リスクを評価する方法。
【請求項９】
ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型を、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて検出する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型を、配列番号２２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて検出する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型を、配列番号２３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて検出する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
診断対象がアジア人種である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ムチン遺伝子及び該遺伝子によりコードされるムチン糖タンパク質に関する。また本発明は、該ムチン遺伝子における多型に基づく粘膜関連疾患の診断、予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
粘膜関連疾患の１種であるびまん性汎細気管支炎（diffuse panbronchiolitis；以下ＤＰＢと略す）は、日本で１９６０年代にその疾患概念が提唱された慢性気道炎症性疾患である。ＤＰＢの発症要因は明らかになっていないが、何らかの環境要因と、その環境要因に対して感受性を示す内的要因との相互作用により発症する多因子疾患と考えられている。さらに、本疾患の発症は東アジアに集積しており欧米人にはほとんどみられないこと、また、欧米からの数少ない報告の半数はアジア系人種であることなどから、疾患感受性には人種差があり、何らかの遺伝性要因が関与していることが以前より想定されてきた。
【０００３】
Ｓｕｇｉｙａｍａらは日本・韓国・中国などの東アジア人に特徴的なＨＬＡ−Ｂ５４抗原の保有率が日本人ＤＰＢ患者集団に有意に高いことを見出した（非特許文献１）。その後、日本においてはＨＬＡ−Ｂ５４（Ｂ＊５４０１）とのＤＰＢの関連が再確認された他、Ｂ＊５５０４も疾患と関連することが示された（非特許文献２）。一方韓国においてはＨＬＡ−Ｂ５４との明らかな関連はなく、かわってＨＬＡ−Ａ１１がＤＰＢと強い関連を示した（非特許文献３）。これらのことから、ＨＬＡ−Ｂ５４自体あるいはＨＬＡ−Ａ１１自体が疾患感受性を規定するのではなく、染色体６ｐ２１．１から６ｐ２１．３３上にかけて位置するＨＬＡ−Ａ遺伝子座とＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の間にＤＰＢの疾患感受性を規定する遺伝子のひとつが存在していると考えたほうが妥当であると考えられた。
【０００４】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子座とＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の間にＤＰＢの疾患感受性を規定する遺伝子のひとつが存在しているという仮説に基づいて、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座とＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の間に同定された１４種類の遺伝マーカー（主にマイクロサテライトマーカー）を利用して疾患感受性候補遺伝領域の絞込みを行った結果、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座より３００ｋｂほどＨＬＡ−Ａ座側の約２００ｋｂの領域に疾患感受性遺伝子のひとつが存在すると推定されている（非特許文献４）。この２００ｋｂの領域には最近Ｍａｔｓｕｚａｋａらにより報告されたＤＰＣＲ１（非特許文献５）の他に既知の遺伝子がほとんど存在しておらず、「ＧｅｎｓｃａｎＧｅｎｅｓ」（遺伝子予測プログラムＧｅｎｓｃａｎを用いて予測された遺伝子）として遺伝子データバンクに登録されたもの（例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ＿００７５９２．６４３、ＮＴ＿００７５９２．６４４など）があるのみである。
【０００５】
従って、ＤＰＢの疾患感受性遺伝子を特定し、ＤＰＢの発症研究や治療に利用することが望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】Sugiyamaら，Analysis of HLA antigens in patients with diffuse panbronchiolitis，Am Reespir Dis，第141巻，p.1459-1462，1990年
【非特許文献２】Keicho Nら，Contribution of HLA genes to genetic predisposition in diffuse panbronchiolitis，Am J Respir Crit Care Med，第158巻，p.846-850，1998年
【非特許文献３】Park MHら，Association of class I antigens with diffuse panbronchiolitis in Korean patients，Am J Respir Crit Care Med，第159巻，p.526-529，1999年
【非特許文献４】Keicho Nら，Fine localization of a major disease-susceptibility locus for diffuse panbronchiolitis，Am J Hum Genet，第66巻，p.501-507，2000年
【非特許文献５】Matsuzakaら，Identification of  novel candidate genes in the diffuse panbronchiolitis critical region of the class I human MHC，Immunogenetics，第54巻，p.301-309，2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、びまん性汎細気管支炎を含む粘膜関連疾患と関係する遺伝子及び粘膜関連疾患の疾患感受性（罹患リスク）の評価を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、新規なムチン遺伝子を単離することに成功し、またこの遺伝子における遺伝子多型がＤＰＢの疾患感受性と関係を有し、遺伝子多型をＤＰＢの診断、予防又は治療に利用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の１〜１３を包含する。
【０００９】
１．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ムチン糖タンパク質であるタンパク質
【００１０】
２．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ムチン糖タンパク質であるタンパク質
【００１１】
３．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ムチン糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプライマー又はプローブとしての機能を有するポリヌクレオチド
【００１２】
４．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ムチン糖タンパク質であるタンパク質
【００１３】
５．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ムチン糖タンパク質であるタンパク質
【００１４】
６．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２６に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ムチン糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２６に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプライマー又はプローブとしての機能を有するポリヌクレオチド
【００１５】
７．上記２、３、５及び６のいずれかのポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
８．上記２、３、５及び６のいずれかのポリヌクレオチド又は上記７の組換えベクターが導入された形質転換体。
９．上記８の形質転換体を培養し、得られる培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、ムチン糖タンパク質の製造方法。
【００１６】
１０．配列番号１に示される塩基配列を有するムチンＧ４遺伝子の多型を検出する手段を含むことを特徴とする、粘膜関連疾患の罹患リスクを診断するためのキット。
【００１７】
上記多型としては、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型が挙げられる。具体的には、長さの異なる反復配列の多型は、例えば４５９９ｂｐのＬ多型（配列番号１７）、３７３５ｂｐのＭｌ多型（配列番号１８）、３５４９ｂｐのＭｓ多型（配列番号１９）、３００６ｂｐのＳｌ多型（配列番号２０）及び２７０９ｂｐのＳｓ多型（配列番号２１）からなる群より選択されるものである。ここで、被験者がＳｓ多型を有する場合に、該被験者は粘膜関連疾患の罹患リスクが低いと評価することができる。
【００１８】
また上記多型としては、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型又は３塩基デリーション型多型が挙げられる。具体的には、例えば、１塩基デリーション型多型としては配列番号１７に示される塩基配列の１８２７番目又は１８３８番目のＣ塩基の欠失があり、また、３塩基デリーション型多型としては配列番号１７に示される塩基配列の３２１０番目〜３２２４番目のＡＣＣ５回反復配列における１つのＡＣＣ配列の欠失がある。ここで、被験者が、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列のＬ多型を有し、かつ該Ｌ多型における１塩基デリーション型多型及び３塩基デリーション型多型の両方又はいずれか一方を有する場合には、該被験者は粘膜関連疾患の罹患リスクが高いと評価することができる。
【００１９】
さらに上記多型としては、ムチンＧ４遺伝子第４エクソンにおける一塩基多型が挙げられる。具体的には、例えば一塩基多型としては配列番号１に示される塩基配列の５４９２番目の塩基におけるＧ／Ａ多型がある。ここで、配列番号１に示される塩基配列の５４９２番目の塩基がＧ／Ａへテロ型又はＡ／Ａホモ型である場合に、被験者は粘膜関連疾患の罹患リスクが高いと評価することができる。
【００２０】
上記診断キットにおいて、検出手段としては、限定されるものではないが、配列番号１、１７、１８、１９、２０、２１、２４及び２５からなる群より選択される塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２１】
上記検出手段として、例えばムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型を検出するための手段は、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットがある。
【００２２】
また上記検出手段として、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型を検出するための手段は、配列番号２２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがある。
【００２３】
上記検出手段としてはまた、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型を検出するための手段は、配列番号２３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがある。
【００２４】
１１．配列番号２６に示されるムチンＧ２遺伝子の多型を検出する手段を含むことを特徴とする粘膜関連疾患の罹患リスクを診断するためのキット。
【００２５】
上記多型としては、ムチンＧ２遺伝子第３エクソンにおける４塩基のインサーション／デリーション型多型が挙げられる。
【００２６】
上記１０及び１１の診断キットにおいて、粘膜関連疾患には、炎症（例えば、びまん性汎細気管支炎、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張炎及び慢性副鼻腔炎）、並びに悪性腫瘍（気道、胎盤、睾丸、脳及び脾臓における悪性腫瘍）が含まれる。
【００２７】
上記診断キットの診断対象は、限定するものではないが、アジア人種であることが好ましい。
【００２８】
１２．粘膜関連疾患の罹患リスクが高いと評価される多型を有するムチン遺伝子の発現を抑制する化合物、又は該多型を有するムチン糖タンパク質の機能を抑制する化合物を含むことを特徴とする粘膜関連疾患の予防用又は治療用医薬。
【００２９】
上記粘膜関連疾患の罹患リスクが高いと評価される多型としては、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型及び３塩基デリーション型多型、並びに配列番号１に示される塩基配列の５４９２番目の塩基におけるＧ／Ａへテロ型及びＡ／Ａホモ型が挙げられる。
【００３０】
また、上記化合物としては、限定されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ及び抗体が挙げられる。
【００３１】
１３．粘膜関連疾患の罹患リスクが低いと評価される多型を有するムチン遺伝子の発現を増大する化合物、又は該多型を有するムチン糖タンパク質を含むことを特徴とする粘膜関連疾患の予防用又は治療用医薬。
【００３２】
上記粘膜関連疾患の罹患リスクが低いと評価される多型としては、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおけるＳｓ多型が挙げられる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の診断キットにより、粘膜関連疾患の罹患リスクを診断することが可能となる。また本発明の予防用又は治療用医薬により、粘膜関連疾患を効果的に予防又は治療することが可能となる。
【００３４】
さらに本発明により、新規なムチン遺伝子及びムチン糖タンパク質が提供される。ムチン糖タンパク質は、生体における重要な役割を果たすことが知られているため、粘膜関連疾患を含む多くの生体内機構の解明に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
１．ムチン遺伝子及びムチン糖タンパク質
（１）新規ムチン遺伝子の同定
本発明のムチンＧ４遺伝子及びムチンＧ２遺伝子は、ヒト気管支上皮細胞から単離され、気管支上皮（Ｇ４及びＧ２）、胎盤（Ｇ４）、睾丸（Ｇ４）、脳（Ｇ２）及び脾臓（Ｇ２）において発現されることが確認された。ムチン遺伝子とは、ムチン糖タンパク質をコードする遺伝子の総称であり、またムチン糖タンパク質とは、糖鎖構造を有する粘液性のタンパク質であり、上皮（例えば粘膜）に存在し、外界からの異物・刺激に対して物理的に上皮を覆って生体を防御する機能を有する。従って、本発明のムチン糖タンパク質及びムチン遺伝子も上皮や粘膜における機能を有すると考えられる。
【００３６】
本発明のムチン遺伝子は、気管支上皮、胎盤、睾丸、脳又は脾臓の組織又は細胞より抽出したＲＮＡから精製したｍＲＮＡを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）又はｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングにより得ることができる。
【００３７】
組織又は細胞からのｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。例えば、上記供給源から、グアニジウムチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法などにより全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００３８】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００３９】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のＤＮＡを有する株を選択するには、例えば、ムチン遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法を採用することができる。
【００４０】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００４１】
その取得した配列を基にしてＰＣＲ法によりプローブを作製し、ｃＤＮＡライブラリーから該遺伝子をスクリーニングすることが望ましい。
【００４２】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法が用いられる。ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの５’又は３’欠失部位をＰＣＲにより迅速に回収する方法である。なお、ＲＡＣＥ法は、市販のキット（First Choice RLM RACE Kit, Ambion）を用いて行うこともできる。
【００４３】
本発明においては、上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、ＰＣＲ産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばApplied Biosystems社製ABI Prism 310 Genetic Analyzer等）を用いて配列決定が行われる。
【００４４】
配列番号１にムチンＧ４遺伝子の塩基配列を、配列番号２にムチンＧ４遺伝子によりコードされるムチン糖タンパク質のアミノ酸配列を例示する。ここで、配列番号１の３５９〜５６７７番目の塩基配列がＣＤＳである。また、配列番号２６にムチンＧ２遺伝子の塩基配列を、配列番号２７にムチンＧ２遺伝子によりコードされるムチン糖タンパク質のアミノ酸配列を例示する。ここで、配列番号２６の３１３〜１０５６番目の塩基配列がＣＤＳである。
【００４５】
ただし、配列番号２又は２７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、ムチン糖タンパク質である限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。ムチン糖タンパク質とは、ムチン型（セリン／スレオニン結合型）の糖タンパク質を指し、タンパク質がムチン糖タンパク質であるか否かは、得られたタンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列を解析し、ムチン糖タンパク質の特徴である、シグナルペプチドの存在、セリン・スレオニンを多く含むアミノ酸配列の反復配列の存在、セリン及びスレオニン含量などを調べることにより確認することができる。
【００４６】
例えば、配列番号２又は２７に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のムチン糖タンパク質に含まれる。具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１７１２番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ａｓｐ）からアスパラギン酸（Ａｓｎ）に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。このタンパク質は、ムチンＧ４遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）の存在によるものである。
【００４７】
上記のムチン糖タンパク質は、気管支上皮（Ｇ４及びＧ２）、胎盤（Ｇ４）、睾丸（Ｇ４）、脳（Ｇ２）及び脾臓（Ｇ２）において発現され、またムチン糖タンパク質とは、糖鎖構造を有する粘液性のタンパク質であり、上皮（例えば粘膜）における細胞保護及び細胞間相互作用などの役割が知られていることから、本発明のムチン糖タンパク質は、例えば、上記組織における細胞保護又は細胞間相互作用を調節する薬物のスクリーニングに使用することができる。さらには、そのような細胞保護又は細胞間相互作用を増強又は低減する薬物をスクリーニングすることにより、かかるムチン糖タンパク質の機能と関連する疾患を予防又は治療するための医薬を開発しうる。
【００４８】
上記ムチン遺伝子のポリヌクレオチドは、気管支上皮、胎盤、睾丸、脳又は脾臓などの組織又は細胞から調製したＤＮＡから、上記遺伝子の塩基配列（配列番号１又は２６）に基づいて設計したプライマーを用いて増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより調製することができる。
【００４９】
また、ムチン遺伝子の塩基配列が決定されているため、化学合成によってポリヌクレオチドを調製することもできる。また、部位特異的突然変異誘発法等によってムチン遺伝子の変異型であってムチン糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。
【００５０】
変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質がムチン糖タンパク質であるか否かは、上述と同様、得られたタンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列を解析し、ムチン糖タンパク質の特徴を調べることにより確認することができる。
【００５１】
さらに、本発明には、上記塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プライマー又はプローブとしての機能を有するポリヌクレオチドも含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が０．３〜１．５Ｍ、好ましくは０．７〜０．９Ｍであり、温度が５０〜８０℃、好ましくは６８℃での条件をいう。
【００５２】
また、「プライマー又はプローブとしての機能を有する」とは、特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有する、という意味である。すなわち、当該ポリヌクレオチドは、本発明のムチン遺伝子のポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と特異的にアニーリング又はハイブリダイズする配列を含む必要があり、その配列の長さが短いために又はその塩基組成が適切ではないために非特異的なアニーリング又はハイブリダイゼーションを頻繁に起こすようなポリヌクレオチドを排除することを意図するものである。
【００５３】
例えば、ポリヌクレオチドをプライマー又はプローブとして使用する場合、プライマー又はプローブとして機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。
【００５４】
また設計の際には、プライマー又はプローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー又はプローブ設計用ソフトウエアを利用することができる。プライマー又はプローブとして特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。
【００５５】
また本発明において「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよいし、ＤＮＡ及びＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドであってもよい。
【００５６】
（２）組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは、上記ムチン遺伝子（ポリヌクレオチド）を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、上記ムチン遺伝子（ポリヌクレオチド）又は本発明の組換えベクターを、目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００５７】
ベクターには、宿主で増殖し得るファージミド又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、細菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージミドＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
【００５８】
ベクターに本発明のポリヌクレオチド（ムチン遺伝子）を挿入するには、まず、精製されたポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００５９】
本発明のムチン遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のムチン遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００６０】
上記の各種配列とベクターＤＮＡとを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、上記各種配列とベクターＤＮＡとをアニーリングさせた後に連結させ、組換えベクターを作製する。
【００６１】
形質転換に使用する宿主としては、導入される遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、酵母、動物細胞（ＮＣＩＨ２９２細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００６２】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母へのポリヌクレオチド又は組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６３】
動物細胞を宿主とする場合は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等が用いられる。プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられる。動物細胞へのポリヌクレオチド又は組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６４】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞へのポリヌクレオチド又は組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００６５】
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００６６】
（３）ムチン糖タンパク質の製造
本発明において、ムチン糖タンパク質は、ムチン遺伝子が導入された前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞又は細胞破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６７】
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約２０〜４０℃で約１〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６８】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５容積％ＣＯ２存在下、約３７℃で約１〜７日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６９】
培養後、ムチン糖タンパク質が細胞内に生産される場合には、細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、ムチン糖タンパク質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からムチン糖タンパク質を単離精製することができる。
【００７０】
ムチン糖タンパク質が得られたか否かは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等により確認することができる。
【００７１】
２．粘膜関連疾患の診断
（１）ムチン遺伝子の多型
本発明のムチン遺伝子（Ｇ４及びＧ２）は、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）と関連する複数の遺伝子多型を有することが見出された。上述したように、ムチン糖タンパク質は、上皮（例えば粘膜）における役割が知られており、また別のムチン遺伝子が炎症性疾患や悪性腫瘍と関係していることも報告されていることから、本発明のムチン遺伝子の多型は、気道粘膜における炎症（例えばびまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張炎及び慢性副鼻腔炎など）、気道、胎盤、睾丸、脳及び脾臓における悪性腫瘍などと関連していると考えられる。本発明においては、本発明のムチン遺伝子の多型が関係していると考えられるこれらの疾患を「粘膜関連疾患」と称する。
【００７２】
ここで、「遺伝子多型」又は「多型」とは、個体間における形質や形態の多様性を引き起こす遺伝子の差異をいい、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）、インサーション／デリーション型多型、及び反復配列の繰り返し数が異なっていることにより生じる多型が含まれる。一塩基多型（ＳＮＰ）とは、一般にはある遺伝子又はある領域の特定の１個の塩基が他の塩基に置換することによる多型を意味する。また、インサーション／デリーション型多型とは、１以上の塩基（例えば１〜数十塩基）が欠失又は挿入していることによる多型をいい、１〜３塩基、さらには数百塩基〜数千塩基の欠失又は挿入を有するものも存在する。さらに、反復配列の繰り返し数が異なっていることにより生じる多型は、２〜数十塩基の配列が繰り返されており、その繰り返し回数が個人間で異なっているものをいう。繰り返しの単位（反復配列）が数塩基から数十塩基のものを特にＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat）という。ＶＮＴＲにおいては、この繰り返し回数の違いが個々人のアレル（対立遺伝子）で異なることにより、バリエーションが獲得されている。
【００７３】
本発明においては、本発明のムチン遺伝子（Ｇ４及びＧ２）における遺伝子多型と粘膜関連疾患との関連性を利用して、ムチン遺伝子における特定の遺伝子多型を検出することにより、被験者における粘膜関連疾患の罹患リスクを診断する。ここで、多型の「検出」とは、ある特定の多型の種類を決定したり、多型の有無を判定することをいい、「タイピング」とも呼ばれる。また「罹患リスク」とは、疾患への罹りやすさ（感受性）を意味し、「罹患リスクが高い多型」とは、他の多型を有する被験者と比較して、その多型を有する被験者が疾患に罹る確率が高いことを意味し、一方「罹患リスクが低い多型」とは、他の多型を有する被験者と比較して、その多型を有する被験者が疾患に罹る確率が低いことを意味する。
【００７４】
粘膜関連疾患の診断に利用される、本発明のムチン遺伝子（Ｇ４及びＧ２）の多型には、以下のものが含まれる：
（ａ）ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の５種の多型（ＶＮＴＲ）
・４５９９ｂｐのＬ多型（配列番号１７）：最も頻度の高い多型であり、約１０アミノ酸（一例としてＴＴＴＡＳＴＥＧＳＥ）の反復配列が約１５０回繰り返されている
・３７３５ｂｐのＭｌ多型（配列番号１８）：Ｌ型と比較して１０７４塩基の欠失と２１０塩基の挿入を有し、反復配列の繰り返し回数が約２９回減少している
・３５４９ｂｐのＭｓ多型（配列番号１９）：Ｌ型と比較して１０５０塩基の欠失を有し、反復配列の繰り返し回数が約３５回減少している
・３００６ｂｐのＳｌ多型（配列番号２０）：Ｌ型と比較して１５９３塩基の欠失を有し、反復配列の繰り返し回数が約５３回減少している
・２７０９ｂｐのＳｓ多型（配列番号２１）：Ｌ型と比較して１８９０塩基の欠失を有し、反復配列の繰り返し回数が約６３回減少している
上記５種の多型のうち、Ｓｓ多型を有する被験者は、粘膜関連疾患の罹患リスクが低いと評価することができる。
【００７５】
（ｂ）ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型
上記第２エクソンのＬ多型（配列番号１７に示される塩基配列）の１８２７番目又は１８３８番目のＣ塩基の欠失（配列番号２４）
【００７６】
（ｃ）ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型
上記第２エクソンのＬ多型（配列番号１７に示される塩基配列）の３２１０番目〜３２２４番目のＡＣＣ５回反復配列における１つのＡＣＣ配列（３塩基）の欠失（配列番号２５）
上記ムチンＧ４遺伝子第２エクソンの長さの異なる反復配列のＬ多型を有し、かつ該Ｌ多型における１塩基デリーション型多型及び３塩基デリーション型多型の両方又はいずれか一方を有する被験者は、粘膜関連疾患の罹患リスクが高いと評価することができる。
【００７７】
（ｄ）ムチンＧ４遺伝子第４エクソンにおける一塩基多型（ＳＮＰ）
配列番号１に示される塩基配列の５４９２番目の塩基における多型（Ｇ／Ａ）
上記塩基がＧ／Ａへテロ型又はＡ／Ａホモ型である被験者は、粘膜関連疾患の罹患のリスクが高いと評価することができる。ここで「Ｇ／Ａヘテロ型」とは、５４９２番目の塩基について一方のアレルは塩基Ｇを有し、もう一方のアレルが塩基Ａを有し、ヘテロ型であることを表し、「Ａ／Ａホモ型」とは、５４９２番目の塩基について両方のアレルが塩基Ａを有し、ホモ型であることを表す。なお、この一塩基多型の存在により、ムチン糖タンパク質におけるアミノ酸配列は、１７１２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される。なお、単に「Ｇ／Ａ」と示すときは、塩基Ｇ又はＡの一塩基多型を表す。
【００７８】
（ｅ）ムチンＧ２遺伝子第３エクソンにおける四塩基のインサーション／デリーション型多型
配列番号２６に示される塩基配列の７９５番目の塩基Ｔと７９５番目の塩基Ｇとの間における「ＣＡＣＴ」の欠失又は挿入
この多型は、粘膜関連疾患と関連している。
【００７９】
（２）診断対象
本発明においては、ムチン遺伝子の多型を利用して粘膜関連疾患の罹患リスクを診断するが、その診断対象となる被験者は、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウスなど）であれば特に限定されない。特に、診断対象はヒトであることが好ましく、さらにはアジア人種であることが好ましい。
【００８０】
遺伝子多型を検出するためには、診断対象の被験者からＤＮＡ又はＲＮＡを調製する必要があるが、この調製は公知の方法を用いて行うことができる。例えばゲノムＤＮＡは、フェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法などにより調製することができる。また、ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート法により調製することができる。
【００８１】
ＤＮＡ又はＲＮＡを調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、細胞又は組織、血液、唾液、鼻腔粘膜からこすりとった細胞などを用いることができる。
【００８２】
（３）遺伝子多型の検出法
上述の通り、本発明のムチン遺伝子の多型は、粘膜関連疾患と一定の関連性を有するため、このムチン遺伝子の多型を検出することにより、粘膜関連疾患の罹患リスクを診断することができる。
【００８３】
遺伝子多型の検出は、当技術分野で公知の多型検出手段により行うことができ、限定するものではないが、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法、ハイブリダイゼーション法を利用した方法、プライマー伸長反応を利用する方法、質量分光法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下にその概要を説明する。
【００８４】
（３−１）直接配列決定法
遺伝子多型は、直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、被験者からＤＮＡを調製する。検出対象となる多型を含む領域をベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）において増幅させる。あるいは、検出対象の多型を含む領域内のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のＤＮＡを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、被験者の有する多型を検出する。
【００８５】
（３−２）ＰＣＲ法
遺伝子多型は、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、特定の多型を有する配列又は野性型配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用して行う。その多型用及び野性型用の両方のプライマーセットを使用して被験者由来のＤＮＡを増幅する。多型用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験者はその特定の多型を有することになる。野生型用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験者は野生型の配列を有することになる。
【００８６】
また、ＶＮＴＲの場合には、その多型部位を含む領域を増幅することができるプライマーセットを設計し、被験者由来のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う。得られる増幅断片は、そのＶＮＴＲの反復配列の繰り返し数に応じて長さが異なるため、電気泳動法を利用して、多型（ＶＮＴＲ）を検出することができる。
【００８７】
（３−３）ＲＦＬＰ法
遺伝子多型は、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象の多型を含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、所定の多型に独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、並びに野生型及び特定の多型の対照により生じた断片の長さと比較することによって、被験者の多型を検出することができる。
【００８８】
（３−４）ハイブリダイゼーション法
遺伝子多型は、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、被験者由来のＤＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、所定の多型（ＳＮＰ等）の有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。
【００８９】
プローブが検出対象の多型配列（例えばＳＮＰ）に対しハイブリダイズしたか否かは、その結合したプローブを可視化することにより直接検出することができる。これは、例えば、ノーザン又はサザンアッセイとして知られている（例えば、Ausabel et al. (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991)参照）。サザンアッセイの場合にはゲノムＤＮＡを、ノーザンアッセイの場合にはＲＮＡを被験者から単離する。続いて、単離したＤＮＡ又はＲＮＡを、一連の制限酵素群で切断する。次に、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、膜に転写する。この分離操作は、例えばアガロースゲル上で行うことができる。膜への転写は、標識化プローブ、又は検出対象の多型に特異的なプローブを、好適なストリンジェンシー条件下で膜に転写して行う。標識は、例えば放射性ヌクレオチドを導入することにより行うことができる。未結合のプローブを除去した後、標識化プローブを可視化することにより、結合の存在を検出することができ、その結合の有無により、特定の多型を有するか否かについて判断しうる。
【００９０】
あるいは、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。この方法においては、オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に貼り付ける。このプローブは、所定の多型に特異的なものとなるように設計する。被験者由来のＤＮＡサンプルをＤＮＡチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００９１】
（３−５）プライマー伸長反応を利用する方法
遺伝子多型は、プライマー伸長反応を利用して検出することもできる。プライマー伸長反応を利用する方法として、例えばＳｎｉＰｅｒ法が挙げられる。ＳｎｉＰｅｒ法とは、ローリングサークル型複製（rolling circle amplification；ＲＣＡ）法と呼ばれる手法を基本原理とするものであり、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを連続して合成していくものである（例えば、米国特許第６，２１０，８８４号及び同第６，１８３，９６０号参照）。この方法によれば、ＤＮＡ増幅が起こった場合に生じる発色反応の有無を測定することによって多型を検出することができる（Lizardi, P. M. et al., Nature Genet., 19, 225-232 (1998); Piated, A. S. et al., Nature Biotech., 16, 359-363 (1998)）。
【００９２】
本発明においては、上述した多型検出方法を利用して、ムチン遺伝子（Ｇ４及びＧ２）の多型を検出する。ここで、多型の検出手段としては、上述の方法に使用するためのオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが挙げられる。
【００９３】
本発明において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２５に示される塩基配列を基本とし、これらの配列全体として使用してもよく、あるいはこれらの配列の一部を含むように（例えば多型部位を含むように又は多型部位を増幅できるような位置に）設計し、合成してもよい。また、上記配列に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを設計してもよい。
【００９４】
プライマー及びプローブの設計は、当技術分野で周知であり、使用する増幅反応又はハイブリダイゼーションなどに応じて適宜設計することができる。具体的な設計方法は、前項「１．ムチン遺伝子及びムチン糖タンパク質」における「（１）新規ムチン遺伝子の同定」の節の記載を参照されたい。
【００９５】
以上のように設計されたプライマー又はプローブは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。
【００９６】
本発明において使用することのできる、ムチン遺伝子の多型を検出するための手段として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００９７】
（ａ）ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列に存在する５種の多型（ＶＮＴＲ）を検出するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）
センスプライマー：5’-CCC ACC ACC TTA TTT GTT CTC CAC-3’（配列番号１１）
アンチセンスプライマー：5’-CAG GGA AAT GAG GAT GAT AGC CCA-3’（配列番号１２）
【００９８】
上記プライマーを使用して、被験者由来のＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行う。増幅反応の条件は、増幅により得られる断片は、５種の多型の種類に応じて長さが異なるため、電気泳動法を利用することにより上記多型を検出することができる。具体的には、Ｌ多型は、約７０５８ｂｐの断片として、Ｍｌ多型は約６１９４ｂｐの断片として、Ｍｓ多型は約６００８ｂｐの断片として、Ｓｌ多型は約５４６５ｂｐの断片として、Ｓｓ多型は約５１６８ｂｐの断片として増幅される。ここで、電気泳動法は、特に限定されるものではなく、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などを使用することができる。
【００９９】
（ｂ）ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ型における１塩基デリーション型多型、すなわち配列番号１７に示される塩基配列の１８２７番目又は１８３８番目のＣ塩基の欠失を検出するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）
シーケンスプライマー：5’- TGT GGT GGT CTC CAA GCC TGT ATT -3’（配列番号２２）
【０１００】
得られるＰＣＲ産物を、プライマー除去するために精製し（例えばExoSapIT（アマシャムファルマシア）を用いて行う）、例えばBigDyeTerminatorキット（ABI）サイクルシーケンス反応を行う。その後、セファデックスＧ５０にてダイターミネーターを除去し、ABI3100 Genetic Analyzerを用いて解析し、シーケンチャーで波形を確認することにより、上記多型を検出することができる。
【０１０１】
（ｃ）ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ型における３塩基デリーション型多型、すなわち配列番号１７に示される塩基配列の３２１０番目〜３２２４番目のＡＣＣ５回反復配列における１つのＡＣＣ配列の欠失を検出するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）
シーケンスプライマー：5’- TAA AAT GAC CAC AGT CTT CAC TGA AAA CTC -3’（配列番号２３）
【０１０２】
このシーケンスプライマーは、上記と同様に用いて、シーケンチャーで波形を確認することにより、多型を検出することができる。
【０１０３】
（４）診断キット
上述したムチン遺伝子の多型を検出するための手段（オリゴヌクレオチド）は、粘膜関連疾患の罹患リスクを診断するためのキットとして提供される。
【０１０４】
本発明の診断キットは、少なくとも１つのムチン遺伝子の多型を検出するための手段を含むものである。また、さらに多型の検出を実施するために必要な１種以上の成分を含んでもよい。そのような成分としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、バッファー（例えばＴｒｉｓ緩衝液）、ｄＮＴＰ、標識用及び検出用試薬（蛍光色素など）、説明書などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の粘膜関連疾患の罹患リスクを診断するためのキットにより、被験者の罹患リスクを簡便かつ迅速に診断することが可能となり、その診断結果に応じて適切な処置を施すことができる。
【０１０６】
３．粘膜関連疾患の予防及び治療
本発明のムチン糖タンパク質及びムチン遺伝子は、粘膜関連疾患の罹患リスクと関係している。すなわち、ムチン遺伝子（Ｇ４及びＧ２）における特定の遺伝子多型を有する被験者は、粘膜関連疾患の罹患リスクが高い又は低いと評価される。従って、本発明のムチン糖タンパク質又はムチン遺伝子を利用して、罹患リスクが高いと評価される被験者の罹患リスクを低減し、粘膜関連疾患を予防かつ治療することが可能となる。
【０１０７】
より具体的に説明すると、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ型における１塩基デリーション型多型及び３塩基デリーション型多型の両方又は一方を有する場合には、粘膜関連疾患の罹患リスクが高いため、かかる多型を有するムチン遺伝子の発現を抑制することにより、又はかかる多型を有するムチン糖タンパク質の機能を抑制することにより、粘膜関連疾患を予防又は治療しうる。
【０１０８】
また、配列番号１に示される塩基配列の５４９２番目の塩基におけるＧ／Ａへテロ型又はＡ／Ａホモ型を有する場合には、粘膜関連疾患の罹患リスクが高いため、かかる多型を有するムチン遺伝子の発現を抑制することにより、又はかかる多型を有するムチン糖タンパク質の機能を抑制することにより、粘膜関連疾患を予防又は治療しうる。
【０１０９】
従って、本発明の粘膜関連疾患の予防用又は治療用医薬は、粘膜関連疾患の罹患リスクが高いと評価される多型を有するムチン遺伝子の発現を抑制する化合物、又は該多型を有するムチン糖タンパク質の機能を抑制する化合物を含むことを特徴とする。
【０１１０】
特定の多型を有するムチン遺伝子の発現を抑制することを目的とする場合は、該遺伝子の発現を直接抑制する医薬を設計する。一般的な方法としては、アンチセンス法及びＲＮＡ干渉が挙げられる。あるいは、ムチン糖タンパク質の機能を抑制するように医薬を設計することも可能である。この場合は、当該タンパク質に対する抗体を使用することができる。
【０１１１】
アンチセンス法は、標的とするムチン遺伝子の配列にアンチセンス配列を特異的に結合させて、ターゲット遺伝子の発現を抑えるというものである。アンチセンス配列は、標的配列の少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである。アンチセンス配列は、細胞ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに結合して翻訳又は転写をブロックし、標的ムチン遺伝子の発現を阻害するものである。アンチセンス配列は、標的ムチン遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り任意のオリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。従って、標的ムチン遺伝子の一部の配列に相補的となるようにアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を設計する。
【０１１２】
設計すべきアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、標的ムチン遺伝子の発現を抑制し得る限り特に限定されるものではないが、例えば１０〜５０塩基、好ましくは１５〜２５塩基である。オリゴヌクレオチドは、公知手法により容易に化学合成することができる。
【０１１３】
また、粘膜関連疾患の罹患リスクの高いムチン遺伝子の翻訳を抑制するために、ＲＮＡ干渉（RNA interference）を利用することも可能である。具体的には、標的とするムチン遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、当該遺伝子のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（Hannon,GJ., Nature (2002) 418,244-251 (review)；特表２００２−５１６０６２号公報；特表平８−５０６７３４号公報）。
【０１１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＲＮＡは、発現ベクターを用いた種々の投与方法で目的の場所（癌細胞等）に到達させることができる。投与は、公知の任意の手法、例えばキメラウイルス若しくはコロイド分散系などの組換え発現ベクターを用いた手法、又はレトロウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを用いた手法により行うことができる。
【０１１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＲＮＡの送達に使用し得るベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
目的の組織又は細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＲＮＡを投与するために使用し得る他の遺伝子送達機構には、コロイド分散系、リポソーム誘導系、人工ウイルスエンベロープなどが含まれる。例えば、送達系は巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム等を利用することができる。  また、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖ＲＮＡの投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与を行うことができる。またその投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。
【０１１７】
抗体を使用する場合は、ポリクローナル抗体であるとモノクローナル抗体であるとを問わない。また、抗体フラグメント（例えばＦａｂフラグメントなど）を使用することができる。抗体は、当技術分野で公知の方法（例えば、ハイブリドーマを用いた方法など）により調製することができる。
【０１１８】
抗体の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。
【０１１９】
なお、抗体を投与（非経口投与）する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【０１２０】
一方、ムチンＧ４遺伝子第２エクソンにおける長さの異なる反復配列の多型がＳｓ多型の場合には、粘膜関連疾患の罹患リスクが低いため、かかる多型を有するムチン遺伝子の発現を増大することにより、又はかかる多型を有するムチン糖タンパク質を投与することにより、粘膜関連疾患を予防又は治療しうる。
【０１２１】
従って、本発明の粘膜関連疾患の予防用又は治療用医薬は、粘膜関連疾患の罹患リスクが低いと評価される多型を有するムチン遺伝子の発現を増大する化合物、又は該多型を有するムチン糖タンパク質を含むものとすることができる。
【０１２２】
特定の多型を有するムチン遺伝子の発現を増大させることを目的とする場合は、該遺伝子の発現を直接増大させる医薬を設計する。一般的な方法としては、標的とする特定の多型を有するムチン遺伝子を組み込んだベクター（ターゲティングベクター）の使用が挙げられる。ターゲティングベクターとは、プロモーター配列に連結した発現遺伝子の核酸配列を意味する。
【０１２３】
遺伝子の発現を増大させる１つの方法としては、標的となるムチン遺伝子の配列に強力なプロモーターを連結させて、ムチン遺伝子の発現を増大させるというものである。まず、ムチン遺伝子の上流に宿主で機能可能なプロモーターを機能可能な形で連結させ、これをウイルスベクターなどのベクターに組み込むことにより、ムチン遺伝子を宿主中で高発現させることが可能なターゲティングベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で連結させる」とは、ムチン遺伝子が導入される宿主においてプロモーターの制御下に当該ムチン遺伝子が発現されるように、該プロモーターと該遺伝子とを連結させることを意味する。すなわち、強力なプロモーターの作用によってムチン遺伝子の発現が増大する。
【０１２４】
宿主で機能可能な強力なプロモーターとしては、例えば、宿主が哺乳動物である場合には、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期または後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
ムチン遺伝子及びプロモーターを組み込むベクターは、宿主において利用可能なベクター、例えば、宿主の細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを有するベクターである。そこで、ベクターには、標的とするムチン遺伝子及びプロモーターの他、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。ベクターの例としては、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ（Amersham Pharmacia社製）、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス、レトロウイルス及びアデノウイルス等のウイルスベクターを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２６】
このようにして作製されたターゲティングベクターは、被験者に直接投与（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）してもよいし、または被験者から採取した細胞、好ましくは幹細胞に導入して、標的のムチン遺伝子を発現する細胞を選択してからその細胞を投与してもよい（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）。ターゲティングベクターの直接投与は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより行うことができる。また、ターゲティングベクターの細胞導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法を用いて行うことができる。標的のムチン遺伝子を発現する細胞の選択は選択マーカーを利用して行うことができ、この方法は当技術分野で周知である。ムチン遺伝子を発現する細胞の投与もまた、ターゲティングベクターの直接投与の場合と同様の製剤形態で投与することができる。
【０１２７】
ターゲティングベクターの投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。
【０１２８】
また、特定の多型を有するムチン遺伝子の発現産物（すなわちムチン糖タンパク質）を直接投与してもよく、その場合には、ムチン糖タンパク質を通常の組換えタンパク質産生方法を利用して大量に入手することができる。ムチン糖タンパク質は、上述のターゲティングベクターの製剤形態と同様にして投与することができ、その投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。
【０１２９】
上述した各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、有効成分との割合もまた適宜調整して（約１〜９０％）、常法により製造することができる。
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕新規ムチンＧ４遺伝子の同定とその発現
肺粘液性類表皮癌由来のヒト気管支上皮細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８４８）から全ＲＮＡを抽出し、５’Ｒａｃｅ及び３’Ｒａｃｅ（First Choice RLM RACE Kit, Ambion）を行った。ＲＡＣＥ法で得られた遺伝子の５’末端側の断片と３’末端側の断片をつなぐため、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーを使用してSuperScript III RT（Invitrogen）で全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、TaKaRa LA Taq（TaKaRa）を用いたｌｏｎｇ ＰＣＲを行い、遺伝子の全長クローニングを行った。
【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
遺伝子から予想されるタンパク質の性状解析にはＳＯＳＵＩ（Classification and Secondary Structure Prediction of Membrane Protein；インターネットホームページhttp://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）とＳｉｇｎａｌＩＰ（Improved prediction of signal peptides - SignalP 3.0.Jannick Dyrlov Bendtsen, Henrik Nielsen, Gunnar von Heijne and Soren Brunak. JMB: under revision 2004；インターネットホームページhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）を用いた。
【０１３３】
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞から得られたＧ４遺伝子の全長は６，１７０塩基で、遺伝子は４つのエクソンからなり、１，７７３アミノ酸のタンパク質をコードしていた。このＧ４遺伝子の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１３４】
上記タンパク質のＮ末端側には２７アミノ酸からなるシグナルペプチドが予測され、Ｃ端側には２３アミノ酸長の膜貫通部位が予測された。２番目のエクソン（第２エクソン）によりコードされる領域はセリン・スレオニンを多く含む約１０アミノ酸（代表的にはＴＴＴＡＳＴＥＧＳＥのパターンを持つ）が約１５０回繰り返されていた。予想されるタンパク質全体におけるセリン含量は１８．４％、スレオニン含量は３３．６％であり、あわせて５２％であった。以上の特徴から、Ｇ４遺伝子がコードするタンパク質は細胞膜貫通型のムチンと予想された。
【０１３５】
ヒト気管支上皮でのＧ４遺伝子の発現を確認するために、気管支上皮細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２より全ＲＮＡを抽出してランダムプライマーで逆転写（ＲＴ）を行い、イントロンをはさむプライマー（配列番号９及び１０；表２参照）にてＰＣＲを行った。また、他組織での発現を調べるために、１６種類のヒト組織由来のｃＤＮＡ（Human MTC panel I & II, CLONTECH）を用いて同様にＰＣＲにてＧ４遺伝子の検出を行った。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
Ｇ４遺伝子のｍＲＮＡ発現は正常のヒト気管支上皮で検出されたが、ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌを用いた結果では肺以外に胎盤や睾丸でも陽性であった。
【０１３８】
〔実施例２〕ムチンＧ４遺伝子における遺伝子多型の検出
本実施例においては、ムチンＧ４遺伝子における遺伝子多型を検出し、疾患との関連性を調べた。
（１）ＶＮＴＲの検出
ムチンに特徴的なタンパク質をコードするムチンＧ４遺伝子の第２エクソンは、約４ｋｂの長さで反復配列を有するＶＮＴＲを含むと考えられたので、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）患者９２例と健常対照１００例から調製したＤＮＡを用いてその第２エクソンの長さの比較を行い、長さが短いものについては欠落する部位の同定を行った。
【０１３９】
具体的には、表３に示すプライマーセットを用いて実施例１で同定したムチンＧ４遺伝子の約７ｋｂｐの第２エクソンを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、ＰＣＲ産物を０．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＥｔＢｒ染色にてバンドの検出を行い、ＰＣＲ産物の長さの比較を行った。
【０１４０】
【表３】
0004649575.tif 000004
【０１４１】
次に、長さが異なる第２エクソンのＤＮＡ配列を解析したが、繰り返し配列のためにエクソン内部にプライマーを設定して直接シーケンスを行うことが不可能であるため、両端にＢａｍＨＩサイトを付加したプライマーセット（表４）で増幅し、制限酵素ＭｂｏＩで消化し、ＢａｍＨＩ処理したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローニングした。
【０１４２】
【表４】
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【０１４３】
ＤＨ５αを用いて得られた各コロニーのプラスミドをＴ３プライマー（配列番号１５）とＴ７プライマー（配列番号１６）にてシーケンスを行った。ＭｂｏＩ処理では断片が大きすぎて、Ｔ３とＴ７を用いても挿入断片の全シーケンスが得られないものについては、その部位について適当なサイズの断片が得られる制限酵素ＨｐｈＩで消化し、TaKaRa BKL Kit（TaKaRa）で末端平滑化を行い、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ（Stratagene）にクローニングした。
【０１４４】
第２エクソンのＶＮＴＲの長さの解析では、約７ｋｂのＰＣＲ産物の長さは電気泳動上で５種類に分離した（図１）。図１において、左から、レーン１はマーカー、レーン２はＳｌ多型、レーン３：Ｌ多型、レーン４：Ｍｓ多型、レーン５：Ｍｌ多型、レーン６：Ｌ多型、レーン７：Ｓｓ多型、レーン８：Ｌ多型を示す。
【０１４５】
長さが予想と異なる４種類のＰＣＲ産物を断片化してシーケンスした結果、データベースに登録されている染色体６ｐ２１．３の全長配列を示す５３Ｌ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２３０４８）では第２エクソンの長さが４，５９９塩基（Ｌ多型に相当する）であるのに対し、表５に示すように欠失（deletion）又は挿入（insertion）を有する第２エクソンが認められた。またＤＰＢと健常対照での各アレル頻度は以下の通りであった。
【０１４６】
【表５】
0004649575.tif 000006
【０１４７】
このように、Ｓｓ型のアリルがＤＰＢで有意に少なく、ＤＰＢ抵抗性に関与している可能性が示唆された。
【０１４８】
表５に示した第２エクソンの各長さでの塩基配列を図２〜６（それぞれ配列番号１７〜２１）に示す。図３に示すＭｌ多型においては、Ｌ多型の第２エクソンの塩基配列に対して挿入された部分を小文字で示す。
【０１４９】
（２）１塩基及び３塩基デリーション型多型
次に、Ｇ４遺伝子の第２エクソンのＶＮＴＲ内に存在する多型を検出した。すなわち、Ｇ４遺伝子の第２エクソンのＶＮＴＲを調べたところ、１塩基デリーション型多型と３塩基デリーション型多型を見出した。これらの変異は、上述の「Ｌ多型」の一部が有する変異である。
【０１５０】
表３に示したプライマーセット（配列番号１１及び１２）を用いて増幅したＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスした。具体的には、ＰＣＲ産物をＥｘｏＳＡＰで精製し、下記シーケンスプライマー（配列番号２２及び２３；表６）を用いて、ＡＢＩサイクルシーケンスキットで反応を行い、セファデックスＧ−５０精製し、ＡＢＩ３１００シーケンサーでシーケンスした。
【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
図７及び８に、それぞれ１塩基デリーション型多型（配列番号２４）と３塩基デリーション型多型（配列番号２５）の場合のムチンＧ４遺伝子第２エクソンの塩基配列を示す。
【０１５３】
１塩基デリーション型多型（配列番号２４）は、４５９９塩基から成る第２エクソン（Ｌ多型；配列番号１７）のうち、１８３７番と１８３８番のＣが２個連なる部分のうち、Ｃが１個欠失する変異である。
【０１５４】
３塩基デリーション型多型（配列番号２５）は、４５９９塩基から成る第２エクソン（Ｌ多型；配列番号１７）のうち、３２１０番から３２２４番までのＡＣＣが５回繰り返される配列（ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ）のうち、ＡＣＣがひとつ減って４回の繰り返しになる変異である。
【０１５５】
ダイレクトシーケンスにより、各多型のホモ接合体では、シーケンスを解析して当該部分の塩基配列の決定することによりその多型を判定できる。また、ヘテロ接合体では、配列番号３６及び３７に示す塩基配列を有するプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られる産物（約４９４ｂｐ）の一部（約１０マイクロリットル）をＥｃｏＲＩにて消化し、アガロース（３％）電気泳動及びエチジウムブロマイド染色を行うことにより、Gタイプは、３２０、１３８、２４及び１２ｂｐのフラグメントが得られ、Ａタイプは３２０、１５０及び２４ｂｐのフラグメントが得られることから、１３８ｂｐのバンドと１５０ｂｐのバンドの有無によって、ヘテロ接合体を判定することができる。
【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
これらのデリーション型多型は、個々の多型についてのアレル頻度としては有意差がないが、両方の多型を含む遺伝子型として評価した場合には、以下のような関係を有する。
（１）１塩基デリーション型多型又は３塩基デリーション型多型のいずれかを有している
ＤＰＢ患者で５７人（６２．０％）
健常対照で４１人（４１．８％）
（２）１塩基デリーション型多型と３塩基デリーション型多型のいずれも有していない
ＤＰＢ患者で３５人（３８．０％）
健常対照で５７人（５８．２％）
【０１５８】
この結果は、カイ二乗でｐ＝０．００５５となる有意差がある。
従って、これらの結果から、このムチンＧ４遺伝子が、ＤＰＢの抵抗性および感受性に関連する遺伝子であることが、強く示唆された。
【０１５９】
（３）一塩基多型
Ｇ４遺伝子について、４つのエクソンを中心にＤＰＢ患者９２例と健常対照１００例のＤＮＡを用いて遺伝子多型を検出し、その関連を解析した。
【０１６０】
その結果、ムチンＧ４遺伝子の第４エクソンに存在する一塩基多型、具体的には、配列番号１の５４９２番目の塩基（Ｇ／Ａ、Ｇ４０４．３）が、ＤＰＢと最も強く関連していた（Ａ／Ａ＋Ｇ／Ａ型対Ｇ／Ｇ型でオッズ比２．２８  ９５％ＣＩ  １．２４〜４．１８）。
【０１６１】
【表８】
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【０１６２】
この一塩基多型は、遺伝子上でアミノ酸変異（アスパラギン／アスパラギン酸）をきたすものであった。
【０１６３】
被検者よりＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより当該ＤＮＡ領域を増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する方法、制限酵素ＥｃｏＲＩＩで消化するＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）などにより、本一塩基多型（Ｇ／Ａ）を判別できた。
【０１６４】
〔実施例３〕新規ムチンＧ２遺伝子の同定とその発現
ヒト気管支上皮細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２から全ＲＮＡを抽出し、５’Ｒａｃｅ及び３’Ｒａｃｅ（First Choice RLM RACE Kit, Ambion）を行った。ＲＡＣＥ法で得られた遺伝子の５’末端側の断片と３’末端側の断片をつなぐため、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーを使用してSuperScript III RT（Invitrogen）で全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、TaKaRa LA Taq（ＴａＫａＲａ）を用いたｌｏｎｇ  ＰＣＲを行い、遺伝子の全長クローニングを行った。
【０１６５】
【表９】
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【０１６６】
遺伝子から予想されるタンパク質の性状解析にはＳＯＳＵＩとＳｉｇｎａｌＩＰを用いた。
【０１６７】
気管支上皮細胞から得られたＧ２遺伝子の全長は約１，６７０塩基で、遺伝子は４つのエクソンからなり、２５１アミノ酸をコードしていた。このＧ２遺伝子の塩基配列を配列番号２６に、アミノ酸配列を配列番号２７に示す。
【０１６８】
上記タンパク質のＮ末端側には２２アミノ酸からなるシグナルペプチドが予測され、膜貫通部位は予測されなかった。２番目のエクソン（第２エクソン）にコードされる領域はセリン・スレオニンを多く含む１１アミノ酸（代表的にはＴＴＴＡＳＴＥＧＳＥのパターンを持つ）が約１４回繰り返されていた。予想されるタンパク質全体におけるセリンの含量は８％、スレオニン含量は１９％、プロリン含量は８％であり、あわせて３５％であった。以上の特徴からＧ２遺伝子がコードするタンパク質は分泌型のムチンと予想された。
【０１６９】
ヒト気管支上皮でのＧ２遺伝子の発現を確認するために、気管支上皮細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２より全ＲＮＡを抽出してランダムプライマーで逆転写（ＲＴ）を行い、イントロンをはさむプライマー（配列番号３４及び３５；表１０）にてＰＣＲを行った。また、他組織での発現を調べるために、１６種類のヒト組織由来のｃＤＮＡ（Human MTC panel I & II, CLONTECH）を用いて同様にＰＣＲにてＧ２遺伝子の検出を行った。
【０１７０】
【表１０】
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【０１７１】
Ｇ２遺伝子のｍＲＮＡ発現は正常のヒト気管支上皮で検出されたが、ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌを用いた結果では肺以外に脳や脾臓などでも陽性であった。
【０１７２】
〔実施例４〕ムチンＧ２遺伝子における遺伝子多型の検出
Ｇ２遺伝子のエクソン領域に存在する多型の検出と関連解析を行ったところ、最も強く関連していたのは第３エクソンに存在する４塩基のインサーション／デリーション型多型であった。すなわち、配列番号２６に示されるＧ２遺伝子の７９５番目の塩基Ｔと７９６番目の塩基Ｇとの間に「ＣＡＣＴ」の４塩基が欠失又は挿入している。Ｇ２遺伝子のプロモーター領域にマイクロサテライト（ｉｒｒ）多型が存在し、アリル４２８と４３２がＤＰＢと強く関連していた。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明の診断キットにより、粘膜関連疾患の罹患リスクを診断することが可能となる。また本発明の予防用又は治療用医薬により、粘膜関連疾患を効果的に予防又は治療することが可能となる。
【０１７４】
さらに本発明により、新規なムチン遺伝子及びムチン糖タンパク質が提供される。ムチン糖タンパク質は、生体における重要な役割を果たすことが知られているため、粘膜関連疾患を含む多くの生体内機構の解明に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチヂウムブロマイド染色した写真を示す図である。左からレーン１：マーカー，２：Ｓｌ，３：Ｌ，４：Ｍｓ，５：Ｍｌ，６：Ｌ，７：Ｓｓ，８：Ｌ
【図２Ａ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＬ多型（４５９９ｂｐ）の塩基配列（配列番号１７）を示す図である。
【図２Ｂ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＬ多型（４５９９ｂｐ）の塩基配列（配列番号１７）を示す図である。
【図３Ａ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＭｌ多型（３７３５ｂｐ）の塩基配列（配列番号１８）を示す図である。
【図３Ｂ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＭｌ多型（３７３５ｂｐ）の塩基配列（配列番号１８）を示す図である。
【図４Ａ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＭｓ多型（３５４９ｂｐ）の塩基配列（配列番号１９）を示す図である。
【図４Ｂ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＭｓ多型（３５４９ｂｐ）の塩基配列（配列番号１９）を示す図である。
【図５Ａ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＳｌ多型（３００６ｂｐ）の塩基配列（配列番号２０）を示す図である。
【図５Ｂ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＳｌ多型（３００６ｂｐ）の塩基配列（配列番号２０）を示す図である。
【図６Ａ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＳｓ多型（２７０９ｂｐ）の塩基配列（配列番号２１）を示す図である。
【図６Ｂ】ムチン遺伝子第２エクソンにおけるＳｓ多型（２７０９ｂｐ）の塩基配列（配列番号２１）を示す図である。
【図７Ａ】ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型の塩基配列（配列番号２４）を示す図である。
【図７Ｂ】ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における１塩基デリーション型多型の塩基配列（配列番号２４）を示す図である。
【図８Ａ】ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型の塩基配列（配列番号２５）を示す図である。
【図８Ｂ】ムチンＧ４遺伝子第２エクソンのＬ多型における３塩基デリーション型多型の塩基配列（配列番号２５）を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列番号３〜１６、２２、２３、２８〜３７：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0004649575.tif 000020
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0004649575.tif 000024
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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