(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真空槽内を所定の真空度とした後、ダイアモンドライク膜の原料ガスを供給し、さらに、窒素源となる原料ガスを導入し、ＣＶＤ法により基板上にＤＮＡ結合基を有するダイアモンドライク膜を形成してＤＮＡ結合層とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２】
前記ダイアモンドライク膜は、少なくとも炭素、ケイ素、酸素、水素を含有するダイアモンドライクナノコンポジット（ＤＬＮ）膜である請求項１のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３】
前記ダイアモンドライク膜は、少なくとも炭素、水素を含有するダイアモンドライクカーボン（ＤＬＣ）膜である請求項１のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項４】
前記ダイアモンドライク膜の原料ガスは、シリコーンオイルを加熱して得る請求項１または２のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項５】
真空槽内を所定の真空度とした後、アミノ変性シリコーンオイルを気化した原料ガスを供給し、ＣＶＤ法により基板上にＤＮＡ結合基を有するダイアモンドライク膜を形成してＤＮＡ結合層とするＤＮＡチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、遺伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や組織における遺伝子発現の様態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロット）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
【０００３】
一方、遺伝子の研究の進展により解析を必要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００４】
このような要望に対して、最近、マイクロアレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまたはバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検出することである。
【０００５】
上記の方法を用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００６】
ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表面に固定する。
【０００７】
図２は、この従来の方法の原理を説明する図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプローブＤＮＡ２１が入っているマイクロプレート２２を用意する。一方、図２（ｂ）に示すよう、プレート２３としてガラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレート２３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤２４をコーティングする。この後、マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡ２１をピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）２４がコーテイングしてあるガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡ１を接触させてスポットする。マイクロプレート２２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このように、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮＡチップを製造していた。
【０００８】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００９】
このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーティングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残る場合もある。
【００１０】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【００１１】
しかし、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないため、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブリダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があった。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
【００１２】
このような問題を解消すべく、結合材として種々の材料が検討されている。例えばＤＬＣ（ダイアモンドライクカーボン）膜は耐熱性、耐久性等を有し、将来的に有望な材料の一つであるが、ＤＬＣ成膜後に表面の塩素化処理を行い、さらにアンモニアガスによる塩素置換でアミノ化を行っている。
【００１３】
このため、製造工程が複雑になり、最終製品の収率が悪くなると共に、コスト低減を図る上で大きな障害となっていた。特に、近年、ＤＮＡチップの臨床現場での応用に対する要望が高まるなか、広く一般大衆に利用可能な価格で提供することは、国民の健康と医療技術の向上を図る上でも極めて重要である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡単な工程で安価に製造でき、しかも水洗い工程等においてプロ−ブＤＮＡ、サンプルＤＮＡの損失が少なく、ＤＮＡサンプルを有効に活用できるＤＮＡチップの製造方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
すなわち上記目的は、以下の本発明の構成により達成される。
（１）真空槽内を所定の真空度とした後、ダイアモンドライク膜の原料ガスを供給し、さらに、窒素源となる原料ガスを導入し、ＣＶＤ法により基板上にＤＮＡ結合基を有するダイアモンドライク膜を形成してＤＮＡ結合層とするＤＮＡチップの製造方法。
（２）前記ダイアモンドライク膜は、少なくとも炭素、ケイ素、酸素、水素を含有するダイアモンドライクナノコンポジット（ＤＬＮ）膜である上記（１）のＤＮＡチップの製造方法。
（３）前記ダイアモンドライク膜は、少なくとも炭素、水素を含有するダイアモンドライクカーボン（ＤＬＣ）膜である上記（１）のＤＮＡチップの製造方法。
（４）前記ダイアモンドライク膜の原料ガスは、シリコーンオイルを加熱して得る上記（１）または（２）のＤＮＡチップの製造方法。
（５）真空槽内を所定の真空度とした後、アミノ変性シリコーンオイルを加熱し、ＣＶＤ法により基板上にＤＮＡ結合基を有するダイアモンドライク膜を形成してＤＮＡ結合層とするＤＮＡチップの製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡチップの製造方法は、基板上にアミノ基修飾ダイアモンドライク膜を同時形成してＤＮＡ結合基含有層とするものである。
【００１７】
すなわち、真空槽内を所定の真空度とした後、ダイアモンドライク膜の原料ガスを供給し、さらに、窒素源となる原料ガスを導入し、ＣＶＤ法により基板上にＤＮＡ結合基を有するダイアモンドライク膜を形成してＤＮＡ結合層とするものである。また、このとき窒素源をダイアモンドライク膜の原料ガスに含ませていてもよい。
【００１８】
ここで、ダイアモンドライク膜とは、ダイアモンドナノコンポジット（ＤＬＮ）またはダイアモンドライクカーボン（ＤＬＣ）により形成された膜をいう。
【００１９】
ＤＬＣ（Diamond Like Carbon ）膜は、炭化水素を励起し、分解して得た高硬度炭素膜であり、ダイヤモンド様炭素、ｉ−カーボン膜等と称されることもある。ＤＬＣ膜については、例えば、特開昭６２−１４５６４６号、同６２−１４５６４７号、New Diamond Forum 、第４巻第４号（昭和６３年１０月２５日発行）等に記載されている。
【００２０】
また、上記文献（New Diamond Forum ）に記載されているように、ラマン分光分析において、１５５０cm-1にブロードな（１５２０〜１５６０cm-1）ラマン吸収のピークを有し、１３３３cm-1に鋭いピークを有するダイヤモンドや、１５８１cm-1に鋭いピークを有するグラファイトとは、明らかに異なった構造を有する物質である。
【００２１】
ＤＬＮ（Diamond Like Nanocomposite ）は、炭素とケイ素の独立したネットワーク構造が相互貫入した２重構造を有するアモルファス硬質薄膜であり、
ａ（ＣＨx）y ・ａ（ＳｉＯz）w
と表すことができる。また、これに第３成分として金属元素を含有していてもよい。ＤＬＮについては、例えばV.F.Dorfman and B.N.Pypkin,Surface and Coating Technology,48,193(1991)、米国特許第５３５２４９２号等に記載されている。ＤＬＮの構造は、ＳＴＭ，ＡＦＭ、Ｘ線解析、電子線回折、ＴＥＭなどにより確認することができる。例えば、ＦＴＩＲスペクトルにおいて、１０１０cm-1 と、８００cm-1 とにＳｉ−Ｏ結合の存在を示すピークが認められる。
【００２２】
通常、ＤＬＣ、ＤＬＮを結合剤として用いる場合、ＣＶＤ法などによりＤＬＣ、ＤＬＮ膜を成膜した後、これを洗浄し、ＵＶ照射により表面炭素原子を塩素置換する。次に、アンモニアガスの存在下でＵＶ照射を行い、塩素置換して、表面炭素原子に対する共有結合可能なアミノ化を行う。そして、ＤＬＣ，ＤＬＮ表面のアミノ基と、ＤＮＡ断片とをアミド結合させる。
【００２３】
しかし、このような従来の手法により製造されたＤＮＡチップは、上記のように製造効率が悪く、収率が悪く、原料を浪費してしまう。これに対し、本発明の方法により製造されたＤＮＡチップは、薄く、均一な結合剤含有層を形成し、ピンホールの発生もないため、ＤＮＡ断片を良好な状態で結合、坦持することができる。また、ＤＬＣ、ＤＬＮ成膜時に、アミド結合に必要なアミノ基も同時に導入されるため、製造工程も簡略化できる。
【００２４】
特にＤＬＮ膜を用いた場合、基板との接着性が良好で、高い安定性を有し、耐熱性、耐光性、機械的強度に優れている。従って、繰り返しの使用にも十分に耐え、ＤＮＡチップを有効に効率よく利用することができる。
【００２５】
ダイアモンド膜の原料としては、ＤＬＣ膜を製造するのであれば、炭素源、水素源となる原料ガスを供給する。また、ＤＬＮ膜を製造する場合には、炭素源、ケイ素源、酸素源、水素源となる原料ガスを供給する。
【００２６】
炭素源としては、ＣＯ、ＣＯ2 、ＣＨ3 、Ｃ2Ｈ5 等が、ケイ素源としては、シラン、メチルシラン等が、酸素源としてはＯ2 等が、水素源としてはＨ2 等が挙げられ、これらの材料を混合して用いてもよいし、１種で複数の材料源とすることもできる。
【００２７】
これらの原料ガスは、用いる材料、成膜する膜の種類に応じて適宜必要とされる量を供給すればよい。
【００２８】
本発明では特に、ＤＬＮ膜を成膜する際にシリコーンオイルを用いるとよい。原料として用いるシリコーンオイルは、オルガノシロキサンであって、ＤＬＮのケイ素源、炭素源、酸素源、水素源となり、一つの材料で容易にＤＬＮの構成元素をバランスよく供給することができる。シリコーンオイルは加熱することにより気化し、原料ガスとなる。
【００２９】
具体的には、ジメチルシリコーン、ジアルキルポリシロキサン、ジアルコキシポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、フルオロアルキルポリシロキサン、アミノ変性シリコーンオイル等を用いることができ、特にジメチルシリコーンが好ましい。シリコーンオイルは、例えば信越化学社製ＫＦ９６、ＫＦ６９等として市販され、入手することができる。
【００３０】
原料となるシリコーンオイルは、所定の容器に入れられ真空槽内に配置される。シリコーンオイルの容器としては、シリコーンオイルとの反応性が低く、所定の加熱温度に耐えうる材料であれば特に限定されるものではない。具体的には、通常、真空蒸着の蒸発源として用いられているような材料（白金、ＰＢＮ等）、容器（蒸着ボート、るつぼ等）を用いることができる。
【００３１】
原料であるシリコーンオイルの加熱温度としては、真空槽内で気化可能な温度であればよく、具体的には２００〜６００℃、好ましくは３００〜４００℃程度である。
【００３２】
真空槽内の真空度としては、好ましくは１０-3 Torr以下、特に１０-4 Torr以下が好ましい。
【００３３】
ＤＬＣ,ＤＬＮにアミノ基を導入するための原料ガスとしては、Ｎ2 、ＮＨ3 等を挙げることができる。これらの原料ガスの流量としては、１〜１００SCCM、特に１〜５０SCCM程度である。さらにこの原料ガスに加えてＨ2 、ＣＨ4 等のガスを導入してもよい。
【００３４】
さらに、窒素源を含有するシリコーンオイルを用いる場合には、上記原料ガスは供給しなくてもよい。このような窒素源を含有するシリコーンオイルとしては、アミノ変性シリコーンオイル等を挙げることができる。
【００３５】
真空槽内に原料を導入し、ＣＶＤ法によりＤＬＣ,ＤＬＮ膜を成膜する。ＣＶＤ法としては、自己バイアスを含むバイアス印加プラズマＣＶＤ法が好ましい。ＣＶＤ法では高周波電源を用いることが好ましく、高周波電力としては５０w〜２kw程度である。また、通常、バイアス電圧は−５０V〜−５kV、全圧は０．０２〜０．２Torr、反応時間は１０〜１２０分、電極間距離は例えば４cm程度、全ガス流量は０．２〜１００SCCMであり、基板温度は１０〜３００℃である。
【００３６】
なお、真空槽の基板上にはＤＬＣ,ＤＬＮ膜を形成するためのガラス基板が配置され、この基板上に所定の距離を離間させて対極が配置される。
【００３７】
得られたアミノ修飾ＤＬＣ,ＤＬＮ膜（ＤＮＡ結合剤含有層）は、蒸留水等により洗浄して用いるとよい。
【００３８】
本発明で得られたＤＮＡ結合剤含有層を有するＤＮＡチップは、プローブＤＮＡとの結合が良好であり、水洗い工程等においてもＤＮＡが剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用することができる。また、耐熱性、耐候性、機械強度に優れるため、繰り返し使用することも可能である。
【００３９】
基板の材質は、透明なガラス、シリコンまたはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による解析の容易さによるものである。シリカ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００４０】
プローブとなるＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００４１】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
【００４２】
点着されるＤＮＡ断片は、基板表面に対して、１０2 〜１０5 種類／ｃｍ2 の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15 モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。
【００４３】
点着後は、必要に応じてインキュベーションを行うことが好ましい。インキュベート後、点着されなかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４４】
前記記載の基板表面上のドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００４５】
上記のようにして作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸とのハイブリダーゼーションである。
【００４６】
サンプルである標的核酸としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
【００４７】
標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００４８】
標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好ましい。
【００４９】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００５１】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないことである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００５２】
【実施例】
［実施例１］
図１に示すような装置を用い、真空槽３１内の基板３３上に、ガラス基板３４を配置し、基板３３上に配置されたガラス基板３４上にアミノ修飾ＤＬＮ膜を膜厚：０．３μm に成膜した。このとき、所定の真空度を維持するように排気しつつ、原料ガスを導入し、交流電源３５から基板３３、対電極３２間にセルフバイアスにてＲＦ電力を印加し、プラズマ３６を形成した。このときの条件としては、
シリコーンオイル：ジメチルシリコーンオイル、信越化学社製、商品名ＫＦ９６ＳＳ
加熱温度：３５０℃
槽内真空度：１０-4 Torr
原料ガス：Ｎ2
原料ガス流量：５SCCM
印加電力：ＲＦ５００Ｗ
であった。
【００５３】
この後、図２（a）−(c）に示すように、マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡ２１をピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。マイクロプレート２２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造した。
【００５４】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００５５】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流し、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡを排出した。
【００５６】
このとき、基板上に結合しているプローブＤＮＡはほとんど剥がれ落ちることなく残留し、水洗工程でＤＮＡが剥がれ落ちないことが確認できた。
【００５７】
その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行った。
【００５８】
その結果、目的とするハイブリダイゼーションが的確に行われることが確認できた。また、基板上に結合しているプローブＤＮＡはほとんど剥がれ落ちることなく残留し、水洗工程でＤＮＡが剥がれ落ちないことが確認できた。
【００５９】
さらに、本発明の方法によれば、アミノ修飾工程が不要となり、少なくとも工程数が２つ減り、製造コストの削減に極めて有効であることがわかった。
【００６０】
［実施例２］
実施例１において、シリコーンオイルとしてアミノ変性シリコーンオイルを用い、原料ガスを導入しない以外は実施例１と同様にしてアミノ変性ＤＬＮ膜を形成し、ＤＮＡチップとして評価した。その結果、実施例１とほぼ同様の結果が得られることが確認できた。
【００６１】
［実施例３］
実施例１において、ＤＬＮ膜を成膜する代わりにＤＬＣ膜を成膜した。このときの条件としては、
原料ガス：エチレン
流量：１〜４SCCM
原料ガス：Ｎ2
流量：５SCCM
槽内真空度：１０-4 Torr
印加電力：ＲＦ５００Ｗ
であった。
【００６２】
上記以外は実施例１と同様にしてＤＮＡチップを得、評価した。その結果、原料ガスの調整が必要なものの、実施例１とほぼ同様の効果が得られることがわかった。
【００６３】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、簡単な工程で安価に製造でき、しかも水洗い工程等においてプロ−ブＤＮＡ、サンプルＤＮＡの損失が少なく、ＤＮＡサンプルを有効に活用できるＤＮＡチップの製造方法、およびこの方法により製造されたＤＮＡチップを提供することである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤＮＡチップの製造装置を示す概略図である。
【図２】ＤＮＡチップの製造工程を示す概略斜視図である。
【符号の説明】
３１    真空槽
３２    対電極
３３    基板
３４    ガラス基板
【図１】
0004772211.tif 000002
【図２】
0004772211.tif 000003