(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３または５に示されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号：４または６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項３】
下記のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子：
ａ）配列番号：３または５のヌクレオチド配列と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列；および
ｂ）配列番号：４または６のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子ならびに異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
下記のものからなる群より選択される単離ポリペプチド：
ａ）配列番号：３または５のヌクレオチド配列のコーディング領域を含む核酸分子に対して少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチド；および
ｂ）配列番号：４または６のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：４または６のアミノ酸配列を含む請求項７記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
さらに異種アミノ酸配列を含む請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
異種アミノ酸配列が免疫グロブリン分子に由来するものである請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号：６のアミノ酸２１〜２４７を含むＧＬ５０分子の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｉｇ融合ポリペプチドである請求項１１記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項７記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１３記載の抗体を含む、免疫応答をモジュレーションするための医薬組成物。
【請求項１５】
Ｂ７−１またはＢ７−２分子に結合する少なくとも１種の抗体をさらに含む、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項７記載の単離ポリペプチドを含む、Ｔ細胞共刺激をモジュレーションするための医薬組成物。
【請求項１７】
試料中の請求項７記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、
ａ）該ポリペプチドに選択的に結合する抗体に試料を接触させ、次いで、
ｂ）該抗体が試料中の該ポリペプチドに結合するかどうかを調べて、そのことにより試料中の該ポリペプチドの存在を検出する
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
配列番号：６のアミノ酸２１〜２４７を含むＧＬ５０分子の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
Ｔ細胞が外来蛋白に対して応答するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって２つのシグナルが休止中のＴリンパ球に与えられなくてはならない（Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D. L., et al. (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709）。第１のシグナルは免疫応答に特異性を付与するものであり、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって提示された外来抗原性ペプチドの認識後にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第２のシグナルは共刺激（costimulation）と呼ばれるものであり、Ｔ細胞が増殖し、機能的になるように誘導する（Lenschow et al. 1996. Annu. Rev. Immunol. 14: 233）。共刺激は抗原特異的でもなく、ＭＨＣにより制限されてもおらず、ＡＰＣにより発現される１またはそれ以上の別個の細胞表面分子によって提供されると考えられている（Jenkins, M.K., et al. 1988 J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; Young, J.W., et al. 1992 J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L., et al. 1991 J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H., et al. 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 271-275; van-Seventer, G.A., et al. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M., et al., 1991 J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M.I., et al., 1989 J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J., et al. 1992 Nature 357, 80-82; Liu, Y., et al. 1992 J. Exp. Med. 175, 437-445）。
ＡＰＣｓ上に発現されるＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）蛋白は重要な共刺激分子である（Freeman et al. 1991.  J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. 1989 J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. 1993 Nature 366:76; Freeman et al. 1993. Science 262:909）。Ｂ７−２は一次免疫応答の間に重要な役割を果たすように思われ、Ｂ７−１は免疫応答の後半になってアップレギュレートされ、一次Ｔ細胞応答の延長または二次Ｔ細胞応答の共刺激において重要であるかもしれない（Bluestone. 1995. Immunology. 2:555）。
【０００２】
Ｂ７−１およびＢ７−２が結合する１のリガンドであるＣＤ２８は休止Ｔ細胞上に構成的に発現され、活性化後に発現が増大する。Ｔ細胞受容体を介するシグナリング後に、ＣＤ２８のライゲーションおよび共刺激シグナルのトランスダクションによりＴ細胞増殖が誘導され、ＩＬ−２が分泌される（Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; June, C. H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609）。ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と呼ばれる第二のリガンドはＣＤ２８と相同的であるが、休止Ｔ細胞上には発現されず、Ｔ細胞活性化後にのみ出現する（Brunet, J. F. et al. (1987) Nature 328:267-270).  CTLA4 appears to be critical in negative regulation of T cell responses (Waterhouse et al. (1995) Science 270:985）。ＣＴＬＡ４の遮断（Block）ブロックは阻害的シグナルを除去することが見出されたが、ＣＴＬＡ４の凝集は、Ｔ細胞応答をダウンレギュレーションする阻害的シグナルを提供することが見出された（Allison and Krummel (1995) Science 270:932）。Ｂ７分子はＣＤ２８に対するよりもＣＴＬＡ４に対して高いアフィニティーを有し（Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569）、Ｂ７−１およびＢ７−２はＣＴＬＡ４分子の別々の部分に結合し、ＣＴＬＡ４への結合に関して異なったキネティクスを有することが見出された（Linsley et al. (1994) Immunity 1:793）。
【０００３】
過去において、Ｂ７共刺激ファミリーのさらなるメンバーの存在についての報告が議論の的となった。Ｂ７−１またはＢ７−２陽性細胞のいずれよりも大きな細胞のサブセットを認識すると思われる抗体ＢＢ−１は、別のＢ７−ファミリーのメンバーであるＢ７−３の存在についての議論を引き起こした。Ｂ７−３の同定は、一部には、ＢＢ−１抗体を用いるＴ細胞受容体不変鎖の発現クローニングにより解決されると考えられた。不変鎖（invariant chain）はＢ７ファミリーに関連していないが、この分子はＴ細胞増殖アッセイにより評価した場合、共刺激を少し容易にした。
ごく最近になって、ＣＤ２８（２４％）およびＣＴＬＡ４（１７％）に対して配列同一性を有するＩＣＯＳと呼ばれる新規表面受容体が記載された（Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216）。ＣＤ２８とは異なり、ＩＣＯＳは刺激されたＴ細胞上でアップレギュレーションされ、ＣＤ２８共刺激により媒介されるサイトカインとは異なる一群のサイトカインの分泌を引き起こした（Hutloff et al. (1999) Nature 397:263）。
【０００４】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性がin vitroにおいて示されており、さらにin vivoモデル系においても示されている。この共刺激経路をブロックすることは、ネズミおよびヒトの系において抗原特異的耐性の発生を引き起こす（Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609; Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257:789-792; Turka, L. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105; Gimmi, C. D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586-6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1753-1763）。逆に、Ｂ７陰性ネズミ腫瘍細胞によるＢ７の発現により、Ｔ細胞により媒介される腫瘍拒絶を伴った特異的な免疫ならびに長期間持続する腫瘍攻撃に対する防御が誘導される（Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102; Townsend, S. E. and Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5687-5690）。それゆえ、共刺激経路を操作することにより、ヒトにおいて免疫応答を刺激または抑制する大きな潜在能力が得られる。
【０００５】
発明の概要
本発明は、少なくとも一部には、本明細書においてＧＬ５０分子と呼ばれる新規核酸分子およびかかる核酸によりコードされるポリペプチドの発見に基づくものである。好ましいＧＬ５０分子はプロフェッショナルな抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハン細胞）および他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）の表面上の抗原を包含し、Ｔ細胞増殖を共刺激し、Ｔ細胞上の共刺激受容体（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、および／またはＩＣＯＳ）に結合し、そして／あるいはＢ７ファミリーのメンバー、例えば、抗−ＧＬ５０抗体を認識する抗体により結合される。
本発明のＧＬ５０核酸およびポリペプチド分子は、例えば、免疫応答のモジュレーションにおいて有用である。したがって、１の態様において、本発明は、ＧＬ５０ポリペプチドをコードする単離核酸分子ならびにＧｌ５０をコードする核酸の検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適当な核酸フラグメントを提供する。
【０００６】
１の具体例において、本発明のＧＬ５０核酸分子は、配列番号：１、３または５あるいはそれらの組み合わせを含むヌクレオチド配列に対して（例えば、ヌクレオチド配列の全長に対して）少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の同一性を有する。
好ましい具体例において、単離核酸分子は配列番号：１、３または５あるいはそれらの組み合わせで示されるヌクレオチド配列を含む。もう１つの好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子はＧＬ５０ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。
本発明のもう１つの具体例は、非ＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子と対比してＧＬ５０核酸分子を特異的に検出する核酸分子、好ましくはＧＬ５０核酸分子に関するものである。例えば、１の具体例において、かかる核酸は少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０または８００ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号：１、３または５、あるいはそれらの組み合わせで示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイゼーションする。
他の好ましい具体例において、本発明の核酸分子はヒトＧＬ５０ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種をコードし、その核酸分子は配列番号：１、３または５、あるいはそれらの組み合わせを含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。
本発明のもう１つの具体例は、ＧＬ５０核酸分子、例えばＧＬ５０核酸分子ののコーディング鎖に対してアンチセンスである単離核酸分子を提供する。
【０００７】
本発明のもう１つの態様は、ＧＬ５０核酸分子を含むベクターを提供する。ある具体例において、ベクターは組み換え発現ベクターである。もう１つの具体例において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、組み換え発現ベクターを含む本発明の宿主細胞、例えば非ヒト哺乳動物細胞のごとき哺乳動物宿主細胞を適当な培地中で培養してポリペプチドを得ることによるポリペプチド、好ましくはＧＬ５０ポリペプチドの製造方法も提供する。
【０００８】
本発明のもう１つの態様は単離または組み換えＧＬ５０ポリペプチドおよび蛋白に関する。
１の具体例において、単離ポリペプチドはヒトＧＬ５０ポリペプチドである。
さらにもう１つの具体例において、単離ＧＬ５０ポリペプチドは可溶性ＧＬ５０ポリペプチドである。
さらなる具体例において、単離ＧＬ５０ポリペプチドは細胞表面上に発現され、例えば、膜貫通ドメインを有するものである。
さらなる具体例において、単離ＧＬ５０ポリペプチドは、活性化Ｔ細胞のサイトカイン分泌および／または増殖を共刺激することにおいて役割を果たす。もう１つの具体例において、単離ＧＬ５０ポリペプチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイゼーションする核酸分子によりコードされる。
【０００９】
本発明のもう１つの具体例は単離ポリペプチド、好ましくはＧＬ５０ポリペプチドであり、配列番号：１、３または５またはそれらの組み合わせを含むヌクレオチド配列に対して（例えば、ヌクレオチド配列の全長に対して）少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
本発明のもう１つの具体例は単離ポリペプチド、好ましくはＧＬ５０ポリペプチドであり、配列番号：２、４または６を含むアミノ酸配列に対して（例えば、アミノ酸配列の全長に対して）少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
さらに本発明は、配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列あるいはそれらの組み合わせを含む核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされるＧＬ５０ポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドは非ＧＬ５０ポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）に作動可能に連結されて融合蛋白を形成することができる。さらに本発明は、本発明のポリペプチド、好ましくはＧＬ５０ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のごとき抗体に関する。さらに、ＧＬ５０ポリペプチド、例えば、生物学的に活性のあるポリペプチドを、医薬上許容される担体を含んでいてもよい医薬組成物中に含ませることもできる。
【００１０】
もう１つの具体例において、本発明は、ＧＬ５０核酸分子またはポリペプチドを検出しうる作用剤に生物学的試料を接触させて、生物学的試料中のＧＬ５０核酸分子またはポリペプチドの存在を検出することによる、生物学的試料中のＧＬ５０核酸分子またはポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。
【００１１】
もう１つの態様において、本発明は、ＧＬ５０ポリペプチド活性のインジケーターを検出しうる作用剤に生物学的試料を接触させて、生物学的試料中のＧＬ５０ポリペプチド活性の存在を検出することによる、生物学的試料中のＧＬ５０活性の存在を検出する方法を提供する。
【００１２】
ＧＬ５０ポリペプチドを発現しうる細胞をＧＬ５０活性をモジュレーションする作用剤と接触させて、細胞中のＧＬ５０活性をモジュレーションすることを特徴とする、ＧＬ５０ポリペプチド活性をモジュレーションする方法を提供する。もう１つの具体例において、作用剤はＧＬ５０活性を刺激する。１の具体例において、作用剤は、好ましくはＧＬ５０ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。もう１つの具体例において、作用剤は、ＧＬ５０遺伝子の転写またはＧＬ５０  ｍＲＮＡの翻訳をモジュレーションすることによりＧＬ５０の発現をモジュレーションする。さらにもう１つの具体例において、作用剤は、ＧＬ５０  ｍＲＮＡまたはＧＬ５０遺伝子のコーディング鎖に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【００１３】
１の具体例において、本発明の方法を用いて、ＧＬ５０のモジュレーターである作用剤を対象に投与することにより、ＧＬ５０分子をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションいずれかのモジュレーションにより利益を受けるであろう疾病（異常なＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の発現または活性により特徴づけられる）または症状を有する対象を治療する。１の具体例において、ＧＬ５０モジュレーターはＧＬ５０ポリペプチドである。もう１つの具体例において、ＧＬ５０モジュレーターはＧＬ５０核酸分子である。もう１つの具体例において、ＧＬ５０モジュレーターは、ＧＬ５０ＧＬとＧＬ５０のリガンドとの間の相互作用をモジュレーションする分子、あるいはＧＬ５０の細胞内ドメインと相互作用する分子である。さらにもう１つの具体例において、ＧＬ５０モジュレーターはペプチド、ペプチド模倣物、または他の小型分子である。好ましい具体例において、異常なＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の発現により特徴付けられる疾病は、ＧＬ５０活性のモジュレーションにより利益を受けるであろう免疫系の疾病または症状である。
【００１４】
また本発明は、（ｉ）ＧＬ５０ポリペプチドをコードする遺伝子の異常な修飾または変異；（ｉｉ）遺伝子の誤調節；（ｉｉｉ）ＧＬ５０ポリペプチドの異常な翻訳後修飾のうち少なくとも１つにより特徴づけられる遺伝学的変化の存在または不存在を同定するための診断アッセイを提供し、野生型遺伝子はＧＬ５０活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【００１５】
もう１つの態様において、本発明は、ＧＬ５０ポリペプチドに結合し、あるいはその活性をモジュレーションする化合物を同定する方法を提供する。該方法は、ＧＬ５０活性を有するＧＬ５０ポリペプチドを含むインジケーター組成物を用意し、インジケーター組成物を試験化合物と接触させ、次いで、インジケーター組成物中のＧＬ５０活性に対する試験化合物の影響を調べて、ＧＬ５０ポリペプチドの活性をモジュレーションする化合物を同定することを特徴とする。
【００１６】
もう１つの態様において、本発明は、ＧＬ５０メンバーのポリペプチドをコードする導入遺伝子を担持している細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００１７】
１の具体例において、本発明は、刺激性の形態のＧＬ５０分子を癌にかかっている対象に投与することを特徴とする癌の治療方法を提供する。好ましい具体例において、刺激性形態のＧＬ５０分子は可溶性形態のＧＬ５０であり、共刺激分子の細胞外ドメインを含む。１の具体例において、共刺激分子は一特異的（monospecific）である。１の具体例において、共刺激分子は二量体である。１の具体例にいおて、共刺激分子は２価である。
【００１８】
もう１つの好ましい具体例において、免疫グロブリン分子の一部分（例えば、システイン残基を含む免疫グロブリン分子の一部分；ヒト免疫グロブリン分子のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン分子の一部分；あるいはヒト免疫グロブリン分子のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む免疫グロブリン分子の一部分）を含む第２の蛋白またはポリペプチドに共刺激分子を融合させる。さらにもう１つの具体例において、免疫グロブリン分子の部分は修飾されて補体固定および／またはＦｃ受容体結合を減じるようになっている。
【００１９】
さらにもう１つの態様において、本発明は、免疫細胞を活性化形態のＧＬ５０分子と接触させて、腫瘍細胞に対する免疫応答を促進させ、腫瘍細胞の増殖を減少させることを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を減少させる方法に関する。
１の具体例において、活性化形態のＧＬ５０分子はＧＬ５０の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドである。
もう１つの具体例において、活性化形態のＧＬ５０分子はＧＬ５０の細胞外ドメインを含む細胞結合ポリペプチドである。
【００２０】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＧＬ５０ポリペプチドドメインを含むポリペプチドを試験化合物およびＧＬ５０結合パートナーと接触させ、次いで、（ｉｉ）ポリペプチドとＧＬ５０結合パートナーとの相互作用をモジュレーションする化合物を同定して、ＧＬ５０により媒介される免疫細胞の活性化をモジュレーションする化合物を同定することを特徴とする、ＧＬ５０により媒介される免疫細胞の活性化をモジュレーションする化合物をスクリーニングする方法に関する。
１の具体例において、ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、および細胞外ドメインからなる群より選択されるＧＬ５０ドメインを含む。
１の具体例において、ドメインはＧＬ５０細胞質ドメインのスプライス変種である。
１の具体例において、ＧＬ５０ポリペプチドドメインは少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００２１】
１の態様において、本発明は、ＧＬ５０分子を発現する免疫細胞を試験化合物に接触させ、次いで、ＧＬ５０を介するシグナルトランスダクションをモジュレーションする試験化合物の能力を調べ、そのことにより免疫細胞におけるシグナルをモジュレーションする化合物を同定することを特徴とする、免疫細胞におけるシグナルトランスダクションをモジュレーションする化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００２２】
発明の詳細な説明
すでに特徴づけられているＢリンパ球活性化抗原、例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２のほかに、Ｔ細胞を共刺激する他の抗原が抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハン細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）の表面上に存在する。
本発明は、少なくとも一部には、本明細書においてＧＬ５０ポリペプチドと呼ばれる新規分子の発見に基づく。ネズミＧＬ５０−１（ｍＧＬ５０−１）はＩＬ−１２活性化マウスリンパ節ライブラリーから単離された。ｍＧＬ５０−１のヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。完全長マウスｍＧＬ５０−１から派生したポリペプチド配列を配列番号：２に示す。配列はマウスＢ７−１およびマウスＢ７−２に対して約２０％の配列同一性を示す。ｍＧＬ５０−１は、リーダー配列、細胞外Ｉｇ様ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、および１個のチロシン残基を含む細胞内ドメインを含む３２２個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする。
【００２３】
マウス末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ＲＮＡを用いる３’ＲＡＣＥ ＰＣＲにより、マウスＧＬ５０の別スプライス形態（ｍＧＬ５０−２）が明らかとなった。ネズミＧＬ５０−２（ｍＧＬ５０−２）のヌクレオチド配列を配列番号：３に示す。ヌクレオチド配列は２７個の種々のアミノ酸からなる細胞内ドメインを有するポリペプチドをコードし、該ポリペプチドはさらに３個のチロシン、コンセンサスポリアデニル化シグナルを有する３’非翻訳領域、およびポリＡテイルを含んでおり、配列番号：４に示される。ｍＧＬ５０−１およびｍＧＬ５０−２の転写物はＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析により見出され、複数の組織パネルのリンパ器官に優先的に局在化していた。同定されたネズミＧＬ５０配列は、すでに報告されているヒト脳ｃＤＮＡクローン、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＢ０１４５５３と関係があることがわかった。
【００２４】
ヒトＰＢＬ ｃＤＮＡの３’ＲＡＣＥを行って、ネズミＧＬ５０と関係あるヒトクローンを同定した。別の３’配列をコードするクローンが同定された。得られたヒトＧＬ５０（ｈＧＬ５０［ＡＢ０１４５５３−ＲＡＣＥ］）クローンのヌクレオチド配列を配列番号：５に示す。ヌクレオチド配列は３０９個のアミノ酸からなる蛋白をコードし、それはｍＧＬ５０−１に対して約２６％のアミノ酸配列同一性を有し、ｍＧＬ５０−２に対して２８％のアミノ酸配列同一性を有し、ヒトＢ７−１に対して約１３％のアミノ酸配列同一性を有し、ヒトおよびマウスのＢ７−２に対して約１３％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２５】
ネズミＧＬ５０−１Ｉｇ融合蛋白を試薬としてを用いるフローサイトメトリーアッセイにより、マウスＩＣＯＳを発現するＣＯＳトランスフェクション体への結合が示されたが、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を発現する細胞への結合は示されなかった。これらの結果は、ＧＬ５０分子が分子のＢ７ファミリーの新規メンバーであることを確認するものである。
【００２６】
ＧＬ５０核酸およびポリペプチド分子
１の具体例において、本発明の単離核酸分子は真核性ＧＬ５０ポリペプチドをコードする。
分子のＧＬ５０ファミリーは、シグナルドメイン、ＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインを包含する多くの保存された領域を共有している。例えば、ｍＧＬ５０−１（配列番号：１）の場合には、２７１８個のコンセンサスヌクレオチドからなるｍＧＬ５０−１配列は、推定分子量３６ｋＤａを有する３２２個のアミノ酸からなる蛋白をコードする。オープンリーディングフレームのハイドロパシープロットにより、リーダー配列に対応する構造（ヌクレオチドほぼ６７から１９５までによりコードされる）、細胞外ドメイン（ヌクレオチドほぼ１９６から９０４によりコードされる）、疎水性膜貫通領域（ヌクレオチドほぼ９０５から９６１によりコードされる）および潜在的な細胞内細胞質ドメイン（ヌクレオチドほぼ９６２から１０３２までによりコードされる）が推定された。シグナルペプチドの開裂はアミノ酸配列中の位置４６において推定される。１の具体例において、ＧＬ５０ポリペプチドの細胞外ドメインは、シグナル配列の開裂後にはＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含むが、ＧＬ５０ポリペプチドの膜貫通および細胞質ドメイン（例えば、図１６に示すＧＬ５０−１のアミノ酸ほぼ４７から２７７までのアミノ酸配列またはｈＧＬ５０のアミノ酸ほぼ２２からほぼ２７８までのアミノ酸配列に対応）は含まない。
【００２７】
ｍＧＬ５０−１アミノ酸配列の分析により、蛋白の細胞質ドメイン中のＩｇドメインに対する類似性が示唆された。Ｉｇ様構造に関しては、４個のシステインが細胞外ドメイン中に見られ、分子内結合ならびにＩｇＶ様ドメインおよびＩｇＣ様ドメインに対応する異なった構造コンホーメーションが可能となっている。これらの領域は両方ともＩｇスーパーファミリーのメンバーのドメインであり、当該分野において認識されている。これらのドメインは、Ｉｇフォールドとして知られる特徴的なフォールディングパターンを有する構造ユニットに対応している。Ｉｇフォールドは２枚のβシートのサンドイッチからなり、各々は５ないし１０個のアミノ酸の逆平行ベータ鎖からなっており、すべてではないが大部分のドメインにおいて２枚のシート間に保存されたジスルフィド結合がある。Ｉｇ、ＴＣＲ、およびＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは同じタイプの配列パターンを共有し、ＩｇスーパーファミリーのＣ１−セットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは他のセットに含まれる。ＩｇＶドメインもまた配列パターンを共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインはＣ−ドメインよりも長く、さらなるβ鎖のペアーを形成する。
【００２８】
ｍＧＬ５０−２、ｍＧＬ５０−１、ｈＧＬ５０、およびニワトリＹ０８８２３分子を図１６に示す。各分子はシグナルペプチド、ＩｇＶ様ドメイン、ＩｇＣ様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ｍＧＬ５０−１中のドメインに対応するｍＧＬ５０−２、ｈＧＬ５０、およびＹ０８８２３のドメインを図１６に示す。
【００２９】
ＧＬ５０ポリペプチド、公表されたＡＢ０１４５５３配列、ならびにヒトおよびマウスのＢ７−１およびＢ７−２配列の並置比較を、Geneworks蛋白並置比較プログラムを用いて、パラメータを以下のようにセットして行った：ギャップをオープンにするためのコスト＝５、ギャップを長くするためのコスト＝５、最小対角線長さ＝４、最大対角線オフセット＝１３０、コンセンサスカットオフ＝５０％、ならびにPam 250マトリックスの使用。並置比較の結果を下表１に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
表１は、ｈＧＬ５０ポリペプチドが、ＡＢ０１４５５３によりコードされるポリペプチドに対して約５０％、ｍＧＬ５０−１およびｍＧＬ５０−２に対して約４０％のアミノ酸配列同一性を有することを示す。ｍＧＬ５０−１およびｍ５０−２は高度のアミノ酸配列同一性、すなわち９２％の同一性を有する。ＧＬ５０ポリペプチドは、他のＢ７ファミリーの分子に対して約２０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３２】
さらなる並置比較を行って、ネズミＧＬ５０、ｈＧＬ５０、ヒトＢ７−１、マウスＢ７−１、マウスＢ７−２、およびヒトＢ７−２蛋白配列の間の関連性の程度を決定した。PileUp分析を用いて（図１２）、６種のすべての分子の細胞外ドメイン中に１８のアミノ酸位置が同じように並置された。Ｂ７分子の推定ＩｇＶ様およびＩｇＣ様フォールドを画定する３２の位置のうち、６種すべての分子において１３の位置が同じように保存されており、最も著しくは、ドメインの分子内フォールディングを可能にする４個のシステインが保存されている。有意な配列保存がある他の領域も細胞外ドメイン中に見られるが、興味深いことに、Ｂ７−１またはＢ７−２のいずれかとより密接に並置される特定の位置においてＧＬ５０配列の同一性がみられる（同一性スコア８）。例えば、ｍＧＬ５０−１の位置８６に対応するバリン残基はｈＧＬ５０およびＢ７−２配列により共有されているが、Ｂ７−１によっては共有されていない。同様に、マウスｍＧＬ５０−１の位置８７のチロシンはｈＧＬ５０およびＢ７−１中の対応位置において保存されているが、Ｂ７−２においては保存されていない。同一性スコアが８である１６の位置のうち、５つの位置がマウスのｍＧＬ５０−１／ｈＧＬ５０およびＢ７−１により共有されており、４つの位置がマウスｍＧＬ５０−１／ｈＧＬ５０およびＢ７−２間で共有されており、６つの位置がＢ７−１およびＢ７−２間で共有されている。ペプチド構造に基づけば、これらの結果は、ＧＬ５０配列が蛋白のＢ７ファミリーに対して平行な系統発生学的空間を占めていることを示唆するものである。
【００３３】
アミノ酸１００個あたりの置換に関して遺伝学的隔たりを測定する分子系統発生学的分析（GrowTree）により樹形図（図１３）が得られ、マウス／ｈＧＬ５０（８５）、ｍ／ｈＢ７−２（６８）およびｍ／ｈＢ７−１（８８）の独立したクラスタリングが存在した。アウトグループ（outgroup）としてｍｍｕ６７０６５  １（マウスブチロフィリン）を用いた。ニワトリのクローンＹ０８８２３もまた、Ｂ７配列（２１５−３２０）よりもＧｌ５０配列（ほぼ１４０）に対して密接に並置されることがわかり、これらの配列が蛋白の別個のサブファミリーを構成することが示された。ＧＬ５０、Ｂ７−２およびＢ７−１ブランチ間の隔たりは大きく（２１６−２８４）、ヒトおよびげっ歯類の系統の開始点以降、これらの分子の間に多数の置換が生じていることが示唆された。ＧＬ５０核酸分子間の遺伝学的隔たりを下表２に示す。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。
【００３６】
Ｉ．定義
本明細書の用語「免疫細胞」は、造血系起源の細胞であって、免疫応答において役割を果たす細胞を包含する。免疫細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞のごときリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球のごとき骨髄細胞を包含する。
本明細書の用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を包含する。用語「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞も包含する。用語「抗原提示細胞」は、専門的な抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を包含する。
本明細書の用語「免疫応答」は、Ｔ細胞共刺激のモジュレーションにより影響を受ける、Ｔ細胞により媒介されるおよび／またはＢ細胞により媒介される免疫応答を包含する。典型的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、および細胞の細胞毒性を包含する。さらに、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞活性化により間接的に引き起こされる免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を包含する。
本明細書の用語「共刺激受容体」は、共刺激シグナルを免疫細胞、例えばＣＤ２８に伝達する受容体を包含する。本明細書の用語「阻害性受容体」は、免疫細胞（例えば、ＣＴＬＡ４）に負のシグナルを伝達する受容体を包含する。共刺激受容体（ＣＤ２８のごとき）が免疫細胞上に存在しなくても阻害性受容体により変換されるような阻害性シグナルが生じる可能性があり、よって、それは共刺激分子をめぐる阻害性受容体と共刺激受容体との間の競争の単なる関数ではない（Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205）。免疫細胞への阻害性シグナルの伝達は免疫細胞における無応答またはアネルギーまたはプログラムされた細胞死を引き起こす可能性がある。好ましくは、阻害性シグナルの伝達は、アポトーシスを包含しない機構を介して作動するものである。本明細書の用語「アポトーシス」は、当該分野において知られた方法を用いて特徴づけることのできるプログラムされた細胞死を包含する。アポトーシス性細胞死は、例えば、細胞収縮、膜の空胞化および細胞断片化を最大化するクロマチン濃縮によって特徴づけることができる。アポトーシスを受けている細胞は特徴的なパターンのヌクレオソーム間ＤＮＡの開裂も示す。
受容体のタイプの相違のほかに、異なる形態の共刺激分子は活性化または阻害性のいずれかでありうる。例えば、活性化受容体（activating receptor）の場合、例えば、活性化受容体の架橋を生じさせる多価形態の共刺激分子によりシグナルが伝達されうるし、あるいは、例えば、活性化受容体に結合するが活性化シグナルを伝達しない共刺激分子により、例えば、受容体への結合に関して活性化形態の共刺激分子と競合することによりシグナルが阻害されうる（有る種の可溶性形態の共刺激分子は阻害性であり得るが、可溶性分子が刺激性である例もある）。同様に、阻害性受容体に結合する共刺激分子の形態により、シグナルが伝達され得ることもあり（例えば、活性化受容体の架橋を生じさせる多価形態の共刺激分子により）、あるいはシグナルが阻害され得ることもある（例えば、阻害性受容体に結合するが阻害性シグナルを伝達しない形態の共刺激分子により）。本明細書に開示した常套的なスクリーニングアッセイを用いて、種々のモジュレーション剤の効果が容易に示され得る。
活性化された免疫細胞に関する本明細書の用語「共刺激」は、受容体により媒介され、増殖またはエフェクター機能を誘発する第２の非活性化シグナル（non-activating signal）（「共刺激シグナル」という）を提供する共刺激分子の能力を包含する。例えば、共刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞受容体により媒介されるシグナルを受け取ったＴ細胞におけるサイトカイン分泌を引き起こしうる。例えば、活性化受容体（activating receptor）を介して細胞受容体により媒介されるシグナルを受け取った免疫細胞は、本明細書において「活性化された免疫細胞」と呼ばれる。
本明細書の用語「活性化受容体」は、抗原、複合体化抗原（例えば、ＭＨＣ分子の文脈において）に結合する、あるいは抗体に結合する免疫細胞受容体を包含する。かかる活性化受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体、およびＦｃ受容体を包含する。
例えば、Ｔ細胞受容体はＴ細胞上に存在し、ＣＤ３分子に結合する。ＭＨＣ分子の文脈において、抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）Ｔ細胞受容体が刺激される。ＴＣＲを介するＴ細胞活性化は多くの変化、例えば、蛋白リン酸化、膜脂質の変化、イオンフラックス、環状ヌクレオチドの変化、ＲＮＡ転写の変化、蛋白合成の変化、および細胞体積の変化を引き起こす。
本明細書の用語「阻害性シグナル（inhibitory signal）」は、免疫細胞上の分子に対する阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）を介して伝達されるシグナルをいう。かかるシグナルは活性化受容体を介する（ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃ分子を介する）シグナルに拮抗し、例えば、第２のメッセンジャー生成阻害；増殖阻害；免疫細胞におけるエフェクター機能阻害、例えば、食作用低下、抗体産生減少、細胞の細胞毒性低下、免疫細胞のメディエイタ（サイトカイン（例、ＩＬ−２）および／またはアレルギー応答のメディエイタのごとき）産生不能；あるいはアネルギー生起を引き起しうる。
本明細書の用語「アジュバント」は、抗原（例えば、腫瘍−関連抗原）に対する免疫応答を高める作用剤を包含する。アジュバントを共刺激分子と混合して投与して、さらに免疫応答を改善することができる。
本明細書の用語「一重特異的」は、ただ１つの特異性を有する分子を包含し、すなわち、それらの分子はそれらの同族のリガンド、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、またはＩＣＯＳに特異的に結合する。かかる一重特異的な作用剤はさらなる特異性を包含するように処理されておらず、かくして、標的化された様式で他の細胞表面分子に結合しない。本明細書の用語「寡特異的」は、１よりも多い特異性を有する分子を包含し、例えば、それらのリガンド以外の分子の対してさらに特異性を有する分子を包含し、例えば、特異性は、腫瘍関連抗原またはＴ細胞受容体のごとき細胞表面分子に対するものである。本明細書の用語「２価」は、１分子あたりそのリガンドと相互作用するための結合部位を２個有する可溶性共刺激分子を包含する。本明細書の用語「ダイマー」は、ホモダイマーとして、すなわち、例えばジスルフィド結合により結合された２個の同一のサブユニットから構成されるユニットとして存在する。本明細書の用語「多量体」は、２個よりも多いサブユニットを有する可溶性形態を包含する。
もう１つの具体例において、活性化形態のＧＬ５０分子は可溶性ＧＬ５０分子である。本明細書の用語「可溶性」は、例えば、細胞に結合していない共刺激分子を包含する。可溶性共刺激分子は、それらが由来した細胞結合分子の機能を保持しており、例えば、それらはＴ細胞上のそれらの同族のリガンドに結合でき、Ｔ細胞上のＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４分子を介してシグナルトランスダクションをすることができるが、それらは可溶性形態であり、すなわち、膜結合していない。好ましくは、可溶性組成物は共刺激分子の細胞外ドメインを含む。
好ましくは、かかる可溶性形態のＧＬ５０はＧＬ５０分子の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む。本明細書の用語「ＧＬ５０分子の細胞外ドメイン」はＧＬ５０分子の一部を包含し、それはＧＬ５０分子の細胞結合形態において細胞外にある。好ましくは、細胞外ドメインはヒトＧＬ５０分子の細胞外ドメインである。１の具体例において、可溶性共刺激分子はＧＬ５０分子の細胞外ドメインを含み、さらにシグナル配列を含む。
本明細書の用語「無応答」は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインを介する刺激に対する免疫細胞の不反応（refractivity）を包含する。無応答は、例えば、免疫抑制剤に対する曝露または高用量の抗原に対する曝露により生じ得る。本明細書の用語「アネルギー」または「寛容」は、活性化受容体により媒介される刺激に対する屈曲を包含する。一般的には、かかる屈曲は抗原特異的であり、寛容化剤投与を止めた後も持続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギー（無応答に対抗するものとしての）は、例えば、ＩＬ−２のごときサイトカイン産生欠如により特徴づけられる。Ｔ細胞が抗原に曝露され、第２のシグナル（共刺激シグナル）の不存在下において最初のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３により媒介されるシグナル）を受け取った場合にＴ細胞アネルギーが生じる。これらの条件下において、同じ抗原に対する細胞の再曝露は（再曝露が共刺激分子の存在かにて起こる場合であっても）、サイトカイン産生は起こらず、かくして、増殖は起こらない。しかしながら、抗原性Ｔ細胞は無関係な抗原に対する応答を備えており、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とともに培養された場合には増殖する可能性がある。例えば、ＥＬＩＳＡまたはインジケーター細胞系を用いる増殖アッセイにより測定した場合、Ｔリンパ球によるＩＬ−２産生欠損によるＴ細胞アネルギーが観察されうる。あるいはまた、レポーター遺伝子を構築することもできる。例えば、アネルギー性Ｔ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下の異種性プロモーターあるいはエンハンサー中に見出される多量体のＡＰ１配列により誘導されるＩＬ−２遺伝子転写を開始させることができない（Kang et al. (1992) Science 257:1134）。
ＧＬ５０ポリペプチドおよび核酸分子は、保存された構造および機能的特徴を有する分子のファミリーを構成する。用語「ファミリー」は、蛋白および核酸をいう場合には、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書で定義される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列の相同性を有する二種またはそれ以上の蛋白または核酸分子を意味する。かかるファミリーのメンバーは天然に存在するものであってもよく、あるいは天然に存在しないものであってもよく、同じ種由来のものであってもよく、あるいは異なる種由来のものであってもよい。例えば、ファミリーはヒト起源の第１の蛋白ならびにヒト起源の他の異なる蛋白を含んでいてもよく、あるいは非ヒト起源のホモログを含んでいてもよい。またファミリーのメンバーは共通の機能上の特徴を有していてもよい。本明細書に記載のＧＬ５０分子は分子の比較的大きいファミリー、すなわち共刺激分子のＢ７ファミリーのメンバーである。本明細書の用語「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７分子」は、Ｂ７ポリペプチド、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３（抗体ＢＢ−１により認識される）、および／またはＧＬ５０に対する配列相同性を有する共刺激分子を包含する。例えば、上表１に示すように、ヒトＢ７−１とＢ７−２とは約２０％のアミノ酸同一性がある。さらに、分子のＢ７ファミリーは共通の機能、例えば、免疫細胞上のＢ７ファミリーのリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、またはＩＣＯＳのうち１種またはそれ以上のもの）および／またはそれらのリガンドに結合する能力ならびに免疫細胞の共刺激を阻害または誘導する能力を有する。
ＧＬ５０ポリペプチドについての本明細書の用語「活性」は、ＧＬ５０ポリペプチドの構造に固有の活性を包含する。用語「活性」は、活性化されたＴ細胞免疫細胞において共刺激シグナルをモジュレーションし、増殖および／またはサイトカイン分泌を誘導する能力を包含する。さらに用語「活性」は、天然リガンドまたは結合相手に結合するＧＬ５０ポリペプチドの能力を包含する。好ましくは、ＧＬ５０ポリペプチドが結合するリガンドはＩＣＯＳ分子である。本明細書の用語、共刺激分子の「活性化形態」は、共刺激受容体を介してシグナルを伝達する（例えば、受容体が共刺激シグナルを伝達する阻害性受容体である場合には（例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳである場合には）免疫細胞を活性化させるシグナルを、あるいは受容体が負のシグナルを免疫細胞に伝達するものである場合には（例えば、ＣＴＬＡ４である場合には）阻害性シグナルを伝達する）。阻害性形態の共刺激分子は免疫細胞へのシグナル（例えば、共刺激シグナルまたは負のシグナル）の伝達を防止する。
本明細書の用語「腫瘍」は、良性および悪性（癌性）の新生物（例えば、カルシノーマ、肉腫、白血病、およびリンパ腫）を包含する。用語「癌」は、一次悪性腫瘍（例えば、それらの細胞が対象の身体の元の腫瘍部位から他の部位に転移しないもの）ならびに二次悪性腫瘍（例えば、それらの細胞が対象の身体の元の腫瘍部位から別の部位に転移するもの）を包含する。
本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう（例えば、天然蛋白をコードするもの）。
本明細書の用語「アンチセンス」核酸分子は、蛋白をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列、または遺伝子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸分子はセンス核酸分子に水素結合することができる。
本明細書の用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいい、用語「非コーディング配列」はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）をいう。
本明細書の用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸分子を輸送しうる核酸分子をいう。１のタイプのベクターは「プラスミド」であり、さらなるＤＮＡセグメントがその中に連結されうる環状２本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントが該ベクター中のウイルスゲノム中に連結されうる。ある種のベクターは、それが組み込まれた宿主細胞中において自律的複製をすることができる。宿主細胞中に導入された後、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そのことにより宿主ゲノムとともに複製するものもある（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）。そのうえ、ある種のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令しうる。かかるベクターを本発明において「組み換え発現ベクター」あるいは単に「発現ベクター」という。一般的には、組み換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」を混用する。なぜなら、プラスミドは最も通常に使用されるベクターの形態だからである。しかしながら、本発明は、同等の機能を発揮する他の形態のかかるベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトトウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウイルス）を包含するものとする。
本明細書の用語「宿主細胞」は、本発明の組み換え発現ベクターのごとき本発明の核酸分子が導入された細胞をいう。用語「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」は混用される。かかる用語は特定の対象細胞のもならずかかる細胞の子孫もしくは潜在的子孫もいうことを理解すべきである。ある種の修飾は突然変異または環境の影響のいずれによっても連続した世代を生じる可能性があり、実際には、かかる子孫は親細胞と同一ではないが、本明細書の用語の範囲内に包含される。
本明細書の用語「トランスジェニック」動物は、その動物の１またはそれ以上の細胞が「導入遺伝子」を含んでいる非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスをいう。用語「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれたＤＮＡであって、成熟動物のゲノム中に残るものであり、例えば、トランスジェニック動物の１またはそれ以上の細胞タイプまたは組織においてコードする遺伝子産物の発現を指令するものである。
本明細書の用語「相同組み換え動物」は、１のタイプのトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスをいい、該動物においては、内在性遺伝子と動物の発生前に動物細胞（例えば、動物の胚性細胞）に導入された外来性ＤＮＡ分子との間の相同組み換えにより内在性遺伝子が変化している。
本明細書の用語「単離蛋白」は、細胞から単離された場合に、あるいは組み換えＤＮＡ法により製造された場合において、実質的に他の蛋白、細胞性物質および培地を含まない、あるいは化学合成された場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない蛋白をいう。
また、本明細書の用語「抗体」は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体の一部」）を包含する。本明細書の用語「抗原結合部分」は、抗原との特異的な結合を保持する１つまたはそれ以上の抗体のフラグメントをいう（例えば、ＧＬ５０）。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントにより機能できることが示されている。用語抗体の「抗原結合部分」中に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る単価のフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ部でジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂフラグメントから成る二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、これらは組み換え法を使用して、単蛋白鎖として形成可能である合成リンカーにより結合でき、ＶＬおよびＶＨ領域は対になり、単価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている：例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; およびOsbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778参照）を形成できる。また、このような単鎖抗体は、用語、抗体の「抗原結合部分」中に包含されるものとする。完全にＩｇＧ分子または他の異性体をコードする発現ベクターを得るために、特定のｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列のいずれも、ヒト免疫グロブリン不変領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に結合できる。また、ＶＨおよびＶｌは、蛋白化学または組み換えＤＮＡ法のいずれかを使用して、Ｆａｂ、Ｆｖまたは他の免疫グロブリンのフラグメントの精製に使用できる。また、ジアボディー（diabody）のような単鎖抗体の他の形態も包含される。ジアボディーは、二価の二重特異性抗体であり、その中において単ポリペプチド鎖上にＶＨおよびＶＬドメインが発現されているが、非常に短いため同一の鎖上の２つのドメイン間を対にすることができないリンカーを使用して、そのことにより、ドメインに他の鎖の相補的なドメインと対になるように強要し、２つの抗原結合部位を形成させる（例えば、Holliger P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al.(1994) Structure 2: 1121-1123参照）。
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、より大きな免疫付着分子の一部であり、抗体または抗体の一部と１つまたはそれ以上の蛋白またはペプチドとの共有または非共有結合により形成されうる。このような免疫付着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作るストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov, S. M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）および２価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作るシステイン残基、標識ペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体の一部は、完全な抗体各々のパパインおよびペプシン消化のような従来の技術を使用して、完全な抗体から製造できる。さらに、抗体、抗体の一部および免疫付着分子は、本明細書に記載されている標準的な組み換えＤＮＡ法を使用して得ることができる。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル；異種、同種または同系；またはその修飾された形態であってもよく、例えば、ヒト化、キメラ等であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＧＬ５０分子に特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特別なエピトープと免疫反応する可能性のある抗原結合部位のただ１種を含む抗体分子の集団をいい、これに対して、用語「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特別な抗原と作用する可能性のある抗原結合部位の多種を含む抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特別な抗原との単一の結合アフィニティーを示す。
本明細書の用語「ヒト化抗体」は、ヒト細胞により作られるより綿密な擬似抗体に変じられる可変および不変の領域を有する非ヒト細胞により作られる抗体を包含する。例えば、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み入れるために非ヒト抗体アミノ酸配列を変えることによる。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲ中のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為または部位特異性突然変異体あるいはインビボでの体細胞突然変異体により導かれる変異体）を包含する。また、本明細書の用語「ヒト化抗体」は、他の哺乳類の種、例えばマウスの胚芽細胞系列由来のＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体も包含する。
本明細書の用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう（例えば、特異的にＧＬ５０に結合する単離抗体は、ＧＬ５０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
本明細書の用語「結合相手」は、ＧＬ５０ポリペプチドが本来的に結合あるいは相互作用してＧＬ５０活性が発揮される標的分子または分子である（例えば、リガンドまたは細胞内相互作用分子（シグナルトランスダクション経路においてＧＬ５０の上流または下流のいずれかで作用する分子のごとき））。
用語「シグナルトランスダクション」は、細胞膜を介して外部環境から、あるいは細胞中へと物理的または化学的シグナルをプロセッシングすることを包含し、酵素（プロテアーゼ、あるいはリン酸化パターンまたは他の翻訳後修飾を変化させうる他の酵素のごとき）の活性化／不活性化、イオンチャンネルまたは細胞内イオン貯蔵の活性化、グアニンヌクレオチド結合蛋白中間体を介するエフェクター酵素活性化、リン酸イノシトールの生成、アデニルシクラーゼの活性化または不活性化、転写因子および／または活性化の直接的活性化（または阻害）のごといくつかの機構のうち１つまたはそれ以上により起こるものであってもよい。「シグナリング経路」は、細胞中への特定のシグナルの「シグナルトランスダクション」に関与する成分をいう。
【００３７】
遺伝学的コード（下記）により定義されるように、特別な蛋白のアミノ酸配列と蛋白をコードできるヌクレオチド配列間に公知かつ明確な一致がある。同様に、遺伝学的コードにより定義されるように、特別な核酸分子のヌクレオチド配列とその核酸分子によりコードされるアミノ酸配列間に公知かつ明確な一致がある。
【００３８】
【表３】
0004737905.tif 000004
【００３９】
重要でよく知られた遺伝学的コードの特徴はその縮重であり、したがって、蛋白の作成に使用されるアミノ酸のほとんどに、１つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレットを使用できる（上図）。したがって、異なるヌクレオチド配列の多くは、与えられるアミノ酸配列をコードできる。結果として、全ての生物で同様のアミノ酸配列を生じるので（ある種の生物は、他よりも効果的にいくつかの配列に翻訳することができるが）、このようなヌクレオチド配列は、機能的に等価であると見なされる。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体を、特定のヌクレオチド配列で発見できる。このようなメチル化は、三ヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響しない。
上記のことを考慮すると、本明細書のＧＬ５０ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列（またはその一部）は、遺伝学的コードをＤＮＡまたはＲＮＡ分子をアミノ酸配列への翻訳に使用して、ＧＬ５０のアミノ酸配列を誘導することに使用できる。同様に、ＧＬ５０のアミノ酸配列に関して、ＧＬ５０ポリペプチドをコードできる対応するヌクレオチド配列を、遺伝学的コードから推論できる（これはその縮重のため、いずれかの特定のアミノ酸配列に対する複数の核酸配列を生じる）。したがって、また、本明細書のＢ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列の記載および／または開示は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示を包含する。同様に、また、本明細書のＧＬ５０のアミノ酸配列の記載および／または開示は、アミノ酸配列をコードできるすべての可能性あるヌクレオチド配列の記載および／または開示も包含すると見なされるべきである。
【００４０】
ＩＩ．単離核酸分子
本発明の１の態様は、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性の有る部分をコードする単離核酸分子、ならびにＧＬ５０をコードする核酸分子（例えば、ＧＬ５０ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用に十分な核酸フラグメントおよびＧＬ５０核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントに関する。本明細書の用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を包含し、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログ使用して生成する。核酸分子は、一重ストランドまたは二重ストランドであってもよいが、好ましくは二重ストランドＤＮＡである。
「単離」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、用語「単離」は、ゲノムＤＮＡが天然に関連するクロモソームから分離された核酸分子を包含する。好ましくは、「単離」核酸分子は、核酸分子をデリバリーする生体のゲノムＤＮＡ中の本来的に核酸分子に隣接している配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の具体例において、単離Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子は、核酸をデリバリーする細胞のゲノムＤＮＡ中の本来的に核酸分子に隣接している約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組み換え法により製造される場合、他の細胞物質または培地から実質的に離れることができ、または化学合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものであってもよい。しかし、「単離」ＧＬ５０核酸分子は、通常にはゲノムＤＮＡ中のＧＬ５０に隣接しない他のヌクレオチド配列に結合する（例えば、ＧＬ５０ヌクレオチド配列は、ベクター配列に結合できる）。ある種の好ましい具体例において、また、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、他の細胞物質を含まないものであってもよい。しかし、ＧＬ５０核酸分子が、他の細胞物質を含まないことは、「単離された」と見なされることに必要でない（例えば、他の哺乳類ＤＮＡから単離され、細菌細胞に挿入されたＧＬ５０ＤＮＡ分子は、やはり「単離された」とみなされる）。
【００４１】
本発明の核酸分子、例えば配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の技術および本明細書に提供した配列情報を使用して単離できる。例えば、ハイブリッド形成プローブとしての配列番号：１、３または５の核酸配列の全てまたは一部を使用して、標準的なハイブリッド形成およびクローニング法を使用してＧＬ５０核酸分子を分離できる（例えば、Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989記載のように）。
さらに、配列番号：１、３または５のすべてまたは一部を包含する核酸分子は、配列番号：１、３または５の配列の各々に基づいて設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離できる。
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは各々のゲノムＤＮＡを、テンプレートおよび特殊なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して、標準的なＰＣＲ増幅法により、増幅できる。このように増幅された核酸は、適当なベクターにクローン化でき、ＤＮＡ配列分析により特徴付けられる。さらに、ＧＬ５０ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを使用する標準的な合成法により製造できる。
【００４２】
好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１、３または５に示されるヌクレオチド配列を含む。
１の具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１、３または５またはいずれかのヌクレオチド配列の一部に示されるヌクレオチド配列の相補物である核酸分子を包含する。配列番号：１、３または５に示されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号：１、３または５の各々に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的な１つであり、したがって、配列番号：１、３または５の各々に示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成でき、したがって安定なデュプレックス（duplex）を形成できる。
さらにもう１つの好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１、３または５に示されるヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部に対して（例えば、ヌクレオチド配列の全長に対して）、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上で一致するヌクレオチド配列を包含する。
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１、３または５の核酸配列の一部だけを含むことができ、例えば、プローブまたはプライマーをして使用できるフラグメントまたはＧＬ５０ポリペプチドの生物学的部分をコードするフラグメントを含むことができる。ＧＬ５０遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種から得られるＧＬ５０ファミリーのホモログのみならず他のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーメンバーの同定および／またはクローニングに使用するために設計されたプローブまたはプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に好ましいオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、３または５のセンス配列、または配列番号：１、３または５の天然に存する対立遺伝子の変異体または突然変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５または１００個の連続したヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列の領域を含む。典型的な具体例において、本発明の核酸分子は、少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０または８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、配列番号：１、３または５の核酸分子配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
他の具体例において、第２の核酸分子は、配列番号：１、３または５の少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００または１１００個の連続したヌクレオチドを含む。
１の具体例において、例えば、プローブとして使用される本発明の核酸分子は配列番号：１の一部、配列番号：５のヌクレオチドほぼ１−３７０を含まない。
好ましくは、本発明の単離核酸分子は、少なくとも、配列番号：１のコーディング領域（ヌクレオチド６７−１０３２中に示される）または配列番号：３のコーディング領域（ヌクレオチド１−１０４１中に示される）または配列番号：５のコーディング領域（ヌクレオチド２４−９５０中に示される）の一部を含む。もう１つの具体例において、本発明の核酸分子は配列番号：１、３または５のコーディング領域全体を含む。
他の具体例において、本発明の核酸分子は、配列番号：１、３または５の少なくとも約３００、４００、５００、６００、７００、８００または少なくとも約９００個のヌクレオチド、あるいは配列番号：１または３の少なくとも約１０００または１１００個の連続したヌクレオチドに対して、少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびさらにより好ましくは９０％の同一性を有する。
ＧＬ５０ヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一または相同蛋白をコードする転写またはゲノム配列の検出に使用できる。好ましい具体例において、さらに、プローブは付着した標識群を含み、例えば、標識群は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共コファクターであることができる。このようなプローブは、ＧＬ５０ポリペプチドを誤って発現する細胞または組織の同定用の診断試験キットの一部として、被験者から得た細胞の試料中のＧＬ５０をコードする核酸レベルの測定、例えば、ＧＬ５０ ｍＲＮＡレベルの検出、またはゲノムＧＬ５０遺伝子が変化または欠失しているかどうかを決定することにより使用できる。
「ＧＬ５０ポリペプチドの生物学的活性部分」をコードする核酸フラグメントは、ＧＬ５０の生物学的活性（ＧＬ５０ポリペプチドの生物学的活性は本明細書に記載されている）を有し、ＧＬ５０ポリペプチドのコードされた一部を発現し（例えば、インビトロでの組み換え発現により）、ＧＬ５０ポリペプチドのコードされた一部の活性を評価するポリペプチドをコードする配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列の一部を単離することにより調製できる。
【００４４】
遺伝学的コードの縮重のため配列番号：１、３または５と異なっているが、配列番号：１、３または５によりコードされたものと同一のＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子は、本発明に包含される。したがって、他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２、４または６に示されたアミノ酸配列を有する蛋白をコードするヌクレオチド配列を有する。他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、ＧＬ５０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
配列番号：１、３または５に示されたＧＬ５０ヌクレオチド配列に加えて、ＧＬ５０ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）中に存在できることは、当業者により理解されるだろう。このようなＧＬ５０遺伝子のゲノム多型は、天然の対立遺伝子の変異のため集団中の個体に存在できる。本明細書の用語「遺伝子」および「組み換え遺伝子」は、ＧＬ５０ポリペプチド、好ましくは、哺乳類のＧＬ５０ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（open reading frame）を含み、さらに、非コーディング調節配列およびイントロンを含むことができる核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子の変異は、機能的および非機能的なＧＬ５０ポリペプチドの両方を含み、典型的には、ＧＬ５０遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜５％の変異を起こすことができる。天然の対立遺伝子の変異の結果得られ、ＧＬ５０ポリペプチドの機能活性を変化させないＧＬ５０遺伝子中のこのようなヌクレオチドの変異および得られたアミノ酸多型は、本発明の範囲に含まれる。
さらに、他のＧＬ５０ファミリーのメンバーをコードしているが、配列番号：１、３または５のＧＬ５０ファミリー配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明に含まれる。例えば、他のｍＧＬ５０ ｃＤＮＡはｈＧＬ５０のヌクレオチド配列に基づいて同定できる。さらに、異なる種から得られるＧＬ５０ポリペプチドをコードしているが、配列番号：１、３または５のＧＬ５０配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲に含まれる。例えば、ｍＧＬ５０ ｃＤＮＡはネズミのヌクレオチド配列に基づいて同定できる。
【００４５】
本発明のＧＬ５０ ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書に開示されるＧＬ５０核酸に対する相同性に基づいて、標準的なハイブリッド形成法によるハイブリッド形成プローブとして本明細書に開示されるｃＤＮＡまたはその一部を使用して、単離できる。例えば、ＧＬ５０ ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ハイブリッド形成プローブとして配列番号：１、３または５のすべてまたは一部、および標準的なハイブリッド形成法を使用して単離できる（例えば、Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載のように)。さらに、ＧＬ５０遺伝子のすべてまたは一部を含む核酸分子は、配列番号：１、３または５の配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単離できる。例えば、ｍＲＮＡは細胞から単離でき（例えば、The guanidinium-thiocyanate extraction procedure of Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299により）、ｃＤＮＡは逆転写を使用して調製できる（例えば、Moloney MLV reverse transcriptase, available from Gibco/BRL, Bethesda, MD; or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL)。ＰＣＲ増幅用の合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１、３または５に示されたヌクレオチド配列に基づいて設計できる。本発明の核酸分子は、にテンプレートとしてｃＤＮＡ、または代わりゲノムＤＮＡ、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標準的なＰＣＲ増幅法によって増幅できる。そのようにして増幅された核酸は、適当なベクター中にクローン化でき、ＤＮＡ配列分析により特徴付けられる。さらに、ＧＬ５０ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法により、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して調製できる。
もう１つの具体例において、数学的アルゴリズムを用いて、共有されるヌクレオチド配列同一性に基づいて本発明の単離核酸分子を同定することができる。かかるアルゴリズムを後でより詳細に説明する（例えば、セクションＩＩＩ参照）。
【００４６】
もう１つの具体例において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリッド形成する。他の具体例において、核酸分子は、少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００ヌクレオチドの長さである。本明細書の用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成」は、ハイブリッド形成ならびにヌクレオチド配列が、互いに少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％の相同性で、典型的に互いにハイブリッド形成したままでの洗浄のための条件を説明するものである。好ましくは、配列が、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％の相同性で、典型的に、互いにハイブリッド形成したままであるような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知のものであり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1.- 6.3.6.に見ることができる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の好ましく非制限的な例は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリッド形成、ついで、５０〜６５℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳでの１回またはそれ以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下での、配列番号：１、３または５の配列とハイブリッド形成する本発明の単離核酸分子は、天然に存する核酸分子に対応する。
本明細書の用語「天然に存する」核酸分子は、天然に存する（例えば、天然蛋白をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。配列番号：１、３または５に示されるＧＬ５０ヌクレオチド配列に加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の軽微な変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団に存在しうることは当業者により理解されるだろう。ＧＬ５０遺伝子中のこのようなゲノム多型は、天然対立遺伝子の変異により集団中の個体に存在できる。このような天然対立遺伝子の変異は、典型的に、遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜２％の変異を与えることができる。天然対立遺伝子の変異の結果得られ、ＧＬ５０ポリペプチドの機能活性を変化させないＧＬ５０中のこのようなヌクレオチド変異体および得られたアミノ酸多型は、本発明の範囲に含まれる。
集団中に存在できるＧＬ５０の天然に存する対立遺伝子の変異体に加えて、さらに、当業者は、例えば、配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列への突然変異により軽微な変化を導くとこができ、したがって、ＧＬ５０ポリペプチドの機能活性を変えることなく、コードされた蛋白のアミノ酸配列の変化を導くことができることを理解するだろう。例えば、「非必須」なアミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換は、配列番号：１、３または５の配列中で形成できる。「非必須」なアミノ酸残基は、ＧＬ５０分子の機能活性を変えることなしに、ＧＬ５０核酸分子の野生型の配列（例えば、配列番号：１、３または５の配列）から変化させることができる残基である。非必須であり、したがって、置換されやすい代表的な残基は、Ｂ７ファミリーメンバー（またはＧＬ５０ファミリーメンバー）のアミノ酸配列の並置比較を行い、保存されない残基を決定することにより、当業者により同定できる。このような残基は保存されないので、より置換されやすい傾向がある。
【００４７】
したがって、本発明の他の態様は、ＧＬ５０活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含むＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このようなＧＬ５０ポリペプチドは、配列番号：２、４または６から得るアミノ酸配列とは異なっているが、やはり固有のＧＬ５０活性を維持している。ＧＬ５０ポリペプチドの非天然変異体をコードする単離核酸分子は、コードされる蛋白中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるように、配列番号；１、３または５のヌクレオチド配列中に１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することができる。突然変異は、位置特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的な方法により、配列番号：１、３または５中に導入されることができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基で起こる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する方法の１つである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、好ましくは、ＧＬ５０中の非必須なアミノ酸残基は、同様の側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置換される。
あるいは、他の具体例において、突然変異体は、例えば、飽和突然変異誘発により、ＧＬ５０コーディング配列の全てまたは一部と共にランダムに導かれ、得られた突然変異体は、ＤＮＡに結合するおよび／または転写を活性化する能力をスクリーニングでき、機能活性を維持する突然変異体を同定できる。突然変異誘発についで、コードされたＧＬ５０突然変異蛋白は、宿主細胞中に、組み換え法により発現でき、突然変異蛋白の機能活性は、ＧＬ５０活性を評価するための当該分野で利用できる分析を使用して決定できる。
したがって、本発明の他の態様は、活性化に必須でないアミノ酸残基の変化を含むＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本明細書に示すパイル−アップ（pile-up）分析のごとき相同性並置比較を用いて、変化させやすいアミノ酸を選択することができる。例えば、６種すべての分子の細胞外ドメインに関して同じように並置される１８個のアミノ酸の位置は十分に保存されたものであり、それゆえ、変化させにくい。同様に、Ｂ７ファミリーの分子の推定上のＩｇＶ様およびＩｇＣ様フォールドを画定する３２個の位置のうち、１３個の位置は６種すべての分子において同じように保存されており、最も著しくは、ドメインの分子内フォールディングを可能にしている４個のシステインが保存されている。それゆえ、これらのアミノ酸は変化させにくい。細胞外ドメイン中には有意な配列保存がされている他の領域も見られる。例えば、ｍＧＬ５０−１の位置８６に対応するバリン残基はｈＧＬ５０およびＢ７−２により共有されており、変化させにくい。同様に、ｎＧＬ５０−１の位置８７のチロシンはｈＧＬ５０およびＢ７−１中の対応位置において保存されている。同一性スコア８を有する１６個の位置（５つの位置がマウスｍＧＬ５０−１／ｈＧＬ５０およびＢ７−１により共有されており、４つの位置がｍＧＬ５０−１／ｈＧＬ５０およびＢ７−２間で共有されており、６つの位置がＢ７−１とＢ７−２間で共有されている）は変化させにくい。さらに、膜貫通および／または細胞質ドメイン中に位置はＧＬ５０ファミリーのメンバー間で保存されている（特に、ＧＬ５０分子の膜貫通または細胞質ドメイン中のチロシン残基）。さらに、ＧＬ５０活性を維持すべき場合には、これらの位置は変化させにくい。
【００４８】
本発明のさらにもう１つの態様は、本来的には含まないＧＬ５０膜貫通または細胞質ドメインをコードする核酸を含むという点でキメラである天然に生じないＧＬ５０核酸分子に関する。例えば、１の具体例において、標準的な分子生物学的方法を用いてＧＬ５０ドメインの膜貫通および／または細胞質ドメインを「入れ換え」あるいは「シャッフル」して、天然に存するＧＬ５０分子と比較して変化したシグナルトランスダクション特性を有するＧＬ５０分子を作成することができる。かかる核酸およびポリペプチド分子もまた本発明に包含される。
さらにもう１つの態様において、ＧＬ５０核酸分子を加工して、別のＢ７ファミリーのメンバー、例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むようにすることができる。例えば、標準的な方法を用いて、天然に存する分子とは異なるリガンド結合および／またはシグナリング特性を有するハイブリッドＧＬ５０／Ｂ７をコードする核酸分子を作成することができる。例えば、１の具体例において、ニワトリＧＬ５０の配列（Ｙ０８８２３）を用いて、変化したシグナリングおよび／または結合特性を有する分子を設計することができる。鳥類ＧＬ５０および該分子の哺乳動物形態の間における配列類似性ならびにリガンド指向性の相違を、この目的のために用いることができる。例えば、鳥類ＧＬ５０様蛋白（Ｙ０８８２３）およびＧＬ５０間で保存されている残基を、ＧＬ５０中に見出される残基で置換する（よりＧＬ５０に近い分子を作成するため）ことにより、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に結合する機能的分子を得ることができる。ハイブリッドＧＬ５０／Ｂ７蛋白を含むＩｇ−融合物または他の構築物を用いて、標的細胞集団の差別的活性化または阻害ならびにＴ細胞表現型の変形を行うことができる。かかる核酸およびポリペプチド分子もまた本発明に包含される。
さらなる本発明の他の態様は、ＧＬ５０融合蛋白をコードする単離核酸分子に関する。非ＧＬ５０ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に結合される、少なくともＧＬ５０ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含むこのような核酸分子は、標準的な組み換えＤＮＡ法により調製できる。
好ましい具体例において、突然変異ＧＬ５０蛋白は：１）活性化されたＴ細胞の増殖および／またはエフェクター機能（例えば、サイトカイン（例、ＩＬ−２またはＩＬ−１０）の分泌）を共刺激（または、例えば、可溶性形態の場合には共刺激の阻害）する能力；２）抗−Ｂ７抗体に結合する能力；および／または３）ＧＬ５０リガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４および／またはＩＣＯＳ）に結合する能力に関してアッセイされうる。
【００４９】
上記ＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子に加えて、さらに、アンチセンスな単離核酸分子は、モジュレーション作用剤として使用できる。「アンチセンス」核酸は蛋白をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、、例えば、二重ストランドｃＤＮＡ分子のコーディングストランドに相補的なヌクレオチド配列、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合しうる。アンチセンス核酸は、ＧＬ５０コーディングストランド全体、またはその蛋白にのみ相補的であり得る。１つの具体例において、アンチセンス核酸分子は、ＧＬ５０をコードするヌクレオチド配列のコーディングストランドの「コーディング領域」に対してアンチセンスである。用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、ＧＬ５０をコードするヌクレオチド配列のコーディングストランドの「非コーディング領域」にアンチセンスである。用語「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’および３’配列をいう（例えば、また、５’および３’非翻訳領域をいう）。
本明細書で開示されたＧＬ５０をコードするコーディングストランド配列が得られたならば、本発明のアンチセンス核酸は、Watson and Crick塩基対合の法則により設計できる。アンチセンス核酸分子は、ＧＬ５０ ｍＲＮＡの完全なコーディング領域に相補的でありえるが、より好ましくは、ＧＬ５０ ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の蛋白だけにアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＬ５０ ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および当該分野で公知の工程を使用する酵素ライゲーション反応（enzymatic ligation reaction）を使用して構築できる。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスヌクレオチド）は、天然に存するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加し、アンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加するように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。アンチセンス核酸の生成に使用できる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨウドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデシン、１−メチルグアニン、１−メチルリノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。代わりに、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス配向（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、関連する標的核酸にアンチセンス配向であり、これは以下のサブセクションにさらに記載する）にサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産できる。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与され、またはin situにおいて生産され、これらはハイブリッド形成し、またはＧＬ５０ポリペプチドをコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに結合し、したがって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、蛋白の発現を阻害する。ハイブリッド形成は、保存ヌクレオチド相補性により、または例えば、ＤＮＡデュプレックスに結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重螺旋の主要な溝での特別な相互作用により、安定なデュプレックスを形成できる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位での直接注入を含む。別法として、アンチセンス核酸分子を修飾して選択された細胞を標的化し、ついで、全身に投与できる。例えば、全身投与するために、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することにより、アンチセンス分子が選択された細胞表面で発現した受容体または抗原に結合するように特異的に修飾できる。また、アンチセンス核酸分子は、本明細書記載のベクターを使用して細胞にデリバリーできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を実現させるため、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構造が好ましい。
【００５０】
さらなる具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二重ストランドハイブリッドを形成し、そこでは通常のβ−ユニットとは対照的にストランドは互いに平行に伸長する（Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641）。また、アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むことができ（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6431-6148)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログを含むことができる（Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)。
【００５１】
さらなる他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、それに相補的な領域を有するｍＲＮＡのような一重ストランド核酸分子を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（hammerhead ribozymes）（Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591に記載）は、ＧＬ５０ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断でき、したがって、ＧＬ５０ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することに利用できる。ＧＬ５０をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示のＧＬ５０のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号：１、３または５）に基づいて設計できる。例えば、Tetrahymena Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が、Ｂ７−４またはＰＤ−１−コーディングｍＲＮＡに切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築できる。例えば、Cech らの米国特許第４，９８７，０７１号；およびCechらの米国特許第５，１１６，７４２号参照。別法として、ＧＬ５０ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することに使用できる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411-1418参照。
【００５２】
別法として、ＧＬ５０遺伝子発現は、ＧＬ５０の調節領域（regulatory region）（例えば、ＧＬ５０プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングすることにより阻害でき、標的細胞中のＧＬ５０遺伝子の転写を防ぐ三重螺旋構造を形成する。一般的に、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. et al (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L. J. (1992) Bioessays 14(12):807-15参照。
さらなる他の具体例において、本発明のＧＬ５０核酸分子は、塩基部、糖部、またはリン酸骨格において修飾でき、例えば、安定性、ハイブリッド形成、または分子の溶解性を改善できる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生じるよう修飾できる（Hyrup, B. and Nielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5-23）。本明細書の用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を、擬似ペプチド骨格により置換し、４つの天然核塩基だけを維持た核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物を意味する。ＰＮＡの天然の骨格は、低イオン強度の環境下でＤＮＡおよびＲＮＡに特異的なハイブリッド形成を可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な、Hyrup and Nielsen (1996) supra and Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載のように固相ペプチド法を使用して実行できる。
【００５３】
ＧＬ５０核酸分子のＰＮＡは、治療および診断用に使用できる。例えば、ＰＮＡは、アンチセンスまたは抗原作用剤として、遺伝子発現の配列特異的なモジュレーションに、例えば、転写または翻訳の停止を誘発し、または複製を阻害することにより、使用できる。また、Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡは、遺伝子中の単塩基対突然変異体の分析に（例えば、ＰＮＡ−指向性ＰＣＲ制限）、他の酵素を組み合わせて使用される場合には「人工制限酵素」として（例えば、上記Ｓ１ヌクレアーゼ（Hyrup and Nielsen (1996) supra））、またはＤＮＡ配列またはハイブリッド形成用のプローブまたはプライマーとして（Hyrup and Nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) supra）使用できる。
ＧＬ５０核酸分子のＰＮＡを治療および診断用途に使用することができる。例えば、転写または翻訳停止を誘導することにより、あるいは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的モジュレーションのためのアンチセンスまたは抗原としてＰＮＡを使用することができる。また、ＧＬ５０核酸分子のＰＮＡを、遺伝子中の単一塩基対変異の分析に（例えば、ＰＮＡに指向されたＰＣＲクランピングにより）；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（上記Hyrup and Nielsen (1996)））と組み合わせた場合に人工制限酵素として；あるいはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（上記Hyrup and Nielsen (1996); 上記Perry-O'Keefe (1996)）使用することもできる。
他の具体例において、ＧＬ５０のＰＮＡは、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームまたは当業者に公知の薬剤デリバリーの他の方法により、（例えば、安定性または細胞摂取を高めるため）修飾できる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができるＧＬ５０核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを得ることができる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）に、ＤＮＡ部分との相互作用を可能ならしめ、その一方で、ＰＮＡ部分は、高い結合アフェニティーおよび特異性を提供するであろう。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合の数、および配向性に関して選択される適当な長さのリンカーを使用して結合できる（Hyrup B. and Nielsen (1996) supra）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup B. and Nielsen(1996) supra および Finn P. J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63に記載のように実行できる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミドカップリング化学物質を使用して、固体支持体上で合成できる。修飾ヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミド）は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端間のリンカーとして使用できる（Mag, M. et al. (1989) Nucleic acid Res. 17:5973-88)。ついで、ＰＮＡモノマーは、キメラ分子を生成する段階的な方法で、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントとカップリングする（Finn P. J. et al. (1996) supra）。代わりに、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントで合成できる（Peterser, K. H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124）。
【００５４】
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボでの宿主細胞受容体のターゲティングのために）、あるいは細胞膜（例えば、Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; ＰＣＴ出願ＷＯ８８／０９８１０参照）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０１３４）の貫通を促進する作用剤を包含する。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成により誘発される切断剤（例えば、Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976参照）または挿入剤（例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549参照）で修飾できる。このために、オリゴヌクレオチドは、他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリッド形成により誘発される架橋剤、運搬剤またはハイブリッド形成により誘発される切断剤）に結合できる。
【００５５】
III.単離ＧＬ５０ポリペプチドおよび抗ＧＬ５０抗体
本発明の１の態様は、単離されたＧＬ５０ポリペプチド、およびその生物活性部分、並びに抗ＧＬ５０抗体を生じさせる免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。一態様において、ネイティブなＧＬ５０ポリペプチドは、標準蛋白精製技術を用いた適当な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。別の態様において、ＧＬ５０ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え発現に代わるものとして、ＧＬ５０ポリペプチドまたはポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある蛋白は、ＧＬ５０ポリペプチドが由来した細胞または組織源由来の細胞性物質または他の混入蛋白を実質的に含まず、あるいは化学合成の場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＧＬ５０ポリペプチドが単離されあるいは組み換え法により製造される細胞の細胞性成分から分離されているＧＬ５０ポリペプチドの調合物を意味する。１の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量で）未満の非ＧＬ５０ポリペプチド（本明細書において「混入蛋白」ともいう）、より好ましくは約２０％の非ＧＬ５０ポリペプチド、さらに好ましくは約１０％未満の非ＧＬ５０ポリペプチド、最も好ましくは約５％未満の非ＧＬ５０ポリペプチドを有するＧＬ５０ポリペプチドの調合物を包含する。また、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分が組み換え法により製造される場合、好ましくは、それは培地を含まないものであり、すなわち、培地が蛋白調合物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００５６】
用語「化学前駆体または他の化学試薬を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される化学前駆体または化学試薬から蛋白が分離されているＧＬ５０ポリペプチドの調合物を包含する。１の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学試薬を実質的に含まない」は約３０％（乾燥重量で）未満の化学前駆体または非ＧＬ５０化学試薬、より好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非ＧＬ５０化学試薬、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非ＧＬ５０化学試薬、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非ＧＬ５０化学試薬を有するＧＬ５０蛋白調合物を包含する。
本発明のもう１つの態様は単離ＧＬ５０ポリペプチドに関する。好ましくは、ＧＬ５０ポリペプチドは配列番号：１、３または５によりコードされるアミノ酸配列を含む。もう１つの具体例において、蛋白は配列番号：２、４または６のアミノ酸配列を含む。他の具体例において、蛋白は、配列番号：２、４または６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。
他の具体例において、本発明は、単離されたＧＬ５０ポリペプチドの部分を提供する。ＧＬ５０ポリペプチドはＧＬ５０ポリペプチドドメインを含む。典型的なＧＬ５０ポリペプチドドメインは図１２に示されるものであり、ＩｇＶ様、ＩｇＣ様、膜貫通、および細胞質ドメインを包含する。
さらに本発明は、可溶性形態のＧＬ５０ポリペプチドに関する。かかる形態は天然に存する形態であってもよく、あるいは加工された形態であってもよく、例えば、ＧＬ５０ポリペプチドの細胞外ドメインを含むものであってもよい。１の具体例において、ＧＬ５０ポリペプチドの細胞外ドメインは、シグナル配列の開裂後にはＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含むが、ＧＬ５０ポリペプチドの膜貫通および細胞質ドメイン（例えば、配列番号：２のアミノ酸ほぼ４７−２７９のアミノ酸配列または配列番号：６のアミノ酸ほぼ２２−２５８）は含まない。
ＧＬ５０ポリペプチドの生物活性部分は、ＧＬ５０ポリペプチドのアミノ酸配列と充分な相同性を示すかまたはそこから誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含んでおり、完全長ＧＬ５０ポリペプチドより少ないアミノ酸を含み、ＧＬ５０ポリペプチドの少なくとも一活性、好ましくは天然結合相手への結合能力を呈する。典型的には、生物活性部分は、ＧＬ５０ポリペプチドの少なくとも一活性を伴うドメインまたはモチーフを含む。ＧＬ５０ポリペプチドの生物活性部分は、例えば少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。
【００５７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するため、最適な比較を目的として配列を並置する（例、ギャップは、最適なアラインメント（並置）のために第１および第２アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同性配列は比較目的に関しては無視され得る）。好ましい態様において、比較目的用に並置させたレファレンス配列の長さは、レファレンス配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。次いで、対応する位置にある残基を比較し、一配列における位置を他の配列で対応する位置と同じ残基が占めるとき、分子はその位置において同一である。従って、２配列間の同一性パーセントは、２配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２配列間の同一性％は、２配列の最適アラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した上での、配列が共有する同一位置の数の関数である。ここで使用されているアミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と均等内容である。
配列比較および２つの配列間の同一性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例はKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873中で改変されたKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264に記載のものである。かかるアルゴリズムはAltshul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）中に含まれている。NBLASTプログラム、スコア＝１００、語長＝１２としてBLASTヌクレオチド検索を行って、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。XBLASTプログラム、スコア＝５０、語長＝３としてBLAST蛋白検索を行って、本発明の蛋白分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的の場合には、Altshul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389に記載されたようにしてギャップを有する並置比較であるGapped BLASTを用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる場合には、個々のプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォールトパラメーターを用いることができる。http://www/ncbi.nlm.nih.gov参照。配列比較のためのアルゴリズムのもう１つの好ましい非限定的な例はMeyers and Miller, CABIOS (1989)である。かかるアルゴリズムはALIGNプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）中に含まれており、それはＧＣＧ配列配置比較ソフトウェアパッケージ中に含まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを用いる場合、PAM120 weight residue table、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いることができる。
さらなる例として、Geneworksプログラム（Oxford Molecular;例えば、バージョン２．５）中の並置比較プログラムを、下記のようにパラメーターをセットして使用することもできる：ギャップクリエイション＝１６、伸長ペナルティー＝４、スコアリングマトリックス＝fastadna.cmp、および一定ＰＡＭファクター。
蛋白配列の並置比較に使用される数学的アルゴリズムのさらなる非限定的な例はLipman-Pearsonアルゴリズム（Lipman and Pearson (1985) Science 227: 1435）である。Lipman-Pearsonアルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ２５０重量残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティー（gap length penalty）１２、ギャップペナルティー４、およびKutple２を用いることができる。核酸配列の並置比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例はWilbur-Lipmanアルゴリズム（Wilbur and Lipman (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726）である。Wilbur-Lipmanアルゴリズムを用いる場合、ウインドウ（window）２０、ギャップペナルティー３、Ktuple３を用いることができる。Lipman-PearsonアルゴリズムおよびWilbur-Lipmanアルゴリズムは両方とも、例えば、DNASTAR配列分析ソフトウェアパッケージの一部であるMegAlignプログラム（例えば、バージョン３．１．７）に含まれている。
配列分析用のさらなるアルゴリズムが当該分野において知られており、Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 3に記載されたADVANCEおよびADAM、ならびにPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444に記載されたFASTAを包含する。
好ましい態様において、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ブロサム６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重量（gap weight）および１、２、３、４、５または６の長さ重量（length weight）を用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて測定される。さらに別の好ましい態様において、２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳgapdna.ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて測定される。
オープンギャップに対するコストを５、伸長ギャップに対するコストを５、最小対角線長を４、最大対角線オフセットを１３０、コンセンサスカットオフを５０％にセットし、Pam 250マトリックスを用いてGeneworks global蛋白並置比較プログラム（例えば、バージョン２．５．１）を使用して蛋白の並置比較を行うこともできる。
さらに本発明の核酸および蛋白配列を「クウェリー（query）配列」として使用することにより、パブリックデータベースに対する検索が遂行され、例えば他のファミリー構成員または関連配列が同定され得る。かかる検索は、Altschulら（１９９０）J.Mol.Biol.２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２.０）を用いて遂行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で遂行することにより、本発明のＧＬ５０核酸分子と相同的なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で遂行することにより、本発明のＧＬ５０ポリペプチド分子と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較目的用のギャップトアラインメントを得るためには、Altschulら（１９９７）Nucleic Acids Res.２５（１７）：３３８９−３４０２記載の要領でギャップトＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップトＢＬＡＳＴプログラムを用いるとき、それぞれのプログラム（例、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。例えば、存在１１および伸長１で設定されたギャップペナルティーでデフォルトBlastnマトリックス１−３を用いて、本発明のヌクレオチド配列を分析した。デフォルト設定：存在１１および伸長１で設定されたギャップペナルティーでのブロサム６２マトリックスを用いて、本発明のアミノ酸配列を分析した。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。
【００５８】
配列並置比較により示されるＲＡＣＥクローン上の多様なカルボキシル領域の存在は、これらの分子の細胞内ドメイン中のさらなるチロシンにより、これらの異なった分子によって別のシグナリング機能を行われうることを示唆する。現在に至るまで、Ｂ７−１またはＢ７−２に関する細胞内シグナリングを調べたいくつかの研究があっただけである。ＧＬ５０配列上の細胞質ドメインのチロシンの存在を基礎として、かかるシグナリングが存在することを予想することができる。マウスおよびヒトのＢ７−１およびＢ７−２の細胞質ドメインを調べることにより無視できる類似性が示され、完全に細胞質配列を欠いているｇｐｉ−アンカード構築物中においてＢ７分子が機能しうるという報告に基づいてＢ７細胞質ドメインが全くなくてもよいことが示唆された。したがって、１の具体例において、ＧＬ５０チロシン分子の細胞内ドメイン中のチロシン残基を変化させて、ＧＬ５０ポリペプチドを介する細胞内シグナルをモジュレーションすることができる。
本発明はまた、ＧＬ５０キメラまたは融合蛋白を提供する。ここで使用されているＧＬ５０「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非ＧＬ５０ポリペプチドに作動可能に結合されたＧＬ５０ポリペプチドを含む。「ＧＬ５０ポリペプチド」は、ＧＬ５０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含し、「非ＧＬ５０ポリペプチド」は、ＧＬ５０ポリペプチドと実質的に相同的ではない蛋白、例えばＧＬ５０ポリペプチドとは異なり、同一または異なる生物体に由来する蛋白に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。ＧＬ５０融合蛋白内では、ＧＬ５０ポリペプチドは、ＧＬ５０ポリペプチドの全部または一部に対応し得る。好ましい態様において、ＧＬ５０融合蛋白は、ＧＬ５０ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性部分、例えばＧＬ５０ポリペプチドの細胞外ドメインを含む。融合蛋白内では、「作動可能に結合された」の語は、ＧＬ５０ポリペプチドおよび非ＧＬ５０ポリペプチドが互いに枠内（in-frame）融合されていることを示すものとする。非ＧＬ５０ポリペプチドは、ＧＬ５０ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合され得る。
例えば、一態様では、融合蛋白は、ＧＬ５０メンバーの配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合されているＧＳＴ−ＧＬ５０メンバーの融合蛋白である。別の態様では、融合蛋白は、ＧＬ５０ヌクレオチド配列がベクター、例えばｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Herrscher,R.F.ら（１９９５）Genes Dev.９：３０６７−３０８２）に挿入されているＧＬ５０融合蛋白であり、例えばＧＬ５０メンバーの配列はインフルエンザ血球凝集素エピトープ標識に枠内融合されている。かかる融合蛋白は、組換えＧＬ５０メンバーの精製を容易にし得る。
【００５９】
ＧＬ５０融合蛋白は、ＧＬ５０活性を有する第１ペプチドをコードするヌクレオチド配列および第１ペプチドの溶解性、親和力、安定性または結合価を改変する部分、例えば免疫グロブリン定常部に対応する第２ペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え発現により製造され得る。好ましくは、第１ペプチドは、Ｂ７−４ポリペプチドの一部から成る（例えば、活性化Ｔ細胞を共刺激するに十分な配列番号：２、４または６に示された配列の一部のアミノ酸残基（例えば、シグナル配列の開裂後の、例えば、配列番号：２のアミノ酸１−４４付近に対応するもの））。第２ペプチドは、免疫グロブリン定常部、例えばヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４（例、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、例えばCaponら、米国特許５１１６９６４、５５８０７５６、５８４４０９５など参照、出典明示により本明細書の一部とする）を含み得る。
特に好ましいＧＬ５０ Ｉｇ融合蛋白は、免疫グロブリン定常部（例、Ｆｃ領域）に結合されたｈＧＬ５０の細胞外ドメイン部分または可変部様ドメインを含む。免疫グロブリン定常部は、免疫グロブリン構造に固有のエフェクター活性を低減化または排除する遺伝子修飾を含み得る。例えば、ＧＬ５０ポリペプチドの細胞外部分をコードするＤＮＡは、例えばＷＯ９７／２８２６７で示されている通り、位置指定突然変異導入法により修飾されたヒトＩｇＧγ１および／またはＩｇＧγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに連結され得る。
【００６０】
典型的な可溶性ＧＬ５０およびＩＣＯＳ構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２６−２９に示す。図２６は典型的なヒトＩＣＯＳ融合淡白の核酸およびアミノ酸配列を示す。図２７は典型的なネズミＩＣＯＳ融合蛋白の核酸およびアミノ酸配列を示す。図２８は典型的なヒトＧＬ５０融合淡白の核酸およびアミノ酸配列を示し、図２９は典型的なネズミＧＬ５０融合蛋白の核酸およびアミノ酸配列を示す。
【００６１】
生成したＧＬ５０−Ｉｇ融合蛋白は、改変された溶解性、結合親和力、安定性および／または結合価（すなわち１分子当たりで利用可能な結合部位の数）を有し得、蛋白精製効率を高め得る。組換え技術により製造される融合蛋白およびペプチドは、蛋白またはペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌され単離され得る。別法として、蛋白またはペプチドを細胞質により保持し、細胞を採取し、溶解し、蛋白を単離し得る。細胞培養物は、典型的には宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は当該分野で公知である。蛋白およびペプチドは、蛋白およびペプチド精製に関し当該分野で公知の技術を用いて細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離され得る。宿主細胞をトランスフェクションし、蛋白およびペプチドを精製する技術は当該分野で公知である。
好ましくは、本発明のＧＬ５０融合蛋白は、標準組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、慣用的技術に従い枠内で一緒に連結され、例えば平滑端状またはスタッガー端状末端を用いて連結させ、制限酵素消化により適当な末端を提供し、適当な場合付着末端を補充し、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない連結を回避し、酵素連結反応させる。別の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用的技術により合成され得る。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて実施され得、これらは２つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせ、それに続いてアニーリングさせ、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成させ得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ：１９９２参照）。さらに、既に融合部分（例、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープ標識）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ＧＬ５０をコードする核酸は、融合部分がＧＬ５０ポリペプチドへ枠内融合されるようにかかる発現ベクター中へクローン化され得る。
別の態様では、融合蛋白は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含むＧＬ５０ポリペプチドである。ある種の宿主細胞（例、哺乳類宿主細胞）では、ＧＬ５０の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して高められ得る。
【００６２】
本発明のＧＬ５０融合蛋白は、医薬組成物に組込まれ、対象にインビボ投与され得る。ＧＬ５０融合蛋白の使用は、免疫疾患、例えば自己免疫疾患の処置、または移植体の拒絶阻害の症例に治療上有用である。さらに、本発明のＧＬ５０融合蛋白を免疫原として使用することにより、対象において抗ＧＬ５０抗体が産生され、ＧＬ５０が精製され、スクリーニングアッセイでＧＬ５０受容体、例えば、ＧＬ５０とＧＬ５０リガンドとの相互作用を阻止する分子が同定され得る。
本発明はまた、ＧＬ５０アゴニスト（ミメティクス（擬似物質）mimetics）としてまたはＧＬ５０アンタゴニストとして機能するＧＬ５０ポリペプチドの変異体に関するものである。ＧＬ５０ポリペプチドの変異体は、突然変異導入、例えばＧＬ５０ポリペプチドの離散した点突然変異または末端切断により生成され得る。ＧＬ５０ポリペプチドのアゴニストは、ＧＬ５０ポリペプチドの天然に存する形態の生物活性と実質的に同じものまたはそのサブセットを保持し得る。ＧＬ５０ポリペプチドのアンタゴニストは、例えばＧＬ５０ポリペプチドの細胞活性を競争的にモジュレーションすることにより、ＧＬ５０ポリペプチドの天然に存する形態の活性の一つまたはそれ以上を阻害し得る。すなわち、特異的生物作用は、制限された機能の変異型で処理することにより誘導され得る。一態様では、蛋白の天然に存する形態の生物活性のサブセットを有する変異体で対象を処置すると、ＧＬ５０ポリペプチドの天然に存する形態で処置した場合に対して対象における副作用が少なかった。
１の具体例において、ＧＬ５０アゴニスト（ミメティクス）としてまたはＧＬ５０アンタゴニストとして機能するＧＬ５０ポリペプチドの変異体は、ＧＬ５０ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＧＬ５０ポリペプチドの突然変異体、例えば先端切除突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１の具体例において、ＧＬ５０変異体の雑多なライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異導入により生成され、雑多な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＧＬ５０変異体の雑多な（variegated）ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列へ酵素的に連結させることにより製造され得、その場合、潜在的なＧＬ５０配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとして、または別法として、そこにＧＬ５０配列のセットを含む大型融合蛋白（例、ファージディスプレーの場合）のセットとして発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＧＬ５０変異体のライブラリーを製造するのに使用され得る様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で遂行され得、次いで合成遺伝子は適当な発現ベクターへ結合され得る。遺伝子の縮重セットの使用により、一混合物で、潜在的なＧＬ５０配列の目的とするセットをコードする配列が全て提供され得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業界では公知である（例えば、Narang,S.A.（１９８３）Tetrahedron ３９：３、Itakuraら（１９８４）Annu.Rev.Biochem.５３：３２３、Itakuraら（１９８４）Science１９８：１０５６、Ikeら（１９８３）Nucleic Acid Res.１１：４７７参照）。
【００６３】
さらに、ＧＬ５０ポリペプチドコーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＧＬ５０フラグメントの雑多な集団を生成することにより、ＧＬ５０ポリペプチドの変異体がスクリーニングされ、それに続いて選択され得る。１の具体例において、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、１分子につきほぼ１回のみニッキングが行なわれ、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生することにより異なるニック産物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再形成二本鎖から一本鎖部分を除去し、そして生成したフラグメントライブラリーを発現ベクターへ結合させる条件下、ヌクレアーゼでＧＬ５０コーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを処理することにより生成され得る。この方法により、様々なサイズのＧＬ５０ポリペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが誘導され得る。
点突然変異または先端切除により製造された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための幾つかの技術が当該分野において知られている。上記技術は、ＧＬ５０ポリペプチドの組み合わせ突然変異導入により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合し得る。高処理量分析ができる、大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広範に使用されている技術は、典型的には遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターへクローニングし、生成したベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、そして目的とする活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で組み合わせ遺伝子を発現させることを含む。再帰アンサンブル突然変異導入法（Recursive ensemble mutagenesis, ＲＥＭ）という、ライブラリーにおける機能性突然変異体の頻度を高める新規技術を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用することにより、ＧＬ５０変異体が同定され得る（ArkinおよびYouvan（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８９：７８１１−７８１５、Delagraveら（１９９３）Protein Eng.６（３）：３２７−３３１）。
１の具体例において、細胞に基くアッセイを利用することにより、雑多なＧＬ５０ライブラリーが分析され得る。例えば、発現ベクターのライブラリーは、ＧＬ５０を普通に合成し、分泌する細胞系へトランスフェクションされ得る。次いで、ＧＬ５０および特定突然変異体ＧＬ５０が分泌されるようにトランスフェクション細胞を培養すると、細胞上清でのＧＬ５０活性に対する突然変異体の発現効果が、例えば若干数の機能的アッセイのいずれかにより検出され得る。次いで、プラスミドＤＮＡを細胞から回収し、ＧＬ５０活性の阻害、あるいは別法として増強について評価し、そして個々のクローンはさらに特性確認され得る。
【００６４】
天然に存するアミノ酸のみで構成されるＧＬ５０ポリペプチドに加えて、ＧＬ５０ペプチドミメティクスもまた提供される。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの場合と類似した特性をもつ非ペプチド薬剤として製薬業界では常用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド・ミメティクス」または「ペプチドミメティクス」と呼ばれ（Fauchere,J.（１９８６）Adv.Drug Res.１５：２９、Veberおよび Freidinger（１９８５）TINS ３９２頁、および Evansら、（１９８７）J.Med.Chem.３０：１２２９、出典明示により本明細書の一部とする）、通常コンピューター化分子モデリングの助けにより開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似したペプチドミメティクスを用いることにより、均等内容の治療または予防効果が生成され得る。一般的に、ペプチドミメティクスは、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物または薬理活性を有するポリペプチド）、例えばヒトＧＬ５０と構造的に類似しているが、当業界では公知であり、さらに次の参考文献：Spatola,A.F.、“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins”中、Weinstein,B.編、Marcel Dekker、ニューヨーク、２６７（１９８３）、Spatola,A.F.、Vega Data（１９８３年３月）、第１巻、３刷、“Peptide Backbone Modifications”（概観）、Morley,J.S.（１９８０）Trends Pharm.Sci.４６３−４６８頁（概観）、Hudson,D.ら（１９７９）Int.J.Pept.Prot.Res.１４：１７７−１８５（−ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２ＣＨ２−）、Spatola,A.F.ら（１９８６）Life Sci.３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）、Hann,M.M.（１９８２）J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）、Almquist,R.G.ら（１９０）J.Med.Chem.２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ２−）、Jennings−White,C.ら（１９８２）Tetrahedron Lett.２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）、Szelke,M.ら、ヨーロッパ出願ＥＰ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、Holladay,M.W.ら（１９８３）Tetrahedron Lett.（１９８３）２４：４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）、および Hruby,V.J.（１９８２）Life Sci.（１９８２）３１：１８９−１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）に記載されている方法により（各々、出典明示により本明細書の一部とする）、−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択された結合によって所望により置換されていてもよい１個またはそれ以上のペプチド結合を有する。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。かかるペプチドミメティクスは、例えば、生産性がより経済的である、化学的安定性が大きい、薬理学的特性（半減期、吸収、有効性、効力等）が高い、特異性が改変されている（例、広域スペクトルの生物活性）、抗原性が低いことなどを含め、ポリペプチド態様を凌ぐ顕著な利点を有し得る。ペプチドミメティクスの標識は、直接的またはスペーサー（例、アミド基）を介して、定量的構造活性データおよび／または分子モデリングにより予測されるペプチドミメティクス上の非干渉性位置（複数も可）への１個またはそれ以上の標識の共有結合を通常伴う。上記非干渉性位置は、一般的にペプチドミメティクス��結合することにより治療効果を生じる高分子（複数も可）との直接接触を形成しない位置である。ペプチドミメティクスの誘導体化（例、標識）は、ペプチドミメティクスの目的とする生物学的または薬理学的活性に実質的には干渉するものであってはならない。
【００６５】
ＧＬ５０アミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸を同じタイプのＤ−アミノ酸（例、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）と系統的に置換する方法を用いることにより、さらに安定したペプチドが生成され得る。さらに、ＧＬ５０アミノ酸配列または実質的に同一となる配列変化を含む強制的（constrained）ペプチドは、例えば、ペプチドを閉環する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによる、当該分野で公知の方法により生成され得る（RizoおよびGierasch（１９９２）Annu.Rev.Biochem. ６１：３８７、出典明示により本明細書の一部とする）。
ここで同定されたＧＬ５０ポリペプチドのアミノ酸配列によると、当業者であれば、ＧＬ５０ペプチド配列およびその配列変異型に対応するポリペプチドを製造することは可能なはずである。上記ポリペプチドは、多くの場合大型ポリペプチドの一部として、ＧＬ５０ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現により原核生物または真核生物宿主細胞で製造され得る。別法として、上記ペプチドは、化学的方法により合成され得る。組換え宿主における異種蛋白の発現、ポリペプチドの化学合成およびインビトロ翻訳に関する方法は、当業界ではよく知られており、Maniatisら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（１９８９）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、Bergerおよび Kimmel、Methods in Enzymology、１５２巻、Guide to Molecular Cloning Techniques（１９８７）、アカデミック・プレス、インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア、Merrifield,J.（１９６９）J.Am.Chem.Soc.９１：５０１、Chaiken I.M.（１９８１）CRC Crit.Rev.Biochem.１１：２５５、Kaiserら（１９８９）Science ２４３：１８７、Merrifield,B.（１９８６）Science２３２：３４２、Kent,S.B.H.（１９８８）Annu.Rev.Biochem.５７：９５７、および Offord,R.E.（１９８０）Semisynthetic Proteins、ウィリー・パブリッシング（これらは出典明示により本明細書の一部とする）にさらに詳述されている。
【００６６】
ペプチドは、典型的には直接化学合成により製造され、例えばＧＬ５０リガンド相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして使用され得る。ペプチドは、非ペプチド部分がＮ−末端および／またはＣ−末端への共有結合により結合している、修飾ペプチドとして製造され得る。ある好ましい態様では、カルボキシ末端またはアミノ末端、またはその両方が化学的に修飾されている。末端アミノおよびカルボキシ基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アミノ末端修飾、例えばアシル化（例、アセチル化）またはアルキル化（例、メチル化）およびカルボキシ末端修飾、例えばアミド化、並びに他の末端修飾、例えば閉環は、本発明の様々な態様に組込まれ得る。ある種のアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列へのペプチド伸長により、有利な物理的、化学的、生化学的および薬理学的特性、例えば高い安定性、強い効力および／または有効性、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態学的特性などが提供され得る。ペプチドを治療に使用することにより、例えば患者における共刺激を改変することによって病気が処置され得る。
単離されたＧＬ５０ポリペプチド、またはその一部もしくはフラグメント（またはかかるポリペプチドをコードする核酸分子）を免疫原として使用すると、標準的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造技術を用いることによりＧＬ５０に結合する抗体が産生され得る。完全長ＧＬ５０ポリペプチドも使用され得、または別法として、本発明は、免疫原として使用されるＧＬ５０の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＧＬ５０の抗原性ペプチドが、少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ＧＬ５０のエピトープを含むことから、ペプチドに対して産生した抗体はＧＬ５０との特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
別法として、ＧＬ５０ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得る。ＧＬ５０ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントは、典型的には配列番号２、４または６に示されたアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ＧＬ５０ポリペプチドのエピトープを含むことにより、ペプチドに対して産生した抗体はＧＬ５０分子との免疫複合体を形成する。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するＧＬ５０の領域、例えば親水性領域である。１の具体例において、抗体は、ＧＬ５０分子に実質的には特異的に結合する。別の具体例において、抗体はＧＬ５０ポリペプチドに特異的に結合する。
好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも約１０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するＧＬ５０ポリペプチドの領域、例えば親水性領域であり、ＧＬ５０またはＰＤ−１ポリペプチドに特有である。一態様において、上記エピトープは、一つの種、例えばマウスまたはヒト由来のＧＬ５０ポリペプチドに特異的であり得る（すなわち、種全体にわたって保存されているわけではないＧＬ５０ポリペプチドの領域に及ぶ抗原性ペプチドが免疫原として使用される。上記非保存残基はアラインメント、例えば本明細書記載のものを用いて測定され得る）。ＧＬ５０ポリペプチドの標準的な疎水性分析を遂行することにより、親水性領域が確認され得る。
典型的には、ＧＬ５０免疫原を用いて、適当な対象（例、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫原で免疫化することにより抗体が産生される。適当な免疫原性調合物は、例えば組換え発現ＧＬ５０ポリペプチドまたは化学合成ＧＬ５０ペプチドを含み得る。さらにこの調合物は、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性ＧＬ５０調合物で適当な対象を免疫化すると、ポリクローナル抗ＧＬ５０抗体応答が誘導される。
【００６７】
したがって、ポリクローナル抗ＧＬ５０抗体は、適当な対象をＧＬ５０免疫原で免疫化することにより上記要領で製造され得る。免疫化対象における抗ＧＬ５０抗体力価は、標準的技術、例えば固定化ＧＬ５０ポリペプチドを用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により時間経過とともにモニターされ得る。所望ならば、ＧＬ５０ポリペプチドに対して指向した抗体分子を、哺乳類から（例、血液から）単離し、さらに公知技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーにより精製すると、ＩｇＧフラクションが得られる。免疫後適当な時点で、例えば抗ＧＬ５０抗体力価が最高であるとき、抗体産生細胞は、対象から入手され、標準的技術、例えばKohlerおよびMilstein（１９７５）Nature ２５６：４９５−４９７により最初に報告されたハイブリドーマ技術（また、Brownら（１９８１）J.Immunol.１２７：５３９−４６、Brownら（１９８０）J.Biol.Chem. ２５５：４９８０−８３、Yehら（１９７６）Proc.Natl.Acad.Sci. ７６：２９２７−３１、および Yehら（１９８２）Int.J.Cancer ２９：２６９−７５も参照）、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら（１９８３）Immunol.Today ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら（１９８５）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、アラン R.リス、インコーポレイテッド、７７−９６頁）またはトリオーマ技術によるモノクローナル抗体の製造に使用され得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマ製造技術は公知である（一般的には、Kenneth,R.H.、Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses、プレナム・パブリッシング・コーポレーション、ニューヨーク、ニューヨーク（１９８０）、Lerner,E.A.（１９８１）Yale J.Biol.Med.５４：３８７−４０２、Gefter,M.L.ら（１９７７）Somatic Cell Genet.３：２３１−３６参照）。簡単に述べると、不死細胞系（代表的には骨髄種）を、上記要領でＧＬ５０免疫原により免疫化した哺乳類からのリンパ球（代表的には脾臓細胞）に融合させ、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングにかけると、ＧＬ５０ポリペプチと好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが同定される。
リンパ球および不死化細胞系の融合に用いられる多くの公知プロトコルのいずれかが、抗ＧＬ５０モノクローナル抗体産生目的に適用され得る（例えば、Galfre,G.ら（１９７７）Nature ２６６：５５０５２、Gefterら（１９７７）前出、Lerner（１９８１）前出、Kenneth（１９８０）前出参照）。さらに、当業者にとって、同様に有用である上記方法の多くの変形があることは明らかである。典型的には、不死細胞系（例、骨髄種細胞系）は、リンパ球と同じ種の哺乳類に由来する。例えば、ネズミハイブリドーマは、本発明免疫原性調合物により免疫化したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系と融合させることにより製造され得る。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性を示すマウス骨髄種細胞系である。若干の骨髄種細胞系のいずれかは、標準的技術による融合相手として使用され得、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８.６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄種系がある。これらの骨髄種系は、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄種細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾臓細胞に融合される。次いで、融合から生成したハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地を用いて選択され、この場合非融合および非生産的融合骨髄種細胞は殺される（非融合脾臓細胞は、形質転換されていないため数日後に死ぬ）。本発明モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＧＬ５０分子と結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマの別の製造方法として、モノクローナル抗ＧＬ５０抗体はＧＬ５０を伴う組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例、抗体ファージディスプレーライブラリー）のスクリーニングによって、ＧＬ５０ポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリー構成員が単離されることにより同定および単離され得る。ファージディスプレーライブラリーを作成し、スクリーニングするキットは市販されている（例、ファルマシア・レコンビナント・ファージ・アンチボディー・システム、カタログ番号２７−９４００−０１、およびストラタジーンSurfZAP（商標）ファージ・ディスプレー・キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作成およびスクリーニングにおいて特に使用され易い方法および試薬の例は、例えばLadnerら、米国特許第５２２３４０９号、Kangら、国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９、Dowerら、国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１、Winterら、国際公開ＷＯ９２／２０７９１、Marklandら、国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９、Breitlingら、国際公開ＷＯ９３／０１２８８、McCaffertyら、国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７、Garrardら、国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０、Ladnerら、国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９、Fuchsら（１９９１）Biotechnology(NY)９：１３６９−１３７２、Hayら（１９９２）Hum.Antibod.Hybridomas ３：８１−８５、Huseら（１９８９）Science２４６：１２７５−１２８１、Griffithsら（１９９３）EMBO J. １２：７２５−７３４、Hawkinsら（１９９２）J.Mol.Biol.２２６：８８９−８９６、Clarksonら（１９９０）Nature３５２：６２４−６２８、Gramら（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：３５７６−３５８０、Garrardら（１９９１）Biotechnology(NY)９：１３７３−１３７７、Hoogenboomら（１９９１）Nucleic Acids Res.１９：４１３３−４１３７、Barbasら（１９９１）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８８：７９７８−７９８２、および McCaffertyら（１９９０）Nature３４８：５５２−５５４において見出され得る。
【００６８】
さらに、組換え抗ＧＬ５０抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含み、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて製造され得るものであり、本発明の範囲内に包含される。上記キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばRobinsonら、国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、Akiraら、ヨーロッパ特許出願１８４１８７、Taniguchi,M.、ヨーロッパ特許出願１７１４９６、Morrisonら、ヨーロッパ特許出願１７３４９４、Neubergerら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３、Cabillyら、米国特許第４８１６５６７号、Cabillyら、ヨーロッパ特許出願１２５０２３、Betterら（１９８８）Science２４０：１０４１−１０４３、Liuら（１９８７）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８４：３４３９−３４４３、Liuら（１９８７）J.Immunol. １３９：３５２１−３５２６、Sunら（１９８７）Proc.Natl.Acad.Sci. ８４：２１４−２１８、Nishimuraら（１９８７）Cancer Res.４７：９９９−１００５、Woodら（１９８５）Nature３１４：４４６−４４９、およびShawら（１９８８）J.Natl.Cancer Inst.８０：１５５３−１５５９、Morrison,S.L.(１９８５)Science２２９：１２０２−１２０７、Oiら（１９８６）Biotechniques ４：２１４、Winter 米国特許５２２５５３９、Jonesら（１９８６）Nature３２１：５５２−５２５、Verhoeyanら（１９８８）Science２３９：１５３４、およびBeidlerら（１９８８）J.Immunol.１４１：４０５３−４０６０に記載された方法を用いることにより、当業界で公知の組換えＤＮＡ技術により製造され得る。
【００６９】
さらに、ヒト化抗体は、標準的プロトコル、例えば米国特許５５６５３３２に開示されたものに従い製造され得る。別の態様において、抗体鎖または特異的結合対構成成分は、当業界公知の技術を用いて、例えば米国特許５５６５３３２、５８７１９０７または５７３３７４３の記載に従い、特異的結合対構成成分のポリペプチド鎖および複製可能遺伝子ディスプレーパッケージの一成分の融合体をコードする核酸分子を含むベクターおよび単結合対構成成分の第２ポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクター間の組換えにより製造され得る。細胞内抗体の使用による細胞での蛋白機能の阻害もまた、当該分野で公知である（例えば Carlson,J.R.（１９８８）Mol.Cell.Biol.８：２６３８−２６４６、Biocca,S.ら（１９９０）EMBO J.９：１０１−１０８、Werge,T.M.ら（１９９０）FEBS Lett.２７４：１９３−１９８、Carlson,J.R.（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０：７４２７−７４２８、Marasco,W.A.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：７８８９−７８９３、Biocca,S.ら（１９９４）Biotechnology(NY)１２：３９６−３９９、Chen,S-Yら（１９９４）Hum.Gene Ther.５：５９５−６０１、Duan,L.ら（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１：５０７５−５０７９、Chen,S-Yら（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１：５９３２−５９３６、Beerli,R.R.ら（１９９４）J.Biol.Chem.２６９：２３９３１−２３９３６、Beerli,R.R.ら（１９９４）Biochem.Biophys.Res.Commun.２０４：６６６−６７２、Mhashilkar,A.M.ら（１９９５）EMBO J.１４：１５４２−１５５１、Richardson,J.H.ら（１９９５）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９２：３１３７−３１４１、MarascoらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６１０、および DuanらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０３８３２参照）。
１の具体例において、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一抗体分子内に２種の異なる抗原に関する結合部位を有する。抗原結合は、同時または逐次的であり得る。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌し得る細胞系の２例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマが産生する二重特異性抗体の例は、米国特許４４７４８９３に開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段（Staerzら（１９８５）Nature３１４：６２８、および Perezら（１９８５）Nature３１６：３５４)およびハイブリドーマ技術（Staerzおよび Bevan（１９８６）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８３：１４５３、および StaerzおよびBevan（１９８６）Immunol,Today７：２４１）により構築された。二重特異性抗体はまた、米国特許５９５９０８４に記載されている。二重特異性抗体のフラグメントは米国特許５７９８２２９に記載されている。
二重特異性作用剤はまた、異なる抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を融合することによって異種ハイブリドーマを製造した後、両抗体を生産および共構築（co-assenmling）するクローンを同定することにより生成され得る。それらはまた、完全免疫グロブリン鎖またはその一部分、例えばＦａｂおよびＦｖ配列の化学的または遺伝子的コンジュゲーションにより生成され得る。例えば、Ｔ細胞受容体複合体、Ｂ細胞受容体複合体、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ２またはＣＤ４５（ＧＬ５０またはＩＣＯＳのほかに）に結合する二重特異性作用剤を得ることができる。
【００７０】
抗ＧＬ５０抗体（例、モノクローナル抗体）を用いると、標準的技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によりＧＬ５０ポリペプチドが単離され得る。抗ＧＬ５０抗体により、細胞からの天然ＧＬ５０ポリペプチドおよび宿主細胞において発現される遺伝的組換えにより製造されたＧＬ５０ポリペプチドの精製は容易になり得る。さらに、抗ＧＬ５０抗体は、ＧＬ５０ポリペプチドの検出（例、細胞リゼイトまたは細胞上清において）に使用され得る。抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち、物理的結合）させることにより検出は容易になり得る。従って、１の具体例において、本発明の抗ＧＬ５０抗体は、検出可能な物質により標識される。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス（発光）物質および放射性物質がある。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがあり、適当な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがあり、適当な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがあり、ルミネセンス物質の例にはルミノールがあり、そして適当な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈがある。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、次の工程を含む方法により得られる抗ＧＬ５０抗体に関するものである：
（ａ）免疫原性ＧＬ５０ポリペプチドまたはＧＬ５０ポリペプチドに特有なその免疫原性部分により動物を免疫化し、そして
（ｂ）ＧＬ５０ポリペプチドに特異的に結合する抗体を動物から単離する。
【００７２】
ＩＶ．組み換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう１つの態様は、ＧＬ５０ファミリーの蛋白（またはその一部分）をコードする核酸分子を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ここで使用されている「ベクター」の語は、それに結合されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を包含する。ベクターの１のタイプは「プラスミド」であり、追加的ＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを包含する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合追加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへ連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製し得る（例、細菌性複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指令し得る。上記ベクターは、ここでは「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。本明細書の場合、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、かかる他の形態の発現ベクターで均等内容の機能を果たすもの、例えばウイルスベクター（例、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ伴生ウイルス）を包含するものと考えられる。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の核酸お含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基いて選択された１つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味するもので、調節配列は、発現されるべき核酸配列に作動可能に結合されている。組換え発現ベクター内で、「作動可能に結合されている」は、興味の対象であるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の（例、インビトロ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞へ導入されたとき宿主細胞における）発現を可能にする状態で調節配列（複数も可）に結合されていることを意味するものとする。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例、ポリアデニル化シグナル）を包含する。上記調節配列は、例えば Goeddel（１９９０）Methods Enzymol.１８５：３−７に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するものおよびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例、組織特異的調節配列）がある。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、目的蛋白の発現レベルなどの因子により異なり得ることを認識するはずである。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、ここに記載されたように（例、ＧＬ５０ファミリーの蛋白、ＧＬ５０蛋白の変異形態、融合蛋白など）核酸によりコードされる、融合蛋白またはペプチドを含む蛋白またはペプチドを製造し得る。
本発明の１の具体例において、ＧＬ５０分子の膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含むベクターを加工することができる。かかる構築物を用いて、ＧＬ５０分子を介する細胞内シグナリングをモジュレーションすることができ、優性な負の変異体として作用しうる。
【００７３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるＧＬ５０ポリペプチドの発現を目的として設計され得る。例えば、ＧＬ５０ポリペプチドは、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ（E.coli）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳類細胞で発現され得る。適当な宿主細胞については、Goeddel（１９９０）前出でさらに検討されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
原核生物における蛋白の発現は、融合または非融合蛋白の発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによりエシェリシア・コリ（E.coli）で行なわれることが多い。融合ベクターは、その中にコードされた蛋白に若干のアミノ酸を、通常には組換え蛋白のアミノ末端に付加する。上記融合ベクターは、典型的には１）組換え蛋白の発現を高める、２）組換え蛋白の溶解性を高める、および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換え蛋白の精製で有用である、といった３つの目的に適うものである。多くの場合、融合発現ベクターでは、蛋白分解性開裂部位が融合部分および組換え蛋白の接合点に導入されることにより、融合蛋白精製後に続いて組換え蛋白が融合部分から分離され得る。上記酵素およびそれらの同族認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼがある。典型的融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテク・インコーポレイテッド、Smith,D.B.および Johnson,K.S.（１９８８）Gene６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランド・バイオラブズ、ベヴァリー、マサチューセッツ）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）があり、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白またはプロテインＡを標的組換え蛋白に融合させる。
精製融合蛋白は、ＧＬ５０活性アッセイ（例、下記で詳述されている直接アッセイまたは競争的アッセイ）において、または例えばＧＬ５０ポリペプチドに特異的な抗体の生成に使用され得る。
【００７４】
適当な誘導性非融合エシェリシア・コリ（E.coli）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Amannら（１９８８）Gene６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Studierら（１９９０）Methods Enzymol.１８５：６０−８９）がある。ｐTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）が介在するＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下Ｔ７ｇｎ１遺伝子をもつ内在プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
エシェリシア・コリ（E.coli）における組換え蛋白発現を最大化させる１の戦略は、蛋白加水分解的に組換え蛋白を開裂する能力が損なわれた宿主細菌で蛋白を発現させることである（Gottesman,S.（１９９０）Methods Enzymol.１８５：１１９−１２８）。別の戦略は、発現ベクターへ挿入される核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸に関する個々のコドンが優先的にエシェリシア・コリ（E.coli）で利用されるものとなるようにする方法である（Wadaら（１９９２）Nucleic Acids Res.２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列の上記改変は、標準的なＤＮＡ合成技術により実施され得る。
【００７５】
もう１つの具体例において、ＧＬ５０発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母エス・セレベシアエ（S.cerevisiae）で発現するベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら（１９８７）EMBO J.６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（KurjanおよびHerskowitz（１９８２）Cell３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら（１９８７）Gene５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア）およびｐｉｃＺ（インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア）がある。
【００７６】
別法として、ＧＬ５０ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現され得る。培養昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞）における蛋白発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Smithら（１９８３）Mol.Cell Biol.３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow,V.A.および Summers,M.D.（１９８９）Virology１７０：３１−３９）がある。
【００７７】
さらに別の具体例において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Seed,B.（１９８７）Nature３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら（１９８７）EMBO J.６：１８７−１９５）がある。哺乳類細胞で使用される場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞に関する他の適当な発現系については、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）の１６および１７章参照。
【００７８】
もう１つの具体例において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定細胞型で優先的に核酸の発現を指令し得る（例、組織特異的調節エレメントは核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当業界では公知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Pinkertら（１９８７）Genes Dev.１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Calameおよび Eaton（１９８８）Adv.Immunol.４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体プロモーター（Winotoおよび Baltimore（１９８９）EMBO J.８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Banerjiら（１９８３）Cell３３：７２９−７４０、Queenおよび Baltimore（１９８３）Cell３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例、ニューロフィラメントプロモーター、Byrneおよび Ruddle（１９８９）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（１９８５）Science ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例、乳漿プロモーター、米国特許第４８７３３１６号およびヨーロッパ出願公開第２６４１６６号）がある。また、発達的調節プロモーター、例えばネズミホックス（hox）プロモーター（Kesselおよび Gruss（１９９０）Science２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Campesおよび Tilghman（１９８９）Genes Dev.３：５３７−５４６）も包含される。
さらに、哺乳類細胞で使用される誘導性調節系は当該分野では公知であり、例えば遺伝子発現が重金属イオン（例えば、Mayoら（１９８２）Cell ２９：９９−１０８、Brinsterら（１９８２）Nature２９６：３９−４２、Searleら（１９８５）Mol.Cell.Biol.５：１４８０−１４８９参照）、熱ショック（例、Nouerら（１９９１）Heat Shock Response中、Nouer,L.編、ＣＲＣ、ボカラトン、フロリダ、１６７−２２０頁参照）、ホルモン（例、Leeら（１９８１）Nature２９４：２２８−２３２、Hynesら（１９８１）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７８：２０３８−２０４２、Klockら（１９８７）Nature３２９：７３４−７３６、Israelおよび Kaufman(１９８９)Nucl.Acids Res.１７：２５８９−２６０４、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２３４３１参照）、ＦＫ５０６−関連分子（例、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１７参照）またはテトラサイクリン類（Gossen,M.および Bujard,H.（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８９：５５４７−５５５１、Gossen,M.ら（１９９５）Science２６８：１７６６−１７６９、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３参照）により調節される系がある。従って、別の態様では、本発明は、ＧＬ５０ ＤＮＡが誘導性真核生物プロモーターに作動可能に結合されていることにより、真核生物細胞におけるＧＬ５０ポリペプチドの誘導性発現が可能となる組換え発現ベクターを提供する。
【００７９】
さらに本発明は、アンチセンス方向で発現ベクターへクローン化された本発明ＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＧＬ５０ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする形で調節配列に作動可能に結合されている。アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に結合された調節配列であって、様々な細胞タイプにおけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指令するもの、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーが選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指令する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で製造される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルス形態であり得、その活性はベクターが導入されている細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節を検討したものについては、Weintraub,H.ら（１９８６）“Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”Reviews-Trends in Genetics、第１巻（１）を参照。
【００８０】
さらに本発明は、本発明組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関するものである。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」の語は、ここでは互換的に使用されている。上記の語は特定対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫または潜在的子孫も包含するものと理解すべきである。突然変異または環境的影響故にある種の修飾が後続の世代で行われ得るため、上記子孫は事実上親細胞と同一ではあり得ないが、依然としてここで使用されている語の範囲内に包含される。
宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。例えば、ＧＬ５０ポリペプチドは、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ（E.coli）、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に公知である。
【００８１】
ベクターＤＮＡは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技術により原核生物または真核生物細胞へ導入され得る。ここで使用されている「形質転換」および「トランスフェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション（脂質小胞を介する遺伝子導入）または電気穿孔を含め、外来核酸（例、ＤＮＡ）を宿主細胞へ導入するための様々な当業界公認の技術を包含するものとする。宿主細胞の適当な形質転換またはトランスフェクション方法は、Sambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual．2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９）、および他の研究室マニュアルに見出され得る。
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションを行うために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術により、細胞の小フラクションのみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムへ組込み得ることは知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー（例、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に興味の対象である遺伝子と一緒に宿主細胞へ導入される。好ましい選択マーカーには、薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものがある。選択マーカーをコードする核酸は、ＧＬ５０ポリペプチドをコードするものと同じベクターで宿主細胞へ導入され得るかまたは別々のベクターで導入され得る。導入された核酸により安定してトランスフェクションされた細胞は、薬剤選別により同定され得る（例、選択マーカー遺伝子が組込まれた細胞は生残り、他の細胞は死ぬ）。
【００８２】
本発明の宿主細胞、例えば培養された原核生物または真核生物宿主細胞は、ＧＬ５０ポリペプチドの製造（すなわち発現）に使用され得る。従って、本発明は、さらに本発明の宿主細胞を用いたＧＬ５０ポリペプチドの製造方法を提供する。前記方法の一態様は、ＧＬ５０ポリペプチドが製造されるように、本発明の宿主細胞（ＧＬ５０ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された）を適当な培養培地で培養することを含む。別の態様において、前記方法はさらに、培地または宿主細胞からのＧＬ５０ポリペプチドの単離を含む。
ある種の宿主細胞はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物の製造に使用され得る。例えば、一態様において、宿主細胞は、ＧＬ５０コーディング配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、上記宿主細胞を用いることにより、外来性ＧＬ５０配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物または内在性ＧＬ５０配列が改変された相同的組換え動物が製造され得る。上記動物は、ＧＬ５０ポリペプチドの機能および／または活性を研究並びにＧＬ５０活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに有用である。ここで使用されている「トランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはげっ歯動物、例えばラットまたはマウスであり、この場合動物の細胞の１個またはそれ以上が導入遺伝子（トランスジーン）を含んでいる。トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などがある。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組込まれており、成熟動物のゲノムに残存している外性ＤＮＡであり、それによってトランスジェニック動物の１種またはそれ以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現が指令される。ここで使用されている「相同的組換え動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであり、この場合内在性ＧＬ５０遺伝子は、動物の発生前に、動物の１の細胞、例えば動物の胚性細胞へ導入された内在性遺伝子および外来性ＤＮＡ分子間の相同的組換えにより改変されている。
【００８３】
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、ＧＬ５０をコードする核酸分子を受精卵母細胞の雄性前核へ導入し、偽妊娠した雌フォスター（養育）動物において卵母細胞を発達させることにより製造され得る。配列番号１、３または５のＧＬ５０ ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムへ導入遺伝子として導入され得る。別法として、ｈＧＬ５０遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスまたはラットＧＬ５０遺伝子が導入遺伝子として使用され得る。別法として、ＧＬ５０遺伝子相同体、例えば別のＧＬ５０ファミリーの構成員が、配列番号１、３または５のＧＬ５０ファミリーｃＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションに基いて単離され（さらに上記サブセクションＩで詳記されている）、導入遺伝子として使用され得る。また、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを導入遺伝子に含ませることにより、導入遺伝子の発現効率を高められ得る。組織特異的調節配列（複数も可）は、ＧＬ５０導入遺伝子へ作動可能に結合されることにより、特定細胞に対してＧＬ５０ポリペプチドの発現を指令し得る。胚操作および顕微注入によるトランスジェニック動物、特に例えばマウスといった動物の製造方法は、当業界では既に慣用的なものになっており、例えば、両方ともLederらによる米国特許第４７３６８６６号および同４８７０００９号、Wagnerらによる米国特許第４８７３１９１号および Hogan,B. Manipulating the Mouse Embryo（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８６）で報告されている。他のトランスジェニック動物の製造には類似方法も使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるＧＬ５０導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞におけるＧＬ５０ ｍＲＮＡの発現に基いて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を用いることにより、導入遺伝子を有する動物が追加的に産み出され得る。さらに、ＧＬ５０ポリペプチドをコードする導入遺伝子をもつトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子をもつ他のトランスジェニック動物へとさらに繁殖され得る。
【００８４】
相同組換え動物を作製するため、ＧＬ５０遺伝子の少なくとも一部分を含むもので、そこに欠失、付加または置換が導入されていることによりＧＬ５０遺伝子が改変、例えば機能的に崩壊されているベクターを製造する。ＧＬ５０遺伝子はヒト遺伝子（例、配列番号１、３または５）であり得るが、さらに好ましくはヒトＧＬ５０遺伝子の非ヒト相同体である（例、配列番号１、３または５のヌクレオチド配列とのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されたｃＤＮＡ）。例えば、ＧＬ５０遺伝子を用いることにより、マウスゲノムにおいて内在性ＧＬ５０遺伝子を改変するのに適した相同組換えベクターが構築され得る。好ましい態様では、相同組換え時、内在性ＧＬ５０遺伝子が機能崩壊されるようにベクターが設計される（すなわち、もはや機能性蛋白をコードしない、「ノックアウト」ベクターとも称される）。別法として、相同組換え時、内在性ＧＬ５０遺伝子は突然変異誘発または他の形で改変されるが、依然として機能性蛋白をコードするようにベクターが設計され得る（例、上流調節領域を改変することにより、内在性ＧＬ５０ポリペプチドの発現が改変され得る）。相同的組換えベクターでは、ＧＬ５０遺伝子の改変部分の５’および３’両末端にＧＬ５０遺伝子の追加的核酸配列が隣接していることにより、ベクターが担う内在性ＧＬ５０遺伝子および胚性幹細胞における内在性ＧＬ５０遺伝子間で相同組換えが行われ得る。付加的な隣接ＧＬ５０核酸配列は、内在性遺伝子との有効な相同的組換えにとって充分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’の両末端）がベクターに含まれている（例、相同的組換えベクターの記載については、Thomas,K.R.および Capecchi,M.R.（１９８７）Cell５１：５０３参照）。ベクターは胚性幹細胞系へ（例、電気穿孔により）導入され、導入されたＧＬ５０遺伝子が内在性ＧＬ５０遺伝子と相同的に組換えられている細胞が選択される（例、Li,E.ら（１９８２）Cell６９：９１５参照）。次いで、選択された細胞は動物（例、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラが形成される（例、Bradley,A.、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、Robertson,E.J.編（ＩＲＬ、オクスフォード、１９８７）１１３−１５２頁参照）。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌養育（フォスター）動物へ移植し、胚を分娩させ得る。生殖細胞に相同的組換えＤＮＡをもつ子孫を用いることにより、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的組換えＤＮＡを含む動物が産み出され得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.（１９９１）Curr.Opin.Biotechnol.２：８２３−８２９および Le MouellecらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３５４号、Smithiesらによる同第ＷＯ９１／０１１４０号、Zijlstraらによる同第ＷＯ９２／０９６８号、および Bernsらによる同第ＷＯ９３／０４１６９号に詳述されている。
【００８５】
前述のものに加えて、当業者であれば、相同的組換えに関して当該分野で知られている他の方法も本発明に適用され得ることを認識するはずである。酵素補助部位特異的組込み系は当該分野では公知であり、第２標的ＤＮＡ分子において予め決められた位置にＤＮＡ分子を組込むのに適用され得る。上記酵素補助組込み系の例には、Creリコンビナーゼ−lox標的系（例、Baubonis,W.および Sauer,B.（１９９３）Nucl.Acids Res.２１：２０２５−２０２９、および Fukushige,S.および Sauer,B.（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：７９０５−７９０９に記載されたもの）およびＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例、Dang,D.T.および Perrimon,N.（１９９２）Dev.Genet.１３：３６７−３７５、および Fiering,S.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：８４６９−８４７３に記載のもの）がある。テトラサイクリン調節誘導性相同的組換え系、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９４４２号およびＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０１３１３号に記載されたものもまた使用され得る。
例えば、別の態様では、導入遺伝子の発現調節を可能にすべく選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が製造され得る。かかる系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えば Laksoら（１９９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：６２３２−６２３６参照。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロマイシス・セレヴィシアエ（Saccharomyces cerebvisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gormanら（１９９１）Science２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が要求される。上記動物は、例えば、一方は選択された蛋白をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２種のトランスジェニック動物を交配することにより、「二重」トランスジェニック動物の構築を通して提供され得る。
【００８６】
また、ここに記載されているヒト以外のトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut,I.ら（１９９７）Nature３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／０７６６８号および同第ＷＯ９７／０７６６９号記載の方法により製造され得る。簡単に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞は、単離され、成長周期を脱し、Ｇ０期へ入るように誘導され得る。次いで、静止細胞は、例えば電気パルスの使用を通じて、静止細胞が単離されたのと同種の動物からの除核卵母細胞へ融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、それが桑実胚または芽細胞に発達するように培養され、次いで偽妊娠した雌フォスター動物へ移される。この雌フォスター動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンとなる。
【００８７】
Ｖ．医薬組成物
ＧＬ５０モジュレーター（例、ＧＬ５０阻害または刺激剤、例えば上記のＧＬ５０核酸分子、ポリペプチド、抗体または、ＧＬ５０活性のモジュレーターとして同定された化合物）は、投与に適した医薬組成物に含有され得る。上記組成物は、典型的には核酸分子、蛋白または抗体および医薬的に許容される担体を含む。ここで使用されている「医薬的に許容される担体」の語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを全て包含するものとする。医薬活性物質に関する上記媒質および薬剤の使用については当該分野では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的活性化合物もまた、組成物中に含有され得る。
【００８８】
本発明医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器またはマルチプルドーズバイアル（multiple dose vial）に封入され得る。
【００８９】
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得る。例えば、コーティング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。
滅菌注射可能溶液は、上記で列挙した成分の１種または組み合わせと共に適当な溶媒に必要量の活性化合物（例、ＧＬ５０ポリペプチドまたは抗ＧＬ５０抗体）を含有させ、次いで必要に応じて滅菌濾過することにより製造され得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤に活性化合物を組込むことにより製造される。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておいたその溶液から有効成分に加えて所望の追加的成分から成る粉末を得ることができる。
【００９０】
経口組成物は、一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入されるかまたは錠剤に圧縮成型され得る。経口治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と共に組込まれ、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて製造され得、流動担体中の化合物は経口適用され、スイッシュ（swish）され、吐き出されるかまたは嚥下される。医薬的に適合し得る結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または似た性質の化合物：結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）、滑剤、例えばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、例えばしょ糖またはサッカリン、または香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
【００９１】
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えば気体、例えば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリバリーされる。
【００９２】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段で行われ得る。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤が製剤に使用される。上記浸透剤は一般的に当業界では公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当該分野で一般的に知られている通り軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。
【００９３】
化合物はまた、直腸デリバリー用の坐薬（例、慣用的坐薬基剤、例えばカカオバターおよび他のグリセリド類による）または停留浣腸形態で製造され得る。
１の具体例において、モジュレーター剤は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体を用いて製造され、例えば移植体（インプラント）およびマイクロカプセル封入デリバリー系を含む放出制御製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。上記製剤の製造方法は、当業者には当然明白なものである。これらの材料はまた、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）はまた、医薬的に許容され得る担体としても使用され得る。これらは、例えば米国特許第４５２２８１１号に記載された通り、当業者に公知の方法に従い製造され得る。
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤するのは特に有利である。ここで使用されている単位用量形態は、処置される対象にとって単位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含む。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当該分野における制限に直接的に左右される。
【００９４】
上記化合物の毒性および治療効率は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定するため、細胞培養物または実験動物における標準製薬方法により測定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物が使用され得る場合、非感染細胞への潜在的損傷を最小にすることにより副作用を低減するためには罹患組織部位へ上記化合物を標的化するデリバリー系の設計は慎重に行うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための範囲の用量を製剤化するのに使用され得る。上記化合物の用量は、好ましくは毒性を全くまたはほとんど伴わずにＥＤ５０を含む循環濃度範囲内に存する。用量は、使用される用量形態および使用される投与経路によりこの範囲内で変動し得る。本発明方法で使用される化合物の場合、治療有効量は最初に細胞培養アッセイから評価され得る。用量を動物モデルで製剤化することにより、細胞培養で測定されたＩＣ５０（すなわち、徴候の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が得られる。上記情報を使用することにより、より正確にヒトにおける有用な用量が測定され得る。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【００９５】
本発明核酸分子は、ベクターへ挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許５３２８４７０参照）または定位注射（例えば Chenら（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.USA９１：３０５４−３０５７参照）により対象へデリバリーされ得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容し得る希釈液中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子デリバリービークルが埋封された遅速放出マトリックスを含み得る。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクターが組換え細胞から無傷で製造され得る場合（例、レトロウイルスベクター）、医薬製剤は遺伝子デリバリー系を生産する１個またはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬組成物は容器、投与に関する使用説明書と一緒にパックまたはディスペンサー中に封入され得る。
【００９６】
ＶＩ．本発明の使用および方法
ここに記載されている核酸分子、ポリペプチド、蛋白相同体および抗体は、下記方法の一つまたはそれ以上において使用され得る：ａ）例えば免疫応答のアップまたはダウンモジュレーションによる処置方法、ｂ）スクリーニングアッセイ、ｃ）予測的医学（例、診断的アッセイ、予知検査、モニター的臨床試験、および薬理遺伝学）。単離された本発明核酸分子は、下記で詳述されている通り、例えば、ＧＬ５０ポリペプチドを発現させ（例えば、遺伝子治療適用での宿主細胞における組換え発現ベクターによる）、ＧＬ５０ ｍＲＮＡ（例、生物学的サンプル中）またはＧＬ５０遺伝子における遺伝的改変を検出し、そしてＧＬ５０活性をモジュレーションするのに使用され得る。ＧＬ５０ポリペプチドは、ＧＬ５０阻害剤の不十分または過剰な生産を特徴とする疾患の処置に使用され得る。さらに、ＧＬ５０ポリペプチドは、天然に存するＧＬ５０リガンドに関するスクリーニング、ＧＬ５０活性をモジュレーションする薬剤または化合物に関するスクリーニング、およびＧＬ５０ポリペプチドの不十分または過剰な生産またはＧＬ５０野生型ポリペプチドと比べて低下または異常活性を有するＧＬ５０ポリペプチド形態の生産を特徴とする疾患の処置に使用され得る。さらに、本発明の抗ＧＬ５０抗体は、ＧＬ５０ポリペプチドの検出および単離、ＧＬ５０ポリペプチドの生物学的利用能の調節、ならびにＧＬ５０活性のモジュレーション、例えば、免疫応答のモジュレーションに使用され得る。
【００９７】
Ａ．処置方法：
本発明は、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に伴う疾患の危険がある（または感受性がある）かまたは罹患している対象の予防的および治療的処置方法を提供する。
【００９８】
１．予防方法
１の態様において、本発明は、ＧＬ５０ポリペプチドあるいはＧＬ５０ポリペプチド発現または少なくとも１つのＧＬ５０活性をモジュレーションする薬剤を対象に投与することによる、対象において異常なＧＬ５０発現または活性に伴う疾患または病状を防ぐ方法を提供する。異常なＧＬ５０発現または活性により誘発されるかまたはそれに起因する疾患の危険がある対象は、例えばここに記載されている診断または予知検査法のいずれかまたは組み合わせにより確認され得る。予防薬の投与は、疾患または障害を阻止するかまたは他の場合その進行を遅らせるように、ＧＬ５０の異常を特徴とする徴候が現れる前に行われ得る。ＧＬ５０の異常または症状のタイプにより、例えば、ＧＬ５０ポリペプチド、ＧＬ５０アゴニストまたはＧＬ５０アンタゴニスト薬剤が対象を処置するために使用され得る。適当な薬剤は、臨床的徴候に基いて決定され得、例えばここに記載されているスクリーニングアッセイを用いて確認され得る。
【００９９】
２．治療方法
本発明のもう１つの態様は、治療目的でＧＬ５０の発現または活性をモジュレーションする方法に関する。したがって、典型的な具体例において、本発明のモジュレーション方法は、ＧＬ５０ポリペプチドまたは細胞に結合したＧＬ５０ポリペプチドの１またはそれ以上の活性をモジュレーションする作用剤と細胞とを接触させることを含む。ＧＬ５０ポリペプチド活性をモジュレーションする作用剤は本明細書に記載の作用剤、例えば、核酸またはポリペプチド、ＧＬ５０ポリペプチドの天然に存する標的分子（例えば、ＧＬ５０リガンド）、ＧＬ５０抗体、ＧＬ５０アゴニストまたはアンタゴニスト、ＧＬ５０アゴニストまたはアンタゴニストのペプチドミネティクス、あるいは他の小型分子でありうる。１の具体例において、作用剤は１またはそれ以上のＧＬ５０活性を刺激する。かかる刺激性の作用剤の例は、ＧＬ５０と刺激性受容体との相互作用を刺激する作用剤、あるいはＧＬ５０と阻害性受容体との相互作用を阻害する作用剤等が挙げられ、例えば、ＧＬ５０ポリペプチド、ある種の可溶性形態のＧＬ５０分子、および細胞中に導入されたＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子である。もう１つの具体例において、作用剤は１またはそれ以上のＧＬ５０活性を阻害する。かかる阻害性作用剤の例は、ＧＬ５０と共刺激受容体との相互作用を減じる作用剤、あるいはＧＬ５０と阻害性受容体との相互作用を促進する作用剤等が挙げられ、例えば、アンチセンスＧＬ５０核酸分子、抗ＧＬ５０抗体、およびＧＬ５０阻害剤である。これらのモジュレーション方法をインビトロにおいて（例えば、細胞を作用剤とともに培養することにより）、あるいはインビボにおいて（例えば、作用剤を対象に投与することにより）行うことができる。そのようなものとして、本発明は、ＧＬ５０ポリペプチドのモジュレーションにより利益を受けるであろう疾病または疾患、例えば、免疫応答のアップモジュレーションまたはダウンモジュレーションから利益を受けるであろう疾病、あるいはＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の異常な発現または活性により特徴づけられる疾病にかかっている個体の治療方法を提供する。１の具体例において、該方法は、ＧＬ５０発現または活性をモジュレーション（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する作用剤（例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定される作用剤）または作用剤の組み合わせを投与することを含む。もう１つの具体例において、該方法は、治療薬としてのＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸を投与して、低下したあるいは異常なＧＬ５０発現または活性を補償することを含む。
ＧＬ５０が異常にダウンレギュレーションされている状況および／またはＧＬ５０活性の増大が有益な効果を奏する可能性のある状況においてはＧＬ５０活性の刺激が望ましい。同様に、ＧＬ５０が異常にアップレギュレーションされている状況および／またはＧＬ５０活性の低下が有益な効果を奏する可能性のある状況においてはＧＬ５０活性の阻害が望ましい。
【０１００】
３．免疫応答のダウンレギュレーション
ＧＬ５０ポリペプチドの機能をダウンレギュレーションし、そのことにより免疫応答をダウンレギュレーションすることが、多くの方法において可能である。ダウンレギュレーションはすでの進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形態であってもよく、あるいは免疫応答の誘導を防止することを含むものであってもよい。Ｔ細胞応答を抑制することにより、あるいはＴ細胞において特異的な寛容を誘導することにより、あるいは免疫応答を弱めるサイトカインの産生を誘導することにより、活性化されたＴ細胞の機能を阻害することができる。一般的には、Ｔ細胞応答の免疫抑制は活発で非抗原特異的なプロセスであり、Ｔ細胞応答性の低下を導くものであるが、Ｔ細胞の抑制剤への連続的な曝露が必要である。寛容とはＴ細胞の無応答性またはアネルギーを包含するものであり、一般的には抗原特異的あり、寛容化剤の投与を止めた後も持続的であるという点で、免疫抑制とは区別できる。機能的には、寛容は、寛容化剤不存在下で特異的抗原にＴ細胞が再曝露されてもＴ細胞がそれに応答しないことにより示される。
例えば、ＧＬ５０ポリペプチド（非活性化形態のＧＬ５０ポリペプチドを包含）または一次活性化シグナルを受け取ったＴ細胞に共刺激シグナルを送達しないようにする抗ＧＬ５０抗体を用いて、ＧＬ５０とＴ細胞上のそのリガンドとの相互作用をブロックし、そのことにより対象において免疫抑制を引き起こし、そして／あるいは寛容を誘導する特異的手段を提供することができる。かかる遮断性または阻害性形態のＧＬ５０ポリペプチドおよび融合蛋白およびブロッキング抗体は、本明細書に記載され当該分野で知られたインビトロ共刺激アッセイに添加された場合にＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害する能力により同定されうる。阻害性形態ｎＧＬ５０ポリペプチドとは対照的に、活性化形態（インタクトな細胞表面上のＧＬ５０ポリペプチドおよびある種の可溶性形態のＧＬ５０のごとき）は、好ましくは、共刺激シグナルをＴ細胞に伝達して、共刺激シグナルを受け取っていない活性化Ｔ細胞と比較して増大したサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）分泌を生じさせるものである。
１の具体例において、ＧＬ５０第１ペプチドが別のＢリンパ球抗原（例、Ｂ７−１またはＢ７−２）の活性を有する第２ペプチドに融合されて成る融合蛋白を用いることにより、Ｔ細胞により媒介される免疫応答がモジュレーションされうる。別法として、Ｂリンパ球抗原の活性を有する２種の別々のペプチド（例えば、ＧＬ５０ポリペプチドとＢ７−２および／またはＢ７−１ポリペプチド）、または阻止抗体の組み合わせ（例、ＧＬ５０ポリペプチドに対する抗体と抗Ｂ７−２および／またはＢ７−１モノクローナル抗体）を、単一組成物として合わせるかまたは別々に投与（同時または連続して）することにより、対象においてＴ細胞により媒介される免疫応答がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされ得る。さらに、ＧＬ５０ポリペプチド活性、Ｂ７−１および／またはＢ７−２活性を有する治療上有効量の１つまたはそれ以上のペプチドを他の免疫モジュレーション剤と一緒に用いて免疫応答に影響を及ぼすことができる。他の免疫モジュレーション剤の例は阻止抗体（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、および／またはＩＣＯＳに対するもの、あるいは他のＴ細胞マーカーに対するもの、あるいはサイトカインに対するもの）、融合蛋白（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ）、または免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）を包含する。
本発明の核酸分子から得られるペプチドは、Ｔ細胞の破壊によりＴ細胞機能をブロックする治療薬の構築に有用である。例えば、説明するように、Ｔ細胞上のリガンドに結合する可溶性、分泌形態のＧＬ５０ポリペプチドまたは抗体を用いることができる。標準的な遺伝子操作法によりかかる分泌形態を構築することができる。可溶性形態のＧＬ５０ポリペプチドまたは抗体をリシンのごとき毒素に連結することにより、Ｔ細胞活性化を防止できる作用剤を作成することができる。１またはそれ以上の免疫毒素の組み合わせ（例えば、Ｂ７−２−リシンおよび／またはＢ７−１−リシンとＧＬ５０−リシンとの組み合わせ）を患者に輸液して、Ｔ細胞、特に多量のＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、および／またはＩＣＯＳまたはＧＬ５０を発現する活性化Ｔ細胞の死滅を引き起こすことができる。
ＧＬ５０ポリペプチドの機能を防止するもう１つの方法はアンチセンスまたは三重鎖オリゴヌクレオチドの使用によるものである。例えば、ＧＬ５０ポリペプチド翻訳開始部位周辺領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。典型的には２００μｇ／ｍｌの１またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞培地に添加することができ、あるいは患者に投与してＧＬ５０ポリペプチドの合成を防止することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞により摂取され、ＧＬ５０ ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションして翻訳を妨害する。別法として、二本鎖ＤＮＡに結合して三重鎖構築物を形成し、ＤＮＡをほどけないようにし、転写を妨げるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。いずれの場合にも、結果としてＧＬ５０ポリペプチドの合成がブロックされる。
ＧＬ５０ポリペプチド機能、例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成の防止は、例えば組織、皮膚および臓器移植の状況、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）において有用であろう。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは組織移植における組織破壊を減少させるはずである。典型的には、組織移植において、免疫細胞が異物として認識後、移植体を破壊する免疫反応により移植拒絶が開始される。Ｂ７リンパ球抗原と免疫細胞上のその本来のリガンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子（例えば、可溶性、モノマー形態のＧＬ５０ポリペプチド単独、あるいはモノマー形態の異なるＢ７ペプチド（例、Ｂ７−１、Ｂ７−２）または阻止抗体との混合）の移植前の投与は、対応する共刺激シグナルの伝達なしに、その分子と免疫細胞上の本来のリガンドとの結合を誘導する。この様式でのＢリンパ球抗原機能のブロックは、Ｔ細胞のごとき免疫細胞によるサイトカイン合成を防止し、かくして、免疫抑制剤として作用する。さらに、共刺激の欠如はＴ細胞をアネルギー化させるに十分でもあり、そのことにより対象に寛容が誘導される。Ｂリンパ球抗原ブロック剤により長期の寛容の誘導により、これらのブロッキング剤の繰り返し投与を回避することができる。対象において十分な免疫抑制または寛容を達成するためには、Ｂリンパ球抗原の組み合わせの機能をブロックすることも必要であるかもしれない。例えば、移植前に、これらの各抗原の活性を有する可溶性形態のペプチドの組み合わせまたはこれらの抗原に対するブロッキング抗体を投与（別々に、あるいは１の組成物中に一緒にして）することにより、Ｂ７−１とＧＬ５０、Ｂ７−２とＧＬ５０、あるいはＢ７−１とＢ７−２とＧＬ５０ポリペプチドの機能をブロックすることが望ましいかもしれない。別法として、他のＴ細胞マーカーに対するブロッキング抗体またはサイトカインに対するブロッキング抗体、他の融合蛋白、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、あるいは免疫抑制剤のごとき他の抑制剤とともに阻害性形態のＧＬ５０ポリペプチドを用いることもできる。
器官移植拒絶反応またはＧＶＨＤを防止することにおける特定のブロッキング剤の有効性を、動物モデルを用いて評価することができ、それらはヒトにおける有効性を予測するものである。Ｂ７ポリペプチドは種間でアミノ酸保存性を示すので、他のＧＬ５０抗原は種間で機能発揮でき、そのことによりヒト蛋白から恒星される剤を動物系において使用することができる。使用できる適当な系の例は、ラットにおける同種心臓移植片およびマウスにおける異種膵臓島細胞移植片を包含し、いずれも、Lenschow et al., Science, 257: 789-792 (1992)およびTurka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105 (1992)に記載されたように、インビボにおけるＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白の免疫抑制効果を試験するために使用されている。さらに、ＧＶＨＤのネズミモデル（Paul ed., Fundemental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847参照）を用いて、インビボにおいて疾病の発症に対するＧＬ５０ポリペプチドのブロッキング機能の効果を調べることができる。
例えば、ＧＬ５０ポリペプチド活性を有するペプチド単独、あるいはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−２活性を有するペプチドとの組み合わせを用いてＧＬ５０ポリペプチド機能をブロックすることも、自己免疫疾患の治療に有用でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対し反応性を示し、疾患の病状に関与するサイトカインおよび自己抗体の生産を促す免疫細胞の不適当な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を阻止することにより、病気の徴候が低減化または排除され得る。共刺激性受容体とＢ７分子の受容体：リガンド相互作用を破壊することによる免疫細胞の共刺激性を遮断する試薬を投与することは、免疫細胞活性化を阻止し、病気のプロセスに関与し得る自己抗体またはサイトカインの生産を阻止するのに有用である。さらに、ブロッキング剤は、病気の長期にわたる緩和を導くことのできる自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導しうる。自己免疫疾患の防止または軽減におけるブロッキング剤の効力は、ヒト自己免疫疾患の充分に特性確認された動物モデルを用いて測定され得る。例としては、ネズミの実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、ネズミの自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、およびネズミの実験的筋無力症がある（Paul編、Fundamental Immunology，ラベン・プレス、ニューヨーク、１９８９、８４０−８５６頁参照）。
アトピー性アレルギーにおけるＩｇＥ抗体応答は非常にＴ細胞依存性であり、かくして、Ｂリンパ球抗原により誘導されるＴ細胞活性化の阻害はアレルギーおよびアレルギー反応の処置において治療上有用でありうる。阻害形態のＧＬ５０ポリペプチド、例えば、ＧＬ５０活性を有するペプチドのみ、あるいはＢ７−１またはＢ７−２のごとき別のＢリンパ球抗原との組み合わせをアレルギー対象に投与して、対象中のＴ細胞により媒介されるアレルギー性応答を阻害することができる。適当なＭＨＣ分子と抱合したアレルゲンに曝露することにより、Ｔ細胞のＧＬ５０共刺激の阻害を行うことができる。アレルゲンの侵入経路および肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥの着生パターンにより、アレルギー反応は本来的に全身的であっても、局所的であってもよい。かくして、阻害形態のＧＬ５０ポリペプチドを適切に投与することにより、Ｔ細胞により媒介されるアレルギー応答を局所的または全身的に阻害することが必要となりうる。
ＧＬ５０抗原機能のブロックによるＴ細胞活性化の阻害はまた、免疫細胞のウイルス感染症において治療上重要であり得る。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の場合、免疫細胞活性化によりウイルス複製が刺激される。ＧＬ５０機能のブロックにより、ウイルス複製が低レベルとなり、それによって、ＡＩＤＳの経過が改善され得る。さらに、Ｂリンパ球抗原の組み合わせ、すなわち、ＧＬ５０とＢ７−２および／またはＢ７−１の機能をブロックすることも望ましいかもしれない。
本発明の１の具体例において、ＧＬ５０ファミリーのメンバーは、Ｔ細胞によるＩＬ−１０分泌を優先的に誘導する（Hutloff et al. (1990) Nature 397:263）。ＩＬ−１０はＴｈ２タイプの応答の発生を促進する一方で、例えば、マクロファージ活性化を減じることにより、ある種のサイトカインの産生のダウンモジュレーション、および細胞により媒介される免疫のダウンモジュレーションを導く（Bai et al. (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 83:117; Koch et al. (1996) J. Exp. Med. 184:741; de Vries (1995) Ann. Med. 27:537）。したがって、本発明の１の具体例において、ＧＬ５０ファミリーのメンバーの活性を増大させることにより、細胞により媒介される免疫応答のダウンモジュレーションを誘導することができる。かくして、本発明の１の具体例において、ＧＬ５０活性を増大させることにより、細胞により媒介される免疫応答が減じられる。
【０１０１】
４．免疫応答のアップレギュレーション
例えば、ＧＬ５０の刺激活性を促進することによる免疫応答のアップレギュレーションもまた治療において有用でありうる。免疫応答のアップレギュレーションは、存在する免疫応答を高めるかまたは初回免疫応答を誘導する形態であり得る。例えば、ＧＬ５０活性を刺激することによる免疫応答の増大はウイルス感染のケースにおいて有用でありうる。ウイルス感染は主に細胞毒性Ｔ細胞により排除される。本発明によれば、Ｔ細胞上のその本来のリガンドと相互作用するＧＬ５０ポリペプチドは、少なくともいくつかのＴ細胞の細胞毒性活性を増大させうえう。活性化形態のＧＬ５０単独のほかに、活性化形態の別のＢ７ファミリーのポリペプチドと組み合わせて、共刺激経路によりＴ細胞活性を刺激することにより、ウイルスのより迅速な排除または完全な排除が有益であろう状況において治療上有用となるであろう。これらの状況は、ウイルス性皮膚疾患、例えばヘルペスまたは帯状疱疹を包含し、それえらの場合において、１価または多価の可溶性ＧＬ５０ポリペプチドまたはかかるペプチドとＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−２活性を有するペプチドとの組み合わせを局所的に皮膚にデリバリーする。さらに、インフルエンザ、通常のカゼ、および脳炎のごｔき全身性ウイルス疾患を、刺激性形態のＧＬ５０を全身投与することにより軽減することができる。
別法として、Ｔ細胞を患者から取り、インビトロにおいてＴ細胞をウイルス抗原を付加したＡＰＣあるいはＧＬ５０ペプチド発現ＡＰＣ（単独で、あるいはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−２活性を有するペプチドとともに）で、あるいはこれと刺激性形態の可溶性ＧＬ５０ペプチド（単独で、あるいはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−２活性を有するペプチドとともに）と一緒にしてＴ細胞を共刺激し、次いで、インビトロで活性化されたＴ細胞を患者に再導入することにより、感染した患者において抗ウイルス免疫応答を増強してもよい。抗ウイルス応答を増強させるもう１つの方法は、患者から感染細胞を単離し、本明細書記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸分子で感染細胞をトランスフェクションして、細胞がその表面上にＧＬ５０分子の全体または一部を発現するようにし、そしてトランスフェクション細胞を患者に再導入することである。感染細胞は共刺激シグナルをＴ細胞にデリバリーでき、そのことによりＴ細胞をインビボにおいて活性化させる。
種々の病原体に対するワクチン中に刺激性形態のＧＬ５０分子を予防的に使用してもよい。病原体、例えばウイルスに対する免疫性は、適当なアジュバント中の刺激性形態のＧＬ５０とともにウイルス蛋白を接種することにより誘導されうる。別法として、病原性抗原およびＧＬ５０抗原活性を有するペプチドの両方の遺伝子をコードする発現ベクター、例えば、ウイルス蛋白をコードする核酸分子および本明細書記載のＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸分子を発現するように加工されたワクシニアウイルス発現ベクターを接種に使用することができる。種々の手段により、例えば、注射（例えば筋肉内、皮内、または粒子加速物質または圧縮気体を用いて粒子を皮膚へ注入させる遺伝子銃による表皮へのＤＮＡ被覆金粒子のバイオリスティック注射（Haynesら、１９９６、J.Biotechnol.４４：３７））によりＤＮＡワクチンを投与することができる。別法として、非侵襲的手段によりＤＮＡワクチンを投与することもできる。例えば、純粋または脂質製剤化ＤＮＡは、呼吸器系または標的とされる他の場所へデリバリーされ得、例えばＤＮＡの経口デリバリーによるパイエル板がある（Schubbert．１９９７、Proc.Natl.Acad.Sci.USA９４：９６１）。弱毒化微生物は、粘膜表面へのデリバリーに使用され得る（Sizemoreら、１９９５、Science、２７０：２９）。１の具体例において、刺激性形態のＧＬ５０分子と同時に抗原を投与する。
別の適用例において、ＧＬ５０機能のアップレギュレーションまたは促進は腫瘍免疫の誘導に有用である。１の具体例において、ＧＬ５０分子を細胞に結合させる。少なくとも１種のＧＬ５０抗原をコードする核酸分子でトランスフェクションされた腫瘍細胞（例、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経細胞芽細胞腫、癌腫）を対象に投与することにより、対象における腫瘍特異的寛容が克服され得る。所望ならば、腫瘍細胞は、Ｂ７ポリペプチド（例、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＧＬ５０）の組み合わせを発現するようにトランスフェクションされ得る。例えば、患者から得られた腫瘍細胞は、ＧＬ５０ポリペプチド単独またはＢ７−１活性および／またはＢ７−２活性を有するペプチドとの組み合わせの発現を指令する発現ベクターによりエクスビボでトランスフェクションされ得る。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻すことにより、トランスフェクションされた細胞の表面でペプチド発現が誘発される。別法として、遺伝子療法技術は、インビボトランスフェクション用腫瘍細胞の標的化に使用され得る。
腫瘍細胞表面上のＧＬ５０分子の活性を有するペプチドの存在は、Ｔ細胞に必要な共刺激シグナルを提供して、トランスフェクションされた腫瘍細胞に対するＴ細胞により媒介される免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスII分子を欠くか、または充分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスII分子を発現し得ない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白およびβ２ミクログロブリン蛋白またはＭＨＣクラスIIα鎖蛋白およびＭＨＣクラスIIβ鎖蛋白の全部または一部（例、細胞質−ドメイン先端切除部分）をコードする核酸でトランスフェクションされることにより、細胞表面でＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスII蛋白を発現し得る。Ｂリンパ球抗原（例、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＧＬ５０）の活性を有するペプチドと共に適当なクラスＩまたはクラスII ＭＨＣを発現させると、トランスフェクション腫瘍細胞に対してＴ細胞仲介免疫応答が誘導される。所望により、ＭＨＣクラスII関連蛋白、例えばインバリアント（invariant）鎖の発現を遮断するアンチセンス構築物をコードする遺伝子はまた、ＧＬ５０ポリペプチドをコードするＤＮＡと共トランスフェクションされることにより、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導し得る。Ｂ７陰性ネズミ腫瘍細胞によるＢ７−１の発現は、腫瘍拒絶および長期間防御を伴うＴ細胞により媒介される特異的免疫を誘導することにより、マウスにおける腫瘍攻撃を行うことが示された（Chen,L.ら（１９９２）Cell７１、１０９３−１１０２、Townsend,S.E.および Allison,J.P.（１９９３）Science２５９、３６８−３７０、Baskar,S.ら（１９９３）Proc.Natl.Acad.Sci.９０、５６８７−５６９０）。かくして、ヒト対象における免疫細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象において腫瘍特異的寛容を克服するのに充分であり得る。
もう１つの具体例において、当該分野において知られている方法を用いて、活性化形態の１またはそれ以上のＧＬ５０ペプチド（例えば、細胞表面上に発現される）を、腫瘍を有する患者に投与してＴ細胞への共刺激シグナルを提供し、抗腫瘍免疫を誘導することができる。
特別な具体例において、免疫細胞を対象から入手し、エクスビボで培養してＴ細胞集団を増大させる。さらなる態様において、その後、免疫細胞を対象に投与する。例えば、当該分野において知られているように、Ｔ細胞に一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルを提供することにより、Ｔ細胞をインビトロで刺激して増殖させることができる。また、様々な形態のＧＬ５０ポリペプチドを用いてＴ細胞の増殖を共刺激することもできる。１の具体例において、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２９４３６号記載の方法に従い免疫細胞をエクスビボで培養する。共刺激分子は、可溶性であり得、細胞膜に結合されるかまたは固体表面、例えばビーズに結合され得る。
【０１０２】
Ｂ．ＧＬ５０により媒介される共刺激により誘導されるサイトカインの同定
ここに記載されているＧＬ５０分子を用いて、ＧＬ５０ポリペプチドによる刺激に応答してＴ細胞により産生されるサイトカインを同定することができる。Ｔ細胞は１次活性化シグナルで最適以下にインビトロ刺激され得、例えば、Ｔ細胞は、ホルボールエステル、抗ＣＤ３抗体または好ましくはＭＨＣクラスII分子を随伴した抗原で刺激されることができ、刺激性形態のＧＬ５０抗原により共刺激シグナルを与えられることができ、例えばＧＬ５０ポリペプチドをコードしその表面でペプチドを発現させる核酸でトランスフェクションされた細胞により、またはペプチドの可溶性刺激性形態により、共刺激シグナルを与えられることができる。培地へ放出された既知サイトカインは、ＥＬＩＳＡによって、あるいはサイトカインを遮断してサイトカインにより誘導されるＴ細胞増殖または他の細胞タイプの増殖を阻止する抗体の能力によって同定され得る。ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡキットはＩＬ−７阻止抗体の場合と同様ジェンザイム（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から入手できる。ＩＬ−９およびＩＬ−１２に対する阻止抗体は、ジェネティクス・インスティテュート（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から入手できる。
上記のインビトロＴ細胞共刺激性アッセイは、共刺激によりモジュレーションされ得る新規サイトカイン同定方法においても使用され得る。例えば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路の刺激がＩＬ−２分泌を促進すると思われる場合、ＩＣＯＳ経路の刺激はＩＬ−１０分泌を促進すると思われる（Hutloffら、１９９、Nature ３９７：２６３）。共刺激時、例えば免疫細胞増殖時に誘導された特定活性が既知サイトカインに対する阻止抗体の付加により阻止され得ない場合、この活性は未知サイトカインの作用から生じ得る。共刺激後、このサイトカインは慣用的方法により培地から精製され、その活性はＴ細胞増殖誘導能力により測定され得る。
寛容の誘導においてある一定の役割を演じ得るサイトカインを同定するため、上記のインビトロＴ細胞共刺激性アッセイが使用され得る。この場合、Ｔ細胞は、１次活性化シグナルを与えられ、選択されたサイトカインと接触させられるが、共刺激性シグナルは与えられない。免疫細胞を洗浄し、休止させた後、細胞を１次活性化シグナルおよび共刺激性シグナルの両方により再攻撃する。免疫細胞が応答（例、サイトカインを増殖または生産）しない場合、それらは寛容にされており、サイトカインは寛容の誘導を阻止していない。しかしながら、免疫細胞が応答する場合、寛容の誘導はサイトカインにより阻止されている。寛容の誘導を阻止し得るそれらのサイトカイン類は、移植レシピエントまたは自己免疫疾患対象において寛容を誘導するより有効な手段としてＢリンパ球抗原を遮断する試薬と共にインビボ遮断に関して標的化され得る。例えば、サイトカイン阻止抗体とともにＧＬ５０阻止薬剤を投与することができる。
【０１０３】
Ｃ．共刺激に影響する分子の同定
本発明の新規Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドのもう１つの適用例は、共刺激リガンド結合および／または共刺激後のＴ細胞を介する細胞内シグナリングのモジュレーターである未同定分子を発見するためのスクリーニングアッセイにおいてこれらのペプチドの１種またはそれ以上を使用することである。例えば、ＧＬ５０分子の活性を有するペプチドを用いる固相結合アッセイを用いて、ＧＬ５０が結合する分子および／または抗原と適当なＴ細胞リガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳ）との結合を阻害する分子を同定することができる。さらに、上記のインビトロＴ細胞共刺激アッセイを用いて、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害するこれらの分子の能力を調べることにより、共刺激後にＴ細胞を介する細胞内シグナリングを妨害する分子（しかし、ＧＬ５０分子のそのリガンドへの結合を妨害しない）を同定することができる。例えば、化合物シクロスポリンＡおよびラパマイシンはＴ細胞受容体経路を介する刺激によるＴ細胞活性化を阻害するが、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を介する刺激によるＴ細胞活性化を阻害しない。それゆえ、異なった細胞内シグナリング経路が共刺激に関与している。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４および／またはＩＣＯＳ経路を介する細胞内シグナリングを妨害する分子は、シクロスポリンＡまたはラパマイシンのごときさらなる免疫抑制剤の使用とともに、あるいはその使用をしなくても、免疫抑制剤として有効でありうる。
【０１０４】
Ｄ．ＧＬ５０ポリペプチドの発現をモジュレーションする分子の同定
本発明の蛋白およびペプチドを用いて生産される抗体は、細胞上のＧＬ５０ポリペプチド発現をモジュレーションする分子に関するスクリーニングアッセイで使用され得る。例えば、ＧＬ５０ポリペプチド発現の変化（例、活性化シグナルに応答して）において最高点を極める細胞内シグナル伝達経路をモジュレーションする分子は、細胞表面における１またはそれ以上のＧＬ５０ポリペプチドの発現をアッセイすることにより同定され得る。分子の存在下における抗ＧＬ５０抗体による免疫蛍光染色の低減化は、分子が細胞内シグナリングを阻止することを示す。ＧＬ５０ポリペプチド発現をアップレギュレーションする分子により、免疫蛍光染色が促進される。別法として、ポリペプチド発現に対する分子の作用は、本発明プローブを用いて細胞のＧＬ５０ ｍＲＮＡレベルを検出することにより測定され得る。例えば、ＧＬ５０ポリペプチドを発現する細胞を、試験される分子と接触させると、細胞におけるｍＲＮＡレベルの増加または減少が、標準的技術、例えばノーザン・ハイブリダイゼーション分析または検出可能マーカーで標識されたｃＤＮＡプローブを用いるｍＲＮＡまたは総ポリ（Ａ＋）ＲＮＡの慣用的ドットブロットにより検出され得る。ＧＬ５０ポリペプチドの発現をモジュレートする分子は、免疫応答を単独または上記の可溶性の阻止性または刺激性試薬と共にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションするのに治療上有用である。例えば、ＧＬ５０の発現を阻害する分子は免疫抑制を目的としてＧＬ５０阻止剤と一緒に投与され得る。上記アッセイにおいて試験され得る分子の例としては、例えば、ＩＬ−４、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびプロスタグランジンのごときサイトカイン類がある。
【０１０５】
【０１０６】
Ｅ．スクリーニングアッセイ
本発明により、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその部分に結合するモジュレーターであって、例えばＧＬ５０の発現またはＧＬ５０の活性に刺激または阻害作用を有するモジュレーター、すなわち候補もしくは試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小型分子または他の薬物)を同定するための方法が提供される。
１の具体例では、本発明により、ＧＬ５０ポリペプチドもしくはポリペプチドまたはその生物活性部分に結合する、またはその活性を調節する候補もしくは試験化合物、例えばＧＬ５０ポリペプチドが結合パートナー(例えば同種リガンドまたは細胞内相互作用物質)と相互作用する能力を調節する候補もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。例えば、１の具体例では、ＧＬ５０の細胞外ドメインの部分を用いることができる。他の具体例では、ＧＬ５０分子の細胞質ドメインの部分を用いることができる。他の具体例では、ＧＬ５０分子の膜貫通ドメインの部分を用いることができる。
【０１０７】
１の具体例では、ＧＬ５０ドメインを含んでいるポリペプチドの変種型をスクリーニングアッセイに用いることができる。例えば、(例えば、例えばランダムまたはカセット変異形成を用いて変異形成された)アミノ酸の変更を含むＧＬ５０ドメインを、目的のスクリーニングアッセイに用いることができる。別に、ＧＬ５０細胞内ドメインのスプライシング変種(例えば、ＧＬ５０-１細胞内ドメイン、ＧＬ５０-２細胞質ドメインまたは、染色体２１の配列決定で同定される、もしくはＲＡＣＥ・ＰＣＲにより同定される追加エキソン)を用いて化合物をスクリーニングすることができる。そのようなＧＬ５０変種を用いて、一定範囲のＧＬ５０分子に対して活性を有する化合物を同定することができ、およびＧＬ５０の活性に不可欠なアミノ酸残基を同定することができる。
【０１０８】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行(spatially addressable parallel)固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「１-ビーズ１-化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選抜を用いる合成ライブラリー法を含む、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くの方法のいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリー法はペプチドのライブラリーに限定されるが、他の４つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小型分子ライブラリーに適用することができる(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【０１０９】
分子ライブラリーの合成に関する方法の例は、当該分野において、例えばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233において見出すことができる。
【０１１０】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner USP 5,223,409)、胞子(Ladner USP '409)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージ上に(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390)提供され得る(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 既出)。
【０１１１】
他の具体例では、アッセイは、ＧＬ５０標的分子(例えば、ＩＣＯＳなどのＧＬ５０リガンドまたは細胞内相互作用分子)を発現している細胞を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＧＬ５０標的分子の活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)能力を測定することを含む、細胞に基づくアッセイである。１の具体例では、ＧＬ５０標的分子は例えば２または３のハイブリッドアッセイで同定される。他の具体例では、ＧＬ５０相互作用分子はＧＬ５０を隣接分子に架橋結合させた後、抗ＧＬ５０抗体を用いて免疫沈降させる標準的な方法を用いて同定される。
【０１１２】
１の具体例では、ヒドロパシープロットにより限定される膜貫通および／または細胞内領域の部分、またはエキソン構造により限定されるドメインを２-ハイブリッドアッセイでエサ(bait)として用いて、これらのドメインに対する結合パートナーを決定することができる。相互作用している蛋白をアッセイに用いて、可能ならば産生または質的対照アッセイとして、相互作用パートナーへのＧＬ５０の結合程度を定量することができる。他の具体例では、細胞質ドメインスプライス変種を異なる２-ハイブリッドアッセイに用いて、いずれかのＧＬ５０スプライス変種に結合するあらゆる範囲の蛋白相互作用物質を収集することができる。
【０１１３】
ＧＬ５０標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えばＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０標的分子またはそのリガンドに結合、もしくはそれらと相互作用する能力を測定することにより達成することができる。ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０分子のリガンドに結合する、またはそれらと相互作用する能力を測定することは、例えば直接結合により達成することができる。
直接結合アッセイにて、ＧＬ５０ポリペプチドをラジオアイソトープまたは酵素ラベルと結合させ、ＧＬ５０標的分子に対するＧＬ５０ポリペプチドの結合を、複合体中の標識ＧＬ５０ポリペプチドを検出することにより測定することができる。例えば、ＧＬ５０分子、例えばＧＬ５０ポリペプチドは、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的または間接的に標識することができ、そしてラジオアイソトープは放射崩壊直接測定またはシンチレーション測定により検出することができる。別に、ＧＬ５０分子は、例えばセイヨウワサビペロキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼ、および適当な基質の生成物への変換の測定により検出することができる酵素標識で酵素標識することができる。
【０１１４】
また、ＧＬ５０とその標的分子の間の相互作用を調節する化合物の能力を、相互作用物質を全く標識せずに決定することも、本発明の範囲内にある。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、ＧＬ５０も標的分子も標識せずに、ＧＬ５０とその標的分子との相互作用を検出することができる。McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906-1912。本明細書中に用いる「マイクロフィジオメーター」(例えば、サイトセンサー)は、細胞がその周囲を酸性化する速度を、光-アドレス可能電位差センサー(light-addressable potentiometric sensor)(ＬＡＰＳ)を用いて測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物とレセプターの間の相互作用の指標として用いることができる。
【０１１５】
好ましい具体例では、ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０結合パートナーに結合する、またはそれと相互作用する能力を決定することは、結合パートナーの活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性(例えば、チロシン残基にてＧＬ５０または他の基質をリン酸化する)は、標的の細胞セカンドメッセンジャーの誘導を検出すること、適当な基質における標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子(検出可能なマーカー、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードしている核酸に作用的に結合する標的-反応調節因子を含む)の誘導を検出すること、あるいは標的-調節細胞反応を検出することにより決定することができる。例えば、ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０標的分子に結合する能力、または相互作用する能力を決定することは、例えば、増殖アッセイで化合物がＴ細胞の共刺激をダウンモジュレートする能力を測定することにより、あるいはＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０ポリペプチドの一部を認識する抗体に結合するその能力を妨害することにより達成することができる。
【０１１６】
さらに別の具体例では、本発明のアッセイは、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する無細胞アッセイである。試験化合物のＧＬ５０ポリペプチドへの結合は、前記のように直接または間接的に決定することができる。好ましい具体例では、アッセイは、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、ＧＬ５０ポリペプチドと結合してアッセイ混合物を形成する公知化合物と接触させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、次いで試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドと相互作用する能力を決定することを特徴とするが、該アッセイにおいては、試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドと相互作用する能力を決定することは、公知化合物と比較して試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に選択的に結合する能力を決定することを特徴とする。
【０１１７】
他の具体例では、アッセイは、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＧＬポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節(例えば、刺激または阻害)する能力を決定する無細胞アッセイである。試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドの活性をモジュレートする能力を決定することは、例えば、ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０標的分子またはリガンドに結合する能力を、前記の直接的に結合を決定するための方法の一つにより測定することにより達成することができる。ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０標的分子に結合する能力を決定することは、リアルタイム・バイオモレキュラー・インターアクション分析(ＢＩＡ)などの方法を用いて達成することもできる。Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書中に用いる「ＢＩＡ」は、生物特異的な相互作用をリアルタイムで、相互作用物質(例えばＢＩＡコア)を標識することなく研究するための方法である。表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)の視覚現象を、生物分子間のリアルタイムの反応の指標として用いることができる。
【０１１８】
他の具体例では、試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドの活性を調節する能力を測定することは、ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０標的分子(例えばＧＬ５０媒介性シグナル伝達経路成分)の活性をさらに調節する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適当な標的に対するエフェクター分子の活性、または適当な標的へのエフェクターの結合を、前記のように決定することができる。
さらに別の具体例では、無細胞アッセイは、ＧＬ５０ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、ＧＬ５０ポリペプチドと結合してアッセイ混合物を形成する公知化合物と接触させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、次いで試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドと相互作用する能力を決定することを特徴とするが、該アッセイにおいては、試験化合物がＧＬ５０ポリペプチドと相互作用する能力を測定することは、ＧＬ５０ポリペプチドがＧＬ５０標的分子に選択的に結合する能力、またはその活性を選択的に調節する能力を決定することを特徴とする。
【０１１９】
本発明の無細胞アッセイは、蛋白(例えば、ＧＬ５０ポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分、またはＧＬ５０が結合するレセプター)の可溶性形態および／または膜結合形態の両方の使用に基づく。膜結合形態の蛋白(例えば、細胞表面ＧＬ５０レセプター)を用いる無細胞アッセイの場合、膜結合形態の蛋白が溶液中で維持されるように溶解剤を用いることが望ましい。そのような溶解剤の例には、ｎ-オクチルグルコシド、ｎ-ドデシルマルトシド、オクタノイル-Ｎ-メチルグルカミド、デカノイル-Ｎ-メチルグルカミド、トライトン(登録商標)Ｘ-１００、トライトン(登録商標)Ｘ-１１４、テシト(登録商標)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、３-［(３-コラミドプロピル)ジメチルアミニオ］-１-プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、３-［(３-コラミドプロピル)ジメチルアミニオ］-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホネート(ＤＨＡＰＳＯ)または、Ｎ-ドデシル＝Ｎ，Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１２０】
本発明の前記アッセイ法の１具体例では、１または両方の蛋白の、複合体を形成していない形態からのその複合体形態の分離を促進するため、ならびにアッセイの自動化を図るために、ＧＬ５０またはその標的分子いずれかを固定することが望ましい。試験化合物のＧＬ５０ポリペプチドに対する結合、または候補化合物の存在下および不在下でのＧＬ５０ポリペプチドの標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適したいずれかの容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が含まれる。１具体例では、１または両方の蛋白がマトリックスに結合するのを可能とするドメインを付加する融合蛋白を提供することができる。例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ/ＧＬ５０融合蛋白またはグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ/標的融合蛋白をグルタチオンセファローゼビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導性マイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれを試験化合物、または試験化合物および非吸着標的蛋白もしくはＧＬ５０ポリペプチドのいずれかと結合させ、そして混合物を複合体形成に資する条件下(例えば、塩およびｐＨの生理的条件)でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、全ての結合していない成分を除き、ビーズの場合、マトリックスを固定化し、複合体を、例えば前記のように直接的または間接的に決定する。別に、複合体をマトリックスから分離し、ＧＬ５０結合または活性のレベルを標準的な方法を用いて決定することができる。
【０１２１】
蛋白をマトリックス上に固定するための他の方法を、本発明のスクリーニングアッセイに用いることもできる。例えば、ＧＬ５０ポリペプチドまたはＧＬ５０標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化ＧＬ５０ポリペプチドまたは標的分子は、当該分野で周知の方法(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチン-ＮＨＳ(Ｎ-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製することができ、ストレプトアビジンでコートされた９６ウェルのプレート(Pierce Chemical)に固定することができる。別法として、ＧＬ５０ポリペプチドまたは標的分子と反応するがＧＬ５０ポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、未結合性標的またはＧＬ５０ポリペプチドをウェル中で抗体結合によりトラップすることができる。ＧＳＴ-固定化複合体に関する前記方法に加え、そのような複合体を検出するための方法には、ＧＬ５０ポリペプチドまたは標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＧＬ５０ポリペプチドまたは標的分子に関連する酵素活性を検出することに依存する酵素-結合アッセイが含まれる。
【０１２２】
他の具体例では、細胞を候補化合物と接触させ、そしてＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の細胞中での発現を決定する方法にて、ＧＬ５０の発現のモジュレーターを同定する。ＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の候補化合物の存在下での発現のレベルを、ＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の候補化合物の不在下での発現のレベルと比較する。次いでこの比較に基づき、候補化合物をＧＬ５０の発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、ＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の発現が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるよりも大きい(例えば、統計学的に有意に大きい)場合、候補化合物は、ＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の発現の刺激物質と同定される。あるいは、ＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の発現が、候補化合物の存在下において、その不在下におけるよりも少ない(例えば、統計学的に有意に少ない)場合、候補化合物はＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の発現の阻害物質と同定される。ＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白の細胞中での発現のレベルは、本明細書中に開示するＧＬ５０ｍＲＮＡまたは蛋白を検出するための方法により決定することができる。
【０１２３】
本発明のさらに別の態様では、ＧＬ５０ポリペプチド、例えば可溶性または膜結合分子またはその部分(例えば、膜貫通または細胞質部分)を、２-ハイブリッドアッセイまたは３-ハイブリッドアッセイにおいて「エサ(bait)蛋白」として用いて(U.S. 特許No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; and Brent WO94/10300を参照されたい)、ＧＬ５０と結合するまたはそれらと相互作用する他の蛋白(「ＧＬ５０結合蛋白」または「ＧＬ５０ｂｐ」)、ならびにＧＬ５０活性に関与する他の蛋白を同定することができる。そのようなＧＬ５０-結合蛋白は、例えば、ＧＬ５０により媒介される情報伝達経路のダウンストリームエレメントとして、ＧＬ５０ポリペプチドまたはＧＬ５０標的によるシグナルの伝達に関与している可能性もある。あるいは、そのようなＧＬ５０-結合蛋白は、ＧＬ５０阻害物質である可能性がある。
【０１２４】
２-ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成る、ほとんどの転写因子の基本単位性に基づく。簡単には、アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一構築物において、ＧＬ５０ポリペプチドをコードする遺伝子を公知の転写因子(例えば、ＧＡＬ-４)のＤＮＡ結合ドメインをコードしている遺伝子に結合させる。他の構築物において、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、同定されていない蛋白(「プレイ(prey)」または「サンプル」)をコードするＤＮＡ配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に結合させる。「バイト(bait)」と「プレイ」蛋白がインビボで相互作用してＧＬ５０-依存性複合体を形成することができる場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインが接近する。この接近により、転写因子に反応する転写調節部位に作動可能な状態で連結されているレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現は検出することができ、機能的転写因子を含んでいる細胞コロニーを単離し、そしてそれを用いてＧＬ５０ポリペプチドと相互作用する蛋白をコードするクローン遺伝子を得ることができる。
【０１２５】
本発明は、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤に関する。従って、本明細書中に開示するように同定された薬剤を適当な動物モデルでさらに用いることは、本発明の範囲内のことである。例えば、本明細書中に開示するように同定される薬剤(例えば、ＧＬ５０調節剤、アンチセンスＧＬ５０核酸分子、ＧＬ５０-特異的抗体、またはＧＬ５０-結合パートナー)を動物モデルに用いて、そのような薬剤を用いた処置の効力、毒性または副作用を決定することができる。別に、本明細書中に記載するように同定される薬剤を動物モデルに用いて、そのような薬剤の活性のメカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤の本明細書に開示する処置のための使用に関する。
【０１２６】
Ｆ．検出アッセイ
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列(および対応する完全遺伝子配列)の部分またはフラグメントを、多くの方法でポリヌクレオチド試薬として用いることができる。例えば、これらの配列を用いて、(ｉ)染色体上にそのそれぞれの遺伝子をマッピングし、こうして遺伝的疾患に関連する遺伝子領域の位置を確認する；(ｉｉ)微量な生物試料から個人を同定する(組織タイピング)；および、(ｉｉｉ)生物試料の法医学的同定に役立てることができる。これらの適用を、以下のサブセクションに記載する。
【０１２７】
１．染色体マッピング
ＧＬ５０はヒト染色体２１ｑ２２に位置付けられている。従って、本明細書中に開示するＧＬ５０ヌクレオチド配列の部分またはフラグメント(コーディングおよび非コーディング両方)を用いて、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と関連付けることができる。
【０１２８】
染色体上の配列の物理的な位置を、遺伝子マップデータと関連付けることができる。(そのようなデータは、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryよりオンラインで入手できるV. McKusick, Mendelian Inheritance in Manに見出される。)同じ染色体領域にマップされた場合、遺伝子と疾患の間の関連性を、次いで、例えばEgeland, J. et al. (1987) Nature, 325: 783-787に開示されている連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により同定することができる。
【０１２９】
さらに、ＧＬ５０遺伝子に関連する疾患に罹患している個人と罹患していない個人の間のＤＮＡ配列の違いを決定することができる。罹患している個人の幾人かまたは全員に変異が認められるが、罹患していない個人には全く認められない場合、変異が特定疾患の原因であることが考えられる。罹患している個人と罹患していない個人の比較には、一般に、染色体展開から確認可能な、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能な染色体における構造変更、欠失または転座などをまず探すことが含まれる。最終的に、数人の個人からの遺伝子の完全な配列決定を行い、変異の存在を確認し、変異を遺伝子多型から区別することができる。
【０１３０】
２．組織タイピング
本発明のＧＬ５０配列を用いて、微量生物試料から個人を同定することもできる。例えば、合衆国軍は、その人員の同定のために制限酵素フラグメント長遺伝子多型(ＲＦＬＰ)を用いることを考えている。この方法では、個人のゲノムＤＮＡを１またはそれ以上の制限酵素で消化し、サザンブロットにおけるプローブとし、同定のためのユニークなバンドを得る。この方法は、ポジティブな同定を困難にしている、失われる、切断される、または盗用される可能性のある「ドッグ・タグ(Dog Tags)」の現在の制限に影響されない。本発明の配列は、(Ｕ.Ｓ.特許５,２７２,０５７に記載されている)ＲＦＬＰのための追加的ＤＮＡマーカーとして有用である。
【０１３１】
さらに、本発明の配列を用いて、個人のゲノムの選択された部分の実際の塩基-対-塩基ＤＮＡ配列を決定する別の方法を提供することができる。つまり、本明細書中に開示するＧＬ５０ヌクレオチド配列を用いて、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製することができる。次いで、これらのプライマーを用いて個人のＤＮＡを増幅し、その後、それを配列決定することができる。
この方法で調製された、個人からの対応するＤＮＡ配列のパネルより、各個人は対立遺伝子の違いによりそのようなＤＮＡ配列のユニークなセットを有するので、ユニークに個人を同定することができる。本発明の配列を用いて、個人および組織からそのような同定配列を得ることができる。本発明のＧＬ５０ヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分をユニークに表す。対立遺伝子の変化は、ある程度はこれらの配列のコーディング領域に生じるが、大部分は非コーディング領域に生じる。個々人の間の対立遺伝子の変化は、各５００塩基につき約１つの頻度で起こることが見積もられる。本明細書中に開示する配列のそれぞれは、ある程度まで、個人からのＤＮＡを同定目的のために比較することができるスタンダードとして用いることができる。多くの遺伝子多型は非コーディング領域に生じるので、各人を区別するのに少数の配列が必要である。それぞれが１００塩基の非コーディング増幅配列を生じる配列番号１、３または５の非コーディング配列により、プライマーのパネルを用いてポジティブな個人の同定が容易に提供され得る。予測されたコーディング配列を用いる場合、ポジティブな個人の同定のためのより適当なプライマーの数は５００-２,０００であろう。
【０１３２】
本明細書に開示するＧＬ５０ヌクレオチド配列由来の試薬のパネルを用いて個人に関するユニークな同定データベースを作成する場合、これらの同じ試薬を後で用いてその個人からの組織を同定することができる。ユニークな同定データベースを用いて、生存している、または死亡した個人のポジティブな同定を、極端に少量の組織試料からなすことができる。
【０１３３】
３．法生物学(forensic biology)における部分ＧＬ５０配列の使用
ＤＮＡに基づく同定法は、法生物学にも用いることができる。法生物学は、犯罪現場で見出される生物学的証拠の遺伝学的分類を、例えば犯罪の犯人をポジティブに同定するための手段として用いている科学分野である。そのような同定を行うのに、ＰＣＲ技術を用いて、犯罪現場で見出される組織、例えば髪もしくは皮膚、または体液、例えば血液、唾液、または精液などの非常に少量の生物学的試料から採取されたＤＮＡ配列を増幅することができる。増幅された配列を次いでスタンダードと比較することができ、これにより生物試料の起源を同定することが可能となる。
【０１３４】
本発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特定の位置に標的され、例えば別の「同定マーカー」(即ち、特定の個人にユニークな他のＤＮＡ配列)を提供することによりＤＮＡに基づく法的同定の確実性を高めることができるポリヌクレオチド試薬、例えばＰＣＲプライマーを提供することができる。前記のように、実際の塩基配列情報を、制限酵素により作成されたフラグメントにより形成されるパターンに確実に代わるものとして同定に用いることができる。遺伝子多型の大部分は非コーディング領域に生じるので、非コーディング領域に標的化される配列がこの使用のために特に適当であり、この方法を用いて、個人を区別することがいっそう容易になる。ポリヌクレオチド試薬の例には、ＧＬ５０ヌクレオチド配列、または少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基の長さを有するその部分が含まれる。
【０１３５】
本明細書中に開示するＧＬ５０ヌクレオチド配列をさらに用いて、特定組織、例えば脳組織を同定するために、例えばインサイチュハイブリダイゼーション法で用いることができるポリヌクレオチド試薬、例えば標識プローブ、または標識可能なプローブを提供することができる。これは、法病理学者が未知起源の組織を与えられる場合に非常に有用であり得る。そのようなＧＬ５０プローブのパネルを用いて、組織を種により、および／または器官のタイプにより組織を同定することができる。
同様に、これらの試薬、例えばＧＬ５０プライマーまたはプローブを用いて、コンタミネーションに関して組織培養物をスクリーニングする(即ち、培養物中の異なるタイプの細胞の混合物の存在をスクリーニングする)ことができる。
【０１３６】
Ｇ．予測薬
本発明は、予後(予測)目的のために診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験をモニターすることを用い、それにより個人を予防的に処置する予測医学の分野にも適する。従って、本発明の一態様は、生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)中でのＧＬ５０ポリペプチドおよび／または核酸の発現ならびにＧＬ５０の活性を測定し、それにより、個人が異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する病気または疾患に罹患しているかどうか、または疾患が進行する危険にあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明により、個人がＧＬ５０ポリペプチド、核酸の発現または活性に関連する疾患を進行させる危険にあるかどうかを決定するための予後(または予測)アッセイも提供される。例えば、ＧＬ５０遺伝子の変異を、生物試料中でアッセイすることができる。そのようなアッセイを予後または予測目的のために用い、それにより個人を、ＧＬ５０ポリペプチド、核酸の発現または活性により特徴付けられる、またはそれに関連する疾患の発症前に予防的に処置することができる。
本発明の他の態様は、臨床試験で、ＧＬ５０の発現または活性における試薬(例えば、薬物、化合物)の影響をモニターすることに関する。
これらのおよび他の試薬を、以下のセクションにさらに詳細に記載する。
【０１３７】
１．診断アッセイ
ＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の生物試料中での存在または不在を検出するための典型的な方法は、生物試料を試験対象から得、次いでＧＬ５０ポリペプチドまたはＧＬ５０ポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ，ゲノムＤＮＡ)を検出することができる化合物または試薬と生物試料と接触させて、生物試料中のＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の存在を検出することを特徴とする。ＧＬ５０ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい試薬は、ＧＬ５０ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１、３または５の核酸のようなｈＧＬ５０核酸、またはその部分、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドの長さの、およびＧＬ５０ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の診断アッセイにおける使用に適した他のプローブを、本明細書中に記載する。
【０１３８】
ＧＬ５０ポリペプチドを検出するのに好ましい試薬は、ＧＬ５０ポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは検出可能なラベルを有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。非処置の抗体、またはそのフラグメント(例えばＦａｂまたはＦ(ａｂ’)２)を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標識された」なる用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合させる(即ち、物理的に結合させる)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに、プローブまたは抗体を直接標識される他の試薬と反応させることにより間接的に標識することが含まれるものとする。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびＤＮＡプローブをビオチンで末端標識して、それを蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することが含まれる。「生物試料」なる用語には、対象から単離された組織、細胞および生物体液、ならびに対象中に存在する組織、細胞および体液が含まれるものとする。即ち、本発明の検出方法を用いて生物試料においてＧＬ５０ｍＲＮＡ、蛋白またはゲノムＤＮＡを、インビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、ＧＬ５０ｍＲＮＡのインビトロでの検出法には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。ＧＬ５０ポリペプチドのインビトロでの検出法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡｓ)、ウェスタン・ブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が含まれる。ＧＬ５０ゲノムＤＮＡのインビトロでの検出法にはサザンハイブリダイゼーションが含まれる。ＧＬ５０ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ法には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、ＧＬ５０ポリペプチドのインビボでの検出法には、標識された抗-ＧＬ抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を標準的な画像処理法で検出することができる放射能活性マーカーで標識することができる。
【０１３９】
１の具体例において、生物試料は試験対象からの蛋白分子を含む。別法として、生物試料には試験対象からのｍＲＮＡ分子または試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物試料は、対象から慣用的方法により単離される血清試料である。
他の具体例では、該方法はさらに、対照の生物試料を対照の対象から得ること、対照の試料をＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または試薬と接触させて、生物試料中のＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を検出すること、および対照試料中のＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中のＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを特徴とする。
【０１４０】
本発明には、生物試料中のＧＬ５０の存在を検出するためのキットも包含される。例えば、該キットには、生物試料中のＧＬ５０ポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出することができる標識化合物または試薬、試料中のＧＬ５０の量を測定する装置、および試料中のＧＬ５０の量をスタンダードと比較する装置を含めることができる。該化合物または試薬は適当な容器に封入することができる。キットには、さらに、キットをＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸を検出するのに用いるための使用説明書を含めることができる。
【０１４１】
２．予後アッセイ
本明細書中に開示する診断法をさらに用いて、異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する病気または疾患を有する、またはそれらを進行させる危険にある対象を同定するのに用いることができる。例えば、本明細書に開示するアッセイ、例えば前記の診断アッセイまたは以下のアッセイを用いて、ＧＬ５０ポリペプチド、核酸の発現または活性に関連する疾患を有するまたは進行させる危険性を有する対象を同定することができる。つまり、本発明により、異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する病気または疾患を同定するための方法であって、試験試料を対象から得、ＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ)を検出する方法が提供され、ここで、ＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の存在が、異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する病気または疾患を有する、またはそれらを進行させる危険にある患者の診断的特徴である。本明細書中で使用する「試験試料」は、関心の対象から得られる生物試料をいう。例えば、試験試料は、生物学的液体(例えば血清)、細胞試料、または組織から得ることができる。
【０１４２】
さらに、本明細書に開示する予知アッセイを用いて、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティクス、蛋白、ペプチド、核酸、小型分子または他の薬物候補)を対象に投与して、異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する病気または疾患を処置することができるかどうかを決定することができる。つまり、本発明により、異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する疾患のための薬剤を用いて対象を効果的に処置することができるかどうかを決定するための方法であって、試験試料を得、ＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の発現または活性を検出する方法(例えば、ここで、ＧＬ５０ポリペプチドまたは核酸の発現または活性が大きいことは、異常なＧＬ５０の発現または活性に関連する疾患を治療するための薬剤を投与することができる対象の診断的特徴である)が提供される。
【０１４３】
本発明の方法を用いて、ＧＬ５０遺伝子の遺伝学的変化を検出し、それにより、変化した遺伝子を有する対象がＧＬ５０遺伝子に関連する疾患を患う危険にあるかどうかを決定することができる。好ましい具体例では、該方法は、対象からの細胞の試料において、ＧＬ５０-蛋白をコードしている遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも一つの変化により特徴付けられる遺伝学的変化の存在または不在、またはＧＬ５０遺伝子の誤発現を検出することを特徴とする。例えば、そのような遺伝学的変化は、１)ＧＬ５０遺伝子からの１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２)ＧＬ５０遺伝子への１またはそれ以上のヌクレオチドの付加；３)ＧＬ５０遺伝子の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４)ＧＬ５０遺伝子の染色体転位；５)ＧＬ５０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルでの変化；６)ＧＬ５０遺伝子、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な変化；７)ＧＬ５０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；８)ＧＬ５０ポリペプチドの非野生型レベル；９)ＧＬ５０遺伝子の対立遺伝子欠失、および１０)ＧＬ５０ポリペプチドの翻訳後の不適当な変更、の少なくとも一つの存在を確認することにより検出することができる。本明細書に開示するように、ＧＬ５０遺伝子の変更を検出するのに用いることができる、当該分野で公知の多数のアッセイ法が存在する。好ましい生物試料は、対象から慣用的手段により単離された組織または血清試料、例えば心臓組織の試料である。
【０１４４】
ある具体例において、変更の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば、Ｕ.Ｓ.特許第４,６８３,１９５および４,６８３,２０２を参照されたい)、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ・ＰＣＲにおける、あるいは、ライゲーション連鎖反応(ＬＣＲ)における(例えば、Landegran et al. (1988) Science 241: 1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照されたい)プローブ／プライマーの使用が含まれ、後者はＧＬ５０遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る(Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682を参照されたい)。この方法は、対象から細胞の試料を収集すること、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離すること、ＧＬ５０遺伝子(存在する場合)のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で、ＧＬ５０遺伝子に特異的にハイブリダイズする１またはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触させること、次いで増幅産物の存在または不在を検出すること、あるいは増幅産物のサイズを検出し、および対照試料と長さを比較することを特徴とする。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に開示する変異を検出するのに用いられる方法のいずれかと組み合わせて予備的増幅ステップとして用いられることが望ましいかもしれないと考えられる。
【０１４５】
別の増幅法には、自己保存配列複製(Guatelli, J. C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878)、転写増幅システム(Kwoh, D. Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177)、Ｑ-ベータレプリカーゼ(Lizardi, P. M. et al. (1988) Bio-Technology 6: 1197)またはいずれかの他の核酸増幅法が含まれ、この後、当業者に周知の方法を用いる増幅分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数で存在している場合に核酸分子を検出するのに特に有用である。
【０１４６】
他の具体例では、試料細胞からのＧＬ５０遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンの変化により同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントの長さのサイズをゲル電気泳動により決定し、そして比較する。フラグメントの長さのサイズに関する試料および対照ＤＮＡ間の違いが、試料ＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムを使用して(例えば、Ｕ.Ｓ.特許第５,４９８,５３１を参照されたい)、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的変異の存在を評価することができる。
【０１４７】
他の具体例では、ＧＬ５０の遺伝的変異は、試料および対照の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることにより同定することができる(Cronin, M. T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759)。例えば、ＧＬ５０の遺伝的変異は、Cronin, M. T. et al（既出）に開示されているような光により生成する(light-generated)ＤＮＡプローブを含む二次元アレイ中にて同定することができ、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料および対照中のＤＮＡの長い鎖を探査し、配列がオーバーラップしているプローブの線状アレイ(array)を作成することにより配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異の同定が可能となる。この工程を行った後に、検出された全ての変種または変異に相補的な、小さな、特異化されたプローブアレイを用いることにより特異的変異の特定を可能とする二次ハイブリダイゼーションアレイを用いる。各変異アレイはパラレルなプローブのセットから構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、もう一方は、変異遺伝子に相補的である。
【０１４８】
さらにもう一つの具体例では、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを用いてＧＬ５０遺伝子を直接配列決定し、試料ＧＬ５０の配列を対応する野生型(対照)の配列と比較することにより変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Maxam and Gilbert((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)またはSanger((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)により開発された方法に基づくものが含まれる。診断アッセイ((1995) Biotechniques 19: 448)を行う場合、質量分析(例えば、ＰＣＴ国際公開ＮＯ.ＷＯ９４／１６１０１;Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162; およびGriffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照されたい)を含む種々の自動配列決定法のいずれかを用いることができることも考えられる。
【０１４９】
ＧＬ５０遺伝子の変異を検出するための他の方法には、切断試薬からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基対を検出する方法が含まれる(Myers et al. (1985) Science 230: 1242)。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野における方法は、野生型ＧＬ５０配列を含む(標識された)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得られる潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二本鎖を提供することで始まる。二本鎖の分子を、対照および試料鎖間の塩基対ミスマッチのために存在しているであろう二本鎖分子の一本鎖領域を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＲＮａｓｅで処理することができ、およびＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素消化することができる。他の具体例では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分けし、変異の部位を決定する。例えば、Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al.(1992) Methods Enzumol. 217: 286-295を参照されたい。好ましい具体例では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを、検出のために標識することができる。
【０１５０】
さらに別の具体例では、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１またはそれ以上の蛋白(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を、細胞の試料から得られたＧＬ５０における点突然変異を検出およびマッピングするために規定されたシステムにて利用する。例えば、イー・コリのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＴミスマッチでＡを切断し、ヒーラ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662)。典型的な具体例に従い、ＧＬ５０配列、例えば野生型ＧＬ５０配列に基づくプローブを、試験細胞からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、そして切断産物を、それが存在する場合には、電気泳動プロトコールなどから検出することができる。例えば、Ｕ.Ｓ.特許第５,４５９,０３９を参照されたい。
【０１５１】
他の具体例では、電気泳動の移動度の変化を用いてＧＬ５０遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖構造遺伝子多型(ＳＳＣＰ)を用いて変異型および野生型核酸間の電気泳動の移動度の違いを検出してよい(Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA: 86: 2766、Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; およびHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79)。試料および対照のＧＬ５０核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させ、次いで復元させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列によって異なり、電気泳動の移動度に関して結果的に生じる変化から、わずか一つの塩基変化も検出することができる。ＤＮＡフラグメントは標識プローブを用いて標識または検出することができる。アッセイの感度は、(ＤＮＡよりも)二次構造が配列の変化に対してよりセンシティブなＲＮＡを用いることにより高めることができる。好ましい具体例では、目的の方法は、ヘテロ二本鎖の分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するものである(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5)。
【０１５２】
さらに別の具体例では、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異型または野生型フラグメントの移動を、変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする(Myers et al. (1985) Nature 313: 495)。ＤＧＧＥを分析法として用いる場合、例えば約４０ｂｐの高融点のＧＣに富むＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲにより追加することによりＤＮＡを修飾して、ＤＮＡが完全に変性しないことを保証する。さらなる具体例では、温度勾配を変性勾配の代わりに用いて、対照と試料ＤＮＡの移動度の違いを同定する(Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753)。
【０１５３】
点突然変異を検出するための他の方法の例には、制限するものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸張が含まれる。例えば、公知の変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが認められる場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができる(Saiki et al. (1986) Nature 324: 164); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230)。オリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に結合し、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異体にハイブリダイズする。
【０１５４】
別法として、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅法を、本発明と組み合わせて用いてよい。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に興味ある変異を有していてもよく(その結果、増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する)(Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448)、あるいは、適当な条件下でミスマッチによりポリメラーゼの伸張が妨げられ、または減じられ得る１プライマーの３’末端に興味ある変異を有していてもよい(Prossner et al. (1993) Tibtech 11: 238)。加えて、新規な制限酵素部位を変異の領域に導入して、切断に基づいて検出を行うことが望ましい可能性もある(Gasparini et al. (1992) nol. Cell Probes 6:1)。所定の具体例において、増幅は、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて行ってもよいことが予想される(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189)。そのような場合、ライゲーションは、５’配列の３’末端に完全なマッチ(match)が存在する場合にのみ起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定部位での公知の変異の存在を検出することができる。
【０１５５】
例えば、本明細書に開示する少なくとも一つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予め包装された診断用キットであって、例えばＧＬ５０遺伝子に関与する疾患または病気の兆項またはファミリーヒストリーを示している患者を診断するために臨床環境で簡便に用いることができる診断用キットを利用することにより、本明細書に記載した方法を行うことができる。
さらに、ＧＬ５０を発現するあらゆる細胞タイプまたは組織を本明細書に開示する予後アッセイに用いてよい。
【０１５６】
ＶＩＩ．ＧＬ５０モジュレーション剤の投与
本発明のＧＬ５０モジュレーション剤を、Ｔ細胞媒介免疫反応を高めるため、または抑制するために、インビボでの医薬的投与に適した生物学的に適合した形態で対象に投与する。「インビボでの投与に適した生物学的に適合した形態」とは、蛋白の治療的効果があらゆる毒性作用に勝っている、投与される蛋白の形態を意味する。対象なる用語には、免疫反応を誘発することができる生きている生物体、例えば哺乳動物が含まれるものとする。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらの形質転換種が含まれる。本明細書に開示する薬剤の投与は、薬剤単独、あるいは医薬上許容される担体と組み合わせた薬剤の治療上有効量を含むいずれかの薬理学的形態であり得る。
【０１５７】
本発明の治療用組成物の治療上有効量の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量として定義される。例えば、ＧＬ５０調節剤の治療上有効量は、個人の疾患状態、年齢、性および体重などの要因、および個人において所望の反応を誘発するペプチドの能力により変化する可能性がある。最適の治療的反応が提供されるように投与管理を調整してよい。例えば、いくつかに分割した投与量を毎日投与してよく、または投与量は治療状況の緊急度合いにより示されるように比例的に減じてもよい。
【０１５８】
ＧＬ５０調節剤(例えば、ペプチド、核酸分子または抗体)は、注射(皮下、静脈内など)、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与によるなど、慣用的方法で投与してよい。投与の経路により、化合物を酵素、酸または化合物を不活性化させる可能性のある他の自然条件の作用から保護するための物質で活性化合物をコーティングしてもよい。例えば、ＧＬ５０モジュレーション剤を非経口投与以外の投与で投与するためには、その不活性化を防ぐための物質でペプチドをコーティングする、またはそのような物質とペプチドを同時投与することが必要であり得る。
【０１５９】
ＧＬ５０モジュレーション剤は、適当な担体、希釈剤またはアジュバントにて個人に投与してよく、酵素インヒビターと共に、またはリポソームなどの適当な担体中にて同時投与してよい。医薬上許容される希釈剤には、生理的食塩水およびバッファー水溶液が含まれる。アジュバントはその最も広い意味で用いられ、およびインターフェロンなどのいずれかの免疫刺激化合物を含む。本明細書中で意図されるアジュバントには、レゾシノール、非イオン界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ-ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどが含まれる。酵素インヒビターには、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート(ＤＥＥＰ)およびトラシロールが含まれる。リポソームには、ウォーター-イン-オイル-イン-ウォーターエマルジョンならびに常套のリポソーム(Sterna et al., (1984) J. Neuroimmunol 7:27)が含まれる。
【０１６０】
活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与してよい。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中に、およびオイル中に調製することもできる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は微生物の生育を妨げるための保存剤を含んでもよい。
注射使用に適した医薬組成物には、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散物、および無菌注射用溶液または分散物を即席調製するための無菌粉末が含まれる。全ての場合に組成物は無菌でなければならず、さらに容易に注射できる程度まで流動的でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、および細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)および適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散物であり得る。適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合は所望される粒子サイズの維持により、さらに界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、ポリアルコール、例えばマンニトールなど、ソルビトール、塩化ナトリウムが組成物中に含まれることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【０１６１】
無菌注射用溶液は、活性化合物(例えば、ＧＬ５０ポリペプチドまたは抗-ＧＬ５０抗体)を所望の量で適当な溶媒中に、前記活性成分の１またはその組み合わせを所望のように含有させた後、濾過滅菌を行うことにより調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、塩基性分散物媒質、および前に列記したものからの所望の他の活性成分を含む無菌ビヒクルに組み入れることにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分(例えば、ペプチド)といずれかの所望される追加の活性成分から成る粉末が、予め滅菌濾過したそれらの溶液から得られる。
【０１６２】
活性成分が前記のように適切に保護される場合、蛋白は、例えば不活性希釈剤または同化性食用担体を用いて経口投与することができる。本明細書に用いられる「医薬上許容される担体」には、いずれかおよび全ての溶媒、分散物媒質、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。医薬上許容される活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は当該分野で周知である。いずれかの常套の媒質または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるそれらの使用が意図される。補足的活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１６３】
投与の簡便さ、および投与量の均一化のために、非経口組成物を投与単位形態として処方することが特に有利である。本明細書に用いられる投与単位は、治療される哺乳動物対象に単一投与製剤として適した物理的に別個の単位を言い、各単位は所望の治療効果を生ずるべく計算された所定の活性化合物を所望の医薬担体と共に含む。本発明の投与単位製剤の詳細は、(ａ)活性化合物特有の特性および達成されるべき特定の治療効果、および(ｂ)個人の感受性を処置するためにそのような活性化合物を配合することに関する当該分野固有の制限により示され、直接これらに依存する。
【０１６４】
本発明の１の具体例では、ＧＬ５０ポリペプチドに対する治療上有効量の抗体が対象に投与される。本明細書中に規定するように、治療上有効量の抗体(すなわち、有効投与量)は、約０.００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびよりいっそう好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。病気または疾患の重篤度、これまでの治療、対象の一般的健康状態および／または年齢、および存在する他の病気を含むがこれらには制限されない所定の要因が、対象を効果的に処置するのに必要とされる投与量に影響を与える可能性があることが当業者は認識するであろう。さらに、治療上有効量の抗体を用いる対象の処置には、単一の処置が含まれ得、好ましくは処置のシリーズが含まれ得る。好ましい具体例では、対象を約０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、週に１回約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間およびよりいっそう好ましくは約４、５または６週間処置する。治療に用いられる抗体の有効投与量は、特定の処置中に、増加または減じてもよい。投与量の変更は、前記のような診断アッセイの結果から得てもよい。
【０１６５】
ＧＬ５０ポリペプチドの発現または活性における薬剤(例えば、薬物または化合物)の影響をモニターすることは、基礎的な薬物のスクリーニングのみならず、臨床試験にも適用することができる。例えば、本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより決定される、ＧＬ５０遺伝子の発現、蛋白レベルを増すための、またはＧＬ５０の活性をアップレギュレートするための試薬の有効性は、低下したＧＬ５０遺伝子発現、蛋白レベルまたはダウンレギュレートされたＧＬ５０の活性を示している対象の臨床試験でモニターすることができる。別法として、スクリーニングアッセイにより決定される、ＧＬ５０遺伝子の発現、蛋白レベルを減じるための、またはＧＬ５０の活性をダウンレギュレートするための試薬の有効性は、増加したＧＬ５０遺伝子発現、蛋白レベルまたはアップレギュレートされたＧＬ５０の活性を示している対象の臨床試験でモニターすることができる。このような臨床試験では、ＧＬ５０遺伝子、および好ましくは疾患に影響を与えた他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現型の「リードアウト(read out)」またはマーカーとして用いることができる。
【０１６６】
例えば、および制限するものではないが、(例えば、前記のスクリーニングアッセイで同定される)ＧＬ５０の活性を調節する薬剤(例えば、化合物、薬物または小型分子)を用いた処置により細胞中で調節される、ＧＬ５０含有遺伝子を同定することができる。つまり、ＧＬ５０関連疾患における薬剤の影響を、例えば臨床試験で研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、そしてＧＬ５０およびＧＬ５０関連疾患に関わる他の遺伝子、それぞれの発現レベルを分析することができる。遺伝子発現のレベル(即ち、遺伝子発現パターン)は、本明細書中に開示するノーザンブロット分析またはＲＴ-ＰＣＲにより、別法として、産生される蛋白の量を測定することにより、本明細書中に開示する方法の一つにより、あるいはＧＬ５０または他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより定量することができる。この方法では、遺伝子の発現パターンを、薬剤に対する細胞の生理的反応の指標であるマーカーとして供することができる。従って、この反応状態を、薬剤を用いた個人の処置前、およびその処置中の種々の時点で測定してもよい。
【０１６７】
好ましい具体例では、本発明により、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティクス、蛋白、ペプチド、核酸、小型分子、または本明細書中に開示するスクリーニングアッセイにより同定される他の薬物候補)を用いる対象の処置の有効性をモニターするための方法であって、(ｉ)薬剤の投与前に対象から投与前試料を得ること、(ｉｉ)ＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの、投与前試料中での発現のレベルを検出すること、(ｉｉｉ)対象から１またはそれ以上の投与後試料を得ること、(ｉｖ)ＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの投与後試料中での発現または活性のレベルを検出すること、(ｖ)ＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの投与前試料中での発現または活性のレベルを、投与後試料または試料(複数も可)中のＧＬ５０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのものと比較すること、次いで(ｖｉ)それに応じて対象への薬剤の投与を変更することを特徴とする方法が提供される。例えば、ＧＬ５０の発現または活性を検出されるレベル以上のレベルに増加させるために、すなわち、薬剤の有効性を増すために、薬剤を増加して投与することが望ましい。別法として、ＧＬ５０の発現または活性を検出されるレベルより低いレベルに低下させるために、すなわち、薬剤の有効性を減じるために、薬剤を減じて投与することが望ましい。そのような具体例によれば、観察可能な表現型の応答が認められない場合でも、ＧＬ５０の発現または活性を薬剤の有効性の指標として用いることができる。
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これは制限するものとして解釈されるべきではない。本出願中に引用される全文献、特許および公開特許出願の内容ならびに図および配列表を参照により本明細書中に組み込む。
【０１６８】
実施例
以下の材料および方法を実施例で用いた。
マウス系統およびＲＮＡの単離：１０Ｅ５ＭＢ４９膀胱癌細胞を注射したマウス（Ｃ５７Ｂ１／６）を、１μｇ／マウス組換えＩＬ１２で７-１１日目および１４-１８日目に処置した。ＲＮＡをリンパ節から９（７５％）、１２（２０％）および１９（５％）日目に単離し、次いでプールした。ＲＮＡＳｔａｔ６０（ｔｅｌｔｅｓｔＢ）を用いてＲＮＡを抽出した後、ポリＡｔｔｒａｃｔ磁気単離システム(Promega）を用いてポリＡ＋ＲＮＡを濃縮した。ｃＤＮＡをスーパークリプトＲＴ（Gibco BRL）を用いて合成した。さらなるｃＤＮＡ源に、マウス胎児胸腺ライブラリー（Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊ）およびＣ５７Ｂ１／６の心臓穿刺由来のマウス末梢血リンパ球を含めた。
【０１６９】
シグナルトラップ：シグナルトラッププロトコルを、Jacobs et al. (1997. Gene. 198: 289)により記載されるように行った。簡単には、サイズ分けしたｃＤＮＡをインベルターゼ発現プラスミドｐＳＵＣ２Ｔ７Ｍ１３ＯＲＩに単一方向にクローニングした。プラスミドクローンの発現ライブラリーをイー.コリにて作成し、次いで酵母のインベルターゼ欠損ｓｕｃ２−株に導入した。酵母ライブラリー中に示されるシグナルトラップされたクローンを、ＹＰＲ寒天プレートで２日培養することにより選抜した。３３３クローンをランダムに選択し、ミニプレップし、次いで配列決定した。
【０１７０】
配列分析：ＧＣＧウィスコンシンパッケージのＴＢｌａｓｔＸ、ＦａｓｔＸ、ｐＦａｍ、Ｐｉｌｅｕｐ、ＧｒｏｗＴｒｅｅおよびＳｉｇｃｌｅａｖｅ、およびＧｅｎｅｗｏｒｋｓ２．５．１をＤＮＡ配列決定操作、データベース検索および配列分析に用いた。図１２で、パイルアップ分析のための同一性スコアは以下の値に従い決定した。1x pair = 1; 2x pair = 2; 3x pair = 3; 3-of-a-kind = 4; 3-of-a-kind plus 1x pair = 5; 2x 3-of-a-kind = 6; 4-of-a-kind = 7; 4-of-a-kind plus 1x pair = 8; 5-of-a-kind = 9。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＤＮＡｓｔａｒ  ＧｅｎｅｑｕｅｓｔモジュールをＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＨＳ２１Ｃ０９８に対して用いて、ｈＧＬ５０のイントロン-エキソン境界を明確にした。さらなる分析をＴＦＡＳＴＡ、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎを用いるＳｅｑＷｅｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧパッケージを用いて行った。距離に比例する系統図を、Ｋｉｍｕｒａコレクションアルゴリズムを用いて、遺伝子距離に基づきＧｒｏｗＴｒｅｅにより作成した。次いで図を再度作成し、ファミリークラスターを表した。
【０１７１】
ｃＤＮＡ末端の３’迅速増幅：プライマー（ＧＬ５０）VL118 (CCCGCAGTCTGCGCTCGCACC;配列番号:7)、VL116 (GTCGACCCACCATGCAGCTAAAGTGTCCCTG; 配列番号:8), (AB014553) VL141 (CGTGTACTGGATCAATAAGACGG; 配列番号:9)、VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; 配列番号:10), (ポリ A-オリゴ)VL054 (CCAGTGAGCAGAGTGACG; 配列番号:11)、VL055 (GAGGACTCGAGCTCAAGC; 配列番号:12)を用いて３’ＲＡＣＥを行った。リンホライト(lympholyte)Ｍを製造業者のプロトコルに従って用いて密度遠心分離によりリンパ球に関してマウス末梢血リンパ球（PBLｓ）を濃縮した。ヒトＰＢＬをヒトロイコパック試料(human leukopac samples)のＦｉｃｏｌｌ-ｐａｑｕｅ密度遠心分離により単離した。全ＲＮＡを以下に記載されるようにリンパ球から抽出した。プライマーＶＬＯ５３（VL053 (CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTT;配列番号:18)）、５μｇの全ＲＮＡおよびスーパークリプトＲＴ（Gibco-BRL)を製造業者のプロトコルに従い２０μｌ反応液中で用いて逆転写を行った。０．５-１．０μｌのＲＴ合成されたｃＤＮＡをＲＡＣＥ操作一回当たりに用いた。３’ＲＡＣＥはFrohman, M. A. (1993) Methods Emzymol. 218: 340-356の方法に従い行った。
【０１７２】
ＲＮＡの単離および分析：全ＲＮＡをＣＣＥ・ＥＳ細胞、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ胚／卵黄嚢およびＣ５７Ｂ１／６末梢血リンパ球から得て、フェーズ-ロック(Phase-lock)ゲルバリア(Eppendorf)を備えたＲＮＡｓｔａｔ６０（Tel-Test B, Friendswood TX)を用いて抽出した。ＲＮＡをノーザン・マックス・システム（Ambion)を用いて分画し、ＺｅｔａＰｒｏｂｅ・ＧＴ（BioRad)上に、製造業者のプロトコルに従いブロットした。複数組織ＲＮＡパネルを購入し(Clontech)、製造業者の指示に従い用いた。３’非翻訳領域に対応する、ｍＧＬ５０-２クローンのヌクレオチド９８４-１３４０（３５７ｂｐ；配列番号：３）のいずれかを含む放射能標識したＤＮＡフラグメントにブロットをハイブリダイズさせ、一方、ｍＧＬ５０のコーディング配列に対応するフラグメントを用いてｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２両転写産物を検出した。ハイブリダイゼーションは、６５℃で、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ(Clontech)を用いて一晩行い、次いで、０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳをハイブリダイゼーション温度で用いて、適当なシグナル：ノイズ比が達されるまで洗浄した。ブロットを画像処理のためにホスホイメージプレートおよびオートラジオグラフィーフィルムに露出した。
【０１７３】
遺伝子発現分析：ＲＴ-ＰＣＴ分析のために、まず鎖ｃＤＮＡ合成をＲＡＣＥ法に関して前に記載したように行った後、重複２５μｌ増幅反応(Advantage Taq, Clontechを用いる）を、ｍＧＬ５０-１に関してはプライマーＲＬＥＥ００１およびＲＬＥＥ００５を、およびｍＧＬ５０-２に関してはプライマーＲＬＥＥ００１およびＲＬＥＥ００３を用いて行った。プライマーＧＡＰＤＨ-ＦおよびＧＡＰＤＨ-Ｒをポジティブな増幅対照として用いた。オリゴヌクレオチドGAPDH-F (TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC; 配列番号:19); GAPDH-R (CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC (配列番号:20); RLEE001 (CATCACTAGCATTAGCCAGGC; 配列番号:13); RLEE003 (TGATGTTGTGAAGCTGAGTGC; 配列番号:14); RLEE005 (TCATGAGCATCGAGCATCG; 配列番号:15); VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; 配列番号:10); VL162B (TCACGAGAGCAGAAGGAGCAGGTTCC; 配列番号:16); および VL163B (GGGCCCCCCAGAACCTGCTGCTTCC; 配列番号:17)を、ｍＧＬ５０-１、ＧＬ５０-ＲＡＣＥ、ＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡおよびＡＢ０１４５５３-ＲＡＣＥクローンの細胞外ドメイン領域のＰＣＲ増幅のために設計した。ポリＡ＋ＲＮＡを含むリンパ組織および非リンパ組織(Clontech)から誘導されたマウスおよびヒトのｃＤＮＡパネル（Clontech）を、ＰＣＲ分析のための材料として用いた。サイクル条件は５分間９５℃の変性段階の後、９５℃で１分、６０℃で１分および７２℃で１分の３５サイクルを行うものであった。反応は、７２℃で１０分延長した後に終えた。ｍＧＬ５０およびｍＧＬ５０-２ＰＣＲのためのサイクル条件は、９５℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で２分間を３３サイクル行うものであり、一方、ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲは３０サイクルで行った。
【０１７４】
ノーザンブロット分析に関しては、商業的に調製されたＲＮＡブロット(Clontech)を、ｍＧＬ５０-１のヌクレオチド１０６５-１５８８（４９４ｂｐ；配列番号：１）またはｍＧＬ５０-２クローンのヌクレオチド９８４-１３４０（３５７ｂｐ；配列番号：３）を含む放射能標識されたＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせた。
フローサイトメトリー：ＣＯＳ細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１-ＣＴＧＦＰ発現ベクター中のｍＧＬ５０-１またはＤＡＰ-１２ｃＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションはリポフェクタミントランスフェクション試薬（Life Technologies)を製造業者のプロトコルに従って用いて行った。細胞をトランスフェクションの３日後に回収した。１０％ウサギ血清を用いて細胞に対する非特異的結合をブロックした。細胞を室温で２０分間、１００μｌのＰＢＳ２％ＦＣＳ中２００ｎｇの融合蛋白で染色した。細胞を洗浄し、ＰＥを結合したヤギ抗マウスＩｇＧを用いて二次染色を行った。細胞は、フローサイトメトリーの直前にプロピジウムヨーダイドで染色した。ポジティブな対照としてＣＯＳ細胞をｈＣＴＬＡ４ｃＤＮＡでトランスフェクションした後、ＰＥを結合した抗ＣＴＬＡ４を用いて、ポジティブに染色している細胞を同定した。
【０１７５】
サイトメトリー分析のための細胞懸濁液をＢａｌｂ／ｃ脾細胞（〜３月齢）から単離し、ＤＭＥＭ、１０％（体積／体積）熱不活性化子牛血清（JR BioScience)、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Irvine Scientific, Santa Ana, CA)、２０μＭ  ２-ベータメルカプトエタノール(Sigma Co.,St. Louis, MO)、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム、およびＭＥＭ非必須アミノ酸(Life Technologies, Rockville, MD)で１回洗浄した。赤血球細胞をＡＣＴ溶解バッファーで溶解し、１回洗浄した。Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞（〜１×１０７細胞／ｍｌ／ウェル）を２５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma)または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、１μｇ／ｍｌのイオノマイシンと共に培養した。細胞をＦＩＴＣ標識抗体(BD-Pharmingen)およびｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍ試薬を用いて染色した後、ＦＡＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアパッケージ（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。細胞の分離を、抗-ＦＩＴＣマイクロビーズ磁気選択(Miltenyi Biotec)を用いて行った後、Ｔ-細胞の豊富化に関するフローサイトメトリー測定を行った。
【０１７６】
Ｉｇ融合蛋白：ＩｇＧ２ａと、ｍＩＣＯＳ、ｈＩＣＯＳ、ｍＧＬ５０-１、およびｈＧＬ５０との融合蛋白を、以下の実施例で用いるために構築した。ＩｇＧ２ａｍの表記は、ＩｇＧ２ａドメインが変異してエフェクター機能が低下したことを示す(Steurer, W. et al. (1995) J. Immunol. 155: 1165-74に記載）。ｈＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図２６に示し、それぞれ配列番号：２３および２４として示す。ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図２７に示し、それぞれ配列番号：２５および２６として示す。ｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図２８に示し、それぞれ配列番号２７および２８として示す。ｍＧＬ１５０-ｍＩｇＧ２ａｍのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図２９に示し、それぞれ配列番号２９および３０として示す。
【０１７７】
実施例１．ｍＧＬ５０-１分子の単離
ＩＬ-１２処置したマウスのリンパ節のＲＮＡに由来する、分泌たんぱく質をコードしているｃＤＮＡを、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)シグナル配列トラップ法(Jacobs et al)を用いることにより、シグナル配列の遺伝子選択下に置いた。単離、次いで配列決定した全部で３３３個のｃＤＮＡ：インベルターゼクローンの中に、Ｂ７-１と限られた配列同一性を有する１の部分ｃＤＮＡクローンが同定され、これをｍＧＬ５０-１（図１、配列番号：１）と名づけた。マウス胎児胸腺ｃＤＮＡライブラリーからＲｅｃＡ媒介性全長ｃＤＮＡを単離して、３’非翻訳領域を含み、該部分シグナルトラップ配列クローンをオーバーラップしている４つのｃＤＮＡをさらに得た。
【０１７８】
コンセンサスを得ている２７１８個のヌクレオチドから成るｍＧＬ５０-１配列は、３６ｋＤａの推定質量を有する３２２のアミノ酸蛋白をコードしていた。オープンリーディングフレームのヒドロパシープロットにより、リーダー配列（配列番号：１のおよそヌクレオチド６７〜１９５によりコードされる配列番号：２のおよそアミノ酸１-４６）、細胞外ドメイン（配列番号：１のおよそヌクレオチド１９６〜９０４によりコードされる配列番号：２のおよそアミノ酸４７-２７９）、疎水性膜貫通領域（配列番号：１のおよそヌクレオチド９０５〜９６１によりコードされる配列番号：２のおよそアミノ酸２８０-２９８）、および潜在的細胞内細胞質ドメイン（配列番号：１のおよそヌクレオチド９６２〜１０３２によりコードされる配列番号：２のおよそアミノ酸２９９-３２２）に対応する構造が予測された。シグナルペプチドの切断は、アミノ酸配列の４６位で予測された。Ｐｆａｍ蛋白モチーフ予測プログラムによるｍＧＬ５０-１の分析により、蛋白の細胞質ドメイン中に、Ｉｇ-ドメインに対する構造類似性が示唆された。Ｉｇ-様構造の保持に関し、分子内結合およびＩｇＶ-様ドメインとＩｇＣ-様ドメインに対応する別個の構造配置を可能性としている４つのシステインが、ドメイン図に基づき細胞外ドメインに見出された。翻訳された蛋白をＧｅｎＢａｎｋデータベースより探索するＦａｓｔＸ配列比較により、ＡＢ０１４５５３、Ｂ７-１、Ｂ７-２およびＹ０８８２３を含む、配列類似性を有する多くの同定ｃＤＮＡクローンが得られた。Ｂ７ファミリーのポリペプチド中で対応しているドメインを図１２に示す。
【０１７９】
実施例２．ＧＬ５０の別のスプライス形態の単離
転写不均一度を決定するために、３’ＲＡＣＥを行い、ネズミのＧＬ５０-１のスプライス変種を単離した。上流配列に対応し、およびｍＧＬ５０-１のイニシエーション開始部位を含む特異的入れ子５’オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅ＰＣＲ産物を、マウスＰＢＬから誘導されたｃＤＮＡから得た。ｍＧＬ５０-１コーディング領域内部の放射能活性オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせて、明らかなハイブリダイゼーションシグナルが検出された。次いで、ポジティブにハイブリダイズしているＰＣＲ産物をクローニングした後、配列分析を行い、そのＲＡＣＥ配列が、いずれも、マウス胎児胸腺ライブラリーから誘導されたコンセンサスｍＧＬ５０-１配列と同一ではないことが明らかであった。異なる長さの伸張ポリアデニル化を有する複数のクローンにより示される２セットのＰＣＲ産物が、ＧＬ５０の別のスプライス形態をコードすることが見出された。１７５９ｂｐの産物、すなわちｍＧＬ５０-２と名付けた１の典型的な産物は、３９ｋＤａの予想分子量を有する、長さにして３４７アミノ酸残基のポリペプチドをコードしていた（図２、図１５）。
【０１８０】
ｍＧＬ５０-１とｍＧＬ５０-２の並置を図３に示す。ｍＧＬ５０-１とｍＧＬ５０-２配列の並置から、ｃＤＮＡのヌクレオチド６７（開始メチオニン／ｍＧＬ５０-２  ＲＡＣＥプライミング部位）からヌクレオチド１０２７までの完全な同一性が示されたが、複数のｍＧＬ５０-２産物中に見出される２個のヌクレオチドは例外であった（ヌクレオチド５３１および７１０、推定アミノ酸配列の２３７位のアルギニンをヒスチジン残基にする（図３））。複数の他のＰＣＲ産物が同じミスマッチをコードしたので、これらの２つのヌクレオチドの相異が、ＲＮＡ出発物質のために用いたマウス間の系統上の違いによるものであることが最も考えられる。ｍＧＬ５０-１の１０２７位およびｍＧＬ５０-２の９６１位の下流の配列は２分子間で異なっていた（図３）。ｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２両配列は、ポリＡテイルから上流に（ｍＧＬ５０-２に関しては１３ｂｐ、ｍＧＬ５０-１に関しては１６ｂｐ）コンセンサスＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルを含んでいた。異なる３’配列がカルボキシ末端をコードする結果として、ｍＧＬ５０-２ではｍＧＬ５０-１の最後の２アミノ酸が欠乏していたが、細胞質ドメインに追加の２７の新規アミノ酸が挿入されていた。ｍＧＬ５０-２に関して予測されるアミノ酸配列により、ｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２両分子に共通するチロシン残基Ｙ２９９およびＹ３０７に加えて、カルボキシ末端に３つのユニークなチロシン残基、Ｙ３２５、Ｙ３２８およびＹ３３３が存在することが示された。ＧｅｎＢａｎｋデータベース検索により、多くのゲノム配列（例えば、受託番号ＡＣ００５８１８、ＡＣ００６５０８、およびＡＦ１１５５１７）、ならびに公知ｍＲＮＡ（マウスデスミン：Ｚ１８８９２；およびマウスセルビビン：ＡＦ１１５５１７）にも見出される複合反復配列（塩基１３４９-１５５４）を除き、ｍＧＬ５０-２産物の異なるコーディング３’ドメインに類似性を有するｃＤＮＡ配列はないことが明らかにされた。そのような非翻訳反復配列はｍＧＬ５０-１には見出されなかった。
【０１８１】
実施例３．ＧＬ５０のヒトオーソログの同定
ネズミのＧＬ５０クローン同定後、データベース検索およびその後の比較により、マウスのｍＧＬ５０-１とｍＧＬ５０-２クローンが、ヒトの脳から単離されたｃＤＮＡ、ＫＩＡＡクローン０６５３（受託番号ＡＢ０１４５５３；Ishikawa et al. (1998) DNA Res. 5: 169）と相同性を有する可能性があることが示唆された。ＡＢ０１４５５３は、分子量６０ｋＤａの推定５５８個のアミノ酸からなる蛋白をコードする、染色体２１上に位置する４．３ｋｂのｃＤＮＡとして記載されている。ＡＢ０１４５５３  ｃＤＮＡの長さもコードされる蛋白の長さもｍＧＬ５０-１のものよりほぼ２倍大きいので、ＡＢ０１４５５３がマウスＧＬ５０配列のヒト相同分子種であるとは考えられなかった。しかし、推定ＡＢ０１４５５３蛋白配列の始めの３０３残基の分析により、ｃＤＮＡのシグナルペプチド領域を除き、ｍＧＬ５０-１との類似性が示された。
【０１８２】
ＡＢ０１４５５３は大きなｃＤＮＡのサイズ分別により得られたので、ＡＢ０１４５５３はもっと小さな遺伝子産物としても存在する変種転写産物を表すと考えられた。そのような、より小さな産物が存在するかどうかを確認するために、ＧＬ５０と配列相同性を有するＡＢ０１４５５３の細胞外ドメインに対応するオリゴヌクレオチドプライマー（VL142(ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; 配列番号:10)およびVL141 (CGTGTACTGGATCAATAAGACGG;配列番号:9)）を用いて、ヒトＰＢＬの３’ＲＡＣＥ分析を行った。アミノ酸残基２４（ＲＡＣＥプライマーの開始点）から残基１２３に、ＡＢ０１４５５３に一致するオープンリーディングフレームをコードしている４つのＲＡＣＥ産物が単離された（図６）。残基１２３から先で、ＡＢ０１４５５３ＲＡＣＥ産物はｃＤＮＡ配列から異なり、９個のアミノ酸をコードしている３’コーディング領域、終結コドン、および短い非翻訳ドメインを有する別の８８個のヌクレオチドを生じる。このような別の３’領域によって、ＡＢ０１４５５３ＲＡＣＥクローン中に、ＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡと比較して未成熟の終結コドンが生じた（図７）。ＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡの共通５’配列と融合させた後、この別に転写される産物によりコードされる推定ポリペプチドに関して予測される全長は３０９アミノ酸であり、マウスＧＬ５０蛋白配列に対してオーソログである、ｈＧＬ５０と呼ばれるヒトの蛋白と一致した（図８）。
【０１８３】
実施例４．ニワトリＢ７-１との並置
すでに特徴付けられているニワトリのＢ７-１（受託番号Ｙ０８８２３）と並置して、１パターンの保存された細胞質ドメイン配列がこれらの分子間で現れた。細胞内領域内において、ｈＧＬ５０蛋白配列はｍＧＬ５０-１と３４％（並べられた残基の９／２６）の同一性を示し、一方、ニワトリＹ０８８２３はヒトもしくはマウスのＧＬ５０またはＧＬ５０-２いずれとも５７％の同一性（並べられた残基の８／１４）を示し、(R)(R)(R)[XX](Q)(H)(X/-)SY(T)(G)(P)（配列番号：２１）のコンセンサスモチーフ（鍵括弧中のアミノ酸は３つの遺伝子間で異なり、丸括弧中のアミノ酸は３つの遺伝子の中の２つに共通し、および鍵括弧または丸括弧をつけていないアミノ酸は３つの遺伝子間で共通する）を得た。このモチーフと相同性を有する蛋白に関するＦａｓｔＡデータベース検索により、モチーフRRRQQHHSYT（配列番号：２２）と同一の配列をコードしている２つのマウスのエントリー、Ｖｅｌｉ-２（受託番号ＡＦ０８７６９４）、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓＬＩＮ-７の相同体であるＭＡＬＳ-２（受託番号ＡＦ１７３０８２）を得た。このユニークなドメインはＶｅｌｉ-２のカルボキシ末端に位置するが、異形態Ｖｅｌｉ-１またはＶｅｌｉ-３には存在せず、シー・エレガンスＬＩＮ-７と相同する領域を越えて伸張している。
【０１８４】
実施例５．ＧＬ５０分子の発現
市販のｃＤＮＡパネルにおけるｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２特異的ＲＴ-ＰＣＲ反応により、心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、７-１５日目の胚およびＰＢＬにおいて、豊富なＰＣＲ産物の生成を得た。ｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２のいずれの転写産物に関しても、脳試料ではわずかな産物しか検出されなかったが、ｍＧＬ５０-２に関して精巣試料で低レベルの産物が検出された（図４）。ｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２の共通細胞外ドメインのいずれか、またはｍＧＬ５０-２またはｍＧＬ５０-１いずれかの３’非翻訳領域に特異的なプローブを用いる市販のＲＮＡブロットのノーザンブロット分析により、差異のあるハイブリダイゼーションが２つの分子間で認められた。細胞外ドメインプローブおよびｍＧＬ５０-１特異的プローブは共に、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣試料において明らかに検出可能な〜２．７ｋｂのメッセージにハイブリダイズしたが（これは、ｍＧＬ５０-１に特異的なブロットにおいてすでに見られているパターンと同一である（Ling et al. (2000) J. Immunol. 164: 1653-7））、ｍＧＬ５０-２特異的プローブは、心臓、脾臓および腎臓試料でのみ検出される１．７ｋｂの転写産物にハイブリダイズし、ｍＧＬ５０-２転写産物が、組織の制限されたサブセットとして最高のｍＧＬ５０-１の発現と同時に転写されることが示唆された（図５）。ポリＡ＋ＲＮＡブロットでは、ｍＧＬ５０-２３’ＵＴＲ特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションが、未分化ＥＳ細胞、１０日目の胚様体、１２．５日目の胚卵黄嚢、および１５日目の胎児肝臓を示す試料で明らかに検出された。これに対して、ｍＧＬ５０-１ｃＤＮＡコーディング配列プローブを用いるハイブリダイゼーションでは、試験された全試料において転写が明らかであった。
【０１８５】
ＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡおよびＡＢ０１４５５３ＲＡＣＥクローンの組織分布を評価するために、ＲＴ-ＰＣＲ／サザンブロット分析を、前記ＧＬ５０配列に関するものと同じ条件下で行った。公表されているＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡの増幅に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; 配列番号:10) およびVL163B (GGGCCCCCCAGAACCTGCTGCTTCC; 配列番号:17)）を用いるＰＣＲの結果から、試験された全試料に関して検出可能なＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡのシグナルは全く存在しなかった（図１０）。公表されているＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡ配列を表すＲＴ-ＰＣＲ産物がないことの説明としては、最適化されていないオリゴヌクレオチドを使用したこと、目的の転写産物が極端に少量しか発生していないこと、またはこの形態の産物が実際にないことが考えられる。オリゴヌクレオチドプライマーＶＬ１４２およびＶＬ１６２Ｂを用いる、ＡＢ０１４５５３ＲＡＣＥに特異的なＲＴ-ＰＣＲ条件で、腎臓、肺、卵巣、胎児肝臓、および白血球において、３５０ｂｐの増幅産物の検出を得、胎児肝臓において最高レベルの増幅産物が検出された。驚くべきことに、脾臓、肺、胸腺、またはリンパ節ではシグナルは実質的に全く検出されなかった。これらの結果は、組織ｃＤＮＡパネルのより小規模の調査においてＡＢ０１４５５３転写産物の分布に関して公表されている報告(Ishikawa et al. (1998) DNA Res. 5:169)と一致するが、ＧＬ５０分子に関して観察された組織分布パターンとは相補しない。
【０１８６】
長く、そして異なる３’非翻訳領域が存在するｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２クローンと異なり、ＡＢ０１４５５３ＲＡＣＥ産物は、ＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡのものと異なるわずか８８ｂｐの配列しか含まなかった。このために、ＲＡＣＥ産物の検出に十分特異的な活性を有するヌクレオチドプローブを設計することができなかった。ｈＧＬ５０のコーディング領域プローブを用いて、市販のヒト複数組織ＲＮＡブロットにおいてノーザンハイブリダイゼーションを行い、転写産物の分布を評価した（図１１）。結果は、全組織に２．４ｋｂ、３．０ｋｂ、７．０ｋｇのおよその分子サイズを有する多くの転写産物の存在が認められることを示し、最高レベルのシグナルが脳、心臓、腎臓、および肝臓試料に見られた。低いハイブリダイゼーションのシグナルが結腸および胸腺で検出された。８．５ｋｂのさらなる転写産物が胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、肺およびＰＢＬを含むパネルのサブセットに検出されたのに対して、３．８ｋｂの転写産物が肺およびＰＢＬ試料に検出された。ユニークな１．１ｋｂの転写産物はＰＢＬ試料においてのみ検出され、これは、５’および３’非翻訳配列を含む場合のｈＧＬ５０に関して予測されるサイズに対応した。他の少数の転写産物の検出は、ブロットの感度範囲が限られているために困難であった。４．３ｋｂの公表されたＡＢ０１４５５３ｃＤＮＡと相関のある明らかな転写産物はなく、この配列が天然に存在している可能性がないこと、または検出可能な限界より低いレベルで発現される可能性があることが示唆される。ｈＧＬ５０ブロットとｈＧＬ５０-ＰＣＲ測定結果を比較したところ、腎臓組織で最大のシグナルを有し、胸腺、脾臓およびＰＢＬなどのリンパ関連組織においてシグナルが少ないという共通の特徴が認められた。
【０１８７】
実施例６．ＧＬ５０ポリペプチドの他のポリペプチドに対する関連性
ｍＧＬ５０-１、ｈＧＬ５０、およびヒトとマウスのＢ７-１およびＢ７-２間の関連度を決定するために、蛋白配列の並置を行った。Ｐｉｌｅｕｐ分析（図１２）から、１８のアミノ酸の位置が全６つの分子間で細胞外ドメイン内に一致して並置された。Ｂ７分子の予測ＩｇＶ-様およびＩｇＣ-様折りたたみ構造を規定する３２の位置のうち、１３の位置が全６つの分子間で一致して保存されており、最も顕著には、ドメインの分子内の折りたたみを可能とする４つのシステインが一致して保存されている。他の意義ある配列保存領域が細胞外ドメインにも見られたが、興味深いことに、ｈＧＬ５０/ｍＧＬ５０の配列が一致する所定の位置で、それらはＢ７-１またはＢ７-２いずれかと接近して整列した（同一性スコア８）。例えば、ｍＧＬ５０-１の７７位に対応するバリン残基は、ｈＧＬ５０、およびネズミとヒトのＢ７-２配列に共通するが、Ｂ７-１とは共通しない。同様に、ｍＧＬ５０-１の７８位のチロシンは、ｈＧＬ５０、およびネズミとヒトのＢ７-１において、対応する位置で保存されているが、Ｂ７-２に関しては保存されていない。同一スコア８を有する１６の位置の中で、５つの位置がｍＧＬ５０-１／ｈＧＬ５０およびＢ７−１に共通し、４つの位置がｍＧＬ５０-１、ｈＧＬ５０およびＢ７-２間に共通し、および６つの位置がＢ７-１およびＢ７-２間に共通する。
ペプチド構造に基づき、これらの結果によりｍＧＬ５０／ｈＧＬ５０配列がＢ７ファミリーの蛋白にパラレルな系統発生的な空間を占めることが示唆される。１００個のアミノ酸当たりの置換に関して遺伝学的距離を測定する分子系統発生分析（GrowTree)より、ｍＧＬ５０／ｈＧＬ５０（８５）、ｍ／ｈＢ７-２（６８）およびｍ／ｈＢ７-１（８８）が独立してクラスター形成する樹形図（図１３）を得た。外集団(outgroup)として、ｍｍｕ６７０６５＿１（マウス・ブチロフィリン）を用いた。ニワトリのクローンＹ０８８２３は、Ｂ７配列（２１５-３２０）よりもＧＬ５０/ＡＢ０１４５５３配列（〜１４０）と並置されることが認められ、これらの配列が蛋白の別のサブファミリーから成ることが示唆された。ＧＬ５０／ＡＢ０１４５５３、Ｂ７-２およびＢ７-１枝間の距離は大きく（２１６-２８４）、ヒトとネズミの系統化開始以来、これらの分子間で多数の置換が生じたことが示唆された。
【０１８８】
マウスとヒトのＣＴＬＡ４（例えば、Dariavach, P. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18:1901; GenBank Accession Number L15006; U.S. patent 5,434,131を参照されたい）およびＩＣＯＳ（Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216）を、同じパラメータを用いて系統発生的関連性に関してさらに分析した。遺伝学的距離により、Ｂ７-様蛋白に関して認められるものと異なるパターンが明らかにされた。これまでの報告に示されているように、マウスとヒトのＩＣＯＳおよびＣＤ２８間の遺伝学的距離（１７６-２５７０）は、ＣＴＬＡ４のもの（２６１-４０５）よりも接近していた。比較により、ＣＤ２８とＣＴＬＡ４間の遺伝学的距離はもっと小さく（１４３-１６７０）、レセプターファミリーのメンバー間の構造的関連性がリガンドファミリーのものとパラレルではないことが示唆された。
【０１８９】
実施例７．ＧＬ５０のＩＣＯＳに対する結合の証明
ＧＬ５０がネズミＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＩＣＯＳのリガンドであるかどうかを決定するために、トランスフェクション結合研究を、ｍＧＬ５０-１発現ベクターを用いて行った（図１４）。ｍＧＬ５０-１またはヒトＤＡＰ-１２ネガティブ対照ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクションした後、ＩＣＯＳ-Ｉｇ、ＣＤ２８-ＩｇまたはＣＴＬＡ-４-Ｉｇ融合蛋白または正常ネズミＩｇのいずれかで染色した。ＣＯＳ細胞を、トランスフェクションの２日後に、５μｇ/ｍｌの融合蛋白で染色した後、ヤギ抗-マウスＰＥ標識抗体で染色した。フローサイトメトリーにより、ＧＬ５０トランスフェクションＣＯＳ細胞の結合が、ＩＣＯＳ-Ｉｇ試薬でのみ検出された（１５％）が、ＣＤ２８-Ｉｇ、ＣＴＬＡ４-Ｉｇ、またはネガティブな染色試薬として使用された正常マウスＩｇに関してはわずかな結合しか検出されなかった。ＤＡＰ-１２ｃＤＮＡトランスフェクション体に関しては、いずれの融合蛋白の結合も検出されなかった。これらの結果により、ＧＬ５０がＩＣＯＳ-Ｉｇのリガンドであることが示唆される。
【０１９０】
本明細書中の特定の結合条件下では認められなかったが、細胞に基づくアッセイにおいて、Ｂ７分子の結合活性がＣＴＬＡ-４よりもＣＤ２８に対して弱いことを示している公表データを考慮すると(Greenfield, E. A. et al. (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:389)、ＧＬ５０がＣＤ２８またはＣＴＬＡ-４のいずれかによりシグナル伝達できる可能性があることも考えられる。
【０１９１】
実施例８．ｍＧＬ５０-２転写産物は機能性細胞表面蛋白をコードする。
ｍＧＬ５０-２転写産物が機能性細胞表面蛋白をコードすることを立証するために、ＥＦ-１アルファプロモーターの転写コントロール下にｍＧＬ５０コーディング領域を発現しているベクターをＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。フローサイトメトリーにより、ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍおよびｈＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍ両方がｍＧＬ５０-１およびｍＧＬ５０-２トランスフェクション細胞に結合することが見出され（９-１４％）、一方、ｍＣＴＬＡ４-ｍＩｇＧ２ａｍを用いてはわずかな結合しか認められず（＜１％）、ｍＧＬ５０-２に認められる異なるカルボキシ-テイルにおける追加残基によりコードされるドメインがこの蛋白の表面の可動化(surface mobilization)に影響しないことが示される（図１７）。ｈＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍが両分子に結合することも注目に値することであり、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８レセプター同様、霊長類／齧歯類の種の境界を越えてターゲットに対してアッセイした場合に、ＩＣＯＳレセプターがリガンド結合力を持つことが示唆される。他のマウス細胞系統を、表面ＩＣＯＳ-リガンドの存在に関して試験した。ＷＥＨＩ２３１細胞はＢ７-１およびＢ７-２両方を表面で発現することがすでに示されており、一方、ＥＳ細胞はＢ７-１のみを提示することが示されている。ＷＥＨＩ２３１細胞のｍＣＴＬＡ４-ｍＩｇＧ２ａｍ染色が、８ｎｇ／ｍｌの試薬を用いて明らかに検出され、一方、ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍの染色は１μｇ／ｍｌで始まるレベルでわずかに検出された。これらの結果は、Ｂ７分子へのｍＣＴＬＡ４-ｍＩｇＧ２ａｍ試薬の結合親和力が、ＷＥＨＩ細胞上のＧＬ５０へのｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍ試薬の結合(ＣＤ２８-ＩｇとＢ７蛋白の間で測定された低い結合親和性に類似する）よりも少なくとも１００倍大きいことを示すものである。ブロッキング抗体の存在下で、ＷＥＨＩ２３１へのｍＣＴＬＡ４-ｍＩｇＧ２ａｍの結合は完全に排除されたが、細胞へのｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍの結合に影響は認められず、ＷＥＨＩ２３Ｂ７-１もＢ７-２も、ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍとの特異的結合を強化しないことが確認された(図１８）。非常に初期の胚環境の典型である細胞におけるＧＬ５０の存在を示しているＲＮＡブロット分析からの証拠を確証するために（前記を参照されたい）、未分化なＣＣＥ  ＥＳ細胞を、Ｂ７-１に対する抗体で直接的に染色することにより、およびｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白で間接的に染色することにより分析した。抗-Ｂ７-１で染色された未分化ＥＳ細胞は（図１９）バックグラウンドに対して、以前の観察(Ling, V. et al. (1998) Exp. Cell. Res. 241: 55-65)と一致する１ログ（１ｌｏｇ）の蛍光シフトを示し、ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍ染色では、バックグラウンドに対して１／２ログの蛍光シフトを示し、着床前の初期胚の未分化内部細胞集団を反映するシステムにおける、Ｂ７およびＧＬ５０タイプの両分子の同時表面提示が立証された。
【０１９２】
実施例９．脾臓部分母集団におけるＧＬ５０の発現
ＧＬ５０表面蛋白を示している主要脾臓細胞型の表現型分析により、ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇの結合が表現型ＣＤ１９+Ｂ細胞で最も容易に検出可能であることが明らかであり、一方、他の脾細胞型がＩＣＯＳ-Ｉｇ染色を示すことが明らかであった(図３０を参照されたい）。ＧＬ５０を提示する他の新たに単離された細胞をさらに同定するために、野生型Ｂａｌｂ/Ｃ脾細胞を、成熟ＢおよびＴ細胞を含まないＲＡＧ１−／−脾細胞と比較した。結果を図２０および表３に示す。
【０１９３】
【表４】
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【０１９４】
予想通り、Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞で、表現型Ｂ細胞に対して高レベルのｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍの結合（図２０ＡおよびＢ）が明らかにされ（ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＣＤ４０＞９４％）、一方、表現型Ｔ細胞およびＴ細胞のサブセット（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋；＜１０％）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ、２６％）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ、４３％）およびＮＫ細胞（ｐａｎ-ＮＫ、２０％）において低レベルの結合が認められた。ｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍの結合は、もっと一般的なリンパマーカーＣＤ２４およびクラスＩＩ（９４％）細胞でも検出された。（ｍＧＬ５０-１特異的プローブを用いる）ノーザンブロット分析により、ＧＬ５０転写産物がＲＡＧ１−／−マウスの脾細胞で発現されることが立証された。これにより、成熟ＴまたはＢ細胞の不存在下で、ＧＬ５０が他の脾細胞部分母集団でも発現されることが示唆された。これらの観察と一致して、ＲＡＧ１−／−脾細胞の分析（図２０Ｂ）により、それらがＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ１９−、およびＣＤ４０−であり、残りのＣＤ１１ｂ＋（３５％）およびＣＤ１１ｃ＋（５５％）細胞がｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧａｍで容易に対比染色されることが立証された。低レベル（＜５％）のＩＣＯＳ-Ｉｇの染色が、Ｂ２２０+、ｐａｎＮＫ＋、およびＣＤ６９＋細胞でも明らかであった。Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞で検出された高いレベルと比較して、ＲＡＧ１−／−脾細胞においてこれら３つのマーカー間のｍＩＣＯＳ-ｍＩｇ染色レベルになぜ格差が存在するのかは現在のところわからない。ＣＤ４＋（４５％）およびＣＤ２４＋（２８％）細胞のｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ染色も、他のＴ細胞マーカーに関して染色は認められなかったが、ＲＡＧ１−／−脾細胞において明らかであった。ＣＤ４＋の染色は樹状細胞においてすでに報告されており(Aicher, A. et al. (2000) J. Immunol. 164: 4689-96)、これは、これらのマウスにおけるＣＤ４＋、ＣＤ１１ｃ＋２つのポジティブな細胞集団の存在により支持された（図２０Ｃ）。ＲＡＧ１−／−脾細胞における表現型マクロファージと樹状細胞サブセットがｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧと結合したことと合わせて、ＧＬ５０転写産物の存在から、インビボでＩＣＯＳによるシグナル伝達を強化する可能性のある、専門の(professional)抗原提示細胞におけるＩＣＯＳ-リガンドの存在が立証される。
【０１９５】
実施例１０．脾細胞部分母集団および胚細胞におけるＧＬ５０スプライス変種ｍＲＮＡの発現
ＩＣＯＳ-リガンドは少なくとも２つのスプライス変種として存在することが考えられるため、実験を行い、脾細胞細胞集団におけるＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２転写産物の存在を半定量的に評価した。ＬＰＳまたはＣｏｎＡの存在下で培養されたＢａｌｂ／Ｃ脾細胞は、試験された全脾細胞においてＩＣＯＳ-リガンドをアップレギュレートすることが見出された（図２０）。これらの細胞の選択的刺激がＧＬ５０-１またはＧＬ５０-２転産物の特異的アップレギュレーションを引き起こすかどうかを決定するために、ＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２転写産物を、転写特異的オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイゼーションプローブのセットを用いてＲＴ-ＰＣＲにより検出した。結果を表４に示す。
【０１９６】
【表５】
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【０１９７】
Ｂａｌｂ／ＣのＣＤ４＋、ＣＤ８＋とＣＤ１９＋細胞のサブセット、およびＲＡＧ１−／−のＣＤ１１ｂ＋とＣＤ１１ｃ＋細胞のサブセットを＞９０％純度までビーズ分離により豊富化した。量を規格化したＲＮＡ試料の２回のＲＴ-ＰＣＲ分析により、ＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２転写産物が非処置ＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ１９+Ｂ細胞に存在していることが明らかにされ、フローサイトメトリー分析からの結果と一致した。しかし、ＦＡＣＳにより表面蛋白が検出され、およびＩＣＯＳ-リガンドポジティブの細胞が多いにもかかわらず、ＧＬ５０-１転写産物もＧＬ５０-２転写産物も、ＣＤ８+Ｔ細胞においては増幅されなかった。ＣＤ８ＧＬ５０の発現がＲＴ-ＰＣＲによる検出能力の閾値未満であり、またはＣＤ８+ＩＣＯＳ-リガンドがこのアッセイによる検出に関してターゲットされないＧＬ５０のさらに他の変種である可能性がある。また、ＣＤ８+細胞上に出現しているＩＣＯＳリガンドの形態が本明細書に記載するＧＬ５０-１またはＧＬ５０-２でない可能性があること、またはＣＤ８＋ＩＣＯＳリガンドが可溶性蛋白として他の場所に生じ、この細胞型に移動される可能性があることは除外できない。低レベルのＧＬ５０-１がＣＤ８＋試料で検出されたことを除いて、ＬＰＳの活性化により、対照細胞に見出されるものに類似する特徴が導かれ、Ｂ細胞をＬＰＳで刺激することにより、Ｔ細胞上でのこの形態のＩＣＯＳ-リガンドの発現が間接的にアップレギュレートされる可能性があることが示唆される。脾細胞のＣｏｎＡ刺激により、全試料に渡ってＧＬ５０-１転写産物が増幅されたが、ＣＤ１９＋細胞では産物は低下した。ＧＬ５０-２転写産物はＣＤ８＋試料で誘導され、ＣＤ１９＋試料では検出されなかった。ＣＤ１９＋細胞においてＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２両者の増幅産物量が低下することにより、ＣｏｎＡに暴露された場合にＢ細胞の転写が調節されることが示唆される。ＲＡＧ１−/−脾細胞では、ＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２がＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ１１ｃ＋ポジティブ細胞で検出され、一方、培養樹状Ｆ５ＭおよびＷＥＨＩ２３１細胞ではＧＬ５０-１の転写が示された。低レベルのＧＬ５０-２が、ＷＥＨＩ２３１およびＬＰＳ活性化Ｆ５Ｍ細胞で検出され、一方、非誘導性Ｆ５Ｍ細胞では増幅産物は検出されなかった。胚組織を示している試料において、ＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２は全試料で検出され、Ｄ０ＥＳ細胞において、高レベルの両スプライス変種が存在した。高レベルのＧＬ５０-１が、１２．５日目の胚および１１．５日目の卵黄嚢試料でも検出された。これらの結果はＲＮＡブロット分析（前記を参照されたい）により示される転写ハイブリダイゼーションの程度と相関を有する。
【０１９８】
実施例１１．ニワトリのＧＬ５０-様分子Ｙ０８８２３はＩＣＯＳに結合しない
ごく最近、Ｂ７-１の結晶構造が３オングストロームレベルで解明され、Ｂ７-１のアミノ末端領域にＣＤ２８／ＣＴＬＡ４との直接的相互作用の原因である荷電残基を有する、平行する２つの折りたたみ回転対称ホモダイマーから成る構造が明らかにされた。ヒトとマウスのＧＬ５０、Ｂ７-１、およびＢ７-２蛋白配列は１９-２７％の配列同一性を示し（表５）、それらが構造的に類似している可能性があることも示唆される。
【０１９９】
【表６】
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【０２００】
Ｙ０８８２３に関するこれまでの分析により、アミノ末端ドメイン内にＤＥＢおよび非ねじれＡＧＦＣＣ’Ｃ’’ベータシートを形成しているベータ鎖が、Ｙ０８８２３とＢ７-１の間で保存されていると予想されることが示唆された(Ikemizu, S. et al. (2000) Immunity 12: 51-60)。興味深いことに、ＧＬ５０配列とＹ０８８２３の間の高程度の予測二次構造の保存が、対応するアミノ末端ドメインのＤＥＢベータシートを含む領域内にも存在した。これらの構造相同性に基づく予測から、この領域における配列同一性により内部ドメインコア内に重要な内部ドメイン静電気的接触が提供され、そして疎水性度が保存されて、ＧＬ５０およびＢ７分子に共通する同様の分子骨格が生じることが示唆される（図１６）。これらの観察に基づき、ニワトリのＹ０８８２３を、ＩＣＯＳレセプターに結合するその能力に関して評価した。成熟Ｙ０８８２３ペプチドを表す配列をＲＴ-ＰＣＲにより得、発現ベクターにサブクローニングし、ＣＯＳ細胞にトランスフェクションして機能性表面蛋白を得た。Ｙ０８８２３トランスフェクション細胞はＣＴＬＡ４-Ｉｇには結合したが、ｈＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍおよびｍＩＣＯＳ-ｍＩｇＧ２ａｍには結合しないことが認められた（図１７）。Ｙ０８８２３のＩＣＯＳへの結合が検出未満のレベルで起こることは除外できないが、本明細書中で用いたアッセイ条件に基づき、ＧＬ５０様蛋白Ｙ０８８２３が、ヒトまたはマウスのＩＣＯＳレセプターのためのリガンドとして交差作用(cross-function)する可能性はないと考えられる。
【０２０１】
構造および遺伝的類似性により、Ｂ７／ＧＬ５０型蛋白が極端な系統発生的境界を越えて保存されていることが示唆されるが、この解釈には、これらの蛋白を利用している機械論的経路も共通しているということが含まれる。これらの蛋白がＴ細胞のシグナル伝達において同じ機能を有するという証拠から、共刺激リガンド、その同種レセプター、および存在する誘導スプライス変種の絶対数および起源に関して疑問が生じる。Ｂ７-Ｉｇ-スーパーファミリーの構造に当てはまる他の蛋白にはＭＯＧおよびブチロフィリンが含まれるが、これらの蛋白が、いずれかの共刺激経路においてリガンドとして関与することは認められていない(Henry, J. et al. (1999) Immunol. Today 20: 285-8)。染色体２１の配列(Hattori, M. et al. (2000) Nature 405: 311-9)を利用して、ヒトＩＣＯＳ-リガンドのゲノム構成が決定され、ｈＧＬ５０(Ling, V. et al. (2000) J. Immunol. 164: 1653-7)およびＫＩＡＡクローン０６５３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＢ０１４４５３）の形態の、少なくとも２つのスプライス変種の存在が示された。Ｂ７-様遺伝子のメンバーの中で、Ｂ７-１、Ｂ７-２、ブチロフィリンおよびｈＧＬ５０の遺伝子構造が報告されている。これらの遺伝子を含むエキソンの絶対数は５〜１２で変化するが、これらの遺伝子は、別個のエキソンが２つのＩｇ-様細胞外ドメインをコードする点、一つのエキソンが膜貫通ドメインをコードする点、そして複数のエキソンが細胞質ドメインをコードする点（例えば、ｈＧＬ５０に関して２個のエキソン、Ｂ７-２に関して２個のエキソン(Jellis, C. E. et al. (1995) Immunogenetics 42: 85-9; Borriello, F. et al. (1995) J. Immunol. 155: 5490-7)）、Ｂ７-１に関して１〜２個のエキソン(Borriello, F. et al. (1994) J. Immunol. 153: 5038-48)、そしてブチロフィリンに関して３個のエキソン(Ogg, S. L. et al. (1996) Mamm. Genome 7: 900-5)）で構造が共通する。ＫＩＡＡ０６５３に関し、細胞質ドメイン１および２をコードしているエキソン間にスプライス結合は用いられておらず、推定イントロン６に２．９ｋｂの読み過しが生じている。染色体２１ＢＡＣクローンＨＳ２１Ｃ０９８とＫＩＡＡ０６５３を並置したところ、ＫＩＡＡ０６５３の異なる３’細胞質ドメインが一致していないことが認められ、７つのミスマッチと１つの１７ｂｐの欠失からなる８の配列不一致が認められた。これに対し、ヒトＧＬ５０をＨＳ２１Ｃ０９８に対してエキソン配列を並置したところ、ポリアデニル化部位を含めて、ポリアデニル化部位まで完全に配列が一致していることが明らかであった。前記の例により、ヒトＧＬ５０、ｍＧＬ５０-１および変種ｍＧＬ５０-２が、細胞質ドメイン１および２のスプライス部位の近く（ｍＧＬ５０-１残基３１６-３１８：Ｅ-Ｌ-Ｔ；図１６）にいくらかのアミノ酸配列同一性を示すことが示される。ｈＧＬ５０／ＡＢ０１４５５３間およびｍＧＬ５０-１／ｍＧＬ５０-２間のスプライシング変化の共通点により、細胞質ドメイン２の異なるスプライシングを可能とし、または促進して、異なる機能ドメインを組み合わせ付加することにより異なるシグナル伝達をおそらく提供する、保存されたメカニズムの可能性が示唆される。ｍＧＬ５０-２ともとのｍＧＬ５０-１が異なる組織特異性で転写されるという所見から、細胞シグナル伝達におけるこれらの分子の調��が生理学的場所および活性化部位に依存するという見解が支持される。
【０２０２】
異なるカルボキシル領域を有する複数形態のＧＬ５０の存在とともに、哺乳類ＧＬ５０と鳥類Ｙ０８８２３間で保存された細胞内モチーフの存在により、これらの分子の細胞内領域における違いが異なるシグナル伝達機能を導いている可能性があることがさらに示唆される。これは、ｍＧＬ５０-１と共通する２残基に加えて、ｍＧＬ５０-２の細胞内ドメインに３つのさらなるチロシン残基が存在しているのが認められることによりさらに支持される。これは、細胞内領域に明らかな保存配列が全くなく、共刺激活性が損なわれることなく細胞内領域が削除されているＢ７-１およびＢ７-２の構造と対照的であり、細胞内シグナル伝達がこれらのＢ７蛋白の重要な特徴ではないことが示唆される(Brunschwig, E. B. et al. (1995) J. Immunol. 155: 5498-505)。ｈＧＬ５０の保存されたモチーフは、疎水性度分析により分子の細胞内部分に存在することが予測されたが、エキソン５の膜貫通ドメインによりコードされており、エキソン６細胞内ドメイン-１によってはコードされていないことが見出された。ニワトリＹ０８８２３ｃＤＮＡクローンでは、配列相同性は、対応するエキソン６／細胞質ドメイン-１の後３つのアミノ酸残基内で終結する。もし、ｈＧＬ５０のゲノム構成がＹ０８８２３中で維持されており、そこで保存されたモチーフがエキソン-５膜貫通ドメインの細胞内部分によりコードされているならば、ｈＧＬ５０中の細胞質ドメインをコードしているエキソン６およびエキソン７に対するオーソログであるＤＮＡセグメントは、ニワトリには全く存在しない可能性があるといえる。Ｂ７細胞質ドメインの構造研究で、これらの配列はほとんどなくてもよいものである可能性があると主張されている(Brunschwig, E. B. et al. (1995) J. Immunol. 155: 5498-505)。しかし、異なる細胞質エキソンがＢ７-１およびＧＬ５０で用いられているという事実により、異なるエキソンドメインの付加が新規Ｂ７-様蛋白が生じる間に起こった可能性があることが示唆される。Ｂ７-様ブチロフィリン蛋白は、その支配的な形態が、この分子からのシグナル伝達を変換するのにおそらく用いられる細胞内リングフィンガーモチーフ(Ring finger motif)をコードしている細胞質ドメイン３を含む(Ogg, S. O. et al. (1996) Mamm. Genome 7: 900-5) 多くのスプライス変種によりコードされる。これらの所見は、エキソン５および他の細胞質ドメイン由来の保存された細胞内モチーフを有するＧＬ５０およびＹ０８８２３などの他のリガンドタイプの分子が、細胞が見出される環境(environmental millieu)に依存して、シグナル送達およびシグナルレセプター分子としての別の役割を有する可能性があるという考えを支持する。
ＧＬ５０の表面発現を示す細胞のサブセットを明確に規定するために、ＲＡＧ１−／−およびＢａｌｂ／Ｃ脾細胞のサブセットの比較表現型タイピングを行った。前記の実施例は、新たに単離されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞ならびにＲＡＧ１−／−のＣＤ１１ｃ＋細胞がＩＣＯＳ-リガンドを発現している細胞の下位集団を含んだことを示す。これらの結果は、ＩＣＯＳ-リガンドがＴ細胞系統(Aicher, A. et al. (2000) J. Immunol. 164(9): 4689-96)および樹状細胞系統(Yoshinaga, S. K. et al. (1999) Nature 402: 827-32)には無いことを示したこれまでの研究とは異なる。精製された細胞のサブセットのＲＴ-ＰＣＲ分析により、ＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２両者が同じ細胞で発現されることが確認され、両転写産物がＩＣＯＳ結合の表面提示に貢献し得ることが示唆された。抗原提示細胞に加えて、共刺激リガンドの初期発現が胚発生のＥＳ細胞モデルで初期に起こり、未分化細胞およびインビトロで１０日培養した胚様体においてＢ７-１およびＧＬ５０-１転写産物が存在することが立証された(Ling, V. et al. (1998) Exp Cell Res. 241: 55-65)。この研究で、ＲＮＡ分析によりＧＬ５０-２転写産物がこれらの組織内で見出されることがさらに立証される。コロニー形成アッセイにおいて、ｃ-ｋｉｔ+／ＰＥＣＡＭ-１+細胞が混合造血前駆体を産生する能力、およびＣＤ４５+細胞がマクロファージ前駆体を産生する能力により証明されるように(Ling, V. and Neben, S. (1997) J. Cell Physiol. 171: 104-15; Ling, V. et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 509-14)、胚様体分化の９日までは、新生造血細胞はインビボにおいて卵黄嚢造血前駆体に表現型的に類似する。これらのＣＤ４５+細胞は、Ｂ７-１+およびＢ７-２+であることも見出され、共刺激リガンドの発現がリンパ球生成の非常に初期に起こることが強く示唆される。これに相応して、高レベルのＧＬ５０-１およびＧＬ５０-２の発現が、胚期の卵黄嚢および胎児肝臓などの胎児造血部位で認められた。最終的なリンパ球形成の直前のものから得られた細胞型である胎児繊維芽細胞培養物においてＩＣＯＳ-リガンドが誘導され得ることは注目に値し、共刺激シグナル伝達カスケードのメカニズムが初期の適応的免疫反応の形成とは無関係に平衡を保っている可能性があることが示唆される。後生動物が、胚発生の系統化段階でおこる共通の発達経路を共有し、複雑な進化に関連する特性を有する、ある中心的な生理学的プロセスが、胚発生のこの期間中に、および成人の生理機能において後ほど反映されることが仮定されている(Kirschner, M. and Gerhart, J. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8420-7)。共刺激リガンドが、胚および成人の両系により用いられるいくらかの中心的プロセスの一部であるかどうかは未だ決定されていない。
【０２０３】
Ｂ７ファミリーメンバー間の大きな遺伝子距離にもかかわらず、霊長類とネズミのＢ７-１およびＢ７-２が系統発生系列を越えてＣＴＬＡ４およびＣＤ２８への交差結合を保持しているという事実により、自然史の時間系列を通じたこれらのシグナル伝達分子内でのヌクレオチド置換に対する耐性が示唆される。共刺激リガンドとそのレセプター間の系統発生的に相異するパターンを比較するために、マウス、ヒトおよびニワトリからのＣＴＬＡ４(Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００９８４３およびＮＭ＿００５２１４）、ＣＤ２８（受託番号ＮＭ＿００７６４２、ＮＭ＿００６１３９、およびＸ６７９１５）、およびＩＣＯＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２５０５５９およびＧｅｎｓｅｑ受託番号Ｖ５３１９９）レセプターの蛋白配列を分析した。グラフで表した場合、これらのレセプターの遺伝子距離値により（表６）、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８蛋白間の距離がＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ４間の距離よりも接近しているパターンが明らかなった（図２１）。
【０２０４】
【表７】
0004737905.tif 000008
【０２０５】
種間のレセプター配列の関連性を比較した場合、ヒトＣＤ２８／ＩＣＯＳの距離値（１７６）はマウスＣＤ２８/ＩＣＯＳの値（２５７）よりも小さかった。同様に、ヒトＣＴＬＡ４／ＩＣＯＳの距離値（２６１）はマウスＣＴＬＡ４／ＩＣＯＳの距離値（４０５）よりも小さいことも認められた。これらのデータにより、ＩＣＯＳ分子の構造が、ＣＴＬＡ４の形態よりもＣＤ２８の形態から由来したと考えられることが示唆される。これに対し、共刺激リガンドの系統発生的分析により、ＧＬ５０およびＢ７-１間の距離値（２４３-２８２）は、ＧＬ５０-Ｂ７-１間の距離値（２００-２７０）とほぼ等しいことが立証された。Ｙ０８８２３は、マウスとヒトのＧＬ５０蛋白に対してＢ７蛋白（２３-３０％、２３０-３１０）よりも高い配列同一性および低い遺伝学的距離値（３６-３７％；１３１-１３８）を示すことが見出された。ＧＬ５０とＢ７-１／Ｂ７-２ファミリーメンバーの間で遺伝学的距離がほぼ等しいこと、ＩＣＯＳとＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーメンバーの間で遺伝学的距離が等値でないことは、レセプターファミリーを支配している進化／機能拘束が、リガンドファミリーを支配しているものと異なることを意味する。
【０２０６】
系統発生的配列関連性はこれらの分子のゲノム配置を反映し得る。Ｂ７-１およびＢ７-２はマウス染色体１６とヒト染色体３に同時に存在し、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳはマウス染色体１とヒト染色体２ｑ３３に同時に存在する。これに対し、ＧＬ５０の遺伝子配置はＢ７の配置と関連せず、ヒトＧＬ５０は染色体２１ｑ２２に位置するが（Hattori, M. et al. (2000) Nature 405: 311-9)、マウスＧＬ５０は染色体１０に位置する。ＴＦａｓｔＸ分析により、さらなるＧＬ５０-様ホモログは染色体２１に同定されず、ＧＬ５０がＢ７-１およびＢ７-２の様に、共にまとめられる遺伝子のファミリーとしては存在しない可能性があることが示唆される。Ｙ０８８２３に関して、この分子がＢ７-１の真のオーソログであるかどうか、Ｙ０８８２３がそのオーソログが哺乳類系で規定されていない新規なＢ７-様分子を表すかどうかは明らかではない。しかし、荷電した残基部位に複数のアミノ酸の置換を含んでいるＢ７およびＹ０８８２３間で共通する２３-３０％の配列同一性から、これらの蛋白がＣＴＬＡ４(O'Regan, M. N. et al. (1999) Immunogenetics 49: 68-71)に対して機能的交差結合を保持していることは驚きであった(O'Regan, M.N. et al. (1999) Immunogenetics 49: 68-71)。Ｙ０８８２３がＧＬ５０に対して強い構造類似性を有し、さらにＢ７-１およびＢ７-２に特徴的な結合特性を保持しているという思いがけない結果から、これらの共刺激リガンドの多様性に対して構造的および機能的拘束が少ないことが示唆される。
【０２０７】
レセプターファミリーおよびリガンドファミリー間で測定される異なる遺伝学的距離は、多くのシナリオにより説明することができる。蛋白のＧＬ５０／Ｂ７ファミリーをコードしている遺伝子がＣＤ２８／ＣＴＬＡ４レセプターをコードしている遺伝子よりも早期に発生した可能性がある。ＩＣＯＳレセプターをコードしている遺伝子の形成は、系統発生中後期に生じた可能性があり、およびＣＤ２８の構造に基づいたものである可能性があり、こうしてＣＴＬＡ４分子よりもＣＤ２８に大きく類似することとなった可能性がある。この仮説により、多くのＢ７-様蛋白が存在し、一方、比較的少ないＣＤ２８-様レセプターしか開示されていないことを説明することができる。ＣＴＬＡ４の所定のエキソンが同義ＤＮＡ変異のレベルでも懸著な配列拘束性を保持することは注目すべきことであり、ランダムな変異からその位置を保護する、未だ規定されていないメカニズムの存在が示唆される(Ling, Vl et al. (1999) Genomics 60: 341-355)。変異を拘束しているメカニズムがＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／ＩＣＯＳ遺伝子座の長さを超えて共刺激レセプター領域を調節すること、またはこれらのレセプターの細胞内シグナル伝達ドメインへ付加される選択圧が多様性の低い割合を維持するのに十分であることが考えられる。
【０２０８】
共刺激リガンドおよびレセプターは、１０-２０％の範囲で免疫グロブリンとホモロジーを共有し、特徴的な鎖内ジスルフィド結合を有する蛋白として定義されている、蛋白のＩｇ-スーパーファミリーに属する。Ｉｇ-スーパーファミリー蛋白は、異なる機能の蛋白中、および脊椎動物系統間に広く分布する。節足動物と脊椎動物の出現は６億年前まで遡り、Ｉｇ-スーパーファミリーの推定前駆体を表している分子はさらにもっと古く、おそらく扁形動物や線虫などの無脊椎動物に存在することが示唆されている。蛋白のＩｇ-スーパーファミリーが少なくとも古代からのものであるという考えは、Ｎ-ＣＡＭなどのいくらかのＩｇ-様蛋白が哺乳類ならびに昆虫で見出されるという知見により支持される。Ｉｇ-に基づく、組合せ適応性免疫系(combinatorial adaptive immune system)を生じさせた免疫学における「ビッグバン」事件(Marchalonis, J. J. et al. (1998) Immunol Rev. 166: 103-22およびその中の引用）は、理論的には１千-２千万年の地質学的に短い時間期間を超えて４億５千万年前、下あごのない魚の発生中に起こった。現在のところ、免疫グロブリン系を分子のＩｇ-スーパーファミリーから発生させた可能性のあるメカニズムは明らかには定められていない。しかし、組合せ免疫系に必要なＩｇ-ドメインと組換え酵素をコードしている遺伝子が、淘汰上の利点を提供するのに十分大きな規模で水平移動されたことを示唆する理論が提唱されている(Bernstein, R. M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9454-9)。細胞の活性化を誘発し、免疫グロブリン分子の変異を促進するのに役立ち、およびクラス転換(class switching)に影響を与えるＩｇ-スーパーファミリー共刺激分子のサイレントなシグナル伝達の特徴を含んでいる包括的な生化学的機構の基礎は全くない。古代軟骨魚系統の現存するメンバー、サメなどが、共刺激分子を持つかどうかは現在知られていないが、ＣＤ２８およびＹ０８８２３などの共刺激関連蛋白がニワトリに存在しているという事実により、いくらかのタイプの共刺激経路が、少なくとも３億年前に出現した鳥類系統のメンバーに存在したことが示唆されており(Burt, D. W. et al. (1999) Nature 402: 411-3)、Ｙ０８８２３分子が、ＧＬ５０またはＢ７いずれかの真のオーソログというよりも、むしろ模範的な共刺激リガンドと非常に類似する、ＧＬ５０およびＢ７両方分子に対する同時代同系統(contemporary cousin)を表している可能性が開かれる。鳥類系統と対照的に、マウスとヒトの系統は約１億年前に分かれ、マウスゲノムがニワトリおよびヒトに見られるものと比較して広範囲にわたって染色体が再配置されていると仮定されている(Burt, D. W. et al. (1999) Nature 402: 411-3)。これらの再配置によりＢ７ファミリーメンバーとＧＬ５０分子コーディング遺伝子間の分離が導かれた可能性があるかどうかは知られていない。鳥類ＩＣＯＳまたはその変種が存在するかどうかも知られていない。
【０２０９】
実施例１２．可溶性ＧＬ５０はヒトＴ細胞を共刺激することができる
可溶性ｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍがヒトＴ細胞を共刺激する能力を、Ｔ細胞共刺激アッセイを用いて測定した。未処理のＣＤ４+Ｔ細胞を精製し、ウェル当たり１０％の細胞で蒔いた。細胞を、細胞１個当たり１個のビーズ、およびビーズ１０７個当たり１または２μｇの抗-ＣＤ３を用いて、ビーズ上の抗-ＣＤ３で刺激した。細胞を、細胞１個当たり１個のビーズ、およびビーズ１０７個当たり３μｇのｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍを用いて、ビーズ上のｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍで処理した。ＣＤ２８のシグナル伝達を（抗-ＣＤ２８（Pharmingen)を用いて）得、またはそれを刺激して、ＣＤ２８媒介共刺激の調節がｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍ媒介共刺激に影響を持つかどうかを測定した。
ＩＬ-２の産生、ＩＬ-１０の産生、および増殖（３Ｈの取り込み）を、共刺激の指標としてアッセイした。サイトカインおよび増幅を刺激７２時間後に測定した。
【０２１０】
図２２に見られるように、ｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍ（ｈＧＬ５０．Ｆｃとも呼ばれる）は、増殖の増加ならびにＩＬ-２およびＩＬ-１０産生の誘導により示されるように、Ｔ細胞を共刺激することができる。ＣＤ２８媒介共刺激を誘導する、ＣＤ２８に対する抗体の存在下、ＩＬ-２の産生も誘導される。図２３は、増殖およびサイトカインの産生における種々の濃度の抗-ＣＤ３および抗-ＣＤ２８の影響を示す。
【０２１１】
図２４は、抗-ＣＤ３で、あるいは抗-ＣＤ３と可溶性ｈＧＬ５０-ｍＩｇＧ２ａｍで（ＣＤ２８媒介共刺激を刺激するために）刺激されたＴ細胞に抗-ＣＤ２８を添加することによりＩＬ-２の産生が誘導されるが、ｈＧＬ５０媒介ＩＬ-１０の産生には影響がないことを示す。
【０２１２】
実施例１３  ＩＣＯＳ／ＧＬ５０経路の刺激を用いるネズミの腫瘍の処置
今のところ、抗腫瘍反応を発生させることに関するＩＣＯＳ／ＧＬ５０共刺激の役割は報告されていない。本研究で、ＩＣＯＳ／ＧＬ５０共刺激の相対的効力を、種々のネズミ腫瘍モデルにおけるＣＤ２８／Ｂ７の共刺激と比較した。腫瘍を有する動物の全身処置のために、ネズミＢ７．２-ＩｇＧ２ｑおよびＧＬ５０-ＩｇＧ２ａの融合蛋白を作成し、それらはそれぞれＢ７．２およびＧＬ５０の細胞外ドメインと、ネズミＩｇＧ２ａのＦｃ部分とから成っていた。ネズミのアイソタイプＩｇＧ２ａを対照として用いた。ＭｅｔｈＡまたはＢ１６Ｇ１メラノーマ腫瘍を有するマウスを、５０μｇ／注射のＧＬ５０-ＩｇＧ２ａまたはＢ７．２-ＩｇＧ２ａ融合蛋白で週に２回３週間皮下処置した。ＭｅｔｈＡモデルにおいて、Ｂ７．２-ＩｇＧ２ａを用いた処置により、１００％まで腫瘍が退化し（図２５Ａ）、マウスが治癒し（図２５Ｅ）、およびＧＬ５０-ＩｇＧ２ａを用いた処置によりマウスの６０-９０％までが治癒し（図２５Ｅ）、４０％腫瘍の成長が明らかに遅延した（図２５Ｄ）．Ｂ１６Ｆ１メラノーマでは、いずれかの蛋白を用いた全身処置により、前記のものに匹敵して明らかに腫瘍の成長が遅延した。両腫瘍モデルで、対照のＩｇＧ２ａ処置は効果を持たなかった(図２５Ａ、ＣおよびＥ）。腫瘍ワクチン研究では、Ｂ１６Ｆ１メラノーマおよびＭＢ４９膀胱癌モデルを用いた。腫瘍細胞を、ネズミＢ７．１またはＧＬ５０いずれかを発現しているＥＦ-１プロモーターを含むベクターでトランスダクションし、Ｇ４１８（ネオマイシン）により選択される腫瘍細胞をインビボ腫瘍形成実験のために皮下注射した。腫瘍細胞におけるＧＬ５０およびＢ７-１の発現を、抗-ｍＢ７-１モノクローナル抗体(Pharmingen、クローン１６-１０Ａ１）またはＩＣＯＳ-ＩｇＧ２ａ融合蛋白を用いたＦＡＣＳ分析により測定した。結果から、(i)Ｂ１６Ｆ１モデルにおいて、ＧＬ５０を発現している腫瘍細胞を注射したマウスの４０％、およびＢ７．１を発現している腫瘍細胞を注射したマウスの２０％がその腫瘍を拒絶すること（図３１Ａ）；(ii)ＭＢ４９モデルにおいて、ＧＬ５０を発現している腫瘍細胞を注射したマウスの３０％、およびＢ７．１を発現している腫瘍細胞を注射したマウスの１０％がその腫瘍を拒絶すること（図３１Ｂ）が立証された。これらの結果により、可溶性ＧＬ５０-１または腫瘍細胞上でのＧＬ５０の発現のいずれかにより提供される、亢進されたインビボでのＩＣＯＳ／ＧＬ５０相互作用が、ネズミ腫瘍モデルのＣＤ２８／Ｂ７経路に関して十分に説明されている抗腫瘍効能に匹敵する有意な抗腫瘍活性を有することが示される。
【０２１３】
同意義
当業者は、常套実験を用いるだけで、本明細書に開示される発明の特定態様に対する多くの均等物を認識、または確認することができる。そのような均等物は請求項に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、シグナル配列クローン（位置１−５１９）およびＲｅｃＡ単離クローン（位置３７４−２７１８）に基づくネズミＧＬ５０−１（ｍＧＬ５０−１）の完全ヌクレオチド配列を示す。シグナル配列をコードする推定ヌクレオチドを箱で囲い、疎水性の膜貫通ドメインに下線を付した。
【図２】  図２は、ネズミＧＬ５０−２（ｍＧＬ５０−２）生成物のヌクレオチド配列を示す。
【図３】  図３は、ｍＧＬ５０−１およびｍＧＬ５０−２生成物の配列並置比較を示す。配列多様性は、ｍＧＬ５０−１についてはヌクレオチド１０２７において、ｍＧＬ５０−２についてはヌクレオチド９６０において生じている。
【図４】  図４は、ｍＧＬ５０−１およびｍＧＬ５０−２のアイソフォーム（isoform）特異的ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図５】  図５は、ｍＧＬ５０−１およびｍＧＬ５０−２の特異的ノーザンブロット分析を示す。
【図６】  図６は、ＡＢ０１４５５３  ＲＡＣＥ生成物のヌクレオチド配列を示す。ボックスで囲んだ領域は、公表されたＡＢ０１４５５３  ｃＤＮＡ配列とＲＡＣＥ生成物との間の多様性領域である。最後のネステッドＲＡＣＥプライマーは位置１から２２まで伸長しており、ヌクレオチド６５５から６７６までに対応している。
【図７】  図７は、翻訳されたＲＡＣＥ生成物および公表されたＡＢ０１４５５３  ｃＤＮＡの並置比較を示す。多様性は、公表されたＡＢ０１４５５３  ｃＤＮＡの残基２９９およびＲＡＣＥ生成物の残基１２３において生じる。
【図８】  図８は、ヒトＧＬ５０（ｈＧＬ５０）の配列を示す。
【図９】  図９は、ＧＬ５０、融合したＡＢ０１４５５３  ＲＡＣＥ生成物（ｈＧＬ５０）、ならびにマウスおよびヒトＢ７−１およびＢ７−２のハイドロパシープロット分析を示す。有意なハイドロパシープロファイルはＧＬ５０とＡＢ０１４５５３との間に見られる。
【図１０】  図１０は、公表されたＡＢ０１４５５３  ｃＤＮＡおよびＡＢ０１４５５３  ＲＡＣＥ生成物のＲＴ−ＰＣＲサザンブロット分析を示す。
【図１１】  図１１は、複数のヒト組織ＲＮＡブロットのノーザンブロット分析を示す。ｈＧＬ５０／ＡＢ０１４５５３のコーディング配列をプローブとして使用した。
【図１２】  図１２は、ｈＧＬ５０、ｍＧＬ５０−１、ｈＢ７−１、ｍＢ７−２、ｈＢ７−２、ｍＢ７−２のパイルアップ分析を示し、その中でシグナルペプチド、Ｉｇ−様ドメイン、膜貫通、および細胞質ドメインが示されている。推定疎水性膜貫通残基に下線を付し、アステリスクはＩｇ構造に貢献する残基を示す。Ｉｇ構造のインジケーターである細胞外システインおよびトリプトファンを太字で示す。
【図１３】  図１３は、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＧＬ５０蛋白間の遺伝学的距離を示すデンドログラム分析を示す。Ｙ０８８２３はニワトリＣＤ８０−様蛋白であり、ＭＭ８６７０６５  １はマウスブチロフィリンである。
【図１４】  図１４は、ＧＬ５０  ＣＯＳトランスフェクション研究の結果を示す。ｍＧＬ５０−１はＣＯＳ細胞において発現され、次いで、ＩＣＯＳ−Ｉｇ、ＣＤ２８−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇのいずれかで染色された。ｍＧＬ５０−１を発現する細胞によりＩＣＯＳ  Ｉｇの結合が検出された。
【図１５】  図１５は、ｍＧＬ５０−１およびｍＧＬ５０−２を図式的に示す。縦線により示される配列多様性は、ｍＧＬ５０−１についてはヌクレオチド１０２７から、ｍＧＬ５０−２についてはヌクレオチド９６０から生じている。反復配列（けば付きのボックス）はＧＬ５０−２の３’ＵＴＲ中に見られ、ヌクレオチド１３４９−１５５４の範囲である。ダッシュおよび矢印の頭はＲＴ−ＰＣＲ分析に使用したオリゴヌクレオチドを示す。横線はノーザンブロット分析に使用したプローブを示す。
【図１６】  図１６は、ｍＧＬ５０−１、ｍＧＬ５０−２、ｈＧＬ−５０、およびＹ０８８２３の間の蛋白配列の並置比較を示す。配列はＰｉｌｅＵｐを用いて並置比較され、これらの分子間で共有されている残基をボックスで囲んだ。配列上の文字は、Ｂ７−１の結晶構造に基づいてＹ０８８２３に関して予想されるペプチドの２次構造を示す。ｈＧＬ５０細胞質ドメイン１配列をコードするエキソンはＣｙ−１と表示されたバーにより示される。
【図１７】  図１７は、マウス、ヒト、およびニワトリのＧＬ５０関連蛋白に対するＩＣＯＳの結合に関するフローサイトメトリー分析を示す。ｍＧＬ５０−１、ｍＧＬ５０−２、ｈＧＬ５０、およびニワトリＢ７様蛋白Ｙ０８８２３をコードする発現プラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞を、ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍ、ｈＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍまたはｍＣＴＬＡ４−ｍＩｇＧ２ａｍとともにインキュベーションし、その後、抗マウスＩｇＧ２ａビオチンで染色し、ストレプトアビジン−ＰＥを用いて検出した。
【図１８】  図１８は、ＷＥＨＩ２３１へのＩＣＯＳの結合を示す。ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍまたはｍＣＴＬＡ４−ｍＩｇＧ２ａｍの滴定量を用いて、ブロッキング抗Ｂ７−１およびＢ７−２抗体またはアイソタイプ対照の存在下においてＷＥＨＩ２３１細胞を染色した。
【図１９】  図１９は、未分化ＥＳ細胞へのＩＣＯＳの結合を示す。抗Ｂ７−１およびｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍ試薬を用いる未分化ＥＳ細胞対比染色の分析により、Ｂ７−１およびＩＣＯＳ−リガンドに関して陽性染色が得られた。
【図２０】  図２０は、Ｂａｌｂ／ｃおよびＲＡＧ１−／−脾臓細胞サブセットのイムノフェノタイピングを示す。１００００個の染色細胞の２次元プロットを示す。５００００個のデータポイントを伴う試料はアステリスクにより示される。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃおよびＲＡＧ１−／−マウスから豊富化された脾臓細胞を、ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍならびにＣＤ３、ＣＤ２４、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ｐａｎＮＫ、ＭＨＣクラスＩＩまたはＣＤ４０に対するＦＩＴＣ−抱合抗体で染色した。さらにフェノタイプを決定するために、ＣＤ４＋、ＩＣＯＳ−リガンド＋細胞、ＲＡＧ１−／−細胞をＰＥ−標識抗ＣＤ４およびＦＩＴＣ−標識抗ＣＤ１１ｃで染色した。（Ｂ）ＲＡＧ１−／−およびＢａｌｂ／ｃマウスから豊富化された脾臓細胞（未処理、ＣｏｎＡ活性化、あるいはＬＰＳ活性化されたもの）を、ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍならびにＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ６９に対する抗体で染色した。
【図２１】  図２１は、ＧＬ５０／Ｂ７リガンドおよびＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／ＩＣＯＳ受容体を系統発生学的に示したものである。表５（ＧＬ５０／Ｂ７リガンド）および表６（ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／ＩＣＯＳ）からの値を用いて、隔たりに比例した系統発生樹が得られた。バーは、１００個のアミノ酸あたりの置換として表現される遺伝学的隔たりを示す。（Ａ）ＧＬ５０／Ｂ７関連蛋白の系統発生樹。受託番号ＭＭＵ６７０６５  １はマウスブチロフィリンを示す。（Ｂ）ＩＣＯＳ／ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４蛋白の系統発生樹。
【図２２】  図２２は、抗ＣＤ２８ブロッキング抗体の不存在下または存在下におけるＴ細胞のＧＬ共刺激による増殖およびサイトカイン誘導を示す。注：ｈＧＬ５０．ＦｃはｈＧＬ５０−ＩｇＧ２ａｍと同じである。
【図２３】  図２３は、種々の濃度の抗ＣＤ２８ブロッキング抗体および抗ＣＤ３刺激の存在下におけるＧＬ５０共刺激により誘導されたＴ細胞増殖を示す。
【図２４】  図２４は、ＣＤ２８刺激の不存在下または存在下におけるＧＬ５０共刺激によるＴ細胞におけるサイトカイン誘導を示す。
【図２５】  図２５は、マウスにおける腫瘍増殖に対するＧＬ５０−ＩｇＧ２ａの阻害能を示す。
【図２６】  図２６は、ｈＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の配列を示す。（Ａ）ｈＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍをコードするヌクレオチド配列（配列番号：２３として示す）。オンコスタチン−Ｍリーダー配列は下線を付したヌクレオチドによりコードされる。ボックスで囲んだヌクレオチドは融合蛋白のマウスＩｇＧ２ａｍドメインをコードする。翻訳開始部位をＸにより示す。イントロンおよび非翻訳領域を破線により示す。停止コドンを二重下線により示す。（Ｂ）ｈＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の推定アミノ酸配列（配列番号：２４として示す）。
【図２７】  図２７は、ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の配列を示す。（Ａ）ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍをコードするヌクレオチド配列（配列番号：２５として示す）。オンコスタチン−Ｍリーダー配列は下線を付したヌクレオチドによりコードされる。ボックスで囲んだヌクレオチドは融合蛋白のマウスＩｇＧ２ａｍドメインをコードする。翻訳開始部位をＸにより示す。イントロンおよび非翻訳領域を破線により示す。停止コドンを二重下線により示す。（Ｂ）ｍＩＣＯＳ−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の推定アミノ酸配列（配列番号：２６として示す）。
【図２８】  図２８は、ｈＧＬ５０−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の配列を示す。（Ａ）ｈＧＬ５０−ｍＩｇＧ２ａｍをコードするヌクレオチド配列（配列番号：２７として示す）。オンコスタチン−Ｍリーダー配列は下線を付したヌクレオチドによりコードされる。ボックスで囲んだヌクレオチドは融合蛋白のマウスＩｇＧ２ａｍドメインをコードする。翻訳開始部位をＸにより示す。イントロンおよび非翻訳領域を破線により示す。停止コドンを二重下線により示す。（Ｂ）ｈＧＬ５０−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の推定アミノ酸配列（配列番号：２８として示す）。
【図２９】  図２９は、ｍＧＬ５０−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の配列を示す。（Ａ）ｍＧＬ５０−ｍＩｇＧ２ａｍをコードするヌクレオチド配列（配列番号：２９として示す）。オンコスタチン−Ｍリーダー配列は下線を付したヌクレオチドによりコードされる。ボックスで囲んだヌクレオチドは融合蛋白のマウスＩｇＧ２ａｍドメインをコードする。翻訳開始部位をＸにより示す。イントロンおよび非翻訳領域を破線により示す。停止コドンを二重下線により示す。（Ｂ）ｍＧＬ５０−ｍＩｇＧ２ａｍ融合蛋白の推定アミノ酸配列（配列番号：３０として示す）。
【図３０】  図３０は、種々の脾臓細胞タイプのＩＣＯＳ−Ｉｇ染色を示す。
【図３１】  図３１は、ＧＬ５０でトランスフェクションされた腫瘍細胞の腫瘍形成性の低下を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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