(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、
ｍth−１５１≦ｍex≦ｍth＋１５１
を満たす、質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、
ｍex−ｍthの値と、アミノ酸置換により生じうる質量変化の値とを比較し、前記ｍex−ｍthが前記アミノ酸置換に特異的な値であるかどうかを確認するステップと、
前記ｍex−ｍthが前記アミノ酸置換に特異的な値であったとき、前記アミノ酸置換に対応するアミノ酸残基が前記未検出ペプチド中に含まれるかどうかを確認し、含まれている場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項２】
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、下記式（１）を満たす質量ｍexおよび質量ｍex'の前記未帰属ピークと切断部位のアミノ酸残基Ｘを抽出するステップと、
下記式（１）におけるΔｍYXに対応するアミノ酸残基Ｙが前記未検出ペプチド中に存在するかどうかを確認するステップと、
前記アミノ酸置換により生じると予測される仮想ペプチド断片の質量に対応する未帰属ピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトル中に存在するかどうかを確認し、存在する場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
ｍex＋ｍex'−１８＝ｍth＋ΔｍYX  （１）
（ただし、上記式（１）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが、切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、切断部位のアミノ酸残基Ｘは複数種類存在してもよい。）
【請求項３】
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドであって、前記仮想ペプチドの配列において隣接する質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対し、下記式（２）を満たす質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、
質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対応するピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトルから欠落しているかどうかを確認し、欠落している場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
ｍth＋ｍth'−１８＝ｍex＋ΔｍYX  （２）
（ただし、上記式（２）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが、切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、切断部位のアミノ酸残基Ｘは２つの前記未検出ペプチドの境界のアミノ酸残基に限る。）
【請求項４】
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、
前記遺伝子においてイントロンと予測されているすべての領域中のうち、ＡＧとＧＴとで挟まれた領域、ＡＧと最近接のエクソンの端点とで挟まれた領域、または最近接のエクソンの端点とＧＴとではさまれた領域、について仮想的に翻訳される仮想ペプチドの仮想アミノ酸配列を求めるステップと、
前記仮想アミノ酸配列を仮想的にトリプシン消化した際の断片の質量を前記未帰属ピークの質量と比較し、これらが一致している場合にはスプライシング変異が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項５】
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、
すべての未検出エクソンとイントロンについて３通りの読み枠で仮想的に翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を求めるステップと、
前記ポリペプチドをトリプシン消化して得られる仮想ペプチド断片の質量と前記未帰属ピークの質量とが一致するかどうかを確認し、これらが一致している場合にはスプライシング変異が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項６】
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、
検出ペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含むエクソンのうち、未検出領域の塩基配列について、読み枠を１塩基または２塩基ずらした際に生成すると予測されるアミノ酸配列を有するペプチドをトリプシンにより仮想的に消化して生じる仮想ペプチド断片の質量と未帰属ピークの質量とが一致するかどうかを確認し、一致している場合にはフレームシフトが生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載のタンパク質の分析方法において、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップは、前記未帰属ピークと、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドと、を用いて、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のすべてについて解析を行うステップを含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載のタンパク質の分析方法において、前記（ｉ）アミノ酸残基への修飾について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドと前記未帰属ピークとの質量の差分を取得するステップと、
前記差分と、前記タンパク質のアミノ酸残基の修飾による質量の増加分とを比較し、前記差分と前記増加分が一致したとき、前記修飾が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれかに記載のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除について解析を行うステップは、
前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドのうち、最もＣ末端側の検出ペプチドよりもＣ末端側に位置する前記未検出ペプチドについて、そのＣ末端側から逐次的にアミノ酸残基を削除した場合のペプチドの質量を計算するステップと、
前記ペプチドの質量に一致する未帰属ピークが前記質量分析スペクトル中に存在しているかどうかを確認し、存在している場合にＣ末端側のアミノ酸残基が切除されていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれかに記載のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除について解析を行うステップは、
前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドのうち、最もＮ末端側の検出ペプチドよりもＮ末端側に位置する前記未検出ペプチドについて、そのＮ末端側から逐次的にアミノ酸残基を削除した場合のペプチドの質量を計算するステップと、
前記ペプチドの質量に一致する未帰属ピークが前記質量分析スペクトル中に存在しているかどうかを確認し、存在している場合にＮ末端側のアミノ酸残基が切除されていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内に含まれるすべてのタンパク質について、その発現と性質を網羅的にとらえるプロテオーム解析が注目されている。プロテオーム解析において汎用されているタンパク質の同定手法はペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）法である（非特許文献１）。ＰＭＦ法においては、二次元電気泳動などにより分離精製されたタンパク質を酵素分解し、その消化断片ペプチド群の質量分析を行う。そして、質量分析により得られたスペクトルを、データベース等に格納されている既知のタンパク質のアミノ酸配列に関する情報から予測される理論的ピークパターンと照合し、試料タンパク質に対応している遺伝子とタンパク質の候補の同定が行われている。【０００３】
【非特許文献１】Ｗｅｎｚｈｕ  Ｚｈａｎｇ、Ｂｒｉａｎ  Ｔ．  Ｃｈａｉｔ、「ＰｒｏＦｏｕｎｄ：Ａｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、２０００年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７２巻、ｐ．２４８２−２４８９
【０００４】
発明の開示【０００５】
ところが、生体内において実際に発現しているタンパク質は、翻訳後修飾、アミノ酸配列変化、またはスプライシングの様式の変化等により、既知のあるいは遺伝子情報から予測されるタンパク質とは異なる一次構造と修飾状態とを有していることがある。このため、既知のあるいは遺伝子から予測されるタンパク質のアミノ酸配列由来の予測断片ピークとの照合を行う従来の方法は、試料タンパク質をさらに詳細に分析するという観点では改善の余地を有していた。【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、タンパク質の一次構造または修飾状態を詳細に分析する技術を提供することにある。【０００７】
従来のＰＭＦ法では、理論的ピークパターンと照合する際に、試料タンパク質の質量分析スペクトル中に存在するピークのすべてが帰属されるわけではない。帰属されなかったピークを、本発明においては「未帰属ピーク」と呼ぶ。また、データベース記載のアミノ酸配列から存在が予想されるペプチド断片のうち、すべての断片が検出されるわけでもない。検出されなかったペプチド断片を、本発明においては「未検出ペプチド」と呼ぶ。試料タンパク質に対応している遺伝子を同定するためには、すべての断片が検出されなくても充分であったため、従来は、遺伝子を同定した後、帰属されずに残るピークの情報は利用されずに捨てられていた。【０００８】
未帰属ピークおよび未検出ペプチドが生じる大きな原因として、データベースに記載されているものとは異なったアミノ酸配列をもつペプチド断片が存在すること、および翻訳後修飾により予測断片とは異なる質量を持つペプチド断片が生じていること、スプライシングの様式が異なっていたこと、等が挙げられる。【０００９】
本発明者は、従来のＰＭＦ法において未帰属のピークは、これらの情報を含んでいると考えた。そして、同定に用いられないピークについても解析対象とすることにより、生体内において実際に発現しているタンパク質に固有の情報を取得することができると考え鋭意検討を行い、本発明に至った。【００１０】
なお、本発明において、試料タンパク質の質量分析スペクトル中に存在する一部のピークを用いて従来のＰＭＦ法等により同定される遺伝子を「仮想遺伝子」と呼ぶ。また、仮想遺伝子から予測されるタンパク質のアミノ酸配列を、「仮想アミノ酸配列」と呼ぶ。また、仮想アミノ酸配列に基づき、タンパク質の部位選択的な断片化により生成すると予測されるペプチド断片を、「仮想ペプチド断片」と呼ぶ。さらに、仮想ペプチド断片群から取得されると予測される質量分析スペクトルを「仮想質量分析スペクトル」と呼ぶ。【００１１】
また、本発明において、「帰属」とは、質量分析スペクトルの解析において、ピークの由来を科学的に特定することを指す。また、「検出」とは、仮想遺伝子から予測される仮想ペプチド断片に対応するピークが、測定された質量分析スペクトルにおいて観測されることをいう。【００１２】
また、本発明において、上述の「未帰属ピーク」は、分析対象のタンパク質の質量分析スペクトル中のピークのうち、仮想質量分析スペクトル中に存在するピークに対応しないピークである。また、「未検出ペプチド」は、仮想質量分析スペクトル中に存在するピークのうち、分析対象のタンパク質の質量分析スペクトル中に存在しなかったピークに対応するペプチド断片である。【００１３】
本発明によれば、分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾
（ｉｉ）アミノ酸置換
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、
ｍth−１５１≦ｍex≦ｍth＋１５１
を満たす、質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、
ｍex−ｍthの値と、アミノ酸置換により生じうる質量変化の値とを比較し、前記ｍex−ｍthが前記アミノ酸置換に特異的な値であるかどうかを確認するステップと、
前記ｍex−ｍthが前記アミノ酸置換に特異的な値であったとき、前記アミノ酸置換に対応するアミノ酸残基が前記未検出ペプチド中に含まれるかどうかを確認し、含まれている場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法が提供される。
また、本発明によれば、
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、下記式（１）を満たす質量ｍexおよび質量ｍex'の前記未帰属ピークと切断部位のアミノ酸残基Ｘを抽出するステップと、
下記式（１）におけるΔｍYXに対応するアミノ酸残基Ｙが前記未検出ペプチド中に存在するかどうかを確認するステップと、
前記アミノ酸置換により生じると予測される仮想ペプチド断片の質量に対応する未帰属ピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトル中に存在するかどうかを確認し、存在する場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法が提供される。
ｍex＋ｍex'−１８＝ｍth＋ΔｍYX  （１）
（ただし、上記式（１）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが、切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、切断部位のアミノ酸残基Ｘは複数種類存在してもよい。）
また、本発明によれば、
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、
前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドであって、前記仮想ペプチドの配列において隣接する質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対し、下記式（２）を満たす質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、
質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対応するピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトルから欠落しているかどうかを確認し、欠落している場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法が提供される。
ｍth＋ｍth'−１８＝ｍex＋ΔｍYX  （２）
（ただし、上記式（２）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが、切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、切断部位のアミノ酸残基Ｘは２つの前記未検出ペプチドの境界のアミノ酸残基に限る。）
また、本発明によれば、
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、
前記遺伝子においてイントロンと予測されているすべての領域中のうち、ＡＧとＧＴとで挟まれた領域、ＡＧと最近接のエクソンの端点とで挟まれた領域、または最近接のエクソンの端点とＧＴとではさまれた領域、について仮想的に翻訳される仮想ペプチドの仮想アミノ酸配列を求めるステップと、
前記仮想アミノ酸配列を仮想的にトリプシン消化した際の断片の質量を前記未帰属ピークの質量と比較し、これらが一致している場合にはスプライシング変異が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法が提供される。
また、本発明によれば、
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、
すべての未検出エクソンとイントロンについて３通りの読み枠で仮想的に翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を求めるステップと、
前記ポリペプチドをトリプシン消化して得られる仮想ペプチド断片の質量と前記未帰属ピークの質量とが一致するかどうかを確認し、これらが一致している場合にはスプライシング変異が生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法が提供される。
また、本発明によれば、
分析対象のタンパク質を所定の位置で選択的に切断して生成したペプチド断片群の質量分析スペクトルを得るステップと、
前記質量分析スペクトルに含まれるピークを用いて前記タンパク質に対応する遺伝子を同定するステップと、
前記ピークのうち、前記遺伝子から予測される仮想ペプチドを前記所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いて、下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行うステップと、
（ｉ）アミノ酸残基への修飾、
（ｉｉ）アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異、
（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除、
を含み、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップにおいて、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップを必ず行い、
前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、
検出ペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含むエクソンのうち、未検出領域の塩基配列について、読み枠を１塩基または２塩基ずらした際に生成すると予測されるアミノ酸配列を有するペプチドをトリプシンにより仮想的に消化して生じる仮想ペプチド断片の質量と未帰属ピークの質量とが一致するかどうかを確認し、一致している場合にはフレームシフトが生じていると判断するステップと、
を含むことを特徴とするタンパク質の分析方法が提供される。
【００１４】
この分析方法においては、従来利用されていなかった未帰属ピークを用いて分析対象のタンパク質について、上記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う。このため、生体内において実際に発現しているタンパク質に固有の情報を取得することができる。こうした情報は、既存のデータベース等を用いて同定された遺伝子の情報からだけでは得られない情報であるため、本発明の分析方法を用いることにより、タンパク質の一次構造または修飾状態をさらに詳細に解析することができる。【００１５】
なお、本発明において、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の解析により、たとえば（ｉ）〜（ｉｖ）の変化が分析対象のタンパク質に生じているかどうかどうかについての知見を得ることができる。また、変化が生じている場合には、変化の態様についての知見を得ることができる。【００１６】
本発明において、遺伝子を同定する前記ステップは、既存のデータベースを用いたＰＭＦ法により行うことができる。こうすることにより、遺伝子を確実に同定することができる。【００１７】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップは、前記ピークのうち、前記未帰属ピークと、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドと、を用いることができる。こうすることにより、分析対象のタンパク質について、さらに詳細な解析を行うことができる。【００１８】
本発明において、（ｉ）乃至（ｉｖ）の少なくとも一つについて解析を行う前記ステップは、前記未帰属ピークと、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドと、を用いて、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のすべてについて解析を行うステップを含んでもよい。
【００１９】
この分析方法においては、上記（ｉ）から（ｉｖ）までのすべての項目について解析を行う。このため、生体内において実際に発現しているタンパク質に固有の情報をさらに詳細に取得することができる。このため、タンパク質の一次構造および修飾状態をさらに詳細に解析することができる。【００２０】
本発明のタンパク質の分析方法において、遺伝子を同定する前記ステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドであって、アミノ酸配列中にセリン残基またはスレオニン残基を含む断片を抽出するステップと、抽出された前記断片に脱水反応が起こった場合の質量に対応する前記タンパク質の前記未帰属ピークが存在しているかどうかを確認し、存在していれば、前記未帰属ピークは帰属されたものとし、対応する前記未検出ペプチドを検出断片とするステップと、を含んでもよい。こうすることにより、分析対象のタンパク質に生じた脱水反応を考慮した上で、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの解析を行うことができる。このため、分析対象のタンパク質の一次構造または修飾状態をさらに確実に分析することができる。【００２１】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉ）アミノ酸残基への修飾について解析を行うステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドと前記未帰属ピークとの質量の差分を取得するステップと、前記差分と、前記タンパク質のアミノ酸残基の修飾による質量の増加分とを比較し、前記差分と前記増加分が一致したとき、前記修飾が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすれば、タンパク質のアミノ酸残基の修飾状態を確実に解析することができる。【００２２】
なお、本明細書において、「修飾」というときは、タンパク質の天然の修飾を指す。修飾は、アミノ酸残基の側鎖への修飾であってもよいし、Ｎ末端もしくはＣ末端への修飾であってもよい。【００２３】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、ｍth−１５１≦ｍex≦ｍth＋１５１を満たす、質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、ｍex−ｍthの値と、アミノ酸置換により生じうる質量変化の値とを比較し、前記ｍex−ｍthが前記アミノ酸置換に特異的な値であるかどうかを確認するステップと、前記ｍex−ｍthが前記アミノ酸置換に特異的な値であったとき、前記アミノ酸置換に対応するアミノ酸残基が前記未検出ペプチド中に含まれるかどうかを確認し、含まれている場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、アルギニン残基およびリジン残基が関与しないアミノ酸置換またはリジン残基からアルギニン残基もしくはアルギニン残基からリジン残基へのアミノ酸置換を確実に検出することができる。【００２４】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、下記式（１）を満たす質量ｍexおよび質量ｍex'の前記未帰属ピークを抽出するステップと、下記式（１）におけるΔｍＹＸに対応するアミノ酸残基Ｙが前記未検出ペプチド中に存在するかどうかを確認するステップと、前記アミノ酸置換により生じると予測される仮想ペプチド断片の質量に対応する未帰属ピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトル中に存在するかどうかを確認し、存在する場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。
ｍex＋ｍex'−１８＝ｍth＋ΔｍYX  （１）
（ただし、上記式（１）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、アミノ酸残基Ｘは複数種類存在してもよい。）【００２５】
こうすることにより、切断部位ではないアミノ酸残基から切断部位のアミノ酸残基への置換が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００２６】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドであって、前記仮想ペプチドの配列において隣接する質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対し、下記式（２）を満たす質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対応するピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトルから欠落しているかどうかを確認し、欠落している場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。
ｍth＋ｍth'−１８＝ｍex＋ΔｍYX  （２）
（ただし、上記式（２）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、切断部位のアミノ酸残基Ｘは２つの前記未検出ペプチドの境界のアミノ酸残基に限る。）【００２７】
こうすることにより、切断部位のアミノ酸残基から切断部位ではないアミノ酸残基への置換が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００２８】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、下記式（３）または下記式（４）を満たす質量ｍexおよび質量ｍex'の前記未帰属ピークを抽出するステップと、下記式（３）または下記式（４）におけるΔｍXRまたはΔｍXKに対応するアミノ酸残基Ｘが前記未検出ペプチド中に存在するかどうかを確認するステップと、前記アミノ酸置換により生じると予測される仮想ペプチド断片の質量に対応する未帰属ピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトル中に存在するかどうかを確認し、存在する場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。
ｍex＋ｍex'−１８＝ｍth＋ΔｍXR  （３）
ｍex＋ｍex'−１８＝ｍth＋ΔｍXK  （４）
（ただし、上記式（３）において、ΔｍXRは、アミノ酸残基Ｘがアルギニン残基Ｒに置換された際の質量変化を表す。また、上記式（４）において、ΔｍXKは、アミノ酸残基Ｘがリジン残基Ｋに置換された際の質量変化を表す。）【００２９】
こうすることにより、アルギニン残基およびリジン残基以外のアミノ酸残基からアルギニン残基またはリジン残基への置換が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３０】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉ）アミノ酸置換について解析を行うステップは、前記仮想ペプチド断片のうち、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドであって、前記仮想ペプチドの配列において隣接する質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対し、下記式（５）または下記式（６）を満たす質量ｍexの前記未帰属ピークを抽出するステップと、質量ｍthおよび質量ｍth'の前記未検出ペプチドに対応するピークが前記タンパク質の前記質量分析スペクトルから欠落しているかどうかを確認し、欠落している場合には、アミノ酸置換が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。
ｍth＋ｍth'−１８＝ｍex＋ΔｍXR  （５）
ｍth＋ｍth'−１８＝ｍex＋ΔｍXK  （６）
（ただし、上記式（５）において、ΔｍXRは、アミノ酸残基Ｘがアルギニン残基Ｒに置換された際の質量変化を表す。また、上記式（６）において、ΔｍXKは、アミノ酸残基Ｘがリジン残基Ｋに置換された際の質量変化を表す。）【００３１】
こうすることにより、アルギニン残基またはリジン残基からアルギニン残基およびリジン残基以外のアミノ酸残基への置換が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３２】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、前記タンパク質のフレームシフト変異またはスプライシング変異体について分析するステップを含んでもよい。【００３３】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、前記遺伝子においてイントロンと予測されているすべての領域中のうち、Ａ（アデニン）Ｇ（グアニン）とＧＴ（チミン）とで挟まれた領域、ＡＧと最近接のエクソンの端点とで挟まれた領域、または最近接のエクソンの端点とＧＴとではさまれた領域、について仮想的に翻訳される仮想ペプチドの仮想アミノ酸配列を求めるステップと、前記仮想アミノ酸配列を仮想的にトリプシン消化した際の断片の質量を前記未帰属ピークの質量と比較し、これらが一致している場合にはスプライシング変異が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、分析対象のタンパク質にスプライシング変異が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３４】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、すべての未検出エクソンとイントロンについて３通りの読み枠で仮想的に翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を求めるステップと、前記ポリペプチドをトリプシン消化して得られる仮想ペプチド断片の質量と前記未帰属ピークの質量とが一致するかどうかを確認し、これらが一致している場合にはスプライシング変異が生じていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、分析対象のタンパク質にスプライシング変異が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３５】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｉｉ）遺伝子の発現様式の変異について解析を行うステップは、検出ペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含むエクソンのうち、未検出領域の塩基配列について、読み枠を１塩基または２塩基ずらした際に生成すると予測されるアミノ酸配列を有するペプチドをトリプシンにより仮想的に消化して生じる仮想ペプチド断片の質量と未帰属ピークの質量とが一致するかどうかを確認し、一致している場合にはフレームシフトが生じていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、分析対象のタンパク質にフレームシフト変異が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３６】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除について解析を行うステップは、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドのうち、最もＣ末端側の検出ペプチドよりもＣ末端側に位置する前記未検出ペプチドについて、そのＣ末端側から逐次的にアミノ酸残基を削除した場合のペプチドの質量を計算するステップと、前記ペプチドの質量に一致する未帰属ピークが前記質量分析スペクトル中に存在しているかどうかを確認し、存在している場合にＣ末端側のアミノ酸残基が切除されていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、分析対象のタンパク質に、仮想ペプチドからのＣ末端側のアミノ酸残基の切除が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３７】
本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除について解析を行うステップは、前記質量分析スペクトル中に存在する前記ピークに対応しない未検出ペプチドのうち、最もＮ末端側の検出ペプチドよりもＮ末端側に位置する前記未検出ペプチドについて、そのＮ末端側から逐次的にアミノ酸残基を削除した場合のペプチドの質量を計算するステップと、前記ペプチドの質量に一致する未帰属ピークが前記質量分析スペクトル中に存在しているかどうかを確認し、存在している場合にＮ末端側のアミノ酸残基が切除されていると判断するステップと、を含んでもよい。こうすることにより、分析対象のタンパク質に、仮想ペプチドからのＮ末端側のアミノ酸残基の切除が生じているかどうかを確実に解析することができる。【００３８】
なお、本発明のタンパク質の分析方法において、前記（ｉｖ）Ｎ末端側またはＣ末端側のアミノ酸残基の切除について解析を行うステップは、一つのアミノ酸残基の切除を解析するステップとすることもできるし、Ｎ末端側またはＣ末端側のペプチドの切除について解析を行うステップとすることもできる。Ｎ末端側またはＣ末端側のペプチドの切除について解析を行うことにより、発現した試料タンパク質の一次構造をより一層確実に分析することが可能となる。【００３９】
本発明のタンパク質の分析方法において、解析を行う前記ステップは、前記ペプチド断片のＭＳ／ＭＳ測定を行うステップを含んでもよい。こうすることにより、より一層正確な解析を行うことができる。【００４０】
以上説明したように本発明によれば、同定された遺伝子から予測される仮想ペプチドを所定の位置で切断して得られる仮想ペプチド断片群の仮想質量分析スペクトル中に存在する仮想ピークに対応しない未帰属ピークを用いることにより、タンパク質の一次構造または修飾状態を詳細に分析する技術が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００４２】
【図１】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図２】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図３】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図４】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図５】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図６】本実施形態に係るタンパク質の解析手順を説明する図である。
【図７】図６の手順を用いた解析方法を説明する図である。
【図８】本実施形態に係るタンパク質の解析手順を説明する図である。
【図９】図８の手順を用いた解析方法を説明する図である。
【図１０】図８の手順を用いた解析方法を説明する図である。
【図１１】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図１２】図１１の手順を用いた解析方法を説明する図である。
【図１３】図１１の手順を用いた解析方法を説明する図である。
【図１４】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図１５】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図１６】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を説明する図である。
【図１７】本実施形態に係るタンパク質の分析方法を説明する図である。
【図１８】本実施形態に係るタンパク質の分析方法を説明する図である。
【図１９】ヒトヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列およびトリプシン消化部位を示す図である。
【図２０】ヒトヘモグロビンＳのβ鎖のアミノ酸配列およびトリプシン消化部位を示す図である。
【図２１】実施例に係るヒトヘモグロビンのβ鎖のマススペクトルを示す図である。
【図２２】実施例に係るヒトヘモグロビンＳのβ鎖のマススペクトルを示す図である。
【図２３】実施例に係るヒトヘモグロビンのβ鎖のマススペクトルを示す図である。
【図２４】実施例に係るヒトヘモグロビンＳのβ鎖のマススペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明の好ましい実施の形態について図面を用いて説明する。
図１は、本発明に係るタンパク質の分析手順の一例を示す図である。図１に示した分析方法では、まず、分析対象のタンパク質のＰＭＦ解析を行い（Ｓ１０１）、タンパク質の遺伝子の同定を行う。【００４４】
なお、以下の実施形態において、ＰＭＦ解析により同定された遺伝子を、「仮想遺伝子」と呼ぶ。また、仮想遺伝子から予測されるタンパク質のアミノ酸配列を、「仮想アミノ酸配列」と呼ぶ。また、仮想アミノ酸配列に基づき、タンパク質の部位選択的な断片化により生成すると予測されるペプチド断片を、「仮想ペプチド断片」と呼ぶ。さらに、仮想ペプチド断片から取得されると予測されるマススペクトル（質量分析スペクトル）を「仮想マススペクトル」と呼ぶ。【００４５】
さらに、以下の実施形態において、「帰属」とは、マススペクトルの解析において、ピークの由来を科学的に特定することを指す。また、「検出」とは、ＰＭＦ解析において同定された遺伝子から予測される仮想ペプチド断片に対応するピークが、測定されたマススペクトルにおいて観測されていることをいう。【００４６】
また、以下の実施形態において、「未帰属ピーク」は、分析対象のタンパク質のＰＭＦ解析の際に測定されたマススペクトル中のピークのうち、仮想マススペクトル中のピークに対応しないピークのことを指す。また、「未検出ペプチド」は、仮想マススペクトル中のピークのうち、ＰＭＦ解析の際に測定されなかったピークに対応する仮想ペプチド断片を指す。【００４７】
ステップ１０１に続き、仮想マススペクトルと、試料タンパク質の質量分析により得られたマススペクトルとを比較し、仮想ペプチド断片のピークに対応しない未帰属ピークの抽出を行う（Ｓ１０２）。なお、未帰属ピークの抽出手順については第一の実施形態において詳細に説明する。【００４８】
そして、得られた未帰属ピークの解析を行い、タンパク質の一次構造と修飾状態について、詳細な解析を行う（Ｓ１０３）。【００４９】
図２は、ステップ１０３の未帰属ピークの解析の内容を示す図である。ステップ１０３では、タンパク質のアミノ酸残基の側鎖または末端の修飾状態の解析を行う（Ｓ１０４）。また、仮想アミノ酸配列中のアミノ酸残基からの置換に関する解析を行う（Ｓ１０５）。また、仮想遺伝子からの発現様式の変異に関する解析を行う（Ｓ１０６）。また、仮想アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端からのペプチドの切除に関する解析を行う（Ｓ１０７）。【００５０】
図３は、図２中のステップ１０６で行う変異の解析について示した図である。ステップ１０６では、測定対象のタンパク質に関するスプライシング変異の解析を行う（Ｓ１０８）。また、測定対象のタンパク質に関するフレームシフト変異の解析を行う（Ｓ１０９）。【００５１】
なお、図２においては、ステップ１０４〜ステップ１０７のすべての解析を順次行っているが、ステップ１０４〜ステップ１０７のステップのうち一つ以上を適宜選択して行えばよく、必要に応じてこれらのうちの一つまたは二つを選択してもよい。【００５２】
同様に、図３においては、ステップ１０８およびステップ１０９の解析を順次行っているが、これらのステップはステップ１０６の解析を行う際に少なくとも一つを行えばよく、必要に応じていずれか一方のみを選択してもよい。【００５３】
ステップ１０４〜ステップ１０７のそれぞれのステップでの具体的な解析方法については、第二の実施形態〜第五の実施形態で順次詳細に説明する。【００５４】
これらの解析を行うことにより、従来のＰＭＦ解析（ステップ１０１）では用いられていなかった未帰属ピークを用いてタンパク質の詳細な解析が可能となる、具体的には、タンパク質の修飾状態の解析、仮想アミノ酸配列からのアミノ酸置換の有無および種類、同定された遺伝子からの変異の有無および態様、および仮想アミノ酸配列からのＮ末端またはＣ末端切除の有無および切除されたペプチドに含まれる数、に関する情報を得ることができる。このため、タンパク質のマススペクトルを充分に活用し、遺伝子情報からは得られないタンパク質の一次構造と修飾状態に関する情報を取得することが可能となる。【００５５】
以下、それぞれのステップについて具体的に説明する。【００５６】
（第一の実施形態）
本実施形態は、図１におけるステップ１０１〜ステップ１０２の具体的な手順に関する。【００５７】
ステップ１０１では、通常のＰＭＦ解析により、試料タンパク質に対応している遺伝子を同定する。図４は、ステップ１０１のＰＭＦ解析の順を示す図である。【００５８】
図４において、まず、分析対象のタンパク質を含む試料から２次元電気泳動などにより目的のタンパク質を分離する（Ｓ１１１）。そして、化学的または酵素的な断片化を行う（Ｓ１１２）。酵素的な断片化には、たとえばトリプシン消化を用いることができる。こうすれば、塩基性アミノ酸残基のＣ末端側でタンパク質を選択的に断片化することができる。以下の実施形態においては、分析対象のペプチドがトリプシンにより断片化されている場合を例に説明する。【００５９】
次に、生成したペプチド断片群の質量分析を行い、マススペクトルを得る（Ｓ１１３）。質量分析には、たとえば、イオントラップ質量分析計、四重極型質量分析計、磁場型質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などを用いることができる。また、イオン化法として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）法などが挙げられる。【００６０】
このうち、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳが好適に用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、イオン化過程において、タンパク質を構成するアミノ酸残基から一部の原子団が欠落することを抑制することができる。また、比較的高分子量のペプチド断片の測定を好適に行うことができる。また、測定対象のタンパク質を試料中からゲル電気泳動を用いて分離し、ゲル中で上述の処理を施した後、回収して測定に供する場合にも、対応する陰イオンと陽イオンの両方を測定可能である。これらのことから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、さらに再現性の高い分析を行うことができる。【００６１】
また、ステップ１１３の質量分析に供するペプチド断片の長さは、たとえば２０〜３０アミノ酸残基以下とすることができる。こうすることにより、質量分析の際に、ペプチド断片のイオン化を確実に行うことができる。【００６２】
次に、既存のデータベース検索を行い、試料タンパク質に対応する遺伝子を有意に同定する（Ｓ１１４）。このとき、試料タンパク質のマススペクトルから消化酵素由来の自己消化断片やケラチン由来の断片など、あらかじめ判明しているノイズピークを除外した後に、代表的なピークのみを選別してデータベース検索にかけてもよい。【００６３】
データベース検索により、試料タンパク質のマススペクトル中に存在するピークの一部が、データベースから予測される仮想ペプチド断片の質量と合致し、対応する遺伝子が同定されるとともに、合致したピークは帰属されることになる。【００６４】
図１にもどり、ステップ１０２では、ステップ１１４（図４）で帰属されなかった未帰属のピークの抽出を行う。ここで、試料タンパク質由来のピークであっても、強度が充分でなければ、データベース検索前の選別で除外されてしまう。従って、この段階で帰属されていないピークの中にも試料タンパク質由来のピークが存在している可能性がある。【００６５】
そこで、まず、同定された遺伝子から予測される仮想ペプチド断片の質量を参照して、未検出として残されている断片のピークが、計測スペクトル中に現れているかどうかを確認する。この際、強度の小さいピークについても注意深く検討する必要がある。この操作によって、計測スペクトルのピークの中で、データベース記載の情報と一致する部分だけが帰属されることになる。【００６６】
以上の操作によって帰属されたピークを帰属ピークと呼ぶ。また、帰属されなかったピークが未帰属ピークであり、同定遺伝子由来の検出されなかった推定断片が未検出ペプチドである。【００６７】
また、ステップ１０２においては、実験過程で生じてしまう化学変化を考慮して未帰属ピークの抽出を行うことができる。【００６８】
ステップ１０１の実験のプロセス上、不可避的に生じてしまう化学変化がある。この場合、ＰＭＦ解析での未帰属ピーク発生の要因となり、後の解析でのノイズとなる可能性があるので、個別の対応が必要となる。ここでは、下記（ａ）〜（ｄ）の化学変化の対応を考える。【００６９】
（ａ）Ｄ−Ｐ開裂
試料タンパク質のアミノ酸配列中にＤ（アスパラギン酸）−Ｐ（プロリン）がある場合、この箇所で開裂反応が起こりやすい。この開裂反応が生じると、マススペクトル中に未帰属ピークが２本発生する。【００７０】
そこで、これに対して以下の対応を行う。まず、ステップ１１４（図４）で同定された遺伝子から予測される仮想ペプチド断片のうち、未検出ペプチドに着目する。そして、アミノ酸配列中にＤ−Ｐの配列を含むものを選び出す。選び出された断片について、Ｄ−Ｐ間の結合を仮想的に開裂させたときに生じる断片の質量を計算する。試料タンパク質のマススペクトル中に、計算された値の箇所に未帰属ピークが存在しているかどうかを確認する。未帰属ピークが存在している場合、その未帰属ピークは帰属されたものとする。また、対応している未検出ペプチドも検出されたものとして扱う。【００７１】
（ｂ）Ｋ−Ｐ、Ｒ−Ｐの非切断
タンパク質をトリプシンで断片化する際の切断サイトは、Ｋ（リジン）およびＲ（アルギニン）残基の直後のペプチド結合である。ここで、ＫまたはＲのＣ末端側アミノ酸がＰである場合には切断されない。このため、Ｋ−ＰまたはＲ−Ｐ配列は非切断部位となり、一箇所の非切断部位について、一つの未帰属ピークと二つの未検出ペプチドが発生することになる。【００７２】
そこで、これに対しては、ＰＭＦ解析における検索段階で、ステップ１１４（図４）でデータベースを利用してトリプシン消化断片の質量パターンを予測する際に、Ｋ−Ｐ間およびＲ−Ｐ間のペプチド結合の切断は起こらないものとする。【００７３】
（ｃ）Ｍの酸化
Ｍ（メチオニン）は、１価と２価の２通りの酸化を受けうる。１価の場合、１６の質量シフトを、２価の場合、３２の質量シフトを生じる。１価の場合は可逆反応、２価の場合は不可逆反応である。ペプチド断片が酸化されたＭを含む場合、このペプチド断片に係るピークは未帰属ピークとなり、対応する仮想断片ペプチドに一つの未検出ペプチドが発生する。【００７４】
そこで、これに対しては、以下の対策を行う。まず、同定された仮想遺伝子から予測される仮想ペプチド断片中の未検出ペプチドに着目し、この中からアミノ酸配列にＭを含むものを選び出す。そして、選び出された断片についてＭの酸化反応が起こったと仮定した場合の質量を計算する。具体的には、１価の酸化反応の場合は１６、２価の酸化反応の場合は３２だけ質量を加算する。そして、計算された値の箇所に未帰属ピークが存在しているか否かを確認し、もし存在していればその未帰属ピークは帰属されたものとする。また、対応している仮想ペプチド断片も検出されたものとして扱う。【００７５】
（ｄ）脱水反応
Ｓ（セリン）残基およびＴ（スレオニン）残基は、脱水反応によりそれぞれデヒドロアラニンおよびデヒドロブチリンとなる場合がある。いずれの場合も、−１８の質量シフトを伴う。【００７６】
そこで、同定された仮想遺伝子から予測される仮想ペプチド断片のうち、未検出ペプチドの中からアミノ酸配列中にＳまたはＴを含むものを選び出す。選び出された断片について脱水反応が起こったと仮定した場合の質量を計算する。そして、タンパク質のマススペクトルを参照し、計算された値の箇所に未帰属ピークが存在しているか否かを確認する。もし存在していれば、その未帰属ピークは帰属されたものとし、対応している仮想ペプチド断片も検出断片として扱う。【００７７】
上記（ａ）〜（ｄ）の手順を踏むことにより、実験過程で生じてしまう化学変化を考慮して未帰属ピークの抽出を行うことができる。このため、未帰属ピークを用いたタンパク質の解析をより一層高い確度で行うことができる。【００７８】
なお、上記（ａ）〜（ｄ）について、ステップ１０１のＰＭＦ解析の段階ですでに対応することもできる。以上の操作を行った場合、その結果を含めて帰属されたピークを帰属ピーク、帰属されなかったピークを未帰属ピーク、そして同定遺伝子由来の検出されなかった推定断片を未検出ペプチドとし、ステップ１０３の解析に移る。【００７９】
（第二の実施形態）
本実施形態は、図１中の未帰属ピークの解析（Ｓ１０３）のうち、図２中の修飾状態の解析（Ｓ１０４）の手順に関する。【００８０】
第一の実施形態で抽出された未帰属ピークの発生原因がステップ１０４の側鎖の修飾である場合、分析対象のタンパク質の質量分析スペクトル中で、未検出ペプチドの質量から所定の質量差だけシフトしたところに、未帰属ピークが存在しているはずである。そこで、本実施形態では、タンパク質の修飾可能性を解析するために、未検出ペプチドのひとつひとつに対して、その質量から特異的な質量差だけシフトしたところに、未帰属ピークが存在しているか否かを探索することにより、試料タンパク質中のアミノ酸残基の修飾の可能性について検討を行う。【００８１】
図５は、修飾状態の解析手順を説明する図である。図５に示したように、まず、考慮の対象とする修飾を選出する（Ｓ１１５）。そして、仮想ペプチド断片中の未検出ペプチドについて、ステップ１１５で選出した修飾による質量シフトを施した断片の質量を算出する（Ｓ１１６）。そして、得られた質量に対応する未帰属ピークが試料タンパク質のマススペクトル中に存在するかどうかを照合する（ステップ１１７）。そして、対応する未帰属ピークの存在が確認されたら、ＭＳ／ＭＳ測定等により翻訳後修飾の存在をチェックする（Ｓ１１８）。以下、これらの各ステップについてそれぞれ説明する。【００８２】
ステップ１１５では、アミノ酸残基の側鎖に生じる修飾のうち代表的なものを選出する。ただし、質量差が１６の場合については、第一の実施形態において既に解析済みである場合には考慮から除いてよい。「代表的な修飾」の選び方は、天然のタンパク質で頻出する修飾を選別する方法でもよいし、研究対象としている現象に関連の深い修飾だけを選別する方法とすることもできる。「代表的な修飾」として選択しなかった修飾を「希少な修飾」と呼ぶ。【００８３】
表１〜表７は、アミノ酸残基の側鎖に生じ得る修飾の例および対応する質量差のリストである。また、表８は、表１〜表７に示した修飾のうち、天然のタンパク質で頻出する修飾を示す表である。ステップ１１５において、さらに具体的には、表８に示した修飾の少なくとも一部を代表的な修飾とし、表１〜７に示した修飾のうち、表８に示されていないものを希少な修飾とすることができる。【００８４】
【表１】
0004702284.tif 000002
【００８５】
【表２】
0004702284.tif 000003
【００８６】
【表３】
0004702284.tif 000004
【００８７】
【表４】
0004702284.tif 000005
【００８８】
【表５】
0004702284.tif 000006
【００８９】
【表６】
0004702284.tif 000007
【００９０】
【表７】
0004702284.tif 000008
【００９１】
【表８】
0004702284.tif 000009
【００９２】
図５にもどり、ステップ１１６の未検出ペプチドからの質量シフトの算出では、同定された仮想遺伝子の未検出ペプチドに着目する。未検出ペプチドのひとつひとつに対して、表１に示した値だけ質量をシフトさせる（Ｓ１１６）。そして、ステップ１１７の対応する未帰属ピークの照合では、ステップ１１６でシフトさせた後の質量の位置に、未帰属ピークがあるか否かを探索する（Ｓ１１７）。対応する未帰属ピークが見つかった場合、そのピークは、側鎖の修飾を伴うペプチド断片のピークである可能性がある。また、質量差の値からは対応する修飾の種類が示唆される。【００９３】
ここで、表１に示したように、それぞれの側鎖の修飾は特定のアミノ酸残基に特異的に生じる。従って、ステップ１１６〜ステップ１１７で示唆された修飾について、その修飾を受け得るアミノ酸残基が着目している断片中に存在していない場合はノイズである可能性が高い。そこで、ステップ１１６で選定された未検出ペプチドのアミノ酸配列を参照して、示唆された修飾を受けうるアミノ酸残基が仮想ペプチド断片中に実際に存在しているか否かを確認する。存在していなければ、その修飾の可能性は否定される。【００９４】
以上のステップにより、翻訳後の修飾の可能性を示唆できる。本実施形態の方法を用いれば、未帰属ピークを用いて簡便に試料タンパク質の側鎖や末端の修飾状態に関する情報を得ることができる。【００９５】
なお、本実施形態において、ステップ１１７の後、ステップ１１８の翻訳後修飾の存在のチェックの手順においては、さらにＭＳ／ＭＳ測定等による確認を行ってもよい。示唆された修飾を含むペプチド断片の可能性のある未帰属ピークについて、対応している断片のＭＳ／ＭＳ測定を行い、考察対象としている未検出ペプチドと同一のアミノ酸配列を持つか否かを検証する。ここで同一性の確認が取れなければ着目しているピークはノイズであると判断される。【００９６】
また、ステップ１１８においては、ＭＳ／ＭＳ測定によるｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを利用することにより、着目した未帰属ピークが解析対象のタンパク質以外のタンパク質に由来するノイズである可能性や、解析対象タンパク質由来の別のトリプシン消化断片に由来するピークである可能性を検討することができる。このため、さらに解析の質をより一層向上させることができる。【００９７】
（第三の実施形態）
本実施形態は、図１中の未帰属ピークの解析（Ｓ１０３）のうち、図２中のアミノ酸置換の解析（Ｓ１０５）の手順に関する。この解析は、たとえば、ステップ１０１、ステップ１０２、およびステップ１０４の解析の後に、帰属されずに残っているピークについて実施する。ひとつひとつのトリプシン消化断片のそれぞれについて、断片内における単一のアミノ酸置換の有無および種類の解析を行う。【００９８】
まず、表９は、試料タンパク質のペプチド断片中に各アミノ酸残基が存在したときの質量増加を示す表である。なお、表９において、アミノ酸残基Ｘに対応する質量をｍxとする。また、表９においてはアミノ酸残基を１文字で表記している。Ｃ＊1、Ｃ＊2、Ｃ＊3、Ｃ＊4、およびＣ＊5はアルキル化によるシステイン誘導体の残基を表しており、それぞれ順にカルボキシアミドメチルシステイン、カルボキシメチルシステイン、ピリジルエチルシステイン、アミノエチルシステイン、およびアクリルアミドシステインである。【００９９】
【表９】
0004702284.tif 000010
【０１００】
また、ペプチド断片中の一つのアミノ酸残基Ｘが、別のアミノ酸残基Ｙに置換された場合に生じる質量差は、
−ｍx＋ｍY＝ΔｍXY
となる。表１０は、アミノ酸置換により生じる質量差ΔｍXYをまとめた表である。表１０においては、ΔｍXYをｄと表記している。また、表１０において、アミノ酸残基Ｘと残基Ｙとの間のアミノ酸置換（ＸからＹまたはＹからＸ）を「ＸＹ」と表記している。アミノ酸残基は、一文字表記で示した。「ＸＹ」に実線の下線が付されているものは、そのアミノ酸置換を実現する塩基置換に要する、最小の置換塩基数が１であるものであり、下線を付していないものは２であるもの、破線の下線を付しているものは３であるものである。また、表中の数値は、正の数値はＸからＹへの「右読み」の置換、負の数値はＹからＸへの「左読み」の置換での質量差である。また、トリプシン消化の切断サイトであるＫおよびＲの関与する置換は、表中で「（）」内に示した。【０１０１】
【表１０】
0004702284.tif 000011
【０１０２】
観測されている未帰属ピークの中心値の質量をｍex、同定された遺伝子由来の未検出ペプチドの質量をｍthとする。未帰属ピークが単一のアミノ酸置換により発生したものか否かを解析する。ここで、トリプシンを用いてタンパク質を断片化した場合、ＫまたはＲの直後のペプチド結合が切断される。このため、ＫまたはＲが関与するアミノ酸置換が起こると、消化断片の質量パターンが変化してしまう。【０１０３】
そこで、本実施形態においては、ＫとＲの関与する置換のある場合とない場合とに分けて解析を行う。具体的には、
（Ｉ）ＫおよびＲの関与しない置換が生じている場合、もしくはＫとＲの間での置換が生じている場合、
（ＩＩ）ＫおよびＲ以外のアミノ酸残基が、ＫまたはＲに置換されて新たな切断サイトを生じる場合、
（ＩＩＩ）ＫまたはＲが別のアミノ酸残基に置換されて、切断サイトが消失する場合、
の３つの場合に分けて解析を行う。上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の解析順序に特に制限はないが、たとえば（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の順に解析することができる。以下、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のそれぞれについて説明する。【０１０４】
なお、本実施形態において、あるピークの中心値の質量がｍの場合にそのピークをピークｍとも呼ぶ。また、あるペプチド断片の質量がｍ'の場合にそのペプチド断片を称してペプチド断片ｍ'とも呼ぶ。【０１０５】
（Ｉ）ＫおよびＲの関与しない置換が生じている場合、もしくはＫとＲの間での置換が生じている場合
図６は、ＫおよびＲの関与しない置換が生じている場合、もしくはＫとＲの間での置換が生じている場合のアミノ酸置換の有無および種類を解析する手順を示す図である。また、図７は、図６を用いた解析方法を説明する図である。図６では、まず、未検出ペプチドのピークｍthから±１５１の範囲内に含まれる質量ｍexをピーク中心とする未帰属ピークｍexを抽出する（Ｓ１１９）。そして、このような未帰属ピークが抽出された場合（Ｓ１１９のＹｅｓ）、抽出され未帰属ピークの質量ｍexと未検出ペプチドの質量ｍthの差、
Δｍ＝ｍex−ｍth
が、アミノ酸置換により生じうる質量変化の値に対応しているかどうかを確認する（Ｓ１２０）。Δｍがアミノ酸置換によるものである可能性がある場合（Ｓ１２０のＹｅｓ）、ΔｍXYに対応するアミノ酸残基Ｘが着目している未検出ペプチド内に存在するかどうかを確認する（Ｓ１２１）。未検出ペプチド中にＸが存在すれば（ステップ１２１のＹｅｓ）、単一のアミノ酸置換の可能性ありという解析結果が得られる（Ｓ１２２）。一方、ステップ１１９〜ステップ１２１のいずれかで「Ｎｏ」となった場合には、単一のアミノ酸置換の可能性なしという解析結果が得られ（Ｓ１２７）、次の解析へと移る。【０１０６】
また、単一のアミノ酸置換の可能性ありという解析結果が得られた場合（Ｓ１２２）、オプションとして、さらに、以下のステップを行うことができる。まず、未帰属ピークｍexに対応するペプチド断片のＭＳ／ＭＳ測定を行い、その結果との整合性の有無を確認する（Ｓ１２３）。ステップ１２３では、具体的には、未帰属ピークｍexが未検出ペプチドｍthと同一領域のペプチドのものかどうかを確認する。未検出ペプチドｍthと同一領域のペプチドのものであることが確認された場合（Ｓ１２３のＹｅｓ）、さらにｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行ってもよい（Ｓ１２４）。以上の結果をデータベースに保存されたアミノ酸配列と照合して相違の有無を確認する（Ｓ１２５）。データベースに保存されたアミノ酸配列と一致すれば（Ｓ１２５のＹｅｓ）、アミノ酸置換の可能性が大きいという解析結果が得られる（Ｓ１２６）。一方、ステップ１２５またはステップ１２６で「Ｎｏ」となった場合、その未帰属ピークｍexはノイズピークであり（Ｓ１２８）、単一のアミノ酸置換ではないという解析結果が得られる（Ｓ１２７）。【０１０７】
以下、図６中の各ステップについて、さらに詳細に説明する。
ステップ１１９では、未検出ペプチドｍthから±１５１の範囲に含まれる未帰属ピークｍexを抽出する。ここで、アミノ酸置換によって発生しうる質量差｜ΔｍXY｜の最大値は、Ｃ*3（ピリジルエチルシステイン）とＧ（グリシン）の間の置換の場合の１５１である。言い換えれば、単一のアミノ酸置換では±１５１より大きな幅の質量変化は生じない。このため、単一アミノ酸置換によるピークシフトを検討するには、同定された仮想遺伝子由来の未検出ペプチドの質量から±１５１の領域だけを考えれば充分である。未検出ペプチドのすべてについて、この領域に存在する未帰属ピークを選択し、ステップ１２０の解析の対象とする。【０１０８】
なお、以上においては、システイン誘導体残基間のジスフィルド結合が還元して切断した後に、再結合することを防ぐためにアルキル化することを考慮し、システイン残基の質量が誘導体となっている場合を含めて質量差の範囲を設定している。具体的には、表１０には、アルキル化の試薬としてモノヨードアセトアミドを用いた場合のカルボキシアミドメチルシステイン（Ｃ*1）、モノヨード酢酸を用いた場合のカルボキシメチルシステイン（Ｃ*2）、４−ビニルピリジンを用いた場合のピリジルエチルシステイン（Ｃ*3）、エチレンイミンを用いた場合のアミノエチルシステイン（Ｃ*4）、およびアクリルアミドを用いた場合のアクリルアミドシステイン（Ｃ*5）の場合が示されている。このため、ｍthからの質量のずれ｜ΔｍXY｜として仮想遺伝子由来の未検出ペプチドの質量から±１５１の領域を考えているが、本実施形態において、ステップ１１９におけるｍthからの質量のずれ｜ΔｍXY｜の最大値は、考慮に入れるアルキル化等の修飾のパターンに応じて適宜設定することが可能であり、±１５１の範囲には限定されない。【０１０９】
また、測定対象のタンパク質にシステイン残基が含まれない可能性が高い場合等においては、アルキル化を考慮に入れないこともできる。この場合、アミノ酸置換によって発生しうる質量差｜ΔｍXY｜の最大値は、Ｗ（トリプトファン）とＧ（グリシン）の間の置換の場合の１２９である。単一のアミノ酸置換では±１２９より大きな幅の質量変化は生じないため、単一アミノ酸置換によるピークシフトを検討するには、同定された仮想遺伝子由来の未検出断片の質量から±１２９の領域だけを考えれば充分である。【０１１０】
ステップ１２０では、未帰属ピークｍexの質量ｍexと未検出ペプチドｍthとの間の質量差が、アミノ酸置換に対応した値となっているか否かを検討する。Δｍ＝ｍex−ｍthを計算し、表１０の情報を用いて、
Δｍ＝ｍex−ｍth＝ΔｍXY
を満たすｍXYが存在するかどうかを確認する。こうすれば、表１０に記載したアミノ酸置換に対応した未帰属ピークだけを選択することができる。また、アミノ酸置換により質量がｍthからｍexへのシフトした可能性のある未帰属ピークを選択するとともに、Δｍの値から、可能性のあるアミノ酸置換の種類も示唆される。【０１１１】
ステップ１２１では、ΔｍXYに対応するペプチドにアミノ酸残基Ｘが存在しているかどうかを確認する。未帰属ピークｍexが試料タンパク質のものではなく、偶然生じているノイズピークである可能性もあるからである。また、このような場合は断片のアミノ酸配列を参照することで除外できる場合がある。【０１１２】
ここで、ΔｍXYはＸからＹへのアミノ酸置換により生じた質量変化であるから、まず未検出ペプチドｍthを構成しているアミノ酸配列を参照し、その中にアミノ酸残基Ｘが実際に存在するか否かを確認する。存在していない場合（Ｓ１２１のＮｏ）、ｍexは同定タンパクからアミノ酸置換により発生したピークではないことがわかる。【０１１３】
ステップ１２３では、ＭＳ／ＭＳ測定による整合性チェックを行い、ステップ１２２で示唆されたアミノ酸置換の可能性をさらに確実なものとする。ＭＳ／ＭＳ測定を行うことにより、アミノ酸配列をより直接的に反映した情報が得られる。このため、未帰属ピークｍexが試料タンパク質から発生したピークであるのか偶発的なノイズであるのかをチェックすることができる。よって、解析の確度を向上させることができる。【０１１４】
ＭＳ／ＭＳ測定を行った後、未帰属ピークｍexが未検出ペプチドｍthと同一領域のペプチドのものか否かを確認する。この確認が取れれば、
（ＩＡ）ｍexとｍthは「同一タンパク質」の同一領域のペプチドに対応していること、および
（ＩＢ）ｍexはＸからＹへのアミノ酸置換に相当する特異的な質量だけｍthからシフトしていること、
という２つの根拠に基づき、アミノ酸残基Ｘの置換の可能性をより強く示唆することができる。【０１１５】
ステップ１２４では、さらに、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってペプチド断片ｍexの部分配列が得られる場合、その部分配列を、着目している未検出ペプチドｍthのアミノ酸配列と比較する。こうすることにより、さらに直接的にアミノ酸置換を確認することができる。このため、さらに正確な解析を行うことができる。【０１１６】
（ＩＩ）ＫおよびＲ以外のアミノ酸残基が、ＫまたはＲに置換されて新たな切断サイトを生じる場合
図８は、ＫおよびＲが別のアミノ酸残基に置換されて、切断サイトが消失する場合の有無についての解析手順を示す図である。また、図９および図１０は、図８に示した手順を用いた解析方法を説明する図である。【０１１７】
図１０は、アミノ酸残基ＸがＲで置換される様子を模式的に示す図である。既存のＲおよびＫ以外のアミノ酸残基がＲまたはＫで置換された場合、そこが新たなトリプシンの切断サイトとなる。このため、トリプシン消化で発生する断片の質量のパターンが変化する。図１０では、Ｒにより置換される場合を示したが、Ｋで置換される場合についても同様である。この置換の結果、ｍexおよびｍex'の２本の未帰属ピークが発生する。【０１１８】
この場合、トリプシンによる切断で生じた２つの断片ｍexおよびｍex'の質量の和と、もとの断片との質量差は、ｍXR＋１８となる。また、Ｋで置換される場合の質量差は、ｍXK＋１８である。ここで、「１８」は、ペプチド結合形成時の脱水による質量変化である。【０１１９】
そこで、図８において、まず、ＫまたはＲによる置換によって発生した新たな未帰属ピークを探索するため、任意の２本の未帰属ピークのペアについて質量の和を計算し、
ｍex＋ｍex'＝ｍth＋ΔｍXR＋１８  （３）'
または
ｍex＋ｍex'＝ｍth＋ΔｍXK＋１８  （４）'
の式を満たす未帰属ピークｍexおよびｍex'の組み合わせがあるかどうかを確認する（Ｓ１２９）。上記式（３）'および（４）'のいずれについても式を満たす未帰属ピークｍexおよびｍex'の組み合わせが存在していなければ（Ｓ１２９のＮｏ）、この種のアミノ酸置換は存在していないと判断する（Ｓ１２７）。【０１２０】
ｍexおよびｍex'の組み合わせが存在している場合、次に、対応する未検出ペプチドｍth中に、アミノ酸残基Ｘが存在しているかどうかを確認する（Ｓ１３０）。存在していなければ（Ｓ１３０のＮｏ）、未帰属ピークｍexおよびｍex'は双方ノイズであると判断される（Ｓ１２７）。【０１２１】
一方、上記式（３）'または（４）'のいずれかを満たすアミノ酸残基Ｘが存在していた場合（Ｓ１３０のＹｅｓ）、未検出ペプチドｍthを、Ｘの直後で切断した時に生じる断片の質量に矛盾はないかどうかを確認する。具体的には、未検出ペプチドｍthをＸの直後で仮想的に切断し、生じる断片の質量の再計算を行い（Ｓ１３１）、得られた質量と着目している２本の未帰属ピークの質量との間の整合性を確認することにより、再現性をチェックする（Ｓ１３２）。ステップ１３２のチェックは、含まれているすべてのアミノ酸残基Ｘについて行う。【０１２２】
たとえば、図１０に示したように、ｍex＋ｍex'＝ｍth＋ΔｍXR＋１８の場合、未検出ペプチドｍthを内部のアミノ酸残基Ｘの直後で切断し、切り口のＸをＲで置換してから、２本の断片の質量を計算する。この質量が着目している２本の未帰属ピークの質量であるｍexおよびｍex'を再現すれば（Ｓ１３２のＹｅｓ）、単一のアミノ酸置換の可能性ありという解析結果が得られる（Ｓ１２２）。なお、ｍex＋ｍex'＝ｍth＋ΔｍXK＋１８の場合は、未検出ペプチドｍthをアミノ酸残基Ｘの直後で切断し、切り口のＸをＫで置換してから、２本の断片の質量を計算し、同様の解析を行う。この段階で矛盾を生じる場合は（Ｓ１３２のＮｏ）、ノイズピークによる偶発的な状況と判断する（Ｓ１２７）。【０１２３】
また、単一のアミノ酸置換の可能性ありという解析結果が得られた場合（Ｓ１３２のＹｅｓ）、前述の（Ｉ）の場合と同様に、引き続き、オプションとしてＭＳ／ＭＳでの整合性チェックを行ってもよい（Ｓ１２３）。こうすることにより、（Ｉ）の場合と同様に、アミノ酸配列をより直接的に反映した情報を得ることができる。このため、着目している２本の未検出ピークが同定タンパク質から発生したものなのか、偶発的なノイズなのかをチェックすることができる。よって、解析の確度をさらに向上させることができる。【０１２４】
また、ステップ１２３では、着目している未帰属イオンであるｍexおよびｍex'のＭＳ／ＭＳを測定して、フラグメンテーション（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の解析を行ってもよい。こうすると、着目している未検出ペプチドｍthとの全部または部分的なペプチドとしての同一性を確認することができる。この確認が取れれば、
（ＩＩＡ）ｍexとｍthは「同一タンパク質」の共通する領域のペプチドであること、
（ＩＩＢ）ｍex'とｍthは「同一タンパク質」の共通する領域のペプチドであること、および
（ＩＩＣ）ｍexとｍex'の和は、ｍth＋１８からＸからＲへのアミノ酸置換もしくはＸからＫへのアミノ酸置換に相当する質量分だけシフトしていること、
の事実に基づき、アミノ酸残基ＸのＲまたはＫによる置換と、トリプシンによる新たな切断の可能性をより一層強く示唆することができる。【０１２５】
また、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってｍexおよびｍex'と未検出ペプチドｍthとの全部または部分的な同一性を確認することもできる。具体的には、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってペプチドｍexおよびｍex'の部分アミノ酸配列が得られる場合、配列が着目しているｍthのペプチドのアミノ酸配列の中に含まれているか否かを確認すればよい。【０１２６】
以上の手続きで整合性の確認ができない場合は、ｍexおよびｍex'はノイズピークであると判断し（Ｓ１２８）、ＫまたはＲによるアミノ酸置換は存在しないとして次の解析に移る。【０１２７】
なお、以上においては、トリプシンによる試料タンパク質の切断の場合を例に説明したが、他の酵素を用いて切断する場合にもこの（ＩＩ）の方法は適用可能である。その場合、切断部位ではないアミノ酸残基から切断部位のアミノ酸残基への置換が生じているかどうかの解析は、以下の手順で行う。まず、仮想ペプチド断片のうち、質量分析スペクトル中に存在するピークに対応しない未検出ペプチドの質量ｍthに対し、下記式（１）を満たす質量ｍexおよび質量ｍex'の未帰属ピークを抽出する。次に、下記式（１）におけるΔｍYXに対応するアミノ酸残基Ｙが未検出ペプチド中に存在するかどうかを確認する。次に、アミノ酸置換により生じると予測される仮想ペプチド断片の質量に対応する未帰属ピークがタンパク質の質量分析スペクトル中に存在するかどうかを確認する。そして、当該未帰属ピークが存在する場合には、アミノ酸置換が生じていると判断することができる。
ｍex＋ｍex'−１８＝ｍth＋ΔｍYX  （１）
（ただし、上記式（１）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、アミノ酸残基Ｘは複数種類存在してもよい。）【０１２８】
試料タンパク質を所定の位置で選択的に切断する方法として、トリプシン処理以外に以下の方法が挙げられる。たとえば、グルタミン酸残基のＣ末端側を切断するＶ８プロテアーゼ、リジン残基のＣ末端側を切断するリシルエンドペプチダーゼ、または、アスパラギン酸もしくはシステインのＮ末端側を切断するエンドプロテアーゼＡＳＰ−Ｎ等の切断位置の特異性を有する他のプロテアーゼを用いた酵素消化を用いることができる。また、メチオニン残基のＣ末端側アミド結合における開裂に特異性を有するＣＮＢｒ等の化学的な試薬を用いた切断手法を用いることもできる。【０１２９】
（ＩＩＩ）ＫまたはＲが別のアミノ酸残基に置換されて、切断サイトが消失する場合
図１１は、ＫまたはＲが他のアミノ酸残基に置換に置換されたことによる切断サイトの消失が生じているかどうかを解析する手順を示す図である。また、図１２は、図１１に示した手順を用いた解析方法を説明する図である。また、図１３は、アミノ酸残基ＲがＸで置換される様子を模式的に示す図である。図１３では、Ｒが置換される場合を示したが、Ｋが置換される場合についても同様である。【０１３０】
既存のＲまたはＫが、ＲおよびＫ以外のアミノ酸残基で置換された場合、その箇所でのトリプシン切断が起きなくなる。このため、トリプシン消化で発生する断片の質量分布が変化し、未帰属ピークが発生する。この置換の結果、ｍthおよびｍth'の２つの未検出ペプチドが発生する。【０１３１】
この場合、トリプシン消化で生じるはずの２つの断片の質量の総和と、観測されているピークの質量差はΔｍRX＋１８である。なお、「＋１８」は、ペプチド結合形成に伴う脱水による値である。また、Ｋが置換される場合の質量差は、ΔｍKX＋１８である。【０１３２】
そこで、図１１において、まず、ＫまたはＲが置換されたことによって発生した新たな未帰属ピークを探索するため、未帰属ピークの質量ｍexより低質量領域にある未検出ペプチドを探索し、この領域にある、タンパク質のアミノ酸配列上で隣接したすべての未検出ペプチドのペアｍthおよびｍth'の質量の和を計算し、
ｍth＋ｍth'＝ｍex＋ΔｍXR＋１８
または
ｍth＋ｍth'＝ｍex＋ΔｍXK＋１８
を満たす未帰属ピークｍexがあるかどうかを確認する（Ｓ１３３）。もし存在していなければ（Ｓ１３３のＮｏ）、この種のアミノ酸置換は存在していないと判断する（Ｓ１２７）。【０１３３】
未帰属ピークｍexが存在する場合（Ｓ１３３のＹｅｓ）、トリプシン切断の欠落が起こっているならば、スペクトル上ではｍthとｍth'の位置にはピークは出現しないはずである。そこで、次に、試料タンパク質のペプチド断片のマススペクトル中にｍthおよびｍth'の位置のピークが欠落しているかどうかを確認する（Ｓ１３４）。これらのピークが欠落していない場合（Ｓ１３４のＮｏ）、ノイズピークによる偶発的な状況と判断する（Ｓ１２７）。【０１３４】
ピークが欠落している場合（Ｓ１３４のＹｅｓ）、ＫまたはＲに対するアミノ酸置換の可能性が示唆される（Ｓ１２２）。この場合、前述の（Ｉ）の場合と同様に、引き続き、ＭＳ／ＭＳでの整合性チェックを行ってもよい（Ｓ１２３）。こうすることにより、（Ｉ）および（ＩＩ）の場合と同様に、アミノ酸配列をより直接的に反映した情報を得ることができる。このため、着目している未検出ピークが同定タンパク質から発生したものなのか、偶発的なノイズなのかをチェックすることができる。よって、解析の確度をさらに向上させることができる。【０１３５】
ここでは、着目している未帰属ピークｍexのＭＳ／ＭＳを測定し、フラグメンテーション（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の解析を行う。そして、着目している未検出ペプチドｍthおよび未検出ペプチドｍth'を接続したペプチドとの同一性を確認する（Ｓ１２３）。この確認が取れれば、
（ＩＩＩＡ）ｍexとｍthまたはｍexとｍth'は「同一タンパク質」の共通する領域のペプチドであること、
（ＩＩＩＢ）ＫまたはＲに対する置換によるトリプシン切断の欠落が実際に確認できたこと、
（ＩＩＩＣ）ｍthとｍth'の和−１８は、ＲからＸのアミノ酸置換もしくはＫからＸのアミノ酸置換に相当する質量の差分だけ、ｍexから引いた値にシフトしていること、
という３点の事実に基づいて、アミノ酸残基ＲまたはＫの別のアミノ酸による置換と、そのためのトリプシン切断の欠落を示唆することができる。【０１３６】
また、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで上記（ＩＩＩＡ）の確認を行ってもよい（Ｓ１２４）。ｍexの部分アミノ酸配列が得られる場合、その部分アミノ酸配列を未検出ペプチドｍthおよびｍth'のアミノ酸配列と比較する。未検出ペプチドｍthまたはｍth'の少なくとも一方に、ｍexの部分アミノ酸配列が含まれているか否かを確認すればよい。この方法で確認することにより、解析結果の信頼性をさらに向上させることができる。またこの場合、置換部位を含むｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅが取れる可能性もある。以上の手順の中で、整合性の確認ができない場合には、ｍexはノイズピークであると判断する（Ｓ１２８）。【０１３７】
なお、以上においては、トリプシンによる試料タンパク質の切断の場合を例に説明したが、他の酵素を用いて切断する場合にもこの（ＩＩＩ）の方法は適用可能である。その場合、切断部位のアミノ酸残基から切断部位ではないアミノ酸残基への置換が生じているかどうかの解析は、以下の手順で行う。まず、仮想ペプチド断片のうち、質量分析スペクトル中に存在するピークに対応しない未検出ペプチドであって、仮想ペプチドの配列において隣接する質量ｍthおよび質量ｍth'の未検出ペプチドに対し、下記式（２）を満たす質量ｍexの未帰属ピークを抽出する。次に、質量ｍthおよび質量ｍth'の未検出ペプチドに対応するピークがタンパク質の質量分析スペクトルから欠落しているかどうかを確認する。そして、当該ピークが欠落している場合には、アミノ酸置換が生じていると判断する。なお、試料タンパク質を所定の位置で選択的に切断する方法として、たとえば上記（ＩＩ）において前述した方法を用いることができる。
ｍth＋ｍth'−１８＝ｍex＋ΔｍYX  （２）
（ただし、上記式（２）において、ΔｍYXは、切断部位ではないアミノ酸残基Ｙが切断部位のアミノ酸残基Ｘに置換された際の質量変化を表す。また、切断部位のアミノ酸残基Ｘは２つの未検出ペプチドの境界のアミノ酸残基に限る。）【０１３８】
以上の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の解析により、未帰属ピークを用いた一アミノ酸残基の置換の有無および種類の網羅的な分析が可能となる。このため、データベース記載の仮想アミノ酸配列からのアミノ酸置換を確実に解析し、測定対象のタンパク質の一次構造情報を取得することができる。【０１３９】
なお、本実施形態において、表１１に示した質量差を伴うアミノ酸置換については、第二の実施形態で説明した側鎖の修飾によっても同一の値の質量差が発生しうる。このため、これらについては別途個別に検討を行ってもよい。表１１は、重複する質量差Δｍ（単位Ｄａ）を伴うアミノ酸置換と天然のタンパク質で頻出する修飾をまとめた表である。表１１においても、アミノ酸残基を一文字表記で示した。【０１４０】
【表１１】
0004702284.tif 000012
【０１４１】
表１１に示した質量差Δｍについての解析は、既にステップ１０２までの段階で完了している。そこで、ここでは、ステップ１０２の段階で表１１に記載のある質量差が検出されている場合に、共通する質量差を伴うアミノ酸置換の可能性も追加して解析する。選定された修飾がＮ末端またはＣ末端に特有のものである場合はデータベース配列と対照することにより、着目している断片が実際にＮ末端またはＣ末端の断片であるかを確認する。もし末端由来の断片でない場合は、可能性はアミノ酸置換に限定される。【０１４２】
（第四の実施形態）
本実施形態は、図１中の未帰属ピークの解析（Ｓ１０３）のうち、図２中の変異体の解析（Ｓ１０６）の手順に関する。この解析は、たとえば、ステップ１０１〜ステップ１０５の解析の後に、帰属されずに残っているピークについて行う。具体的には、データベース記載のスプライシング様式と、試料タンパク質の発現に際して起こったスプライシングの様式との間の相違の有無およびその内容を解析する。スプライシング様式が変化していれば、トリプシン消化による生じたペプチド断片のマススペクトルに変化が生じているはずであり、本実施形態では、未帰属ピークを用いてこの変化を解析する。【０１４３】
まず、スプライシングの様式が異なる場合の具体的状況として、たとえば、
状況１：データベース上ではイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）とされている領域を利用した新規の選択的スプライシングが生じている場合、
状況２：データベース記載の一部のエクソン予測に誤りが含まれている場合、
状況３：異常スプライシングが生じた場合、
等が挙げられる。【０１４４】
これらの要因としては、エクソン（ｅｘｏｎ）とイントロンの境界における塩基配列の変異とスプライシング機構をつかさどるタンパク質の機能異常などが考えられるが、基本的にどのような成熟ｍＲＮＡが生じるのか予測するのは困難である。そこで、すべての未検出エクソンとイントロン領域について、３通りの読み枠で仮想的に翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を求め、未帰属ピークとの対応関係を調べる。【０１４５】
試料タンパク質の質量分析で検出されたペプチド断片について、データベースに記載の仮想アミノ酸配列上にマッピングするとともに、仮想遺伝子の塩基配列上にマッピングし、対応している塩基配列領域を抽出する。なお、以下の実施形態において、データベースに記載があるエクソンの中で、ステップ１０４の修飾の解析が終了した段階で検出されたペプチド断片が、ひとつもマップされず、対応関係がつかないものを「未検出エクソン」と呼ぶ。【０１４６】
以下、未検出エクソンを用いた３つの解析方法について説明する。なお、解析方法１および２は、図３のステップ１０８に対応する。また、解析方法３は、図３のステップ１０９に対応する。また、解析方法１〜３に示した解析は、必要に応じて適宜選択して行うことができる。また、複数組み合わせて行うことにより、解析の確度を向上させることができる。たとえば、解析方法１、２、３の順にすべての解析を行うことができる。【０１４７】
（前処理）
まず、帰属済みピークに対応している、仮想遺伝子上の塩基配列をマークする。ＰＭＦ解析はデータベース記載のスプライシング様式に拠っているので、この段階ではすべてエクソン領域にマップされるはずである。【０１４８】
（解析方法１）
第一の解析方法として、スプライシング様式の違いの検討が挙げられる。この解析方法において、スプライシング様式の違いには、データベースの記載に誤りがあった場合も含むものとする。【０１４９】
この方法では、イントロンと予測されている領域が翻訳に用いられているかどうかを確認する。具体的には、イントロンと予測されているすべての領域中の「Ａ（アデニン）Ｇ（グアニン）／ＧＴ（チミン）」、「ＡＧ／最近接のエクソンの端点」、または「最近接のエクソンの端点／ＧＴ」ではさまれた領域について、そこから仮想的に翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を求め、このアミノ酸配列をトリプシン消化で仮想的に消化した際の断片の質量を予測し、未帰属ピークの質量と対照する。その結果、未帰属ピークと対応関係が付く塩基配列領域をマークする。未帰属ピークとの対応関係がつく塩基配列領域がひとつでも存在すれば、その領域がタンパク質の翻訳に使われている可能性があると判断される。また、このような塩基配列領域が複数存在する場合はそのイントロン領域が翻訳に用いられている可能性はより高いと判断される判断される。【０１５０】
なおこの比較対照の際に、第二の実施形態で説明した修飾の可能性を加味した解析を適用することも可能である。また、この部分の解析操作を適用することで、データベース記載のエクソン−イントロン構造に誤りがある場合の解析にも対応することが可能となる。また、通常、イントロン境界の塩基配列はＧＴ−ＡＧであるが、いくつかの遺伝子については５'末端および３'末端の配列がＡＴとＡＣからなるイントロンが報告されていることから、必要に応じて「ＡＣ／ＡＴ」、「ＡＣ／最近接のエクソンの端点」、または「最近接のエクソンの端点／ＡＴ」ではさまれた領域について、同様にして解析を行ってもよい。【０１５１】
（解析方法２）
第二の解析方法として、異常スプライシングの検討が挙げられる。この方法では、すべての未検出エクソンとイントロン領域について３通りの読み枠で仮想的に翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を求める。そして、このアミノ酸配列をトリプシン消化して得られる仮想的なペプチド断片の質量を予測し、未帰属ピークの質量と対照する。そして、未帰属ピークとの対応関係が得られる塩基配列領域をマークする。未帰属ピークとの対応関係が付く塩基配列領域がひとつでも存在すれば、その読み枠と領域が異常スプライシングによって使用されている可能性がある。また、このような塩基配列領域が複数存在する場合は、その読み枠と領域が異常スプライシングによって使用されている可能性は、より高いと判断される。【０１５２】
（解析方法３）
第三の解析方法として、フレームシフト変異の解析が挙げられる。解析方法１および２ではスプライシング異常の解析手順を説明したが、類似の手順を用いてフレームシフト変異の探索を行うことができる。【０１５３】
検出されたペプチド断片がマップされているエクソンに着目する。その中の未検出領域の塩基配列について、残り２通りのすべての読み枠で対応するアミノ酸配列を予測する。そして、予測されたアミノ酸配列をトリプシンにより仮想的に消化して生じる仮想ペプチド断片の質量を予測し、未帰属ピークの質量と対照する。質量の一致する断片がひとつでも存在すれば、塩基配列の変異のために途中からフレームシフトを起こしている可能性がある。また、このような断片が複数存在する場合は、塩基配列の変異のために途中からフレームシフトを起こしている可能性は、より高いと判断される。【０１５４】
なお、この方法においても、比較対照の際に、解析方法１の場合と同様に、先に論じた修飾の可能性を加味した解析を適用することができる。【０１５５】
また、これらの手順により得られた解析結果は次のように分類できる。
（１）変異体であると判定できない場合、
（２）変異体であると判定できる場合１：フレームシフトを含まず、新規エクソンの検出による場合、
（３）変異体であると判定できる場合２：フレームシフトを含む場合。【０１５６】
本実施形態では、上記（１）〜（３）の結果に応じて、引き続き行う解析手順を適宜選択する。図１４および図１５は、ステップ１０６の変異体の解析の後の手順を示す図である。上記（１）の結果が得られた場合には、図１４に示した系列の解析のみを行う。また、上記（２）または（３）の結果が得られた場合には、図１４および図１５の双方の系列の解析を行う。図１４に示した解析は、データベースに登録されているフレームでの解析であり、上記（２）または（３）の結果が得られた場合でも、このフレームが使用されている領域があるため、検証する必要がある。【０１５７】
図１４において、ステップ１３５では、末端が修飾されていない場合について、Ｎ末端およびＣ末端の切除の可能性を検討する。また、ステップ１３６では、末端が修飾されている場合について、Ｎ末端およびＣ末端の切除の可能性を検討する。末端切除の解析方法については、第五の実施形態にて具体的に説明する。なお、ここでは、ステップ１０６までの解析の後、帰属されずに残っているピークについて検討を行う。また、Ｎ末端またはＣ末端の断片が検出されている場合には、検出された末端の解析は行わなくてよい。【０１５８】
次に、希少な修飾の解析を行う（Ｓ１３７）。ステップ１０６までで未帰属のピークについて、表１〜表７中の希少な修飾の可能性を解析する。解析には、第二の実施形態で説明した方法を用いることができる。なお、無差別にすべての候補を拾いたいという場合には、ステップ１０４までのステップで帰属されずに残ったピークに対して解析を行ってもよい。この場合、ステップ１３７は、ステップ１０４以降のいずれのタイミングで行ってもよい。【０１５９】
次に、同一断片内に修飾とアミノ酸置換が複数存在する場合の解析を行う（Ｓ１３８〜Ｓ１４２）。ここでは、同一断片内に修飾とアミノ酸置換があわせて２つ存在する場合を例に説明する。【０１６０】
ステップ１３７までのステップで未帰属のピークについて、解析を行う。たとえば、図１４では、複数の修飾とアミノ酸置換が生じていると予測される可能性の高さが
代表的な修飾が２つ（Ｓ１３８）＞代表的な修飾＋アミノ酸置換（Ｓ１３９）＞アミノ酸置換が２つ（Ｓ１４０）＞アミノ酸置換＋希少な修飾（Ｓ１４１）＞希少な修飾が２つ（Ｓ１４２）
という順序であると考えられる場合の解析順序を示している。この場合、次の１．〜５．に示す順で解析する。【０１６１】
１．ステップ１３７までの解析の後に未帰属のピークに対してＳ１３８に関する解析を行い、
２．未帰属として残ったピークに対してＳ１３９に関する解析を行い、
３．未帰属として残ったピークに対してＳ１４０に関する解析を行い、
４．未帰属として残ったピークに対してＳ１４１に関する解析を行い、
５．未帰属として残ったピークに対してＳ１４２の解析を行う。【０１６２】
複数の修飾とアミノ酸置換が生じていると予測される可能性の高さが異なる場合、それに応じて上記１．〜５．の順序を入れ替えて解析を行うことができる。また同程度の可能性であれば、直列ではなく、並列で解析を行ってもよい。たとえば、ステップ１３９の可能性とステップ１４０の可能性が同程度であれば、図１６に示した順序で解析を行うことができる。なお、図１６の手順で解析を行う場合、ステップ１４１では、ステップ１３９およびステップ１４０までの解析を行った段階で未帰属のピークを用いて解析を行う。【０１６３】
また、図１５では、ステップ１０６の変異体の解析の後、変異領域についての解析を行う（Ｓ１４３〜Ｓ１４６）。ステップ１０６でのイントロン領域からの翻訳産物の探索やフレームシフトの探索では、対象としているタンパク質の仮想遺伝子の塩基配列を参照して、着目している塩基配列領域に対応しているアミノ酸配列を予測し、トリプシン消化断片の質量を予測して未帰属ピークの質量との照合を行う。この照合の際に、ステップ１０４、ステップ１０５、ステップ１３５、ステップ１３６およびステップ１３７と同様の解析を行うのが図１５の解析におけるステップ１４３〜ステップ１４６である。【０１６４】
まず、変異領域での代表的な修飾の解析を行う（Ｓ１４３）、次に、変異領域でのアミノ酸置換の解析を行う（Ｓ１４４）、そして、変異領域でのＮ末端およびＣ末端の切除の解析を行う（Ｓ１４５）、そして、変異領域での希少な修飾の解析を行う（Ｓ１４６）。【０１６５】
ステップ１４３〜１４６の具体的な解析には、以上の実施形態に記載の方法および第五の実施形態に記載の方法を用いることができる。【０１６６】
（第五の実施形態）
本実施形態は、図１中の未帰属ピークの解析（Ｓ１０３）のうち、図２中の末端切除の解析（Ｓ１０７）の手順に関する。本実施形態では、ステップ１０１〜ステップ１０４の解析の後に、帰属されずに残っているピークについて解析する。ステップ１０４の側鎖の修飾の解析が終了した段階で、データベースから予測されるＮ末端もしくはＣ末端のトリプシン消化断片が未検出の場合、翻訳後に切除されたために未検出となっている可能性がある。本実施形態では、こうした末端切除の有無および切除されたアミノ酸残基の種類、数について解析を行う。なお、本実施形態の手順は、両末端のトリプシン消化断片がイオン化するのに充分長い場合に好適に用いられる。【０１６７】
また、本実施形態において、ＰＭＦ解析で仮想遺伝子を同定した後に、検出されたペプチド断片が対応しているアミノ酸配列領域を称して、「実測データによりカバーされている配列領域」と表現する。【０１６８】
（Ｃ末端の切除の解析）
試料タンパク質の実際のＣ末端を含む断片が、翻訳後のプロセシングによって、データベースから予測される断片と質量が相違するために、未検出となっている可能性を検討する。仮想アミノ酸配列から生成する仮想ペプチド断片のうち、最もＣ末端側の検出断片以降のアミノ酸配列について、Ｃ末端が翻訳後切除されたために未検出となっているかどうかを解析する。図１７は、データベースから予測されるトリプシン消化断片のカバーの状況を模式的に示す図である。【０１６９】
まず、ステップ１０４までの解析で検出されたペプチド断片のうち、最もＣ末端側の断片以降のすべての未検出ペプチドに着目する。そして、着目したすべての未検出ペプチドについて、そのＣ末端側から逐次的にアミノ酸残基を削除した場合のペプチドの質量を計算する。そして、この仮想的プロセシングに対応する質量と同じ値の質量の未帰属ピークが存在していないかどうかを探索し、該当する未帰属ピークを抽出する。ここで選択される未帰属ピークが実際のＣ末端を含む未帰属ピークの候補となる。【０１７０】
なお、以上の手順で未帰属ピークの候補が選択されなかった場合には、さらにＣ末端を含む断片の中に何らかの修飾がある可能性を検討することができる。具体的には、たとえば表８に示した関心のある修飾について、まず、着目している仮想的プロセシング後の未検出ペプチドの中に、その修飾を受け得るアミノ酸残基が存在しているものを選択する。そして、仮想プロセシングで計算された質量の値に選択した修飾に伴う質量差を加味して、修飾つきの仮想的な断片の質量を計算する。そして、修飾基を有する未帰属ピークが存在していないかを探索する。ここで選択される未帰属ピークは、修飾を含む実際のＣ末端のペプチドに対応している。【０１７１】
また、以上の手順に続き、ＭＳ／ＭＳ測定による整合性検証を行ってもよい。上述の手順で抽出された未帰属ピークがノイズである可能性を排除するために、この未帰属ピークのＭＳ／ＭＳ測定を行う。図１７中に※で示した着目している未検出ペプチドと、未帰属ピークとの同一性を検証し、同一性の確認が取れればＣ末端の切除がより強く示唆される。なお、この段階でｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより部分アミノ酸配列を得て同一性を検証する方法を用いてもよい。【０１７２】
以上の解析により、Ｃ末端側のプロセシングが示唆された場合には、Ｃ末端のアミノ酸配列のシークエンシングを行えばさらに確実な検証が可能となる。【０１７３】
（Ｎ末端の切除の解析）
試料タンパク質の実際のＮ末端を含む断片が、翻訳後のプロセシングによってデータベースから予測される断片と質量が相違するために未検出となっている可能性を検討する。仮想アミノ酸配列から生成する仮想ペプチド断片のうち、最もＮ末端側の検出断片以前（Ｎ末端側）のアミノ酸配列について、Ｎ末端が翻訳後切除されたために未検出となっているかどうかを解析する。図１８は、データベースから予測されるトリプシン消化断片のカバーの状況を模式的に示す図である。【０１７４】
まず、ステップ１０４までの解析で検出されたペプチド断片のうち、最もＮ末端側の断片よりもＮ末端側のすべての未検出ペプチドに着目する。そして、着目したすべての未検出ペプチドについて、そのＮ末端側から逐次的にアミノ酸残基を削除した場合のペプチドの質量を計算する。そして、この仮想的プロセシングに対応する質量と同じ値の質量の未帰属ピークが存在していないかどうかを探索し、該当する未帰属ピークを抽出する。ここで選択される未帰属ピークが実際のＮ末端を含む未帰属ピークの候補となる。【０１７５】
なお、以上の手順で未帰属ピークの候補が選択されなかった場合には、さらにＮ末端を含む断片の中に何らかの修飾がある可能性をＣ末端側の場合と同様にして検討することができる。【０１７６】
また、以上の手順に続き、ＭＳ／ＭＳ測定による整合性検証を行ってもよい。上述の手順で抽出された未帰属ピークがノイズである可能性を排除するために、この未帰属ピークのＭＳ／ＭＳ測定を行う。図１８中に「※」で示した着目している未検出ペプチドと、未帰属ピークとの同一性を検証し、同一性の確認が取れればＮ末端の切除がより強く示唆される。なお、この段階でｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより部分アミノ酸配列を得て同一性を検証する方法を用いてもよい。【０１７７】
以上の解析により、Ｎ末端側のプロセシングが示唆された場合には、Ｎ末端のアミノ酸配列のシークエンシングを行えばさらに確実な検証が可能となる。【０１７８】
本実施形態の方法を用いれば、分析対象のタンパク質に、仮想アミノ酸配列からの末端ペプチドの切除が生じているかどうかを解析することができる。このとき、Ｎ末端側とＣ末端側との解析を独立に行うため、確実な解析が可能である。また、末端ペプチドが切除されているとの解析結果が得られた際には、あわせて、切除されたアミノ酸残基数と配列構成に関する情報も取得することができる。このため、従来のＰＭＦ解析では得られなかったタンパク質のより正確な一次構造情報を高い確角度で安定的に得ることができる。【０１７９】
以上、本発明を実施形態に基づき説明した。これらの実施形態は例示であり、様々な変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。【０１８０】
たとえば、ステップ１０３の未帰属ピークの解析で行う検討において、前述した（ｃ）酸化および（ｄ）脱水反応については、同一の質量差を伴うアミノ酸置換と修飾が存在する。表１２は、酸化または脱水反応と同一の質量差を伴うアミノ酸置換および修飾をまとめた表である。表１２においても、アミノ酸残基は一文字表記で示した。【０１８１】
【表１２】
0004702284.tif 000013
【０１８２】
表１２に示した変化は、特定のアミノ酸残基に伴うものである。そこで、ステップ１０３において前述の（ｃ）または（ｄ）の検討で新たに帰属できたピークに対して、データベースを利用して対応しているペプチドのアミノ酸配列を参照する。そして、該当するアミノ酸残基が含まれていれば、可能性として追加し、該当アミノ酸残基が含まれていなければ棄却することができる。
【実施例】
【０１８３】
本実施例では、アミノ酸配列が既知のアミノ酸置換を含む変異タンパク質を用いてアミノ酸置換の解析を行った。試料としてヒトヘモグロビンのβ鎖（配列番号１）およびヒトヘモグロビンＳのβ鎖（配列番号２）を用いた。図１９および図２０はそれぞれ、ヒトヘモグロビンのβ鎖およびヒトヘモグロビンＳのβ鎖のアミノ酸配列およびトリプシン消化により生じると予測される仮想ペプチド断片の質量を示す図である。図１９および図２０より、これらのペプチド鎖はＮ末端から６残基目が異なり、ヘモグロビンがＥ、ヘモグロビンＳがＶとなっている。これらの差は、Ｎ末端側から１番目のトリプシン消化断片の質量差となって現れるはずである。【０１８４】
そこで、これらのタンパク質のマススペクトルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法により測定した。図２１〜図２４は、得られたマススペクトルを示す図である。図２１〜図２４中の横軸は質量（ｍ／ｚ））を示し、縦軸は強度を示す。図２１はヘモグロビンのβ鎖のマススペクトルを示す図である。図２２は、ヘモグロビンＳのβ鎖のマススペクトルをしめす図である。図２３は、図２１の７９９＜ｍ／ｚ＜１００１の領域の拡大図である。また、図２４は、図２２の７９９＜ｍ／ｚ＜１００１の領域の拡大図である。【０１８５】
図２３および図２４を対照すると、ヘモグロビンＳにおいては、ヘモグロビンのｍ／ｚ＝９５２．５４２３のピークが消失し、代わりに、ｍ／ｚ＝９２２．５７４６のピークが出現していることがわかる。これらの質量差Δｍ＝−２９．９６７７である。【０１８６】
そこで、この質量差に対応するアミノ酸置換が生じうるかどうかを表１０で確認すると、確かに表１０におけるｄ＝Δｍ＝３０には、ＶからＥへの置換が存在する。また、この質量差に対応する１アミノ酸置換であって、ＲまたはＫが関与しない置換は、表１０よりＭからＴ、ＶからＥ、ＴからＡ、またはＳからＧのいずれかとなる。本実施例の場合、対応するヘモグロビンのトリプシン消化断片のアミノ酸配列にＭおよびＳは含まれていないことから、可能性はＶからＥまたはＴからＡの二種類に絞られる。この場合、置換残基の位置も特定されることになる。【０１８７】
このように、本実施例では、従来利用されていなかった未帰属ピークを用いてアミノ酸置換の可能性を示唆する解析結果を得ることができた。なお、本実施例では、ＶからＥまたはＴからＡの二種類の可能性が生じる結果となったが、以上において説明した他の解析方法や、試料タンパク質に関する他の情報と組み合わせて解析を行うことにより、置換の可能性をＶからＥにさらに絞り込むことも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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