(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透光性の基体と、前記基体上に配置され、前記基体に達する複数の貫通孔が設けられた遮光膜と、前記複数の貫通孔のそれぞれから表出する前記基体に結合された複数のプローブ生体分子と、を備え、前記複数の貫通孔のそれぞれの直径が３００μm以上であるバイオチップの製造方法であって、
前記基体、前記基体上に配置された前記遮光膜、及び前記遮光膜上に配置された高分子膜を備えるバイオチップ用基板であって、それぞれ前記高分子膜及び前記遮光膜を貫通し、前記基体表面を露出させる、それぞれ直径が３００μm以上の前記複数の貫通孔が設けられており、前記複数の貫通孔から表出する前記基体の表面に導入された複数の水酸基を更に備えるバイオチップ用基板を準備するステップと、
前記複数の水酸基に複数のプローブ生体分子を各々結合させるステップと、
前記遮光膜及び前記高分子膜をアルカリ溶液に浸し、前記高分子膜を前記遮光膜から剥離させるステップと、
を含む、バイオチップの製造方法。
【請求項２】
前記基体には、前記複数の貫通孔に通じる複数のウェルが設けられている、請求項１に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項３】
表面に複数の水酸基を導入可能な透光性の基体と、
前記基体上に配置された遮光膜と、
前記遮光膜上に配置された架橋性の高分子膜と、
を備え、
それぞれ前記高分子膜及び前記遮光膜を貫通し、前記基体表面を露出させる複数の貫通孔が設けられており、
前記複数の貫通孔のそれぞれの直径が３００μm以上であり、
前記高分子膜は、プローブ生体分子が前記基体に導入される間、前記遮光膜の表面を保護し、また、前記高分子膜は、前記プローブ生体分子が前記基体に導入された後、アルカリ溶液に浸されることにより、前記遮光膜の表面から剥がされる、
バイオチップ用基板。
【請求項４】
前記基体には、前記複数の貫通孔に通じる複数のウェルが設けられている、請求項３に記載のバイオチップ用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子検出技術に関し、特にバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップとは、被検対象であるターゲット生体分子と特異的に結合するプローブ生体分子を基板表面の特定位置に固定した素子の総称である。DNAチップにおいては、例えばスライドガラス板等の基板上に、それぞれ既知の配列を有する1本鎖DNAであるプローブDNAが、数千〜数万種類、アレイ状に配列されている。DNAチップに蛍光標識したターゲットDNAを含む被験液を供給すると、配列がプローブDNAと相補関係にあるターゲットDNAのみがプローブDNAと水素結合で結合して相補的2本鎖を形成する。そのため、蛍光発色の有無により被験液中にプローブDNAと相補関係にあるターゲットDNAが存在するか否かを確認することができる（例えば、特許文献1参照。）。しかし従来のバイオチップは、蛍光発色の有無を検査するための落射照明を有する高価なスキャナが必要であるという問題があった。
【特許文献１】特表２００２−５３７８６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、透過光で発色反応を確認できるバイオチップを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様によれば、透光性の基体と、基体上に配置され、基体に達する複数の貫通孔が設けられた遮光膜と、複数の貫通孔のそれぞれから表出する基体に結合された複数のプローブ生体分子と、を備え、複数の貫通孔のそれぞれの直径が３００μm以上であるバイオチップの製造方法であって、基体、基体上に配置された遮光膜、及び遮光膜上に配置された高分子膜を備えるバイオチップ用基板であって、それぞれ高分子膜及び遮光膜を貫通し、基体表面を露出させる、それぞれ直径が３００μm以上の複数の貫通孔が設けられており、複数の貫通孔から表出する基体の表面に導入された複数の水酸基を更に備えるバイオチップ用基板を準備するステップと、複数の水酸基に複数のプローブ生体分子を各々結合させるステップと、遮光膜及び高分子膜をアルカリ溶液に浸し、高分子膜を遮光膜から剥離させるステップと、を含む、バイオチップの製造方法が提供される。
【０００５】
本発明の第２の態様によれば、表面に複数の水酸基を導入可能な透光性の基体と、基体上に配置された遮光膜と、遮光膜上に配置された架橋性の高分子膜と、を備え、それぞれ高分子膜及び遮光膜を貫通し、基体表面を露出させる複数の貫通孔が設けられており、複数の貫通孔のそれぞれの直径が３００μm以上であり、高分子膜は、プローブ生体分子が基体に導入される間、遮光膜の表面を保護し、また、高分子膜は、プローブ生体分子が基体に導入された後、アルカリ溶液に浸されることにより、遮光膜の表面から剥がされる、バイオチップ用基板が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、透過光で発色反応を確認できるバイオチップを提供可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【０００９】
（第1の実施の形態）
本発明の第1の実施の形態に係るバイオチップは、図1及びA-A方向から見た断面図である図2に示すように、表面に複数の水酸(-OH)基を導入可能な透光性の基体15、及び基体15上に配置され、基体15に達する複数の貫通孔41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h, 41i, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 42i, 43a, 43b, 43c, 43d, 43e, 43f, 43g, 43h, 43i, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 45a, 45b, 45c, 45d, 45e, 45f, 45g, 45h, 45i, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 47a, 47b, 47c, 47d, 47e, 47f, 47g, 47h, 47i, 48a, 48b, 48c, 48d, 48e, 48f, 48g, 48h, 48i, 49a, 49b, 49c, 49d, 49e, 49f, 49g, 49h, 49iが設けられた遮光膜13を備える。基体15の材料としては合成石英(SiO2)等が使用可能である。遮光膜13の材料としてはチタン(Ti)、白金(Pt)、クロム(Cr)、ニオブ(Nb)、タンタル(Ta)、及びタングステン(W)等の遷移金属、或いはアルミニウム(Al)及び金(Au)等の金属が使用可能である。遮光膜13の材料としては、他に、一酸化チタン(TiO)或いは二酸化チタン(TiO2)等の遷移金属酸化物、窒化チタン(TiN)等の遷移金属窒化物、及び炭化チタン(TiC)等の遷移金属炭化物等が使用可能である。複数の貫通孔41a〜49iのそれぞれの直径は300μm以上である。
【００１０】
さらに第1の実施の形態に係るバイオチップは、図2に示すように、複数の貫通孔41a〜41iのそれぞれを介して表出する基体15の表面に配置された複数の生体物質層91a, 91b, 91c, 91d, 91e, 91f, 91g, 91h, 91iを備える。複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにおいては、複数のデオキシリボ核酸(DNA)、複数のリボ核酸(RNA)、複数のペプチド核酸(PNA)、あるいは複数のタンパク質等の複数のプローブ生体分子のそれぞれの官能基が、図3に示すように基体15表面の水酸(-OH)基と共有結合している。プローブ生体分子がDNA、RNA、あるいはPNAである場合は、それぞれの配列はターゲット生体分子と相補的となるよう設計される。
【００１１】
なお、基体15表面に直接生体物質層91a〜91iのそれぞれを配置することに第1の実施の形態は限定されない。図4に示す例では、基体15の複数の貫通孔41a〜41iのそれぞれを介して表出する部分の表面上に、シランカップリング層81a, 81b, 81c, 81d, 81e, 81f, 81g, 81h, 81iが配置されている。シランカップリング層81a〜81iのそれぞれにおいては、図5に示すように、複数のシランカップリング剤のそれぞれのメチル基(-CH3)あるいはエチル基(-C2H5)が基体15表面の水酸(-OH)基と酸塩基反応で化学結合している。
【００１２】
複数のシランカップリング剤のそれぞれには、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3-グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3-グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン、及び3-アミノプロピルトリエトキシシラン等が使用可能である。
【００１３】
シランカップリング層81a〜81iのそれぞれの上には、生体物質層91a, 91b, 91c, 91d, 91e, 91f, 91g, 91h, 91iが配置されている。生体物質層91a〜91iのそれぞれにおいては、複数のプローブ生体分子のそれぞれに導入されたリン酸アミダイト誘導体がシランカップリング層81a〜81iのシランカップリング剤のエポキシ基と加水分解反応により共有結合している。
【００１４】
あるいは、シランカップリング剤とプローブ生体分子は架橋剤を介して結合してもよい。例えば、受容体、リガンド、アンタゴニスト、抗体、抗原等のタンパク質に含まれるリジン(Lys)のアミノ(-NH2)基、アスパラギン酸(Asp)及びグルタミン酸(Glu)のカルボキシル(-COOH)基、チロシン(Tyr)のフェノール(-C6H4(OH))基、ヒスチジン(His)のイミダゾール(-C3H3N2)基、システイン(Cys)のチオール(-SH)基等の官能基と、シランカップリング剤のアミノ基やエポキシ基とを架橋剤で結合してもよい。図6に示す例においては、シランカップリング剤のアミノ(-NH2)基と抗体95a, 95b, 95cのアミノ(-NH2)基とを、両端でアミノ(-NH2)基と反応する架橋剤であるジスクシンイミジルスベレート(Disuccinimidyl suberate : DSS)で結合している。
【００１５】
架橋剤としては、他に、両端でアミノ基と反応するビスサルフォスクシンイミジルスベレート(Bis [Sulfosuccinimidyl] suberate : BS3)、ジメチルスベルイミデート(Dimethyl suberimidate・HCl : DMS)、ジスクシンイミジルグルタレート(Disuccinimidyl glutarate : DSG)、ローマン試薬(Loman's Reagent)、 3, 3' - ジチオビスサルフォスクシンイミジルプロピオネート(3, 3' - Dithiobis [sulfosuccinimidyl propionate] : DTSSP)、 エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート(Ethylene glycol bis [succinimidylsuccinate] : EGS)、アミノ基とカルボキシル基と反応する1-エチル - 3 - [3 - ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド(1 - Ethyl - 3 - [3 - Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride : EDC)等が使用可能である。
【００１６】
またさらに架橋剤としては、アミノ基とチオール基と反応するm-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(m - Maleimidobenzyl - N - hydroxysuccinimide ester : MBS)、 スクシンイミジル4 - [N - マレイミドメチル] - シクロヘキサン - 1 - カルボキシレート(Succinimidyl 4 - [N - maleimidomethyl] - cyclohexane - 1 - carboxylate : SMCC)、 スクシンイミジル 4 - [p - マレイミドフェニル] - ブチレート(Succinimidyl 4 - [p - maleimidophenyl] - buthrate : SMPB)、 N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(N - Succinimidyl 3 - [2 - pyridyldithio] propionate : SPDP)、N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)サルフォスクシンイミドエステル(N - [γ - Maleimidobutyloxy] sulfosuccinimide ester : Sulfo - GMBS)、 サルフォスクシンイミジル6 - [3' (2 - ピリジルジチオ) - プロピオンアミド] ヘキサノエート(Sulfosuccinimidyl 6 - [3' (2 - pyridyldithio) - propionamide] hexanoate : Sulfo - LC - SPDP)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシサルフォスクシンイミドエステル(m - Maleimidebenzoyl - N - hydoroxysulfo - succinimide ester : Sulfo - MBS)、サルフォスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(Sulfosuccinimidyl 4 [N - maleimidomethyl] - cyclohexane - 1 - carboxylate : Sulfo - SMCC)、サルフォスクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(Sulfosuccinimidy 4 - [p - maleimidophenyl] - butyrate : Sulfo - SMPB)等が使用可能である。なお、図1に示す他の複数の貫通孔42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの断面図も、図2乃至図6と同様であるので説明は省略する。
【００１７】
以上、図1乃至図6に示した第1の実施の形態に係るバイオチップは、透光性の基体15上に複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれがスポット状に配置され、さらに複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれの周囲に遮光膜13が配置されている。第1の実施の形態に係るバイオチップを用いて検査をするときには、ビオチンで標識したターゲット生体分子を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。ターゲット生体分子とプローブ生体分子との相互作用に必要な時間バイオチップを放置した後、バイオチップを洗浄して未反応のターゲット生体分子を除去する。次に西洋わさび過酸化酵素（HRP : Horseradish Peroxidase）標識ストレプトアビジンを含む溶液を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。室温で1時間静置した後、バイオチップを洗浄して未反応のストレプトアビジンを除去する。洗浄後、テトラメチルベンジジン(TMB : Tetramethyl benzidine)を含む溶液を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。ここで、複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにターゲット生体分子がトラップされていれば、ターゲット生体分子のHRPによってTMBが発色する。したがって、基体15の遮光膜13が配置された面と反対側の背面から照明光を照射すれば、遮光膜13によりコントラストが向上するため、複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにおける発色反応の有無を基体15の透過光で容易に確認することが可能となる。また複数の貫通孔41a〜49iのそれぞれの直径を300μm以上にすることにより、複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにおける発色反応の有無を肉眼で確認することも可能となる。
【００１８】
次に、図7乃至図25を用いて、第1の実施の形態に係るバイオチップの製造方法について説明する。
【００１９】
(a) 図7に示すように、SiO2等からなる基体15を用意し、基体15上にTi等からなる遮光膜13をスパッタリング法又は化学的気相堆積法(CVD)法等を用いて形成する。遮光膜13形成後、表面を酸素(O2)プラズマで5分間処理する。次に図8に示すように、遮光膜13上に化薬マイクロケム社のエスユー8(SU-8)3000シリーズ等の感光性のエポキシ樹脂含有溶液をスピン塗布し高分子膜11を形成する。スピン塗布の条件としては、例えば、5秒かけて毎分300回転まで加速し、10秒間毎分300回転を維持する。さらに5秒かけて毎分500回転まで加速し、15秒間毎分500回転を維持する。その後5秒かけて毎分4500回転まで加速し、30秒間毎分4500回転を維持する。最後に5秒かけてスピンを停止させる。
【００２０】
(b) 高分子膜11を形成後、高分子膜11を予備硬化（プリベーク）処理する。まず基体15を65℃に設定されたホットプレートにのせ、2分経過後、ホットプレートを80℃に設定する。20分経過後、ホットプレートを95℃に設定し、15分間放置する。15分経過後、ホットプレートの電源を切り、1時間放置する。その後、図1に示した複数の貫通孔41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれの形状に対応するマスクパターンを有するフォトマスクを用いて、紫外線で高分子膜11の一部を選択的に露光する。露光後、高分子膜11を露光後ベーク(PEB)処理する。具体的には、基体15を65℃に設定されたホットプレートにのせ、2分経過後、ホットプレートを95℃に設定し、6分間放置する。6分経過後、ホットプレートの電源を切り、1時間放置する。その後SU-8現像液等を用いて高分子膜11を現像すると、高分子膜11は感光性を有するため、図9に示すように、高分子膜11の一部が選択的に除去される。
【００２１】
(c) 一部が選択的に除去された高分子膜11をエッチングマスクとして用いて、遮光膜13の一部を等方性のウェットエッチングにより選択的に除去する。エッチング溶液としてはフッ酸(HF)、硝酸(HNO3)、及び水(H2O)の混合液等が使用可能である。選択的除去により、図10に示す複数の貫通孔41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれが形成される。
【００２２】
(d) 次に基体15を撹拌された水酸化ナトリウム(NaOH)溶液中に室温で2時間放置する。ここでNaOH溶液とは、98gのNaOH、294mlの蒸留水、及び392mlのエタノールを混合した溶液である。NaOH溶液中に放置することにより、図11に示すように、貫通孔41a〜41iのそれぞれから表出する基体15の表面に複数の水酸(-OH)基が導入される。なお、水酸(-OH)基の導入はUVオゾンクリーナ等で行ってもよい。
【００２３】
(e) 3-グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3-グリシドキシプロピルトリエトキシシラン等の官能基にエポキシ基を有するシランカップリング剤、あるいはN-2（アミノエチル）3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-アミノプロピルトリエトキシシラン等の官能基にアミンを有するシランカップリン剤等を図10に示す貫通孔41a〜41iのそれぞれから表出する基体15の表面上に滴下し、図12に示すシランカップリング層81a, 81b, 81c, 81d, 81e, 81f, 81g, 81h, 81iのそれぞれを形成させる。例えば、エポキシ基を有するシランカップリング剤を15℃の環境下で滴下した場合、図13に示すように、基体15表面に複数のエポキシ基が導入される。なお、図12に示す透光性の基体15と遮光膜13とのコントラストにより、シランカップリング剤を滴下する時に、貫通孔41a〜41iの位置は容易に判別できる。
【００２４】
(f) 基体15表面に残った未反応の水酸(-OH)基を、例えば、無水酢酸と1-メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン溶液）で処理してアセチル化し、キャッピングする。次に図14に示すように、基体15表面に導入されたシランカップリング剤のエポキシ基を加水分解し、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれに水酸(-OH)基を導入する。
【００２５】
(g) 図15に示すように、5’末端がジメトキシトリチル(DMTr)基で保護され、3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた1塩基目のヌクレオシドを準備する。なお図16に示すように、ヌクレオシドに含まれるアデニン(A)及びシトシン(C)のアミノ基はベンゾイル基で保護されており、グアニン(G)のアミノ基はイソブチル基で保護されている。次に1塩基目のヌクレオシドを、図12に示すシランカップリング層81a〜81iのそれぞれに滴下する。滴下によって、図17に示すようにシランカップリング剤の水酸(-OH)基に1塩基目のヌクレオシドのリン酸シアノエチルアミダイト誘導体を塩基触媒等を用いて結合させる。
【００２６】
(h) シランカップリング剤の未反応の水酸(-OH)基は無水酢酸と1-メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン溶液）で処理してアセチル化し、2塩基目以降のヌクレオシドとの結合を阻害する。次に、1塩基目のヌクレオシドのジメトキシトリチル(DMTr)基を3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護し、図18に示すように5’水酸(-OH)基を1塩基目のヌクレオシドに導入する。
【００２７】
(i) 3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた2塩基目のヌクレオシドをシランカップリング層81a〜81iに滴下し、図19に示すように、1塩基目のヌクレオシドの5’水酸(-OH)基に2塩基目のヌクレオシドのリン酸シアノエチルアミダイト誘導体を塩基触媒等を用いて縮合反応で結合させる。なお、1塩基目のヌクレオシドの未反応の5’水酸(-OH)基は無水酢酸とテトラヒドロフラン溶液で処理してアセチル化し、キャッピングする。
【００２８】
(j) 縮合反応で生じた亜リン酸トリエステル結合は、ヨウ素と水（ピリジン含有テトラヒドロフラン溶液）で酸化し、図20に示すように、より安定なリン酸トリエステル結合に変換させる。その後、2塩基目のジメトキシトリチル(DMTr)基を除去し、図21に示すように目的のDNA鎖長になるまでヌクレオシドホスホロアミダイトとの縮合反応を繰り返し、図4に示した生体物質層91a〜91iを形成する。
【００２９】
(k) DNA伸長後、高分子膜11が浸るように基体15を55℃でアンモニア(NH4OH)水等のアルカリ溶液に30分間沈めるアルカリ溶液処理を行う。なお、NH4OH水の重量パーセント濃度は調整時で40%である。アルカリ溶液処理により、図22に示すように、リン酸基に結合したシアノエチル保護基が脱離する。またアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)等の塩基が図23に示すように脱保護される。さらにアルカリ溶液処理により、遮光膜13と高分子膜11の密着力が低下する。その後、基体15をNH4OH水から取り出し、図24に示す高分子膜11の側面115にエアガン等で空気等の気体を吹き付け、高分子膜11を遮光膜13から剥離させる。最後に末端のジメトキシトリチル(DMTr)基を図25に示すように脱保護し、第1の実施の形態に係るバイオチップの製造方法を終了する。
【００３０】
なお、第1の実施の形態に係るバイオチップの製造法は、これに限られない。例えば、図7で基体15条に遮光膜をスパッタリング法又は化学的気相堆積法(CVD)法等を用いて形成すると説明した。これに対し、例えばUV硬化型の黒色スクリーンインキ等を用いて、基体15上に複数の貫通孔41a〜49iを有する遮光膜13を形成してもよい。あるいは、予め複数の貫通孔41a〜49iを有する遮光膜13を準備し、接着剤等で基体15上に貼り付けてもよい。この場合も、遮光膜13の材料は金属類に限られず、樹脂や不溶紙等を用いてもよい。その他、インクジェットプリンタ等を用いて遮光膜を形成してもかまわない。また、第1の実施の形態に係るバイオチップの基体15は、図26に示すように、遮光膜13の複数の貫通孔41a〜41iにそれぞれ通じる複数のウェル51a, 51b, 51c, 51d, 51e, 51f, 51g, 51h, 51iを有していてもよい。複数の生体物質層91a〜91iは、複数のウェル51a〜51iのそれぞれの底部に配置される。図26に示すバイオチップを製造する際には、図10に示したように遮光膜13に複数の貫通孔41a〜41iを形成した後、さらにドライエッチング法等で遮光膜13をエッチングマスクにして基体15を選択的に除去すればよい。例えば被検液の容量を確保したい場合等に、複数のウェル51a〜51iを基体15に形成すればよい。
【００３１】
（変形例）
図1に示した複数の貫通孔41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれから表出する基体15表面に異なる塩基配列を有するプローブDNAを合成することも可能である。以下、複数の貫通孔41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれに異なる塩基配列を有するプローブDNAを合成する方法を説明する。
【００３２】
(a) 図12に示すように、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれを形成させた後、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれに含まれるシランカップリング剤のエポキシ基を加水分解し、シランカップリング層81a〜81iのそれぞれに水酸(-OH)基を導入する。その後、5塩基のチミン(T)を有するヌクレオシドを順次シランカップリング剤に結合させる。次に、貫通孔41d, 41e, 41fに図27に示すように埋め込み樹脂を埋め込み、ブロック層130a, 130b, 130cを形成する。埋め込み樹脂の材料には、ジメチルスルホキシド(DMSO)に平均分子量20,000のポリヒドロキシスチレン(PHS)を重量比5%で溶かしたものが使用可能である。
【００３３】
(b) 埋め込み樹脂が埋め込まれなかった貫通孔41a, 41b, 41c, 41g, 41h, 41iのそれぞれのヌクレオシドのジメトキシトリチル(DMTr)基を3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護する。その後、溶剤でブロック層130a, 130b, 130cを除去する。次に、3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた新たなヌクレオシドを貫通孔41a〜41i内部に滴下すると、新たなヌクレオシドはジメトキシトリチル(DMTr)基が脱保護されたヌクレオシドの5’水酸(-OH)基のみと反応して結合する。
【００３４】
(c) 図12に示した貫通孔41a, 41b, 41c, 41g, 41h, 41iに図28に示すように埋め込み樹脂を埋め込み、ブロック層131a, 131b, 131c, 131d, 131e, 131fを形成する。次に埋め込み樹脂が埋め込まれなかった貫通孔41d, 41e, 41fのそれぞれのヌクレオシドのジメトキシトリチル(DMTr)基を3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン酸性溶剤で脱保護し、溶剤でブロック層131a, 131b, 131c, 131d, 131e, 131fを除去する。その後、3'末端の水酸基が三価のリン酸アミダイト誘導体にされた新たなヌクレオシドを貫通孔41a〜41iに滴下すると、新たなヌクレオシドはジメトキシトリチル(DMTr)基が脱保護された貫通孔41d, 41e, 41f内のヌクレオシドの5’水酸(-OH)基のみと反応して結合する。
【００３５】
(d) その後、貫通孔41a〜41iのいずれかの内部への埋め込み樹脂の充填、ジメトキシトリチル(DMTr)基の脱保護、埋め込み樹脂の除去、及びヌクレオシドの重合反応を繰り返すことにより、複数の貫通孔41a〜41i, 42a〜42i, 43a〜43i, 44a〜44i, 45a〜45i, 46a〜46i, 47a〜47i, 48a〜48i, 49a〜49iのそれぞれに異なる塩基配列を有するプローブDNAが合成される。
【００３６】
（第2の実施の形態）
第2の実施の形態に係るバイオチップは、図29及びA-A方向から見た断面図である図30に示すように、透光性の基体15、及び基体15の第１面10上に配置され、第１面10に達する複数の貫通孔41a, 41b, 41c, 41d, 41e, 41f, 41g, 41h, 41iが設けられた遮光膜13、及び基体15の第１面10と対向する基体15の第２面20上に結合された複数のプローブ生体分子をそれぞれ有する複数の生体物質層91a, 91b, 91c, 91d, 91e, 91f, 91g, 91h, 91i, 92a, 92b, 92c, 92d, 92e, 92f, 92g, 92h, 92i, 93a, 93b, 93c, 93d, 93e, 93f, 93g, 93h, 93i, 94a, 94b, 94c, 94d, 94e, 94f, 94g, 94h, 94i, 95a, 95b, 95c, 95d, 95e, 95f, 95g, 95h, 95i, 96a, 96b, 96c, 96d, 96e, 96f, 96g, 96h, 96i, 97a, 97b, 97c, 97d, 97e, 97f, 97g, 97h, 97i, 98a, 98b, 98c, 98d, 98e, 98f, 98g, 98h, 98i, 99a, 99b, 99c, 99d, 99e, 99f, 99g, 99h, 99iを備える。複数の生体物質層91a〜99iのそれぞれの拡大断面図は図3と同様であるので、説明は省略する。また、図5及び図6に示したように、シランカップリング剤や架橋試薬等を介して複数のプローブ生体分子を基体15に結合してもよいのはもちろんである。図29及び図30に示す複数の生体物質層91a〜99iのそれぞれにビオチンで標識したターゲット生体分子を含む被検液を滴下した後、HRP標識ストレプトアビジンを含む溶液を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。静置及び洗浄後、TMBを含む溶液を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。ここで、複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにターゲット生体分子がトラップされていれば、ターゲット生体分子のHRPによってTMBが発色する。したがって、第1面10側から照明光を照射すると、貫通孔41a〜41iのそれぞれから基体15に入射した照明光の透過光により、発色反応の有無が容易に確認することが可能となる。
【００３７】
次に、第2の実施の形態に係るバイオチップの製造方法について説明する。まず、図7乃至図10で説明した方法により、基体15の第1面10上に複数の貫通孔41a〜41iを有する遮光膜13を形成する。図31で、基体15の第2面上にリソグラフィ法等を用いて複数の開口を有する高分子膜111を形成する。なお、高分子膜111の複数の開口のそれぞれの形成位置は、遮光膜13の複数の貫通孔41a〜41iの形成位置と対向する。図32で、高分子膜111の複数の開口のそれぞれから表出する基体15の第2面20上に複数の生体物質層91a〜91iを形成する。その後、高分子膜111を第2面20から、第2の実施の形態に係るバイオチップが完成する。
【００３８】
なお、第2の実施の形態に係るバイオチップの形状は図30に限定されない。例えば、図33に示すように、基体15にウェル61a, 61b, 61c, 61d, 61e, 61f, 61g, 61h, 61iを設け、ウェル61a〜61iのそれぞれの底部に複数の生体物質層91a〜99iを配置してもよい。あるいは、図34に示すように第2面20上に生体物質層191を配置してもよい。基体15の第1面10側から照明光を照射すれば、遮光膜13により照射光の入射領域が限定されるため、生体物質層191が第2面20上に均一に配置されていても、発色反応の有無のコントラストが明瞭となる。
【００３９】
（第3の実施の形態）
第3の実施の形態に係るバイオチップは、図35及びA-A方向から見た断面図である図36に示すように、透光性の複数の支持部材215a, 215b, 215c, 215d, 215e, 215f, 215g, 215h, 215i、複数の支持部材215a〜215iのそれぞれの上に結合された複数のプローブ生体分子を有する複数の生体物質層291a, 291b, 291c, 291d, 291e, 291f, 291g, 291h, 291i、及び支持部材215a〜215iのそれぞれの外周に配置された遮光部材213を備える。複数の支持部材215a〜215iのそれぞれの材料には、SiO2等が使用可能である。遮光部材213の材料としては、金属類及び樹脂等が使用可能である。図35に示す複数の生体物質層292a, 292b, 292c, 292d, 292e, 292f, 292g, 292h, 292i, 293a, 293b, 293c, 293d, 293e, 293f, 293g, 293h, 293i, 294a, 294b, 294c, 294d, 294e, 294f, 294g, 294h, 294i, 295a, 295b, 295c, 295d, 295e, 295f, 295g, 295h, 295i, 296a, 296b, 296c, 296d, 296e, 296f, 296g, 296h, 296i, 297a, 297b, 297c, 297d, 297e, 297f, 297g, 297h, 297i, 298a, 298b, 298c, 298d, 298e, 298f, 298g, 298h, 298i, 299a, 299b, 299c, 299d, 299e, 299f, 299g, 299h, 299iのそれぞれの下部にも、支持部材が配置されている。複数の生体物質層291a〜299iのそれぞれの拡大断面図は図3に示した生体物質層91aの拡大断面図と同様であるので、説明は省略する。また、図5及び図6に示したように、シランカップリング剤や架橋試薬等を介して複数のプローブ生体分子を複数の支持部材215a〜215iのそれぞれに結合してもよいのはもちろんである。図35及び図36に示す複数の生体物質層291a〜299iのそれぞれにビオチンで標識したターゲット生体分子を含む被検液を滴下した後、HRP標識ストレプトアビジンを含む溶液を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。静置及び洗浄後、TMBを含む溶液を複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれに滴下する。ここで、複数の生体物質層91a〜91iのそれぞれにターゲット生体分子がトラップされていれば、ターゲット生体分子のHRPによってTMBが発色する。したがって、複数の生体物質層291a〜299iのそれぞれが配置されていない側から照明光を照射すると、複数の支持部材215a〜215iのそれぞれに入射した照明光の透過光と遮光部材213のコントラストにより、発色反応の有無が容易に確認することが可能となる。
【００４０】
次に、第3の実施の形態に係るバイオチップの製造方法について説明する。まず図37に示すように、複数の貫通孔71a, 71b, 71c, 71d, 71e, 71f, 71g, 71h, 71iを有する遮光部材213を用意する。図38で、複数の貫通孔71a〜71iに、複数の支持部材215a〜215iをそれぞれ挿入する。図39で、リソグラフィ法等により遮光部材213上に複数の支持部材215a〜215iを表出さえる複数の開口を有する高分子膜111を形成する。図40で、複数の支持部材215a〜215iの上に複数の生体物質層91a〜91iをそれぞれ形成する。その後、高分子膜111を除去し、第3の実施の形態に係るバイオチップが完成する。
【００４１】
なお、第3の実施の形態に係るバイオチップの形状は図36に限定されない。例えば、図41に示すように、複数の支持部材215a〜215iのそれぞれの厚みと、遮光部材213の厚みは異なっていてもよい。遮光部材213を複数の支持部材215a〜215iのそれぞれよりも厚くすることにより、側壁を遮光部材213、底面を複数の支持部材215a〜215iのそれぞれの表面とする複数のウェルを設け、複数のウェルの底面に生体物質層291a, 291b, 291c, 291d, 291e, 291f, 291g, 291h, 291iをそれぞれ配置してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの上面図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの断面図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１の拡大断面図である。
【図４】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第２の断面図である。
【図５】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第２の拡大断面図である。
【図６】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第３の拡大断面図である。
【図７】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１の工程断面図である。
【図８】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第２の工程断面図である。
【図９】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第３の工程断面図である。
【図１０】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第４の工程断面図である。
【図１１】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第５の工程断面図である。
【図１２】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第６の工程断面図である。
【図１３】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第７の工程断面図である。
【図１４】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第８の工程断面図である。
【図１５】本発明の第１の実施の形態に係るヌクレオシドホスホロアミダイトの化学式である。
【図１６】本発明の第１の実施の形態に係るヌクレオシドの塩基の第１の化学式である。
【図１７】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第９の工程断面図である。
【図１８】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１０の工程断面図である。
【図１９】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１１の工程断面図である。
【図２０】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１２の工程断面図である。
【図２１】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１３の工程断面図である。
【図２２】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１４の工程断面図である。
【図２３】本発明の第１の実施の形態に係るヌクレオシドの塩基の第２の化学式である。
【図２４】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１５の工程断面図である。
【図２５】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第１６の工程断面図である。
【図２６】本発明の第１の実施の形態に係るバイオチップの第３の断面図である。
【図２７】本発明の第１の実施の形態の変形例に係るバイオチップの第１の工程断面図である。
【図２８】本発明の第１の実施の形態の変形例に係るバイオチップの第２の工程断面図である。
【図２９】本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの上面図である。
【図３０】本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１の断面図である。
【図３１】本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第１の工程断面図である。
【図３２】本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第２の工程断面図である。
【図３３】本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第２の断面図である。
【図３４】本発明の第２の実施の形態に係るバイオチップの第３の断面図である。
【図３５】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの上面図である。
【図３６】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの第１の断面図である。
【図３７】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの第１の工程断面図である。
【図３８】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの第２の工程断面図である。
【図３９】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの第３の工程断面図である。
【図４０】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの第４の工程断面図である。
【図４１】本発明の第３の実施の形態に係るバイオチップの第２の断面図である。
【符号の説明】
【００４３】
10…第1面
11…高分子膜
13…遮光膜
15…基体
20…第2面
41a〜49i, 71a〜71i…貫通孔
51a〜51i, 61a〜61i…ウェル
81a〜81i…シランカップリング層
91a〜99i, 191, 291a〜299i…生体物質層
95a〜95c…抗体
111…高分子膜
115…側面
130a〜130c, 131a〜131f…ブロック層
213…遮光部材
215a〜215i…支持部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
0004763402.tif 000004
【図４】
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【図５】
0004763402.tif 000006
【図６】
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【図７】
0004763402.tif 000008
【図８】
0004763402.tif 000009
【図９】
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【図１０】
0004763402.tif 000011
【図１１】
0004763402.tif 000012
【図１２】
0004763402.tif 000013
【図１３】
0004763402.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0004763402.tif 000019
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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