(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニンであるＦ蛋白質において、当該フェニルアラニンを置換する工程を含む、下記（ａ）または（ｂ）に記載のウイルスの細胞融合能を低下させる方法。
（ａ）モルビリウイルス属に属するウイルス。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する細胞融合能を持つＦ蛋白質を有するウイルス。
【請求項２】
ウイルスが麻疹ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２７８位またはその相同な位置のアミノ酸をロイシンに置換することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニンであるＦ蛋白質において、当該フェニルアラニンを置換する工程を含む、下記（ａ）または（ｂ）に記載のウイルスの細胞融合能を低下させたウイルスの製造方法。
（ａ）モルビリウイルス属に属するウイルス。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する細胞融合能を持つＦ蛋白質を有するウイルス。
【請求項５】
ウイルスが麻疹ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記２７８位またはその相同な位置のアミノ酸をロイシンに置換することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、モルビリウイルス由来Ｆ蛋白質の位置特異的な変異による細胞融合能の低下方法に関する。このＦ蛋白質は、ウイルスの弱毒化に有用である。
背景技術
モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属は、モノネガウイルス目パラミキソウイルス科の下位に位置する一属であり、麻疹ウイルスを初めとする多くの病原性ウイルスが含まれている。麻疹ウイルスは、急性の発疹性疾患である「ハシカ」の原因ウイルスである。麻疹ウイルスは広く小児に感染し、発熱、発疹、咳などの症状を示す。時に、麻疹脳炎、麻疹肺炎などの重篤な合併症を引き起こし、死にいたらしめる事もある。又、ごく稀に、感染治癒後にも持続感染し、予後不良の脳炎、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）をおこす。唯一有効な予防手段は弱毒麻疹ウイルスワクチンの予防接種である。
弱毒麻疹ウイルスワクチンの１つであるＡＩＫ−Ｃ株は、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株を羊の腎臓細胞、鶏胚細胞に継代する事によって得られたウイルス株である。ＡＩＫ−Ｃ株は、抗体獲得率と安全性に優れ、国際的にも高い評価を得ている。この弱毒生麻疹ワクチンの普及に伴って麻疹罹患者は著明に減少している。一般に、ワクチンの抗体獲得率と安全性とは相反する特性である。したがって、両者をともに高い水準で維持することは容易ではない。そのため、ＡＩＫ−Ｃ株における弱毒化のメカニズムを他の株やウイルスに応用できれば、弱毒化ワクチンの開発において有用である。
しかし、このウイルスの弱毒化が、どのようなメカニズムによりもたらされているのかは未だ不明である。
発明の開示
本発明は、細胞融合能が低下したウイルスを製造するために用いるＤＮＡを提供することを課題とする。また本発明は、ウイルスのＦ蛋白質の特定の部位に変異を導入してウイルスの細胞融合能を低下させる方法、およびＦ蛋白質の特定の部位の変異により細胞融合能を低下させたウイルス提供することを課題とする。本発明の方法により製造された細胞融合能が低下したウイルスは、弱毒ウイルスとしてワクチン製造などに有用である。
モルビリウイルス属のウイルスの増殖、拡散には細胞融合が深く関わっており、この細胞融合能の差が、ウイルスの病原性に影響を与えているのではないかと考えられている。本発明者らは、ある種のウイルス蛋白質の変異が細胞融合能を低下させているのであれば、その変異を同定し、変異蛋白質を有するウイルスを作製することにより、ウイルスの増殖や毒性を制御することができると考えた。
そこで、本発明者らは、複数の部位に変異を導入した麻疹ウイルス由来のＦ蛋白質およびＨ蛋白質を細胞で発現させ、それらの変異が細胞融合能に与える影響を調べた。その結果、Ｆ蛋白質の２７８位のアミノ酸が、細胞融合能と密接に関与することを見出した。高い細胞融合能を有するＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株では、Ｆ蛋白質の２７８位はフェニルアラニンになっている。そして本発明者らは、複数の部位に変異を有するＦ蛋白質のうち、２７８位がＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株と同じフェニルアラニンである変異体は、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質と同等の細胞融合能を示すが、このアミノ酸を変異させることによって、細胞融合能を有意に低下させることができることを突きとめた。このように、本発明はＦ蛋白質の２７８位のアミノ酸と細胞融合能との関係を初めて開示するものである。
本発明者らは以上の知見に基づき、ウイルスのＦ蛋白質の２７８位のアミノ酸を改変することにより、その細胞融合能を低下させることが可能であることを見出した。細胞融合能が低下したウイルスは、宿主における増殖と拡散が困難となり、弱毒化が達成されると考えられる。これまで、ワクチン開発に有用な弱毒化ウイルスの単離はウイルス変異株のスクリーニングに頼っており、効率が低く時間を要するものであった。本発明により、任意のウイルスを容易に弱毒化することが可能になる。
すなわち本発明は、細胞融合能が低下したウイルスを製造するために用いるＤＮＡ、ウイルスのＦ蛋白質の特定のアミノ酸に変異を導入してウイルスの細胞融合能を低下させる方法、およびＦ蛋白質の特定の部位の変異により細胞融合能を低下させたウイルスに関し、より具体的には以下の各発明に関する。
〔１〕細胞融合能が低下したウイルスを製造するために用いる下記（ａ）、または（ｂ）に記載のＤＮＡ。
（ａ）モルビリウイルス属に属するウイルスのＦ蛋白質に由来する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡ。
〔２〕麻疹ウイルス由来の蛋白質をコードする、〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔３〕前記フェニルアラニン以外のアミノ酸がロイシンである、〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔４〕〔１〕に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。
〔５〕〔１〕に記載のＤＮＡを含むベクター。
〔６〕細胞融合能を低下させた麻疹ウイルスを再構成するために用いる、〔５〕に記載のベクター。
〔７〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸に変異を導入する工程を含む、下記（ａ）または（ｂ）に記載のウイルスの細胞融合能を低下させる方法。
（ａ）モルビリウイルス属に属するウイルス、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するＦ蛋白質を有するウイルス、
〔８〕ウイルスが麻疹ウイルスである、〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記２７８位またはその相同な位置のアミノ酸をロイシンに置換することを特徴とする、〔７〕に記載の方法。
〔１０〕    〔７〕に記載の方法により得ることができる、細胞融合能が低下しているウイルス。
〔１１〕    弱毒ウイルスである、〔１０〕に記載のウイルス。
〔１２〕    〔１１〕に記載のウイルスを含む医薬組成物。
〔１３〕    ワクチンとして用いる、〔１２〕に記載の医薬組成物。
あるいは本発明は、モルビリウイルス属に属するウイルスのＦ蛋白質に由来する蛋白質であって、配列番号：２（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株）に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡの、細胞融合能が低下したウイルスの製造方法における使用に関する。また本発明は、配列番号：２（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株）に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有する蛋白質であって、配列番号：２（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株）に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡの、細胞融合能が低下したウイルスの製造におけるＤＮＡの使用に関する。更に本発明は、これらＤＮＡを含むベクターの、細胞融合能が低下した麻疹ウイルスの再構成における使用に関する。
本発明は、細胞融合能が低下したウイルスを製造するために用いるＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡは、モルビリウイルス属に属するウイルスのＦ蛋白質に由来する蛋白質であって、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質（配列番号：２）の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。また、本発明のＤＮＡには、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：２）と少なくとも６５％の同一性を有する蛋白質であって、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。配列番号：２に示すアミノ酸配列との同一性は、望ましくは８０％以上、より望ましくは９５％以上とする。アミノ酸配列の同一性は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ  Ｖｅｒ．１０（ソフトウエア開発株式会社）を使用した３Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅｒｓｏｎ法によって決定することができる。
モルビリウイルスに属するウイルスとしては、例えば、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、犬ジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、アザラシジステンパーウイルス（ｐｈｏｃｉｄ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、リンダーペストウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。
本発明において、配列番号：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質は、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる蛋白質と類似の構造を持つ。したがって、その２７８位に相同な位置にあるフェニルアラニンは、配列番号：２における２７８位のフェニルアラニンと同様に細胞融合能の維持に重要な役割を果たしていると考えることができる。またモルビリウイルス属に属するウイルスは、分類学的に近縁のウイルスであることから、そのＦ蛋白質の構造は保存されている。したがって、やはり配列番号：２における２７８位に相同な位置のフェニルアラニンは、細胞融合能の維持に重要な役割を果たしていると考えることができる。モルビリウイルス属に属するウイルスのＦ蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果を図４に示す。このようにして、各ウイルスのＦ蛋白質を構成するアミノ酸配列中の、２７８位に相当するアミノ酸を明らかにすることができる。
本発明において、Ｆ蛋白質の細胞融合能の低下とは、２７８位と相同な位置にフェニルアラニンを有する蛋白質が示す細胞融合能に対して、有意な低下を示すことを意味する。有意な低下とは、より具体的には、たとえば５０％、より望ましくは７０％以上の低下を示すことができる。細胞融合能の低下とは、細胞融合能の完全な欠失を含む。Ｆ蛋白質の細胞融合能は、例えば顕微鏡下のウイルス感染細胞の大きさをコンピュータで画像解析処理して、ある大きさ以上の細胞でしめられる面積の割合を算出し、ウイルス株毎のこの割合を数値で比較することによりウイルスの細胞融合能を比較できる。また、麻疹ウイルスのように浮遊細胞で生育しうる場合には、フローサイトメータなどで細胞の大きさを分析し、数値化して、比較する事ができる。また０．５％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、ギムザ染色を行い、染色されたプラークの大きさを顕微鏡で観察することによって比較することができる。
細胞融合能はウイルスの増殖、拡散性を決定する主要な因子の１つであると考えられている。細胞融合能を低下させることによってウイルスの増殖、拡散能が低下し、その結果として弱毒化が達成されると考えられる。一方で本発明に基づけばわずか１アミノ酸の変異によって弱毒化がもたらされるため、抗原としての構造は維持される。したがって、抗体獲得率を高い水準に保ちながら、弱毒化が効果的に達成されるのである。
麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質のアミノ酸配列、および該蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号：２および１に示す。対象とする蛋白質において、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質の２７８位のアミノ酸と相同な位置は、相互のアミノ酸配列を比較することにより決定することができる。対象蛋白質における当該位置は、必ずしも２７８位である必要はない。例えば、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質に対して１または複数のアミノ酸が付加、挿入、および／または欠失したような構造からなる蛋白質の場合は、２７８位以外の位置である可能性がある。このような蛋白質について、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質の２７８位のアミノ酸と相同な位置を決定するには、相互のアミノ酸をなるべく一致させ、かつ性質の似たアミノ酸をなるべく一致させるように両者のアミノ酸配列に適宜ギャップを挿入してアミノ酸配列を並列（アライメント）させる。これにより、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質の２７８位に相同な位置が、対象とする蛋白質でいずれの位置に相当するのかを決定することができる。このような手法は当業者にとっては周知であり、市販または公開されているコンピュータソフトウェア、例えば解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  ＶＥＲ．１０（ソフトウエア株式会社）等を用いて容易に行うことができる。
対象とする蛋白質において、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質の２７８位に相当する位置がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明の細胞融合能が低下したウイルスを製造するために用いられる。ＤＮＡの由来に特に制限はなく、天然のＤＮＡであっても、人為的または自発的に変異が導入されたＤＮＡであってもよい。また、人工的にデザインされた配列からなるＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡは、例えば、公知のハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．）を利用して調製することができる。ＤＮＡの単離には、ポリメラーゼ連鎖反応技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．）を利用することもできる。
即ち、当業者においては、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、ウイルス由来のＤＮＡなどをスクリーニングしＤＮＡを単離することができる。ハイブリダイゼーション法に必要なプローブや、ＰＣＲ法に必要なプライマーの塩基配列は、例えばＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質のｃＤＮＡ配列（配列番号：１）に基づいて設計することができる。単離したＤＮＡがコードするアミノ酸配列におけるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質の２７８位のアミノ酸と相同な位置を同定して、その位置がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡを調製することは容易になし得ることである。
得られたＤＮＡを適宜改変することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質におけるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質の２７８位に相当するアミノ酸が、フェニルアラニン以外の所望のアミノ酸となるようにすることができる。あるいはこのフェニルアラニンを欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）する変異を導入することも、本発明に含まれる。どのアミノ酸に置換するかは、適宜選択することが可能である。実施例に記載したように、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質の２７８位のアミノ酸と相同な位置のアミノ酸をロイシンに置換した蛋白質は、有意な細胞融合能の低下を引き起こした。従って、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質の２７８位のアミノ酸と相同な位置のアミノ酸をロイシンに改変されている蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明において好適に用いられる。
また、本発明によりＦ蛋白質のこの位置のアミノ酸は細胞融合能に重要な機能を有していることが判明した。従って、該当する位置がフェニルアラニン以外のアミノ酸である場合に、このアミノ酸をさらに別のアミノ酸に変異させれば、細胞融合能をより低下させたり、逆に低下の程度を減少させたりすることが可能である。なお、細胞融合能の低下には、細胞融合能の消失も含まれる。
アミノ酸に変異を導入する方法はよく知られている。例えば、変異ウイルスを含むウイルスライブラリーや、変異Ｆ蛋白質をコードするＤＮＡライブラリー等を作製し、望みのアミノ酸配列をコードするＤＮＡをスクリーニングすることによって単離することができる。あるいは変異の入ったウイルスを自然界からスクリーニングすることもできる。更に、公知の遺伝子工学的技術を用いて、部位特異的に変異を導入することも可能である。部位特異的に変異を導入するためには、例えば、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）．Ｇｅｎｅ  ７７，５１−５９）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；８２（２）：４８８−９２）法を用いることができる。
また本発明においては、Ｆ蛋白質の２７８位に相当する部位がフェニルアラニン以外のアミノ酸である限り、それ以外の部位を変異させても構わない。例えば、本発明のＤＮＡには、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質（配列番号：２）において２７８位がフェニルアラニン以外であり、２７８位のアミノ酸以外の１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。モルビリウイルスに属するウイルスから得たＤＮＡがコードするＦ蛋白質のアミノ酸を人為的に改変するのであれば、改変されるアミノ酸の数は、通常、２７８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸において、５アミノ酸以内、好ましくは３アミノ酸以内、さらに好ましくは１アミノ酸である。このようなアミノ酸の改変は、例えばＦ蛋白質のさらなる細胞融合能の低下を目的として、また、制限酵素部位の導入などＤＮＡの操作性の向上を目的として、さらに、Ｆ蛋白質が持つ細胞融合能以外の性質の改変を目的として行われ得る。また、蛋白質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
一般に蛋白質の性質をできるだけ損なわないようにするためには、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましいと考えられる。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、本発明は、本発明のＤＮＡによりコードされる蛋白質に関する。本発明の蛋白質を用いて、細胞融合能が低下したウイルスを製造することができる。本発明の蛋白質は、これをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入することにより発現させることができる。麻疹ウイルスなどにおいては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターから、細胞融合能を低下させたウイルスを再構成させることができる。麻疹ウイルスをｃＤＮＡから再構成させる方法は、Ｒａｄｅｃｋｅ（Ｒａｄｅｃｋｅ  Ｆ，Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ  Ｐ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｈ，Ｋａｅｌｉｎ  Ｋ，Ｈｕｂｅｒ  Ｍ，Ｄｏｔｓｃｈ  Ｃ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｇ，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ  ＭＡ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ；１４（２３）：５７７３−８４）の方法、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｈ，Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ，Ｐ．，Ｋａｅｌｉｎ，Ｋ．，Ｄｏｔｓｃｈ，Ｃ．，Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６４（１）：５７−６４）の方法が報告されている。これらの方法によれば、麻疹ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、およびＬ蛋白質をコードするＤＮＡから、麻疹ウイルスを再生することができる。従って、このＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして、本発明のＤＮＡを用いれば、細胞融合能が低下した麻疹ウイルスを再構成させることができる。すなわち、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、およびＬ蛋白質をコードするＤＮＡを転写させることにより、その転写産物は麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡとして機能し、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下で麻疹ウイルス粒子が形成される。得られたウイルスは、適当な宿主に感染させてさらに増幅させることができる。
具体的には、麻疹ウイルス株よりＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを合成する。公知の部位特異的変異導入法を用いて、Ｆ蛋白質の野生株の２７８位のアミノ酸に相当する部位に変異が導入された（例えばロイシンに）ｃＤＮＡを作製する。これと、他の麻疹ウイルスの遺伝子をコードするｃＤＮＡから、制限酵素部位を利用してウイルス全ゲノムＲＮＡに相当するゲノムｃＤＮＡを構築する。これをＴ７プロモーターの下流にクローニングする。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現ワクチニアウイルスを感染させた宿主細胞に、上記ウイルスゲノムｃＤＮＡを持つプラスミドと麻疹ウイルスの転写、複製に必須なＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子をＴ７プロモーターの下流にクローニングしたプラスミドをコトランスフェクトし、数日間培養する。この培養上清から、細胞融合能が低下した組換え麻疹ウイルスを回収する。この方法により、任意の麻疹ウイルス株を弱毒化することが可能である。生産させたウイルスは、さらに適当な宿主で増幅することができる。
麻疹ウイルス以外のモルビリウイルスの再構成法としては、Ｂａｒｏｎら（Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．（１９９７）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７１（２）：１２６５−７１）の方法、および甲斐ら（甲斐智恵子、三浦竜一、清水房子、佐藤宏樹、藤田賢太郎、畠間真一、大橋謙司朗、上間匡、高橋英司、第４７回日本ウイルス学会学術集会抄録集（１９９９）ｐ２８９、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ法を用いた組み換えイヌジステンパーウイルスの作製）の方法、さらには特許ＷＯ９７／１６５３８が知られている。
本発明に加えて、ウイルスのＰ蛋白質に変異を与えることによって、細胞融合能の低下とともに、温度感受性の形質をウイルスに導入することができる。本発明者らは、モルビリウイルスのＰ蛋白質において、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質を用いることによって温度感受性の形質を導入できることを明らかにしている。この知見を本発明に組み合わせることにより、細胞融合能の低下とともに、温度感受性の形質についても変異をもたらし、より安全性に優れたワクチン製剤を提供することができる。
加えて本発明は、ウイルスの細胞融合能を低下させる方法に関する。本発明の方法は、モルビリウイルス属に属するウイルスのＦ蛋白質、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有する蛋白質において、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質（配列番号：２）の２７８位に相同な位置のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする。本発明によって得られる、ウイルスの細胞融合能は、例えば顕微鏡下のウイルス感染細胞の大きさをコンピュータで画像解析処理して、ある大きさ以上の細胞でしめられる面積の割合を算出し、ウイルス株毎のこの割合を数値で比較することによりウイルスの細胞融合能を比較できる。また、麻疹ウイルスのように浮遊細胞で生育しうる場合には、フローサイトメータなどで細胞の大きさを分析し、数値化して、比較する事ができる。また、０．５％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、ギムザ染色を行い、染色されたプラークの大きさを顕微鏡で観察することによって比較することができる。
これにより得ることができる、細胞融合能が低下したウイルスは、宿主内での増殖、拡散能が低下するため毒性が少ない。これらのウイルスは安全な生ワクチンの製造のために極めて有用である。本発明によれば、どのようなウイルス株に対しても、そのＦ蛋白質を遺伝子工学的に改変して弱毒化することが可能である。本発明のウイルスをワクチンなどの医薬組成物として使用する場合は、ウイルス自体を医薬として使用する以外に、公知の薬学的処方を適用して製剤化されうる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。ワクチンとして使用する場合は、適宜アジュバントと組み合わせて投与することができる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、使用目的などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
一般に麻疹ワクチン株ウイルスは、日本においては、厚生省が許可したＳＰＦ設備で生産された発育卵から調製したニワトリ胚培養細胞に接種して培養する。培養後、微生物迷入否定試験に合格したワクチン液に安定剤を加えて精製してワクチン原液を得る。ワクチン原液は−８０℃に保存されるとともに、安全性と有効性について検定する。検定に合格したワクチン原液を最終バルクとしてプールする。これをワクチン製剤として、数度の国家検定と自家検定に合格したものが最終製品として販売される。
また、本発明のウイルスは、遺伝子治療用のベクターとしても利用できる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］Ｆ蛋白質の細胞融合能の比較解析
Ｖｅｒｏ細胞継代ＡＩＫ−Ｃ株とその親株であるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株から、Ｆ、Ｈ翻訳領域をそれぞれＰＣＲで増幅し、プラスミドＢＳＳＫ（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．（１９８８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（１５），７５８３−７６００）のＴ７プロモーターの下流に挿入し、Ｆ蛋白質発現プラスミドｐＡＩＫ−Ｆ０１、ＰＥｄｍ−Ｆ、ならびにＨ蛋白質発現プラスミドｐＡＩＫ−Ｈ、ｐＥｄｍ−Ｈを構築した。Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質のアミノ酸配列および該蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号：２および１に、ＡＩＫ−Ｃ株のＦ蛋白質のアミノ酸配列および該蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号：４および３に示す。Ｂ９５ａ細胞にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを感染後、これらの発現プラスミドをコトランスフェクションさせ細胞融合能を検討した。
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表１のように、Ｆ蛋白質、Ｈ蛋白質発現プラスミドの組み合わせを変更して検討した結果、細胞融合能の大小はＦ蛋白に規定されている事が明らかとなった。
細胞融合に及ぼすＦ蛋白質２７８位アミノ酸の影響をさらに確かめるため、ＡＩＫ−Ｃ株を、ｐＡＩＫ−Ｆ０１とｐＥｄｍ−Ｆを用いてさらに実験を行った。上記のように、構築したｐＡＩＫ−Ｆ０１は、既に報告したＭｏｒｉらのＡＩＫ−Ｃの塩基配列（配列番号：３）から想定されるアミノ酸（配列番号：４）と比較して３６２位がＴｙｒ（Ｙ）に変化がみられた。Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株から構築したｐＥｄｍ−ＦはｐＡＩＫ−Ｆ０１と比較して６ヶ所のアミノ酸の差が認められた。この２種のプラスミドを制限酵素Ｂｓｔ１１０７で組み換え、ｐＭＶ−Ｆ−ＳＶＳとｐＭＶ−Ｆ−ＶＦＹを構築した。さらに両プラスミドをＢｓｔ１１０７，Ｐｓｈ  ＡＩで組み換え、ｐＭＶ−Ｆ−ＶＦを構築した。このプラスミドとｐＡＩＫ−Ｆ０１とＳａｌＩで組み換えることでｐＭＶ−Ｆ２７８Ｐｈｅを構築した。
これらのプラスミドをＳａｌＩ，Ｂｓｔ１１０７，ＰｓｈＡＩの制限酵素を利用して、ｐＭＶ−Ｆ−ＶＬを構築した。Ｈ蛋白質発現パートナーとしてｐＡＩＫ−Ｈと各々のプラスミドをコトランスフェクションさせ細胞融合能をみると、２７８位のアミノ酸がＰｈｅであるｐＥｄｍ−Ｆ，ｐＭＶ−Ｆ−ＶＦＹ，ｐＭＶ−Ｆ−ＶＦ，ｐＭＶ−Ｆ−２７８Ｆが大きな細胞融合を示した（図１）。以上の事実から、ＡＩＫ−Ｃ株の細胞融合能が低いことは、Ｆ蛋白質の２７８番目のアミノ酸が規定していることが明らかとなった。つまり野生株のＦ蛋白２７８位はＰｈｅ（Ｆ）で、強い細胞融合能を示す。一方ＡＩＫ−Ｃワクチン株ではこの位置がＬｅｕ（Ｌ）に変異しており、この変異が細胞融合能の低下をもたらし、弱毒化の要因のひとつとなっていると考えられた。
２７８位がＬｅｕであるｐＡＩＫ−Ｆ０１、ＡＩＫ−Ｃ株のＦ蛋白質の２７８位がＰｈｅに変異しているｐＭＶ−Ｆ２７８Ｐｈｅ（図中ではｐＭＶ−Ｆ２７８Ｆで示した）、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＦ蛋白質をコードするｐＥｄｍ−Ｆを発現させた細胞の細胞融合の様子を図２に示した。２７８位がＰｈｅの場合は、細胞融合による顕著なシンシチウム形成が観察されたが、２７８位がＬｅｕの場合（図中ではｐＡＩＫ−Ｆ０１で示した）は、有意に小さいシンシチウムが観察された。
［実施例２］細胞融合能を低下させた麻疹ウイルスの作製
ＡＩＫ−Ｃ株から感染クローン（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ）を構築し、Ｆ蛋白質の変異を導入したｃＤＮＡクローンから感染ウイルス粒子を回収しＶｅｒｏ細胞でプラークアッセイを行った。
麻疹ワクチンＡＩＫ−Ｃ株から全延長のｃＤＮＡを構築した。まずＦ蛋白領域２７８のアミノ酸がＡＩＫ−Ｃ株と同じＬｅｕである感染クローンＭＶＡＫ−Ｆ２７８Ｌｅｕ（実施例１におけるｐＡＩＫ−Ｆ０１のＦ遺伝子を保持）とＦ蛋白質２７８をＰｈｅに変換した感染クローンＭＶＡＫ−Ｆ２７８Ｐｈｅ（実施例１におけるｐＭＶ−Ｆ２７８ＰｈｅのＦ遺伝子を保持）を構築した。これらの感染クローンを、Ｂ９５ａ細胞にＮ，Ｐ，Ｌ発現プラスミドとともにコトランスフェクションし上清を２代培養し感染クローンを回収した。回収したウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ３７℃培養しプラークアッセイを行った。
結果を図３に示す。３３℃では、Ｆ２７８Ｐｈｅを導入したクローンウイルスは大きいプラークを形成し（ＭＶＡＫ−Ｆ２７８Ｐｈｅ）、ワクチン種株と同じＦ２７８Ｌｅｕであるクローンウイルスは小さいプラーク（ＭＶＡＫ−Ｆ２７８Ｌｅｕ）を示した。ＡＩＫ−Ｃワクチンウイルスは３３℃で多くは小さいプラーク（ＡＩＫ−Ｃ３３）であるが、中には大きいプラークを呈するものも存在した。また、これらのウイルスは３９℃ではプラークは観察されなかった。一方、親株のＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株は３３℃（Ｅｄｍ３３）、３９℃（Ｅｄｍ３９）ともに大きいプラークを示した。
産業上の利用の可能性
本発明により、細胞融合能が低下したウイルスを製造するために用いるＤＮＡ、ウイルスのＦ蛋白質の特定の部位に変異を導入してウイルスの細胞融合能を低下させる方法、およびＦ蛋白質の特定の部位の変異により細胞融合能を低下させたウイルスが提供された。本発明により、弱毒化ウイルスを容易に作り出すことができる。これにより、新たに出現してくる新型ウイルスに対する生ワクチンを迅速に開発することが可能になる。
特にモルビリウイルス属には麻疹ウイルスの他、犬ジステンパーウイルス、アザラシジステンパーウイルス、リンダーペストウイルスのような病原ウイルスが多く含まれる。したがって、モルビリウイルス属のウイルスを最小限の変異で弱毒化しうる本発明の方法は、ワクチン開発において大変有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｆ蛋白質の変異体の細胞融合能を測定した結果を示す図である。バーの中に書きこまれた数字とアルファベットは、ｐＡＩＫ−Ｆ０１とｐＥｄｍ−Ｆの塩基配列より推定されたＦ蛋白質のアミノ酸配列間で変異がみられた位置とそのアミノ酸を示す。また、細胞融合能は、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株由来のＦ領域プラスミドｐＥｄｍ−Ｆと同じ水準にあるものを＋＋＋として示した。
図２は、ＡＩＫ−Ｃ株、およびＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株に由来するＦ蛋白質の細胞融合を観察した結果を示す写真である。２７８Ｌｅｕと示したのが２７８位がロイシンとなっている蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した結果である。Ｂ９５Ｍｏｃｋは、ワクシニアウイルス（ｖＴｆ７−３）のみを感染させた場合の結果である。
図３は、ＡＩＫ−Ｃ株から感染クローンを構築し、Ｆ蛋白質の変異を導入したｃＤＮＡクローンから感染ウイルス粒子を回収しＶｅｒｏ細胞でプラークアッセイを行った結果を示す写真である。図中、上段が培養温度３９℃の、下段が培養温度３３℃の結果を示す。
図４は、モルビリウイルス属に属するウイルスのＦ蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果である。２７８位に相同な位置をボックスで示した。上から順に、ＡＩＫ−Ｃ株、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株、犬ジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、アザラシジステンパーウイルス（Ｐｈｏｃｉｄ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、およびリンダーペストウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）のＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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