(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたプロバイオティック株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２， ＤＳＭ １３４３４。
【請求項２】
単離されたプロバイオティック株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ０２Ａ， ＤＳＭ １３４３２。
【請求項３】
チーズの製造における添加物としての使用のための、請求項１または２に記載の株。
【請求項４】
請求項１または２に記載の株を１０６〜１０９ｃｆｕ／ｇの量で含有する乳フード製品。
【請求項５】
＞１０７ｃｆｕ／ｇの量である請求項４に記載の乳フード製品。
【請求項６】
株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２， ＤＳＭ １３４３４を含有することを特徴とする、改善された風味を有する硬質または半硬質チーズである請求項４または５に記載の製品。
【請求項７】
株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ０２Ａ， ＤＳＭ １３４３２を含有することを特徴とする、改善された風味を有する硬質または半硬質チーズである請求項４または５に記載の製品。
【請求項８】
慣用的なヨーグルトカルチャーと混合されて、株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２， ＤＳＭ １３４３４を含有することを特徴とする、ヨーグルトである請求項４または５に記載の製品。
【請求項９】
慣用的なヨーグルトカルチャーと混合されて、株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ０２Ａ， ＤＳＭ １３４３２を含有することを特徴とする、ヨーグルトである請求項４または５に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、発酵乳製品、特にプロバイオティックチーズ（probiotic cheese）の製造のために使用され得るラクトバチルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei）の新規株に言及する。
【０００２】
発明の背景
スウェーデンのチーズは、乳酸菌のスターターカルチャー（starter culture）によって発酵された低温殺菌牛乳（pasteurised cows milk）から製造される。酸性化されたミルクは、レンネット（キモシン）によって凝固され、そして凝固されたミルクは、切断されそして撹拌される。ホエーおよびチーズグレイン（cheese grains）の混合物は、徐々に加熱される。ホエーは分離され、そしてチーズグレインは、チーズへと圧縮されて、これは加塩（salted）されそして熟成される；ホエー分離および圧縮の順序（order）は、チーズの種類に依存する。熟成の間、主に乳酸菌の二次フローラ（secondary flora）が自然に増殖する。
【０００３】
スウェーデンの硬質および半硬質チーズは、熟成の間、自然に増殖する二次ミクロフローラ（secondary microflora）［しばしば、非スターター乳酸菌（non-starter lactic acid bacteria）、ＮＳＬＡＢと呼ばれる］によって支配される。この自発的フローラ（spontaneous flora）は、添加されたスターターカルチャーに続き、そしてチーズを熟成させる選択的条件下で増殖する。ＮＳＬＡＢは、低温殺菌に耐えた後に生乳と共に、あるいはチーズ製造のために使用される他の成分と共に、酪農プラント（dairy plant）へ入ると考えられる。スウェーデンおよびノルウェーのチーズに最も一般的に見られるＮＳＬＡＢは、Lactobacillus属そして特にLactobacillus paracasei種に属する。Lindberg, A. -M.ら, Bacterial flora of Norwegian and Swedish semi-hard cheese after ripening, with special reference to Lactobacillus, Netherlands Milk & Dairy Journal 50 (1996) 563-572を参照のこと。ＮＳＬＡＢは、熟成の数日後に増殖し始め、そして熟成の１ヶ月後に約１０6〜１０7ｃｆｕ／ｇのレベルに達し、そしてこのレベルは少なくとも５ヶ月間維持される。チェダーチーズは、乳酸桿菌（lactobacilli）によって支配されるＮＳＬＡＢの同一の発達を示す。チェダーから報告される種の例は、Lactobacillus casei、Lactobacillus plantarumおよびLactobacillus brevisであるが、通常、優勢種（dominating species）は、Lactobacillus caseiまたはLactobacillus paracaseiである。ＮＳＬＡＢが制御されないので、ある程度のチーズ品質のバリエーションがＮＳＬＡＢの組成の変動（variability）に起因することは、もっともらしい。熟成のプロセスおよびＮＳＬＡＢの自然発生的フローラ（spontaneous flora）の増殖を制御するために、例えばLactobacillusの株の純粋なカルチャーが、チーズ製造における添加物として使用された。この添加物は、一般的に、チーズ製品の香り（aroma）および風味（flavour）に対して効果［；該効果は予測可能でなく、そして試行錯誤によって試験されなければならない］を有する。
【０００４】
乳製品中のプロバイオティック微生物は、この十年間、熱心な研究についての対象であった。プロバイオティック生物（例えば、LactobacillusおよびBifidobacterium種）を含む乳製品の潜在的健康促進効果は、上記研究を刺激した。プロバイオティック細菌は、消化時にある数において健康利益を奏する、“その微生物バランスを改善することによって宿主動物に有益な影響を与える、生きている微生物フィードサプリメント（a live microbial feed supplement which beneficially affects the host animal by improving its microbial balance）"として記載される（Fuller, R., Probiotics in man and animal, Journal of applied Bacteriology, 66 (1989) 365-378）。機能的プロバイオティックスの選択についての望ましい特徴が、Klaenhammer, T. R. ら, Selection and design of probiotics, International Journal of Food Microbiology 50 (1999) 45-47によって、要約および記載されている。選択基準は、４つの基本的カテゴリー、即ち、無毒性のような適切性（appropriateness）、バイアビリティーのような技術的適性（technological suitability）、腸内で生き残る能力である競合性（competiveness）、性能（performance）および機能性（functionality）に分けられると言われている。これらの基準がインビボで機能性に影響を与える機構を理解することは、将来における主な課題を示すだろう。
【０００５】
先行技術
以前の研究は、ビフィズス菌（bifidobacteria）および多数のプロバイオティックLactobacillus株が、硬質チーズ（例えば、チェダーチーズおよびゴーダチーズ）中で十分に生き残り得ることを実証した。
【０００６】
Gomes, A. M.ら, Incorporation and survival of Bifidobacterium sp. strain Bo and Lactobacillus acidophilus strain Ki in a cheese product, Netherlands Milk & Dairy Journal 49 (1995) 71-95は、スターターとしてビフィズス菌（Bifidobacterium）の株およびL. acidophilusの株の組み合わせを使用してのプロバイオティックゴーダチーズの製造を開示している。両種とも比較的十分に生き残るが、官能特性（sensory properties）は悪影響を受けることが見出された。
【０００７】
Dinkarら, Growth and viability of Bifodobacterium bifidum in Cheddar cheese, J Dairy Sci 77:2854-2864, 1994は、チェダーへのBifidobacterium bifidumの混合を開示している。チーズ製造の後期（例えば、ミリング（milling）または加塩（salting））に該菌を添加物（adjunct）として添加すると、熟成６ヶ月後にチーズの品質に対する悪影響なしに良好なバイアビリティー（viability）（１０7ｃｆｕ／ｇ）が得られた。この研究に続いて、熟成の８ヶ月の期間にわたってチェダーにおいて研究された、多数のプロバイオティックLactobacillus株、L. salivariusおよびL. paracaseiの性能である、試行が行なわれた；Gardinerら, Development of a probiotic Cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains, Applied and Environmental Microbiology, 292-2199, June 1998。プロバイオティックL. paracasei株は、チーズ中で多数へと増殖しそして官能特性ではなく蛋白質分解に影響を与えたので、添加物として特に好適であると結論付けられた。
【０００８】
発明の説明
本発明は、チーズの製造において添加物として使用され得るLactobacillus paracaseiの新規のプロバイオティック株に言及し、該株は、チーズにおける有利な生存特性（survival properties）および良好な風味をチーズに与える能力を有する。
【０００９】
本発明は、特に、乳製品におけるプロバイオティックスとして使用され得、そしてチーズの製造において添加物（adjunct）として使用される場合、胃腸管で生き延び（surviving）そして味の良いチーズ製品を提供することを特徴とする、Lactobacillus paracaseiの株に言及する。
【００１０】
好ましい局面によれば、本発明は、株Lactobacillus paracasei 8700:2［これは、２０００年４月１０日に、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙに寄託され、そして受託番号ＤＳＭ １３４３４が与えられた］またはその変異株に言及する。図１は、この株のＲＥＡ−プロフィール、即ち、制限酵素Ｈｉｎｄ III（レーンＣ）、Ｃｌａ Ｉ（レーンＢ）およびＥｃｏ ＲＩ（レーンＡ）で切断した後の全染色体ＤＮＡから得られた制限エンドヌクレアーゼ分析プロフィール（Restriction Endonuclease Analysis profile）を示す。ＳＴＤは、Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ（Life Technologies）およびＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＶＩ（Rouche Molecular Biochemicals, Boehringer Mannheim）の組み合わせである、サイズマーカー（size marker）を示す。
【００１１】
別の好ましい局面によれば、本発明は、株Lactobacillus paracasei 02A［これは、２０００年４月１０日に、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙに寄託され、そして受託番号ＤＳＭ １３４３２が与えられた］またはその変異株に言及する。図２は、この株のＲＥＡ−プロフィール、即ち、制限酵素Ｈｉｎｄ III（レーンＣ）、Ｃｌａ Ｉ（レーンＢ）およびＥｃｏ ＲＩ（レーンＡ）で切断した後の全染色体ＤＮＡから得られた制限エンドヌクレアーゼ分析プロフィールを示す。ＳＴＤは、Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ（Life Technologies）およびＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＶＩ（Rouche Molecular Biochemicals, Boehringer Mannheim）の組み合わせである、サイズマーカーを示す。
【００１２】
ＲＥＡ−分析は、Johanssonら, International Journal of Systematic Bacteriology (1995) 10, 670-675に従って行った。
【００１３】
図３は、株０２Ａ（レーン２）および株８７００：２（レーン３）のＲＡＰＤ−プロフィールを示す。レーン１および４は、ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＶＩ（Rouche Molecular Biochemicals, Boehringer Mannheim）である。ＲＡＰＤ−分析は、以下の「材料および方法」に記載のように行なった。
【００１４】
本発明の新規株は、発酵乳製品、ヨーグルトおよびアイスクリーム、スプレッド（spread）、フレッシュチーズ（fresh cheese）、硬質および半硬質チーズ（カーフ−レンネット（calf-rennet）を用いて製造されそして脂肪含有量５〜５０％を含む）、ソフトチーズ、ならびにカルゲ（quarge）およびカルゲベース製品（脂肪含有量０．１〜４０％を含む）、ならびに発酵ドレッシング（fermented dressing）有りまたは無しのケソ（keso）あるいはカード（curd）中の生菌のような、任意の乳フード製品（dairy food product）におけるプロバイオティックとして使用され得る。
【００１５】
本発明に従う株の好ましい使用は、チーズの製造における添加物（adjunct）としてである。
【００１６】
本発明はまた、本発明の新規株の１以上を含有する乳フード製品に言及する。フード製品中のプロバイオティック株の含有量は、１０6〜１０9ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０7ｃｆｕ／ｇ超であるべきである。
【００１７】
好ましい局面によれば、本発明は、株Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434を含有する、改善された風味（flavour）を有する硬質または半硬質チーズ；あるいは、株Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432を含有する、改善された風味を有する硬質または半硬質チーズを言及する。
【００１８】
別の局面によれば、本発明はまた、慣用のヨーグルトカルチャー（cultures）と混合されて、株Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434、またはLactobacillus paracasei 02A, DSM 13432を含有するヨーグルトを言及する。
【００１９】
実施例
チーズモデルにおけるプロバイオティック株のスクリーニングテスト
腸起源の１５の異なるLactobacillus株（Lactobacillus rhamnosus １１株、Lactobacillus paracasei ３株、およびLactobacillus plantarum １株）を、チーズ中で増殖しそして生き延びる能力、およびチーズ風味に対する影響をモニターする、チーズモデルにおけるスクリーニング試験において、テストした。該異なる株は、Molin, G.ら, Numerical taxonomy of Lactobacillus spp. associated with healthy and diseased mucosa of the human intestines, Journal of Applied Bacteriology 74 (1993) 314-323に記載の方法を使用して、ヒト腸から得た。
【００２０】
このテストの結果として、該株のうちの４つを、更なる研究のために選択した；該株を以下の表１に示す。
【００２１】
【表１】
0004789396.tif 000002
【００２２】
３０＋ラウンド−アイド（round-eyed）チーズにおけるプロバイオティック株のスクリーニングテスト
この研究は、乾物中（in dry matter）少なくとも３０％脂肪を含むラウンド−アイド（round-eyed）チーズ中の添加物としての、３株のLactobacillus paracaseiおよび１つのLactobacillus plantarum株（全てヒト腸粘膜から単離した）の性能（performance）を調べる。
【００２３】
該テスト株は上記の表１に示される。
【００２４】
材料および方法
チーズ製造
チーズを、低温殺菌した（pasteurised）（７３℃、１５秒）牛乳（Skanemejerier, Horby, Sweden）から、標準プロトコルに従って、４００ ｌ バット（vat）中で製造した。製造したチーズは、乾物中３０％脂肪を含む半硬質ラウンド−アイド（round-eyed）であった。チーズミルク（cheese milk）に、テスト株１０6ｃｆｕ／ｍｌを接種した。解凍された凍結バッファーからの、乳酸スターターカルチャーの接種（３０分）後、該テスト株を該ミルクに添加した。各バッチは約１０ｋｇの４つのチーズを製造し、その中から、３つを１２℃で熟成させ、そして１つを初めは１６℃で１４日間そしてその後１２℃で熟成させた。チーズをプラスチック箔において熟成させた。チーズ製造を４重で行った。４つのバッチを各週製造した（異なる添加物を含む３バッチ、および添加物を含まない１コントロールバッチ）。製造順序は、各週についてランダムにした。総計２２バッチを製造した（６コントロールバッチ、および４添加物カルチャーの各々を含む４バッチ）。
【００２５】
チーズ分析
異なる添加物を用いて製造した２つの別個のバッチおよび２つのコントロールバッチを、熟成５ヶ月後にサンプル化した（各バッチから１チーズ）。残りの４コントロールバッチおよび異なる添加物を含む２重バッチを、熟成６ヶ月後にサンプル化した（異なる開始温度で熟成した各バッチから２チーズ）。チーズを、官能特性（sensory properties）、微生物学的特性、および物理化学的特性についてサンプル化した。
【００２６】
チーズの微生物学的サンプリング
１０ｇのサンプルを、チーズの中央から無菌で回収し、そして２．５分間Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（Seward Medical Limited, London SE1 1PP, UK）において２％クエン酸ナトリウム溶液９０ｍｌでホモジナイズした。慣用的な希釈およびプレーティング（plating）後、全好気性および嫌気性生存カウント（viable counts）を、４日間２８℃でインキュベートしたＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（ＢＨＩ；Difco, Sparks, USA）上で行なった。Lactobacilliの生存カウントを、４日間２８℃で嫌気的にインキュベートしたＲｏｇｏｓａ寒天（Merck, Darmstadt, Germany）上で分析した。
【００２７】
チーズからの微生物の単離
７コロニーを、各サンプルからランダムに選んだ。２つを全生存カウント（ＢＨＩ寒天）から、そして３つをLactobacilliの選択的生存カウント（Ｒｏｇｏｓａ寒天）から選んだ。２０コロニー以上を含むカウント可能なプレートを使用した。
【００２８】
微生物学的分析
ＲＥＡ−分析
染色体ＤＮＡを、Johanssonら, 1995のプロトコル（上記を参照のこと）に従って、制限エンドヌクレアーゼ分析（Restriction Endonuclease Analysis）（ＲＥＡ）のために調製した。染色体ＤＮＡを、共有結合的に閉環された環状プラスミドＤＮＡ（プラスミドＤＮＡの大半）から、臭化エチジウムを含むＣｓＣｌ勾配中、色素浮遊密度遠心（dye buoyant densisty centrifugation）によって、分離した。プラスミドＤＮＡの線状および開環状形態のいくらかは、依然として、調製物中に存在し得るが、最終結果に僅かに寄与するのみである。染色体ＤＮＡの濃度を、蛍光計（Model TKO 100, Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA）においてモニターした。ＤＮＡ（０．７５ｍｇ）を、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ、ＣＬＡＩまたはＥＣＯＲＩ（Boehringer）で、４時間、３７℃で別々に消化させた。ゲルの電気泳動およびスキャンニングを、Johanssonらによって記載されるように行なった。１５０〜２３５ｍｍのサイズの水に浸した水平の（submerged horizontal）０．９％アガローススラブゲル（agarose slab gels）を使用した。０．２ｍｇ量の高分子量ＤＮＡマーカー（８．５〜４８．５ｋｂの分子量のＤＮＡフラグメントを含む）（Bethesda Research Laboratories, BRL）および０．５ｍｇのＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（０．２〜２．２ｋｂの分子量のＤＮＡフラグメントを含む）（Boehringer Mannheim）を、基準として使用した。ゲルを、８．５℃で１８時間、４０Ｖの一定電圧でランした。緩衝液を、ラン期間の間、再循環させた。その後、ゲルを、臭化エチジウム（２ｍｇ／ｍｌ）中で２０分間染色させ、蒸留水中に供せられ（destined）、ＵＶトランスルミネーター（UVP Inc., SanGabriel, USA）を用いて３０２ｎｍで可視化し、そして撮影した。ゲル電気泳動をランするこの方法は、十分に分散されそして比較的十分に分離されたバンド（約１．８ｋｂの分子量に至るまで）を与える。フォトネガティブ（photonegatives）上のＲＥＡ−パターンを、２００ｄｐｉの解像度の平台型スキャナーを備えるコンピュータへスキャンした。ゲル画像を、次いで、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓフォーマット（Applied Maths, Kortrijk, Belgium）に変換した。標準化とゲルの全ての更なる分析を、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ １．０において行なった。ゲルトレース（gel traces）を、ピアソンの積率相関係数（Pearson product moment correlation coefficient）および群平均法（the unweighted pair group method by arithmetic averages）（ＵＰＧＭＡ）で分析した。３切断物（即ち、ＨＩＮＤ ＩＩＩ、ＣＬＡ ＩおよびＥｃｏ ＲＩによる）からのデータを、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ １．０を使用して、各株について組み合わせた。
【００２９】
ＲＡＰＤ−分析
全ての分離株を、ランダム増幅多型ＤＮＡ（Randomly Amplified Polymorphic DNA）、即ちＲＡＰＤの方法によって型決定した（typed）（Quednauら， 1998, Current Microbiology, 36, 332-336）。粗細胞抽出物を、ＢＨＩ寒天プレートからの分離株について１ｍｌ ＢＨＩ中、そしてＲｏｇｏｓａ寒天プレートからの分離株について１ｍｌ Lactobacillus含有培地（Lactobacillus carrying medium）（ＬＣＭ）中、２８℃でインキュベートした一晩培養物から調製した。純粋な培養物の細胞を、１ｍｌ滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Millipore S. A., Molsheim, France）中で２回洗浄し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｘｅｒ（5432; Eppendorf, Hamburg, Germany）を使用して、２ｍｍ直径のガラスビーズを含むエッペンドルフチューブ中において破砕した。使用したプライマーは、１５ｍＭの反応混合物中濃度の配列５’−ＡＣＧＣＧＣＣＣＴ−３’を有した。Lactobacillus plantarumについてそうであると以前に証明されていたように（Johansson, M. L.ら， Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for typing of Lactobacillus plantarum strains, Letters in Applied Microbiology, 21 (1995) 155-159）、ＲＡＰＤ−手順は、現在型決定されたLactobacilliについてのゲル上に好適な数の別個のバンドを生じさせた。
【００３０】
ゲルのバンドパターンを、Ｇｅｌ ＣｏｍｐａｒTM４．２（Applied Maths, Kortrijk, Belgium）を使用することによって、ピアソンの積率相関係数（Pearson product moment correlation coefficient）（登録商標）および群平均法（the unweighted pair group method by arithmetic average）（ＵＰＧＭＡ；Romesburg, 1984）で分析した。ＲＡＰＤ−パターンのコンピュータ処理クラスター分析（computeried cluster analysis）を、可視的比較と組み合わせた。
【００３１】
官能評価（sensory assessment）
チーズは、５ヶ月後、７採点者（６専門採点者およびルンド大学食品技術部のスタッフ１メンバー）によって、特質（attributes）の数、（以下の品質：表面（surface）、香り（smell）、初期テクスチャ（initial texture）、二次テクスチャ（secondary texture）、風味（flavour）、および以下の強度：香り、風味、悪臭（off-flavour））ならびに全体的品質を考慮して、嗜好尺度（hedonic scale）（分析後０−１０スケールに翻訳された）について採点された。６ヶ月後、チーズは、４専門採点者によって、表面−、テクスチャ−、香り−、風味−および全体的−品質ならびに１１の関連する特質（attributes）の強度を考慮して、嗜好尺度について採点された。チーズを１６℃へ和らげ、そして任意の３アラビア数でマークしそして任意の順で利用した。
【００３２】
結果
チーズ製造
製造中のチーズのｐＨは、全てのテストグループにおいて類似であった。チーズの組成は、このスケールでチーズを製造することにおける困難性に起因して、テストグループ間で予想されるように変化した。
【００３３】
チーズの微生物学的分析
熟成の５ヶ月後にサンプル化したチーズにおいて、添加物を用いて製造されたチーズは、参照チーズよりも約１Ｌｇ ｃｆｕ／ｇ高い生存カウントを有した。値を以下の表２に与える。
【００３４】
【表２】
0004789396.tif 000003
【００３５】
熟成の５ヶ月後にサンプル化したチーズの全てからの分離株（１０チーズ、７０分離株）は、１２の異なるＲＡＰＤ−タイプに分類された。コントロールチーズからの分離株は７の異なるＲＡＰＤ−タイプへ分類され、一方、添加物０４Ｃを用いて製造されたチーズからの分離株は５の異なるＲＡＰＤ−タイプであり、そして添加物０２Ａを用いて製造されたチーズからの分離株は４の異なるＲＡＰＤ−タイプであった。添加物８７００：２および８５８９：２を用いて製造されたチーズからの分離株は、それぞれ、３の異なるＲＡＰＤ−タイプであった。全てのチーズは、共通の１つのＲＡＰＤ−タイプの分離株を有した。
【００３６】
使用された添加物カルチャー（adjunct cultures）の全てが、熟成５ヶ月後に、チーズの対応の２重サンプルにおいて見られた。添加物カルチャー０４Ｃ、８５８９：２および０２Ａを、Lactobacillus−選択的寒天のみから再分離した（０４Ｃ：６分離株から２つ；  ８５８９：２：６分離株から３つ；  ０２Ａ  ６分離株から４つ）。１コントロールチーズにおいて、０４Ｃと同一のＲＡＰＤ−タイプの１分離株が見られ、そして他のコントロールチーズにおいて、０２Ａと同一のＲＡＰＤ−タイプの１分離株が見られた。添加物８７００：２を、全カウント寒天（８分離株から２つ）およびLactobacillus−選択的寒天（６分離株から６つ）から再分離した。
【００３７】
熟成６ヶ月後にサンプル化されたチーズにおいて、全テストグループについての全生存カウントは、１２℃で熟成されたチーズにおいて類似であった（８、０−８、４Ｌｇ（ｃｆｕ／ｇチーズ））。最初１６℃で熟成されたチーズにおいて、全生存カウントは、一般的に、１２℃で熟成されたチーズにおいてよりも、特にコントロールチーズにおいて、より低かった（７、４−７、５Ｌｇ（ｃｆｕ／ｇチーズ））。１２℃で熟成されたチーズにおけLactobacilliの選択的カウントは、一般的に、添加物を用いて製造されたチーズにおいて（７、６−７、８Ｌｇ（ｃｆｕ／ｇチーズ））、コントロールにおいて（７、３Ｌｇ（ｃｆｕ／ｇチーズ））よりも高かった。熟成６ヶ月後のlactobacilliの選択的カウントは、増加された初期熟成温度によって影響されなかった。
【００３８】
官能評価
熟成の５ヶ月後、コントロールチーズは、添加物を用いて製造したチーズと比較して、テクスチャ（初期および二次）について有意に低いスコアを有した。表面は、コントロールおよび添加物８７００：２を用いて製造したチーズにおいて、添加物８５８９：２および０２Ａを用いて製造したチーズと比較して、有意に低いスコアを有した。添加物８７００：２および０２Ａを用いて製造したチーズは、コントロールチーズと比較して、風味品質および全体的品質について有意により高いスコアを有した。添加物カルチャーで製造されたチーズの中でも、８７００：２を用いて製造されたチーズは、全体的品質について最高のスコアおよび悪臭強度について最低のスコアを有した。０２Ａを用いて製造されたチーズは、風味品質および強度について最高のスコアを有した。全ての分析されたチーズは、香りの品質および強度について非常に類似したスコアを受けた（データは示さない）。
【００３９】
以下の表３において、各テストグループの２バッチからの１チーズについての、製造の間のｐＨ、乾物中（in dry matter）の脂肪および非脂肪固形分中の湿気（平均±標準偏差）が示される。官能評価についてのスケールは、１＝悪い品質、低い強度；  １０＝良好な品質、高い強度；  平均±標準偏差である。
【００４０】
熟成の６ヶ月後、有意な差異は、異なるテストグループ由来のチーズ間で、見られなかった。にもかかわらず、見られた主な動向は、増加された初期熟成温度が、テクスチャ品質および改善された風味を、特に添加物を用いて製造されたチーズについて減少させたことであった。
【００４１】
【表３】
0004789396.tif 000004
【００４２】
プロバイオティック特性のテスト
また、チーズ中に送達された場合に腸管（intestinal passage）を生き延びる株の能力を、制御し、そして自然に増殖する第２ミクロフローラ（microflora）と比較する。
【００４３】
投与研究
経口投与
株０２Ａおよび８７００：２を接種したチーズを、投与研究のために選択した。この選択は、接種されたチーズの優れた風味、および熟成の間にチーズにおいて増殖しそして生き延びるテスト株能力に基づいた。カルチャーは、１０7ｃｆｕ／ｇチーズ以上で、チーズ中に存在した。経口投与のためのボランティアを、無作為に３グループに分割した：１）添加された添加物を含まないコントロールチーズを消費した、２）８７００：２が接種されたチーズを消費した、および３）０２Ａを接種されたチーズを消費した。グループ１は８ボランティアからなり（４３〜５１才の４男性および４女性）、グループ２は１０ボランティアからなり（２５〜５５才の５男性および５女性）、そしてグループ３は１１ボランティアからなった（２６〜６０才の６男性および５女性）。研究は５週間続けられた。第３〜４週の間、１５０ｇのチーズを毎日投与し、これは＞０．５・１０9ｃｆｕのテスト株の一日用量に対応する。研究の間、人は、プロバイオティック細菌または抗生物質を含有する製品を食することが禁止された。糞便サンプルを、投与開始前（第２週）、投与の２週間後（第４週）、および投与終了後の１週間（第５週）に回収した。
【００４４】
糞便からの微生物の単離
糞便の慣用的な希釈およびプレート（plating）後、lactobacilliの生存カウントを、３日間３７℃で嫌気的にインキュベートしたＲｏｇｏｓａ寒天上で分析した。３コロニーを、型決めのために各サンプルから無作為に採取した。２０コロニー以上を含むカウント可能なプレートを使用した。
【００４５】
分離株の型決め（typing）
ランダム増幅多型ＤＮＡ（Randomly Amplified Polymorphic DNA）（ＲＡＰＤ；Quednauら, 1998, 前出）の方法によって全ての分離株を型決めした。
【００４６】
再分離
添加物を用いて製造されたチーズ由来の分離株のＲＡＰＤパターンを、添加物および参照チーズ由来の分離株のＲＡＰＤパターンと比較した。添加物を含むチーズ由来の分離株が添加物と同一のＲＡＰＤ−タイプである場合、添加物は再分離されたと考えられた。
【００４７】
各人からの糞便由来の分離株からのＲＡＰＤ−パターンを、添加物、この添加物を用いて製造されたチーズ由来の分離株および参照チーズ由来の分離株のＲＡＰＤ−パターンと比較した。添加物と同一のＲＡＰＤ−タイプの分離株が、チーズの投与後であって投与前ではない糞便中に見られる場合、添加物は腸管を生き延びたと結論付けられた。また、添加物と同一のＲＡＰＤ−タイプの分離株が、チーズ投与後１週間後であって投与前ではない糞便中に見られる場合、添加物はヒト腸（bowel）にコロニー形成したと結論付けられた。
【００４８】
統計分析
生存カウントおよび官能スコアの変動および有意差の分析を、ｔ−分布（t-distribution）を使用して信頼区間（confidence intervals）を計算することによって行なった。３サンプリング時間での糞便中の生存カウントの有意差の統計評価を、ＳＰＳＳ６．０（SPSS inc., Chicago, USA）を使用してＷｉｌｃｏｘｏｎランクサムテスト（Wilcoxon rank sum test）で行なった。
【００４９】
経口投与の結果
株０２Ａが、投与終了直後、１１ボランティア中６の糞便中に見られた。株８７００：２についての対応の数は、１０ボランティア中１０であった。０２Ａまたは８７００：２はいずれも、投与終了後１週間、これら２グループにおけるボランティアのどの糞便中にも見られなかった。コントロールチーズにおいてまたは添加物を用いて製造されたチーズにおいて自然に生じるＲＡＰＤ−タイプはいずれも、ボランティアの糞便中に見られなかった。しかし、０２Ａと同一のＲＡＰＤ−タイプの分離株が、投与終了直後に、コントロールチーズを投与された２ボランティアの糞便中に見られた。また、０４Ｃと同一のＲＡＰＤ−タイプの分離株が、投与終了後の１週間、２ボランティアの糞便中に見られた。これらの２ボランティアに、コントロールチーズまたは添加物０２Ａを用いて製造されたチーズを投与した。糞便中のLactobacilliの生存カウントは、チーズ消費後、全てのグループにおいて増加した。増加は、添加物カルチャーを含有するチーズを食したグループについて、統計的に有意であった。投与終了後、Lactobacilliの生存カウントは、添加物カルチャーを含有するチーズを食したグループについて減少し、グループ３について有意、一方、そしてそれは、コントロールチーズを食したグループについて増加した。
【００５０】
以下の表４は、研究における３つのグループについてのLactobacilliの選択的カウント（selective count）を示す。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
結論
上記の実験は、２つの株、Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434、およびLactobacillus paracasei 02A, DSM 13432がチーズ製造のための添加物カルチャーとして十分に機能しそして熟成５ヶ月後にチーズから再分離され得ることを示した。該株はまた、官能特性に対して良い影響を有し、このことは、それらは自然に増殖する二次ミクロフローラ（microflora）に優勢であったことを意味する。
【００５３】
投与研究は、該２株が、胃腸管を生き延びる際の競争の要求を満たし、そして従って潜在的プロバイオティック株についての選択基準を満たすようであることを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、株Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434のＲＥＡ−プロフィールの画像である。
【図２】  図２は、株Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432のＲＥＡ−プロフィールの画像である。
【図３】  図３は、２つの株L. paracasei 8700:2および02AのＲＡＰＤ−プロフィールの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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