(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ｉ）で表される化合物またはその塩。
【化１】
0004847014.tif 000024
［式中：
Ｒ１−Ｒ１０は、各々独立して、水素、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールアシル、シクロアルキルアシルおよびＣ−１結合糖からなる群より選択され、前記Ｃ−１結合糖はグルコース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノースおよびガラクトースからなる群から選択され、
ＸはＯＲ８またはＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ１１およびＲ１２は、水素である］
【請求項２】
式（ｉ）で表される化合物またはその塩。
【化２】
0004847014.tif 000025
［式中：
Ｒ３−Ｒ５はメチル、エチルまたはプロピルであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６−Ｒ１０は、各々独立して、水素、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキルおよびＣ−１結合糖からなる群より選択され、前記Ｃ−１結合糖はグルコース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノースおよびガラクトースからなる群から選択され、
ＸはＯＲ８またはＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ１１およびＲ１２は、水素である］
【請求項３】
式（ｉ）で表される化合物またはその塩。
【化３】
0004847014.tif 000026
［式中：
Ｒ１およびＲ２は水素であり、
Ｒ３−Ｒ５は、メチルであり、
Ｒ６−Ｒ７は水素であり、
ＸはＯＲ８であり、
Ｒ８は水素、メチル、エチルまたはプロピルであり、
Ｒ１１およびＲ１２は、水素である］
【請求項４】
Ｒ８が水素、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ−１結合糖からなる群から選択され、前記Ｃ−１結合糖はグルコース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノースおよびガラクトースからなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物または塩。
【請求項５】
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、フェニルおよびベンジルからなる群より選択されるところの、請求項１、２および４のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項６】
Ｒ１−Ｒ７が、各々、独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピルメチル、シクロプロピルエチル、シクロブチルメチル、シクロブチルエチル、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、フェニル、ベンジル、アセチルおよびＣ−１結合糖からなる群から選択され、前記Ｃ−１結合糖はグルコース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノースおよびガラクトースからなる群から選択される、請求項１、４および５のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項７】
前記Ｃ−１結合糖がＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の任意の位置でアセタール結合またはＲ８でエステル結合またはＲ９もしくはＲ１０位でアミド結合を形成している、請求項１、２および４〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２が両方とも水素であるところの、請求項１、２および４〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項９】
Ｒ３がメチルであるところの、請求項１、２および４〜８のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１０】
Ｒ３−Ｒ５の少なくとも一つがメチル、エチルまたはプロピルであるところの、請求項１、２および４〜９のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１１】
Ｒ３−Ｒ５の少なくとも一つがメチルであるところの、請求項１０記載の化合物または塩。
【請求項１２】
Ｒ３−Ｒ５の少なくとも２つがメチル、エチルまたはプロピルであるところの、請求項１０記載の化合物または塩。
【請求項１３】
Ｒ３−Ｒ５の少なくとも２つがメチルであるところの、請求項１２記載の化合物または塩。
【請求項１４】
Ｒ３−Ｒ５のすべてがメチル、エチルまたはプロピルであるところの、請求項１２記載の化合物または塩。
【請求項１５】
Ｒ３−Ｒ５のすべてがメチルであるところの、請求項１４記載の化合物または塩。
【請求項１６】
Ｒ６およびＲ７が両方とも水素であるところの、請求項１、２および４〜１５のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１７】
ＸがＯＲ８であり、Ｒ８が水素、メチル、エチルおよびプロピルからなる群より選択されるところの、請求項１、２および４〜１６のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１８】
Ｒ８がメチルであるところの、請求項１７記載の化合物または塩。
【請求項１９】
ＸがＮＲ９Ｒ１０であり、ここで、Ｒ９およびＲ１０は両方とも水素またはメチルであるか；またはＲ９およびＲ１０は異なるが、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも一方が水素であり、他方がＣ１−６アルキルであるところの、請求項１、２および４〜１６のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項２０】
Ｃ１−６アルキルがメチル、エチルまたはプロピルであるところの、請求項１９記載の化合物または塩。
【請求項２１】
式（ｉｉ）で表される化合物またはその塩。
【化４】
0004847014.tif 000027
【請求項２２】
下記の式で表される化合物またはその塩。
【化５】
0004847014.tif 000028
【請求項２３】
式（ｉｉ）で表される化合物を医薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物。
【化６】
0004847014.tif 000029
【請求項２４】
癌または癌性状態を治療するための医薬組成物であって、治療的に有効量の式（ｉｉ）で表される化合物を含む医薬組成物。
【化７】
0004847014.tif 000030
【請求項２５】
癌または癌性状態が、白血病、肉腫、乳癌、結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、中皮腫、骨髄腫、食道／口腔癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮頸癌、骨肉腫、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、肝癌および腸癌および胃癌、腫瘍および黒色種からなる群より選択されるところの、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
細胞増殖過多に付随する病態または状態を治療するための医薬組成物であって、治療的に有効量の下記式（ｉｉ）で表される化合物を含む医薬組成物。
【化８】
0004847014.tif 000031
【請求項２７】
病態または状態が、アテローム性動脈硬化症、再発狭窄症、関節リウマチ、骨関節症、炎症性関節炎、乾癬、歯周病およびウイルスにより誘発される細胞増殖過多からなる群より選択されるところの、請求項２６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、シクロペンタベンゾフランコアを有する化合物に関する。より詳細には、本発明は６−オキシ位置で嵩高い置換基を有するシクロペンタベンゾフラン化合物、たとえばシクロペンタベンゾフランコアがジオキサニルオキシ基により置換されているものに関する。本発明はさらに療法におけるこれらの化合物の使用および前記化合物を含む組成物にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ａｇｌａｉａは、インド−マレーシアおよび西太平洋領域における１００を越える（ほとんどは大木）種を含むセンダン（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）科の大きな属である。用途としては、熱、骨折、出産および炎症の治療が挙げられる。抽出物はさらに、殺菌剤、殺虫剤、香水、収斂剤、強壮剤、清涼剤として（Dr Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Databases）および腹部腫瘍の治療のために（Pannel,ら、1992, Kew Bull., （16）273-283）用いられる。
最近、多くの１Ｈ−シクロペンタ［ｂ］ベンゾフランリグナンがＡｇｌａｉａ種から単離されている（たとえば、ＷＯ９７／０８１６１；ＪＰ９７１７１３５６；Ohse,ら、J Nat Prod, 1996, 59（7）：650-52；Leeら、Chem. Biol. Interact., 1998, 115（3）：215-28；Wuら、J. Natl. Prod., 1997, 60（6）：606-08；Bohnenstengelら、Z. Naturforsch., 1999, 54c （12）：55-60およびBohnenstengelら、Z. Naturforsch., 1999, 54c （12）：55-60およびBohnenstengelら、Z. Naturforsch, 1999, 54c （12）：1075-83, Xu, Y. J.ら、2000, J. Nat. Prod., 63, 4732-76（これらの内容をすべて出典明示により本発明の一部とする）参照）。これらの化合物の多くは、その殺虫活性に関して注目されている（Janprasert,ら、1993, Phytochemistry, 32 （1）, 67-69；Ishibashiら、1993, Phytochemistry, 32 （2）, 307-310；Hiort,ら、1999, J. Nat. Prod., 62 （12）, 1632-1635）。密接に関連したコア構造を有する殺虫化合物はAglaia roxburghianaから単離され、ＷＯ９６０４２８４において農薬における活性成分としての使用に関して記載されている。
【０００３】
新規化合物（本明細書に記載の化合物ＡおよびＢ）は、珍しくシクロペンタ［ｂ］ベンゾフランコアの８−位にジオキサニルオキシ基を有するAglaia leptantha、Miq.（Meliaceae）から単離されている。化合物ＡおよびＢは癌細胞増殖および生存力に対する潜在的な細胞毒性および細胞増殖抑制作用を示すことが証明されており、従って本発明の化合物は癌および癌性状態または細胞増殖過多に関連する他の病気の治療において治療薬として有用である。
【０００４】
本明細書および請求の範囲全体を通して、前後関係から他の方法が必要とされない限り、「含む」なる語、およびその語尾変化は記載されている整数または段階または整数または段階の群を含むが、他の整数または段階あるいは整数または段階の群は含まないことを意味する。
第一の態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物またはその塩またはプロドラッグに関する。
【０００５】
【化１】
0004847014.tif 000002
【０００６】
Ｒ4−Ｒ10は、各々独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいシクロアルキルアルキル、置換されていてもよいアリールアシル、置換されていてもよいシクロアルキルアシルおよびＣ−１結合糖からなる群から選択される；
ＸはＯＲ8またはＮＲ9Ｒ10である；
Ｒ11およびＲ12は、各々独立して、水素であるか、またはＯＲ4およびＲ11、および／またはＯＲ5およびＲ12は一緒になってメチレンジオキシ基を形成する；
Ｙは、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいベンジル、置換されていてもよいベンゾイル、置換されていてもよいＣ3−Ｃ8シクロアルキル、好ましくは置換されていてもよいＣ5−Ｃ6シクロアルキル、置換されていてもよいＣＨ2−（Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル）（好ましくは、置換されていてもよいＣＨ2−（Ｃ5−Ｃ6シクロアルキル））、置換されていてもよい５−６員ヘテロサイクリルおよび置換されていてもよいＣＨ2−（５−６員ヘテロサイクリル）からなる群から選択される］
【０００７】
好ましい例において、本発明は式（ｉ）の化合物（立体異性体を含む）またはその塩またはプロドラッグに関する。
【化２】
0004847014.tif 000003
【０００８】
［式中：
Ｒ１−Ｒ１０は、各々独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいシクロアルキルアルキル、置換されていてもよいアリールアシル、置換されていてもよいシクロアルキルアシルおよびＣ−１結合糖からなる群より選択され、
ＸはＯＲ８またはＮＲ９Ｒ１０であり、
Ｒ１１およびＲ１２は、各々独立して、水素であるか、またはＯＲ４およびＲ１１、および／またはＯＲ５およびＲ１２は一緒になってメチレンジオキシ基を形成する］
【０００９】
本発明の好ましい化合物は式（ｉｉ）：
【化３】
0004847014.tif 000004
を有するか、またはその塩またはプロドラッグである。
【００１０】
式（ｉｉ）はジオキサニル部分において４個のキラル中心を有する。実施例１に記載されるように、式（ｉｉ）の２つの異性体−化合物ＡおよびＢが現在単離されている。
もう一つの態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物、例えば、式（ｉ）の化合物、またはその塩またはプロドラッグを、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と合わせて含む組成物を提供する。
【００１１】
さらにもう一つの態様において、本発明は癌または癌性状態あるいは細胞増殖過多に付随する病態または状態を治療するための方法であって、治療有効量の式（Ｉ）、例えば式（ｉ）の化合物、またはその塩、誘導体またはプロドラッグを、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。本発明の化合物により治療することのできる個々の癌性状態として、肺癌、前立腺癌、結腸癌、脳腫瘍、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌および乳癌ならびに白血病が挙げられる。本発明の化合物により治療することのできる細胞増殖過多に付随する病態または状態として、アテローム性動脈硬化症、再発狭窄症、関節リウマチ、骨関節症、炎症性関節炎、乾癬、歯周病またはウイルスにより誘発される細胞増殖過多が挙げられる。
【００１２】
（図面の簡単な記載）
図１：化合物ＡはＴＨＰ−１白血病性細胞の分化を促進する。
ＴＨＰ−１細胞を４日間、表示したように１０ｎＭの化合物Ａの存在下または不在下で培養した。表示されている場合は、細胞を化合物Ａの存在下または不在下でＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍｌ）（３日）またはＰＭＡ（０．１μＭ）（４日）でも処理した。画像は位相差顕微鏡（倍率×２００）で可視化した細胞のものである。
図２：細胞周期進行およびＴＨＰ−１細胞の生存力に対する化合物Ａの作用。
ＴＨＰ−１細胞を表示された濃度の化合物Ａまたは１０００ｎＭのパクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）とともに２日間培養し、その後集め、プロピジウムヨージドでの染色の前に７０％エタノール中で固定し、ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーにより測定した。数値は、≧２Ｎ  ＤＮＡ含量を有するすべての細胞に対する様々な細胞周期の時期における細胞の割合（％）を示し、また培養期間中に起こるマーカー（垂直線）の左側の死滅細胞の割合（％）（すなわち、サブジプロイド（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）≦２Ｎ細胞）を示す。
【００１３】
図３：Ａ５４９細胞の増殖に対する化合物Ａの作用
Ａ５４９細胞を約１００００細胞／ウェルで接種し、表示された濃度の化合物Ａまたはパクリタクセルの存在下で培養した。細胞を集め、様々な時点でトリパンブルー染色された細胞を血球計で計測することにより生存細胞数を測定した。結果は三重複培養の平均±ＳＥＭである。
図４：細胞周期進行およびＡ５４９細胞の生存力に対する化合物Ａの作用。
Ａ５４９細胞を６日間表示された濃度の化合物Ａまたは１μＭのパクリタクセルとともに培養し、次に集め、プロピジウムヨージドでの染色する前に７０％エタノール中エタノール中で固定し、ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーにより測定した。数値は≧２ＤＮＡ含量を有する全細胞に対するさまざまな細胞周期時期における細胞の割合（％）を示し、培養期間中に起こるマーカーに左側の死滅細胞の割合（％）（すなわち、サブジプロイド≦２Ｎ細胞）も示す。
【００１４】
図５：化合物ＡおよびＢはＫ５６２白血病性細胞のＧ２／Ｍ期蓄積を誘発する。
Ｋ５６２細胞を３日間表示された濃度の化合物ＡまたはＢとともに培養し、次に集め、プロピジウムヨージドでの染色する前に７０％エタノール中で固定し、ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーにより測定した。数値は≧２Ｎ  ＤＮＡ含量を有する全細胞に対するそれぞれ細胞周期のＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期における細胞の割合（％）を示す。
図６：Ａ５４９細胞に対する化合物の細胞増殖抑制作用は可逆的である。
Ａ５４９細胞を約１００００細胞／ウェルで接種し、表示された濃度の化合物Ａまたはパクリタクセルの存在下で培養し、生存細胞数を様々な時点でトリパンブルー染色された細胞を血球計で計測することにより測定した。５日に、細胞の一部を洗浄し、様々な処置をしていない新鮮な培地中に再懸濁させ、計測前にさらに４日間培養した。
【００１５】
図７：化合物ＡはＡ５４９細胞のカンプトテシン−およびパクリタクセル−誘発性細胞毒性を抑制する。
９６ウェルプレート中Ａ５４９細胞を３日間１０ｎＭの化合物Ａの存在下または不在下で、表示された濃度の（Ａ）カンプトテシンまたは（Ｂ）パクリタクセルとともに培養した。次に蛍光ＤＮＡ−結合色素ＹＯＹＯ−１を添加することにより膜統合性の損失を評価し、細胞死を伴う蛍光の増大を、蛍光プレートリーダーを用いて測定した。
図８：化合物Ａは抗癌剤により誘発される細胞周期停止および細胞死を抑制するが、スタウロスポリンによっては抑制されない。
６ウェルプレート中Ａ５４９細胞を３日間１０ｎＭの化合物Ａの存在下または不在下で、表示するように０．１μＭのカンプトテシン、１０μＭのビンブラスチン、１μＭのパクリタクセルまたは１μＭのスタウロスポリンとともに培養した。細胞を次に集め、プロピジウムヨージドで染色する前に７０％エタノール中で固定し、ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーにより測定した。数値は≧２Ｎ  ＤＮＡ含量を有するすべての細胞に対する様々な細胞周期の時期における細胞の割合（％）を示し、また培養期間中に起こるマーカーの左側の死滅細胞の割合（％）（すなわち、サブジプロイド≦２Ｎ細胞）も示す。
【００１６】
図９：化合物ＡはＡ５４９細胞において老化−関連β−ガラクトシダーゼ活性を誘発しない。
Ａ５４９細胞を１００００細胞／ウェルで６ウェルプレート中、様々な濃度の化合物Ａ（１０−５０ｎＭ）または２５０ｎＭのドキソルビシンの存在下または不在下で１０日間接種した後、すでに記載されているようにして処理し、老化関連β−ガラクトシダーゼ活性について一夜染色した（Dimriら、1995, Proc Natl Acad Sci USA 1995 92（20）：9363-7）。化合物Ａについて、１０ｎＭ処置だけを示すが、試験した他のどの濃度でも検出可能なＳＡ−βｇａｌ活性はなかった。ＰＣ、位相差顕微鏡。ＢＦ、明視野顕微鏡。倍率２００倍。
図１０：化合物Ａはマウス異種移植片モデルにおいてヒト腫瘍の増殖を抑制する。
無胸腺Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Rygard and Povisen, 1969, Acta Pathol Microbiol Scand, 77：758）に２×１０６ＰＣ３細胞を背側腹部に皮下的に接種した。腫瘍が触知できるようになっていた８日後に化合物Ａを１週間に３回腹膜組織内注射により投与した（３ｍｇ／ｋｇ）。化合物Ａをまずエタノール中に可溶化し、次にｃｒｅｍａｐｈｏｒｅと１：１で混合し、注射用に塩溶液中で希釈した。対照動物を同様の方法で同じビヒクルであるが、化合物Ａを含まないもので処置した。（Ａ）化合物Ａの平均腫瘍体積に対する作用。表示された時間でマイクロメーターカリパスを用いて腫瘍体積を測定した。データは平均腫瘍体積±ＳＥＭを表す。（Ｂ）平均腫瘍重量に対する化合物Ａの作用。実験の最後に（ＰＣ３細胞の接種後２９日）、マウスを屠殺し、腫瘍を摘出し、その後秤量した。データは平均腫瘍重量±ＳＥＭを表す。
【００１７】
（発明の開示）
シクロペンタ［ｂ］ベンゾフランは以前に６−または８−位にメトキシまたはヒドロキシ基を有することが記載されている。Gregerら、2001, Phytochemistry, 57, （1）;57-64。対照的に、本発明の化合物は６−オキシ位に立体的に嵩高い基、特にジオキサニル基を有する。（下位式（ａ）として以下に記載される）式（ｉｉ）のジオキサニル基は以前に天然源からは報告されていなかった。本発明を理論により拘束することを意図しないが、立体的に嵩高い基、すなわち、メトキシ基よりも空間的に大きな基が６−オキシ位に存在することは、シクロペンタ［ｂ］ベンゾフランコアを有する化合物に細胞毒性および細胞増殖抑制特性の両方を賦与する。
【００１８】
【化４】
0004847014.tif 000005
本発明はその範囲内に式（Ｉ）、特に式（ｉ）の化合物、例えば化合物ＡおよびＢの医薬的に許容される塩、誘導体またはプロドラッグを含む。
【００１９】
「塩」または「プロドラッグ」なる語は、任意の医薬的に許容される塩、エステル、グリコシド、溶媒和物、水和物または受容患者に投与することにより本明細書に記載する本発明の化合物を提供（直接または間接的に）できる任意の他の化合物を包含する。
適当な医薬的に許容される塩としては、医薬的に許容される無機酸、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸の塩、あるいは医薬的に許容される有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸および吉草酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、これらに限定されないが、医薬的に許容されるカチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムと形成されるものが挙げられる。
【００２０】
塩の調製は当業界において公知の方法により行うことができる。医薬的に許容されない塩も医薬的に許容される塩の調製において中間体として有用であるので、本発明の範囲内に含まれると考えられる。
本発明の化合物は、結晶形態であってもよいし、溶媒和物（例えば水和物）であってもよい。溶解の方法は、当業者に公知である。
式（Ｉ）の化合物のプロドラッグも本発明の範囲に含まれる。「プロドラッグ」なる語は、本発明の化合物にインビボで変換される誘導体を包含し、例えば、インビボにて分解されて本発明の化合物を放出することのできる、遊離ヒドロキシ基のエステル（例えば、アセテート）およびグリコシド誘導体を包含する。その他の適切なプロドラッグは、遊離カルボン酸基のエステルを含みうる。適切なプロドラッグの調製についてはＤｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｌｓｅｖｅｉｒ，１９８５にさらに記載されており、その内容は参照により取り込まれる。
【００２１】
式（Ｉ）のＹ基、特に式（ｉ）の化合物のジオキサニル基は不斉中心を有し、従って、１以上の立体異性体の形態において存在できると認識される。本発明は従って、１またはそれ以上の不斉（キラル）中心で実質的に純粋な異性体形態、例えば約９０％ｅｅ以上、例えば約９５％または９７％ｅｅ、好ましくは９９％以上の化合物、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物にも関する。かかる異性体は慣例の方法、例えば、クロマトグラフィー、または分割剤の使用により分割できる。本発明は従って、化合物ＡおよびＢを提供する。
【００２２】
本明細書において使用する場合、「アルキル」なる語は、単独または「アリールアルキル」などの複合語において用いられる場合、直鎖、分岐または環状炭化水素基、好ましくは、Ｃ１−２０、例えば、Ｃ１−１０を意味する。「Ｃ１−Ｃ６アルキル」なる語は、１−６個の炭素原子を有する直鎖、分岐または環状アルキル基を意味する。「Ｃ１−６アルキル」の例としては、メチル、エチル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、３−メチルペンチルおよび２，３−ジメチルブチルが挙げられる。環状Ｃ１−６アルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。アルキルの他の例としては：ヘプチル、５−メチルヘキシル、１−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，４−ジメチルペンチル、１，２，３−トリメチルブチル、１，１，２−トリメチルブチル、１，１，３−トリメチルブチル、オクチル、６−メチルヘプチル、１−メチルヘプチル、１，１，３，３−テトラメチルブチル、ノニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−または７−メチルオクチル、１−、２−、３−、４−または５−エチルヘプチル、１−、２−または３−プロピルヘキシル、デシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−および８−メチルノニル、１−、２−、３−、４−、５−または６−エチルオクチル、１−、２−、３−または４−プロピルヘプチル、ウンデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−または９−メチルデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−または７−エチルノニル、１−、２−、３−、４−または５−プロピルオクチル、１−、２−または３−ブチルヘプチル、１−ペンチルヘキシル、ドデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−または１０−メチルウンデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−エチルデシル、１−、２−、３−、４−、５−または６−プロピルノニル、１−、２−、３−または４−ブチルオクチル、１−２−ペンチルヘプチルなどが挙げられる。アルキル基は、所望により本明細書において定義する１以上の置換基で置換されていてもよい。所望により、直鎖、分岐または環状炭化水素基（少なくとも２個の炭素原子を有する）は１、２またはそれ以上の飽和度を含み、アルケニルまたはアルキニル基、好ましくはＣ２−２０アルケニル、より好ましくはＣ２−６アルケニル、またはＣ２−２０アルキニル、より好ましくはＣ２−６アルキニル基が形成される。その例は、１または２以上の二重結合、または１または２以上の三重結合を含む炭化水素残基を含む。従って、「アルキル」はアルケニルおよびアルキニルを包含すると見なされる。
【００２３】
「アリール」なる語は、単独または「アリールアルキル」などの複合語において用いられる場合、芳香族炭化水素または芳香族複素環（ヘテロアリール）系の単一、多核、接合または融合残基を意味し、ここにおいて、環状炭化水素残基の１以上の炭素原子は複素原子で置換されて、芳香族残基が得られる。２以上の炭素原子が置換されている場合、これは２以上の同じ複素原子により置換されていてもよいし、異なる複素原子により置換されていてもよい。適当な複素原子としては、Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｅが挙げられる。
【００２４】
「アリール」の例としては、フェニル、ビフェニル、ターフェニル、クォーターフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、アントラセニル、ジヒドロアントラセニル、ベンズアントラセニル、ジベンズアントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、ピレニル、イデニル、アズレニル、クリセニル、ピリジル、４−フェニルピリジル、３−フェニルピリジル、チエニル、フリル、ピロリル、インドリル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピラジニル、チアゾリル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、プリニル、キナゾリニル、フェナジニル、アクリジニル、ベノキサゾリル、ベンゾチアゾリルなどが挙げられる。好ましい炭化水素アリール基としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。好ましい複素環式アリール基としては、ピリジル、チエニル、フリル、ピロリルが挙げられる。アリール基は、所望により本明細書に定義される１以上の所望の置換基により置換されていてもよい。
【００２５】
「アシル」なる語は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ基（式中、Ｒはアルキルまたはアリール基である）を意味する。アシルの例としては、直鎖または分岐アルカノイル、例えば、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、２−メチルプロパノイル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロパノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、ノナデカノイルおよびイソサノイル；シクロアルキルカルボニル、例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニルおよびシクロヘキシルカルボニル；アロイル、例えば、ベンゾイル、トルオイルおよびナフトイル；アラルカノイル、例えば、フェニルアルカノイル（例えば、フェニルアセチル、フェニルプロパノイル、フェニルブタノイル、フェニルイソブチリル、フェニルペンタノイルおよびフェニルヘキサノイル）およびナフチルアルカノイル（例えば、ナフチルアセチル、ナフチルプロパノイルおよびナフチルブタノイル）が挙げられる。Ｒ基は所望により前記のように置換されていてもよいので、「アシル」は所望により置換されていてもよいアシルを意味する。
【００２６】
アルキル、アリールまたはアシルの任意の置換基としては、ハロ（ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード）、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル（ｎ−およびｉ−体）、Ｃ１−６アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（ｎ−およびｉ−体）、ブトキシ（ｎ−、ｓｅｃ−およびｔ−体）、ニトロ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピル（ｎ−およびｉ−体）アミノ）、Ｃ１−６ジアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ）、ハロメチル（例えば、トリフルオロメチル、トリブロモメチル、トリクロロメチル）、ハロメトキシ（例えば、トリフルオロメトキシ、トリブロモメトキシ、トリクロロメトキシ）およびアセチルが挙げられる。さらに、Ｙ（フェニル、ベンジル、ベンゾイル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＣＨ２−（Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル）、５−６員ヘテロサイクリルおよびＣＨ２（５−６員ヘテロサイクリル）の任意の置換基としては、前記の置換基と同様に、１以上のヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アリールアルキルオキシ、シクロアルキルアルキルオキシ、アリールアシルオキシ、シクロアルキルアシルオキシおよびＣ１−結合糖オキシで置換されたアルキルが挙げられる。
【００２７】
「アリールアルキル」および「シクロアルキルアルキル」なる語は、それぞれアリールおよびシクロアルキル基で置換された（好ましくは末端で）アルキル基を意味する。同様に、「アリールアシル」および「シクロアルキルアシル」なる語は、それぞれアシルおよびシクロアルキル基で置換された（例えば、末端で置換された）アシル基を意味する。
好ましいＣ−１結合糖は、式（Ｉ）において示す主鎖骨格に糖の１−炭素（慣用の化学的ナンバリング）を介して結合して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の任意の位置でアセタール結合またはＲ８でエステル結合あるいはＲ９またはＲ１０位でアミド結合を形成するフラノースまたはピラノースサッカライド（糖）置換基である。サッカライド基の例としては、還元糖、例えばグルコース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノースおよびガラクトースが挙げられ、それぞれは式（Ｉ）の構造の酸素原子にサッカライド基のＣ−１炭素を介して結合する。
【００２８】
５−６員ヘテロサイクリル基としては、独立してＯ、Ｎ、ＳおよびＳｅから選択される１以上のヘテロ原子を含む前記のような芳香族５−６員ヘテロサイクリル基（ヘテロアリール）および非芳香族５−６員ヘテロサイクリル基が挙げられる。その例としては、ジオキサニル、ピラニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジル、モルホリノ、ピペラジニル、チオモルホリノおよび例えば前記のような糖が挙げられる。
本発明の式（Ｉ）または式（ｉ）の一例において、各Ｒ４−Ｒ７およびＲ１−Ｒ７は、各々独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピルメチル（またはシクロプロピルエチル）、シクロブチルメチル（または−エチル）、シクロペンチルメチル（または−エチル）、シクロヘキシルメチル（または−エチル）、フェニル、ベンジル、アセチルおよびＣ−１結合糖からなる群から選択される。
【００２９】
本発明の式（Ｉ）、（ｉ）または（ｉｉ）のもう一つの例において、Ｘ＝ＯＲ８のＲ８は、水素、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ−１結合糖からなる群から選択される。
本発明の式（Ｉ）、（ｉ）または（ｉｉ）のもう一つの例において、Ｘ＝ＮＲ９Ｒ１０のＲ９およびＲ１０は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、フェニルまたはベンジルから選択される。
【００３０】
式（ｉ）（すなわち、Ｒ１−Ｒ７のうちのいずれか一つは水素でない）の化合物を形成するための化合物ＡおよびＢのヒドロキシル基の誘導化を、ヒドロキシ基のアルキル化、アリール化またはアシル化について当該分野で公知の方法、例えば、Protective Groups in Organic Synthesis T.W. Greene and P.G.M. Wutz, （1999） Wiley Interscience, New York, and Advanced Organic Chemistry, J. March, （4th Edition）, Wiley-InterScience（その全体を出典明示により本発明の一部とする）に記載されているようにしてにより行うことができる。例えば、ヒドロキシ基は、ハロゲン化アルキル、例えば、ヨウ化メチルまたは硫酸ジアルキル、例えば、硫酸ジメチルおよびジエチルを用いてアルキル化することができる。アシル化は、塩基またはカップリング剤の存在下で、適当なカルボン酸、酸ハロゲン化物および酸無水物での処理により行うことができる。ベンジル化は、ハロゲン化ベンジル化合物、例えば臭化、塩化、またはヨウ化ベンジルでの処理により行うことができる。メチルエステルの脱エステル化は、エステルを水性塩基で処理することにより行うことができる。カルボン酸のエステル化は、酸の存在下での適当なアルコールでの処理、または硫酸アルキルまたはハロゲン化アルキルでの処理を含む慣用の手段により達成することができる。
【００３１】
グリコシド形成は、化学的に、例えば、出発物質を保護された糖化合物（Ｃ−１はヒドロキシルまたはカルボキシル基でのカップリングのためにハロゲン化により活性化され、糖ヒドロキシルは保護基によりブロックされている）と反応させることにより行うことができる。別法として、グリコシド形成は適当なグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、ＵＤＰ−ガラクトース依存ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−グルコース依存グリコシルトランスフェラーゼ（ＳＩＧＭＡ）を用いて酵素により行うことができる。
当業者は、選択的に１以上の前記定義のＲ１−Ｒ１０基（ここにおいて、Ｒ１−Ｒ１０は水素ではない）を組み入れるためには、１以上のオキシおよび／またはカルボキシ基の適切な保護および／または脱保護が必要であることを認識するであろう。１以上のヒドロキシまたはカルボキシ基の選択的誘導化は、慣例の技術により、適当な条件下で様々な程度の安定性を有する保護基の使用により行うことができる。
【００３２】
カルボン酸またはエステル基（すなわち、ＸがＯＲ８であるもの）をアミド（ＸがＮＲ９Ｒ１０である）へ変換する方法は、当業者に公知であり、カップリング試薬、例えばＤＣＣの存在下でカルボン酸を適当なアミンで処理すること、または酸ハロゲン化物を適当なアミンで処理することを含む。他の適当な方法は、Larock, R.E., Comprehensive Organic Transformations pp963-995, VCH Publishers （1989）に記載されている。
本明細書において用いられる場合、「保護基」なる語は、特定の官能基、例えばヒドロキシまたはカルボン酸を、該基が他の方法では活性である条件下で一時的に不活性にすることができる導入された官能基を意味する。適当な保護基は当業者に公知であり、例えば、Protective Groups in Organic Synthesis（前出）に記載されている。ヒドロキシの適当な保護基としては、アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル）、アシル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、ベンゾイルなど）、ベンジル、およびシリル基（例えば、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなど）が挙げられる。ヒドロキシ置換基およびカルボキシ置換基の他の適当な基（酸、アミドなど）は、Greene（前出）に見出すことができる。ある条件下での様々な基の安定性は当業者には理解され、さらにProtective Groups in Organic Synthesis（前出）に例示されている。
【００３３】
これらの保護された化合物は式（Ｉ）のある化合物の調製において中間体として有用であり、従って、これらは本発明のさらにもう一つの態様を形成する。
ある基、例えばアルキル、アシルまたはアリールアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、アセチル、ベンジルなど）は、式（Ｉ）の化合物において一時的な保護基または非水素Ｒ１−Ｒ６基としてのいずれかの働きをする。
公知方法を用いてジオキサニル基をシクロペンタベンゾフランコアの６−位から開裂させることができ、ジオキサン化合物を得る。結果として得られるジオキサン化合物は、他の化合物、例えば、本明細書の引例に記載されているような他のシクロペンタベンゾフラン化合物の対応する６−オキシ位または他のオキシ位を含むオキシ−置換化合物を置換するために用いることができる。
【００３４】
６−位にメトキシまたはヒドロキシ置換基を有するシクロペンタベンゾフラン化合物、例えば、本明細書に記載されている文献（出典明示により本発明の一部とする）に記載されているもの、例えば参考化合物１−３（実施例３に記載）は、適当ならば、６−脱メチル化され、結果として得られる６−ヒドロキシ基は適当なＹ前駆体と反応して６−ＯＹ基を形成することも理解されるであろう。その方法は当該分野において公知であり、例えば、一方法は６−ＯＨ基をＹ−ハロゲン化合物（ただし、ハロゲンは、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを包含する）と反応させることを含む。かかる６−ＯＹ化合物は本発明のさらにもう一つの態様を形成する。
【００３５】
ある好ましい例において、１以上の次の定義が適用される：
Ｒ１およびＲ２は両方とも水素である。
Ｒ１およびＲ２は水素であり、Ｒ３はメチルである。
Ｒ３−Ｒ５の少なくとも一つは、メチル、エチルまたはプロピルであり、好ましくはメチルである。
Ｒ３−Ｒ５の少なくとも２つは、メチル、エチルまたはプロピルであり、好ましくはメチルである。
Ｒ３−Ｒ５のすべてはメチル、エチルまたはプロピルであり、好ましくはメチルである。
Ｒ６およびＲ７は両方とも水素である。
【００３６】
Ｒ１１およびＲ１２の少なくとも一つは水素であり、好ましくはＲ１１およびＲ１２は両方とも水素である。
ＸはＯＲ８である（式中、Ｒ８は水素、メチル、エチルまたはプロピルから選択され、好ましくはメチルである）。
ＸはＮＲ９Ｒ１０である（式中、Ｒ９およびＲ１０は両方とも水素またはメチルであるか；またはＲ９およびＲ１０は異なり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも一方は水素であり、他方はＣ１−６アルキル、例えば、メチル、エチルまたはプロピルである）。
Ｙは所望により置換されていてもよい５−６員ヘテロサイクリル基または所望により置換されていてもよいＣ５−Ｃ６シクロアルキル基である。
式（ｉｉ）の特に好ましい形態は、化合物ＡおよびＢである。
【００３７】
本発明の化合物は、患者における癌性状態、または細胞の増殖過多に関連する他の状態の治療において有用である。本発明の化合物により治療される患者としては、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット）、実験室試験用動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ウサギ、霊長類）または捕獲された野生動物が挙げられる。ヒトが治療される患者であるのが最も好ましい。
本明細書において用いられる場合、「治療」なる語は、癌、腫瘍または増殖過多細胞の成長の予防、遅延化、妨害または停止、あるいは標的とされる細胞の数（または成長塊の大きさ）の減少または前記細胞の全体的破壊を包含することが意図され、ここにおいて前記細胞とは癌、腫瘍または増殖過多細胞である。
【００３８】
本発明の化合物により治療される癌性状態は、癌または腫瘍が単純（モノクローナル、すなわち、単一の新生細胞種からなる）、混合（ポリクローナル、すなわち、１以上の新生細胞種からなる）または化合物（すなわち、１以上の新生細胞種からなり、１以上の胚葉から由来する）であってもよい状態を包含する。本発明により治療される癌性状態のいくつかの例としては、白血病および乳癌、結腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、脳腫瘍、皮膚癌、肝臓癌、大腸癌および胃癌、腫瘍および黒色種が挙げられる。良性過形成の例は、血管（例えば、血管種）、前立腺、腎臓、副腎、肝臓、結腸（例えば、結腸陰窩）、副甲状腺および他の組織を包含する。
【００３９】
本発明の化合物は、細胞増殖抑制ならびに細胞毒性特性を有するので、これらは、たとえば細胞増殖過多に関連する状態または症状などの癌または腫瘍細胞以外の細胞の標的集団の成長の抑制においても治療薬として潜在的な用途を有する。かかる状態は、アテローム性動脈硬化症および再発狭窄症（新脈管内膜過形成）および炎症性応答によるかまたは付随する増殖過多、例えば、関節炎（慢性関節リウマチ、骨関節炎および炎症性関節炎を包含する）、乾癬および歯周病、あるいはヒト乳頭種ウイルスなどの細胞のウイルス感染による細胞性増殖過多を包含する。
【００４０】
本発明の化合物、例えば、化合物ＡおよびＢは、他の治療化合物、例えば、パクリタクセル、カンプトテシン、ビンブラスチンおよびドキソルビシンを含む抗癌化合物と組み合わせて療法において用いることができる。
従って、本発明のもう一つの態様は、癌または癌性状態を治療する方法であって、有効量の式（Ｉ）の化合物およびさらなる治療薬をそれを必要とする患者に投与することを含む方法、前記化合物の他の治療薬との組み合わせにおいて使用される医薬の製造における使用に関する。
本発明の化合物およびさらなる治療薬は、同時に、単一組成物としてまたは別個の組成物として投与してもよいし、あるいは別々に、すなわち診断する医師により決定された適当な間隔で順次投与してもよい。従って、本発明は式（Ｉ）の化合物をさらにもう一つの治療薬と合わせて含むキットも提供する。
【００４１】
本明細書において用いる場合、化合物の「有効量」とは、所望の投与レジメに従って投与された場合に所望の治療活性を提供する化合物の量である。投与は、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月または数年の間隔で、あるいはこれらの期間のいずれかにわたって連続的に行うことができる。適当な投与量は、投与量により、体重１ｋｇあたり約０．１ｎｇないし体重１ｋｇあたり１ｇの範囲にある。投与量は、好ましくは投与量により、体重１ｋｇあたり１μｇ−１ｇ、例えば、投与により体重１ｋｇあたり１ｍｇないし１ｇの範囲である。一例において、投与量は、投与につき体重１ｋｇあたり１ｍｇないし５００ｍｇの範囲である。もう一つの例において、投与量は、投与につき体重１ｋｇあたり１ｍｇないし２５０ｍｇの範囲である。さらにもう一つの例において、投与量は投与につき体重１ｋｇあたり１μｇないし１００ｍｇの範囲であり、例えば、投与につき体重１ｋｇあたり５０ｍｇまでである。各患者についての投与レジメは、患者の年齢、体重、健康状態および医学的履歴および治療される状態の程度および進行に依存し、診断する医師が決定できる。
活性成分は一回の投与または連続投与において投与することができる。活性成分を単独で投与することもできるが、組成物、好ましくは医薬組成物とすることが好ましい。
【００４２】
担体は、組成物の他の成分と適合性であるという意味で医薬的に許容されなければならず、また患者に対して有害であってはならない。組成物は、経口、経直腸、経鼻、局所（口内および舌下を含む）、経膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適したものを含む。組成物は便宜的に単位投与形態にすることができ、また調剤分野において周知の方法により調製することができる。かかる方法は、活性成分を１以上の補助成分を構成する担体と会合させる段階を含む。一般に、組成物は、活性成分を液体担体または微粉砕された固体担体または両者と均一かつ密接に会合させ、その後、必要ならば成形して製品にすることにより調製される。
経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル、サシェまたは錠剤（それぞれが所定料の活性成分を含む）などの独立単位；散剤または顆粒剤；水性または非水性液体中溶液または懸濁液；あるいは水中油液体乳液または油中水液体エマルジョンとして提示することができる。活性成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとして提示することもできる。
【００４３】
錠剤は、所望により１以上の補助成分とともに圧縮または成形することにより調製することができる。圧縮錠剤は、適当な機械で所望により結合剤（例えば、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤、例えば、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤と混合してもよい粉末または顆粒などの易流動形態における活性成分を圧縮することにより調製できる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化された化合物の混合物を適当な機械で成形することにより調製できる。錠剤は、所望によりコートしてもよいし、あるいはスコアをつけてもよく、例えば、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いてその中に含まれる活性成分の放出を遅延化または制御して、所望の放出特性を提供するために処方することができる。錠剤は、所望により腸溶コーティングを施して、一部が胃ではなく腸で放出されるようにすることができる。
【００４４】
口中局所投与に適した組成物は、フレーバーを添加したベース、通常シュークロースおよびアカシアまたはトラガカントガム中活性成分を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリン、またはシュークロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中活性成分を含む香錠；および適当な液体担体中活性成分を含む洗口剤を包含する。
経直腸投与に適した組成物は、例えば、カカオ脂、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどを含む適当な基剤を用いて坐剤として提示することができる。
経膣投与に適した組成物は、活性成分に加えて、当該分野において適当であることが知られている担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー処方として提示することができる。
非経口投与に適した組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、殺菌剤および組成物を意図される受容体の血液と等張にする溶質を含む水性および非水性等張滅菌注射溶液；および懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。組成物は、単位用量または多剤滅菌容器、例えば、アンプルおよびバイアル中に提示することができ、また使用前に注射用に例えば水などの滅菌液体担体を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）条件において貯蔵することができる。即席注射溶液および懸濁液は、すでに記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００４５】
好ましい単位剤形組成物は、本明細書においてすでに記載した活性成分の１日用量または単位用量、１日準用量、またはその適当なフラクションを含むものである。
活性成分、特に前記のものに加えて、本発明の組成物は、問題となる組成物の種類に関して慣用の他の薬剤を含むことができると理解され、例えば、経口投与に適したものは結合剤、甘味料、増粘剤、矯味矯臭剤、崩壊剤、コーティング剤、保存料、滑剤および／または時間遅延剤などのさらなる薬剤を含むことができる。適当な甘味料としては、シュークロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが挙げられる。適当な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が挙げられる。適当な矯味矯臭剤としては、ペパーミント油、冬緑油、チェリー、オレンジまたはラズベリーフレーバーが挙げられる。適当なコーティング剤としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪族アルコール、ゼイン、シェラックまたはグルテンが挙げられる。適当な保存料としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適当な滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが挙げられる。適当な時間遅延剤としては、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートが挙げられる。
【００４６】
本発明の１以上の態様は、癌性状態または細胞の増殖過多に関連する状態の化学療法において用いられる公知方法、組成物、薬剤または化合物よりも優れた利点を有する（またはこれらに関連する欠点を回避する）方法、組成物、薬剤または化合物も提供する。かかる利点としては：増大した治療活性、軽減された副作用、非非癌性または非増殖過多細胞に対する軽減された細胞毒性、向上した安定性あるいはより簡単で、安価でまたは高収率の合成または単離プロセスによる前記化合物を得るためのより容易に利用可能な手段が挙げられる。
【００４７】
当業者らは本明細書に記載された本発明は具体的に記載された以外の変更および修正が可能であることを理解するであろう。本発明は精神および範囲内のかかる変更および修正をすべて包含すると理解される。本発明はさらに、本明細書において言及されているか、または表示されたすべての工程、特性、組成物および化合物も、個別にまたは包括的に、前記工程または特性の任意の２またはそれ以上の任意またはすべての組み合わせを包含する。
本明細書中に開示される参考および引用文献はその全体が本明細書中に組み込まれるようにすべきである。
本発明を、本発明を説明する目的で包含され、前記の概論を制限すると解釈されるべきではない以下の実施例を参照して説明する。
【００４８】
（実施例）
実施例１
Aglaia leptanthaからの化合物ＡおよびＢの単離
化合物ＡおよびＢを次の手順を用いて単離した：
（ａ）樹木種のAglaia leptanthaからの粉砕された樹皮のサンプルをメタノールで処理する。
（ｂ）抽出物を濾過し、結果として得られた溶液を真空下で濃縮する。
（ｃ）抽出物をＣ−１８Varian抽出カラム（１０ｇ）上固相抽出（０．１％アセトニトリル／水中ギ酸を使用、アセトニトリル濃度を増大させる）により分別する。
（ｄ）７：２０の比のアセトニトリル／水溶出液を用いて得られる溶出液を集める。化合物ＡおよびＢは２００、２７３ｎｍで最大のＵＶ吸収を有し（アセトニトリル／水／０．１％ギ酸）、次の条件下で約３０．６７分（化合物Ａ）および３１．０５分（化合物Ｂ）のＨＰＬＣ保持時間を有する：
Ｃ−８対称カラム（ＷＡＴＥＲＳ）、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ  １ｍｌ／分、０％から９０％水中アセトニトリル直線勾配（４０分）、０．１％ギ酸を使用。
（ｅ）工程（ｄ）で得られるフラクションを濃縮する。
【００４９】
（ｆ）工程（ｅ）で得られる濃縮物をＣ−１８分取カラム（ＷＡＴＥＲＳ，Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  Ｃ−１８、６ミクロン、２．５×２５ｃｍ）上２０ｍｌ／分の流量で、２５％から４５％の水中アセトニトリル（３０分）の直線勾配、０．１％ギ酸を用いてクロマトグラフィーにかける。
（ｇ）約２２分で工程（ｄ）において概要を記載したクロマトグラフィーおよび分光特性を有する溶出液を集め、濃縮する。
（ｈ）（ｇ）で得られる各溶出液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０カラム上、溶媒としてメタノールを使用してクロマトグラフにかける。（ｄ）に概要を記載したスペクトル特性を有するフラクションを集め、濃縮する。これらのサンプルを化合物ＡおよびＢの構造解明に用いた。
（ｉ）工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の代わりに、（ａ）で得られるメタノール抽出物を等体積の水およびジクロロメタンで分配してもよい。ジクロロメタン相を次に工程（ｅ）−（ｈ）に従って処理する。
【００５０】
このようにして得られた化合物は次の分光および物理的特性を有する；
ＵＶ／Ｖｉｓ吸収最大：２２３、２７５ｎｍ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ中）。
ＭＳ：陽イオンモードにおいてＥＳＩソースを用いてＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計で質量スペクトルを得た。サンプルを０．１％ＭｅＯＨ中ＦＡ中に溶解させ、シリンジポンプを用いて３μＬ／分の速度で注入することによりソース中に導入した。化合物Ａについて、シグナルをｍ／ｚ６７７［Ｍ＋Ｎａ＋］＋で観察し；ＭＳ２はｍ／ｚ６５９［Ｍ＋Ｎａ−Ｈ２Ｏ］＋；ＭＳ３はｍ／ｚ６２７（３２ａｍｕの損失）；ＭＳ４はｍ／ｚ５９５（さらに３２ａｍｕ損失）およびｍ／ｚ４５１（１７６ａｍｕの損失、ジオキサン側鎖と等しい）であった。化合物Ｂについて、陽イオンモードにおいてｍｚ６７７．２［Ｍ＋Ｎａ＋］＋でシグナルが観察され、ＭＳ２はｍｚ６２７．２およびｍｚ６５９．２で娘イオンを生じた。シグナルをｍ／ｚ６２７．２でさらにフラグメント化すると、ｍ／ｚ５９５．３で娘イオンが生じた。
【００５１】
分析エレクトロスプレーソース（ＥＳＩ）を備えたＢｒｕｋｅｒ４７ｅフーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ）で化合物Ａの正確な質量スペクトルを得た。サンプルをＭｅＯＨ中に溶解させ、シリンジポンプを用いて６０μＬ／分の速度で直接注入することによりソース中に導入した。ソースを１００ｖのキャピラリー電圧で操作した。ｍ／ｚ６７７．２１９４［Ｍ＋Ｎａ］＋測定値で１つのシグナルが観察された；Ｃ３４Ｈ３８Ｏ１３Ｎａ＋は６７７．２２０４を要する。
【００５２】
ＮＭＲ
４００および５００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ＮＭＲ分光計で、それぞれＣＤ３ＯＤおよびＣＤＣｌ３中、化合物ＡおよびＢ（下記の式（ｉｉ）を参照のこと）のＮＭＲスペクトルを得た。次の実験を行った：１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ。１Ｈ  ＮＭＲ化学シフト（ＣＤＣｌ３中で得る）および１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフトを表１に記載する。
【００５３】
【化５】
0004847014.tif 000006
化合物ＡおよびＢ
【００５４】
【表１−１】
0004847014.tif 000007
【表１−２】
0004847014.tif 000008
【００５５】
実施例２
化合物ＡおよびＢのシクロペンタベンゾフランコア上のジオキサニル側鎖の置換位置の決定（化合物ＡおよびＢのアセチル化）
本発明の目的は化合物ＡおよびＢ中のシクロペンタベンゾフランコアへのジオキサニル側鎖の付着位置を間違いなく決定することである。
化合物ＡおよびＢを無水ピリジン（Ａ：２８０μＬ中４．２ｍｇ；Ｂ：４００μＬ中３ｍｇ）に溶かし、無水酢酸を添加した（Ａ：１４０μＫ、Ｂ：２００μＬ）。反応混合物をアルゴン雰囲気下でそれぞれ１４時間（Ａ）および２２時間（Ｂ）攪拌した。減圧下で溶媒を除去して橙色残渣としてジアセタートを得た（Ａ：５．８ｍｇ；Ｂ：３ｍｇ）。粗残渣の精製を６０％酢酸エチル／ペトロールで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで行った。化合物Ａのジアセタート、化合物Ａ’（式（ｉｉｉ））を收率６８％（３．２ｍｇ）で得、化合物Ｂのジアセタート、化合物Ｂ’（式（ｉｉｉ））を收率４１％（１．４ｍｇ）にて得た。
【００５６】
２つの反応生成物の純度を逆相ＨＰＬＣにより実施例１にて記載されている同じ装置を用いて評価した（カラム：ＸｔｅｒｒａＣ−１８、１ｍＬ／分、勾配：４０分間で０から１００％のＭｅＣＮ）。化合物Ａ’およびＢ’の構造を、実施例１に記載されているのと同じ条件を用いて、エレクトロスプレーＭＳならびに１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲ実験により解明した。化合物Ａ’およびＢ’のＮＭＲスペクトルを５００および４００ＭＨｚのＶａｒｉａｎＩＮＯＶＡ装置を用いてＣＤＣｌ３中で得た。
【００５７】
双方の化合物は、ＨＰＬＣ分析にて、化合物Ａ’は２６．３分の、化合物Ｂ’は２７．７分の保持時間にて一本のピークを示した。化合物Ａ’およびＢ’はｍ／ｚで７６１［Ｍ＋Ｎａ］＋および１４９９［２Ｍ＋Ｎａ］＋の陽性分子イオンを示し、それは分子式Ｃ３８Ｈ４２Ｏ１５を示すものである。１および２Ｄ  ＮＭＲ実験（１Ｈ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ）はジオキサニル側鎖上の２つのヒドロキシル官能基がアセチル化されたことを示した。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフトを表２に、ＮＯＥＳＹスペクトルを表３に要約する。
【００５８】
両方のジアセタートのＨＭＢＣ実験はＨ−５、Ｈ−７およびＨ−１’’’のプロトンシグナルが芳香族環の炭素６と明らかな相関関係にあることを示す。Ｈ−７とメトキシ基のプロトンシグナルは芳香族環の炭素６と相関関係にある。このことはジオキサニル側鎖がシクロペンタベンゾフランコアの位置Ｃ−６に結合していることを明示するものである。
【００５９】
ジオキサニル側鎖の位置決定するためのさらなるサポートを両方の化合物のＮＯＥＳＹスペクトルから誘導した。Ｈ−５およびＨ−７の両方からジオキサニル側鎖のＨ−１’’’に対するＮＯＥシグナルが観察され、Ｈ−７だけがＣ−８メトキシシグナルに対するＮＯＥシグナルを示す。２つの化合物のジオキサニル環系にて観察されるＮＯＥシグナルは、それらがジヒドロキシエタン側鎖の立体化学については異なるものであることを明示する。シクロペンタベンゾフランコアについてのＮＯＥシグナルは開示されたデータと一致しており、表１および２に示される立体化学を確認する。
【００６０】
【化６】
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(iii)
化合物Ａ’およびＢ’（化合物ＡおよびＢのジアセタート）
【００６１】
【表２−１】
0004847014.tif 000010
【表２−２】
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【００６２】
【化７】
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【００６３】
【表３】
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【００６４】
実施例３
化合物ＡおよびＢはヒト腫瘍細胞系について細胞増殖抑制性および細胞毒性である
（ａ）化合物ＡおよびＢをAlgaia lepthanthaの樹皮サンプルから、リポポリ多糖（ＬＰＳ）で活性化されたＴＨＰ−１ヒト前単球白血病性細胞（Tsuchiya,ら、Int. J. Cancer, 1980, 26（2）：171-6）により、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生を抑制するその能力により同定した。表２は化合物ＡおよびＢのＴＮＦ−α産生の抑制についての活性を、ＴＨＰ−１細胞についてのＷＳＴ−１減少、ＤＮＡ合成およびタンパク質合成分析を用いて測定した一般的細胞代謝に対するその影響と比較した結果をまとめる。化合物ＡおよびＢは、ＷＳＴ−１減少、ＤＮＡおよびタンパク質合成分析において活性である様々な類似した濃度でＴＮＦ−α産生を潜在的に抑制した。比較のために、化合物ＡおよびＢのＡ５４９肺上皮癌細胞に対する作用（Leiberら、Int. J. Cancer, 1976, 17（1）：62-70）も測定し、該データも表２に記載されている。化合物ＡおよびＢはＡ５４９細胞によるインターロイキン−１（ＩＬ−１）誘発細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）発現の抑制について、これらの細胞においてタンパク質およびＤＮＡ合成抑制がＴＨＰ−１細胞についてのように様々な類似の濃度で起こる場合でも著しく効力が低い。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
＊ＤＭＳＯ中に溶解させた精製化合物ＡおよびＢをＴＨＰ−１およびＡ５４９細胞の両方において様々な分析において抑制活性について一定範囲の濃度にわたり同時に試験した。関連する応答の５０％抑制に至る濃度（ＩＣ５０）を示す。ＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦαの産生を、次のマウス抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（捕捉抗体、ＭＡＢ６１０；検出抗体、ビオチニル化ＭＡＢ２１０；両方ともR & D Systems, Minneapolis MN, USAから入手）を用いてサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により１８時間にわたって培養上清中に放出される際に測定した。Ａ５４９細胞によるＩＣＡＭ−１の表面発現を、ヨーロピウム標識されたマウス抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（R & D Systems Cat No.BBA3）を用いて直接抗体結合により培養の２４時間後に分析し、Ｄｅｌｆｉａ分析（EG&G Wallac, Turku, Finland）を用いて時間分解蛍光により測定した。ＴＨＰ−１細胞によるＷＳＴ−１（Roche, Cat. No.1644807）の減少を製造業者のインストラクションに従って培養した１８時間後に測定した。ＴＨＰ−１細胞について４８時間後、１０％の通常のＬ−ロイシン濃度（５ｍｇ／ｍＬ）を含む増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ）中で培養したＡ５４９細胞について７２時間後の［１４Ｃ］−ロイシンの吸収としてタンパク質合成を測定した。正常増殖培地中ＴＨＰ−１細胞については４８時間後、Ａ５４９細胞については７２時間後の［１４Ｃ］−チミジン（０．５μＣｉ／ｍＬ）の吸収としてＤＮＡ合成を測定した。
【００６７】
（ｂ）化合物Ａを、ＴＨＰ−１およびＡ５４９細胞に加えて様々なヒト腫瘍タイプに由来する細胞系のパネルに対する細胞毒性および細胞増殖抑制活性について評価した（表３）。これらは、Ｋ５６２白血病性細胞（Lozzio and Lozzio,1975,Blood45：321-34）、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞（Kaighnら、1979, Invest. Urol. 17：16-23）およびＳＦ２６８グリア芽細胞腫細胞（Westphalら、1985, Biochem. Biophys. Res. Commun., 132：284-9）を含んでいた。化合物Ａは試験したほぼすべての細胞系において強力な細胞増殖抑制活性を示し、ＧＩ５０値は１−７ｎＭの範囲であった。化合物Ａはさらに、様々な腫瘍細胞系に対して強力な細胞毒性効果を示した。興味深いことに、ＴＨＰ−１およびＰＣ３細胞は、３または６日培養した後に得られるＬＣ５０値がほとんど差がなく最も迅速に殺されることが判明した。しかしながら、化合物Ａの細胞毒性効力はＫ５６２、Ａ５４９およびＳＦ２６８細胞について６日培養した後に劇的に増加した。細胞増殖を抑制するために必要とされる化合物Ａの濃度は、細胞毒性応答を惹起するために必要とされるものよりも著しく低いことに注意すべきである。従って、化合物Ａの細胞増殖抑制効果は、細胞死を誘発するその能力と生化学的に区別できる。表６は、化合物Ｂが様々な腫瘍細胞系に対して化合物Ａについて観察されるものと匹敵する効力で細胞毒性効果を示すことを示す。
【００６８】
【表５】
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【００６９】
＊精製された化合物Ａを、表示されたさまざまなヒト腫瘍タイプ由来の細胞系のパネルに対する細胞毒性および細胞活性について最大１×１０−６Ｍ（１０００ｎＭ）までの濃度の範囲にわたって試験した。ＧＩ５０値は、３日培養した後に細胞数の増加（未処理細胞と比較して）を５０％抑制する化合物の濃度を表す。相対的な細胞数は、細胞をジギトニン（Beckerら、Anal Biochem, 1994, 221（1）：78-84）で溶解させた後、蛍光ＤＮＡ−結合色素（ＹＯＹＯ−１）を用いて細胞ＤＮＡを測定することにより決定した。ＬＣ５０値は細胞の５０％を殺す化合物の濃度を表す。プロピジウムヨージド（Nicolettiら、J. Immunol. Methods, 1991, 139：271-79）で染色した後フローサイトメトリーにより測定されるサブジプロイドＤＮＡを示す死滅細胞の割合として、細胞死を測定した。
【００７０】
【表６】
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＊化合物ＡおよびＢの細胞毒性活性を表５に記載するさまざまな腫瘍細胞系について比較した。
【００７１】
（ｃ）化合物ＡをＮＣＩインビトロ抗癌スクリーンにてかなり大規模の細胞系パネルに対して試験し（表７）、上記した結果を確認した。全細胞タンパク質の測定値に基づく種々のアッセイを用いて、化合物Ａがすべての細胞系で広範かつ強力な細胞増殖抑制作用を有し、試験した最少の用量（１０ｎＭ）であっても最大限の細胞増殖の阻害を示す結果を確認する。表５のデータと一致する培養の２日後に測定された細胞毒性作用は、ＣＯＬＯ−２０５結腸癌細胞の１０ｎＭから７８６−０腎臓癌細胞の約９０μＭの範囲にあるＬＣ５０値で様々であった。これらのデータは化合物Ａが広範囲に及ぶ、白血病、肺癌、結腸癌、脳癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌および乳癌を含む、種々の主たる型の癌を提示する腫瘍細胞系に対して強力なインビトロ活性を有したことを示す。
【００７２】
【表７】
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【００７３】
＊  化合物Ａをナショナル・キャンサー・インスティテュート・インビトロ・アンチチャンサー・ドラッグ・デリバリー・スクリーンにて活性について試験した。このために、ＢｏｙｄおよびＰａｕｌｌ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５、３４：９１−１０９に記載されるように、主要な型の癌を提示する一連の種々のヒト腫瘍細胞系に対して１０−４Ｍないし１０−８Ｍの範囲にある５０倍の希釈度で化合物Ａを試験した。簡単に言えば、この試験はスルホロダミン（sulforhodamine）Ｂで染色することで関連する細胞の数を測定する前に、細胞を化合物Ａと共に４８時間インキュベートすることを必要とした。ＧＩ５０値は処理していない対照と比べて５０％まで細胞の正味の増殖を阻害する化合物Ａの濃度を示すものである。ＬＣ５０値は実験の開始と比べて細胞の正味の５０％喪失（死滅）をもたらす化合物Ａの濃度を示すものである。該データはこのように実施した２つの実験からの平均値を示すものである。
【００７４】
実施例４
化合物Ａの細胞毒性活性は新規ジオキサニルオキシ置換を含まない他の公知の関連した化合物により共有されない。化合物Ａ’は細胞毒性を示す。
（ａ）表８は、化合物Ａの細胞増殖抑制および細胞毒性作用をＣ−６位で新規ジオキサニルオキシ基を含まない３つの以前に同定された１Ｈ−シクロペンタ［ｂ］ベンゾフランリグナンと比較する。参考化合物は次の通りである：ロカグラオール（参考化合物１）（Ohseら、J Nat Prod, 1996, 59（7）：650-52）；４’−デメトキシ−３’，４’−メチレンジオキシロカグラオール（参考化合物２）；メチル４’−デメトキシ−３’，４’−メチレンジオキシロカグレート（参考化合物３）（leeら、Chem Biol Interact, 1998, 115（3）：215-28）。すべての４種の化合物はＡ５４９細胞において検出可能な細胞毒性活性を示し、化合物Ａが最も有効であり、ついで次第に低くなる順でそれぞれ参考化合物３、２および１であった。重要なことに、試験した化合物のうち、化合物Ａ以外ではどれも３日間の分析にわたって５０００ｎＭまでの量でＴＨＰ−１またはＡ５４９細胞のいずれかにおいて感知できる細胞毒性を示さなかった。本発明を理論により制限することを意図しないが、Ｃ６−位での新規ジオキサニルオキシ置換は化合物Ａにより示される細胞毒性活性について重要であり、これを他の以前に同定された１Ｈ−シクロペンタ［ｂ］ベンゾフランリグナンと区別する。
【００７５】
【化８】
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【００７６】
【表８】
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【００７７】
＊  様々な化合物の濃度を最大５×１０−６Ｍ（５０００ｎＭ）まで増大させて、Ａ５４９およびＴＨＰ−１細胞を試験し、細胞増殖および細胞生存性に対する作用を３日間培養した後に測定した。表３について記載したＹＯＹＯ−１を用いて細胞数における相対的変化を測定することによりＧＩ５０値を測定した。ＹＯＹＯ−１吸収を用いて膜完全性の損失の関数として細胞死を測定することにより、ＬＣ５０値を測定した（Beckerら、Anal Biochem, 1994, 221（1）：78-84）。参考化合物の構造も示す。
【００７８】
（ｂ）表９は、化合物Ａ’およびＢ’が非修飾化合物と少なくとも同様の効能でＴＨＰ−１白血病性のＷＳＴ−１減少を阻害したため、化合物ＡおよびＢのジオキサニル側鎖のアセチル化がその生物学的活性を減少させなかったことを示す。表４に示される値と比較したこのＷＳＴ−１減少実験にて示されるすべての化合物についてより低いＩＣ５０値は、後者のアッセイにおいて用いられる１８時間の処理と比較して３日間処理した場合に、細胞の感受性の強化を反映している。
【００７９】
【表９】
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＊  ＤＭＳＯに可溶化させた精製した化合物を、ＷＳＴ−１減少を測定する前に３日間種々の化合物の存在下で培養することを除き、表４に記載されるようにＴＨＰ−１白血病性細胞によるＷＳＴ−１の減少に対するその効果について一連の濃度にわたって試験した。
【００８０】
実施例５
化合物Ａは急性タンパク質合成抑制活性を有する
化合物Ａをさらに、一般的タンパク質生合成を急速に抑制できるかどうかを決定するために試験した。一般的タンパク質生合成分析として［１４Ｃ］ロイシンの不溶性細胞物質中への取り込みを用いて、表６は化合物ＡがＴＨＰ−１細胞の添加後３時間以内に明らかな抑制効果を有し、ＩＣ５０が約３０ｎＭであることを示す。同じ時間にわたって測定したＤＮＡ合成も抑制されたが、効力は低く（ＩＣ５０が約７０ｎｍ）、タンパク質合成抑制に次ぐ。シクロヘキシミドは公知のタンパク質合成抑制物質であるが（Obrigら、1971, J. Biol. Chem. 246（1）, 174-181）、これもタンパク質およびＤＮＡ合成の両方を抑制し、化合物Ａはその効果においてシクロヘキシミドよりも著しく有効であった。表６はＡ５４９細胞における一般的タンパク質合成を抑制することを示し、ＩＣ５０は約３０ｎＭであり、これはＴＨＰ−１細胞において観察されるものと類似している。
【００８１】
【表１０】
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【００８２】
＊  ＴＨＰ−１細胞およびＡ５４９細胞を、（１μＣｉ／ｍＬ）［１４Ｃ］ロイシン（タンパク質合成）または［１４Ｃ］チミジン（ＤＮＡ合成）をさらに２時間添加する前に表示された濃度の化合物Ａで１時間前処理した。ＩＣ５０値は未処理対照細胞培養物と比較して放射性同位元素の取り込みを５０％抑制するために必要な化合物Ａの濃度を表す。
【００８３】
実施例６
化合物はヒト白血病性細胞系の分化を誘発する。
通常懸濁液中に結合せずに増殖するＴＨＰ−１単球白血病性細胞についての実験において、本発明者らは細胞の１０ｎＭ化合物Ａへの暴露を延長すると、細胞が蓄積してプラスチックに付着し、さまざまな仮足を示した（図１）。これは成熟マクロファージに非常に特徴的な形態であり、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）またはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を含む他の公知のマクロファージ分化の誘発因子で細胞を処理した場合に同様の形態的影響が観察された。これを調査するために、さらに、ＨＬ６０ヒト前骨髄球白血病性細胞（Collins,ら、Nature, 1977, 270：347-9）に対する化合物Ａのこの影響を調べた（表１１）。この広く用いられる細胞系は、ヒト前骨髄球分化のモデルとしてよく特徴づけられている（Colling, Blooc, 1987, 70（5）：1233-44）。この実験において、フローサイトメトリー分析によりＣＤ１４表面抗原発現を測定することにより、単球分化を定量化した。ＬＰＳ−結合タンパク質であるＣＤ１４を骨髄単球の細胞の表面上に発現し、通常、未分化ＨＬ６０細胞において非常に低レベルで発現される（Ferreroら、Blood, 1983, 61（1）：171-9）。前記のＴＨＰ−１データと一致して、表１０は、１０ｎＭより高い用量で化合物Ａは、培養の４日後に残存する生存ＨＬ６０細胞においてＣＤ１４発現を著しく増大させた。これらのデータを合わせると、化合物Ａはヒト白血病性細胞系の分化を誘発する能力を有することが強く指摘される。
【００８４】
【表１１】
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【００８５】
＊  ＨＬ６０細胞を４日間表示した濃度の化合物Ａとともに培養し、その後集め、７０％エタノール中に固定する。細胞を次にマウスモノクローナル抗ＣＤ１４抗体（ＯＫＭ１）で染色し、ＦＩＴＣ−接合ヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いてこれを測定した。染色された細胞をフローサイトメトリーにより可視化し、分析をその前方および側方光散乱特性に基づいて固体の時間で可視と判断された細胞に限定した。二次抗体とともにインキュベートすることにより細胞の非特異的染色を調節した。
【００８６】
実施例７
様々な濃度の化合物Ａで処理されたＴＨＰ−１細胞のＤＮＡ含量（図２）により、１０ｎＭでわずかに細胞毒性（死滅細胞の蓄積が増大）であることが示され、これらの条件下で細胞が細胞周期のＧ０／Ｇ１層において蓄積させた。このことは、化合物ＡもＴＨＰ−１細胞における細胞毒性活性を有する。図２は、薬剤パクリタクセルを不安定にする微小管（Sorgerら、Curr Opin Cell Biol, 1997, 9（6）：807-14）は、ＴＨＰ−１細胞死も誘発するが、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ期において蓄積させる。
化合物ＡのＡ５４９細胞の増殖に対する細胞増殖抑制効果は、９日の期間にわたって間隔を置いて細胞の数を直接係数することにより確認した（図３）。も処理細胞と比較した場合、１０ｎＭの化合物Ａは細胞数の増加を９５％以上防止し、この時点で観察される死滅細胞の１０％よりも少なかった（トリパンブルー排除により測定）。従って、これらの条件下で、減少した細胞数は増加した細胞死により、段に引き起こすことはできない。細胞数の顕著な抑制は、２日以内に見られ、このことは化合物Ａが迅速に採用することを示す。５０ｍＭおよび２５０ｍＭの高濃度で、化合物Ａは細胞毒性効果を有し、９日後に細胞死をそれぞれ８６％および１００％まで増大させ、この時点で素の出発数より低いレベルまで細胞数を減少させた。１０ｎＭの非細胞毒性濃度で、化合物ＡはＡ５４０細胞に対して迅速で有効な細胞増殖抑制効果を有する。
【００８７】
化合物Ａの作用の有力なメカニズムの同定を助けるために、細胞周期のどこにおいてその働きをするかを確認するためにＤＮＡ含量分析を行った（図４）。６日間化合物Ａで処理されたＡ５４９細胞の細胞周期分析によりの、顕著な細胞毒性が明らかでない１０ｎＭで、細胞周期のＧ０／Ｇ１期において細胞の割合がわずかに減少し、同時にＧ２／Ｍ期において細胞が増大する。前記図３の成長曲線データとあわせて、これらのデータは１０ｎＭの化合物が細胞周期のすべての期を全般的に延長し、おそらくＧ２／Ｍ期の延長がわずかにより顕著であった。これは、細胞周期のＧ２／Ｍ期で選択的に作用することがしられている薬剤であるパクリタクセルの作用と対照的である（図４）。５０ｎＭと２５０ｎＭの死滅細胞の数の間にはほとんど差がないが、さらに高い量では細胞周期のＧ０／Ｇ１期において細胞の蓄積が大きかった。従って、ＴＨＰ−１細胞（図２）と比較して、Ａ５４９細胞における細胞周期のＧ０／Ｇ１期全体にわたって進行を抑制するために高濃度の化合物Ａが必要とされる。
【００８８】
実施例８
化合物Ａの細胞増殖抑制作用はＡ５４９細胞において可逆的である
化合物Ａの作用の可逆性を確認した。このために、Ａ５４９細胞は未処理のままにするか、あるいは様々な濃度の化合物Ａまたはパクリタクセルの存在下で５日間培養した後、該化合物を除去し、細胞をさらに４日間培養した後、細胞数を測定した（図６）。１０ｎＭの化合物Ａは著しい細胞毒性梨に９日まで細胞数の増加を有意に抑制した。しかしながら、これらの培養のために、化合物Ａが５日後に除去された場合、細胞数においてその後の４日の培養よりも５倍を越えて増大し、２〜３の集団が倍加することを表す。細胞に対して致命的な処理、例えば高濃度の化合物Ａまたはパクリタクセルの存在の作用は、これらを除去することにより逆転しなかった。
【００８９】
実施例９
化合物Ａは様々な抗癌剤により惹起される細胞周期依存性を抑制する
化合物の細胞周期作用をさらに調べるために、細胞性死濃度のこの化合物を細胞周期の特定の地点で作用することがしられている他の抗癌剤と組み合わせて、化合物Ａがその細胞周期依存性作用を乱すかどうかを調べた。蛍光ＤＮＡ−結合色素ＹＯＹＯ−１の排除を測定することにより細胞生存性を３日後に分析した（Beckerら、Anal Biochem, 1994, 221（1）：78-84）。Ａ５４９細胞をカンプトテシンおよびパクリタクセルの存在下で濃度を増大させながら１０ｎＭの非細胞毒性量の化合物Ａで処理した。カンプトテシンは、ＤＮＡ複製に必要とされる酵素であるＤＮＡトポイソメラーゼ１の抑制物質であり、細胞周期のＳ期を乱し、Ｓ期チェックポイントの活性化のためにその後細胞を死滅させる（Darzynkiewiczら、Ann N Y Acad Sci, 1996, 803：93-100）。パクリタクセルは、すでに記載したように、有糸分裂紡錘体の形成に必要とされる微小管機能を抑制し、これによりＭ期チェックポイントを活性化させ、その後細胞を死滅させる（Sorgerら、Curr Opin Cell BIol, 1997 9（6）：807-14）。図７は、１０ｎＭ化合物Ａはカンプトテシンおよびパクリタクセル両方の細胞毒性を、これらの薬剤が２０００倍過剰に添加された場合でも著しく減少させる。化合物Ａは、優先的にカンプトテシンおよびパクリタクセルの細胞周期依存性細胞毒性効果を防止する。
【００９０】
これを、ＤＮＡ含量分析を用いてより詳細に調査して、細胞周期進行および細胞死を明確に測定した。この実験において、カンプトテシンおよびパクリタクセル細胞に加えて、ビンブラスチン（もう一つの微小管抑制物質（（Sorgerら、1997、前出）およびスタウロスポリン（キナーゼ抑制物質）でも処理した（Gescher, Crit Rev Oncol Hematol., 2000, 34（2）：127-35）。すでに判明しているように、１０ｎＭの化合物Ａで処理されたＡ５４９細胞はＧ０／Ｇ１において細胞がわずかに減少し、Ｇ２／Ｍ期細胞がわずかに増加し、３日にわたる培養で細胞死の増加は検出できなかった（図８）。公知の作用メカニズムと一致して、カンプトテシンは細胞周期のＳ期において細胞が蓄積され、サブジプロイドＤＮＡ含量を有するものとして検出される死滅細胞のレベルも増大した。予想されるように、ビンブラスチンおよびパクリタクセルは両方とも細胞周期のＧ２／Ｍ期において細胞の大部分が制止する。しかしながら、これらの薬剤のすべてについて、１０ｎＭの化合物Ａの存在は、その特徴的な細胞周期阻止を防止し、著しくその細胞毒性効果を抑制し、サブジプロイド死滅細胞の出現を劇的に減少させる。対照的に、化合物Ａは、細胞周期のあらゆる活性期で細胞を殺すことができるらしい薬剤であるスタウロスポリンの細胞毒性効果に対してほとんど影響を及ぼさない。
【００９１】
実施例１０
化合物Ａの細胞毒性効果は複製老化のバイオマーカーと相関しない
１０ｎＭの化合物Ａの存在下で培養したＡ５４９細胞の成長速度が劇的に減少するので（図３）、この化合物がこれらの不死細胞の複製老化を誘発する可能性を考慮することになる。これらの条件下でのこの可能性と一致して、老化表現型を高度に誘発する形態を有するＡ５４９細胞がしばしば観察され、非常に平面化され、その通常の外観と比較して表面積が大きくなっている（例えば図９サブパネルａおよびｂと比較）。さらに、ヒト細胞の老化とよく相関することがすでに記載されているバイオマーカーである老化−関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）活性を測定することにより、これを評価した（Dimriら、Proc. Natl Acad Sci USA 1995 92（20）：9363-7）。最近、ドキソルビシン、シスプラチン、シタラビン、エトポシドおよびパクリタクセルを含む様々なメカニズムにより作用する抗癌剤はすべて様々な腫瘍細胞系においてＳＡ−β−ｇａｌ活性を誘発することができる（Chang et a., Cancer Res 1999, 59（15）：3761-7）。従って、化合物Ａに加えてＡ５４９細胞も実験対照としてドキソルビシンで処理した。この薬剤は、ＤＮＡ／トポイソメラーゼＩＩ複合体を安定化し、これによりＤＮＡ；および損傷を引き起こすことにより作用し、その結果その後Ｓ期細胞周期停止および／または細胞死に至る（Froeligh-Ammon and Osheroff, 1995, J. Biol. CHem. 270（37）：21429-21432）。図９は、先の報告と一致して、２５０ｎＭのドキソルビシンで処理されたＡ５４９細胞は平面化され、老化細胞の拡大された表現型を示し、ＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す。対照的に、１０−５０ｎＭのさまざまな用量の化合物Ａは、細胞が平面化し、拡大された形態を示す場合でもＳＡ−β−ｇａｌ活性を誘発できなかった。従って、様々な他の抗癌剤と対照的に、化合物Ａの細胞増殖抑制作用は細胞老化のこの特定のマーカーと相関しない。
【００９２】
実施例１１
化合物Ａは細胞増殖を抑制するが、細胞の大きさの増大を抑制しない。
個々の細胞の大きさの増大を反映した細胞増殖および細胞成長は生化学的に別個のプロセスであることはよく知られている（Pardee, Science, 1989, 246：602-8）。ある濃度で化合物Ａは明らかな細胞毒性なしに細胞増殖を抑制できるが、化合物Ａが細胞成長にも影響を及ぼすかどうかを評価した。これらの実験のためにＡ５４９細胞を１０ｎＭまでの様々な非細胞毒性量の化合物Ａで処理し、相対的な細胞の大きさを、６日培養した後、フローサイトメトリーを用いて、細胞の大きさに直接関連する前方光散乱特性について調べた。平均細胞体積の増加（％）は、未処理細胞集団に対する処理細胞集団の平均前方散乱値の相対的変化を表す。
【００９３】
【表１２】
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【００９４】
＊
指示されるように種々の非毒性濃度の化合物Ａと一緒に６日間培養したＡ５４９細胞を、フローサイトメトリーにより、細胞の大きさと直接関係するそのフォワード・ライト・スカッター特性について試験した。細胞平均容量の％増加は未処理の細胞集団に対する処理した細胞集団の平均フォワードスカッター値における相対的変化を示す。
【００９５】
実施例１２
化合物Ａのインビボでヒト腫瘍細胞の成長を抑制する能力を、２×１０６ＰＣ３ヒト前立腺腫瘍細胞を背側腹部領域に皮下注射したオス無胸腺マウスを用いて評価した。一旦ＰＣ３腫瘍が諸口できるようになった８日後に化合物を腹膜内注射により投与すること（３ｍｇ／ｋｇ）を開始し、腫瘍細胞の初回接種の２９日後まで１週簡に３回続けた。この時点ですべてのマウスを屠殺し、腫瘍を摘出し、秤量した。図１０Ａはビヒクル単独で処理された対衝動物と比較して、化合物Ａで処理されたマウスは実験の過程全体にわたって平均腫瘍体積の増加が大きく減少した。これは、実験の最後で腫瘍を摘出し、秤量した際に確認され、化合物Ａ処理は、平均腫瘍重量を約６０％減少させることが判明した（図１０Ｂ）。体重は対照および処理群のいずれについても影響を受けず、実験期間にわたって平均体重が同様の約１２％の減少を示した。従って化合物Ａはインビボ抗腫瘍活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
（原文に記載なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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