(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高さより幅が広い偏平な流路を内部に有するフローセルと、
前記フローセルに流速を制御して試料溶液を導入する試料溶液導入部と、
前記流路の幅方向から前記試料溶液の流れる方向にほぼ垂直に、円形のスポット状に集光した励起光を照射する光照射部と、
長方形の受光部を有する光検出デバイスと、
前記励起光照射によって試料溶液中に生じた蛍光像を前記光検出デバイスの受光部に結像させる対物レンズと、
前記光検出デバイスの出力を時系列的に結合することにより２次元蛍光画像を生成する手段とを有し、
前記光検出デバイスの長方形の受光部には長辺方向にＭ個、短辺方向にＭより少ないＮ個（Ｎは２以上の整数）の光検出ピクセルが配列され、前記長辺方向が前記流路内における前記励起光の伝播方向に沿って配置され、
各光検出ピクセルで受光した露光量から変換された電荷量のデータを前記短辺方向に隣接するＮ個の光検出ピクセル同士で加算し、Ｍ×１個の一次元配列データとして前記光検出デバイスの外部に出力し、前記２次元蛍光画像を生成する手段は前記一次元配列データを配列方向と垂直な方向に時系列に並べることにより２次元蛍光画像を生成し、
前記Ｍ×Ｎ個の光検出ピクセルの露光時間Texpよりも、前記露光時間Texp内に前記Ｍ×Ｎ個の光検出ピクセルで受光した露光量から変換された電荷量のデータを前記光検出デバイスの外部に出力する時間Ttransの方が短いことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の蛍光検出装置において、前記試料溶液は前記流路を均一な流れとして流れることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
請求項１記載の蛍光検出装置において、前記対物レンズは０．７５以上の開口数を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
請求項１記載の蛍光検出装置において、前記対物レンズの倍率をｍ、前記蛍光の中心波長をλ、前記光検出ピクセルの試料溶液の流れる方向に垂直方向の長さをｗとするとき、ｗ／ｍ≦λを満たすことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
請求項１記載の蛍光検出装置において、前記試料溶液は蛍光標識付分子を含み、前記２次元蛍光画像から蛍光標識付分子の数を計数する手段を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項６】
請求項１記載の蛍光検出装置において、前記フローセルは、前記試料溶液を包んで流れるシース流の導入口を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項７】
高さより幅が広い偏平な流路を内部に有するフローセルと、
前記フローセルに流速を制御して蛍光標識付分子を含有する試料溶液を導入する試料溶液導入部と、
前記流路の幅方向から前記試料溶液の流れる方向にほぼ垂直に、スポット状に集光した励起光を照射する光照射部と、
長方形の受光部を有する光検出デバイスと、
前記励起光照射によって試料溶液中に生じた蛍光像を前記光検出デバイスの受光部に結像させる対物レンズと、
前記光検出デバイスの出力を時系列的に結合することにより２次元蛍光画像を生成する手段とを有し、
前記光検出デバイスの長方形の受光部には長辺方向にＭ個、短辺方向にＭより少ないＮ個（Ｎは１以上の整数）の光検出ピクセルが配列され、前記長辺方向が前記流路内における前記励起光の伝播方向に沿って配置され、
前記光検出デバイスは、露光時間Texp内に前記Ｍ×Ｎ個の光検出ピクセルで受光した露光量から変換された電荷量のデータを１つの単位として前記光検出デバイスの外部に出力し、
前記流路の前記励起光が照射されている領域を流れている試料溶液の平均速度をｖ、前記光検出ピクセルの前記短辺方向の長さをｌｐ、前記対物レンズの倍率をｍ、前記光検出デバイス上で１つの蛍光標識が前記長辺方向に複数の光検出ピクセルにまたがって検出され、その平均光検出ピクセル数をｎｓとするとき、次の条件を満たすことを特徴とする蛍光検出装置。
（ｎｓ×ｌｐ）／（ｍ×Texp）≦ｖ≦（Ｎ×ｌｐ）／（ｍ×Texp）
【請求項８】
高さより幅が広い偏平な流路を内部に有するフローセルと、
前記フローセルに流速を制御して蛍光標識付分子を含有する試料溶液を導入する試料溶液導入部と、
前記流路の幅方向から前記試料溶液の流れる方向にほぼ垂直に、スポット状に集光した励起光を照射する光照射部と、
長方形の受光部を有する光検出デバイスと、
前記励起光照射によって試料溶液中に生じた蛍光像を前記光検出デバイスの受光部に結像させる対物レンズと、
前記光検出デバイスから出力される一次元配列データを配列方向と垂直な方向に時系列に並べることにより２次元蛍光画像を生成する手段と、
前記手段で得られた２次元蛍光画像中での蛍光像の大きさ又は強度を計測する計測手段とを有し、
前記光検出デバイスの長方形の受光部には長辺方向にＭ個、短辺方向にＭより少ないＮ個の光検出ピクセルが配列され、前記長辺方向が前記流路内における前記励起光の伝播方向に沿って配置され、
前記受光部の各光検出ピクセルは、所定の周期で、受光によって発生した電荷あるいは前記短辺方向の上流側に隣接する光検出ピクセルがある場合には当該上流側に隣接する光検出ピクセルから転送されてきた電荷と前記受光によって発生した電荷とを合わせた電荷を前記短辺方向の下流側に隣接する光検出ピクセルに順次転送し、Ｍ×１個の一次元配列データとして前記光検出デバイスの外部に出力し、
更に、前記計測手段によって計測された２次元蛍光画像中での蛍光像の大きさ又は強度に基づいて、前記周期あるいは前記試料溶液導入部による試料溶液の流速を調整する手段を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項９】
請求項８記載の蛍光検出装置において、
前記流路の前記励起光が照射されている領域を流れている前記蛍光標識付分子の平均速度をｖ、前記光検出ピクセルの前記短辺方向の長さをｌｐ、前記対物レンズの倍率をｍ、前記周期をＴｆ、前記光検出デバイスから外部へのデータ転送レートをｆとするとき、次の関係が満たされていることを特徴とする蛍光検出装置。
ｖ≒ｌｐ／（ｍ×Ｔｆ）
Ｔｆ≧Ｍ／ｆ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出装置に関し、例えば生体から採取されたＤＮＡやＲＮＡ又は蛋白質などの微量な生体物質を化学増幅の過程を経ずに、定量するのに適した蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡなどの極微量な生体物質を定量するためにはＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）などの化学増幅を利用するのが一般的である。化学増幅法を利用する場合、増幅された後の産物を定量することによって増幅前の生体物質の量を推定する。ところが、増幅率にばらつきが必ずあるために、生体物質の定量の推定値は不正確になってしまう。この問題を解決するために、化学増幅を使わずに極微量な生体物質を直接定量することが望まれる。これを実現する方法のひとつが単分子計測と呼ばれる方法である。
【０００３】
ここでの単分子計測とは、定量の対象となる生体物質に蛍光標識を結合させ、レーザで励起することによって蛍光標識された分子をカウントする方法を指す（例えば非特許文献１を参照）。非特許文献１では、０．３μＬの試料溶液中の１０００個程度のＤＮＡ分子を検出することが可能であるとの記載がある。図１に、この従来法を実現する検出系の構成を示す。蛍光標識された分子を励起するためのレーザ光５はレーザ光源１から出射され、露光時間を調整するためのシャッタ２を通過し、レンズ３で集光され、キャピラリ１２に入射される。キャピラリの中には定量することを目的とした生体物質（以下、ターゲットと呼ぶ）を含む試料溶液が充填されている。ターゲットは、キャピラリ１２に導入される前に蛍光標識されている。それゆえ、試料溶液中にターゲットが含まれていれば、レーザ光照射によって蛍光が発生する。このとき試料溶液中にターゲットは分散しており、キャピラリ中のレーザ光が照射された領域（体積：５×１０-11Ｌ）にあるターゲットは点状の発光体として見える。このような発光体を検出するために、レーザ光照射領域の像を対物レンズ６によってカメラ７中にあるＣＣＤ（Charge Coupled Device）８上に結像させて蛍光画像を得る。取得された画像データにおいて、レーザ光照射領域中のバックグラウンドから発光体を識別し、数をカウントすることによって蛍光標識付ターゲット分子を定量する。
【０００４】
図２は、キャピラリ中でレーザ光が照射する領域の拡大図である。試料溶液が充填され、断面が角型のキャピラリ１２に、２つのシリンドリカルレンズによってスポットを楕円型に整形したレーザ光１３を照射する。レーザ照射体積１６は、図示のように試料溶液の流れ方向に引き伸ばされた形状である。すなわち、図２に示すようにレーザ照射（スポット）幅１７はレーザ照射高さ１８よりも長くしている。これはレーザ照射高さ１８を大きくしすぎると、蛍光像がぼけて点状にならないものが多くなり、感度が低下するからである。また、キャピラリ断面の幅１９は５０μｍ程度である。幅を増やすことによって計測体積を増やすことは可能であるが、断面形状は扁平に加工することが困難なため、極端に幅のみを増やすことができない。キャピラリ断面の高さ２０を増やすと上記と同様にぼけた蛍光像が多数観測され、バックグラウンドが低下し、感度が低下することになる。蛍光標識されたターゲット１４は、矢印１５の方向に９０ｍｍ／秒で電気泳動されている。
【０００５】
図１及び図２から分かるように、電気泳動の方向１５とレーザ光の入射方向５は垂直である。これは、電気泳動された蛍光標識付ターゲット分子の濃度を移動距離別に測定するために必要な構成である。このような構成は、特許文献２〜６にも開示されている。また、これらの公知例では、２枚のガラス基板の間にゲルを挿入し、ゲル中の分子を電気泳動によって分子サイズ別に分離する。分子サイズ別の蛍光標識付ターゲット分子濃度を２枚のガラス基板の間を通過するレーザ光によって励起し、蛍光計測によって分子サイズ別の濃度を定量する。
【０００６】
また、非特許文献１及び特許文献２〜６に開示されている方法では、蛍光の計測方向とレーザ光の入射方向が垂直に設定されている。特許文献７〜９には、電気泳動は用いないが、レーザ光励起方向と蛍光の計測方向が垂直である構成が開示されている。特に特許文献７には、蛍光を測定しようとする蛍光物質あるいは蛍光物質を含む試料は試料セルに充填され、レーザ光は試料セルの一方の端から入射し、内部を通過して他方の端から出射する。試料セルはレーザ光の進行方向に沿って長い形状であり、ガラス等の透明材料で形成される。本構成を用い、パルス励起光の出力タイミングに同期した信号に基づいて、蛍光強度の積算値をパルス励起光と略直交する方向から検出し、蛍光寿命を算出することが記載されている。特許文献８、９にも、２枚のガラス板の間にゲルを充填し、レーザ光をガラス板の端からゲル内部に入射することが記載されている。この構成でゲル中に存在する蛍光の濃度を計測する。特許文献１０には、光学測定チップ中にレーザ光を入射し、その蛍光測定の方向と入射レーザ光の方向を異なるようにする構成が開示されている。
【０００７】
一方、特許文献１には、ターゲットを含む試料溶液を平面上に保持し、試料溶液の裏面又は上面からレーザ光で励起することによって、蛍光標識付ターゲット分子からの蛍光を検出するシステムが開示されている。特に、このシステムでは、多くの試料溶液中のターゲット濃度を蛍光検出によって定量するために、検出器に対して試料がスキャン（移動）可能となるようにすることが開示されている。
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５２８７１４号公報
【特許文献２】特開昭６３−０２１５５６号公報
【特許文献３】特開平０７−１３４１０１号公報
【特許文献４】特開平０８−１０５８３４号公報
【特許文献５】特開平０９−０４３１９７号公報
【特許文献６】特開平０９−２１０９１０号公報
【特許文献７】特開平０９−２２９８５９号公報
【特許文献８】特開平１０−５１３５５５号公報
【特許文献９】特開平１０−５１３５５６号公報
【特許文献１０】特開２００３−１７７０９７号公報
【非特許文献１】Analytical Chemistry, Vol.74, No.19, 5033(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、極微量な生体物質を増幅せずに短時間で正確に定量することである。特に、定量したい生体物質を蛍光標識し、標識された生体物質をカウントすることによって定量する方式において、単位時間当たりの計測体積を増加させ、計測する体積中の分子をできるだけ漏れなくカウントすることによって正確に定量することを課題とする。
【００１０】
非特許文献１に開示された構成は、ターゲットを電気泳動によって動かすことによって、試料溶液中のターゲット分子数を計測しているが、一定時間に計測できる溶液の体積はターゲットの移動平均速度を向上させることによって実現できる。しかし、以下のような理由でターゲット移動平均速度を大幅に上げることはできない。まず、ターゲット移動平均速度（一般には蛍光標識付ターゲット分子の移動平均速度）を上げると、露光時間が維持されている状況では点状に見えていた蛍光標識ターゲットは露光時間中に１ピクセル以上移動するため、像は棒状となり、１ピクセルあたりの蛍光量が低下するため感度が低下し、計測できなくなってしまう。また、露光時間を短くして、像が棒状にならないようにすると当然蛍光量が少なくなってしまい、感度が低下し測定できなくなってしまう。このとき、蛍光量の低下を防ぐために励起レーザ強度を増せば良いが、十分安価で小型のレーザ光源では強度も制限されている。それゆえ、移動平均速度を大幅に高速化して単位時間あたりの計測体積を増やすことはできない。
【００１１】
また、非特許文献１に開示された構成では、レーザ光の照射方向と垂直な方向にターゲットを移動させ、試料溶液中の蛍光標識付ターゲット分子の蛍光像をＣＣＤで一定の時間間隔で取得する。この時間間隔をフレーム時間とすると、フレーム時間中にターゲットが移動する距離を計測している画像に対応する溶液領域のターゲットの移動と平行方向の長さよりも短くしなければ、計測できないターゲット分子が発生し、ターゲット分子数が少ない場合には正確な定量ができなくなってしまう。また、ＣＣＤで取得した画像データを外部に出力するための時間も画像サイズに比例して長くなるが、フレーム時間よりも短くなくてはならない。このことは、仮に十分な感度が得られたとしても、データ転送時間に制限されて単位時間あたりの計測体積が拡大できくなることを示している。
【００１２】
特許文献１に開示されている構成の場合、試料へのレーザ照射領域の面積に反比例してレーザ励起密度が低下するため、感度を維持したまま広い計測領域を確保することが困難である。その理由は、レーザの試料溶液への入射方向と蛍光の計測方向が一致しているため、レーザ照射領域を拡大すると必然的に励起強度密度が低下するからである。実際、特許文献１の実施例１では、レーザ照射領域は１００〜１００００ｍｍ2程度である。これ以上レーザ照射領域を拡大すると、ＳＮ比が低減してしまい、一つのターゲットに標識された蛍光体又は蛍光体群からの蛍光計測が難しくなる。
【００１３】
特許文献２〜６では、電気泳動によって分子サイズごとに分離された蛍光標識付ターゲット分子の濃度を蛍光強度によって計測する。それゆえ、試料溶液中の分子の移動平均速度が分子サイズや電荷量によって変化するように、分子の移動平均速度に差異がでるようにするゲルなどの手段が試料を保持するためのセル（ガラス板）の間になければならない。ここで試料がセル中を移動したときに、ゲルはセルに対して本質的には止まっていなければならない。それゆえ、特許文献２〜６においては、セル中を試料溶液が移動するときにはセル中での試料溶液は均一ではない。均一ではないようにすることによって、特定の分子を分離して検出することが可能になる。特許文献８、９においても、特許文献２〜６と同様に２枚のガラス板の間に電気泳動を行うためのゲルが挿入されていることが必要であり、２枚のガラス板中の試料溶液は均一ではない。
【００１４】
特許文献７は、蛍光物質の寿命を測定するのが目的であるため、パルスレーザを用い、試料セル中にレーザ光を伝播させ、励起開始時間の異なる蛍光の強度の分布を計測する。そのため、試料溶液を励起レーザ光に対して垂直方向に移動させる手段はない。特許文献１０では、レーザ光の照射方向と蛍光の計測方向を垂直にしている。しかし、光検出器は蛍光の強度と波長を測定するものであり、単分子計測が可能なように蛍光強度の分布又は蛍光分子像を計測するものではない。
【００１５】
以上の通り、従来の技術では、単分子計測に際して、一定時間に広範囲の試料を高精度に測定することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明では、フローセルの高さより幅が広い偏平な流路に蛍光標識付分子を含有する試料溶液を流し、試料溶液の流れる方向にほぼ垂直に細いレーザ光を照射して蛍光標識を励起する。長辺方向にＭ個、短辺方向にＮ個（Ｍ＞Ｎ）の光検出ピクセルからなる長方形の受光部を有するＣＣＤ等の光検出デバイスを、受光部の長辺方向を励起光の伝播方向に合わせて配置し、励起領域の像を対物レンズによって光検出デバイスの受光部に結像させ、光検出デバイスから出力される１次元像を時系列的に結合することにより２次元蛍光画像を生成する。
【００１７】
このとき、Ｍ×Ｎ個の光検出ピクセルの露光時間Texpよりも、その露光時間Texp内にＭ×Ｎ個の光検出ピクセルで受光した露光量から変換された電荷量のデータを光検出デバイスの外部に出力する時間Ttransの方が短くなるような条件で測定する。
【００１８】
別な態様では、光検出デバイスが露光時間Texp内にＭ×Ｎ個の光検出ピクセルで受光した露光量から変換された電荷量のデータを１つの単位として光検出デバイスの外部に出力し、フローセルの流路の励起光が照射されている領域を流れている試料溶液の平均速度をｖ、光検出ピクセルの短辺方向の長さをｌｐ、対物レンズの倍率をｍ、光検出デバイス上で１つの蛍光標識が長辺方向に複数の光検出ピクセルにまたがって検出され、その平均光検出ピクセル数をｎｓとするとき、次の条件を満たすようにする。
（ｎｓ×ｌｐ）／（ｍ×Texp）≦ｖ≦（Ｎ×ｌｐ）／（ｍ×Texp）
【００１９】
また、本発明の別な態様では、光検出デバイスから出力された一次元像を時系列に並べることにより生成した２次元蛍光画像中での蛍光像の大きさ又は強度を計測する計測手段を有する。光検出デバイスの受光部の各光検出ピクセルは、所定の周期で、短辺方向の上流側に隣接する光検出ピクセルがない場合には受光によって発生した電荷を短辺方向の下流側に隣接する光検出ピクセルに順次転送し、短辺方向の上流側に隣接する光検出ピクセルがある場合には当該上流側に隣接する光検出ピクセルから転送されてきた電荷と自らの受光によって発生した電荷とを合わせた電荷を短辺方向の下流側に隣接する光検出ピクセルに順次転送し、最終段において、順次、Ｍ×１個の一次元配列データとして光検出デバイスの外部に出力し、更に、計測手段によって計測された２次元蛍光画像中での蛍光像の大きさ又は強度に基づいて、前記転送の周期あるいは試料溶液導入部による試料溶液の流速を調整する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によると、化学増幅を用いることなく試料溶液中の微量のターゲット分子の定量を短時間で行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２２】
図３は、高スループットな単分子計測を実現する本発明の蛍光測定装置の構成例を示す概略図である。また、図４は、試料フローセルの一例を示す概略斜視図である。
【００２３】
Ａｒ+レーザ等の励起用レーザ光源１からのレーザ光５を、均一試料溶液が流れているフローセル１０５の内部に照射し、標識付ターゲット分子からの蛍光をライン状ＣＣＤ素子２４で計測する。ここで均一な試料溶液とは、空間的に分子の種類や濃度が均一であることを意味する。また、ライン状ＣＣＤ２４は、図１に示したＣＣＤ８と異なり、光検出ピクセルの配置が正方形でなく長方形の形をしており、長方形の長尺方向のピクセル数が多いＣＣＤである。シャッタ２によって露光時間を適切に調節して、標識付ターゲット分子を励起する。なお、ほぼ連続的な露光を実現するために、シャッタは用いずに露光時間のタイミング、及び長さの制御を、制御系９から信号線１０を通して実行してもよい。励起レーザ光５はレンズ２０７によって集光され、フローセル１０５の内部（試料溶液が流れている部分）でほぼ平行光にされる。このときレーザ励起密度は、レーザスポット幅１１７（この長さをＬｓとする）に反比例する。ライン状ＣＣＤカメラ２３で撮像する線状の領域内の標識付ターゲット分子４を励起するため、励起レーザ光５のビーム形状は、蛍光標識付ターゲット分子の移動方向１７２に引き伸ばさず、円形とした。
【００２４】
図４に示した試料フローセル１０５は２枚の石英基板１３１，１３２から構成されている。試料溶液は、シリンジ及びシリンジポンプから構成される流速制御部２１によって流速が制御されて、ガラスキャピラリ２７１を通って試料流路入り口１６４からフローセル１０５に入り、試料流路部１６３を流れる。流速制御部２１は、標識付ターゲット分子が試料流路部１６３のライン状ＣＣＤ２４で計測している領域を平均速度ｖで流れるように制御する。
【００２５】
サンプルフローセル１０５に入射されたレーザ光は２枚の石英基板１３１，１３２の間を伝播し、その２枚の石英基板の間を流れる試料溶液中の蛍光標識付ターゲット分子に結合している蛍光体を励起する。光の伝播距離は数ｍｍ程度までは長くできるので、照射領域をレーザ光伝播方向へ拡大し、スループットを向上させることができる。発生した蛍光は対物レンズ６によって集光され、ライン状ＣＣＤ素子２４上で結像する。ライン状ＣＣＤ素子２４の光検出ピクセルは、励起レーザ光の進行方向に平行な方向にＭ個配置し、標識付ターゲット分子４の移動方向１７２に対して垂直にこのＭ個の光検出ピクセルが並ぶようにした。ターゲット分子の移動方向に平行な方向のピクセル数はＮ（Ｍ＞Ｎ）である。
【００２６】
ライン状ＣＣＤ素子２４からの蛍光イメージデータは、信号線１１を通してライン状ＣＣＤ２４の外部に出力される。このような構成で蛍光標識付ターゲット分子４からの蛍光強度分布像をライン状ＣＣＤ素子２４によって時間的なロスなく連続的に取得し、この１次元像を時系列的に並べることによって２次元蛍光強度分布像（以下、２次元蛍光像）を再構成する。得られた２次元蛍光像から蛍光標識付ターゲット分子数を粒子計数部２６にてカウントし、結果が制御コンピュータ９に出力される。制御コンピュータ９では、サンプルフローセル中を通過した試料溶液の体積と計測できた蛍光標識付ターゲット分子の数の比からターゲット分子の濃度を計測する。また、蛍光計測を終了した標識付ターゲット分子は、サンプルフローセルを通過した後、試料流路出口１６５からガラスキャピラリ２７２を通って廃液溜２２に入り、回収される。
【００２７】
サンプルフローセルの作製方法の一例について説明する。２枚の石英基板１３１，１３２の間に流路を形成するため、基板１３２の流路になる部分をエッチングによって凹ませる。基板１３１には試料溶液の入口と出口となる穴１６４，１６５を設け、基板１３２と張り合わせた後、接着する。基板１３２のエッチングしない領域は、励起レーザ光を試料溶液に照射するための窓の役割を担っているため、その内壁及び外壁面は平坦な鏡面とする。図２１は、サンプルフローセルの上面図である。試料溶液は流入口１６４から入り、流路部１６３をフローしたあと、試料流路出口１６５から排出される。
【００２８】
サンプルフローセルの幅１１９は、非特許文献１の場合に比較して、レーザ照射領域を大幅に拡大するためとセルの扱いやすさの観点から、数ｍｍ以上に設定した。また、サンプルフローセル１０５の長さ１２１は、計測する試料体積とは無関係に決定できるため、コストや扱い安さの観点から数ｃｍに設定した。レーザ励起スポット幅１１７は１００μｍ幅から２０μｍ幅へ縮小し、レーザ励起密度を５倍向上させ、後述するようにして、スループットを５倍向上させることができるようにした。
【００２９】
次に、本発明による単分子計測の高スループット化の方法について説明する。単分子計測においては蛍光標識付ターゲット分子一分子からの蛍光を計測しなければならないため、光の計測系は高感度でなくてはならない。すなわち、露光時間Texpに、蛍光体とレーザパワー及び検出系の量子効率から決まる下限値Texpminが存在する。この単分子計測可能という条件を満たすと同時に、高スループット化しなければならない。スループットを向上するためには、後に示すようにフロー平均速度を増さなくてはならない。励起レーザ照射幅１１７をＬｓとし、標識付ターゲット分子の平均速度ｖとしたとき、レーザ照射幅を通過する時間TcrossはTcross＝Ｌｓ／ｖである。蛍光の取り込み時間はTcrossが最大であるから、Texp≦Tcrossである。
【００３０】
また、全ての蛍光標識付ターゲット分子を計測するためには、１フレームの画像をとり始めて次のフレームを取り始めるまでの１周期の時間Tframeは、Tcrossよりも短くなければならない。それゆえ、単分子計測特有の課題である、全ての分子を計測すると同時に最大限に蛍光を取り込むことを両立するためには、Tframe＝Texpでなければならない。しかし、一般にこの条件を満たすことができない。この条件を満たすためには、１フレームの画像データを素子外へデータ転送する時間Ttransが露光時間Texpよりも短くなくてはならない。この条件が満たされているとき、図５に示すように露光時間Texpと１フレームの時間Tframeを一致させることができる。逆にデータ転送時間Ttransが露光時間Texpよりも長い場合で最大限のスループットを得るためにTexp＝Tcrossとしている場合には、全ての分子を計測できなくなってしまうし、逆に全ての分子を計測するためにTframe＝Tcrossとする場合にはTexp＜Tcrossとなり、標識付ターゲット分子からの蛍光を最大限とりこむことができなくなり感度が低下することになる。すなわち、Ttrans＜Texpが成り立つ場合には、露光時間Texpの最小値がフロー平均速度の最大値を決定し、vmax＝Ｌｓ／Texpminである。いま、ライン状ＣＣＤ２４のフローに平行な方向の光検出ピクセル数をＮとし、フローに垂直な方向の光検出ピクセル数をＭとし、１秒間のデータ出力ピクセル数、すなわち、データ転送レートをｆ［Ｈｚ］とすると、データ転送時間が露光時間よりも短く、フロー平均速度が最大値をとるための条件は下式(1)となる。
ＭＮ／ｆ≦Texpmin      (1)
【００３１】
次に、式(1)が成立し、フロー平均速度最大の時にスループットが最大値をとることを確かめる。いま励起レーザパワーの最大値をImax［Ｗ］とし、蛍光体及び検出系を合わせたシステムの感度は検出できる最低エネルギー密度Eexmin［Ｊ／ｍｍ2］とする。全ての分子を計測するときのフロー平均速度の最大値vmaxは、４Imax／（πＨvmax）＝Eexminを満たしていなくてはならない。ここで、Ｈは励起レーザ断面のフローに垂直方向の軸の長さである。また、ライン状ＣＣＤ２４のフローに平行な方向の１光検出ピクセルに対応するサンプルフロー中の長さをｌｐとし、フローに垂直な方向の１光検出ピクセルに対応する長さをｗとすると、フロー中のライン状ＣＣＤ２４に対応する面積はＳ＝ＭＮｗｌｐであるから、スループットＴｐはＴｐ＝ｖＭｗＨである。よってスループットの最大値はTpmax＝vmaxMwH＝４ImaxＷ／（πExpmin）である。ここでＷ＝Ｍｗは、ライン状ＣＣＤ２４の視野のフローに垂直な方向の長さすなわち計測領域幅である。スループットの最大値はレーザスポットサイズには依存せず、レーザの強度Imax及び蛍光体の吸収断面積・発光効率・光学系の量子効率及びＣＣＤの感度（最低受光エネルギー）で決まるTexpminと、計測領域幅Ｗのみに依存する。このことは、計測領域幅を固定すれば、スループットを向上するためには蛍光標識を変えるか、ＣＣＤを変えるか、レンズ系の明るさを変えるしかなく、式(1)の条件を満足することによってスループットは最大値をとることができることを示している。
【００３２】
また、光検出ピクセルのサイズｗは蛍光像のサイズ即ち蛍光の波長程度の大きさ程度にすべきであるから、式(1)の条件が満たされている場合にはスループットはＭに比例する。よって、同じ式(1)より、ＮはＭより小さいことが必要である。それゆえ光検出デバイスとしては、フローに垂直方向を長辺とするライン状ＣＣＤ２４が必要である。
【００３３】
言うまでもなく、本発明においては蛍光像を取得しなければならないため、光検出ピクセル数は複数でなければならないから、ライン状ＣＣＤ素子２４について、式(2)で示す条件をみたしていなければならない。
２≦Ｎ×Ｍ≦Texp×ｆ，  Ｍ＞Ｎ        (2)
【００３４】
次に、重要なことは、蛍光標識付ターゲット分子がある平均速度で流れており、スループットを向上するために平均速度を増大させると、検出できる蛍光量が低下し、感度が低下する可能性があることである。蛍光標識付ターゲット分子の検出感度を低下させないためには、蛍光標識付ターゲット分子の平均速度について、以下に示すある条件が成り立っていなければならない。
【００３５】
上記説明から明らかなように、励起用レーザ光を十分細く絞ることができる場合には、ｆを向上させることが困難な状況でスループットを最大化するための最良の方法はＮ＝１とすることである。
【００３６】
次に、この条件を満たす蛍光検出装置の別の構成例を示す。この構成例は、光検出デバイスを前記と同様に複数の光検出ピクセルで構成し、試料流路部を流れる試料中の蛍光標識付ターゲット分子の平均速度の平均値をｖ、光検出ピクセルの流速に平行な方向の一辺の長さをｌｐ、フローセルで発生した蛍光を光検出デバイス上で結像させる光学系の倍率をｍとし、光検出デバイスのフローに垂直な方向のピクセル数をＮとするとき、次式(3)を満たすことが必要である。
（ｎｓ×ｌｐ）／（ｍ×Texp）≦ｖ≦（Ｎ×ｌｐ）／（ｍ×Texp）      (3)
【００３７】
ここで、ｎｓは光検出デバイス上で蛍光標識付ターゲット分子がフローと平行方向に複数のピクセルにまたがって検出されるとき、その平均ピクセル数をさす。より正確には、個々の蛍光標識付ターゲット分子の像の中心付近の蛍光量ピーク値の半分をとる全半値幅を、流速とは垂直方向のピクセル数で表わした数値である。蛍光標識付ターゲット分子は、露光時間中のブラウン運動や前記光学系の結像が完全でないことが原因で流速とは垂直方向にも実際の分子のサイズよりも大きなスポット状の像として観測される。
【００３８】
上記条件式(3)の意味を説明するために、フロー平均速度と感度の関係を次に示す。図６に、露光時間中に１ピクセルを移動する平均速度が１になるように規格化した粒子の平均速度を横軸にとり、破線でスループットを示した。また、実線で蛍光検出量すなわちシグナル量と蛍光検出時のＳＮ比を示した。ここでスループット、シグナル量及びＳＮ比は、蛍光標識付ターゲット分子の平均速度１の時の値を１となるように規格化した数値である。また、図６中の範囲２０９は式(3)の条件を満足する範囲を示している。この範囲は、ｎｓ＝３，Ｎ＝２０の場合の前記各量の平均速度依存性を図示している。ｎｓ＝３は典型的な数値であり、一般にはｎｓは２〜数十の値をとる。Ｎ＝２０は式(3)の条件の範囲が見易くなるように選んだのであり、他の数を選んでもよい。また、図６中の点線２０８は非特許文献１の電気泳動平均速度に対応し、１．８の値を示している。
【００３９】
図６中に示されているスループットは、蛍光標識付ターゲット分子の平均速度に比例している。これは図６で描かれた平均速度範囲で式(2)の条件を満たしていると仮定しているためである。一般には式(2)の条件はある速度で満たされなくなる。このときスループットは一定値を示すようになり、それ以上は上昇しない。すなわち、高スループット化を実現するためには式(2)と式(3)の条件が同時に満たされることが望ましい。
【００４０】
次に、式(3)の条件の下限について説明する。これは露光時間中に光検出ピクセルｎｓ個だけ移動する平均速度に対応する。まず、シグナル量と平均速度との関係について説明する。露光時間中に蛍光標識付ターゲット分子が移動しても光検出デバイスに対応する試料流路部の領域の中に納まるような遅い平均速度で移動している場合には、複数の光検出ピクセルで検出された蛍光量を全て足し合わせることによって一定のシグナル量を得ることができる。すなわち、図６中でＮ＝２０に対応して、平均速度２０以下ではシグナル値は一定に保たれる。しかし、式(3)の条件の上限を超えると、露光時間中の蛍光を全て計測することができなくなり、平均速度が増すに従って急激にシグナルが低下する。よって蛍光標識付ターゲット分子の平均速度は式(3)の条件の上限値よりも小さくなくてはならない。また、ＳＮ比についても上限を超えるとシグナルの低下に対応して急激に劣化するが、式(3)の条件の範囲内では、平均速度が速い方がその平均速度の平方根に反比例して緩やかに低下する。ここでＳＮ比の定義は、前記シグナルと、蛍光標識付ターゲット分子の像がない領域、すなわちバックグラウンドの揺らぎの標準偏差との比である。ＳＮ比は平均速度の増大にともなって、蛍光像の面積が拡大し、面積に比例してバックグラウンドは増大するため、バックグラウンドの標準偏差は面積の平方根に比例して増大する。よって、ＳＮ比は平均速度の平方根に反比例して減少する。
【００４１】
一方、下限値よりも遅い平均速度で移動させた場合には、蛍光標識付ターゲット分子の光学系の結像のボケによって、像の面積は変わらずＳＮ比は変化しない。非特許文献１における平均速度は１．８であり、ブラウン運動による揺らぎが０．３以下である。このとき蛍光標識付ターゲット分子の平均速度（文献中では移動）やブラウン運動（文献中では拡散）によるボケが問題にならないと記載されている。それゆえ、像のもともと持っているボケの量が前記平均速度よりも大きいことを示している。実際、図９は非特許文献１と同様の光学系で測定した像であり、ｎｓは３〜５程度であることから、このことを裏付けている。式(3)の条件の平均速度範囲は、ＳＮ比は平均速度の平方根に反比例して低下し、スループットは平均速度に比例して増大する領域である。平均速度に対するスループットの依存性の方が大きいため、蛍光検出器としてのトータルの性能、すなわち、単位時間に計測できる分子数を増大させることができる。
【００４２】
実際、非特許文献１ではＭ＝２００、Ｎ＝２００、Ｖ＝１．８であるが、Ｎを４０にすることによってレーザ照射領域を１／５にし、励起密度を５倍向上することができる。このときＳＮ比は√５倍向上する。一方、この条件下で平均速度を５倍上げるとＳＮ比は１／√５になるが、前記励起密度向上の効果と相殺して、ＳＮ比は変化しない。よって、Ｎを２００から４０に変えることよって平均速度を５倍向上することができる。このようにできた理由は、スループット向上の効果がＳＮ比向上の効果を上回っているからである。なお、条件(2)を超えて平均速度を上げた場合には、上記感度維持は不可能である。
【００４３】
また、平均速度が式(3)の条件の下限より遅い場合には、同じ蛍光体が何度も励起され、蛍光体が劣化する（蛍光強度が低下する）ことがあるため、この平均速度範囲はこの理由でも適切でない領域でもある。
【００４４】
スループットを向上するための別の構成例は、光検出デバイスを前記と同様に複数の光検出ピクセルで構成し、試料流路部を流れる試料中の蛍光標識付ターゲット分子の平均速度の平均値をｖ、光検出ピクセルの流速に平行な方向の一辺の長さをｌｐ、試料流路部で発生した蛍光を光検出デバイス上で結像させる光学系の倍率をｍとするとき、ターゲット分子の平均速度と向きにあわせて、光検出ピクセルで変換された電気信号を１ラインごとに転送しながら、光検出する。この１ラインの１ピクセル分の移動時間をＴｆとするとき、次式(4)の条件が凡そ満たされているようにする。
ｖ＝ｌｐ／（ｍ×Ｔｆ）        (4)
【００４５】
本構成では光検出と光検出デバイス内でのデータ転送が、蛍光標識付ターゲット分子の平均速度に合わせて同時に実行されるようになる。すなわち、蛍光標識付ターゲット分子の移動にあわせて、検出した電気信号を加算して移動させるため、光検出デバイスを通過する時に発生する蛍光は全てほぼｎｓ個のピクセルに平均速度にほとんど関係なく入射させることができる。そのため、余分なバックグラウンドによるノイズを取り込むことがなくなる。よって、ＳＮ比を変えずにスループットを向上することができるのである。すなわち、図６に示した式(3)の条件の平均速度領域においてもＳＮ比を低下させることなく平均速度を増すことができる。逆に、データ転送の速度とターゲット分子の速度がずれている場合には、速度がずれるにつれて蛍光標識付ターゲット分子の像は平均速度方向にのび、像の面積が大きくなってしまう。したがって、蛍光は全て計測することはできても、像の面積が増加した分だけ、バックグラウンドの影響が大きくなり、ＳＮ比が低下する。一方、このような検出を実現するためには、光検出デバイス外部へのデータ転送時間は前記流速に合わせたピクセル間のデータ転送時間よりも短くなくてはならないから、次式の条件が満たされている必要がある。
Ｔｆ≧Ｍ／ｆ        (5)
【００４６】
ただし、最も好適な条件は、スループットを最大化する式(5)で等号が成立する場合である。本構成においては、式(1)が式(5)に、式(3)が式(4)に対応する。
【００４７】
スループットを向上するための別の構成例は、前記条件式(2)〜(5)の少なくとも一つを満足すると同時に、フローセルの内部で生じる蛍光を検出部に集光・結像させる対物レンズを有し、対物レンズの開口数が０．７５よりも大きくする。
【００４８】
蛍光標識は一般に、その崩壊断面積と発光断面積の比から、１つの蛍光体が発することのできる光子の数がきまる。たとえば、ＦＩＴＣの場合には２８００個程度の光子しか放出することができない。１つの標識付粒子が３×３ピクセルに結像したとすると、１ピクセルあたりには９１０個程度である。単分子計測するためには、少なくともＳＮ比＝１０以上が必要である。背景光によるノイズが無視でき、光検出デバイスとして最も高感度なＣＣＤを使ったとしても、その読み出しノイズはフォトン８個程度はあるため、光検出デバイスの量子効率は最大９０％であることを考慮すると、対物レンズの光子取り込み効率は１０％以上でなければならない。この１０％の取り込み効率を実現するためには、ＮＡは０．６以上でなければならない。
【００４９】
スループットを向上するための他の構成例は、前記条件(1)〜(3)を満足すると同時にフローセルの内部で生じる蛍光を検出部に集光・結像させる対物レンズを備え、λを蛍光の中心波長とするとき、光検出ピクセルの一辺に対応する試料流路の長さｗ／ｍが次式(6)を満たすようにする。
ｗ／ｍ≦λ        (6)
【００５０】
通常、蛍光標識の波長は３００〜７００ｎｍ程度であり、前記光学の分解能は波長と同程度であると考えられる。この光学系の分解能より光検出ピクセルを大きくとると、蛍光以外の背景光を多く１つの光検出ピクセルの中に取り込みやすくなるため、ＳＮ比が低下する。よって、条件式(6)が成立していなければならない。
【００５１】
スループットを向上するための別の構成例は、フローセルと、フローセルに均一な試料溶液を流す手段と、フローセルに励起光を照射する光照射部と、フローセルの内部で生じる蛍光を検出する検出部とを具備し、前記条件式(2)〜(5)のいずれかを満たし、蛍光標識付ターゲット分子からの蛍光を検出部で画像化し、得られた蛍光強度分布画像から蛍光標識付ターゲット分子数を計数する手段である粒子数計数部を有する。ここで蛍光強度分布画像とは蛍光強度分布像のことを指し、光検出デバイスに対応する１枚の画像をこの像を得た時系列順に並べた画像、一連の画像群及びこの画像群に対してなんらかの信号処理操作を行った画像群のことを指す。
【００５２】
本構成では、粒子数計数部において得られた蛍光強度分布画像から蛍光標識付ターゲット分子の数をカウントし、サンプルフローセル中を通過した試料溶液の体積と計測できた蛍光標識付標識付分子の数の比からターゲット分子の濃度を計測する。ここで、蛍光標識付ターゲット分子の数をカウントする方法として典型的なものは、次のようなものである。蛍光標識付ターゲット分子は、蛍光強度分布画像の中でスポット状の電気信号値のピークとして表されている。ある一定の閾値以上のピーク値を持つスポットの数をカウントすることによって、蛍光標識付ターゲット分子の数をカウントすることができる。
【００５３】
本発明による蛍光検出装置の別の構成例は、フローセルと、フローセルに均一な試料溶液を流す手段と、フローセルに励起光を照射する光照射部と、フローセルの内部で生じる蛍光を検出する検出部とを具備し、前記条件式(2)〜(5)を満足すると同時に蛍光を分光するための素子有する。分光素子によって波長の異なる光が流速方向と垂直方向に分解されるのが好ましい。
【００５４】
本発明の蛍光検出装置の別の構成例では、前記式(2)〜(5)を満たすように構成された蛍光検出装置におけるフローセルがシースフローセルになっている。
【００５５】
図７は、本発明による蛍光測定装置の他の構成例を示す概略図である。また、図８は、サンプルフローセルの他の例を示す概略斜視図である。
【００５６】
この蛍光測定装置のＣＣＤ光検出デバイス２８は、条件式(2)を満たしている。図５に示すようなほぼ連続的な露光を実現するために、露光時間のタイミング及び長さの制御は、制御系９から信号線１０を通して実行する。また、ＣＣＤカメラ２９で撮像する領域の形状は流速方向を短辺とする長方形が好適である。なぜなら、上記式(1)を満たして、かつ、スループットを向上するためにはＭを大きくしてＮを小さくした方がよいからである。よって、励起レーザ光のビーム形状は、ターゲット分子の移動方向に平行な方向に引き伸ばす必要はない。ビーム形状は楕円ではなく、円形でよいので、レーザ光は単一のレンズ２０７で集光した。ここでＣＣＤ光検出デバイス２８はＭ＝１００、Ｎ＝２０、ｆ＝１ＭＨｚ、Texp＝１８ｍ秒、１フレーム時間を２０ｍ秒とした。また、ここでの受光部の光検出ピクセルの数は、光検出デバイス全体の数とは関係なく、自由に設定することが可能である。たとえば上記、Ｍ＝１００、Ｎ＝２０の受光部を実現するために光検出デバイス内のピクセル数は１０００×５００ピクセルであってもよい。
【００５７】
図８は、フローセルの他の例を示す概略斜視図である。図７中では１０６に対応する。このフローセル１０６は、図４に示したフローセルとは異なり、１枚の石英基板１３７を切削することによって作製する。石英基板１３７の中央付近を矩形状に切削し、試料流路部１６３を形成する。また、フローセル１０６に入射されたレーザ光は、試料流路部の上側の壁と下側の壁の間を多重反射しながら伝播し、上記試料流路部を流れる試料溶液中の蛍光標識付ターゲット分子４に結合している蛍光体を励起する。これによって、照射領域のレーザ伝播方向への拡大が実現できる。発生した蛍光は対物レンズ６によって集光し、長方形状ＣＣＤ素子２８上に結像させる。長方形状ＣＣＤ素子２８は長尺方向を励起レーザ光の照射方向に平行に配置し、蛍光標識付ターゲット分子４の移動方向１７２に対して垂直に光検出ピクセルが並ぶようにした。標識付ターゲット分子が含まれる試料溶液は、一定の流速で試料流路部１６３を流れるようにシリンジ及びシリンジポンプから構成された流速制御部２１で制御する。このような構成で、蛍光標識付ターゲット分子からの蛍光強度分布像を長方形状ＣＣＤ素子２８によって時間的なロスなく連続的に取得し、これらの像を時系列的に並べることによって、蛍光強度分布画像を再構成する。得られた蛍光強度分布画像から蛍光分子数をカウントし、フローセル中を通過した試料溶液の体積と計測できた標識付ターゲット分子の数の比からターゲット分子の濃度を計測する。また、蛍光計測を終了した標識付ターゲット分子はフローセルを通過し、廃液溜２２にて回収する。
【００５８】
図７に示したフローセルの詳細を説明する。試料流路部１６３の厚さは、試料溶液と石英基板との間の多重反射によって効率的に励起レーザを伝播させるために２５μｍに設定した。試料流路部２枚の石英基板のうちの一枚には、試料流路部の入口１６４及び出口１６５となる穴を設けた。サンプルフローセルの幅１１９は、非特許文献１の場合に比較して、レーザ照射領域を大幅に拡大するために数ｍｍ以上に設定している。また、フローセル１０６の長さ１２１はサンプルセルとは異なり計測する試料体積とは無関係に決定できるため、コストや扱い安さの観点から数ｃｍに設定している。
【００５９】
レーザ励起スポット幅１１７は５０μｍ幅から１０μｍ幅へ縮小し、レーザ励起密度を５倍向上させ、スループットを５倍向上させることができるようにした。
【００６０】
以下、具体的な実施例に基づいて本発明を説明する。
【実施例１】
【００６１】
本実施例では、図３に示す蛍光検出装置を用いた。サンプルフローセルは、図４に示すものを用いた。Ａｒ+レーザ光源１から出射されたレーザ光を焦点距離３１ｍｍのアクロマティックレンズ２０７によって集光し、スポット径２０μｍまで絞る。この状態でサンプルフローセル１０５にレーザ光を入射させ、図４中の２枚の石英基板１３１，１３２の間の試料流路部１６３の中を伝播させる。レーザ光は試料流路部１６３で標識付ターゲット分子４を励起し、蛍光を発生させる。励起レーザ光が基板１３１，１３２と溶液の界面で散乱しないように、試料流路部の厚さは５０μｍとし、スループット向上のために試料流路部の幅Ｗを２５０μｍとした。試料流路部１６３の厚さ、すなわち基板１３２に形成した凹みの深さは２５μｍとした。サンプルフローセルの幅１１９はハンドリング及び機械的強度を保持するために３．２ｍｍに設定した。こうして、レーザ励起スポット幅１１７は１００μｍ幅から２０μｍ幅へ縮小し、レーザ励起密度を５倍向上させ、スループットを５倍向上させることができるようにした。
【００６２】
発生した蛍光は、倍率２０倍、開口数０．７５の対物レンズ６によってライン状ＣＣＤ素子２４上に結像させた。使用したライン状ＣＣＤ素子２４のピクセル数はレーザ光伝播方向に４５０ピクセル、これと垂直方向に２０ピクセルとした。さらにこの２０ピクセルは１ピクセルにＣＣＤ素子内でビニングする（蛍光によって発生した２０ピクセル分の電荷を１ピクセル分の電荷量としてまとめて、信号線１１を通して、データ合成部２５に転送する）ことによって、ライン状ＣＣＤ素子２４の光検出ピクセル数を４５０×１ピクセルとなるようにして、１次元蛍光像を出力した。標識付ターゲット分子４が検出領域を一定の流速で流れるように、シリンジ及びシリンジポンプから構成された流速制御部２１で制御して、試料流路部１６３を通過させる。
【００６３】
このように流速が一定の状態で、時間的なロスなくライン状ＣＣＤ素子２４から得られた蛍光像データを時系列的に並べることによって、２次元蛍光像をデータ合成部２５にて再構成する。このようにして得られた２次元蛍光像に基づいてターゲット分子数計数部２６で分子数をカウントし、フローセル中を通過した試料溶液の体積との比からターゲット分子の濃度を計測することが可能となる。このとき、粒子数計数部２６でのカウントは、次のように行った。まず、２次元蛍光像の例としては図９に示したような画像がある。画像中では蛍光強度が強いほど、白くなるように表現されているため、画像中の白い点が標識付ターゲット分子に対応する。黒い部分は分子がないバックグラウンドであるが、この領域もレーザ光が試料溶液に照射されることによって弱く光を発している。蛍光標識付ターゲット分子からの蛍光強度に比べて、その強度が小さいため、画像中では黒く表わされている。ターゲット分子数計測部では、バックグラウンドの蛍光強度を評価し、その差が適切に設定されていた閾値よりも大きい蛍光標識付ターゲット分子像に対応する白いスポットの数を数えることによって蛍光標識付ターゲット分子数の計数を実現している。
【００６４】
ライン状ＣＣＤ２４の駆動は、制御系９からトリガ（引き金）信号によって制御した。露光時は１８ｍ秒、データ転送時間は１５ｍ秒であり、これらの時間に対応する処理は図５に示したように同時に実行される。露光の後、データ転送の準備のためにライン状ＣＣＤ素子２４内でのデータ転送が必要であるが、このために必要な時間は０．５ｍ秒以下である。それゆえ、測定時間全体の２．５％だけが露光しないロスタイムとなっており、ほぼ連続的な露光を実現している。使用したＣＣＤの光検出ピクセル数はＭ＝４５０、Ｎ＝２０、ｆ＝１ＭＨｚ、Texp＝１８ｍ秒であるから、ＭＮ／ｆ＝９［ｍ秒］＜Texpであるので、条件式(2)を満足している。また、標識ターゲット分子のフロー速度ｖを５００μｍ／秒とした。この数値を規格化フロー速度に変換すると、１８であり、条件式(3)を満たしている。
【００６５】
図９は、データ合成部２５で合成された２次元分子蛍光の像である。試料は３．８ｋｂの二本鎖ＤＮＡにインターカレータＹＯＹＯ−１でラベルした溶液でＤＮＡ濃度は１０-12Ｍ、ＹＯＹＯ−１濃度は１０-9Ｍとした。
【００６６】
非特許文献１に開示されている方法では単分子計測のスループットは０．０５４μｌ／分であったが、本法によって、スループットは１．５μｌ／分以上に向上したことが確認された。これは、フロー速度が約５倍速くなったこと、及び試料流路部の幅が５０μｍから２５０μｍに５倍増加したことによる。もちろん、広がった試料流路部の全体を計測するために、Ｍは１００から４５０に増加させた。
【実施例２】
【００６７】
本実施例の蛍光検出装置は、実施例１と同様である。ただし、本実施例では、サンプルフローセルの基板にレーザ光を全反射させるための膜を設けた。このようなサンプルフローセルによれば、同じレーザ励起強度に対してレーザ励起密度を向上できるため、露光時間を短縮でき、スループット向上が期待できる。特に条件(2)が満たされている場合は測定時間中の露光時間以外のロスタイムの割合が小さいため、露光時間の短縮に反比例してスループット向上できるため、サンプルフローセルを構成する基板への全反射膜の付与の効果は大きい。
【００６８】
図１０に、サンプルフローセルの断面構造図を示す。２枚の石英基板１３１，１３２の間に試料溶液（試料）が流れており、アクロマティックレンズ２０７で集光したレーザビーム１１３が溶液中に入射し、伝播しながら蛍光標識を励起する。２枚の石英基板と溶液の界面でレーザ光が全反射することによって、溶液中を光が漏れることなく伝播できるようになるため、励起レーザ強度密度を向上させることができる。全反射を実現するためには、溶液より低屈折率の薄膜１６０を試料流路部１６３の領域に形成する必要がある。この低屈折率材料としてはフッ素樹脂が好ましい。本実施例では、アモルファス・フルオロポリマー（屈折率１．２９）を用いた。
【００６９】
低屈折率材料として適用可能な屈折率範囲は溶液の屈折率より０．１％以上小さく、１より大きければよい。屈折率の上限値は溶液の屈折率に依存している。標識付ターゲット分子４以外の塩や高分子の濃度によって、溶液の屈折率は１．３３〜１．３７程度まで変化する。使用する条件における溶液の屈折率の変動が小さい場合、使用する溶液の屈折率に対して０．１％以上小さい膜を形成し、励起レーザ光を２枚のガラス基板の間に伝播させることができる。０．１％以下の屈折率差の場合は、レーザの入射条件が厳しく現実的でない。屈折率差は大きい方が溶液屈折率変化への安定性が高く、望ましいが、蛍光体の励起に使われる波長領域で１より小さな屈折率を実現するためには光の吸収が伴うため不適当である。実際には１．２〜１．３５の屈折率範囲が好適である。
【００７０】
図１２を用いて、この低屈折率薄膜１６０の効果を説明する。このグラフはセル中に保持された溶液の厚さに対してサンプルセルへの入力レーザ強度を１０ｍＷと一定としたときの、励起強度密度の平均値を示している。実線は低屈折率薄膜がない場合、点線は低屈折率薄膜がある場合の励起強度密度を示している。溶液としては純水（屈折率１．３３）を仮定している。溶液の厚さが薄くなるほど、レーザ励起密度が向上することが分かる。レーザ励起密度が上がると蛍光分子の検出感度が向上する。また、溶液を薄くすると、蛍光以外のバックグランドノイズ（水のラマン散乱や溶液中の分子の散乱などによる散乱）の影響を相対的に小さくすることもできる。
【００７１】
なお、本実施例ではサンプルセル中に保持した溶液の厚さ（低屈折率の薄膜たる第１の層と第２の層との間隔）を１５μｍとした。試料溶液の厚さをあまり薄くしすぎるとレーザ照射体積が小さくなってしまい。スループットが低下するため、厚さを１５μｍ以上とすることが望ましく、１５μｍとした。しかし、ターゲットの計測感度は薄い方が高いため、用途に応じてスループットと蛍光標識の蛍光強度の兼ね合いから厚さを決定することになる。
【００７２】
また、上記の低屈折率膜１６０の替わりに誘電体膜（誘電体単層又は多層膜）を形成し、溶液とガラス基板の界面での反射率を向上することも、レーザ励起密度向上のために有効である。図１１は、最も簡単な構成として誘電体（単層）薄膜を反射膜に用いたサンプルセルの断面図である。上記低屈折薄膜（図１０の１６０）の換わりに基板の屈折率よりも屈折率の高い誘電体膜１６６を形成した。すなわち、２枚の基板の各々の向き合う面に各々第１の誘電体膜と第２の誘電体膜とを薄膜として形成した。
【００７３】
この場合、誘電体薄膜１６６と溶液との界面で全反射は起きず、かなりの強度の光が反射せずに通過するが、誘電体薄膜１６６の屈折率をガラス基板１３１，１３２の屈折率より高く設定しているため、誘電体薄膜１６６とガラス基板（１３１又は１３２）との界面で全反射がおきる。さらに試料溶液の厚さを比較的薄くして、光が反射するため、より高い励起レーザ密度を得ることができる。誘電体膜をＳｉＮ（屈折率１．９５、厚さ０．４μｍ）としたときの励起レーザ密度のデータを、図１２中に▲のプロットで示した。図１２から分かるように低屈折率薄膜を用いた場合よりは励起密度が低いが、ガラスのみを用いた場合よりは励起密度が向上している。
【００７４】
誘電体薄膜の屈折率範囲は基板であるガラスの屈折率より大きくしなければならないため、ガラス基板の屈折率が１．４５のとき１．４５以上の屈折率が必要になる。試料溶液の厚さは１５μｍとして良好なレーザ励起強度を得ることができる。試料溶液の厚さ範囲は１０〜３０μｍ範囲が最適である。また、上記誘電体膜を多層にすることも可能であることは言うまでもない。この場合、各々の誘電体膜は各々屈折率の異なる複数の層を具備してもよく、例えば各々が２層からなる場合には、溶液と接する層が基板と接する層よりも屈折率が高いものとしてもよい。多層化の最も簡単な場合は、上記誘電体膜と基板との間に屈折率の良く制御されたクラッド層としてＳｉＯ2層（屈折率１．４５）を厚さ１５μｍ挿入してもよい。こうすることよってより安定した全反射が得られる。
【００７５】
また、さらに複雑な場合として、たとえば、図１１において１６６の位置にガラス基板１３２側から３．６μｍのＳｉＮ層（屈折率１．９５）を形成し、その上に３．７μｍのＳｉＯ2層（屈折率１．４５）を形成し、その上に溶液が保持されるようにする。また、上側のガラス基板の表面には上下反転した順序で同様の２層を形成する。これによって９９％以上の高反射率を確保することが可能で、レーザ励起密度を向上することができる。上記の例は多層膜として二層より構成した反射膜を示したが、より多数の層を組み合わせて反射膜を形成してもよい。
【００７６】
このように誘電体膜を用いることのメリットは、溶液に接触する面を安定にたもち、試料溶液への不要な化学物質の混入の可能性を極力排除することが可能であることである。
【００７７】
また、図１０と図１１においてサンプルフローセルの入射部分に、ガラスとほぼ同じ屈折率の接着剤を用いて窓用ガラス板１３６を貼り付けている。これは石英基板１３２，１３１の側面にある凸凹を、ガラス板１３６を貼り付けることによって実質的になくし、サンプルフローセルへ入射時に前記凸凹によって光が散乱し、溶液中まで伝播する光強度が減衰するのを防ぐためである。
【００７８】
本実施例のサンプルフローセルを用いることによって感度が向上し、同じＹＯＹＯ１の蛍光体を用いても露光時間Texpを短くすることができ、スループットを向上することができた。実際には露光時は４ｍ秒、データ転送時間は３ｍ秒であり、これらの時間に対応する処理は図５に示したように同時に実行される。露光の後、データ転送の準備のためにライン状ＣＣＤ素子２４内でのデータ転送が必要であるが、このために必要な時間は０．２ｍ秒以下であり、ほぼ連続的な露光を実現している。使用したＣＣＤの光検出ピクセル数はＭ＝１０００、Ｎ＝２０、ｆ＝１０ＭＨｚ、Texp＝４ｍ秒であるから、ＭＮ／ｆ＝２［ｍ秒］＜Texpであるので、条件式(2)を満足している。また、標識ターゲット分子のフロー速度を２０００μｍ／秒とした。この数値を規格化フロー速度に変換すると８であり、条件式(3)を満たしている。
【００７９】
非特許文献１に開示されている方法では単分子計測のスループットは０．０５４μｌ／分であったが、本法によって、スループットは１２μｌ／分以上に向上したことが確認された。これは、フロー速度が約２０倍速くなったこと、及び試料流路部の幅が５０μｍから５００μｍに１０倍増加したことによる。もちろん、広がった試料流路部の全体を計測するために、Ｍは１００から１０００に増加させた。
【実施例３】
【００８０】
ＣＣＤ光検出デバイスのピクセル数について条件式(3)が成立している実施例について説明する。
【００８１】
本実施例の蛍光検出装置の装置構成は図３に示したとおりである。Ａｒ+レーザ光源１から出射されたレーザ光を焦点距離３１ｍｍのアクロマティックレンズ２０７によって集光し、スポット径を２５μｍまで絞る。この状態でフローセル１０５にレーザ光を入射させ、図４中の２枚の石英基板１３１，１３２の間の試料流路部１６３の中を伝播させる。レーザ光は試料流路部１６３で標識付ターゲット分子４を励起し、蛍光を発生させる。このとき一般的に基板１３１，１３２の屈折率と試料溶液の屈折率の間には比較的大きな差が存在するため、レーザ光は試料溶液と石英基板１３１，１３２の間を多重反射しながら伝播する。この伝播の状況は実施例１の場合と同様であり、実施例１で説明したように試料流路部の厚さが２５±１５μｍのとき励起レーザ強度密度を最大にすることができるので、本実施例でも試料流路部の厚さを２０μｍとした。標識付ターゲット分子４は一定の流速になるようにシリンジ及びシリンジポンプから構成された流速制御部２１で制御し、試料流路部１６３を通過させ、廃液溜２２に至るようにする。
【００８２】
また、このとき発生した蛍光を高効率で検出するために開口数０．７５の対物レンズ６によって、２０倍の倍率で長方形状ＣＣＤ光検出デバイス２８上に結像させた。
【００８３】
図１３に、光検出ＣＣＤ素子２８の概略図を示す。素子上の領域３００は受光部であり、光検出ピクセル３０１が流速方向３０６に平行な方向にＭ個、これに垂直な方向にＮ個配列されている。本実施例ではＭ＝４５０、Ｎ＝２０とした。また、素子上の領域３０２は、フレームトランスファー領域である。光検出ピクセルで蛍光を光から電気信号（電荷）に変化した後、チップ内でフレームトランスファー領域３０２に転送する。このとき、受光部で光から変換された電気信号は行ごとに１ピクセルずつ垂直転送周波数ｆｖ（Ｈｚ）のレートで転送される。それゆえ、Ｍ×Ｎの受光部の電荷をフレームトランスファー領域に移動させるためには、Ｎ／ｆｖ（秒）の時間が必要である。Ｎ＝２０、ｆｖ＝１ＭＨｚの場合には、この時間は２０μ秒であり、露光時間１８ｍ秒にくらべて十分短い。また、時間的余裕をとって１フレーム時間は２ｍ秒とした。フレームトランスファーが終了した時点で次の露光を開始する一方、フレームトランスファー領域にある電荷を１行ずつ水平転送部３０４に移動させる。移動した電荷は図１３中の矢印３０７の方向に、１ピクセルずつ、ピクセルクロック周波数ｆでＣＣＤ光検出デバイスの外に出力する。それゆえ、受光部のＭ×Ｎ個の光検出ピクセルで検出した蛍光量データをＣＣＤ光検出デバイス外に出力するためには、Ｍ×Ｎ／ｆ（秒）かかることになる。
【００８４】
図１４に、本実施例でのタイムテーブルを示す。条件(1)が成立しているため、露光時間の方が光検出外へのデータ転送時間よりも長く、１フレームに必要な時間は露光時間とチップ内でのデータ転送時間（フレームトランスファーに要する時間）の和で与えられる。ただし、上記のように露光時間に比べてチップ内データ転送時間は十分短いため、１フレームに必要な時間は露光時間でほぼ決定される。
【００８５】
また、さらにこの２０ピクセルを１ピクセルにＣＣＤ素子内でビニングする（蛍光によって発生した２０ピクセル分の電荷を１ピクセル分の電荷量としてまとめて、信号線１１を通して、データ合成部２５に転送する）ことによって、長方形状ＣＣＤ光検出デバイス２８の光検出ピクセル数を４５０×１ピクセルとなるようにして、１次元蛍光像を出力してもよい。
【００８６】
試料溶液の流速は、１８ｍ秒の露光時間中に１８ピクセル移動する平均速度とした。図６中では１８の規格化平均速度に対応する。図１５に規格化平均速度に対するＳＮ比の変化の測定結果を示す。図６に示したように、規格化平均速度２０まで上昇すると平均速度の平方根に反比例して低下し、規格化平均速度２０を超えると平均速度に比例して低下するはずである。測定結果でも、規格化平均速度２０までのＳＮ比の低下は小さく、それより平均速度を上げたときにＳＮ比が低下することが確認された。
【００８７】
本実施例の蛍光検出装置を用いて濃度定量を行った結果について説明する。試料溶液としては、３．８ｋｂの二本鎖ＤＮＡにインターカレータＹＯＹＯ−１で標識した溶液を使用した。ＤＮＡ濃度が１０-14Ｍ、１０-13Ｍ、１０-12Ｍの３種類の溶液を準備し、規格化平均速度１８でフローさせたときの標識付ターゲット分子数を計測した。このとき、前記光学系を用いて計測した時の計測領域は５０×１０×２０μｍであり、この試料体積で６００フレームだけ計測し、結果を図１６に示した。図中の理論直線は計測領域とフレーム数及び試料濃度から決まる分子数である。図１６から本実施例の構成によって、分子数から濃度定量ができることが実証した。
【００８８】
また、この測定は規格化平均速度１８で行い、他のパラメータはｎｓ＝３、ＬＰ＝１０μｍ、ｍ＝２０、ｆ＝１ＭＨｚ、Texp＝１８ｍ秒、Ｍ＝４５０、Ｎ＝２０であるから、条件式(2)及び(3)を満たしている。よって、本実施例は条件(2)を満足した蛍光検出装置の構成の実施例にもなっている。また、ＹＯＹＯ１の発光波長は０．５１μｍである。前記光学系の倍率は２０倍、ピクセルの一辺の長さは１０μｍであるから、条件式(6)を満たしている。
【００８９】
非特許文献１に開示されている方法では単分子計測のスループットは０．０５４μｌ／分であったが、本法によって、スループットは１．５μｌ／分以上に向上したことが確認された。これは、フロー速度が約５倍速くなったこと、及び試料流路部の幅が５０μｍから２５０μｍに５倍増加したことによる。もちろん、広がった試料流路部の全体を計測するために、Ｍは１００から４５０に増加させた。
【実施例４】
【００９０】
図１８に本実施例での装置構成を示す。図１８に示した蛍光検出装置は、スポットサイズ計測部３１０を備え、また制御コンピュータ９の機能として、蛍光標識付ターゲット分子（ターゲット分子）の蛍光強度及び数に関する統計データ処理部３１１と、ＣＣＤ垂直転送同期信号，均一試料流速制御信号生成部３１２を有する点で図７に示した傾向検出装置と異なる。また、ＣＣＤ光検出デバイス内での電気信号転送制御方法も異なる。ここでは、実施例３と異なる点について主に説明する。
【００９１】
図１７は、本実施例で使用するＣＣＤ光検出デバイス２８内でのピクセル構成を示す図である。３００はＭ×Ｎの光検出ピクセルから構成される光検出部である。矢印３０６は蛍光標識付ターゲット分子の移動方向を示している。このとき、蛍光標識付ターゲット分子の移動にあわせて、矢印３０６の方向に蛍光から変換された電気信号を転送する。転送された先の光検出ピクセルでは、このピクセルで変換された電気信号と１つ上のピクセルから転送されてきた電気信号の和を次のピクセルへ転送する。よって、電気信号の転送平均速度と蛍光標識付ターゲット分子の転送平均速度が完全に一致する場合には、ＣＣＤ光検出デバイスの受光部に入射する蛍光をすべて１つの光検出ピクセルに入射させることができる。光学系のぼけによって蛍光像が複数のピクセルにまたがる場合には、本実施例の実行によって蛍光流速と同じ方向に蛍光像（スポット）が拡大せず、ＳＮ比が一定に維持されることになる。
【００９２】
また、本実施例の蛍光測定装置では複数の蛍光標識付ターゲット分子が異なる速度で試料流路部を流れることを避けることは極めて困難である。転送平均速度と蛍光標識付ターゲット分子の平均速度ズレが生じた場合には蛍光スポットの大きさが流速方向に拡大するが、本転送を実施しない場合に比べればその拡大を縮小することができ、ＳＮを向上させることができる。
【００９３】
本実施例の重要な点は、異なる平均速度を持った蛍光標識付ターゲット分子を最も感度高く計測できる平均速度を抽出する点にある。最適な平均速度を抽出する方法には２種類ある。第１の方法は、蛍光標識付ターゲット分子計数部（粒子数計数部）でカウントする前の段階で、蛍光スポットサイズ及び強度計測部３１０にて各蛍光標識付ターゲット分子に対応する像の大きさ又は強度（ピーク値又は積分値）計測する。制御コンピュータ中で構成した統計的揺らぎが小さくなるように十分多数の蛍光標識付ターゲット分子（ターゲット分子）について像の大きさまたは強度データを統計データ処理部３１１へ送り、スポットサイズの平均値を最小化するか蛍光強度の平均値を最大化するようにＣＣＤ垂直転送同期信号、均一試料流速制御信号生成部３１２で制御信号を生成する。これらの信号は、信号線１０，２７からそれぞれの信号を送信する。ここで垂直転送とは、流速に平行な方向の転送をさしている。また、第２の方法は、蛍光標識付ターゲット分子計数部（ターゲット分子計数部）でカウントした後、計測された蛍光スポットの数と、蛍光スポットの強度（ピーク値又は積分値）を、統計データ処理部３１１へ送り、蛍光スポット数又は蛍光スポットの強度の平均値を最大化するようにＣＣＤ垂直転送同期信号、均一試料流速制御信号生成部３１２で制御信号を生成し、信号線１０及び２７からそれぞれの信号を送信する。
【００９４】
具体例をあげると、垂直転送周期Ｔｆ＝０．２ｍ秒すなわち５０００ピクセル／秒で垂直転送し、このときの蛍光標識付ターゲット分子の平均移動平均速度は２．５ｍｍ／秒である。ピクセル数はＭ＝１０００、Ｎ＝２０、ピクセルクロックレートｆ＝３５ＭＨｚである。また、ピクセルサイズは１０μｍ、光学系の倍率は２０倍とした。よって、式(3)を満たしていることが分かる。
【００９５】
また、本実施例の場合には連続転送のための条件は式(2)ではなく式(5)である。Ｎ／ｆμ秒であり、垂直転送周期より小さく条件式(5)を満たしている。垂直転送上記構成でＬＰ／（ｍ×Ｔｆ）は２．５ｍｍ／秒であり、条件式(4)を満たしていることが分かる。
【００９６】
非特許文献１に開示されている方法では単分子計測のスループットは０．０５４μｌ／分であったが、本法によって、スループットは１５μｌ／分以上に向上したことが確認された。これは、フロー速度が約２５倍速くなったこと、及び試料流路部の幅が５０μｍから５００μｍに１０倍増加したことによる。もちろん、広がった試料流路部の全体を計測するために、Ｍは１００から１０００に増加させた。
【実施例５】
【００９７】
実施例１〜４の蛍光検出装置に、計測した蛍光の蛍光波長スペクトルを計測する機能を付加した実施例について説明する。本実施例によると、蛍光スポットそれぞれからの蛍光スペクトルが計測できる。このことにより、複数種類のターゲット分子を同時に計測し、別々に定量することが可能になる。また、このような構成にすることによって複数の標識付ターゲット分子が同時に計測できるためスループットの向上が可能である。
【００９８】
図１９は、本実施例による蛍光検出装置の構成例を示す図である。対物レンズ６によって蛍光標識付ターゲット分子からの蛍光をほぼ平行光にし、プリズム等の波長分散素子３１３を光路中に挿入することによって分光し、さらに結像レンズによってＣＣＤ検出素子上にスペクトルを結像させる。本実施例では波長分散による分光方向は流路方向とほぼ垂直な方向に選んだ。これによってフロー速度が増したり、転送速度とフロー速度にズレが生じたりしても、蛍光スポットが伸びる方向と分光方向が直交するため、良好に蛍光スポットの分光が実現できる。また、波長分散方向を励起光の伝播方向とほぼ垂直に選ぶことも可能である。この場合には異なる標識付ターゲット分子からの蛍光スペクトルが光の伝播方向には小さくなり、高い濃度すなわち、ＣＣＤ上に多数の蛍光分子像がある場合にも傾向分子像間の干渉の可能性が下がり、良好に計測することが可能である。波長分散素子としてはプリズムの替わりにグレーティングを用いてもよい。
【実施例６】
【００９９】
本実施例の傾向検出装置は、装置全体の構成は実施例１又は実施例４と同じである。ただし、本実施例ではフローセルがシースフローセルになっている。
【０１００】
図２０はシースフローセルの例を示す図であり、試料溶液のフローの周囲にシース液（試料水溶液の溶媒）を流すようになっている。シースフローセルは石英製で、フローセル１３７の外壁は励起光の照射、及び高感度の蛍光の検出に好適な材料を使っている。フローセルの内部に試料溶液流路部１６３を設け、励起レーザ光１１３をアクロマティックレンズで集光し、溶液中にレーザ光を伝播させることによって標識付ターゲット分子４を励起することも前記実施例と同様である。相違点は試料溶液の導入部４００及び排出部４０１が試料流路部１６３の断面の一部に構成され、試料溶液の周囲にシース液（たとえば試料溶液の溶媒）が混ざらずに層を形成して流れるように構成されている点である。シース液は、シース液導入部４０２からシース液排出部４０３に流される。試料溶液はフローセルの壁面１６３に触れることなく、導入部４００から４０１に向かって一定の速度で流れることになる。シース液の速度は試料溶液の境界付近で試料溶液の速度と一致させることができ、試料溶液はその断面の中で分布を持つことなく均一に流れることができる。
【０１０１】
シースフローセルには次の２つの利点がある。第１点は、シースフローでないフローセルでは試料溶液中の標識付ターゲット分子の速度は壁面に近いほど遅くなるが、シースフローセル中の試料水溶液は壁面と接触しないため、標識付ターゲットの速度の分布が小さく、均一した速度で流れるようになる。特に、ターゲット分子の平均速度とデータ転送速度とが一致しない分子を低減させることができる。すなわち、感度を向上させ、これに伴って、スループットも向上させることができる。第２点は、フローセル中を伝播する励起用レーザ強度はフローセルの一部（通常は中心部分）が強く、周辺では弱くなってしまう。シースフローを使わない、フローセルでは周辺部分を流れる標識付ターゲット分子からの発光が弱くなってしまう。全ての分子を計測できなくなってしまうことにもなり得る。シースフローセルでは、励起レーザ強度が弱い部分に標識付ターゲット分子が存在しないようにすることによって、この問題を回避することができる。また、試料溶液が直接フローセルの壁面に接触しないため標識付ターゲット分子が壁面に付着しなくなり、洗浄の工程を省く又は少なくする効果も持っている。これらの課題とその解決の効果は単分子計測において特に顕著である。
【０１０２】
本実施例では、流路１６３の全体の厚さを１００μｍ、幅を１ｍｍとし、試料溶液の流れは幅を０．５ｍｍ、厚さを１０μｍとした。これによって、標識付ターゲット分子の速度分布を１σの速度差を１０％以内にすることができる。また、蛍光強度の平均値を３０％程度向上させ、蛍光強度のばらつきも小さくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】従来法を実現する検出系の構成図。
【図２】キャピラリのレーザが照射された領域の拡大図。
【図３】本発明による蛍光検出装置の構成例を示す図。
【図４】サンプルフローセルの概略図。
【図５】サンプルフローセル及びラインセンサを用いた実施例における露光時間のタイムテーブル。
【図６】フロー平均速度と感度の関係を示したグラフ。
【図７】本発明による蛍光検出装置の構成例を示す図。
【図８】サンプルフローセルの概略図。
【図９】蛍光分子像の例を示す図。
【図１０】サンプルフローセルの断面模式図。
【図１１】低屈折率薄膜を用いたサンプルフローセルの断面模式図。
【図１２】誘電体薄膜を用いたサンプルフローセルの断面模式図。
【図１３】光検出ＣＣＤ素子の概略図。
【図１４】条件(1)が満たされた場合のタイムテーブル。
【図１５】規格化平均速度に対するＳＮ比の変化の測定結果を示すグラフ。
【図１６】分子数カウントと濃度の関係の測定結果を示すグラフ。
【図１７】光検出ＣＣＤ素子の概略図。
【図１８】本発明による蛍光検出装置の構成例を示す図。
【図１９】本発明による蛍光検出装置の構成例を示す図。
【図２０】シースフローセルの概略図。
【図２１】サンプルフローセルの上面図。
【符号の説明】
【０１０４】
１  レーザ光源
２  シャッタ
３  レンズ
４  蛍光標識ターゲット
５  レーザ光
６  対物レンズ
７  ＣＣＤカメラ
８  ＣＣＤ
９  制御コンピュータ
１０  同期信号線
１１  画像データ転送用信号線
１２  キャピラリ
１６  レーザ照射体積
１７  レーザ照射領域の幅
１８  レーザ照射領域の高さ
１９  キャピラリの幅
２０  キャピラリの高さ
２１  流速制御部
２２  廃液溜
２３  ライン状ＣＣＤカメラ
２４  ライン状ＣＣＤ素子
２５  データ合成部
２６  粒子数計数部
２８  光検出デバイス
２９  ＣＣＤカメラ
１０５  サンプルフローセル
１０６  サンプルフローセル
１１３  レーザビーム
１１７  レーザスポット幅
１１９  セルのレーザ伝播方向の幅
１２０  セルのレーザ伝播方向に対して垂直方向の幅
１２１  サンプルフローセルの長さ
１３１  セルを構成するガラス基板（上側）
１３２  セルを構成するガラス基板（下側）
１３３  ２枚のガラスの間隔を決定するスペーサ
１３５  レーザ入射・出射部光散乱防止板
１３７  フローセル
１６０  低屈折率薄膜
１６３  試料流路部
１６４  試料流路入口
１６５  試料流路出口
１６６  誘電体膜
１７２  試料の流れの方向（レーザ照射領域付近）
２０７  レーザ集光用アクロマティックレンズ
３００  光検出ＣＣＤ素子中の受光部
３０１  光検出ピクセル
３０２  フレームトランスファー領域
３０３  電荷バッファピクセル
３０４  水平転送部
３０５  水平転送ピクセル
３０６  蛍光標識付ターゲット分子の流速方向
３０７  素子外へのデータ転送ピクセル
３１０  スポットサイズ計測部
３１１  統計データ処理部
３１２  ＣＣＤ垂直転送同期信号，均一試料流速制御信号生成部
【図１】
0004763485.tif 000002
【図２】
0004763485.tif 000003
【図３】
0004763485.tif 000004
【図４】
0004763485.tif 000005
【図５】
0004763485.tif 000006
【図６】
0004763485.tif 000007
【図７】
0004763485.tif 000008
【図８】
0004763485.tif 000009
【図９】
0004763485.tif 000010
【図１０】
0004763485.tif 000011
【図１１】
0004763485.tif 000012
【図１２】
0004763485.tif 000013
【図１３】
0004763485.tif 000014
【図１４】
0004763485.tif 000015
【図１５】
0004763485.tif 000016
【図１６】
0004763485.tif 000017
【図１７】
0004763485.tif 000018
【図１８】
0004763485.tif 000019
【図１９】
0004763485.tif 000020
【図２０】
0004763485.tif 000021
【図２１】
0004763485.tif 000022