(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソフラボン類を含有する大豆種子または大豆種子由来の加工製品がイソフラボン換算濃度で１．２〜４％存在する培地中でβ−グルコシダーゼ活性を有する霊芝菌または椎茸菌を培養し、イソフラボン類のアグリコン及び霊芝菌または椎茸菌の培養生成物を含有する成分を取得することを特徴とする抗腫瘍作用を有する物質の製造方法。
【請求項２】
予め霊芝菌または椎茸菌を培養し、β−グルコシダーゼ活性を高めた後イソフラボン類を含有する大豆種子または大豆種子由来の加工製品を培地に投入して培養し、イソフラボン類のアグリコン及び霊芝菌または椎茸菌の培養生成物を含有する成分を取得する請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
イソフラボン類を含有する大豆種子または大豆種子由来の加工製品及びβ−グルコシダーゼが存在し、前者の濃度がイソフラボン換算で１．２〜４％である培地中で、β−グルコシダーゼ活性を有する霊芝菌または椎茸菌を培養し、イソフラボン類のアグリコン及び霊芝菌または椎茸菌の培養生成物を含有する成分を取得することを特徴とする抗腫瘍作用を有する物質の製造方法。
【請求項４】
イソフラボン類のアグリコンがゲニステインである請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
抗腫瘍作用が腫瘍新生血管阻害作用である請求項１または３記載の製造方法。
【請求項６】
抗腫瘍作用が腫瘍細胞増殖抑制作用である請求項１または３記載の製造方法。
【請求項７】
腫瘍細胞増殖抑制作用が腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用である請求項６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は抗腫瘍作用などの生理活性を有する物質に関する。さらに詳しく言えば、大豆などのイソフラボン類のアグリコンの生理活性及び担子菌培養物の生理活性が増強された新規な物質、その製造方法及びその物質の用途である健康食品組成物、動物用あるいは水産養殖用飼料組成物及び抗腫瘍剤に関する。
背景技術
大豆や大豆加工製品の摂取が発癌のリスクを軽減し、原発性あるいは化学物質等により誘導される癌の防御に関与していることが報告されている。この作用は大豆に含まれるイソフラボンによるものである。大豆イソフラボンは女性ホルモン様作用を有し、乳癌、大腸癌、前立腺癌等の癌、心血管疾患、脳機能、骨粗鬆症、アルコール依存症、更年期障害、高脂血症等に対して幅広く防御的に生理活性作用を示すことが明らかにされている。
大豆イソフラボンとしては、ゲニスチン（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）、グリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）等が知られている。これらは、それぞれゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）をアグリコンとするグルコース配糖体であり、大豆イソフラボンは大豆種子中でグルコース配糖体、あるいはその誘導体の形で存在している。
大豆イソフラボンの生理活性作用は主にそのアグリコンに基く作用であって、グルコース配糖体の形では生理活性作用はそれほど強くはない。これは配糖体のままでは小腸から吸収しがたいためである。
大豆イソフラボン配糖体を分解して、そのアグリコンを得る方法はいくつか提案されている。例えば、大豆中のβ−グルコシダーゼの作用により、アグリコンへ変換する方法（特開平１−２５８６６９号）、醤油粕または醤油油中に生成されたイソフラボンアグリコンを抽出する方法（特開平５−１７０７５６号）、大豆蛋白に麹菌を作用させてアグリコンを含むイソフラボン化合物を得る方法（特開平８−２１４７８７号）、植物蛋白を抽出後、β−グルコシダーゼ又はエステラーゼによってアグリコン化する方法（特表平９−５０３７８１号，米国特許第５７６３３８９号）、大豆胚軸に微生物由来の酵素を作用させ、含まれるイソフラボン化合物をアグリコン化する方法（特開平１１−８９５８９号）がある。
アグリコンの中でも特にゲニステインは、チロシンキナーゼ阻害、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害、血管新生抑制等の生理活性作用を示す。但し、血管新生抑制効果などの生理活性効果を得るには、血漿中に高濃度のゲニステインが必要であり、腸管からの吸収が難しい配糖体のゲニスチン摂取のみでゲニステイン必要量を満たすことは困難であるため、十分な生理活性効果を得るにはアグリコンであるゲニステインの形で必要量を摂取しなければならない。
一方、担子菌、例えば椎茸菌やサルノコシカケ等の菌糸体やその培養物は、免疫賦活作用や抗腫瘍作用等の生理活性作用を有することが知られており、一部は抗癌剤等として使用されている。
これら抗癌剤は、近年は腫瘍新生血管阻害作用を持つ物質と併用される場合が多い。これは同一の治療標的に対して作用機序の異なる物質を併用することにより高い治療効果が期待されるからである。
腫瘍新生血管阻害作用を持つ物質としては、例えばムコ多糖類の混合物であるサメ（鮫）軟骨を原料とするものや、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）等が知られており、その一部は実際に使用されている。
腫瘍新生血管阻害作用とは、大きくなった腫瘍が自らの増殖に必要な栄養や酸素を供給するために、自ら血管新生促進物質を産生して血管を新しく生成して増殖しようとする働きを抑制・阻害する作用を言う。
腫瘍新生血管阻害物質は、このような腫瘍細胞の血管新生を防止してその肥大化を抑制・阻害する物質であり、その投与によって腫瘍を消滅させることができるので、癌治療に有用である。
腫瘍新生血管阻害物質は、経口摂取や静脈注射によってその効果を得ることができるが、現状では経口摂取できる物質は少ない。静脈注射は患者の負担が大きい欠点がある。
経口摂取に用いられる前記サメ軟骨は、腫瘍新生血管阻害効果を得るには一日当り約２０グラム以上もの大量摂取が必要であるが、生臭く不快な味があるため摂取し難い欠点がある。この不快な臭いや味を抑え、かつ強酸性の胃内で溶解せずに腸内まで到達させて、そこで溶解・吸収される性質を付与する目的で、サメ軟骨を粉砕して微粉末状としたり、この微粉末を更に油脂類や糖類等でコーティングする等の繁雑な処理が行われている。
また、アンジオスタチンは未だ実用化されておらず、従って、経口投与が可能で、しかも安全性の高い腫瘍新生血管阻害物質が求められている。
発明の開示
本発明の課題は、前記従来技術の問題点を解消し、担子菌培養物の抗腫瘍作用等の生理活性作用を補強し得る、大豆などイソフラボン類のアグリコンの生理活性をも活用した新規な物質を提供することにある。
更に、本発明の課題は、前記新規な物質の製造方法及びその物質の用途である健康食品、動物用あるいは水産養殖用飼料及び抗腫瘍剤を提供することにある。
前記課題に鑑み鋭意検討した結果、本発明者らは大豆種子やその加工製品等のイソフラボン類を含有する材料（イソフラボン類含有材料）の存在下で担子菌を培養し、担子菌の産生するβ−グルコシダーゼの作用によってグルコース配糖体のイソフラボン（ゲニスチン等）をグルコースとアグリコン（ゲニステイン等）に分解し、担子菌の培養によって産生した物質と共にアグリコンを培養系中に蓄積させ、イソフラボン類のアグリコンの生理活性と、担子菌培養物の生理活性とを有し、かつそれらの生理活性が前記アグリコンと担子菌培養物各々単独の混合物の場合よりも増強された生理活性を有する新規物質が得られることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の生理活性作用物質、その製造方法、およびその物質を利用する健康食品組成物、動物用あるいは水産養殖用飼料組成物および抗腫瘍剤に関する。
１）イソフラボン類を含有する材料が存在する培地中で、β−グルコシダーゼ活性を有する担子菌を培養して得られる、イソフラボン類のアグリコンと担子菌の培養生成物とを含む生理活性作用を有する物質。
２）イソフラボン類を含有する材料及びβ−グルコシダーゼが存在する培地中で、β−グルコシダーゼ活性を有する担子菌を培養して得られる、イソフラボン類のアグリコンと担子菌の培養生成物とを含む生理活性作用を有する物質。
３）イソフラボン類のアグリコンの生理活性及び担子菌の培養生成物の生理活性が相乗的に増加している前記１または２に記載の物質。
４）イソフラボン類のアグリコンがゲニステインである前記１乃至３のいずれかに記載の物質。
５）生理活性作用が抗腫瘍作用である前記１乃至４のいずれかに記載の物質。
６）抗腫瘍作用が腫瘍新生血管阻害作用である前記５記載の物質。
７）抗腫瘍作用が腫瘍細胞増殖抑制作用である前記５記載の物質。
８）腫瘍細胞増殖抑制作用が腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用である前記７記載の物質。
９）イソフラボン類を含有する材料が、大豆種子、大豆種子由来の加工製品またはクズの根である前記１乃至４のいずれかに記載の物質。
１０）β−グルコシダーゼ活性を有する担子菌が霊芝菌または椎茸菌である前記１または２に記載の物質。
１１）イソフラボン類を含有する材料が存在する培地中でβ−グルコシダーゼ活性を有する担子菌を培養し、イソフラボン類のアグリコン及び担子菌の培養生成物を含有する成分を取得することを特徴とする生理活性作用を有する物質の製造方法。
１２）予め担子菌を培養し、β−グルコシダーゼ活性を高めた後イソフラボン類を含有する材料を培地に投入して培養し、イソフラボン類のアグリコン及び担子菌の培養生成物を含有する成分を取得する前記１１記載の生理活性作用を有する物質の製造方法。
１３）イソフラボン類を含有する材料及びβ−グルコシダーゼが存在する培地中で担子菌を培養し、イソフラボン類のアグリコン及び担子菌の培養生成物を含有する成分を取得することを特徴とする生理活性作用を有する物質の製造方法。
１４）イソフラボン類のアグリコンがゲニステインである前記１１乃至１３のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質製造方法。
１５）生理活性作用が抗腫瘍作用である前記１１乃至１４のいずれかに記載の製造方法。
１６）抗腫瘍作用が腫瘍新生血管阻害作用である前記１５記載の製造方法。
１７）抗腫瘍作用が腫瘍細胞増殖抑制作用である前記１５記載の製造方法。
１８）腫瘍細胞増殖抑制作用が腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用である前記１７記載の製造方法。
１９）イソフラボン類を含有する材料が、大豆種子、大豆種子由来の加工製品またはクズの根である前記１１または１２に記載の製造方法。
２０）β−グルコシダーゼ活性を有する担子菌が霊芝菌または椎茸菌である前記１１または１３に記載の製造方法。
２１）前記１乃至１０のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質を含有する健康食品。
２２）前記１乃至１０のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質を有効成分とする飼料組成物。
２３）前記１乃至１０のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質を有効成分とする抗腫瘍剤。
発明の詳細な説明
［本発明化合物の製造方法］
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の生理活性作用を有する物質は、代表例として以下の方法で得ることができる。
すなわち、マルツエキス、酵母エキス、セルロース、酒石酸アンモニウム等の成分からなる培地に担子菌を植菌し、一定条件下で培養してβ−グルコシダーゼを始めとする各種酵素を産生した酵素活性が高まった段階で、大豆種子やその加工品などのイソフラボン類含有材料を投入し、β−グルコシダーゼ活性が高くなる温度、ｐＨ条件下で撹拌、通気培養を続けてイソフラボン配糖体の実質的に全てをアグリコンに変換させた後、培養系全体を加熱して系内の酵素を失活させて酵素反応を停止させ、更に必要により凍結乾燥等の手段により乾燥、粉末化して本発明の物質を得るものである。
本発明において使用するイソフラボン類含有材料としては、大豆種子、脱脂大豆、あるいはこれらの適宜の組織の一部（表皮、胚乳、胚軸等）をそのまま用いてもよく、これらを水、アルコール類ないしこれらの混合物による抽出物として用いてもよい。具体例としては豆乳をあげることができるが、大豆種子等から適宜の手段で分離したイソフラボン類そのものをも好適に使用できる。
なお、本発明において、「イソフラボン類」とは、グルコース配糖体としてのイソフラボンをはじめ、マロニルゲニスチン、アセチルゲニスチン等のグルコース配糖体誘導体、及びグルコース配糖体の構成成分であるアグリコンを含み、これらのいずれかを含有する材料が、「イソフラボン類含有材料」である。
本発明においては、イソフラボン類含有材料として、大豆、脱脂大豆等から製造された加工品、例えば味噌、醤油、納豆等の加工品等でも、そこにイソフラボン類が含まれる限りイソフラボン類含有材料として使用することができる。
さらに、イソフラボン類を含む大豆以外の植物、例えばクズ、レッドクローバー、アルファルファ、エゾノレンリソウ、オランダヒユ、エニシダ等のマメ科植物類、あるいはこれらのイソフラボン類を含む植物組織を水、アルコール類等により抽出した抽出液等もイソフラボン類含有材料として使用することができる。特にゲニステインが豊富に含まれているクズの根が、好適に使用できる。
本発明に用いるβ−グルコシダーゼ活性を有する担子菌としては、例えば次のものを挙げることができる。
椎茸（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、コフキサルノコシカケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、エノキタケ（ナメタケ）（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、キクラゲ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ  ａｕｒｉｃｕｌａ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、チョレイマイタケ（Ｇｒｉｆｏｒａ  ｕｍｂｃｌｌａｔａ）、フクロタケ（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ  ｖｏｌｖａｃｅａ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ニンギョータケ（Ａｌｂａｔｒｅｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｓ）、ニオウシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）。
本発明においては、上記の担子菌をイソフラボン類を含む材料の存在下において培養する。
培地には、上記イソフラボン類を含む材料の他に各種の炭素源あるいは窒素源を添加してもよい。炭素源の例としてはブドウ糖、ショ糖、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。
窒素源の例としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。
その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ１塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
培養は、通常の中温菌の培養に準じればよく、ｐＨ２〜６、１０〜４５℃、好ましくは１５〜３０℃の温度で撹拌し、通気培養を行う。培養は、イソフラボン配糖体が実質的に全てアグリコンに変換するまで継続することが好ましい。培養時間は菌の量やイソフラボン類含有材料の形態にもよるが、通常４〜２０日間、好ましくは６〜１２日間程度である。
培養終了後、培養系全体を加熱して系内の酵素を失活させて酵素反応を停止させる。本発明の生理活性を有する物質は、培養液と菌糸体との混合液を濃縮乾固した後粉砕することにより粉末状で得られる。凍結乾燥法を採用して乾燥した後微粉砕してもよい。
本発明においては、前記の担子菌と共にβ−グルコシダーゼ酵素剤を併用して、担子菌の酵素活性を増強することもできる。
この目的に使用する酵素剤としては、アスペルギルス属、バチルス属、リゾープス属等の微生物由来の酵素製剤、あるいは大豆、アーモンド等の植物を起源とする酵素製剤を挙げることができる。大豆、アーモンド等の場合は、これらの種子の粉砕物をそのまま使用してもよい。
イソフラボン類含有材料の担子菌培地に対する添加比率は、イソフラボン配糖体のアグリコンと糖への変換量（ゲニスチンのゲニステインへの変換量）に大きく影響する。
例えば、大豆イソフラボン製剤（イソフラボン４０％含有）を椎茸菌と共に、マルツエキス、酵母エキス等を含む培地にて培養する場合、ゲニステインへの大きな変換量が得られる大豆製剤の培地への適切な添加濃度は３〜１０％であり、５％以下が好ましい。
培養中に担子菌によって産生されるβ−グルコシダーゼ活性の変化は、アグリコン生成に大きく影響する。霊芝菌を用いて前項同様の培地で１０〜６０℃で培養し、β−グルコシダーゼ活性の変化、培地のｐＨ変化などを調べたところ、β−グルコシダーゼ活性は培地ｐＨ２．０〜６．０の間で最も高く、温度を４０〜７０℃程度にすると、一層酵素活性が高まることが判明している。
［薬理活性］
本発明の生理活性物質は、既に抗腫瘍作用や免疫賦活作用を有することが知られている担子菌の培養によって産生される生理活性物質と、血管新生抑制作用等を有することが知られているイソフラボン類のアグリコン（ゲニステイン等）とが単に混在した状態にあるのでなく、両者が何らかの形で結合した状態にある一体の物質であるか、あるいは培養の結果生じる何らかの未知物質の存在が推定される。その理由は、担子菌のみの培養で得た物質とゲニステインとを単純に混合しただけでは、本発明の物質と同等の生理活性（腫瘍血管新生抑制効果）は得られないからである。
なお、担子菌のみの培養によって生成する物質は、抗腫瘍作用や免疫賦活作用を有するものの、腫瘍血管新生抑制作用はない。
乾燥・粉末化した本発明の物質は、独特の深い苦味やキナコに似た香ばしい香りを有する褐色の粉体である。その化学成分分析結果と生理学的性質を以下に示す（測定方法は後述の実施例の項参照）。
（１）本発明物質の化学成分
１）水分：                ３％以下
２）タンパク質：    ７．０〜１０．０％
３）脂質：          ５．０〜  ８．０％
４）糖質：        ７５．０〜８５．０％
５）食物繊維：      ０．５〜  ２．０％
６）灰分：          ２．０〜  ５．０％
７）イソフラボン類（凍結乾燥粉末１ｇ当たり）
ダイジン        ０．００〜  ０．６０ｍｇ
ダイゼイン    ２８．００〜３０．００ｍｇ
ゲニスチン      ０．００〜  ０．４０ｍｇ
ゲニステイン  ５５．００〜６５．００ｍｇ
グリシチン      ０．００〜  ０．５０ｍｇ
グリシテイン  １２．００〜１５．００ｍｇ
（２）生理学的性質
１）腫瘍細胞の増殖抑制作用：マウスメラノーマ細胞、マウス大腸癌、マウス肺癌細胞、マウス血管内皮細胞、ラット乳癌細胞、ヒト前立腺癌細胞、ヒト膀胱癌細胞などの増殖を抑制する。
２）腫瘍血管新生抑制作用：マウスの腫瘍血管新生を抑制する。
前記した本発明の物質の腫瘍血管新生抑制作用は、後述の実施例に示すようにマウス腫瘍細胞を用いたイン・ヴィトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びイン・ヴィボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験、鶏卵膜を用いたエクス・オヴォ（ｅｘ  ｏｖｏ）試験（ＣＡＭ法：ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）によって確認された。
産業上の利用可能性
［医薬品への適用］
本発明により、イソフラボンを含有する安価な材料を用いて、安全、かつ容易に経口投与ができ、優れた生理活性作用を有する物質を容易に製造することができる。
本発明の物質はイソフラボン類のアグリコンの有する生理活性作用及び担子菌の培養生成物の有する生理活性作用が相乗的に強化されており、実験により確認された効果に基づく癌の治療及び／または予防剤（抗腫瘍剤）のみでなく、骨粗鬆、更年期障害、心血管疾患、脳機能障害、アルコール依存症、高脂血症等の治療及び／または予防剤、あるいは免疫賦活剤、女性ホルモン様物質としての利用も考えられる。
さらに本発明の物質は、古来より長期間食用に供されてきた茸および大豆等を原料とするので、多量に摂取しても安全上の問題はなく、前記イソフラボン類のアグリコンの有する生理活性作用と担子菌の培養生成物の有する生理活性作用が増強された動物あるいは水産用養殖の飼料、及び健康食品等としても利用できる。
本発明の物質は、食品、医薬品等として主として経口で用いられるが、その摂取量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なり、通常、成人一人当たり、一回につき、１００ｍｇ〜５ｇ程度（乾燥物換算）である。
本発明の物質を投与する際には、一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤、塗布剤とする際に、必要により適宜の補助資材（澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等）を使用することもできる。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例および比較例に基き説明するが、本発明はこれらの記載により何等限定されるものではない。
実施例１：イソフラボン類含有材料存在培地での担子菌の培養（１）
（１）原料
ａ．イソフラボン類含有材料
イソフラボン４０％含有大豆製品（米国、ＡＨＤ社製）。含有イソフラボン成分（製剤１ｇあたり）は以下の通り：
ダイジン        ８０．２５ｍｇ
ダイゼイン        ２．２０ｍｇ
ゲニスチン    １０３．９４ｍｇ
ゲニステイン      ２．４８ｍｇ
グリシチン      ３０．６０ｍｇ
グリシテイン      ３．６７ｍｇ
ｂ．担子菌
（株）アミノアップ化学で、マルツエキス液体培地中に２５℃で保管した霊芝菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）。
（２）培養条件
ａ．培地
マルツエキス（オリエンタル酵母（株）製）    １０．００ｇ
酵母エキス（味の素（株）製）                  １．２５ｇ
水                                            １．０リットル（Ｌ）
ｂ．培養方法
培地はオートクレーブで滅菌した後、４℃で保管したものを用いた。この培地（ｐＨ５．５）に霊芝菌を植菌して２５℃、１３０ｒｐｍで振とう培養した。この培養の間、２日ごとに培養液のβ−グルコシダーゼ活性を測定し、酵素活性が培養開始時よりも高くなった時点で粉末大豆製剤（イソフラボン類含有材料）を培地の２．５％の濃度で培地に添加し、更に培養を続けた。ゲニステイン及びゲニスチン含量を測定し、ゲニスチンが全てゲニステインに変換されたことが確認された時点で培養を終了した。培養終了後、培養液全体を１２１℃で３０分間加熱処理することにより酵素反応の停止と殺菌処理を完了した。次いで凍結乾燥して乾燥粉末化した。
なお、培養液のβ−グルコシダーゼ活性は、β−グルコシダーゼ標品（オリエンタル酵母（株）製、酵母由来）を用い、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノジド（シグマ社製）と反応させ４００ｎｍ吸光度を利用して測定した。
また、培養液中のイソフラボン生成量は、イソフラボン標品（ゲニスチン、ゲニステイン、シグマ社製）を使用し、Ｆｒａｎｋｅ，Ａ．Ａ．らの方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，４２：１９０５−１９１３，１９９４）に準拠し、ＯＤＳカラム（ＴＳＫ  ｇｅｌ−８０Ｔｍ，４．５×１５０ｍｍ）により、溶離液としてアセトニトリル−水−酢酸（１０／９０／０．１→４０／６０／０．１）を用いて溶出し（０．８ｍｌ／ｍｉｎ）、２６０ｎｍの吸収により測定した。
以上により得られた本発明の物質（発明物質１）は褐色微粉末であり、下記の特性を有する。以下の分析において、水分は７０℃減圧乾燥法、タンパク質はケルダール法、脂質は酸分解法、食物繊維は酵素−重量法、灰分は直接灰化法により測定し、糖質は差引き値より求めた。
ａ．化学的性質
１）水分          ０．７％
２）タンパク質    ８．８％
３）脂質          ６．２％
４）糖質        ８０．６％
５）食物繊維      １．０％
６）灰分          ２．７％
７）イソフラボン類（凍結乾燥粉末１ｇあたり）
ダイジン        痕跡
ダイゼイン    ２８．４７ｍｇ
ゲニスチン      痕跡
ゲニステイン  ５９．１１ｍｇ
グリシチン      痕跡
グリシテイン  １３．５３ｍｇ
ｂ．生理学的特性
ｉ）腫瘍細胞増殖抑制作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
Ｂ１６／ＢＬ６マウスメラノーマ細胞、Ｃｏｌｏｎ  ２６マウス大腸癌細胞、ＳＳＴ−２ラット乳癌細胞、Ｔ２４ヒト膀胱癌細胞、及びＤｕ１４５ヒト前立腺癌細胞を用いて腫瘍細胞増殖抑制試験を行った。実施例１の物質（発明物質１）を蒸留水に懸濁して高圧蒸気滅菌処理し、１００μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌまで、連続的な濃度で細胞に加えた。０．１％エタノールに溶解したゲニステイン標準品（シグマ社製）を陽性対照として用い、腫瘍細胞懸濁液を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で１〜２×１０６ｗｅｌｌに調整して３７℃で２４時間培養し、これに発明物質１あるいはゲニステイン標準品を加えて更に４８時間培養した。ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｙａｚｏｌ−２−ｙｌ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法によりマイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を調べた。発明物質１の各種培養癌細胞に対する増殖抑制効果を、未処理の対照群の腫瘍増殖に対する増殖抑制率として表１に示す。数値が高い程、癌細胞の増殖抑制効果が高いことを示している。
0004763202.tif 000002
表１から、各種培養癌細胞において発明物質１は濃度依存的に癌細胞の増殖を抑制し、高い癌細胞増殖抑制効果を有することが分かる。
ｉｉ）血管内皮細胞増殖抑制試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
マウス脳血管内皮細胞ＬＥ−１細胞を１％ゼラチンでコートした９６穴マイクロプレートで２４時間予備培養し、１０〜０．１μｇ／ｍｌの濃度にて発明物質１で処理した後、更に２４時間培養した。細胞の増殖はＭＴＴ法により検出した。表２に示すように、発明物質１はマウス脳血管内皮細胞に対して、濃度依存的に高い増殖抑制効果を示した。このことから、発明物質１は血管内皮細胞増殖作用、すなわち血管新生抑制作用を有することが判明した。
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ｉｉｉ）各種腫瘍細胞の５０％増殖抑制濃度（ＩＣ５０）（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）：発明物質１、ゲニステイン標準品および担子菌培養物の比較
３ＬＬマウス肺癌細胞、Ｃｏｌｏｎ  ２６マウス大腸癌細胞、ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞、Ｄｕ１４５ヒト前立腺癌細胞およびＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞を使用し、これらに対する発明物質１、ゲニステイン標準品（Ｓｉｇｍａ社製）および担子菌培養物（実施例１と同一の条件で担子菌のみを培養して得た生産物）の５０％増殖抑制濃度（ＩＣ５０）を調べた。
すなわち、発明物質１、ゲニステイン標準品または担子菌培養物を蒸留水に懸濁し高圧蒸気滅菌処理し、１０００μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌまで、連続的な濃度で細胞に加えた。腫瘍細胞懸濁液は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で１〜２×１０５ｗｅｌｌに調整し、３７℃で２４時間培養し、発明物質１あるいはゲニステイン標準品を加えてさらに４８時間培養し、ＭＴＴ法によりマイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を調べた。その結果を表３に示す。数値が低い程、低濃度で培養癌細胞増殖の５０％の抑制が可能であることを示している。
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表３に示すとおり、発明物質１はどの培養癌細胞においても高い癌細胞増殖抑制効果を示した。発明物質１による各種培養癌細胞に対する増殖抑制のＩＣ５０はゲニステイン標準品、担子菌培養物のいずれと比較しても有意に低いことが明らかである。この事実は、発明物質１がゲニステイン標準品、担子菌培養物のいずれとも全く異なる物質であることを窺わせるものである。
発明物質１の腫瘍細胞増殖抑制作用は、腫瘍細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導が考えられるため、Ｔ２４細胞をチャンバースライド内で細胞数を５００００で２４時間培養し、発明物質１を２００μｇ／ｍｌとなるよう培地に加えて更に４８時間培養した後、スライド上の細胞を固定してＴＵＮＥＬ染色キットで染色したところ、発明物質１の処理により癌細胞のアポトーシスが明瞭に認められた。
ｉｖ）腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用
発明物質１による腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用をＤＮＡレベルで確認するため、アポトーシスを起した細胞の遺伝子に特異的に見られるＤＮＡラダーを電気泳動法で検索した。
方法：ＳＨＲ／ＮＣｒｊラット（雄，６週齢）の皮下にＳＳＴ−２（ヒト乳腺ガン）を接種し、腫瘍の形成が確認された後に発明物質１を１％含有する水を自由摂取により２週間投与し、更に１週間、発明物質１を１０％含有する水を強制経口投与した。対照群には０．０５％ＮａＨＣＯ３水溶液を、３週間自由摂取させた。その後腫瘍組織からＤＮＡを抽出して電気泳動を行い、ＤＮＡラダーを検索した結果、発明物質１を投与した群にはＤＮＡラダーが明瞭に認められ、発明物質１はＤＮＡレベルにおいてもアポトーシスを誘導していることが明らかとなった。
また、発明物質１を投与したラットの乳ガン細胞の成長、分裂及び分化の過程（細胞周期）における細胞数を核ＤＮＡの染色により分析するフローサイトメトリー法によって、発明物質１による腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用を調べた。
細胞培養：１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ培地中で培養したＳＳＴ−２ラット乳ガン細胞（１０×１０６／ｍｌ）１０ｍｌを内径１０ｃｍの培養皿に入れて１時間培養した後、次のように試料を加えた。
対照：ＤＭＳＯ（１０μｌ，最終濃度として０．１％以下）
発明物質１処理：発明物質１を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解し、１０μｌを１０ｍｌの細胞培養液中に加えた。発明物質１の最終濃度は１００μｇ／ｍｌとした。試料の添加後更に４８時間培養し、培養終了後細胞を回収して細胞懸濁液を７０％エタノールで２４時間固定し、０．１％グルコース及びＲＮａｓｅ（１００Ｕ／ｍｌ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に室温で３０分間、再懸濁した。細胞はフローサイトメトリーの直前にプロピジウムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ：５０μｇ／ｍｌ）を用いて１０分間染色した。発明物質１で処理したＳＳＴ−２細胞の細胞周期をフローサイトメトリーにより分析した。
その結果、発明物質１で処理したＳＳＴ−２細胞は、細胞周期におけるＤＮＡ合成と細胞分裂の間のギャップ（Ｇ１期）とＤＮＡ合成期（Ｓ期）にかけての期間（Ｇ１Ｓ期）において停止しており、細胞がＤＮＡを合成できなくなった状態を示した。Ｇ１Ｓ期のＤＮＡ含有量は全体の６５．４８％から５５．９１％に減少しており、発明物質１による処理でＳＳＴ−２細胞のアポトーシスを起した細胞は１．９４％から５．２０％に増加した。この結果から、ＳＳＴ−２細胞はＧ１Ｓ期の停止によりアポトーシスを誘導していることが明らかである。
大豆イソフラボン類、ゲニステイン、担子菌抽出物等が細胞のアポトーシスを誘導することは、既に知られていが（例えばＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，５２３１−３８，１９９８，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９１，１６４−１７３，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９４，９４４−９５０，１９９２，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９８，６１，４８５−４８７等）、前述の通り、発明物質１は明らかにゲニステインや担子菌培養物とは全く異なる物質であり、発明物質１の癌細胞に対するアポトーシス誘導作用は、本発明者らが初めて発見したものである。
ｖ）腫瘍血管新生抑制試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ダブルチャンバー法による血管新生抑制試験を行った。
本試験では、細胞培養プレートにマウス大腸癌細胞Ｃｏｌｏｎ  ２６を培養し、そのウエルの内側に直径８μｍの穴の開いたウエルを挿入して、内側ウエルに敷かれたコラーゲンゲル上でマウス脳血管内皮細胞ＬＥ−１を培養した。内側のウエルの底の穴から外側のウエル内の大腸癌細胞から産成される血管内皮細胞刺激因子による刺激を受けて新生血管が形成される。血管の新生が確認されたところで、発明物質１を外側のウエルに加え、更に３日間培養する。培養後コラーゲンゲル上の細胞を写真撮影し、コンピュータによる画像処理を経て画像解析ソフトＮＩＨイメージ（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ）を用いて形成された血管内皮細胞による管腔の長さの合計、及び内皮細胞数を計測し、正常細胞の管腔長に対する割合から血管新生抑制率を算出した。結果は表４に示すとおりであり、発明物質１で処理したものは新生血管が大きく消失していた。
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ｖｉ）腫瘍血管新生抑制試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
背部皮下法によるｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍血管新生抑制試験を行った。両面にポアサイズ０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）を貼ったミリポアリングをマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ  ２６（１×１０７ｃｅｌｌ）で満たし、ＢＡＬＢ／ｃマウス背皮下に移植した。発明物質１を１日あたり１ｇを強制経口投与し、チャンバー移植から５日目にチャンバーを摘出して血管の分布を写真に記録した。写真はコンピュータに取込み、画像解析ソフトＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いてグリーンフィルター処理し、分布血管を二値化処理した後、移植部位における血管の面積から面積率を計測した。結果を表５に示す。腫瘍細胞処理されたマウスではＣｏｌｏｎ  ２６誘導皮下血管の面積は正常マウスの約２倍であったのに対し、発明物質１摂取マウスでは正常マウスと変らず、発明物質１の経口摂取により腫瘍血管新生が顕著に抑制されたことが明らかとなった。
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ｖｉｉ）血管新生抑制試験（ｅｘ  ｏｖｏ）
鶏受精卵を用いたＣＡＭ法（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）によるｅｘ  ｏｖｏ血管新生抑制試験を行った。卵黄膜上の血管の新生を観察する方法で、卵黄上に血管新生抑制物質を投与して、血管新生の抑制を卵殻を開いて直接観察できる。１０日齢の鶏卵を３７℃、湿度６０％で３日間培養した後卵殻に小さい穴を開け、注射針で３ｍｌの卵白を吸出して穴を防水テープで塞ぎ、更にこの穴の反対側に１０×１．０ｃｍの窓を開け、胚に血管が形成されているのを確認してから窓を塞いで、更に３日間培養した。その後、発明物質１を滅菌したリン酸緩衝食塩水溶液として窓から卵内に加え、更に４日間培養した後卵殻を開いて卵黄膜上の血管の分布を写真に記録した。この写真をコンピュータに取込み、画像解析ソフトＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いてグリーンフィルター処理し、分布血管を二値化処理した後、移植部位における血管の面積から面積率を計測した。結果を表６に示す。発明物質１での処理によって卵黄膜上に分布する血管の面積は減少し、正常卵に対して抑制率は８６．４％という高い値を示し、血管新生抑制効果が明らかとなった。
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実施例２：イソフラボン類含有材料存在培地での担子菌の培養（２）
下記の原料を用い、実施例１と同様の条件で培養を行って本発明の物質（発明物質２）を得た。
（１）原料
ａ．イソフラボン類含有材料
北海道産全粒大豆（ゲニスチン  ０．７３０ｍｇ／ｇ、ゲニステイン  ０．０４１ｍｇ／ｇ含有、いずれも無水物換算）を水道水に一晩浸漬して吸水させ、１０倍量の水を加えて約１００℃で３０分蒸煮した後固形分を除去した豆乳。
イソフラボン含有量は以下の通り：
イソフラボン含有量（μｇ／ｍｌ）：
ダイジン        １１．６８
ダイゼイン        ２．５１
ゲニスチン      ４５．２２
ゲニステイン      ３．５１
グリシチン        ５．６２
グリシテイン    １１．３３
ｂ．担子菌
（株）アミノアップ化学でマルツエキス寒天培地に２５℃で保管した椎茸菌（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）。
（２）得られた本発明の物質（発明物質２）は発明物質１同様の褐色の微粉末であり、下記の化学的、生理学的特性を有する（測定方法は実施例１に同じ）。
ａ）化学的特性
１）水分              ０．９％
２）タンパク質      １２．９％
３）脂質              １．３％
４）糖質            ７３．９％
５）食物繊維          ３．１％
６）灰分              ７．９％
７）イソフラボン類（凍結乾燥粉末１ｇあたり）
ダイジン          痕跡
ダイゼイン      ２０．５０ｍｇ
ゲニスチン        痕跡
ゲニステイン    ３７．２０ｍｇ
グリシチン        痕跡
グリシテイン      ８．４９ｍｇ
ｂ）生理学的特性
実施例１記載の方法と同様の方法により、発明物質２について腫瘍細胞増殖抑制試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、血管内皮細胞増殖抑制試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、腫瘍血管新生抑制試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、腫瘍血管新生抑制試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、血管新生抑制試験（ｅｘ  ｏｖｏ）を行った。結果を表７〜１１に示す。
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表７から明らかなとおり、発明物質２は各種培養癌細胞について高い抑制率を示し、癌細胞増殖抑制効果が高いことが明らかとなった。
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表８から明らかなとおり、発明物質２では濃度依存的に高い脳内血管内皮細胞増殖抑制効果が認められ、血管新生抑制作用を有することが明らかとなった。
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表９から明らかなとおり、発明物質２で処理されたものは新生血管が減少しており、１４．３％の高い抑制率を示した。
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表１０から明らかなとおり、腫瘍細胞処理したマウスではＣｏｌｏｎ  ２６誘導皮下血管の面積は正常マウスの約２倍であるのに対し、発明物質２を投与したマウスでは正常マウスと変らなかった。従って、発明物質２の摂取により腫瘍血管新生が抑制されたことが明らかとなった。
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表１１から明らかなとおり、発明物質２の処理により卵黄膜上に分布する血管の面積は減少し、正常卵に対して６１．３％の高い抑制率を示し血管新生抑制効果が認められた。
比較例：担子菌の単独培養物とゲニステインとの混合物の生理作用
担子菌として実施例１と同様の霊芝菌を用い、イソフラボン類含有材料の添加を省略した以外は実施例１と同様の条件で培養、凍結乾燥等を行って褐色の乾燥粉末（比較物質１）を得た。比較物質１の化学的特性は以下のとおりである（分析法は実施例１と同じ）。
化学的性質
水分            １．６％
タンパク質    １２．９％
脂質            １．６％
糖質          ７１．４％
食物繊維        ３．８％
灰分            ８．７％
次いで比較物質１の９４ｇを１Ｌの水に分散させて全体を６０℃に加温し、ゲニステイン（シグマ社製）６ｇを加えて３０分間撹拌を続けた後、全体を真空凍結乾燥して乾燥粉末（比較物質２）を得た。
発明物質１、発明物質２、比較物質１及び比較物質２についてｅｘ  ｏｖｏによる血管新生抑制試験、及び担癌マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍試験を行った。ｅｘ  ｏｖｏによる血管新生抑制試験は実施例１と同様に行い、また担癌マウスによるｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖抑制試験は下記の方法で行った。
Ｂ−１６メラノーマ細胞（１×１０５ｃｅｌｌ）をＣ５７／ＢＬマウスに皮下移植し、発明物質１、２及び比較物質１、２をそれぞれ５％の濃度で粉末飼料に混合し、腫瘍を移植すると同時に２１日間自由摂取させた。２１日目に腫瘍を摘出し、質量を測定した。
これらの試験結果を表１２及び表１３に示す。
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表１２及び表１３から明らかなように、ｅｘ  ｏｖｏによる血管新生抑制効果及び担癌マウスによる腫瘍増殖抑制効果は比較物質１及び比較物質２では対照と変らないのに対し、発明物質１及び発明物質２では高い抑制効果を示すことが確認された。