(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の少なくとも１つの標的分析物の存在を検出する方法であって、
工程ａ）表面に蛍光物質を有する微小粒子と標的分析物と、標的分析物を介して互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成される自己集合体とを結合させ、自己集合体結合粒子を作製する第１工程、及び
工程ｂ）該自己集合体結合粒子を分析することにより標的分析物を検出する第２工程、を含み、
前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブが、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’が設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブであり、
前記微小粒子が前記標的分析物と特異的に結合する捕捉用物質を有し、
前記ａ）工程が、前記標的分析物と特異的に結合可能な第１の領域と、前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブ中の１つのオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有する第２の領域と、を有するアシストプローブを用い、該アシストプローブと前記微小粒子が有する前記捕捉物質に特異的に結合した前記標的分析物との間で複合体を形成する工程、及び前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて前記アシストプローブと結合した自己集合体を形成させ、前記自己集合体結合粒子を作製する工程を含むことを特徴とする標的分析物の検出方法。
【請求項２】
前記標的分析物が複数種であり、
前記微小粒子が、前記標的分析物に対応した捕捉用物質を有し、且つその表面にそれぞれ異なる蛍光物質を有する複数種の微小粒子であり、
前記アシストプローブが、前記標的分析物に対応した複数種のアシストプローブであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つが蛍光物質又は蛍光物質と結合可能な物質で標識され、該蛍光物質と前記微小粒子表面の蛍光物質とは、蛍光の波長又は強度が異なることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ｂ）工程において、前記自己集合体結合粒子を、フローサイトメトリーを用いて分析することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記標的分析物が核酸であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法に用いられ、試料内の少なくとも１つの標的分析物の存在を検出する、下記ａ）〜ｃ）を含むことを特徴とする標的分析物の検出キット。
ａ）表面に蛍光物質を有し、且つ前記標的分析物と特異的に結合する捕捉用物質を有する微小粒子、
ｂ）５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’が設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ、及び
ｃ）前記標的分析物と特異的に結合可能な第１の領域と、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブ中の１つのオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有する第２の領域と、を有するアシストプローブ。
【請求項７】
前記標的分析物が複数種であり、
前記微小粒子が、前記標的分析物に対応した捕捉用物質を有し、且つその表面にそれぞれ異なる蛍光物質を有する複数種の微小粒子であり、
前記アシストプローブが、前記標的分析物に対応した複数種のアシストプローブであることを特徴とする請求項６記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己集合体を形成する二種のオリゴヌクレオチドを用いたシグナル増幅方法に関する。より詳細には、蛍光粒子上で、標的分析物、好ましくは複数の標的分析物を高感度で検出するための自己集合体結合粒子の製造方法及びフローサイトメトリーを用いた標的分析物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に微小粒子を用いた測定法として、ラテックス凝集法、フローサイトメトリー法などが挙げられる。しかし、ラテックス凝集法などでは、一度に一種類の標的分析物しか検出できない。しかし、フローサイトメトリーを用いた方法の中には、蛍光波長や強度の異なる複数種の微小粒子を用いて、多項目を同時に検出する方法がある（例えば、特許文献１等参照。）。上記フローサイトメトリー法を用いた多項目同時検出において、例えば遺伝子を検出する場合、事前に検体をＰＣＲ等の遺伝子増幅法を行う必要があり、感度が十分とはいえない。また、ＰＣＲ等の核酸合成による増幅では、多項目を同時に増幅することは困難であるため、項目が多い場合には一度の増幅では対応できない。【０００３】
一方、薄井らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告している（特許文献２及び３）。この方法は、互いに相補的塩基配列領域を保持させた二種のオリゴヌクレオチド（プローブという）を自己集合反応させてプローブ同士の集合体（ポリマー）を形成させる方法であり、該ポリマーを定量することにより、試料中の被験遺伝子の検出に応用するものである。この方法は、例えば、使用するプローブの相補的塩基配列領域の１箇所を試料中の被験遺伝子と相補的塩基配列とすることにより、該プローブと被験遺伝子とを結合させてからプローブのポリマーを形成させることにより被験遺伝子を有効に検出する方法であって、パルサー（PALSAR）法と呼ばれている。
【特許文献１】特表２００２−５０１１８４号公報
【特許文献２】特許第３，２６７，５７６号公報
【特許文献３】国際公開第０１／７５１５７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記したパルサー法による検出感度の向上及び複数項目同時検出を可能にすべく鋭意研究を重ねてきた。本発明は、微小粒子上の標的分析物検出のための感度の向上及び多項目同時検出が可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、フローサイトメトリー法を用いた多項目同時検出とパルサー法を組み合わせることにより、高感度で多項目同時検出が可能な本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明の自己集合体結合粒子の作製方法は、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、表面に蛍光物質を有する微小粒子（以下、蛍光微小粒子とも称する。）上に、二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成させ、前記微小粒子の表面に前記自己集合体を結合させてなる微小粒子（以下、自己集合体結合粒子と称する。）を製造することを特徴とする。
前記微小粒子に標的分析物を結合させ、該標的分析物を介して前記微小粒子と前記自己集合体が結合されることが好適である。
前記標的分析物としては、例えば、核酸が挙げられる。【０００６】
本発明の自己集合体結合粒子は、表面に蛍光物質を有し、且つ表面に互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成される自己集合体を結合させてなる微小粒子である。該自己集合体結合粒子は、前記本発明の自己集合体結合粒子の製造方法で製造される。【０００７】
本発明の標的分析物の検出方法は、試料内の少なくとも１つの標的分析物の存在を検出する方法であって、下記工程ａ）及びｂ）を含むことを特徴とする。
ａ）表面に蛍光物質を有する微小粒子と標的分析物と、標的分析物を介して互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成される自己集合体とを結合させてなる自己集合体結合粒子を作製する第１工程、及び
ｂ）該自己集合体結合粒子を分析することにより標的分析物を検出する第２工程。【０００８】
前記微小粒子が前記標的分析物と特異的に結合する捕捉用物質を有することが好ましい。
前記ａ）工程が、前記標的分析物と特異的に結合可能であり、前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブ中の１つのオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するプローブ（以下、アシストプローブと称する。）を用い、該アシストプローブと前記微小粒子が有する前記捕捉物質に特異的に結合した前記標的分析物との間で複合体を形成する工程、及び前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて前記アシストプローブと結合した自己集合体を形成させ、前記自己集合体結合粒子を作製する工程を含むことが好適である。【０００９】
前記ｂ）工程において、前記自己集合体結合粒子を、フローサイトメトリーを用いて分析することが好ましい。【００１０】
本発明において、前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つが蛍光物質又は蛍光物質と結合可能な物質で標識され、該蛍光物質と前記微小粒子表面の蛍光物質とは、蛍光の波長又は強度が異なることが好ましい。【００１１】
また、本発明において、前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブとして、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’が設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブが好適に用いられる。【００１２】
本発明の標的分析物の検出キットは、試料内の少なくとも１つの標的分析物の存在を検出する、下記ａ）及びｂ）を含むことを特徴とする。
ａ）表面に蛍光物質を有する微小粒子、及び
ｂ）５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’が設けられた、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。【００１３】
前記微小粒子が前記標的分析物と特異的に結合する捕捉用物質を有することが好ましい。
本発明の検出キットは、更に、前記標的分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブ中の１つのオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するアシストプローブを含むことが好適である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、微小粒子上の標的分析物検出のための検出感度を向上させることができ、更に特許文献１記載の方法と組み合わせることにより、多項目同時検出を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。【００１６】
本発明は、表面に蛍光物質を有する微小粒子上に、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する二種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体（ポリマー）を形成させ、シグナル増幅を行うものであり、試料中の標的分析物の検出における検出感度を著しく向上させることができる。【００１７】
本発明の試料中の標的分析物の検出方法について説明する。まず、表面に蛍光物質を有する微小粒子と標的分析物を結合させ、パルサー法を利用して標的分析物を介して前記微小粒子上に自己集合体を形成させ、自己集合体を含む微小粒子（自己集合体結合粒子）を作製する（第１工程）。その後、自己集合体結合粒子を分析し、試料中の標的分析物の存在を確定する（第２工程）。【００１８】
前記標的分析物としては、例えば、核酸が挙げられる。
本発明における標的分析物を含む試料は、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、喀痰、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。試料中の標的分析物は公知の方法により抽出し、場合によっては公知の方法により増幅して使用可能である。【００１９】
前記微小粒子としては、その表面が少なくとも一つの蛍光染料によって染色された微小粒子、又はその表面に染色済みナノ粒子が結合している微小粒子を用いることが好ましい。
また、前記微小粒子が、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソピレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロライド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリグリシジルメタクリル酸塩、ポリメチルメタクリル酸塩、または、それらの混合物、共重合体、合成物もしくは、磁石または磁気応答性の金属酸化物を有することが好適である。【００２０】
前記微小粒子が標的分析物に特異的に結合可能な捕捉用物質を含み、該捕捉用物質と標的分析物の結合により微小粒子と標的分析物を結合させることが好ましい。捕捉用物質として、該標的核酸の１領域に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、キャプチャープローブと称する。）を用いることが好ましい。これら捕捉用物質と微小粒子の結合方法は特に限定されず、公知の方法により捕捉用物質を固定化した微小粒子を用いることができる。【００２１】
パルサー法に用いられる二種のオリゴヌクレオチド・プローブとしては、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し、自ら自己集合して集合体を形成することができるものであり、例えば、特許文献２及び３記載のオリゴヌクレオチド・プローブが用いられる。【００２２】
前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブが、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブ（ＨＣＰ−１とも称する）と、５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブ（ＨＣＰ−２とも称する）と、からなる一対の第１及び第２プローブ（ＨＣＰとも称する）であることが好ましい。
【化１】
0004847961.tif 000002
【化２】
0004847961.tif 000003
【００２３】
前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域であり、前記第１及び第２プローブをハイブリダイズさせることにより、下記化学式（３）に示される構造を有するポリマーを形成することができる。
【化３】
0004847961.tif 000004
【００２４】
上記したオリゴヌクレオチド・プローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット参照。）やＬＮＡ（Locked Nucleic Acid、例えば、Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998. 54, 3607-3630. 、Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998. 120, 13252-13253.、及びWahlestedt C et al. PNAS. 2000. 97, 5633-5638.参照。）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、例えばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸類似体（例えばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、例えばＤＮＡのみから構成される必要がなく、必要に応じて、例えば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。【００２５】
微小粒子上に自己集合体を形成させる方法としては、前記パルサー法で用いられる二種のオリゴヌクレオチド・プローブ中の１オリゴヌクレオチド・プローブ（例えば、第１プローブ）の一部又は全てと同じ核酸領域を有し、且つ標的分析物に特異的に結合可能なアシストプローブを用いて、アシストプローブと標的分析物を結合させ、アシストプローブ、標的分析物及び捕捉用物質を有する微小粒子からなる複合体を形成した後、該アシストプローブと前記二種のオリゴヌクレオチド・プローブを反応させ、アシストプローブを介して標的分析物と自己集合体を結合させることが好ましい。
なお、捕捉用物質と標的分析物との反応、及び標的分析物とアシストプローブとの反応の順序は特に限定されず、いずれを先に行ってもよく、また同時に行ってもよい。【００２６】
前記アシストプローブは、標的分析物に応じて適宜選択可能である。例えば、標的分析物が核酸の場合、標的分析物の１領域（キャプチャープローブに相補的な領域を除く）に相補的な配列を有するアシストプローブを用い、ハイブリダイゼーションにより結合させることが好ましい。【００２７】
前記パルサー法で用いられる二種のオリゴヌクレオチド・プローブは、標識物質で標識されたものを用いることが好ましい。例えば、５’末端もしくは３’末端にＣｙ３等の蛍光物質もしくはビオチン、ジゴキシゲニンなどの物質で修飾されたものを用いることができ、パルサー反応後、ビオチンにはアンチビオチンもしくはストレプトアビジンと蛍光物質によるコンジュゲート、ジゴキシゲニンにはアンチジゴキシゲニンと蛍光物質のコンジュゲートを結合させ、蛍光物質を間接的に結合させることができる。
前記蛍光物質は、微小粒子の表面に結合した蛍光物質とは異なるものを選択し、微小粒子認識のための蛍光波長と、標的分析物検出のための蛍光波長を区別することが好ましい。【００２８】
前記パルサー法で用いられる二種のオリゴヌクレオチド・プローブをハイブリダイゼーション反応させることにより、該オリゴヌクレオチド・プローブが自己集合し、自己集合体が形成される。使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、１０2〜１０15本の範囲で用いられる。自己集合体形成の反応条件に特に限定はなく、標的分析物に応じて適宜反応溶液及び反応温度を選択することができる。【００２９】
前記反応溶液は緩衝液を用いることが好ましい。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。特に自己集合体形成に際し、Ｔｍ値を下げる作用のある試薬、例えばテトラエチルアンモニウムクロライド（TEAC）やテトラメチルアンモニウムクロライド（TMAC）等（例えば、William B. MELCHIOR et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 70, No. 2, pp. 298-302, 1973等参照。）を用いることが好適である。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。【００３０】
自己集合体形成の温度条件は、使用するプローブがハイブリダイズ可能な温度であれば特に制限されず、例えば、標的分析物が核酸の場合、通常の４０〜９０℃の範囲で、好ましくは４５〜６５℃の範囲で実施することができる。【００３１】
前述した如く、標的分析物及び自己集合体を含む微小粒子である自己集合体結合粒子を形成させた後、該自己集合体結合粒子を分析することにより、標的分析物を検出することができる。自己集合体結合粒子の分析方法としては特に限定されないが、フローサイトメトリーを用いることが好ましい。【００３２】
フローサイトメトリーによる検出方法は、蛍光微小粒子認識用の表面蛍光と、自己集合体結合粒子の自己集合体に結合した蛍光物質による蛍光とを検出する必要があるため、１本以上の励起用レーザーと２種類以上の波長が異なる検出用センサーが必要である。例えば、Luminex社の蛍光ビーズを蛍光微小粒子として用いる場合は、蛍光微小粒子認識に、２種類の蛍光検出用センサーを用い、標的分析物検出用に検出用センサーが１つ必要である。これらの測定には、上記条件を満たすものであればいずれも使用可能であり、例えばLuminex100（Luminex社製）、FACSシステム（ベクトンディッキンソン社製）などを用いることができる。【００３３】
以下、標的分析物（標的物質）として核酸を検出する場合を例に、本発明の標的分析物の検出方法をより具体的に説明する。
図１〜図３は、本発明の標的分析物の検出方法の第１の例を原理的に示す概略説明図である。第１の例は、標的物質として核酸を検出する場合の例を示す。図１〜３において、１０は蛍光標識された微小粒子、１６は標的核酸、１２は標的核酸に相補的な塩基配列を有するキャプチャープローブである。２０及び２２は自己集合体形成に用いられる二種のオリゴヌクレオチド・プローブであり、図中では一対のＨＣＰ［２０：ＨＣＰ−１（核酸領域ＸＹＺ）、２２：ＨＣＰ−２（核酸領域Ｘ’Ｙ’Ｚ’）］を用いた場合の例を示した。両プローブは予め蛍光物質２４で標識されている。１４はＨＣＰ−１と同じ核酸領域（ＸＹＺ）を有し、且つ標的核酸２０に相補的な核酸領域（Ｔ1）を有するアシストプローブである。【００３４】
図１に示した如く、キャプチャープローブ１２を固定した微小粒子１０、アシストプローブ１４、標的核酸１６が、図２に示した如く、互いに相補する領域を持つ場合、２箇所でハイブリダイゼーションが行われ、複合体が形成される。その後、図３に示した如く、該複合体上に、予め蛍光物質２４で標識した一対のＨＣＰ［ＨＣＰ−１（符号２０）及びＨＣＰ−２（符号２２）］を用い、自己集合体反応により自己集合体２６を形成させ、得られた自己集合体結合粒子２８の分析、例えば、フローサイトメトリーを用いたシグナル測定を行い、標的物質の有無を確定する。【００３５】
図４〜図６は、本発明の標的分析物の検出方法の第２の例を原理的に示す概略説明図である。第２の例は、標的物質として６種類の遺伝子を同時に検出する場合の例を示す。図４〜６は、標的物質である６種の遺伝子（４２ａ〜４２ｆ）中、４種の遺伝子（４２ａ，４２ｂ，４２ｄ及び４２ｆ）が試料中に存在する場合の例を示した。
図４〜図６中、４０ａ〜４０ｆは微小粒子であり、それぞれ６種類の標的遺伝子４２ａ〜４２ｆに対応したキャプチャープローブ４１ａ〜４１ｆが結合されており、その表面にそれぞれ異なる蛍光物質を含む。４４ａ〜４４ｆはアシストプローブであり、それぞれ６種の標的遺伝子４２ａ〜４２ｆに相補的な核酸領域（Ｔa〜Ｔf）を有し、且つＨＣＰ−１と同じ核酸領域（ＸＹＺ）を有する。【００３６】
図４に示した如く、６種類の遺伝子に対応したキャプチャープローブ４１ａ〜４１ｆをそれぞれ固定した蛍光微小粒子４０ａ〜４０ｆ、６種類の遺伝子にそれぞれ対応したアシストプローブ４４ａ〜４４ｆ、６種類のうち４種類に対応した標的核酸を含む試料を、同一反応液に入れハイブリダイゼーション反応を行うと、図５に示した如く、標的核酸の存在する４種類のみ粒子上で複合体が形成される。その後、図６に示した如く、標的核酸の種類に関わらず一対のＨＣＰ（２２及び２４）のみを加えることにより、自己集合体反応により該複合体上に自己集合体２６を形成させ、自己集合体結合粒子（４８ａ，４８ｂ，４８ｄ，４８ｆ）を得ることができる。【００３７】
自己集合体形成後の反応液を、フローサイトメーターを用いて測定すると、微小粒子表面の蛍光の波長あるいは強度により６種類の標的物質を分別し、その上、自己集合体による蛍光を測定することにより、複数種の標的物質を高感度で同時に検出することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【００３９】
（実施例１及び比較例１）
微小粒子上におけるパルサー法の有用性について実証した。１種類の微小粒子を用いて、各濃度（０〜５ｆｍｏｌ）の標的遺伝子（以下、ターゲットオリゴＤＮＡと称する）に対する陽性シグナルの蛍光強度をパルサー法の有無で比較した。【００４０】
１．材料
パルサー法で用いられる一対のＨＣＰとして、下記塩基配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブ（ＨＣＰ−１Ａ及びＨＣＰ−２Ａ）を用いた。
ＨＣＰ−１Ａの塩基配列（配列番号１）
5'-Cy3-CGTATCAATGATAGCCGATC CGCCTAAGTTCGATATAGTC CGCGTATACTAAGCGTAATG-3'
ＨＣＰ−２Ａの塩基配列（配列番号２）
5'-Cy3-GATCGGCTATCATTGATACG GACTATATCGAACTTAGGCG CATTACGCTTAGTATACGCG-3'【００４１】
ターゲットオリゴＤＮＡとして、ApolipoproteinE（ApoE）由来の下記塩基配列を有するターゲットオリゴＤＮＡ−１を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡ−１の塩基配列（配列番号３）
5'-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'【００４２】
キャプチャープローブとして、前記ターゲットオリゴＤＮＡ−１に相補的な塩基配列を有する下記キャプチャープローブ−１を用いた。
キャプチャープローブ−１の塩基配列（配列番号４）
5'-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCG-NH2-3'【００４３】
アシストプローブとして、前記ＨＣＰ−１Ａと同じ塩基配列、及び前記ターゲットオリゴＤＮＡ−１に相補的な塩基配列を有する下記アシストプローブ−１を用いた。
アシストプローブ−１の塩基配列（配列番号５）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG GTACTGCACCAGGCGGCCGC-3'【００４４】
微小粒子として、カルボキシル基コートビーズ（Luminex社製）を用いた。前記キャプチャープローブ−１をEDC試薬を用いて微小粒子に固定化し、実施例１で用いた。【００４５】
２．方法
（２−１）第１ハイブリダイゼーション
下記組成の第１ハイブリダイゼーション溶液（全量５０μＬ）を調製し、該溶液を９５℃２分間反応させ、６８℃１２０分間反応させた後、１５℃に保持した。
〈第１ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
微小粒子（キャプチャープローブ固定済）：５００個
アシストプローブ−１：１．５ｐｍｏｌ
ターゲットオリゴＤＮＡ−１：０，０．１，０．５，１又は５ｆｍｏｌ
１．５Ｍ  ＴＭＡＣ
０．１％  N-Lauroylsarcosine
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）【００４６】
（２−２）第２ハイブリダイゼーション（パルサー法）
下記組成の第２ハイブリダイゼーション液（全量５０μＬ）を調製し、該第２ハイブリダイゼーション溶液を２分９５℃で熱処理後、前記第１ハイブリダイゼーションの反応後の溶液に添加し（最終量１００μＬ）、６８℃で６０分間反応させた後、１５℃に保持した。
〈第２ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
ＨＣＰ−１Ａ：５０ｐｍｏｌ（実施例１）又は０（比較例１）
ＨＣＰ−２Ａ：５０ｐｍｏｌ
１．５Ｍ  ＴＭＡＣ
０．１％  N-Lauroylsarcosine
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）【００４７】
（２−３）測定
前記第２ハイブリダイゼーション反応後、フローサイトメーターにて測定を行った。測定は、フローサイトメーターとしてLuminex100（Luminex社製）を使用し、各項目１００個前後微小粒子の蛍光強度を測定後、中央値を求めた。結果を表１及び図７に示す。なお、数値はブランク値を引いた値を示した。【００４８】
【表１】
0004847961.tif 000005
【００４９】
表１及び図７に示した如く、パルサー法によりシグナル増幅した結果、実施例１の０．１ｆｍｏｌの中央値は、パルサー法を用いていない比較例１の５ｆｍｏｌの中央値よりも高く、パルサー法により著しく感度が上昇していることが示された。【００５０】
（実施例２−１〜２−３）
パルサー法による４種類の蛍光微小粒子の同時検出を行った。４種類の蛍光強度の異なる微小粒子にそれぞれ異なる４種類のキャプチャープローブを結合させ、それらに対応するターゲットオリゴＤＮＡを、１種類（実施例２−１）、２種類（実施例２−２）又は４種類（実施例２−３）混ぜて、パルサー法にて同時にシグナルを増幅し、フローサイトメーターで測定した。【００５１】
１．材料
パルサー法で用いる一対のＨＣＰとして、実施例１と同じＨＣＰ−１Ａ及びＨＣＰ−２Ａを用いた。【００５２】
ターゲットオリゴＤＮＡとして、実施例１と同じターゲットオリゴＤＮＡ−１、5,10-MethylenetetrahydrofolateReductase（MTHFR）由来の下記塩基配列を有するターゲットオリゴＤＮＡ−２、Hemochromatosisgene（HFE）由来の下記塩基配列を有するターゲットオリゴＤＮＡ−３、及びKRAS由来の下記塩基配列を有するターゲットオリゴＤＮＡ−４を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡ−２の塩基配列（配列番号６）
5'-TGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAG-3'
ターゲットオリゴＤＮＡ−３の塩基配列（配列番号７）
5'-TGCCTCAGAGCAGGACCTTGGTCTTTCCTTGTTTGAAGCTTTGGGCTACGTGGATGACCAGCTGTTCGTGTTCTATGATCATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCCCGAACTCCATGGGTTTC-3'
ターゲットオリゴＤＮＡ−４の塩基配列（配列番号８）
5'-TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTCTCTCCCGCACCTGGGAGCCGCTGAGCCTCTGG-3'【００５３】
キャプチャープローブとして、前記ターゲットオリゴＤＮＡ−１〜４にそれぞれ相補的な塩基配列を有するキャプチャープローブ−１〜４を用いた。なお、キャプチャープローブ−１は実施例１と同じである。
キャプチャープローブ−２の塩基配列（配列番号９）
5'-CCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGC-NH2-3'
キャプチャープローブ−３の塩基配列（配列番号１０）
5'-GATCATAGAACACGAACAGCTGGTCATCCACGTAGCCCAAAGCTTCAAACAAGGAAAGACC-NH2-3'
キャプチャープローブ−４の塩基配列（配列番号１１）
5'-NH2-AGGTGCGGGAGAGAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG-3【００５４】
アシストプローブとして、前記ターゲットオリゴＤＮＡ−１〜４にそれぞれ相補的な塩基配列を有し、且つ前記ＨＣＰ−１Ａと同じ塩基配列を有するアシストプローブ−１〜４を用いた。なお、アシストプローブ−１は実施例１と同じである。
アシストプローブ−２の塩基配列（配列番号１２）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG-3'
アシストプローブ−３の塩基配列（配列番号１３）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATGC TCCACACGGCGACTCTCAT-3'
アシストプローブ−４の塩基配列（配列番号１４）
5'-TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG-3'【００５５】
微小粒子として、４種のカルボキシル基コートビーズ（Luminex社製）を用いた。該微小粒子にそれぞれ前記キャプチャープローブ−１〜４のいずれかを固定化した。【００５６】
２．方法
第１ハイブリダイゼーション溶液中の微小粒子、ターゲットオリゴＤＮＡ及びアシストプローブを下記の如く変更した以外は実施例１と同様の方法で反応及び測定を行った。
ａ）微小粒子：４種の微小粒子（キャプチャープローブ固定済）を各５００個
ｂ）ターゲットオリゴＤＮＡ：ターゲットオリゴＤＮＡ−１（実施例２−１）、ターゲットオリゴＤＮＡ−１及び２（実施例２−２）、又はターゲットオリゴＤＮＡ−１〜４（実施例２−３）を各０，０．１，０．５，１又は５ｆｍｏｌ
ｃ）アシストプローブ：アシストプローブ−１〜４を各０．３７５ｐｍｏｌ（４種混合した全量１．５ｐｍｏｌ）【００５７】
実施例２−１〜２−３の結果をそれぞれ図８〜図１０に示す。なお、キャプチャープローブ−１を結合させた微小粒子の蛍光強度の結果をApoE-1、キャプチャープローブ−２を結合させた微小粒子の蛍光強度の結果をMTHFR、キャプチャープローブ−３を結合させた微小粒子の蛍光強度の結果をHFE-1、キャプチャープローブ−４を結合させた微小粒子の蛍光強度の結果をKRAS-1としてそれぞれ示した。また、数値はブランク値を引いた値を示した。【００５８】
図８〜１０に示した如く、ApoE-1については、ターゲットオリゴＤＮＡが１種類の場合や２、４種など他のターゲットが複数存在する場合においても、ほとんど変わらない高いシグナルを示したことから、パルサー法によるシグナル増幅は項目数に影響を受けないことがわかった。また、加えたターゲットのみ非常に高いシグナルが検出されたことから、パルサー法の特異性は非常に高かった。【００５９】
（実施例３）
パルサー法による１４種類の蛍光微小粒子の同時検出を行った。１４種類の蛍光強度の異なる微小粒子にそれぞれ異なる種類のキャプチャープローブを結合させ、それらに対応するターゲットオリゴＤＮＡを４種類混ぜて、パルサー法にて同時にシグナルを増幅し、フローサイトメーターで測定した。【００６０】
第１ハイブリダイゼーション溶液中の微小粒子、アシストプローブ及びターゲットオリゴＤＮＡを下記の如く変更した以外は実施例２と同様の方法で反応及び測定を行った。
ａ）微小粒子：１４種類のキャプチャープローブ（キャプチャープローブ−１〜１４）をそれぞれ固定化した１４種のカルボキシル基コートビーズ（Luminex社製）を各５００個
ｂ）ターゲットオリゴＤＮＡ：ターゲットオリゴＤＮＡ−１〜４を各０．５ｆｍｏｌ
ｃ）アシストプローブ：アシストプローブ−１〜１４を各０．１１ｐｍｏｌ（１４種混合した全量１．５ｐｍｏｌ）【００６１】
なお、ＨＣＰ−１Ａ及び２Ａ、ターゲットオリゴＤＮＡ１〜４、キャプチャープローブ−１〜４、及びアシストプローブ−１〜４は実施例２と同じであり、キャプチャープローブ−５〜１４及びアシストプローブ−５〜１４はそれぞれ下記遺伝子に対応するように設定した。
キャプチャープローブ−５及びアシストプローブ−５：Angiotensinogen（Ang）
キャプチャープローブ−６及びアシストプローブ−６：ApolipoproteinB100（ApoB）
キャプチャープローブ−７及びアシストプローブ−７：ApoE（ターゲットオリゴＤＮＡ−１とは異なる領域、ApoE-2と称する）
キャプチャープローブ−８及びアシストプローブ−８：Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase（G3P）
キャプチャープローブ−９及びアシストプローブ−９：HFE（ターゲットオリゴＤＮＡ−３とは異なる領域、HFE-2と称する）
キャプチャープローブ−１０及びアシストプローブ−１０：KRAS（ターゲットオリゴＤＮＡ−４とは異なる領域、KRAS-2と称する）
キャプチャープローブ−１１及びアシストプローブ−１１：MediumChainAcyl-CoADehydrogenase（MCAD）
キャプチャープローブ−１２、１３及びアシストプローブ−１２、１３：p53の１領域（それぞれp53-1,p53-2と称する）
キャプチャープローブ−１３及びアシストプローブ−１３：β-actin（BA）【００６２】
キャプチャープローブ−５の塩基配列（配列番号１５）
5'-AAGGGTATGCGGAAGCGAGCACCCCAGTCTGAGATGGCTCCTGCCGGTGTGAGCCTGAGGG-NH2-3'
キャプチャープローブ−６の塩基配列（配列番号１６）
5'-NH2-GGGAATATTCAGGAACTATTGCTAGTGAGGCCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCACACG-3'
キャプチャープローブ−７の塩基配列（配列番号１７）
5'-NH2-GCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC-3'
キャプチャープローブ−８の塩基配列（配列番号１８）
5'-TGGTGGTGCAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCAC-NH2-3'
キャプチャープローブ−９の塩基配列（配列番号１９）
5'-NH2-GACGGTGAGGGCTCCCAGATCACAATGAGGGGCTGATCCAGGCCTGGGTGCTCCACCTGGC-3'
キャプチャープローブ−１０の塩基配列（配列番号２０）
5'-TGACCTGCTGTGTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCCATCAATTACTACTTGCTTCC-NH2-3'
キャプチャープローブ−１１の塩基配列（配列番号２１）
5'-AAAGTTGAACTAGCTAGAATGAGTTACCAGAGAGCAGCTTGGGAGGTTGATTCTGGTCGTC-NH2-3'
キャプチャープローブ−１２の塩基配列（配列番号２２）
5'-NH2-CCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCC-3'
キャプチャープローブ−１３の塩基配列（配列番号２３）
5'-CGGGGAGCAGCCTCTGGCATTCTGGGAGCTTCATCTGGACCTGGGTCTTCAGTGAACCATT-NH2-3'
キャプチャープローブ−１４の塩基配列（配列番号２４）
5'-NH2-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGATGACCTGGCCGTCAGGCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3'【００６３】
アシストプローブ−５の塩基配列（配列番号２５）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG TGTTCTGGGTACTACAGCAG-3'
アシストプローブ−６の塩基配列（配列番号２６）
5'-GTCTTCAGTGAAGCTGCAGG CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG-3'
アシストプローブ−７の塩基配列（配列番号２７）
5'-GCCTGGCAGTGTACCAGGCC CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG-3'
アシストプローブ−８の塩基配列（配列番号２８）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG GGCCAGGGGTGCTAAGCAGT-3'
アシストプローブ−９の塩基配列（配列番号２９）
5'-ACGTATATCTCTGCTCTTCC CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG-3'
アシストプローブ−１０の塩基配列（配列番号３０）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG TCATTGCACTGTACTCCTCT-3'
アシストプローブ−１１の塩基配列（配列番号３１）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG TGCTGGCTGAAATGGCAATG-3'
アシストプローブ−１２の塩基配列（配列番号３２）
5'-CGGACGATATTGAACAATGG CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG-3
アシストプローブ−１３の塩基配列（配列番号３３）
5'-CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG CTGCTGGTGCAGGGGCCACG-3'
アシストプローブ−１４の塩基配列（配列番号３４）
5'-GGAGGAGCTGGAAGCAGCCG CGTATCAATGATAGCCGATCCGCCTAAGTTCGATATAGTCCGCGTATACTAAGCGTAATG-3'【００６４】
結果を表２及び図１１に示す。なお、数値はブランク値を引いた値を示し、０以下は全て０として表示した。表２及び図１１に示した如く、１４種類の異なる微小粒子を用いても、加えたターゲットのみに反応し、高いシグナルを示した。【００６５】
【表２】
0004847961.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の標的分析物の検出方法の第１の例を示す概略説明図であり、キャプチャープローブを結合させた微小粒子、アシストプローブ及び標的核酸を示す。
【図２】本発明の標的分析物の検出方法の第１の例を示す概略説明図であり、図１に示した微小粒子上のキャプチャープローブ、標的核酸、アシストプローブがハイブリダイゼーションにより複合体を形成したことを示す。
【図３】本発明の標的分析物の検出方法の第１の例を示す概略説明図であり、（ａ）は、パルサー法で用いる一対のオリゴヌクレオチド・プローブを示し、（ｂ）は、図２の複合体上に自己集合体が形成していることを示す。
【図４】本発明の標的分析物の検出方法の第２の例を示す概略説明図であり、キャプチャープローブを結合させた微小粒子、アシストプローブ及び標的核酸を示す。
【図５】本発明の標的分析物の検出方法の第２の例を示す概略説明図であり、標的核酸の存在する４種類の粒子上にのみ複合体を形成していることを示す。
【図６】本発明の標的分析物の検出方法の第２の例を示す概略説明図であり、図５の複合体上に自己集合体が形成していることを示す。
【図７】実施例１及び比較例１の結果を示すグラフである。
【図８】実施例２−１の結果を示すグラフである。
【図９】実施例２−２の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例２−３の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例３の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６７】
１０，４０ａ〜４０ｆ：微小粒子、１２，４１ａ〜４１ｆ：キャプチャープローブ、１４，４４ａ〜４４ｆ：アシストプローブ、１６，４２ａ，４２ｂ，４２ｄ，４２ｆ：標的核酸、２０：ＨＣＰ−１、２２：ＨＣＰ−２、２４：蛍光物質、２６：自己集合体、２８，４８ａ，４８ｂ，４８ｄ，４８ｆ：自己集合体結合粒子。
【図１】
0004847961.tif 000007
【図２】
0004847961.tif 000008
【図３】
0004847961.tif 000009
【図４】
0004847961.tif 000010
【図５】
0004847961.tif 000011
【図６】
0004847961.tif 000012
【図７】
0004847961.tif 000013
【図８】
0004847961.tif 000014
【図９】
0004847961.tif 000015
【図１０】
0004847961.tif 000016
【図１１】
0004847961.tif 000017
【配列表】
0004847961000001.app