(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電流を用いて生物学的に活性な分子を高等真核細胞の核に導入するインビトロ方法であって、核への該導入は、細胞分裂とは独立して、２〜１０ｋＶ／ｃｍの電界強度および少なくとも１０μｓの持続時間および少なくとも１Ａの電流を有するパルスによって達成されることを特徴とする該方法。
【請求項２】
パルスの電界強度が３〜８ｋＶ／ｃｍである請求項１記載の方法。
【請求項３】
パルスが最大２００μｓの持続時間を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
パルスが、１ｍｓないし最大５０ｍｓの持続時間を持つ１Ａないし最大２.５Ａの電流の流れによって中断されることなく続けられる請求項１ないし３いずれか１記載の方法。
【請求項５】
生物学的に活性な分子が核酸を含み、あるいは少なくとも核酸の一部を含む請求項１ないし４いずれか１記載の方法。
【請求項６】
核酸がペプチド、蛋白質、多糖、脂質、またはこれらの分子の組み合わせまたは誘導体との複合体にて、またはそれらと会合して存在する請求項５記載の方法。
【請求項７】
核酸と複合体化した、または核酸と会合した分子を、導入された核酸の細胞のゲノムへの組み込み、核内局所化または保持、クロマチンとの会合、または発現の調節のために用いる請求項６記載の方法。
【請求項８】
導入された核酸の細胞のゲノムへの組み込みに用いられる核酸と複合体化された分子が、レトロウイルス・インテグラーゼ、原核生物トランスポザーゼ、真核生物トランスポザーゼ、配列−特異的リコンビナーゼ、トポイソメラーゼ、Ｅ.ｃｏｌｉ ｒｅｃＡ、Ｅ.ｃｏｌｉ ｒｅｃＥ、Ｅ.ｃｏｌｉ ｒｅｃＴ、ファージλレッドα、ファージλレッドβおよびファージλターミナーゼよりなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
核内保持またはクロマチンとの会合で用いられる核酸と複合体化または会合した分子が、ＥＢＶ蛋白質ＥＢＮＡ−１のドメインを含む請求項６記載の方法。
【請求項１０】
真核細胞が休止非分裂細胞である請求項１ないし９いずれか１記載の方法。
【請求項１１】
真核細胞がヒト末梢血細胞である請求項１ないし９いずれか１記載の方法。
【請求項１２】
真核細胞がヒト血液の多能性前駆細胞である請求項１ないし９いずれか１記載の方法。
【請求項１３】
真核細胞がヒト、ラット、マウスおよびニワトリのニューロンからの胚細胞である請求項１ないし９いずれか１記載の方法。
【請求項１４】
真核細胞がヒト骨髄細胞である請求項１ないし９いずれか１記載の方法。
【請求項１５】
トランスフェクトされた真核細胞が診断方法に用いられる請求項１ないし１４いずれか１記載の方法。
【請求項１６】
エクス・ビボ遺伝子治療のための薬物の調製用の請求項１ないし１５いずれか１記載のトランスフェクトされた真核細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞分裂とは独立して、低い細胞死滅率にて、電流を用い、ＤＮＡおよび／または他の生物学的に活性な分子を高等真核細胞の核に輸送するのを可能とする新規な方法に関する。本発明は、さらに、トランスフェクションおよび細胞分析の間の時間を短くし、かくして、実験を加速する方法に関する。ＤＮＡおよび／または他の生物学的に活性な分子の核局所化で用いることができる最適化された電気的パルスを記載する。
【０００２】
発明の背景
核は真核生物ＤＮＡの機能的位置であるので、外部ＤＮＡは転写されるためには核に進入されなければならない。慣用的なトランスフェクション方法は、細胞膜を通じての細胞質へのＤＮＡの輸送を引き起こすにすぎない。核エンベロープは高等真核生物の細胞分裂の間に一時的に崩壊するという理由のみで、ＤＮＡは受動的に核に進入でき、従って、そのコードされた蛋白質は発現させることができる。非常に小さなＤＮＡ分子（オリゴヌクレオチド）のみが、核エンベロープ中のポアを通じて自由に拡散することができる。休止細胞または分裂条件の低い率を持つ細胞の効果的なトランスフェクションが提供されなければならず、その結果、より大きなＤＮＡ分子が閉じられた核膜を通って十分な量で核に進入できる。本明細書中に記載する方法はこれを高等真核細胞で可能とする。
【０００３】
先行技術
ＤＮＡは電流の助けを借りて緩衝液から細胞に導入することができることは長い間知られていた。しかしながら、従前に記載されている実験条件は、高等真核細胞の細胞質へのＤＮＡの輸送に制限されており、従って、トランスフェクトされたＤＮＡの発現は、細胞分裂の間、核エンベロープの崩壊に依存したままである。高等真核細胞の核へのＤＮＡの電気的に標的化された導入に向けられた公知の方法はない。電気的核輸送で最適化されたシステムは未だ知られていない。
【０００４】
エレクトロポレーションの開発は、生体膜が短い電気的パルスの効果を介して一時的により透過性となるという観察に基づいている（Neumann & Rosenheck 1972）。１９７６年に、Auerらは、電流を通じてのＤＮＡの赤血球細胞への取込みを記載した。
【０００５】
細胞系細胞のエレクトロポレーションの最初の報告は１９８２年に遡る（Neumannら）。ネズミ線維芽細胞系は、ほとんどの場合、３秒の間隔の一連の３パルスにて、８ｋＶ／ｃｍの電界強度および各々５μｓの持続時間を有する短いパルスを用いてトランスフェクトされた。２週間後に、分析が行われた。電気的核輸送は観察されなかった。
【０００６】
トランスフォーマーを短くすることによって、Potterら（1984）も、８ｋＶ／ｃｍの電界強度を生じさせ、それを、細胞系細胞のトランスフェクションに用いた。しかしながら、電流は最大０.９Ａに制限された。再度、電気的核輸送は観察されなかった。
【０００７】
開発の間に、より低電圧での徐々に長くした放電が用いられた。というのは、ほぼ１ｋＶ／ｃｍの電界強度は、（１０〜２０μｍの平均細胞直径を持つ）細胞膜中のポアの最適開口に十分なように見えたからである。かくして、高等真核細胞のエレクトロポレーションのための市販のデバイスおよび供給されたプロトコルのほとんどは、これらの電界強度でのトランスフェクションにつき最適化されている。
【０００８】
１つの場合（Bertlingら，１９８７）において、細胞質および核中のＤＮＡの分布速度が、分裂細胞系で追跡された。ＤＮＡ濃度の増加とは別に、ＤＮＡの核への早期取り込みを最適化しようとする他の試みはなされなかった。より具体的には、電気的パラメーターが分布に対して影響を有し得るかは調べられなかった。
【０００９】
１９８６年以来、トランスフェクションの方法としてのエレクトロポレーションに関する特許が提供されてきた。主に、それらはデバイスの構成およびパルスの形態を記載する。ＤＮＡの核への非有糸分裂輸送の問題に向けられたものはない。
【００１０】
Bio-Rad Laboratories, Richmond, U.S.A.に対する米国特許第４，７５０，１００号（１９８６）は、コンデンサー放電によって最大１２５Ａにて最大３０００Ｖを供する特定のデバイス構成を記載する。
【００１１】
米国特許第５，８６９，３２６号（Genetronics, Inc., San Diego, U.S.A., 1996）は、それに関し２、３またはそれ以上のパルスを２つの別々の電源を用いて発生させることができる特定のデバイス構成を記載する。しかしながら、米国特許第５，８６９，３２６号は、これらのパルスがＤＮＡの細胞質への輸送を超える効果を有することを示していない。
【００１２】
米国特許第６，００８，０３８号およびＥＰ  ０  ８６６  １２３  Ａ１（Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, 1998）は、それにより１０〜５００μｓの短いパルスおよび最大１.５ｋＶを発生させることができるデバイスを記載するが、再度、ＤＮＡの核への輸送をもたらすことができるある条件を示していない。
【００１３】
現在知られている方法は、低い細胞死滅率でもって、ＤＮＡおよび／または他の生物学的分子の核への効率的な輸送を可能としない。
【００１４】
従って、本発明の目的は、低い細胞死滅率をもって、ＤＮＡおよび／または他の生物学的電子の核への効率的な輸送を確保する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、トランスフェクションおよびトランスフェクトされた細胞の引き続いての分析の間の時間をおおいに短くする方法を提供することにある。
【００１６】
該目的は、本出願の特許請求の範囲の主題によって解決される。
【００１７】
本明細書中において、ＤＮＡの効率的な核輸送を媒介する特異的電気的条件、および特に低い細胞死滅率をもたらす放電および電流をまず記載する。低い細胞死滅率につき最適化された緩衝液および実験手法を同様に記載する。
【００１８】
発明の記載
本明細書中に記載する方法において、２ないし１０ｋＶ／ｃｍの非常に高い電界強度を用いて、細胞分裂とは独立して核に進入させるおいて、ＤＮＡおよび／または生物学的に活性な分子を助ける。これらの電界強度は、エレクトロポレーションで通常用いられているものよりも実質的に高く、細胞膜ポアの効果的な開口に十分な電界強度（Lurquin， 1997によると平均して１ｋＶ／ｃｍ）よりも高い。
【００１９】
従って、本発明の主題は、電流を用いて生物学的に活性な分子を真核細胞の核に導入する方法であって、核への該導入が、２〜１０のｋＶ／ｃｍの電界強度を有するパルス、および少なくとも１０μｓの持続時間および少なくとも１Ａの電流によって達成されることを特徴とする該方法である。
【００２０】
用いる高電圧の結果、核エンベロープの双方の膜中にポアが生じ、あるいは核ポア複合体が分子に対してより透過性となることができ、かくして、核への生物学的に活性な分子の非常に効果的な輸送を可能とする。該パルスは、核輸送効果を達成するには、少なくとも１０μｓの持続時間を有することを必要とする。
【００２１】
本明細書中で用いる用語「生物学的に活性な分子」は、核酸、ペプチド、蛋白質、多糖、脂質またはその組み合わせを含む。ただし、それらは細胞中で生物学的活性を示すものとする。
【００２２】
核への核酸、ペプチド、蛋白質および／または他の生物学的に活性な分子の導入は、好ましくは、本発明の好ましい具体例では、３〜８ｋＶ／ｃｍの電界強度、２００μｓを超えないパルスの持続時間を有するパルスによって達成することができる。細胞にわたる１〜２Ｖの電圧の結果、細胞膜中のポアの効果的および可逆的な開口がもたらされる（Zimmermannら, 1981）。これは、１０〜２０μｍの細胞直径において平均して１ｋＶ／ｃｍに対応する。区別されるようにより高い電圧の結果，１ｍｓ未満のパルス持続時間においてさえ、不可逆的な膜の崩壊がもたらされる（Zimmernammら，1981）。しかしながら、これは、本発明の方法を用いると起こらない。本発明による方法において、２〜１０ｋＶ／ｃｍ、好ましくは３〜８ｋＶ／ｃｍにおいてさえ、実質的な不可逆的膜崩壊が起こりえないほど十分に短いが、同時に、核輸送効果を達成するには依然として十分に長い最大２００μｓにパルス持続時間を維持するのが特に好ましい。
【００２３】
該方法の好ましい具体例において、１ｍｓないし最大５０ｍｓの持続時間を持つ１Ａないし最大２.５Ａの電流の流れによって、中断されることなくパルスを続ける。
【００２４】
電流を用いるトランスフェクションは２つの効果：細胞膜のエレクトロポレーションおよび得られた膜ポアを介するＤＮＡの電気泳動に基づいている。記載したエレクトロポレーションパルスは、各細胞型の細胞膜にポアを開けるのに十分なパルスの開始において電圧が存在し、かつパルスのさらなる経過がＤＮＡ電気泳動に十分であるように、それらの生成およびそれらの形態とは独立して双方の条件に適合する。
【００２５】
本発明の好ましい具体例において、２〜１０ｋＶ／ｃｍの電界強度が、細胞膜を介してのＤＮＡおよび／または他の生物学的に活性な分子の核への輸送のためにパルスの開始において１０〜２００μｓの間用いられ、引き続いての電気泳動は通常の条件下で行われる。
【００２６】
強いパルスおよび低い強度の短い持続時間および／または引き続いて電流の流れの短い持続時間を介して、電気的核輸送でのトランスフェクションは、非常に高い初期電圧にもかかわらず、細胞の高い生存率につき最適化される。同時に、一次細胞のタイプに応じて微妙なチューニングを行うことができる。短くかつ非常に高い電圧パルスはＤＮＡの電気泳動に寄与できるので、それは、引き続いての電流の流れが少数の細胞タイプにつき強く減少されるかまたは完全に省略することができる。
【００２７】
好ましいバージョンにおいては、緩衝液、細胞および核酸（およびおそらくは他の生物学的に活性な分子）を満たしたキュベットを、２〜１０ｋＶ／ｃｍの電界強度を持つ（１０〜２００μｓの長さの）短いインパルス、続いての５０ｍｓまで最大２.５Ａの電流に曝露する。
【００２８】
より好ましいバージョンにおいて、緩衝液、細胞および核酸（およびおそらくは他の生物学的に活性な分子）を満たしたキュベットを、３〜８ｋＶ／ｃｍの電界強度を持つ（１０〜１００μｓの長さの）短いインパルス、続いての３０ｍｓまでの最大２.２Ａの電流に曝露する。
【００２９】
このトランスフェクション方法は、細胞分裂とは独立しているので、分裂細胞ならびに低い分裂活性を持つ休止または一次細胞をトランスフェクトすることができる。
【００３０】
本発明の具体例において、ヒト末梢血細胞（好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、またはヒト血液の多能性前駆細胞）のごとき一次細胞をトランスフェクトする。もう１つの好ましい具体例において、真核細胞は、ヒト、ラットまたはマウスまたはニワトリからのニューロンの胚細胞を含む。
【００３１】
もう１つの好ましい具体例はヒト骨髄細胞を含む。
【００３２】
本発明による方法でトランスフェクトされた真核細胞は、診断方法で、およびエクス・ビボ（ex-vivo）遺伝子治療用の薬物を調製するのに用いることができる。
【００３３】
トランフェクション効率は分裂一次細胞および細胞系で増大させることができる。というのは、ＤＮＡはそれが分解する細胞分裂まで細胞質に留まる必要がないからである。かつ、分析の時点で細胞分裂を受けていない細胞を同様に分析することができる。
【００３４】
さらに、分析はトランスフェクション後直ちに可能であり、その結果、実験がかなり加速される。発現ベクターでのトランスフェクション実験では、プロモーターおよび発現された蛋白質に応じて、トランスフェクションからほぼ２０時間後に分析を行うことができる。細胞質におけるトランスフェクトされたＤＮＡの短い滞留のため、ＤＮＡはヌクレアーゼの効果にほとんど曝露されないであろう。
【００３５】
電気的核輸送に関しては、細胞分裂単独により予測されるよりも、多量のＤＮＡを分裂細胞の核に輸送することができる。両者は、完全な発現カセットの組み込みの確立を実質的に増大させる。
【００３６】
用語「電気的核輸送」は、細胞分裂とは独立して、電流によって引き起こされる、高等真核細胞の核への生物学的に活性な分子の輸送を記載する。
【００３７】
好ましくは、核に進入させることを意図する生物学的活性分子が、核酸、特にＤＮＡを含み、あるいは少なくとも１つの核酸の一部を含む。
【００３８】
核酸がペプチド、蛋白質、多糖、脂質またはこれらの分子の組み合わせまたは誘導体との複合体にて、またはそれらと会合して存在することができる。核酸複合体化した、またはそれと会合した分子は、細胞のゲノムでのトランスフェクトされた核酸分子の組み込み、核内局所化または保持、クロマチンとの会合、または発現の調節を助ける。
【００３９】
好ましい具体例においては、核酸と複合体化し、細胞のゲノムでの導入された核酸の組み込みで用いられる分子は、レトロウイルスインテグラーゼ、原核生物トランスポザーゼ、真核生物トランスポザーゼ、配列特異的リコンビナーゼ、トポイソメラーゼ、E. coli recA、E. coli recE、E. Coli recT、ファージλレッドα、ファージλレッドβおよびファージλターミナーゼよりなる群から選択される。
【００４０】
特に好ましい具体例において、核酸と複合体となるか、またはそれと関連して、クロマチンとの細胞内保持または会合に用いる分子は、ＥＢＶ蛋白質ＥＢＮＡ−１のドメインを含む。これらのドメインは、該ＥＢＮＡ−１蛋白質のアミノ酸８−５４および／または７２−８４、または７０−８９、および／または３２８−３６５を含む（Marechalら、1999）。
【００４１】
本発明による方法に用いるのに適当な緩衝剤は、以下の組成：０.４２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２；５.３６ｍＭ ＫＣｌ；０.４１ｍＭ ＭｇＳＯ４；１０３ｍＭ ＮａＣｌ；２３.８ｍＭ ＮａＨＣＯ３；５.６４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１１.１ｍＭ ｄ（＋）−グルコース；３.２５μＭグルタチオン；２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；ｐＨ７.３を有する「緩衝液１」である。
【００４２】
真核細胞の核への核酸の導入では、以下のプロトコールを行う：１×１０５〜１×１０７個の細胞および１０μｇまでのＤＮＡを室温にて１０分間２ｍｍの電極間隔を持つキュベット内の１００μｌ緩衝液１中でインキュベートし、次いで、本発明による条件に従ってトランスフェクトする。その後直ちに、該細胞を血清を含まない４００μｌ細胞培養基でキュベット外にすすぎ、３７℃にて１０分間インキュベートする。次いで、細胞を３７℃の温度の（血清を含む）細胞培養基中で培養する。
【００４３】
例えば、蛋白質の電気的核輸送は、以下のプロトコールにより生じる：１００μｌの適当な緩衝液中の１０μｇまでの蛋白質を本発明の条件により１×１０５〜１×１０７個の細胞にトランスフェクトする。その後直ちに、該細胞を血清を含まない４００μｌ細胞培養基でキュベット外にすすぎ、３７℃にて１０分間インキュベートする。次いで、細胞を３７℃の温度の（血清を含む）細胞培養基中で培養し、６時間までのインキュベート期間後に分析する。
【００４４】
適当なキュベットは、例えば、原核生物のエレクトロポレーションにつき商業的に入手可能なキュベットのごとき２ｍｍまたは１ｍｍの電極間隔を持つものである。
【００４５】
用いられた略語は本発明により以下の意味を有する。
Ｄｕｄｅｎ辞書に列記された略語に加えて、以下の略語を用いた：
ＦＡＣＳ  蛍光活性化セルソーター
ＦＣＳ    ウシ胎仔血清
Ｈ        時間
ｋＶ      キロボルト
Ｍｓ      ミリ秒
μｓ      マイクロ秒
ＰＢＭＣ  末梢血単核球細胞
ＰＥ      フィコエリスリン
【００４６】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するが、限定として考えられるべきではない。
【００４７】
実施例１
電界強度およびパルス持続時間に関連する電気的核輸送
新たに調製され刺激されていないヒト末梢血からの単核球細胞（ＰＢＭＣ）をネズミＭＨＣクラスＩ蛋白質Ｈ−２Ｋｋの重鎖をコードしているベクターでトランスフェクトした。緩衝液１中の１０μｇのベクターＤＮＡを一緒に含む１×１０６個の細胞を２ｍｍ電極間隔を持つキュベットに室温にて移し、記載された条件下にてトランスフェクトした。その後直ちに、細胞を５００μｌ ＲＰＭＩ培地（ウシ胎仔血清ＦＣＳを含まない）でキュベット外へすすぎ、３７℃にて１０分間インキュベートし、次いで、予め温めた培地（ＦＣＳを含む）で培養皿に移した。５時間培養後、該細胞を引き続いてジゴキシゲニン結合抗−Ｈ−２Ｋｋ抗体と、次いで、Ｃｙ５結合抗−ジゴキシゲニン抗体、ならびに該Ｔヘルパー細胞の同定用のフィコエリトリン（ＰＥ）−結合抗−ＣＤ４抗体とインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により分析した。死滅細胞数は、ヨウ化プロピジウム染色により決定した。
図１は、（ａ）４０μｓの持続時間を持つパルスでの電界強度に対する、および（ｂ）５ｋＶ／ｃｍのパルス持続時間に対するＴヘルパー細胞のトランスフェクション効率を示す。
【００４８】
実施例２
バルス後の電流による電気的核輸送の効率の増大
新たに調製した刺激していないＰＢＭＣを実施例１に記載されたＨ−２Ｋｋ発現ベクターでトランスフェクトした。４０μｓ間の５ｋＶ／ｃｍのパルスは、異なる強度および持続時間の電流の流れにより中断されなかった。５時間インキュベーション後、該細胞を実施例１のごとく分析し、Ｔヘルパー細胞のトランスフェクション効率を決定した（図２）。
【００４９】
実施例３
ＰＢＭＣのトランスフェクション
新たに調製した刺激していないＰＢＭＣを、実施例１に記載のごとく、５ｋＶ／ｃｍの４０μｓパルス、続いて、２０ｍｓ間の２.２Ａの電流の流れによりＨ−２Ｋｋ発現ベクターでトランスフェクトし、実施例１のごとく分析した。
【００５０】
図３は、該ＰＢＭＣのＣＤ４陽性およびＣＤ４陰性の画分中の一部分のトランスフェクトされた細胞の分析を示す。３６％の該ＣＤ４＋および１９％のＣＤ４−細胞は、トランスフェクトしたＤＮＡを発現する。２６％の死滅率の４分の３は、トランスフェクション手順のためである。
【００５１】
実施例４
ヒト臍帯からの一次（分裂）内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における電気的核輸送
実施例１に記載のごとく、ＨＵＶＥＣを５ｋＶ／ｃｍの７０μｓパルス、続いて、１０ｍｓ間の２.２Ａの電流の流れによりＨ−２Ｋｋ発現ベクターでトランスフェクトし、４時間後、引き続いてジゴキシゲニン結合抗−Ｈ−２Ｋｋ抗体と、次いで、Ｃｙ５結合抗−ジゴキシゲニン抗体、ならびにヨウ化プロピジウムとインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により分析した。
【００５２】
図４に示すごとく、該細胞の５８％が、３２％の死滅率でトランスフェクトしたＤＮＡを発現する。２４時間の分裂時間を有する細胞の１００％において、ＤＮＡがトランスフェクションにより細胞質に達し、該トランスフェクション後の再生が考えられないならば、ＤＮＡは、最大１６％の細胞にて核エンベロープの崩壊により核に達することができる。
【００５３】
実施例５
ある種の細胞系（ＨｅＬａ）における電気的核輸送
実施例４に記載のごとく、ＨｅＬａ細胞を４ｋＶ／ｃｍの１００μｓパルスによりトランスフェクトし、３時間後に分析した。図５に示すごとく、２８％の細胞がトランスフェクトしたＤＮＡを発現し、死滅率は５.５％であった。２４時間の分裂時間を有する細胞の１００％において、ＤＮＡがトランスフェクションにより細胞質に達し、該トランスフェクション後の再生が考えられないならば、ＤＮＡは、３時間後に最大１２.５％の細胞にて核エンベロープの崩壊により核に達する。
【００５４】
実施例６
種々の刺激されていない一次細胞および細胞系のトランスフェクション効率
１×１０６個のＰＢＭＣ、他の一次細胞または細胞系の細胞を実施例１に記載の手順に従い種々の発現ベクターおよび実施例１に記載の設定でトランスフェクトした。引き続いて行なったフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳｃａｎ）において、種々のサブ集団を特異的抗体により同定した。以下の表１において、平均トランスフェクション効率をリストする。ＣＤ３４＋前駆細胞のトランスフェクションの分析では、２.５〜５×１０６個のＰＢＭＣをトランスフェクトした。この時間間隔の間、細胞系の細胞は全く分裂を受けなかったか、またはほんのわずかだけが分裂を受けたので、そのトランスフェクション効率の最初の分析を３.５時間後に行なった。また、星印（＊）を付けた値はトランスフェクションの３日後に測定し、それらは２４時間の値と同様に高かった。
【００５５】
実施例７
ＨｅＬａ細胞中のＨＰＶ１８−Ｅ２蛋白質の電気的核輸送
蛋白質の電気的核輸送は、例えば、転写アクチベーター蛋白質およびレポーター構築体の同時のトランスフェクションにより示すことができ、その発現は、核中のアクチベーター分子の結合により作動できる。かくして、ＨｅＬａ細胞をプロモーター配列の上流のパピローマウィルス転写アクチベーターＨＰＶ１８−Ｅ２に対する４つの結合部位、ならびにルミネセンスレポーター配列を含有するプラスミドのベクターｐＣ１８Ｓｐ１ｌｕｃと、精製したＨＰＶ１８−Ｅ２蛋白質とでトランスフェクトした。室温にて、１×１０６個の細胞を緩衝液中の２００ｎｇベクターＤＮＡおよび８ｎｇ蛋白質と一緒にキュベットに移し、４ｋＶ／ｃｍの１００μｓパルスでトランスフェクトした。３７℃および５％ＣＯ２での６時間インキュベーション後、細胞を相対的ルミネセンス活性を測定することにより分析した。
【００５６】
図６は、該蛋白質を含むベクターＤＮＡのコトランスフェクションを示し、蛋白質の含まない調製物は対照値を表す。８ｎｇ蛋白質とのコトランスフェクション後、該対照に比較してルミネセンス活性の明らかな増大を観察し、それは、該転写アクチベーターが核に達し、その結果、レポーター配列を発現することを示す。従って、本発明による方法は、真核細胞の核にも蛋白質の導入を可能とする。
【００５７】
実施例８
抗体の電気的核輸送
抗体の電気的核輸送は、例えば、以下のセットアップにより得ることができる。１×１０６個のＨｅＬａ細胞を、室温にて、４ｋＶ／ｃｍの１０μｓパルスで、続いて、５Ａおよび１０ｍｓの電流の流れによる中断なく、１００μｌ緩衝液中の核特異的蛋白質複合体ＮＤ１０に対して指向される抗体でトランスフェクトした。該パルスの送達直後に、細胞を血清を含まない４００μｌの細胞培養基でキュベット外へすすぎ、３７℃にて１０分間インキュベートした。該細胞を３７℃の温かい細胞培養基（血清を含む）中で培養し、３７℃および５％ＣＯ２にて５時間インキュベートした。次いで、それらをホルムアルデヒド／グルタルアルデヒド中で固定し、トリトンＸ１００で透過性とし、抗−ＮＤ１０抗体に特異的なＦＩＴＣ標識抗体と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡により分析した。
【００５８】
実施例９
ＣＨＯ細胞中のＤＮＡ−蛋白質複合体の電気的核輸送
ＤＮＡ−蛋白質複合体の電気的核輸送は、例えば、トランスフェクトしたレポータープラスミド−リプレッサー複合体の発現の抑制により示すことができる。この目的のために、ＣＨＯ細胞をプロモーターおよびｌａｃリプレッサー分子が結合するＨ２Ｋｋマーカー配列間のｌａｃ−オペレーター配列を有するベクター（ｐＳｐｅ（Ｌａｃ０）１−Ｈ２Ｋｋ）でトランスフェクトした。同時に、該細胞をヒトＣＤ４をコードし、ｌａｃ−オペレーター配列を含有しないベクターｐＭＡＣＳ４.１でコトランスフェクトした。というのは、ｌａｃリプレッサー分子はそれに特異的に結合できないからである。１×１０６個の細胞を、緩衝液中で、ｌａｃ０配列を含む１μｇのＨ２Ｋｋ発現ベクターＤＮＡおよびｌａｃ０配列を含まない１μｇのＣＤ４発現ベクターＤＮＡと、室温にて、３０分間２００ｎｇｌａｃリプレッサー蛋白質と共にインキュベートし、キュベットに移し、７０μｓ間の５ｋＶ／ｃｍのパルス、続いて、６０ｍｓ間の２.２Ａの電流の流れでトランスフェクトした。３７℃および５％ＣＯ２にて５.５時間インキュベーション後、細胞をトリプシン化し、染色し、各マーカーの発現につきフローサイトメトリーにより分析した。Ｈ２Ｋｋ発現は、Ｃｙ５結合抗−Ｈ−２Ｋｋ抗体とのインキュベーションにより分析し、ＣＤ４発現をフィコエリトリン（ＰＥ）−結合抗−ＣＤ４抗体とのインキュベーションにより分析した。
【００５９】
図７に示された２つの実験結果は、結合したｌａｃリプレッサーの有無でのＤＮＡ蛋白質複合体のトランスフェクション後のマーカー配列の発現を示す。特異的に結合したｌａｃリプレッサー（ｌａｃ０配列を含むＨ２Ｋｋ発現ベクター、プラスミド１）では、ｌａｃリプレッサーのない対照に比較してＨ２Ｋｋ発現の明らかな抑制が見られ、一方、特異的ｌａｃリプレッサー結合のない（ｌａｃ０配列のないＣＤ４発現ベクター、プラスミド２）では、該ＣＤ４発現の抑制は生じなかった。これは、該ＤＮＡ−蛋白質複合体が核に達し、該リプレッサー蛋白質は、マーカー配列の発現の抑制を生じなったことを示す。従って、本発明による方法は、真核細胞の核へのＤＮＡ−蛋白質複合体の導入も可能とする。
【００６０】
実施例１０
ペプチド−ＤＮＡ−複合体の電気的核輸送
ペプチド−ＤＮＡ−複合体の電気的核輸送は、例えば、トランスフェクションに先立つレポータープラスミドのプロモーターおよびレポーターカセット間のＰＮＡ結合配列に対するＰＮＡ（ペプチド核酸）の結合によるレポータープラスミドの発現抑制により示すことができる。１μｇのＨ−２Ｋｋ発現ベクターを２５μＭ ＰＮＡペプチド（低濃度）または５０μＭ ＰＮＡペプチド（高濃度）を含む１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５℃にて１５分間インキュベートした。該発現ベクターを２つの変形、特異的ＰＮＡ結合配列の有無で用い、また、非特異的ＰＮＡペプチド（ペプチド１）および特異的結合ＰＮＡペプチド（ペプチド２）を用いた。特異的ＰＮＡ結合は、制限部位の標識を生じ、各制限分析により確かめた。用いたＰＮＡペプチドは、以下のＤＮＡ結合配列：NH２-CCTTTCTCCCTTC−ペプチド（ペプチド１）またはNH２-CTCTTCCTTTTTC−ペプチド（ペプチド２）を有した。ペプチド部分は、以下の配列：NH２-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED−COOHを有するにすぎない。Ｋ５６２細胞のトランスフェクションでは、以下の配列：NH２−GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED−COOHを含むペプチド部分を用いた。インキュベーション後、該複合体をＣＨＯ細胞において７０μｓ間の５ｋV／ｃｍのパルス、続いて、４０ｍｓ間の２.２Ａの電流の流れ、およびＫ５６２細胞において１００μｓ間の５ｋＶ／ｃｍのパルス、続いて、１０ｍｓ間の５Ａの電流の流れによりトランスフェクトした。３７℃および５％ＣＯ２での４時間インキュベーション後、細胞をＣｙ５結合抗―Ｈ−２Ｋｋ抗体で染色し、フローサイトメトリーによりＨ−２Ｋｋ発現につき分析した。
【００６１】
図８は、レポーター構築体の発現に対するベクターＤＮＡを含むＰＮＡペプチドの特異的結合および非特異的相互作用の効果を示し、それに加えて、該ペプチド−ＤＮＡ複合体が核に達したことを示す。従って、本発明による方法は、真核細胞の核へのペプチド−ＤＮＡ複合体の導入も可能とする。
【００６２】
【表１】
0004794111.tif 000002
【００６３】
引用文献
Auer, D., Brandner, G., Bodemer, W. (1976), Dielectric breakdown of the red blood cell membrane and uptake of SV40 DNA and mammalian RNA. Naturwissenschaften, 63: 391
Bertling, W., Hunger-Bertling, K., Cline, M.J. (1987), Intranuclear uptake and persistence of biologically active DNA after electroporation of mammalian cells. J Bicchem Biophys Methods Jul; 14(4): 223-32
Lurquin, P. F. (1997), Gene transfer by electroporaticn. Mol Biotechnol Feb; 7(1): 5-35
Marechal, V., Dehee, A., Chikhi-Brachet, R., Piolot, T., Coppey-Moisan, M., Nicolas, J.-C. (1999), Mapping EBNA--1 domains involved in binding to metaphase chromosomes. Virol. 73:4385-4392
【００６４】
Neumann, E., Rosenheck, K. (1972), Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membrane Biol. 10: 279-290
Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P.H. (1982), Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J; 1(7): 841-5
Potter, H., Weir, L., Leder, P. (1984), Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A Nov; 81(22): 7161-5
Zimmermann, U., Scheurich, P., Pilwat, G., Benz, R. (1981), Cells with manipulated functions: new perspectives for cell biology, medicine and technology, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 20: 325-344
【００６５】
引用特許
米国特許第4,750,100号, Ragsdale, C.W. (1988), Transfection high voltage controller
米国特許第5,869,326号, Hofmann, G. A. (1999), Electroporation employing user-configured pulsing scheme
米国特許第6,008,038号/ EP 0 866123 A1, Kroger, W., Jagdhuber, B., Ricklefs, H-J. (1999), Method and a circuit arrangement for the electropermeation of living cells
【図面の簡単な説明】
【図１】    図１（ａ）および１（ｂ）は、（ａ）４０μｓの持続時間を持つパルスでの電界強度に対する、および（ｂ）５ｋＶ／ｃｍのパルス持続時間に対するＴヘルパー細胞のトランスフェクション効率を示す。
【図２】    図２（ａ）および（ｂ）は、４０μｓ間の５ｋＶ／ｃｍのパルス後、異なる強度および持続時間の電流による中断がないＴヘルパー細胞のトランスフェクション効率を示す。
【図３】    図３は、該Ｈ−２Ｋｋ発現ベクターでトランスフェクトされたＰＢＭＣのＦＡＣＳｃａｎを示す。該細胞を引き続いてジゴキシゲニン結合抗−Ｈ−２Ｋｋ抗体と、次いで、Ｃｙ５結合抗−ジゴキシゲニン抗体、ならびに該Ｔヘルパー細胞の同定用のフィコエリトリン（ＰＥ）−結合抗―ＣＤ４抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。死滅細胞数は、ヨウ化プロピジウム染色により決定した（非染色蛍光性チャンネルＦＬ３）（ＳＳＣ＝側方散乱光；ＦＳＣ＝前方散乱光）。
【図４】    図４は、５ｋＶ／ｃｍの７０μｓパルス、続いて１０ｍｓ間の２.２Ａの電流によりトランスフェクトされた、ヒト臍帯からの一次（分裂）内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における電気的核輸送のＦＡＣＳｃａｎ分析である。該細胞を引き続いてジゴキシゲニン結合抗−Ｈ−２Ｋｋ抗体と、次いで、Ｃｙ５結合抗−ジゴキシゲニン抗体、ならびにヨウ化プロピジウムとインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により分析した（非染色蛍光性チャンネルＦＬ２およびＦＬ３）（ＳＳＣ＝側方散乱光；ＦＳＣ＝前方散乱光）。
【図５】    図５は、Ｈ−２Ｋｋ発現ベクターを含む４ｋＶ／ｃｍの１００μｓパルスによりトランスフェクトされた後のある細胞系（ＨｅＬａ）における電気的核輸送のＦＡＣＳｃａｎ分析である。４時間後、該細胞を引き続いてジゴキシゲニン結合抗−Ｈ−２Ｋｋ抗体と、次いで、Ｃｙ５結合抗−ジゴキシゲニン抗体、ならびにヨウ化プロピジウムとインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により分析した（非染色蛍光性チャンネルＦＬ２およびＦＬ３）（ＳＳＣ＝側方散乱光；ＦＳＣ＝前方散乱光）。
【図６】    図６は、転写活性蛋白質（ＨＰＶ １８−Ｅ２）の電気的核輸送をＨｅＬａ細胞中のレポーター構築体（ｐＣ１８Ｓｐ１ｌｕｃ）に対するその効果の分析により示す。蛋白質およびプラスミドが、４ｋＶ／ｃｍの１００μｓパルスにより細胞に導入された６時間後に測定を行なった。
【図７】    図７は、５ｋＶ／ｃｍの７０μｓパルス、続いての２.２Ａおよび６０ｍｓの電流による中断のないＤＮＡ蛋白質複合体でトランスフェクトされた５ 1/2の時間後ＣＨＯ細胞へのＤＮＡ−ｌａｃ−リプレッサー複合体の電気的核輸送のフローサイトメトリー測定の２つのダイアグラムを示す。
【図８】    図８は、ＣＨＯおよびＫ５６２細胞へのペプチド−ＤＮＡ複合体の電気的核輸送のフローサイトメトリー測定の２つのダイアグラムを示す。該複合体は、５ｋＶ／ｃｍの７０μｓパルス、続いての４０ｍｓ間の２.２Ａの電流により該ＣＨＯ細胞に、および５ｋＶ／ｃｍの１００μｓパルス、続いての１０ｍｓ間の５Ａの電流により該Ｋ５６２細胞に導入された。分析はトランスフェクションの４時間後に行なった。
【図１】
0004794111.tif 000003
【図２】
0004794111.tif 000004
【図３】
0004794111.tif 000005
【図４】
0004794111.tif 000006
【図５】
0004794111.tif 000007
【図６】
0004794111.tif 000008
【図７】
0004794111.tif 000009
【図８】
0004794111.tif 000010