(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９に記載の野生型配列と比較した場合に変異しているＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであって、該変異はＳ４３０Ｐ、Ｆ８４９ＩおよびＦ８８０Ｙからなる群から選択される変異の少なくとも１つを含み、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはまた、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の６３３位でセリンからプロリンへのアミノ酸変化を有するという点で少なくとも変異している、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
変異が、前記群から選択される２個以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
少なくともＳ６３３Ｐ変異、Ｆ８４９Ｉ変異およびＦ８８０Ｙ変異を含む、請求項１に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
Ｓ４３０Ｐ変異、Ｓ６３３Ｐ変異、Ｆ８４９Ｉ変異およびＦ８８０Ｙ変異を含む、請求項３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
請求項１に記載の変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードしている、ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子と適当な発現調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換されており、変異したＲＮＡポリメラーゼを発現することが可能な、形質転換細胞。
【請求項８】
等温転写介在核酸増幅反応における、請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項９】
等温転写介在増幅反応において使用するための酵素混合物であって、
−請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡポリメラーゼ、
−逆転写酵素活性を有する酵素、
を含む、前記酵素混合物。
【請求項１０】
等温転写介在増幅反応において使用するための酵素混合物であって、
−請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡポリメラーゼ、
−逆転写酵素活性およびＲｎａｓｅＨ活性を有する酵素、
を含む、前記酵素混合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、例えば高温条件下で安定性が高まるバクテリオファージ由来の変異型ＲＮＡポリメラーゼに関する。バクテリオファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼの一例は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７は、大腸菌に感染することができるバクテリオファージである。その他の大腸菌感染性Ｔ７類似のバクテリオファージの例は、Ｔ３、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２、及びＣ２３である。サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染性バクテリオファージの一例は、ＳＰ６である。バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼは、自己のプロモーター配列に対して高い選択性を有する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列とは結合するが、他のバクテリオファージのプロモーター配列とは結合しないであろう。高度のプロモーター特異性によって、バクテリオファージの転写反応は、自己のゲノムにのみ起こり、宿主のゲノムでは起こらないことが確実となる。Ｔ７バクテリオファージのヌクレオチド配列の完全長が既知であり、ファージＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７遺伝子１によりコードされている。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと類似しているその他のＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＳＰ６及びＴ３のＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ３  ＲＮＡＰは、Ｔ７  ＲＮＡＰとの約８０％の相同性を示す。Ｔ７遺伝子１は、クローニングされ、細菌において発現されており、酵素の大量生産が可能となっている（Ｓｔｕｄｉｅｒらの米国特許第４９５２４９６号）。Ｔ７ポリメラーゼは、９８．６Ｋｄａという分子量を有する８８３アミノ酸の単鎖タンパク質である。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、正確に転写されるため補助因子を必要としない。酵素は、単独で、そのプロモーターを認識し、転写を開始させ、ＲＮＡ転写物を伸長させ、転写を終結させることができる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、自己のプロモーターからのＤＮＡの転写効率が極めて高く、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼと比較して５倍の速度でＲＮＡを伸長させる。バクテリオファージ由来のポリメラーゼは、その選択性、活性、及び完全な転写物生成能により、多様な目的に極めて有用である。
【０００２】
本発明は、変異しているＴ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに関する。
【０００３】
Ｔ７様バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの特定の変異体が、いくつか記載されている。例えば、ＷＯ９１／０５８６６には、オルタナティブ発現系が記載されている。その系は、細菌においてクローニングされた遺伝子を直接転写させるため、バクテリオファージＴ７プロモーターを使用しようという試みである。その系は、短縮型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。その遺伝子は、ヌクレオチド（野生型Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の塩基３８０９及び３８７７に相当する塩基１個以上）の欠失により変異している。この欠失は、フレームシフトを起こし、その結果、新たな翻訳終止コドンが作られる。米国特許第号５３８５８３４号にも、変異Ｔ７  ＲＮＡＰが記載されている。米国特許第５３８５８３４号に記載された変異体は、グルタミン酸（２２２）をリジンに変換する、Ｔ７遺伝子１のヌクレオチド６６４におけるＧからＡへの転位である。この変異体は、改変されたプロモーターを認識し、従って、変異体は、通常は不活性であるＴ７プロモーター点変異から転写を開始させることができる。
【０００４】
Ｉｋｅｄａら（Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：９０７３−９０８０，１９９２及びＩｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：２５１７−２５２４，１９９２）は、変異型Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子配列又はプロモーター配列の活性をスクリーニングするために使用されうる２つの適合性プラスミドを記載している。第一のプラスミドは、大腸菌ｔａｃプロモーターと連結したＴ７遺伝子１（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子）を保持しており、第二のプラスミドは、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を保持している。Ｔ７ポリメラーゼがＴ７プロモーターと相互作用し、第二のプラスミドからＣＡＴ遺伝子を転写する場合、これらの２つのプラスミドを保持している大腸菌は、ＣＡＭ（クロラムフェニコール）耐性である。Ｔ７プロモーター又はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのいずれかが不活性である場合には、ＣＡＴ遺伝子は転写されず、従って大腸菌はｃａｍ感受性であろう。Ｉｋｅｄａらは、それらのプラスミドを使用して、いくつかの変異のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの活性に対する効果を調査した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子１が適当なプロモーターの調節下にある１つのプラスミド上にあり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＣＡＴのような耐性遺伝子を調節する第二のプラスミド上にある、Ｉｋｅｄａらにより記載されたものと同様のプラスミド系を用いて、変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの活性に関してスクリーニングすることも可能である。
【０００５】
バクテリオファージによりコードされたＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）を利用したインビトロ転写は、分子生物学において広範に適用される手法となっている。インビトロ転写の後に、多量のＲＮＡバクテリオファージを作製する手法としてのＲＮＡポリメラーゼは核酸増幅法の一部である。そのような方法は、例えばＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、及びＴＭＡである。インビトロ転写は、ＰＣＲ増幅後の付加的な長さの増幅工程として、ＰＣＲとの組み合わせても記載されている。
【０００６】
前記の適用全てについて、転写反応の反応速度が改善され、より重要なこととして、より高温で等温増幅法（ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、及びＴＭＡ）が実施できるよう、反応温度を上昇させることが可能であれば有利であろう。より高温でのインキュベーションで該等温増幅反応を行うと、構築されたＲＮＡがより効率よく増幅できる。このことは、長いＲＮＡ配列が長い場合（５００ヌクレオチド超）の増幅及び多重反応（即ち、１つの反応混合物における複数のＲＮＡ配列の増幅）の場合に重要となる。
【０００７】
本発明は、安定性が向上したＴ７様バクテリオファージ由来ＲＮＡポリメラーゼの変異体に関する。
【０００８】
ランダムに変異誘発されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体の分析より、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼタンパク質に対して安定効果を有し、通常（通常は３７から４１℃である）よりも高温で酵素活性を可能にする、可能な変異が多数明らかとなった。バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）において、Ｉｋｅｄａら（１９９２）に記載された、２プラスミド系でランダムに変異誘発されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ配列が、スクリーニングすることにより分析された。バチルス・ステアロサーモフィルスを高温（４５から５０℃）で培養すると、これらの温度において、変異型Ｔ７配列がポリメラーゼ活性を示し、より安定なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする場合にのみ、ＣＡＭ耐性が得られた。バチルス・ステアロサーモフィルス系において、一方のプラスミドはＴ７プロモーターの調節下にある抗生物質耐性遺伝子（ＣＡＴ）を含有し、他方のプラスミドはバチルスプロモーターの調節下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの変異体ライブラリーを含有する。変異によって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが高温において機能することが可能になった場合、バチルス・ステアロサーモフィルスはＣＡＭ耐性となるであろう。安定性が向上したＴ７ポリメラーゼ変異体は、同時係属中の共有の出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９９／０９７１６に既に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ／ＥＰ９９／０９７１６に記載された変異のうちの一つは、酵素の６３３位におけるセリンからプロリンへの変異であった。本発明により、酵素の安定性を高めるさらなる変異が見出された。本発明に係る変異には、Ｔ７配列におけるＦ８４９Ｉ変異、Ｆ８８０Ｙ変異、及びＳ４３０Ｐ変異が含まれる。好ましいのは、これらの変異のうちの２個以上を、好ましくはＳ６３３Ｐ変異と組み合わせて含む変異体である。本発明に係る変異体は、例えば、Ｆ８４９Ｉ変異又はＦ８８０Ｙ変異のいずれかと組み合わせてＳ６３３Ｐ変異を含みうる。本発明に係るもう一つの変異体は、Ｆ８８０Ｙ変異と組み合わせてＦ８４Ｉ変異を含む。改良された安定性に関する良好な結果は、Ｓ６３３Ｐ変異及びＦ８４９Ｉ変異を含み、さらにＦ８８０Ｙ変異を含む変異体によっても得られた。本発明の最も好ましい実施態様は、Ｓ４３０Ｐ変異とＳ６３３Ｐ変異とＦ８４９１変異とＦ８８０Ｙ変異とを含む四重変異体（４個の変異を含む変異体）である。この変異体は、５０℃において、野生型酵素よりも少なくとも４４倍ほど熱安定性が高まる（野生型の１．９分に対し８４．５分というＴ１／２を有する）。さらに、５０℃における四重変異体の比活性は、５０℃における野生型の比活性よりも約１２倍大きい（野生型の４．８単位／μｇに対し、変異体は５６．８単位／μｇ）。本発明に係る好ましい変異型ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７又はＳＰ３バクテリオファージ由来の変異ＲＮＡポリメラーゼである。これらの酵素間では相同性が高いので、Ｔ７遺伝子１配列での変異は、Ｔ３バクテリオファージの対応する遺伝子配列においても同一の効果を有する可能性が高い。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとＴ３  ＲＮＡポリメラーゼとの相同性は８０％であるため、Ｔ７遺伝子におけ��６３３セリン→プロリン変異と同一の効果が、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼにおける６３４セリン→プロリンアミノ酸変異についても予想されうる。
【０００９】
特に、Ｔ７又はＴ３  ＲＮＡポリメラーゼをコードしている遺伝子に関する場合は野生型タンパク質と比較するとコードされたＲＮＡポリメラーゼの安定性を高める変異を１個以上含有するＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子も、本発明の一部である。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の６３３位におけるセリンからプロリンへのタンパク質内アミノ酸変化は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列の１８９７位におけるＴ→Ｃ変異に起因している。バクテリオファージＴ７の完全ゲノム配列の３１７１番目のヌクレオチドであるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の最初のヌクレオチドを１番として、Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．及びＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．［（１９８３）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔ７  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４），４７７−５３５］により発表されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ野生型配列（配列番号９）と比較して変異を、評価する。
【００１０】
本発明は、さらに、本発明に係る変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現のための発現方法に関する。
【００１１】
遺伝子発現には、遺伝子を、該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を可能にする制御配列の調節下に置く。通常、これは、発現させる遺伝子をそのような制御配列の下流にクローニングして実施される。遺伝子又は遺伝子断片の発現を可能にする制御配列は、例えば、エンハンサー配列と組み合わせてもよいし、又は組み合わせなくてもよいプロモーター配列でありうる。これらの配列は、その天然形態において遺伝子と連結されていることが見出されるプロモーター配列でありうる。又は、それは、異種プロモーターであってもよい。異種プロモーターを使用する利点は、遺伝子の天然プロモーターを認識しない宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能になる点である。さらに、異種プロモーターは、遺伝子の発現を任意の所望の時点で開始させることができるよう、誘導可能プロモーターであってもよい。プロモーター部位は、転写の最初に、ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列である。プロモーター部位は、それらの起源である細胞の型に応じて、多様な型で存在する。プロモーター配列は、原核生物、真核生物、及びウイルスの起源のプロモーターに関して記載されている。前記の型の組換えＤＮＡ分子は、例えば、適当なＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、制御配列を含有する断片を同酵素で切断し、そして発現させるべき核酸配列がプロモーター配列の調節下に置かれるよう、両断片を連結することにより作成されうる。有用な組換え体を作成するための多くの方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載されている。一般に、組換え核酸配列は、いわゆるベクター分子にクローニングされよう。次いで、クローニングされた核酸配列を細胞へと運ぶために、適当な宿主細胞において自己複製能を有する組換えベクター分子が使用されうる。これは、組換えベクター分子の複製が起こる細胞であり得る。それは、本発明に係る変異型ＲＮＡポリメラーゼが発現されるよう、ベクターの制御配列が認識されるような細胞であってもよい。細菌において使用するためのベクター、例えばｐＢＲ３２２、３２５、及び３２８、様々なｐＵＣベクター、即ちｐＵＣ８、９、１８、１９、特異的発現ベクター；ｐＧＥＭ、ｐＧＥＸ、及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）、バクテリオファージに基づくベクター；ラムダ−ｇｔＷｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｍ１３由来ファージ、ＳＶ４０、パピローマウイルス、アデノウイルス、又はポリオーマウイルスに基づくウイルス配列を含有する真核細胞における発現のためのベクターを含む、広範囲のベクターが現在既知である（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．編；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８８），Ｌｅｎｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．；１１０：１−２４（１９９０））。変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする制御配列の調節下にある核酸配列を含む全ての組換え分子が、本発明の一部と見なされる。
【００１２】
さらに、本発明は、変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、又は変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする制御配列の調節下にある変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸配列を含有する宿主細胞を含む。本発明は、変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、又は変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする制御配列の調節下にある変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を含有するウイルスベクターを含有する宿主細胞も含む。高頻度に使用される発現系は、細菌、酵母、真菌、昆虫、及び哺乳動物の細胞の発現系である。そのような系は、当分野において周知であり、容易に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｌａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡより市販されている。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌に基づくベクター、又はｐＧＥＭのような細菌発現ベクター、又はバクテリオファージと組み合わされた、細菌起源、例えば大腸菌、バチルス・ズブチリス、及びラクトバチルス属の細胞であり得る。宿主細胞は、真核生物起源の細胞、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合わされた酵母細胞、又はベクターもしくは組換えバキュロウイルスと組み合わされた昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））、例えばＴｉプラスミドに基づくベクターもしくは植物ウイルスベクターと組み合わされた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ；Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））、やはり適切なベクターもしくは組換えウイルスと組み合わされたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、もしくはＣｒａｎｄｅｌｌネコ腎細胞のような哺乳動物細胞のような高等真核生物の細胞であってもよい。
【００１３】
従って、本発明に係るＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子と、適当な発現調節配列とを含む発現ベクター、及びそれらで形質転換された宿主細胞も、本発明の一部である。
【００１４】
本発明に係る変異型ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼが通常使用される過程、及びＲＮＡポリメラーゼが例えば高温で使用され、従って改良された安定性が向上し有利であろう過程、全てにおいて有用である。本発明に係る変異型ＲＮＡポリメラーゼは、核酸の増幅のための等温転写介在増幅過程において特に有用であろう。従って、等温転写介在増幅法におけるＲＮＡポリメラーゼの使用も、本発明の一部である。
【００１５】
転写介在増幅技術は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含む鋳型からの複数のＲＮＡコピーの転写を含む。これらの方法によると、複数のＲＮＡコピーが、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される機能的プロモーターを含むＤＮＡ鋳型から転写される。該コピーは、再び標的として使用され、それらから、ある量のＤＮＡ鋳型が新たに得られる、等である。そのような方法は、ＧｉｎｇｅｒａｓらのＷＯ８８／１０３１５及びＢｕｒｇらのＷＯ８９／１０５０に記載されている。等温転写介在増幅技術は、ＤａｖｅｙらのＥＰ３２３８２２（ＮＡＳＢＡ法と関連）、ＧｉｎｇｅｒａｓらのＥＰ３７３９６０、及びＫａｃｉａｎらのＥＰ４０８２９５に記載されている。転写介在増幅反応は、熱安定酵素を用いても実施されうる。転写介在増幅は、通常、およそセ氏３７から４１度の温度で実施される。これらの熱安定酵素は、より高温（４１℃超）での反応が可能である。そのような熱安定法は、Ｔｏｙｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  ＫＫの名称で出願されたＥＰ６８２１２１に記載されている。
【００１６】
ＥＰ３２３８２２、ＥＰ３７３９６０、及びＥＰ４０８２９５に記載された方法は、等温連続法である。この方法は、増幅を達成するために、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ（Ｈ）活性、及びＲＮＡポリメラーゼ活性という４つの酵素活性が必要とされる。これらの活性のうちのいくつかは、１つの酵素で一体化されうるため、通常必要なのは２又は３個の酵素である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する酵素である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する。転写介在増幅反応においては、ＡＭＶ（トリ筋芽細胞腫ウイルス）又はＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）のような逆転写酵素が、これらの活性のため使用されうる。そのような酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、内因性ＲＮａｓｅＨ活性は有しない。さらに、大腸菌ＲＮａｓｅＨのようなＲＮａｓｅＨが、転写介在増幅反応の反応混合物に添加されうる。
【００１７】
転写介在増幅法において一般に使用されるＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。従って、複数のＲＮＡコピーを転写するために使用される鋳型に組み込まれるプロモーターは、Ｔ７プロモーターであろう。通常、標的配列を含む核酸から、プロモーターを含む鋳型が作出されなければならない。該核酸は、増幅反応のために投入される出発材料中に存在しうる。出発材料中に存在する核酸は、通常、はるかに長い配列の一部に標的配列を含有するであろう。標的配列の３’末及び５’末の両方に、別の核酸配列が存在していてもよい。増幅反応は、出発材料由来のこの核酸と、前記活性を共同で提供する適切な酵素と、少なくとも１個、通常は２個のオリゴヌクレオチドとを混合することにより開始する。これらのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、プロモーターの配列を含むべきである。
【００１８】
転写介在増幅法は、インプット材料が一本鎖ＲＮＡである場合に特に有用であるが、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡも、インプット材料として使用されうる。転写介在増幅法が、標的配列の３’末及び５’末の両方に付加的な配列を含む（「プラス」方向の）一本鎖ＲＮＡを含む試料に対して実施される場合、先行技術に記載されたような方法により便利に使用されるオリゴヌクレオチド対は、
−  ５’末にプロモーター（好ましくは、Ｔ７プロモーター）の配列が接着している、標的配列の３’末とハイブリダイズすることができる第一オリゴヌクレオチド（通常、「プロモーター−オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）（このオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部分は、インプット材料として使用されるプラスＲＮＡと反対の極性を有する）、
−  標的配列の３’末を含む第二オリゴヌクレオチド（「プライマー」）（このオリゴヌクレオチドは、プラスＲＮＡと同一の極性を有する）
からなるであろう。そのようなオリゴヌクレオチド対を、適切な活性を有する全ての酵素と、十分な量の必要なリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドと共に１つの反応混合物中に混合し、適切な条件下で（即ち、適切な緩衝条件下で、かつ適切な温度で）で十分な時間、保持した場合に、等温連続増幅反応が起こる。
【００１９】
本発明に係るＲＮＡポリメラーゼは、他の核酸増幅法と共に使用されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応では、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列、特にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を組み込んでいるプライマーが使用される場合がある。これによって、ＰＣＲ反応のＤＮＡ産物を生成するためのＲＮＡの転写が可能となる。この場合にも、本発明に係るＲＮＡポリメラーゼが適用されうる。
【００２０】
従って、本発明により提供されるようなＲＮＡポリメラーゼと、逆転写酵素活性を有する酵素と、ＲｎａｓｅＨ活性を有する酵素とを含む、等温転写介在増幅反応において使用するための酵素混合物も、本発明の一部である。
【００２１】
以下、実施例により本発明をさらに例示する。
【００２２】
実施例１  発現プラスミド上のＨｉｓタグ化Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子への（１個以上の）変異の導入
変異の置換は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使用した部位特異的変異誘発により実施した。全ての手順を、キットに同封された製造業者のプロトコルに従い実施した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸６３３位におけるセリンからプロリンへの変異の導入に使用したオリゴプライマーは、以下の通りである。
Ａ：５’−ＧＴＧ−ＴＧＡ−ＣＴＡ−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＧＧ−ＴＣＡ−ＴＧＡ−ＣＧＣ−ＴＧＧ−３’
Ｂ：５’−ＣＣＡ−ＧＣＧ−ＴＣＡ−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＴＡＧ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−３’
オリゴヌクレオチドＢは、オリゴヌクレオチドＡと相補的である。下線が施された配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列の１８９７位におけるＴ→Ｃ変異を含むオリゴヌクレオチド配列を含有する変異クローンのスクリーニングに使用されるＭｓｐＩ制限部位を示す。その他の変異を導入するために使用したプライマーを、以下に示す。
【００２３】
Ｓ４３０Ｐ（Ｔ１２８８Ｃ）置換：
Ａ：５’−ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＡ−３’
Ｂ：５’−ＴＴＧ  ＣＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＡＡＣ−３’
【００２４】
Ｆ８４９Ｉ（Ｔ２５４５Ａ）置換（新たなＳａｕ３ＡＩ部位が出現）
Ａ：５’−ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＣＡＣ−３’
Ｂ：５’−ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＡＡ−３’
【００２５】
Ｆ８８０Ｙ（Ｔ２６３９Ａ）置換（新たなＭｌｕＩ部位が出現）
Ａ：５’−ＴＣＴ  ＴＡＧ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＡＡＣ−３’
Ｂ：５’−ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＡＧＴ  ＣＣＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＡＧＡ−３’
【００２６】
ＰＣＲ反応混合物及び条件は、以下の通りであった。
１０×Ｐｆｕ緩衝液                          ５μｌ
オリゴヌクレオチドＡ（１００ｎｇ／μｌ）    １．２５μｌ
オリゴＢ                                    １．２５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                            １．２５μｌ
プラスミド鋳型＊                              １μｌ
Ｈ２Ｏ                                      ４１μｌ
計                                          ５０μｌ
【００２７】
プラスミド鋳型は、後の手順における簡便な精製のためのヒスチジンタグと融合した、データベースに発表されているような完全なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ野生型遺伝子配列（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔｕｄｉｅｗ，Ｆ．Ｗ．（１９８３）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔ７  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４），４７７−５３５）を含有している。Ｔ７  ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４９３１）を鋳型として使用したＰＣＲにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングした。次いで、ｔａｇ配列をｐＵＣ１８のマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）へ挿入することにより予め作成しておいたｐＵＣ１８（ｔａｇ）プラスミドの適切な制限部位へ、ＰＣＲ増幅されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡをクローニングした。配列決定によりＴ７  ＲＮＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列が挿入されたことを確認した後、Ｔａｇ−Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ融合遺伝子を、ｐＫＫ２２３−３発現プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２７−４９３５−０１）の適切な部位へとサブクローニングし、Ｔａｇ−Ｔ７  ＲＮＡＰ／ｐＫＫ２２３−３を作成した。以下の温度周期プロトコルによりＰＣＲ反応を実施した。
９５℃      ３０秒
５５℃      １分
６８℃      １４分／１８サイクル
ＰＣＲ反応の後、ＤｐｎＩ制限酵素１０単位を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＤｐｎＩ処理されたＤＮＡ１μｌを使用して、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。最後に、ＭｓｐＩ制限酵素を使用したプラスミドＤＮＡのスクリーニングにより、変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼクローンを単離した。
【００２８】
実施例２
変異を含有する制限断片と、他の（１個以上の）変異を含有する変異遺伝子の同断片との置換により、複数個の変異（アミノ酸置換）を含有する（１個以上の）変異Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を構築した。置換のため使用した制限部位は、以下の通りであった。
【００２９】
【化１】
0004832694.tif 000002
【００３０】
実施例３：インビトロ転写アッセイ
インビトロ転写アッセイのための反応混合物は以下の通りである。
１０×Ｔ７  ＲＮＡＰ緩衝液            ５μｌ
ｒＮＴＰ（各２５ｍＭ）                ０．８μｌ
０．１％ＢＳＡ                        ５μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０単位／μｌ）    ０．５μｌ
鋳型プラスミド（０．５μｇ／μｌ）    １μｌ
Ｔ７  ＲＮＡＰ                        ２５単位
Ｈ２Ｏ／                                計５０μｌ
各温度で６０分間インキュベート
前記の反応混合物３μｌを０．７％アガロースゲルにアプライ
結果を、図１に示す。
【００３１】
実施例４：Ｗ．Ｔ．及び四重変異体（Ｆ８８０Ｙ＋Ｆ８４９１Ｉ＋Ｓ６３３Ｐ＋Ｓ４３０Ｐ）の比活性の比較
以下のプロトコルを使用して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの酵素的転写活性を決定する。
【００３２】
１．以下の反応混合物を調製する。
【００３３】
【表１】
0004832694.tif 000003
【００３４】
２．前記の反応混合物４５μｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに分散させる。
【００３５】
３．混合物を３７℃で３分間インキュベートする（プレインキュベーション）。
【００３６】
４．アッセイする酵素溶液（＊１）５μｌを添加し、短時間でよく混合する。
【００３７】
５．３７℃で１０分間インキュベートする。
【００３８】
６．３．６％ＰＣＡ溶液（３．６％過塩素酸、０．１Ｍ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７）１．５ｍｌを添加して反応を停止させ、氷上で１０分間インキュベートする。
【００３９】
７．濾過し、標準的な方法に従い［３Ｈ］を測定する。
【００４０】
このアッセイにおいて、転写活性は、以下の式を使用することにより計算される。
活性（単位／μｌ）＝［ｃｐｍ（試料）−ｃｐｍ（ブランク）］×２４／ｃｐｍ（全）
（１単位とは、６０分間に１ｎｍｏｌの標識ヌクレオチド三リン酸の酸不溶性材料への組み込みを触媒する活性と定義される）
【００４１】
（＊１）必要に応じて、酵素溶液は希釈緩衝液で０．５から４単位／μｌに希釈する。
希釈緩衝液：２０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．５）
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１ｍＭ  ＤＴＴ
５０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール
【００４２】
（＊２）１０×転写緩衝液  ４００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＤＴＴ
結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
0004832694.tif 000004
【００４４】
実施例５
この実施例では、以下のプロトコルを使用して、異なるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの半減期Ｔ１／２を決定する。
【００４５】
１．以下の反応混合物を調製する。
（１アッセイ用）
１０×転写緩衝液          １０μｌ
０．５Ｍ  ＫＣｌ          １４μｌ
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）    １０μｌ
Ｈ２Ｏ                    ５６μｌ
計                        ９０μｌ
（転写緩衝液：４００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び５０ｍＭ  ＤＴＴ）
【００４６】
２．アッセイすべき酵素溶液１０μｌを添加し、よく混合する。
【００４７】
３．適切な温度でインキュベートする。
【００４８】
４．５又は１０分毎に５μｌを採取し、直ちに転写活性アッセイの反応混合物（実施例３参照）へと移し、（残存）活性を測定する。
【００４９】
５．Ｔ（インキュベーション時間）に対しｌｎ［ｃｐｍ（ｔ＝Ｔ）−ｃｐｍ（ブランク）］−［ｃｐｍ（ｔ＝０）−ｃｐｍ（ブランク）］］をプロットする。
【００５０】
６．ｅ（＝２．７１８）／傾きとしてＴ１／２（分）を導出する。
野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと変異体との比較の結果
【００５１】
【表３】
0004832694.tif 000005
【００５２】
実施例６：Ｔ７  ＲＮＡＰ酵素の大規模産生系の確立
大量の酵素を得るため、大腸菌の培養及びＴ７  ＲＮＡＰ酵素の精製の条件を調査した。最終的に決定された条件は、以下の通りであった。精製条件に関しては、Ｓｔｕｄｉｅｒ（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，８１，２０３５−２０３９，１９８４）による発表を参照のこと。
【００５３】
６．１：Ｔ７  ＲＮＡＰ発現プラスミドを保有する大腸菌の培養の手順
１．Ｔ７  ＲＮＡＰ発現プラスミドを保有する単一コロニー大腸菌ＢＬ２１をＬＢ培地２ｍｌへと接種し、３０℃で１６時間培養（種種培養）。
【００５４】
２．種培養物１ｍｌをＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃で１６時間培養（種培養）。
【００５５】
３．種培養物１００ｍｌをＴＢ培地６Ｌに接種し、３７℃で１０から１２時間培養（主培養）。（使用される培地は、全て、１ｍｌ当たり５０μｇのアンピシリンを含有する。）
【００５６】
ＬＢ培地：トリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ）        １０ｇ
イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）    ５ｇ
ＮａＣｌ                                １０ｇ／Ｌ
ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整
ＴＢ培地：トリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ）        １２ｇ
イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）    ２４ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                              ２．３１ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                              １２．５ｇ
グリセロール                            ４ｍｌ／Ｌ
結果を表２に与える。
【００５７】
【表４】
0004832694.tif 000006
【００５８】
６．２  Ｔ７  ＲＮＡＰの精製の手順
１．大腸菌１００ｇを緩衝液Ａ  ５００ｍｌに懸濁させ、フレンチプレスにより破砕した。次いで、この溶解物を遠心分離し、上清（粗抽出物）を得た。
【００５９】
２．粗抽出物に、５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液１６．９ｍｌを添加し、核酸を沈殿させた。遠心分離により上清を得た。
【００６０】
３．ＰＥＩ処理後の上清に、硫酸アンモニウムを最終４５％飽和で添加した。混合物を４５℃で３０分間攪拌し、沈殿を可能にした。硫酸アンモニウム沈殿物を遠心分離により収集し、緩衝液Ｂ（＋５０ｍＭ  ＮａＣｌ）２００ｍｌに溶解させ、次いで同緩衝液に対し透析した。
【００６１】
４．酵素溶液をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１００ｍｌカラムに担荷させた。カラムを緩衝液Ｂ（＋１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、緩衝液Ｂ（＋２ｍＭ  ＮａＣｌ）でタンパク質を溶出させた。ピーク画分をプールした。
【００６２】
５．収集したプールに、硫酸アンモニウムを最終４５％飽和で添加した。次いで、硫酸アンモニウム沈殿物を収集し、緩衝液Ｂ（＋２５ｍＭ  ＮａＣｌ）２００ｍｌに溶解させ、同緩衝液に対し透析し、ＤＥＡＥ−セルロファイン（ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ）カラムの２００ｍｌカラムに担荷させた。カラムを緩衝液Ｂ（＋２５ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、２５ｍＭ  ＮａＣｌから１５０ｍＭ  ＮａＣｌへの勾配１０００ｍｌでタンパク質を溶出させた。ピーク画分を収集した。
【００６３】
６．収集したプールに、硫酸アンモニウムを最終４５％飽和で添加した。次いで、硫酸アンモニウム沈殿物を収集し、保存緩衝液３０ｍｌに溶解させ、同緩衝液に対し透析した。
得られた酵素は、最後に濾過し、−３００℃で保存した。
【００６４】
【表５】
0004832694.tif 000007
【００６５】
結果を表３に示す。
【００６６】
【表６】
0004832694.tif 000008
【００６７】
６．３  精製されたＴ７  ＲＮＡＰの品質管理アッセイ
精製された酵素を、以下の品質管理アッセイ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｓｓａｙｓ）及びインビトロ転写アッセイにより試験した。
【００６８】
エキソヌクレアーゼ活性の機能的欠如：
精製された酵素１２０単位を３Ｈ−大腸菌（ＮＥＴ−５６１）１０μｌと共に３７℃で４時間インキュベートした。酸可溶性ＤＮＡの放出は、０．０１％／単位／時間である。
【００６９】
エンドヌクレアーゼ活性の機能的欠如：
精製された酵素６０単位をｐｈｉＸ１７４  ＤＮＡ１μｇと共に３７℃で４時間インキュベートする。アガロースゲル電気泳動におけるバンドパターンに可視的変化は検出されない。
【００７０】
Ｒｎａｓｅ活性の機能的欠如：
精製された酵素２００単位を１６Ｓ＆２４ＳリボソームＲＮＡ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）２μｇと共に３７℃で４時間インキュベートする。アガロースゲル電気泳動におけるバンドパターンに可視的変化は検出されない。
【００７１】
転写反応の性能
各３０単位の精製された酵素及び市販のＲＮＡＰを、以下の前記インビトロ転写アッセイにおいて使用した。混合物をセ氏３７度及び４８度の両方で１時間インキュベートした。精製された酵素によりセ氏４８度で産生されたＲＮＡの量は、市販の酵素により３７度で産生されたＲＮＡの量とほぼ同一であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  様々な温度における、野生型及び四重変異体の転写アッセイの結果を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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