(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の加熱工程を含み生物・化学系試料を取り扱う反応・分析装置において、
流路で連結または連結可能に配置された２つ以上の室が形成され、これら流路および室の一部または全部を反応部として試料の生物・化学的な反応を行わせるカートリッジと、
このカートリッジを上から押圧して前記室にある溶液を移送するローラと、
光を放射する発光部と、
反射面が楕円球面となっていて、前記発光部を第１焦点に配置した楕円反射鏡と、
前記カートリッジの下部に設けられ、前記発光部および前記楕円反射鏡を、第２焦点が前記カートリッジ上となるように保持し、前記カートリッジの面に沿って２次元的に動き、加熱する室や流路を選択する可動ステージと、を備え、
前記可動ステージは、あらかじめ記憶された前記カートリッジの形状や加熱する室や流路の位置により、反応の進行に伴い自動的に制御されることを特徴とする反応・分析装置。
【請求項２】
前記駆動手段は、前記カートリッジに対する前記集光手段の角度を制御することを特徴とする請求項１に記載の反応・分析装置。
【請求項３】
前記カートリッジは、生物・化学反応の内容に応じて光学フィルタを有することを特徴とする請求項１または２に記載の反応・分析装置。
【請求項４】
前記発光部は、前記反応部の加熱温度に応じて光の強度あるいは照射時間を制御することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の反応・分析装置。
【請求項５】
前記発光部は、光の照射・非照射の繰り返しにより前記反応部の温度を制御することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の反応・分析装置。
【請求項６】
前記カートリッジは、前記反応部における試料の移動速度を制御することによって前記反応部の温度を制御することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の反応・分析装置。
【請求項７】
前記発光部および集光手段の組み合わせを複数用いることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の反応・分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物・化学的な反応を行わせるカートリッジを用いて、決められたプロトコルに従って、個人差がなく容易に分析を行うことができる反応・分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、溶液の合成や溶解、検出、分離などの処理においては、通常試験管やビーカー、フラスコ、ディスポーザブルチューブ、ピペットなどが利用されていた。例えば、図１０に示すように、物質Ａと物質Ｂを試験管あるいはビーカーなどの容器１と容器２に採取しておき、これを試験管あるいはビーカーなどの容器３に注入し、混合・攪拌などして物質Ｃを作る。このようにして合成された物質Ｃについては、例えば発光、発熱、呈色、比色などの観察が行われる。
あるいは、混合した物質をろ過あるいは遠心分離などして、目的の物質を分離抽出することもある。
【０００３】
また、溶解の処理、例えば有機溶剤で溶かすなどの処理においても試験管あるいはビーカーなどのガラス器具を用いて行われる。検出処理の場合も、図１０と同様に、容器１の被試験物質Ａと容器２の試薬を容器３に入れてその反応結果を観察する。
【０００４】
しかしながら、従来のフラスコやチューブなどを使用する方式では操作が煩雑であり、個人差も大きく、手間もかかるという問題があった。また、生物・化学反応を行う場合には、加熱・冷却を必要とするものも多くある。
【０００５】
そこで、従来より、下記の特許文献１に示すような、化学反応用カートリッジが提案されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−０２４５１６号公報
【０００７】
上記提案は、駆動システムの加熱を行う加熱手段をカートリッジの室または流路に直に接触させて加熱を行うものであり、加熱手段が接触する部分の弾性体を薄く形成することにより、カートリッジでも高速に加熱を行うことができるようにしたものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、接触加熱を前提としたものは、上記提案のようにカートリッジの弾性体を薄型にしたり（図１１参照）、駆動システムの加熱手段の接触部の形状や大きさ、当たりに多くの技術やノウハウを必要とするなど、加熱手段がカートリッジの構造に左右されるという問題がある。また、駆動システムが複雑で大掛かりとなり、高コストとなってしまう。
【０００９】
本発明は、上記のような従来の問題をなくし、カートリッジの構造に左右されることなく自由度の高い加熱ができるようにするとともに、駆動システムの簡略化かつ低コスト化を図ることができる反応・分析装置を実現することを目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような目的を達成するために、本発明の請求項１では、所定の加熱工程を含み生物・化学系試料を取り扱う反応・分析装置において、
流路で連結または連結可能に配置された２つ以上の室が形成され、これら流路および室の一部または全部を反応部として試料の生物・化学的な反応を行わせるカートリッジと、
このカートリッジを上から押圧して前記室にある溶液を移送するローラと、
光を放射する発光部と、
反射面が楕円球面となっていて、前記発光部を第１焦点に配置した楕円反射鏡と、
前記カートリッジの下部に設けられ、前記発光部および前記楕円反射鏡を、第２焦点が前記カートリッジ上となるように保持し、前記カートリッジの面に沿って２次元的に動き、加熱する室や流路を選択する可動ステージと、を備え、
前記可動ステージは、あらかじめ記憶された前記カートリッジの形状や加熱する室や流路の位置により、反応の進行に伴い自動的に制御されることを特徴とする。
【００１６】
請求項２では、請求項１に記載の反応・分析装置において、前記駆動手段は、前記カートリッジに対する前記集光手段の角度を制御することを特徴とする。
【００１７】
請求項３では、請求項１または２に記載の反応・分析装置において、前記カートリッジは、生物・化学反応の内容に応じて光学フィルタを有することを特徴とする。
【００１８】
請求項４では、請求項１乃至３に記載の反応・分析装置において、前記発光部は、前記反応部の加熱温度に応じて光の強度あるいは照射時間を制御することを特徴とする。
【００１９】
請求項５では、請求項１乃至４のいずれかに記載の反応・分析装置において、前記発光部は、光の照射・非照射の繰り返しにより前記反応部の温度を制御することを特徴とする。
【００２０】
請求項６では、請求項１乃至５のいずれかに記載の反応・分析装置において、前記カートリッジは、前記反応部における試料の移動速度を制御することによって前記反応部の温度を制御することを特徴とする。
【００２１】
請求項７では、請求項１乃至６のいずれかに記載の反応・分析装置において、前記発光部および集光手段の組み合わせを複数用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
このように、発光部と集光手段を設け、発光部からの光を加熱したい反応部に集光させる構成とすることにより、カートリッジの構造に左右されることなく自由度の高い加熱ができるようにするとともに、駆動システムの簡略化かつ低コスト化を図ることができる反応・分析装置を実現することができる。
本発明によれば、ペルチェのように外部から室や流路に接触固定する作用手段とは異なり、光が当たる所であれば加熱できるため、非接触の自由度がある。また、伝熱の場合、熱を下げるときに加熱部材の保熱で時定数が悪化するが、本発明は放射のため、この問題がない。
【００２３】
請求項２では、集光手段として楕円反射鏡を採用することにより、低コスト材料で光の集光作用を得ることができる。さらに、請求項３および請求項４では、楕円の「一方の焦点から出た光は、楕円の表面で反射してもう一方の焦点に集まる」という性質を利用して、効率よく光を集光させることができる。
また、楕円反射鏡は楕円の長軸や短軸を調整することができるため、発光部・集光手段と加熱対象となるカートリッジの室・流路までの距離を任意に選択することができる。そのため、駆動システム側にも自由度ができ、ひいては駆動系の負荷軽減および簡略化を図ることができる。
さらに、集光により「点」での加熱が可能なため、カートリッジ等のマイクロ化にも対応することができる。
【００２４】
請求項５では、発光部や集光手段をカートリッジに対して相対的に動かす駆動手段を設けることにより、生物・化学反応の進行具合によって加熱したい反応部が複数ある場合でも対応することができる。また、駆動手段は請求項６のように発光部と集光手段を搭載した可動ステージとしてもよいし、請求項７のように集光手段のカートリッジに対する角度を制御して加熱したい反応部を選択するようにしてもよい。
【００２５】
生物・化学反応の中には蛍光物質等の劣化が懸念されるような反応もあるが、そのような反応を扱う場合には、請求項８のように発光部に適切な光学フィルタを設けることによって試料の保護や分解防止を図ることができる。なお、光学フィルタは発光部に設けてもよいし、カートリッジの室や流路の手前に設ける構成としてもよい。光学フィルタとしては、特定の波長の光を遮断するカットフィルタや、光の光量を制御するようなＮＤフィルタが考えられる。
【００２６】
請求項９では、発光部の光の強度あるいは照射時間を制御することによって、加熱対象の反応部を希望の温度に調整することができる。加熱温度が大きい場合には光の強度を強めたり、照射時間を長くしたりする。加熱温度が小さい場合には光の強度を弱めたり、照射時間を短くしたりする。
また、温度調整は、請求項１０のように光の照射・非照射の繰り返しにより行ってもよい。これは化学反応のような恒温反応に適していると考えられる。加熱温度が大きい場合には照射時間を長くしたり、繰り返しの間隔を短くしたりする。加熱温度が小さい場合には照射時間を短くしたり、繰り返しの間隔を長くしたりする。
さらに、ＰＣＲ等のような加熱サイクルを必要とする反応では、請求項１１のように流路や室における試料の流速の調整により温度制御することとしてもよい。加熱温度が大きい場合には流速を小さくし、加熱温度が低い場合には流速を大きくする。
【００２７】
また、請求項１２では、ひとつのカートリッジにつき発光部・集光手段の組み合わせを複数用いることにより、同時に加熱したい室や流路が複数ある場合に対応することができるなど、カートリッジの構造や取り扱う生物・化学反応の種類にバリエーションを持たせることが可能である。なお、発光部・集光手段の組み合わせは、加熱したい反応部の数に応じて備えることとしてもよい。その場合、集光手段として用いる楕円反射鏡の軸長は必ずしも統一する必要はなく、カートリッジの形状や駆動システムに合わせて個別に柔軟に決定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、図面を用いて本発明の反応・分析装置を説明する。
【実施例１】
【００２９】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明による反応・分析装置で用いる化学反応用カートリッジの基本的構成の一例を示す図である。なお、図１（ａ）は斜視図、同図（ｂ）は弾性体下面図、同図（ｃ）はＺ−Ｚ’断面図である。化学反応用カートリッジ１００は、気密状で弾力性のあるゴムなどの弾性体１１０と、硬質材料で形成された平板状の基板１２０より形成されている。
【００３０】
弾性体１１０の裏面には、図１（ｂ）のように、それぞれ表面側に凹んだ、溶液用の室１１１、１１２、１１４と、反応部用の室（反応部室という）１１３および１１５と、廃液収容用の室（廃液収容室という）１１６と、各室をそれぞれ連結する流路１１７、１１８が形成されている。溶液室１１１、１１２、１１４には、図２（ｃ）のように、注射器１２２などで、あらかじめ溶液Ａ、溶液Ｂ、溶液Ｃをそれぞれ注入しておく。
弾性体１１０の室と流路以外の平面状の接着領域１１９は、図１（ｃ）に示すように、基板１２０の表面に接着される。これにより各室と流路は弾性体１１０と基板１２０で密閉され、溶液の外部漏れが防止できる構造となっている。
【００３１】
カートリッジにおける溶液の移送はローラ１３０を動かすことによって行う。図２に示すように、ローラ１３０をカートリッジ１００の左端部で、室１１１が押し潰される程度に、上から押しつける。ローラ１３０はカートリッジ１００の全幅にわたって押圧する。
【００３２】
この状態で、図３（ａ）に示すようにローラ１３０を位置１のところから回転させて右方向へ移動すると、室１１１に保存されている溶液Ａが右方向へ押し出される。溶液Ａは流路１１７を通って反応部室１１３へ送り込まれる。
【００３３】
図３（ｂ）のように位置２のところまで回転移動させて行くと、今度は室１１２内の溶液Ｂの送り出しが始まり、溶液Ｂは流路１１７を通って反応部室１１３へ押し出される。このとき、流路１１７の途中もローラ１３０の押下により押し潰され、これが逆止弁となって、溶液Ｂの室１１１への逆流は防止される。このようにして、室内の流体状の物質を移動または阻止することができる。
【００３４】
反応部室１１３では、溶液ＡとＢが混合し反応する。ここで言う反応とは、例えば、混合、合成、溶解、分離などである。
【００３５】
同様に、図３（ｃ）のようにローラ１３０を回転移動させていくと、反応部室１１３の溶液ＡとＢ、さらに溶液室１１４内の溶液Ｃが順次押し出され、反応部室１１５に移動する。
このように、ローラ１３０を動かすことによって、各部屋の液が混合し反応する。
【００３６】
このようなカートリッジは小型、軽量、低価格に作製でき、密閉状のカートリッジ内で物質の混合や合成、溶解、分離、検出などの処理のプロトコルを個人差なく容易に行うことができる。そして、このようなカートリッジの利用により、例えばダイオキシンのような毒物・危険物・有害物や、細菌・ウイルスなど、危険性のある対象の密閉環境内での分析・検出が可能となる。
【００３７】
本発明は、上記のような構成のカートリッジを用いた反応・分析装置において、１１３、１１５のような反応部室や流路を加熱する手段として提案されたものである。
【００３８】
図４は本発明による反応・分析装置の一実施例を示す図である。上記カートリッジ１００の下部に、カートリッジ１００の面に沿って２次元的に位置を動かすことができる可動ステージ５００を設け、可動ステージ５００上に光を放射する光源３００と、反射面が楕円球面になっている楕円反射鏡４００を設置する。光源３００からの光を楕円反射鏡４００の鏡面で反射して集光し、集光した光をカートリッジ１００上において加熱したい流路や室に当てることにより加熱を行う。
【００３９】
図５は光源３００と楕円反射鏡４００の位置関係を示す図である。Ｆ１は楕円反射鏡４００の第１焦点、Ｆ２は第２焦点である。
図５（ａ）は光源３００を第１焦点Ｆ１に配置した例である。一般に楕円には「一方の焦点から出た光は、楕円の表面で反射してもう一方の焦点に集まる」という性質があるため、光源３００を第１焦点Ｆ１に配置することにより、光源３００から放射された光を楕円反射鏡４００の第２焦点Ｆ２に集めることができ、光を効率良く一点に集光することができる。
なお、図５（ｂ）は光源３００を楕円反射鏡４００の外部に配置した例である。光源３００は楕円反射鏡４００の第１焦点Ｆ１を外部から照射する。第１焦点Ｆ１を通過した光は、図５（ａ）と同様に楕円反射鏡４００の鏡面で反射されて第２焦点Ｆ２に集まるため、光源３００を楕円反射鏡４００に対しこのように設置することも可能である。
【００４０】
光源３００と楕円反射鏡４００は、第２焦点に相当する位置がカートリッジ１００上となるように可動ステージ５００に保持される。もしくは、可動ステージ５００自体を調整して楕円反射鏡４００の第２焦点がカートリッジ１００上に合うようにする。加熱する室や流路は、可動ステージ５００を動かすことにより選択する。
【００４１】
なお、第１焦点Ｆ１と第２焦点Ｆ２の位置は、図６に示すように、楕円の形状から計算により求めることができる。一般に、ＸＹ平面において楕円の半長軸の長さをａ、半短軸の長さをｂとしたとき、楕円の座標（ｘ，ｙ）は下記の式１を満たす。また、楕円の第１焦点Ｆ１と第２焦点Ｆ２の位置は、それぞれ式２および式３で表され、ａとｂの値で一義的に決定することができる。
0004770568.tif 000002
【００４２】
光源３００と楕円反射鏡４００による加熱は、カートリッジ１００上での生物・化学反応の進行に合わせて行う。たとえば、カートリッジ１００の反応部室１１３および１１５での反応において、それぞれ加熱を行う場合を考える。
【００４３】
図７は光源３００と楕円反射鏡４００で複数の室の加熱を行う様子を示す図である。まず、可動ステージを制御して、反応部室１１３の位置に光の集光点がくるように位置させる。ローラ１３０が回転移動し、溶液Ａと溶液Ｂが反応部室１１３に送り出されて加熱が必要なフェーズに移行すると、光源３００を発光させ、加熱を開始する。そして反応部室１１３における反応の終了、または反応の加熱フェーズの終了に伴い、光源３００を消灯させる。
【００４４】
反応部室１１３での加熱作業が終了すると、再度可動ステージ５００を制御し、楕円反射鏡４００の第２焦点Ｆ２が反応部室１１５の位置となるよう移動させる。ローラ１３０がさらに回転移動し、溶液Ａ、Ｂ、Ｃが反応部室１１５に送り出されて加熱が必要なフェーズに移行すると、光源３００を発光させ、加熱を開始する。そして反応部室１１５における反応の終了、または反応の加熱フェーズの終了に伴い、光源３００を消灯させる。
【００４５】
可動ステージ５００の制御は、カートリッジ１００の形状や加熱する室や流路の位置をあらかじめ反応・分析装置に記憶させておき、反応の進行に伴い自動的に行われる構成とする。
【００４６】
反応部室１１３、１１５は、光源３００の発光強度や照射時間などを制御することによって希望の温度に調整する。加熱温度は反応の種類や内容によって最適なものを選択する。
たとえば、反応の際に高温に保つ必要がある場合、すなわち反応部室の加熱温度が大きい場合には、光の強度を強めたり、照射時間を長くしたりする。一方反応部室の加熱温度が小さい場合には、光の強度を弱めたり、照射時間を短くしたりする。
また、ＰＷＭ制御やＰＦＭ制御により照射・非照射の割合や周波数を調整する構成も考えられる。反応部室の加熱温度が大きい場合には、照射の割合を大きくしたり、周波数を高くしたりする。加熱温度が小さい場合には、照射の割合を小さくしたり、周波数を下げたりする。なお、発光強度や照射時間などの調整は、加熱する反応部室ごとや流路ごとに行うことができる。
【００４７】
光源３００としては、レーザーや、ハロゲン・キセノン・水銀に代表されるような白色光源等が考えられるが、加熱温度や装置全体の物理的構成から適当な光源を採用する。また、ＬＥＤを用いて安価に構成することも可能である。
【００４８】
また、反応部室１１３、１１５で行う反応が、光の照射により蛍光物質等の退色が懸念されるようなものである場合には、光源３００に適切な光学フィルタを設けて試料の保護や分解防止を図る。たとえば、光源３００から発せられる光の波長のうち特定のものが試料に悪影響となるような場合には、光学フィルタとしてその特定の波長を遮断するカットフィルタやバンドパスフィルタが考えられる。また、併せてＮＤフィルタの使用も可能である。
【００４９】
なお、光学フィルタは、光源３００に設けるのではなく、カートリッジの室や流路の手前に設ける構成としてもよい。たとえば反応部室１１３と１１５とでカットしたい波長が異なるような場合には、光源３００に光学フィルタを設けるよりも、反応部室１１３と１１５の手前にそれぞれ別々の光学フィルタを設ける方が効率的である。
【００５０】
このように、光源３００と楕円反射鏡４００を用いることにより、ペルチェのように外部からの伝熱とは異なり、非接触で加熱を行うことができる。さらに、楕円反射鏡４００は設計上その長軸や短軸を調整することができるため、光源３００・楕円反射鏡４００と加熱対象となるカートリッジの室・流路までの距離を任意に選択することができる。そのため、駆動システム側にも自由度ができ、ひいては駆動系の負荷軽減および簡略化を図ることができる。また、光を利用する方が伝熱よりも温度制御が容易で昇温も早いという利点もある。
【００５１】
さらに、焦点位置という「点」での加熱が可能であり、カートリッジ１００上の流路や室にピンポイントに光を効率よく照射し加熱することができ、ひいてはカートリッジ等のマイクロ化にも対応することができる。
【００５２】
このように、カートリッジの構造に左右されることなく自由度の高い加熱ができるようにするとともに、駆動システムの簡略化かつ低コスト化を図ることができる反応・分析装置を実現することができる。
【００５３】
なお、本発明による反応・分析装置で取り扱う反応としては、生物反応ではＰＣＲ増幅、核酸の等温増幅、核酸の転写反応、ハイブリダイゼーション、核酸のフラグメント化、細胞の粉砕・培養などが考えられる。また、化学反応では、重合反応、触媒反応、転移反応、置換反応、付加反応や、吸熱反応時の給熱などが考えられる。
【実施例２】
【００５４】
加熱サイクルを必要とする反応では、流路や室における試料の流速でも温度制御することが可能である。
【００５５】
図８は加熱サイクルの様子を示す図である。試料をリング状に形成した流路１２３内に導入し、その中で流動させる。流路１２３の一部を図に示すように光源３００と楕円反射鏡４００で加熱する。試料は流路１２３内を流れながら楕円反射鏡４００の焦点のポイントで加熱される。その後試料は流路１２３内を流れるうちに放熱し冷却され、再び楕円反射鏡４００の焦点のポイントを流れる際に加熱される。
【００５６】
このように試料を流路内で周回させながら加熱と冷却を繰り返すことによって、加熱サイクルを容易に実現することができる。
【００５７】
加熱温度の制御は、光源３００の照射強度等だけでなく、試料の流速によっても制御することができる。試料の流速を小さくすれば単位体積あたりの加熱時間が長くなるため高温でのサイクルとすることができる。一方試料の流速を大きくすれば低温でのサイクルとすることができる。
【００５８】
このような加熱サイクルは、特にＰＣＲ等の生物反応に適していると考えられる。他にも、加熱・冷却を高速に繰り返す必要がある反応や、温度変化の激しい反応にも有効と考えられる。
【実施例３】
【００５９】
前記実施例１では、光源３００と楕円反射鏡４００を可動ステージ５００上に設置し、可動ステージ５００を動かすことにより加熱したい室や流路を選択したが、カートリッジ１００に対する楕円反射鏡４００の角度の制御により選択する構成とすることができる。
【００６０】
図９は楕円反射鏡４００の角度により加熱する室や流路の選択を行う例を示す図である。試料が反応を行う室や流路の進行に合わせて、楕円反射鏡４００の設置角度を図９（ａ）〜（ｃ）のように変化させ、カートリッジ上での加熱位置を制御する。
角度の制御は、図９のように光源３００と楕円反射鏡４００の両方をともに変化させてもよいし、光源３００は固定し楕円反射鏡４００のみ角度を変化させる構成としてもよい。
なお、角度を変化させることにより焦点のピントが合わなくなる場合には、角度の制御とともに、カートリッジ上にピントが合うよう可動ステージ５００を上下方向に調整するようにしてもよい。
【００６１】
また、楕円反射鏡４００の角度制御は可動ステージと組み合わせて実施してもよい。さらに、ひとつのカートリッジにつき実施例１〜３で示したような光源３００・楕円反射鏡４００の組み合わせを複数用いてもよい。同時に加熱したい室や流路が複数ある場合に容易に対応することができるなど、カートリッジの構造や取り扱う生物・化学反応の種類にバリエーションを持たせることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は本発明による反応・分析装置で用いる化学反応用カートリッジの基本的構成の一例を示す図。
【図２】図２はカートリッジの動作状態を示す図。
【図３】図３はカートリッジの動作状態を示す図。
【図４】図４は本発明による反応・分析装置の一実施例を示す図。
【図５】図５は光源と楕円反射鏡の位置関係を示す図。
【図６】図６は楕円の軸長と焦点の関係の説明図。
【図７】図７は光源と楕円反射鏡で複数の室の加熱を行う様子を示す図。
【図８】図８は加熱サイクルの様子を示す図。
【図９】図９は楕円反射鏡の角度により加熱する室や流路の選択を行う例を示す図。
【図１０】図１０は従来の処理方式の説明図。
【図１１】図１１は従来例によるカートリッジの一例を示す図。
【符号の説明】
【００６３】
１００          カートリッジ
１１０          弾性体
１１１、１１２、１１４  室
１１３、１１５  反応部室
１１６          廃液収容室
１１７、１１８、１２３  流路
１１９          接着領域
１２０          基板
１２１          注射針
１２２          注射器
１３０          ローラ
３００          光源
４００          楕円反射鏡
５００          可動ステージ
６０１、６０２  バルブ
【図１】
0004770568.tif 000003
【図２】
0004770568.tif 000004
【図３】
0004770568.tif 000005
【図４】
0004770568.tif 000006
【図５】
0004770568.tif 000007
【図６】
0004770568.tif 000008
【図７】
0004770568.tif 000009
【図８】
0004770568.tif 000010
【図９】
0004770568.tif 000011
【図１０】
0004770568.tif 000012
【図１１】
0004770568.tif 000013