(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中に存在する分子の質量数に関する情報を得るための情報取得方法であって、
前記液体を液滴として吐出させる第一の工程と、
当該吐出された液滴を液溜め部に受領し、導入通路を通じて液体として流し、先鋭部から静電噴霧を行うことで、電荷を帯びたさらに微細な液粒とし、前記液粒から、液体の蒸散によって前記液体中に存在した分子のイオンを得る第二の工程と、
前記イオンの質量数に関する情報を質量分析法により得る第三の工程と、
を含むことを特徴とする情報取得方法。
【請求項２】
前記第一の工程が、インクジェットノズルから液滴を吐出させる工程であることを特徴とする請求項１記載の情報取得方法。
【請求項３】
前記第二の工程が、前記液粒を加熱する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の情報取得方法。
【請求項４】
前記第一の工程が、複数のインクジェットノズルから複数の種類の液滴を順次吐出する工程であって、前記第三の工程が、前記各々の液滴に含まれる分子の質量数に関する情報を順次取得する工程であることを特徴とする請求項２記載の情報取得方法。
【請求項５】
前記第一の工程が複数のインクジェットノズルから任意の複数の種類の液滴を吐出する工程であって、前記第二の工程が前記複数の液滴を混合し反応させる工程を含み、前記第三の工程が前記反応の生成物の質量数に関する情報を取得する工程であることを特徴とする請求項２記載の情報取得方法。
【請求項６】
前記複数の種類の液滴が、ＤＮＡを溶解した溶液と、特定の塩基配列を質量情報においてラベル化できる溶液との組合せであり、当該各溶液の反応により生成する分子の質量分析により、前記特定の塩基配列の存在に関する情報を得ることを特徴とする請求項５記載の情報取得方法。
【請求項７】
前記複数の種類の液滴が、蛋白質の溶解した溶液と、ある特定の蛋白質を質量情報においてラベル化できる溶液との組合せであり、当該各溶液の反応により生成する分子の質量分析により、前記特定の蛋白質の存在に関する情報を得ることを特徴とする請求項５記載の情報取得方法。
【請求項８】
試料溶液を供給するインクジェットノズルと、
当該インクジェットノズルから吐出された液滴を受領する液滴溜め部と、
当該液滴溜め部に受領された液滴を電圧が印加される部位に液体として導く導入通路と、
当該導入通路より電圧の印加される部位に導かれた液滴をさらに微小な液粒にして静電噴霧する先鋭部と、
当該液粒に熱を加えるヒーターと、
当該液体中に含まれていた分子のイオンを取り込むイオン取り込み口と、
当該取り込まれたイオンを質量に基づいて分離する質量分析装置と、
を具備することを特徴とする情報取得装置。
【請求項９】
前記導入通路が、液体クロマトグラフィーにより液体中の成分を分離する通路であることを特徴とする請求項８記載の情報取得装置。
【請求項１０】
前記導入通路が、毛管現象により前記液体溜めより前記先鋭部に導くものである請求項１から７のいずれかに記載の情報取得方法。
【請求項１１】
前記導入通路が、毛管である請求項８または９に記載の情報取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に存在する分子の質量数及び複数の種類の溶液を混合した際の反応に関する情報を取得するための情報取得方法及び情報取得装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エレクトロスプレーイオン化の原理は、まず試料溶液を高電位が印加されたキャピラリーの先端から静電噴霧させることにより電荷を持った液滴を作り、ついでこの荷電液滴を熱や不活性ガスを用いて脱溶媒することにより試料分子に荷電を移行させてイオン化するというものである。
【０００３】
このようにしてイオン化した分子は、質量分析装置へと導かれて質量分析に供される。
【０００４】
エレクトロスプレーイオン化は、低分子化合物から生体高分子までのイオン化法として広く用いられている。
【０００５】
特に、このイオン化法は高い熱をかけたり、高エネルギー粒子を衝突させたりしないため、温和な条件で物質をイオン化できる特徴を持つことから、ペプチド、たんぱく質、核酸などの生体高分子を破壊することなく多価イオンを生成させることができる、などの特徴をもつ。
【０００６】
溶液試料が対象であるので、シリンジポンプを用いて試料溶液を直接導入する際のイオン化法や、液体クロマトグラフィーと組合せたＬＣ／ＭＳやキャピラリー電気泳動と組合せたＣＥ／ＭＳのイオン化法として利用されている。
【０００７】
一般的なエレクトロスプレーイオン化には、内径１００〜１２０μｍ程度の金属製細管又は内径２０〜１００μｍのシリカ製細管が用いられる。
【０００８】
試料溶液の流量は内径により異なるが、実用的には１００〜１００００ｎｌ／ｍｉｎ．である。
【０００９】
１９９０年代には溶液試料を３０〜５００ｎｌ／ｍｉｎ．の極微流量でイオン化できるようにした、ナノ・エレクトロスプレーイオン化用細管（ナノ・エレクトロスプレーイオン化法）が登場した（特許文献１）。
【００１０】
これは、金属薄膜あるいは導電性高分子薄膜を被覆した内径５〜５０μｍのガラス製あるいはフューズドシリカ製で、流量３０〜３０００ｎｌ／ｍｉｎ．でイオン化することが可能であり、溶液試料量を低減できる長所を有していた。
【００１１】
内径５０〜１００μｍのカラムを用いた流速１００〜３００ｎｌ／ｍｉｎ．のナノＬＣとこのナノ・エレクトロスプレーイオン化法を組合せることにより、極低流量のナノＬＣ／ＭＳを行うことができる。
【００１２】
ナノＬＣによる試料の分離と濃縮効果により、試料量の低減、高感度化が図られることから、ナノＬＣ／ＭＳは生体内の極微量蛋白質を解析するプロテオミクスなどのバイオテクノロジー分野で広く活躍している（非特許文献１）。
【００１３】
併せて、流量を低減することにより質量分析装置へのイオンの取り込み効率も改善させることができる。
【００１４】
一般にエレクトロスプレーイオン化により生成したイオンの取り込み効率は１０−６〜１０−１０と極めて低いが、試料溶液の流量を低減させることで約１０−２に向上させることができる（非特許文献２）。
【００１５】
また、試料の導入方法としては、測定したい試料ごとに容器に入れ、オートサンプラーなどを用いて導入する。
【００１６】
例えば、複数の試料が混合した際にどのような反応を起こすかを調査するためには、事前に試料を反応させたものを容器に準備し、それの試料導入を行うことで測定を行う。
【特許文献１】米国特許第５，７８８，１６６号明細書
【非特許文献１】山田尚之；Ｊ．  Ｍａｓｓ．  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊｐｎ．，  ２０００，  ４８（３），  １８７−１９２
【非特許文献２】Ｍ．  Ｗｉｌｍ  ｅｔ  ａｌ．；  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９６，  ６８，  １−８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このようにナノＬＣによる濃縮効果やイオン取り込み効率の向上によって感度の向上及び必要となる試料量の低減が図られてきたが、従来のキャピラリーポンプを用いた試料導入では再現性が良好とは言えず、極微量の試料を多数分析するには多くの手間と時間を要する。
【００１８】
また、感度面でも数十ｎｌ／ｍｉｎ以下の領域で安定した流量を得ることは困難であり、イオンの取り込み効率向上にも限界があった。
【００１９】
さらに、試料導入においては測定したい試料ごとにあらかじめ容器に入れておく必要があり、複数の種類の試料が混合した際にどのような反応を起こすかを調査するためには、事前に試料を反応させたものを容器に準備する必要があった。
【００２０】
また、試料量が極微量であるため、試料の汚染や試料調製時の計量誤差の影響も大きいという課題があった。
【００２１】
本発明は前記の課題を解決するもので、極微量の試料を短時間で再現性良く測定でき、また流量を従来の数十分の１である１ｎｌ／ｍｉｎ．以下とすることで更なる感度向上を実現する手法を提供する。
【００２２】
また、複数の試料を汚染や計量誤差の影響が少ない状態で混合し、さらに混合による反応を容易に調査できる手法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記の課題を解決するために、本発明は、液体中に存在する分子の質量数に関する情報を得るための情報取得方法であって、前記液体を液滴として吐出させる第一の工程と、当該吐出された液滴を液溜め部に受領し、導入通路を通じて液体として流し、先鋭部から静電噴霧を行うことで、電荷を帯びたさらに微細な液粒とし、前記液粒からの液体の蒸散によって前記液体中に存在した分子のイオンを得る第二の工程と、前記イオンの質量数に関する情報を質量分析法により得る第三の工程と、を含むことを特徴とする。
【００２４】
また、本発明は、情報取得装置であって、試料溶液を供給するインクジェットノズルと、当該インクジェットノズルから吐出された液滴を受領する液滴溜め部と、当該液滴溜め部の液滴を電圧の印加される部位に液体として導く導入通路と、当該導入通路より電圧の印加される部位に導かれた液滴をさらに微小な液粒にして静電噴霧する先鋭部と、当該液粒に熱を加えるヒーターと、当該液体中に含まれていた分子のイオンを取り込むイオン取り込み口と、当該取り込まれたイオンを質量に基づいて分離する質量分析装置と、を具備することを特徴とする。
【００２５】
このように、イオン源への溶液の供給をインクジェット法のような試料調製時の汚染の影響を受けにくく、かつ定容性に優れた極微量液滴で行い、イオン源においては毛管現象及び静電噴霧により安定した流量でエレクトロスプレーを行うことにより、極微量の試料を短時間で再現性良く測定でき、また流量を従来の数十分の１である１ｎｌ／ｍｉｎ．以下とできる。
【００２６】
これにより更なる感度向上を実現することができる。
【００２７】
また、インクジェット法は高い着弾精度を持つことから、複数の種類の試料液滴を制御することで試料を混合することができ、これにより混合した際に生じる反応を容易に調査できる。
【００２８】
また、イオン源において溶液輸送の通路に液体クロマトグラフィーとして用いることのできる保持材を設置することで、液体中の成分を分離して測定することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、試料溶液中に含まれる分子の質量数を得る情報取得方法において、感度に優れ、再現性の良い手法が提供される。
【００３０】
また、複数の種類の使用溶液の反応を容易に調査できる手法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００３２】
図３は、本発明の情報取得装置の実施形態を示す模式図である。
【００３３】
図３において、１０は試料溶液を供給するインクジェットノズル、２０は静電噴霧により試料溶液をミスト化して噴出させるエレクトロスプレー、２５は質量分析装置のイオン取り込み口、４０は質量分析装置本体である。
【００３４】
インクジェットノズル１０から定量の液滴として吐出した試料溶液は、エレクトロスプレー２０の上部の液溜め部２１に着弾する。
【００３５】
着弾した試料溶液は、毛管２２によって先端の先鋭部２３に送られ、先鋭部２３で帯電されてさらに微小な液滴（ミスト）として空中に噴霧される。
【００３６】
ミストは、空中を浮遊する間に液体が蒸発し、ミスト中に含まれていた分子が帯電した状態となってイオン取り込み口２５に入る。
【００３７】
取り込まれたイオンは、質量分析器４０によって分離され検出される。
【００３８】
以下、工程別に詳しく説明する。
【００３９】
はじめに、液体を液滴として吐出させる第一の工程について説明する。
【００４０】
エレクトロスプレーから、定常的に安定なミストが噴出されるためには、毛管２２中を一定の時間、一定の流速で試料溶液を流す必要がある。そのために液溜め部２１に一定量の試料溶液を供給する。これは試料溶液の体積が制御された状態で液滴とすることができ、また試料溶液に対してダメージを与えないインクジェット法が最適である。
【００４１】
インクジェットノズルへの試料溶液供給については、溶液が大量にある場合は溶液供給タンクから行うことができる。
【００４２】
溶液が極微量である場合には、毛管現象などにより溶液を採取し、この毛管を溶液供給タンクとして用いることも可能である。
【００４３】
さらに、吐出前に時間を置くことで溶媒の気液界面から溶媒が蒸発し、これにより試料の濃縮効果を得ることもできる。
【００４４】
また、インクジェット法は高い着弾精度を持つことから、複数の種類の試料液滴を制御することで試料を混合することができる。
【００４５】
これにより混合した際に生じる反応物を容易に調製することができる。
【００４６】
次に、該液滴に高電圧を印加して静電噴霧を行うことでさらに微細な液滴とし、前記液滴中に存在する分子のイオンを得る第二の工程について説明する。
【００４７】
静電噴霧とは、液滴を帯電させることでクーロン力により１０ｎｍ程度の非常に微細な液滴へと分散する現象である。
【００４８】
本発明においては、インクジェットなどにより吐出された液滴に対してこの現象を起こすための構成として、以下のように工夫した。
【００４９】
すなわち、吐出された液滴を受領できる液滴溜め部２１、及びこの液滴溜め部２１に一時的に保持された液体を毛管現象により高電圧の印加される先端の尖鋭部２３に順次輸送する導入通路２２を持つ構成である。
【００５０】
導入通路２２は、液溜め部２１の微量の液滴が一定時間一定の流量で流れるように、液滴の体積に応じて管径を細くする。
【００５１】
本実施形態においては、直径２μｍ、長さ１００μｍの毛管とした。
【００５２】
このとき、毛管の体積は０．４ｐｌ程度なので、液滴溜め部２１の試料溶液が１０ｐｌ程度あれば、試料溶液を安定した流量で順次毛管内に導入することができ、一定時間、定常的な毛管流を作ることができる。
【００５３】
尖鋭部２３の先端では印加された高電圧により静電噴霧現象が起こり、これにより試料溶液は電荷を帯びた微細な液滴となる。
【００５４】
さらに、噴霧された液滴中に存在する分子のイオンを得るために熱を加えて余分な溶媒を脱離する熱源を構成要素として持つことで最終的に溶液中のイオンを得ることができる。
【００５５】
また、溶液輸送の通路に液体クロマトグラフィーとして用いることのできる保持材を設置することで、液体中の成分を分離して測定することができる。
【００５６】
例えば、オクタデシルシリル基を直径２μｍ程度の通路の内壁に化学修飾することで成分の分離効果を得ることができる。
【００５７】
特に、これは試料の脱塩に対して有効である。
【００５８】
エレクトロスプレーイオン化は試料溶液中に塩が存在すると、そのイオン化効率が大きく低下するため、脱塩効果を持つこの構成は有効である。
【００５９】
次に、該イオンの質量数に関する情報を質量分析法により得る第三の工程について説明する。
【００６０】
上記第二の工程によって得られたイオンは大気圧下に存在する。
【００６１】
一般に質量分析法は高真空下でイオンの電磁場における挙動を調べることで行われる。
【００６２】
そのため、高真空である質量分析装置の中に、例えば、差動排気によって取り込みを行う。
【００６３】
この際に、イオンの取り込み効率を上げるために引き出し電極によりイオンの誘導を行うことが望ましい。
【００６４】
また、一般にイオン化する試料溶液流量が多い場合には分析装置内を汚染しないようスプレーの広がる方向とイオンの取り込み方向を１軸に置かないように設定するが、本発明のイオン源は試料溶液流量が極めて微量であるため、イオンの取り込み効率向上に有効であるようにスプレーの広がる方向とイオンの取り込み方向を１軸に置くことも容易である。
【００６５】
さらに、これに対して四重極レンズなどでイオンを収束させることで、イオン取り込み効率をより向上させることも可能である。
【００６６】
このようにして取り込んだイオンは飛行時間型質量分析法、二重収束型質量分析法、四重極型質量分析法、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分析法などの手法でその質量を計測することができる。
【００６７】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。
【００６８】
以下に示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる具体的形態に限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
（１）  インクジェットによる試料供給装置の作製
インクジェットヘッド１０、１０’（液滴容量：３０ｐｌ）を用意し、試料液滴を供給できるシステムを作製する。このシステムでは２種類の溶液を同じ位置に一度に吐出することができる（図１）。
（２）  インクジェット液滴用エレクトロスプレーイオン源２０の作製
厚さ２５０μｍのＳｉ基板を異方性エッチングすることにより四角錐状のくぼみ（底面のサイズ：２００μｍ×２００μｍ、深さ１４０μｍ）を掘り込む。反対面には四角錐状の突起（底面のサイズ：２００μｍ×２００μｍ、高さ１４０μｍ）を異方性エッチングにより形成する。
【００７０】
このくぼみと突起の頂点を結ぶように径２μｍの通路を形成する。
【００７１】
突起側の面には金を蒸着する。また、くぼみはＳｉ基板の酸化によりＳｉＯ２層を形成し、シランカップリング処理によりＯＤＳ（オクタデシルシリル）基を形成させる（図２）。
（３）  インクジェットによる試料供給装置及びインクジェット液滴用エレクトロスプレーイオン源を備えた質量分析装置の作製
飛行時間型質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社製  Ｑ−Ｔｏｆ  Ｕｌｔｉｍａ  ＡＰＩ）４０に上記（１），（２）に記載のインクジェットによる試料供給装置１０，１０‘及びインクジェット液滴用エレクトロスプレー２０、及びセラミックヒーター３０を設置する（図３）。
（４）  インクジェットによる試料供給装置及びインクジェット液滴用エレクトロスプレーイオン源を備えた質量分析装置を用いたＤＮＡのハイブリダイゼーションの分析
上記（３）に記載の装置を用いて溶液１（５００μＭ合成オリゴＤＮＡ溶液（フナコシ株式会社）１２ｍｅｒ  ：  ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  溶媒：Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））及び溶液２（５００μＭ合成オリゴＤＮＡ（フナコシ株式会社）１２ｍｅｒ：ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  溶媒：Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））をそれぞれインクジェットヘッド１０、１０’に設置し、同時に吐出させる。
【００７２】
その結果、ＤＮＡがハイブリしたことを示す質量数のピークを得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、複数の種類の試料中に含まれる分子の質量数に関する情報を得るに際して有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】インクジェットを用いた試料溶液の供給システムを示す図である。
【図２】インクジェット液滴に対応したエレクトロスプレーイオン源を示す図である。
【図３】インクジェットによる試料供給及びインクジェット液滴用エレクトロスプレーイオン源を備えた質量分析装置を示す図である。
【符号の説明】
【００７５】
１０、１０’      インクジェットヘッド
２０              エレクトロスプレー
２１             液溜め部
２２             毛管
２３             先鋭部
２５             イオン取り込み口
３０              セラミックヒーター
４０             質量分析装置
【図１】
0004789533.tif 000002
【図２】
0004789533.tif 000003
【図３】
0004789533.tif 000004