(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入すべきｓｉＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする工程を含む、細胞にｓｉＲＮＡを導入する方法において、シクロデキストリン・デンドリマー結合体におけるシクロデキストリンとデンドリマーとのモル比が１．５〜５：１である、上記方法。
【請求項２】
シクロデキストリンが、α−シクロデキストリンである、請求項１記載の細胞にＲＮＡを導入する方法。
【請求項３】
ジェネレーションが２〜３のデンドリマーを使用する、請求項１又は２に記載の細胞にｓｉＲＮＡを導入する方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載の方法により細胞にｓｉＲＮＡを導入し、導入したｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項５】
シクロデキストリン・デンドリマー結合体（ここで、デンドリマー結合体におけるシクロデキストリンとデンドリマーとのモル比は１．５〜５：１である）を含む、ｓｉＲＮＡ導入剤。
【請求項６】
ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制のために使用する、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞にＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを導入する方法に関する。より詳細には、本発明は、シクロデキストリン・デンドリマー結合体を用いて細胞にＲＮＡを導入する方法に関する。
【背景技術】  二本鎖ＲＮＡによって配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果，ＲＮＡの発現が抑制される現象は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ／ＲＮＡｉ）と称されている。このＲＮＡｉは線虫をはじめ、昆虫、植物、菌類など様々な生物種間で保存されており、生物共通の核酸レベルの防御システムである。
最近、このＲＮＡｉの現象を利用してノックアウトマウス等を作成し、ＲＮＡの働きを研究することが広まってきている。
ＲＮＡｉ用のＲＮＡ導入剤としてカチオニックリポソーム、カチオニックリピッド、カチオニックペプチドなどのいわゆるカチオニックキャリアーを用いる技術に関する報告がなされており、最近では、いくつかのｓｉＲＮＡ導入剤が市販されている。例えば、例えば、リポフェクタミン２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、トランスファストＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、リポフェクチンＴＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＲＮＡｉフェクト（ＱＩＡＧＥＮ）等が知られている。しかし、これらのｓｉＲＮＡ導入剤は高価で、化学的安定性に乏しく、かつ導入効果も満足のいく水準にない。
一方、Ｊ．Ｓｕｈら，ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ２５，６３−７５（１９９７）には、シクロデキストリンとデンドリマーからなる結合体が開示されているが、非ウイルス性ベクターとして機能することについての記載はない。また、特開２００１−１０３９６９号公報には、シクロデキストリン・デンドリマー結合体からなる遺伝子導入剤が、非ウイルス性ベクターとして使用可能であることが開示されている。しかし、非ウイルス性ベクターの全てがＲＮＡ導入剤、特にｓｉＲＮＡ導入剤として適しているわけではない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に効率よく導入する方法を提供することである。本発明の他の目的は、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に安価に導入する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、生体に害を及ぼす可能性の少ない方法で、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に導入する方法を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションすることによって細胞にＲＮＡを効率よく導入することができ、導入したＲＮＡによるＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によれば、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする工程を含む、細胞にＲＮＡを導入する方法が提供される。
好ましくは、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリンである。
好ましくは、ジェネレーションが２〜３のデンドリマーを使用する。
好ましくは、ＲＮＡは２本鎖ＲＮＡであり、さらに好ましくは、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により細胞にＲＮＡを導入し、導入したＲＮＡによるＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、シクロデキストリン・デンドリマー結合体を含む、ＲＮＡ導入用ベクターが提供される。上記ＲＮＡ導入用ベクターは、ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明で用いることができるシクロデキストリン・デンドリマー結合体の構造の一例を示す。
図２は、シクロデキストリン・デンドリマー結合体のｓｉＲＮＡ導入作用を示す模式図である。
図３は、本発明の実施例で用いた遺伝子発現ベクターｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡおよびｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡの構造を示す。
図４は、ｓｉＲＮＡの量を変化させた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図５は、デンドリマー／シクロデキストリン結合体と遺伝子発現ベクターの比率を変化させた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図６は、各種のＲＮＡ導入剤を用いた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図７は、ｓｉＲＮＡの量を変化させた場合における、ＨｅｐＧ２細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
図８は、各種の細胞におけるｓｉＲＮＡ効果を比較した結果を示す。
図９は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡの配列特異的な効果を測定した結果を示す。
図１０は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞及びＨｅｐＧ２細胞）におけるｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの濃度依存的な効果を測定した結果を示す。
図１１は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼす投与比率（ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体）の効果を測定した結果を示す。
図１２は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／各種担体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ用の各種ベクターの効果を測定した結果を示す。
図１３は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／担体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞における当該ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
図１４は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体のトランスフェクション後の効果を測定した結果を示す。
図１５は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションした後のＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡ／担体の複合体の投与量の比率の効果を測定した結果を示す。
図１６は、ｐＤＮＡ／担体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす、ｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／担体の複合体のポストトランスフェクションにおける各種担体の阻害効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする工程を含む、細胞にＲＮＡを導入する方法に関する。
１．シクロデキストリン・デンドリマー結合体
本発明の方法では、ＲＮＡ導入剤として、図１に例示する構造のシクロデキストリン・デンドリマー結合体を用いることができる。このシクロデキストリン・デンドリマー結合体は、デンドリマーとシクロデキストリンを溶媒中で加熱・混合することにより容易に製造することができる。
（シクロデキストリン）
シクロデキストリン・デンドリマー結合体を構成するシクロデキストリンは、α、β、またはγシクロデキストリンである。これらα、β、またはγシクロデキストリンは、化学修飾型または非修飾型のシクロデキストリンであることもできる。これらα、β、またはγシクロデキストリンは市販品を容易に入手できる。本発明ではこれらのうちα−シクロデキストリンがその導入剤としての効果が最も優れているため、好ましい。
シクロデキストリンはその水酸基の一部もしくは全部がアセチル化されていてもよく、またはグルコース、マンノース、サッカロース等の糖で修飾されていてもよい。これらの修飾剤と、シクロデキストリンとの反応は、両者を例えば水溶液にし、加熱・攪拌することにより製造することができる。導入剤として用いる場合は、変性しない方が導入効率が高いため好ましい。
（デンドリマー）
本発明で用いられるシクロデキストリン・デンドリマー結合体のひとつの構成成分であるデンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）は、アンモニアあるいはエチレンジアミンをコア分子とし、その分子にマイケル付加反応でアクリル酸メチルおよびエチレンジアミンを付加し、この反応を繰り返すこと（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）により得られる高度に枝分かれした樹枝状構造を特徴とし、その末端に多数の一級アミノ基を有した新しいタイプの合成ポリマーである。本発明で用いるデンドリマーとしては、ポリアミドアミン型であることが好ましい。
ポリアミドアミン型デンドリマーは、アンモニアにアクリル酸メチルとエチレンジアミンとを反応させて（アンモニア：アクリル酸メチル：エチレンジアミン＝１：３：３（モル比））、ジェネレーション０（Ｇ０）と呼ばれる中心核を合成する。ジェネレーション０はアンモニアに由来する窒素の周りに、アクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が３つ結合した形を有する。ジェネレーション０（Ｇ０）のアミドアミンの末端にエチレンジアミンの一方のアミノ基が存在する。そこで、この中心核（ジェネレーション０（Ｇ０））にアクリル酸メチル：エチレンジアミン＝３：３（モル比）を反応させることで、上記アミドアミンの末端のアミノ基に２つのアクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が結合する。このようにＧ０のアミノ基由来の窒素に２つのアクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が結合したものは、ジェネレーション１（Ｇ１）と呼ばれる。このようにして順次、アクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体を結合させていくことで、ジェネレーション２、３、４、５、６（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６）が得られる。この状態を下記の反応スキームに示す。
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ポリアミドアミン型デンドリマーは、市販さており、市販品を容易に入手できる。本発明の結合体に用いるデンドリマーは、ポリアミドアミン型デンドリマーであれば特に制限はないが、例えば、Ｇ２に属するものであることができる。
デンドリマー・シクロデキストリン結合体は、デンドリマーとシクロデキストリンとを混合し、水性媒体の存在下で加熱攪拌するというわずか２段階の反応で合成できることから、市販のＲＮＡ導入剤に比べコスト的に有利であると考えられる。
本発明で用いるシクロデキストリン・デンドリマー結合体におけるシクロデキストリンとデンドリマーとのモル比は通常１．５〜５：１、好ましくは２〜４：１程度であることが好ましい。
シクロデキストリン・デンドリマー結合体は、後述の実施例で示すように、トシル化シクロデキストリンとデンドリマーとを加温条件下で数時間反応させることで合成できる。トシル化（トルエンスルホニル化）シクロデキストリンは、ｐ−トルエンスルホニルクロライドとシクロデキストリンとをピリジン中で反応させることで得られる。
２．ｓｉＲＮＡ
本発明では、上記したシクロデキストリン・デンドリマー結合体は、細胞内の特に細胞質に対してＲＮＡを導入する働きをなす。即ち、上記したシクロデキストリン・デンドリマー結合体はＲＮＡ導入剤として使用することができ、この中でも特にｓｉＲＮＡの導入剤として有効である。ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）とは、重合度が２０前後（例えば、１８〜２３塩基程度）の低重合度のＲＮＡで、そのＲＮＡを導入することによりＲＮＡの発現を阻害する働きを有するＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは通常、二本鎖からなっている。なお、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが実証されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４−４９８）。
シクロデキストリン・デンドリマー結合体とｓｉＲＮＡは、図２の上の模式図に示す通り、静電的相互作用により複合体を形成する。
本発明で用いるシクロデキストリン・デンドリマー結合体とＲＮＡとのモル配合比は、通常１：５〜１０：１、好ましくは１；３〜３：１の範囲であることが好ましい。
３．ＤＮＡ発現ベクターとの併用
本発明の方法で用いることのできるシクロデキストリン・デンドリマー結合体はそのまま単独でＲＮＡ導入剤として使用することもできるが、他のＤＮＡ発現ベクターと併用して用いることもできる。
上記の場合、シクロデキストリン・デンドリマー結合体とＤＮＡ発現ベクターとの配合割合（モル比）は、通常１００００：１〜１：１、好ましくは１０００；１〜１０：１の範囲であることが好ましい。
４．細胞にＲＮＡを導入する方法
本発明のＲＮＡ導入方法では、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションする。例えば、ＲＮＡを導入すべき細胞を含有する培地０．５〜１ｍｌ（細胞量約２×１０５個）に、導入すべきＲＮＡを含有する溶液とシクロデキストリン・デンドリマー結合体含有溶液を添加する。導入すべきＲＮＡを含有する溶液は、例えば、ＲＮＡ量が１〜２μｇ／μｌとなるように添加し、シクロデキストリン・デンドリマー結合体含有溶液は、例えば、シクロデキストリン・デンドリマー結合体が１ｍＭとなるように添加する。添加後、約２４時間インキュベートすることにより、トランスフェクションすることができる。ＲＮＡを導入すべき細胞を含有する培地の種類や量は、使用する細胞に応じて適宜決定することができ、また、ＲＮＡ及びシクロデキストリン・デンドリマー結合体の添加量やインキュベーション時間も適宜変化させることができる。
５．シクロデキストリン・デンドリマー結合体のｓｉＲＮＡ導入作用
本発明で用いる特定のシクロデキストリン・デンドリマー結合体は、ｓｉＲＮＡ導入剤として、図２のようにエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれた後、エンドソームに移行する。シクロデキストリン・デンドリマー結合体のシクロデキストリン部分はエンドソーム部分の膜成分と相互作用し、膜成分を破壊することによりｓｉＲＮＡを細胞内に効果的に放出すると考えられる。放出されたｓｉＲＮＡは配列特異的にｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。
６．用途：試薬
本発明の細胞内へのＲＮＡの導入方法によれば、遺伝子の任意の部位の機能を阻害する働きをするため、遺伝子操作により遺伝子の本来の発現が阻害にされたノックアウト哺乳動物を産生することができる。このことは遺伝子創薬の研究等に有用に使用することができる。
７．ＲＮＡ導入用ベクター
本発明のＲＮＡ導入用ベクターは、シクロデキストリン・デンドリマー結合体からなる。シクロデキストリン・デンドリマー結合体は、前記シクロデキストリンが、例えば、非修飾型又は化学修飾型のα、β又はγシクロデキストリンであり、デンドリマーが例えば、ポリアミドアミン型またはポリ（エチレンイミン）型であることができ、またデンドリマーが例えば、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７またはＧ８に属するものであることができる。このベクターは上記のように、細胞へのＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡの導入に使用することができる。
以下に実施例を挙げて本発明につき更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら制約されるものではない。
【実施例】［実施例１］：デンドリマー／シクロデキストリン結合体の調製
（トシル化α−ＣｙＤの調製）
Ｍｅｌｔｏｎらの方法に準じて合成した。ベンゼンで水分を共沸除去した乾燥α−シクロデキストリン（α−ＣｙＤ）８ｇを無水ピリジン５００ｍＬに溶解後、５℃以下に冷却、攪拌しながらｐ−トルエンスルホニルクロライド６ｇを加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液に水（約１００ｍＬ）を注ぎ込み反応を停止させた後、減圧濃縮し、アセトン１００ｍＬを添加して析出した沈殿物を濾取した。沈殿物は吸着クロマトグラフィーを用いて分離、精製した。
（多孔性ポリスチレン樹脂（ＤＩＡＩＯＮＲ  ＨＰ−２０）；溶離液：メタノール／水＝０：１００ｖ／ｖ→１００：０ｖ／ｖ；２．３ｇ，収率２９％）．ＦＡＢ−Ｍａｓｓ［Ｍ−Ｈ］−ｍ／ｚ１１２５．
（α−シクロデキストリン／デンドリマー（Ｇ３）結合体（置換度２．４）の合成）
デンドリマー（スターバーストポリアミドアミンデンドリマーであるＳｔａｒｂｕｒｓｔ  ＰＡＭＡＭ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ（Ｇ２．０、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））０．５ｍＬ（１．４５×１０−５ｍｏｌ）を試験管エバポレーターに加えて減圧下メタノールを完全に留去した。その後、トシル化α−ＣｙＤ（３．４７×１０−５ｍｏｌ）３９ｍｇを加え、軽く混合し、試験管内を窒素置換後、油浴中、６０℃で２４時間攪拌した。反応物をＴＯＳＯＨ  ＴＳＫＧｅｌ  ＨＷ−４０Ｓ（５．３ｃｍ２×７０ｃｍ，溶出緩衝液：０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム）を用いてゲルろ過した。結合体を含むフラクション画分を濃縮後、濃縮液を０．５ｍＬの水に再溶解し、メタノール３ｍＬを加えて十分に白濁するまで混和した。沈殿物を含む溶液を１５００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上清を取り除き、再びメタノール３ｍＬを添加してよく混合し、同様に遠心分離した後上清を取り除き、残渣中のメタノールを試験管エバポレーターにより完全に留去した。α−ＣＤＥ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＤＳ２．４）：収量１８％；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ  ｆｒｏｍ  ＴＭＳ）４．９４（Ｈ１，α−ＣｙＤ），３．８６−３．７４（Ｈ３，Ｈ５，Ｈ６，α−ＣｙＤ），３．５３−３．４７（Ｈ２，Ｈ４，α−ＣｙＤ），３．２７−３．１３（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），３．０５−２．８１（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），２．７２−２．５１（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），２．３６−２．３１（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）．
物性測定
（ＮＭＲスペクトル測定）
１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子（株）製α−５００ＦＴ−ＮＭＲスペクトロメータを用いて２５℃で測定した。溶媒はＤＭＳＯ−ｄ６あるいはＤ２Ｏを用い、サンプルの濃度は１０ｍＭとした。１Ｈ−ならびに１３Ｃ−シグナルの化学シフトは、ＤＭＳＯあるいはＨ２Ｏのピークを用いてテトラメチルシラン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ，ＴＭＳ）からの低磁場シフトとして表した。
（ＦＡＢマススペクトル測定）
日本電子（株）製ＪＭＳ−ＤＸ  ３０３質量分析計を用いて室温で測定した。マトリックスにはＤＭＳＯ：ジエタノールアミン（１：１）混合溶媒を用いた。
［実施例２］：ＲＮＡの導入
（１）遺伝子発現ベクター
遺伝子発現ベクターとして図３に示したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡとｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡの２種類のベクターを使用した。
ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡとｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡの増幅は以下の通り行った。各プラスミドＤＮＡを導入した大腸菌株ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（ＢＡＣＴＯＴＲＹＰＴＯＮＥ  １０ｇ，ＢＡＣＴＯ  ＹＥＡＳＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ  ５ｇ，ＮａＣｌ  ５ｇ／１０００ｍＬ）３ｍＬ中、３７℃で一晩前培養し、その６０μＬを新たなＬＢ培地２５ｍＬに加え、３７℃で１６〜２４時間旋回培養した。プラスミドＤＮＡの精製はＱＩＡＧＥＮ製Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＭＡＸＩを用いて行った。精製操作はマニュアルに準じて行い、精製後のＤＮＡ濃度は、ＴＥに溶解して日立製作所（株）製Ｕ−２０００Ａ型分光光度計を用い、１０Ｄ２６０＝５０μｇＤＮＡ／ｍＬとして算出した。また、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値から、タンパク混入の有無を判定し、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８以上のものを実験に使用した。
（２）ｓｉＲＮＡ
上記（１）に記載した遺伝子発現ベクターｐＧＬ２とｐＧＬ３による遺伝子の細胞内での発現を、下記の塩基配列を有するｓｉＲＮＡを導入することにより抑制した。なお、ｓｉＲＮＡは通常の化学合成法により合成した。
0004649571.tif 000003
0004649571.tif 000004
（３）各種細胞の培養
（ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養）
マウス繊維芽細胞由来の株化細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１６０ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）２０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１５０ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（ＨｅｐＧ２細胞の培養）
ヒト肝芽細胞癌由来の株化細胞であるＨｅｐＧ２細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１６０ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）１０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１００ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（Ａ５４９細胞の培養）
ヒト肺上皮細胞癌由来の株化細胞であるＡ５４９細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１６０ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）１０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１００ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（ＭＤＣＫ細胞の培養）
イヌ腎臓細胞癌由来の株化細胞であるＭＤＣＫ細胞８×１０５個を１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地（５９０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１６０ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１×１０５Ｕ／Ｌペニシリン、０．１ｇ／Ｌストレプトマイシン）１０ｍＬに懸濁し、旭テクノグラス（株）製組織培養ディッシュ（１００ｍｍ）に播種して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。セミコンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、２０００ｒｐｍ１０分間遠心分離後、上清をすべて取り除き、得られたペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの密度で分散した。この細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅに５×１０４／５００μＬになるように播種し、２４時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
（４）デンドリマー／シクロデキストリン結合体／プラスミドＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体の作製
１．５ｍＬエッペンドルフチューブに各種培地を添加し、ＴＥに溶解したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ２μＬ（１μｇ／μＬ）とｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡあるいはｐＧＬ２ｓｉＲＮＡ（０．４２−０．８４μｇ）を添加し、穏やかに攪拌した。その後、ＨＢＳＳに溶解した各種濃度のデンドリマー／シクロデキストリン結合体を添加し、１０秒間ボルテックスを用いて攪拌後、１５分間室温でインキュベートした。この試料を、デンドリマー／シクロデキストリン結合体／ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体としてトランスフェクション実験に用いた。
（５）トランスフェクション
細胞を１０％ＦＣＳを含む培地で２４時間前培養した。培地を取り除き、デンドリマー／シクロデキストリン結合体／ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体２００μＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間インキュベートしてトランスフェクションを行った。その後さらにＦＣＳ２２．２μＬを添加（最終濃度１０％ＦＣＳ）し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２下で２３時間インキュベートした。
（６）細胞抽出液の調製
トランスフェクション終了後の各種細胞をＣａ２＋，Ｍｇ２＋不含等張リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））２ｍＬで２回洗浄後、ＰＢＳ（−）で５倍希釈した細胞溶解剤２００μＬを添加し、１５分間室温でインキュベートして細胞を溶解し、凍結（−８０℃）・融解（３７℃）を３回繰り返した後、得られた細胞溶解液を１０，０００ｒｐｍ、５分間で遠心分離した。得られた上清を細胞抽出液とした。
（７）ルシフェラーゼ活性測定
細胞抽出液２０μＬをルミノメーター用試験管に採取し、これにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬを添加し、３０秒後にルミノメーター（Ｌｕｍａｔ：ＬＢ９５０６）で１０秒間の発光量を測定した。ここで得られた値と、タンパク濃度をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）により測定した結果から、単位タンパク量あたりのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）を算出した。
上記実験の結果を図４〜図８に示す。
図４は、ｓｉＲＮＡの量を０．４２μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、又は０．８４μｇとした場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）は２．０μｇ使用した。デンドリマー／シクロデキストリン結合体：ｐＤＮＡの添加量の比率は１００：１である。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
†、対照に対してｐ＜０．０５
図５は、デンドリマー／シクロデキストリン結合体と遺伝子発現ベクター（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡとｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ）の比率を変化させた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．００５
†、対照に対してｐ＜０．００５
図６は、各種のＲＮＡ導入剤を用いた場合における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。ＴｒａｎｓＦａｓｔ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００およびｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ／ｐＤＮＡの添加量の比率は、それぞれ１／１とした。Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  Ｇ３及びα−ＣＤＥｓ／ｐＤＮＡの添加量の比率は１００／１とした。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
†、対照に対してｐ＜０．０５
図７は、ｓｉＲＮＡの量を０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、又は０．７μｇとした場合のＨｅｐＧ２細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼすｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの効果を測定した結果を示す。
ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）は２．０μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
†、対照に対してｐ＜０．０５
図８は、各種の細胞におけるｓｉＲＮＡ効果を比較した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
上記実験のさらに別の結果を図９〜図１２に示す。
図９は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡの配列特異的な効果を測定した結果を示す。
ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡあるいはｐＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ）は２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の添加量の比率は１／１００である。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
†、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
‡、ｐＧＬ３に対してｐ＜０．０５
図１０は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞及びＨｅｐＧ２細胞）におけるｐＧＬ３  ｓｉＲＮＡの濃度依存的な効果を測定した結果を示す。ｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。各値は３〜４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
図１１は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ発現に及ぼす投与比率（ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体）の効果を測定した結果を示す。左図の上方の線はｐＧＬ３ｓｉＲＮＡなしの場合、左図の下方の線はｐＧＬ３ｓｉＲＮＡありの場合を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。阻害（％）は、（ｐＧＬ３ｓｉＲＮＡありの場合のルシフェラーゼ活性）／（ｐＤＮＡのみの場合のルシフェラーゼ活性）の百分率を示す。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
図１２は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／各種担体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ用の各種ベクターの効果を測定した結果を示す。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。市販のトランスフェクション試薬／ｐＤＮＡの投与量の比率は、１／１とした。ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の投与比率は１／１００とした。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
†、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
上記実験のさらに別の結果を表１〜表４に示す。
表１は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
表２は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ２）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
表３は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＡ５４９細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
表４は、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ２）／ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の三成分複合体をトランスフェクションしたＡ５４９細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす各種ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。
なお、表１〜４において、１）ＣＶは変動係数を示す。
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0004649571.tif 000006
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0004649571.tif 000008
上記実験のさらに別の結果を図１３〜図１６に示す。
図１３は、ｐＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ／担体の三成分複合体をトランスフェクションした各種細胞における当該ベクターの阻害効果を比較した結果を示す。ｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
図１４は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体のポストトランスフェクションの効果を測定した結果を示す。
実験の手順は以下の通りである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（５×１０４細胞／ウエル）を２４時間インキュベートした後に、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ複合体を添加し、さらに１時間インキュベートした。細胞を２回洗浄した後、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ／α−ＣＤＥ複合体を添加し、１時間インキュベートした。ＦＣＳ（牛胎児血清）を終濃度１０％となるように添加し、２２時間インキュベートした後、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）とタンパク質含量を測定した。
ここではｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の投与量の比率は１／１００とした。ｐＤＮＡは２．０μｇ使用し、ｓｉＲＮＡは０．７μｇ使用した。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
†、ｐＧＬ２に対してｐ＜０．０５
図１５は、ｐＤＮＡ／α−ＣＤＥ結合体の複合体をポストトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼすｓｉＲＮＡ／担体の複合体の投与量の比率の効果を測定した結果を示す。グラフ中、各群には３列ずつ結果が存在するが、左の列はコントロールを示し、真中の列はｐＧＬ２ｓｉＲＮＡを用いた結果を示し、右の列はｐＧＬ３ｓｉＲＮＡを用いた結果を示す。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。ＰＥＩはポリエチレンイミンを示す。
＊、コントロールに対してｐ＜０．０５
図１６は、ｐＤＮＡ／担体の複合体をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるルシフェラーゼ活性に及ぼす、ｐＧＬ３ｓｉＲＮＡ／担体の複合体のポストトランスフェクションにおける各種担体の阻害効果を示す。各値は４回の実験の平均±Ｓ．Ｅを示す。
図４〜図１６及び表１〜４に示した結果から、本発明の方法に従って、導入すべきＲＮＡとシクロデキストリン・デンドリマー結合体の存在下で細胞をインキュベーションすることによって細胞に効率的にＲＮＡを導入することができ、導入したＲＮＡによるＲＮＡｉ効果により標的遺伝子の発現を効果的に抑制できることが実証された。また、上記したＲＮＡｉ効果による標的遺伝子の発現抑制は、試験した様々な細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、及びＨｅｐＧ２細胞）において配列特異的に観察された。α−ＣＤＥ結合体を用いた発現抑制効果は、市販のトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００）を用いた場合よりも優れていることが実証された。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法によれば、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に効率よく導入できる。また、ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に安価に導入できる。更に本発明によれば、生体に害を及ぼす可能性の少ないＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを細胞内に安価に導入する方法を提供することができる。ＲＮＡｉは配列が知られている標的遺伝子のｍＲＮＡをノックアウト（破壊）することによりその遺伝子の機能を探索することができる方法であり、また細胞レベルで確認できるため、動物を使用して確認する従来の遺伝子ノックアウト法に比べ、非常に簡単で安価であり、短時間で結果が得られる。本発明の方法をＲＮＡｉ法に適用することにより、安価かつ簡便に効率よく遺伝子の機能を解析することが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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