(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ＡＰＮを含む軟骨細胞の脱分化阻害剤であって、培養が、インビトロでの２次元培養である、脱分化阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載の脱分化阻害剤であって、細胞治療または実験薬理学、特に医薬のスクリーニングに用いることができる軟骨細胞を得るための、脱分化阻害剤。
【請求項３】
軟骨の組織を得るための、請求項１または２記載の脱分化阻害剤であって、該組織が、組織療法または実験薬理学、特に医薬のスクリーニングに、移植片または移植体として用いることができる、脱分化阻害剤。
【請求項４】
軟骨細胞または軟骨細胞移植体を調製するための、請求項１〜３のいずれか一項記載の脱分化阻害剤を使用するための方法であって、
適切ならば、脱分化阻害剤を完全にか、もしくは部分的に排除するために、培養中の軟骨細胞を適切な緩衝液を用いて洗浄する、一つもしくはそれ以上の工程と、
適切ならば、適切な酵素を用いて、形成され得る細胞外材料を酵素消化する工程と、
適切ならば、培養された軟骨細胞を回収する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
同一の表現型を有する分化した軟骨細胞によって構成される、組織または組織移植体として用いることができる軟骨細胞基質をインビトロで調製するための、請求項１〜３のいずれか一項記載の脱分化阻害剤を使用するための方法であって、
インビトロ軟骨細胞培養を、組織間質を構成するのに充分な軟骨細胞基質が形成されるまで、実施することと、
適切ならば、脱分化阻害剤を完全にか、もしくは部分的に排除するために、培養中の軟骨細胞基質を適切な緩衝液を用いて洗浄する、一つもしくはそれ以上の工程と、
適切ならば、細胞基質を回収する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
軟骨移植体の新合成のための、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、組織もしくは細胞療法、または実験薬理学に用いることができるインビトロ細胞培養法を実施する際の、リシルオキシダーゼ阻害剤の使用である。
【０００２】
リシルオキシダーゼは、コラーゲンおよびエラスチンの架橋結合を、触媒しつつ誘導し、対応するα−アミノアジピン−Ｓ−セミアルデヒドへのリシルおよびヒドロキシリシル残基の酸化的脱アミノ：ＲＣＨ2ＮＨ2＋Ｏ2＋Ｈ2Ｏ−＞ＲＣＨＯ＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2を触媒する、アミンオキシダーゼである［雑誌論文：Smith-Mango & Kagan, Matrix Biology 1998, 16:387を参照されたい］。形成されるアルデヒド残基は、隣接するその他の非修飾アルデヒドまたはアミン官能との、分子内および分子間結合へと導く自発的な一連の縮合に付される。これらの縮合は、コラーゲンおよびエラスチンの分子内および分子間架橋の開始点にある。酵素の活性部位に作用する、直接ＬＯ活性阻害剤のうちでも、β−ＡＰＮは、最も一般的に用いられている［雑誌論文：H.M. Kagan, Acta Tropica, 77 (2000) 147-152を参照されたい］。
【０００３】
コラーゲンおよびエラスチンのＬＯに依存する架橋結合は、インビトロで新合成される組織および移植体の形成の不可欠のパラメーターであって：架橋結合の不在は、抵抗力に富む組織の構成を許さず、架橋結合の過多（または、不適切な化学的架橋）は、過大な剛性、および組織の収縮へと導く。
【０００４】
本発明は、軟骨特異的な細胞への軟骨細胞に特異的なＬＯ阻害剤の添加が、これらの細胞の脱分化の相殺を許すという事実を立証する、本発明者らによる。事実、軟骨移植体の軟骨細胞による形成に関する重大な問題は、該細胞が脱分化し、コラーゲン軟骨（軟骨タイプのコラーゲン：II、IX、XIおよびＸ）を生成する潜在能力を失うということである。この阻害剤なしでは、脱分化した軟骨細胞は健康な軟骨中に異常な種類のコラーゲン（Ｉ、III）を合成する。したがって、ＬＯ阻害剤の一時的な添加は、軟骨の形成に重要で可逆的な影響を与えて、その特異的な物理学的特性は、それを構成するコラーゲンの存在に結び付けられる。
【０００５】
その上、本発明者らは、再建皮膚のモデルを構成する際の同じＬＯ阻害剤剤の添加が、細胞の表現型に対する効果に移行することも立証した。再建皮膚の試験されたモデルの細胞成分は、繊維芽細胞および角化細胞である。繊維芽細胞は、真皮の原繊維状コラーゲン（タイプＩおよびIII）およびエラスチンを特に合成するが、角化細胞は、障壁機能を有する角質層と同程度に、表皮のすべての層を形成するよう分化する。ＬＯ阻害剤の存在下では、再建皮膚の特性が変えられる。コラーゲンの架橋結合の不在は、繊維芽細胞による支持体スポンジの、より充分なコロニー形成、および細胞外基質の形成の増大はもとより、再建皮膚の収縮の低下を許すことが観察される。一方、真皮のさらに良好な組織化が、非常に充分に形成された顆粒層とともに観察される。したがって、ＬＯ阻害剤の一時的な添加は、この材料の大量の調製を促進しつつ、再建皮膚の形成および組織化の制御に積極的な効果を有する。
【０００６】
軟骨の生検をきっかけに、またＬＯ阻害剤の存在下で、本発明者らは、標準的条件による供血者からの血清の存在下では、軟骨細胞は、いかなる異常なコラーゲンも除去された細胞外基質の産生を得つつ、培養２週間後出さえ、また培地中で合成されたコラーゲンの可溶化の増大にもかかわらず、二次元プラスチック支持体上で増殖するのが可能になることを立証した（図１、２）。そのような基質は、培養期間の間、その流動性が減少することが認められ：最適培養期間を、産生された基質の量、およびその望みの流動性の関数として選んだ。そうして、その拒絶、または欠陥があるいかなる再吸収も既に得られた好都合な特性を相殺する、外因性の支持体を用いることは、不要である。
【０００７】
代表的なＬＯ阻害剤であるβ−ＡＰＮの不在下で、細胞外基質は、軟骨型コラーゲンが非常に乏しく、主として、Ｉ型コラーゲンはもとより、よりわずかな程度にIII型コラーゲンによっても、すなわち、軟骨の発生に参加しないコラーゲンからも構成される。その上、基質は、注射筒による注入にいかに頼ろうとも適合する、流動性の不在を有する。
【０００８】
軟骨細胞によるリシルオキシダーゼ（少なくともＬＯＸおよびＬＯＬｌ）のいくつかのイソ型の発現は、明白であるが、酵素の活性のみを阻害するにすぎない（表Ｉ）、β−ＡＰＮ（図３）による処理によっては変更されない。異なった濃度（５０〜２００μg/ml）で用いられるβ−ＡＰＮの添加は、インビトロでその収縮を低下させることができる、ヒトの再建皮膚の形成を許す。その上、５０μg/mlのβ−ＡＰＮは、繊維芽細胞によるスポンジのコロニー形成、および細胞外基質の合成の拡大を向上させる。また、表皮の組織化を、非常に充分に形成された顆粒層とともに向上させて、高度に構造化された角質層を生じる。表皮の分化および収縮の低下に対するこの効果は、それ自体を剥離させる薄片の形成を抑えて、再建皮膚の調製を促進することができる（図４）。
【０００９】
何らかの組織移植体を得るためには、ＬＯ阻害剤の使用をいかなる細胞培養にも適用することができるが、それは、コラーゲンおよびＬＯが、すべての動物組織に存在する成分および要素であるからである。しかし、培養条件は、用いられる細胞型、および標的となる基質の関数として変化する可能性がある。
【００１０】
本発明の主題は、インビトロで培養中の細胞の脱分化の阻害剤としての、リシルオキシダーゼ（ＬＯ）直接または間接阻害剤の使用であって、該細胞の表現型を、該細胞のインビトロ培養の方法を実施する状況において、培養期間全体にわたって、実際的には一定に保つための使用である。
【００１１】
したがって、本発明の、より詳しい主題は、その表現型が保存される、分化した細胞の調製のための上記の阻害剤の使用である。
【００１２】
本発明は、さらに詳しくは、組織または組織移植体として用いることができる細胞基質を調製するための上記阻害剤の使用であって、該基質が、該阻害剤の存在下で、該細胞によって、かつ該基質と接触して条件付けられた細胞外培地から構成される、阻害剤の使用に関するものである。
【００１３】
本発明の主題は、
（Ａ）ＬＯの活性部位のカルボニル基と反応する第一級アミン、より詳しくは、カルボニルと結合した後、共鳴によって安定化された生成物を生じるそれ、たとえば下記の第一級アミン：
エチレンジアミン、
ヒドラジン、フェニルヒドラジンおよびその誘導体、セミカルバジド、ならびに尿素誘導体、
アミノニトリル、たとえばβ−アミノニトリル（β−ＡＰＮ）または２−ニトロエチルアミン、
不飽和または飽和ハロアミン、たとえば２−ブロモエチルアミン、２−クロロエチルアミン、２−トリフルオロエチルアミン、３−ブロモプロピルアミン、ｐ−ハロベンジルアミン、
セレノホモシステインラクトン；
【００１４】
（Ｂ）培養中の細胞に浸透するか、または浸透しない、銅キレート化剤；
【００１５】
（Ｃ）ＬＯの活性部位に対して誘導された、抗ＬＯ阻害抗体；
から選ばれる、直接ＬＯ阻害剤の上記の使用でもある。
【００１６】
本発明の主題は、
（Ａ）ＬＯによるリシルおよびヒドロキシリシル残基の酸化的脱アミノから生じる、アルデヒド誘導体を阻害する化合物、たとえば、チオールアミン、特にＤ−ペニシラミン、または２−アミノ−５−メルカプト−５−メチルヘキサン酸、Ｄ−２−アミノ−３−メチル−３−（（２−アセトアミドエチル）ジチオ）ブタン酸、ｐ−２−アミノ−３−メチル−３−（（２−アミノエチル）ジチオ）ブタン酸、４−（（ｐ−１−ジメチル−２−アミノ−２−カルボキシエチル）ジチオ）ブタンスルフィン酸ナトリウム、２−アセトアミドエチル−２−アセトアミドエタンチオールスルファナート、４−メルカプトブタンスルフィン酸ナトリウム三水和物のような、その類似体；
【００１７】
（Ｂ）アンチセンスのような、ＬＯの生合成を阻害する化合物；
から選ばれる、間接ＬＯ阻害剤の上記の使用でもある。
【００１８】
本発明の、より詳しい主題は、β−ＡＰＮおよび／またはＤ−ペニシラミンから選ばれる、ＬＯ阻害剤の上記の使用である。
【００１９】
本発明は、ヒトまたは動物起源のすべての細胞のインビトロ培養の方法を実施するための、上記に定義されたとおりのＬＯ阻害剤の使用であって、該細胞が、定常分化を伴う表現型に保たれ、特に、軟骨の軟骨細胞、角膜細胞、皮膚細胞（たとえば真皮の繊維芽細胞、および表皮の角化細胞）、血管の内皮細胞、骨の骨芽細胞、肝細胞、腎細胞、筋細胞、幹細胞または多分化能細胞から選ばれる、ＬＯ阻害剤の使用にも関するものである。
【００２０】
発明の主題は、インビトロでの細胞培養法を実施するための、上記に定義されたとおりのＬＯ阻害剤の使用であって、細胞治療または実験薬理学、特に医薬のスクリーニングに用いることができる細胞を得るための、ＬＯ阻害剤の使用でもある。
【００２１】
本発明は、組織、たとえば皮膚または軟骨の組織を得るための、インビトロでの細胞培養法を実施するための、上記に定義されたとおりのＬＯ阻害剤の使用であって、該組織が、組織療法または実験薬理学、特に医薬のスクリーニングの際に、移植片または移植体として用いることができる、ＬＯ阻害剤の使用にも関するものである。
【００２２】
本発明の主題は、上記に定義されたとおりの１種類またはそれ以上のＬＯ阻害剤を含有することを特徴とする、いかなる細胞培養培地でもある。
【００２３】
本発明は、インビトロでの細胞培養法であって、その際、該細胞の表現型が、その培養の間、当初見出されたのと同一の段階に維持され、該方法が、上記に定義されたとおりの１種類またはそれ以上のＬＯ阻害剤を含有する適切な培地中に該細胞の培養体を含む、細胞培養法にも関するものである。
【００２４】
本発明の、より詳しい主題は、培養中の分化した細胞の表現型を、該細胞がその培養の間に見出されたのと近似するか、または同一である段階に絶えず維持するための方法であって、上記に定義されたとおりの１種類またはそれ以上のＬＯ阻害剤を含有する、適切な培地中に該細胞の培養体を含むことを特徴とする方法である。
【００２５】
本発明の主題は、同一の表現型を有する分化した細胞、またはそのような細胞が構成する細胞移植体を調製する方法であって、
上記に定義されたとおりのインビトロでの細胞培養法を実施することと、
適切ならば、ＬＯ阻害剤、または用いられた阻害剤を完全にか、もしくは部分的に排除するために、培養中の細胞を適切な緩衝液を用いて洗浄する、一つもしくはそれ以上の段階と、
適切ならば、適切な酵素を用いて、形成され得る細胞外材料を酵素消化する段階と、
適切ならば、培養された細胞を回収する段階と
を含むことを特徴とする方法でもある。
【００２６】
本発明は、分化した細胞が構成する、組織または組織移植体として用いることができる、上記に定義されたとおりの細胞基質をインビトロで調製する方法であって、
上記に定義されたとおりのインビトロでの細胞培養法を、組織間質を構成するのに充分な、上記に定義されたとおりの細胞基質が形成されるまで実施することと、
適切ならば、ＬＯ阻害剤、または用いられた阻害剤を完全にか、もしくは部分的に排除するために、培養中の細胞基質を適切な緩衝液を用いて洗浄する、一つもしくはそれ以上の段階と、
適切ならば、上記に定義されたとおりの細胞基質を回収する段階と
を含むことを特徴とする方法にも関するものである。
【００２７】
より詳しくは、本発明の主題は、上記に定義されたとおりの組織または組織移植体をインビトロで調製する方法であって、該方法を軟骨細胞から実施するときに、軟骨移植体の新合成にか、または該方法を繊維芽細胞および／もしくは角化細胞から実施するときに、代用皮膚の製造に用いられる、インビトロで調製する方法である。
【００２８】
本発明は、薬理学的に興味深い分子、特に医薬をスクリーニングする方法であって、
上記に定義されたとおりのインビトロ細胞培養法を、適切ならば、組織間質を構成するのに充分な細胞基質が形成されるまで、実施することと、
適切ならば、ＬＯ阻害剤、または用いられた阻害剤を完全にか、もしくは部分的に排除するために、培養中の細胞基質を適切な緩衝液を用いて洗浄する、一つもしくはそれ以上の工程と、
試験される分子を、先行段階の間に得られた細胞または組織の存在下に置く工程と、
上記細胞または組織に対する該分子の何らかの効果を検出することと
を含むことを特徴とする方法にも関するものである。
【００２９】
本発明の主題は、上記に定義されたとおりの、表現型が保たれた分化した細胞、またはそのような細胞が構成する細胞移植体であって、上記に定義されたとおりのＬＯ阻害剤を、適切ならば痕跡として、含有することを特徴とする、細胞でもある。
【００３０】
本発明は、上記に定義されたとおりの細胞に基づく細胞基質または組織もしくは組織移植体であって、上記に定義されたとおりのＬＯ阻害剤を、適切ならば痕跡として、含有することを特徴とする、細胞にも関するものである。
【００３１】
本発明の、より詳しい主題は、上記に定義されたとおりの方法の実施によって得られる、上記の細胞または細胞移植体、あるいは細胞基質または組織もしくは組織移植体である。
【００３２】
本発明は、健康な軟骨には通常存在しないコラーゲン（すなわちコラーゲンＩおよびIII）を基本的に含まない細胞外基質を含み、かつ軟骨に特異的なすべてのコラーゲン（すなわちコラーゲンII、IX、XI、および適切ならばＸ）を含む軟骨組織移植体にも関するものである。
【００３３】
本発明の、より詳しい主題は、上記の軟骨移植体であって、上記に定義されたとおりのＬＯ阻害剤を、適切ならば痕跡として、含有することを特徴とする、軟骨移植体である。
【００３４】
本発明の、より詳しい主題は、上記に定義されたとおりの方法の実施によって得られる、上記の軟骨移植体でもある。
【００３５】
本発明は、その当初の軟骨型の表現型が、インビトロでの細胞操作の予備的な時期の間も保たれた、軟骨細胞の移植体にも関する。
【００３６】
本発明の主題は、繊維芽細胞および／または角化細胞から実施された請求項１１記載の方法の実施によって得られる限りの、再建皮膚または代用皮膚の移植体に相当する、上記の組織移植体でもある。
【００３７】
本発明を、ＬＯ阻害剤の可能な使用を下記の記載によってさらに説明する。
【００３８】
組織工学における組織移植体の生成は、一般的には、大きな障害：すなわち、構想された使用に適合しない物理化学的特性を有する、異常な組織の回避を克服しなければならない。細胞をインビトロで培養して、それらを増殖させ、均一な細胞外基質を産生することは、それによって、細胞培養の形式に従って多少とも際立つ、その生化学的表現型の変更を生じる。
【００３９】
現在まで、軟骨細胞の培養は、この観点からは、表現型のこの変更を常に伴った。軟骨細胞の培養のために現在まで提出された解決策は、それが平面のプラスチック支持体であれ、様々な種類（様々な構成要素、セラミック等々と組みあわせた、多少とも架橋結合したコラーゲンスポンジ）の三次元支持体であれ、培養体への可溶性の因子（ホルモン、ビタミン、本質的に細胞性の因子）の添加（またはときにはそれからの除去）からなる。
【００４０】
再建皮膚の生成は、特定の条件下に置いた繊維芽細胞および角化細胞の相互作用に基づく。この生成の改良を許す介入は、限定されており、しばしば経験のみに頼って、劣悪に規定される。そのため、数種類の栄養素が、必須であると判明し、培養条件に追加されている。β−ＡＰＮによる処理は、二つの細胞型を指向するという特色を有する。
【００４１】
本発明の方法は、組織工学ではいかなる種類の培養にも適用される。それは、培養中の細胞が合成する細胞外基質の物理的状態に作用して、これが様々な細胞受容体を介して細胞に送るというシグナルを調整し、こうして、生検から単離された細胞の分化の状態を調節することからなる。
【００４２】
ＬＯ阻害剤は、現在まで、コラーゲンを産生し、細胞が分泌するコラーゲンの架橋結合を阻害し、こうしてそれらの可溶化の条件を改良するために、用いられている。そのため、そのような阻害剤は、標準的な様式では、細胞外基質を変化させるとして認識され、現在まで、わずか三様の状況：
架橋結合していない、容易に収縮できるコラーゲンの産生、
ＬＯの作法機序に関する根本的な研究、
線維症を生じる一定の病理学におけるコラーゲンの過剰な架橋の阻害に寄与することで用いられているにすぎない。
【００４３】
これらの３分野以外では、ＬＯ活性の阻害は、現在まで、障害であって利点ではないように思われている。
【００４４】
本発明の主要な利点は、下記のことである。
【００４５】
β−ＡＰＮ、すなわち代表的なＬＯ活性阻害剤は、アミノニトリルである。この非常に廉価である化合物は、現在まで、培養中の細胞の表現型を維持するのに用いられたことがない。培養中の細胞に用いられる用量では無害であって、それでも、その作用は、生物内のその他の細胞に達しかねず：そのため、必然的に標的を有する治療目的には、危険性なしで用いることができない。移植体としてのその使用前の培養体からのその除去は、培養体中のβ−ＡＰＮを枯渇させるための連続的な洗浄によって助けられる。その他の特異的なＬＯ活性阻害剤は、そのようなモデルにおけるそれらのin vivo耐性レベルに関して比較して、役立てることができる。
【００４６】
５０μg/mlという標準的濃度のβ−ＡＰＮの有効性は、その不在下では軟骨細胞の脱分化が最高となる、培養２週後のすべてであった。この濃度は、再建皮膚の処置に役立つ。
【００４７】
その時点での、β−ＡＰＮによる処置の停止は、細胞によって連続的に分泌される（またはβ−ＡＰＮの存在下では、さらに発現されさえする）、ＬＯの活性の回復を許す。β−ＡＰＮによるＬＯの阻害は、不可逆的ではあるが、洗浄、および処置の停止によるβ−ＡＰＮの排除は、選ばれた時点でのこの酵素の活性のインビトロでの回復を許す。そのため、コラーゲンおよびエラスチン原繊維、すなわちＬＯの基質の望みの架橋結合をプログラム化することができる。
【００４８】
本発明の方法は、組織工学におけるいかなる種類の培養にも該当する：
いかなる種類の支持体：培養皿のプラスチック支持体のような最も簡単なもの、または一定の三次元培養モデルのような最も精巧なもの。
様々な組織移植体（軟骨、骨、皮膚、角膜、血管等々）向けのいかなる種類の細胞も。記載された処理は、２種類の移植体に用いることができる：
（ａ）インビトロで増殖させた軟骨細胞の懸濁液。その上、事前のβ−ＡＰＮによる培養の処理は、トリプシン処理による生存可能な細胞の単離収量を向上させる。
（ｂ）軟骨細胞に富み、規定された粘度を有する軟骨性基質。
【００４９】
局所的に損傷したか、または壊死した関節軟骨（特に臀部）の場合、脱分化していない軟骨細胞に富む基質の注入に頼るのが望ましいことがあり得る。細胞ローンの流動性は、培養の持続期間の関数であり、そのため、必要性に従って、外科医が容易に選ぶことができる。この利点は、当然、組織工学で遭遇する、その他いかなる状況にも共通する。
【００５０】
ＬＯ阻害剤との接触の与えられた期間後にこうして得られた細胞ローンは、薬理毒物学における研究の支えとしても役立つことができる。
【００５１】
１．詳細な説明
１．１．）材料および方法
軟骨細胞培養モデル：
（ａ）実験的な軟骨細胞培養モデルは、二次元のプラスチック上でのニワトリ胚軟骨細胞の培養によるそれである。細胞の胚性状態は、成体の軟骨細胞とは異なり、コラーゲンの高レベルの合成を許す。軟骨細胞が起源とするニワトリの胸骨は、その後の肥大が可能な軟骨細胞、または不可能なそれ（それぞれ、胸骨の頭部または尾部の区画）という二つの純粋な下位集団を得るのを可能にした。ウシまたはヒトの軟骨細胞の生検は、この区別を許さない。記載される結果は、常に、調べた軟骨細胞の下位集団を区別した。
【００５２】
４mMのＬ−グルタミン抗生物質および２５μg/mlのアスコルビン酸塩（分泌されたコラーゲンの三重らせん単位の安定に必要な因子）を有する培養を、場合により１００ng/mlのインスリンおよび５０μg/mlのβ−ＡＰＮで置き換えた、１０％の血清の存在下または不在下で、２週間継続した。血清の不在は、保護剤（１mMのシステインおよび１mMのピルビン酸塩）の添加を必要にさせた。サンプル採取の１日前に、１０μＣｉの14Ｃ−プロリンを培養体に加え、次いで、そのローンまたは培地をペプシン処理（ペプシン０．２mg/ml/pH４／２４時間）し、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１５％アクリルアミドにて４．５の勾配）、次いで蛍光撮影分析に付した。そうして、蛍光撮影図は、ペプシン耐性タンパク質帯域、すなわち基本的にコラーゲンおよびリポカリン（脂質輸送によるタンパク質）のみを明らかにした。これらの帯域の既知の位置は、軟骨型コラーゲンの合成の低下に付随する、コラーゲンＩのα２Ｉ鎖の出現による細胞の脱分化の明示を許した。
【００５３】
リシルオキシダーゼ活性は、３００，０００dpmの標識化エラスチンを用いて、酵素の基質であるリシンについて検定した［Shackelton & Hulmes, Anal. Biochem. (1990) 185:359-362］。軟骨細胞培養体中のリシルオキシダーゼの存在の決定は、対応する培地、または細胞ローンから抽出したタンパク質から分離した帯域を移転した、支持体の免疫装飾の標準的方法に従って実施した。
【００５４】
（ｂ）正常なヒト軟骨細胞の培養体は、臀部プロテーゼまたは靱帯形成外科手術の際に採取した軟骨に由来し、そうしてこれを酵素消化に付した。これらの軟骨生検は、res nullus（ゼロ指標）と見なした。
【００５５】
寛骨臼靱帯から抽出した軟骨細胞を、β−ＡＰＮの存在下でのプラスチック上の二次元培養に用いた：ヒアルロニダーゼの存在下または不在下での軟骨の酵素消化後に得られた培養体を比較した（図４および５）。
【００５６】
靱帯形成外科手術後に得られた軟骨細胞を、β−ＡＰＮの存在下または不在下でのコラーゲン−ＧＡＧ−キトサンスポンジ[Collombel et al., 1987]*での三次元培養に用いた（図７および８）。
【００５７】
* Collombel, C., Damour, O., Gagneu, C., Poinsignon, F., Echinard, C., Marichy, J., Peau artificielle et son procede de fabrication、フランス国特許第87-08752号公報（１９８７年６月１５日）、１９８８年６月１４日付けヨーロッパ特許第88 420194.8号公報
【００５８】
再建皮膚培養モデル
再建皮膚の形成を許す方法は、１９８７年６月１５日付けフランス国特許第８７−０８２５２号公報に記載されたそれである。
【００５９】
この再建皮膚モデルの支持体は、Duplan-Perratら[J. Invest. Dermatol., 2000, 114:365］が刊行した手法による、キトサンによって架橋結合したコラーゲン−グリコサミノグリカンを基剤に有する真皮基質（ＤＳ）によって構成した。繊維芽細胞をＤＳの内部に接種して、等価の真皮を得た。再建皮膚（ＲＳ）は、等価真皮内での培養の１５日後（第１５日）に、角化細胞を接種することによって得た。真皮繊維芽細胞は、ヒト包皮の外移植片から、真皮−表皮分離後に得て、１０％ウシ胎児血清、４mMのＬ−グルタミン、１０ng/mlのＥＧＦ（Austral Biologic）、１００UI/mlのペニシリン、１００μg/mlのゲンタマイシン、および１μg/mlのアムホテリシンＢで強化した、ＤＭＥＭ培地（Sigma）中で、単層として培養した。角化細胞は、ヒト皮膚生検サンプルから、トリプシン処理による真皮−表皮分離後に得た。細胞を、栄養層（照射繊維芽細胞）に接種し、１０％のウシ胎児血清、１０ng/mlのＥＧＦ、１．６ng/mlのヒドロコルチゾン、０．１２UI/mlのウムリン、０．１nMのコレラ毒素、０．２μMのトリヨードチロニン、２４μg/mlのアデニン、４mMのＬ−グルタミン、１００UI/mlのペニシリン、１００μg/mlのゲンタマイシン、および１μg/mlのアムホテリシンＢで強化した、ＤＭＥＭおよびＨＡＭＦ１２中で培養した。
【００６０】
Ｉ型およびIII型のウシコラーゲンの基剤（７２％）と、キトサン（２０％）によって架橋結合したグリコサミノグリカン（８％）との混合物を、６穴プレートに注入した。次いで、こうして得られた真皮基質を、−８０℃に凍結し、凍結乾燥した。真皮基質内に繊維芽細胞を接種し、再水和させ、１cm2あたり２５０，０００細胞の率で滅菌した。角化細胞は、１５日後（第１５日）に、２００，０００〜２５０，０００細胞／cm2の密度で接種した。再建皮膚は、５０μg/mlのビタミンＣで予め強化した、記載された培地中で８日間、浸漬として培養した。次いで、再建皮膚を、ＤＭＥＭを基剤とし、上記の濃度のウシ胎児血清、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ウムリン、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ゲンタマイシンおよびアムホテリシンＢ、ならびにアスコルビン酸で強化した、単純化された培地を用いて、空気−液体境界面まで引き上げた。再建皮膚を、６０日まで培養した。第３０日および第６０日に、異なる分析に向けて、サンプルを採取した。
【００６１】
リシルオキシダーゼ阻害剤の使用
接種したら直ちに、β−ＡＰＮ（５０μg/ml）を培地に加え、２日ごとに更新し、再建皮膚を形成中の軟骨細胞の培養体、そうして繊維芽細胞のそれに適用した。５０μg/mlの濃度は、細胞に有害ではなく、細胞増殖に認め得る影響を与えなかった。より高い２００μg/mlの濃度は、単離培養体中の繊維芽細胞および角化細胞の生存率と増殖とに対して僅かな影響を有するにすぎないことが判明した。
【００６２】
１．２．）結果
リシルオキシダーゼ群の様々な酵素に特異的な抗体は、初めて、軟骨細胞におけるこれらの異なるイソ型の特定を、電気泳動による分離後の免疫装飾はもとより、蛍光顕微鏡を通じて観察される、細胞ローンの免疫指標化によっても許した。特異的なリシルオキシダーゼ活性も、初めて軟骨細胞の培地中で立証された（表Ｉ）。
【００６３】
抗ＬＯ抗体は、再建皮膚におけるこれらのイソ型の検出も許す。いくつかの結果は、真皮、表皮および真皮表皮接合部のレベルでのＬＯＸ（図４）、すなわちＬＯＸＬ１およびＬＯＸＬ２の強い発現を示した。角化細胞におけるＬＯのこれらのイソ型の発現を観察したことは、コラーゲンの合成もエラスチンのそれも皆無であるこのレベルでは、完全に独創的である。
【００６４】
軟骨細胞の「軟骨」表現型の調節
増殖およびタンパク質合成の率がそれによって最適となる、血清の存在下では、調べた軟骨細胞は、培養の第一週後に明瞭に脱分化したが、それは文献中のデータと一致する。培養全体へのβ−ＡＰＮの添加は、蛍光撮影図におけるコラーゲンα２Ｉ鎖の不在が証明するとおり、すべての脱分化を排除した。同様に、β−ＡＰＮは、繊維芽細胞形態の細胞が容易に認められる、非処理培養体中に第１日になおさら観察される、形態学的変化も排除した。
【００６５】
血清の不在下では、軟骨細胞は、プラスチック支持体に充分に付着したが、非常な困難を伴って拡散するか、尾部軟骨細胞の場合は全く拡散さえしなかった。軟骨細胞の同化作用剤、たとえばインスリンの存在は、合成の率を多少とも増加させ、β−ＡＰＮの有無に拘わらず、生化学的脱分化を誘導しなかったが、β−ＡＰＮの不在下では、形態学的変化を示した（図１）。
【００６６】
したがって、培地中の血清の存在は、それでも、高率の増殖および合成を達成するのに望ましく、β−ＡＰＮは、生化学的および形態学的表現型の変化の排除を許す。
【００６７】
こうして処理されたが、第２日と第３日との間に研究された軟骨細胞の培養は、細胞ローンはもとより、培地中でも正常なコラーゲンの存在を示した。それでも、β−ＡＰＮは、肥大性軟骨細胞によるコラーゲンＸの正常な外見を許した：β−ＡＰＮの不在下での、この合成の低下は、脱分化マーカーである、コラーゲンＩの合成に先行することが知られている（図２）。そのため、これらのコラーゲン、軟骨型のすべては、まさに、ＬＯに依存する架橋の効果の下で、シグナルを軟骨細胞に送ることに徐々に寄与するような構造を獲得するように思われ、それは、インビトロでの培養における生化学的表現型の変化の開始点に存在する
【００６８】
。
β−ＡＰＮによる脱分化のこの阻害の起源は、証明されないままである。β−ＡＰＮの存在下での培養は、これらのＬＯの合成および分泌を全く変更しなかった（図３）。したがって、β−ＡＰＮは、まさに、酵素のアミンオキシダーゼ活性にのみ作用するにすぎず、その分泌には作用しない。
【００６９】
ヒト軟骨細胞へのモデルの適用
軟骨の酵素消化による細胞の収縮の方法は、軟骨の単一生検内の軟骨細胞の異なる下位集団が立証されるのを許す。これは、収縮培地へのヒアルロニダーゼの添加後の、大腿骨軟骨の寛骨臼靱帯の表面および深部の軟骨細胞に該当する。接種すると、細胞のこれら２種類の集団は、コラーゲンＩではなく、コラーゲンIIを産生する。そうして、深部軟骨細胞のみが、β−ＡＰＮの存在下で、その形態学およびその表現型をその後２週間保存し、その時点で増殖して、軟骨型の、コラーゲンＩなしの細胞外基質を産生する。
【００７０】
したがって、軟骨の組織工学の目的には、適正に単離された、β−ＡＰＮに感受性を有する軟骨細胞の集団を用いることが必要である。
【００７１】
それでも、プラスチック上の培養体でのその操作に必要な、培養期間の関係で脱分化したヒト軟骨細胞は、好都合には、β−ＡＰＮの存在下での三次元（３Ｄ）培養体に入れることができる。３Ｄ培養に入れることは、アガロース中の３Ｄ培養について記載されたとおり、血清の存在下で二次元培養の際に失われた、軟骨の表現型への復帰を確実にするのに、それ自体では、充分ではない。効果的には、スポンジ内の軟骨細胞の三次元培養から得られた画分における、コラーゲンＩ、コラーゲンIIおよびアグリカンの三重標識免疫蛍光は、培養３ヶ月後の軟骨細胞の軟骨の表現型の保存に対するβ−ＡＰＮの好都合な効果が立証されるのを可能にする。
【００７２】
その効果とは、スポンジ内のコラーゲンIIが沈着した部域の拡大、ならびにコラーゲンIIおよびアグリカンの標識付け（軟骨マーカー）の、β−ＡＰＮによるコラーゲンＩのそれと組みあわせた強さの明確な増加である。
【００７３】
自家組織移植体としてのその使用の前の細胞培養からβ−ＡＰＮを排除しようとする処理の有効性を確保することが必要である。この操作は、二つの必要条件を満たす：
１−修復しようとする移植された軟骨中の正常なリシルオキシダーゼ活性を回復すること、
２−患者の細胞におけるβ−ＡＰＮの、あり得る有害な効果という、仮説であるが、立証されていない危険性を排除すること。
【００７４】
β−ＡＰＮによるリシルオキシダーゼ活性の阻害効果の下での、コラーゲンIXの鎖間の架橋における、初めて観察された変更は、非常に早発であり（コラーゲンＩの脱分化マーカーの出現に先行する）、可逆的である（遅くともβ−ＡＰＮの排除の後の６日以内）ことが判明した（図９）。こうして、本発明者らは、β−ＡＰＮなしの培地の使用前のＰＢＳによる細胞ローンの反復的洗浄が、活性β−ＡＰＮのすべての痕跡を排除するのに充分であると判明することを、証明した。
【００７５】
その上、高密度の接種は、２Ｄ培養における脱分化の出現を確かに遅延させることが、確認された。
【００７６】
再建皮膚の形成の調節
単層として培養された繊維芽細胞および角化細胞に対するβ−ＡＰＮの予備研究
細胞計測数は、β−ＡＰＮのみが、繊維芽細胞および角化細胞に対して、比較的強い用量で阻害効果を有するにすぎないことを示している。事実、これらの細胞の数は、６００μg/mlのβ−ＡＰＮの存在下で培養したとき、対照に比して約５０％減少した。しかし、２００μg/mlの濃度では、繊維芽細胞の増殖は、僅かに増大するが、角化細胞のそれは、約１０％低下した。一方、８００μg/ml以下で、密集状態での繊維芽細胞および角化細胞に対して観察される、β−ＡＰＮの毒性効果は皆無であった。ＭＴＴ生存率試験の結果は、細胞計測数のそれを追認する。結論として、これらの結果は、β−ＡＰＮは、高濃度（５００μg/mlより大）では、繊維芽細胞および角化細胞の増殖に対して阻害効果を有することを示す。強調すべきであるのは、２００μg/mlでのβ−ＡＰＮは、場合により、低密度で接種された繊維芽細胞、および高密度で接種された繊維芽細胞および角化細胞に対して、細胞活性（増殖および生存率）の増大を生じ得ることである。
【００７７】
再建皮膚（ＲＳ）
移植片に関するβ−ＡＰＮの重要な効果は、コラーゲンの架橋結合が誘導する収縮のあり得る低下であると思われる（図１０）。
【００７８】
β−ＡＰＮで浸漬かつ処理した再建皮膚の表面は、浸漬したが処理しなかったＲＳのそれより大であって、収縮現象の弱体化を示唆する。実際、空気−液体境界面に引き上げる前に観察された結果を考慮するならば、非処理対照の皮膚は、その本来の状態に比して４０％の表面積の低下を示して、５００μg/mlのβ−ＡＰＮで処理した皮膚についての僅か１７％と対比される。
【００７９】
培養３５日には、対照再建皮膚、または５０μg/mlのβ−ＡＰＮで処理したそれの表面積は、当初の本来の表面積に比して、５０％であったが、２００および５００μg/mlのβ−ＡＰＮで処理した再建皮膚は、４０％の表面積を有するにすぎなかった。空気−液体境界面での培養２週間後の再建皮膚の表面積について観察された、β−ＡＰＮの効果は、今回はもはや用量依存性ではなかった。２００または５００μg/mlのβ−ＡＰＮで処理したＲＳの、対照に比して、有意に大きい表面積が注目された。５０μg/mlのβ−ＡＰＮで処理したＲＳは、非処理対照と対比されるその表面積のいかなる有意な差も示さなかった。
【００８０】
ＲＳの組織学（図１１）は、５０μg/mlまたは２００μg/mlのβ−ＡＰＮでの処理によって根本的に変化したようには見えなかった。処理ＲＳは、豊富な細胞外基質（ＥＣＭ）を有する真皮、および基底の有棘顆粒層と角質層とを有する表皮によって構成されるように思われた。たとえ形成されたＲＳが、より脆弱であり、表皮が微細であるとしても、表皮の標準的な一般的構造は保存された。繊維芽細胞によるスポンジの初期コロニー形成は、β−ＡＰＮの存在によって促進されて、ＥＣＭ合成の増大へと移行した。
【００８１】
正常な皮膚、および本発明者らの再建皮膚モデルでは、基底層の角化細胞は、幹細胞を代表する。付随するその表現型の展開、および表皮の外層へのその移動は、角質層の形成を許すことになる。この角質層は、皮膚の障壁機能を確保することから、不可欠である。しかし、その形成は、皮膚の充分に大きい見本の合成を許すよう制御されなければならない。たとえ、β−ＡＰＮの一時的な添加が、角化細胞の初期表現型の展開を減速するように見えても、基底の有棘顆粒層および角質層への全体的組織化は維持される。
【００８２】
免疫組織学および超微細構造の解析は、処理ＲＳの有意な変更を明らかにした。原繊維状コラーゲンである、ＥＣＭの構造的成分は、改質された繊維へと組織化された。分泌されたコラーゲンの分子は、隣接する繊維間に結合を有して、不規則な直径の繊維形態に沈着した。本発明者らは、遂に、in situハイブリダイゼーションによって、５０μg/mlのβ−ＡＰＮによる処理が、真皮および表皮との双方における、ＬＯＸおよびＬＯＸＬ遺伝子の検出の僅かな増加へと移行することを示した。
【００８３】
表Ｉ
プラスチック上での培養中の軟骨細胞の細胞ローンで注目されたリシルオキシダーゼ活性
ニワトリ胚の胸骨からの軟骨細胞の二つの集団（頭部区画における肥大性、コラーゲンＸを合成する、および尾部区画における非肥大性）
接種：４百万個の細胞／３５mmペトリ皿（Ｐ３５）
培養体＋２５μg/mlのアスコルビン酸塩、＋１mMのピルビン酸塩、±１０％ＦＣＳ、±１mMのシステイン。血清（１．５ml）なしの培地の採集の２４時間前に、細胞ローンを、血清なし＋システインの培地で洗浄した。２４時間後の培地のアリコートを、１０倍に濃縮し、次いで、トリチウム化エラスチン基質の異なるバッチによる、リシルオキシダーゼ活性のアッセーに付した。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
結論：
リシルオキシダーゼ活性（β−ＡＰＮによって阻害し、トリチウム化した水の生成によって検定した）は、培地に分泌される。培地に記録された特異的活性は、培養７日目の方が１３日目より強い。細胞外基質は、培養１３日目のリシルオキシダーゼ活性の天然コラーゲン性の基質では、より豊富であって、そのため、細胞ローン中の酵素を保持していると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】プラスチック上の二次元での培養２週間後の軟骨細胞の脱分化に対する、リシルオキシダーゼ活性の効果を示す図である。  ニワトリ胚の胸骨の頭部区画からの４百万個の軟骨細胞を、直径３５mmのペトリ皿（Ｐ３５）内の、１０％血清（インスリン１００ng/mlと置き換えた）を含有するか、または含有しないＤＭＥＭ培地に、β−ＡＰＮ（５０μg/ml）の有無を伴って接種した。２５μg/mlのアスコルビン酸塩を含有する培地を、２日ごとに交換した。14Ｃ−プロリンで最後の２４時間標識化した、新合成されたコラーゲンを、順化培地の標準的なペプシン処理後に単離し、次いで、還元性条件なしで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに、次いで蛍光撮影分析に付した。観察：  強力に同化性である、血清の存在下では、軟骨細胞の生化学的脱分化（コラーゲンＩが分泌され、コラーゲンＸの合成が停止）は、これらの肥大性軟骨細胞に特異的なコラーゲンＸの比率を上昇させる、β−ＡＰＮの作用下で全面的に阻害した。同様に、β−ＡＰＮは、これらのコンドリオソームの肥大し、拡散しない形態学的特徴性を保存した。  血清の不在下では、軟骨細胞は、皿のプラスチックに付着したが、拡散しなかった。培養１５日後には、β−ＡＰＮの不在は、単一の形態学的変化のみを生じたにすぎないが、細胞増殖は、全体として、インスリンの存在にも拘わらず、減速されたままであった。
【図２】血清の存在下、プラスチック上の二次元での培養の３日後の、軟骨細胞の脱分化に対するリシルオキシダーゼの効果を示す図である。図１について記載した蛍光撮影分析による研究は、ここでは、ペプシン処理したローンおよび培地についてである。観察：  β−ＡＰＮの存在のみが、培地および細胞ローン中に特定された、肥大性軟骨細胞（頭部）によるコラーゲンＸの正常な発現（蛍光撮影図の下側帯域）を許した。コラーゲンＸの合成の阻害は、脱分化の際の軟骨細胞によるコラーゲンＩの出現に先行することが公知であって、そのため、培養第１日に開始されたが、異常なコラーゲンは、未だ合成されなかった。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いでニトロセルロース膜に移転した、細胞ローン、および軟骨細胞の培地の抽出物の、抗ＬＯＸ、ＬＯＸＬ１抗体による免疫装飾を示す。  サンプル採取の前日に、細胞ローンを、血清なしの培地で３回洗浄した。次いで、培地を、完全培地に２４時間交換した。  培養第６および１４日に、培地をサンプル採取し、４℃で３０分間、最終１０％のＴＣＡによる標準的な様式で沈澱させた。遠心分離ペレットを、アセトンで洗浄し、電気泳動緩衝液５０μlに可溶化した。洗浄した細胞ローンを、８Ｍの尿素、０．５％のＮｏｎｉｄｅ、１６mMのリン酸二ナトリウム、pH８、およびプロテアーゼ阻害剤の混合物中で、４℃で２時間溶解させた（３００μl／Ｐ３５）。尿素の濃度を４Ｍに調整してから、懸濁液を遠心分離した。上清をＴＣＡで沈澱させ、次いで対応する培地についてのとおり、処理した。  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロット分析によって移転した後、タンパク質の帯域を、ラットからのポリクローナル抗ＬＯＸおよび抗ＬＯＸＬ１抗体、次いで、アルカリ性ホスファターゼで標識付けした第二の抗ウサギ抗体を用いてから、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ試薬（Roche Diagnostic GmbH, Mannheim、ドイツ国）で展開する、免疫装飾によって分析した。（１）ＬＯＸおよびＬＯＸＬ１は、酵素活性のアッセーについて記載したとおりの条件下で培養した、軟骨細胞によって発現された。２４時間のみの培地とは異なり、１〜２週間後にローンに蓄積されたリシルオキシダーゼを示すことができた。（２）β−ＡＰＮの存在は、リシルオキシダーゼ分子の発現によって変更されず、表Ｉが示すとおり、酵素活性のみが阻害されたにすぎない。
【図４】プラスチック上での２Ｄ培養における寛骨臼軟骨の軟骨細胞によって合成された、放射能標識化されたコラーゲンの蛍光撮影分析による特定を示す図である。軟骨の酵素消化培地に加えたヒアルロニダーゼの効果を調べた。  14Ｃ−プロリンによる２４時間放射能標識化を、培養の第２、７および１４日に、血清とβ−ＡＰＮとの存在下（それぞれ第２日、第７日および第１４日）で実施した。培地および細胞ローンのペプシン処理した抽出物を、電気泳動、次いで蛍光撮影分析に付した。  寛骨臼軟骨の表面部域（偶数）および深部域（奇数）を分離してから、ヒアルロニダーゼの存在または不在下で酵素消化に付した。観察：（ｂ）軟骨の二つの下位集団、すなわち深部および表面部は、細胞ローンまたは培地でいかなるコラーゲンも合成しない培養第２日に、軟骨の表現型を示した。（ｃ）軟骨の事前の消化の際にヒアルロニダーゼの存在下で、深部域は、培養第７および１４日と同様に、コラーゲンＩを合成しないままであった。逆に、表面部域の細胞は、ますます分化して、培養第７日から第１４日までコラーゲンＩを産生した。新合成されたコラーゲンＩは、細胞ローンにも存在した。コラーゲンIIIは、培地中で第１４日に、より遅くに、少量産生されたが、細胞ローンでは、コラーゲンIIとは異なって、非常に小量が保持されたにすぎない。（ｄ）軟骨の事前の消化の際にヒアルロニダーゼの不在下で、規定されたばかりの軟骨の二つの下位集団が、培養２週間の間、分化しつつ、同様に発生した。
【図５】プラスチック上での２Ｄ培養における寛骨臼軟骨の形態学を示す図である。観察は、放射能標識化に用いたのと同じ培養体上で、血清およびβ−ＡＰＮの存在下で、培養の第７および１４日（７および１４日目）に実施した。  ヒアルロニダーゼの存在（＋）または不在（−）下での、軟骨の従来の酵素消化。観察：（ｅ）ヒアルロニダーゼの存在下での消化（＋）：培養第７日には（ａ、ｅ）、深部域の細胞は、in situで観察できるとおり、軟骨に特徴的である形態学を示した。対照的に、繊維芽細胞型の表面部域の細胞は、無数の微細な突起を有した。これらの相違は、少なくとも培養第１４日までの連続的増殖の際も維持された。（ｆ）ヒアルロニダーゼの不在下での消化（−）：細胞は、より豊富な細胞外基質に含まれたが、細胞の二つの下位集団間の形態学的相違は、より不明瞭であった（ｂ、ｆ、ｄおよびｈ）。
【図６】正常なヒト軟骨の構造を示す図である。
【図７】β−ＡＰＮの存在下、３Ｄで撹拌しつつ１ヶ月間培養した、正常なヒト軟骨を示す図である。  血清およびβ−ＡＰＮの存在下、コラーゲン−ＧＡＧ−キトサンのスポンジ中で、正常なヒト軟骨の３Ｄ培養を実施した。軟骨細胞は、事前に増殖し、脱分化した。  組織学的分析は、正常なヒト軟骨のそれ（図６）に酷似した組織学的構造を有する、濃密な厚い部域の存在を示した。軟骨は、それが新合成した大量の細胞外基質に囲まれ、小空洞内に順応している。より深くでは、非常に弱い基質合成を有する、スポンジのコロニー形成が観察された。
【図８】β−ＡＰＮなしで、撹拌しつつ、３Ｄで１ヶ月間培養した、正常なヒト軟骨を示す図である。ここでは、β−ＡＰＮなしで処理された、コラーゲン−ＧＡＧ−キトサンの同じスポンジが、表面に、スポンジの限定された表面に局在する、濃密であるが非常に厚くはない部域を有する。より深くでは、基質のコロニー形成および合成は、β−ＡＰＮで処理されたスポンジと異ならない。  結論として、β−ＡＰＮによる処理は、表面では正常なヒト軟骨のそれに近い構造の発生に有利に働くように思われる。
【図９】ニワトリ胚の肥大性軟骨の細胞ローンで産生された、コラーゲンIXの鎖の架橋に対するβ−ＡＰＮの効果の可逆性を示す図である。蛍光撮影分析による研究。  胸骨の頭部区画の軟骨を、高濃度（Ｐ３５ペトリ皿あたり５百万個の細胞）で接種し、次いで、培養の第７、１４および２４日に14Ｃ−プロリンで放射能標識化した（それぞれ、７、１４および２１日目）。  β−ＡＰＮは、培養の全持続期間について存在（＋）したか、もしくは不在（−）であるか、または第１週の間のみ存在した（（＋））。観察：  コラーゲンIXの二つの主帯域の存在は、培養全体の間のβ−ＡＰＮの存否の関数として変化する：帯域Ａは、β−ＡＰＮの不在に関連するが、帯域Ｂは、基本的には、β−ＡＰＮの存在下で観察された。第１週のみに限定されたβ−ＡＰＮの存在は、β−ＡＰＮなしの培養に特徴的である、培養の２および３週後の電気泳動像を与えた。  すべての場合に、コラーゲンＸの合成は、培養の加齢とともに増大したが、コラーゲンＩの合成は、当初の高密度の接種（１．５百万に変えて５百万の細胞／Ｐ３５）によって減速された。結論：  コラーゲンIXの架橋に対するβ−ＡＰＮの効果が示された。すなわち、それは、コラーゲンＩの合成を特徴とする、脱分化に対するそれに先行する。これらの結果は、（ｂ）β−ＡＰＮの効果の可逆性、（ｃ）細胞ローンの反復的洗浄後の細胞培養からのβ−ＡＰＮの排除、次いでβ−ＡＰＮなしの培地の使用の有効性を示す。
【図１０】再建皮膚の収縮に対するβ−ＡＰＮの効果を示す図である。β−ＡＰＮは、皮膚が依然として浸漬培養中にあるときに、対照に比して、収縮の用量依存性の有意な低下を生じさせた（灰色で）。空気−液体境界面で２週後に（白色で）、収縮は、対照に比して、依然として低下するが、２００〜５００μg/mlの濃度に対してのみそうであるにすぎない。
【図１１】β−ＡＰＮありか、またはなしで再建された皮膚の免疫組織学的解析を示すグラフである。１および２は、第一抗体なしでのヘマトキシリンによる、対照の染色を示し、３〜６は、β−ＡＰＮの存在（１、３、５）または不在（２、４、６）下での、ペルオキシダーゼで標識付けた第二抗体による、ＬＯＸの免疫検出を示す。  暗褐色の染色は、抗原ＬＯＸの存在を標識付けし、対照画分には不在である。  形成の３５日後に、再建皮膚は、コラーゲン−ＧＡＧ−キトサンのスポンジに沈積した真皮と、角化細胞によって形成された表皮とによって構成された。  真皮レベルでは、β−ＡＰＮによる処理は、繊維芽細胞によるスポンジの、より大きいコロニー形成を許し、それが、細胞外基質の合成の増大へと移行した。ＬＯＸの発現は、より強力であるように思われる。  表皮レベルでは、全般的な層形成は回復したが、β−ＡＰＮの処理は、より大きな顆粒線が認められた。ＬＯＸの発現も増加した。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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