(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直腸癌細胞又は結腸癌細胞を検出する方法であって、採取した２試料の1試料は非癌部組織から採取した試料であり、他の試料は検出を行おうとする試料であり、それぞれの試料につき、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現につき、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を用い、ウェスタンブロット法により発現量を調べ、検出を行おうとする試料に対する非癌部組織由来試料の発現量の比が１．７倍以上である場合、直腸癌細胞又は結腸癌細胞であると判定することを特徴とする直腸癌細胞又は結腸癌細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に特異的な遺伝子及びそれを用いた診断キットに関し、更にはそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。特に大腸上部に発生した癌は自覚症状に乏しく、発見時には病状が進行している危険性が高いためより早期発見がより重要である。
従来、大腸癌に対しては、主に便潜血反応によるスクリーニングと、ＣＥＡあるいはＣＡ１９−９等の血清マーカーによる診断、並びに治療経過の診断が行われている。しかしこれらの方法はいずれも進行癌では陽性率が高いものの、早期癌では陽性率が極めて低く、正確な診断が困難であった。
一方、悪性腫瘍の簡便かつ確実な早期診断を可能とする方法として、癌組織特異的タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験体への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験体に対しても広範囲に実施することが可能である。例えば、特開平７−５１０６５号公報には糖タンパク質３９の腫瘍マーカーとしての利用が開示されている。
また、国際公開第２００４／０１８６７９号パンフレットには、ＣＥＮＰ−Ａを用いた癌診断キットに関する技術が記載されている。
しかしながら、上記特許文献１に記載の技術だけでは癌の発現を完全に確認することについて未だ課題を残し、複数の手段を用いることでよりより確実に判定する必要がある。
以上、本発明は、新たな癌の発現に関連する遺伝子の更なる特定及びそれを用いた診断キットを提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００３】
以上を鑑み、本発明は以下の具体的な手段を採用する。
まず第一の手段として下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドとする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列と相同性が少なくとも７０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なおこの手段において、癌を検出するためのマーカーとして用いられることも好ましい。この手段におけるポリヌクレオチドは癌部組織において高発現していることが確認されたため、マーカーとして利用することにより癌診断に大きく寄与することができる。なお、配列番号１に記載の塩基配列との相同性としては７０％以上が好ましく、より好ましくは８０％、更には９０％以上が好ましい。
また第二の手段として、第一の手段におけるポリヌクレオチドを含む核酸分子とする。
また第三の手段として、第一の手段におけるポリヌクレオチドと特異的な因子を用いる癌診断キットとする。なお本明細書でいう「特異的な遺伝子」とは、ポリヌクレオチドに対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満のもの）ポリヌクレオチドに対する親和性よりも有意に高いものをいう。親和性は、例えばハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
なおこの手段において、特異的な因子は核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子及びそれらの複合分子からなる群のうち少なくともいずれかであること、前記癌診断キットが診断する癌は、直腸癌又は結腸癌であること、が望ましい。
また第四の手段として、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマーとする。
また第五の手段として、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーとする。
また第六の手段として、配列番号３に記載のプライマーと配列番号４に記載のプライマーからなるプライマーセットとする。
また第七の手段として、採取した二つの細胞それぞれに対し配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるたんぱく質の発現量を求めるステップ、その求めた発現量の比を算出するステップ、を有する方法とする。なおこの場合において、試料の一方は非癌組織から採取した試料とし、もう一方を例えば癌部組織であるとの疑いのある組織から採取した試料とし、この両者において発現量の比が異なる場合、癌について疑いのあるハイリスク者であると判定することができる。
またこの手段において、たんぱく質の発現量を求めるステップは、ウエスタンブロットを用いてなること、採取した二つの細胞のうち一つは非癌部組織における細胞であること、採取した二つの細胞のうち一つは癌部組織における細胞であること、算出した発現量の比が１．７以上であるか否かを判定するステップ、を有することも望ましい。
以上により、新たに癌の発現に関連する遺伝子を更に特定でき、またそれを用いた診断キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＣＥＮＰ−Ｈに対するウェスタンブロットの結果を示す図である。
図２は、ｈＭｉｓ１２に対するウェスタンブロットの結果を示す図である。
図３は、直腸癌の組織とそれに隣接する非直腸癌の組織の断面を抗ヒトＣＥＮＰ−Ｈポリクロナール抗体で染色した結果を示す図。
図４は、直腸癌組織と通常組織の各表面におけるＣＥＮＰ−ＨのｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲとリアルタイム定量ＰＣＲを用いて調査した結果を示す図である。
図５は、直腸癌組織と通常組織の各表面におけるＣＥＮＰ−ＨのｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲとリアルタイム定量ＰＣＲを用いて調査した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の実施の一例について詳細に説明する。
（組織の採取）
初期の結腸直腸癌患者１５名の体の組織を外科的方法により採取した。組織は、癌の組織（以下「癌組織」という。）及びこの癌の組織から５〜１０ｃｍ離れた部分における組織（以下「非癌組織」という。）をそれぞれ採取した。なお採取した組織はすぐに液体窒素に浸し、−８０℃に冷凍保存した。
（タンパク質抽出）
次に、冷凍保存した組織を、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（７Ｍ  ｕｒｅａ、２Ｍ  ｔｈｉｏｕｒｅａ、２％  ３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−Ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、２％  ＩＰＧ  ｂｕｆｆｅｒ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）に入れ、ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）を用いて溶解し、１００００×ｇの遠心分離を４℃で１時間行った後、上清を採取し、タンパク質を抽出した。
（イムノブロット）
タンパク質は、タンクトランスファー装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）の中でｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、そのメンブレンをまず５％ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを含有するＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）でブロックした。次に、一次抗体として、１：５０００に希釈したウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体、１：１００に希釈したウサギ抗ｈＭｉｓ１２抗体、１：５００に希釈したヤギ抗βアクチン抗体をそれぞれＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに入れたものを用い、二次抗体としては、１：３０００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ、１：５００に希釈したウサギ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ、をそれぞれｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに入れたものを用いた。
なお抗原メンブレン上の抗体は強化化学発光検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により検出した。また各バンドの強度はＮＩＨ画像により測定した。
（ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲ）
ｔｏｔａｌＲＮＡは、癌組織及び非癌組織からそれぞれＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。またｃＤＮＡは、抽出した各ｔｏｔａｌＲＮＡから１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてそれぞれ合成した。
そしてこの合成により得られたそれぞれのｃＤＮＡをテンプレートとし、ＣＥＭＰ−ＨのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。なおＰＣＲは、配列番号３に記載の塩基配列を有するプライマーをフォワード、配列番号４に記載の塩基配列を有するプライマーをリバースとして用い、コントロールとしてＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ又はβアクチンを増幅した。
そして次に、ＣＥＮＰ−ＨのｃＤＮＡリアルタイム定量ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒキャピラリー中で実施した。なおそのＰＣＲ反応混合液は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファー、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）を用い、それにＭｇＣｌ２を３．０ｍＭ、配列番号３に記載のプライマー及び配列番号４に記載のプライマーそれぞれを０．５μＭずつ加え、合計２．０μｌ中で行った。
そしてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア  バージョン３．３（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて分析した。
（免疫組織染色法）
凍結組織切片は、スライドガラス上で乾燥後、４℃のアセトン中で固定した。そしてＰＢＳで３回洗浄した後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１０％の牛の胎児の血清／ＰＢＳ）で１時間ブロックした。
試料は１：２０００に希釈したウサギ抗ＣＥＮＰ−Ｈ抗体、１：１０００に希釈した抗ヒトＣＥＮＰ−Ａモノクロナル抗体の一方若しくは双方を用い、３％の牛の血清のアルブミン／ＰＢＳ中で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、試料は１：１０００に希釈したＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ４８８  若しくは５９４結合ヤギ抗ウサギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）及び／又はＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ５９４結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに１時間インキュベートした。
ＤＮＡは、ＤＡＰＩ  ＩＩＩ  Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ（Ｖｙｓｉｓ社製）を用いて対比染色した。試料は蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＱＦＩＳＨ社製）により観察した。なおＨＥ染色のため、組織切片をｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで３０分染色し、１００％のエタノール及びｘｙｌｅｎｅで乾燥し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔを用いて封入した。
（結果）
ウェスタンブロットによる結果を図１に示す。図１に示すとおり、ＣＥＮＰ−Ｈは１５症例いずれにおいても癌組織で非常に多く発現していた。特に、非癌組織と癌組織のＣＥＮＰ−Ｈ発現の比は１．７〜９．６であり、癌組織と非癌組織において大きな差異が見られた。一方これに対し、他の動原体たんぱく質であるｈＭｉｓ１２の場合は、癌組織、非癌組織において特段の差異を見出すことはできなかった（図２参照、図中のＣａｓｅ番号は図１におけるＣａｓｅ番号と同一の組織であることを示す）。
次に、ＣＥＮＰ−Ｈが間質細胞ではなく癌細胞で発現していることを確かめるために、大腸直腸癌の組織とそれに隣接する非癌部の組織の断面を抗ヒトＣＥＮＰ−Ｈポリクロナール抗体で染色した。その結果を図３に示す。なお図３（ａ）は癌部のＨＥ染色像を、図３（ｂ）（ｃ）（ｄ）は癌部のＣＥＮＰ−Ｈ抗体による免疫染色像を、図３（ｅ）は非癌部のＨＥ染色像を、図３（ｆ）は非癌部のＣＥＮＰ−Ｈの染色像をそれぞれ示している。
この結果、ＣＥＮＰ−Ｈは、ＣＥＮＰ−ＡやＣＥＮＰ−Ｃのような他のセントロメアたんぱく質と同様に、セントロメアと一致して、細胞の核の中で小さな斑点状に現れる点として存在していることが確認された。そのＣＥＮＰ−Ｈは、非癌部組織に比較して（図３（ｆ））、癌部では数及びサイズにおいて増加していることが確認された（図３（ｃ）及び（ｄ）参照）。なお、染色されたＣＥＮＰ−Ｈは、間質細胞ではなく、癌部上皮において確認された。また、本実験を様々な組織切片において行ったが、どれも同様の結果を示した。
以上、ＣＥＮＰ−Ｈは、癌細胞内において発現していることが確認できた。
次に、ＣＥＮＰ−Ｈの過剰発現が転写により増加した結果であることを確認するために、大腸直腸癌組織におけるＣＥＮＰ−ＨのｍＲＮＡの量と、非癌部組織におけるＣＥＮＰ−ＨのｍＲＮＡの量とをＲＴ−ＰＣＲとリアルタイム定量ＰＣＲを用いて解析した。この結果を図４及び図５に示す。
図４で示すとおり、癌組織におけるＣＥＮＰ−ＨのｍＲＮＡの発現レベルは非癌部組織に比べ非常に増大していることがわかる。そして更に、ＣＥＮＰ−ＨのｍＲＮＡの発現レベルは、図１にて示した非癌組織と癌組織のＣＥＮＰ−Ｈ発現の比に強い相関を示していることがわかった。なおコントロールとしてのＧＡＰＤＨについて確認したが、癌組織及び非癌部組織において差異は見られなかった。
図５は図４で示したｍＲＮＡの発現レベルを非癌組織と癌組織との間で比較したものであって、スタットビュー統計解析ソフトによって求めた。図５によると、癌組織（Ｃａｎｃｅｒ）は非癌組織（Ｎｏｒｍａｌ）に比べ、約５倍も高く発現していた。これによってもＣＥＮＰ−Ｈの発現を調べることにより癌の存在を確かめることができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
以上、本発明によれば、新たに癌の発現に関連する遺伝子を特定することができ、更にはそれを用いた診断キットを提供することができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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