(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルムス腫瘍遺伝子（WT1）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体であって、次の塩基配列：
５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG-３′（配列番号：２）又は
５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配列番号：６）
を有するものを含んで成る胃癌、肺癌または卵巣癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対する発現阻害物質を含んで成る、固形腫瘍治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルムス(Wilms) 腫瘍は、染色体１１ｐ１３に位置するウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の両対立遺伝子の不活性化により生ずる小児腎腫瘍である(Call KM et al., Cell 60：509, 1990)。ＷＴ１の非コード上流配列 (C.E.Camphellら、Oncogene 9：583-595, 1994)及びイントロンを含むコード領域(D.A.Haberら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88：9618-9622, (1991))はすでに報告されており、腫瘍等の増殖及び分化に関与することが予想される(D.A.Haberら、前掲）。
【０００３】
また、本発明者らは、ＷＴ１が白血病細胞の増殖に関与している（K. Inoue, et al., Blood, 84 (9) 3071-3079 (1994)）ことから、ＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が白血病細胞の増殖を抑制・阻害することを見い出した（ＰＣＴ特許公開ＷＯ９６／３８１７６）。しかしながら、ＷＴ１の発現阻害物質が固形腫瘍の増殖を抑制・阻害することは知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、ウイルムス(Wilms) 腫瘍遺伝子（ＷＴ１）に対する発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍の治療剤を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＷＴ１に対する発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤を提供する。ここで、固形腫瘍とは、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等である。本発明で使用するＷＴ１に対する発現阻害物質は、ＷＴ１の発現を阻害するものであれば何でもよく、たとえば、ＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、ＷＴ１に対して dominant negativeに働くＷＴ１変異遺伝子および変異タンパク質、デコイ  ＤＮＡなどの低分子阻害物質またはＷＴ１に特異的に結合し転写活性を阻害するペプチドなどの低分子阻害物質など挙げられる。本発明で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ＷＴ１の転写キャッピング部位に対するもの、翻訳開始領域に対するもの、エクソンに対するものまたはイントロンに対するものなどのＷＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００６】
例えばＷＴ１の転写キャッピング部位を含む領域のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：９で表わされ、またＷＴ１のコード領域のエクソン１〜１０のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列は配列番号：１０〜１９で表わされるが、本発明はこのようなＷＴ１のセンスＤＮＡ鎖の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を用いる。このアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、通常ＷＴ１のアンチセンスＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の連続した５〜５０個、好ましくは、９〜３０個の塩基またはＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に結合することができるものであれば、断続的または部分的に相補的な５〜７０個、好ましくは、９〜５０個の塩基から成るアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体である。
【０００７】
転写キャッピング部位に対するものとしては、例えば次の塩基配列：５′-AGGGTCGAATGCGGTGGG -3′（配列番号：２）及び５′-TCAAATAAGAGGGGCCGG-３′（配列番号：４）などのものが挙げられる。また、翻訳開始領域に対するものとしては、翻訳開始コドンＡＴＧ並びにその上流及び／又は下流を含む領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が挙げられ、例えば次の塩基配列：５′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-３′（配列番号：６）などが挙げられる。
【０００８】
また、ＷＴ１のコード領域には１０個のエクソンが含まれており、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、これらのエクソンのいずれかに含まれる配列に対するもの、又はスプライシング後に連続するいずれか２個のエクソンにわたる配列に対するものあるいは、連続するイントロンとエクソンにわたる配列に対するもの、全てのイントロン及び３′，５′側非コード領域の配列に対するものである。１例として、第６エクソンに対するものであり、次の塩基配列：５′-CGTTGTGTGGTTATCGCT-３′（配列番号：８）に対するものが挙げられる。
さらに、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖と断続的または部分的に相補的な塩基配列を有する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は対応する領域については特に問わないが、これらの中には、ＷＴ１のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を切断する機能を有するリボザイムのようなものも含まれる。
【０００９】
本発明において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の構造は、化１に示したとおりであるが、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低級アルキル基あるいは一級アミンまたは二級アミンのいずれでもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ（Ｓ）のいずれでもよい。Ｚは水素または水酸基である。ＢはＺが水素のときアデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、Ｚが水酸基のときアデニン、グアニン、ウラシルあるいはシトシンのいずれかから選ばれ、主としてＷＴ１をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒは独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいは低級アルキル基である。ｎは７−２８である。
【００１０】
【化１】
0004789095.tif 000002
【００１１】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体としては修飾されていないアンチセンスオリゴヌクレオチドだけでなく、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。この様な修飾体として、例えば前述のメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、その他ホスホロチオエート修飾体あるいはホスホロアミデート修飾体等が挙げられる（化２参照）。
【００１２】
【化２】
0004789095.tif 000003
【００１３】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は次のとおり常法によって得ることができる。
化１のＸ及びＹがＯ、Ｚが水素又は水酸基であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystems社製など）によって容易に合成される。
【００１４】
Ｚが水素であるアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
例えば、 T.Atkinson, M.Smith, in Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 35-81 (1984)； M.H.Caruthers, Science, 230, 281 (1985)； A.Kume, M.Fujii, M.Sekine, M.Hata, J.Org.Chem., 49, 2139 (1984)；B.C.Froehler, M.Matteucci, Tetrahedron Lett., 27, 469 (1986)； P.J.Garegg, I.Lindh, T.Regberg, J.Stawinski, R.Stromberg, C.Henrichson, ibid, 27, 4051 (1986)；
【００１５】
B.S.Sproat, M.J.Gait, in Oligonucleotide Synthesis： A Practical Approach, ed.M.J.Gait, IRL Press, 83-115 (1984)； S.L.Beaucage and M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 21, 719-722 (1980)；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191 (1981)を参照のこと。
【００１６】
Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ることができる（Moody H.M., et al., Nucleic Acids Res., 17, 4769-4782 (1989)) 。
Ｘがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる（M.A.Dorman, et.al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984)；K.L.Agarwal and F.Riftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。
【００１７】
ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法(C.A.Stein, et.al., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221 (1988)) あるいはテトラエチルチウラム  ジスルフィドを用いて、固相合成法により得ることができる（H.Vu and B.L.Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008 (1991)) 。
Ｘ, ＹがともにＳであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイトに変換しイオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる（W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Chem.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。
【００１８】
Ｘが一級アミンあるいは二級アミンであるホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホスホネートを一級あるいは二級アミンで処理することにより固相合成法で得ることができる（B.Froehler, et.al. Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839 (1988))。あるいは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイドで酸化しても得ることができる（H.Ozaki, et.al., Tetrahedron Lett., 30, 5899-5902 (1989)) 。
【００１９】
Ｚが水酸基であるアンチセンスオリゴリボヌクレオチドの合成法は、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドに比べて、リボース（糖）に２′−水酸基があるためその保護を行わなければならない点できわめて複雑ではあるが、保護基およびリン酸化方法を適宜選択することによって合成することができる（微生物学基礎講座  ８巻、遺伝子工学、大塚栄子、三浦一伸共著、安藤忠彦、坂口健二編、１９８７年１０月１０日、共立出版株式会社発行参照）。
【００２０】
精製および純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うことができる。分子量の確認は、 Electrospray Ionization Mass Spectrometry又は Fast Atom Bonbardment-Mass Spectrometryで行うことができる。
本発明のＷＴ１に対する発現阻害物質は、genomic DNA からmatureなmRNAに至るいかなる段階においても作用し、その発現を抑制することによって固形腫瘍細胞の増殖を阻害すると考えられる。従って、本願発明の発現阻害物質は固形腫瘍の治療のために有効であると期待される。
【００２１】
本発明の発現阻害物質は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤などの外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調製することができる。
【００２２】
本発明の発現阻害物質は患者の患部に直接適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適応させる。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００２３】
本発明の発現阻害物質の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重などに応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。また、その投与方法は、患者の状態、薬剤形態などに応じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、胸腔内投与、髄腔内投与、腫瘍内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与などの種々の投与方法から適宜好ましい方法を用いることができる。
以下本発明を実施例において詳しく説明する。
【００２４】
【実施例】
合成例１．
以下に使用するオリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号：１〜８）およびランダム配列（Ｒａｎｄ）を、自動合成装置（Applied Biosystems) を用いて合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、エタノール沈澱を３回行い、そしてリン酸緩衝液に懸濁した。
合成したオリゴヌクレオチドは次の通りである。なお、ランダム配列（Ｒａｎｄ）は、塩基１８個の配列で理論上４の１８乗種類の配列の混合物となっている。
【００２５】
配列番号：１  転写キャッピング部位のセンス配列（ＳＥ１）
配列番号：２  転写キャッピング部位のアンチセンス配列（ＡＳ１）
配列番号：３  転写キャッピング部位のセンス配列
配列番号：４  転写キャッピング部位のアンチセンス配列
配列番号：５  翻訳開始領域のセンス配列（ＳＥ２）
配列番号：６  翻訳開始領域のアンチセンス配列（ＡＳ２）
配列番号：７  エクソン６のセンス配列
配列番号：８  エクソン６のアンチセンス配列
【００２６】
実施例１．
ＷＴ１発現陽性の胃癌ＡＺ５２１株の細胞を５×１０4 個／ml、１００μｌ／ウエルの量で、平底９６−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地に接種した。オリゴヌクレオチドＡＳ１又は対照ＳＥ１もしくはｒａｎｄを、３連のウエルに、最終濃度が１００μｇ／mlとなるように添加した。２時間のインキュベーションの後、各ウエルに最終濃度が１０％となるようにＦＣＳを添加した。２４時間毎に、前記の量の半分のオリゴヌクレオチドを培養物に添加した。
【００２７】
９６時間培養した後、色素排除法により生存細胞を計数した。対照培養物として、ヌクレオチドを含有しない同じ体積のＰＢＳを添加し、そしてこの対照培養物の細胞数を１００％とした。
この結果を図１に示す。この図から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１は、対応するセンスオリゴヌクレオチドＳＥ１に比べて強く細胞の増殖を阻害した。
【００２８】
実施例２．
実施例１と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２、又はｒａｎｄを２００μｇ／ml濃度で添加した。図２から明らかな通り、ランダム配列（ｒａｎｄ）は胃癌細胞の増殖をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１及びＡＳ２は胃癌細胞の増殖を阻害した。
【００２９】
実施例３．
実施例１と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２、又はｒａｎｄを４００μｇ／mlの濃度で添加した。図３から明らかな通り、ランダム配列（ｒａｎｄ）に比べて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１又はＡＳ２は胃癌細胞の増殖を阻害した。
なお、実施例１〜３の結果から明らかなごとく本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの胃癌細胞増殖阻害効果は濃度依存的であった。
【００３０】
実施例４．
実施例１と同様の実験を行ったが、固形腫瘍細胞として肺癌ＯＳ３株の細胞を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２、又は対照ランダム配列（ｒａｎｄ）を２００μｇ／mlの量で用いた。図４から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１及びＡＳ２は対照ランダム配列（ｒａｎｄ）に比べて強い肺癌細胞増殖阻害効果を示した。
【００３１】
実施例５．
実施例５と同様の実験を行ったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１を４００μｇ／ml、又は対照としてＳＥ１もしくはｒａｎｄを４００μｇ／ml使用した。図５から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１はその他の対照オリゴヌクレオチドに比べて、肺癌細胞増殖阻害効果を示した。
なお、実施例４及び５の比較から、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの肺癌細胞増殖阻害効果が濃度依存的であることが明らかである。
【００３２】
実施例６．
実施例１と同様の実験を行ったが、固形腫瘍細胞として、卵巣癌ＴＹＫｎｕ株の細胞を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１を４００μｇ／ml、又は対照オリゴヌクレオチドＳＥ１もしくはｒａｎｄを４００μｇ／ml用いた。図６から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１は、その他の対照オリゴヌクレオチドに比べて顕著な卵巣癌細胞増殖阻害効果を示した。
【００３３】
参考例１
実施例と同様の実験を行ったが、被験細胞として、ＷＴ１発現陰性の肺アデノカルシノーマ細胞系ＷＴＡＳ  ＰＣ１４を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ１もしくはＡＳ２を４００μｇ／ml又は対照オリゴヌクレオチドｒａｎｄを４００μｇ／ml用いた。図７から明らかな通り、ＷＴ１発現陰性の細胞に対しては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは有意な増殖阻害効果を示さなかった。
【００３４】
実施例７．
表２記載の各種の腫瘍細胞株からＲＮＡを抽出し、下記のＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＷＴ１ｍＲＮＡの発現量を定量した。表２に白血病細胞株Ｋ５６２におけるＷＴ１の発現量を１．０として各種腫瘍細胞株でのＷＴ１の発現量を相対的に示した。
各細胞株より通常の方法〔例えば acid-guanidine-phenol-chloroform method：Anal. Biochem.,  162, 156 (1987)〕に従い総ＲＮＡを抽出し、ジエチルピロカーボネート処理水に溶解して、吸光度２６０nmにて光学的に定量化した。
【００３５】
１μｇの総ＲＮＡを含むジエチルピロカーボネート処理水１５．５μｌを、６５℃で５分間加熱し、６００Ｕの逆転写酵素（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ：GIBCO-BRL ）、５００mmol／１の各デオキシヌクレオチドトリフォスフェート（dNTP：Pharmacia)、７５０ngのオリゴｄＴプライマー及び４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（Boehringer Mannheim ）を含むＲＴ緩衝液（５０mmol／１トリスＨＣｌ（pH８．３）；７０mmol／１  ＫＣｌ；３mmol／１  ＭｇＣｌ2 ；１０mmol／１ジチオスレイトール）の１４．５μｌと混合した。
【００３６】
混合物を３７℃で９０分間インキュベートし、７０℃で２０分間加熱後、使用時まで−２０℃にて保存した。
ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer-Cetus）にて、９４℃、１分の変性、６４℃、１分（βアクチン：６０℃、１分）のプライマーアニーリング（annealing ）及び、７２℃、２分の鎖延長（chain elongation）の条件で繰り返しサイクルを行ない、ＰＣＲ産物（第１ラウンドＰＣＲ）を得た。
該ＰＣＲ産物のデンシトメーター単位（後記）が５００未満の場合には、第１ラウンドＰＣＲ産物の２．５μｌを含む反応液にて、ネステッド内方プライマーによる第２ラウンドＰＣＲを行なった。
【００３７】
得られたＰＣＲ産物を、文献〔J. Immunol., 147, 4307, (1991)〕記載の方法に準じて以下の通り定量した。
即ち、２０ngの総ＲＮＡからのＰＣＲ産物を、０．０５μｇ／mlのエチジュームブロマイドを含む１．３％アガロースゲルに分離し、ポラロイドフィルム（Polaroid 665 film, Polaroid Corp. ）にて撮影した。
ネガフィルムを、２５℃、５分間にて現像し、デンシトメーター（CS-9000 ：島津）にて検定して「デンシトメーター単位」として得た。
尚、上記においてＲＮＡ不含の場合のＰＣＲ産物を用いた結果を陰性コントロールとした。
また、上記において使用したプライマーは表１に示す通りである。
【００３８】
【表１】
0004789095.tif 000004
【００３９】
尚、内部コントロールとしたβアクチンのプライマーとしては、文献〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,  82, 6133, (1985)〕に記載のものを使用した。これら各プライマーは全て常法に従い化学合成した。
ＲＴ−ＰＣＲへのＲＮＡ使用量と各サンプルにおけるＲＮＡ分解の相違を標準化するために、ＷＴ１遺伝子の結果（デンシトメーター単位）をβアクチンのそれで除し、これをＷＴ１遺伝子発現レベルとした。
結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
0004789095.tif 000005
【００４１】
上記の結果、種々の固形腫瘍由来の培養株においてＷＴ１遺伝子が発現していることが確認された。
以上の通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは固形腫瘍細胞の増殖の阻害のために有効であり、従って新規な固形腫瘍治療剤として期待される。
【００４２】
【配列表】
0004789095.tif 000006
【００４３】
0004789095.tif 000007
【００４４】
0004789095.tif 000008
【００４５】
0004789095.tif 000009
【００４６】
0004789095.tif 000010
【００４７】
0004789095.tif 000011
【００４８】
0004789095.tif 000012
【００４９】
0004789095.tif 000013
【００５０】
0004789095.tif 000014
【００５１】
0004789095.tif 000015
【００５２】
0004789095.tif 000016
【００５３】
0004789095.tif 000017
【００５４】
0004789095.tif 000018
【００５５】
0004789095.tif 000019
【００５６】
0004789095.tif 000020
【００５７】
0004789095.tif 000021
【００５８】
0004789095.tif 000022
【００５９】
0004789095.tif 000023
【００６０】
0004789095.tif 000024
【００６１】
0004789095.tif 000025
【００６２】
0004789095.tif 000026
【００６３】
0004789095.tif 000027
【００６４】
0004789095.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、胃癌ＡＺ５２１株の細胞の増殖に対する１００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２は、胃癌ＡＺ５２１株の細胞の増殖に対する２００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図３】図３は、胃癌ＡＺ５２１株の細胞の増殖に対する４００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図４】図４は、肺癌ＯＳ３株の細胞の増殖に対する２００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図５】図５は、肺癌ＯＳ３株の細胞の増殖に対する４００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図６】図６は、卵巣癌ＴＹＫｎｕ株の細胞の増殖に対する４００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＷＴ１発現陰性の肺アデノカルシノーマ細胞系、ＷＴＡＳ  ＰＣ１４の細胞の増殖に対する４００μｇ／mlのオリゴヌクレオチドの阻害効果を示すグラフである。
【図１】
0004789095.tif 000029
【図２】
0004789095.tif 000030
【図３】
0004789095.tif 000031
【図４】
0004789095.tif 000032
【図５】
0004789095.tif 000033
【図６】
0004789095.tif 000034
【図７】
0004789095.tif 000035