(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖因子を加えたカルボキシルメチルキチン溶液にガンマ線照射することを特徴とする骨修復材の製造方法。
【請求項２】
上記ガンマ線照射後に凍結乾燥処理を行うことを特徴とする請求項１記載の骨修復材の製造方法。
【請求項３】
エポキシ基が１分子内に２ケ以上導入された化合物を上記カルボキシルメチルキチン溶液に添加することを特徴とする請求項１記載の骨修復材の製造方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかの項に記載の製造方法によって得られた骨修復材であって、上記ガンマ線照射することによって得られたカルボキシルメチルキチン架橋体内に増殖因子が固定されていることを特徴とする骨修復材。
【請求項５】
上記カルボキシルメチルキチン架橋体がゲル状物であることを特徴とする請求項４記載の骨修復材。
【請求項６】
上記カルボキシルメチルキチン架橋体がスポンジ状物であることを特徴とする請求項４記載の骨修復材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨欠損部を修復するための骨修復材、特に多糖類を架橋してなり増殖因子を徐放することが可能な骨修復材とその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多糖類を架橋してなる生体用材料として、従来から次のようなものがあった。
（１）多糖とイオン化放射線反応性化合物とを共有結合してなるイオン化放射反応性多糖とし、この反応性多糖に対しイオン化放射線を照射することにより、上記共有結合された反応性化合物における残基どうしを架橋反応させてなる架橋多糖。
（２）カルボキシルメチルキチン溶液を凍結乾燥した後、熱架橋してなる骨修復材。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来技術のうち（１）は、多糖とイオン化放射線反応性化合物とを共有結合する工程を含み、その製造方法が煩雑である。また、この架橋多糖を長期間生体内に埋入しておくと、イオン化放射線反応性化合物が生体に悪影響を与えるおそれがあった。さらに、この架橋多糖が生理活性物質を担持している場合、比較的短時間で生理活性物質を徐放してしまう傾向がある。これは、架橋多糖として多糖とイオン化放射線反応化合物とを共有結合させたものを使用するため、生理活性物質と架橋多糖との化学的結合力が弱く、両者は架橋多糖が生理活性物質を包理しているような状態であるためと考えられる。また、この架橋多糖は難溶性で分解速度が遅いので、骨修復材として用いる場合、新生骨の生成速度と分解速度がマッチングせず新生骨の形成を阻害する恐れがある。
また、（２）の従来技術は、熱架橋を行うので、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：骨形成性タンパク質）などの増殖因子を含有させようとしても、増殖因子が変性したり分解したりするので、増殖因子を含有させることができない。また、機械的強度があまり大きくないので、手術中の取り扱いに注意が必要である。
このような従来技術の課題に鑑み、本発明は、生体に安全であること、増殖因子を含有してそれを効率的に徐放させることができること、術中の取り扱いが非常に容易であることが可能な骨修復材とその製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、カルボキシルメチルキチンは溶液の状態でガンマ線照射を行うことによって良好な架橋体を得ることができることを見出し本発明を成した。
【０００５】
すなわち、請求項１の骨修復材の製造方法は、増殖因子を加えたカルボキシルメチルキチン溶液にガンマ線照射することを特徴とする。
【０００６】
かかる方法によれば、ガンマ線照射によりカルボキシルメチルキチンのカルボキシメチル基及び水酸基が架橋されゲル状物を形成する。このとき、高温加熱処理しないので、増殖因子が変性したり分解してしまうことがない。
【０００７】
さらに、この骨修復材の製造方法は、上記従来技術のようにイオン化放射線反応性化合物との共有結合物を形成したり、必ずしも生体に安全であるとは言いきれない種類の架橋剤を使用する必要がないので、簡便かつ安全である。
【０００８】
また、この製造方法によって得られる骨修復材は請求項４に記載されるように、上記ガンマ線照射することによって得られたカルボキシルメチルキチン架橋体内に増殖因子が固定されていることを特徴とする。そのため、骨欠損部に充填されたかかる骨修復材において、増殖因子が内部から外部に短期間で漏出するのではなく、カルボキシルメチルキチンが分解吸収されていく過程で、分解された部分のカルボキシルメチルキチンから増殖因子が徐放される。これらの増殖因子が、周囲に存在する未分化間葉系細胞や繊維芽細胞を骨芽細胞に分化させ新生骨を生成する。
【０００９】
このとき、上記カルボキシルメチルキチン架橋体の生体内での分解速度が新生骨の生成速度と非常によくマッチングするので、骨欠損部の骨修復に十分な量の骨が形成される。
【００１０】
なお、上記カルボキシルメチルキチン架橋体が請求項５記載のようにゲル状に維持されている場合、ゲル状物はスポンジ状物よりも崩壊しにくいので取り扱いが容易である。
【００１１】
次に、請求項２の骨修復材の製造方法は、上記ガンマ線照射後に凍結乾燥処理を行うことを特徴とする。
【００１２】
かかる構成によれば、得られる骨修復材は請求項６記載のようにスポンジ状物となる。このスポンジ状物は、その多孔部分に骨芽細胞等を貯留できるので、新生骨の形成が活発となる。
【００１３】
次に、請求項３の骨修復材の製造方法によれば、エポキシ基が１分子内に２ケ以上導入された化合物を上記カルボキシルメチルキチン溶液に添加することを特徴とする。
【００１４】
かかる構成によれば、ガンマ線架橋の架橋効率を向上させることができる。このとき、上記エポキシ系架橋剤は未反応のエポキシ残基が不活性化される特徴を有するので、生体に害を与えにくい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を詳しく説明する。
【００１６】
本発明の骨修復材は、カルボキシルメチルキチン（以下、ＣＭキチンと略称する）の架橋体に増殖因子を固定したものである。
【００１７】
ＣＭキチンは、生体に安全な分解性物質として公知である。そして、ＣＭキチンはガンマ線照射によって架橋することができ、その際、イオン化放射線反応性化合物との共有結合物を形成したり、必ずしも生体に安全であるとは言いきれない種類の架橋剤を使用しなくても良い。
【００１８】
この骨修復材の使用方法は、骨の欠損部にあわせてメス等で適当な大きさ・形状に骨修復材をトリミングし、骨欠損部に押し込めてフィティングさせる。ＣＭキチン架橋体をゲル状物とした場合、骨修復材がゲル状で弾力性を有するので、手で扱うときにも崩れにくく、骨欠損部への押し込みも容易である。
【００１９】
また、上記骨修復材の形態は、ゲル状物である他、スポンジ状物であっても良い。この場合、ゲル状物に比べて崩壊性は高く、取り扱いに注意が必要である反面、穴部分に骨芽細胞等を貯留することができる点で、新生骨形成を活発化するのに有利となる。
【００２０】
ＣＭキチンの架橋と増殖因子の固定は、後述のガンマ線照射によって達成することができる。ここで、増殖因子とは、細胞を分化、増殖する作用を有する因子であり、代表的にはＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：繊維芽細胞増殖因子）、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：骨形成性タンパク質）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：血管内皮増殖因子）、ＧＤＦ（ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：増殖分化誘導因子）、ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：トランスフォーミング増殖因子）等がある。
【００２１】
かかる構成によれば、骨欠損部に充填された骨修復材において、増殖因子が内部から外部に漏出するのではなく、ＣＭキチンが分解吸収されていく過程で、分解された部分のカルボキシルメチルキチンから増殖因子が徐放される。これらの増殖因子が、周囲に存在する未分化間葉系細胞や繊維芽細胞を骨芽細胞に分化させ新生骨を生成する。このとき、増殖因子がＣＭキチンの架橋体に固定されているため、長期に渡って増殖因子が徐放され続けて骨欠損部の骨修復に十分な量の骨が形成される。
【００２２】
このような骨修復材を得るための製造方法を以下に説明する。
【００２３】
まず、ＣＭキチンと増殖因子を蒸留水に溶解させる。さらに架橋剤を使用する場合、架橋剤の添加もこのとき行う。次に、この溶液を所望の型に入れ、この溶液に対してガンマ線照射を行う。
【００２４】
ここで、ガンマ線を用いるのは、ガンマ線は透過性が高く、ＣＭキチン溶液の内部に対しても有効であるからである。
【００２５】
ＣＭキチンの濃度は、１〜３０ｗｔ％の範囲が好ましく、さらに好ましい範囲は５〜２０ｗｔ％である。この濃度が１ｗｔ％未満では、架橋が十分に施されずに、ゲル状物にならない恐れがある。また、上記濃度が３０ｗｔ％より高い場合、局所的にＣＭキチン濃度が高値となりすぎて、骨形成を阻害する恐れがある。また、ＣＭキチンの濃度が５％未満では成形性が低下する場合があり、他方、上記濃度が２０ｗｔ％より高い場合、骨形成が不良となる場合がある。
【００２６】
上記ＣＭキチンは水溶性の観点から、ＣＭ化度が０．５以上のものを使用する。分子量に制限はないが、分子量が大きければ大きいほど架橋されやすい。そのため分子量の下限は５０００であり、水溶性の観点から、好ましくは１万から２００万の範囲が好ましい。
【００２７】
増殖因子の種類は、特に限定されるものではなく、上記ＦＧＦ、ＢＭＰ、ＶＥＧＦ、ＧＤＦ、ＴＧＦ−βに限定されるものでないが、徐放性の制御の観点から考慮すると、塩基性ＦＧＦやＢＭＰ等の塩基性の増殖因子が望ましい。
【００２８】
架橋剤としては安全性の点から、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等を用いることが好ましい。エポキシ系の架橋剤であれば、未反応のエポキシ残基が不活性化される特徴を有するので、生体に害を与えにくい。そのうち、エポキシ基を分子内に２ヶ以上導入された化合物がＣＭキチンとともに使用可能である。
【００２９】
なお、架橋剤の使用に当たっては注意が必要である。というのは、架橋剤を添加することにより架橋が強くなりすぎると、分解された部分のＣＭキチンにおける上記増殖因子がＣＭキチンから簡単に離脱しない状態となる。このため、骨修復材の設置当初、増殖因子が作用せず、その後の新生骨の形成が緩慢となってしまう恐れがある。そのため、架橋剤は、ガンマ線照射でＣＭキチンが充分架橋させることができない場合に行い、その添加量も必要最低限とすることが好ましい。
【００３０】
しかも、架橋剤であるエポキシ化合物の添加量はＣＭキチンの重量に対して３０％以下に抑える必要がある。エポキシ化合物の添加量が３０％を越えると強度が低下し、同時に、生体が異物反応を起こす可能性があるためである。
【００３１】
上記ガンマ線の照射線量は、０．１〜５．０Ｍｒａｄの範囲で選択されうる。
【００３２】
０．１Ｍｒａｄ未満では、架橋が不十分であり、ゲル状物にならない。５．０Ｍｒａｄより多く照射すると、ガンマ線によりＣＭキチン主鎖の変性とともに、ＣＭキチンが分解され低分子化が促進されるため、ゲル状態を保つことができない。
【００３３】
また、このゲル状物を、さらに凍結乾燥することにより骨修復材をスポンジ状物とすることができる。
【００３４】
【実施例１〜５】
カルボキシルメチルキチンを蒸留水に１，５，１０，２０，３０ｗｔ％の各濃度で溶解させた。各溶液に１０ｐｐｍの割合で増殖因子の一種であるｒｈ−ＢＭＰ−２を添加後、攪拌し、ガンマ線を照射してゲル状物の骨修復材を得た。
【００３５】
【実施例６】
カルボキシルメチルキチンを蒸留水に５ｗｔ％の濃度で溶解させた。調整された溶液に１０ｐｐｍの割合でｒｈ−ＢＭＰ−２を添加後、攪拌し、ガンマ線を照射して架橋した。その後、−８０℃で凍結後、凍結乾燥を行うことにより、スポンジ状の骨修復材を得た。
【００３６】
【実施例７】
カルボキシルメチルキチンを蒸留水に５ｗｔ％の濃度で溶解させた。調整された溶液に０．２５ｗｔ％の割合でポリエチレングリコールジグリシジルエーテルを、そして１０ｐｐｍの割合でｒｈ−ＢＭＰ−２を添加後、攪拌し、ガンマ線を照射して架橋してゲル状物の骨修復材を得た。
【００３７】
【実験例】
実施例１〜７の骨修復材を家兎脛骨骨幹部に形成した骨欠損部に埋入して、経時的な修復状態を観察した。
【００３８】
その他、骨修復材の物性は、メスでトリミングを行った時の目視観察により成形性(崩壊性)を確認し、圧縮方向の歪みが０．５になるまで圧縮した後、荷重を除いたときの変位の復帰状況により柔軟性を確認した。
上記実験例の結果を表１に示した。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１から明らかなように、動物実験で確認された骨形成の面では、ＣＭキチン濃度が上昇すると骨形成不全を引き起こす傾向が見られ、低濃度の方が有利であることが分かった。他方、骨修復材の物性面（成形性または柔軟性）では、逆にＣＭキチン濃度が低いゲル状物の骨修復材は不利であった。
【００４１】
スポンジ状の骨修復材（実施例６）も物性面では不利であったが、骨形成では有利であり、化学架橋剤を使用したゲル状物の骨修復材（実施例７）では物性面では優れていたが、骨形成の面で若干不利になる傾向が見られた。
【００４２】
以上、本発明の実施形態を例示したが、本発明はこれら実施形態に限定されるものではなく、発明の目的を逸脱しない限り任意の形態とすることができることは言うまでもない。
【００４３】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、増殖因子を加えたカルボキシルメチルキチン溶液にガンマ線照射することにより骨修復材を製造するので、ガンマ線照射によりカルボキシルメチルキチンのカルボキシメチル基及び水酸基が架橋されゲル状物を形成する。したがって、高温加熱処理しないので、増殖因子が変性や分解してしまうことがない。
【００４４】
さらに、この骨修復材の製造方法は、上記従来技術のようにイオン化放射線反応性化合物との共有結合物を形成したり、必ずしも生体に安全であるとは言いきれない種類の架橋剤を使用する必要がないので、簡便かつ安全である。
【００４５】
また、この方法により得られる骨修復材は、カルボキシルメチルキチン架橋体内に増殖因子が固定されたものとなる。そして、骨欠損部に充填されたかかる骨修復材において、増殖因子が内部から外部に短期間で漏出するのではなく、カルボキシルメチルキチンが分解吸収されていく過程で、分解された部分のカルボキシルメチルキチンから増殖因子が除放される。これらの増殖因子が、周囲に存在する未分化間葉系細胞や繊維芽細胞を骨芽細胞に分化させ新生骨を生成する。
【００４６】
このとき、上記カルボキシルメチルキチン架橋体の生体内での分解速度が新生骨の生成速度と非常によくマッチングするので、骨欠損部の骨修復に十分な量の骨が形成される。
【００４７】
なお、上記カルボキシルメチルキチン架橋体がゲル状に維持されている場合、ゲル化物はスポンジ状物よりも崩壊しにくいので取り扱いが容易である。
【００４８】
また、上記骨修復材の製造方法において、上記ガンマ線照射後に凍結乾燥処理を行う場合、得られる骨修復材はスポンジ状物となる。このスポンジ状物は、多孔部分に骨芽細胞等を貯留できるので、新生骨の形成が活発となる。
【００４９】
さらに、上記骨修復材の製造方法において、エポキシ基が１分子内に２ケ以上に導入された化合物を上記カルボキシルメチルキチン溶液に添加する場合、ガンマ線架橋の架橋効率を向上させることができる。このとき、未反応のエポキシ残基が不活性化されるので、上記エポキシ系架橋剤は生体に害を与えにくい。