(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板上の流路とを備える光学分析用チップであって、前記流路には、試料導入部と、観測部と、前記試料導入部と観測部の間の、測定対象物質を吸着する吸着領域を含むことを特徴とする光学分析用チップ。
【請求項２】
前記流路が多孔質膜であることを特徴とする請求項１に記載の光学分析用チップ。
【請求項３】
試料導入部から観測部へ、吸着領域を迂回する流路をさらに含み、この迂回する流路を通る試料が、吸着領域を通る試料よりも多くの時間をかけて観測部に到達することを特徴とする請求項１または２に記載の光学分析用チップ。
【請求項４】
前記迂回する流路が多孔質膜であることを特徴とする請求項３に記載の光学分析用チップ。
【請求項５】
前記観測部には、少なくとも測定対象物質を検出する測定領域と、参照領域とを含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【請求項６】
前記測定領域に、抗体、抗原、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、シクロデキストリン修飾物、または、天然若しくは合成環状化合物であってイオノフォアとして機能する材料が固定化されていることを特徴とする請求項５に記載の光学分析用チップ。
【請求項７】
前記吸着領域が、吸着剤として、プロテインＡ、デキストランまたはその修飾物、有機被膜を有するシリカ、または有機被膜を有するアルミナを含むことを特徴とする請求項５に記載の光学分析用チップ。
【請求項８】
前記基板と前記流路の間に金属薄膜をさらに有することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【請求項９】
測定光に対して透明な基板と、
この基板の表面に接合されるチップ本体と、
このチップ本体に形成されて測定液体を導入するための導入ポートと、
この導入ポートから導入された測定液体が導かれる第１の流路と、
この第１の流路の、前記基板と前記チップ本体との間に配置され、測定光が照射される観測部と、
前記観測部に位置し、前記第１の流路の壁面に設けられた金属薄膜層と、
前記第１の流路から分岐して前記観測部よりも上流側で再び当該第１の流路に合流する第２の流路と、
この第２の流路との分岐部分および合流部分との間に位置し、前記第１の流路内に組み込まれた、測定液体に含まれる所定の成分を捕捉するための吸着領域と、
測定液体が前記分岐部分から前記第２の流路を通って前記観測部に達するよりも早く、前記分岐部分から前記第１の流路を通って前記観測部に達するように、前記観測部に到達するまでの時間に差を生じさせる手段と
を具えたことを特徴とする光学分析用チップ。
【請求項１０】
前記チップ本体に組み込まれて前記観測部よりも下流側の前記第１の流路に接続し、前記観測部を通過した測定液体を吸収する液体吸収保持部をさらに具えたことを特徴とする請求項９に記載の光学分析用チップ。
【請求項１１】
前記観測部には、少なくとも測定対象物質を検出する測定領域と、参照領域とを含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の光学分析用チップ。
【請求項１２】
前記測定領域に到達するまでの時間に差を生じさせる手段が、前記第２の流路の壁面に形成された親水性処理層であることを特徴とする請求項９から１１のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【請求項１３】
前記測定領域に到達するまでの時間に差を生じさせる手段が、前記第２の流路に臨む前記基板の表面から前記第２の流路内に突出する少なくとも１つの流路抵抗増大ブロックであることを特徴とする請求項９から１１のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【請求項１４】
前記測定領域に到達するまでの時間に差を生じさせる手段が、前記分岐部分から前記合流部分に至る前記第１の流路の容積よりも前記第２の流路の容積を大きく設定したことであることを特徴とする請求項９から１１のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【請求項１５】
前記測定領域に到達するまでの時間に差を生じさせる手段が、前記第２の流路の途中に設けられた測定液体を貯溜する液溜め部であることを特徴とする請求項９から１１のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【請求項１６】
前記第１の流路の測定領域には、分子選択性材料が固定されていることを特徴とする請求項１１に記載の光学分析用チップ。
【請求項１７】
前記分子選択性材料が抗体、抗原、酵素、オリゴヌクレオシド、リボヌクレオシド、およびシクロデキストリン修飾化合物からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１６に記載の光学分析用チップ。
【請求項１８】
前記吸着領域がプロテインＡを修飾剤とするデキストランゲル、有機膜被覆シリカ、および有機膜被覆アルミナから選択される少なくとも１つの吸着剤を含むことを特徴とする請求項９に記載の光学分析用チップ。
【請求項１９】
基板と、該基板上の金属薄膜と、該金属箔膜上の観測部とを含む光学分析用チップであって、該観測部には、測定領域と参照領域が設けられており、前記測定領域には特定の分子と選択的に相互作用する第１の分子選択性物質が固定化され、前記参照領域には前記第１の分子選択性物質が相互作用する特定の分子に対する選択性のみが異なる第２の分子選択性物質が固定化され、前記第１の分子選択性物質と第２の分子選択性物質は、同じ方法で基板上に固定化されることを特徴とする光学分析用チップ。
【請求項２０】
前記測定領域には特定の分子と選択的に相互作用する第１の分子選択性物質が固定化され、前記参照領域には前記第１の分子選択性物質が相互作用する特定の分子に対する選択性のみが異なる第２の分子選択性物質が固定化され、前記第１の分子選択性物質と第２の分子選択性物質は、同じ方法で基板上に固定化されることを特徴とする請求項５または１１に記載の光学分析用チップ。
【請求項２１】
前記第１の分子選択性物質および前記第２の分子選択性物質が、抗体または抗原であり、かつ、同一の系統であることを特徴とする請求項１９または２０に記載の光学分析用チップ。
【請求項２２】
前記第２の分子選択性物質が第１の分子選択性物質を不活性化したものであり、不活性化が、Ｘ線、γ線または電子線から選択される高エネルギー線の照射、熱処理、電気化学的酸化若しくは還元、または、酸性若しくはアルカリ性の緩衝液との接触により実現されることを特徴とする請求項１９または２０に記載の光学分析用チップ。
【請求項２３】
前記第１の分子選択性物質および前記第２の分子選択性物質が、ＤＮＡであり、かつ、前記第２の分子選択性物質が前記第１の分子選択性物質を構成する塩基の１０％以下の塩基が置換されたものであることを特徴とする請求項１９または２０に記載の光学分析用チップ。
【請求項２４】
前記測定領域および前記参照領域を１組とする観測部が基板上の流路内に複数設けられており、各観測部の測定領域には互いに異なる第１の分子選択性物質が固定化されており、観測部がそれぞれ異なる分子を検出できることを特徴とする請求項５、１１または１９のいずれか１項に記載の光学分析用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学分析用チップに関する。特に、本発明は、液体サンプルを扱う光学的センサであって、測定対象となる液体中の生体関連物質、環境汚染物質、または健康影響物質のような化学物質を選択的に測定するものに用いることができる分析用チップに関する。本発明の分析用チップは、分子選択性物質を用いることができる。また、本発明の分析用チップは、夾雑物を含む実サンプルを測定するものであり、測定の際の測定感度を高め、高精度化したものである。本発明の分析用チップは、測定の際の測定操作の簡易化と、測定の際の測定感度を高め、高精度化することを目的としたものである。
【背景技術】
【０００２】
液体サンプル中の化学物質を測定する方法としては、例えば、分子選択性物質を予め固定化しておき、そこへ液体サンプルを流して、結合する分子を選択的に検出する電気学的測定方法および光学的測定方法がある。【０００３】
光学的方法では、蛍光物質や吸光物質を予め固定化しておいたプローブ分子を用いる手法がある。この他には、分子と固定化された分子選択性物質との結合を直接観察することができる全反射光学系を用いる方法がある。この方法は、励起されるエバネッセント波をプローブ光として用い、表面近傍での結合を直接的かつ高感度に測定する方法として知られている。全反射光学系の中でもよく用いられるのは、基板表面に形成された金属薄膜の全反射により励起される表面プラズモンがサンプルにより吸収されるのを利用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法と、基板表面とサンプルとの屈折率差による全反射により励起されるエバネッセント波がサンプルにより吸収されるのを利用する減衰全反射型測定法である。【０００４】
全反射光学系で液体サンプルを測定するためには、基板上に流路を形成し、その流路内に予めプローブ分子を固定しておくか、または、プローブ分子を固定化した上に流路を形成する手段がとられる。そして、この流路に液体サンプルを通過させ、固定化プローブ分子とサンプル中の測定対象物質の相互作用に基づいて、上記の全反射光学系を用いてサンプル中に測定対象物質が含まれているかどうかの測定、さらには測定対象物質の定量を行うことができる（例えば、前記流路に照射した測定光の反射光の状態から、液体中に特定の化学物質がどの程度含まれているか否かを測定することができる。）。【０００５】
さらに、全反射光学系と分子選択性物質を用いた測定は、クロマトグラフィーに代表される高コスト、高精度、かつ高感度な分析に比べ、現場試験にも適した低コストで短時間のスクリーニングに適していると考えられる。全反射光学測定を実施する簡易装置は、例えば特許文献１に記載されており、既に開発されている。【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２１４１３１号公報
【発明の開示】
【０００７】
光学測定において高感度な分析を実施するには、測定対象物を含まないリファレンスとなる参照サンプルを用意することが求められる。測定対象物質を含む実サンプルに対するリファレンスとして、測定対象物質を含まないサンプルを別途調製することも可能ではあるが、実サンプルそのものから測定対象物質を除去したものが、リファレンスとして理想的であると考えられる。このような観点から、実サンプルから測定対象物質を除去した参照サンプルを準備し、これをリファレンスとして用いることも行われている。しかし、この参照サンプルの作製について、煩雑な前処理操作が必要な場合があり、オンサイトあるいは簡易測定としては、このような前処理操作の必要性は好ましくない。
【０００８】
また、例えば、血清、血液、尿、その他の動物の体液、環境水、植物からの採取液のような、実際に測定するサンプルが液体サンプルである場合、このような液体サンプルには、測定対象物質以外の多くの夾雑物が存在している。全反射光学測定を実施する場合、このような夾雑物の影響を除去して選択的に測定対象物質を検出する必要が生じる。オンサイトでの測定を考慮した場合、このような夾雑物の除去処理も好ましいことではない。
【０００９】
上述のような、基板上に予めプローブ分子を固定化した全反射光学系による測定では、測定領域の設けられている基板上の空間に多くの夾雑物が吸着または蓄積するという問題がある。このような夾雑物の吸着による蓄積がある場合、従来では、プローブ分子を固定化していない領域を参照領域とし、測定領域と参照領域との差分測定を実施することにより、プローブ分子による反応以外の変化を差し引き、夾雑物の影響をある程度抑えていた。しかし、低濃度の測定対象物の検出を目的とする場合、プローブ分子が存在しない参照領域における夾雑物の吸着や蓄積が測定領域における吸着や蓄積と異なることが多かった。このため、参照領域と測定領域の差分をとっても、夾雑物の影響を除去できず、測定におけるベースラインが変化し、検出されるべき信号よりもベースラインが大きく変化してしまうという問題があった。
【００１０】
さらに、表面プラズモン共鳴測定法においては試料の屈折率の変化量を共鳴角度の変化から読み取る装置が一般的に用いられているが、液体である試料の屈折率は気体より大きく、試料の導入前後でその共鳴角度が１５〜２０度程度も変化する場合がある。このような大きな共鳴角度の変化は、可動式の検出系を持った研究室用の分析装置であれば検出可能であるが、可動部分を持たない簡易装置においては、試料が導入されていない状態での共鳴角度を検出することが不可能であり、信号が得られない状態となってしまう。逆に、可動式の検出系を持ったものであっても、その検出動作に時間が掛かってしまうことから、素早い測定ができないという問題もある。
【００１１】
本発明の目的は、測定液体から基準となる基準試料を調製して測定液体中における測定対象物の含有状態を極めて容易かつ簡便に行い得る光学分析用チップを提供することにある。
【００１２】
また、本発明は、実サンプルを分析用チップに投入するだけで、測定対象物質を除去した参照サンプルが調製できると共に、実サンプル中の測定対象物の選択的検出を可能にする光学分析用チップを提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、基板上に固定化されたプローブ分子と測定対象物質との相互作用に基づいて、測定対象物質を検出する測定法、例えば全反射光学系を用いた測定法において、測定領域と参照領域への夾雑物の吸着や蓄積の差から生じるシグナルノイズを抑えることができる分析用チップを提供することを目的とする。本発明の分析用チップにより夾雑物を多く含む液体サンプルを測定した場合でも、全反射光学系を用いた測定の高感度化および高精度化が達成できる。
【００１４】
本発明は光学分析用チップに関する。第１の実施形態の光学分析用チップは、基板と、該基板上の流路とを備える光学分析用チップであって、前記流路には、試料導入部と、観測部と、前記試料導入部と観測部の間の、測定対象物質を吸着する吸着領域を含む。前記流路は、多孔質膜であってもよい。
【００１５】
さらに、上記の光学分析用チップは、試料導入部から観測部へ、吸着領域を迂回する流路をさらに含むことができる。この迂回する流路は、多孔質であってもよい。また、この迂回する流路を通る試料が、吸着領域を通る試料よりも多くの時間をかけて観測部に到達することができる。本発明の光学分析用チップでは、前記観測部に、少なくとも測定対象物質を検出する測定領域と、参照領域とを含むことができる。
【００１６】
前記測定領域に、抗体、抗原、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、シクロデキストリン修飾物、または、天然若しくは合成環状化合物であってイオノフォアとして機能する材料が固定化させることができる。
【００１７】
前記吸着領域は、吸着剤として、プロテインＡ、デキストランまたはその修飾物、有機被膜を有するシリカ、または有機被膜を有するアルミナを含むことができる。
【００１８】
上記の光学分析用チップには、基板と前記流路の間に金属薄膜をさらに有することができる。
【００１９】
別の実施形態の光学分析用チップは、測定光に対して透明な基板と、この基板の表面に接合されるチップ本体と、このチップ本体に形成されて測定液体を導入するための導入ポートと、この導入ポートから導入された測定液体が導かれる第１の流路と、この第１の流路の、前記基板と前記チップ本体との間に配置され、測定光が照射される観測部と、前記観測部に位置し、前記第１の流路の壁面に設けられた金属薄膜層と、前記第１の流路から分岐して前記観測部よりも上流側で再び当該第１の流路に合流する第２の流路と、この第２の流路との分岐部分および合流部分との間に位置し、前記第１の流路内に組み込まれた、測定液体に含まれる所定の成分を捕捉するための吸着領域と、測定液体が前記分岐部分から前記第２の流路を通って前記観測部に達するよりも早く、前記分岐部分から前記第１の流路を通って前記観測部に達するように、前記観測部に到達するまでの時間に差を生じさせる手段と、を具える。
【００２０】
このチップ本体は、これに組み込まれて前記観測部よりも下流側の前記第１の流路に接続し、前記観測部を通過した測定液体を吸収する液体吸収保持部をさらに具えることができる。
【００２１】
前記観測部には、少なくとも測定対象物質を検出する測定領域と、参照領域とを含むことができる。
【００２２】
この実施形態の光学分析用チップでは、前記測定領域に到達するまでの時間に差を生じさせる手段が、（ａ）前記第２の流路の壁面に形成された親水性処理層、（ｂ）前記第２の流路に臨む前記基板の表面から前記第２の流路内に突出する少なくとも１つの流路抵抗増大ブロック、（ｃ）前記分岐部分から前記合流部分に至る前記第１の流路の容積よりも前記第２の流路の容積を大きく設定したこと、または（ｄ）前記第２の流路の途中に設けられた測定液体を貯溜する液溜め部であってよい。
【００２３】
また、この実施形態の光学分析用チップは、第１の流路の測定領域には、分子選択性材料が固定されてもよい。前記分子選択性材料は、抗体、抗原、酵素、オリゴヌクレオシド、リボヌクレオシド、およびシクロデキストリン修飾化合物からなる群から選択される少なくとも１つを含むことができる。また、この実施形態の光学分析用チップは、前記吸着領域はプロテインＡを修飾剤とするデキストランゲル、有機膜被覆シリカ、および有機膜被覆アルミナから選択される少なくとも１つの吸着剤を含むことができる。
【００２４】
上記の各実施形態の光学分析用チップでは、前記測定領域には特定の分子と選択的に相互作用する第１の分子選択性物質が固定化され、前記参照領域には前記第１の分子選択性物質が相互作用する特定の分子に対する選択性のみが異なり、他の特性は前記第１の分子選択性物質と同等である第２の分子選択性物質が固定化され、前記第１の分子選択性物質と第２の分子選択性物質は、同じ方法で基板上に固定化されることができる。
【００２５】
本発明の別の実施形態の光学分析用チップは、基板と、該基板上の金属薄膜と、該金属箔膜上の観測部とを含む分析用チップであって、該観測部には、測定領域と参照領域が設けられており、前記測定領域には特定の分子と選択的に相互作用する第１の分子選択性物質が固定化され、前記参照領域には前記第１の分子選択性物質が相互作用する特定の分子に対する選択性のみが異なり、他の特性は前記第１の分子選択性物質と同等である第２の分子選択性物質が固定化され、前記第１の分子選択性物質と第２の分子選択性物質は、同じ方法で基板上に固定化される。
【００２６】
本発明の上記各実施形態の光学分析用チップでは、前記第１の分子選択性物質および前記第２の分子選択性物質が、抗体または抗原であり、かつ、同一の系統であることが好ましい。前記第２の分子選択性物質が第１の分子選択性物質を不活性化したものであり、不活性化が、Ｘ線、γ線または電子線から選択される高エネルギー線の照射、熱処理、電気化学的酸化若しくは還元、または、酸性若しくはアルカリ性の緩衝液との接触により実現されることが好ましい。また、前記第１の分子選択性物質および前記第２の分子選択性物質が、ＤＮＡであり、かつ、前記第２の分子選択性物質が前記第１の分子選択性物質を構成する塩基の１０％以下の塩基が置換されたものであることが好ましい。
【００２７】
本発明の上記各実施形態の光学分析用チップでは、前記測定領域および前記参照領域を１組とする観測部が基板上の流路内に複数設けられており、各観測部の測定領域には互いに異なる第１の分子選択性物質が固定化されており、観測部がそれぞれ異なる分子を検出できる。
【００２８】
本発明による光学分析用チップは、測定対象物質を含む液体サンプルを試料導入部に投入するだけで、測定対象物質を除いた参照サンプルを調製でき、この参照サンプルと測定対象物質が含まれる実サンプルを測定することが可能となる。さらに、本発明によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イオン、アミノ酸、ペプチドのセンシングを高感度かつ簡易に実施できるようになる。
【００２９】
本発明の光学分析用チップによると、測定液体が分岐部分から第２の流路を通って観測部に達するよりも早く、分岐部分から第１の流路を通って観測部に達するようにさせる手段を具えているので、フィルタを通過した基準試料が最初に観測部に到達することとなる。このため、簡易的な表面プラズモン共鳴測定装置を用いた場合であっても、測定値の基準となる信号を最初に得ることができ、その後第２の流路を通った測定液体が観測部に到達することで、測定液体の正確な分析を行うことができる。本発明の光学分析用チップには、観測部に測定領域と参照領域を設けることができる。このような構成とすることで、測定液体を導入ポートから第１の流路に供給するだけで基準試料の調製がなされ、しかも測定領域に固定された分子選択性材料と測定対象物との相互作用に基づく測定対象物の検出および定量が可能である。
【００３０】
本発明によれば、多くの夾雑物を含む実サンプルの測定時に起こるベースラインの変化を小さく抑えることができ、多くの夾雑物を含むサンプル中の少量の測定対象物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明による光学分析用チップを用いる表面プラズモン共鳴測定装置の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の一実施形態の光学分析用チップを示す平面概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の一実施形態の光学分析用チップを示す断面概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の別の実施形態の光学分析用チップを示す平面概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の別の実施形態の光学分析用チップを示す断面概略図である。
【図４】図４は、（ａ）〜（ｅ）は本発明の光学分析用チップの製造工程を示す図である。
【図５】図５は、（ａ）〜（ｄ）は本発明の光学分析用チップの製造工程を示す図である。
【図６】図６は、流路上の＊の位置に到達した溶液中の測定対象物質の時間的変化を示す図である。
【図７】図７は、ライン１〜３の位置における、測定された信号の強度の時間的変化を示す図である。
【図８】図８は、本発明による光学分析用チップの一実施形態の断面図である。
【図９】図９は、図８中のＩＸ−ＩＸ矢視断面図である。
【図１０】図１０は、図８中のＸ−Ｘ矢視断面図である。
【図１１】図１１は、図８に示した光学分析用チップの測定領域の部分を透視した状態で抽出拡大した立体投影図である。
【図１２】図１２は、図８に示した光学分析用チップを用いた測定結果を電流値の変化として模式的に示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明による光学分析用チップの他の実施形態において、第２の流路の一部を透視した状態で抽出拡大した立体投影図である。
【図１４】図１４は、本発明による光学分析用チップの別な実施形態の断面図である。
【図１５】図１５は、図１４中のＸＶ−ＸＶ矢視断面図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本発明の光学分析用チップの一実施形態を示す平面概略図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本発明の光学分析用チップの一実施形態を示す断面概略図である。
【図１７】図１７は、本発明の光学分析用チップの別の実施形態を示す概略図である。
【図１８】図１８は、（ａ）〜（ｄ）は、図１６に示す光学分析用チップの製造工程を説明するための図である。
【図１９】図１９は、（ａ）〜（ｄ）は、図１６に相当する光学分析用チップの別の製造工程を説明するための図である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、図１９の参照領域の分子選択性物質の不活化に使用する電気化学的装置の概略図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、本発明の光学分析用チップを示す概略図である。
【図２１】図２１は、光学分析用チップにフローセルを設置した場合の概略図である。
【図２２】図２２は、光学分析用チップの測定領域および参照領域の表面プラズモン共鳴を測定した場合の共鳴角度とシグナル強度の関係を示すグラフである。
【図２３】図２３は、光学分析用チップＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶについて、表面プラズモン共鳴を測定した場合の、時間対｛θ（測定領域）−θ（参照領域）｝の関係を示すグラフである。
【図２４】図２４は、光学分析用チップＩについて、表面プラズモン共鳴を測定した場合の、時間対｛θ（測定領域）−θ（参照領域）｝の関係を、抗原への応答結果と、ベースラインについて示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明による光学分析用チップを表面プラズモン共鳴測定装置による液体試料の分析に応用した実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、本発明はこれらの実施形態のみに限らず、これらをさらに組み合わせたり、特許請求の範囲に記載された本発明の概念に包含されるあらゆる変更や修正が可能である。つまり、本発明はその精神に帰属する他の任意の技術にも当然応用することができるものであることに留意されたい。例えば、表面プラズモン共鳴測定装置のみならず、分子選択性材料をプローブ分子として全反射形の光学測定系を用いたセンシング、例えば紫外光、可視光、赤外光を用いた減衰全反射型測定法や、全反射光励起を用いた吸光／発光分析などにも適用可能である。【００３３】
表面プラズモン共鳴測定装置の概念を図１に示す。表面プラズモン共鳴測定装置１は、光学分析用チップ１０の測定領域に向けて測定光Ｌｍを照射する光源２と、光学分析用チップ１０がマッチングオイルを介して重ね合わされる半円柱状をなす集光レンズ（シリンドリカルプリズム）３と、光学分析用チップ１０の測定領域にて反射した反射光Ｌｒを検出する光検出器４と、この光検出器４によって検出された信号を処理する図示しない信号処理部とを有する。【００３４】
光源２からの光は、集光レンズ３によって線状に集束され、光学分析用チップ１０の測定領域に照射される。集光レンズ３と光源２あるいは検出器４とのいずれかの間に偏光子（図示せず）が入れられ、ｐ偏光成分のみを検出する。その反射光Ｌｒが再び集光レンズ３を通って光検出器４に導かれるようになっており、信号処理部（図示せず）にてその信号が処理されて光学分析用チップ１０に供給された測定液体の分析が行われる。図１に示す光学分析用チップ１０は、基板１１と、この基板１１の表面に接合されるチップ本体１２とから構成される。【００３５】
上述のような光学分析用チップについて以下に詳細に説明する。本発明の光学分析用チップは、以下のような態様に分類できる。【００３６】
（１）光学分析用チップの流路の試料導入部と観測部の間に吸着領域（フィルタ領域）を設ける。これにより、最初は測定対象物が吸着領域で吸着され、参照サンプルが観測部に到達する。次いで、吸着領域が測定対象物で飽和されるか、あるいは、測定対象物の吸着を停止させると、測定対象物を含む試料が観測部に到達し、測定対象物の観測を行うことができる。【００３７】
（２）光学分析用チップの流路（主流路）に迂回路を設け、主流路と迂回路を通る試料に時間差を生じさせる。この態様では、さらに、主流路に吸着領域（フィルタ領域）を設けることが好ましい。この態様では、測定対象物は主流路の吸着領域で吸着され、参照サンプルが観測部に到達する。一方、迂回路には、測定対象物を含む試料が流れ、主流路を流れる参照サンプルよりも遅れて試料が観測部に到達する。【００３８】
（３）光学分析用チップの観測部において、測定領域と参照領域を設ける。この態様では、測定領域には、分子選択性物質を固定し、参照領域には分子選択性がなく、他の特性は測定領域に固定される分子選択性物質と同等な物質を固定する。この態様では、測定領域と参照領域に同時に夾雑物を含むサンプル液が流れ、夾雑物が測定領域および参照領域に同時に吸着されたり蓄積されたりする。その結果、測定領域および参照領域の差分を測定すると、夾雑物の吸着や蓄積の影響が相殺され、測定上のベースラインの変化を小さく抑えることができる。【００３９】
本発明では、上記（１）〜（３）の態様を個別に、または、２以上組み合わせて実施することができる。【００４０】
以下に、本発明の第１の実施形態および第２の実施形態に係る光学分析用チップについて説明する。第１の実施形態は、上記（１）および（３）の組み合わせの態様に相当する。また、第２の実施形態は、吸着領域を設けた場合の上記（２）および（３）の組み合わせの態様の態様に相当する。【００４１】
第１の実施形態に係る光学分析用チップは、基板と、該基板上の多孔質膜からなる流路とを備える光学分析用チップであって、前記流路には、試料導入部と、観測部と、前記試料導入部と観測部の間の、測定対象物質を吸着する吸着領域を含み、前記観測部には、少なくとも測定対象物質を検出する測定領域と、参照領域とを含む。【００４２】
また、第２の実施形態に係る光学分析用チップは、試料導入部から観測部へ、吸着領域を迂回する流路をさらに含み、この迂回する流路を通る試料が、吸着領域を通る試料よりも多くの時間をかけて観測部に到達するようにしたものである。【００４３】
以下に、これらの本発明を図面を参照しながら説明する。【００４４】
Ａおよび図２Ｂは、本発明の第１の実施形態に対応する光学分析用チップ１００を示す図である。図２Ａはその平面図であり、図２ＢはそのＩＩＢ−ＩＩＢ断面図である。【００４５】
本発明の光学分析用チップは、基板１０２上に、多孔質膜から成る流路１０４が設けられている。この流路の一端には、サンプルを滴下する試料導入部１０６が設けられている。なお、試料導入部は、液体サンプルを滴下できる構造であればどのようなものでもよく、流路の他の領域と区別できる明確な領域として形成される必要はない。従って、流路と同じ材料から形成されることが好ましい。また、流路には、ライン１から３（１１４、１１２、１１０）からなる観測部１１６が含まれる。観測部１１６は、ライン１および２（１１４、１１２）からなる参照領域１１８と、測定対象物質を検出するための測定領域（図２Ａおよび図２Ｂの場合、１１０）を含む。なお、図２Ａおよび図２Ｂでは、参照領域に２種類のラインを設ける例を示したが、ラインは１種類であってもよい。さらに流路は、試料導入部と観測部の間に、測定対象物質を吸着する吸着領域１０８が設けられる。吸着領域に固定される吸着剤は、測定対象物質を選択的に吸着してもよく、または、測定対象物質を含む複数の物質を吸着してもよい。【００４６】
測定領域には、測定対象物質に対して選択的に結合する分子選択性物質を固定化する。具体的には、抗体、抗原、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、シクロデキストリン修飾物、または、天然若しくは合成環状化合物であってイオノフォアとして機能する材料を挙げることができる。例えば、ヒトＩｇＧ抗原を検出する場合には、抗ヒトＩｇＧを固定化すればよい。【００４７】
参照領域には、測定対象物質とは結合しないが、分子選択性物質に類似の参照物質を固定化する。例えば、測定領域に固定化した分子選択性物質と測定対象物質との相互作用が異なる参照物質を固定化すればよい。具体的には、例えば、抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ）を測定領域に固定化した場合、この抗体と起源若しくは種が異なる抗体（例えば、抗ヤギＩｇＧ）を参照領域に固定化すればよい。なお、図２Ａおよび図２Ｂに示したように参照領域に２つのラインを設ける場合には、その１つに上記のような参照物質を固定化し、他方にブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン）のような、分子選択性物質および参照物質を含まない材料からなる部分を形成することが好ましい。このようにすることで、測定領域および参照物質を固定化した領域にもブロッキング剤を適用したような場合に、より高精度の検出が可能となる。【００４８】
参照領域に１種類のラインのみを設ける場合、ラインには、上記のように参照物質を固定化してもよく、分子選択性物質および参照物質を含まないラインとしてもよい。【００４９】
吸着領域には、吸着剤として測定対象物質を吸着できる材料を固定化する。例えば、プロテインＡ、デキストランまたはその修飾物、例えばプロテインＡを修飾剤とするデキストランゲル、修飾デキストランの微粒子など、有機被膜を有するシリカ、有機被膜を有するアルミナなどの測定対象物質を吸着できる材料を用いる。なお、吸着剤は、測定対象物質を含む複数の物質を吸着してもよい。【００５０】
流路に使用する材料は、液体サンプルが、試料導入部から観測部へ吸引などの特別な操作を用いなくても移動することができる、多孔質膜を形成できるものであれば特に限定されない。例えば、セルロース、またはセルロースアセテート、ニトロセルロースのようなセルロース誘導体を用いることができる。【００５１】
基板は、光学分析用チップを装着する測定装置（例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置）で使用する光に対して透明である材料であれば特に限定されることなく、いずれの材料も用いることができる。例えば、ガラス基板、プラスチック基板などを用いることができる。【００５２】
図２Ａおよび図２Ｂには図示していないが、本発明の光学分析用チップは、基板と流路の間に金属薄膜を含むことが好ましい。金属薄膜は例えば、金のような材料を用いることができる。金薄膜のような金属薄膜を設けることで、本発明の光学分析用チップを表面プラズモン共鳴装置用の分析チップとして使用することができる。【００５３】
第１の実施形態の光学分析用チップについて、その動作を説明する。測定対象物質を含む液体サンプルを試料導入部から光学分析用チップに導入すると、流路を形成する多孔質材料の毛管現象により、液体サンプルは流路に沿って観測部の方向へ流れる。液体サンプルが流れると、まず、吸着剤の存在する吸着領域へ液体サンプルが到達する。吸着領域には、測定対象物質を吸着する吸着剤が含まれているため、測定対象物質が吸着され、その他の物質は観測領域へ流れる。ここで、観測領域へ流れる液体サンプルは、測定対象物質を含まないものとなっているので、リファレンス用サンプルが観測領域へ到達したことになる。【００５４】
液体サンプルをさらに流し続けると、吸着領域の吸着剤は限られた量であるため、吸着領域の吸着剤は飽和して、測定対象物質を吸着しなくなる。この状態になると、観測領域へ測定対象物質が到達することになり、測定対象物質の測定が可能となる。【００５５】
このように、第１の実施形態の光学分析用チップは、吸着領域が測定対象物質で飽和されるまでの、液体サンプルを導入した直後はリファレンス用サンプルが観測部に到達する。この液体サンプルを導入した直後のリファレンス用サンプルの測定結果が測定上のベースラインとなる。次いで時間をおいて測定対象物質を含む液体サンプルが観測部に到達し、測定対象物質の測定が行われる。【００５６】
本発明の光学分析用チップは、リファレンス用サンプルを別途調製する必要なく、測定対象物質を含む液体サンプルを光学分析用チップに投入する操作のみで、測定上のベースラインとなる信号と、測定対象物質を含むサンプルの測定信号の双方を連続して取得することが可能となる。【００５７】
次に、図３Ａおよび図３Ｂを参照して、本発明の第２の実施形態に対応する光学分析用チップ２００を説明する。図３Ａは第２の実施形態の光学分析用チップの平面図であり、図３Ｂは、図３ＡのＩＩＩＢ−ＩＩＩＢ断面図である。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、第２の実施形態の光学分析用チップは、基板２０２上に図２Ａおよび図２Ｂで説明したのと同様の主流路２０４が設けられている。主流路は、その一端に、サンプルを滴下する試料導入部２０６が設けられている。また、主流路には、ライン１から３（２１４、２１２、２１０）からなる観測部２０８が含まれる。観測部２０８は、ライン１および２（２１４、２１２）からなる参照領域２１６と、測定対象物質を検出するための測定領域（図３Ａおよび図３Ｂの場合、２１０）を含む。さらに主流路は、試料導入部と観測部の間に、測定対象物質を選択的に吸着する吸着領域２１８が設けられる。なお、図３Ａおよび図３Ｂでは、参照領域に２種類のラインを設ける例を示したが、ラインは１種類であってもよい。基板、吸着領域、観測部等の主流路の構造、材料等の特徴は、第１の実施形態で説明した通りである。【００５８】
第２の実施形態の光学分析用チップは、試料導入部から観測部へかけて、吸着領域を迂回する迂回路２２０を含む。迂回路は、多孔質膜からなり、この迂回路を通る試料が、吸着領域を通る試料よりも多くの時間をかけて観測部に到達するように配置される。この条件を満たす限り、迂回路の形状、材料等は自由である。例えば、迂回路は、図３Ａおよび３Ｂに示されるような矩形、または、後述する図８に示すようなラダー状であってもよい。本発明の光学分析用チップでは、主流路と迂回路を形成する多孔質膜材料は同じ材料を用いることが好ましい。【００５９】
本発明の光学分析用チップにおいて、多孔質膜からなる流路は、厚さ３００〜１０、０００ｎｍ（１０μｍ）、好ましくは３００〜１０００ｎｍである。また、流路の全長、測定領域および参照領域の基板上の位置などは、光学的測定法（例えば、表面プラズモン共鳴測定法）に適合するように適宜選択すればよく、このような選択は当業者が容易に行いうるものである。【００６０】
次に、第２の実施形態の光学分析用チップの動作について説明する。測定対象物質を含む液体サンプルを試料導入部から光学分析用チップに導入すると、多孔質材料の毛管現象により、液体サンプルは、主流路方向と迂回路方向へ流れる。【００６１】
主流路方向へ流れた液体サンプルは、まず、吸着剤の存在する吸着領域へ液体サンプルが到達する。吸着領域には、測定対象物質を吸着する吸着剤が含まれているため、測定対象物質が吸着され、その他の物質は観測領域へ流れる。ここで、観測領域へ流れる液体サンプルは、測定対象物質を含まないものとなっているので、リファレンス用サンプルが観測領域へ到達したことになる。【００６２】
一方、迂回路方向へ流れた液体サンプルは、吸着領域を通ることなく、直接観測部に到達するので、測定対象物質を含んだままである。また、迂回路を経由する液体サンプルは、吸着領域を通る試料（主流路を経由する試料）よりも多くの時間をかけて観測部に到達するため、主流路を経由し、測定対象物質が除去されたリファレンス用サンプルが観測部に到達するよりも後に、観測部に到達することになる。【００６３】
このように、主流路を経由した液体サンプルはリファレンス用サンプルとなり、迂回路を経由する液体サンプルは測定試料となり、主流路と迂回路を経由したそれぞれの液体サンプルは観測部に到達するのに時間差が生じるので、一回の試料の導入で、リファレンス用サンプルと測定対象物質の測定が可能となる。【００６４】
次に、本発明の光学分析用チップの製造方法について図面を参照しながら説明する。【００６５】
まず、基板３０２上に蒸着などにより、金のような金属薄膜３０４を形成する（図４（ａ））。金属薄膜は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置用であれば、５０ｎｍ程度の膜厚を有する。次に、金属薄膜上に、レジストまたはテープ３０６により、流路の形状が露出するようなパターンを作製する（図４（ｂ））。図３Ａおよび図３Ｂに示すような迂回路２２０を有する光学分析用チップの場合には、迂回路を含むパターンを形成すればよい。次に、セルロースアセテートのようなセルロース誘導体の有機溶媒溶液をスピンコート法などでコーティングし、乾燥させて有機溶媒を除去し、レジストまたはテープを除去して、流路部分３０８を形成する（図４（ｃ））。【００６６】
次に、流路の吸着領域３１０に相当する部分に、測定対象物質を吸着する吸着剤を含む溶液を適用し、吸着剤を流路に固定化させる（図４（ｄ））。吸着剤を適用する際、必要に応じて吸着領域に相当する部分を活性化してもよい。例えば、プロテインＡを吸着剤として用いる場合、カルボジイミドの水溶液を吸着領域に適用して多孔質材料を活性化しておくことが好ましい。【００６７】
次に、流路の観測部に相当する部分に、分子選択性物質および参照物質を固定化する。観測部３１２の測定領域３１４に、分子選択性物質３１６を含む溶液を滴下し、乾燥することで分子選択性物質を固定化することができる。観測部の参照領域３１８には、測定対象物質とは結合しないが、分子選択性物質に類似の参照物質３２０を含む溶液を滴下し、乾燥して、参照物質を固定化することができる（図４（ｅ））。なお、図２Ａおよび図２Ｂと同様に、参照領域に２つのライン３２２、３２４を設ける場合には、その１つに上記のようにして参照物質を固定化し、他方にブロッキング剤３２６を含む溶液を滴下し、乾燥させ、分子選択性物質および参照物質を含まない参照領域を形成することもできる。なお、ブロッキング剤を含む領域は、測定領域、および参照物質を含む参照領域に滴下して、これらの領域をブロッキングした場合に、測定条件を均質化するために設けることが好ましい。【００６８】
次に、本発明の光学分析用チップの別の製造方法について説明する。【００６９】
上述のように、基板３０２上に金属薄膜３０４を形成し、金属薄膜上に、レジストまたはテープ３０６により、流路の形状が露出するようなパターンを作製する。この際、流路の吸着領域３１０に相当する部分は露出しないようにしておく（図５（ａ））。また、図３に示すような迂回路２２０を形成する場合には、迂回路を含むパターンを形成すればよい。次に、セルロースアセテートのようなセルロース誘導体の有機溶媒溶液をスピンコート法などでコーティングし、乾燥させて有機溶媒を除去し、レジストまたはテープを除去して、吸着領域の部分で分離された流路部分４０２を形成する（図５（ｂ））。【００７０】
次に、吸着領域３１０に、測定対象物質を吸着する吸着剤を含む溶液（好ましくは、流路を形成する多孔質材料との混合溶液）を適用し、溶媒等を除去して、流路部分４０２と連結するように吸着領域を形成する（図５（ｃ））。次いで、上述のように、観測部を形成して流路３０８が形成された光学分析用チップを製造することができる（図５（ｄ））。【００７１】
本明細書で、「固定化」とは、上述のように、吸着剤、分子選択性物質、参照物質等を流路に吸着させる場合を含め、流路上に化学的または物理的に結合させることを含む。【００７２】
なお、上記の、第１および第２の実施形態の説明では、流路に多孔質膜を用いて、試料が毛管現象により移動する例を示したが、本発明はこれに限定されない。例えば、流路に多孔質膜を用ず、流路の下流部分にポンプ等の吸い上げ手段を設ける構成とすることもできる。また、上記第１の実施形態では、上記本発明の態様の（１）と（３）を組み合わせ、第２の実施形態では上記本発明の態様の（２）（吸着領域を設けた場合）と（３）を組み合わせたが、本発明はこれらに限定されない。上記本発明の態様の（１）単独、または、上記本発明の態様の（２）単独で、光学分析用チップを構成することもできる。この場合、観測部で適宜目的の物質を測定できるように構成すればよい。【００７３】
次に、上記の表面プラズモン共鳴測定装置１に用いられる別の実施形態（第３の実施形態）の光学分析用チップ１０について説明する。この光学分析用チップは、上記本発明の態様の（２）（吸着領域を設けた場合）および（３）の組み合わせに相当する。【００７４】
光学分析用チップ１０の断面構造を図８に示す。また、そのＩＸ−ＩＸ矢視断面構造およびＸ−Ｘ矢視断面構造をそれぞれ図９および図１０に示す。本実施形態における光学分析用チップ１０は、基板１１と、この基板１１の表面に接合されるチップ本体１２とを有する。本実施形態における基板１１は、縦、横、高さが例えば１０ｍｍ、１６ｍｍ、１ｍｍの薄板状をなし、測定光Ｌｍに対して透明なガラスまたはプラスチックで形成される。また、本実施形態におけるチップ本体１２は、縦、横、高さが例えば７ｍｍ、１０ｍｍ、４ｍｍの直方体形状をなし、機械加工やエッチング加工などが容易な樹脂、本実施形態ではポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を所定形状に加工したものを採用している。【００７５】
基板１１の表面には、チップ本体１２を接合した場合に図８中、二点鎖線で囲まれた観測部Ｚｍに位置する第１の流路１３に臨む約５０ｎｍの厚みの矩形パターンの金薄膜層１４（図１１参照）が蒸着法などによって形成されうる。観測部Ｚｍは基板１１のほぼ中央部に設定されることが好ましい。この金薄膜層１４の部分の外観を図１１に拡大して示す。金薄膜層１４の上の観測部には、分子選択性材料である抗体が固定されて抗体固定領域Ａ、Ｂ、Ｃを画成している。本実施形態においては、金薄膜層１４に対する抗体を含む液体の滴下量を制限することにより、第１の流路１３を横切るように３つの抗体固定領域Ａ、Ｂ、Ｃが形成されうる。本実施形態におけるこれら３つの抗体固定領域Ａ、Ｂ、Ｃは、異なる抗原に対して選択性を持つ抗ヒトＩｇＧ、抗ウサギＩｇＧ、抗ヤギＩｇＧを含むことができる。これらの抗体固定領域Ａ、Ｂ、Ｃは、対応した抗体を含む液体を金薄膜層１４の所定の抗体固定領城Ａ、Ｂ、Ｃにそれぞれ滴下し、所定時間放置した後に残留している液体を吸い取り、液体中に含まれる抗体の一部を金薄膜層１４の表面に付着させることによって形成することができる。【００７６】
一方、チップ本体１２の長手方向（図８中、左右方向）一端側の幅方向（図８中、上下方向）中央部には、排出ポートとなる０．６ｍｍ程度の貫通穴１５が形成されている。また、チップ本体１２の長手方向他端側の幅方向中央部には、第１の流路１３の一部を画成する段付き穴１６が形成されている。導入ポートとなる段付き穴１６の小径部１６ａの内径は、例えば、約０．４５ｍｍであり、後述するフィルタ１７が充填される大径部１６ｂの内径は例えば０．６ｍｍである。また、この段付き穴１６に隣接して第２の流路１８の液溜め部となる、例えば２．５ｍｍの内径の止まり穴１９がチップ本体１２の長手方向他端側の一方の隅部に形成されている。この止まり穴１９の底部と段付き穴１６の大径部１６ｂとは第２の流路１８の一部となる連通穴２０を介して連通している。つまり、連通穴２０と段付き穴１６の大径部１６ｂとの接続部が本発明における分岐部分となる。本実施形態では、連通穴２０の径および長さに比して止まり穴１９の径が非常に大きく設定されているため、この止まり穴１９から連通穴２０を穿設するためのドリルヘッドを止まり穴１９に差し込んで連通穴２０を形成することができる。これ以外の形成方法も可能であるが、加工工数が増大したり、液漏れ防止のための追加の工程が必要な場合がある。このチップ本体１２の基板１１との接合面２１には、貫通穴１５と段付き穴１６の大径部１６ｂとに連通して第１の流路１３の一部となる幅が、例えば０．５ｍｍで深さ、つまり高さが、例えば５０μｍの一直線状をなす溝２２と、一端側がこの溝２２の途中に連通すると共に他端側が止まり穴１９に連通して第２の流路１８の一部となる幅が、例えば０．３ｍｍで高さが５０μｍのラダー状の溝２３とが刻設されている。このラダー状の溝２３の末端と一直線状をなす溝２２との接続部分が２つの流路１３、１８の合流部分となり、その下流側の一直線状をなす溝２２の長手方向中央部に位置する第１の流路１３が観測部Ｚｍとなる。ラダー状の溝２３に代えて渦巻き状または迷路状の溝とすることも可能であり、基本的にこれらの形状や断面構造などは任意の選択的事項である。【００７７】
段付き穴１６の大径部１６ｂの連通穴２０との接続部分よりも第１の流路１３の下流側には、測定液体中に含まれる所定の成分を捕捉するためのフィルタ（本明細書では吸着剤とも称する）１７が充填される。本実施形態におけるフィルタ１７は、活性炭や、モルキュラーシーブや、デキストラン、セルロース、アガロース、カードランを主材料とするゲル状微粒子や、疎水性基を含む有機物で修飾されたシリカや、アルミナ微粒子などを採用することができる。このフィルタ１７は、段付き穴１６の大径部１６ｂに圧入されるグラスファイバ製の多孔質保持部材２４にて連通穴２０の入口部分を塞がないように段付き穴１６の大径部１６ｂの中央部分に保持される。【００７８】
このように作られたチップ本体１２の接合面２１にプラズマ処理を施し、先の基板１１の表面に形成された金薄膜層１４が一直線状をなす溝２２の所定位置、つまり観測部Ｚｍに位置するように、チップ本体１２の接合面２１と基板１１の表面とを重ね合わせて相互に押し付け、チップ本体１２の接合面２１を基板１１の表面に対して一体的に接合する。このようにして、段付き穴１６の小径部１６ａから大径部１６ｂ介して一直線状をなす溝２２に至る第１の流路１３と、連通穴２０から止まり穴１９を通ってラダー状の溝２３に至る第２の流路１８とを形成した光学分析用チップ１０が作製される。第１の流路１３の容積が第２の流路１８の容積よりも充分小さければ、これらの流路１３、１８の形態はどのようなものであってもよく、上述したような実施形態にのみ限定されるものではないことに注意されたい。【００７９】
図１に示した表面プラズモン共鳴測定装置を用いて測定を行う場合、光学分析用チップ１０の導入ポート、つまり段付き穴１６の小径部１６ａに図示しない測定液体供給管を接続し、図示しないマイクロシリンジポンプを用いて測定対象物となる抗原、すなわちヒトＩｇＧ（サンプルａ）、ウサギＩｇＧ（サンプルｂ）および夾雑物であるアルブミンを含む０．１モル／Ｌの濃度のリン酸緩衝液を測定液体として光学分析用チップ１０内に供給する。そして、観測部Ｚｍを通過した測定済みの測定液体を排出ポート、つまり貫通穴１５につなげた図示しない廃液管を用いて光学分析用チップ１０の外部に排出させ、その間に光源２から測定光を光学分析用チップ１０の基板１１から観測部Ｚｍに照射し、光検出器４に導かれるその反射光Ｌｒを信号処理部にて処理し、その屈折率およびその変化量を求める。この測定結果を図１２に示す。【００８０】
測定液体は、第１の流路１３からフィルタ１７を通過し、その間に抗原および夾雑物であるアルブミンがフィルタ１７に吸着されて基準試料となり、第１の流路１３の観測部Ｚｍにｔ１時に到達する。ここで検出される表面プラズモン共鳴角度の信号、つまり屈折率Ｎが測定の基準となる。次に、第２の流路１８からの夾雑物および抗原を含んだ測定液体が第１の流路１３との合流部分から第１の流路１３内に流れ込み、ｔ１時よりも遅いｔ２時に観測部Ｚｍに到達してｔ３時以降にこれらの混合比が安定状態となる。ここで、測定液体中の夾雑物および測定対象物である抗原が、観測部の抗体固定領域Ａ、Ｂ、Ｃにそれぞれ吸着する。夾雑物であるアルブミンは、３つの抗体固定領域Ａ、Ｂ、Ｃすべてに等しく吸着するが、抗原であるヒトＩｇＧおよびウサギＩｇＧはそれぞれ対応する抗体固定領域Ａ、Ｂに選択的に吸着する。この結果、抗ヤギＩｇＧが固定された抗体固定領域Ｃと、他の２つの抗体固定領域Ａ、Ｂとの差分がそれぞれヒトＩｇＧおよびウサギＩｇＧによる信号に対応した屈折率の変化量ａ、ｂとして検出される。全反射型の光学系を用いた表面修飾形式の抗原抗体反応においては、反応速度が抗原濃度と比例し、表面プラズモン共鳴角度の時間変化から測定液体中のヒトＩｇＧの定量が可能となる。つまり、屈折率の変化量ａ、ｂとして表わされる表面プラズモン共鳴角度の時間変化から、ヒトＩｇＧおよびウサギＩｇＧの定量ができる。【００８１】
第１の流路１３に組み込まれたフィルタ１７を通過しにくい、夾雑物を多く含む測定液体や粘性の高い測定液体の場合、分岐部分から第１および第２の流路１３、１８を通って観測部Ｚｍに到達するまでの時間ｔ１、ｔ２により大きな差を生じさせる必要がある。このような目的のため、第２の流路１８の壁面に親水性処理層を形成するようにしてもよい。例えば、先の実施形態におけるラダー状の溝２３の内周壁およびこれと共に第２の流路１８を画成する基板１１の表面にアミノ基を有するシランカップリング剤を塗布し、これを親水性処理層とすることができる。親水性のシランカップリング材は、これに接する第２の流路１８内のリン酸緩衝液中の水分を引き付けるような作用を持つため、第２の流路１８内のリン酸緩衝液の流動が抑制され、観測部Ｚｍに達するまでの時間ｔ２をさらに遅延させることができる。【００８２】
同様に、分岐部分から第１および第２の流路１３、１８を通って観測部Ｚｍに到達するまでの時間ｔ１、ｔ２に大きな差を生じさせる手段として、図１３に示すような第２の流路１８に臨む基板１１の表面から第２の流路１８内に突出する１つ以上の流路抵抗増大ブロック２５を所定間隔で形成したり、ランダムに形成したりすることも有効である。この実施形態における流路抵抗増大ブロック２５は、例えば、直径が５０μｍで高さが３０μｍの円柱状をなし、レジストを用いて基板１１の表面にパターン形成されている。このように、第２の流路１８内に流路抵抗増大ブロック２５を介在させることにより、第２の流路１８の抵抗を増大させることができ、観測部Ｚｍに達するまでの時間を遅延させることが可能である。【００８３】
上述した第３の実施形態では、測定後の液体を排出ポート、つまり貫通穴１５から光学分析用チップ１０の外に排出するようにしたが、光学分析用チップ１０内に保持させるようにすることも可能である。【００８４】
このような変形形態に係る光学分析用チップ１０の例を図１４および図１５に示す。図１４は断面構造を示し、図１５は図１４のＸＶ−ＸＶ矢視断面構造を示す。これらの図において、先の実施形態と同一機能の要素にはこれと同じ符号を記すに止め、重複する説明は省略する。この実施形態においては、先の貫通穴１５に代えて吸収体２６を収容する空隙部２７が第１の流路１３の末端に接続するようにチップ本体１２内に形成されている。この空隙部２７内には、液体を吸収し、保持するための、パルプやゲル状高分子のような吸収体２６が収容されている。本実施形態においては、測定流体が第１の流路１３から空隙部２７の吸収体２６に達すると、吸収体２６が測定流体を吸収し、保持するため、測定流体の供給ポンプを作動させなくても導入ポート、つまり段付き穴１６の小径部１６ａから光学分析用チップ１０内に導入された測定流体を自動的に吸引して第２の流路１８からも測定流体を吸収体２６へと導くことができる。【００８５】
なお、第３の実施形態の光学分析用チップでは、流路は細管であってよいが、この他、流路を多孔質材料で形成することもできる。多孔質材料には、第１および第２の実施形態で説明したものが含まれる。また、第３の実施形態では、上記本発明の態様の（２）（吸着領域を設けた場合）と（３）を組み合わせた例を示したが、本発明はこれに限定されない。上記本発明の態様の（２）単独で、光学分析用チップを構成することもできる。この場合、観測部で適宜目的の物質を測定できるように構成すればよい。【００８６】
上述のような第３の実施形態に係る光学分析用チップによれば、測定液体が分岐部分から第２の流路を通って観測部に達するよりも早く、分岐部分から第１の流路を通って観測部に達するようにさせる手段を具えていることによる上述の効果に加え以下のような効果を有する。【００８７】
チップ本体に組み込まれて観測部よりも下流側の第１の流路に接続し、観測部を通過した測定液体を吸収する液体吸収保持部を具えている場合、測定液体をこの光学分析用チップ内に流すための電動ポンプなどを省略することが可能となる。また、測定後の廃液が液体吸収保持部に保持されて外部に流出しないため、後処理が容易となる。【００８８】
第２の流路の壁面に親水性処理層を形成した場合、第２の流路を通る測定液体中の水成分が親水性処理層に親和性を持つため、第２の流路内での測定液体の流動が抑制されることとなる。この結果、測定液体が分岐部分から第２の流路を通って観測部に達するよりも早く、分岐部分から第１の流路を通って観測部に達するようにさせることができる。【００８９】
第２の流路に臨む基板の表面から第２の流路内に突出する少なくとも１つの流路抵抗増大ブロックを形成した場合、流路抵抗増大ブロックが第２の流路内の測定液体の流動を阻害することとなる。この結果、測定液体が分岐部分から第２の流路を通って観測部に達するよりも早く、分岐部分から第１の流路を通って観測部に達するようにさせることができる。【００９０】
分岐部分から合流部分に至る第１の流路の容積よりも第２の流路の容積を大きく設定した場合、測定液体が分岐部分から第２の流路を通って観測部に達するよりも早く、分岐部分から第１の流路を通って観測部に達するようにさせることができる。特に、第２の流路の途中に測定液体を貯溜する液溜め部を配した場合、フィルタを通過して観測部に達する基準試料と、第２の流路を通って観測部に達する測定流体との到達時間を大きくずらすことが可能となる。【００９１】
第１の流路の観測部に抗体や抗原などの分子選択性材料を固定した場合、生体に関わる免疫反応の測定が可能となる。特に、分子選択性材料が酵素の場合には生体関連物質または医薬、食品の品質管理や、環境作用物質の検出が可能である。オリゴヌクレオシドやリボヌクレオシドの場合には測定対象物質の遺伝子レベルの情報の特定が可能となる。シクロデキストリン修飾化合物の場合にはイオンやアミノ酸の選択的測定が可能である。さらに、フィルタがプロテインＡを修飾剤とするデキストランゲルを含む場合、ＩｇＧ系免疫物質を除去した基準試料をこの光学分析用チップ内で調整することができ、ＩｇＧ系免疫物質を測定対象とする光学分析用チップを得ることができる。有機膜被覆シリカおよび有機膜被覆アルミナの少なくとも一方を含む場合、ＩｇＧ以外のタンパク質、アミノ酸、イオンを除去した基準試料を光学分析用チップ内で調整することができ、ＩｇＧ以外のタンパク質、アミノ酸、イオンを検出対象とする光学分析用チップを得ることができる。測定対象物が多様な種類の夾雑物を含む場合、プロテインＡを修飾剤とするデキストランゲルを下部に、有機膜被覆シリカあるいは有機膜被覆アルミナを上部に充填して利用することもできる。【００９２】
次に、本発明の第４および第５の実施形態について説明する。第４および第５の実施形態は、本発明の上記態様の（３）に相当する。【００９３】
第４の実施形態の光学分析用チップは、基板と、該基板上の金属薄膜と、該金属箔膜上の観測部を有し、該観測部には、測定領域と参照領域が設けられている。この光学分析用チップでは、前記測定領域に特定の分子と選択的に相互作用する第１の分子選択性物質が固定化され、前記参照領域に、前記第１の分子選択性物質が相互作用する特定の分子に対する選択性のみが異なり、他の特性は前記第１の分子選択性物質と同等である第２の分子選択性物質が固定化され、前記第１の分子選択性物質と第２の分子選択性物質は、同じ方法で基板上に固定化されることが好ましい。【００９４】
以下に、第４の実施形態の光学分析用チップを図面を参照して本発明を説明する。【００９５】
本発明の第４の実施形態の光学分析用チップは、図１６Ａおよび図１６Ｂに示すようなものである。図１６Ｂは、図１６ＡのＸＶＩＢ−ＸＶＩＢ断面図である。この光学分析用チップは、基板１００１上に、蒸着のような方法により形成された金属薄膜１００２、好ましくは金薄膜を有し、この金薄膜上に、測定領域１００３および参照領域１００４が設けられている。測定領域１００３および参照領域１００４は、図に示されるように、直線上に並列して並ぶように配置されることが好ましい。【００９６】
測定領域および参照領域は、後述するように試料を輸送するフローセルの流路に沿って配置されるが、測定領域または参照領域のいずれをフローセルの入口側に近い方に配置してもよい。【００９７】
測定領域および参照領域に用いられる分子選択性物質には、抗体、抗原、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの生体関連物質、イオノフォア、デキストラン修飾物などの非生体関連物質などが含まれる。さらに、プロテインエンジニアリングにより得られた、相互に選択性が異なり、立体構造が類似した抗体同士なども用いることができる。【００９８】
測定領域および参照領域に用いられる分子選択性物質は、測定対象物質との選択性のみが異なるように設計したものであることが好ましい。このような設計は、測定対象物質との選択性のみが異なるように合成（化学的、生物学的などのいずれの手段でもよい）すること、あるいは、測定対象物質との選択性のみが異なるように分子選択性物質を不活性化させることが含まれる。【００９９】
具体的には、測定領域には、光学分析用チップで測定するべき測定対象物質と選択的に相互作用する第１の分子選択性物質が固定化される。第１の分子選択性物質は、測定対象物質と選択的に相互作用できるものであり、具体的には、上述のような生体関連物質、非生体関連物質、プロテインエンジニアリングの手法により得られたものなどが含まれる。【０１００】
参照領域には第２の分子選択性物質が固定される。第２の分子選択性物質は、第１の分子選択性物質が相互作用する特定の分子に対する選択性のみが異なり、他の特性は第１の分子選択性物質と同等であれば特に限定されない。すなわち、第２の分子選択性物質は、測定対象物質以外の他の分子に対して相互作用しない以外、前記第１の分子選択性物質と特性が同等である物質である。本発明では、第１の分子選択性物質と同種類または同系統の物質を第２の分子選択性物質として用いることが好ましい。【０１０１】
第２の分子選択性物質には、例えば第１の分子選択性物質を不活性化したものを用いることができる。ここで、不活性化とは、第１の分子選択性物質に特定の処理を施し、測定対象物質に対する選択性のみを、第１の分子選択性物質と異なるようにすることをいう。このような不活化処理には、例えば、Ｘ線、γ線、電子線などの高エネルギー線を照射すること、熱処理、電気化学的酸化若しくは還元、または、酸性若しくはアルカリ性の緩衝液との接触などが含まれる。【０１０２】
上述の方法で第２の分子選択性物質を得ることができるほか、第１の分子選択性物質が抗体である場合、第２の分子選択性物質には、同系統の抗−抗体を用いることもできる。例えば、測定対象物質ｃに対して選択性を有する抗体Ｃを測定領域に固定する場合を考える。このとき、参照領域には、測定対象物質ｃとは異なる物質を、抗体Ｃを得たのと同じ動物（例えば、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ラクダ等）へ抗原として投与して調製した抗−抗体（抗体Ｃ’）を固定化する。抗体Ｃが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどの場合、抗体Ｃ’は、それぞれ、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＤ等である。これら抗−抗体は、ＦｃであるかまたはＦａｂであるかについても同一であり、測定対象物質に対する選択性のみが異なるものである。【０１０３】
また、第１の分子選択性物質として、測定対象物質ｄに選択性を有する抗原Ｄを用いる（すなわち、測定領域に抗原Ｄを固定化する）場合を考えると、参照領域に固定する第２の分子選択性物質は、抗原Ｄとは、測定対象物質ｄに対する選択性のみが異なる抗原Ｄ’を用いることができる。【０１０４】
さらに、第１の分子選択性物質として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を用いることができる。これらは、測定対象物質と、複合体形成のような選択的なカップリングができるものであれば特に制限されない。【０１０５】
ＤＮＡやＲＮＡを第１の分子選択性物質として用いる場合、第２の分子選択性物質は第１の分子選択性物質を構成する塩基のいくつかが追加、置換、欠失等されたものとすることができる。具体的には、ＤＮＡを第１の分子選択性物質として用いる場合、第２の分子選択性物質は第１の分子選択性物質を構成する塩基の１０％以下の塩基が置換されたものであることが好ましい。【０１０６】
基板は、光学分析用チップを装着する測定装置（例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置）で使用する光に対して透明である材料であれば特に限定されることなく、いずれの材料も用いることができる。例えば、ガラス基板、プラスチック基板などを用いることができる。【０１０７】
本発明で測定領域に抗体のような生体関連物質を用いると、生体関連物質の選択性は極めて高いので、サンプル溶液中に多くの夾雑物が存在していても、生体関連物質と測定対象物質との相互作用、例えば抗原−抗体反応そのものの反応速度に対する影響は少ない。従って、サンプル溶液中に多くの夾雑物が存在していても、高感度かつ高精度で測定対象物質を検出および／または定量することができる。【０１０８】
本明細書において、相互作用とは、分子選択性物質が測定対象物質と化学的または物理的に作用し合うことをいい、例えば水素結合、イオン結合、分子間結合、分子内への物質の取り込み、複合体形成、吸着などがある。例えば、上記生体関連物質であれば、抗原−抗体反応、酵素−基質間相互作用、ＤＮＡやＲＮＡが二本鎖を形成する際の塩基対結合などがある。【０１０９】
次に本発明の第５の実施形態について説明する。第５の実施形態の光学分析用チップは、図１７に示すようなものである。この光学分析用チップは、基板１００１上に、蒸着のような方法により形成された金属薄膜１００２、好ましくは金薄膜を有し、この金薄膜上に、複数の測定領域１０１３、１０１５および参照領域１０１４、１０１６が並列に設けられている。この実施形態では、測定領域１０１３および参照領域１０１５と、測定領域１０１４および参照領域１０１６が１組となって、観測部１０１０および１０１１を形成する。観測部１０１０および観測部１０１１は、それぞれ異なる種類の分子を検出できるように異なる種類の第１の分子選択性物質をそれぞれの測定領域に固定する。また、第１の分子選択性物質に合わせて第２の分子選択性物質を固定する。第１の分子選択性物質および第２の分子選択性物質は、上述の通りである。なお、この実施形態では、２つの観測部を設ける例を示したが、本発明はこれに限定されず、さらに多くの観測部を設けてもよい。【０１１０】
複数の観測部を基板上に設ける場合、各観測部は、試料を輸送するフローセルの流路に沿って、好ましくは各観測部が直線上に並列して並ぶように配置されることが好ましい。【０１１１】
本発明の光学分析用チップにおける、測定領域および参照領域の基板上の位置などは、光学的測定法（例えば、表面プラズモン共鳴測定法）に適合するように適宜選択すればよい。このような選択は、当業者によって適宜行いうる。【０１１２】
本発明の光学分析用チップは、上述のように第１の分子選択性物質を測定領域に適用し、第１の分子選択性物質と測定対象物質との選択性のみが異なる第２の分子選択性物質を参照領域に適用することにより、サンプルを測定する際、夾雑物の吸着や蓄積の影響が相殺され、測定上のベースラインの変化を小さく抑えることができる。【０１１３】
次に、第４の実施形態と第５の実施形態の光学分析用チップの製造方法を、図面を参照しながら説明する。【０１１４】
第４の実施形態の光学分析用チップは、例えば図１８（ａ）から（ｄ）に示す手順で調製することができる。まず、基板上１００１に蒸着などにより、金のような金属薄膜１００２を形成する（図１８（ａ））。金属薄膜は、例えばＳＰＲ装置用であれば、５０ｎｍ程度の膜厚を有する。次に、金属薄膜上に、測定領域１００３および参照領域１００４に相当する開口部１０３０、１０３２を有するカバーシール１０３４を貼付する（図１８（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ））。この開口部の各々に第１の分子選択性物質および第２の分子選択性物質を含む溶液（例えば、抗体または抗−抗体のリン酸バッファ溶液）１０２１、１０２２をそれぞれ滴下し、所定時間静置する（図１８（ｃ））。この後、溶液を除去し、カバーシールを剥がして、測定領域および参照領域に、それぞれ第１の分子選択性物質および第２の分子選択性物質が固定化された光学分析用チップを得ることができる（図１８（ｄ））。静置の時間は、固定する材料により異なるが、例えば抗体のリン酸バッファ溶液を用いた場合、数分から６０分、好ましくは２０分程度である。本発明で、「固定化」とは、上述のように、第１の分子選択性物質および第２の分子選択性物質を基板、好ましくは金属薄膜上に載置する場合を含め、基板または金属薄膜上に化学的または物理的に結合させることを含む。【０１１５】
第５の実施形態の光学分析用チップは、図１８（ｂ）で示した、カバーシールに、複数の観測部に相当する開口部を設けたものを用いて、各観測部に、測定対象物質に応じた分子選択性物質を固定化することで調製することができる。【０１１６】
次に、１つの観測部を有する光学分析用チップの別の製造方法について図１９および図２０を参照して説明する。まず、基板１００１上をマスク１０４０で覆う。このマスクは、金属薄膜１０４８、１０４９、１０５０を成膜する部分にあけられた３つの開口と、パット部１０４４、１０４５に相当する開口と、金属薄膜１０４９およびパット部１０４５、金属薄膜１０５０およびパット部１０４４をそれぞれ結ぶ連結部１０４６、１０４７に相当する開口を有する。これらの開口を通して、蒸着のような手段により、金のような材料から成る金属薄膜１０４８、１０４９、１０５０を成膜する（図１９（ａ））。【０１１７】
次に、マスクを除去し、金属薄膜１０４８、１０４９の部分に開口部１０５１、１０５２を有するカバーシール１０５４を貼付し、この開口部１０５１、１０５２に第１の分子選択性物質１０５５の溶液を滴下し、所定時間静置する（図１９（ｂ））。この後、溶液を除去し、カバーシールを剥がして、金属薄膜１０４８、１０４９上に第１の分子選択性物質１０５５が固定化された基板を得る（図１９（ｃ））。【０１１８】
次に、図１９（ｄ）に示すような、連結部１０４６、１０４７の一部を覆い、金属薄膜１０４９、１０５０の部分でウェル状になった開口部１０５３を有するパターンのカバーシール１０５６を貼付する。このウェル状の開口部１０５３に電解質溶液を保持することができるようになっている。このようにした基板の前記ウェル１０５３に、電解質溶液（例えばリン酸バッファ溶液）を滴下し、図２０Ａに示すように、銀・塩化銀参照電極、ポテンシオスタット、ファンクションジェネレータを用いて、金属薄膜１０４９上の第１の分子選択性物質を不活性化して、第２の分子選択性物質１０５８とする。最後に、参照電極、電解質溶液、カバーシール、ポテンシオスタット、ファンクションジェネレータ等を取り除き、光学分析用チップを得ることができる（図２０Ｂ）。【０１１９】
本発明の光学分析用チップの製造方法において、第２の分子選択性物質を第１の分子選択性物質を不活性化して調製する場合、第１の分子選択性物質の不活性化は、参照領域に予め第１の分子選択性物質を固定化した後に行ってもよいし、予め第１の分子選択性物質を不活性化した後に参照領域に不活性化した第１の分子選択性物質を固定化してもよい。【０１２０】
このようにして得られた光学分析用チップは、例えば表面プラズモン共鳴装置（例えば特許文献１に記載の装置）に設置し、図２１に示すように、上部にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製フローセルを取付けて使用される。なお、フローセルへは、マイクロシリンジポンプから液体サンプルを、チューブを介して導入することができる。【０１２１】
液体サンプルが導入されると、測定領域と参照領域に同時に夾雑物を含むサンプル液が流れ、夾雑物が測定領域および参照領域に同時に吸着されたり蓄積されたりする。その結果、測定領域および参照領域の差分を測定すると、夾雑物の吸着や蓄積の影響が相殺され、測定上のベースラインの変化を小さく抑えることができる。従って、液体サンプル中の低濃度の測定対象物質を検出したときに得られる信号の変化に比べ、ベースラインの変化が小さく抑えられるので、高感度かつ高精度で測定対象物質を検出または定量することができる。【０１２２】
なお、第４および第５の実施形態は、本発明の上記態様の（３）に相当するが、本発明はこれに限定されず、上記態様の（１）および／または（２）と上記態様（３）を組み合わせることができる。【０１２３】
本発明の光学分析用チップは、全反射光学系および分子選択性物質を固定化して用いる測定系に適用することが可能であり、表面プラズモン共鳴測定法に限らず、プリズムあるいは回折格子を利用した全反射測定法に基づく吸収測定用チップとして適用することができる。
【実施例】
【０１２４】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
本実施例は、図２Ａおよび図２Ｂに示すような迂回路を持たない流路の光学分析用チップであって、吸着剤としてプロテインＡ吸着剤を用いる例を示す。【０１２５】
有機溶媒にセルロースアセテートを溶解して、セルロースアセテート溶液を調製した。ＢＫ７ガラス基板上に金薄膜（厚さ５０ｎｍ）を蒸着により形成した。この金薄膜上に、レジスト膜またはテープを適用し、流路に相当する一部の金薄膜が露出したパターンを形成した。パターン化した、金／ガラス基板をスピンコーターに設置し、先に調製したセルロースアセテート溶液を滴下した後、基板を回転させ、有機溶媒を蒸発させて白色の膜状の流路を形成した。次に、プロテインＡのバッファ溶液を調製し、これを流路の吸着領域に滴下し、プロテインＡを流路に吸着させて吸着領域を形成した。なお、プロテインＡを吸着させた領域は、予めカルボジイミドの水溶液を滴下し、乾燥させて、活性化しておいた。このようにして、長さ１０ｍｍ×幅１ｍｍ×厚さ１μｍの流路を形成した。【０１２６】
次に、流路の測定領域に相当する部分（図２Ａおよび図２Ｂのライン３に相当する部分）に、抗ヒトＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）を少量滴下し、乾燥させて抗体を固定化した。同様に、抗ヒトＩｇＧを固定化した領域と並んだ部分（図２Ａおよび図２Ｂのライン２の部分）に、抗ヤギＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液を滴下し、乾燥させて参照抗体を固定化した。【０１２７】
次に、ブロッキング剤溶液として、４ｍｇ・ｍＬ−１のウシ血清アルブミンのリン酸バッファ溶液を調製し、この溶液を、抗体を固定化した測定領域および参照領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン３および２）の部分と、さらに参照領域の別の領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン１の部分）に滴下して乾燥させた。【０１２８】
作製した光学分析用チップを表面プラズモン共鳴測定装置のプリズム上に、マッチングオイルを介して取り付けた。光学分析用チップの流路の試料導入部に液体サンプルとしてヒトＩｇＧを含むリン酸バッファ溶液を滴下した。液体サンプル中の測定対象物質であるヒトＩｇＧは、吸着領域のプロテインＡに吸着され、ヒトＩｇＧを含まないリン酸バッファ溶液が観測領域に到達してＳＰＲが観測される。図２Ｂにおいて、＊で示された部分へ到達する、ヒトＩｇＧの液体サンプル中の濃度プロファイルを図６に示した。図６から明らかなように、時間ｔ０において、ヒトＩｇＧを含まないリファレンス用サンプルが測定領域に到達する。時刻ｔ０からヒトＩｇＧを含む液体サンプルが測定領域に到達する時刻ｔ１までの間に観測されるＳＰＲの角度が測定上のベースレベルとなる。【０１２９】
次に、さらに液体サンプルを滴下するか、あるいは、吸着領域をプラスチックなどで保護し、吸着剤領域を飽和させるか、あるいは測定対象物質が吸着剤に吸着されないようにした後、大量の液体サンプルを試料導入部から導入すると、ヒトＩｇＧを含む液体サンプルが測定領域に到達し、ヒトＩｇＧが測定領域の抗ヒトＩｇＧと選択的に結合する。一方、参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域およびブロッキング剤のみを固定した領域はヒトＩｇＧとは結合しない。従って、この段階では、図７に示すように測定領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン３の部分）のみＳＰＲの角度が増大し、参照領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン２および１の部分）のＳＰＲの角度の上昇はごく僅かとなる。測定領域（ライン３）と参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域（ライン２）の差が、ヒトＩｇＧの抗ヒトＩｇＧへの選択的な結合を表し、この角度の増大の時間変化からヒトＩｇＧの定量が可能となる。【０１３０】
プロテインＡ吸着剤は、ＩｇＧのＦｃ部分と選択的に接合する性質を有するので、本実施例はサンプルからＩｇＧのみを除去してリファレンス用サンプルを調製したい場合に適する。
（実施例２）
本実施例は、図２Ａおよび図２Ｂに示すような迂回路を持たない流路の光学分析用チップであって、吸着剤として修飾デキストラン微粒子吸着剤を用いる例を示す。【０１３１】
有機溶媒にセルロースアセテートを溶解したセルロースアセテート溶液と、このセルロースアセテート溶液に修飾デキストラン微粒子（メタクリル酸修飾デキストランをラジカル重合で微粒子化したもの）（直径１５〜３０μｍ）を混合したセルロースアセテート・デキストラン微粒子混合溶液を調製した。ＢＫ７ガラス基板上に金薄膜（厚さ５０ｎｍ）を蒸着により形成した。この金薄膜上に、レジスト膜またはテープを適用し、流路に相当する一部の金薄膜が露出したパターンを形成した。この際、流路の吸着領域を露出しないようにし、吸着領域にはセルロースアセテート溶液が堆積しないようにした。次に、パターン化した、金／ガラス基板をスピンコーターに設置し、先に調製したセルロースアセテート溶液を滴下した後、基板を回転させ、有機溶媒を蒸発させて白色の膜状の流路を形成した。次に、吸着領域に、先に調製したセルロースアセテート・デキストラン微粒子混合溶液を滴下し、乾燥させて、先に形成した白色の膜状の流路と連結するように吸着領域を形成した。このようにして、長さ１０ｍｍ×幅１ｍｍ×厚さ１μｍの流路を形成した。【０１３２】
次に、流路の測定領域に相当する部分（図２Ａおよび図２Ｂのライン３に相当する部分）に、抗ヒトＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）を少量滴下し、乾燥させて抗体を固定化した。同様に、抗ヒトＩｇＧを固定化した領域と並んだ部分（図２Ａおよび図２Ｂのライン２の部分）に、抗ヤギＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液を滴下し、乾燥させて参照抗体を固定化した。【０１３３】
次に、ブロッキング剤溶液として、４ｍｇ・ｍＬ−１のウシ血清アルブミンのリン酸バッファ溶液を調製し、この溶液を、抗体を固定化した測定領域および参照領域（図２のライン３および２）の部分と、さらに参照領域の別の領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン１の部分）に滴下して乾燥させた。【０１３４】
作製した光学分析用チップを表面プラズモン共鳴測定装置のプリズム上に、マッチングオイルを介して取り付けた。光学分析用チップの流路の試料導入部に液体サンプルとしてヒトＩｇＧを含むリン酸バッファ溶液を滴下した。液体サンプル中の測定対象物質であるヒトＩｇＧは、吸着領域のデキストラン微粒子に吸着され、ヒトＩｇＧを含まないリン酸バッファ溶液が観測領域に到達してＳＰＲが観測される。このヒトＩｇＧを含まないリファレンス用サンプルが観測されるＳＰＲの角度が測定上のベースレベルとなる。【０１３５】
次に、さらに液体サンプルを滴下するか、あるいは、吸着領域をプラスチックなどで保護し、吸着剤領域を飽和させるか、あるいは測定対象物質が吸着剤に吸着されないようにした後、大量の液体サンプルを試料導入部から導入すると、ヒトＩｇＧを含む液体サンプルが測定領域に到達し、ヒトＩｇＧが測定領域の抗ヒトＩｇＧと選択的に結合する。一方、参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域およびブロッキング剤のみを固定した領域はヒトＩｇＧとは結合しない。従って、この段階では、図７に示すように測定領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン３の部分）のみＳＰＲの角度が増大し、参照領域（図２Ａおよび図２Ｂのライン２および１の部分）のＳＰＲの角度の上昇はごく僅かとなる。測定領域（ライン３）と参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域（ライン２）の差が、ヒトＩｇＧの抗ヒトＩｇＧへの選択的な結合を表し、この角度の増大の時間変化からヒトＩｇＧの定量が可能となる。【０１３６】
本実施例は、デキストラン微粒子は、ＩｇＧ以外のタンパク質も吸着することから、多様なタンパク質類を除去したリファレンス用サンプルを調製したい場合に適する。すなわち、測定対象物質であるＩｇＧ以外のタンパク質も除去したい場合や、ＩｇＧ以外のタンパク質を測定対象物質とする場合にデキストラン微粒子を吸着剤として用いることができる。
（実施例３）
この実施例は、図３Ａおよび図３Ｂに示すような迂回路を持つ流路の光学分析用チップであって、吸着剤としてプロテインＡを吸着剤を用いる例を示す。【０１３７】
有機溶媒にセルロースアセテートを溶解して、セルロースアセテート溶液を調製した。ＢＫ７ガラス基板上に金薄膜（厚さ５０ｎｍ）を蒸着により形成した。この金薄膜上に、レジスト膜またはテープを適用し、主流路および迂回路に相当する一部の金薄膜が露出したパターンを形成した。パターン化した、金／ガラス基板をスピンコーターに設置し、先に調製したセルロースアセテート溶液を滴下した後、基板を回転させ、有機溶媒を蒸発させて白色の膜状の主流路および迂回路を形成した。次に、プロテインＡのバッファ溶液を調製し、これを流路の吸着領域に滴下し、プロテインＡを流路に吸着させて吸着領域を形成した。なお、プロテインＡを吸着させた領域は、予めカルボジイミドの水溶液を滴下し、乾燥させて、活性化しておいた。このようにして、長さ１０ｍｍ×幅１ｍｍ×厚さ１μｍおよび迂回路の全長８ｍｍの流路を形成した。【０１３８】
次に、主流路の測定領域に相当する部分（図３Ａおよび図３Ｂのライン３に相当する部分）に、抗ヒトＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）を少量滴下し、乾燥させて抗体を固定化した。同様に、抗ヒトＩｇＧを固定化した領域と並んだ部分（図３Ａおよび図３Ｂのライン２の部分）に、抗ヤギＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液を滴下し、乾燥させて参照抗体を固定化した。【０１３９】
次に、ブロッキング剤溶液として、４ｍｇ・ｍＬ−１のウシ血清アルブミンのリン酸バッファ溶液を調製し、この溶液を、抗体を固定化した測定領域および参照領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン３および２）の部分と、さらに参照領域の別の領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン１の部分）に滴下して乾燥させた。【０１４０】
作製した光学分析用チップを表面プラズモン共鳴測定装置のプリズム上に、マッチングオイルを介して取り付けた。光学分析用チップの流路の試料導入部に液体サンプルとしてヒトＩｇＧを含むリン酸バッファ溶液を滴下した。液体サンプル中の測定対象物質であるヒトＩｇＧは、吸着領域のプロテインＡに吸着され、ヒトＩｇＧを含まないリン酸バッファ溶液が観測領域に到達してＳＰＲが観測される。このヒトＩｇＧを含まないリファレンス用サンプルで観測されるＳＰＲの角度が測定上のベースレベルとなる。【０１４１】
一方、迂回路を流れたヒトＩｇＧを含む液体サンプルは、リファレンス用サンプルが測定領域に到達した後に、測定領域に到達し、ヒトＩｇＧが測定領域の抗ヒトＩｇＧと選択的に結合する。一方、参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域およびブロッキング剤のみを固定した領域はヒトＩｇＧとは結合しない。従って、この段階では、図７に示すように測定領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン３の部分）のみＳＰＲの角度が増大し、参照領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン２および１の部分）のＳＰＲの角度の上昇はごく僅かとなる。測定領域（ライン３）と参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域（ライン２）の差が、ヒトＩｇＧの抗ヒトＩｇＧへの選択的な結合を表し、この角度の増大の時間変化からヒトＩｇＧの定量が可能となる。【０１４２】
測定対象物質を含むサンプルが、迂回路を経て観測領域に到達することから、粘性が低く、流路内の進行が早いサンプルを測定したい場合には、本実施例に示した迂回路を設けることで、リファレンス用サンプルが観測領域に到達した後に測定対象物質を含む液体サンプルが観測領域に到達するように、時間差の調整が可能となる。また、本実施例のようにプロテインＡ吸着剤は、ＩｇＧのＦｃ部分と選択的に接合する性質を有するので、本実施例はサンプルからＩｇＧのみを除去してリファレンス用サンプルを調製したい場合に適する。
（実施例４）
本実施例は、図３Ａおよび図３Ｂに示すような迂回路を持つ流路の光学分析用チップであって、吸着剤としてデキストラン微粒子吸着剤を用いる例を示す。【０１４３】
有機溶媒にセルロースアセテートを溶解したセルロースアセテート溶液と、このセルロースアセテート溶液に修飾デキストラン微粒子（メタクリル酸修飾デキストランをラジカル重合で微粒子化したもの）（直径１５〜３０μｍ）を混合したセルロースアセテート・デキストラン微粒子混合溶液を調製した。ＢＫ７ガラス基板上に金薄膜（厚さ５０ｎｍ）を蒸着により形成した。この金薄膜上に、レジスト膜またはテープを適用し、流路に相当する一部の金薄膜が露出したパターンを形成した。この際、流路の吸着領域を露出しないようにし、吸着領域にはセルロースアセテート溶液が堆積しないようにした。次に、パターン化した、金／ガラス基板をスピンコーターに設置し、先に調製したセルロースアセテート溶液を滴下した後、基板を回転させ、有機溶媒を蒸発させて白色の膜状の流路を形成した。次に、吸着領域に、先に調製したセルロースアセテート・デキストラン微粒子混合溶液を滴下し、乾燥させて、先に形成した白色の膜状の流路と連結するように吸着領域を形成した。このようにして、長さ１０ｍｍ×幅１ｍｍ×厚さ１μｍおよび迂回路の全長８ｍｍの流路を形成した。【０１４４】
次に、主流路の測定領域に相当する部分（図３Ａおよび図３Ｂのライン３に相当する部分）に、抗ヒトＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）を少量滴下し、乾燥させて抗体を固定した。同様に、抗ヒトＩｇＧを固定した領域と並んだ部分（図３Ａおよび図３Ｂのライン２の部分）に、抗ヤギＩｇＧを１００μｇ・ｍＬ−１含むリン酸バッファ溶液を滴下し、乾燥させて参照抗体を固定化した。【０１４５】
次に、ブロッキング剤溶液として、４ｍｇ・ｍＬ−１のウシ血清アルブミンのリン酸バッファ溶液を調製し、この溶液を、抗体を固定化した測定領域および参照領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン３および２）の部分と、さらに参照領域の別の領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン１の部分）に滴下して乾燥させた。【０１４６】
作製した光学分析用チップを表面プラズモン共鳴測定装置のプリズム上に、マッチングオイルを介して取り付けた。光学分析用チップの流路の試料導入部に液体サンプルとしてヒトＩｇＧを含むリン酸バッファ溶液を滴下した。液体サンプル中の測定対象物質であるヒトＩｇＧは、吸着領域のデキストラン微粒子に吸着され、ヒトＩｇＧを含まないリン酸バッファ溶液が観測領域に到達してＳＰＲが観測される。このヒトＩｇＧを含まないリファレンス用サンプルが観測されるＳＰＲの角度が測定上のベースレベルとなる。【０１４７】
一方、迂回路を流れたヒトＩｇＧを含む液体サンプルは、リファレンス用サンプルが測定領域に到達した後に、測定領域に到達し、ヒトＩｇＧが測定領域の抗ヒトＩｇＧと選択的に結合する。一方、参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域およびブロッキング剤のみを固定した領域はヒトＩｇＧとは結合しない。従って、この段階では、図７に示すように測定領域（図２のライン３の部分）のみＳＰＲの角度が増大し、参照領域（図３Ａおよび図３Ｂのライン２および１の部分）のＳＰＲの角度の上昇はごく僅かとなる。測定領域（ライン３）と参照領域の抗ヤギＩｇＧを固定した領域（ライン２）の差が、ヒトＩｇＧの抗ヒトＩｇＧへの選択的な結合を表し、この角度の増大の時間変化からヒトＩｇＧの定量が可能となる。【０１４８】
測定対象物質を含むサンプルが、迂回路を経て観測領域に到達することから、粘性が低く、流路内の進行が早いサンプルを測定したい場合には、本実施例に示した迂回路を設けることで、リファレンス用サンプルが観測領域に到達した後に測定対象物質を含む液体サンプルが観測領域に到達するように、時間差の調整が可能となる。また、本実施例では、デキストラン微粒子は、ＩｇＧ以外のタンパク質も吸着することから、多様なタンパク質類を除去したリファレンス用サンプルを調製したい場合に適する。すなわち、測定対象物質であるＩｇＧ以外のタンパク質も除去したい場合や、ＩｇＧ以外のタンパク質を測定対象物質とする場合にデキストラン微粒子を吸着剤として用いることができる。
（実施例５）
本実施例は、測定領域および参照領域に用いる分子選択性物質の組み合わせとしてどのようなものが適切かを判断するためのものである。【０１４９】
金薄膜（厚さ約５０ｎｍ）を蒸着形成したＢＫ７ガラス基板（縦１６ｍｍ×横１６ｍｍ）に、図１８（ｂ）に示すように、２つの開口部１０３０、１０３２が設けられたカバーシール１０３４を貼り付けた。この開口部１０３０に、ヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液を滴下し、開口部１０３２にヤギから抽出した抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液とをそれぞれ滴下して、室温環境下で２０分以上静置した。この後、溶液を吸い取り、カバーシールを剥がして、チップＩを作製した。【０１５０】
同様に、２つの開口部１０３０、１０３２が設けられたカバーシール付き金／ガラス基板について、開口部１０３０にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を滴下し、室温下で上述のように静置し、後処理したチップＩＩと、開口部１０３０にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液を滴下し、開口部１０３２にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）のリン酸バッファ溶液を滴下して、上記と同様に処理したチップＩＩＩと、開口部１０３０にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液を滴下し、開口部３２にウサギから抽出した抗エンテロトキシンＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液を滴下して、上記と同様に処理したチップＩＶを作製した。【０１５１】
作製したチップは、表面プラズモン共鳴測定装置（特許文献１）に設置し、チップの上部に図２１に示すような、ＰＤＭＳ製フローセルを貼り付けた。フローセルへは、マイクロシリンジポンプから供給される液体サンプルが、チューブを介して導入されるようにしてある。さらに、液体スイッチを併用することで、液体サンプルの種類を瞬時に切り替えられるようににセッティングした。【０１５２】
基板上の開口部１０３０に相当する部分を測定領域１００３とし、開口部１０３２に相当する部分を参照領域１００４とした。この２つの領域において表面プラズモン共鳴を測定すると、測定結果から、図２２に示すような共鳴角度（θ（測定領域）、θ（参照領域））が得られる。この共鳴角度の時間変化を測定すると、それらの差分で表される｛θ（測定領域）−θ（参照領域）｝／時間［ｄｅｇ・ｓ−１］が２つの領域における分子選択性物質の活性の差を表すことになる。【０１５３】
夾雑物を多く含む、液体サンプルとして、市販の牛乳を用い、フローセルを用いたセッティングがなされたチップへ、牛乳を導入すると、牛乳中に含まれる脂肪、カゼイン、タンパク質などが、抗体の固定化された観測部および抗体の固定化されていない金の表面に吸着および蓄積される。牛乳を流す時間が長くなると、表面プラズモン共鳴装置で測定される共鳴角度の位置も大きくなっていく。【０１５４】
牛乳内に、測定対象物質として、牛乳に含まれることのないヒトＩｇＧ抗原を混ぜておくと、抗ヒトＩｇＧが固定化された測定領域のθ（測定領域）の増加速度［ｄｅｇ・ｓ−１］が、θ（参照領域）の増加速度［ｄｅｇ・ｓ−１］を上回ることが期待される。数ｎｇ・ｍＬ−１レベルの低濃度の抗原を測定する場合、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］台のシグナルとなる。従って、ベースラインは、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］レベル以下に抑える必要がある。ベースラインは、本実施例の場合、抗ヒトＩｇＧが含まれていない牛乳、すなわち、牛乳のみをチップに導入した場合の差分となる。【０１５５】
チップＩＩ、チップＩＩＩおよびチップＩＶを用いて測定した場合、１０−５から１０−４［ｄｅｇ・ｓ−１］の範囲でベースラインの変化が生じた。一方、チップＩでは、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下にベースラインの変化を抑えることができた（図２３参照）。【０１５６】
このように、同じ動物から抽出した選択性のみ異なる同じ系統のＩｇＧであって、ＩｇＧ抗体として物理的な大きさが等しいＦｃ同士を測定領域および参照領域用の抗体として用いることで、多くの夾雑物を含む液体サンプルを測定する際の、夾雑物の吸着および蓄積に起因する、ノイズとなるベースラインの変化を抑えることができる。
（実施例６）
２つの開口部１０３０、１０３２が設けられたカバーシール付き金／ガラス基板について、これら２つの開口部１０３０、１０３２にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を滴下し、開口部１０３２の参照領域に相当する部分にのみ電子線を照射して抗体の選択性を低下させた。その他は、実施例５と同様に処理して、光学分析用チップＶを得た。この光学分析用チップＶを実施例５と同様に表面プラズモン共鳴装置に設置し、フローセルをセッティングし、牛乳を導入して表面プラズモン共鳴を測定した。測定領域と参照領域との差分測定におけるベースラインの変化は、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下に抑えることができた。
（実施例７）
参照領域１００４用の分子選択性物質を調製するため、ヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を４０℃の恒温槽で１時間温め、室温に戻した。これにより、不活性化した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を得た。【０１５７】
次に、２つの開口部１０３０、１０３２が設けられたカバーシール付き金／ガラス基板について、開口部１０３０にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を滴下し、先に調製した、不活性化した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を、開口部１０３２の参照領域に相当する部分に滴下した。その他は、実施例５と同様に処理して、光学分析用チップＶＩを得た。この光学分析用チップＶＩを実施例５と同様に表面プラズモン共鳴装置に設置し、フローセルをセッティングし、牛乳を導入して表面プラズモン共鳴を測定した。測定領域と参照領域との差分測定におけるベースラインの変化は、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下に抑えることができた。
（実施例８）
図１９（ａ）に示すような、金属薄膜を形成するための３つの開口と、パット部１０４４、１０４５を形成するための開口と、連結部１０４６、１０４７を形成するための開口を有するマスクを、ＢＫ７ガラス基板に設置した。この開口を通して、蒸着のような手段により、金薄膜１０４８、１０４９、１０５０を成膜した。次に、マスクを除去し、開口部１０４１、１０４２の位置に設けられた金薄膜１０４８、１０４９の部分に開口部１０５１、１０５２が一致するように、開口部１０５１、１０５２を有するカバーシールを貼付した（図１９（ｂ））。この開口部１０５１、１０５２にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液を滴下し、室温で２０分間静置した後、溶液を除去し、カバーシールを剥がした。【０１５８】
次に、図１９（ｃ）に示すような、連結部１０４６、１０４７の一部を覆い、パッド部１０４４、１０４５が露出し、ヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）が固定化された金薄膜１０４９と、ヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）が固定化されていない１０５０の部分が露出した開口部１０５３を有するカバーシールを貼付する。ここで、金薄膜１０４９および金薄膜１０５０を露出させている開口部は、ウェル状になっており、溶液を保持できる。このようにした基板のウェル状の開口部分に、リン酸バッファ溶液を滴下した。次に、図２０に示すように、銀・塩化銀参照電極の先端がウェル状の開口部内のリン酸バッファ溶液に接するように配置し、ポテンシオスタットに接続した。金薄膜１０４９の部分を作用極とし、金薄膜１０５０の部分を対極としてポテンシオスタットに接続した。次に、ポテンシオスタットおよびファンクションジェネレータを用いて、作用極へ印加する電位を−０．３から１．２［Ｖ  ｖｓ．  銀・塩化銀参照電極］まで掃引し、さらに１．２から−０．３［Ｖ  ｖｓ．  銀・塩化銀参照電極］まで戻るという電位サイクルを与えた。この電位サイクルの適用により、金属薄膜１０４９上のヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を不活性化した。最後に、参照電極、リン酸バッファ溶液、カバーシール、ポテンシオスタット、ファンクションジェネレータ等を取り除き、光学分析用チップＶＩＩを得た。【０１５９】
この光学分析用チップＶＩＩを実施例５と同様に表面プラズモン共鳴装置に設置し、フローセルをセッティングし、牛乳を導入して表面プラズモン共鳴を測定した。測定領域と参照領域との差分測定におけるベースラインの変化は、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下に抑えることができた。
（実施例９）
２つの開口部１０３０、１０３２が設けられたカバーシール付き金／ガラス基板について、これら２つの開口部１０３０、１０３２にヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧのリン酸バッファ溶液を滴下し、開口部１０３２の参照領域に相当する部分にのみｐＨ１．６８の標準緩衝液（ナカライ社製）を滴下し、抗体の選択性を低下させた。その他は、実施例５と同様に溶液を吸い取って、光学分析用チップＶＩＩＩを得た。この光学分析用チップＶＩＩＩを実施例５と同様に表面プラズモン共鳴装置に設置し、フローセルをセッティングし、牛乳を導入して表面プラズモン共鳴を測定した。測定領域と参照領域との差分測定におけるベースラインの変化は、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下に抑えることができた。
（実施例１０）
以下のＡ鎖（配列番号１）およびＢ鎖（配列番号２）を有するＤＮＡを含むリン酸バッファ溶液を準備した。Ａ鎖は測定領域用のＤＮＡであり、Ｂ鎖は参照領域用のＤＮＡである。【０１６０】
Ａ鎖：5'-CCT CTG ACT TCA ACA GCG ACA CT-3'  （配列番号１）
Ｂ鎖：5'-CCT CAG ACT TCA ACA GGG ACA CT-3'  （配列番号２）
２つの開口部１０３０、１０３２が設けられたカバーシール付き金／ガラス基板について、開口部１０３０にＡ鎖を含むリン酸バッファ溶液を滴下し、開口部１０３２にＢ鎖を含むリン酸バッファ溶液を滴下し、実施例５と同様に溶液を吸い取って、ＤＮＡを金薄膜状に固定して、光学分析用チップＸを得た。この光学分析用チップＸを実施例５と同様に表面プラズモン共鳴装置に設置し、フローセルをセッティングし、牛乳を導入して表面プラズモン共鳴を測定した。測定領域と参照領域との差分測定におけるベースラインの変化は、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下に抑えることができた。
（実施例１１）
図１７に示すような、複数の観測部を有する光学分析用チップを調製した。ヤギから抽出した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液と、ヤギから抽出した抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）のリン酸バッファ溶液を、観測部１０１０の測定領域および参照領域にそれぞれ滴下した。また、観測部１０１１には、実施例１０で用いたＤＮＡのＡ鎖およびＢ鎖を、観測部１０１１の測定領域および参照領域にそれぞれ滴下した。各領域の溶液を吸い取った後、抗体およびＤＮＡの両方を固定化した光学分析用チップＸＩを得た。この光学分析用チップＸを実施例５と同様に表面プラズモン共鳴装置に設置し、フローセルをセッティングし、牛乳を導入して表面プラズモン共鳴を測定した。抗体を固定した測定領域および参照領域と、ＤＮＡを固定した測定領域および参照領域の差分測定におけるベースラインの変化は、それぞれ、１０−６［ｄｅｇ・ｓ−１］以下に抑えることができた。
（実施例１２）
実施例５で作製した光学分析用チップＩを用いて、５０ｎｇ・ｍＬ−１のヒトＩｇＧ抗原を含む牛乳から成る液体サンプルを、実施例５で説明したような表面プラズモン共鳴装置とフローセルを備えた測定装置に導入し、表面プラズモン共鳴を測定した。その結果、ベースラインのレベルと比較して、｛θ（測定領域）−θ（参照領域）｝で表されるシグナルの、明らかに傾きの大きな応答が得られた（図２４参照）。なお、ベースラインのレベルは、液体サンプルを導入する前に、ヒトＩｇＧを含まない牛乳を用いて測定して得られたものである。【０１６１】
上記の結果は、不活性化していない抗ヒトＩｇＧを固定化した測定領域において、より多くのヒトＩｇＧ抗原が結合したことを示すものである。一方、上記の結果は、参照領域に固定化した不活性化された抗ヒトＩｇＧのヒトＩｇＧ抗原に対する選択性は、測定領域に比べ低くなっていることを示している。【０１６２】
次に、実施例６から９で調製した光学分析用チップＶ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩについても、５０ｎｇ・ｍＬ−１のヒトＩｇＧ抗原を含む牛乳から成る液体サンプルを用いて、同様に表面プラズモン共鳴を測定した。測定の結果、図２４に示したのと同様の傾きを持つ応答が得られた。このことは、不活性化を行っていないか、あるいは、プロテインエンジニアリングを受けていない抗ヒトＩｇＧ抗体を固定化した測定領域において、より多くのヒトＩｇＧ抗原が結合されたことを示すものである。一方、上記の結果は、参照領域に固定化した不活性化された抗ヒトＩｇＧのヒトＩｇＧ抗原に対する選択性は、測定領域に比べ低くなっていることを示している。【０１６３】
次に、光学分析用チップＸを用いて、Ａ鎖と特異的な結合を形成するＣ鎖（配列番号３）からなるＤＮＡを１ｎｍｏｌ・ｍＬ−１含有する牛乳を調製し、上述と同様に表面プラズモン共鳴を測定した。【０１６４】
Ｃ鎖：3'-GGA GAC TGA AGT TGT CGC TGT GGG TG-5'  （配列番号３）
その結果、ＤＮＡを含まない牛乳から得られたベースラインのレベルより大きな傾き、３×１０−５［ｄｅｇ・ｓ−１］の応答が得られた。【０１６５】
また、抗体およびＤＮＡを固定化した光学分析用チップＸＩを用いて、５０ｎｇ・ｍＬ−１のヒトＩｇＧ抗原およびＣ鎖からなるＤＮＡを含む牛乳サンプルについて、同様に表面プラズモン共鳴を測定した。その結果、｛θ（測定領域）−θ（参照領域）｝で表されるシグナルとして、抗体を固定化した観測部では、ベースラインレベルより大きく、かつ図２４に示したのと同じ傾きの応答が得られ、ＤＮＡを固定化した観測部では、前述と同様の３×１０−５［ｄｅｇ・ｓ−１］の応答が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明の光学分析用チップは、分子と固定化された分子選択性物質との結合を直接観察することができる全反射光学系を用いる光学的測定方法に利用可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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