(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗エストロゲン薬剤を含む治療に対する乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測する方法であって、ハイブリダイゼーション特性において、その５'−位置で非メチル化されるシトシン塩基をシトシンと異なって検出され得る塩基に変換する少なくとも１つの薬剤に、治療前あるいは治療中に被検者から得た生体試料中の標的核酸の少なくとも１つを接触させることによって、PITX2遺伝子および／またはそれらの制御領域を含む少なくとも１つの標的核酸のメチル化パターンを分析することを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載のPITX2遺伝子の分析において、
−STMN1, PSAおよびCGAからなる群から選択される、または
−ONECUT2, WBP11,CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PSAT1, CGA および PCAFからなる群から選択される、
遺伝子がさらに分析される方法。
【請求項３】
請求項１に記載のPITX2遺伝子の分析において、TP53, PTGS2, CYP2D6, MSMB,WBP11, TMEFF2, ESR1, ERBB2およびPCAFからなる遺伝子群から選択される遺伝子がさらに分析される方法。
【請求項４】
前記遺伝子群は、WBP11,TMEFF2, ESR1, ERBB2およびPCAFからなる群である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸は、配列番号: 27, 83,90および91、ならびにこれらに相補的な配列からなる群から得られる１つまたはそれ以上の配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸は、配列番号: 126, 137,129, 125, 132, 122, 123, 131, 133, 134, 127, 130, 135, 124, 128および136、およびこれらに相補的な配列からなる群から得られる１つまたはそれ以上の配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
乳房組織の前記細胞増殖障害は、インサイチュ管癌腫、小葉癌腫、膠質癌腫、尿細管癌腫、髄様癌、異形成癌腫、インサイチュ管内癌腫、インサイチュ小葉癌腫およびインサイチュ乳頭癌腫からなる群から選択される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記被検者は、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体陽性である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療は、乳房組織の再発性または転移性細胞増殖障害の処置のための治療である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療は補助的治療である、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検者は化学治療を受けなかった、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号: 411, 412, 515,516, 685, 686, 789および790、ならびにこれらに相補的な配列からなる群から選択される配列のうちの１つによる長さが少なくとも１８塩基の配列の核酸分子からなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（PNA）−オリゴマーであって、配列番号:411, 412, 515, 516, 685, 686, 789および790に記載の核酸配列のうちの１つにハイブリダイズするかあるいは同一である、長さ少なくとも１８ヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列のオリゴマーからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１４】
塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１３に記載されるオリゴマーからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１５】
請求項１３または１４のいずれかに記載される少なくとも２つのオリゴマーを含むオリゴマーのセットからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１６】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相体に結合していることを特徴とする請求項１３〜１５に記載されるオリゴヌクレオチドのセットからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１７】
配列番号: 411, 412, 515, 516, 685, 686, 789および790、ならびにこれらに相補的な配列のうちの１つを含む核酸配列の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用される、請求項１３〜１５のうちの１つに記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１８】
重亜硫酸塩試薬ならびに請求項１３〜１７の１つに記載されるオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーを含むキットからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【請求項１９】
さらに、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、Ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｇｈｔ、Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔｈｙｌ、核酸配列決定およびこれらの組合せからなる群から得られるメチル化分析を実施するための標準的試薬を含む、請求項１８に記載のキットからなるタモキシフェン治療における乳房組織の細胞増殖障害を有する被検者の反応性を予測するための診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子生物学における近年の方法論的発展によって研究されてきた観察のレベルは、遺伝子そのもの、これらの遺伝子のＲＮＡへの翻訳およびその生成タンパクである。個々の発生過程のどの時点でどの遺伝子にスイッチが入るか、また、いかにして特定細胞および組織の特定遺伝子の活性化および阻害が制御されるかの問題は、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度および特性に相互に関連している。この点で、病的状態が個々の遺伝子またはゲノムの変化したメチル化パターンにおいて、自らを明らかにするであろう。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡメチル化は、例えば、転写制御、遺伝的刷り込みおよび腫瘍形成においてある役割を演じている。したがって、遺伝情報の１構成成分として、５−メチルシトシンの同定はかなり興味あるものである。しかしながら、５−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対挙動を有するから、５−メチルシトシン位置は配列決定によって同定することができない。さらに、５−メチルシトシンによってもたらされる後成的情報は、ＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【０００３】
５−メチルシトシンのＤＮＡ分析のための相対的に新しく、かつ目下、最も頻繁に使用される方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特異的な反応に基づく。これはその後のアルカリ加水分解において、その塩基対形成挙動でチミジンに対応するウラシルに変換される。しかしながら、５−メトルシトシンはこれらの条件下で未変性のまま残存する。その結果、そのハイブリダイゼーション挙動でシトシンと元来、区別され得ないメチルシトシンが、「正常な」分子生物学的技術を使用して、例えば増幅およびハイブリダイゼーションまた配列決定によって、唯一、残存するシトシンとして検出され得るような方法で、元のＤＮＡを変換する。これらの技術の全ては、完全に活用され得る塩基対形成に基づく。感度からみて、先行技術はアガロースマトリックス中で分析されるＤＮＡを包埋する方法に限定され、すなわち、ＤＮＡの拡散および再生を阻止し（重亜硫酸塩のみが単鎖ＤＮＡと反応する）、そして高速透析で沈殿および精製工程の全てを置換する（オレク(Olek)A,  オズワルド(Oswald）J, ウォルター(Walter)J,「重亜硫酸塩系シトシンメチル化分析のための修正および改良方法」Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6）。本方法を使用すると、個々の細胞を分析することが可能となり、これが本方法の潜在性を示す。しかしながら、目下、長さが約３０００塩基対以下の個々の領域のみが分析されるが、数千の可能性あるメチル化事象に関する全体的な細胞分析は可能ではない。しかしながら、本方法は少量のサンプルから得た非常に小さな断片を確実に分析することはできない。これらは拡散を保護するにもかかわらずマトリックス中で失われる。
５−メチルシトシンを検出する別な公知方法に関する概要は、次の総説文献：レイン(Rein)T、デパムフィリス(DePamphilis)M.L,  ゾルバス(Zorbas)H,   Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255から集めてもよい。
【０００４】
現在まで、いくつかの例外（例えば、ツェシュニック(Zeschnigk)M、リッチ(Lich)C、ビュティング（Buiting）K、ドエルフラー(Doerfler)W、ホルステムケ(Horsthemke)B、「ＳＮＲＰＮ座のアレル変異メチル化相違に基づくアンジェルマンおよびプラダー・ウィリー症候群の診断のための単管ＰＣＲ試験」、Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8）を除いて、重亜硫酸塩技術が唯一、研究において使用されている。しかしながら、いつも公知遺伝子の短い特定断片が重亜硫酸処理に続いて増幅され、いずれかが完全に配列決定されるか（オレク(Olek)A、ウォルター(Walter)J、「Ｈ１９メチル化刷り込みの移植前個体発生」、Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6）または個々のシトシン位置がプライマー伸長反応（ゴンザルゴ(Gonzalgo)ML、ジョーンズ(Jones)PA、「メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）を使用する特定部位でのメチル化相違の迅速定量」、Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31、ＷＯ９５／００６６９）または酵素分解（ション(Xiong)Z、レアード（Laird）PW、COBRA：「高感度および定量的ＤＮＡメチル化分析」、Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4）よって検出される。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出もまた、記述されている（オレク(Olek)ら、ＷＯ９９／２８４９８）。
【０００５】
個々の遺伝子のメチル化検出における重亜硫酸塩技術の使用を扱っている別な刊行物は、グリッグ(Grigg)G、クラーク(Clark)S、「ゲノムＤＮＡの５−メチルシトシン残基の配列決定」、Bioassays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431；ツエシュニク(Zeschnigk)M、シュミッツ(Schmitz)B、ディトリッチ(Dittrich)B、ビューティング(Buiting)K、ホルステムケ(Horsthemke)B、ドエルフラー(Doerfler)W、「ヒトゲノム中の刷り込みされたセグメント：ゲノム配列決定法により測定されたプラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群領域中の異なったＤＮＡメチル化パターン」、Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3)387-95；フェイル(Feil)R、チャールトン(Charlton)J、バード(Bird)AP、ウォルター(Walter) J、レイク(Reik)W、「個々の染色体上のメチル化分析：重亜硫酸塩ゲノム配列決定の改良プロトコール」、Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6；マーチン(Martin)V、リビエラス(Ribieras)S、ソン−ウォン(Song-Wang)X、リオ(Rio)MC、ダンテ(Dante)R、「ゲノム配列決定はｐＳ２遺伝子の５'領域中のＤＮＡ低メチル化とヒト乳癌セルラインでのその発現の相関性を示す」、Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4:ＷＯ９７／４６７０５、WO９５／１５３７３およびＷＯ９５／４５５６０がある。
オリゴマーアレー製造における先行技術の概要は、１９９９年１月に発行されたNature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement, Volume21, January 1999)およびそこに引用された文献から集めることができる。
【０００６】
蛍光標識されたプローブは、しばしば、固定化ＤＮＡアレーのスキャニングに使用される。特異的プローブの５'−ＯＨへのＣｙ３およびＣｙ５染料の単純な結合は、蛍光標識において特に適している。ハイブリダイズされたプローブの蛍光検出は、例えば、共焦点顕微鏡によって実施してもよい。とりわけ、Ｃｙ３およびＣｙ５染料は市販されている。
【０００７】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生物分子の分析には非常に効率的な開発である（カラス(Karas)M、ヒレンカムプ（Hillenkamp）F、「１０，０００ダルトンを超える分子質量を有するタンパクのレーザー脱離イオン化」、Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301）。分析物は光吸収性マトリックス中に包埋される。マトリックスを短いレーザーパルスで蒸発させ、未断片化方法で蒸気相中へ分析物分子を輸送する。分析物はマトリックス分子の衝突によってイオン化される。適用された電位がこのイオンをフィールドフリー飛行管中へ加速する。その異なった質量によって、イオンは異なった速度で加速される。より小さなイオンは大きなものよりも早く検出器へ届く。
【０００８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定は、ペプチドおよびタンパクの分析にきわめて適している。核酸の分析はいくぶんより困難である（グット(Gut)IG、ベック(Beck)S、「ＤＮＡおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分光分析」、Current Innovations and Future Trends 1995, 1;147-57）。核酸の感度は、ペプチドよりも約１００倍も悪く、断片サイズが大きくなるにつれて反比例して減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスによるイオン化方法は、かなり効率が低い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定では、マトリックスの選択が著しく重要な役割を果たす。ペプチドの脱離には、非常に微細な結晶化を生じるいくつかの効率的なマトリックスが見出されている。ＤＮＡに対するいくつかの反応性マトリックスが今では存在するが、しかしながら、感度の相違はまだ減少していない。感度の相違は、ペプチドにより類似するような方法にて、ＤＮＡを化学的に変性することによって減少させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル化化学を使用して電荷中性ＤＮＡに変換され得る（グット(Gut)IG、ベック(Beck)S、「選択的ＤＮＡアルキル化のための手法と質量分析による検出」、Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73）。この変性ＤＮＡへの電荷タグの結合は、ペプチドにおいて見られた感度と同じ程度に感度が増加する。電荷タギングのさらなる利点は、未変性基質の検出をかなり困難なものとする不純物に対する分析における大きな安定性である。
ゲノムＤＮＡは標準方法によって細胞、組織または他の試験試料ＤＮＡから得られる。この標準的方法論は、フリッシュ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)編、Molecular Cloning：「研究室マニュアル」、1989などの参考文献に見られる。
【０００９】
乳癌は目下、女性の中で第２番目に多いタイプの癌である。２００１年には、浸潤性乳癌の１９０，０００以上の新規な症例およびインサイチュ乳癌の４７，０００以上の付加的な症例が診断された。発生率および死亡率は年齢とともに増加していて、１９９４年〜１９９８年の期間に、年齢２０〜２４歳の女性の乳癌発生率は、人口１００，０００人当たり、たった１．５人であった。しかしながら、そのリスクは年齢７５〜７９歳の中では４８９．７人に増加している。死亡率はここ十年では約５％減少していて、５年生存率に与える要素は、年齢、癌の状態、社会経済的要因および人種を含む。
【００１０】
乳癌は乳房組織内の細胞の制御されない増殖として定義される。乳房は管によって互いに結合された１５〜２０の葉からなる。癌は管内で最も多く生じるが、炎症性乳癌と呼ばれる最も稀なタイプの癌では葉内でも見出される。
【００１１】
乳癌の早期検出、分類および治療の方法を改良する必要性が絶えず存在することは当業者には理解されるであろう。子宮頸癌および皮膚癌などのいくつかの他の多くの癌の検出とは逆に、乳癌を分類および検出するには固有の困難性が存在する。
【００１２】
いかなる治療法も第１ステップは、この疾患の定義された分類と対比した患者状態の評価である。しかしながら、このようなシステムの価値は、分類の質に固有に依存している。乳癌はその大きさ、位置および転移の発生により段階付けされる。治療法としては外科手術、放射性治療、化学治療およびホルモン治療が挙げられる。これらはまた、外科手術に対する補助的治療としても使用される。
【００１３】
ホルモン治療は癌細胞へのエストロゲンの影響を阻止するか、または血清エストロゲン濃度を減少させるために開発されている。タモキシフェン（ＴＡＭ）は乳癌患者のための最も広く使用される抗エストロゲン薬剤である。これは乳癌細胞のエストロゲン刺激を阻止し、エストロゲン受容体の転座および核結合を阻害するように作用する。ＴＡＭは原発性乳癌患者のための補助的活動環境(setting)および転移性疾患の治療のために使用され、その有効性はいくつかの臨床試験で立証されている。５年間の治療は年間の疾患再発率を４７％まで減少させ、年間の死亡率を２６％まで減少させていて、この減少は異なった年齢群において類似している。また、これは対側性乳房腫瘍を発生する頻度を減少させる。ＴＡＭは最も毒性の少ない抗悪性腫瘍薬であるが、ある組織にはエストロゲン特性を有するので、これはリスクが子宮内膜癌の３倍に増加する。他のホルモン治療としては、アロマターゼ阻害剤が挙げられる。これは脂肪組織（閉経後の女性のエストロゲンの主要な起源）中の酵素、アロマターゼを遮断し、脂肪組織中のエストロゲンが減少あるいは消滅することとなる。また、エストロゲン受容体を遮断または調整する新規な薬剤が開発されていて、それらは一般にＳＥＲＭ＝選択的エストロゲン受容体調整剤として要約されている。腫瘍に対して入手可能なエストロゲンの量を減少させるなおも他の方法は、性ホルモン制御のフィードバックループを妨害する薬剤（ＬＨ−ＲＨ類似体）をより高濃度に投与することにある。
【００１４】
一般的に、ホルモン治療の副作用は化学療法に比べて害が少ない。しかしながら、ホルモン治療は癌では成長因子としてのエストロゲンを除去あるいは減少させるので、これらは成長因子としてエストロゲンに依存する腫瘍のみに作用する。機能的ＥＲ経路を有しない癌の成長は、ホルモン治療によって調整することができない。
【００１５】
癌がホルモン治療に対して反応するか否かを決定する現在の方法は、ホルモン受容体の発現を分析することである。ある患者群のみが治療から恩恵を受けるであろうから、ホルモン受容体の状態はいかなるホルモン治療の前にも試験されるべきである。この目的では、ＥＲ（エストロゲン受容体）およびＰＲ（プロゲレステロン受容体）状態が全ての患者において規定通り試験され、これらは反応の予測マーカー（予測マーカーまたは因子とは特定の治療に対する反応または反応の欠如に関する測定値である）として考慮される。ＥＲ状態は、補助的ホルモン治療活動環境およびまた進行した転移性疾患における反応の予測である。
【００１６】
目下、ＥＲ陽性およびＰＲ陽性患者はＴＡＭ治療を受け、患者の残り１０％は化学治療を受けている。問題はホルモン治療がホルモン受容体陽性患者の下位群にのみ有効であり、またＥＲ陰性患者はＴＡＭに対して最初から反応するようであることにある。それ故、非反応者の下位群はホルモン治療から恩恵を受けないのみならず、その逆効果を受け、代わって化学治療を受ける機会を失うであろう。他方、ホルモン治療から恩恵を受けることができたＥＲ陰性下位群は、代わりの化学治療を受けるであろう。数種の異なった分析が生化学およびＩＨＣ（免疫組織化学）分析を含み、ＰＲおよびＥＲを測定するために入手可能であるが、染色方法の標準化の欠如および研究室間の可変性(variability)が存在する（Clin. Cancer Res 2000, 6:616-621）。
【００１７】
目下、数種の予測マーカーが評価中である。現在までにほとんどの患者はホルモン治療としてタモキシフェンを投与されていて、マーカーのほとんどはタモキシフェンに対する反応または抵抗に関与していることが示されている。しかしながら、どれか一方または他方のホルモン治療に対する反応の間には大きな重複が存在すると一般的に想定されている。実際、ＥＲおよびＰＲ発現はいかなるホルモン治療においても患者を選択するために使用される。ＴＡＭに関与しているマーカーの中で、反応はｂｃｌ−２である。高濃度のｂｃｌ−２は、転移性疾患患者におけるＴＡＭ治療反応と延命とのの有望な相関性を示し、ＥＲ陰性患者下位群に対して価値ある情報を加えた（(J Clin Oncology 1997, 15 5:1916-1922; Endocrine, 2000, 13(1):1-10)。さらに、評価および確認を必要とする進行性乳癌の患者においてｃ−ｅｒＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）過剰発現の独立した予測値に関する確信ある証拠が存在する(British J of Cancer 1999, 79 (7/8):1220-1226; J Natl Cancer Inst, 1998,90 (21): 1601-1608)。
【００１８】
他の予測マーカーとしては、ＳＲＣ−１（ステロイド受容体活性化補助因子−１）、ＣＧＡ遺伝子過剰発現、細胞動力学およびＳ相分画分析( Breast Cancer Res and Treat , 1998, 48:87-92; Oncogene 2001, 20:6955-6959)が挙げられる。近年、ｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）およびＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤タイプ１）が、互いに予後の悪い患者の下位群と補助的全身治療の恩恵を受ける患者の下位群を明確にするために有用であることを示した(J Clinical Oncology, 2002, 20 n°4)。これらのマーカーの全てはまだ反応の確証されたマーカーではないので、さらに見込みある治験における評価を必要とする。
【００１９】
多くの癌関連遺伝子は、乳房腫瘍形成中にＣｐＧアイランドの高メチル化によって不活性化されることが示されている。カルシウム結合タンパクＳ１００Ａ２（受託番号ＮＭ＿００５９７８）の低下した発現は、乳癌の発症に関連している。この遺伝子のプロモーター領域の高メチル化が新生物細胞中に観察されて、腫瘍細胞中のＳ１００Ａ２抑制が部位特異的メチル化によって仲介されるとの証拠を提供する。
【００２０】
ＳＹＫ遺伝子（受託番号ＮＭ＿００３１７７）は造血細胞中で多量に発現するタンパクチロシンキナーゼ、Ｓｙｋ（脾臓チロシンキナーゼ）をコードする。Ｓｙｋは正常乳房管上皮細胞中で発現するが、浸潤性乳癌のサブセットでは発現しない。また、Ｓｙｋ発現の損失は、大きな移動および浸潤などの悪性表現型に関連しているようである。発現の損失はＤＮＡ高メチル化の結果として、ユアン(Yuan) Y, メンデツ(Mendez) R, サヒン(Sahin) A およびダイ（Dai）JL (「高メチル化はヒト乳癌のＳＹＫ遺伝子のサイレンシングとなる。」Cancer Res. 2001 Jul 15;61(14):5558-61)（非特許文献１）が示すように、転写レベルで生じる。
【００２１】
ＴＧＦ−β２型受容体（ＴＧＦＢＲ２遺伝子、ＮＭ＿００３２４２がコードする）は、セリン／スレオニンキナーゼの複合体を経て膜透過情報伝達経路である役割を果たす。遺伝子の変異は乳房を含めて、いくつかの原発性腫瘍および数種の腫瘍誘導セルライン中に検出されている(ルッケ(Lucke) CD, フィルポット(Philpott) A, メトカルフェ(Metcalfe) JC, トンプソン(Thompson) AM, ヒューズ−デイビーズ(Hughes-Davies) L, ケンプ(Kemp) PR, ヘスキース(Hesketh) R「反復性ヒト乳癌のトランスフォーミング成長因子β２型受容体中の変異阻止」Cancer Res. 2001 Jan 15;61(2):482-5.)（非特許文献２）。
【００２２】
ＣＯＸ７Ａ２ＬおよびＧＲＩＮ２Ｄ遺伝子は、ＣｐＧ−ＧＢＳ（ゲノム結合部位）法を使用して、ワタナベ(Watanabe)ら、(「CpGアイランドライブラリーによるエストロゲン反応性遺伝子の単離」 Molec. Cell. Biol. 18: 442-449, 1998.)（非特許文献３）により新規なエストロゲン反応性要素としてともに同定された。ＣＯＸ７Ａ２Ｌ遺伝子（受託番号ＮＭ＿００４７１８）はペプチド２−様チトクロームＣオキシダーゼサブユニットＶIIＡをコードする。ノザンブロット分析は乳癌セルラインのエストロゲン治療後にＣＯＸ７Ａ２Ｌの上流制御を検出した。ＧＲＩＮ２Ｄ遺伝子（受託番号ＮＭ＿０００８３６）はＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート、向イオン性、サブユニット２Ｄグルタメート受容体、神経伝達系に関与するＮＭＤＡ受容体チャンネルのサブユニットをコードし、さらに、ｃＤＮＡの発現は骨肉腫セルライン中に観察されている。ＶＴＮ遺伝子（ビトロネクチン受託番号ＮＭ＿０００６３８としても公知である。）はインビトロで動物細胞の付着および拡延を促進し、補体Ｃ５ｂ−９複合体により細胞溶解を阻止し、そして血液凝固においてアンチスロンビンIII−スロンビン作用を調整する７５ｋＤグリコプロテイン（血清拡延性因子または補体Ｓ−プロテインとも呼ばれる）をコードする。さらに、この遺伝子の発現は癌細胞の進行および浸潤に連結している。
【００２３】
ＳＦＮ遺伝子（ストラチフィンとしても公知である）は、１４−３−３ファミリー、１４−３−３シグマのポリペプチドをコードする。１４−３−３ファミリーのタンパクはホスホセリン含有タンパクに結合してシグナル伝達を仲介する。ＳＦＮ遺伝子の発現は乳癌では失われ、これは新生物形質転換の初期段階での高メチル化によるようである（ウムブリヒト(Umbricht) CB, エブロン(Evron) E, ガブリエルソン(Gabrielson) E, フェルグソン(Ferguson) A, マークス(Marks) J, スクマー(Sukumar) S. 「１４−３−３シグマ（ストラチフィン）の高メチル化は乳癌の初期現象である。」Oncogene. 2001 Jun 7;20(26):3348-53)（非特許文献４）。
【００２４】
ＰＳＡ−Ｔとしても公知であるＰＳＡ遺伝子（受託番号ＮＭ＿０２１１５４）は、前立腺特異的抗原をコードし、その技術的に正しい名称がカリクレイン３であるＰＳＡ（受託番号ＮＭ＿００１６４８）として一般に呼ばれる遺伝子と混同されることはない。ＰＳＡ−Ｔ遺伝子はセリン生合成経路中の第２工程の触媒酵素であるタンパク、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする。遺伝子発現レベルの変化は、ｍＲＮＡ発現分析によってモニターされ、遺伝子の上流制御が６試料の研究において結腸癌腫中で同定されている(Electrophoresis 2002 Jun;23(11):1667-76 「結腸癌腫における遺伝子発現のｍＲＮＡ差異的ディスプレー」、オヤラ(Ojala) P, サンドストローム(Sundstrom) J, グロンロース(Gronroos) JM, ビルタネン(Virtanen) E, タルビネン(Talvinen) K,ネバライネン(Nevalainen) TJ.)。
【００２５】
スタチミン遺伝子（ＮＭ＿００５５６３）は、微小管動態を制御する保存細胞内可溶質リンタンパク質であるスタチミンとしても公知である腫瘍性タンパク１８をコードする。このタンパクは種々のヒト悪性腫瘍で多く発現する。ヒト乳癌では、スタチミン遺伝子は腫瘍のサブセット中で上流制御されることが示されている。
【００２６】
ＰＲＫＣＤ遺伝子はタンパクキナーゼＣ酵素ファミリーの一員をコードし、Ｂ細胞情報伝達および成長、アポトーシスおよび種々の細胞型の差異の制御に関与している。
【００２７】
これらの分子のいくつかはカスケート様方式で相互作用する。ＳＴＭＮ１を標的とするＰＲＫＳＤ活性はＳＦＮ結合およびＳＹＫリン酸化によって調節される。これはともに細胞分割を必要とするチューブリン重合に影響を与える。
【００２８】
ＭＳＭＢ遺伝子（受託番号ＮＭ＿００２４４３）は１０ｑ１１．２に位置するとされている。これは前立腺が分泌する主要なタンパクの１つであるβ−ミクロセミノタンパク（ＭＳＰ）をコードする。さらに、これは前立腺癌の診断マーカーとして有用である。ｍＲＮＡ分析を使用すると、低濃度のβ−ＭＳＰｍＲＮＡ発現とタンパクがホルモン治療の進行に関連し、かつ、これは潜在的侵襲性前立腺癌の徴候であると推定されている(サカイ(Sakai) H, ツルサキ(Tsurusaki) T, カンダ(Kanda) S, コージ(Koji) T, スアン(Xuan) JW, サイトウ(Saito) Y.「前立腺癌におけるβ−ミクロセミノプロテインｍＲＮＡ発現の予後的意義」Prostate.1999 Mar 1;38(4):278-84.)。
【００２９】
ＴＰ５３遺伝子（受託番号ＮＭ＿０００５４６）は最もよく特性化されている腫瘍抑制タンパクの１つであるタンパクｐ５３をコードする。ｐ５３タンパクは転写因子として作用し、細胞サイクルの主要な制御因子として働く。変異によるこの遺伝子の不活性化は、細胞サイクルを破壊し、代わって腫瘍形成を助ける。この遺伝子に関連するメチル化変化は乳癌では有意であると報告されている。サラスワチ(Saraswati)ら、 (Nature405, 974 - 978 (22 Jun 2000)「弱められたＨＯＸ５機能はヒト乳房腫瘍におけるｐ５３発現を制限することができる」（非特許文献５）は、乳房腫瘍における低濃度のｐ５３ｍＲＮＡがＨＯＸＡ５遺伝子のメチル化に関連していると報告している。ＨＯＸ５Ａ遺伝子産物は、ｐ５３のプロモーター領域に結合し、この遺伝子の発現を仲介する。ｐ５３遺伝子そのもののプロモーター領域のメチル化は報告されている（カン(Kang) JH, キム(Kim) SJ, ノー(Noh) DY, パク(Park) IA, コー(Choe) KJ, ヨー(Yoo) OJ, カン(Kang) HS「ｐ５３プロモーターのメチル化は乳房発癌への補充経路である：インサイチュ管癌腫から浸潤性管癌腫への進行におけるｐ５３プロモーターのＣｐＧメチル化とｐ５３遺伝子の変異との相関性」Lab Invest. 2001 Apr;81(4):573-9.)（非特許文献６）。ここで、ｐ５３プロモーター領域のＣｐＧメチル化は乳癌で見出されることが証明され、かつ、ｐ５３プロモーター領域のメチル化は乳房腫瘍の新生物進行への別な経路であると仮定された。タモキシフェンによる治療はｐ５３遺伝子の発現の程度を減少させることが観察されている（ファクザジィ(Farczadi) E, カスザス(Kaszas) I, バキ(Baki) M, スゼンデ(Szende) B、「短期間のタモキシフェン治療後の乳房腫瘍におけるアポトーシス、有糸分裂、Ｈｅｒ−２、ｐ５３およびＢｃ１２発現の変化」Neoplasma. 2002;49(2):101-3)。
【００３０】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子（受託番号ＮＭ＿０００１０６）はヒトチロクロームＰ４５０（ＣＹＰ）スーパーファミリーの１員である。このファミリーの多くのメンバーは薬剤代謝に関与している（例えば、Curr Drug Metab. 2002 Jun;3(3):289-309,ドロリンゲス(Rodrigues)AD, ラシュモア(Rushmore)TH参照)。これらのチトクロームＰ４５０のうち、ＣＹＰ２Ｄ６は最も広範囲に特性化されている。これは非常に多型であり（この遺伝子の７０以上の変異体が記載されている）、かつ、アレル変異が酵素活性の増加と減少となる。ＣＹＰ２Ｄ６酵素は抗うつ薬、神経遮断薬、いくつかの抗不整脈薬を含む多数の臨床的に重要な薬剤の代謝を触媒する(Nature 1990 Oct 25;347(6295):773-6「チトクロームＰ４５０ＣＹＰ２Ｄ座位での一次遺伝子欠損の同定」グー(Gough) AC, マイルス(Miles)JS, スパー(Spurr)NK, モス(Moss)JE, ゲディック(Gaedigk)A, アイケルバウム(Eichelbaum)M, ウォルフ(Wolf)CR)）。
【００３１】
ＰＴＧＳ２遺伝子（受託番号ＮＭ＿０００９６３）はプロスタグランジン−エンドパーオキシドシンターゼ（プロスタグランジン−エンドパーオキシドシンターゼ２）の誘導性アイソザイムをコードする。この遺伝子の異常なメチル化は、肺癌で同定されている(Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002 Mar;11(3):291-7 「ＤＮＡメチル化マーカーを使用する肺癌セルラインの階層的クラスター形成」、ビルマニ(Virmani)AK, ツー(Tsou)JA, シーグムンド(Siegmund)KD,シェン(Shen)LY, ロング(Long)TI, レアード(Laird)PW, ガツダー(Gazdar)AF, レアード−オフリンガ(Laird-Offringa)IA.)。
【００３２】
ＣＧＡ遺伝子（受託番号ＮＭ＿０００７３５）はグリコプロテインホルモンのα−ポリペプチドをコードする。さらに、これはエストロゲン受容体α（ＥＲα）−反応性遺伝子として同定されていて、その遺伝子の過剰発現は乳癌のＥＲ陽性に関連している。ビーチェ(Bieche)らは補助的タモキシフェン治療に続く一次外科手術により治療した１２５ＥＲα−陽性の閉経後乳癌患者におけるこの遺伝子のｍＲＮＡ濃度を試験した。最初の結果は、ＣＧＡ遺伝子過剰発現とスカーフ−ブルーム−リチャードソン(Scarff-Bloom-Richardson)組織病理学的グレードＩ＋IIとプロゲステロンおよびエストロゲン受容体陽性と間の有意な関連を示した。これはＣＧＡが腫瘍攻撃性が低いマーカーであることを示唆した(「乳癌の新規なエストロゲン受容体反応性遺伝子としてのＣＧＡの同定：ホルモン治療への反応を予測するための傑出した候補マーカー」Cancer Research, 61, 1652-1658, February 15, 2001,イワンビーチェ(Ivan Bieche), ベアトリスパーフェ(Beatrice Parfait),ビビアンルドウサル(Vivianne Le Doussal), マーチンオリビ(Martine Olivi), マリー−クリスチンリオ(Marie-Christine Rio), ロゼットリデロー(Rosette Lidereau)およびマイケルビドウド(Michel Vidaud)（非特許文献７）。さらに、ｍＲＮＡ発現分析はＣＧＡ発現濃度をタモキシフェン反応に関連させ、ＥＲＢＢ２マーカー（反応不良マーカー）分析と組み合わせると、この遺伝子は乳癌のタモキシフェン反応の予測的マーカーとして有用であると推論されている(Oncogene 2001 Oct 18;20(47):6955-9「ＥＲα−陽性閉経後乳癌患者のホルモン治療に対する反応の新規な予測者であるＣＧＡ遺伝子」ビーチェ(Bieche) I, パーフェ(Parfait) B, ノグーズ(Nogues) C, アンドリュー(Andrieu) C, ビダウド(Vidaud) D, スピラトス(Spyratos) F, リンデロー(Lidereau) R, ビダウド(Vidaud) M)（非特許文献８）。著者達はタモキシフェン治療反応とともにＣＧＡ遺伝子の発現に関連する有意なデータを提供している。しかしながら、この分析は全てｍＲＮＡ発現の相対的濃度分析に焦点を合わせている。これは中または高処理能力に適した方法論ではなく、臨床分析の開発における好適な原理でもない。
【００３３】
ＰＩＴＸ−２遺伝子（ＮＭ＿０００３２５）は眼、歯および脳下垂体前葉などの前方構造の発達中に発現されることが知られている転写因子（ＰＩＴＸ−２）をコードする。この遺伝子の発現は細胞分化および増殖に関連しているけれども、これまで発癌での役割またはホルモン治療に対する反応は認識されていない。さらに、この遺伝子のメチル化状態の公知分析は現在まで報告されていない。
【００３４】
ＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｒａｓ関連ドメインファミリー１Ａ）遺伝子は３ｐ２１．３での候補腫瘍抑制因子遺伝子である。ＲａｓＧＴＰアーゼは細胞増殖および細胞外シグナルに対する反応におけるアポトーシスを制御する分子スイッチのスーパーファミリーである。ＲＡＳＳＦ１Ａは腫瘍抑制因子遺伝子であることが意図され、そして、この遺伝子の後成的変化は種々の癌で観察されている。ＲＡＳＳＦ１Ａのメチル化は原発性非小細胞肺癌の予後不良に関連している(キム(Kim) DH, キム(Kim) JS, ジ(Ji) YI, シム(Shim) YM, キム(Kim) H, ハン(Han) J, パク(Park) J., 「ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーターの高メチル化は、原発性非小細胞肺癌では喫煙開始年齢および予後不良の関連する」Cancer Res. 2003 Jul 1;63(13):3743-6.)。これは膵臓癌の発症（クズミン(Kuzmin) I, リウ(Liu) L, ダムマン(Dammann) R, ゲイル(Geil) L, スタンブリッジ(Stanbridge) EJ, ウイルクジンスキー(Wilczynski) SP, レーマン(Lerman) MI, ファイファー(Pfeifer) GP.「子宮頸癌のＲＡＳ関連ドメインファミリー１Ａ遺伝子の不活性化とヒトパピローマウイルス感染の役割」Cancer Res. 2003 Apr 15;63(8):1888-93.)ならびにとりわけ睾丸腫瘍および前立腺癌に関連している。この遺伝子のメチル化の癌診断マーカーとしての応用は、米国特許第６，５９６，４８８号（特許文献１）に記載されているが、患者の適当な治療法の選択における応用について記載されていない。
【００３５】
また、ジストログリカン前駆体遺伝子（ジストロフィン関連グリコプロテイン１）（ＮＭ＿００４３９３）は３ｐ２１内に位置する。ジストログリカン（ＤＧ、ＤＡＧ１としても公知である）は２つのサブユニット、すなわちα−ＤＧおよびβ−ＤＧを含む接着分子である。この分子は細胞外マトリックスと細胞質区画の間の重大な相互関係に起因し、それ自体、転移性疾患への進行に寄与するであろうと仮定される。この遺伝子の減少した発現は、大腸、前立腺および乳癌の高い腫瘍程度と段階に関連している。
【００３６】
１８ｑ２１．３１に位置するワンカット−２転写因子遺伝子（ＮＭ＿００４８５２）は、成人および発達中の肝臓遺伝子発現のホメオ−ドメイン転写因子制御因子である。
【００３７】
トレフォイル因子（ＴＦＦ）２遺伝子（ＮＭ＿００３２２５）はタンパクのトレフォイルファミリーの一員である。これらは通常、消化管の粘膜中に最も高濃度で発現するが、乳房を含む他の組織の原発性腫瘍中に異所的にしばしば発現する。ＴＦＦ１の発現は培養中のエストロゲン反応性乳癌細胞中でエストロゲンにより制御され、その発現はエストロゲン受容体の発現に関連していて、ＴＦＦ１は腫瘍におけるホルモン反応性のマーカーである。ＴＦＦ１プロモーターメチル化は非発現性胃癌誘導セルラインおよび組織中に観察されている。
【００３８】
ＴＭＥＦＦ２（ＮＭ＿０１６１９２）は上皮成長因子（ＥＧＦ）様モティーフおよび２つのホリスタチンドメインを含む膜貫通タンパクをコードする。これは前立腺および脳組織中に過剰発現されることが示され、これは前立腺癌細胞の抗増殖性効果を示すアンドロゲン制御因子であることが示唆されている。
【００３９】
エストロゲン受容体をコードするＥＳＲ１遺伝子（ＮＭ＿０００１２５）のメチル化は、肺、食道、脳および結腸直腸を含む数種の癌タイプに関連している。エストロゲン受容体（ＥＳＲ）はホルモン結合、ＤＮＡ結合および転写活性化において重要な数種のドメインからなるリガンド活性化転写因子である。
【００４０】
ＰＣＡＦ（ＮＭ＿００３８８４）遺伝子はｐ３００／ＣＢＰ関連因子（ＰＣＡＦ）をコードする。ＣＢＰとｐ３００は細胞成長および／または分化に関与する多くの配列特異的因子に結合する大きな核タンパクである。ｐ３００／ＣＢＰ関連因子はＣＢＰとｐ３００とともにインビボ結合活性を発揮する。このタンパクは核ヒストンおよびヌクレオソーム核粒子とのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し、これは転写制御において直接的役割を果たす。ｐ３００／ＣＢＰ関連因子もまたＮＦ−κ−Ｂｐ６５に関連する。このタンパクはｐ５３のＣ−末端部分においてＬｙｓ３２０のアセチル化によってｐ５３遺伝子の発現を制御することが示されている。
【００４１】
ＷＢＰ１１（ＮＭ＿０１６３１２）遺伝子は核タンパクをコードし、ｍＲＮＡスプライシング因子および中間径フィラメント含有核周囲ネットワークとともに共存する。これはＮｐｗ３８、核タンパクのＷＷドメインに結合する２つのプロリンリッチ領域を含み、従って、このタンパクはＮｐｗ３８−結合タンパク、ＮｐｗＢＰとも呼ばれている。
【特許文献１】米国特許第６，５９６，４８８号
【非特許文献１】Yuan Y, Mendez R, Sahin A およびDai  JL Cancer Res. 2001 Jul 15;61(14):5558-61
【非特許文献２】Lucke CD, Philpott A, Metcalfe JC, Thompson AM, Hughes-Davies L, Kemp PR, Hesketh R  Cancer Res. 2001 Jan 15;61(2):482-5.
【非特許文献３】Watanabe, Molec. Cell. Biol. 18: 442-449, 1998.
【非特許文献４】Umbricht CB, Evron E, Gabrielson E, Ferguson A, Marks J, Sukumar S. Oncogene. 2001 Jun 7;20(26):3348-53
【非特許文献５】Saraswati, (Nature405, 974 - 978 22 Jun 2000)
【非特許文献６】Kang JH, Kim SJ, Noh DY, Park IA, Choe KJ, Yoo OJ, Kang HS  Lab Invest. 2001 Apr;81(4):573-9.
【非特許文献７】Cancer Research, 61, 1652-1658, February 15, 2001,  Ivan Bieche, Beatrice Parfait,Vivianne Le Doussal, artine Olivi, Marie-Christine Rio, Rosette LidereauおよびMichel Vidaud
【非特許文献８】Oncogene 2001 Oct 18;20(47):6955-9  Bieche I, Parfait B, Nogues C, Andrieu) C, Vidaud D, Spyratos F, Lidereau R, Vidaud  M
【発明の開示】
【００４２】
本発明はホルモン治療に対する乳房組織の細胞増殖障害を有する患者の反応を予測するための方法および核酸を提供する。ここに記載される方法および核酸を使用して、この治療方式に対する患者の反応の統計的に有意なモデルが開発され、治療法選択を決定する患者および医者を助けるために使用され得る。記載される方法は乳房組織の細胞増殖障害を患う患者の治療法としてホルモン治療の適合性を評価するために使用されるべきである。したがって、本発明は現在の治療反応予測方法に関連する問題を減少させるように思える。
【００４３】
ホルモン治療に関連するリスク、負担および利益について患者および医者に重大な情報を提供するために、ここに記載される方法および核酸を使用して、患者反応性が乳房組織の細胞増殖障害のためのホルモン治療前または中に評価され得る。したがって、これはここに例示される方法および核酸が、患者治療法選択のより正確な評価を患者と医者の双方が可能となることにより、患者の生活の質および治療成功の可能性を改善するために使用され得ると理解されるであろう。
【００４４】
本発明の目的は、最も好ましくは、xxSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF (表１参照) および／またはそれらの制御領域からなる群から選択される遺伝子の１つまたは組合せのメチル化パターンの分析によって達成される。本発明はxxSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF群から選択される遺伝子の１つまたは組合せの核酸が、目的のゲノム配列内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別することができる試薬または一連の試薬と接触させることを特徴とする。
【００４５】
本発明の目的はまた、STMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGAおよび PCAF遺伝子の群の１つまたは複数のサブセットのＣｐＧメチル化の分析によっても達成される。特に下記サブセットが好ましい。
【００４６】
-TP53, PTGS2, FGFR1, PSA, CGA, CYP2D6 および MSMB
-STMN1, PITX2, PSA および CGA
-STMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, SYK, GRIN2D, PSA, COX7A2L, VTN およびPRKCD
-ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF 
【００４７】
本発明はゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確認する方法を利用できる。本方法はエストロゲン受容体経路を標的とするか、またはエストロゲン代謝、産生または分泌に関与する１つまたはそれ以上の薬剤を含む治療法による治療に対する患者の反応の正確な予測を可能として、乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングに使用される。特に好ましい実施態様では、本発明の方法は前記治療法に反応する患者と反応しない患者の区別を可能とする。
【００４８】
本発明の方法はインサイチュ管癌腫、小葉癌腫、膠質癌腫、尿細管癌腫、髄様癌、異形成癌腫、インサイチュ管内癌腫、インサイチュ小葉癌腫およびインサイチュ乳頭癌腫を含む乳房組織の広範囲の細胞増殖障害の分析に使用してもよいが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の方法は２つの治療活動環境において前記治療法に対する反応の予測に特に適している。１つの実施態様では、本方法は図１に示されるように、最初の非化学療法治療、例えば外科手術（ここでは補助的活動環境と呼ぶ）への第２治療法としてホルモン経路を標的とする治療を受ける患者に適用する。このような治療はしばしば段階１〜３の乳癌を患う患者に処方される。この実施態様では、反応者とは一定期間中に検出可能な乳癌を再発しない人と定義され、非反応者とはこの期間内に再発する人である。
【００５０】
さらなる好ましい実施態様では、前記方法は無疾患期間後に一次的手段（好ましくは外科手術）による治療に続いて乳癌の再発を患う患者に適用する。ここで、ホルモン経路標的治療は癌腫再発の検出に対する反応に処方されている。このような治療は特に転移が生じる後期癌腫を患う患者にしばしば処方される。したがって、この臨床的環境はまた、「転移活動環境」とも呼ばれる。この実施態様では、反応者とは部分的または完全な緩解に入った人、すなわちその疾患がさらに転移するか、または上記検出可能なレベルを残す人に対して、その癌が未検出可能レベルまで後退する被検者である。この方法論は本方法がエストロゲンおよび／またはプロゲストロン受容体状態とは別個に、いかなる被検者にも適用される先行技術においてさらに改良を示す。したがって、好ましい実施態様では、被検者はエストロゲンまたはプロゲストロゲン受容体状態について試験される必要がない。
【００５１】
さらに、本方法はシトシンメチル化および前記遺伝子内の単一ヌクレオチド多型の分析を可能とする。
【００５２】
本発明の目的はSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF 遺伝子および／またはそれらの制御領域のうちの１つまたはそれ以上のメチル化パターンの分析によって達成される。特に好ましい実施態様では、前記遺伝子の配列は、配列番号: 27, 40, 122, 43, 131, 50, 74, 127, 135, 86, 90, 128, 129, 99, 105, 115, 121, 126, 137, 129, 125, 132, 122, 123, 131, 133, 134, 127, 130, 135, 124, 128 および 136 およびこれらの相補的配列を含む。
【００５３】
本発明の目的はまた、前記遺伝子群のうちの下記サブセットから選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のメチル化パターンを分析しても達成される。１つの実施態様では、本発明の目的は、TP53, PTGS2, FGFR1, PSA, CGA, CYP2D6 および MSMBからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のメチル化パターン分析によって達成され、前記遺伝子の配列が配列番号: 68, 50, 74, 90, 91, 92 および 99を含むことがさらに好ましい。さらなる実施態様では、本発明の目的はSTMN1, PITX2, PSA および CGAからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のメチル化パターン分析によって達成され、前記遺伝子の配列は配列番号: 27, 83, 90 および 91を含むことがさらに好ましい。本発明の目的はSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, SYK, GRIN2D, PSA, COX7A2L, VTN および PRKCDからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のメチル化パターン分析によって達成され、前記遺伝子の配列は配列番号: 27, 40, 41, 43, 78, 86, 90, 105, 115, 121を含むことがさらに好ましい。目的がONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAFからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のメチル化パターン分析によって達成されることも本発明の一実施態様であり、前記遺伝子の配列は配列番号: 126, 137, 129, 125, 132, 122, 123, 131, 133, 134, 127, 130, 135, 124, 128 および 136を含むことが好ましい。
【００５４】
患者が補助的治療としてこの治療を受ける場合、前記遺伝子はTP53, PTGS2, PITX2, CYP2D6, MSMB, WBP11, TMEFF2, ESR1, PITX2 および PCAFからなる群から選択されることが好ましく、そして、前記遺伝子の配列は配列番号: 131, 50, 135, 129, 99, 137, 133, 134, 135 および 136を含むことがさらに好ましい。
【００５５】
また、この遺伝子群の下記サブセットも好ましい：
TP53, PTGS2, CYP2D6 および MSMB、ここで、この遺伝子の配列は配列番号: 68, 50, 92 および 99を含むことがさらに好ましく、
PITX2、ここで、この遺伝子の配列は配列番号: 83を含むことがさらに好ましく、
WBP11, TMEFF2, ERBB2, ESR1, PITX2 および PCAF、ここで、この遺伝子の配列は配列番号: 137, 132, 133, 134, 135 および 136を含むことがさらに好ましい。
【００５６】
患者が転移活動環境の反応においてこの治療を受ける場合、前記遺伝子はSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, FGFR1, SYK, GRIN2D, PSA, CGA, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, SYK, RASSF1, PSAT1および CGAからなる群から選択されることが好ましく、前記遺伝子の配列は配列番号: 27, 40, 122, 43, 74, 127, 86, 90, 128, 105, 115, 121, 126, 129, 125, 132, 122, 123, 131, 127, 130, 124 および 128を含むことがさらに好ましい。
【００５７】
この遺伝子群の下記サブセットもまた好ましい；
FGFR1, PSA および CGA、ここで、これらの遺伝子の配列は配列番号: 74, 90 および 91を含むことがさらに好ましく、
STMN1, PSA および CGA、ここで、これらの遺伝子の配列は配列番号: 27, 90 および 91を含むことがさらに好ましく、
STMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, SYK, GRIN2D, PSA, COX7A2L, VTN および PRKCD、ここで、これらの配列は配列番号: 27, 40, 41, 43, 78, 86, 90, 105, 115, 121を含むことがさらに好ましく、 
ONECUT2, CYP2D6, DAG1, S100A2, TFF1, TP53, SYK, RASSF1, PSAT1 および CGA、ここで、これらの遺伝子の配列は配列番号: 126, 129, 125, 122, 123, 131, 127, 130, 124 および 128を含むことが好ましい。
【００５８】
好ましい実施態様では、本方法は被検者から得た生物学的試料中の前記核酸配列を少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させることによって達成される。ここで、前記試薬または一連の試薬は標的核酸内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する。
【００５９】
好ましい実施態様では、本方法は下記工程を含む：
本方法の第一工程では、ゲノムＤＮＡ試料はＤＮＡ、ＤＮＡ源、例えば、セルライン、組織学的スライド、生検、パラフィン中に包埋された組織、乳房組織、血液、血漿、リンパ液、リンパ組織、管細胞、管洗浄液、乳頭吸引液、骨髄およびこれらの組合せを含む細胞または細胞成分などの起源から単離されなければならない。抽出は当業者にとって標準的である手段によって行う。これらは洗浄剤溶解物、超音波およびガラスビースによるボルテキシングの使用を含む。核酸は一度抽出されると、ゲノム二本鎖ＤＮＡが分析に使用される。
【００６０】
好ましい実施態様では、ＤＮＡは本方法の次工程に先たって分解してもよい。これは特に制限酵素を使用する当該技術分野で標準的な手段によって行ってもよいが、これに限定されない。
【００６１】
本方法の第２工程では、ゲノムＤＮＡ試料は５'−位で非メチル化されているシトシン塩基がウラシル、チミンまたはハイブリダイゼーション挙動においてシトシンと類似していない他の塩基に変換されるように処理する。
【００６２】
ゲノムＤＮＡの上記処理は、好ましくは重亜硫酸塩（亜硫酸塩、二亜硫酸塩）、そして続いて、非メチル化シトシン核酸塩基をウラシルまたは塩基対形成挙動においてシトシンに類似していない他の塩基に変換することとなるアルカリ加水分解を実施する。もしも重亜硫酸塩溶液が反応に使用されるなら、次いで非メチル化シトシン塩基に付加が生じる。さらに、変性剤または溶媒ならびにラジカル妨害剤が存在しなければならない。次いで、次のアルカリ加水分解は非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの変換を生じる。変換されたＤＮＡは次いでメチル化シトシンの検出に使用される。
【００６３】
前処理されたＤＮＡ断片はプライマーオリゴヌクレオチドおよび好ましくは熱安定性ポリメラーゼを使用して増幅される。統計的および実際的検討から、長さ１００〜２０００塩基対を有する好ましくは６つ以上の異なった断片が増幅される。数種のＤＮＡ断片の増幅は１つの同じ反応容器中で同時に実施することができる。通常、増幅はポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって実施される。
【００６４】
このようなプライマーの設計は当業者には自明である。これらは付表: 配列番号 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794に特定される下記塩基配列の少なくとも１８塩基対セグメントに対して、それぞれ配列が逆相補的または同一である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくはこれらがＣｐＧジヌクレオチドを含まないことを特徴とする。本方法の特に好ましい実施態様では、前記プライマーオリゴヌクレオチドの配列は、目的の乳房細胞特異的ＤＮＡのみに選択的にアニールし、かつ増幅するように設計され、それによってバックグランドまたは非関連ＤＮＡの増幅を減少させる。本発明の状況では、バックグランドＤＮＡとは関連組織特異的メチル化パターンを有しないゲノムＤＮＡを意味し、この場合、関連組織とは乳房組織であると解釈される。
【００６５】
本発明では、少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドが増幅中に固相に結合していることが好ましい。異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー配列は四角形または六角形の格子形態の平面固相に配置され、固相表面は好ましくはシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなり、ニトロセルロースまたはプラスチックなどの他の材料も同様に使用することが可能である。
【００６６】
増幅によって得られた断片は、直接または間接に検出可能な標識を担持していてもよい。標識は蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出できる典型的な質量を有する検出可能な分子断片の形状が好ましく、産生される断片は質量分析計でより良く検出性されるために１価陽性または陰性電荷を有することが好ましい。検出はマトリックス支援レーザー脱着／イオン化質量分析測定（ＭＡＬＤＩ）によるかまたは電子線スプレー質量分光測定（ＥＳＩ）を使用して実施し、かつ可視化してもよい。
【００６７】
次工程では、核酸増幅産物は治療に先たってゲノムＤＮＡのメチル化状態を測定するために分析される。
【００６８】
核酸の後処理分析は別な方法を使用して実施してもよい。処理された核酸のメチル化状態特異的分析のためのいくつかの方法は以下に記載され、他の別法は当業者には自明であろう。
【００６９】
分析は本方法の増幅工程中に実施してもよい。１つのこのような実施態様では、xxSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF遺伝子および／またはそれらの制御領域内の前選択されたＣｐＧ位のメチル化状態は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用して検出してもよい。「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）との用語は、ハーマン(Herman)ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996, および米国特許 ５，７８６，１４６号および 第６，２６５，１７１号に記載される当該技術分野にて認識されているメチル化分析を呼ぶ。重亜硫酸塩処理ＤＮＡの増幅のためのメチル化状態特異的プライマーの使用はメチル化核酸と非メチル化核酸の区別を可能とする。ＭＳＰプライマー対は重亜硫酸塩処理ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、前記プライマーの配列は少なくとも１つのＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに対して特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧのＣ位の３'−位に「Ｔ」を含む。したがって、本発明では好ましくは、前記プライマーの塩基配列は、配列番号.: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および794に記載される前処理核酸配列およびこれらに相補的な配列 にハイブリダイズする長さ少なくとも９ヌクレオチドを有する配列を含むことを必要とする。ここで前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドを含む。
【００７０】
本方法の１つの実施態様では、ＣｐＧ位のメチル化状態はハイブリダイゼーション分析によって測定してもよい。本方法のこの実施態様では、本方法の第２工程で得られた増幅産物は、オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブのアレーまたはセットにハイブリダイズさせる。この状況ではハイブリダイゼーションは以下に記載される方法で行なう。ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブのセットは、好ましくは少なくとも４オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーからなる。この方法では、増幅産物は固相に既に結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして作用する。非ハイブリダイズ断片は続いて除去する。前記オリゴヌクレオチドは付表に特定される塩基配列のセグメントに逆相補的または同一である長さ１０ヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドを含む。さらなる好ましい実施態様では、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシン、またはＴｐＧの場合、チアミンは１０−マーの５'−末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである。１つのオリゴヌクレオチドはＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドのそれぞれに存在する。
【００７１】
非ハイブリダイズ増幅産物は次いで除去される。本方法の最終工程では、ハイブリダイズした増幅産物が検出される。この状況では、増幅産物に結合した標識がオリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位置で同定され得る。
【００７２】
本方法のさらなる実施態様では、ＣｐＧ位置のメチル化状態は処理されたＤＮＡをＰＣＲ増幅プライマー（ここで、該プライマーはメチル化特異的または標準のいずれであってもよい）にハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドプローブによって測定してもよい。
【００７３】
この方法の特に好ましい実施態様は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(ABI Prism 7700 Sequence Detection Systemを使用するTaqManTMPCR、Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California)を使用する蛍光系リアルタイム定量ＰＣＲ(ハイド(Heid)ら、 Genome Res. 6:986-994, 1996)の使用である。TaqManTMＰＣＲ反応はフォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーの間に位置するＧｐＣ−リッチ配列にハイブリダイズするように設計されたTaqManTMプローブと呼ばれる非伸長性尋問オリゴヌクレオチドを使用する。TaqManTMプローブはさらにTaqManTM オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合されたリンカー分子（例えば、ホスホアミダイト）に共有結合した蛍光「レポーター分子」および「消光剤分子」を含む。重亜硫酸塩処理に続く核酸内のメチル化分析のために、プローブはMethyl Light 分析としても公知である米国特許第６，３３１，３９３号（参考としてここに挿入される）に記載されるように、メチル化特異的であることが必要である。本発明で使用するのに適した TaqManTM 検出方法論の変法としては、二重プローブ技術（LightcyclerTM）または蛍光増幅プライマー(SunriseTM技術)が挙げられる。これらの技術は重亜硫酸塩処理ＤＮＡでの使用に適した方法、さらにＣｐＧジヌクレオチド内のメチル化分析において応用してもよい。
【００７４】
重亜硫酸塩処理核酸の分析によるメチル化評価でのプローブオリゴヌクレオチドの使用にさらに好適な方法は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用である。このようなオリゴヌクレオチドの使用は、BioTechniques 23(4), 1997, 714-720 D. ユ(Yu), M.ムカイ(Mukai), Q. リュ(Liu), C. スタインマン(Steinman)に記載される。ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドはＰＣＲプライマーとともに目下、重亜硫酸塩処理核酸にハイブリダイズさせる。核酸のＰＣＲ増幅はブロッキングプローブの５'−位置で終結し、それによってブロッキングプローブの相補的配列が存在すると、核酸の増幅は抑制される。プローブはメチル化状態特異的方法において重亜硫酸塩処理核酸にハイブリダイズするように設計してもよい。例えば、非メチル化核酸の集団内でのメチル化核酸の検出では、問題の位置で非メチル化されている核酸の増幅の抑制は、「ＣＡ」とは反対にある問題の位置の「ＣＧ」を含むブロッキングプローブの使用によって実施されるであろう。
【００７５】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ法では、ポリメラーゼ仲介増幅の有効な中止は、ポリメラーゼにより伸長されないブロッカーオリゴヌクレオチドを必要とする。好ましくはこれは３'−デオキシオリゴヌクレオチドまたは「遊離」ヒドロキシル基よりも３'−位置で誘導化されたオリゴヌクレオチドであるブロッカーの使用により達成される。例えば、３'−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドはブロッカー分子の好ましいクラスの代表である。
【００７６】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ仲介分解は防止されるべきである。好ましくはこのような防止は５'−３'−エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用、または例えば、ブロッカー分子をヌクレアーゼ耐性とするその５'−末端でチオエート架橋を有する変性ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用のいずれかを含む。特別な応用はブロッカーのこのような５'変性を必要としないであろう。例えば、もしもブロッカー結合部位とプライマー結合部位が重複するなら、それにより、プライマー（例えば過剰ブロッカーとともに）の結合防止、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解が実質的に防止されるであろう。これはポリメラーゼがブロッカーの方に向かって、かつその中へ（５'〜３'方向に）プライマーを伸長しないこと、つまり、正常にはハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解となる方法であるとの理由による。
【００７７】
本発明の目的において、かつ、ここに実施されるように特に好ましいブロッカー／ＰＣＲ実施態様はブロッキングオリゴヌクレオチドとしてペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用を含む。このようなＰＮＡブロッカーオリゴマーはそれらがポリメラーゼにより分解も伸長もしないから、理想的に適している。
【００７８】
したがって、好ましくは前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794 の１つに記載される前処理された核酸配列およびこれらに相補的な配列にハイブリダイズする長さ少なくとも９ヌクレオチドを有する配列を含むことが必要である。ここで、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【００７９】
本方法のさらに好ましい実施態様では、ＣｐＧ位置のメチル化状態の測定はゴンザルゴ(Gonzalgo)およびジョーズ(Jones) (Nucleic Acids Res. 25:2529-2531)に記載されるように、ＭＳＳＮｕＰＥなどの鋳型定方向オリゴヌクレオチド伸長を使用して実施する。
【００８０】
本方法のさらなる実施態様では、ＣｐＧ位置のメチル化状態の測定は本方法の第２工程で生成した増幅産物の配列決定およびその次の配列分析によって可能となる(サンガー(Sanger) F.ら、 1977 PNAS USA 74: 5463-5467)。
【００８１】
本発明による方法は、上記手段を組み合わせて行ってもよい。本発明の特に好ましい態様では、リアルタイム検出プローブの使用はＭＳＰおよび／またはブロッカーオリゴヌクレオチドを同時に組み合わせる。
【００８２】
本発明のさらなる実施態様は、前処理を必要とすることなく、ゲノムＤＮＡのメチル化状態を分析する方法である。この方法の第１および第２工程では、ゲノムＤＮＡ試料は組織または細胞起源から得て単離しなければならない。このような起源としてはセルライン、組織学的スライド、体液またはパラフィンに包埋された組織を挙げることができる。抽出は当業者に標準的である手段によって行う。これらの手段としては洗浄剤分解、超音波およびガラスビーズを使用するボルテキシングの使用が挙げられる。核酸は一旦、抽出されるとゲノム２本鎖ＤＮＡが分析に使用される。
【００８３】
好ましい実施態様では、ＤＮＡは処理前に分解してもよく、これは特に制限エンドヌクレアーゼを使用する当該技術分野で標準的な手段によってもよい。第３工程では、次いでＤＮＡは１つまたはそれ以上のメチル化感受性制限酵素で消化する。消化は制限部位でのＤＮＡの加水分解が特定ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の情報となるように実施する。
【００８４】
好ましい実施態様では、制限断片を増幅する。さらに好ましい実施態様では、これはポリメラーゼチェインリアクションを使用して実施する。
【００８５】
最終工程では、増幅産物を検出する。検出は例えば、ゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、ＰＣＲ生成物内の検出可能なタグの導入、ＤＮＡアレー分析、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ分析などの当該技術分野で標準的な手段であってもよいが、これらに限定されない。
【００８６】
前記方法は、好ましくはゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確認するために使用する。
【００８７】
この方法を可能とするために、本発明はさらに、STMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF群から選択される遺伝子の１つまたは組合せの変性ＤＮＡ、ならびに前記遺伝子内のシトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーを提供する。本発明は遺伝的および後成的パラメーター、および前記ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化パターンが乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングに特に適しているとの発見に基づく。
【００８８】
本発明の核酸はゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターの分析のために使用することができる。
【００８９】
本発明のこの目的は、配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡおよびこれらに相補的な配列の長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸を使用して達成する。
【００９０】
開示される本発明の目的は配列番号: 345, 346, 381, 382, 393, 394, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717 および 718の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡおよびこれらに相補的な配列の長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸を使用して達成してもよい。
【００９１】
開示される本発明の目的は、配列番号: 299, 300, 411, 412, 425, 426, 427, 428, 573, 574, 685, 686, 699, 700, 701 および 702の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡおよびこれらに相補的な配列の長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸を使用して達成してもよい。
【００９２】
開示される本発明の目的は配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 401, 402, 417, 418, 425, 426, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 675, 676, 691, 692, 699, 700, 729, 730, 749, 750, 761, 762の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡおよびこれらに相補的な配列の長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸を使用して達成してもよい。
【００９３】
開示される本発明の目的は配列番号: 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡおよびこれらに相補的な配列の長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸を使用して達成してもよい。
【００９４】
したがって、変性核酸は疾患関連遺伝的パラメーターおよび後成的パラメーターの確認に関連していない。
【００９５】
本発明の目的はさらに、ゲノムシトシンメチル化状態を検出するための前処理されたＤＮＡの分析のためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーによって達成し、前記オリゴヌクレオチドは配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794に記載される前処理されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズする長さ少なくとも１０ヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含む。本発明のオリゴマープローブは、ホルモン治療への患者反応に関連した態様について、生物学的試料の分析中に特定遺伝的および後成的パラメーターを確認することを初めて可能とする重要でかつ有効な手段を構成する。前記オリゴヌクレオチドは乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングを可能とする。オリゴマーの塩基配列は好ましくは少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドを含む。プローブはまた、特に好ましい対形成特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが前記オリゴヌクレオチドの３分の１の中央、１３−マーのオリゴヌクレオチドの５'−末端から第５〜９番目のヌクレオチド内に存在するか、またはＰＮＡ−オリゴマーの場合、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが９−マーの５'−末端から第４〜６番目のヌクレオチドのあることが好ましい。
【００９６】
本発明のオリゴマーは、通常、配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794内の少なくとも２つのオリゴマーおよびＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに対する１つまでのオリゴマーを含む、いわゆる「セット」として使用される。
【００９７】
本方法の特に好ましい実施態様では、配列番号: 1733-1736, 1967-1994, 2003-2024, 2031 - 2034, 2045-2134に記載されるオリゴマーが、転移活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【００９８】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 2011, 2012, 2017 - 2024 および 2031 - 2034に記載されるオリゴマーが転移活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【００９９】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 2003-2024に記載されるオリゴマーが転移活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１００】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 2003-2020 および 2045-2112に記載されるオリゴマーが転移活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１０１】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 1733-1736, 1967-1994, 2011-2025,2045-2052, 2069-2078 および 2127-2134に記載されるオリゴマーが転移活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１０２】
本方法の特に好ましい実施態様では、配列番号: 1691-1692, 1925-1932, 1941-1954, 1965-1966, 1995-2002, 2025-2030, 2035 - 2044 および 2135 - 2142に記載されるオリゴマーが補助的活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１０３】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 2035- 2044に記載されるオリゴマーが補助的活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１０４】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 2025-2030に記載されるオリゴマーが補助的活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１０５】
本方法のさらなる実施態様では、配列番号: 1691-1692, 1925-1932, 1941-1954, 1965-1966, 1995-2002 および 2135 -2142に記載されるオリゴマーが補助的活動環境でのホルモン治療に対する被検者の反応を予測するために使用される。
【０１０６】
本発明のオリゴヌクレオチドのセットの場合、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは固相に結合されていることが好ましい。さらに、１つのセットの全てのオリゴヌクレオチドは固相に結合されていることが好ましい。
【０１０７】
さらに、本発明は(配列表および表１に詳細に記載されるSTMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF遺伝子およびこれらに相補的な配列の)前記配列または前記配列の前処理したものの分析によって、ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも２ｎ（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー）のセットに関する。
【０１０８】
オリゴマーのセットはまた、STMN1, SFN, S100A2, TGFBR2, TP53, PTGS2, FGFR1, SYK, PITX2, GRIN2D, PSA, CGA, CYP2D6, MSMB, COX7A2L, VTN, PRKCD, ONECUT2, WBP11, CYP2D6, DAG1, ERBB2, S100A2, TFF1, TP53, TMEFF2, ESR1, SYK, RASSF1, PITX2, PSAT1, CGA および PCAF遺伝子の前記配列または前記配列の前処理されたものの分析によって単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するために使用してもよい。
【０１０９】
本発明の方法は、当該技術分野で公知であり、ホルモンまたはホルモン関連経路を標的とする治療の結果の予測として目下、使用されるマーカーおよび臨床的指標の導入によって改良および補充されるであろうことが当業者には自明であろう。さらに好ましくは、前記マーカーとしては結節状態、年齢、閉経状態、程度、エストロゲンおよびプロゲストロン受容体が挙げられる。
【０１１０】
本発明の基礎を形成する遺伝子は、「遺伝子パネル」、すなわち本発明の特別な遺伝子配列および／またはそれらの各情報的メチル化部位を含む集合体を形成するために使用してもよい。遺伝子パネルの形成は、乳癌治療の特定態様の迅速および特異的分析を可能とする。本発明に記載され、かつ使用される遺伝子パネルは、エストロゲン受容体経路を標的とするか、またはエストロゲン代謝、産生または分泌に関与する１つまたはそれ以上の薬剤を含む治療により処置の結果を予測することによって、乳房細胞増殖障害の治療において驚くべき高い効率で使用することができる。このパネルの各遺伝子の分析は患者の反応の評価に寄与するが、しかしながら、好ましい実施態様では患者評価はたった１つの遺伝子の分析によって達成してもよい。「遺伝子パネル」の１メンバーの分析は安価であるが、患者反応を評価するより正確性が低い手段であり、パネルの複数のメンバーの分析は本方法を実施するむしろより高価な手段であるが、より高い正確性（技術的に好ましい解決策）をもたらす。
【０１１１】
本発明の方法の効率は、化学治療により治療されなかった患者に適用した場合、改善される。したがって、本方法が化学治療を受けなかった被検者の評価に使用されることが、この方法の特に好ましい実施態様である。
【０１１２】
本発明では、本発明により入手可能となった異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーの配列（いわゆる「アレー」）が同様に固相に結合されたような方法にて存在することが好ましい。異なったオリゴヌクレオチド−および／またはＰＮＡ−オリゴマー配列のアレーは、四角形または六角形格子の形態である固相上に配置されることを特徴とすることができる。固相表面は好ましくはシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成される。しかしながらペレットまたは樹脂マトリックスの形態で存在することができるニトロセルロースならびにナイロンなどのプラスチックが好適な代替品である。
【０１１３】
したがって、本発明のさらなる主題は、乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングのために担体物質に固定されたアレーを製造する方法である。前記方法では本発明の少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合される。このようなアレーを製造する方法は、固相化学および感光性保護基を使用する、例えば米国特許第５，７４４，３０５号から公知である。
【０１１４】
本発明のさらなる主題は、乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングのためのＤＮＡチップに関する。ＤＮＡチップは本発明の少なくとも１つの核酸を含む。ＤＮＡチップは例えば、米国特許第５，８３７，８３２号から公知である。
【０１１５】
さらに、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩含有試薬、配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794に特定される塩基配列、および／またはＰＮＡ−オリゴマーの１８塩基長セグメントにその配列が各場合、対応するか、あるいは相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット、ならびに記載される方法を実施し、かつ評価するための指示書から構成されていてもよいキットである。
【０１１６】
さらに好ましい実施態様では、前記キットはＣｐＧ位置特異的メチル化分析を達成するための標準的試薬を含み、前記分析は以下の技術：ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、Ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｇｈｔ、Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔｈｙｌおよび核酸配列決定のうちの１つまたはそれ以上を含む。しかしながら、本発明に従うキットはまた、前記成分の一部のみを含むことができる。  
【０１１７】
Ｍｅｔｈｙｌ  Ｌｉｇｈｔ（登録商標）分析のための通常の試薬（例えば、通常のＭｅｔｈｙｌ  Ｌｉｇｈｔ（登録商標）系キットに見られるように）は特定遺伝子のためのＰＣＲプライマー（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；至適化ＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【０１１８】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析のための通常の試薬（例えば、通常、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ系キットに見られるように）は、特定遺伝子のためのＰＣＲプライマー（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）；至適化ＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性コントロールプライマー；特定遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；反応緩衝液（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）および放射活性ヌクレオチドを含んでいてもよいが、これらに限定されない。さらに、重亜硫酸塩変換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ再生試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝液；およびＤＮＡ再生成分を含んでいてもよい。
【０１１９】
ＭＳＰ分析のための通常の試薬（例えば、通常のＭＳＰ系キットに見られるように）は、特定遺伝子のためのメチル化および非メチル化ＰＣＲプライマー（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）、至適化ＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、および特定プローブを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明のオリゴマーまたはそのアレーならびに本発明のキットは、乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングのために使用することが意図される。本発明では、本方法は好ましくは、ゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーターの分析のために、特に乳房細胞増殖障害の改良治療およびモニタリングでの使用に用いられる。
【０１２１】
本発明の方法はより多くの情報に基づく治療管理を可能とすることによって、乳房細胞増殖障害の改良された治療およびモニタリングに使用される。
【０１２２】
さらに、本発明は患者または個人にとって不利であるか、または関連性ある事象の診断および／または予知に関し、ゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーター、すなわち本発明の手段により得られた前記パラメーターが、遺伝的および／または後成的パラメーターの他のセットと比べられ、その相違が患者または個人にとって不利であるか、あるいは関連性ある事象の診断および／または予知の基礎として役立つ。
【０１２３】
本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」との用語は、二本鎖構造を形成する試料ＤＮＡ中でワトソン−クリック塩基対形成に従って完全に相補的な配列へオリゴヌクレオチドが結合することとして理解されるべきである。
【０１２４】
本発明の文脈では、「遺伝的パラメーター」とは、ゲノムＤＮＡおよびさらにその制御に必要である配列の変異および多型である。特に、挿入、欠失、点変異、反転および多型性および特に好ましくはＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）が変異とされる。
【０１２５】
本発明の文脈では、「メチル化部位」との用語は目的の核酸に存在するメチル化の程度を意味すると解釈され、これは絶対的または相対的な用語、すなわちパーセントまたは他の数値で、あるいは他の組織との比較として表現され、ここでは高メチル化、低メチル化または有意に類似あるいは同一であるメチル化状態を有するとして記述される。
【０１２６】
本発明の文脈では、遺伝子の「制御領域」との用語は、遺伝子の発現に影響を与えるヌクレオチド配列を意味すると解釈される。この制御領域は前記遺伝子の内、近位または遠位に存在するであろう。この制御領域としては構成プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター制御要素はまた、遺伝子の転写または翻訳の効率を制御するある種のエンハンサー配列要素を含む。
【０１２７】
本発明の文脈では、「化学治療」との用語は、癌を治療する薬剤または化学物質の使用を意味すると解釈される。この定義は放射性治療（高エネルギー線または粒子を使用する治療）、ホルモン治療（ホルモンまたはホルモン類似物質（合成置換体）による治療）および外科手術治療を除外する。
【０１２８】
本発明の文脈では、「後成的パラメーター」とは特にシトシンメチル化およびさらにゲノムＤＮＡのＤＮＡ塩基およびさらにその制御に必要である配列の変異である。さらに、後成的パラメーターとしては、例えば記述される方法を使用して直接に分析され得ないが、代わってＤＮＡメチル化に関連するヒストンのアセチル化が挙げられる。
【０１２９】
本発明の文脈では、「補助的治療」は初期非化学治療、例えば外科手術に直ちに続く癌患者の治療を意味すると解釈される。一般的に補助的治療の目的は、補助的治療を行わない場合と比べて再発のリスクが有意により小さなことである。
【０１３０】
本発明の文脈では、「エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体陽性」との用語は、エストロゲンおよび／またはプロゲステロンの結合を受けやすいその表面受容体上で発現する細胞を意味すると解釈される。
【０１３１】
以下に、配列、図面および実施例をもとに、より詳細に本発明を説明するが、これらに限定されない。
【０１３２】
図１は本発明の方法の好ましい応用を示す。Ｘ軸は腫瘍塊を示し、線「３」は検出限界を示す。Ｙ軸は時間を示す。したがって、この図は段階１〜３の乳癌のホルモン治療の単純化されたモデルを図示す。ここで、初期治療は外科手術（ポイント１）であり、その後、タモキシフェンによる補助的治療であった。最初のシナリオでは、治療（４）の反応者は観察の持続時間中、検出限界以下に留まっているとして示される。治療（５）の非反応者はある期間、無病生存（２）であり、続いて癌腫塊が検出限界に届く再発となった。
【０１３３】
図２は本発明の方法の他の好ましい応用を示す。Ｘ軸は腫瘍塊を示し、線「３」は検出性限界を示す。Ｙ軸は時間を示す。したがって、この図は最終段階の乳癌のホルモン治療の単純化されたモデルを図示する。ここで、初期治療は外科手術（ポイント１）であり、その後、タモキシフェンにより治療される再発（２）であった。最初のシナリオでは、治療（４）の反応者は観察持続中、検出限界以下に留まっているとして示される。治療（５）の非反応者は再発から回復しない。
【０１３４】
図３は実施例１のＣｐＧアイランドのメチル化分析を示す。１遺伝子当たりのＣｐＧアイランドはグループ化され、客観的反応との相関性がホテリング（Hotelling）のＴ２統計量によって決定された。黒点は示された遺伝子のｐ−値を示す。２０個の最も情報ある遺伝子が、増加するｐ−値とともに左から右へ並べて示される。上部点線は未補正有意差値（Ｐ＜０．０５）を示す。下部点線はフォールス・ディスカバリー・レート（false discovery rate）補正２５％後の有意差を示す。下部線（この場合、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ）以下にある最も大きなｐ−値をもつ遺伝子よりも小さいかまたは同じｐ−値をもつ全ての遺伝子は有意と考えられる。選択されたＦＤＲ補正は同定された遺伝子が７５％のチャンス・トルー・ディスカバリー(chance true discoveries)を有することを保証する。
【０１３５】
図４は図３（実施例１）で測定した生存奏効率と有意差に関連する１０個の遺伝子の生のＣｐＧジヌクレオチドメチル化データを示す。対象反応者（ＣＲ＋ＰＲ）から得た腫瘍は左側に示され、進行性疾患（ＰＤ）の患者から得た腫瘍は右側に示される。灰色陰影は平均値からのＣｐＧジヌクレオチドメチル化状態の相対的距離を示す。ＣｐＧジヌクレオチドは１個の遺伝子当たりグループ化される。示された遺伝子は増加する有意差に従い上部から下部へ順序づけられる。明るい灰色は低メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、濃い灰色は高メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示す。メチル化データは個々のＣｐＧジヌクレオチド毎に１つの標準偏差に集中され、かつ、規準化される。
【０１３６】
図１２および１３はアルゴリズムを使用して、２クラスの組織（転移活動環境のホルモン治療に対する反応者と非反応者）間のＣｐＧメチル化相違による実施例３で得られたデータのランクづけされたマトリックスを示す。これらの図は灰色の段階で示され、最も有意なＣｐＧ位置は上部へ向かって減少する有意差を示すマトリックスの下部に存在する。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定位置の非メチル化を示し、メチル化の程度に従って、明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各行は１つの試料における異なったＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。左側に遺伝子名を示し、右側に個々のＣｐＧ位置のｐ−値を示す。ｐ−値は観察された分布がデータセット中に偶然に生じた可能性である。
【０１３７】
図１４は実施例１（データセット３）の組合せスコアの無増悪生存期間（ＰＦＳ）曲線を示す。患者のタモキシフェン治療開始後のＰＦＳ曲線が示される。これらは伝統的な予測マーカー、年齢、有力な再発部位、無病期間およびＥＲ水準に基づく予測的スコア（χ2=１４．０;自由度３）を使用してグループ化される（Ａ）。ＤＮＡメチル化に基づくスコア（χ2=２７．５; 自由度３)はホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡ−Ｔ）、スタスミン（ＳＴＭＮ１）、Ｓ１００プロテインＡ２（Ｓ１００Ａ２、トランスフォーミング成長因子β受容体II（ＴＧＦＢＲ２）およびグルタミン酸受容体２Ｄ（ＧＲＩＮＤ２Ｄ）の統計的に独立した予測遺伝子を含んで示される（Ｂ）。生存曲線は実施例１で作成され、有意差が実施例１に記載されるように計算された。計算された予測的スコアは５０名の患者をそれぞれ４つのグループ（ｑ１〜ｑ４）にその値の２５、５０および７５の百分位数を使用して分割した。Ｘ軸の下の数は、０、１２、２４および３６ケ月の示された時点での各グループの危険な状態の患者数を示す。無増悪生存（パーセント）はＹ軸上にプロットされ、増悪への時間（月）はＸ軸上にプロットされる。
【０１３８】
図５〜１２はアルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示す。図５、７、９および１１は灰色の段階で示され、ここで、最も有意なＣｐＧ位置は上部へむかって減少する有意差を有するマトリックスの下部に存在する。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定位置の非メチル化を示し、メチル化の程度に従って、明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各行は１つの試料における異なったＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。左側に遺伝子名を示し、右側に個々のＣｐＧ位置のｐ−値を示す。ｐ−値は観察された分布がデータセット中に偶然に生じた可能性である。図６、８、１０および１２は先の図（即ち、それぞれ図５、７、９および１１）の赤色−緑色版である。赤色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、緑色は特定位置の非メチル化を示す。
【０１３９】
図１５はログスケールで未修正ｐ−値を示す。ｐ−値は多重ロジスティック回帰モデルからの可能性比率（ＬＲ）テストから計算された。目的の個々のゲノム領域はそれぞれ点で示され、上部点線は２５％フォールス・ディスカバリー・レートにおけるカットオフ点を示し、下部点線はボンフェロニ(Bonferroni)修正５％限界を示す。
【０１４０】
図１６は実施例１で得たデータ（データセット４）の最もよい１０個の増幅産物のランクづけされたマトリックスを示す。ｐ−値は多重ロジスティック回帰モデルからの可能性比率（ＬＲ）テストから計算された。図は灰色段階で示され、ここで最も有意なＣｐＧ位置は上部へ向かって減少する有意差を有するマトリックスの下部に存在する。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定位置の非メチル化を示し、メチル化の程度に従って、明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各行は１つの試料における異なったＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置におけるｐ−値は右側に示される。ｐ−値は観察された分布がデータセット中で偶然に生じた可能性である。
【０１４１】
図１７はＥＳＲ１遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（下部曲線）は非反応者を示し、直線（上部曲線）は反応者を示す。
【０１４２】
図１８はＰＣＡＦ遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（上部曲線）は非反応者を示し、直線（下部曲線）は反応者を示す。
【０１４３】
図１９はＰＩＴＸ２遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（上部曲線）は非反応者を示し、直線（下部曲線）は反応者を示す。
【０１４４】
図２０はＴＭＥＦＦ２遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（上部曲線）は非反応者を示し、直線（下部曲線）は反応者を示す。
【０１４５】
図２１はＷＢＰ１１遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（下部曲線）は非反応者を示し、直線（上部曲線）は反応者を示す。
【０１４６】
図２１はＥＲＢＢ２遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（下部曲線）は非反応者を示し、直線（上部曲線）は反応者を示す。
【０１４７】
配列番号: 27, 40, 122, 43, 131, 50, 74, 127, 135, 86, 90, 128, 129, 99, 105, 115, 121, 126, 137, 129, 125, 132, 122, 123, 131, 133, 134, 127, 130, 135, 124, 128 および 136は、表１の遺伝子の５'および／または制御領域および／またはＣｐＧリッチ領域を示す。これらの配列はＧｅｎｂａｎｋから誘導され、目下、予期されない配列材料のわずかな変異の全て、例えば、わずかな欠失およびＳＮＰを含むと解釈されるが、これらに限定されない。
【０１４８】
配列番号: 299, 300, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 345, 346, 381, 382, 393, 394, 401, 402, 411, 412, 417, 418, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 443, 444, 455, 456, 475, 476, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 573, 574, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 619, 620, 655, 656, 667, 668, 675, 676, 685, 686, 691, 692, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 717, 718, 729, 730, 749, 750, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793 および 794は、表１に記載されるゲノム配列から誘導されたＤＮＡの前処理された配列を示す。これらの配列は、目下、予期されない配列材料のわずかな変異の全て、例えば、わずかな欠失およびＳＮＰを含むと解釈されるが、これらに限定されない。
【０１４９】
配列番号: 2003, 2003, 2003, 2003, 2004, 2004, 2004, 2004, 2005, 2005, 2005, 2005, 2006, 2006, 2006, 2006, 2007, 2007, 2007, 2007, 2008, 2008, 2008, 2008, 2009, 2009, 2009, 2009, 2010, 2010, 2010, 2010, 2011, 2011, 2011, 2012, 2012, 2012, 2013, 2013, 2014, 2014, 2015, 2015, 2016, 2016, 2017, 2017, 2017, 2018, 2018, 2018, 2019, 2019, 2019, 2020, 2020, 2020, 2021, 2021, 2022, 2022, 2023, 2023, 2024, 2024, 2025, 2025, 2026, 2026, 2027, 2027, 2028, 2028, 2029, 2029, 2030, 2030 - 2035, 2035, 2036, 2036, 2037, 2037, 2038, 2038 - 2045, 2045, 2046, 2046, 2047, 2047, 2048, 2048, 2049, 2049, 2050, 2050, 2051, 2051, 2052, 2052, 2053, 2053, 2054, 2054, 2055, 2055, 2056, 2056, 2057, 2057, 2058, 2058, 2059, 2059, 2060, 2060 - 2073, 2073, 2074, 2074 - 2077, 2077, 2078, 2078 - 2081, 2081, 2082, 2082 - 2095, 2095, 2096, 2096, 2097, 2097, 2098, 2098, 2099, 2099, 2100, 2100, 2101, 2101, 2102, 2102, 2103, 2103, 2104, 2104 - 2109, 2109, 2110, 2110, 2111, 2111, 2112, 2112, 2113, 2113, 2114, 2114 - 2123, 2123, 2124, 2124, 2125, 2125, 2126 および 2126 〜2142は、表２および３に記載される配列番号: 1 〜 配列番号: 63のゲノムＤＮＡ内のＣｐＧ位置の分析において有用であるオリゴマーの配列を示す。
【０１５０】
配列番号 2001 〜 配列番号 2140は、配列番号: 27, 40, 122, 43, 131, 50, 74, 127, 135, 86, 90, 128, 129, 99, 105, 115, 121, 126, 137, 129, 125, 132, 122, 123, 131, 133, 134, 127, 130, 135, 124, 128 および 136に記載されるゲノムＤＮＡのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析において特に有用であるオリゴマーの配列を示す。
【０１５１】
配列番号: 54, 配列番号: 56 および 配列番号: 133は、ＴＭＥＦＦ２遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 349,350,353,354, 511, 623, 624, 627, 628, 785 および 786はそれらの前処理された配列を示す。
【０１５２】
配列番号: 56, 70 および 136は、ＥＳＲ１遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号:357, 358, 385, 386, 515, 514, 631, 632, 659, 660, 787 および 788はその前処理された配列を示す。
【０１５３】
配列番号: 135 および 配列番号: 83は、ＰＩＴＸ２遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 411, 412, 515, 516, 685, 686, 789 および 790は、その前処理された配列を示す。
【０１５４】
配列番号: 119 および 配列番号: 136は、ＰＣＡＦ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号:483, 484, 517, 518, 757, 758, 791, 792はｍその前処理された配列を示す。
【０１５５】
配列番号: 137は、ＷＢＰ１１遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 519, 520, 793 および 794はその前処理された配列を示す。
【０１５６】
配列番号: 27は、ＳＴＭＮ１遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 299, 300, 573 および 574はその前処理された配列を示す。
【０１５７】
配列番号: 90 および 配列番号: 124は、ＰＳＡＴ１としても公知であるＰＳＡ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 425, 426, 699, 700, 493, 494, 767 および 768はその前処理された配列を示す。
【０１５８】
配列番号: 91 および 配列番号: 128は、ＣＧＡ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 427, 428, 501, 502, 701, 702, 775 および 776はその前処理された配列を示す。
【０１５９】
配列番号: 74は、ＦＧＦＲ１遺伝子のゲノム配列を示し、および 配列番号: 393, 394, 667 および 668はその前処理された配列を示す。
【０１６０】
配列番号:50は、ＰＴＧＳ２遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 345, 346, 619 および 620はその前処理された配列を示す。
【０１６１】
配列番号: 90は、ＭＳＭＢ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 443, 444, 717 および 718 はその前処理された配列を示す。
【０１６２】
配列番号: 68 および 配列番号: 131は、ＴＰ５３遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 381, 382, 507, 508, 655, 656, 781 および 782はその前処理された配列を示す。
【０１６３】
配列番号: 92は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 429, 430, 703 および 704はその前処理された配列を示す。
【０１６４】
配列番号: 41 および 配列番号: 122は、Ｓ１００Ａ２遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 327, 328, 489, 490, 601, 601, 763 および 764はその前処理された配列を示す。
【０１６５】
配列番号: 121は、ＰＲＫＣＤ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 487, 488, 761 および 762はその前処理された配列を示す。
【０１６６】
配列番号: 78 および 配列番号: 127は、ＳＹＫ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 401, 402, 499, 500, 675, 676, 773 および 774はその前処理された配列を示す。
【０１６７】
配列番号: 115は、ＶＴＮ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 475, 476, 749, 750はその前処理された配列を示す。
【０１６８】
配列番号: 86は、ＧＲＩＮ２Ｄ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 417, 418, 691 および 692はその前処理された配列を示す。
【０１６９】
配列番号: 43は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 331, 332, 605 および 606はその前処理された配列を示す。
【０１７０】
配列番号: 105は、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 455, 456, 729 および 730はその前処理された配列を示す。
【０１７１】
配列番号: 42 および 配列番号: 123は、ＴＦＦ１遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 329, 330, 491, 492, 603, 604, 765 および 766はその前処理された配列を示す。
【０１７２】
配列番号: 125は、ＤＡＧ１遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 495, 496, 769 および 770 はその前処理された配列を示す。
【０１７３】
配列番号: 126は、ＯＮＥＣＵＴ遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 497, 498, 771 および 772 は、その前処理された配列を示す。
【０１７４】
配列番号: 129は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 503, 504, 777 および 778はその前処理された配列を示す。
【０１７５】
配列番号: 59 および 配列番号: 130は、ＲＡＳＳＦ１遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号:363, 364, 505, 506, 637, 638, 779, 780はその前処理された配列を示す。
【０１７６】
配列番号: 132は、ＥＲＢＢ２遺伝子のゲノム配列を示し、配列番号: 509, 510, 783 および 784はその前処理された配列を示す。
【実施例】
【０１７７】
実施例１
ＤＮＡ試料はウィザードキット(Promega)を使用して抽出し、２００名の患者から得た試料を分析し、候補マーカーを選択して４つのデータ分析を実施した。
【０１７８】
重亜硫酸塩処理とｍＰＣＲ
全ての試料の全ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩で処理して非メチル化シトシンをウラシルへ変換した。残存するメチル化シトシンはそのままであった。重亜硫酸塩処理はオレク(Olek)ら、(1996)が記載するプロトコールをわずかに変更して実施した。重亜硫酸塩化した後、各ＤＮＡ試料１０ｎｇを６〜８プライマー対を含む次のｍＰＣＲ反応に使用した。
【０１７９】
各反応は下記のものを含んでいた。
４００μＭ  ｄＮＴＰ
２ｐｍｏｌ 各プライマー
１ U  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ (Qiagen)
１０ｎｇ  ＤＮＡ (重亜硫酸塩処理)
【０１８０】
さらに、プライマーの詳細は表１に示される。
９５℃で１５分間の変性、続いて５５℃で４５分間のアニーリング、６５℃で２分間のプライマー伸長を４０回、繰り返した。６５℃で最終伸長を１０分間、実施した。
【０１８１】
ハイブリダイゼーション
次いで、個々の試料のそれぞれから得た全ＰＣＲ産物は、分析下の各ＣｐＧ位置における固定化された１対のオリゴヌクレオチドを有するガラススライドとハイブリダイズさせた。これらの検出オリゴヌクレオチドは、それぞれ、本来、非メチル化（ＴＧ）またはメチル化（ＣＧ）された１つのＣｐＧ部位のまわりの重亜硫酸塩変換配列にハイブリダイズするように設計されていた。使用したハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドのさらに詳細なことは、表２を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件はＴＧおよびＣＧ変異体間の１つのヌクレオチドの相違を検出できるように選択した。
【０１８２】
各多重ＰＣＲ産物５μｌは、１０×Ｓｓａｒｃ緩衝液 (１０×Ｓｓａｒｃ：２３０ｍｌ  ２０×ＳＳＣ、１８０ｍｌラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液２０％、ｄＨ２Ｏで１０００ｍｌに希釈)中に希釈した。次いで、反応混合物を以下のようにして検出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。９５℃で変性、１０℃まで冷却、４２℃で一夜、ハイブリダイゼーション、続いて４２℃で１０×Ｓｓａｒｃ および ｄＨ２Ｏで洗浄した。さらに、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの詳細は表２に示される。
【０１８３】
ハイブリダイズした各オリゴヌクレオチドから得た蛍光シグナルは、ジェネピック(genepix) スキャナーとソフトウェアを使用して検出した。２つのシグナル（各ＣｐＧ位置を分析するために使用されたＣＧオリゴヌクレオチドとＴＧオリゴヌクレオチドから得た）の割合は蛍光シグナルの強度比較に基づいて計算した。
【０１８４】
データ分析方法
チップデータの分析：生ハイブリダイゼーション強度からメチル化割合へ；各ＣｐＧ位置のログメチル化割合（ｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ））は下記工程を含む標準化された前処理情報ラインに従って測定した。各スポットでは、中央背景画素強度が中央前景画素強度から差し引かれる（これはハイブリダイゼーション強度を訂正した背景の良い推定値となる）。各ＣｐＧ位置のＣＧおよびＴＧ検出オリゴヌクレオチドでは、４つの余分なスポット強度の背景補正中央値が採用される。各チップおよび各ＣｐＧ位置では、ｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）割合が計算される。各試料では、余分なチップ反復以上のｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）強度が採用される。この割合はハイブリダイゼーションノイズが可能性あるメチル化割合の完全な範囲を越えるおよそ一定の変動を有するとの性質を有する（フーバー(Huber）ら、2002)。
【０１８５】
主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）は新規な座標系上に測定ベクター（例えば、チップデータ、いくつかのＣｐＧなどの上のメチル化プロフィールなど）を描出する。新規な座標軸は主成分として参照される。第１主成分はデータの最も大きな変動の方向をスパンする。次の成分は減少する変動により順序付けられ、互いに直交する。異なったＣｐＧ位置は、異なったウェイトでもって異なった成分に従うデータクラウドの伸長に寄与する。ＰＣＡは未管理技術、すなわちデータポイントの標識を考慮にいれない技術である（さらに詳細は、例えばリップレイ(Ripley)(1996)参照）。
【０１８６】
ＰＣＡは通常、データから高い変動を有する態様を可視化または抽出するために、低次元部分空間上に高次元データ（我々のケースではメチル化−アレーデータ）を描出するように使用される。本報告では、我々はデータの統計的品質管理のために２次元描出を使用する。我々はチップデータ上の異なったプロセスパラメーターの効果を調査し、変化するプロセスパラメーターが測定値に大きな変更を生じることを排除する。
【０１８７】
ＰＣＡのローバスト版は、１つの域外値チップを検出し、さらなる分析からこれらを排除するために使用される（モデル(Model)ら、2002）。
【０１８８】
仮想検定
主たる仕事は、２つのクラス間のメチル化の平均的程度における有意な相違を示すマーカーを同定することである。有意な相違は、２つのクラスの平均的メチル化が同じであるとの帰無仮説がｐ＜０．０５でもって拒絶され得るときに検出される。我々はこの検定を潜在的マーカーの全体的セットに応用するから、我々は多重検定におけるｐ−値を補正しなければならない。これはフォールス・ディスカバリー・レート (FDR) 法 (デュドワ(Dudoit)ら、2002)を応用して実施された。
【０１８９】
２つのクラスのメチル化の程度が同じであるとの帰無仮説を検定するために、我々はロジスティック回帰分析モデル(ベネイブルズ(Venables)およびリプレイ(Ripley), 2002)のための尤度比検定を使用した。１つのマーカーのロジスティック回帰分析モデルは関心あるそれぞれのゲノム領域中の全てのＣｐＧ位置から得たメチル化測定の一次的組合せである（ＲＯＩ）。マーカーの有意なｐ−値はこのＲＯＩが２つのクラスによって与えられる関心ある問題に対するいくつかの系統的な補正を有することを意味する。しかしながら、少なくとも正式には、それはマーカーの実際の予測的力について述べていない。
【０１９０】
管理された学習によるクラス予測
選択カーカーのＣｐＧ全体が相違した組織クラス間をいかに十分に差別化することができるかについての信頼性ある評価を与えるために、我々は分類によってその予測の正確性を決定することができる。この目的のために、我々はそれらのクラス標識によってあるセットの組織試料を使用して、メチル化プロフィールに基づく予測機能を計算する。この段階はトレーニングと呼ばれ、それはデータ標識によって示される先の知識を活用する。次いで、この機能の予測正確性は交差確証により、または１設置の独立した試料で検定される。選択方法としては、我々はサポート・ベクター・マシン(SVM)アルゴリズム(デューダ(Duda) (2001), クリスチアンニニ(Christiannini) (2000))を使用して、予測機能を学習する。もしも他に言及されていないなら、この報告では、偽陽性または偽陰性分類を伴うリスクがそれぞれのクラスの大きさに等しく関連しているとされる。これは学習アルゴリズムが目的とともにクラス予測機能を得て、独立した試料セットの正確性を至適化することを伴う。したがって、得られた分類物の感度と特異性はおよそ等しいと期待され得る。
【０１９１】
データ分析
データセット１および２（図５〜１３）
次いでデータはアルゴリズムを使用して２つのクラスの組織間のＣｐＧメチル化相違に従ってランク付けされたマトリックスス中に分類する。図５、７、９および１１〜１３は灰色段階で示され、ここで、最も有意なＣｐＧ位置は上部に向かって減少する有意差をもつマトリックスの底部に存在する。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定の位置の非メチル化を示し、メチル化程度は明るい灰色（メチル化の低割合）から暗い灰色（メチル化の高割合）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各欄は１つの試料における異なったＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。ＣｐＧおよび遺伝子同定物が示される左側には、これは問題の遺伝子および使用された検出オリゴマーを確証するために添付する表（表５）に相互参照されている。ｐ−値は観察された分布がデータセットで偶然に生じた可能性である。図６、８、１０および１２は先の図（すなわち、それぞれ図５、７、９および１１）の元の赤−緑バージョンである。暗い灰色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、明るい灰色は特定位置の非メチル化を示す。
【０１９２】
データセット１：補助的活動環境
外科手術後、直ちに補助治療としてタモキシフェンで治療した患者試料のメチル化パターン分析（図１）は、図５〜８のマトリックス中に示される。この分析では、ＰＴＧＳ２、ＭＳＭＢ、ＴＰ５３およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は２つのクラスの組織（治療に対する反応者と治療に対する非反応者）間で有意に相違してメチル化されていた。
【０１９３】
図３および４に示される分類では、ＴＰ５３ およびＭＳＭＢ遺伝子は薬剤タモキシフェンに対する非反応者で有意により多くメチル化されていた。ここで、３６ケ月以下の無疾患生存の被検者は非反応者として分類され、６０ケ月以上無疾患生存の被検者は反応者として分類し、この分類は感度０．８４および感度０．１６でもって実施された。
【０１９４】
図７および８で示される分類では、ＰＴＧＳ２遺伝子は薬剤タモキシフェンに対する非反応者で有意により多くメチル化された。ここで、２４ケ月以下の無疾患生存の被験者は非反応者として分類し、１００ケ月以上無疾患生存の被検者は反応者として分類した。この分類は感度０．８９および感度０．４８で実施した。
【０１９５】
データセット１：転移活動環境
転移活動環境においてタモキシフェンで治療した患者試料のメチル化パターンの分析（図２参照）は図９〜１２のマトリックス中に示される。この分類で分析された被検者は最初の治療に続いて再発し、続いての転移はタモキシフェンで治療した。
【０１９６】
図９および１０に示される分類では、ＦＧＦＲ１ およびＰＳＡ遺伝子は薬剤タモキシフェンに対する非反応者で有意により少なくメチル化されていた。進行性疾患の被検者は非反応者として分類し、部分的または完全に寛解に達した被検者は反応者として分類した。この分類は感度０．４５および感度０．８１で実施された。
【０１９７】
この分類の感度は、化学治療を受けなかったこれらの患者を分析することのみによって改善され得たであろう。この分類は、図１１および１２に示されるように、ＦＧＦＲ１、ＰＳＡおよびＣＧＡ遺伝子は薬剤タモキシフェンに対する非反応者において有意により少なくメチル化されていた。それ故、この分類の感度は０．５４に、特異性は０．８５に改善された。
【０１９８】
データセット２：転移活動環境
図１２は非反応者と対比する薬剤の反応者の全試料セットの分析を示す。ここで、薬剤に対する反応者が非反応者と対比され、２つのクラスの組織間にメチル化におい有意な相違がＳＴＭＮ１ およびＰＳＡ遺伝子において観察された。
【０１９９】
付加的治療として化学治療を受けた患者はデータセットから除外した。付加的マーカーはＣＧＡ遺伝子において観察された（図１３参照）。
【０２００】
データセット２：補助的活動環境
各ＣｐＧは、公知予測マーカーＮ−段階と腫瘍サイズとともにコックス 比例ハザードモデル中に入れた。最もよいマーカーはＰＩＴＸ２遺伝子であった。
【０２０１】
最良マーカー（オリゴヌクレオチド番号3522:2087）におけるコックスモデルは、次の通りである：
【０２０２】
【表１】
0004649331.tif 000002
【０２０３】
3522:2087は、ｎ段階と独立して生存時間に関する情報を提供する。腫瘍サイズは予期される生存時間において有意な予測力を示していない。
【０２０４】
データセット４：転移活動環境
タモキシフェン治療の成功または失敗を予測する各遺伝子プロモーターの能力を決定するために、測定された個々のＣｐＧをホテリング（Hotelling）のＴ２統計量を使用して遺伝子毎に組み合わせた。いくつかの遺伝子は多重比較において適度保存フォールス・ディスカバリー・レート２５％補正後、タモキシフェンに対する反応に有意に関連していた（図３参照）。この遺伝子はＯＮＥＣＵＴ２、ＷＢＰ１１、ＣＹＰ２Ｄ６、ＤＡＧ１、ＥＲＢＢ２、Ｓ１００Ａ２、ＴＦＦ１、ＴＰ５３、ＴＭＥＦＦ２、ＥＳＲ１、ＳＹＫ、ＲＡＳＳＦ１、ＰＩＴＸ２、ＰＳＡＴ１、ＣＧＡおよびＰＣＡＦであった。
【０２０５】
図１５はログスケールの未修正ｐ−値を示す。ｐ−値は多重ロジスティック回帰モデルの可能性比率（ＬＲ）テストから計算された。目的の個々のゲノム領域はそれぞれ点で示され、上部点線は２５％フォールス・ディスカバリー・レートにおけるカットオフ点、下部点線はボンフェロニ(Bonferroni)修正５％限界を示す。
【０２０６】
図１６は実施例１で得たデータの最もよい１１増幅産物のランクづけされたマトリックスを示す（データセット４）。ｐ−値は多重ロジスティック回帰モデルの可能性比率（ＬＲ）テストから計算された。図は灰色段階で示され、ここで最も有意なＣｐＧ位置は上部へ向かって減少する有意差を有するマトリックスの下部に存在する。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定位置の非メチル化を示し、メチル化の程度に従って、明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各行は１つの試料における異なったＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。個々のＣｐＧ位置におけるｐ−値は右側に示される。ｐ−値は観察された分布がデータセット中で偶然に生じた可能性である。
【０２０７】
データセット４：補助的活動環境
各増幅産物において、その増幅産物のための全オリゴ対における平均メチル化が計算され、その集団はその平均メチル化値によって等しい大きさの群に分けられた。その結果はカプラン−マイヤー(Kaplan-Meier)法で推定された無疾患生存曲線として、図１７〜２１に示される。ｐ−値は、次の通りであった。
【０２０８】
ＥＳＲ１：p = 0.0371
ＰＣＡＦ：p = 0.0105
ＰＩＴＸ２：p = 3e-04
ＴＭＥＦＦ２：p = 0.0106
ＷＢＰ１１：p = 0.0366
ＥＲＢＢ２：p=  0.018
【０２０９】
データセット３
タモキシフェン治療の成功または失敗を予測する各遺伝子プロモーターの能力を決定するために、測定された個々のＣＰＧをホテリング（Hotelling）のＴ２統計量を使用して遺伝子毎に組み合わせた。潜在的マーカーを同定するには、本発明者らは客観的反応（ＣＲ＋ＰＲ、４５名の患者）または治療開始からまさしく進行性疾患（ＰＤ、７８名）のいずれか極度の反応タイプを示した１２３名の患者について最初の分析を実施した。いくつかの遺伝子は多重比較において適度保存フォールス・ディスカバリー検定２５％補正後、タモキシフェンに対する反応に有意に関連していた（図３参照）。この遺伝子はＳＴＭＮ１、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＳＹＫ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＰＳＡ、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＶＴＮおよびＰＲＫＣＤであった。
【０２１０】
ＤＮＡメチル化データマトリックスから、我々は多数のＣｐＧアイランド遺伝子において、高メチル化がタモキシフェン治療に対する好ましい反応と相関していたが、スタチミン１／腫瘍性タンパク１８（ＳＴＭＮ１）およびストラフィン／１４−３−３タンパクσ（ＳＦＮ）では、低メチル化が寛解に関与していたと結論つけた。
【０２１１】
続いて、中間的なタイプの反応を示す人（安定な疾患（ＳＤ、６ケ月以上疾患に変化なし）の５９名の患者および６ケ月以下、安定な疾患の１８名の患者）を含めて２００名の患者全てをロジスティック回帰分析にて分析した。選択された各遺伝子について、我々は測定された異なったＣｐＧジヌクレオチドの全体的反応（＝客観的反応＋ＳＤ）におけるロジスティック回帰からの推定を遺伝子毎に組み合わせた。全体の同齢集団では、１０個の遺伝子全てにおいてタモキシフェン治療に対する奏効率が、その腫瘍が好ましくない状態を有する患者よりも好ましいＤＮＡメチル化状態を有していた患者において、約１５〜２０％高かった（オッズ比(ＯＲ)が１．５〜３．５の範囲）。従って、マーカー遺伝子では前者群の患者の中央ＰＦＳは、後者群（ハザード率(ＨＲ）が０．５４〜０．７７)よりも平均して１．８倍長かった。すなわち、完全な同齢集団でもこれらのマーカー遺伝子はタモキシフェン治療後の疾患結果に関連していた。
【０２１２】
進行型乳癌患者のタモキシフェン治療に対する反応の予測は、伝統的には患者、疾患および腫瘍特性、すなわち、年齢、再発の第一顕性部位、無疾患期間およびＥＲ状態に基づく。我々は伝統的予測因子（伝統的因子に基づくスコア）の多変換推定でもって計算した予測的スコアをＤＮＡメチル化データのみ（ＤＮＡメチル化に基づくスコア）と対比した。ＤＮＡメチル化に基づくスコアでは、我々はそのＤＮＡメチル化状態が互いに独立して反応を予測する遺伝子のみを含めた。これを確定するために、我々はマーカー遺伝子のそれぞれのＤＮＡメチル化状態の情報を多変換ロジスティック回帰モデルに同時に加えた。有意でない遺伝子（ｐ＜０．０５）の変数減少後、ＳＴＭＮ１、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＳＹＫ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＰＳＡ、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＶＴＮおよびＰＲＫＣＤ遺伝子は統計的に有意であり、互いに独立して反応を予測した。伝統的な因子に基づくスコアに続いて比べられたＤＮＡメチル化に基づくスコアは、これらの遺伝子の多重変換推定から誘導された。
【０２１３】
伝統的予測因子またはＤＮＡメチル化状態のいずれかに基づく各腫瘍のスコアは、その２５％、５０％および７５％値によって患者を４つの群に分割するために使用した（表３）。ＤＮＡメチル化に基づくスコアは、伝統的因子に基づくスコアよりも全体的反応を伴ったより良い識別強度を示した（表３）。ＤＮＡメチル化に基づくスコアの全体的奏効率は、第１四半期（ｑ１）の患者では２６％（ＯＲセット１．０）から増加し、第２四半期（ｑ２）では３４％（ＯＲ＝１．５）、第３四半期（ｑ３）では６６％（ＯＲ＝５．５）およびｑ４の最終四半期では８２％（ＯＲ＝１３．０）（Ｐ<０．００１）であったが、伝統的因子に基づくスコアでは、その率は、このスコアのｑ１の３６％（ＯＲ、セット１．０）から４６％（ＯＲ＝１．５）（ｑ２）を経て、６４％（ＯＲ＝３．２）および６２％（ＯＲ＝２．９）（ｑ３）（ｑ４）へそれぞれ（Ｐ＝０．０１３）増加した（表３）。
【０２１４】
同様に、ＤＮＡメチル化に基づくスコアにおける極端な四半期の中央ＰＦＳは、４．２倍異なっていたが（３．８ヶ月から１６．１ヶ月へ）、伝統的因子に基づくスコアにおいては２つの極端な四半期間の差異はその半分に過ぎなかった（４．７ヶ月から９．７ヶ月へ）（図１４Ａの曲線を図１４Ｂと比較）。
【０２１５】
それゆえに、我々が初めて、たった５つの遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドＤＮＡメチル化状態に基づく後成的プロフィールがタモキシフェン治療により治療されたＥＲ−陽性進行型乳癌の患者で治療反応の可能性を予測できることを示した。さらに、この予測は一般的に使用された伝統的予測因子に基づく予測よりもより正確であり、ＤＮＡメチル化分析が臨床治療決定に有用であることを示唆した。したがって、腫瘍組織ＤＮＡの後成的プロファイリングは十分保存される腫瘍組織材料に大きく依存する長ったらしい(tedious)ｍＲＮＡプロファイリングに代わる競争力があって、かつ単純な代替であるに違いない。そのうえ、この後成的ＤＮＡプロフィールは非常に安定であり、特定部位（遺伝子のプロモーター領域）に局在し、そしてＰＣＲで容易に増幅され得る。それに加えて、ＤＮＡメチル化状態測定は所定期間凍結されるか、あるいは容易に入手できるパラフィン包埋された腫瘍組織材料で実施でき、日常的臨床活動環境に広く応用され得る。
【０２１６】
実施例２：Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ分析
以下の実施例では、ＰＳＡＴ１遺伝子のタモキシフェン反応関連メチル化状態がブロッカーオリゴヌクレオチドおよびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブを含むリアルタイム分析を使用して、２４名の患者試料の分析によって証明した。
【０２１７】
プライマー: TAGGTTGGTAGGGGTAG                         (配列番号:2143)
プライマー: AAAACTCACATCCCCATTAA                      (配列番号:2144)
プローブ: TTTTTTGTATTGATTAAAAATGGGGGTTGAAATAGTA       (配列番号:2145)
メチル化特異的プローブ: CGCGAGGAGGAGTAATTGTTTC        (配列番号:2146)
メチル化特異的プローブ: TGTGAGGAGGAGTAATTGtTTTGATTT  (配列番号:2147)
【０２１８】
この反応はそれぞれ、以下の分析条件でもって各ＤＮＡ試料について３回、実施した。
反応溶液：
Ｑｉａｇｅｎ  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ５Ｕ
１０×ＰＣＲ緩衝液                  １ｘ
ＭｇＣｌ２                          ３ｍＭ
プライマー                          各３００ｎＭ
プローブ                            各２５０ｎＭ 
ｄＮＴＰs                          各２００ｎＭ
ＢＳＡ                            ０．２５ｍｇ／ｍｌ
鋳型ＤＮＡ                          １０ｎｇ
サイクリングプロフィール：
１５分間、９５℃ 変性
５５回：９５℃で１０ 秒、５５℃で２０ 秒、５７℃で３秒、７２℃で２０秒、結果は表４に示される。
【０２１９】
【表２−１】
0004649331.tif 000003
【表２−２】
0004649331.tif 000004
【表２−３】
0004649331.tif 000005
【表２−４】
0004649331.tif 000006
【表２−５】
0004649331.tif 000007
【０２２０】
【表３−１】
0004649331.tif 000008
【表３−２】
0004649331.tif 000009
【表３−３】
0004649331.tif 000010
【表３−４】
0004649331.tif 000011
【０２２１】
【表４】
0004649331.tif 000012
【０２２２】
ａ，ロジスティック回帰は、タモキシフェン治療に対する反応タイプと因子の関係の強度を検定するために使用した；ｂ，オッズ比；ｃ，９５％信頼区間、ｄ，伝統的因子、年齢（＞７０歳、５５〜７０歳、４１〜５５歳対≦４０歳）、再発の顕性部位（内臓または骨対軟部組織への再発）、無疾患間隔（＞１２ヶ月対≦１２ヶ月）およびｌｏｇＥＲ値の多変換分析に基づくスコア。スコアは２５％、５０％および７５％値に基づく群（ｑ１〜ｑ４）に分割した。ｅ，５つの独立した予測遺伝子、ＰＳＡ−Ｔ、ＳＴＭＮ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＴＧＦＢＲ２およびＳ１００Ａ２のＤＮＡメチル化状態に基づくスコア。スコアは伝統的因子に基づくスコアの場合と同じく、ｑ１〜ｑ４の群に分割した。
【０２２３】
【表５】
0004649331.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】本発明の方法の好ましい応用を示した図である。
【図２】本発明の方法の他の好ましい応用を示した図である。
【図３】実施例１のＣｐＧアイランドのメチル化分析を示した図である。
【図４】図３（実施例１）で測定した生存奏効率と有意差に関連する１０個の遺伝子の生のＣｐＧジヌクレオチドメチル化データを示した図である。
【図５】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図６】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図７】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図８】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図９】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図１０】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図１１】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織間のＣｐＧメチル化相違による実施例１（データセット１）で得られた付加的データのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図１２】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織（転移活動環境のホルモン治療に対する反応者と非反応者）間のＣｐＧメチル化相違による実施例３で得られたデータのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図１３】アルゴリズムを使用して、２クラスの組織（転移活動環境のホルモン治療に対する反応者と非反応者）間のＣｐＧメチル化相違による実施例３で得られたデータのランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図１４Ａ】実施例１（データセット３）の組合せスコアの無増悪生存期間（ＰＦＳ）曲線を示した図である。
【図１４Ｂ】実施例１（データセット３）の組合せスコアの無増悪生存期間（ＰＦＳ）曲線を示した図である。
【図１５】ログスケールで未修正ｐ−値を示した図である。
【図１６】実施例１で得たデータ（データセット４）の最もよい１０個の増幅産物のランクづけされたマトリックスを示した図である。
【図１７】ＥＳＲ１遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（下部曲線）は非反応者を示し、直線（上部曲線）は反応者を示した図である。
【図１８】ＰＣＡＦ遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（上部曲線）は非反応者を示し、直線（下部曲線）は反応者を示した図である。
【図１９】ＰＩＴＸ２遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（上部曲線）は非反応者を示し、直線（下部曲線）は反応者を示した図である。
【図２０】ＴＭＥＦＦ２遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（上部曲線）は非反応者を示し、直線（下部曲線）は反応者を示した図である。
【図２１】ＷＢＰ１１遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（下部曲線）は非反応者を示し、直線（上部曲線）は反応者を示した図である。
【図２２】ＥＲＢＢ２遺伝子のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）計算無病生存曲線を示し、点線（下部曲線）は非反応者を示し、直線（上部曲線）は反応者を示した図である。
【図１】
0004649331.tif 000014
【図２】
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【図３】
0004649331.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
0004649331.tif 000019
【図７】
0004649331.tif 000020
【図８】
0004649331.tif 000021
【図９】
0004649331.tif 000022
【図１０】
0004649331.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0004649331.tif 000026
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
0004649331.tif 000029
【図１６】
0004649331.tif 000030
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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