(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）培養菌（３８）を収容するための少なくとも第一および少なくとも第二の培養容器（４、６）、
（ｂ）ガス源（１２）、
（ｃ）培地源（１８）、
（ｄ）殺菌剤（２１）用の源（２０）、
（ｅ）前記ガス源を前記培養容器（４、６）に連結させる導管系であって、前記二つの培養容器（４または６）を前記培地源（１８）または前記殺菌剤（２１）用の前記源（２０）に選択的に連結させるための手段を含み、ガス、培地および／または殺菌剤を個々の前記培養容器（４、６）に供給する前記導管系はそれぞれ共通部分を有する導管系、および、
（ｆ）共通の導管部分を有する二つの連結導管を介して前記二つの培養容器（４、６）を互いに連結させる手段、
を含む懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択する装置。
【請求項２】
選択的に連結させる前記手段がバルブである請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記共通の導管部分（３４）は、前記二つの培養容器（４、６）の最上端と最下端との間のあるレベルに配置されている請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記共通の導管部分（３４）が、前記培養菌（３８）を前記培養容器（４、６）から排出することのできる放出導管（３６）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記導管部分（３２、３４；３３、３５）がサイホントラップを形成している請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記連結導管の一方（３２）が、前記培養容器（４、６）の下部に連結され、前記連結導管の前記他方（３０）が、前記培養容器（４、６）の上部に連結されている請求項３または５に記載の装置。
【請求項７】
前記培地源（１８）からの導管（１４、１６）および／または前記殺菌剤（２１）用の前記源（２０）からの導管（２２、２４）が、前記それぞれの培養容器（４、６）に割り当てられ、前記ガス源（１２）から伸びている導管（８、１０）に挿入されて取り付けられている請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記ガス源（１２）、前記培地源（１８）および／または前記殺菌剤（２１）用の前記源（２０）に連結されている導管系の導管が加圧されている請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
それぞれの培養容器（４、６）が、固有の閉鎖可能な放出導管（２６、２８）を有する請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記放出導管（２６、２８）が、前記培養容器（４、６）の上部から挿入されて取り付けられている、および／または前記連結導管（３０）から分岐している請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
平行に配列された、複数の第一の培養容器（４ｊ）および／または複数の第二の培養容器（６ｊ）を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
（ａ）少なくとも一つの第一の培養容器（４）に収容されている培養菌（３８）を有し、
（ｂ）前記第一の培養容器（４）内の前記培養菌（３８）に、ガス源（１２）からガスを連続的に供給し、培地源（１８）から液体を定期的に送り出し、
（ｃ）前記培養菌（３８）を、適切な導管連結部により、前記第一の培養容器（４）から連結導管（３２〜３５）を介して少なくとも一つの第二の培養容器（６）内に移送し、
（ｄ）前記第一の培養容器（４）を殺菌するため、前記第一の培養容器（４）を殺菌剤（２１）用の源（２０）に連結し、
（ｅ）前記殺菌剤（２１）を前記第一の培養容器（４）から除去し、
（ｆ）前記第二の培養容器（６）内の前記培養菌（３８）にガス源（１２）からガスを連続的に供給し、培地源（１８）から液体を定期的に送り出し、
（ｇ）前記培養菌（３８）を、適切な導管連結部により、前記第二の培養容器（６）から連結導管（３２〜３５）を介して前記第一の培養容器（４）内に返送し、
（ｈ）前記第二の培養容器（６）を殺菌するため、前記第二の培養容器（６）を殺菌剤（２１）用の源（２０）に連結し、
（ｉ）前記殺菌剤（２１）を前記第二の培養容器（６）から除去し、
（ｊ）（ｂ）から（ｈ）の工程を選択自由に繰り返す、
工程を含む懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択する方法。
【請求項１３】
前記それぞれの培養容器（４、６）に割り当てられている前記導管部分が、適切な導管連結部により殺菌される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記導管部分または前記培養容器（４、６）内の前記殺菌剤（２１）の残余が、殺菌後に中和される請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
殺菌剤（２１）の排出されていないどの時点においても、培養菌（３８）を前記培養機器（２）から排出することのできる請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
一方の培養容器（４または６）から前記他方の培養容器（４または６）への前記培養菌（３８）の移送が、周期的に行われる請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
一方の培養容器（４または６）から前記他方の培養容器（４または６）への培養菌（３８）の移送が、導管に住みついているすべての細胞を、これらの周期のいずれか一つの間に破壊するような間隔で行われる請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
一方の培養容器（４または６）から前記他方の培養容器（４または６）への培養菌（３８）の移送が、懸濁状態にある生物体の個体群を、どの時点でも維持し、前記機器のどの部分に付着しているすべての細胞を、これらの周期のいずれか一つの間に破壊するような間隔で行われる請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
導管が、バルブにより連結されている請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記培養菌（３８）に供給される液体が、栄養培地および／または洗浄液を含む請求項１２〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記殺菌剤（２１）が、前記培養容器（４、６）に割り当てられた放出導管（２６、２８）を通して、少なくとも部分的に除去される請求項１２〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも前記（ｂ）〜（ｈ）のうち二つの工程が、一時的に重複する、または同時に行われる請求項１２〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
殺菌にＮａＯＨが用いられる請求項１２〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
培養菌がケモスタット条件またはタービドスタット条件の下で維持されている請求項１２〜２３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択する方法および装置に関する。
【０００２】
従来、直列的および連続的培養方法とは区別されている。直列的培養技術では、無菌増殖培地の収容された培養容器に、同一の増殖条件の下で増殖された培養菌の分画を植え付ける。この周期は、新たな培養菌が増殖したときに繰り返される（Lenski, R.E. and Travisano, M. (1994): Dynamics of adaption and diversification: A 10,000-generation experiment with bacterial populations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6808-6814）。最も長期間にわたる微生物生物体の増殖に関して記載のある先行技術の実験は、この方法で実施された（Lenski and Travisano, loc. cit.）。連続的増殖方法では（Dijkuizen, D.E. (1993): Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution, Meth. Enzymol. 224, 613-631）、培養菌は、予め定められた体制に従って新鮮増殖培地を用いて連続的に希釈される。先行技術では、このような実験が限られた期間持続するとだけ記載されている（Dijkuizen, loc. cit.）。
【０００３】
上記の先行技術は、懸濁状態にある生物体の永久増殖を確実にする連続的培養方法が今まで記載されていないという点において、とりわけ不利である。記載されている全ての機器は、機器の内側面に住みつく耐希釈（静的）変異体を選択している（Chao, L. and Ramsdell, G. (1985): The effects of wall populations on conexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures, J. Gen. Microbiol. 131, 1229-1236）。これらの変異体は、懸濁状態にある生物体に作用する適応圧力から逃れる亜細胞を形成する。一定の細胞密度での連続培養、例えばタービドスタット（turbidostat）などは、耐希釈変異体による侵入に対して特に影響を受けやすく、比較的短い期間にわたって実施することだけが可能である（約２００世代）。先行技術は、これらの問題点を記載しているが、今までこれに対して不適切な解決の可能性を提示しただけである。従って、このような方法は、その潜在性に非常に早く気づいたにもかかわらず、科学的および工業的な目的には実際に使用されていない（Monod, J. (1950): La technique de la culture continue. Theorie et applications, Ann. Inst. Pasteur 79, 390-410; Novick, A. and Szilard, L. (1950): Description of the chemostat, Science 112, 715-716）。培養機器の、今回の場合は簡単な培養容器の定期的な改良と述べることのできる直列的培養では、このような耐希釈変異体による侵入は避けられる。しかし、これには多くの作業を伴い、つまり、多くの人手を必要とし、完全な無菌状態の要求される条件下での反復操作により、この培養菌は汚染されやすい（Lenski and Travisano, loc. cit.）。無菌環境での直列的培養のロボット化は、これらのリスクを減らすことができるであろう。しかし、多数の培養容器を必要とするという代償を払うことになるであろうし、ロボットの機械的精度および無菌環境が維持されなければならないため、限定されることになるであろう。
【０００４】
したがって、本発明の課題は、懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択する改良された方法および改良された装置を提供することである。この課題は、請求項により特徴づけられる実施形態を提供することにより解決される。
【０００５】
この課題の解決に際し、本発明は、装置が、連続的な増殖状態にある細胞の懸濁液を保つという基本的な考え方から出発している。耐希釈変異体は、機器のいかなる部分にも蓄積されてはならない。その機能は、液体の流れ（フルイディクス）を制御することで確保される。例えば栄養培地および洗浄液などの液体の定期的な送り出し、ならびに例えば空気などの無菌ガスの連続的な供給が確保されているという前提条件の下で、機器は、無限の期間にわたって自律的に作動しなければならない。例えば、ケモスタットまたはタービドスタットなどの様々な培養体制を適用できる。必要に応じて、細胞の特定成分を適切な溶液の効果により分離または遊離させることができる。必要に応じて、一つの機器の中身または中身の一部を別の機器に移送できるように、複数のこれらの機器を互いに連結させることができる。
【０００６】
細胞の個体群が、連続的培養条件の下での懸濁状態でのみ増殖するという必要条件は、生物体懸濁液を第一の培養容器から第二の培養容器に周期的に移送することにより具体的に満たされるのが好ましい。移送後、第一の培養容器は殺菌処理されなければならず、必要に応じて殺菌剤を中和させると、第一の培養容器には、第二の培養容器から返送された培養菌を収容する準備が再び整うことになり、引き続いて第二の培養容器の殺菌および中和を行う。この過程は、（ｉ）懸濁状態にある生物体の個体群をどの時点でも維持すること、および（ｉｉ）機器のどの部分にあるすべての耐希釈変異体を、これらの周期のいずれか一つの間に破壊することを確実にする。
【０００７】
培養容器の交互殺菌法は、機器の表面に住みつく様々な生物体に対して直接的および規則的に選択を行い、静的な耐希釈個体群の増殖および適応を回避するのが好ましい。生物体の連続的培養のためのどの装置も、自然選択が希釈に抵抗する突然変異体を好んでいる機器と見なすことができる。希釈に耐えるために、記載の方法から培養個体群に提示されている唯一の可能性は、懸濁状態での増殖率の上昇である。発酵方法とは異なり、本発明は、静的変異体に対して同時に選択を行い、常に培養条件により良く適応している動的変異体を好む自動化遺伝学的方法を記載している。
【０００８】
したがって、先行技術に対して本発明は、一定の細胞密度（タービドタット）を有する体制が無限の期間にわたって維持されうることと、自然発生による細胞または遺伝的に変更された細胞の成長率を上げられる、という利点を特に有する。工業的な応用例は、化学生成物（例えば、化学合成の中間生成物または環境汚染物質など）を新陳代謝させることが可能な自然変異体の濃縮である。さらなる応用は、酵素または代謝系路の改良であろう。すなわち、基体から生成物への変換が細胞の新陳代謝を制限する措置であるなら、また細胞にこの基体を過度に供給できるのであれば、記載の条件下での連続的な培養は、基体の転換率の上昇に起因する成長率の上昇をもたらすことになり、この転換率の上昇は、基体に要求される転換の選択対象である酵素のための一つまたは複数の遺伝子内の継続的突然変異の定着に起因している。
【０００９】
本発明のさらなる利点は、機器により、複数の様々な増殖溶媒を生物体懸濁液に供給できることである。これは、幾重または交互の適応を実施すること、および培養生物体の代謝能力を分散させることを可能にする。新鮮培地の供給とは別に、予め定められた細胞密度を変量に依存させることができる。この密度を達成することは、化学的および物理的作用物質の効果を条件付けることができ、これらの作用物質の毒性は、生物体の個体群が常にその許容限界にある、またはさらに抵抗力のある変異体が選ばれるように調整される。また、洗浄剤または溶媒の供給により、細胞のある成分を抽出することができる。特に、プラスミドまたはウイルスなどの遺伝物質が自動的に抽出されうるのに対し、宿主細胞は破壊される。しかし、自然にまたは合成的に作られた核酸と共に、細胞に遺伝的変形または感染の能力を与える特定の作用物質を供給することができる。この遺伝物質をその後個体群に導入する。非常に一般的な意味において、二つ以上の機器を互いに連結することができる。これにより、異なる生物体を自動的に互いに接触させることができ、例えば接合エピゾーム、ファージ、トランスポゾンなどの非常に異なる遺伝物質を、自動的に導入することができる。
【００１０】
以下、本発明の好ましい実施形態を、図面を参照しながら例示する。
【００１１】
懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択するための図１から図１６に示した装置を、培養機器２と称することもできる。培養機器２は、無限の期間にわたって懸濁状態にある細胞を増殖させる。自然選択により、選ばれた培養条件にさらにより良く適応する遺伝変異体が濃縮される。使用される生物体は、原核生物でも真核生物でもよい。また、使用される生物体は、自然発生による生物体でも遺伝的に変異した生物体でもよい。連続的（Kubitschek, H.E. (1970): Introduction to research with continuous cultures, Prentice-Hall; Pirt, S.J. (1975): Principles of microbe and cell cultivation, Blackwell）、周期的（Pirt, loc. cit.）または条件付き（Bryson, V. (1952): The turbidostatic selector - a device for automated isolation of bacterial variants, Science 116, 48-51; Fraleigh, S.P., Bungay, H.R. and Clesceri, L.S. (1989): Continuous culture, feedback and auxostats, TIBTech. 7, 159-164）培養条件を用いることができる。培地の物理的および化学的特徴は、ユーザーにより選択可能である。
【００１２】
以下、培養機器２の構成および作動を、図１から図１６に基づいて記載する。培養機器２は、基本的に第一の培養容器４と第二の培養容器６とを含む。二つの培養容器４および６はそれぞれ、導管８および１０を介して加圧ガス供給１２に連結され、導管８および１０は、培養容器４および６の下部に挿入されて取り付けられているのが好ましい。また、導管１４および１６を介して、培養容器４および６は同じく加圧されている培地源１８に連結されている。ガス供給１２を二つの培養容器４および６に連結させるため、導管１４および１６は、培地源１８から伸びて、それぞれの導管８および１０に挿入されて取り付けられているのが好ましい。また、殺菌剤２１（例えば、ＮａＯＨ）用の加圧源２０があり、前記源２０が、導管２２および２４を介して培養容器４および６にそれぞれ連結されている。導管２２および２４は、導管１４および１６との関連で前述したように、導管８および１０に挿入されて取り付けられるのが好ましい。
【００１３】
また、培養容器４および６の上には、それぞれの培養容器４または６を殺菌および中和している間に余分な殺菌剤２１または洗浄液１９を排出するため、放出導管２６および２８がそれぞれ設けられている。さらに、培養容器４および６を互いに連結するために、二つの培養容器４および６の間に連結導管３０、３１、３２および３３が設けられている。これらの連結導管のうち少なくとも二つには、放出導管３６を備えている共通部分３４および３５を有するのが好ましく、前記放出導管３６は、二つの培養容器４または６の一方を完全に空にするため、または培養菌３８あるいはその一部を排出するために用いられる。
【００１４】
懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択するための本発明の方法を制御するために、導管または導管部分１４、１６、２２、２４、３０、３２、３３、３４、３５および３６は、バルブを含んでいる（図式的に示す）。バルブは、例えば機械的に作動させることができるし、または図示されていない制御手段を用いて、電気的、あるいは電子的、好ましくは自動的に制御可能である。
【００１５】
図１から図１６に基づき、以下に、上記の培養機器２を用いた本発明の方法の作動をさらに詳しく説明する。この関連で指摘しておくべきなのは、閉じられた導管部分は細い線で示され、液体の流れることのできるまたは流れている導管部分あるいは導管が太い線で示されていることである。バルブは図式的に示されているだけであるため、その図示されている様子から、使用されているバルブの種類を結論づけてはならない。また、導管図およびバルブ配置は図式的でしかない。適切なバルブおよび可能な限り最適な導管連結およびバルブ配置は、応用の種類により変えることができる。
【００１６】
図１から図１６は、培養／殺菌周期の中で最も重要な連続の工程を示す。図１によれば、細胞懸濁液は、予め定められた培養体制の下で（ケモスタットまたはタービドスタット）、第一の培養容器内に収容されている。バルブの制御は、例えば栄養培地および洗浄液などの液体を定期的に培養菌に送り出し、例えば空気などの殺菌ガスの連続的供給を保障するために、第一の培養容器４をガス供給１２および培地源１８の両方に連結させるようにして行われる。第一の培養容器４と殺菌剤２１用の源２０との間の連結は、それぞれのバルブにより中断される。第二の培養容器６は、ガス源１２に連結されている。導管３６を介して、培養菌３８またはその部分を排出することができる。
【００１７】
図２によれば、培養菌３８は、導管３２、３４、３５および３３を介して、第二の培養容器６の中に移送されたが、その際、導管２８の開口は、圧力補償を保障する。培地源１８および殺菌剤用の源２０から培養容器４および６へと導いく全ての導管は、閉じられている。
【００１８】
図３に示された状況では、導管３２、３４、３５および３３が閉じられ、導管２２および２６が開かれた後に、殺菌剤２１が第一の培養容器４に充填された。殺菌剤２１の余りは、放出導管２６を介して排出される。培地源１８および培養容器６との間の連結１６がなされた後、ならびに導管２８が閉じられ、導管部分３１、３３、３５および３６が開かれた後、第二の培養容器６内の培養菌３８に、培地を再び定期的に供給できる。
【００１９】
図４は、それぞれの導管部分が開かれて、放出導管２６が閉められた後に、殺菌剤２１による導管３０、３４および３６の殺菌を示している。
【００２０】
図５によれば、導管２２、２６および３３が閉じられ、導管３２が開かれた後に、今度は殺菌剤２１を第一の培養容器４から除去する。
【００２１】
図６から図８は、残留しているかもしれない殺菌剤２１の残余を、新鮮培地により第一の培養容器４およびそれぞれの導管部分から除去および中和するための好ましい自由選択の工程を示している。
【００２２】
図６では、導管３２および３６が閉じられ、導管２６が開かれた後、導管１４を開くことによって培地が第一の培養容器４に充填される。余分な培地は、導管２６から排出される。図４の状況に類似して、今度は導管３０、３４および３６が培地により洗い流され（図７）、図５の状況に類似して、培地は培養容器から最終的に除去される（図８）。
【００２３】
培養容器４の導管２６を開いて導管３２および３４を閉めた後には、細胞懸濁液が今度は第二の培養容器６に収容されているという図１に示された状況と鏡面対称的な状況になっている。培養菌３８またはその部分は、導管３６を介して排出できる。
【００２４】
図１０から図１６は、図１の開始状況に戻るためのそれぞれの対称的な工程を表わしている。すなわち、図１０は、培養菌３８が第二の培養容器６から第一の培養容器４内へ返送されるのを示し、図１１は、殺菌剤２１による第二の培養容器６の殺菌を示し、図１２は、導管部分３１、３５および３６の殺菌を示し、図１３は、導管部分３３、３５、３６を介した殺菌剤２１の除去を示し、図１４は、新鮮培地を用いた培養容器６および放出導管２８の洗浄を示し、図１５は、新鮮培地を用いた導管３１、３５および３６の洗浄を示し、図１６は、導管３３、３５および３６を介した使用済培地の除去を示している。導管１４が培養容器４に向けて開かれているとき、導管３０および３４は開かれ、導管２６は閉じられていて、導管２８は開かれ、導管部分３３および３５は閉じられていて、図１の開始状況が復元されている。
【００２５】
指摘しておくべきなのは、上記方法において、殺菌剤が放出導管３６を通って流れていないどの時点でも、それぞれの連結部分および放出導管３６を通じて培養菌３８が排出されうることが保障されていることである。
【００２６】
また、本発明は二つの培養容器４および６の使用に限られず、さらに多くの培養容器を配置することもできる。例えば、培養容器を直列および／または平行に連結して、複数の第一の培養容器４および複数の第二の培養容器６を設けてもよい。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態では、例えばもうすでに使用したが再度使用するかもしれない殺菌剤２１を一時的に保管するために、第一および第二の培養容器に加えて、さらに培養容器を設けることも可能であろう。予想される中間工程のためにも、さらに培養容器を設けることが考えられるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、細胞懸濁液が第一の培養容器に収容された開始位置に置かれている、懸濁状態にある生細胞の増殖加速化を選択する本発明にかかる装置を示している。
【図２】  図２は、細胞懸濁液が、第二の培養容器に収容されている図１の装置を示している。
【図３】  図３は、第一の培養容器に殺菌剤が収容されている図２の装置を示している。
【図４】  図４は、個々の導管部分の殺菌を示している。
【図５】  図５は、第一の培養容器から殺菌剤を除去している間の装置、およびそれぞれの導管部分を示している。
【図６〜図８】  図６〜図８は、第一の培養容器から殺菌剤の残余を除去および中和する工程、ならびに洗浄液の入ったそれぞれの導管部分を示している。
【図９】  図９は、第一の培養容器およびそれぞれの導管部分が殺菌および中和されている図３の装置を示している。
【図１０〜図１６】  図１０〜図１６は、培養菌を第二の培養容器から第一の培養容器に移送するための対応する逆の過程を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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