(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式によって定義されるオリゴヌクレオチドプライマーセットであって：
５’−（Ｇ）ｉＩ（ＧＴ）ｊ（Ｔ）ｒ（Ｇ）ｍＩＲＺＮＮおよび５’−（Ｇ）ｉＩ（ＴＧ）ｊ−１ＴＩ（Ｔ）ｒ（Ｇ）ｍＩＲＺＮＮ
または
５’−（Ｇ）ｉＩ（ＴＧ）ｊ（Ｔ）ｒ（Ｇ）ｍＩＲＺＮＮおよび５’−（Ｇ）ｉＩ（ＧＴ）ｊ−１ＧＩ（Ｔ）ｒ（Ｇ）ｍＩＲＺＮＮ
ここで：
Ｉは２’−デオキシイノシンであり；
Ｒはジアミノプリン、２’−デオキシグアノシン、およびチミジンからなる群から選択され；
Ｚは、８−オキソ−２’−デオキシアデノシンおよび８−オキソ−２’−デオキシグアノシンからなる群から選択され；
Ｎは２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシトシン、２’−デオキシグアノシン、およびチミジンからなる群から選択され；
Ｇは２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
ｉは３と８との間の整数であり；
ｊは３と５との間の整数であり；
ｒは３と６との間の整数であり；そして
ｍは３と８との間の整数である、
オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般にDNA配列決定および分析の方法に関し、さらに詳しくは、オリゴヌクレオチドプライマーの連続的な伸長により１塩基毎に配列決定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
大規模配列決定プロジェクトは、代表的には、その配列が決定されるべきであるポリヌクレオチドの部分の連続的なより小さなクローンのライブラリーの産生を含む。ゲノムDNAは断片化され、そして酵母人工染色体（YAC）またはコスミド中に挿入され、その挿入物は次に断片化され、そして配列決定用のファージまたはプラスミドベクター中に挿入される（例えば、Hunkapillerら、Science, 254: 59-67(1991)）。大規模配列決定プロジェクトは、いわゆる「指向性」または「ランダム」ストラテジーのいずれかによって行われ得るが、両方のアプローチは、テンプレートがSangerチェーンターミネーション法の１つまたは別の変法によって配列決定のために調製される少なくとも１つまたは２つの多大な労力を要する工程を含む。
【０００３】
これらの多大な労力を要する工程を減少または削除するために、多くの提案がなされている。例えば、１つの指向性ストラテジーは、ベクター特異的「ユニバーサル」プライマーを用いた配列決定の最初のラウンド、それに続く獲得されたばかりの配列情報から産生される新規の配列決定用プライマーの合成の反復サイクルおよび引き続く新規プライマーを用いる新規配列決定を含む。このような様式で、テンプレートを断片化およびサブクローン化する必要性を伴うことなく新規に決定されたプライマーの連続によって比較的大きな配列決定用テンプレートに沿って「ウォーキング」し得る。このようなアプローチの欠点は、次のラウンドの伸長を行うために各サイクルで新規プライマーを得ることが困難であることである。プロセスは、合成されるべき次のプライマーを待っている間耐え難いほどに緩慢になるか、または例えば、15ヌクレオチド長のプライマーに対して1×109より多くなり得る全ての可能な配列のプライマーのライブラリーを維持する必要性によって実用的でなくなるかのいずれかである。この困難さを軽減するための、より短いオリゴヌクレオチド（例えば、ペンタマーまたはヘキサマー）のライブラリーから構築されるプライマーを必要とする提案が行われている（例えば、Kotlerら、Proc.Natl.Acad.Sci., 90:4241-4245 (1993); Kieleczawaら、Science, 258: 1787-1791 (1992)など）。しかし、ヘキサマーでさえ、少なくとも4096のオリゴヌクレオチドのライブラリーが必要とされる。
【０００４】
テンプレート調製の問題の他に、上記のように、指向性およびランダムアプローチの両方が、標識DNAフラグメント（各フラグメントは共通の起点を有し、かつ既知の塩基で終結する）のセットの生成を必要とする配列決定のSangerチェーンターミネーション法を使用する。フラグメントのセットは、代表的には、高解像度ゲル電気泳動によって分離される。これらは単一ヌクレオチド以下でサイズが異なる非常に大きなフラグメントを区別する能力を有さねばならない。不幸なことに、いくつかの有意な技術的問題が、より長い配列を用立てるため、または大量の資本および労力投資を伴わない大容量配列決定を用立てるための、サンガーベースアプローチの効率的なスケールアップを深刻に妨げている。このような問題としては、i)多大な労力を要するゲル電気泳動分離工程は、自動化が困難であり、そしてデータの解析に過剰の変動性（例えば、温度の影響によるバンドの広がり、DNA配列決定フラグメントにおける二次構造による圧縮、分離ゲルにおける不均一性など）を導入する；ii)その特性（例えば、プロセシビティー、忠実度、重合速度、チェーンターミネーターの取り込み速度など）がしばしば配列依存性である核酸ポリメラーゼ；iii)ゲル中で空間的に重なるバンドに典型的にはfmol量で存在するDNA配列決定フラグメントの検出および分析；iv)標識部分が単一の均一相に濃縮されずに数百の空間的に分離されたバンドに分布することによる低シグナル；およびv)単一レーン蛍光検出の場合、適切な発光特性および吸収特性、量子収率、およびスペクトル分解性を持つ色素の利用可能性が挙げられる。例えば、Trainor, Anal. Biochem., 62:418-426 (1990); Connellら, Biotechniques, 5:342-348 (1987); Kargerら, Nucleic Acids Research ,19:4955-4962 (1991); Fungら, 米国特許第4,855,225号；およびNishikawaら, Electrophoresis, 12:623-631 (1991)。
【０００５】
（i）DNAフラグメントの高解像度電気泳動分離を必要としない、（ii）大規模配列決定プロジェクトにおいて必要とされるテンプレートの数を減少させる、そして（iii）多数の標的ポリヌクレオチドへの同時または平行適用を受け入れ得る代替的なアプローチが、DNAを配列決定するのに利用可能になれば、配列決定技術において重要な進歩が達成され得る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ポリヌクレオチドの配列を決定するための新規な方法およびアプローチを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、実行のためにわずかなプライマーしか必要としない配列決定のための新規な「プライマーウォーキング」アプローチを提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、大規模配列決定プロジェクトに必要とされるテンプレートの数を減少させるための方法およびキットを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、正常および疾患組織ならびに細胞における遺伝子発現のパターンを迅速に分析するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、数千の異なるポリヌクレオチドの集団（例えば、cDNAライブラリー由来のポリヌクレオチドのサンプルまたはゲノムDNAのセグメント由来のフラグメントのサンプル）を同時に分析および/または配列決定するための方法、キット、および装置を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、ポリヌクレオチドの集団を同定するための方法、キット、および装置を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、代表的なコスミドまたはYACの挿入物に対応するサイズ範囲のDNAのセグメントを配列決定するための方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法に関する。この方法は：（ａ）プライマーのセットを提供する工程であって、このセットの各々のプライマーは末端ヌクレオチド、テンプレート配置セグメント、および１つ以上の複雑度減少ヌクレオチドを含有する伸長領域を有する、工程；（ｂ）プライマー結合部位およびポリヌクレオチドを含有するテンプレートを形成する工程であって、プライマー結合部位がセットの少なくとも１つのプライマーに相補的である、工程；（ｃ）伸長領域がテンプレートのプライマー結合部位と完全にマッチした二重鎖を形成する、セットからのプライマーを伸長することによって選択的に形成された二本鎖DNAを増幅することによってテンプレートからアンプリコンを形成する工程；（ｄ）アンプリコンの同定によってプライマーの伸長領域の末端ヌクレオチドを同定する工程；（ｅ）テンプレートのプライマー結合部位を変異させて、プライマー結合部位を伸長の方向に１ヌクレオチドシフトする工程；および（ｆ）ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す工程を包含する、方法である。
【００１４】
上記方法において、上記アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応による二本鎖DNAを増幅する工程によって形成され得る。
【００１５】
上記方法において、上記複雑度減少ヌクレオチドはデオキシイノシンであり、そして上記ポリメラーゼ連鎖反応および二本鎖DNAを形成するための伸長は、デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシシチジントリホスフェート、デオキシイノシントリホスフェート、およびチミジントリホスフェートの存在下で行われ得る。
【００１６】
上記方法において、上記テンプレートのプライマー結合部位を変異させる工程は、二本鎖DNAを、テンプレート配置セグメントが二本鎖DNAのプライマー結合部位の隣接するヌクレオチドとミスマッチしたヌクレオチドを含有するプライマーで伸長し、そして増幅することによって行われ、それによって隣接するヌクレオチドの正体はプライマーを用いるオリゴヌクレオチド定方向変異誘発によって変化され得る。
【００１７】
本発明はまた、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：（ａ）第１のプライマーのセットを提供する工程であって、セットの各々の第１のプライマーが3'-末端ヌクレオチド、テンプレート配置セグメント、および１つ以上の複雑度減少ヌクレオチドを含有する伸長領域を有する、工程；（ｂ）第１のプライマー結合部位、プロモーター、ポリヌクレオチド、および第２のプライマー結合部位を含有する二本鎖DNAテンプレートを提供する工程であって、第１のプライマー結合部位が、少なくとも１つの第１のプライマーと伸長可能な二重鎖を形成し得る、工程；（ｃ）プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、二本鎖DNAテンプレートからRNA転写産物の集団を産生する工程；（ｄ）それとともに伸長可能な二重鎖を形成する第１のプライマーを伸長することによってRNA転写産物中の第１のプライマー結合部位を変異させる工程であって、その結果、第１のプライマー結合部位が、伸長の方向に１ヌクレオチドシフトされ、そして一本鎖DNAテンプレートが形成される、工程；（ｅ）一本鎖DNAテンプレートからアンプリコンを形成させる工程；（ｆ）アンプリコンの同定によって、一本鎖DNAテンプレートを形成するように伸長された第１のプライマーの3'末端ヌクレオチドを同定する工程；（ｇ）ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで工程（ｂ）〜（ｆ）を繰り返す工程を包含する、方法に関する。
【００１８】
上記方法において、上記RNA転写産物の集団を産生する工程は、その集団からDNAを除去する工程をさらに包含し得る。
【００１９】
上記方法において、上記アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応によって二本鎖DNAを増幅することによって形成され得る。
【００２０】
上記方法において、第１のプライマーの伸長領域の１つ以上の複雑度減少ヌクレオチドは、2'-デオキシイノシン、8-オキソ-2'-デオキシアデノシン、および8-オキソ-2'-デオキシグアノシンからなる群から選択され得る。
【００２１】
上記方法において、上記RNA転写産物の集団からDNAを除去する工程は、DNaseでその集団を処理する工程を包含し得る。
【００２２】
上記方法において、上記RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼであり得る。
【００２３】
本発明はまた、下式によって定義されるオリゴヌクレオチドプライマーであって：
5'-Ｘ1Ｘ2...ＸkＩＲＺＮＮ
Ｘ1Ｘ2...Ｘkは、各Ｘiはi＝１、２、...kであり、Ｘiは、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシシトシン、2'-デオキシグアノシン、チミジン、および2'-デオキシイノシンからなる群から選択されるようなオリゴヌクレオチドであり；
Ｉは2'-デオキシイノシンであり；
Ｒはジアミノプリン、2'-デオキシグアノシン、およびチミジンからなる群から選択され；
Ｚは、8-オキソ-2'-デオキシアデノシンおよび8-オキソ-2'-デオキシグアノシンからなる群から選択され；
Ｎは2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシシトシン、2'-デオキシグアノシン、およびチミジンからなる群から選択され；そして
ｋは８〜30の範囲にある、オリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【００２４】
上記プライマーにおいて、Ｘ1Ｘ2...Ｘkは下式によって定義され得る：
5'-(Ｇ)iＩ(ＧＴ)j(Ｔ)r(Ｇ)m
または
5'-(Ｇ)iＩ(ＴＧ)j(Ｔ)r(Ｇ)m
ここで：Ｇは2'-デオキシグアノシンであり、Ｔはチミジンであり、Ｉは2'-デオキシイノシンであり、ｉは３と８との間の整数であり；ｊは３と５との間の整数であり；ｒは３と６との間の整数であり；そしてｍは３と８との間の整数である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、テンプレート変異によるテンプレートに沿った選択的な伸長およびプライマー前進による反復サイクルヌクレオチド同定によってこれらおよび他の目的を達成する。本発明の重要な特徴は、配列決定用テンプレート上の全ての可能なプライマー結合部位にアニーリングさせるのに必要とされるプライマーの数を減少させるための複雑度減少(complexity-reducing)ヌクレオチドを含有するプライマー（本明細書中では「ローリングプライマー」と呼ばれる）のセットを提供することである。本発明の別の重要な特徴は、標的ポリヌクレオチド中の４つのヌクレオチドの内の少なくとも１つを同族の複雑度減少ヌクレオチドまたはその相補物で系統的に置換することである。配列決定は、その末端ヌクレオチドのみが異なるローリングプライマーを配列決定用テンプレートのプライマー結合部位にアニーリングさせることによって開始され、その結果、末端ヌクレオチドがテンプレートと完全な相補体を形成するローリングプライマーのみが伸長産物の形成を導く。アンプリコンを形成させるために二本鎖伸長産物を増幅した後、末端ヌクレオチド、そしてそれゆえテンプレート中のそれの相補物が、アンプリコンの正体(identity)によって同定される。例えば、単純な実施態様において、末端ヌクレオチドは、別個の伸長および増幅反応に用いられる４つの容器中のアンプリコンの存在または非存在によって同定され得る。次いで、首尾良く増幅されたポリヌクレオチドのテンプレートのプライマー結合部位は、例えば、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発によって変異され、その結果、引き続くローリングプライマーは、以前のローリングプライマーの結合部位と比較して１ヌクレオチドだけ伸長の方向にシフトする部位で変異テンプレートと完全にマッチする二重鎖を形成するセットから選択され得る。次いで、選択的伸長、増幅および同定の工程が繰り返される。この様式で、プライマーは、配列決定プロセスの間ポリヌクレオチドに沿って「ロール」して、各サイクルでテンプレートに沿って一回に１ベース移動する。
【００２６】
一般に、本発明のこの局面は、以下の工程で実行される：(a）プライマー（すなわち、ローリングプライマー）のセットを提供する工程、ここでセットの各々のプライマーは、１つ以上の複雑度減少ヌクレオチドおよび末端ヌクレオチドを含む伸長領域を有する；(b）プライマー結合部位および配列を決定されるべきポリヌクレオチドを含むテンプレートを形成させる工程、ここでプライマー結合部位は、セットの少なくとも１つのプライマーの伸長領域に相補的である；(c）セット由来のプライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせる工程、ここでプライマーの伸長領域は、テンプレートと完全にマッチした二重鎖を形成し、そして二本鎖DNAを形成するようにプライマーを伸長する；(d）アンプリコンを形成させるために二本鎖DNAを増幅する工程；(e）アンプリコンの正体によってプライマーの伸長領域の末端ヌクレオチドを同定する工程；(f）テンプレートのプライマー結合部位を変異させ、その結果、プライマー結合部位が伸長の方向に１以上のヌクレオチドシフトされ、それによって１以上のヌクレオチド標的ポリヌクレオチドを効率的に短縮する工程；および（g）ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで（c)〜(f）の工程を繰り返す工程。
【００２７】
本発明の重要な特徴は、オリゴヌクレオチドタグの使用によってその方法を多くの異なるポリヌクレオチドに平行して適用し得ることである。本発明のこの局面に従って、集団の各ポリヌクレオチドは、そのような相補物の空間的に制御可能な（addressable）アレイ上のタグ相補物に配列情報を転移するためのオリゴヌクレオチドタグに結合される。すなわち、ユニークタグは、コピーされそしてそのような相補物のアレイ上の固定された位置でその相補物に配列情報をシャトルするのに用いられ得る集団の各ポリヌクレオチドに結合される。タグがその相補物とハイブリダイズした後、転移された配列情報を示すシグナルが産生される。タグされたポリヌクレオチドの配列は、対応するタグ相補物の位置での情報転移およびシグナル検出の繰り返しサイクルによって決定される。
【００２８】
標的ポリヌクレオチドの集団全体をそのような位置に分類するよりもむしろ個々の空間的な位置に情報をシャトルするタグを用いることによって、少なくとも２つの主要な利点が得られる：第１に、タグは大いにより小さな分子実体であり、その結果、拡散およびハイブリダイゼーションの動態学は大いにより有利である。第２に、空間的に個々の位置でのタグローディングは検出に十分である必要があるだけであり、一方、標的ポリヌクレオチドローディングは生化学的処理および検出の両方に十分である必要がある；従って、はるかに少ないタグが空間的に個々の部位にロードされる必要があるだけである。
【００２９】
本発明のこの実施態様の重要な局面は、実質的に全ての異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するように、集団の各々のポリヌクレオチドにオリゴヌクレオチドタグを結合させることである。以下により完全に説明されるように、これはタグ-ポリヌクレオチド結合体の完全なアンサンブルのサンプルを取得することにより達成される。ここで各々のタグは任意のポリヌクレオチドに結合する等しい確率を有する。
【００３０】
本発明において用いられるオリゴヌクレオチドタグは、天然のオリゴヌクレオチドと比較して増大した結合強度および特異性を有するサブユニットからなる相補的なオリゴマーの化合物にハイブリダイズし得る。このような相補的なオリゴマーの化合物は、本明細書中では「タグ相補物」と呼ばれる。タグ相補物のサブユニットは、非天然のヌクレオチドアナログのモノマーからなり得るか、またはそれらは３〜６ヌクレオチドの範囲の長さを有するオリゴマーまたはそのアナログを含み得、このオリゴマーは最小限にクロスハイブリダイズするセットから選択される。このようなセットにおいて、セットのオリゴマーおよびセットの任意の他のオリゴマーの相補物からなる二重鎖は、少なくとも２つのミスマッチを含む。換言すれば、最小限にクロスハイブリダイズするセットのオリゴマーは、せいぜい、同じセットの任意の他のオリゴマーの相補物と少なくとも２つのミスマッチを有する二重鎖を形成する。特定の実施態様で利用可能なオリゴヌクレオチドタグの数は、サブユニットが最小限にクロスハイブリダイズするセット由来のオリゴマーである場合、タグ当たりのサブユニットの数およびサブユニットの長さに依存する。後者の場合には、一般に、その数は、タグの長さがｎヌクレオチド長のタグに関して４nである全ての可能な配列の数よりも大いに少ない。タグ相補物に好ましいモノマーとしては、ペプチド核酸モノマー、およびその隣接するヌクレオシドとともに3'-NHP(=O)(O-)O-5'結合を有するヌクレオシドホスホラミデートが挙げられる。後者の化合物は、本明細書中でN3'φP5'ホスホラミデートと呼ばれる。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグおよびそれらのタグ相補物の両方は、3〜6ヌクレオチド長の天然のオリゴヌクレオチドからなる最小限にクロスハイブリダイズするセットから選択される複数のサブユニットを含む。
【００３１】
一般に、本発明のこの実施態様は以下の工程によって実行される：(a）タグのレパートリーからオリゴヌクレオチドタグを集団の各ポリヌクレオチドに結合させて、実質的に全ての異なるポリヌクレオチドが、結合した異なるオリゴヌクレオチドタグを有するようにタグ-ポリヌクレオチド結合体を形成させる工程；(b）ローリングプライマーで選択的に増幅された各々のポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドの正体に従って各々のタグを標識する工程；(c）タグポリヌクレオチド結合体からタグを切断する工程；および（d）検出のためのタグ相補物の空間的に制御可能なアレイ上に標識タグを分類する工程。好ましくは、このプロセスは、配列決定される各々のポリヌクレオチドをユニークに同定するのに、またはランダムに産生されたフラグメントからより大きなポリヌクレオチドを再構築するのに十分な回数繰り返される。
【００３２】
要約すると、本発明は、DNA配列決定のための新規な「プライマーウォーキング」法を提供する。さらに、本発明は、平行適用のために容易に自動化され、そして大量の配列情報の産生を必要とする操作（例えば、ゲノムDNAフラグメントの大規模配列決定、mRNAおよび/またはcDNAフィンガープリント法、および遺伝子発現パターンの高解像度測定）において特に有用である。
【００３３】
定義
オリゴヌクレオチドタグに関して本明細書中で用いられる「相補物」または「タグ相補物」は、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして完全にマッチした二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施態様では、オリゴヌクレオチドタグは二本鎖または一本鎖のいずれかであるように選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補物」は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補物または二本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補物のいずれかを包含することを意味する。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、モノマー対モノマーの相互作用の通常のパターン(例えば、ワトソン−クリック（Watson-Crick）型の塩基対形成、塩基の積み重ね、フーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン型の塩基対形成など）により標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは連結物(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのアノマー型、ペプチド核酸(PNA)などを含む)の直鎖オリゴマーを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結され、少数のモノマーユニット(例えば３〜４)から数10のモノマーユニットのサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが一連の文字(例えば、「ATGCCTG」)により示される場合はいつも、他に記載されない限り、ヌクレオチドは左から右に5'→3'の順であり、「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、「G」はデオキシグアノシンを示し、および「T」はチミジンを示すことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを含む。天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが用いられ得るとき、例えば、酵素によるプロセシングが必要とされる場合、通常、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要であることは当業者には明らかである。
【００３５】
テンプレートへのプライマーアニーリングに関する「伸長可能二重鎖」は、そのようなアニーリングによって形成される二重鎖において、プライマーの3'-末端ヌクレオチドおよび3'-末端から２番目のヌクレオチドが、テンプレートにおける隣接ヌクレオチドとワトソン-クリック塩基対を形成すること、およびその二重鎖がポリメラーゼによるテンプレートに沿ったプライマーの伸長を許容するのに十分安定であることを意味する。この用語は、プライマーとテンプレートとの間に形成された二重鎖に多数のミスマッチが存在し得ることを意図する。
【００３６】
二重鎖に関して「完全にマッチした」は、二重鎖を作るポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖中の全てのヌクレオチドが他鎖中のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対形成を受けるように、互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ(例えば、デオキシイノシン、２-アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど)の対形成を含む。三重鎖に関しては、この用語は、三重鎖が完全にマッチした二重鎖および第３鎖からなり、ここで、全てのヌクレオチドが、完全にマッチした二重鎖の塩基対とのフーグスティーンまたは逆フーグスティーン会合を受けることを意味する。逆に、二重鎖におけるタグとオリゴヌクレオチドとの間の「ミスマッチ」は、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレット(triplet)がワトソン−クリックおよび／またはフーグスティーンおよび／または逆フーグスティーン結合を受け得ないことを意味する。
【００３７】
本明細書中に用いられる「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオシドおよびヌクレオチドを含み、これは2'-デオキシ型および2'-ヒドロキシル型(例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第２版(Freeman, San Francisco, 1992)に記載されたように)を含む。本明細書中に用いられる「天然のヌクレオチド」は、４つの一般の天然のデオキシヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴをいう。ヌクレオシドに関して「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド(例えば、Scheit, Nucleotide Analogs(John Wiley, New York, 1980)；UhlmanおよびPeyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)などに記載された)を含む。ただし、それらは特異的にハイブリダイズし得る。このようなアナログは、結合特性を増強し、プローブの複雑度を減少し、特異性を増大させるなどのように設計された合成ヌクレオシドを包含する。
【００３８】
本明細書中に用いられる「アンプリコン」は、増幅反応の産物を意味する。すなわち、それは、２、３の開始配列から複製される、通常二本鎖の、同一のポリヌクレオチドの集団である。好ましくは、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で産生される。
【００３９】
本明細書中で用いられる「複雑度減少ヌクレオチド」は、（i）１より多い天然のヌクレオチドのいずれかと対形成する場合に、同族の天然のヌクレオチド、（すなわちそれが置換する天然のヌクレオチド）を含有する同一の二重鎖と実質的に等価な安定性の二重鎖を形成し得る、そして（ii）その同族の天然のヌクレオチドと実質的に同じ酵素によってプロセスされ得る天然または非天然のヌクレオチドをいう。好ましくは、複雑度減少ヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによってプロセスされる場合、縮重性または多義性を示さない。すなわち、複雑度減少ヌクレオチドが、ポリメラーゼによってコピーされているテンプレート中に存在する場合、ポリメラーゼは、複雑度減少ヌクレオチドの部位にユニークなヌクレオチドを取り込ませる。同様に、複雑度減少ヌクレオチド３リン酸がDNAポリメラーゼの基質である場合、それは、単一種のヌクレオチドの部位のみ（すなわち、両方ではなくその相補物の一方または他方）に取り込まれる。候補複雑度減少ヌクレオチドは、簡単なハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、融解温度比較で）において、そして試験重合化が従来の配列決定または放射性標識した複雑度減少ヌクレオチドの取り込みによって検査される取り込みアッセイにおいて容易に試験される（例えば、Bessmanら、Proc.Natl.Acad.Sci., 44:633 (1958)）。好ましくは、本明細書中で用いられる「実質的に等価な安定性」は、試験13マー二重鎖の融解温度が、Kawaseら、Nucleic Acids Research, 14:7727-7736 (1986)に記載されるように、天然の同族のヌクレオチドを含有する同一の二重鎖の融解温度の20パーセント内であることを意味する。
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、DNA配列決定への「プライマーウォーキング」アプローチを提供する。ここで、特別のセットのプライマーが、テンプレートコピーおよび変異のために用いられる。このセット中の異なるプライマーの数は、複雑度減少ヌクレオチドとプライマーとの組み合わせ使用およびテンプレート変異のプロセスによって最小化される。コピーおよび変異の各サイクル内で、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが同定され、そして配列決定用テンプレートが１個短縮化される。テンプレートの短縮化は、事実上、標的配列のヌクレオチドをプライマー結合部位のヌクレオチドに変換する変異から生じる。
【００４１】
重要な局面において、本発明は、「バルク」または溶液相生化学プロセスで得られる配列情報を固体相上の個々の空間的に制御可能な部位にシャトルするオリゴヌクレオチドタグを使用することによって、大多数のポリヌクレオチドを平行して配列決定する方法を提供する。空間的に制御可能な部位で産生されたシグナルは、オリゴヌクレオチドタグによって保有される配列情報を伝達する。下記により完全に説明されるように、配列決定は、好ましくは、ローリングプライマーの使用によってヌクレオチドを同定するサイクルおよび標的ポリヌクレオチドを短縮化するサイクルを交互にすることによって実行される。
【００４２】
１つの局面において、本発明のオリゴヌクレオチドタグは、最小限にクロスハイブリダイズするセットのサブユニットから選択された複数の「ワード」またはサブユニットを含む。このようなセットのサブユニットは、２つより少ないミスマッチしたヌクレオチドを有する同じセットの別のサブユニットの相補物と二重鎖または三重鎖を形成し得ない。従って、二重鎖を形成するレパートリーの任意の２つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、２ヌクレオチド異なるよりも決して「近接」しない。特定の実施態様において、レパートリーの任意の２つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、例えば、サブユニットが３つよりも少ないミスマッチしたヌクレオチドを有する同一のセットの別のサブユニットの相補物と二重鎖を形成し得ないように最小限にクロスハイブリダイズするセットを設計することなどによってなお「さらに」離され得る。通常、本発明のオリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補物は、天然のヌクレオチドのオリゴマーであり、それゆえそれらは酵素（例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、末端転移酵素など）によって都合良くプロセスされ得る。
【００４３】
本発明の別の局面において、タグ相補物は、ポリヌクレオチド標的に対して増強された結合強度および増強された特異性を有する、典型的にはアンチセンス治療薬のために開発された一連の化合物を含む非天然のヌクレオチドモノマーからなる。「オリゴヌクレオチド」の定義において上で記載したように、この化合物は、天然のヌクレオチドの種々の異なる改変（例えば、塩基部分、糖部分、および/またはモノマーからモノマーへの結合の改変）を含む。このような化合物はまた、オリゴヌクレオチドループ、オリゴヌクレオチド「クランプ」、および増強された結合および特異性を促進する同様の構造を含む。
【００４４】
ローリングプライマー
好ましくは、ローリングプライマーは、15〜30ヌクレオチド長であり、そして以下の形態を有する：
Ｘ1Ｘ2...ＸkＹＹ...ＹＮ
ここで、Ｘiは反復サブユニットに好適に配列されたヌクレオチドである；Ｙは複雑度減少ヌクレオチドまたはそれらの相補物である；そしてＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ、あるいはデオキシイノシンのような複雑度減少ヌクレオチドのいずれかの末端ヌクレオチドである。Ｘiヌクレオチドのセグメント（本明細書中では「テンプレート配置セグメント」と呼ばれる）は、反復サブユニットに好適に配置され、その結果、プライマーは、標的ポリヌクレオチドの第１のヌクレオチドと並列した末端ヌクレオチドを有してプライマー結合部位に正しく登録される。好ましくは、反復サブユニットは、プライマーが１つ以上の反復サブユニット分登録外である場合に、それがテンプレートにアニールされたままであるには不安定すぎるようになるように十分に長い。好ましくは、反復サブユニットは４〜８ヌクレオチド長である。下記でより明白になるように、一連の同一のサブユニットとしてテンプレート配置セグメントを配列することは、ローリングプライマーのセットで必要とされるプライマーの全体の数を減少させる。好ましくは、テンプレート配置セグメントは、２つ以上のヌクレオチドの群から選択され、これらの内の少なくとも１つは使用される複雑度減少ヌクレオチドの相補物である。好ましい実施態様において、下線を付したＸkは、オリゴヌクレオチド定方向変異誘発（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1995)に十分に記載される技術）によってテンプレートが変異される位置を示す。
【００４５】
セグメントYY...YNは、本明細書中では、プライマーの「伸長領域」と呼ばれる。なぜなら、プライマーがテンプレートに沿ってこの末端から伸長されるからである。好ましくは、伸長はポリメラーゼによって実行され、その結果、YY...YNは5'→3'方向である。しかし、この方向は、伸長の他の方法を用いて（例えば、米国特許第5,114,839号に記載されるようにオリゴヌクレオチドブロックを連結することにより）3'→5'であり得る。本発明の重要な特徴は、末端のヌクレオチドＮがテンプレート中の隣接するヌクレオチドとワトソン-クリック塩基対を形成する場合にのみ、伸長が起こることである。伸長領域は、たとえＸk位置にミスマッチが存在するとしても、テンプレートと安定な二重鎖を形成し得る２よりも多い最小数のヌクレオチドを含む。即ち、好ましい実施態様において、伸長領域とテンプレートとの間の二重鎖は、オリゴヌクレオチド定方向変異誘発を実行するのに十分安定でなければならない。好ましくは、伸長領域は、３〜６のヌクレオチドを含み、そして最も好ましくは４つのヌクレオチドを含む。好ましくは、Ｙは、デオキシアデノシン(Ａ)およびデオキシイノシン(Ｉ)からなる群より選択される。
【００４６】
特定の実施態様に必要とされるローリングプライマーの数はいくつかの要因に依存し、これは使用される複雑度減少ヌクレオチドの型、プライマーの長さ、伸長領域の長さ、およびテンプレート配置セグメントの反復サブユニット長を含む。例えば、以下のプライマーのセット（配列番号１〜配列番号６）は、６ヌクレオチド長のＧおよびＡのサブユニットからなる18ヌクレオチド長のテンプレート配置セグメントを有する。
【００４７】
【表１】
0004789294.tif 000002
ＹがＡまたはＩであり、そしてＮがＡ、Ｃ、Ｉ、またはＴである場合、上記のローリングプライマーのセットは、192（＝６×２3×４）のプライマーを含む。特に、各「YYY」は以下の配列の全てを表す：AAA、AAI、AII、AIA、IAI、IAA、IIA、およびIII。上記の例から理解されるように、テンプレート配置セグメントは、任意のサイクル後に伸長の方向に１ヌクレオチドだけプライマーをシフトさせるために利用可能である。すなわち、サブグループ（5）由来のプライマーがサイクルで使用された場合、使用される次のプライマーはサブグループ（6）から選択され、サブグループ（6）由来のプライマーがサイクルで使用された場合、使用される次のプライマーはサブグループ（1）から選択される（以下同様）。PCRがテンプレートをコピーおよび増幅するのに使用される場合、テンプレートは、事実上、各サイクルで１ヌクレオチド短縮化される。
【００４８】
あるいは、伸長領域の結合強度は、末端ヌクレオチドの直ぐ隣りを除いた全ての位置において、ＧをＩに、そしてジアミノプリン（Ｄ）をＡに置換することによって改善され得る。すなわち、「YYY」の配列の代替的なセットは、DDA、DDI、DGI、DGA、GDI、GDA、GGI、およびGGAを含む。
【００４９】
別の実施態様において、テンプレート配置セグメントは、配列決定が進行するときにローリングプライマー結合部位を変異させるための複雑度減少アナログを含み、その結果、より少ないそのようなセグメントが必要とされる。例えば、以下のテンプレート配置セグメントは、全てのテンプレートヌクレオチドをＣに変換する伸長領域とともに使用され得る。
【００５０】
【表２】
0004789294.tif 000003
プライマーp1およびp2は、代替的な様式で用いられる。プライマーp1およびp2は両方とも位置１でＣをＡに、そして位置３でＣまたはＡをＣに変換する。これは、それらがアニールする場合、プライマーのいずれもの末端における非常に安定なGC塩基対の２つのセグメントを維持する。プライマーp2は、反復GTダイマーの内部セグメント内にさらなるデオキシイノシンを含有する。それぞれの反復単位が、相から正確に１ヌクレオチドはずれていることに留意されたい。位置２のデオキシイノシンは、プライマー結合部位を、伸長の方向での１ヌクレオチドのシフトを有してプライマーp1と完全にマッチした二重鎖を形成するプライマー結合部位に変換する。従って、プライマーp1およびp2の使用を交替することによって、各サイクルにおいてプライマーを１ヌクレオチド前進させ得る。
【００５１】
ローリングプライマーを用いた配列決定
配列決定の前に、標的ポリヌクレオチドは処理され、その結果、１以上の種類のヌクレオチドがそれらの同族の複雑度減少ヌクレオチドに置換される。好ましい実施態様において、これは、dGTPがdITPに置換されるPCRにおいて標的ヌクレオチドを複製することによって都合良く達成される。次いで、配列決定用のテンプレートは、標的ポリヌクレオチドをプライマー結合部位に結合することによって調製される。代表的には、これは、プライマー結合部位を保有するベクターに標的ポリヌクレオチドを挿入することによって達成される。好ましくは、プライマー結合部位は、標的ポリヌクレオチドに関して3'方向にあり、その結果プライマー伸長がDNAポリメラーゼで実行され得る。このような挿入は、上記のローリングプライマーが使用される場合には、StuIまたはEcl 136IIのような平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼを用いて都合良く実行される。これらの酵素は、上記のプライマーに相補的である標的ポリヌクレオチドの始まりに隣接した３塩基の配列を残す。好ましくは、プライマー（本明細書中では「Ｔ」プライマーと呼ばれる）は、標的ポリヌクレオチドの他方の末端に配置され、その結果、それはPCRによって増幅され得る。例えば、配列決定は、上記のプライマーの使用を仮定すると、以下に示される４つの別個の反応においてこのようなテンプレート（配列番号９）上で開始され得る。
【００５２】
【表３】
0004789294.tif 000004
ここで「NNNN...NNN」は標的ヌクレオチドを表し、そして「BBBB...BB」はPCRにより配列を増幅するためのＴプライマー結合部位の相補物を表す。下線を付した配列は、ローリングプライマーの伸長領域を示す。これらのプライマーのテンプレート配置セグメントは、上記のサブグループ（1）由来のプライマーに対応するように随意に選択された。（本方法を説明するために）ローリングプライマー結合部位に隣接するポリヌクレオチドの配列が「TAIC」であると仮定した場合、反応１のみがアンプリコンの形成を生じ、そしてポリヌクレオチドの最初のヌクレオチドはＴとして同定される。好ましくは、増幅の前に、プライマーは、好ましい実施態様において、dATP、dCTP、dITP、およびdTTPの存在下で、Sequenaseのような高忠実度のDNAポリメラーゼで伸長される。例えば、標識プライマーが用いられ、そして伸長産物が伸長しないプライマーから分離される場合、選択的な伸長がまた、単一の容器中で実行され得ることが理解されるべきである。重要な特徴は、その末端ヌクレオチドがテンプレートと正確なワトソン-クリック塩基対を形成するプライマーのみが伸長されることである。好ましくは、伸長の後、反応混合液中のいずれの一本鎖DNAもMung beanヌクレアーゼのような一本鎖ヌクレアーゼで消化される。このような伸長および消化の後に、次いで残りの二本鎖DNAが、好ましい実施態様において、再びdATP、dCTP、dITP、およびdTTPの存在下で増幅され、アンプリコンが生成される。好ましくは、この増幅は、５〜10サイクルのPCRによって達成され、その結果、異常な増幅産物が産生される可能性は非常に低いかまたは全くない。
【００５３】
反応１由来のアンプリコンのサンプルは、取り出され、そしてサブグループ（2）由来の以下のプライマーを含有する４つの新たな容器に分割される：
【００５４】
【表４】
0004789294.tif 000005
標的ポリヌクレオチドの最初のヌクレオチドは以前のサイクルで決定されたので、示されるように、サブグループ（2）から、その伸長領域が形態「IIAN」を有するプライマーを選択する。これは、下部鎖の下線を付したＴにおけるミスマッチを作製し、これは、オリゴヌクレオチド定方向変異誘発によって生成される任意のアンプリコンにおいてＣに変異される。すなわち、プライマーは、アンプリコン中の部位の変異を指向させるオリゴヌクレオチドである。従って、この「Ｔ」は、アンプリコンにおいて「Ｃ」に変換される。標的の第２のヌクレオチドはＡであるので、反応７および反応８は両方ともアンプリコンの生成に導く。単一の標的ポリヌクレオチドのみが現在考慮されているので、いずれのアンプリコンも次のサイクルのためにサンプリングされ得る。下記に十分に説明されるように、複数のポリヌクレオチドが同時に配列決定される場合、さらなる「プール」工程が実行されなければならない。
【００５５】
上記のように、２つのアンプリコンの内の１つのサンプルが、形態「IAIN」を有する伸長領域を有するサブグループ（3）由来のプライマーを含有する４つの新たな容器に分配される。
【００５６】
【表５】
0004789294.tif 000006
反応９および10は両方ともアンプリコンを生成する；従って、第３の塩基は、「I」として同定される。次のサイクルのために、次いで、これは、形態「AIAN」を有する伸長領域を有するサブグループ（4）由来のプライマーの選択に導びき、そしてプロセスは継続される。
【００５７】
RNAテンプレート選択を用いた配列決定
選択性における有意な増大は、RNAテンプレートおよび逆転写酵素を用いてローリングプライマーを伸長することにより、達成され得る。選択性の獲得は、部分的に、RNAテンプレートが合成された後のヌクレアーゼ消化による所望されないDNAの容易な除去から生じる。この実施態様の一般的なスキームは図１に説明される。配列決定されるべき二本鎖DNA（dsDNA）テンプレート（100）は、例えば、このようなエレメントを含む適切なベクターへのクローニングによって、RNAポリメラーゼプロモーターとローリングプライマー結合部位との間に連結される。標準的なプロトコルを用いて、ベクターは、dsDNAテンプレート（100）およびローリングプライマー結合部位の下流で線状化され、そしてdsDNAテンプレート（100）のRNAコピー（120）および結合部位が、T7 RNAポリメラーゼのようなRNAポリメラーゼを用いて合成される（110）。合成の後、反応混合液は、DNaseで処理されて余分のDNAが除去され、そしてRNAコピーが精製される。精製されたRNAに、適切なローリングプライマー（本明細書中では「第１のプライマー」と呼ばれる）が添加され（130）、そしてRNAテンプレートと伸長可能な二重鎖を形成するローリングプライマーが逆転写酵素で伸長される。このような伸長の後、RNAは、加水分解によって（例えば、加熱によるおよび/または逆転写酵素のRNase H活性による作用による）除去され、そして得られたssDNA（140）が、好ましくはPCRによって増幅される。好ましくは、PCRにおけるプライマーの１つ（本明細書中では「第２のプライマー」と呼ばれる）は、次回の転写のためのプロモーター配列を含み；そしてさらに好ましくは、他のプライマーは、ローリングプライマー結合部位のテンプレート配置セグメントに結合する。
【００５８】
この実施態様のためのローリングプライマー（すなわち、第１のプライマー）の好ましいセットは以下の形態を有する：
Ｘ1Ｘ2...ＸkＩＲＺＮＮ
ここでＸ1Ｘ2...Ｘkは、上記のようなテンプレート配置セグメントであり、Ｉはデオキシイノシンであり、ＲはＧおよびジアミノプリン（「Ｄ」）からなる群より選択され、Ｚは8-オキソ-2-デオキシアデノシン（「オキソ-A」）および8-オキソ-2-デオキシグアノシン（「オキソ-G」）からなる群より選択され、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴからなる群より選択される。この実施態様において、テンプレートの任意のヌクレオチドが、伸長および増幅工程においてＺと塩基対合することによってＣまたはＴのいずれかに変換される。これはなぜなら、Ｚ位置にオキソ-Aを有するプライマーが選択される場合はいつでも、それはＧまたはＴのいずれかと塩基対合し得るが、テンプレートとして用いられる場合には、それはＴの取り込みのみを許容するからである。同様に、Ｚ位置にオキソ-Gを有するプライマーが選択される場合はいつでも、それはＡまたはＣのいずれかと塩基対合し得るが、テンプレートとして用いられる場合にはＣの取り込みのみを許容する。Ｒは、単にＴまたはＣのいずれかとの安定な塩基対を提供する「プレイスセイバー（place saver）」として作用する（ジアミノプリンは、ＴＤ塩基対のより大きな安定性のためにＴよりも好ましい）。最後に、ＩはＴをＣに変換する。明らかに、Ｇもまたこの位置で使用され得る。上記のように、プライマーp1およびp2のテンプレート配置セグメントが用いられる場合、配列決定に必要とされるローリングプライマーの総数は128（＝２×２×２×16）である。
【００５９】
上記の形態のローリングプライマーは、従来のケミストリーおよび種々のヌクレオチドアナログについてのホスホルアミダイトモノマー（これらは、例えば、Glen Research (Sterling, VA)から市販されている）を用いて自動化DNA合成機において容易に合成される。
【００６０】
サブユニットの最小限にクロスハイブリダイズするセットからのオリゴヌクレオチドタグの構築
上記のように、本発明の重要な実施態様は、Brennerによって、米国特許第5,604,097号;同第5,635,400号;および同第5,654,413号において；そして国際出願第PCT/US96/09513号において（これらは参考として本明細書中に援用される）開示される型のオリゴヌクレオチドタグによる、複数の標的ポリヌクレオチドの同時配列決定を含む。
【００６１】
本発明の方法において用いられるオリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補物は、12〜60ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり得；より好ましくは、それらは18〜40ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり；そして最も好ましくは、それらは25〜40ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲である。アンチセンスモノマーから構築される場合、オリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補物は、好ましくは、10〜40モノマーの長さの範囲であり、より好ましくは、それらは12〜30モノマーの長さの範囲である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは一本鎖であり、そして特異的ハイブリダイゼーションは、タグ相補物とのワトソン-クリック塩基対合を介して生じる。
【００６２】
化学合成の後、タグのライブラリーは、増幅のためのプライマー結合領域ならびに切除およびポリヌクレオチドへの結合を容易にする制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むPCRアンプリコンとして都合良く維持される。好ましくは、プライマーの組成は、右および左プライマーがおおよそ同じ融解およびアニーリング温度を有するように選択される。いくつかの実施態様において、タグを含む構築物を選択された領域で一本鎖にする「除去（stripping）」および交換反応の使用を可能にするために、いずれか一方または両方のプライマーおよびタグの他のフランキング配列は、４つの天然のヌクレオチドの内の３つまたはより少ないものからなる。このような反応は、通常、DNAポリメラーゼ（例えば、T4 DNAポリメラーゼ）などの酵素の3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を使用し、そしてそれらはSambrookら、Molecular Cloning,第２版 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)に記載されている。
【００６３】
上記のように、タグの重要な使用は、標的ポリヌクレオチドから、タグ相補物を含む固相支持体に情報を「シャトル」するためである。好ましくは、この工程は、二本鎖テンプレートのタグ含有セグメントを切り出すこと（例えば、１つ以上の制限ヌクレアーゼ）、反応混合液からそれを分離すること、その切り出されたタグを変性および標識すること、ならびに検出のために固相支持体にそれを適用することによって実行される。この工程は、標準的な分子生物学的技術を用いる種々の方法で実行され得、それらの内の１つが以下に例示される。同様に、切り出されたタグは、種々の方法で標識され得、それらには放射活性部分、蛍光部分、発色部分、化学ルミネセンスマーカーなどの直接的または間接的結合が含まれる。DNAを標識するためおよびDNAプローブを構築するための方法論の多くの包括的レビューは、本発明のタグを標識することに適用可能なガイダンスを提供する。このようなレビューは、Kricka編、Nonisotopic DNA Probe Techniques (Academic Press, San Diego, 1992); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, 1992); KellerおよびManak, DNA Probes,第２版（Stockton Press, New York, 1993);およびEckstein編、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Kessler編、Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules (Springer-Verlag, Berlin, 1992);などを含む。
【００６４】
好ましくは、タグは、１つ以上の蛍光色素（例えば、Menchenら、米国特許第5,188,934号;およびBegotら、国際出願第PCT/US90/05565号により開示される）で標識される。
【００６５】
タグ相補物のための固相支持体
好ましくは、配列情報の検出は、タグがそれらの相補物にハイブリダイズする空間的に分離した位置で起こる。タグ転移の連続サイクルからのシグナルの検出が、配列決定操作を通して同じタグ相補物位置と関連することが重要である。そうでなければ、シグナルの配列は、タグおよびタグ相補物に対応するポリヌクレオチドの配列の誠実な代表とはならない。この要求は、タグ相補物の空間的に制御可能なアレイを提供することによって満たされる。本明細書中で用いられる「空間的に制御可能な（spatially addressable）」は、特定のタグ相補物の位置が、配列決定操作を通して記録および追跡され得ることを意味する。タグ相補物の正体の知識は重大でない；タグ転移のサイクル間でその位置が同定可能であることのみが重要である。好ましくは、タグ相補物を含有する領域は、分離しており（すなわち、異なるタグ相補物を含有する領域と重複しない）、その結果、シグナル検出はより便利になる。一般に、空間的に制御可能なアレイは、タグ相補物を固相支持体上で結合または合成することによって構築される。
【００６６】
本発明での使用のための固相支持体は、広範な形態を有し得、微粒子、ビーズ、および膜、スライド、プレート、ミクロマシーンドチップ（micromachined chip）などを含む。同様に、本発明の固相支持体は、広範な組成を含み得、それは、ガラス、プラスチック、シリコーン、アルカンチオレート誘導体化金（alkanethiolate-derivatized gold）、セルロース、低架橋ポリスチレンおよび高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む。好ましくは、分離した粒子の集団が、各々が同じタグ（および他はなし）の相補的配列の均一のコーティング（または集団）を有するように用いられるか、あるいは、単一支持体または数個の支持体が、各々が同じタグ（および他はなし）への相補的配列の均一のコーティング（または集団）を含む空間的に分離した領域で用いられるかのいずれかである。後者の実施態様では、領域の面積は、特定の適用に従って変化し得、通常、領域は、数μm2(例えば、3〜5)から数百μm2(例えば、100〜500)の面積の範囲である。
【００６７】
タグ相補物は、その上でタグ相補物が合成される固相支持体と共に用いられ得るか、あるいは、別々に合成され得、そして使用のために固相支持体に結合され得る。例えば、これは以下に開示される：Lundら、Nucleic Acids Research、16:10861-10880(1988)；Albretsenら、Anal.Biochem.、189:40-50(1990)；Wolfら、Nucleic Acids Research、15:2911-2926(1987)；またはGhoshら、Nucleic Acids Research、15:5353-5372(1987)。好ましくは、タグ相補物は、同じ固相支持体上で合成され、そして同じ固相支持体と共に用いられ得、それは、種々の形態を含み得、そして種々の結合部分を含み得る。このような支持体は、タグ相補物の均一集団が合成される領域の、微粒子もしくはアレイ（array）、またはマトリックスを含み得る。広範な微粒子支持体が、本発明で用いられ得、それは制御細孔ガラス（CPG）、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどからなる微粒子を含み、以下の例示的な参考文献中に開示されている：Meth.Enzymol.、Ａ節、11-147頁、第44巻（Academic Press、New York、1976）；米国特許第4,678,814号；同第4,413,070号；および同第4,046,720号；ならびにPon、19章、Agrawal(編)、Methods in Molecular Biology、第20巻（Humana Press、Totowa、NJ、1993）。微粒子支持体としては、市販のヌクレオシド誘導体化CPGおよびポリスチレンビーズ（例えば、Applied Biosystems、Foster City、CAから入手可能）；誘導体化磁性ビーズ；ポリエチレングリコールでグラフト化されたポリスチレン（例えば、TentaGelTM、Rapp Polymere、Tubingen Germany）などがさらに挙げられる。支持体の特性（例えば、材料、多孔度、サイズ、形状など）、および用いられる結合部分のタイプの選択は、タグが用いられる条件に依存する。例示的な結合部分は、Ponら、Biotechniques、6:768-775(1988)；Webb、米国特許第4,659,774号：Baranyら、国際特許出願第PCT/US91/06103号；Brownら、J.Chem.Soc.Commun.、1989:891-893；Damhaら、Nucleic Acids Research、18:3813-3821(1990)；Beattieら、Clinical Chemistry、39:719-722(1993)；MaskosおよびSouthern、Nucleic Acids Research、20:1679-1684(1992)などに開示されている。以下により十分に記載されるように、タグ相補物が微粒子上に結合または合成される場合、微粒子の集団は、空間的に制御可能なアレイを形成するように固相支持体に固定される。
【００６８】
上記のように、タグ相補物はまた、単一の（または数個の）固相支持体上で合成されて、タグ相補物で均一にコーティングされた領域のアレイを形成し得る。すなわち、このようなアレイ中の各領域内で、同じタグ相補物が合成される。このようなアレイを合成するための技術は、以下に開示される：McGallら、国際出願第PCT/US93/03767号；Peaseら、Proc.Natl.Acad.Sci.、91:5022-5026(1994)；SouthernおよびMaskos、国際出願第PCT/GB89/01114号；MaskosおよびSouthern（上記で引用）；Southernら、Genomics、13:1008-1017(1992)；ならびにMaskosおよびSouthern、Nucleic Acids Research、21:4663-4669(1993)。
【００６９】
好ましくは、本発明は、同じタグ配列の相補物で均一にコーティングされた微粒子またはビーズを用いて実行される。微粒子支持体、およびそれらの表面へオリゴヌクレオチドを共有結合または非共有結合する方法は、周知であり、以下の参考文献により例示される：BeaucageおよびIyer（上記で引用）；Gait（編）Oligonucleotide Synthesis；A Practical Approach（IRL Press、Oxford、1984）；ならびに上記の参考文献。一般に、微粒子のサイズおよび形状は重要ではない；しかし、最少の試薬およびサンプルの使用でオリゴヌクレオチドタグの多くのレパートリーの構築および操作を容易にするので、直径数μm（例えば、1〜2μm）から数百μm（例えば、200〜1000μm）の範囲のサイズの微粒子が好ましい。
【００７０】
好ましくは、市販の制御細孔ガラス（CPG）またはポリスチレン支持体が、本発明における固相支持体として用いられる。このような支持体は、塩基不安定性のリンカーおよび結合された最初のヌクレオチドを有して入手可能である（例えば、Applied Biosystems（Foster City、CA））。好ましくは、500オングストローム〜1000オングストロームの間の孔サイズを有する微粒子が用いられる。
【００７１】
他の好ましい適用では、非多孔性微粒子が、その光学特性のために用いられ、この微粒子は、平面支持体（例えば、顕微鏡スライド）の上で多数の微粒子を追跡する場合、有利に用いられ得る。特に好ましい非多孔性微粒子は、Bangs Laboratories（Carmel, IN）から入手可能であるグリシダルメタクリレート（glycidal methacrylate）（GMA）ビーズである。このような微粒子は、種々のサイズで有用であり、そしてタグまたはタグ相補物を合成するための種々の結合基で誘導体化される。好ましくは、タグ化された微粒子の多量（massively）の平行操作のために、直径５μmのGMAビーズが用いられる。
【００７２】
標的ポリヌクレオチドへのタグの結合
本発明の重要な局面は、同じタグが異なるポリヌクレオチドに結合しないように、集団（例えば、cDNAライブラリー）のポリヌクレオチドをタグ化することである。この後者の条件は、タグのレパートリーをポリヌクレオチドの集団に連結し、続いて連結された配列をクローニングおよびサンプリングすることによって本質的に満たされ得る。オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、多数の方法（例えば、直接的な酵素的連結、タグ配列を含むプライマーを用いた増幅（例えば、PCRを介する）など）で、ポリヌクレオチドの集団に連結され得る。最初の連結工程は、タグ−ポリヌクレオチド結合体の非常に大きな集団を生じ、その結果、一般に、単一のタグが、多くの異なるポリヌクレオチドに結合される。しかし、結合体の十分に小さいサンプルをとることによって、「重複」、すなわち２つの異なるポリヌクレオチド上の同じタグ、を得る確率は、無視できるほど小さくすることができる。（サンプル中の同じポリヌクレオチドを有する異なるタグを得ることもまた可能であることに留意されたい。この場合は、単に、ポリヌクレオチドが二回処理（例えば、配列決定）されることに導く。また、遺伝子発現のパターンが分析される場合、mRNA豊富さの差異故に、同一のポリヌクレオチドを有する複数のタグが共通の発生となり、そして予測される）。下記でより十分に説明されるように、サンプル中の重複を得る確率は、ポアソン分布によって推定され得る。なぜならサンプル中の結合体の数は大きいからである（例えば、数千以上のオーダー）。そしてタグレパートリーは大きい（例えば、数万以上のオーダー）ので、特定のタグを選択する確率は小さい。好ましくは、タグレパートリーのサイズは、分析される集団中のポリヌクレオチドの異なる種の数の約100倍である。あるいは、換言すれば、タグレパートリーの複雑度は、好ましくは、分析されるポリヌクレオチドの集団の複雑度の約100倍である。一般に、サンプルが大きければ大きいほど、重複を得る確率は大きくなる。従って、設計トレードオフは、大きなサンプルのタグ−ポリヌクレオチド結合体を選ぶこと（これは、例えば、ショットガン配列決定操作における標的ポリヌクレオチドの十分なカバーを確実にする）と、小さなサンプルを選ぶこと（これは、最小数の重複が存在することを確実にする）との間に存在する。大部分の実施態様では、重複の存在は、単に、さらなるノイズ源を付加するか、または配列決定の場合には、走査およびシグナル処理に僅かな複雑化を付加するに過ぎない。なぜなら、多数の信号を同時に与えるタグ相補物の領域は単純に無視することができるからである。タグをポリヌクレオチドに結合させることに関して本明細書中で用いる「実質的にすべて」という用語は、本質的に重複のない、タグ−分子結合体の集団を得るのに用いられるサンプリング手順の統計的性質を反映することを意味する。タグ−分子結合体の実際の割合に関して、実質的にすべての意味は、タグがどのように使用されるかに依存する。核酸配列決定のためには、好ましくは、実質的にすべては、タグの少なくとも80％がユニークな結合したポリヌクレオチドを有することを意味する。より好ましくは、タグの少なくとも90％がユニークな結合したポリヌクレオチドを有することを意味する。なおより好ましくは、タグの少なくとも95％がユニークな結合したポリヌクレオチドを有することを意味する。そして、最も好ましくは、タグの少なくとも99％がユニークな結合したポリヌクレオチドを有することを意味する。
【００７３】
好ましい実施態様において、タグ、配列決定されるべきポリヌクレオチド、プライマー結合部位、および配列を操作するための他のエレメントが、クローニングベクター中に挿入されて、必要なときにサンプリングされ、そして増幅され得る基礎ライブラリーが確立される。例えば、このような構築物は以下の形態を有し得る：
【００７４】
【表６】
0004789294.tif 000007
ここで、「Ｔ」またはタグ結合部位および「Ｓ」または配列決定プライマー結合部位は、適切なプライマーとともに、クローニングベクターのインサートを増幅するために用いられて、引き続く分析のためのPCRアンプリコンが形成される。PCR増幅および末端ヌクレオチドの同定の工程の後に、切断部位は、アンプリコンからタグを切り出すために用いられる。下記のように、増幅の後、標的ポリヌクレオチドが、同定工程で用いられるヌクレアーゼによる所望ではない切断から保護されることが重要である。好ましくは、これは、メチル化および制限エンドヌクレアーゼの注意深い選択によって達成される。
【００７５】
タグ化ポリヌクレオチドの配列決定
集団の標的化ポリヌクレオチドを同時に配列決定するための好ましい実施態様は、図２ａに図示される。好ましくは、タグ化ポリヌクレオチドの集団は、dATP、dCTP、dITP、およびdTTPの存在下で上記のようなベクターから増幅されて、Ｔプライマー結合部位(12)、切断部位(14)（下記に示されるようにこれは任意である）、タグ(16)、切断部位(18)、標的ポリヌクレオチド(20)、およびローリングプライマー結合部位(22)を含有する二本鎖DNA(10)の集団を生じる。
【００７６】
最初の集団において、ローリングプライマー結合部位(22)は、伸長領域(24)に対する既知の相補物（例えば、下記の実施例に示されるようなAGG）を含有する。最初の集団のサンプルは、好ましくは、４つの別個の容器（28〜34）に移される(26)。ここでそれらは、伸長領域-AIIA、-AIIC、-AIIG、および-AIITを有する上記のサブグループ(1)のローリングプライマーと組み合わせられる（４つのローリングプライマーは、１つの容器に配置され、そして伸長に関して互いに競合することを許容され得る；しかし、プライマーが別々に使用される場合、エラーはより低いようである）。サブグループ(1)〜(6)のローリングプライマーは、本発明を例証するために本明細書中で用いられる。明白に、ローリングプライマーの多くの代替的な形態が用いられ得る。引き続くサイクルにおいて、以下により完全に記載されるように、転移工程(26)はより複雑になる。なぜなら、４つよりも多い容器（すなわち、本明細書中で例証される実施態様において32（＝４×８）まで）が伸長反応に必要とされるからである。二本鎖DNA(10)が適切なローリングプライマーと組み合わされた後、以下の工程(36)が行われる：二本鎖DNAが、例えば、加熱によって変性される；ローリングプライマーがローリングプライマー結合部位にアニールするように温度を低下させる；dATP、dCTP、dITP、およびdTTPの存在下で、Sequenaseのような高忠実度DNAポリメラーゼでプライマーが伸長される；好ましくは、いかなる残存する一本鎖DNAも、例えばMung beanヌクレアーゼのような一本鎖ヌクレアーゼで消化されて、引き続く増幅における残渣一本鎖DNAの干渉の可能性が減少される；Ｔプライマー添加される；そして二本鎖伸長産物が増幅され、好ましくは５〜10サイクルのPCRで増幅され、それぞれアンプリコンＡ(38)、アンプリコンＣ(40)、アンプリコンＧ(42)、およびアンプリコンＴ(44)が産生される。
【００７７】
一本鎖ヌクレアーゼでの消化の工程に対する代替物、および/または補充物として二本鎖DNA(10)は、メチラーゼで処理され得る（または同等に、5-メチルシトシン三リン酸の存在下で増幅され得る）。このような処置の後、少なくとも２つの伸長反応の産物ではない任意の二本鎖DNAは、切断部位(18)でヘミメチル化または完全にメチル化される。従って、それらの配列上の部位(18)を認識するヌクレアーゼはそれを切断しない。アンプリコンのサンプルが、Ｔプライマー上のビオチンのような捕獲因子によって取得される場合、ヌクレアーゼで切断部位(18)を切断させることによって、分析のためにタグが放出され得る。しかし、メチル化またはヘミメチル化されている部位は、固相支持体(48)へのタグの適用において疑似的なシグナルを生じるように切断されない。
【００７８】
サンプルが各アンプリコンから取得された後、タグは、以下により完全に記載されるように、切断部位(14)および/または(18)によって切り出され、そして標識(46)される。次いで、標識タグは、用いられる標識システム、タグ混合物の複雑度などの要因に依存して、固相支持体(48)上のそれらのタグ相補物に個々に適用されるか、またはプールされ、そして支持体に適用されるかのいずれかである。アンプリコンのサンプルはまた、本発明の方法に従って、さらなる処理(50〜56)のために取得される。最も最近に決定されたヌクレオチドの正体、および現在の伸長領域の正体に依存して、サンプルは、次のサイクルのためのローリングプライマーの入った容器に個々に分注されるか、またはサンプルは１つ以上の他のサンプルと組み合わされ、そして次のサイクルのためのローリングプライマーの入った容器に分注され得る。１つのポリヌクレオチドの場合とは異なり、ポリヌクレオチドの集団が配列決定される場合、全ての容器はほとんどいつも、増幅反応の結論としてアンプリコンを含有する。従って、伸長、消化、および増幅の後、容器28、30、32、および34中のアンプリコンは、それぞれ、開始位置（またはより一般的には、ローリングプライマー結合部位に隣接するヌクレオチド位置）にＴ、Ｇ（またはＩ）、Ｃ、およびＡを有する標的ポリヌクレオチドに対応する。この情報、および現在のアンプリコンの伸長領域の配列の知識を用いて、次のサイクルのローリングプライマーが選択され得る。１つのポリヌクレオチドの場合のように、各々の連続サイクルにおいて、ローリングプライマーは、ローリングプライマー伸長の方向にテンプレートに沿って１以上のヌクレオチドだけローリングプライマー結合部位をシフト、または前進するプライマーが選択される。好ましくは、１ヌクレオチドシフトは各サイクルで生じる。上記のように、伸長工程に選択されるローリングプライマーはまた、増幅においてテンプレート中に変異を生じるように働く。この変異は、伸長領域の内部のほとんどのヌクレオチドを、現在のサイクルのローリングプライマーのテンプレート配置セグメントに相補的なヌクレオチドに変化させる。以下の表において、配列決定操作のサイクル２〜４におけるプライマー選択およびアンプリコンプールのパターンが、上記の実施態様に関して説明される。第１のサイクルにおいて、最初のテンプレートが、変性および伸長のために４つの容器に分配される。
【００７９】
【表７】
0004789294.tif 000008
第２のカラムのヌクレオチド間の線の右のヌクレオチドは、アンプリコンを産生するのに用いられるローリングプライマーの末端ヌクレオチドである。一般に、次のサイクルのローリングプライマーを決定するためのアルゴリズムは以下のようである：(i)現在のローリングプライマーの伸長領域の末端ヌクレオチドの末端（第２のカラムの「IIA」配列の最も左の「Ｉ」）にヌクレオチドをドロップする、(ii)ヌクレオチドＩまたはＡのどちらかが、末端ヌクレオチドと塩基対形成したヌクレオチドに相補的であるかを決定する（すなわち、上記の例では：アンプリコンＡに対して「Ａ」、アンプリコンＣに対して「Ａ」（なぜなら、ＡはＩならびにＣと塩基形成するから）、アンプリコンＧに対して「Ｉ」（なぜならＩはＣと塩基形成するから）、およびアンプリコンＴに対して「Ｉ」（なぜならＩはＡとも塩基形成するから)）、(iii)決定されたヌクレオチドＩまたはＡを末端ヌクレオチドの左に挿入する。この実施態様に関して、伸長領域配列間の変化の一般的パターンは、図２ｂに説明される。より長い伸長領域がより複雑なパターンを導くが、許容し得る変化を規定する基本的アルゴリズムは同じままである。
【００８０】
【表８】
0004789294.tif 000009
【００８１】
【表９】
0004789294.tif 000010
代表的には、８回目のサイクルで32の反応物が必要となり、配列決定が止まるまで各サイクルで必要とされ続ける。
【００８２】
明白に、上記で概説されたさらなる工程は、例えば、最初の伸長産物を適切でない一本鎖DNAおよび/または一本鎖ヌクレアーゼ（用いられた場合には）から分離するために実行される。ポリヌクレオチドおよび他の試薬、PCRのための温度制御などの操作が、市販の研究室ロボット（例えば、Biomek 1000(Beckman Instruments, Fullerton, CA)）で実行され得る。
【００８３】
ローリングプライマーおよびＴプライマーは、Jiら、Anal.Chem. 65: 1323-1328 (1993); Cantorら、米国特許第5,482,836号などによって教示されるように、分離のための三重鎖形成によって、固着された一本鎖オリゴヌクレオチドに結合し得る二本鎖セグメントを有するように構築され得る。従って、例えば、このような一本鎖オリゴヌクレオチドを保有する磁性ビーズは、アンプリコンを捕獲するため、そして例えば、選択的に増幅された二本鎖DNA（他のDNAは増幅されず、それゆえヘミメチル化されたままであるので切断は生じない）の切断部位18でタグを切断するヌクレアーゼを含有する個々の容器にそれらを移すために用いられ得る。好ましくは、Ｔプライマーは、放出されたタグを捕獲させ、そして都合良く標識し得る5'ビオチンを含有する。例えば、アビジン化磁性ビーズによる捕獲の後、二本鎖セグメントの3'鎖は、タグに隣接するヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）の存在下で、T4 DNAポリメラーゼのような酵素の使用によってタグまではがし戻される。従って、隣接するヌクレオチドが3'末端へ鎖に沿って他に存在しなければ、ポリメラーゼの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性は、隣接するヌクレオチドまで3'鎖をはがし戻し、この点で、隣接するヌクレオチドを過ぎてさらにはがすことを防ぐために交換反応が開始される。次いで、タグの3'末端は、伸長反応において標識dNTPで標識され得る。標識の後、非ビオチン化鎖は、変性によって除去され、そして検出のために空間的に制御可能なアレイに適用され得る
標識タグがそれらのタグ相補物にハイブリダイズし、そして検出された後に、タグは、洗浄によって除去され、次のセットのアンプリコン由来の標識タグが適用され得る。
【００８４】
空間的に制御可能な部位での検出シグナルを測定するための装置
好ましくは、空間的に制御可能なアレイは、タグ相補物を含有する微粒子を固相表面に固定することによって確立される。光産生シグナル（例えば、化学発光、蛍光など）が使用される場合にはいつでも、このようなアレイ上のハイブリダイズしたタグおよび/または酵素学的事象を検出するために種々の装置が用いられ得る。例えば、国際特許出願PCT/US91/09217、PCT/NL90/00081、およびPCT/US95/01886に記載されるような、走査システムが用いられ得る。好ましくは、タグ相補物を含有する微粒子はフローチャンバーに液体粒子スラリーとしてロードされる。そこで、それらは、基板への微粒子上のDNAの非特異的結合とフローチャンバーの障壁に向かってその粒子を押す穏やかな流動との組み合わせによってその場に保持される。例示的な装置は図３に説明される：フローチャンバー(500)は、標準的ミクロマッチング技術（例えば、Ekstromら、国際特許出願PCT/SE91/00327；Brown、米国特許第4,911,782号；Harrisonら、Anal.Chem. 64: 1926-1932 (1992)など）を用いて、ガラスプレート(506)に液体の入口(502)および出口(504)を有する窩洞をエッチングすることによって調製される。フローチャンバー(500)の寸法は、ロードされた微粒子(508)（例えば、GMAビーズ）が、10〜20万のビーズの緊密に詰められた平面の単層の窩洞(510)に配置され得るような寸法である。窩洞(510)は、エッチングされたガラスプレート(506)上のガラスカバースリップ(512)の陽極結合によって入り口および出口とともに閉ざされたチャンバー中に作製される（例えば、Pomerantz、米国特許第3,397,279号）。その場所でガラスカバースリップを伴って、窩洞(510)は、単層が形成されることを確証するために、微粒子の直径よりも数10パーセント大きな高さを有する。出口(504)に隣接する障壁または棚がガラスプレート(506)に存在し、これは、スラリーの微粒子に対する関門を形成するが、同時にスラリーの液体成分または他の試薬が自由に通過することを許容する。試薬は、自動化DNAおよびペプチド合成機に一般に使用されるように、マイクロプロセッサーにより制御されるバルブブロック(522)を通って、シリンジポンプからフローチャンバーに(514から520)調節される（例えば、Bridghamら、米国特許第4,668,479号；Hoodら、米国特許第4,252,769号；Barstowら、米国特許第5,203,368；Hunkapiller、米国特許4,703,913号；など）。
【００８５】
詳細には、ハイブリダイズしたタグは、光源(526)（これは、レーザー、水銀アークランプなどであり得る）からの照射光線(524)でその蛍光標識を励起することにより検出される。照射光線(524)は、フィルター(528)を通過し、そしてフローチャンバー(500)中のタグ相補物に特異的にハイブリダイズしたタグ相補物上の蛍光標識を励起する。生じる蛍光(530)は、共焦顕微鏡(532)により集められ、フィルター(534)を通過させられ、そしてCCDカメラ(536)に向けられる。これは、ワークステーション(538)による処理および解析のためにビーズアレイの電子画像を作製する。好ましくは、約25 nM濃度のタグは、１分あたり１〜２μLの流速で、10分間、20℃で、50 mM NaCl、３mM Mg、10 mM Tris-HCl(pH 8.5)からなるハイブリダイゼーション緩衝液中でフローチャンバーを通過させられ、その後、タグにより保有される蛍光標識は照射され、そして蛍光は収集される。タグは、ハイブリダイゼーション緩衝液を、１分あたり１〜２μLの流速で、55℃で、10分間フローチャンバーを通過させることにより、タグ相補物から融解される。
【００８６】
配列決定適用において、微粒子は、種々の方法で基板の表面に固定され得る。
固定は、微粒子が、顕著な損失なく、試薬への曝露および洗浄の連続的なサイクルを行わせるのに十分に強力であるべきである。基板がガラスであるとき、その表面は、市販の試薬（例えば、Pierce Chemical)を用いて、アルキルアミノリンカーで誘導体化され得、これは次に、再び従来のケミストリーを用いて、アビジンに架橋され、アビジン化された表面を形成し得る。ビオチン部分は、多くの方法で微粒子に導入され得る。
【００８７】
本発明の方法を実施するためのキット
本発明は、本発明の種々の実施態様を実施するためのキットを含む。好適には、本発明のキットは、本発明による伸長および増幅を実施するためのローリングプライマーのセットを含む。キットはまた、固相支持体に付着されたタグ相補物のレパートリーを含み得る。さらに、本発明のキットは、対応するタグのレパートリー（例えば、ソートされるべきポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして、またはクローニングベクターのエレメントとして）を含み得る。好適には、タグ相補物のレパートリーは、微粒子に結合される。キットはまた、酵素的プロセシングのための適切な緩衝液、検出ケミストリー（例えば、タグを標識するための蛍光または化学ルミネセンス成分など）、使用説明書、プロセシング酵素（例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ、トランスフェラーゼなど）を含み得る。配列決定のための重要な実施態様において、キットはまた、プロセシングのために微粒子を固定するための、アビジン化された顕微鏡スライドまたはマイクロタイタープレートのような基板を含み得る。
【００８８】
【実施例】
実施例１
タグライブラリーの構築
例示的なタグライブラリーを以下のように構築して、以下の式により規定される、ヌクレオチドＡ、Ｇ、およびＴの化学合成９ワードタグを形成する：
【００８９】
【表１０】
0004789294.tif 000011
ここで、「[4(A,G,T)9]」は、各タグがＡ、Ｇ、およびＴの９個の４マーワードからなるタグ混合物を示し；そして「p」は5'ホスフェートを示す。この混合物を、以下の右および左プライマー結合領域（配列番号10および配列番号11）に連結する：
【００９０】
【表１１】
0004789294.tif 000012
右および左プライマー結合領域を上記タグ混合物に連結し、その後、連結構造の一本鎖部分をDNAポリメラーゼで充填し、次いで、以下に示す右および左プライマーと混合し、そして増幅してタグライブラリーを得る。
【００９１】
【表１２】
0004789294.tif 000013
左プライマー結合領域の下線部分はRsrII認識部位を示す。右プライマー結合領域の最も左の下線領域は、Bsp120I、ApaI、およびEcoO109Iの認識部位、ならびにHgaIの切断部位を示す。右プライマー結合領域の最も右の下線領域は、HgaIの認識部位を示す。必要に応じて、右または左プライマーは、（従来の試薬、例えば、Clontech Laboratories, Palo Alto, CAから入手可能な試薬を用いて）結合したビオチンを有して合成され、増幅および／または切断後の精製を容易にし得る。
【００９２】
実施例２
cDNA「サイン(signature)」配列決定のためのタグ-ポリヌクレオチド結合体のプラスミドライブラリーの構築
cDNAを、mRNAのポリＡ領域の境界でアンカーしたpGGCCCT15(AまたはGまたはC)を第１鎖の合成のためのプライマーとして、そしてN8(AまたはT)GATCを第２鎖の合成のためのプライマーとして用いて、従来のプロトコルによりmRNAサンプルから生成する。すなわち、両方は縮重プライマーであり、その結果、第２鎖プライマーは２つの形態で存在し、そして第１鎖プライマーは３つの形態で存在する。第２鎖プライマー中のGATC配列はMboIの認識部位に対応し；他の４塩基認識部位は同様に使用され得る（例えば、BamHI、SphI、EcoRIなどの認識部位）。第２鎖プライマーの認識部位に隣接するＡおよびＴの存在は、除去（stripping）および交換反応を次の工程で使用して、「GGCCC」の５塩基5'突出を生じさせ得ることを確実にする。第１鎖プライマーをmRNAサンプルにアニールし、そして逆転写酵素で伸長し、その後、RNA鎖を逆転写酵素のRNase H活性により分解し、一本鎖cDNAを残す。第２鎖プライマーを、従来のプロトコルを用いて、アニールし、そしてDNAポリメラーゼにより伸長する。第２鎖合成後、得られたcDNAを、製造者のプロトコルを用いて、CpGメチラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）でメチル化する。次いで、cDNAの3'鎖を、dATPおよびdTTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼを用いて、上記の除去および交換反応によりその末端を削除し、その後、cDNAを、予めHgaIで切断した実施例１のタグライブラリーに連結して、以下の構築物を得る：
【００９３】
【表１３】
0004789294.tif 000014
別に、以下のクローニングベクター（配列番号12）を、例えば、Bluescriptファージミド（Stratagene, La Jolla, CA）のような市販のプラスミドから出発して、構築する。
【００９４】
【表１４】
0004789294.tif 000015
ローリングプライマー結合部位は、上記のサブグループ(1)のローリングプライマーに対応する。プラスミドをPpu MIおよびPmeIを用いて切断し（挿入物が配向されるようにRsrII適合性末端および平滑末端を得）、次いでDAMメチラーゼでメチル化する。タグ含有構築物をRsrIIで切断し、次いで開環プラスミドに連結し、その後、結合体をMboIおよびBamHIで切断して,プラスミドを連結および閉環させる。次いで、プラスミドを、増幅し、そして本発明による伸長および増幅のためのテンプレートとしての使用のために単離する。
【００９５】
実施例３
cDNAライブラリーのサイン配列決定
実施例２において構築したプラスミドを、上記のローリングプライマーおよび以下のＴプライマー（配列番号13）とともに、伸長産物およびアンプリコンを生成させるために使用する：
【００９６】
【表１５】
0004789294.tif 000016
ここで、Ｉは、Ｔプライマーおよびローリングプライマーのアニーリング温度および融解温度の釣り合いをとるために付加したデオキシイノシンである。好ましくは、アニーリング温度は、約55℃である。明らかに、多数の他の配列が、本発明の実施において用いられ得る。上記のローリングプライマーが用いられる。
【００９７】
Ｔプライマー結合部位からローリングプライマー結合部位を含むセグメントを、実施例２のプラスミドから切り出し分離する。（これは、当業者に公知の種々の方法で、例えば、セグメントに隣接する制限部位を含むようにプラスミドを加工して、または単純にPCRにより直接増幅することにより、達成され得る）。デオキシグアノシンをデオキシイノシンで置換した後（例えば、dITPの存在下でのPCRにより）、セグメントを４つの容器に小分けし、変性し、そして適切なローリングプライマーを添加する。条件を、ローリングプライマーのアニーリングを可能にするように調節し、その後プライマーを、Sequenaseなどの高忠実度ポリメラーゼを用いて、dATP、dCTP、dITP、およびdTTPの存在下で、製造者のプロトコルを使用して、伸長する。残りの一本鎖DNAを一本鎖ヌクレアーゼ（例えば、Mung beanヌクレアーゼ）で消化する。必要に応じて、二本鎖DNA伸長産物は、例えば、三重鎖の形成（例えば、Ｔプライマー結合領域、および磁性ビーズに付着された適切な一本鎖相補物の間）を介する捕獲により、反応混合液から分離され得る。
【００９８】
二本鎖DNAを、Ｔプライマー（および、分離工程が使用された場合はローリングプライマー）と組み合わせ、そしてdATP、dCTP、dITP、およびdTTPの存在下での５〜10サイクルのPCRにより増幅して、４つの最初のアンプリコンを形成する。これらのサンプルを合わせ、そして伸長の次のサイクルのための適切なローリングプライマーとともに容器中に再分配する。サンプルをまた分析のために抜く。
【００９９】
好ましくは、分析のためのサンプルを、Ｓプライマーと三重鎖を形成する一本鎖配列を有する磁性ビーズ上に別々に捕獲する。次いで、ビーズを、ApaI（これは、タグを標的ポリヌクレオチドから切断する）を含有する反応混合液に移す。タグを含む遊離鎖（配列番号14）を、次に、アビジンでコートした磁性ビーズによりそのビオチン化Ｔプライマーを介して捕獲し、そして反応容器に移す。ここで、その3'末端を、T4 DNAポリメラーゼおよびdGTPの存在下で、以下に示すように除去する：
【０１００】
【表１６】
0004789294.tif 000017
ここで、dUTP*は標識dUTPを表し、そしてddATPはジデオキシアデノシン三リン酸を表す。好ましくは、dUTPを、４つのアンプリコンの各々について、別々のスペクトル的に解像可能な蛍光色素で標識する。各々のアンプリコンについての遊離タグ（配列番号15）を混合し、そしてその相補物へのハイブリダイゼーションおよび検出のための空間的に制御可能なアレイに、適用される。
【０１０１】
実施例４
RNAへの変換を伴う標的ポリヌクレオチドの配列決定
この実施例では、テンプレートのRNAへの循環的変換を用いる実施態様により、dsDNAテンプレートを、ローリングプライマーを用いて配列決定する。以下のベクター（配列番号16）を標準的なクローニングベクター（例えば、pUC19）から、T7プロモーターエレメント（二重下線）およびローリングプライマー結合部位（一重下線）をポリリンカー領域の示された制限部位に挿入することにより、調製する：
【０１０２】
【表１７】
0004789294.tif 000018
標的ポリヌクレオチドのBamHI部位への挿入後、図2aの開始テンプレート(200)を得る。ベクターをHinD IIIで切断することにより線状化した後、RNA転写が生じる。図2aおよび2bは、プロセスを８サイクル行う場合に、テンプレートおよびローリングプライマー結合部位の配列において生じる変化を示す。各サイクルにおいて、テンプレート中の１つのヌクレオチドを同定する。矢印(210)は、変異が生じるヌクレオチド位置を示し、そして「変換されたテンプレート」の二重下線ヌクレオチドは、生じる変化を示す。この実施例において、示された伸長領域を有する、上記のp1およびp2プライマーを、逆転写酵素（Promega, Madison, WI）とともに用いる。伸長領域中の小文字「ａ」は、オキソ-Aを示し、そして伸長領域中の小文字「ｇ」はオキソ-Gを示す。増幅工程を、T7プロモーターエレメント（下線）を含む正方向プライマー（以下に示す）ならびに以下のp1およびp2逆方向プライマーを使用するPCRを用いて実施する：
【０１０３】
【表１８】
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RNAを、dsDNAテンプレートから、RiboMax RNA生産システム（Promega, Madison, WI）を用いて、製造者のプロトコルを使用して生成する。簡潔に記載すると、50μl反応容量中で、0.1 pmolのdsDNAテンプレートを、30 U/μl T7 RNAポリメラーゼ、1.5 U/μlヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、および19 U/μl無機ピロホスファターゼと合わせ、そして混合液を37℃で２〜４時間、転写緩衝液（80 mM HEPES-KOH(pH 7.5)、2.4 mM MgCl2、２mMスペルミジン-HCl、40 mM DTT、および各々7.5 mMの４つのリボヌクレオシド三リン酸）中でインキュベートする。47μl H2Oおよび１μlの100 mM MnCl2を添加し、65℃で５分間加熱した後、２μl（4.2 U）のDNaseI（U.S. Biochemical）を添加し、そして混合液を37℃で30分間インキュベートする。次いで、RNAを、反応混合液から、QIAGEN（Santa Clarita, CA）RNA精製システム（溶出容量30μl）を用いて精製する。
【０１０４】
４つの別々の逆転写反応混合液を形成する。各々は１〜10 pmolアリコートの転写されたRNAおよび５pmolの、フルオレセイン（例えば、FAM（Perkin-Elmer Corp.Applied Biosystems Division, Foster City, CAから入手可能である））で標識した適切なローリングプライマーを含有する。RNAを変性するために65℃に５分間加熱した後、反応混合液を氷上で冷却し、そして逆転写酵素（0.1 U/μl）およびRNaseインヒビター（0.85 U/μl）を、50 mM Tris-HCl(pH 8.1)、８mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、および各々25〜50μMの４つのデオキシヌクレオシド三リン酸からなる緩衝液に添加し、その結果10μlの反応容量を得る。反応混合液を50〜55℃で５分間インキュベートし、その後、それらを95℃で５分間インキュベートし、それによりいかなる残存するRNAをも効果的に破壊する。４つの反応混合液は、それぞれ3'末端Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを有するローリングプライマーに対応する。従って、各々のサイクルにおいて、４つの反応液の１つのみが、ssDNA伸長産物の合成を生じる。反応成分をゲル電気泳動により分離することによって、産物を同定し、その後、伸長産物を含有するバンドを切り出し、そしてssDNAを回収する。
【０１０５】
上に列挙するプライマーを使用する従来のPCRにおいてssDNA伸長産物を増幅することにより、dsDNAテンプレートを再形成する。
【０１０６】
実施例５
RNAテンプレート上でのプライマー選択に対するdNTP濃度の効果
この実施例では、異なるデオキシヌクレオシド三リン酸濃度の、プライマー選択に対する効果を、３サイクルのRNA合成、プライマー選択、および増幅を介して検討した。伸長反応に４つのプライマー各々の混合物を用いた以外は、各サイクルの工程を、実施例４に記載のように実施した。その結果、3'末端Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを有するプライマーは、示された濃度のdNTPにおいて、逆転写酵素による伸長について、互いに競合した。図5a〜5cに示す結果は、約50μM以下のdNTP濃度が、逆転写酵素によるプライマー伸長における最大の選択性を導くことを示す。図5aについては、正確なプライマーは以下のとおりであった：
【０１０７】
【表１９】
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図5bについては、正確なプライマーは以下のとおりであった：
【０１０８】
【表２０】
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図5cについては、正確なプライマーは以下のとおりであった：
【０１０９】
【表２１】
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【０１１０】
【発明の効果】
本発明によって、ポリヌクレオチドの配列を決定するための新規な方法およびアプローチが提供される。
【０１１１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、RNAテンプレート選択を用いる好ましい実施態様の工程を説明する模式図である。
【図２ａ】図２ａは、複数のタグ化ポリヌクレオチドの同時分析を用いる本発明の好ましい方法の工程を説明する模式図である。
【図２ｂ】図２ｂは、現在の工程のローリングプライマー伸長領域の同定に基づいて選択される引き続く工程のためのローリングプライマーの伸長領域を説明する模式図である。
【図３】図３は、タグ相補物の空間的に制御可能なアレイ上の標識タグを検出するための装置を説明する模式図である。
【図４ａ】図４ａは、本方法の好ましい実施態様の連続的な工程においていかにして配列決定用テンプレートが変化するかを説明する模式図である。
【図４ｂ】図４ｂは、本方法の好ましい実施態様の連続的な工程においていかにして配列決定用テンプレートが変化するかを説明する模式図である。
【図５ａ】図５ａは、逆転写酵素によるRNAテンプレート上のローリングプライマー伸長の選択性におけるdNTP濃度の影響を説明する模式図である。
【図５ｂ】図５ｂは、逆転写酵素によるRNAテンプレート上のローリングプライマー伸長の選択性におけるdNTP濃度の影響を説明する模式図である。
【図５ｃ】図５ｃは、逆転写酵素によるRNAテンプレート上のローリングプライマー伸長の選択性におけるdNTP濃度の影響を説明する模式図である。
【符号の説明】
１０  二本鎖DNA
１２  プライマー結合部位
１４  切断部位
１６  タグ
１８  切断部位
２０  標的ポリヌクレオチド
２２  ローリングプライマー結合部位
２４  伸長領域
２８  容器
３０  容器
３２  容器
３４  容器
３８  アンプリコンＡ
４０  アンプリコンＣ
４２  アンプリコンＧ
４４  アンプリコンＴ
４８  固相支持体
２１０  変異が生じるヌクレオチド位置
５００  フローチャンバー
５０２  入口
５０４  出口
５０６  ガラスプレート
５１０  窩洞
５１２  ガラスカバースリップ
５１４  シリンジポンプ
５２２  バルブブロック
５２４  照射光線
５２６  光源
５２８  フィルター
５３０  蛍光
５３２  共焦顕微鏡
５３４  フィルター
５３６  CCDカメラ
５３８  ワークステーション
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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