(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆の製造工程のうち、少なくとも浸漬工程でジグリコシダーゼを添加し、原料の大豆に由来するイソフラボン配糖体を加水分解してなることを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆。
【請求項２】
浸漬工程及び発酵工程でジグリコシダーゼを添加するものであることを特徴とする請求項１に記載のイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆。
【請求項３】
ジグリコシダーゼがペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）に由来することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆。
【請求項４】
納豆の製造工程のうち、少なくとも浸漬工程でジグリコシダーゼを添加し、原料の大豆に由来するイソフラボン配糖体を加水分解することを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆の製造方法。
【請求項５】
浸漬工程及び発酵工程でジグリコシダーゼを添加するものであることを特徴とする請求項４に記載のイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆の製造方法。
【請求項６】
ジグリコシダーゼがペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）に由来することを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、納豆およびその製造法に関し、詳細には、生体への吸収性に優れたイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
納豆は大豆を納豆菌により発酵させて得られる日本の伝統的な食品であり、該納豆の原料である大豆は、近年、ガン、動脈硬化、心臓疾患、骨粗鬆症の予防、更年期障害におけるホテリの軽減等に効果があるといわれ、植物エステロゲンと称されるイソフラボンの代表的な供給源でもある。
原料の大豆中のイソフラボンは、アグリコン（非糖質部分）であるイソフラボンと糖が結合した配糖体（以下「イソフラボン配糖体」ともいう。）とアグリコンであるイソフラボン（以下「イソフラボンアグリコン」ともいう。）の状態で存在している。また、このイソフラボン配糖体には糖部分の６位の水酸基がサクシニル基、アセチル基もしくはマロニル基で置換された配糖体（以下「修飾イソフラボン配糖体」ともいう。）も含まれており、その存在比率は、加工度合の少ない大豆素材では５０％前後と言われている。
【０００３】
一方、納豆を製造するに際して、納豆菌と共にフラボノイドまたはカテキン成分を多量に含有する天然成分、例えば、イチョウ葉エキスを添加して、カラシ等を添加しなくても食しやすい納豆を製造する方法の発明がある（特開平１１−３１３６３１号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、イソフラボン配糖体、特に修飾イソフラボン配糖体の生体への吸収性は、イソフラボンアグリコンに比して著しく悪いため、折角納豆を摂取しても納豆中に含まれる修飾イソフラボン配糖体のままでは、植物エステロゲンとしての上記効果を十分発揮させることができない。
また、上記特開平１１−３１３６３１号公報に記載の発明は、イチョウ葉エキスに含まれるフラボノイド成分の苦み成分を利用して納豆の食味を向上させることを目的とするものに過ぎず、原料大豆中に本来含まれるイソフラボンアグリコンの含有率を高め、ひいてはイソフラボンアグリコンの有する前記の種々の生理活性を充分に発揮させることを意図するものではない。
【０００５】
そこで、本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、生体への吸収性に優れる大豆に由来するイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆およびその製造方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、納豆の製造工程にジグリコシダーゼを添加することにより、大豆の形態を損なうこと無く納豆中のイソフラボンアグリコン量を高めることができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
請求項１に係る発明は、納豆の製造工程のうち、少なくとも浸漬工程でジグリコシダーゼを添加し、原料の大豆に由来するイソフラボン配糖体を加水分解してなることを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆を要旨とする。ここで、イソフラボン配糖体には糖部分の６位の水酸基がサクシニル基、アセチル基若しくはマロニル基で置換された修飾イソフラボン配糖体も含まれる。
【０００８】
次に、請求項２に係る発明は、請求項１に記載の発明において、浸漬工程及び発酵工程でジグリコシダーゼを添加するものであることを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆を要旨とする。
【０００９】
また、請求項３に係る発明は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、ジグリコシダーゼがペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）に由来することを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆を要旨とする。
【００１０】
更に、請求項４に係る発明は、納豆の製造工程のうち、少なくとも浸漬工程でジグリコシダーゼを添加し、原料の大豆に由来するイソフラボン配糖体を加水分解することを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆の製造方法を要旨とする。
【００１１】
更にまた、請求項５に係る発明は、請求項４に記載の発明において、浸漬工程及び発酵工程でジグリコシダーゼを添加するものであることを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆の製造方法を要旨とする。
【００１２】
また、請求項６に係る発明は、請求項４又は請求項５に記載の発明において、ジグリコシダーゼがペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）に由来することを特徴とするイソフラボンアグリコンに富む大豆の形態を維持した納豆の製造方法を要旨とする。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明のイソフラボンアグリコンに富んだ納豆は、原料の大豆に由来するイソフラボン配糖体を加水分解して製造することができる。また、該イソフラボン配糖体の加水分解は、納豆の製造工程にジグリコシダーゼを添加することにより行うことができる。
【００２４】
前記の納豆の製造工程は、納豆の製造技術分野において通常行われるものであればよく、具体的には、まず大豆を洗浄し（水洗工程）、水中に浸漬して吸水させた後（浸漬工程）、所定の蒸煮条件下、蒸し器中で蒸煮して蒸煮大豆を得る（蒸煮工程）。蒸煮工程の常圧下の蒸煮条件は、通常、圧力が約１．０ｋｇ／ｃｍ２で温度が約１００℃である。また、加圧下の蒸煮条件は、通常、圧力が１．５〜２ｋｇ／ｃｍ2で温度が１２８〜１３３℃の範囲である。次に、このようにして得られた蒸煮大豆に納豆菌を接種混合し（納豆菌接種工程）、その後所定の容器に充填する。このようにして容器に充填された蒸煮大豆を発酵室に搬入し、室温４２℃前後で２２〜２６時間発酵させ（発酵工程）、品温を下げて納豆菌の生育を停止させ、その後、５℃付近で２４〜４８時間熟成後（熟成工程）、包装して出荷される。なお、原料の大豆の種類、大きさ、仕込量、蒸煮条件、発酵条件（発酵温度、発酵時間、発酵室の大きさ、形状等）、熟成条件、納豆収納容器の形状や材質等は適宜変更することができ、上記に限定されるものではない。また、納豆とは糸引納豆を意味するが、糸引納豆には引き割り納豆、雪割納豆なども含まれる。
【００２５】
更に、前記イソフラボン配糖体の加水分解は、納豆の製造工程のうち、浸漬工程、納豆菌接種工程および発酵工程の少なくとも１の工程にジグリコシダーゼを添加することにより行うことができ、好ましくは発酵工程への添加であり、更に好ましくは浸漬工程への添加であり、特に好ましくは浸漬工程と発酵工程の両工程への添加である。
【００２６】
浸漬工程への添加は、発酵工程への添加よりもイソフラボンアグリコンの生成率が高く（後記の表１、２参照）、また浸漬工程と発酵工程の両工程への添加については、意外にも浸漬工程または発酵工程への添加に比して相乗的にイソフラボンアグリコンの生成率が高められるためである（後記の表１〜３参照）。従って、ジグリコシダーゼの添加工程および添加量を適宜選択することにより、イソフラボンアグリコンに富んだ納豆のイソフラボンアグリコンの含有量を調整することも可能である。
なお、水洗工程では添加したジグリコシダーゼが洗い流され、蒸煮工程ではジグリコシダーゼが失活するため、ジグリコシダーゼを添加する工程としては好ましくない。
【００２７】
ジグリコシダーゼの添加量は、大豆中のイソフラボン配糖体を所望の程度に加水分解するに必要な量を適宜定めることができるが、通常は大豆１００ｇあたり０．２６〜５２，０００単位であり、好ましくは、２．６〜２６，０００単位であり、特に好ましくは、２６〜５，２００単位である。
【００２８】
ジグリコシダーゼの添加態様は、浸漬工程、納豆菌接種工程、発酵工程での大豆の状態により、溶液状、懸濁液状等の液状、粉末状、顆粒状等の固形上等の態様を適宜選択することができる。通常は、ジグリコシダーゼの水溶液が用いられ、上記工程の少なくとも１の工程において大豆に散布される。
【００２９】
本発明において、ジグリコシダーゼとは、糖鎖加水分解酵素に分類される酵素であって、配糖体を構成している糖以外の化合物（以下「アグリコン」という。）と単一あるいは複数の種類の糖類より構成された直鎖および分岐糖鎖とが糖鎖の水酸基を介して結合したいわゆる配糖体を基質とする事ができ、二糖単位で基質を認識して切断しアグリコンを生成する酵素をいい、このジグリコシダーゼは、また、既存のグルコシダーゼでは難分解であるアセチル体、サクシニル体もしくはマロニル体等の修飾配糖体を糖とアグリコンに分解する酵素でもある。
【００３０】
本発明に記載したジグリコシダーゼは、イソフラボン配糖体を非常に効率よく加水分解し、かつ遊離グルコースの影響をほとんど受けない。従って、大豆に含有されるイソフラボン配糖体であるダイズイン、ゲニスチン、グリシチン等、並びに修飾イソフラボン配糖体であるこれらのアセチル体、サクシニル体、マロニル体等の高効率な加水分解に適した酵素である。
【００３１】
本発明で使用するジグリコシダーゼとしては、例えば、ジグリコシダーゼ活性が確認されているアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属等の様々な微生物が生産するジグリコシダーゼを使用することができる。
【００３２】
より好適なジグリコシダーゼとしては、ジグリコシダーゼ生産能が確認されているアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＩＦＯ４４０７（入手先  財団法人  発酵研究所  大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＩＡＭ  ２０２０、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＩＡＭ２０４６、ペニシリウム  マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）ＩＡＭ７１５３（入手先  東京大学分子細胞生物学研究所  東京都文京区弥生１−１−１）が生産するジグリコシダーゼが挙げられる。
【００３３】
特に好ましいジグリコシダーゼとしては、ペニシリウム  マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）ＩＡＭ７１５３株が生産するジグリコシダーゼである。ペニシリウム  マルチカラー由来のβ−ガラクトシダーゼは食品添加物リストに掲載されている安全性の認められている酵素であり、かかる安全性の高い菌から生産されるジグリコシダーゼについても高い安全性が推測されるためである。
【００３４】
上述した各種微生物などを用いてジグリコシダーゼを製造するためには、当該微生物の培養に適合した方法や条件を適宜設定できる。例えば、上述した各種菌株の培養法としては液体培養法、固体培養法の何れも採用できるが、液体培養法が好適である。液体培養は、例えば、以下のように行うことができる。
【００３５】
培地としては、ジグリコシダーゼを生産する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
【００３６】
更に、ジグリコシダーゼを生産蓄積せしめるために培地に各種の誘導物質を添加することができる。誘導物質としては例えば糖類が使用でき、好ましくはゲントース（例えば、ゲントース＃８０、日本食品化工（株））、ゲンチビオース、ゲンチオリゴ糖（例えば、ゲンチオリゴ等、和光純薬工業（株））、ガラクトマンナン等が利用できる。これらの誘導物質の添加量は目的とするジグリコシダーゼの生産能が増大される量であれば特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０％が添加される。
【００３７】
培地のｐＨは例えば約３〜８、好ましくは約５〜６程度に調製し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３０℃程度で、１〜１５日間、好ましくは４〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。しかしながら、上述した各種の培養条件などは当然のことながら、培養する対象である微生物や細胞により適宜変更され、本発明のジグリコシダーゼが生産される条件であれば、その条件等は限定されない。
得られた培養液からジグリコシダーゼを単離精製するには、ジグリコシダーゼ活性を指標として、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを組み合わせ、常法により処理して、精製したジグリコシダーゼを得ることができる（参考文献  蛋白質・酵素の基礎実験法、堀尾  武一著、南江堂）。本発明のジグリコシダーゼは上述のジグリコシダーゼを生産する微生物を培養した培養液そのままでも利用できる。もちろん本培養液は本発明の使用目的に応じてその精製度合いを適宜変更することができる。
【００３８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
参考例１（ペニシリウム  マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌlｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）ＩＡＭ７１５３株を用いたジグリコシダーゼの培養）
2.0%の脱脂大豆、3.0%ブドウ糖、0.5%リン酸二水素カリウム、0.4%硫酸アンモニウム、0.3%乾燥酵母を含む生育培地（pH5.6）を121℃で20分間殺菌した。殺菌した培地100 mLに対して生産菌を1エーゼ接種し、27℃、140 min−1の振とう速度で前培養を行った。5日後、1.0%サンファイバーR、2.0%リン酸二水素カリウム、1.0%硫酸アンモニウム、3.13%ミーストP1Gを含むpH4.9の本培地20 Lを30 L容のジャーファーメンターにて、150 min−1で攪拌しながら121℃で20分間殺菌した。前培地を1.5%で接種し、攪拌数250 min−1、通気量0.75 vvm （15 L/min）、内圧0.5 Kg/cm2（４８ｋＰａ）、27±1℃で8日間培養した。
【００４０】
ジグリコシダーゼの精製
培養ブロスに濾過助材としてゼムライトスーパー56MとファインフローAをそれぞれ全液量の2%質量を添加し、珪藻土ろ過を行った。限外濾過膜 UF AIP-2020（MW6,000）で20倍濃縮を行うとともに、pH4.7の20 mM酢酸緩衝液で置換した。上記限外濾過濃縮液に硫酸アンモニウムを添加し、50％硫安塩析を行った。得られた沈殿を除去し、上清に更に硫安を添加して80％硫安塩析を行った。沈殿を回収し、pH4.7の20 mM酢酸緩衝液に溶解した。溶解液を10-DGカラム（BioRad Co.）に通し、緩衝液を30％飽和硫酸アンモニウムを含むpH4.7の20 mM酢酸緩衝液に交換した。この溶液を疎水クロマトグラフィー（HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose High Performance （Pharmacia））にアプライし、ジグリコシダーゼ活性を示す画分をβ-グルコシダーゼおよびβ-キシロシダーゼ活性の画分と分離させた。室温にて、2 mL/minの流速で30％飽和硫安を含む20 mM酢酸緩衝液で溶出を開始し、30-0％の直線勾配によって溶出した。10-12.5％飽和硫安濃度でジグリコシダーゼ活性を示す画分が溶出された。回収したジグリコシダーゼ画分を濃縮し、遠心分離した上清を10-DGカラムにかけて溶解液をpH7.1の25 mMトリス塩酸緩衝液に交換した。この液を等電点クロマトグラフィー（Mono-P HR5/20 （Pharmacia））にアプライし、pH5.0のポリバッファー74で1 mL/min、室温で溶出を開始した。目的のジグリコシダーゼ活性は、pH6.2からpH6.3で溶出した。この画分のSDS電気泳動でシングルバンドが得られたことから、ジグリコシダーゼが精製できたことが示された。
【００４１】
ジグリコシダーゼ活性測定法
自動化学分析装置（東芝社製、TBA-30R）を用い、ジグリコシダーゼサンプル30μＬをパラニトロフェニル（pNP）プリメベロシドを2 mMに酢酸緩衝液（pH 5.5）に溶解せしめたもの200μＬと混合し、40℃、サイクルタイム22.5 sec.で9.75分間反応させた後、炭酸ナトリウム250μＬを加え412 nmの吸光度を測定する。サンプル由来のブランクの測定は基質溶液の代わりに20 mM酢酸緩衝液（pH 5.5）を用いて同様に測定する。この条件下で吸光度を1上昇させる酵素量を1単位とする。
上記pNP-プリメベロシドは、pNP-グルコシド（メルク社製）とキシロオリゴ糖（和光純薬社製）を酵素キシロシダーゼ（シグマ社製）を用いて反応させ、pNP-グルコシドにキシロースをβ-1,6結合で1残基転移させることにより合成した。
【００４２】
実施例１（浸漬工程にジグリコシダーゼを添加するイソフラボンアグリコンに富む納豆の製造法）
１．水洗工程
乾燥大豆（国産優良大豆、伊勢惣製。 以下同じ。）を用い、それぞれの重量が１５０ｇとなるように３つのグループとした。各グループの乾燥大豆を水を用いて充分に洗浄した。
【００４３】
２．浸漬工程
上記の水洗した各グループの大豆にそれぞれ４５０ｍＬの水を添加し、グループ１にはジグリコシダーゼを添加せずに、グループ２にはジグリコシダーゼ ０．０７５ｇ（１９０単位）、グループ３にはジグリコシダーゼ ０．７５ｇ（１，９００単位）を添加して、それぞれ約２０℃で２４時間浸漬した。
【００４４】
３．蒸煮工程
上記の浸漬した大豆を、抓んだ際に潰れる程度を目安に、常圧下（約１．０ｋｇ／ｃｍ２）、４時間蒸煮した。
【００４５】
４．納豆菌接種工程
上記の蒸し大豆を各グループごとにステンレス製トレイ（２３×２９．５×５ｃｍ）に移し、大豆の重量を測定したところ、各グループの蒸し大豆の重量はそれぞれ約３００ｇであった。４５ｍＬの滅菌水に０．１ｇの納豆菌（バチルス ナットー、高橋祐蔵研究所製）を懸濁して納豆菌懸濁液を調製し、当該懸濁液各１５ｍＬを各グループの蒸し大豆に添加し十分に混合した。
【００４６】
５．発酵工程
上記の納豆菌を添加した蒸し大豆を入れたステンレストレイを発泡スチロール製の箱に入れ、４５℃に設定した恒温槽内（槽内温度４２℃）で２４時間発酵させた。
【００４７】
各種イソフラボン配糖体及びイソフラボンアグリコンの測定方法
上記の発酵させた納豆８０ｇに８０％（v/v）エタノール３００ｍＬを添加し、ミキサー（ＶＡ−Ｗ３５，日立製作所株式会社製）を用いて破砕した。該破砕液を室温で１時間攪拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分）して上清を回収し、該上清を適宜希釈して下記の条件でＨＰＬＣに付しイソフラボン配糖体及びイソフラボンアグリコンを分離、検出した。
HPLC定量分析条件
カラム：TOSOH TSK gel ODS-80TMカラム（HPLC、Shimadzu CLASS LC-10システム）。インジェクター：オートインジェクター（Shimadzu, SIL-10AXL）。溶離方法：溶離液A（アセトニトリル）と溶離液B （10％酢酸溶液）をそれぞれ2％、98％含む溶液で開始し、5分後から溶離液A 50％、溶離液B 50％で終了する直線濃度勾配を用いた。全流速：0.8 mL/min。検出方法：UV検出器（Shimadzu, SPD-10AV）を用い、260 nmにおける吸光度により検出した。標準化合物：ナカライテスク社製の下記イソフラボン化合物の精製品（ダイズイン、6"-O-アセチルダイズイン、ダイゼイン、グリシチン、グリシテイン、ゲニスチン、6"-O-マロニルゲニスチン、、6"-O-アセチルゲニスチン、ゲニステイン）を用いた。
サクシニルダイズイン、サクシニルグリシチン、サクシニルゲニスチンについては、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２２（１１）１１９４（１９９９）に記載の方法により製造し、標準化合物として使用した。
即ち、２２１．４ｇの納豆を凍結乾燥、粉砕、２．５Ｌのクロロホルムで脱脂し、次いで室温下２．５Ｌのメタノールで２４時間抽出して１８．５ｇの抽出物を得た。該抽出物をＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０ カラム（三菱化成（株）製）により、水８００ｍＬ、３０％メタノール１６００ｍＬ、次いで７０％メタノール２５００ｍＬを用いて分画した。７０％メタノール画分（１．０ｇ）をメタノールに溶解後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ カラム（４×７９ｃｍ、メタノール）によるゲルろ過に付した。該溶出画分をＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ａｒｔ．５７２１（メルク社製）、移動相：クロロホルム−メタノール−水（６５：３５：１０）の下層、Ｖａｕｇｈａｎ 試薬で検出）により５画分（第１画分（６８８ｍｇ）、第２画分（４０ｍｇ）、第３画分（３６ｍｇ）、第４画分（２５ｍｇ）、第５画分（３７ｍｇ）、Ｋｄ＝０−０．７０、０．７１−１．０７、１．０８−１．８６、１．８７−２．１９、２．２０−２．８０）に分画した。サクシニルダイズイン（２４ｍｇ）とサクシニルグリシチン（１．５ｍｇ）を第２画分からＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ｐａｃｋ Ａ３２４、１０×３００ｍｍ；移動相：メタノール−水−酢酸（４５：５４．９：０．１））により、サクシニルゲニスチン（１８ｍｇ）を第３画分からＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ｐａｃｋ Ａ３２４、１０×３００ｍｍ；移動相：アセトニトリル−水−酢酸（２５：７４．９：０．１））により得た。含水メタノールからの再結晶により、サクシニルダイズイン、サクシニルゲニスチン、サクシニルグリシチンをそれぞれ無色針状晶（２０ｍｇ）、無色板状晶（１５ｍｇ）、無色針状晶（１ｍｇ）として得た。
【００４８】
なお、後記の実施例２および実施例３についても同様の方法で各種イソフラボン配糖体およびイソフラボンアグリコンについて測定を行った。
【００４９】
表１から明らかなように、総イソフラボンアグリコン量（μｍｏｌ）は、ジグリコシダーゼ未添加の納豆に対して、ジグリコシダーゼ０．０７５ｇ添加の納豆では１５．９倍、ジグリコシダーゼ０．７５ｇ添加の納豆では２４．８倍に増加した。
【００５０】
以上のように、イソフラボンアグリコンの生成量はジグリコシダーゼ添加量の増加と共に増加し、該納豆中のイソフラボンの存在比率は、ジグリコシダーゼ未添加の納豆では総イソフラボン配糖体９７．５％、総イソフラボンアグリコン２．５％であるのに対して、ジグリコシダーゼ０．０７５ｇ添加の納豆では総イソフラボン配糖体６３．６％、総イソフラボンアグリコン３６．４％であり、ジグリコシダーゼ０．７５ｇ添加の納豆では総イソフラボン配糖体４１．１％、総イソフラボンアグリコン５８．９％であった。
【００５１】
このように、浸漬工程にジグリコシダーゼを０．０７５ｇ〜０．７５ｇ添加することにより、該納豆中のイソフラボンアグリコンの含有比率を３６．４％〜５８．９％に調整することが可能である。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
実施例２（発酵工程にジグリコシダーゼを添加するイソフラボンアグリコンに富む納豆の製造法）
１．水洗工程
乾燥大豆５００ｇを水を用いて充分に洗浄した。
【００５４】
２．浸漬工程
上記の水洗した大豆に水１，５００ｍＬを添加し、約２０℃で２４時間浸漬した。
【００５５】
３．蒸煮工程
上記の浸漬した大豆を、抓んだ際に潰れる程度を目安に、常圧下（約１．０ｋｇ／ｃｍ２）、４時間蒸煮した。
【００５６】
４．納豆菌接種工程
上記の蒸し大豆をステンレス製トレイ（２３×２９．５×５ｃｍ）に移し、大豆の重量を測定したところ、蒸し大豆の重量は１０８６．３４ｇであった。５０ｍＬの滅菌水に０．１ｇの納豆菌（バチルス ナットー、高橋祐蔵研究所製）を懸濁して納豆菌懸濁液を調製し、当該懸濁液を当該蒸し大豆に添加し十分に混合した。
【００５７】
５．発酵工程
上記の納豆菌を添加した蒸し大豆をそれぞれの重量が３００ｇとなるようにステンレス容器（２３×２９．５×５ｃｍ）に入れ、３つのグループとした。グループ１にはジグリコシダーゼを添加せず滅菌水１０ｍＬを添加し、グループ２にはジグリコシダーゼ ０．０７５ｇ（１９０単位）を滅菌水１０ｍＬに溶解した液を、グループ３にはジグリコシダーゼ ０．７５ｇ（１，９００単位）を滅菌水１０ｍＬに溶解した液を添加し、スパーテルで十分混合した後、プラスチックトレイに移した。当該プラスチックトレイを発泡スチロール製の箱に入れ、４５℃に設定した恒温槽内（槽内温度４２℃）で２４時間発酵させた。
【００５８】
表２から明らかなように、総イソフラボンアグリコン量（μｍｏｌ）は、ジグリコシダーゼ未添加の納豆に対して、ジグリコシダーゼ０．０７５ｇ添加の納豆では５．５倍、ジグリコシダーゼ０．７５ｇ添加の納豆では１３．８倍に増加した。
【００５９】
以上のように、イソフラボンアグリコンの生成量はジグリコシダーゼ添加量の増加と共に緩やかに増加し、該納豆中のイソフラボンの存在比率は、ジグリコシダーゼ未添加の納豆では総イソフラボン配糖体９７．６％、総イソフラボンアグリコン２．４％であるのに対して、ジグリコシダーゼ０．０７５ｇ添加の納豆では総イソフラボン配糖体８７．３％、総イソフラボンアグリコン１２．７％であり、ジグリコシダーゼ０．７５ｇ添加の納豆では総イソフラボン配糖体６５．６％、総イソフラボンアグリコン３４．４％であった。
【００６０】
このように、発酵工程にジグリコシダーゼを０．０７５ｇ〜０．７５ｇ添加することにより、該納豆中のイソフラボンアグリコンの含有比率を１２．７％〜３４．４％に調整することが可能である。
【００６１】
【表２】
0004832677.tif 000003
【００６２】
実施例３（浸漬工程及び発酵工程にジグリコシダーゼを添加するイソフラボンアグリコンに富む納豆の製造法）
１．水洗工程
乾燥大豆を用い、それぞれの重量が１５０ｇとなるように３つのグループとした。各グループの乾燥大豆を水を用いて充分に洗浄した。
【００６３】
２．浸漬工程
上記の水洗した各グループの大豆にそれぞれ４５０ｍＬの水を添加し、グループ１にはジグリコシダーゼを添加せずに、グループ２にはジグリコシダーゼ ０．０７５ｇ（１９０単位）、グループ３にはジグリコシダーゼ ０．７５ｇ（１，９００単位）を添加して、それぞれ約２０℃で２４時間浸漬した。
【００６４】
３．蒸煮工程
上記の浸漬した大豆を、抓んだ際に潰れる程度を目安に、常圧下（約１．０ｋｇ／ｃｍ２）、４時間蒸煮した。
【００６５】
４．納豆菌接種工程
上記の蒸し大豆を各グループごとにステンレス製トレイ（２３×２９．５×５ｃｍ）に移し、大豆の重量を測定したところ、各グループの蒸し大豆の重量はそれぞれ約３００ｇであった。４５ｍＬの滅菌水に０．１ｇの納豆菌（バチルス ナットー、高橋祐蔵研究所製）を懸濁して納豆菌懸濁液を調製し、当該懸濁液各１５ｍＬを各グループの蒸し大豆に添加し十分に混合した。
【００６６】
５．発酵工程
上記の納豆菌を添加した蒸し大豆のグループ１にはジグリコシダーゼを添加せず滅菌水１０ｍＬを添加し、グループ２にはジグリコシダーゼ ０．０７５ｇ（１９０単位）を滅菌水１０ｍＬに溶解した液を、グループ３にはジグリコシダーゼ ０．７５ｇ（１，９００単位）を滅菌水１０ｍＬに溶解した液を添加し、スパーテルで十分混合した後、プラスチックトレイに移した。当該プラスチックトレイを発泡スチロール製の箱に入れ、４５℃に設定した恒温槽内（槽内温度４２℃）で２４時間発酵させた。
【００６７】
表３から明らかなように、総イソフラボンアグリコン量（μｍｏｌ）は、ジグリコシダーゼ未添加の納豆に対して、ジグリコシダーゼ０．０７５ｇ添加の納豆では４２．４倍、ジグリコシダーゼ０．７５ｇ添加の納豆では４４．２倍に増加した。
【００６８】
以上のように、イソフラボンアグリコンの生成量はジグリコシダーゼ添加量の増加と共に著しく増加し、該納豆中のイソフラボンの存在比率は、ジグリコシダーゼ未添加の納豆では総イソフラボン配糖体９７．５％、総イソフラボンアグリコン２．５％であるのに対して、ジグリコシダーゼ０．０７５ｇ添加の納豆では総イソフラボン配糖体３．０％、総イソフラボンアグリコン９７．０％であり、ジグリコシダーゼ０．７５ｇ添加の納豆では総イソフラボン配糖体０．８％、総イソフラボンアグリコン９９．２％であった。従って、浸漬工程及び発酵工程にジグリコシダーゼを０．０７５ｇ〜０．７５ｇ添加することにより、該納豆中のイソフラボンアグリコンの含有比率を９７．０％〜９９．２％に調整することが可能である。
【００６９】
本実施例の浸漬工程と発酵工程の両工程にジグリコシダーゼをそれぞれ０．０７５ｇを添加した場合（ジグリコシダーゼの総添加量０．１５ｇ）の納豆中のイソフラボンアグリコンの生成量は８．４８μｍｏｌであるが、これは、納豆中のイソフラボンアグリコンの生成量が、浸漬工程にジグリコシダーゼ０．７５ｇ  を添加する実施例１の場合には４．９６μｍｏｌ、発酵工程にジグリコシダーゼ０．７５ｇを添加する実施例２の場合には２．７６μｍｏｌであることからは予想を遥かに超えた結果であり、ジグリコシダーゼの浸漬工程と発酵工程の両工程への添加による相乗効果が示唆される。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
以上、実施例１〜３で示したように、イソフラボン配糖体であるダイズイン、グリシチン及びゲニスチン、修飾イソフラボン配糖体であるサクシニルダイズイン、アセチルダイズイン、サクシニルグリシチン、マロニルゲニスチン、サクシニルゲニスチン、アセチルゲニスチンは、ジグリコシダーゼの添加により、イソフラボンアグリコンに加水分解され、対応するイソフラボンアグリコンであるダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインが生成した。また、ジグリコシダーゼを添加する工程、添加するジグリコシダーゼ量を調節することにより、所望の含有比率のイソフラボンアグリコンに富んだ納豆を製造することが可能である。
【００７２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、大豆に含まれるイソフラボン配糖体を該大豆から取出すこと無く加水分解することにより、イソフラボンアグリコンに富んだ納豆を製造でき且つジグリコシダーゼの添加量、添加工程を適宜選択することにより、イソフラボンアグリコンの含有率を調節することができるので、大豆の形態を維持しつつ該大豆中のイソフラボンアグリコンを所望の含有率に増大させることができるという利点がある。また係る利点はイソフラボン配糖体を含有する他の豆類にも広く適用できるため、イソフラボンアグリコンの含有比率を増しつつ、豆類の形態を維持させることが必要な用途にも適用可能である。また、本発明の納豆は、生体への吸収性に優れるイソフラボンアグリコンの含有率が高いので、該納豆を食することで該イソフラボンアグリコンによるガン、動脈硬化、心臓疾患、骨粗鬆症、更年期障害のホテリの軽減等の生理活性が期待される。