(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の組換えダニアレルゲン。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン
【請求項２】
以下の(a)又は(b)の組換えダニアレルゲン。
(a) 配列番号３５で表わされるアミノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン
(b) 配列番号３５で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン
【請求項３】
コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）由来のダニアレルゲンであって、以下の(i)〜(iv)の特性を有するダニアレルゲン：
(i)  SDS-PAGEで測定した場合に150kDa〜200kDaの分子量を有する；
(ii)  N末端アミノ酸配列が配列番号１９に表される；
(iii)  配列番号４及び１０で表される部分アミノ酸配列を有する；及び
(iv)  コナヒョウヒダニ抗原に対するIgEに反応する。
【請求項４】
配列番号３５で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する、請求項３記載のダニアレルゲン。
【請求項５】
さらに、以下の特性(v)を有する請求項３又は４に記載のダニアレルゲン：
(v)  等電点電気泳動及びSDS-PAGEの２次元電気泳動を行った場合に、分子量が150kDa〜250kDaで、pHが4.5のスポットに検出される。
【請求項６】
以下の(a)又は(b)のダニアレルゲンをコードする遺伝子。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むダニアレルゲン
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有するダニアレルゲン
【請求項７】
以下の(a)又は(b)のダニアレルゲンをコードする遺伝子。
(a) 配列番号３５で表わされるアミノ酸配列を含むダニアレルゲン
(b) 配列番号３５で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有するダニアレルゲン
【請求項８】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号１の塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項９】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号３４で表される塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号３４の塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項１０】
請求項３から５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンをコードするDNAを含む遺伝子。
【請求項１１】
請求項８または９に記載の遺伝子によりコードされる、組換えダニアレルゲン。
【請求項１２】
請求項６から１０のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の組換えダニアレルゲンと他のタンパク質との融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項３から５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンと他のタンパク質との融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１２記載の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次いで、融合している他のタンパク質を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の組換えダニアレルゲンまたは請求項１３記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
【請求項１９】
請求項３から５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンまたは請求項１４記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
【請求項２０】
請求項１または２に記載の組換えダニアレルゲンまたは請求項１３記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
【請求項２１】
請求項３から５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンまたは請求項１４記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
【請求項２２】
請求項１または２に記載の組換えダニアレルゲンに対するモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項３から５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンに対するモノクローナル抗体。
【請求項２４】
請求項１１に記載の組換えダニアレルゲンに対するモノクローナル抗体。
【請求項２５】
請求項２２から２４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いる屋内塵中の請求項３から５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンの免疫学的測定方法。
【請求項２６】
ELISAである請求項２５記載の屋内塵中の請求項３〜５のいずれか１項に記載のダニアレルゲンの免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンに関し、特にイヌのアトピーの原因となるダニアレルゲンに関する。本発明は、さらに該アレルゲンをコードする遺伝子、該遺伝子を発現させ得る発現ベクター、発現ベクターで形質転換された形質転換体、該組換えダニアレルゲンの製造方法、ダニアレルギー疾患治療剤、およびダニアレルギー疾患診断薬に関する。
【背景技術】  アトピー性皮膚炎、気管支喘息等のアレルギー疾患の主要な原因として、屋内塵性ダニが知られている。従来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とされ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入性アレルゲン等の回避が困難な抗原で引き起こされる疾患においては、該減感作療法が広く行われている。しかしながら、減感作療法では感作抗原によるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要とされ、そのような安全な感作抗原の研究が進められている。
ダニアレルギー疾患については、屋内塵中のアレルゲン源としてヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）及びコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）の２種のダニが報告されている（非特許文献１および２を参照）。これらのダニから、主要ダニアレルゲンが分画されており、それらはダニ排泄物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量２４−２８ｋＤの糖蛋白（ｐＩ  ４．６〜７．２）、及び／又は分子量１４．５−２０ｋＤのタンパク質（ｐＩ  ５〜７．２）であることがわかっている（非特許文献３から７を参照）。
ダニアレルゲンの遺伝子について、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるＤｅｒ  ｐ１（分子量：２５，３７１）及びＤｅｒ  ｐ２（分子量：１４，１３１）が、またコナヒョウヒダニの主要アレルゲンであるＤｅｒ  ｆ１（分子量：２５，１９１）及びＤｅｒ  ｆ２（分子量：１４，０２１）がクローニングされ塩基配列も決定されている（非特許文献８から１５を参照）。これらのアレルゲンについて組換えアレルゲンも作製されており、アレルゲンの研究が進んでいる。また、分子量約３０，０００のアレルゲンとしてＤｅｒ  ｆ３もその塩基配列が報告されている（非特許文献１６を参照）。さらにダニアレルゲンとして、ｍａ１０，ｍａ３，ｍａ１５，ｍａ２９，ｍａ４４，ｍａ５０，ｍａ１１３，ｍａ１１４，ｍａ１１５（特許文献１を参照）も報告されといる。さらに、抗Ｄｅｒ  ｆ２血清と強い交差反応性を示す、ｍａ１２４も報告されている（特許文献２を参照）。
また、イヌにおいて９８ｋＤａと１０９ｋＤａのＤｅｒ  ｆ１５（非特許文献１７を参照）及び６０ｋＤａのＤｅｒ  ｆ１８（非特許文献１８を参照）がＩｇＥが強く反応するアレルゲンであるとの報告がある。
ダニアレルギー疾患の診断方法としては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物および／またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験が主流であった。ＲＡＳＴ（ｒａｄｉｏ  ａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ  ｔｅｓｔ）法による血清中のＩｇＥ抗体価（相対値）の測定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験等も併用されてはいたが、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難であった。
従来より、屋内塵（ハウスダスト）抽出液を用いて、屋内塵性ダニを特異的アレルゲンとする気管支喘息の減感作治療法が行われてきた。しかし、屋内塵の組成は十分分析されていなかった。また、屋内塵には多種類の不純物が含まれるので、アナフィラキシーを誘発する危険もあり、その際の屋内塵の投与量も極度に制限されていた。このため従来の減感作治療は効果が極めて低かった。従って、より有効でありかつ安全な減感作治療用抗原が望まれていた。従来より、高分子粗ダニ排泄物画分に減感作治療に有効なアレルゲンが存在することが知られていたが、このような画分からは減感作治療用に充分な量のダニアレルゲンは得られなかった。従って、ダニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法では、治療用抗原の安定供給は困難である。また、前記のように、従来より遺伝子組換え技術により種々の組換えダニアレルゲンについて報告されていた。しかしながら、これらのアレルゲンは必ずしも、実際の治療に有効とはいえず、より有効な新たなダニアレルゲン活性の高い組換えダニアレルゲンの提供が望まれていた。
【特許文献１】特開平７−１１２９９９号公報
【特許文献２】特開平７−２７８１９０号公報
【非特許文献１】Ａｌｌｅｒｇ．Ａｓｔｈｍａ，１０，３２９〜３３４（１９６４）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ，４２，１４〜２８（１９６８）
【非特許文献３】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，５８７〜５９２（１９８０）
【非特許文献４】Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７６，７５３〜７６１（１９８５）
【非特許文献５】Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４６，６７９〜６８７（１９８２）
【非特許文献６】Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，２１４〜２２３（１９８６）
【非特許文献７】Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７５，６８６〜６９２（１９８５）
【非特許文献８】Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，１２７〜１２９（１９８８）
【非特許文献９】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７，１７５〜１８２（１９８８）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，１４５７〜１４６２（１９８９）
【非特許文献１１】Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９１，１１８〜１２３（１９９０）
【非特許文献１２】Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９１，１２４〜１２９（１９９０）
【非特許文献１３】Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｏｌ．，３９，５５７〜５６１（１９９０）
【非特許文献１４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，２１，２５〜３２（１９９１）
【非特許文献１５】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，２１，３３〜３７（１９９１）
【非特許文献１６】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７７，６２〜６６（１９９５）
【非特許文献１７】Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，７８，２３１〜２４７（２００１）
【非特許文献１８】Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１２，７９〜８６（２００３）
【発明の開示】
本発明は、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンの提供を目的とする。より具体的には、本発明は、ダニ虫体由来の遺伝子を提供することを目的とし、また、該遺伝子を発現させ得る発現ベクターを提供することを目的とする。さらに、本発明は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られるアレルゲン活性を有する新規なダニアレルゲンの提供を目的とする。さらにまた、本発明は、組換えダニアレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患治療剤の提供および組換えダニアレルゲンを含む新規なダニアレルギー疾患診断薬の提供を目的とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規なダニアレルゲンを見出し、該アレルゲンが減感作治療に優れた効果を奏することを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］  以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えダニアレルゲン、
（ａ）配列番号２または３５で表わされるアミノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン
（ｂ）配列番号２または３５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン
［２］  以下の（ａ）又は（ｂ）のダニアレルゲンをコードする遺伝子、
（ａ）配列番号２または３５で表わされるアミノ酸配列を含むダニアレルゲン
（ｂ）配列番号２または３５で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有するダニアレルゲン
［３］  以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１または３４で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１または３４の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［４］  ［１］のダニアレルゲンの断片ペプチド、
［５］  配列番号３から１９で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含むアミノ酸配列からなる［４］の断片ペプチド、
［６］  ［４］または［５］の断片ペプチドをコードするダニアレルゲンの断片遺伝子、
［７］  ［２］もしくは［３］の遺伝子または［６］に記載の断片遺伝子を含有する組換えベクター、
［８］  ［１］のダニアレルゲンと他のタンパク質との融合タンパク質、
［９］  ［７］の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞、
［１０］  ［９］の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法、
［１１］  ［９］の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次いで、融合している他のタンパク質を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法、
［１２］  ［１］の組換えダニアレルゲン、［４］の断片ペプチドまたは［８］記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、
［１３］  ［１］の組換えダニアレルゲン、［４］の断片ペプチドまたは［８］記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬、
［１４］  ［１］に記載のダニアレルゲンに対する抗体、
［１５］  モノクローナル抗体である［１４］のダニアレルゲンに対する抗体、
［１６］  ［１５］のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
［１７］  ［１４］から［１６］のいずれかの抗体を用いる屋内塵中のダニアレルゲンの免疫学的測定方法、ならびに
［１８］  ＥＬＩＳＡである［１７］の屋内塵中のダニアレルゲンの免疫学的測定方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１１６０８９の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、リコンビナントイヌＦｃεＲＩα鎖の電気泳動の結果を示す写真である。
図２は、リコンビナントイヌＦｃεＲＩα鎖のＩｇＥ結合性を示す図である。
図３は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ特異的ＩｇＥの検出の結果を示す図である。
図４は、リコンビナントイヌＦｃεＲＩα鎖を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図５は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ抽出抗原の２次元電気泳動パターンを示す写真である。
図６は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅアレルゲンタンパク質の２次元電気泳動ウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図７−１は、Ｚｅｎ１遺伝子の部分塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
図７−２は、Ｚｅｎ１遺伝子の部分塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である（図７−１の続き）。
図８−１は、Ｚｅｎ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
図８−２は、Ｚｅｎ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である（図８−１の続き）。
図８−３は、Ｚｅｎ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である（図８−２の続き）。
図８−４は、Ｚｅｎ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である（図８−３の続き）。
図９は、大腸菌を用いて作製・精製したリコンビナントＺｅｎ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１０は、抗Ｚｅｎ１ポリクローナル抗体のウエスタンブロッティングによる反応解析の結果を示す写真である。レーン１はリコンビナントＺｅｎ１を、レーン２はダニ虫体の結果を表す。
図１１は、リコンビナントＺｅｎ１のＩｇＥ反応性をＥＬＩＳＡにて解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
（１）  ダニアレルゲンＺｅｎ１タンパク質の単離および部分配列決定
臨床的にダニアレルギーと診断された動物から得られたダニアレルゲン特異的ＩｇＥを用いてダニアレルギーを特定する。具体的には、例えばダニアレルゲン特異的ＩｇＥを含む血清、ダニ抽出物およびアレルゲン特異的ＩｇＥを認識するＩｇＥレセプターを用いたウエスタンブロッティングよりダニアレルゲンを同定すればよい。アレルゲンの同定は公知の方法により行うことができる。
このようにして同定される本発明の新規なダニアレルゲンであるＺｅｎ１タンパク質は、分子量１５０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質である。
同定されたダニアレルゲンの単離は、電気泳動を行い、ダニアレルゲンのスポットからダニアレルゲンを抽出することにより行うことができる。この際、他のタンパク質と完全に分離するためには、２次元電気泳動を行うことが望ましい。
抽出したダニアレルゲンを用いて、公知の方法で部分配列決定を行うことができる。部分配列を決定する公知の方法として、ＭＳ／ＭＳ解析によるｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇやペプチドマッピングがある。
（２）  ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡクローンの作製
ダニよりｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡを鋳型にしてダニアレルゲンｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、スクリーニングすることにより、本発明のダニアレルゲンをコードするＤＮＡを得ることができる。
ｍＲＮＡの供給源はダニ虫体であり、好ましくは屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダニ等の虫体であるが、これらには限定されない。ｍＲＮＡの調製は、通常行われる手法により行うことができる。得られたｍＲＮＡを鋳型として、上記（１）により得られた配列情報に基づいてプライマーを設計し、ダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡ断片を合成する。得られた断片をｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）等の適当なベクターにサブクローニングし、常法により、例えばサイクルシークエンス法により塩基配列を決定する。
本発明のダニアレルゲンの部分アミノ酸配列を配列番号３から１９に示す。このうち、配列番号３から７に示される配列がｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより決定した配列であり、配列番号１９にＮ末端アミノ酸配列を示す。配列番号８から１８に示される配列がペプチドマッピングにより決定した配列である。
本発明は、ダニアレルゲンであるＺｅｎ１タンパク質の断片であって、配列番号３から１９に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つを含むアミノ酸配列からなるダニアレルゲンを含む。
配列番号１に本発明のダニアレルゲンであるＺｅｎ１タンパク質をコードするＺｅｎ１遺伝子のＤＮＡの部分塩基配列を、配列番号３４に全長塩基配列を示す。配列番号２に本発明のダニアレルゲンであるＺｅｎ１タンパク質の部分アミノ酸配列を、配列番号３５に全長アミノ酸配列を例示する。
これらのアミノ酸配列からなるタンパク質がダニアレルゲン活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号２または配列番号３５で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
このような配列番号２または配列番号３５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２または配列番号３５のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しているものが挙げられる。
このような配列番号２または配列番号３５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２または配列番号３５のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
また、上記配列番号１または配列番号３４に示すＤＮＡ配列を有する遺伝子と相補的な配列からなるＤＮＡと下記の条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであってダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。すなわち、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にＤＮＡを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％  フォルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ〕中で４２℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるＤＮＡである。
さらに、上記ＤＮＡに対するＲＮＡ、又は該ＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＲＮＡであってダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするＲＮＡも本発明に含まれる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤＮＡは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１１８  Ｎ（宝酒造社製）、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。
本発明の発現ベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく常法により行うことができる。例えば、ダニアレルゲンｃＤＮＡのＥｃｏＲＩで消化した断片を、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＩ部位に挿入することができる。また、該断片をプラスミドベクターｐＧＥＸ−４ＴのＥｃｏＲＩ部位に連結して発現ベクターを得ることができる。
本発明の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母又は動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌としては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が、動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヨトウガの卵巣細胞であるＳｆ  ２１細胞やＳｆ  ９細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
本発明の組換えダニアレルゲンには、直接発現に加えて、他のタンパク質との融合タンパク質として発現されたものも含まれ、以下、該融合タンパク質を融合組換えダニアレルゲンという。ここで、融合する他のタンパク質としては特に限定されないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質等が挙げられる。
本発明の組換えダニアレルゲンは、アレルゲン活性に必須な領域のみのペプチド断片であってもよく、また、アレルゲン活性に必須な領域からなるものであってもよい。また、ダニアレルゲンタンパク質のみを発現させて得られたものの他に、融合タンパク質として発現したものから他のタンパク質を脱離せしめて得られたものでもよい。
すなわち、本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質である。ここで、ダニアレルゲン活性を有するとは、哺乳動物に対してアレルギー反応を誘導し得ることをいう。
本発明のダニアレルゲンは、以下の方法により製造することができる。上記形質転換株の培養終了後、菌体を集菌し、種々のプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊する。細胞デブリスにある膜局在性のタンパク質をフェニルメタンスルフォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチンＡ、エチレンジアミン四酢酸等のプロテアーゼインヒビター及びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ４０等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得られたダニアレルゲン・グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、例えばグルタチオン固定化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー等で精製する。なお、グルタチオン固定化担体は、ファルマシア社製のものである。また、抗ダニ虫体抗体固定化担体は、活性化されたトレシル担体（例えば、トレシルＧＭゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨパール（東ソー社製）、トレシルセファロース（ファルマシア社製）等が用いられる）にウサギ抗ダニ虫体抗体を共有結合させたものである。また、ダニアレルゲンと６×Ｈｉｓ等のＨｉｓ  ｔａｇとの融合タンパクを得て、金属を固定化した固定化金属アフィニティービーズ等を用いて精製することもできる。
精製された融合組換えダニアレルゲンは、プロテアーゼで消化し、ＥＬＩＳＡ及びダニアレルギー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー，３７，７２５（１９８８））でモニター下に、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせて分画する。
本発明は、ダニアレルゲンを有効成分として含むダニアレルギー疾患治療剤をも包含する。該治療剤は、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により精製された組換えダニアレルゲンまたはその断片ペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として調製することができる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行うことができる。更に、例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて成人１回あたり約２０μｇ以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１から数回程度投与される。
また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製された組換えダニアレルゲンまたはその断片ペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられる。
また、ダニアレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば、組換えダニアレルゲンまたはその断片ペプチドをハンクス緩衝液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球から遊離するヒスタミン量をＨＰＬＣを用いて測定する〔アレルギー，３７，７２５（１９８８）〕。
このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量の５０％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することになる。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応させた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持つＩｇＧ抗体（遮断抗体）が存在するためである。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。アレルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギーの正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用である。
本発明は、本発明のダニアレルゲンまたはその断片ペプチドに対する抗体も包含する。該抗体は公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる。該抗体は、例えば屋内塵ダスト中のダニアレルゲンの有無等を測定するのに用いることができる。該測定は公知の免疫学的方法により行うことができ、例えばＥＬＩＳＡにより行うことができる。この際、屋内塵からタンパク質を抽出し、測定すればよい。
なお、本発明のダニアレルゲンの組換えタンパク質を発現させ、発現させた当該組換えタンパク質を用いてダニアレルギー患畜犬との特異ＩｇＥ反応、あるいは皮内反応などの試験を実施することにより、本発明のダニアレルゲンタンパク質がアレルゲンタンパクとしての機能を確定させることが出来る。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
尚、各実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク、和光純薬、シグマ、ディフコなどから購入した市販のものを使用した。また、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は宝酒造、東洋紡、インビトロジェン、などから購入し、販売者の指示に従って使用した。
【実施例１】  ＩｇＥ検出系の確立
イヌ高親和性ＩｇＥレセプターα鎖（ＦｃεＲＩα）ｃＤＮＡのシグナルペプチド部位を除いた細胞外領域を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位を付加したかたちでＰＣＲにて増幅し、大腸菌発現プラスミドベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１（アマシャムバイオサイエンス社製）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社製）に形質転換した。この形質転換株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地中、３７℃で一晩培養した後、少量を新たなＬＢ培地に継代し、６００ｎｍのＯＤが１．０になるまで培養した。ついで、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加した後３時間目に集菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。再度集菌した細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で超音波処理することにより溶解し、遠心により不溶画分を除去し、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したイヌＦｃεＲＩαを含む可溶性画分を回収した。次いで、この可溶化画分からグルタチオンセファロース４Ｂカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）によりＧＳＴと融合したイヌＦｃεＲＩαを得た。１０リットルの培養液から１．０ｍｇの融合タンパク質（ＧＳＴ−ＦｃεＲＩα）を得た。得られた精製ＧＳＴ−ＦｃεＲＩαはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４５ｋＤａの単一のバンドを呈することを確認した（図１）。イムノプレートに（ナルジェヌンク社製）リコンビナントイヌＩｇＥ（ＢＥＴＨＹＬ社製）と精製イヌＩｇＧを１．０μｇ、つぎに０．１μｇ、０．０５μｇ、０．０２５μｇ、０．０１２５μｇ、０．００６２５μｇと２倍階段希釈で固相化し、精製ＧＳＴ−ＦｃεＲＩαの反応性を確認したところ、ＩｇＥと反応しＩｇＧと反応しないことを確認した（図２）。イムノプレート（ナルジェヌンク社製）にコナヒョウヒダニ抽出抗原（ＧＲＥＥＲ社製）４．０μｇを固相化し、コナヒョウヒダニ陽性イヌ血清（コナヒョウヒダニ抗原液（ＧＲＥＥＲ社製）を生理食塩水にて５０倍に希釈したものを用いた皮内反応によりコナヒョウヒダニに陽性を呈したイヌ血清）を反応させ、ビオチン標識したＧＳＴ−ＦｃεＲＩαを加え、さらにペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）及び基質添加による発色反応によりＧＳＴ−ＦｃεＲＩα鎖がダニアレルゲン特異的ＩｇＥを認識することを確認した（図２）。さらにコナヒョウダニ抽出抗原（ＧＲＥＥＲ社製）４．０μｇをイムノプレート（ナルジェヌンク社製）に固相化し、コナヒョウダニ抽出抗原を免疫したイヌ血清を反応させた。本ＧＳＴ−ＦｃεＲＩαと５６℃にて１時間熱処理したコナヒョウヒダニ陽性イヌ血清とは反応しないこと、またイヌ精製ＩｇＧとは反応しないこと、そしてリコンビナントイヌＩｇＥ（ＢＥＴＨＹＬ社製）と反応が確認されることにより、本ＧＳＴ−ＦｃεＲＩαはアレルゲン特異的ＩｇＥを認識するものと考えられた（図３）。図３中「−」は５６℃にて１時間処理しないものを、「＋」は５６℃にて１時間処理したものを示し、「ｃｏｎｔ．」は、非免液血清を示す。
【実施例２】  ウエスタンブロッティングによるダニ主要アレルゲンの解析
アトピー性皮膚炎を発症し、コナヒョウヒダニアレルゲン抽出抗原液（ＧＲＥＥＲ社製）を用いた皮内反応及び実施例１にて確立したリコンビナントイヌＦｃεＲＩα鎖を用いたＥＬＩＳＡ法にてダニアレルギーと診断された８頭のイヌ血清及び血漿を用いてウエスタンブロット解析を実施した。コナヒョウヒダニ抽出抗原液１００．０μＬにβ−メルカプトエタノールを終濃度５０．０μＬ／ｍＬになるように添加したＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）２００μＬを加え、１００℃で５分間熱処理した後、ゲル濃度５〜２０％のポリアクリドアミドゲル（ＰＡＧＥＬ；ＡＴＴＯ社製）にアプライし、電気泳動を行った。電気泳動が終了した後、ＰＶＤＦメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ；アマシャムバイオサイエンス社製）にトランスファーし、メンブランをブロッキング液（５％スキムミルク添加ＰＢＳＴ（ＰＢＳに終濃度０．１％になるようにＴｗｅｅｎ２０を加えたもの））中で４℃にて一晩放置した。メンブランをＰＢＳＴで１０分間洗浄したのち、イヌ血清または血漿をブロッキング液で１０倍希釈しメンブランに添加し室温にて３時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を３回行った後、ビオチン標識したイヌＦｃεＲＩαをブロッキング液で希釈しメンブランに添加し室温にて２時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を３回行った後、ＰＢＳＴで１０，０００倍に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（アマシャムバイオサイエンス社製）をメンブランに添加し室温にて１時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を５回行った後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社製）反応液をメンブラン上に添加し５分間室温にて反応させた後、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ；アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてシグナルを検出した。その結果、分子量１５０ｋＤａから２５０ｋＤａの間に強く反応するタンパク質を検出した（図４）。図４中、矢印で示したバンドが分子量１５０ｋＤａから２５０ｋＤａの間の強く反応するタンパク質のバンドである。図４中、１から８までの数字は、８頭のイヌのそれぞれを示し、「ｃｔ．」は陰性血清を示す。
【実施例３】  ２次元電気泳動によるダニアレルゲンタンパク質の解析
分子量１５０ｋＤａから２５０ｋＤａの間のＩｇＥの強く反応するアレルゲンタンパク質の単離を２次元電気泳動にて実施した。２次元電気泳動はプロティアンＩＥＦセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて実施した。コナヒョウヒダニ抽出抗原（ＧＲＥＥＲ社製）１．０ｍｇを１．０ｍＬの膨潤バッファー（２−Ｄ  スターターキット；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に溶解した。溶解液３００μＬを１７ｃｍのＩＰＧ  Ｒｅａｄｙストリップゲル（ｐＨ４−７；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にフォーカシングトレイを用いてＡｃｔｉｖｅ条件（５０Ｖ，２０℃，１２時間）にて膨潤させた。膨潤後、以下の条件にてフォーカシングを行った。まず、ＳＴＥＰ１（２５０Ｖ，２０分，２０℃）にて過剰の塩類を除く操作を行い、ＳＴＥＰ２にて６時間かけて電圧を２５０Ｖから１０，０００Ｖまで上昇させた。ＳＴＥＰ３にて電圧１０，０００Ｖ、トータルボルトアワー値６０，０００ＶＨにてフォーカシングを行った。２次元目の電気泳動を行う前にＩＰＧ  ＲｅａｄｙストリップゲルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡化バッファーＩ（６Ｍ  尿素、０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、２％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて１０分間穏やかに振とうした。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ平衡化バッファーＩＩ（６Ｍ  尿素、０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、２％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、２．５％（ｗ／ｖ）ヨードアセテアミド；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にてさらに１０分間穏やかに振とうすることにより平衡化を行った。平衡化を行ったＩＰＧ  ＲｅａｄｙストリップゲルをＰＩＩレディーゲル（８−１６％；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の上に１％（ｖ／ｗ）ローメルトアガロース（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて密着させた。４０ｍＡ定電流（初期電圧値１３５Ｖ、最終電圧値４００Ｖ）でおよそ３時間電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをＢｉｏ−Ｓａｆｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて染色し、タンパク質スポットのパターン解析を行った（図５）。
【実施例４】  ウエスタンブロット解析によるアレルゲンスポットの同定
２次元電気泳動後、タンパク質スポットをＰＶＤＦメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ；アマシャムバイオサイエンス社製）にトランスファーし、メンブランをブロッキング液（５％スキムミルク添加ＰＢＳＴ（ＰＢＳに終濃度０．１％になるようにＴｗｅｅｎ２０を加えたもの））中で４℃にて一晩放置した。メンブランをＰＢＳＴで１０分間洗浄したのち、イヌ血清または血漿をブロッキング液で１０倍希釈しメンブランに添加し室温にて３時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を３回行った後、ビオチン標識したイヌＦｃεＲＩαをブロッキング液で希釈しメンブランに添加し室温にて２時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を３回行った後、ＰＢＳＴで１０，０００倍に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（アマシャムバイオサイエンス社製）をメンブランに添加し室温にて１時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を５回行った後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社製）反応液をメンブラン上に添加し５分間室温にて反応させた後、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ；アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてシグナルを検出した。その結果、分子量が１５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの間で、ｐＨがおよそ４．５に強く反応するスポットを検出し、本発明のアレルゲンタンパク質（Ｚｅｎ１）スポットを得た（図６）。図６中左上の図（６−１）は、コナヒョウダニの２次元電気泳動パターン（ｐＨ４〜７）を示し、右上の図（６−２）は、コナヒョウダニ陽性アトピー性皮膚炎発症イヌ患畜血清を用いたウエスタンブロット解析（ｐＨ４〜７）を示し、左下の図（６−３）は、コナヒョウダニの２次元電気泳動パターン（ｐＨ３．９〜５．１）を示し、右下の図（６−４）は、コナヒョウダニ陽性アトピー性皮膚炎発症イヌ患畜血清を用いたウエスタンブロット解析（ｐＨ３．９〜５．１）の反応スポット（図中上部に黒い円形のスポットとしてみえる矢印の部分）を２次元電気泳動パターンに照らし合わせたものである。矢印のスポットに強い反応が認められた。
【実施例５】  Ｚｅｎ１タンパク質のプロテオーム解析
２次元電気泳動により単離したＺｅｎ１タンパク質スポットをゲルより切り出し、ＭＳ／ＭＳ解析を行った。多くのＭＳ／ＭＳデータを得ることが出来たが、何もヒットしなかった。新規タンパク質であると考えられた５つのペプチドについてｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法を行いアミノ酸配列（配列番号３から７）を決定した（表１）。これらのアミノ酸配列に関し、ＢＬＡＳＴサーチを実施したが、明確なヒットは得られなかった。
【表１】
0004733022.tif 000002
【実施例６】  Ｚｅｎ１タンパク質のペプチドマッピング解析
２次元電気泳動により単離したＺｅｎ１タンパク質スポットをゲルより切り出し、ペプチドマップを作製し、８つのピークに対してアミノ酸シークエンスを実施した。その結果、１１のアミノ酸断片の配列（配列番号８から１８）を決定した（表２）。ＢＬＡＳＴサーチを実施したが、明確なヒットは得られなかった。
【表２】
0004733022.tif 000003
0004733022.tif 000004
【実施例７】Ｚｅｎ１タンパク質のＮ末端アミノ酸配列分析
２次元電気泳動により単離したＺｅｎ１タンパク質スポットをゲルより切り出し、ＨＰ  Ｇ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて定法によりＺｅｎ１タンパク質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１９）を決定した（表３）。この配列に関してＢＬＡＳＴサーチを実施したが、明確なヒットは得られなかった。
【表３】
0004733022.tif 000005
【実施例８】ダニ全ＲＮＡの抽出とダニポリ（Ａ）ｍＲＮＡの分離
常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得られる生ダニ虫体を飽和食塩水約２．０Ｌに入れ、良くかき回した後３０分間放置した。上清のダニ虫体を茶漉しを用いてすくい取り、生理食塩水を用いて洗浄した後乾燥させた。ダニ虫体１．０ｇをＦａｓｔＴｒａｃｋ  ２．０  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてそのマニュアルに従って全ＲＮＡの抽出とダニポリ（Ａ）ｍＲＮＡの分離を行った。
【実施例９】ダニｃＤＮＡの合成
実施例８にて分離したダニポリ（Ａ）ｍＲＮＡのうち１００ｎｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ−α−；ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてそのマニュアルに従って逆転写反応を行った。
【実施例１０】ＰＣＲによるＺｅｎ１遺伝子の増幅
Ｚｅｎ１タンパク質のＮ末端アミノ酸配列をもとにプライマーＮ−１（５’−ＧＡＹＧＡＹＧＴＮＴＴＲＡＡＲＣＡＲＡＣＮＧＡＲＧＡＲ−３’（配列番号２０）：Ｙ＝Ｃ  ｏｒ  Ｔ，Ｎ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ｔ，Ｒ＝Ａ  ｏｒ  Ｇ，）とＮ−２（５’−ＧＡＹ  ＧＡＹ  ＧＴＮ  ＣＴＮ  ＡＡＲ  ＣＡＲ  ＡＣＮ  ＧＡＲ  ＧＡＲ−３’（配列番号２１）：Ｙ＝Ｃ  ｏｒ  Ｔ，Ｎ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ｔ，Ｒ＝Ａ  ｏｒ  Ｇ，）を設計し、それぞれセンスプライマーとした。また、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法により得られたアミノ酸配列をもとに１２のプライマー（配列番号２２から３３）を設計し（表４）、それぞれリバースプライマーとした。実施例９にて合成したダニｃＤＮＡを鋳型とし、１．０μｇを使用しＥｘ  ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａバイオ社製）を用い、マニュアルに従ってサンプルを調整し、９４℃にて２分間熱変性処理した後、９４℃１分間、６５℃２分間、７２℃３分間を１サイクルとし、これを３５回行った後、７２℃９分反応後、４℃に保存するサイクルで行った。リバースプライマー４１５−４（５’−ＲＴＴＮＡＧＮＡＧＲＴＣＹＴＴＮＧＣＲＴＣＹＴＴ−３’（配列番号２５）：Ｎ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ｔ，Ｒ＝Ａ  ｏｒ  Ｇ，Ｙ＝Ｃ  ｏｒ  Ｔ，）を用いてＰＣＲを行った際におよそ１，０００ｂｐを、また４９１−２（５’−ＲＴＴ  ＲＴＣ  ＮＧＣ  ＮＡＧ  ＲＴＣ  ＹＴＴ  ＲＴＴ−３’（配列番号２９）：Ｎ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ｔ，Ｒ＝Ａ  ｏｒ  Ｇ，Ｙ＝Ｃ  ｏｒ  Ｔ，）を用いてＰＣＲを行った際におよそ８８０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【表４】
0004733022.tif 000006
0004733022.tif 000007
【実施例１１】  Ｚｅｎ１遺伝子のクローニング
実施例１０にてプライマーＮ−１と４１５−４を用いて増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルより回収し（ＴａＫａＲａ社製ＳＵＰＲＥＣ−０１）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のクローニングサイトにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、宿主大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｒｉｒｏｇｅｎ社製）を形質転換した。すなわち、大腸菌コンピテントセルとプラスミドを混和後、氷上で３０分、４２℃で３０秒、氷上で２分の温度処理を行い、ＳＯＣ培地（２％  Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に浮遊して３７℃で１時間インキュベートした。その後５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地上（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  ｔｒｙｐｔｏｎ、１％  ＮａＣｌ）に形質転換した大腸菌を３７℃、一晩培養後に大腸菌コロニーを得た。白色の挿入断片を含むと考えられるクローンを選択し、一晩５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地で培養後、プラスミドＤＮＡをＧＦＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により精製した。アマシャム社製のダイプライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）により塩基配列の解析を行った。なお、最終的な塩基配列の決定は、３クローンの塩基配列解析を行い、各クローンの塩基配列の完全一致をもって決定とした（図７−１および図７−２）。
【実施例１２】  Ｚｅｎ１遺伝子の解析
実施例１１にてクローニングしたＺｅｎ１遺伝子の遺伝子解析をＧｅｎｅｔｙｘ−ｗｉｎ  ｖｅｒ．６ソフトウェア（ソフトウェア開発社製）を用いて実施した。塩基数は１０２０ｂｐでアミノ酸残基は３４０であった（図７−１および図７−２、配列番号１および２）。本遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列に関してＢＬＡＳＴサーチを実施したが、明確なヒットは得られず、本Ｚｅｎ１遺伝子は新規のものと考えられた。
【実施例１３】  Ｚｅｎ１完全長ｃＤＮＡの単離
完全長のｃＤＮＡの単離はＲａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法を用いた。実施例８において使用したダニ虫体よりＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＡＣＥ用のテンプレートをマニュアルに従って作製した。また、実施例１２において得られたＺｅｎ１の部分配列をもとに５’及び３’末端を増幅するための１ｓｔ  ＰＣＲ及びＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーを合成した（表５）。５’及び３’末端の増幅反応は、上記において作製したＲＡＣＥ用のテンプレートを１．０μＬとり、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）Ｋｉｔに付属の５’及び３’用プライマーを各３．０μＬ、ｄＮＴＰミックス溶液（１０ｍＭ  ｅａｃｈ）を１．０μＬ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に付属の１０×ｃＤＮＡ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを５．０μｌ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを１．０μＬ、１０μＭに調整した上記において合成した１ｓｔ  ＰＣＲ用の遺伝子特異的プライマーを１．０μＬ加え、滅菌蒸留水にて５０．０μＬに調整した。遺伝子の増幅はＴｏｕｃｈｄｏｗｎ  ＰＣＲ法を用いた。調整したサンプル液を９４℃にて１分間熱変性処理した後、９４℃で３０秒間、７２℃で４分間を１サイクルとしたものを５回行い、つづいて９４℃で３０秒間、７０℃で４分間を１サイクルとしたものを５回行い、最後に９４℃で３０秒間、６８℃で４分間を１サイクルとしたものを２５回行った後、４℃に保存するサイクルで行った。１ｓｔ  ＰＣＲが終了した後、５’及び３’末端の増幅反応液からそれぞれ１．０ｍＬとり、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）Ｋｉｔに付属のＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用の５’及び３’用プライマーを各１．０μＬ、ｄＮＴＰミックス溶液（１０ｍＭ  ｅａｃｈ）を１．０μＬ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に付属の１０×ｃＤＮＡ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを５．０μｌ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを１．０μＬ、１０μＭに調整した上記において合成した１ｓｔ  ＰＣＲ用の遺伝子特異的プライマーを１．０μＬ加え、滅菌蒸留水にて５０．０μＬに調整した。遺伝子の増幅は上記のＴｏｕｃｈｄｏｗｎ  ＰＣＲ法を用いた。得られた５’及び３’末端の増幅断片を１．０％のアガロースゲルにて電気泳動により確認した後、これらを切り出して回収し（ＴａＫａＲａ社製ＳＵＰＲＥＣ−０１）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のクローニングサイトにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、宿主大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｒｉｒｏｇｅｎ社製）を形質転換した。すなわち、大腸菌コンピテントセルとプラスミドを混和後、氷上で３０分、４２℃で３０秒、氷上で２分の温度処理を行い、ＳＯＣ培地（２％  Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に浮遊して３７℃で１時間インキュベートした。その後５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地上（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  ｔｒｙｐｔｏｎ、１％  ＮａＣｌ）に形質転換した大腸菌を３７℃、一晩培養後に大腸菌コロニーを得た。白色の挿入断片を含むと考えられるクローンを選択し、一晩５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地で培養後、プラスミドＤＮＡをＧＦＸ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により精製した。アマシャム社製のダイプライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）により塩基配列の解析を行った。なお、最終的な塩基配列の決定は、３クローンの塩基配列解析を行い、各クローンの塩基配列の完全一致をもって決定とした。その結果、Ｚｅｎ１の５’及び３’末端の塩基配列を決定することが出来た（図８−１から図８−４、配列番号３４および３５）。
【表５】
0004733022.tif 000008
0004733022.tif 000009
【実施例１４】  リコンビナントＺｅｎ１の精製
実施例１３にて得られたＺｅｎ１のｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位を付加したかたちでＰＣＲにて増幅し、大腸菌発現プラスミドベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１（アマシャムバイオサイエンス社製）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社製に形質転換した。この形質転換株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地中、３７℃で一晩培養した後、少量を新たなＬＢ培地に継代し、６００ｎｍのＯＤが１．０になるまで培養した。ついで、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加した後３時間目に集菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。再度集菌した細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で超音波処理することにより溶解し、遠心により不溶画分を除去し、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したＺｅｎ１を含む可溶性画分を回収した。次いで、この可溶化画分からグルタチオンセファロース４Ｂカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）によりＧＳＴと融合したＺｅｎ１を得た。精製したＧＳＴと融合したＺｅｎ１を含む溶液にこの融合タンパク濃度のおよそ１／１００重量のＴｈｒｏｍｂｉｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）を加え、２２℃にて２０時間反応させることによりＧＳＴとＺｅｎ１とを切り離した。その後、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）によりＴｈｒｏｍｂｉｎを除去し、リコンビナントＺｅｎ１を精製した。得られた精製Ｚｅｎ１はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいておよそ６０ｋＤａの単一のバンドを呈することを確認した（図９）。
【実施例１５】  抗Ｚｅｎ１ポリクローナル抗体の作製とダニタンパク質との反応性の解析
実施例１４において精製したリコンビナントＺｅｎ１をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、メス、４週齢）６頭に１週間隔にて５回免疫し、その後これらのマウスから採血して血清を分離し、ＥＬＩＳＡにてＩｇＧ抗体の反応を解析した。ＥＬＩＳＡは、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）にリコンビナントＺｅｎ１  １．０μｇ及びコナヒョウヒダニ抽出抗原（ＧＲＥＥＲ社製）４．０μｇをそれぞれ固相化し、ブロッキング液（１０％  ＦＢＳ添加ＰＢＳに終濃度０．０５％になるようにＴｗｅｅｎ２０を加えたもの）にて３７℃で１時間ブロッキングした後、マウス血清をブロッキング液にて１０００倍に希釈したものを室温で１時間反応させた。イムノプレートを洗浄した後、ブロッキング液にて２０００倍希釈したＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗（ＺＹＭＥＤ社製）を反応させ、イムノプレートを洗浄した後、酵素基質溶液（ＡＢＴＳ液）１００μＬを各ウエルに添加、３７℃１０分間反応させた。酵素反応は各ウエルに１００μＬの０．３２％フッ化ナトリウム溶液を添加して停止させた。各ウエルの４１４ｎｍの吸光度をイムノリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）で測定した。本ＥＬＩＳＡにてＩｇＧが反応することを確認した上で、Ｚｅｎ１に対するポリクローナル抗体とした。
本ポリクローナル抗体のリコンビナントＺｅｎ１及びダニ虫体におけるマウスＩｇＧの反応性はウエスタンブロットにおいて解析した。５０μｇ／ｍＬに調整したリコンビナントＺｅｎ１タンパク液１００．０μＬとコナヒョウヒダニ抽出抗原液１００．０μＬにβ−メルカプトエタノールを終濃度５０．０μＬ／ｍＬになるように添加したＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）２００μＬを加え、１００℃で５分間熱処理した後、ゲル濃度５〜２０％のポリアクリドアミドゲル（ＰＡＧＥＬ；ＡＴＴＯ社製）にアプライし、電気泳動を行った。電気泳動が終了した後、ＰＶＤＦメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ；アマシャムバイオサイエンス社製）にトランスファーし、メンブランをブロッキング液（５％スキムミルク添加ＰＢＳＴ（ＰＢＳに終濃度０．１％になるようにＴｗｅｅｎ２０を加えたもの））中で４℃にて一晩放置した。メンブランをＰＢＳＴで１０分間洗浄したのち、ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＺＹＭＥＤ社製）をＰＢＳＴで２０，０００倍希釈しメンブランに添加し室温にて２時間反応させた。ＰＢＳＴで１０分間洗浄を５回行った後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社製）反応液をメンブラン上に添加し５分間室温にて反応させた後、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ；アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてシグナルを検出した。その結果、分子量およそ６０ｋＤａのリコンビナントＺｅｎ１に反応するシグナルと分子量１５０ｋＤａから２５０ｋＤａの間に反応する天然型のＺｅｎ１のシグナルを検出した（図１０）。このことにより、実施例１３において単離した完全長のＺｅｎ１  ｃＤＮＡは、ダニ虫体中の分子量が１５０ｋＤａから２５０ｋＤａの間のアレルゲンタンパク質をコードしているということを確認したこととなる。
【実施例１６】  リコンビナントＺｅｎ１のＩｇＥ反応性の解析
実施例１４において精製したリコンビナントＺｅｎ１のアレルゲン性の評価をＥＬＩＳＡにて実施した。イムノプレート（ナルジェヌンク社製）にリコンビナントＺｅｎ１  １．０μｇを固相化し、ブロッキング液（１０％  ＦＢＳ添加ＰＢＳに終濃度０．０５％になるようにＴｗｅｅｎ２０を加えたもの）にて３７℃で１時間ブロッキングした後、９頭のコナヒョウヒダニ陽性イヌ血清（コナヒョウヒダニ抗原液（ＧＲＥＥＲ社製）を生理食塩水にて５０倍に希釈したものを用いた皮内反応によりコナヒョウヒダニに陽性を呈したイヌ血清）と陰性コントロールイヌ血清を反応させ、ビオチン標識したＧＳＴ−ＦｃεＲＩαを加え、さらにペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）及び酵素基質溶液（ＡＢＴＳ液）添加による発色反応を行い、酵素反応を各ウエルあたり１００μＬの０．３２％フッ化ナトリウム溶液を添加することにより停止させた。各ウエルの４１４ｎｍの吸光度をイムノリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）で測定した。すなわち、この操作により皮内反応にてダニに陽性と確認されたイヌ９頭及び陰性イヌ（ｃｏｎｔｒｏｌ）の血清中のＩｇＥのリコンビナントＺｅｎ１に対する反応をリコンビナントイヌＦｃεＲＩαを用いたＥＬＩＳＡ系にて解析した。その結果、陰性イヌの値（点線）を上回る値が確認された。このことにより、リコンビナントＺｅｎ１がＩｇＥに反応するアレルゲンタンパク質であることを確認した（図１１）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供することが可能となった。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図１】
0004733022.tif 000010
【図２】
0004733022.tif 000011
【図３】
0004733022.tif 000012
【図４】
0004733022.tif 000013
【図５】
0004733022.tif 000014
【図６】
0004733022.tif 000015
【図７−１】
0004733022.tif 000016
【図７−２】
0004733022.tif 000017
【図８−１】
0004733022.tif 000018
【図８−２】
0004733022.tif 000019
【図８−３】
0004733022.tif 000020
【図８−４】
0004733022.tif 000021
【図９】
0004733022.tif 000022
【図１０】
0004733022.tif 000023
【図１１】
0004733022.tif 000024
【配列表】
0004733022000001.xml