(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の茶発酵液を含有することを特徴とする茶−発酵飲料。
【請求項２】
更に茶抽出液を含む請求項１に記載の茶−発酵飲料。
【請求項３】
乳酸菌を、粘膜免疫賦活作用を発揮する有効量含有する請求項１または２に記載の茶−発酵飲料。
【請求項４】
乳酸菌を、ＩｇＡ産生亢進作用を発揮する有効量含有する請求項１または２に記載の茶−発酵飲料。
【請求項５】
乳酸菌を、茶−発酵飲料中に１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ含有する請求項１〜４のいずれかに記載の茶−発酵飲料。
【請求項６】
乳酸菌を、茶−発酵飲料中に１０5ｃｆｕ／ｍＬ〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ含有する請求項１〜５のいずれかに記載の茶−発酵飲料。
【請求項７】
ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌および茶抽出液を含有することを特徴とする茶飲料。
【請求項８】
乳酸菌を、粘膜免疫賦活作用を発揮する有効量含有する請求項７に記載の茶飲料。
【請求項９】
乳酸菌を、ＩｇＡ産生亢進作用を発揮する有効量含有する請求項７に記載の茶飲料。
【請求項１０】
乳酸菌を、茶飲料中に１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ含有する請求項７〜９のいずれかに記載の茶飲料。
【請求項１１】
乳酸菌を、茶飲料中に１０5ｃｆｕ／ｍＬ〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ含有する請求項７〜１０のいずれかに記載の茶飲料。
【請求項１２】
茶含有培地でラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を培養する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の茶−発酵飲料の製造方法。
【請求項１３】
茶−発酵飲料の乳酸菌含有量を、１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬに調整する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
茶含有培地が、茶由来のブリックス度０．１０〜０．５０の茶抽出液であり且つ培養が、２５℃〜５０℃の温度で１２時間〜３２時間を要して行われる請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
茶含有培地が、茶由来のブリックス度０．１８〜０．３０の茶抽出液であり且つ培養が、３０℃〜４０℃の温度で１５時間〜２０時間を要して行われる請求項１２〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の茶−発酵飲料の製造方法であって、下記の工程：
（１）茶含有培地でラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を培 養して茶発酵液を得る工程、
および、
（２）上記（１）の工程によって得られた茶発酵液に茶抽出液を添加する工程、
を含む方法。
【請求項１７】
（２）の工程において、茶抽出液を、最終的な茶−発酵飲料の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０となり、且つ乳酸菌含有量が１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬとなるように茶発酵液に添加する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７〜１１のいずれかに記載の茶飲料の製法であって、ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌と茶抽出液とを混合する工程を含む茶飲料の製造方法。
【請求項１９】
茶抽出液を、最終的な茶飲料の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０となり、且つ乳酸菌含有量が１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬとなるように乳酸菌と混合する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
粘膜免疫賦活作用を有する茶−発酵飲料の製造のための、ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。
【請求項２１】
ＩｇＡ産生亢進作用を有する茶−発酵飲料の製造のための、ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。
【請求項２２】
粘膜免疫賦活作用を有する茶飲料の製造のための、ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。
【請求項２３】
ＩｇＡ産生亢進作用を有する茶飲料の製造のための、ラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス  プランタラム (Lactobacillus plantarum) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶−発酵飲料および茶飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、以下の事項が知られている。【０００３】
（１）伝統的に茶葉を発酵させることは知られており、碁石茶、プーアル茶、ミアン茶などの発酵茶が知られている。【０００４】
（２）茶葉から茶葉中で増殖し得るラクトバチルス属プランタラム種菌（乳酸菌）を分離して液体培地で培養し、茶葉を熱湯に浸漬した後放冷し、この放冷物に前記培養菌を接種して所定期間発酵させてなる緑茶発酵物が知られている（特許文献１）。【０００５】
（３）酵母及び細菌を用いて、茶またはコーヒーから、簡単な製造条件および比較的短い製造時間で大量の醗酵飲料を製造する方法が知られている（特許文献２）。【０００６】
（４）粘膜免疫は、粘膜上に病原体が付着した際の最初に行われる感染防御機構である（非特許文献１）。【０００７】
（５）粘液中の分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）は、バクテリア、ウイルスなどの病原体に対する防御作用を示す（非特許文献２および３）とともに、微生物の産生する毒素を中和する役割も担っている（非特許文献４）。
【特許文献１】特許２８７６００６号
【特許文献２】特開平９−２２００５４号
【非特許文献１】Brandtzaeg, P. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146:13 1989
【非特許文献２】Czinn, S, J. et al., Vaccine 11:637 1993
【非特許文献３】Renegar, K. et al., J. Immunol. 146:1972 1991
【非特許文献４】Brandtzaeg, P APMIS 103:1 1995; Kilian, M. et al Microbiol. Rev. 52:296 1988
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はラクトバチルス属プランタラム種菌（乳酸菌）を用いて発酵させた茶、もしくは該菌を添加した茶であって、従来知られていない高いＩｇＡ産生亢進作用を有する飲料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、先に優れた粘膜免疫賦活作用、生体防御機構向上作用などを奏し得、プロバイオティックスとして、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)に係る発明を特許出願した（特願２００３−２９７５７０号、ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２１３６）。
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、先に見出した乳酸菌は、これを茶抽出液に配合する場合に、お茶本来の風味などに悪影響を与えず、しかも上記乳酸菌の有する優れたＩｇＡ産生亢進作用または粘膜免疫賦活作用は保持されるという事実を見出した。また、該乳酸菌は茶抽出液中でも発酵（培養、増殖）容易であり、しかも、かくして得られる茶−発酵飲料は、お茶本来の風味などに悪影響を受けておらず、該乳酸菌に由来する優れたＩｇＡ産生亢進作用または粘膜免疫賦活作用を奏し得るという事実を見出した。本発明は、これらの知見を基礎として更に研究を重ねた結果、完成されたものである。
【００１１】
本発明は、下記項１〜２３に記載の要旨の発明を提供する。【００１２】
項１．ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の茶発酵液を含有することを特徴とする茶−発酵飲料。【００１３】
項２．更に茶抽出液を含む項１に記載の茶−発酵飲料。【００１４】
項３．乳酸菌を、粘膜免疫賦活作用を発揮する有効量含有する項１または項２に記載の茶−発酵飲料。【００１５】
項４．乳酸菌を、ＩｇＡ産生亢進作用を発揮する有効量含有する項１または項２に記載の茶−発酵飲料。【００１６】
項５．乳酸菌を、茶−発酵飲料中に１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ含有する項１または項２に記載の茶−発酵飲料。【００１７】
項６．乳酸菌を、茶−発酵飲料中に１０5ｃｆｕ／ｍＬ〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ含有する項１または項２に記載の茶−発酵飲料。【００１８】
項７．ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌および茶抽出液を含有することを特徴とする茶飲料。【００１９】
項８．乳酸菌を、粘膜免疫賦活作用を発揮する有効量含有する項７に記載の茶飲料。  【００２０】
項９．乳酸菌を、ＩｇＡ産生亢進作用を発揮する有効量含有する項７に記載の茶飲料。【００２１】
項１０．乳酸菌を、茶飲料中に１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ含有する項７に記載の茶飲料。【００２２】
項１１．乳酸菌を、茶飲料中に１０5ｃｆｕ／ｍＬ〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ含有する項７に記載の茶飲料。【００２３】
項１２．茶含有培地でラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を培養する工程を含む、項１に記載の茶−発酵飲料の製造方法。【００２４】
項１３．茶−発酵飲料の乳酸菌含有量を、１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬに調整する工程を更に含む、項１２に記載の方法。【００２５】
項１４．茶含有培地が、任意成分を含んでいてもよい、茶由来のブリックス度０．１０〜０．５０の茶抽出液であり且つ培養が、２５℃〜５０℃の温度で１２時間〜３２時間を要して行われる項１２または項１３に記載の製造方法。【００２６】
項１５．茶含有培地が、任意成分を含んでいてもよい、茶由来のブリックス度０．１８〜０．３０の茶抽出液であり且つ培養が、３０℃〜４０℃の温度で１５時間〜２０時間を要して行われる項１２または項１３に記載の製造方法。【００２７】
項１６．項２に記載の茶−発酵飲料の製造方法であって、下記の工程：
（１）茶含有培地でラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌を培養して茶発酵液を得る工程、
および、
（２）上記（１）の工程によって得られた茶発酵液に茶抽出液を添加する工程、
を含む方法。【００２８】
項１７．(２)の工程において、茶抽出液を、最終的な茶−発酵飲料の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０となり、且つ乳酸菌含有量が１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬとなるように茶発酵液に添加する、項１６に記載の方法。【００２９】
項１８．項７に記載の茶飲料の製法であって、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌と茶抽出液とを混合する工程を含む茶飲料の製造方法。【００３０】
項１９．茶抽出液を、最終的な茶飲料の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０となり、且つ乳酸菌含有量が１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬとなるように乳酸菌と混合する、項１８に記載の方法。【００３１】
項２０．粘膜免疫賦活作用を有する茶−発酵飲料の製造のための、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。【００３２】
項２１．ＩｇＡ産生亢進作用を有する茶−発酵飲料の製造のための、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。【００３３】
項２２．粘膜免疫賦活作用を有する茶飲料の製造のための、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。【００３４】
項２３．ＩｇＡ産生亢進作用を有する茶飲料の製造のための、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用。【００３５】
本発明の茶−発酵飲料および茶飲料は、従来のお茶の味を大切に温存させたものである。特に、本発明の茶−発酵飲料は発酵させているにも拘わらず、発酵臭および従来の発酵茶などに特有の味を有しないかもしくは軽微にしたものである。本発明の茶−発酵飲料および茶飲料は、ＩｇＡ産生亢進作用および粘膜免疫賦活作用を奏し得ることを特徴としている。【００３６】
以下、本発明の茶−発酵飲料および茶飲料に利用する特定の乳酸菌につき詳述し、次いで、本発明の茶−発酵飲料および茶飲料につき詳述する。【００３７】
乳酸菌
本発明の茶−発酵飲料および茶飲料に利用する乳酸菌は、それぞれ、ラクトバチルス (Lactobacillus) ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス (Lactobacillus) ONRIC b0240 (FERM BP-10065)と命名される(以下、両者を、「ＯＮＲＩＣ乳酸菌」と総称する場合がある。)。
【００３８】
（１）スクリーニング
（１−１）起源微生物
起源微生物としては、ヒト腸内容物、植物性食品および動物性食品から分離され、大塚製薬株式会社大津栄養製品研究所で保存している乳酸菌を利用する。【００３９】
（１−２）スクリーニング方法
目的とする乳酸菌のスクリーニングは、マウスパイエル板細胞培養系を用いて、ＩｇＡ産生誘導能を指標として実施する。該ＩｇＡ産生能の試験方法の詳細は、後記試験例１に示すとおりである。【００４０】
（２）スクリーニングされた微生物
（２−１）ラクトバチルス ONRIC b0239
（ａ）肉眼的特徴
（ａ−１）ＭＲＳ寒天培地
円形からやや不規則、半球形、平滑、乳白色
（ａ−２）ＢＬ寒天培地
円形からやや不規則、半球形、平滑、白褐色
（ｂ）顕微鏡的特徴
桿菌で運動性を持たない。芽胞は形成しない。【００４１】
（ｃ）生育温度
３０〜３３℃で良好に発育する。【００４２】
（ｄ）生理学的、生化学的特徴
グラム染色性：陽性
0004832425.tif 000002
0004832425.tif 000003
以上の諸性質から、バージィーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)に照らし、本菌株をLactobacillus plantarumに属する菌株と同定し、Lactobacillus ONRIC b0239と命名し、平成１５年８月６日に、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６に住所を有する独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(AIST)に寄託番号FERM P-19469として寄託した。該微生物は、現在、国際寄託に移管されており、その国際寄託番号はFERM BP-10064である。【００４３】
（２−２）ラクトバチルス ONRIC b0240
（ａ）肉眼的特徴
（ａ−１）ＭＲＳ寒天培地
円形からやや不規則、半球形、平滑、乳白色
（ａ−２）ＢＬ寒天培地
円形からやや不規則、半球形、平滑、白褐色
（ｂ）顕微鏡的特徴
桿菌で運動性を持たない。芽胞は形成しない。【００４４】
（ｃ）生育温度
３０〜３３℃で良好に発育する。【００４５】
（ｄ）生理学的、生化学的特徴
グラム染色性：陽性
0004832425.tif 000004
0004832425.tif 000005
以上の諸性質から、バージィーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)に照らし、本菌株をLactobacillus plantarumに属する菌株と同定し、Lactobacillus ONRIC b0240と命名し、平成１５年８月６日に、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６に住所を有する独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(AIST)に寄託番号FERM P-19470として寄託した。該微生物は、現在、国際寄託に移管されており、その国際寄託番号はFERM BP-10065である。【００４６】
ＯＮＲＩＣ乳酸菌に認められる特有の粘膜免疫賦活作用およびこれに寄与するＩｇＡ産生亢進作用は、次のように考えられている。即ち、まず腸管免疫系を構成するパイエル板のＭ細胞が管腔にある抗原を取り込む。該抗原は樹状細胞などの抗原提示細胞によってＣＤ４  Ｔ細胞に提示される。抗原特異的なＴ細胞の作用により、未熟なＢ細胞が成熟しつつ粘膜固有層に移動して最終的にＩｇＡ抗体産生細胞に分化する。このＩｇＡ産生亢進機構にＯＮＲＩＣ乳酸菌がどのように関与するかについては現在なお明確ではないが、少なくともＯＮＲＩＣ乳酸菌の存在によってＩｇＡ産生亢進がなされるためにはパイエル板のＭ細胞が抗原を取り込む必要があることから、ＯＮＲＩＣ乳酸菌はこの抗原としての機能を果たし得るものであると考えられる。この抗原としての機能を果たすという面からは、ＯＮＲＩＣ乳酸菌は、特に生菌である必要はなく、通常の一般的加熱滅菌操作によって滅菌されたものであってもよい。【００４７】
茶−発酵飲料
本発明の茶−発酵飲料は、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌(ＯＮＲＩＣ乳酸菌)の茶発酵液をその必須成分として含有することを特徴とする。必須成分としての茶発酵液は、茶を含有する培地でＯＮＲＩＣ乳酸菌を培養することにより調製される。本発明の茶発酵液には、培養後のＯＮＲＩＣ乳酸菌を含む。本発明において、ＯＮＲＩＣ乳酸菌を含む培養後の茶含有培地は、そのまま本発明の茶発酵液とすることができる。【００４８】
本明細書において、茶含有培地とは、適当な溶媒（好ましくは水または湯）に茶葉および／またはその粉砕物（粉末など）を含むものであっても、茶葉および／またはその粉砕物を、適当な溶媒（好ましくは水または湯）で抽出して得られる茶抽出液であってもよく、また、該茶抽出液を噴霧乾燥手段などにより粉末化して得られる粉末(粉末エキス)を、適当な溶媒（好ましくは水または湯）に含むものであってもよい。これらの培地の原料として利用することができる茶（茶葉、Tea Sinensis）には、例えば、煎茶、玉露、棒茶、粉茶、番茶、ほうじ茶、玄米茶、抹茶などに分類される各種の緑茶類を代表として、他に、紅茶、烏龍茶、黒茶（プーアル茶、ミアン茶、碁石茶など）や、それら以外の植物からの茶様飲料であるハーブティー、ルイボス茶、甜茶、甘茶などが含まれる。これらは、一種単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。【００４９】
このような茶として具体的には、例えば、鉄観音茶、色種茶、水仙茶、黄金桂茶、煎茶、かぶせ茶などを挙げることができる。【００５０】
茶含有培地として、上記各種の茶葉および／またはその粉砕物を含む水または湯などを用いる場合、培地中に含まれる茶葉および／またはその粉砕物の量は、特に限定されるものではないが、一般には最終的な培地における茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０、好ましくは０．１８〜０．３０となるような範囲から選択することができる。【００５１】
「ブリックス度」とは、一般に溶液１００ｇあたりの可溶性固形物重量（ｇ）を表し、示差濃度計（例えば、デジタル示差濃度計  ＤＤ−５：株式会社アタゴ製）、屈折計などにより計測される。ブリックス度は、溶液中に複数の可溶性固形物が溶解している場合、それらの合計値として測定されるが、本明細書において、「茶由来のブリックス度」とは、茶由来の可溶性固形物の濃度に基づいて測定されるブリックス度を表す。即ち、「茶由来のブリックス度」は、茶含有培地、茶抽出液、最終的な飲料などの溶液１００ｇあたりに含まれる茶由来の可溶性固形物重量（ｇ）を表す。【００５２】
茶含有培地として、上記各種の茶葉および／またはその粉砕物の抽出液を用いる場合は、一般的に飲用されるお茶と同様に、これらの茶葉などを水または湯で抽出したものを用いることができる。該抽出液の濃度は特に限定されるものではないが、通常、茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０、好ましくは０．１８〜０．３０となる範囲から選択される。【００５３】
また、茶を含有する培地として、上記各種の茶葉を原料とする粉末エキスを含む水または湯などを用いる場合、粉末エキスとして具体的には、例えば、ＦＤ緑茶エキスパウダー、ＦＤジャスミン茶エキスパウダー、ＦＤ烏龍茶エキスパウダー（以上、三栄源社）、麦茶エキストラクトパウダー、紅茶エキストラクトパウダー、緑茶エキストラクトパウダー（以上、高砂香料工業株式会社）などをあげることができる。これらの粉末エキスは、一般にこれらのうちの一種単独もしくは二種以上を水または湯に溶解した水溶液の形態で培地として利用することができる。これらの粉末エキスの水または湯への添加量は、特に限定されるものではないが、通常、得られる水溶液の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０、好ましくは０．１８〜０．３０の範囲となる量から選択される。【００５４】
本発明の茶発酵液は、例えば、上記茶を含有する培地にＯＮＲＩＣ乳酸菌を１０4〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ（培地）となるように接種し、２５〜５０℃の温度で、１２時間〜３２時間培養することにより得ることができる。【００５５】
ここで、ＯＮＲＩＣ乳酸菌の培養（発酵）は、予め適当な発酵用培地に該乳酸菌を接種して培養したスターターを利用する方法によるのが好ましい。ここでスターターとしては、例えば代表的には予め９０〜１２１℃、５〜２０分間通常の殺菌処理を行った発酵用培地、例えばＭＲＳ培地、１０％脱脂粉乳培地などに、凍結保存菌体、凍結乾燥菌体などの形態のＯＮＲＩＣ乳酸菌を接種して培養したものを挙げることができる。このようにして得られるスターターは、通常、ＯＮＲＩＣ乳酸菌を１０4〜１０7ｃｆｕ／ｇ培養物程度含んでいるのが好ましい。【００５６】
スターターとして用いられる発酵用培地には、必要に応じてＯＮＲＩＣ乳酸菌の良好な生育を行うための発酵促進物質、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えることができる。【００５７】
スターターの調製および茶発酵液の調製におけるＯＮＲＩＣ乳酸菌の培養条件は、一般に、発酵温度２５〜５０℃程度、好ましくは３０〜４０℃程度、発酵時間１２〜３２時間程度、好ましく１５時間〜２０時間程度から選ばれる。特に好ましい培養条件としては、３３℃、１６時間をあげることができる。【００５８】
ＯＮＲＩＣ乳酸菌の培養（発酵）の際には、更に必要に応じて、茶含有培地中に、該乳酸菌の維持、増殖などに適した栄養成分などの任意成分を適量含有させることもできる。該栄養成分の具体例としては、各微生物の培養のための培養培地に利用される例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、例えばペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類、微量金属元素、その他の栄養成分などの各成分を挙げることができる。ビタミン類としては、例えばビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどを例示できる。微量金属元素としては、例えば亜鉛、セレンなどを例示できる。その他の栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などの各種オリゴ糖を例示できる。これらのオリゴ糖の配合量は、特に限定されるものではないが、通常、得られる茶発酵液中に３重量％程度以下となる量範囲から選ばれるのが好ましい。【００５９】
かくして得られる茶発酵液は、そのまま本発明の茶−発酵飲料とすることができ、また、該茶発酵液を凍結乾燥などして得られる粉末エキスを水などに溶解して本発明の茶−発酵飲料とすることもできる。さらに、上記の如くして得られる茶発酵液を濃縮、または水などで希釈して本発明の茶−発酵飲料としてもよく、茶発酵液にさらに茶抽出液を加えて本発明の茶−発酵飲料としてもよい。ここで、茶発酵液に添加される茶抽出液は、上記の茶含有培地として使用される茶葉および／またはその粉砕物を適当な溶媒(好ましくは水または湯)で抽出して得られる茶抽出液と同様であり、また、該茶抽出液を噴霧乾燥手段などにより粉末化して得られる粉末(粉末エキス)を、水または湯などに溶解したものを用いることもでき、その濃度は特に制限されない。【００６０】
本発明茶−発酵飲料中のＯＮＲＩＣ乳酸菌の含有量は、茶発酵液を利用する場合もその凍結乾燥品などを利用する場合もいずれも、一般には、１０4〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ前後、好ましくは１０5〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ前後となる量から適宜選択することができる。該乳酸菌の含有量は、茶含有培地の培養条件、菌の接種量などを変えることによって調整してもよく、茶発酵液を濃縮または希釈することにより調整してもよい。また、茶発酵液の粉末エキスを用いる場合には、該粉末エキスの添加量を変えることによってＯＮＲＩＣ乳酸菌の含有量を調整してもよい。【００６１】
茶発酵液に茶抽出液を加えて本発明の茶−発酵飲料とする場合、両者の配合割合は、例えば、両者を混合して得られる本発明茶−発酵飲料が、該乳酸菌を１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは１０5ｃｆｕ／ｍＬ〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ含み且つ該茶−発酵飲料の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０、好ましくは０．１８〜０．３０の範囲となるように適宜決定することができるが、これに限定されない。【００６２】
ここで、ｃｆｕ（コロニー形成単位）は下記方法により計測された生菌数で示されるものであって、実際に飲料中にこの数の生菌が含まれることを意味するものではない。即ち、本発明飲料は、一般には通常の加熱手段などによって殺菌されて製品とされるものであるため、該製品中には生菌は存在しない場合がある。そのような場合でも、該製品は殺菌前に計測された生菌数に相当する死菌が含まれており、本発明所期の効果を奏し得る。本明細書において、このような殺菌処理などを施された飲料についての菌数は、殺菌処理などを施す前に計測した生菌数にて示すものとする。【００６３】
＜乳酸菌数の計測＞
生菌数の測定は、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地を用いて３３℃下で混釈培養を行い、生育したコロニー数を計測することにより求められる。この生菌数と濁度とは相関するため、予め生菌数と濁度との相関を求めておくと、生菌数の測定に代えて濁度を測定することによって上記生菌数を計数できる。【００６４】
本発明茶−発酵飲料中へのＯＮＲＩＣ乳酸菌の配合量は、上記菌数を目安として、調製される飲料の種類、利用する乳酸菌の種類などに応じて適宜変更することができる。【００６５】
本発明茶−発酵飲料には、更に必要に応じて、通常の飲食品と同様に、適当な可食性担体（食品素材）を添加することができる。【００６６】
かくして、本発明の茶−発酵飲料を得ることができる。本発明の茶−発酵飲料は、最終的に適当な容器に無菌的に充填して飲料製品とすることができる。この製品は、お茶本来の風味を有しているのに加えて、含有するＯＮＲＩＣ乳酸菌に由来する特有の粘膜免疫賦活作用またはＩｇＡ産生亢進作用を有している。【００６７】
本発明茶−発酵飲料の摂取量は、これを摂取する生体の年齢、性別、体重、疾患の程度などに応じて適宜決定され、特に限定されるものではないが、一般には、該飲料中に含まれるＯＮＲＩＣ乳酸菌数に換算して、１日ヒト１人当たりの乳酸菌摂取量（菌数）が約１０6〜１０10ｃｆｕとなる範囲から選ばれるのがよい。従って、本発明茶−発酵飲料の摂取量はまた、該飲料中の菌数に応じて適宜選択され得るが、一般には約５０〜１０００ｍＬの範囲から選択されるのが好ましい。【００６８】
本発明はまた、粘膜免疫賦活作用またはＩｇＡ産生亢進作用を有する茶−発酵飲料の製造のための、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用をも提供する。【００６９】
茶飲料
本発明は、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌（ＯＮＲＩＣ乳酸菌）を含む茶飲料をも提供する。この茶飲料は、該乳酸菌と茶抽出液とを必須成分として含有する。【００７０】
ここで、利用されるＯＮＲＩＣ乳酸菌は、前述した本発明茶−発酵飲料の調製に利用される茶発酵液から単離して得られる菌体またはその凍結乾燥品などであってもよい。また、本発明の茶飲料に利用される乳酸菌は、ＯＮＲＩＣ乳酸菌を、茶を含有しない適当な培地で培養して得られる、該乳酸菌を含む培養液の形態であってもよく、また、該培養液から単離して得られる菌体またはその凍結乾燥品などの形態であってもよい。【００７１】
茶を含有しない培地としては、前述したＭＲＳ培地、１０％脱脂粉乳培地などの、通常の乳酸菌の培養に用いられることの知られている栄養培地の他、例えば野菜類、果実類、豆乳（大豆乳化液）などを発酵用原料物質として含む液をあげることができる。【００７２】
本発明茶飲料の製造に利用される乳酸菌は、これらの液中でＯＮＲＩＣ乳酸菌を培養して得られる発酵液（培養液）の形態であってもよく、該発酵液を利用して得られる粗精製品、精製品、これらの凍結乾燥粉末などであってもよい。【００７３】
発酵用原料物質として利用される野菜類および果実類には、各種野菜および果実の切断物、破砕物、磨砕物、搾汁、酵素処理物、それらの希釈物および濃縮物が含まれる。野菜類には、例えばカボチャ、ニンジン、トマト、ピーマン、セロリ、ホウレンソウ、有色サツマイモ、コーン、ビート、ケール、パセリ、キャベツ、ブロッコリーなどが含まれる。果実類には、例えばリンゴ、モモ、バナナ、イチゴ、ブドウ、スイカ、オレンジ、ミカンなどが含まれる。【００７４】
野菜または果実の切断物、破砕物または磨砕物は、例えば上記野菜類または果実類を洗浄後、必要に応じて熱湯に入れるなどのブランチング処理した後、クラッシャー、ミキサー、フードプロセッサー、パルパーフィッシャー、マイコロイダー(MycolloiderTM, 特殊機化工業社製)などを用いて切断、破砕、磨砕することによって得ることができる。搾汁は、例えばフィルタープレス、ジューサーミキサーなどを用いて調製することができる。また上記磨砕物を濾布などを用いて濾過することによっても搾汁を調製することができる。酵素処理物は、上記切断物、破砕物、磨砕物、搾汁などにセルラーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチン分解酵素などを作用させることによって調製できる。希釈物には水で１〜５０倍に希釈したものが含まれる。濃縮物には、例えば凍結濃縮、減圧濃縮などの手段によって１〜１００倍に濃縮したものが含まれる。【００７５】
発酵用原料物質の他の具体例である豆乳は、常法に従い、大豆原料から調製することができる。該豆乳には、例えば、脱皮大豆を水に浸漬後、コロイドミルなどの適当な粉砕機を用いて湿式粉砕処理後、常法に従いホモジナイズ処理した均質化液、水溶性大豆蛋白質を水中に溶解した溶解液なども包含される。【００７６】
乳酸菌を利用した発酵は、予めスターターを用意し、これを前記各種の発酵用原料物質に接種して発酵させる方法が好ましい。ここでスターターとしては、例えば代表的には予め９０〜１２１℃、５〜２０分間通常の殺菌処理を行った発酵用原料物質を添加した１０％脱脂粉乳培地などに、ＯＮＲＩＣ乳酸菌を接種して培養したものを挙げることができる。このようにして得られるスターターは、通常、ＯＮＲＩＣ乳酸菌を１０7〜１０9ｃｆｕ／ｇ培養物程度含んでいる。【００７７】
スターターに用いる発酵用原料物質には、必要に応じてＯＮＲＩＣ乳酸菌の良好な生育のための発酵促進物質、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えることができる。【００７８】
培養条件は、一般に、発酵温度２０〜４５℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度、発酵時間１０〜３０時間程度から選ばれる。【００７９】
また、本発明茶飲料の他方の必須成分である茶抽出液については、前記本発明茶−発酵飲料において茶発酵液に添加される茶抽出液についてと同様である。【００８０】
ＯＮＲＩＣ乳酸菌と茶抽出液との配合割合は、例えば、両者を混合して得られる本発明茶飲料が、該乳酸菌を１０4ｃｆｕ／ｍＬ〜１０8ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは１０5ｃｆｕ／ｍＬ〜１０7ｃｆｕ／ｍＬ含み且つ該茶飲料の茶由来のブリックス度が０．１０〜０．５０、好ましくは０．１８〜０．３０の範囲となるように適宜決定することができるが、これに限定されない。【００８１】
かくして、本発明の茶飲料を得ることができる。本発明の茶飲料は、最終的に適当な容器に無菌的に充填して飲料製品とすることができる。この製品は、お茶本来の風味を有しているのに加えて、ＯＮＲＩＣ乳酸菌に由来する粘膜免疫賦活作用またはＩｇＡ産生亢進作用を有している。【００８２】
本発明茶飲料の摂取量は、これを摂取する生体の年齢、性別、体重、疾患の程度などに応じて適宜決定され、特に限定されるものではないが、一般には、該飲料中に含まれるＯＮＲＩＣ乳酸菌数に換算して、１日ヒト１人あたり乳酸菌数が約１０6〜１０10ｃｆｕとなる範囲から選ばれるのがよい。従って、本発明茶飲料の摂取量はまた、該飲料中の菌数に応じて適宜選択され得るが、一般には約５０〜１０００ｍＬの範囲から選択されるのが好ましい。【００８３】
本発明はまた、粘膜免疫賦活作用またはＩｇＡ産生亢進作用を有する茶飲料の製造のための、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌の使用をも提供する。
【発明の効果】
【００８４】
本発明によれば、お茶本来の風味などに悪影響を与えず、優れたＩｇＡ産生亢進作用または粘膜免疫賦活作用を有する茶−発酵飲料または茶飲料が提供される。これらの摂取によれば、その優れたＩｇＡ産生亢進作用または粘膜免疫賦活作用に基づいて、生体防御作用を強化できると考えられる。【００８５】
本発明の茶−発酵飲料または茶飲料は、原料として用いる茶葉の種類や、茶発酵液、茶抽出液などの配合を変化させることによって、例えば、軽い香りと爽やかな酸味、軽い香りとキレのある味、濃褐色を呈しマイルドな味などを付与し得、お茶本来の飽きのこない味、香りなどを有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ラクトバチルス ONRIC b0240の投与が、パイエル板細胞からのＩｇＡ産生に及ぼす結果を示すグラフである。
【図２】ラクトバチルス ONRIC b0240の投与がＩｇＧ産生に及ぼす影響を明らかにするグラフである。
【図３】ラクトバチルス ONRIC b0240死菌（２×１０9ｃｆｕ相当）摂取２１日後のヒト唾液中総Ｓ−ＩｇＡ量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明の茶−発酵飲料および茶飲料の製造方法を実施例としてあげ、次いで本発明の茶−発酵飲料および茶飲料に利用する特定の乳酸菌につき行った試験例をあげるが、本発明は、これらの例に限定されるものではない。【００８８】
各例中、％は特記しない限り重量％を示す。
【実施例１】
【００８９】
茶−発酵飲料の製造方法１
（１）凍結保存菌体の製造
前前培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＭＲＳ液体培地（Difco製）１０ｍＬに、−８０℃で凍結保存したラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)を解凍して１００μＬ加え、このものを３３℃で１６時間静置培養することにより、本菌株の前前培養液（菌数：約１０9ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【００９０】
前培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＭＲＳ液体培地（Difco製）１０ｍＬに、前記で調製した前前培養液１００μＬを接種し、３３℃にて１６時間静置培養することにより、本菌株の前培養液（菌数：約１０9ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【００９１】
本培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＭＲＳ液体培地（Difco製）１Ｌに、前記で調製した前培養液１０ｍＬを接種し、３３℃にて１６時間静置培養することにより、本菌株の本培養液（菌数：約１０9ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【００９２】
集菌・洗浄
本培養液１Ｌを１１０００回転／分にて１０分間遠心分離して菌体を回収し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。さらに遠心分離にて菌体を回収し、再度滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、遠心分離にて菌体を回収した。緑茶エキスパウダー（三栄源社）２ｇを脱イオン水１０００ｇで溶解後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した液に上記で回収した菌体を懸濁させ、懸濁液を‐８０℃で保存した。かくして得られた凍結保存菌の菌数は、１．６×１０9ｃｆｕ／ｍＬであった。【００９３】
（２）茶−発酵飲料の製造
緑茶エキスパウダー（三栄源社）３．４ｇを脱イオン水２０００ｇ中に添加後、６０℃に加温し、同温度で１０分間攪拌してエキスを溶解させた。得られた溶液を室温まで冷却し、滅菌済み試薬瓶に２０００ｍＬ移した。この溶液の茶由来のブリックス度は０．３２であった。【００９４】
凍結保存したラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)１．６×１０9ｃｆｕ／ｍＬの２００μＬを前記試薬瓶中に接種し、菌接種後の試薬瓶内容物を３３℃で１６時間保温して静置培養することにより、緑茶発酵液を調製した。このものの乳酸菌量は１０7ｃｆｕ／ｍＬであった。【００９５】
一方、ウーロン茶（三井農林社）２０ｇに、９３℃の脱イオン水１０００ｍＬを加え、６分間隔でスタート時、中間および終了時の３回攪拌した。得られた茶葉を含む液を、ステンレスフィルターで濾過後、濾液を氷浴上で３０℃以下に冷却した。冷却後の濾液を脱イオン水で２０００ｍＬに希釈した。得られた茶抽出液の茶由来のブリックス度は０．２４であった。【００９６】
このウーロン茶（茶抽出液）１０００ｍＬに前記で調製した緑茶醗酵液１０００ｍＬを混合し、混合物に更にビタミンＣ５００ｍｇ／Ｌを添加した。得られた混合液を加熱殺菌し、適当な容器に充填して、本発明の茶−発酵飲料を調製した。【００９７】
得られた本発明の茶−発酵飲料は、軽い香りと爽やかな酸味を有するものであった。そのｐＨは５．２であり、含まれる本発明の乳酸菌数は５．２×１０6ｃｆｕ／ｍＬであった。【００９８】
上記で得られた本発明の茶−発酵飲料は、後述する試験例に示すような試験において、優れたＩｇＡ産生促進活性及び粘膜免疫賦活活性を有すると認められた。
【実施例２】
【００９９】
茶−発酵飲料の製造方法２
（１）凍結乾燥菌体の製造
前前培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＭＲＳ液体培地（Difco製）１０ｍＬに、−８０℃で凍結保存したラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)を解凍して１００μＬ加え、このものを３３℃で１６時間静置培養することにより、本菌株の前前培養液（菌数：約１０9ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【０１００】
前培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＭＲＳ液体培地（Difco製）１０ｍＬに、前記で調製した前前培養液１００μＬを接種し、３３℃にて１６時間静置培養することにより、本菌株の前培養液（菌数：約１０9ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【０１０１】
本培養
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＭＲＳ液体培地（Difco製）１Ｌに、前記で調製した前培養液１０ｍＬを接種し、３３℃にて１６時間静置培養することにより、本菌株の本培養液（菌数：約１０9ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【０１０２】
集菌・洗浄
本培養液１Ｌを１１０００回転／分にて１０分間遠心分離して菌体を回収し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。さらに遠心分離にて菌体を回収し、再度滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、遠心分離にて菌体を回収した。緑茶エキスパウダー（三栄源社）２０ｇを脱イオン水１０００ｇで溶解後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した液に上記で回収した菌体を懸濁させ、懸濁液を凍結乾燥した。かくして得られた凍結乾燥菌体粉末中の菌数は、３．７×１０9ｃｆｕ／ｇであった。【０１０３】
（２）茶−発酵飲料の製造
緑茶エキスパウダー（三栄源社）４ｇを脱イオン水２０００ｇ中に添加後、６０℃に加温し、同温度で１０分間攪拌してエキスを溶解させた。得られた溶液を室温まで冷却し、滅菌済み試薬瓶に２０００ｍＬ移した。この液の茶由来のブリックス度は０．３６であった。【０１０４】
凍結乾燥したラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)３．７×１０9ｃｆｕ／ｇの２５ｍｇを前記試薬瓶中に接種し、試薬瓶内容物を３３℃で１６時間保温して、菌を静置培養した。（想定初期菌数５×１０4ｃｆｕ／ｍＬ）。【０１０５】
かくして得られた培養液１０００ｍＬに、ビタミンＣ５００ｍｇを添加した後、得られた混合液を加熱殺菌し、適当な容器に充填して、本発明の茶−発酵飲料を調製した。【０１０６】
（３）茶−発酵飲料の品質評価
得られた茶−発酵飲料は、以下の物性を有するものであった。
＜凍結乾燥菌を用いて得られた本発明の発酵茶＞
ｐＨ：４．７５
菌数：４．１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ（乳等省令（食品衛生法）乳酸菌数の測定法による）
濁度：０．０３８（分光光度計Ｕ−３０００、日立）
乳酸含量：１４．８ｍｇ／１００ｍＬ（高速液体クロマトグラフィ、日本分光）
酢酸含量：０．６ｍｇ／１００ｍＬ（高速液体クロマトグラフィ、日本分光）
クエン酸含量：１．２ｍｇ／１００ｍＬ（高速液体クロマトグラフィ、日本分光）
茶由来のブリックス度：０．２４（デジタル示差濃度計ＤＤ−５（株式会社アタゴ製）
官能評価：茶の風味があり、酸味が感じられる（供試茶を４℃で試飲させて評価）
上記で得られた本発明茶−発酵飲料は、後述する試験例に示すような試験において、優れたＩｇＡ産生促進活性及び粘膜免疫賦活活性を有すると認められた。
【実施例３】
【０１０７】
茶飲料の製造方法１
ウーロン茶（三井農林社）４０ｇに、９３℃の脱イオン水１０００ｍＬを加え、６分間でスタート時、中間および終了時の３回攪拌した。得られた茶葉を含む液を、ステンレスフィルターで濾過後、濾液を氷浴上で３０℃以下に冷却した。得られた茶抽出液の茶由来のブリックス度は０．９６であった。【０１０８】
一方、予め、人参果汁１５％を含む水溶液１０００ｍＬに、ラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM P-10065)の凍結保存菌（実施例１−（１）で調製したもの）１ｍＬを接種し、３３℃で２４時間培養後、培養液を遠心分離して６０℃、１０分間以上で殺菌した後、濃縮菌液（菌体含量：約１０10ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。【０１０９】
前記ウーロン茶濾液（茶抽出液）１０００ｍＬに、上記ラクトバチルス ONRIC b0240の濃縮菌液４ｍＬを添加し、得られた混合液中にビタミンＣ５００ｍｇ／Ｌを添加して、更に水で全量を４０００ｍＬに希釈し、得られた希釈液を適当な容器に充填して、本発明茶飲料製品を調製した。【０１１０】
かくして得られた本発明茶飲料は、軽い香りとキレのある味であった。そのｐＨは５．５であり、菌数は２．６×１０7ｃｆｕ／ｍＬであった。【０１１１】
上記で得られた本発明茶飲料は、後述する試験例に示すような試験において、優れたＩｇＡ産生促進活性及び粘膜免疫賦活活性を有すると認められた。
【実施例４】
【０１１２】
茶飲料の製造方法２
実施例３において、原料として利用したウーロン茶に代えてプーアル茶（三井農林社）（得られた茶抽出液の茶由来のブリックス度は０．６４である）を用い、ラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM P-10065)に代えてラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM P-10064)（実施例１−（１）と同様にして調製した凍結保存菌体）を用い、同様にして、本発明茶飲料製品を調製した。【０１１３】
得られた本発明の茶飲料は、濃褐色を呈しており、マイルドな味で、独特の香りがあった。そのｐＨは５．５であり、菌数は２．６×１０7ｃｆｕ／ｍＬであった。【０１１４】
上記で得られた本発明茶飲料は、後述する試験例に示すような試験において、優れたＩｇＡ産生促進活性及び粘膜免疫賦活活性を有すると認められた。
【実施例５】
【０１１５】
茶−発酵飲料の製造方法３
実施例２において、ラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM P-10065)に代えてラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM P-10064)を用いて、同様にして、本発明茶−発酵飲料を調製した。【０１１６】
得られた本発明茶−発酵飲料は、茶の風味があり、酸味があった。そのｐＨは５．０であり、菌数は４．０×１０6ｃｆｕ／ｍＬであった。【０１１７】
上記で得られた本発明茶−発酵飲料は、後述する試験例に示すような試験において、優れたＩｇＡ産生促進活性及び粘膜免疫賦活活性を有すると認められた。
【実施例６】
【０１１８】
茶−発酵飲料の製造方法４
実施例１において、原料として利用した緑茶エキスパウダーに代えて紅茶抽出エキスパウダーを用い、ウーロン茶に代えて紅茶を用い、ラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM P-10065) に代えてラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM P-10064)（凍結保存菌体）を用いて、同様にして、本発明の茶−発酵飲料を調製した。【０１１９】
得られた本発明の茶−発酵飲料は、紅茶の味を保持したものであった。そのｐＨは５．８であり、菌数は１．２×１０7ｃｆｕ／ｍＬであった。【０１２０】
上記で得られた本発明の茶−発酵飲料は、後述する試験例に示すような試験において、優れたＩｇＡ産生促進活性及び粘膜免疫賦活活性を有すると認められた。【０１２１】
試験例１
この例は、ＯＮＲＩＣ乳酸菌のＩｇＡ産生誘導能を、YasuiらおよびIkenagaらに記載の方法〔Yasui, H., et al., Microbial Ecology in Health and Disease, 5, 155 (1992); Ikenaga, T., et al., Milk Science, 51, 27 (2002)〕に従ってパイエル板細胞培養系を用いてin vitroで試験した例であり、次の通り実施された。【０１２２】
（１）供試動物
近交系雌性マウスSPF/VAF BALB/c AnNCrjを使用した。【０１２３】
試験マウスを入荷後、1週間検疫した。検疫期間中はMF固形飼料(オリエンタル酵母社製)および水道水を自由摂取させた。【０１２４】
（２）パイエル板細胞培養法
検疫終了後、各群の体重が均等になるように８０匹のマウスを１０匹ずつ群分けした。群分け後、毎日１０匹のマウスを屠殺し、小腸を取り出し、小腸からパイエル板を切り出し、ＭＥＭ培地[イーグルＭＥＭ (NISSUI社製)、2mM グルタミン (GIBCO社製)、1mM ピルビン酸ナトリウム (GIBCO社製)、ＭＥＭ非必須アミノ酸 (GIBCO社製)]を添加した遠沈管中で氷冷した。メッシュを用いて単一細胞懸濁液を調製し、５ｍＬのＭＥＭ培地でよく洗い込んだ。細胞懸濁液を濾過し、４℃下、１０００回転／分、１０分間遠心処理を行った。遠心後、培養上清を吸引除去し、沈殿を５ｍＬのＭＥＭ培地に懸濁させた。同様の操作を２回繰り返した後、沈殿を１０ｍＬの５％ＦＢＳ(GIBCO社製)含有ＭＥＭ培地に懸濁させ、パイエル板細胞の生細胞数を計数し、細胞浮遊液を９６ウエル細胞培養用プレートに播いて細胞培養用プレートを調製した。【０１２５】
（３）供試菌体の調製
供試菌体として、ラクトバチルス ONRIC b0239 (FERM BP-10064)およびラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)を利用した。各菌は、それぞれその培養に適した培地にて定常期まで培養後、遠心して菌体を集菌した（７０００ｇ×１０分間、４℃）。ＰＢＳ（−）にて３回洗浄後、菌体を５ｍＬの生理食塩水に懸濁させた。菌数を把握するため６６０ｎｍにて濁度を測定し、その後、オートクレーブにて１００℃で３０分間加熱滅菌処理した。６６０ｎｍにおける濁度が１．０のとき菌数を２．０×１０9／ｍＬとした。【０１２６】
（４）培養上清中のＩｇＡ濃度の測定
上記（２）で調製したパイエル板細胞を５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁させて、２．５×１０6細胞／ｍＬに調整し、その２００μＬを９６ウエル細胞培養用プレートに入れた。このプレートの各ウエルに２．０×１０9／ｍＬの供試菌体懸濁液（前記（３）で調製したもの）を２０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で７日間培養した。【０１２７】
上記菌体２０μＬに代えて、５０μｇ／ｍＬのＬＰＳ(リポポリサッカライド)を２０μＬ添加したものを陽性対照とした。【０１２８】
次いで、得られた各培養物上清の総ＩｇＡ濃度を市販キットを用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１２９】
（５）ＯＮＲＩＣ乳酸菌のＩｇＡ産生促進活性
前記（４）に従って測定されたＯＮＲＩＣ乳酸菌における総ＩｇＡ量を、対照としてのＭＥＭ培地にＰＢＳ（−）  １０μＬを添加して（菌体無添加）同様にして７日間培養して得た培養物上清の同測定値を基準（１．０）として、その相対比(Stimulation Index; S.I.)にて、下記表１に示す。【０１３０】
また、下記表１〜表４には、既知の各種乳酸菌などについて行った同一試験の結果を併記する。また陽性対照（ＬＰＳ  ５０μｇ／ｍＬ）における試験結果を「陽性対照」として併記する。表中、Strain No.に示される微生物保存機関の略号と名称は、それぞれ以下の通りである。【０１３１】
ATCC: アメリカンタイプカルチャーコレクション (American Type Culture Collection; Manassas, VA, U.S.A.)
JCM: 理化学研究所微生物系統保存施設 (Japan Collection of Microorganism, The Institute of Physical and Chemical Research, RIKEN)
NRIC: 東京農業大学応用生物化学部菌株保存室 (NODAI Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture; Setagaya-ku, Tokyo, Japan)【０１３２】
【表１】
0004832425.tif 000006
【０１３３】
【表２】
0004832425.tif 000007
【０１３４】
【表３】
0004832425.tif 000008
【０１３５】
【表４】
0004832425.tif 000009
【０１３６】
表１〜４に示されるとおり、対照（ＰＢＳ）のＩｇＡ産生を１とした場合、陽性対照の平均Ｓ．Ｉ．は、１３．１を示し、ＩｇＡ産生を強く誘導していることが判った。よって本培養系はパイエル板細胞からのＩｇＡ産生を評価する上で有用であると判断した。【０１３７】
各種乳酸菌によるＩｇＡ産生誘導能を見ると、Ｓ．Ｉ．は、ラクトバチルス ONRIC b0239が５．６１、ラクトバチルス ONRIC b0240が６．３１であり、他の菌株の０．８〜１．４に比べて突出して高いＩｇＡ産生誘導能を有することが判った。【０１３８】
ＩｇＡは病原微生物の粘膜からの侵入阻止、ウイルス・毒素の中和、食物アレルゲンの侵入阻止などの働きをしており、このような機能を有するＩｇＡの産生を高めておくことは生体防御の上で重要である。【０１３９】
試験例２
この例は、ラクトバチルス ONRIC b0240 (FERM BP-10065)のＩｇＡ産生誘導能をin vivoで試験したものであり、次の通り実施された。【０１４０】
（１）供試動物およびその飼育
８週齢BALB/c雄性マウス５０匹を入荷後、１週間検疫した。検疫期間中および引き続く試験期間中、実験動物にはＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母社製）および水道水を自由摂取させた。【０１４１】
検疫終了後、各実験動物を生理食塩水投与群（１５匹）、ラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）投与群（１５匹）およびラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）投与群（１５匹）に群分けた。【０１４２】
（２）経口投与用ラクトバチルス ONRIC b0240の調製
経口投与用のラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）およびラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）は、それぞれ以下の方法により調製した。【０１４３】
生菌：
ラクトバチルス ONRIC b0240をＭＲＳ培地にて定常期まで培養した後、遠心（３５００回転／分×１０分、４℃）にて集菌した。生理食塩水にて２回遠心洗浄後、菌体を生理食塩水に懸濁して、４×１０9ｃｆｕ／ｍＬに調整した。【０１４４】
死菌
上記で得た生菌懸濁液を、オートクレーブ（１２１℃、１５分加熱）処理後、洗浄用ソニケーター(BRANSON 2510)で４５分間超音波処理を行った。【０１４５】
（３）試験方法
上記（２）で調製したラクトバチルス ONRIC b0240（生菌および死菌）のそれぞれを、試験開始より７日間（５匹）、１４日間（５匹）または２１日間（５匹）に亘って、ラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）投与群（５＋５＋５＝１５匹）およびラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）投与群（５＋５＋５＝１５匹）の各群マウスに、毎朝、経口投与（１０9ＣＦＵ／２５０μＬ／匹／日）した。各投与期間終了後に、各群マウスを断頭屠殺してチューブに採血し、４℃下、３０００回転／分、１０分間遠心分離して血清を調製した。また、以下の方法によりパイエル板細胞を調製した。即ち、各群マウスを屠殺後、小腸を摘出し、眼科用ハサミで小腸からパイエル板を切り出し、不完全培地(incomplete medium; 10mg ゲンタマイシン添加RPMI1640培地)を添加した２４ウェルマイクロプレートに入れて氷冷した。メッシュを用いて単一細胞懸濁液を調製し、５ｍＬの不完全培地で良く洗った。得られた細胞浮遊液を濾過し、４℃下、１０００回転／分で１０分間遠心分離処理した。遠心分離処理後、培養上清を吸引除去し、沈殿を５ｍＬの不完全培地に懸濁させた。上記洗浄、濾過、遠心分離、培養上清の吸引除去操作を、更に１回繰り返した後、得られた沈殿をパイエル板細胞とした。【０１４６】
また、コントロールとしての生理食塩水投与群（１５匹）のマウスは、ラクトバチルス ONRIC b0240（生菌および死菌）を与えることなく飼育し、同様に試験開始より７日間（５匹）、１４日間（５匹）および２１日間（５匹）後に、血清およびパイエル板細胞を調製した。【０１４７】
ＩｇＡ産生試験
調製した各パイエル板細胞（沈殿）を、０．５ｍＬの完全培地(２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭメルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地)に懸濁させて、細胞濃度を２×１０6細胞／ｍＬに調整し、生細胞数をカウント後、細胞浮遊液を１００μＬずつ９６ウエル細胞培養用プレートの各ウエルに播種した。【０１４８】
パイエル板細胞が産生するＩｇＡ量は、パイエル板細胞をそのまま培養し、産生されるＩｇＡ量を調べる方法と、この培養系に更にパイエル板細胞刺激物質としてラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）を添加して培養し、産生されるＩｇＡ量を調べる方法との２つの方法により検討した。後者の方法は、実際の生体内におけるパイエル板細胞の環境に近いものと想定される。即ち、この試験でラクトバチルス ONRIC b0240（生菌または死菌）を経口投与する場合は、摂取された乳酸菌は何らかの形でパイエル板細胞に刺激を与えることが予想される。【０１４９】
パイエル板細胞刺激物質としてのラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）は、下記方法に従って調製した。【０１５０】
パイエル板細胞刺激用ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）
前記で調製した経口投与用のラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）の懸濁液を、更にリン酸バッファーで菌数が１０7ｃｆｕ／ｍＬ（６６０ｎｍでの濁度０．２７５）となるように希釈し、得られた菌体懸濁液を、オートクレーブ（１２１℃、１５分加熱）処理後、洗浄用ソニケーター(BRANSON 2510)で４５分間超音波処理した。【０１５１】
パイエル板細胞刺激物質を利用する方法は、パイエル板細胞刺激用ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）１０μＬを各ウエルに添加し、さらにＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０を１００μＬ各ウエルに添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で７日間パイエル板細胞を培養した。パイエル板細胞刺激物質を利用しない方法では、上記ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）の代わりに１０μＬの生理食塩水を各ウエルに添加して、以下同様の操作によってパイエル板細胞を培養した。【０１５２】
（４）測定
細胞培養液から遠心分離にて培養上清を回収し、該培養上清中に分泌される総ＩｇＡ濃度の測定に供するまで−８０℃で凍結保存した。【０１５３】
上記培養上清中の総ＩｇＡ濃度の測定および血清中の総ＩｇＧ濃度の測定は、いずれも市販のキットを用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１５４】
（５）結果
結果を図１（ＩｇＡ濃度）および図２（ＩｇＧ濃度）に示す。【０１５５】
図１は、培養上清中のＩｇＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す棒グラフである。図中、白抜き棒は、コントロールとしての生理食塩水投与群（「生理食塩水」と表示）の結果である。網掛け棒は、ラクトバチルス ONRIC b0240 (生菌)投与群（「b0240生菌」と表示）の結果である。黒塗り棒は、ラクトバチルス ONRIC b0240 (死菌)投与群（「b0240死菌」と表示）の結果である。無刺激は、各群マウス由来のパイエル板細胞の培養系にラクトバチルス ONRIC b0240 (死菌)を添加することなく培養した場合を示す。菌体刺激は、各群マウス由来のパイエル板細胞の培養系にラクトバチルス ONRIC b0240 (死菌)を添加して該菌の刺激下に培養した場合を示す。各結果は、各群供試マウス５匹について得られた結果を平均±標準偏差(Mean±SD)で表示する。各結果の上に表示したＰ値は、スチューデンツｔ−テスト(Student t-test)におけるコントロールに対する危険率を示す。【０１５６】
該図に示される結果から、次のことが明らかである。【０１５７】
（１）７日間投与の場合：
菌体刺激の場合、ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）投与群は、生理食塩水投与のコントロールよりも有意に高値を示した（Ｐ＝０．０１０）。【０１５８】
（２）１４日間投与の場合：
無刺激の場合、ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）投与群（無刺激の黒塗り棒参照）は、コントロール（生理食塩水投与後無刺激）よりも、有意に高値を示した（Ｐ＝０．０４８）。【０１５９】
また、菌体刺激を行った場合は、ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）を投与した群およびラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）を投与した群のいずれも、コントロール（生理食塩水投与）に比して有意に高値を示した（それぞれｐ＝０．０３４およびｐ＝０．００２）。【０１６０】
（３）２１日間投与の場合：
無刺激の場合、ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）を投与した群は、コントロール群よりも有意に高値を示した（Ｐ＝０．０４７）。【０１６１】
また、菌体刺激を行った場合、ラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）投与群およびラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）投与群は、コントロール群よりもいずれも有意に高値を示した（それぞれｐ＝０．０１５およびｐ＝０．００５）。【０１６２】
図２は、ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）の２１日間投与がＩｇＧ産生に及ぼす影響を明らかにする棒グラフであり、縦軸は血清ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。【０１６３】
該図に示される結果から、ラクトバチルス ONRIC b0240（死菌）の投与は、コントロール（生理食塩水投与）に比して有意に高い血清ＩｇＧ濃度を示すことが判る（ｐ＝０．００６４）。またラクトバチルス ONRIC b0240（生菌）の投与も、コントロール（生理食塩水投与）に比して、高い血清ＩｇＧ濃度を示すことが判る。【０１６４】
以上の結果より、ラクトバチルス ONRIC b0240は、パイエル板に存在する免疫担当細胞あるいは腸管上皮細胞とその周辺の免疫担当細胞を刺激することで粘膜免疫応答を誘導し、最終的にパイエル板細胞からの総ＩｇＡ産生を高めたものと推定される。また、ラクトバチルス ONRIC b0240の投与は、ＩｇＡのみならず血清中のＩｇＧも高めることが判った。【０１６５】
これらのことから、ＯＮＲＩＣ乳酸菌の摂取は、粘膜免疫のみならず全身免疫も賦活し、これらの２段構えで生体の免疫応答を賦活し、体の内と外から生体を防御する可能性が示唆される。このような作用が生菌のみならず死菌においても認められることから、ＯＮＲＩＣ乳酸菌は、経口ワクチン的なプロバイオティクスの新たな活用法として期待できるものと考えられる。【０１６６】
試験例３
この試験はＯＮＲＩＣ乳酸菌の摂取がインフルエンザ下気道感染の防御に有効であることを明らかにするものである。【０１６７】
本発明者らは、ＯＮＲＩＣ乳酸菌のＩｇＡを介した感染防御効果を明らかにするため、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）を下気道にまで到達させる下気道感染モデルマウスを用いて、ラクトバチルス ONRIC b0240を利用して調製した発酵物の摂取による感染防御効果を、感染後の生存日数を指標として検討した。本試験は以下の通り実施された。【０１６８】
(1)供試動物
日本チャールス・リバー株式会社より入荷した近交系雌性SPF/VA/VAF マウス(系統名：BALB/c AnNCrj)(5週齢)を４日間、以下の条件で検疫後、体重による群分け（蒸留水群、牛乳群およびラクトバチルス ONRIC b0240含有発酵乳群）を行った。
餌／給餌法：MF固形飼料(オリエンタル酵母株式会社)／自由摂取
水／給水法：水道水／給水瓶による自由摂取
環境：温度：２３±２°Ｃ、湿度：６０±１０％
照明時間：明期  ７：００〜１９：００、暗期  １９：００〜７：００
（２）試験方法
各群マウス（ｎ＝４５）に、ＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母社製）と共に、被験物（（１）蒸留水、（２）牛乳または（３）ラクトバチルス ONRIC b0240含有発酵乳）を、２週間摂取させた。【０１６９】
被験物としての牛乳は、ＬＬ牛乳（大阿蘇牛乳：らくのうマザーズ社製）を蒸留水で７５％に希釈して利用した。被験物としてのラクトバチルス ONRIC b0240含有発酵乳は、予め１０％スキムミルク水溶液に懸濁させ−８０℃で凍結保存しておいたラクトバチルス ONRIC b0240 をスターターとして、牛乳１Ｌに該スターター（生菌数１０8ｃｆｕ）を加え、３３℃で１６時間発酵させたものである。該ラクトバチルス ONRIC b0240含有発酵物の菌体含量は５×１０7ｃｆｕ／ｍＬである。これを蒸留水で７５％に希釈して試験に利用した。【０１７０】
被験物は給水瓶による自由摂取とし、摂取量は摂取前後の被験物の重量減少量とした。【０１７１】
摂取開始２週間後に、各群マウスをケタラ−ル（塩酸ケタミン）により麻酔後、その一方の鼻腔にＩＦＶ液５０μＬを経鼻接種（１０、１０2または１０3ｐｆｕ／５０μＬ  ＰＢＳ／匹、それぞれの濃度におけるｎ＝１５）して、ＩＦＶをマウスに感染させた。その後、各群実験動物の生死を毎日観察した。被験物は感染後から死亡を確認するまで与え続けた。【０１７２】
使用ＩＦＶ株としては、大塚製薬株式会社微生物研究所に保存されているIFV: A/PR/8/34/H1N1株を用いた。該株を０．１％ＢＳＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＭＥＭ培地に懸濁させ、次いでＰＢＳ（＋）を用いてウイルス含量が１０〜１０3ｐｆｕ／５０μＬとなるように希釈し、ＩＦＶの接種用ウイルス液を調製した。なお、ＰＢＳ（＋）はＰＢＳ（−）粉末（コージンバイオ社製）９．５５ｇ、ＣａＣｌ2（無水）１００．００ｍｇおよびＭｇＣｌ2（無水）４６．９０ｍｇを蒸留水に溶解して１０００ｍＬとして調製した。【０１７３】
（３）結果
各群マウスの生存日数を、ＩＦＶ経鼻摂取後、毎日朝（８：３０〜９：００）および夕方（１７：３０〜１８：００）の二回、確認した。【０１７４】
その結果、蒸留水を摂取させたコントロール群および牛乳を摂取させた対照群では、接種ウイルス量を１０2ｐｆｕ／匹とした場合、いずれも７日目までに全例が死亡した。接種ウイルス量を１０3ｐｆｕ／匹とした場合、いずれも６日目夕方までに全例が死亡した。これに対して、ラクトバチルス ONRIC b0240含有発酵乳を摂取させた群では、コントロール群に対して、実験動物の生存日数を延長する傾向が認められた。【０１７５】
また、接種ウイルス量を１０ｐｆｕ／匹とした場合、全ての群において１４日目で７０％以上が生存しており、ラクトバチルス ONRIC b0240含有発酵乳を摂取させた群では、８６．７％が生存しており、コントロール群のそれ（８０％）に対して、生存率を延長させる傾向が認められた。【０１７６】
また、各群マウスの体重を被験物摂取開始から感染日までは２日毎に、感染後は毎朝（８：３０〜９：００）、電子天秤を用いて測定した。なお、測定は各測定日において生存していたマウスについて行い、得られた値は全測定値の平均値で示した。【０１７７】
その結果、全ての群において、２日目から若干の体重減少が認められた。体重変化の推移は、各群において同様であり、差は認められなかった。【０１７８】
（４）考察
本試験の結果および前記試験例１および２に示される試験の結果から、総合的に判断して、ＯＮＲＩＣ乳酸菌およびこれを含む発酵物は、ＩＦＶ感染に対して感染防御効果を奏し得ると考えられる。【０１７９】
本発明は、免疫賦活作用およびＩｇＡ産生促進作用を有するＯＮＲＩＣ乳酸菌を含む茶−発酵飲料および茶飲料を提供するものであり、これらはその摂取によって病原微生物などの粘膜からの侵入を阻止する生体防御効果を奏することが期待できる。【０１８０】
試験例４
この試験はＯＮＲＩＣ乳酸菌死菌の摂取がインフルエンザ下気道感染の防御に有効であることを明らかにするものである。【０１８１】
（１）被験物質
ラクトバチルス ONRIC b0240死菌を被験物質として用いた。【０１８２】
（２）供試動物
日本エスエルシー株式会社より入荷した雌性BALB/c/Cr Slc（ＳＰＦ）マウス（５週齢）を７日間、以下の条件で検疫後、群分けを行った。
餌／給餌法：固形飼料  ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業株式会社）／自由摂取
水／給水法：１２３〜１２４℃、１００分間高圧蒸気滅菌済み水道水／給水瓶による自由摂取
環境：温度：２３±２℃、湿度：５５±１５％、換気：１５回／時間
照明時間：明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００。【０１８３】
（３）ウイルスの調製
超低温冷凍庫に凍結乾燥保存してあるインフルエンザウイルスＡ型（ＩＦＶＡ：ＰＲ８株）を細胞増殖用培地中（１０％ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭ(Gibco)）でＭＤＣＫ細胞（イヌ腎細胞；RCB0995株）にM.O.I.(Multiplicity of infection)＝０．０１で感染させ、３７℃、５％ＣＯ2存在下で７２時間培養した（１継代）。連続して５代継代したものを大量培養し、蔗糖密度勾配超高速遠心法によりウイルス液を分離・精製し、１ｍＬずつ分注後−８０℃超低温冷凍庫にて実験使用時まで保存した。ウイルス液の一部は、１０倍段階希釈法にて細胞変性効果を確認し、ウイルス感染力価（ＴＣＩＤ50）を測定した。【０１８４】
（４）試験方法
（４−１）群分け
群構成は、ウイルス摂取群４群およびウイルス非接種群２群の計６群とした。ウイルス接取群の４群の接取ウイルス濃度は１０7.5ＴＣＩＤ50／ｍＬとした。ウイルス接取が確実に行われたマウスを各群に１０匹ずつ割り付けた。なお、群分けの指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時に層別無作為に割り付けた。ウイルス非接取群の動物数も１０匹とした。【０１８５】
（４−２）被験物質の投与
検疫・検収の終了後、１週間予備飼育を行った６週齢のBALB/c雌マウスに、被験物質をマウス１匹当たり０．２ｍＬずつ、試験期間を通じて１日１回強制経口投与した。被験物質の濃度は、マウスの体重１ｋｇあたりの被験物質投与量が、５００、１００または２０ｍｇ／ｋｇとなるように設定した。なお、陰性対象には生理食塩液を同様に投与した。【０１８６】
（４−３）ＩＦＶＡの接種
被験物質または生理食塩液を３週間連続強制経口投与した６週齢のBALB/c雌マウスに、動物番号順に動物体重２０ｇ当たり、塩酸ケタミン注射液（５０ｍｇ／ｍＬ；三共株式会社）２０倍希釈液０．２ｍＬとドロペリドール注射液（２．５ｍｇ／ｍＬ；三共株式会社）２０倍希釈液０．１ｍＬを後肢筋肉内に注射し、全身麻酔を施した。麻酔下において、上記（３）で調製したＩＦＶＡ液をマウスの右鼻腔に５０μＬ経鼻的に接種した。なお、ウイルス非接種群には生理食塩液５０μＬを同様に注入した。【０１８７】
（４−４）生存率の測定
ＩＦＶＡ接種後２週間の経過観察を行った。ＩＦＶＡ接種後生存した個体数を群当たりの総数で除した値に１００を乗じた値を生存率とした。【０１８８】
（５）統計処理
実験対照群と各被験物質投与群間の有意差は、クラスカル−ウォリスのＨ検定またはマン−ホイットニーのＵ検定を用いて検定し、危険率５％未満を有意とした。また、観察期間における生存期間に関してはフィッシャー検定による有意差検定を行った。【０１８９】
（６）結果
結果を表５に示す。【０１９０】
【表５】
0004832425.tif 000010
【０１９１】
ウイルス感染動物における生理食塩水投与群の生存率は０％、平均生存日数は８．５日であった。一方、ウイルス感染動物における被験物質投与群の生存率および平均生存日数は、５００ｍｇ／ｋｇ投与群８０．０％、１３．１日、１００ｍｇ／ｋｇ投与群３０．０％、９．２日および２０ｍｇ／ｋｇ投与群０％、８．５日であった。ウイルス感染後の観察期間中の生存期間および観察期間終了時の生存率において、５００ｍｇ／ｋｇ投与群は対照群に対して有意に高い値を示した（それぞれ、ｐ＝０．０００２およびｐ＝０．０００７）。また、ウイルス未感染動物における被験物質投与群および同物質非投与群の生存率および平均生存日数に関しては、いずれも１００％、１４．０日であった。【０１９２】
試験例５
この試験は、ＯＮＲＩＣ乳酸菌（死菌）の継続摂取が、ヒトの唾液中ＩｇＡ産生量に及ぼす影響を明らかにするものである。【０１９３】
被験者は成人女性２０名とし、スクリーニング時の唾液中総Ｓ−ＩｇＡ量を指標に、水摂取群（対照群）、ラクトバチルス ONRIC b0240死菌（２×１０9ＣＦＵ相当／日）摂取群に各１０名を割り付けた。【０１９４】
試験期間中は、水またはラクトバチルス ONRIC b0240死菌含有水（菌数２×１０9ＣＦＵ相当：２００ｍｌ／日）を摂取させた。被験物質摂取前後に、下記の要領で唾液中総Ｓ−ＩｇＡ量を測定した。【０１９５】
唾液採取日の定刻に蒸留水にて洗口し、５分後、サリベットを用いて唾液を１分間採取し、秤量した。唾液分泌量に応じて２〜３回この作業を繰り返した。この際、正確な採取時間をタイマーにより計測し、記録した。得られた唾液は遠心分離を行うまで４℃で冷蔵保存した。その日のうちにサンプルを２５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、沈殿物を取り除いた。得られる上清の量が少ない場合はさらに同条件で遠心分離を行った。上清を１．５ｍｌ容マイクロチューブに採取し、測定時まで−３０℃で凍結保存した。測定には、上清をブロッキング液（魚ゼラチン（SIGMA, St. Louis, MO）１ｇ／５０ｍｌを含む、０．０５％ポリオキシエチレンソルビタンモノウレート含有ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０相当品、ナカライテスク、京都））で２０００倍希釈したサンプルを用いた。ＩｇＡ濃度はＥＬＩＳＡ法（一次抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＡ（DAKO、Denmark）、二次抗体：ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＡ（DAKO）、標準抗体：精製ヒト分泌型ＩｇＡ（Cappel, Aurora, OH））にて測定した。なお、総Ｓ−ＩｇＡ量は、一分間あたりの唾液分泌量とＳ−ＩｇＡ濃度の積として算出した。【０１９６】
試験期間中の唾液中総Ｓ−ＩｇＡ量の増加量を、被験物質摂取２１日目における唾液中総Ｓ−ＩｇＡ量から、被験物質摂取前の唾液中総ＩｇＡ量を引いた差として算出した。得られた結果を図３に示す。試験期間中の唾液中総Ｓ−ＩｇＡ量の増加量について、ラクトバチルス ONRIC b0240死菌（２×１０9ｃｆｕ相当）摂取群（５２．２１±２４．４１μｇ）は、水摂取群（−２１．８１±２８．３３μｇ）に比べて高い値を示し、その差は統計学的にも有意なものであった（ｐ＝０．０００１）。
【図１】
0004832425.tif 000011
【図２】
0004832425.tif 000012
【図３】
0004832425.tif 000013