(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚に投与されたときに抗原性又は免疫原性応答を生じる、植物によって発現される組換えペプチドの、魚の治療又は予防的処置のための医薬の製造における使用であって、
当該組換えペプチドは、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質であり、前記医薬は、魚に経口投与するための医薬である、前記使用。
【請求項２】
前記医薬が魚への経口送達用に調合されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬が、食餌用ペレットの形態である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬が、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質であるペプチドを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記組換えペプチドが、配列番号５、６、７又は８の何れかを包含するＤＮＡによってコードされている、請求項１〜４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記魚がサケ科の魚である、請求項１〜５の何れか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記組換えペプチドが、トウモロコシ（Ｚｅａ Ｍａｙｓ）に由来する、請求項１〜６の何れか一項に記載の使用。
【請求項８】
植物によって発現される組換えペプチドを含む魚用飼料であって、当該組換えペプチドは、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質である、前記魚用飼料。
【請求項９】
前記組換えペプチドが、植物組織中に含まれている、請求項８に記載の飼料。
【請求項１０】
前記植物組織が種子組織である、請求項９に記載の飼料。
【請求項１１】
少なくとも１つの栄養素又は賦形剤をさらに含む、請求項８〜１０の何れか一項に記載の飼料。
【請求項１２】
植物によって発現される組換えペプチドを、１又は複数の賦形剤及び必要に応じて加えられる１又は複数の栄養素と混合することを含む、魚用経口ワクチン製剤を調製する方法であって、当該組換えペプチドは、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質である、前記方法。
【請求項１３】
魚に経口投与されたときに、抗原性又は免疫原性反応を生じるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞であって、当該ペプチドは、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質である前記植物細胞。
【請求項１４】
魚に経口投与されたときに、抗原性又は免疫原性反応を生じるペプチドをコードするヌクレオチドを発現するように改変されたトランスジェニック植物であって、当該ペプチドは、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質である前記トランスジェニック植物。
【請求項１５】
請求項１４のトランスジェニック植物の種子。
【請求項１６】
ペプチドで魚を免疫化する方法であって、植物によって発現される前記ペプチドを含む組成物を魚に経口投与することを含み、前記ペプチドは、ＩＰＮＶから得られるＶＰ２若しくはＶＰ３タンパク質である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック植物中での魚疾病抗原の発現及び該抗原のワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ１０年にわたって、様々な有用なタンパク質を発現するために、トランスジェニック植物を使用することが成功を収めてきた。例えば、植物中でのアプロチニンの産生（米国特許第５，８２４，８７０号）及びアビジン（米国特許第５，７６７，３７９号）と並んで、植物中でのプロテアーゼの産生（米国特許第６，０８７，５５８号参照）が行われてきた。植物中で上手く産生されるこれらのタンパク質中には、ウイルスワクチン（米国特許第６，１３６，３２０号）、伝染性胃腸炎及び肝炎ワクチン（米国特許第５，９１４，１２３号及び第６，０３４，２９８号）など、哺乳類細菌及びウイルスの様々な病原体抗原が含まれている。これらの特許及び本明細書に引用されている参考文献は全て、本明細書に参考文献として組み込まれる。
【０００３】
得られたペプチドの多くは、マウス（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：  １３３６１３４３；  Ｗｉｇｄｏｒｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：  ３４７−３５３）及びヒト（Ｋａｐｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １３：  １７９６−１７９９）で、本来の病原体と同等に、免疫原性反応を誘導した。経口送達された後、これらの食物ワクチンは免疫原性を示し、保護を誘導することができた。組換えＥ．コリ熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬｔＢ）を発現するトウモロコシを加えた基本的な食餌を与えたマウスは、良好な用量依存的ＩｇＧ及びＩｇＡ反応を開始した（Ｓｔｒｅａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｐｌａｎｔ  ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｕｎｉｑｕｅ  ａｄｖａｎｃｅｓ”  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００１）  １９：  ２７４２−２７４８）。最初に開発された食物ワクチン技術の中には、肝炎、ＴＧＥＶ及びノーウォークウイルス抗原並びに様々な他のウイルス抗原を発現するトランスジェニックポテトが含まれる（例えば、Ｔｈａｎａｖａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９２：  ３３５８−３３６１；米国特許第６，１３６，３２０号；米国特許第６，０３４，２９８号；米国特許第５，９１４，１２３号；米国特許第５，６１２，４８７号及び米国特許第５，４８４，７１９号；Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９３：  ５３３５−５３４０；“ＶＰ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ”  （Ｗｉｇｄｏｒｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５５：  ３４７−３５３を参照。）。
【０００４】
ワクチン製造のためにトランスジェニック植物を使用することには、伝統的なワクチン製造法に比べて、幾つかの利点が秘められている。第一に、トランスジェニック植物は、一般に、病原体又は毒素の小さな抗原性部分のみを発現するように構築されているので、生物個体に感染又は生得的毒性をもたらす可能性がなく、有害な反応が生じる可能性が少ない。第二に、植物に感染することができるヒト又は動物の公知の病原体が存在しないので、ウイルス又はプリオンが混入する懸念がなくなる。第三に、トランスジェニック穀物中での免疫原の産生は、食用穀物に対して一般的に用いられているものと同じ確立された植物の播種、採集、保存、輸送及び加工技術に依拠しているので、トランスジェニック植物は、大規模ワクチン製造の極めて経済的な手段となる。第四に、植物の天然のタンパク質貯蔵コンパートメント中で免疫原を発現させると、安定性が最大化するため、冷凍の必要性が最低限に抑えられ、輸送及び保存コストを低く保つことができる。第五に、複数のトランスジェニック植物株の種子を単一のワクチンに配合することによって、多成分ワクチンを調合することが可能である。第六に、一般的に摂食される食用植物（穀類など）中に免疫原が発現されると、直接経口投与することが可能となり、食物ワクチンが製造できる。
【０００５】
初回免疫又は追加免疫としての経口ワクチン送達は、あらゆる大きさの魚に対する集団免疫に適しており、魚を手で取り扱わなければならない注射送達に比べて魚に与えるストレスが小さく且つ粘膜免疫を誘導することから、水産養殖産業からの要望が極めて大きな方法である。しかし、特に大型の魚の場合、経口送達の費用対効果が、本方法の商業化に対する大きな障害となっていた。魚の消化系による抗原の破壊及び吸収によって、経口抗原送達の効力が制約されることが報告されている。
【０００６】
本発明者らは、トランスジェニック植物が魚の経口ワクチン接種用抗原の経済的な製造にとって理想的なシステムとなり得ることを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの側面において、魚に投与されたときに、魚に抗原性又は免疫原性応答を生じる、植物由来の組換えアミノ酸配列の、魚の疾病を予防又は治療するための医薬の製造における使用が提供される。好ましくは、前記組換えアミノ酸配列は、魚に疾病又は病変を引き起こす生物の抗原である。
【０００８】
本発明の１つの側面において、植物は、魚に投与されたときに、魚に抗原性又は免疫原性反応を生じるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で形質転換される。
【０００９】
本発明のさらなる側面において、前記アミノ酸配列の発現は、前記植物の種子に対して優先的に誘導される。
【００１０】
別の側面において、本発明は、植物細胞中での発現によって得られ、魚に疾病又は病変を引き起こす生物に内在するアミノ酸配列を提供する。
【００１１】
別の側面において、本発明は、植物由来の組換えアミノ酸配列、特に、魚に疾病又は病変を引き起こす生物の抗原である、植物由来の組換えアミノ酸配列を含む、魚への経口送達に適した組成物を提供する。
【００１２】
さらに別の側面において、本発明は、魚に疾病又は病変を引き起こす生物の抗原である、植物由来の組換えアミノ酸配列を含む組成物を魚に投与することを含む、疾病に対して魚を免疫化する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書において使用される「魚」という用語は、魚類、甲殻類及びその他の水生動物を意味する。魚類には、硬骨魚又は軟骨魚であり得る全ての有脊椎魚が含まれる。本発明のワクチンを与えるのに最も有力な魚類種は、サケ及びマス種、特に、ギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｋｉｓｕｔｃｈ）、カワマス（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ  ｆｏｎｔｉｎａｌｉｓ）、ブラウントラウト（Ｓａｌｍｏ  ｔｒｕｔｔａ）、チヌックサケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、サクラマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ  ｍａｓｏｕ）、カラフトマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｇｏｒｂｕｓｃｈａ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、ホッキョクイワナ（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ  ａｌｐｉｎｕｓ）及び大西洋サケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）などの、サケ科の魚である。しかしながら、鯉（ｋｏｉ）、キンギョ、コイ（ｃａｒｐ）、ナマズ、ブリ、タイ、スズキ、カワカマス、オヒョウ、コダラ、ティラピア、ターボット、オオカミウオなどの観賞魚種など、伝染性疾患に罹患し得る他のあらゆる種の魚に対して有効であり得る。
【００１４】
甲殻類の例には、二枚貝、イセエビ、シュリンプ、カニ及びカキが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の養殖された水生動物には、ウナギ、イカ及びタコが含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
「植物に由来する」組換えアミノ酸配列とは、トランスジェニック植物中で発現されるように操作された、当該植物に本来内在していないアミノ酸配列をいう。
【００１６】
本発明のアミノ酸配列は、魚に投与されたときに、魚に抗原性又は免疫原性反応をもたらすアミノ酸配列である。
【００１７】
魚に病変を引き起こす生物の抗原及びこのような抗原をコードするヌクレオチド配列は、注射、浸漬、スプレー、魚の飼料へのワクチンの直接添加又は魚細胞中への遺伝子導入を介して曝露された魚に投与されている。例えば、米国特許第６，４６２，０２７号は、免疫原をコードする単離された非伝染性ポリヌクレオチドを、水生動物に接触させる方法を記載している。米国特許第６，１８０，６１４号は、トランスフェクションによって、抗原を基礎としたワクチンをコードするＤＮＡプラスミドを魚に導入することを記載している。プロモーターは、魚の中で発現を誘導することができる。この特許明細書は、微生物によって発現された組換えタンパク質は封入体を形成できるので、タンパク質の回収が少ないか、又は存在しないことを指摘している。さらに、本特許明細書は、免疫反応の誘導には、抗原性タンパク質が正しくグリコシル化されて、折り畳まれることが必要となり得ることを示唆しており、動物細胞以外の細胞中ではこれを達成し得ないと、発明者らは述べている。しかしながら、本発明者らは、魚に投与されたときに、抗原性又は免疫原性反応を引き起こすことができる、正しくプロセッシングが行われた抗原性アミノ酸配列を植物中で作製することが可能であることを発見した。
【００１８】
このような遺伝子を用いたワクチンの作製に大きな関心が存在するため、魚に抗原性又は免疫原性反応を生じる多くのアミノ酸配列（「抗原」とも称される。）のコード配列が、既に配列決定されており、現在も配列決定が行われている。本発明の原理を説明するために、ある種の抗原を用いて、具体的な例が以下に記載されているが、本発明は特定の抗原に対して限定されるものではない。むしろ、魚に抗原性又は免疫反応を生じさせる任意のアミノ酸配列を使用することができる。好ましい実施形態では、魚に病変を引き起こす生物の抗原が使用される。このような抗原は、免疫を誘導し、又は増強するために使用され、この抗原をコードする、対応するヌクレオチド配列が、本発明において有用である。これまでに単離された、このような配列の多数の例のうち幾つかを挙げると、米国特許第６，４７１，９６４号に記載されている伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ、ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓａｌｍｏｎ  ａｎａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）の構造タンパク質−１をコードするｃＤＮＡ、並びに「Ｔｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  “Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆｌｏｕｎｄｅｒ  Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ，  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ”  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９  （７−８）：  ８０１−８０９；  Ｃｏｒｂｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ，  Ｐ，  Ｍ，  ＮＶ，  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”  Ｄｉｓ．  Ａｑｕａｔ．  Ｏｒｇａｎ  ３９  （１）  ：  ２９−２６；  Ｎｕｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｔｆｉｓｈ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｔｆｉｓｈ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  （ＩＨＶ−１）”Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ８４  （３−４）：  １５１−１６８  ；  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｃｉｌａｔｅ  Ｉｃｈｔｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｉｌｉｉｓ”Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．．  ８９  （１４）：  ６３６３−６３６７」および「Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＹＡＶ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒａｌ  ａｓｃｉｔｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ”  ��ｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４（７）：  １４９４−１４９７」に記載されているものが含まれる。
【００１９】
本発明の方法が有用であり得る様々な病原体の例には、出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性膵壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）、伝染性造血組織壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ、ｓａｌｍｏｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、コイ春ウイルス血症ウイルス、ソウギョ出血性ウイルス、神経壊死ウイルス又はシマアジ神経壊死ウイルスなどのノダウイルス科、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、アエロモニス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、レニバクテリウム・サルモニナラム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）、エルシニア属、パスツレラ属（フォトバクテリウム・ダムセラなど）、ビブリオ属（Ｖ．アンギラルム及びＶ．オーダリ（Ｖ．  ｏｒｄａｌｉｉ）など）、エドワードシエラ属（Ｅ．イクタルリ（Ｅ．ｉｃｔａｌｕｒｉ）及びＥ．ターダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）など）、ピシリケッチア・サルモニス（サケ科リケッチア性敗血症の原因）、イリドウイルス、心筋症症候群ウイルス、タウラ症候群ウイルス、ペナエウスモノドンウイルス、エビイエローヘッドウイルス（ｓｈｒｉｍｐ  ｙｅｌｌｏｗｈｅａｄ  ｖｉｒｕｓ）、エビホワイトスポットウイルス（ｓｈｒｉｍｐ  ｗｈｉｔｅｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）及び連鎖球菌属が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明において使用できる、魚に病変を生じさせる公知の抗原の他の例には、ＩＰＮＶ  ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質、ＩＨＮＶ  Ｇタンパク質、ＶＨＳＶ  Ｇタンパク質、ノダウイルスキャプシドタンパク質、ＷＯ  ０１／１０４６９号に開示されているＩＳＡＶ抗原、ＷＯ  ９９／５８６３９号に開示されているＳＰＤＶ抗原、ＷＯ  ０１／６８８６５号に開示されているＰ．  サルモニス抗原、ＷＯ  ０１／０９３４０号に開示されているホワイトスポットウイルス抗原が含まれる。魚の病原体抗原の核酸及びアミノ酸配列が数多く知られており、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース及びその他のデータ源から入手することができる。
【００２１】
「魚に疾病又は病変を引き起こす生物の」本発明のアミノ酸配列又は抗原とは、以下に記載されているように、組換えＤＮＡ技術を通じて植物細胞中に発現される、魚の病原体のアミノ酸配列又は抗原（又はそれらの誘導体）である。本発明を実施する上で使用される「抗原」は、魚に疾病を引き起こすウイルス、細菌、真菌、寄生生物、原虫などから得られる完全長の抗原性タンパク質であり得、又は、免疫原性部分、その断片もしくは誘導体を構成し得る。アミノ酸配列の「誘導体」とは、アミノ酸配列のレベル又は３Ｄのレベル（すなわち、基準配列と概ね同じ形状と立体配置を有する分子）で基準配列に関連する配列である。誘導体には、魚に抗原性又は免疫原性反応を誘導することができる配列相同体、変異体、模倣体、ミモトープ、類縁体、単量体の形態及び機能的均等物（生物から直接取得されるか、又は合成的に製造されるかを問わない。）が含まれる。具体的には、（天然又は合成アミノ酸との）アミノ酸の置換、欠失、反転、挿入及び付加によって得られる誘導体を挙げることができる。
【００２２】
この抗原は、アミノ酸配列又はタンパク質であると否とにかかわらず、「目的の抗原」である。「目的の遺伝子」とは、所望の抗原又は選択マーカーであるポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を表す。目的の遺伝子は、植物に対して使用されるコドンを最適化することによって、植物の転写及び翻訳に対して最適化することができる（以下の考察を参照。）。
一般に、上記組換え遺伝子を構築するために利用できる方法は、発現を改善するために、必要に応じて様々な修飾を含み、細部において異なってもよい。しかしながら、従来使用されていた方法には、ＰＣＲ増幅、すなわち、クローニングに便利な制限部位を有する遺伝子を与えるために、互いにアニーリング及び連結が為される、重複する相補的な合成オリゴヌクレオチドを設計及び合成することが含まれる。使用される方法は、分子生物学者にとって標準的な方法である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）。
【００２３】
遺伝子が、所望の局在化配列などの所望の特性を含有するように操作された時点で、標準的な方法によって、発現ベクターの中に遺伝子を配置する。適切な発現ベクターの選択は、発現ベクターを宿主細胞中に導入する方法に依存するであろう。典型的な発現ベクターは、細菌宿主中での発現ベクターの増殖と選択を行うために細菌の複製起点と抗生物質耐性遺伝子とをコードする原核生物のＤＮＡ要素と、外来ＤＮＡ配列（本発明においては、目的の抗原をコードするであろう。）を挿入するためのクローニング部位と、前記外来遺伝子の転写の開始を調節する真核生物のＤＮＡ要素（プロモーターなど）と、及び転写のプロセシングを調節するＤＮＡ要素（転写終結／ポリアデニル化配列など）と、を含有する。発現ベクターは、最終的に植物染色体中にベクターを組み込むために必要とされる配列を含有することもできる。
【００２４】
好ましい実施形態において、前記発現ベクターは、転写の開始を調節するプロモーターに機能的に連結された、選択マーカーをコードする遺伝子も含有する。「機能的に連結された」とは、目的の遺伝子（この場合には、選択マーカーをコードする遺伝子）が、ｍＲＮＡの転写とｍＲＮＡの翻訳が正しく起こって、所望のポリペプチド又はタンパク質を産生するように、正しい配向性と正しいフレーム配置でプロモーターの下流に位置するものと理解される。植物の発現ベクター及びレポーター遺伝子の一般的な解説については、「Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  “Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．  ｐ  ８９−１１９」を参照されたい。一実施形態では、前記選択的遺伝子はグルホシナート耐性をコードする遺伝子であり、別の実施形態では、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーターの調節下にあるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（「ｐａｔ」）又はトウモロコシに対して最適化されたｐａｔ遺伝子であり得る。該遺伝子は、ビアラホスに対する耐性を付与する（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ（１９９０）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３；  Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：  ８３５；  ａｎｄ  Ａｎｚａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎ．  ２１９：  ４９２）。
【００２５】
「プロモーター」とは、転写を誘導するのに十分な最少配列を意味する。細胞種特異的、組織特異的に調節可能な又は外部シグナル若しくは因子によって誘導可能なプロモーター依存性遺伝子発現を与えるのに十分であるプロモーター要素も本発明に含まれ、このような要素は、前記遺伝子の５’又は３’領域に配置することができる。目的の構造遺伝子の転写を制御するために当該遺伝子の内在性プロモーターを使用することもできるが、プロモーターは、多くの場合、外来制御配列である。それぞれ、抗原性タンパク質及び選択遺伝子の発現を調節するために使用されるプロモーター要素は、植物に適合する任意のプロモーターであり得る。それらは、例えば、ユビキチンプロモーター（欧州特許出願第０，３４２，９２６号）；リブロース−１，５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）に対するプロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ３：  １６７１，  １９８４  ；  Ｂｒｏｇｌｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４：  ８３８，  １９８４）；又は（アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導プラスミド上に担持され、植物活性を有する）ノパリンシンターゼ及びオクトパインシンターゼプロモーターなどの、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の腫瘍誘導プラスミドから得られるプロモーター；又はＣａＭＶのカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１０：  ５１１，１９８４  ；  Ｏｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１３：  ８１０，１９８５）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｇｏｗｄａ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３Ｄ；３０１，１９８９）若しくはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３０７，  １９８７）などのウイルスプロモーターなどの植物遺伝子プロモーターであり得る。「Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  “Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｓ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：  １９９−１３０２及び欧州特許出願ＥＰ−Ａ−３４２，９２６」も参照されたい。あるいは、マンノピンシンターゼプロモーターなどの植物プロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ３：  ２７２３，１９８４）；熱ショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐｌ７．５−Ｅ又はｈｓｐｌ７．３−Ｂ；（Ｇｕｒｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：  ５５９，１９８６  ；  Ｓｅｖｅｒｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５：  ８２７，１９９０）；又はエタノール誘導性プロモーター（Ｃａｄｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １６：１７７，  １９９８）を使用することができる。本発明において適切に使用される植物プロモーターの例の総説については、国際特許出願ＷＯ  ９１／���９８０６号を参照されたい。本発明の一実施形態において、アミノ酸をコードする前記ＤＮＡは、ＰＧＮｐｒ６プロモーター（ＷＯ  ０１／９４３９４号）の転写調節下にある。これは、ユビキチン様のプロモーターである。
【００２６】
好ましい実施形態において、組織特異的プロモーターは、種子に対してＤＮＡの転写を優先的に誘導するために与えられる。一つのこのようなプロモーターは、グロブリンプロモーターである。これは、「Ｂｅｌａｎｇｅｒ，  Ｆ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｋｒｉｚ，  Ａ．  Ｌ．  （１９９１）  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｉｚｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ−１  ｇｅｎｅ”  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９：８６３−９７２」によって記載されている、トウモロコシのグロブリン−１−遺伝子のプロモーターである。これは、受託番号Ｌ２２３４４としてＧｅｎｂａｎｋデータベースにも見出すことができる。別の例は、ファセオリンプロモーターである。「Ｂｕｓｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  “Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ａｎ  Ａ／Ｔ−ｒｉｃｈ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｕｎｄ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ａ  ｆｒｅｎｃｈ  ｂｅａｎ  Ｂ−ｐｈａｓｅｏｌｉｎ  ｇｅｎｅ”  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  （１）  ：  ８３９−８５３」を参照されたい。
【００２７】
発現ベクターは、必要に応じて、プロモーターと目的の遺伝子の間に位置するシグナル配列も含有することができる。シグナル配列とは、翻訳されるべき目的のタンパク質又はポリペプチドを誘導して、真核細胞の内部又は外部にある特定の位置に配置するために細胞によって使用されるヌクレオチド配列であり、対応するアミノ酸配列の場合もあり得る。植物シグナル配列の１つの例は、大麦α−アミラーゼ分泌シグナルである（Ｒｏｇｅｒｓ，  （１９８５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０，３７３１−３７３８）。多くのシグナル配列が、本分野において公知である。例えば、「Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：  ４９；  Ｃｌｏｓｅ，  Ｐ．  Ｓ．，  （１９９３）  Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；  Ｋｎｏｘ，  Ｃ．  （１９８７），  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｂａｒｌｅｙ”，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９：３−１７；  Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９１：  １２４−１２９；  Ｆｏｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：  ４８３−４９６；  Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８：  ８３４；  Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０８：  １６５７；  Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１），  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２  ：１２９；  Ｋａｌｄｅｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  “Ａ  ｓｈｏｒｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ”  Ｃｅｌｌ  ３９  ：  ４９９−５０９」および「Ｓｔｅｉｆｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｉｚｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｌｅａｆ  ａｎｄ  ｒｏｏｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：  ７８５−７９３」を参照されたい。
【００２８】
一実施形態において、前記植物選択マーカー及び前記目的の遺伝子は何れも、同一のプロモーターに機能的に連結することができる。別の実施形態において、前記植物選択マーカー及び前記目的の遺伝子は、異なるプロモーターに機能的に連結することができる。さらに別の第三及び第四の実施形態において、前記発現ベクターは、同一のプロモーター又は異なるプロモーターに連結することができる２以上の目的の遺伝子を含有することができる。
【００２９】
プロモーター、選択可能なマーカー、シグナル配列及び前記構築物の他の成分に対して多数の改変を利用できることが、当業者には自明である。
【００３０】
本発明に従えば、植物が目的の遺伝子を発現して、目的の抗原を産生することができるように、上記要素から構成され、該植物のゲノム中に組み込まれたＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物が作製される。該トランスジェニック植物は、適切には、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ，  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、イモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）及びマメ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）などの、動物に給餌するために都合よく栽培される種であり得る。あるいは、前記トランスジェニック植物は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、亜麻（Ｌｉｎｕｍ）、サイザル麻（Ａｇａｖｅ  ｓｐｐ．，  Ｆｕｒｃｒａｅａ  ｓｐｐ．）、松、モミ及びヒマラヤスギなどの、食用には適さない種であり得る。このようなトランスジェニック植物を作製するために、遺伝子を含有する発現ベクターは、プロトプラスト、未成熟な胚及び成長点などの無処置の組織、カルス培養物又は単離された細胞中に導入することができる。好ましくは、発現ベクターは、無処置の組織中に導入される。植物組織を培養する一般的な方法は、例えば、「Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ  （ｅｄｓ）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．  ６７−６８」及び「Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  “Ｃｅｌｌ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ”  ｉｎ  Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ３ｄ  Ｅｄｉｔ．  Ｓｐｒａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ  （ｅｄｓ）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃ．  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  ｐｐ．  ３４５−３８７」に記載されている。ＤＮＡ分子中に取り込まれた選択可能なマーカーは、形質転換体の選択を可能とする。
【００３１】
当業者が利用可能な、植物組織中に発現ベクターを導入する方法は様々であり、選択された植物に依存するであろう。多様な植物種を形質転換する操作は周知であり、広く文献に記載されている。例えば、「Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  ｓｕｐｒａ  ；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  ２６」および「Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２：  ４２１−４７７」を参照されたい。例えば、ＤＮＡ構築物は、マイクロプロジェクタイルを介した送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：  ７０−７３）；電気穿孔法（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８２：５８２４）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｅｍｂｏ．  Ｊ．  ３：２７１７−２７２）；直接的遺伝子移入（ＷＯ  ８５／０１８５６号及びＥＰ−Ａ−２７５，０６９号）、インビトロプロトプラスト形質転換（米国特許第４，６８４，６１１号）及び植物細胞プロトプラスト又は胚形成カルスの微量注入（Ｃｒｏｓｓｗａｙ，  （１９８５）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０２：  １７９−１８５）などの技術を用いて、植物細胞のゲノムＤＮＡ中に導入し得る。植物組織をアグロバクテリウム・ツメファシエンスとともに同時培養することも別の選択肢であり、この場合、バイナリーベクター系（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  “Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  （Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：  ７４５−  ７５０））中にＤＮＡ構築物が配置される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主の病原性機能によって、細胞をこの細菌に感染させると、構築物が植物細胞ＤＮＡ中に挿入されるであろう。例えば、「Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：  ４９６−４９８」及び「Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８０：４８０３」を参照されたい。
【００３２】
アブラナの形質転換を行うための標準的な方法は、「Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）“Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：  ２３８−２４２」に記載されている。トウモロコシの形質転換は、「Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：  ８３３」および「Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ，  前出」によって記載されている。アグロバクテリウムは、主に双子葉植物に使用されるが、トウモロコシなどのある種の単子葉植物をアグロバクテリウムによって形質転換することができる。例えば、米国特許第５，５５０，３１８号を参照されたい。コメの形質転換は、「Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｓ  Ｌ．）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ＤＮＡ”  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６  （２）：  ２７１−２８２」、「Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  ２３９」および「Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：  ６３８９」によって記載されている。ムギは、トウモロコシ又はコメを形質転換するために使用される技術と類似の技術によって形質転換することができる。モロコシの形質転換は、「Ｃａｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  “Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ”  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｐｌａｎｔ．  ３３：  ９２−１００」及び「Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  １０４：  ３７」によって記載されている。ダイズの形質転換は、米国特許第５，０１５，５８０号を含む、数多くの文献に記載されている。
【００３３】
１つの好ましい方法において、おおむね上記Ｉｓｉｄａ及び米国特許第５，５９１，６１６号にも記載されているアグロバクテリウム形質転換法が、取得された形質転換体の数を向上させる、本発明者らが見出した修飾を施して使用される。Ｉｓｈｉｄａの方法は、培養中にＩ型カルスを産生するトウモロコシのＡ１８８変種を使用する。１つの好ましい実施形態において、培養中でＩＩ型胚形成カルスを開始するＨｉ  ＩＩトウモロコシ株が使用される。Ｉｓｈｉｄａは、ｂａｒ又はｐａｔ遺伝子を選択のために使用するときには、ホスフィノトリシンに対する選択を推奨しているが、別の好ましい実施形態では、代わりにビアラホスを使用する。一般に、’６１６特許に記載されており、以下でさらに詳しく概要が説明されているように、少なくとも７日間、脱分化誘導培地上で植物の外植片を培養することによって、脱分化が得られ、脱分化中又は脱分化後の組織を目的の遺伝子を有するアグロバクテリウムと接触させる。培養される組織は、例えば、カルス、不定胚様組織及び懸濁細胞であり得る。この好ましい実施形態において、アグロバクテリウムの懸濁液は、１０６ないし１０１１個の細胞／ｍＬの細胞集団を有し、前記組織と３ないし１０分間接触されるか、又は、少なくとも７日間、アグロバクテリウムとともに継続的に培養される。アグロバクテリウムは、プラスミドｐＴＯＫ１６２を含有することができ、目的の遺伝子は該プラスミドのＴ領域の境界配列の間に存在するか、又は目的の遺伝子は別のプラスミドを含有するアグロバクテリウム中に存在し得る。病原性領域は、Ｔｉプラスミド又はＲｉプラスミドの病原性領域に由来するものであり得る。Ｉｓｈｉｄａのプロトコールで使用されている細菌株は、高病原性Ａ２８１株に由来する３つのｖｉｒ座位を含有する４０ｋｂのスーパーバイナリープラスミドを有するＬＢＡ４４０４である。該プラスミドは、テトラサイクリンに対する耐性を有する。クローニングベクターは、スーパーバイナリープラスミドとともに共挿入される。クローニングベクターは、Ｅ．コリ特異的複製起点を有するが、アグロバクテリウム複製起点を有していないので、スーパーバイナリープラスミドとともに共挿入されないと、アグロバクテリウム中で生存できない。ＬＢＡ４４０４株は病原性が高くなく、スーパーバイナリープラスミドを用いないと用途が限られるので、本発明者らは、さらに別の実施形態において、ＥＨＡ１０１株が好ましいことを見出した。ＥＨＡ１０１株は、高病原性Ａ２８１株から得られる安全化されたヘルパー株である。ＬＢＡ４４０４親由来の共挿入されたスーパーバイナリー／クローニングベクターを単離し、ＥＨＡ  １０１中に電気穿孔を行い、スペクチノマイシン耐性に対して選択する。ＥＨＡ１０１がプラスミドを確実に含有するようにするため、プラスミドを単離する。ＥＨＡ１０１は、カナマイシンに対する耐性を有する安全化されたｐＴｉを含有している。Ｈｏｏｄ  ＥＥ，  Ｈｅｌｍｅｒ  ＧＬ，  Ｆｒａｌｅｙ  ＲＴ，  Ｃｈｉｌｔｏｎ  ＭＤ  （１９８６）“Ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａ２８１  ｉｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎ  ａ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ���ＴｉＢｏ５４２  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｏｆ  Ｔ−ＤＮＡ”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６８：  １２９１−１３０１。
【００３４】
さらに、Ｉｓｈｉｄａのプロトコールでは、記述されているように、プレート上でアグロバクテリウムの新鮮な培養物を増殖させ、プレートから細菌を掻き取り、トウモロコシ胚とともにインキュベーションを行うために、’６１６特許に述べられているとおりに、共培養培地中に再懸濁する。この培地は、４．３ｇのＭＳ塩、０．５ｍｇのニコチン酸、０．５ｍｇのピリドキシン塩酸塩、１．０ｍＬのチアミン塩酸塩、カザミノ酸、１．５ｍｇの２，４−Ｄ、６８．５ｇのスクロース及び３６ｇのグルコースを含み、全てｐＨ５．８である。さらに好ましい方法において、１ｍＬ培養液中で一晩細菌を増殖させた後、形質転換が起こるべき翌日に、新鮮な１０ｍＬの培養液中に再度播種される。細菌は、対数期まで増殖し、ＯＤ６００＝０．５以下、好ましくは０．２ないし０．５の密度で採集される。次いで、培地を除去するために細菌を遠心し、共培養培地中に再度懸濁する。Ｈｉ  ＩＩが使用されるので、Ｈｉ  ＩＩに対して好ましい培地が使用される。この培地は、「Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ｃ．Ｉ．  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃ．Ｅ．  （１９８５）  “Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｒｉａｂｌｅ，  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｍａｉｚｅ  ｃａｌｌｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ”  Ｐｌａｎｔａ  １５４：２０７−２１４」に、かなり詳細に記載されている。再懸濁培地は、上述したものと同じである。さらなるＨｉ  ＩＩ培地は全て、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇらに記載されているとおりである。その結果、植物細胞の再分化と植物への再生が起こる。再分化は、脱分化と呼ばれることがあるが、前者の用語のほうが、細胞がある形態と属性から始まって、培地上に配置されてその属性を喪失し、新しい属性を有するように「リプログラミングが行われた」状態になるという過程をより正確に記述している。このようにして、胚盤細胞が胚形成カルスになる。
【００３５】
アミノ酸配列の最も高い発現レベルを選択することが好ましく、このため、形質転換された植物細胞、トランスジェニック植物及び組織特異的発現における発現レベルを確かめることが有用である。このような方法の一つは、目的の抗原の発現を、総可溶性タンパク質のパーセントとして測定することである。一つの標準的なアッセイは、当業者に周知であるＢｒａｄｆｏｒｄアッセイである（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  （１９７６）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：２４８）。組換えアミノ酸配列の生化学的活性も測定して、野生型標準と比較すべきである。
【００３６】
目的の遺伝子の発現のレベルは、トランスジェニック植物の染色体上に目的の遺伝子を安定的に維持することによって増大させることができる。除草剤耐性が目的の遺伝子と物理的に近接している連鎖遺伝子を使用することによって、トランスジェニック植物集団に対する選択圧を維持し、目的の遺伝子が失われていない植物を得ることができるであろう。
【００３７】
本発明のトランスジェニック植物を用いれば、前記アミノ酸配列を商業的な量で製造することができる。このように、上記選択及び増殖技術は、従来の様式で採集されるトランスジェニックを複数与える。組換えアミノ酸配列を発現する植物の種子は、商業的な工程に使用することができ、又は前記アミノ酸配列は抽出することができる。種子そのものを使用する場合には、例えば、種子を粉末にした後、商業的な工程に適用することができる。バイオマスからの抽出は、公知の方法によって行うことができる。任意の製造系に対する後処理プロセスとは、製品合成後（本ケースでは、トランスジェニック種子でのタンパク質の産生）の全ての単位操作を表す（Ｋｕｓｎａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  ５６：  ４７３−４８４）。種子は、種子全体をすりつぶして粉末として加工されるか、又は分画されて、外皮及び胚乳から胚が分離される。胚を使用する場合、ヘキサン抽出を用いて脱脂するのが通常であり、残りの圧搾された胚をすりつぶして粗挽き粉又は粉末にする。幾つかのケースでは、胚は直接使用されるか、又はアミノ酸配列を抽出することができる（例えば、ＷＯ  ９８／３９４６１号を参照。）。組換えアミノ酸配列の抽出を増大させ、野生の種子タンパク質の抽出を最小限に抑えるために、特定のｐＨの水性緩衝液中に抽出するのが一般的である。引き続き、アミノ酸配列の濃縮又は精製を行うことができる。
【００３８】
さらなる実施形態では、一旦形質転換が起こったら、他の植物に遺伝子を導入するために、植物育種を使用することができる。これは、例えば、上述されているトランスジェニック植物を別の植物と他花授粉すること、及び前記アミノ酸配列を発現する植物を後続世代から選別することなど、植物育種について本分野で公知の任意の手段によって達成することができる。本明細書で使用される植物育種法は、当業者に周知である。植物育種技術の考察については、「Ｐｏｅｈｌｍａｎ  （１９８７）  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｒｏｐｓ，  ＡＶＩ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏ．，  Ｗｅｓｔｐｏｒｔ  Ｃｏｎｎ．」を参照されたい。本方法において有用な多くの穀類植物は、植物の受粉法を活用する技術によって品種改良される。ある花の花粉が同じ植物の同じ花又は別の花に移動されると、植物は自家受粉する。別の植物の花から花粉が来れば、植物は他花授粉される。例えば、アブラナでは、通常、植物は自家不稔性であり、変異体を発見し、又は遺伝的な介入を行うことによって、自家和合性を取得しなければ、他花受粉しかすることができない。コメ、オート麦、小麦、大麦、エンドウ豆、豆、大豆、タバコ及び綿などの自家受粉する種では、雄性植物と雌性植物が解剖学的に並列されている。天然受粉の間、ある花の雄性生殖器官が同じ花の雌性生殖器官を受粉する。トウモロコシ植物（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）は、自家受粉及び他花受粉の両技術によって、品種改良することができる。トウモロコシは、房に位置する雄花と穂に位置する雌花を同じ植物上に有している。トウモロコシは、自家受粉又は他花受粉することができる。
【００３９】
受粉は、手、風若しくは昆虫による受粉又は稔性の雄性植物と不稔性の雄性植物との機械的な接触など、任意の手段によって行うことができるが、これらに限定されるものではない。多くの植物種で商業的な規模で雑種種子を製造する場合、風又は昆虫による受粉が好ましい。一方の植物プールを不稔性の雄性花粉供与体とし、他方を稔性の雄性花粉供与体とするための様々な方法を使用することによって、受粉過程をさらに厳格に調節することができる。これは、手で房を除去すること、細胞質雄性不稔又は熟練した育種家に周知の様々な方法を通じた雄性不稔の調節によって行うことができる。さらに高度な雄性不稔系の例には、Ｂｒａｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６５４，４６５号及び第４，７２７，２１９号、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，８５９，３４１号及び第６，０１３，８５９号に記載されているものが含まれる。
【００４０】
遺伝子を植物に導入するために、戻し交雑法を使用し得る。この技術は、植物に形質を導入するために、何十年にもわたって使用されてきた。周知であるこの植物育種法及びその他の植物育種法についての記述例は、「Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ    Ｎｅａｌ  Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９８８）」などの参考文献に見出すことができる。典型的な戻し交雑のプロトコールでは、対象となる原変種（反復親）を、転移させるべき目的の単一遺伝子を保有する別の変種（一回親）に交雑させる。次いで、この交雑から得られた子孫を再度反復親と交雑し、一回親に由来する転移された単一遺伝子に加えて、変換された植物中に、反復親の所望の形態的及び生理的特性が実質的に全て回復された植物が得られるまで、この過程を繰り返す。
【００４１】
植物由来の組換えアミノ酸配列を魚に投与する好ましい方法は、必要に応じて組換えアミノ酸配列を従来の飼料に混合することによって、経口的に与えることである。投与の別の方法には、浸漬、腹腔内注射及び筋肉内注射が含まれる。
【００４２】
トランスジェニック植物組織は、魚に餌として与えるか、又は他の物質と混合して、魚に餌として与えるか、又は抽出して魚に投与することができる。
【００４３】
ワクチンの経口送達形態には、前記組換えアミノ酸配列と一又は複数の賦形剤及び必要に応じて加えられる一又は複数の栄養素との任意の組み合わせが包含される。本明細書で使用される賦形剤には、シリカ、結合剤、エマルジョン、界面活性物質、脂肪酸、脂肪、油など、及び組成物を調製するために必要とされる他の任意の添加物を含み得る。
【００４４】
典型的な魚用飼料は、代謝可能なエネルギー源（炭水化物）、タンパク質源、脂肪源、並びに必要に応じて加えられる繊維、ビタミン及びミネラルなど、様々な栄養源を含むことができる。前記飼料の正確な組成は、当該魚の種類、特に魚が肉食性であるか否かに依存する。商業的規模では、飼料は、圧縮又は押し出された食物ペレットの形態で、都合よく与え得る。植物由来の組換えアミノ酸配列は、より一般的なタンパク質源（魚粉、血粉、トウモロコシのグルテン、大豆粕など）の代わりに、食餌中に取り込ませることができる。あるいは、植物由来の組換えアミノ酸配列は、予め形成された魚用飼料の表面に付着させ得る。
【００４５】
前記植物由来の組換えアミノ酸配列は、経口送達用に腸溶コーティングを施し得る。腸溶コーティングは、プロテアーゼ及び胃の比較的低いｐＨレベルからワクチンを保護する。これによって、ワクチンは、リンパ系組織を伴う後腸に到達することが可能となり、ワクチンが魚を保護する有効性が最大化される。腸溶コーティングは、酸性ｐＨによって影響を受けないが、腸のさらに高いｐＨ環境を通過すると溶解されるポリマーコーティングを含むのが通例である。
【００４６】
好ましい実施形態において、前記植物由来の組換えアミノ酸配列は、植物の種子、葉、果実、茎、塊茎などのトランスジェニック植物素材の形態で魚に投与され、好ましくは、トランスジェニック植物素材は、他のいかなる飼料にも混合されない。別の実施形態では、前記植物由来の組換えアミノ酸配列は、魚に餌を与える直前に、予め形成された魚用食餌と物理的に（可逆的に）混合される。
【００４７】
不必要な抽出操作を避けるために、前記植物由来の組換えアミノ酸配列は精製されていない（未精製）形態で魚に送達することが好ましい。これは、組換えアミノ酸配列を抽出又は濃縮するために、原料植物の食用部分が特別に処理又は加工を受けていないことを意味する。
【００４８】
ワクチンの有効用量は、被検体の大きさ及び種並びに投与の様式に応じて変動し得る。最適な用量は、獣医又は養殖専門家が試行錯誤を通じて決定することができる。ワクチンは、単一の投薬量中に、約１ないし１０００μｇ、好ましくは約１０ないし２００μｇ、さらに好ましくは約５０ないし１００μｇの組換えアミノ酸配列を含み得る。
【００４９】
本発明のワクチンは、予防又は治療目的のために、魚に投与し得る。本ワクチンは、標的伝染性疾患に対して長期的な保護を誘導することができる。魚の場合に「長期的な」保護とは、ワクチン接種後から７日を超える、より好ましくは２０日を超える、最も好ましくは７０日を超える防御免疫反応を意味する。
【実施例１】
【００５０】
植物へのアビジンの形質転換及び発現レベルの検出
植物中にアビジンを発現させるためのプラスミドの構築
トウモロコシにアビジンを形質転換させるためのプラスミドの構築は、米国特許第５，７６７，３７９号に記載されており、参考文献として本明細書に組み込まれる。ニワトリの卵白アビジンｃＤＮＡは、「Ｇｏｐｅ  ＭＬ．  （１９８７）  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：  ３５９５−３６０６」によって報告された。好ましいトウモロコシコドンの使用表（ＧＣＧ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学のＭｉｋｅ  Ｃｈｅｒｒｙが編纂）を用いて、アミノ酸配列を逆翻訳して核酸配列を得る。コンピュータによって生成されたこの合成配列から、適合性のある制限部位末端を備えた重複する相補的オリゴヌクレオチドを設計し、次いで、アニーリングを行い、連結させて、トウモロコシに対して最適化された遺伝子を得る。使用した配列は、’３７９特許に記載されており、参考文献として本明細書に組み込まれる。トウモロコシの好ましいコドンを用いて（重複する相補的ヌクレオチドを使用して）、大麦α−アミラーゼシグナル配列（Ｒｏｇｅｒｓ，  （１９８５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０，  ３７３１−３７３８）も合成する。大麦α−アミラーゼシグナル配列がアビジン遺伝子の５’末端に位置し、翻訳中にコドンが正しく使用されて所望の抗原が得られるように、適切なフレーム配置で、これら２つの遺伝子断片間にある適合性制限部位を連結する。得られた大麦α−アミラーゼシグナル配列／アビジンセグメントを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、ベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の製品）中にクローニングして（図１（配列番号１）を参照）、プラスミドｐＰＨＩ５１４２を得る。大麦αアミラーゼシグナル配列／アビジン領域を含有するＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ断片を単離し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）から得られたプラスミド中に、骨格としてクローニングする。このプラスミドでは、トウモロコシのユビキチンプロモーター（ＵＢＩ１ＺＭ）、第一のエキソン及び第一のイントロンを含む、トウモロコシユビキチン５’領域と、ポテトプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ（ＰｉｎＩＩ）転写終結領域（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ，  （Ｊａｎｕａｒｙ  １９８９（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１１５−１２２）の間に、正しい配向性で、シグナル配列／アビジン遺伝子断片が挿入されている。得られたプラスミドは、ｐＰＨＩ５１６８である（図２）。該プラスミドと共形質転換されるのは、二重３５Ｓプロモーター（例えば、Ｆｒｉｚ，  Ｓ．Ｅ．Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ９８：５４５−５５０）に連結されたストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のｂａｒ遺伝子（上記及びＷｈｉｔｅ  Ｊ．（１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：１０６２）、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子由来のイントロン（Ｃａｌｌｉｓ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １：１１８３−１２００）及びＰｉｎＩＩターミネーター（Ａｎ  Ｇ．  ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １  ：  １１５−１２２）を含有するプラスミド（ｐＰＨＩ６１０）である。���用されるこれらの構築物及び工程は、上記’３７９特許に完全に記載されている。’３７９特許に記載されている実験では、ｂａｒ遺伝子が使用されており、本明細書に記載されている他の実験では、トウモロコシに対して最適化されたｐａｔ遺伝子が使用されていることに留意されたい。図３は、この配列（配列番号２）を示す。
【００５１】
アビジン発現植物を作製するための形質転換及び組織培養
ヘリウム粒子加速装置ＰＤＳ１０００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いた微粒子銃による形質転換を使用して、“Ｈｉ  ＩＩ”トウモロコシ植物の単一の未成熟胚に由来する確立されたカルス株（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＣＬ，  Ｇｒｅｅｎ  ＣＥ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＲＬ  （１９９１）  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎ．  Ｃｏｏｐ．  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，  ６５：  ９２−９３）を形質転換する。Ｈｉ  ＩＩは、形質転換が容易であるため、研究で多用されるトウモロコシ植物の系統である。Ｔｏｍｅｓらの操作（Ｔｏｍｅｓ  ＤＴ，  Ｒｏｓｓ  ＭＣ，  Ｓｏｎｇｓｔａｄ  ＤＤ  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｐｐ．１９７−２１３）に従い、アビジン遺伝子（ｐＰＨＩ５１６８）とｂａｒ選択可能マーカー遺伝子（ＰＨＰ６１０）の等モル量で共形質転換する前に、７１０ｍメッシュを通して、脆いＩＩ型胚形成形態を示す組織を篩にかける。Ｒｅｇｉｓｔｅｒらのプロトコール（Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  Ｊ．Ｃ．−ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５：９５１−９６１）に従って、ビアラホス（３ｍｇ  Ｌ−１）の存在下で、ｂａｒ遺伝子を発現する形質転換体を選択する。選択されたコロニーのＥＬＩＳＡスクリーニングによって、アビジン遺伝子も発現している共形質転換体を同定する。アビジンを発現しているコロニーから複数の植物（Ｔ０世代）を再生し、温室に移し、葉組織中のアビジン発現についてアッセイを行う。Ｔ０植物を雌親とし、非形質転換近交系（ＰＨＮ４６；米国特許第５，５６７，８６１号）を雄親とした異系交配によって、Ｔ１種子を取得する。
【００５２】
トウモロコシ中のアビジンを検出するためのＥＬＩＳＡ
種子中のアビジンの発現を検出するために、以下の操作を使用する。種子を粉末化し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ  ７．０（ＰＢＳＴ）中に抽出する。ＢｒａｄｆｏｒｄマイクロタイターアッセイＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｍ．  １９７６．  Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：２４８−２５４）を用いて、総タンパク質を定量した。ＥＬＩＳＡは、マイクロタイタープレートがウサギ抗アビジン抗体で覆われ、アビジンタンパク質が４℃で一晩捕捉され、プレートをヤギ抗アビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）と反応させた後、抗ヤギアルカリホスファターゼ包合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と反応させる、典型的なサンドイッチスタイルである。パラ−ニトロフェニルリン酸でアルカリホスファターゼを検出し、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上で４０５ｎｍを読み取る。
【実施例２】
【００５３】
植物中へのＬｔＢの形質転換及び発現の検出
ＬｔＢの配列と植物中への導入は、米国特許第６，１９４，５６０号に記載されており、本実験ではこの配列と方法が使用され、米国特許第６，１９４，５６０号は参考文献として本明細書に組み込まれる。ここで使用されるベクターは、’５６０特許に記載されているベクターとは、幾つかの点が異なる。このベクターは、ＰＧＮ７１０１であり、図４に示されている。コドンの使用をトウモロコシに対して最適化するために、ヒト由来のＥ．コリ株のＬｔＢ遺伝子（Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｉｓｔｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｏｒｉｇｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  Ａｐｒ；  ４８（１）：７３−７）を合成する（図５Ａを参照（配列番号３）。）。該遺伝子を包含するオリゴヌクレオチドにアニーリングを行い、連結し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、産物を増幅する。ＰＣＲを用いて、ＬｔＢのＮ末端に大麦α−アミラーゼ分泌シグナル（ＢＡＡＳＳ）をコードするオリゴヌクレオチド配列を付加し、この完全なＢＡＡＳＳ：ＬｔＢ配列断片をベクター骨格中に挿入すると、プラスミドＰＧＮ５４３１が得られる。ＢＡＡＳＳ：ＬｔＢ配列は、図５Ｂに示されている（配列番号４）。制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｐａＩを用いて、ＰＧＮ５４３１からＢＡＡＳＳ：ＬｔＢ配列を取り出し、ベクターＰＧＮ２７７４中の対応する制限部位に連結すると、中間体ベクターＰＧＮ７０２０が得られる。この中間体ベクターでは、ＢＡＡＳＳ：ＬｔＢは、トウモロコシの構成的プロモーター及びユビキチン制御系から得られるＰＧＮｐｒ１（野生型トウモロコシポリユビキチン−１）と命名された翻訳されないリーダー配列の３’に配置され、ポテトプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ転写ターミネーター（ＰｉｎＩＩ）の５’に配置される。制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩを用いて、ＰＧＮ７０２０から、ＢＡＡＳＳ：ＬｔＢ発現カセット（プロモーター、リーダー、ＢＡＡＳＳ：ＬｔＢ及びＰｉｎＩＩ配列）を取り出し、植物形質転換ベクターＰＧＮ３７７０中の対応する部位に連結する。ＰＧＮ７１０１と称される最終ＢＡＡＳＳ：ＬｔＢ形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミド由来の左右の境界配列と、グルホシナート・アンモニウムに対する耐性を与える、ストレプトミセス・ビリジクロモジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）のｐａｔ遺伝子とを含有する。
【実施例３】
【００５４】
植物へのＩＰＮＶの形質転換及び発現の検出
伝染性膵壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）は、軟体動物、甲殻類及び多種の魚、特にサケ科の魚に伝染する。ＩＰＮＶ感染は、稚魚又は２年子の段階で魚を死亡させ、生き残った集団の成長も減少させるので、サケ科の魚の生産に壊滅的な影響を与え得る。このウイルスに対して有効なワクチンを製造しようとする数多くの試みが為されてきた。これまでのところ、注射された不活化ウイルスを用いた場合にのみ保護が観察されているが、このワクチンは、高価で、実用的でないことが明らかとなっている。該ウイルスの主要な構造的及び免疫原性タンパク質であるＶＰ２及びＶＰ３が、上記の方法を用いてトウモロコシ中で発現される。
【００５５】
まず、それぞれ、プラスミドｐＵＫ−ＮＶＰ２及びｐＵＫ−ＮＶＰ３から、ＶＰ２及びＶＰ３に対するヌクレオチド配列を取得する。これら２つのプラスミド中のタンパク質に対する配列は、Ｎ１株と近縁関係にあるノルウェーＩＰＮＶ株から得られる。トウモロコシに対してコドンの使用を最適化するために、遺伝子配列の５’及び３’末端に対して幾つかのヌクレオチド修飾を施す。
【００５６】
コドンを最適化するためのヌクレオチドの変更に加えて、ｐＵＫ−ＮＶＰ２中のＶＰ２遺伝子から喪失されている５’ＶＰ２配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｐＵＫ−ＮＶＰ２から得られるＶＰ２配列の５’末端にアニールさせる。ポテトプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ転写終結因子（ＰｉｎＩＩ）（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  （１９８９）  １：  １１５−１２２）から得られる配列とともに、ＶＰ２の３’末端の、コドンを最適化するためのヌクレオチド変化をコードするオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲを用いて、ｐＵＫ−ＮＶＰ２から得られるＶＰ２配列の３’末端に付加する。制限酵素ＳｃａＩＩ及びＢｂｓＩを用いてｐＵＫ−ＮＶＰ２から単離された、内部ＶＰ２断片とともに、これら２つのＰＣＲ断片を互いに連結して、図６に示されている完全なＶＰ２ヌクレオチド配列（配列番号５）を含有するプラスミドＰＧＮＫ５６７６を得る。
【００５７】
ＰＣＲを用いて、回復されたＶＰ２遺伝子のＮ末端に、大麦α−アミラーゼ分泌シグナル（ＢＡＡＳＳ）をコードするオリゴヌクレオチド配列を付加する。ＰＣＲから生成された断片をベクター骨格中に入れると、図７に示されているＢＡＡＳＳ：ＶＰ２ヌクレオチド配列（配列番号６）を含有するプラスミドＰＧＮＫ５４４３が得られる。
【００５８】
トウモロコシに対してコドンを最適化するヌクレオチドの変化をコードするオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲを用いて、ｐＵＫ−ＮＶＰ３から得られるＶＰ３配列の５’及び３’両末端にアニールする。
【００５９】
ＰＣＲ断片をベクター骨格に入れ、図８に示されている部分的に最適化されたＶＰ３配列（配列番号７）を含有するプラスミドＰＧＮＫ５５８１を与える。ＰＣＲを用いてＶＰ３のＮ末端に、ＢＡＡＳＳをコードするオリゴヌクレオチド配列を付加する。ＰＣＲ断片をベクター骨格中に入れると、図９に示されているＢＡＡＳＳ：ＶＰ３配列（配列番号８）を含有するプラスミドＰＧＮＫ５３３０が得られる。
【００６０】
それぞれがＶＰ２及びＶＰ３に対する遺伝子を両方含有している２つの別個の植物形質転換ベクターを構築する。第一の構築物は、それぞれ、トウモロコシ種子の好ましいプロモーター（ＰＧＮｐｒ２と称される。）とＰｉｎＩＩターミネーターとを含有する別個の発現カセット中にＢＡＡＳＳ：ＶＰ２及びＢＡＡＳＳ：ＶＰ３に対する配列を含有する。制限酵素ＮｃｏＩ及びＰａｃＩを用いて、ＰＧＮＫ５４４３からＢＡＡＳＳ：ＶＰ２配列を切断する。ＰｉｎＩＩターミネーターと、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来する左右の境界配列と、グルホシナート・アンモニウムに対する耐性を与えるストレプトミセス・ビリジクロモジェネスのｐａｔ遺伝子とを含有するＰＧＮ９００４植物形質転換ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＰａｃＩ制限部位に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで切断されたＰＧＮｐｒ２断片とともに、この断片を連結する。このプラスミドをＰＧＮＫ５４６１と称する。同様の方法で、ＮｃｏＩ及びＰａｃＩを用いて、ＰＧＮＫ５３３０からＢＡＡＳＳ：ＶＰ３配列を切断する。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ  ＰＧＮｐｒ２断片とともに、この断片を、ＰＧＮ９００４のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰａｃＩ部位に連結して、プラスミドＰＧＮＫ５３３５を得る。制限酵素ＡｓｃＩとＰａｃＩを用いて、ＰＧＮＫ５４６１から、ＰＧＮｐｒ２プロモーター、ＢＡＡＳＳ、ＶＰ２及びＰｉｎＩＩターミネーターを含有するＢＡＡＳＳ：ＶＰ２発現カセットを切断する。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｌｕＩを用いて、ＰＧＮｐｒ２プロモーター、ＢＡＡＳＳ、ＶＰ３及びＰｉｎＩＩターミネーターを含有するＢＡＡＳＳ：ＶＰ３発現カセットを、ＰＧＮＫ５３３５から切断する。ＰＧＮ９００４のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰａｃＩ制限部位にこれら２つの断片を連結すると、ＢＡＡＳＳ：ＶＰ２及びＢＡＡＳＳ：ＶＰ３発現カセットを両方含有する最終植物形質転換ベクターが得られる。ＰＧＮ９０８４と表記されるこの構築物（図１０）は、前記タンパク質が細胞壁へ送られ、主として種子の中に蓄積するように設計されている。次いで、上述のＩｓｈｉｄａプロトコールの変法に従って、植物を形質転換する。ＰＧＮ９０８４の形質転換から得られる植物は、ＮＶＡと表記される。
【００６１】
第二の植物形質転換ベクターも、ＰＧＮｐｒ２プロモーター及びＰｉｎＩＩターミネーターの制御下にある別個の発現カセット中にＶＰ２とＶＰ３をともに含有するが、大麦α−アミラーゼ分泌シグナル（ＢＡＡＳＳ）が存在しない。ＢｓｔＢＩ制限部位に至るまで（ＢｓｔＢＩ制限部位を含む。）のＶＰ２配列の５’部分を、制限酵素ＢｂｓＩ及びＢｓｔＢＩを用いて、ＰＧＮＫ５５７３から切断する。この断片とＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ  ＰＧＮｐｒ２断片を、ＰＧＮＫ５４６１中のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｔＢＩ部位に連結して、ＶＰ２発現カセットを含有するプラスミドＰＧＮＫ５６７６を得る。制限酵素ＮｃｏＩ及びＰａｃＩを用いて、ＰＧＮＫ５５８１からＶＰ３配列を切断する。この断片とＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ  ＰＧＮｐｒ２断片を、ＰＧＮ９００４のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰａｃＩ部位に連結して、ＶＰ３発現カセットを含有するプラスミドＰＧＮＫ５６８１を得る。制限酵素ＡｓｃＩ及びＰａｃＩを用いて、ＰＧＮＫ５６７６からＶＰ２発現カセットを切断する。酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｌｕＩを用いて、ＰＧＮＫ５６８１からＶＰ３発現カセットを切断する。ＰＧＮ９００４のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰａｃＩ制限部位にこれら２つの断片を連結すると、ＶＰ２及びＶＰ３発現カセットをともに含有する最終植物形質転換ベクターが得られる。ＰＧＮ９１１１と表記されるこの構築物（図１１）は、前記タンパク質が細胞質へ送られ、主として種子の中に蓄積するように設計されている。ＰＧＮ９１１１の形質転換から得られる植物は、ＮＶＢと表記される。
【００６２】
ポリクローナル抗ＩＰＮＶ完全ウイルス抗体を用いたウェスタンブロット分析は、ＮＶＡ及びＮＶＢ種子の両方に、タンパク質ＶＰ２及びＶＰ３が発現されていることを示す。ＮＶＡ種子中に発現されるＶＰ２及びＶＰ３タンパク質は、ＩＰＮＶ完全ウイルス標準に見出される、対応する固有のタンパク質に比べて、ウェスタンブロット上で若干大きく走行する（図１２）。レーン１はタンパク質マーカー、レーン２−４はＩＰＮＶ完全ウイルスの精製調製物、レーン５は対照トウモロコシ種子抽出物（陰性対照）、レーン６−１１は様々なＮＶＡ種子から得られる抽出物、及びレーン１２はＩＰＮＶ完全ウイルスの非精製調製物を示している（注意、完全ウイルスの精製過程は、それらのウェルの上部に尾を引いた塗沫状のパターンを与える。）。
【００６３】
ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質は、ＢＡＡＳＳによって、ＮＶＡ種子中の細胞壁に誘導されるので、これらのタンパク質はグリコシル化されると予想される。理論に拘泥することを望むものではないが、両タンパク質のサイズのこのような増加は、植物中における該タンパク質のグリコシル化を示唆していると考えることができる。ＮＶＢ種子中に発現されるＶＰ２及びＶＰ３は何れも、ＩＰＮＶ完全ウイルス標準に比べて、ウェスタンブロット上で、予想サイズの箇所に走行する（図１３）。レーン１はタンパク質マーカー、レーン２はＮＶＡ種子からの抽出物、レーン３−９は様々なＮＶＢ種子からの抽出物、１０−１２は漸増量の非精製ＩＰＮＶ完全ウイルスを示している。
【００６４】
これらのタンパク質は植物細胞の細胞質中に発現されるので、タンパク質の修飾は全く起こらないと予想される。
【００６５】
ＮＶＡ種子中のＶＰ２及びＶＰ３の発現レベルは、ウェスタンブロットによって測定される。スポットデンシトメトリーを用いて、種子抽出物から得られるＶＰ２及びＶＰ３タンパク質バンドの強度を測定し、次いで、既知量の完全ウイルスのバンドと比較する。この方法を用いると、ＮＶＡ  Ｔ２種子中でのＶＰ２の発現は０．１％ＴＳＰ（総可溶性タンパク質）と算出され、ＮＶＡ  Ｔ２種子中でのＶＰ３の発現は０．３％ＴＳＰと算出される。ＮＶＢ種子中のＶＰ２の発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定される。ＥＬＩＳＡは、マイクロタイタープレートがヒツジ抗ＩＰＮＶ完全ウイルス抗血清で覆われ、植物抽出物中のＩＰＮＶタンパク質が４℃で一晩捕捉され、プレートをＡＳ１マウスモノクローナル抗ＶＰ２抗体と反応させた後、アルカリホスファターゼが包合されたヒツジ抗マウスＩｇＧと反応させる、典型的なサンドイッチスタイルである。アルカリホスファターゼは、パラニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ｐＮｐｐ）を用いて検出し、吸光度マイクロプレートリーダー上で４０５ｎｍを読み取る。この方法を用いると、ＮＶＢ  Ｔ１種子中のＶＰ２の発現は、最も高い単一の種子で、０．１７％ＴＳＰと測定される。
【実施例４】
【００６６】
アビジン及びＬｔＢを用いた給餌研究
この新しい技術を魚で評価するために、この実験は、トウモロコシによって発現された組換えマーカータンパク質を含有する食餌の経口投与によって液性免疫反応がサケ科の魚に誘導されるかどうかを決定するように設計される。大西洋サケに、１日当り体重の約２％の量で、ＬｔＢ（餌の５％又は１０％）又はニワトリ卵白アビジン（餌の１０％又は２０％）を発現している２種類の用量の未精製トウモロコシを含有する食餌を５日間、正常な食餌を１２日、それから処理された食餌を５日与える。魚の群には、精製されたＬｔＢとアビジンタンパク質も、陽性対照として腹腔内注射する。
【００６７】
魚の成長、糞便中の組換えタンパク質の残留及び液性免疫反応を調べる。ＬｔＢ（マウスに強い抗体反応を生じさせ得ることが以前に示されている。）及びアビジン（マウスでは、ＬｔＢより弱い抗原であることが以前に示されている。）の様々な量に対して、魚の抗体反応を比較する。
【００６８】
大西洋サケの体重は、それぞれ約２０ｇである。幾つかの陰性対照群と陽性対照群を有する計１１の処理群が存在する（表１）。それぞれ１０匹の魚からなるＡ及びＢ陽性対照群には、油性アジュバントを加えた調製物を腹腔内注射する。群Ａには、一匹の魚当り４μｇのＬｔＢタンパク質を単回注射し、群Ｂには、一匹の魚当り２０μｇのアビジンタンパク質を単回注射するが、何れも、トウモロコシの発現系から精製された組換えタンパク質である。９つの群はそれぞれ３５匹の魚を含み、群ＣないしＧは陰性対照である。群Ｃには、市販の魚用ペレットを与える。群Ｄには、５％の非トランスジェニックトウモロコシ胚を含むペレットを与える。群Ｅには、１０％の非トランスジェニックトウモロコシ胚を含むペレットを与える。群Ｆには、１０％の非トランスジェニックトウモロコシ粉末を有する魚粉で作ったペレットを与え、群Ｇには、２０％の非トランスジェニックトウモロコシ粉末を有するペレットを与える。実験群では、群Ｈには、５％のＬｔＢトランスジェニックトウモロコシ胚を有する魚用ペレットを与え、群Ｉには、１０％のＬｔＢトウモロコシ胚を有するペレットを与える。群Ｊには、１０％のトランスジェニックアビジン含有粉末を有するペレットを与え、群Ｋには、２０％のアビジン粉末を有するペレットを与える。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
＊油性アジュバント中に４μｇの精製された組換えＬｔ−Ｂ（群Ａ）又は２０μｇのアビジン（群Ｂ）を含有する０．１ｍＬのＰＢＳを、それぞれの魚に腹腔内（ｉｐ）注射する。
【００７１】
魚は、１０℃で飼育する。給餌から２日後、４日後、７日後、１４日後及び２１日後に、ＥＬＩＳＡを用いて、糞便中に残存する組換えタンパク質を測定するために、９つの食餌群Ｃ−Ｋに属する５匹の魚を屠殺する。８週目に、全１１群の魚１０匹を屠殺し、体重を測定し、ＥＬＩＳＡによって、血清中の特異抗体を測定する。
【００７２】
糞便中のマーカータンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡは、ウサギ抗アビジン又は抗ＬｔＢ抗体を用いて、４℃で一晩、マイクロタイタープレートを被覆する典型的なサンドイッチスタイルである。ＰＢＳＴ中に希釈された魚の糞便試料をウェルに添加し、アビジン又はＬｔＢタンパク質を補足するために、プレートを４℃で一晩インキュベートする。このプレートを、ヤギ抗アビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）又はマウスビオチン化ＬｔＢ抗体とともに反応させた後に、抗ヤギアルカリホスファターゼ包合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）又はＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．，  Ｏａｋｄａｌｅ，  ＯＮ）と反応させる。アルカリホスファターゼは、パラニトロフェニルリン酸（Ｐｉｅｒｃｅ，  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒ  ＭＪＳ  Ｂｉｏｌｙｎｘ  Ｉｎｃ．，  Ｂｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＯＮ，  Ｃａｎａｄａ）を用いて検出し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，  Ｖｅｒｍｏｎｔ）上で４０５ｎｍを読み取る。
【００７３】
魚の血清中の抗アビジン及び抗ＬｔＢ特異抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ：
魚の血清中の特異抗体を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する。精製ＬｔＢ又はトウモロコシに発現された精製アビジン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、４℃で一晩、プレートウェルを被覆し、ＰＢＳＴ−１％  ＢＳＡ中の魚血清の２倍希釈液を添加し、１７℃で一晩プレートをインキュベートして、魚の抗体を捕捉させる。一次抗体、モノクローナル抗大西洋サケＩｇ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，  ＯＮ，  Ｃａｎａｄａ）をプレートに添加し、次いで、アルカリホスファターゼで標識された抗マウスＩｇ二次抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）（両抗体ともに、ＰＢＳＴ−１％ＢＳＡ中に希釈されている。）をプレートに添加する。パラニトロフェニルリン酸基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した後、マイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、４０５ｎｍの吸光度を読み取る。抗体力価は、終末点希釈として算出する。
【００７４】
２つのマーカータンパク質を発現する粉砕されたトウモロコシを食餌に添加しても、図１４に示されているように、魚の成長には影響を与えない。表２に示されているように、２つのマーカータンパク質は、長期間にわたって（処理された食餌の給餌を中止してから少なくとも２１日後まで）、糞便中に検出することができる。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
マーカータンパク質の経口投与は、液性免疫反応を誘導する。ワクチン接種から８週後には、陰性対照群の魚のみが、検出可能な特異的血清抗体反応を有さない。トウモロコシによって発現される非精製マーカータンパク質を与えた魚の抗体反応は、図１５に示されているように、油性アジュバント中の純粋なタンパク質を注射された魚の抗体反応と同程度の強さである。
【実施例５】
【００７７】
ＩＰＮＶを用いた給餌研究
伝染性膵壊死ウイルスＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を含有するトウモロコシの給餌に記載された方法が遂行されるであろう。動物の糞便及び臓器中にウイルスタンパク質並びに抗体反応が存在すると予想される。毒性ウイルスで魚を攻撃誘発すると、トウモロコシによって発現されたＩＰＮＶタンパク質の経口投与が保護を与えると予測される。
【００７８】
魚を７つの群に分けて、識別のためにタグを付ける。陽性対照群Ａは、ＩＰＮＶに対する保護を誘導する市販のワクチンを注射された魚からなり、陰性対照群Ｂは、市販の食餌ペレットを与えられるであろう。表３に概説されているように、残りの群は、発現されたＩＰＮＶタンパク質を加えたトウモロコシ胚及び加えないトウモロコシ胚を含有する食餌を５日間、通常の食餌を１２日間、トウモロコシ胚を含有する食餌を５日間与える。食餌へのトウモロコシ胚の導入率（ｇトウモロコシ／ｇ食餌）は、１０％及び２０％であろう。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
ワクチン接種から４週後、数日間、全ての魚を塩水に慣らし、次いで、流動する塩水中において周温（９−１２℃）で飼養するであろう。塩水に移動させてから５週後に、共同生活状態でＩＰＮＶの攻撃誘発に魚を曝露させるであろう。未処置の魚に生きたＩＰＮＶを注射し、ワクチン接種された魚を含有するタンクに加えるであろう。毎日の死亡率を５週間にわたってモニターするであろう。
【００８１】
ワクチン接種から１ないし５週後に毎週及び攻撃誘発の時点で、群ＣないしＧ当り５匹の魚を屠殺して、ＩＰＮＶタンパク質の残存と分布を調べるために糞便及び臓器を採取するであろう。魚（群Ａ及びＢに属する５匹の魚を含む。）を攻撃誘発の時点で屠殺し、出血させて、ＥＬＩＳＡによって血清の抗体を調べるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、アビジン成熟タンパク質をコードする配列に融合された大麦α−アミラーゼ配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、ｐＰＨＩ５１５８のプラスミドマップである。
【図３】図３は、トウモロコシに対して最適化されたｐａｔ配列（配列番号２）を示す。
【図４】図４は、ＰＧＮ７１０１のプラスミドマップである。
【図５Ａ】図５Ａは、トウモロコシに対してコドンが最適化されたＬｔＢのヌクレオチド配列（配列番号３）である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＢＡＡＳＳ：ＬｔＢのヌクレオチド配列（配列番号４）である。
【図６】図６は、ＩＰＮＶ  ＶＰ２のヌクレオチド配列（配列番号５）である。
【図７】図７は、ＢＡＡＳＳ：ＶＰ２のヌクレオチド配列（配列番号６）である。
【図８】図８は、ＩＰＮＶ  ＶＰ３のヌクレオチド配列（配列番号７）をある。
【図９】図９は、ＢＡＡＳＳ：ＶＰ３のヌクレオチド配列（配列番号８）である。
【図１０】図１０は、ＰＧＮ９０８４のプラスミドマップである。
【図１１】図１１は、ＰＧＮ９１１１のプラスミドマップである。
【図１２】図１２は、事象ＮＶＡから得られた、種子に発現されたＶＰ２及びＶＰ３タンパク質のウェスタンブロットである。
【図１３】図１３は、事象ＮＶＢから得られた、種子に発現されたＶＰ２及びＶＰ３タンパク質のウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、０の時点（第一のバー）及びワクチン接種から８週後（第二のバー）の時点における、魚の平均重量を示すグラフである。標準誤差を表すバーも示されている。
【図１５】図１５は、トウモロコシ中に発現された組換えアビジン（Ａ）又はＬｔＢ（Ｂ）の注射後又は給餌から８週の時点で、ＥＬＩＳＡによって測定された大西洋サケの平均抗体反応を示すグラフである。バーは、平均の標準誤差を表している。各群で試料を採取した動物の数（Ｎ）が、各群について表示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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