(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満関連疾患の予防または治療用の薬物の調製のための球状OBG3フラグメントの使用であって、該球状OBG3フラグメントが、
（i）配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸104〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸111〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸135〜247、配列番号6のアミノ酸101〜244、配列番号6のアミノ酸108〜244、および配列番号6のアミノ酸132〜244、または
（ii）1以上10以下の保存的アミノ酸置換を有する該球状OBG3フラグメントの変異体、または
（iii）ポリエチレングリコールと結合した、若しくはIgG Fc融合ペプチドの形態での、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸104〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸111〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸135〜247、配列番号6のアミノ酸101〜244、配列番号6のアミノ酸108〜244、および配列番号6のアミノ酸132〜244
からなる群より選択されるものであり、（ii）または（iii）の球状OBG3フラグメントが、食後の脂肪血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、ブドウ糖レベル、遊離脂肪酸の酸化または体重から選択されるパラメータのうち少なくとも1つで変化を引き起こすものであり、（ii）または（iii）の球状OBG3フラグメントにより引き起こされる上記変化は、（i）の球状OBG3フラグメントにより引き起こされる変化と同等である、上記使用。
【請求項２】
肥満関連疾患が、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ボディーマスの減少または体重増加の防止用の薬物の調製のための球状OBG3フラグメントの使用であって、該球状OBG3フラグメントが、
（i）配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸104〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸111〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸135〜247、配列番号6のアミノ酸101〜244、配列番号6のアミノ酸108〜244、および配列番号6のアミノ酸132〜244、または
（ii）1以上10以下の保存的アミノ酸置換を有する該球状OBG3フラグメントの変異体、または
（iii）ポリエチレングリコールと結合した、若しくはIgG Fc融合ペプチドの形態での、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸104〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸111〜247、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸135〜247、配列番号6のアミノ酸101〜244、配列番号6のアミノ酸108〜244、および配列番号6のアミノ酸132〜244
からなる群より選択されるものであり、（ii）または（iii）の球状OBG3フラグメントが、食後の脂肪血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、ブドウ糖レベル、遊離脂肪酸の酸化または体重から選択されるパラメータのうち少なくとも1つで変化を引き起こすものであり、（ii）または（iii）の球状OBG3フラグメントにより引き起こされる上記変化は、（i）の球状OBG3フラグメントにより引き起こされる変化と同等である、上記使用。
【請求項４】
前記保存的アミノ酸置換が、
（a）脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびPheから選択される1つのアミノ酸の、他の脂肪族アミノ酸への置き換え、
（b）ヒドロキシル残基SerとThrとの相互交換、
（c）酸性残基AspとGluとの交換、
（d）アミド残基AsnとGlnとの間での置換、
（e）塩基性残基LysとArgとの交換、または
（f）芳香族残基PheのTyrへの置き換え、もしくは芳香族残基TyrのPheへの置き換え
である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記球状OBG3フラグメントが、配列番号6のアミノ酸101〜244からなるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記球状OBG3フラグメントが、配列番号6のアミノ酸108〜244からなるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記球状OBG3フラグメントまたは変異体がホモ三量体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記球状OBG3フラグメントまたは変異体が、タンパク質分解に耐性がある修飾ペプチド結合を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(技術分野)
本発明は、代謝研究分野に関し、特に、ボディーマスを減少させる上で効果的かつ肥満関連疾患および機能障害の治療に役立つ化合物の発見に関する。本発明の方法によって治療できるのではないかと思われる肥満関連疾患または機能障害としては、高脂質血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病および高血圧症があげられるが、これに限定されるものではない。
【０００２】
(発明の背景)
以下の説明は、本発明に対する理解を容易にすることを意図したものであり、本発明に対する従来技術であると認めることを意図したものではない。
【０００３】
広く一般に見られ、増加しつつある重大な公衆衛生問題に肥満症がある。米国では人口の20%が太りすぎであり、欧州ではこれよりも若干低めの比率で太りすぎの人がいる(Friedman (2000) Nature 404:632-634)。肥満症は、高血圧症、心血管疾患、糖尿病および癌ならびに呼吸器合併症および変形性関節炎のリスクが高くなることと関連している(Kopelman (2000) Nature 404:635-643)。さほど大幅に体重減少しなくても、こうした関連の状態は改善される。
【０００４】
環境、食事、年齢および運動を含むライフスタイル因子が肥満症において何らかの役割を果たしていることは分かっているが、双生児研究、家族凝集性の分析および養子研究ではいずれも、肥満症の大部分は遺伝的因子であることが示されている(Barsh et al (2000) Nature 404:644-651)。これらの研究に一致して、同定される肥満症関連遺伝子の数は増え続けているという事実がある。さらに徹底した研究がなされた遺伝子としては、レプチン(ob)およびその受容体(db)、プロ・オピオメラノコルチン(Pomc)、メラノコルチン-4-受容体(Mc4r)、アグーチタンパク質(Ay)、カルボキシペプチダーゼE(fat)、5-ヒドロキシトリプタミン受容体2C(Htr2c)、不可知（nescient）塩基性ヘリックスループヘリックス2(Nhlh2)、プロホルモンコンバターゼ1IPCSK1)およびTubbyタンパク質(tubby)をコードする遺伝子があげられる(rev'd in Barsh et al (2000) Nature 404:644-651)。
【０００５】
(発明の開示)
本発明は、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントと呼ばれる、全長OBG3ポリペプチドの一部に、人間や他の哺乳動物での体重減量に対する効用および体重増加予防をはじめとするin vitroおよびin vivoでの予想外の作用があるという発見に基づくものである。哺乳動物でのOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメント投与によるこうした予想外の作用には、エピネフリンの投与、イントラリピッドの静脈内注射または高脂肪試験食の投与によって引き起こされた高遊離脂肪酸レベルの低減ならびに筋肉細胞での脂肪酸酸化の亢進、高脂肪/高糖食を摂取した哺乳動物での体重減量も含まれる。一般に全長OBG3ポリペプチドの投与にはin vivoまたはin vitroで何ら効果がないとすれば、これらの作用は予想外かつ驚くべきものである。全長OBG3ポリペプチドの投与後に何らかの作用が観察される程度に作用を得るのに必要な全長OBG3ポリペプチドのレベルから考えて、現時点ではこのポリペプチドを人間用の潜在的な治療薬として実現することはできない。これとは対照的に、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントは、もともと効果が高く、人間での治療において実現可能なレベルで提供することが可能なものである。
【０００６】
したがって、本発明は、OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメント、前記OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド、前記OBG3ポリヌクレオチドおよびgOBG3ポリヌクレオチドを含むベクター、前記OBG3ポリヌクレオチドおよびgOBG3ポリヌクレオチドに対する細胞組換え体ならびに、前記OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントを含む薬学的および生理学的に許容可能な組成物、体重を減少させるまたは肥満関連疾患および機能障害を治療する目的で前記OBG3およびgOBG3の薬学的および生理学的に許容可能な組成物を投与する方法を対象としたものである。肥満症関連活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのアッセイも本発明の一部である。
【０００７】
第1の態様では、本発明は、全長OBG3ポリペプチドよりも有意に大きな活性を有する、精製されたOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメント、単離されたOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメント、または、組換えOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントであって、前記活性が、脂質分配活性、脂質代謝活性およびインスリン様活性からなる群から選択される、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを特徴とするものである。好ましい実施形態では、前記ポリペプチドフラグメントが、配列番号6の6以上238以下の連続したアミノ酸、あるいは、配列番号2または配列番号4の6以上241以下の連続したアミノ酸を含む、本質的に当該アミノ酸からなる、または当該アミノ酸からなるものである。他の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドフラグメントが、配列番号6、配列番号2または配列番号4の対応する連続したアミノ酸に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むものである。
【０００８】
他の極めて好ましい実施形態では、前記ポリペプチドフラグメントが、精製されたgOBG3フラグメント、単離されたgOBG3フラグメントまたは組換えgOBG3フラグメントを含む、本質的に当該フラグメントからなる、または当該フラグメントからなるものである。好ましくは、前記gOBG3ポリペプチドフラグメントは、配列番号6のアミノ酸88〜244のうち少なくとも6の連続したアミノ酸または配列番号2または配列番号4のアミノ酸91〜247のうち少なくとも6の連続したアミノ酸を含む、本質的に当該アミノ酸からなる、または当該アミノ酸からなるものである。あるいは、前記gOBG3フラグメントが、配列番号6の対応するアミノ酸88〜244に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列、あるいは、配列番号2または配列番号4のアミノ酸91〜247に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列からなる、または当該アミノ酸配列からなるものである。
【０００９】
さらに他の好ましい実施形態では、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントは、体内を循環している(i)遊離脂肪酸、(ii)ブドウ糖および/または(iii)トリグリセリドの(血液、血清または血漿)レベル(濃度)を低下させることができる。遊離脂肪酸レベル低下活性、ブドウ糖レベル低下活性および/またはトリグリセリドレベル低下活性を示す、さらに他の好ましいポリペプチドフラグメントは、同一モル濃度の全長OBG3よりも有意に大きい活性を有し、一過性の活性よりも大きい活性を有するおよび/または持続的な活性を有する。
【００１０】
さらに他の好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントに、同一モル濃度の全長OBG3ポリペプチドと比して筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化を有意に刺激するものがある。さらに別の好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントとして、前記フラグメントの存在下で、未処理細胞または全長OBG3で処理した細胞と比して、少なくとも10%、20%、30%、35%または40%多いオレイン酸の酸化を分化C2C12細胞で引き起こすものがあげられる。
【００１１】
さらに別の好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントとして、肝臓株化細胞(好ましくはBPRCLマウス肝細胞(ATCC CRL-2217))でのレプチン取込みにおいて全長OBG3よりも少なくとも30%効率がよいものがあげられる。
【００１２】
さらに他の好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントに、高脂肪食を摂取した後の血漿遊離脂肪酸量の増加を有意に抑えるものがある。
【００１３】
さらに他の好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントとして、高脂肪食を摂取すると生じるケトン体の産生を有意に抑制または排除するものがあげられる。
【００１４】
さらに他の好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントとして、in vitroおよび/またはin vivoにて多量体(ヘテロ多量体またはホモ多量体など)を形成するものがあげられる。好ましい多量体としては、ホモ二量体またはホモ三量体がある。他の好ましい多量体としては、少なくとも4、6、8、9、10または12のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントサブユニットを含むホモ多量体があげられる。他の好ましい多量体として、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを含むヘテロ多量体があげられる。
【００１５】
さらに別の好ましい実施形態は、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを含む異種ポリペプチドを含む。
【００１６】
第2の態様では、本発明は、第1の態様で述べた前記OBG3ポリペプチドフラグメントをコードする、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドまたはその相補体を特徴とするものである。さらに他の実施形態では、かかるポリヌクレオチドが、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、一本鎖および二本鎖である。
【００１７】
第3の態様では、本発明は、第2の態様で述べた前記ポリヌクレオチドを含む、本質的に当該ポリヌクレオチドからなる、または当該ポリヌクレオチドからなる組換えベクターを特徴とするものである。
【００１８】
第4の態様では、本発明は、第3の態様で述べた前記組換えベクターを含む、本質的に当該ベクターからなる、または当該ベクターからなる組換え細胞を特徴とするものである。さらに他の実施形態には、本発明のポリヌクレオチドに対する宿主細胞組換え体が含まれる。
【００１９】
第5の態様では、本発明は、第1の態様で述べた前記OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを含む、本質的に当該ポリペプチドフラグメントからなる、または当該ポリペプチドフラグメントからなる、薬学的または生理学的に許容可能な組成物あるいは薬学的または生理学的に許容可能な希釈剤を特徴とするものである。
【００２０】
第6の態様では、本発明は、ボディーマスを減少させる必要のある個体に、第5の態様で述べた前記薬学的または生理学的に許容可能な組成物を提供または投与することを含む、ボディーマスを減少させる方法を特徴とするものである。
【００２１】
好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容可能な組成物での治療対象となる、ボディーマスを減少させる必要のある前記個体を識別することが、OBG3単一ヌクレオチド多型(SNP)の遺伝子型を判定するか、前記個体から採取した臨床試料においてOBG3ポリペプチドまたはgOBG3ポリペプチドまたはmRNAレベルを測定することを含む。好ましくは、前記臨床試料は、血漿、尿および唾液からなる群から選択される。好ましくは、全長OBG3または自然なタンパク質分解によって切断されたOBG3フラグメントの血中レベル、血清レベルまたは血漿レベルが、健常で太りすぎではない患者の場合と比して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%減少するように、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを個体に投与する。
【００２２】
第7の態様では、本発明は、肥満関連疾患または機能障害の治療が必要になった際に、この治療が必要な個体に、第5の態様で述べた前記薬学的または生理学的に許容可能な組成物を提供または投与することを含む、かかる疾患または障害を防止または治療する方法を特徴とするものである。好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容可能な組成物での治療対象となる、当該治療を必要とする前記個体を識別することが、OBG3単一ヌクレオチド多型(SNP)の遺伝子型を判定するか、前記個体から採取した臨床試料においてOBG3ポリペプチドまたはgOBG3ポリペプチドまたはmRNAレベルを測定することを含む。好ましくは、前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿および唾液からなる群から選択される。好ましくは、前記肥満関連疾患または機能障害が、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。好ましい実施形態では、前記個体が哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００２３】
関連する態様では、本発明の実施形態は、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを含む組成物を個体に提供または投与するステップを含む、個体において所望の生物応答を引き起こすまたは誘導する方法であって、前記生物応答が、
(a)体内を循環している遊離脂肪酸の(血液、血清または血漿のいずれかの)レベル(濃度)を減少させること、
(b)体内を循環しているブドウ糖の(血液、血清または血漿のいずれかの)レベル(濃度)を減少させること、
(c)体内を循環しているトリグリセリドの(血液、血清または血漿のいずれかの)レベル(濃度)を減少させること、
(d)筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化を刺激すること、
(c)肝臓または肝細胞へのレプチン取込み量を増すこと、
(e)高脂肪食を摂取した後の血漿遊離脂肪酸量の増加を抑えること、
(f)高脂肪食を摂取すると生じるケトン体の産生を抑制または排除すること、からなる群から選択され、
前記生物応答が、同一モル濃度の全長OBG3ポリペプチドによって引き起こされるまたは誘導される生物応答と比して、有意に大きいまたは少なくとも10%、20%、30%、35%または40%大きいか、あるいは、前記生物応答が一過性の応答よりも大きいか、あるいは、前記生物応答が持続的である、方法を含む。
【００２４】
第8の態様では、本発明は、第1の態様で述べたOBG3ポリペプチドフラグメントを作出する方法であって、タンパク質分解による切断、組換え法および人工合成からなる群から選択される方法を特徴とするものである。
【００２５】
第9の態様では、本発明は、組換えOBG3ポリペプチドフラグメントまたは組換えgOBG3ポリペプチドフラグメントまたは全長OBG3ポリペプチドの作出方法であって、乳が前記組換えOBG3ポリペプチドフラグメントまたは組換えgOBG3ポリペプチドフラグメントまたは全長タンパク質を含むトランスジェニックな非ヒト哺乳動物を提供し、前記非ヒト哺乳動物の乳から前記組換えOBG3ポリペプチドフラグメントまたは組換えgOBG3ポリペプチドフラグメントまたは前記全長OBG3ポリペプチドを精製することを含む方法を提供するものである。一実施形態において、前記非ヒト哺乳動物は、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはマウスである。もう1つの実施形態では、この方法は、前記乳から組換え全長OBG3ポリペプチドを精製することを含み、前記タンパク質をin vitroにて切断し、所望のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを得ることをさらに含む。
【００２６】
第10の態様では、本発明は、肥満関連疾患および機能障害を治療するおよび/またはボディーマスを減少させるまたは増加させるために、第1の態様で述べたポリペプチドを使用することを特徴とするものである。好ましくは、前記肥満関連疾患および機能障害が、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。
【００２７】
第11の態様では、本発明は、肥満関連疾患および機能障害を治療するおよび/またはボディーマスを減少させるための薬物の調製に、第1の態様で述べたポリペプチドを使用することを特徴とするものである。好ましくは、前記肥満関連疾患または機能障害が、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。好ましい実施形態では、前記個体が哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００２８】
第12の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体を治療する方法で利用される、本発明の第1の態様に記載のポリペプチドまたは本発明の第5の態様に記載の組成物を提供するものである。
【００２９】
第13の態様では、本発明は、美容目的で体重を減少させる方法であって、第5の態様で述べた前記薬学的または生理学的に許容可能な組成物または第1の態様で述べたポリペプチドを個体に提供することを含む方法を特徴とするものである。好ましくは、前記体重を減少させる場合、前記個体のBMIが20以上25以下である。あるいは、前記体重を増大させる場合、前記個体のBMIが15以上20以下であると好ましい。
【００３０】
第14の態様では、本発明は、ボディーマスを減少させるおよび/または肥満関連疾患または機能障害を治療または予防するための、第5の態様で述べた薬学的または生理学的に許容可能な組成物を特徴とするものである。好ましくは、前記肥満関連疾患または機能障害が、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。好ましい実施形態では、前記個体が哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容可能な組成物での治療対象となる前記個体を識別することが、OBG3単一ヌクレオチド多型(SNP)の遺伝子型を判定するか、前記個体から採取した臨床試料においてOBG3ポリペプチドまたはgOBG3ポリペプチドまたはmRNAレベルを測定することを含む。好ましくは、前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿および唾液からなる群から選択される。
【００３１】
第15の態様では、本発明は、美容上の理由で体重を減少させるための第5の態様で述べた薬学的または生理学的に許容可能な組成物を特徴とするものである。
【００３２】
第16の態様では、OBG3またはOBG3ポリペプチドフラグメントが、前記第5の態様で述べた薬学的または生理学的に許容可能な組成物または第1の態様で述べたポリペプチドを個体に提供することを含む、インスリン耐性を治療する本発明特徴方法（invention features methods）である。
【００３３】
本願明細書にて開示し、上記にて述べた方法の好ましい態様において、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントまたはポリヌクレオチドの個体への投与量は、体内を循環しているOBG3ポリペプチドの(血液、血清または血漿のいずれかの)レベル(濃度)を正常なレベル(太りすぎではない個体のレベル)まで減少させるのに十分な量である。「正常なレベル」とは、体内を循環しているすべてのOBG3ポリペプチド(全長OBG3およびそのフラグメント)の総濃度または、体内を循環している、タンパク質分解によって切断されたすべてのOBG3ポリペプチドのみの濃度とすることができる。
【００３４】
(発明の詳細な説明)
本発明を一層詳細に説明する前に、下記の定義によって、本願明細書において本発明を説明する上で用いる用語表現の意味と範囲を示し、定義する。
【００３５】
本願明細書において同義に用いられるものとして、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」という用語は、2つ以上のヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のいずれかで構成されるRNA配列、DNA配列またはRNA/DNAハイブリッド配列を含む。これらの用語は、一例として(a)選択的結合基、(b)プリン類似体、(c)ピリミジン類似体または(d)類似の糖類などであるがこれに限定されるものではない、少なくとも1つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含する。類似の結合基、プリン、ピリミジンおよび糖の一例については、国際特許出願公開第WO 95/04064号などを参照のこと。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、ex vivo生成またはこれらの組み合わせの他、従来技術において周知の精製方法を用いるなど、周知の方法で調製できる。
【００３６】
本願明細書では、ポリヌクレオチドコンストラクト、組換えポリヌクレオチドおよび組換えポリペプチドという用語は、従来技術で用いられている意味と同じである。「上流」および「下流」という表現は、従来技術で用いられている意味と同じである。「塩基対の」および「Watson & Crick塩基対の」という表現は、本願明細書では同義であり、従来技術で用いられている意味と同じである。同様に、「相補的」、「その相補体」、「相補体」、「相補的なポリヌクレオチド」、「相補的な核酸」および「相補的なヌクレオチド配列」という表現は、本願明細書では同義であり、従来技術で用いられている意味と同じである。
【００３７】
他の核酸、含水炭素、脂質およびタンパク質(ポリヌクレオチドの合成に使用される酵素など)を含むがこれに限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクターを示す上で、「精製された」という用語を使用する。また、精製は、線状ポリヌクレオチドから共有結合的に緊密なポリヌクレオチドを分離することや、その逆なども指す。ポリヌクレオチドは、試料の少なくとも約50%、60%、75%または90%が単一のポリヌクレオチド配列を含む場合に実質的に純粋なものである。場合によっては、これにはコンホメーション(線状vs.共有結合的に緊密)の判定も関与する。実質的に純粋なポリヌクレオチドは一般に、核酸試料を約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%w/w含む。ポリヌクレオチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざまな手段を適用し、ゲルの染色時に単一のポリヌクレオチドバンドを可視化するなどの方法で示すことができるものである。特定の目的では、HPLCまたは従来技術において周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることができる。
【００３８】
同様に、本願明細書では、核酸、脂質、含水炭素、他のタンパク質を含むがこれに限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリペプチドを示す上で、「精製された」という表現を使用する。いくつかの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、試料のポリペプチド分子の少なくとも約50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または99.5%が単一のアミノ酸配列を含む場合に、実質的に純粋なものである。いくつかの好ましい実施形態では、実質的に純粋なポリペプチドは一般に、タンパク質試料を約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または99.5%w/w含む。ポリペプチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざまな方法を適用し、ゲルの染色時に単一のポリペプチドバンドを可視化するなどの方法で示すことができるものである。特定の目的では、HPLCまたは従来技術において周知の他の方法によって一層高い解像度を得ることができる。
【００３９】
さらに、本願明細書において使用する場合、「精製された」という表現は絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的に定義することを意図して用いられる。出発材料または天然材料を、少なくとも1桁、好ましくは2桁または3桁、一層好ましくは4桁または5桁まで精製することが特に企図するところである。あるいは、異種ポリヌクレオチド(DNA、RNAまたは両方)またはポリペプチドに対して「少なくとも」純度百分率として精製を表すこともできる。好ましい実施形態として、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、96%、98%、99%、99.5%または100%純粋である。さらに好ましい実施形態として、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して「少なくとも」90%から100%の間で適当な数字から1,000分の1桁までの範囲の純度(たとえば少なくとも99.995%純粋)を有する。また、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度を、担体溶液以外のすべての材料および化合物に対する純度率(上述)として表してもよい。1,000分の1桁目までの各数字を個々の種の純度としてもよい。
【００４０】
「単離された」という表現で示す物質は、その本来あるべき環境(天然由来のものであれば自然環境など)から外れたものでなければならない。たとえば、生きた動物が持つ天然由来のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたとは言わないが、同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドを自然体系で共存しているいくつかの物質またはすべての物質から分離すると、これは単離されたことになる。かかるポリヌクレオチドがベクターの一部である、および/または、かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成物の一部であることもあるが、このような状態であっても、そのベクターや組成物が自然環境の一部をなしているのでなければ、単離されているとする。
【００４１】
「単離された」という定義から明確に除外されるのは、存在する天然由来の染色体(chromosome spreadsなど)、in vitro核酸調製物またはトランスフェクトされた/形質転換された宿主細胞調製物として存在する、人工染色体ライブラリ、ゲノムライブラリおよびcDNAライブラリであり、ここでの宿主細胞は、in vitro不均一な調製物であるか、単一コロニーの不均一な個体群として蒔かれたものである。また、5' ESTがベクター分子中の核酸挿入物の数の5%(あるいは1%、2%、3%、4%、10%、25%、50%、75%または90%、95%または99%)未満である、上記のライブラリも明確に除外される。さらに、ホールセルゲノムDNA調製物またはホールセルRNA(機械的に剪断または酵素的に消化された前記ホールセル調製物を含む)も明確に除外される。さらに、電気泳動培地(アガロースゲルまたはナイロンブロットなどにおける個体群の不均一なバンドから単一のバンドを削除することによってさらに分離)中で異種ポリヌクレオチドから本発明のポリヌクレオチドがさらに分離されていない、電気泳動(そのブロット法を含む)によって分離されたin vitro調製物または不均一な混合物のいずれかとしての上記のホールセル調製物も明確に除外される。
【００４２】
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列と相補であり、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を示す。プライマーは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド重合の開始点として機能する。
【００４３】
「プローブ」という用語は、試料中に存在する特定のポリヌクレオチド配列の同定に使用できる定義済の核酸セグメント(あるいは下記において定義するPNAなどのヌクレオチド類似セグメント)であって、同定対象となる特定のポリヌクレオチド配列と相補であるヌクレオチド配列を有する前記核酸セグメントを示す。
【００４４】
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さとは無関係にアミノ酸のポリマーを指す。したがって、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定するものでもこれを除外するものでもない。たとえば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などが共有結合的に付加されたポリペプチドもポリペプチドという用語に明示的に包含される。さらに、この定義には、1種またはそれ以上のアミノ酸類似体(たとえば、非天然由来のアミノ酸、独立した生物体系で天然にのみ発生するアミノ酸、哺乳動物系由来の修飾アミノ酸などを含む)を含有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチドの他、従来技術において周知の天然由来および非天然由来の他の修飾も含まれる。本願明細書において使用する「OBG3」という用語は、特に明記しない限り総称的にマウスまたはヒトのOBG3を指す。「ACRP30」および「AdipoQ」という用語は、具体的にはOBG3のマウスでの形態を指し、「APM-1」という用語は、具体的にはこの遺伝子のヒトでの形態を指す。
【００４５】
特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の化合物/ポリペプチドは、肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配を調節することができるため、「肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配が関与している疾患」を治療できると思われる。「末梢組織」という用語には筋肉および脂肪組織を含むことを意図している。好ましい実施形態では、本発明の化合物/ポリペプチドが食餌脂質を筋肉に分配する。別の好ましい実施形態では、食餌脂質は脂肪組織に分配される。他の好ましい実施形態では、食餌脂質は肝臓に分配される。さらに他の好ましい実施形態では、本発明の化合物/ポリペプチドは、好ましくは遊離脂肪酸(FFA)である食餌脂質の筋肉による酸化を亢進または抑止する。食餌脂質にはトリグリセリドおよび遊離脂肪酸を含むがこれに限定されるものではない。
【００４６】
食餌脂質の分配に関与すると思われる好ましい疾患としては、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病などの肥満症および肥満関連疾患および機能障害があげられる。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。
【００４７】
本願明細書にて使用する「異種」という用語は、OBG3ポリペプチドまたはOBG3ポリペプチド以外または本発明のOBG3ポリペプチドまたはgOBG3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを示すことを意図したものである。
【００４８】
「含む(comprising)」、「〜からなる(consisting of)」および「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」という表現は、それぞれの標準的な意味に従って定義される。米国特許審査便覧にて定義される意味は従来技術において定義された意味に優先し、連邦巡回控訴裁判所の判例法を管理する際に定義される意味は米国特許審査便覧に記載されている意味に優先する。この点に留意して、それぞれの表現に関連した具体的な意味を明確にするために本願全体を通してこれらの表現を互いに入れ替える場合がある。
【００４９】
本発明の特定のポリヌクレオチド「に対する宿主細胞組換え体」という表現は、前記細胞において自然には見られないような方法で前記ポリヌクレオチドを含むように人間の手で変更された宿主細胞を意味する。たとえば、前記宿主細胞は、本発明の前記ポリヌクレオチドで一過的にまたは安定してトランスフェクトまたは形質導入したものであってもよい。
【００５０】
本願明細書で使用する「肥満症」という用語は、WHOの体重に関する分類において定義されている(Kopelman (2000) Nature 404:635643)。18.5未満は低体重(やせ)、18.5〜24.9で普通体重(正常)、25.0〜29.9で肥満1度(過体重)、30.0〜39.0で肥満2度(肥満症)、40.0 BMI以上は肥満度3である。BMIはボディーマス指数(病的肥満症)であり、単位はkg/m2である。ウェスト囲を用いて代謝合併症の危険性を示すことも可能である。この場合、男性ではウェスト囲94cm以上で危険値となり、102cm以上で実質的に危険性が高くなる。同様に、女性では88cm以上で危険値となり、88cm以上で実質的に危険性が高くなる。ウェスト囲は、肋骨下縁と骨盤上縁との間の中間点においてcm単位で測定される。肥満症を示す他の測定値としては、皮脂厚をキャリパーで測定してcmで表した測定値である皮脂厚、除脂肪部分は主に電解質溶液であるため除脂肪部分の方が脂肪部分よりも電流が良く流れるという原理に基づくバイオインピーダンス、四肢に印加した弱電流(インピーダンス)に対する抵抗を測定することで、経験的に導き出される式を用いて体脂肪を推定することがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００５１】
「肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配に作用する因子」という表現は、上述したような肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配を調節する本発明の化合物またはポリペプチドを指す。好ましくは、かかる因子は、食餌脂質、好ましくは遊離脂肪酸(FFA)の筋肉による酸化を亢進または抑止する。好ましくは、当該因子は個体の体重を減少させるか増加させ、あるいは、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病などの肥満関連疾患または機能障害の治療または妨害に用いられる。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。
【００５２】
「肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配に作用する因子に対する応答」という表現は、化合物を代謝する能力、プロドラッグをアクティブドラッグに変換する能力、個体における薬剤の薬物動態(吸収、分布、除去)および薬理効果(受容体関連)を含むがこれに限定されるものではない薬効を指す。
【００５３】
「肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配に作用する因子に対する副作用」という表現は、薬剤の重要な薬理学的作用が持続したことに起因する治療の有害作用または薬剤と宿主に固有の因子との相互作用に起因する特異体質有害反応を指す。「肝臓と末梢組織との間での食餌脂質の分配に作用する因子に対する副作用」には、皮膚毒性、血液毒性または肝臓毒性などの有害反応を含むがこれに限定されるものではなく、さらに、胃腸潰瘍形成、血小板機能障害、腎不全、腎炎、水性鼻漏を伴う血管運動性鼻炎、血管神経性浮腫、全身蕁麻疹および気管支喘息から喉頭浮腫および気管支収縮、低血圧およびショックまで含む。
【００５４】
本願明細書にて使用する「OBG3関連疾患および機能障害」という表現は、OBG3が正しく機能しない状態を含む、あるいは、OBG3レベルまたは活性を調節することによって治療または防止することが可能な、あらゆる疾患または機能障害を指す。「OBG3が正しく機能しない状態」とは、OBG3発現の異常なレベル(上昇または低下のいずれかであるが、好ましくは低下)、OBG3の異常な活性(上昇または低下)およびリガンドまたは結合パートナーとの間での異常な相互作用(亢進または抑止)を含むがこれに限定されるものではない。「異常な」とは、正常な細胞、組織または患者に見られる、あるいは、その細胞、組織または患者に、病気の発症前にかつて見られた活性のタイプまたは活性レベルからの変化を意味する。好ましい実施形態では、これらのOBG3関連疾患および機能障害には、上述した肥満症および肥満関連疾患および機能障害を含む。
【００５５】
「美容処置」という用語は、個体が臨床的に太りすぎであったり臨床的にやせていたりしない場合に個体のボディーマスを増加または減少させる本発明の化合物またはポリペプチドでの処置を含むことを意図している。したがって、これらの個体は、ボディーマス指数(BMI)が臨床的な肥満症でのカットオフ値未満(25kg/m2未満など)であり、かつ、臨床的なやせのカットオフ値を上回っている(18.5kg/m2を超えているなど)。また、これらの個体は、健常である(本発明の肥満関連疾患または機能障害がない)ことが好ましい。また、「美容処置」は、状況次第では、たとえば、具体的にウェスト周りまたは腰回り、あるいは腰回りと太股などでの増加または減少など、脂肪組織の一層局所的な増加を包含することを意図したものである。こうした脂肪組織の局所的な増加または減少は、ウェストサイズまたは腰回りサイズの増加または減少などによって識別することが可能なものである。
【００５６】
本願明細書で使用する「防止する」という表現は、肥満症またはOBG3に関連した異常の物理的な現れを妨害するために、疾患または体調の臨床徴候の発症前に化合物を投与することを指す。
【００５７】
本願明細書で使用する「治療する(処置する)」という表現は、臨床徴候の発症後に化合物を投与することを指す。
【００５８】
本願明細書で使用する「治療が必要になった際」という表現は、個体または動物に治療が必要であるまたは治療することによって利点が得られるという介護者(人間の場合は医師、看護婦、臨床看護婦など、非ヒト哺乳動物を含む動物の場合は獣医)による判断を指す。この判断は、介護者の持つ専門技能の範囲内であるが、個体または動物が病気である、あるいは本発明の化合物によって治療可能な体調の結果として病気になるであろうという判断を含む、さまざまな要因に基づいてなされる。
【００５９】
「治療の必要性に気付く」という表現は、上記の「美容処置」で述べたような美容的な理由で個体が減量を希望しているという準臨床的な判断を指す。他の実施形態では、「治療の必要性に気付く」という表現が、動物の所有者がその動物に美容処置を行うという判断を指す場合もある。
【００６０】
本願明細書で使用する「個体」という用語は、哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマまたは霊長目、最も好ましくはヒトを含むあらゆる動物を指す。
【００６１】
「非ヒト動物」という用語は、鳥類、さらに通常は哺乳動物、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギまたは齧歯類、さらに好ましくはラットまたはマウスなどの動物を含む非ヒト脊椎動物を指す。「動物」および「哺乳動物」のいずれの用語も、「非ヒト」という用語が明記されている場合を除き、ヒトの被検体も明示的に含むものとする。
【００６２】
本願発明者らは、高脂肪/糖食を与えたマウスにおいて、血漿遊離脂肪酸、ブドウ糖およびトリグリセリドの食後応答をgOBG3と呼ばれるOBG3のフラグメントが有意に抑止できることを見出した。レプチン、インスリンまたはグルカゴンのレベルに対しては有意な効果はなかった。また、gOBG3は、in vitroおよびex vivoにおいて筋肉での遊離脂肪酸の酸化を亢進することが見出された。さらに、gOBG3は、高脂肪/高糖の食事を19日間与えたマウスにおいて体重増加の上昇率を少なくし、次いで妨害することが分かった。同一の高脂肪/高糖の食事で6ヶ月間維持されたマウスでは、依然として高脂肪/高糖の食事を与えられていたにもかかわらず、gOBG3治療によって16日間にわたって有意に持続的な体重減少が認められた。
【００６３】
本発明は、遊離脂肪酸(FFA)の分配にOBG3ポリペプチドフラグメントを使用し、かつエネルギのホメオスタシスを制御する重要な新たなツールとしてこれを使用することを包含する。循環から脂質を有意に除去してFFA酸化を引き起こすことができる組織のうち、量からみて筋肉が最も重要である。食物の摂取量には干渉せずに体重を調節する独特で新規な薬学的ツールに、球状OBG3がある。
【００６４】
(本発明の好ましい実施形態)
I.本発明のOBG3ポリペプチドフラグメント
in vitroおよびin vivoにて測定可能な活性を有するOBG3ポリペプチドフラグメントを同定した。これらの活性としては、高脂肪/糖食を与えたマウスにおける、血漿遊離脂肪酸、ブドウ糖およびトリグリセリドの食後応答の抑制(実施例8)、in vitroおよびex vivoにおける筋肉での遊離脂肪酸の酸化の亢進(実施例12)、高脂肪/高糖の食事を与えたマウスでの持続的な体重減少(実施例14)があげられるが、これに限定されるものではない。in vitroおよびin vivoでのOBG3ポリペプチドフラグメント活性についての他のアッセイ(実施例4、7、9、11、13など)も提供するので、当業者であれば等価なアッセイを設計することが可能である。
【００６５】
これとは対照的に、「無傷の」OBG3ポリペプチドまたは「全長」OBG3ポリペプチドは、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントで同定されたin vivoまたはin vitroでの活性を持たない。ほとんどの場合、活性は存在しないか最小でも使用するアッセイの制御値の範囲では検出不可能なものである。他の場合として、活性を測定することは可能であるが、極めて低いレベルで存在するおよび/または本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントに比してモル換算でかなり多くのタンパク質を必要とする(実施例10などを参照のこと)。本願明細書で使用する「無傷の」OBG3ポリペプチドまたは「全長」OBG3ポリペプチドという表現は、N-末端メチオニンからC-末端停止コドンまで、OBG3ポリペプチドのあらゆる全長ポリペプチド配列を意味する。無傷のOBG3ポリペプチドまたは全長OBG3ポリペプチドの例を、配列番号2(マウス)、配列番号4(マウス)および配列番号6(ヒト)にあげておく。本願明細書で使用する「OBG3ポリペプチドフラグメント」という用語は、「肥満症関連活性」を有する「無傷の」OBG3ポリペプチドまたは「全長」OBG3ポリペプチドのフラグメントを指す。「gOBG3ポリペプチドフラグメント」という用語は、球状領域のみのポリペプチドフラグメントを指し、「OBG3ポリペプチドフラグメント」よりも狭義の用語である。「フラグメント」という用語は、無傷のOBG3ポリペプチドまたは全長OBG3ポリペプチドの一部と完全に同一であるが全体が同一ではない配列を含むポリペプチドを意味する。かかるフラグメントは、「自立状態」(すなわち他のポリペプチドの一部であったり他のポリペプチドと融合したものではない)であってもよいし、あるいは1またはそれ以上のフラグメントが単一のポリペプチド中に存在していてもよい。OBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントは、特に明記しない限り、全長OBG3ポリペプチドの連続的なフラグメントである。
【００６６】
本願明細書において使用する「肥満症関連活性」という用語は、OBG3ポリペプチドフラグメントについて本願明細書にて述べる活性のうち少なくとも1つ、好ましくはすべてを指す。これらの活性を判断するためのアッセイを本願明細書に明記する(実施例4、7〜9、11〜14など)ので、当業者であれば等価なアッセイを設計することが可能である。任意に、「肥満症関連活性」は、脂質分配活性、脂質代謝活性およびインスリン様活性、あるいは、これらのカテゴリのうち1つに入る活性からなる群から選択されるものであってもよい。「脂質分離」活性とは、脂肪組織、肝臓および筋肉を含む主要な組織群の中から、食餌脂質の位置を特定する能力を意味する。本願発明者らは、筋肉、肝臓または脂肪組織への脂質の分配時に本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントが何らかの役割を果たすことを示した。「脂質代謝」活性とは、脂質の代謝に影響する能力を意味する。また、本願発明者らは、遊離脂肪酸の酸化実験(実施例4、8、10、11、12)によって、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントが遊離脂肪酸の血漿レベルに影響をおよぼす能力ならびに筋肉で脂質の代謝を亢進する能力を有することを示し、かつ、トリグリセリドの血漿レベルおよび筋肉中レベルに一過的に影響する(実施例8、10、13)ことを示した。「インスリン様」活性とは、OBG3ポリペプチドフラグメントがブドウ糖の血漿レベルを調節する能力を意味する。本願発明者らは、OBG3ポリペプチドフラグメントが、インスリンの作用と同様にインスリンレベルには有意に影響しないがブドウ糖レベルには影響することを見出した(実施例9および10)。これらの作用は、無傷の(全長)OBG3ポリペプチドの存在下では認められないか、あるいは、全長OBG3ポリペプチドの場合と比してOBG3ポリペプチドフラグメントの存在下では有意に大きい。
【００６７】
本願明細書において使用する「有意に大きい」という用語は、肥満症関連アッセイでのOBG3ポリペプチドフラグメントの活性を、同じアッセイでの全長OBG3ポリペプチドの活性と比した場合の比較結果を指す。本願明細書において使用する「有意に」とは、当業者が一般に判断するものとして統計的に有意であることを意味する。たとえば、一般には平均±SEMとしてデータを算出し、p値≦0.05で統計的に有意であるとみなされる。統計的な解析は一般に、対応のないデータに対するStudentのt検定または対応のあるデータに対するStudentのt検定のうち、それぞれの研究で適切な方を用いて行われる。全長OBG3ポリペプチドが存在する場合と比較して、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントが存在することで活性が有意に変化する例として、特定のパラメータが少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%増加または減少することがあげられる。OBG3ポリペプチドフラグメントの存在下で、無傷のOBG3ポリペプチドが存在する場合と比較して、測定可能なパラメータのうち1つまたはそれ以上であるが必ずしもすべてとは限らないパラメータが有意に変化する。
【００６８】
代表的な「肥満症関連アッセイ」を実施例4、7〜9および11〜14にあげておく。これらのアッセイは、食後応答の測定方法、遊離脂肪酸の酸化の測定方法および体重調節の測定方法を含むがこれに限定されるものではない。好ましい実施形態では、非ヒト動物、好ましくはマウスで食後応答を測定する。好ましい実施形態では、食餌脂質の変化を測定し、好ましくは遊離脂肪酸および/またはトリグリセリドの変化を測定する。他の実施形態では、ブドウ糖、インスリン、レプチンのそれぞれのレベルを含むがこれに限定されるものではない他の生理学的パラメータを測定する。他の好ましい実施形態では、細胞中、好ましくは非ヒト動物、好ましくはマウスの筋肉細胞または組織中の遊離脂肪酸の酸化をin vitroまたはex vivoにて測定する。さらに他の好ましい実施形態では、高脂肪/高糖の食事で、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは齧歯類(ラットまたはマウス)、霊長類、イヌ類、ネコ類またはprocinesで体重調節を測定する。任意に「肥満症関連活性」には本願明細書で具体的に明記していない他の活性を含むこともある。通常、肥満症および代謝研究の分野に関連する「測定可能なパラメータ」は、遊離脂肪酸レベル、遊離脂肪酸の酸化、トリグリセリドレベル、ブドウ糖レベル、インスリンレベル、レプチンレベル、食物の摂取量、体重、レプチンおよびリポタンパク質の結合、取込みおよび分解およびLSR発現からなる群から選択される。
【００６９】
これらの肥満症関連アッセイでは、全長OBG3ポリペプチドではない好ましい本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントを用いることで、食後の脂肪血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、ブドウ糖レベル、遊離脂肪酸の酸化および体重からなる群から選択される測定可能なパラメータのうち少なくとも1つで有意な変化が引き起こされるであろうと思われる。あるいは、全長OBG3ポリペプチドではないが好ましい本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントを用いることで、LSR活性の上昇、レプチン活性の上昇およびリポタンパク質活性の上昇からなる群から選択される測定可能なパラメータのうち少なくとも1つで有意な変化が認められるであろうと思われる。「LSR」活性とは、細胞表面または特定のコンホメーションでのLSRの発現ならびに、レプチンおよびリポタンパク質を結合し、取込み、分解する能力を意味する。「レプチン」活性とは、LSRによる結合、取込みおよび分解ならびに、血液脳関門を通っての輸送、潜在的には、LSRが必ずしも媒介因子ではないか、唯一の媒介因子であるような場合にこれらのことが発生することを意味する。同様に、「リポタンパク質」活性とは、LSRによる結合、取込みおよび分解ならびに、LSRが必ずしも媒介因子ではないか、唯一の媒介因子であるような場合にこれらのことが発生することを意味する。
【００７０】
本発明は、特に、単離されたOBG3ポリペプチドフラグメント、精製されたOBG3ポリペプチドフラグメントまたは組換えOBG3ポリペプチドフラグメントを対象とするものである。本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントは、美容処置または肥満関連疾患および機能障害の治療または予防のいずれかの目的で、(OBG3ポリペプチドのアンタゴニストを使って)体重を減少させたり増加させたりするのに有用である。また、OBG3ポリペプチドフラグメントは、OBG3フラグメント特異抗体を産生するためのOBG3フラグメント活性のアゴニストまたはアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイで特に有用である他、診断アッセイでも特に有用である。
【００７１】
全長OBG3ポリペプチドは、
1.  配列番号6、配列番号2または配列番号4のアミノ酸1〜17からのN-末端の推定シグナル配列、
2.  配列番号6のアミノ酸18〜41または配列番号2または配列番号4のアミノ酸18〜44からの一意な領域、
3.  配列番号6のアミノ酸42〜107または配列番号2または配列番号4のアミノ酸45〜110からのコラーゲン様領域、
4.  配列番号6のアミノ酸108〜244または配列番号2または配列番号4のアミノ酸111〜247からの球状領域
を含む別個の領域少なくとも4つで構成される。
【００７２】
「コラーゲン残基」という用語については、アミノ酸のグリシンX、Yのトリプレット（ここで、XおよびYはどのようなアミノ酸であってもよい）を意味する従来技術において標準的な形で使用する。
【００７３】
本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントは、単離された形態で提供されると好ましく、部分的または実質的に精製されたものであってもよい。OBG3ポリペプチドフラグメントの組換え的に生成したものを、Smith et al. ((1988) Gene 67(1):31-40)に記載された一ステップ法または本願明細書に開示する方法あるいは、従来技術において周知の方法によって実質的に精製することが可能である(実施例1〜3などを参照のこと)。また、本発明のポリペプチドフラグメント用の抗体を利用して、タンパク質精製の技術分野において周知の方法によって、天然源または組換え源から本発明のフラグメントを精製することも可能である。
【００７４】
OBG3ポリペプチドフラグメントの部分的な精製または選択を必要とする本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントの調製についても具体的に企図されている。これらの粗調製物は、おそらくフラグメントの完全な精製前にいくつか精製ステップを追加して、OBG3ポリペプチドフラグメントを発現する細胞を濃縮すると得られるのではないかと考えられる。OBG3ポリペプチドフラグメントを発現する細胞をペレット状にし、これを溶解させるか、粗ポリペプチドを凍結乾燥させるなどのことが可能である。
【００７５】
OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントは、少なくとも6の連続したアミノ酸から全長OBG3ポリペプチドよりも1アミノ酸短いだけの長さまで、アミノ酸数が整数であればどのような長さであってもよい。したがって、ヒトのOBG3(配列番号6)では、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントは6〜243の整数で表される数のうちいくつの連続したアミノ酸であってもよい。マウスのOBG3(配列番号2または配列番号4)では、OBG3またはgOBG3フラグメントは、たとえば6〜246の整数で表される数のうちいくつの連続したアミノ酸であってもよい。本願明細書では「整数」という用語をその数学的な意味で使用する。したがって、代表的な整数としては、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246があげられる。
【００７６】
上述したようなOBG3フラグメントは各々、そのN-末端とC-末端の位置でさらに特定することが可能である。たとえば、特定の無傷OBG3ポリペプチド配列および連続した全長OBG3ポリペプチド配列について、連続した6アミノ酸から全長OBG3ポリペプチドよりも1アミノ酸短いだけのフラグメントが占有し得るあらゆるN-末端およびC-末端の位置の組み合わせが本発明に含まれる。したがって、6の連続したアミノ酸からなるフラグメントは、配列番号6の1〜6、2〜7、3〜8、4〜9、5〜10、6〜11、7〜12、8〜13、9〜14、10〜15、11〜16、12〜17、13〜18、14〜19、15〜20、16〜21、17〜22、18〜23、19〜24、20〜25、21〜26、22〜27、23〜28、24〜29、25〜30、26〜31、27〜32、28〜33、29〜34、30〜35、31〜36、32〜37、33〜38、34〜39、35〜40、36〜41、37〜42、38〜43、39〜44、40〜45、41〜46、42〜47、43〜48、44〜49、45〜50、46〜51、47〜52、48〜53、49〜54、50〜55、51〜56、52〜57、53〜58、54〜59、55〜60、56〜61、57〜62、58〜63、59〜64、60〜65、61〜66、62〜67、63〜68、64〜69、65〜70、66〜71、67〜72、68〜73、69〜74、70〜75、71〜76、72〜77、73〜78、74〜79、75〜80、76〜81、77〜82、78〜83、79〜84、80〜85、81〜86、82〜87、83〜88、84〜89、85〜90、86〜91、87〜92、88〜93、89〜94、90〜95、91〜96、92〜97、93〜98、94〜99、95〜100、96〜101、97〜102、98〜103、99〜104、100〜105、101〜106、102〜107、103〜108、104〜109、105〜110、106〜111、107〜112、108〜113、109〜114、110〜115、111〜116、112〜117、113〜118、114〜119、115〜120、116〜121、117〜122、118〜123、119〜124、120〜125、121〜126、122〜127、123〜128、124〜129、125〜130、126〜131、127〜132、128〜133、129〜134、130〜135、131〜136、132〜137、133〜138、134〜139、135〜140、136〜141、137〜142、138〜143、139〜144、140〜145、141〜146、142〜147、143〜148、144〜149、145〜150、146〜151、147〜152、148〜153、149〜154、150〜155、151〜156、152〜157、153〜158、154〜159、155〜160、156〜161、157〜162、158〜163、159〜164、160〜165、161〜166、162〜167、163〜168、164〜169、165〜170、166〜171、167〜172、168〜173、169〜174、170〜175、171〜176、172〜177、173〜178、174〜179、175〜180、176〜181、177〜182、178〜183、179〜184、180〜185、181〜186、182〜187、183〜188、184〜189、185〜190、186〜191、187〜192、188〜193、189〜194、190〜195、191〜196、192〜197、193〜198、194〜199、195〜200、196〜201、197〜202、198〜203、199〜204、200〜205、201〜206、202〜207、203〜208、204〜209、205〜210、206〜211、207〜212、208〜213、209〜214、210〜215、211〜216、212〜217、213〜218、214〜219、215〜220、216〜221、217〜222、218〜223、219〜224、220〜225、221〜226、222〜227、223〜228、224〜229、225〜230、226〜231、227〜232、228〜233、229〜234、230〜235、231〜236、232〜237、233〜238、234〜239、235〜240、236〜241、237〜242、238〜243、239〜244からなる群から選択される位置を占有し得る。連続した238アミノ酸からなるフラグメントは、配列番号6の1〜238、2〜239、3〜240、4〜241、5〜242、6〜243および7〜244からなる群から選択される位置を占有し得る。同様に、配列番号6で6アミノ酸から243アミノ酸長の他のすべてのフラグメントが占有し得る位置が本発明に包含されるが、いずれも上記の2つの例をもとに速やかに予測することが可能である。したがって、明細書を不必要に長くするのを避ける目的で、これらの位置を個々に列挙することはしない。さらに、配列番号2または配列番号4の6〜241の連続したアミノ酸からなるフラグメントが占有し得る位置が本発明に包含さ��るが、いずれも上記の2つの例をもとに速やかに予測することが可能である。したがって、明細書を不必要に長くするのを避ける目的で、これらの位置を個々に列挙することはしない。また、連続した6アミノ酸から他のどの全長OBG3ポリペプチドよりも1アミノ酸短いだけのフラグメントが占有する位置についても、上記の2つの例をもとに速やかに予測することが可能である。したがって、明細書を不必要に長くするのを避ける目的で、これらの位置を個々に列挙することはしない。
【００７７】
あるいは、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを、式「n〜c」(nとcを含む)で説明することも可能である。この場合、「n」はポリペプチドの最もN-末端寄りのアミノ酸位置(配列表で定義するとおり)に等しく、「c」は最もC-末端寄りのアミノ酸位置(配列表で定義するとおり)に等しい。さらに、「n」は1以上で本発明の全長ポリペプチド配列のアミノ酸数から6を引いた数以下の整数(配列番号6では238、配列番号2または4では241)に等しく、「c」は7以上で全長ポリペプチド配列のアミノ酸数以下の整数(配列番号6では244、配列番号2または4では247)に等しく、「n」は「c」よりも少なくとも6小さな整数である。したがって、配列番号6では、「n」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、234、235、236、237、238からなる一覧から選択される任意の整数であり、「c」は、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244からなる群から選択される任意の整数である。「n」位置と「c」位置との組み合わせはいずれも、本発明の特定の実施形態として包含される。さらに、式「n」から「c」を「n1−n2」から「c1−c2」という具合に変更することも可能である。この場合、「n1−n2」および「c1−c2」は、任意の2つの整数から選択される位置範囲を示し、この位置範囲より��上で配列表のアミノ酸位置が表される。あるいは、この式の代わりに「n1−n2」から「c」、「n」から「c1−c2」とすることも可能である。
【００７８】
上述した特定の実施形態ならびに本願明細書で述べるポリペプチドおよびポリヌクレオチドフラグメントの他の実施形態については、「少なくとも」特定のサイズまたは特定のN-末端および/またはC-末端位置、あるいは特定のサイズまたは特定のN-末端および/またはC-末端位置と「等しい」、「以下」、「未満」、「〜以上〜以下」または「〜から〜まで」などと変更する場合がある。なお、本発明の実施形態を説明する上で用いている範囲はいずれも、特に明記しない限りは上限値と下限値を含むものであることに注意されたい。
【００７９】
また、本発明は、N-末端位置およびC-末端位置によって特定された任意のフラグメント各々、あるいは、上述したようなアミノ酸残基のサイズによって特定される任意のフラグメントを除外することについても対応している。また、N-末端位置およびC-末端位置によって特定されるか、あるいは上述したようなアミノ酸残基のサイズによって特定される、どのような数のフラグメントであっても、個々の種で見た場合には除外される場合がある。さらに、N-末端位置およびC-末端位置によって特定されるか、あるいは上述したようなアミノ酸残基のサイズによって特定される、どのような数のフラグメントであっても、任意の組み合わせでポリペプチドフラグメントを構成する場合があり、任意に、非OBG3ポリペプチド配列を含む場合もある。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、OBG3ポリペプチドフラグメントは、「球状OBG3」(gOBG3)フラグメントである。本願明細書において使用する「gOBG3フラグメント」または「gOBG3」または「gOBG3ポリペプチド」という用語は、全長OBG3ポリペプチド(上記にて定義)の球状領域のうち6以上137以下の任意の整数で表される数のアミノ酸を含む、全長OBG3ポリペプチドのフラグメントを指す。好ましい実施形態では、gOBG3ポリペプチドフラグメントは、全長OBG3ポリペプチドのコラーゲン領域のうち1以上66以下の任意の整数で表される数のアミノ酸を含み、好ましくは、無傷のOBG3ポリペプチドの球状領域に隣接するコラーゲン領域から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の連続したアミノ酸残基を含む。球状領域に「隣接する」とは、球状領域のすぐN-末端側であって、各コラーゲンアミノ酸をN-末端方向に連続して加えている第1コラーゲンアミノ酸を意味する。したがって、たとえば、gOBG3ポリペプチドフラグメントにコラーゲンアミノ酸が1つしかない場合、これは、球状領域の第1アミノ酸に隣接した5'であって、配列番号6のコラーゲンアミノ酸107であるか、配列番号2または配列番号4のアミノ酸110である。gOBG3フラグメントに球状領域と隣接するコラーゲンアミノ酸が20ある場合、これらのアミノ酸は、配列番号6のコラーゲンアミノ酸88〜107であるか、配列番号2または配列番号4のアミノ酸91〜110である。
【００８１】
他の好ましい実施形態では、gOBG3ポリペプチドフラグメントは、配列番号6のアミノ酸101〜244、108〜244または132〜244と、配列番号2または配列番号4のアミノ酸104〜247、111〜247または135〜247から選択される。さらに他の好ましい実施形態では、本発明は、図1に示すいずれかのgOBG3フラグメント配列の中から115以上175以下の連続したアミノ酸を含むgOBG3ポリペプチドフラグメントを特徴とするものである。この場合、前記115以上175以下の連続したアミノ酸のうち12以下がOBG3のコラーゲン様領域に存在する。好ましくは、gOBG3ポリペプチドフラグメントは、125以上165以下または135以上155以下のアミノ酸を含み、9以下のアミノ酸がコラーゲン様領域に存在する。さらに好ましくは、125以上165以下または135以上155以下のアミノ酸を含み、6以下のアミノ酸がコラーゲン様領域に存在するか、あるいは、140以上150以下アミノ酸を含み、3以下のアミノ酸がコラーゲン様領域に存在する。好ましくは、gOBG3フラグメントは哺乳動物、好ましくはヒトまたはマウスであるが、最も好ましくはヒトである。
【００８２】
本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントは、修飾OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをはじめとして、上述したOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントの変異体、フラグメント、類似体および誘導体を含む。
【００８３】
変異体
本発明のOBG3フラグメント配列およびgOBG3フラグメント配列のアミノ酸の中には、タンパク質の構造または機能に対する有意な影響を伴うことなく変更可能なものがあることは、当業者であれば明らかであろう。フラグメント配列には活性を左右する重要なアミノ酸があることになる。したがって、本発明は、上述したような肥満症関連活性を有するOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントの変異体をさらに包含するものである。このような変異体には、活性にほとんど影響しないようにするための従来技術において周知の一般的な規則に従って選択される、自然変異または人間が操作したもののいずれかを基準にしたアミノ酸の欠失、挿入、逆位、繰返し、置換を1つまたはそれ以上含むOBG3フラグメント配列が含まれる。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作出する方法を以下で簡単に説明する。
【００８４】
変化に対するアミノ酸配列の耐性を研究する方法には主に2通りある(Bowie, et al. (1990) Science, 247, 1306-10を参照のこと)。第1の方法は進化の過程を利用したものであり、変異は自然淘汰によって受け入れられるか拒絶される。第2の方法では、クローニングした遺伝子の特定の位置に遺伝子工学を使ってアミノ酸の変更を導入し、機能的に維持された配列を選択またはスクリーニングによって同定する。
【００８５】
これらの研究によって、タンパク質はアミノ酸の置換に対して驚くほど寛容であって、タンパク質の特定の位置でどのアミノ酸変化が許容可能なものとなりやすいかを示すことが明らかになった。たとえば、最も内側に潜り込んだアミノ酸残基には非極性側鎖が必要であるが、表面の側鎖のほとんどの特徴は保存されないのが普通である。このような表現型的にサイレントな他の置換については、本願明細書に引用するBowie et al. (上掲)に記載されている。
【００８６】
保存される置換として一般に見られるのが、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびPheのうちの1つを他の1つに変える代置、ヒドロキシル残基SerとThrとの相互交換、酸性残基AspとGluとの交換、アミド残基AsnとGlnとの間での置換、塩基性残基LysとArgとの交換、芳香族残基Phe、Tyrでの代置がある。また、以下のグループのアミノ酸は一般に、等しい変化を表す。(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr、(2)Cys、Ser、Tyr、Thr、(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe、(4)Lys、Arg、His、(5)Phe、Tyr、Trp、His。
【００８７】
同様に、正常な機能には不可欠である本発明のOBG3ポリペプチドフラグメント配列およびgOBG3ポリペプチドフラグメント配列のアミノ酸についても、部位特異的変異導入またはアラニン走査変異導入などの従来技術において周知の方法で同定することが可能である(Cunningham、et al. (1989) Science 244(4908):1081-5などを参照のこと)。後者の方法では、分子の各残基に単一のアラニン変異を導入する。その後、上述したようなアッセイを使用して、得られる変異分子の肥満症関連活性を試験する。特に興味の対象となるのが、凝集が少ないなど、特性が改善されて極めて望ましい特性を持つタンパク質が産生される場合がある、電荷を持ったアミノ酸と他の電荷を持ったアミノ酸または中性アミノ酸との置換である。凝集体は免疫性であるため、凝集は活性を抑えるだけでなく薬学的または生理学的に許容可能な製剤を調製する際に問題となりやすいものである(Pinckard, et al., (1967) Clin. Exp. Immunol 2:331-340; Robbins, et al., (1987) Diabetes Jul;36(7):838-41; およびCleland, et al., (1993) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 10(4):307-77などを参照のこと)。
【００８８】
したがって、本発明のOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントのフラグメント、誘導体、類似体または相同体は、たとえば、(i)置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされていてもよいし、コードされていなくてもよい(すなわち、非天然由来のアミノ酸であってもよい)、1またはそれ以上のアミノ酸残基が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基で置換されているもの(好ましくは保存されたアミノ酸残基)、あるいは、(ii)1またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは、(iii)OBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントが、フラグメントの半減期を長くするための化合物(たとえばポリエチレングリコール)などの他の化合物と融合しているもの、あるいは、(iv)IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダー配列または二次配列あるいは、上記の形態のフラグメントを精製する際に用いられる配列またはプロタンパク質配列など、別のアミノ酸が上記の形態のフラグメントに融合したものである。かかるフラグメント、誘導体および類似体は、本願明細書の教示内容から当業者が容易に判断できるものであると思われる。
【００８９】
本発明のさらに他の実施形態は、1以上であるが、50以下の保存されたアミノ酸置換、40以下の保存されたアミノ酸置換、30以下の保存されたアミノ酸置換および20以下の保存されたアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。また、少なくとも1であるが、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下の保存されたアミノ酸置換を有する、OBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供される。
【００９０】
本発明の修飾されたOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントのもう1つの特定の実施形態として、タンパク質分解に対する耐性があるポリペプチドがあげられる。たとえば、-CONH-ペプチド結合が修飾され、(CH2NH)還元結合、(NHCO)レトロ逆転結合、(CH2-O)メチレン-オキシ結合、(CH2-S)チオメチレン結合、(CH2CH2)カルバ結合、(CO-CH2)cetomethylene結合、(CHOH-CH2)ヒドロキシエチレン結合)、(N-N)結合、E-alcene結合または-CH=CH-結合のうち1つまたはそれ以上によって代置されたOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントなどがこれに該当する。したがって、本発明は、少なくとも1つのペプチド結合が上述したように修飾されたOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントまたはその変異体を包含する。
【００９１】
また、アミノ酸にはLまたはDの鏡像異性体がある。いくつかの実施形態では、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントにおいてアミノ酸の鏡像異性体を変更し、体内での半減期を延ばすようにすると好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸がL体であると好ましい。他の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸がD体であると好ましい。
【００９２】
同一率
本発明のポリペプチドは、上述したようなOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントと少なくとも50%同一である、少なくとも60%同一である、あるいは、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。OBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントと、たとえば少なくとも95%「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドという表現によって、アミノ酸配列は、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列のアミノ酸100あたり最大で5カ所のアミノ酸変更部分を含み得る以外は、OBG3ポリペプチドフラグメント配列またはgOBG3ポリペプチドフラグメント配列とアミノ酸配列が同一であることを意味する。配列表の配列に対応する配列を有するOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントが参照配列である。したがって、OBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントのアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも95%同一であるポリペプチドを得るには、OBG3ポリペプチドフラグメント配列またはgOBG3ポリペプチドフラグメント配列と比較した場合に、配列に含まれるアミノ酸残基のうち、挿入、欠失または他のアミノ酸との置換が可能なのは最大で5%(100分の5)である。これらの変更は、アミノ末端またはカルボキシ末端でなされてもよいし、配列に含まれる残基に各々分散するか、あるいは配列内の1つまたはそれ以上の連続したまとまりとして、両末端位置の間にある他の任意の場所でなされていてもよい。
【００９３】
現実問題として、従来は、特定のポリペプチドがOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントと何パーセントか同一であるか否かについて、周知のコンピュータプログラムを用いて判断することができる。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALW (Pearson and Lipman, (1988) Proc Natl Acad Sci USA Apr;85(8):2444-8; Altschul et al., (1990) J.  Mol.  Biol.  215(3):403-410; Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res.  22(2):4673-4680; Higgins et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:383-402; Altschul et al., (1997) Nuc.  Acids Res.  25:3389-3402; Altschul et al., (1993) Nature Genetics 3:266-272)があげられるが、何らこれらに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Karlin and Altschul (1990) Proc Natl Acad Sci USA Mar;87(6):2264-8; Altschul et al., 1990, 1993, 1997, いずれも上掲載などを参照のこと)を用いてタンパク質配列および核酸配列の相同性を評価する。特に、5つの専用BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施する。
(1)BLASTPおよびBLAST3で、アミノ酸の問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較、
(2)BLASTNで、ヌクレオチドの問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較、
(3)BLASTXで、ヌクレオチドの問い合わせ配列を6つの読み枠(両方の鎖)で変換した概念的翻訳産物を、タンパク質配列データベースと比較、
(4) TBLASTNで、タンパク質の問い合わせ配列を、すべて6つの読み枠(両方の鎖)で変換したヌクレオチド配列データベースと比較、
(5) TBLASTXで、ヌクレオチドの問い合わせ配列を6つの読み枠で変換したものを、6つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００９４】
BLASTプログラムは、アミノ酸の問い合わせ配列または核酸の問い合わせ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られる被検配列との間で、本願明細書で「ハイスコアセグメント対」と呼ぶ類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対はスコアリングマトリックスによって同定(すなわち整列化)されると好ましいのであるが、これらのスコアリングマトリックスについては多くのものが従来技術において周知である。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてBLOSUM62マトリックス(Gonnet et al., (1992) Science Jun 5;256(5062):1443-5; Henikoff and Henikoff (1993) Proteins Sep;17(1):49-61)を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、PAMまたはPAM250マトリックスも使用できる(たとえば、Schwartz and Dayhoff, eds, (1978) Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington:  National Biomedical Research Foundationを参照のこと)。BLASTプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるKarlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい(Karlin and Altschul, (1990) Proc Natl Acad Sci USA Mar;87(6):2264-8などを参照のこと)。BLASTプログラムについては、デフォルトのパラメータで使用してもよいし、ユーザがパラメータを変更して使用することもできるが、このパラメータはデフォルトのパラメータであると好ましい。
【００９５】
グローバル配列アライメントとも呼ばれる、問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列との間で全体が最もマッチするものを求める好ましい方法を、Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを用いて得ることができる。この場合、配列アライメントの問い合わせ配列と対象配列はいずれもアミノ酸配列である。前記グローバル配列アライメントの結果は同一率で示される。FASTDBアミノ酸アライメントで使用するのに好ましいパラメータは次のとおりである。Matrix=PAM 0、k-tuple=2、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=20、Randomization Group=25 Length=0、Cutoff Score=1、Window Size=配列長、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window Size=247または対象アミノ酸配列長のうち、短い方。
【００９６】
FASTDBプログラムではグローバル同一率の算出時に対象配列のN-末端およびC-末端での切り詰めを考慮していないため、内部欠失ではなくN-末端の欠失またはC-末端の欠失が原因で対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合は同一率として得られる結果を手作業で補正しなければならない。問い合わせ配列に対してN-末端およびC-末端が切り詰められた対象配列では、対応する対象残基と一致しない/整列されない、対象配列のN-末端およびC-末端である問い合わせ配列の残基数を問い合わせ配列の全塩基に対する比率として算出することによって、同一率を補正する。残基が一致する/整列されるか否かについては、FASTDB配列アライメントの結果から判断する。次に、この比率を、指定のパラメータを用いて上記のFASTDBプログラムによって計算された同一率から減算し、最終的な同一率のスコアを得る。この最終的な同一率のスコアが、本発明の目的で用いられるものである。問い合わせ配列と一致しない/整列されない、対象配列のN-末端およびC-末端に対する残基、すなわち、対象配列の最も遠いN-末端残基およびC-末端残基から外れた問い合わせアミノ酸残基のみ、同一率のスコアを手作業で調整すべきものとみなす。
【００９７】
たとえば、アミノ酸残基長90の対象配列を100残基の問い合わせ配列と整列させて同一率を判定する。対象配列のN-末端で欠失が発生するため、FASTDBアライメントではN-末端の第1の残基が一致しない/整列されないことになる。10の不対残基が配列の10%(N-末端およびC-末端での一致しない残基数/問い合わせ配列に含まれる残基総数)であるため、FASTDBプログラムによって算出された同一率のスコアから10%分を引く。残りの90の残基が完全に一致すれば、最終的な同一率は90%になる。
【００９８】
もう1つの例では、90残基の対象配列を100残基の問い合わせ配列と比較する。今度は欠失が内部欠失であるため、対象配列のN-末端またはC-末端には問い合わせ配列と一致しない/整列されない残基はない。この場合、FASTDBによって算出された同一率を手作業で補正することはない。繰り返すが、FASTDBアライメントで示されるように、問い合わせ配列とは一致しない/整列されない、対象配列のN-末端およびC-末端から外れた残基位置のみ手作業で補正する。本発明の目的では、これ以外に手作業での補正は行わない。
【００９９】
生産
本願明細書の開示内容全体を通して、OBG3ポリペプチドフラグメントについて説明している箇所はいずれも、OBG3ポリペプチドフラグメントの好ましい部分集合としてgOBG3フラグメントも想定されている点に注意されたい。
【０１００】
OBG3ポリペプチドフラグメントは、ヒトまたは哺乳動物の組織試料から単離されるか、あるいは、ヒトまたは哺乳動物の細胞においてヒトまたは哺乳動物の遺伝子から発現されたものであると好ましい。本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントは、従来技術において周知の一般に用いられる発現方法によって生成できる。所望のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを、適当な宿主に適した発現ベクターに連結する。組換えポリペプチドフラグメントの形成には真核生物宿主系と原核生物宿主系の両方が使用される。溶解された細胞または培地からポリペプチドフラグメントを単離し、意図した用途に合う程度まで精製する。精製は、分化抽出(differential extraction)、塩分画(salt fractionation)、クロマトグラフィ、遠心などの従来技術において周知のいずれかの方法で行う。タンパク質のさまざまな精製方法については、たとえば、Methods in Enzymologyを参照のこと。また、OBG3ポリペプチドフラグメントで用いた方法については実施例1〜3を参照のこと。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドを乳から単離する。ポリペプチドを全長OBG3ポリペプチドとして精製し、精製後に必要に応じてin vitroにて切断してOBG3フラグメントを生成することが可能である。あるいは、OBG3フラグメント自体を乳から精製することもできる。多種多様な方法のうち任意のものを用いて、本ポリペプチドを乳から精製することができる。これらの方法の一例として、Protein Purification Applications, A Practical Approach (New Edition), Edited by Simon Roe, AEA Technology Products and Systems, Biosciences, Harwell; Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Wilkins and Velander (1992) 49:333-8; 米国特許第6,140,552号および同第6,025,540号; Hennighausen, Protein Expression and Purification, vol. 1, pp. 3-8 (1990); Harris et al. (1997) Bioseparation 7:31-7; Degener et al. (1998) J. Chromatog. 799:125-37; Wilkins (1993) J. Cell. Biochem. Suppl. 0 (17 part A):39に教示されているものなどがあり、当該文献に開示の内容を本願明細書に援用する。一般的な実施形態では、たとえば比較的低速で乳を遠心して脂質画分を分離し、速度を増して上澄を遠心して乳に含まれるカゼインを残りの成分である「ホエー」画分から分離する。多くの場合、このホエー画分中には医用タンパク質が認められる。このタンパク質については、標準的なクロマトグラフィや、本件出願明細書の他の部分で説明している方法などタンパク質の精製で一般に用いられる他の方法を用いて、ホエー画分から単離することが可能なものである。好ましい一実施形態では、たとえばアフィニティクロマトグラフィを使って、OBG3ポリペプチドに特異な抗体を用いてOBG3ポリペプチドを精製する。また、特定サイズのタンパク質を単離するための電気泳動などの方法で、特定のOBG3フラグメントを単離する方法を使用することも可能である。OBG3ポリペプチドは哺乳動物の乳に本来存在するものであることが明らかになっている(実施例17などを参照)ため、上記の方法を用いて単離されるOBG3ポリペプチドは自然に産生されるものであってもよいし、あるいは、上述したように非ヒト哺乳動物の乳腺にあるタンパク質の組換え精製の結果として得られるものであってもよい。このような一実施形態において、OBG3フラグメントは、異種の抗原ポリペプチド配列との融合タンパク質として生成される。この抗原配列を用いて、たとえば標準的なイムノアフィニティ的な方法でタンパク質を精製することができる。
【０１０２】
また、短めのタンパク質フラグメントであれば化学的な合成によって作出することができる。あるいは、本発明のタンパク質をヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織から抽出する。タンパク質の精製方法は従来技術において周知であり、一例としては、洗浄剤またはカオトロピック剤を使用して粒子を破壊した後、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、密度による遠心沈降およびゲル電気泳動などによってポリペプチドを差分抽出および分離することがあげられる。
【０１０３】
図4に示すものをはじめとして、どのようなOBG3フラグメント cDNAを用いてOBG3ポリペプチドフラグメントを発現させてもよい。従来のクローニングテクノロジーを使用して、発現対象となるOBG3フラグメントをコードする核酸を、発現ベクターでプロモーターに作動可能に連結させる。発現ベクターにおけるOBG3フラグメントcDNA挿入物は、全長OBG3ポリペプチド(後に修飾)に対するコード配列、6アミノ酸長から全長OBG3ポリペプチドよりも6アミノ酸短い長さまで、gOBG3フラグメントまたは変異体および%同様のポリペプチドを含むものであってもよい。
【０１０４】
発現ベクターは、従来技術において周知の哺乳動物、酵母、昆虫またはバクテリアの発現系であればどのようなものであってもよい。このうちのいくつかを本願明細書にて説明し、その一例を実施例(実施例1〜3)にて列挙する。ジェネティクスインスティテュート社(マサチューセッツ州Cambridge)、ストラタジーン社(カリフォルニア州La Jolla)、プロメガ社(ウィスコンシン州Madison)およびインビトロゲン社(カリフォルニア州San Diego)をはじめとするさまざまな提供業者から、市場販売されているベクターおよび発現系を入手することができる。必要があれば、発現を促進してタンパク質の正しい畳み込みを容易にするには、Hatfield, et al.の米国特許第5,082,767号に説明されているように、発現ベクターを導入する特定の生物に合わせて配列のコドンコンテキストおよびコドンペアリングを最適化することができる。当該特許の内容全体を本願明細書に援用する。
【０１０５】
OBG3ポリペプチドフラグメントをコードする核酸に開始部位として機能するメチオニンがない場合は、従来の手法を利用して開始メチオニンを核酸の第1コドンの隣に導入することができる。同様に、OBG3ポリペプチドフラグメントcDNAから得た挿入物にポリAシグナルがない場合は、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてpSG5(ストラタジーン)からポリAシグナルを抜き、これを哺乳動物の発現ベクターpXT1(ストラタジーン)に組み込むことで、上記の配列をコンストラクトに付加することができる。pXT1は、Moloneyマウス白血病ウイルスから得られるLTRとgag遺伝子の一部とを含む。コンストラクトにおけるLTRの位置がゆえに、安定したトランスフェクションを効率よく行うことができる。ベクターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。
【０１０６】
OBG3フラグメントをコードする配列がポリAシグナルに対して正しい位置にくるように慎重に注意を払いながら、所望のOBG3 cDNAと相補であり、かつ、5'プライマーに組み込まれたPst Iに対する制限エンドヌクレアーゼ配列と、これに対応するcDNA 3'プライマーの5'末端におけるBglIIに対する制限エンドヌクレアーゼ配列とを含有するオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、OBG3ヌクレオチド配列を含有するベクターから、PCRによってOBG3フラグメントをコードする核酸を得ることができる。このようにして起こるPCR反応で得られる精製フラグメントをPstIで消化し、エキソヌクレアーゼでブラントエンド化し、Bgl IIで消化し、精製してpXT1に連結する。これによって、ポリAシグナルを含有し、かつBglIIで消化された状態になる。別の方法については実施例1〜3で述べる。
【０１０７】
OBG3フラグメント発現ベクターのマウスNIH 3T3細胞へのトランスフェクションが、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する方法の一実施形態である。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するには、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、カチオン脂質トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染などの方法を用いることが可能である。このような方法は、Davis et al. ((1986) Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., Amsterdam)などの多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。組換えベクターのない宿主細胞によって本発明のポリペプチドを実際に発現させてもよいことも明確に企図されている。本発明のOBG3フラグメントを細胞において発現させる方法については、実施例1〜3で説明する。
【０１０８】
硫酸アンモニウム沈殿法またはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオン交換クロマトグラフィまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水的相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィをはじめとする周知の方法によって、本発明のポリペプチド(すなわちOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメント)を組換え細胞培養物から回収し、精製することが可能である。最も好ましくは、精製には高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を利用する。また、直接に単離するか培養された体液、組織および細胞を含む天然の源から精製された産物、化学合成法による産物、たとえば、バクテリア、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞などの原核生物宿主または真核生物宿主から組換え法によって産生された産物から、本発明のポリペプチドおよび好ましくはその分泌された形態を回収することが可能である。
【０１０９】
組換え産生法で利用する宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されたものであってもグリコシル化されていないものであってもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていないものである。また、本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主が媒介する過程の結果として初期修飾メチオニン残基を含むものであってもよい。したがって、翻訳開始コドンによってコードされるN-末端メチオニンは一般に、真核細胞での翻訳後にはどのようなタンパク質からでも高効率で除去されることが従来技術において周知である。ほとんどの原核生物では大半のタンパク質に存在するN-末端メチオニンが効率よく除去されるが、いくつかのタンパク質では、N-末端メチオニンが共有結合的に連結しているアミノ酸の性質によっては原核生物での除去過程は効率が悪い。
【０１１０】
本願明細書にて説明するベクターコンストラクトを含む宿主細胞を包含することに加え、本発明は、内在性遺伝物質(コード配列など)の欠失または代置が起こるように、および/または本発明のポリヌクレオチドと作用的に関連した遺伝物質(異種ポリヌクレオチド配列など)を含むように操作され、内在性のポリヌクレオチドを活性化、変更および/または増幅する、脊椎動物由来、特に哺乳動物由来の一次宿主細胞、二次宿主細胞、不死化した宿主細胞も包含する。たとえば、従来技術において周知の技法を用いて、異種対照領域(プロモーターおよび/またはエンハンサーなど)と内在性ポリヌクレオチド配列とを相同的組換えによって作用的に関連させることができる。たとえば、1997年6月24日発行の米国特許第5,641,670号、1996年9月26日公開の国際特許出願公開第WO 96/29411号、1994年8月4日発行の国際特許出願公開第WO 94/12650号; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA Nov;86(22):8932-5; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA Nov;86(22):8927-31;およびZijlstra et al. (1989) Nature Nov 23;342(6248):435-8などを参照のこと。かかる文献の内容を本願明細書に援用する)。
【０１１１】
修飾
また、本発明のポリペプチドは、従来技術において周知の方法を利用して化学的に合成することも可能なものである(たとえば、Creighton, 1983 Proteins. New York, New York: W.H. Freeman and Company; およびHunkapiller et al., (1984) Nature Jul 12-18;310(5973):105-11などを参照のこと)。たとえば、ペプチド合成器を使用して本発明の比較的短いフラグメントを合成することが可能である。さらに、必要があれば、非伝統的なアミノ酸または化学的なアミノ酸類似体を、フラグメント配列に対する置換または付加として導入することが可能である。非伝統的なアミノ酸としては、一般的なアミノ酸のD異性体、2,4-ジアミノ酪酸、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、g-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b-アラニン、フルオロアミノ酸、b-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸などのデザイナー（designer）アミノ酸およびアミノ酸類似体全般を含むがこれに限定されるものではない。さらに、アミノ酸はD体(右旋回)またはL体(左旋回)となり得る。
【０１１２】
本発明は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、周知の保護基/封鎖基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などによって、翻訳時または翻訳後に分化的に修飾されたポリペプチドフラグメントを包含する。臭化シアノジェン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成などを含むがこれに限定されるものではない周知の技法によって、多数の化学的修飾のうちどれを実施してもよい。
【０１１３】
本発明に包含する他の翻訳後修飾としては、たとえば、N-結合炭水化物鎖またはO-結合炭水化物鎖、N-末端またはC-末端のプロセシング)、化学部分のアミノ酸バックボーンへの結合、N-結合炭水化物鎖またはO-結合炭水化物鎖の化学的修飾、原核生物宿主細胞での発現の結果としてのN-末端メチオニン残基の付加または欠失があげられる。ポリペプチドフラグメントを、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和標識などの検出可能な標識で修飾し、ポリペプチドの検出および単離が可能なようにしてもよい。
【０１１４】
また、ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の改善、あるいは、免疫性の低減など、さらに他の利点を生み得る本発明のポリペプチドの化学修飾された誘導体が本発明によって提供される。米国特許第4,179,337号を参照のこと。誘導体化用の化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択すればよい。ポリペプチドは、分子内の任意の位置または分子内の予め定められた位置で修飾でき、1、2、3またはそれ以上の化学部分が結合したものであってもよい。
【０１１５】
ポリマーは、どのような分子量であってもよく、分枝状であっても分枝状でなくてもよい。取扱と製造のしやすさから考えて、ポリエチレングリコールの場合であれば、好ましい分子量は約1kDaから約100kDaの間である(「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物中に、明記されている分子量よりも多い分子もあれば少ない分子もあることを示している)。所望の治療プロファイル(たとえば、所望の徐放期間、生物活性がある場合はこの活性に対する作用、取扱のしやすさ、治療用タンパク質または類似体に対する抗原性およびポリエチレングリコールの他の周知の作用の程度または欠如など)に応じて他のサイズを用いてもよい。
【０１１６】
機能ドメインまたは抗原ドメインに対する作用上の理由で、ポリエチレングリコール分子(または他の化学部分)は、ポリペプチドに結合している必要がある。当業者が利用できる結合方法は多数あり、たとえば、本願明細書に援用する欧州特許第EP 0 401 384号(PEGをG-CSFにカップリング)があげられる。また、塩化トレシルを用いてのGM-CSFのペガレーションについて報告しているMalik et al. (1992) Exp Hematol. Sep;20(8):1028-35も参照のこと。)たとえば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基と共有結合的に結合していてもよい。反応性基とは、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合可能な基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リシン残基およびN-末端アミノ酸残基を含むものであってもよい。これらの遊離カルボキシル基を有する残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびC-末端アミノ酸残基を含むものであってもよい。さらに、ポリエチレングリコール分子を結合するのにスルフヒドリル基を反応性基として利用してもよい。治療目的で好ましいのは、N-末端またはリシン基での結合などのアミノ基での結合である。
【０１１７】
N-末端で化学修飾されたタンパク質が特に必要になる場合がある。本組成物の一例としてポリエチレングリコールを利用すると、さまざまなポリエチレングリコール分子(分子量によっては、分枝しているなど)、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質(ポリペプチド)分子に対する比率、実施すべきペガレーション反応のタイプ、選択したN-末端的にペガレーションしたタンパク質の取得方法から選択することができる。N-末端的にペガレーションした調製物(すなわち、必要であればこの部分を他のモノペガレーションした部分から分離)を取得する方法は、N-末端的にペガレーションした物質をペガレーションしたタンパク質分子の個体群から精製することなどがある。N-末端で化学修飾された選択的タンパク質に対して、特定のタンパク質での誘導体化に利用できる異なるタイプの一次アミノ基(リシンとN-末端)の反応性が異なることを利用する還元アルキル化を施してもよい。適切な反応条件下で、ポリマーを含有するカルボニル基を用いてのN-末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化を達成する。
【０１１８】
多量体
本発明のポリペプチドフラグメントは、単量体であっても多量体(すなわち、二量体、三量体、四量体およびそれ以上の多量体)であってもよい。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドフラグメントの単量体および多量体、これを含むその調製物および組成物(好ましくは、薬学的または生理学的に許容可能な組成物)に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体または四量体である。別の実施形態では、本発明の多量体は少なくとも二量体、少なくとも三量体または少なくとも四量体である。
【０１１９】
本発明に包含される多量体は、ホモマーであってもヘテロマーであってもよい。本願明細書において使用するホモマーという用語は、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメント(本願明細書にて説明するように、これらのポリペプチドフラグメントに対応する、ポリペプチドフラグメント、変異体、スプライス変異体および融合タンパク質を含む)に対応するポリペプチドのみを含有する多量体を指す。これらのホモマーは、アミノ酸配列が同一または異なるポリペプチドフラグメントを含むものであってもよい。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、アミノ酸配列が同一のポリペプチドフラグメントのみを有する多量体である。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、アミノ酸配列が異なるポリペプチドフラグメントを含有する多量体である。特定の実施形態では、本発明の多量体はホモ二量体(アミノ酸配列が同一または異なるポリペプチドフラグメントを含有するなど)またはホモ三量体(アミノ酸配列が同一および/または異なるポリペプチドフラグメントを含有するなど)である。さらに他の実施形態では、本発明のホモマー的な多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体または少なくともホモ四量体である。
【０１２０】
本願明細書において使用するヘテロマーという用語は、本発明のポリペプチドに加えて異種ポリペプチドを1つまたはそれ以上含有する(すなわち異なるタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントに対応する)多量体を指す。特定の実施形態において、本発明の多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。別の実施形態において、本発明のヘテロマー的な多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
【０１２１】
本発明の多量体は、疎水的、親水的、イオン的および/または共有結合的な会合の結果であってもよく、および/または、リポソーム形成などによって間接的に結合されていてもよい。このため、一実施形態では、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触すると、たとえばホモ二量体またはホモ三量体などの本発明の多量体が形成される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドが溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体(本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む)と接触すると、たとえばヘテロ三量体またはヘテロ四量体などの本発明のヘテロ多量体が形成される。他の実施形態では、本発明のポリペプチドとの共有結合的な会合および/または本発明のポリペプチド間の共有結合的な会合によって、本発明の多量体が形成される。かかる共有結合的な会合は、ポリペプチド配列に含まれるアミノ酸残基(たとえば、配列表に列挙されている残基、あるいは、寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる残基)1つまたはそれ以上を伴う場合がある。一例において、共有結合的な会合は、未変性(すなわち天然由来の)ポリペプチドにおいて相互作用する、ポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間の架橋である。別の例では、共有結合的な会合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、かかる共有結合的な会合は、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれるアミノ酸残基1つまたはそれ以上を伴う場合がある。
【０１２２】
一例において、共有結合的な会合は本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間である(米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。具体例において、共有結合的な会合は、(本願明細書で説明するような)本発明のFc融合タンパク質に含まれる異種配列間である。別の具体例では、本発明の融合タンパク質の共有結合的な会合は、たとえば、oseteoprotegerinなどの共有結合的に会合した多量体を形成できる別のタンパク質からの異種ポリペプチド配列間である(開示内容全体を本願明細書に援用する、国際特許出願公開第WO 98/49305号などを参照のこと)。もう1つの実施形態では、2またはそれ以上の本発明のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して接合されている。その一例として、米国特許第5,073,627号(本願明細書に援用)に開示されているペプチドリンカーがあげられる。従来の組換えDNA技術を利用して、ペプチドリンカーによって分離された本発明のポリペプチドを複数含有するタンパク質を生成してもよい。
【０１２３】
本発明の多量体ポリペプチドを調製するためのもう1つの方法は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドの使用を伴うものである。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、当該ジッパーが存在するタンパク質の多量体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは、もともといくつかのDNA結合タンパク質において同定されて以来、さまざまな異なるタンパク質において見出されている(Landschulz et al., (1988) Genes Dev. Jul;2(7):786-800)。周知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する天然由来のペプチドおよびその誘導体があげられる。本発明の可溶性多量体タンパク質を生成するのに好適なロイシンジッパードメインの一例としては、本願明細書に援用するPCT出願WO 94/10308に記載されているものなどがあげられる。溶液中で二量体化または三量体化するポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を、好適な宿主細胞で発現させ、得られる可溶性多量体融合タンパク質を従来技術において周知の技法で培地上清から回収する。
【０１２４】
本発明の三量体ポリペプチドでは、生物活性の上昇という利点が得られる場合がある。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分としては、三量体を優先的に形成するものがあげられる。一例として、本願明細書に援用する、Hoppe et al. FEBS Letters (1994) May 16;344(2-3):191-5および米国特許出願第08/446,922号に記載されているような肺サーファクタントタンパク質D(SPD)由来のロイシンジッパーがあげられる。本発明の三量体ポリペプチドを調製するにあたって、天然由来の三量体タンパク質から誘導される他のペプチドを利用してもよい。もう1つの例では、Flag(R)と、Flag(R)ポリペプチド配列を含む本発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチド配列との相互作用によって、本発明のタンパク質を会合させる。さらに他の実施形態では、本発明のFlag(R)融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗Flag(R)抗体との相互作用によって本発明のタンパク質を会合させる。
【０１２５】
従来技術において周知の化学的な技法を用いて本発明の多量体を生成してもよい。たとえば、本発明の多量体に含有させたいポリペプチドを、従来技術において周知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化法を用いて化学的に架橋させてもよい(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。また、従来技術において周知の技法を用いて本発明の多量体を生成し、多量体に含有させたいポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間の分子間架橋1つまたはそれ以上を形成してもよい(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。さらに、システインまたはビオチンをポリペプチドのC-末端またはN-末端に加えることで、本発明のポリペプチドを常法に従って修飾し、従来技術において周知の技法を適用してこれらの修飾ポリペプチド1つまたはそれ以上を含む多量体を生成してもよい(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。また、従来技術において周知の少なくとも30の技法を適用し、本発明の多量体に含有させたいポリペプチド成分を含むリポソームを生成してもよい(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。
【０１２６】
あるいは、従来技術において周知の遺伝子工学的な技法を用いて本発明の多量体を生成することもできる。一実施形態では、本願明細書にて説明する融合タンパク質技術または従来技術において周知の融合タンパク質技術(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)を用いて、本発明の多量体に含まれるポリペプチドを組換え的に生成する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列にライゲートし、さらにはポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドに元のC-末端からN-末端の方法で逆向きにライゲート(リーダー配列が欠如)することによって、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドを生成する(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。別の実施形態では、本願明細書または従来技術において周知の他の文献に記載されている組換え法を適用し、膜貫通ドメイン(または疎水性またはシグナルペプチド)を含み、かつ、膜再構成法によってリポソームに取り込まれる、本発明の組換えポリペプチドを生成する(開示内容全体を本願明細書に援用する米国特許第5,478,925号などを参照のこと)。
【０１２７】
II.本発明のOBG3ポリヌクレオチド
好ましいポリヌクレオチドとしては、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするものがあげられる。OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドについては、その活性のアンタゴニストおよびアゴニストについてのスクリーニングアッセイに使用する組換え細胞でポリペプチドを発現させる他、その活性のアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイ、診断スクリーニングおよび抗体の生成ならびに肥満関連疾患および機能障害の治療および/または予防および/またはボディーマスを減少させることを含むがこれに限定されるものではない、さまざまな方法で利用すべく行うその精製を容易にするが、これに限定されるものではない、さまざまな方法で利用することができる。
【０１２８】
本発明は、OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドと、本願明細書にて記載するその変異体ポリペプチドフラグメントとに関する。これらのポリヌクレオチドは、精製、単離および/または組換えしたものであってもよい。いずれの場合も、本発明の所望のOBG3ポリヌクレオチドおよびgOBG3ポリヌクレオチドは、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードし、本願明細書にて説明および検討する肥満症関連活性を有するものである。
【０１２９】
フラグメント
ポリヌクレオチドフラグメントとは、全長OBG3ポリペプチドまたは特定のOBG3ポリペプチドのヌクレオチド配列またはgOBG3ポリペプチドのヌクレオチド配列の一部であるが全部ではない部分と完全に同一の配列を有するポリヌクレオチドである。このようなフラグメントは「自立状態」であってもよい、すなわち、他のポリヌクレオチドの一部であったり他のポリヌクレオチドと融合したものでなくてもよい。あるいは、これらのフラグメントは、他の非OBG3または非gOBG3(異種)ポリヌクレオチドでその一部または一領域を構成するものであってもよい。しかしながら、いくつかのOBG3ポリヌクレオチドフラグメントまたはgOBG3ポリヌクレオチドフラグメントを単一のポリヌクレオチド中で構成するようにしてもよい。
【０１３０】
本発明のOBG3ポリヌクレオチドは、連続した18塩基から、配列番号1、配列番号3または配列番号5の全長OBG3ポリペプチドのポリヌクレオチド配列などの無傷のOBG3ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列よりも連続した18塩基分だけ短い数の塩基を含む。この実施形態の一態様において、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725または740の連続したヌクレオチドを含む。
【０１３１】
上記の好ましい核酸サイズに加えて、さらに好ましい核酸は、少なくとも18のヌクレオチドを含む。ここで「少なくとも18」とは、配列表(配列番号1、配列番号3または配列番号5)あるいは本願明細書の他の部分で示すように、18以上で、無傷のOBG3ポリペプチドcDNAの最も3'寄りのヌクレオチド位置から18ヌクレオチド分だけ短い整数以下のどのような整数でもよいと定義される。
【０１３２】
さらに、上述したように、少なくとも18ヌクレオチド長の核酸フラグメントも本発明の好ましいポリヌクレオチドに含まれる。この5'位置および3'位置に関してさらに具体的に説明すると、5'位置および3'位置は、以下の配列表に記載の位置番号によって表される。アレルおよび変性体および他の変異体については、位置1をORFの最も5'寄りのヌクレオチドであると定義する。すなわち、開始コドン(ATG)のヌクレオチド「A」から始めて残りのヌクレオチドに連番を振る。したがって、連続した少なくとも18ヌクレオチド長である本発明のポリヌクレオチドフラグメントが本発明の無傷OBG3ポリペプチドのポリヌクレオチドを占有し得る5'と3'のヌクレオチド位置の各組み合わせが、本発明においては個々の種として含まれている。5'位置および3'位置によって特定されるポリヌクレオチドフラグメントについては容易に想像が可能であり、明細書を不必要に長くするのを避ける目的で、これらの位置を個々に列挙することはしない。
【０１３３】
本発明のポリヌクレオチドフラグメントの上記の種は、式「x〜y」で表現することも可能である点に注意されたい。この場合、「x」はポリヌクレオチドの最も5'寄りのヌクレオチド位置に等しく、「y」は最も3'寄りのヌクレオチド位置に等しい。さらに、「x」は1以上で本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数から18を引いた数以下の整数に等しく、「y」は19以上で本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数から18ヌクレオチドを引いた整数に等しい。「x」は「y」よりも少なくとも18小さな整数である。
【０１３４】
また、本発明は、5'位置および3'位置によって特定される本発明のポリヌクレオチドフラグメントの種、あるいは、上述したようなヌクレオチドのサイズによって特定されるポリヌクレオチドについては、どのようなものであっても除外することに対応している。5'位置および3'位置によって特定される、あるいは、上述したようなヌクレオチドのサイズによって特定される、どのような数のフラグメントであっても除外される場合がある。
【０１３５】
本発明のgOBG3ポリヌクレオチドフラグメントは、本発明の好ましい実施形態のセクションIIで述べるgOBG3フラグメントをコードする全長ポリヌクレオチド配列に対する連続した18塩基を含む。この実施形態の一態様において、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの、少なくとも18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460または465の連続したヌクレオチドを含む。
【０１３６】
上記の好ましい核酸サイズに加えて、さらに好ましい核酸は、少なくとも18ヌクレオチドを含む。ここで「少なくとも18」とは、18以上で、本願明細書に記載するgOBG3フラグメントcDNAの最も3'寄りのヌクレオチド位置に対応する数以下のどのような整数でもよいと定義される。
【０１３７】
さらに、上述したように、少なくとも18ヌクレオチド長の核酸フラグメントも本発明の好ましいポリヌクレオチドに含まれる。この5'位置および3'位置に関してさらに具体的に説明すると、5'位置および3'位置は、以下の配列表に記載の位置番号によって表される。アレルおよび変性体および他の変異体については、位置1を読み枠(ORF)の最も5'寄りのヌクレオチドであると定義する。すなわち、開始コドン(ATG)のヌクレオチド「A」から始めて残りのヌクレオチドに連番を振る。したがって、連続した少なくとも18ヌクレオチド長である本発明のポリヌクレオチドフラグメントが本発明のgOBG3フラグメントのポリヌクレオチドを占有し得る5'と3'のヌクレオチド位置の各組み合わせが、本発明においては個々の種として含まれている。5'位置および3'位置によって特定されるポリヌクレオチドフラグメントについては容易に想像が可能であり、明細書を不必要に長くするのを避ける目的で、これらの位置を個々に列挙することはしない。
【０１３８】
本発明のポリヌクレオチドフラグメントの上記の種は、式「x〜y」で表現することも可能である点に注意されたい。この場合、「x」はポリヌクレオチドの最も5'寄りのヌクレオチド位置に等しく、「y」は最も3'寄りのヌクレオチド位置に等しい。さらに、「x」は1以上で本発明のgOBG3ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数から18を引いた数以下の整数に等しく、「y」は9以上で本発明のgOBG3ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数以下の整数に等しい。「x」は「y」よりも少なくとも18小さな整数である。「x」位置と「y」位置との組み合わせはいずれも、本発明の特定の実施形態として包含される。さらに、式「x」から「y」を「x1−x2」から「y1−y2」という具合に変更することも可能である。この場合、「x1−x2」および「y1−y2」は、配列表の任意の2つのヌクレオチド位置から選択される位置範囲を示す。あるいは、この式の代わりに「x1−x2」から「y」、「x」から「y1−y2」とすることも可能である。
【０１３９】
上述した特定の実施形態ならびに本願明細書で述べるポリヌクレオチドフラグメントの他の実施形態については、「少なくとも」特定のサイズまたは特定の5'位置および/または3'位置、あるいは特定のサイズまたは特定の5'位置および/または3'位置と「等しい」、「以下」、「未満」、「〜以上〜以下」または「〜から〜まで」などと変更する場合がある。
【０１４０】
また、本発明は、5'位置および3'位置によって特定される本発明のポリヌクレオチドフラグメントの種、あるいは、上述したようなヌクレオチドのサイズによって特定されるポリヌクレオチドについては、どのようなものであっても除外することに対応している。5'位置および3'位置によって特定される、あるいは、上述したようなヌクレオチドのサイズによって特定される、どのような数のフラグメントであっても除外される場合がある。
【０１４１】
変異体
他の好ましい実施形態では、OBG3フラグメントおよびgOBG3フラグメントをコードするOBG3ポリヌクレオチドおよびgOBG3ポリヌクレオチドの変異体についても想定している。ポリヌクレオチドの変異体は、本願明細書で使用する用語として、参照ポリヌクレオチドとは配列が異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、天然由来のアレリック変異体などの天然由来の変異体であっても、天然に産生されることが明らかになっていない変異体であってもよい。上記のような非天然由来のポリヌクレオチド変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または有機体に適用される技術をはじめとする変異導入術によって作製できるものである。通常は配列の違いには限度があるため、参照ヌクレオチド配列と変異体のヌクレオチド配列は全体的に見れば類似しており、多くの領域が同一である。
【０１４２】
上記にて述べた配列とは実質的に異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重がゆえに本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド変異体も明確に想定されている。また、上述した変性変異体を生成することは当業者にとって日常的な作業であり、たとえば特定の宿主についてコドンの発現を最適化するなどの目的(ヒトmRNAのコドンを他の哺乳動物またはバクテリアの宿主細胞によって好ましいコドンに変更するなど)で行われている。
【０１４３】
上述したように、変異体ポリヌクレオチドは、天然アレリック変異体などの天然由来のものであってもよいし、組換え方法によって得られるものであってもよい。「アレリック変異体」という表現は、有機体の染色体上の特定の座に座位する遺伝子のいくつかの形態のうちひとつを意図している(B. Lewin, (1990) Genes IV, Oxford University Press, New Yorkなどを参照のこと)。非天然由来の変異体については、従来技術において周知の変異導入法によって生成することが可能である。このような核酸変異体としては、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって生成されるものがあげられる。置換、欠失または付加には、1またはそれ以上のヌクレオチドを伴う場合がある。コード領域が変わると、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加が生じ得る。このうち特に好ましいのが、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントの特性および活性が変化しない、サイレント置換、付加および欠失である。また、この意味では保存された置換も好ましい。
【０１４４】
変異体のポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの変化は好ましくはサイレントであるが、これはそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸には変化がないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチドが変化することで、参照配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸に置換、付加、欠失、融合および切り詰めが生じることもある。
【０１４５】
ヌクレオチド置換によって1つまたはそれ以上のアミノ酸が変化する場合、好ましいOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントとしては、本発明の好ましい実施形態のセクションIで説明した1つまたはそれ以上の肥満症関連活性を保持するものがあげられる。
【０１４６】
「同一の活性を保持する」とは、アッセイにおいて変異体OBG3またはgOBG3ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて測定する活性が、本願明細書の実施例部分でgOBG3フラグメントを用いて測定する活性の少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%であって、かつ、101%、102%、103%、104%、105%、110%、115%、120%または125%以下であることを意味するものである。
【０１４７】
活性が「上昇する」とは、アッセイにおいて変異体OBG3またはgOBG3ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて測定する活性が、本願明細書の実施例部分でgOBG3フラグメントを用いて測定する活性の少なくとも125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、170%、180%、190%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、400%、450%または500%であることを意味するものである。
【０１４８】
活性が「低下する」とは、アッセイにおいて変異体OBG3またはgOBG3ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて測定する活性が、本願明細書の実施例部分でgOBG3フラグメントを用いて測定する活性の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%または50%低下することを意味するものである。
【０１４９】
同一率
本発明はさらに、本発明の好ましい実施形態のセクションIで説明したような肥満症関連活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号3または配列番号5のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントと、配列が少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である核酸分子も対象としている。もちろん、遺伝コードの縮重によって、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示される核酸配列またはそのフラグメントと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である多数の核酸分子が、生物活性のあるポリペプチドをコードすることは、当業者であれば容易に理解できよう。事実、これらのヌクレオチド配列の変性変異体はいずれも同一のポリペプチドをコードするため、これは上述した比較アッセイを実施しなくても当業者には明らであろう。また、変性変異体以外の核酸分子については、生物活性のあるポリペプチドをコードするものが相応数あることは当該技術分野において認められるであろう。これは、本発明の好ましい実施形態のセクションIにおいて上述したように、(特定の脂肪族アミノ酸を第2の脂肪族アミノ酸に代置するなど)タンパク質の機能にはほとんど影響しないか全く影響しないアミノ酸の置換がどのようなものなのか当業者が十分に分かっているためである。
【０１５０】
本発明の参照ヌクレオチド配列とたとえば少なくとも95%「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントをコードする参照ヌクレオチド配列100ヌクレオチドあたり最大で5カ所の変異を含み得ること以外は、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列の最大で5%のヌクレオチドを、欠失、挿入または他のヌクレオチドで置換すればよい。問い合わせ配列は完全配列であってもよいし、本願明細書にて述べるようにして特定したフラグメントであってもよい。
【０１５１】
特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるか否かを判定し、定義するための方法は、周知のコンピュータプログラムを用いて実施可能なものである。グローバル配列アライメントとも呼ばれる、問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列との間で全体が最もマッチするものを求める好ましい方法を、Brutlag et al., ((1990) Comput Appl Biosci. Jul;6(3):237-45)のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを用いて得ることができる。この場合、配列アライメントの問い合わせ配列と対象配列はいずれもDNA配列である。RNA配列であれば、まずU'をT'に変更して比較することができる。前記グローバル配列アライメントの結果は同一率で示される。同一率を計算するためのDNA配列のFASTDBアライメントで使用するのに好ましいパラメータは次のとおりである。Matrix=Unitary、k-tuple=4、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=30、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty 0.05、Window Size=500または対象ヌクレオチド配列のうち、短い方。
【０１５２】
内部欠失ではなく5'または3'での欠失が原因で対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合は結果を手作業で補正しなければならない。これは、FASTDBプログラムでは同一率の算出時に対象配列の5'および3'での切り詰めを考慮していないためである。問い合わせ配列に対して5'または3'末端が切り詰められた対象配列では、一致しない/整列されない、対象配列の5'および3'である問い合わせ配列の塩基数を問い合わせ配列の全塩基に対する比率として算出することによって、同一率を補正する。ヌクレオチドが一致する/整列されるか否かについては、FASTDB配列アライメントの結果から判断する。次に、この比率を、指定のパラメータを用いて上記のFASTDBプログラムによって計算された同一率から減算し、最終的な同一率のスコアを得る。この補正されたスコアが、本発明の目的で用いられるものである。FASTDBアライメントから明らかになる、問い合わせ配列と一致しない/整列されない対象配列の5'および3'ヌクレオチドから外れたヌクレオチドのみ、同一率のスコアを手作業で調整すべき対象とみなす。
【０１５３】
たとえば、90-ヌクレオチドの対象配列を100-ヌクレオチドの問い合わせ配列と整列させて同一率を判定する。対象配列の5'末端で欠失が発生するため、FASTDBアライメントでは、5'末端の最初の10ヌクレオチドについて一致/整列は示されない。不対の10ヌクレオチドが配列の10%(5'末端および3'末端での一致しないヌクレオチド数/問い合わせ配列に含まれるヌクレオチド総数)であるため、FASTDBプログラムによって算出された同一率のスコアから10%分を引く。残りの90のヌクレオチドが完全に一致すれば、最終的な同一率は90%になる。
【０１５４】
もう1つの例では、90ヌクレオチドの対象配列を100ヌクレオチドの問い合わせ配列と比較する。今度は欠失が内部欠失であるため、対象配列の5'または3'には問い合わせ配列と一致しない/整列されないヌクレオチドはない。この場合、FASTDBによって算出された同一率を手作業で補正することはない。繰り返すが、問い合わせ配列とは一致しない/整列されない、対象配列の5'および3'から外れたヌクレオチドのみ手作業で補正する。本発明の目的では、これ以外に手作業での補正は行わない。
【０１５５】
融合
別の異種アミノ酸配列に対するコード配列とインフレームに融合した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。また、非5'および3'配列、ベクター配列の他、精製、プローブ化または初回刺激用の配列を含むがこれに限定されるものではない、別の非コード配列と共に本発明のポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。たとえば、異種配列は、リボソーム結合およびmRNA安定性などのmRNAプロセシングや転写において何らかの役割を果たす、転写された非翻訳配列があげられる。あるいは、異種配列は、別の機能性を与える別のコード配列を含むものであってもよい。このため、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列などのタグ配列に融合してもよい。本発明のこの態様の特定の好ましい実施形態では、タグアミノ酸配列は、pQEベクター(キアゲン社, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)で提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。特に、こうしたタグの多くが市販のものである。たとえば、ヘキサヒスチジンを用いることで、融合タンパク質を都合よく精製することができる(Gentz et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA  Feb;86(3):821-4を参照のこと)。精製に役立つもう1つのペプチドに「HA」タグがあるが、これはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質からエピトープ誘導したものに相当する(Wilson et al., (1984) Cell 37(3):767-78を参照のこと)。上述したように、他のこのような融合タンパク質は、N-末端またはC-末端でFcに融合したOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントcDNAを含む。
III.本発明の組換えベクター
【０１５６】
本願明細書では、環状または線状であり、二本鎖または一本鎖で、細胞宿主あるいは単細胞の宿主有機体または多細胞の宿主有機体に移入する対象として探査される、該当するポリヌクレオチドを少なくとも1つ有するDNAまたはRNA分子を示すのに「ベクター」という用語を用いる。
【０１５７】
本発明は、本願明細書にて説明するポリヌクレオチドをいずれか1つ含む組換えベクターに関する。
【０１５８】
本発明は、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリを包含する。
【０１５９】
第1の好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターを用いて、好適な細胞宿主に挿入されたポリヌクレオチドを増幅する。このポリヌクレオチドは、組換えベクターの複製の都度増幅される。挿入されるポリヌクレオチドは、本発明のgOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするものであってもよい。
【０１６０】
本発明による組換えベクターの第2の好ましい実施形態は、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる。特定の実施形態の範囲内で、発現ベクターを用いて、本発明において述べる本発明のOBG3フラグメント、好ましくは修飾OBG3フラグメントを発現させ、これをさらに精製し、たとえば、肥満関連疾患用の治療薬、あるいは単に個体のボディーマスを減らす目的で利用することができる。
【０１６１】
発現を起こさせるには、ベクターに適当なシグナルを与えてやる必要がある。前記シグナルとしては、宿主細胞で該当する遺伝子の発現を促進するウイルスソースおよび哺乳動物ソースの両方から得られるエンハンサー/プロモーターなどのさまざまな調節要素があげられる。本発明の発現ベクターには一般に、産物を発現する永久的で安定した細胞クローンを作出するための主要な薬剤選択マーカーが含まれている。これらのベクターは、ポリペプチドの発現と薬剤選択マーカーの発現とを結びつける要素だからである。
【０１６２】
特に、本発明は、OBG3ポリペプチドフラグメントから選択される制御配列の制御下または外来性の制御配列の制御下で、本発明のOBG3フラグメントまたは本願明細書において述べる修飾OBG3フラグメントをコードする核酸またはその変異体またはそのフラグメントを含む発現ベクターに関する。
【０１６３】
したがって、本発明の好ましい発現ベクターは、(a)自己に作動可能に連結されたコーディングポリヌクレオチドの発現を促進する、OBG3フラグメント制御配列と、(b)制御配列に作動可能に連結され、好適な細胞宿主および/または宿主有機体でのその発現を可能にする、本発明のOBG3フラグメントコード配列からなる群から選択される。
【０１６４】
本発明のベクターで見つけることのできる要素のうちのいくつかについて、下記のセクションで一層詳細に説明する。
【０１６５】
1)本発明の発現ベクターの一般的な特徴
本発明による組換えベクターは、染色体DNA、非染色体DNA、半合成DNAまたは合成DNAからなるものであってもよい、YAC(酵母人工染色体)、BAC(バクテリア人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミドまたは線状DNA分子ですらも含むが、これに限定されるものではない。かかる組換えベクターは、以下に示すものを組み合わせた転写単位を有するものであってもよい。
(1)遺伝子発現において調節的な役割を有する、1つまたは複数の遺伝因子。たとえばプロモーターまたはエンハンサーなど。エンハンサーはDNAのシス調節要素であり、通常は長さ約10〜300bpでプロモーターに作用して転写量を増す。
(2)mRNAに転写され、最終的にはポリペプチドに翻訳される構造配列またはコード配列。前記構造配列またはコード配列は、(1)で述べた調節要素に作動可能に連結されている。
(3)適当な転写開始配列および転写終結配列。酵母または真核生物の発現系で使用することを意図した構造単位は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むものであると好ましい。あるいは、リーダー配列または輸送配列のない状態で組換えタンパク質を発現させる場合、N-末端残基を含むものであってもよい。後でこの残基を発現された組換えタンパク質から切断し、あるいは切断せずに、最終産物を得るようにしてもよい。
【０１６６】
一般に、組換え発現ベクターには、複製開始点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、下流の構造配列の転写を指図するための高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。異種構造配列を、適当な相で、翻訳開始配列および翻訳終結配列、好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔あるいは細胞外培地への分泌を指示できるリーダー配列とアセンブルする。所望の配列を哺乳動物の宿主細胞でトランスフェクトおよび発現するようにベクターを調節した特定の実施形態では、好ましいベクターに、所望の宿主での複製開始点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、さらには必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、5'-フランキング非転写配列が含まれることになる。SV40起源などSV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位およびポリアデニル化部位を用いて所望の非転写遺伝因子を得るようにしてもよい。
【０１６７】
2)調節要素
プロモーター
異種遺伝子を発現させる細胞宿主を考慮して、本発明の発現ベクターで使用する好適なプロモーター領域を選択する。標的細胞で核酸の発現を指示できるのであれば、該当する核酸配列の発現を制御するのにどのプロモーターを使うかは重要ではない。したがって、ヒトの細胞が標的である場合は、ヒトまたはウイルスのプロモーターなど、ヒトの細胞で発現可能なプロモーターに隣接し、このプロモーターの制御下にある核酸コード領域の位置決めをすると好ましい。
【０１６８】
好適なプロモーターは、発現を制御する対象となる核酸や発現対象となるコード配列を含む在来ポリヌクレオチドに内在し得る核酸とは異種のものであってもよい。また、プロモーターは一般に、コンストラクトプロモーター/コード配列が挿入される組換えベクター配列とは異種のものである。
【０１６９】
たとえばCAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター、さらに好ましくはpKK232-8およびpCM7ベクターなどを使用して、所望の遺伝子から任意にプロモーター領域を選択することができる。好ましいバクテリアプロモーターは、LacI、LacZ、T3またはT7バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター、gpt、λPR、PLおよびtrpプロモーター(EP 0036776)、ポリヘドリンプロモーター、あるいはバキュロウイルス由来のp10タンパク質プロモーター(Kit Novagen)(Smith et al., (1983) Mol Cell Biol Dec;3(12):2156-65; O'Reilly et al., 1992)、λPRプロモーターまたはtrcプロモーターである。
【０１７０】
真核生物のプロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、マウスメタロチオネイン-Lがあげられる。また、脂肪組織、筋肉組織または肝臓での発現を容易にするものなど、特定の細胞タイプに特異なプロモーターを選択してもよい。都合の良いベクターおよびプロモーターの選択方法については当業者の知識の範囲内である。
【０１７１】
プロモーターの選択についても遺伝子工学分野の当業者であればなし得ることである。たとえば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYの第1巻、第2巻、第3巻(1989)またはFuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biologyに説明された方法を参照することができる。
【０１７２】
他の調節要素
cDNA挿入物を使用する場合、ポリアデニル化シグナルを入れて遺伝子転写物を正しくポリアデニル化したいことが普通である。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を正しく実施する上では重要ではないと思われる。かかる配列のうちヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のものを利用できる。さらに、発現カセットの一要素としてターミネーターも企図される。これらの要素は、メッセージレベルを高め、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするよう機能するものである。
【０１７３】
上述したような適当なDNA配列を含むベクターを利用して適当な宿主を形質転換し、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現ができるようにすることが可能である。
【０１７４】
3)選択可能なマーカー
このようなマーカーは、発現コンストラクトを含む細胞の容易な同定を可能にする細胞を同定可能な状態で変化させるものである。形質転換した宿主細胞の選択用の選択可能なマーカー遺伝子は、真核生物の細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性であり、S. cerevisiaeまたはテトラサイクリンにはTRP1、E. coliではリファンピシン耐性またはアンピシリン耐性、放線菌ではレバンサッカラーゼであると好ましい。後者のマーカーはネガティブ選択マーカーである。
【０１７５】
4)好ましいベクター
バクテリアベクター
代表的ではあるが限定するものではない一例として、バクテリアで使用するのに有用な発現ベクターとしては、pBR322(ATCC 37017)の遺伝因子を有する市販のプラスミドに由来する複製物のバクテリア起源および選択可能なマーカーがあげられる。かかる市販ベクターとしては、たとえば、pKK223-3(スウェーデンUppsalaのファルマシア社)、pGEM1(米国ウィスコンシン州Madisonのプロメガバイオテク社)があげられる。
【０１７６】
好適なベクターは当業者間で他にも多数知られ、市販されている。一例として、バクテリアベクター:pQE70、pQE60、pQE-9(キアゲン)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A (ストラタジーン); ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (ファルマシア); pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (ストラタジーン); pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL (ファルマシア); pQE-30 (QIAexpress)があげられる。
【０１７７】
バキュロウイルスベクター
本発明のポリペプチドの発現に適したベクターが、昆虫細胞および昆虫株化細胞で増殖可能なバキュロウイルスベクターである。好適な特定の宿主ベクター系に、Spodoptera frugiperda由来のSF9株化細胞(ATCC No. CRL 1711)をトランスフェクトするのに用いられるpVL1392/1393バキュロウイルス移入ベクター(Pharmingen)がある。
【０１７８】
バキュロウイルス発現系でのApm1球状頭部ポリペプチドの発現に適した他のベクターとしては、Chai et al. (1993; Biotechnol Appl Biochem. Dec;18 ( Pt 3):259-73); Vlasak et al. (1983; Eur J Biochem Sep 1;135(1):123-6);およびLenhard et al. (1996; Gene Mar 9;169(2):187-90).によって説明されているものがあげられる。
【０１７９】
ウイルスベクター
特定の一実施形態では、アデノウイルスからベクターを得る。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、Feldman and Steg (1996; Semin Interv Cardiol Sep;1(3):203-8)またはOhno et al. (1994; Science Aug 5;265(5173):781-4)に説明されているものである。本発明の特定の実施形態による別の好ましい組換えアデノウイルスに、ヒトアデノウイルス2型または5型(Ad 2またはAd 5)または動物起源のアデノウイルスがある(フランス特許出願第FR-93.05954号)。
【０１８０】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターも一般に、外因性ポリヌクレオチドを特にヒトを含む哺乳動物にin vivoで移入する上で利用できる組換え遺伝子送達系であるとされている。これらのベクターによって、遺伝子を効率よく細胞に送達し、移入された核酸を宿主の染色体DNAに安定して取り込むことができる。
【０１８１】
本発明のレトロウイルスによるin vitroまたはin vivoでの遺伝子送達ビークルの調製または構築用として特に好ましいレトロウイルスとしては、Mink-Cell Focus Inducingウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスがあげられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070Aウイルスおよび1504Aウイルス、Abelson(ATCC No VR-999)、Friend(ATCC No VR-245)、Gross(ATCC No VR-590)、Rauscher(ATCC No VR-998)およびMoloneyマウス白血病ウイルス(ATCC No VR-190、PCT出願公開第WO 94/24298号)があげられる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスは、Bryanハイタイター(ATCC Nos VR-334、VR-657、VR-726、VR-659およびVR-728)を含んでいる。他の好ましいレトロウイルスベクターに、Roth et al.(1996)、PCT出願公開第WO 93/25234号、PCT出願公開第WO 94/ 06920号、Roux et al., ((1989) Proc Natl Acad Sci U S A Dec;86(23):9079-83), Julan et al., (1992) J. Gen. Virol. 3:3251-3255およびNeda et al., ((1991) J Biol Chem Aug 5;266(22):14143-6)に記載されているものがある。
【０１８２】
本発明で企図されるさらに他のウイルスベクター系にアデノ随伴ウイルス(AAV)がある。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的なライフサイクルを得るためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする天然由来の欠損性ウイルスである。(Muzyczka et al., (1992) Curr Top Microbiol Immunol;158:97-129)。また、これは自己のDNAを非分割細胞に組み込み、安定した組み込みの頻度を高くすることのできる限られたウイルスのうちの1つである。(Flotte et al., (1992) Am J Respir Cell Mol Biol Sep;7(3):349-56; Samulski et al., (1989) J Virol Sep;63(9):3822-8; McLaughlin et al., (1989) Am. J. Hum. Genet. 59:561-569)AAVの持つ有利な特徴の1つは、形質転換細胞に対する一次細胞の形質導入効率が低いことに由来するものである。
【０１８３】
5)組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドを発現させるためには、これらのコンストラクトを細胞に送達しなければならない。この送達は、実験室での株化細胞の形質転換方法などでin vitroにて実施してもよいし、あるいは特定の疾患状態の治療などでin vivoまたはex vivoで実施してもよい。
【０１８４】
1つの機序に、発現コンストラクトを感染性のウイルス粒子に包埋するウイルス感染がある。
【０１８５】
本発明では、ポリヌクレオチドを哺乳動物の培養細胞に移入するための非ウイルス的な方法もいくつか企図している。これらの方法としては、リン酸カルシウム沈澱反応(Graham et al., (1973) Virology Aug;54(2):536-9; Chen et al., (1987) Mol Cell Biol Aug;7(8):2745-52)、DEAE-デキストラン(Gopal, (1985) Mol Cell Biol May;5(5):1188-90)、電気穿孔(Tur-Kaspa et al., (1986) Mol Cell Biol Feb;6(2):716-8; Potter et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA Nov;81(22):7161-5.)、指向性マイクロインジェクション(Harland et al., (1985) J Cell Biol Sep;101(3):1094-9)、DNA担持リポソーム(Nicolau et al., (1982) Biochim Biophys Acta Oct 11;721(2):185-90; Fraley et al., (1979) Proc Natl Acad Sci USA Jul;76(7):3348-52)、受容体媒介トランスフェクション(Wu and Wu, (1987) J Biol Chem Apr 5;262(10):4429-32; Wu and Wu (1988) Biochemistry Feb 9;27(3):887-92)があげられるが、これに限定されるものではない。これらの手法の中には、in vivoまたはex vivoでの用途にうまく適合させられるものもある。
【０１８６】
発現ポリヌクレオチドを細胞に送達した後、これをレシピエント細胞のゲノムに安定して組み入れることができる。この組み入れは、相同的組換え(遺伝子交換)によって同族位置および配向で行ってもよいし、あるいは無作為に不特定の位置に統合(遺伝子増強)してもよい。さらに別の実施形態では、DNAの別個のエピゾーム型セグメントとして核酸を細胞で安定して維持することができる。このような核酸セグメントまたは「エピゾーム」は、宿主細胞のサイクルとは独立に、あるいはこれと同期して維持および複製ができる程度に配列をコードする。
【０１８７】
タンパク質またはペプチドをin vivoにて脊椎動物の細胞の内部に送達する方法についての特定の一実施形態は、該当するポリペプチドを作動可能にコードする、生理学的に許容可能な担体と裸のポリヌクレオチドとを有する調製物を、細胞を有する組織の間質空間に導入し、これによって裸のポリヌクレオチドを細胞の内部に取り込んで生理学的な効果を持たせるステップを含む。これは特にin vitroでの移入に適用可能であるが、in vivoでも同様に適用できる。
【０１８８】
「裸の」ポリヌクレオチドを含む、in vitroおよびin vivoで使用される組成物については、PCT出願公開第WO 90/11092号(Vical Inc.)およびPCT出願公開第WO 95/11307号(Institut Pasteur, INSERM, Universit・d'Ottawa)ならびにTascon et al. (1996) Nature Medicine. 2(8):888-892およびof Huygen et al. ((1996) Nat Med Aug;2(8):893-8)による文献に記載されている。
【０１８９】
本発明のさらに他の実施形態では、粒子衝突(biolistic)を用いて本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを含む本発明の裸のポリヌクレオチドを細胞に移入することができる。前記粒子は、Klein et al. ((1990) Curr Genet Feb;17(2):97-103)によって説明されているように、細胞膜を穿孔して細胞を死滅させずに細胞に入り込むことができるように高い速度まで加速されたDNA被覆微粒子である。
【０１９０】
さらに他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに包埋することができる(Ghosh and Bacchawat, (1991) Targeted Diagn Ther;4:87-103; Wong et al., (1980) Gene 10:87-94; Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol.;149:157-76)。レプチン、トリグリセリド、ACRP30または他の周知のLSRリガンドをリポソーム膜に取り込むことによって、LSRを発現する細胞にこれらのリポソームをさらに標的してもよい。
【０１９１】
特定の実施形態において、本発明によれば、本願明細書に記載のApm1球状頭部ポリペプチドのin vivo産生用の組成物が得られる。この組成物は、このポリペプチドを作動可能にコードする裸のポリヌクレオチドを、生理学的に許容可能な担体の溶液中に含み、組織に導入してその組織の細胞に前記ポリペプチドを発現させるのに適している。
【０１９２】
所望の宿主有機体に注入するベクターの量は、注入部位によってさまざまである。表示用量としては、ベクター0.1〜100μgの範囲で、動物の体、好ましくはマウスの体などの哺乳動物の体に注入する。
【０１９３】
本発明によるベクターの別の実施形態では、宿主細胞、好ましくは処理対象となる動物から事前に採取した宿主細胞、さらに好ましくは筋細胞などの体細胞にin vitroにてベクターを導入することができる。以後のステップで、所望のApm1球状頭部ポリペプチドまたはその所望のフラグメントをコードするベクターで形質転換した細胞を動物の体に再導入し、体内の組換えタンパク質を局所的または体全体に送達する。
【０１９４】
IV.本発明の組換え細胞
本発明のもう1つの目的は、本願明細書にて述べるポリヌクレオチドのうちいずれかによって、正確には、「本発明のポリヌクレオチド」欄に記載されているものなどの本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞組換え体からなる。これらのポリヌクレオチドは、一過性または安定したトランスフェクションの結果として細胞中に存在することができる。本発明は、 「本発明の組換えベクター」に記載したものなどの組換えベクターで形質転換された(原核細胞)宿主細胞または当該組換えベクターでトランスフェクトした(真核細胞)宿主細胞を含む。
【０１９５】
大まかに言うと、本発明の組換え宿主細胞は、本願明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクターのうち少なくとも1つを含む。
【０１９６】
本発明の組換えベクター用のレシピエントとして用いる好ましい宿主細胞は次のとおりである。
a)原核生物宿主細胞: Escherichia coli(大腸菌株)(I.E. DH5- 菌株)、Bacillus subtilis(枯草菌)、Salmonella typhimurium(サルモネラ菌)の他、Pseudomonas(シュードモナス)Streptomyces(ストレプトマイセス)およびStaphylococcus(スタフィロコッカス)などの種から得られる菌株。
b)真核宿主細胞:HeLa細胞(ATCC No. CCL2; No. CCL2.1; No. CCL2.2)、Cv 1 細胞(ATCC No. CCL70)、COS細胞(ATCC No. CRL1650; No. CRL1651)、Sf-9 細胞(ATCC No. CRL1711)、C127細胞(ATCC No. CRL-1804)、3T3(ATCC No. CRL-6361)、CHO(ATCC No. CCL-61)、ヒト腎293(ATCC No. 45504; No. CRL-1573)、BHK(ECACC No. 84100501; No. 84111301)、PLC細胞、HepG2およびHep3B。
【０１９７】
宿主細胞中のコンストラクトを従来の方法で利用して、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を得ることができる。
【０１９８】
好適な宿主を形質転換して増殖させて適切な細胞密度にした後、温度シフトまたは化学誘導などの適切な手段によって選択したプロモーターを誘発し、細胞をさらに培養する。
【０１９９】
一般に、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的な手段で破壊し、得られる粗エキスを以後の精製用に保持する。
【０２００】
凍結融解サイクルの繰り返し、超音波処理、機械的な破壊または細胞溶解剤を使用するなどの都合の良い方法によって、タンパク質の発現に使用される微生物細胞を破壊することができる。このような方法は当業者間で周知である。
【０２０１】
さらに、本発明によれば、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシおよび人間を含まない霊長類からなる群から選択される動物において、上記の組換え細胞をin vitroまたはin vivoで作出することができる。in vitroにて作出される組換え細胞を、後で動物などに対して外科移植することが可能である。組換え細胞を動物にてin vivoで作出するための方法は従来技術において周知である。
【０２０２】
また、本発明は、a)外来(異種)ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内在性染色体DNAに挿入する、b)内在性染色体DNAを除去する、および/またはc)内在性染色体DNAを外来ポリヌクレオチドと代置するように遺伝子操作した、脊椎動物由来、好ましくは哺乳動物由来、特にヒト由来の一次、二次および不死化した相同的組換え宿主細胞を包含する。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および/または代置は、標的遺伝子に作動可能に連結された、プロモーター配列およびエンハンサー配列など、標的遺伝子のコード配列および/または調節領域に対するものであってもよい。
【０２０３】
さらに、本発明は、該当する細胞で通常は発現されない標的遺伝子を変更する、in vitroまたはin vivoにて相同的組換え宿主細胞を作出するための方法に関する。好ましくは、変更によって、通常の増殖条件下または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドを産生するのに適した条件下で、標的遺伝子が発現される。この方法は、(a)(i)標的配列と、(ii)制御配列および/またはコード配列と、(iii)必要があれば不対のスプライス供与部位と、を含むポリヌクレオチドコンストラクトを用いて、in vitroまたはin vivoにて細胞をトランスフェクトすることによって、トランスフェクトされた細胞を生成するステップと、(b)当該トランスフェクトされた細胞を相同的組換えに適した条件下でin vitroまたはin vivoにて維持するステップと、を含む。
【０２０４】
本発明はさらに、通常は遺伝子が発現しない細胞においてin vitroまたはin vivoで標的遺伝子の発現を変更する方法であって、(a)(i)標的配列と、(ii)制御配列および/またはコード配列と、(iii)必要があれば不対のスプライス供与部位と、を含むポリヌクレオチドコンストラクトを用いて、in vitroまたはin vivoにて細胞をトランスフェクトすることによって、トランスフェクトされた細胞を生成するステップと、(b)当該トランスフェクトされた細胞を相同的組換えに適した条件下でin vitroまたはin vivoにて維持することによって、相同的組換え細胞を生成するステップと、(c)上記遺伝子の発現に適した条件下で当該相同的組換え細胞をin vitroまたはin vivoにて維持するステップと、を含む方法に関する。
【０２０５】
本発明はさらに、通常は遺伝子が発現しない細胞においてin vitroまたはin vivoで内在性標的遺伝子の発現を変更することによって、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、a)(i)標的配列と、(ii)制御配列および/またはコード配列と、(iii)必要があれば不対のスプライス供与部位と、を含むポリヌクレオチドコンストラクトを用いて、in vitroにて細胞をトランスフェクトすることによって、トランスフェクトされた細胞を生成するステップと、(b)当該トランスフェクトされた細胞を相同的組換えに適した条件下でin vitroまたはin vivoにて維持することによって、相同的組換え細胞を生成するステップと、(c)上記遺伝子の発現に適した条件下で当該相同的組換え細胞をin vitroまたはin vivoにて維持することによって、ポリペプチドを生成するステップと、を含む方法に関する。
【０２０６】
本発明はさらに、通常は遺伝子が発現しない細胞タイプにおいて標的遺伝子の発現を変更するポリヌクレオチドコンストラクトに関する。これは、ポリヌクレオチドコンストラクトを標的細胞の染色体DNAに挿入すると発生する。かかるポリヌクレオチドコンストラクトは、a)標的配列と、b)制御配列および/またはコード配列と、c)必要であれば不対のスプライス供与部位と、を含む。さらに、上述したようなポリヌクレオチドコンストラクトも包含される。このコンストラクトはさらに、ポリペプチドをコードし、かつ、染色体DNAを用いた相同的組換え後に内在性標的遺伝子とインフレームであるポリヌクレオチドを含む。
【０２０７】
これらの組成物を生成し、上記の方法を実施するには、米国特許第6,054,288号、同第6,048,729号、同第6,048,724号、同第6,048,524号、同第5,994,127号、同第5,968,502号、同第5,965,125号、同第5,869,239号、同第5,817,789号、同第5,783,385号、同第5,733,761号、同第5,641,670号、同第5,580,734号; 国際特許出願公開第WO96/29411号、同第WO 94/12650; Koller et al., (1994) Annu.  Rev.  Immunol.  10:705-730)による化学技術文献など(いずれも開示内容全体を本願明細所に援用する)に記載されているものなどの従来技術において周知の技法を用いることができる。
【０２０８】
ヒトをはじめとする哺乳動物の細胞でのOBG3遺伝子発現を不完全にするか、あるいは本発明に従って動物細胞のゲノムにおけるOBG3遺伝子相当物をOBG3ポリヌクレオチドと代置してOBG3ゲノム配列またはOBG3 cDNA配列を挿入した状態でOBG3遺伝子発現を増強することができる。このような遺伝的な変化は、上述した特定のDNAコンストラクトを用いる相同的組換え現象によって生み出すことのできるものである。
【０２０９】
使用できる宿主細胞の1種にマウス接合体などの哺乳動物接合体がある。たとえば、NaCl 100mM、スペルミン30μM、スペルミジン70μMを含有する、トリス-HCl 10mM、pH7.4、EDTA 250μM中、BACインサートであれば1ng/ml、P1バクテリオファージインサートであれば3ng/μlからの濃度範囲にあらかじめ調節した精製DNA分子などの、該当する精製DNA分子をマウス接合体に微量注射する。微量注射するDNAの大きさが大きい場合、Schedl et al ((1993) Nature Mar 18;362(6417):258-61)に記載されているように、ポリアミンと高い塩濃度を用いて、DNAが機械的に破壊されてしまうのを防止することができる。
【０２１０】
本願明細書で説明したDNAコンストラクトをはじめとする本発明のポリヌクレオチドのうちいずれかを、胚性幹細胞(ES)、好ましくはマウスのES細胞に導入する。着床前胚盤胞の内部細胞塊の多分化能を持つ未分化細胞からES細胞株を得る。好ましいES細胞株としては、ES-E14TG2a(ATCC No. CRL-1821)、ES-D3(ATCC No. CRL1934およびNo. CRL-11632)、YS001(ATCC No. CRL-11776)、36.5(ATCC No. CRL-11116)があげられる。ES細胞を未分化状態に維持するために、胚性表現型を保存する適当なシグナルを提供し、かつES細胞接着のマトリックスとして機能する成長抑制支持細胞の存在下でこれを培養する。好ましい支持細胞は、実質的にどのようなマウス菌株でも13〜14日目の胚組織から樹立される一次胚線維芽からなるものであり、これをAbbondanzo et al.(1993; Methods Enzymol;225:803-23)に記載されているようにして培養中で保持し、Robertson ((1987) Embryo-derived stem cell lines.  In: E.J.  Robertson Ed.  Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach.  IRL Press, Oxford)に記載されているようにして輻射によって成長を抑制するか、あるいはPease and Williams (1990; Exp Cell Res. Oct;190(2):209-11)に記載されているように抑制濃度のLIFを用いることで成長を抑制する。
【０２１１】
宿主細胞中のコンストラクトを従来の方法で利用して、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を得ることができる。
【０２１２】
宿主を適宜形質転換して増殖させて適切な細胞密度にした後、温度シフトまたは化学誘導などの適切な手段によって、選択したプロモーターを誘発し、細胞をさらに培養する。一般に、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的な手段で破壊し、得られる粗エキスを以後の精製用に保持する。凍結融解サイクルの繰り返し、超音波処理、機械的な破壊または細胞溶解剤を使用するなどの都合の良い方法によって、タンパク質の発現に使用される微生物細胞を破壊することができる。このような方法は当業者間で周知である。
【０２１３】
IV.トランスジェニック動物
また、本発明は、組換えOBG3ポリペプチド、すなわち組換えOBG3フラグメントまたは全長OBG3ポリペプチドを発現する非ヒト動物および植物を生成するための方法および組成物を提供するものである。これらの動物または植物はトランスジェニックすなわち、その細胞の各々がOBG3ポリペプチドをコードする遺伝子を含むことが可能であり、あるいは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該動物または植物の体細胞、たとえば、哺乳動物の乳房分泌組織上皮細胞に導入することが可能である。好ましい実施形態では、非ヒト動物は、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギなどの哺乳動物である。
【０２１４】
哺乳動物などのトランスジェニック動物を作出するための方法は当業者間で周知であり、本発明ではこのような方法のうちいずれを使ってもよい。簡単に説明すると、ES細胞などの多能性幹細胞を、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトするなどの方法でトランスジェニック哺乳動物を作出することができる。形質転換に成功したES細胞を初期胚に導入し、これを同一種の哺乳動物の子宮に移植する。場合によっては、形質転換後の(「トランスジェニック」)細胞が、得られる動物の生殖系列の一部を含むことがあるが、そのような場合には当該生殖系列のトランスジェニック細胞を含む成体の動物を他の動物と交配させることで、各細胞に導入遺伝子を有する最終的にトランスジェニック動物の個体群を得ることができる。この個体群は導入遺伝子を子孫に対して安定的に伝達することができる。また、該当するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを微量注射によって受精卵または初期胚に導入する、あるいは、導入遺伝子を含むレトロウイルスに接合子を感染させて導入遺伝子を動物に導入するなどの、ポリヌクレオチドを導入するための他の方法を利用してもよい(Jaenisch, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260-1264)。トランスジェニック哺乳動物を作出する方法については、Wall et al. (1992) J Cell Biochem 1992 Jun;49(2):113-20; Hogan, et al. (1986) in Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;国際特許出願公開第WO 91/08216号または米国特許第4,736,866号に記載されている。
【０２１５】
好ましい方法では、受精した卵母細胞にポリヌクレオチドを微量注射する。一般に、常法に従って受精した卵母細胞への微量注射を行い、続いて「移植前胚」が得られるまでこれをin vitroにて培養する。かかる移植前胚は、約16〜150の細胞を含むものであると好ましい。受精した卵母細胞を移植前段階に培養する方法については、たとえば、Gordon et al. ((1984) Methods in Enzymology, 101, 414); Hogan et al. ((1986) in Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) (for the mouse embryo); Hammer et al. ((1985) Nature, 315, 680) (for rabbit and porcine embryos); Gandolfi et al. ((1987) J. Reprod. Fert. 81, 23-28); Rexroad et al. ((1988) J. Anim. Sci. 66, 947-953) (for ovine embryos); and Eyestone et al. ((1989) J. Reprod. Fert. 85, 715-720); Camous et al. ((1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785); and Heyman et al. ((1987) Theriogenology 27, 5968) (for bovine embryos)に記載されている。これらの文献の開示内容全体を本願明細書に援用する。次に、移植前胚を常法によって適当なメスに移入し、導入遺伝子を導入した発達時期に応じてトランスジェニック動物またはキメラ動物を出産できるようにする。
【０２１６】
導入遺伝子の取り込み頻度は低いことが多いため、本願明細書に記載のいずれかの方法を利用して、移植前胚への導入遺伝子取り込みを検出するようにすると望ましいことが多い。さまざまな方法の中から任意のものを利用して、移植前胚における導入遺伝子の存在を検出することができる。たとえば、1つまたはそれ以上の細胞を移植前胚から除去し、PCRなどの適当な常法を利用して除去した細胞における導入遺伝子の有無を検出することができる。あるいは、常法を利用して子宮内または分娩後に導入遺伝子の存在を検出することができる。
【０２１７】
本発明の特に好ましい実施形態では、乳に組換えOBG3ポリペプチドを分泌するトランスジェニック哺乳動物を作出する。乳腺は極めて効率的なタンパク質産生器官であるため、このような方法を利用して1リットルあたりの数グラム量の範囲でタンパク質濃縮物を生成することができる。これよりも有意に多い量でタンパク質濃縮物を得られることもある。好ましくは、OBG3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺特異的プロモーターに作動可能に連結させ、任意に、他の調節要素に作動可能に連結させて、乳腺で発現させる。好適なプロモーターおよび他の要素としては、哺乳動物の短鎖および長鎖WAP、αカゼイン、βカゼインおよびκカゼイン、αおよびβラクトグロブリン、β-CN 5'遺伝子由来のプロモーターならびにマウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーターを含むがこれに限定されるものではない。かかるプロモーターおよび他の要素については、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギおよびモルモットを含むがこれに限定されるものではない哺乳動物から誘導することができる。プロモーターおよび他の制御配列、ベクターおよび他の関連技術については、たとえば、Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Jost et al. (1999) Nat. Biotechnol 17:160-4;米国特許第5,994,616号、同第6,140,552号、同第6,013,857; Sohn et al. (1999) DNA Cell Biol. 18:845-52; Kim et al. (1999) J. Biochem. (Japan) 126:320-5; Soulier et al. (1999) Euro. J. Biochem. 260:533-9; Zhang et al. (1997) Chin. J. Biotech. 13:271-6; Rijnkels et al. (1998) Transgen. Res. 7:5-14; Korhonen et al. (1997) Euro. J. Biochem. 245:482-9; Uusi-Oukari et al. (1997) Transgen. Res. 6:75-84; Hitchin et al. (1996) Prot. Expr. Purif. 7:247-52; Platenburg et al. (1994) Transgen. Res. 3:99-108; Heng-Cherl et al. (1993) Animal Biotech. 4:89-107; and Christa et al. (2000) Euro. J. Biochem. 267:1665-71に記載されている。これらの開示内容全体を本願明細書に援用する。
【０２１８】
もう1つの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、たとえば乳房分泌組織上皮細胞などの乳腺の体細胞にin vivoにて導入することによって、乳において本発明のポリペプチドを生成することができる。たとえば、プラスミドDNAをDEAE-デキストランと共に(Hens et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1523:161-171などを参照のこと)、コンストラクトの受容体媒介エンドサイトーシスを引き起こすことが可能なリガンドと共に(Sobolev et al. (1998) 273:7928-33などを参照のこと)、あるいは、レトロウイルスベクター(たとえばギボンザル白血病ウイルス)などのウイルスベクターにおいて(Archer et al. (1994) PNAS 91:6840-6844などを参照のこと)乳管経由で注入することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、上述したような乳腺特異的プロモーターまたはCMVまたはMoMLV LTRなどの発現力の強いプロモーターに、ポリヌクレオチドを作動可能に連結させることができる。
【０２１９】
ベクター、プロモーター、調節要素などが本発明で利用するのにどの程度適しているかについては、たとえばMacT細胞(ウシ乳房上皮細胞)またはGME細胞(ヤギ乳房上皮細胞)などの乳房上皮細胞の細胞をin vitroにてトランスフェクトし、トランスフェクション効率と導入遺伝子の細胞での発現効率を評価することで、事前に評価することができる。
【０２２０】
in vivo投与では、任意の濃度範囲(1〜500μg/ml、好ましくは50〜100μg/ml)にて、任意の容量(1〜100ml、好ましくは1〜20ml)で、適当な製剤の形でポリヌクレオチドを投与することができ、任意の回数(1回、2回、3回、5回または10回など)、任意の頻度(1日毎、2日毎、3日毎、5日毎、10日毎または任意の日数毎など)で投与することができる。好適な濃度、頻度、投与形態などは、特定のポリヌクレオチド、ベクター、動物などによって変わり、当業者が容易に判断し得るものである。
【０２２１】
好ましい実施形態では、Archer et al. ((1994) PNAS 91:6840-6844)に記載されているようにしてギボンザル白血病ウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを使用する。レトロウイルスでの感染には一般に細胞分裂が
必要であるため、安息香酸エストラジオール、プロゲステロン、レセルピンまたはデキサメタゾンなどの因子を利用して、ベクターの投与に伴って乳腺での細胞分裂を刺激することができる。さらに、ポリブレンなどのアクセサリー化合物を利用してレトロウイルスによる感染方法および他の感染方法を容易にすることもできる。
【０２２２】
乳からOBG3ポリペプチドを得るための本願明細書にて記載の方法では、hexestrol、エストロゲンおよび/またはプロゲステロンを使用するなど、標準的な乳分泌誘導方法で、得られる乳の量を増やし、よって得られるOBG3ポリペプチドの量を増やすことが可能である。
【０２２３】
このような実施形態で用いるポリヌクレオチドは、全長OBG3ポリペプチドをコードするものであってもOBG3フラグメントをコードするものであってもよい。一般に、コードされるポリペプチドには、タンパク質が確実に乳に分泌されるようにするためのシグナル配列を含む。全長OBG3配列を使用する場合、たとえば全長タンパク質を乳から単離し、好適なプロテアーゼを用いてin vitroにて切断することが可能である。あるいは、第2のプロテアーゼコードポリヌクレオチドを動物または乳腺細胞に導入し、ここでプロテアーゼを発現させてOBG3ポリペプチドをin vivoにて切断し、乳からのOBG3フラグメントの単離を指令できるようにしてもよい。
【０２２４】
V.本発明の薬学的または生理学的に許容可能な組成物
本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントを、非ヒト動物および/またはヒトに、単独または薬学的または生理学的に許容可能な組成物として投与することができる。後者の場合、好適な担体または賦形剤と混合されている。この場合、薬学的または生理学的に許容可能な組成物を、治療有効量で提供することが可能である。治療有効量とは、本願明細書に記載の方法で判断する肥満関連疾患または機能障害の症状または生理学的状態を予防または軽減する効果を得るのに十分なOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントの量を意味する。また、治療有効量とは、体重の削減または体重増加の予防、あるいは体重増加率の予防などの効果を、美容上の理由でこれを必要とする個人に対して発揮するのに必要なOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントの量を指すこともできる。本発明のOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントの治療有効用量とは、連続して反復使用または投与することで体重減少または体重増加を促進するのに適している用量である。OBG3ポリペプチドフラグメントの処方および投与の方法については、「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co., Easton, PA最終版に記載されている。
【０２２５】
本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントを利用して治療または妨害することが可能な疾患または機能障害としては、肥満症、インスリン耐性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、非インスリン依存型糖尿病およびII型糖尿病を含むがこれに限定されるものではない、肥満症および肥満関連疾患および機能障害があげられる。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを利用して、作業時または運動時に肉体性能を高めたり、幸福感を増したりしてもよい。肉体性能活性としては、歩くこと、走ること、飛び跳ねること、持ち上げることおよび/または登ることがある。
【０２２６】
OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントまたはそのアンタゴニストを利用して、読み書き障害、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動障害(ADHD)を治療できる他、脂肪酸の代謝、具体的には特定の長鎖多不飽和脂肪酸の産生を調節することで、精神分裂病などの精神障害を治療することもできる。
【０２２７】
本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを単独または他の薬学的または生理学的に許容可能な化合物との組み合わせで提供し得ることは、明示的に考慮されている。肥満症および他の疾患および機能障害の治療に有用な他の化合物としては、すでに従来技術において周知である。
【０２２８】
好ましい実施形態では、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントは、本願明細書に記載の方法および従来技術において周知の方法を用いてインスリン耐性および糖尿病を治療する上で有用であり、この目的で使用される。特に、好ましい実施形態は、ブドウ糖代謝を動物またはヒトの被検体において治療的に加減および調節する方法であって、治療が必要になった際に(あるいは毎日決まったタイミングで)OBGまたはOBG3ポリペプチドフラグメント(または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)を、動物またはヒトの被検体において血漿ブドウ糖レベルを低下させるのに十分な用量および期間で被検体に投与することを含む方法に関する。
【０２２９】
さらに好ましい実施形態は、糖尿病を予防または治療する方法であって、治療が必要になった際に(あるいは毎日決まったタイミングで)OBGまたはOBG3ポリペプチドフラグメント(または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)を、動物またはヒトの被検体において血漿ブドウ糖レベルを低下させるのに十分な用量および期間で被検体に投与する方法に関する。
【０２３０】
投与経路
好適な投与経路としては、従来技術において周知の方法を利用した、経口投与、経鼻投与、経直腸投与、経粘膜投与または経腸管投与の他、筋肉注射、皮下注射、骨髄注射ならびにくも膜下腔内注入、脳室内への直接注入、静脈注入、腹腔内注入、鼻腔内注入、肺内注入(吸引)または眼球内注入を含む非経口送達があげられる。体重減少を促進する上で特に有用な化合物投与方法には、長期間にわたってOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを送達する装置をレシピエントの腹腔に外科移植する方法がある。特に好ましい他の投与経路としては、エアロゾル製剤および持効性製剤がある。本発明による医薬品の徐放製剤、特に持効性製剤が明示的に企図される。
【０２３１】
組成物/製剤
本発明によって使用される薬学的または生理学的に許容可能な組成物および医薬品については、賦形剤および助剤を含む生理学的に許容可能な担体を1種またはそれ以上利用して、従来の方法で処方できる。適した処方は選択する投与経路によって決まる。
【０２３２】
本願明細書に記載の医薬品には、薬学的または生理学的に許容可能な担体と、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントであるポリペプチド少なくとも1種とを含むものがある。注射用では、水溶液中、好ましくはハンクス液やリンゲル液などの生理学的に相溶な緩衝液、あるいは、リン酸緩衝液または炭酸水素緩衝液などの生理食塩緩衝液中にて、本発明の薬剤を処方する。経粘膜投与用では通過しようとする障壁に適した貫通刺胞を用いて処方する。このような貫通刺胞は従来技術において一般に知られている。
【０２３３】
経口摂取可能な薬学的または生理学的に許容可能な調製物としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルならびに、グリセロールまたはソルビトールなどのゼラチンおよび可塑化剤で作られたソフトシールカプセルがあげられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、スターチなどの結合剤および/またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、さらには任意に安定化剤との混合物で活性成分を含むことが可能である。ソフトカプセルの場合は、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなどの好適な液体に活性成分を溶解または懸濁させる。また、安定化剤を添加してもよい。経口投与用の製剤はいずれも、このような投与に適した剤形のものとする。
【０２３４】
頬側投与では、本組成物を従来の方法で処方したタブレットまたは薬用ドロップの形にすることができる。
【０２３５】
吸入投与の場合、二酸化炭素などの好適な気体推進剤を利用して、本発明に従って使用する化合物を加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー状にして送達すると都合がよい。加圧エアロゾルの場合、分注量を秤量して送達するための弁を設けて用量単位を判断する。吸入器または散布器で使用するゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジに、本化合物とラクトースまたはスターチなどの好適な粉末ベースとの混合粉末を入れて処方してもよい。
【０２３６】
これらの化合物を、大量瞬時投与注射または連続注入などの注射による非経口投与用に処方してもよい。注射用製剤については、保存剤を加え、たとえばアンプルまたは多用量型容器などに入れた単位剤形の形で提供できる。これらの組成物は、水性のビヒクル中の懸濁液、溶液または乳液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの処方剤を含有してもよい。
【０２３７】
非経口投与用の薬学的または生理学的に許容可能な製剤は、水可溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を水性懸濁液に含有させてもよい。任意に、好適な安定化剤または化合物の可溶性を高める薬剤を懸濁液に含有させ、極めて濃度の高い溶液状の調製物が得られるようにしてもよい。
【０２３８】
あるいは、パイロジェンが混入していない滅菌水などの好適なビヒクルで使用前に組成するよう、活性成分を粉末状または凍結乾燥形態にしてもよい。
【０２３９】
上述した製剤に加えて、持効性製剤調製物として本化合物を組成してもよい。このような作用期間の長い製剤については、移植(皮下または筋肉内)または筋肉注射などによって投与することができる。このため、たとえば、好適なポリマー材料または疎水性材料(許容可能なオイル中の乳濁液として)またはイオン交換樹脂、あるいはやや溶解しにくい誘導体(やや溶解しにくい塩などとして)と共に本化合物を組成することができる。
【０２４０】
また、治療薬を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放系を利用して化合物を送達してもよい。さまざまな徐放材料が開発されており、当業者間で周知である。化学的な性質次第では、徐放カプセルは数週間から100日程度まで化合物を放出することができる。
【０２４１】
治療用試薬の化学的な性質および生物学的な安定性によっては、タンパク質を安定させるための別の方法を利用してもよい。
【０２４２】
薬学的または生理学的に許容可能な組成物は、固体相またはゲル相の好適な担体または賦形剤を含むものであってもよい。このような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖類、スターチ類、セルロース誘導体、ゼラチンの他、ポリエチレングリコールなどのポリマーがあげられるが、これに限定されるものではない。
有効用量
【０２４３】
本発明で使用するのに適した薬学的または生理学的に許容可能な組成物としては、意図した目的を達成するのに効果的な量で活性成分が含有された組成物があげられる。具体的には、治療有効量とは、治療対象となる被検体に症状が発症するのを防止または既存の症状を軽減するのに効果的な量を意味する。効果的な量の判定は当業者がなし得る程度のことであり、特に、本願明細書にて記載する詳細な開示を参照すれば容易になし得るであろう。
【０２４４】
本発明の方法で使用される化合物では、最初に細胞培養アッセイを行って治療有効量を推定することが可能である。たとえば、動物モデルにおいて、濃度点または濃度範囲を含む循環濃度範囲が得られるような投与量を処方し、レプチンまたはリポタンパク質の取込み量を増やす、あるいは、in vitro系での結合を増すことが可能である。このような情報を利用して、人間での有用な用量を一層正確に判定することができる。
【０２４５】
治療有効量とは、患者において症状が軽減される化合物量を指す。このような化合物の毒性および治療効率については、LD50(被検個体群の50%致死量)およびED50(個体群での50%有効量)を求めるなどの形で、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的方法を用いて判定することが可能である。毒性と治療効果との用量比が安全係数であり、これをLD50とED50との比として表すことができる。安全係数の高い化合物が好ましい。
【０２４６】
人間に用いる用量の範囲を定める際には、これらの細胞培養アッセイおよび動物実験で得られるデータを利用することができる。このような化合物の用量は、毒性がわずかであるかまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内であると好ましい。使用する剤形および投与経路に応じて、この範囲内で用量を変えてもよい。正確な処方内容、投与経路および用量については、それぞれの医師が患者の体調を考慮して選択することができる(Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1などを参照のこと)。
【０２４７】
薬用量および間隔を個々に調節し、状況に応じて体重減少または体重増加を維持または妨害するのに十分な活性化合物の血漿レベルを達成することができる。これらの効果を達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に左右される。
【０２４８】
投与間隔についても最低有効濃度値を用いて判断することができる。化合物は、時間の10〜90%、好ましくは30〜90%、最も好ましくは50〜90%で血漿レベルを最低有効濃度以上に維持できる投与計画で投与すべきである。局所投与または選択的な取込みの場合、該当する薬剤の効果的な局所濃度は血漿濃度とは無関係のこともある。
【０２４９】
もちろん、組成物の投与量は、治療対象となる被検体の体重や苦痛の重篤度、投与方法および担当医師の判断などによって決まる。
【０２５０】
毎日または定期的に投与して所望の結果を得ることが可能な本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントの量に関して、好ましい用量範囲は、循環血漿中の高トリグリセリド含有リポタンパク質のレベル低下分を含み、体重あたり0.01〜0.5mg/kgである。一層好ましい用量範囲は0.05〜0.1mg/kgである。もちろん、これらの日用量を1日の中で少量ずつ定期的に送達または投与することも可能である。また、これらの用量範囲は好ましい範囲にすぎず、本発明を限定するものではないことに注意されたい。
【０２５１】
治療方法
マウスをgOBG3ポリペプチドフラグメントで処置すると、トリグリセリドレベルが低下し、遊離脂肪酸レベルが低下し、ブドウ糖レベルが低下し、体重が減少すると同時に、筋肉酸化量が増す。
【０２５２】
本発明は、特に、肥満関連疾患および機能障害を防止または治療する方法であて、当該治療が必要になった際に、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを個体に提供することを含む方法を対象としている。好ましくは、OBG3ポリペプチドフラグメントは、in vitroまたはin vivoで肥満症関連活性を有する。好ましくは、OBG3ポリペプチドフラグメントは、好ましくは経口摂取される製薬組成物の形で個体に提供される。好ましくは、個体は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。好ましい実施形態では、肥満関連疾患または機能障害が、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、インスリン耐性、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、II型糖尿病および脂肪萎縮性糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症、トリグリセリド過剰血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、腫瘍形成関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。極めて好ましい実施形態において、製薬組成物でOBG3ポリペプチドフラグメントを利用して、美容上の理由で健常な個体の体重を調節することができる。
【０２５３】
また、本発明は、肥満関連疾患および機能障害を防止または治療する方法であって、当該治療が必要になった際に、本発明のアッセイ(発明の好ましい実施形態のセクションVIおよび実施例で説明)によって同定される化合物を個体に提供する方法を特徴とするものである。好ましくは、これらの化合物は、細胞においてin vitroで、筋肉においてex vivoで、あるいは動物モデルにおいて、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントの作用に拮抗または作用する(agoniez)。あるいは、これらの化合物は、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントがレプチンおよび/またはリポタンパク質取込みおよび/または結合に対しておよぼす作用に作用または拮抗する。任意に、これらの化合物は、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントのin vitroまたはin vivoでのLSRとの相互作用、結合または取込みを妨害する。好ましくは、この化合物は、好ましくは経口摂取される製薬組成物の形で個体に提供される。好ましくは、個体は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。好ましい実施形態では、肥満関連疾患または機能障害は、肥満症および肥満関連疾患ならびに、アテローム性動脈硬化症、心疾患、インスリン耐性、高血圧症、脳卒中、シンドロームX、II型糖尿病および脂肪萎縮性糖尿病などの機能障害からなる群から選択される。本発明の方法による治療対象となるII型糖尿病関連合併症としては、微小血管病変、眼病変および腎病変があげられる。心疾患としては、心不全、冠不全および高血圧があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物での治療対象となる他の肥満症関連機能障害としては、高脂質血症、トリグリセリド過剰血症および高尿酸血症があげられる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または機能障害としては、悪液質、萎縮病、AIDS関連体重減少、腫瘍形成関連体重減少、摂食障害および過食症があげられる。極めて好ましい実施形態では、製薬組成物を用いて美容上の理由で体重を調節する。
【０２５４】
さらに広義に言うと、本発明は、個体がApm1マーカー(Apm1は全長OBG3ポリペプチドのヒト相同体を示す)について特定の遺伝子型を持っていることが明らかになった場合、あるいは、たとえば疾患のない個体の代表値などの対照量と比較して、あるいは、その個体の該当する疾患または状態の発症前と比較して、全長または好ましくは一層生物学的活性の高いApm1フラグメントの血漿Apm1量が低いことが明らかになった場合に、OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントでの治療を対象とするものである。いずれの場合も、治療には薬学的に許容可能なgOBG3またはOBG3ポリペプチドフラグメントを個体に提供することを含む。提供するOBG3フラグメントまたはgOBG3フラグメントの正確な量については、資格のある医師の指示のもとに臨床試験を行って判断すればよいが、個体あたり1日量で5〜7mgの範囲になると思われる。通常、好ましい範囲は個体あたり1日量で0.5〜14mgであり、極めて好ましい範囲は個体あたり1日量で1〜10mgである。gOBG3ポリペプチドフラグメントまたはOBG3ポリペプチドフラグメントでの治療によって利益を得られる個体であるか否かは、少なくとも2通りの方法すなわち血漿血清レベル判定値と遺伝子型で判定することができる。
【０２５５】
OBG3/APM1レベル
予備研究によって、太りすぎの人々は全長OBG3/Apm1のレベルが太りすぎではない人よりも低いことが明らかになった。本発明は、全長OBG3/Apm1レベルが低い(好ましくは太りすぎの)個体を本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントで治療することを想定している。また、本発明は、好ましくは、OBG3/Apm1の生物学的に活性なフラグメントのレベルが低い個体を本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントで治療することを包含する。さらに他の実施形態では、従来技術において標準的な基準で医師が判断して、全長OBG3(または早熟OBG3ポリペプチドフラグメント)のレベルが、太りすぎではない個体、好ましくは健常な個体よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、約100%または100%低い個体、好ましくは太りすぎの個体に、本発明のOBG3ポリペプチドフラグメントまたはOBG3ポリペプチドフラグメントを投与する。個体における全長OBG3レベルを判定および比較する方法は従来技術において周知であり、放射性イムノアッセイ、ELISA、ウエスタンブロット、ドットブロットまたはアレイの一部などの形式でApm1に特異な抗体を使用することなどを含むがこれに限定されるものではない。Apm1およびそのフラグメントに対する抗体を生成する方法ならびにSNPを含むタンパク質については、PCT/IB99/01858、米国特許出願第09/434,848号および国際特許出願公開第WO 99/07736号に記載されており、これらの文献における開示内容全体、図面、図または表を本願明細書に援用する。さらに、本発明のOBG3/gOBG3ポリペプチドフラグメントに特異な抗体、その生成方法およびその用途は本願明細書に記載のとおりである。
【０２５６】
APM1遺伝子型判定
本発明の治療によって利益を得られる個体を識別するための遺伝子型判定を利用した方法治療は、Apm1遺伝子の単一ヌクレオチド多型(SNP)が、太りすぎの青年と遊離脂肪酸(FFA)および呼吸商レベルと関連していることが明らかになったという所見に基づくものである。また、BMIとレプチンとの関連性を示す所見、さらには、ブドウ糖レベルとの関連性を示す所見もある。さらに、FFAに関連するApm1 SNPとレプチン代謝との組み合わせから、重度の過体重になるであろう人を予測することもできる(データ図示せず)。
【０２５７】
Apm1 SNPおよび遺伝子型判定方法については、PCT/IB99/01858ならびに米国特許出願第09/434,848号に記載されているため、これらの公報の開示内容および図面、図または表を本願明細書に援用する。「遺伝子型」という用語は、本願明細書では、個体または試料中に存在するアレルの同一性を示す。試料または個体のバイアレリックマーカーの「遺伝子型を判定する」という表現は、個体のバイアレリックマーカー部分にある特定のヌクレオチドまたは特定のアレルを判定することを指す。
【０２５８】
かかる遺伝子型判定方法は、従来技術において周知の手法でAPM1バイアレリックマーカー部位でのヌクレオチドの同一性を判断することを含む。好ましくは、マイクロシークエンシングを利用する。遺伝子型を利用して、gOBG3ポリペプチドフラグメントまたはOBG3ポリペプチドフラグメントで個体を治療すべきかどうかを判定する。このため、これらの遺伝子型判定方法は、単一の個体由来の核酸試料で実施するとよい。これらの方法は従来技術において周知であり、上記にて引用して以下で簡単に説明する出願において十分に説明されている。
【０２５９】
従来技術において周知の適当な方法を用いて、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドを同定することができる。検出対象となるバイアレリックマーカーアレルが同定され、本発明において具体的に明記されているため、この検出は、当業者であればさまざまな手法のうち適当なものを用いて実施できる単純なものである。多くの遺伝子型判定方法では、該当するバイアレリックマーカーを持つDNA領域をあらかじめ増幅しておく必要がある。現時点では標的またはシグナルを増幅すると好ましいことが多いが、増幅を必要としない超高感度検出方法も本遺伝子型判定方法に包含される。
【０２６０】
バイアレリック多型の検出に利用することのできる当業者間で周知の方法としては、従来のドットブロット解析、一本鎖立体構造多型解析(SSCP; Orita et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA Apr;86(8):2766-70)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ヘテロ二重鎖解析、ミスマッチ切断検出、Sheffield et al. (1991; Am J Hum Genet Oct;49(4):699-706); White et al. (1992), Grompe et al. ((1989) Proc Natl Acad Sci USA Aug;86(15):5888-92; (1993) Nat Genet. Oct;5(2):111-7)に記載されている他の従来の手法があげられる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、米国特許第4,656,127に記載されているような特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いるものがある。
【０２６１】
好ましい方法では、シークエンシングアッセイ、アレル特異的増幅アッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイによって、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接判定する。いくつかの好ましい方法について以下に述べる。極めて好ましい方法はマイクロシークエンシング法である。「配列決定」という用語は、本願明細書では、二重鎖プライマー/鋳型錯体のポリメラーゼ伸展を意味し、従来の配列決定とマイクロシークエンシングの両方を含むものとする。
【０２６２】
1)シークエンシングアッセイ
配列決定法によって多型部位に存在するヌクレオチドを判定することができる。好ましい実施形態では、従来技術において周知の方法を用いて配列決定前にDNA試料をPCR増幅する。好ましくは、染料プライマーサイクル配列決定プロトコルを使用して、増幅したDNAで自動ジデオキシターミネーター配列決定反応を行う。配列解析によって、バイアレリックマーカー部位に存在する塩基を同定することができる。
【０２６３】
2)マイクロシークエンシングアッセイ
マイクロシークエンシング法では、単一ヌクレオチドプライマー伸展反応によって標的DNAの多型部位にあるヌクレオチドを検出する。この方法は、標的核酸において該当する多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズされる適切なマイクロシークエンシングプライマーを必要とするものである。ポリメラーゼを使用して、多型部位のヌクレオチドと相補的である1つのシングルddNTP(鎖ターミネーター)でプライマーの3'末端を特異的に伸展させる。次に、組み込まれたヌクレオチドの同一性を適当な方法で判定する。
【０２６４】
一般に、マイクロシークエンシング反応は蛍光ddNTPを用いて行われ、伸展されたマイクロシークエンシングプライマーをABI 377配列決定装置での泳動によって解析し、EP 412 883に記載されているようにして取り込まれたヌクレオチドの同一性を判定する。あるいは、キャピラリー泳動を用いてさらに多数の検定を同時に行うようにすることもできる。
【０２６５】
さまざまな方法を利用してddNTPの標識と検出を行うことができる。Chen and Kwok ((1997) Nucleic Acids Res. Jan 15;25(2):347-53)およびChen et al. ((1997) Proc Natl Acad Sci USA Sep 30;94(20):10756-61)に、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した均一相検出方法が説明されている。この方法では、多型部位を有する増幅ゲノムDNAフラグメントを、アレル染料標識ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび修飾Taqポリメラーゼの存在下、5'-フルオレセイン標識プライマーでインキュベートする。鋳型に存在するアレルに特異な染料ターミネーターによって、染料標識プライマーを1塩基分だけ伸展させる。遺伝子型判定反応の終了時、反応混合物における2種類の染料の蛍光強度を、分離または精製などの処理を行わずに直接解析する。これらのステップはいずれも同一のチューブで行うことができるものであり、蛍光の変化をリアルタイムに監視できる。あるいは、MALDI-TOF質量スペクトロメトリによって伸展したプライマーを解析してもよい。マイクロシークエンシングプライマーに付加された塊ごとに多型部位の塩基を同定する(Haff and Smirnov, (1997) Nucleic Acids Res. Sep 15;25(18):3749-50; (1997) Genome Res. Apr;7(4):378-88を参照のこと)。
【０２６６】
確立されたマイクロシークエンシング法あるいはこれに手を加えて開発または変更したものによって、マイクロシークエンシングを行ってもよい。他の選択肢としては、いくつかの固相マイクロシークエンシング法があげられる。プライマーまたは標的分子を固相支持体に固定化または捕捉する不均一相(hetelogeneous)検定で行うこと以外、基本的なマイクロシークエンシングプロトコルは先に説明したものと同じである。プライマーの分離と末端ヌクレオチドの付加解析を容易にするために、オリゴヌクレオチドを固相支持体に結合させるか、親和分離とポリメラーゼ伸展とが可能な方法で修飾する。合成オリゴヌクレオチドの5'末端および内部ヌクレオチドをさまざまな方法で修飾し、ビオチン化などの異なる親和分離法を可能にすることができる。単一の親和性基をオリゴヌクレオチド上で使用する場合、取り込まれたターミネーターのリジェント(regent)からオリゴヌクレオチドを分離することができる。これによって、物理的な分別またはサイズによる分別が必要なくなる。2つ以上の親和基を使用すれば、2つ以上のオリゴヌクレオチドをターミネーター試薬から分離して同時に解析することができる。これによって、1回の伸展反応で複数の核酸種または一層多くの核酸配列情報を解析することができる。親和基は必ずしも初回刺激オリゴヌクレオチド上にある必要はなく、鋳型上にあってもよい。
【０２６７】
たとえば、ビオチン標識DNAとストレプトアビジン被覆マイクロ滴定ウェルまたはアビジン被覆ポリスチレン粒子との相互作用を利用して固定化を行うことができる。同様に、オリゴヌクレオチドまたは鋳型を高密度状で固相支持体に結合させてもよい。ddNTPを取り入れたこのような固相マイクロシークエンシング反応は放射線標識可能なものである(Syv舅en, (1994) Clin Chim Acta. May;226(2):225-36)。あるいは、フルオレセインに結合させることも可能である(Livak and Hainer, (1994) Hum Mutat.;3(4):379-85)。放射線標識ddNTPの検出は、シンチレーションベースの手法で行うことができる。フルオレセイン結合ddNTPの検出は、アルカリホスファターゼと抱合した抗蛍光抗体の結合後、色素生産性基質(p-ニトロフェニルホスフェートなど)と共にインキュベートすることを基本としている。
【０２６８】
考え得る他のレポーター検出イオン対としては、ジニトロフェニル(DNP)に結合したddNTPと抗DNPアルカリホスファターゼ抱合体(Harju et al., (1993) Clin Chem. Nov;39(11 Pt 1):2282-7)またはo-フェニレンジアミンを基質として用いたビオチン標識ddNTPと西洋わさびペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン(WO 92/15712)があげられる。もう1つの選択的固相マイクロシークエンシング方法として、Nyren et al. ((1993) Anal Biochem. Jan;208(1):171-5)は、Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay(ELIDA)によってDNAポリメラーゼ活性を検出することを主体とする方法について述べた。
【０２６９】
Pastinen et al. ((1997) Genome Res. Jun;7(6):606-14)は、固相ミニシークエンシング原理をオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用する単一ヌクレオチド多型の複合検出方法について説明している。固相支持体(DNAチップ)に結合したDNAプローブの高密度アレイについては後述する。
【０２７０】
多型ヌクレオチドに隣接して3'末端を有するプライマーであればどのようなものを使用してもよいことは理解できよう。同様に、マイクロシークエンシング解析が、どのようなバイアレリックマーカーまたは本発明のバイアレリックマーカーの組み合わせに対して実行してもよいものであることも理解できよう。
【０２７１】
3)アレル特異的増幅アッセイ法
アレル特異的増幅すなわち選択的な戦略によって、バイアレリックマーカーの2つのアレルを区別し、他のアレルを増幅することなく、あるいはさらに高い増幅率で一方のアレルだけを増幅することができる。これは、多型塩基を一方の増幅プライマーの3'末端に所在させることによって達成される。プライマーの3'末端からの伸展がゆえに、この位置近辺でのミスマッチは増幅に阻害的な悪影響を及ぼす。したがって、適切な増幅条件下で、これらのプライマーはその相補アレルでのみ増幅を指示する。正確なミスマッチ位置の判断方法およびこれに対応するアッセイ条件については当業者間で周知である。
【０２７２】
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」(OLA)では、標的分子の一本鎖の当接配列にハイブリダイズできるように設計された2つのオリゴヌクレオチドを利用する。一方のオリゴヌクレオチドをビオチン標識し、他方を検出可能な状態で標識する。正確な相補的配列が標的分子中に見つかった場合は、末端が当接して捕捉および検出が可能なライゲーション基質が得られるようにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。OLAは、単一ヌクレオチド多型を検出でき、Nickerson et al. ((1990) Proc Natl Acad Sci USA Nov;87(22):8923-7)に説明されているPCR法と有利に併用される。この方法では、PCRを用いて標的DNAの指数的な増幅を行い、これをOLAを用いて検出する。
【０２７３】
単一ヌクレオチド多型の検出に特に適している他の増幅方法としては、LCR(リガーゼ連鎖反応)およびGap LCR(GLCR)があげられる。LCRでは二対のプローブを用いて特定の標的を指数的に増幅する。各オリゴヌクレオチド対の配列を選択し、これらの対が標的の同一鎖の当接配列とハイブリダイズできるようにする。かかるハイブリダイゼーションによって、鋳型依存性リガーゼの基質が形成される。本発明によれば、バイアレリックマーカー部位の同一鎖の近位配列と遠位配列とを有するオリゴヌクレオチドを用いてLCRを実施することができる。
【０２７４】
一実施形態では、どちらのオリゴヌクレオチドを設計してバイアレリックマーカー部位を持たせてもよい。かかる実施形態では、オリゴヌクレオチド上のバイアレリックマーカーと相補的な特定のヌクレオチドが標的分子に含まれているかまたは欠けている場合にオリゴヌクレオチドが連結されるように反応条件を選択する。
【０２７５】
別の実施形態では、WO 90/01069に記載されているように、オリゴヌクレオチドにはバイアレリックマーカーを持たせず、標的分子とハイブリダイズさせたときに「間隙」が形成されるようにする。この間隙に相補dNTPまたは別のオリゴヌクレオチド対を「満たす」(DNAポリメラーゼによって媒介)。このように、各サイクルの終了時、各一本鎖には次のサイクルの間に標的として機能できる相補体があり、所望の配列の指数関数的なアレル特異的増幅が達成される。
【０２７６】
核酸分子のあらかじめ選択された部位でのヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、リガーゼ/ポリメラーゼ媒介Genetic Bit AnalysisTMがある(WO 95/21271)。この方法は、あらかじめ選択された部位に存在するヌクレオチドと相補的なヌクレオシド三リン酸をプライマー分子の終端に組み入れ、第2のオリゴヌクレオチドと連結させるものである。反応の固相に付加された特定のラベルの検出または溶液での検出によって反応を監視する。
【０２７７】
4)ハイブリダイゼーションアッセイ法
バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するための好ましい方法は、核酸ハイブリダイゼーションを利用するものである。このような反応で都合よく利用できるハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは、Apm1バイアレリックマーカーを囲むApm1 cDNAに特異なプローブを含む。サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび固相ハイブリダイゼーションなど、どのようなハイブリダイゼーションアッセイを利用してもよい(上掲のSambrook et al.を参照のこと)。
【０２７８】
ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基対によって2本の一本鎖核酸が二本鎖構造に形成されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補関係にある核酸鎖間またはミスマッチのマイナーな領域を含む核酸鎖間で起こり得る。一方の形式のバイアレリックマーカーとハイブリダイズされ、他方とはハイブリダイズされずに、異なるアレル型を区別することのできる特定のプローブを設計することができる。アレル特異的プローブは対で用いられることが多く、対の一方が起始アレルを含む標的配列と完全にマッチし、他方が選択的アレルを含む標的配列と完全にマッチする。
【０２７９】
ハイブリダイゼーション条件は、アレル間のハイブリダイゼーション強度に有意な差が認められる程度にストリンジェントなものでなければならず、好ましくは本質的にバイナリ応答を呈し、これによってプローブが一方のアレルとハイブリダイズされる。正確に相補的な標的配列とのみプローブがハイブリダイズされる、ストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件が従来技術において周知である(Sambrook et al.、上掲)。ストリンジェントな条件は配列依存であり、環境によって異なるものである。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特異配列の融点(Tm)よりも約5℃低い温度に選択される。かかるハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができるものではあるが、固相ハイブリダイゼーションアッセイを利用すると好ましい。ハイブリッド反応の前に本発明のバイアレリックマーカーを含む標的DNAを増幅してもよい。
【０２８０】
プローブと標的DNAとの間に形成される安定したハイブリッド二重鎖の有無を検出することによって、試料中の特定のアレルの存在を検出する。ハイブリッド二重鎖の検出は、さまざまな方法で行うことができる。標的またはプローブに結合する検出可能な標識を利用し、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にするさまざまな検出アッセイ形式が周知である。一般に、ハイブリダイゼーション二重鎖をハイブリダイズされなかった核酸から分離し、二重鎖に結合した標識を検出する。当業者であれば、洗浄ステップを取り入れて余分な標的DNAまたはプローブ、結合せずに残ったコンジュゲートなどを洗い流してもよいことは理解できよう。さらに、プライマーおよびプローブにある標識を用いてハイブリッドを検出するには、標準的な異種アッセイフォーマットが適している。
【０２８１】
最近になって開発された2つのアッセイでは、分離や洗浄などを行わなくてもハイブリダイゼーションを利用してアレルを区別することができる(Landegren U. et al., (1998) Genome Res. Aug;8(8):769-76を参照のこと)。TaqManアッセイでは、累積する増幅産物に特異的にアニールされたDNAプローブを消化するTaq DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性を利用する。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によって相互作用するドナー・アクセプタ染料対でTaqManプローブを標識する。増幅時に進行中のポリメラーゼによってTaqManプローブが切断されると、消光アクセプタ染料からドナー染料が解離し、ドナー蛍光が大幅に増大する。2つのバイアレリック変異体を検出するのに必要なすべての試薬を反応の最初に組み合わせ、結果をリアルタイムで監視することができる(Livak et al., 1995を参照のこと)。
【０２８２】
選択的均質ハイブリダイゼーションを利用した方法では、分子的な指標がアレルの区別に用いられる。分子的な指標は、均質溶液中での特定の核酸の存在を示すヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである。標的に結合すると、内部的に消光するフルオロフォアを保持する立体配置的な再編成が起こる(Tyagi et al., (1998) Nat Biotechnol. Jan;16(1):49-53)。
【０２８３】
本願明細書において提供されるポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションアッセイに利用して、生物学的試料のバイアレリックマーカーアレルを検出することのできるプローブを作出できる。これらのプローブは、好ましくは8〜50ヌクレオチドを含み、本発明のバイアレリックマーカーを有する配列に対して十分に相補であってこの配列とハイブリダイズすることができ、かつ、好ましくは一方のヌクレオチドにおける変化のみについての標的配列を区別できる程度に特異的であることを特徴とする。特に好ましいプローブは25ヌクレオチド長である。好ましくは、バイアレリックマーカーはポリヌクレオチドプローブの中心から4 ヌクレオチド以内にある。特に好ましいプローブでは、バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの中心にある。好ましい実施形態では、多型塩基が前記ポリヌクレオチドの中心から5、4、3、2、1ヌクレオチド以内にあり、さらに好ましくは前記ポリヌクレオチドの中心にある。好ましくは、本発明のプローブを固相支持体に標識または固定化する。
【０２８４】
アレル特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検定することによって、特定の試料中でのバイアレリックマーカーアレルの有無を検出することができる。「ハイブリダイゼーションアッセイ」にはアレイ形式の高スループット並列ハイブリダイゼーションが特に包含されるが、これについては後述する。
【０２８５】
5)オリゴヌクレオチドのアドレス指定可能なアレイに対するハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチド配列に基づくハイブリダイゼーションアッセイでは、完全にマッチする標的配列変異体とミスマッチ変異体とに対する短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性の違いを利用している。オリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイが選択された位置で固相支持体(チップなど)に結合した基本的な構造によって、多型情報に効率的にアクセスできる。各DNAチップには、格子状のパターンに配置され、ダイム硬貨程度の大きさまで小型化された個々の合成DNAプローブを数千から数百万含むことができる。
【０２８６】
チップテクノロジーは、すでにさまざまな事例に応用されて成功をおさめている。たとえば、突然変異のスクリーニングが、BRCA1遺伝子、S. cerevisiaeミュータント株およびHIV-1ウイルスのプロテアーゼ遺伝子でなされる(Hacia et al., (1996) Nat Genet. Dec;14(4):441-7; Shoemaker et al., (1996) Nat Genet Dec;14(4):450-6; Kozal et al., (1996) Nat Med. Jul;2(7):753-9)。カスタマイズベースで、Affymetrix (GeneChip(TM), Hyseq (HyChip and HyGnostics)および Protogene Laboratoriesなどで、バイアレリック多型検出用のさまざまな形態のチップを作製することができる。
【０２８７】
一般に、これらの方法では、標的配列に多型性のマーカーが含まれる個体から得た標的核酸配列セグメントと相補関係にあるオリゴヌクレオチドプローブの配列を利用している。欧州特許第EP 785280号には、単一のヌクレオチド多型検出用のタイリング(tiling)戦略について記載されている。
【０２８８】
簡単に説明すると、このアレイは一般に、特定の多数の多型について「タイル張り」してもよい。「タイリング」という用語は一般に、該当する標的配列に相補的な配列と、この配列のあらかじめ選択されたバリエーション(1カ所またはそれ以上の特定の位置でモノマーの基本セットのメンバすなわちヌクレオチド1つまたはそれ以上で置換されているなど)で構成される、規定されたオリゴヌクレオチドプローブのセットの合成を意味する。タイリング戦略はさらに、国際特許出願公開第WO 95/11995号に記載されている。特定の態様では、多数の同定された特異的バイアレリックマーカー配列でアレイをタイル張りする。特に、アレイにタイル張りをして、それぞれが特定のバイアレリックマーカーまたはバイアレリックマーカーのセットに特異な多数の検出ブロックが含まれるようにする。
【０２８９】
たとえば、検出ブロックをタイル張りして多数のプローブが含まれるようにし、これらのプローブが特定の多型を含む配列セグメントにまたがるようにすることができる。各アレルに対して相補関係にあるプローブが必ず得られるようにするために、バイアレリックマーカーで異なる対のプローブを合成する。多型塩基で異なるプローブだけでなく、一置換プローブも検出ブロックの中にタイル張りされるのが普通である。これらの一置換プローブは、多型自体の部分に塩基を有し、かつ多型からいずれかの方向に一定数まで塩基を有する。これが残りのヌクレオチド(A、T、G、C、Uから選択される)で置換されている。一般に、タイル張りされた検出ブロック内のプローブには、バイアレリックマーカーから5塩基離れたところまでの配列位置の置換基が含まれる。一置換プローブによって、タイル張りされたアレイの内部が制御され、実際のハイブリダイゼーションと人為的なクロスハイブリダイゼーションとを区別できる。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄が終了したら、このアレイを走査してアレイ上での位置を判定し、この位置に標的配列をハイブリダイズさせる。次に、走査後のアレイから得られるハイブリダイゼーションデータを解析し、バイアレリックマーカーのアレルのうち試料中に存在するもの(1つまたは複数)を特定する。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、国際特許出願公開第WO 92/10092号および同第WO 95/11995号、さらに米国特許第5,424,186号に記載されているようにして行うことができる。
【０２９０】
したがって、いくつかの実施形態では、チップが約15ヌクレオチド長のフラグメントの核酸配列のアレイを含むものであってもよい。好ましい実施形態では、多型塩基が前記ポリヌクレオチドの中心から5、4、3、2、1ヌクレオチド以内にあり、さらに好ましくは前記ポリヌクレオチドの中心にある。いくつかの実施形態では、チップは、これらのポリヌクレオチド少なくとも2、3、4、5、6、7、8またはそれ以上のアレイを含む。
【０２９１】
6)統合系
多型の解析に使用できるもう1つの技術にマルチコンポーネント統合系があげられる。この系では、PCRおよびキャピラリー電気泳動反応などのプロセスを単一機能の装置で簡略化かつ区分化する。かかる手法の模範例が、PCR増幅とキャピラリー電気泳動とをチップに統合することについて説明した米国特許第5,589,136号に開示されている。
【０２９２】
主にマイクロ流体系を使用する場合に統合系の使用を考慮することができる。これらの系は、ガラス、ケイ素、石英またはプラスチックウェーハ上に設計されたマイクロチャネルのパターンがマイクロチップ内に含まれたものである。試料の動きを、マイクロチップの異なるエリアで印加される電力、電気浸透的または流体静動力によって制御し、機能的な顕微値を得ると共に可動部材なしでポンプ移動させる。電圧を変えることでマイクロ加工されたチャネル間での流体の流れを制御し、マイクロチップの異なる部分にポンプ送りする流体の流量を変化させる。
【０２９３】
バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するために、核酸増幅、マイクロシークエンシング、毛細管電気泳動、蛍光検出などのレーザー誘導蛍光検出方法に、マイクロ流体系を組み合わせてもよい。
【０２９４】
第1のステップでは、好ましくはPCRによってDNA試料を増幅する。次に、ddNTP(各ddNTPに特異的な蛍光)と、標的多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズさせた適当なオリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーとを用いて、増幅産物の自動マイクロシークエンシング反応を行う。3'末端での伸長終了後、キャピラリー電気泳動によって、取り込まれなかった蛍光ddNTPからプライマーを分離してを除去する。キャピラリー電気泳動で用いられる分離媒質としては、たとえば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはデキストランを用いることができる。単一ヌクレオチドプライマー伸展産物に取り込まれたddNTPを蛍光検出によって同定する。このマイクロチップを使用すれば、少なくとも96〜384個の試料を並行して処理できる。これには、ddNTPの通常の4色レーザー誘起蛍光検出を使うことができる。
【０２９５】
Apm1バイアレリックマーカー
現在同定されているAPM1バイアレリックマーカーを以下の表1に示す。FFA レベルとリンクしたマーカーがA5、A6、A7、レプチン/BMI指数の変化とリンクしたマーカーがA3、A4である。A5、A6およびA7は、完全な連鎖不平衡状態にある。このため、個体の遺伝子型がA6でGGである場合、A7はAAになり、両方の遺伝子型がFFAレベルの低下とリンクして、たとえばgOBG3ポリペプチドフラグメントまたはOBG3ポリペプチドフラグメントでの治療が適切であるといったことが示される。同様に、個体の遺伝子型がA4でACまたはCCである場合、gOBG3ポリペプチドフラグメントまたはOBG3ポリペプチドフラグメントでの治療が有益であると考えられる。あるいは、A7にAA遺伝子型、A4にACまたはCC遺伝子型を持つ個体であれば、gOBG3ポリペプチドフラグメントまたはoBG3ポリペプチドフラグメントでの治療が示される。
【０２９６】
遺伝子型と危険因子および治療との上述した関連性は一例にすぎない。gOBG3フラグメントまたはOBG3フラグメントでの治療が適している(または不適切である)個体を示す他の関連性を、従来技術において説明のある方法またはPCT/IB99/01858に記載の方法を用いて識別することも可能である。gOBG3フラグメントまたはOBG3フラグメントの投与によって「回復」方向に影響があったことが明らかなパラメータの変化に関連した遺伝子型が、肥満症の治療での体重の減少との関連性など、治療を行うことを示す関連性となり得る。一方、糖尿病治療または体重減少に副作用を示す(インスリンレベルに対するマイナス影響など)遺伝子型は、治療を行ってはならないことを示す関連性となり得る。
【０２９７】
【表１】
0004698914.tif 000002
【０２９８】
Apm1関連性解析
関連性解析は個体群頻度に的をあてており、連鎖不平衡の現象に頼っている。連鎖不平衡は、同一染色体上の異なる遺伝子座で一対の特定のアレルがランダムに発生する頻度とのずれである。特定の遺伝子における特定のアレルが特定の形質の発生に直接関与している場合、形質陰性個体群またはランダムな対照個体群での場合と比べると、羅患(形質陽性)個体群ではその発生頻度が統計的に高くなる。連鎖不平衡が存在すると、形質誘発アレルを持つハプロタイプに存在する他のすべてのアレルの頻度も、形質陰性個体やランダムな対照例よりも形質陽性個体での方が高くなる。したがって、形質誘発アレルと連鎖不平衡状態にある任意のアレル(特にバイアレリックマーカーアレル)と形質との間の関連性が分かれば、そこから特定の領域に形質関連遺伝子が存在するかどうかを十分に推測することができる。
【０２９９】
形質に関連した特定のマーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカーはすべて、その形質に関連することになるため、バイアレリックマーカーについて症例対照個体群の遺伝子型を判定し、形質誘発アレルに狭い範囲で局在する関連性を識別することができる。連鎖不平衡を利用することで、症例対照個体群での限られた数の遺伝的多型(特にバイアレリックマーカー)の相対頻度を解析し、形質誘発アレルを見出すことが可能になる。これは、考えられるあらゆる機能的多型をスクリーニングする方法に代わる手段である。関連性解析では、血縁のない症例対照個体群でのマーカーアレルの頻度を比較するため、複雑な形質を詳細に解析する強力なツールとなる。
【０３００】
症例対照個体群 (取り込み基準)
個体群ベースの関連性解析では、家系での継承とは無関係であるが、特定の遺伝マーカーまたはマーカーのセットの有病率を症例対照個体群で比較する。これは、血縁のない症例(未羅患または形質陽性)個体と血縁のない対照(未羅患、形質陰性または無作為)個体とを比較することに基づく症例対照研究である。この対照群は、未羅患個体または形質陰性個体で構成されると好ましい。また、対照群は、民族が症例個体群と一致すると好ましい。さらに、対照群は、研究対象となる形質についての既知の主な混乱要因が症例個体群と一致する(たとえば、年齢に依存する形質の場合は年齢が一致する)ものであると好ましい。理想的には、2つの試料の個体を疾患の状態だけが異なると思われる形でペアにする。本願明細書では、「形質陽性個体群」、「症例個体群」および「羅患個体群」という用語を同義のものとして使用する。
【０３０１】
関連性解析を用いた複雑な形質の詳細な解析において重要なステップは、症例対照個体群の選択である(Lander and Schork, (1994) Science, Sep 30;265(5181):2037-48を参照のこと)。症例対照個体群の選択時の主なステップは、特定の形質または表現型を臨床的に定義することである。形質陽性表現型の群と形質陰性表現型の群に入れる個体を慎重に選択すれば、本願明細書において提案する関連性による方法でどのような遺伝的形質でも解析することができる。臨床表現型、発病年齢、家族歴および重症度の4つの基準を用いるとよいことが多い。
【０３０２】
連続的形質または定量的形質(たとえば血圧など)の選択方法としては、解析対象の形質の表現型分布の両端で個体を選択し、形質陽性個体群と形質陰性個体群に、表現型に重複のない個体が含まれるようにする。症例対照個体群は、表現型的にみて一様な個体群であると好ましい。形質陽性個体群および形質陰性個体群は、各々が解析対象の個体群全体の1〜98%、好ましくは1〜80%、より好ましくは1〜50%、さらに好ましくは1〜30%、最も好ましくは1〜20%であり、好ましくは重複のない表現型を示す個体から選択される、表現型的にみて一様な個体の個体群で構成される。2つの形質表現型の違いが明確になればなるほど、バイアレリックマーカーで関連性を検出できる確率が高くなる。劇的に異なるが比較的均一な表現型を選択すると、研究対象となる個体群のサンプルサイズが十分に有意であるという前提で、関連性解析において効率的な比較を行うことができ、遺伝レベルでの著しい差異を検出できる可能性もある。
【０３０３】
好ましい実施形態では、50〜300の形質陽性個体、好ましくは約100個体からなる第1の群は、その表現型に基づいて募集される。これらの研究には、ほぼ同数の形質陰性個体も取り入れる。
【０３０４】
本発明では、取り込み基準の一般的な例としては、肥満症および肥満症に関連する機能障害ならびに、遊離脂肪酸レベル、ブドウ糖レベル、インスリンレベル、レプチンレベル、トリグリセリドレベル、遊離脂肪酸酸化レベルおよび体重減少などの肥満症に関連のある生理学的パラメータがあげられる。
【０３０５】
関連性解析
候補遺伝子を含む領域由来のバイアレリックマーカーを用いて関連性解析を行うための汎用的な戦略は、個体を2つのグループ(症例対照個体群)に分けてスキャンし、両方のグループに含まれる本発明のバイアレリックマーカーのアレル頻度を計測して統計的に比較することである。
【０３０６】
解析したバイアレリックマーカーのうち少なくとも1つまたはそれ以上で形質との間の統計的に有意な関連性が特定された場合、関連アレルが形質を誘発する直接の原因である(すなわち、関連アレルが形質誘発アレルである)か、あるいは関連アレルが形質誘発アレルとの間で連鎖不平衡状態にあるという仮説を立てることができる。候補遺伝子機能に関する関連アレルの特殊特性は、通常、関連アレルと形質の間の関係に更なる病識を与える(偶然または連鎖不平衡において)。候補遺伝子内の関連アレルは形質誘発アレルではない可能性が最も高いが、実際の形質誘発アレルとの間で連鎖不平衡状態にあるということが、何らかの証拠によって示された場合、関連マーカー付近の配列決定を行い、多型を用いてさらに繰返し関連性解析を行うことで、形質誘発アレルを見出すことができる可能性がある。
【０３０７】
関連性解析は通常、連続した2つのステップで行われる。第1フェーズでは、候補遺伝子から得た少数のバイアレリックマーカーの頻度を、形質陽性個体群と形質陰性個体群の両方で判定する。解析の第2フェーズでは、関連の領域から得たさらに高密度のマーカーを用いて、特定の形質の原因である遺伝座の位置をさらに正確に求める。ただし、解析中の候補遺伝子の長さが、APMIの場合のように、比較的短い場合、１つのフェーズだけで有意な関連性を確立するのに十分である。
【０３０８】
ハプロタイプ解析
上述したように、突然変異または転移のいずれかによって病因アレルを持つ染色体が最初に個体群に現れたとき、突然変異遺伝子は必ず、被結合マーカーのセットを持つ染色体すなわち先祖のハプロタイプ上にある。このハプロタイプを複数の個体群にわたって追跡し、特定の形質との統計学的な関連性を解析することができる。個別に行う(アレルごとの)関連性解析を、ハプロタイプ解析とも呼ばれる多点関連性解析で補足することによって、関連性解析の統計的な効果が大きくなる。このように、ハプロタイプ関連性解析によって、先祖のキャリアハプロタイプの頻度とタイプを定義することができる。ハプロタイプ解析は、個々のマーカーでの解析の統計的な力を高めるという点で重要なものである。
【０３０９】
ハプロタイプ頻度解析の第1ステージでは、同定された本発明のバイアレリックマーカーのさまざまな組み合わせに基づいて考え得るハプロタイプの頻度を判定する。次に、このハプロタイプ頻度を形質陽性個体と対照個体の異なる個体群と比較する。統計的に有意な結果を得るのにこの解析で使わなければならない形質陽性個体の数は通常、30〜300の範囲であり、好ましい個体数は50〜150の範囲である。同じことが解析に使う未羅患個体(または無作為対照個体)の数にもあてはまる。この第1の解析の結果から、評価した各ハプロタイプ頻度についての症例対照個体群におけるハプロタイプ頻度が分かり、p値およびオッズ比を算出する。統計的に有意な関連性が見出されると、解析対象の形質で影響された特定のハプロタイプを有する個体について、相対リスクを概算することができる。
【０３１０】
相互作用解析
本発明のバイアレリックマーカーを用いて、ポリジーンの相互作用によって生じた検出可能な形質に関連のあるバイアレリックマーカーのパターンを特定することができる。未結合座に所在するアレル間の遺伝的相互作用の解析を行うためには、本願明細書に記載の手法を用いた個体の遺伝子型判定が必要となる。選択したバイアレリックマーカーセットに関して適切な統計的有意性をもってなされるアレル相互作用解析はハプロタイプ解析とみなすことができる。相互解析は、第1の座についての特定のハプロタイプを基準として症例対照個体群を層別化し、各亜個体群で第2の座との間のハプロタイプ解析を実施することからなる。
【０３１１】
VII.OBG3ポリペプチドフラグメント活性のモジュレータを同定するためのアッセイ
本発明は、OBG3ポリペプチドフラグメント活性またはgOBG3ポリペプチドフラグメント活性を細胞にて調節する1種またはそれ以上の化合物のスクリーニング方法であって、試験対象となる潜在的な化合物を、OBG3ポリペプチドフラグメント作用または活性の調節が1つまたはそれ以上の化合物を示す細胞に提供する、スクリーニング方法を特徴とするものである。使用可能なアッセイの一例を、実施例4、実施例7〜9および実施例11〜14にあげておく。OBG3ポリペプチドフラグメント単独での作用との比較で阻害活性または刺激活性を調べる被検化合物を上記のアッセイに加える。OBG3ポリペプチドフラグメントの追加をベースに作用を観察する他のアッセイを利用して、OBG3ポリペプチドフラグメント活性のモジュレータ、あるいは、OBG3ポリペプチドフラグメントが存在することで細胞にどのような影響がおよぶかについてスクリーニングする。重要なステップとして、未知の化合物を適用し、次にアッセイを監視してOBG3ポリペプチドフラグメントのみを細胞に適用したときに見られる状態からどのように変化するか確認することがあげられる。変化とは、OBG3ポリペプチドフラグメントに加えて化合物が存在する場合にOBG3ポリペプチドフラグメント単独の場合と比較して有意に異なる内容として定義される。この場合、有意に異なるとは、測定可能な作用における少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%「増加」または「減少」することを指す。
【０３１２】
本願明細書において使用する「調節」という用語は、活性の測定可能な変化を意味する。一例として、脂肪分解刺激受容体(LSR)調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、血漿FFAレベル、FFA酸化、TGレベル、ブドウ糖レベルおよび体重があげられるがこれに限定されるものではない。これらの作用はin vitroであってもよいが、好ましくはin vivoでの作用である。活性の調節は活性の上昇または低下であり得る。したがって、LSR活性を上昇または低下させることが可能であり、レプチン活性を上昇または低下させることが可能であり、リポタンパク質活性を上昇または低下させることが可能である。同様に、FFA、TGおよびブドウ糖レベル(および体重)をin vivoにて上昇または低下させることができる。遊離脂肪酸の酸化については、in vivoまたはex vivoで亢進または抑止することが可能である。
【０３１３】
「LSR」活性とは、細胞表面または特定のコンホメーションでのLSRの発現ならびに、レプチンおよびリポタンパク質を結合し、取込み、分解する能力を意味する。「レプチン」活性とは、LSRによる結合、取込みおよび分解ならびに、血液脳関門を通っての輸送、潜在的には、LSRが必ずしも媒介因子ではないか、唯一の媒介因子であるような場合にこれらのことが発生することを意味する。同様に、「リポタンパク質」活性とは、LSRによる結合、取込みおよび分解ならびに、LSRが必ずしも媒介因子ではないか、唯一の媒介因子であるような場合にこれらのことが発生することを意味する。アッセイの一例を、実施例4、実施例7〜9および実施例11〜14にあげておく。これらのアッセイおよび他の類似したアッセイを利用して、OBG3ポリペプチドフラグメント活性を調節する化合物を判定する/同定することが可能である。場合によっては、OBG3ポリペプチドフラグメント活性をすべて調節するわけではなく特定のものだけを調節する化合物を同定することが重要な場合があるが、すべての活性が調節されると好ましい。
【０３１４】
本願明細書において使用する「上昇している」という用語は、当該化合物の非存在下におけるOBG3ポリペプチドフラグメントの作用と比較して、何らかの測定可能な形でOBG3ポリペプチドフラグメント活性を上昇させる、この化合物が持つ能力を指す。かかる化合物が存在することで、たとえばOBG3ポリペプチドフラグメントしか存在しない対照例と比べてレプチン結合および/または取込み量が増加することがある。好ましくは、活性の上昇は、OBG3フラグメントの存在下での活性レベルと比較して、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%の上昇である。
【０３１５】
同様に、本願明細書において使用する「低下している」という用語は、当該化合物の非存在下におけるOBG3フラグメントの作用と比較して、何らかの測定可能な形で活性を低下させる、化合物の持つ能力を指す。たとえば、当該化合物が存在することで、マウスでは、FFA、TGおよびブドウ糖の血漿濃度が低下する。また、かかる化合物が存在することで、たとえばOBG3フラグメントしか存在しない対照例と比べてレプチン結合および/または取込み量が減少することがある。好ましくは、活性の低下は、OBG3フラグメントのみの存在下での活性レベルと比較して、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%の低下である。
【０３１６】
本発明は、ボディーマスを調節する必要が生じた際に個体のボディーマスを調節するための潜在的化合物を同定するための方法であって、a)細胞をgOBG3フラグメントおよび候補化合物と接触させ、b)LSR調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、FFA酸化調節からなる群から選択される結果を検出し、c)前記結果が前記細胞をgOBG3ポリペプチドフラグメント単独と接触させたときに得られる前記結果とは異なる場合に、前記結果が前記潜在的な化合物を特定する方法を特徴とするものである。
【０３１７】
好ましい実施形態において、前記接触させることが前記LSRのリガンドをさらに含む。好ましくは、前記リガンドが、サイトカイン、リポタンパク質、遊離脂肪酸およびC1qからなる群から選択され、より好ましくは、前記サイトカインがレプチンであり、最も好ましくは前記レプチンが米国仮特許出願第60/155,506号(その内容全体、図、図面または表を本願明細書に援用する)に記載されているレプチンポリペプチドフラグメントである。
【０３１８】
他の好ましい実施形態において、前記OBG3またはgOBG3ポリペプチドフラグメントはマウスまたはヒトである。他の好ましい実施形態では、前記細胞が、PLC、CHO-K1、Hep3BおよびHepG2からなる群から選択される。
【０３１９】
さらに他の好ましい実施形態では、前記リポタンパク質調節が、結合、取込みおよび分解からなる群から選択される。好ましくは、前記調節が、前記結合、取込みまたは分解の亢進である。あるいは、前記調節が、前記結合、取込みまたは分解の抑止である。
【０３２０】
他の好ましい実施形態では、レプチン調節が、結合、取込み、分解および輸送からなる群から選択される。好ましくは、前記調節が、前記結合、取込み、分解または輸送の亢進である。あるいは、前記調節が、前記結合、取込み、分解または輸送の抑止である。好ましくは、前記輸送が血液脳関門を通っての輸送である。
【０３２１】
さらに他の好ましい実施形態では、前記LSR調節が、前記細胞の表面での発現である。好ましくは、前記検出することがFACSを含み、より好ましくは前記検出することがさらに前記LSRを特異的に結合する抗体を含み、最も好ましくは前記抗体が前記LSRのカルボキシ末端を特異的に結合する。
【０３２２】
さらに他の好ましい実施形態では、前記潜在的な化合物が、ペプチド、ペプチドライブラリ、非ペプチドライブラリ、ペプトイド、脂肪酸、リポタンパク質、医薬品、抗体、小分子、プロテアーゼからなる群から選択される。他のアンドプロテアーゼ(andproteases)。本発明の他の特徴および利点については、図面の簡単な説明および実施例に記載されている。これらの特徴および利点は一例にすぎず、いずれにしても本発明を限定するものではない。本件出願を通して、さまざまな刊行物、特許および公開特許出願を引用している。本件特許出願で参照した刊行物、特許および公開特許明細書の開示内容を本件開示内容に援用する。
【０３２３】
(実施例)
以下の実施例は、一例であって限定することを意図したものではない。当業者であれば、本願明細書の開示内容(いずれも本発明の一部をなす)に基づいて等価なアッセイおよび方法を設計することが可能であろう。
【０３２４】
本件明細書全体を通して使用する全長OBG3ポリペプチドという用語は、タンパク質相同体ACRP30(Scherer et al (1995) J Biol. Chem. 270:26746-9)、AdipoQ(Hu et al (1996) J Biol Chem 271:10697-10703)およびヒト相同体Apm-1(Maeda et al (1996) Biochem Biophys Res Commun 221:289-9)またはGBP28(Nakano et al (1996) J Biochem (Tokyo) 120:803-812)を包含することを意図している点に注意されたい。OBG3も他の相同体を包含するものとする。
【０３２５】
実施例1:  組換えOBG3の産生
組換えOBG3を生成するための方法の一例を以下に述べる。この方法ではマウス類似体について説明しているが、当業者であれば、ここに提供する情報を利用して、ヒト類似体を含むがこれに限定されるものではない他のOBG類似体を産生することができるであろう。ヒト(apm1)およびマウス(AdipoQおよびacrp30)OBG3のアミノ酸配列のアライメントを図1に示す。
【０３２６】
組換えOBG3類似体をBamH1とXho1との間でpTRC His B(インビトロゲン)にクローニング(図2)し、E. coli DH5-αにて保持する。ACRP 30に見られる#3のGがAを代置する382位以外、OBG3挿入物の配列はACRP 30 genbank U37222の塩基88〜791に相当する(MではなくV)。クローン#3の場合と同様に、AdipoQ U49915における対応するヌクレオチドはGである。ヒト配列APM-1 D45371ではアミノ酸Vも保存される。
【０３２７】
培養:
アンピシリン100μg/mLを含有するLB寒天培地にバクテリアをプレートアウトする。コロニー1つを培地(寒天なし)5mLに37℃にて一晩接種する。この初期培養2mLを、LB培地200mLとアンピシリン100μg/mLとが入った500mL容のエルレンマイヤーフラスコに加える。旋回振盪器にてOD600=0.2になるまで37℃で培養する。最終濃度が1mM(ストック溶液=1M)になるようにIPTGを加える。37℃で一晩培養する。
【０３２８】
溶解:
あらかじめ秤量した管内での遠心(Sorvall、3500rpm、15分、4℃)によってバクテリアをペレット化する。
細胞溶解用緩衝液3mL/gに4℃にてペレットを再懸濁させる。
PMSF 10mMを40μL/g加える。
リゾチーム10mg/mLを80μL/g加える。
氷上にて間欠的に振盪しながら20分間培養する。
10%デオキシコール酸ナトリウム30μL/gを加える。
溶菌液が粘性になるまで37℃で培養する。
液体窒素中にて凍結し37℃で融解する工程を3回繰り返す。
2×、30秒、25%サイクル、パワーレベル2.5で超音波処理する。
15000rpm、4℃にて30分間遠心する。
上清を回収する。
注:超音波処理ステップの前または後で溶菌液を冷凍保存することが可能である。
【０３２９】
バッチ精製:
1.  Probond樹脂(インビトロゲン;1mlL=2mL懸濁ゲル)1mLを5mL容のカラムに装填する。PBS 5mLで洗浄する。
2.  バクテリア上清5mLをゲル1mLに適用する。(容積が極めて大きい場合、小さなカラムを数本使用。)
3.  ホスフェート緩衝液(pH7.8)24mLで洗浄し、続いてホスフェート緩衝液(pH6)24mLで洗浄する。
4.  イミダゾール緩衝液で溶出し、1mLの画分を回収する。
5.  280nmでのODまたはSDS-PAGE(12.5%;2×試料緩衝液中で1/2に希釈)によって減圧条件(100℃、5分)下で画分を分析する
6.  タンパク質含有画分をプールする(通常、濃度0.8〜1mg/mLで画分数2〜4、濃度0.2〜0.4mg/mLで画分1、5および6)。
7.  1×PBS、24mM重炭酸アンモニウムまたは50mM Tris、pH7.4(250nM NaCl含有)で完全に透析する。必要に応じてSpeed-Vacで濃縮する。
8.  タンパク質をローリー法で分析する。
9.  分注して20℃で保管する。
【０３３０】
液体クロマトグラフィ系での精製
1.  Probond樹脂5mLを5mL容のカラムに装填する。
2.  4体積倍量のホスフェート緩衝液(pH7.8)を用いて1mL/分で洗浄する。
3.  溶菌液(0.45μで濾過または3000rpmで30分、4℃にて遠心、Beckman Allegra 6R)25mLを0.5mL/分で注入する。
4.  4体積倍量のホスフェート緩衝液(pH7.8)を用いて1mL/分で洗浄する。
5.  12体積倍量のホスフェート緩衝液(pH5.5)を用いて1mL/分で洗浄する。
6.  結合した画分を、1Mイミダゾール含有ホスフェート緩衝液(pH5.5)を用いて1mL/分で溶出する。
7.  画分を回収し、バッチ精製のステップ7〜9で説明したようにしてタンパク質を透析および分析する。
【０３３１】
実施例2:  酵素的切断による球状OBG3の生成
ウシ膵臓由来(Sigma E.C.=3.4.21.4)のアセチル化トリプシン-Type V-Sを用いて、タンパク質400u/mgで25℃にて10分、精製されたOBG3(上述した方法または等価な方法によって取得)を培養する。
固定化したトリプシンインヒビターの入ったポリプレップカラム(Biorad 731-1550)に+4℃で試料を通して反応を停止させる。
画分1.0mLを回収する。タンパク質濃度を判定する。
画分を含有するタンパク質をプールし、透析チューブを用いてM.W.カットオフ=10,000daにてPBSで徹底的に透析する。
Amicon YM-10 Centricon Filter(ミリポア、M.W.カットオフ=10,000da)上にて濃縮する。フィルタを滅菌する。
Markwell改良ローリー法(1981)またはBCAタンパク質アッセイ(イリノイ州ロックフォードのピアスケミカル社)に従って、BSAを標準として用いて最終タンパク質濃度を判定する。
【０３３２】
4〜20%勾配ゲルを用いてSDSPAGE解析によって純度および切断効率を確認する。無傷のOBG3は、明らかにAdipoQのN-末端でヒスチジンに結合した同時転写ベクター配列が原因で単一のバンドとして約37kDAで移行し、74kDaで二量体を形成する。切断されたOBG3は約18kDaでバンドを形成する(gOBG3)。その他の分解産物はいずれも10kDa未満であり、N-末端領域から生成される。これらの産物を、MWカットオフ10,000で半透膜を用いた透析によって所望の18kDaバンドから分離する。gOBG3の潜在的な切断部位を2カ所、図3に示す。実際の切断部位をアミノ酸103(ヒトgOBG3またはAPM1ではアミノ酸100)として同定する(図7)。すなわち、gOBG3切断産物のN-末端がLys 104(ヒトgOBG3またはAPM1ではLys 101)になる。
【０３３３】
クロストリパインなどの同様の産物が得られる他の酵素的/タンパク質分解的な方法を利用することも可能である。他の好ましい酵素は、好ましくはOBG3をコラーゲン様尾部と球状頭部との間の接合部付近の部位(ヒトgOBG3で約アミノ酸108、マウスgOBG3で約アミノ酸111)にて切断し、好ましくは反応を容易に停止させることができ、好ましくは固定化したインヒビターまたは同様の方法を用いて容易に除去でき、好ましくはN-末端フラグメントを切断して小断片(10,000MW未満)にする。切断によって、6コラーゲンリピート、より好ましくは3コラーゲンリピートより多くが存在しなくなり、最も好ましくはコラーゲンリピートが全く存在しなくなると好ましい。コラーゲンリピートはGLY-X-Yからなる。本願明細書に記載のin vitroおよびin vivoアッセイ(実施例4〜6、8〜10)を用いて、活性gOBG3が生成されたか否かの判断をすることができる。
【０３３４】
実施例3:  組換え法によるgOBG3の生成
制限部位クローニング
第1の方法は、球状頭部領域の開始部分近辺に一意な制限部位を探すことである(マウスおよびヒトOBG3ポリペプチドの核酸配列を配列表に示す)。このような配列が存在する場合、これを使って5'コラーゲン様領域を球状頭部領域から切断することが可能である。一意な部位が存在しない場合、存在する場合よりも困難にはなるが、部分消化を行うことで2カ所以上を切断する制限酵素を用いて切断を行うこともできる。適当な酵素を用いて球状頭部の3'末端をそのベクターバックボーンから切断してもよい。切断後、球状頭部を発現ベクターにクローニングし、正しいフラグメントを含むコンストラクトを同定することが可能である。AdipoQについては、Tau Iがコラーゲン尾部を球状頭部から分離させる一意な酵素であるように思われる。
【０３３５】
PCRクローニング
もう1つの方法として、(cDNAが利用できる場合)PCR産物を該当するベクターに直接クローニングできるように末端に制限部位のあるプライマーを用いて、無傷配列から該当する領域をPCRすることがあげられる。あるいは、RT-PCRを用いてgOBG3を生成し、これを脂肪組織RNAから単離することも可能である。
【０３３６】
E. coliベクター
たとえば、Bam HI部位をセンスオリゴに入れ、Xho I部位をアンチセンスオリゴに入れてAdipoQ球状領域をpTrcHisBにクローニングすることが可能である。これによって、PCR産物を単離し、この産物を消化し、同じくBam HIおよびXho Iで消化したpTrcHisBベクターに結合することができるようになる(図4)。ベクターpTrcHisBにはN-末端6-ヒスチジンタグがあるため、ニッケル樹脂カラムを用いて過発現されたタンパク質を溶菌液から精製することができる。タンパク質のE. coliでの過発現にはpTrcHisBベクターを使用する。
【０３３７】
E. coliベクターへのクローニング用のオリゴの一例としては、
A)  obg3センス  CTTAGTGGATCCCGCTTATGTGTATCGCTCAG  左から6塩基対目に6bpのBamHI部位がある(このため、遺伝子と相同的である領域はヌクレオチド13で開始する)、
B)  obg3アンチセンス  GCTGTTCTCGAGTCAGTTGGTATCATGG  左から6塩基対目に6bpのXhoIがある(このため、遺伝子と相同的である領域はヌクレオチド13で開始する)があげられる。
【０３３８】
PCR条件の一例を以下に列挙する。
反応における最終濃度は次のとおりである。
1×PEバイオシステムズ緩衝液A
1.5mM MgCl2
dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各200μM
PEバイオシステムズから入手したAmplitaq Gold2.5単位
プライマー(センスおよびアンチセンス)各0.4μM
プラスミド鋳型10ng
【０３３９】
サイクリングパラメータ:
95℃で10分  --- 1サイクル
95℃で30秒
56℃で30秒
72℃で30秒
上記3ステップを30サイクル繰返す
72℃で7分  --- 1サイクル
【０３４０】
BACベクター
6×Hisバキュロウイルスキット(ファーミンジェン)などを利用して、バキュロウイルス系で球状頭部を過発現させることもできる。複数のクローニング部位で利用可能な酵素を用いてAdipoQ球状領域を適当なベクターにクローニングする。これによって、多遺伝子発現、シグナルペプチド切断、イントロンスプライシング、核輸送、機能的タンパク質、リン酸化、グリコシル化、アシル化など、E.coli系にまさる利点がいくつかある真核生物系でのタンパク質の過発現が可能になる。
【０３４１】
バキュロウイルスベクターへのクローニング用のオリゴの一例としては、
A)  obg3センス  CTTAGTGAATTCGCTTATGTGTATCGCTCAGA  左から6塩基対目に6bpのEcoRI部位がある(このため、遺伝子と相同的である領域はヌクレオチド13で開始する)、
B)  obg3アンチセンス  GCTGTTCTGCAGTCAGTTGGTATCATGG  左から6塩基対目に6bpのPstI部位がある(このため、遺伝子と相同的である領域はヌクレオチド13で開始する)があげられる。
【０３４２】
PCR条件の一例を以下に列挙する。
反応における最終濃度は次のとおりである。
1×PEバイオシステムズ緩衝液A
1.5mM MgCl2
dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各200μM
PEバイオシステムズから入手したAmplitaq Gold2.5単位
プライマー(センスおよびアンチセンス)各0.4μM
プラスミド鋳型10ng
【０３４３】
サイクリングパラメータ:
95℃で10分  --- 1サイクル
95℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
上記3ステップを30サイクル繰返す
72℃で7分  --- 1サイクル
【０３４４】
哺乳動物ベクター
球状OBG3を哺乳動物の発現ベクターにクローニングし、3T3-L1細胞(未分化アディポサイト前駆体)などの哺乳動物の細胞で発現させて哺乳動物の細胞から精製することもできる。次に、その内在環境に極めて近い環境で球状頭部を生成する。しかしながら、これが必ずしも最も効率的なタンパク質生成方法であるとは限らない。
【０３４５】
実施例4:  肥満症関連活性のIn Vitro試験
後述するものを含むさまざまなin vitroアッセイを利用して、gOBG3ポリペプチドフラグメントの複数種の調製物と複数種の配列変異体の活性を評価する。これらのアッセイは、gOBG3ポリペプチドフラグメントのアンタゴニストおよびアゴニストを発育させるのに使用可能なものの一例にすぎない。これを実施するために、上記のアッセイにおいてgOBG3ポリペプチドフラグメントが候補分子の存在下でたとえばレプチンおよび/またはLSR活性に対しておよぼす作用を、候補分子の非存在下でのアッセイにおけるgOBG3ポリペプチドフラグメントの作用と比較する。gOBG3ポリペプチドフラグメントは高カロリー食事を摂取したマウスにおいて体重を減少させることが明らかになっている(実施例5)ため、これらのアッセイは体重を減少させる(または増加させる)ための候補治療薬を同定する機能も果たす。
【０３４６】
肝臓株化細胞:
たとえば、PLC、HepG2、Hep3B(ヒト)、Hepa1-6、BPRCL(マウス)またはMCA-RH777、MCA-RH8994(ラット)などの肝臓株化細胞を利用して、LSRに対するgOBG3ポリペプチドフラグメントの有効性についての試験を実施することが可能である。ヒトの株化細胞では、APM1および球状APM1が優先的に利用される。齧歯類では、全長および球状AdipoQ/ACRP30が優先的に利用される。
【０３４７】
グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM(高ブドウ糖)にて、細胞密度300,000個/ウェルで6穴プレートにBPRCLマウス肝細胞(ATCC受託管理)を蒔いた(0日目)(Bihain & Yen, 1992)。2日目に培地を交換した。3日目、ホスフェート緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)(2mL/ウェル)を用いて集密的な単層を1回洗浄した。0.2%(w/v)BSA、5mM Hepes、2mM CaCl2、重炭酸ナトリウム3.7g/Lを含むpH7.5のDMEMにて、組換えAdipoQ(AQ)または球状AdipoQ(AQ-GH)の濃度を上げながら37℃で30分間細胞をインキュベートした。125I-マウスレプチン(比活性22100cpm/ng)10ng/mLを加えた後、37℃で3時間インキュベーションを続けた。0.2%BSAを含むPBSで単層を2回連続して洗浄した後、PBS/BSAで1回洗浄し、次いでPBSで2回連続して洗浄した。0.24mM EDTAを含有する0.1N NaOHを用いて細胞を溶解させた。溶菌液をチューブに回収し、ガンマカウンタを用いて計数した。
【０３４８】
一例としての実験の結果を3組の判定の平均値として図5に示す。
【０３４９】
これらの結果から、肝臓株化細胞へのレプチン取込み量の増加という点ではgOBG3ポリペプチドフラグメントの方がOBG3よりも少なくとも30%効率的であることが分かる(図5)。このアッセイを利用して、gOBG3ポリペプチドフラグメントおよび関連化合物(またはアゴニストまたはアンタゴニスト)の肝臓へのレプチン取込み量を増大または減少させる効率を判定することができ、gOBG3ポリペプチドフラグメント/化合物がその作用を発揮する機序を判定することができる。
【０３５０】
血液脳関門モデル:
脳由来の細胞を利用して、gOBG3ポリペプチドフラグメントが脳におけるレプチン輸送におよぼす作用を判定することができる。想定される方法のひとつとして、Dehouck, et al(J Neurochem  54:1798-801, 1990;図面、表または図を含む開示内容全体を本願明細書に援用する)に記載されているような血液/脳関門モデルを利用することがあげられる。このモデルでは、LSRまたは他の受容体によるレプチン(または他の分子)の輸送にgOBG3ポリペプチドフラグメントがどのような作用をおよぼすのかについて、脳毛細管内皮細胞と星状膠細胞の共培養物を使って試験する。
【０３５１】
このアッセイは、gOBG3ポリペプチドフラグメントが脳へのレプチン輸送に対しておよぼす潜在的な作用を示すインジケーターとなり得るものであり、脳内LSRまたは他の受容体を介してのgOBG3ポリペプチドフラグメント変異体の持つレプチン輸送調節能をスクリーニングする目的で利用できる。また、このアッセイを利用すれば、gOBG3ポリペプチドフラグメントがLSRまたは他の受容体を介してのレプチン輸送に対しておよぼす作用の推定上のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングすることもできるであろう。血液脳関門を通ってのレプチン輸送料が増すと、おそらく満腹因子としての作用も増大するのではないかと思われる。
【０３５２】
LSR発現のFAC解析
抗LSR抗体および蛍光二次抗体を用いる表面フローサイトメトリーによって細胞表面でのLSR発現レベルを測定し、gOBG3ポリペプチドフラグメントがLSRに対しておよぼす作用を判定することができる。フローサイトメトリーは生物学的粒子の特性の測定に用いられる、レーザを利用した技術である。フローサイトメトリーの基本原理は、励起源からの光が移動する粒子に衝突すると光が散乱して蛍光が放出されるということにある。
【０３５３】
これは、OBG3ポリペプチドフラグメントおよびgOBG3ポリペプチドフラグメントおよび変異体ならびにgOBG3ポリペプチドフラグメントの推定上のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに容易に利用できるスループットの高いアッセイである。以下、2通りのアッセイについて述べる。抗体、株化細胞およびgOBG3ポリペプチドフラグメント類似体は実験ごとに変わるが、ヒト株化細胞、ヒト抗LSR抗体および球状APM1を利用して、人間の治療に用いる変異体、アゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【０３５４】
アッセイ1:
収集してFACSで解析する前に、無傷OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントで細胞を前処理する(または未処理)。非酵素的な解離溶液(シグマ)を用いて細胞を収集し、次いで、抗LSR 81Bまたは無関係な抗血清の1:200希釈液を用いて、1%(w/v)BSAを含むBS中にて、4℃で1時間細胞をインキュベートする。同一の緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ウサギFITC標識抗体(ペンシルバニア州Gilbertsvilleのロックランド)を細胞に加え、続いて4℃にてさらに30分間インキュベーションする。洗浄後、細胞を2%ホルマリンで固定する。FACSCaliburサイトメータ(ニュージャージー州フランクリンレークスのベクトンディッキンソン)を用いてフローサイトメトリー分析を行う。
【０３５５】
in vitro肝臓株化細胞アッセイ(上述)から、gOBG3ポリペプチドフラグメントの濃度が高くなるにつれてLSR活性(レプチン結合)も上昇することが明らかになった。特定の理論に拘泥するわけではないが、これは細胞表面でのLSR結合部位が増えた結果であるか、あるいはレプチンに対する親和性が変化した結果ではないかと想定される。おそらく、FACSアッセイを用いることでLSR結合部位の数の違いを検出できるが、親和性の違いが反映されるコンホメーションの違いを検出することもできるであろうと思われる。抗体はLSRのC-末端に対するものであると好ましい。
【０３５６】
アッセイ2:
製造業者の指示に従い、分析前にT175フラスコ中で細胞を48時間培養する。
【０３５７】
細胞をFAC緩衝液(1×PBS/2%FBS、フィルタ滅菌)で1回洗浄し、FAC緩衝液10mL中で手作業でフラスコから掻き出す。細胞懸濁液を15mL容の円錐チューブに移し、1200rpm、4℃で5分間遠心する。上清を破棄し、4℃まで冷却した10mL FAC緩衝液に細胞を再懸濁させる。細胞数の計数を実施し、FAC緩衝液を用いて細胞密度を1×106個/mLの濃度に調節する。分析を行うために48穴プレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを加えた。1200rpmで5分間、4℃にて細胞を遠心する。プレートを調べて細胞がペレット化されていることを確認し、上清を取り除き、プレートをボルテックスミキサーで振盪して細胞を再懸濁させる。FAC緩衝液1mlを各ウェルに加えた後、1200rpmで5分間、4℃にて遠心する。ここで説明した細胞の洗浄を合計3分間実施する。
【０３５８】
適切な最終希釈倍率(working dilution)(たとえば1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:500、1:800、1:1000、1:2000、1:4000、1:5000または1:10000)を求めるためにスクリーニング実験を行って力価を判定した一次抗体を、総容積50μLのFAC緩衝液中にて細胞に加える。光線を遮断してプレートを1時間4℃にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞を上述したようにして3回洗浄する。適切な最終希釈倍率(たとえば1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:500、1:800、1:1000、1:2000、1:4000、1:5000または1:10000)を求めるためにスクリーニング実験を行って力価を測定した適切な二次抗体を、総容積50μLのFAC緩衝液中にて細胞に加える。光線を遮断してプレートを1時間4℃にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞を上述したようにして3回洗浄する。最終洗浄時、FAC緩衝液500μLに細胞を再懸濁させ、FAC取得用チューブ(acquisition tube)に移す。光線を遮断して試料を氷上にのせ、1時間以内に分析する。
【０３５９】
蛍光顕微鏡観察によって検出したgOBG-3の細胞結合と取込み
gOBG3の蛍光イソチオシアネート(FITC)標識:  シグマ社のFluoroTag FITC標識用キット(ストック溶液番号FITC-1)を利用して、1mg/mL濃度の精製gOBG3をFITCで標識した。シグマ社のハンドブックに概説されている小規模標識用プロトコールに従ってgOBG3を標識した。
【０３６０】
細胞培養:  C2C12マウス骨格筋細胞(ATCC、Manassas、VA CRL-1772)およびHepa-1-6マウス肝細胞(ATCC、Manassas、VA CRL-1830)を1ウェルあたり2×105個の細胞密度で6穴プレートに播種した。受託管理機関の指示に従って分析前にC2C12細胞およびHepa-1-6細胞を24〜48時間培養した。細胞が80%集密的であるときにアッセイを実施した。
【０３６１】
顕微鏡を使ったFITC標識gOBG3細胞の結合と取込みの観察:  ヒトLSR(81B:マウスLSRとは交差反応しないヒトLSRのN-末端配列;93A:マウスLSRと交差反応するc-末端配列)用の抗体またはgC1qr(953)用の抗血清の存在下/非存在下にて、37℃、5%CO2雰囲気にて1時間、C2C12細胞およびHepa1-6細胞をインキュベートした。2μg/mLの濃度でLSR抗体を培地に加えた。未希釈血清(高濃度)または1:100希釈液(低濃度)2.5μLの容量で抗gC1qr抗血清を培地に添加した。指定された抗体を用いてのインキュベーション後、FITC-gOBG3(50nM/mL)を各細胞培養ウェルに加えた。37℃、5%CO2雰囲気にて1時間、細胞を再度インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、ウェルから細胞を掻爬して1mLのPBSに入れた。細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、1000rpmで2分間遠心した。上清を除去し、200μLのPBSに細胞を再懸濁させた。倍率40倍での蛍光顕微鏡観察によってFITC-gOBG3の結合および取込みを分析した。
【０３６２】
C2C12細胞およびHepa1-6細胞を分析すると、LSR抗体の存在下または非存在下の両方について、FITC-gOBG3の結合プロファイルと取込みプロファイルに関しては表現型が同一であることが分かる。FITC-gOBG3は、マウス肝細胞とマウス筋芽細胞のいずれにおいても細胞質のベシクルに局在しているように見えることから、FITC-gOBG3の結合および取込みが起こっているのではないかと思われる。マウスLSRを認識する抗LSR抗体で細胞をあらかじめ処理しておくと、FITC-gOBG3の取込みが阻害されるように見える。しかしながら、FITC-gOBG3の細胞表面への結合は、小さな細胞部分(C2C12およびHepa 1-6)であっても間違いなく発生している。gC1qr抗血清濃度が低いと、FITC-gOBG3の添加前に抗体で事前処理をしなかった細胞の表現型での場合と同様に、FITC-gOBG3はいずれの細胞タイプでも細胞質のベシクルに局在しているように見える。FITC-gOBG3の取込みおよび結合の表現型はマウスLSRを認識しないLSR抗体での事前処理には影響されない。これらのことから総合的に考えると、上記のデータから判断して、マウスLSRと交差反応するヒトLSR抗体によってFITC-gOBG3の取込みを阻害できるのではないかと思われる。しかしながら、この表現型は他の非交差反応性LSR抗体を用いた場合には再現されない。したがって、このアッセイは、細胞に対するOBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントの取込みおよび/または結合を容易にするか妨害する作用因子を同定する上で役立つのではないかと思われる。
【０３６３】
リポタンパク質受容体としてのLSRに対する作用
リポタンパク質の結合、LSRの内部移行活性および分解活性に対してgOBG3がどのような作用をおよぼすのかについて試験することができる。リポタンパク質受容体としてのLSRの測定については、Bihain & Yen, ((1992) Biochemistry May 19;31(19):4628-36;(これらの文献における開示内容全体、図面、表または図を本願明細書に援用する))に記載されている。LSR(または他の受容体)のリポタンパク質の結合活性、内部移行活性および分解活性に対してgOBG3がおよぼす作用を、無傷のOBG3による作用と比較し、さらには別の対照として未処理細胞による作用と比較することができる。また、このアッセイを利用して、gOBG3の活性変異体および阻害変異体ならびに肥満症関連活性のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングすることもできる。
【０３６４】
グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM(高ブドウ糖)にて、細胞密度300,000個/ウェルで6穴プレートにヒト肝臓PLC細胞(ATCC受託管理)を蒔いた(0日目)(Bihain & Yen, 1992)。2日目に培地を交換した。3日目、ホスフェート緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)(2mL/ウェル)を用いて集密的な単層を1回洗浄した。0.2%(w/v)BSA、5mM Hepes、2mM CaCl2、重炭酸ナトリウム3.7g/Lを含むpH7.5のDMEMにて、ヒト組換えレプチン10ng/mLと共に37℃で30分間細胞をインキュベートした後、gOBG3の濃度を上げながら37℃でさらに30分間インキュベーションした。0.8mMオレイン酸塩と125I-LDL 20μg/mLとを加えた後、37℃で2時間インキュベーションを続けた。0.2%BSAを含むPBSで単層を2回連続して洗浄した後、PBS/BSAで1回洗浄し、次いでPBSで2回連続して洗浄した。125I-LDLのオレイン酸塩誘導結合、取込みおよび分解の量を上述したようにして測定した(Bihain & Yen, 1992、上掲)。結果を3組の判定の平均値として示す。
【０３６５】
図6に示されるように、gOBG3を添加するとリポタンパク質受容体としてのLSRの活性が上昇する。LDLのオレイン酸塩誘導結合および取込みの方が分解よりもgOBG3による影響を大きく受けているように見える。このようにLSR活性が上昇することで、食後の状態で高トリグリセリド含有リポタンパク質のクリアランスが亢進される可能性がある。このため、脂肪組織に蓄積されるよりも多くの食事脂肪が肝臓から除去されるのであろう。
【０３６６】
このアッセイを利用して、化合物(またはアゴニストまたはアンタゴニスト)がLSR活性(または他の受容体によるリポタンパク質の取込み、結合および分解)を上昇または低下させる効率を判定し、よって高トリグリセリド含有リポタンパク質のクリアランス速度に対する影響を判定することができる。
【０３６７】
筋肉分化に対する作用
C2C12細胞(マウス骨格筋株化細胞;ATCC CRL 1772、Rockville、MD)を完全DMEM(w/グルタミン、pen/strepなど)+10%FCS中にて低密度で播種する(約15〜20%)。2日後には細胞は80〜90%集密になる。この時点で、培地をDMEM+2%ウマ血清に交換して分化が可能なようにする。培地を毎日交換する。2%ウマ血清にしてから3〜4日後に豊富な筋管が形成されるが、C2C12分化の正確な時間経過は、どのくらいの期間にわたって継代したか、どのように維持されたかなどの要因に左右される。
【０３６８】
gACRP30が存在することによって筋肉の分化にどのような作用がおよぶかを試験するために、播種翌日の細胞がDMEMw/10%FCSにあるうちにgACRP30(1〜2.5μg/mL)を添加した。細胞を蒔いた2日後(gACRP30を最初に加えてから1日後)、約80〜90%の集密度で、培地をgACRP30加DMEM+2%ウマ血清に交換した。
【０３６９】
これらの結果から、gACRP30を加えると添加から1日以内で細胞が組織化しはじめることが分かる。gACRP30で処理しなかった細胞がランダムに配向するのとは対照的に、gACRP30で処理した細胞は互いに一定の関係で整列された。また、gACRP30を使用しない場合は分化まで3〜4日を要したのに対して、gACRP30で処理をすると処理のわずか2日後には分化が起こった。
【０３７０】
筋肉細胞での脂肪酸の酸化に対しておよぼす作用
2μg/mLのgACRP30の存在下および非存在下で4日間かけてC2C12細胞を分化させた。4日目、1-14C-オレイン酸塩(0.2mM)から14CO2への変換を90分間測定してオレイン酸の酸化率を求めた。gACRP30の存在下で分化したC2C12細胞での方が、gACRP30の非存在下で分化した対照例に比して40%多くのオレイン酸の酸化が認められた。この実験を利用して、OBG3ポリペプチドおよびgOBG3ポリペプチドの、活性フラグメントおよびペプチドならびにアゴニストおよびアンタゴニストまたは活性因子および阻害因子をスクリーニングすることができる。
【０３７１】
gACRP30がオレイン酸の酸化率に対しておよぼす作用を分化C2C12細胞(マウス骨格筋細胞;ATCC、Manassas、VA CRL-1772)および肝細胞の株化細胞(Hepa1-6;ATCC、Manassas、VA CRL-1830)にて比較した。培養後の細胞については製造業者の指示に従って維持した。オレイン酸の酸化についてのアッセイを上述したようにして実施した(Muoio et al(1999) Biochem J 338;783-791)。簡単に説明すると、ほぼ集密的な筋細胞を低血清分化培地(DMEM、2.5%ウマ血清)中にて4日間保持したところ、4日目に筋管の形成が最大に達した。10%FCSを加えた同じDMEM培地中で肝細胞を2日間保持した。実験の1時間前に培地を除去し、前インキュベーション培地(MEM、2.5%ウマ血清、3mMブドウ糖、4mMグルタミン、25mM Hepes、FFAを含有しない1%BSA、0.25mMオレイン酸塩、5μg/mLゲンタマイシン)1mLを加えた。酸化実験の開始時、14C-オレイン酸(1μCi/mL、ミズーリ州セントルイスのアメリカンラジオラベルドケミカル社)を加え、gACRP30 2.5μg/mLの非存在下/存在下にて37℃で90分間細胞をインキュベートした。インキュベーション期間後、培地0.75mLを除去し、筋肉FFA酸化実験の欄で後述するようにして14C-酸化産物についてアッセイした。
【０３７２】
90分にわたって判定したC2C12細胞でのオレイン酸の酸化量は、gACRP30で処理した細胞では有意に増大した(39%;p=0.036、両側t-検定)。これとは対照的に、gACRP30と共にインキュベートした肝細胞ではFFA酸化率に検出可能な増大は認められなかった。
【０３７３】
培養細胞におけるオレイン酸の酸化後のトリグリセリドおよびタンパク質についての分析
オレイン酸の酸化についてのアッセイを行うために培地を移した後、細胞を氷上においた。トリグリセリドおよびタンパク質の含有量を判定するために、1×PBS 1mLで細胞を洗浄し、残っている培地を除去した。各ウェルに細胞解離溶液(シグマ)300μLを加え、37℃にて10分間インキュベートした。プレートを軽く叩いて細胞を遊離させ、1×PBSを0.5mL加えた。細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、各ウェルを新たな1×PBS 0.5mLで洗浄し、適当なエッペンドルフチューブに移した。1000rpmで10分間、室温にて試料を遠心した。上清を破棄し、1×PBS/2%chaps750μLを細胞ペレットに添加した。細胞懸濁液をボルテックスし、氷上にて1時間放置した。次に、13000rpmで20分間、4℃にて試料を遠心した。上清を新たなチューブに移し、分析するまで-20℃で冷凍しておいた。Sigma DiagnosticsGPO-TRINDER酵素キットを利用して、各試料のトリグリセリドレベルの定量的な測定値を求めた。以下の例外を除いて基本的にはマニュアルに概説されている方法に従った。48穴のプレートでアッセイを実施し、試料容量350μLをアッセイし、対照ブランクを350μL PBS/2%chapsで構成し、標準に10μL標準をキットプラス690μL PBS/2%chapsに入れた。Packard Spectra Countにて、波長550nmで試料を分析した。製造業者による指示に従って、BCAタンパク質アッセイ(ピアス)を利用して、各上清試料25μLについてのタンパク質分析を行った。試料の分析はPackard Spectra Countにて波長550nmで実施した。
【０３７４】
C2C12細胞とHepa 1-6細胞のいずれにおいても、ACRP30およびgACRP30の非存在下/存在下でのトリグリセリドの産生率は有意に変化しなかった。ACRP30およびgACRP30の非存在下/存在下で、タンパク質含有量は分析対象としたすべての細胞で同一であった。
【０３７５】
実施例5:  高脂肪食を摂取したマウスにgOBG3がおよぼす作用
約6週齢のC57Bl/6マウス(1群あたり8匹)を用いて実験を行う。すべてのマウスを個々に飼育する。実験期間中をとおしてマウスに高脂肪食を与え続ける。高脂肪食(カフェテリア食;リサーチダイエット社から入手可能なD12331)の組成は以下のとおりである。タンパク質kcal%16、ショ糖kcal%26および脂肪kcal%58。脂肪は主に硬化ココナッツ油で構成されていた。
【０３７６】
これらのマウスに高脂肪食を6日間与え続けた後、イソフルラン麻酔を用いてマイクロ浸透圧ポンプを挿入し、このポンプを用いて、gOBG3、OBG3、生理食塩水および無関係のペプチドを、18日間マウスに皮下注射(s.c.)する。gOBG3については、50、25および2.5μg/日の用量で与え、OBG3は、100、50および5μg/日、無関係のペプチドは10μg/日の用量で与える。高脂肪食を与えた1日目、3日目、5日目に体重を測定し、治療の開始後は毎日体重を測定する。心臓穿刺によって最終血液試料を採取し、これを用いて、トリグリセリド(TG)、総コレステロール(TC)、ブドウ糖、レプチンおよびインスリンレベルを判定する。各群ごとに1日あたりの消費食物量も調べておく。
【０３７７】
予備実験において、2.5μg/日のgOBG3で処理したマウスは体重が有意に減少した。
【０３７８】
実施例6:  ヒトにおける肥満症関連活性試験
医師の提案と確立されたガイドラインとに従ってヒトにおいてgOBG3の有効性試験を実施する。マウスで試験したパラメータ(食物摂取量、重量、TG、TC、ブドウ糖、インスリン、レプチン、FFAなど)をヒトでも試験する。短期間のうちに生理学的要因に変化が見られるのではないかと思われる。体重増加が変化するには長めの期間が必要であろう。また、食事を慎重に監視する必要がある。球状OBG3を体重70kgの被験者1人あたりタンパク質の日用量約6mg、あるいは1日あたり約10mgの量で与える。1日あたり1mgまたは5mgから最大で1日あたり20mg、50mgまたは100mg、などの他の用量を試験してもよい。
【０３７９】
実施例7:  マウス脂肪萎縮性糖尿病モデルにおける肥満症関連活性の試験
以前、レプチンには先天性脂質代謝異常が認められるマウスにおいてインスリン耐性および真性糖尿病から回復させる作用があるとの報告がある(Shimomura et al. Nature 401: 73-76 (1999);これらの文献における開示内容全体、図面、図または表を本願明細書に援用する)。レプチンは、脂肪萎縮性糖尿病が認められる別の脂質代謝異常のマウスモデルでは、あまり効果がないことが明らかになっている(Gavrilova et al Nature 403: 850 (2000);これらの文献における開示内容全体、図面、図または表を本願明細書に援用する)。本発明は、OBG3ポリペプチドフラグメントまたはgOBG3ポリペプチドフラグメントを用いて、単独またはレプチン、レプチンペプチド(米国仮特許出願第60/155,506号)または他の化合物との併用で、このモデルにおいてインスリン耐性および高血糖を抑えることを包含する。実施例5で述べた方法(または実施例8〜10で述べる方法)によってgOBG3を投与すること以外は、アッセイには、すでにGavrilova et al. ((2000) Diabetes Nov;49(11):1910-6; (2000) Nature Feb 24;403(6772):850)で説明がなされている、A-ZIP/F-1マウスを用いるアッセイを含む。マウスのブドウ糖およびインスリンレベルを試験し、食物摂取量および肝臓重量を監視し、さらには、本願発明者らによる実験のほとんどで測定されるレプチン、FFAおよびTGレベルなどの他の要因を監視する(上記実施例5または実施例8〜10を参照のこと)。
【０３８０】
実施例8:  C57 BL/6マウスにおいて血漿遊離脂肪酸に対してgOBG-3がおよぼす作用
健常なC57BL6/Jマウスにおいてacrp-30の球状頭部が食後の脂肪血(PPL)に対しておよぼす作用を試験した。ACRP-30は、adipo Qの別名であり、ヒトapm-1タンパク質に対するマウスタンパク質相同体である。OBG3は、これらの形態をすべて示すのに用いられる総称である。g-acrp30またはgOBG3など、頭に「g」を付すことで球状頭部形態であることを示す。使用したgOBG3については、実施例2で上述したような組換えOBG3のタンパク質分解的な消化によって調製した。アセチル化トリプシンをプロテアーゼとして用いた。
【０３８１】
この実験で使用したマウスについては実験の2時間前に断食させた後、基線の血液試料を採取した。血液試料はいずれも、EDTAをコーティングした毛細管(それぞれの時点で50μLずつ)を用いて尾部から採取した。時刻0(午前8:30)に、標準的な高脂肪食(バター6g、ヒマワリ油6g、脱脂粉乳10g、ショ糖10g、蒸留水12mL、Nb#6、JF、pg.1に従って調製した新鮮なもの)を、胃管栄養法(vol.=体重の1%)によってすべての動物に与えた。
【０３８２】
高脂肪食を与えた直後に、gOBG3 25μgを生理食塩水100μLに混合して腹腔内注射した。45分の時点と1時間45分の時点で同じ用量(100μL中25μg/mL)を再度注射した(処理群、n=8)。対照動物(n=8)には生理食塩水を注射した(3×100μL)。未処理の動物と処理した動物とを交互に取り扱った。
【０３８３】
血液試料を1時間間隔で採取し、すみやかに氷上に置いた。各時点の経過後に遠心によって血漿を調製した。血漿を-20℃で保持し、標準的な試験キット(シグマおよび和光)を利用して24時間以内に、遊離脂肪酸(FFA)、トリグリセリド(TG)およびブドウ糖値を求めた。利用できる血漿の量に限りがあるため、ブドウ糖についてはプールしておいた試料を用いて2回重複して判定した。各時点ごとに、処理群ごとに8体の動物すべてから得た血漿を等量ずつプールした。したがって、ブドウ糖について示してあるエラーバーは2回の判定のSDを表し、TGおよびFFAについての動物個体間のムラを表すものではない。
【０３８４】
結果
gOBG3で処理したマウスでは、1〜4時間のすべての時点で高脂肪食による血漿FFAの上昇が有意に低かった。このことから、FFAの酸化量が増加していると解釈することができる(図8)。
【０３８５】
また、gOBG3で処理することで、未処理マウスに比して血漿TGの上昇率が有意に低くなった。しかしながら、この作用はFFAに対する作用ほど顕著ではなかった(図9)。
【０３８６】
gOBG3での処理後にブドウ糖の代謝回転が有意に改善された。この作用から、おそらくFFAが減少したことによってインスリン感受性が改善されているのだろうと解釈することができる(図10)。
【０３８７】
2回(0分および45分;データ図示せず)しか処理を行わなかった過去の実験においてもすでに同様の結果が認められていた。gOBG3の持つ強力なFFA抑止作用と、これよりは少ないがTG抑止作用とが両方得られる状態が観察された。
【０３８８】
実施例9:  C57 BL/6マウスにおいて血漿レプチンおよびインスリンに対してgOBG-3がおよぼす作用
健常なC57BL6/Jマウスにおいてacrp-30の球状頭部が食後の脂肪血(PPL)時に血漿レプチンおよびインスリンレベルに対しておよぼす作用を試験した。0時間、2時間、4時間の時点で血液を採取し、RIAによるレプチンおよびインスリンの判定に必要な、より多くの血液試料を得られるようにしたこと以外は、実施例8で説明したものと同一の実験方法を用いた。
【０３８９】
簡単に説明すると、16体のマウスを実験の2時間前に断食させた後、基線の血液試料を採取した。血液試料はいずれも、EDTAをコーティングした毛細管(それぞれの時点で100μLずつ)を用いて尾部から採取した。時刻0(午前9:00)に、標準的な高脂肪食(実施例8参照)を胃管栄養法(vol.=体重の1%)によってすべての動物に与えた。高脂肪食を与えた直後に、gOBG3 25μgを生理食塩水100μLに混合して腹腔内注射した。45分の時点と1時間45分の時点で同じ用量(100μL中25μg)を再度注射した(処理群、n=8)。対照動物(n=8)には生理食塩水を注射した(3×100μL)。未処理の動物と処理した動物とを交互に取り扱った。
【０３９０】
血液試料をすみやかに氷上にのせ、各時点の経過後に遠心によって血漿を調製した。血漿を-20℃で保持し、標準的な試験キット(和光)を利用して24時間以内に遊離脂肪酸(FFA)値を求めた。レプチンおよびインスリンについては、製造業者によるプロトコールに従ってRIA(ML-82KおよびSRI-13K、ミズーリ州セントチャールズのLINCOリサーチ社)によって判定した。しかしながら、血漿は20μLしか使用しなかった。各判定を2回繰り返した。利用できる血漿の量に限りがあるため、レプチンおよびインスリンについては、両処理群とも動物2体ずつのプール4つで求めた。
【０３９１】
結果
上記にて示した(実施例8)とおり、gOBG3で処理した群では2時間の時点で高脂肪食によって発生する食後の血漿FFAの増大が有意に抑えられた(図11)。血漿レプチンレベルにはどの時点でも有意な変化は認められなかった。gOBG3での処理はレプチンレベルに何ら影響しなかった(図12)。インスリンレベル(図13)については2時間の時点で些細な上昇が示されている。しかしながら、t0からの変化率として分析すると、この上昇分(212%vs.260%、対照例vs.処理群)は統計的には有意ではなかった(p=0.09)。
【０３９２】
これらのデータから、gOBG3で処理することによってFFA代謝が加速されるという先に示した結果が再確認される。また、gOBG3はレプチンおよびインスリンの血漿レベルには影響せず、gOBG3は食後に脂肪血となった時に高血糖を抑え、さらには数日間にわたって治療をほどこすと治療時に体重減少を誘導することが分かる。特定の理論に拘泥するわけではないが、これらのデータから、a)体重の減少は代謝のレプチン非依存性亢進によって引き起こされる、b)gOBG3がインスリン感受性の増大につながるのではないかと考えられる。
【０３９３】
実施例10:  C57 BL/6マウスにおいて、血漿FFA、TGおよびブドウ糖に対してOBG-3がおよぼす作用
健常なC57BL6/Jマウスにおいてacrp30の球状頭部が、食後の脂肪血(PPL)時に、血漿FFA、TG、ブドウ糖、レプチンおよびインスリンのレベルに対しておよぼす作用についてはすでに説明した。高脂肪食を摂取した健常なC57BL6/Jマウスに与えたgOBG3(2.5μg/日)に起因する体重減少についても上記にて示した(実施例5)。これと比較して、マウスで比較的わずかな作用を誘導するにはさらに高用量の完全形態のacrp30(200μg/日)が必要であった。この例から、血漿FFA、TGおよびブドウ糖のレベルに対して、acrp30-完全形態によってどのような作用がおよぶのかが分かる。
【０３９４】
実施例8で説明したものと同様の実験方法を用いた。簡単に説明すると、14体のマウスを実験の2時間前に断食させた後、基線の血液試料を採取した。血液試料はいずれも、EDTAをコーティングした毛細管(それぞれの時点で50μLずつ)を用いて尾部から採取した。時刻0(午前9:00)に、標準的な高脂肪食(実施例8参照)を胃管栄養法(vol.=体重の1%)によってすべての動物に与えた。高脂肪食を与えた直後に、OBG3 25μgを生理食塩水100μLに混合して4体のマウスに腹腔内注射した。45分の時点と1時間45分の時点で同じ用量(100μL中25μg)を再度注射した。第2の処理群(n=4)には、50μgのOBG3を同じ間隔で3回与えた。対照動物(n=6)には生理食塩水を注射した(3×100μL)。未処理の動物と処理した動物とを交互に取り扱った。
【０３９５】
血液試料をすみやかに氷上に置いた。各時点の経過後に遠心によって血漿を調製した。血漿を-20℃で保持し、標準的な試験キット(シグマおよび和光)を利用して24時間以内に、遊離脂肪酸(FFA)、トリグリセリド(TG)およびブドウ糖値を求めた。
【０３９６】
結果
全長OBG3で処理したところ、統計的に有意な減少(p<0.05)が認められたt=2時間以外は、血漿FFAレベルに対する影響はなかった(図14)。食後のTG(図15)には有意な変化が認められず、ブドウ糖レベル(図16)には処理した動物で変化が見られた。
【０３９７】
ここに提示したデータから、球状領域(実施例5、8、9)で観察された結果とは対照的に、完全形態のOBG3では、FFA、TGおよびブドウ糖レベルが低下しなかったことが分かる。胃管栄養処置後2時間の時点でのみ、OBG3で処理した事例でFFA血漿濃度が有意に低下した(p<0.05)。これらの結果から、in vivoでは全長タンパク質よりもgOBG3の方が活性が数段高いことが分かる。体重の減少にも同様の作用が認められた。球状頭部の方が全長タンパク質よりも数段活性が高かった。
【０３９８】
実施例11:  エピネフリン注射後にgACRP30がFFAに対しておよぼす作用
マウスでは、高脂肪/ショ糖試験食の胃内投与後に血漿遊離脂肪酸が増加する。これらの遊離脂肪酸は、ほとんどが脂肪分解酵素すなわちリポタンパクリパーゼ(LPL)および肝性リパーゼ(HL)の活性によって産生される。この種では、これらの酵素は、内皮と結合した形態と血漿中を自由に循環している形態のどちらにおいても有意な量で認められる16。もう1つの血漿遊離脂肪酸ソースが、β-アドレナリン刺激後に遊離脂肪酸を脂肪組織から放出させるホルモン感受性リパーゼ(HSL)である。gACRP30がHSLによって放出される遊離脂肪酸の代謝も調節するのか否かを試験するために、マウスにエピネフリンを注射した。
【０３９９】
2群のマウス(各群n=5)にエピネフリン(5μg)を腹腔内注射した。処理群には1時間前にエピネフリンと共にgACRP30(25μg)を注射し、対照動物には生理食塩水を注射した。血漿を単離し、上述したようにして(実施例10)遊離脂肪酸およびブドウ糖を測定した。図18に示されるように、エピネフリン注射(5μg)によって、血漿遊離脂肪酸およびブドウ糖が増加した。いずれの作用もgACRP30処理マウスで有意に抑えられた。
【０４００】
このようにブドウ糖レベルとFFAレベルの上昇が抑えられるのは、単離された脂肪組織からin vitroにてFFAの放出が誘導されることからも分かるように、エピネフリンのβ-アドレナリン作用が遮断されるためではない。これらの対照研究では、健常なC57BL/6Jマウスから脂肪組織を除去し、クレブス-ヘンゼライト重炭酸緩衝液中でインキュベートした。エピネフリンを加え、90分のインキュベーション後に培地中に含まれるFFAの濃度を判定した。エピネフリン(10μM)によって、培地中の遊離脂肪酸は1.7倍に増加した。gACRP30またはACRP30の濃度を50μg/mlまで高めても、エピネフリンによるこの作用が阻害されることはなかった。
【０４０１】
上記にて提示したデータから、ACRP30の球状領域によってエネルギー基質の代謝に非常に大きな薬学的作用がおよび、特に血漿遊離脂肪酸に対して最も大きな作用がおよぶことが分かる。さらに、LPLの阻害(これによって、血漿トリグリセリドが増加しているにもかかわらず、実際に観察される血漿トリグリセリドは減少することがある)とHSLの阻害のいずれも血漿FFA濃度が減少することに対する説明とはならない。このため、最も単純な説明は、gACRP30によって細胞的な取込みが促進され、循環から除かれる遊離脂肪酸の量が増えるということであろう。
【０４０２】
実施例12:  gACRP30が筋肉FFAの酸化に対しておよぼす作用
gACRP30が筋遊離脂肪酸の酸化に対してどのような作用をおよぼすのかについて調査するために、C57BL/6Jマウスから得た無傷の後肢筋肉を単離し、オレイン酸塩を基質として用いてFFA酸化を測定した(Clee et al (2000) J Lipid Res 41:521-531; Muoio et al (1999) Am J Physiol 276:E913-921)。上記にて説明したようにして単離後の筋肉におけるオレイン酸の酸化を測定した(Cuendet et al (1976) J Clin Invest 58:1078-1088; Le Marchand-Brustel (1978) Am J Physiol 234:E348-E358)。簡単に説明すると、頚椎脱臼によってマウスを屠殺し、ヒラメ筋とEDL筋を後肢からすみやかに単離した。各筋肉の遠位腱を縫合糸に結び付け、異なる培地に移しやすいようにした。インキュベーションについてはいずれも、FFAを含有しない4%ウシ血清アルブミン(画分V、RIAグレード、シグマ)および5mMブドウ糖(シグマ)を加えたクレブス-ヘンゼライト重炭酸緩衝液(118.6mM NaCl、4.76mM KCl、1.19mM KH2PO4、1.19mM MgSO4、2.54mM CaCl2、25mM NaHCO3、10mM Hepes、pH7.4)1.5mL中30℃にて実施した。実験のあいだをとおしてオレイン酸塩(シグマ)の総濃度を0.25mMに維持した。すべての培地をインキュベーション前に酸素化(95%O2;5%CO2)した。ガス洗浄器(ニュージャージー州バインランドのKontes社)によって気泡を送ることで、実験のあいだをとおして気体混合物を水和させておいた。
【０４０３】
酸素化を施しながらインキュベーション培地で筋肉を30分間洗浄した。次に、これらの筋肉を新鮮な培地(1.5mL)に移し、1μCi/mLの[1-14C]オレイン酸(アメリカンラジオラベルドケミカル社)の存在下、30℃にてインキュベートした。この培地を含むインキュベーションバイアルをゴム製の隔壁で封止し、ここからワットマン紙片(1.5cm×11.5cm)を付けた中央のウェルをぶら下げた。
【０４０４】
一定の酸素化を施しながら行う10分間の初期インキュベーションが経過した後、気体の循環を停止して系を外部環境から遮断し、30℃にて90分間筋肉をインキュベートした。この時間の終わりに、Solvable(コネチカット州メリデンのパッカードインスツルメント社)0.45mLを中央のウェルのワットマン紙に注入し、バイアルを氷上に移して筋肉によるオレイン酸の酸化を停止させた。
【０４０５】
5分後、筋肉を培地から取り出し、培地0.5mLのアリコートも除去した。バイアルを再度封止し、ゴム製の隔壁を穿孔して35%過塩素酸1mLを注射器で培地に注入した。酸性化した培地から放出されるCO2を中央のウェルのSolvableによって回収した。30℃にて90分の回収時間後、ワットマン紙を中央のウェルから取り外し、シンチレーション液(コネチカット州メリデンのパッカードインスツルメント社、HionicFlour)15mLを仕込んだシンチレーションバイアルに入れた。液体シンチレーション計数によって14C放射活性の量を定量化した。オレイン酸の酸化率を筋肉1gあたり90分で産生されたオレイン酸塩のnmol量で表した。
【０４０６】
gACRP30またはACRP30がオレイン酸の酸化に対しておよぼす作用を試験するために、これらのタンパク質を最終濃度2.5μg/mLで培地に加え、作業の間をとおして培地内に保持した。
【０４０７】
酸化能の異なる2種類の筋肉(ヒラメ筋および長指伸筋(EDL))を試験した(図19)。EDLおよびヒラメ筋の筋肉を健常なC57BL/6Jマウス(n=18)の両脚から単離した。各ペアのうち一方の筋肉を、gACRP30 2.5μg/mLを加えた培地でインキュベート(濃い灰色)し、他方をgACRP30のない培地でインキュベートした(対照−薄い灰色)。このような実験設計にすることで、本願発明者らは、同一の動物から単離した一組の筋肉でオレイン酸の酸化を対にして比較することができた。14C-オレイン酸の酸化を90分かけて判定した。EDLおよびヒラメ筋の筋肉をgACRP30 2.5μg/mlを含む培地で90分インキュベーションすると、どちらのタイプの筋肉でもオレイン酸の酸化が統計的に有意に亢進される(p<0.05、ペア、片側t検定)または(p=0.0041、被検体作用内での反復測定分散分析、多標本球形仮説検定)。
【０４０８】
どちらのタイプの筋肉においてもgACRP30に対して有意な応答が認められた。FFA酸化の相対的な亢進は、EDLで17%(p=0.03)、ヒラメ筋で10%(p=0.04)であった。人間の筋肉は体重の約25%を占める。したがって、遊離脂肪酸の酸化が中程度に亢進するだけでも、全体のエネルギ利用に対して量的に重要な結果につながる可能性がある。
【０４０９】
実施例13:  マウスから単離した筋肉および肝臓においてgArcp30がトリグリセリドに対しておよぼす作用
gACRP30によって誘導されるFFA酸化の亢進が、筋肉または肝臓へのFFAの送達についても起こるのか否かを判定するために、マウスのgACRP30処理後に後肢筋肉および肝臓のトリグリセリド含有量を測定した。処理動物および未処理動物から後肢筋肉ならびに肝臓試料を採取し、標準的な脂質抽出法(Shimabukuro et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:4637-4641)を利用してトリグリセリドおよび遊離脂肪酸の濃度を求め、次いで標準的な試験キットを用いてTGおよびFFAを分析した。
【０４１０】
動物をgACRP30で短期処理(屠殺前3時間以内で各25μgを2回注射)したところ、後肢筋肉と肝臓組織のいずれにおいてもトリグリセリド含有量は変化しなかった(データ図示せず)。しかしながら、処理の3日後(この期間中、健常なC57BL/6Jマウスには通常の齧歯類用の食事を与えた)、25μgのgACRP30を1日2回注射したマウスに、生理食塩水を注射したマウスと比して有意に高い(p=0.002)筋肉トリグリセリド含有量(対照:薄い灰色;gACRP30:濃い灰色)が認められた(図20A)。これは、肝臓トリグリセリドに増加が認められないこととは対照的であった(図20B)。さらに、互いに独立して行った筋肉TG含有量の直接測定と凍結顕微鏡切片のオイルレッドO染色のいずれにおいても、処理の16日後に筋肉TGの検出可能な増加は観察されなかった。要するに、これらのデータから、TG含有量の増加は一過性であったことが分かる。
【０４１１】
これらのデータは、gACRP30が遊離脂肪酸の筋肉への送達量を増して血漿からの遊離脂肪酸の排除率を少なくとも部分的に高めるのだという見解と一致する。FFAの多くはすぐに酸化されてしまうが、一部はトリグリセリドとして蓄積されて後で酸化される。高脂肪/糖食の摂取後に処理動物と未処理動物とにおいて血漿中のケトン体の濃度を測定したところ、上記の解釈がさらに裏付けられた。
【０４１２】
ケトン体(KB)は、遊離脂肪酸が酸化した結果として肝臓において産生されるが、KBの形成が筋肉で有意に起こるわけではない。高脂肪試験食を摂取させて生理食塩水を注射したマウスでは、以後の3時間で血漿KBレベルが有意に上昇した(183±12%、n=6)。一方、gACRP30で処理した動物では血漿KB濃度の上昇は認められなかった。このため、gACRP30はKBの形成を直接阻害するか、肝臓でのFFA酸化を阻害することによってKBの産生量を抑えることができる。
【０４１３】
実施例14:  gACRP30がマウスの体重増加&体重減少に対しておよぼす作用
独立した2つの研究から、gACRP30は全体のエネルギホメオスタシスにも影響することが明らかになった。まず最初に、10週齢のオスC57BL/6Jマウスに極めて高脂肪/ショ糖の精製食を19日間与え、体重増加を促進した(実施例5参照)。この時点での平均体重は30gであった。次に、これらのマウスに浸透圧ポンプ(デラウェア州ニューアークのアルゼット社)を外科的に移植し、gACRP30を2.5μg/日、ACRP30を5μg/日または生理食塩水を送達した。マウスに高脂肪食を与え続け、その後10日間体重を記録した。
【０４１４】
生理食塩水で処理したマウスまたは全長ACRP30 5μg/日で処理したマウスでは、それぞれ平均で1日あたり0.16%および0.22%の割合で体重が増え続けた。これとは対照的に、gACRP30で処理したマウスでは最初の4日で有意な体重減量(-3.7%、p=0.002)が認められ、その後体重は一定に維持された(図21A)。このように、健常なマウスの同系交配系では、低用量のgACRP30を毎日連続して注入すれば、高脂肪/ショ糖摂取による体重増加を持続的に妨害することが可能である。
【０４１５】
同一の高脂肪/高糖の食事を6ヶ月間にわたって与えた、9月齢のオス成熟C57BL/6Jマウスの太りすぎの個体において実施した第2の研究で、上記の結果を確認し、さらに進展させた。研究を開始したときの平均体重は52.5±0.8gであった。8体のマウスからなる群を、生理食塩水、ACRP30またはgACRP30で16日間処理した。処理群の動物にはタンパク質25μgを1日2回皮下注射した。指示した時点で体重を記録した。
【０４１６】
gACRP30で処理したところ、3日目に有意な(p<0.05)体重減少が認められた。この作用は、研究を続けるにつれて一層有意になった。16日間の研究期間のあいだ、gACRP30を注射した太りすぎのC57BL/6Jマウスでは、高脂肪/高糖の食事を与え続けられたという事実にもかかわらず、初期体重から約8%(p=0.001)減少した(図21B)。生理食塩水で処理した動物では、体重に些細な変動が認められたのみであった(p=n.s.)。最初の実験で使った量よりも10倍多い量で全長ACRP30で処理した動物では、有意な体重減少(-3.2%、p=0.025)が認められた。興味深いことに、gACRP30で処理したマウスでは16日におよぶ研究期間のあいだを通して一定の割合で体重が減少しつづけたのに対し、全長ACRP30で処理した動物での体重減量率は研究の後のフェーズになるほど小さくなった。gACRP30で処理した動物における食事の摂取量は、生理食塩水またはACRP30で処理した動物とさほど違わなかった(図21D)。
【０４１７】
gACRP30で処理したところ、血漿遊離脂肪酸の濃度が有意に低下した(図21C)。この作用は、治療3日後から有意であり(p<0.05vs.生理食塩水)、研究期間中をとおして完全に維持された。研究16日目の血漿FFAレベルを示しておく。初期FFA血漿濃度は3つの処理群のいずれにおいても同一であった。しかしながら、減少が認められるにもかかわらず、これらの大柄で太りすぎの動物での血漿遊離脂肪酸の濃度が健常なマウスの場合と比して約40-60%高いまま維持される点に注意されたい。終血液試料について実施した血液化学分析(SGPT、SGOT、尿素、クレアチニンまたはビリルビンの判定を含む)では、異常な血漿パラメータは何ら認められなかった(図22)。
【０４１８】
全体をとおして平均±SEMとしてデータを表した。p値<0.05を統計的に有意であるとみなした。統計解析は主に、各研究に示したように、不対のStudentのt検定または対のStudentのt検定のいずれかを用いて実施した。
【０４１９】
実施例15:  免疫沈降後のヒト血漿におけるAPM-1(gOBG3)フラグメントの検出
使用したACRP30タンパク質の組換え形態は、見かけ上の分子量が37kDaであり、74kDaの二量体を形成する(図23A、レーンII)。アセチル化トリプシンを用いて、全球状頭部領域(gACRP30)を含み、かつ、見かけ上の分子量18kDaで移行するタンパク質分解性フラグメントを生成した(図23A、レーンI)。両タンパク質調製物(ACRP30およびgACRP30)は本質的にエンドトキシンのないものであった。ActiClean Etoxアフィニティカラム(カリフォルニア州カールズバッドのSterogene Bioseparations社)を使用し、製造業者のプロトコールに従って、潜在的なエンドトキシン汚染物を除去した。Endosafe、Charleston、SCによってエンドトキシンレベルを求めた。精製gACRP30のN-末端配列決定によって求められるように、切断部位はアミノ酸104の直前(ヒトgOBG3またはAPM1の場合はアミノ酸101の直前)であった。
【０４２０】
ヒト血漿Apm1の免疫沈降に続いてウエスタンブロットを行い、免疫沈降ステップならびに検出ステップで球状頭部特異的抗血清を利用して、apm-1すなわちACRP30のヒト相同体の切断産物を検出した。ジメチル-pimelimidate-二塩酸塩(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社)を用いて免疫前(preimmune)血清または球状頭部ドメインまたはヒト非相同的領域(HDQETTTQGPGVLLPLPKGA)に対する血清をタンパク質A(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社)に架橋させた。洗浄(0.2M塩)後、常法を利用してタンパク質Aからタンパク質を溶出し、SDS-PAGEによって分離し、Protran(R)純ニトロセルロース膜(ニューハンプシャー州キーンのSchleicher and Schuell)に移した。ビオチンで標識した球状頭部ドメイン抗体、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびCN/DAB基質キット(イリノイ州ロックフォードのピアス社)を用いて、製造業者の指示に従ってApm-1産物を可視化した。
【０４２１】
この切り詰め形態の見かけ上の分子量は27kDaであり、apm-1の完全形態の約70%に相当していた(図23B、レーンIV)。apm-1のヒト非相同領域(HDQETTTQGPGVLLPLPKGA)に対する異なる抗体を用いて免疫沈降を実施した際には、この切り詰め形態を検出することはできなかった。このドメインは、球状ドメイン外のタンパク質のNH2末端に向かって所在している(図23、レーンV)。球状ドメインまたは非球状ドメインのいずれかに対する両抗apm-1抗体は、タンパク質の全長形態ならびに見かけ上の分子量74kDaで存在量が少ない二量体を識別した。
【０４２２】
実施例16:  イントラリピッド注射後にgACRP30がFFAに対しておよぼす作用
2群のマウス(各n=5)にイントラリピッド20%(クリンテック)を30μLの大量瞬時投与量で静脈(尾静脈)注射して血漿FFAを急激に上昇させたため、腸吸収がバイパスされた(イントラリピッドは栄養療法に使われる静脈内脂肪乳剤である)。処理群(◆gACRP30処理)にはイントラリピッドを与える30分前および60分前にgACRP30(25μg)を注射し、対照動物(▲対照)には生理食塩水を与えた。上述したようにして血漿を単離し、FFAを測定した。
【０４２３】
イントラリピッド注射によってピークが誘導された後にgACRP30が血漿FFAの崩壊に対しておよぼす作用を監視した。図24に示されるように、gACRP30はイントラリピッド注射後に血漿からのFFAの排除を促進している。このように、gACRP30は腸吸収に干渉せずにFFAのクリアランスを促進する。特定の理論に拘泥することを望むわけではないが、イントラリピッドは有意なインスリン応答を引き出すわけではないため、上記の結果からFFA代謝のgACRP30調節がインスリンとは無関係に起こるということが分かる。
【０４２４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒト(APM1)およびマウス(AdipoQおよびACRP30)OBG3ポリペプチドの配列のアライメントを示す。
【図２】  pTrcHisBのBamHI部位およびXhoI部位にクローニングされたAdipoQの核酸配列を示す。AdipoQは510で開始され、1214で終端する(挿入物をボールドで示す)。このコンストラクトにはN-末端シグナル配列(MLLLQALLFLLILP)は含まれない。
【図３】  APM1のタンパク質構造の概略図を示す。カルボキシ末端のN-末端(AA 1〜17)、一意な領域(AA 18〜41)、コラーゲン領域(AA 42〜107)および球状領域(AA 108〜244)における推定上のシグナル配列を示す。AA 100およびAA 131の後の2つのプロテアーゼ切断部位が示されている。
【図４】  pTrcHisBにクローニングされたAdipoQの球状領域の核酸配列を示す。AdipoQ球状領域は510で開始され、927塩基対で終端する。挿入物をボールドで示す。
【図５】  マウス肝臓株化細胞BPRCLにおいてAdipoQ(AQ)およびAdipoQ球状頭部(AQ-GH)が細胞関連125I-レプチンに対しておよぼす作用を比較した結果を示すグラフである。化合物(AQまたはAQ-GH)の量を次第に増やした場合の結果を対照値に対する百分率で求め、3回の判定の平均を図示する。
【図６】  6A、6Bおよび6Cは、gOBG3の量を次第に増やした場合のマウス肝臓株化細胞BPRCLにおける125I-LDL結合、取込みおよび分解のグラフを示す。
【図７】  ヒト(apm1)およびマウス(AdipoQおよびacrp30)obg3の印刷物として公開された配列を有するobg3クローン(obg3クローン;図2の挿入物)のタンパク質配列アライメントを示す。このアライメントでは、アミノ酸(AA)45〜110にコラーゲン様領域が含まれ、AA 111〜247に球状領域が含まれる。リシン遮断トリプシンからの切断部位は、AA58、61、95、103、115、125および134の後にくる。gOBG3産物のアミノ末端配列決定によって求めたところ、gOBG3開始部位はAA 104(ヒトgOBG3またはAPM1では101)である。
【図８】  高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてgOBG3(3×25μg i.p.)が血漿FFAに対しておよぼす作用を示すグラフである(*p<0.02)。
【図９】  9Aおよび9Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてgOBG3(3×25μg i.p.)が血漿TGに対しておよぼす作用を示すグラフである(2時間、3時間および4時間でp<0.05)。図9AではTGをmg/dlで示し、図9BではTGを開始値に対する百分率で示す。
【図１０】  高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてgOBG3(3×25μg i.p.)が血漿ブドウ糖に対しておよぼす作用を示すグラフである。
【図１１】  11Aおよび11Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてgOBG3(3×25μg i.p.)が血漿FFAに対しておよぼす作用を示すグラフである。図11AではFFAをmMで示し、図11BではFFAを開始値に対する百分率で示す。
【図１２】  12Aおよび12Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてgOBG3(3×25μg)が血漿レプチンに対しておよぼす作用を示すグラフである。図12Aではレプチンをng/mLで示し、図12Bではレプチンを開始値に対する百分率で示す。
【図１３】  13Aおよび13Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてgOBG3(3×25μg)が血漿インスリンに対しておよぼす作用を示すグラフである。図13Aではインスリンレベルをng/mLで示し、図13Bではインスリンを開始値に対する百分率で示す。
【図１４】  14Aおよび14Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてOBG3が血漿FFAに対しておよぼす作用を示すグラフである。t=2時間で両方の処理群でFFAに有意な減少が認められた(p<0.05)。図14AではFFAレベルをmMで示し、図14BではFFAを開始値に対する百分率で示す。
【図１５】  15Aおよび15Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてOBG3が血漿TGに対しておよぼす作用を示すグラフである。図15AではTGレベルをmg/dlで示し、図15BではTGを開始値に対する百分率で示す。
【図１６】  16Aおよび16Bは、高脂肪食摂取後にC57BL6/JマウスにおいてOBG3が血漿ブドウ糖に対しておよぼす作用を示すグラフである。図16Aではブドウ糖レベルをmg/dlで示し、図16Bではブドウ糖レベルを開始値に対する百分率で示す。
【図１７】  別のAPM1 SNPを識別する表である。マイクロシークエンシングに用いる既知の塩基対の変化、位置、前のマーカー、単位複製配列、フォワードプライマーおよびリバースプライマーに関する情報を示す。
【図１８】  18Aおよび18Bは、マウスにおいてエピネフリンを注射した結果、gACRP30を注射するとFFA(図18A)およびブドウ糖(図18B)の増加にどのような作用がおよぶのかについて示すグラフである。
【図１９】  マウスから単離した筋肉において、gACRP30での処理によって脂肪酸の代謝にどのような作用がおよぶのかについて示すグラフである。
【図２０】  20Aおよび20Bは、gACRP30での処理によってマウスから単離した筋肉および肝臓のトリグリセリド含有量にどのような作用がおよぶのかについて示すグラフである。
【図２１】  21A、21B、21Cおよび21Dは、グラフである。gACRP30での処理によって、マウスにおける体重の増加と減少にどのような作用がおよぶのかについて示すグラフである。図示の処理は、生理食塩水(菱形)、ACRP30(四角形)およびgACRP30(三角形)である。図21Aは、高脂肪食摂取19日後のマウスの処理結果を示す。図21Bは、高脂肪食摂取6ヶ月後のマウスの処理結果を示す。
【図２２】  生理食塩水の注射、ACRP30注射またはgACRP30注射を行った場合の被検血液化学値を示す表である。
【図２３】  23Aおよび23Bは、ACRP30およびgACRP30(23A)の精製時のSDS-PAGE分離結果とapm1の切断産物(23B)とを示す。図23A、レーンIIはFPLCで精製したACRP30の完全形態を示す。レーンIはタンパク質分解による切断産物gACRP30を示す。図23Bはウエスタンブロット後の免疫沈降後のapm-1の切断産物を示す。この切り詰め形態の見かけ上の分子量は27kDaであり、apm-1の完全形態の約70%に相当する(レーンIV)。タンパク質のヒト非相同的領域(HDQETTTQGPGVLLPLPKGA)に特異な第2の抗血清を用いて免疫沈降を実施し、検出に同一の抗球状頭部抗血清を使用した際には、この切り詰め形態を検出することはできなかった(レーンV)。同一の動物の免疫前血清ではタンパク質を検出することはできなかった。両方の特異抗体(見かけ上の分子量74kDa)でapm-1の二量体が認められた。
【図２４】  gACRP30(菱形)または生理食塩水の対照(正方形)での処理後に、イントラリピッドを注射して得られる血漿FFAの排除状態を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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