(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される担体と、
（ａ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）  配列番号４に記載のアミノ酸配列；
（ｃ）  配列番号６に記載のアミノ酸配列；
（ｄ）  配列番号２の少なくともアミノ酸１〜４５２からなる、免疫原性断片；または
（ｅ）  配列番号２の少なくともアミノ酸６９〜６５１からなる、免疫原性断片
を含んでなる、ポリペプチド
とを含んでなる、クラミジア感染に対するワクチン。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
ポリペプチドが、配列番号２の少なくともアミノ酸１〜４５２からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
ポリペプチドが、配列番号２の少なくともアミノ酸６９〜６５１からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
ポリペプチドが、（ａ）〜（ｅ）のいずれかに融合した異種シグナルペプチドをさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
患者における肺炎クラミジアの増殖を阻害するための医薬の製造における、核酸の使用であって、
核酸が
（ｉ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ii）  配列番号４に記載のアミノ酸配列；
（iii） 配列番号６に記載のアミノ酸配列；
（iv）  配列番号２の少なくともアミノ酸１〜４５２からなる、免疫原性断片；または
（ｖ）  配列番号２の少なくともアミノ酸６９〜６５１からなる、免疫原性断片；
をコードするものである、使用。
【請求項１３】
核酸が配列番号１、３または５のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
患者における肺炎クラミジアの増殖を阻害するための医薬の製造における、ポリペプチドの使用であって、
ポリプチドが
（ａ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）  配列番号４に記載のアミノ酸配列；
（ｃ）  配列番号６に記載のアミノ酸配列；
（ｄ）  配列番号２の少なくともアミノ酸１〜４５２からなる、免疫原性断片；または
（ｅ）  配列番号２の少なくともアミノ酸６９〜６５１からなる、免疫原性断片
を含んでなる、使用。
【請求項１５】
患者における肺炎クラミジアの増殖を阻害するために用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項を記載のワクチン。
【請求項１６】
肺炎クラミジアの感染症を予防または治療するために用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明はヒトなどの哺乳類におけるクラミジア感染症の予防および治療に使用できるクラミジア（Chlamydia）７６ＫＤａ外膜タンパク質抗原および対応するＤＮＡ分子に関する。
【０００２】
背景技術
クラミジアは原核生物である。それらは、リポ多糖および大腸菌(E coli)で見られるタンパク質と構造的および機能的に類似するいくつかの膜タンパク質を含む三層の外膜をはじめ、グラム陰性菌との形態的および構造的類似性を示す。それらは、代謝上不活性であるが感染力のある細胞外段階と、複製はするが感染力のない細胞内段階からなる独自の二相性生活環を有する偏性細胞内寄生体である。生活環の複製段階は感染した宿主細胞の細胞質からこの細菌を隔離する膜に結合した封入体内で起こる。
【０００３】
肺炎クラミジア(C.pneumonia)は一般的なヒト病原体で、初めにオウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)のTWAR株として記載されていたが、その後は新種であると認識されている。肺炎クラミジアは他のクラミジア種（トラコーマクラミジア(C. trachomatis)、Ｃ．ペコラム(C. pecorum)およびオウム病クラミジアとは抗原的、遺伝的および形態的に異なっている。それはトラコーマクラミジアまたはオウム病クラミジアといずれかとＤＮＡ配列において１０％以下の相同性しか示さない。
【０００４】
Ｃ．ニューモニアはコミュニティ獲得性の肺炎の一般的な原因であり、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)よりもわずかに低い頻度である(Grayston et al. (1995) Journal of nfectious Diseases 168:1231; Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36:1477)。それはまた気管支炎および副鼻腔炎をはじめとする上気道症状および疾患を引き起こす(Grayston et al. (1990) Journal of Infectious Diseases 168:1231; Grayston et al (1990) Journal of Infectious Diseases 161:618; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases, 18:501; Wang et al (1986) Chlamydial infectious, Cambridge University Press, Cambridge, p.329)。大部分の成人集団（６０％を超える）は肺炎クラミジアに対する抗体を持っており(Wang et al (1986) Chlamydial infection, Cambridge University Press, Cambridge, p.329)、これはまだ認識されていないか、または無症候性である過去の感染を示している。
【０００５】
肺炎クラミジア感染は通常には急性呼吸器系疾患（すなわち、咳、咽頭炎、嗄声、および発熱；聴診での異常な胸部音）として示される。ほとんどの患者では咳が２〜６週間持続し、回復が遅い。このようなケースの約１０％で、上気道感染の後に気管支炎または肺炎が起こる。さらに肺炎クラミジア流行の際には、次ぎにこれらの肺炎患者の約半数、特に虚弱者や高齢者で肺炎球菌の同時感染が認めれた。上記で示されたように、肺炎クラミジア感染が呼吸器系感染以外の疾患にも関連するさらに多くの証拠がある。
【０００６】
この生物の貯蔵庫はおそらくヒトである。オウム病クラミジアとは対照的に、鳥類または動物の貯蔵庫は知られていない。伝染については明らかには定義されていない。それは分泌物との直接的な接触、媒介物、または風媒拡散によると考えられる。長い潜伏期間があり、それは何ヶ月も持続する。流行の分析に基づけば、感染者はその生物の効率の悪い媒介者であるので、肺炎クラミジアはある集団にゆっくり拡散すると考えられる（患者から患者の間隔は平均３０日）。肺炎クラミジア罹病率は普遍的である。小児期に最初に感染した後、成人期に再感染が起こる。肺炎クラミジアは、２〜３年持続する高い発病率（流行病）間隔を重ね合わせると著しくは世界中の伝染病であると考えられる。トラコーマクラミジア感染は肺炎クラミジアに対する交差免疫を付与しない。感染症は経口抗せ物質テトラサイクリンまたはエリスロマイシン（２ｇ／ｄ、少なくとも１０〜１４日間）で容易に治療される。最近開発された薬剤アジスロマイジンはクラミジア感染症に対して単回投与として極めて有効である。
【０００７】
ほとんどの場合、肺炎クラミジア感染は軽いことが多く、合併症もなく、感染症の９０％までは亜急性であるか、認識されない。工業国の小児の間では感染は５才まではまれであると考えられていたが、最近の研究(E Normann et al, Chlamydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections, Acta Paediatrica, 1998, Vol 87, Iss 1, pp 23-27)では、この世代の子供の多くは血清反応陰性であるにもかかわらず感染のＰＣＲ証拠を示し、２〜４才の１７〜１９％有病率と見積もられることが報告されている。発展途上国では、幼児の間の肺炎クラミジア抗体の血清有病率は上昇し、肺炎クラミジアは急性下気道疾患、ならびに世界の熱帯地方の幼児よび小児の死亡率の重要な原因であり得ると疑われる。
【０００８】
血清有病率の研究および地方の流行病の研究によれば、肺炎クラミジアの一次感染は通常、５才から２０才の間で起こる。米国では例えば、肺炎クラミジアによって引き起こされる毎年の小児肺炎の３０，０００症例であると見積もられる。感染は小児または若年（例えば、学生や徴兵）群の中で集団発生する。
【０００９】
肺炎クラミジアはコミュニティ獲得性の下気道感染症の１０〜２５％を起こす（スェーデン、イタリア、フィンランドおよび米国から報告）。流行中、肺炎クラミジアは感染は肺炎の症例の５０〜６０％にのぼると考えられる。このような期間にはまた、さらに肺炎球菌による混合感染があることが報告されている。
【００１０】
成人期の再感染もよくあり、臨床徴候はより軽い傾向にある。集団血清有病率の研究に基づけば、年齢とともに曝露が増す傾向にあり、これは特にヒトにおいて明らかである。何人かの研究者が、持続性、無症候性の肺炎クラミジア感染状態がよくあることであると推測している。
【００１１】
中年または高年者では、肺炎クラミジア感染は慢性気管支炎および副鼻腔炎へと進行する可能性がある。米国での研究は、６０才より若い人において肺炎クラミジアによって引き起こされた発病率は年間１，０００人につき１症例であるが、若年層では発病率は３倍に上昇していたことを明らかにした。肺炎クラミジア感染は病床中にある患者を除いては入院につながることはまれである。
【００１２】
極めて重要なのは、アテローム性動脈硬化症と肺炎クラミジア感染との関連である。従来の肺炎クラミジア感染と心臓発作、冠動脈疾患および頸動脈疾患との関係を示すいくつかの疫学研究がある(Saikku et al. (1988) Lanet; ii:983; Thom et al. (1992) JAMA 268:68; Linnanmaki et al. (1993), Circulation 87:1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116:273; Melnick et al (1993) American Journal of Medicine 95:499)。さらに、この微生物は冠動脈、頸動脈、末梢動脈および大動脈のアテロームおよび脂肪索で検出されている(Shor et al. (1992) South African. Medical Journal 82:158; Kuo et al. (1993) Journal of Infectious Diseases 167:841; Kuo et al. (1993) Arteriosclerosis and Thrombosis 13:1500; Campbell et al (1995) Journal of Infectious Diseases 172:585; Chiu et al. Circulation, 1997 (In Press))。種々の肺炎クラミジアは冠動脈および頸動脈から回収されている(Ramirez et al (1996) Annals of Internal Medicine 125:979; Jackson et al. Abst. K121, p272, 36ｔｈ ICAAC, 15-18 Sept. 1996, New Orleans)。さらに肺炎クラミジアはウサギモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の変化を誘導することが示されている(Fong et al (1997) Journal of Clinical Microbiology 35:48)。考え併せるとこれらの結果は、、クラミジア性のアテローム性動脈硬化症の疫学的重要性は依然証明されてはいないが、肺炎クラミジアがヒトにおいてアテローム性動脈硬化症を引き起こし得るという高い可能性があることを示している。
【００１３】
いくつかの最近の研究はまた、肺炎クラミジア感染と喘息との間の関連も示している。感染は喘鳴性の喘息性気管支炎、成人発症喘息および成人における喘息の急性再燃に結びつけられており、小規模研究では何人かで長期抗生物質治療が効果的にゆっくりと疾病の重篤度を軽減することが示されている(Hahn DL, et al. Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998 Jan; 80(1): 45-49; Hahn DL, et al. Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptomitic asthma. Epidemiol Infect. 1996 Dec; 117(3): 513-517; Bjornsson E, et al. Serology of chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperresponsiveness. Scand J Infect Dis. 1996; 28(1): 63-69; Hahn DL. Treatment of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a befor-after trial. J Fam Pract. 1995 Oct; 41(4): 345-351; Allegra L, et al. Acute exacerbations of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection. Eur Respir J. 1994 Dec; 7(12): 2165-2168; Hahn DL, et al. Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezng, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma. JAMA. 1991 Jul 10; 266(2): 22
5-230)。
【００１４】
これらの結果に照らして、肺炎クラミジア感染に対する防御ワクチンが極めて重要であると考えられる。いずれのヒトクラミジア感染にも有用なワクチンはまだない。有効なワクチンは物理的または化学的に不活化したクラミジアを用いて開発できると考えられる。しかしながらかかるワクチンは高い安全域がない。一般に、安全なワクチンはその微生物の遺伝子操作のよって弱毒化するか、または組換えによって作出される。従って、ヒトクラミジア感染に対する有効かつ安全なワクチンを作出する主な障壁は、クラミジア、特に肺炎クラミジアに関する遺伝情報が不十分であることであった。
【００１５】
肺炎クラミジアおよびオウム病クラミジアを用いた研究では、クラミジアに対する安全かつ有効なワクチンが達成可能な目標であることを示している。例えば、トラコーマクラミジアの肺感染から回復したマウスはその後の膣攻撃によって誘導される不妊症から保護される(Pal et al. (1996) Infection and Immunity. 64:5341)。同様に、不活化したオウム病クラミジアで免疫化したヒツジはその後のクラミジア誘発性の流産および死産から保護された(Jones et al. (1995) Vaccine 13:715)。クラミジア感染症からの保護はＴｈ１免疫応答、特にＩＮＦｇ（ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する）の誘導と関連づけられている(Igietsemes et al. (1993) Immunology 5:317)。ＣＤ４＋細胞系統またはクローンの、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスへの養子移入は攻撃または明らかな慢性疾患からの防御を付与し(Igietseme et al (1993) Regional Immunology 5:317; Magee et al (1993) Regional Immunology 5: 305)、またＣＤ４＋Ｔ細胞のin vivo涸渇は攻撃後の疾病を悪化させた(Lander et al. (1991) Ynfection & Immunity 59:3774; Magee et al (1995) Infection & Immunity 63:516)。しかしながら、粘膜表面の十分高力価の中和抗体の存在も保護作用を発揮し得る(Cotter et al. (1995) Infection and Immunity 63:4704)。
【００１６】
肺炎クラミジア種内の抗原のバリエーションは遺伝情報が不十分であるために十分記載されていないが、バリエーションはトラコーマクラミジアに基づいて存在しているものと予測される。トラコーマクラミジアの血清学的亜型は主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）における抗原バリエーションに基づいて定義されているが、公表されている肺炎クラミジアＭＯＭＰ遺伝子配列はこの微生物のいくつかの異なる単離物の間ではダリエーションを示していない(Campbell et al (1990) Infection and Immunity 58:93; McCafferty et al (1995) Infection and Immunity 63:2387-9; Knudsen et al (1996) Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna)。Melgosa et al.（Infect. Immun. 1994. 62:880)は、肺炎クラミジアの単一株から７６ｋＤａの抗原をコードする遺伝子をクローニングすることを請求している。９ｋＤａおよび９ｋＤａのシステイン豊富な外膜タンパク質遺伝子を含むオペロンが記載されている(Watson et al., Nucleic Acids Res (1990) 18:5299; Watson et al., Microbiology (1995) 141:2489)。肺炎クラミジアに対する免疫血清によって認識される多くの抗原は総てのクラミジア間で保存されているが、９８ｋＤＡ、７６ｋＤａおよび他のいくつかのタンパク質は肺炎クラミジア特異的である可能性がある(Perez Melgosa et al., Infect. Immun. 1994. 62:880; Melgosa et al., FEMS Microbiol Lett (1993) 112:119; Campbell et al., J Clin Microbiol (1994) 32:583)。肺炎クラミジア血清型の数および相対頻度の評価、ならびに抗原の定義はまだ可能ではない。肺炎クラミジアＣＷＬ−０２９株の全ゲノム配列はすでに知られており(http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)、さらなる配列が入手できるので、抗原バリエーションのよりよい理解が得られる。
【００１７】
肺炎クラミジアに対して血清を免疫化することによって認識される多くの抗原は総てのクラミジアにわたって保存されているが、９８ｋＤａ、７６ｋＤａおよび５４ｋＤａタンパク質は肺炎クラミジア特異的であると思われる(Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36: 1477; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases, 18:501; Wiedmann-Al-Ahmad M, et al. Reactions of polyclonal and neutralizing anti-p54 monoclonal antibodies with an isolated, species-specific 54-kilodalton protein od Chlamydia pneumoniae, Clin Diagn Lab Immunil. 1997 Nov; 4(6): 700-704)。
患者由来の血清による単離物の免疫ブロッティングは、単離物間でブロッティングパターンにバリエーションがあることを示し、血清型肺炎クラミジアが存在し得ること示している(Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231; Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medecine 125:979)。しかしながらこの結果は、患者の血清の免疫ブロットプロフィールが感染後経時的に変化するので、患者の感染状態によって混乱しているかもしれない。血清型の数および相対頻度の評価、ならびに抗原の定義は依然として可能ではない。
【００１８】
従って、クラミジア感染を予防および治療するのに用いられる治療する肺炎クラミジアのポリヌクレオチド配列を同定および単離する必要性がある。
【００１９】
【発明の概要】
本発明は、クラミジア感染を予防、治療または診断する方法に使用できる、クラミジアポリペプチド指定７６ｋＤａタンパク質（配列番号１）をコードする精製および単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明の一つの形態では、ポリヌクレオチド分子は配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００２０】
本発明のもう一つの形態は単離されたＤＮＡ分子に対応するポリペプチドを提供する。対応するコードペプチドのアミノ酸配列は配列番号２で示されている。
【００２１】
本発明のもう一つの形態は末端切断型ＤＮＡに対応する末端切断型ポリペプチドを提供する。一つの具体例では、末端切断型ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３および４で示されている。もう一つの具体例では、末端切断型ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５および６で示されている。
【００２２】
Melgosa et al.は肺炎クラミジアから７６ｋＤａタンパク質をクローニングし、Melgosa et al.によって報告されているように公開されている肺炎クラミジアのゲノム配列(http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)と遺伝子配列を比較し、これにより実際にこの領域のゲノム配列が、５’部分と３’部分に少なくとも二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいることが明らかになったことを報告している。Melgosa et al.によって報告された配列は５’ＯＲＦの５’末端のフレーム内融合したものである。このようにMelgosaの推定タンパク質は単に７６ｋＤａ融合タンパク質に過ぎず、種々の肺炎クラミジア単離物からの免疫ブロッティングによって見られる７６ｋＤａタンパク質でない。これに対し、本発明の７６ｋＤａタンパク質はゲノムのこの領域の３’ＯＲＦによってコードされている全長タンパク質である。注目すべきは、このゲノム配列のさらなる解析(http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)により、５’ＯＲＦの開始コドンの上流にある少なくとも一つのフレーム内ＡＴＧが明らかとなることであり、このことはその５’ＯＲＦが一以上のより大きなＯＲＦの一部をないしている可能性があることを示唆している。
【００２３】
当業者ならば、クラミジア７６ｋＤａタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する限り、本発明はまたかかるポリペプチドに由来する断片をコードするポリヌクレオチドを提供することが分かるであろう。さらに、本発明は、本明細書に記載の非必須アミノ酸の付加、欠失または置換によって生じるかかるペプチドおよびそれらに由来する断片の変異体および誘導体、ならびにを提供するものと理解される。当業者ならば、本発明はクラミジアポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供される限り、さらにかかるポリペプチドと特異的に結合する単一特異性抗体を提供することが容易に分かるであろう。
【００２４】
本発明は広い応用を有し、発現カセット、ベクターおよび本発明のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む。従って、本発明はさらに（ｉ）組換え宿主系において本発明のポリペプチドを製造する方法、ならびに関連の発現カセット、ベクター、および形質転換またはトランスフェクト細胞；（ii）希釈剤または担体と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチドを含有するワクチン、またはポックスウイルス、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)またはコレラ菌(Viblerae cholerae)ベクターなどの生ワクチン（かかるワクチンおよびワクチンベクターは、例えばクラミジア感染を予防および治療するのに有用である）、ならびに関連の医薬組成物および関連の治療および／または予防方法；（iii）裸の形態もしくは送達ビヒクルと配合した本発明のＲＮＡまたはＤＮＡ分子、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチドの組合せ、または単一特異性抗体、ならびに関連の医薬組成物の治療的および／または予防的使用；（iv）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、単一特異性抗体、または本発明のポリペプチドの使用を含み得る、生物学的サンプルにおけるクラミジアの存在の診断方法；および（ｖ）抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポリペプチドの精製方法を提供する。
【００２５】
【発明の具体的説明】
本発明の具体例である以下の配列を参照しながら本発明を説明する。
配列番号１は７６ｋＤａタンパク質遺伝子の全長配列である。
配列番号２は７６ｋＤａタンパク質の推定全長アミノ酸配列である。
配列番号３は７６ｋＤａタンパク質遺伝子の５’末端切断型ヌクレオチド配列である。
配列番号４は７６ｋＤａタンパク質の５’末端切断型アミノ酸配列である。
配列番号５は７６ｋＤａタンパク質遺伝子の３’末端切断型ヌクレオチド配列である。
配列番号６は図９のｐＣＡＤ７６ｋＤａによる免疫防御の基礎をなす７６ｋＤａタンパク質の３’末端切断型アミノ酸配列である。
配列番号７は末端切断型７６ｋＤａタンパク質を含むポリペプチドをコードする配列である。この配列を鋳型として用い、断片をＰＣＲ増幅して構築物ｐＣＡＤ７６ｋＤａの一部を形成する。
配列番号８はｐＣＡＤ７６ｋＤａから発現させた場合の末端切断型７６ｋＤａタンパク質の推定アミノ酸配列である。
配列番号９は全長７６ｋＤａタンパク質遺伝子をクローニングし、さらにｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａの全長７６ｋＤタンパク質遺伝子を増幅するために用いられる５’プライマーである。
【００２６】
配列番号１０は全長７６ｋＤａタンパク質遺伝子をクローニングし、さらにｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａの全長７６ｋＤタンパク質遺伝子を増幅するために用いる３’プライマーである。
配列番号１１はｐＣＡＩ５５５の５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅するために用いる５’プライマーである。
配列番号１２はｐＣＡＩ５５５の５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子断片を増幅するために用いる３’プライマーである。
配列番号１３はｐＣＡＤ７６ｋＤａの３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅するために用いる５’プライマーである。
配列番号１４はｐＣＡＤ７６ｋＤａの末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子断片を増幅するために用いる３’プライマーである。
【００２７】
クラミジア７６ｋＤａタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は肺炎クラミジアゲノムから同定されてものである。このタンパク質をコードする遺伝子およびその断片を発現プラスミドに挿入したところ、クラミジア感染に対する免疫防御が付与されることが示された。従ってこの７６ｋＤａタンパク質および関連のポリペプチドを用いてクラミジア感染を予防および治療することができる。
【００２８】
本発明の第一の態様によれば、クラミジアポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、そのアミノ酸配列は配列番号２、４および６で示されている。
【００２９】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然に存在する環境から取り出されたポリヌクレオチドと定義される。例えば生細菌のゲノム中、または遺伝子バンクの一部として存在する天然ＤＮＡ分子は単離されないが、細菌ゲノムの残存部分から同分子は分離される、例えばクローニング（増幅）の結果として単離される。典型的には単離されたＤＮＡ分子は天然に存在するゲノムの５’または３’末端にすぐ隣接するＤＮＡ領域（例えばコドン領域）から遊離している。かかる単離ポリヌクレオチドはベクターまたは組成物の一部であってよいが、かかるベクターまたは組成物がかかるポリヌクレオチドの自然環境の一部ではないということから「単離された」と定義される。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）のいずれか、またはその改変体、変異体、相同体もしくは断片である。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれかであり、一本鎖であれば、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖のいずれかである。配列番号１、３または５で示される本発明のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つが、（ａ）コード配列、（ｂ）（ａ）の転写により誘導されるリボヌクレオチド配列、または（ｃ）遺伝子コードの重複または縮重により同じポリペプチドをコードするコード配列である。「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、いずれのアミノ酸鎖をも意味する。本願では両用語を相互に使用してもよい。
【００３１】
本発明の第一の態様によれば、配列番号２、４または６と相同なアミノ酸配列が提供される。本明細書において使用される「相同アミノ酸配列」とは、臨界融解温度（Ｔｍ）を超えない２５〜３５℃において、配列番号１、３または５の核酸配列のいずれの部分ともハイブリダイズする核酸配列によって総てまたは一部がコードされるいずれかのポリペプチドである。相同アミノ酸配列は配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列と１つ以上の保存的アミノ酸置換に関して異なるものである。またかかる配列は血清型変異体（下記）ならびに免疫原性などのポリペプチド本来の特徴を維持する、欠失または挿入を含む配列も包含する。かかる配列は配列番号２、４または６と好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは８０％、および最も好ましくは９０％同一である。
【００３２】
相同アミノ酸配列には配列番号２、４または６と同一または実質的に同一の配列が挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９７％、および最も好ましくは９９％同一であり、かつ好ましくは参照配列と大部分の保存的アミノ酸置換に関して異なる配列を意味する。
【００３３】
保存的アミノ酸置換は同種類のアミノ酸間の置換である。これらの種類には、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンのような非荷電極性側鎖を有するアミノ酸；リジン、アルギニン、およびヒスチジンのような塩基性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸、およびグルタミン酸のような酸性側鎖を有するアミノ酸；およびグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステインのような非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。
【００３４】
相同性は、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis Software Packageのような配列解析ソフトウェアを用いて求められる。アミノ酸配列を同一性が最大となるように配列する。配列に人為的にギャップを挿入し適当な配列を得てもよい。ひと度最適なアライメントが設定されれば、全位置数に対し、両配列のアミノ酸が一致する位置を総て記録することにより相同性の程度が確認される。
【００３５】
同様に相同ポリヌクレオチド配列も定義される。相同配列はコード配列配列番号１、３または５と好ましくは少なくとも４５％、さらに好ましくは６０％、および最も好ましくは８５％同一のものである。
【００３６】
本発明の第一の態様によれば、配列番号２、４または６と相同な配列を有するポリペプチドには、天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに配列番号２、４または６のポリペプチド本来の特徴を維持する変異体または天然には存在しないいずれの他の変異体も包含される。
【００３７】
当技術分野では公知であるように、対立遺伝子変異体はポリペプチドの生物学的機能を変更しない、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有することを特徴とするポリペプチドのもう一つの形態である。「生物学的機能」とは、たとえその機能が細胞の増殖または生存に必要でなくとも、それが天然に存在する細胞におけるポリペプチドの機能を意味する。例えばポーリンの生物学的機能は細胞外媒質に存在する化合物を細胞へ侵入させることである。生物学的機能は抗原性特性とは性質が異なる。ポリペプチドは１以上の生物学的機能を有し得る。
【００３８】
対立遺伝子変異体は本来極めて一般的なものである。例えば肺炎クラミジアなどの細菌種は通常対立遺伝子の小さな変化に関し互いに異なる種々の株で表される。実際、異なる株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドはそれぞれの株で同一でないアミノ酸配列（およびポリヌクレオチド配列）を有していてもよい。この変動にかかわらず、一般に多くの対立遺伝子変異体に対して向けられた免疫応答が実証されている。クラミジアＭＯＭＰ抗原の研究では、株間のＭＯＭＰのアミノ酸配列の変化にかかわらず、雑種株抗体結合が起こるとともに感染力の中和がなされ、免疫原として用いた際に、ＭＯＭＰがアミノ酸変化を許容することが示される。
【００３９】
相同ポリペプチドまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドは、常法により抽出されたゲノム細菌ＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅法によって回収される。これにはコードドメインの５’および３’末端の上流および下流に適合する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用が含まれる。好適なプライマーは配列番号１、３または５で提供されるヌクレオチド配列情報により設計される。その工程は次の通りである：１０〜４０個、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチドからなるプライマーを選択する。効率的なハイブリダイゼーションを確実にするのに十分な比率でＣおよびＧを含有する、すなわちＣおよびＧヌクレオチド量が全ヌクレオチド含量の少なくとも４０％、好ましくは５０％である、プライマーを選択することが有利である。標準的なＰＣＲ反応は典型的には１００μＬにつき０．５〜５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、各２０〜２００μＭのデオキシヌクレオチド（好ましくは同濃度）、全デオキシヌクレオチド濃度にわたって０．５〜２．５ｍＭ、１０５〜１０６の標的分子、および約２０Ｐｍｏｌの各プライマーを含む。ＰＣＲサイクル約２５〜５０回を行い、アニーリング温度をプライマーの真のＴｍより１５〜５℃低い温度とする。よりストリンジェントなアニーリング温度にすると誤ってアニーリングしたプライマーの識別が向上し、プライマーの３’末端への誤ったヌクレオチドの組み込みが少なくなる。変性温度は９５℃〜９７℃が典型であるが、Ｇ＋Ｃ豊富な標的の変性についてはより高い温度が適当であろう。実施するサイクル数は最初の標的分子の濃度にもよるが、典型的には特異的でないバックグラウンド産物が集積する傾向にあるので、４０サイクルを超えない方がよい。
【００４０】
相同ポリペプチドまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを回収する別法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによるものがある。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野では十分に知られており、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons INc., 1994), Silhavy et al. (Silhavy et al. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1994)、およびDavis et al. (Davis et al. A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1980)に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を至適化する重要なパラメーターは、その温度を超えると２本の相補ＤＮＡ鎖が互いに分離する臨界融解温度を得るのに用いる式で表される(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1977) 4:1539)。約６００個以上のヌクレオチドでなるポリヌクレオチドの場合、この式は次の通りである：
Ｔｍ＝81.5＋0.41x(%G+C)＋16.6log(陽イオン濃度)−0.63x(%ホルムアミド)−600／塩基数。
【００４１】
好適なストリンジェント条件下では、ハイブリダイゼーション温度（Ｔｈ）は約２０〜４０℃、２０〜２５℃、または好ましくは計算値Ｔｍを超えない３０〜４０℃である。最適温度および塩条件が容易に求め得ることは当業者には明らかであろう。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドに関しては（ｉ）４２℃で４〜１６時間以内、６×５０％ホルムアミド含有ＳＳＣにおける、または（ii）６５℃で４〜１６時間以内、６×ＳＳＣ水溶液（１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））における、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズインキュベーション双方の間にストリンジェント条件に達する。
【００４３】
典型的には、ハイブリダイゼーション実験は６０〜６８℃、例えば６５℃で行われる。このような温度では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は６×ＳＳＣ、好ましくは２×ＳＳＣまたは１×ＳＳＣ、より好ましくは０．５×ＳＳＣ、０．３×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣ（ホルムアミドの不在下）行うことができる。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含む。
【００４４】
天然には存在しない有用な相同体およびその断片は、アミノ酸配列変化および／または欠失を許容すると思われる抗原の領域を同定する公知の方法を用いて設計される。例として、異なる種由来の相同ポリペプチドを比較し、保存された配列を同定することを挙げる。さらに分岐した配列が最も配列変化を許容すると考えられる。配列間の相同性は例えばAltschul et al., Nucleic Acids Res,;25:3389-3402 (1997)のＢＬＡＳＴ相同性検索アルゴリズムを用いて解析すればよい。あるいは、コンピューターによって支援される可能性のあるＴまたはＢ細胞エピトープの解析に基づいて配列がＴおよび／またはＢ細胞とより高い反応性を有するように改変する。さらにもう１つの別法では、in vitroにおいてポリペプチド内のある特定のアミノ酸残基または配列を変異させ、次いでのその変異ポリペプチドを、以下に概略を記した方法によりクラミジア感染症を予防または治療する能力についてスクリーニングする。
【００４５】
当業者ならば、本発明のスクリーニングプロセスに従うことによって配列番号２、４または６のある特定の相同体がクラミジア感染症の予防または治療に有用であるかを過度な実験を行うことなく求められることが容易に理解されるであろう。
【００４６】
スクリーニング手順は
（ｉ）動物、好ましくはマウスを試験相同体または断片により免疫化し；
（ii）免疫化した動物にクラミジアを接種し；さらに
（iii）クラミジアに対する感染防御を付与するそれらの相同体または断片を選択する
工程を含んでなる。
【００４７】
「感染防御を付与する」とは、試験相同体または断片で免疫化していない対照動物と比べた場合のクラミジア感染症のいずれかの影響の重篤度の軽減を意味する。
【００４８】
本発明の第一の態様によれば、配列番号２、４または６の部分配列、配列番号２、４または６と相同なポリペプチド配列の部分配列、内部欠失により全長ポリペプチドから誘導されたポリペプチド、および融合タンパク質であるポリペプチド誘導体が提供される。
【００４９】
タンパク質に対する免疫応答を誘導するのに必要とされるものは総てタンパク質の小さな（例えば８〜１０個のアミノ酸）免疫原性領域であるため、ワクチンとしてタンパク質免疫原の断片および変異体を使用することは免疫学の分野では一般に認られた慣例である。クラミジア以外の病原体の表面に曝された抗原に対応する種々の短い合成ペプチドがそれぞれの病原体、例えばネズミ乳癌ウイルスの１１残基ペプチド(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1977) 4:1539)、セムリキ森林ウイルスの１６残基ペプチド(Snijders et al., 1991. J.Gen.Virol. 72:557-565)、およびイヌパルボウイルス由来の１５残基各々の２つの重複ペプチド(Langeveld et al., Vaccine 12(15):1473-1480,1994)に対する有効なワクチン抗原であることが分かっている。
【００５０】
従って本記載により、配列番号２、４または６の部分配列またはその相同アミノ酸配列が全長配列固有のものであり、本発明により教示されることは当業者には容易に理解されるであろう。かかるポリペプチド断片の長さは少なくとも１２個のアミノ酸であることが好ましい。それらの長さが少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、および、さらに好ましくは少なくとも７５個のアミノ酸、およびさらに好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸であることが有利である。
【００５１】
配列番号２、４または６と相同な配列の部分配列をコードする３０〜６００個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドは、以下に概略を記したパラメーターを用い、かつ増幅される断片の５’および３’末端の上流および下流の配列に適合するプライマーを使用するＰＣＲ増幅法により回収される。かかる増幅物の鋳型ポリヌクレオチドは配列番号１、３または５と相同な全長ポリヌクレオチド、またはＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーなどのポリヌクレオチド混合物に含まれるポリヌクレオチドのいずれかである。部分配列を回収する別法としては、上記の条件下においてＴｍの計算式を用いてスクリーニングハイブリダイゼーションを行う。３０〜６００個のヌクレオチドからなる断片を回収する場合、計算値Ｔｍを減法（６００／塩基対のポリヌクレオチドサイズ）により補正し、ストリンジェント条件をＴｍを超えない５〜１０℃であるハイブリダイゼーション温度で定義する。２０〜３０塩基より短いオリゴヌクレオチドを得る場合、Ｔｍの計算式は次の通りである：Ｔｍ＝４ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。例えば、５０％Ｃ＋Ｇの１８個のヌクレオチド断片は約５４℃のＴｍを有するであろう。配列番号２、４または６の断片またはその相同配列である短いペプチドは化学合成(E. Gross and H. J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesis, John Wiley & Sons (1981)、およびM. Bodanzki, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984))により直接得られる。
【００５２】
有用なポリペプチド誘導体、例えばポリペプチド断片をアミノ酸配列のコンピューター支援解析を用いて設計する。これにより表面に曝された有望な抗原性領域が同定されよう(Hughs et al., 1992. Infect. Immun. 60(9):3497)。プログラムＳＥＱＳＥＥ(Wishart DS, et al., “ＳＥＱＳＥＥ：タンパク質配列解析に適した総合プログラム” Comput Appl Biosci. 1994 Apr; 10 (2): 121-32)を使用する、産物の順応性および疎水性に基づく配列番号２、４または６にある６個のアミノ酸配列の解析では、有用な免疫原性断片および変異体を選択する基準として使用してもよい、可能性あるＢおよびＴ細胞エピトープが明らかとなり得る。この解析では抗体により認識されると考えられる外面特徴の適当な組合せを使用する。ＨＬＡ−Ａ０２０１  ＭＨＣサブクラスの有望なＴ細胞エピトープがＮＩＨで開発されたアプローチとエミュレートする、アルゴリズムにより明らかにすることができる(Parker KC, et al. "Peptide binding to MHC class I molecules: implications for antigenic peptide prediction." Immunol Res 1995; 14 (1) 34-57)。
【００５３】
感染防御Ｔ細胞依存性免疫応答を誘導するエピトープはポリペプチドの長さの範囲全体に存在する。しかしながら、いくつかのエピトープはポリペプチドの２次および３次構造によりマスクされる。かかるマスクされたエピトープを明らかにするため、大きな内部欠失を引き起こし、それによってもとのタンパク質構造の大部分を取り除いてマスクされたエピトープを露出させる。かかる内部欠失は時に株間の高変異性の免疫優性領域を取り去るという付加的な利点をもたらす。
【００５４】
ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドおよび大きな内部欠失を有するおよびポリペプチドを常法により構築する(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wily & Sons Inc., 1994)。かかる方法には標準ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、クローニングしたＤＮＡ分子の制限酵素処理、またはKunkel et al.(Kunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448)の方法が挙げられる。これらの方法の成分およびその使用説明書はStratageneなどの様々な販売元から容易に入手可能である。ひと度欠失変異体を構築すれば、それらを上記のようにクラミジア感染症を予防または治療する能力について調べる。
【００５５】
本明細書において使用される「融合ポリペプチド」は、他のいずれかのポリペプチドとＮまたはＣ末端で融合した本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を含有するものである（以後ペプチドテールと記す）。かかる融合ペプチドを得る簡便な方法はポリヌクレオチド配列のインフレーム融合物、すなわちハイブリッド遺伝子の翻訳による。融合ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子を発現ベクターに挿入し、それを用いて宿主細胞を形質転換またはでトランスフェクトする。そうでなければ、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、ペプチドテールをコードするポリヌクレオチドが既に存在する発現ベクターに挿入する。かかるベクターおよびその使用説明書は商業的に入手可能である、例えばペプチドテールがマルトース結合タンパク質である、New England BiolabsのｐＭａｌ−ｃ２またはｐＭａｌ−ｐ２系、Pharmaciaのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ系、またはNovagenから入手可能なＨｉｓ−Ｔａｇ系。これらおよび他の発現系により本発明のポリペプチドおよび誘導体のさらなる単離のための便宜な手段が提供される。
【００５６】
融合ポリペプチドの有利な例としては、本発明のポリペプチドまたは相同体もしくは断片と、コレラ毒素または大腸菌(E. coli)易熱性毒素のいずれかのサブユニットＢのようなアジュバント活性を有するポリペプチドとを融合したものである。もう一つの有利な融合物はポリペプチド、相同体または断片と、強力なＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープとを融合したものである。かかるエピトープは当技術分野で公知のもの（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原、D. R. Millich et al., "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a single synthetic T cell site", Nature. 1987. 329: 547-549)、または、可能性のあるＴまたはＢ細胞のコンピュータ補助分析に基づく本発明のもう一つのポリペプチドにおいて同定されたものであってよい。本発明のこの態様に従い、融合ポリペプチドは配列番号２、４または６、またはその相同体もしくは断片由来のＴまたはＢ細胞エピトープを含んでなる（ここで、エピトープはそのポリペプチドまたは相同体もしくは断片の多様な変異体から誘導され、各々のエピトープはそのエピトープのポリペプチド内の位置および配列において他とは異なっている）。かかる融合物は全ポリペプチド、相同体または断片に対するＴまたはＢ細胞応答を最適にするため、それはクラミジア感染症の予防および治療に有効である。
【００５７】
融合を達成するために、本発明のポリペプチドと、アジュバント活性を有するポリペプチドのＮ、または好ましくはＣ末端、またはＴもしくはＢ細胞エピトープとを融合する。そうでなければ、本発明のポリペプチド断片をアジュバント活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入する。またＴまたはＢ細胞エピトープを本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入してもよい。
【００５８】
第一の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは異種シグナルペプチドを含有する、本発明のポリペプチドへと成熟するハイブリッド前駆体ポリペプチドもコードする。「異種シグナルペプチド」とは、本発明のポリペプチドの天然に存在する前駆体には見られないシグナルペプチドを意味する。
【００５９】
ＲＮＡ、ＤＮＡ、または改変体もしくはその組合せを包含する本発明のポリヌクレオチド分子は多方面に適用される。ＤＮＡ分子は例えば（ｉ）組換え宿主系においてコードされたポリペプチドを生産するプロセスにおいて、（ii）クラミジア感染症を予防および／または治療する方法および組成物においてさらに用いられる、ポックスウイルスなどのワクチンベクターの構築において、（iii）裸の形態で、または送達ビヒクルと配合したワクチン薬剤として（ＲＮＡ分子と同様）、および（iv）本発明のポリヌクレオチドを過剰発現できる、またはそれを無毒性、変異型で発現する弱毒クラミジア株の構築において用いられる。
【００６０】
従って、本発明の第二の態様は、（ｉ）発現に必要なエレメントの制御下、特に適当なプロモーターの制御下に置かれた本発明のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；（ii）本発明の発現カセットを含有する発現ベクター；（iii）本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換またはトランスフェクトした原核生物または真核生物細胞、ならびに（iv）本発明のＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下において、本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換またはトランスフェクトした原核生物または真核生物細胞を培養し、細胞培養物からコードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含む、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を生産する方法を含む。
【００６１】
組換え発現系は原核生物および真核生物宿主から選択される。真核生物宿主には、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)）、哺乳類細胞（例えばＣＯＳＩ、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＪＥＧ３細胞）、節足動物細胞（例えばスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)（ＳＦ９）細胞）、および植物細胞が挙げられる。好ましい発現系としては大腸菌のような原核生物宿主がある。当業者には細菌および真核生物細胞は商業的供給者をはじめいくつかの異なる供給者、例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)から入手可能である。組換えタンパク質発現に用いる細胞の商業的供給者は細胞の使用説明書も提供する。
【００６２】
発現系の選択は発現されるポリペプチドに望まれる特徴によって異なる。例えば、特定の脂質化形態(lipidated form)または他のいずれかの形で本発明のポリヌクレオチドを生産するのが有用であると考えられる。
【００６３】
総てのベクターおよび発現制御配列ならびに宿主が本発明のポリヌクレオチドを等しく十分に発現するとは考えられないことは当業者には容易に理解されるであろう。しかしながら、下記の指針により、過度な実験を行うことなく、かつ本発明の範囲を逸脱することなく、ベクター、発現制御配列および宿主が選択できよう。
【００６４】
ベクターを選択する場合、そこに存在し、かつ可能な限り複製し得るベクターと適合する宿主を選択する必要がある。ベクターコピー数、コピー数を調節する能力、抗生物質耐性などの他のタンパク質の発現が考慮される。発現制御配列を選択する場合、いくつかの変数が考慮される。重要な変数には配列の相対強度（例えば、種々の条件下において発現を駆動する能力）、配列の機能を調節する能力、発現されるポリヌクレオチドと制御配列間の適合性（例えば二次構造は効率的な転写を妨げるヘアピン構造を回避すると考えられる）がある。宿主を選択する場合、所望のコンホメーションで産物を発現でき、スケールアップが容易で、さらにそれが最終産物の精製を容易にすることが望むならば、選択されたベクターと適合し、発現産物のいずれかの起こりうる有毒作用に耐性であり、発現産物を効率的に分泌できる単細胞宿主を選択する。
【００６５】
発現カセットの選択は発現されるポリペプチドに望まれる特徴だけでなく選択される宿主系にもよっても異なる。典型的には発現カセットは選択された宿主系において機能し得るものであり、かつ構成的または誘導性であり得るプロモーター；リボソーム結合部位；要すれば開始コドン（ＡＴＧ）；シグナルペプチド、例えば脂質化(lipidation)シグナルペプチドをコードする領域；本発明のＤＮＡ分子；停止コドン；および所望により３’末端領域（翻訳および／または転写ターミネーター）を含む。シグナルペプチドコード領域は本発明のポリヌクレオチドに隣接し、適当なリーディングフレームに存在する。シグナルペプチドコード領域は成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と相同または異種であり、発現に用いられる宿主の分泌機構と適合する。本発明のＤＮＡ分子により単独またはシグナルペプチドとともに構成されるリーディングフレームは転写および翻訳が宿主系において起こるようにプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターおよびシグナルペプチドコード領域は広く知られており、当業者ならば入手可能である。例えばアラビノースにより誘導可能であり（プロモーターａｒａＢ）かつ大腸菌などのグラム陰性菌において機能し得る、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)（および誘導体）のプロモーター（米国特許第５,０２８,５３０号およびCagnon et al., (Cagnon et al., Protein Engineering (1991) 4(7):843)に記載）；Ｔ７ポリメラーゼを発現する数多くの大腸菌株において機能し得る、ＲＮＡポリメラーゼをコードするバクテリオファージＴ７遺伝子のプロモーター（米国特許第４,９５２,４９６号に記載）；ＯｓｐＡ脂質化シグナルペプチド；およびＲｌｐＢ脂質化シグナルペプチド(Takase et al., J. Bact. (1987) 169:5692)が挙げられる。
【００６６】
典型的には発現カセットは選択された発現系で複製する能力が選択される発現ベクターの一部である。発現ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）は、例えばPouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985, Supp. 1987)に記載されるものから選択することができる。好適な発現ベクターは商業的供給者から購入することができる。
【００６７】
宿主細胞を発現ベクターで形質転換／トランスフェクトする方法は当技術分野では十分に公知であり、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wily & Sons Inc., 1994)に記載されるように選択した宿主系によって異なる。
【００６８】
発現の際、本発明の組換えポリペプチド（またはポリペプチド誘導体）は生産され細胞内コンパートメントに留まり、細胞外媒質または原形質膜空間に分泌／放出されるか、または細胞膜に埋め込まれる。ポリペプチドは組換え細胞培養物の遠心分離後の細胞抽出物からまたは上清から実質的に精製された形で回収される。典型的には組換えポリペプチドは抗体に基づくアフィニティー精製により、またはポリペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドとアフィニティー結合小ドメインとの融合などの当業者によって容易に適合できる十分に公知な他の方法により精製する。本発明のポリペプチドを免疫アフィニティーにより精製するのに有用な抗体は下記のようにして得られる。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドはまたワクチンとしても有用である。遺伝子送達ビヒクル（生ワクチンベクター）としてウイルスまたは細菌宿主を用いるか、または遺伝子を遊離型で、例えばプラスミドに挿入して投与するかの２つの主要な経路がある。本発明のポリヌクレオチドの治療または予防効力は下記のようにして評価される。
【００７０】
従って、本発明の第三の態様によれば、（ｉ）発現に必要なエレメントの制御下に置かれた本発明のＤＮＡ分子を含有するポックスウイルスなどのワクチンベクター；（ii）本発明のワクチンベクターとともに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物；とりわけ（iii）治療または予防上有効な量の本発明のワクチンベクターを含有する医薬組成物；（iv）哺乳類に免疫原性上有効な量の本発明のワクチンベクターを投与してクラミジアに対する感染防御または治療免疫応答を誘導することを含む、哺乳類（例えばヒト）のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法；またこの方法は動物（例えばネコまたは鳥）のクラミジア感染症を治療または予防する獣医学的適用に用いることができる；さらに詳しくは（ｖ）感染した個体に予防または治療量の本発明のワクチンベクターを投与することを含む、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス(C. trachomatis)、Ｃ．プシタチ(C. psittaci)、肺炎クラミジア、Ｃ．ペコラム(C. pecorum)）感染症を予防および／または治療する方法が提供される。さらに本発明の第三の態様によれば、クラミジア感染症を予防および／または治療する医薬の製造における本発明のワクチンベクターの使用が含まれる。
【００７１】
本明細書において、ワクチンベクターは本発明の１つまたはいくつかのポリペプチドまたは誘導体を発現する。ワクチンベクターはさらに免疫応答を増大する（アジュバント効果）インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などのサイトカインを発現すると考えられる。発現される各成分が哺乳類細胞における発現に必要なエレメントの制御下に置かれていることは明らかである。
【００７２】
本発明の第三の態様によれば、組成物はそれぞれが本発明のポリペプチドまたは誘導体を発現し得るいくつかのワクチンベクターを含んでなる。組成物はまた付加的なクラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もしくは誘導体；または必要に応じてＩＬ−２もしくはＩＬ−１２などのサイトカインと共に、または該サイトカインをを発現し得るワクチンベクターを含んでなってもよい。
【００７３】
哺乳類における感染症を治療または予防する予防接種方法は、いずれかの一般的な経路により、特に粘膜（例えば目、鼻腔内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣、または尿管）表面にまたは非経口（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹膜内）経路により投与される本発明のワクチンベクターの使用を含んでなる。好ましい経路はワクチンベクターの選択による。１回の投与で治療を果たしてもよいし、または間隔をおいて反復してもよい。好適な用量は当業者に理解されている、ワクチンベクター自体、投与経路または予防接種する哺乳類の条件（重量、年齢など）といった種々のパラメーターによって異なる。
【００７４】
当技術分野で入手可能な生ワクチンベクターには、アデノウイルスおよびポックスウイルスなどのウイルスベクター、ならびに細菌ベクター（例えば赤痢菌属(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、カルメットーゲラン菌(Bacille bilie de Calmette-Guerin)（ＢＣＧ）、および連鎖球菌(Streptococcus)）が挙げられる。
【００７５】
アデノウイルスベクター例、ならびに本発明のＤＮＡ分子を発現し得るアデノウイルスベクターの構築方法が米国特許第４，９２０，２０９号に記載されている。ポックスウイルスベクターにはワクシニアおよびカナリヤポックスウイルスがあり、それぞれ米国特許第４,７２２,８４８号および米国特許第５,３６４,７７３号に記載されている。例えばワクシニアウイルスベクターの記載はTartaglia et al., Virology (1992) 188:217、カナリヤポックスの参照文献はTaylor et al. Vaccine (1995) 13:539も参照。哺乳類細胞における発現に好適な条件下で本発明のポリヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入するために、本発明のポリヌクレオチドを発現し得るポックスウイルスベクターをKieny et al., Nature (1984) 312:163に記載される相同組換えにより得る。一般に治療または予防に使用するワクチンウイルスベクターの用量はキログラム当たりのプラーク形成単位が、約１×１０４〜約１×１０１１、有利には約１×１０７〜約１×１０１０、好ましくは約１×１０７〜約１×１０９であってよい。好ましくは、ウイルスベクターを、例えば４週間おきに３回で、非経口投与する。本発明のウイルスベクターを含有する組成物に化学アジュバントを加えることを避け、それによってウイルスベクター自身に対する免疫応答を最小にすることが好ましい。
【００７６】
経口生ワクチンとして有用な無毒性コレラ菌変異株が知られている。Mekalanos et al., Nature (1983) 306:551および米国特許第４，８８２，２７８号では、機能し得るコレラ毒素が生産されないように欠失させた、２つのｃｔｘＡ対立遺伝子それぞれの実在する量のコード配列を有する株が記載されている。ＷＯ９２／１１３５４では、変異（この変異を単一株においてｃｔｘＡ変異と組み合わせてもよい）によりｉｒｇＡ遺伝子座を不活性化した株が記載されている。ＷＯ９４／０１５３３では、機能し得るｃｔｘＡおよびａｔｔＲＳ１  ＤＮＡ配列を欠いた欠失変異体が記載されている。ＷＯ９４／１９４８２に記載されるように、これらの変異株を遺伝子操作して非対応抗原を発現させる。本発明のＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を発現し得るコレラ菌株の有効なワクチン用量は、選択された投与経路に適した用量中の生存細菌数、約１×１０５〜約１×１０９、好ましくは約１×１０６〜約１×１０８を含有する。好ましい投与経路としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましくはこれらのベクターは鼻腔内または経口投与される。
【００７７】
非対応抗原の組換え発現用に遺伝子操作した、またはしない弱毒ネズミチフス菌株、および経口ワクチンとしてのそれらの使用は、Nakayama et al. (Bio/Technology (1988) 6:693)およびＷＯ９２／１１３６１に記載されている。
好ましい投与経路としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましくはこれらのベクターは鼻腔内または経口投与される。
【００７８】
本発明においてワクチンベクターとして用いられる他の細菌株は、High et al., EMBO (1992) 11:1991およびSizemore et al., Science (1995) 270:299（フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)）; Medaglini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:6868（ストレプトコッカス・ゴルドニー(Streptococcus gordonii)）、Flynn J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31（Bacille Calmette Guerin）、ＷＯ８８／０６６２６、ＷＯ９０／００５９４、ＷＯ９１／１３１５７、ＷＯ９２／０１７９６、およびＷＯ９２／２１３７６（カルメットーゲラン菌）に記載されている。
【００７９】
細菌ベクターでは本発明のポリヌクレオチドを細菌ゲノムに挿入するか、または遊離状態でプラスミドの一部として残す。
【００８０】
本発明のワクチン細菌ベクターを含んでなる組成物はアジュバントをさらに含有してもよい。いくつかのアジュバントが当業者に公知である。好ましいアジュバントは以下に挙げるように選択される。
【００８１】
従って、本発明の第四の態様によれば、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドとともに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物；（ii）治療または予防上有効な量の本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物；（iii）免疫原性上有効な量の本発明のポリヌクレオチドを投与してクラミジアに対する感染防御免疫応答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法；さらに詳しくは（iv）感染した個体に予防または治療量の本発明のポリヌクレオチドを投与することにより、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス、Ｃ．プシタチ、肺炎クラミジア、またはＣ．ペコラム）感染症を予防および／または治療する方法が提供される。さらに本発明の第四の態様によれば、クラミジア感染症を予防および／または治療する医薬の製造における本発明のポリヌクレオチドの使用が含まれる。好ましい使用には哺乳類細胞における、特に哺乳類細胞において複製できず、かつ哺乳類ゲノムに実質的に組み込むことのできないプラスミドにおける発現の条件下に置かれたＤＮＡ分子の使用が挙げられる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドの使用には、治療または予防目的での哺乳類へのワクチンとしての投与が挙げられる。かかるポリヌクレオチドは哺乳類細胞において複製できず、かつ哺乳類ゲノムに組み込むことのできないプラスミドの一部としてＤＮＡの形で用いられる。典型的には、かかるＤＮＡ分子は哺乳類細胞の発現に好適なプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは遍在して、または組織特異的のいずれかで機能する。非組織特異的プロモーターの例としては、初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４,１６８,０６２号に記載される）およびラウス肉腫ウイルスプロモーター（Norton & Coffin, Molec. Cell Biol. (1985) 5:281に記載される）が挙げられる。組織特異的プロモーターの例としては、筋肉細胞における発現を駆動するデスミンプロモーター（Li et al., Gene (1989) 78:243、Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:6562およびLi & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403に記載される）である。プロモーターの使用については当業者は十分に公知である。有用なベクターは多くの公報、特にＷＯ９４／２１７９７およびMartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7: 1205で記載されている。
【００８３】
ワクチンとして用いられる本発明のポリヌクレオチドは対応するポリペプチドの前駆体または成熟型のいずれかをコードする。前駆体型ではシグナルペプチドは相同または異種のいずれかである。後者の場合、組織型プラスミノゲン因子（ｔＰＡ）のリーダー配列などの真核生物リーダー配列が好ましい。
【００８４】
本明細書において、本発明の組成物は１つまたはいくつかのポリヌクレオチドとともに所望によりウレアーゼサブユニットＡ、Ｂもしくはその両方などの別のクラミジア抗原、またはその断片、誘導体、変異体もしくは類似体をコードする少なくとも一つの付加的なポリヌクレオチドを含有する。また組成物は免疫応答を増強するためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などのサイトカインをコードする付加的なポリヌクレオチドを含有してもよい。これらの付加的なポリヌクレオチドは発現に好適な制御下に置かれている。同じ組成物に含まれる本発明のＤＮＡ分子および／または付加的なＤＮＡ分子は同じプラスミドに存在することが有利である。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチド治療薬の製造に分子生物学におけるポリヌクレオチドの調製および精製標準手法を用いる。ワクチンとして用いるための本発明のポリヌクレオチドは以下に概略を記した種々の方法により処方される。
【００８６】
一つの方法ではポリヌクレオチドはいずれの送達ビヒクルも用いない裸の形態で使用される。かかるポリヌクレオチドは単に滅菌生理食塩水または滅菌緩衝溶液などの生理学上許容される溶液に、担体を用いてまたは用いずに希釈する。担体が存在する場合には、担体が等張性、低張性、または弱高張性であることが好ましく、スクロース溶液、例えば２０％スクロース含有溶液により得られるような比較的低いイオン強度を有する。
【００８７】
別法では細胞の取り込みを助ける薬剤と結合したポリヌクレオチドを使用する。かかる薬剤の例は（ｉ）ブピバカインなどの細胞透過性を改変する化学物質（例えばＷＯ９４／１６７３７参照）、（ii）ポリヌクレオチドをカプセル封入するリポソーム、または（iii）それ自身がポリヌクレオチドと結合する陽イオン脂質またはシリカ、金、もしくはタングステン微粒子である。
【００８８】
陰イオンおよび中性リポソームは当技術分野では十分に公知であり（例えばリポソーム作製方法の詳細な説明に関する、Liposomes: A Practical Approach, Rpc New Ed, IRL press (1990)参照）、ポリヌクレオチドをはじめとする広範囲の産物を送達するのに有用である。
【００８９】
陽イオン脂質もまた当技術分野では公知であり、遺伝子送達には常用されている。かかる脂質には、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるリポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）などのコレステロール誘導体が挙げられる。これらの陽イオン脂質の記載はＥＰ１８７,７０２、ＷＯ９０／１１０９２、米国特許第５,２８３,１８５号、ＷＯ９１／１５５０１、ＷＯ９５／２６３５６、および米国特許第５,５２７,９２８号に見出すことができる。遺伝子送達用の陽イオン脂質は、例えばＷＯ９０／１１０９２に記載されるようにＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）のような中性脂質と結合させて用いることが好ましい。
【００９０】
陽イオンリポソームを含有する製剤は所望により他のトランスフェクション促進化合物を含有してもよい。それらの多くはＷＯ９３／１８７５９、ＷＯ９３／１９７６８、ＷＯ９４／２５６０８、およびＷＯ９５／２３９７に記載されている。それらには核膜を通るＤＮＡの輸送を促進するのに有用なスペルミン誘導体（例えばＷＯ９３／１８７５９参照）およびＧＡＬＡ、グラミシジンＳ、ならびに陽イオン胆汁酸塩などの膜透過性化合物（例えばＷＯ９３／１９７６８参照）が挙げられる。
【００９１】
金またはタングステン微粒子はＷＯ９１／００３５９、ＷＯ９３／１７７０６、およびTang et al. (Nature (1992) 356:152)に記載されるように遺伝子送達に用いられる。米国特許第４,９４５,０５０号、米国特許第５,０１５,５８０号、およびＷＯ９４／２４２６３に記載されるもののように、微粒子で被覆したポリヌクレオチドを無針注入装置（「遺伝子銃」）を用いて皮内または表皮内経路で注入する。
【００９２】
ワクチン受容者に用いるＤＮＡ量は、例えばＤＮＡ構築に用いるプロモーターの強さ、発現遺伝子産物の免疫原性、投与をしようとする哺乳類の条件（例えば哺乳類の体重、齢、および全身の健康状態）、投与様式、および剤型による。一般に、治療または予防上有効な量、約１μｇ〜約１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜約８００μｇ、およびさらに好ましくは約２５μｇ〜約２５０μｇをヒト成人に投与してもよい。１回の投与で投与を果たしてもよいし、または間隔をおいて反復してもよい。
【００９３】
投与経路はワクチン分野で用いるいずれの便宜な経路であってもよい。一般的な指針として、本発明のポリヌクレオチドは粘膜表面、例えば目、鼻腔内、肺、口腔、腸、直腸、膣、および尿管表面により；または非経口経路、例えば静脈内、皮下、腹膜内、皮内、表皮内、または筋肉内経路により投与する。投与経路の選択は選択される製剤による。ブピバカインと結合させて処方したポリヌクレオチドは筋肉投与が有利である。中性もしくは陰イオンリポソームまたはＤＯＴＭＡまたはＤＣ−Ｃｈｏｌなどの陽イオン脂質を用いる場合、製剤は静脈内、鼻腔内（エアゾル化）、筋肉内、皮内、および皮下経路により注入することが有利であろう。裸の形態のポリヌクレオチドは筋肉内、皮内、または皮下経路により投与することが有利であろう。
【００９４】
必ずしも必要ではないが、かかる組成物はアジュバントを含有していてもよい。もしそうであれば、アジュバント作用を示すために同時投与する必要のない浸透性アジュバント、例えば米国特許第５,０５７,５４６号に記載されるＱＳ２１などが好ましい。
【００９５】
本願で提供される配列情報により診断目的で用いる特異的なヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計が可能になる。従って、本発明の第五の態様によれば、配列番号１、３または５に示される配列の遺伝子コードの縮重で見られる、または縮重により誘導された配列を有するヌクレオチドプローブまたはプライマーが提供される。
【００９６】
本願において使用される「プローブ」とは、上記のように、ストリンジェント条件下で、配列番号１、３または５を有する核酸分子と、または配列番号１、３または５と相同な配列と、またはその相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズするＤＮＡ（好ましくは一本鎖）またはＲＮＡ分子（または改変体もしくはその組合せ）をいう。一般に、プローブは全長配列よりかなり短い。かかるプローブは約５〜約１００個、好ましくは約１０〜約８０個のヌクレオチドを含有する。特にプローブは配列番号１、３または５の一部と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは９５％相同である、またはかかる配列と相補的である配列を有する。プローブはイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、またはジアミノ−２，６−プリンなどの改変塩基を含有してもよい。糖またはリン酸残基も改変または置換してもよい。例えばデオキシリボース残基をポリアミドで置き換えてもよく(Nielsen et al., Science (1991) 254:1497)、リン酸残基をジホスフェート、アルキル、アリールホスホネートおよびホスホロチオエートエステルなどのエステル基で置き換えてもよい。さらにリボヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基をアルキル基のような官能基などで改変してもよい。
【００９７】
本発明のプローブは捕捉または検出プローブとして診断試験に用いられる。便宜にはかかる捕捉プローブは共有結合手段によりまたは受動的吸着により固相支持体に直接的または間接的に固定する。検出プローブは放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ならびに発色性、蛍光性、または発光性基質を加水分解し得る酵素、発色性、蛍光性、または発光性化合物、ヌクレオチド塩基類似体、およびビオチンから選択される検出マーカーで標識する。
【００９８】
本発明のプローブをドットブロット法(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York)、サザンブロット法(Southern, J. Mol. Biol. (1975) 98:503)、ノーザンブロット法（ＲＮＡを標的として用いることを除いて、サザンブロットと同じ）、またはサンドイッチ手法(Dunn et al., Cell (1977) 12:23)などのいずれの通常のハイブリダイゼーション手法にも用いてよい。後の手法では互いに少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有する特異的な捕捉プローブおよび／または特異的な検出プローブの使用が含まれる。
【００９９】
プライマーは増幅プロセス（例えばＰＣＲ）、伸長プロセス、または逆転写法における酵素的ＤＮＡ重合を開始するのに用いる、通常約１０〜約４０個のヌクレオチドのプローブである。ＰＣＲをはじめとする診断法に用いるプライマーを当技術分野で公知な方法で標識する。
【０１００】
本明細書において記載されるように、本発明はまた（ｉ）生物学的材料においてクラミジアの存在を検出および／または同定する本発明のプローブを含んでなる試薬；（ii）（ａ）該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、（ｂ）該材料からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出して変性させ、さらに（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションが検出されるように本発明のプローブ、例えば捕捉、検出プローブもしくはその両方に曝す、生物学的材料においてクラミジアの存在を検出および／または同定する方法；および（iii）（ａ）該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、（ｂ）そこからＤＮＡを抽出し、（ｃ）抽出したＤＮＡに少なくとも１つ、および好ましくは２つの本発明のプライマーを提供してポリメラーゼ鎖反応により増幅し、さらに（ｄ）増幅したＤＮＡ断片を生産する、生物学的材料においてクラミジアの存在を検出および／または同定する方法も包含する。
【０１０１】
配列番号１、３または５ポリヌクレオチド配列、その相同体、および各々の部分配列の開示によりそれらの対応するアミノ酸配列が使用可能になることは明らかである。従って本発明の第六の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体が提供される。
【０１０２】
本明細書において使用される「実質的に精製されたポリペプチド」はそれが天然に存在する環境から選別されたポリヌクレオチド、および／またはそれが合成される環境に存在する多数のポリヌクレオチドから遊離したポリペプチドと定義される。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは細胞質ポリペプチドから遊離したものである。本発明のポリペプチドが天然源、すなわちクラミジア株から精製され得る、または組換え手段により生産され得ることは当業者には容易に理解されよう。
【０１０３】
本発明の第六の態様によれば、ポリペプチド、相同体または断片がクラミジアに対する感染防御をすると考えられる標的動物において、その免疫原性を向上させるために改変されたまたは処理されたポリペプチド、相同体または断片が提供される。かかる改変または処理には：３−メチルヒスチジン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジンなどのアミノ酸誘導体によるアミノ酸置換、アミノ酸の遊離アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシル側基の改変などのポリペプチド、相同体または断片の調整後に行われる改変または欠失が挙げられる。
【０１０４】
特異的抗原性を有する本発明のポリヌクレオチドによりコードされる相同ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体の同定は、配列番号１、３または５のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドに対して作製した抗血清との交差反応性によるスクリーニングにより達成される。の手順は次の通りである：単一特異性高度免疫抗血清を、精製参照ポリペプチド、融合ポリペプチド（例えばＭＢＰ、ＧＳＴ、またはＨｉｓ−ｔａｇ系の発現産物、その使用に関する記載および説明についてはｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａ、ＢおよびＣに関する、またＸｐｒｅｓｓ（商標）系タンパク質精製に関するInvitrogen製品マニュアルに含まれている）、または抗原性であると推測される合成ペプチドに対して作製する。抗血清を融合ポリペプチドに対して作製する場合、２つの異なる融合系を使用する。特異性抗原性は以下のようにウエスタンブロット法(Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:4350)、ドットブロット法、およびＥＬＩＳＡ法などのいくつかの方法により求めることができる。
【０１０５】
ウエスタンブロットアッセイでは、スクリーニングする産物を精製調製物または大腸菌全抽出物のいずれかとして、Laemmli(Nature (1970) 227:680)により記載されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法に付す。ニトロセルロース膜に移した後、この材料を約１：５〜約１：５０００、好ましくは約１：１００〜約１：５００の希釈範囲で、希釈した単一特異性高度免疫抗血清とともにさらにインキュベートする。その産物に対応する一つのバンドが上記の希釈範囲のいずれかで反応性を呈すれば、特異的抗原性が示される。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡ法では、スクリーニングする産物を被覆抗原として用いることが好ましい。全細胞抽出物を用いてもよいが、精製調製物が好ましい。要するに、約１０μｇタンパク質／ｍｌの調製物約１００μｌを９６−ウェルポリカーボネートＥＬＩＳＡプレートに分注する。このプレートを３７℃で２時間、次いで４℃で一晩インキュベートする。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファー）で洗浄する。ウェルを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ２５０μｌで飽和させ、非特異的抗体結合を妨げる。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーで洗浄する。抗血清は０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーで連続的に希釈する。各ウェルに希釈物１００μｌを加える。プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、洗浄して標準法により評価する。例えば、特異的抗体をウサギで生産した場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合体をウェルに加える。インキュベーションを３７℃で９０分間で行い、プレートを洗浄する。適当な基質により反応物を顕出させ、この反応物を比色定量（分光光度計により測定された吸光度）により測定する。上記の試験条件下で、Ｏ．Ｄ．値が非免疫対照血清より大きい場合に陽性反応を示す。
【０１０７】
ドットブロット法でも、全細胞抽出物を用いてもよいが、精製産物が好ましい。要するに、約１００μｇ／ｍｌの産物の溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で連続的に２倍希釈する。各希釈物１００μｌを９６−ウェルドットブロット装置(Biorad)にセットしたニトロセルロース膜０．４５μｍに塗布する。系を減圧してバッファーを除去する。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えてウェルを洗浄し、膜を風乾する。膜をブロッキングバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ脱脂乳）で飽和させ、約１：５０〜約１：５０００、好ましくは約１：５００の抗血清希釈物とともにインキュベートする。反応物を標準手順により調べる。例えば、ウサギ抗体を用いる場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合体をウェルに加える。インキュベーションを３７℃で９０分間で行い、ブロットを洗浄する。適当な基質により反応物を顕出させて停止させる。この反応物を発色スポットの様子から、例えば比色定量により視覚的に測定する。上記の試験条件下で、発色スポットが少なくとも約１：５、好ましくは少なくとも約１：５００の希釈物と結合する場合に陽性反応を示す。
【０１０８】
本発明のポリペプチドまたは誘導体の治療または予防効力は下記のように評価できる。本発明の第七の態様によれば、（ｉ）本発明のポリペプチドとともに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物；とりわけ（ii）治療または予防上有効な量の本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物；（iii）免疫上有効な量の本発明のポリペプチドを哺乳類に投与してクラミジアに対する感染防御免疫応答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法；さらに詳しくは（iv）感染した個体に予防または治療量の本発明のポリペプチドを投与することにより、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス、Ｃ．プシタチ、肺炎クラミジア、またはＣ．ペコラム）感染症を予防および／または治療する方法が提供される。さらに本発明の第七の態様によれば、クラミジア感染症を予防および／または治療する医薬の製造における本発明のポリペプチドの使用が含まれる。
【０１０９】
本明細書において、本発明の免疫原性組成物はワクチン分野で知られる便宜な経路、特に粘膜（例えば目、鼻腔内、肺、口腔、胃、腸、直腸、膣、または尿管）表面にまたは非経口（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹膜内）経路により投与する。投与経路の選択はポリペプチドと結合したアジュバントなどのいくつかのパラメーターによる。粘膜アジュバントを用いる場合には鼻腔内または口腔経路が好ましい。脂質処方またはアルミニウム化合物を用いる場合には非経口経路が好ましく、皮下または筋肉内経路が最も好ましい。この選択もまたワクチン薬剤の性質による。例えば、ＣＴＢまたはＬＴＢと融合した本発明のポリペプチドは粘膜表面に投与することが最もよい。
【０１１０】
本明細書において、本発明の組成物は１つまたはいくつかの本発明のポリペプチドまたは誘導体を含有する。所望により組成物は少なくとも一つの付加的なクラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含有してもよい。
【０１１１】
本発明の組成物における使用では、ポリペプチドまたはその誘導体をリポソーム、好ましくは中性または陰イオンリポソーム、ミクロスフェア、ＩＳＣＯＭＳ、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）中にまたはそれとともに処方して、送達を促進および／または免疫応答を増強する。当業者はこれらの化合物を容易に入手できる；例えばLiposomes: A Practical Approach,RCP New Ed, IRL press(1990)参照。
【０１１２】
リポソームなど以外のアジュバントも用いられ、当技術分野では公知である。アジュバントは抗原を局所デポジットに封鎖することにより、それを急速な分散から守る、またはそれらは宿主を刺激して免疫系のマクロファージまたは他の成分に対し化学走性である因子を分泌する物質を含有すると考えられる。一般的には当業者によって、例えば以下に記載されるもの（本発明の第１１の態様に基づくもの）から適当な選択がなされるであろう。
【０１１３】
当業者ならば容易に決定できるが、治療は１回の投与で果たしてもよいし、または必要に応じて間隔をおいて反復してもよい。例えば、開始用量の後、週単位または１ヶ月単位の間隔をおいて３回の追加免疫抗原投与を続ける。好適な用量は当業者には容易に決定できるが、受容者（例えば成人または小児）、個々のワクチン抗原、投与経路または頻度、アジュバントの有無またはタイプ、および所望の効果（例えば感染防御および／または治療）を含む種々のパラメーターによって異なる。一般に、本発明のワクチン抗原を粘膜経路によって約１０μｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約２００ｍｇの量を投与する。投与が非経口経路の場合、通常用量は約１ｍｇ、好ましくは約１００μｇの限度を超えない。
【０１１４】
ワクチン薬剤として用いる場合、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを多段階免疫化プロセスの要素として連続的に用いてもよい。例えば、まず哺乳類にポックスウイルスなどの本発明のワクチンベクターを、例えば非経口経路によりに注入し、次いでワクチンベクターによりコードされるポリペプチドで２回、例えば粘膜経路により追加免疫抗原を加える。また別の例では本発明のポリペプチドまたは誘導体と結合したリポソームを開始に用い、粘膜アジュバント（例えばＬＴ）と組み合わせた本発明の可溶性ポリペプチドまたは誘導体を用いて粘膜により追加免疫抗原刺激を行う。
【０１１５】
本発明の第七の態様によれば、本発明のポリペプチド誘導体はまた、例えば血液サンプルにおいて抗クラミジア抗体の存在を検出する診断試薬として用いられる。かかるポリペプチドの長さは約５〜約８０個、好ましくは約１０〜約５０個のアミノ酸である。診断方法により、それらを標識するまたは標識しないのいずれかである。かかる試薬を含む診断方法を以下に記載する。
【０１１６】
公知の実験室手法を用い、本発明のＤＮＡ分子の発現においてポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を生産し精製する。以下に記載されるように、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は精製を促進する融合テールを有した融合タンパク質として生産される。融合産物を用いて小型哺乳類、例えばマウスまたはウサギを免疫化し、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に対する抗体（単一特異性抗体）を作製する。よって本発明の第八の態様によれば、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体と結合する単一特異性抗体が提供される。
【０１１７】
「単一特異性抗体」とは特異な天然に存在するクラミジアポリペプチドと反応し得る抗体を意味する。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかである。単一特異性抗体は組換え体、例えばキメラ（例えば、ヒト不変部と結合したネズミ由来の可変部により構成された）、ヒト化型（動物、例えばネズミ由来の超可変部とともにあるヒト免疫グロブリン不変主鎖）および／または一本鎖であってよい。ポリクローナルおよび単一特異性抗体は双方とも免疫グロブリン断片、例えばＦ（ａｂ）’２またはＦａｂフラグメントの形であってもよい。本発明の抗体はいずれのイソ型のもの、例えばＩｇＧまたはＩｇＡであってよいが、ポリクローナル抗体は単一イソ型またはイソ型の混合物ある。
【０１１８】
本発明のポリペプチド、相同体または断片に対する抗体はそのポリペプチド、相同体または断片を含んでなる組成物による哺乳類の免疫化により産生される。かかる抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生方法は当技術分野では十分に公知である。例えば、"Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Eds. E. Harlow and D. Lane (1988)、およびD. E. Yelton et al., 1981. Ann. Rev. Biochem. 50: 657-680参照。モノクローナル抗体についてはKohl and Milstein (1975) Nature 256:495-497参照。
【０１１９】
本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に対して作製される本発明の抗体を標準免疫学的アッセイ法、例えばウエスタンブロット解析法、ドットブロットアッセイ法、またはＥＬＩＳＡ法(例えばColigan et al., Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照)を用いて作製して同定する。抗体は生物学的サンプルなどのサンプルにおいてクラミジア抗原の存在を検出する診断法に用いられる。また抗体は本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を精製するアフィニティークロマトグラフィーにも用いられる。以下でさらに考察するように、かかる抗体を予防および治療的受動的免疫化方法に用いてもよい。
【０１２０】
よって本発明の第九の態様によれば、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体を含有する生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在を検出する試薬；および（ii）免疫複合体が形成されるように生物学的サンプルと本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体とを接触させて、かかる複合体を検出してサンプルまたはサンプルが誘導される生物体においてクラミジアの存在を示すことにより、生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在を検出する方法が提供される。
【０１２１】
いずれを用いるとしても免疫複合体がサンプルの成分と抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体とで形成されること、および結合していない材料がいずれも複合体の検出前に除去されることは当業者には容易に理解されるであろう。ポリペプチド試薬がサンプル、例えば血液サンプルにおいて抗クラミジア抗体の存在を検出するのに有用であり、本発明の抗体が胃抽出物または生検などのサンプルをクラミジアポリペプチドの存在についてスクリーニングするのに有用であることは明らかである。
【０１２２】
診断適用では、試薬（すなわち本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体）は遊離状態にあるか、またはチューブ、ビーズ、または当分野において用いられるいずれかの他の通常の支持体などの固相支持体に固定されているかである。固定は直接的または間接的手段によりなし遂げられる。直接的手段としては受動的吸着（非共有結合）または支持体と試薬との共有結合が挙げられる。「間接的手段」とは試薬と相互作用する抗試薬化合物が固相支持体に最初に付着することを意味する。例えば、ポリペプチド試薬を用いる場合に、それが生物学的サンプルにおいて抗体の認識に関係していないエピトープと結合するのであれば、それに結合する抗体が抗試薬として作用し得る。間接的手段にはまた、例えばビタミンなどの分子がポリペプチド試薬に接合され、その対応する受容体が固相に固定されるリガンド−受容体系も用いられる。これはビオチン−ストレプトアビジン系によって例示される。あるいは、ペプチドテールを化学的にまたは遺伝子操作により試薬に加え、接合または融合された産物をペプチドテールの受動的吸着または共有結合により固定する。
【０１２３】
使用説明書も含んでなるキットにかかる診断薬が含まれていてもよい。この試薬はそれがその標的と結合した場合に試薬の検出がなされる検出手段によって標識される。検出手段はフルオレセインイソシアネートまたはフルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光剤、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素、または１２５Ｉまたは５１Ｃｒなどの放射性元素であってよい。
【０１２４】
従って本発明の第１０の態様によれば、生物学的サンプルについて本発明の単一特異性抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、生物学的サンプルから、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を精製する方法が提供される。
【０１２５】
本発明の精製法における使用に関し、抗体はポリクローナルまたは単一特異性抗体のいずれか、および好ましくはＩｇＧ型である。精製ＩｇＧは常法により抗血清から調製する(Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY.)。一般的なクロマトグラフィー支持体、ならびに抗体を接合する標準方法については、例えばAntibodies: A Laboratory Manual, D. Lane, E. Harlow, Eds. (1988)に記載されている。以下に概略を記す。
【０１２６】
要するに、好ましくはバッファー溶液中の肺炎クラミジア抽出物などの生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体（すなわち抗原）をクロマトグラフィー材に吸着させるように、好ましくは生物学的サンプルの希釈に用いるバッファーで平衡化した材料に適用する。本発明の抗体と結合したゲルまたは樹脂などのクロマトグラフィー材はバッチ型またはカラムのいずれかである。結合しない成分を洗い流し、次いで抗原をグリシンバッファー、またはカオトロピック剤、例えばグアニジンＨＣｌ、もしくは高塩濃度（例えば、３Ｍ  ＭｇＣｌ２）を含有するバッファーなどの好適な溶出バッファーで溶出する。溶出画分を回収し、例えば２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより抗原の存在を検出する。
【０１２７】
本発明の第１１の態様によれば、（ｉ）本発明の単一特異性抗体とともに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物；（ii）治療または予防上有効な量の本発明の単一特異性抗体を含んでなる医薬組成物；および（iii）感染した個体に治療または予防量の本発明の単一特異性抗体を投与することにより、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス、Ｃ．プシタチ、肺炎クラミジア、またはＣ．ペコラム）感染症を治療または予防する方法が提供される。さらに本発明の第１１の態様によれば、クラミジア感染症を治療または予防する医薬の製造における本発明の単一特異性抗体の使用が含まれる。
【０１２８】
単一特異性抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか、好ましくはＩｇＡイソ型のもの（優勢）である。受動的免疫化では抗体を重炭酸バッファーの存在下で哺乳類の粘膜表面、例えば胃粘膜に、例えば経口または胃内投与することが有利である。また全身投与は重炭酸バッファーを用いずに行われる。本発明の単一特異性抗体を単一有効成分として、または異なるクラミジアポリペプチドに対して特異的な少なくとも一つの単一特異性抗体との混合物として投与する。用いる抗体量および特定の管理方法は当業者により容易に決定される。大部分の目的には、例えば抗体約１００〜１,０００ｍｇを１週間毎日投与、または抗体約１００〜１,０００ｍｇを２または３日間１日当たり３回投与が有効な管理法である。
【０１２９】
治療または予防効力を当技術分野の常法を用いて、例えば粘膜免疫応答の誘導または感染防御および／または治療的免疫の誘導を、例えば肺炎クラミジアマウスモデルを用いて測定することにより評価する。モデルの肺炎クラミジア株を別のクラミジア株と置き換えてもよいことは当業者に容易に理解されるであろう。例えば、肺炎クラミジア由来のＤＮＡ分子およびポリペプチドの効果は、好ましくはマウスモデルにおいて肺炎クラミジア株を用いて評価する。感染防御はクラミジア感染症の程度を対照群のものと比較して求める。感染症が対照群に比べて軽減されている場合に感染防御を示す。本発明のポリヌクレオチド、ワクチンベクター、ポリペプチドおよびその誘導体、ならびに抗体に対してかかる評価がなされる。
【０１３０】
上記のいずれのワクチン組成物においても有用なアジュバントは以下の通りである。
【０１３１】
非経口投与用アジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびヒドロキシリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物が挙げられる。標準プロトコールに従い、抗原をアルミニウム化合物で沈降させる、またはそれに吸着させる。ＲＩＢＩ(ImmunoChem, Hamilton, MT)などの他のアジュバントも非経口投与に用いられる。
【０１３２】
粘膜投与用アジュバントには細菌毒、例えばコレラ毒（ＣＴ）、大腸菌易熱性毒（ＬＴ）、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒Ａおよび百日咳毒（ＰＴ）、もしくはその組合せ、サブユニット、変性毒素、または天然コレラ毒サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製製剤などのその変異体が挙げられる。これらの毒素のいずれに対する断片、相同体、誘導体、および融合物もアジュバント活性を保有している場合にはそれらもまた適当である。好ましくは弱毒化した変異体を用いる。好適な変異体は、例えばＷＯ９５／１７２１１（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ  ＣＴ変異体）、ＷＯ９６／０６６２７（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ  ＬＴ変異体）、およびＷＯ９５／３４３２３（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ  ＰＴ変異体）に記載される。本発明の方法および組成物において用いられるさらなるＬＴ変異体には、例えばＳｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−６９Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−１１０−Ａｓｐ、およびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ変異体が挙げられる。例えば大腸菌、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)、ネズミチフス菌、またはシゲラ・フレクスネリ(Shigella Flexneri)の細菌モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）；サポニン、またはポリアクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）ミクロスフェアなどの他のアジュバントも粘膜投与に用いられる。
【０１３３】
粘膜および非経口投与の双方に有用なアジュバントには、ポリホスファゼン（ＷＯ９５／０２４１５）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３ｂ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール；米国特許第５,２８３,１８５号およびＷＯ９６／１４８３１）およびＱＳ−２１（ＷＯ８８／０９３３６）が挙げられる。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、または抗体を含有する本発明の医薬組成物は常法で製造される。特に医薬上許容される希釈剤または担体、例えば水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水とともに処方される。一般に希釈剤または担体は投与形ならびに経路、および医薬上の標準法に基づき選択される。好適な医薬上の担体または希釈剤、ならびに医薬製剤における使用に医薬上必要不可欠なものは、Remington's Pharmaceutical Sciences、当分野における標準的な参照文献およびＵＳＰ／ＮＦに記載されている。
【０１３５】
本発明はまた、本発明のクラミジアポリペプチドおよび粘膜アジュバントと抗生物質、制酸剤、スクラルファート、またはその組合せとを併用した経口投与によりクラミジア感染症を治療する方法も含む。ワクチン抗原およびアジュバントとともに投与し得るかかる化合物の例としては、例えばマクロライド、テトラサイクリン、およびその誘導体（用い得る抗生物質の特異例として、アジトロマイシンもしくはドキシサイクリンまたはサイトカインもしくはステロイド類などの免疫調節剤が挙げられる）などの抗生物質がある。さらにともに結合した１種を超える上記成分を含有する化合物を用いる。本発明はまたこれらの方法を行うための組成物、すなわち医薬上許容される担体または希釈剤中に本発明のクラミジア抗原（または抗体）、アジュバント、および１種以上の上記の化合物を含有する組成物も含む。
【０１３６】
最近、９ｋＤａのシステイン豊富な外膜タンパク質は、ヒトにおいて保存されているエピトープ、ネズミαミオシン重鎖エピトープＭ７Ａ−αと交差反応する配列を含んでいることが示されている(Bachmaier et al., Science (1999) 283:1335)。この交差反応性は心血管疾患の発症の一因であることを示しているので、ワクチンとして使用される場合はそのタンパク質からこのエピトープおよびヒト抗原と交差反応するその他のエピトープのいずれもを除去するのが有効であり得る。従って、本発明のさらなる具体例は、例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチドからエピトープをコードするヌクレオチドを欠失させるまたは置換して、ワクチンとしてのタンパク質の有効性と安全性を向上させることでコード配列を改変することを含む。ヒト抗原との望ましくない相同性または交差反応性を持つことがわかっているいずれの防御抗原に対しても同様のアプローチが適当であり得る。
【０１３７】
本発明の方法および組成物において用いられる上記化合物の量については当業者ならば容易に求められる。治療／免疫化計画についても公知であり、当業者によって容易に計画される。例えば、非ワクチン成分を１〜１４日目に投与して、ワクチン抗原＋アジュバントを７、１４、２１、および２８日目に投与することが可能である。
【０１３８】
【実施例】
上記の開示は一般に本発明を説明するものである。さらに完全な理解は以下の具体的な例により得られる。これらの例は単に例示のために記載されるものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況が提案されまたは便宜となる限り、形態の変更および同等物との置換も考えられる。ここでは特定の用語が用いられているが、かかる用語は説明を意図したものであって、限定しようとするものではない。
【０１３９】
例１：
この例は全長７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含むプラスミドベクターｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａの調製を示すものである。
全長７６ｋＤａタンパク質遺伝子を５’プライマー（5'ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGTTAATCCTATTGGTCCAGG3'）（配列番号９）および３’プライマー（5'GCGCCGGATCCCTTGGAGATAACCAGAATATAGAG3'）（配列番号１０）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、肺炎クラミジアゲノムＤＮＡから増幅した。５’プライマーはＮｏｔＩ制限部位、リボゾーム結合部位、開始コドン、および全長７６ｋＤａタンパク質コード配列の５’末端付近の配列を含む。３’プライマーは７６ｋＤａタンパク質のＣ末端配列をコードする配列およびＢａｍＨＩ制限部位を含む。停止コドンを除き、さらなるヌクレオチドを挿入してヒスチジンタグとのフレーム内融合物を得た。
増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット(Qiagen) を用いてＰＣＲ断片を精製し、その後ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下で転写する例２に記載のｐＣＡ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ真核生物発現ベクター（図４）へクローニングした。
【０１４０】
例２：
この例は真核生物発現ベクターｐＣＡ／Ｍｙｓ−Ｈｉｓの調製を示す。
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ(Invitrogen)をＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで制限処理してＣＭＶプロモーターを除去し、残りのベクター断片を単離した。プラスミドＶＲ−１０１２(Vical)由来のＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡをＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ断片上に単離した。これらの断片を連結してプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを作出した。全長７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含んだＰＣＲ断片をＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したものをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで制限処理したプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと連結してプラスミドｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａを作出した（図４）。
【０１４１】
得られたプラスミドｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａをエレクトロポレーションによって大腸菌ＸＬ−１ブルー(Stratagene)へトランスフェクトし、これを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地で増殖させた。プラスミドはエンド・フリー・プラスミド・ギガ・キット（商標）(Qiagen)大スケールＤＮＡ精製系によって単離した。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度で求め、ゲル電気泳動に付して臭化エチジウム染色し、分子量標準と比較してプラスミドを確認した。遺伝子の５’および３’末端はＬｉＣｏｒモデル４０００ＬＤＮＡシーケンサーおよびＩＲＤ−８００標識プライマーを用いた配列決定によって確認した。
【０１４２】
例３：
この例は肺炎クラミジアの鼻腔攻撃に対する防御を達成するためのマウスの免疫化を示す。
これまでに、マウスが肺炎クラミジアの種々の単離物による鼻腔内感染に感受性があることが示されている(Yang et al., 1993)。ＡＲ−３９株(Grayston, 1989)は、裸のＤＮＡとして送達されたクラミジア遺伝子産物の致死下の肺炎クラミジアの肺感染に対する防御応答を誘起する能力を調べるための抗原投与感染モデルとしてＢａｌ／ｃマウスにおいて用いた。防御免疫は肺感染の加速化されたクリアランスと定義される。
【０１４３】
７〜９週齢の雄Ｂａｌ／ｃマウス群（７〜１０匹／群）を例１および２に記載の肺炎クラミジア全長７６ｋＤａタンパク質のコード配列を含むプラスミドＤＮＡで筋肉内（ｉ．ｍ．）および鼻腔内（ｉ．ｎ．）感作させた。対照個体群には生理食塩水またはクラミジア遺伝子の挿入物を欠いたプラスミドベクターを与えた。
【０１４４】
ｉ．ｍ．感作では、０、３および６週の３回、ＰＢＳ５０μｌ中ＤＮＡ１００μｇを左、右の四頭筋に交互に注射した。ｉ．ｎ．感作では、０、３および６週の３回、ＤＮＡ５０μｇを含むＰＢＳ５０μｌを麻酔したマウスに吸入させた。８週目に、致死下の肺炎クラミジア抗原投与の増殖を制限する能力を試験するために、免疫化しマウスにＳＰＧバッファー１００μｌ中の肺炎クラミジアＡＲ３９株５×１０５ＩＦＵを鼻腔内接種した。
【０１４５】
抗原投与後５および９日目にマウスから肺を摘出し、直ちにＳＰＧバッファー（７．５％スクロース、５ｍＭグルタミン酸塩、１２．５ｍＭリン酸塩  ｐＨ７．５）中で本発明ホモジネートした。このホモジネートはアッセイまで−７０℃で凍結保存した。ホモジネート希釈物を感受性細胞の単層に接種することで感染性クラミジアの存在に関してアッセイした。この接種物を３０００ｒｐｍ１で１時間細胞上へ遠心分離した後、シクロヘキシミド１μｇ／ｍｌの存在下で３５℃にて３日間インキュベートした。単層のインキュベーション後、ホルマリンおよびメタノールで固定し、次ぎに肺炎クラミジアおよびペルオキシダーゼ基質として金属で増強したＤＡＢを感染させたウサギからの回復期血清を用いてクラミジア封入体の存在に対して免疫ペルオキシダーゼ染色した。
【０１４６】
図７および表１は、ｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａをｉ．ｎ．およびｉ．ｍ．感作させたマウスの肺のクラミジア力価が９日目で６例中５例で３０，０００ＩＦＵ／肺（平均２３，５５０）未満であり、一方、生理食塩水を感作させた偽性の対照マウスの値の範囲は２０，８００〜３２３，３００ＩＦＵ／肺（平均２０６，３７５）であった（表１）。他の２種のプラスミドＤＮＡ構築物のｐＣＡＣＰＮＭ８０６およびｐＣＡＣＰＮＭ７６０では防御できず、感作マウスの肺の力価は生理食塩水を感作させた対照マウスで得られたものと同等であったので、ＤＮＡの感作自体は認められた防御効果の一因ではなかった。構築物ｐＣＡＣＰＮＭ８０６およびｐＣＡＣＰＮＭ７６０は全長７６ｋＤａタンパク質をコードするヌクレオチド配列が関連のない配列をコードする肺炎クラミジアヌクレオチド配列に置換されていること以外はｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａと同一である。
【０１４７】
【表１】
0004695763.tif 000002
【０１４８】
例４：
この例は５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含むプラスミドベクターｐＣＡＩ５５５の調製を示すものである。
５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を５’プライマー（5'ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAGTCTGGCAGATAAGCTGGG3')（配列番号１１）および３’プライマー（5'GCGCCGGATCCCTTGGAGATAACCAGAATATA3'）（配列番号１２）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、肺炎クラミジアゲノムＤＮＡから増幅した。５’プライマーはＮｏｔＩ制限部位、リボゾーム結合部位、開始コドン、および７６ｋＤａタンパク質コード配列の２番目のＭｅｔコドンを含む。３’プライマーは３’７６ｋＤａタンパク質のＣ末端配列をコードする配列およびＢａｍＨＩ制限部位を含む。停止コドンを除き、さらなるヌクレオチドを挿入してヒスチジンタグとのフレーム内融合物を得た。
増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット(Qiagen) を用いてＰＣＲ断片を精製し、その後ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下で転写する例５に記載のｐＣＡ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ真核生物発現ベクター（図５）へクローニングした。
【０１４９】
例５：
この例は真核生物発現ベクターｐＣＡ／Ｍｙｓ−Ｈｉｓの調製を示す。
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ(Invitrogen)をＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで制限処理してＣＭＶプロモーターを除去し、残りのベクター断片を単離した。プラスミドＶＲ−１０１２(Vical)由来のＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡをＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ断片上に単離した。これらの断片を連結してプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを作出した。５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含んだＰＣＲ断片をＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したものをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで制限処理したプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと連結してプラスミドｐＣＡＩ５５５を作出した（図５）。
【０１５０】
得られたプラスミドｐＣＡＩ５５５をエレクトロポレーションによって大腸菌ＸＬ−１ブルー(Stratagene)へ導入し、これを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地で増殖させた。プラスミドはエンド・フリー・プラスミド・ギガ・キット（商標）(Qiagen)大スケールＤＮＡ精製系によって単離した。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度で求め、ゲル電気泳動に付して臭化エチジウム染色し、分子量標準と比較してプラスミドを確認した。遺伝子の５’および３’末端はＬｉＣｏｒモデル４０００Ｌ  ＤＮＡシーケンサーおよびＩＲＤ−８００標識プライマーを用いた配列決定によって確認した。
【０１５１】
例６：
この例は肺炎クラミジアの鼻腔攻撃に対する防御を達成するためのマウスの免疫化を示す。例４および５に記載されているように感作に用いるＤＮＡプラスミドが肺炎クラミジア５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質のコード配列を含んでいること以外は上記例３に記載されている。
【０１５２】
図８および表２は、ｐＣＡＩ５５５をｉ．ｎ．およびｉ．ｍ．感作させたマウスの肺のクラミジア力価が９日目で６例中６例で１３，０００ＩＦＵ／肺（平均６，０５０）未満であり、一方、生理食塩水を感作させた偽性の対照マウスの値は１０６，１００ＩＦＵ／肺（平均３９，６２５）であった（表２）。他の２種のプラスミドＤＮＡ構築物のｐＣＡＩ１１６およびｐＣＡＩ１７８では防御できず、感作マウスの肺の力価は生理食塩水を感作させた対照マウスで得られたものと同等であったので、ＤＮＡの感作自体は認められた防御効果の一因ではなかった。構築物ｐＣＡＩ１１６およびｐＣＡＩ１７８は５’末端切断型７６ｋＤａタンパク質をコードするヌクレオチド配列が防御性のない配列をコードする肺炎クラミジアヌクレオチド配列およびヌクレオシド５’二リン酸ホスホトランスフェラーゼタンパク質に置換されていること以外はｐＣＡＩ５５５と同一である。
【表２】
0004695763.tif 000003
【０１５３】
例７：
この例は３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含むプラスミドベクターｐＣＡＤ７６ｋＤａの調製を示すものである。
３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を５’プライマー（5'GCTCTAGACCGCCATGACAAAAAAACATTATGCTTGGG3'）（配列番号１３）および３’プライマー（5'CGGGATCCATAGAACTTGCTGCAGCGGG3'）（配列番号１４）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、肺炎クラミジアゲノムＤＮＡから増幅した。５’プライマーはＸｂａＩ制限部位、リボゾーム結合部位、開始コドン、および７６ｋＤａタンパク質コード配列の５’末端の上流の７６５ｂｐ配列を含む。３’プライマーは７６ｋＤａタンパク質のコドン４５２の下流の２１ｂｐ配列、およびＢａｍＨＩ制限部位を含む。さらなるヌクレオチドを挿入してヒスチジンタグとのフレーム内融合物を得た。ただし、７６５ｂｐ５’領域および２１ｂｐ３’領域を含んだことは意図的なものではない。これらの配列は７６ｋＤａタンパク質遺伝子の一部ではない。しかしながら、この配列を用いて免疫防御が達成された（例６）。
増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット(Qiagen) を用いてＰＣＲ断片を精製し、その後ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下で転写する例８に記載のｐＣＡ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ真核生物発現ベクター（図６）へクローニングした。
【０１５４】
例８：
この例は真核生物発現ベクターｐＣＡ／Ｍｙｓ−Ｈｉｓの調製を示す。
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ(Invitrogen)をＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで制限処理してＣＭＶプロモーターを除去し、残りのベクター断片を単離した。プラスミドＶＲ−１０１２(Vical)由来のＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡをＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ断片上に単離した。これらの断片を連結してプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを作出した。３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含んだＰＣＲ断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したものをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限処理したプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと連結してプラスミドｐＣＡＤ７６ｋＤａを作出した（図６）。
【０１５５】
得られたプラスミドｐＣＡＤ７６ｋＤａをエレクトロポレーションによって大腸菌ＸＬ−１ブルー(Stratagene)へ導入し、これを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地で増殖させた。プラスミドはエンド・フリー・プラスミド・ギガ・キット（商標）(Qiagen)大スケールＤＮＡ精製系によって単離した。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度で求め、ゲル電気泳動に付して臭化エチジウム染色し、分子量標準と比較してプラスミドを確認した。遺伝子の５’および３’末端はＬｉＣｏｒモデル４０００Ｌ  ＤＮＡシーケンサーおよびＩＲＤ−８００標識プライマーを用いた配列決定によって確認した。
【０１５６】
例９：
この例は肺炎クラミジアの鼻腔攻撃に対する防御を達成するためのマウスの免疫化を示す。例７および８に記載されているように感作に用いるＤＮＡプラスミドが肺炎クラミジア３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質のコード配列を含んでいること以外は上記例３に記載されている。
【０１５７】
図９および表３は、ｐＣＡＤ７６ｋＤａをｉ．ｎ．およびｉ．ｍ．感作させたマウスの肺のクラミジア力価が５例中５例で２，４００ＩＦＵ／肺未満であり、一方、生理食塩水を感作させた、または改変されていないベクターを感作させた偽性の対照マウスの値の範囲はそれぞれ１，８００〜２３，１００ＩＦＵ／肺（平均１１，８１１）、および１６，６００〜２６，１００ＩＦＵ／肺（平均２２，１００）であった（表２）。改変されていないベクターによっては防御が認められないことから、ＤＮＡ自体は認められた防御効果の一因ではないことが確認される。このことはさらに付加的なプラスミドＤＮＡ構築物では防御できず、その肺の平均力価が生理食塩水で感作された対照マウスで認められるものと同等であるという結果によって支持される。構築物ｐｄａｇＡは３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質をコードするヌクレオチド配列がタンパク質ｄａｇＡをコードする肺炎クラミジアヌクレオチド配列に置換されていること以外はｐＣＡＤ７６ｋＤａと同一である。
【０１５８】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  肺炎クラミジア由来の７６ｋＤａタンパク質遺伝子の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）および７６ｋＤａタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】  肺炎クラミジア７６ｋＤａタンパク質遺伝子の制限酵素解析を示す。
【図３】  肺炎クラミジア由来の３’末端切断型７６ｋＤａタンパク質遺伝子を含むヌクレオチド配列およびその対応する推定アミノ酸配列を示す（注：ヌクレオチド１〜６６５および２１２２〜２２３８は７６ｋＤａタンパク質遺伝子とは関連がない）。
【図４】    全長７６ｋＤａ遺伝子を含むプララスミドｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａの構成および構成要素を示す。
【図５】  ５’末端切断型の７６ｋＤａ遺伝子を含むプラスミドｐＣＡＩ５５５の構成および構成要素を示す。
【図６】  図３の３’末端切断型の７６ｋＤａ遺伝子を含むプラスミドｐＣＡＤ７６ｋＤａの構成および構成要素を示す。
【図７】  ＤＮＡ感作後のｐＣＡＣＰＮＭ５５５ａによる肺炎クラミジア感染に対する防御を示す。
【図８】  ＤＮＡ感作後のｐＣＡＩ５５５ａによる肺炎クラミジア感染に対する防御を示す。
【図９】  ＤＮＡ感作後のｐＣＡＤ７６ｋＤａによる肺炎クラミジア感染に対する防御を示す。図７〜９で、個々のデータ点は各動物についてのもの（白抜きの菱形）、ならびに各群の平均値および標準偏差（黒四角）を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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