(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親真菌クチナーゼの変異体であって、
（１）前記親クチナーゼが、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）DSM 1800株に由来し；そして
（２）前記変異体が、下記置換（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つ：
（ａ）A14P＋E47K；
（ｂ）E47K；
（ｃ）E179N/Q；
（ｄ）E6N/Q＋E47K＋R51P；
（ｅ）A14P＋E47K＋E179N/Q；
（ｆ）E6N/Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E179N/Q；又は
（ｇ）E6N/Q＋E10N/Q＋A14P＋E47K＋R51P＋E17N/Q、
を含み、且つ親クチナーゼより高い熱安定性を有する、
ことを特徴とする真菌クチナーゼの変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNA配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のDNA又は請求項３に記載のベクターを有する形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の変異体を生産する方法であって、
ａ）前記変異体を発現し、そして好ましくは分泌するように、請求項４に記載の細胞を培養し、そして
ｂ）該変異体を回収すること
を含む方法。
【請求項６】
ポリ（エチレンテレフタレート）の環式オリゴマーの酵素的加水分解のための方法であって、該環式オリゴマーを請求項１に記載のクチナーゼ変異体で処理することを含む方法。
【請求項７】
前記環式オリゴマーが環式トリ（エチレンテレフタレート）である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記処理が60〜80℃で、好ましくは65〜75℃で行われる請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記環式オリゴマーが、ポリエステル含有布帛又はヤーンの繊維中又はそれ上に存在する請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
続いて、前記布帛又はヤーンをゆすぐ、好ましくは約pH７〜約pH11の範囲のpHを有する水溶液でゆすぐことを更に含む請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリエステル布帛又はヤーンを染色するための方法であって、
ａ）該布帛又はヤーンを、請求項１に記載のクチナーゼ変異体で処理し；そして
ｂ）該処理した布帛を反応性染料又は分散染料で染色する；
ことを含む方法。
【請求項１２】
界面活性剤及び請求項１に記載の変異体を含む洗剤組成物。
【請求項１３】
PET含有ヤーン又は布帛の機能的仕上げを改良するための方法であって、
ａ）該ヤーン又は布帛を請求項１に記載の変異体で処理し、そして
ｂ）次に、該ヤーン又は布帛を、軟化剤、防しわ樹脂、静電防止剤、抗汚染（anti-soiling）剤からなる群から選択される仕上げ剤で処理する、
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、クチナーゼ変異体、より詳しくは改良された熱安定性を有するクチナーゼ変異体に関する。本発明は、その変異体をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むベクター、そのＤＮＡ配列又はベクターを有する形質転換された宿主細胞、その変異体を生産する方法、及びその変異体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
クチナーゼは、基質クチンを加水分解することができる脂肪分解酵素である。クチナーゼは種々の真菌から知られている（P.E. Kolattukudy in“Lipases”, Ed. B. Borg-Stroem and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471〜504)。フサリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）のクチナーゼのアミノ酸配列及び結晶構造は記載されている（S. Longhi et al., Journal of Molecular Biology, 268 (4), 779〜799 (1997)）。ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からのクチナーゼのアミノ酸配列も公開されている（ＵＳ  ５，８２７，７１９）。
【０００３】
フサリウム・ソラニ・ピシのクチナーゼのいくつかの変異体が公開されている：WO 94/14963; WO 94/14964; Appl. Environm. Microbiol. 64, 2794-2799, 1998; Proteins: Structure，Function and Genetics 26, 442-458, 1996; J. of Computational Chemistry 17, 1783-1803, 1996; Protein Engineering 6, 157-165, 1993; Proteins: Structure, Function, and Genetics 33, 253-264, 1998; J. of Biotechnology 66, 11-26, 1998; Biochemistry 35, 398-410, 1996。
【０００４】
真菌クチナーゼは、ポリ（エチレンテレフタレート）の環式オリゴマーの酵素的加水分解に、例えばポリ（エチレンテレフタレート）繊維からのヤーン又は布帛の仕上げに用いることができる（ＷＯ９７／２７２３７）。しかしながら、より高いプロセス温度を許容するために、知られた真菌クチナーゼの熱安定性を改善することが要求される。
【０００５】
発明の概要
本発明者らは、改良された熱安定性を有する真菌クチナーゼの特定の変異体を見い出した。
従って、本発明は、
ａ）（結晶構造におけるアミノ酸残基から計算して）Ｎ末端アミノ酸の位置から１７Å以内、及び／又は
ｂ）Ｎ末端アミノ酸から２０位置以内
に位置する１又は複数のアミノ酸残基の置換を含む親真菌クチナーゼの変異体を供する。
【０００６】
本発明はその変異体をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含む発現ベクター、そのＤＮＡ配列又は発現ベクターを有する形質転換された宿主細胞、その変異体を生産する方法、その変異体を用いる方法、及びその変異体を含む界面活性組成物も供する。
発明の詳細な記載
真菌クチナーゼ
親クチナーゼは真菌クチナーゼ、例えば糸状菌クチナーゼ、例えばヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）又はフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の株、特にＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）又はＦ．ソラニ・ピシ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）、より詳しくはＨ．インソレンス株ＤＳＭ１８００に対してネイティブであるものである。
【０００７】
Ｈ．インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列は、ＵＳ  ５，８２７，７１９の配列番号：２及び配列番号：１に示される。Ｈ．インソレンスクチナーゼのために本明細書に用いるナンバリングシステムは、前記配列番号：２に示す成熟ペプチドに基づく。
Ｆ．ソラニ・ピシのクチナーゼのアミノ酸配列は、ＷＯ９４／１４９６４の図１Ｄに成熟ペプチドとして示される。Ｆ．ソラニ・ピシクチナーゼのための本明細書で用いるナンバリングシステムは、ＷＯ９４／１４９６４に用いるものであり；それは、前記図１Ｄに示されるプロ配列を含み；これにより、成熟クチナーゼは位置１６〜２１４にある。
【０００８】
親クチナーゼは、Ｈ．インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼと、少くとも５０％（特に少くとも７０％又は少くとも８０％）、相同であるアミノ酸配列を有し得る。親クチナーゼは、特に、Ｈ．インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼと共にアラインすることができるものであり得る。
アミノ酸及び変化についての命名法
本明細書及び請求の範囲は、１文字コードでアミノ酸を示す。配列中の特定のアミノ酸はその１文字コード及びその位置により同定され、例えばＱ１は位置１、即ちＮ末端のＧｌｎ（グルタミン）を示す。
【０００９】
置換を定義するために本明細書に用いる命名法は、基本的にＷＯ９２／０５２４９に記載される。これによりＲ５１Ｐは、位置５１のＲ（Ａｒｇ）のＰ（Ｐｒｏ）での置換を示す。
相同性及びアラインメント
本発明の目的のため、相同性の程度は、適切には、ポリペプチド配列比較について次のセッティング：３．０のＧＡＰ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ及び０．１のＧＡＰ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙで、Needleman, S.B.及びWunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443〜45 に記載される方法に従って決定することができる。その決定は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, USA 53711）に供されるＧＡＰのような知られたコンピュータープログラムにより行うことができる。
【００１０】
２つの所定の配列は、同じパラメータを用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ（前掲）に記載される方法に従ってアラインすることができる。これは、ＧＡＰプログラム（前掲）によって行うことができる。
クチナーゼの３次元構造
Ｈ．インソレンスのクチナーゼの構造は、例えば、X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. and Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989 に供されるようなＸ線結晶学法についての原理に従って解いた。同形置換法を用いて２．２Å分解能で解いた結晶構造についての構造配置を標準的なＰＤＢフォーマット（Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT)で図１に示す。
【００１１】
Ｆ．ソラニ・ピシのクチナーゼの構造は、Martinezら（1992) Nature 356, 615〜618に記載される。Ｆ．ソラニ・ピシ及びＨ．インソレンスのクチナーゼの３Ｄ構造は、図２でコンピューターモデルとして比較される。
真菌のクチナーゼの全体の３次元構造は極めて類似しており、Ｘ線結晶学により高度に相同であることが示されていることに注目すべきである。Ｆ．ソラニ・ピシ及びＨ．インソレンスからのクチナーゼ間の類似性は、図２のコンピューターモデルから明白に明らかである。それゆえ、１つの真菌クチナーゼについて示される型の改変は、他の真菌クチナーゼについても機能的であろう。
【００１２】
Ｎ末端近くの置換
本発明の変異体は、Ｎ末端の近傍に１又は複数のアミノ酸置換を有する。その置換は、Ｎ末端の１７Åの距離以内（例えば１２Å以内）及び／又は２０位置以内（例えば１５位置以内）である。Ｎ末端からの距離は、そのアミノ酸のＣα原子間で計算されるべきであり、結晶構造内の（即ちＸ線構造で見える）アミノ酸から計算される。
【００１３】
Ｈ．インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼにおいて、２つのＮ末端アミノ酸（Ｑ１及びＬ２、即ち位置１及び２のＧｌｎ及びＬｅｕ）はＸ線構造において見えないので、その距離はアミノ酸Ｇ３から計算されるべきである。１７Å以内のアミノ酸は、位置３−１２，１８，２０−６０，６２−６４，８２，８５−８６，１００−１０８，１１０−１１１，１３０−１３２，１７４，１７６−１８２，１８４−１８５，１８８、及び１９２を含む。１２Å以内のものは、位置３−８，２２−２７，３０−４７，５３−５９，１０２，１７７、及び１８０−１８１を含む。
【００１４】
Ｆ．ソラニ・ピシのクチナーゼにおいて、Ｎ末端アミノ酸Ｇ１７はＸ線構造で見える。１７Å以内のアミノ酸は、位置１７−２６，３４−７５，７７−７９，１０１，１１５，１１７−１１９，１４７，１９１−１９７，１９９−２００、及び２０３を含む。１２Å以内のものは、位置１７−２２，３８，４０，４５−５８，６０，６５、及び７０−７２を含む。
【００１５】
本発明の変異体は、親酵素と比べて改良された熱安定性を有する。熱安定性は、例えば９０Ｋ／hrのスキャン速度でpH８．５で、例えば例に記載されるように、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）により変性温度から決定することができる。その変異体は、親酵素より少くとも５℃高い変性温度を有し得る。
上述の領域内の置換の総数は、上述の領域中、典型的には１〜１０、例えば１〜５の置換である。更に、本発明のクチナーゼ変異体は、任意に、他の親酵素の改変、例えば上述の領域の外側の１０又はそれ未満、例えば５又はそれ未満の変換（置換、欠失又は挿入）を含む。これにより、変異体の全体のアミノ酸配列は、親クチナーゼと比べて、典型的には１〜２０、例えば１〜１０の変換を含む。
【００１６】
溶媒がアクセス可能な表面
露出したアミノ酸残基、即ち溶媒にアクセス可能な表面を有するアミノ酸残基に１又は複数の置換を行うことができる。これは、W. Kabsch及びC. Sander, Biopolymers, 22 (1983) pp.2577〜2637に記載される“ｄｓｓｐ”プログラム（version October 1988）により計算することができる。
【００１７】
Ｈ．インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼにおいて、以下のアミノ酸がＮ末端のＧ３の１７Å以内にあり、０より大きい溶媒にアクセス可能な表面を有する：３−１２，１８，２６−３３，３６−３８，４０−４５，４７−５６，５９−６０，６２−６４，８２，８５−８６，１０４−１０５，１７４，１７６−１７９，１８１−１８２，１９２。
【００１８】
特定の置換
Ｎ末端近くの置換は、特に、電荷を増加させるもの、即ち負に荷電したアミノ酸の中性もしくは正に荷電したアミノ酸での置換又は中性アミノ酸の正に荷電したアミノ酸での置換であり得る。これにより、ヒュミコラ・インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼ中の位置Ｅ６，Ｅ１０，Ｅ３０，Ｅ４７，Ｄ６３，Ｅ８２及び／又はＥ１７９に対応する位置での負のアミノ酸残基は、中性又は正のアミノ酸、例えばＲ，Ｋ，Ｙ，Ｈ，Ｑ又はＮにより置換することができる。いくつかの特定の置換は、Ｅ６Ｑ／Ｎ，Ｅ１０Ｑ／Ｎ，Ｅ４７Ｋ／Ｒ又はＥ１７９Ｑ／Ｎに相当するものである。また、Ｈ．インソレンスクチナーゼ中のＮ７，Ｓ１１，Ｎ４４又はＮ５２に相当する位置の中性アミノ酸残基は、正のアミノ酸（Ｒ，Ｋ又はＨ）により置換することができる。
【００１９】
Ｎ末端近くの置換の別の例は、Ｐｒｏ残基での置換、例えばヒュミコラ・インソレンス株ＤＳＭ１８００のクチナーゼ中のＡ１４Ｐ又はＲ５１Ｐに対応する置換である。
特定の変異体
以下は、Ｈ．インソレンスクチナーゼにおける変異体のいくつかの例である。他の親クチナーゼに基づいて対応する変異体を作り出すことができる。
【００２０】
Ｒ５１Ｐ
Ｅ６Ｎ／Ｑ＋Ｌ１３８Ｉ
Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ
Ｅ４７Ｋ
Ｅ１７９Ｎ／Ｑ
Ｅ６Ｎ／Ｑ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐ
Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｅ１７９Ｎ／Ｑ
Ｅ４７Ｋ＋Ｅ１７９Ｎ／Ｑ
Ｅ４７Ｋ＋Ｄ６３Ｎ
Ｅ６Ｎ／Ｑ＋Ｅ１０Ｎ／Ｑ＋Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐ＋Ｅ１７９Ｎ／Ｑ
Ｅ６Ｎ／Ｑ＋Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐ＋Ｅ１７９Ｎ／Ｑ
Ｑ１Ｐ＋Ｌ２Ｖ＋Ｓ１１Ｃ＋Ｎ１５Ｔ＋Ｆ２４Ｙ＋Ｌ４６Ｉ＋Ｅ４７Ｋ
クチナーゼ変異体の使用
本発明のクチナーゼ変異体は、例えばポリ（エチレンテレフタレート）の環式オリゴマー、例えばｃ３ＥＴと略記される環式トリ（エチレンテレフタレート）の酵素的加水分解のために用いることができる。
【００２１】
特に、これは、ポリエステル含有布帛又はヤーンから、このような環式オリゴマーを、その布帛又はヤーンをクチナーゼ変異体で処理し、任意に次にその布帛又はヤーンを約pH７〜約pH１１の範囲のpHを有する水溶液でゆすぐことにより除去するために用いることができる。ポリエステルの処理は、便利には、ｃ３ＥＴのガラス転移温度（約５５℃）超、ポリエステルのガラス転移温度（約７０℃）未満で行われる。これにより、その処理は、好適には５０〜８０℃で、例えば６０〜７５℃で行うことができる。その過程はＷＯ９７／２７２３７と同様に行うことができる。
【００２２】
クチナーゼ変異体は、ポリエステル含有織物、例えばＰＥＴ（エチレングリコール及びテレフタル酸のポリマー）、Ｐ３ＧＴ（１，３−プロパンジオール及びテレフタル酸のポリマー）又はポリエステル／コットンブレンドを処理するために用いることができる。その処理は、ポリエステル織物に、例えばもち及び快適さを改良し、水透過性を増加させ、静電防止作用を減少させ、手ざわり及び柔らかさを改良し、再沈着特性を変化させ、及び／又は色を清澄化する利益を与え得る。
【００２３】
クチナーゼ変異体は、クチナーゼ変異体での処理、次の仕上げ剤、例えば軟化剤、抗しわ樹脂、静電防止剤、抗ソイリング剤、又はしわのない永久的なプレス又は耐火効果を与える剤での処理により、ＰＥＴ含有ヤーン又は布帛の機能的な仕上がりを改良するために用いることができる。クチナーゼでの処理は、その表面内の官能基の数を増加させることができ、これは、機能的な仕上げを付与するために用いることができる。仕上げ剤の例は、Ｎｉｈｏｎ  Ｓｅｎｉ  Ｓｅｎｔａａ  ＫＫにより１９９８年１０月１５日に公開された“ＳＥＮＳＨＯＫＵ  ＳＩＡＧＥＫＡＫＯ  ＢＥＮＲＡＮ”に記載される。
【００２４】
本発明のクチナーゼ変異体は、界面活性剤においても役立ち、ここではそれは、ＷＯ９４／０３５７８及びＷＯ９４／１４９６４に記載されるように脂肪汚れの除去を改良するために組み込むことができる。クチナーゼ変異体の洗濯界面活性剤への付加は、いくつかの洗浄／着用サイクルの間に蓄積された布地からの悪臭を減少させることができる。
【００２５】
クチナーゼ変異体は、ポリエステル、例えばポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−エチレングリコール−テレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ乳酸、ポリブチレンスクシネート、及びポリ（ヒドロキシ酪酸）−コ−（ヒドロキシ吉草酸）、例えばＪＰ−Ａ−５−３４４８９７に記載されるような、例えばフィルム及びボトルの分解及びリサイクルのためにも用いることができる。
【００２６】
クチナーゼ変異体は、リパーゼ及びクチナーゼの他の知られた適用のため、例えばベーキング工業（例えばＷＯ９４／０４０３５及びＥＰ  ５８５  ９８８に記載）において、製紙工業（例えばピッチ除去のため、ＥＰ  ３７４  ７００を参照のこと）において、及び革、ウール及び関連工業（例えば動物の皮、羊皮又はウールの脱脂のため）において、並びに脂肪（ｄｅｇｒｅａｓｉｎｇ）／脂肪（ｄｅｆａｔｔｉｎｇ）に関連する他の適用のためにも用いることができる。それは、有機合成（例えばエステル化、エステル交換反応又はエステル加水分解反応）における触媒として脂肪及び油工業において固定化された形態で用いることができる。
【００２７】
ポリエステルの染色
本発明は、ポリエステル布帛又はヤーンを染色するための方法を供する。この過程において、布帛又はヤーンは、最初に、クチナーゼで、例えば１２〜４８時間、５０〜７０℃で、又は６５〜７０℃、pH７〜１０で処理され、次に染料、例えば反応性染料、分散染料又はカチオン性染料で染色される。反応性染料は、ＯＨ又はＣＯＯＨ基と反応するもの、例えば構造：発色団−ＮＨＰｈ−ＳＯ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｎａを有するものであり得る。染色は、４０〜８０℃で、例えば２０〜６０分、行うことができる。
【００２８】
クチナーゼは、親クチナーゼより少くとも５°高い、例えば７〜１０°高いpH８．５での熱変性温度Ｔｄ、例えば６５℃又はそれ超の値を有するクチナーゼであり得る。その測定は、本明細書の実施例に記載されるようにＤＳＣによって行うことができる。
界面活性剤
布帛又はヤーンの処理において、酵素との接触を改良するために慣用的な湿潤剤及び／又は分散剤を用いることができる。湿潤剤は、非イオン性界面活性剤、例えばエトキシ化脂肪アルコールであり得る。極めて有用な湿潤剤は、エトキシ化及びプロポキシ化脂肪酸エステル、例えばＢｅｒｏｌ  ０８７（Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ，Ｓｗｅｄｅｎの製品）である。
【００２９】
分散剤は好適には、非イオン性、アニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性界面活性剤から選択することができる。より詳しくは、分散剤は、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルキルアリールスルホネート、長鎖アルコールスルフェート（一級及び二級アルキルスルフェート）、スルホン化オレフィン、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スルホスクシネート、スルホン化メチルエーテル、アルカンスルホネート、リン酸エステル、アルキルイソチオネート、アシルサルコシド、アルキルタウリド、フッ素界面活性剤、脂肪アルコール及びアルキルフェノール縮合物、脂肪酸縮合物、エチレンオキシドのアミンとの縮合物、エチレンオキシドのアミドとの縮合物、スクロースエステル、ソルビタンエステル、アルキロアミド、脂肪アミンオキシド、エトキシ化モノアミン、エトキシ化ジアミン、アルコールエトキシレート及びそれらの混合物から選択することができる。極めて有用な分散剤は、アルコールエトキシレート、例えばＢｅｒｏｌ  ０８（Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ，Ｓｗｅｄｅｎの製品）である。
【００３０】
クチナーゼ変異体を調製するための方法
本発明のクチナーゼ変異体は、例えばＷＯ９４／１４９６３又はＷＯ９４／１４９６４（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載されるように、当業界で知られた方法により調製することができる。以下に、クチナーゼコーディングＤＮＡ配列のクローニングのための方法、次にそのクチナーゼコーディング配列内の特定の部位で突然変異を作り出すための方法を記載する。
【００３１】
クチナーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親クチナーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界で公知の種々の方法を用いて、問題のクチナーゼを生産するいずれかの細胞又は微生物から単離することができる。最初に、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、研究すべきクチナーゼを生産する生物からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて作製されるべきである。次に、クチナーゼのアミノ酸配列が知られているなら、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、問題の生物から調製したゲノムライブラリーからクチナーゼコーディングクローンを同定するために用いることができる。あるいは、別の知られたクチナーゼ遺伝子と相同な標識化オリゴヌクレオチドプローブ含有配列は、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、クチナーゼコーディングクローンを同定するためにプローブとして用いることができよう。
【００３２】
クチナーゼコーディングクローンを同定するための更に別の方法は、ゲノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、クチナーゼ陰性細菌を得られたゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換し、そして次にその形質転換された細菌を、クチナーゼのための基質（即ちマルトース）を含む寒天にプレートし、それによりクローンに同定すべきクチナーゼを発現させることに関するであろう。
【００３３】
あるいはその酵素をコードするＤＮＡ配列は、確立されている標準的な方法、例えばS.L. Beaucage and M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p.1859〜1869に記載されるホスホロアミジト法、又はMatthesら、(1984), EMBO J. 3, p.801〜805に記載される方法により合成して調製することができる。ホスホロアミジト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニーリングし、連結し、そして好適なベクターにクローニングされる。
【００３４】
最後に、そのＤＮＡ配列は、標準的技術に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のフラグメント（好適には、全ＤＮＡ配列の種々の部分に対応するフラグメント）を連結することにより調製される、ゲノム及び合成起源の混合、合成及びｃＤＮＡ起源の混合、又はゲノム及びｃＤＮＡ起源の混合のものであり得る。そのＤＮＡ配列は、例えばＵＳ  ４，６８３，２０２又はR.K. Saikiら（1988), Science 239, 1988, pp.487〜491 に記載されるように、特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
【００３５】
部位特異的変異誘発
クチナーゼコーディングＤＮＡ配列を単離し、そして変異のための要求される部位を同定した後、合成オリゴヌクレオチドを用いて変異を同定した後、合成オリゴヌクレオチドを用いて変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、要求される部位に隣接したヌクレオチド配列を含む。特定の方法において、ＤＮＡの一本鎖ギャップ、クチナーゼコーディング配列を、クチナーゼ遺伝子を有するベクター内に作る。次に、要求される変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同な部分とアニーリングする。次に残りのギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）で満たし、その構成物をＴ４リガーゼを用いて連結する。この方法の特定の例はMorinagaら（1984), Biotechnology 2, p 646〜639に記載される。ＵＳ  ４，７６０，０２５はそのカセットの小さな変化を行うことによる、多重変異体をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、Ｍｏｒｉｎａｇａの方法により、いずれか一回で、更により多くの種々の変異を導入することができる。それは、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるからである。
【００３６】
クチナーゼコーディングＤＮＡ配列に変異を導入するための別の方法はNelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p.147〜151に記載される。それは、ＰＣＲ反応においてプライマーの１つとして化学的に合成したＤＮＡを用いることにより導入された要求される変異を含むＰＣＲフラグメントの３−ステップ生成に関する。ＰＣＲ生成フラグメントから、変異を有するＤＮＡフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼでの開裂により単離し、発現プラスミドに再挿入することができる。
【００３７】
クチナーゼ変異体の発現
本発明によれば、上述の方法により、又は当業界で知られたいずれかの別の方法により生産された変異体をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルをコードする調節配列、並びに任意に、レプレッサー遺伝子又は種々のアクティベーター遺伝子を含む発現ベクターを用いて、酵素形態で発現させることができる。
【００３８】
発現ベクター
本発明のクチナーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利にかりることができるいずれのベクターであってもよく、ベクターの選択は、しばしばそれが導入される宿主細胞に依存するであろう。ベクターは、宿主細胞に導入した時に、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが導入されている染色体と一緒に複製されるものであってよい。好適な発現ベクターの例にはｐＭＴ８３８がある。
【００３９】
プロモーター
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は好適なプロモーター配列に作用可能に結合されるべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すいずれのＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。
【００４０】
本発明のクチナーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を、特に細菌宿主において命令するための好適なプロモーターの例は、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガロース遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼのプロモーター（ａｍｙＱ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。真菌宿主内での転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼをコードする遺伝子から得られるもの、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター（Alber 5 (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, p.419〜434）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラチックプロティナーゼ、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニゲル酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニゲルグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、Ａ．オリザエアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニジュランスアセトアミダーゼである。
【００４１】
発現ベクター
本発明の発現ベクターは、好適な転写ターミネーター、及び真核生物においては本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能に結合したポリアデニル化配列も含み得る。ターミネーション及びポリアデニル化配列は、好適には、プロモーターと同じソースから得ることができる。
【００４２】
ベクターは、問題の宿主細胞内でベクターが複製するのを可能にするＤＮＡ配列を更に含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製の起点である。
ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞の欠損を補う遺伝子、例えばＢ．サブチリス又はＢ．リケニホルミスからのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロランフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるものも含み得る。更に、ベクターは、アスペルギルス選択マーカー、例えばａｍｄＳ，ａｒｇＢ，ｎｉａＤ及びｓＣ、ヒグロマイシン耐性を与えるマーカーを含み得、又は選択は、例えばＷＯ９１／１７２４３に記載されるように同時形質転換によって行うことができる。
【００４３】
クチナーゼ変異体をコードする本発明のＤＮＡ構成物、プロモーター、ターミネーター及び他の要素を各々連結するため、並びに複製のために必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために用いる手順は当業者に公知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989)。
【００４４】
宿主細胞
先に定義した本発明のＤＮＡ構成物又は発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、有利には、本発明のクチナーゼ変異体の組換え生産において宿主細胞として用いられる。その細胞は、便利にはそのＤＮＡ構成物を（１又は複数のコピーにおいて）宿主染色体に組み込むことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構成物で形質転換することができる。この組込みは、そのＤＮＡ配列は細胞内でより安定に維持されるので一般に有利であると考えられる。ＤＮＡ構成物の宿主染色体への組込みは、慣用的な方法に従って、例えば相同的又は非相同的組換えにより行うことができる。あるいは、細胞は、異なる型の宿主細胞とあわせて上述のように発現ベクターで形質転換することができる。
【００４５】
本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳動物又は昆虫の細胞であってよいが、好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は（イーストを含む）真菌細胞である。
好適な細菌の例は、グラム陽性細菌、例えば、Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bachillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis、又はStreptomyces lividansもしくはStreptomyces murinus 、又はグラム陰性細菌、例えばE. coli である。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により、又はそれ自体、知られた方法でコンピテント細胞を用いることにより行うことができる。
【００４６】
イースト生物は、好ましくは、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はスキゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択することができる。
宿主細胞は、糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に属する株、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、又はフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の株、例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（完全状態でＧｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ、以前はＳｐｈａｅｒｉａ  ｚｅａｅと呼ばれ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｒｏｓｅｕｍ及びＧｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｒｏｓｅｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｅｒｅａｌｉｓと同義）、又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ（完全状態でＧｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｐｕｒｉｃａｒｉｓと呼ばれ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｃｌｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍと同義）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｋｋｗｅｌｌｎｓｅと同義）、又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍであってもよい。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞はプロテアーゼ欠損又はプロテアーゼマイナス株である。
これは、例えば、“ａｌｐ”欠損と呼ぶアルカリプロテアーゼ遺伝子を有するプロテアーゼ欠損株アスペルギルス・オリザエＪａＬ１２５であり得る。この株は、ＷＯ９７／３５９５６（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）に記載される。
【００４８】
糸状菌細胞は、それ自体知られた方法で、プロトプラスト形成及びそのプロトプラストの形質転換、次の細胞壁の再生に関する方法によって形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用はＥＰ  ２３８  ０２３（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）に記載される。その内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
形質転換体の培養によるクチナーゼ変異体の生産
本発明は、とりわけ、本発明のクチナーゼ変異体を生産する方法であって、その変異体の生産に資する条件下で宿主細胞を培養し、そしてその細胞及び／又は培養培地からその変異体を回収することを含む方法に関する。
細胞を培養するために用いる培地は、問題の宿主細胞を増殖させ、本発明のクチナーゼ変異体の発現を得るために適したいずれかの慣用的な培地であってもよい。好適な培地は、商業的供給元から利用でき、又は公開されている方法に従って（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載される通り）調製することができる。
【００５０】
宿主細胞から分泌されたクチナーゼ変異体は、便利には、公知の手順、例えば遠心又はろ過により培地から細胞を分離し、そして硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質成分を沈殿させ、次にクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いることにより、培養培地から回収することができる。
【００５１】
植物における変異体の発現
本発明は、回収できる量でこの酵素を発現し、生産するように、本発明の変異体をコードするＤＮＡ配列で形質転換されているトランスジェニック植物、植物の部分又は植物細胞にも関する。その酵素は、植物又は植物の部分から回収することができる。あるいは、その組換え酵素を含む植物又は植物の部分をそれ自体、用いることができる。
【００５２】
トランスジェニック植物は、双子葉植物でも単子葉植物でも、略してｄｉｃｏｔでもｍｏｎｏｃｏｔでもよい。単子葉植物の例は、草、例えばイチゴツナギ（ｍｅａｄｏｗ  ｇｒａｓｓ）（ブルーグラス、Ｐｏａ）、飼料草、例えばフェスキマ（ｆｅｓｔｕｃａ）、ライグラス（ｌｏｌｉｕｍ）、温帯草、例えばＡｇｒｏｓｔｉｓ及び穀物、例えばコムギ、オート、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ類及びトウモロコシ（コーン）である。
【００５３】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ類、例えばルピナス、ポテト、シュガービート、エンドウ、マメ及びダイズ、並びにアブラナ類（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ科）、例えばカリフラワー、脂肪種子ナタネ及びそれに密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【００５４】
植物の部分の例は、幹、カルス、葉、根、果実、種子及び塊茎である。本文脈において、特定の植物の組織、例えばクロロプラスト、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム及び細胞質も植物の部分と考えられる。更に、組織起源である限り、いずれの植物細胞も植物の部分であると考えられる。
これらの植物、植物の部分及び植物細胞の子孫も本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
本発明の変異体を発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界で知られた方法に従って作製することができる。要約すると、植物又は植物細胞は、本発明の酵素をコードする１又は複数の発現構成物を植物宿主ゲノムに組み込み、そして得られた改変された植物又は植物種子をトランスジェニック植物又は植物細胞に伝播することにより作製される。
【００５６】
便利には、発現構成物は、選択された植物又は植物の部分において遺伝子の発現のために要求される好適な調節配列と作用可能な関係で本発明の酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ構成物である。更に、発現構成物は、その発現構成物が組み込まれている宿主細胞を同定するために役立つ選択マーカー、及び問題の植物へのその構成物の導入のために必要なＤＮＡ配列を同定するために役立つ選択マーカーを含み得る（後者は用いるＤＮＡ導入法に依存する）。
【００５７】
調節配列、例えばプロモーター及びターミネーター配列並びにシグナル又はトランジット配列の選択は、例えば、いつ、どこでそしていかにして酵素の発現が要求されるかに基づく。例えば、本発明の酵素をコードする遺伝子の発現は、構成的であっても誘導性であってもよく、又は発達段階もしくは組織特異的であってもよく、その遺伝子産物は、特定の組織もしくは植物の部分、例えば種子もしくは葉を標的にすることができる。調節配列は、例えばTagueら、Plant, Phys, 86, 506, 1988 に記載される。
【００５８】
構成的発現のため、３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターを用いることができる（Franckら、1980, Cell 21 : 285〜294）。器官特異的プロモーターは、貯蔵シンク器官、例えば種子、ポテト塊茎及び果実から（Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24 : 275〜303）、もしくは代謝シンク組織、例えば分裂組織から（Ｉｔｏら、1994, plant Mol. Biol. 24 : 863〜878）のプロモーター、種子特異的プロモーター、例えばコメからのゼラチン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Ｗｕら、Plant and Cell Physiology Vol. 39, No.8 pp.885〜889 (1998)）、レグミンＢ４からのＶｉｃｉａ  ｆａｂａプロモーター及びConrad U. らJournal of Plant Physiology Vol. 152, No.6 pp.708〜711 (1998) に記載されるＶｉｃｉａ  ｆａｂａからの未知の種子タンパク質遺伝子、種子油体タンパク質からのプロモーター（Chenら、Plant and cell physiology vol. 39, No.9 pp.935〜941 (1998), Brassica napusからの貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモーター、又は例えばＷＯ９１／１４７７２に記載されるような当業界で知られたいずれかの他の種子特異的プロモーターであり得る。更に、プロモーターは、葉特異的プロモーター、例えばコメ又はトマトからのｒｂｃｓプロモーター（Kyozukaら、Plant Physiology Vol. 102, No.3 pp.991〜1000 (1993)) 、コレラウィルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra, A及びHiggins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No.1, pp.85〜93 (1994)）、又はコメからのａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Kagayaら、Molecular and General Genetics Vol. 248, No 6 pp.668〜674 (1995)）、又は創傷誘導性プロモーター、例えばポテトｐｉｎ２プロモーター（Ｘｕら、Plant Molecular Biology Vol. 22, No.4 pp.573〜588 (1993)）であり得る。
【００５９】
植物において酵素のより高い発現を行うためにプロモーターエンハンサー要求を用いることができる。例えば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと酵素をコードするヌクレオチド配列との間におかれたイントロンであり得る。例えば、Ｘｕら（前掲）は、発現を増強するためのコメアクチン１遺伝子の最初のイントロンの使用を開示する。
【００６０】
選択マーカー遺伝子及びいずれかの他の発現構成物の部分は、当業界で利用できるものから選択することができる。
ＤＮＡ構成物は、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウィルス媒介形質転換、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換、及びエレクトロポレーションを含む、当業界で知られた慣用的な技術に従って植物ゲノムに組み込まれる（Gasserら、Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamotoら、Nature, 338, 274, 1989）。
【００６１】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝子転移は、トランスジェニック双子葉植物を作り出すために選択される方法である（報告について、Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19 : 15〜38）が、それは、単子葉植物を形質転換するためにも用いることができる。但し、他の形質転換法がこれらの植物のために一般的に好ましい。現在、トランスジェニック単子葉植物を作り出すための選択される方法は、胚カルス又は発達中の胚のパーティクルボンバードメント（形質転換するＤＮＡでコーティングされた微細な金又はタングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant J. 2 : 275〜281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5 : 158〜162; Vasil ら、1992, Bio/Technology 10 : 667〜674）。単子葉植物の形質転換のための別の方法は、Omirulleh Sら；Plant Molecular biology Vol. 21, No.3 pp.415〜428 (1993)に記載されるようなプロトプラスト形質転換に基づく。
【００６２】
形質転換の後、組み込まれた発現構成物を有する形質転換体が選択され、当業界で公知の方法に従って完全な植物に再生される。
材料及び方法
プラスミド
ｐＪＳＯ０２６
これは、ＷＯ９７／０７２０５、及びJ.S. Okkels, (1996)“A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae”, Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences)に記載されるＳ．セレビシアエ発現プラスミドである。
【００６３】
ｐＦｕｋｕ８３
これは、ｐＪＳＯ０２６から作製された、ＴＰＩプロモーターの制御下でのＨ．インソレンスクチナーゼの発現のためのイースト及び大腸菌シャトルベクターである。
基質
ＢＥＴＥＢ
テレフタル酸ビス（２−ヒドロキシエチル）エステルジベンゾエートは本明細書においてＢＥＴＥＢ（ベンゾイル−エチレン−テレフタリック−エチレン−ベンゾエート）と略記する。それは、テレフタル酸ビス（２−ヒドロキシエチル）エステル及び安息香酸から調製した。
【００６４】
リパーゼ活性（ＬＵ）
リパーゼのための基質は、乳化剤としてアラビアゴムを用いて、トリブチリン（グリセリントリブチレート）を乳化することにより調製する。pH７で３０℃でのトリブチリンの加水分解の後、pH−ｓｔａｔタイトレーション実験を行った。リパーゼ活性の１ユニット（１LU）は、標準条件で１分当りに１μmol の酪酸を放出することができる酵素の量に等しい。
【００６５】
示差走査熱量測定
サンプル及び標準溶液を、熱量計へのサンプルの充填の直前に注意深く脱気する（標準：酵素を含まない緩衝液）。サンプル及び標準溶液（約０．５mL）を２０分、５℃で熱的に予め平衡化させる。ＤＳＣスキャンを、５℃〜９５℃で、約９０Ｋ／hrのスキャン速度で行う。変性温度を、約＋／−１℃の精度で測定する。ＭｉｃｒｏＣａｌ  ｔａｃ．からのＶＰ−ＤＳＣが本実験のために好適である。
【００６６】
方法
ＰＣＲ条件
ステップ１：９４℃、１２０秒
ステップ２：９４℃、６０秒
ステップ３：５０℃、６０秒
ステップ４：７２℃、１５０秒
ステップ２にいく、３５サイクル
ステップ５：７２℃、４８０秒
ステップ６：  ４℃、永久に
実施例
実施例１：クチナーゼ変異体の調製
Ｈ．インソレンスをコードするＤＮＡ配列は、ＵＳ  ５，８２７，７１９（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）に記載されるように得て、配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有することが見い出された。
【００６７】
変異体を、局所化ランダム変異誘発、及びＢＥＴＥＢプレート上で１日、６０℃でのインキュベーションによる陽性クローンの選択により調製した。ＢＥＴＥＢプレートは、２００mL／Ｌの５００mMグリシン緩衝液（pH８．５）、１．２５ｇ／ＬのＢＥＴＥＢ（熱いエタノールに溶解）及び２０ｇ／Ｌの寒天を含んだ。
３つの陽性変異体を単離し、それらのアミノ酸配列を決定した。それらは親Ｈ．インソレンスクチナーゼと比べて以下の改変を有することが見い出された：
Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ
Ｅ４７Ｋ
Ｅ１７９Ｑ
実施例２：部位特異的変異誘発
置換：Ｅ６Ｑ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐを有するＨ．インソレンスクチナーゼの変異体は以下の通り調製した：
一対のＰＣＲプライマーを、以下の通り、近くの存在する制限酵素を利用して、アミノ酸置換を導入するためにデザインした（アスタリスクは導入された変異を示す）。
【００６８】
上流プライマー：Ｅ６ＱＦ
cgg cag ctg gga gcc atc c*ag aac
Pvu II
下流プライマー：Ｅ４７Ｋ，Ｒ５１Ｐ
cgc cct gga tcc aga tgt tcg* gga tgt ggg act t*aa ggc
BamH I
ＰＣＲは、これらのプライマー及びテンプレートとしてｐＦｕｋｕＮＬ８３を用いて、上述のＰＣＲ条件下で行った。
【００６９】
得られたＰＣＲフラグメントを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｓｐｉｎｃｏｌｕｍにより精製し、ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで消化した。
得られたフラグメントをゲルで精製し、同じ制限酵素部位で消化した、ｐＦｕｋｕＮＬ８３に連結した。
実施例３：クチナーゼ変異体の熱安定性
変異体
Ｈ．インソレンスクチナーゼ及びその以下の変異体について以下に記載の通り熱安定性をテストした：
（ａ）  Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ
（ｂ）  Ｅ４７Ｋ
（ｃ）  Ｅ１７９Ｑ
（ｄ）  Ｅ６Ｑ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐ
（ｅ）  Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｅ１７９Ｑ
（ｆ）  Ｅ６Ｑ＋Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐ＋Ｅ１７９Ｑ
（ｇ）  Ｅ６Ｑ＋Ｅ１０Ｑ＋Ａ１４Ｐ＋Ｅ４７Ｋ＋Ｒ５１Ｐ＋Ｅ１７９Ｑ
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
クチナーゼ変異体の熱安定性を、pH４．５（５０mM酢酸緩衝液）及びpH８．５（５０mMグリシルグリシン緩衝液）でＤＳＣにより研究した。熱変性温度Ｔｄは、一定のプログラムされた加熱速度での酵素溶液の加熱の後に得られたサーモグラム（Ｃｐ  ｖｓ．Ｔ）における変性ピーク（主要な吸熱ピーク）の頂点として得た。
【００７０】
親クチナーゼはpH８．５で６３℃のＴｄを有することが見い出された。上述の変異体のうちの６つが７０〜７３℃のＴｄ、即ち７〜１０°の改良を有することが見い出された。
親クチナーゼはpH４．５で６１℃のＴｄを有することが見い出された。上述の変異体のうち５つが６４〜６６℃のＴｄ、即ち３〜５°の改良を有することが見い出された。
【００７１】
ＢＥＴＥＢの加水分解
Ｈ．インソレンスクチナーゼ及び上述の変異体のうちの２つの熱安定性を、上昇温度でＢＥＴＥＢの加水分解により測定した。各々のクチナーゼについて、以下の混合物を５５〜７０℃の範囲で種々の温度で１７時間、インキュベートした。
【００７２】
０．１mL  ０．５Ｍグリシルグリシン緩衝液（pH８．５）
０．１mL  ０．５％  ＢＥＴＥＢ（エタノールに溶解）
０．１mL  酵素溶液（約２５LU／mL）
０．７mL  ＭｉｌｌｉＱ水
加水分解の程度を、インキュベーションの後に測定した。結果を以下の表に示す。
【００７３】
【表１】
0004615723.tif 000002
【００７４】
これらの結果は、変異体が親クチナーゼと比べて改良された熱安定性を有することを示す。
ＢＥＴＥＢの加水分解
Ｈ．インソレンスクチナーゼ及び上述の変異体のうちの３つの熱安定性を、２時間、６０℃でＢＥＴＥＢの加水分解により測定した。加水分解は、温度を６０℃に固定し、クチナーゼ投与量を変化させたことを除いて上述の条件で行った。この結果を以下の表１に示す。
【００７５】
【表２】
0004615723.tif 000003
【００７６】
結果は、親クチナーゼより変異体でかなり迅速な６０℃での加水分解を示す。
実施例４：ｃ３ＥＴの加水分解
Ｈ．インソレンスクチナーゼ及び上述の変異体のうちの５つを、上昇温度でｃ３ＥＴの加水分解においてテストした。各々のクチナーゼについて、以下の混合物を種々の温度で２時間、インキュベートした。
【００７７】
０．１１５mg  ｃ３ＥＴ（ＨＦＩＰに溶かした２mM  ｃ３ＥＴ  ０．１mLを反応容器にとった。真空下で溶媒を除去し、次に７０℃で一晩、乾燥させた。）
０．１mL  ０．５Ｍグリシル−グリシン緩衝液（pH８．５）
０．１mL  酵素溶液（約６００LU／mL）
０．８mL  ＭｉｌｌｉＱ水
インキュベーションの後、２mLの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）を各々の反応混合物に加え、次に加水分解率をＨＰＬＣにより測定した。図３に示す結果は、変異体が親クチナーゼと比べて改良された熱安定性を有することを明らかに示す。
【００７８】
実施例５：ヤーン上でのｃ３ＥＴの加水分解
Ｈ．インソレンスクチナーゼ及び上述の変異体のうちの５つの熱安定性を、製品としてｃ３ＥＴを含むポリエステルヤーンを用いてテストした。以下の基質混合物を６０又は６５℃でプレインキュベートした：
０．１ｇ  ポリエステルヤーン
０．２mL  ０．５Ｍグリシル−グリシン緩衝液（pH８．５）
１．７mL  ＭｉｌｌｉＱ水
プレインキュベーションの後、０．１mLの酵素溶液（約１０００LU／mL）を各々の反応容器に加え、１７時間、インキュベートした。次に、２mLのＨＦＩＰを加え、３０分放置して、ポリエステルヤーンの表面上にあるｃ３ＥＴを抽出し、加水分解させ；次にその加水分解比を測定した。結果を図４に示す。
【００７９】
変異体はポリエステルヤーン上のｃ３ＥＴを加水分解するため親クチナーゼより有効である。１つの変異体は６０℃でより６５℃でより高い加水分解率を示す。
実施例６：クチナーゼ変異体でのヤーンの処理
異なる温度又は投与量でのポリエステルヤーン上でのｃ３ＥＴ加水分解の時間経過を検査した。異なる温度での時間経過を図５に示す。至適温度が６５℃であることがわかる。７０℃において、その活性の約半分がまだ残っている。酵素投与量の増加を伴う時間経過を図６に示す。投与量２７５及び５５０LU／mLでの曲線は、同じであるように見え、このことは、加水分解率は１００〜２７５LU／mLの投与量の間で安定状態に達することを示す。おそらく２００LU／mLが十分である。
【００８０】
実施例７：反応性染料でのポリエステルの染色
以下のポリエステル布帛をテストした：
織布：約２×２cm、３４mg
メリヤス：約１．５×１．５cm、５０mg
各々の布帛を０．９mLの５０mM  ＧｌｙＧｌｙ（グリシル−グリシン）緩衝液（pH８．５）及びＨ．インソレンスクチナーゼの変異体の０．１mL溶液（１１００LU／mL）に加え、６５又は７０℃でインキュベートした。１日後に、別の０．１mL酵素溶液を加え、インキュベーションを更に２日間、続け、次に布帛をとり、水でゆすいだ。親クチナーゼで比較実験を行い、ブランクは酵素なしで同様に処理した。
【００８１】
それら布帛を６０℃で３０分、３リッターの脱イオン水中９ｇ及び１２０ｇのＮａ2 ＳＯ4 並びに６０ｇのＮａ2 ＣＯ3 の混合物中で撹拌し、次に温水を流しながらゆすいだ。反応性染料はＣｅｌｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｂ（Mitsui Chemical Co, Japan の製品）であり、それは、構造：発色団−ＮＨＰｈ−ＳＯ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｎａを有する。
【００８２】
全ての４つの実験（織布及びメリヤス、６５及び７０℃）によって、布帛は均一に染色された。
実施例８：編織物（Ｋｎｉｔｔｅｄ  ｔｅｘｔｉｌｅ）からのポリエステル断片の可溶化
編まれたポリエステル織物（ＰＥＴ、エチレングリコール及びテレフタル酸）の１×１cmサンプルを、０．０１mgのＨ．インソレンスクチナーゼの変異体と共にpH１０、６０℃で１mLの緩衝液中で１時間、インキュベートした。その反応混合物を分離し、テレフタル酸の放出を、２５０nmでのＯＤ（ＯＤ250 ／mg  ＰＥＴとして表す）を測定することにより見い出した。比較実験は、酵素なし又は親クチナーゼで行った。結果：
【００８３】
【表３】
0004615723.tif 000004
【００８４】
結果は、変異体がポリエステルを可溶化するのに有効であることを示す。
別の実験形態において、クチナーゼ変異体を６５℃で２時間、０．５〜２００LU／mLの種々の量の変異体を用いて、非イオン性界面活性剤（アルコールエトキシレート、製品名Ｓｏｆｔａｎｏｌ  ５０）の添加あり及びなしでテストした。結果は、非イオン性界面活性剤の存在下でより可溶化することを示した。
【００８５】
実施例９：ポリカプロラクトン及びポリエステルフィルムの加水分解
約０．１ｇのポリカプロラクトン又はポリエステルフィルムをチューブに入れた。それらをＨ．インソレンスクチナーゼ（４５０LU）あり又はなしで５mLの５０mM  ＧｌｙＧｌｙ緩衝液（pH８．５）に浸漬した。それらを７０℃で５時間、インキュベートした。その反応の後、我々は、ポリカプロラクトン及びポリエステルフィルムの両方で、酵素でのチューブの表面上の加水分解物の薄層を観察した。他方、酵素なしの対照では変化は観察されなかった。ポリカプロラクトンの場合、１０重量％の損失があった。ポリエステルの重量変化はなかった。
【００８６】
実施例１０：ｃＰＥＴ加水分解
クチナーゼ変異体の能力を、親酵素（Ｈ．インソレンスクチナーゼ）と比較した。試験は次の通り行った：
（ブラック）ＰＥＴ−布帛（約４cm×１３cm）のオリゴマーで染色したスワッチを、いわゆるミニタージトメーター（ｍｉｎｉｔｅｒｇｉｔｏｍｅｔｅｒ）装置において比較的低い撹拌での酵素処理にかける。ＰＥＴ−布帛を、円柱状穿孔ホルダー（半径約２cm、高さ約６cm）にマウントする。それはその軸上を回転し、ＰＥＴ布帛のオリゴマー染色側がその円柱の外側に面する。
【００８７】
布帛を所定の温度（ここでは６５℃）で１００mLの処理溶液を含む１５０mLガラスビーカーに浸漬する。所定の処理時間（ここでは９０分）の後、ＰＥＴスワッチをその浴から除去し、脱イオン水でゆすぎ、空気乾燥させる。
コンディショニングの後、そのスワッチを、オリゴマー染色を有する側上の（オリゴマー染色除去に関して）視覚的にランク付けする。
【００８８】
−２：ブランクよりかなり悪いサンプル（酵素なし）
−１：ブランクより少し悪いサンプル（酵素なし）
０：サンプルはブランクと区別できない
１：ブランクに対して少し改善されたサンプル
２：ブランクよりかなり改善されたサンプル
また、スワッチを、色の強さ（６００nmにおけるＫ／Ｓ値）を定量するために分光光度測定（装置：Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ  Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｅｒ）により読んだ。
【００８９】
以下の表は、同様の条件下で酵素の能力を比較する試験についてのテスト条件を要約する。
温度                        ６５℃
緩衝液                      ５０mMグリシン緩衝液、pH１０．３
処理時間（分）              ９０
酵素の投与量（LU／ｇ）      ３００００
試験からの結果を以下に要約する。
【００９０】
【表４】
0004615723.tif 000005
【００９１】
この実験のセットから、親酵素は所定のテスト条件で効果がないか又は極めて限られた効果しか示さない（おそらく酵素が活性を保持するのに温度が高すぎるため）のに対し、クチナーゼ変異体はＰＥＴ−布帛からオリゴマー染色の実質的な除去を供することが明らかである。
実施例１１：ｃＰＥＴ加水分解
Ｈ．インソレンスクチナーゼのpH及び温度プロフィールを、モデル分散性染色実験においてテストした。その試験は以下の通り行った：
（ブラック）ＰＥＴ−布帛のオリゴマー染色スワッチをＷｅｒｎｅｒ  Ｍａｔｈｉｓ  Ｌａｂｏｍａｔにおいて典型的な分散染色配列の条件に加える。その方法の概略において、スワッチは、緩衝液に加えられ、１３０℃に加熱され、処理温度に冷却される。酵素又は緩衝液が加えられ、次に３０分、要求される温度に保持される。その溶液を室温に冷やし、洗浄液中での濁度を測定する。濁度の減少はクチナーゼ活性の直接的基準であり、加水分解されたｃＰＥＴオリゴマーに相当する。
【００９２】
実験の詳細な記載
黒色のＰＥＴ（約４cm×１３cm）スワッチを、０．２ｇ／ＬのＬｕｔｅｎｓｏｌ  ＡＴ１１（ＢＡＳＦ）を含む１４０mLの１００mM  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に加え、Ｌａｂｏｍａｔ（分当り３２回転）に充填する。
Ｌａｂｏｍａｔを９℃／分の勾配で１３０℃に加熱し、１０分、維持する。
【００９３】
ビーカーを（以下の表に従う）ラン温度に、９℃／分の勾配で冷やし、１分、維持する。
好適なpHの１０mL酵素溶液（１００LU／mLの変異体）又は緩衝液（０LU／mL）をそのビーカーに注入する。
Ｌａｂｏｍａｔを２℃／分の勾配で温度に再加熱し、そして３０分、維持する。
【００９４】
スワッチを除去し、その洗浄液を室温に冷やす。
洗浄液の濁度を測定する。
評価：濁度は、Ｈａｃｈ  １８９００  Ｒａｔｉｏ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒで測定した（１．８，１８、及び１８０ＮＴＵ濁度標準で標準化）。酵素の能力を、ブランク液（酵素なし）の濁度と酵素処理した液体の濁度との間の差としてブランクに対して計算した。
【００９５】
クチナーゼ変異体の相対的能力（濁度の減少）を計算し、その結果を以下の表に示す。負の数字が得られた時、結果を“ネガティブ”として供する。負の数字は、セット・アップのバリエーションにより引きおこされる、アーティファクトと仮定する。
【００９６】
【表５】
0004615723.tif 000006
【００９７】
結果は、クチナーゼ変異体は、pH９及び７５℃周囲のセット・アップでの至適オリゴマー除去で、広いpH及び温度範囲にわたって活性であることを示す。
実施例１２：ｃＰＥＴ加水分解
処理時間の効果を、モデル分散性染色実験においてＨ．インソレンスクチナーゼについて研究した。試験は以下の通り行った：
（ブラック）ＰＥＴ−布帛のオリゴマー染色スワッチを、Ｗｅｒｎｅｒ  Ｍａｔｈｉｓ  Ｌａｂｏｍａｔにおける典型的な分散染色配列の条件にかける。その方法の概略において、スワッチは、緩衝液に添加され、１３０℃に加熱され、処理温度に冷却される。酵素又は緩衝液（１００mM  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  pH９）を加え、次に０〜４０分、７５℃に維持する。その溶液を室温に冷やし、洗浄液の濁度を測定する。濁度の減少は、クチナーゼ活性の直接的基準であり、加水分解されたｃＰＥＴオリゴマーに相当する。
【００９８】
実験の詳細な記載
黒いＰＥＴ（約４cm×１３cm）スワッチを、０．２ｇ／Ｌ  Ｌｕｔｅｎｓｏｌ  ＡＴ１１（ＢＡＳＦ）を含む１４０mLの１００mM  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に加え、Ｌａｍｂｏｍａｔに充填する（分当り３２回転）。
Ｌａｂｏｍａｔを９℃／分の勾配で１３０℃に加熱し、その温度を１０分、保持する。
【００９９】
そのビーカーを７５℃に、９℃／分の勾配で冷却し、そして１分、保持する。
１０mLの酵素溶液（１００LU／mLの変異体）又は１００mMのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液pH９．０（０LU／mL）をそのビーカーに注入する。
そのＬａｂｏｍａｔを、７５℃に、２℃／分の勾配で再加熱し、好適な分（０〜４０分、以下の表を参照のこと）、保持する。
【０１００】
スワッチを除去し、その洗浄液を室温に冷やす。
洗浄液の濁度を測定する。
評価：濁度をＨａｃｈ  １８９００  Ｒａｔｉｏ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒで測定する（１．８，１８、及び１８０ＮＴＵ濁度標準で標準化）。酵素能力を、０に等しい時間でのブランクに対して比較する：時間０のブランク液（酵素なし）の濁度から酵素処理した液体の濁度（所定時間）を引く。
【０１０１】
クチナーゼ変異体の相対的能力（濁度の減少）を計算し、結果を以下の表に示す。
【０１０２】
【表６】
0004615723.tif 000007
【０１０３】
結果は、酵素の効果が経時的に増加することを示す。この酵素投与量及びオリゴマー濃度で、約２０分超で安定状態になるようである。
実施例１３：繊維修飾
分散性染色ポリエステル布帛の湿潤特性への効果を、染色前にＨ．インソレンスクチナーゼの変異体でその布帛を処理することにより研究した。それゆえ、その実験は、２つのフェーズ：実際の繊維修飾及び分散性染色手順からなる。
フェーズ１−繊維修飾
装置：        Ａｔｌａｓ  Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ  ＬＰ２
布帛：        Ｔｅｓｔｆａｂｒｉｃｓからのニット１００％洗上げポリエス
テル
pH：          ５０mMリン酸カルシウム緩衝液、pH７
研磨剤：      ５ビッグスチールボール
ビーカー容量：１２０mL
処理：        ６５℃で２時間、次に９０℃に上げ、そして１時間、保持する
スワッチ調製：３×１．５ｇスワッチの布帛に切断、ビーカー当り３＝４．５
ｇ
すすぎ：
脱イオン水ですすぐ。
フェーズ２−染色−分散性染料
染色液：
脱イオン水を一緒に加えて液体比１：２０を作る。
【０１０４】
０．４％  Ｄｉａｎｉｘ  Ｒｅｄ（ＤｙＳｔａｒ）ＳＥ−ＣＢ（ｏｗｔ）pHを４．５〜５にする。
染色手順：
１．繊維修飾からの処理当り１つのスワッチを染色のために用いる（１．５ｇ／スワッチを液体比計算のために用いる）。
【０１０５】
２．上述の方法に従って染浴を作る。冷たい染色液をＬａｂｏｍａｔビーカーに加え、３．５℃／分の勾配で５５℃に加熱する。温度に達したら５分、行う。
３．ビーカーに布帛を加える。
４．１．５℃／分の勾配で１３０℃に温度を上げる。３０分、染色する。
５．５℃／分の勾配で７０℃に冷やす。浴に入れるか、収集せず、そして１０分、高温（６０℃）で布帛をゆすぐ。高温すすぎの後、全てのブリーディングが停止するまで、室温でオーバーフローですすぐ。
【０１０６】
６．一晩、空気乾燥させる。
テスト／分析：
ＡＡＴＣＣ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ６１−洗浄に対する染色堅牢度
染浴抽出パーセント分光光度計
Ｋ／Ｓ及びＬ* −反射率計
ＡＡＴＣＣ  ＴＭ−７９  Ｐｒｏｐ  Ｔｅｓｔ
結果：
繊維修飾からの結果を以下の表に示す。
【０１０７】
【表７】
0004615723.tif 000008
【０１０８】
結果は、ポリエステルの変異体での処理は湿潤度を実質的に増加させる。このセット・アップにおいて分散性染料での染色能力への悪影響は見られない。
実施例１４：洗濯場でのクチナーゼ変異体の使用によるヒトの汗／脂で汚された織物での悪臭削減
悪臭削減に関するクチナーゼの能力は、Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒで行う１サイクル洗浄試験においてテストすることができる。
【０１０９】
実験条件：
洗浄液：ビーカー当り１０００mL
スワッチ：１００％ポリエステル（インターロックニット、先にＳｏｘｈｌｅｔ抽出により洗浄）。ビーカー当り２４のスワッチ１３．３×３．５cm）。
汚れ：運動後に腋窩をふくことにより適用するヒト男性の腋窩の甘及び脂
洗剤：５ｇ／Ｌの標準色洗剤。pH調節なし。
【０１１０】
水の硬度：３．２mM  Ｃａ2+／Ｍｇ2+（５：１の比）
水の温度：３０℃
洗浄時間：３０分
すすぎ：水道水で１５分
評価：
洗浄後、湿潤スワッチを閉じた色のついた２００mLガラスの中に入れる。訓練された感覚パネル（９〜１１の判定者）が、その湿ったサンプルの上部空き部分のにおいをかぐことによりにおいを評価し、全体のにおい強度を評価する。そのにおい強度は、各々の端に言葉を記した１５cmの統一されていない線のスケール上にマークすることにより記録される（そのスケールの始めに‘なし’、端に極めて強い）。全ての評価を２回、行う。スワッチを、洗浄後１，２、及び３日目に評価する（スワッチは常にガラス内に維持する）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｈ．インソレンスのクチナーゼの３Ｄ構造についての座標を示す。
【図２】  Ｆ．ソラニ・ピシ（左側）及びＨ．インソレンス（右側）からのクチナーゼの３次元構造を示すコンピューターモデルである。Ｎ末端アミノ酸及びこの周囲１２Å及び１７Å直径のゾーンを同定するために異なる色を用いている。
【図３】  ｃ３ＥＴの加水分解を示す。詳細は例に示す。
【図４】  ｃ３ＥＴの加水分解を示す。詳細は例に示す。
【図５】  ｃ３ＥＴの加水分解を示す。詳細は例に示す。
【図６】  ｃ３ＥＴの加水分解を示す。詳細は例に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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