(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号25に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号26に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び、配列番号27に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域、及び、配列番号45に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む組成物であって、その糖鎖組成がフコース欠損抗体の割合が高くなるように、又は、バイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加された抗体の割合が高くなるように改変された抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項２】
以下のいずれかの重鎖可変領域；
（１）配列番号81に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（２）配列番号82に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（３）配列番号83に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（４）配列番号84に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（５）配列番号85に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（６）配列番号86に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
（７）配列番号87に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
及び、配列番号89に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む組成物であって、その糖鎖組成がフコース欠損抗体の割合が高くなるように、又は、バイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加抗体の割合が高くなるように改変された抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項３】
配列番号25に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号26に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び、配列番号27に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域、及び、以下の（１）から（１５）のうちのいずれか；
（１）配列番号90に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（２）配列番号91に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（３）配列番号92に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（４）配列番号93に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（５）配列番号94に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（６）配列番号95に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（７）配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（８）配列番号97に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（９）配列番号98に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（１０）配列番号99に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（１１）配列番号100に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（１２）配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（１３）配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
（１４）配列番号103に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、又は、
（１５）配列番号104に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号46に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるCDR3、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項４】
以下の（１）から（７）のうちいずれか；
（１）配列番号81に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（２）配列番号82に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（３）配列番号83に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（４）配列番号84に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（５）配列番号85に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（６）配列番号86に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
（７）配列番号87に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
及び、以下の（１）から（１５）のうちいずれか；
（１）配列番号107に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（２）配列番号108に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（３）配列番号109に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（４）配列番号110に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（５）配列番号111に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（６）配列番号112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（７）配列番号113に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（８）配列番号114に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（９）配列番号115に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（１０）配列番号116に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（１１）配列番号117に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（１２）配列番号118に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（１３）配列番号119に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（１４）配列番号120に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
（１５）配列番号121に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗体を含む抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項５】
フコース欠損抗体の割合が20％以上となるようにその糖鎖組成が改変された請求項1から4のいずれかに記載の抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項６】
フコース欠損抗体の割合が50％以上となるようにその糖鎖組成が改変された請求項1から4のいずれかに記載の抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項７】
フコース欠損抗体の割合が90％以上となるようにその糖鎖組成が改変された請求項1から4のいずれかに記載の抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項８】
細胞を用いる抗グリピカン3抗体の製造方法であって、請求項1から7において規定される抗グリピカン3抗体をコードする遺伝子が糖鎖にフコースを付加する能力が低い細胞に導入される工程、及び当該細胞を培養する工程を含む製造方法。
【請求項９】
糖鎖にフコースを付加する能力が低い細胞が、フコーストランスポーターが欠損した細胞である請求項8に記載の製造方法。
【請求項１０】
バイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加された抗体の割合が20％以上となるようにその糖鎖組成が改変された請求項1から4のいずれかに記載の抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項１１】
バイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加された抗体の割合が50％以上となるようにその糖鎖組成が改変された請求項1から4のいずれかに記載の抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項１２】
バイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加された抗体の割合が90％以上となるようにその糖鎖組成が改変された請求項1から4のいずれかに記載の抗グリピカン3抗体組成物。
【請求項１３】
細胞を用いる抗グリピカン3抗体の製造方法であって、請求項1から4又は10から12において規定される抗グリピカン3抗体をコードする遺伝子が糖鎖にバイセクティングN-アセチルグルコサミン構造を形成する能力を有する細胞に導入される工程、及び当該細胞を培養する工程を含む製造方法。
【請求項１４】
以下のステップ；
（ａ）請求項1から4において規定される抗グリピカン3抗体をコードする遺伝子が糖鎖にフコースを付加する能力が低い細胞又は糖鎖にバイセクティングN-アセチルグルコサミン構造を形成する能力を有する細胞に導入される工程、及び
（ｂ）当該細胞を培養する工程、
を含む抗グリピカン3抗体の製造方法。
【請求項１５】
請求項1から7又は10から12のいずれかにおいて規定される抗グリピカン3抗体組成物を有効成分として含有する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞障害活性、特に抗体依存性細胞傷害性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）が増強された、グリピカン３抗原に対する抗体（抗グリピカン３抗体）およびその製造方法に関する。
【背景技術】  グリピカン３（ＧＰＣ３）は、細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーの１つであり、発生における細胞分裂や、癌細胞の増殖に関与している可能性があることが示唆されているが、その機能はまだよく解明されていない。
ＧＰＣ３に結合するある種の抗体が、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）活性およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害）活性により細胞増殖抑制作用を有することが見いだされている（ＷＯ２００３／０００８８３）。また、ＧＰＣ３が生体内で切断されて可溶型ＧＰＣ３として血中に分泌され、これを検出しうる抗体を用いて癌の診断が可能であることが示唆されている（ＷＯ２００４／０２２７３９、ＷＯ２００３／１００４２９、ＷＯ２００４／０１８６６７）。
抗体の細胞傷害活性を利用した抗癌剤を開発する場合、用いられる抗体は高いＡＤＣＣ活性を有していることが好ましい為、ＧＰＣ３を認識する抗体においても高い細胞傷害活性を有する抗ＧＰＣ３抗体が望まれていた。
抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、ＷＯ  ９９／５４３４２には、抗体のグリコシル化を修飾することによりＡＤＣＣ活性を改良することが記載されている。また、ＷＯ  ００／６１７３９には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりＡＤＣＣ活性を調節することが記載されている。ＷＯ  ０２／３１１４０には、ＹＢ２／０細胞において抗体を産生せしめることにより、α−１，６コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。ＷＯ  ０２／７９２５５には、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を有する抗体が記載されている。しかしながら、糖鎖の修飾によってＡＤＣＣ活性が増強された抗グリピカン３抗体は知られていない。
従って、本発明は糖鎖組成の変化によってＡＤＣＣ活性が増強された抗グリピカン３抗体組成物およびその製造方法を提供しようとするものである。
【発明の開示】
本発明者は上記の課題を解決すべく種々検討した結果、グリピカン３をターゲットとした場合においても、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）が欠損した糖鎖を有する抗体が高い細胞障害活性を有することを見出した。従って、本発明は、糖鎖組成が変化した抗グリピカン３抗体組成物、より具体的にはフコースが欠損した抗グリピカン３抗体の割合が増加した抗体組成物を提供する。本発明の糖鎖改変抗グリピカン３抗体組成物は、高い細胞障害活性を有しているので、抗癌剤などの細胞増殖抑制剤に有用である。
本発明はまた、上記の糖鎖が修飾された抗体の製造方法において、ＹＢ２／０細胞などのフコース付加能が低下した宿主細胞に抗グリピカン３抗体をコードする核酸を導入し、該宿主細胞を培養することにより当該抗体を取得することを特徴とする、抗グリピカン３抗体組成物の製造方法を提供する。好ましくは、糖鎖へのフコース付加能が減少した細胞はフコーストランスポーター欠損細胞である。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｎ−グリコシル結合糖鎖の基本構造を示す。
図２は、各キメラ抗体の、ヒトＰＢＭＣを用いＨｅｐＧ２を標的細胞とした場合のＡＤＣＣ活性を示す。
図３は、各キメラ抗体の、ヒトＰＢＭＣを用いＨｕＨ７を標的細胞とした場合のＡＤＣＣ活性を示す。
図４は、各抗体の、ヒトＰＢＭＣを用いＨｕＨ−７を標的細胞とした場合のＡＤＣＣ活性を示す。
図５は、ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体（ａ，ｂ，ｃ）およびＣＨＯ細胞産生の抗体から調製したアガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖の順相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図６は、図５で示したピークＧ（０）およびＧ（０）−Ｆｕｃの推定構造を示す。
図７は、ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体（ａ）およびＣＨＯ細胞産生の抗体（ｂ）についてＤＳＣ（示差走査熱量計）測定チャートを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、糖鎖組成が変化した抗グリピカン３抗体組成物を特徴とする。抗体の細胞障害活性の発現には、抗体に結合した糖鎖の構造が大きな影響を及ぼすことが知られている。抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のアスパラギンの側鎖のＮ原子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリンまたはスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合するＯ−グリコシル結合糖鎖があり、本発明においてフコースの存否が問題となるのはＮ−グリコシド結合糖鎖である。
抗体に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の基本構造を図１に示す。Ｎ−グリコシル結合糖鎖は図１のＩｇＧ基本糖鎖（１）および（３）に示すごとく、１個のマンノース（Ｍａｎ）と２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１，４結合で結合した基本構造（コア）「−Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡＣβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−」を有し、この構造の右のＧｌｃＮＡｃを還元末端と称し、左側のＭａｎを非還元末端と称する。フコース（Ｆｕｃ）が結合している場合、これは主として、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位とがα結合している。他方、図１のＩｇＧ基本糖鎖（２）に示す糖鎖においては、基本構造（コアー）の非還元末端に、前記２個の糖鎖のほかに、１個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１，４結合により結合している。このＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が、「バイセクテングＮ−アセチルグルコサミン」である。バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖は、Ｏ−グリコシル結合糖鎖またはＮ−グリコシル結合糖鎖であり、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）により、Ｎ−アセチルグルコサミンを糖鎖に転移させることにより形成される。この酵素をコードする遺伝子は既にクローニングされており、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列は記載されている（ＮＣＢＩデーターベース（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｄ１３７８９））。
本発明において、糖鎖組成が変化した抗体組成物（糖鎖改変抗体組成物）とは、基準となる宿主細胞で産生される抗体組成物とは異なる糖鎖組成を有する抗体組成物のことをいう。
本発明において、糖鎖組成が変化したか否かは、基準となる宿主細胞で産生される抗体組成物を基準として判断することができる。基準となる抗体組成物と異なる糖鎖組成を有する抗体組成物の場合、その抗体組成物は糖鎖組成が変化した抗体組成物となる。
本発明において基準となる宿主細胞はＣＨＯ  ＤＧ４４である。ＣＨＯ  ＤＧ４４は、例えばインビトロジェン社から入手することが可能である。
糖鎖組成が変化した抗体組成物の例としては  抗体組成物中のフコース（例えば、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）欠損抗体の割合が増加した抗体組成物や、抗体組成物中のバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）付加抗体の割合が増加した抗体組成物などを挙げることができる。
本発明の好ましい態様としては、フコース欠損抗体の割合が、基準となる抗体組成物と比較して高い抗体組成物を挙げることができる。
なお、抗体には複数のＮ−グリコシル糖鎖を有することもあるので、本発明のフコース欠損抗体には、フコースが全く付加していない抗体だけでなく、付加しているフコースの数が減少している抗体（少なくとも１つ以上の糖鎖においてフコースが付加されていない抗体）なども含まれる。
宿主細胞で糖鎖改変抗体を製造する場合、全て同一の糖鎖を有する均一な抗体を含有する組成物を得ることは困難なことが多い。従って、例えば、糖鎖組成が変化した抗体組成物がフコース欠損抗体の割合が増加した抗体組成物である場合、本発明の糖鎖組成が変化した抗体組成物にはフコースが欠損した抗体とフコース欠損していない抗体の両方が含まれることがあるが、フコースが欠損した抗体の割合が、基準となる宿主細胞で作製された抗体組成物よりも高い。本発明のフコース欠損抗体の割合が高い抗体組成物において、フコース欠損割合は特に限定されないが好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
また、本発明のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン付加抗体の割合が高い抗体組成物において、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン付加抗体の割合は特に限定されないが、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
本発明の糖鎖組成が変化した抗グリピカン３抗体組成物は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。
例えば、フコース欠損抗体は、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を付加する能力を有しないかまたはその能力が低い宿主細胞中で抗グリピカン３抗体を発現させることにより製造することができる。
フコースを付加する能力を有しないまたはその能力が低い宿主細胞は特に限定されないが、例としては、フコース転移活性が欠損または低くなっている宿主細胞、ゴルジ体内のフコース濃度が低くなっている宿主細胞、などを挙げることができる。より具体的には、ラットミエローマＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＹＢ２／０細胞と略される）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２として保存されている）、ＦＴＶＩＩＩノックアウトＣＨＯ細胞（ＷＯ  ０２／３１１４０）、Ｌｅｃ１３細胞（ＷＯ０３／０３５８３５）、フコーストランスポーター欠損細胞（ＷＯ  ２００５／０１７１５５）などを挙げることができる。
フコーストランスポーター欠損細胞とは、フコーストランスポーターの存在量が正常細胞より少ないか、またはフコーストランスポーターの構造に変異を有することにより、フコーストランスポーターの機能が低下している細胞である。フコーストランスポーター欠損細胞としては、例えば、フコーストランスポーター遺伝子がノックアウトされている細胞（以下、「ＦＴ−ＫＯ細胞」と呼ぶ。）、フコーストランスポーター遺伝子の一部が欠損または変異している細胞、フコーストランスポーター遺伝子の発現系に欠陥を有する細胞などが挙げられる。チャイニーズハムスターのフコーストランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列およびフコーストランスポーターのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１２６および１２７に示す。
また、配列番号１２６に示す塩基配列を利用して、ＲＮＡｉ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を用いても本発明のフコーストランスポーター欠損細胞を取得することができる。ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のｍＲＮＡが特異的に分解され、タンパク質として発現されなくなる現象をいう。ＲＮＡｉの場合、通常、二本鎖ＲＮＡが用いられるが、特に限定されず、例えば、自己相補的な一本鎖ＲＮＡ中で形成される二本鎖を用いることも可能である。二本鎖を形成する領域は、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端）が一本鎖になっていてもよい。ＲＮＡｉに用いられるオリゴＲＮＡは、その長さは限定されない。本発明のオリゴＲＮＡの長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には１９〜２３ｂｐ）である。
上述のようにＲＮＡｉ法は、ある遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）が、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊する、という現象を利用した方法である。用いるフコーストランスポーター遺伝子の全長配列に対応する二本鎖ＲＮＡを用いてもよいし、一部の配列に対応する短い（例えば、２１〜２３ｂｐの）ｄｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）を用いてもよい。該二本鎖ＲＮＡは、直接細胞に取り込ませてもよいし、二本鎖ＲＮＡを産生するベクターを作製し、宿主細胞に導入して細胞内で二本鎖ＲＮＡを産生させてもよい。例えば、本発明のフコーストランスポーターをコードするＤＮＡの全部又は一部を逆向きの反復配列となるようにベクターに組み込み、該ベクターを宿主細胞に導入すればよい。ＲＮＡｉ法は、Ｆｉｒｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８），３９１，８０６−８１１、Ｍｏｎｔｇｏｉｎｅｒｙ  Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８），９５，１５５０２−１５５０７、Ｔｉｍｍｏｎｓ  Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８），３９５，８５４、Ｓ▲ａ▼ｎｃｈｅｚ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），９６，５０４９−５０５４、Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），９６，１４５１−１４５６、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９８），９５，１０１７−１０２６、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８），９５，１３９５９−１３９６４、Ｗｉａｎｎｙ  Ｆ．ｅｔ  ａｌｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００），２，７０−７５等の記載に従って行うことができる。
ＲＮＡｉ法等により取得されるフコーストランスポーター欠損細胞のスクリーニングはフコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによるフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
また、糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が付加した抗体は、糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗グリピカン３抗体を発現させることにより製造することができる。
バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンが付加した糖鎖を有する抗体の製造方法は既に公知である（ＷＯ  ０２／７９２５５）。糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を形成する能力を有する宿主細胞は特に限定されず、例えば、ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを有する宿主細胞を用いることが可能である。従って、ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターおよび抗グリピカン３抗体をコードする発現ベクターを有する宿主細胞を用いて、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンが付加した糖鎖を有する抗グリピカン３抗体を製造することができる。ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡと抗グリピカン３抗体をコードする遺伝子は同一のベクター上に存在してもよいし、異なるベクター上に存在してもよい。
また、抗体組成物中のフコース欠損抗体またはバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン付加抗体の割合を増加される他の方法として、フコース欠損抗体またはバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン付加抗体を精製することにより組成物中のそれらの抗体の割合を増加させる方法を挙げることができる。
糖鎖の解析は当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、抗体にＮ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（Ｒｏｃｈｅ）等を作用させ、糖鎖を抗体から遊離させる。その後、セルロースカートリッジを用いた固相抽出（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３２（２００１），３８１−３８８）による脱塩後に濃縮乾固し、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行う（Ｋｏｎｄｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５４：８（１９９０），２１６９−２１７０）。得られたＰＡ化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製ＰＡ化糖鎖とする。その後、ＯＤＳカラムによる逆相ＨＰＬＣ分析を行うことにより測定することが可能である。また、ＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ＯＤＳカラムによる逆相ＨＰＬＣ分析およびアミンカラムによる順相ＨＰＬＣ分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施することにより行うことも可能である。
本発明において糖鎖が改変される抗グリピカン３抗体は、グリピカン３に結合する抗体であれば特に限定されない。グリピカン３への結合は特異的であることが好ましい。本発明において好ましい抗グリピカン３抗体としては、以下の表１に示されるＣＤＲ配列を有する抗体を挙げることができる。
【表１】
0004794457.tif 000002
0004794457.tif 000003
上記の表に記載のＣＤＲ配列を有する抗体は高い細胞障害活性を有する。上記の表に記載のＣＤＲ配列を有する抗体は、グリピカン３上のアミノ酸番号５２４−５６３のエピトープを認識する。アミノ酸番号５２４−５６３のエピトープを認識する抗体は細胞障害活性が高いので、本発明の抗グリピカン３抗体として好ましい。
本発明の１つの好ましい態様においては、本発明の糖鎖組成が変化した抗体組成物はＡＤＣＣ活性が増強していることを特徴とする。本発明においてＡＤＣＣ活性が増強しているか否かは、基準となる抗体組成物と比較して、該基準よりも高いＡＤＣＣ活性を示す場合にはＡＤＣＣ活性が増強されていると判断される。
ＡＤＣＣ活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、エフェクター細胞、標的細胞および抗グリピカン３抗体を混合し、ＡＤＣＣの程度を調べることにより測定することができる。より具体的には、例えば、エフェクター細胞としてマウス脾細胞やヒト末梢血や骨髄から分離した単核球等を利用し、標的細胞としてはヒト肝細胞株ＨｕＨ−７等のグリピカン３を発現するヒト株化細胞を用いる。標的細胞をあらかじめ５１Ｃｒにより標識し、これに抗グリピカン３抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベーションを行う。インキュベーション後上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりＡＤＣＣ活性を測定することができる。
抗グリピカン３抗体
抗グリピカン３抗体の作製は当業者に公知の方法により行うことが可能である。すなわち、グリピカン３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトグリピカン３を、Ｌａｇｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８８（１９９７），１５１−１５６に開示されたグリピカン３（ＭＸＲ７）遺伝子／アミノ酸配例を発現することによって得る。すなわち、グリピカン３をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトグリピカン３タンパク質を公知の方法で精製する。次に、この精製グリピカン３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、グリピカン３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトグリピカン３のアミノ酸配列より化学合成により得ることができる。抗グリピカン３抗体がＡＤＣＣの作用、ＣＤＣによる作用、増殖因子活性の阻害により細胞増殖抑制活性を阻害することから、また抗グリピカン３抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させることにより、細胞増殖を抑制し得ることから、本発明の抗グリピカン３抗体の認識するグリピカン３分子上のエピトープは特定のものに限定されず、グリピカン３分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗グリピカン３抗体を作製するための抗原は、グリピカン３分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
特に好ましい態様において、グリピカン３のアミノ酸番号５２４−５６３のエピトープを認識する抗体を取得する場合には、感作抗原としてアミノ酸番号５２４−５６３を含むペプチドを用いることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（���融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリピカン３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、グリピカン３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるグリピカン３を投与して抗グリピカン３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からグリピカン３に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。具体的には、抗グリピカン３抗体を産生するハイブリドーマから、抗グリピカン３抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｅｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。目的とする抗グリピカン３抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。本発明で使用される抗グリピカン３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を���乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。キメラ抗体およびヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領或およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られずグリピカン３に結合し、グリピカン３の活性を阻害する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗グリピカン抗体を使用す���こともできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はグリピカン３分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がグリピカン３を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、グリピカン３を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
本発明で使用される抗体の製造のためには、発現された抗体に糖鎖を付加する機能を有する任意の真核細胞発現系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。レクチンカラムを用いた所望の糖鎖を有する抗体の分離は当業者に公知の方法により行うことができ、例えばＷＯ０２／３０９５４に記載の方法で行うことができる。
抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。本発明で使用される抗グリピカン３抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、グリピカン３をコーティングしたプレートに、抗グリピカン３抗体を含む試料、例えば、抗グリピカン３抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
医薬組成物
本発明は、本発明の糖鎖組成が変化したグリピカン３抗体組成物を含む医薬組成物を提供する。
本発明の抗体組成物を含有する医薬組成物は癌などの細胞増殖に関連する疾患の治療および／または予防に有用であり、特に肝癌の治療および／または予防に有用である。本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性刑、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−３１１３５６号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
マウス抗ヒトグリピカン３抗体の作製
抗ＧＰＣ３抗体作製のための免疫タンパク質として、Ｃ末端側の疎水性領域（５６４−５８０アミノ酸）を欠損させた可溶型ＧＰＣ３タンパク質を作製し、これを用いて免疫を行った。自己免疫疾患マウスであるＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、日本チャールズ・リバーより購入）を免疫動物として用いた。７週齢、もしくは８週齢より免疫を開始し、初回免疫には可溶型ＧＰＣ３を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、ベクトンディッキンソン社）を月いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。５回免疫の後、最終免疫として５０μｇ／ｈｅａｄとなるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。最終免疫の４日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、ＡＴＣＣより購入）と２：１になるように混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により細胞融合を行った。スクリーニングは可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、ＧＰＣ３に対して強い結合活性を有する抗体を１１クローン（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ１Ｅ７、Ｍ３Ｂ８、Ｍ１１Ｆ１、Ｌ９Ｇ１１、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ５Ｂ９、Ｍ１０Ｄ２）取得した。
得られた抗ＧＰＣ３抗体のうち、特にＭ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８が強いＣＤＣ活性を示したことから、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８のエピトープを含むＧＳＴ融合タンパク質である、グリピカン３の５２４番目のＡｌａから５６３番目のＬｙｓまでのペプチドとＧＳＴの融合タンパク質（ＧＣ−３）を免疫原として、Ｂａｌｂ／ｃ（日本チャールズリバーより購入）３匹、ＭＲＬ／ｌｐｒ３匹に対して免疫を行った。初回免疫にはＧＣ−３を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、ＦＣＡを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／ｈｅａｄとなるように調製したものをＦＩＡでエマルジョン化したものを皮下に投与した。５回免疫の後、全マウスに対し最終免疫（５０μｇ／ｈｅａｄ）を尾静脈内に行い細胞融合を行った。スクリーニングは、Ｃ末端側の疎水性領域（５６４−５８０アミノ酸）を欠損させた可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、ＧＰＣ３に対して強い結合活性を有する抗体を５クローン（ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４）取得した。
このようにして得られた抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域を定法によりクローニングし、配列を決定した。さらに、既知の抗体のアミノ酸配列のデータベースと比較して相同性を調べることにより、ＣＤＲ領域を決定した。ＣＤＲ領域の配列は表１および２に示される。
実施例２
抗ＧＰＣ３抗体マウス−ヒトキメラ抗体の作製
抗ＧＰＣ３抗体ＧＣ３３のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ１およびκ鎖定常領域配列に連結した。抗体のＨ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＮｈｅＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトＩｇＧ１定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社）に挿入されているｐＢ−ＣＨベクターにクローニングした。ＮｈｅＩ部位により、マウスＨ鎖可変領域とヒトＨ鎖（γ１鎖）定常領域が連結している。作製されたＨ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングした。また、抗体のＬ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＢｓｉＷＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトｋａｐｐａ鎖定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社）に挿入されているｐＢ−ＣＬベクターにクローニングした。ＢｓｉＷＩ部位により、ヒトＬ鎖可変領域と定常領域が連結している。作製されたＬ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＵＣＡＧクローニングした。本ベクターｐＵＣＡＧは、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られる２．６ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９ベクター（東洋紡社）の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に連結し、クローニングしたベクターである。
抗ＧＰＣ３マウス―ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、Ｌ鎖遺伝子断片が挿入されたｐＵＣＡＧベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社）で消化して得られる遺伝子断片をＨ鎖遺伝子が挿入されたｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、抗ＧＰＣ３マウス―ヒトキメラ抗体遺伝子（Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列は自己列番号３に、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に示される。）を発現する。
実施例３
低フコース型抗ＧＰＣ３キメラ抗体の作製
宿主細胞としてＹＢ２／０（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６６２）を用い、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。実施例２で作製した抗ＧＰＣ３キメラ抗体発現ベクター２５μｇを７．５×１０６／０．７５ｍＬ  ＰＢＳ（−）のＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＴ−１６６２）へ、エレクトロポレーション法で１．４ｋＶ，２５μＦの条件で導入した。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で１０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによりキメラ抗体高発現株のスクリーニングを実施し、定常発現株を樹立した。各抗ＧＰＣ３マウス―ヒトキメラ抗体の精製は、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて行った。
実施例４
ヒト末梢血由来ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性の測定
ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
標的細胞の調製
１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ）およびＨｕＨ−７細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてディッシュから剥離し、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、１日間培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのＣｒ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養し、この細胞を培地で１回洗浄し、５０μＬの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加え標的細胞とした。
クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、氷上で１５分反応させた後に、ヒトＰＢＭＣ溶液１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル）を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃４時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞に２％ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
抗ＧＰＣ３キメラ抗体のヒトＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性を図２および３に示す。図中、縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は添加した抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。図２は標的細胞としてＨｅｐＧ２を用いた場合の、図３はＨｕＨ−７を用いた場合の結果を示す。白抜きはＣＨＯ細胞産生キメラＧＣ３３抗本の活性を、黒塗りはＹＢ２／０産生キメラＧＣ３３抗体の活性をそれぞれ示す。低フコース型であるＹＢ２／０産生ＧＣ３３キメラ抗体は、ＣＨＯ細胞産生ＧＣ３３キメラ抗体に比較して強いＡＤＣＣ活性を示したことより、糖鎖の改変によって抗ＧＰＣ３抗体のＡＤＣＣ活性が増強されることが明らかとなった。
実施例５
抗体産生細胞の樹立
ＳＦＭＩＩ（＋）培地にハイグロマイシンＢの最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように調製し、フコーストランスポーター欠損株（クローン名３Ｆ２）を継代した。８Ｘ１０６個の３Ｆ２を０．８ｍＬのダルベッコリン酸緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液に２５μｇの抗体発現ベクター（参考実施例１及び２）を加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅに細胞懸濁液を移した。氷上で１０分間放置した後に、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲＩＩで１．５ｋＶ，２５μＦＤの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞をＳＦＭＩＩ（＋）培地４０ｍＬに懸濁して９６穴平底プレート（イワキ社）に１００μｌ／ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをＣＯ２インキュベータ内で、２４時間、３７℃で培養した後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（インビトロジェン社、ｃａｔ．１０１３１−０２７）を終濃度０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加した。薬剤に耐性になった細胞の抗体産生量を測定し、ヒト化抗ＧＰＣ３抗体産生細胞株をそれぞれ樹立した。
実施例６
抗体の精製
抗体発現株より培養上清を回収し、Ｐ−１ポンプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＨｉｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣＡＴ＃  １７−５０８０−０１）にチャージした。結合バッファー（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１ＭＧｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出液は直ちに中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で中和した。ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＡＴ＃  ５００−０１１１）により抗体の溶出画分を選択しプールした後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−ＹＭ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃４３０４）にて２ｍＬ程度まで濃縮した。次に、２０ｍＭ酢酸バッファー，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，（ｐＨ６．０）にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてゲルろ過により分離した。モノマー画分のピークを回収し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−ＹＭ１０にて濃縮後、ＭＩＬＬＥＸ−ＧＷ  ０．２２μｍ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃  ＳＬＧＶ  ０１３ＳＬ）を用いてＦｉｌｔｒａｔｉｏｎした後、４℃で保管した。精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、モル吸光計数から換算した。
実施例７
ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性
ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗ＧＰＣ３抗体のヒトＰＢＭＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を図４に示す。方法は実施例４に記載の方法で行った。図中、縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は添加した抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。標的細胞としてはＨｕＨ−７を用いた。白抜きはＷｉｌｄ  ＴｙｐｅのＣＨＯ細胞産生抗ＧＰＣ３抗体の活性を、黒塗りはＦＴ−ＫＯ細胞産生抗ＧＰＣ３抗体の活性をそれぞれ示す。低フコース型であるＦＴ−ＫＯ細胞産生抗ＧＰＣ３抗体は、Ｗｉｌｄ  ＴｙｐｅのＣＨＯ細胞産生抗ＧＰＣ３抗体に比較して強いＡＤＣＣ活性を示した。このことによりＦＴ−ＫＯ細胞産生抗ＧＰＣ３抗体ではＡＤＣＣ活性が増強されることが明らかとなった。
実施例８
ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体糖鎖の解析
１．２−アミノベンズアミド標識糖鎖（２−ＡＢ化糖鎖）の調製
本発明のＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体、及び対照試料としてＣＨＯ細胞産生の抗体に、Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を作用させ、糖鎖を蛋白質から遊離させた（Ｗｅｉｔｚｈａｎｄｌｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８３：１２（１９９４），１６７０−１６７５）。エタノールを用いた除タンパク質後（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０８：１１（２００１），１６８７−１６９５）、濃縮乾固し、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った（Ｂｉｇｇｅ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３０：２（１９９５），２２９−２３８）。得られた２−ＡＢ化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製２−ＡＢ化糖鎖とした。次に，β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（生化学工業）を精製２−ＡＢ化糖鎖に作用させ，アガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖とした。
２．アガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析
前項の方法で、本発明のＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体、及び対照試料としてＣＨＯ細胞産生抗体についてアガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖の調製を行った後、アミドカラム（東ソー製ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０）による順相ＨＰＬＣ分析を行い、クロマトグラムを比較した。ＣＨＯ細胞産生抗体ではＧ（０）が主成分として存在しており、Ｇ（０）−Ｆｕｃはピーク面積比として４％程度であった。一方，ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体ではＧ（０）−Ｆｕｃが主成分であり，いずれの産生株においてもピーク面積比として９０％以上存在していた（図５および表２）。ピークＧ（０）およびＧ（０）−Ｆｕｃの推定構造を図６に示す。
【表２】
0004794457.tif 000004
実施例９
ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体の熱安定性分析
１．ＤＳＣ測定用試料溶液の調製
２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．０）を透析外液とし，これに７００μｇ相当量の抗体溶液を封入した透析膜を浸して一昼夜透析し，試料溶液とした。
２．ＤＳＣによる熱変性温度測定
試料溶液およびリファレンス溶液（透析外液）を十分に脱気した後、これらをそれぞれ熱量計セルに封入し２０℃での熱平衡化を十分に行った。次にＤＳＣ走査を２０℃〜１００℃で約１Ｋ／分走査速度で行った。結果は、温度の関数としての変性ピークの頂点として表される（図７）。本測定より，ＣＨＯ細胞産生抗体およびＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体における熱変性温度は同等であった。
参考実施例１
ＧＣ３３のヒト化
公開されているＫａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｋａｂａｔ／）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）より抗体の配列データを入手し、Ｈ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、Ｈ鎖可変領域はＤＮ１３（Ｓｍｉｔｈｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；３６：１１３−１２４）と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖可変領域はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０６４１０５のｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＫ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＶＬＪ  ｒｅｇｉｏｎ，ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ，ｃｌｏｎｅ：Ｋ６４と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖のシグナル配列についてはＡＢ０６４１０５と相同性の高いＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｓ４０３５７のシグナル配列を利用した。これらの抗体のフレームワーク領域（以下、ＦＲ）に相補性抗原決定領域（以下、ＣＤＲ）を移植したヒト化抗体を作製した。
具体的には、５０ｂａｓｅ程度の合成オリゴＤＮＡを約２０ｂａｓｅ程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴＤＮＡをＰＣＲ法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。５’端の合成オリゴＤＮＡの末端に挿入したＨｉｎｄＩＩＩ配列、および３’端の合成オリゴＤＮＡの末端に挿入したＢａｍＨＩ配列で切断し、ヒトＩｇＧ１定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇγ１、ヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇκへクローニングした（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３７１−３８１）。このようにして作製したヒト化ＧＣ３３はＨ鎖、Ｌ鎖それぞれｖｅｒ．ａと命名した。Ｈ鎖、Ｌ鎖ともにｖｅｒ．ａのヒト化ＧＣ３３（ｖｅｒ．ａ／ｖｅｒ．ａ）はマウスＧＣ３３可変領域の抗体（ｍｏｕｓｅ／ｍｏｕｓｅ）と比較して結合活性が低かった。Ｈ鎖とＬ鎖についてマウスＧＣ３３配列とｖｅｒ．ａ配列をキメラに組み合わせた抗体（ｍｏｕｓｅ／ｖｅｒ．ａ、ｖｅｒ．ａ／ｍｏｕｓｅ）を作製し結合活性を評価した結果、ｖｅｒ．ａ／ｍｏｕｓｅで結合活性の低下が認められ、アミノ酸置換による結合活性の低下はＨ鎖に起因する事が判明した。そこで、Ｈ鎖の改変体ｖｅｒ．ｃ、ｖｅｒ．ｆ、ｖｅｒ．ｈ、ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋを作製した。全てのヒト化ＧＣ３３はマウスＧＣ３３可変領域を有するキメラ抗体と同等の結合活性を示した。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖可変領域ｖｅｒ．ａ、ｖｅｒ．ｃ、ｖｅｒ．ｆ、ｖｅｒ．ｈ、ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋの塩基配列を配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０に、アミノ酸配列を配列番号８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７に示す。ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖可変領域ｖｅｒ．ａの塩基配列を配列番号８８に、アミノ酸配列を配列番号８９に示す。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖可変領域ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋでは、６番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されているが、これらの抗体は熱安定性が顕著に増加していた。
参考実施例２
ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖の改変
蛋白質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定数が知られており、Ａｓｎ−Ｇｌｙが特に脱アミド化し易い配列として知られている（Ｒｏｃｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１；９８；９４４−９４９．）。配列番号８８に示されるヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖ｖｅｒ．ａ可変領域のＣＤＲ１内にあるＡｓｎ３３については、一次配列がＡｓｎ−Ｇｌｙであることから、脱アミド化が容易に起きやすい配列である事が予想された。
Ａｓｎ３３の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、Ａｓｎ３３をＡｓｐに置換した改変抗体を作製した。点変異の導入には、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。すなわち、１２５ｎｇのセンスプライマー（ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＡＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ：配列番号１２４）、１２５ｎｇのアンチセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ：配列番号１２５）、５μＬの１０ｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１０ｎｇのヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖ｖｅｒ．ａがクローニングされたＨＥＦｇκ、１μＬのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０μＬの反応液を、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で９分からなるサイクルを１２回行った。その後制限酵素ＤｐｎＩを加え３７℃で２時間消化したものを添付のＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞に導入し形質転換体を得た。正しく変異の導入されたクローンについて、可変領域を切り出し、再度ＨＥＦｇκへクローニングし直した。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖ｖｅｒ．ｋがクローニングされたＨＥＦｇγ１と共にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＣＯＳ７細胞へ導入し一過性に発現させた培養上清を回収した。抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより抗体濃度を定量し、可溶型ＧＰＣ３コア蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡにより改変抗体の結合活性を評価した。Ａｓｎ３３をＡｓｐに置換した改変抗体（Ｎ３３Ｄ）では結合活性が消失しており、Ａｓｎ３３で脱アミド化が起きた場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。
Ａｓｎ３３の脱アミド化を抑制する方法として、Ｇｌｙ３４を他のアミノ酸に改変する方法が報告されている（ＷＯ０３０５７８８１Ａ１）。上記方法に従い、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いＣｙｓ、Ｍｅｔを除く他の１７アミノ酸に置換した改変抗体Ｇ３４Ａ、Ｇ３４Ｄ、Ｇ３４Ｅ、Ｇ３４Ｆ、Ｇ３４Ｈ、Ｇ３４Ｎ、Ｇ３４Ｐ、Ｇ３４Ｑ、Ｇ３４Ｉ、Ｇ３４Ｋ、Ｇ３４Ｌ、Ｇ３４Ｖ、Ｇ３４Ｗ、Ｇ３４Ｙ、Ｇ３４Ｒ、Ｇ３４Ｓ、Ｇ３４Ｔを作製し、ＣＯＳ７細胞一過性発現培養上清を用いて結合活性の評価を行った。その結果、Ｐｒｏ（Ｇ３４Ｐ）、Ｖａｌ（Ｇ３４Ｖ）以外へのアミノ酸置換は結合活性を維持している事が判明した。
上述の改変抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９０（Ｇ３４Ａ）、配列番号９１（Ｇ３４Ｄ）、配列番号９２（Ｇ３４Ｅ）、配列番号９３（Ｇ３４Ｆ）、配列番号９４（Ｇ３４Ｈ）、配列番号９５（Ｇ３４Ｎ）、配列番号９６（Ｇ３４Ｔ）、配列番号９７（Ｇ３４Ｑ）、配列番号９８（Ｇ３４１）、配列番号９９（Ｇ３４Ｋ）、配列番号１００（Ｇ３４Ｌ）、配列番号１０１（Ｇ３４Ｓ）、配列番号１０２（Ｇ３４Ｗ）、配列番号１０３（Ｇ３４Ｙ）、配列番号１０４（Ｇ３４Ｒ）、配列番号１０５（Ｇ３４Ｖ）、配列番号１０６（Ｇ３４Ｐ）に記載する。また、上述の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０７（Ｇ３４Ａ）、配列番号１０８（Ｇ３４Ｄ）、配列番号１０９（Ｇ３４Ｅ）、配列番号１１０（Ｇ３４Ｆ）、配列番号１１１（Ｇ３４Ｈ）、配列番号１１２（Ｇ３４Ｎ）、配列番号１１３（Ｇ３４Ｔ）、配列番号１１４（Ｇ３４Ｑ）、配列番号１１５（Ｇ３４Ｉ）、配列番号１１６（Ｇ３４Ｋ）、配列番号１１７（Ｇ３４Ｌ）、配列番号１１８（Ｇ３４Ｓ）、配列番号１１９（Ｇ３４Ｗ）、配列番号１２０（Ｇ３４Ｙ）、配列番号１２１（Ｇ３４Ｒ）、配列番号１２２（Ｇ３４Ｖ）、配列番号１２３（Ｇ３４Ｐ）に記載する。
参考実施例３
ＣＨＯ細胞におけるフコーストランスポーター遺伝子の破壊
１．ターゲッティングベクターの構築
（１）  ＫＯ１ベクターの作製
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（インビトロジェン社）よりＨｙｇ５−ＢＨとＨｙｇ３−ＮＴのプライマーでＰＣＲすることによって、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）の開始コドンの５’側にＢａｍＨ  ＩサイトとＴＧＣＧＣの配列を付加することで、フコーストランスポーター遺伝子の開始コドンの５’側と同じ配列にし、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ付加シグナルまでの領域を含む３’側にはＮｏｔ  Ｉサイトを付加してＨｙｇｒを抜き出した。
フォワードプライマー
Ｈｙｇ５−ＢＨ    ５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＴＧＡＡＡＡＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号１２８）
リバースプライマー
Ｈｙｇ３−ＮＴ    ５’−ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＣＧ−３’（配列番号１２９）
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターｖｅｒ．１（以下、ＫＯ１ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクター（Ｙａｇｉ  Ｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．８７，ｐ９９１８−９９２２，１９９０）に、フコーストランスポーターの５’側（配列番号１２６に示す塩基配列のＮｏ．２，７８０のＳｍａ  ＩからＮｏ．４，２３２のＢａｍＨ  Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４，２８４からＮｏ．１０，９３４のＳａｃ  Ｉまで）、及びＨｙｇｒフラグメントを各々挿入することで構築した。ベクターの特徴としては、Ｈｙｇｒにプロモーターが付加されていないことから、相同組み換えを起こしたときにフコーストランスポーターのプロモーターによって、Ｈｙｇｒが発現することとなる。しかしながら、相同組み換えによって１コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンＢに対する耐性を獲得するほどＨｙｇｒが発現するとは限らない。なお、ＫＯ１ベクターはＮｏｔ  Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ１ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４１塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
（２）ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｈｙｇｒの作製
ｐＫＪ２ベクター（Ｐｏｐｏ  Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｖｏｌ．２８，ｐ２９９−３０８，１９９０）よりマウスｐｇｋ−１遺伝子のプロモーターをＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｓｔ  Ｉによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｓｔ  ＩサイトにクローニングしてｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１を作製した。ＨｙｇｒはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏよりＨｙｇ５−ＡＶとＨｙｇ３−ＢＨのプライマーでＰＣＲすることによって、Ｈｙｇｒの５’側にＥｃｏＴ２２  ＩサイトとＫｏｚａｋ配列を付加し、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ付加シグナルまでの領域を含む３’側にはＢａｍＨ  Ｉサイトを付加してＨｙｇｒを抜き出した。
フォワードプライマー
Ｈｙｇ５−ＡＶ    ５’−ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号１３０）
リバースプライマー
Ｈｙｇ３−ＢＨ    ５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号１３１）
このＨｙｇｒ（ＥｃｏＴ２２  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ）フラグメントをｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１のＰｓｔ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉサイトに挿入し、ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｈｙｇｒを作製した。
（３）ＫＯ２ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターｖｅｒ．２（以下、ＫＯ２ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクターにフコーストランスポーターの５’側（配列番号１２６に示す塩基配列のＮｏ．２，７８０のＳｍａ  ＩからＮｏ．４，２３２のＢａｍＨ  Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４，２８４からＮｏ．１０，９３４のＳａｃ  Ｉまで）、及びｐｇｋ−１−Ｈｙｇｒフラグメントを各々挿入することで構築した。ＫＯ１ベクターと異なり、ＫＯ２ベクターはＨｙｇｒにｐｇｋ−１遺伝子のプロモーターが付加されていることから、相同組み換えによって１コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンＢに対する耐性を獲得する。なお、ＫＯ２ベクターはＮｏｔ  Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ２ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４６塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
（４）ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒの作製
ｐＰＵＲベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をＰｓｔ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断し、切り出されたフラグメント（Ｐｕｒｏｒ）をｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１のＰｓｔ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉサイトに挿入し、ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒを作製した。
（５）ＫＯ３ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターｖｅｒ．３（以下、ＫＯ３ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクターにフコーストランスポーターの５’側（配列番号１２６に示す塩基配列のＮｏ．２，７８０のＳｍａ  ＩからＮｏ．４，２３２のＢａｍＨ  Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４，２８４からＮｏ．１０，９３４のＳａｃ  Ｉまで）、及びｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒフラグメントを各々挿入することで構築した。なお、ｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒの３’末端には、以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。なお、ＫＯ３ベクターはＮｏｔ  Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ３ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４６塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
リバースプライマー
ＲＳＧＲ−Ａ    ５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  Ｃ−３’（配列番号１３２）
以上の３種類のターゲッティングベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子のノックアウトを試みた。
２．ＣＨＯ細胞へのベクターの導入
ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ  ＨＴ−（インビトロジェン社、ｃａｔ  １２０５２−０９８）にＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）（インビトロジェン社  ｃａｔ．１１０６７−０３０）とペニシリンストレプトマイシン（インビトロジェン社  ｃａｔ．１５１４０−１２２）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ  ＨＴ−の容量に対して、それぞれ１／１００量を加えた。これを培養用の培地（以下、ＳＦＭＩＩ（＋）と称する）としてＣＨＯ細胞のＤＸＢ１１株を継代し、さらに遺伝子導入後の培養もこのＳＦＭＩＩ（＋）で行った。８Ｘ１０６個のＣＨＯ細胞を０．８ｍＬのダルベッコリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す。インビトロジェン社  ｃａｔ  １４１９０−１４４）に懸濁した。細胞懸濁液に３０μｇのターゲッティングベクターを加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（４ｍｍ）（バイオラッド社  ｃａｔ．１６５２０８８）に細胞懸濁液を移した。氷上で１０分間放置した後に、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（バイオラッド社ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３４０ＢＲ）で１．５ｋＶ，２５μＦＤの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を２００ｍｌのＳＦＭＩＩ（＋）培地に懸濁して２０枚の９６穴平底プレート（イワキ社  ｃａｔ．１８６０−０９６）に１００μｌ／ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをＣＯ２インキュベータ内で、２４時間、３７℃で培養した後、薬剤を添加した。
３．ノックアウトの第一段階
ＫＯ１ベクター、もしくはＫＯ２ベクターをそれぞれＣＨＯ細胞に導入し、ベクター導入から２４時間後にハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社  ｃａｔ．１０６８７−０１０）による選抜を行った。ハイグロマイシンＢは０．３ｍｇ／ｍｌになるようにＳＦＭＩＩ（＋）に溶解し、１００μｌ／ウェル添加した。
４．ＰＣＲによる相同組み換え体のスクリーニング
（１）ＰＣＲ用のサンプルの調整
相同組み換え体はＰＣＲ法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いるＣＨＯ細胞は９６穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を５０μｌ／ウェル加えて５５℃、２時間加温し、続いて９５℃、１５分加熱することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲの鋳型とした。細胞溶解用の緩衝液は、１ウェルあたり１０ＸＬＡ緩衝液ＩＩ（タカラ社ＬＡ  Ｔａｑに添付）５μｌ、１０％ＮＰ−４０（ロッシュ社  ｃａｔ．１３３２  ４７３）２．５μｌ、プロティナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、タカラ社  ｃａｔ．９０３３）４μｌ、及び蒸留水（ナカライテスク社  ｃａｔ．３６４２１−３５）３８．５μｌで構成されている。
（２）ＰＣＲの条件
ＰＣＲ反応混合物は上記のＰＣＲサンプル１μｌ、１０ＸＬＡ緩衝液ＩＩ５μｌ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、プライマー（各１０μＭ）２μｌ、ＬＡＴａｑ（５ＩＵ／μｌ  ｃａｔ．ＲＲ００２Ｂ）０．５μｌ、及び蒸留水２９．５μｌ（全５０μｌ）とした。ＫＯ１ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、ＴＰ−Ｆ４とＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１、ＫＯ２ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、ＴＰ−Ｆ４とＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１をＰＣＲプライマーに用いた。
ＫＯ１ベクターを導入した細胞のＰＣＲは、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、及び６０℃にて２分間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７２℃にて７分の複加熱とした。ＫＯ２ベクターを導入した細胞のスクリーニングには９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、及び７０℃にて３分間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７０℃にて７分の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、ＫＯ１ベクターでは、約１．６ｋｂ、ＫＯ２ベクターでは約２．０ｋｂのＤＮＡが増幅される。プライマーはＴＰ−Ｆ４がベクターの外側で、かつ５’側のフコーストランスポーターのゲノム領域に設定し、ＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１、及びＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１はベクター内のＨｙｇｒの中に設定した。
フォワードプライマー（ＫＯ１，ＫＯ２）
ＴＰ−Ｆ４    ５’−ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＣＧＣ−３’（配列番号１３３）
リバースプライマー（ＫＯ１）
ＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１    ５’−ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号１３４）
リバースプライマー（ＫＯ２）
ＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１    ５’−ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＧＡ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＡＧＣ−３’（配列番号１３５）
５．ＰＣＲスクリーニング結果
ＫＯ１ベクターを導入した細胞は９１８個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１個であった（相同組み換え効率は約０．１％）。また、ＫＯ２ベクターを導入した細胞は５３７個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１７個であった（相同組み換え効率は約３．２％）。
６．サザンブロット解析
さらに、サザンブロット法によっても確認を行った。培養した細胞から定法に従ってゲノムＤＮＡを１０μｇ調整し、サザンブロットを行った。配列番号１２６に示す塩基配列のＮｏ．２，１１３−Ｎｏ．２，５００の領域から、以下の二種類のプライマーを用いてＰＣＲ法により３８７ｂｐのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノムＤＮＡはＢｇｌ  ＩＩで切断した。
フォワードプライマー
Ｂｇｌ−Ｆ：５’−ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＧＡＡＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ−３’（配列番号１３６）
リバースプライマー
Ｂｇｌ−Ｒ：５’−ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  Ｃ−３’（配列番号１３７）
Ｂｇｌ  ＩＩによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体からは約３．０ｋｂ、ＫＯ１ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約４．６ｋｂ、ＫＯ２ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約５．０ｋｂのバンドがそれぞれ出現する。ＫＯ１ベクター、及びＫＯ２ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のそれぞれ１、７種類を実験に用いた。ＫＯ１ベクターで唯一獲得された細胞は５Ｃ１と名づけたが、その後の解析により複数の細胞集団から構成されることが明らかになったので、限界希釈によってクローン化し、その後の実験に用いることにした。また、ＫＯ２ベクターで獲得された細胞の一つを６Ｅ２と名付けた。
７．ノックアウトの第二段階
ＫＯ１ベクター、及びＫＯ２ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し、３種類のベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞株の樹立を試みた。ベクターと細胞の組み合わせは、以下の通りである。方法１．ＫＯ２ベクターと５Ｃ１細胞（ＫＯ１）、方法２．ＫＯ２ベクターと６Ｅ２細胞（ＫＯ２）、方法３．ＫＯ３ベクターと６Ｅ２細胞（ＫＯ２）。ベクターをそれぞれの細胞に導入し、ベクター導入から２４時間後にハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン（ナカライテスク社、ｃａｔ．２９４５５−１２）による選抜を開始した。ハイグロマイシンＢは方法１では最終濃度が１ｍｇ／ｍｌ、方法２では最終濃度が７ｍｇ／ｍｌになるようにした。さらに方法３では、ハイグロマイシンＢの最終濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌ、ピューロマイシンの最終濃度が８μｇ／ｍｌになるように添加した。
８．ＰＣＲによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。方法１に関するスクリーニングは、前述のＫＯ１ベクター、及びＫＯ２ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出するＰＣＲを両方行った。方法２に関しては、下記のＰＣＲプライマーを設計した。配列番号１２６に示す塩基配列のＮｏ．３，９２４−３，９５０の領域にＴＰＳ−Ｆ１を、Ｎｏ．４，２４８−４，２７４にＳＨｙｇｒｏ−Ｒ１を設定した。このＰＣＲプライマーによって、ＫＯ２ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの遺伝子領域の３５０ｂｐが増幅される。従って、方法２におけるＰＣＲスクリーニングにおいては、３５０ｂｐが増幅されないものを、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞とみなすことにした。ＰＣＲの条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、７０℃にて１分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７０℃にて７分の複加熱とした。
フォワードプライマー
ＴＰＳ−Ｆ１：５’−ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号１３８）
リバースプライマー
ＳＨｙｇｒｏ−Ｒ１：５’−ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号１３９）
方法３に関しては、フォワードプライマーにＴＰ−Ｆ４、リバースプライマーにＲＳＧＲ−Ａを用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて７分の複加熱とした。ＫＯ３ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、約１．６ｋｂのＤＮＡが増幅される。このＰＣＲでＫＯ３ベクターによって相同組み換えを起こした細胞を検出するとともに、ＫＯ２ベクターでの相同組み換えが残っていることも確認した。
９．ＰＣＲスクリーニング結果
方法１では６１６個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１８個であった（相同組み換え効率は２．９％）。方法２では５２４個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は２個であった（相同組み換え効率は約０．４％）。さらに、方法３では３８２個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は７個であった（相同組み換え効率は約１．８％）。
１０．サザンブロット解析
前述の方法に準じて解析を行った。その結果、解析できた細胞のうち、フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を１つ見出した。第一段階のノックアウトでは、ＰＣＲとサザンブロットの解析結果が一致したが、この第二段階のノックアウトでは、一致しなかった。この原因としては、１．例えば、方法１でＫＯ１、ＫＯ２のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在している、２．フコーストランスポーター遺伝子が一対（２遺伝子）ではなく複数対（あるいは３遺伝子以上）存在する、３．第一段階のノックアウトが成功した細胞株を培養していると、継代中に残ったフコーストランスポーター遺伝子がコピー数を増やすことなどの可能性が考えられた。
１１．フコースの発現解析
さらに、ＰＣＲで相同組み換え体と判断された２６の細胞におけるフコースの発現を解析した．５μｇ／ｍＬのＬｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＦＩＴＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベクターラボラトリー社  ｃａｔ．ＦＬ−１０４１）、２．５％のＦＢＳ、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ溶解液と称する）１００μｌで１×１０６個の細胞を氷冷中で１時間染色した。その後、ＦＡＣＳ溶解液で細胞を３回洗浄してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）で測定を行った。その結果、サザンブロット解析でフコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損していろと判断された細胞のみ、フコースの発現が低下していることが明らかになった。
以上の結果より以下のことが判明した。
フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠失していろ細胞は１株しかなく、スクリーニングした数が６１６個であったことを考えると、相同組み換えの頻度は約０．１６％と低い結果になった。第二段階のノックアウトで、ＰＣＲとサザンブロットの解析結果が一致しなかった理由は、前述のようにいくつか考えられるが、方法３においては、２種類の薬剤で選抜しているため、得られた細胞株がＫＯ２ベクター、ＫＯ３ベクターのそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在しているとは考えられない。また、その他のＰＣＲで相同組み換えを起こしたと判断された細胞株もすべて、複数の細胞集団から構成されているとは考えにくい。前述のようにフコーストランスポーター遺伝子が３以上存在した場合には、細胞におけるターゲッティングは格段に難しくなり、ＫＯ１ベクターのようなＨｙｇｒが発現しにくいもの使用し、なおかつ数多くのスクリーニングを行わないと相同組み換え体が得られないものと考えられた。
【図１】
0004794457.tif 000005
【図２】
0004794457.tif 000006
【図３】
0004794457.tif 000007
【図４】
0004794457.tif 000008
【図５】
0004794457.tif 000009
【図６】
0004794457.tif 000010
【図７】
0004794457.tif 000011
【配列表】
0004794457000001.xml