(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸残基21−452を含んで成る、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記単離されたポリペプチドが、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基21−677、及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基1−692から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基21−452に対してカルボキシル−末端位置に存在する、配列番号２のアミノ酸残基453−473を含んで成るトランスメンブランドメインをさらに含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、前記トランスメンブランドメインに対してカルボキシル−末端位置に存在する、配列番号２のアミノ酸残基474−677を含んで成る細胞内ドメインをさらに含んで成る請求項３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基21−452に対してアミノ−末端位置に存在する、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−20を含んで成るシグナル分泌配列をさらに含んで成る請求項４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基21−677を含んで成るアミノ酸配列をコードする核酸分子、及び（ｃ）配列番号１のヌクレオチド214−2184のヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド214−2184の相補体を含んで成る核酸分子に対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズされたまま存続する核酸分子から成る群から選択された、Zcytor14ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項６記載の単離された核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸残基21−452を含んで成るアミノ酸配列をコードする核酸分子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターであって、前記プロモーターが前記核酸分子により操作可能的に連結され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターにより操作可能的に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターを含んで成る組換えウィルス。
【請求項１０】
細菌、酵母細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択された、請求項８記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項１１】
Zcytor14タンパク質を生成するために請求項８記載の発現ベクターを用いる方法であって、前記発現ベクターを含んで成り、そして前記Zcytor14タンパク質を生成する組換え宿主細胞を培養する段階を含んで成る方法。
【請求項１２】
請求項１記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸残基21−452から成る単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３記載の単離されたポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１３記載の単離されたポリペプチド及び免疫グロブリン成分を含んで成る融合タンパク質。
【請求項１６】
免疫グロブリン成分が、免疫グロブリン重鎖不変領域である、請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記免疫グロブリン重鎖不変領域が、Fcフラグメントである、請求項１６記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は一般的に、ヒト細胞により発現される新規タンパク質に関する。特に、本発明は、“Zcytor 14”と称する受容体をコードする新規遺伝子、及びZcytor 14ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【０００２】
発明の背景：
サイトカインは、多くの細胞型の増殖及び分化の調節を包含する種々の生物学的効果を仲介する可溶性の小さなタンパク質である（例えば、Araiなど., Annu. Rev. Biochem. 56: 783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76: 241 (1994) を参照のこと）。サイトカイングループを構成するタンパク質は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子及び他の調節分子を包含する。例えば、ヒトインターロイキン−17は、インターロイキン−６、細胞内付着分子１、インターロイキン−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現、及びプロスタグランジンE2発現を刺激し、そしてCD34+造血前駆体の好中球への選択的成熟において役割を演じるサイトカインである。（Yaoなど., J. Immunol. 155: 5483 (1995); Fossiez など., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996)）。
【０００３】
サイトカインを結合する受容体は典型的には、高い親和性でサイトカインを結合し、そしてこの結合現象を、一定の受容体サブユニットの細胞質部分を通して細胞にトランスダクションする１又は複数の膜内在性タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、いくつかのクラスに分類されている。例えば、インターフェロンの結合及び/又はその効果のトランスダクションを担当する受容体鎖は、特徴的な200個の残基の細胞外ドメインに基づいて、タイプIIサイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【０００４】
サイトカイン及びそれらの受容体の明らかにされたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの臨床学的可能性及びそれらについての必要性を示す。
【０００５】
発明の要約：
本発明は、“Zcytor 14”と称する新規受容体を提供する。本発明はまた、Zcytor 14ポリペプチド及びZcytor 14融合タンパク質、並びにそのようなポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子、及びそれらの核酸分子及びアミノ酸配列の使用方法を提供する。
【０００６】
発明の特定の記載：
１．概観：
Zcytor 14をコードする実例のヌクレオチド配列は、配列番号１により提供される。コードされるポリペプチドは、次ぎのアミノ酸配列を有する：
【０００７】
【表１】
0004737903.tif 000002
【０００８】
従って、Zcytor 14遺伝子は、692個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。Zcytor 14の特徴は、推定上のシグナル配列（配列番号２のアミノ酸残基１−20）、細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基21−452）、トランスメンブランドメイン（配列番号２のアミノ酸残基453−473）、及び細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基）を包含する。
次ぎのアミノ酸配列を有する、“Zcytor 14-1”と称する変異体Zcytor 14タンパク質が同定されている：
【０００９】
【表２】
0004737903.tif 000003
【００１０】
このポリペプチドをコードする実例のヌクレオチド配列は、配列番号４により提供される。
配列分析は、Zcytor 14-1が受容体ポリペプチドの切断された形であることを示した。すなわち、Zcytor 14-1は、配列番号２のアミノ酸残基1−113を欠いている。配列番号10は、Zcytor 14のN−末端部分を含むZcytor 14-1ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００１１】
Zcytor 14及びZcytor 14-1アミノ酸配列の比較はまた、それらの２種のポリペプチドが他方では、スプライシングされた変異体であることを示した。Zcytor 14のアミノ配列は、Zcytor 14-1が欠いている17個のアミノ酸セグメント（配列番号２のアミノ酸残基339−355）を含み、そしてZcytor 14は、Zcytor 14-1に見出される、アミノ酸339に続く13個のアミノ酸セグメント（配列番号５のアミノ酸残基350−362）を欠いている。両アミノ酸セグメントを含むポリペプチドは配列番号11により供給され、そして配列番号12は13個及び17個の両アミノ酸セグメントを欠いているポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００１２】
Zcytor 14遺伝子は染色体3p25−3p24に存在する。下記に論じられるように、この領域は、種々の障害及び疾病に関連している。
ノザン分析は、甲状腺、副腎、前立腺及び肝臓組織においてZcytor 14遺伝子の強い発現が存在し、そして心臓、小腸、胃及び気管組織においては、低い発現が存在することを示す。対照的に、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢白血球、脊髄、リンパ節及び骨髄における発現はほとんどか又はまったく存在しない。それらの観察は、Zcytor 14配列が種々の組織間で分化することを示す。
【００１３】
下記のように、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基21−452、（ｂ）配列番号10のアミノ酸残基21−435、（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基21−677、及び（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基1−692から成る群から選択された対照アミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、又は少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含んで成る、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号10のアミノ酸配列のいずれかから成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。例示的なポリペプチドは、配列番号２，10，11及び12から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを包含する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基21−452、又は配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基21−435のいずれかを含んで成る細胞外ドメインを含んで成るポリペプチドにも関する。そのようなポリペプチドは、前記細胞外ドメインに関してカルボキシル−末端位置に存在する、配列番号２のアミノ酸残基453−473を含んで成るトランスメンブランドメインをさらに含んで成る。それらのポリペプチドはまた、前記トランスメンブランドメインに関してカルボキシル−末端位置に存在する、配列番号２のアミノ酸残基474−677又は配列番号10のアミノ酸残基457−673のいずれかを含んで成る細胞内ドメイン、及び任意には、前記細胞外ドメインに関してアミノ−末端位置に存在する、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−20を含んで成るシグナル分泌配列を含んで成る。
【００１５】
本発明はまた、変異体Zcytor 14ポリペプチドを包含し、ここで前記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性又は95％以上の同一性から成る群から選択された、配列番号２のアミノ酸配列との同一性を共有し、そして前記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列との間のいずれかの差異は１又は複数の保存性アミノ酸置換によるものである。
【００１６】
本発明はさらに、そのようなポリペプチドと特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントを提供する。典型的な抗体は、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体に由来するヒト適合された抗体及びヒトモノクローナル抗体を包含する。例示的な抗体フラグメントは、F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab ，Fv, scFv及び最少認識単位を包含する。本発明はさらに、キャリヤー、及び本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗−イディオタイプ抗体を含んで成る組成物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基21−677又は配列番号10のアミノ酸残基21−673のいずれかを含んで成るアミノ酸配列をコードする核酸分子、及び（ｃ）配列番号１のヌクレオチド214−2184のヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド214−2184の補体を含んで成る核酸分子に対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズされたまま存続する核酸分子から成る群から選択された、Zcytor14ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。例示的な核酸分子は、核酸分子（ｃ）によりコードされるアミノ酸配列と配列番号２のその対応するアミノ酸配列との間のいずれかの差異が保存性アミノ酸置換のためであるそれらの核酸を包含する。本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド214−2184、又は配列番号１のヌクレオチド154−2184を含んで成る単離された核酸分子にも関する。
【００１８】
本発明はまた、そのような核酸分子を含んで成るベクター及び発現ベクターを包含する。そのような発現ベクターは、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記核酸分子に操作可能的に連結され、そして前記核酸分子が転写ターミネーターに操作可能的に連結される。本発明はさらに、それらのベクター及び発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞及び組換えウィルスを包含する。例示的な宿主細胞は、細菌、酵母、菌類、昆虫、哺乳類、及び植物細胞を包含する。そのような発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞は、発現ベクターを含んで成り、そしてZcytor 14タンパク質を生成するそのような組換え宿主を培養し、そして任意には、その培養された宿主細胞からZcytor 14タンパク質を単離することによって、Zcytor 14ポリペプチドを調製するために使用され得る。
【００１９】
さらに、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー、及び少なくとも１つのそのような発現ベクター、又はそのような発現ベクターを含んで成る組換えウィルスを含んで成る医薬組成物を提供する。本発明はさらに、医薬的に許容できるキャリヤー及び本明細書に記載されるポリペプチドを含んで成る医薬組成物を包含する。
【００２０】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるZcytor 14RNAの存在を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）Zcytor 14核酸プローブと、（i）前記生物学的サンプルから単離された試験RNA分子、又は（ii）前記単離されたRNA分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ、ここで前記プローブが、配列番号１のヌクレオチド配列の一部、又はその相補体から成るヌクレオチド配列を含んで成り；そして（ｂ）前記核酸プローブ、及び前記試験RNA分子又は合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出し、ここで前記ハイブリッドの存在が前記生物学的サンプルにおけるZcytor 14 RNAの存在を示す。
【００２１】
本発明はさらに、生物学的サンプルにおけるZcytor 14の存在を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）前記生物学的サンプルと、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体、又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触が、前記生物学的サンプルへの前記抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われ、そして（ｂ）前記結合された抗体又は結合された抗体フラグメントのいずれかを検出する段階を含んで成る。そのような抗体又は抗体フラグメントはさらに、放射体同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセントラベル、酵素ラベル、生物ルミネセントラベル及びコロイド状金から成る群から選択された検出できるラベルを含んで成る。
【００２２】
本発明はまた、それらの検出方法を行うためのキットを提供する。例えば、Zcytor 14遺伝子発現の検出のためのキットは、核酸分子を含んで成る容器を含んで成り、ここで前記核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド214−2184のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド214−2184の補体を含んで成る核酸分子、（ｃ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ａ）のフラグメントである核酸分子、及び（ｄ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ｂ）のフラグメントである核酸分子から成る群から選択される。そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含んで成る。他方では、Zcytor 14タンパク質の検出のためのキットは、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントを含んで成る容器を含んで成る。
【００２３】
本発明はまた、配列番号２又は配列番号10のアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを特異的に結合する、抗−イディオタイプ抗体又は抗−イディオタイプ抗体フラグメントも企画する。
【００２４】
本発明はさらに、Zcytor 14分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び生物学的活性のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を包含し、ここで前記Zcytor 14分泌シグナル配列は、配列番号２の残基１〜20のアミノ酸配列を含んで成る。生物学的活性のポリペプチドは、第VIIa因子、プロインスリン、インスリン、卵胞刺激ホルモン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、エリトロポエチン、及びトロンボポエチンを包含する。さらに、本発明は、Zcytor 14分泌シグナル配列及びポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を提供し、ここで前記Zcytor 14分泌シグナル配列は、配列番号２の残基１〜20のアミノ酸配列を含んで成る。
【００２５】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸残基21−452又は配列番号10のアミノ酸残基21−435のいずれかを含んで成る細胞外Zcytor 14ドメインをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸残基21−452、又は配列番号10のアミノ酸残基21−435のいずれかから成る単離されたポリペプチド、そのようなポリペプチドを特異的に結合する抗体、及びそのような抗体と特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体を包含する。
【００２６】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸残基21−452又は配列番号10のアミノ酸残基21−425のいずれかを含んで成るZcytor 14細胞外ドメイン及び免疫グロブリン成分を含んで成る融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質においては、免疫グロブリン成分は、免疫グロブリンH鎖不変領域、例えばヒトFcフラグメントであり得る。本発明はさらに、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を包含する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次ぎの詳細な記載に基づいて明らかになるであろう。
【００２７】
２．定義：
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。
【００２８】
核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばDNA及びRNA）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び/又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。
【００２９】
塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００３０】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“contig ”とは、他の核酸分子に対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有する核酸分子を示す。連続した配列とは、核酸分子の全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの核酸分子を“オーバーラップ”すると言われる。
【００３１】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
【００３２】
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーRNA（mRNC）に転写される核酸分子を言及する。
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子が、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００３３】
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
“線状DNA”とは、遊離5’及び3’及び末端を有する非環状DNA分子を示す。線状DNAは、閉環DNA分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な破壊により調製され得る。
【００３４】
“相補的DNA（cDNA）”とは、逆転写酵素によりmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖DNA分子及びその相補的DNA鎖から成る二本鎖DNA分子を言及するために用語“cDNA”を用いる。用語“cDNA”はまた、RNA鋳型から生成されたcDNA分子のクローンも言及する。
【００３５】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の5’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。それらのプロモーター要素は、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化−特異的要素（DSE：McGeheeなど., Mol. Endocrinol. 7: 511 (1993)）、サイクリックのAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE：Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)）、グルココルチコイド応答要素（GRE）及び他の転写因子のための結合部位、例えばCRE/ATF（O’Reillyなど., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)）、AP2 (Yeなど., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)）、及びオクタマー因子（一般的には、Watsonなど., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Kummings Publishing Company, Inc. 1987), and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)）を包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００３６】
“コアプロモーター”は、TATAボックス及び転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
【００３７】
“調節要素”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織又はオルガネラにおいて独占的に又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。それらのタイプの調節要素は通常、“細胞−特異的”、“組織−特異的”、又は“オルガネラ−特異的”態様で発現される遺伝子に結合されている。例えば、Zcytor 14プロモーターは、腎臓、膵臓又は脾臓組織に対して、甲状腺、副腎、前立腺及び肝臓組織において、操作可能的に結合された遺伝子の発現を高い程度、刺激すべきである。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００３８】
“異種DNA”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、DNA分子又はDNA分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外来性DNA）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性DNA）に由来するDNAを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主DNAセグメントに操作可能的に連結されるポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であると思われる。逆に言えば、異種DNA分子は、外来プロモーターと操作可能的に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種DNAであると思われる。
【００３９】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００４０】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“組み込まれた遺伝子要素”とは、その要素がヒト操作を通して細胞中に導入された後、宿主細胞の染色体中に組み込まれているDNAのセグメントである。本発明においては、組み込まれた遺伝子要素は通常、エレクトロポレーション又は他の技法により細胞中に導入される線状化されたプラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子要素は、元の宿主細胞からその子孫に通過される。
【００４１】
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００４２】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“操作可能的に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、操作可能的に連結される。
【００４３】
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。本明細書においては、組換え宿主の例は、発現ベクターからZcytor 14を生成する細胞である。対照的に、Zcytor 14は、Zcytor 14の“天然源”であり、そして発現ベクターを欠いている細胞により生成さえ得る。
“インテグレイティブ組換え体”は、異種DNAが細胞ゲノムDNA中に組み込まれるようになる組換え宿主細胞である。
【００４４】
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスを結合するポリペプチドにより融合されるZcytor 14ポリペプチドの少なくとも一部を含むことができる。そのような融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーを用いて、多量のZcytor 14を単離するための手段を提供する。
【００４５】
用語“受容体”とは、“リガンド”と称する生物活性分子に結合する、細胞結合されたタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を介在する。受容体は、膜結合されたシトソール又は核；モノマー（例えば、胸腺刺激性ホルモン受容体、β−アドレナリン作用受容体）又はマルチマー（例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体IL−３受容体、GM−CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポエチン受容体及びIL−６受容体）であり得る。膜結合された受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多−ドメイン構造により特徴づけられる。一定の膜結合された受容体においては、細胞外リガンド−結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含んで成る別々のポリペプチドに位置する。
【００４６】
一般的に、受容体へのリガンドの結合は、細胞の代謝における変更を導く、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体のコンホメーション変化をもたらす。受容体−リガンド相互作用にしばしば連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMPを生成の上昇、細胞カルシウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を包含する。
【００４７】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００４８】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％以上の純度、又は99％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００４９】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はmRNAへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を包含する。
【００５０】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語“イムノモジュレータ−”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時−刺激分子、造血因子及びそれらの分子の合成類似体を包含する。
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプテン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０9Ｍ-1の結合親和性を有する。
【００５２】
“抗−イディオタイプ抗体”とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書においては、抗−イディオタイプの抗体は、抗−Zcytor 14抗体の可変領域と結合し、そして従って、抗−イディオタイプ抗体はZcytor 14のエピトープを模倣する。
“抗体フラグメント”は、抗体の一部、例えばF(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Aab及び同様のものである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損なわれていない抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗−Zcytor 14モノクローナル抗体フラグメントは、Zcytor 14のエピトープと結合する。
【００５３】
用語“抗体フラグメント”はまた、特定の抗原に結合する、合成の又は遺伝的に構築されたポリペプチド、例えばL鎖可変領域から成るポリペプチド、H及びL鎖の可変領域から成る“Fv”フラグメント、L及びH鎖可変領域がペプチドリンガーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（“svFvタンパク質”）、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を包含する。
“キメラ抗体”は、囓歯動物抗体に由来する種々のドメイン及び相補的決定領域を含む組換えタンパク質であるが、ところが抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
【００５４】
“ヒト適合された抗体”は、モノクローナル抗体のネズミ相補的決定領域がネズミ免疫グロブリンのH及びL可変鎖からヒト可変ドメインに移行されている組換えタンパク質である。
本明細書において使用される場合、“治療剤”は、治療のために有用である接合体を生成するために抗体成分に接合される分子又は原子である。治療剤の例は、薬剤、毒素、イムノモジュレーター、キレート化剤、硼素化合物、光活性剤又は染料、及び放射生同位体を包含する。
“検出できるラベル”は、診断のために有用な分子を生成するために抗体成分に接合され得る分子又は原子である。検出できるラベルの例は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン又は他のマーカー成分を包含する。
【００５５】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００５６】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,  EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など.,  Methods  Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlagTM ペプチド（Hoppなど.,  Biotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein  Expression  and  Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードする核酸分子は、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
【００５７】
“裸の抗体”は、抗体フラグメントに対立するものとして、治療剤により接合されない完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びに一定の組換え抗体、例えばキメラ性及びヒト適合された抗体を包含する。
本明細書において使用される場合、用語“抗体成分”は、完全な抗体及び抗体フラグメントの両者を包含する。
“免疫接合体”は、治療剤又は検出できるラベルと抗体成分との接合体である。
【００５８】
本発明において使用される場合、用語“抗体融合タンパク質”とは、抗体成分及びZcytor 14ポリペプチド成分を含んで成る組換え分子を言及する。抗体融合タンパク質の例は、Zcytor 14細胞ドメイン、及びFcドメイン又は抗原−結合領域のいずれかを含んで成るタンパク質を包含する。
“標的ポリペプチド”又は“標的ペプチド”は、少なくとも１つのエピトープを含み、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞、又は感染剤抗原を担持する細胞上で発現されるアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに、主要組織適合性複合体分子により提供されるペプチドエピトープを認識し、そして典型的には、標的細胞を溶解し、又は標的細胞の例に他の免疫細胞を補充し、それにより標的細胞を殺害する。
【００５９】
“抗原性ペプチド”は、T細胞により認識されるMHC−ペプチド複合体を形成するために、主要組織適合複合体分子を結合し、それにより、T細胞への提供に基づいて細胞毒性リンパ球応答を誘発するペプチドである。従って、抗原性ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、そして細胞毒性T細胞応答、例えば抗原を結合するか又は発現する標的細胞に対する細胞溶解又は特異的サイトカイン開放を誘発することができる。抗原性ペプチドは、抗原提供細胞又は標的細胞上に、クラスI又はクラスII主要組織適合性複合体分子に関して結合され得る。
【００６０】
真核生物においては、RNAポリメラーゼIIは、mRNAを生成するために構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子はRNAポリメラーゼII鋳型を含むより企画され、ここでRNA転写体は特定のmRNAの配列に対して相補的である配列を有する。RNA転写体は、“アンチセンスRNA”と呼ばれ、そしてアンチセンスRNAをコードする核酸分子は“アンチセンス遺伝子”と呼ばれる。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合することができ、mRNA翻訳の阻害をもたらす。
【００６１】
“Zcytor 14に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“Zcytor 14アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）Zcytor 14遺伝子の一部と共に安定した三量体を形成できるか、又は（ｂ）Zcytor 14遺伝子のmRNA転写体の一部と共に安定した二量体を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
“リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己分解性RNA及びそれらの触媒機能を行う核酸分子を包含する。
“外部案内配列”は、細胞内mRNAの特定種に内因性リボザイム、すなわちRNアーゼPを方向づけ、RNアーゼPによるmRNAの分解をもたらす核酸分子である。外部案内配列をコードする核酸分子は、“外部案内配列遺伝子”と呼ばれる。
【００６２】
用語“変異体Zcytor 14遺伝子”は、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。そのような変異体は、天然に存在する多型現象のZcytor 14遺伝子、及び配列番号２のアミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を含む合成遺伝子を包含する。Zcytor 14遺伝子の追加の変異体形は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の挿入又は欠失を含む核酸分子である。変異体Zcytor 14遺伝子は、その遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその補体と、緊縮条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定され得る。
【００６３】
他方では、変異体Zcytor 14遺伝子は、配列−比較により同定さえ得る。２つのアミノ酸配列は、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の応答により整列される場合、同じである場合、“100％のアミノ酸配列同一性”を有する。配列比較は、標準のソフトウェアプログラム、例えばDNASTAR（Madison, Wisconsin）により製造されるLASERGENE生物情報コンピューターサイトに包含されるそれらのプログラムを用いて行われ得る。
【００６４】
最適な整列を決定することによって、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に良く知られている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu など. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins.” In Methods in Gene Biotechnology, Pages 123-151 (CRC Press. Inc. 1997), 及びBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998) を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法は下記に記載される。
【００６５】
変異体Zcytor 14遺伝子又は変異体Zcytor 14ポリペプチドを同定するために使用される特定の方法にもかかわらず、変異体遺伝子又はそれによりコードされるポリペプチドは、その抗−ウィルス又は抗−増殖活性により、又は抗−Zcytor 14抗体に対して特異的に結合する能力により機能的に特徴づけられる。
【００６６】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされたポリペプチドにおける変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００６７】
用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（paralogs）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００６８】
本発明は、Zcytor 14遺伝子の機能的フラグメントを包含する。本発明においては、Zcytor 14遺伝子の“機能的フラグメント”は、本明細書に記載されるドメインであるか、又は抗−Zcytor 14抗体と少なくとも特異的に結合する、Zcytor 14ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を言及する。
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”X又は“およそ”Xとして表される場合、Xの言及された値は、±10％で正確であると理解されるであろう。
【００６９】
３．Zcytor 14遺伝子の生成：
ヒトZcytor 14遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１及び４に基づいてのポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。それらの技法は、標準であり、そして十分に確立されている。
【００７０】
例示されるように、ヒトZcytor 14遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトcDNAライブラリーから単離され得る。この場合、第１段階は、当業者に良く知られている方法を用いて、組織、例えば甲状腺、副腎、前立腺又は肝臓組織からRNAを単離することによって、cDNAライブラリーを調製することである。一般的に、RNA単離技法は、細胞を分解するための方法、RNAのRNアーゼ指図された分解を阻害するための手段、及びDNA、タンパク質及び多糖類汚染物からRNAを分離する方法を提供すべきである。
【００７１】
例えば、全RNAは、液体窒素において組織を凍結し、その凍結された組織を乳針及び乳棒により粉砕し、細胞を溶解し、フェノール/クロロホルムの溶液により前記粉砕された組織を抽出し、タンパク質を除き、そして塩化リチウムによる選択的沈殿によりRNAを残る不純物から分離することによって単離され得る（例えば、Ausubel など., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition pages4-1〜4-6  (John Wiley& Sons 1995 )[“Ausubel (1995)”]; Wuなど., Methods in Gene Biotechnology, pages33-41 (CRC Press, Inc. 1997 ) [“Wu(1997)”]を参照のこと）。
【００７２】
他方では、全RNAは、粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートにより抽出し、有機溶媒により抽出し、そしてRNAを汚染物から示差遠心分離により分離することによって単離され得る（例えば、Chirgwinなど., Biochemistry 18: 52 (1979); Ausubel (1995) P.4-1〜4-6; Wu (1997) P.33-41 を参照のこと）。
【００７３】
cDNAライブラリーを構成するために、ポリ(A)+RNAが全RNA調製物から単離されるべきである。ポリ(A)+RNAは、オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィーの標準技法を用いて、全RNAから単離され得る（例えば、Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad.Sci. USA69: 1408 (1972); Ausubel (1995) P. 4-11〜4-12を参照のこと）。
【００７４】
二本鎖cDNA分子は、当業者に良く知られている技法を用いて、ポリ(A)+RNAから合成される（例えば、Wu (1997) P.41-46を参照のこと）。さらに、市販のキットが、二本鎖cDNA分子を合成するために使用され得る。例えば、そのようなキットは、Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) 及びSTRATAGENE (La Jolla, CA) から入手できる。
【００７５】
種々のクローニングベクターが、cDNAライブラリーの構成のために適切である。例えば、cDNAライブラリーは、バクテリオファージに由来するベクター、例えばλgt10バクターにおいて調製され得る。例えば、Huynhなど., “Construction and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λ11” in DNA Cloning: A Practica Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) at pages 47-52 を参照のこと。
他方では、二本鎖cDNA分子は、プラスミドベクター、例えばPBLUESCRIPTベクター（STRATAGENE；La Jolla, CA）, LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) 又は他の市販のベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、American Type Culture Collection (Manassas. VA) から入手できる。
【００７６】
クローン化されたcDNA分子を増幅するために、cDNAライブラリーが、標準技法を用いて、原核宿主中に挿入される。例えば、cDNAライブラリーは、例えばLife Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) から得られるコンピテントE.コリDH5細胞中に導入され得る。
ヒトゲノムライブラリーは、当業界において良く知られている手段により調製され得る（例えばAusubel (1995) p. 5-1〜5-6; Wu (1997) p. 307-327を参照のこと）。ゲノムDNAは、界面活性剤Sarkosylにより組織を溶解し、その溶解物をプロテイナーゼKにより消化し、不溶性残骸を溶解物から遠心分離により清浄し、イソプロパノールを用いて溶解物から核酸を沈殿し、そして塩化セシウム密度グラジエント上で再懸濁されたDNAを精製することによって単離され得る。
【００７７】
ゲノムライブラリーの生成のために適切であるDNAフラグメントは、ゲノムDNAのランダム剪断により、又は制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNAの部分消化により得られる。ゲノムDNAフラグメントは、従来の技法、例えば適切な末端を供給するために制限酵素消化の使用、DNA分子の所望しない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処理の使用、及び適切がリガーゼによる連結に従って、ベクター、例えばバクテリオファージ又はコスミドベクター中に挿入され得る。そのような操作のための技法は当業界において良く知られている（例えば、Ausubel (1995) p. 5-1〜5−6; Wu (1997) p. 307-327 を参照のこと）。
他方では、ゲノムライブラリーは、市販源、例えばResearch Genetic (Huntsville, AL) 及びATCC (Marassas, VA) から得られる。
【００７８】
cDNA又はゲノムクローンを含むライブラリーは、標準方法を用いて、配列番号１及び４に基づかれる１又は複数のポリヌクレオチドプローブによりスクリーンされ得る（例えば、Ausubel (1995) p. 6-1〜6-11を参照のこと）。
Zcytor 14遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書に記載されるように、Zcytor 14遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーによるポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いて得られる。
【００７９】
PCRによるライブラリーのスクリーニングの一般的方法は、例えば、Yuなど., “Use of The Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries”. In Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Application, White (ed.), p.211-215 (Humana Press, Inc. 1993)により提供される。さらに、関連する遺伝子を単離するためへのPCRの使用の技法は、例えばPreston, “Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols; Current Metods and Applications. White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993) により記載される。
【００８０】
下記のようにして生成された抗−Zcytor 14抗体はまた、cDNAライブラリーからのZcytor 14遺伝子をコードするDNA配列を単離するためにも使用され得る。例えば、抗体はλgt11発現ライブラリーをスクリーンするために使用され、又は抗体はハイブリッド選択及び翻訳に続くイムノスクリーニングのために使用され得る（例えば、Ausubel（1995）p.6-12〜6-16; Margolis など., “Screening λ expression libraries with untibody and Protein Probes” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など (eds.) p. 1-14 (Oxford University Press 1995) を参照のこと）。
【００８１】
他に、Zcytor 14遺伝子は、お互いプライムする長いオリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載されるヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することによって得られる（例えば、Ausubel (1995) p.8-8〜8-9を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応を用いての確立された技法は、少なくとも２kbの長さのDNA分子を合成する能力を提供する（Adang など., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993). Bambot など., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dilfon など., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Constrauction of Synthetic Genes,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. White (ed.), Pages 263-268. (Humana Press. Inc. 1993), 及びHolowachukなど., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)。
【００８２】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミジット方法のようなプロトコールを用いて、“遺伝子機会”により合成され得る。化学的に合成される二本鎖DNAが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のような用途のために必要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（60〜80の塩基対）の生成は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、長い遺伝子（300以上の塩基対）の生成に関しては、化学的DNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、特殊な手段が必要とされる。この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュラー形でアセンブルされる。
【００８３】
ポリヌクレオチド合成の再考のためには、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura など., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), などClimie など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990) を参照のこと。
【００８４】
Zcytor 14 cDNA又はZcytor 14ゲノムフラグメントの配列は、標準の方法を用いて決定され得る。本明細書に開示されるZcytor 14ポリヌクレオチド配列はまた、Zcytor 14遺伝子の5’側の非−コード領域をクローン化するためのプローブ又はプライマーとして使用され得る。Zcytor 14遺伝からのプロモーター要素は、例えば乳腫瘍組織又はトランスジェニック動物、又は遺伝子治療を受けている患者において異種遺伝子の発現を方向づけるために使用され得る。Zcytor 14プロモーター又は調節要素を含むゲノムフラグメントの同定は、十分に確立された技法、例えば欠失分析を用いて達成され得る（一般的には、Ausubel (1995) を参照のこと）。
【００８５】
5’側フランギング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第5,641,670号に開示される方法に従って、“遺伝子活性化”によるZcytor 14タンパク質の生成を促進する。手短くに言及すれば、細胞における内因性Zcytor 14遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、及び対になっていないスプライスドナー部位を含んで成るDNA構造体を、Zcytor 14遺伝子座中に導入することによって変更される。標的配列は、内因性Zcytor 14遺伝子座を有する構造体の相同組換えを可能にするZcytor 14 5’側非コード配列であり、それにより、前記構造体内の配列は内因性Zcytor 14コード配列により操作可能的に連結されるようになる。この場合、内因性Zcytor 14プロモーターが、他の調節は列により置換されるか又はそれにより補充され、増強された組織特異的、又は他方では、調節された発現が提供される。
【００８６】
４．Zcytor 14遺伝子変異体の生成：
本発明は、本明細書に開示されるZcytor 14ポリペプチドをコードする種々の核酸分子、例えばDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３は、それぞれ配列番号２のZcytor 14ポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者は、配列番号３の縮重配列がまた、Tに代わってUを置換することによって、それぞれ配列番号２をコードするすべてのRNA配列を提供することを認識するであろう。
【００８７】
従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド154〜2229、及びそれらのRNA同等物を含んで成るZcytor 14ポリペプチド−コード核酸分子を企画する。同様に、配列番号６のZcytor 14−１縮重配列はまた、UとYとを置換することによって、配列番号５をコードするすべてのRNA配列を提供する。
第１表は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３及び６内に使用される1文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードYはC又はTのいずれかを示し、そしてその補体RはA又はGを示し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
【００８８】
【表３】
0004737903.tif 000004
所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号３に使用される縮重コドンが第２表に示される。
【００８９】
【表４】
0004737903.tif 000005
【００９０】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２、５及び10〜12のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【００９１】
異なった種は“選択的コドン使用法”を示すことができる。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980; Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 199６;  Wain−Hobson、など.,Gene  13：355−64，1981；Grosjean  and  Fiera，Gene  18：199−209、1982；Holm,Nuc．Acids  Res．14：3075−87、1986；Ikemura，Ｊ．Mol．Biol．158：573−97，1982、Sharyp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494(1995), 及びMakrides, Microbiol. Rev. 60: 512(1996) を参照のこと。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(表２を参照のこと)。例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったThrコドンが好ましい。
【００９３】
特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００９４】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物を表すポリペプチド及び核酸分子を供給する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのZcytor 14ポリペプチドである。ヒトZcytor 14ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃDNAは、Zcytor 14を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用いてクローン化され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。
【００９５】
Zcytor 14コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なZcytor 14ｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示される代表的なZcytor 14配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応を用いてもクローン化され得る。さらに、cDNAライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDNAの発現がZcytor 14ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。
【００９６】
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトZcytor 14の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の範囲内である。
【００９７】
Zcytor 14ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００９８】
本発明の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。例えば、そのような核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、配列番号１のヌクレオチド154−2229のヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド154−2229を含んで成る核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。
【００９９】
１対の核酸分子、例えばDNA-DNA, RNA-RNA及びDNA-RNAは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのTmは、１〜1.5％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。
【０１００】
緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（Tm）よりも約５〜25℃低い温度、及び１MまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのTmを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、20〜70℃の温度、及び６×SSC及び０〜50％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。高い程度の緊縮性は、40〜70℃の温度で及び４×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。
【０１０１】
高い緊縮条件は典型的には、42〜70℃の温度、及び１×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【０１０２】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのTmは、標的配列の50％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下での）である。Tmに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【０１０３】
Tmを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのDNA、RNA及びDNA−RNAハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1988)； Ausubel など., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照のこと）。
【０１０４】
配列分析ソフトウェア、例えばOLIGO6.0（LSR; Long Lake, MN）及びPrimer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてTmを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、50以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたTmよりも約20〜25℃低い温度で行われる。50以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Tm又はそれよりも５〜10℃以下で行われる。これは、DNA−DNA及びDNA−RNAハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１０５】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼす。小さなプローブ配列、すなわち50個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベーション時間（およそ分〜時）が、ハイブリッド形成を達成するために使用され得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコット時間の３倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により、特定の配列について計算され得る。
【０１０６】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもたらし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。A−T対は、塩化ナトリウムを含む水溶液においてG−C対よりも低い安定性である。従って、G−C含有率が高いほど、ハイブリッドはより安定する。配列内のG及びC残基の平等な分布がまた、ハイブリッド安定性に正に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のTmを変えるために操作され得る。例えば５−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンはTmを高めるためにチミジンにより置換され、そして７−デアズ−2’−デオキシグアノシンは、Tmに対する依存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブッリドの安定性に影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばDenhardt溶液（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）、変性されたサケ精子DNA、粉乳（BLOTTO）、ヘパリン又はSDS、及びNa+源、例えばSSC（１×SSC：0.15：NのNaCl、15mMのクエン酸ナトリウム）又はSSPE（１×SSPE：1.8MのNaCl、10mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.7）を含む。典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、10mM〜１MのNa+を含む。
【０１０８】
不安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリッドのTmを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、50％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる場合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【０１０９】
例示のように、変異体Zcytor 14ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子により、５０％ホルムアミド、５×SSC、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×Denhardt’s 溶液（100×Denhardt’s 溶液：２％（w/v）のFicoll 400, 2% (w/v)のポリビニルピロリドン及び２％（w/v）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μg/mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【０１１０】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc. からのEXPRESSHYB Hybridization Solution），そしてハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１１１】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.5×〜２×SSC溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体Zcytor 14ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、55〜65℃での、0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液、例えば５５℃での、0.1％SDSを含む0.5×SSC溶液、又は65℃での0.1％SDSを含む２×SSC溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるSSCをSSPEにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【０１１２】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、50〜65℃での0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.1×〜0.2×SSCの溶液による洗浄を包含する。例えば、変異体Zcytor 14ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５0〜６５℃での、0.1％SDSを含む0.１×〜0．２×SSC溶液、例えば５0℃での、0.1％SDSを含む0.1×SSC溶液、又は６５℃での0.1％SDSを含む0.２×SSC溶液に等しい。
【０１１３】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたZcytor 14ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれらのオルト体に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも95％以上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【０１１４】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得るZcytor 14変異体核酸分子を企画する：配列番号２のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなZcytor 14変異体は、（１）55〜65℃での0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも70％,少なくとも80％,少なくとも90％,少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【０１１５】
他方では、Zcytor 14変異体は、（１）50〜65℃での0.1％SDSを含む0.1×〜0.2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも70％,少なくとも80％,少なくとも90％,少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１１６】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び第３表（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“BLOSUM62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：（［同一の適合するものの合計数］／[より長い配列の長さ＋  ２種の配列を整合するためにそのより長い配列中に導入されるギャップの数]）（100）。
【０１１７】
【表５】
0004737903.tif 000006
【０１１８】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、１つのアミノ酸配列及び推定上の変異体のアミノ酸配列により供給される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載される。手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１である場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。
【０１１９】
次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。“カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
【０１２０】
最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。FASTA 分析のための好ましいパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギャップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラム中に導入され得る。
【０１２１】
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は、上記に設定される他のパラメーターを伴なって、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【０１２２】
本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。例えば、配列番号２の１又は複数のアミノ酸置換を含む変異体が得られ、ここでアルキルアミノ酸がZcytor 14アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に代わって置換され、芳香族アミノ酸がZcytor 14アミノ酸における芳香族アミノ酸に代わって置換され、硫黄含有アミノ酸がZcytor 14アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に代わって置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸Zcytor 14アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に代わって置換され、酸性アミノ酸がZcytor 14アミノ酸配列における酸性アミノ酸に代わって置換され、
【０１２３】
塩基性アミノ酸がZcytor 14アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に代わって置換され、又は二塩基性モノカルボン酸アミノ酸Zcytor 14アミノ酸配列における二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に代わって置換される。通常のアミノ酸の中で、“保存性アミノ酸置換”は、次のグループの個々内のアミノ酸間の置換により示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。
【０１２４】
BLOSUM62表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ］。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。
【０１２５】
単に化学的性質に基づいてのアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記で論じられたように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【０１２６】
Zcytor 14の特定の変異体が、その対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２）に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有することによって特徴づけられ、ここでアミノ酸配列の変動は、１又は複数のアミノ酸置換による。
【０１２７】
Zcytor 14遺伝子における保存性アミノ酸変化が、配列番号１のいずれか１つに列挙されるヌクレオチドに代わってヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図された突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いての突然変異誘発及び同様の方法により得られる（Ausubel（1995）pages8-10〜8-22; 及びMcPhrson（ed.）, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) を参照のこと）。変異体Zcytor 14ポリペプチドが、抗−Zcytor 14抗体を特異的に結合する能力により同定され得る。
【０１２８】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３,３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。
【０１２９】
例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09, 1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。
【０１３０】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991−98, 1996 )。 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１３１】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 1993)。
【０１３２】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Zcytor 14アミノ酸により置換され得る。
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991）, Coombs and Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering” ,in Proteins: Analysis and Design, Angeletti(ed.) Ppages 259-311(Academic Press, Inc. 1998))。
【０１３３】
後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
【０１３４】
配列分析はZcytor 14受容体結合部位を同定するために使用され得るが、Zcytor 14受容体結合ドメインの位置はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造体の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Ves など., Science 255: 306 (1992), Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), 及びWlodaver など., FEBS Lett. 309:59 (1992) を参照のこと。
【０１３５】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。
【０１３６】
使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。さらに、ビオチン又はFITCによりラベルされたZcytor 14は、インターフェロン−ε受容体の発現クローニングのために使用され得る。
【０１３７】
開示されるZcytor 14ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1994及びWIPO公開WI97／20078により開示されるように、DNA  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNA分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１３８】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。生物学的に活性のポリペプチド又は抗−Zcytor 14抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１３９】
本発明はまた、Zcytor 14ポリペプチドの“機能的フラグメント”及びそのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。核酸分子の通常の欠失分析は、Zcytor 14ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１のヌクレオチド配列を有するDNA分子は、一連の欠失を得るためにBal3 Tヌクレアーゼにより消化され得る。
【０１４０】
次に、フラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そして細胞−細胞相互作用について、又はZcytor 14抗体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための1つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するフラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、Zcytor 14遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【０１４１】
この一般的アプローチの例示として、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に対する研究が、Horisberger and Di Marco, pharmac. Ther. 66: 507 (1995) により要約されている。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばTreulterなど., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993), Content など., “Expression and preliminary deletion analysisi of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon”, in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), Pages 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, “The EGF Enzyme”, in Cortrol of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton など., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985), Counailleau など., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga など., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi など., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); 及びMeiselなど., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996)により記載される。
【０１４２】
Zcytor 14ポリペプチドの機能的フラグメントの例は、トランスメンブランドメインを欠いているZcytor 14の可溶性形である。例示的なZcytor 14可溶性形は、配列番号２のアミノ酸残基１−452、配列番号２のアミノ酸残基21−452、配列番号10のアミノ酸残基1−435、又は配列番号10のアミノ酸残基21−435から成るポリペプチドを包含する。
【０１４３】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ配列に比較して、アミノ配列変化を有するZcytor 14遺伝子の機能的フラグメントも企画する。変異体Zcytor 14遺伝子は、上記のように、開示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造体に基づいて同定され得る。構造体に基づいて変異体遺伝子を同定するもう１つのアプローチは、可能性ある変異体Zcytor 14遺伝子をコードする核酸分子が、上記のように、配列番号１又は４のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができるかどうかを決定することである。
【０１４４】
本発明はまた、本明細書に記載されるZcytor 14ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る。（例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad Sci. USA81: 3988, 1983を参照のこと）。
【０１４５】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてそのようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Sutcliffeなど., Science 219: 660, 1983を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。
【０１４６】
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは本明細書に開示されるアミノ酸配列の少なくとも４〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜15個のアミノ酸、又は約15〜約30個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Zcytor 14ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 及びCortese など., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996を参照のこと）。
【０１４７】
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana Press, Inc., 1992), Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-84 (Cambridge University Press 1995), 及びColigan など. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons, 1997)により記載される。
【０１４８】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのZcytor 14ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のZcytor 14変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号１、２、３、４、５、６、８、９、10、11及び12の少なくとも1つの配列を提供するデータ構造によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【０１４９】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライブ、ランダムアクセス記憶（RAM）チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ（DLT）、ディスクカーシ及びZIPディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、CD−読み取りのみ記憶（ROM）、CD−再書き込みできる（RW）及びCD−再記録できる）、及びデジタル可転性/ビデオディスク（DVD）（例えば、DVD−ROM, DVD−RAM及びDVD＋RW）により例示される。
【０１５０】
６．Zcytor 14ポリペプチドの生成：
十分な長さのポリペプチド、機能的フラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、組換え宿主細胞において生成され得る。Zcytor 14遺伝子を発現するためには、ポリペプチドをコードする核酸分子が、発現ペプチドにおいて転写発現を制御し、そして次に、宿主細胞中に導入される調節配列に操作可能的に連結されるべきである。転写調節配列、例えばプロモーター及びエンハンサーの他に、発現ベクターは、翻訳調節配列、及び発現ベクターを担持する細胞の選択のために適切なマーカー遺伝子を包含することができる。
【０１５１】
真核細胞において外来性タンパク質の生成のために適切である発現ベクターは、典型的には、（１）細胞宿主における発現ベクターの増殖及び選択を提供するための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする真核DNA要素；（２）転写の開始を制御する真核DNA要素、例えばプロモーター；及び（３）転写体のプロセッシングを制御するDNA要素、例えば転写終結/ポリアデニル化配列を含む。上記で論じられたように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路中に方向づける分泌配列コードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、Zcytor 14発現ベクターは、Zcytor 14遺伝子、及びいずれかの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１５２】
本発明のZcytor 14タンパク質は、哺乳類細胞において発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Vero; ATCC  CRL1587）、ヒト胚腎細胞（293−HEK; ATCC CRL1573）、子供のハムスター腎細胞（BHK−21, BHK−570；ATCC CRL8544, ATCC CRL10314）、イヌ腎細胞（MDCK；ATCC CCL34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO−K1; ATCC CCL61; CHO DG44 [Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 (1986)]、ラット下垂体細胞（CH1；ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝癌細胞（H−４−II−E；ATCC CRL1548）、SV40−形質転換されたモンキー腎細胞（COS−１；ATCC CRL1650）及びネズミ胚細胞（NIH−3T3；ATCC CRL1658）を包含する。
【０１５３】
哺乳類宿主に関しては、転写及び翻訳シグナルは、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウィルス又は同様のものに由来することができ、ここで調節するシグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連している。適切な転写及び翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えばアクチン、コラーゲン、ミコシン及びメタロチオネイン遺伝子から得られる。
【０１５４】
転写調節配列は、RNA合成の開始を方向づけるために十分なプロモーター領域を含む。適切な真核プロモーターは、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamerなど., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)）、ヘルペスウィルスのTKプロモーター（Mcknight, Cell 31 : 355 (1982)）、SV40初期プロモーター（Benoistなど., Nature 290: 304 (1981)）、Rous肉腫ウィルスプロモーター（Gormanなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)）、サイトメガロウィルスプロモーター（Foeckingなど., Gene 45: 101 (1980)）及びマウス乳腫瘍ウィルスプロモーター（一般的には、Etcheverry, “Expression of Engineered Protein in Mammalian Cell Culture”, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など., (eds.), p. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照のこと）を包含する。
【０１５５】
他方では、原核プロモーター、例えばバクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターは、その原核プロモーターが真核プロモーターにより調節される場合、哺乳類細胞におけるZcytor 14遺伝子発現を制御するために使用され得る（Zhouなど., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990), 及びKaukamanなど., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991) を参照のこと）。
【０１５６】
発現ベクターは、種々の標準の技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクト−介在性供給、エレクトロポレーション及び同様のものを用いて、宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、トランスフェクトされた細胞が選択され、そして増殖され、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞が供給される。真核細胞中にベクターを導入するための技法、及び優性選択マーカーを用いてのそのような安定した形質転換体を選択するための技法は、例えばAusubel (1995) 及びMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991) により記載される。
【０１５７】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。この場合、選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
【０１５８】
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばCD4,CD8,クラスI  MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１５９】
Zcytor 14ポリペプチドはまた、ウィルス供給システムを用いて、培養された哺乳類細胞により生成され得る。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと）。アデノウィルスシステムの利点は、比較的大きなDNA挿入体の収容、高い力価に増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び異なったプロモーターを含む多数の入手できるベクターとの使用を可能にする柔軟性を包含する。
【０１６０】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAの大きな挿入体（7kbまでの）が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又はトランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスDNA中に導入され得る。EI遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製の無能性をもたらす、ウィルスベクターからの必須EI遺伝子を欠失することは任意である。例えば、アデノウィルスベクター−感染されたヒト293細胞（ATCC No. CRL−1573, 45504, 45505）は、有意な量のタンパク質を生成するために比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養物において増殖され得る（Garnierなど., Cytotechnol. 15: 145 (1994) を参照のこと）。
【０１６１】
Zcytor 14はまた、他の高等真核細胞、例えば鳥類、菌類、昆虫、酵母、又は植物細胞においても発現され得る。バキュロウィルスシステムは、昆虫細胞中に、クローン化されたZcytor 14遺伝子を導入するための効果的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリホルニカ（Autographa californica） 核多角体病ウィルス（AcMNPV）に基づかれており、そして良く知られているプロモーター、例えばショウジョウバエ熱ショックタンパク質（hsp）70プロモーター、オートグラファ・カルホルニカ核多角体病ウィルス即時−初期遺伝子プロモーター（ie-I）及び遅延された初期39K プロモーター、バキュロウィルスp10プロモーター及びジョウジョウバエメタロチオネインプロモーターを含む。
【０１６２】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luckow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Bac−to−BacTMキット（Life  Technologies, Rockville,  MD）として市販されている。このシステムは、“bacmid”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、Zcytor 14リガンドポリペプチドをコードするDNAを移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBacI TM (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and  Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【０１６３】
さらに、トランスファーベクターは発現されたZcytor 14リガンドポリペプチドのC−又はN−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu  エピトープ標識をコードするDNAとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Grussenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）。当業界において知られている技法を用いて、Zcytor 14遺伝子を含むトランスファーベクターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離される。
【０１６４】
例示的なPFASTBACベクターは、相当の程度まで修飾され得る。例えば、前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Pcor, p6.9又はMPプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and  Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【０１６５】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のZcytor 14リガンド分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチMelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67（PharMingem, San Diego, CA)は、生来の分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【０１６６】
組換えウィルス又はbacmidは、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞は、IPLB−Sf−21に由来する細胞系、スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）さなぎ卵巣細胞系、例えばSf9 (ATCC CRL 1711)、Sf21AE及びSf21（Invitrogen Corporation; San Diego, CA）、及びショウジョウバエSchneider−２細胞、並びにトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するHIGH FIVEO 細胞系（Invitrogen）を包含する（アメリカ特許第5,300,435号）。
【０１６７】
市販の血清フリー培地が、細胞の増殖及び維持のために使用され得る。適切な培地は、Sf9細胞に関しては、Sf900IITM (Life Technologies) 又はESF921TM (Expression Systems)；及びトリコプルシア・ニ細胞に関しては、Ex−cellO405TM (JRH Biosiences, Lenexa, KS) 又はExpress FiveOTM (Life Technologies)を包含する。組換えウィルスが使用される場合、細胞は典型的には、組換えウィルスストックが0.1〜10、より典型的には、約３の感染の多重度（MOI）で添加される地点で、約２〜５×105個の細胞１〜２×106個の細胞の接種密度で触媒される。
【０１６８】
バキュロウィルスでの組換えタンパク質を生成するための確立された技法は、Baileyなど., “Manipulation of Baculovirus Vectors”, in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), P. 147-168 (The Humana Press, (nc. 1991) により、Patel など., “The buculovirus expression system”, in DNA Cloing2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.) p.205-244 (Oxford University Press 1995) により、Ausubel (1995) p.16-37〜16-57により、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Proteocols (The Humana Press, Inc. 1995) により、及びLucknow, “Insect Cell Expression Technology”, in Protein Engineering: Principles and Practice. Cleland など. (eds.), p.183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) により提供される。
【０１６９】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本明細書に開示される遺伝子を発現するためにも使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ(pichia methanolica) を包含する。酵母における発現のための適切なプロモーターは、GAL1（ガラクトース）、PGK（ホスホグリセリンキナーゼ）、ADH（アルコールデヒドロゲナーゼ）、AOX1（アルコールオキシダーゼ）、HIS4（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）及び同様のものからのプロモーターを包含する。
【０１７０】
外因性DNAによりS.  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０１７１】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kingsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,092 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号；及び第4,661,454号を参照のこと。
【０１７２】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１７３】
例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCregg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mcknight など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
【０１７４】
例えば、組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、Raymond、アメリカ特許第5,716,808号、Raymond、アメリカ特許第5,736,383号、Raymondなど.,Yeast 14: 11-23 (1998)、及びWIPO公開WO97／17450, WO97／17451、WO98／02536及びWO98／02565に開示される。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ  アルコール利用遺伝子（AUG１又はAUG２）のものであることが好ましい。
【０１７５】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のものを包含する。宿主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（AUG１及びAUG２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１７６】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP４及びPRB１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数（t）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１７７】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、損なわれていない植物組織又は単離された植物細胞中にも導入され得る。植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、マイクロプロジェクティル−介在性供給、DNA注射、エレクトロポレーション及び同様のものによる植物組織の直接的な感染又はそれらと共にs植物細胞の同時培養を包含する。例えば、Horschなど., Science 227：1229 (1995)、Kleinなど., Biotechnology 10: 268 (1992) 及びMikiなど., “Procedures for Intoducing Foreign DNA into Plants”, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick など. (eds.), P.67-88 (CRC Press, 1993) を参照のこと。
【０１７８】
他方では、Zcytor 14遺伝子は、原核宿主細胞において発現され得る。原核細胞においてZcytor 14ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に良く知られており、そしてT4, T3, Sp6及びT7ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのPR及びPLプロモーター、E.コリのtrp, recA, 熱ショック、lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA及びlacZプロモーター、B.スブチリスのプロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセスプロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターを包含する。原核プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watsonなど., molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), 及びAusubelなど. (1995) により再考されている。
【０１７９】
例示的な原核宿主は、E.コリ及びバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）を包含する。E.コリの適切な株は、BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4, DH5, DH51, DH51F, DH51MCR, DH 10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451及びER1647を包含する（例えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) を参照のこと）。バチルス・スブチリスの適切な株は、BR151、YB886、MI119、MI120及びBI70を包含する（例えば、Hardy, “Bacillus Cloning Methods”, in DNA Cloning: A Practical Approach, Clover (ed.) (IRL Press 1985) を参照のこと。
【０１８０】
細菌、例えばE.コリにおいてZcytor 14ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１８１】
原核宿主においてタンパク質を発現するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Williamsなど., “Expression of foreign protein in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), P.15 (Oxford University Press 1995), Ward など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, p. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 及びGeorgiou, “Expression of Proteins in Bacteria”, in Protein Engineering: Principles and Practice; Cleland など. (eds.), p101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) を参照のこと）。
【０１８２】
細菌、酵母、昆虫及び植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準方法は、Ausubel (1995) により提供される。
哺乳類細胞系により生成される外来性タンパク質を発現し、そして回収するための一般的方法は、例えばEtcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture “in Protein Englineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), p163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) により提供される。細菌系により生成されるタンパク質を回収するための標準技法は、例えばGrisshammer など., “Purification of Over-Produced proteins from E.coli cells “in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), p.59-92 (Oxford University Press 1995) により提供される。
【０１８３】
バキュロウィルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) により記載される。
【０１８４】
他方では、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分固相方法、フラグメント縮合又は従来の溶液合成により合成され得る。それらの合成方法は、当業者に良く知られている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart et al., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. 3.3 (1986). Atherton など., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989). Fields and Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis.” Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), 及び Lloyd-Williams など., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。
【０１８５】
全体的な化学合成方法、例えば“生来の化学的連結”及び“発現されたタンパク質連結”における変動性もまた標準である（例えば、Dawsonなど., Science 266: 776 (1994), Hackengなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir など., proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 6705 (1998),及び Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)を参照のこと）。
【０１８６】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、配列番号２，５，10，11又は12の少なくとも６個、少なくとも９個又は少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。例えば、本発明は、次ぎのアミノ酸配列の15個の連続したアミノ酸を含んで成るか、又はそれらから成るポリペプチドを包含する：配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基21−452、配列番号10のアミン酸配列のアミノ酸残基21−435、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基474−677、又は配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基457−673。
【０１８７】
本発明の１つの態様においては、ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列の20個，30個，40個，50個，100個又はそれ以上の連続した残基を含んで成る。例示のように、本発明は、次のアミノ酸配列の30又は40個の連続したアミノ酸を含んで成るか、又はそれらから成るポリペプチドを包含する：配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基21−452、配列番号10のアミン酸配列のアミノ酸残基21−435、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基474−677、又は配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基457−673。そのようなペプチド及びポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマー及びプローブとして有用である。
【０１８８】
７．Zcytor 14融合タンパク質及び接合体の生成：
１つの一般的な種類のZcytor 14類似体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変異体である。もう１つの一般的種類のZcytor 14類似体は、下記のように、抗−イディオタイプ抗体及びそのフラグメントにより供給される。さらに、抗−イディオタイプの可変ドメインを含んで成る組換え抗体が、類似体として使用され得る（例えば、Monfardiniなど., proc. Assoc. Am. Physicians 108: 420 (1996) を参照のこと）。
【０１８９】
抗−イディオタイプZcytor 14抗体の可変ドメインはZcytor 14を模倣するので、それらのドメインは、Zcytor 14結合活性を提供することができる。、抗−イディオタイプ触媒性抗体を生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Joronなど., Ann. N. Y. Acad. Sci. 672:216(1992), Fribouletなど., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229(1994),及びAvalleなど., Ann. N. Y. Acad. Sci.864:118(1998)を参照のこと）。
【０１９０】
Zcytor 14類似体を同定するもう１つのアプローチは、結合ライブラリーの使用により提供される。ファージ表示及び他の結合ライブラリーを構成し、そしてスクリーニングする方法は、例えばKayなど., Phage Display of Peptide and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, アメリカ特許第5,783,384号、Kay, など., アメリカ特許第5,747, 334号及びKauffmanなど., アメリカ特許第5,723,323号号により提供される。
Zcytor 14ポリペプチドは、インビボ及びインビトロの両者において使用される。例示として、Zcytor 14の可溶形が、培養された細胞により生成されるZcytor 14リガンドの効果を阻害するために、細胞培養培地に添加され得る。
【０１９１】
Zcytor 14の融合タンパク質は、組換え宿主においてZcytor 14を発現するために、そして発現されたZcytor 14を単離するために使用され得る。下記に記載されるように、特定のZcytor 14融合タンパク質はまた、診断及び治療にも使用される。１つのタイプの融合タンパク質は、組換え宿主細胞からのZcytor 14ポリペプチドを案内するペプチドを含んで成る。Zcytor 14ポリペプチドを、真核細胞の分泌経路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、Zcytor 14発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列はZcytor 14に由来するが、適切なシグナル配列はまた、もう１つの分泌されたタンパク質から誘導されるか、又は新たに合成され得る。
【０１９２】
分泌シグナル配列は、Zcytor 14−コード配列に操作可能的に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるヌクレオチド配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
【０１９３】
Zcytor 14又は哺乳類細胞により生成されるもう１つのタンパク質（例えば、アメリカ特許第5,641,655号に記載されるような組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子シグナル配列）は、組換え哺乳類宿主におけるZcytor 14の発現のために有用であるが、酵母シグナル配列は、酵母細胞における発現のために有用である。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母対合現象α−因子（MFα１遺伝子によりコードされる）、インバーターゼ（SUC2遺伝子によりコードされる）又は酸性ホスファターゼ（PHO遺伝子によりコードされる）に由来するそれらのものである。例えば，Romanos など., “Expression of Cloned Genes in Yeast” in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), p.123-167 (Oxford University Press 1995) を参照のこと。
【０１９４】
細菌細胞においては、毒性を低め、安定性を高め、そして発現されたタンパク質の回収性を高めるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現することが、しばしば所望される。例えばZcytor 14は、グルタチオンS−トランスフェラーゼポリペプチドを含んで成る融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンS−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には、可溶性であり、そして固定されたグルタチオンカラム上でE. コリ融解物から容易に精製できる。類似するアプローチにおいては、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含んで成るZcytor 14融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより単離され得、そして切断されたタンパク質A遺伝子のC−末端を含んで成る融合タンパク質は、IgG−セファロースを用いて精製され得る。
【０１９５】
細菌細胞において異種ポリペプチドを、融合タンパク質として発現するために確立された技法は、Williamsなど., “Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies”, in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), p.15-58 (Oxford University Press 1995) により記載される。さらに、市販の発現システムが利用できる。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム（Promega Corporation, Madison, WI）は、アビジンを含んで成る樹脂により、発現の間、ビオチニル化されるポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０１９６】
原核又は真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、ポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、c-myc標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質P, RYIRS 標識（抗−RYIRS抗体と結合する）、Gln−Gln標識及びFLAG標識（抗−FLG抗体と結合する）を包含する。例えば、Luoなど., Srch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti など., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 及びZhengなど., Gene 186: 55 (1997) を参照のこと。そのようなペプチド標識コードする核酸分子は、例えばSigma−Aldrich Corporation (St. Louis, MO) から入手できる。
【０１９７】
本発明はまた、分泌経路中に他のポリペプチドを方向づけるために本発明のZcytor 14ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列の使用を企画する。配列番号２のアミノ酸残基１〜20に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られており、そして本明細書に開示される方法を用いてもう1つのポリペプチドに操作可能的に連結されるシグナル融合ポリペプチドが製造され得る。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路中に追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有する。
【０１９８】
例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は通常分泌されないタンパク質の活性成分、例えば受容体の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。後者に関して、典型的なポリペプチドは、医薬的活性の分子、例えば第VIIa因子、プロインスリン、インスリン、卵胞刺激ホルモン、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−（IL−I）〜IL−18）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（G−CSF）及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（GM−CSF））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、−ω、−δ、−τ及び−ε）、幹細胞増殖因子、例えば“SI因子”、エリトロポエチン及びトロンボポエチンを包含する。
【０１９９】
本発明の融合ポリペプチドに含まれるZcytor 14分泌シグナル配列は好ましくは、追加のペプチドを分泌経路中に方向づけるために、その追加のペプチドにアミノ末端融合される。Zcytor 14分泌シグナル配列を含んで成る融合タンパク質は、標準の技法を用いて構成され得る。
【０２００】
もう1つの形の融合タンパク質は、Zcytor 14ポリペプチド、及び２又は３個の複領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが、しかし可変領域を欠いている免疫グロブリンH鎖不変領域、典型的なFcフラグメントを含んで成る。例示のように、Chang など., (アメリカ特許第5,723,125号) は、ヒトインターフェロン及びヒト免疫グロブリンFcフラグメントを含んで成る融合タンパク質を記載する。インターフェロンのC−末端は、ペプチドリンカー成分によりFcフラグメントのN−末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性であるT細胞不活性配列を主に含んで成るペプチドである。典型的なペプチドリンカーは、アミノ酸配列：GGSGG SGGG SGGGG S (配列番号７) を有する。
【０２０１】
融合タンパク質においては、好ましいFc成分は、溶液において安定性であり、そして活性を活性化する補体をほとんど有さないか又は完全に有さないヒトγ鎖である。従って、本発明はZcytor 14成分及びヒトFcフラグメントを含んで成るZcytor 14融合タンパク質を企画し、ここで前記Zcytor 14成分のC−末端は、ペプチドリンカー、例えば配列番号７のアミノ酸配列から成るペプチドを通してFcフラグメントのN−末端に結合される。Zcytor 14成分は、Zcytor 14分子又はそのフラグメントであり得る。例えば、融合タンパク質は、細胞外ドメイン（例えば、可溶性Zcytor 14受容体）を含むZcytor 14のフラグメント及びFcフラグメント（例えば、ヒトFcフラグメント）を含んで成る。
【０２０２】
もう１つの態様においては、Zcytor 14融合タンパク質は、IgG配列、IgG Zcytor 14のアミノ酸末端に共有結合されるZcytor 14成分、及びZcytor 14のアミノ酸末端に共有結合されるシグナルペプチドを含んで成り、ここで前記IgG配列は、次の順序での次の要素から成る：CH2ドメイン及びCH3ドメイン。従って、IgG配列はCH1ドメインを欠いている。Zcytor 14成分は、本明細書に記載されるように、Zcytor 14活性、例えばZcytor 14リガンドと結合する能力を示す。抗体及び非抗体部分の両者を含んで成る融合タンパク質を生成するこの一般的なアプローチは、LaRochelleなど., ヨーロッパ特許第742830号（WO95/21258号）により記載されている。
【０２０３】
Zcytor 14成分及びFc成分を含んで成る融合タンパク質は、インビトロアッセイ手段として使用され得る。例えば生物学的サンプルにおけるZcytor 14リガンドの存在は、Zcytor 14−免疫グロブリン融合タンパク質を用いて検出され得、ここでZcytor 14成分は、前記リガンド、及び高分子、例えばタンパク質A又は抗−Fc抗体を結合するために使用され、すなわち固体支持体に融合タンパク質を結合するために使用される。さらに、そのようなシステムは、Zcytor 14リガンドのその受容体への結合を妨害するアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。
【０２０４】
抗体融合タンパク質の他の例は、抗原−結合ドメイン、及びZcytor 14細胞外ドメインを含むZcytor 14フラグメントを含んで成るポリペプチドを包含する。そのような分子は、Zcytor 14結合活性の有益性のための特定の組織を標的化するために使用され得る。
【０２０５】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべては、サイトカイン受容体ファミリーの他のメンバーからの機能的に同等のドメインにより本発明のZcytor 14間で置換され得る。ポリペプチド融合体は、Zcytor 14融合類似体を生成するために、組換え宿主細胞において発現され得る。Zcytor 14ポリペプチドは、複数の成分又はドメイン、例えば精製の親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間での１又は複数の切断部位を含むことができる。例えば、Tuanなど., Connective Tissue Research 34; 1(1996) を参照のこと。
【０２０６】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。融合タンパク質の酵素的及び化学分解のための一般的な方法は、例えばAusubel（1995）、p. 16-19〜16−25により記載される。
【０２０７】
Zcytor 14ポリペプチドは、Zcytor 14リガンドを同定し、そして単離するために使用される得る。Zcytor 14細胞外ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸残基1−425、又は21−452）及び可溶性Zcytor 14受容体の他の形が、特にそれらの方法のために有用である。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドが、カラム上に固定され、そしてカラム上で作動する生物学的サンプルからのリガンドを結合するために使用され得る（Hermansonなど. (eds.), Immobilized Affinity Ligand Techniques, P. 195-202 (Academic Press 1992)）。
【０２０８】
受容体リガンドとして、Zcytor 14ポリペプチドの活性が、受容体結合及び続く生理学的細胞応答に関連する、細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する、珪素に基づくバイオセンサーのマイクロフィジオメーターにより測定され得る。典型的な装置は、Molecular Devices, Sunnyvale, CAにより製造されるCytosensorTM マイクロフィジオメーターである。種々の細胞応答、例えば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。
【０２０９】
例えば、McConnell, H.M.など., Science 257：1906-1912, 1992; Pitchford, S. など., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997: Arimilli, S. など., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. など., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998を参照のこと。さらに、マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたっての細胞培地における細胞外酸性化変化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激に対する細胞応答、例えばZcytor 14のアゴニスト、リガンド又はアンタゴニストを直接的に測定する。
【０２１０】
マイクロフィジオメーターは、Zcytor 14ポリペプチドを発現しない対照の真核宿主に比較して、Zcytor 14−発現真核細胞の応答を測定するために使用され得る。Zcytor 14−調節刺激に対して応答性の適切な細胞は、Zcytor 14発現バクターを含んで成る組換え宿主細胞、及び天然においてZcytor 14を発現する細胞を包含する。細胞外酸性化は、Zcytor 14−調節された細胞応答についての1つの測定を提供する。
【０２１１】
さらに、このアプローチは、Zcytor 14リガンド、そのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。例えば、分子は、Zcytor 14ポリペプチドを発現する細胞を供給し、前記細胞の第1部分を、試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の第２部分を、試験化合物の存在下で培養し、そして前記第１部分と比較して、前記第2部分が細胞応答を示すかどうかを決定することによって、Zcytor 14リガンドのアゴニストとして同定され得る。
【０２１２】
他方では、固相システムが、Zcytor 14リガンド、Zcytor 14リガンドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するために使用され得る。例えば、Zcytor 14ポリペプチド又はZcytor 14融合タンパク質が、市販のバイオセンサー装置の受容体チップの表面上に固定され得る（BLACORE, Biacore AB; uppsala, Sweden）。この装置の使用は、例えばkarlsson, Immunol. Methods 145:229 (1991)、及びCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554 (1993) により開示される。
【０２１３】
手短には、Zcytor 14ポリペプチド又は融合タンパク質は、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、共有結合される。次ぎに、試験サンプルが、細胞を通して通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは固定されたポリペプチド又は融合タンパク質に結合し、培地の屈折率の変化を引き起こし、これが金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。このシステムは、結合親和性が計算され得るオン−及びオフ−速度の測定、及び結合の化学量論の評価を可能にする。このシステムはまた、抗体−抗原相互作用、及び他の補体/抗−補体対の相互作用を試験するためにも使用され得る。
【０２１４】
Zcytor 14結合ドメインはさらに、Zcytor 14リガンドアゴニストの推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関連して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、耕造体の物理的分析により特徴づけられ得る。例えば、de Vosなど., Science 255:306 (1992), Smithなど., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), 及びWlodaverなど., FEBS Lett. 309: 59 (1992) を参照のこと。
【０２１５】
本発明はまた、Zcytor 14ポリペプチドがポリマーにより連結される、化学的に修飾されたZcytor 14組成物を企画する。例示的なZcytor 14ポリペプチドは、機能的なトランスメンブランドメインを欠いている可溶性ポリペプチドである。典型的には、前記ポリマーは、Zcytor 14結合体が水性環境、例えば生理学的環境において沈殿しないよう水溶性である。適切なポリマーの例は、単一の反応基、例えばアシル化のための活性エステル、又はアルキル化のためのアルデヒドを有する修飾されている１つのポリマーである。
【０２１６】
この場合、重合化の程度は調節され得る。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（C1−C10）アルコキシ、又はそれらのアリールオキシ誘導体である（例えば、Harrisなど., アメリカ特許第5,252,714号を参照のこと）。ポリマーは枝分かれ鎖であっても、又は枝分かれ鎖でなくても良い。さらに、ポリマーの混合物がZcytor 14接合体を生成するために使用され得る。
【０２１７】
治療のために使用され得るZcytor 14接合体は、医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分を含むことができる。適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ−PEG、モノ−（C1−C10）アルコキシ−PEG、アリールオキシ−PEG、ポリ−（N−ビニルピロリドン）PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン/酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物基材のポリマーを包含する。適切なPEGは、約600〜約60,000、例えば5,000、12,000及び25,000の分子量を有することができる。Zcytor 14接合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物も含むことができる。
【０２１８】
Zcytor 14接合体の１つの例は、Zcytor 14成分、及びZcytor 14成分のN−末端に結合される酸化ポリアルキル成分を含んで成る。PEGは、１つの適切な酸化ポリアルキルである。例示として、Zcytor 14は、PEG、すなわち“PEG化”として知られている方法により修飾され得る。Zcytor 14のPEG化は、当業界において知られているPEG化反応のいずれかにより行われ得る（例えば、ヨーロッパ特許第0154316号、Delgadoなど., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994) 及びFrancis など., Int, J. Hematol. 68: 1 (1998) を参照のこと）。
【０２１９】
例えば、PEG化は反応性ポリエチレングリコール分子によるアシル化反応又はアルキル化反応により行われ得る。他のアプローチにおいては、Zcytor 14接合体は、PEGの末端ヒドロキシ又はアミノ基が活性化されたリンカーにより置換されている活性化されたPEGを縮合することによって形成される（例えば、Karasiewiczなど., アメリカ特許第5,382,657号を参照のこと）。
【０２２０】
アシル化によるPEG化は典型的には、Zcytor 14ポリペプチドとPEGの活性エステル誘導体との反応を必要とする。活性化されたPEGエステルの例は、N−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたPEGである。本明細書において使用される場合、用語“アシル化”とは、Zcytor 14と水溶性ポリマー間のタイプの結合を包含する：アミド、カルバメート、ウレタン及び同様のもの。
【０２２１】
アシル化によるPEG化されたZcytor 14の調製方法は、典型的には、（ａ）Zcytor 14ポリペプチドとPEG（例えば、PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステル）とを、１又は複数のPEG基がZcytor 14に結合する条件下で反応せしめ、そして（ｂ）その反応生成物を得る段階を含んで成る。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメーター及び所望する結果に基づいて決定されるであろう。例えば、PEG：Zcytor 14の比が高いほど、ポリPEG化されたZcytor 14生成物の％が高くなる。
【０２２２】
アシル化によるPEG化の生成物は典型的には、リシンε−アミノ基がアシル結合を通してPEG化されるポリPEG化されたZcytor 14生成物である。典型的には、その得られるZcytor 14は、少なくとも95％、モノ−、ジ−又はトリ−ペルギレートされるが、但し高い程度のPEG化を有するいくつかの種は、その反応条件に依存して形成され得る。PEG化された種は、標準の精製方法、例えば透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び同様のものを用いて、接合されていないZcytor 14ポリペプチドから分離され得る。
アルキル化によるPEG化は一般的に、還元剤の存在下で、Zcytor 14と、PEGの末端アルデヒド誘導体との反応を包含する。PEG基は好ましくは、−CH2−NH基を通してポリペプチドに結合される。
【０２２３】
モノPEG化された生成物を生成するためへの還元性アルキル化を通しての誘導体化は、誘導体化のために利用できる異なったタイプの第１アミノ基の示差反応性を利用する。典型的には、前記反応は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のN−末端残基のα−アミノ基との間のpKa差異の利用を可能にするpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、反応性基、例えばアルデヒドを含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が調節される。ポリマーとの接合は、他の反応性基、例えばリシン側鎖アミノ基の有意な修飾を伴なわないで、タンパク質のN−末端で優先的に生じる。本発明は、Zcytor 14モノポリマー接合体の実質的な調製物を提供する。
【０２２４】
モノポリマーZcytor 14接合体分子の実質的に均質な集団を生成するための還元性アルキル化は、（ａ）Zcytor 14のアミノ末端でのα−アミノ基選択的修飾を可能にするために適切なpHでの還元性アルキル化条件下で反応性PEGとンZcytor 14ポリペプチドとを反応せしめ、そして（ｂ）反応生成物を得る段階を含んで成る。還元性アルキル化のために使用される還元剤は、水溶液において安定性であり、そして好ましくは、還元性アルキル化の初期工程において形成されるSchiff塩基のみを還元できるべきである。好ましくは還元剤は、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン及びビリジンボランを包含する。
【０２２５】
モノポリマーZcytor 14接合体の実質的に均質な集団に関しては、還元性アルキル化反応条件は、Zcytor 14のN−末端への水溶性ポリマーの成分の結合を可能にするそれらの条件である。そのような反応条件に、N−末端でのα−アミノ基とリシンアミノ基との間のpKa差異を提供する。pHはまた、使用されるポリマー：タンパク質の比にも影響を及ぼす。一般的に、pHが低い場合、タンパク質よりも過剰量のポリマーが、N−末端α−基が反応性であるほど、より多くのポリマーが最適な条件を達成するために、必要とされるので、所望される。pHが高い場合、ポリマー：Zcytor 14は、より多くの反応性基が利用できるので、高くある必要はない。典型的には、pHは、３〜９又は３〜６の範囲内であろう。
【０２２６】
考慮すべきもう1つの因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が高いほど、より少数のポリマー分子がタンパク質に結合され得る。PEG化反応に関しては、典型的な分量は、約２kDa〜約100kDa、約5kDa〜約50kDa又は約12kDa〜約25kDaである。水溶性ポリマー：Zcytor 14のモル比は、一般的に、１：１〜100：１の範囲であろう。典型的には、水溶性ポリマー：Zcytor 14のモル比は、ポリPEG化に関して、１：１〜20：１であり、そしてモノPEG化に関しては、１：１〜５：１であろう。
【０２２７】
ポリペプチド及び水溶性ポリマー成分を含んで成る接合体を生成するための一般的な方法は当業界において知られている。例えば、Karasiewiczなど., アメリカ特許第5,382,657号、Greewaldなど., アメリカ特許第5,738,846号、Nieforthなど., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996), Monkarsh など., Anal. Biochem. 247: 434 (1997) を参照のこと。
本発明は、本明細書に記載されるペプチド又はポリペプチドを含んで成る組成物を企画する。そのような組成物はさらに、キャリヤーを含むことができる。前記キャリヤーは、従来の有機又は無機キャリヤーであり得る。キャリヤーの例は、水、緩衝液、アルコール、ポリエチレングリコール、マクロゲル、ゴマ油、トウモロコシ油及び同様のものを包含する。
【０２２８】
８．Zcytor 14ポリペプチドの単離：
本発明のポリペプチドは、汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、又は95％以上の純度に精製することが好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さない。本発明のポリペプチドはまた、99.9％以上の純度である医薬的に純粋な状態に精製され得る。特定の製剤においては、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０２２９】
分別及び/又は従来の精製方法は、天然源（例えば、前立腺又は甲状腺組織）から精製されたZcytor 14、合成Zcytor 14ポリペプチド、及び組換え宿主細胞から精製された組換えZcytor 14ポリペプチド及び融合Zcytor 14ポリペプチドの調製物を得るために使用され得る。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好ましい。
【０２３０】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl ブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharmacia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０２３１】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離及び精製の特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988、及びDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照のこと。
【０２３２】
Zcytor 14単離及び精製における追加の変動は、当業者により調節され得る。例えば、下記のようにして得られる抗−Zcytor 14抗体は、免疫親和性精製により多量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０２３３】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される( Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。
【０２３４】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐHの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（M. Deutscher, (ed.), Methods Enzymol. 182, 529(1990)）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、FLAG標識、Glu-Gku標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０２３５】
Zcytor 14ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、下記のようにして、化学合成を通して調製され得る。Zcytor 14ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても、又はグリコシル化されなくても良く；PEG化されても、又はPEG化されなくても良く；そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は含まなくても良い。
【０２３６】
9．Zcytor 14タンパク質に対する抗体の生成：
Zcytor 14に対する抗体は、例えば抗原として、Zcytor 14発現ベクターの生成物又は天然源から単離されたZcytor 14を用いて得られる。特に有用な抗−Zcytor 14抗体は、Zcytor 14を、“特異的に結合する”。抗体は、その抗体が次の２つの性質の少なくとも１つを示す場合、特異的に結合すると思われる：（１）抗体が限界レベルの結合活性を伴って、Zcytor 14に結合し、そして（２）抗体がZcytor 14に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない場合。
【０２３７】
第１の特徴に関しては、抗体は、それらが、106M-1又はそれ以上、好ましくは107M-1又はそれ以上、より好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴なって、Zcytor 14ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、Scatchard 分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)）により、当業者により容易に決定され得る。第２の特徴に関しては、抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、Zcytor 14を検出するが、しかし現在知られているポリペプチドを検出しない場合、関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。既知の関連するポリペプチドの例は、既知のサイトカイン受容体である。
【０２３８】
抗−Zcytor 14抗体は、抗原性Zcytor 14エピトープ−担持ペプチドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド及びポリペプチドは、配列番号２内に含まれる、少なくとも９個、又は15〜約30個のアミノ酸の配列、又は本明細書に開示されるもう１つのアミノ酸配列を含む。しかしながら、30〜50個のアミノ酸、又は本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列の大きな部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、Zcytor 14と結合する抗体を誘発するためにも有用である。所望には、エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するよう選択される（すなわち、前記配列は、比較的親水性の残基を包含し、そして疎水性残基は好ましくは、回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列がまた、抗体生成のために所望される。
【０２３９】
例示のように、Zcytor 14における可能性ある抗原性部位が、LASERGENE（DNASTAR；Madison, WI）のPROTEANプログラム（バージョン3.14）により実効されるように、Jameson-Wolf method, Jameson and Wolf, CABIOS 4: 181, (1988) を用いて、同定された。デフォールトパラメーター（default parameter）が、この分析に使用された。
【０２４０】
Jameson−Wolf方法は、タンパク質構造予測のために６種の主要サブルーチンを組合すことによって、可能性ある抗原決定基を予測する。手短には、Hopp−Woods方法、Hoppなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3924 (1981) が最初に、最大の局部親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定するために使用された（パラメーター：平均７個の残基）。第２段階においては、Emini方法、Eminなど., J. Virolgy 55: 836 (1985) が、表面確立を計算するために使用された（パラメーター：表面決定限界値（0.6）＝１）。第３に、Karplus−Schultz方法、Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985) が、主鎖柔軟性を予測するために使用された（パラメーター：柔軟性限界値（0.2）＝１）。
【０２４１】
分析の第４及び第５段階においては、二次構造の予測が、Chou-Fasmanの方法、Chou, “Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition”, in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), p.549-586 (1978) を用いて、データに適用された（Chou-Fasman パラメーター：コンホメーション表＝64タンパク質；β領域限界値＝105；Grrnier-Robsonパラメーター：α及びβ決定パラメーター＝０）。
【０２４２】
第６のサブルーチンにおいては、柔軟性パラメーター及び水治療/溶媒接近性因子が、“抗原指数”として呼ばれる表面輪郭値を決定するために組合された。最終的に、ピーク拡大機能が、抗原指数に適用され、内部領域に対する表面領域の移動度に由来する追加の自由エネルギーを計算するために、それぞれのピーク値の20, 40, 60又は80％を付加することによって主用表面ピークを拡大する。しかしながら、この計算は、ヘリカル領域がほとんど柔軟性になる傾向がないので、ヘリカル領域に存在するいずれかの主用ピークにも適用されなかった。
【０２４３】
この分析の結果は、配列番号２の次のアミノ酸配列が適切な抗原性ペプチドを提供することを示した：アミノ酸26−33（“抗原性ペプチド１”）、アミノ酸41-46 (“抗原ペプチド２”)、アミノ酸74−81（“抗原性ペプチド３”）、アミノ酸95−105（“抗原性ペプチド４”）、アミノ酸109−119（“抗原ペプチド５”）、アミノ酸95−119（“抗原性ペプチド６”）、アミノ酸178−185（“抗原ペプチド）、アミノ酸200−206（“抗原ペプチド８”）及びアミノ酸231−238（“抗原性ペプチド９”）、アミノ酸231−241（“抗原性ペプチド10”）、アミノ酸264−270（“抗原性ペプチド11”）、
【０２４４】
アミノ酸274−281（“抗原性ペプチド12”）、アミノ酸317−324（“抗原性ペプチド13”）、アミノ酸357−363（“抗原性ペプチド14”）、アミノ酸384−392（“抗原性ペプチド15”）、アミノ酸398−411（“抗原性ペプチド16”）、アミノ酸405−411（“抗原性ペプチド17”）、アミノ酸423−429（“抗原性ペプチド18”）、及びアミノ酸434−439（“抗原性ペプチド19”）。本発明は、Zcytor 14に対する抗体を生成するために抗原性ペプチド１−19のいずれか１つの使用を企画する。
本発明はまた、抗原性ペプチド１−19の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドを企画する。
組換えZcytor 14タンパク質、又は天然源から単離されたZcytor 14に対するポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。例えば、Green など., “Production of polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protecols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 及びWilliams など., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.), page 15 (Oxford University press 1995を参照のこと。
【０２４５】
Zcytor 14ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばZcytor 14又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に結合されるか又は連結され得る。
【０２４６】
ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マウス、ウサギ、テンジュクネズミ、ヤギ又は羊において生ぜしめられるが、本発明の抗−Zcytor 14抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な技法は、例えばGoldenbergなど., 国際特許出願番号WO91/11465号及びLosmanなど., Int. J. Cancer 46: 310, 1990に見出され得る。
【０２４７】
他方では、モノクローナル抗−Zcytor 14抗体が生成され得る。特定抗原に対する囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例えば、Kohler など., Nature 256: 495 (1975), Coliga など., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley など., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995を参照のこと)。
【０２４８】
手短には、モノクローナル抗体は、Zcytor 14遺伝子生成物を含んで成る組成物をマウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、B−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる。
【０２４９】
さらに、本発明の抗−Zcytor 14抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成するよう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、ヒトH鎖及びL鎖遺伝子座の要素が、内因性H鎖及びL鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Greenなど., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg など., Nature 368: 856, 1994, 及びTaylorなど., Inc. Immun. 6: 576, 1994により記載される。
【０２５０】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン−Aセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Coligan, page 2.7.1-2.7.12及びpage 2.9.1^2.9.3; Bainesなど.,” Purification of Imunoglobulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, vol, 10, p. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) を参照のこと）。
【０２５１】
特定の用途に関しては、抗−Zcytor 14抗体のフラグメントを調製することが所望される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解により得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又はパパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、F(ab’)2として示される５Sフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解により生成され得る。このフラグメントはさらに、3.5S Fab’ 単価フラグメントを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。
【０２５２】
任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシンを用いての酸素分解が２種の単位Fabフラグメント及びFcフラグメントを直接的に生成する。それらの方法は、例えば、Goldenberg, アメリカ特許第4,331,647号、Nisonoff など., Arcg Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman など., in Methods in Enzymology vol. 1, p. 422 (Academic Press 1967), 及びColigan, p. 2.8.1-2.8.10及び2.10-2.10.4により記載される。
【０２５３】
抗体を分解する他の方法、例えば単価L−H鎖フラグメントを形成するためへのH鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
例えば、Fvフラグメントは、VH及びVL鎖の会合を含んで成る。この会合は、Inbar など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972により記載のように、非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例えば、Sandhu, Crit. Rew. Biotech. 12: 437, 1992を参照のこと）。
【０２５４】
Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるVH及びVL鎖を含んで成る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドにより連結されるVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含んで成る構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばE.コリ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ScFvを生成するための方法は、例えばWhitlow など., Methods: A Companion to Metheds in Enzymology 2:97, 1991により記載される。Bird など., Science 242:423, 1988, Ladner など., アメリカ特許第4,946,778号、Packなど., Bio/Technology 11: 1271, 1993及びSandhu, 前記も参照のこと。
【０２５５】
例示のように、scFvは、インビトロで、Zcytor 14ポリペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたZcytor 14タンパク質又はペプチドの作用を通して）によって得られる。可能性あるZcytor 14ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０２５６】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム  ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladner など., アメリカ特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号；Ladner など., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698 号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、Zcytor 14に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるZcytor 14配列を用いてスクリーンされ得る。
【０２５７】
抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性−決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のDCRをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えば抗体−生成細胞のRNAから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Larrick など., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter など., (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 及びWard など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch など., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照のこと）。
【０２５８】
他方では、抗−Zcytor 14抗体は、“ヒト適合された”モノクローナル抗体から誘導され得る。ヒト適合されたモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンH及びL可変鎖からのマウス相補的決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行することにより生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ相対物の骨格領域において置換される。ヒト適合されたモノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、Orlandiなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989により記載される。
【０２５９】
ヒト適合されたモノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Jones など., Nature 321:522, 1986, Carter など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rey. Biotech. 12: 437, 1992, Singer など., J. Tmmun. 150: 2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 及びQueen など., アメリカ特許第5,693,762号（1997）により記載される。
【０２６０】
ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準技法を用いて、抗−Zcytor 14抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することにより調製され得る。例えば、Greenなど., “Production of Ployclonal Antisera” in Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), P. 1-2 (Humana Press 1992) を参照のこと。また、Coligan, 前記、p.2.4.1-2.4.7も参照のこと。
【０２６１】
他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗−Zcytor 14抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。もう1つの方法として、ヒト適合された抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイプ抗体を調製するための方法は、例えばIrie, アメリカ特許第5,208,146号, Greeneなど., アメリカ特許第5,637,677号、及びVarthakovi and Minocha, J. Gen. Virol 77: 1875, 1996により記載される。
【０２６２】
１０．遺伝子発現及び遺伝子構造を検出するためへのZcytor 14ヌクレオチド配列の使用：
核酸分子は、生物学的サンプルにおけるZcytor 14遺伝子の発現を検出するために使用され得る。一定のプローブ分子は、配列番号１又は４のヌクレオチド配列、又はその一部を含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号１又は４のヌクレオチド配列の補体、又はその一部を有する1本鎖核酸分子を包含する。本明細書において使用される場合、用語“一部”とは、少なくとも８個のヌクレオチド〜少なくとも20個又はそれ以上のヌクレオチドを言及する。一定のプローブは、他のサイトカイン受容体遺伝子における相当の領域に対して低い配列類似性を有する、Zcytor 14遺伝子の領域と結合する。
【０２６３】
基本的アッセイにおいては、一本鎖プローブ分子が、プローブと標的Zcytor 14 RNA種との間の塩基対合を促進する、温度及びイオン強度の条件下で、生物学的サンプルから単離されたRNAと共にインキュベートされる。末結合のプローブをハイブリダイズされた分子から分離した後、ハイブリッドの量が検出される。
【０２６４】
RNA検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法は、ノザン分析及びドット/スロット  ブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、Ausubel 前記、p４−１〜４−27、及びWuなど. (eds.)、”Analysis of Gene Expression at the RNA Level”, in Methods in Gene Biotechnology, p. 225-39, CRC Press, Inc., 1997を参照のこと）。核酸プローブは、放射性同位体、例えば32P又は35Sにより検出できるようラベルされ得る。他方では、Zcytor 14 RNAは、非放射性ハイブリダイゼーション方法により検出され得る（例えば、Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993を参照のこと）。
【０２６５】
典型的には、非放射能性検出は、クロモゲン又は化学ルミネセンス基質の酵素転換により達成される。例示的な非放射性成分は、ビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニンを包含する。
Zcytor 14オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断のためにも有用である。例示として、16F−ラベルされたオリゴヌクレオチドが対象に投与され、そして陽電子射出断層撮影法により可視可され得る（Tavitian など., Nat. Med. 4: 467, 1998）。
【０２６６】
多くの診断方法は、検出方法の感度を高めるために、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を利用する。PCRを実施するための標準技法は良く知られている（一般的には、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications, Humana Press, Inc., 1993; Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer, Humana Press, Inc., 1996; Hanausek and Walaszed (eds.), Tumor Marker Protocols, Humana Press, Inc., 1998; Lo (ed.), Clinical Applications of PCR, Humana Press, Inc., 1998及びMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis, Humana Press, Inc., 1998を参照のこと）。
【０２６７】
PCRプライマーは、他のタンパク質、例えば、他のサイトカイン受容体タンパク質における相当の領域に対して低い配列類似性を有するZcytor 14遺伝子の一部を増幅するよう企画される。
診断アッセイについてのPCRの１つの変法は、逆転写酵素−PCR（RT−PCR）である。RT−PCR技法においては、RNAが生物学的サンプルから単離され、cDNAに逆転写され、そしてそのcDNAがZcytor 14プライマーと共にインキュベートされる（例えば、Wuなど. (eds.), “Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR”, in Methods in Gene Biotechnology, P. 15-28, CRC Press, Inc. 1997を参照のこと）。次に、PCRが行われ、そして生成物が標準技法を用いて分析される。
【０２６８】
例示のように、RNAは、例えば上記グアニジニウム−チオシアネート細胞溶解を用いて、生物学的サンプルから単離される。他方では、固相技法が、細胞溶解物からmRNAを単離するために使用され得る。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、dTの短いホモポリマー、又はZcytor 14アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたRNAにより感作され得る。オリゴ−dTプライマーは、対照の標的配列を提供することができる種々のmRNAヌクレオチド配列が増幅される利点を提供する。Zcytor 14配列は、典型的には20個の長さの塩基である２種のフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
【０２６９】
PCR増幅方法は、種々のアプローチを用いて検出され得る。例えば、PCR生成物は、ゲル電気泳動により分別され、そして臭化エチジウム染色により可視化される。他方では、分別されたPCR生成物は、膜に移行され、検出できるようにラベルされたZcytor 14プローブによりハイブリダイズされ、そしてオートラジオグラフィーにより試験され得る。追加の他のアプローチは、化学ルミネセンス検出及びC−TRAK比色アッセイを提供するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデオキシリボ核酸三ミリ酸の使用を包含する。
【０２７０】
Zcytor 14発現の検出のためのもう1つのアプローチは、サイクリングプローブ技法（CDT）であり、ここで一本鎖DNA標的物が過剰のDNA−RNA−DNAキメラプローブと結合し、複合体を形成し、RNA部分がRNアーゼHにより分化され、そして分解されたプローブの存在が検出される（例えば、Beggsなど., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996, 及び Bekkuouiなど., Biotechniques 20: 240, 1996を参照のこと）。
【０２７１】
Zcytor 14配列番号の検出のための他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（CATCH）及びリガーゼ鎖反応（LCR）のようなアプローチを利用することができる（例えば、Marshallなど., アメリカ特許第5,686,272号（1997）、Dyerなど., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Ehrichtなど., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997; 及びChadwickなど., J. Viro. Methods 70:59, 1998を参照のこと）。他の標準方法も当業者に知られている。
【０２７２】
Zcytor 14プローブ及びプライマーはまた、組織サンプルにおけるZcytor 14遺伝子発現を検出し、そして位置決定するためにも使用され得る。そのような現場ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Choo (ed.), In situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; We など. (eds.), “Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH), “ in Methods in Gene Biotechnology, pages 259-278, CRC Press, Inc., 1997; 及びWuなど. (eds.), “Localizaion of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH),” in Methods in Gene Biotechnology, pages 279-289, CRC Press, Inc., 1997を参照のこと）。
【０２７３】
種々の追加の診断アプローチも当業者に良く知られている（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996; 及びElles, molecular Diagnosis of Genetics Diseases, Humana Press Inc., 1996を参照のこと）。適切な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織、生検及び検死を包含する。
【０２７４】
Zcytor 14遺伝子は、ヒト染色体3p25−3p24に存在する。この領域は、種々の障害、例えば色素性乾皮症、Marfan−様結合組織障害、心筋脂肪症、糖尿病、ファンコーニ貧血症、腎細胞癌、Marfan症候群、Von Hippel−Lindau症候群及び瞼裂縮小に関連している。さらに、サイトカイン受容体の突然変異は特定の疾病に関連している。例えば、サイトカイン受容体の多形現象は、肺胞タンパク質症、家族性周期性発熱及び赤白血病に関連している。
【０２７５】
従って、Zcytor 14ヌクレオチド配列は、種々の疾病についての連鎖に基づく試験において、及び対象の染色体がZcytor 14遺伝子に突然変異を含むかどうかを決定するために使用され得る。Zcytor 14遺伝子座での検出できる染色体逸脱は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。Zcytor 14遺伝子を不活性化する遺伝子変更が特に興味の対象である。
【０２７６】
Zcytor 14遺伝子座に関連する逸脱は、分子遺伝子技法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、RNアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press. Inc. 1991), Marian, Chest 108：255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnositics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Morecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Burren など. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Habor Laboratory Press 1998), Dracopoli など. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), 及びRichards and Ward, “Molecular Diagnostic Testing,” in Principles of Molecular Medicine, Pages 83-88 (Humana Presa. Inc. 1998) を参照のこと）。
【０２７７】
タンパク質切断試験はまた、翻訳−終結突然変異がコードされたタンパク質の一部のみを生成する、遺伝子の不活性化を検出するために有用である（例えば、Stoppa-Lynnet など., Blood 91: 3920 (1998) を参照のこと）。このアプローチによれば、RNAが生物学的サンプルから単離され、そしてcDNAを合成するために使用される。次に、PCRが、Zcytor 14標的物配列を増幅し、そしてRNAポリメラーゼプロモーター、翻訳開始配列及びインフレ−ムATGトリプレットを導入するために使用される。
【０２７８】
PCR生成物が、RNAポリメラーゼを用いて転写され、そして転写体がT7−結合された網様体溶解物システムによりインビトロで翻訳される。次に、翻訳生成物が、その翻訳生成物の長さを決定するために、SDS−PAGEにより分別される。タンパク質切断試験は、例えば、Dracopoliなど. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, p.9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998) により記載される。
【０２７９】
本発明はまた、Zcytor 14遺伝子発現のための診断アッセイを行うための又はZcytor 14遺伝子における突然変異を検出するためのキットも企画する。そのようなキットは、核酸プローブ、例えば配列番号１又は４のヌクレオチド配列又はその一部を含んで成る二本鎖分子、及び配列番号１又は４のヌクレオチド配列の補体又はその一部を有する一本鎖核酸分子を含んで成る。プローブ分子は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。キットは、PCRを行うための核酸プライマーを含んで成る。
【０２８０】
そのようなキットは、上記核酸診断アッセイを行うためのすべての必要な要素を含むことができる。キットは、Zcytor 14プローブ又はプライマーを含んで成る少なくとももう１つの容器を含むであろう。キットはまた、Zcytor 14配列の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光色素、化学ルミネセント剤、及び同様のものを包含する。
【０２８１】
キットはまた、Zcytor 14プローブ及びプライマーがZcytor 14遺伝子発現を検出するために使用される、使用者に知られるための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入されている核酸分子が、Zcytor 14をコードする核酸分子、又はZcytor 14コードのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子のいずれかを検出するために使用され得ることを記載する。その文書の材料は、容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０２８２】
１１．Zcytor 14を検出するためへの抗−Zcytor 14抗体の使用：
本発明は、Zcytor 14の存在についてインビトロで生物学的サンプルをスクリーンするためへの抗−Zcytor 14抗体の使用を企画する。1つのタイプのインビトロアッセイにおいては、抗−Zcytor 14抗体が液相において使用される。例えば、生物学的サンプルにおけるZcytor 14の存在は、生物学的サンプルと、微量のラベルされたZcytor 14及び抗−Zcytor 14抗体とを、Zcytor 14とその抗体との間の結合を促進する条件下で混合することによって試験され得る。
【０２８３】
サンプルにおけるZcytor 14及び抗−Zcytor 14の複合体が、前記複合体を、抗体、例えばFc抗体又はスタフィロコーカスタンパク質Aと結合する同定されたタンパク質とを接触することによって、反応混合物から分離され得る。生物学的サンプルにおけるZcytor 14の濃度は、抗体に結合されるラベルされたZcytor 14の量に反比例し、そして遊離ラベルにされたZcytor 14の量に直接的に関連する。例示的な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織生検及び検死材料を包含する。
【０２８４】
他方では、抗−Zcytor 14抗体が固相キャリヤーに結合されるインビトロアッセイが行われ得る。例えば、抗体が、不溶性支持体、例えばポリマー−被覆されたビーズ、プレート又は管に抗体を結合するために、ポリマー、例えばアミノデキストランに結合され得る。他の適切なインビトロアッセイは、当業者に明らかであろう。
【０２８５】
もう１つのアプローチにおいては、抗−Zcytor 14抗体が、生検検体から調製された組織切片においてZcytor 14を検出するために使用され得る。そのような免疫化学的検出が、比較的多くのZcytor 14を決定するために、及び試験される組織におけるZcytor 14の分布を決定するために使用され得る。一般的な免疫化学的技法は、十分に確立されている（例えば、Ponder, “Cell Marking Techniques and Their Application.”in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), pages 115-38 (IRL Press 1987), Coligan at pages 5.8.1-5.8.8, Ausubel (1995) at pages 14.6.1 to 14.6.13 (Wiley interscience 1990), and Manson (ed.), Methods In Molecular Biology. Vol. 10: Immunochemical Proteocols (The Humana Press. Inc. 1992) を参照のこと）。
【０２８６】
免疫化学的検出は、生物学的サンプルと抗−Zcytor 14抗体とを接触し、そして次に、前記生物学的サンプルと、抗体に結合する検出できるラベルされた分子とを接触せしめることによって行われ得る。例えば、前記検出できるラベルされた分子は、抗−Zcytor 14抗体に結合する抗体成分を含んで成る。他方では、抗−Zcytor 14抗体は、アビジン/ストレプタビジン（又はビオチン）により接合され、そして検出できるラベルされた分子はビオチン（又はアビジン/ストレプタビジン）を含むことができる。この基本的技法の多くの変法は、当業者に良く知られている。
【０２８７】
他方では、抗−Zcytor 14抗体が、抗−Zcytor 14免疫接合体を形成するために、検出できるラベルにより接合され得る。適切な検出できるラベルは、例えば放射生同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル又はコロイド状金を包含する。そのような検出できるラベルされた免疫接合体の製造及び検出方法は、当業者に良く知られており、そして下記により詳細に記載される。
検出できるラベルは、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明のために特に有用である同位体は、3H, 125I, 131I, 35S及び14Cである。
【０２８８】
抗−Zcytor 14免疫接合体はまた、蛍光化合物によりラベルされ得る。蛍光ラブルされた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫接合体を暴露し、そして得られる蛍光を検出することによって決定される。蛍光ラベル化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。
【０２８９】
他方では、抗−Zcytor 14免疫接合体は、化合物ルミネセンス化合物に抗体化合物を接合することによって、検出的にラベルされ得る。化学ルミネセンス−標識された免疫接合体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。化学ルミネセンスラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルを包含する。
【０２９０】
同様に、化学ルミネセンス化合物は、本発明の抗−Zcytor 14免疫接合体をラベルするために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高める生物学的システムに見出されるタイプの化学ルミネセンスである。生物ルミネセンスタンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。ラベリングのために有用である生物ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【０２９１】
他方では、抗−Zcytor 14免疫接合体は、酵素に抗−Zcytor 14抗体化合物を接合することによって検出できるようラベルされ得る。抗−Zcytor 14−酵素接合体が適切な基質の存在下でインキュベートされる場合、酵素成分は、分光光度、蛍光又は可視手段により検出され得る化学成分を生成するために基質と反応する。多くの特異的免疫接合体を検出できるようにラベルするために使用され得る酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを包含する。
【０２９２】
当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切なラベルを知っているであろう。抗−Zcytor 14抗体へのマーカー成分の結合は、当業界において知られている標準技法を用いて達成され得る。これに関しての典型的な方法論は、Kennedyなど., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schursなど., Clim. Acta 81:1 (1977), Shihなど., Int’l. J. Cancer 46:1101 (1990), steinなど., Cancer  Res. 50:1330 (1990), 及びColigan、前期により記載される。
【０２９３】
さらに、免疫化学的検出の便利さ及び多様性は、アビジン、ストレプタビジン及びビオチンにより接合された抗−Zcytor 14抗体を用いることによって増強され得る（例えば、Wilchek. など., (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), and Bayerなど., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.) pages 149-162 (The Humana Press. Inc. 1992) を参照のこと）。
【０２９４】
イムノアッセイを行うための方法は十分に確立されている。例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagonostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), Pages 180-208. (Cambridg University Press, 1995), Perry, “The Role of Monoclonal antibodies in the Advancement of Immunoassay Technoogy”, in Monoclonal Antibodies; Principles and applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), and Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996 を参照のこと。
【０２９５】
本発明はまた、Zcytor 14遺伝子発現についての免疫学的診断アッセイを行うためのキットも企画する。そのようなキットは、抗−Zcytor 14抗体又は抗体フラグメントを含んで成る少なくとも１つの容器を含んで成る。キットはまた、Zcytor 14抗体又は抗体フラグメントの存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル、コロイド状金及び同様のものを包含する。
【０２９６】
キットはまた、Zcytor 14抗体又は抗体フラグメントが、Zcytor 14タンパク質を検出するために使用される、使用者に伝達するための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入される抗体又は抗体フラグメントが、Zcytor 14を検出するために使用され得ることを言及する。文書の材料は容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０２９７】
１２．Zcytor 14活性を有するポリペプチドの治療的使用：
本発明は、Zcytor 14活性を有するタンパク質、ポリペプチド及びペプチド（例えば、Zcytor 14ポリペプチド（例えば、Zcytor 14ポリペプチド（例えば、Zcytor 14の可溶性形）、Zcytor 14類似体（例えば、抗−Zcytor 14抗−イディオタイプ抗体）、及びZcytor 14融合タンパク質））の、適切な量のこのポリペプチドを欠いている対象への使用を包含する。対照的に、Zcytor 14アンタゴニスト（例えば、生物学的に不活性である抗−Zcytor 14抗体は又は抗−Zcytor 14抗−イディオタイプ抗体）が、過剰のZcytor 14を生成する対象を処理するために使用され得る。
【０２９８】
例示のように、Zcytor 14は、ヒトインターロイキン−17受容体と類似性を共有するアミノ酸配列を有する。研究によれば、インターロイキン−17は免疫応答の開始又は維持において中枢的な役割を演じることが示されている（例えば、Jovanovicなど., J. Immunol. 160: 3513 (1998) を参照のこと）。さらに、インターロイキン−17が滑液細胞により炎症メディエーターの生成を活性化し、そしてインターロイキン−17がリウマチ様関節炎の特徴である前炎症パターンに寄与する証拠が存在する（Chabaudなど., J. Immunol. 161：409（1998）；Chabaudando など., Arthritis Rheum. 42: 963 (1999)）。従って、Zcytor 14活性を有するポリペプチド（例えば、Zcytor 14ポリペプチド、Zcytor 14の機能的フラグメント、例えば可溶性Zcytor 14受容体、抗−Zcytor 14抗−イディオタイプ抗体、等）が、炎症及び炎症に関連する状態、例えばリウマチ様関節炎を処理するために使用され得る。
【０２９９】
一般的に、投与されるZcytor 14（又はZcytor 14類似体又は融合タンパク質）の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。典型的には、約１pg/kg〜10mg/kg（剤の量/患者の体重）の範囲でのZcytor 14の用量（但し、それよりも低いか又は高い用量もまた、環境が指図する場合、投与され得る）を、受容体に供給することが所望される。
【０３００】
Zcytor 14ポリペプイドの対象への投与は、局部カテーテルを通しての灌流によるか又は直接的な病変内注入による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与する場合、投与は連続的注入によるか、又は一回又は複数回のボーラスによることができる。
【０３０１】
投与の追加経路は、経口、粘膜、肺及び経皮を包含する。経口供給は、ポリエステル微小球、ゼイン微小球、プロテイノイド微小球、ポリシアノアクリレート微小球及び脂質基剤システムのために適切である（例えば、DiBase and Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Protein”, in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p.255-288 (Plenum Press 1977) を参照のこと）。鼻腔内供給の実行可能性は、インスリン投与のそのような態様により例示される（例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1997) を参照のこと）。
【０３０２】
Zcytor 14を含んで成る乾燥又は液体粒子は、乾燥−粉末分散機、液体エーロゾル発生器又はネブライザーの助けにより調製され、そして吸入され得る（例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton など., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999) を参照のこと）。このアプローチは、エーロゾル化されたインスリンを肺に供給する電動吸入器であるAERX糖尿病治療システムにより例示される。研究によれば、48,000kDaほどの大きなタンパク質が、経皮投与の実行可能性を例示する、低周波超音波の助けにより治療濃度で皮膚を通して供給されることが示された（Mitragotriなど., Science 269: 850 (1995)）。エレクトロポレーションを用いての経皮供給は、Zcytor 14活性を有する分子を投与するもう１つの手段を提供する（Pottsなど., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)）。
【０３０３】
Zcytor 14結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はヘプチドを含んで成る医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って配合され得、それによれば、治療用タンパク質が医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。組成物は、その投与が受容体患者により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。無菌リン酸緩衝溶液は、医薬的に許容できるキャリヤーの1つの例である。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている。例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) を参照のこと。
【０３０４】
治療のためには、Zcytor 14活性を有する分子及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的に有効な量で患者に投与される。Zcytor 14活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチド、及び医薬的に許容できキャリヤーの組み合わせは、その投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的に有効な量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体患者の生理学において検出される変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。
【０３０５】
Zcytor 14（又はZcytor 14類似体又は融合タンパク質）を含んで成る医薬組成物は、液体形、エーロゾル、又は固体形で維持され得る。液体形は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形を包含する。後者の形は、ミニ浸透ポンプ及び移植体により例示される（Bremer など., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997): Ranade. “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer など., “Protein Delivery with Infusion Pum-s,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), Pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey など., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), Pages 93-117 (Plenum Press 1997)）。
【０３０６】
リポソームは、治療用ポリペプチドを、患者に、静脈内、腹膜内、鞘内、筋肉内、皮下、又は経口、吸入又は鼻腔内供給するための１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り組む１又は複数の脂質二層から成る微小ビークルである（一般的には、Bakker Woudenberg など., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim Drugs 46:618 (1993), and Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” in Drug Delivery Systems, Ranade and組生Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照のこと）。リポソームは、組成において細胞膜に類似し、そして結果として、リポソームは安全に投与され、そして生分解性である。
【０３０７】
調製方法に依存して、リポソームは、単層又は多層性であり得、そしてリポソームは0.02μm〜10μm以上の範囲の直径でサイズ的に変化することができる。種々の剤がリポソームに封入され得る：疎水性剤は二層に分割され、そして親水性剤は内部水性空間内に封入される（例えば、Macky など., Liposomes In Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987), 及びOstroなど., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989) を参照のこと）。さらに、リポソームサイズ、二層の数、脂質組成、及びリポソームの電荷及び表面性質を変えることにより、封入される剤の治療利用性を調節することが可能である。
【０３０８】
リポソームは、実質的にいずれかのタイプの細胞に吸着することができ、そして次に、封入された剤をゆっくりと開放する。他方では、吸収されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイト−シス化され得る。エンドサイト−シスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解が伴ない、そして封入された剤が開放される（Scherphof など., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)）。静脈内投与の後、小さなリポソーム（0.1〜1.0μm）は、典型的には、肝臓及び脾臓に主として位置する網内細胞系の細胞により摂取されるが、ところが3.0μmよりも大きなリポソームは肺に沈着される。網内細胞系の細胞による小さなリポソームのこの好ましい摂取は、マクロファージ及び肝臓の腫瘍に化学治療剤を供給するために使用されて来た。
【０３０９】
網内細胞系は、いくつかの方法、例えば多量のリポソーム粒子による飽和、又は薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化により回避され得る（Claassenなど., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)）。さらに、リポソーム膜中への糖脂質−又はポリエチレングリコール−誘導されたリン脂質の組み込みは、網内細胞系による有意に低められた摂取をもたらすことが示されている（Allen など., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen など., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０３１０】
リポソームはまた、リン脂質組成を変えることによって、又はリポソーム中に受容体又はリガンドを挿入することによって、特定の細胞又は器官を標的化するためにも調製され得る。例えば、高い含有率の非イオン性界面活性剤により調製されたリポソームが、肝臓を標的化するために使用されて来た（Hayakawaなど., 日本特許04-244,018号；Katoなど., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)）。
【０３１１】
それらの配合物は、メタノールにおいて、大豆ホスファチジルコリン、α−トコフェロール及びエトキシル化され、水素付加されたヒマシ油（HCO−60）を混合し、前記混合物を真空下で濃縮し、そして次に、前記混合物を水により再構成することによって調製された。大豆由来のステリルグルコシド混合物（SG）及びコレステロール（Ch）と共にジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）のリポソーム配列物はまた、肝臓を標的化することが示されている（Shimizuなど., Biol. Pharm. Bull. 20:881（1997））。
【０３１２】
他方では、種々の標的化リガンドが、リポソーム、例えば抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン及び輸送タンパク質の表面に結合され得る。例えば、リポソームは、肝臓細胞の表面上で独占的に発現されるアシアログリコプロテイン（ガラクトース）受容体標的化するために、枝分かれ型のガラクトシル脂質誘導体により変性され得る（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashiなど., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)）。同様に、Wuなど., Hepatology 27: 772 (1988) は、アジアロフェチュインによるリポソームのラベリングが短くされたリポソーム結晶半減期を導き、そしてアジアロフェチュイン−ラベルされたリポソームの肝細胞による摂取を非常に高めたことを示している。
【０３１３】
他方では、枝分かれ型のガラクトシル脂質誘導体を含んで成るリポソームの肝臓蓄積が、アジアロフェチュインの前注入により阻害され得る（Murahashiなど., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)）。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞へのリポソームの標的化のためのもう１つのアプローチを提供する（Kamps など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)）。さらに、Gehoなど., (アメリカ特許第4,603,044号)は、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆管受容体に対する特異性を有する、肝細胞−指図されたリポソーム小胞供給システムを記載する。
【０３１４】
組織標的化へのより一般的なアプローチにおいては、標的細胞は、標的細胞により発現されるリガンドに対して特異的な、ビオチニル化された抗体によりプレラベルされる（Harasymなど., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。遊離抗体の血漿排除の後、ストレプタビジン−接合されたリポソームが投与される。もう1つのアプローチにおいては、標的化抗体は、リポソームに直接的に結合される（Harasymなど., Adv. Drug. Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。
【０３１５】
Zcytor 14活性を有するポリペプチドは、タンパク質のマイクロカプセル封入の標準技法を用いて、リポソーム内に封入され得る（例えばAndersonなど., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Andersonなど., Cancer Res. 50: 1853 (1990), and Cobenなど., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving など., “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,” in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993), Wassef など., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)を参照のこと）。上記に示されるように、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含むことができる。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Allenなど., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０３１６】
分解性ポリマー微小球が、治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するため企画された。微小球は、分解性ポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（PLG）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、モノ生分解性エチルビニルアセテートポリマー（タンパク質がポリマー封入される）から調製されるGombotz and Pettit, Bioconugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery.” In Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus など., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール（PEG）被覆された超微小球はまた、治療用タンパク質の静脈内投与のためのキャリヤーを提供することができる（例えば、Grefなど., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997) を参照のこと）。
【０３１７】
本発明はまた、上記で論じられたように、ポリペプチドがポリマーにより結合されている、Zcytor 14活性を有する化学的に変性されたポリペプチド及びZcytor 14アンタゴニストを企画する。
他の用量形は、例えば、Anset and Popovich. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical sciences. 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) により、及びRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) により示されるように、当業者により考案され得る。
【０３１８】
例示のように、医薬組成物は、Zcytor 14細胞外ドメイン又はZcytor 14アンタゴニスト（例えば、Zcytor 14ポリペプチドを結合する抗体又は抗体フラグメント）と共に１つのポリペプチドを含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。治療用ポリペプチドは、単一又は複数回の用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成されるであろう無菌粉末として供給され得る。他方では、そのようなキットは、治療用ポリペプチドの投与のための乾燥粉末分散機、液体エーロゾル発生機又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の指示及び使用法に対する文書での情報を包含する。さらに、そのような情報は、Zcytor 14組成物が、Zcytor 14に対する既知の過敏性を有する患者に禁忌を示される提示も包含することができる。
【０３１９】
１３．Zcytor 14ヌクレオチド配列の治療的使用：
本発明は、Zcytor 14を、そのような処理の必要な対象に供給するためへのZcytor 14ヌクレオチド配列の使用を包含する。さらに、Zcytor 14遺伝子発現を阻害する治療用発現ベクター、例えばアンチセンス分子、リボザイム又は外部案内配列分子が供給され得る。
【０３２０】
Zcytor 14を発現する組換え宿主細胞の使用、Zcytor 14をコードする裸の核酸の供給、Zcytor 14をコードする核酸分子と共にカチオン性脂質キャリヤーの使用、及びZcytor 14を発現するウィルス、例えば組換えレトロウィルス、組換えアデノ−関連ウィルス、組換えアデノウィルス、及び組換えヘルペス単純ウィルス（HSV）の使用を包含する、Zcytor 14遺伝子を対象に導入するための多くのアプローチが存在する（例えば、Mulligan, Science 260: 926 (1993), Rosenberg など., Science 242: 1575 (1988), LaSalle など., Science 250: 988 (1993), Wolffなど., Science 247: 1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3: 203 (1991) を参照のこと）。エクスビボアプローチにおいては、細胞が対象から単離され、Zcytor 14遺伝子を発現するベクターによりトランスフェクトされ、そして次に、対象中に移植される。
【０３２１】
Zcytor 14遺伝子の発現をもたらすために、Zcytor 14遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、遺伝子転写を制御するために、コアプロモーター及び任意には、調節要素に操作可能的に連結される発現ベクターが構成される。発現ベクターの一般的な必要性は、上記に記載されている。
【０３２２】
他方では、Zcytor 14遺伝子は、組換えウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクター（例えば、Kass-Eister など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 11498 (1993), Kolis など., proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91: 215 (1994), Liなど., Hum. Gene Ther. 4;403 (1993), Vincent など., Nat. Genet. 5:130 (1993), and Zabner など., Cell 75: 207 (1993)）、アデノウィルス−関連ウィルスベクター（Flotteなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613 (1993)）、アルファウィルス、例えば“Semliki Forest ウィルス及びSindbisウィルス（Hertz and Huang, J. Vir. 66: 857 (1992), Raju and Huang, J.vir. 65:2501 (1991), 及びXiongなど., Science 243: 1188 (1989)）、ヘルペスウィルスベクター（Koeringなど., Hum. Gene. Therap. 5: 457 (1994)）、
【０３２３】
ポックスウィルスベクター（Ozakiなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 653 (1993), Panicali and Paoietti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927 (1982)）、ポックスウィルス、例えばカナリヤポックスウィルス又はワクシニアウィルス（Fisher-Hochなど., Proc. Hatl. Acad. Sci. USA 86: 317 (1989) 及びFlexner など., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86 (1989)）、及びレトロウィルス（Baba など., J. Neurosurg 79: 729 (1993), Ram など., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiyaなど., J. Neurosci. Res. 33: 493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860 (1993) 及びAndersonなど., アメリカ特許第5,399,346号）を用いて供給され得る。種々の態様においては、ウィルスベクター自体又はウィルスベクターを含むウィルス粒子のいずれかが、下記に記載される方法及び組成物に使用され得る。
【０３２４】
１つシステムの例示として、アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは、異種核酸分子の供給のための十分に特徴づけられた遺伝子トランスファーベクターである（Beckerなど., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)）。アデノウィルスシステムは、次のいくつかの利点を提供する：（ｉ）比較的大きなDNA挿入体を収容する能力、（ii）高い力価に増殖する能力、（iii）広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び（iV）多くの異なったプロモーター、例えば遍在性で、組織特異的な、及び調節できるプロモーターと共に使用される能力。さらに、アデノウィルスは、そのウィルスが血流において安定しているので、静脈内注射により投与され得る。
【０３２５】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスベクターを用いて、挿入体は、直接的な連結により、又は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスDNA中に組み込まれる。典型的なシステムにおいては、必須E1遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、E1遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内供給される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。E1遺伝子欠失を有するアデノウィルス供給システムが宿主細胞において複製しない場合、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするであろう。宿主細胞はまた、その対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、異種タンパク質を分泌するであろう。分泌されたタンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高く血管化された肝臓）から循環に侵入するであろう。
【０３２６】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、E1−欠失され、そしてさらに、E2A又はE4の欠失を含む（Luskyなど., J. Virol. 72: 2022 (1998); Raper など., Human Gene Therapy 9: 671 (1998)）。E2bの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Amalfitanoなど., J. Virol. 72:926 (1998)）。完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種DNAの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（gutless）”アデノウィルスの生成は、異種DNAの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Yeh and Perricaudet, FASEB J. 11: 615 (1997) を参照のこと）。
【０３２７】
治療用遺伝子を発現できる組換えウィルスの高い力価のストックが、標準方法を用いて、感染された哺乳類細胞から得られる。例えば、組換えHSVは、Vero細胞において、Brandtなど., J. Gen. Virol. 72: 2043 (1991), Herold など., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991), Grauなど., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 30: 2474 (1989), Brandiなど., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), 及びBrawn and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Human Press 1997) により記載のようにして、調製され得る。
【０３２８】
他方では、Zcytor 14遺伝子を含んで成る発現ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより、対象の細胞に導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felgner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。
【０３２９】
インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に化学的に得られる。標的化されたペプチド（例えば、ホルモン又は神経伝達物質）、タンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０３３０】
エレクトロポレーションは、投与のもう１つの態様である。例えば、Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16: 867 (1998) は、筋肉中への遺伝子トランスファーのためへのインビボエレクトロポレーションの使用を示している。  遺伝子療法へのもう1つのアプローチにおいては、治療用遺伝子は、Zcytor 14の発現を阻害するZcytor 14アンチセンスRNAをコードすることができる。アンチセンス分子のための適切な配列は、本明細書に開示されるZcytor 14のヌクレオチド配列から誘導され得る。
【０３３１】
他方では、調節要素がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に操作可能的に連結される発現ベクターが構成され得る。リボザイムは、mRNA分子における一定の標的配列に向けられるエンドヌクレアーゼ活性を発現するよう企画され得る（例えば、Draper and Macejak, アメリカ特許第5,496,698号、McSwiggen, アメリカ特許第5,525,468号、Chowrira and McSwiggen, アメリカ特許第5,631,369号及びRobertson and Goldberg, アメリカ特許第5,225,337号を参照のこと）。本発明においては、リボザイムはZcytor 14 mRNAと結合するヌクレオチド配列を包含する。
【０３３２】
もう１つのアプローチにおいては、調節要素がZcytor 14遺伝子をコードするmRNA分子のRNアーゼP−介在性切断を促進できるRNA転写体の生成を方向づける発現ベクターが構成され得る。このアプローチによれば、外部案内配列が、細胞リボザイムにより続いて切断される、特定種の細胞内mRNAに内因性リボザイム、すなわちRNアーゼPを向けるために構成され得る（例えば、Altmanなど., アメリカ特許第5,168,053号、Yuanなど., Science 263: 1269 (1994), Paceなど., WO96/18733号、Georgeなど., WO96/21731号及びWemerなど., WO97/33991号を参照のこと）。
【０３３３】
好ましくは、前記外部案内配列は、Zcytor 14 mRNAに対して相補的な10〜15個のヌクレオチド配列、及び3’−NCCAヌクレオチド配列（ここで、Nは好ましくはプリンである）を含んで成る。外部案内配列転写体は、mRNAと相補的外部案内配列との間での塩基対の形成により、標的化されたmRNA種に結合し、従って、前記塩基対合された領域の5’側に位置するヌクレオチドでのRNアーゼPによるmRNAの切断を促進する。
【０３３４】
一般的に、Zcytor 14ヌクレオチド酸配列を有する治療用ベクター、例えば組換えウィルスを含んで成る組成物の用量は、対照の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。治療用ベクターの適切な投与経路は、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、及び腫瘍を含む腔中への注射を包含する。例示のように、Hortonなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1553 (1999)は、インターフェロン−αをコードするプラスミドDNAの筋肉内注射がネズミモデルにおいて一次及び転移性腫瘍に対する可能性ある抗腫瘍効果を生成することを示す。
【０３３５】
本発明のウィルスベクター、非ウィルスベクター又はウィルス及び非ウィルスベクターの組み合わせを含んで成る組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知方法に従って配合され得、それによれば、ベクター又はウィルスは、医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。上記で示されるように、組成物、例えばリン酸緩衝溶液は、その投与が受容体対象により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), 及びGilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) を参照のこと）。
【０３３６】
治療のためには、治療用遺伝子ベクター、又はそのようなベクターを含んで成る組換えウィルス、及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的有効量で対象に投与され得る。発現ベクター（又はウィルス）及び医薬的に許容できるキャリヤーの組み合わせは、投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的有効量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体対象の生理学において検出できる変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。
【０３３７】
治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスにより処理される対象がヒトである場合、治療は好ましくは、体細胞遺伝子治療である。すなわち、治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスによるヒトの好ましい処理は、ヒト生殖細胞系の一部を形成し、そして次の世代に通され得る核酸分子を細胞中に導入すること（すなわち、ヒト生殖系遺伝子治療）を必要としない。
【０３３８】
１４．トランスジェニックマウスの生成：
トランスジェニックマウスは、すべての組織において、又は組織−特異的又は組織に好ましい調節要素の制御下で、Zcytor 14遺伝子を過剰発現するよう構築され得る。Zcytor 14のそれらの過剰生成体は、過剰発現に起因する表現型を特徴づけるために使用され得、そしてトランスジェニック動物は過剰Zcytor 14により引き起こされるヒト疾病のためのモデルとして作用することができる。Zcytor 14を過剰発現するトランスジェニックマウスはまた、大きな動物の乳汁又は血液におけるZcytor 14、例えば可溶性Zcytor 14の生成のためのモデル生物反応体を提供する。
【０３３９】
トランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Jacob, “Expression and Knockout of interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995), and Abbud and Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgeic Mice,” in Gen Expression Systems: using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)を参照のこと）。
【０３４０】
例えば、Zcytor 14遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを生成するための方法は、成熟した受精能雄（種マウス）（B6C3f1, 生後２−８ヶ月（Tacomic Farms, Germantown, NY））、精管切除された雄（duds）(B6D2f1, ２−８ヶ月(Taconic Farms）)、 思春期直前受胎能雌（ドナー）（B6C3f1, 4-5週（Taconic Farms））、及び成熟した受胎能雌（受容体）（B6D2f1, ２−４ヶ月（taconic farms））により開始することができる。
【０３４１】
ドナーは、１週間、気候順応化され、そして次に、約８IU/マウスのPregnant Mare’s Serum ゴナドトロピン（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）I.P. により、及び46−47時間後、8IU/マウスのヒトChorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)) L.P. により注射され、過剰排卵を誘発された。ドナーが、ホルモン注射に続いて、種マウスにより交配される。排卵は一般的に、hCG注射の13時間以内に生じる。交接は、交配の次の朝、膣栓の存在により確認される。
【０３４２】
受精された卵を手術用スコープ下で集める。卵管を集め、そして卵を、ヒアルロニダーゼ（Sigma）を含む尿検査用スライド中に開放する。卵を、１度、アヒルロニダーゼにより洗浄し、そして２度、Whitten’s W640 媒体（Menino and O’cloray, Biol. Reprod. 77: 159 (1986), 及びDienhart and Downs, Zygote 4: 129 (1996) により記載される）により洗浄し、これを５％CO2、5％O2及び90％N2と共に37℃でインキュベートする。次に、卵を、マイクロインジェクションまで、37℃/5％CO2のインキュベーターに貯蔵する。
【０３４３】
Zcytor 14コード配列を含むプラスミドDNA10〜12μgを、線状化し、ゲル精製し、そしてマイクロインジェクションのために５−10ng/μlの最終濃度で、10mMのトリス−HCl (pH7.4), 0.25mMのEDTA（pH8.0）の溶液に再懸濁する。例えば、Zcytor 14コード配列は、配列番号２のアミノ酸残基をコードすることができる。
プラスミドDNAを、暖かな、CO2平衡化された鉱油により被覆された1度のW640媒体に含まれる、収穫された卵中にマイクロインジェクトする。DNAを注射用針中に吸い込み（0.75mmのID, 1mmのOD硼珪酸塩ガラス細管から引き抜かれる）、そして個々の卵中に注入する。注射用針により、個々の卵の、ハプロイド前核の１つ又は両者中に貫通する。
【０３４４】
数ピコリットルのDNAを前核中に注入し、そして注射用針を、核と接触しないよう引き抜く。前記方法を、すべての卵が注入されるまで、反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、前もってガス抜きされたW640媒体を有する器官組織−培養皿中に移し、37℃/5％CO2のインキュベーターにおいて一晩、貯蔵する。
【０３４５】
次の日、２細胞の胚を、偽妊娠受容体中に移す。受容体は、精管切除されたdudsとの交接の後、膣栓の存在により同定される。受容体に麻酔をし、そして背面左側上の毛を剃り、そして手術用顕微鏡に移す。切開を、皮膚において、及び胸郭、背部及び後脚により概略される腹部の中央、すなわち膝と脾臓との間の中途まで筋肉壁を通して行う。生殖器官を、小さな手術用ドレープ上に切除する。脂肪パッドを、手術用ドレープ上に広げ、そして子供用止血小鉗子（Roboz, Rockville, MD）を、脂肪パットに取り付け、そしてマウスの背部上をつるし、器官が腹部にスライドすることを防ぐ。
【０３４６】
鉱油、続いて交互にW640及び空気気泡を含む精巧なトランスファーピペットにより、前日の注入からの12〜17個の健康な２−細胞胚を、受容体中に移す。膨張した膨大部を位置決定し、そしてその膨大部と包との間の卵管を保持し、卵管の刻み目を前記包に隣接して、28gの針により行い、膨大部又は包を裂かないことを確かめる。
【０３４７】
ピペットを、卵管における刻み目に移し、そして胚を吹き込み、最初の空気気泡のピペットからの除去を可能にする。脂肪パッドを軽く、腹膜中に押し込み、そして生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を、１つの縫合により閉じ、そして皮膚を傷口用クリップにより閉じる。マウスは、少なくとも４時間、37℃の暖かなスライド上で回復した。
受容体を、対でカゴに戻し、そして19−21日の妊娠を可能にする。誕生後、19−21日の産後を、離乳の前に可能にする。離乳子供の性別を鑑別し、そして別々の性別のカゴに入れ、そして0.5cmの生検（遺伝子型識別のために使用される）を、尾から、無菌のハサミにより取る。
【０３４８】
ゲノムDNAを、QIAGEN DNEASYキットを用いて、その製造業者の説明書に従って、切り取られた尾から調製する。ゲノムDNAを、同じプラスミドに導入されたZcytor 14遺伝子又は選択マーカー遺伝子を増幅するために企画されたプライマーを用いて、PCRにより分析する。動物がトランスジェニックであることが確かめられた後、それらは、トランスジェニック雌を野生型雄と共に、又はトランスジェニック雄を１又は複数の野生型雌と共に配置することによって、近交系に戻し交雑する。子供が生まれ、そして離乳され、性別を分け、そしてそれらの尾を、遺伝子型識別のために切り取る。
【０３４９】
生存動物におけるトランスジーンの発現について調べるために、部分肝切除を行う。手術準備を、zyphoid工程下で直接的に上部腹部に行う。無菌技法を用いて、小さな1.5−2cmの切開を、胸骨下で行い、そして肝臓の左側葉を取り出す。４−０絹糸を用いて、下部葉を体腔外に確保するために、その下部葉の回りを縛る。クランプを用いて、その結び目を保持し、そして吸収性Dexon (American Cyanamid; Wayne, N. J.) の第２ループを、最初の結び目に隣接して配置する。遠位切断をDexon結び目から行い、そして約100mgの切除された肝臓組織を、無菌ペトリ皿に配置する。
【０３５０】
切除された肝臓切片を、14mlのポリプロピレン丸底管に移し、そして液体窒素において凍結し、そして次に、ドライアイス上に貯蔵する。手術部位を、縫合及び傷口用クリップにより閉じ、そして動物のカゴを、37℃で加熱されるパッド上に、手術の後、24時間、配置する。動物を手術の後、毎日調べ、そして傷口用クリップを、手術の７−10日後に取り除く。Zcytor 14 mRNAの発現レベルを、RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイ又はポリメラーゼ鎖反応を用いて、個々のトランスジェニックマウスについて試験する。
【０３５１】
Zcytor 14を過剰発現するトランスジェニックマウスを生成する他に、その遺伝子を異常に低く発現するか、又はまったく発現しないトランスジェニックマウスを構築することは有用である。そのようなトランスジェニックマウスは、Zcytor 14の欠失に関連する疾病のための有用なモデルを提供する。上記で論じられたように、Zcytor 14遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、又は外部案内配列遺伝子を用いて阻害され得る。
【０３５２】
Zcytor 14遺伝子を過少発現するトランスジェニックマウスを生成するためには、そのような阻害配列がZcytor 14 mRNAに標的化される。特定の遺伝子の異常に低い発現をトランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Wuなど., “Gene Under Expression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and DNA Strategies” in Methods in Gene Biotechnology, p. 205-224 (CRC Press 1997) を参照のこと）。
【０３５３】
Zcytor 14遺伝子発現をほとんどか又はまったく有さないトランスジェニックマウスを生成するための他のアプローチは、非官能性Zcytor 14遺伝子により置換された、少なくとも１つの正常Zcytor 14対立遺伝子を有するマウスを生成することである。非官能性Zcytor 14遺伝子を企画する１つの方法は、もう１つの遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子を、Zcytor 14をコードする核酸分子内に挿入することである。
【０３５４】
いわゆるそれらの“ノックアウトマウス”を生成するための標準の方法は、当業者に知られている（例えば、Jacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd, 1994), 及びWuなど., “New Strategies for Gene Knockout,” in Methods in Gene Biotechnology, Pages 339-365 (CRC Press 1997)を参照のこと）。
一般的に記載されて来た本発明は、次ぎの例により容易に理解されるであろう。但し、それらの例は、本発明を制限するものではない。
【０３５５】
実施例
例１．Zcytor 14遺伝子の発現
ノザン分析を、Human Multiple Tissue Blots (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) を用いて行った。２種のプローブを、ゲル精製されたPCR生成物から生成した。第１のプローブを、プライマーとして、ZC21798（5’ CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3’; 配列番号８）及びZC21808 (5’ TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3’; 配列番号９) を用いて製造した。前記プローブを、Amersham (Arlington Heights, IL) からのMultiprime ラベリングキットを用いて、製造業者のプロトコールに従って、放射性ラベルした。プローブを、NUCTRAPプッシュカラム（STRATAGENE, La Jolla, CA）を用いて精製した。
【０３５６】
EXPRESSHYB (CLONTECH) 溶液を、ノザンブロットのためのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液のために使用した。ハイブリダイゼーションは、65℃で一晩、行われた。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットを、0.1％のSDS及びSSCを含む溶液において次の通りに、それぞれ30分間、洗浄した：２×SSCにおいて室温で２度、0.1×SSCにおいて50℃で３度、0.1×SSCにおいて55℃で1度、及び0.1×SSCにおいて65℃で１度。結果は、Zcytor 14遺伝死が甲状腺、副腎、前立腺及び肝臓組織において強く発現され、そして心臓、小腸、胃及び気管組織においてより低い程度、発現されることを示した。対照的に、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢白血球、脊髄、リンパ節及び骨髄においては、ほとんどか、又はまったく発現は存在しなかった。
【配列表】
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