(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡ断片または発現化配列タグ（ＥＳＴ）内に含まれる核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドに対する免疫グロブリンまたはその断片を作成する方法であって、
ａ）融合タンパク質を含む封入体を形成可能な条件下、宿主細胞内でこの融合タンパク質をコードする核酸分子を発現する工程：
ここで、該融合タンパク質は、
ａａ）該条件下の宿主細胞において発現された場合に封入体内に含まれ、そして繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインを含む（ポリ）ペプチド／タンパク質融合パートナーおよび、
ａｂ）該（ポリ）ペプチドを含み、
該宿主細胞は大腸菌である；
ｂ）該封入体を単離する工程；ならびに、
ｃ）遺伝子ＩＩＩタンパク質が繊維状ファージの表面に提示されており、遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインを含む繊維状ファージの表面に提示された、免疫グロブリンまたはその断片の組換えライブラリーのメンバーを選択することによって、該（ポリ）ペプチドと特異的に結合する免疫グロブリンまたはその断片を作成する工程を含む方法。
【請求項２】
該融合タンパク質が該融合パートナーをＮ末端部分として含み、該（ポリ）ペプチドをＣ末端部分として含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該融合タンパク質がさらに、該融合パートナーと該（ポリ）ペプチドを連結する（ポリ）ペプチドリンカーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該リンカーが開裂シグナルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ゲノムＤＮＡ断片または該ＥＳＴが原核生物またはウイルスから得られたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該原核生物またはウイルスが病原性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ゲノムＤＮＡ断片または該ＥＳＴが真核生物から得られたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴが非哺乳類種から得られたものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴが哺乳類種から得られたものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該哺乳類種がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該核酸が該融合タンパク質の過剰発現を可能にする条件下で発現される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該融合タンパク質がサイトゾルで発現される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該融合パートナーが遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ酸１〜８２からなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴが、１００塩基対から２０００塩基対の長さである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴが、（ポリ）ペプチドをコードするか、あるいは推定のオープンリーディングフレームからなる核酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程ｂ）がさらに、（ｉ）該融合タンパク質を適当な条件下で可溶化する工程を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
工程ｂ）がさらに、（ｉｉ）該融合タンパク質を適当な条件下で再フォールディングさせる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該融合タンパク質を遊離形態で精製する工程をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
該免疫グロブリン断片がＦｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴによってコードされる（ポリ）ペプチドに対する特異的結合パートナーの作成に関する。この（ポリ）ペプチドは、宿主細胞内での発現時に封入体を形成している融合タンパク質の部分として発現される。この封入体を用いて、該（ポリ）ペプチドと特異的に結合する結合パートナーを作成する。この特異的結合パートナー、特に免疫グロブリンまたはその断片は、対応するゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴを含む核酸配列によってコードされるタンパク質の分析および機能的特徴付けに有用である。本発明はさらに、本発明の方法において用いられる核酸分子、ベクターおよび宿主細胞に関する。
【０００２】
本発明はさらに、融合パートナーとして繊維状ファージ（filamentous phage）の遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインを含む融合タンパク質を、該融合パートナーと融合された（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現するために使用すること、および（ポリ）ペプチド／タンパク質の発現方法に関する。
【０００３】
数年前から、ヒトゲノムの配列決定およびそこにコードされるタンパク質の構造および機能の同定および特徴付けに対し、多大な努力が行われてきた。これにより最終的には、疾患の予防、診断および治療に関する新たな標的が提供されるであろう(Collins & Galas, 1993; Adams et al., 1995)。
【０００４】
現在、ヒトゲノム上に分布する遺伝子の同定および特徴付けに関し、２つの異なるアプローチが行われている。１つのアプローチでは、大きなゲノムＤＮＡ断片を単離し、クローニングし、配列決定する。生命情報科学ソフトウェアを用いてこれらのゲノム配列中の潜在的オープンリーディングフレームを同定する。しかし、このアプローチでは、ゲノム中に散在するタンパク質をコードしている配列を発見するためにタンパク質をコードしていない広い範囲のヒトＤＮＡの配列を決定することが必要になる。過度の配列決定が必要であるのに加えて、生命情報科学ソフトウェアが得られたゲノム配列を誤って特徴付けすることもある。それゆえ、このソフトウェアは非コード化ＤＮＡを誤ってコード化ＤＮＡと特徴付けする間違った陽性を示し、あるいはコード化ＤＮＡを非コード化ＤＮＡと誤認する間違った陰性を示すこともある。
【０００５】
別のアプローチでは、ヒトタンパク質をコードする単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。このアプローチを用いて、ゲノムのタンパク質をコードする配列由来のＤＮＡに対してのみの配列決定を行う。しばしば、発現化配列タグ（expressed sequence tags）（ＥＳＴ）と称される配列を得るために、ｃＤＮＡの短い範囲のみを配列決定する（ＷＯ９３／００３５３）。
【０００６】
原理的には、次いでＥＳＴを用いて、このＥＳＴ配列に隣接する配列を含む、より延長されたｃＤＮＡを単離または精製することができる。これらの延長されたｃＤＮＡは、ＥＳＴの起源となる遺伝子の部分的あるいは完全コード化配列を含み得る。
【０００７】
相同性、構造的モチーフなどが同定できる特定の場合には、ゲノムＤＮＡまたはその断片、ＥＳＴ、延長されたｃＤＮＡ、および／またはそれによってコードされる（ポリ）ペプチド／タンパク質を分析することによって、インビトロまたはインビボで試験し、あるいは証明できる機能を（ポリ）ペプチド／タンパク質に対して割り当てることができる。しかし、種々のＥＳＴ配列決定に対する努力は莫大な数のＥＳＴに向けられ、その情報をどのように構造化するのが最善であるか、および興味深い配列をどのように同定するかという問題に至った。これゆえ、依然として、興味のある（ポリ）ペプチド／タンパク質に対して、細胞および組織タイプに対するその局在性、特定の疾患または発生段階におけるその上行調節または下行調節、または特定の相互作用またはシグナル伝達経路を活性化または遮断するその役割を分析する研究手段を開発し、使用する必要がある。
【０００８】
１つのアプローチは、そのような研究手段として抗体またはその断片を用いることである。ＷＯ９３／００３５３では、ＥＳＴを発現し、対応する（ポリ）ペプチドで動物を免疫して抗体を作成することが示されている。同様のアプローチでは、ＥＳＴ配列を含むＤＮＡ構築物を動物に注射し、インビボで発現された（ポリ）ペプチドに対する免疫応答を生じさせる(Sykes & Johnston, 1999)。しかし、これらのアプローチは抗体作成の高速処理には不向きである。
【０００９】
別法として、ＥＳＴ配列中にて重複するペプチド群のセットに対する抗体を作成する(Persic et al., 1999)。このアプローチは、組換え抗体ライブラリーのスクリーニングと組み合わせて、抗体断片を高速処理する研究手段として発展させることが原理的には可能である。しかし、十分に高い親和性を有する抗ペプチド抗体を得ることはしばしば困難である。
【００１０】
したがって、本発明が克服すべき技術的課題は、ゲノムＤＮＡまたはＥＳＴに対応するタンパク質を分析し、機能的に特徴付けするための、ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴによってコードされる（ポリ）ペプチドと結合する特異的結合パートナー、特に抗体または抗体断片を作成する、一般に適用可能な方法を提供することである。上記技術的課題の解決方法は、請求の範囲に特徴付けされる態様を提供することによって達成される。宿主細胞、例えば大腸菌における発現時に封入体の形成を導く（ポリ）ペプチド／タンパク質融合パートナーとの融合物として（ポリ）ペプチドを発現することによる、特異的結合パートナー、例えば抗体または抗体誘導化産物を作成するための、ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴによってコードされる（ポリ）ペプチドを提供し、それによって得られる封入体および融合タンパク質に対する特異的結合パートナーを作成する本発明の技術的アプローチは、先行技術に開示も示唆もされていない。
【００１１】
本発明に関するさらなる課題は、例えば宿主細胞に対して有毒であるために、容易に遊離形態で発現させることができない（ポリ）ペプチド／タンパク質の発現方法を発明することである。この技術的課題に対する解決方法もまた、請求の範囲に特徴付けされる態様を提供することによって達成される。（ポリ）ペプチド／タンパク質を、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインを含む融合タンパク質として発現し、これにより封入体を形成させる本発明の技術的アプローチは、先行技術に開示も示唆もされていない。
【００１２】
したがって本発明は、ゲノムＤＮＡ断片または発現化配列タグ（ＥＳＴ）内に含まれる核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドに対する特異的結合パートナーを作成する方法であって、
ａ）以下のものを含む融合タンパク質を含む封入体を形成可能な条件下、宿主細胞内でこの融合タンパク質をコードする核酸分子を発現する工程：
ａａ）該条件下の宿主細胞において発現された場合に封入体内に含まれる（ポリ）ペプチド／タンパク質融合パートナーおよび、
ａｂ）該（ポリ）ペプチド；
ｂ）該封入体を単離する工程；ならびに、
ｃ）該（ポリ）ペプチドと特異的に結合する特異的結合パートナーを作成する工程を含む方法に関する。
【００１３】
本発明の記載中、「特異的結合パートナー」とは、目的の（ポリ）ペプチドと特異的に結合可能な分子である。このような特異的結合パートナーは、ペプチド、束縛化ペプチド（a constrained peptide）、免疫グロブリンまたはその断片、または天然に存在するタンパク質の同族結合パートナー（a cognate binding partner）、例えば目的の（ポリ）ペプチドを含むレセプターに対するリガンドであってよい。このような同族リガンドは、本発明の融合タンパク質との結合に関して、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。また特異的結合パートナーは、例えば小分子の混合ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる小分子のような非タンパク質性特異的結合パートナーであってもよい。特異的結合パートナーはさらに、特異的結合パートナーと対応する（ポリ）ペプチドの相互作用を検出できるように修飾してもよい。このような修飾物は検出および／または精製タグ(Hochuli et al., 1988; Lindner et al., 1992; Hopp et al., 1988; Prickett et al., 1989; Knappik & Plueckthun, 1994)、または酵素(Blake et al., 1984)、または特異的結合パートナーと融合またはカップリングさせたレポーター分子であってよい。
【００１４】
本発明の記載中、用語「（ポリ）ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された複数、すなわち２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つまたはそれ以上の鎖からなる分子に関する。
【００１５】
用語「タンパク質」とは、少なくとも（ポリ）ペプチドの一部が、その（ポリ）ペプチド鎖（群）内および／または間の二次、三次または四次構造の形成によって規定される三次元配置が得られているか、あるいは獲得可能なそのような（ポリ）ペプチドを表す。この定義は、天然に存在するタンパク質または少なくとも部分的に人工的であるタンパク質などのタンパク質ならびに、上に記載したように規定される三次元配置を有する完全長タンパク質の断片またはドメインを含む。
【００１６】
用語「ゲノムＤＮＡ断片」とは、生物のゲノムの部分を形成し、そこから入手されたか、あるいは入手可能な連続する核酸配列を表す。
【００１７】
用語「発現化配列タグ（ＥＳＴ）」とは、ｃＤＮＡのある範囲（stretches）を配列決定することによって得られる連続するＤＮＡ配列である。
【００１８】
本発明では、このようなゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴは、（ポリ）ペプチドをコードするか、あるいは推定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる核酸配列を含む。
【００１９】
ＥＳＴデータベース(Eckmann et al., 1998; Bouck et al., 1999)はしばしば質の低い配列を含む(Aaronson et al., 1996)。当業者であれば、与えられたゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴ配列中の少なくとも１つの推定ＯＲＦを同定できるであろうし、また対応する組の融合タンパク質発現用に同定されるすべてのＯＲＦをクローニングし、それらを本発明にしたがって用いることは当業者に対して過度の負担を与えるものではないであろう。
【００２０】
ゲノムＤＮＡ断片またはＥＳＴの長さは好ましくは１００〜２０００塩基対、より好ましくは２００〜１５００塩基対である。
【００２１】
本発明で用いられる融合タンパク質をコードする核酸分子またはこの核酸分子を含む適当なベクターは、融合タンパク質の発現を生じさせるか、あるいは可能にするために必要な非コード化ＤＮＡ配列をさらに含む。本発明で用いられる融合タンパク質をコードする核酸分子の構築方法、この核酸分子を含むベクターの構築方法、このベクターの適当に選択された宿主細胞への導入方法、該融合タンパク質の発現を生じさせるか、あるいは達成する方法は、当分野に周知である（例えば Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994 を参照）。
【００２２】
（ポリ）ペプチド／タンパク質の発現中、いくつかの宿主系において封入体の形成が観察され得る。封入体は宿主細胞内に含まれる（ポリ）ペプチド／タンパク質の不溶性凝集物である。これは非常に密集した粒子であり、その細胞内の位置（subcellular location）とは無関係に非晶性または準結晶性構造を示す。適当な条件下、封入体に含まれる組換え（ポリ）ペプチド／タンパク質は総計で、全細胞タンパク質の約５０％またはそれ以上である。封入体の形成およびその性質およびその適用は詳細に調べられている（例えば Rudolph, 1996; Rudolph & Lilie, 1996; Rudolph et al., 1997; Lilie et al., 1998 を参照）。封入体の精製方法も同様にそこに記載されており、当業者に周知である。
【００２３】
融合パートナーおよび（ポリ）ペプチド／タンパク質を含む融合タンパク質の発現によって形成される封入体形成を、該（ポリ）ペプチド／タンパク質の一般的発現方法として使用することはＷＯ９８／３０６８４に記載されている。
【００２４】
本発明の方法に適当な融合パートナーは、宿主細胞内での発現時に封入体内において見られる任意の（ポリ）ペプチド／タンパク質であってよい。ほとんどの場合、封入体形成は、用いられる系またはタンパク質に関わらず、高い発現率の結果生じるものである。特定のタンパク質の封入体形成の性向とその本質的性質、例えば分子量、疎水性、フォールディング経路などの間に相関はないと考えられる。封入体形成が観察されるための、本発明の融合パートナーとして用いるのに適当な候補物質である（ポリ）ペプチド／タンパク質には、大腸菌タンパク質、例えばマルトース結合タンパク質(Betton & Hofnung, 1996)、ＲＮアーゼＩＩ(Coburn & Mackie, 1996)、アルカリホスファターゼ(Derman & Beckwith, 1995)、ホスホリパーゼＡ(Dekker et al., 1995)、β−ラクタマーゼ(Rinas & Bailey, 1993)、チオレドキシン(Hoog, et al., 1984; WO 98/30684)、および非大腸菌タンパク質、例えばヒトプロカテプシンＢ（procathepsin B）(Kuhelj et al., 1995)、ブタインターフェロン−γ(Vandenbroeck et al., 1993)またはＴ５ ＤＮＡポリメラーゼ(Chatterjee et al., 1991)が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
上に記載される宿主は、細菌、例えば大腸菌（例えば Ge et al, 1995 を参照）または枯草菌（Bacillus subtilis）(Wu et al., 1993)；真菌、例えば酵母(Horwitz et al., 1988; Ridder et al., 1995)または糸状菌(Nyyssoenen et al., 1993)；植物細胞(Hiatt, 1990, Hiatt & Ma, 1993; Whitelam et al., 1994)；昆虫細胞(Potter et al., 1993; Ward et al., 1995)または哺乳類細胞(Trill et al., 1995)を含むがこれらに限定されない、タンパク質の生産において一般的に用いられるたくさんの宿主のいずれかであってよい。
【００２６】
「（ポリ）ペプチドと特異的に結合する結合パートナー」の作成および、場合により、同定は、特異的結合パートナーのタイプに応じ、当業者に周知の種々の方法を用いて達成することができる。例えば、化学的化合物、ペプチドまたは生体分子、例えば免疫グロブリンの混合ライブラリーを、好ましくは精製後の標的である単離された封入体に関して、あるいはより好ましくはその封入体から得られた、可溶化形態または再フォールディング形態の融合タンパク質に関して、あるいは標的である遊離の（ポリ）ペプチドに関してスクリーニングし、ならびに／あるいは選択することができる（例えば http://www.5z.com/divinfo/reviews.html; Pinilla et al., 1999; Woodbury & Venton, 1999; Borman, 1999; Eisele et al., 1999; Lebl, 1999 を参照）。
【００２７】
本発明の方法の好ましい態様では、融合タンパク質は、Ｎ末端部分として融合パートナーを、Ｃ末端部分として（ポリ）ペプチドを含む。さらに好ましいのは、融合タンパク質が、融合パートナーと（ポリ）ペプチドを連結する（ポリ）ペプチドリンカーをさらに含んでいる方法である。このリンカーは約１〜約３０、好ましくは約５〜約１５の範囲のアミノ酸からなるものであり得る。特に好ましいのは、該リンカーが開裂シグナルを含む方法である。
【００２８】
本発明の記載中、用語「開裂シグナル」とは、例えば化学反応または酵素反応による融合パートナーと（ポリ）ペプチド間での融合タンパク質の開裂を可能にし、遊離形態の該（ポリ）ペプチドを得ることが可能なアミノ酸配列を表す。このような開裂シグナルは、当業者に周知のプロテアーゼ、例えばエンテロキナーゼまたはトロンビンの特異的認識配列であるのが好ましい。別法として、化学物質、例えば臭化シアンを用いて融合タンパク質を化学的分解によって開裂させてもよい。
【００２９】
融合タンパク質には、Ｎ末端および／またはＣ末端、および／または（ポリ）ペプチドリンカー内にさらなる（ポリ）ペプチド配列を含ませることができる。これには、例えば融合タンパク質の同定および／または精製を可能にする（ポリ）ペプチドが含まれる。このような（ポリ）ペプチドタグの例には、Ｈｉｓｎ(Hochuli et al., 1988; Lindner et al., 1992)、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ(Hopp et al., 1988; Prickett et al., 1989; Knappik & Plueckthun, 1994)、またはＳｔｒｅｐタグ(Schmidt & Skerra, 1993; Schmidt & Skerra, 1994; Schmidt et al., 1996)がある。こららのタグはすべて当分野に周知であり、当業者には完全に利用可能なものである。
【００３０】
本発明の方法のさらに好ましい態様では、該ゲノムＤＮＡ断片または該ＥＳＴは原核生物またはウイルスから得られたものである。最も好ましいのは、該原核生物またはウイルスが病原体である方法である。
【００３１】
ヒトに対して病原性であるか、あるいは動物または植物に対して病原性である生物のゲノムの配列決定によって、予防、診断および／または治療的介入のための新規標的タンパク質を調べることができる。
【００３２】
さらに好ましいのは、該融合タンパク質の過剰発現を可能にする条件下で該核酸を発現させる方法である。
【００３３】
さらに好ましい態様では、本発明は、該ゲノムＤＮＡ断片または該ＥＳＴが真核生物から得られたものである方法に関する。
【００３４】
好ましい態様では、本発明は、該ゲノムＤＮＡ断片または該ＥＳＴが非哺乳類種から得られたものである方法に関する。
【００３５】
さらに好ましいのは、該ゲノムＤＮＡ断片または該ＥＳＴが哺乳類種から得られたものである方法である。
【００３６】
最も好ましい態様では、本発明は、該哺乳類種がヒトである方法に関する。
【００３７】
本発明の方法の好ましい態様では、該宿主細胞は真核生物細胞である。特に好ましくは酵母または昆虫細胞である。
【００３８】
本発明の方法の最も好ましい態様では、該宿主細胞は原核生物細胞である。特に好ましくは細菌細胞である。最も好ましくは、該細菌細胞は大腸菌細胞である。
【００３９】
本発明のさらなる好ましい態様は、該融合タンパク質が細菌宿主細胞のサイトゾルで発現される方法に関するものである。特に好ましいのは、本発明にしたがって、該融合パートナーが少なくとも１つのジスルフィド結合を含む融合タンパク質をサイトゾルで発現することである。
【００４０】
ジスルフィド結合の形成は通常、この還元的細胞区画においては生じないので、ジスルフィド結合した（ポリ）ペプチド／タンパク質が細菌サイトゾルで生産されるならば、封入体形成が予測され得ることがわかった。この結果、不適当なフォールディングとなり、凝集する(Lilie et al., 1998)。
【００４１】
さらに好ましいのは、該融合パートナーが分泌タンパク質であり、該核酸が、融合タンパク質を周辺質へ輸送するシグナル配列をコードする核酸配列を含まない方法である。分泌（ポリ）ペプチド／タンパク質のサイトゾル発現は封入体の形成を生じさせることが観察された(Lilie et al., 1998)。
【００４２】
好ましい態様では、本発明は、該融合パートナーが宿主細胞の内生（ポリ）ペプチド／タンパク質である方法に関する。
【００４３】
最も好ましいのは、該融合パートナーが該宿主細胞に対して外来性の（ポリ）ペプチド／タンパク質である方法である。
特に好ましいのは、該融合パートナーが大腸菌マルトース結合タンパク質、大腸菌ＲＮアーゼＩＩ、大腸菌アルカリホスファターゼ、大腸菌ホスホリパーゼＡ、大腸菌β−ラクタマーゼ、大腸菌チオレドキシン、ヒトプロカテプシンＢ、ブタインターフェロン、およびＴ５ ＤＮＡポリメラーゼ由来である方法である。
【００４４】
本発明の方法のさらに最も好ましい態様では、該宿主細胞は大腸菌であり、該融合パートナーは繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩの第一Ｎ末端ドメインを含む。好ましくは、該融合パートナーは遺伝子ＩＩＩタンパク質の２つのＮ末端ドメインからなり、より好ましくは遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインからなる。最も好ましくは、該融合パートナーは遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ酸１〜８２からなる。
【００４５】
Ｆｆ繊維状ファージｆ１、ｆｄおよびＭ１３による大腸菌の感染は、ファージ粒子の一端に位置する遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ）のＦコンジュゲーティブ線毛（F conjugative pilus）の先端部との相互作用によって開始される(Model & Russel, 1988)。成熟ｇ３ｐ（４０６アミノ酸）はリンカー配列によって分離された３つのドメインから構成される(Stengele et al., 1990; Krebber et al., 1997)。以下の役割を各ドメインに割り当てることが可能である：ｇ３ｐのＮ末端ドメイン（Ｎ１）は膜浸透を担い(Riechmann & Holliger, 1997)、真ん中のドメイン（Ｎ２）は細菌のＦ線毛との結合を担い(Stengele et al., 1990)、ならびにＣ末端ドメイン（ＣＴ）は、ファージ形態形成の役割を担い、ならびにファージ粒子の一端をキャップする(Crissmann & Smith, 1984)。ｇ３ｐの２つのＮ末端ドメイン（Ｎ１−Ｎ２）の結晶構造およびＮ１の溶液構造は解明されている(Lubkowski et al., 1998; Holliger & Riechmann, 1997)。精製されたＮ１は、ｍＭ濃度において非常に可溶性であり、単量体であることが示された(Holliger & Riechmann, 1997)。しかし、大腸菌細胞質におけるＮ１またはＮ１−Ｎ２の発現は、封入体の形成を生じ、それからタンパク質を再フォールディングさせることができる(C. Krebber, 1996; Krebber et al., 1997)。Ｎ１およびＮ１−Ｎ２融合タンパク質の発現は細胞にとって有毒である(C. Krebber, 1996)から、例えばｐＥＴ(Stratagene, La Jolla, CA, USA)またはｐＢＡＤ発現系(Invitrogen BV, Groningen, The Netherlands)を用いて融合遺伝子の転写を厳重に調節するのが好ましい。これらのベクターの使用は、遺伝子産物の有毒作用が予想され、想定され、あるいは観察されるすべての場合で適用可能であり、発現条件の調節において当業者に周知の第一段階の１つである。
【００４６】
ｇＩＩＩｐの第一Ｎ末端ドメインを含む融合パートナーはこれらの融合パートナーを含む融合タンパク質がサイトゾル発現時にすぐに封入体を形成するが、容易に可溶化できる(Krebber et al., 1997)ので、特に有用である。
【００４７】
融合パートナーは上記の親融合パートナー（例えばｇＩＩＩｐの第一Ｎ末端ドメインを含む（ポリ）ペプチド／タンパク質）の変異体または突然変異体であってよいが、ただし該変異体または突然変異体は、親融合パートナーが封入体に含まれる条件下、宿主細胞内での発現時に同様に封入体に含まれるものである。このような変異体または突然変異体は、親融合パートナーに対して、例えば１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（群）を加え、置換し、ならびに／あるいは欠失させることによって得ることができる。発現時の封入体形成は、当業者が容易にモニターできる性質のものであるから、本発明の方法に適当な性質を有する変異体または突然変異体を同定するために過度の実験を行う負担を必要としない。
【００４８】
さらに好ましい態様では、本発明は、工程ｂ）がさらに（ｉ）該融合タンパク質を適当な条件下で可溶化する工程を含む方法に関する。
【００４９】
さらに好ましい態様では、本発明は、工程ｂ）がさらに（ｉｉ）適当な条件下で該融合タンパク質を再フォールディングさせる工程を含む方法に関する。
【００５０】
封入体内に含まれる（ポリ）ペプチド／タンパク質を可溶化し、ならびに／あるいは再フォールディングさせる方法は十分に研究され、当業者に周知である（例えば Rudolph, 1996; Rudolph & Lilie, 1996; Rudolph et al., 1997; Lilie et al., 1998 を参照）。
【００５１】
別の態様では、本発明は該融合タンパク質がさらに、該融合パートナーと該（ポリ）ペプチドを連結する、開裂シグナルを含む（ポリ）ペプチドリンカーを含み、工程ｂ）がさらに、（ｉｉｉ）該融合タンパク質を該融合パートナーと該（ポリ）ペプチド間で開裂させる工程および（ｉｖ）遊離形態の該（ポリ）ペプチドを単離する工程を含む方法に関する。さらに好ましいのは、該融合タンパク質または遊離形態の該（ポリ）ペプチドを精製する工程をさらに含む方法である。
【００５２】
該融合パートナーと該（ポリ）ペプチド間での融合タンパク質の開裂を可能にする開裂シグナルを含む融合タンパク質の構築は本明細書中、上に記載されている。
【００５３】
本発明の方法の好ましい態様では、該特異的結合パートナーは免疫グロブリンまたはその断片である。
【００５４】
本明細書中、「免疫グロブリン」という用語は「抗体」の類義語として用いられる。本発明の免疫グロブリン断片は、Ｆｖ(Skerra & Plueckthun, 1988)、ｓｃＦｖ(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988)、ジスルフィド結合したＦｖ(Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et al., 1993)、Ｆａｂ（Ｆａｂ'）２断片または当業者に周知の他の断片であって、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変ドメインを含むものであり得る。特に好ましいのは、ｓｃＦｖ断片形式である。
【００５５】
本発明の方法の最も好ましい態様では、該免疫グロブリンまたはその断片は、（ｉ）該封入体、該融合タンパク質または該（ポリ）ペプチドで動物を免疫し、（ｉｉ）この動物によって生産される、該封入体、該融合タンパク質または該（ポリ）ペプチドと特異的に結合する免疫グロブリンを選択することによって作成される。動物を免疫する方法および特異的免疫グロブリンをスクリーニングし、ならびに／あるいは選択する方法は当業者に周知である。
【００５６】
本発明のさらに最も好ましい態様では、該免疫グロブリンまたはその断片は、該封入体、該融合タンパク質または該（ポリ）ペプチドと特異的に結合する免疫グロブリンまたはその断片の組換えライブラリーのメンバーを選択することによって作成される。免疫グロブリンまたはその断片の組換えライブラリーは種々の刊行物に記載され（例えば Vaughan et al., 1996; Knappik et al., 2000; WO 97/08320 を参照）、当業者に周知である。
【００５７】
特に好ましいのは、該ライブラリーが複製可能遺伝的パッケージの表面に表示されている方法である。
【００５８】
用語「複製可能遺伝的パッケージ」とは、（ポリ）ペプチド／タンパク質ライブラリーメンバーをコードする遺伝情報とそこから発現される（ポリ）ペプチド／タンパク質を関連付けることによって、（ポリ）ペプチド／タンパク質のライブラリーのメンバーの表現型と遺伝子型を結び付けるものを表す。このライブラリーは、所望の性質に関してスクリーニングおよび／または選択可能であり、スクリーニングおよび／または選択される（ポリ）ペプチド／タンパク質はそれに関連する遺伝情報を介して同定することができる。「複製可能遺伝的パッケージ」の例には、細胞、例えば細菌(WO 90/02809; Georgiou et al., 1993; Francisco & Georgiou, 1994; Daugherty et al., 1998)、酵母(Boder & Wittrup, 1997; Kieke et al., 1997; Cho et al., 1998; Kieke et al., 1999)、昆虫細胞(Ernst et al., 1998)、ウイルス、例えばバクテリオファージ(WO 90/02809; Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996)、レトロウイルス(Russell et al., 1993)、胞子(WO 90/02809)、または核酸分子とそれから発現される（ポリ）ペプチド／タンパク質の複合体、例えばリボソーム複合体中(Hanes & Plueckthun, 1997; Hanes et al., 1998; Hanes et al., 1999)または非共有結合によって結合する複合体(Cull et al., 1992; Schatz, 1993; Schatz et al., 1996; Gates et al., 1996)または共有結合によって結合する複合体(Nemoto et al., 1997)中のような複合体が含まれる。
【００５９】
さらに好ましいのは、該複製可能遺伝的パッケージが繊維状ファージである方法である。
【００６０】
本発明の記載中、用語「繊維状ファージ」とは、種々のグラム陰性細菌を感染できるバクテリオファージのクラスを表す。これは、長い筒を形成するタンパク質コーティング中にパッケージングされた、共有結合的に閉環された一本鎖ＤＮＡゲノムを有する。これらのファージのうち最も特徴付けされているものには、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１およびその誘導体がある。繊維状ファージは外来（ポリ）ペプチド／タンパク質およびそのライブラリーの表示用によく用いられ、種々のアプローチおよび適用がいくつかの刊行物に総括されている(例えば Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996)。
【００６１】
特に好ましいのは、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ）のＮ末端ドメインを融合パートナーとして含む融合タンパク質の、繊維状ファージ表面に表示された免疫グロブリンまたはその断片の組換えライブラリーをバイオパニング（biopanning）するための使用である。以下の性質により、Ｎ１はファージディスプレイライブラリーのバイオパニングにおいて使用されるべき特に適当な候補である：
−Ｎ１（成熟ｇ３ｐのアミノ酸１〜８２）は小さく、４．１４の低いｐＩを有し、通常生理的ｐＨで行われるバイオパニングに用いられる慣用的ミクロタイタープレートに対するコーティングに有利であり、
−Ｎ１結合ｓｃＦｖをその表面に表示するほとんどのファージは、３〜５コピーのＮ１を含むｇ３ｐをその表面に保持する他のファージと結合し、自動的に除去される。
【００６２】
別の態様では、本発明は、ａａ）繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインおよびａｂ）ゲノムＤＮＡ断片または発現化配列タグ（ＥＳＴ）に含まれる核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、この融合タンパク質を細菌宿主細胞の周辺質へ輸送するためのシグナル配列をコードする核酸配列を含まないものに関する。
【００６３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。好ましくは、該ベクターは発現ベクターである。
【００６４】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。特に好ましいのは、大腸菌細胞である宿主細胞である。
【００６５】
さらに、本発明は、融合パートナーと融合された（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現するための、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインを融合パートナーとして含む、封入体の形態で得られた融合タンパク質の使用に関する。融合パートナーおよび（ポリ）ペプチド／タンパク質を含む融合タンパク質の発現による封入体形成を用いる、該（ポリ）ペプチド／タンパク質の発現方法としての一般的方法は(WO 98/30684)に記載されている。
【００６６】
融合タンパク質はさらに、該融合パートナーと該（ポリ）ペプチド／タンパク質を連結するリンカー配列を含んでもよい。このリンカーは約１〜約３０、好ましくは約５〜約１５アミノ酸から構成され得る。このリンカーは融合タンパク質をこの融合パートナーとこの（ポリ）ペプチド／タンパク質間で開裂させ、遊離形態の該（ポリ）ペプチド／タンパク質を獲得可能にする開裂シグナルを含んでいてもよい。このような開裂シグナルは好ましくは、当業者に周知のプロテアーゼ、例えばエンテロキナーゼまたはトロンビンの特異的認識配列である。別法として、融合タンパク質は、臭化シアンのような化学物質での化学分解によって開裂させてもよい。このような融合タンパク質は、再フォールディングさせた後に、インビトロＳＩＰにおいて同様に用いることができる(Krebber et al., 1997)。
【００６７】
本発明はさらに、（ポリ）ペプチド／タンパク質の発現方法であって、
ａ）ａａ）繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質の第一Ｎ末端ドメインおよび、
ａｂ）該（ポリ）ペプチド／タンパク質
を含む融合タンパク質を含む封入体形成を可能にする条件下、宿主細胞内でこの融合タンパク質をコードする核酸分子を発現することを含む方法に関する。
【００６８】
特に好ましいのは、さらに
ｂ）該封入体を単離する工程；ならびに、
ｃ）適当な条件下で該融合タンパク質を可溶化する工程
を含む方法である。
【００６９】
本発明にしたがって作成される特異的結合パートナーは、該（ポリ）ペプチドを含む天然に存在する（ポリ）ペプチド／タンパク質の同定および／または特徴付けに用いることができる。このような使用には、免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、細胞抽出物のウエスタンブロット分析、組織または細胞に対する免疫組織化学または免疫細胞化学、細胞抽出物を用いる免疫沈降、免疫共沈降などにおける特異的結合パートナー、例えば免疫グロブリンまたはその断片の使用が含まれるがこれに限定されない。このような結合アッセイまたは類似の方法および標的物質の単離における特異的結合パートナー、例えば免疫グロブリンまたはその断片の使用は、当業者に周知である。
【００７０】
本発明にしたがって作成される特異的結合パートナーを用いることによって、該（ポリ）ペプチドを含む天然に存在する（ポリ）ペプチド／タンパク質を同定し、ならびに／あるいは特徴付けすることが可能であろう。天然に存在する（ポリ）ペプチド／タンパク質を天然起源から単離する方法および、これらの（ポリ）ペプチド／タンパク質を直接、あるいはこれらをコードする遺伝情報を介して同定する方法は当業者に周知である。
以下に実施例を挙げ、本発明を説明する。
【００７１】
実施例
以下の記載では、すべての分子生物学的実験は標準的プロトコル(Ausubel et al., 1995)にしたがって行う。
【００７２】
実施例１：ファージを用いる機能的ゲノム科学：Ｎ１融合タンパク質の過剰発現、封入体からの精製、再フォールディングさせた融合タンパク質に対するファージディスプレイライブラリーのバイオパニング
発現ベクターの作成
用いられるすべてのベクターは発現ベクターｐＴＦＴ７４（Freund et al., 1993）の誘導体である。このベクターの唯一のＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間へ、Ｎ末端に追加のメチオニン残基を含むファージｆｄの成熟ｇ３ｐのアミノ酸１〜８２をコードするＤＮＡ配列、マルチクローニング部位および６ｘＨｉｓ精製タグをコードするＤＮＡ配列を挿入し、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈ（図１、完全なベクター配列は後ろに示す）を作成した。成熟ｇ３ｐの最初の８２アミノ酸はドメインＮ１（アミノ酸１〜６７）およびＮ１とＮ２間のリンカーの最初の１５アミノ酸を含む（Lubkowski et al., 1998）。マルチクローニング部位に融合された、唯一のＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間にＭｅｔ−Ａｌａ、６ｘＨｉｓ精製タグおよびファージｆｄのｇ３ｐのアミノ酸２〜８２をコードするＤＮＡ配列およびすべての３つのリーディングフレーム用の３つの終止コドンを有する第二のベクター、ｐＴＦＴ７４−Ｈ−Ｎ１−ＭＣＳ（図２、完全ベクター配列は後ろに示す）を作成した。公開されている配列と比較して、ベクターｐＴＦＴ７４内では、第５７位のＧがＴへヌクレオチド交換されていることがわかった。
【００７３】
ＰＣＲによって作成されたＤＮＡ断片または以下および図３の説明内に示されるアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドカセットとして作成されたＤＮＡ断片をベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈ内の唯一のＢｓｉＷＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位間、あるいは唯一のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位間へクローニングした。
ＰＣＲ中に５'末端および３'末端に適当な制限部位を導入することを除き、Hua et al. (1998) によって記載される手法と同様にして、ＰＣＲ増幅されたＥＳＴを大量に（高速処理で）クローニングするためにベクターｐＴＦＴ７４−Ｈ−Ｎ１−ＭＣＳを用いる。オリゴｄＴプライム化一方向性クローン化ｃＤＮＡ（oligo dT primed, directionally cloned cDNAs）に関するこの方法では、各ｃＤＮＡクローニングベクターの挿入物の増幅に、プライマーが４つだけ必要とされる（３つのオープンリーディングフレームにおけるＥＳＴ挿入物増幅用の３つの正方向プライマー（forward primer）およびｃＤＮＡクローニングベクターの下流配列に対応する逆方向プライマー（reverse primer））。挿入物の６つの可能なリーディングフレームすべてをカバーする６ＰＣＲ産物の作成用には、各ｃＤＮＡクローニングベクターに対して８つのプライマーが必要とされる。
【００７４】
融合タンパク質の発現、精製および再フォールディング
発現、精製および再フォールディングは(C. Krebber, 1996; Krebber et al., 1997)に記載のように行った。簡単には、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞(Studier et al., 1990)をそれぞれのｐＴＦＴ７４ベクター（以下を参照）で形質転換し、ＯＤ５５０が０．９〜１．２になるまで培養した。Ｎ１融合タンパク質の発現の誘導は１ｍＭ ＩＰＴＧを用い、３７℃で３時間行った。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって、可溶化された封入体からＮ１融合タンパク質を精製し、再フォールディングさせた。再フォールディング時のタンパク質濃度は通常＜１ｍｇ／ｍＬであった。
以下の構築物を用いた：
【００７５】
−Ｎ１−ｈａｇ：抗体１７／９によって認識されるヘマグルチニン由来のエピトープＤＶＰＤＹＡＳ(Schulze-Gahmen et al., 1993; Krebber et al., 1995)を含むアミノ酸配列ＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬＲＳＨＨＨＨＨＨと融合されたＮ１（Ｎ末端に追加のメチオニン残基を含むファージｆｄの成熟ｇ３ｐのアミノ酸１〜８２）。これはオリゴヌクレオチドカセット（これは以下の２つのオリゴヌクレオチドから作成される：５'−ＧＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＡ−３'および５'−ＡＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣ−３'）を、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−ＨのＢｓｉＷＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位間へクローニングすることによって得ることができる。
【００７６】
−Ｎ１−ＭａｃＩ：アミノ酸配列ＰＹＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳＤＩＡＦＬＩＤＧＳＧＳＩＩＰＨＤＦＲＲＭＫＥＦＶＳＴＶＭＥＱＬＫＫＳＫＴＬＦＳＬＭＱＹＳＥＥＦＲＩＨＦＴＦＫＥＦＱＮＮＰＮＰＲＳＬＶＫＰＩＴＱＬＬＧＲＴＨＴＡＴＧＩＲＫＶＶＲＥＬＦＮＩＴＮＧＡＲＫＮＡＦＫＩＬＶＶＩＴＤＧＥＫＦＧＤＰＬＧＹＥＤＶＩＰＥＡＤＲＥＧＶＩＲＹＶＩＧＶＧＤＡＦＲＳＥＫＳＲＱＥＬＮＴＩＡＳＫＰＰＲＤＨＶＦＱＶＮＮＦＥＡＬＫＴＩＱＮＱＬＲＥＫＩＦＡＩＥＧＴＱＴＧＳＳＳＳＦＥＨＥＭＳＱＥ（これはヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３を含む）および６ｘＨｉｓタグを含むＣ末端配列と融合されたＮ１（Ｎ末端に追加のメチオニン残基を含むファージｆｄの成熟ｇ３ｐのアミノ酸１〜８２）。ＨＬ−６０細胞のｃＤＮＡを鋳型として用い、ならびにオリゴヌクレオチドＣＲ−３ｆｏｒ（５'−ＧＴＡＣＧＴＡＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＧＣ−３'）およびＣＲ−３ｒｅｖ（５'−ＧＴＡＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＣ−３'）を用いてＰＣＲを行い、制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてＰＣＲ産物を消化し、この断片をベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−ＨのＢｓｉＷＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位間へクローニングしてベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭａｃＩ−Ｈを作成することによって得ることができる。
【００７７】
−Ｎ１(Krebber et al., 1997)
−図３に示されるＮ１融合物では、ＤＮＡ断片をｃＤＮＡクローンから、あるいはゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−ＨのＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位間へクローニングした。
【００７８】
Ｎ１−ＭａｃＩ結合物のスクリーニングでは、６ｘＨｉｓタグを含むＣ末端配列と融合されたヒトＣＲ−３αのアミノ酸１４９〜３５３を含むヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリーＰ１１２１５）の精製された断片（ＭａｃＩ）を用いた。これはクローンｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭａｃＩ−ＨからのＰＣＲによって得ることができる。クローニング時、遺伝子の５'末端にＡＴＧコドンを加えた。発現および精製は標準的方法を用いて行った（The QIAexpressionist（登録商標）第３版：A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins (July 1998). QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）。
【００７９】
Ｎ１−ＭａｃＩおよびＮ１に対するＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖファージライブラリーのパニング
標準的手法(Kay et al., 1996)およびＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖライブラリー(WO 97/08320)を用いて、Ｎ１−ＭａｃＩおよびＮ１に対するパニングおよび選択されたｓｃＦｖの特徴付けを行った。Ｎ１−ＭａｃＩおよびＮ１を、４℃で１２時間、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬの濃度で、Nunc Maxisorb ミクロタイタープレート（＃４４２４０４）にコーティングした。Ｎ１−ＭａｃＩの場合では、パニング前にファージを５％脱脂粉乳および０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（パニングＮＭａ）または５％脱脂粉乳、０．１％トゥイーン２０および０．５ｍｇ／ｍＬ Ｎ１−ｈａｇを含むＰＢＳ（パニングＮＭｂ）と１：１混合した。Ｎ１の場合、パニング前にファージを５％脱脂粉乳および０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（パニングＮａ）または５％脱脂粉乳、０．１％トゥイーン２０および０．５ｍｇ／ｍＬ Ｎ１を含むＰＢＳ（パニングＮｂ）と１：１混合した。ファージをこれらのバッファー中、室温で２時間インキュベートした後、抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに適用した。
３ラウンドのパニング後、各パニングから９２クローンをＥＬＩＳＡで分析した。パニングＮａおよびＮｂでは、Ｎ１に対する結合物は得られなかったのに対し、パニングＮＭａおよびＮＭｂでは、Ｎ１−ＭａｃＩに対するいくつかの結合物が選択された。これらの結合物をまた、ＭａｃＩに対する結合に関して試験した。ＥＬＩＳＡにおいてバックグラウンドに対して少なくとも３倍高いシグナルを示したクローンを陽性であるとした。
【００８０】
１．ＮＭａ
Ｎ１−ＭａｃＩに対して陽性：７７
ＭａｃＩに対して陽性：３７
２．ＮＭｂ
Ｎ１−ＭａｃＩに対して陽性：８５
ＭａｃＩに対して陽性：８０
すべてのＭａｃＩ結合物はまたＮ１−ＭａｃＩを認識する。比較的少量のＮ１−ｈａｇをブロッキングに用いると、ＭａｃＩ結合物数の１００％増加が生じる。しかし、Ｎ１−ＭａｃＩにはさらなるＮ末端リンカー残基が存在し、Ｎ１−ｈａｇを用いる非ＭａｃＩ結合物の完全なブロッキングは不可能である。いくつかの結合物に関して、特異的なＥＬＩＳＡを行い、これによりＭａｃＩに対して強力かつ特異的な選択的ｓｃＦｖ結合が示された（図４）。
【００８１】
実施例２：発現ベクターｐＢＡＤ−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈの構築および性質
ベクターｐＢＡＤ−Ｎ１−ＭＳＣ−Ｈは発現ベクターｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA）に基づくものであり、厳重に調節されたａｒａＢＡＤプロモーターの制御下での、タンパク質の発現を可能にする。マルチクローニング部位（ＭＣＳ）が後に続いているＮ１ドメインをコードするコード化領域およびＨｉｓｘ６タグをコードするコード化領域を含む発現カセット（３１１ｂｐ、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片）を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ（４０４６ｂｐ）に挿入することによってベクターｐＢＡＤ−Ｎ１−ＭＳＣ−Ｈを構築した。ｐＢＡＤ−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈのベクターマップおよび配列を図５に示す。
ｐＴＦＴベクター（実施例１および２を参照）と比較してこのベクターの有益な点は、融合タンパク質発現が厳重に制御され、潜在的に有毒な構築物のクローニングが可能であることである。さらに、クローニング株から発現株への変換のためのさらなるクローニング工程は必要ない。不利益は、ｐＴＦＴベクターと比較して発現収量が低いことがあることである。
【００８２】
実施例３：遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ１ドメインを含む融合タンパク質の発現発現ベクターのクローニング
Ｎ１融合タンパク質の発現用に用いられるベクターは実施例１に記載されるベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈ（図１、完全なベクター配列は後ろに示す）である。ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈ内へは、ＰＣＲによって作成されたか、あるいは以下のかっこ内に記載される（ポリ）ペプチドおよびタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドカセットとして作成されたＤＮＡ断片を唯一のＢｓｉＷＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位間か、あるいは唯一のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位間へクローニングして、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ｈａｇ（実施例１を参照）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭａｃI（実施例１を参照）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｕ１ｆｌ（ｈＣＭＶの完全長ＵＬ８４と融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｕ２（ｈＣＭＶのＵＬ８４のアミノ酸６８〜５８６を含むポリペプチドと融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｕ４（ｈＣＭＶのＵＬ８４のアミノ酸３００〜５８６を含むポリペプチドと融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−I１ｆｌ（成熟完全長ヒトＩＣＡＭ−１と融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｉ３（ヒトＩＣＡＭ−１のアミノ酸４０１〜４８０を含むポリペプチドと融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｉ４（ヒトＩＣＡＭ−１のアミノ酸１５１〜５３２を含むポリペプチドと融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｂ１（成熟ヒトＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸１〜１９８を含むポリペプチドと融合されたＮ１）、ｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ａ１４（成熟ヒトＭＨＣクラスＩＩα鎖アミノ酸１〜１９２を含むポリペプチドと融合されたＮ１）およびｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｎｐ５０（ヒトＮＦ−κＢ ｐ５０のアミノ酸２〜３６６を含むポリペプチドと融合されたＮ１）を作成した。すべての構築物は親和性（アフィニティー）精製用のＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有する。
【００８３】
Ｎ１融合タンパク質の大量発現
繊維状バクテリオファージＭ１３のｇ３ｐのドメインＮ１を大腸菌において過剰発現させ、封入体から精製し、活性タンパク質へ再フォールディングさせることができる（Krebber et al., 1997）。種々のポリペプチドをＮ１のＣ末端に融合させ、大腸菌において発現させて大量生産し、封入体形成させた（図６）。Ｎ１−ＭａｃＩの場合、封入体がすでにほとんど排他的にＮ１−ＭａｃＩを含んでいたので、Ｎ１−ＭａｃＩはＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって、さらなる精製が必要ではなかった（図６）。驚くべきことに、すべてのＮ１融合タンパク質（１０／１０）は、同じ再フォールディング条件を用いて約０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で再フォールディングさせた後に溶解性であり、純度は少なくとも９０％であった（図７）。タンパク質収量は、Ｎ１−ＭａｃＩの場合、１００ｍｇ／発現培養物１Ｌ程度に高く、通常は１ｍｇ〜１０ｍｇ／発現培養物１Ｌの範囲であった。
【００８４】
参考文献
【表１】
0004794789.tif 000002
【表２】
0004794789.tif 000003
【表３】
0004794789.tif 000004
【表４】
0004794789.tif 000005
【表５】
0004794789.tif 000006
【表６】
0004794789.tif 000007
【表７】
0004794789.tif 000008
【表８】
0004794789.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  発現ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈのベクターマップ。
【図１ｂ】  発現ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈの配列。
【図２ａ】  発現ベクターｐＴＦＴ７４−Ｈ−Ｎ１−ＭＣＳのベクターマップ。
【図２ｂ】  発現ベクターｐＴＦＴ７４−Ｈ−Ｎ１−ＭＣＳの配列。
【図３】  融合タンパク質構築物の発現。発現後、全細胞可溶化液を還元条件下、１２％ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙ ゲル（Bio-Rad）上で泳動した。このゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
レーン１、高分子量のＲａｉｎｂｏｗマーカー（Amersham）、タンパク質の分子量を示す；
レーン２、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の断片と融合されたＮ１（融合タンパク質の質量（計算値）：３３．４ｋＤ）；
レーン３、ＭＨＣクラスＩＩα鎖の断片と融合されたＮ１（融合タンパク質の質量（計算値）：３２．２ｋＤ）；
レーン４、ＩＭＡＧＥクローン４３４３２２由来のｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈへのクローニング用にＰＣＲによって増幅されたヒトＮＦ−κＢ ｐ１００Ｃ末端２８０アミノ酸と融合されたＮ１（融合タンパク質の質量（計算値）：３９．９ｋＤ）；
レーン５、成熟ヒトＩＣＡＭ−１と融合されたＮ１（融合タンパク質の質量（計算値）：６５．７ｋＤ）；
レーン６、ヒトＩＣＡＭ−１の断片と融合されたＮ１（未処理（unprocessed）タンパク質のアミノ酸４０１〜４８０、融合タンパク質の質量（計算値）：１９．３ｋＤ）；
レーン７、ヒトＩＣＡＭ−１の断片と融合されたＮ１（未処理タンパク質のアミノ酸１５１〜５３２、融合タンパク質の質量（計算値）：５２．２ｋＤ）；
レーン８、ヒトサイトメガロウイルスのＵＬ８４の断片と融合されたＮ１（アミノ酸６８〜５８６、融合タンパク質の質量（計算値）：６８．４ｋＤ）；
レーン９、ヒトサイトメガロウイルスのＵＬ８４の断片と融合されたＮ１（アミノ酸２００〜５８６、融合タンパク質の質量（計算値）：５３．２ｋＤ）；および、
レーン１０、ヒトサイトメガロウイルスのＵＬ８４の断片と融合されたＮ１（アミノ酸３００〜５８６、融合タンパク質の質量（計算値）：４２．２ｋＤ）
【図４】  Ｎ１−ＭａｃIに対して選択される３つの異なるｓｖＦｖ（クローン１〜３）の特異的ＥＬＩＳＡ。発現ベクター上のｓｃＦｖクローン１〜３を含むＪＭ８３細胞の周辺質フラクションの調製は(Knappik et al., 1993)に記載されている。ＰＢＳ中のＮ１−ＭａｃI、ＭａｃＩ、Ｎ１−ｈａｇ、Ｎ１およびＢＳＡそれぞれ１μｇを４℃で１２時間、Nunc Maxisorbミクロタイタープレート（＃４４２４０４）にコーティングし、次いで５％脱脂粉乳を含むＰＢＳを用いてこれを室温で２時間ブロックした。周辺質フラクションを、５％脱脂粉乳および０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳと１：１混合し、室温で１時間インキュベートした後、これらをミクロタイタープレートのブロックされたウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした。すべてのＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖはＮ末端Ｍ１ ＦＬＡＧ（Knappik & Plueckthun, 1994）を保持していたので、Ｍ１抗ＦＬＡＧ抗体（Sigme #F-3040）をウェルに適用し、室温で１時間インキュベートした（二次抗体）。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Sigma #A-6782; 三次抗体）および基質としてＢＭブルー可溶化物（Boehringer Mannheim # 1484281）を用いて、結合したＭ１抗ＦＬＡＧ抗体を検出した。ブロックし、周辺質フラクション、Ｍ１抗ＦＬＡＧ抗体および抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートとインキュベートした後、０．０５％トゥイーン２０および１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳバッファーを用いてＥＬＩＳＡプレートを５回洗浄した。基質を加え、３７０ｎｍの吸光度を測定した。
【図５ａ】  発現ベクターｐＢＡＤ−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈのベクターマップ。
【図５ｂ】  発現ベクターｐＢＡＤ−Ｎ１−ＭＣＳ−Ｈの配列。
【図６】  融合タンパク質構築物の発現および１工程の親和性精製。サンプルを還元条件下、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）上で泳動した。クーマシーブルーを用いてこのゲルを染色した。
レーン１、（１０３の倍数で）相対的な分子量を示すマーカータンパク質；
レーン２、１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導３時間後の、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−ＭａｃＩを宿す大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの粗製の可溶化液；
レーン３、Ｎ１−ＭａｃＩ発現由来の再フォールディングさせた封入体；
レーン４、親和性精製された再フォールディングさせたＮ１−ＭａｃＩ；
レーン５、１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導３時間後の、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｕ２を宿す大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）の粗製の可溶化液；
レーン６、親和性精製された再フォールディングさせたＮ１−Ｕ２；
レーン７、１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導３時間後の、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｉ３を宿す大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）の粗製の可溶化液；
レーン８、親和性精製された再フォールディングさせたＮ１−Ｉ３；
レーン９、１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導３時間後の、ベクターｐＴＦＴ７４−Ｎ１−Ｂ１を宿す大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）の粗製の可溶化液；
レーン１０、親和性精製された再フォールディングさせたＮ１−Ｂ１。
【図７】  親和性精製された再フォールディングさせたＮ１融合タンパク質の精製。サンプルを還元条件下、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）上で泳動した。クーマシーブルーを用いてこのゲルを染色した。融合タンパク質の分子量（計算値）をかっこ内に示す。
レーン１、（１０３の倍数で）相対的な分子量を示すマーカータンパク質；レーン２、Ｎ１−Ｕ１ｆｌ（７５．６ｋＤａ）；レーン３、Ｎ１−Ｕ２（６８．４ｋＤａ）；レーン４、Ｎ１−Ｕ４（４２．２ｋＤａ）；レーン５、Ｎ１−Ｉ１ｆｌ（６５．７ｋＤａ）；レーン６、Ｎ１−Ｉ３（１９．３ｋＤａ）；レーン７、Ｎ１−Ｉ４（５２．２ｋＤａ）；レーン８、Ｎ１−Ｂ１（３３．４ｋＤａ）；レーン９、Ｎ１−Ａ１４（３２．２ＫＤａ）；レーン１０、Ｎ１−Ｎｐ５０（５１．３ｋＤａ）。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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