(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチン及びカルシウムを含むミルク物質を任意に添加された可溶性または不溶性のカルシウム源と共に撹拌して０．４％以下のカルシウム濃度を得て、オステオポンチンが溶解状態に維持される一方で他のミルク構成成分が沈殿するように、ｐＨを３．５乃至５．０に、且つ／またはオステオポンチンを凝集または結合させる一方で溶解状態の他のミルク構成成分が除去されるように、ｐＨを６．０乃至８．５に調整することを特徴とする、ミルクからのオステオポンチンの単離方法。
【請求項２】
ミルク物質を添加された可溶性カルシウム塩と混合し、ｐＨを、オステオポンチンが溶解状態に維持される一方で他のミルク構成成分が沈殿するようにｐＨ３．５乃至５．０に調整することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨが、４．０乃至４．６に調整されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｐＨが、約４．２に調整されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
添加された可溶性カルシウム源が、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
ミルク物質を添加された不溶性カルシウム塩と混合し、ｐＨを、オステオポンチンが結合または凝集する一方で他のミルク構成成分の大部分を沈殿させることなくオステオポンチンを沈殿させるようにｐＨ６．０乃至８．５にに調整することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｐＨが、６．５乃至８．０に調整されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨが、約７に調整されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一工程には可溶性のカルシウム源及び３．５乃至５．０のｐＨが含まれ、少なくとも別の工程には不溶性のカルシウム源及び６．０乃至８．５のｐＨが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オステオポンチンを含有するミルク物質が、乳漿生成物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
オステオポンチンを含有するミルク物質が、濃縮乳漿生成物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
オステオポンチンを含有するミルク物質が、ミルクの化学的酸性化に由来する乳漿生成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
オステオポンチンを含有するミルク物質とカルシウム源とが、Ｃａ濃度が約０．２％になるように混合されることを特徴とする、請求項２または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミルクからのオステオポンチンの単離のための新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、本来、鉱質化された骨の膠原性細胞外基質から単離される分泌物である、粘着性グリコリンタンパク質である（Franzen A, Heinegard, D. 1985. Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcified matrix. Biochem. J. 232:715-724）。近年、オステオポンチンは、骨芽細胞、動脈性平滑筋細胞、白血球、数タイプの上皮細胞、及び異なる系統の変態細胞を含む多数の様々な細胞タイプによって発現されることが判明している（Denhardt DT, Butler WT, Chambers AF, Senger DR.(eds.). 1995. Osteopontin: role in cell signalling and adhesion. Ann. N. Y. Acad. Sci., 760）。したがって、ＯＰＮは、腎臓、胎盤、分泌上皮及び内耳の神経節、及び脈管系の平滑筋を含む多数の組織中において検出されている（Butler WT, Ridall AL, Mckee MD. 1996. Osteopontin.  In Bilezekian JP, Rai LG, Rodan GA(eds.DS) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, U.S.A., pp167-181）。さらにまた、ＯＰＮは、多数の体液中、とりわけ血漿、尿、胆汁、及び乳汁中にも存在し、多くの変態細胞中において発現の増大を示す（Senger DR, Peruzzi CA, Gracey CF, Papadopoulos A, Tenen DG. 1988. Secreted Phosphoproteins associated with neoplastic transformation: close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res. 48: 5770-5774）。オステオポンチンは、アミノ酸のおよそ２５％がアスパルテート／アスパラギン酸及びグルタメート／グルタミン酸、並びにリン酸化アミノ酸である、高度酸性である（Sorensen ES, Petersen TE. 1994 Identification of two phosphorylation motifs in bovine osteopontin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 198:200-205; Sorensen ES, Hojrup, P, Petersen, TE. 1995. Posttranslatinal modifications of bovine osteopontin: Identification of twenty-eight phosphorylation and three O-glycosylation sites. Protein Sci. 4: 2040-2049）。
【０００３】
オステオポンチンは、ＲＧＤ（アルギニン、グリシン、アスパルテート）インテグリン結合配列を含み、これは細胞の様々な表面への結合、例えば骨の再造形の際の骨芽細胞の骨への結合を促進することができる。細胞結合能力に加えて、オステオポンチンはサイトカインとして作用することが可能である。オステオポンチンについて他に提唱される使用または役割には、化学走性及び一酸化窒素シンターゼ発現の抑制が含まれる。
【０００４】
したがって、オステオポンチンには、製薬剤としての使用が提唱されてきた。ＥＰ７０５８４２は、変形性関節症及び慢性関節リウマチの診断、予防、及び治療におけるオステオポンチンの使用を提唱している。オステオポンチンはまた、哺乳類における骨成長及び傷の治癒を促進する役割を果たすと考えられている。例えばＥＰ９４２４５２及びＷＯ９９３３４１５を参照のこと。さらにまた、オステオポンチンは、一酸化窒素の抑制のために提唱されている。ＵＳ５６９５７６１を参照のこと。オステオポンチンはまた、食品への添加のために二価の金属塩の可溶化のために提唱されている。ＪＰ９１７３０１８の要約を参照のこと。
【０００５】
オステオポンチンは、鉱質化された骨を含む多数の組織及び液体から、実験スケール（ミクログラムから低量のミリグラムのスケール）の量で単離されている。しかしながら、実験用並びに工業用のオステオポンチンには、多大な需要がある。オステオポンチンを単離するための既知の方法は全て、工業用の使用にはあまりに少量の、実験スケールのものである。
【０００６】
Sorensen ES, Petersen TE. 1993. Journal of Dairy Research 60, 189-97, Purificatin and characterization of three proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine milk (「牛乳のプロテオースペプトンフラクションから単離される三つのタンパク質の精製及び特徴付け」)には、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を要する方法、タンパク質の沈殿が記載されている。この方法は、ＴＣＡが食品用として許可されていないため、食品成分の製造には適さない。さらにまた、該方法にはゲル濾過が含まれ、これは大スケールの製造には適当でない。
【０００７】
Bayless KJ, Davis GE, Meininger GA. 1997. Protein Expression and Purification 9, 309-314, Isolation and biological properties of osteopontin from bovine milk(「牛乳由来のオステオポンチンの単離及び生物学的特性」)には、イオン交換及び、二工程のフェニルセパロース（phenyl-separose）カラムでの疎水性クロマトグラフィーを含む方法が記載されている。該方法の複雑さ、特に疎水性クロマトグラフィーのため、該方法は、オステオポンチンの大スケールの精製には応用できないものとなっている。
【０００８】
Senger DR. Peruzzi CA, Papadopoulos A, Tenen DG. 1989. Biochimica et Biophysica Acta 996, 43-48. Purification of a human milk protein closely similar to tumor-secreted phosphoproteins and osteopontin (「腫瘍分泌リンタンパク質及びオステオポンチンに近似するヒトミルクプロテインの精製」)には、精製方法が提唱されている。ヒトのミルクについて記載された精製方法には、クエン酸バリウム親和性並びに逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーが含まれ、このため大スケールの精製には応用不可能になっている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題を解消する。本発明は、牛乳（及び、例えばヤギ、ヒツジ、スイギュウ、ラマ、ラクダ等の乳産生家畜哺乳類からのミルク）からのオステオポンチンの大スケールの精製または単離のための方法を開示する。ミルクオステオポンチンは、家畜動物由来のミルク中に天然に存在するため、非常に好ましい。本発明によれば、オステオポンチンは、乳製品製造のために認可された技術によって単離される。この食品等級のオステオポンチンは、したがって、いかなる危険も伴わずにヒトの消費向けの食品における成分として使用することができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ミルクからのオステオポンチンの単離のための方法を提唱し、ここではオステオポンチンを含有するミルク物質とカルシウムを含有する物質が撹拌され、オステオポンチンが溶解状態に維持される一方で他のミルク構成成分が沈殿するように、またはオステオポンチンを凝集または結合させる一方で他の可溶性成分が除去されるように、ｐＨが調整される。
【００１１】
該方法は、一以上の工程で行うことができる。オステオポンチンを溶液中に維持する工程と、これを結合もしくは凝集させる工程とを、併合することも可能である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において、原材料は好ましくはオステオポンチンを含有するミルクに基づく。乳漿は、優れた原材料であるが、これはここに含まれるカゼインタンパク質が除去されているからである。特にミルクの化学的酸性化から発生する乳漿が好適であるが、これはオステオポンチンが損なわれていないためである。他方では、チーズ乳漿中に含まれるオステオポンチンは、部分的に加水分解されている可能性がある。しかしながら、これがオステオポンチンの特性を減ずるか、または完全に破壊するかは依然知られていない。
【００１３】
変性し、沈殿したタンパク質からのオステオポンチンの分離は、乳業において通常行われているように精密濾過または遠心分離によって行って良い。
【００１４】
孔サイズは、０．１乃至１．４μmであってよい。セラミックフィルターは、機械的安定性及び寿命が長いことにより特に適当である。分離は１０乃至８０℃の温度にて起こりうる。５０乃至５５℃が、優れた性能及び安定な細菌学上状態により特に好適である。
【００１５】
全てのタイプの陰イオン交換体が使用可能である。ここでは、DEAE Sepharose fast flow exchangerを使用する。イオン交換の間はｐＨはおよそ３乃至およそ６に変化しうる。
【００１６】
（Ａ）オステオポンチンの溶解または可溶化または（Ｂ）オステオポンチンの凝集または結合を含む工程を、一つの工程中において併合することができる。製品流を濃縮、分離、乾燥させる、または乳業において通常使用される他の処理工程を行うために、これらの工程の前及び／または後に様々な方法で処理することができる。したがって、例えば精密濾過を利用することができる。当業者であれば、適当なフィルターを容易に決定することができるであろう。例えばTetra Paks "Dairy processing Handbook" (1995), pp 123-132.を参照のこと。
【００１７】
通常は、本発明の処理工程を開始する前に、乳漿を濃縮して処理しようとする水の量を低減することが好ましい。乳漿の予備濃縮のためには、従来のいかなる限外濾過システム：プレート及びフレーム；中空繊維、管状、セラミック、及び螺旋状のものも利用することもできる。螺旋状システムが、現在のところ経済的な観点から、特に好適である。オステオポンチンに膜を通過させない、あらゆる膜が好適である。こうした膜の孔サイズは、20，000D未満である。好適な膜は、例えばKoch HFK131、 Desal PW、または類似の膜である。
【００１８】
可溶性のＣａ源は、水酸化カルシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウムなどのあらゆる可溶性カルシウム化合物であってよい。亜硝酸カルシウム及び硝酸カルシウムもまた使用可能であるが、オステオポンチンを食品工業において使用しようとするならば通常は薦められない。
【００１９】
オステオポンチンを不溶性Ｃａ源に凝集もしくは結合させるために、Ｃａ3ＰＯ4または他の不溶性Ｃａ源を使用して良い。リン酸カルシウムまたは他の不溶性塩をオステオポンチンと共に沈殿させるためのｐＨ調整は、６．０乃至８．５の範囲内であって良い。特に、約７．０のｐＨが好適である。有機並びに無機のあらゆる塩基が、この処理工程におけるｐＨ調整剤として使用可能である。特に、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）2の塩基が好適である。特にＮａＯＨが適当である。
【００２０】
オステオポンチンを溶解状態に維持するためのｐＨ調整は、３．５乃至５．０、好ましくは４．０乃至４．６である。ｐＨ４．２が最も好ましい。ｐＨ調整のためには、有機又は無機の酸を使用可能である。塩酸は強度及び価格により、特に好適である。オステオポンチンを含有するミルク出発物質がミルク由来の天然カルシウムも含有するならば、加えるカルシウムはより少量かまたは全く加えない。また、ｐＨ調整のためのＣａ（ＯＨ）2の使用により、他のＣａ源の量を最少化することができる。通常は、適当な量は、溶液中のカルシウムの濃度が０．２％である場合には一つになる。下限はないが、タンパク質１％当たり約０．０５％未満ではオステオポンチンの収量が減少する。０．１％のカルシウムは有効であるが、オステオポンチンの収量は０．２％のカルシウムを使用する場合と比較して減少する。０．４％までのカルシウムの濃度を試験した。しかしながら、０．２％を越える濃度では僅かな増加が得られるのみである。したがって、０．２％が好ましいが、０．３％を使用しても良い。
【００２１】
沈殿したリン酸カルシウムまたはオステオポンチンを含有する他の固体Ｃａ源の分離は、残部から、精密濾過または遠心分離などのあらゆる既知の方法によって分離することができる。孔サイズは、０．１乃至１．４μmであってよい。セラミックフィルターは、機械的安定性及び寿命が長いことにより特に適当である。分離は１０乃至８０℃の温度にて起こりうる。５０乃至５５℃が、優れた性能及び安定な細菌学上状態により特に好適である。溶解したカルシウム塩からのオステオポンチンの分離のためには、あらゆる限外濾過システム：プレート及びフレーム；中空繊維、管状、セラミック、及び螺旋状のものなどを利用することもできる。螺旋状システムは、経済的な観点から特に好適である。オステオポンチンを通さない、あらゆる膜を使用可能である。こうした膜の基準な孔サイズは、典型的には20，000D未満である。好適な膜は、例えばKoch HFK131、 Desal PW、または類似の膜である。全てのタイプの陰イオン交換体が使用可能である。ここでは、DEAE Sepharose fast flow exchangerを使用する。
【００２２】
イオン交換の間に、ｐＨはおよそ３乃至およそ６に変化しうる。
【００２３】
乳漿タンパク質濃縮物、ＷＰＣ、Ｃａ3（ＰＯ4）2を沈殿させるためのｐＨを７．０に調整する前の濃縮水、またはオステオポンチンを有する他の固体の微生物濾過により、より純粋な凝集物が産生し、これはまた、処理工程におけるさらなる処理についてより純粋な生成物を与え、よってさらに、少々より純粋なオステオポンチン生成物を与える。
【００２４】
下記の実施例は、本発明を詳説することを企図し、制限を企図するものではない。
【００２５】
【実施例】
（実施例１）
ｐＨ４．５５、タンパク質０．５３％、オステオポンチンおよそ２０ppm（０．００２％）、及び乾燥物質４．５０％である1000kgのカゼイン乳漿を、タンパク質が膜を通過しないような基準孔サイズを有する膜を備えた、螺旋状限外濾過プラントにおいて濃縮する。典型的な基準孔サイズは、10,000Dである。濾過の間の温度は、５０℃であり、平均圧力は３．５バールである。オステオポンチンを含有しない透過水が９００kgになるまで濃縮を行い、これを除去する。濃縮の間の平均流量は、４５．６リットル／m2/hである。ｐＨ４．５５であり、３．８６％のタンパク質、およそ２００ppmのオステオポンチン（０．０２％）、及び１０．３％の乾燥物質を含む100kgの濃縮水が残る。
【００２６】
100kgの濃縮水を、６８℃にて１５秒間殺菌して、５０℃に冷却する。その後、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて７．０に調整する。
【００２７】
２時間静置した後、０．１．４μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを７．０に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は３１０リットル／m2/hである。
【００２８】
精密濾過による２０．０kgの濃縮水を回収し、氷水中にて８℃に冷却したところ、ｐＨ７．０、タンパク質０．５８％、オステオポンチンおよそ１０００ppm（０．１％）、及び乾燥物質４．１％となる。濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥すると、１３．６％のタンパク質、およそ２．３％のオステオポンチン、及び９６．４％の乾燥物質を含む０．７kgの粉末が得られる。乾燥物質は、８０％の灰分、２７％のカルシウム、及び１３．８％のリンからなる。
【００２９】
（実施例２）
ｐＨ４．５５、タンパク質０．５５％、オステオポンチンおよそ２０ppm（０．００２％）、及び乾燥物質４．５３％である2000kgのカゼイン乳漿を、タンパク質が膜を通過しないような基準孔サイズを有する膜を備えた、螺旋状ＵＦプラントにおいて濃縮する。典型的な基準孔サイズは、10,000Dである。濾過の間の温度は、１２℃であり、平均圧力は３．５バールである。オステオポンチンを含有しない透過水が１８００kgになるまで濃縮を行い、これを除去する。濃縮の間の平均流量は、２７．６リットル／m2/hである。ｐＨ４．５５であり、３．９７％のタンパク質、およそ２００ppmのオステオポンチン（０．０２％）、及び１０．４％の乾燥物質を含む200kgの濃縮水が残る。
【００３０】
200kgの濃縮水を、６８℃にて１５秒間殺菌して、５０℃に冷却する。その後、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて７．０に調整する。
【００３１】
３０分間静置した後、０．２m2の１．４μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを７．０に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は３１０リットル／m2/hである。精密濾過による２０．０kgの濃縮水を回収し、氷水中にて８℃に冷却したところ、ｐＨ７．０、タンパク質１．２５％、オステオポンチンおよそ２０００ppm（０．２％）、及び乾燥物質８．３％となる。
【００３２】
濃縮水を、２８％塩酸を用いて３．０にｐＨ調整すると、ほぼ透明な溶液が生成する。
【００３３】
このｐＨ３．０に調整した溶液を、5,000Dのカットオフ値をもつ膜で１０℃、平均圧力４．０バールにて限外濾過する。濃縮水を、透過水中の導電性が０．１μS未満になるまで、高温脱塩水を用いてダイアフィルトレーションする。濾過全般に亘り、平均流量は１７．８リットル／m2/hである。２．４２％のタンパク質、およそ４，０００ppmのオステオポンチン（０．４％）、及び２．６％の乾燥物質を含む、１０kgの濃縮水が回収される。
【００３４】
濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、８９．６％のタンパク質、およそ１４．８％のオステオポンチン、及び９６．４％の乾燥物質を含む０．２kgの粉末が得られる。
【００３５】
（実施例３）
ｐＨ４．５５、1000kgの予め濃縮したカゼイン乳漿、３．７６％のタンパク質、およそ２００ppmのオステオポンチン（０．０２％）、及び１０．３％乾燥物質を、６７℃にて１５秒間殺菌して、５０℃に冷却する。その後、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて７．０に調整する。
【００３６】
６０分間静置した後、２．４m2の１．４μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを７．０に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は３２５リットル／m2/hである。
【００３７】
ｐＨ７．０であって、１．２２％のタンパク質、およそ２０００ppmのオステオポンチン（０．２％）、及び８．３％の乾燥物質を含む、精密濾過による１００kgの濃縮水が回収され、プレート状熱交換器で５℃に冷却される。
【００３８】
濃縮水を、２８％塩酸を用いて３．０にｐＨ調整すると、ほぼ透明な溶液が生成する。このｐＨ３．０に調整した溶液を、5,000Dのカットオフ値をもつ膜で１０℃、平均圧力４．０バールにて限外濾過する。濃縮水を、透過水中の導電性が１００μS未満になるまで、脱塩水を用いてダイアフィルトレーションする。その後、ｐＨ＝４．５である０．４５MのＫＨ2ＰＯ4を用いて、濃縮水中のｐＨが４．５になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は１５．９リットル／m2/hである。１２．１％のタンパク質、およそ２０，０００ppmのオステオポンチン（２．０％）、及び１３．４％の乾燥物質を含む、１０kgの濃縮水が回収される。
【００３９】
濃縮水を、ｐＨ＝４．５である０．４５MのＫＨ2ＰＯ4で平衡させた陰イオン交換体を用いたカラムをポンプ通過させる。こうしてオステオポンチンがカラムに結合し、一方では他の乳漿タンパク質の大半が結合しない。該カラムを、２８０nmでの吸収が０になるまで、ｐＨ＝４．５である０．４５ＭのＫＨ2ＰＯ4で洗う。
【００４０】
オステオポンチンを、ｐＨ＝４．５である０．７ＭのＫＨ2ＰＯ4を用いて２８０nmでの吸収が０になるまで陰イオン交換体から溶離させ、５００gのタンパク質（うち４０％がオステオポンチン）を含有する溶離液５０リットルを回収する。溶離液を濃縮し、5,000Dの孔サイズをもつ限外濾過膜で、１０℃、平均圧力４．０バールにて塩を除去するためにダイアフィルトレートする。１０．７％の乾燥物質、およそ４％のオステオポンチン、及び９．６％のタンパク質を含む５kgの濃縮水が回収される。濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、８６．０％のタンパク質、およそ３６％のオステオポンチン、及び９５．８％の乾燥物質を含む０．５kgの粉末が得られる。
【００４１】
（実施例４）
ｐＨ４．５６、タンパク質０．５２％、オステオポンチンおよそ２０ppmの（０．００２％）、及び乾燥物質４．５０％である1000kgのカゼイン乳漿を、７１℃にて１５秒間殺菌して、５０℃に冷却する。その後、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて７．０に調整する。
【００４２】
２時間静置した後、１．４m2の１．４μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを７．０に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は５２０リットル／m2/hである。
【００４３】
精密濾過による３０．０kgの濃縮水を回収し、氷水中にて８℃に冷却したところ、ｐＨ７．０、タンパク質０．７８％、オステオポンチンおよそ６７０ppm（０．０７％）、及び乾燥物質１６．１％となる。濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、４．７％のタンパク質、およそ０．４％のオステオポンチン、及び９６．４％の乾燥物質を含む４．５kgの粉末が得られる。乾燥物質は、８５％の灰分、２７％のカルシウム、及び１３．８％のリンからなる。
【００４４】
（実施例５）
ｐＨ４．５６、タンパク質０．５１％、オステオポンチンおよそ２０ppm（０．００２％）、及び乾燥物質４．５０％である5000kgのカゼイン乳漿を、６９℃にて１５秒間殺菌して、５０℃に冷却する。その後、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて７．０に調整する。
【００４５】
２時間静置した後、１．４m2の１．４μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを７．０に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は５５０リットル／m2/hである。
【００４６】
精密濾過による１５０kgの濃縮水を回収し、氷水中にて８℃に冷却したところ、ｐＨ７．０、タンパク質０．７３％、オステオポンチンおよそ６７０ppm（０．０７％）、及び乾燥物質１６．４％となる。
【００４７】
濃縮水を、２８％塩酸を用いて３．０にｐＨ調整すると、ほぼ透明な溶液が生成する。このｐＨ３．０に調整した溶液を、10,000Dのカットオフ値をもつ膜で１０℃、平均圧力４．０バールにて限外濾過する。濃縮水を、透過水中の導電性が１００μS未満になるまで、脱塩水を用いてダイアフィルトレーションする。濾過全般に亘り、平均流量は２５．３リットル／m2/hである。１１．０％のタンパク質、およそ１０，０００ppmのオステオポンチン（１．０％）、及び１２．４％の乾燥物質を含む、１０kgの濃縮水が回収される。
【００４８】
濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、８３．８％のタンパク質、およそ７．６％のオステオポンチン、及び９６．２％の乾燥物質を含む１．１kgの粉末が得られる。
【００４９】
（実施例６）
ｐＨ４．５６、タンパク質０．５４％、オステオポンチンおよそ２０ppm（０．００２％）、及び乾燥物質４．５０％の10,000kgのカゼイン乳漿を、６９℃にて１５秒間殺菌して、５０℃に冷却する。その後、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて７．０に調整する。
【００５０】
２時間静置した後、２．８m2の１．４μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを７．０に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は５７０リットル／m2/hである。
【００５１】
精密濾過による３００kgの濃縮水を回収し、氷水中にて８℃に冷却したところ、ｐＨ７．０であって、０．７６％のタンパク質、およそ６７０ppmのオステオポンチン（０．０７％）、及び１６．３％の乾燥物質となる。
【００５２】
濃縮水を、２８％塩酸を用いて３．０にｐＨ調整すると、ほぼ透明な溶液が生成する。このｐＨ３．０に調整した溶液を、10,000Dのカットオフ値をもつ膜で１０℃、平均圧力４．０バールにて限外濾過する。濃縮水を、透過水中の導電性が１００μS未満になるまで、脱塩水を用いてダイアフィルトレーションする。濾過全般に亘り、平均流量は２４．６リットル／m2/hである。１０．８％のタンパク質、およそ１０，０００ppmのオステオポンチン（１．０％）、及び１２．３％の乾燥物質を含む、２０kgの濃縮水が回収される。
【００５３】
濃縮水を、ｐＨ＝４．５である０．４５MのＫＨ2ＰＯ4で平衡させた陰イオン交換体を用いたカラムをポンプ通過させる。こうしてオステオポンチンがカラムに結合し、一方では他の乳漿タンパク質の大半が結合しない。該カラムを、２８０nmでの吸収が０になるまで、ｐＨ＝４．５である０．４５ＭのＫＨ2ＰＯ4で洗う。
【００５４】
オステオポンチンを、ｐＨ＝４．５である０．７ＭのＫＨ2ＰＯ4を用いて２８０nmでの吸収が０になるまで陰イオン交換体から溶離させ、５６０gのタンパク質（うち３６％がオステオポンチン）を含有する溶離液５０リットルを回収する。溶離液を濃縮し、5,000Dの孔サイズをもつ限外濾過膜で、１０℃、平均圧力４．０バールにて塩を除去するためにダイアフィルトレートする。１２．３％の乾燥物質、およそ４％のオステオポンチン、及び１１．２％のタンパク質を含む５kgの濃縮水が回収される。濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、８７．６％のタンパク質、およそ３１％のオステオポンチン、及び９６．２％の乾燥物質を含む０．６kgの粉末が得られる。
【００５５】
（実施例７）
ｐＨ４．５３、タンパク質０．５５％、オステオポンチンおよそ２０ppm（０．００２％）、及び乾燥物質４．５０％である10000kgのカゼイン乳漿を、タンパク質がが通過しないような基準孔サイズを有する膜を備えた、螺旋状ＵＦプラントにおいて限外濾過／ダイアフィルトレートする。典型的な基準孔サイズは、20,000Dである。濾過の間の温度は、１５℃であり、平均圧力は３．５バールである。濾過が終わると、ｐＨ４．５４であって、２３．１％のタンパク質、およそ１，３００ppmのオステオポンチン（０．１３％）、及び２８．７％の乾燥物質が回収される。濃縮の間の平均流量は、２５．６リットル／m2/hである。１５２kgの濃縮水を７２２kgの脱塩水で希釈してタンパク質含量が４．０％になるようにする。ｐＨを、６％のＮａＯＨを用いて７．４に調整する。その後８５℃にて３０分間熱処理を行い、８℃への冷却を行う。６．４kgのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを熱処理した濃縮水に加え、ｐＨを６％のＮａＯＨを用いて４．２に調整する。
【００５６】
２時間（または翌日まで）静置した後、５０℃に加熱し、１．４m2の０．８μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを４．２に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は４１５リットル／m2/hである。プレート状熱交換器（ＰＶＶ）にかけて継続して８℃に冷却すると、ｐＨ４．２であり、０．１６％のタンパク質、およそ１００ppmのオステオポンチン（０．０１％）、及び４．１％の乾燥物質を含む透過水が合計２，０００リットル回収される。
【００５７】
精密濾過による透過水を、６％ＮａＯＨを用いて６．６にｐＨ調整し、これを螺旋状ＵＦプラントで、透過水中の導電性が５００μS未満になるまで１０℃、平均圧力４．０バールにて限外濾過／ダイアフィルトレートする。５０００Ｄの孔サイズを有する膜での濾過を行う。ｐＨが６．５であり、７．９％のタンパク質、およそ５，０００ppmのオステオポンチン（０．５％）、及び９．６％の乾燥物質を含む濃縮水４０kgが回収される。
【００５８】
濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、７９．２％のタンパク質、およそ７．６％のオステオポンチン、及び９６．２％の乾燥物質を含む３．５kgの粉末が得られる。
【００５９】
（実施例８）
ｐＨ４．５５、タンパク質２３．２％、オステオポンチンおよそ１，３００ppm（０．１３％）、及び乾燥物質２９．１％である２00kgのカゼイン乳漿を、１，０００kgの脱塩水で希釈し、６％のＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整する。その後８５℃にて３０分間熱処理を行い、８℃への冷却を行う。８．８kgのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを熱処理した濃縮水に加え、ｐＨを６％の塩酸を用いて４．１に調整する。
【００６０】
２時間（または翌日まで）静置した後、５０℃に加熱し、２．８m2の０．８μmセラミック膜で、５０℃、平均圧力４．０バールにて精密濾過を行う。ｐＨを４．１に調整した５０℃の高温脱塩水を用いて、透過水中の導電性が１００μS未満になるまでダイアフィルトレーションを行う。濾過全般に亘り、平均流量は４４５リットル／m2/hである。プレート状熱交換器（ＰＶＶ）にかけて８℃に冷却すると、ｐＨ４．１であり、０．１６％のタンパク質、およそ１００ppmのオステオポンチン（０．０１％）、及び４．０％の乾燥物質を含む透過水が合計２，８００リットル回収される。
【００６１】
精密濾過による透過水を、６％ＮａＯＨを用いて６．６にｐＨ調整し、これを螺旋状ＵＦプラントで、透過水中の導電性が５００μS未満になるまで１０℃、平均圧力４．０バールにて限外濾過／ダイアフィルトレートする。５０００Ｄの孔サイズを有する膜での濾過を行う。ｐＨが６．５であり、１１．２％のタンパク質、およそ６，５００ppmのオステオポンチン（０．６５％）、及び１２．４％の乾燥物質を含む濃縮水４０kgが回収される。
【００６２】
濃縮水を、ｐＨ＝４．５である０．４５MのＫＨ2ＰＯ4で平衡させた陰イオン交換体を用いたカラムをポンプ通過させる。こうしてオステオポンチンがカラムに結合し、一方では他の乳漿タンパク質の大半が結合しない。該カラムを、２８０nmでの吸収が０になるまで、ｐＨ＝４．５である０．４５ＭのＫＨ2ＰＯ4で洗う。
【００６３】
オステオポンチンを、ｐＨ＝４．５である０．７ＭのＫＨ2ＰＯ4を用いて２８０nmでの吸収が０になるまで陰イオン交換体から溶離させ、５００gのタンパク質（うち５０％がオステオポンチン）を含有する溶離液５０リットルを回収する。溶離液を濃縮し、5,000Dの孔サイズをもつ限外濾過膜でダイアフィルトレートして、１０℃、平均圧力４．０バールにて塩を除去する。１０．７％の乾燥物質、およそ５％のオステオポンチン、及び９．６％のタンパク質を含む５kgの濃縮水が回収される。濃縮水を、NIROタワードライヤーにおいてスプレー乾燥させると、８６．０％のタンパク質、およそ４５％のオステオポンチン、及び９５．８％の乾燥物質を含む０．５kgの粉末が得られる。