(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞において高レベルに発現するようにコドンが最適化された、ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子であって、前記ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が配列番号９に示される、前記合成核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項４】
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むベクターを適切な宿主細胞に導入することと、
（ｂ）前記ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと、
を含む、組換え宿主細胞におけるヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現方法。
【請求項５】
Ｅ１領域の欠失およびＥ１領域の挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含み、
前記挿入部分は発現カセットを含み、
前記発現カセットは、
（ａ）ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードする、配列番号９に示されるコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターと、
を含む、アデノウイルスベクター。
【請求項６】
Ａｄ５ベクターである、請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
Ａｄ６ベクターまたはＡｄ２４ベクターである、請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般に癌の治療に関する。より具体的に、本発明は、ヒト細胞環境で発現するようにコドンが最適化されている、本明細書でｈＨＥＲ２．ｏｔｐと称するヒト腫瘍関連ポリペプチド上皮成長因子２／ｎｅｕ抗原をコードする合成ポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ヒト細胞環境で発現するようにコドンが最適化されている、本明細書でｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔと称するＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の切断型をコードする合成ポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、前記合成ポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび宿主に関する。本発明はまた、ｈＨＥＲ２．ｏｐｔを有するアデノウイルスベクターおよびプラスミド構築物並びに癌を予防治療するためのワクチンおよび医薬組成物におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子２は、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロトオンコジーン（ｃ−ｅｒｂＢ−２とも称される）によってコードされた膜貫通腫瘍関連抗原で、細胞表面受容体の上皮成長因子受容体ファミリーの１構成要素である。該ＨＥＲ２遺伝子は、元々ラットの神経グリア芽細胞腫から単離され（Ｓｈｉｈ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：２６１〜２６４（１９８１））、その後ヒト細胞からクローニングされて、特徴が調べられた（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２〜３９（１９８５）、Ｋｉｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４〜７６（１９８５））。
【０００３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕはさらに、細胞増殖および分化に関与する４種類の受容体から構成される受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファイリーの１構成要素として分類されている。該ＨＥＲ受容体は、２量体として増殖因子に結合することによって、正常な細胞増殖の維持に関与する。具体的に、ヒトＨＥＲ２は、ＥＧＦＲファミリー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）のその他の構成要素と共にヘテロ２量体を形成する（Ｋｌａｐｐｅｒ他、Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７７：２５〜７９（２０００））。ｈＨＥＲ２の２量体化およびチロシンの自己リン酸化に続いて、細胞質の情報伝達分子の結合部位が生じ、第２の情報伝達分子の動員が開始する。こうして、細胞増殖に重要な遺伝子の活性化を最終的にもたらす細胞内情報伝達カスケードが開始する。
【０００４】
皮膚および乳房、胃腸組織、生殖管および尿管を含めた様々な組織の成人上皮細胞において検出されるＨＥＲ２／ｎｅｕ転写物およびコード１８５ｋＤ蛋白質の発現は通常低レベルである（Ｐｒｅｓｓ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３〜９６２（１９９０））。胚の発達中に対応する胎児組織においても高レベルでＨＥＲ２／ｎｅｕ発現が検出される（Ｐｒｅｓｓ他、前述）。
【０００５】
いくつかの発見によって、ＨＥＲ２抗原は積極的な特異的免疫治療にとって魅力ある標的となった。まず、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子は通常、乳房、卵巣、子宮、結腸および前立腺の癌および肺の腺癌などの様々な悪性腫瘍において過剰発現しているか、増幅されている（Ｄｉｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１：３４３〜３７１（１９９７））。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、癌患者の予後の悪さおよび再発性の高さと相関する（Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７〜７１２（１９８９））。ヒトＨＥＲ２を増幅すると、ＭＡＰキナーゼ活性および細胞増殖の増加が引き起こされ、腫瘍細胞の悪性度の高さに関与する（Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ他。Ｅｍｂｏ  Ｊ  １３（１４）：３３０２〜１１（１９９４））。腫瘍におけるＨＥＲ２の高レベルの発現は、正常な成人組織における低レベルの発現とは正反対である。
【０００６】
さらに、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現を伴う悪性腫瘍に罹患した多くの癌患者は、ＨＥＲ２蛋白質に対して免疫応答を生じた。抗ｈＨＥＲ２細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、乳癌および卵巣癌の患者から単離された（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ他。Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１（１）：２２５〜３４（１９９３）、Ｐｅｏｐｌｅｓ他。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２（１４）：６５４７〜５１（１９９５））。いくつかのＨＬＡ−Ａ２．１関連ｈＨＥＲ２ペプチドは定義づけられており、ペプチド特異的Ｔ細胞をインビトロで生成することができた（Ｆｉｓｋ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７（１）：８〜９３（１９９７）、Ｙｏｓｈｉｎｏ他。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４（１３）：３３８７〜９０（１９９４）、Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ他。Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５２（２）：１０９〜１８（１９９７））。
【０００７】
前記の発見によって、抗ＥｒｂＢ−２免疫効果機構が癌患者において活性化されることが示され、このような免疫反応性を増強する潜在的な利点が強調されている。ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する免疫応答を利用した効果的なワクチンは、この免疫性を防御的および／または予防的レベルまで高め、自己寛容を克服するにちがいない。
【０００８】
前記の詳述に基づいて、ＨＥＲ２／ｎｅｕは悪性腫瘍の免疫学的治療を開発するための標的として追究した。抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、乳癌の治療として研究されており、それぞれの抗体による取り組みは様々な程度の成功を示している（考察については、Ｙａｒｄｅｎ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１（追補２）：１〜１３（２００１）を参照のこと）。
【０００９】
さらに、ＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とするＤＮＡおよびペプチドをベースとしたワクチンが報告された。Ａｍｉｃｉ他（米国特許第６１２７３４４号）は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターに機能的に結合させた完全長ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡを含む発現ベクターを投与することによってＨＥＲ２／ｎｅｕに対する免疫を誘発する方法を開示している。Ｍｏｒｒｉｓ他（ＷＯ２００４／０４１０６５）は、非情報伝達性ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターによって変更した樹状細胞によるワクチン接種の方法を開示している。Ｃｈｅｅｖｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｓｉｓは、ＨＥＲ２ペプチドによってＨＥＲ２／ｎｅｕに関連した癌に対してヒトを免疫する方法を開示している（米国特許第５８５６５３８号）。さらに、ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドをベースとしたワクチンは、齧歯類のモデルで研究されている（概論については、Ｄｉｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１：３４３〜７１（１９９７）参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
多くのワクチンの開発および商品化は、宿主生物をうまく形質転換する外来遺伝子を高い発現濃度で獲得することに伴う困難さのために、妨げられている。したがって、前述のｈＨＥＲ２蛋白質をコードする野生型ヌクレオチド配列が同定されたにもかかわらず、企図する宿主細胞において発現させるために最適化されたｈＨＥＲ２をコードしているヌクレオチド配列を利用したヒトＨＥＲ２蛋白質の容易に再生可能な材料を開発することが強く望まれており、前記材料によって有効で、自己寛容によって妨害されない癌ワクチンの開発が可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、乳癌および卵巣癌を含めた数多くの腺癌に関連するヒトＨＥＲ２遺伝子によって発現した蛋白質生成物に対する免疫を惹起するか、または増強する組成物および方法に関する。具体的に、本発明はヒトＨＥＲ２蛋白質または該ＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むヒトＨＥＲ２蛋白質の切断型（以後ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ）をコードし、ヒト細胞で高濃度に発現するようにコドンが最適化されているポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、合成ポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターおよびプラスミドをベースとしたベクターを提供し、ＨＥＲ２に関連した癌を予防し、および／または治療するための免疫原性組成物およびワクチンにおける前記ベクターの使用を開示する。本明細書で説明したポリヌクレオチドは、その野生型ＨＥＲ２よりもヒトＨＥＲ２に対する細胞性および体液性免疫応答を惹起するのに効率的である。
【００１２】
本発明はまた、配列番号２で表したようなヒト上皮成長因子抗原（以後ｈＨＥＲ２）をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト細胞において高濃度で発現するようにコドンが最適化されている（以後、ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ）合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明はさらに、配列番号１４で表したようなヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭをコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト宿主細胞において高濃度に発現するようにコドンが最適化されている合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本明細書で開示した核酸分子は、選択した宿主細胞にトランスフェクトすることができ、該組換え宿主細胞は、十分な濃度の機能的ｈＨＥＲ２蛋白質（配列番号２）またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質（配列番号１４）を発現させるための原料となる。
【００１３】
本発明はさらに、ヒトＨＥＲ２蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする合成核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様は、ｈＨＥＲ２蛋白質（配列番号２）をコードするＤＮＡ分子（配列番号１）を示す図１に開示される。本発明の好ましい核酸分子は、ヒト細胞において高濃度で発現するようにコドンが最適化されている。この好ましいポリヌクレオチドの配列はまた、チロシンキナーゼ活性を破壊する変異を含有する（ＡＡＡ２２５７ＧＣＣ、Ｋ７５３Ａ）。この変異を含有しないヌクレオチド配列もまた、本発明によって企図される。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする合成核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様は、ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質（配列番号１４）をコードするＤＮＡ分子（配列番号９）を示す図６Ａに開示される。本発明の好ましい核酸分子は、ヒト細胞において高濃度に発現するようにコドンが最適化されている。
【００１５】
本発明はまた、この明細書を通じて開示した核酸分子を含有する組換えベクター並びに原核細胞および真核細胞の両方の組換え宿主細胞に関する。
【００１６】
本発明はさらに、（ａ）ヒト細胞で最適に発現するためにコドンが最適化されている、ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードする合成ポリヌクレオチドを含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＨＥＲ２蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるコドン最適化ヒトＨＥＲ２蛋白質の発現方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、（ａ）ヒト細胞で最適に発現するためにコドンが最適化されている、ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードする合成ポリヌクレオチドを含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるコドン最適化ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現方法に関する。
【００１８】
本発明の他の態様は、合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む癌の予防または治療方法であり、該合成核酸分子は配列番号２で表したヒト上皮成長因子２抗原（ｈＨＥＲ２）または配列番号１４で表したヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト細胞において高濃度に発現するようにコドンが最適化されている。
【００１９】
本発明はさらに、Ｅ１領域に欠失があり、Ｅ１領域に挿入のあるアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、前記挿入は、（ａ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよび（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む発現カセットを含む。
【００２０】
本発明はまた、プラスミド部分および発現カセット部分を含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒト細胞において最適に発現させるためにコドンを最適化した、ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＤＴＭ蛋白質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む。
【００２１】
本発明の他の態様は、（ａ）哺乳類にｉ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドおよびｉｉ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む第１のベクターを導入すること、（ｂ）予め定めらた時間を経過させること、および（ｃ）該哺乳類にｉ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドおよびｉｉ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む第２のベクターを導入することを含む、前記哺乳類を癌から予防するか、またはＨＥＲ２に関連した癌に罹患した前記哺乳類を治療する方法である。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明白に別段の指定がない限り、複数の対象物を含む。
【００２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて使用したように、以下の定義および略語を適用する。
【００２４】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ鎖が結合するＤＮＡ鎖の認識部位のことである。該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼとの開始複合体を形成し、転写活動を開始し、推進する。該複合体は、「エンハンサー」と称する活性化配列または「サイレンサー」と称する阻害配列によって変更することができる。
【００２５】
「カセット」という用語は、ベクターから発現されるヌクレオチドまたは遺伝子配列、たとえば、ＨＥＲ２蛋白質またはＨＥＲ２ＥＤＴＭ蛋白質をコードするヌクレオチドまたは遺伝子配列のことである。一般的に、カセットは、ある実施形態では、ヌクレオチドまたは遺伝子配列を発現させるための制御配列を提供するベクター内に挿入された遺伝子配列を含む。他の実施形態では、該ヌクレオチドまたは該遺伝子配列はそれの発現用制御配列を提供する。さらに他の実施形態では、該ベクターはいくつかの制御配列を提供し、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列はその他の制御配列を提供する。たとえば、該ベクターは、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列を転写するためのプロモーターを提供することができ、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は転写停止配列を提供する。該ベクターによって提供されることができる制御配列は、エンハンサー、転写停止配列、スプライシングアクセプターおよびドナー配列、イントロン、リボソーム結合配列およびポリ（Ａ）付加配列を含むがそれだけに限定はされない。該カセットは、カセットテープの概念と同じで、各カセットは独自の配列を有する。したがって、カセットを交換することによって、ベクターは異なる配列を発現する。５’および３’末端に制限部位があるために、該カセットは容易に挿入したり、除去したり、他のカセットで置換したりすることができる。
【００２６】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物または宿主組織に導入することができるいくつかの手段を意味する。ベクターには、プラスミド、（アデノウイルスを含む）ウイルス、バクテリオファージおよびコスミドを含む様々な種類がある。
【００２７】
アデノウイルスベクターに関して使用した「第１世代」という用語は、複製に欠陥のある前記アデノウイルスベクターを意味する。一般的に、第１世代アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域が欠失しているか、または不活性化しており、好ましくはＥ３遺伝子領域が欠失しているか、または不活性化している。
【００２８】
「ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ」という名称は、イントロンＡを有するヒトＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、完全長コドン最適化ヒトＨＥＲ２遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化配列および転写終止配列並びに最小ｐＵＣ骨格を含む、本明細書で開示したプラスミド構築物である（実施例２参照）。
【００２９】
「ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ」という名称は、イントロンＡを有するヒトＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、ヒトＨＥＲ２遺伝子の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むコドン最適化切断型ヒトＨＥＲ２遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化配列および転写終止配列並びに最小ｐＵＣ骨格を含む、本明細書で開示したプラスミド構築物である（実施例２参照）。
【００３０】
「ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔ」という名称は、構築物がコドン最適化ヒトＨＥＲ２遺伝子の代わりに野生型完全長ヒトＨＥＲ２遺伝子を含むこと以外は前述の通りである構築物を意味する。
【００３１】
「ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｗｔ」という名称は、構築物がコドン最適化完全長ヒトＨＥＲ２遺伝子の代わりにＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列を含む野生型切断型ヒトＨＥＲ２遺伝子を含むこと以外は前述の通りである構築物を意味する。
【００３２】
「ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ」、「ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ」および「ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｗｔ」という名称は、Ｅ１およびＥ３領域に欠失があるＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む、本明細書で開示した３種類の構築物を意味する。「ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ」構築物においては、Ｅ１領域は、イントロンＡを有さないヒトＣＭＶプロモーターの制御下にあるＥ１と平行したコドン最適化完全長ヒトＨＥＲ２遺伝子およびそれに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって置換されている。「ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ」構築物は、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域がＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドの配列を含むヒトＨＥＲ２遺伝子のコドン最適化切断型によって置換されていること以外は本質的に前述の通りである。「ＭＲＫＡｄ５／ｈＨＥＲ２．ｗｔ」構築物は、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域が野生型完全長ヒトｈＨＥＲ２配列によって置換されていること以外は、本質的に前述の通りである（実施例１１参照）。
【００３３】
「有効量」という用語は、免疫応答を生じるように、十分なワクチン組成物が適切な濃度のポリペプチドの産生を誘導することを意味する。当業者であれば、この濃度は変更可能であることを承知している。
【００３４】
「治療」という用語は、治療的処置および予防的または防御的手段の両方を意味する。治療の必要な人とは、既に疾患を有する人および疾患に罹りやすい人または疾患を防御すべき人を含む。
【００３５】
「疾患」とは、本明細書で説明した方法またはワクチンまたは免疫組成物で治療することによって利益を受ける状態のことである。この用語は、哺乳類を問題となる疾患に罹りやすくする病的状態を含む慢性および急性障害または疾患を含む。本発明の方法およびワクチンは、乳癌、結腸癌、胃癌、卵巣癌および肺癌を含むがけっしてそれだけに限定はされない、異常なＨＥＲ２／ｎｅｕ関連の発現または情報伝達に関連した障害または状態の治療のために企図される。
【００３６】
「保存的アミノ酸置換」とは、１個のアミノ酸残基がもう１個の化学的に類似したアミノ酸残基によって置換されることを意味する。このような保存的置換の例は、１個の疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）と他のものとの置換、１個の極性残基と電荷が同じ他の極性残基との置換（たとえば、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸）である。
【００３７】
「ｈＨＥＲ２．ｗｔ」はヒト上皮成長因子２抗原を意味し、「ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ」はコドン最適化ヒト上皮成長因子２抗原を意味する。
【００３８】
「ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｗｔ」は切断型ヒト上皮成長因子２抗原を意味し、「ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ」はコドン最適化切断型ヒト上皮成長因子２抗原を意味する。ＨＥＲ２の切断型、「ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｗｔ」および「ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ」は、ヒトＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
【００３９】
「哺乳類」という用語は、人類を含めた任意の哺乳類を意味する。
【００４０】
略語「Ａｇ」は、抗原を意味する。
【００４１】
略語「Ａｂ」は抗体を意味し、「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体を意味する。
【００４２】
略語「ＯＲＦ］は、遺伝子のオープンリーディングフレームを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
ヒト上皮成長因子２（ｈＨＥＲ２）は通常、乳癌、卵巣癌、胃癌および結腸癌を含めたいくつかの異なる種類の腫瘍を伴う。本発明は、異常なｈＨＥＲ２発現が癌または癌の発症に関連するｈＨＥＲ２遺伝子によって発現した蛋白質生成物に対する免疫を惹起するか、または高める組成物および方法に関する。異常なｈＨＥＲ２発現は腫瘍開始時には存在するが、腫瘍が進行した後には検出されなくてもよく、その逆であってもよいので、異常なｈＨＥＲ２発現が癌を伴うことは、ｈＨＥＲ２蛋白質が癌の発症の全ての時点において腫瘍組織で発現されていることを必要としない。
【００４４】
このために、完全長ヒトＨＥＲ２蛋白質または本明細書でＨＥＲ２ＥＤＴＭと称する切断型ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。前記切断型ＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。計画した宿主細胞、好ましい実施形態ではヒト細胞に適したコドンを使用するために、合成ＤＮＡ分子のコドンを設計する。中和抗体および細胞性免疫によってＨＥＲ２関連癌に対する効果的な免疫予防を提供するプラスミドベースワクチンまたは組換えアデノウイルスを開発するために、該合成分子を使用することができる。該合成分子は、免疫原組成物として使用することができる。本発明は、霊長類およびヒトなどの哺乳類を含めた脊椎動物に直接インビボで導入し、該動物においてコードされた蛋白質の発現を誘導するポリヌクレオチドを提供する。
【００４５】
野生型ヒトＨＥＲ２ヌクレオチド配列は報告されている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２〜３９（１９８５）、Ｋｉｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４〜７６（１９８５））。本発明は、完全長ヒトＨＥＲ２蛋白質、またはｈＨＥＲ２の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む切断型ヒトＨＥＲ２蛋白質、ＨＥＲ２ＥＣＤＴＭをコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子は、ヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヒト細胞によって好まれるコドンを使用するために変更されており、したがってヒト宿主細胞においてｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭを高濃度で発現させることが可能である。該合成分子は、中和抗体および細胞性免疫によってｈＨＥＲ２を伴う癌に対する効果的な免疫予防を提供する癌ワクチンとして使用することができる、ｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の材料として使用することができる。あるいは、該合成分子は、ＤＮＡワクチンまたはアデノウイルスワクチンのベースとして使用することができる。
【００４６】
４種類の可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６０個を上回る変種の形で存在することが可能である。これらのコドンが提供する情報は、異なるアミノ酸２０個（並びに転写開始および終止）のみなので、いくつかのアミノ酸は、複数のコドンによってコードされることが可能であり、コドン重複として公知の現象である。完全には理解されていないが、種類の異なる細胞の内在ＤＮＡに、別のコドンが均一に存在することはない。実際に、特定の種類の細胞ではある種のコドンには本来備わっている様々な序列または「選択性」が存在するようである。１例として、アミノ酸ロイシンはＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含めた６種類のＤＮＡコドンのいずれかによって特定される。微生物のゲノムコドン出現頻度を徹底的に分析することによって、Ｅ．ｃｏｌｉの内在性ＤＮＡではロイシンを指定するコドンとして最も一般的にＣＴＧを含有し、一方酵母および粘菌のＤＮＡではロイシンを指定するコドンとして最も一般的にＴＴＡを含有することが明らかになった。この階層的観点から、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主によってロイシンリッチなポリペプチドの高濃度発現が得られる可能性は、使用したコドンの頻度にある程度まで左右されるものと一般的に考えられている。たとえば、ＴＴＡコドンに富んだ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉでは十分に発現せず、一方ＣＴＧに富んだ遺伝子はおそらくこの宿主で高濃度に発現するものと思われる。同様に、酵母宿主細胞では、ロイシンに富んだポリペプチドの発現に好まれるコドンはＴＴＡである。
【００４７】
組換えＤＮＡ技術においてコドン選択現象が深く関わっていることは明らかで、該現象によって、形質転換が成功した宿主生物において外来遺伝子の高濃度発現を実現できなかったかつての多くの失敗を説明することが可能である。すなわち、あまり「好ましくない」コドンが挿入遺伝子内に繰り返し存在して、宿主細胞の発現機構があまり効率よく作動できない可能性がある。この現象は、計画した宿主細胞が好むコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えＤＮＡ技術を実践するために最適な形態の外来遺伝子材料となることを示唆する。したがって、本発明の１態様は、ヒト細胞で高濃度に発現させるためにコドンを最適化したヒトｈＨＥＲ２遺伝子である。本発明の好ましい実施形態では、同じ蛋白質配列をコードする他のコドンを使用することによって、ヒト細胞における外来ｈＨＥＲ２蛋白質発現の制約を取り除くことができることが見いだされた。本発明の他の態様は、ヒトＨＥＲ２の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、ヒト宿主細胞で高濃度に発現させるために最適化されたコドンである切断型ヒトｈＨＥＲ２遺伝子、ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭである。
【００４８】
本発明によれば、本明細書に参照により組み込むＬａｔｈｅの「アミノ酸配列データから推測された合成オリゴヌクレオチドプローブ：理論および実際の考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２（１９８５）に記載されたように、ヒトＨＥＲ２遺伝子配列およびヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ遺伝子配列は、野生型の同等物と比較して同一の翻訳配列を有するが他のコドンを使用したポリヌクレオチド配列に変換された。この方法は一般に、高発現ヒト遺伝子に通常関連しない野生型配列のコドンを同定すること、およびこのコドンとヒト細胞において高発現するために最適なコドンとを置換することから構成される。前記最適なコドンとは、本明細書では「ヒトに好まれる」コドンのことである。次に、該新規配列について、これらのコドン置換によって生じた望ましくない配列を調べる（たとえば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライシング認識部位の偶発的な発生、望ましくない制限酵素部位、高ＧＣ含量など）。所望しない配列は、同一アミノ酸をコードする異なるコドンで既存のコドンを置換することによって除去される。次に、該合成遺伝子部分の発現が改善されていることを試験する。
【００４９】
前述の方法を使用してヒトｈＨＥＲ２およびヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭの合成遺伝子配列を作製して、ヒト細胞で高い濃度で発現するために最適化したコドンを含む完全長および切断型遺伝子を得た。前記の方法は、癌ワクチンで使用するコドン最適化遺伝子を設計するための１方法を要約したものであるが、該方法を少し変更するか、または配列を少し変化させることによって、同様のワクチンの有効性または遺伝子発現の増加を実現できることは当業者に理解されている。当業者はまた、ＤＮＡ分子のほんの一部のコドンをコドン最適化して、ヒト細胞において高濃度のｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ発現をもたらす他のＤＮＡ分子を構築できることを理解するであろう。本発明の核酸分子は、実質的に他の核酸を含まない。
【００５０】
したがって、本発明は、ヒトｈＨＥＲ２蛋白質、たとえば、配列番号２で記載したヒトＨＥＲ２蛋白質、またはヒトＨＥＲ２蛋白質の生物学的に活性のある断片または変異型をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト宿主で発現するために最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。ｈＨＥＲ２蛋白質の前記変異型は、保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失または添加を含むが、それだけに限定されない。このような生物学的活性のある断片および／または変異体はいずれも、配列番号２で示したようなｈＨＥＲ２蛋白質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模倣した蛋白質または蛋白質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用癌ワクチンの開発に有用であるように、機能的なヒトＨＥＲ２蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００５１】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、切断型ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質（配列番号１４）をコードするヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドで、該ポリヌクレオチド配列は、ヒト宿主で発現するために最適化されたコドンを含む。本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、配列番号９で記載したヌクレオチドの配列を含む。
【００５２】
本発明はまた、ヒトＨＥＲ２蛋白質、たとえば配列番号２で示した完全長ヒトＨＥＲ２蛋白質または切断型ＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質、たとえば、配列番号１４で示したＨＥＲ２ＥＤＴＭ配列を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の合成核酸分子は、ヒト細胞において高濃度で発現するようにコドンが最適化されている。
【００５３】
本発明の範囲内にはまた、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＨＥＲ２ポリペプチド変種をコードするヌクレオチドの配列を含むコドン最適化ポリヌクレオチドが含まれ、ここにおいて、配列番号２の全体の長さでＮａ個までのアミノ酸の変更を含むことが可能で、Ｎａは式、
Ｎａ＝Ｘａ−（ＸａＹ）によって算出され、
式中、Ｘａは配列番号２のアミノ酸総数であり、Ｙの値は０．９０であり、ＸａおよびＹの積が整数でないとき、このような積を最も近接した整数に四捨五入してからＸａから差し引く。同様に、本発明はまた、配列番号１４で示したＨＥＲ２ＥＤＴＭポリペプチドの変種をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を企図する。
【００５４】
本発明はまた、この明細書を通じて開示した核酸分子を含有する組換えベクター並びに原核細胞および真核細胞の両方の組換え宿主細胞に関する。本発明の合成ＤＮＡ分子、関連ベクターおよび宿主は、癌ワクチンの開発に有用である。
【００５５】
本発明の好ましいＤＮＡ分子は、図２で示し配列番号２で表したヒトＨＥＲ２蛋白質をコードする、（図１で示した）配列番号１のような本明細書で開示したヌクレオチド配列を含む。配列番号１で示したヌクレオチド配列は、ヒト細胞で最適に発現するためにコドンが最適化された。ＰＣＲ増幅の問題を回避するために、本発明のこの実施形態では、同一アミノ酸組成を保存しながらＧＣ含量を減少させたあまり厳密ではない最適化設計を３６０１位から３８０５位の間のｈＨＥＲ２配列に採用した。図５を参照のこと。
【００５６】
本発明の他の好ましいＤＮＡ分子は、配列番号１４で表したヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードする、（図６Ａで示した）配列番号９として本明細書で開示したヌクレオチド配列を含む。配列番号９で示したヌクレオチド配列は、ヒト細胞で最適に発現するためにコドンが最適化された。
【００５７】
当業者であれば、１個または複数のコドンをヒトに好まれるコドンに変更すれば、ヒト細胞で高濃度に発現するためにコドンを最適化されたその他のＨＥＲ２配列を設計することができることに気づくであろう。本発明の合成ＨＥＲ２ヌクレオチド配列を含むコドンの少なくとも約８０％は、ヒトに好まれるコドンであることが好ましい。コドンの少なくとも約８５％は、ヒトに好まれることがさらに好ましく、コドンの少なくとも約９０％がヒトに好まれることがさらにより好ましい。
【００５８】
本発明はまた、ヒトＨＥＲ２蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１の生物学的に活性のある断片または変異体を含む。任意のこのような生物学的活性のある断片および／または変異体は、配列番号２で表したｈＨＥＲ２蛋白質を含むが、それだけに限定されないｈＨＥＲ２蛋白質の薬理学的特性を少なくとも実質的に模倣した蛋白質または蛋白質断片のいずれかをコードする。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチド置換、欠失、添加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断を含むが、必ずしもそれだけに限定される必要はない。本発明の変異体は、癌ワクチンの開発に有用であるように真核細胞において機能的ｈＨＥＲ２蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００５９】
本発明はまた、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号９のヌクレオチド配列とは著しく異なるが、それでも配列番号２で表したｈＨＥＲ２蛋白質または配列番号１４で示したｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードする、ｈＨＥＲ２蛋白質またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードする合成コドン最適化ＤＮＡ分子に関する。このような合成ＤＮＡは、本発明の範囲内にあるものとする。したがって、本発明は、同一の蛋白質を発現する数多くのＤＮＡ分子をもたらすことができるコドン重複を開示する。本発明の範囲内にはまた、発現した蛋白質の基本的な物理特性を実質的に変更しないＤＮＡ配列の変異が含まれる。たとえば、ロイシンをバリンに、リジンをアルギニンに、またはグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化が生じる可能性はない。
【００６０】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然に生じるペプチドと異なる特性を有するペプチドをコードするために改変できることが知られている。ＤＮＡ配列の改変方法は、部位特異的変異誘発を含むが、それだけに限定されない。改変された特性の例は、基質に対する酵素またはリガンドに対する受容体の親和性の変化を含むが、それだけに限定されない。
【００６１】
本発明はまた、ＧＦＰ（緑の蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープ、ＧＳＴおよびＦｃを含むが、それだけに限定されない様々なマーカーに結合させたヒトＨＥＲ２蛋白質の一部を発現する融合構築物を含むが、それだけに限定されないｈＨＥＲ２ｏｐｔおよびｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭｏｐｔ融合構築物に関する。任意のこのような融合構築物は、関心のある細胞系で発現させることが可能で、本明細書で開示したヒトＨＥＲ２蛋白質の修飾因子をスクリーニングするために使用することが可能である。ＤＯＭ、ｈｓｐ７０およびＬＴＢを含むが、それだけに限定されない、ヒトＨＥＲ２に対する免疫応答を高めるために構築された融合蛋白質もまた、企図される。
【００６２】
本発明はさらに、この明細書を通じて開示した合成核酸分子を含む組換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されることが可能である。ほとんどのクローニングには、ＤＮＡベクターが好まれる。一般的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母の人工染色体、およびｈＨＥＲ２蛋白質またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードすることができるその他の形態のエピソームＤＮＡまたは統合ＤＮＡを含む。特定の遺伝子輸送またはその他の用途に適切なベクターを決定することは、十分当業者の範囲内である。
【００６３】
ｈＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化ＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＨＥＲ２を高濃度に発現するために使用することができる。さらに、ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化ＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭを高濃度に発現するために使用することができる。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスを含むが、それだけに限定されない。また、所望するならば、様々な細菌発現ベクターを使用して、細菌細胞で組換えｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭを発現することができる。さらに、様々な真菌細胞発現ベクターを使用して、真菌細胞で組換えｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭを発現することができる。さらに、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用して、昆虫細胞で組換え蛋白質を発現することができる。
【００６４】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換または形質移入した宿主細胞に関する。組換え宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、酵母などの真菌細胞を含めるがそれだけに限定されない原核細胞または真核細胞、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系を含むがそれだけに限定されない哺乳類細胞、並びにショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞系を含むがそれだけに限定されない昆虫細胞であってよい。このような組換え宿主細胞は、ｈＨＥＲ２、ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭまたは生物学的に等価な形態を生成するために適した条件下で培養することができる。本発明の好ましい実施形態では、該宿主細胞はヒトである。本明細書で定義したように、「宿主細胞」という用語は、遺伝子を組み換えたヒトの体、遺伝子を組み換えたヒト胎児または遺伝子を組み換えたヒト胚における宿主細胞を含むものではない。
【００６５】
前述のように、ｈＨＥＲ２蛋白質またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭを発現するために使用することができる。したがって、本発明の他の態様は、（ａ）ヒトＨＥＲ２またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭをコードするコドン最適化核酸を含むベクターを適切なヒト宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＨＥＲ２蛋白質または前記ＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現方法である。
【００６６】
本発明の好ましい態様は、（ａ）配列番号１で表した核酸を含むベクターを適切なヒト宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＨＥＲ２蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるヒトＨＥＲ２蛋白質の発現方法である。
【００６７】
本発明の他の好ましい態様は、（ａ）配列番号９で表した核酸を含むベクターを適切なヒト宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質の発現方法である。
【００６８】
宿主細胞でｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭが発現した後、ｈＨＥＲ２またはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質を活性型の蛋白質に回収することができる。いくつかの蛋白質精製方法が有用で、使用に適している。組換えｈＨＥＲ２蛋白質またはＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組み合わせ、または個々の適用によって細胞溶解物および抽出物から精製することができる。さらに、組換え蛋白質は、完全長ｈＨＥＲ２蛋白質またはｈＨＥＲ２蛋白質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体で作製した免疫親和性カラムを使用することによって、その他の細胞蛋白質から分離することができる。
【００６９】
本発明の核酸は、ヒト細胞において蛋白質の効果的な発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットに組み込むことができる。本発明の１実施形態では、該カセットは、コドンを最適化した完全長ｈＨＥＲ２遺伝子と共に、プロモーターなど、それに作動可能に結合した転写および翻訳制御関連配列並びに終止配列を含有する。本発明の第２の実施形態では、該カセットは、ヒトＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードする切断型ＨＥＲ２遺伝子、ＨＥＲ２ＥＣＤＴＭを含有する。好ましい実施形態では、該プロモーターはイントロンＡ配列（ＣＭＶ）を含まないサイトメガロウイルスプロモーターであるが、当業者であれば、強力なイムノグロブリンなどの多数のその他の公知のプロモーター、またはその他の真核細胞遺伝子プロモーターを使用できることを認識するであろう。好ましい転写終結区は、ウシ成長ホルモン終結区であるが、その他の公知の転写終結区もまた使用することができる。ＣＭＶ−ＢＧＨ終結区の組み合わせは特に好ましい。
【００７０】
本発明によれば、ｈＨＥＲ２ｏｐｔまたはｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭｏｐｔ発現カセットは、ベクターに挿入される。該ベクターは、好ましくはアデノウイルスベクターであるが、プロモーターに結合した線状ＤＮＡまたはその他のベクター、たとえば、アデノ関連ウイルスまたは改変ワクチンウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターもまた使用することができる。
【００７１】
選択したベクターがアデノウイルスの場合、ベクターがいわゆる第１世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能性Ｅ１遺伝子領域を有することが特徴で、好ましくはアデノウイルスＥ１遺伝子領域が欠失していることが好ましい。いくつかの実施形態では、該発現カセットはＥ１遺伝子が通常位置する位置に挿入される。さらに、これらのベクターは、場合によって非機能性Ｅ３領域を有するか、Ｅ３領域を欠失している。使用したアデノウイルスゲノムは、Ｅ１およびＥ３領域の両方が欠失していること（ΔＥ１ΔＥ３）が好ましい。該アデノウイルスは、ウイルスＥ１遺伝子を発現する公知の細胞系、たとえば、２９３細胞、またはＰＥＲＣ．６細胞、または一時的に、または安定して形質転換して外来蛋白質を発現する２９３またはＰＥＲＣ．６細胞から得られた細胞系で増殖することができる。たとえば、テトラサイクリン制御プロモーター系などの遺伝子発現が制御された構築物を使用するとき、該細胞系は、制御系に関連した成分を発現することができる。このような細胞系の１例は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３であり、その他は当業界で公知である。
【００７２】
アデノウイルスベクターの操作に便利なように、該アデノウイルスはシャトルプラスミド型であることが可能である。本発明はまた、プラスミド部分およびアデノウイルス部分を含むシャトルプラスミドベクターを対象としており、該アデノウイルス部分はＥ１が欠失し、場合によってＥ３も欠失したアデノウイルスゲノムを含み、コドン最適化ヒトＨＥＲ２またはコドン最適化ｈＨＥＲ２ＤＣＤＴＭを含む発現カセットが挿入されている。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが容易に除去され得るように、プラスミドのアデノウイルス部分に隣接して制限部位がある。該シャトルプラスミドは、原核細胞または真核細胞で複製することができる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態では、該発現カセットはｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（本明細書に参照により組み込むＥｍｉｎｉ他、ＷＯ０２／２２０８０を参照のこと）に挿入される。このプラスミドは、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計は、５’シス作用パッキング領域をＥ１遺伝子にさらに伸長し、ウイルスパッケージングを最適化するために重要であることが発見された要素を組み入れ、ウイルス増幅の増強をもたらすことによって、以前のアデノウイルスベクターよりも改良された。有利なことに、この増強されたアデノウイルスベクターは、何度か継代増殖させた後でも遺伝子安定性を維持することができる。
【００７４】
ＤＮＡ構築物を調製および精製する分子生物学の標準的技術によって、本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミドおよびＤＮＡ免疫原を調製することが可能である。
【００７５】
本発明によって、ヒト細胞において高濃度で発現するようにコドンが最適化された、本明細書で説明した合成ｃＤＮＡ分子（配列番号１および配列番号９）は、対応する野生型配列よりも効率的に発現することが測定された。さらに、本明細書では、ｈＨＥＲ２ｏｐｔはｈＨＥＲ２よりも免疫原性が高く、細胞性および体液性両方の免疫応答をより効果的に惹起することが示された。
【００７６】
したがって、前述のベクターは、異常なＨＥＲ２発現に関連した腺癌の発症の予防および／または既存の癌の治療のための免疫原性組成物およびワクチンに使用することができる。本発明のベクターは、形質転換が成功した宿主生物における外来性ＨＥＲ２の高濃度発現に伴う問題を排除することによって、ワクチン開発および商品化を可能にする。このために、本発明の１態様は、配列番号２で表したヒトＨＥＲ２蛋白質または配列番号１４で表したヒトＨＥＲ２ＥＤＴＭ蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含むコドン最適化合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む、ＨＥＲ２を伴う癌の予防または治療方法である。
【００７７】
前述の方法によれば、該ワクチンベクターはいかなる哺乳類の癌の治療または予防のためにも投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、該哺乳類はヒトである。
【００７８】
さらに、当業者は説明した治療方法および予防方法で使用するために任意の種類のベクターを選択することができる。好ましくは、該ベクターはアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。本発明の好ましい実施形態では、該ベクターはアデノウイルスＥ１領域に欠失があり、アデノウイルスＥ１領域に挿入のあるアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、前記挿入は、（ａ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよび（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む発現カセットを含む。
【００７９】
本発明はさらに、Ｅ１領域に欠失があり、Ｅ１領域に挿入のあるアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、前記挿入は、（ａ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよび（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む発現カセットを含む。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターである。
【００８１】
本発明の他の好ましい実施形態では、該ベクターはＡｄ６ベクターまたはＡｄ２４ベクターである。
【００８２】
他の態様では、本発明は、プラスミド部分および発現カセット部分を含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよび（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む。
【００８３】
本発明はまた、プラスミド部分および発現カセット部分を含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよび（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書で開示した組換えアデノウイルスワクチンは、免疫応答の増強を誘導するためにプラスミドをベースとしたポリヌクレオチドワクチンによる様々な初回／追加免疫の組み合わせで使用される。この場合、この２種類のベクターは「初回および追加免疫」計画で投与される。たとえば、第１の種類のベクターを投与し、次に所与の時間、たとえば、２週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、６ヶ月後またはその他の適切な間隔を経て、第２の種類のベクターを投与する。好ましくは、該ベクターは同一のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせをコードする発現カセットを有する。プラスミドＤＮＡをまた使用する実施形態では、該ベクターは哺乳類細胞または昆虫細胞によって認識される１種または複数のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態では、該プラスミドは強力なプロモーターを含有し、たとえば、ＣＭＶプロモーターであるが、それだけに限定されない。該合成ヒトＨＥＲ２遺伝子、ＨＥＲ２ＥＣＤＴＮ遺伝子、または発現すべきその他の遺伝子は、このようなプロモーターに結合されるだろう。このようなプラスミドの１例は、前述のような哺乳類発現プラスミドＶ１Ｊｎｓである（本明細書に参照により組み込まれるＪ．Ｓｈｉｖｅｒ他、ＤＮＡ  Ｖａｃｃｈｉｎｅｓ、Ｍ．Ｌｉｕ他著、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｎ．Ｙ．、７７２：１９８〜２０８（１９９６））。
【００８５】
前述のように、アデノウイルスベクターワクチンおよびプラスミドワクチンは、免疫応答を惹起する単一の治療計画の一部として脊椎動物に投与することができる。このために、本発明は、（ａ）ｉ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭをコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよびｉｉ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合させたプロモーターを含む第１ベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定した時間量を経過させること、および（ｃ）ｉ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭをコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチド、およびｉｉ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳類に導入することを含む哺乳類の癌の予防方法に関する。
【００８６】
前述の防御方法の１実施形態において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。他の実施形態では、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００８７】
本発明はさらに、（ａ）ｉ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチド、およびｉｉ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予備決定された時間経過させること、および（ｃ）ｉ）ヒトＨＥＲ２蛋白質またはヒトＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドおよびｉｉ）該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、ＨＥＲ２関連癌に罹患した哺乳類の治療方法に関する。
【００８８】
前述の治療方法の１実施形態において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。他の実施形態では、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００８９】
ワクチン受容体に導入すべき発現可能なＤＮＡまたは転写されたＲＮＡの量は、使用したプロモーターの強度および発現遺伝子産物の免疫原性に部分的に左右される。一般に、免疫学的または予防的に有効な用量、約１ｎｇから１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇのプラスミドワクチンベクターを直接筋肉組織に投与する。組換えアデノウイルスの有効量は、粒子約１０６個〜１０１２個で、好ましくは約１０７個〜１０１１個である。皮下注射、皮内注射、皮膚からの圧入およびその他の投与様式、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入送達もまた企図される。追加免疫ワクチン接種を行うこともまた、企図される。本発明のワクチンの非経口的導入と同時に、またはその後で、アジュバント、たとえば、インターロイキン１２蛋白質を非経口的に、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下またはその他の投与手段で投与することもまた、有利である。
【００９０】
本発明のワクチンは、裸であること、すなわち、いかなる蛋白質、アジュバントまたは受容体の免疫系に影響を与えるその他の薬剤が関与していないことが可能である。この場合、ワクチンベクターは生理学的に許容される溶液、たとえば、滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水に溶かすことが望ましい。あるいは、本発明のワクチンまたは免疫原組成物と共に免疫賦活剤、たとえば、アジュバント、サイトカイン、蛋白質、またはその他の担体を投与することが有利であり得る。したがって、本発明は、本発明の組成物および方法と組み合わせてこのような免疫賦活剤を使用することを含む。本明細書で使用した免疫賦活剤とは、外来抗原に対する（抗体および／または細胞性）免疫応答を増強または助長する本質的に任意の物質のことである。前記免疫賦活剤は、ＤＮＡまたは蛋白質の形態で投与することができる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、破傷風毒素、ＩＬ１２、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を含むが、それだけに限定されない様々な免疫賦活剤はいずれも、本発明のワクチンおよび免疫組成物と組み合わせて使用することができる。前記免疫賦活剤は、当業界で周知である。ＤＮＡの細胞による摂取を助ける薬剤、たとえば、それだけに限定されないがカルシウムイオンはまた、使用することができる。これらの薬剤は一般的に、形質移入を容易にする試薬および薬剤として許容される担体のことである。当業者であれば、特定の免疫賦活剤または薬剤として許容される担体並びに適切な時間および投与様式を決定することができる。
【００９１】
本明細書で記載した刊行物は全て、本発明と関連づけて使用することが可能な方法および材料を記載し、開示するために参照により組み込む。ここにおけるいかなる開示内容も、本発明が、先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００９２】
添付した図面を参考にして本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明はそれらの厳密な実施形態に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲で定義した本発明の範囲または精神を逸脱することなく、当業者が様々な変更および修正を実行できることを理解されたい。
【００９３】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００９４】
コドン配列を最適化したヒトＨＥＲ２
完全なｈＨＥＲ２．ｏｐｔコーディング配列を合成して、ＢＩＯＮＥＸＵＳ（Ｂｉｏｎｅｘｕｓ  Ｉｎｃ．Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）によって組み立て、ｐＣＲ−平滑末端ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にクローニングした。ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ  ｃＤＮＡはオリゴヌクレオチドを使用して構築し、ＰＣＲによって組み立てた。本明細書で説明した多くの実験では、使用したｈＨＥＲ２．ｏｐｔヌクレオチド配列は５’末端に最適化したＫｏｚａｋ配列、配列番号１１で表した完全なヌクレオチド配列を有していた。
【００９５】
さらに、ＡＰＴ結合リジン残基７５３は、コドンＡＡＡをＧＣＡで置換することによってアラニン（Ｋ７５３Ａ）に置換した。この変異によって、対応する蛋白質のチロシンキナーゼ活性を阻害し、下流の情報伝達現象およびヒト（Ｍｅｓｓｅｒｌｅ他。Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０５（１）：１〜１０（１９９４））またはラットＨＥＲ２（Ｂｅｎ  Ｌｅｖｉ他、前記）で生じる癌遺伝子活性がなくなる。さらに、キナーゼ欠損Ｋ７５６Ａ変異は、共発現癌遺伝子ｈＨＥＲ２．ｗｔの情報伝達活性を不活性化することができる。
【実施例２】
【００９６】
プラスミド構築物
ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔ：ヒトＨＥＲ２野生型をコードする配列は、プラスミドｐＬＴＲ−２／ｅｒｂ−Ｂ２（Ｐ．Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ、Ｅｕｒｏｅａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙから恵与された、Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７（４８１１）：１７８〜８２（１９８７））からプライマーｈＮｅｕ．ｆｏｒ１
【００９７】
【化１】
0004772674.tif 000002
およびｈＮｅｕ．ｒｅｖ２
【００９８】
【化２】
0004772674.tif 000003
およびＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用してＰＣＲによって増幅した。増幅産物には最適化した翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６（４）：９４７〜５０（１９８７）、Ｋｏｚａｋ、Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １５（２０）：８１２５〜４８（１９８７））が組み込まれており、ＰｍｅＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、哺乳類の発現プラスミドｐＶ１ＪｎｓＡのＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩ部位にクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２（９）：７７７〜８３（１９９３）参照）。このように生じたプラスミドｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２はイントロンＡ配列を有するヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターの転写制御下で完全長野生型ヒトＨＥＲ２配列を含有していた。ヒト野生型ＨＥＲ２コーディング配列の後にはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列があった。
【００９９】
ｐＶｌＪ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ：ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片３７９３ｂｐは、プラスミドｐＣＲ−ｈＨＥＲ２ｏｐｔから切り出し、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢ（Ｍｏｎｇｔｏｍｅｒｙ他、前述）の対応する部位にクローニングし、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔプラスミドを作製した。
【０１００】
ｐＶｌＪ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ：２１６８ｂｐの断片は、プライマーＥｃｏＲＶ−ｆｏｒ
【０１０１】
【化３】
0004772674.tif 000004
およびＳａｌＩ−ｒｅｖ
【０１０２】
【化４】
0004772674.tif 000005
と共にＴａＫａＲａ  ｔａｑ）を使用して、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔから増幅した。得られた断片は、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢ（Ｍｏｎｇｔｏｍｅｒｙ他、前述）の対応する部位にクローニングし、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔプラスミドを作製した。
【実施例３】
【０１０３】
コドンを最適化したｈＨＥＲ２  ｃＤＮＡ
合成ヒトＨＥＲ２遺伝子（ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ、図１）を、各アミノ酸（以後ａａ）残基についてヒトに好ましい（ヒト化）コドンを組み込むために設計した。遺伝子の組み立て中、ＰＣＲ増幅において、３６４２位から始まる８６ｂｐの配列は、この領域には配列ＧＣ含量が高いために一貫して除去された。この問題を克服するために、同一ａａ組成を保存しながらＧＣ含量を減少させた、あまり厳密ではない最適化設計物をｈＨＥＲ２配列のために３６０１位から３８０５位の間に採用した。
【０１０４】
コドン最適化ｃＤＮＡは、元々のクローンに対して８３．９％のヌクレオチド同一性を維持するように改変された。該コドン最適化ｃＤＮＡは、ｐＶ１Ｊベクター（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、前述）のＫｏｚａｋ最適化配列
【０１０５】
【化５】
0004772674.tif 000006
の前、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）／イントロンＡプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終止シグナルの制御下に配置してクローニングした。該構築物は、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ｏｐｔ（実施例２参照）と命名した。
【実施例４】
【０１０６】
プラスミド構築物のインビトロ発現
ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔおよびｐＶ１Ｊ．ＨＥＲ２．ｏｐｔ構築物のインビトロ発現は、ヒト胚性腎細胞系ＨＥＫ−２９３またはマウス筋芽細胞系Ｃ２Ｃ７を一時的に形質移入し、フローサイトメトリーでヒトＨＥＲ２発現を検出することによって評価した。免疫に使用したヒトＨＥＲ２をコードする、エンドトキシンフリーの高次コイルプラスミドＤＮＡ  ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２−ｗｔ発現カセットが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１２Ｓ細胞からＱｉａｇｅｎエンドフリープラスミドＧｉｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製された。
【０１０７】
プラスミドｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔが、ＨＥＫ−２９３細胞中にリポフェクタミン形質移入された（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。同様に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ７が、プラスミドｐＨｙｇＥＧＦＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）およびｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔの１：１または１０：１混合物で形質移入された。
【０１０８】
ＨＥＫ−２９３またはＣ２．７細胞のインビトロ形質移入によって、コドン最適化配列はｗｔ配列と比較してｈＨＥＲ２発現が劇的に改善されていることが示された（図３ＡおよびｃＢ）。
【実施例５】
【０１０９】
マウスの免疫
６週齢の近交系メスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ、Ｔｕｒｉｎ大学のＧ．Ｆｏｒｎｉから恵与された）が、標準的条件下で維持された。マウスは欧州連合および研究所の指針に従って処理した。特に、マウスは、手順に必要とされるとき、ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ  ５００、Ｍｅｒｉａｌ  Ｉｔａｌｉａ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）１００ｍｇ／ｋｇ体重およびキシラジン（Ｘｉｌｏｒ、ＢＩＯ  ９８、Ｓ．Ｌａｚｚａｒｏ、Ｂｏｌｏｇｎａ、Ｉｔａｌｙ）５．２ｍｇ／ｋｇで完全に麻酔した。
【０１１０】
既に記載されたように（Ｒｉｚｚｕｔｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７〜２２（１９９９））、プラスミドＤＮＡ  ５０マイクログラムを６、８および１０週目にマウスの大腿４頭筋に５０μｌの用量で電気的に注射した。皮膚を切開せずに、両大腿４頭筋に、最適化した、または最適化していないｐＣＭＶ＿ｈＮｅｕ  ５０μｇを注射し（生理学的溶液５０μｌ中２５μｇ／注射）、前述のように電気刺激（ＥＳ）を行った（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２４）：１１５９８〜６０７（２０００）、Ｒｉｚｚｕｔｏ他、前述）。簡単に説明すると、電気ショックは１０００両極性パルス（１３０Ｖ、７５ｍＡ、２００μｓ／相）、１０回であった。
【０１１１】
Ａｄ注射は、５０μｌの用量でマウスの大腿４頭筋に実施した。血清試料は７週目（１回目の免疫の１週間前、出血前）および１２週目（最後の免疫の２週間後）に採取した。
【実施例６】
【０１１２】
マウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ測定法
抗原特異的方法でＩＦＮ−γを分泌するマウス脾細胞は、標準的酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）測定法を使用して検出された（Ｍｕｙａｈｉｒａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８（１）：４５〜５４（１９９５））。マルチスクリーン９６ウェルＭＡＩＰ濾過プレート（カタログ番号ＭＡＩＰＳ４５１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、滅菌ＰＢＳで希釈したアフィニティー精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（ＩｇＧ１、Ｒ４−６Ａ２クローン、カタログ番号１８１８１Ｄ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で被覆した。一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴ（０．００５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液）で洗浄して、Ｒ１０培地で３７℃で２時間インキュベートして非特異的結合をブロックした。
【０１１３】
脾細胞は、安楽死させたマウスから滅菌的に脾臓を取り出すことによって得た。脾臓破砕は、金属格子上で切断した脾臓をすりつぶすことによって実施した。細胞ペレットに０．１ＸＰＢＳ  １ｍｌを添加し１５秒以上激しく撹拌して、浸透圧溶解することによって赤血球細胞を除去した。次に、２ＸＰＢＳ  １ｍｌを添加し、１ＸＰＢＳで体積を４ｍｌにした。室温で１２００ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞をペレットにし、該ペレットをＲ１０培地１ｍｌに再懸濁した。室温で１２００ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞をペレットにし、該ペレットをＲ１０培地（１０％牛胎児血清、Ｌ−グルタミン  ２ｍＭ、１ｍｌ当たりペニシリン５０Ｕ、１ｍｌ当たりストレプトマイシン５０μｇ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、２−メルカプトエタノール  ５０μＭを補給したＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁した。生細胞をチュルク染色を使用して計数した。
【０１１４】
２匹以上の免疫マウスから得られた脾細胞は、単一ペプチドまたはペプチドプール６μｇ／ｍｌの存在下で、２．５〜５  １０５細胞／ウェルの密度で１５時間インキュベートされた。各マウスの陽性内部対照としてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍｌで使用した。ＰＢＳＴで十分に洗浄した後、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−ガンマ抗体（カタログ番号１８１１２Ｄ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加した。該プレートを４℃で一晩インキュベートして、次にＰＢＳＴで洗浄してからストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを添加した（カタログ番号１３０４３Ｅ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。室温で２時間インキュベーションした後、該プレートをＰＢＳＴで十分に洗浄して、スポットを発色させるために１段階ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート基質（カタログ番号３４０４２、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共に５分から１５分間インキュベートすることによって発色させた。水中でプレートをすすいで、反応を停止させた。ＤＭＳＯおよびコンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ）は各試料のバックグラウンドおよび陽性対照として含めた。スポットはコンピュータ支援画像分析（ＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴ２．６ソフトウェアを備えたＡＩＤ  ＥＬＲ０２、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって計数した。
【０１１５】
ウェル当たりにプレーティングした細胞の総数当たりの陽性ＩＦＮ−γ産生脾細胞の出現頻度は、２種類の異なる細胞濃度で２連ずつ行って得られたスポットの平均値から、同じように非パルス脾細胞を含有する対照ウェルで測定したスポットで得られた平均値を差し引いて算出された。ＩＦＮ−γ産生細胞の出現頻度の変化は、対照の測定値から算出された９５％信頼限界を超えるものと定義した。ｐ値＜０．０５での差は優位であると見なした。
【実施例７】
【０１１６】
ヒトＨＥＲ２蛋白質における免疫優性Ｔ細胞エピトープの同定
アミノ酸１１個が重複したアミノ酸１５個のペプチド３１２個は、ヒトＨＥＲ２配列全体に亘るように設計された。不溶性問題を克服するために設計された７個のペプチドもまた含むこれらのペプチドは，ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）によって合成された。ペプチドは全て、ＨＰＬＣによって純度が＞９０％であることが示され、ＨＰＬＣ精製をしないで使用した。ペプチドはＤＭＳＯで３５ｍｇ／ｍｌになるように再構成した。すぐに溶解しないペプチドは、溶解を助けるために３７℃で振盪した。必要であれば、ＤＭＳＯをさらに１倍から３倍体積添加して、振盪して数時間経ってもまだ溶解しないペプチドを完全に溶解させた。再構成されたペプチドは、各ペプチドが混合物中で等しくなるように一緒にした。各ペプチドの混合物中における最終濃度は１ｍｇ／ｍｌと計算された。該混合物を小分けして、８０℃に保存した。
【０１１７】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（遺伝的背景Ｈ−２ｄ）においてヒトＨＥＲ２遺伝子の免疫優勢Ｔ細胞エピトープを同定するために、６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿４頭筋にＡｄ５−ｈＨＥＲ２を１０９ｖｐ注射することによって免疫した。２回目の注射は３週間後に実施した。第２のマウス群も同様に陰性対照として生理食塩水溶液を注射した。２回目の注射の３週間後に、該動物を殺処分して、マウス脾細胞中におけるＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の出現頻度をインターフェロン−γ酵素結合イムノスポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ）測定法によって評価した。
【０１１８】
それぞれアミノ酸の長さが１５個で、１１残基ずつ重複し、ヒトＨＥＲ２蛋白質配列全体に亘る３１１個のペプチドを１１個のプールに一緒にして、Ｎ末端からＣ末端に向かってアルファベット文字ＡからＫで記した。これらのプールそれぞれがＩＦＮ−γ脾臓Ｔ細胞を刺激する能力を試験された。ペプチドプールＡ、ＢおよびＭでは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによって、ペプチドのない対照と比較してＡｄ５−ｈＨＥＲ２で免疫したマウスでは統計学的に有意にＩＦＮ−γが産生されることが示された。活性に関与する個々のペプチドを同定するために、プールＡ、ＢおよびＭのペプチドを下位プールに分割したところ、その中でＡＩＶ、ＢＩＩＩおよびＭＩが陽性を示した。次に、これらの陽性下位プールの単一のペプチドがＩＦＮ−γ放出を引き起こす能力を試験された。重複したペプチドｈＮｅｕ−１５およびｈＮｅｕ−１６は、高くて同程度の反応性を示した。重複したペプチドｈＮｅｕ−１５およびｈＮｅｕ−４２はかなり低い反応性を示した。他のペプチド、ｈＮｅｕ−３０１はまた、Ｔ細胞エピトープを含有することが示された。
【０１１９】
これらのデータを確認し、ＩＦＮ−γ産生に関係するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団を同定するために、ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を細胞内染色（ＩＣＳ）によって特徴付けた。マウスの脾細胞を分泌阻害剤ブレフェルジンＡの存在下で単一のペプチドと共に１２時間インキュベートし、固定し、透過処理して、次に細胞内ＩＦＮ−γ、ＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ８マーカーで染色して、フローサイトメトリーによって分析した。ＩＣＳによって、ペプチドｈＮｅｕ−１５の反応性が確認され、ＣＤ８＋細胞を活性化できるエピトープとして同定した。ペプチドｈＮｅｕ１５およびｈＮｅｕ１６は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析において同等の反応性を有していたので、ＣＤ８＋エピトープは２種類のペプチドに共通の１１アミノ酸残基に含まれていることが示唆された。
【０１２０】
標的ナノマー配列を同定するために、ｈＮｅｕ１５およびｈＮｅｕ１６の間の重複する領域に亘ってアミノ酸９個のペプチド３種類を試験した。ｈＮｅｕ１５．３が最も反応性が高く、アミノ酸１５個のペプチドｈＮｅｕ−１５およびｈＮｅｕ−１６と比較してわずかに強い反応性を示した。興味深いことに、この反応性の約半分がまたｈＮｅｕ１５．１で検出され、重複するが異なるＣＤ８＋エピトープ２種類がこの１１アミノ酸配列に共存することが示された。
【０１２１】
ＩＦＮ−γＩＣＳ分析によってまた、ｈＮｅｕ３０１の反応性が確かめられ、ＣＤ８＋エピトープとして分類された。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによるこれらのＣＤ８＋エピトープの分析によって、ＩＣＳによって得られた結果が確かになった。最後に、ｈＮｅｕ４１およびｈＮｅｕ４２ペプチドで検出された反応性は低く、その低い反応性はＣＤ４＋に優勢であった。
【実施例８】
【０１２２】
細胞内サイトカイン染色
細胞内ＩＦＮ−γ産生が、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ標準方法に従って測定された。簡単に説明すると、脾細胞２ｘ１０６個が、Ｒ１０培地中において単一ペプチドまたはプールしたペプチド６μｇ／ｍｌおよび蛋白質輸送阻害剤としてブレフェルジンＡ（を備えたＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ＰｌｕｓＴＭおよびＧｏｌｄｇｉＰｌｕｇＴＭキット、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の存在下で１５時間培養された。スタフィロコッカス  エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（カタログ番号Ｓ４８８１、ＳＩＧＭＡ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）１０μｇ／ｍｌおよびＤＭＳＯが、それぞれ陽性対照およびバックグラウンド対照として脾細胞と共に試験された。
【０１２３】
表面抗原を染色する前に、Ａｂ抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２を使用して非特異的免疫蛍光シグナルを減少させた（カタログ番号５５３１４２、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。特異的シグナルが、ＡＰＣ−抗マウスＣＤ３ｅ、ＰＥ−抗マウスＣＤ４およびＰｅｒＣＰ−抗マウスＣＤ８ａ（カタログ番号５５３０６６、５５３６５３および５５３０３６、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で得られた。次に、該細胞を洗浄して、固定して、透過処理して、細胞内ＩＦＮ−γをＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（カタログ番号５５４４１１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して染色した。Ｔリンパ球ＩＦＮ−γは、１０００ｘ［（ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋）／（ＣＤ３＋およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋）］として算出された。一般に、少なくとも５００００個のＣＤ３＋リンパ球が、ＣＤ３＋イベントおよび小リンパ球を同時ゲーティングすることによって収集された。全試料を染色２４時間以内にＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して入手した。
【実施例９】
【０１２４】
抗体の力価測定およびアイソタイプ決定
抗体力価測定用の血清は、眼窩後方出血によって得られた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をＮａＨＣＯ３  ５０ｍＭ（ｐＨ９．６）に溶かしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１１２３）の濃度２μｇ／ｍｌ溶液で４℃で一晩被覆した。過剰な抗体を除去し、ＰＢＢＳＴ５緩衝液（ＢＳＡ  ５％、Ｔｗｅｅｎ  ０．５％）で３７℃で６０分間インキュベートすることによって非特異的結合をブロックした。洗浄後、ＩｇＢ２−細胞の上清を飽和状態で添加し、ＲＴで２時間インキュベートした（Ｃｈｅｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（１３）：７６２０〜９（１９９６））。ＩｇＧ２細胞（イスラエル、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＹ．Ｙａｒｄｅｎ博士から恵与された）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインとヒトＩｇのＦｃ部分との２量体融合物を分泌するＨＥＫ−２９３細胞である。プレートを洗浄し、ＰＢＢＳＴ１緩衝液（ＢＳＡ１％、Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％）による血清の系列希釈（１：４０００から１：２５６００）を４℃で一晩インキュベートした。予備免疫した血清をバックグラウンドとして使用した。洗浄は、ＰＢＢＳＴ１で実施した。２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ  ＡＰ結合体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５７２７２および５５３３８９）は、ＰＢＢＳＴ５で１：４００００に希釈して、室温で２〜３時間、振盪機上でインキュベートした。洗浄後、プレートをジエタノールアミンに溶かしたＳｉｇｍａ１０６ホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１０６）と共にインキュベートすることによって発色させた。プレートを自動ＥＬＩＳＡ読み取り機（Ｌａｂｓｉｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によって読み取り、結果をＡ＝Ａ４０５ｎｍ−Ａ６２０ｎｍで表した。それぞれの試料について、予備免疫血清で検出されたバックグラウンドシグナルを差し引いた。
【０１２５】
抗ｈＨＥＲ２血清の力価は、同希釈の自己由来予備免疫血清の吸収よりも少なくとも３倍大きい吸収を生じる血清の限界希釈の逆数として算出された。
【実施例１０】
【０１２６】
ｈＨＥＲ２ｏｐｔの高い免疫原性
野生型およびコドン最適化ｈＨＥＲ２発現ベクターによって誘導されるインビボでの免疫応答を調べるために、（実施例５で説明したように）ＢＡＬＢ／ｃマウスをｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔプラスミドＤＮＡによって、その後ＥＳによって筋肉内から免疫した。マウスは６、８および１０週齢のときに３回注射を行った。最後の免疫を行ってから２週間後に脾細胞を各マウスから単離した。プラスミドＤＮＡ免疫によって生じるＩＦＮγ分泌ｈＨＥＲ２特異的ＣＤ８Ｔ細胞前駆体出現頻度を定量するために、Ｈ−２ｄ制限Ｔ細胞エピトープｈＮｅｕ１５．３およびｈＮｅｕ４２についてＥＬＩＳＰＯＴ測定を使用した。ＨＥＲ２野生型配列で免疫して生じるＣＤ８＋応答はわずかに検出することが可能で、ＣＤ４＋ペプチドとの反応性はなかった。対照的に、最適化したＨＥＲ２配列は、ＣＤ８＋ペプチドに対する応答を１０倍強く誘導し、試験したエピトープに特異的なＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ、平均値）が２８６個まで生じた。検出されたＣＤ４＋活性はまた、低かった。ペプチド特異的ＩＦＮγＳＦＣは、ｐＶ１Ｊ−ｎｓＢ免疫マウスでは検出されなかった（データは示さなかった）。
【０１２７】
同マウスの血清が、基質としてＩｇＧ２蛋白質を使用してＥＬＩＳＡによって試験された（図４Ｂ）。ｈＨＥＲ２特異的抗体力価が、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ免疫マウス全てにおいて検出され、Ａｂ力価の相乗平均は、ＩｇＧ１では４６０００またはＩｇＧ２ａでは７８０００であった。対照的に、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔ免疫群はｈＨＥＲ２特異的抗体の約１００倍低い相乗平均力価を示した。したがって、これらの結果は、ｈＨＥＲ２のコドン最適化ｃＤＮＡが野生型配列よりも効率的に細胞性および体液性免疫応答を惹起することを示す。
【実施例１１】
【０１２８】
アデノウイルスベクター
ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｗｔ：ヒトＨＥＲ２  ｃＤＮＡを含有するｐＶ１Ｊ＿ｈＨＥＲ２からのＳｗａＩ−ＳａｌＩ  ＤＮＡ断片をシャトルプラスミド  ポリＭＲＫΔＥ１（Ｂｅｔｔ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（１９）：８８０２〜０４（１９９４））の対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドｐＭＲＫΔＥ１＿ｈＨＥＲ２はヒトＨＥＲ２  ｃＤＮＡの発現を推進するヒトＣＭＶプロモーター、それに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有していた。プラスミドｐＭＲＫΔＥ１＿ｈＨＥＲ２をアデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ５＿ＨＶ０と組み合わせて、アデノウイルス前駆体プラスミドｐＡｄ５−ｈＨＥＲ２ｗｔを作製した。
【０１２９】
ＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＨＥＲ２ｏｐｔを、ＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１５６ｂｐ挿入物を精製して、ポリＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドのＥｃｏＲＩにクローニングした（本明細書に参照により組み込まれるＥｍｉｎｉ他、ＷＯ０２／２２０８０参照）。
【０１３０】
プラスミドｐＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｗｔおよびｐＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔをＰａｃＩ消化によって直線化して、ＰｅｒＣ６細胞に形質移入し、Ａｄ５−ｈＨＥＲ２組換えアデノウイルスを作製した。このウイルスを、複数回増幅することによって大量に増殖させ、塩化セシウム勾配超遠心（Ｆａｌｌａｕｘ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９（１３）：１９０９〜１７（１９９８））によって精製した。ウイルスＤＮＡを、プロテイナーゼＫ消化によって抽出して、ゲノムの強度は制限分析によって確認した。
【０１３１】
ＨＥＫ２９３細胞を、様々な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を使用してＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはＭＲＫＡｄ５−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔで感染させた。ウェスタンブロット分析によって発現をモニターすることによって、ｗｔＨＥＲ２配列から発現された完全長蛋白質と比較してコドン最適化配列から発現された切断型蛋白質では１０倍以上の差があることが明らかになった（データは示さず）。
【実施例１２】
【０１３２】
免疫計画の比較
いずれもＣＭＶ−ＨＥＲ２発現カセットを有する、アデノウイルスおよび電気刺激を伴うプラスミドＤＮＡの抗ヒトＨＥＲ２細胞性免疫応答誘導効率を比較した。ｗｔＢＡＬＢ／ｃマウスまたは（ＮｅｕＴ、Ｌｕｃｃｈｉｎｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ６４（３）：２０３〜９（１９９２）に示されたような）ラットＨＥＲ２を過剰発現するＢＡＬＢ／ｃトランスジェニックマウスの大腿４頭筋にｐＶ１Ｊ−ＨＥＲ２プラスミド５０μｇを注射し、６週齢および９週齢のときにＥＳを行った。追加免疫の２週間後に、動物を殺処分して脾細胞を収集し、免疫優性ｐ１８５エピトープを含有するペプチドで誘発した。ＢＡＬＢ／ｃおよびｎｅｕＴマウスいずれにおいても、ヒトペプチドの誘発によって検出されるスポット形成細胞（ＳＦＣ）は非常に少なかった（図５）。平均して、応答はＡｄ５−ＨＥＲ２免疫によって誘導される応答よりも５０倍低かった。前記のデータは、いずれの方法でもＢＡＬＢ／ｃおよびｎｅｕＴマウスにおいてプラスミドｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２で免疫したマウスはかなりの応答を誘導することを示している。
【実施例１３】
【０１３３】
ヒトＣＥＡおよびＥｐＣＡＭ抗原と組み合わせたヒトＨＥＲ２によるアカゲザルの免疫
ヒト腫瘍抗原ＨＥＲ２とその他の腫瘍抗原を組み合わせたアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の免疫効率を評価するために、アカゲザル４匹（オス２匹およびメス２匹）の群をヒト腫瘍抗原Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡおよびＨＥＲ２／ｎｅｕのコドン最適配列を発現するプラスミドＤＮＡベクターの混合物で免疫した。
【０１３４】
免疫研究は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＰＲＣ、Ｒｉｊｓｗｉｊｋ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。これらの免疫研究は、ヒト抗原によって誘導された同抗原のアカゲザル相同体に対するＴ細胞応答を評価するために設計された。
【０１３５】
サルは、０、２、４、６、８、１０、１２、１４および１６週目に筋肉内注射によってワクチン接種して、その後電気刺激を行った。動物を麻酔して、体重２〜５キロの動物についてプラスミドＤＮＡ６ｍｇを含有する溶液１ｍｌを（２カ所に０．５ｍｌ／部位ずつ）注射した。
【０１３６】
電気刺激については、１００ｓｑｕａｒｅ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｐｕｌｓｅ（各１秒）２連発を１秒間隔で全処理時間３秒に亘って行った。パルス長は、２ｍｓｅｃ／相で、パルス周波数１００Ｈｚで振幅は１００ｍＡ（定電流）であった。
【０１３７】
次に、同サルをヒトＨＥＲ２、ヒトＣＥＡまたはヒトＥｐＣＡＭのｗｔ配列それぞれ発現する３種類のアデノウイルス５（ΔＥ１〜ΔＥ３、「第１世代」、Ｐ２レベル）の混合物で２７週目および３１週目にワクチン接種した。
【０１３８】
前記免疫方法を使用して、ヒトＨＥＲ２のサル相同体に対する免疫応答を測定するために、血液試料を４週間毎に１年間収集した。細胞性免疫応答は、ＩＦＮγエリスポット測定法によって測定した。図７で報告した結果から、前記で述べた免疫方法はヒトＨＥＲ２／ｎｅｕの内因性サル相同体に対する特異的な免疫応答を誘導するのに効果的であることが示される。
【実施例１４】
【０１３９】
ｐＶ１Ｊ−ＨＥＲ２ｏｐｔおよびｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔで免疫することによってマウスで惹起されるｐ１８５特異的Ｔ細胞応答の比較
細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを保持したｐ１８５のＣ末端欠損変異体（ＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ）の免疫効率を評価した。完全長（ｐＶ１Ｊ−ＨＥＲ２．ｏｐｔ）または切断型蛋白質（ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ）のコドン最適化配列を発現するプラスミドＤＮＡを１０週目および１２週目に電気的に注射して、１４週目に分析を実施した。ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定したように、ＣＤ４＋反応性としてもＣＤ８＋反応性としても、切断型蛋白質ＨＥＲ２ＥＣＤＴＭは、完全長ｐ１８５蛋白質よりも強く抗ｐ１８５細胞性応答を誘導した（図８）。Ｃ２．７マウス筋芽細胞におけるインビトロ発現分析では、２種類のプラスミドの間の発現の差は明らかではなかった（データは示さず）。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ−１】ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド（ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示した図である。実施例１を参照のこと。パネルＢは、ヒトＨＥＲ２蛋白質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ａ−２】ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド（ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示した図である。実施例１を参照のこと。パネルＢは、ヒトＨＥＲ２蛋白質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド（ｈＨＥＲ２．ｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示した図である。実施例１を参照のこと。パネルＢは、ヒトＨＥＲ２蛋白質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】ＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内染色（ＩＣＳ）分析によるヒトＨＥＲ２蛋白質の免疫優性Ｔ細胞エピトープの同定を示した図である。Ａｄ５−ｈＨＥＲ２で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスのヒトＨＥＲ２特異的細胞性免疫の誘導について分析した。ＩＦＮ−γ分泌型抗ヒトＨＥＲ２  Ｔ細胞の数は、（第１の列に示した）マウス群の脾細胞でペプチド収集物または単一ペプチドを使用してＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。示したデータは、いくつかの独立した実験を表す。値は、ペプチド無しで測定したバックグラウンド値（一般に、１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞数未満）を差し引いたスポット形成コロニーの数（ＳＦＣ）／１０６全脾細胞数として表す。抗原性ペプチド無しの対照実験で測定したバックグラウンドの３倍を上回る数を陽性と見なし、太字で示した。ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の頻度は、ＩＣＳによって測定した。示したデータは、いくつかの独立した実験を表す。値は、１０００ｘ［（ＩＦＮ−γＣＤ３＋およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋）／（ＣＤ３＋およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋）］として表す。１％より高い値は陽性と見なし、太字で示した。測定で使用したペプチド収集物または単一のペプチドによって包含される配列を左に示す。数字は、ヒトＨＥＲ２蛋白質のアミノ酸残基の位置を意味する。
【図３Ａ】（Ａ）ヒト胚性腎ＨＥＫ−２９３細胞および（Ｂ）マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ７における形質移入後のｈＨＥＲ２のインビトロ発現を示した図である。データは、空のｐＶ１ＪｎｓＡプラスミドによって生じたシグナルを差し引いたチャンネル蛍光の相乗平均として表す。Ｃ２Ｃ７細胞では、データはｐＥＧＦＰ  ＤＮＡ形質移入の効率について正規化する。
【図３Ｂ】（Ａ）ヒト胚性腎ＨＥＫ−２９３細胞および（Ｂ）マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ７における形質移入後のｈＨＥＲ２のインビトロ発現を示した図である。データは、空のｐＶ１ＪｎｓＡプラスミドによって生じたシグナルを差し引いたチャンネル蛍光の相乗平均として表す。Ｃ２Ｃ７細胞では、データはｐＥＧＦＰ  ＤＮＡ形質移入の効率について正規化する。
【図４Ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒトＨＥＲ２に対する免疫応答を示した図である。パネル（Ａ）は、野生型ＨＥＲ２と比較してコドン最適化ＨＥＲ２が著しく高いＥＬＩＳＰＯＴ値を与えたことを示す。マウスを２匹ずつ含む４群をプラスミドｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔで免疫した結果を示す（５０μｇ／用量を大腿４頭筋に電気注射する）。最後の注射から２週間後に、マウス脾細胞中のＩＦＮ−γ分泌型Ｔ細胞の出現頻度をペプチドｈＮｅｕ１５．３（ａａ６３〜７１、ＣＤ８＋エピトープを含む）、ｈＮｅｕ３０１（ａａ１２０２〜１２１４、ＣＤ８＋エピトープを含む）およびｈＮｅｕ４２（ａａ１６５〜１７９、ＣＤ４＋エピトープを含む）を使用したＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ測定法によって測定した。各試験量で２回反復したところ、脾細胞２．５ｘ１０５個および５ｘ１０５個の結果が得られた。平均値は、ペプチド無しで測定したバックグラウンド濃度（一般的に１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）を差し引くことによって算出した。結果は、ＳＦＣの数／１０６全脾細胞数として表した。パネル（Ｂ）は、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔがｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔと比較して著しく高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ体液性応答を惹起することを示す。血清試料は、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔプラスミドＤＮＡで免疫した４匹のマウスの群から６週目（１回目の免疫の前日、出血前）および１４週目（最後の注射を行って２週間後）に収集した。各マウス群から収集した血清の抗ｈＨＥＲ２抗体力価は、標的抗原としてｈＨＥＲ２の２量体細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）を使用したＥＬＩＳＡによって測定した。ＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａを使用して、結合したマウス抗体を検出した。
【図４Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒトＨＥＲ２に対する免疫応答を示した図である。パネル（Ａ）は、野生型ＨＥＲ２と比較してコドン最適化ＨＥＲ２が著しく高いＥＬＩＳＰＯＴ値を与えたことを示す。マウスを２匹ずつ含む４群をプラスミドｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔで免疫した結果を示す（５０μｇ／用量を大腿４頭筋に電気注射する）。最後の注射から２週間後に、マウス脾細胞中のＩＦＮ−γ分泌型Ｔ細胞の出現頻度をペプチドｈＮｅｕ１５．３（ａａ６３〜７１、ＣＤ８＋エピトープを含む）、ｈＮｅｕ３０１（ａａ１２０２〜１２１４、ＣＤ８＋エピトープを含む）およびｈＮｅｕ４２（ａａ１６５〜１７９、ＣＤ４＋エピトープを含む）を使用したＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ測定法によって測定した。各試験量で２回反復したところ、脾細胞２．５ｘ１０５個および５ｘ１０５個の結果が得られた。平均値は、ペプチド無しで測定したバックグラウンド濃度（一般的に１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）を差し引くことによって算出した。結果は、ＳＦＣの数／１０６全脾細胞数として表した。パネル（Ｂ）は、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔがｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔと比較して著しく高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ体液性応答を惹起することを示す。血清試料は、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔまたはｐＶ１−ｈＨＥＲ２．ｏｐｔプラスミドＤＮＡで免疫した４匹のマウスの群から６週目（１回目の免疫の前日、出血前）および１４週目（最後の注射を行って２週間後）に収集した。各マウス群から収集した血清の抗ｈＨＥＲ２抗体力価は、標的抗原としてｈＨＥＲ２の２量体細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）を使用したＥＬＩＳＡによって測定した。ＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａを使用して、結合したマウス抗体を検出した。
【図５】ｐＶ１Ｊ−ＨＥＲ２およびＡｄ５−ＨＥＲ２で免疫することによってマウスで惹起されるｐ１８５特異的Ｔ細胞応答の比較を示した図である。（ＮｅｕＴとして示される、Ｌｕｃｃｈｉｎｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ６４（３）：２０３〜９（１９９２）参照）ラットＨＥＲ２を過剰発現する野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＢＡＬＢ／ｃトランスジェニックマウスは、６週齢および９週齢時に、ｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２．ｗｔＤＮＡ（５０μｇ／用量を大腿４頭筋に注射）で免疫して、次に電気刺激を与えるか、またはＡｄ５−ｈＨＥＲ２．ｗｔで免疫した。１２週齢時に、指定したペプチドを使用したＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、マウス群でＩＦＮ−γを分泌する抗ヒト細胞の数を測定した。示したデータは、独立したいくつかの実験を表したものである。値は図１の通りに表す。
【図６Ａ】パネルＡは、切断型ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド（ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ、配列番号９）のヌクレオチド配列を示した図であり、前記蛋白質はＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。パネルＢは、ＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを示し、この第２のポリヌクレオチドは「野生型」ヌクレオチド配列を含み、コドンは最適化されていない（ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｗｔ、配列番号１０）。
【図６Ｂ】パネルＡは、切断型ヒトＨＥＲ２蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド（ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔ、配列番号９）のヌクレオチド配列を示した図であり、前記蛋白質はＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。パネルＢは、ＨＥＲ２蛋白質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードする第２のポリヌクレオチドを示し、この第２のポリヌクレオチドは「野生型」ヌクレオチド配列を含み、コドンは最適化されていない（ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｗｔ、配列番号１０）。
【図７】ヒト抗原ＨＥＲ２、ＣＥＡおよびＥｐＣＡＭを発現する３種類のプラスミドの混合物で免疫したアカゲザルで誘導された細胞性応答の分析を示した図であり、このプラスミドはヒト細胞において高濃度に発現するようにコドンが最適化されたヌクレオチド配列を含む。次に、３種類の抗原それぞれの野生型配列を発現する３種類のＡｄ５ベクターの混合物で同じ動物を免疫した。相同性の高い（配列類似性９８．２％）アカゲザルＨＥＲ２蛋白質に対する細胞性免疫応答を、毎月ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによって１年間測定した。値は、ペプチド無しで測定されたバックグラウンド値を差し引いて、ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣとして表す。抗原ペプチド無しの対照実験で測定したバックグラウンドと有意に異なる値（Ｐ＜０．０５）および任意に選択した閾値５５ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣより高い値が、太字で示されている。
【図８】ｐＶ１Ｊ−ＨＥＲ２ｏｐｔおよびｐＶ１Ｊ−ｈＨＥＲ２ＥＣＤＴＭ．ｏｐｔで免疫することによってマウスで惹起されるｐ細胞性免疫応答の比較を示した図である。値は、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＩＦＮγ分泌型脾臓細胞の発生頻度を意味する。示したデータは、３匹の動物から得られ、いくつかの独立した実験を代表するものである。値は、ペプチド無しで測定したバックグラウンド値（一般的に、５ＳＦＣ／１０６脾細胞数未満）を差し引いたＳＦＣ／１０６全脾細胞数として表す。抗原ペプチド無しの対照実験で測定したように、バックグラウンドと有意に異なる値（Ｐ＜０．０５）および任意に選択した閾値２２ＳＦＣ／１０６脾細胞より高い値が、太字で示されている。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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