(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のヘレグリンを含んでなり、ベーター前駆細胞の分化又は増殖、あるいは成熟ベーター細胞の増殖を誘導又は促進することにより、哺乳類の膵臓機能不全を治療するための医薬であって、前記膵臓機能不全は糖尿病性網膜症を含まない医薬。
【請求項２】
哺乳類の糖尿病を治療するための医薬である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記ヘレグリンをベーターセルリンとの組合せで投与する、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項２に記載の医薬。
【請求項５】
カニューレを使用して前記哺乳類へ投与するために製剤化される、請求項１から４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項６】
供与哺乳類由来の成熟ベーター細胞又はベーター前駆細胞をヘレグリンの有効量へインビトロで曝露し、それにより前記ベーター前駆細胞の分化又は増殖、あるいは成熟ベーター細胞の増殖を誘導又は促進する工程、次に前記成熟ベーター細胞又はベーター前駆細胞を受容哺乳類へ投与するために製剤化する工程を含んでなる、膵臓機能不全の治療するための医薬を製造するための方法。
【請求項７】
前記供与哺乳類及び前記受容哺乳類が同じ哺乳類である、請求項６の方法。
【請求項８】
前記供与哺乳類及び前記受容哺乳類が異なる哺乳類である、請求項６の方法。
【請求項９】
前記受容哺乳類へ免疫抑制剤を更に投与する、請求項６から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ベーター前駆細胞又は成熟ベーター細胞をヘレグリンの有効量へ曝露することを含んでなる、ベーター前駆細胞又は成熟ベーター細胞の増殖を促進又は誘導するインビトロ方法。
【請求項１１】
ベーター前駆細胞をヘレグリンの有効量へ曝露することを含んでなる、ベーター前駆細胞を成熟ベーター細胞へ分化させることを促進又は誘導するインビトロ方法。
【請求項１２】
ヘレグリンを含んでなる、哺乳動物のベーター前駆細胞又は成熟ベーター細胞の増殖を促進又は誘導するための薬剤であって、前記哺乳動物は糖尿病性網膜症を有さない薬剤。
【請求項１３】
ヘレグリンを含んでなる、哺乳動物のベーター前駆細胞を成熟ベーター細胞へ分化させることを促進又は誘導するための薬剤であって、前記哺乳動物は糖尿病性網膜症を有さない薬剤。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の薬剤の有効量、ベーターセルリンの有効量及び製薬的に許容可能な担体を含んでなる組成物。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載の薬剤の有効量及びベーターセルリンの有効量を含んでなる組成物を含有する容器、及びインビボ又はインビトロにおいて前記薬剤及びベーターセルリンを使用するための指示書を提供する前記容器のラベル又は挿入包装物を含んでなる製造品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、糖尿病治療及び膵臓機能不全に関連する他の状態におけるErbBレセプターリガンド及びErbBレセプター抗体の利用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
（ErbBレセプター及びリガンドファミリー）
細胞成長及び分化を制御する信号の伝達は、一部、種々の細胞性タンパク質のリン酸化によって制御されている。タンパク質チロシンキナーゼは、このプロセスを触媒する酵素である。レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、細胞内基質のリガンド刺激チロシンリン酸化を経由することによって細胞の成長を方向づけると考えられている。ErbBレセプターファミリーは、レセプターチロシンキナーゼスーパーファミリーのサブクラスＩに属し、上皮細胞成長因子（EGFR又はErbB1）、ErbB2（HER2又はp185neu）、ErbB3（HER3）、及びErbB4（HER4又はtyro2）を含んでなる４つの明らかなレセプターを含む。
EGFR又はErbB1はヒト悪性腫瘍の原因と示唆されており、特にこの遺伝子の発現は、乳房、膀胱、肺及び腹部のさらなる悪性腫瘍において観察される。増大したEGFR発現は、自己分泌刺激経路によるレセプターの活性化となる、同じ腫瘍細胞によるEGFRリガンド、形質転換成長因子−アルファ(TGF-α）の生成の増加にしばしば関連していると報告されている（Baselgaら, Pharmac Ther., 64:127-154 (1994)）。EGFR、又はそのリガンドTGF-アルファ及びEGFに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の治療における治療剤として評価されている（例えば、Baselgaら, 上掲；Masuiら, Cancer Research, 44:1002-1007(1984)；Wuら, J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)を参照されたい）。
【０００３】
クラスＩサブファミリーの第２のメンバーであるp185neuは、元々は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞種由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。neu遺伝子（erbB2及びHER2とも呼ばれている）は、185kDaのレセプタープロテインチロシンキナーゼをコードしている。ヒトErbB2遺伝子の増幅及び／又は過剰発現は、乳房及び卵巣癌における乏しい予後と相関している[Slamonら, Science, 235:177-182 (1987)；及びSlamonら, Science, 244:707-712 (1989)；米国特許第4,968,603]。ErbB2の過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸及び膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても観察されている。従って米国特許第4,968,603号においてSlamonらは、腫瘍細胞におけるErbB2遺伝子増幅又は発現を測定する様々な診断試験法を記載している。
ラットp185neu及びヒトErbB2遺伝子産物に対する抗体が記述されている。例えば、Drebinら, Cell 41:695-706(1985)；Meyersら，Methods Enzym. 198:277-290(1991)；及びWO94/22478は、ラット遺伝子産物であるp185neuに対する抗体に言及している。Hudziakら,  Mol. Cell. Biol. 9:1165-1172(1989)には、ヒトの乳房腫瘍株化細胞SKBR3を使用して特徴付けられた抗-ErbB2抗体パネルの産生が記載されている。他の抗-ErbB2抗体が文献において報告されている（例えば、米国特許5,821,337号及び5,783,186号；国際公開94/00136；Tagliabueら, Int. J. Cancer 47:933-937(1991)；McKenzieら,Oncogene 4:543-548(1989)；(Maierら, Cancer Res. 51:5361-5369(1991)；Bacusら, Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Xuら, Int. J. Cancer 53:401-408(1993)；Kasprzykら, Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancockら, Cancer Research. 51:4575-4580(1991)；Shawverら, Cancer Research. 54:1367-1373(1994)；Arteagaら, Cancer Research. 54:3758-3765(1994)；Harwerthら, J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)を参照のこと）。
【０００４】
erbB3又はHER3と呼ばれる、更なる関連遺伝子が同様に記載されている。例えば米国特許第5,183,884号及び同第5,480,968号；Krausら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197(1989)；欧州特許出願番号444,961A1；及びKrausら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904(1993)を参照されたい。Krausら(1989)は、erbB1及びerbB2と同じく、erbB3がヒト悪性腫瘍において一役を担うであろうことを示す、erbB3mRNAのレベルの際立った上昇があるヒト乳房腫瘍細胞株に存在することを発見した。また、Krausら,上掲(1993)は、キメラEGFR/ErbB3レセプターのErbB3触媒ドメインのEGF依存性活性化は、形質導入されたNIH-3T3細胞の増幅的反応となることを示した。これは、現在、NIH-3T3における内在性ErbB1又はErbB2の結果であると考えられている。更には、これらの研究者は、幾つかのヒト乳房腫瘍細胞株が、EGFR/ErbB3レセプターがヒト悪性腫瘍において一役を担うことを更に示す、定常状態のErbB3チロシンリン酸化の顕著な上昇を明らかにした。癌におけるerbB3の役割は、他の者によって調べられた。erbB3は，乳房（Lemoineら, Br. J. Cancer 66:1116-1121(1992)）、胃腸（Pollerら, J. Pathol. 168:275-280(1992)）、Rajkumerら, J. Pathol. 170: 271-278(1993)、及びSanidasら, Int. J. Cancer 54: 935-940(1993)）、及び膵臓癌（Lemoineら, J. Pathol. 168:269-273(1992)；Friessら, Clinical Cancer Research 1: 1413-1420(1995)）での過剰発現が認められた。
【０００５】
上皮細胞成長因子レセプタープロテインチロシンキナーゼのクラスＩサブファミリーは、更にErbB4レセプターを含むように拡大されている（欧州特許出願第599,274号；Plowmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993);及びPlowmanら, Nature, 366:473-475 (1993)を参照されたい）。Plowmanらは、ErbB4発現の増大が、乳腺癌を含む上皮由来のある種の癌腫と相関していることを見出した。ErbB4の発現を評価するヒトの腫瘍状態（特に乳房癌）の検出のための診断方法は、欧州特許出願第599,274号に記載されている。
このようなErbBレセプターに結合及び／又は活性化する種々のリガンドは、文献に記載されている。リガンドは、EGF（Savageら, J. Biol. Chem. 247: 7612-7621(1972)）、TGF-アルファ（Marquardt等, Science 223: 1079-1082(1984)）、アンフィレグリン（amphiregulin）（Shoyabら, Science 243:1074-1076(1989)；Kimuraら, Nature 348:257-260(1990)；Cookら, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557(1991)）、ヘパリン結合EGF（HB-EGF）（Higashiyamaら, Science 251:936-939(1991)）、ベーターセルリン（betacellulin）（Shingら, Science 259:1604-1607(1993)）、及びエピレグリン（epiregulin）（Toyodaら, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500(1995)）に相当するポリペプチドを含む。ErbB1は、６つの異なったリガンドに結合している；上皮細胞成長因子（EGF）、TGF-アルファ、アンフィレグリン（amphiregulin）、HB-EGF、ベーターセルリン（betacellulin）、及びエピレグリン（epiregulin）（例えば、Groenenら, Growth Factors 11: 235-257(1994)）。
【０００６】
単一遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリン（heregulin）タンパク質のファミリーは、ErbB3及びErbB4のリガンドである。更に以下において論じられるように、ヘレグリンファミリーは、NDFs、GGFs、及びARIAを含む（Groenenら, Growth Factors 11:235-257(1994)；Lemke, Molec. & Cell. Neurosc. 7: 247-262(1996)；Leeら, Pharm. Rev. 47: 51-85(1995)）。更なるErbBリガンドである、ErbB3又はErbB4へ結合すると報告されているニューレグリン-２（neuregulin-2）(NRG-3)（Changら, Nature 387: 509-512(1997)；Carrawayら, Nature 387: 512-516(1997)）、及びErbB4に結合するニューレグリン-３（neuregulin-3）（Zhangら, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567(1997)）が同定された。HB-EGF、ベーターセルリン（betacellulin）、及びエピレグリンもErbB4へ結合する。
EGF及びTGF-アルファはErbB2と結合しないが、EGFはErbB1及びErbB2を刺激してヘテロ二量体を形成し、ErbB1を活性化してヘテロ二量体におけるErbB2のリン酸転移反応を生じる。二量体化及び／又はリン酸転移反応がErbB2チロシンキナーゼを活性化するとおもわれる。ErbB3がErbB2と同時発現される場合、活性なシグナル伝達複合体が形成され、ErbB2に対する抗体はこの複合体を破壊することが可能である[Sliwkowskiら, J. Biol. Chem., 269:14661-14665 (1994)]。更に、ErbB2と共に同時発現された場合、ヘレグリンに対するErbB3の親和性がより高い親和性状態まで増大する（ErbB2-ErbB3タンパク質複合体に関するLeviら, J. Neuroscience, 15: 1329-1340 (1995); Morriseyら, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:1431-1435 (1995); 及びLewisら, Cancer Research, 56:1457-1465 (1996)）。ErbB3のように、ErbB4はErbB2と活性なシグナル伝達複合体を生成する[Carrawayら, Cell, 78:5-8 (1994)]。
【０００７】
Holemsらは、彼らが、ヘレグリン-アルファ（HRG-アルファ）、ヘレグリン-ベーター１（HRG-ベーター1）、ヘレグリン-ベーター２（HRG-ベーター2）、ヘレグリン-ベーター２-様（HRG-ベーター2-様）、及びヘレグリン-ベーター３（HRG-ベーター3）と呼ぶErbB2レセプターのポリペプチドアクチベーターファミリーを単離し、クローン化した（Holmesら, Science, 256:1205-1210(1992)；WO92/20798；及び米国特許第5,367,060）。45kDaポリペプチドであるHRG-アルファは、MDA-MB-231ヒト乳房癌細胞株の条件付き培地から精製された。これらの研究者は、MCF7乳房腫瘍細胞における、精製ヘレグリンポリペプチドのErbB2レセプターのチロシンリン酸化を活性化する能力を明らかにした。さらには、SK-BR-3細胞（高いレベルのErbB2レセプターを発現する）におけるヘレグリンポリペプチドの分裂促進活性が例証された。
ヘレグリンは、最初の213アミノ酸残基が実質的に同一であるが、Ｃ末端部分が異なる２つの変異体EGF-様ドメインに基づくアルファ及びベーターの２つの主要型に分類される。にもかかわらず、これらのEGF様ドメインは、それらに含まれる６個のシステイン残基の間隔が同一である。アミノ酸配列の比較に基づいて、Holemsらは、EGF様ドメインの最初と６番目のシステイン間において、HRGsは、ヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF）に対して45％の類似性、アンフィレグリン（amphiregulin）（ＡＲ）に対して35％同一性、TGF-アルファに対して32％の同一性、そしてEGFに対して27％の同一性であることを見出した。
【０００８】
ラットと等価のヒトHRGである44kDa のneu 分化因子（NDF）は、最初にPelesら, Cell, 69: 205-216(1992)；及びWenら, Cell, 69: 559-572(1992)によって記載された。HRGポチペプチドのように、NDFは、EGF様ドメインが後に続くイムノグロブリン（Ig）相同性ドメインを有し、Ｎ末端のシグナルペプチドを欠く。続いて、Wenら, Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919(1994)は、NDFsのファミリーを拡張するために「徹底的なクローニング」を実行した。この研究は、６つの明白な線維芽細胞のpro-NDFsを明らかにした。Holmesらによる命名法を採用し、NDFsは、EGF様ドメインの配列に基づきアルファ又はベーターポリペプチドのように分類される。これらの研究者は、異なるNDFイソ型（アイソフォーム）は選択的スプライシングによって生成され、明白な組織特異的機能を担うと結論つけている。NDFに関する欧州特許第505,148；及び国際公開93/22424；及び国際公開93/28133を参照のこと。
Fallsら, Cell, 72:801-815(1993)は、彼らがアセチルコリンレセプター誘導活性（ARIA）ポリペプチドと呼ぶ、ヘレグリンファミリーのその他のメンバーについて記載している。ニワトリ由来のARIAポリペプチドは、筋アセチルコリンレセプターの合成を刺激する。また、国際公開94/08007を参照のこと。ARIAは、ベーター型のEGFドメインを持つＩ型ヘレグリンである。
Marchionniら, Nature, 362:312-318(1993)は、彼らがグリア成長因子（GGFs）と呼ぶ幾つかのウシ由来タンパク質を同定した。これらのGGFsは、上記に記載の他のヘレグリンタンパク質とIg様ドメイン及びEGF様ドメインを共有するが、また、アミノ末端クリングルドメインを有する。GGFsは、通常、Ig様ドメインとEGF様ドメインの間に完全なグリコシル化間隔領域を有しない。GGFs、GGFIIのうちの一つが、Ｎ末端シグナルペプチドを有する。また、GGFsとそれらの利用に言及する、国際公開92/18627；国際公開94/00140；国際公開94/04560；国際公開94/26298；及び国際公開95/32724を参照のこと。
Hoら, J. Biol. Chem. 270(4):14523-14532(1995), は、感覚及び運動ニューロン誘導因子（SMDF）と呼ばれる、ヘレグリンファミリーのその他のメンバーについて記載した。このタンパク質は、明白なＮ末端ドメインを除いて、全ての他のヘレグリンポリペプチドの特徴であるEGF様ドメインをする。SMDFと他のヘレグリンポリペプチドとの主要な違いは、SMDFはIg様ドメイン及び全ての他のヘレグリンポリペプチドの特徴である「グリコ」間隔を欠くことである。SMDFのその他の特徴は、Ｎ末端近傍の疎水性アミノ酸の２つの一続きである。
【０００９】
ヘレグリンポリペプチドは、最初にそれらがErbB2レセプターを活性化する能力に基づいて同定されたが（Holmesら, 上掲）、neu及びneu形質移入繊維芽細胞を発現するある卵巣細胞が、NDFに結合又は交差結合せず、さらにチロシンリン酸化を起こすためにNDFへ反応しないことが発見された（Pelesら, EMBO J. 12: 961-971(1993)）。このことは、完全なヘレグリン反応性を与えるためには、その他の細胞性成分が必要であることを示した。Carrawayらは、続いて、125I-rHRGβ1177-244がウシerbB3によって安定的に形質導入されたNIH-3T3繊維芽細胞と結合し、形質導入されていない親細胞には結合しないことを証明した。従って、研究者は、ErbB3はHRGのレセプターであり、HRGレセプターであるErbB3とErbB2レセプターの両方を発現する細胞でのErbB2レセプターのリン酸化のみならず内在性チロシン残基のリン酸化をも媒介することを示唆した（Carrawayら, J. Biol. Chem. 269(19):14303-14306(1994)）。Sliwkowskiら, J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)は、ErbB3のみで形質導入された細胞は、ヘレグリンに対して低い親和性を示すのに対し、ErbB2及びErbB3の両方で形質導入された細胞は、高い親和性を示すことを発見した。
この知見は、以前、Kokaiら, Cell 58:287-292(1989)；Sternら, EMBO J. 7:995-1001(1988)；及びKingら, 4:13-18(1989)によって記載された「レセプタークロストーキング（receptor cross-talking）」に相関する。これらの研究者は、EGFのErbB1への結合は、ErbB1キナーゼドメインの活性化及びp185HER2の交差リン酸化となることを発見した。これは、リガンド誘導レセプターヘテロ二量体化及びヘテロ二量体内でのレセプターの付随的交差リン酸化の結果であると考えられている（Wadaら, Cell 61:1339-1347(1990)）。
Plowman及び彼らの同僚は、p185HER4/p185HER2活性化を同じように研究した。彼らは、p185HER2のみ、p185HER4のみ、又は２つのレセプターを同時にヒトTリンパ球において発現させ、ヘレグリンがp185HER4のチロシンリン酸化を刺激することが可能だが、両レセプターを発現している細胞では、p185HER2のリン酸化の刺激のみが可能であることを証明した（Plowmanら, Nature, 366:473-475 (1993)）。
【００１０】
（ErbBレセプターリガンドの他の生物学的役割）
幾つかのグループによって、種々のErbBリガンドの他の生物学的役割が研究された。例えば、ベーターセルリンは、血管平滑筋細胞及び網膜色素上皮細胞において成長促進活性を示すことが報告されている（Shingら, 上掲）。Fallsら,上掲は、ARIAが筋管分化において一役を担う、すなわち運動ニューロンのシナプス後性筋細胞において神経伝達物質レセプターの合成と濃度へ影響を与えることを発見した。Corfas及びFischbachは、ARIAはまた、筋肉においてナトリウムチャンネルの数を増加させることを証明した（Corfas 及びFischbach, J. Neuroscience, 13(5): 2118-2125(1993)）。また、GGFIIが副融合性鎮静ヒト筋芽細胞（subconfluent quiescent human myoblasts）の分裂促進因子であり、GGFIIの継続的な存在におけるクローン性ヒト筋芽細胞の分化が、分化の６日後に筋管の増加となることを示した（Sklarら, J. Cell Biochem., Abst. W462,18D,540(1994)）。また、1994年11月24日発行の国際公開94/26298を参照されたい。
Holmesら, 上掲は、HRGが、乳房細胞株（例えばSK-BR-3及びMCF-7）に対して分裂促進作用を及ぼすことを発見した。スワン細胞に対するGGFsの分裂促進活性もまた報告されている（例えば、Brockesら, J. Biol. Chem. 255(18):8374-8377(1980)；Lemke及びBrockes, J. Neurosci. 4: 75-83(1984)；Brockesら, J. Neuroscience 4(1): 75-83(1984)；Brockesら, Ann Neurol. 20(3): 317-322(1986)；Brockes, Methods in Enzym. 147: 217-225(1987)及びMarchionniら, 上掲を参照のこと）。
Pinkas-Kramarskiらは、NDFが神経細胞、胚のグリア細胞、成人ラット脳、及びラット脳細胞の初代培養において発現されると思われることを発見し、NDFが星状細胞（アストロサイト）の生存及び成熟因子として作用しうることを示唆した（Pinkas-Kramarskiら, PNAS, USA 91: 9387-9391(1994)。Meyer及びBirchmeier, PNAS, USA 91: 1064-1068(1994)は、マウス胚形成の間及び周産期の動物におけるヘレグリンの発現を、インサイツハイブリダイゼーション及びリボヌクレアーゼ防御実験を用いて分析した。また、Meyerら, Development 124(18):3575-3586(1997)を参照のこと。同様に、Danilenkoら, Abstract 3101, FASEB 8(4-5):A535(1994)及び Danilenkoら, Journal of Clinical Investigation 95(2):842-851(1995)は、NDFとErbB2レセプターの相互作用が、傷修復中の上皮性転移と分化を方向づけることに重要であることを発見した。
【００１１】
Ramら, Journal of Cellular Physiology 163:589-596(1995)は、不死ヒト乳房上皮細胞株MCF-10Aにおける分裂促進活性を調べた。Danilenkoら, Journal of Clinical Investigation 95(2):842-851(1995)は、NDFが、切除性で深く、部分的に厚い傷の修復のインビボモデルにおける上皮転移へ影響を与えるかどうかを調べた。対照の傷とrhNDF-α２で処置した傷の間では、基底角化細胞(ケラチノサイト）と超基底角化細胞の増殖において統計上の際だった違いが無かったことが報告されている。Marikovskyら, Oncogene 10: 1403-1411(1995)は、異数体BALB/MK持続性角化細胞細胞株の増殖性反応を研究し、上皮角化細胞におけるNDFのα及びβ-イソ型の効果を調べた。
膵臓細胞の増殖及び分化において種々のErbBリガンドが担うであろう潜在的役割が、数人の研究者によって報告されている。膵臓の島細胞（ランゲルハンスの島にも相当）は、ホルモン、インスリン、及びグルカゴンを生成することで知られている。そのような島細胞は、胎児小管膵臓内皮細胞の幹細胞から誘導されると考えられている（Pictet及びRutter, 「Development of the embryonic pancreas」Endocrinology, Handbook of Physiology, 1972, American Physiological Society, Washington D.C., page 25-66）。特に、発生においては、膵臓は、後に管細胞、腺房細胞又は島細胞へ分化しうる未分化細胞の単一層からなる小管のシステムを形成する（LeDouarin, Cell, 53: 169-171(1998)；Teitelman, Recent Prog. Hormone Res., 47:259-297(1991)）。
【００１２】
アルファ細胞及びベーター細胞に相当する細胞を含む、組織学的に同定が可能な島細胞の幾つかの異なるタイプがある。インシュリンは、ベーター細胞によって膵臓島で合成される。種々の環境下において、島ベーター細胞は、十分な量のインシュリンを分泌できないことがあり、それは最終的には血中グルコースの異常な高レベルへとつながる（しばしば、高血糖症と呼ばれる）。細胞レベルでのイシュリン生成の制御は、転写、翻訳、及び翻訳後レベルで機能する制御機構を通してベーター細胞で達成される（Sjoholm, J. Int. Med., 239:211-220(1996)）。イシュリンは、哺乳類において多様な生物学的活性を有し、その中の幾つかは組織特異的である。例えば、インシュリンは、乳房腺においてミルクの生成を増大し、肝臓において脂肪生成を刺激し、筋肉組織へのグルコース輸送を促進し、そして結合組織の成長を刺激する。
哺乳類のインシュリン欠乏症は、深刻な生理学的症状となる。例えば、Ｉ型糖尿病では、膵臓は、典型的にはインシュリンを僅か又は全く生成しない。Ｉ型糖尿病は、膵臓ベーター細胞が典型的に破壊されるT細胞媒体自己免疫疾患と一般的に特徴づけられる。この疾患は、通常、子供及び青年期に発症するが、どの年齢においても起こる。多様な環境的引き金、例えば、あるウイルス又は食事成分が、T細胞が重要な役割を担う自己免疫プロセスを惹起すると提唱されている（Akerblomら, Diabetes/Metabolism Reviews, 14:31-67(1998))。Ｉ型糖尿病に対する感受性又は耐性は、また、個人の遺伝的性質に依存している（Tischら, Cell, 85:291-297(1996)）。一般的な概説として、Rabinovitchら, Prevention and Treatment of Diabetes and Its Complications, 82:739-755(1998)を参照のこと。
【００１３】
II型糖尿病として知られている症状において、膵臓は、通常、ある程度のインシュリンを生成するが、その分泌量は、哺乳類にとっては生理学的に許容しうるグルコースレベルを維持するためには不十分である。II型糖尿病は、さらに良く知られている型の糖尿病であり、何百万という人々に発症し、その多くはこの疾患の症状を有していること気づいていない。この型の糖尿病は、通常、三つに分かれてはいるが相互に関連している欠損症によって特徴づけられる。発症した個人は、一つ又は全てのこれらの欠損症及び様々な程度を有する。これらの欠損症は、インシュリン抵抗症、イシュリン分泌傷害、及び肝臓による不適切なグルコース遊離である。
さらにその他の糖尿病の型は、妊娠糖尿病に相当する。この型の糖尿病は、典型的には、最初、妊娠期間に個々に診断され、出産後に解消する糖尿病の症状である。
そのような糖尿病の症状のさらなる合併症は多様で、そして心臓発作、脳梗塞、失明及び腎疾患の危険を次々と増大する、小及び大内径血管損傷及び末梢神経損傷を含む。
【００１４】
様々な研究者が、島細胞への特定のEGF、ヘレグリン及びヘレグリン関連ポリペプチドの効果を報告している。1995年7月27日に発行された国際公開95/19785には、膵臓島前駆細胞の成熟インシュリン分泌細胞への分化をもたらすために十分な量のガストリン/CCKレセプターリガンドとEGFレセプターリガンド（例えばTGF-アルファ）の組合せが投与される、糖尿病の治療方法が記載されている。国際公開95/19785は、TGF-アルファポリペプチドの単独投与が島細胞前駆体の分化を刺激することができないことを教える。
1997年5月15日に発行された国際公開97/17086では、特定のベーターセルリンタンパク質が膵臓細胞株の分化、AR42J（化学的に誘導された膵臓腫瘍由来のラット細胞）がイシュリン産生ベーター細胞への分化、を促進することが可能であったことを報告している。国際公開97/17086出願では、また、EGF、TGF-アルファ及びFGFのような他のヘレグリンファミリーが、AR42J細胞におけるような分化を効率的に誘導できないことが報告されている（また、Ishiyamaら, Diabetologia, 41:623-628(1998)；Mashimaら, J. Clin. Invest., 97:1647-1654(1996)を参照のこと。）AR42J細胞においてある程度の分化活性を示すが、そのような実験で試験されたベーターセルリンタンパク質は、成長因子（増殖性）活性を有しなかった（Ishiyamaら,上掲)。
【００１５】
このようなリガンドの膵臓膵島細胞腺腫細胞株に対する効果は、また、文献に記載されている。Huotariらは、EGF、TGF-アルファ及びTGF-ベーターが不活性であったが、ベーターセルリンがインビトロにおいてINS-1細胞に対して分裂促進効果を示したことを報告している（Huotari ら, Endrocrinology, 139: 1494-1499(1998)）。更に、ベーターセルリン、EGF、TGF-アルファ、又はTGF-ベーターが、INS-1細胞のインシュリン含有量に影響しなことが報告されていた。EGF及びTGF-アルファが僅かに分裂促進的であったが、ベーターセルリンは、RINm5F細胞に対して分裂促進効果を有しなかった（Huotariら, 上掲）。
Watadaらは、島細胞におけるインシュリン遺伝子の発現にとって重要であると考えられる幾つかの転写因子について研究した（Watadaら, Diabetes 45:1826-1831(1996)）。特に、Watadaらは、マウス膵臓の個体発生の間にイシュリンより前に現れることが発見され、その発現が成人動物において膵臓ベーター細胞に限定される因子である転写因子PDX-1を調べた。PDX-1遺伝子は、αTC1.6細胞に導入され、細胞が多様な成長因子で処理された場合に、遺伝子発現パターンの変化が観察された。Watadaらは、ベーターセルリンは、内在性インシュリン及びPDX-1発現αTC1.6細胞でのグルコキナーゼ遺伝子発現の誘導することが可能であったが、成長因子TFG-アルファ、TGF-β、EGF、IGF-I及びbFGFは、そのような効果を有しなかったことを報告している。
【００１６】
（発明の要約）
本発明は、膵臓機能不全治療のための方法と組成物に関し、特に哺乳類における糖尿病に関する。本発明は、一部分は、インシュリンの発現又は分泌、又は転写因子の発現、或いは膵ベーター細胞に特有のマーカーについての多様な検出法において陽性の試験結果であるErbBレセプターリガンドの同定に基づく。従って、ここにおいて記載されるErbBレセプターリガンドは、インシュリン欠損症に関連した症状の治療にとって有用な薬剤である。
一実施態様では、本発明は、膵臓機能不全に関連した哺乳類の症状、特にベーター細胞機能障害に関連した哺乳類の症状を治療する方法を提供する。好ましい実施態様は、治療される症状は糖尿病であり、よりさらに好ましいのはＩ型糖尿病である。方法は、そのような治療を必要としている哺乳類へErbBレセプターリガンドの有効量を投与することを含む。この方法において使用することが好ましいリガンドは、ベーターセルリンである。選択的には、エキソビボ（生体外）で、成熟ベーター細胞又はベーター前駆体細胞をErbBレセプターリガンドの有効量へ曝露することを含む。エキソビボにおいて処理（曝露）された細胞は、次に、適切な移植技術を使用して哺乳類へ投与しても良い。
【００１７】
その他の実施態様では、本発明は、ベーター前駆細胞又は成熟ベーター細胞の増殖を誘導又は刺激する方法を提供する。この方法は、ベーター前駆細胞又は成熟ベーター細胞をErbBレセプターリガンドの有効量へ曝露することを含む。
本発明は、更に、ベーター前駆細胞の分化増殖を誘導又は刺激する方法を提供する。この方法においては、そのような前駆細胞を含むベーター前駆細胞又は未分化組織は、ErbBレセプターリガンドの有効量へ曝露される。
本発明は、また、ErbBレセプターリガンド及び容器を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、容器は、製薬的に許容可能な容器である。そのような組成物を調製する方法が提供され、ErbBレセプターリガンドの有効量を容器と混合することを含む。
本発明は、なお更に、ErbBレセプターリガンドの有効量を含む組成物、そのような組成物及び容器へ固定されるラベルを含む容器、又はここに開示された治療的方法における前記ErbBレセプターリガンドの使用のための指示書を提供する或いは言及するする包装挿入物を含んでなる製薬的な産物又は製造品を提供する。
上記に相当する方法及び組成物のいずれか又はすべてにおいては、本発明は、一つ又は更なるErbBレセプターに対する抗体、好ましくはアゴニストの使用及び利用を提供する。
【００１８】
（本発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここにおいて使用される「 ErbBレセプター」という用語は、 ErbBレセプターファミリーに属するレセプタータンパク質キナーゼに相当し、その天然配列の形においては、典型的には、一つ又はそれ以上のErbBリガンド（下記に定義）に結合しうる細胞外ドメイン、親油性膜貫通ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化される一又はそれ以上のチロシン残基を有するカルボキシ末端シグナリングドメインを含む。「 ErbBレセプター」という用語は、天然配列ポリペプチドレセプター及びそのアミノ酸配列変異体を含む。 ErbBレセプターは、例えばヒト組織型又はその他の起源のような多様な起源から単離することが可能であり、或いは組み換え体及び／又は合成方法によって調製することが可能である。本発明において考慮されるErbBレセプターは、EGFR、ErbB2、ErbB3、及びErbB4レセプターであるが、これらに限定されない。
【００１９】
「 ErbB1」及び「EGFR」は，例えば、 Humphreyら, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:4207-4211(1990)に記載されている欠失変異体のようなCarpenterらが開示したものの自然発生変異体を含む、Carpenterら, Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)に開示されているレセプターに相当する。ErbB1は、ErbB1タンパク質をコードする遺伝子に相当する。
「ErbB2」、「HER2」は、例えばSembaら, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6497-6501(1985)及びYamamotoら, Nature 319:230-234(1986)(Gene Bank受託番号 X03363)に記載されているレセプターに相当する。erbB2という用語は、ヒトErbB2をコードする遺伝子に相当し、neuはラットp185neuをコードする遺伝子に相当する。
「ErbB3」及び「HER3」は、例えば、Krausら, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 9193-9197(1989)はもちろんのこと米国特許第5,183,884号及び第5,480,968号に開示されたレセプターに相当する。
「ErbB4」及び「HER4」は、例えば、欧州特許出願599,274、Plowmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750(1993)、及びPlowmanら, Nature 366: 473-475(1993)に開示されたレセプターに相当する。
ここにおいて言及された「ErbBヘテロ二量体」とは、少なくとも２つの異なるErbBレセプターを含んでなる非共有結合的に結合したオリゴマーである。このような複合体は、これらのレセプターの両方を発現する細胞がErbBリガンドへ暴露された場合に形成が可能であり、Sliwkowskiら, J. Biol. Chem., 269:14661-14665(1994)に記載されているように、免疫沈降法により単離され、SDS-PAGEにより分析される。このようなヘテロ二量体の例は、EGFR-ErbB2、ErbB2-ErbB3、及びErbB3-ErbB4複合体を含む。
【００２０】
「 ErbBレセプターリガンド」及び「 ErbBリガンド」という用語は、一つ又はそれ以上のErbBレセプターへ結合及び／又はそれを活性化するポリペプチドに相当する。「 ErbBリガンド」という用語は、天然配列ポリペプチドリガンド及びそれのアミノ酸配列変異体を含む。ErbBリガンドは、例えばヒト組織型又はその他の起源のような多様な起源から単離することが可能であり、或いは組み換え体及び／又は合成方法によって調製することが可能である。好ましくは、ここに開示された方法における利用においては、ErbBリガンドは、組み換え体方法によって調製できる。候補ErbBリガンドの一つ又はそれ以上のErbBレセプターへの結合は、1998年8月13日に発行された国際公開98/35036に記載されているような既知の検出方法を利用することで容易に確定できる。ErbBレセプターの活性化は、対象であるErbBレセプターを含んでなるErbBヘテロ二量体へのErbBリガンドの結合のよって媒介されるシグナル伝達系（例えば、ErbBレセプター又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するErbBレセプターの細胞内キナーゼドメインによって生じる）に相当する。一般的には、これは、ヘテロ二量体の一つ又はそれ以上のキナーゼドメインを活性化するErbBヘテロ二量体へのErbBリガンドの結合を含み、そのことによって一つ又はそれ以上のレセプターのチロシン残基のリン酸化を生じ、そして／又は更なる基質ポリペプチドのチロシン残基のリン酸化を生じる。ErbBレセプターのリン酸化は、1998年8月13日に発行の国際公開98/35036に記載のものを含んでなる多様なリン酸化検定方法の利用によって数量化が可能である。
【００２１】
本発明にて考慮されるErbBリガンドは、下記のものに相当するポリペプチド、及び例えば、下記の各学術誌及び特許に記載のポリペプチドを含むが、それらに限定されない：  上皮細胞成長因子（EGF）（Savageら, J. Biol. Chem. 247: 7612-76721(1972)）；
トランスフォーミング成長因子-アルファ（TGF-α）（Marquardtら, Science 223: 1079-1082 (1984)）；
アンフィレグリン（シュワン細胞腫由来成長因子又は角化細胞(ケラチノサイト)自己分泌成長因子として知られている；Shoyabら, Science 243:1074-1076(1989)；Kimuraら, Nature 348:257-260(1990)；Cookら, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557(1991)）；
ベーターセルリン（Shingら, Science 259:1604-1607(1993)；Sasadaら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173(1993)）；
ヘパリン結合上皮細胞成長因子（HB-EGF）（Higashiyamaら, Science 251:936-939(1991)；
エピレグリン（Toyodaら, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500(1995)；Komurasakiら, Oncogene 15:2841-2848(1997)）；
ニューレグリン-２(NRG-2)（Carrawayら, Nature 387: 512-516(1997)）；
ニューレグリン-３(NRG-3)（Zhangら, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567(1997)）；及び
ヘレグリン(HRG)、米国特許第5,641,689号又はMarchionniら, Nature, 362:312-318(1993)に開示されているヘレグリン遺伝子産物によってコードされているErbBリガンドポリペプチド。HRGの範囲内に包含されるここにおいて使用されている用語は、ヘレグリン-アルファ、ヘレグリン-ベーター１、ヘレグリン-ベーター２、及びヘレグリン-ベーター３（Holmesら, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第5,641,869号）；NDF（Pelesら, Cell 69:205-216(1992)）；ARIA（Fallsら, Cell, 72:801-815(1993)）；GGF成長因子タンパク質（Marchionniら, Nature, 362:312-318(1993)）；SMDF（Hoら, J. Biol. Chem. 270(4):14523-14532(1995)）；及びガンマーヘレグリン（Schaeferら, Oncogene 15:1385-1394(1997)）。
【００２２】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」という用語には、特に、特定のポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。
「ErbBリガンド変異体」又は「ErbBレセプターリガンド変異体」は、一つ又はそれ以上のErbBレセプター結合し、そして／又はそれを活性化する天然配列ErbBリガンド以外のリガンドポリペプチドに相当し、各々の天然配列ポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、更に好ましくは少なくとも90％、及びなお更に好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する。ErbBリガンド変異体は、天然配列リガンド及び天然配列リガンドの少なくとも5、10、15、20、25、30、又は40アミノ酸残基の連続配列を有する断片を含む；Ｎ又はＣ末端へアミノ酸残基が挿入された、又は上記に記載の配列又はその断片の中へアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列変異体；一つ又はそれ以上の残基が他の残基へ置換されたアミノ酸配列変異体。ErbBリガンド変異体は、例えば部位特異的或いはPCR突然変異誘発による設定突然変異を包含する変異体を含み、ウサギ、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、ウマ、マウス、及びヒツジなどの多様な動物に由来する。
【００２３】
ここに定義される配列に対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ErbBリガンドポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。配列アライメントの実行及び配列同一性を決定する方法は、熟練の技術者に知られており、過度の実験をおこなわずに実施が可能で、％同一性値の計算は正確に得ることが可能である。例えば、アラインメントは、WU-BLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）及びAlign2（ジェネンテク社によって作成され、1991年12月10日に米国著作権事務所へ登録）のような入手可能なコンピュータープログラムを使用しておこなえる。コンピューターソフトウェアの初期設定パラペーターを利用して随意的におこなえる。
【００２４】
「単離されたポリペプチド」とは、HRGのような、その自然環境の成分から同定、分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）ローリー法又は有効なタンパク質定量法で測定したときに95重量％より多く、最も好ましくは99重量％より多くの、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN-末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度に、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。単離されたポリペプチドは、起源となるポリペプチドが欠けている環境下では、その他の種の組み換え体細胞の中の一つの種からのポリペプチドを含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２５】
「抗体」(Abs)と「免疫グロブリン」(Igs)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベルで、骨髄腫によって増加したレベルで産生される。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」フラグメントが産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得るF(ab')2フラグメントが得られる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域は相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００２６】
またFabフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFabフラグメントとは異なる。F(ab')2抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するFab'フラグメントの対として生産された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００２７】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントも含む。
「抗体フラグメント」には、全長抗体の一部、一般には全長抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFvフラグメント；ダイアボディー(diabodies)；直鎖抗体；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００２８】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。「モノクローナル」という修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature 256:495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClacksonら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体のフラグメントを特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。
【００２９】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの超可変領域の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク(FR)領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、供与抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての超可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmanら, Nature 332, 323-329(1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００３０】
「単鎖Fv」すなわち「sFv」抗体フラグメントは、抗体のVH及びVLドメインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合に対する所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間にさらに含んでいる。sFvのレビューには、例えば、Plueckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)を参照されたい。
「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを意味するもので、フラグメントは軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を同じポリペプチド鎖(VH-VL)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許404,097；国際公開93/11161号；及びHollingerほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)にさらに詳しく記載されている。
【００３１】
本出願において使用する場合、「線状抗体」なる表現は、Zapataら, ProteinEng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を指す。簡単に言えば、これらの抗体は一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。線状抗体は、二重特異性又は単一特異性となれる。
ここにおいて使用される「ErbBレセプターアゴニスト抗体」とは、一つ又はそれ以上のErbBレセプターに結合し、及び／又はそれを活性化する一つ又はそれ以上のErbBレセプターに対する抗体に相当する。ErbBレセプターの結合及び／又は活性化は、ここにおいて記載された既知の検出方法によって確かめることができる。
「成熟ベーター細胞」という用語は、通常の生理学的状態において、インシュリンを分泌することによってグルコース濃度の変化（約2mMから20mMの間）へ反応することのできる分化した上皮細胞に相当する。成熟ベーター細胞は、更に、インシュリン、グルコキナーゼ及び／又はPDX-1の発現によって特徴づけられる。
ここで用いられる「ベーター前駆細胞」とは、成熟ベーター細胞への分割と分化が可能な上皮細胞に相当する。ベーター前駆細胞は、遺伝子マーカーPDX-1及び／又はPax4の発現及び非上皮性起源の遺伝子マーカー（例えばビメンチン）の発現の欠如によって更に特徴づけられる。
「治療する」、「治療」及び「治療法」という用語は、広い意味で使用され、ここに記載された症状の予防（予防法）、緩和、縮小、及び治療をを含む。
【００３２】
「有効量」とは、インビトロ及び／又はインビボにおいて成熟ベーター細胞或いはベーター前駆細胞の増殖を刺激又は誘導する、或いはインビトロ及び／又はインビボにおいてベーター前駆細胞の分化を刺激又は誘導するErbBリガンド又はErbBレセプターアゴニスト抗体の量に相当する。
一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
「膵臓機能不全」という用語は、一般的には、ベーター細胞の機能の減少又は損失の結果、又はベーター細胞総量の減少又は損失によって起こる哺乳類の症状に相当する。膵臓機能不全は、例えば、哺乳類のインシュリンレベルの欠乏、哺乳類のインシュリンの分泌手段の欠乏又は代謝病理現象によって更に特に特徴づけられうる。膵臓機能不全は、例えば、ベター前駆細胞の成熟ベーター細胞への不十分な分化、又は例えば、膵島炎又は自己免疫疾患において生じるベーター細胞の破壊が原因である可能性がある。
「糖尿病」及び「真性糖尿病」という用語は、広い意味で使用され、一般的には、インシュリン欠乏症に関連する哺乳類の症状や病理現象に相当し、インシュリン依存性糖尿病（また、Ｉ型糖尿病又はIDDMに相当）、栄養失調症関連糖尿病（MRD）及び青年期の成人発症型糖尿病（または、MODYに相当)のような当該分野で知られている症状を含む。
「哺乳類」という用語は、ヒト、家畜、農場飼育動物、犬、ウマ、ネコ、などを含む哺乳類と分類される全ての動物に相当する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３３】
II．本発明の方法及び組成物
出願者は、下記に更に詳しく記載しているように、多様なErbBレセプターリガンドが効果的に膵臓細胞の転写因子又はマーカーの発現を変化させることを発見した。一般的には、前駆（又は相対的に未分化）細胞は、特定の細胞マーカーの存在又は不在によって同定され、機能的には、細胞各々の適切な細胞型へ分化する能力によって同定される。ベーター前駆細胞のためのマーカーの定義は、少なくとも一部分は、それらの起源の組織学的特徴及び膵臓形成に必要な転写因子に由来する。Edlund, Diabetes 47:1817-1823(1998)；Bouwens, J. Pathology 184: 234-239(1998)及びSanderら, J. Mol. Med. 75:327-340(1997)は、膵臓組織の発生の総説及び膵臓細胞マーカーの考察、特に多様な転写因子の発現及び膵臓細胞発生の段階と機能の印としてのそうようなマーカーの役割を提供する。
現在、少なくとも哺乳類の腺管上皮細胞のサブセットは、機能性内分泌細胞（胚発生の間と成人期の胎児膵臓の両方）を生じることが可能であり、それ故に、前駆体は、例えば、膵臓腺管上皮細胞と関連しているマーカーであるサイトケラチン-19を発現することが合理的に予想できる。
転写因子、PDX-1は、典型的には、哺乳類において腸内皮細胞のサブセットとして発現され、このような細胞の時間的及び空間的出現は、初期膵臓前駆細胞であるこれらの細胞と一致している。また、PDX-1の遺伝的不活性化は、哺乳類における膵臓と膵臓組織の欠乏へとつながる。従って、ベーター前駆細胞は、合理的には、PDX-1を発現することを期待される。転写因子Pax4、Pax6、及び／又はNeuroDの欠乏は、成熟ベーター細胞及び成熟島細胞の欠乏にはつながらず、同様に、ベーター前駆細胞は、合理的には、一つ又はすべてのこれらのマーカーを発現することが予想される。
【００３４】
インシュリン、ブドウ糖輸送担体2（glut2）、転写因子ISL1、及びグルコキナーゼ（GLK）は、成熟ベーター細胞において発現される。これらは、また、ベーター前駆細胞において低レベルで発現され、その細胞は成熟ベーター細胞表現型への分化へ向かうようになる。成熟島細胞においては、各内分泌細胞型は、通常は、主要なホルモンのうちの単に一つを発現する − ベーター細胞はインシュリンを発現、アルファ細胞はグルカゴン、そしてデルタ細胞はソマトスタチンを分泌する。対照的に、島前駆細胞は、一つ以上の島ホルモンをコードしている遺伝子を発現することができる。従って、ベーター前駆細胞は、また、グルカゴン及びソマトスタチンを発現することができる。リボゾームタンパク質、RPL19をコードしている遺伝子は、細胞型の大部分で発現され、実施例に記載されているように、細胞数の変化を表すために使用できる。
成熟ベーター細胞の増殖又は成長を誘導するためにErbBレセプターリガンド又はErbBレセプターアゴニスト抗体を使用することは、哺乳類におけるインシュリン分泌を増加させるために有益である。ベーター細胞の総量の増大は、例えば糖尿病において起こるベーター細胞の損失又は機能不全を補完するために重要な手段を構成する。ベーター前駆細胞は、また、哺乳類においては幼児期から成人期を通して存在しており、成熟ベーター細胞へのそのようなベーター前駆細胞の分化を誘導又は刺激するためにErbBレセプターリガンドまたはErbBレセプターアゴニスト抗体を使用することは、インシュリン欠乏症に関連した症状を治療することにとって有益である。
【００３５】
Ａ．ErbBリガンドの調製
ErbBリガンド（ErbBレセプターと同様に、例えばアゴニスト抗体を調製するためのイムノゲンとして使用が可能）は、インビトロでのポリペプチド合成方法、又は下記に示すような宿主-ベクター系を利用した組み換え体細胞培養を含んでなる当該分野において知られている各種の技術によって調製が可能である。
随意的に哺乳類宿主細胞が用いられ、そのような宿主は、通常の方法でのErbBリガンドプレプロ配列をプロセッシングするための翻訳後系を含んでよいし、含まなくてもよい。宿主細胞がそのような系を含んだ場合、天然サブドメイン断片を培養から回収することは可能である。含まない場合は、適切なプロセッシングは、必修の酵素による宿主の形質転換、又はインビトロの方法でそれらを供給することによって達成できる。しかし、単に配列断片を生産したのであれば、細胞を選択されたポリペプチドのためのプレプロ又は構造遺伝子で形質転換することは必修ではない。例えば、開始コドンはErbBリガンドポリペプチドをコードするDNAの5'末端へ結合させることができ、このDNAは宿主細胞を形質転換するために使用され、そしてその産物は、Met N-末端型（望ましいならば、外来性Met（メチオニン）は、インビトロ又は内因性、又はN-末端デメチオニリナーゼによって取り除かれてもよい）。代わって、ErbBリガンドは、宿主細胞によって認識されるシグナル配列との融合物として発現でき、その宿主細胞は、更に下記に記載の成熟ErbBリガンドを加工し、分泌する。天然配列ErbBリガンドのアミノ酸配列変異体は、同じような方法で生産できる。
【００３６】
１．DNAの単離
ErbBリガンドをコードするＤＮＡは、ErbBリガンドをコードするｍＲＮＡを保有しており、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ErbBリガンドをコードするDNAは、cDNAライブラリーから得ることができる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブによってスクリーニングできる。cDNA発現ライブラリーのためには、適切なプローブは、リガンドを認識し、リガンドへ特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む；同じ又は異なった種のErbBリガンドcDNAの既知又は疑われる部分をコードする約20-80塩基の長さのオリゴヌクレオチド；及び／又は同じ或いは類似の遺伝子をコードする、それの相補的又は相同的なcDNA或いは断片。ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングのためのプローブは、限定されないが、オリゴニクレオチドを含む；cDNA又はその断片で、同じ又は類似の遺伝子をコードするもの；及び／又はそれの相同ゲノムDNA又は断片。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook ら, Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)の第10-12章に記載の標準的方法を使用して行うことができる。
ErbBリガンドをコードする遺伝子を単離する代替方法は、Sambrook ら,上掲の第14章に記載のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用する方法である。この方法は、ErbBリガンドにハイブリッドするオリゴヌクレオチドプローブの利用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択のための戦略は、下記に記載されている。
【００３７】
その他の対象となる遺伝子を得る代替方法は、Engelsら, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28:216-734(1989)に記載の中の一方法を利用してそれを合成する方法である。これらの方法は、トリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びH-ホスホネート法、PCR及び他のオートプライマー法、及び固相支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法は、遺伝子の全核酸配列が知られているの場合、コード鎖に対して相補的な核酸配列が入手可能な場合に使用が可能であり、又は代わって、標的であるアミノ酸配列が知られている場合、各アミノ酸残基の知られている及び好ましいコード化残基を使用して潜在的な核酸配列を推測することが可能である。
選択的な方法は、多様な組織のcDNAライブラリーをスクリーンするために慎重に選択されたオリゴヌクレオチド配列を利用することである。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さであり、且つ間違ったポジティブ反応が最小化されるよう十分に明白でなければならない。例えば、核酸配列そのものは、ErbBリガンドの保存性又は高相同性ヌクレオチド配列又は領域に基づいている。オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の位置に縮重している可能性あがる。縮重オリゴヌクレオチドの利用は、ライブラリーが、種における優先的なコドンの利用が知られていない種よりスクリーニングされる場合に、特に重要である可能性がある。オリゴヌクレオチドは、スクリーンニングされるライブラリーのDNAへのハイブリダゼーションによって検出されるように標識化されなければならない。好ましい標識方法は、当該分野において知られている、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32P-ラベル化ATPを利用してオリゴヌクレオチドを放射線標識する方法である。しかし、限られるのではないが、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む他の方法が、オリゴヌクレオチドを標識するために使用されてもよい。
【００３８】
２．アミノ酸配列変異体
ErbBレセプターリガンドのアミノ酸配列変異体及びその機能的断片は、DNAに適切なヌクレオチド変化を導入して、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成により調製される。そのような変異体は、天然配列ErbBのアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換の何れの組合せは、最終構成物において現れるように構築されることができる。アミノ酸変化は、また、グリコシル化の位置の数を変えること、膜の固着の特徴を改変すること、挿入、欠損、又は他には天然配列ポリペプチドのリーダー配列に作用すること、又はそのタンパク質分解性への感受性を修正することなどの翻訳後プロセスを改変することが可能である
ErbBリガンドのアミノ酸配列変異体の設計においては、変異部位の位置及び変異の性質は、修正されるポリペプチドの特徴に基づく。変異の部位は、例えば(１)まず保存性選択物、ついで達成される結果に応じてよりラジカルな選択物で置換し、(２)標的残基を欠失させ、又は(３)位置づけされた部位に近接して他のレセプターリガンドの残基を挿入することによって、個々に、或いは連続して修飾できる。
【００３９】
突然変異誘発に適したポリペプチドの或る残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells（Science 244: 1081-1085 (1989)）に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン）に置換され、アミノ酸と細胞内外の水性環境との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのドメインは、置換部位において又はそれに対して更なる或いは他の変異体を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたErbBリガンド変異体を所望の活性についてスクリーニングする。アミノ酸配列変異体の構造には、二つの主要な可変部がある。これらは、天然配列からの変異体であり、そして自然に生じた対立遺伝子又はDNAを変異させることによってつくられた予め決定された変異型を表す可能性があり、天然には見出されない対立遺伝子或いは変異体に帰着する。通常、選択された変異の位置及び性質は、修正される特徴に基づく。
【００４０】
アミノ酸配列欠損は、通常、約1から30残基の範囲は、更に好ましくは約1から10残基、そして典型的には約1から5は近接している。継続的な欠損の数は、例えばシステイン架橋結合、ベータープリーツシート又はアルファへリックスの作用を受けたドメインのポリペプチドの三次構造を保存するために選択さる。
アミノ酸配列挿入は、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。配列内挿入物は、約1から10残基の範囲は、更に好ましくは約1から5残基、そして最も好ましく約1から3である。配列内挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つErbBリガンド（細菌組み換え体細胞培養でのErbBの直接発現による人工産物）、及びの組み換え体宿主細胞からの成熟ErbBリガンドの分泌を容易にする、異種N-末端シグナル配列のErbBリガンドのN-末端への融合物を含む。そのようなシグナル配列は、通常、意図された宿主細胞種から得られ、それ故にその細胞と相同性がある。適切な配列は、STII、tPA、又は大腸菌のlpp、酵母のアルファ因子、そして哺乳類のヘルペスgDなどのウイルスシグナルを含む。
【００４１】
他のErbBリガンドの挿入変異体は、免疫原性ポリペプチド、例えばベーターラクタマーゼ又は大腸菌 trp遺伝子座によってコードされた酵素、或いは酵母タンパク質、ウシ血清アルブミン、及び化学走化性ポリペプチド、のErbBリガンドのN-又ははC-末端への融合物を含む。1989年4月6日に公開の国際公開 89/02922に記載の、イムノグロブリン不変領域（又は他のイムノグロブリン領域）、アルブミン、フェリチンのような長い半減期を有するタンパク質を共なうErbBリガンドECDのC-末端挿入物は、考慮されている。
その他の変異体のグループは、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、少なくともポリへプチドにおいて少なくとも一つのアミノ酸が除去され、そしてその位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発について最も興味深い部位は、ポリペプチドの活性部位として同定された部位、及び多様な種からのErbBリガンドに見出されたアミノ酸が側鎖バルク、電荷及び／又は疎水性の点で実質的に異なる、という部位を含む。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、他のレセプターリガンドと相同的なポリペプチドの領域、又は、より好ましくは分子の非相同的な領域へ導入されるであろう。
【００４２】
一実施態様では、シグナル配列の開始メチオニル残基以外の何れにメチオニル残基、又は、そのような各メチオニル残基に対して約3残基N-又はC-末端側内に位置する何れの残基は、その他の残基によって置換されるか除去される。代わって、約1-3残基がそのような部位へ挿入される。
ErbBリガンドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基は、また、分子の酸化安定性を向上させるため、及び異常な架橋結合を防ぐために、一般的にはセリンで置換されであろう。
ErbBリガンドのアミノ酸配列変異体をコードしているDNAは当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、天然源からの単離（自然発生アミノ酸配列変異体の場合）又はオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。これらの技術は、核酸（DNA又はRNA）、又はそのような核酸に対して相補的な核酸を使用するであろう。
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、置換、欠損、及び挿入変異体を調製するに随意的な方法である。この技術は当技術分野でよく知られており、Adelmanら, (1983) DNA, 2:183(1983)に記載されている。簡潔に言えば、DNAテンプレートへの所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドにハイブリッド化させることによって変化させ、ここで、そのテンプレートは非変性又は天然のDNA配列を含むプラスミド又はバクテリオファージの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込むテンプレートの二番目の相補鎖の全体を合成することに利用され、そしてDNAの選択的改変をコードする。
【００４３】
一般的には、少なくとも25ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが使用される。最適のオリゴヌクレオチドは、変異をコードしているヌクレオチドの何れかの側のテンプレートに対して完全に相補的な12から15ヌクレオチドを有する。これは、オリゴヌクレオチドが一本鎖DNAテンプレート分子へ正確にハイブリッドすることを確かなものにする。オリゴヌクレオチドは、Creaら, Proc. Natl. Acad. Sci., 75: L5765(1978)によって記載されているように当該分野で知られている技術を利用して容易に合成される。
一本鎖DNAテンプレートは、また、標準的な技術を利用して、二本鎖プラスミド（又は他の）DNAを変性することによって生成することが可能である。
天然DNA配列の改変のためには（例えば、アミノ酸配列変異体を生成するために）、適切なハイブリダイゼーションの条件下において、オリゴヌクレオチドを一本鎖テンプレートとハイブリダイゼーションさせる。通例、DNAポリメラーゼＩのクレノー断片であるDNA重合化酵素は、次に、オリゴヌクレオチドを合成のプライマーとして利用し、テンプレートの相補鎖を合成するために添加される。DNAの一本鎖がポリヌクレオチドの変異型をコードし、他の鎖（元のテンプレート）が天然、ポリペプチドの未改変配列をコードするようなヘテロ二重鎖分子が形成された。このヘテロ二重鎖分子は、次に、適切な宿主細胞、一般には大腸菌JM101のような原核生物、へ形質転換される。細胞は成長した後、アガロースプレートへプレートされ、変異DNAを含む細菌コロニーを同定するために32P-リン酸で放射線標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングされた。次に、変異領域が除去され、タンパク質生産のために適切なベクター、通常は適切なホストの形質転換のために典型的に用いられる発現ベクター型、へ導入された。
【００４４】
プラスミドの両鎖が変異を含む場合、ホモ二重鎖分子が作成されるように、即上記に記載の方法は修正されるであろう。修正は、次の通りである：上記に記載のように、一本鎖ヌクレオチドは、一本鎖テンプレートへアニールされる。デオキシリボアデノシン（dATP）、デオキシリボグアノシン（dGTP）、及びデオキシリボチミジン（dTTP）の三つのデオキシリボヌクレオチドの混合物は、修飾dCTP-(aS)と呼ばれるチオ-デオキシリボシトシン（アマシャムコーポレーションより入手可能）と混合された。この混合物は、テンプレート-オリゴヌクレオチド複合物へ添加された。この混合物へのDNAポリメラーゼの添加によって、変異塩基を除くテンプレートに同一なDNA鎖が生成された。更に、この新しいDNA鎖は、DNA鎖を制限エンドヌクレアーゼ消化から保護してくれるdCTP-(aS)をdCTPに代わって含む。二本鎖ヘテロ二重鎖のテンプレートが適切な制限酵素によって切れ目を入れられた後、テンプレート鎖は、変異誘発を受ける部位を含む領域の先にあるにおいてExoIIIヌクレアーゼ又はその他の適切なヌクレアーゼによって消化される。反応は、そして、単に部分的に一本鎖である分子を遊離して停止する。次に、完全な二本鎖DNAホモ二重鎖が、すべての４つデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ATP、及びDNAリガーゼの存在下においてDNAポリメラーゼを利用して形成される。このホモ二重鎖分子は、上記に掲載した大腸菌 JM101のような適切な宿主へ形質転換される。
一つ以上のアミノ酸が置換される変異体をコードするDNA幾つかの方法の内の一つで生成されるであろう。アミノ酸が、ポリペプチド中において隣接して位置しているのであれば、それらは、所望するアミノ酸置換のすべてをコードするひとつのオリゴヌクレオチドを使用して同時に変異させることができるであろう。しかし、アミノ酸が互いにある距離を置いて位置しているのであるならば（約10アミノ酸以上によって分離）、所望する変化のすべてをコードする一本のオリゴヌクレオチドを生成することはさらに困難である。代わって、二つの代替方法のうちの一つが用いられるであろう。
【００４５】
最初の方法では、分離されたオリゴヌクレオチドは、置換される各アミノ酸に対して生成される。次に、オリゴヌクレオチドは、同時に一本鎖テンプレートへアニールされ、テンプレートから合成されるDNAの二番目の鎖は、所望するアミノ酸置換のすべてをコードする。
代替方法は、所望する変異体を生成するために、突然変異誘発の二つ又はそれ以上の一巡を含む：野生型DNAはテンプレートとして利用され、最初の所望するアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、このテンプレートへアニールされ、次にヘテロ二重鎖DNA分子が生成される。二巡目の突然変異誘発は、一巡目の突然変異誘発において生成された変異DNAをテンプレートとして利用する。従って、このテンプレートは、すでに一つ又はそれ以上の変異を含む。次に、さらなる所望するアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、このテンプレートへアニールされ、生じたDNA鎖は、最初及び二巡目の突然変異誘発由来の突然変異をコードする。このDNA生成物は、三巡目及びそれ以上の突然変異誘発においてテンプレートとして利用が可能である。
ＰＣＲ突然変異誘発もまたアミノ酸配列変異体を製造するために好適である。下記の議論はDNAに関するが、この技術には，また、RNAへの応用が見出される。PCR技術は、一般的に、次の方法に関する（Erlichら,上掲, R.Higuchiら, による章, p.61-70）を参照されたい)。少量のテンプレートDNAがPCRの出発材料として使用される場合、テンプレートDNAにおける対応する領域とは配列が僅かに異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートと異なる位置でのみテンプレート配列と異なる比較的多量の特異的ＮＡ断片を生成することができる。プラスミドDNAへの変異の導入において、プライマーの一つは変異の位置と重なり合うよう、そして変異を含むようにに設計される；他のプライマーの配列は、プラスミドの反対側の配列のひと続きに対して同一であるべきであるが、この配列はプラスミドDNAのどこにででも位置することができる。しかし、最後には、プライマーによって結合されているDNAのすべての増幅領域が容易に配列決定されるように、二番目のプライマーの配列は、一番目のプライマーから200ヌクレオチド以内に位置することは好ましい。先程記載したようなプライマーの一対を使用したPCR増幅は、プライマーによって特定される変異の位置、及び恐らくは他の位置が異なるDNA断片の集団を生じる。
【００４６】
テンプレートの生成物質に対する比率がかなり低い場合、生成DNA断片の大部分は、所望する変異を取り込む。この生成物質は、標準的なDNA技術の使用においてPCRテンプレートとなるプラスミドの対応する領域に代わって使用できる。
分離した位置の変異は、二番目の変異プライマーの利用又は異なった変異プライマーによる二回目のPCRを行い、生じた二つのPCR断片を同時に、三箇所（又はそれ以上）ライゲーションでベクターへ結合させることのどちらかで導入が可能である。
変異体を調製する他の方法であるカセット突然変異誘発は、Wellsら, (Gene 34:315-323 (1985))により記載された方法に基づく。出発材料は変異される出発ポリペプチドDNAを含んでなるプラスミド(又は他のベクター)である。変異される出発DNAのコドンが同定される。同定される変異部位の各側に独特な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。そのような制限部位が存在しない場合は、出発ポリペプチドＤＮＡの適切な位置にそれを導入するために上述したオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を使用してこれを生成しうる。プラスミドＤＮＡはこれらの部位で切断されてそれを線形化する。制限部位間のＤＮＡ配列をコードするが所望の変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドは常套的な手順を使用して合成され、そこでは、オリゴヌクレオチドの二本のストランドが別個に合成され、ついで標準的な方法を使用して共にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは線形化されたプラスミドの末端と適合性である5'及び3'末端を有するように設計され、プラスミドに直接に結合できる。しかして、このプラスミドは変異ＤＮＡ配列を含んでいる。
任意このような方法及び技術が、本発明において有用であるErbBリガンド変異体を調製又は同定するために用いられる。特に、参考文献は、本発明において有用であろう多様なヘレグリン変異体を開示する国際公開98/35036に通じる。
【００４７】
３．クローニング媒体へのDNAの挿入
天然又は変異体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は、１）DNA増幅の為又はDNAの発現の為に利用されるのか、２）ベクターへ挿入されるDNAの大きさ、及び３）ベクターによって形質転換される宿主細胞に依存する。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。
【００４８】
(i)  シグナル配列成分
一般に、シグナル配列は、ベクターの成分又はベクターに挿入されるＤＮＡの一部である。天然DNAは、ポリペプチドの翻訳後プロセスの間に切断されるアミノ末端（ポリペプチドをコードするDNAの5'末端）のシグナル配列をコードすると考えられている。例えば、ErbBリガンドは細胞から分泌されるが、ポリペプチドのカルボキシ末端領域の膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメインを有する為に、膜へ付き刺さり止まっている。従って、ErbBリガンドの分泌、可溶性種では、膜貫通ドメインを含む分子のカルボキシ末端ドメインは、通常は除去されている。切断型変異体をコードするDNAが宿主によって認識されるシグナル配列をコードするならば、この切断型ErbBリガンド変異体は、細胞より分泌されるであろう。選択されたポリペプチドは、直接のみならず、異種ポリペプチド、好ましくはシグナル配列又は成熟ポリペプチドのN-及び／又はC-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドとの融合物としても発現されるであろう。一般には、シグナル配列はベクターの成分、又はベクターへ挿入されるDNAの一部分である。本発明の範囲内に含まれるのは、天然シグナル配列が除去及び異種シグナル配列で置き換えられたErbBリガンドである。選択された異種シグナル配列は、認識そして加工されるもの、すなわち、シグナルペプチダーゼ、宿主細胞によって切断されるものである。天然ErbBリガンド配列を認識せず、加工しない原核生物宿主細胞にとっては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で代替される。酵母の分泌に関しては、ErbBリガンドシグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー又は酸ホスフォターゼリーダーによって代替されてもよい。哺乳動物細胞の発現においては、他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質が適切であろうが、天然シグナル配列で十分である。
【００４９】
（ii)複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
多くの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌においてベクターがクローン化され、そのベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して複製することはできないとしても、発現する。
DNAは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムDNAに見られる配列と相補的なDNA配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及び選択されたポリペプチドのDNAの挿入をもたらす。DNAは、PCRで増幅できるし、そして何れの複製成分無しで宿主細胞へ直接に形質移入される。
【００５０】
(iii)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で成長させた形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換されていない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、(c)例えばバシラスのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン［Southernら,J. Molec. Appl. Genet., 1：327(1982)］、ミコフェノール酸［Mulliganら, Science, 209：1422(1980)］又はハイグロマイシン［Sugdenら, Mol. Cell. Biol., 5：410-413(1985)］が使用される。上述した３つの例は、真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬物G418又はネオマイシン(ジェネテシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ耐性を付与する。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子と選択されたポリペプチドをコードするDNAの双方を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。
【００５１】
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub ほかにより, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高いメトトレキセートに接触させる。これによりDHFR遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、ErbBリガンドをコードするDNAのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしMtxに高度に耐性である変異体DHFR遺伝子が使用されたような場合には内在性DHFRの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ATCC番号CCL61CHO-K1を使用することができる(欧州特許117,060)。あるいは、選択ポリペプチド、野生型DHFRタンパク質をコードするDNA配列、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる（米国特許第4,965,199号を参照のこと）。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingsmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。trp1遺伝子は、例えば、ATCC第44076号あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85: 12 (1977)］。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Leu2欠陥酵母株(ATCC 20,622あるいは 38,626)は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【００５２】
(iv)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に結びついているプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合しているErbBリガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約100ないし1000塩基対)の開始コドンの上流側(5')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの2つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例えば、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でDNAからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源DNAからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、ErbBリガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然ErbBリガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもErbBリガンドDNAの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。しかし、より多い転写及び天然ErbBリガンドプロモーターに比べて発現ErbBリガンドのより高い生成が可能であるため、異種プロモーターが好まれる。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng ら, Nature, 275:615 (1978), Goeddel ら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); 及び欧州特許 36,776］、tPA（U.S. 5,641,655）及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター［deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することで選択されたポリペプチドをコードするDNA［Siebenlist ほか, Cell, 20:269 (1980)］にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用するプロモータもまたコード化ＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００５３】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ほか, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは、Hitzemanら, 欧州特許第73, 657A号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
真核生物のプロモーター配列が知られている。ほとんど全ての真核生物の遺伝子は、転写開始位置から25ないし30塩基上流の位置にATリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流の位置にはXがヌクレオチドであるCXCAAT領域がある。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端にポリＡ尾が付加されていることを示すシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに挿入されている。
【００５４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの遺伝子の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そしてErbBリガンド配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点をさらに含むSV40制限断片として簡便に得られる［Fiersほか, Nature, 273:113 (1978);Mulligan及びBerg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakisら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 (1981)］。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIII制限断片として簡便に得られる［Greenawayほか, Gene, 18:355-360 (1982)］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の修飾は米国特許第4,601,978号に開示されている。また、サル細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現について、Grayら, Nature, 295：503-508(1982)を；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyesら, Nature, 297：598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現について、Canaani及びBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79：5166-5170(1982)を；プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長い末端反復を用いたCV-1サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、及びマウスNIH-3T3細胞における細菌CAT配列の発現について、Gormanほか, Proc. Natl. Acas. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)を参照のこと。
【００５５】
(v)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の選択されたポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向及び位置が独立しており、転写ユニットの5'［Laiminsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)］及び 3'［Luskyほか, Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)］、イントロン内部［Banerjiほか, Cell, 33:729 (1983)］並びにコード配列自身の内部［Osbornら, Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)］に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100-270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ErbBリガンドDNAの5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
【００５６】
(vi)転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ポリペプチドをコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。3'非翻訳領域は、また、転写終結部位を含む。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はDNA断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌（E.coli）K12菌株294(ATCC 31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又はMessingら, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法又はMaxamら, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって配列決定する。
特に、本発明の実施において有用なのは、哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することである。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookほか,上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたDNAによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、類似体及び同定する目的のために特に有用である。このような一過性発現系は、米国特許第5,024,939号に記載されている。
組換え脊椎動物細胞培養での選択されたポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第117,060号; 及びLevinsonら，欧州特許第117,058号に記載されている。
【００５７】
４．  宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌、バチルス・スブチルス（B.subtilis）のようなバチルス、シュードモナス・アルギノーサ（P.aeruginosa）のようなシュードモナス属（Pseudomonas)、サルモネラ・トリフューム（Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセスキャンス（Serratia marcescans）を含む。大腸菌X1776（ATCC31,537）及び大腸菌W3110（ATCC27,325）が適しているが、好ましい大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌294（ATCC31,446）である。これらの例は、制限的ではなく具体的である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解性酵素を分泌べきである。あるいは、クローニングのインビトロ方法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応、が適している。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は適切な発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、例えば分裂酵母ポンベ(Schizosaccharomyces  pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 (1981); 1985年5月2日発行の欧州特許第139,383号）、クルイベロミセス(Kluiveromyces)宿主（米国特許第4,943,529号）、例えばＫ．ラクチス(K.lactis)（ Louvencourt等, J. Bacteriol., 737 (1983)）；Ｋ．フラギリス(K. fragilis)、Ｋ．ブルガリクス(K. bulgaricus)、Ｋ．サーモトレランス(K. thermotolerans)、及びＫ．マルキシアヌス(K. marxianus)、ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許 第402,226号）；ピチアパストリス(Pichia pastoris)（欧州特許 第183,070号; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)）；カンジダ（Candida）、トリコデルマレーシア(Trichoderma reesia）（欧州特許 第244,234号）；アカパンカビ（Neurospora crassa）（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)）、及び糸状菌、例えばニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、トリポクラディウム(Tolypocladium)（1991年1月10日公開の国際公開91/00357)、及びアスペルギルス(Aspergillus)宿主、例えばＡ．ニデュランス(A. nidulans)（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn等, Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)）；及びクロカビ（A.Niger）（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)）などの多数の他の属、種、及び株が普通に利用可能であり、ここでも有用である。
【００５８】
グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている［例えば、Luckowら, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Millerら, Genetic Engineering, Set low, JKら, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaedaら, Nature, 315:592-594 (1985)を参照のこと］。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカNPVのL-1変異体とボンビクス・モリ NPVのBm-5株が公に利用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのある菌株と共にインキュベートすることによってトランスフェクトされる。A. トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、ErbBリガンドをコードしているDNAが、植物細胞宿主がトランスフェクトされるようにその植物細胞宿主に移され、そして適切な条件下でErbBリガンドをコードしているDNAを発現させる。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる［Depickerら,J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)］。また、T-DNA780遺伝子の上流領域から分離されるDNAセグメントは、組換えDNAを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる［1989年6月21日公開の欧州特許 第321,196号］。
【００５９】
培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は、当該分野おいてよく知られている［例えば、Tissue Culture, Academic Press, 編者Kruse及びPatterson(1973)を参照のこと］。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株［293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)］;ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)］;サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51);TRI細胞［Motherほか, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)］; MRC5細胞;FS4細胞である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎臓株293及びチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
宿主細胞を形質移入し、好ましくは上述の発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【００６０】
トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体成分によってであろうと、DNAが複製可能であるように、生物体中にDNAを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Sambrookら,上掲,の第16.30-16.37項に記載のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は、Axelによって1983年8月16日に公開の米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又はプロトプラスト融合もまた用いることもできる。
【００６１】
５．宿主細胞の培養
ErbBリガンドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookほかにより記載されているような適切な培地で培養される。
ErbBリガンドの生産に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地、例えばハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が宿主細胞の培養に適切である。また、HamとWallace, Meth. Enz., 58:44(1979), Barnes及びSato, Anal. Biochem., 102:255 (1980); 米国特許第4,767,704号;4,657,866号;4,927,762号; 又は4,560,655号;国際公開90/03430; 国際公開87/00195; 米国再発行特許第30,985号; 米国特許第5,122,469号に記載された任意の培地を宿主細胞の培養培地として用いることができる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばHEPES）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
この明細書において言及される宿主細胞は、インビトロ培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
ErbBリガンドが相同組み換え、又は組み換え体生産方法で、ポリペプチドをコードするDNAをすでに含む細胞へ導入されるエレメントを利用するこの分野で現在使用されている方法によって生産されることは、なお一層想像される。例えば、強力なプロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、又は外来性転写調節性エレメントは、所望するポリペプチドをコードするDNAの転写へ影響を及ぼすのに十分な近接性及び方向性において意図される宿主細胞のゲノムへ挿入される。
【００６２】
６．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に32Pである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識、類似物である。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ErbBリガンドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して調製され得る。
【００６３】
７．ポリペプチドの精製
ErbBリガンドは、細胞膜分画から回収することができる。あるいは、タンパク質分解によって切断又は切断され発現された可溶性断片或いはサブドメインは、培養培地から可溶性ポリペプチドとして回収される。ポリペプチドは、分泌シグナル無しで直接に発現された場合に、宿主細胞溶菌液より回収できる。
ErbBリガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、ErbBリガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、ErbBリガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからErbBリガンドを精製することが望ましい。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。そして、膜及び可溶性タンパク質分画が分離される。ついで、ErbBリガンドは、ErbBリガンドが膜結合かどうかによって、可溶性分画（プロテアーゼの存在を必要とする）及び培地溶菌液の膜分画から精製することができる。次の手順が適切な精製手順の例である：イミュノ・アフィニティ又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ、ヘパリンSEPHAROSE又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過である。
残基が欠失され、挿入され、又は置換されたペプチド変異体は、その変異によって惹起された実質的な性質変化を考慮に入れて、天然配列ポリペプチドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原、免疫グロブリン配列、又はレセプター配列とErbBリガンドとの融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。ウサギポリクローナル抗-ErbBリガンドカラムのようなイミュノ・アフィニティカラムは、少なくとも一つの残ったイムノエピトープへそれを結合させることでErbBリガンドを吸収するために用いることができる。例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然ポリペプチドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるポリペプチド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば理解できるであろう。
【００６４】
８．ポリペプチドの共有結合的修飾
ErbBリガンドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。天然配列とのアミノ酸配列変異体の双方は共有結合的に修飾することができる。本発明の範囲内に含まれる共有結合的修飾の一つは、ErbBリガンド断片である。ErbBリガンド断片、例えば40アミノ酸残基までを有するものは、化学合成によって、又は全長ErbBリガンドポリペプチド又はErbBリガンド変異体ポリペプチドの酵素的或いは化学的切断によって共有結合的に調製できる。共有結合的修飾の他の型は、ErbBリガンドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又はN-或いはC-末端残基と反応できる有機誘導体形成試薬と反応させることによって分子内に導入することができる。
システイニル残基は最も一般的にはα−ハロアセタート（及び対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基も又ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(５−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、 N−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基はpH5.5-7.0でジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的であるからである。ｐ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、好ましくはpH6.0で0.1Mのカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【００６５】
リジニル及びアミノ末端残基はスクシン又は他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬は、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミダート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオン、及びグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応である。
アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、とりわけ、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。更に、これらの試薬はリジンの基並びにアルギニンのε-アミノ基と反応するかも知れない。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味を持って、なされる。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使用して、それぞれがＯ-アセチルチロシル種と3-ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基はラジオイムノアッセイ用の標識化タンパクを調製するために125I又は131Iを用いてヨウ素化され、クロラミンＴ法が適切である。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）がカルボジイミド（R-N=C=N-R'）（ここで、RとR'は異なったアルキル基）、例えば、1-シクロヘキシル-3-（2-モルホリニル−4-エチル）カルボジイミド又は1-エチル-3-（4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。さらには、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換される。
【００６６】
二官能性試薬による誘導体形成は、水不溶性支持体マトリックス又は表面へのErbBリガンドの架橋に有用であり、又その逆も同様である。良く用いられる架橋剤は、例として、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とそのエステル、3,3'-マレイミドジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、及びビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能性マレイミドを含む。メチル-3-［（ｐ-アジゾフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第3,969,287号；3,691,016号；4,195,128号；4,247,642号；4,229,537号及び4,330,440号に記載されている反応性基質がタンパク固定に用いられる。
グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基にそれぞれ脱アミド化される。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は本発明の範囲内に入る。
その他の修飾は、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman; Co., San Francisco, PP.79-86 (1983)）、N-末端アミンのアセチル化及び任意のC-末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００６７】
ErbBリガンドは随意的に、ErbBリガンドに対して異種のポリペプチドと融合する。異種ポリペプチドは随意的に、M13遺伝子III又は遺伝子VIIIタンパク質のようなファージコートタンパク質に見出されるようなアンカー配列である。これらの異種ポリペプチドは、側鎖又は末端残基を通してErbBリガンドポリペプチドへ共有結合的に共役させることができる。
ErbBリガンドはまた、その天然グリコシル化パターンを改変することによって共有結合的に修飾されるであろう。これら実施態様中の一つ又はそれ以上の炭水化物置換基は、与えられた部位の単糖類成分を付加、除去、又は変化させることによって、又はグリコシル化部位が付加又は除去されるようにErbBリガンドの残基を修飾することによって修飾させる。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N-結合又はＯ-結合の何れかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である場合、アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニンというトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチドの何れかが存在すると、可能性の有るグリコシル化部位が作り出される。5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンも又用いられるが、Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシルアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、N-アセチルガラクトーサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖の一つが結合することを意味する。
【００６８】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一以上の上述したトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位のもの）を含むように変化させることによってErbBリガンドへ付加される。この改変は、ErbBリガンドへ一以上のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる（Ｏ-結合グリコシル化部位の場合）。簡単にするには、ErbBリガンドはDNAレベルでの変化によって、特にErbBリガンドをコードしているDNAを、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが産生されるように予め選んだ塩基で突然変異することによって好ましく改変される。
ErbBリガンドへの配糖体の化学的又は酵素的共役は、炭水化物官能基の数を増加させる。これらの手順は、Ｎ-結合又はＯ-結合グルコシル化能を有する宿主細胞中でポリペプチドを生産させる必要がないという点で有利である。用いられる結合様式に応じて、糖（一以上）は、（ａ）アルギニンとヒスチジンに、（ｂ）遊離のカルボキシル基に、（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、（ｄ）セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミノ基に結合される。これらの方法は1987年9月11日公開 の国際公開87/05330及びAplin及びWriston（ CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981)）に示されている。
ErbBリガンド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になされる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価な化合物への該ポリペプチドの曝露を必要とする。この処理により、該ポリペプチドを無傷のまま残しながら、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く殆ど又は全ての糖の開裂がなされる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinら, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdgeほか, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により示されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakuraら, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
【００６９】
潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskinほか, J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)によって記載されているように、化合物ツニカマイシンを使用して防ぐことができる。ツニカマイシンはタンパク質-N-グルコシド結合の形成を阻害する。
ErbBリガンドの共有結合修飾は、米国特許番第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載されているように、ErbBリガンドを種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることによっても修飾できる。膜非結合ErbBリガンドのインビボでの循環半減期を増加させる一つの好ましい方法は、膜非結合ErbBリガンドを、ポリエチレングリコール（PEG）のような伸張した半減期を与えるポリマーと共役させることである。（Maxfieldら, Polymer 16,505-509(1975)；Bailey, F.E.,ら, Nonionic Surfactants(Schick, M. J., 編)pp.794821, 1967）；（Abuchowski, Aら, J.Biol. Chem. 252, 3582-3586, 1977；Abuchowski, Aら, Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186, 1984）；（Katre, N.V.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 1487-1491, 1987；Goodson, R.ら, Bio Technology, 8, 343-346, 1990）。PEGへの共役はまた、免疫原性及び毒性を減少させたと報告されている（Abuchowski, Aら, J. Biol. Chem., 252, 3578-3581, 1977）。
ErbBリガンドは、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルジョン中の界面重合（例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-（メチルメタアシル）マイクロカプセル）によって調製されるマイクロカプセル中に捕捉されるであろう。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16 版, Oslo, A., 編集者, (1980)に開示されている。
【００７０】
Ｂ．抗-ErbBレセプター抗体の調製
本発明で使用するための考慮される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びその断片である。好ましくは、本発明の方法において用いられる抗体は、ベーター前駆細胞又は成熟ベーター細胞の増殖を誘導又は刺激する、又はベーター前駆細胞の分化を誘導又は刺激するErbBレセプターアゴニスト抗体を包含する。
【００７１】
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。免疫化されている種において免疫原性であるタンパク質、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸を使用して、関連抗原を抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート100g又は5g（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント3容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の1/5ないし1/10のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。7ないし14日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００７２】
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターもしくはマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT-欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国より入手し得るMOP-21およびM.C.-11マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナサス、バージニア、アメリカ合衆国より入手し得るSP-2又はX63-AgB-653細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００７３】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって求めることができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地を包含する。また、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００７４】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているDNAは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。
抗体を生産するハイブリドーマ細胞株は、一つ又はそれ以上のErbBレセプターと結合する抗体の培養上清をスクリーニングすることで同定できる。これは、可溶性レセプター製剤を使用する常套的な免疫検定法によって、又は細胞結合レセプター及び標識された候補抗体を使用したFACSによって完遂される。ErbBレセプターアゴニスト抗体は、好ましくは、当該分野において知られたチロシンリン酸化検定キットを使用して測定が可能なErbBレセプターのリン酸化を活性化できる抗体である。一つ又はそれ以上のErbBレセプターに対するあるアゴニスト抗体が、例えば，Yarden, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2569-2573(1990)及びDefizeら, EMBO J. 5:1187-1192(1986)によって以前、記載された。
【００７５】
ハイブリッド細胞株は、細胞培養培地のインビトロ培養において維持することができる。本発明の細胞株は、ヒポキサンチン-アミノプテリンチミジン（HAT）培地の連続細胞株を含む成分において分泌及び／又は維持することができる。事実、一度ハイブリッド細胞株が樹立されると、それは種々の栄養的に十分な培地において維持が可能である。さらには、ハイブリッド細胞株は、液体窒素のもとで凍結及び貯蔵することを含めて、いくつもの常套的な方法で貯蔵及び維持が可能である。凍結細胞株は、モノクローナル抗体の回復した合成及び分泌によって無制限に蘇生させて培養することができる。分泌抗体は、常套的方法、例えば沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は類似の方法によって組織培養上清から回収される。ここにおいて記載された抗体は、また、IgG又はIgMの精製の常套的方法、すなわちこれまでにこれらのイムノグロブリンの精製に利用されてきたであろう、例えばエタノール又はポリエチレングリコール沈殿法によってハイブリドーマ細胞培養から回収される。
ヒト抗体が使用されるであろう。このような抗体は、ヒトハイブリドーマ（Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985)）を使用して得ることができる。マウス可変領域及びヒト不変領域の適切な生物活性（例えば，ヒト補体を活性化及びADCCを媒体する能力）を含むキメラ抗体、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号（Morrisonら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)；Neubergerら, Nature 312:604(1984)；Takedaら, Nature 314:452(1985))は、常套的CDR-移植方法（Riechmannら, Nature, 332:333-327 (1988)；欧州特許第0328404A1号；欧州特許第02394000A2号)によって生産されたヒト化抗体のように、本発明の範囲内である。
【００７６】
モノコローナル抗体の生成を迂回する抗体分子（Fab又は可変領域断片）の抗原結合領域の組み換え体DNA種を作製する技術は、また、本発明の実行の中に包含される。一つの技術は、免疫性を付与された対象から得られた免疫細胞より抗体特異的メッセンジャーRNAを抽出し、これらを相補DNA（cDNA）へ転写し、そしてcDNAを細菌発現系へクローン化して、所望する結合特性について選択する。Scripps/Stratagene法は、細胞膜周辺腔（細菌細胞膜と細胞壁の間）へ移動する発現Fabタンパク質を生じるリーダー配列を含むバクテリオファージラムダベクター系を使用する。
一つの方法は、所望する特性によってレセプターと結合する機能性Fab断片を同定するために、迅速に多量の機能性Fab断片を生成しスクリーニングすることができる。あるいは、抗体は、Hoogenboom, Tibtech 1997年2月(第15巻）；Neriら, Cell Biophysics 27: 47-61(1995)；Winterら, Annu. Rev. Immunol., 12: 433-55(1994)；及びSoderlindら, Immunol. Rev. 130: 109-124(1992)及びLowmanら, Biochem., 30: 10832-10838(1991)に記載の一価ファージ・ディスプレイ技術と同様にその中に記載の参考文献によって調製される。
【００７７】
Ｃ．治療的組成物及び方法
ErbBレセプターリガンド又はErbBレセプターアゴニストは、成熟ベーター細胞又は前駆ベーター細胞増殖を誘導又は刺激するために用いられるであおう。ErbBレセプターリガンド又はErbBレセプターアゴニスト抗体はまた、ベーター前駆細胞分化を誘導又は刺激するために用いられるであろう。ErbBレセプターの使用は、特に、下記の方法に関する。しかしながら、本発明のErbBレセプターアゴニスト抗体は、同じように用いられるであろうことが注視されている。
本発明の方法は、哺乳類の膵臓機能不全の治療の方法を含む。好ましい方法は、糖尿病治療の方法、更に好ましくはＩ型糖尿病である。ErbBレセプターリガンドが、そのような治療が必要な哺乳類の治療において、単一治療剤として投与されるであろうことが注視されている。あるいは、ErbBリガンドは、一つ又はそれ以上の他のErbBリガンドとの組合せで投与されてもよい。例えば、哺乳類は、ヘレグリン及びベーターセルリンの組合せが投与されてもよい。ErbBレセプターリガンドが、インシュリン、スルホニル尿素、シクロスポリン又は他の免疫抑制剤、チオゾールデネジオン(thiozolidenediones）及びメトホルミンのような膵臓機能不全、又は膵臓機能不全と関連している症状を治療するのに有用な薬剤又は治療法との組合せで投与されうることが、更に考慮されている。
【００７８】
薬学的に許容される製剤ような組成物は、所望の程度の純度を有するErbBレセプターリガンドを任意の容器、賦形剤又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 上掲）と混合することにより貯蔵のために調製される。製薬上許容される容器、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストロースを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN、PLUTONICS、又はポリエチレングリコール（PEG）等の界面活性剤を含む。
インビボ投与に用いるErbBレセプターリガンドは無菌でなければならない。このことは、凍結乾燥及び再構成に先だって又はそれに続いて、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成できる。製剤は通常、凍結乾燥した形態又は溶液で貯蔵される。
ErbBレセプターリガンドを含む治療的組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。
【００７９】
投与経路は、周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、又は病巣内経路、又は下記のような徐放システムでの注射又は注入に従う。選択されたErbBレセプターリガンドは、注入によって又は大量瞬時投与によって連続的に投与される。ErbBレセプターリガンドは、例えば膵臓又は膵臓組織へカニューレ装置を挿入することによって、哺乳類へカニューレ経由で投与される。カニューレ装置はまた、ErbBレセプターリガンドを、腹腔動脈を経由して哺乳類へ投与するために用いられる。治療薬剤の送達の為のカニューレ装置の使用は、当該分野で知られており、熟練技術者に知られた技術を使用して完遂される。
【００８０】
徐放性製剤の適例としては、ErbBレセプターリガンドを含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスがあり、マトリックスは、例えばフィルム状又はマイクロカプセルの形付けられた物である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、Langerら, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載されているヒドロゲル（例えばポリ（2-ヒドロキシエチル―メタクリレート）等）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ乳酸（米国特許第3,773,919号、欧州特許第 58,481号）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸の共重合体（Sidmanほか, Biopolymers, 22:547-556 (1983)）、非分解性エチレン―酢酸ビニル（上記Langerら）、LUPRON DEPOT（乳酸―グリコル酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微粒子）等の分解性乳酸―グリコル酸共重合体及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第 133,988号）等がある。エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等の重合体は100日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、37℃で水分に曝されることで、変性又は凝集し、生理活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。かかる機構によって安定性を得るための合理的な処置が考えられる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間S―S結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を変更し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリックス化合物を開発することで安定性を保証することができる。
【００８１】
徐放性組成物は、リポソーム的に包括されたErbBレセプターリガンドを含む。選択されたリガンドを含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、DE 3,218,121、Epsteinほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwangほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、欧州特許第 52,322号、欧州特許第36,676号、欧州特許第88,046号、欧州特許第143,949号、欧州特許第142,641号、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号、及び欧州特許第102,324号等による方法によって生成する。通常、リポソームは、脂質含有量が約30モル％以上コレステロールであり、選択される割合が最適な治療法に対して調整された微小（約200-800オングストローム）な単層状のものである。増大した循環時間のリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
治療的に用いられるErbBリガンドの有効量は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態に依存する。治療者は、最大の治療効果を得ることが要求されるときに、用量を滴定し投与経路を修正する必要があるであろう。典型的な用量は、上記にて言及した要因に依存し、約1μg/kgから約1 mg/kg及び100mg/kg又はそれ以上までであろう。典型的には、臨床医は、所望の効果が達成される用量に達するまで選択されたポリペプチドを投与するであろう。投与の決定及びスケジュールを作ることは、当該分野の日常的技術の範囲内である。有効投与量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる投与-反応曲線より推定が可能であろう。この治療の進行状況は、常套的検定方法、例えばc-ペプチドレベルの試験、グルコース耐性試験、又はグルコースレベルの血液分析によって容易にモニターできる。
【００８２】
本発明はまた、ErbBリガンドを用いた哺乳類細胞のエキソビボ治療法の方法を提供する。このようなエキソビボ治療法は、例えば培養中のベーター前駆細胞の処置、及び続いて処置細胞を、そのような処置を必要としている哺乳類へ適切な移植技術を利用して移植することにおいて有用である。随意的には、移植は自家移植であり、哺乳類自身の細胞を除去し、培養においてErbBリガンドで処置し、そして次に同じ哺乳類へ移植し戻す。
この方法においては、成熟ベーター細胞又はベーター前駆細胞を含む細胞又は組織は、哺乳類から得られ（例えば、外科的又は生体組織検査法によって）、好ましくは無菌的に得られる。インビトロ培養に必要な細胞の数又は組織の量は、経験的に決定できる。細胞又は組織は、次に適切な細胞又は組織培養シャーレ又はプレートに置かれ、一つ又はそれ以上のErbBリガンドに曝露される。典型的には、ErbBリガンドは、約0.1から約100nMの濃度で細胞へ添加され、好ましくは約1から50nMである。所望するならば、ベーター細胞集団を十分に増大するために、細胞を数世代に渡って培養してもよい。Ham'sF10, MEM, RPMI 1640, 及びDMEMを含む当該分野に置いて知られている種々の細胞培養培地は、インビトロ培養に適している。このような培地は、シグマ（セントルイス、ミズーリー州）及びGIBCO（グランド アイランド、ニューヨーク州）より入手できる。典型的には、培養培地は、炭水化物（グルコースのような）、必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、微量元素、及び場合によっては哺乳類起源の血清を含む。細胞培養条件は、ベーター細胞の増殖及び／又は分化へ作用するのに適していなければならない。
【００８３】
所望するならば、処置細胞又は組織は、上記に記載のように容器において製剤化することができる。処置細胞又は組織は、次に、当該分野で知られている技術を用いて、受容哺乳類へ注入或いは移植することができる。受容哺乳類は、供与哺乳類と同じ個体であってもよいし、又はその他の異種哺乳類であってもよい。哺乳類へ移植される処置細胞又は組織の「有効量」は、例えば治療目的物、投与経路、及び患者の状況に依存する。それは、投与量を決定する、及び最適な治療効果を得るために投与手段を修正する開業医の通常技術の範囲内にある。処置細胞又は組織の単回又は複数回投与量を、受容哺乳類へ投与してもよい。インビトロ又は哺乳類モデルにおける、おおよその投与量の範囲を決定することは望ましいことであり、それからヒトの患者の投与量が推定することができる。異種細胞又は組織を受容哺乳類へ移植する方法においては、シクロスポリンのような当該分野で知られている免疫抑制剤は、また、典型的に受容哺乳類へ投与される。
哺乳類への処置細胞の移植に続いて、インビトロにおいて、哺乳類へ一つ又はそれ以上のErbBリガンドを更に又は連続して投与することは、例えば、ベーター細胞によるインシュリン分泌をさらに増加させるために有用であろう。このような、ErbBリガンドのさらなる又は連続投与は、上記に記載の方法及び組成物を利用して完遂することができる。
ErbBレセプターに関する、ここに記載された任意の、又はすべての方法、組成物、及び手順は、二者択一的、或いは組合せで、本出願において記載のErbBレセプターアゴニスト抗体を用いる。
【００８４】
遺伝子治療法も、本発明において提供されている。ErbBレセプターリガンドをコードする核酸が、遺伝子治療で用いられてもよい。遺伝子治療の応用においては、例えば欠損の遺伝子を交換するために、治療に効果的な遺伝子産物の生体内合成の目的で細胞内に遺伝子を導入する。遺伝子療法とは、一度の処理で持続する効果を得る従来の遺伝子療法も、治療に効果的なDNA又はmRNAを一度又は何度も投与する遺伝子治療剤投与法も含む。アンチセンスRNA及びDNAは、生体内で特定の遺伝子の発現を阻止する治療剤として利用できる。短かいアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内に導入すると、細胞膜への取り込み制限により、細胞内濃度が低いにも関わらず、抑制剤として機能することは既に発表済みである（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83:4143-4146 (1986)）。オリゴヌクレオチドは、例えば陰性リン酸ジエステル基を無荷電基で置換することで、取り込みを増強するように変更できる。
【００８５】
生細胞に核酸を導入する方法は様々である。それら方法は、試験管内で培養細胞内にトランスフェクトするか宿主の細胞内に生体内でトランスフェクトするかによって異なる。試験管内で哺乳類細胞に核酸をトランスフェクトするのに適する方法として、例えばリポソームの使用、電気穿孔法、微量注入、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等がある。現在好まれている生体内遺伝子転移法としては、ウイルス（通常レトロウイルス）ベクターを用いた形質移入やウイルス性コートタンパク質―リポソーム形質移入（Dzauほか, Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)）等がある。状況によっては、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異性を有する抗体や標的細胞上の受容体に対するリガンド等、標的細胞をターゲットする薬剤を核酸源に設けることが好ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質、例えば特定の細胞型に対して向性であるキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングの際に内部移行するタンパク質の抗体、及び細胞内局所性をターゲットし、細胞内半減期を延長するタンパク質等をターゲティング及び／又は取り込みを容易化するために使用できる。受容体介入エンドサイトーシス法は、例えばWuほか, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagnerら, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87:3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルについてはAndersonほか, Science, 256:808-813 (1992)を参照。
【００８６】
Ｄ．キット及び製造品
本発明の更なる実施態様においては、例えば上述の治療的又は非治療的用途に使用可能なErbBリガンド（又はErbBレセプターアゴニスト抗体）を含むキット及び製造品が提供される。製造品にはラベルが付された容器が含まれる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、上述の治療的又は非治療的用途に有効な活性剤を含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は、ErbBリガンド（又はErbBレセプターアゴニスト抗体）である。容器のラベルには、組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用されることが示され、また上述のもののような、インビボ又はエキソビボのいずれかの使用の指示が示されている。
本発明のキットは、典型的には、上述の容器と、商業上及び使用者の観点から望まれる、バッファー、希釈液、フィルター、針、注入器及び使用説明が記されたパッケージ挿入物を含む、材料を含む一又は複数の他の容器を含んでいる。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【００８７】
（実施例）
実施例１
マウス胎児膵臓細胞の初代培養は、種々のErbBリガンドによって検定され、そして種々のマーカーの発現又はインシュリンが調べられた。
膵臓は、CD1マウス（チャールズ リバー ラボラトリー）のe14胎児から解剖された。そして、膵臓は、F12/DMEM中の1.37mg/mlのコラーゲン/デスパーゼ（べーリンガーマンハイム）で37℃で40から60分間に渡って消化された。インキュベーションに続いて、消化物を等量の5％BSAによって中和し、そして細胞は一度、RPMI1640（Gibco）によって洗浄された。
第一日目、細胞は、PBS中の20マイクログラム/mlラミニン（べーリンガーマンハイム）によって前被覆された12ウェル組織培養プレートへ接種された。1-2胎児の膵臓からの細胞を、初代培養培地（10マイクログラム/ml rhインシュリン（ジェネンテック社）を含むRPMI1640）、50マイクログラム/mlアプロチニン（べーリンガーマンハイム）、60マイクログラム/mlウシ下垂体抽出物（BPE）（Pel-Freeze）、100ng/mlゲンタマイシンのウェルへ1:1000の割合、10ml PBS、10マイクログラム/mlトランスフェリン（シグマ）、10ng/ml EGF（BRL）、10マイクロリッターの5X10-9 M トリヨードチロニン（シグマ)、100マイクロリッターの10nM エタノールアミン（シグマ）へ1:1000の割合、そして10ml 200標準エタノール、2マイクロリッターの1nM ヒドロコルチゾン（シグマ）、100 マイクロリッターの10nM プロジェステロン(シグマ）、及び500マイクロリッターの1マイクロモル フォルスコリン（Calbiochem）の各ウェルへ分布させた。細胞培養は、次に37℃でインキュベートされた。
第二日目、初代培養培地は除かれ、付着細胞はRPMI1640で洗浄された。次に、2mlの最小培地（10マイクログラム/mlトランスフェリン、1マイクログラム/mlインシュリン、100ng/mlゲンタマイシン、50マイクログラム/mlアプロチニン、1マイクログラム/ml BPEを含むRPMI1640）が、次のErbBレセプターリガンド（組み換え体ヒト型）と共に加えられた：EGF、HG-EGF、TGF-アルファ、アンフィレグリン、ベーターセルリン、及びヘレグリン。ヘレグリンポリペプチド（ジェネンテック社）は、EGFドメインのみ（HRG-ベーター1177-244)）からなる。他ののリガンドは、４つの異なる濃度で培地へ添加された−200ng/ml、100ng/ml、20ng/ml及び4ng/ml。
【００８８】
第４日目、培地はウェルから除かれ、mRNAが細胞から調製されて，Figure １にて同定されたマーカーの発現レベルが検定された。マーカーは、Edlund, Diabetes 47:1817-1823(1998)及びBouwens, J. Pathology 184:234-239(1998)、及びそれらに引用されている参考文献にもにさらに記載されている。読み出されたmRNAは、前駆体又は成熟表現型に関連する種々のマーカーを発現する細胞数の変化を示すために使用された。マーカー発現は、実時間定量的RT-PCRによって分析された（Gibsonら,Genome Research,6:986-994 (1996)）。それが関連するマーカーの発現の増加を生じた場合、ErbBリガンドは陽性であると確定された。
結果は、Figure１に示されている。示されているように、マーカー−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルカゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、Cytoker19、の発現が測定された。また、各々のリガンドに観察された結果が、Figure２(HB-EGF)、３(ヘレグリン)、４(アンフィレグリン)、５(EGF)、６(TGF-アルファ)、及び７(ベーターセルリン)に棒線図で鮮明に図解されている。
試験されたすべてのErbBリガンドは、一つ又はそれ以上のマーカーの発現を変化させた。ヘレグリンを除くすべてのリガンドは、リガンドへの48時間に渡る曝露で、倍以上のPDX-1を生産した。試験されたすべてのリガンドは、アミラーゼ発現を増加せず、アンフィレグリン、EGF、及びTGF-アルファは、実際にはアミラーゼマーカーの発現のレベルを減少させた。
【００８９】
実施例２
ヘレグリン，ErbB2又はErbB3の何れかについてのマウス異種接合体(+/-)は、ジーンターゲティング技術によって作製され、一つの機能性遺伝子コピーの消失と標的タンパク質の関連減少を生じた。異種接合マウス系列及び野生型マウス（妊娠及び妊娠していない）におけるヘレグリンのインビボ活性が、次に調べられた。
キメラマウスは、Ericksonら, Development 124: 4999-5011(1997)に記載のように、ジーンターゲティングによって作製された。マウスは、背景系統又は戻し交配レベルに基づいたヘレグリン反応について違いが記録されていないC57BL/6J及びBalb/Cマウスと交尾させられた。平均体重各20gの各遺伝子型の成人8-12週齢マウスは、ALZAポンプを用いて組み換え体ヒトヘレグリン-ベーター1（アミノ酸177-244）の14日間に渡る持続性全身送達によって処置された（Holmesら, Science 256: 1205-1210(1992)）。ヘレグリンを受けた遺伝型群は、6匹の雌と6匹の雄から構成された。各遺伝子型（2匹の雌と3匹の雄）の対照群は、PBS（Giibco）を受けた。ALZAミニ-浸透ポンプ（モデル2002；ポンプ速度：0.5マイクロリッター/時間；期間：14日；貯蔵容量：200マイクロリッター）は、製造者指示書にしたがって、PBSで希釈したヘレグリンで満たされ、投与量が0.75mg/kg/日又は1.0mg/kg/日で動物へ送達された。ポンプは、無菌移植の前に、PBS中に4℃で一晩、保管された。動物は、腹腔内に送達された75-80mg/kgのケタミン、7.5-15mg/kgのキシラジン、及び0.75mg/kgのアセプロマジンによって麻酔をかけられた。充満ポンプ、配達入り口は最初、背中に沿った皮下嚢へ挿入された。動物は、個々に飼育され、そして毎日観察された。瀕死状態の動物はどれも、直ちに犠牲され、そして検死された。
【００９０】
生存する動物は、14日目に犠牲にされ、検死された。臓器組織は、室温で一晩、10％の中性緩衝ホルマリンで固定され、続いて70％エタノール中に貯蔵された。パラフィン包埋のために、組織は等級アルコール、続いてサリチル酸メチル、そして57℃でパラプラスト(Paraplast)での一晩に渡る湿潤によって脱水された。連続した6マイクロメーター切片は、ヘマトキシリン-エオシン染色及び組織学的な分析の前に切りとられ、そしてポリ-リジン被覆スライドへ固定された。
ヘレグリン処置への耐性は、遺伝子型によって変化した。死亡率は、最も高い死亡率（12/12=100%）を有するヘレグリン(+/-)動物群の遺伝子型(p<0.001)の間、最小死亡率（1/12=8%）を有するErbB2及びErbB3(+/-)動物群と中間の死亡率（7/12=58%）を有する野生型群の間では異なる。性による明確な死亡率の違いは無かった。野生型及びヘレグリン処置を受けたヘレグリン(+/-)動物は、流涙、脱水、肩をすぼめるようなしわ舌ごけ、低体温、著しい機能低下を示した。野生型及びヘレグリン(+/-)動物はまた、肥大した腹部を有すように思われる。PBSを受けた対照動物は、全14日間を臨床的な徴候を示さずに生存した。
膵臓は、検死で、処置された非生存野生型及びヘレグリン(+/-)マウスにおいてほぼ正常に思われ、恐らくは投与ヘレグリンへの動物の短時間曝露(5-6日)を反映した、限られた管拡張症及び最小過形成をともなっていた（Figure８(b)及び(c)を参照のこと）。対照的に、全14日間に渡る処置を受けたErbB2及びErbB3(+/-)動物では、検死において、明白な管過形成及びに肥大が主要な膵臓管が無く、管腔の管に炎症細胞の存在があった（Figure８(d)及びFigure８(e)）。アミラーゼのレベルは、多くの動物で上昇したが、腺房細胞の損傷は広範ではなかった。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】  ErbBレセプターリガンド、HB-EGF(“rh.HB-EGF”)、ヘレグリン(“rh.HRG”)、アンフィレグリン(“rh.AR”)、EGF(“rh.EGF”)、TGF-アルファ(“rh.TGF-a”)、及びベーターセルリン(“rh.BTC”)の培養初代マウス胎児膵臓細胞における種々のマーカーの発現への影響を調べた実施例１に記載の結果。
【Ｆｉｇ２】 HB-EGFのマーカー発現−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルガゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、及びCytoker19への影響（発現の倍数変化で測定された）を例示した棒線図。
【Ｆｉｇ３】 ヘレグリンの発現マーカー−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルガゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、及びCytoker19への影響（発現の倍数変化で測定された）を例示した棒線図。
【Ｆｉｇ４】  アンフィレグリンの発現マーカー−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルガゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、及びCytoker19への影響（発現の倍数変化で測定された）を例示した棒線図。
【Ｆｉｇ５】  EGFの発現マーカー−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルガゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、及びCytoker19への影響（発現の倍数変化で測定された）を例示した棒線図。
【Ｆｉｇ６】  TGF-アルファの 発現マーカー−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルガゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、及びCytoker19への影響（発現の倍数変化で測定された）を例示した棒線図。
【Ｆｉｇ７】  ベーターセルリンの発現マーカー−RPL19、NeuroD、Pax4、PDX-1、インシュリン、Glut2、GLK、Pax6、グルガゴン、ISL1、アミラーゼ、ソマトスタチン、及びCytoker19への影響（発現の倍数変化で測定された）を例示した棒線図。
【Ｆｉｇ８】  ヘレグリン処置を受けた非処置野生型動物(a)、及び野生型(b)、ヘレグリン(+/-)(c)、ErbB2(+/-)(d)、及びErbB3(+/-)動物(e)からの膵臓組織の代表的切片(20X)。この切片は、5-6日間のみの投与を受けたヘレグリン(+/-)処置動物の場合を除く、14日間のヘレグリン処置を受けた動物から得る。管過形成（矢印で示されている）の存在は、野生型と ErbB2及び ErbB3(+/-)動物群において最も明白で、ヘレグリンへの長期に渡る曝露を反映した可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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