(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体上に固定されたプローブへの標的物質の結合の有無または結合量を測定することにより標的物質を検出する方法において、
標的物質と特異的に結合し得るプローブが固相担体上に固定されたプローブ固定担体を用意する工程と、
前記測定結果に影響する前記プローブ固定担体に固有の製造条件を入手する工程と、
前記プローブ固定担体に試料を反応させて、該プローブ固定担体の有するプローブへの標的物質の結合の有無または該プローブへの標的物質の結合量を測定して測定結果を得る工程と、
前記製造条件に基づいて前記測定結果を補正手段において補正する工程と、
前記補正された測定結果を最終結果として前記補正手段内に記録するか、または前記補正手段から出力する工程と
を有し、
前記製造条件を予め変えて製造したプローブ固定担体を前記標的物質と反応させ、該標的物質の量を測定した検量線を作成しておき、該検量線を使用して、前記プローブ固定担体の有するプローブへの該標的物質の結合の有無または結合量に関する測定結果を補正して補正された測定結果を得る
ことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
固相担体上に固定されたプローブへの標的物質の結合の有無または結合量を測定することにより標的物質を検出する方法において、
標的物質と特異的に結合し得るプローブが固相担体上に固定されたプローブ固定担体を用意する工程と、
前記測定結果に影響する前記プローブ固定担体に固有の製造条件を入手する工程と、
前記プローブ固定担体に試料を反応させて、該プローブ固定担体の有するプローブへの標的物質の結合の有無または該プローブへの標的物質の結合量を測定して測定結果を得る工程と、
前記製造条件に基づいて前記測定結果を補正手段において補正する工程と、
前記補正された測定結果を最終結果として前記補正手段内に記録するか、または前記補正手段から出力する工程と
を有し、
前記製造条件を変更した際に、前記プローブに結合する標的物質の量がどのように変化するかを予めシミュレートしておき、該シミュレーション結果を使用して、前記プローブ固定担体の有するプローブへの該標的物質の結合の有無または結合量に関する測定結果を補正して補正測定結果を得る
ことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項３】
前記プローブ固定担体には複数種のプローブが固定されている請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記製造条件が、（１）前記プローブの固定領域の面積及び形状の少なくとも一方、（２）前記プローブ固定担体に固定されたプローブ量を測定して得られる値、（３）前記固相担体の表面が固定剤溶液により処理されていることで該プローブが固定されている場合における該固定剤溶液の固定剤濃度、のうち少なくとも１つを含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記プローブ固定担体は、前記固相担体に前記プローブを含むプローブ溶液を付与して製造されたものであり、前記製造条件が、（１）該プローブ溶液のプローブ濃度、（２）該プローブ溶液の吸光度、（３）該プローブ溶液に含まれるプローブを前記固相担体に結合させる反応の反応時間、（４）該プローブ溶液の付与体積の少なくともいずれかを測定した値を含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記プローブ溶液の前記固相担体への付与が、液体を吐出するための吐出口と、前記プローブ溶液を格納するリザーバーと、前記吐出口と前記リザーバーとをつなぐ流路と、を有するプローブ溶液付与装置により行なわれ、該プローブ付与装置内において前記吸光度を測定する請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記プローブが核酸である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
プローブ固定担体に試料を反応させた際の該プローブ固定担体の有するプローブへの標的物質の結合の有無または結合の量を測定するための測定装置において、
前記プローブへの前記標的物質の結合の有無または結合量を測定するための測定手段と、
前記測定手段で得られた測定結果に影響する該プローブ固定担体に固有の製造条件を読み取るための読み取り手段と、
前記測定手段での測定結果を前記読み取り手段で読み取った製造条件に基づいて補正する補正手段と、
前記補正手段により補正された測定結果を出力する手段と
を備え、
前記製造条件を変更した際に、前記プローブに結合する標的物質の量がどのように変化するかを予めシミュレートしておき、前記補正手段は、該シミュレーション結果を使用して、前記補正を行う
ことを特徴とする測定装置。
【請求項９】
請求項８に記載の測定装置で使用される製造条件に関する情報が記録されていることを特徴とする記録媒体。
【請求項１０】
標的物質検出用のキットにおいて、
標的物質と特異的に結合し得るプローブを固相担体に固定したプローブ固定担体と、
請求項９に記載の記録媒体と、
を有することを特徴とするキット。
【請求項１１】
前記記録媒体が、前記固相担体のプローブが固定されていない領域に配置されている請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
標的物質検出用のネットワークを利用した標的物質検出用システムであって、
標的物質と特異的に結合し得るプローブを固相担体に固定したプローブ固定担体と、
ネットワークを利用して所得し得る状態で保持された請求項８に記載の測定装置で使用される製造条件と、
を有することを特徴とする標的物質検出用システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製造条件付きプローブ固定担体を用いた標的物質の検出方法及びそのための装置、製造条件を記録した記録媒体、キット及びネットワーク利用システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
プローブ固定担体の一例としてDNAチップが挙げられる。DNAチップとは、プローブとして、遺伝子の発現、変異、多型などの同時解析に非常に有効である多数のDNA断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高密度アレイである。例えば、米国特許第5,688,642号明細書には、フォトリソグラフィーを用いて作製された固相オリゴヌクレオチドアレイが示され、国際公開第95/25116号パンフレット、米国特許第5,688,642号明細書にはインクジェット法を用いた固相DNAプローブアレイの作製方法が示されている。また、標的物質の検出処理工程では、一般に蛍光物質などで標識化した標的物質を固相プローブアレイのプローブと接触させる、いわゆるハイブリダイゼーション反応が行なわれる。このハイブリダイゼーション反応は、通常標的物質を溶解させた溶液に固相プローブアレイを接触または浸漬させ、熱を加える反応であり、標的物質の濃度や反応温度などはプローブと標的物質の組み合わせによって異なる。さらにプローブと標的物質が結合したかを蛍光検出器などの装置を用いて測定する。
【特許文献１】米国特許第5,688,642号明細書
【特許文献２】国際公開第95/25116号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらDNAチップに用いられるプローブは、cDNAを用いる場合と、オリゴヌクレオチドを用いる場合とに大別できるが、いずれにしてもプローブは高価あるいは貴重な物であり、使用量を極力抑えたい。こうした要望に対応する上で、微小量を固相担体に固定化したプローブ固体担体の利用が種々検討されている。できるだけ少ない量のプローブを利用する場合、正確な測定結果を得るには標的物質のプローブへの結合力（結合量）を厳密に測定する必要があり、そのためには、各プローブが正確に同じ形状で、同じ量が固相担体に結合されていることが望まれる。ところが、微小量のプローブを扱う場合、測定結果に影響するプローブ固定領域の形状や、固定されたプローブの密度などを各プローブ固相担体ごとに均一にすることが困難な場合がある。特に、疾病の遺伝子診断や病原体としての微生物の検出などにおいては、より正確な精密測定が要求され、プローブ固定状態のバラツキによる測定結果への影響を排除できる方法が重要となる。
【０００４】
本発明の目的は、標的物質の測定結果へのプローブ固定担体の有するプローブの固相担体への固定状態のバラツキによる影響を排除できる標的物質の検出方法及びそのための装置を提供することにある。本発明の他の目的は、この検出方法に用いるための製造条件記録を保持した記録媒体、ならびに標的物質検出用キット及びシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の標的物質の検出方法の第一の態様は、
固相担体上に固定されたプローブへの標的物質の結合の有無または結合量を測定することにより標的物質を検出する方法において、
標的物質と特異的に結合し得るプローブが固相担体上に固定されたプローブ固定担体を用意する工程と、
前記測定結果に影響する前記プローブ固定担体に固有の製造条件を入手する工程と、
前記プローブ固定担体に試料を反応させて、該プローブ固定担体の有するプローブへの標的物質の結合の有無または該プローブへの標的物質の結合量を測定して測定結果を得る工程と、
前記製造条件に基づいて前記測定結果を補正手段において補正する工程と、
前記補正された測定結果を最終結果として前記補正手段内に記録するか、または前記補正手段から出力する工程と
を有し、
前記製造条件を予め変えて製造したプローブ固定担体を前記標的物質と反応させ、該標的物質の量を測定した検量線を作成しておき、該検量線を使用して、前記プローブ固定担体の有するプローブへの該標的物質の結合の有無または結合量に関する測定結果を補正して補正された測定結果を得る
ことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【０００６】
本発明の標的物質の検出方法の第二の態様は、
固相担体上に固定されたプローブへの標的物質の結合の有無または結合量を測定することにより標的物質を検出する方法において、
標的物質と特異的に結合し得るプローブが固相担体上に固定されたプローブ固定担体を用意する工程と、
前記測定結果に影響する前記プローブ固定担体に固有の製造条件を入手する工程と、
前記プローブ固定担体に試料を反応させて、該プローブ固定担体の有するプローブへの標的物質の結合の有無または該プローブへの標的物質の結合量を測定して測定結果を得る工程と、
前記製造条件に基づいて前記測定結果を補正手段において補正する工程と、
前記補正された測定結果を最終結果として前記補正手段内に記録するか、または前記補正手段から出力する工程と
を有し、
前記製造条件を変更した際に、前記プローブに結合する標的物質の量がどのように変化するかを予めシミュレートしておき、該シミュレーション結果を使用して、前記プローブ固定担体の有するプローブへの該標的物質の結合の有無または結合量に関する測定結果を補正して補正測定結果を得る
ことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【０００９】
本発明にかかる測定装置は、
プローブ固定担体に試料を反応させた際の該プローブ固定担体の有するプローブへの標的物質の結合の有無または結合の量を測定するための測定装置において、
前記プローブへの前記標的物質の結合の有無または結合量を測定するための測定手段と、
前記測定手段で得られた測定結果に影響する該プローブ固定担体に固有の製造条件を読み取るための読み取り手段と、
前記測定手段での測定結果を前記読み取り手段で読み取った製造条件に基づいて補正する補正手段と、
前記補正手段により補正された測定結果を出力する手段と
を備え、
前記製造条件を変更した際に、前記プローブに結合する標的物質の量がどのように変化するかを予めシミュレートしておき、前記補正手段は、該シミュレーション結果を使用して、前記補正を行う
ことを特徴とする測定装置である。
【００１０】
本発明にかかる媒体は、上記構成の測定装置で使用される製造条件に関する情報が記録されていることを特徴とする記録媒体である。
【００１１】
本発明の標的物質検出用のキットは、
標的物質と特異的に結合し得るプローブを固相担体に固定したプローブ固定担体と、
上記構成の記録媒体と、
を有することを特徴とするキットである。
【００１２】
本発明の標的物質検出用システムは、
標的物質検出用のネットワークを利用した標的物質検出用システムであって、
標的物質と特異的に結合し得るプローブを固相担体に固定したプローブ固定担体と、
ネットワークを利用して所得し得る状態で保持された上記構成の測定装置で使用される製造条件と、
を有することを特徴とする標的物質検出用システムである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、標的物質の測定結果に影響する製造条件をプローブ固定担体固有の製造条件として記録保持し、標的物質の検出時における測定結果をこの記録された製造条件に基づいて補正することで、製造条件に起因する測定値にバラツキを排除してより正確な測定が可能となる。本発明によれば、微小量のプローブを用いる場合の精密測定に特に有用な検出方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においては、標的物質の検出における測定結果に影響するプローブ固定担体製造時に用いた条件、すなわち、プローブを固相担体に固定する際の条件が、各プローブ固定担体に固有の製造条件としてその製造時に記録媒体中に記録して保持される。こうして得られた製造条件記録付きプローブ固定担体を用い、標的物質の検出を行う際に測定結果に対して製造条件に基づいた補正を行うことで、より正確な検出を可能が可能となる。例えば、微少量のプローブあるいはプローブ溶液を扱う際に、プローブの濃度、固定量などがばらついても、そのバラツキを測定し、製造条件記録として保持しておき、検出時に測定結果をこの製造条件に基づいて補正することで、標的物質のプローブへの結合力（結合量）を厳密に測定可能とすることができる。
【００１５】
本発明にかかるプローブ固定担体は、標的物質に特異的に結合することで標的物質の検出を可能とするプローブと、このプローブが固定されている固相担体とを有して構成されるとともに、製造時における測定結果に影響する条件（製造条件）を読み取り可能に保持している。
【００１６】
固相担体としては、プローブを固定し、得られたプローブ固定担体を用いて標的物質を検出あるいは分離するのに支障のない物であれば特に限定される物ではない。マイクロアレイを例に挙げるのであれば、標的物質の検出や汎用性を考慮すると、ガラス基板やプラスティック基板が好ましく、さらにはアルカリ成分などが含まれない無アルカリガラス基板や石英基板が特に好ましい。プローブを固相担体上に固定する方法としてはさまざまな方法が知られている。DNAを例に挙げるならば、基材上においてプローブの合成を行うことにより基材上に固定する方法と、予め用意されたプローブをピンもしくはスタンプあるいはインクジェット法などにより基材上に付与することにより固定する方法とがある。
【００１７】
固相担体上にてプローブの合成を行う固定方法としては、例えば、米国特許第５１４３８５４５号明細書に記載されているように、固相担体の選択された領域からアクチベ−タ−によって保護基を除去し、除去可能な保護基を有するモノマ−を前記領域に結合させることを繰返すことにより、固相担体上で種々の配列を有するポリマ−を合成する方法が知られている。また、予め用意されたプローブを基材上に付与することにより固定する方法としては、例えば、特開平８−２３９７５号公報に記載されているように、基材及び該基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させることにより固定する方法が知られている。また、特開平８−３３４５０９号公報に記載されているように、生物学的に活性な物質の検出において、カルボジイミドを有する化合物上にカルボジイミド基を介して固定化することを用いて検出する方法が知られている。更に、特開２００１−１７８４４２号公報には、末端部にチオール基を有するＤＮＡ断片と、チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基を有する鎖状分子が一方の末端で表面に固定された固相担体とを液相にて接触させることにより、ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合を形成させることによるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法が記載されており、チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基としては、具体的にはマレイミジル基、α、β−不飽和カルボニル基、α−ハロカルボニル基、ハロゲン化アルキル基、アジリジン基およびジスルフィド基からなる群より選ばれる基を含む置換基であると記載されている。
【００１８】
プローブの固定化方法に関しては、上述のようにDNA断片の固定方法だけでも多くの方法が知られているが、本発明ではプローブ種類やその固定メカニズムに関しては特に限定される物ではない。
【００１９】
また、プローブを基材上に付与する方法としては、プローブを水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、特開平１１−１８７９００号公報で公開されているようなインクジェット法、あるいはピン法などにより反応性基を有する基材にスポットする方法が知られている。スポッティング方法に関し、上述した方法の中でも特にインクジェット法は、高速、高密度で尚且つ正確なスポッティングができることから好適なスポッティング方法である。インクジェット法とは、ごく細いノズルの中にプローブを含む溶媒を入れ、ノズルの先端近くを瞬間的に加圧ないし加熱し、ノズルの先端（吐出口）から正確に極微量のプローブを含む溶媒を飛び出させ、空間を飛翔させて基材面に付着させるというものである。インクジェット法によるスポッティング方法において、プローブ溶液に含まれる成分はプローブ溶液としてインクジェットヘッドから吐出させた時にプローブに対して実質的に影響を与えないものであって、且つインクジェットヘッドを用いて基材上に正常に吐出可能である媒体組成を満たすものであれば、特に限定されるものではない。例えば、インクジェットヘッドが媒体に熱エネルギーを付与して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである場合、グリセリン、チオジグリコール、イソプロピルアルコール、アセチレンアルコールを含む液体はプローブ溶液に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的に述べるのであれば、グリセリン５〜１０重量％、チオジグリコール５〜１０重量％、アセチレンアルコール０．５〜１重量％を含む液体がプローブ溶液として好適に用いられる。また、インクジェットヘッドが圧電素子を用いて媒体を吐出させるピエゾジェットヘッドである場合、エチレングリコール、イソプロピルアルコールを含む液体はプローブ溶液に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的には、エチレングリコール５〜１０重量％、イソプロピルアルコール０．５〜２重量％を含む液体がプローブ溶液として好適に用いられる。
【００２０】
このようにして得られたプローブ溶液をインクジェットヘッドより吐出させ基材上に付着させた時、スポットの形状が円形で、また吐出された範囲が広がることがない。高密度にプローブ溶液をスポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連結を有効に抑えることができる。
【００２１】
標的物質のプローブへの結合力（結合量）を正確に測定しようとした場合、各プローブが同じ形状で、同じ量が結合されていることが望ましい。このようなことからインクジェット方式は非常に好ましいスポット法と言える。
【００２２】
プローブとしては、固相担体に固定化でき、標的物質に対して特異的に結合し得るものが利用される。プローブとして利用できるものとして種々の物質が知られており、例えば核酸（オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片など）、抗体や酵素などに代表されるタンパク質あるいはペプチド、その他糖鎖などを用いることができる。プローブ固定担体は、固相担体上にプローブの固定領域（固定していない領域と区別し得る領域をいう）の複数が形成されたものであってもよい。また、プローブ固定担体は、複数種のプローブ固定領域を有するものであってもよい。
【００２３】
プローブとしてＤＮＡを用いたＤＮＡチップは、プローブとしてオリゴヌクレオチドを用いる場合と、ｃＤＮＡを用いる場合に大別され、いずれにしても高価あるいは貴重な場合が多く、プローブやプローブ溶液の量を減らすことが望まれていることは前述したとおりである。しかしながら、微少量の液滴は正確にハンドリングすることが難しい場合が多い。本発明によれば、プローブ濃度など性能に影響する製造条件がばらついても、そのバラツキ量を予め測定しておくこと、もしくはプローブ量を分析しておくことで、その結果を分析装置で補正し、正確な計測を行うことが可能となる。
【００２４】
測定結果に影響する条件の一つとしては、プローブと固相担体との反応時間などがあげられる。プローブと固相担体との結合反応にかかる反応時間は、固定メカニズムや温度などにもよるが、数分から数時間かかる。多くの種類のプローブを同時にスポットすることは困難であるので、通常は１から数種類のプローブを同時にスポットする。しかし、最初にスポットしたプローブと最後にスポットしたプローブとでは固定にかかる時間が変わってしまうことになる。このように結合反応時間が変わると、プローブと固相担体との反応効率が変わってくる。上述したようにインクジェット法では高速にスポットが完了することから、このような時間の差による影響は少ないが、特にピン法では一般に同時に製造するチップが増えた場合に時間を要する場合が多いことから、スポットされた時間（実際の結合反応時間）を記録し、分析装置でこの時間を加味して分析結果を出力することでより正確な結果を得ることができる。
【００２５】
その他の条件としては、固相担体に固定されたプローブの量（密度）が挙げられる。このプローブの固定量を規定する条件として、固相担体に付与するプローブ溶液の有するプローブ濃度、固相担体表面にプローブ固定のための固定剤を配置して、この固定剤にプローブ溶液を反応させてプローブを固定化する場合における固定剤の固相担体表面における量（密度）、あるいは固相担体に付与する固定剤溶液における固定剤濃度などを挙げることができる。
【００２６】
例えば、特開平11-187900号公報に公開される実施例では洗浄したガラス基板を、固定剤溶液として１wt%のアミノシランカップリング剤水溶液および、0.3mg/mLのＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシイミド溶液で処理している。これら２種類の固定剤の中でも、特にこのシランカップリング剤の濃度が振れるとＤＮＡチップとしての性能も変わってくる（図１参照：プローブ溶液のプローブ濃度を一定とし、反応に必要な量を超える十分な標的物質を含む標的物質溶液を反応させ、0.1wt%の時の蛍光強度を１として図示した）。次に、プローブ溶液のプローブ濃度が振れた場合のＤＮＡチップの性能の差異について図２に示した（8μＭの時の蛍光強度を１として図示した）。当然ながらプローブ濃度を高くしていくと、ある濃度を超えるとプローブ固定量は一定となる。しかしながらこのような濃度では、高価なプローブを相当量使用することになりコストの面で不利であること、また未反応のプローブを除去する際にスポット外にも結合し、バックグラウンドの上昇につながることから、それほど高濃度では使用しないことが望ましく、従ってプローブ濃度とＤＮＡチップの性能がほぼ比例関係にある領域（例えば図２の系の場合では１０μM以下）を使用する場合も多い。
【００２７】
以上のことから、製造条件としてプローブ溶液の濃度のみならずプローブ固定担体作製に必要な全ての材料の濃度を上述した製造条件として記録し、分析装置へフィードバックする意味があることがわかる。例えば、固定剤を使用して固相担体にプローブを固定する場合には、固相担体表面の処理に用いる固定剤溶液の固定剤濃度とプローブ溶液のプローブ濃度を製造条件として記録して測定値補正に用いることが好ましい。
【００２８】
固定剤溶液における固定剤の濃度の測定は、種々の公知の方法により行なうことができる。例えば、原子吸光、溶液の屈折率、自動滴定装置など、固定剤の種類に応じて選択する。プローブ固定担体の製造に利用される固定剤の種類は限られていることから濃度測定に必要な測定方法の選択は容易であり、濃度測定も容易に行うことができる。
【００２９】
しかし、一般にマイクロアレイと呼ばれるプローブ固定担体は用途などによって数種類から数万種類のプローブが固定されており、プローブ溶液の濃度を測定する方法としては、測定数が多いことを考えるとプローブ溶液を固相担体に付与する付与装置内で、もしくは付与装置の有するプローブ溶液を供給する分注装置内で測定することが好ましい。プローブ溶液の付与装置としては、液体を吐出するための吐出口と、プローブ溶液を格納するリザーバーと、吐出口とリザーバーとをつなぐ流路と、を有するプローブ溶液付与装置を利用することができ、この付与装置内の測定可能な位置でプローブ濃度を測定する。
【００３０】
例えば特開２００３−６３０１３号公報は、発光素子と受光素子を内蔵したインクジェットヘッドを開示している。プローブとしてオリゴヌクレオチドもしくはｃＤＮＡなどのＤＮＡを例に挙げるならば、２６０ｎｍの波長の光を発光素子から照射し、受光素子でその光を受光して得られる吸光度から濃度を算出することで、自動で短時間に複数種のプローブ溶液の濃度を測定することが可能となる。吸光度から濃度への換算は、プローブによってモル吸光係数が異なるので、予め計算しておく必要がある。
【００３１】
また、複数のプローブ溶液を格納するマルチウェルプレート内あるいは、マルチウェルプレート等への分注過程で測定することも可能である。本発明で言う製造装置とは、このような分注機などをも含む。なお、ここではプローブ溶液あるいはその他材料の濃度を測定できれば良く、測定法に限定される物ではない。
【００３２】
このような方法で多くのプローブの濃度を測定することは可能であるが、数万種類のプローブそれぞれに対して検量線を作成することは非常に手間がかかる。このような場合はシミュレーションで検量線を作成する方法も用いることができる。例えば、プローブの長さが長くなると立体障害の影響で、固相担体との反応効率が落ちることが予想されるが、このためプローブの長さや3次構造の取り方などをパラメーターとして、濃度、反応効率への影響をシミュレーションし、これを検量線とすることも好ましい。
【００３３】
ただし、ＤＮＡチップを例に挙げるならば、通常多くのプローブは固定されてはいるが、融解温度（Ｔｍ）をほぼ一定に設計することが好ましく、このため各プローブの長さもほぼ一定していることから、すべてにおいて実測あるいはシミュレーションで検量線を作成することは好ましいが、１種類のプローブの検量線を他のプローブに適用することも可能である。
【００３４】
プローブ固定量を規定するファクターとして、更に、プローブ溶液の付与量があげられる（プローブ溶液のプローブ濃度を一定とし、反応に必要な量を超える十分な標的物質を含む標的物質溶液を反応させて蛍光強度を測定した。図３参照）。今回実施した系では、吐出量約１６ｐＬ以下であれば吐出量と蛍光強度はほぼ比例関係にある。
【００３５】
ピン法でのスポットの場合、一般にその形状、付与量が一定にならないことが多い。そこでスポット後、共焦点レーザー顕微鏡などを用いて、そのスポットの体積を測定し、それを分析装置にフィードバックすることも効果がある。しかしインクジェット方式でスポットした場合は各スポットが均一の量で付与されるため、基材の接触角が同じであれば、面積から体積も算出でき、二次元のみ測長可能な測定装置を使用することも可能である。図４では、吐出量とスポットの面積との関係を示した。今回の系では、約８ｐＬから約２０ｐＬの範囲で、スポット面積と吐出量が比例関係にあることがわかり、この範囲ではスポットの体積を測定せずとも面積からプローブ溶液の付与量を算出できる。
【００３６】
以上述べてきた製造条件は、製造条件であってプローブの固定量を直接的に反映するものではなく、間接的にプローブの固相担体への固定量（密度）に関する情報を提供するものであり、簡便な方法による製造条件の測定が可能である。しかし、プローブの種類、プローブ固定担体の使用目的などによっては、更に正確なプローブ固定量（密度）が必要となる。そのような場合には、固相担体に固定されたプローブの量（密度）を直接測定して製造条件として記録することが好ましい。
【００３７】
本発明におけるプローブ固定担体に固有の製造条件をまとめると、
（１）前記プローブの固定領域の面積及び形状の少なくとも一方、
（２）前記プローブ固定担体に固定されたプローブ量を測定して得られる値、及び
（３）前記固相担体の表面が固定剤溶液により処理されていることで該プローブが固定されている場合における該固定剤溶液の固定剤濃度、
のうち少なくとも１つを用いることができる。また、プローブの固定領域がプローブ溶液の固相担体への付与により形成される場合には、上記の（１）〜（３）の条件に加えて、
（Ａ）プローブ溶液のプローブ濃度、
（Ｂ）プローブ溶液の吸光度、
（Ｃ）プローブ溶液に含まれるプローブを固相担体に結合させる反応の反応時間、及び
（Ｄ）プローブ溶液の付与体積の少なくともいずれかを測定した値、
の中から更に選択することができる。
【００３８】
また、製造条件には、プローブ固定担体の製造上の規格値や製造上での実測値を用いることもできる。プローブの固定領域の形状に関しては、プローブ溶液を固相担体に付与した際のドット（スポット）の形状（固定領域の形状）が製造条件を反映している場合などに、製造条件として固定領域の形状を採用することができる。
【００３９】
プローブ溶液のプローブ濃度は、吸光度測定などにより求めることができる。
特開２００４−８５５４６号公報ではＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析法）を用いてＤＮＡチップの分析を行っている。この方法では破壊検査乃ち抜き取り検査となるが、ＤＮＡチップの定量性に優れた二次元イメージング、さらには、組成分析が可能であることから、本発明の分析法としては好ましい物である。なお、分析法はこれらに限定されるものではない。また、本発明で言う製造装置とは、上述したＴＯＦ−ＳＩＭＳ等プローブ量（密度）などの製造条件を分析する装置を物理的に内蔵されていない物も含む。
【００４０】
本発明においては、プローブ固定担体には、測定結果に影響する製造条件が、そのプローブ固定担体に固有の情報として付与される。各プローブ固定担体に付与された製造条件に関する記録は、各種の記録媒体やネット中のサーバー内のメモリー中に保持し、プローブ固定担体を用いた標的物質の検出時の測定結果の補正用の情報として読み出し可能としておく。
【００４１】
記録媒体はプローブ固定担体に搭載しても良いし、これらを同一パッケージに梱包しても良い。例えば、上述した固定剤溶液の濃度（上述のシランカップリング剤の濃度など）のようにデータ量として少ない場合は、プローブ固定担体のプローブが固定されていない部分にバーコードや二次元コードなどでその情報を記録する方法がある。しかし、上述したＤＮＡチップのようなプローブ数の多いバイオチップのプローブ溶液の濃度やプローブ固定量といった場合などのように情報量が多いものについては、上述したバーコードや二次元コードのみでは記録できる情報量に限りがあることから、ＩＣタグのような記録容量の大きな記録媒体に記録し、これをプローブ固定担体自体に添付するか、プローブ固定担体を支持する筐体の中に組み込む方法などがある。さらにはCD-ROMといった光ディスクや磁気ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリと言った記録媒体に記録し、これをプローブ固定担体と同一パッケージにし、ユーザーへと提供する方法なども考えられる。
【００４２】
さらには、製造条件に関する情報を記録した記録媒体や、ネット上のサーバーにおける電子情報を、プローブ固定担体のメーカーなどが保有しておき、この情報を保持したコンピュータと、後述するユーザー所有の分析装置とをネットワークで結び、プローブ固定担体をユーザーが使用する際に、製造条件をダウンロードして使用する方法もある。この場合はプローブ固定担体あるいはそれを支持する筐体、パッケージ内に、シリアル番号やロット番号など、そのプローブ固定担体の識別子を付しておくことが好ましく、この識別子をメーカーなどが保有するコンピュータに送信し、その識別子に対応するプローブ固定担体の製造条件をダウンロードして読み取り可能とする方法などがある。
【００４３】
なお、記録媒体の種類、分析装置へのデータの提供方法はこれに限定される物ではない。
【００４４】
次に補正のかけ方であるが、例えばプローブ濃度を例にとるならば、予めプローブ濃度の異なる条件でプローブ固定担体を作製しておく。そしてそのプローブ固定担体のプローブと例えば蛍光物質で標識化した標的物質をハイブリダイゼーションさせ、洗浄し、蛍光検出器で検出する。この濃度と蛍光検出器の結果をグラフにしておく（図２参照）。この時、同じプローブ固定担体を使用しても、ユーザー環境（例えば標的物質の濃度や、ハイブリダイゼーション温度や洗浄条件など）によって検出結果が異なることから、検量線は測定結果ではなく、ある基準を決め、この基準の時の検出結果を基準値として正規化を行うことが好ましい（図２の場合は、８μＭを基準とし、この時の蛍光強度を１とした）。
【００４５】
さらに、ＤＮＡチップを例に挙げるならば、プローブの配列によってＴｍが異なることから、代表される１つのプローブに対して検量線を作成するよりも、全てのプローブに対して検量線を作成することが好ましい。なお、補正のかけ方のアルゴリズムについてはこれに限定されない。
【００４６】
以上述べた各製造条件から測定結果の補正に有用なものを１つ、あるいは２つ以上を選択して記録しておき、測定結果を補正することができる。
【００４７】
こうして製造されたプローブ固定担体のプローブと標的物質とを反応させ、標的物質の結合量を測定する分析装置には様々な種類がある。ＤＮＡチップを例に挙げるならば、前述したとおり標的物質を予め蛍光物質で標識化しておき、プローブ固定担体のプローブとハイブリダイゼーションさせ、これを洗浄して蛍光検出器で検出する方法が多く用いられている。この場合、各プローブによって結合量が異なると、正確に標的物質の量や結合力を測定できないことになる。そこで上述したプローブ固定担体の各プローブ量を記録した記録媒体から結合量を読み出し、上述した検量線を用いて計測結果を補正する。
【００４８】
このように補正された計測結果は、製造条件、例えばプローブ濃度などがばらついても、非常にバラツキの少ない計測結果が得られる。
【００４９】
なお、本発明で用いられる分析装置は蛍光検出器に限らず、特開平５−１９９８９８号公報で公開されているような、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された遺伝子サンプルとを反応させた後、遺伝子とハイブリダイズした前記核酸プローブを検出することによって前記目的遺伝子の存在を確認する遺伝子検出法において、前記核酸プローブを電極表面に固定化して用いることと、二本鎖核酸に特異的に結合し、かつ電気化学的に活性な二本鎖認識体を、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加することと、前記電極を介した電気化学的な測定により、前記核酸プローブと目的遺伝子との二本鎖核酸に結合した二本鎖認識体を検出し、これにより目的遺伝子とハイブリダイズした前記核酸プローブの存在を検出することを特徴とする遺伝子検出法などにも応用できる。
【００５０】
ネットワークを含むシステムを利用したＤＮＡチップを用いた遺伝子診断の例を図７に示す。メーカー（１７）が所有するプローブスポッター（２）がある。このスポッターは上述したプローブ濃度測定機能付きインクジェットを用い、プローブ溶液（１）の濃度を計測しながら固相担体上にプローブ溶液を付与し固定させＤＮＡチップ（６）を作成する。この際に、どのプローブをどの位置に付与するかという指示を含む製品データ（３）を用いて付与する位置を決定する。計測した濃度は、各プローブの濃度を記録し、ＣＤ−Ｒのような記録媒体に記録する（７）。ＤＮＡチップと濃度情報が記録されたメディアをユーザー（１６）に提供する。
【００５１】
ユーザーはＤＮＡチップのプローブと標的物質をハイブリダイゼーションさせ、これを検査装置（８）の蛍光検出器（１４）で計測して、その測定結果としてのＲａｗＤａｔａ（１３）を得る。また、濃度情報が記録されたメディアを分析装置のドライブ（１１）に入れる。ＣＤ−Ｒに記録されている濃度データ（１０）と先ほどの計測結果のＲａｗＤａｔａを濃度情報によって補正し、この補正値と、どのプローブがＤＮＡチップ上のどの場所に配置されているかといった製品データ（９）から診断結果（１５）を創出する。
【００５２】
更に、上記の構成のプローブ固定担体と、上記の構成の製造条件を記録した記録媒体と、を少なくとも用いて標的物質検出用のキットを構成することができる。このキットには、更に、プローブと標的物質を反応させるための試薬や形成されたハイブリッド体を検出するための試薬などを追加することができる。先に述べたとおり、製造条件に関する情報は、プローブ固定担体の適当な領域を記録媒体としてこれに記録させておいても良いし、別途用意した記録媒体に書き込んで、プローブ固定担体と別にして同一パッケージ内に同梱させてもよいし、あるいは、プローブ固定担体に固定してもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
[実施例１]
プローブ濃度がばらついた場合の蛍光強度の補正方法について説明する。
(1)基材の作製
スライドガラスを予め６０℃に加温した１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液にガラス基板を１０分間浸した。引き続き純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着した水酸化ナトリウムを水洗、除去した。十分にすすいだ後、純水中にスライドガラスを浸漬し、超音波洗浄を１０分間行った。超音波洗浄後、純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着したパーティクルを水洗、除去した。その後、このスライドガラスをスピンドライで乾燥させた。アミノシランカップリング剤(商品名：KBM-603；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように溶解して30分間撹拌し、この水溶液にスライドガラスを30分間浸漬させた後取り出して水で洗浄し、オーブン中に入れ120℃で１時間乾燥させた。
(2)プローブの合成
本実施例においてプローブは、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、該標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで該標的核酸を検出する１本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１および、配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
5'HS-(CH2) 6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'（配列番号：１）
(3)プローブの固定
上記(2)で合成した２種のDNA断片（配列番号：１）をグリセリン７．５重量%、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールE１００；川研ファインケミカル(株)社製)１重量％を含む水溶液に、０．１５６μＭ、０．３１３μＭ、０．６２６μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、８μＭ、10μＭ、２０μＭになるよう溶解させた。これらのDNA断片を含む水溶液それぞれをバブルジェットプリンターで、上記(1)の方法によって作製したスライドガラスに別々にスポッティングした。この際、15倍のルーペによる観測ではサテライトスポット（液体が固相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット）は観測されなかった。プローブを含む溶液をスポッティングしたスライドガラスを室温で10分間放置し、1MNaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)で洗浄した。
【００５４】
(4)ブロッキング・ハイブリダイゼーション反応
1MNaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に1.0重量%になるようウシ血清アルブミンを溶解させ、上述の方法で作製したDNAチップを室温で2時間浸漬させ、ブロッキング反応を行った。配列番号１のプローブと相補的な核酸配列を有するDNA断片の5’末端にローダミンを結合させて標識化したDNA断片を合成し、これを1MNaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に50nMになるように溶解させた。ブロッキング処理を行ったDNAチップをこの標識化したDNA断片を含む溶液に浸漬し、45℃で2時間放置した。その後、1MNaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)で未反応のDNA断片を洗浄し、さらに純水で洗浄を行った。
(5)濃度と蛍光強度の関係
ハイブリダイゼーションを行ったDNAチップを蛍光スキャナ(商品名：GenePix4000B；Axon Instruments, Inc.製)で波長５３２ｎｍの蛍光観測を行った。その結果、各々のスポットがほぼ円形であり、その直径は45μmであった。そしてＰＭＴ４００Ｖ, レーザーパワー１００％で測定し、プローブ濃度８μＭの蛍光強度を１として、その比を求め、グラフ化した物を図２に示した。図２からわかるとおり、上述したように今回の系では１０μM以下の濃度では、プローブ濃度と蛍光強度が比例関係になっていることがわかる。
(6)ＤＮＡチップの作成
２４本のマイクロチューブに予め配列番号１のオリゴヌクレオチドを０．０１２５ｎｍｏｌになるように自動分注システムを用いて分注し、乾燥させた。これを、グリセリン7.5重量%、尿素7.5重量％、チオジグリコール7.5重量％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールE100；川研ファインケミカル(株)社製)1重量％を含む水溶液１００ｍＬに（計算上は８μＭになるように）溶解させた。
【００５５】
この溶液を９６穴マルチウェルプレートに入れ替え、プレートリーダーで吸光度を測定し、これを濃度に換算した。この結果を図５に示した。なお、この時の３σ／平均値は0.078であった。このウェルプレートからバブルジェットヘッドのリザーバーへとプローブ溶液を移動させ、(1)で作成したスライドガラスに別々にスポッティングした。プローブを含む溶液をスポッティングしたスライドガラスを室温で10分間放置し、1MNaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)で洗浄した。
(7)ブロッキング・ハイブリダイゼーション反応
(4)と同様の方法で、ブロッキング、ハイブリダイゼーション反応を行った。
(8)結果
ハイブリダイゼーションを行ったDNAチップを蛍光スキャナ(商品名：GenePix4000B；Axon Instruments, Inc.製)で波長５３２ｎｍの蛍光観測を行った。その結果、各々のスポットがほぼ円形であり、その直径は45μmであった。そしてＰＭＴ４００Ｖ、レーザーパワー１００％で測定し、その結果を図６に示した。この蛍光強度の３σ／平均値は、０．０６６であった。（５）で示したように今回用いた濃度領域では、プローブ濃度と蛍光強度は比例関係であるので、検量線を用いずに、さらに図５で示した濃度で割って補正した。その結果も図６に記した。この補正後の３σ／平均値は、０．０１６であった。
このように、補正を行わない結果よりも補正を行った結果の方がバラツキが大幅に低減されていることがわかる。
【００５６】
上述のように、１種類のプローブを複数スポットし、その濃度のバラツキによる測定値の変動を補正することが可能である。複数種類のプローブを同一固相担体にスポットした場合についても、各プローブごとに同様の操作により測定結果の補正が可能である。
【００５７】
効果かつ貴重なプローブを固相担体に固定したプローブ固定担体の製造には、プローブあるいはプローブ溶液の少量ハンドリング技術が必要になるが、少量ハンドリングを正確に行うには限界がある。しかし、以上の結果から本発明を用いれば、正確性が一部欠いても、正確な検出結果が得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】シランカップリング剤濃度とＤＮＡチップ性能の関係を示す図である。
【図２】プローブ濃度とＤＮＡチップ性能の関係を示す図である。
【図３】プローブ付与量とＤＮＡチップ性能の関係を示す図である。
【図４】プローブ付与量と面積との関係を示す図である。
【図５】各プローブ溶液間での濃度のバラツキを示す図である。
【図６】実施例１の結果を示す結果である。
【図７】ネットワークを利用した遺伝子診断の概念図を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１    プローブ溶液
２    プローブスポッター
３    製品データ
４    プローブ濃度測定機能付きインクジェットヘッド
５    記録媒体
６    ＤＮＡチップ
７    記録媒体
８    検査装置
９    製品データ
１０  濃度データ
１１  分析用のドライブ
１２  診断ソフト
１３  測定結果
１４  蛍光検出器
１５  診断結果
１６  ユーザー
１７  メーカー
【図１】
0004789518.tif 000002
【図２】
0004789518.tif 000003
【図３】
0004789518.tif 000004
【図４】
0004789518.tif 000005
【図５】
0004789518.tif 000006
【図６】
0004789518.tif 000007
【図７】
0004789518.tif 000008
【配列表】
0004789518000001.app