(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋コラーゲンを調製するための方法であって、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションして、架橋コラーゲンを形成させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの極性溶媒が、少なくとも１つの有機極性溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの有機極性溶媒がアルコールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの有機極性溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの極性溶媒が水に混和性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が、緩衝剤を含む緩衝化溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が、リン酸緩衝化生理食塩水を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水、５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある前記少なくとも１つの極性溶媒、および緩衝剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記コラーゲンが、天然コラーゲン、繊維状コラーゲン、繊維状アテロペプチドコラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物起源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コラーゲンが、単分子状アテロペプチドコラーゲンから再構成された繊維状コラーゲンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記コラーゲンが、天然コラーゲンのタンパク質分解的消化により得られる単分子状アテロペプチドコラーゲンを再構成することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの還元糖が、下記の式Ｉまたは式ＩＩ：
【化１】
0004664568.tif 000014
（式中、
Ｒ1は、Ｈまたは低級のアルキルもしくはアルキレン、アミノ酸、ペプチド、サッカリド、プリン塩基またはピリミジン塩基、リン酸化プリン塩基またはリン酸化ピリミジン塩基であり、
ｎは２〜９の整数であり、そして
ｐおよびｑはそれぞれ独立して０〜８の整数であり、ただし、ｐおよびｑの和は少なくとも２であり、かつ８以下である）
のいずれかによって表される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの還元糖が、天然に存在する還元糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの還元糖が、ジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、セプトース、オクトース、ナノースまたはデコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの還元糖が、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの還元糖が二糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記二糖が、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノースおよびトレハロースからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの物質が、前記インキュベーション工程が行われている溶液に加えられ、前記マトリックス内に固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの物質が、抗菌剤、抗炎症剤、組織誘導性を有する因子、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの還元糖がＤ（−）リボースであり、かつ前記少なくとも１つの極性溶媒がエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水および５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にあるエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶液が２５％〜５０％（ｖ／ｖ）の範囲にある水および５０％〜７５％（ｖ／ｖ）の範囲にあるエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶液が約３０％（ｖ／ｖ）の水および約７０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶液におけるＤ（−）リボースの濃度が０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶液におけるＤ（−）リボースの濃度が０．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記インキュベーション工程の後、前記架橋コラーゲンを洗浄して、前記少なくとも１つの極性溶媒および過剰な前記少なくとも１つの還元糖を除く工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記架橋コラーゲンを脱水する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記架橋コラーゲンを臨界点乾燥に供する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インキュベーション工程の前に前記コラーゲンを乾燥または凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記架橋コラーゲンを乾燥または凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載される方法によって調製される架橋コラーゲン調製物。
【請求項３２】
架橋コラーゲンを調製するための方法であって、水、少なくとも１つの親水性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションして、前記架橋コラーゲンを形成させる工程を含む方法。
【請求項３３】
前記インキュベーション工程の前記インキュベーションの継続時間を制御して、前記架橋コラーゲンの架橋度を制御する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インキュベーション工程において使用される前記少なくとも１つの還元糖の濃度を制御して、前記架橋コラーゲンの架橋度を制御する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記インキュベーション工程において使用される前記少なくとも１つの親水性溶媒の濃度を制御して、前記架橋コラーゲンの架橋度を制御する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの還元糖の未反応量の少なくとも一部を除き、かつ前記少なくとも１つの親水性溶媒の少なくとも一部を除く工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記架橋コラーゲンを洗浄して、前記少なくとも１つの還元糖の未反応量の少なくとも一部を除き、かつ前記少なくとも１つの親水性溶媒の少なくとも一部を除く工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
架橋コラーゲンを調製するための方法であって、水、少なくとも１つの極性溶媒およびＤ（−）リボースを含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程を含む方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの極性溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記コラーゲンが、天然コラーゲン、繊維状コラーゲン、繊維状アテロペプチドコラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物起源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記コラーゲンが、単分子状アテロペプチドコラーゲンから再構成された繊維状コラーゲンを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記コラーゲンが、天然コラーゲンのタンパク質分解的消化により得られる単分子状アテロペプチドコラーゲンを再構成することによって得られるアテロペプチド繊維状コラーゲンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶液におけるＤ（−）リボースの濃度が０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記溶液におけるＤ（−）リボースの濃度が０．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記溶液が１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水および５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある前記少なくとも１つの極性溶媒を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記溶液が１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にあるリン酸緩衝化生理食塩水および５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある前記少なくとも１つの極性溶媒を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶液が、緩衝剤を含む緩衝化溶液である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記溶液がリン酸緩衝化生理食塩水を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶液が、１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水、５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある少なくとも１つの極性溶媒、および緩衝剤を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
架橋コラーゲンを調製するための方法であって、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中で再構成アテロペプチド繊維状コラーゲンをインキュベーションする工程を含む方法。
【請求項５１】
前記溶液が緩衝化溶液である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを調製するための方法であって、
水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程、および
前記インキュベーション工程の前記コラーゲンをインキュベーションする継続時間を制御して、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを得る工程
を含む、方法。
【請求項５３】
所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを調製するための方法であって、
水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程、および
前記少なくとも１つの極性溶媒の濃度を選択して、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを得る工程
を含む、方法。
【請求項５４】
所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを調製するための方法であって、
水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程、および
前記インキュベーション工程において使用される前記少なくとも１つの糖の濃度を選択して、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを得る工程
を含む、方法。
【請求項５５】
繊維状コラーゲンからその調製のためのプロセスにより得られる改善された架橋繊維状コラーゲンマトリックスであって、前記プロセスが、下記の工程：
再構成された繊維状コラーゲンを含むマトリックスを提供する工程、および
前記繊維状コラーゲンを架橋するために、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中で前記マトリックスをインキュベーションして、架橋繊維状コラーゲンマトリックスを形成させる工程
を含む、架橋繊維状コラーゲンマトリックス。
【請求項５６】
移植可能なデバイスの形態である、請求項５５に記載のマトリックス。
【請求項５７】
前記移植可能なデバイスが、ガイドされた組織再生のためのコラーゲンベース膜バリアである、請求項５６に記載のマトリックス。
【請求項５８】
前記プロセスが、前記インキュベーション工程の後に前記架橋コラーゲンマトリックスを洗浄して、前記少なくとも１つの極性溶媒の少なくとも一部および未反応の過剰な前記少なくとも１つの還元糖を除く工程をさらに含む、請求項５５に記載のマトリックス。
【請求項５９】
前記プロセスが、前記架橋繊維状コラーゲンマトリックスを脱水する工程をさらに含む、請求項５５に記載のマトリックス。
【請求項６０】
前記プロセスが、前記架橋繊維状コラーゲンマトリックスを臨界点乾燥に供する工程をさらに含む、請求項５５に記載のマトリックス。
【請求項６１】
前記プロセスが、前記架橋繊維状コラーゲンマトリックスを乾燥または凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項５５に記載のマトリックス。
【請求項６２】
前記繊維状コラーゲンが、単分子状アテロペプチドコラーゲンから再構成された繊維状コラーゲンを含む、請求項５５に記載のマトリックス。
【請求項６３】
前記繊維状コラーゲンが、天然コラーゲンのタンパク質分解的消化により得られる単分子状アテロペプチドコラーゲンを再構成することによって調製される、請求項５５に記載のマトリックス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、概して架橋コラーゲンマトリックスおよび調製物に関し、より詳細には、還元糖を用いてコラーゲンを架橋するための新規な方法、ならびにこの方法を用いて形成される架橋コラーゲンマトリックスおよび調製物に関する。
【０００２】
【発明の背景】
コラーゲンは、哺乳動物生物の全タンパク質の約２５％〜３０％を占める動物界の重要な分子である。コラーゲンは、繊維状ネットワークおよび他の形態の超構造体として組織化されている天然の生体ポリマーである。繊維状コラーゲンおよび特にＩ型コラーゲンは最大の存在率を有し、結合組織タンパク質の８０％を占めている。繊維状コラーゲンの高い存在率、様々な動物起源からそれらが得られること、および三次元の繊維状マトリックスに重合させることができる精製されたコラーゲンを抽出することができ、かつそのモノマー溶液を調製することができることにより、これらのコラーゲンは天然の生体物質の理想的な候補物になっている。さらに、繊維状コラーゲンは高い保存度を示しており、従って、弱い抗原である。繊維状コラーゲン分子の主要な抗原性部位は、分子のらせん部分に隣接する非らせんのテロペプチド内に存在する。
【０００３】
インビボでは、繊維状コラーゲンのポリマー構造は、酵素プロセスによって形成される分子間の架橋によって安定化されている。コラーゲン分子がスタッガーアセンブリ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）であるために、これらの架橋のほとんどは、１つの分子のテロペプチドドメインと隣接分子のらせんドメインとの間で架橋している。グリケーションのプロセスによるさらなる架橋形成が、コラーゲンおよび結合組織の老化の一部として生じている。
【０００４】
コラーゲンを含むタンパク質のグリケーションが、タンパク質がグルコースに曝された結果として起こる、生涯にわたる老化の生理学的プロセスとして生じている。グリケーションされた繊維状コラーゲンは、増大した架橋レベルを示しており、従って、コラーゲンを分解する特異的な酵素であるコラゲナーゼによる分解に対してより大きい抵抗性を有することが見出されていた。
【０００５】
グルコースによるグリケーションの過程は遅い。これは、血清中におけるその生理学的濃度が比較的低く、従って、そのほんの小さい割合が、反応性形態である非環状のアルデヒド形態で見出されているからである。Ｄ（−）リボースが、繊維状コラーゲンにおけるコラーゲン分子のグリケーションおよび架橋を誘導する際にグルコースよりも１０００倍大きい反応性を有することが見出されていた。例えば、天然の繊維状コラーゲンを０．２ＭのＤ（−）リボース中で５日間インキュベーションすることは、生理学的濃度のグルコースに２０年間曝されることと等価である。グリケーションによる架橋によって生じる架橋は、主として、隣接分子の三重らせんドメイン間で生じる。
【０００６】
コラーゲンに基づく生体製造物の性能は、一方では、宿主内におけるその機能的寿命を制御することに依存しており、他方では天然コラーゲン成分の生物学的性質の保持に依存している。コラーゲン成分の機能的寿命は、コラゲナーゼ（メタロプロテイナーゼ）による特異的な酵素分解に対するその抵抗能に依存している。この能力は、直接的には、コラーゲンポリマー内の分子内架橋および分子間架橋の数に関連している。架橋の数が多いほど、コラゲナーゼ分解抵抗性が大きくなる。
【０００７】
この分野で知られている優れた例示的な架橋剤は、現在まで、グルタルアルデヒドおよび他の関連する非生理学的な薬剤である。これらの架橋剤は、コラーゲン分子のアミノ酸残基と反応して、分子間の架橋を形成する。しかし、これらの強力な薬剤は、架橋コラーゲンに基づく生体製造物の生物適合性および生物学的活性に対して負の影響を及ぼし得る。そのような負の影響は、コラーゲン分子のコンホメーションの変化によって、そして架橋剤が浸出することによってもたらされる。従って、非生理学的な薬剤によって架橋されたコラーゲン製造物は、宿主組織によって良好に受け入れられず、また宿主組織内における一体化は良くない。さらに、局所的な炎症およびより複雑な全身的反応は、グルタルアルデヒドで架橋されたコラーゲン製造物の不都合な副作用である。
【０００８】
米国特許第４，９７１，９５４号（Ｂｒｏｄｓｋｙ他）には、グリケーションのプロセスによってコラーゲンマトリックスを架橋するための生理学的な薬剤としてＤ（−）リボースまたは他の還元性の生理学的な糖を使用することが開示されている。しかし、Ｂｒｏｄｓｋｙ他によって開示された方法は、コラーゲン性基質が天然のコラーゲン繊維からなる場合には効率的であるが、再構成された繊維状コラーゲンから製造されたコラーゲンマトリックスに対して、特に、コラーゲンがアテロペプチドコラーゲンである場合は部分的に有効であるにすぎない。アテロペプチドコラーゲンは、天然のコラーゲンをペプシンで可溶化することによって製造される。ペプシンはコラーゲン分子の抗原性テロペプチドを切り離すので、ペプシン可溶化コラーゲンは、生物医学産業において最も多く利用されている形態である。
【０００９】
Ｂｒｏｄｓｋｙ他によって米国特許第４，９７１，９５４号に開示された方法では、架橋はグリケーションのプロセスにより生じている。このプロセスにおいて、非環状形態のＤ（−）リボースが、コラーゲン分子の三重らせんドメイン内に位置するリシル残基およびヒドロキシリシル残基のε−アミノ基と自発的に縮合する。縮合生成物はシッフ塩基であり、これはアマドリ転移を受けて、ケトアミン付加物を形成する。隣接するコラーゲン分子上に位置するケトアミンは縮合して、共有結合した架橋を形成するが、その正確な性質は、蛍光性の複素環構造および他のタイプが近年提案されているとしても、まだ明らかにされていない。
【００１０】
Ｂｒｏｄｓｋｙ他は、例えば、ラットの腱に由来する天然の繊維状Ｉ型コラーゲンなどの天然の繊維状Ｉ型コラーゲンに対するグリケーションプロセスを開示している。しかし、Ｂｒｏｄｓｋｙ他のグリケーション法による架橋は可逆的である。例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２６３（３３）巻、１７６５０頁〜１７６５７頁、１９８８）に発表された「糖由来の架橋により二量体化したコラーゲン鎖の単離および部分的特徴付け」と題する論文において、Ｔａｎａｋａ他は、Ｄ（−）リボースで１日間にわたって架橋したラットの腱コラーゲンは、５日の期間が終了したときに５０％の可逆性の範囲にあることを示している。
【００１１】
米国特許第５，９５５，４３８号（Ｐｉｔａｒｕ他）は、なかでも、膜に形成され、次いでＤ（−）リボースなどの還元糖によって架橋されるアテロペプチドの再構成されたコラーゲンフィブリルから作製されるコラーゲンマトリックスおよびコラーゲン膜の調製方法を開示している。それらから作製された膜またはインプラントは、その後、インプラントの三次元形状を保持しながら乾燥および滅菌するために臨界点乾燥に供される。臨界点乾燥法により、コラーゲンマトリックスのコラゲナーゼ分解抵抗性が改善される。
【００１２】
天然コラーゲンをＤ（−）リボースで架橋することにより、天然のコラーゲン繊維はコラゲナーゼ分解に対して抵抗性になる。しかし、アテロペプチドの再構成されたコラーゲンフィブリルのＤ（−）リボースによる架橋は、コラゲナーゼ分解に対するその抵抗性の増大において無視できるほどの効果しかない。この理由は不明である。Ｔａｎａｋａ他による研究（参考文献リストを参照のこと）は、リボースにより誘導される、天然コラーゲン分子間の架橋が、主として隣接コラーゲン分子の三重らせん部分間で生じていることを示しているので、テロペプチドの除去は、アテロペプチドコラーゲンの架橋度に影響を及ぼさないはずである。１つの考えられる説明は、再構成されたコラーゲンフィブリルにおけるアテロペプチドコラーゲン分子の充填が、（参考文献リストの参考文献１６で議論されているように）天然のコラーゲンフィブリルにおける充填とは異なるということである。充填のこの違いが、次に、Ｄ（−）リボースにより形成された共有結合架橋の強さおよび数の低下を生じさせ得る分子間距離またはアラインメントの変化を生じさせ得ると考えられる。
【００１３】
【発明の要旨】
従って、本発明の好ましい実施形態により、架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションして、架橋コラーゲンを形成させる工程を含む。
【００１４】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖は還元糖である。
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、極性溶媒は有機極性溶媒である。
【００１５】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、有機極性溶媒はアルコールである。
【００１６】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、有機極性溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００１７】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、極性溶媒は、水に混和性である。
【００１８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は、緩衝剤を含む緩衝化溶液である。
【００１９】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液はリン酸緩衝化生理食塩水を含む。
【００２０】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は、１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水、５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある少なくとも１つの極性溶媒、および緩衝剤を含む。
【００２１】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、コラーゲンは、天然コラーゲン、繊維状コラーゲン、繊維状アテロペプチドコラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物起源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００２２】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、コラーゲンは、単分子状アテロペプチドコラーゲンから再構成された繊維状コラーゲンを含む。
【００２３】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、コラーゲンは、天然コラーゲンのタンパク質分解的消化により得られる単分子状アテロペプチドコラーゲンを再構成することによって得られる。
【００２４】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖は、下記の式Ｉまたは式ＩＩのいずれかによって表される化合物である：
【００２５】
【化２】
0004664568.tif 000002
【００２６】
式中、
Ｒ1は、Ｈまたは低級のアルキルもしくはアルキレン、アミノ酸、ペプチド、サッカリド、プリン塩基またはピリミジン塩基、リン酸化プリン塩基またはリン酸化ピリミジン塩基であり、
ｎは２〜９の整数であり、そして
ｐおよびｑはそれぞれ独立して０〜８の整数であり、ただしｐおよびｑの和は少なくとも２であり、かつ８以下である。
【００２７】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖は、天然に存在する還元糖である。
【００２８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖は、ジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、セプトース、オクトース、ナノースまたはデコースである。
【００２９】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖は、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースからなる群から選択される。
【００３０】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖は二糖である。
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、二糖は、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノースおよびトレハロースからなる群から選択される。
【００３１】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、少なくとも１つの物質が、インキュベーション工程が行われている溶液に加えられ、マトリックス内に固定化される。
【００３２】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、物質は、抗菌剤、抗炎症剤、組織誘導性を有する因子、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００３３】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、糖はＤ（−）リボースであり、かつ極性溶媒はエタノールである。
【００３４】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水および５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にあるエタノールを含む。
【００３５】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は２５％〜５０％（ｖ／ｖ）の範囲にある水および５０％〜７５％（ｖ／ｖ）の範囲にあるエタノールを含む。
【００３６】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は約３０％（ｖ／ｖ）の水および約７０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む。
【００３７】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液中におけるＤ（−）リボースの濃度は０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００３８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液中におけるＤ（−）リボースの濃度は０．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００３９】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、インキュベーション工程の後、架橋コラーゲンを洗浄して、極性溶媒および過剰な糖を除く工程をさらに含む。
【００４０】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、架橋コラーゲンを脱水する工程をさらに含む。
【００４１】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、架橋コラーゲンを臨界点乾燥に供する工程をさらに含む。
【００４２】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、インキュベーション工程の前にコラーゲンを乾燥または凍結乾燥する工程をさらに含む。
【００４３】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、架橋コラーゲンを乾燥または凍結乾燥する工程をさらに含む。
【００４４】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、本明細書中上記に開示される方法によって調製される架橋コラーゲン調製物が提供される。
【００４５】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの親水性溶媒および少なくとも１つの糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションして、架橋コラーゲンを形成させる工程を含む。
【００４６】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、インキュベーション工程のインキュベーションの継続時間を制御して、架橋コラーゲンの架橋度を制御する工程をさらに含む。
【００４７】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、インキュベーション工程において使用される糖の濃度を制御して、架橋コラーゲンの架橋度を制御する工程をさらに含む。
【００４８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、インキュベーション工程において使用される親水性溶媒の濃度を制御して、架橋コラーゲンの架橋度を制御する工程をさらに含む。
【００４９】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、糖の未反応量の少なくとも一部を除き、かつ親水性溶媒の少なくとも一部を除く工程をさらに含む。
【００５０】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、この方法は、架橋コラーゲンを洗浄して、糖の未反応量の少なくとも一部を除き、かつ親水性溶媒の少なくとも一部を除く工程をさらに含む。
【００５１】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの極性溶媒およびＤ（−）リボースを含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程を含む。
【００５２】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、極性溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００５３】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、コラーゲンは、天然コラーゲン、繊維状コラーゲン、繊維状アテロペプチドコラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物起源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００５４】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、コラーゲンは、単分子状アテロペプチドコラーゲンから再構成された繊維状コラーゲンを含む。
【００５５】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、コラーゲンは、天然コラーゲンのタンパク質分解的消化により得られる単分子状アテロペプチドコラーゲンを再構成することによって得られるアテロペプチド繊維状コラーゲンである。
【００５６】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液におけるＤ（−）リボースの濃度は０．１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００５７】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液におけるＤ（−）リボースの濃度は０．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【００５８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水および５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある少なくとも１つの極性溶媒を含む。
【００５９】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にあるリン酸緩衝化生理食塩水および５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある少なくとも１つの極性溶媒を含む。
【００６０】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は、緩衝剤を含む緩衝化溶液である。
【００６１】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液はリン酸緩衝化生理食塩水を含む。
【００６２】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は、１５％〜９５％（ｖ／ｖ）の範囲にある水、５％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲にある少なくとも１つの極性溶媒、および緩衝剤を含む。
【００６３】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの還元糖を含む溶液中で再構成アテロペプチド繊維状コラーゲンをインキュベーションする工程を含む。
【００６４】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、溶液は緩衝化溶液である。
また、本発明の別の好ましい実施形態により、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程、およびコラーゲンをインキュベーションする継続時間を制御して、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを得る工程を含む。
【００６５】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程、および極性溶媒の濃度を選択して、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを得る工程を含む。
【００６６】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを調製するための方法が提供される。この方法は、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの糖を含む溶液中でコラーゲンをインキュベーションする工程、およびインキュベーション工程において使用される糖の濃度を選択して、所望する分解抵抗性を有する架橋コラーゲンを得る工程を含む。
【００６７】
また、本発明の別の好ましい実施形態により、その調製プロセスによって繊維状コラーゲンから得られる改善された架橋繊維状コラーゲンマトリックスが提供される。このプロセスは、再構成された繊維状コラーゲンを含むマトリックスを提供する工程、および繊維状コラーゲンを架橋するために、水、少なくとも１つの極性溶媒および少なくとも１つの糖を含む溶液中でマトリックスをインキュベーションして、架橋繊維状コラーゲンマトリックスを形成させる工程を含む。
【００６８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、マトリックスは、移植可能なデバイスの形態である。
【００６９】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、移植可能なデバイスは、ガイドされた（ｇｕｉｄｅｄ）組織再生のためのコラーゲンベース膜バリアである。
【００７０】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、マトリックスを調製するために使用されるこのプロセスは、インキュベーション工程の後に架橋コラーゲンマトリックスを洗浄して、極性溶媒の少なくとも一部および未反応の過剰な糖を除く工程をさらに含む。
【００７１】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、このプロセスは、架橋された繊維状コラーゲンマトリックスを脱水する工程をさらに含む。
【００７２】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、マトリックスを調製するために使用されるこのプロセスは、架橋された繊維状コラーゲンマトリックスを臨界点乾燥に供する工程をさらに含む。
【００７３】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、マトリックスを調製するために使用されるこの方法は、架橋された繊維状コラーゲンマトリックスを乾燥または凍結乾燥する工程をさらに含む。
【００７４】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態により、繊維状コラーゲンは、単分子状アテロペプチドコラーゲンから再構成された繊維状コラーゲンを含む。
【００７５】
最後に、本発明の別の好ましい実施形態により、繊維状コラーゲンは、天然コラーゲンのタンパク質分解的消化により得られる単分子状アテロペプチドコラーゲンを再構成することによって調製される。
【００７６】
（発明の詳細な説明）
本発明を理解し、そして本発明が実際にどのように実施され得るかを理解するために、いくつかの好ましい実施形態を、添付された図面を参照して、単なる非限定的な実施例として次に記載する。
【００７７】
本発明は、Ｄ（−）リボースなどの還元糖で架橋されたアテロペプチド再構成コラーゲンの新規な調製方法を開示する。この方法は、アテロペプチド再構成コラーゲンマトリックスの安定した架橋をＤ（−）リボースが誘導できないことを克服し、そして天然または再構成されたコラーゲンマトリックスを架橋するＤ（−）リボースの能力を改善する。この方法は、本方法により形成されるＤ（−）リボース架橋コラーゲンマトリックスの生分解速度を正確に制御することができる。
【００７８】
Ｐｉｔａｒｕ他によって米国特許第５，９５５，４３８号に開示される方法において、発明者らは、繊維状コラーゲンマトリックスの緩衝化されたリボース水溶液中における架橋、それに続く、Ｄ（−）リボースによって架橋されたコラーゲンマトリックスに基づくインプラントの三次元形状を保つための臨界点乾燥プロセスを開示している。リボース水溶液中でのインキュベーションによる架橋工程の後に臨界点乾燥工程を使用することにより、得られた架橋コラーゲンマトリックスのコラゲナーゼ抵抗性が改善されることが知られていた。
【００７９】
本発明の発明者らは、極性溶媒、例えば、約３０％〜８５％（ｖ／ｖ）の濃度範囲で、エタノール（これに限定されない）が、架橋工程においてコラーゲンがインキュベーションされる緩衝化されたＤ（−）リボース溶液に含まれる場合、得られた架橋コラーゲンの分解抵抗性（細菌コラゲナーゼによる分解に対する抵抗性として測定される）が、Ｄ（−）リボースを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でコラーゲンマトリックスをインキュベーションすることによって得られる架橋コラーゲンマトリックスの分解抵抗性と比較して、驚くほど、そして予想外に改善されたことを見出した。
【００８０】
別の予想外の発見は、Ｄ（−）リボースのアルコール性溶液中でインキュベーションされた架橋コラーゲンの分解抵抗性が、Ｄ（−）リボースを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でコラーゲンマトリックスをインキュベーションし、その後、臨界点乾燥することによって得られる架橋コラーゲンマトリックス（米国特許第５，９５５，４３８号に開示されるように調製される架橋コラーゲンマトリックス）の分解抵抗性よりも著しく大きいということであった。
【００８１】
（実施例１）
コラーゲンマトリックスを、米国特許第５，９５５，４３８号に開示される方法を使用してコラーゲンから調製した。簡単に記載すると、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ（ＡＲ、米国）から市販されているウシの腱から調製され、０．０１ＭのＨＣｌに溶解され、そして４℃で維持されている分子精製されたペプシン処理のＩ型ウシコラーゲンの溶液（１〜１０ミリグラム／ミリリットル）を０．１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に中和して、適切な鋳型に注入し、２０℃〜３８℃の範囲の温度で２４時間インキュベーションする。製造されたマトリックスは、その後、過剰な溶液を除くために、ピストンによって圧縮される。その後、得られたコラーゲン膜を下記の５タイプの異なる処理に供した。
【００８２】
処理群１−この群の膜はＰＢＳ中で１１日間インキュベーションされた。
処理群２−この群の膜は３％のＤ（−）リボースのＰＢＳ溶液中で１１日間インキュベーションされた。
【００８３】
処理群３−この群の膜は３％のＤ（−）リボースのＰＢＳ溶液中で１１日間インキュベーションされた。インキュベーション後、膜をＰＢＳで数回洗浄して、Ｄ（−）リボースを除いた。次いで、膜を、増大する濃度の一連のエタノール溶液（３０％〜１００％のエタノール）で脱水し、その後、米国特許第５，９５５，４３８号の第７欄４行〜１５行に詳しく開示されるような臨界点乾燥に供した。
【００８４】
処理群４−この群の膜は、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ、７０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび３％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースを含む溶液中で１１日間インキュベーションされた。
【００８５】
処理群５−この群の膜は、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ、７０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび３％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースを含む溶液中で１１日間インキュベーションされた。インキュベーション後、膜をＰＢＳで数回洗浄して、Ｄ（−）リボースを除いた。次いで、膜を、増大する濃度の一連のエタノール溶液（７０％〜１００％のエタノール）で脱水し、その後、本明細書中上記の処理群３に開示されるような臨界点乾燥に供した。
【００８６】
上記に開示される処理が完了した後、すべての膜を細菌コラゲナーゼ消化に対する抵抗性について試験した。試験は、分解緩衝液の１ミリリットルあたり３５０ユニットの細菌コラゲナーゼを含む溶液中で試験膜を指示された時間にわたってインキュベーションすることによって行われた。分解緩衝液には、１１１ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＺｎＣｌ2および２１．３ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ＝７．４５）が含まれた。細菌コラゲナーゼは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＭＯ、米国）から市販されている細菌コラゲナーゼ（カタログ番号Ｃ−９８９１）である。コラゲナーゼアッセイが終了したとき、上清およびペレットにおける消化コラーゲンおよび非消化コラーゲンの量を、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（第３２巻、３３頁〜４３頁、１９９６）に発表された、「コラーゲンの濃度を測定するためのＬｏｗｒｙ法の改変」と題するＫｏｍｓａ−Ｐｅｎｋｏｖａ  Ｒ．他による論文に開示されるような改変Ｌｏｗｒｙ法によって測定した。消化コラーゲンの量は、各サンプルにおける総タンパク質の割合として表される。
【００８７】
上記に記載される５タイプの処理に対する結果を下記の表１に示す。
【００８８】
【表１】
0004664568.tif 000003
【００８９】
表１の値は、消化されたコラーゲンの量を、コラゲナーゼを用いた特定のインキュベーション時間での試験されたサンプル膜における総タンパク質の割合として表している。（１００％は、示された消化時間で、サンプルが完全に消化されたことを示し、０％は全く消化されていないことを示している）。
【００９０】
結果は、７０％エタノールと３０％ＰＢＳとの混合液中の３％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースとインキュベーションすることによって架橋された膜（処理群４）の分解抵抗性が、ＰＢＳ中のＤ（−）リボースとインキュベーションすることによって架橋された膜（処理群２）の分解抵抗性よりも高く、そしてまたＰＢＳ中のＤ（−）リボースとインキュベーションすることによって架橋され、その後、脱水および臨界点乾燥に供された膜（処理群３）の分解抵抗性よりも高かったことを示している。
【００９１】
膜が、７０％エタノールと３０％ＰＢＳとの混合液中の３％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースとインキュベーションすることによって架橋され、その後、脱水および臨界点乾燥に供された場合（処理群５）、分解抵抗性が一層さらに増大したこともまた認められた。
【００９２】
従って、本発明の１つの好ましい実施形態により、コラーゲン、またはコラーゲンマトリックス、またはコラーゲンもしくはコラーゲンマトリックスを含む構造体が、反応性（還元性）の糖、ならびにアルコールおよび／または他の親水性有機溶媒を含む緩衝化された溶液中でインキュベーションされる。好ましくは、インキュベーションは３７℃の温度で行われる。しかし、インキュベーション温度は４℃〜６０℃の間で変化させることができる。好ましくは、インキュベーション時間は、所望する架橋度に依存して１日〜２８日の間で変化させることができる。しかし、他の異なるインキュベーション時間もまた、特に分解抵抗性の所望する程度に依存して使用することができる。
【００９３】
好ましくは、糖は、例えば、ＰＢＳなどの緩衝化された生理的食塩水溶液に溶解することによってインキュベーション混合物に導入される。しかし、インキュベーション溶液のｐＨおよび／またはイオン強度を制御するために、この分野で知られている他の好適な緩衝液または緩衝化された生理的食塩水溶液を使用することは可能であり得る。
【００９４】
好ましくは、インキュベーション混合物または溶液におけるアルコール濃度は５０％〜７５％（ｖ／ｖ）の間である。しかし、アルコール濃度は５％〜８５％の間で変化させることができる。還元糖の好ましい濃度は０．５％〜３％（ｗ／ｖ）の間である。しかし、還元糖の濃度は０．１５％〜６％の間で変化させることができる。それにもかかわらず、アルコールおよび／または還元糖の他の異なる濃度もまた、特に、インキュベーション温度、およびｐＨレベルなどの他の反応条件に依存して、そして生成物の所望する分解抵抗性に依存して使用することができる。
【００９５】
一般に、本発明の１つの好ましい実施形態により、本発明のコラーゲンマトリックスの架橋は下記のように行われる。最初に、繊維状コラーゲンの調製物またはマトリックスが、この分野で知られている、コラーゲンマトリックスまたはコラーゲンフィブリル調製物を調製する方法のいずれかに従って調製される。コラーゲンは、下記に記載される実施例に示される方法だけでなく、使用され得るコラーゲンを調製することに関して、この分野で知られている方法または上記の米国特許のいずれかに開示される方法のいずれかによって調製することができる。コラーゲンマトリックスは、エタノールおよびＤ（−）リボースを含む中性の緩衝化された水溶液中でインキュベーションされる。エタノールの濃度は、好ましくは約７０％（ｖ／ｖ）であるが、約３０％〜８５％（ｖ／ｖ）の範囲内にすることができる。Ｄ（−）リボースの濃度は、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）であるが、約０．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲内にすることができる。インキュベーション時間は、所望する架橋度に従って決定される。典型的には、１４日間のインキュベーション期間を使用することができが、インキュベーション時間は約１日〜２１日の範囲内で変化させることができる。
【００９６】
（実施例２）
本実施例では、エタノール−リボース溶液によって架橋された注射可能なコラーゲンマトリックスの調製が開示される。
【００９７】
繊維状コラーゲンのマトリックスを、本明細書中上記の実施例１に詳しく開示されるように、ペプシン処理されたウシ腱のＩ型コラーゲンから調製する。冷却された酸性コラーゲン溶液（ｐＨ３、３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度）をリン酸アルカリ緩衝液で中和し、３７℃に加温して、２４時間激しく撹拌する。連続した撹拌により、１５０ミクロンの範囲で小粒子が形成される。３７℃で２４時間インキュベーションした後に得られた繊維状コラーゲンの粒子状マトリックスを遠心分離して、コラーゲン粒子を沈殿させる。上清を除き、ペレットを、遠心分離および再懸濁を繰り返すことによってリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄する。
【００９８】
上記のようにして調製された粒子状コラーゲンマトリックスのサンプルを４つの群に分けた。各群には４つの異なる処理の１つを施した：
群Ａ：粒子状コラーゲンマトリックスを、７０％（ｖ／ｖ）エタノール、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳおよび３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースを含む溶液中で１４日間インキュベーションした。
【００９９】
群Ｂ：粒子状コラーゲンマトリックスを、ＰＢＳに溶解された３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中で１４日間インキュベーションした。
【０１００】
群Ｃ：粒子状コラーゲンマトリックスを、７０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳを含む溶液中で１４日間インキュベーションした。
【０１０１】
群Ｄ：粒子状コラーゲンマトリックスをＰＢＳ中で１４日間インキュベーションした。
【０１０２】
インキュベーション期間後、サンプルをグリケーションレベルについて分析した。リボース残基の数は分子間架橋の推定される数を示しており、１ｍｇの架橋コラーゲンから還元により放出されるホルムアルデヒドの量によって表される。アッセイ方法は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（第２６３号、１７６５０頁〜１７６５７頁、１９８８）に発表された「糖由来の架橋により二量体化したコラーゲン鎖の単離および部分的特徴付け」と題する論文において、Ｔａｎａｋａ  Ｓ．、Ａｖｉｇａｄ  Ｇ．、Ｅｉｋｅｎｂｅｒｒｙ  Ｅ．Ｆ．およびＢｒｏｄｓｋｙ  Ｂ．によって、そしてＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（第１３４号、４９９頁〜５０４頁、１９８３）に発表された「他のホルムアルデヒドアルデヒド類の簡便な分光測定法による測定：過ヨウ素酸酸化されたグリコール系への応用」と題する論文においてＡｖｉｇａｄ  Ｇ．によって記載されるように使用した。
【０１０３】
同じサンプルはまた、本明細書中上記の実施例１について詳しく開示されるように、細菌コラゲナーゼによる分解について分析された。アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１０４】
次に図１Ａを参照する。図１Ａは、１ミリグラムのサンプルあたり形成されたホルムアルデヒドのナノモル数として表されるサンプル中の分子間架橋の数に対する群Ａ〜Ｄの４つの異なるインキュベーション処理の影響を例示する棒グラフである。１と記される垂直棒は実施例２の群Ａに対する結果を表し、２と記される垂直棒は実施例２の群Ｂに対する結果を表し、３と記される垂直棒は実施例２の群Ｃに対する結果を表し、４と記される垂直棒は実施例２の群Ｄに対する結果を表す。図１Ａのそれぞれの棒は３つの異なる測定値の平均値を表し、キャップ付きの棒は平均値の標準偏差を表す。
【０１０５】
エタノール中でインキュベーションされた粒子状コラーゲンマトリックス（実施例２の群Ｃ）の架橋数は、大ざっぱには、ＰＢＳ中でインキュベーションされたコントロールの粒子状マトリックス（実施例２の群Ｄ）について認められる架橋数と類似していた。ＰＢＳに溶解された３％Ｄ（−）リボースの溶液中でインキュベーションされた粒子状コラーゲン（実施例２の群Ｂ）における架橋数は、ＰＢＳのみ中でインキュベーションされた粒子状マトリックス（実施例２の群Ｄ）の架橋数よりも約２倍多かった。７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳを含む溶液に溶解された３％Ｄ（−）リボースで処理された粒子状コラーゲン（実施例２の群Ａ）における架橋数は、ＰＢＳ中で、またはリボースを伴うことなく、７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳ中でインキュベーションされた粒子状コラーゲン（それぞれ、実施例２の群Ｄおよび群Ｃ）の架橋数よりも約４倍多く、そしてＰＢＳに溶解された３％Ｄ（−）リボースにおいてインキュベーションされた粒子状コラーゲン（実施例２の群Ｂ）における架橋数よりも２．２６倍多かった。
【０１０６】
次に図１Ｂを参照する。図１Ｂは、細菌コラゲナーゼによる分解に対する粒子状コラーゲンの抵抗性に対する、本明細書中上記に開示される実施例２の群Ａ〜Ｄの４つの異なるインキュベーション処理タイプの影響を例示する概略的な棒グラフである。細菌コラゲナーゼ分解に対する抵抗性は、本明細書中上記の実施例１に開示されるように測定された。
【０１０７】
図１Ｂにおいて、５と記される垂直棒は実施例２の群Ａに対する結果を表し、６と記される垂直棒は実施例２の群Ｂに対する結果を表し、７と記される垂直棒は実施例２の群Ｃに対する結果を表し、８と記される垂直棒は実施例２の群Ｄに対する結果を表す。図１Ｂのそれぞれの棒は３つの異なる測定値の平均値を表し、キャップ付きの棒は平均値の標準偏差を表す。
【０１０８】
図１Ｂに例示される結果は、７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳ中でのインキュベーション（実施例２の群Ｃ）が、細菌コラゲナーゼ分解に対する抵抗性に関して何ら実質的な影響を有しておらず、その影響が、ＰＢＳのみ中でインキュベーションされたコントロールサンプル（実施例２の群Ｄ）の細菌コラゲナーゼ分解に対する抵抗性と類似していたことを明らかにしている。結果は、７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳの存在下で３％リボース中でインキュベーションされた粒子状コラーゲン（実施例２の群Ａ）が、ＰＢＳの存在下で３％Ｄ（−）リボース中でインキュベーションされた粒子状コラーゲンよりも約２０倍大きい細菌コラゲナーゼ分解抵抗性を有し、そしてＰＢＳのみ、または７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳのいずれかの中でインキュベーションされた粒子状コラーゲン（それぞれ、実施例２の群Ｄおよび群Ｃ）よりも３５倍〜４０倍大きい細菌コラゲナーゼ分解抵抗性を有したことを示している。
【０１０９】
温度、ならびに還元糖およびアルコールの濃度が一定に維持されている場合、インキュベーション時間を増大することにより、架橋数の増大および細菌コラゲナーゼ分解に対するコラーゲンマトリックスの抵抗性の増大が生じている。
【０１１０】
次に図２Ａおよび図２Ｂを参照する。これらは、それぞれ、エタノール、ＰＢＳおよびＤ（−）リボースを含有する溶液中でインキュベーションされたコラーゲンマトリックスのグリケーションレベルおよびコラゲナーゼ分解に対するインキュベーション時間の影響を例示する概略的なグラフである。
【０１１１】
粒子状コラーゲンマトリックスを本明細書中上記の実施例２に記載されるように調製した。次いで、調製されたコラーゲンマトリックスを、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳおよび７０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む溶液の３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中で、１日間、３日間、９日間および１４日間にわたってインキュベーションした。それぞれの時点で、マトリックスを、グリケーションのレベルについて（図２Ａ）、そして細菌コラゲナーゼによる消化に対するマトリックスの抵抗能について（図２Ｂ）、本明細書中上記に開示されるグリケーションレベルアッセイおよびコラゲナーゼ分解アッセイを使用することによってアッセイした。
【０１１２】
図２Ａおよび図２Ｂにおいて、横軸はインキュベーション時間を日数で表す。図２Ａの縦軸は、グリケーションレベル（１ミリグラムのコラーゲンから還元により放出されるホルムアルデヒドのナノモル数として表される）を表す。図２Ｂの縦軸は、消化されたコラーゲンの量をサンプル中の総タンパク質の割合として表す。図２Ａおよび図２Ｂにおける各点は、それぞれ、様々なインキュベーション時間におけるグリケーションレベルおよびコラゲナーゼ分解の値の平均値を表す。キャップ付きの棒は平均値の標準偏差を表す（ｎ＝３）。従って、温度、糖濃度およびエタノール濃度が一定に維持されている場合、インキュベーション時間を増大することにより、架橋数の増大およびコラーゲンマトリックスのコラゲナーゼ分解抵抗性の増大が生じている。
【０１１３】
次に図３を参照する。図３は、ＰＢＳおよび様々なエタノール濃度を含む溶液の存在下でＤ（−）リボースにより架橋されたコラーゲンマトリックスの細菌コラゲナーゼによる分解に対する架橋時のエタノール濃度の影響を例示する概略的なグラフである。粒子状コラーゲンマトリックスのサンプルを本明細書中上記の実施例２に詳しく記載されるように調製して、０％、３０％、５０％、７０％および８５％（すべての割合はｖ／ｖとして示される）のエタノールを含有するＰＢＳに溶解された３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中で６日間インキュベーションした。インキュベーション期間が終了したとき、マトリックスのサンプルを、本明細書中上記に詳しく記載されるように、細菌コラゲナーゼ消化に対する抵抗能についてアッセイした。横軸はＰＢＳ含有インキュベーション媒体中のタノール濃度（％ｖ／ｖ）を表す。縦軸は、サンプルコラーゲン全体の割合としての消化されたコラーゲンの量として表される％分解を表す。結果は、特定の架橋反応条件のもとでは、最大のコラゲナーゼ分解抵抗性をもたらすエタノール濃度が約５０％〜８５％の範囲にあることを示している。８５％のエタノール中でインキュベーションされたサンプルの結果から理解され得るように、エタノール濃度を７０％よりも増大することにより、コラゲナーゼ分解抵抗性が低下することが認められる。従って、温度、糖濃度およびインキュベーション時間が一定に維持されている場合、アルコール濃度を特定の最適な濃度まで増大させることにより、架橋数の増大およびコラーゲンマトリックスのコラゲナーゼ分解抵抗性の増大が生じている。
【０１１４】
次に図４を参照する。図４は、Ｄ（−）リボースのエタノール性溶液により架橋されたコラーゲンマトリックスの細菌コラゲナーゼによる分解に対する架橋時のＤ（−）リボース濃度の影響を例示する概略的なグラフである。粒子状コラーゲンマトリックスのサンプルを本明細書中上記の実施例２に詳しく記載されるように調製して、７０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ中のＤ（−）リボース濃度が増大する溶液中で１４日間インキュベーションした。インキュベーション期間が終了したとき、マトリックスサンプルを、本明細書中上記に詳しく記載されるように細菌コラゲナーゼ消化に対する抵抗能についてアッセイした。横軸はインキュベーション溶液中のＤ（−）リボース濃度（％ｗ／ｖ）を表す。縦軸は、コラーゲンマトリックスサンプル全体の割合としての消化されたコラーゲンの量として表される％分解を表す。結果は、特定の架橋反応条件のもとでは、Ｄ（−）リボースの濃度を０．１％〜３％の範囲において増大させることにより、架橋コラーゲンマトリックスの細菌コラゲナーゼによる分解に対する抵抗性が増大していることを明らかにしている。従って、温度、インキュベーション時間およびエタノール濃度が一定に維持されている場合、還元糖の濃度を低下させることにより、架橋数の増大およびコラーゲンマトリックスのコラゲナーゼ分解抵抗性の増大が生じている。
【０１１５】
本明細書中上記に開示される架橋方法はまた、本明細書中下記の実施例３において明らかにされるように、皮膚増強を目的とした市販のコラーゲン調製物の架橋レベルおよび分解抵抗性を増大させることにおいても効果的である。
【０１１６】
（実施例３）
Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）は、ウシの真皮から得られる注射可能な高濃度のペプシン処理アテロペプチドのウシ真皮調製物である。このコラーゲン物質は、注射後または移植後にインビボでフィブリルを形成させるために注射および留置することができる。
【０１１７】
Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）によって製造され、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｅｓｔｈｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＣＡ、米国）から市販されている。（約３５ミリグラム／ミリリットルの濃度で）Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）１物質を３つのサンプル群に分け、これらを下記の処理に供した。
【０１１８】
群１−１ミリリットルのＺｙｄｅｒｍ（登録商標）１を２０ミリリットルのＰＢＳと混合して、１４日間インキュベーションした（これはコントロール群である）。
【０１１９】
群２−１ミリリットルのＺｙｄｅｒｍ（登録商標）１を、ＰＢＳに溶解された３％Ｄ（−）リボースの２０ミリリットルと混合して、１４日間インキュベーションした。
【０１２０】
群３−１ミリリットルのＺｙｄｅｒｍ（登録商標）１を、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳおよび７０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む溶液に溶解された３％Ｄ（−）リボースの２０ミリリットルと混合して、１４日間インキュベーションした。
【０１２１】
すべての群を３７℃でインキュベーションした。
インキュベーション期間が終了したとき、サンプルを、本明細書中上記の実施例２に詳しく記載されるようにコラゲナーゼ分解に対する抵抗性についてアッセイした。アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１２２】
結果を下記の表２に示す。可溶化（分解）コラーゲンの量が、各サンプルにおける総タンパク質の割合として示される。結果は平均値±標準偏差（ｎ＝３）として示される。
【０１２３】
【表２】
0004664568.tif 000004
【０１２４】
表２の結果は、試験されたサンプルにおける総コラーゲンの割合としての消化コラーゲンの量として表されている。結果は、Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）１物質の架橋において、３０％ＰＢＳおよび７０％エタノールを含む溶液に溶解された３％Ｄ（−）リボースを用いたインキュベーションは、ＰＢＳに溶解された３％Ｄ（−）リボース中でのインキュベーションよりも約４倍大きい効力を有することを明らかにしている。
【０１２５】
７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳを含む溶液に溶解された３％Ｄ（−）リボースでＺｙｄｅｒｍ（登録商標）１を処理することにより、細菌コラゲナーゼ分解に耐えるこの物質の能力が５倍増大した（表２）。
【０１２６】
本発明の方法によって調製された注射可能なコラーゲン調製物、例えば、上記の実施例２および実施例３に記載されるようにして調製される注射可能物（これに限定されない）は、なかでも、化粧品、泌尿器学、胃腸病学、耳鼻咽喉科学、整形外科および他の医学分野における皮膚増強、ならびに薬物、タンパク質、ホルモンおよびゲノム物質の制御された送達を含む様々な目的のために利用することができる。
【０１２７】
本発明はまた、成形された移植可能なコラーゲンマトリックスの調製において、エタノール−リボース溶液によって架橋されるコラーゲンマトリックスを利用するために適用することができる。
【０１２８】
（実施例４）
本実施例では、本発明の架橋方法がコラーゲンマトリックスの予備成形されたシートに適用されることが明らかにされる。コラーゲンシートを、本明細書中上記に開示されるように、ウシのペプシン処理されたアテロペプチドのモノマーコラーゲン溶液から調製した。簡単に記載すると、繊維状コラーゲンのマトリックスを、冷却した酸性コラーゲン溶液（ｐＨ３；３ｍｇ／ｍｌ）をリン酸アルカリ緩衝液で中和し、適切な鋳型内で３７℃に溶液を加温することにより調製する。その後、モノマー溶液を重合させることによって形成される繊維状コラーゲン格子を、好適なピストンまたは任意の他の好適な圧縮デバイスを使用することによって圧縮して、液体を格子から絞り出しながら、所望する形態および単位容積あたりのコラーゲン含有量を得る。約３センチメートルの直径および約０．５ミリメートルの厚さを有するコラーゲンディスクが上記のように形成され、これを、３つの異なるインキュベーション溶液中で１１日間インキュベーションした。予備成形されたコラーゲンシートの第１の群をＰＢＳ中でインキュベーションした。予備成形されたコラーゲンシートの第２の群をＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースの溶液中でインキュベーションした。予備成形されたコラーゲンシートの第３の群を、７０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳにおける３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中でインキュベーションした。インキュベーション期間が終了したとき、予備成形されたコラーゲンシートの３つの群を、本明細書中上記に開示されるように、脱水して、臨界点乾燥に供し、そして本明細書中上記の実施例１に開示されるように細菌コラゲナーゼ分解に対するそれらの抵抗性についてアッセイした。アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３５０コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は５時間であった。
【０１２９】
結果を下記の表３に示す。結果は、エタノール／ＰＢＳの混合物に溶解されたＤ（−）リボース中で架橋されたシートが、ＰＢＳに溶解されたＤ（−）リボース中でインキュベーションされたそのようなシートよりも実質的に大きい細菌コラゲナーゼ分解抵抗性を有したことを示している。
【０１３０】
【表３】
0004664568.tif 000005
【０１３１】
一般に、本発明の好ましい実施形態に従って、シート、チューブまたは任意の他の成形品などの成形品が、本明細書中上記に詳しく開示されるように、繊維状コラーゲンのマトリックスから調製される。コラーゲンマトリックスは、最大が７０％エタノールであるエタノール濃度が増大する一連のエタノール水溶液中で徐々に脱水される。その後、鋳型で成形されたか、またはそれ以外の方法で成形されたコラーゲンマトリックス品は、７０％エタノールを含有する３％Ｄ（−）リボースの水溶液中でインキュベーションされる。所望する架橋量が、インキュベーション時間を変化させることによって得られる。本明細書中上記に開示され、そして図２Ａ〜図２Ｂに例示されるように、インキュベーション時間が長いほど、細菌コラゲナーゼ消化に対するコラーゲンマトリックスの抵抗性の程度が大きなっている。所望する架橋度が得られた後、マトリックスは、濃度が低下する一連のエタノール溶液中で水和させることができる。あるいは、得られたコラーゲンマトリクスは、米国特許第５，９５５，４３８号（Ｐｉｔａｒｕ他）に詳しく記載されるように、さらに脱水して、臨界点乾燥に供することができる。最初の方法が選ばれた場合、マトリックスは湿潤環境で保存および貯蔵することができ、その後、移植または他の使用が行われる。第２の方法が選ばれた場合、乾燥させたコラーゲンマトリックスは乾燥状態で保存および貯蔵することができる。
【０１３２】
本明細書中に開示される方法により架橋され得るコラーゲンマトリックスは、この分野で知られている任意の形態を取ることができる。例えば、本明細書中上記に開示されるコラーゲンタイプのいずれかから作製されるシート、チューブ、スポンジ、フレーク、ゲル、ビーズ、マイクロ球体および他の関連する幾何学的形態を本発明の方法によって架橋することができる。本発明の実施形態に従って、マトリックスのコラーゲンは、医薬品、他のタンパク質または合成ポリマーなどの薬剤で化学的および／または物理的に修飾することができる。
【０１３３】
Ｄ（−）リボースの正確な濃度、エタノール濃度、およびそれ以外の架橋条件のいずれか（インキュベーション時間およびインキュベーション温度など、これらに限定されない）は、コラーゲンマトリックスから作製されるインプラントまたは物品の最終的な分解特性を制御することが所望される場合には変化させることができる。そのような制御された変化により、なかでも、制御されたインビボ分解抵抗性を有するインプラントおよび他のコラーゲン型物品の形成が可能になる。
【０１３４】
（実施例５）
本発明の架橋方法を使用して調製される架橋コラーゲンの本明細書中上記に開示される例には、ウシコラーゲン調製物の使用が含まれるが、本発明の架橋コラーゲンは、他の種々の供給源に由来するコラーゲンに対して適用することができる。下記に示される２つの実験では、本発明の架橋方法がヒトコラーゲンの２つの異なる形態に対して適用されている。
【０１３５】
実験１．
ヒトのアキレス腱を、この分野で知られているように、フィシンで処理して、非コラーゲン性タンパク質を除いた。アキレス腱を小片（１〜２ｍｍ2）に切断して、４つのサンプル群に分けた。第１のサンプル群をコントロール群としてＰＢＳ中で１４日間インキュベーションした。第２のサンプル群を、ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースの溶液中で１４日間インキュベーションした。第３のサンプル群を、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳおよび７０％（ｖ／ｖ）エタノールの混合物における３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中で６日間インキュベーションした。第４のサンプル群を、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳおよび７０％（ｖ／ｖ）エタノールの混合物における３％Ｄ（−）リボースの溶液中で１４日間インキュベーションした。
【０１３６】
実験２．
Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ（ＭＡ、米国）から市販されているＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMは、非コラーゲン性タンパク質を除いた後のヒト皮膚に由来する注射可能なコラーゲンマトリックスであり、在庫可能な同種インプラント材料として使用されている。ＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMコラーゲンマトリックスを４つのサンプル群に分けた。第１のＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMサンプル群をコントロール群としてＰＢＳ中で１４日間インキュベーションした。第２のＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMサンプル群を、ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースの溶液中で１４日間インキュベーションした。第３のＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMサンプル群を、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳおよび７０％（ｖ／ｖ）エタノールの混合物における３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中で６日間インキュベーションした。第４のＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMサンプル群を、３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳおよび７０％（ｖ／ｖ）エタノールの混合物における３％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液中で１４日間インキュベーションした。
【０１３７】
架橋期間が終了したとき、実験１および実験２のすべてのサンプルを、本明細書中上記の実施例１に詳しく開示されるように細菌コラゲナーゼによるコラーゲン分解に対する抵抗性についてアッセイした。アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３５０コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は５時間であった。
【０１３８】
結果を下記の表４に示す。
【０１３９】
【表４】
0004664568.tif 000006
【０１４０】
表４におけるコラゲナーゼ分解の結果は、各サンプルにおける総タンパク質の割合としての可溶化コラーゲンの量として示されている。結果は、平均値±平均値の標準偏差（ｎ＝３）として示されている。表４の結果は、本発明の架橋方法が、異なる供給源から得られたコラーゲンに対して適用可能であることを明らかにしている。表４の結果はまた、７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースにおいてヒトコラーゲンをインキュベーションすることにより、架橋された脱タンパク処理ヒトコラーゲンサンプルのコラーゲン溶解性分解に耐える能力が、ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースにおいて同じ長さの時間にわたってインキュベーションされたヒトコラーゲンサンプルと比較して数倍増大していることを明らかにしている。７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースにおいてインキュベーションされたヒトアキレス腱サンプルでの分解コラーゲンの量は、ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースにおいてインキュベーションされたヒトアキレス腱サンプルでの分解コラーゲンの量よりも約１／１６に低下していた。同様に、７０％エタノールおよび３０％ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースにおいてインキュベーションされたＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMサンプルでの分解コラーゲンの量は、ＰＢＳにおける３％Ｄ（−）リボースにおいてインキュベーションされたＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTMサンプルでの分解コラーゲンの量よりも約１／７に低下していた。
【０１４１】
一般に、本発明の架橋方法は、本明細書中上記に詳しく記載されるように再構成によって、またはコラーゲンマトリックスを含む組織から非コラーゲン性タンパク質およびプロテオグリカンを除くことによって、コラーゲンの分子溶液から調製され得る種々の供給源のコラーゲンマトリックスの異なるタイプに適用することができる。そのような組織の例として、血管、皮膚、心膜、腱、靱帯、骨、筋膜、嚢、角膜、強膜、腸などが挙げられる。これらの組織は、ウシ、ブタ、ヒトなど（これらに限定されない）を含む種々の種から得ることができる。非コラーゲン性タンパク質およびプロテオグリカンの除去は、この分野で知られているように酵素消化および抽出によって行うことができる。脱タンパク質工程の後、残留するコラーゲンマトリックスが、本明細書中上記に開示される実施例に記載される方法論に従って、緩衝化されたＤ（−）リボースのエタノール性水溶液において架橋される。
【０１４２】
本発明の方法によって架橋され得るコラーゲンは、コラーゲン含有組織から細胞成分および／または非コラーゲン性タンパク質を完全または部分的に抽出することにより調製された天然のコラーゲン繊維であり得る。本発明の方法はまた、天然型（ペプシン処理されていない）コラーゲン分子の再構成フィブリルを架橋するために使用することができる。本発明の方法はまた、再構成されたアテロペプチドコラーゲンフィブリルを架橋するために使用することができる。さらに、上記に開示されたコラーゲン形態の組合せもまた、本発明の方法によって架橋することができる。
【０１４３】
本発明の種々の好ましい実施形態に従って、コラーゲンマトリックスは、種々の適用のために適するようにするために架橋することができ、例えば、組織工学における細胞外マトリックスの足場物質、医薬品および生物学的薬剤（活性なタンパク質、遺伝子および遺伝子ベクター）に対する制御放出システム、誘導された組織再生および骨再生のための膜、組織増強用の注射可能または移植可能な増量剤、天然器官および／または再構成器官および／または人工器官を固定するための外皮、人工的な組織または器官（例えば、人工乳房など）を調製するための充填材料、ならびにコラーゲンおよび他の天然型もしくは人工のポリマー構造体または天然型もしくは合成された有機化合物および無機化合物またはこれらの組合せを含む複合材料の成分（これらに限定されない）などに適するようにするために架橋することができる。
【０１４４】
本発明のコラーゲンマトリックスおよび調製物を調製するための出発物質の例には、皮膚、骨、腱、靱帯、胎盤およびその他などの、コラーゲンが多い動物およびヒトの組織が挙げられ、そしてインビトロまたは遺伝子導入生物において調製される組換えコラーゲンが挙げられる。コラーゲンマトリックスは単一タイプのコラーゲンを含むことができるが、この分野で知られている様々なコラーゲンタイプの混合物もまた含むことができる。本発明の架橋コラーゲン調製物および／またはコラーゲンマトリックスの調製において使用され得るコラーゲンタイプの例には、この分野で知られているＩ型〜ＸＶＩＩＩ型のコラーゲンが挙げられる。
【０１４５】
本発明の架橋コラーゲン調製物および／またはコラーゲンマトリックスの調製において使用され得るコラーゲン分子の他のタイプの他の例には、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（第７９巻（１０）、１７８９頁〜１７９３頁、２０００）に発表された「セメント質由来の付着タンパク質により媒介される細胞付着におけるＭＡＰキナーゼｐ４２（ｅｒｋ−２）／ｐ４４（ｅｒｋ−１）の役割」と題するＫｏｍａｋｉ他による論文に開示されるような、歯周細胞タイプの付着および拡大を促進するセメント質由来付着タンパク質（ＣＡＰ）などのコラーゲン性タンパク質、およびこの分野で知られている他のコラーゲン性分子、または修飾されたコラーゲン様ペプチド、例えば、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（３０１（５）、１１９１頁〜１２０５頁、２０００年９月）に発表された「単一荷電ペアを有するコラーゲン様ペプチドの結晶における互い違いの分子充填」と題する論文においてＫｒａｍｅｒ他によって開示されるコラーゲン様ペプチド、もしくはＮａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（６（５）、４５４頁〜４５７頁、１９９９年５月）に発表された「コラーゲン三重らせん構造の配列依存的な立体配座の振動」と題する論文においてＫｒａｍｅｒ他によって開示されるコラーゲン様ペプチドなど（これらの限定されない）がある。
【０１４６】
本発明の方法を使用して架橋するために好適なコラーゲン溶液の調製はこの分野で知られている。市販のコラーゲン製造物、例えば、Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）、ＤｅｒｍａｌｏｇｅｎTM、あるいはコラーゲン溶液および／または天然型繊維状コラーゲンマトリックスおよび／または再構成型繊維状コラーゲンマトリックスの形態である他の類似する製造物などもまた、本発明の方法による架橋のためのコラーゲン出発物質として有用である。本発明の方法によって架橋される好適なコラーゲンマトリックスの様々なタイプを調製するための代表的な方法が、特に、米国特許第４，７０３，１０８号、米国特許第４，０６０，０８１号、米国特許第４，４１８，６９１号、米国特許第４，３７４，１２１号、米国特許第４，７０３，１０８号、米国特許第４，４０９，３３２号および米国特許第４，９７１，９５４号に開示される。
【０１４７】
好ましくは、Ｄ（−）リボースが、コラーゲンを架橋するために使用される。しかし、本発明の方法に従って架橋するために同様に使用され得る反応性の糖の他の例として、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、アロース、アルトース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、フルクトース、タロース、または任意の他のジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、セプトース、オクトース、ナノースもしくはデコースが挙げられる。
【０１４８】
エタノールとは異なる他のアルコール、および他の極性有機溶媒または親水性有機溶媒もまた本発明の架橋方法において使用できることは特筆される。
【０１４９】
（実施例６）
さらなる実験を、７０％エタノールの存在下で架橋されたコラーゲンサンプルのコラゲナーゼ分解抵抗性に対する様々な異なる還元糖の影響を評価するために行った。
【０１５０】
繊維状コラーゲンのマトリックスを、本明細書中上記の実施例１に詳しく開示されるように、ペプシン処理されたウシ腱のＩ型コラーゲンから調製する。冷却された酸性コラーゲン溶液（ｐＨ３、３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度）をリン酸アルカリ緩衝液で中和し、３７℃に加温して、２４時間激しく撹拌する。連続した撹拌により、１５０ミクロンの範囲で小粒子が形成される。３７℃で２４時間インキュベーションした後に得られる繊維状コラーゲンの粒子状マトリックスを遠心分離して、コラーゲン粒子を沈殿させる。上清を除き、ペレットを、遠心分離および再懸濁を繰り返すことによってリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄する。
【０１５１】
５ミリグラムの上記の再懸濁された繊維状コラーゲンの粒子状マトリックスをそれぞれが含む５個の等しい一部を、７０％エタノール（ｖ／ｖ）、３０％ＰＢＳ（ｖ／ｖ）および１％（ｗ／ｖ）の還元糖を含む３０ミリリットルの溶液中で３７℃で１１日間インキュベーションした。７０％エタノールの存在下で試験された種々の還元糖は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＭＯ、米国）からカタログ番号Ｒ７５００として市販されているＤ（−）リボース、ＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｏｏｌｅ、英国）からカタログ番号１０１１７として市販されているＤ（−）グルコース、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ，ＡＧ（スイス）からカタログ番号４７７４０として市販されているＤ（−）フルクトース、ＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｏｏｌｅ、英国）からカタログ番号１０２７４として市販されているスクロース（α−Ｄ−グルコピラニシル−β−Ｄ−フルクトース）、およびＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＭＯ、米国）からカタログ番号Ｍ５８８５として市販されているマルトース（４−Ｏ−αＤ−グルコピラニシル−Ｄ−グルコース）であった。
【０１５２】
これらの異なるタイプの糖とのインキュベーション期間が終了したとき、試験されるコラーゲンサンプルを遠心分離により集め、ＰＢＳで３回洗浄して、本明細書中上記の実施例２に詳しく開示されるように細菌コラゲナーゼ消化に対する抵抗性について試験した。アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１５３】
実験結果を下記の表５に示す。表５の右欄には、コラーゲンサンプルがインキュベーションされた糖のタイプが示される。表５の左欄の数字は、各サンプルにおける総タンパク質の割合として示される可溶化（分解）コラーゲンの量を示している。
【０１５４】
【表５】
0004664568.tif 000007
【０１５５】
表５に示される結果から理解され得るように、Ｄ（−）リボースは、糖によって架橋された繊維状コラーゲンのコラゲナーゼ分解抵抗性を改善することにおいて最も大きい効力を有していた。それ以外の糖の効力は、Ｄ（−）リボースの効力よりも低い。
【０１５６】
二糖のスクロースおよびマルトースのみが実施例６で試験されたが、適切なインキュベーション時間および条件を使用することによってコラーゲンを架橋するために、ラクトース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノースおよびトレハロースなど（これらに限定されない）の他の二糖を使用することが可能であり得ることは特筆される。
【０１５７】
（実施例７）
さらなる実験を、様々な還元糖を用いたコラーゲンの架橋に対する様々な異なる有機溶媒の影響を評価するために行った。
【０１５８】
粒子状の繊維状コラーゲンマトリックスの懸濁物を、本明細書中上記の実施例６に詳しく開示されるように、ペプシン処理されたウシ腱のＩ型コラーゲンから調製した。１０個のコラーゲンサンプル（各サンプル中に５ミリグラムのコラーゲン）を調製した。コラーゲンサンプルのそれぞれを、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳ、７０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒および１％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースを含有する３０ミリリットルの溶媒混合液中で３７℃で１１日間インキュベーションした。試験された有機溶媒は、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、１−ブタノール、１−ヘキサノール、アセトン（ジメチルケトン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチルおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であった。
【０１５９】
コントロール実験では、５ミリグラムのコラーゲンのサンプルが、ＰＢＳにおける１％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボースの溶液において３７℃で１１日間インキュベーションされた（下記の表６のサンプル番号１）。
【０１６０】
インキュベーション期間が終了したとき、１−ブタノール、１−ヘキサノール、アセトンおよび酢酸エチルの存在下でインキュベーションされたコラーゲンサンプル（それぞれ、下記の表６のサンプル６、７、８および１０）を、７０％がエタノールのＰＢＳで２回洗浄して、有機溶媒を除いた。その後、すべてのサンプルのコラーゲンを遠心分離により集め、すべてのサンプルをＰＢＳで３回洗浄した。その後、すべてのサンプルのアリコートを、本明細書中下記に詳しく開示されるようにトリプシンによる分解に対する抵抗性について、そして本明細書中上記の実施例２に詳しく開示されるようにコラゲナーゼによる分解に対する抵抗性についてアッセイした。コラゲナーゼ分解アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１６１】
【表６】
0004664568.tif 000008
【０１６２】
表において、**は、インキュベーション時に、１−ブタノール、１−ヘキサノールおよび酢酸エチルをそれぞれ含む表６のサンプル番号６、７および１０において、有機溶媒を含む相が水溶液から分離し（繊維状コラーゲンがサンプルにおける異なる水相として現れ）、そして若干の固体が有機溶媒層と水相との界面に現れたことを示している。表６のサンプル６、７および１０では、有機溶媒がエタノールで洗浄され、遠心分離によって析出させられた後、コラーゲンが、インキュベーション時に有機溶媒相が認められなかった残る試験サンプル（表６のサンプル番号１〜５、８、９および１１）の遠心分離ペレットの白っぽいエマルション様の外観とは外観が異なる黄色味を帯びた固体の詰まった析出物として現れた。極性があまりない溶媒の１−ブタノール、１−ヘキサノールおよび酢酸エチルは、水との混和性がより低く、おそらくはコラーゲンの変性を生じさせたことが推定される。この推定は、トリプシン分解抵抗性アッセイの結果が、１−ブタノール、１−ヘキサノールおよび酢酸エチルで処理されたコラーゲンサンプル（それぞれ、表６のサンプル番号６、７および１０）がトリプシンによって分解されたことを示したという事実によって裏付けられ得る。
【０１６３】
典型的には、変性していない天然型のコラーゲンは、トリプシンによる非特異的なタンパク質分解的消化に対する抵抗性を有するはずであり、一方、変性したコラーゲンは、トリプシンを用いた消化によって分解される。従って、表６のトリプシン抵抗性アッセイの結果は、試験されたコラーゲンサンプルの変性度を示していると考えられる。
【０１６４】
トリプシン消化試験手順
１００ミリリットルの反応緩衝液保存溶液を、２ミリリットルの１０ｍＭ  ＨＣｌを９８ミリリットルのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．６に調節された６７ｍＭのリン酸ナトリウムを含む）と混合することによって調製した。
【０１６５】
トリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＭＯ、米国）からカタログ番号Ｔ８００３として市販されている）を反応緩衝液溶液に溶解して、１ミリリットルの反応緩衝液あたり２０００ユニットのトリプシン活性を有するトリプシン溶液を作製した。
【０１６６】
トリプシン抵抗性アッセイを下記のように行った：容量が１００マイクロリットルであるコラーゲンサンプルを、事前に重量測定した試験管に入れた。コラーゲンを１３，０００ｇで２分間遠心分離して、上清を捨てた。試験管を再び重量測定して、ペレット重量を引き算により求め、そしてペレットの体積を、ペレットの高さ（レベル）を試験管表面にマーカーで印を付けることによって大まかに求めた。消化を、上記に開示された反応緩衝液におけるトリプシン溶液の０．５ミリリットルを各試験管のコラーゲンペレットに加えることによって開始し、試験管を２５℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーションが完了した後、試験管を１３，０００ｇで２分間遠心分離して、ペレットの体積を、本明細書中上記に開示されたように印を付けることによって大まかに求めた。試験管を再び重量測定して、ペレットの重量を（引き算により）求めた。ペレットはまた、その外観およびサイズを測定する前後において肉眼により調べられた。
【０１６７】
表６の最も右側の欄において、用語「無傷」は、トリプシン消化の２４時間後にサンプルから遠心分離されるコラーゲンペレットの重量および体積が、それぞれ、トリプシン溶液を添加する前の同じサンプルから遠心分離されるコラーゲンペレットの重量および体積から±２５％よりも大きく変化しなかったことを示している。用語「分解」は、トリプシン消化の２４時間後にサンプルから遠心分離されるコラーゲンペレットの重量および体積が、それぞれ、トリプシン溶液を添加する前の同じサンプルから遠心分離されるコラーゲンペレットの重量および体積から約２５％よりも大きく変化したことを示している。
【０１６８】
１−ブタノール、１−ヘキサノールおよび酢酸エチルで処理されたコラーゲンサンプル（それぞれ、表６のサンプル番号６、７および１０）は、トリプシン溶液中で２４時間後に肉眼で観測可能なペレットが遠心分離されなかったように、トリプシン溶液との２４時間のインキュベーションの後、トリプシンによって完全に分解されていたことは特筆される。
【０１６９】
表６のコラゲナーゼ分解アッセイの結果は、サンプルにおけるコラーゲンの実質的な変性を生じさせなかった溶媒の中で、Ｄ（−）リボースで処理されたコラーゲンサンプルのコラゲナーゼ分解抵抗性を増大させる効力の順序が、ＤＭＳＯ≒アセトン＞エタノール＞メタノール＞プロパノール＞イソプロパノール＞ＴＨＦであったことを示している。
【０１７０】
極性があまりなく、水相とは異なる第２の相として分離する、例えば、酢酸エチル、１−ブタノールおよび１−ヘキサノールなどの溶媒（すなわち、水相に完全に混和しなかった溶媒）はコラーゲンを変性させたことは明らかである。
【０１７１】
従って、好ましくは、架橋媒体において使用される溶媒（１つまたは複数）は、コラーゲンが糖と反応する水相に完全に混和する極性溶媒（または極性溶媒の混合物）であるはずである。
【０１７２】
表６にまとめられた結果は、極性溶媒を含有する緩衝化された水溶液中においてコラーゲンをＤ（−）リボースとインキュベーションすることにより、得られたコラーゲンのコラゲナーゼ分解抵抗性が、ＰＢＳだけにおいてインキュベーションされたコラーゲンと比較して増大したことを示している。結果はまた、比較的極性の水混和性アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノールおよびイソプロパノールなど）は、Ｄ（−）リボースとインキュベーションされたコラーゲンサンプルのコラゲナーゼ分解抵抗性を増大させることにおいて効果的である一方で、アルコールとは化学的に異なる他の極性溶媒もまた、類似した効力または一層より大きい効力で使用できることを示している。
【０１７３】
（実施例８）
下記の実験を、７０％アセトン（ジメチルケトン）の存在下においてＤ（−）リボースで架橋されたコラーゲンのコラゲナーゼ分解抵抗性に対するＤ（−）リボース濃度の影響を調べるために行った。
【０１７４】
粒子状の繊維状コラーゲンマトリックスの懸濁物を、本明細書中上記の実施例６に詳しく開示されるように、ペプシン処理されたウシ腱のＩ型コラーゲンから調製した。５個のコラーゲンサンプル（各サンプルは５ミリグラムのコラーゲンを含む）を調製した。コラーゲンサンプルのそれぞれを、７０％（ｖ／ｖ）アセトンおよび３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳならびに指定された濃度のＤ（−）リボースを含む３０ミリリットルの溶液中で３７℃で１１日間インキュベーションした。試験された５個の異なる溶液におけるＤ（−）リボースの最終濃度は、０．５％、１％、２％、３％および５％であった（Ｄ（−）リボースの濃度はｗ／ｖとして表される）。インキュベーション期間が終了したとき、コラーゲンを遠心分離により集め、ＰＢＳで３回洗浄してアセトンを除き、そしてサンプルを、本明細書中上記の実施例２に詳しく開示されるようにコラゲナーゼ分解抵抗性についてアッセイした。コラゲナーゼ分解アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１７５】
実施例８の実験結果を下記の表７に示す。
【０１７６】
【表７】
0004664568.tif 000009
【０１７７】
表７の結果は、使用された特定のインキュベーション条件のもとでは、架橋コラーゲンの最大の分解抵抗性が、７０％アセトンの存在下においては約１％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲のＤ（−）リボース濃度で達成されることを示している。
【０１７８】
（実施例９）
下記の実験を、７０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下においてＤ（−）リボースで架橋されたコラーゲンのコラゲナーゼ分解抵抗性に対するＤ（−）リボース濃度の影響を調べるために行った。
【０１７９】
粒子状の繊維状コラーゲンマトリックスの懸濁物を、本明細書中上記の実施例６に詳しく開示されるように、ペプシン処理されたウシ腱のＩ型コラーゲンから調製した。５個のコラーゲンサンプル（各サンプルは５ミリグラムのコラーゲンを含む）を調製した。コラーゲンサンプルのそれぞれを、７０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび３０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳならびに指定された濃度のＤ（−）リボースを含む３０ミリリットルの溶液中で３７℃で１１日間インキュベーションした。試験された５個の異なる溶液中のＤ（−）リボースの最終濃度は、０．５％、１％、２％、３％および５％であった（Ｄ（−）リボースの濃度はｗ／ｖとして表される）。インキュベーション期間が終了したとき、コラーゲンを遠心分離により集め、ＰＢＳで３回洗浄してＤＭＳＯを除き、そしてサンプルを、本明細書中上記の実施例２に詳しく開示されるようにコラゲナーゼ分解抵抗性について試験した。コラゲナーゼ分解アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１８０】
実施例９の実験結果を下記の表８に示す。
【０１８１】
【表８】
0004664568.tif 000010
【０１８２】
表８の結果は、使用された特定のインキュベーション条件のもとでは、架橋コラーゲンの最大の分解抵抗性が、７０％ＤＭＳＯの存在下においては約０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲のＤ（−）リボース濃度で達成されることを示している。
【０１８３】
（実施例１０）
実施例１０の実験は、４つの異なる極性有機溶媒の存在下でのコラーゲンの架橋における種々のＤ（−）グルコース濃度の相対的効力を測定するために行われた。
【０１８４】
粒子状の繊維状コラーゲンマトリックスの懸濁物を、本明細書中上記の実施例６に詳しく開示されるように、ペプシン処理されたウシ腱のＩ型コラーゲンから調製した。４個のコラーゲンサンプル（各サンプルは５ミリグラムのコラーゲンを含む）を、４つの異なるインキュベーション混合液（３０ミリリットル）中で３７℃で１１日間インキュベーションした。それぞれのインキュベーション混合液には、７０％（ｖ／ｖ）の指定された有機極性溶媒、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳおよび１％（ｗ／ｖ）のＤ（−）グルコースが含まれた。４つの異なる有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトンおよびＤＭＳＯであった。
【０１８５】
さらに４個のコラーゲンサンプルを調製した。各サンプルは５ミリグラムのコラーゲンを含んだ。このさらなる４個のサンプルを、４つの異なるインキュベーション混合液（３０ミリリットル）中で３７℃で１１日間インキュベーションした。それぞれのインキュベーション混合液は、７０％（ｖ／ｖ）の指定された有機極性溶媒、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳおよび５％（ｗ／ｖ）のＤ（−）グルコースを含んだ。４つの異なる有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトンおよびＤＭＳＯであった。
【０１８６】
インキュベーション期間が終了したとき、８個のすべてのコラーゲンサンプルのコラーゲンを遠心分離により集め、ＰＢＳで３回洗浄して有機溶媒を除き、そしてコラーゲンサンプルを、本明細書中上記の実施例２に詳しく開示されるようにコラゲナーゼ分解抵抗性について試験した。コラゲナーゼ分解アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３００コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であり、コラゲナーゼにおけるインキュベーション時間は３時間であった。
【０１８７】
実施例１０の実験結果を下記の表９に示す。
【０１８８】
【表９】
0004664568.tif 000011
【０１８９】
ｓ  表９の結果から理解され得るように、極性溶媒のエタノール、メタノール、アセトンおよびＤＭＳＯのいずれかが７０％で存在する際には、１％および５％の濃度のＤ（−）グルコースは、コラーゲンの分解抵抗性を増大させることにおいて、Ｄ（−）リボースよりも効力が小さいと考えられる。しかし、コラゲナーゼ分解抵抗性を増大させるために、Ｄ（−）グルコースの存在下でのインキュベーション期間を、実施例１０で使用された１１日間よりも長くすることは可能であり得る。
【０１９０】
（実施例１１）
分子精製されたペプシン処理のウシＩ型コラーゲンの溶液（２．５ミリグラム／ミリリットル）を、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ（ＡＲ、米国）から市販されているウシ腱から調製して、０．０１ＭのＨＣｌに溶解し、４℃で保った。１００ミリグラムのコラーゲンを含む４０ミリリットルの溶液のサンプル容量を０．１Ｍ酢酸の４．０リットルの容量に対して４℃で２日間透析した。透析期間が終了したとき、透析されたコラーゲンサンプルを市販の凍結乾燥機で凍結乾燥（冷凍乾燥）して、凍結乾燥された非繊維状コラーゲンの白色スポンジ様物を得た。
【０１９１】
約５ミリグラムの凍結乾燥された非繊維状コラーゲンの４個のサンプル（下記の表１０のサンプル１〜４）を試験管に入れて、下記のように試験した：
サンプル１−インキュベーションが、７０％（ｖ／ｖ）のエタノールおよび３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳを含む溶媒混合物中で１２日間行われた。
【０１９２】
サンプル２−インキュベーションが、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳおよび１％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースを含む溶媒混合物中で１２日間行われた。
【０１９３】
サンプル３−インキュベーションが、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール、３０％（ｖ／ｖ）のＰＢＳおよび１％（ｗ／ｖ）のＤ（−）リボースを含む溶媒混合物中で６日間行われた。
【０１９４】
サンプル４−未処理のままであった。このサンプルはコントロールサンプルとして使用された。
【０１９５】
指定されたインキュベーション期間が終了したとき、（最初にインキュベーションされなかったサンプル４を除き）、インキュベーションされたサンプルは、液体が除かれ（ｄｒａｉｎ）、ＰＢＳで３回洗浄された。その後、４個のサンプルのそれぞれをほぼ等しい量で３つに分割した。その後、各サンプルの３つの部分を、本明細書中上記の実施例１に詳しく開示されるように、１時間、３時間および５時間のインキュベーション時間でコラゲナーゼ分解抵抗性についてアッセイした。コラゲナーゼ分解アッセイにおいて使用されたコラゲナーゼ濃度は３５０コラゲナーゼユニット／ｍｌ分解緩衝液であった。
【０１９６】
実施例１１の実験結果を下記の表１０に示す。
【０１９７】
【表１０】
0004664568.tif 000012
【０１９８】
表１０の数字は、消化されたコラーゲンの量を最初のサンプル重量の割合として示している。
【０１９９】
実施例１１の結果は、非繊維状コラーゲンもまた本発明の方法によって効果的に架橋され得ることを示している。本明細書中上記に開示されるように形成された凍結乾燥されたコラーゲンは、凍結乾燥する前に維持された溶液の酸性度のために、（実施例１に記載されるコラーゲン膜の場合と同様に）繊維状コラーゲンに再構成されなかった。それにもかかわらず、実施例１１に開示されるように調製された非繊維状の凍結乾燥コラーゲンもまた本発明の方法によって架橋され、そしてそのコラゲナーゼ分解抵抗性が著しく増大していた。このことは、コラーゲンフィブリルの存在は必須ではないことを示し、そして繊維状の形態に加えて、他の形態のコラーゲンが、そのコラゲナーゼ分解抵抗性を増大させるために、本発明の方法を使用して処理され得ることを示している。
【０２００】
一般に、本発明の方法は、（米国特許第４，９７１，９５４号（Ｂｒｏｄｓｋｙ他）および米国特許第５，９５５，４３８号（Ｐｉｔａｒｕ他）に詳しく開示されているように）下記の式Ｉまたは式ＩＩのいずれかによって表される様々な異なる還元糖または還元糖誘導体を使用して実施することができる：
【０２０１】
【化３】
0004664568.tif 000013
【０２０２】
式中、Ｒ1は、Ｈまたは低級アルキルもしくはアルキレン、アミノ酸、ペプチド、サッカリド、プリン塩基またはピリミジン塩基、リン酸化プリン塩基またはリン酸化ピリミジン塩基であり、ｎは２〜９の整数であり、そしてｐおよびｑはそれぞれ独立して０〜８の整数であり、ただし、ｐおよびｑの和は少なくとも２であり、かつ８以下である。
【０２０３】
本明細書中上記の一般式Ｉまたは一般式ＩＩを有する様々な化合物がコラーゲンの架橋において異なる反応速度を示し得ること、そして架橋生成物が様々な異なる程度の分解抵抗性を示し得ることが当業者によって理解される。
【０２０４】
上記に記載された実施形態に対する様々な改変が、それらを考慮して当業者には明らかであることもまた理解される。上記の実施形態は例示として示され、限定としては示されていない。例えば、１つの極性溶媒が、本明細書中上記に開示された特定の実施形態および実験において使用されているが、本発明の方法は、１つの極性溶媒の使用に限定されない。従って、様々な極性溶媒の多くの異なる組合せを使用することができる。例えば、水および１を超える極性溶媒が存在するもとでコラーゲンの架橋を行うことが可能であり得る。非限定的な例では、アセトンおよびエタノールの水性（緩衝化または非緩衝化）混合物を使用することができ、別の非限定的な例では、水（または緩衝液または生理的食塩水）、エタノール、プロパノールおよびＤＭＳＯの四元混合物を使用することができる。複数の異なる極性溶媒の水性混合物の使用は、得られる架橋コラーゲン調製物の分解抵抗性を細かく調節したい場合には好都合であり得る。というのも、複数の極性溶媒を含む水性混合物の使用により、架橋コラーゲン調製物の分解抵抗性の程度の細かい調節および制御が容易になり得るからである。
【０２０５】
同様に、当業者は、本発明が、架橋するために（本明細書中上記に開示される式Ｉまたは式ＩＩを有する化合物の１つまたは複数などの）１つの還元糖または還元糖誘導体の使用に限定されないことを理解する。従って、本発明の架橋された繊維状コラーゲン調製物はまた、水と１つ以上の極性溶媒との混合物が存在するもとで繊維状コラーゲンを１つ以上の還元糖の混合物とインキュベーションすることによって製造することができる。例えば、１つの非限定的な例において、繊維状コラーゲンは、１．５％のＤ（−）リボースおよび３％のＤ（−）グルコースを含む、７０％エタノールと３０％水との溶液とともにインキュベーションすることができる。別の非限定的な例では、繊維状コラーゲンは、１．０％のＤ（−）リボースおよび３％のＤ（−）グルコースを含む、３５％エタノールと、３５％アセトンと、３０％ＰＢＳとの溶液とともにインキュベーションすることができる。還元糖の種々の組合せの使用は、最終的な架橋コラーゲン調製物の分解抵抗性のより微細な制御が可能になり得るので好都合であり得ることは特筆される。従って、そのような糖混合物および溶媒混合物の使用は、より大きい分解抵抗性を最終的な架橋コラーゲン調製物に必ずもたらすとは限らないが、生成物の特性のより微細な制御を可能にし得る。
【０２０６】
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が、コラーゲンの架橋を行うために実験において使用された緩衝化生理的食塩水であったが、架橋インキュベーション溶液のｐＨおよび／またはイオン強度を調節するための他の異なる緩衝液または緩衝化生理的食塩水または緩衝剤溶液もまた、本発明の方法を実施するために使用できることはさらに特筆される。
【０２０７】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  異なる実験処理に供された粒子状コラーゲン調製物の４サンプルのグリケーションレベルを例示する概略的な棒グラフである。
【図１Ｂ】  図１Ａの対応するサンプルと同じ４つの異なる実験処理に供された粒子状コラーゲン調製物の４サンプルの細菌コラゲナーゼによる分解率を例示する概略的な棒グラフである。
【図２Ａ】  エタノールおよびＤ（−）リボースを含有する溶液中でインキュベーションされたコラーゲンマトリックスのグリケーションレベルおよびコラゲナーゼ分解抵抗性に対するインキュベーション時間の影響を例示する概略的なグラフである。
【図２Ｂ】  エタノールおよびＤ（−）リボースを含有する溶液中でインキュベーションされたコラーゲンマトリックスのグリケーションレベルおよびコラゲナーゼ分解抵抗性に対するインキュベーション時間の影響を例示する概略的なグラフである。
【図３】  エタノールを含有するＤ（−）リボース溶液によって架橋されたコラーゲンマトリックスの細菌コラゲナーゼによる分解に対する架橋時のエタノール濃度の影響を例示する概略的なグラフである。
【図４】  エタノールを含有するＤ（−）リボース溶液によって架橋されたコラーゲンマトリックスの細菌コラゲナーゼによる分解に対する架橋時のＤ（−）リボース濃度の影響を例示する概略的なグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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