(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブランハメラ・カタラリス（Branhamella catarrhalis）抗原蛋白質であって、ＳＤＳゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約30kDaであり、下記のＮ末端配列
NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV
を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原蛋白質を含む免疫原性組成物。
【請求項３】
ワクチンであることを特徴とする請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の抗原蛋白質を用いて免疫原性組成物を調製することを特徴とする免疫原性組成物の調製法。
【請求項５】
免疫原性組成物が呼吸器系感染症の予防もしくは治療用のワクチン組成物であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫原性組成物が中耳炎の予防もしくは治療用ワクチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の抗原蛋白質を、それ以外の他のブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）由来の抗原蛋白質と共に含有する抗原組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の抗原蛋白質に対して増強された抗体。
【請求項９】
a)請求項８に記載の一種以上の抗体を供試サンプルと接触せしめ、
b)請求項１に記載の抗原蛋白質の存在を検出することを特徴とする、ブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）の検出又は同定方法。
【請求項１０】
a)請求項１に記載の抗原蛋白質、又は請求項７に記載の抗原組成物を供試サンプルと接触せしめ、
b)ブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）に対する抗体の存在を検出することを特徴とする、ブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）の検出又は同定方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗原蛋白質、又は請求項７に記載の抗原組成物を用いてブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）の検出又は同定を行うことを特徴とするブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）の検出又は同定方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗原蛋白質、請求項７に記載の抗原組成物、又は請求項８に記載の抗体を備えたことを特徴とするブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）の検出又は同定用のキット。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗原蛋白質、又は請求項２に記載の免疫原性組成物を含有する医薬。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗原蛋白質、又は請求項２に記載の免疫原性組成物を含有することを特徴とするブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）に対する免疫応答誘発用薬剤。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗原蛋白質、又は請求項２に記載の免疫原性組成物を含有することを特徴とする呼吸器感染症予防薬。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗原蛋白質、又は請求項２に記載の免疫原性組成物を含有することを特徴とする中耳炎用治療又は予防薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ブランハメラ・カタラリス（Branhamella catarrhalis）から得た新規な蛋白質、この蛋白質をコードしたＤＮＡ配列、並びにそれらの同定及びワクチン用基質としての使用に関するものである。
【０００２】
ブランハメラ・カタラリス（B. catarrhalis）は、別名モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）としても知られており、人に呼吸器系感染症を引き起こすグラム陰性好気性菌である。B. catarrhalisは、人、特に児童の呼吸器系細菌叢の一部として生存可能な菌である。この菌は成人における下位呼吸器系感染症及び児童における中耳炎を引き起こす（Klein J.O., Clin. Infect. Dis., 19: 823-833 (1994); Murphy T.F., Microbial. Rev., 60:267-279 (1996); Nicotra他, Arch. Intern. Med., 146:890-893）。或る研究によれば、成人で慢性的な阻害性肺炎症を伴う化膿性の悪化症状の約30％はB. catarrhalisによるものであることが確認されている（Verghese他, Antimicrob. Agents Chemother., 34:1041-1044 (1990)）。中耳液の培養を利用した研究では、中耳炎の段階の15〜20％はB. catarrhalisによって引き起こされていることが明らかとなっている（上記Klein (1994)）。
【０００３】
B. catarrhalisによって引き起こされる感染症は、この菌の外膜抗原に対する免疫応答を誘発する（Chapman他, J. Infect. Dis., 151: 878-882 (1985); Faden他, Infect. Immun., 60: 3824-3829 (1992); Sethi他, Infect. Immun., 63:1516-1520 (1995)）。B. catarrhalisに対する抗体は上位呼吸器系内の分泌液中に存在する（上記Fadden (1992); Stenfors, L.E.及びRaisanen, S., Acta Otolaryngol., 113: 191-195 (1993)）。B. catarrhalisによって引き起こされる中耳炎に対する防御には系特異的粘膜免疫応答が重要である（上記Fadden (1992); 上記Stenfors及びRaisanen (1993)）。
【０００４】
B. catarrhalisから分離されるプロテインｄとその抗原としての積極利用は数多くの特許公報、例えば国際公開公報WO90/12591, WO93/03761, WO95/09025, WO95/31215, WO96/12733及びWO97/41731に開示されている。
【０００５】
しかしながら、B. catarrhalisから或る特定範囲の抗原を提供することは、例えば一層良好で効果的なワクチンを提供するために引き続き要求されているところである。本発明者は、免疫応答の誘起に使用可能な係る特定範囲の蛋白質の分離を果たし、同定ツールとしての利用を見い出したものである。
【０００６】
即ち、本発明は第１の態様としてブランハメラ・カタラリス（B.catarrhalis）抗原である蛋白質を提供するものであり、この蛋白質はＳＤＳゲル電気泳動法で測定される約30kDaの見掛け分子量をもち、下記のＮ末端配列
NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV
を有することを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の蛋白質及びポリペプチドは、抗原物質として有用である。この物質は「抗原性」及び／又は「免疫原性」である。ここで、一般的に「抗原性」であると言うことは、係る蛋白質又はそれを構成するポリペプチド断片（以下、フラグメントと称す）が抗体増加用に使用可能であるか、或いは実際に患者に免疫応答を誘発可能であると言うことを意味する。また「免疫原性」であると言うことは、係る蛋白質又はそのフラグメントが患者の防御免疫応答の誘発に使用可能であることを意味する。従って、免疫原性である場合には係る蛋白質又はそのフラグメントは免疫応答だけでなく付加的に抗体に因らない免疫応答の生起にも寄与可能である。
【００１７】
本発明の蛋白質又はそのフラグメントが本発明の理念の範疇で例えば抗原性又は免疫原性物質としても使用できることは当業者であれば理解できることである。即ち、本発明は、例えば一つ以上の相加、欠失、置換などを含む係る抗原蛋白質又はその抗原性フラグメントも包含するものである。更に、一つのアミノ酸を別の類似タイプのアミノ酸に置換することも可能である。例えば一つの疎水アミノ酸を別のものに置換することが可能である。アミノ酸配列の比較にはCLUSTALプログラムなどのソフトウエアプログラムを用いることができる。このプログラムはアミノ酸配列同士を比較し、いずれか適切なほうの配列にスペースを挿入して最適な整合を見出すものである。最適整合に対するアミノ酸の同一性や相似度（同一性プラスアミノ酸タイプの保存性）を計算することができる。また、BLASTxのようなプログラムで相似配列間の最長ストレッチを揃え、適合する相似値を付すことができる。従って、比較結果を得てそれぞれ異なるスコアを有する幾つかの相似領域を見出すことが可能である。本発明では、これら両タイプの分析を考慮に入れている。
【００１８】
相同体又は誘導体の場合、上述の抗原蛋白質又はその抗原性フラグメントとの同一性の度合いは、この相同体又は誘導体が連鎖球菌肺炎抗原性又は免疫原性を残していなければならないことよりも重要ではない。但し、上述の抗原蛋白質又はその抗原性フラグメントに対して少なくとも60％の相似度（上記の通り）を有する相同体又は誘導体とすることが好ましい。好適には少なくとも70％の相似度、更に好適には少なくとも80％の相似度を有する相同体又は誘導体が好ましい。最適には少なくとも90％又は95％の相似度を有する相同体又は誘導体とするのがよい。
【００１９】
これに代えて、相同体又は誘導体は、例えば所要の抗原蛋白質又はその抗原性フラグメントを効果的にタグ付けすることにより精製を容易にする部分を結合した融合蛋白質とすることもできる。この場合、「タグ」を除去することは必要であり、或いは融合蛋白質自体が有用な抗原性を充分に残している必要がある。
【００２０】
本発明による抗原蛋白質は、遺伝子クローニング技術を用いてほぼ純粋な形で提供することができる。これらの技術については、例えばジェイ・サムブルック（J. Sambrook）他による文献「分子クローニング（Molecular Cloning）第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Cold Spring Harbor Laboratory Press） 1989年」に述べられている。即ち、本発明による抗原蛋白質のＮ末端配列をプローブ基質として用いて個々の蛋白質をコードする遺伝子を分離することができる。従って、本発明は、別の態様として、特定の配列、すなわち
(i)   ：前記抗原蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又はそれに等価なＲＮＡ配列、
(ii)  ：(i)の配列のいずれかに対して相補的な配列、
(iii) ：(i)及び(ii)の配列のいずれかに対して実質的な同一性を有する配列、又は
(iv)  ：前記抗原蛋白質の相同体、誘導体又は抗原性フラグメントをコードする配列、
を含むか或いは該特定配列のみからなる核酸分子を提供する。
【００２１】
本発明の核酸分子はこれらの複数の配列及び／又は抗原性フラグメントを含むことができる。本発明は、当業者に明らかなように、ここに例示した特別新規な核酸分子の新規変異体を含むことができる。このような変異体は本発明に包含されるものである。これら変異体は、例えば菌株の変異により実在するものである。例えば、相加、置換及び／又は欠失などが含まれる。加えて、特に微生物発現システムを利用する際は、発現に用いる特定組織に既知の適正なコドン使用法を利用することによって核酸配列を扱うことが望ましい。従って、合成、即ち非天然由来の変異体も本発明の範疇に含まれるものである。
【００２２】
本発明で言う「等価なＲＮＡ」とは、或る与えられたＤＮＡ分子の配列に対して相補的な配列を有する或る与えられたＲＮＡ分子を意味する（ＲＮＡ中では遺伝子コードにおけるＴがＵで置き換えられていても良い）。
【００２３】
相似度又は同一性を特定する目的で核酸配列間の比較を行う場合、BESTFITやGAPなどのソフトウエアプログラム（両プログラム共にウィスコンシン・ジェネティクス・コンピュータ・グループ（GCG: Wisconsin Genetics Computer Group）のソフトウエア・パッケージで入手可能）を利用することができる。このうち、例えばBESTFITは二つの配列を比較して最も相似するセグメント同士の最適な整合を生成する。また、GAPは両配列をそれらの全長に沿って整合させることができ、いずれか適切なほうの配列にスペースを挿入することによって最適な整合を検出可能である。尚、核酸配列の同定における比較に関しては、本発明の理念の範疇で各配列の全長に沿って整合をとることにより比較することが好ましい。
【００２４】
実質的な同一性をもつ配列とは配列間の同一性が少なくとも50％であることが好ましく、要すれば少なくとも75％、更に要すれば少なくとも90％又は少なくとも95％の配列とするとよい。或る場合には配列間の同一性は99％以上のこともある。
【００２５】
ここで、「実質的な同一性もつ配列」とは、その配列が前述のいずれかの配列に対して従来技術の核酸配列よりも高い同一性の度合いを有していることを意味する。
【００２６】
但し、本発明の核酸配列が新規な遺伝子製品の少なくとも一部をコードするものである場合、そのような遺伝子製品又はその新規な一部分をコードすることのできる全ての配列は本発明の技術的範疇に包含されるものである。
【００２７】
核酸分子は分離又は組換え体とすることができる。この核酸分子はベクターに取り込まれ、このベクターが宿主に取り込まれる。このようなベクター及び適合する宿主は本発明の更に別の態様を構成するものである。
【００２８】
従って、例えば前述のＮ末端アミノ酸配列に基づいて設計されたプローブを用いることにより、B. catarrhalis中の遺伝子を同定することができる。同定された遺伝子は次いで制限酵素を用いて切り出すことができ、ベクター中にクローニングすることができる。このベクターは発現用の適正な宿主に導入することが可能である。
【００２９】
本発明の核酸分子は、該核酸分子の配列部分に対して相補的な適正なプローブを用いることによりB. catarrhalisから得ることができる。プローブ用の適切なサイズのフラグメントを得るためには制限酵素又は超音波処理技術を用いることができる。
【００３０】
これに代えて所要の核酸配列を増幅するためにＰＣＲ技術を用いてもよい。従って、前述のようにして得られる配列データはＰＣＲで用いるための二つのプライマーの設計に用いることができ、それにより全遺伝子又はそのフラグメントを含む所要の配列をターゲットにして高度に増幅することができる。この場合、一方のプライマーはＤＮＡ分子の或るストランド上に位置する第１配列に対して高い特異性を定常的に示し、他方のプライマーは該ＤＮＡ分子の相補的なストランド上で第１配列に相補的な配列から間隔を開けて位置する第２配列に対して高い特異性を示すものであればよい。
【００３１】
典型的なプライマーは少なくとも15〜25ヌクレオチドである。
【００３２】
更に別の代替手法として化学合成法も利用可能であり、これは自動化されていても良い。比較的短い配列は化学的に合成及び連結反応させて長い配列とすることができる。
【００３３】
ＳＤＳゲル電気泳動法による分子量測定で±10％程度の変動率範囲内に収まる結果が得られることは当業者に認識されているところである。従って、本明細書で述べている分子量の表示値も同様にして測定されるものである限り同様の変動率を含むものであることは述べるまでもない。
【００３４】
本発明の抗原蛋白質を構成する幾つかのフラグメントはまた、係るフラグメントが有効な抗原性を充分に残しているという条件付きで使用可能であることは当業者の理解するところである。このようなフラグメントをスクリーニングする技術は当業者に周知である。従って、本発明は第２の態様として前述蛋白質の一種以上の抗原性フラグメントを提供するものである。
【００３５】
上述のように、本発明の抗原蛋白質（その抗原性フラグメントを含む）の主要な用途の一つは免疫応答の誘発にある。従って、第３の態様として本発明は免疫原性組成物、好ましくはワクチン組成物を提供するものであり、この組成物は本発明による一種以上の抗原蛋白質（その抗原性フラグメントを含む）を含有するものである。係る組成物は、標準的な調合用担体物質、賦形剤、希釈剤などと共に処方可能である。また免疫応答を刺激するのに有用な一種以上のアジュバントを含有しても良い。本発明のワクチン組成物は一種以上のアジュバントを含有することができる。周知のアジュバントとしては、水酸化アルミニウムなどの無機物のゲルや、フロイント不完全アジュバントなどの油中水型エマルジョンがある。その他の有用なアジュバントも当業者に周知である。
【００３６】
本発明はまた、第４の態様として、本発明による抗原蛋白質またはその一種以上の抗原性フラグメントを用いた免疫原性組成物の調製法を提供する。この免疫原性組成物は好ましくはワクチンである。好適な実施形態においては、係るワクチンは呼吸器系感染症の予防又は治療、或いは中耳炎の予防又は治療向けのものである。
【００３７】
特に、以下の抗原蛋白質とその相同体及び誘導体、或いはその一種以上の抗原性フラグメントが免疫原性組成物の調製に用いられる。
【００４２】
(v)   ：ＳＤＳゲル電気泳動法で測定される約30kDaの見掛け分子量をもち、下記のＮ末端配列
NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV
を有する蛋白質。
【００４６】
以上に示した抗原蛋白質、その誘導体、相同体、或いは抗原性フラグメントは、精製又は分離された製剤として単独で、或いは他のB. catarrhalis由来の抗原蛋白質との混合物として提供可能である。
【００４７】
従って、本発明は更に、第５の態様として、係る本発明による抗原蛋白質、その一種以上の相同体もしくは誘導体、或いはその一種以上の抗原性フラグメントを、付加的な少なくとも一種の他のB. catarrhalis抗原もしくはその一種以上のフラグメントと共に含有する抗原組成物を提供するものである。
【００４８】
更に、本発明の抗原蛋白質またはその抗原性フラグメントは抗体の増強すなわち選択的な調製に用いることができる。
【００４９】
従って、更に別の態様として、本発明は、本発明の抗原蛋白質或いはその一種以上の抗原性フラグメントに対して増強された抗体を提供するものである。好適な抗体は本発明の抗原蛋白質に特異的に結合し、従って係る抗原蛋白質を高純度にすることができるものである（例えば、係る抗体は本発明の抗原蛋白質に固定化し、結合して用いることができる。その後、抗原蛋白質は適正な条件下において好適な溶出液で溶出される）。
【００５０】
本発明の技術的範疇に属する抗体は、モノクロナールまたはポリクロナール抗体とすることができる。
【００５１】
ポリクロナール抗体は、本発明の蛋白質を好適な宿主動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、或いはサル）に注射し、宿主動物における抗体産生を刺激することにより増強することができる。要すれば、本発明の蛋白質と共にアジュバントを投与しても良い。前述のような公知のアジュバントをこの目的で用いることが可能である。かくして得られた抗体は次いで本発明の蛋白質に結合させることにより高純度に精製することができる。
【００５２】
モノクロナール抗体は、ハイブリドーマから作成することができる。即ち、モノクロナール抗体は、成長細胞を形成するために所要の抗体を産生する骨髄腫細胞及び脾臓細胞を融合させることで形成することができる。従って、これには周知のケーラー及びミルシュタイン技法（Kohler & Milstein technique, Nature 256 (1975)参照）もしくはこの技法の変形手法を利用することが可能である。
【００５３】
特定の蛋白質に結合させてモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体を製造する技術は本技術分野では今や充分に開発されている。このような技術は標準的な免疫学教本、例えばロイト(Roitt)他による「免疫学（Immunology） 第２版、1989年、チャーチルリビングストン社(Churchill Livingstone) ロンドン発行」に詳述されている。
【００５４】
これら全ての抗体に加えて、本発明はそれらの誘導体、即ち本発明による抗原蛋白質に結合可能な誘導体を包含するものである。従って、本発明には抗体フラグメント及び合成抗体が含まれる。抗体フラグメントと合成抗体の例は、例えばドーガル(Dougall)他により「ティブテック(Tibtech) 12, 372-379頁, 1994年09月」に述べられている。
【００５５】
抗体フラグメントには、前出のロイト他による文献に述べられているような例えばＦabフラグメント、Ｆ(ab)２フラグメント、及びＦｖフラグメントなどが含まれる。Ｆｖフラグメントは、単鎖Ｆｖ（scＦｖ）分子として知られている合成抗体を生成するように修飾することができる。これには、Ｖｈ及びＶｌ領域を共有結合して分子の安定性を増すペプチドリンカーが含まれる。使用可能な他の合成抗体にはＣＤＲペプチドがある。これらは抗原結合性決定基を含む合成抗体である。模擬ペプチドも使用可能である。通常、これらの分子はＣＤＲループ構造を模擬して抗原相互反応性の側鎖を含む構造的に限定された有機物リングである。
【００５６】
合成抗体にはキメラ型分子が含まれる。従って、例えばヒト化（或いは霊長類化）抗体またはその誘導体は本発明の技術的範疇に属するものである。ヒト化抗体の一例は、ヒト・フレームワーク領域を有し、齧歯類高度可変領域は持たない抗体である。キメラ型の抗体の生成手法は、例えばモリソン(Morrison)他により「PNAS, 81, 6851-6855頁,(1984)」に、またタケダ(Takeda)他により「Nature, 314, 452-454頁,(1985)」に述べられている。
【００５７】
合成抗体はまた、抗原結合の他に幾つかの所要特性を有する分子、例えば標識分子（蛍光又は放射線標識など）を提供する付加部分を備えた分子を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明による抗体又はその誘導体はB. catarrhalisの検出又は同定における使用にも有用である。
【００５９】
第７の態様として、本発明はB. catarrhalisの検出又は同定方法を提供するものであり、この方法では、
a)  本発明による一種以上の抗体を供試サンプルと接触せしめ、
b)  本発明による一種以上の抗原蛋白質又は一種以上のその抗原性フラグメントの存在を検出することからなるものである。
【００６０】
この他に、本発明による抗原蛋白質をB. catarrhalisに対する抗体の検出に用いることも可能であり、このような抗体は患者から得た生化学サンプル中に存在する可能性がある。従って、本発明は、更に別の態様として、
a)  本発明による抗原蛋白質、その一種以上の抗原性フラグメント、又は本発明による抗原組成物を供試サンプルと接触せしめ、
b)  B. catarrhalisに対する抗体の存在を検出する、
ことからなるB. catarrhalisの検出又は同定方法を提供するものである。
【００６１】
更に別の態様として、本発明はB. catarrhalisの検出又は同定における本発明の抗原蛋白質とその抗原性フラグメント或いは抗原組成物の使用を提供するものである。この検出又は同定は試験管内(in vitro)で行うことが好ましい。
【００６２】
本発明における抗原蛋白質、その抗原性フラグメント、或いは抗原組成物は、前述のB. catarrhalisの試験管内検出及び／又は同定用のキットの一部として提供することができる。従って、本発明は、更に別の態様として、本発明による抗原蛋白質とその抗原性フラグメント又は抗原組成物、或いは本発明による少なくとも一種の抗体を備えたB. catarrhalis検出及び／又は同定用キットを提供する。
【００６３】
上述のように、本発明の抗原蛋白質やその抗原性フラグメントはB. catarrhalisに対する免疫応答の誘発に使用可能である。従って本発明は、更に別の態様として、本発明による抗原蛋白質とその抗原性フラグメント又は本発明による免疫原性組成物を含有する医薬を提供するものである。
【００６４】
本発明は、更に別の態様として、
(a) 患者の免疫応答の誘起における本発明による抗原蛋白質とその抗原性フラグメント又は本発明による免疫原性組成物の使用、
(b) 本発明による抗原蛋白質、又はその少なくとも一種の抗原性フラグメント、又は本発明による免疫原性組成物の有効量を、好ましくはワクチンとして患者に投与することからなる呼吸器感染症の治療又は予防法、及び
(c) 本発明による抗原蛋白質、又はその少なくとも一種の抗原性フラグメント、又は本発明による免疫原性組成物の有効量を、好ましくはワクチンとして患者に投与することからなる中耳炎の治療又は予防法、
をも提供するものである。
【００６５】
尚、本書で述べている抗原蛋白質（即ち実際はその抗原性フラグメント）の簡便な製法はＤＮＡ組換え技術を利用した方法である。
【００６６】
以下に実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例はいずれにせよ本発明を限定するものではない。
【００６７】
実施例１：蛋白質の精製
(i) ：30kDa及び71kDa
20mLのブレーンハートインフュージョンブロス（以下、ＢＨＩブロス）に４〜５コロニーのB. catarrhalisＫ65株（オーストラリア、パースのサー・チャールス・ガーディナー病院で採取された喀痰からの臨床分離株、Ｋ65株はβラクタマーゼを生じる）を接種し、これを振盪培養器中で37℃にて一晩培養した。この培養株を各２mLずつ４本の500 mLフラスコのＢＨＩブロスに添加し、これらを振盪培養器中で37℃にて一晩培養した。この細菌をペレットにし、JA−14型ローターを用いたベックマンJA−２型遠心器により４℃、10000rpmにて15分ずつ３回にわたりPBS中で洗浄した。蛋白質は、ツヴィッタージェント(Zwittergent)抽出法及び酢酸ナトリウム／βメルカプトエタノール添加後のｐＨ調整を省いたエタノール沈殿法を用いて抽出した。この最終生成物を蒸留水で透析し、15.35mg/mLで40mL、即ち合計614mgの蛋白質を得た。この蛋白質を凍結乾燥した。
【００６８】
抽出蛋白質を約60mg／mLのバッファーＡ（25mMトリスHCl、pH8.1）に懸濁してから BioRad Q2型イオン交換カラムに装填した。各ランにつき１mLの注入量とした。カラムはバッファーＡで１mL／１分にて５分間洗浄した。蛋白質は、連続勾配溶出法と、100％バッファーＡから100％バッファーＢ（25mMのトリスHCl＋0.5MのNaCl、pH8.1）への段階勾配溶出法との組み合わせを用いて５〜10分にわたり溶出した。段階溶出に続き100％バッファーＢにより4分間の洗浄を行い、その後更に100％バッファーＡによる1分間の洗浄を行った。得られたフラクション２，３及び４を蓄えてPD−10カラム上で脱塩し、希釈トリスバッファーに変えてから凍結乾燥した。
【００６９】
蒸留水で容量を600μLに調整し、2.4mLの還元バッファー(62.5mMのトリス、pH6.8、10％(vol/vol)グリセロール、２％(wt/vol)ＳＤＳ、５％(vol/vol)βメルカプトエタノール)と混合し、37℃で30分インキュベートした。バイオラッド491型プレップ・セル（Bio-Rad Model 491 Prep Cell）を使用して予備ＳＤＳゲル電気泳動を実行したが、これには、40mLの９％Ｔ-1.42％Ｃアクリルアミド／BIS（N,N'-メチレンビス・アクリルアミド）分離ゲルを重合した10mLの４％Ｔ-0.36%Ｃアクリルアミド／BISスタッキングゲルと共に内径37mmのカラム内で用いた。0.025MのトリスHClでカラムからフラクションを溶出して凍結乾燥により濃縮し、分析用ＳＤＳゲル電気泳動により蛋白質含有量を分析した。71kDaの蛋白質はフラクション57〜80中に存在した。これらを蓄えて凍結乾燥し、2.5mLの蒸留水で再構成した。更に希釈ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）でバッファー交換して脱塩し、蛋白質を緩衝するＰＢＳの濃度が等浸透圧となるように再構成した。
【００７０】
この同じ調製セルのランから55〜65kDaの蛋白質を含むフラクション26〜34及び20〜35kDaの蛋白質を含むフラクション４〜17も収集した。フラクション４〜17は更に14％Ｔ-1.42％Ｃアクリルアミド/BIS分離ゲルを４％Ｔ-0.36Ｃアクリルアミド/BISスタッキングゲルと共に用いて精製した（図１の流れ図参照）。これらのフラクションを前述と同様に蛋白質含有量の分析に付し、適合する範囲のフラクションを集めて精製蛋白質を脱塩及び濃縮した。
【００７１】
(ii)：他の蛋白質の精製
20mLのＢＨＩブロスに４〜５コロニーのB. catarrhalisＫ65株を接種し、これを振盪培養器中で37℃にて一晩培養した。この培養株を各２mLずつ４本の500 mLフラスコのＢＨＩブロスに添加し、これらを振盪培養器中で37℃にて一晩培養した。この細菌をペレットにし、JA−14型ローターを用いたベックマンJA−２型遠心器により４℃、10000rpmにて15分ずつ３回にわたりＰＢＳ中で洗浄した。蛋白質は、ツヴィッタージェント(Zwittergent)抽出法及び酢酸ナトリウム／βメルカプトエタノールのｐＨをpH４に調整したエタノール沈殿法を用いて抽出した。
【００７２】
抽出蛋白質を約60mg／mLのバッファーＡに懸濁してから前述と同様のプロトコルを用いる BioBad Q2型イオン交換カラムに装填した。カラムから得たピークを蛋白質含有量の分析に付し、適合する範囲のフラクションを集め、予備ゲル電気泳動（図２に示すカラムと前述プロトコルを使用）により更に精製した。ＳＤＳを使用した予備電気泳動を含む全ての蛋白質精製操作は上記洗浄剤をリン酸カリウムによる沈殿で除去して行った。
【００７３】
結果
B. catarrhalisの他のメンブレン抽出物から単一抽出手法により10〜300μgの範囲の量で幾つかの蛋白質を精製した。図３に23〜71kDaの範囲の蛋白質の分析ＳＤＳゲル電気泳動による分析結果を示す。
【００７４】
アミノ酸配列の同定
Ｎ末端配列の決定
Ｎ末端配列の決定は、アプライド・バイオシステムス社(Applied Biosystems)から供給されたプロトコルに従って行った。但し、この他にも、文献：松平、J.Biol. Chem., 262; 10035-10038頁(1997)に述べられている方法に従って同様の配列決定を行うこともできる。
【００７５】
内部ペプチドの配列決定
この配列決定は、ＳＤＳゲル電気泳動法と互換性のあるＳ−２−カルボキシアミド化法を用いて行った。10％グリセロール(vol/vol)と、５％(wt/vol)ＳＤＳ、0.025MのトリスHCl、及び100mMの1,4-DTTからなるpH8.3の溶液中で蛋白質に対するアルキル化反応を実行した。先ず、この混合物を90℃で15分間インキュベートすることにより蛋白質を還元した。得られたサンプルを37℃に冷却してアクリルアミドを最終濃度2Mまで添加し、該混合物をアルゴン雰囲気の暗所中で30〜60分間にわたりインキュベートした。ＳＤＳ還元バッファーを加えてサンプルをＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ゲルを染色して取り出されるクーマシーにより蛋白質を可視化した。この操作は71kDaの蛋白質に対しても行われたが、この蛋白質はＮ末端の配列が決定できなかった。
【００７６】
実施例２：免疫処置要項
パイエル板内(IPP)免疫化処置はラット用の方法（キッド(Kyd)他、Infect. Immun., 63; 2931-2940 (1995)参照）の変形である。免疫接種材料は、前記蛋白質を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ：ミシガン州セントルイスのシグマ社(Sigma)製）に１：１の比率で乳化させて投与量が2.5μg〜10μgの範囲となるように準備した。特定行減退除去（ＳＰＦ）環境に維持したＳＰＦ雄BALB/cマウスに0.25mLのケタミン／キシラジン含有ＰＢＳ（塩酸ケタミン［オーストラリア国ニューサウスウェールズ州スミスフィールドのトロイ・ラボラトリーズ製］５mg／mL、塩酸キシラジン［オーストラリア国ニューサウスウェールズ州ピンブルのバイエル社製］２mg／mL）を皮下注射することにより麻酔した。マウス腹壁に１cmの中央切開部を形成してそこから小腸を露出させ、26Ｇニードルを使用して約１μLの接種量を漿膜下組織の各パイエル板に送り込んだ。小腸を無菌ＰＢＳでリンスし、腹腔を縫合した。偽免疫処理マウスには同様の手術でＩＦＡ及びＰＢＳの乳液を注射した。
【００７７】
気管内(IT)刺激をIPP免疫処置後の14日目に与えた。これらのマウスは、静脈麻酔薬サッファン（Saffan：全量１kg当たり20mgのアルファドンを含有。0.15mL；オーストラリア国ニューサウスウェールズ州エヌス・ライドのピットマン・ムーア社製）で鎮静させた。蛋白質含有ＰＢＳ20μL（IPPに投与したのと同量）を気管に経口挿入した22.5Gカテーテル（日本国東京のテルモ社製）を介して肺に送り込んだ。この接種材料は0.3mLずつ二回の空気で拡散させた。
【００７８】
細菌感染
１リットル当たりウマの脱繊維素血液50mLを補充したＢＨＩ培養基板上においてB. catarrhalisを一晩培養した。培養基板を37℃にて５％ＣＯ２雰囲気内で一晩インキュベートして菌を採取し、ＰＢＳ内で三回洗浄した。濃度は405nmにおける光学的濃度測定で評価し、上記の一晩経過した培養基板における接種物系列希釈のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数することで確認した。マウスはサッファンの静注で鎮静させた。生きたB. catarrhalisを添加したＰＢＳの丸薬状接種物を前述の気管内刺激と同様にして肺に送り込んだ。マウスを汗腺から時間後又は必要とされるときのいずれかにペントバルビタールソーダの腹膜内注射で殺した。心臓穿刺により血液を採取し、血清採取のために凝固させた。喉部を切開して気管を露出させ、カニューレを介して肺に0.5mLのＰＢＳを点滴及び回収することによって気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を採取した。ＢＡＬ液を採取した後、完全な肺を取り出して２mLのＰＢＳ中に置き、組織ホモジナイザー（9500rpm; Heidolph DIAX 600, ドイツ国ケルハイムのエレクトロ社製）で均質化した。ＢＡＬ液と均質化肺組織をＣＦＵ識別用平板系列希釈による細菌浄化値の分析にかけた。血清は、４℃、450×ｇで１０分間遠心分離機（Juoan BR3.11型、フランス国のサン・ナゼール社製）にかけて分離し、−80℃で保管した。
【００７９】
結果
精製蛋白質によってマウスにIPP免疫処置を行い、気管内刺激を行った。図４に示すデータはＢＡＬ液と肺組織のそれぞれにおける細菌浄化値の増加率(％)を非免疫処置のものとの比較で示している。
【００８０】
見掛けの分子量が71kDaの蛋白質はＢＡＬ液における浄化率の向上に最も有効であるが、この蛋白質に対する免疫応答は肺組織の浄化値では有効性が低い。
【００８１】
見掛けの分子量が44kDaの蛋白質による免疫処理で得られる免疫応答は、ＢＡＬ液及び肺組織の双方について細菌浄化に有効である。15kDa及び30kDaの各蛋白質による免疫処置はＢＡＬ液及び肺組織の双方について50％以上高い浄化率の向上を示したが、ＢＡＬ液について同等の浄化率を示した14.5kDaの蛋白質は肺組織には同じ防御効果をもたらすものではなかった。14kDaの蛋白質はＢＡＬ液における細菌浄化には有効ではないが、肺組織に対しては浄化率を若干向上できるものであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例における30kDa及び71kDaの各蛋白質の分離操作を示す流れ図である。
【図２】  本発明の実施例における14kDa、14.5kDa及び15kDaの各蛋白質の分離操作を示す流れ図である。
【図３】  銀染法により精製した蛋白質のＳＤＳ電気泳動ゲル分画グラフである。
【図４】  B. catarrhalis感染マウスにおける本発明の抗体による免疫処置を行った場合と行わなかった場合の浄化率データを示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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