(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉タンパク質を含有する食材に、タンパク質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するタンパク質脱アミド酵素を添加し、該酵素を該筋肉タンパク質に作用させることを特徴とする食肉加工品又は水産練り製品の製造方法。
【請求項２】
筋肉タンパク質が畜肉、鳥肉、魚肉、軟体動物、又は甲殻類に由来するものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
タンパク質脱アミド酵素がＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のプロテイングルタミナーゼであり、タンパク質脱アミド酵素の添加量が、食材１ｇに対して０．０１〜１００ユニットであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の方法により得られたことを特徴とする食肉加工品又は水産練り製品。
【請求項５】
タンパク質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するタンパク質脱アミド酵素を含有することを特徴とする食肉軟化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質脱アミド酵素を用いた食肉加工品又は水産練り製品及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人間は生命維持に必要なタンパク質の供給源として、家畜、家禽を主体とする哺乳類や鳥類の骨格筋組織に代表される食肉、魚類骨格筋組織である魚肉、その他脊椎、無脊椎動物の体組織や器官等を利用している。上記した動物性のタンパク質食品は、起源いかんに関わらず、アクチン、ミオシンなどの共通の筋肉タンパク質を含み、これは食品中で共通の加工特性を発現している。例えば、筋肉タンパク質の機能特性としては、保水性、結着性、弾力性、ゲル化性などが挙げられる。これらの特性は、ソーセージやカマボコなどの練り製品中への脂肪や水分の取り込み、或いは肉塊接合型製品の結着性やゲル化性等に大きく寄与している。このように種々の機能特性を有する筋肉タンパク質は、一般に、加熱、凍結、冷蔵、加圧等の加工処理を行うことによって変性を受ける。筋肉タンパク質の変性は、肉自身の旨味を引き出しておいしさを付与する一方で、肉組織からのドリップの発生やそれに伴う歩留まりの低下など加工上の観点から好ましくない問題を生じるだけでなく、原料によっては、肉質が硬くなり、しなやかさが損なわれ、パサついた食感へと変化するなど官能上への悪影響も及ぼす。例えば、食肉の中でもステーキやカツフライなど、比較的大きな塊の肉（肉片）を調理する場合、柔らかさやジューシーさはおいしく食べるための重要な要素であるが、このような肉は加熱調理で硬くなる性質があり、また肉汁も流出して失われる傾向にある。また、蒸し蒲鉾等水産練り製品は、加熱が過ぎると過剰に硬化し、しなやかさが損なわれ、離水も増加する傾向がある。
加工処理による肉の硬化抑制のために、従来から有機酸モノグリセリドを使用する方法（特開昭４９−２０３５３号公報）、レシチン等の界面活性剤を使用する方法（特開平４−１４８６６３号公報）、塩類等を使用する方法（特開平４−３６１６７号公報）、及び酵素を使用する方法（特開平４−２７８０６３号公報）が知られている。水産練り製品にしなやかさを付与する方法としてトランスグルタミナーゼとアルカリ金属塩を併用する方法（特開平８−８０１７６号公報）が知られている。また、加工処理による肉の保水力の低下ならびに歩留まりの低下という問題に対しては、重合リン酸塩や糖類の添加が一般的に知られている。重合リン酸塩は、筋肉タンパク質であるミオシンとアクチンを解離させる働きがあり、食肉加工製品の結着性と歩留まり向上に対して飛躍的な効果があるが、カルシウムの吸収阻害作用などの懸念から、消費者からは重合リン酸塩排除の要望も高い。その他、食肉、魚肉加工品の保水性やゲル化を改善する目的としては、トランスグルタミナーゼを作用させる方法（特許第２６３０８２９号）、凝乳酵素で分解したカゼインアルカリ塩とカルシウムイオンの混合水溶液を用いる方法（特開平３−９４６２４号公報）、また、塩化ナトリウム及び澱粉を含有した液を食肉に吸収させる方法（特開平６−３４３４２４号公報）などがある。タンパク質脱アミド酵素の食肉加工品、水産練り製品への利用については、タンパク質脱アミド酵素により脱アミド化した大豆蛋白質をソーセージに添加する方法（特開２０００−５０８８７号公報）が知られている。このように、筋肉タンパク質の変性に伴う食品加工における諸般の課題に対し、そのケースごとに様々な解決方法がとられてきたが、消費者ニーズが多様化する昨今、それら対策は十分なものとは言い難い。
尚、特開２０００−５０８８７号公報にはタンパク質脱アミド酵素はミオシン、アクチンなどの肉タンパク質に対して作用すると記載されているが、タンパク質脱アミド酵素の肉タンパク質への反応性について記載されているのみであり、筋肉タンパク質を含む原料へ該酵素を作用させた効果については具体的な記載はない。すなわち、特開２０００−５０８８７号公報に開示されている技術は、食材に添加する分離蛋白質の機能性（可溶性、分散性、起泡性、泡沫安定性、乳化性、乳化安定性等）を向上させる技術であり、後述する本願発明の効果、すなわち食肉加工品、水産練り製品における、加熱後の歩留まり向上、保存中の離水抑制効果、なめらか、しなやかでソフトな食感へ改質する効果について記載も示唆もない。また、特開２０００−５０８８７号公報において、原料として添加している脱アミド化大豆タンパク質は、最終製品中にはごく僅かしか含まれておらず、しかも該タンパク質は、８０℃で３０分の加熱処理をして調製されたものであるから、当然酵素は失活しており、ソーセージ中で肉蛋白質に対して該酵素は作用していないという点においても、本発明の製造法とは区別されることは自明である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、筋肉タンパク質を含む食品の加工（加熱、冷凍、冷蔵等）、保存において生じる、該タンパク質の変性に起因する、歩留まり低下の抑制・離水の抑制、しなやかでソフトな食感の保持、味・風味の劣化の抑制を実現する食品及びそのような食品の製造方法を提供するものである。
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意研究を行った結果、筋肉タンパク質を含む食材にタンパク質脱アミド酵素を添加し、筋肉タンパク質に作用させることにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
１．筋肉タンパク質を含有する食材に、タンパク質脱アミド酵素を添加し、該酵素を該筋肉タンパク質に作用させることを特徴とする食肉加工品又は水産練り製品の製造方法。
２．筋肉タンパク質が畜肉、鳥肉、魚肉、軟体動物、又は甲殻類に由来するものであることを特徴とする前記１記載の方法。
３．タンパク質脱アミド酵素の添加量が、食材１ｇに対して０．０１〜１００ユニットであることを特徴とする前記１又は２記載の方法。
４．前記１乃至３のいずれかに記載の方法により得られたことを特徴とする食肉加工品又は水産練り製品。
５．タンパク質脱アミド酵素を含有することを特徴とする食肉軟化剤。
本発明におけるタンパク質脱アミド酵素は、タンパク質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する。当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。この様な酵素の例として、特開２０００−５０８８７号公報或いは特開２００１−２１８５０号公報に開示された酵素があるが、これらに特に限定されるものではない。タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質脱アミド酵素を産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。タンパク質脱アミド酵素の調製に用いられる微生物は特に限定されない。
微生物の培養液からのタンパク質脱アミド酵素の調製方法については、公知のタンパク質分離、精製方法（遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
本発明のタンパク質脱アミド酵素の活性は、特開２０００−５０８８７号公報記載の方法を改良した方法、すなわち、下記の方法で測定する。
（１）３０ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含む１７６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１００μｌにタンパク質脱アミド酵素を含む水溶液１０μｌを添加して、３７℃、１０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。
（２）このとき、酵素濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で適宜希釈し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ−ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ−ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いての３４０ｎｍの吸光度を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（Ｆ−ｋｉｔ付属、グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度を測定する。Ｆ−ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）タンパク質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク製）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる。
（５）タンパク質脱アミド酵素の活性を以下の式により求める。
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝（反応液中のアンモニア濃度（μｍｏｌ／ｍｌ）×反応液量（ｍｌ）×酵素希釈率）÷（酵素量（ｍｌ）×タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×反応時間（ｍｉｎ））
本発明における筋肉タンパク質は、筋繊維に存在する筋漿タンパク質、筋肉の収縮に関わる筋原繊維タンパク質あるいは結合組織に存在する結合組織タンパク質である。筋漿タンパク質として、細胞質可溶性タンパク質であり、解糖系に関与する大部分の酵素を含むアルブミン、ミオグロビン等が挙げられる。筋原繊維タンパク質としては、主要構成成分であるミオシン、アクチン、アクトミオシン、トロポミオシン、トロポニン、コネクチンなどが挙げられる。結合組織タンパク質には、主要構成タンパク質であるコラーゲン、エラスチンが挙げられる。該筋肉タンパク質が各種加工等の処理によって変性を受けた原料、例えば、コラーゲンを変性させて得られるゼラチンなども本発明の筋肉タンパク質を含有する食品原料に含まれる。
筋肉タンパク質を含有する食材は、例えば、畜肉、鳥肉、魚肉又は軟体動物又は甲殻類の筋肉、いわゆる肉を指し、骨・歯・爪以外の、筋肉・脂肪・血液・腱・内臓・髄・脳を含む部位を指す。具体的には、牛、豚、羊などの畜産動物、ニワトリ、カモ、ダチョウなどの鳥類、イワシ、マグロ、サケ、タラ等の魚類、タコ、イカ等の軟体動物、カニ、エビ等の甲殻動物、クロコダイル、ヘビ等の爬虫類、カエル等の両生類に由来する肉であるが、本発明に用いる原料は如何なる種類を問わない。
上記の食材を用いて加工される食肉加工品には、例えば、ハム、ソーセージ、チャーシュー、肉団子、ハンバーグ、ミートボール、ミートローフ、ローストビーフ、ローストポークなどが挙げられ、さらにカットされた食肉、ボイル、ロースト等加熱加工された食肉、酵素的あるいは機械的に軟化処理された食肉も含まれる。また水産練り製品には、すり身、蒲鉾、カニ蒲鉾、はんぺん、竹輪、揚げ蒲鉾、つみれ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、フィッシュボールなどが挙げられるが、肉タンパク質からなる製品であれば、種類は限定されない。
食材へのタンパク質脱アミド酵素の添加方法は、ソーセージ、蒲鉾等の練り製品の場合、食材を細切、磨砕、ペースト化する工程で、酵素液又は酵素粉末を単独であるいは調味料等他の原料とともに添加してもよいし、ペースト化後に、酵素液又は酵素粉末を単独であるいは調味料等他の原料とともに添加してもよい。ハム等の場合、酵素液を、原料肉に注入してもよいし、酵素液に原料肉を浸漬してもよい。また、原料肉に酵素液又は酵素粉末をふりかけてもよい。酵素を添加する形態としては、酵素粉末を粉末原料と予め混合したものを用いてもよいし、酵素を調味液等の液体原料に溶解したものを用いてもよい。
タンパク質脱アミド酵素の添加量は食材１ｇすなわち原料肉１ｇに対して０．０１〜１００ユニットが好ましく、０．１〜１０ユニットがより好ましい。タンパク質脱アミド酵素の反応条件（反応の時間、温度、反応系のｐＨなど）は、特に限定されないが、好ましい反応温度は、５〜７０℃である。反応系のｐＨは２〜１０が好ましく、より好ましくは４〜８であり、さらに好ましくは、ｐＨ５〜８である。反応時間は１０秒〜５日間が好ましく、より好ましくは１０分〜２４時間である。また、これらの条件は、使用する酵素の純度や、食材に含まれるタンパク質の種類や状態、純度などに応じて適宜変更ないし調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
以下に実施例を挙げ、本発明をされに詳しく説明する。本発明は、この実施例により何ら限定されない。
【実施例１】
【０００５】
本実施例では、タンパク質脱アミド酵素として、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のプロテイングルタミナーゼを使用した。Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼ（ＥＣ．３．５．１）遺伝子の配列はすでに決定されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８．１４１０−１４２１（２００１）］。この配列を参考にして、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて使用頻度の高いコドンへの変換を行い配列番号１に示した遺伝子配列を構築した。この配列はプロテイングルタミナーゼのシグナル配列（プレ部分）とプロ部分および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。この全遺伝子配列を合成により作製した。構築した配列番号１の遺伝子配列情報に基づいて、配列番号５（５’−ＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧＴＣ−３’）と配列番号６（５’−ＧＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣ−３’）に示した配列のプライマーを合成した。配列番号５に示したプライマーはプロテイングルタミナーゼのシグナル配列のＮ末端配列を含んでおり、配列番号６に示したプライマーは成熟型プロテイングルタミナーゼのＣ末端とＢａｍＨＩの認識配列を含んでいる。配列番号１に示した配列を有するＤＮＡを鋳型として配列番号５と配列番号６に示した配列のプライマーを用いてＰＣＲを行い、プロテイングルタミナーゼのプロ部分および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。このＰＣＲ断片を特開平９−０７０２９１号公報記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入した後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入した。プロテイングルタミナーゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、プラスミドを回収した。このプラスミドにクローン化された断片の塩基配列を決定し、配列番号１に示した配列と一致することを確認した。
大腸菌に由来するＴｏｒＡシグナルペプチドを含むＴｏｒＡ遺伝子の配列は既に決定されている（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：１１６９−１１７９（１９９４））。この配列を参考にして、配列番号７（５’−ＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＧ−３’）と配列番号８（５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＧ−３’）に示したプライマーを合成し、常法（斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］）に従って調製した大腸菌Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＴｏｒＡをコードする領域およびその上流にあるシグナル配列を含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従って行った。なお、配列番号８の配列は制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含んでいる。ＴｏｒＡのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を配列番号３に示す。
国際公開パンフレットＷＯ０１／２３５９１記載のプラスミドｐＰＫＳＰＴＧ１を鋳型としてプロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号９（５’−ＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＧ−３’）、配列番号１０（５’−ＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴＴＧＡＡＴＡＧ−３’）に示す配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより増幅した。配列番号１０の配列は、ＴｏｒＡシグナルペプチドをコードする遺伝子の５’末端の配列を含んでいる。次にこのＰＣＲ産物、並びに、配列番号７と配列番号８に示す配列を有するプライマーにより増幅されたＴｏｒＡをコードする遺伝子配列およびその上流にあるシグナル配列を含む領域を含むＰＣＲ産物とを１：１で混合し、これらを鋳型とし、配列番号８と配列番号９に示した配列を有するプライマーによりクロスオーバーＰＣＲを実施した。これによりＰＳ２プロモーター領域を含む配列、ＴｏｒＡシグナル配列、およびＴｏｒＡをコードする配列を含む融合遺伝子が増幅された。このクロスオーバーＰＣＲ産物を制限酵素ＳｃａＩおよびＢａｍＨＩにて消化した後、アガロースゲル電気泳動により約３．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。このＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出し、ＥａｓｙＴｒａｐＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて回収し、特開平９−３２２７７４号公報記載のプラスミドｐＰＫ４のＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＰＫＴ−ＴｏｒＡを得た。このプラスミドに挿入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築されていることが確認された。このプラスミドを鋳型とし、配列番号９と配列番号１１（５’−ＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＧＴＣＧＣＧＧＣＧ−３’）に示す配列を有すプライマーを用いて、ＰＳ２のプロモーター領域およびＴｏｒＡシグナルペプチドをコードする領域を含む部分をＰＣＲにより増幅した。なお、配列番号１１に示した配列は、プロ構造つきタンパク質脱アミド酵素をコードする領域の５’末端の配列を持っている。次に、プロテイングルタミナーゼがクローン化されているプラスミドを鋳型として、配列番号６と配列番号１２（５’−ＧＡＴＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡ−３’）に示す配列を有するプライマーを用いたＰＣＲにより、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。更に、これらのＰＣＲ産物を１：１で混合し、それらを鋳型とし、配列番号６と配列番号９に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーＰＣＲを実施することにより、ＰＳ２プロモーター領域およびＴｏｒＡシグナル配列とプロ構造つきタンパク質脱アミド酵素をコードする遺伝子との融合遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳｃａＩおよびＢａｍＨＩにて消化した後、アガロースゲル電気泳動を実施し、約３．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。このＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出し、ＥａｓｙＴｒａｐＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて回収し、特開平９−３２２７７４号公報記載のプラスミドｐＰＫ４のＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＰＫＴ−ＰＰＧを得た。プラスミド中の挿入配列の塩基配列を決定し、予想される融合遺伝子ができていることが確認された。なお、プロ構造付きのプロテイングルタミナーゼのアミノ酸配列を配列番号２に、ＴｏｒＡシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す。しかしながら、天然型プロテイングルタミナーゼのアミノ酸配列のままで、市販プロテアーゼによる成熟化を行った場合に、プロ配列が正しく切断されないことが予想された。そこで、天然型プロテイングルタミナーゼのＮ末端配列と同じ配列にもつようにプロ配列の切断が行われるよう、プロ配列のＣ末端配列”ＱＴＮＫ”を”ＦＧＰＫ”に変更した。”ＦＧＰＫ”への変更は、配列番号１３（５’−ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ−３’）と配列番号１４（５’−ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’）に示す配列を有するプライマーを用いた。配列番号１３の配列は、プロ配列部分を増幅するためのプライマー、配列番号１４の配列は、成熟体部分を増幅するためのプライマーである。ｐＰＫＴ−ＰＰＧを鋳型として、配列番号１２と配列番号１３に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼのプロ配列部分を、配列番号１４と配列番号６に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼの成熟体部分をそれぞれ増幅した。さらに、これらのＰＣＲ産物を１：１で混合し、これらを鋳型として配列番号６と配列番号１２に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーＰＣＲを実施することにより、プロ配列Ｃ末端がＦＧＰＫに変更されたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子を増幅した。このクロスオーバーＰＣＲ産物をｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトにクローニングし（ｐＵＣＰＰＧ（ＦＧＰＫ））、塩基配列の確認を行ったところ、ｐｒｏ配列が変更されていた。次に、ｐＰＫＴ−ＰＰＧのＡａｔＩＩ−ＢｓｔＰＩ断片（大）とｐＵＣＰＰＧ（ＦＧＰＫ）のＡａｔＩＩ−ＢｓｔＰＩ断片（小）を連結して、ｐＰＫＴ−ＰＰＧ（ＦＧＰＫ）を構築した。
構築したプラスミドｐＰＫＴ−ＰＰＧ（ＦＧＰＫ）を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９を形質転換し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＭ液体培地において３０℃で４８時間培養した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ培養液の遠心上清をフィルター（０．４５μｍ）濾過し、その濾液を限外濾過膜（分子量１万以下排除）を用いて濃縮した。５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）によりバッファー交換を行い、トリプシンによりタンパク質脱アミド酵素のプロ構造部を切断し、成熟化を行った。その後、再び濃縮、バッファー交換（２０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ５．０）を行い、その濃縮サンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、タンパク質脱アミド酵素の活性画分を回収し、酵素精製品とした。前述の方法に従い、酵素精製品のタンパク質あたりの活性を測定したところ約１００〜１４０Ｕ／ｍｇであった。
豚腕肉ミンチ１００重量部、１０％食塩水２０重量部をフードカッターに入れて１５秒間混合した後、水５重量部を加えた（対照品）。豚腕肉ミンチ１００重量部、１０％食塩水２０重量部をフードカッターに入れて１５秒間混合・細切した後、豚腕肉ミンチ１ｇに対し０．１ユニットに相当する前述のタンパク質脱アミド酵素精製品（１００Ｕ／ｍｇ）を、５重量部の水に添加し混ぜて、豚肉に加えた。（試験品１）。試験品１と同様に、タンパク質脱アミド酵素を豚腕肉ミンチ１ｇに対し、０．２ユニットに相当するタンパク質脱アミド酵素精製品を加えたものを試験品２、１ユニット加えたもの試験品３、１０ユニット加えたものを試験品４とした。各原料を合わせた後、全体をへらでかき混ぜ、再びフードカッターで１５秒間混合した。このかき混ぜ、混合の操作を４回繰り返した後、直径３ｃｍコラーゲンケーシングチューブに充填し、５℃で１時間静置した。その後、これを６０℃の乾燥雰囲気下で４０分間乾燥し、７５℃で２時間の蒸煮工程を経て、冷却した。なお、酵素添加品（試験品１〜４：いずれも本発明品）において、乾燥工程では酵素反応が進行し、蒸煮工程では、酵素はそのほとんどが失活すると考えられる。対照品および試験品１〜４について加熱歩留まりと物性を測定し、さらに官能検査によって食感及び味を評価した。加熱歩留まりは、加熱後重量／加熱前重量（％）で表した。物性については、試験品を高さ３ｃｍの円柱にスライスし、テクスチャーアナライザー（ＳＴＡＢＬＥ  ＭＩＣＲＯＳＹＳＴＥＭＳ製  ＴＡ．ＸＴ２ｉ）を用いて、断面に５ｍｍ球を１ｍｍ／秒で突き刺した際の破断応力を測定した。官能評価は３ｃｍ厚にスライスしたサンプルを８名の訓練されたパネラーに試食させ、硬さ、しなやかさについて評価した。評価の結果を表１に示す。
試験品２〜４は、対照品に比べ、ソフトで滑らかさが向上し、総合評価も概ね向上していた。また、試験品２〜４はプリン的食感が強く、舌ざわりが滑らかで、切断面がつややかできめ細かくなる傾向にあり、細切するタイプのソーセージとして好ましい品質となった。これらの効果は、食材１ｇに対しタンパク質脱アミド酵素の添加量が１ユニット以上で顕著であったが、０．１ユニットでも認識できるものであった。さらに対照品と試験品３については、密封して９０℃の水中で１０分間茹でてから官能評価を行ったところ、対照品が硬い食感に変化したの対し、試験品３は、なめらかな食感を維持していた。
【表１】
0004763621.tif 000002
【実施例２】
【０００６】
ＦＡ級冷凍摺り身をフレーク状に解砕したすり身１，０００ｇをステファンカッターで細切、攪拌した（低速１．５分→中速１．５分→高速１．５分）。続いて、食塩３０ｇおよび氷水６００ｇを加え、ステファンカッターで細切、攪拌した（低速１．０分→中速３０秒→高速２分）。次に、馬鈴薯澱粉「エスサン銀嶺」（味の素（株）製）５０ｇ、砂糖５０ｇ、みりん２０ｇ、うま味調味料「味の素」（味の素（株）製）１０ｇおよび実施例１記載の方法で調製したタンパク質脱アミド酵素精製品（１００Ｕ／ｍｇ）を原料すり身１ｇ当たり５ユニット添加した後、再びステファンカッターで中速にて品温が８〜１０℃になるまで攪拌した。このようにして得た練り肉を不透過性ビニリデンケーシングチューブに充填し、４０℃で４０分間加温して坐らせた後、８５℃で３０分間加熱してケーシング蒲鉾を得た（試験品）。対照として、酵素を添加せずに４０℃で４０分間加温して坐らせた蒲鉾を同様の方法で試作した（対照品）。これらの蒲鉾について、テクスチャーアナライザーを用いて、断面に５ｍｍ球を１ｍｍ／秒で突き刺した際の破断応力と凹み（破断時のひずみ）を測定した。また、加熱後の歩留まりと２週間保存後の離水の状態観察と官能評価を実施した。その結果を表２に示す。
表２に示したように、試験品（本発明品）は対照品と比べて、破断応力が低下し、凹みが増加した。また、本発明品はソフトでしなやかな食感へと変化した。加熱後の離水を除いた重量を測定した結果、本発明品の方が重量の変化が少なく、対照品に対して加熱歩留まりが向上していた。一方、味、風味などは対照品と同等であった。さらに、２週間５℃で冷蔵保存した後の離水の状態を観察した結果、本発明品の蒸し蒲鉾ではほとんど離水がなく、食感、味、風味なども保存前のものと同等であった。
【表２】
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同じ方法で調製した蒲鉾を用い、強制離水評価を行った。オートクレーブ（１２１℃、３０分）処理後に発生する離水と、−３０℃で凍結し融解した後に発生するの離水の２項目について調べた。離水率は、離水重量（ｇ）／処理前の重量（ｇ）として求めた。その結果を表３に示す。本発明品では、いずれも離水率が抑制されており、特に、原料１ｇ当たり０．２ユニット以上の添加で顕著に抑制されていた。このように、タンパク質脱アミド酵素を添加して調製した蒲鉾は、離水が発生しやすくなる処理を行っても、離水が抑制されていた。
【表３】
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同じ方法で調製した蒲鉾を用い、電子レンジ加熱（５００Ｗ、２０〜６０秒）による水分損失量を測定し、保水性の評価を行った。結果を表４に示す。タンパク質脱アミド酵素をすり身原料１ｇ当たり０．１ユニット以上添加することで、水分損失量は抑えられ、その効果は酵素濃度に依存して高まった。対照品の蒲鉾は、表面が乾燥して硬く、皺が多いのに対し、本発明品はしなやかで、張りのある状態を維持していた。食感も、対照品が硬化し、しなやかさが損なわれたのに比べ、本発明品は柔らかさとしなやかさの劣化はほとんどみられなかった。これは、本発明品は、加熱による水分蒸発と、それによる食感の劣化（硬くなり、しなやかさが損なわれる）が抑制されていることを示している。本結果から、本発明によるレトルトや煮込みのような過度な加工処理を施す肉タンパク質含有食品の品質向上が期待された。
【表４】
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【実施例３】
【０００７】
豚ロース肉１００重量部、１０％食塩水２０重量部、水５重量部を合わせ、真空パウチした後、冷蔵下で一晩、タンブラー中で回転させて塩漬を行った（対照品）。実施例１記載の方法で調製したタンパク質脱アミド酵素精製品（１００Ｕ／ｍｇ）を豚ロース肉１ｇに対し０．１ユニット、１ユニット、５ユニット相当量を水に溶解して、対照品と同じ要領で豚ロース肉を塩漬した（それぞれ試験品１〜３  ：いずれも本発明品）。翌日、不透過性円筒ビニリデンケーシング（直径７ｃｍ）に充填し、６０℃の乾燥雰囲気下で６０分間乾燥し、続いて６０℃で３０分間燻煙し、６０℃で２時間および７５℃で３０分間の蒸煮工程を経て、冷却しハムを得た。対照品と試験品１〜３について離水を除き重量測定をし、加熱後重量／加熱前重量（％）の値を算出し、加熱歩留まりを求めた。さらに２ｍｍ厚にスライスしたハムを用い、８名のパネラーによって官能評価を行った。官能評価は、まず、ハムのスライス面の滑らかさを手触りで評価、続いて試食し、硬さ、しっとり感について５段階で評価した。表５に試作結果を示す。
本発明品の加熱歩留まりは、対照品に比べて増加し、酵素添加量が多いほど効果は大きかった。また、本発明品のハムスライス面は非常に滑らかで、食感もソフトであった。さらに本発明品は、咀嚼時のぱさつきが明らかに少なく、飲み込み時の嚥下回数が少ないことから飲み込みやすいとの評価を受けた。
【表５】
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同じ記載の方法で試作したハムのうち、酵素を肉１ｇあたり１ユニット添加してつくったハムの再加熱離水を調べた。すなわち、ハムを真空パックして沸騰水（１００℃）中で５分間加熱した後に生じる離水量を測定し、離水率を求めた（離水率（％）＝離水量（ｇ）／元の重量（ｇ））。結果を表６に示した。本発明品のハムは、対照品に比べると離水率が減少した。この結果より、包装後のハムの表面を殺菌する目的で再加熱した際の離水が抑制され、品質が向上する可能性が示された。
【表６】
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【実施例４】
【０００８】
表７に示すレシピに従って、２種類の浸漬液を調製した。すなわち、食塩のみの浸漬液（対照品）、タンパク質脱アミド酵素を含む浸漬液（試験品）である。原料として用いる豚ロース肉ブロックは予め筋切りし、それぞれの重量を測定し、肉原料１００ｇあたり、各浸漬液を２５ｇ加え、真空パックした。４℃で１２時間静置して浸漬液を肉中に十分に拡散させて、漬け込み肉を得た。さらにホットプレート（約１６０℃）で表裏１．５分ずつ焼成して焼成肉を得た。焼成時の加熱歩留まりを、以下の式により求めた。
加熱歩留まり（％）＝（加熱後の固形部重量）／（加熱前の全重量）
さらに、７名のパネラーによる官能評価を実施し、「肉のやわらかさ」について５段階で評価した。
表８に、加熱歩留まり及び官能評価の結果を示した。試験品の浸漬液を用いた豚肉（本発明品）は対照品のそれと比較して、加熱歩留まりが向上した。また、試験品の浸漬液を用いた豚肉（本発明品）は、対照品のそれと比較して、本来肉が有している繊維感を維持したまま、ジューシーでかつ食感がやわらかく、サクッと歯が通っていく感じであった。豚ロース肉の他に、牛サーロイン、鶏むね肉でも同じの試作を行ったところ、同様の効果が得られた。すなわち、タンパク質脱アミド酵素により食肉を軟化させることができたことから、該酵素は食肉軟化剤として使用できることが確認された。
【表７】
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【表８】
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比較例１
実施例４で示したように、本発明で用いるタンパク質脱アミド酵素は、肉を柔らかくする目的でしばしば使用されるプロテアーゼと同様の効果があることが見出された。そこで、プロテアーゼとの比較を実施した。表７記載の浸漬液にタンパク質脱アミド酵素の代わりに、浸漬液あたり０．０１％のプロテアーゼ製剤（（パパイン、天野エンザイム製）を溶解し、実施例７と同じ方法で、豚ロース肉と、鶏むね肉の漬け込み肉を調製した。豚ロースは焼成し、鶏むね肉は真空パックし沸騰水中で１０分間加熱した。これらを官能評価したところ、プロテアーゼ使用品はいずれも硬さの面ではやわらかくなってはいたものの、肉特有の繊維感が損なわれ、本発明品とは異なる品質であった。特に、鶏肉については軟化の程度が過剰で、一部は溶けており、肉として全く噛みごたえのないものであった。このように、食肉軟化剤としてプロテアーゼの使用すると、反応が進みすぎた場合、過度な軟化、肉質（食味、食感）の低下を引き起こすことから、その反応制御が非常に難しいことが課題となっている。しかしながらタンパク質脱アミド酵素は、肉に本来の適度な繊維感を保持させるため、食肉軟化剤として使用した場合の反応制御が非常に容易で、流通、保存時間に依存しにくいため安定した品質の商品を供給することが可能である。これは、タンパク質脱アミド酵素の軟化機構が、食肉タンパク質の分解ではなく、食肉タンパク質の加熱凝集性の緩和であることに起因すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、筋肉タンパク質を含む食品の加工（加熱、冷凍、冷蔵等）、保存において生じる、該タンパク質の変性に起因する、歩留まり低下の抑制・離水の抑制、しなやかでソフトな食感の保持、味・風味の劣化の抑制を実現する食品及びそのような食品の製造方法を提供することができるので、本発明は食品分野において極めて有用である。
［配列表］
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