(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする花成制御遺伝子、または、配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加、および／または、挿入されてなる配列であって花成抑制活性を有するアミノ酸配列をコードする花成制御遺伝子、の発現を制御することにより、花成を制御することを特徴とする花成制御方法。
【請求項２】
上記花成制御遺伝子の発現を抑制することにより、花成を促進させることを特徴とする請求項１に記載の花成制御方法。
【請求項３】
植物において、（１）配列番号１に示す塩基配列からなり、花成を抑制する花成制御遺伝子を含んでなるＤＮＡ、または、（２）配列番号２に示す塩基配列からなり、花成を抑制する花成制御遺伝子を含んでなるＤＮＡ、が含む花成制御遺伝子の発現を制御することにより、花成を制御することを特徴とする花成制御方法。
【請求項４】
上記花成制御遺伝子の発現を抑制することにより、花成を促進させることを特徴とする請求項３に記載の花成制御方法。
【請求項５】
植物において、（１）配列番号１に示す塩基配列からなり、花成を抑制する花成制御遺伝子を含んでなるＤＮＡ、または、（２）配列番号２に示す塩基配列からなり、花成を抑制する花成制御遺伝子を含んでなるＤＮＡ、が含む花成制御遺伝子に対し、塩基の置換、欠失、および挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることで、この花成制御遺伝子の発現を抑制し、花成を促進させることを特徴とする花成制御方法。
【請求項６】
上記置換は、配列番号１に示す塩基配列における３０１２番目の塩基をシトシンからチミンに置換するものであることを特徴とする請求項５に記載の花成制御方法。
【請求項７】
上記挿入は、Ｔ−ＤＮＡの挿入であることを特徴とする請求項５に記載の花成制御方法。
【請求項８】
上記花成制御遺伝子の発現を抑制することにより、さらに、花序の形態を変化させることを特徴とする請求項２、４、５、６、７の何れか一項に記載の花成制御方法。
【請求項９】
上記植物がシロイヌナズナであることを特徴とする請求項１ないし８の何れか一項に記載の花成制御方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、花成を制御する遺伝子（花成制御遺伝子）、この遺伝子がコードするタンパク質、この遺伝子の発現を制御することによる花成制御方法、並びに、形質転換植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物には一般に、栄養生長期と生殖生長期とがある。特に、種子植物については、生長相が栄養生長期から生殖生長期へ転換し、花芽が形成される時期があり、この栄養生長期から生殖生長期への転換のことを花成と称している。
【０００３】
種子植物における花成の機構の解明は、学術的に重要なテーマーであるだけでなく、産業的にも特に重要なテーマの一つである。例えば、種子植物の花成が人為的に制御可能となれば、農園芸作物の収穫時期、育種などがより効率的に行いうると期待されている。
【０００４】
従来より今日まで、花成の機構に関して、アブラナ科の野草であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）をモデル植物として研究が進められている。シロイヌナズナは、世代時間が約５週間から６週間と短く、植物体が小さく、生育も容易である。また、染色体数は２ｎ＝１０と少ない。さらに、ゲノムサイズも約１３５Ｍｂｐと小さい。加えて、Ｔｉ，Ｒｉプラスミドベクターを用いて、遺伝子を導入する系も開発されている。それゆえ、シロイヌナズナは、各種農園芸作物などの産業植物を含む高等植物のモデルとして注目されており、早くからゲノム構造解析が進められてきた。現在、野生型シロイヌナズナ（生態型Columbia）の全ゲノム配列が明らかになっている。
【０００５】
さらに、シロイヌナズナを用いた研究によって、花成の制御機構には、部分的に機能が重複する４つの制御経路、すなわち、光周期依存的促進経路、自律的促進経路、春化依存的促進経路、ジベレリン依存的促進経路からなるモデルが存在することが明らかになっている（化学と生物 Vol.38,No.12,pp.826〜829(2000))。また、各制御経路上で機能する重要な遺伝子（花成制御遺伝子と総称する）も同定され、個々の制御経路の解明および理解も進んできている。
【０００６】
本発明者らは、以前に、花成制御遺伝子の一つであるFLOWERING LOCUS Ｔ遺伝子（ＦＴ遺伝子）をクローニングして解析した結果、このＦＴ遺伝子が特に光周期に依存して花成プロセスを制御する「花成のスイッチ遺伝子」の有力な候補であることを見出している（Y.Kobayashi, H.Kaya, K.Goto, M.Iwabuchi & T.Araki : Science, 286 1960-1962 (1999) 他）。上記ＦＴ遺伝子は、花序分裂組織決定遺伝子の最も重要なものの一つとして知られているLEAFY 遺伝子（ＬＦＹ遺伝子）と同時に強制発現させることで、植物の発芽後に、栄養成長を経ずに直ちに花芽を形成させる機能を示す。
【０００７】
それゆえ、花成の制御機構の解明および理解を進めることで、上記ＦＴ遺伝子を中心とした、花成の人為的な制御系を確立できる可能性が示唆されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記ＦＴ遺伝子の詳細な機能については、実質的に研究が開始されたばかりであるため分からないことも多い。例えば、ＦＴ遺伝子の発現は、ＣＯ遺伝子を介した光周期依存的促進経路による発現制御を受けるが、他の未知遺伝子を介した発現制御も受けていることが予想されている（細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１２  新版  植物の形を決める分子機構  第１版  １３８頁〜１４９頁（秀潤社））。
【０００９】
よって、ＦＴ遺伝子の発現制御にかかる新規な花成制御遺伝子を見出すことができれば、従来とは異なる様式で、人為的に花成をコントロールできる可能性がでてくる。また、このような新規な花成制御遺伝子を用いてＦＴ遺伝子の機能をより詳細に解明し、その理解を進めることが可能となる。加えて、新規な花成制御遺伝子を用いて、あるいはその発現を抑制して、植物の花成を効果的に促進または抑制可能となることなどが期待される。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、花成の制御機構の理解・解明と、花成の人為的制御系の確立とが可能な、新規な花成制御遺伝子を単離することにある。加えて、この花成制御遺伝子を用いて、あるいはその発現を抑制して植物の花成を制御する方法、並びに、この方法により花成を制御した植物を得ることにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、シロイヌナズナからクローニングされた新規な花成制御遺伝子が、公知の花成制御遺伝子であるＦＴ遺伝子の発現を抑制することにより花成を抑制することを見出し、さらに、この新規な花成制御遺伝子の発現を制御することで、花成のタイミングが制御可能となることを見出して、本願発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかる花成制御遺伝子は、上記の課題を解決するために、植物から単離され、花成に関与するＦＴ遺伝子またはその相同遺伝子の発現を抑制することで花成を抑制することを特徴としている。
【００１３】
上記新規な花成制御遺伝子、その翻訳産物（タンパク質）は、短日・長日いずれの条件にかかわらず植物の花成を抑制する。さらに詳細には、上記新規な花成制御遺伝子、その翻訳産物は、栄養成長期におけるＦＴ遺伝子の発現を抑制する。一方、以下に説明するように、この花成制御遺伝子の発現を抑制すれば、植物の花成が促進されるとともに花序に形態変化が生じる。すなわち、この花成制御遺伝子の植物内での発現を制御（過剰発現または抑制）することで、植物の花成タイミングおよび花序の形態などを人為的に制御することが可能となる。
【００１４】
なお、上記の花成制御遺伝子は、少なくとも花成制御に関与する構造遺伝子領域を含んでいればよく、加えて、この構造遺伝子領域の発現調節に関与する調節遺伝子領域（プロモータ、エンハンサ、ＲＮＡポリメラーゼ結合領域など）を含んでいてもよい。また、この花成制御遺伝子は、イントロンなどの非コード領域およびエクソンを含んだゲノムＤＮＡであってもよく、上記構造遺伝子領域に少なくとも対応したｃＤＮＡであってもよい。さらに、花成制御遺伝子は、一本鎖（コーディング鎖のみ）の状態で存在するものであってもよく、相補鎖と結合して二本鎖の状態で存在するものであってもよい。
【００１５】
上記新規な花成制御遺伝子として、具体的には、例えば、シロイヌナズナから単離され、栄養成長期間において花成に関与するＦＴ遺伝子の発現を抑制することで花成を抑制するＴＦＬ２(TERMINAL FLOWER 2) 遺伝子が挙げられる。
【００１６】
ＴＦＬ２遺伝子は、より具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片中にその調節遺伝子領域および構造遺伝子領域の双方が含まれた構成となっており、また、配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片中にはその構造遺伝子領域のみが含まれた構成となっている。
【００１７】
配列番号１および２に示す塩基配列からなる上記ＤＮＡ断片はいずれも、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡから取得されたものである。また、このＤＮＡ断片の転写産物である成熟ｍＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡにおいて、上記構造遺伝子領域に対応する領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））は、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ（本発明にかかる花成制御遺伝子の一つ）である。
【００１８】
配列番号１または２に示す塩基配列からなるＤＮＡ中に含まれる花成制御遺伝子、並びに、配列番号３に示す塩基配列からなる花成制御遺伝子はいずれも、配列番号４で示すアミノ酸配列をコードしている。つまり、本発明にかかるＴＦＬ２タンパク質は、配列番号４に示すアミノ酸配列からなる。よって、本発明にかかる花成制御遺伝子とは、上記例示の花成制御遺伝子に限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその相同アミノ酸配列からなるタンパク質（花成抑制機能を示すものに限る）をコードするあらゆるＤＮＡを含むものとする。
【００１９】
また、本発明にかかる花成制御方法は、上記の課題を解決するために、植物において、上記いずれかの花成制御遺伝子の発現を制御する（発現を抑制する、または過剰発現させる）ことにより、花成を制御することを特徴としている。
【００２０】
上記の方法によれば、植物の花成タイミングおよび花序の形態などを人為的に制御することが可能となる。具体的には、上記花成制御遺伝子の発現を人為的に抑制すれば、光周性に関わりなく農園芸作物の収穫時期をシフトさせる（一般に早める）ことができる。特に、芽生えから花成までの期間が短縮されることに加え、上記花成制御遺伝子の発現抑制により花序の形態が変化するので、葉数、サイズ、花序の形態などの外観が従来とは異なる状態で開花に至る新規な花卉園芸作物を提供することができる。また、花成制御遺伝子を人為的に過剰発現させれば、光周性に関わりなく農園芸作物の収穫時期をシフトさせる（一般に遅らせる）ことができる。特に、発現が抑制される場合と同様に、外観が従来とは異なる状態で開花に至る新規な花卉園芸作物を提供することができる。
【００２１】
また、本発明にかかる花成制御遺伝子の発現を抑制する特に好適な方法としては、この花成制御遺伝子に対し、塩基の置換、欠失、および挿入から選択される少なくとも一つを生じさせる方法が挙げられ、より具体的には、１）花成制御遺伝子内に不所望な終始コドンが形成されるように、配列番号１に示す塩基配列における３０１２番目の塩基（配列番号２では１３６４番目の塩基に相当）をシトシンからチミンに置換する方法や、２）上記花成制御遺伝子にＴ−ＤＮＡを挿入する方法などが挙げられる。
【００２２】
また、上記の花成制御方法は、特に、シロイヌナズナなどの植物に適用可能であり、この方法を採用することで、花成が制御されてなる形質転換シロイヌナズナなどの形質転換植物を提供可能となる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図面に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明にかかる花成制御遺伝子は、植物から単離され、花成を抑制する機能を示す新規な遺伝子（花成抑制遺伝子）である。また、後述するように、この花成制御遺伝子は、花成に関与するＦＴ遺伝子またはその相同遺伝子の発現を抑制することにより、植物の花成を抑制していると考えられる。
【００２５】
ここで、「ＦＴ遺伝子の相同遺伝子」とは、本願発明者等がシロイヌナズナから単離したＦＴ遺伝子（FLOWERING LOCUS Ｔ遺伝子：後述する）と実質的に同一の機構により花成に関与する遺伝子全般を指すものとする。また、本願発明は植物の花成に関連することから、特に断りのない限り、以下の説明において、「植物」とは種子植物（裸子植物および被子植物）のみを指すものとする。
【００２６】
以下、本発明にかかる新規な花成制御遺伝子として、特に、シロイヌナズナから単離された花成制御遺伝子 TERMINAL FLOWER 2遺伝子（ＴＦＬ２遺伝子）を例に挙げて具体的に説明する。ＴＦＬ２遺伝子は、FLOWERING LOCUS Ｔ遺伝子（ＦＴ遺伝子）の発現を抑制し、花成を抑制する機能を示す遺伝子であり、その発現が人為的に抑制されるとＦＴ遺伝子の発現量が増加して、花成促進を引き起こす。つまり、ＴＦＬ２遺伝子は、植物の花成制御に関わる重要かつ新規な遺伝子であり、ＦＴ遺伝子の発現に重大に関与すると考えられる。
【００２７】
なお、ここで、「ＦＴ遺伝子の発現量が増加する」および「花成が促進される」とはそれぞれ、同一環境下で同一期間生育された野生型シロイヌナズナ（ＴＦＬ２遺伝子の発現が人為的に制御されていないもの）と比較して増加および促進されている状態を指すものとする。
【００２８】
図１に示すように、現在までに明らかとなったシロイヌナズナの花成プロセスの概要では、LEAFY 遺伝子（ＬＦＹ遺伝子）、ＦＴ遺伝子、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 遺伝子（ＳＯＣ１遺伝子）それぞれが花芽分裂組織決定遺伝子の発現を直接的に制御し、これにより花成がコントロールされる。また、より上流側で花成を制御する遺伝子としてCONSTANS遺伝子（ＣＯ遺伝子）、FLOWERING LOCUS C 遺伝子（ＦＬＣ遺伝子）、ＦＣＡ遺伝子、FRIGIDA 遺伝子（ＦＲＩ遺伝子）などの存在が確認されている。
【００２９】
上記のＣＯ遺伝子は、光周期依存的促進経路を構成する遺伝子の一つである。より具体的には、長日条件によりその発現量が増加して、上記ＬＦＹ遺伝子、ＦＴ遺伝子、ＳＯＣ１遺伝子の発現量を増加させる。この結果、花芽分裂組織決定遺伝子の発現量が増加し、花成が促される。
【００３０】
上記のＦＬＣ遺伝子は、春化依存的促進経路および自律的促進経路を統合する遺伝子である。より具体的には、春化処理またはＦＣＡ遺伝子の発現によりその発現が抑制され、ＦＲＩ遺伝子の発現によりその発現量が増加する。なお、上記のＦＣＡ遺伝子およびＦＲＩ遺伝子はいずれも自律的促進経路を構成する遺伝子の一つである。
【００３１】
また、上記ＦＬＣ遺伝子の発現は、ＦＴ遺伝子およびＳＯＣ１遺伝子の発現を抑制し、花成を抑制するように機能するとの推測もある。なお、この推測は、ＦＬＣ遺伝子の上流遺伝子であるＦＣＡ遺伝子が変異したミュータントｆｃａにおいて、ＦＬＣ遺伝子の発現量が増加し、ＦＴ遺伝子およびＳＯＣ１遺伝子の発現が低くなっているとの観察に基づいたものに過ぎず（Samach,A.et.al:www.sciencemag.org SCIENCE VOL 288(2000),P1613-1616）、例えば、「ＦＬＣ遺伝子の発現が抑制されたミュータントｆｌｃにおいてＦＴ遺伝子の発現量が増加する」、などの直接的な証拠は未だ見出されていない。また、さらに最近の研究では、ＦＬＣ遺伝子はＦＴ遺伝子よりも、むしろＳＯＣ１遺伝子のリプレッサーであると考えられている(Araki T. (2001):Current Opinion on Plant Biology 4,p63-68) 。
【００３２】
またジベレリン依存的促進経路は、上記のＬＦＹ遺伝子の発現を制御する。より具体的には、ジベレリン処理によりＬＦＹ遺伝子の発現量が増加して、花成が促進される。
【００３３】
つまり、上記のＬＦＹ遺伝子は、ジベレリン依存的促進経路と光周期依存的促進経路とにより発現が制御されて花成を制御し、ＦＴ遺伝子およびＳＯＣ１遺伝子は、光周期依存的促進経路、春化依存的促進経路、および自律的促進経路により発現が制御されて花成を制御すると考えられている。
【００３４】
なお、後述するが、本発明にかかるＴＦＬ２遺伝子がコードするＴＦＬ２タンパク質は、その一次構造から判断して、図１に示すＣＯ遺伝子およびＣＯ様遺伝子の翻訳産物（ＣＯタンパク質およびＣＯ様タンパク質（ＣＯ（様）タンパク質と総称する））と特異的に結合する可能性が高い。よって、自然環境下で生育する野生型シロイヌナズナでは、ＴＦＬ２遺伝子がＦＴ遺伝子の発現を直接抑制する可能性に加え、産生したＣＯ（様）タンパク質にＴＦＬ２タンパク質が結合してＣＯ（様）タンパク質の機能が阻害され、この結果、ＦＴ遺伝子の発現が一定期間抑制されるとも推測される。
【００３５】
以下、上記ＴＦＬ２遺伝子の具体的な構成について詳細に説明する。なお、本願発明において、「花成制御遺伝子」とは少なくともその構造遺伝子領域を含むものであればよいが、以下の説明において、単にＴＦＬ２遺伝子と称する場合には、その調節遺伝子領域および構造遺伝子領域の双方を含む概念とする。
【００３６】
上記ＴＦＬ２遺伝子は、その遺伝子座がシロイヌナズナ・ゲノムの第５番染色体上約１５ｃＭ（センチモルガン）の位置に大まかにマップされてはいたものの(http://www.arabidopsis.org/参照) 、本願発明者らによりシロイヌナズナから初めて単離された新規な花成制御遺伝子である。
【００３７】
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡにおいて、上記ＴＦＬ２遺伝子の構造遺伝子領域は、図２（ａ）に示すように６個のエクソン（黒塗りの四角で示す）と、このエクソン間に介在する５個のイントロンとを含んで構成されている。配列番号２にその塩基配列を示すように、上記の構造遺伝子領域は２０３４塩基対（約２ｋｂｐ）のサイズを有しており、１〜３６０番目の塩基、６７４〜６９９番目の塩基、８０１〜８８７番目の塩基、１０００〜１７５５番目の塩基、１８３８〜１８９８番目の塩基、１９８７〜２０３４番目の塩基、に相当する領域が、６つのエクソンに対応している。
【００３８】
また、調節遺伝子領域も含めたＴＦＬ２遺伝子の全長をゲノムＤＮＡ上で正確に特定することは困難であるが、実施例にて述べる約５．７ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片（その塩基配列を配列番号５で示す）内にＴＦＬ２遺伝子は確実に含まれており、このゲノムＤＮＡ断片においてＴＦＬ２遺伝子に隣接する遺伝子のＯＲＦ(Open Reading Frame)を除いた領域、すなわち配列番号１に示す塩基配列（４０３２塩基対）を有するゲノムＤＮＡ内には、ＴＦＬ２遺伝子が確実に含まれる。
【００３９】
さらに、上記ＴＦＬ２遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡのアミノ酸コード領域（ＯＲＦ(Open Reading Frame)）は、配列番号３に示す１３３８塩基対のサイズを有している。
【００４０】
配列番号１〜３に塩基配列を示す上記ＤＮＡはいずれも、配列番号４に示す４４５個のアミノ酸からなるタンパク質（花成制御タンパク質：ＴＦＬ２タンパク質）をコードしており、必要に応じて、適切な調節遺伝子領域（プロモータなど）の下流側に連結して宿主中に導入すればＴＦＬ２タンパク質に翻訳される。なお、配列番号３に示す塩基配列と、それがコードするアミノ酸配列との関係は、図７〜図９にも併記する。
【００４１】
すなわち、配列番号１〜３に塩基配列を示すＤＮＡは全て、本発明にかかる花成制御遺伝子の範疇に含まれる。つまり、本発明にかかる花成制御遺伝子は、植物のゲノム中に含まれる形態、すなわちイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、例えば、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンを含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡのＵＴＲ(untranstated region) に対応する領域を含んでいてももちろんよく、特に翻訳効率などに重大な影響を与える３’ＵＴＲに対応する領域を少なくとも含んでいることがより好ましい。
【００４２】
また、配列番号４に示すアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列（相同アミノ酸配列）を有する変異タンパク質も、本発明にかかる花成制御タンパク質の範疇に含まれ、この変異タンパク質をコードするＤＮＡも、本発明にかかる花成制御遺伝子の範疇に含まれる。ここで「相同アミノ酸配列」とは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加、および／または、挿入されてなる配列であって、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同様の花成制御活性を有するタンパク質を構成する配列をさす。なお、１または数個のアミノ酸残基の欠失などは自然界では一般的におこり得るものであり、さらに、公知の部位特異的変異誘発法(Kunkel et al.(1985):Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.82.p488-) を用いて人為的に行うこともできる。
【００４３】
ＴＦＬ２遺伝子の構造遺伝子領域がコードするＴＦＬ２タンパク質は、図２（ｂ）に示すように、クロモドメイン（９７〜１４５番目のアミノ酸に相当）およびクロモシャドウドメイン（３７６〜４４５番目のアミノ酸に相当）を含んでなり、また、アスパラギン酸とグルタミン酸とに富んだ領域（Ｅ，Ｄリッチ領域：６３〜９９番目のアミノ酸に相当）も存在する（配列番号４、図７〜９に記載のアミノ酸配列も参照）。この特徴は、ショウジョウバエから単離され、哺乳動物でもそのホモログが発見されているポリコーム遺伝子Ｐｃ（(Polycomb)：クロモドメインを有する）などと共通点があり、ＴＦＬ２遺伝子はポリコーム遺伝子の新規なホモログだと考えられる。
【００４４】
これまでに植物から単離されたポリコーム遺伝子のホモログには、ＭＥＤＥＡ遺伝子、ＣＬＦ遺伝子、ＦＩＥ遺伝子などがあるが、これら遺伝子の翻訳産物は、ＳＥＴドメインまたはＷＤリピートをもつタイプのみであり、ＴＦＬ２遺伝子のようにクロモドメインおよびクロモシャドウドメインを有する翻訳産物をコードするものは、植物では前例がなかった。なお、ドメインの共通性から見たショウジョウバエのポリコーム遺伝子と、シロイヌナズナ(Arabidopsis) の遺伝子との対応関係は、図３（ｂ）に示す通りである。
【００４５】
ショウジョウバエにおいて、ポリコーム遺伝子は、ホメオティック遺伝子の発現に関わる遺伝子として機能している。図３（ａ）に示すように、ポリコームタンパク質群（図中、Ｈｂ，ｄＭｉ，Ｐｃ，Ｐｓｃ，Ｅ（ｚ），Ｅｓｃ）は、ポリコーム応答配列と呼ばれるＤＮＡ配列に結合し、ヘテロクロマチン形成を誘導する。ヘテロクロマチンとはクロマチンが凝集したものであり、これが形成された遺伝子座の転写は阻害される。このようにして、発現しなくなった領域には、発生過程において、体の各部分の形態を決定する機能に関与するホメオティック遺伝子（図中、Ｕｂｘ(Ultra bithorax)遺伝子）がある。
【００４６】
実施例でも述べるが、ＴＦＬ２遺伝子は、栄養成長期にあるシロイヌナズナにおいてＦＴ遺伝子の発現を抑制する機能を示す。図４に示すように、酵母 two-hybrid systemを利用してスクリーニングされた、ＴＦＬ２タンパク質に結合するタンパク質（ＣＯ様タンパク質：CO-like protein)のアミノ酸配列は、ＣＯ遺伝子の翻訳産物であるＣＯ（CONSTANS) タンパク質のアミノ酸配列と相同性（約３６％）を示すので、栄養成長期では、産生されたＴＦＬ２タンパク質がＣＯ様タンパク質に結合し、該ＣＯ様タンパク質の機能を阻害してＦＴ遺伝子の発現制御に関与する可能性が示唆される。
【００４７】
一方、ＴＦＬ２遺伝子の単離には至らなかったものの、シロイヌナズナｔｆｌ２変異体と思われる変異体では、長日・短日条件下共に花成が促進されることが既に報告されている(Larssonら (Genetics 149:597-605(1998)) ) 。図３を用いて説明したように、ＴＦＬ２遺伝子はポリコーム遺伝子のホモログであると考えられるので、当該ＴＦＬ２遺伝子がヘテロクロマチン形成を誘導し、ＦＴ遺伝子の発現を直接抑制するとともに、この発現抑制状態の維持に関わる可能性が示唆される。さらに、ＴＦＬ２遺伝子の機能喪失は、花成の光周期依存性を打破した早咲き植物の作出を可能とする。よって、ＴＦＬ２遺伝子は光周期依存的な花成制御経路が正常に機能するために不可欠な遺伝子の一つであると考えられる。
【００４８】
本発明にかかるＴＦＬ２遺伝子のクローニング方法としては、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。本発明においては、後述する実施例で説明するように、野生型シロイヌナズナの特定遺伝子が機能破壊されて生じた早咲き表現型の突然変異体を用いて、シロイヌナズナのゲノムデータベースから上記特定遺伝子（ＴＦＬ２遺伝子）を同定し、クローニングしている。
【００４９】
シロイヌナズナについては様々なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーが市販されているので、上記ＴＦＬ２遺伝子またはそのｃＤＮＡの少なくとも一部配列をプローブとして、ＴＦＬ２遺伝子またはそのｃＤＮＡを容易に取得することができる。また、ＴＦＬ２遺伝子またはそのｃＤＮＡを公知の方法で合成することもできる。なお、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする場合には、ＴＦＬ２遺伝子に隣接した配列をプローブとしてもよい。ＴＦＬ２遺伝子またはそのｃＤＮＡを取得するためのライブラリーは、例えば、STRATAGENE社やCLONTECH社などから容易に入手可能である。
【００５０】
また、本発明では、シロイヌナズナ由来の上記ＴＦＬ２遺伝子を用いて、他の植物からＴＦＬ２遺伝子のホモログをクローニングすることも可能である。この場合のクローニング方法としても、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００５１】
具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている植物の場合には、上記ＴＦＬ２遺伝子の塩基配列に基づいて相同性のある塩基配列をデータベース中から検索すればよい。また、ゲノムがデータベース化されていない植物の場合には、たとえば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたスクリーニング法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニング・ベクターを使用して対象となる植物からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、上記ＴＦＬ２遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブな断片をスクリーニングするステップとを含む方法を用いることができる。
【００５２】
すでに説明したように、ＴＦＬ２遺伝子は、ＦＴ遺伝子の発現を抑制して、シロイヌナズナの花成を抑制する機能を示す。例えば、ＴＦＬ２遺伝子が機能破壊されたシロイヌナズナｔｆｌ２変異体では、同一環境下にある野生型シロイヌナズナと比較してＦＴ遺伝子の発現量が１０倍以上増加し、栄養生長分裂組織から花序分裂組織への転換が促進される（実施例参照）。そのため、シロイヌナズナｔｆｌ２変異体における花成に必要な時間は、野生型シロイヌナズナにおける花成に必要な時間の半分程度（長日条件下）またはそれ以下（短日条件下）に短縮される。よって、ＴＦＬ２遺伝子は、日長による花成の制御に不可欠な因子であると考えられる。加えて、シロイヌナズナｔｆｌ２変異体では、無限花序から有限花序へと花序の形態が変化し、頂花(terminal flower) をつけるようになる。
【００５３】
よって、本発明にかかる花成制御遺伝子（ＴＦＬ２遺伝子など）の発現量を、人為的にコントロール（過剰発現または抑制）することで、植物の花成タイミングおよび花序の形態などを人為的に制御することが可能となる。具体的には、上記花成制御遺伝子の発現を人為的に抑制すれば、光周性に関わりなく農園芸作物の収穫時期をシフトさせる（一般に早める）ことができる。特に、芽生えから花成までの期間が短縮されることに加え、上記花成制御遺伝子の発現抑制により花序の形態が変化するので、葉数、サイズ、花序の形態などの外観が従来とは異なる状態で開花に至る新規な花卉園芸作物を提供することができる。また、花成制御遺伝子を人為的に過剰発現させれば、光周性に関わりなく農園芸作物の収穫時期をシフトさせる（一般に遅らせる）ことができる。特に、発現が抑制される場合と同様に、外観が従来とは異なる状態で開花に至る新規な花卉園芸作物を提供することができる。
【００５４】
本発明にかかる花成制御遺伝子を植物内で過剰発現させる方法は特に限定されないが、一般には、遺伝子工学的手法により、単離した花成制御遺伝子を発現可能な状態で植物細胞内に導入する（方法（１））、などの公知の方法が採用される。なお、「植物において、花成制御遺伝子を過剰発現させる」とは、植物内で、花成制御遺伝子がコードするタンパク質（ＴＦＬ２タンパク質など）を人為的に過剰産生させることをいう。
【００５５】
また、植物において、上記花成制御遺伝子の発現を人為的に抑制する方法は特に限定されないが、例えば、Ａ）花成制御遺伝子の発現調節に関与する調節遺伝子領域へのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻害する方法（方法（２））、Ｂ）植物内で、花成制御遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を発現させることにより、タンパク質への翻訳を抑制する方法（方法（３））、Ｃ）花成制御遺伝子の構造遺伝子領域（特にエクソン内）または調節遺伝子領域に、塩基の置換、欠失、および挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることでこの花成抑制遺伝子を機能破壊して、その転写自体を抑制する方法（方法（４））、など公知の方法が採用される。ここで、「植物において、花成制御遺伝子の発現を抑制する」とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、または、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の少なくとも一方のステップを人為的に抑制することを指す。
【００５６】
なお、上記の方法（１）・（３）では、発現させるＤＮＡ断片を、遺伝子工学的手法により植物細胞内に導入する工程が必要となるが、この工程には公知の方法を採用すればよい。例えば、１）植物細胞内で転写可能なプロモータ、２）プロモータに結合した上記ＤＮＡ断片、３）必要に応じて結合されるＤＮＡ配列（例えば、ＵＴＲに相当する配列や、ＲＮＡ分子のポリアデニル化に関するシグナル配列など）、を含んでなる二本鎖ＤＮＡ分子を発現カセットとして、直接的またはベクターを介して植物細胞（インタクトな細胞以外にも、スフェロプラスト、プロトプラストも含む）内に導入する。
【００５７】
上記発現カセットを植物細胞内に直接的に導入する方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、など公知の方法を採用すればよい。また、発現カセットをベクターを介して植物細胞内に導入する方法としては、適切な中間ベクターまたはバイナリーベクター（プラスミドベクター）中に上記発現カセットをクローニングし、これをアグロバクテリウム属菌に取り込ませ、植物細胞に感染させる方法が一般に採用される。
【００５８】
植物細胞内で転写可能な上記プロモータの種類も特に限定されるものではなく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータなどの恒常発現型のプロモータや、紫外線などの外的ストレスの付与により活性化する誘導発現型のプロモータが採用される。なお、誘導発現型のプロモータを採用する場合には、本発明にかかる花成制御遺伝子の植物細胞内における発現を微妙に制御可能となり、植物の花成タイミングがより自在に制御される。
【００５９】
また、上記方法（３）において、花成制御遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を発現させるためには、花成制御タンパク質をコードするＤＮＡの少なくとも一部、例えば、配列番号３に示すｃＤＮＡの全領域または一部領域を上記プロモータの下流にアンチセンス方向に連結して発現カセットを構成すればよい。
【００６０】
なお、上記方法（１）・（３）において、発現カセットが導入された植物細胞から再生個体を作出する方法は、植物種毎に確立された方法に従って行えばよい。
【００６１】
また、上記方法（４）において、構造遺伝子領域または調節遺伝子領域に、塩基の置換または欠失を生じさせるためには、放射線照射、中性子線照射、エチルメタンスルフォン酸処理などの従来公知の突然変異体誘導方法を採用すればよく、得られた突然変異体の中から花成促進の表現型を示す変異体を選抜すればよい。一方、上記構造遺伝子領域または調節遺伝子領域に塩基の挿入を生じさせるためには、例えば、減圧湿潤法を用いてＴ−ＤＮＡをゲノムに挿入し、得られた突然変異体の中から花成促進の表現型を示す変異体を選抜すればよい。また、ここでＴ−ＤＮＡとは、少なくともその両端にある境界領域を含んでなるものを指し、内部の遺伝子は他のＤＮＡ配列に置き換えられていてもよい。
【００６２】
なお、上記方法（１）〜（４）により作出された植物体、またはこの植物体をもとに無性生殖あるいは有性生殖により作出された植物体のうち、花成促進の表現型を示す変異体または花成遅延（抑制）の表現型を示す変異体を、本発明にかかる形質転換植物とする。また、いうまでもないが、本発明にかかる形質転換植物の範疇には、種子や植物体そのもの以外にも、植物体をなす細胞、組織、器官、並びに、誘導カルス、プロトプラスト、スフェロプラストなども含むものとする。
【００６３】
また、本発明にかかる形質転換植物は、種子植物の形質転換体として取得されるものである。ここで、種子植物とは、具体的には、アサガオなど花そのものを鑑賞する花卉園芸作物、シロイヌナズナなどの実験植物、あるいは、花成後に生じる種子（ここでは果実も含む）を利用する種子作物などを挙げることができる。なお、本発明にかかる花成制御遺伝子の発現を制御すれば、本来とは異なる外観で開花し、加えて花序の形態変化も生じるので、上記種子植物の中でも花卉園芸作物が特に好ましく、中でも、ストック（アラセイトウ）、コアラセイトウ、ハナダイコン、ニワナズナ、などのアブラナ科（シロイヌナズナを含む科）の植物が特に好適である。また、上記種子作物としては、たとえば、イネ、キビ、アワ、トウモロコシ、大麦、コムギ、モロコシ、ライムギ、エンバク等の穀物類；大豆、小豆等のマメ科植物；ワタ、ナタネ等のその他の種子を利用する植物；トマト、キュウリ、ナスなどの実生の野菜；リンゴ、ナシ、サクランボ、ブドウ、柑橘類、バナナ等の果物；ココア、コーヒー等の嗜好品作物；等が挙げられる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明にかかるＴＦＬ２遺伝子、そのｃＤＮＡクローンの取得方法、並びにＴＦＬ２タンパク質の取得方法について、図面に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００６５】
〔実施例１〕
（シロイヌナズナｔｆｌ２変異体の取得、ＴＦＬ２遺伝子の取得）
本発明にかかるＴＦＬ２遺伝子の同定および単離は、Ｔ−ＤＮＡタギング法に従い行った( 「モデル植物ラボマニュアル p162-167 ：シュプリンガー・フェアラーク東京(2000 年発行) 」の記載参照) 。つまり、野生型シロイヌナズナ（生態型Columbia）において、ＴＦＬ２遺伝子内にＴ−ＤＮＡが挿入されたｔｆｌ２変異体（形質転換シロイヌナズナ：ｔｆｌ２−３変異体と称する）を新規に作出した。以下、ｔｆｌ２−３変異体の作出方法をより詳細に説明する。
【００６６】
Ｔ−ＤＮＡの導入による変異体の取得は、以下に概要を示す減圧湿潤法に従い行った。なお、特に断りのない限り、この工程の詳細な条件は、「細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ１５  新版  モデル植物の実験プロトコール p109-113 ：秀潤社(2001 年発行) 」の記載に従っている。また、ベクターには、Ｗａｌｄｅｎらの開発したアクティベーションＴ−ＤＮＡタギング用ベクター（pPCVICEn4HPT）を用いた（「細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５  新版  モデル植物の実験プロトコール p135-136 ：秀潤社(2001 年発行) 」）。このベクターを用いると、得られた変異体からプラスミドレスキュー法によるクローニングが可能となる。
【００６７】
まず、野生型シロイヌナズナ（生態型Columbia）を、所定の生育法に従って長日条件下で生育し、アグロバクテリウム属細菌が感染可能な状態とする。次いで、野生型シロイヌナズナをアグロバクテリウム属細菌の懸濁液に浸し、それをデシケーターに入れて減圧する。次いで、野生型シロイヌナズナをデシケーターから取り出して育成し、種子を収穫する。なお、得られた種子から形質転換体を選択する際には、Ｔ−ＤＮＡが有する抗生物質耐性遺伝子（耐性マーカー）を指標とすればよい。
【００６８】
減圧浸潤法にて得られる変異体は、Ｔ−ＤＮＡ挿入による遺伝子破壊株であり、以降の解析の便宜上、Ｔ２世代（遺伝子型が劣性ホモ型）から早咲きの表現型を示す個体のみを選別した。次に、選別したＴ２世代の個体を野生型シロイヌナズナに戻し交配して、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位を一ヶ所とした。そして、変異形質と外来遺伝子（Ｔ- ＤＮＡ上の遺伝子）由来の形質とが共分離する個体を選別し、ｔｆｌ２−３変異体とした。次に、Ｔ−ＤＮＡ上の抗生物質耐性遺伝子により付与される薬剤耐性と、表現型との連鎖を調べ、Ｔ−ＤＮＡによりタグされているか否かを確認した。
【００６９】
また、Ｔ−ＤＮＡをマーカーとして、目的の遺伝子（ＴＦＬ２遺伝子）を同定するために、以下に概要を示すプラスミドレスキュー法を採用した（「細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５  新版  モデル植物の実験プロトコール p140-141 ：秀潤社(2001 年発行) 」参照）。まず、ｔｆｌ２−３変異体のゲノムＤＮＡを単離・精製し、次いで、このゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で消化した。なお、制限酵素の選択は、Ｔ−ＤＮＡの一端（好ましくは両端）にあるＤＮＡ領域を回収でき、Ｔ−ＤＮＡに含まれるβ−ラクタマーゼ遺伝子をマーカーとして利用できるように考慮すればよい。次いで、制限酵素消化により得られたＤＮＡ断片をセルフライゲーションさせ、このＤＮＡ断片を大腸菌に導入した。次いで、上記β−ラクタマーゼ遺伝子をマーカーとして、Ｔ−ＤＮＡを含む大腸菌を選抜した。これにより、Ｔ−ＤＮＡを含むＤＮＡ断片がクローニングされた。
【００７０】
次いで、回収したＤＮＡ断片のうちＴ−ＤＮＡに隣接する領域の塩基配列を決定し、さらに、この塩基配列を、公開データベースに登録された野生型シロイヌナズナ（生態型Columbia）のゲノムの塩基配列情報を用いて検索し、両配列が一致するゲノムＤＮＡ上の領域およびその近傍がＴＦＬ２遺伝子であると判断した。また、この検索の結果、配列番号１に示す塩基配列における１３５４番目〜２８８５番目の塩基（配列番号５に示す塩基配列における２６５３番目〜４１８４番目の塩基）が欠失し、その部位に約１．５ｋｂｐのサイズの上記Ｔ−ＤＮＡが挿入されていることが判明した。
【００７１】
次いで、決定した塩基配列をもとにプローブを作成し、サザンハイブリダイゼーション法による確認を行った（実施例２参照）。また、決定した塩基配列から作成したプローブを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、ＴＦＬ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片、およびｃＤＮＡを単離した。さらに、ＴＦＬ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片を、シロイヌナズナｔｆｌ−２変異体に導入し、形質が回復することを確認した（実施例３参照）。
【００７２】
〔実施例２〕
（シロイヌナズナｔｆｌ２変異体の詳細な解析）
野生型シロイヌナズナ（生態型Columbia）において、ＴＦＬ２遺伝子が機能破壊されたと考えられるシロイヌナズナｔｆｌ２変異体として、ｔｆｌ２−１変異体、ｔｆｌ２−２変異体、およびｔｆｌ２−３変異体（実施例１参照）の３種を用意した。これら３種の変異体はいずれも早咲きの表現型を示すものである。
【００７３】
ｔｆｌ２−１変異体は野生型シロイヌナズナの種子に中性子線照射して、また、ｔｆｌ２−２変異体はｔｆｌ1 変異体の種子をＥＭＳ処理して作出されたものである。なお、ｔｆｌ２−１変異体、およびｔｆｌ２−２変異体の作出・選抜方法については、Larsson ら（Genetics 149 597-605(1998)）により詳細に説明されている。なお、これら変異体では、新規な花成制御遺伝子に機能破壊があると推測されてはいたが、当該花成制御遺伝子の単離・配列決定は未だなされていなかった。
【００７４】
はじめに、ｔｆｌ２−１変異体の変異部位の特定法について説明する。まず、ｔｆｌ２−１変異体よりIsoplant（ニッポンジーン社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。次いで、このゲノムＤＮＡ１ｕｇを鋳型とし、ＴＦＬ２遺伝子のタンパク質コード領域（配列番号２に示す塩基配列参照）および前後のスペーサー合計約４ｋｂｐを、ＭＶＡ１−ＳプライマーとＭＶＡ１０−ＡプライマーとをプライマーセットとしたＰＣＲ用キット(TaKaRa Ex Taq (TaKaRa社製）により増幅した。なお、増幅条件はキット添付の手引書の記載に従っている。次いで、得られた増幅産物を、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen社製）にＴＡ−クローニングし、以下に示す１１のプライマーにより配列決定を行った。尚、配列決定の際には、BigDye Terminator Sequencing kit(PE Applied Biosystems社製) によりキット添付の手引書の記載に従って反応を行い、DNA sequencer 310 (PE Applied Biosystems社製) により配列を解析した。
【００７５】
なお、上記１１のプライマーの配列は、
MVA 1-S   caaaactgactgggaattggagg
MVA 2-S   cagagaaaaaggttgttctc
MVA 3-S   gaactgcaaattttatagtaac
MVA 4-S   ctgatttttcaatctcctttg
MVA 5-S   gaacgcgattaccttgattc
MVA 6-S   ggccaaagcttgatgaaggg
MVA 7-S   gagtttttctaatcttacttgg
MVA 8-S   gagtttttctaatcttacttgg
MVA 9-S   gaaatctgactcttctacgtc
MVA 10-S  gatggatccacaagtaacaac
MVA 10-A  catcagcgaaatgtcatacgaaag
である。
【００７６】
上記方法によりｔｆｌ２−１変異体の塩基配列を解析した結果、すでに全ゲノム配列が公開されている野生型シロイヌナズナ(Columbia)と比べ、一カ所塩基配列の異なる部位を発見した（配列番号１に示す塩基配列における３０１２番目の塩基（配列番号２では１３６４番目の塩基に相当））。この結果、野生型シロイヌナズナではCAA とグルタミンをコードするところが、ｔｆｌ２−１変異体ではTAA と変異してストップコドンとなり、結果として配列番号４に示す４４５アミノ酸のうち２７９アミノ酸しか翻訳されなくなっていた。なお、２８０番目以降のアミノ酸配列にはＮ末端にあるクロモシャドウドメインが含まれるが、このクロモシャドウドメインは、ホニュウ類ＨＰ１タンパク質（ヘテロクロマチンタンパク質）、酵母Ｓｗｉ６タンパク質など生物種を超えて良く保存されている領域である。よって、少なくともこの領域に異常が生じればＴＦＬ２タンパク質の機能に影響する可能性が高いと考えられる。
【００７７】
次に、ｔｆｌ２−２変異体の変異部位の特定法について説明する。特定は、サザンハイブリダイゼーション法により行った。まず、ｔｆｌ２−２変異体よりIsoplant（ニッポンジーン社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。次いで、このゲノムＤＮＡ１０ｕｇを制限酵素ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ (TaKaRa社製) で別々に消化し、得られたＤＮＡ断片を、1 x TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA pH 8.0) 中に配された0.7%アガロースゲル上にアプライして電気泳動を行った。次いで、０．５Ｍ−ＮａＯＨで25分間、０．４Ｍ−ＨＣｌで１０分間、アガロースゲルごと変性し、２０ｘＳＳＣ(3 M sodium chloride, 200 mM sodium citrate)によりナイロンメンブレン（バイオダインA 、ポール社製）にブロットした。なお、メンブレンを80度で２時間焼き付けた。
【００７８】
ハイブリダイゼーションに用いた標識プローブは、PCR DIG プローブ合成キット（PCR DIG Probe Synthesis Kit,ロシュ社製）を用い、製造業者の示す方法に従い作成した。なお、この標識プローブは、ＴＦＬ２遺伝子のｃＤＮＡの全コーディング領域に相当するものであり、以下に示す一組のプライマー
Pc 1-S   ggtctagacatgaaaggggcaagtggtgc
Pc 1-A   ggctgcagttaaggcgttcgattgtacttg
を用いて作成されている。また、ハイブリダイゼーションは、DIG 標識核酸検出キット（DIG Nucleic Acid Detection Kit, ロシュ社製）を用い、製造業者の示す方法に従って行った。
【００７９】
なお、比較のため、野生型シロイヌナズナ(Columbia)、ｔｆｌ２−１変異体、およびｔｆｌ２−３変異体についても、上記方法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果は、図５に示す。
【００８０】
制限酵素ＸｈｏＩで処理したデータ（図５参照）では、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ）とｔｆｌ２−１変異体との間で、ＴＦＬ２遺伝子に相当するバンドが同じ位置に認められる。これは、ｔｆｌ２−１変異体がポイントミューテーションによるものであることを反映している。また、ｔｆｌ２−２変異体では、野生型に認められる約３ｋｂｐのバンド（矢印にて示す）が全く認められない。このことは、ｔｆｌ２−２変異体が、ＴＦＬ２遺伝子の欠損によるものであることを示す。さらに、ｔｆｌ２−３変異体では、ＴＦＬ２遺伝子へのＴ−ＤＮＡの挿入を反映して、バンドがシフトしている（矢印にて示す）。なお、上記したＴＦＬ２遺伝子における変異は、図２（ａ）にまとめて示す通りである。
【００８１】
〔実施例３〕
（ＴＦＬ２遺伝子およびそのｃＤＮＡの取得、並びに機能の確認）
上記したように野生型シロイヌナズナ(Columbia)の全ゲノム配列はすでに明らかとなっており、ゲノムの各領域をカバーしたバクテリア人工染色体が構築・配布されている。そこで、ＴＦＬ２遺伝子が含まれると思われるＢＡＣクローン（名称：AB006706,MVA3 ）を、かずさＤＮＡ研究所より入手した。次いで、上記ＢＡＣクローンを制限酵素ＮｃｏＩ(TaKaRa 社製) により消化し、約５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片（上記ＢＡＣクローンの９０６７番目〜１４７３０番目の塩基に相当）を切り出し、これを形質転換ベクターｐＣＧＮ１５４７（CALGENE 社製）にサブクローニングした。また、切り出された約５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号５に示す通りである。
【００８２】
次いで、上記形質転換ベクターが導入されたクローン（MVA3 5.7 kb/pCGN）を、アグロバクテリウムＣ５８Ｖを用いて、バキュームインフィルトレーション（減圧湿潤法）によりｔｆｌ２−１変異体に導入した。なお、上記５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片は、ＴＦＬ２遺伝子の他は両脇の未同定遺伝子の部分配列しか含まないので、導入されたのは事実上ＴＦＬ２遺伝子だけである。MVA3 5.7 kb/pCGNを導入したｔｆｌ２−１変異体のＴ１植物では、得られた１２系統すべてにおいて野生型と同等の表現型への回復が観察された。また、２系統ではＴ２植物における表現型の分離比も検定したところ、３５：１０及び２９：８と良好な分離を示した。なお、図６は、上記５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が導入されたｔｆｌ２−１変異体（図中、右側）と、ｔｆｌ２−１変異体（図中、左側）とを同一環境下で育成した結果を示しており、ｔｆｌ２−１変異体では、ＴＦＬ２遺伝子を導入することで野生型と同等の表現型に回復する。
【００８３】
また、ここで単離されたＴＦＬ２遺伝子のｃＤＮＡは、公知の方法に従って合成した。具体的には、アイソジェン（ニッポンジーン社製）を用いて野生型シロイヌナズナ（Columbia）より全ＲＮＡを抽出し、TaKaRa LA RNA PCR kit （TaKaRa社製）によりｃＤＮＡを合成した。合成に際しては、キットに添付のOligo d(T)アダプタープライマーとMVA 5-S プライマー（gaacgcgattaccttgattc）とを用いて3'側の非翻訳領域を含むｃＤＮＡを増幅した。次いで、増幅産物をpCR 2.1 ベクター（インビトロジェン社製）にＴＡ−クローニングし、配列決定した。なお、ＴＡ−クローニングから配列決定に至る工程は、ｔｆｌ２−１変異体の変異部位の特定法と同様に行った。また、ｃＤＮＡの合成条件、ＰＣＲの条件については、製造業者の示す方法に従っている。
【００８４】
ここで決定したｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号６、および、図７〜図９に示す通りであり、３’側非翻訳領域（ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ）を含んでいる。また、図７〜図９にはこのｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列（ＴＦＬ２タンパク質）も併記している。なお、本発明にかかる花成抑制遺伝子は、少なくともアミノ酸コード領域（配列番号３参照）を含んでいればよいので、配列番号６に示す塩基配列を有するＤＮＡも本発明にかかる花成制御遺伝子の一つである。
【００８５】
〔実施例４〕
（花成制御遺伝子の発現量）
次に、野生型シロイヌナズナ(Columbia)およびｔｆｌ２−１変異体における、花成制御遺伝子の発現量を観察した。なお、比較のために、ＴＦＬ２遺伝子に加え、他の花成制御遺伝子（ＦＴ、ＬＦＹ、ＳＯＣ１）の発現量についても併せて観察した。また、これら遺伝子の発現量の定量は、以下のように行った。
【００８６】
シロイヌナズナをＭＳ寒天培地上（ムラシゲ・スクーグ培地、和光純薬）に播種し、ｔｆｌ２−１変異体については１４日間、野生型シロイヌナズナについては２１日間、長日条件下（明期１６時間、暗期８時間）で生育させた。そして、両者の栄養生長分裂組織を経時的にサンプリングした。尚、いずれの場合も、サンプリングは暗期から明期になる際（夜明け）に行った。
【００８７】
サンプルからの全ＲＮＡの抽出は、アイソジェン（ニッポンジーン社製）を用いて行った。そして、得られた全ＲＮＡ２ｕｇを鋳型にし、Superscript II（GIBCOBRL社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。なお、いずれの行程も製造業者の示す方法に従っている。次いで、合成したｃＤＮＡ５０ｕｌのうち、２．５ｕｌを使用して、その中に含まれるＦＴ遺伝子、ＬＦＹ遺伝子、ＳＯＣ１遺伝子、ＴＦＬ２遺伝子それぞれのｃＤＮＡ分子数をTaqMan PCR法により定量した。また、内部標準としてＡｃｔｉｎ２遺伝子のｃＤＮＡの分子数を同時に定量し、各遺伝子の相対的な量を決定した。なお、ＦＴ遺伝子、ＴＦＬ２遺伝子、Ａｃｔｉｎ２遺伝子については、TaqMan PCR Reagent Kit(PE Applied Biosystems社製) を用いてTaqMan PCR法による反応を行い、一方、ＬＦＹ遺伝子、ＳＯＣ１遺伝子については、SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Kit(PE Applied Biosystems  社製) を用いてTaqMan PCR法による反応を行った。また、解析はいずれも、ABI PRISM 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems 社製) を用いて行った。各遺伝子発現量の定量に用いたプライマープローブセットは以下に示す通りである。なお、ＬＦＹ、ＳＯＣ１の発現量は、使用したキット(SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Kit)を用いてプローブなしで定量した。
【００８８】
0004677583.tif 000002
各遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）の定量結果は、図１０〜図１３に示す通りであり、図１０にはＦＴ遺伝子の発現量が、図１１にはＴＦＬ２遺伝子の発現量が、図１２にはＬＦＹ遺伝子の発現量が、図１３にはＳＯＣ１遺伝子の発現量がそれぞれグラフ化されている。なお、各図において相対量（％）とは、Ａｃｔｉｎ２遺伝子の発現量を基準としてもとめたものであり、各図中（矢印）は、栄養成長分裂組織が花序茎頂分裂組織に分化するタイミング（花成タイミング）を示すものである。
【００８９】
図１０から判るように、野生型シロイヌナズナ（図中（Ｃｏｌ）におけるＦＴ遺伝子の発現は、花成タイミング経過後でも比較的低いのに対し、ｔｆｌ２−１変異体では、ＦＴ遺伝子が常時、高発現（野生型の約１０倍）している。すなわち、ＴＦＬ２遺伝子はＦＴ遺伝子の発現を抑制して、花成を抑制する一方で、ＴＦＬ２遺伝子の発現が抑制されるとＦＴ遺伝子の発現が増大し、花成が促進されることを示唆する。
【００９０】
また、図１１から、野生型シロイヌナズナでは、ＴＦＬ２遺伝子が定常的に発現していることが判る。なお、ｔｆｌ２−１変異体では、ＴＦＬ２遺伝子が発現しないのでデータは示していない。
【００９１】
また、図１２、図１３からは、同一生育ステージ（例えば花成時）で比較すれば、野生型シロイヌナズナとｔｆｌ２−１変異体との間で、ＬＦＹ遺伝子、ＳＯＣ１遺伝子の発現量にほぼ差のないことが判る。
【００９２】
なお、図１４には、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した、ＴＦＬ２遺伝子の組織別発現量を示す。この図から、ＴＦＬ２遺伝子が、特に花序茎頂分裂組織（図中、ＩＭ＋ＦＭ）で発現し、花成に関与することが示唆される。なお、この測定は野生型シロイヌナズナを用いて行った。また、図１４中、ＡＸは側芽を、ＦＬは花を、ＣＬはカウレン葉を、ＲＬはロゼット葉を、ＳＴは茎を、ＲＯは根をそれぞれ表している。
【００９３】
【発明の効果】
本発明にかかる花成制御遺伝子は、以上のように、植物から単離され、花成に関与するＦＴ遺伝子またはその相同遺伝子の発現を抑制することで花成を抑制する構成である。
【００９４】
上記の構成によれば、この花成制御遺伝子の植物内での発現を制御（過剰発現または抑制）することで、植物の花成タイミングおよび花序の形態などを人為的に制御することが可能となるという効果を奏する。
【００９５】
本発明にかかる花成制御遺伝子は、具体的には、配列番号１・２に示す塩基配列からなるＤＮＡ中に含まれ、また、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。これらのＤＮＡはいずれも、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその相同アミノ酸配列からなる本発明にかかるタンパク質をコードする。
【００９６】
本発明にかかる花成制御方法は、以上のように、植物において、上記いずれかの花成制御遺伝子の発現を制御することにより、花成を制御する方法である。
【００９７】
上記の方法によれば、植物の花成タイミングおよび花序の形態などを人為的に制御することが可能となる。具体的には、上記花成制御遺伝子の発現を人為的に抑制すれば、光周性に関わりなく農園芸作物の収穫時期をシフトさせる（一般に早める）ことができる。また、花成制御遺伝子を人為的に過剰発現させれば、光周性に関わりなく農園芸作物の収穫時期をシフトさせる（一般に遅らせる）ことができる。また、芽生えから花成までの期間が短縮または遅延されることに加え、上記花成制御遺伝子の発現制御により花序の形態が変化するので、葉数、サイズ、花序の形態などの外観が従来とは異なる状態で開花に至る新規な花卉園芸作物を提供することができるという効果を奏する。
【００９８】
また、上記の花成制御方法は、特に、シロイヌナズナなどの植物に適用可能であり、この方法を採用することで、花成が制御されてなる形質転換シロイヌナズナなどの形質転換植物を提供可能となるという効果を奏する。
【００９９】
【配列表】
0004677583.tif 000003
0004677583.tif 000004
0004677583.tif 000005
0004677583.tif 000006
0004677583.tif 000007
0004677583.tif 000008
0004677583.tif 000009
0004677583.tif 000010
0004677583.tif 000011
0004677583.tif 000012
0004677583.tif 000013
0004677583.tif 000014
0004677583.tif 000015
0004677583.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】シロイヌナズナにおける花成制御のモデルの一つを説明する図である。
【図２】（ａ）は、本発明にかかる花成制御遺伝子（ＴＦＬ２遺伝子）の構成を説明する図であり、（ｂ）は（ａ）に示す遺伝子がコードするタンパク質（ＴＦＬ２タンパク質）の構成を説明する図である。
【図３】（ａ）は、ポリコーム遺伝子による遺伝子発現抑制の機構を説明する図であり、（ｂ）は、シロイヌナズナから単離された花成制御遺伝子と、公知のポリコーム遺伝子またはそのホモログとの対応関係を説明する図である。
【図４】図２（ｂ）に示すＴＦＬ２タンパク質が結合するタンパク質と、ＣＯタンパク質との相同性を説明する図である。
【図５】野生型シロイヌナズナとｔｆｌ２変異体とについて、サザンハイブリダイゼーションによりＴＦＬ２遺伝子の存在を確認した実験結果を示す図である。
【図６】ＴＦＬ２遺伝子が、ｔｆｌ２変異体の表現型を回復させた実験結果を示す図である。
【図７】ＴＦＬ２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図８】図７に示す塩基配列の続きを示す図である。
【図９】図８に示す塩基配列の続きを示す図である。
【図１０】野生型シロイヌナズナとｔｆｌ２変異体とについて、ＦＴ遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１１】野生型シロイヌナズナについて、ＴＦＬ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１２】野生型シロイヌナズナとｔｆｌ２変異体とについて、ＬＦＹ遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１３】野生型シロイヌナズナとｔｆｌ２変異体とについて、ＳＯＣ１遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１４】野生型シロイヌナズナにおける、ＴＦＬ２遺伝子の組織別発現量を示すグラフである。
【図１】
0004677583.tif 000017
【図２】
0004677583.tif 000018
【図３】
0004677583.tif 000019
【図４】
0004677583.tif 000020
【図５】
0004677583.tif 000021
【図６】
0004677583.tif 000022
【図７】
0004677583.tif 000023
【図８】
0004677583.tif 000024
【図９】
0004677583.tif 000025
【図１０】
0004677583.tif 000026
【図１１】
0004677583.tif 000027
【図１２】
0004677583.tif 000028
【図１３】
0004677583.tif 000029
【図１４】
0004677583.tif 000030