(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネマチックオーダードセルロースからなる生体高分子を含む基板と、基板上に存在する培養液とを用いてセルロース産生菌であるアセトバクター キシリナム（Ａcetobactor xylinum）を培養してセルロース膜を製造する方法であり、
基板を構成するネマチックオーダードセルロースからなる生体高分子が配向されているものであるセルロース膜の製造法。
【請求項２】
前記生体高分子を含む基板がフィルム状のものである請求項１記載のセルロース膜の製造法。
【請求項３】
前記生体高分子を含む基板が一軸延伸されたものである請求項１又は２記載のセルロース膜の製造法。
【請求項４】
前記生体高分子を含む基板表面を僅かに覆うように培養液が添加されている請求項１〜３のいずれか１記載のセルロース膜の製造法。
【請求項５】
基板を構成する前記生体高分子の配向に沿ってセルロース産生菌を走行させる請求項１〜４のいずれか１記載のセルロース膜の製造法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１記載のセルロース膜の製造法において、前記生体高分子を含む基板を基材とし、前記基材上にセルロース膜を形成する、セルロース膜複合体の製造法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１記載のセルロース膜の製造法において、前記生体高分子を含む立体形状の基板を基材とし、前記基材上にセルロース膜を形成する、セルロース膜複合体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バクテリアを利用した分子配向性の高いセルロース膜の製造法及びセルロース膜複合体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
セルロースは、引張強度等の物理的強度が大きく、乾燥状態においては、酸素に対するバリヤ性も有しているため、繊維やフィルム材料として汎用されている。
【０００３】
セルロース材料として汎用されている天然セルロースは、元々の形態が繊維状であるため、これを直接フィルム状に成型することはできず、一旦は何らかの溶媒に溶かし、再生セルロースとする必要があり、この際に結晶性が低下することが避けられない。また、比較的高純度で結晶性が高いといわれるコットンの場合でも、合成高分子等に比べると結晶性は低い。
【０００４】
一方、バクテリアセルロースは、分子量が大きく、純度、結晶性及びフィブリル化したときの分子配向性が高いため、高機能性セルロース材料として注目されており、バクテリアセルロースとしては、例えば酢酸菌により産生されるものが知られている、この酢酸菌は、リボン状のミクロフィブリルを生産してゲル状集積物やゲル状皮膜を形成する。よって、これらのゲル状集積物やゲル状皮膜を水中で離解し、水に分散させた後、紙を漉くと同様にして成型物を得ることができ、成型物は高い弾性係数を活かしてスピーカーコーン等に利用されている。
【０００５】
このようにバクテリアセルロースは、非常に優れた性質を有しているものであるが、高配向性のセルロースが得られないという点で改善の余地がある。高配向性のものが得られない理由は、バクテリアが産生したリボン状ミクロフィブリルが網状に絡みあっているため、配向させることが難しいこと、更に前記リボン状ミクロフィブリルが捩れているため、それらが重なり合うときに顕著な構造の不整合が生じるためである。（例えば、A.R.White and R.Ｍ.Brown Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(1981)1047-1051参照)また、実用面において、このミクロフィブリルの集合体は、バクテリアセルロースの一つであるナタデココの例でも分かるように、寒天状で可塑性を欠いているため、所望の形状に成型することが困難であり、リファイナー等の解砕機で一旦解砕するなどの方法を適用せざるを得ない。
【０００６】
本発明は、従来のバクテリアセルロースを利用した膜の製造法に比べて製造工程を簡略化することができ、更に高配向のセルロース膜を得ることができるセルロース膜の製造法及びセルロース膜複合体の製造法を提供することを課題する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記のとおり、従来法では、バクテリアセルロースを産生する際、セルロース産生菌が、リボン状ミクロフィブリルを産生しながら勝手な方向に動き回るため、ミクロフィブリルが相互に絡み合った、配向性の低いものしか得られなかった。
【０００８】
そこで、本発明者等は、セルロース産生菌を一方向にほぼ直線的に移動させることができれば、必然的に配向性の高いフィルムが得られることに着目し、セルロース産生菌を培養する際に用いる基板として、菌に対して親和性を持つ高分子が配向された、好ましくは親和性を持つ高分子と親和性を持たない高分子とのブレンド物が配向された「生体高分子レール」を用い、セルロース産生菌を、生体高分子レールから脱線することなく一方向に走行させることで、配向性の高いセルロース膜が得られることを見出し、本発明を完成したものである。
【０００９】
即ち本発明は、課題の解決手段として、生体高分子を含む基板と、基板上に存在する培養液とを用いてセルロース産生菌を培養してセルロース膜を製造する方法であり、基板を構成する生体高分子が配向されているものであるセルロース膜の製造法を提供する。
【００１０】
更に本発明は、他の解決手段として、上記のセルロース膜の製造方法において、生体高分子を含む基板を基材とし、前記基材上にセルロース膜を形成する、セルロース膜複合体の製造法を提供する。
【００１１】
更に本発明は、他の解決手段として、上記のセルロース膜の製造方法において、生体高分子を含む立体形状の基板を基材とし、前記基材上にセルロース膜を形成する、セルロース膜複合体の製造法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のセルロース膜の製造法は、生体高分子を含む基板を用い、かつ前記生体高分子が配向されているものであることを特徴とするものであり、セルロース産生菌の培養条件等は公知の条件を適用することができる。
【００１３】
基板は、生体高分子のみから形成されていてもよく、少なくともセルロース産生菌と接する部分が生体高分子で形成されていれば、生体高分子と他の材料、例えば合成高分子と生体高分子との積層体でもよい。
【００１４】
基板を構成する生体高分子としては、タンパク質、多糖及びこれらの複合体等を挙げることができる。これらの生体高分子としては、例えば、セルロース系材料、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、バイオポリエステルから選ばれる１又は２以上を挙げることができる。
【００１５】
生体高分子としては、再生セルロースを含むセルロース系材料が好ましく、セルロースと酢酸セルロースとの混合物からなるもの〔水膨潤したセルロースを約２倍に延伸したネマチックオーダードセルロース；Togawa and Kondo, Journal of Polymer Science., Ｂ.Polymer Physics, 37.451-459(1999)参照〕、Ｎ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシドを主とする溶媒から再生した表面での配向度の高いリヨセルと呼ばれるもの、ポリノジックレーヨンと呼ばれるもの、ベンベルグレーヨンがより好ましく、セルロースと酢酸セルロースとの混合物（セルロース：酢酸セルロース（重量比）＝９：１〜１：９）からなるものが特に好ましい。
【００１６】
生体高分子を含む基板は、生体高分子が配向されているものであり、この配向された分子が、上記した「生体高分子レール」として機能するものである。特に、菌に対して親和性の高い生体高分子と、親和性の低い高分子（親和性の高い生体高分子とは別種の生体高分子、化学修飾された生体高分子及び合成高分子のいずれでもよい）とのブレンド物を配向させることにより、効果的な「生体高分子レール」を得ることができる。
【００１７】
このような配向された生体高分子を含む基板は、上記したように配向性の高い生体高分子を用いることができるほか、例えば、生体高分子をフィルム状又はシート状に成型した後、一軸延伸処理することで、所望の方向に配向した生体高分子を含む基板を得ることができる。
【００１８】
生体高分子を含む基板の厚みは特に制限されるものではなく、所望の厚み範囲に設定することができるが、上記のとおり、一軸延伸処理することを考慮すればフィルム状又はシート状のものが好ましく、合成樹脂等との積層体とする場合には、より厚みの大きな板状の積層体でもよい。
【００１９】
本発明のセルロース膜の製造法で用いるセルロース産生菌は特に制限されるものではなく、β−１，４−グルコシド結合を主たる結合形式とする多糖を菌体外に産生するものであれば如何なるものであってもよい。このようなセルロース産生菌としては、アセトバクター  キシリナム（Ａcetobactor xylinum）、アセトバクター  パスツリアヌム（Acetobactor pasteurianum）、アセトバクター  ランセンス（Ａcetobactor rancens）等の酢酸菌、サルシナ  ベントキュリ（Sarcina ventriculi)、バクテリウム  キシロイデス（Bacteirum xyloides)、シュードモナス（Pseudomonas）属菌、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属菌等を挙げることができる。
【００２０】
本発明のセルロース膜の製造法で用いる培養液は、上記したセルロース産生菌を培養できるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、アセトバクター  キシリナム（Ａcetobactor xylinum）を用いた場合は、蔗糖（５g/100ml)、酵母エキス（0.5g/100ml)、硫酸アンモニウム（0.5g/100ml)、燐酸二水素カリウム（0.3g/100ml)、硫酸マグネシウム（0.05g/100ml)及び脱イオン水からなる組成の培養液（１２０℃で滅菌）を用いることができる。
【００２１】
また、培養温度や培養時間等の培養条件は、使用したセルロース産生菌に応じて、適正条件を適宜設定することができる。
【００２２】
次に、本発明のセルロース膜の製造法の一例を説明し、合わせて本発明による作用を説明する。
【００２３】
まず、金属、プラスチック、ガラス製等の適当な平底容器内に、配向された生体高分子を含む基板を置く。次に、所要量の培養液を添加するが、予め容器内に培養液を入れた後に、基板を置いてもよい。培養液の添加量は、セルロース産生菌を培養するに十分な量であれば特に制限されるものではないが、セルロース産生菌を、生体高分子レール上を脱線することなく走行させるため、生体高分子を含む基板表面を僅かに覆うように培養液が添加されていることが望ましい。
【００２４】
次に、セルロース産生菌を接種し、適温に保持する。このとき、予め培養液にセルロース産生菌を接種したものを容器内に入れてもよいが、この場合には、基板を入れる前にセルロースの産生が開始されるため、基板を入れた後、基板上の培養液にセルロース産生菌を接種することが望ましい。
【００２５】
その後、接種されたセルロース産生菌は、リボン状のミクロフィブリルを産生しながら、生体高分子の非配向部分と配向部分からなる生体高分子レールに沿って、一方向又は逆方向にほぼ直線的に移動する。
【００２６】
このようにして、所定時間培養することで、配向性が高くかつ均一なフィルム状の膜が得られる。このとき、培養時間を調整することで、膜厚も調整することができる。
【００２７】
なお、本発明のセルロース膜の応用例として、セルロース産生菌と共に他の有用物質を添加することで、前記有用物質も均一に含有するフィルムを得ることができる。例えば、有用物質として染料を添加すれば、染料分子が一定方向に吸着されたフィルムを得ることができ、これは光学的機能を示す偏光板としての利用が考えられる。
【００２８】
また、本発明のセルロース膜の製造法を適用すれば、生体高分子を含む基板を基材とし、前記基材上にセルロース膜を形成することで、基材とセルロース膜からなるセルロース膜複合体を製造することもできる。
【００２９】
更に、生体高分子を含む基板として所望の立体形状のもの（例えば、ビスコースレーヨン繊維の束）を用い、それを基材とすることで、立体形状のセルロース膜複合体を製造することもできる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００３１】
製造例１（配向された生体高分子を含んだ基板の調製）
セルロース６０ｍｇを１％の無水塩化リチウムを含むジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）１０ｍｌに溶解させた溶液中に、１．３２ｇのピリジン、１．７２ｇの無水酢酸を加えて、３０℃で３時間攪拌して反応させた。反応終了後、反応液を１００ｍｌのエタノール中に注ぎ込み、生成した沈殿を濾過し、自然乾燥した後、真空乾燥機（４０℃）中で２４時間乾燥させた。
【００３２】
次に、乾燥させた試料をＤＭＡｃ約５ｍｌ中に加えて攪拌し、完全に溶解させた後、再度エタノール中に注ぎ込み、濾過し、自然乾燥した後、真空乾燥機（４０℃）中で乾燥して、酢酸セルロースを得た。得られた酢酸セルロースをＮＭＲ測定により置換度を確認したところ、置換度は０．４５（２位が０．１６４、３位が０．０２５、６位が０．２６１）であった。
【００３３】
次に、セルロース１００ｍｇを水に浸して１晩放置した後、濾過とメタノール置換の操作を４回繰り返し、その後、メタノールに替えてＤＭＡｃを用いて置換する操作を５回繰り返して、最終的に濾過した。この濾過物を０．５０ｇの塩化リチウムとＤＭＡｃ９．５ｇの混合液に加え、溶解させた。
【００３４】
次に、この溶液に、上記した酢酸セルロース１００ｍｇを加え、溶解させた後、遠心分離及び濾過して、不溶物を除去した。その後、上澄み液をペトリ皿に広げ、水を共存させた箱の中で１週間放置した。その後、吸湿して生成したフィルムを流水中で１週間洗浄し、長方形に切断した後、両短辺を挟み、２．３倍の長さにゆっくりと引き延ばした。その後、そのまま両短辺を固定したままの状態で、自然乾燥して、本発明の製造法で用いる配向されたセルロース混合物（ネマチックオーダードセルロース）を含む基板（厚み０．３ｍｍ）を得た。
【００３５】
この基板の高分解能電子顕微鏡写真を図１に示す。この図１に示す基板は、負染色されているため、白色部分が配向部分を示しており、統計的解析によれば、幅０．４７ｎｍの線が、間隔０．６６ｎｍで並んでいることが確認された。スペースフィリングモデルを（１→４）−β−グルカン鎖に適用すると、この幅０．４７ｎｍという数値は、グルコース分子を横から見た場合（Narrow axis）に相当するものである。従って、この図１に示すものは、グルコース環が表面に対して横向きになって、間隔０．６６ｎｍで並んだものと推定された。これは、フィルム表面にセルロース分子中のヒドロキシル基が配向していることを意味し、極めて表面活性が高いものと考えられる。
【００３６】
製造例２
セルロース１００ｍｇを水に浸して１晩放置した後、濾過とメタノール置換の操作を４回繰り返し、その後、メタノールに替えてＤＭＡｃを用いて置換する操作を５回繰り返して、最終的に濾過した。この濾過物を０．５０ｇの塩化リチウムとＤＭＡｃ９．５ｇの混合液に加え、溶解させた。
【００３７】
次に、この溶液に市販のメチルセルロース（信越化学工業社製）１００ｍｇを加えて溶解させた後、遠心分離及び濾過して不溶物を除去した。その後、上澄み液をペトリ皿に広げ、水を共存させた箱の中で１週間放置した。その後、吸湿して生成したフィルムを流水中で１週間洗浄し、長方形に切断した後、両短辺を挟み、２．３倍の長さにゆっくりと引き延ばした。その後、そのまま両短辺を固定したままの状態で、自然乾燥して、本発明の製造法で用いる配向されたセルロース混合物（ネマチックオーダードセルロース）を含む基板（厚み０．３ｍｍ）を得た。
【００３８】
実施例１
ステンレス製の浅底容器内に製造例１で得た基板を置き、基板の表面がすれすれに覆われる程度の培養液を添加し、更にセルロース産生菌を接種した後、温度３０℃で培養した。なお、セルロース産生菌は、アセトバクター  キシリナム（Ａcetobactor xylinum）を用い、培養液は、蔗糖（５g/100ml)、酵母エキス（0.5g/100ml)、硫酸アンモニウム（0.5g/100ml)、燐酸二水素カリウム（0.3g/100ml)、硫酸マグネシウム（0.05g/100ml)及び脱イオン水からなる組成の培養液（１２０℃で滅菌）を用い、静置培養を開始して１〜２日後に水面に生じるゲル状の膜を取り除いた下層の液を利用した。
【００３９】
このようにして培養を行ったときの、セルロース産生菌の挙動を、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡により２時間毎に観察したものの一つ（培養開始から約２時間後）を図２に示す。
図２に示すとおり、セルロース産生菌は、一方向又は逆方向に、ほぼ直線的に走行していることが確認され、他の時間における１１回の観察でも同様の走行状態であることが確認された。
【００４０】
なお、図２において、水平線（左右方向への線）を配向軸として、各菌体と認められる像の両端を結ぶ線との角度を測定した。これを概念的に示したのが図３であり、図３の場合を右回り（−）、逆の場合を左回り（＋）として、配向軸と計１０個の菌体と認められる像の両端を結ぶ線（Ａ）とのなす角度θを測定した。その結果、判定不能が１、−２°が１、＋２°が１、＋３°が３、＋８°が１、＋９°が１、＋１０°が１、１９°が１であった。
【００４１】
約４８時間経過後に培養を終了させた後、基板上に形成されたセルロースフィルムの状態を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）写真に撮り、図４に示した。図４から明らかなとおり、生体高分子の配向に沿ってバクテリアセルロースが産生され、フィルムをなしていることが確認された。
【００４２】
実施例２
製造例２で得た基板を用い、実施例１と同様にしてアセトバクター  キシリナムを培養してセルロース膜の製造を行って、最終的に基板上にセルロースフィルムが形成されたことを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により確認した。また、培養開始後２時間後から１８時間後までの計１１個の各菌体の挙動を、実施例１と同様にして光学顕微鏡により観察した。その結果、１８時間経過後における角度θは、−２０°、−１５°、−６°、−５°、＋１°、＋２°、＋４°、＋６°、＋９°、＋１１°、＋１８°であった。
【００４３】
比較例１
無配向アガロースゲルを基板として用い、実施例１と同様にしてアセトバクター  キシリナムを培養してセルロース膜の製造を行った。培養開始後から４時間後の光学顕微鏡による計１２個の菌体挙動の観察の結果、角度θは、−７９°、−８１°、−２５°、−１５°、−３°、＋８°、＋１５°、＋１７°、＋３０°、＋４７°、＋５０°、＋５２°であり、各菌体がランダム方向にセルロースを産生していることが確認された。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のセルロース膜の製造法を適用すれば、高配向性のセルロース膜を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  製造例１で得た基板の高分解能電子顕微鏡写真である。
【図２】  実施例１における菌体挙動を示す光学顕微鏡写真である。
【図３】  実施例１における菌体挙動を説明するための概念図である。
【図４】  実施例１において基板上に形成されたセルロースフィルムの原子間力顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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