(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むＣ型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼのプロテアーゼ活性を評価するための代理細胞ベースシステムであって、
a）以下の(I)及び(II)を含む第一キメラDNA分子：
(I) 哺乳類の細胞のトランスフェクションによりDNA分子の発現を誘導することができるCMVプロモーター、SV40初期プロモーターシステム又はRSV（ラウス肉腫ウイルス）LTRプロモーターシステム；及び
(II) 以下のi)及びii)を含むSEQ ID NO.1で定義されるDNA分子又はSEQ ID NO.2のポリタンパク質をコードするDNA分子
i) 前記発現システムと作用可能に結合されたHCV組換えDNA分子；ここで、前記HCV DNA分子は以下を含むNS3-5ポリタンパク質をコードする：
‐活性NS3プロテアーゼ領域、
‐翻訳によりER膜に包埋させ、NS3プロテアーゼ活性の補助因子として作用させるのに充分なNS4A領域、
‐任意のその誘導体、変異体又はフラグメントを含むNS4B及びNS5A領域、及び
‐前記NS3プロテアーゼにNS5A/5B切断部位を提供するのに充分な、任意のその誘導体、変異体又はフラグメントを含むNS5Bタンパク質；
ii) 及び前記HCV DNA分子の下流を融合したトランス活性化因子領域、ここで、前記トランス活性化因子領域はレポーター遺伝子の発現を開始できるトランス活性化因子分子をコードする；
b）及び前記トランス活性化因子分子に反応するオペロンと結合した前記レポーター遺伝子をコードする第二キメラDNA分子；
それによって、前記第一組換え分子の発現は前記哺乳類の細胞の小胞体に固定された融合ポリタンパク質の産生を導き、前記固定したタンパク質は前記プロテアーゼによって切断することができ、その結果前記プロテアーゼ活性を評価する方法として前記レポーター遺伝子の発現を含むための前記トランス活性化因子領域のトランスロケーションを与える前記代理細胞ベースシステム。
【請求項２】
SEQ ID NO.1で定義される組換えDNA分子。
【請求項３】
SEQ ID NO.2で定義される組換えタンパク質。
【請求項４】
哺乳類の宿主細胞へのトランスフェクションのための発現プラスミドであって、請求項１記載の(II)のDNA分子を含む前記プラスミド。
【請求項５】
請求項４記載の発現プラスミドでトランスフェクションされる哺乳類の宿主細胞。
【請求項６】
SEQ ID NO.1の核酸分子を含む発現プラスミドでトランスフェクションされる哺乳類の細胞株。
【請求項７】
一次肝細胞、肝細胞株、繊維芽細胞、リンパ球、腎細胞からなる群から選択される請求項６記載の哺乳類の細胞株。
【請求項８】
293、Huh-7、WRL68、HepG2及びチャング肝細胞からなる群から選択される請求項７記載の哺乳類の細胞株。
【請求項９】
NS3プロテアーゼ活性の評価方法であって、
a）最初に、HCVプロテアーゼポリタンパク質及び発現される前記レポーター遺伝子産物を生じる条件下で、請求項５で定義されるトランスフェクションされた宿主細胞をインキュベートし、
b）発現された前記遺伝子産物の量を測定する工程を含む前記NS3プロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項１０】
工程a）において、細胞を少なくとも1時間インキュベートする請求項９項記載の方法。
【請求項１１】
細胞を18時間インキュベートする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項９項記載の方法を含む、HCV NS3プロテアーゼ活性の阻害剤としての可能性を同定する方法であって、
c）請求項９記載の方法によって、前記阻害剤としての可能性を有する化合物の存在下で前記プロテアーゼの活性をアッセイし、ここで前記化合物は工程a）の後、宿主細胞に加えられ、工程b）において、前記活性をアッセイする前に、宿主細胞をさらにインキュベートし、
d）工程c）の結果と工程b）の結果を比較する工程をさらに含む前記HCV NS3プロテアーゼの阻害剤としての可能性を同定する方法。
【請求項１３】
阻害剤としての可能性を有する化合物の存在下、又は非存在下で、トランスフェクションされた宿主細胞を30時間さらにインキュベートする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞を20時間インキュベートする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
細胞を10時間インキュベートする請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳類の細胞培養システム及びＣ型肝炎ウイルス（HCV）NS3プロテアーゼの活性及びその阻害のアッセイ方法に関する。より詳細には、本発明は、組換え分子、トランスフェクションした哺乳類の宿主細胞アッセイシステム及びNS3プロテアーゼ活性及び抗HCV化合物の候補によるその阻害の測定方法に関する。
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、輸血後の重要な病原菌（etiological agent）であり、世界的に院外感染性（community-acquired）非Ａ非Ｂ型肝炎である。世界中で100万人を超える人々がそのウイルスによって感染していると見積もられる。キャリヤーの多くは慢性的に感染を起こし、多くは慢性Ｃ型肝炎と呼ばれる慢性肝疾患に進行する。このグループは、肝硬変、肝細胞癌及び死に至る末期の肝疾患等の深刻な肝疾患のために危険性が高い。HCVがウイルス持続性を定着させ、高い率の慢性肝疾患を生じるメカニズムは、詳細には解明されていない。HCVがどのように宿主免疫システムと相互作用し、そして逃れるかは知られていない。さらに、HCV感染及び疾患に対する保護における細胞及び体液性免疫反応の役割が明らかにされなければならない。
【０００２】
ウイルス臨床研究は、医薬化合物が慢性Ｃ型肝炎に冒されている患者のHCV感染を効率的に治療できるかを確認することを目的として行われている。これらの研究は、単独及びリバビリン等のその他の抗ウイルス剤と組み合わせて、インターフェロン-αの使用を含んでいる。このような研究は、実質的に多くの関係者がこれらの治療に応答しないことを示し、それは好ましい応答であり、高い割合で、治療の終了後、再発することが見出された。現在まで、HCV感染の治療用の広く有効な抗ウイルス化合物は存在しない。
【０００３】
HCVは、フラビウイルス（Flaviviridae）科の被殻鎖（enveloped positive strand）RNAウイルスである。
一本鎖HCV RNAゲノムは約9500ヌクレオチドの長さであり、約3000のアミノ酸の単一の大きなポリタンパク質をコードする単鎖で開いた読み取りフレーム（single open reading frame: ORF）を有する。感染した細胞において、このポリタンパク質は、細胞及びウイルスプロテアーゼによって複数の部位で切断されて、構造及び非構造（NS）タンパク質を産生する。構造タンパク質（C、E1、E2及びE2-p7）は、ウイルス粒子を構成するポリペプチドを含む。非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）は、HCV RNAゲノムの複製を触媒し、制御する酵素又はアクセサリー・ファクター（accessory factors）をコードする。構造的タンパク質のプロセシングは宿主細胞プロテアーゼによって触媒される。成熟した非構造的タンパク質の産生は2つのウイルス性コードプロテアーゼによって触媒される。第1は、ポリタンパク質由来のNS3タンパク質の放出を自己触媒するNS2-3亜鉛依存金属プロテアーゼ（zinc-dependent metalloprotease）である。放出されたNS3は、Ｎ末端にセリンプロテアーゼ領域を含み、ポリタンパク質由来の残存する切断（remaining cleavages）を触媒する。放出されたNS4Aタンパク質は少なくとも2つの役割を有する。第1は、NS3タンパク質と安定な複合体を形成し、NS3/NS4A複合体の膜局在化を補助することであり（Kimら、1999）、第2は、NS3プロテアーゼ活性のための補助因子として作用することである。この膜結合型複合体は、ポリタンパク質の残存する部位の切断を触媒し、こうしてNS4B、NS5A及びNS5Bの放出をもたらす。また、NS3タンパク質のＣ末端セグメントは、ヌクレオシドトリホスファターゼ及びRNAヘリカーゼ活性に入り込む。NS5Bは、HCVの複製に関与するRNA依存RNAポリメラーゼである。
【０００４】
NS3タンパク質のＮ末端の180アミノ酸は、最初の工程としてNS3/4Aの自己切断（auto-cleavage）を媒介するトリプシン様セリンプロテアーゼである。さらに、膜結合型NS3/4A複合体は、NS4A/4b、NS4B/5A及びNS5A/NS5B接合部を切断して、ウイルス複製に必要であると考えられているウイルス酵素を放出する。NS3/NS4Aの複合化は、ポリタンパク質の経時的に下流のプロセシングにおいて重要な工程である。NS3タンパク質は最も詳細に特徴付けられたHCVタンパク質である。すべてのプロセシング部位の切断の動力学的パラメータは記載されている。Ｎ末端プロテアーゼ及びＣ末端ヘリカーゼ領域の両方は、独立に結晶化され、高分解能三次元モデルはこれらの構造体について存在する。
NS3プロテアーゼ活性は創薬のための魅力的な標的である。酵素の研究は、NS5A/5B切断部位のＮ末端産物に基づくペプチドが酵素の競合的阻害剤であることを示している。これらのペプチドは、臨床的に有効な抗HCV化合物と同様にNS3プロテアーゼ阻害剤を合理的に設計する医薬品化学の試みにおいて有用な出発点として役立っている。
【０００５】
HCVの高い発生率及びHCV感染の結果のために、HCVに対する治療化合物の発見は重要になっている。その目的のために、HCVに対する化合物を発見しようという試みは、抗HCV化合物をスクリーニングし、選択するためのアッセイシステムの開発を必要としている。
現在まで、HCVウイルスのための便利な細胞培養複製システムは、入手できない。この欠如は、大抵のＨＣＶ阻害剤のスクリーニングをin-vitro酵素アッセイ及び間接的な代理細胞ベースアッセイに制限している（Lohmannら（1999））。これは、細胞培養において、抗HCVとしての可能性を有する化合物の評価を著しく限定している。
【０００６】
Hirowatariら（1995）は、NS5A/NS5B切断部位（NS3の基質）及びトランス活性化因子Tax 1と融合したNS2/NS3領域を含む第一プラスミド及びその発現がTax 1のトランス活性化に依存するレポーター遺伝子を含む第二プラスミドの同時トランスフェクションを記載する。NS5A/5B部位は、発現したNS2又はNS3プロテアーゼ活性によって切断され、その結果Tax 1を放出して、第二プラスミドのレポーター遺伝子をトランス活性化する。このように、発現したレポーター遺伝子の量は、NS2又はNS3のタンパク質分解活性の尺度である。欠点の1つは、このシステムはNS2金属プロテアーゼの活性とNS3プロテアーゼ活性との区別ができないことである。さらに、このシステムは、NS4A領域と複合化する場合（その複合体はプロテアーゼの特異性を増大する）、NS3タンパク質のプロテアーゼ活性の尺度を提供しない。また、このアッセイは、ポリタンパク質のプロセシングの自然な状態に最も近いシステムにおいて、プロテアーゼ活性を測定させない。最後に、別の欠点は、このシステムが半定量的であり、そのため高い処理量の定量的なスクリーニングに適していないという事実にある。
【０００７】
Overton, H.ら（1995）は、昆虫の細胞において、バキュロウイルス発現HCV NS3活性を教示する。NS3プロテアーゼ活性を発現するように設計された一連のバキュロウイルス構築物及び種々の基質が記載される。一部のNS2/NS3及びNS3/NS4A/NS4Bをコードする構築物は昆虫の細胞株にトランスフェクションされる。NS3からNS5A及びNS5A/5Bまでをコードする追加のウイルス性構築物は、単独で又は上記構築物の1つと一緒にトランスフェクションされる。発現され、切断された産物はウエスタン分析によって免疫学的に可視化される。このシステムにおける幾つかの欠如は、ウイルス感染（この現象は細胞の通常の機能をさらに乱す）の必要性と同様に、哺乳類の細胞株の代わりに昆虫を使用することに関する。また、このシステムはT7ポリメラーゼ発現システム（このシステムは本発明のシステムにとって必要ではない）を利用する。さらに、分解産物の検出方法は、長く、正確に定量化することは難しく、高い処理量スケールを許容しない。
【０００８】
Songら（1996）は、イースト中のlexA-GAL4融合タンパク質を利用するプロテアーゼアッセイシステムを記載した。著者らは、及びlexA-DNA結合領域とGAL4の転写性活性領域の間にNS3プロテアーゼ及び切断部位を挿入することを記載する。NS3プロテアーゼによるその部位の切断は、形質転換イーストがβ-ガラクトシダーゼを合成できないようにGAL4を転写的に不活性にする。このシステムはNS4Aを欠き、HCVポリタンパク質においてプロセシングを再現しない。
Cho, Y.G.ら（1997）は、シンドビスウイルス複製システムを用いるアッセイを教示する。このハイブリッドウイルス構築物は、NS4A/NS4B切断配列によってSINコアタンパク質と結合したHCV NS3/NS4Aプロテアーゼ領域をコードする。哺乳類の細胞株のウイルス粒子の構築は、NS4A/4B切断部位の処理に依存する。このシステムの１つの主な欠点は、HCVプロテアーゼ活性が細胞の細胞変性形態学変化を誘導するキメラウイルスを産生することにある。培地のpH変化の測定は、せいぜいこれらの変化を測定する半定量的な方法を構成する。このシステムの別の欠点は、シンドビスコアタンパク質がＮＳ３部位と同様に天然セリンプロテアーゼ切断部位を含むことであり、こうしてこのシステムを潜在的なプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするための使用に制限する。
【０００９】
Cho, Y.G.ら（1998）は、NS3/NS4A領域及び哺乳類の細胞株にトランスフェクションされた、SEAP（分泌したアルカリホスファターゼ）遺伝子と融合したNS4A/4B切断部位をコードする発現ベクターを教示する。NS3プロテアーゼによるNS4A/4B部位の切断は培地にSEAPタンパク質を放出する。培地のSEAPタンパク質の量は、NS3プロテアーゼ活性の尺度である。このシステムの1つの欠点は、レポーター分子が基質たんぱく質と直接融合し、そのためウイルス複合タンパク質（NS3/NS4A）の自然コンホメーションに影響を与える事実にある。別の主な欠点は、分泌されるレポータータンパク質の量がシステムにおいて発現され、切断されるタンパク質の量に正比例する事実による（切断される1つの基質分子＝分泌される1つのレポーター分子）。HCVポリタンパク質は、非常に低いレベルで発現するシステムであるため（その自然の状況においてさえ）、観測されるシグナルは、大きなスクリーニングスケールで行うには低すぎる。
【００１０】
WO 98/00548は、ピコナウイルス（好ましくはポリオウイルス）、HCV NS3プロテアーゼ領域及び単NS3プロテアーゼターゲット部位を含むハイブリッドウイルスを記載する。これらのキメラウイルスは、HCV NS3のタンパク質分解プロセシング活性はウイルス生存度及び増殖に必須であるように操作される。異なるNS3切断部位（NS5A/NS5B、NS4A/NS4B又はNS4B/NS5A）を有する種々のハイブリッドを教示する。生存度は、HeLa単層細胞のプラークアッセイを用いてウイルス価によって測定される。今度の場合も、このシステムは、高い処理量の様式で大量の潜在的な阻害剤の定量的なスクリーニング方法を提供せず、ポリタンパク質セグメントの自然の状況において、NS3プロテアーゼ活性のスクリーニングを提供しない。
【００１１】
Vertexによる米国特許第5,861,267号は、NS3/NS4A領域の発現及び分泌したIL-1βレポーター（インターロイキン-1β）と融合したNS4A/NS4B切断部位を利用するHCV NS3プロテアーゼのアッセイ方法を開示する。NS3プロテアーゼによるＮＳ４Ａ／４Ｂ部位の切断はＮＳ３プロテアーゼ活性を直接測定できる培地にIL-1βを放出する。このシステムは、NS3/NS4A複合体に隣接した切断部位でのNS3切断の阻害を試験し、この状況は、複数部位のポリタンパク質プロセシングの標準条件を意味せず、又は複製しない。さらに、このシステムは、測定されるシグナルがシステムにおいて発現されるタンパク質の量及び切断されるタンパク質の量に正比例するレポーターシステムを提供し、今度の場合も、大きなスクリーニングスケールで行うには低すぎるシグナルを生じる。
【００１２】
AgouronによるWO 00/08469は、NS2金属プロテアーゼ、NS3プロテアーゼ、NS4A補助因子及び種々の切断されたNS4B及び5A（前述のNS5A/5B切断部位）からなるプロテアーゼ・レポーター構築物を含む別のシステムを開示する。しかし、このシステムはNS3プロテアーゼ活性／特異性を最適化するために完全なポリタンパク質を有することの重要性を開示しない。さらに、このシステムはワクシニアウイルスベクターによる感染を要求し、このファクターは、宿主細胞の完全性（host cell integrity）を緩和し、アッセイのポリタンパク質プロセシング現象の際のシス又はトランスプロテアーゼ切断のメカニズムに影響を及ぼす場合がある。ワクシニア発現を使用することの別の欠点は、アッセイの細胞が約24時間後にネクローシスになり、その結果、より長期間の動力学的アッセイのためのこのアッセイの使用を制限する事実による。
【００１３】
VertexによるWO 00/12727は、リガンド結合領域を含む融合タンパク質を有するシステムを開示し、このDNA結合領域は、VP16活性化領域を生じるリガンド応答要素と結合して、レポーター遺伝子の発現を制御できる。NS5A/5B切断部位は融合タンパク質内に挿入され、分離構築物から発現されるNS3/4プロテアーゼによる切断でレポーター遺伝子発現を調節する。今度の場合も、このシステムは、NS3プロテアーゼ活性／特異性を最適化するために完全なポリタンパク質を有することの重要性を開示しない。
従って、高い処理量のシステムにスケールアップできることにより、大量の抗HCV化合物のスクリーニングアッセイを開発することは重要になってくる。従って、本発明は、容易に実施でき、信頼性があり、高感度で、大スケールで再現できるアッセイを提供する。
従って、本発明の目的は、細胞ベースシステム及びHCV NS3プロテアーゼ活性の阻害薬を測定するために向上した感度を有するアッセイを提供することであり、このアッセイは、HCV疾患の経過において感染した細胞に生じる、できる限り多くのNS3ポリタンパク質プロセシング現象を再現する構築物のプロテアーゼ活性を同時に試験するように設計される。
【００１４】
発明の概要
このように、本発明は、公知のアッセイと比較した場合、HCV NS3プロテアーゼ活性に対する向上した感受性を有する細胞ベースアッセイシステムの開発に関するものであり、HCV NS3プロテアーゼ活性を調節（特に阻害）できる化合物のスクリーニング試験に有用である。
本発明は、非細胞変性ウイルスプロモーターシステムの制御の下で、HCVのNS3-5領域の下流と結合したトランス活性化因子領域を含む第一の構築物を提供する。また、トランス活性化因子の結合に感受性があるオペレーターの制御の下で、レポーター遺伝子を含む第二の構築物を提供する。
NS3-5領域は、NS3プロテアーゼ、続いてNS4A補助因子、NS4B及びNS5Aタンパク質（任意のその誘導体、変異体又はフラグメントを含む）、NS5A/5B切断部位を構成するのに充分なNS5Bタンパク質（任意のその誘導体、変異体又はフラグメントを含む）によって終了するものを含むNS3ポリタンパク質をコードする。ポリタンパク質から発現され、放出される場合、トランス活性化因子は測定可能であるレポーター遺伝子の転写及び発現を開始する。
【００１５】
このシステムの利点は、発現される場合、NS4A補助因子領域は小胞体膜に包埋され、その結果NS4Aと複合体化される場合、NS3プロテアーゼを固着し、ポリタンパク質の下流の切断部位がいずれも処理されない場合、（非特異的トランスロケーションを防止することによって）バックグラウンドシグナルを減少させる事実を何倍も含んでいる。また、このシステムの利点は、測定されるシグナルの種々のレベルの増幅にある。出願人は、増幅の第一レベルはタンパク質が感覚的にポリタンパク質の未変性コンホメーション及びヒトの感染の際に生じる自然なプロセシング現象を再現する事実にあると考える。これは、その特異性と同様NS3プロテアーゼ切断の活性を増大する。従って、核及びレポーター発現へのシグナルトランスロケーションは、より特異的であり、高い処理量のスクリーニングアッセイについて受け入れられる最低限に減少したバックグラウンドノイズである。
【００１６】
また、トランス活性化因子システムの使用は、シグナル出力をさらに増大する増幅の第二レベルを提供する。
最後に、このトランス活性化因子システムは、抗生物質の存在に感受性があり、アッセイの固有なバックグラウンドノイズの尺度を与え、その結果、アッセイ及び試験化合物の両方の特異性を保証する内部“組み込み（built-in）”のネガティブコントロールを提供する。
このように、本発明は、自然感染プロセスを実質的に再現する状況におけるＨＣＶ非構造タンパク質のプロセシングを厳密に模倣するシステムにおいてNS3プロテアーゼ阻害の測定能力を有する細胞ベースアッセイを提供する。その他の公知のアッセイと比較した場合、本発明の哺乳類の細胞ベースシステムは感受性が高く、増大したシグナル／ノイズ比を示す。従って、このシステムを使用するアッセイは、高い処理量のスクリーニングシステムに容易にスケールアップできる。
【００１７】
従って、本発明の第一の実施態様によれば、以下を含むＣ型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼのプロテアーゼ活性を評価する代理細胞ベースシステムを提供し、a）以下を有する第一キメラ分子、
i）哺乳類の細胞のトランスフェクションにより前記第一キメラの発現を含むことができる非細胞変性発現システム、及び
ii）前記発現システムと結合可能なHCV組換えDNA分子；ここで、NS3-5ポリタンパク質をコードする前記HCV DNA分子は以下を含む：
・活性NS3プロテアーゼ領域、
・翻訳によりER膜に包埋させ、NS3プロテアーゼ活性の補助因子として作用さるのに充分なNS4A領域、
・任意のその誘導体、変異体又はフラグメントを含むNS4B及びNS5A領域、及び
・前記NS3プロテアーゼにNS5A/5B切断部位を提供するのに充分な、任意のその誘導体、変異体又はフラグメントを含むNS5Bタンパク質；
iii）及び前記HCV DNA分子の下流を融合したトランス活性化因子領域、ここで、前記トランス活性化因子領域はレポーター遺伝子の発現を開始できるトランス活性化因子分子をコードする；
b）及び前記トランス活性化因子分子に反応するオペロンと結合した前記レポーター遺伝子をコードする第二キメラDNA分子；
それにより、前記第一の組換え分子の発現は前記哺乳類の細胞の小胞体に固定した融合ポリタンパク質の産生を導き、固定したタンパク質はプロテアーゼによって切断され、その結果前記プロテアーゼ活性を評価する方法として、前記レポーター遺伝子の発現を含むために、前記トランス活性化因子領域のトランスロケーションを与える。
【００１８】
第二の実施態様において、本発明は、このシステムにおいて有用である組換えDNA分子及び任意のそのフラグメント、変異体及び誘導体を包含する。
第三の実施態様において、本発明は、本発明の組換えDNA分子から産生される組換えタンパク質を包含する。
第四の実施態様において、また本発明は、組換えDNA分子の内いずれかを含むベクターをも包含する。
第五の実施態様において、本発明は、これらのベクターによりトランスフェクションされた真核生物の宿主細胞を包含する。
第六の実施態様において、本発明は、本発明の組換え分子及びトランスフェクションされた宿主細胞を用いるNS3プロテアーゼ活性のアッセイ方法を包含し、またこの方法は、その阻害剤としての可能性の同定に有用である。
本発明のその他の目的、利点及び特徴は、具体例であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない、添付した図面を参照した以下の好ましい実施態様の限定されない説明を読むことにより明らかになるであろう。
【００１９】
好ましい実施態様の詳細な説明
定義
他に定義しない限り、ここで使用される化学的及び技術的用語及び命名法は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法等の手順は、技術において使用される通常の方法である。このような標準方法は、例えばSambrookら（1989）及びAusubelら（1994）等のリファレンスマニュアルに見出される。
ヌクレオチド配列は、単鎖によって、5'から3'方向に、左から右へ、技術において一般に使用される1文字のヌクレオチドシンボルを用いて、IUPAC-IUB生化学的命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）（1972）の推奨に従って、本明細書に示される。
本明細書の記載は、多くの日常的に使用される組換えDNA（rDNA）技術用語を参照する。にもかかわらず、このようなrDNA用語の選択された例の決定は、明瞭さ及び整合性のために提供される。
【００２０】
技術において知られる用語“組換えDNA”、“組換え核酸分子”又は“組換えプラスミド”は、DNAセグメントの連結から生じるDNA分子を参照する。これは、しばしば遺伝子操作として参照される。
本明細書で使用される用語“DNAセグメント又は分子又は配列”はデオキシリボヌクレオチドのアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及び／又はシトシン（Ｃ）を含む分子を参照する。これらのセグメント、分子又は配列は、天然又は合成誘導体に見出される。遺伝コードに従って解読する場合、これらの配列は、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント等と呼ばれるアミノ酸の直鎖状配列（linear strech）又は配列をコードできる。
本明細書で使用される用語“遺伝子”は技術においてよく知られ、単一のタンパク質又はポリペプチドを定義する核酸配列に関係する。ポリペプチドは、タンパク質の機能的活性が保持される限りにおいては、コード配列の全長配列又は任意の部分によってコードされる。
【００２１】
“構造遺伝子”は、RNAへと転写され、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳され、その結果特定のポリペプチド又はタンパク質を生じるるDNA配列を定義する。“構造タンパク質”は、ウイルス粒子の中に取り込まれるHCVタンパク質、すなわちコア“C”、E1、E2及びE2-p7を定義する。“非構造タンパク質”は、ウイルス粒子に含まれないHCVタンパク質、すなわちNS2、NS3、NS4A、NS5A及びNS5Bを定義する。
“制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素”は、DNA分子の特定の塩基配列（長さにおいて、通常4、5又は6塩基対）認識し、この配列が現れるすべての場所でDNA分子を切断する能力を有する酵素である。このような酵素の例は、塩基配列Ｇ↓ＡＡＴＴＣを認識し、DNA分子をこの認識部位で切断するEcoRIである。
“制限酵素断片”は、制限エンドヌクレアーゼによるDNAの分解によって産生されるDNA分子である。任意の与えられたゲノム又はDNAセグメントは、特定の制限エンドヌクレアーゼによって制限酵素断片の少なくとも2つの分離した分子に分解される。
【００２２】
“アガロースゲル電気泳動”は、DNAのサイズに基づく二重鎖DNA分子を分画するための分析方法である。この方法は、DNA分子が篩を通るようにゲルを通って移動する事実に基づき、それによって最も小さいDNA分子は最も大きな移動度を有し、ゲルを通って最も離れたところへ移動する。ゲルの篩特性は、最も大きなDNA分子を遅延させ、これらは最も小さい移動度を有する。分画したDNAは、技術においてよく知られた方法を用いたゲルの染色、核酸雑種形成又は検出可能な標識による分画されたDNA分子のタギングによって可視化される。これらのすべての方法は、技術においてよく知られ、特定の方法はAusubelら（supra）により見出される。
“オリゴヌクレオチド又はオリゴマー”は、2つ以上の、好ましくは3つより多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子である。分子の正確な大きさは多くの因子に依存し、最終的機能又はオリゴヌクレオチドの使用にも依存する。オリゴヌクレオチドは合成的に、クローニングにより、又は増幅により誘導される。
【００２３】
“配列増幅”は、大量のターゲット配列の産生方法である。一般に、1つ以上の増幅プライマーは、核酸配列にアニールされる。好適な酵素を用いて、プライマーの近くで、又はプライマーの間で見出される配列は増幅される。本明細書で使用される増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）である。
“増幅プリマリー”は、ターゲット配列の近くのDNA領域をアニールでき、技術においてよく知られる好適な条件の下でDNA合成のための開始プライマーとして役立つオリゴヌクレオチドを参照する。合成プライマー伸長産成物は、ターゲット配列と相補的である。
用語“領域（domain）”又は“領域（region）”は、タンパク質内の特定の機能又は構造を定義する特定のアミノ酸配列を参照する。本明細書における例として、NS3プロテアーゼ領域は、HCV非構造ポリタンパク質に含まれる。
【００２４】
用語“レポーター遺伝子”は、“レポータータンパク質”をコードするヌクレオチド配列を参照する。レポータータンパク質は、遺伝子発現を評価するための検出可能な方法を提供する。レポーター遺伝子は、“レポータープラスミド”に含まれる。本発明の目的のための有用なレポーター遺伝子としては、分泌したアルカリ性ホスファターゼ（SEAP）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアミノトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GPF）等が挙げられる。
用語“レポーターシステム”は、2つ以上のレポーターの組み合わせを参照する。本発明の目的のための有用なレポーターシステムの非制限的例は、ルシフェラーゼ又は分泌したアルカリ性ホスファターゼ（SEAP）等の第二レポーターの発現を支配するtTA等の遺伝子活性化因子である第一レポーターである。
用語“活性化因子”及び“オペロン”は、“活性化因子”分子がオペロンに含まれるオペレーターと結合して、“オペロン”の発現を刺激するシステムを参照する。このようなシステムとしては、テトラサイクリントランス活性化因子（tTA）、HIV-1 tatトランス活性化因子、GAL 4トランス活性化因子、NFκβ等が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される用語“キメラ分子”又は“キメラ”は、自然には一緒に結合されない少なくとも2つの核酸領域を参照する。本発明のこのようなキメラの非制限的例としては、HCV NS3-4A-4B-5A-5B-tTA領域構築物が挙げられる。発現した場合、このようなキメラは“融合タンパク質”を生じる。
本明細書で定義される用語“融合タンパク質”は、自然には一緒に結合されない少なくとも2つのポリペプチドセグメントを参照する。本発明のこのような“融合タンパク質”の非制限的例としては、tTA及びSEAP等のレポーター能力を直接的又は間接的に有するタンパク質と結合するHCVポリタンパク質の一部が挙げられる。
用語“プラスミド”、“ベクター”又は“DNA構築物”は、技術において一般に知られ、任意の遺伝因子を参照し、オリゴヌクレオチド配列又は本発明の配列を組み込み、本発明のDNAがクローン化されるDNA媒体として役立つプラスミドDNA、ファージDNA、ウイルスDNA等が挙げられるが、これらに限定されない。多くのタイプのベクターが存在し、技術においてよく知られている。
【００２６】
用語“発現ベクター”は、上述の通りにベクターを定義するが、宿主へのトランスフォーメーション又はトランスフェクションの後、挿入された配列が発現できるようにデザインされる。クローン化遺伝子（挿入された配列）は、通常プロモーター配列等の調節領域配列の制御下で配置される。このような発現制御配列は、ベクターが原核生物又は真核生物宿主又は両方の結合可能な遺伝子（シャトルベクター）を発現するように設計されるか否か、さらにエンハンサーエレメント、ターミネーション配列、組織特異性エレメント及び／又は翻訳開始及び終結部位等の転写性エレメントを含むか否かに依存して変化する。
用語“非細胞変性”発現システムは、発現される細胞システムにおいて細胞変性の変化を誘導しないシステムを定義する。この発現システムは、ウイルスとの同時感染を要求せず、細胞病態及び細胞死を最終的に誘導する非HCVウイルス成分の発現を生じない。非細胞変性プロモーターの例は、CMVプロモーターシステム、SV40初期プロモーターシステム又はRSV（ラウス肉腫ウイルス）LTRプロモーターシステムである。
【００２７】
“真核生物発現システム”は、好適な発現ベクターと興味ある遺伝子を発現するために使用される真核細胞株との組み合わせを意味する。また、設計された遺伝子を含むプラスミドベクターを使用してもよい。すべての場合に、ベクターは、好適な調節領域（プロモーター）を含み、興味ある細胞タイプの遺伝子を発現する。典型的に使用される真核細胞タイプは、プラスミドベクターでトランスフェクションされたイースト（例えばサッカロミセスセレヴィシエ、Pischia pastoris）、及び過渡的又は恒常的発現のためのDNAベクターでトランスフェクションされた哺乳類の細胞である。本発明の目的のために有用な好ましい細胞株は、肝組織に由来する。
【００２８】
宿主細胞又はインジケーター細胞は、このようなDNAが細胞内に導入される場合、外来性又は異種性DNA（例えばDNA構築物）によって“トランスフェクション”されている。トランスフェクションするDNAは、細胞のゲノムを産生する染色体DNAに組み込んでもよく（共有結合的に結合）、又組み込まなくてもよい。原核生物、イースト及び哺乳類の細胞において、例えばトランスフェクション／トランスフォームするDNAは、プラスミド等のエピソームエレメント上で維持してもよい。真核細胞に関して、安定にトランスフェクションされる細胞の例は、トランスフェクションするDNAが染色体に組み込まれているものであり、染色体の複製を経て娘細胞によって遺伝する。この安定性は、真核細胞がトランスフェクションするDNAを含む娘細胞の集団を含む細胞株又はクローンを確立する能力によって示される。トランスフェクション法は、技術においてよく知られている（Sambrookら, 1989、Ausubelら, 1994）。
本発明を行うのに有用なヌクレオチド配列及びポリペプチドとしては、ミュータント、ホモログ、サブタイプ、準種（quasi-species）、アレル等が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本発明の配列はポリタンパク質をコードすることが理解されている。本発明のポリタンパク質及び任意のその変異体、誘導体又はフラグメントは、活性プロテアーゼを自己処理することは当業者にとって明らかである。
【００２９】
本明細書で使用されるように、名称“変異体”は、本発明の状況において、配列が核酸であろうとアミノ酸であろうと、本来の配列のものと実質的に同様である生物活性（機能的又は構造的）を保持する分子を表す。この変異体は、同一の又は異なる種に由来してもよく、自然変異体であってもよく、又合成的に調製していもよい。このような変異体としては、タンパク質の生物活性が保存されることを条件として、1つ以上のアミノ酸が置換、欠如又は付加されたアミノ酸配列が挙げられる。配列の生物活性が一般に保持されることを条件として、同様のことは、1つ以上のヌクレオチドが置換、欠如又は付加された核酸配列の変異体に適用する。
【００３０】
用語“誘導体”は、これらの分子の一部が正常でない付加的な化学物質を含む場合、上述のいずれの変異体も含むことを意味する。これらの化学物質は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期の改善、毒性の低減及び望ましくない副作用の排除又は低減を含む種々の目的を有する。さらに、これらの物質は、標識化及び結合する目的で使用され、又はそれらは融合産物に含まれてもよい。上述の効果を媒介できる異なる物質は、RemingtonのThe Science and Practice of Pharmacy (1995)で見出される。このような物質を分子と結合させる方法は、技術においてよく知られている。
用語“フラグメント”は、同定されるDNA、RNA又はアミノ酸配列の任意のセグメント及び／又は本発明によって要求されるその生物活性（機能的又は構造的）を実質的に保持する上述のいずれかの変異体又は誘導体の任意のセグメントを参照する。
本発明の用語“変異体”、“誘導体”及び“フラグメント”は、組換えDNA技術によって単離／精製され、化学的に合成され、又は製造されるタンパク質又は拡散分子を参照する。これらのすべての方法は、技術においてよく知られている。本明細書において、以下に例証するように、本発明で使用されるヌクレオチド配列及びポリペプチドは、例えばin vitro突然変異誘発によって改変される。
【００３１】
例えば、本発明で定義されるように、NS3タンパク質の所望するフラグメントは、そのプロテアーゼ活性を保持しなければならない。NS4Aタンパク質の所望するフラグメントは、そのプロテアーゼ補助因子活性を保持し（機能的活性）、ER膜に包埋させるその疎水性タンパク質をも保持する（構造的活性）。NS4Bタンパク質の所望するフラグメントは、天然のものにできる限り近づけてポリタンパク質をプロセシングさせるために、その構造的活性を保持する。NS5Aタンパク質の所望するフラグメントは、天然のものにできる限り近づけてポリタンパク質をプロセシングさせるためにその構造的活性を保持するが、その機能的活性をも保持して、機能的NS5A/5B切断部位を提供する。NS5Bタンパク質の所望するフラグメントは、機能的NS5A/5B切断部位を保持するのに充分でなければならない。例えば、NS5Bタンパク質の最初の6つのアミノ酸は、この目的のために充分である。各領域のこのような機能的又は構造的活性は、過度に実験をすることなく、当業者によって容易に評価できる。
【００３２】
本明細書で使用される用語“切断部位”はHCV NS3プロテアーゼによって“シス”又は“トランス”で切断されるポリペプチドを参照する。
本明細書で使用される用語“ターゲット切断部位”又は“ターゲット部位”は、NS3/4A切断部位の下流の切断部位を参照する。NS3プロテアーゼの少なくとも1つのターゲット部位は、トランス活性化因子のトランスロケーション及びレポーター遺伝子の発現を得るために、及びレポーター遺伝子産物の測定を達成するために切断されなければならない。それ自身によるその切断がレポーター遺伝子産物を放出しないため、本明細書では、NS3/4A切断部位は、“ターゲット”部位としてみなされない。
本明細書で使用される用語“機能的切断部位”は、（突然変異又は任意のその他の化学的方法によって）改変されているがNS3プロテアーゼによって切断できる状態である前駆物質ポリペプチドの切断部位を意味する。このような改変としては、核酸コドン又はアミノ酸の保存された置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
好ましい実施態様
細胞ベースアッセイ
従って、本発明の最初の実施態様に従って、以下を含むＣ型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼのプロテアーゼ活性を評価するための代理細胞ベースシステムを提供する：
a）以下を含む第一キメラＤＮＡ分子：
i）哺乳類の細胞のトランスフェクションによる前記第一キメラの発現を含むことができる非細胞変性発現システム；及び
ii）前記発現システムと結合可能なHCV組換えDNA分子；ここで前記HCV DNA分子は以下を含むNS3-5ポリタンパク質をコードする：
‐活性NS3プロテアーゼ領域、
‐トランスレーションによりER膜で包埋させ、NS3プロテアーゼ活性の補助因子として作用させるのに充分なNS4A領域、
‐その任意の誘導体、変異体又はフラグメントを含むNS4B及びNS5A領域、及び
‐前記NS3プロテアーゼのためにNS5A/5B切断部位を提供するのに充分な、その任意の誘導体、変異体又はフラグメントを含むNS5Bタンパク質；
iii）及び前記HCV DNA分子の下流を融合したトランス活性化因子領域、ここで前記トランス活性化因子領域はレポーター遺伝子の発現を開始できるトランス活性化因子分子をコードする；
b）及び前記トランス活性化因子分子に応答するオペロンと結合した前記レポーター遺伝子をコードする第二キメラDNA分子；
それによって、前記第一組換え分子の発現は、前記哺乳類の細胞の小胞体に固定された融合ポリタンパク質の産生を導き、前記固定したタンパク質は前記プロテアーゼによって切断されることができ、その結果前記プロテアーゼ活性を評価する方法として前記レポーター遺伝子の発現を含むための前記トランス活性化因子領域のトランスロケーションを与える。
【００３４】
第一の実施態様の好ましい局面において、キメラ分子は、一度翻訳された活性プロテアーゼを提供するのに充分なNS3領域、その変異体、誘導体又はフラグメントを有するHCVポリタンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を包含する。これは、ヘリカーゼ領域を排除するために切断されたNS3タンパク質又はヘリカーゼ領域が不活化されるNS3タンパク質を含む。本発明に必要なNS4A領域は、翻訳されたNS4Aタンパク質、その変異体、誘導体又はフラグメントが翻訳によりER膜のポリタンパク質を包埋させ、NS3プロテアーゼ活性のための補助因子として作用させるのに充分であることを必要とする。
本発明に必要なNS4B領域は、翻訳されたタンパク質がNS5A/5Bターゲット切断部位を考慮してNS3プロテアーゼの正しい構造配向を与えるのに充分な長さであることを必要とする。従って、NS4Bタンパク質の変異体、誘導体又はフラグメントは、その切断部位（4A/4B又は4B/5A）において、又はそのポリタンパク質の定位効果（orienting effect）を損なうことなしに、その未変性生物活性を除去するために突然変異することができる。
【００３５】
本発明に必要なNS5A領域は、翻訳されたタンパク質がNS5A/5Bターゲット切断部位を考慮してNS3プロテアーゼの正しい構造配向を与えるのに充分な長さであることを必要とする。従って、NS5Aタンパク質の変異体、誘導体又はフラグメントは、その上流の切断部位（4B/5A）において突然変異し、又はポリタンパク質及びNS5A/5B切断部位におけるその定位効果を損なうことなしに、それぞれの生物活性を排除するために突然変異することができる。
最後に、本発明に必要なNS5A/5B切断部位は、機能的すなわちNS3プロテアーゼによって認識され、切断されなければならない。このような機能的ターゲット切断部位は、NS3プロテアーゼによって切断することができる限り、その誘導体、変異体又はフラグメントを含む。NS5A/5B切断部位の好ましい実施態様は、NS5B領域の最初の6つのアミノ酸を包含する。
【００３６】
この第一の実施態様の別の局面において、全長NS3ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。あるいは、上述のように必要な領域の変異体を含む部分的なポリタンパク質をコードする部分的なヌクレオチド配列を提供する。
あるいは、キメラ分子は、すべての機能的切断部位：NS3/4A；4A/4B；4B/5A及び5A/5Bを含む前駆物質ポリタンパク質の誘導体、変異体又はフラグメントを発現することができるヌクレオチド配列を包含する。あるいは、少なくともNS5A/5Bは、機能的切断部位であるが、その他の切断部位は、非機能的になるように修飾されていてもよい。
この第一の実施態様の特別な局面に従って、非細胞変性プロモーターシステムは、CMVプロモーター、SV40初期プロモーターシステム又はRSV（ラウス肉腫ウイルス）LTRプロモーターシステムを含む。
【００３７】
この第一の実施態様の特別な局面に従って、レポーターシステムは、第一の組換え核酸と結合したトランス活性化因子領域を含み、これにより、発現した融合タンパク質から切断された場合、トランス活性化因子は、核に移動し、産物がNS3プロテアーゼ活性の評価方法として測定されるレポーター遺伝子の発現を活性化する。トランス活性化因子領域の融合は、アッセイの感受性を増大する増幅レベルを提供する。この特別な局面に従って、トランス活性化因子によるレポーター遺伝子システムの活性化は、前駆物質ポリタンパク質の切断が特異的であることを保証する手段として特異的に抑制してもよい（組み込み型負の制御（built-in negative control））。このような特別の局面のものは、哺乳類の細胞株におけるテトラサイクリン制御トランス活性化因子の設計及び潜在的使用を記載するGossen, M.及びBujard, H. (1992) の方法に順応させたシステムを含む。
この方法において、tetリプレッサーは、単純ヘルペスウイルスタンパク質16（VP16）の活性化領域と融合し、その結果テトラサイクリン依存トランス活性化因子（tTA）を産生する。このtTAは、結合したtetオペロン／ウイルスプロモーターの制御下でレポーター遺伝子の転写／発現を開始する。レポーター遺伝子の産物は、遺伝子活性化及びタンパク質発現の指標である。
【００３８】
しかし、レポーターシステムの好ましい局面において、トランス活性化因子は、それがターゲット切断部位の下流であり、従って切断により放出される限り、キメラ分子又は融合タンパク質のいずれにあってもよい。より好ましくは、トランス活性化因子は、組換え分子の3'末端に位置する。トランス活性化因子としては、テトラサイクリントランス活性化因子（tTA）、NFκB、HIV-1 tat及びGAL-4が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、トランス活性化因子はtTAである。レポーター分子としては、分泌性アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアミノトランスフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、レポーター分子はSEAP又はルシフェラーゼである。より好ましくは、レポーター分子はSEAPである。
【００３９】
好ましい局面において、レポーターシステムはtTA及びルシフェラーゼの組み合わせ又はtTA及びSEAPの組み合わせである。より好ましくは、レポーターシステムはtTA及びSEAPの組み合わせである。
トランス活性化因子及びレポーターシステムの異なる順列が技術においてよく知られた方法を用いて結合されることは、本発明の局面であり、これらのすべては本発明の範囲内である。本発明の目的に有用な異なるレポーター分子が存在するため、レポーター遺伝子産物の検出は、公知の方法の使用と一致する。例えば、ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ基質として補酵素Ａ（Promega製ルシフェラーゼアッセイシステム, NI, USA）を用いて化学発光反応によって測定され、SEAPは、CSPD基質及びエンハンサー（Tropix, Inc.製, MA, USA）を組み込む化学発光反応によって測定される。
【００４０】
組換えＤＮＡ分子及びタンパク質
第二の実施態様において、本発明は、このアッセイにおいて有用な組換えＤＮＡ分子及び任意のそのフラグメント、変異体及び誘導体を包含する。本発明のこの第二の実施態様の特定の局面に従って、SEQ ID NO.1に定義される核酸分子を提供する。
第三の実施態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子から産生される組換えタンパク質を包含する。この第二の実施態様の特定の局面に従って、SEQ ID NO.2に定義されるアミノ酸配列を提供する。
アミノ酸及びヌクレオチド配列の上述の実施態様に従って、本明細書の配列と機能的に等価であるすべてのその変異体、誘導体及びフラグメントは、本発明の範囲内である。
【００４１】
ベクター
第四の実施態様において、また本発明は、前記組換えDNA分子のいずれかを含むベクターを包含する。SEQ ID NO.1の核酸分子が哺乳類の宿主細胞へのトランスフェクションのための発現プラスミドに挿入されることは、この第四の実施態様の特別の局面である。第四の実施態様の好ましい局面において、本発明の目的のために有用な異なるプラスミド、ベクター又はウイルスは、ヒトの宿主細胞を安定に、又は過渡的にトランスフォームすることができるヒトの発現プラスミド、ベクター又はウイルスを含む。これらは公知であり、本発明の範囲である。より好ましくは、プラスミドは、tTA遺伝子が存在するpUHD15-1 CMVプロモーターベースプラスミド及びpUHC13-3 tTA制御可能なルシフェラーゼ又はSEAPレポータープラスミドからなる群から選択される。この第四の実施態様の最も好ましい局面において、SEQ ID NO.1の核酸は、pUHD15-1プラスミドに挿入される。
【００４２】
トランスフェクション
宿主細胞における上述のベクターのトランスフェクションは、同時に（同時トランスフェクション）又は連続して行ってもよい。あるいは、レポーターシステムのトランスフェクションは初めに行ってもよく、安定なトランスフェクタントを得るために、後にそれらをHCV領域含有ベクターの第二のトランスフェクションで使用して、本発明に有用な二重のトランスフェクタント（過渡的又は安定な）を得る。
【００４３】
宿主細胞
第五の実施態様において、本発明は、これらのベクターでトランスフェクションされる真核生物の宿主細胞を包含する。従って、この第五の実施態様の特定の局面に従って、上記で定義されるキメラ分子を含む発現プラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。より詳細には、SEQ ID NO.1の核酸分子でトランスフェクションされた哺乳類の細胞株を提供する。第五の実施態様の好ましい局面において、宿主細胞は、安定に、又は過渡的にトランスフォームされる哺乳類の細胞である。哺乳類の宿主細胞及び細胞株としては、一次肝細胞、肝細胞株、繊維芽細胞、リンパ球、腎細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。より好ましくは、キメラ分子でトランスフェクションされる過渡的なヒトの細胞株を提供する。より一層好ましくは、ヒトの細胞株は、肝又は腎細胞株である。最も好ましくは、宿主細胞は、293、Huh-7、WRL68、HepG2及びチャング細胞（Chang cells）からなる群から選択してもよい。
【００４４】
阻害剤の同定方法
第六の実施態様において、本発明は、組換え分子及び本発明のトランスフェクションした宿主細胞を用いてNS3プロテアーゼ活性の評価方法を包含する。この第六の実施態様の特定の局面において、上記で定義したシステムを用いて抗ＨＣＶ阻害剤をスクリーニング方法を提供する。この第六の実施態様の特定の局面に従って、以下の工程を含むＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ活性のアッセイ方法を提供する：
a）最初に、上述のように、HCV NS3-5ポリタンパク質及び発現される前記レポーター遺伝子産物を生じる条件下でトランスフェクションされた宿主細胞をインキュベートする工程；及び
b）発現された前記遺伝子産物の量を測定する工程。
【００４５】
この第六の実施態様の別の特定の局面に従って、以下の工程を含むＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの阻害剤として化合物を同定する方法を提供する：
a、b）上記で定義した方法によって前記化合物の非存在下で前記プロテアーゼの活性をアッセイする工程；及び
c）上述の方法によって前記化合物の存在下で前記プロテアーゼの活性をアッセイする工程、ここで前記化合物は前記最初のインキュベーション後宿主細胞に加えられ、前記活性をアッセイした後、宿主細胞はさらにインキュベートされる；及び
d）工程c）の結果と工程b）の結果を比較する工程。
本発明のアッセイ及び方法は、当業者によく知られた哺乳類の細胞増殖条件下、すなわち生理的pH、PBS等の緩衝剤を用いた塩濃度、30°から42°の範囲の温度、適した細胞培地及び細胞増殖のために十分な時間の提供で行われる。
【００４６】
本発明の方法の好ましい概念において、トランスフェクションされた宿主細胞はコードされた前駆物質アミノ酸配列を発現及びプロセシングさせるために、及びレポーター分子の発現のために十分な時間をかけてインキュベートされる。より詳細には、細胞は少なくとも1時間、最も詳細には少なくとも18時間、インキュベートされ、レポーター遺伝子産物の量は標準と比較される。本明細書において、標準は、トランスフェクションされていない宿主細胞又は媒体でトランスフェクションされた宿主細胞を参照する（ベクター又はプラスミドは、前駆物質アミノ酸配列をコードする組換え核酸分子を有さない）。
第五の実施態様の好ましい局面において、トランスフェクションされた宿主細胞は、試験化合物の存在下又は非存在下で、約30時間、特に約20時間、さらに特に約10時間さらにインキュベートされ、レポーター遺伝子産物の量が比較される。
【００４７】
実施例
材料
すべての制限酵素は、ファルマシアバイオテクインコーポレイテッド社（ケベック, カナダ）から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応法は、製造業者の説明書を用いてIDラボ社（ON, カナダ）から入手したID-検査済みポリメラーゼで行った。熱安定性アルカリホスファターゼは、ギブコ-BRL（MD, USA）から入手した。ライゲーション反応は、製造業者の説明書に従って、ファルマシアバイオテクインコーポレイテッド社（ケベック, カナダ）から入手したT4 DNAリガーゼを用いて行った。HCV-tTAキメラは、CMVプロモーター（ディスプレーシステムバイオテクノロジーインコーポレイテッド社, CA, USA）によって発現されるtTA遺伝子をコードするベクターpUHD15-1を用いて構築し、ヌクレオチド配列は制限部位Xba 1を用いて挿入したHCVタンパク質をコードした。また、ルシフェラーゼレポータープラスミド（pUHC13-3）は、ディスプレーシステムバイオテクノロジー社から入手した。プラスミドPCR3.1は、インビトロゲン社から入手し、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスは、Bernard Moss（NIH, MD, USA）から入手した。HCV 1bウイルスcDNAは、HCV J4/38（遺伝子銀行受け入れ番号（accession number）：D13558）のHCV 1b配列に由来するプライマーを用いてウイルスに感染させたヒトの血清サンプルのRT-PCRにより産生し、3'末端の増幅で使用されるプライマーは、遺伝子銀行受け入れ番号D36922に由来した。このHCV cDNAは配列され（SEQ ID NO 1の部分的な配列）、図２Ａから２Ｉに示される組換え分子の構築で使用される特異的HCVセグメントの増幅反応におけるテンプレートとして役立った。
【００４８】
標準方法は、すべての増幅反応、制限酵素消化、部位特異的オリゴヌクレオチド変異誘発、クローン化、プラスミドDNAの単離、細胞培養、トランスフェクション及びウエスタンブロット分析について使用した（Sambrookら, 1989）。上述のプライマー対によって産生された増幅産物は、制限酵素Nhe 1及びXba 1によって消化し、プラスミドpUHD15-1を制限したXba 1にクローン化し、大腸菌にトランスフォームした。トランスフォームは、制限酵素分析による方向性で選別される。選択されたインフレームHCV-tTAキメラは、図２Ａから２Ｉに示される。これらの各HCV-tTAキメラは、TAクローン化（インビトロゲン, CA, USA）によってプラスミドPCR3.1に付加的にサブクローン化し、その結果T7プロモーターの制御下でHCV-tTAキメラを認識する。
【００４９】
実施例１：HCV 1bのRT-PCR及び増幅した産物の配列
HCV 1B RNAを有するヒトの血清サンプルを逆転写し、HCV 1B cDNA配列（HCV J4/83；受け入れ番号D13558）にまたがる12センス及びアンチセンスプライマーを用いて増幅した。Kolykhalovら（1996）によって記載されるHCV（受け入れ番号D63922）に由来するプライマーを用いて、3'末端配列を増幅した。RT-PCR反応は、HCV-1b全体にわたる4つの重複フラグメント産生した。そのフラグメントは、固有の制限酵素部位の消化により構築され、結合して全長HCV cDNAを形成した。この得られたcDNAを完全に配列し、すべての増幅反応においてテンプレートとして使用し、増幅産物をこの利用において記載されたキメラの構築物に使用した。TTAに融合される配列されたポリタンパク質領域はSEQ ID NO 1に、翻訳されたアミノ酸配列はSEQ ID NO 2に示される。
【００５０】
実施例２：キメラの構築において使用されるHCVフラグメントの増幅
NS3遺伝子の5'末端に相補的なフォワードプライマー（GGCGCTAGCGCGCCCATCACGGCCTAC（SEQ ID NO 3））はすべての増幅反応で使用されたNhe 1部分を含む。本明細書で使用される3'末端に相補的なすべての逆プライマーはXba 1部位を含む。逆プライマー（GGCTCTAGAGTAAGGGAGGTGT GAGGC（SEQ ID NO 4））をキメラＡ及びＢの配列を増幅するために使用し、NS4B P1'からP6'までの切断部位を含む。逆プライマー（GGCTCTAGAGTAAGGGAGGTGTGAGGGGCGCTCTTCC（SEQ ID NO 5））をキメラＣのHCV配列を増幅するために使用し、それはNS4A/NS4B P1-P1'残基の置換が導入されるNS4B P1'からP6'までの切断部位に対応する。
2つの重複逆プライマー（GCAGCAGACGACGTCCTCGAATTCCCGGTAG AG GAC（SEQ ID NO 6）及びGGCTCTAGACCATGTGTAGGACATCGAGCAGCAGACGACGTCCTC（SEQ ID NO 7））を、クローンＡ及びＢそれぞれのNS4A/NS4B切断部位がNS5A/NS5B切断部位で置換されるキメラＤ及びＥのHCV配列を増幅するために使用した。
2つの重複逆プライマー（GCAGCAGACGACGTCCTCGAATTCCCGGTAGAGGAC（SEQ ID NO 6）及びGGCTCTAGACCATGTGTAGGACATAGGCCTGCAGACGACGTCCTC（SEQ ID NO 8））を、キメラＦのHCV配列 を増幅するために使用し、それは、NS5A/NS5B P1-P1'残基の置換が導入される NS5B P1'からP6'までの切断部位に対応する。
【００５１】
キメラＧのHCV配列は、全長HCV cDNAをSEQ ID NO 3及びSEQ ID NO 7のプライマーで増幅することによって産生した。これは、HCV NS3からNS5B-P6'コドンにまたがる配列を含めて産生した。
同様に、キメラＩのHCV配列は、全長HCV cDNAテンプレートをSEQ ID NO 3及びSEQ ID NO 8のプライマーで増幅することによって産生した。これは、HCV NS3からNS5B-P6'コドンにまたがる配列を含めて産生し、P1-P1'切断部位置換を含む。
クローンＢ、Ｅ及びＨは、セリンを残基1165でアラニン突然変異に導入し、NS3活性部位ミュータントを産生するオリゴヌクレオチド（CCCCCGGGTGCACACAGCTGCCC GGAAGATGCCCACAACGGCCCCGAAGGGCAGAGCAGTGGGCCACCCGCAGAGCC（SEQ ID NO 9））による部位特異的変異誘発によって改変したHCV cDNAテンプレートを用いて増幅した。
構築物ＡからＩに含まれるHCVポリタンパク質の非構造領域は、特異性が各タンパク質の接合部にまたがるアミノ酸配列によって決定されるNS3プロテアーゼ切断によって処理した。この切断部位の優先度は、以前、ペプチド基質及び精製したNS3プロテアーゼによってin vitroで再現された（Kwongら, 1998参照）。
【００５２】
in vivoでのこの利用において、切断を検討した。種々の異種発現システムにおけるポリタンパク質の発現及び成熟HCVタンパク質の出現は、ウエスタンブロット分析によって処理された産物の間接的試験によってモニターした。NS3プロテアーゼ活性の最適な高処理量レポーターベースアッセイを提供する試みの中で、図２Ａから２Ｉに示される活性化因子／レポーターと融合したHCVポリタンパク質セグメントの異なる構築物を評価した。
HCV-tTA融合の3つの異なるファミリーを構築し、in vivo切断の効率を試験した。結果は、NS3切断の効率が切断部位にまたがる配列によって決定されるだけでなく、その他のタンパク質又はHCVポリタンパク質の領域に関しては、その部位の位置的な状況によっても決定されることを示した。
【００５３】
この発見を示すために使用されるHCV-tTA融合の3つのファミリーは、以下のものである：
NS3からNS4AにまたがるクローンＡ、Ｂ及びＣは、NS4Bの6番目のアミノ酸に融合したtTA活性化因子を有して、tTAの切断はNS4Bタンパク質のプロセシングを模倣する；
クローンＤ、Ｅ及びＦは、NS4A/NS4B接合部にまたがる12のアミノ酸セグメント（DEMEEC↓ASHLPY）がNS5A/NS5B接合部にまたがる配列（EDVVCC↓SMSYTW）に変更された以外は（i）と同様であり、この変異体は、NS4B の状況においてtTAに位置し、まだより効率的な切断部位（NS5A/NS5B）に存在する；及び
クローンＧ、Ｈ及びＩは、NS3アミノ末端であり、NS5Bの6番目のアミノ酸で終結し、tTAと融合したHCV非構造領域を含み、そのためtTAの切断は、その位置的な状況において、NS5Bタンパク質のプロセシングを模倣する。
変異体（クローンＢ、Ｅ及びＨ）は、NS3プロテアーゼ活性部位突然変異を含み（セリン1165からアラニンへ、アミノ酸残基は、HCVポリタンパク質の初めから1165番目の位置である。）、これらは、tTA切断が活性NS3プロテアーゼに依存することを示すためのコントロールとして使用される。
変異体（クローンＣ、Ｆ、Ｉ）は、R-Pジアミノ酸モチーフに突然変異したP1-P1'切断部位を含み、これらは、tTAプロセシングがtTA活性化因子により操作された接合部で機能的NS3切断配列部位にのみ依存することを示すためのコントロールとして使用される。
【００５４】
実施例３：トランスフェクション／T7ワクシニアウイルス（vvT7-3）感染細胞におけるHCV-tTA融合の可視化
CMVプロモーターによるHCV NS3プロテアーゼの発現がウエスタンブロット分析による可視化にとって低すぎるため、ワクシニアウイルスT7（vvT7-3）発現システム（Elroy-Stein, O.及びMoss, B., 1998）を用いて293細胞の融合タンパク質の発現によって各キメラのプロテアーゼの活性を変えた。
DMEM-10% FBSの6ウエルプレートの60％コンフルエンスに増殖した細胞をvvT7-3に感染させ（感染効率10から15）、 リン酸カルシウム法を用いて5μgのpCR3.1 HCV-tTA構築物Ａ、Ｂ及びＣをトランスフェクションした。トランスフェクション後18時間で、細胞を収集し、細胞ライセート全体からタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、電気泳動的に膜に移動させ、膜をHCV特異的ポリクローナル抗体でプローブした。
【００５５】
キメラＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩを含むプラスミドpCR3.1をvvT7感染した293細胞にトランスフェクションし、HCVタンパク質プロセシングを、HCV特異的ポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロット分析により試験した。キメラＡは、成熟したNS3及びNS4Aタンパク質反応バンドを生じることを示した（図３Ａ及び３Ｂ、レーンＡ）。NS4Aタンパク質は、54のアミノ酸のみを含むため、分子量の小さい分子の検出を可能にする条件下でゲルを流すことが必要であった（図３Ｂ下部パネル）。NS3の不活性S1165A突然変異をコードするキメラＢは、NS3及びNS4A反応バンドの欠如によって示されるようにポリタンパク質前駆物質を処理しない（図３Ａ及び３Ｂ、レーンＢ）。NS4A/NS4B切断部位突然変異を有するキメラＣは、成熟したNS3に対応する反応バンドを生じるが（図３Ａ、レーンＣ）、成熟したNS4A反応バンドを生じない。NS4A-tTA切断部位での切断の欠如（図３Ｂ、レーンＣ）は、抗NS4Aのウエスタンブロット法におけるNS4A-tTA融合の検出によって確認される。
【００５６】
キメラＤ、Ｅ及びＦにおいて、NS4A/4B切断部位をNS5A/5B切断部位で置換した。キメラＤを含むトランスフェクションした宿主細胞の発現は、成熟したNS3タンパク質に対応する反応バンドを生じた（図４、レーンＤ）。S1165A突然変異を有するキメラＥは、明らかなNS3反応バンドを有さず（図４、レーンＥ）、ポリタンパク質前駆物質が処理されないことを示す。活性NS3プロテアーゼを有するキメラＦは、成熟したNS3を産生するが、おそらくNS4A-tTA切断部位での切断をブロックする切断部位突然変異を有する（図４、レーンＦ）。
入手可能な抗NS4A抗血清は、NS4Aタンパク質のC末端でエピトープを認識する。キメラＤ、Ｅ及びＦは、NS5A/NS5B切断部位を与えるために修飾されたこのセグメントを有している。従って、これらのキメラのプローブとして抗NS4A抗血清を用いたウエスタンブロット分析は、修飾されたNS4Aを検出できなかった。
【００５７】
キメラＧ、Ｈ及びＩは、多くのHCVポリタンパク質を含む。キメラＧを含むトランスフェクタントの発現は、結果として期待される成熟したタンパク質、NS3、NS4A、及びNS5Aに処理される前駆物質ポリタンパク質を生じる。これらは、それぞれの抗血清によってプローブされるウエスタン分析によって可視化した（図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ、レーンＧ）。S1165A突然変異を有し、NS3を不活性化するキメラＨは、ポリタンパク質前駆物質を処理せず、いずれの成熟したタンパク質も産生しない（図５、レーンＨ）。NS5A/5B切断部位突然変異を有するキメラＩは、成熟したNS3及びNS4Aタンパク質を産生するが（図５Ａ及び５Ｂ、レーンＩ）、NS5A/tTA切断部位で切断できない（図５Ｃ、レーンＩ）。
【００５８】
実施例４：ルシフェラーゼアッセイ
HCV-tTAキメラの3つのファミリー（クローンＡ、Ｄ及びＧ）、及びその活性部位及び切断部位ミュータント変異体を、pUHC13-3レポーターにより293細胞に、それぞれ同時トランスフェクションし、NS3依存ルシフェラーゼ発現の範囲を決定した（図６）。35mmウエルの細胞を図２Ａから２Ｉに記載される各構築物及びリン酸カルシウム法を用いたpUHC13-3レポータープラスミドで同時トランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後48時間で収集し、リン酸緩衝食塩水で2回洗浄した。収集した細胞を200μlのリーシス（lysis）緩衝液（25mM トリスホスフェート pH 7.8、2mM DTT、2mM 1.2 ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-テトラ酢酸、10％ グリセロール及び1％ トリトン X-100）に溶解し、5分間12000gで遠心分離した。10μlの上澄みを96ウエルプレートで50μlのルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）と混合し、生じた光の量をジジェネ光量計（Digene luminometer）又はパッカードトップカウント（Packard top-count）シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００５９】
キメラＡは、約1200000cpsのルシフェラーゼ活性を生じ、このシグナルは、キメラＢ（不活性NS3プロテアーゼ）及びキメラＣ（切断部位突然変異）によって産生されるルシフェラーゼ（500000cps）よりも2から3倍高い。
キメラＤによって表されるHCV-tTA融合ファミリーは、293細胞において1300000cpsのルシフェラーゼ活性を生じた。このシグナルのNS3依存性は、キメラＥ（不活性NS3プロテアーゼ）及びキメラＦ（切断部位突然変異）によって産生される明らかに少量のルシフェラーゼ（100000から300000cps）によって強調される。
キメラＧによって表される最も長いHCV-tTA融合は、 最も高いルシフェラーゼシグナルを生じた（約2200000cps）。このシグナルのNS3依存性は、キメラＨ（不活性NS3プロテアーゼ）及びキメラＩ（切断部位突然変異）によって産生される少量のルシフェラーゼ（100000から300000cps）によって増強される。
トランスフェクションされた293細胞で生じるNS3依存ルシフェラーゼシグナルは、野生型／活性部位ミュータントから得られるシグナルの比として発現される（図７）。Ａ／Ｂ、Ｄ／Ｅ及びＧ／Ｈの比は、それぞれルシフェラーゼの3、15.4及び28.1倍の活性を生じる。
これらの結果は、その“自然な”状況によって先行されるNS5A/NS5B切断部位を含むHCV NS3-5ポリタンパク質のすべての領域(NS3からNS5Bの6番目のアミノ酸までの領域を含む)を有する構築物Ｇが、ルシフェラーゼの最も高い活性化を生じたことを示す。
【００６０】
実施例５：テトラサイクリン内部標準バリデーション
HCV-tTAキメラから発現される成熟tTAは、テトラサイクリン標準化様式（controllable fashion）で機能する。例えば図８は、pUD15-1から発現されるキメラＧ及びpUHC13-3レポーターにより同時トランスフェクションされた細胞由来ライセートがテトラサイクリン感受性のルシフェラーゼ活性を示すことを示す。テトラサイクリンの非存在下でキメラＧを発現する細胞は、2,000,000cpsを超えるルシフェラーゼ活性を生じる。テトラサイクリンの存在下では、成熟tTA活性化因子の活性を阻害して、結果として40000cpsのルシフェラーゼ活性を生じる。テトラサイクリンの非存在下で、Ｇキメラトランスフェクタントによって産生されるルシフェラーゼの量は、コントロールpUHD15-1から産生されるルシフェラーゼの量と同じオーダーである。さらに、キメラＨ及びpUHC13-3の同時トランスフェクションは、ルシフェラーゼのtTA活性が活性NS3プロテアーゼを必要とすることを示す。不活性プロテアーゼをコードするキメラＨトランスフェクタントは、成熟tTAを産生することができず、結果として90000cpsのルシフェラーゼ活性のみを生じる。
【００６１】
実施例６：トランスフェクションした肝細胞（WRL68）のルシフェラーゼアッセイ
HCVは、肝細胞で見つかるため、このアッセイが肝細胞のウエルと等しく作用することを検証することは重要であった。従って、ルシフェラーゼ活性化を各キメラについて肝細胞株WRL68で試験した（図９）。この細胞株における活性化は、NS3依存であることを見出し、異なるキメラにおける活性ルシフェラーゼ発現の効率（図１０）は、293細胞におけるキメラの活性化効率と類似している。
【００６２】
実施例７：DNAの量に関するルシフェラーゼ活性化の最適化
同時トランスフェクション実験の重要な点は、細胞に導入されるプラスミドDNAの量である。この二成分システムは、HCV-tTAプラスミド及びルシフェラーゼレポータープラスミドの相対量の最適化を必要とした。0.1から1μgの範囲のHCV-tTAプラスミドＧを、0.2μgのpUHC13-3ルシフェラーゼレポータープラスミドによって293細胞（6ウエルプレートの50％コンフルエント）へ同時トランスフェクションした（図１１）。これらのトランスフェクタントにおいて最適なルシフェラーゼ活性化は、0.4から0.7μgのHCV-tTAプラスミドで得られた。同様に、最適なルシフェラーゼ活性化は、WRL68細胞における0.4から0.7μgのHCV-tTAキメラＧで見られた（図１２）。
【００６３】
実施例８：NS3トランス切断活性
全長ポリタンパク質から産生されたNS3プロテアーゼは、トランスでNS5A/5B接合部を切断できる（Tomeiら, 1993; Bartenschlagerら, 1994; Linら, 1994）。HCV-tTAキメラの有用性を、NS3トランス切断活性を示すのに使用した。図１３は、キメラＧが約2,000,000cpsを生じるためにルシフェラーゼの発現を活性化できることを明らかにする。tTA接合部で不活性プロテアーゼ及び切断部位突然変異を含むキメラＨ及びＩは、明らかにより少ないルシフェラーゼを活性化する（図５参照）。キメラＨ、Ｉ及びpUHC13-3レポーターの293細胞への三重トランスフェクションは、キメラＩから発現された活性NS3プロテアーゼがキメラＨにおいてコードされる“未変性”（無修飾）NS5A/5B接合部を切断できることを示すルシフェラーゼ活性を回復する（約2,000,000cps）。肝細胞株WRL68の同様の三重トランスフェクションは、部分的にルシフェラーゼ活性を回復した（図１４）。
【００６４】
実施例９：SEAPアッセイ（高処理量システム）
肝細胞、10％ウシ胎児血清で補充したCHO-SFMII培地（ギブコBRL）において増殖したHuh-7を、FuGene6 Boehringer Mannheim（マンハイム, ドイツ）を用いて、キメラＧ及びpUHC13-3 SEAP（修飾したpUHC 13-3）レポータープラスミドで同時トランスフェクションした。pUHC 13-3レポータープラスミドを、ルシフェラーゼをSEAPで置換することによって修飾した。5時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、異なる濃度の化合物を含む96ウエル培養プレートで1ウエル当たり80,000細胞で培養し、24時間インキュベートした。培地に分泌したSEAPの量は、Phospha-light基質（Tropix Inc., MA, USA）により測定した。
【００６５】
実施例１０：特異的NS3阻害剤によるバリデーション
本明細書に記載されたアッセイは、WO 00/09543に記載された酵素のアッセイによって40nMのIC50でNS3プロテアーゼを阻害するために示される化合物により確認した。
図１５は、分泌された測定したSEAPの量が方法に依存した投与量を減少させることを示す。さらに、この結果は、この化合物が細胞浸透性であり、細胞ベースアッセイにおいてその阻害性効力を保持することを示す。本発明のアッセイで測定されるこの化合物のEC50は、75nMである。結果として投与量依存性を生じるこの化合物の濃度の増加は、分泌されたSEAPの量を減少させ、NS3プロテアーゼ活性による1つ以上の部位での切断の増加した阻害剤に対応する。さらに、コントロール実験において（図１５、白四角）、この化合物は1μM未満の濃度でコントロールtTA活性を明らかに阻害しない。この化合物は本発明のアッセイの有用性及び特異性を確認する。
【００６６】
NS5Bの約6番目のアミノ酸までの未変性NS3ポリタンパク質のすべての切断部位を包含するHCVキメラ分子が、哺乳類の細胞においてHCV NS3プロテアーゼ活性を評価する目的のための最も効果的な構築物であることは、本発明の驚くべき、かつ有利な結果である。このキメラは、NS3-NS4Aプロテアーゼヘテロダイマー複合体を形成する全長HCV非構造領域のプロセシングを模倣し、その結果NS3プロテアーゼ活性の活性を改善する。この組換え分子の改善された有効性は、その他の公知のアッセイよりも特異的であり、敏感であるNS3プロテアーゼ活性の新しいアッセイシステムの基本を提供している。さらに、この改善された新しいシステムは、高処理量スクリーニングシステムにスケールアップできる、プロテアーゼ活性の阻害剤のスクリーニングするためのアッセイシステムを確立するのに有用である。
【００６７】
考察
図７及び８に示されるように、出願人は従来技術の代表的な構築物（構築物Ａ及びＤ）を再現し、最適化せずに高処理量のアッセイにおいてこのシステムの使用を試みた。得られたシグナル及びシグナル／ノイズ比は、アッセイの自動化を許容するのに最適化でなかった。
アッセイの感度を改善するための1つの方法は、成熟NS3-5ポリタンパク質の標準のコンホメーションを実質的に再現する構築物を提供することであり、その結果その未変性の状態でNS3プロテアーゼ活性を模倣する。驚いたことに、従来技術のシステムとの比較により、本発明の構築物は、2倍から6倍高いシグナル／ノイズ比への増加を提供する。
従って、出願人は、新規の改善した細胞ベースシステム及び信頼性及び再現性のある方法でプロテアーゼ活性を測定するためのアッセイを開発した。図７及び９の実験を行った後、出願人は、驚いたことにプロテアーゼ基質の追加の切断部位が得られるシグナルを改善することを見出した。これは、基質が1度、2度又は3度切断されされようと、ただ1つのトランス活性化因子分子が放出されるために驚くべきことである。シグナルが増加する事実は予想外であり、このシステムを有利にする。より詳細に、図７及び９は、構築物Ａ（1つの切断部位、従来技術で記載される）対構築物Ｄ（1つよりも多い切断部位）対構築物Ｇ（未変性ポリタンパク質）を用いた場合、得られるシグナルの増加を示す。出願人は、構築物Ｇが充分に高い活性を増加及び高処理量のアッセイをセットアップするのに充分な再現性を提供することを予測できなかった。
【００６８】
図８及び１０は、使用した細胞株に依存して、各追加の切断部位がバックグラウンドシグナルの増加なしに、2から6回よりも多いシグナルを与えることを示し、さらに切断部位の追加が、従来技術によって予測も、示唆もされていないため、予測されていたこと以上に増加した活性をシステムに与えることを示している。
活性の増加に加えて、NS3プロテアーゼによる経時的な切断の特異性の増大が見られる。HCV NS3プロテアーゼのin vitro構造研究に基づいて、最近の新しい理論は、NS3プロテアーゼ触媒機構が、誘発適合理論（induced-fit mechanism）によって酵素活性化に寄与する特異的な基質によって安定化されることである（Barbatoら, 2000, EMBO J., 19, 1195-1206）。ポリタンパク質に関連して表されるように、多重基質を組み込むin vivo細胞ベースアッセイが、結果としてより高い細胞ベース特異的活性によってNS3プロテアーゼを生じる本発明の特許請求の範囲は、この理論に対する生物学的な支持を提供する。
また、ポリタンパク質の発現のレベルは、CMVプロモーター等の非細胞変性発現システムにより発現したタンパク質を可視化できないほど低くはない（ワクシニアウイルス発現システムが使用されている限り）。従って、そのような低いレベルの発現がルシフェラーゼ又はSEAPのこのようなよい検出を導くことは、はるかに驚くべきことである。
【００６９】
参考文献：
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【図面の簡単な説明】
【図１】  NS3プロテアーゼ活性がルシフェラーゼの活性化を媒介する2つのプラスミドベースアッセイの模式的な概要を示す。スキームは、5A/5Bターゲット切断部位を経たテトラサイクリントランス活性化因子領域（tTA）と結合した組換えHCV非構造前駆物質ポリタンパク質を示す。初期プロセシング工程において、NS4Aは、NS3により“シスで”切断されて、NS3/NS4Aの円の重なりによって示される複合体を形成する。この複合体は、小胞体膜（ＥＲ）と結合しており、下流のターゲット部位（4A/4B、4B/5A及び5A/5B）の切断を触媒し、その結果、組換え分子からtTA領域を放出する。一度遊離すると、tTA領域は核に移動し、レポーター遺伝子、この場合にはルシフェラーゼの発現をトランス活性化する。このように、NS3プロテアーゼ活性及びNS3/4A切断部位の下流の切断は、ルシフェラーゼの発現に必須である。
中央のパネルは、ルシフェラーゼトランス活性化が放出されたtTA領域の非存在下で発生しないことを示す。tTAの非放出の可能なメカニズムは、NS3プロテアーゼ活性の欠如（この場合のように突然変異によって）、又は下流のターゲット切断部位の障害物である。
下のパネルは、ルシフェラーゼトランス活性化がテトラサイクリンの存在下で発生しないことを示す。NS3ポリタンパク質が切断され、tTA領域が核へトランスロケーションされるが、テトラサイクリンはtTAと結合し、DNA結合及びレポーター遺伝子の発現を妨げ、その結果ルシフェラーゼのバックグラウンド活性を測定するための信頼できる内部コントロールを提供する。
【図２】  それぞれのコントロールを有するテトラサイクリントランス活性化因子（tTA）と融合したHCVポリタンパク質の異なる部分を含むキメラの3つの異なるファミリーの模式図を示す。これらのキメラのHCVセグメントをコードするDNAは、pUHD15-1のNhe 1及びXba 1部位にXba 1フラグメントとしてクローン化されて、tTAキメラを産生する。
【図２Ａ】  第一ファミリーの第一キメラを示し（構築物Ａ）、組換え分子は、HCVの全長NS3タンパク質（プロテアーゼ及びヘリカーゼ領域の両方を含む）、全長NS4A（P6からP1で示される最後の6個のアミノ酸を含む）、tTAタンパク質と融合したP1'からP6'で示されるNS4Bの最初の6個のアミノ酸を含む。P6からP1及びP1'からP6'アミノ酸は、矢印で示される4A/4B切断部位を挟む。
【図２Ｂ】  第一ファミリーの第二キメラを示し（構築物Ｂ）、NS3タンパク質がセリンからアラニンまでのアミノ酸1165（S1165A）で突然変異したことを除いて２Ａと同じ組換え分子である。この構築物はコントロールとして与えられ、突然変異はNS3プロテアーゼ活性を完全に取り除く。
【図２Ｃ】  第一ファミリーの第三キメラを示し（構築物Ｂ）、NS4A/4B切断部位に隣接するP1及びP1'で示される2つのアミノ酸が、それぞれシステイン及びアラニンからアルギニン及びプロリンまで変化させることを除いて２Ａと同じキメラである。これらの変化は、この部位での切断を防ぐ。この構築物は切断部位のコントロールとして与えられる。
【図２Ｄ】  第二ファミリーの第一キメラを示し（構築物Ｄ）、この構築物はNS4A/NS4B切断部位を挟むアミノ酸配列（P6-P6'）がNS5A/NS5B切断部位を定義するアミノ酸配列（P6-P6'）で置換されるが、２Ａのキメラと同様である。
【図２Ｅ】  第二ファミリーの第二キメラを示し（構築物Ｅ）、NS3プロテアーゼがセリンからアラニンまでのアミノ酸（S1165A）を突然変異することによって不活性化されることを除いて２Ｄと同じ構築物である。この構築物は第二キメラのためのコントロールとして与えられる。
【図２Ｆ】  第二ファミリーの第三キメラを示し（構築物Ｆ）、NS5A/5B切断部位に隣接するP1及びP1'で示される2つのアミノ酸が、それぞれシステイン及びセリンからアルギニン及びプロリンまで変化させることを除いて２Ｄと同じ構築物である。これらの変化はこの部位での切断を防ぐ。この構築物は5A/5B切断部位のコントロールとして与えられる。
【図２Ｇ】  第三ファミリーの第一キメラを示し（構築物Ｇ）、組換え分子は、全長NS3タンパク質、全長NS4A、NS4B及びNS5Aタンパク質とtTAタンパク質と融合した部分的なNS5Bタンパク質（P1'からP6'で示される最初の6個のアミノ酸からなる）との間の領域を含む。全長NS5A及び5BのP1'からP6'は矢印で示されるように、5A/5Bターゲット切断部位を挟む。
【図２Ｈ】  第三ファミリーの第二キメラを示し（構築物Ｈ）、それは、NS3プロテアーゼがセリンからアラニンまでのアミノ酸の突然変異（S1165A）により不活性化されることを除いて、２Ｇと同じ組換え分子である。この構築物は、NS3プロテアーゼ活性の負のコントロールとして与えられる。
【図２Ｉ】  第三ファミリーの第三キメラを示し（構築物Ｉ）、それは、NS5A/5B切断部位に隣接するP1及びP1'で示される2つのアミノ酸が、それぞれシステイン及びセリンからアルギニン及びプロリンまで変化させることを除いて、２Ｇと同じ組換え分子である。これらの変化はこの部位での切断を防ぐ。この構築物は5A/5Bターゲット切断部位のコントロールとして与えられる。
【図３】  ウエスタンブロット分析の結果を示す。PCR増幅及びTAクローニングにより発現プラスミドpCR3.1に挿入される図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに記載されるキメラは（インビトロゲン, CA, USA）、T7 RNAポリメラーゼが存在する組換えT7ワクシニアウイルス（vvT7-3）とともにヒトの胚の腎臓細胞株293に過渡的にトランスフェクションされる。トランスフェクションし、感染させた細胞を増殖し、細胞タンパク質を抽出し、電気泳動し、ブロットし、プローブする。
【図３Ａ】  ブロットがNS3タンパク質をポリクローナル抗体でプローブした場合の結果を示す。レーンＡ、Ｂ及びＣは、２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに記載される構築物に対応し、レーン“−”は、ニセの293トランスフェクションされた細胞のコントロールを示す。レーンＡ及びＣは成熟NS3タンパク質（NS3）の存在を示し、S1165A突然変異を有する構築物を表すレーンＢは、予備的処理されたNS3（pre）の存在を示すが、いずれかの成熟NS3タンパク質を有するようには見えない。
【図３Ｂ】  ブロットがNS4Aをポリクローナル抗体でプローブした場合の結果を示す。レーンＡは成熟NS4Aタンパク質（NS4A）の存在を示し、S1165A突然変異を有する構築物２Ｂを表すレーンＢは、いずれかの成熟NS4Aタンパク質を有するようには見えず、同様に、突然変異した切断部位を有する構築物Ｃを表すレーンＣも、成熟NS4Aタンパク質を有するようには見えない。54のアミノ酸からなる成熟NS4Aタンパク質を可視化するために、細胞抽出物は、膜に移動した16.5％ SDS PAGEとリシンゲルで分解され、NS4Aポリクローナル抗体でプローブされる。得られたバンドは下のパネルに示される。
【図４】  ウエスタンブロット分析の結果を示す。PCR産物の直接TAクローニングにより発現プラスミドpCR3.1に挿入される図２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆに記載されるキメラは、T7 RNAポリメラーゼが存在する組換えT7ワクシニアウイルス（vvT7-3）とともに哺乳類の宿主細胞株293に過渡的にトランスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞を増殖し、細胞タンパク質を抽出し、電気泳動し、ブロットし、プローブする。結果はNS3タンパク質をポリクローナル抗体でプローブするブロットを示す。レーンＤ、Ｅ及びＦは、それぞれ２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆに記載される構築物に対応し、レーン“−”は、ニセの293トランスフェクションされた細胞のコントロールを示す。レーンＤ及びＦは成熟NS3タンパク質（NS3）の存在を示し、他方ではS1165A突然変異を有する構築物を表すレーンＥは、予備的処理されたNS3（pre）の存在を示すが、いずれかの成熟NS3タンパク質を有するようには見えない。
【図５】  ウエスタンブロット分析の結果を示す。PCR産物の直接TAクローニングにより発現プラスミドpCR3.1に挿入される図２Ｇ、２Ｈ及び２Ｉに記載されるキメラは、T7 RNAポリメラーゼが存在する組換えT7ワクシニアウイルス（vvT7-3）とともに哺乳類の宿主細胞株293に過渡的にトランスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞を増殖し、細胞タンパク質を抽出し、電気泳動し、ブロットし、プローブする。
【図５Ａ】  NS3タンパク質をポリクローナル抗体でプローブしたブロットの結果を示す。レーンＧ、Ｈ及びＩは、それぞれ２Ｇ、２Ｈ及び２Ｉに記載される構築物に対応し、レーン“−”はニセの293トランスフェクションされた細胞のコントロールを示す。レーンＧ及びＩは成熟NS3タンパク質（NS3）の存在を示すが、他方ではS1165A突然変異を有する構築物を表すレーンＨは、いずれかの成熟NS3タンパク質を有するようには見えない。
【図５Ｂ】  NS4Aタンパク質をポリクローナル抗体でプローブしたブロットの結果を示す。レーンＧ、Ｈ及びＩは、それぞれ２Ｇ、２Ｈ及び２Ｉに記載される構築物に対応し、レーン“−”はニセの293トランスフェクションされた細胞のコントロールを示す。レーンＧ及びＩは成熟NS4Aタンパク質（NS4A）の存在を示すが、他方ではS1165A突然変異を有する構築物を表すレーンＨは、いずれかの成熟NS4Aを有するようには見えない。
【図５Ｃ】  NS5Aタンパク質をポリクローナル抗体でプローブしたウエスタンブロットの結果を示す。レーンＧ、Ｈ及びＩは、それぞれ構築物Ｇ、Ｈ及びＩに対応し、レーン“−”はニセの293トランスフェクションされた細胞のコントロールを示す。レーンＧは成熟NS5Aタンパク質（NS5A）の存在を示すが、他方ではS1165A突然変異を有する構築物を表すレーンＨは、いずれかの成熟NS5Aを有するようには見えない。同様に突然変異したNS5A/5B切断部位を有する構築物Ｉを表すレーンＩも、成熟NS5Aタンパク質を有するようには見えず、未処理のNS5A-tTA融合タンパク質は、約90kDaの産物として検出される。
【図６】  構築物ＡからＩの1つ及びpUHC13-3レポータープラスミドで同時トランスフェクションされた293細胞の抽出物で行ったルシフェラーゼアッセイの結果を示す。ルシフェラーゼ活性は1秒当たりのフォトン数の測定である。表示ＡからＩは、それぞれ図２Ａから２Ｉに記載される構築物に対応する。コントロールＢ、Ｅ及びＨはプロテアーゼ活性部位に欠陥があり、他方でコントロールＣ、Ｆ及びＩは欠陥のある切断部位を有する。このアッセイの結果は、ルシフェラーゼ活性が活性NS3プロテアーゼ及び機能的切断部位の両方に依存することを示す。さらに、結果は、構築物Ｇが構築物Ａ又はＤよりも大きなルシフェラーゼ活性を示すことを示す。これらの値は2つの実験の平均である。
【図７】  図６で示される値を用いて、構築物Ａ、Ｄ及びＧとそれぞれの活性部位突然変異体Ｂ、Ｅ及びＨとによって産生されるルシフェラーゼ活性の比を示す。結果は、Ｇ／Ｈの比がＡ／Ｂ及びＤ／Ｅよりも、それぞれ約9倍及び2倍大きいことを示す。全長NS3、NS4A、NS4B及びNS5A、及びNS5Bの一部を含むHCV非構造的領域の最も長いひと配列を有する構築物Ｇは、最も大きなNS3依存ルシフェラーゼ応答を生じる。結果は、n回の実験の平均である。
【図８】  テトラサイクリン応答性転写性トランス活性化因子におけるテトラサイクリンの効果を示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、テトラサイクリン応答性転写性トランス活性化因子のNS3プロセシングによって制御される。ルシフェラーゼアッセイは、構築物Ｇ又はＨ、又はポジティブコントロールtTA-産生性プラスミド（pUHD15-1）、及びルシフェラーゼレポーターを含むpUHC13-3プラスミドを同時トランスフェクションした293細胞の抽出物で行った。クローズドバー及びオープンバーは、それぞれテトラサイクリンの欠乏及び存在を示す。構築物Ｇは、テトラサイクリン制御シグナルを産生することに注意すべきであり、（構築物Ｈにおいて）NS3プロテアーゼ活性の不活性化は、このシグナルを無効にする。
【図９】  構築物ＡからＩの1つ及びpUHC13-3レポータープラスミドを同時トランスフェクションした肝細胞株WRL68の抽出物で行われるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。ルシフェラーゼ活性は、毎秒のフォトン数の測定である。コントロールＢ、Ｅ及びＨは、プロテアーゼ活性部位において欠陥がある。コントロールＣ、Ｆ及びＩは、欠陥のある切断部位を有し、このため機能的（切断する）NS3プロテアーゼ切断部位を有さない。このアッセイの結果は、ルシフェラーゼ活性が活性NS3プロテアーゼ及び機能的切断部位の両方に依存することを示す。さらに、この結果は、構築物Ｇが構築物Ａ又はＤよりも大きなルシフェラーゼ活性を示すことを示す。
【図１０】  構築物Ａ、Ｄ及びＧとそれぞれの活性部位突然変異体Ｂ、Ｅ及びＨとによって産生されるルシフェラーゼ活性の比を示す。ルシフェラーゼアッセイは、構築物Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＨの1つ及びレポータープラスミドpUHC13-3を同時トランスフェクションした肝細胞株WRL68の抽出物で行った。ルシフェラーゼ活性は、毎秒のフォトン数の測定である。結果は、Ｇ／Ｈの比がＡ／Ｂ及びＤ／Ｅの比の、それぞれ約5倍及び3.5倍大きいことを示す。また、部分又は全長NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bを含むHCV非構造領域の最も長いひと配列を有する構築物Ｇは、WRL68細胞株の最も大きなNS3依存ルシフェラーゼ応答を産生するようにみえる。
【図１１】  293細胞株を形質転換するためのプラスミドDNAの量の最適化の結果を示す。異なる量の構築物Ｇ又は対応する欠陥のあるNS3コントロール構築物ＨのDNAは、pUHC13-3の一定量（0.2μg）と同時トランスフェクションした。50％コンフルエンシーで6ウェルプレートの細胞を使用した。結果は、pUHC13-3（0.2μg）よりも約3倍多いNS3コードプラスミドDNAの量（0.6μg）が293細胞において最適なNS3依存ルシフェラーゼシグナルを産生することを示す。
【図１２】  肝細胞株WRL68を形質転換するためのプラスミドDNAの量の最適化の結果を示す。異なる量の構築物Ｇ又は対応する欠陥のあるNS3コントロール構築物ＨのDNAは、pUHC13-3の一定量（0.2μg）と同時トランスフェクションした。結果は、pUHC13-3（0.2μg）よりも約2.5倍多い量（0.6μg）が肝細胞株WRL68において最適なNS3依存ルシフェラーゼシグナルを産生することを示す。
【図１３】  構築物Ｉから発現されるNS3タンパク質が293細胞において、“トランス”のHCV非構造ポリタンパク質を切断できることを示す。実験は、pUHC13-3レポーターと構築物Ｇ、Ｈ又はＩの1つを同時トランスフェクションすることを意味する。また、構築物Ｈ及びＩは、pUHC13-3レポータープラスミドと一緒に同時トランスフェクションされる。構築物Ｇとレポーターとのトランスフェクションのみが、強いルシフェラーゼ活性シグナルを生じるのに対して、構築物Ｈとレポーター（NS3プロテアーゼ活性部位突然変異体）又は構築物Ｉとレポーター（切断部位突然変異体）のトランスフェクションは、弱いルシフェラーゼ活性を生じる。レポータープラスミドと一緒に構築物Ｈ及びＩとの三重同時トランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性シグナルを回復する。構築物Ｉから発現される機能的NS3タンパク質は、構築物Ｈから発現される無修飾切断部位を処理でき、それによってテトラサイクリンオペロンのルシフェラーゼの発現を開始するテトラサイクリントランス活性化因子を放出する。トランスフェクションで使用されるプラスミドDNAの異なる量は、示される通りである。
【図１４】  肝細胞株WRL68を用いた図１３と同様の実験の結果を示す。同様に、結果は、構築物Ｉから産生されるNS3タンパク質がWRL68細胞において、“トランス”のHCV非構造ポリタンパク質を切断できることを示す。示されるように、異なる量のプラスミドDNAはトランスフェクションで使用される。
【図１５】  黒四角：構築物Ｇ及び分泌アルカリ性ホスファターゼ（SEAP）を発現するpUHC13-3レポータープラスミドを同時トランスフェクションされた宿主細胞におけるSEAP発現のtTAトランス活性化因子のHCV NS3プロテアーゼ活性の％阻害を示す。白四角：コントロールpUHD15-1及びpUHC13-3プラスミドを同時トランスフェクションされた宿主細胞においてトランス活性化SEAPのコントロールtTA（HCV NS3とは無関係）活性の％阻害を示す。細胞は、種々の濃度の阻害剤Ａの存在下でトランスフェクション後に増殖した。SEAP活性を測定し、EC50及びTC50値を決定した。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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