(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化銀粉末を、アンモニア水、濃塩酸、アルカリ性シアン化物水溶液、チオ硫酸塩水溶液及び炭酸アンモニウム水溶液から選ばれる水系溶媒に溶解し、超音波照射下に、メタノール、エタノール、メチルセロソルブ及びブチルセロソルブから選ばれる有機溶媒を添加して析出させた微細塩化銀粉末と、銀ペーストを混練して得られた銀・塩化銀ペーストインクを用いて多孔質担体に印刷することにより得られる銀・塩化銀電極。
【請求項２】
請求項１記載の銀・塩化銀電極を有する電極部とクロマトグラフィーマトリックス部から構成され、検体溶液中の分析対象物質を検出及び定量するためのセンサーであって、クロマトグラフィーマトリックス部が、（ａ）一個又は複数個の試料添加部位、（ｂ）該試料添加部位の下流に接触して位置し、分析対象物質と親和性を有する酵素標識された特異結合物質を移動可能に保持した特異反応部位、（ｃ）該特異反応部位の下流に接触して位置し、分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質を固定化した競合反応部位、（ｄ）該競合反応部位の下流に接触して位置し、前記標識酵素に対する基質を移動可能に保持した酵素反応部位、からなる電気化学的バイオセンサー。
【請求項３】
シート状に成形したものである請求項２記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項４】
電極部が、前記酵素反応部位あるいはその下流に接触して位置し、多孔質担体に印刷配置されたものであって、前記電極部を構成する作用電極、対電極及び参照電極のうち、参照電極が請求項１記載の銀・塩化銀電極である請求項３記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項５】
電極部が酵素反応部位にある請求項４記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項６】
クロマトグラフィーマトリックス部分が純セルロースクロマトグラフィーペーパーからなるものである請求項４又は５記載の電気化学的バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は酵素センサー、免疫センサー等のバイオセンサーに用いることのできる電極及び当該電極を用いた電気化学的バイオセンサーに関する。
背景技術
酵素センサー、免疫センサー等のバイオセンサーは、血液や尿等の体液中に含まれる微量成分を簡易迅速に検出・定量する手段として有用であり、特に在宅医療及び地域医療の充実に伴ない、家庭内や臨床検査の専門家がいない地域診療の場においての臨床診断が重要視されている今日においては、使用方法が簡単で且つ小型で使い捨てのできる簡易測定キットの開発が望まれている。
斯かる状況の下、電気化学的な測定法を用いたバイオセンサーにおいては、小型で使い捨て可能な電極の開発がなされ、絶縁体等にカーボン又はグラファイトの微粒子を含むゾル／ゲル状の材料（Ｗａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，１１７１−１１７５等）や市販のカーボンペーストインク等を印刷した印刷電極が開発されている。また、電気化学的バイオセンサーの参照電極としては、一般に銀・塩化銀電極が使用される場合が多く、斯かる電極を印刷により作製する方法としては、銀ペーストインクで印刷した後塩化銀層を塩酸中で電析する方法、銀の上に塩化第二鉄を反応させ塩化銀層を作製する方法、塩化銀を主体とする層を塗工により作製する方法（特開平８−９４５７３）、更には銀粉末と塩化銀末を予め混合しプレスして作製する方法（特開昭６２−４３５５６）或いは銀粉末と塩化銀末を高分子のバインダーで混合し塗布して作製する方法（特開平２−９００５２）等が知られている。
しかし、銀上に後から塩化銀層を塗布する方法は、操作が煩雑で塩化銀層が物理的に破損しやすい等の欠点があり、また、銀粉末と塩化銀末を予め混合する方法においては、電極の内部抵抗が大きくなったり、銀粉末と塩化銀末が均一でなかったり、これらの粒子径が大きいためスクリーンプリントで目詰まりを起す等の問題が生じていた。
発明の開示
本発明の目的は、極めて簡単に作製でき、且つ均質で電導率のよい銀・塩化銀電極及び当該電極を用いた電気化学的バイオセンサーを提供することにある。
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、可溶化させた塩化銀を超音波照射下で析出させることにより得られる微細塩化銀粉末を用いて作製した銀・塩化銀電極が、優れた均質性及び電導性を有し、当該電極を用いることにより、小型で使い捨て可能なバイオセンサーが安価で容易に作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、塩化銀粉末を水系溶媒に溶解し、超音波照射下に有機溶媒を添加して析出させた微細塩化銀粉末と、銀ペーストを混練して得られた銀・塩化銀ペーストインクを用いて印刷することにより得られる銀・塩化銀電極を提供するものである。
また本発明は、当該銀・塩化銀電極を電極部に有する電気化学的バイオセンサーを提供するものである。
また本発明は、クロマトグラフィーマトリックス部分と電極部分から構成される検体溶液中の分析対象物質を検出及び定量するためのセンサーであって、そのクロマトグラフィーマトリックス部分が、（ａ）一個又は複数個の試料添加部位、（ｂ）試料添加部位の下流に接触して位置し、分析対象物と親和性を有する酵素標識された特異結合物質を移動可能に保持した特異反応部位、（ｃ）該特異反応部位の下流に接触して位置し、分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質を固定化した競合反応部位、（ｄ）該競合反応部位の下流に接触して位置し、前記標識酵素に対する基質を移動可能に保持した酵素反応部位からなり、電極部分が、該酵素反応部位あるいはその下流に接触して位置し、作用電極、対電極及び参照電極が多孔質担体に印刷配置されたものであるシート状電気化学的バイオセンサーを提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の銀・塩化銀電極は、塩化銀粉末を水系溶媒に溶解し、超音波照射下に有機溶媒を添加して析出させた微細塩化銀粉末と、銀ペーストを混練して得られた銀・塩化銀ペーストインクを用いて印刷することにより作製できる。以下（１）〜（４）にその詳細を説明する。
（１）水系溶媒への溶解
溶解は、塩化銀粉末を水系溶媒中に添加攪拌することにより行われる。
ここで、水系溶媒とは、塩化銀を溶解するものであれば特に限定されるものではないが、例えばアンモニア水、濃塩酸、アルカリ性シアン化物水溶液、チオ硫酸塩水溶液、炭酸アンモニウム水溶液等が挙げられ、好ましくは、アンモニア水である。
また、溶解は、通常３０〜５０℃で攪拌することで効率よく行うことができる。
（２）微細粉末化
微細粉末化は、超音波の照射下、塩化銀溶液に有機溶媒を添加することにより行なわれる。
超音波は、通常２０ＫＨｚ以上、特に塩化銀粉末の均質性の観点から、２８ＫＨｚ〜４２ＫＨｚで照射することが好ましい。また、超音波照射には、超音波を任意の容器に照射可能とする超音波浴、例えば超音波洗浄器等を用いることができる。
ここで用いられる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、メチルセロソルブ、ブチルセロソルブなど水系溶媒に溶解する有機溶媒ならいずれでも使用可能であるが特にメタノールが好ましい。
斯かる有機溶媒の添加量は、溶媒によって異なるが沈渣が有効に生成する量比の添加が必要で、例えば２倍〜１０倍程度が好ましい。添加はゆっくり行うことが好ましく、例えば全量に対して１秒あたりその１００分の１量を添加する程度の速度で行うことができる。
また、得られた沈渣は必要に応じて▲１▼静置、▲２▼上清除去、▲３▼有機溶媒添加の操作を繰り返して洗浄・溶媒転換を行い、懸濁液のまま銀ペーストインクに混練することができる。▲１▼静置の操作は、塩化銀微粉末が固化しない程度の強度で遠心分離で代替えすることができる。この場合の遠心力は５０×ｇ〜３００×ｇの範囲で設定可能だが１００×ｇ程度で数１０秒から１分程度の遠心操作が好ましい。▲３▼有機溶媒再添加の操作においては微細粉末化及び洗浄の効果向上の目的で超音波浴中での添加が望ましい。この有機溶媒添加操作の過程で微細粉末化に使用した溶媒から銀・塩化銀ペーストへの混合に都合の良い溶媒に転換することができる。例えばメタノールでの洗浄からペーストインクを構成する溶媒に転換して洗浄することができ、望ましくはメチルセルロソルブ、ブチルセロソルブ、酢酸メチルセロソルブ、酢酸ブチルセロソルブ、イソホロン、ブチルカルビトールアセテートなどを使用することができる。
また、▲１▼静置〜▲３▼有機溶媒添加の操作は、数回、例えば２〜８回、好ましくは５回程度繰り返し、▲２▼上清除去したものを使用するのが、溶媒を転換する上で好ましい。
（３）銀・塩化銀ペーストの製造
微細塩化銀粉末を、銀ペースト例えばポリエステル樹脂をバインダーとした一液性のポリマー型銀ペースト（例えば銀ペーストＬＳ−４１１（ＡＳＡＨＩ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ社製）等）中に混練し、印刷用の銀・塩化銀ペーストとすることができる。
微細塩化銀粉末の配合比は、重量比で銀・塩化銀ペーストの０．１％〜４０％であり、好ましくは０．２％〜２０％である。
得られた銀・塩化銀ペーストインクは、均質性がよく３００メッシュ程度のスクリーンを用いたスクリーンプリントでも目詰まりすることなく印刷することが可能となる。
（４）電極の印刷
銀・塩化銀ペーストインクを用いた電極の印刷は、電子工学分野においてよく知られている任意の方法を用いることができ、具体的には、ポリエステル繊維やステンレスのスクリーンメッシュに電極図形パターンを光感光技術で形成し、これを原版として印刷するスクリーン方式又はＸＹ２軸方向に可動可能なノズル若しくは印刷物固定台を利用し、電極図案パターンに沿ってペーストインクを空気圧等で吐出しながら印刷するインクジェット方式又はディスペンス方式等を利用することができる。
かくして得られた銀・塩化銀電極は、酵素センサー、免疫センサー等のバイオセンサーにおける電極部の電極、特に参照電極として使用することができる。例えば、分析対象物質を検体溶液から分離展開するクロマトグラフィーマトリックス部と電極部とから構成される免疫センサーに代表される電気化学的バイオセンサーの電極部に応用することが考えられ、装置全体の小型化を可能にする。
更に、本発明は、銀・塩化銀電極を用いた電気化学的バイオセンサーを提供するものである。以下にその内容を説明する。
即ち、本発明の電気化学的バイオセンサーは、検体溶液中の分析対象物質を検出及び定量するためのセンサーであって、そのクロマトグラフィーマトリックス部が、（ａ）一個又は複数個の試料添加部位、（ｂ）該試料添加部位の下流に接触して位置し、分析対象物質と親和性を有する酵素標識された特異結合物質を移動可能に保持した特異反応部位、（ｃ）該特異反応部位の下流に接触して位置し、分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質を固定化した競合反応部位、（ｄ）該競合反応部位の下流に接触して位置し、前記標識酵素に対する基質を移動可能に保持した酵素反応部位からなり、電極部が、該酵素反応部位あるいはその下流に接触して位置し、印刷配置されたものである。
ここでいう分析対象物質とは、例えばペプチド、タンパク質、複合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、ホルモン類、核酸類等の生体関連物質を意味し、更に具体的には、例えば卵胞刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、胎盤性ゴナドトロピン、甲状腺ホルモン、プロゲステロン、エストラジオール等のホルモン類、リポ蛋白、アポリポ蛋白、アルブミン、ヘモグロビン等の生体微量成分等が挙げられる。
検体溶液とは、斯かる生体関連物質を含む液体、主に血液、血漿、血清、唾液、尿等の生物由来の液体試料をいうが、粘液、体組織あるいは細胞等の固形を、緩衝液等の液体に懸濁もしくは溶解させたものであってもよい。
本発明の電気化学的バイオセンサーは、基本的に免疫反応を行うクロマトグラフィーマトリックス部である（ａ）〜（ｄ）と、電極部から構成されるものであるが、ここで、クロマトグラフィーマトリックス部は多孔質担体より構成される。
多孔質担体は、検体溶液を毛細管現象により移行させるための媒体として機能するものであれば特に限定されず、この様な素材としては、例えばセルロース膜（ろ紙）、ガラス繊維ろ紙（例えば、ＧＦ／Ａ，Ｗｈａｔｍａｎ製）、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリスチレン・ポリエステル等のプラスチック繊維による不織布やスポンジ様の多孔質素材等を用いることができる。多孔性部分の寸法は特に制限ないが、本センサーで１個の多孔性部分を使用する場合、幅２ｍｍ〜１０ｍｍ、長さ３０ｍｍ〜１５０ｍｍ、厚さ２０μｍ〜１０００μｍのものを用いることができる。
試料添加部位（ａ）は、短い多孔質部分を複数個用いて構成されていてもよく、この場合には検体溶液が毛細管現象により上流から下流に移動可能な様に互いに接触状態で配置すればよい（なお、「上流」及び「下流」とは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて検体溶液が多孔性部分を移動する方向を意味する）。
また、試料添加部位（ａ）においては、必要に応じてＴｒｉｓ緩衝剤、ジエタノール緩衝剤、リン酸緩衝剤等のｐＨ緩衝剤又は非特異的結合を阻止する目的でゼラチン、牛血清アルブミン、カゼイン等の蛋白質や任意の界面活性剤を塗布することができる。
特異反応部位（ｂ）は、分析対象物質と親和性を有する酵素標識された特異結合物質を移動可能な状態で保持し、検体溶液中の分析対象物質と標識された特異結合物質との反応の場を提供する場である。
特異結合物質は、該分析対象物質と特異的に反応する物質であって、例えば、任意の抗原に対する抗体、任意の核酸に対する相補的な核酸、種々の生理活性物質に対するレセプター等を挙げることができるが、好ましくは任意の抗原に対する抗体である。
また、特異結合物質に導入する標識酵素としては、基質と組み合わせることにより電気化学的信号を発生できる酸化還元酵素であれば特に限定されず、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ホースデッシュパーオキシダーゼ等のオキシダーゼ類やデヒドロゲナーゼ類を用いることができる。また、これらの酵素を特異結合物質に導入する方法は汎用されている任意の方法を用いることができる。
当該酵素標識された特異結合物質は、該溶液を多孔質担体に含浸させ、凍結乾燥、陰圧乾燥、送風乾燥、自然乾燥等の任意の手段に付すことにより、移動可能な状態で保持することができる。
競合反応部位（ｃ）は、分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質を固定化し、上流から移動してきた検体溶液中の分析対象物質と酵素標識された特異結合物質との反応混合物（分析対象物質と酵素標識された特異結合物質との反応生成物である複合体、及び未反応の酵素標識された特異結合物質）のうち、未反応の酵素標識された特異結合物質が捕獲、除去される。
ここで、分析対象物質と同様な反応性を有する物質とは、分析対象物質自体、特異結合物質と反応する部分を残してこれを断片化した物質、特異結合物質と結合可能な類似の構造を持つ物質、分析対象物質を熱・試薬・ｐＨなどの手段で変性させた物質、タンパク質・ペプチド・核酸などの場合その構成単位であるアミノ酸や核酸塩基の配列が近似したもの又は人工的に変化させた物質等が挙げられ、好ましくは分析対象物質である。
分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質の固定化は、特に限定されないが、一般的には多孔性部分を分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質の溶液に一定時間浸漬させた後、多量の緩衝液又は洗浄液、例えば一般的なｐＨ緩衝液又はこれらにＴｗｅｅｎ  ２０等の界面活性剤を加えたものによって濯ぎ・洗浄し、乾燥することにより行うことができる。また、固定化する分析対象物質又は分析対象物質と同様な反応性を有する物質がタンパク質の場合は、脱離する可能性があるため共有結合により固定化するのが好ましい。その一例として、ジアゾ化ろ紙又はＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅ  ＡＢＣ（Ｐａｌｌ社製）等を用いることができる。
酵素反応部位（ｄ）は、前記標識用酵素と反応して信号を発生する基質を移動可能な状態で保持し、当該基質が上流から移動してきた分析対象物質と酵素標識された特異結合物質との複合体と反応し電気化学的信号発生物質を生成する。
基質としては、標識酵素により適宜選択され、例えばアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼを始めとするオキシダーゼ類、デヒドロゲナーゼ類を酵素として使用した場合、それぞれｐ−アミノフェニルフォスフェート、水素供与体及び過酸化水素、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、還元体としてのグルコース等の基質及び酸素、水素供与体等の基質及びＮＡＤ＋を適宜組み合わせて利用することができる。
これらの基質の保持は酵素標識された特異結合物質の場合と同様に多孔性部分に基質溶液を含浸させ凍結乾燥、陰圧乾燥、送風乾燥等の手法で行うことができる。
電極部は、酵素反応部位（ｄ）で生成した電気化学的信号発生物質の信号を電気化学的に測定する部位であり、作用電極、対電極及び参照電極の三つの印刷電極よりなる。当該電極は、酵素反応部位（ｄ）或いはその下流に接触して位置し、多孔質担体に印刷配置され、毛細管現象によりクロマトグラフィーマトリックス内を浸透、移動してきた反応液と接触する。
電極は、作用電極及び対電極にはカーボンペーストインク、参照電極には銀・塩化銀ペーストインクが用いられ、印刷して作製される。ここで、用いられる銀・塩化銀電極としては、電導性がよく、参照電極として安定して使用できるもであれば特に限定されるものではないが、電導性及び簡便性等を考慮すれば、上述したような、塩化銀粉末を水系溶媒に溶解し、超音波照射下に有機溶媒を添加して析出させた微細塩化銀粉末と、銀ペーストを混練して得られた銀・塩化銀ペーストインクを用いて印刷されたものが好ましい。特に濾紙等の多孔質担体に銀・塩化銀電極を印刷配置する場合には、銀ペースト印刷後に塩化銀層を作製する方法は適用できず、予め銀・塩化銀粉末を混練したペーストを用いることが好ましい。また、多孔質担体に適合するように均質性及び電導性に優れた銀・塩化銀ペーストを用いることが好ましい。
尚、カーボンペーストインクはポリエステル樹脂をバインダーとした一液性のポリマー型カーボンペースト、例えばＦＴＵ−６０（ＡＳＡＨＩ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ社製）を使用することができる。
このように、多孔質担体上に電極部を配置することから、この領域に移動してきた検体溶液の下流への移動を止める絶縁部分を設けることが必要となる。ここでいう絶縁部分とは電気的に電導性がないものであって且つ水溶液の進入を防ぐものをいうが、当該絶縁部分は、コーティング剤、絶縁性塗料や接着剤等の各種プラスチックの有機溶媒溶液等を塗布浸透させ固化させることにより作製できる。
斯かる三つの電極は、外部と接触可能な状態にあり、電気化学測定用ポテンショスタット装置又はこれと同等の一定電圧を発生可能な定電圧装置で印加できるようにされ、発生する電流がアンペロメトリーによって測定される。
尚、当該電気化学的バイオセンサーは、蒸発防止、強度補強、遮光等の目的で、試料添加部位又はその一部及び測定装置との接続部分を残して透明ないしは不透明なプラスチックフィルム等でカバーすることができる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１  銀・塩化銀電極の作製と評価
（１）銀・塩化銀ペーストの作製
塩化銀（片山化学工業）１０ｇを濃アンモニア水（２８％、和光純薬）７０ｍＬに懸濁し３０℃湯浴中で撹拌して溶解した。塩化銀溶液を超音波槽に移し、約３０ＫＨｚの超音波照射下でメタノール１４０ｍＬを徐々に滴下して塩化銀の微細な粉末を析出させた。撹拌後５分静置し上清を吸引除去し沈渣にメタノール１５０ｍＬを加え沈渣を洗浄した。同様の操作を５回繰り返しアンモニアを除いた後ブチルセロソルブを用いてメタノールと同様に沈渣の洗浄操作を行った。最終的にブチルセロソルブ中の懸濁物として約６７０ｍｇの塩化銀微粉末を得た。この塩化銀微粉末懸濁液を銀ペーストインクＬＳ−４１１（アサヒ化学研究所）に対し２０から０．２５％の比率で混合し均一になるように練り合わせた。
（２）印刷参照電極の評価
前項で作製した銀・塩化銀参照電極を評価するために市販の参照電極と比較した。
（１）で作製した各混合比の電極用銀・塩化銀ペーストを用いて３０５メッシュ及び１２０メッシュのスクリーンを用いてスクリーン印刷して印刷参照電極を作製した。測定装置への接続部と電極部の間にフッ素樹脂のコーティング剤（ＣＴ−３００−２、アサヒ科学研究所）をライン状に塗布し、陰圧下で乾燥して絶縁部分を設けた。
基準電極とするＢＡＳ社製参照電極（ＲＥ−１Ｂ）と、銀・塩化銀ペーストのみを印刷した電極パッドを塩化銀粉末少量を飽和ＫＣｌ溶液に加えた試験電極液に浸漬し、ＲＥ−１Ｂを２６３Ａポテンショスタット装置（ＥＧ＆Ｇ）の参照電極側に、銀・塩化銀電極を作用電極側に接続して電極間の電位差を測定した。結果を表１及び２に示す。
0004695316.tif 000002
0004695316.tif 000003
表１，２のようにいずれの電極でも測定開始初期には電位差−１０ｍＶと小さな電位差を示しほとんど差が無かった。また、混合比が低いもので計測時間が長くなると電位差が広がる傾向が見られたが、２０分後でも電位差は−１５ｍＶ以内とその差は小さく市販の実験用参照電極とほぼ同様の性能を示した。特に本発明では迅速な測定に必要充分の性能を示す参照電極が望まれるが、この印刷参照電極は予定する使用方法の範囲でも実用上問題無く使用可能であることが分かった。
（３）印刷電極での電気化学的測定による参照電極の評価
純セルロースクロマトグラフィペーパー３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を印刷基板として用いた。カーボンペーストインクＦＴＵ−６０（アサヒ化学研究所）を用いて図１に示したように作用電極及び対電極をスクリーン印刷した。これを１２０℃、３０分間陰圧下で乾燥固化した。これに各混合比の銀・塩化銀ペーストインクを用いて図１に示すような配置で参照電極をスクリーン印刷した後同様に１２０℃、３０分間陰圧下で乾燥固化した。続いて、作用電極の先端から１０ｍｍの位置にフッ素樹脂のコーティング剤（ＣＴ−３００−２、アサヒ科学研究所）をライン状に塗布し陰圧下で乾燥して絶縁部分を設けた。最終的に印刷３電極を含む１０ｍｍ×３０ｍｍ部分を切り出し印刷電極とした。２６３Ａポテンショスタット装置（ＥＧ＆Ｇ）の測定端子に対応するそれぞれの電極をつなぎ、電気化学測定用ソフトウェアＭｏｄｅｌ  ２７０／２５０を用いてＣｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＣＡ）、Ｃｙｃｌｉｃ  Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ（ＣＶ）によって電気化学測定を行った。電気化学的活性物質ｐ−アミノフェノール０．５ｍＭ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ塩化カリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）６０μＬを電極部に添加して電流値（μＡ）を計測した。ＣＡでは測定開始後６０秒の電流値、ＣＶでは０から３００ｍＶの電流値（μＣ）を測定した。結果を表３に示す。
0004695316.tif 000004
表３に示したように塩化銀の混合比いずれにおいてもほぼ同様の測定結果となり適正に測定できた。
実施例２
本発明による電気化学的バイオセンサーを作製し、それを用いて試料中のヒト血清アルブミンを測定した。
（１）試料添加部の作製
コンジュゲートパッド（５０×１００ｍｍ）を２％（ｗ／ｖ）ブロックエース（大日本製薬（株））を含むＰＢＳ溶液に浸漬し１０分間振盪処理した。これを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で５分間３回振盪洗浄し真空乾燥器中で乾燥した。最終的には１０ｍｍ×２０ｍｍの大きさになるように切断し絶縁体ベース上に配置して使用する。
（２）酵素標識抗体パッドの作製
酵素標識特異結合物質としてはβ−ガラクトシダーゼ標識した抗ヒト血清アルブミン抗体を用いた。標識用抗体はアメリカンコーレックス社のβ−ガラクトシダーゼ標識抗アルブミンヤギ抗体（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を用いた。コンジュゲートパッド（５０×１００ｍｍ）を２％（ｗ／ｖ）ブロックエース（大日本製薬（株））を含むＰＢＳ溶液に浸漬し１０分間振盪処理した。これを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で５分間３回振盪洗浄し真空乾燥器中で乾燥した。このパッドを０．２％（ｗ／ｖ）ブロックエース１０μｇ／ｍＬの濃度に調製した標識抗体を含むＰＢＳ溶液４ｍＬ中に浸漬しこの液を保持したまま液体窒素に投入して急速冷凍した後凍結乾燥した。最終的には１０ｍｍ×２０ｍｍの大きさになるように切断し絶縁体ベース上試料添加部の下流側に配置して使用する。（３）ヒト血清アルブミン膜の作製
多孔性ナイロン膜Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ  ＡＢＣ（Ｐａｌｌ社）（５０×１００ｍｍ）をヒト血清アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）１ｍｇ／ｍＬを含むＰＢＳ溶液１０ｍＬ中で１時間振盪反応させた。これを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で５分間３回振盪洗浄し真空乾燥器中で乾燥した。さらに、２％（ｗ／ｖ）ブロックエース（大日本製薬（株））を含むＰＢＳ溶液に浸漬し１０分間振盪処理した後真空乾燥器中で乾燥した。最終的には１０ｍｍ×１０ｍｍの大きさになるように切断し絶縁体ベース上酵素標識抗体パッドの下流側に配置して使用する。
（４）基質パッドの作製
純セルロースクロマトィーペーパー３１ＥＴＣｈｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）（５０×１０ｍｍ）を５ｍＭｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬ中に浸漬しこの液を保持したまま液体窒素に投入して急速冷凍した後凍結乾燥した。最終的には１０ｍｍ×１０ｍｍの大きさになるように切断し絶縁体ベース上ヒト血清アルブミン膜の下流側に配置して使用する。
（５）参照電極用銀・塩化銀ペーストの作製
実施例１（１）と同様にして銀・塩化銀ペーストインクを作製した。
（６）電極パッドの作製
純セルロースクロマトグラフィーペーパー３１ＥＴＣｈｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を印刷基板として用いた。カーボンペーストインクＦＴＵ−６０（アサヒ化学研究所）を用いて図１に示したように作用電極及び対電極をスクリーン印刷した。これを１２０℃、３０分間陰圧下で乾燥固化した。これに銀・塩化銀ペーストインクを用いて図１に示すような配置で参照電極をスクリーン印刷した後同様に１２０℃、３０分間陰圧下で乾燥固化した。続いて、作用電極の先端から１０ｍｍの位置にポリエステル樹脂のコーティング剤（ＣＴ−３００−２、アサヒ科学研究所）をライン状に塗布し陰圧下で乾燥して絶縁部分を設けた。最終的に印刷３電極を含む１０ｍｍ×３０ｍｍ部分を切り出し電極パッドとして基質パッドの下流側に配置して使用する。
（７）ヒト血清アルブミンの測定
上記のようにして作製した各パーツはそれぞれ互いにその１部を接触した形でプラスチック製絶縁体上に図１のように配置し接着した。電極パッドの接点部分を介してカーボン線の内作用電極を２６３Ａポテンショスタット装置（ＥＧ＆Ｇ）の作用極端子に、もう一方のカーボン線の対電極を対極端子に、銀・塩化銀電極参照電極側を参照極端子に接続した。さらに、この２６３Ａポテンショスタット装置からＧＰＩＢラインを通じてコンピュータに接続し電気化学測定用ソフトウェアＭｏｄｅｌ  ２７０／２５０で計測およびデータ解析を行った。測定には作用電極の電位を参照電極に対して３００ｍＶに設定しクロノアンペロメトリーで測定した。
０．２％ブロックエースを含むＰＢＳ溶液中にヒト血清アルブミンを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含む試料溶液３００μＬを試料添加部に添加して順次下流側に展開させ電流値の継時変化を測定し測定開始から１分後の電流値を記録した。結果を表４に示す。
0004695316.tif 000005
表４に示すように、電流値はアルブミン濃度に依存して高くなり本発明の装置によって試料中の血清アルブミン濃度の定量を簡便、迅速に行えることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明の銀・塩化銀電極は、均質性が高く電導率が優れるという性質を有し、簡易に且つスクリーン印刷法においても目詰まりなく作製することができる。また、当該銀・塩化銀電極を利用した本発明の電気化学的バイオセンサーは、分析対象物質を迅速且つ正確に検出及び定量することができると共に、その形態を小型で且つ使い捨て可能とすることができる。従って、簡易測定キットとして家庭内、緊急医療現場、ベッドサイド、地域診療等幅広い分野で使用できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の電気化学的バイオセンサーの模式図である。図中の符号は次のとおりである。
１：試料添加部位
２：特異反応部位
３：競合反応部位
４：酵素反応部位
５：絶縁部分
６：測定装置との接続部
７：電極部
ａ：対電極
ｂ：作用電極
ｃ：参照電極
【図１】
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