(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトHsp70タンパク質、又はそのC末端フラグメントの腫瘍疾患又は癌疾患治療におけるNK細胞の活性化用の薬剤学的組成物、医薬的生成物又は医薬的アジュバンドの生成のための使用であって、前記フラグメントがHsp70タンパク質のアミノ酸454-460（NLLGRFE）を含む使用。
【請求項２】
前記Hsp70タンパク質又はフラグメントは組換えタンパク質である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記活性化が、NK細胞により仲介される免疫反応の誘発を含む、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
前記活性化が、NK細胞増殖の刺激及び／又はNK細胞の細胞溶解活性の増加を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
腫瘍細胞に対する前記細胞溶解活性が増加される請求項4に記載の使用。
【請求項６】
白血病細胞、リンパ腫細胞、腫瘍細胞、又は固体腫瘍の転移細胞に対する前記細胞溶解活性が増加される請求項5に記載の使用。
【請求項７】
サイトカインが更に使用される請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
インターロイキンがサイトカインとして使用される請求項7に記載の使用。
【請求項９】
IL-2、IL-12及び／又はIL-15がインターロイキンとして使用される請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
生理学的細胞懸濁液をNK細胞を含むヒトHsp70タンパク質、又はそのC末端フラグメントと混合し、かつ、インキュベートして、NK細胞の活性化を誘因するNK細胞のエクスビボ又はインビトロ活性化方法であって、前記フラグメントがHsp70タンパク質のアミノ酸454-460（NLLGRFE）を含む方法。
【請求項１１】
前記活性化はNK細胞の増殖刺激及び／又はその細胞溶解性の増加を含む請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
末梢、単核血液細胞又はNK細胞を含むフラクションがNK細胞を含む生理学的細胞懸濁液として使用される請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞懸濁液が、細胞表面にHsp70を発現するヒト又は動物細胞を更に含む請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍細胞が、ヒト又は動物細胞として使用される請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
白血病細胞、リンパ腫細胞、腫瘍細胞、固体腫瘍の転移細胞及びウイルス性、真菌性及び／又は細菌性感染症患者の細胞が、ヒト又は動物細胞として使用される請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞及びタンパク質を含む前記生理学的細胞懸濁液は、少なくとも3時間インキュベートされる請求項10から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベーションは4日間行われる請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
サイトカインが更に使用される請求項10から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
インターロイキンがサイトカインとして使用される請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
IL-2、IL-12及び／又はIL-15がインターロイキンとして使用される請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍は固体腫又は転移性である請求項1から9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記癌が白血病又はリンパ腫である請求項1から9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
ヒトHsp70タンパク質のC末端フラグメント及び／又は請求項10から20のいずれか一項により活性化された治療的有効量のNK細胞、更に、担体物質及び／又はアジュバントを含み、前記フラグメントがヒトHsp70タンパク質のアミノ酸454-460（NLLGRFE）を含む、薬剤学的調製物、医薬的生成物又は医薬的アジュバント。
【請求項２４】
前記タンパク質は少なくとも10μg/mlの濃度で存在する請求項23に記載の薬剤学的調製物、医薬的生成物又は医薬的アジュバント。
【請求項２５】
前記タンパク質は1000μg/ml以下の濃度で存在する請求項24に記載の薬剤学的調製物、医薬的生成物又は医薬的アジュバント。
【請求項２６】
前記Hsp70タンパク質、そのフラグメントは、組換えタンパク質である請求項23から25のいずれか一項に記載の薬剤学的調製物、医薬的生成物又は医薬的アジュバント。
【請求項２７】
前記Hsp70タンパク質は、ヒトHsp70のC末端フラグメント(アミノ酸384から561)を含む請求項9、21又は22に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、NK細胞の活性化のためのHsp70タンパク質又はそのフラグメントの使用、Hsp70タンパク質若しくはそのフラグメント、又は活性化されたNK細胞を含む薬剤学的調製物、医薬的生成物又は医薬的アジュバント、NK細胞の活性化方法、更に、本発明の方法により得られた生成物の医薬的使用に関する。
【０００２】
シャペロンは、多くの基本的な細胞内過程において必要とされる。特に、細胞ストレスを中和することで知られている。シャペロンの内もっとも解析されているのは、分子量が70kDaである熱ショックタンパク質(HSP)群である(Multhoffら、Cell Stress & Chaperones 1 (3) (1996)、167)。これらのタンパク質は、進化過程において高率で保存されている。それらは、細胞内の折り畳まれていないポリペプチド又は間違って折り畳まれたポリペプチドへ結合し、それらを安定化し、その結果それらの重合を阻害するか、又はトランスメンブラン転位を可能にする。Hsp70は、核内、細胞質ゾル内及び特定の腫瘍細胞の細胞表面に位置する。細胞内でのそのシャペロンとしての役割以外に、Hsp70ファミリーのメンバーは、免疫系の刺激、例えば、病原体の存在による炎症過程に関する役割、及び、インビボ及びインビトロ細胞内抗腫瘍免疫反応に関する役割を担っているようである。従って、熱ショックタンパク質の治療的使用の範囲は、従来技術において示されている。WO 97/10000には、熱ショックタンパク質及び非共役結合でこのタンパク質と結合している外因抗原分子(ペプチド)からなる複合体の使用が、腫瘍及び感染症の予防及び治療に関して記載されている。複合体に熱ショックタンパク質と共に存在する抗原は、腫瘍細胞から採取される。それらは、同様の特徴、即ち、共に免疫反応を誘発する。Multhoffら、Biol. Chem. 379 (1998)、295-300は、NK細胞を含む非-MHC-制限エフェクター細胞の認識におけるHsp70を含むHSPsの役割を挙げている。特に、NK細胞は、腫瘍細胞表面に存在するHsp70分子を認識し、次いで腫瘍細胞を溶解することが見い出された。癌治療へのもう一つの研究は、Tamuraとその共同研究者(Tamuralら、Science 278 (1997)、117-123)により紹介されている。彼らは、自己移植腫瘍から由来する腫瘍を有するマウスを熱ショック調製物を用いて効果的に治療することが可能であることを証明した。しかし、自己移植ではない腫瘍又は正常組織からの調製物は、腫瘍の退行を導くことはなかった(Blachereら、J. Exp. Med. 186 (1997) 1315-1322)。Tamuraらによる研究においては、HSPsは、詳細に渡って識別されていない多くのペプチドと共に複合体を形成する。これらをまとめると、従来技術は、ペプチドと複合体を形成するか及び／又は腫瘍細胞のような細胞の表面に存在する場合、HSP分子の免疫活性を示すと言える。従って、熱ショックタンパク質の潜在力が、様々な疾患と戦うために基本的に認識されてはいるが、治療における有効な使用は、出発材料(腫瘍材料)の分量と同様に、特定の複合体又は細胞調製物の調製に通常依存している。これらの複合体又は細胞調製物の普遍的又は患者を選ばない使用を想像することは難しい。
【０００３】
従って、本発明の基礎となる課題は、従来技術において示された上記欠点を持たない熱ショックタンパク質の免疫潜在力を使用するための新規手段及び方法を提供することにある。
【０００４】
この課題は、請求項において特徴づけられた態様の提供により解決される。
【０００５】
従って、本発明は、NK細胞活性化のための薬剤学的調製物、医薬的生成物又は医薬的アジュバントの生成のためのHsp70タンパク質、そのカルボキシ末端(C末端)フラグメント若しくはその誘導体又はHsp70タンパク質のC末端領域と70％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質の使用に関する。
【０００６】
本発明によれば、薬剤学的調製物は、人体上又は人体内で使用される場合、病気、慢性的な軽症の病気、物理的障害又は病理的不快の治癒、軽減、予防、又は認識を目的とする物質及び調製物として定義される。
【０００７】
本発明によれば、医薬的生成物は、個別に又はそれぞれの物質の組み合わせで使用される全ての物質、又は製造者がその機能に応じて、疾患を検出、予防、モニタリング、治療又は軽減するためヒトに投与することを目的とする他の材料(subject-matters)であって、人体内又は人体上におけるその主な効果が、薬理学的又は免疫学的有効調製物又はそのような調製物に補助されることにより効果を持つ代謝によっては達成されない材料であることができる。
【０００８】
本発明によれば、医薬的アジュバントは、薬剤学的調製物の調製のために(活性成分として)使用される物質であることができる。
【０００９】
更に、本発明は、NK細胞のエクスビボ又はインビトロ活性化のためのHsp70タンパク質、そのC末端フラグメント若しくはその誘導体又はHsp70タンパク質のC末端領域(アミノ酸384-641)と70％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質の使用に関する。
【００１０】
本発明によれば、「Hsp70タンパク質」という用語は、その発現を熱だけでなく、更に、多くの他の試薬、例えば、アミノ酸アナログ、重金属、イオノホア又は細胞毒素により誘発することができる真核生物の熱ショックタンパク質であって、誘発による発現増加係数は、構成性発現と比較した場合少なくとも5であるタンパク質に関する。下記の図5は、このタンパク質のN末端ATPaceドメイン及びC末端基質結合ドメインを含むHsp70タンパク質の組成を示す。完全なアミノ酸配列はMilnerら、Immunogenetics 32 (4) (1990)242-251において公開されている。
【００１１】
本発明によれば、Hsp70タンパク質の「カルボキシ末端(C末端)フラグメント」という用語は、ヒトHsp70のアミノ酸384-641領域のアミノ酸配列を有する(ポリ)ペプチドを含む。本発明は、更に、C末端フラグメント384-641のフラグメントも含む。更なる態様では、この用語は、本発明により「Hsp70タンパク質」と言う用語にも含まれるもう一つのタンパク質領域に由来する(ポリ)ペプチドを含み、この領域は、上記ヒトHsp70タンパク質のC末端領域と相応する。本発明により使用されるHsp70タンパク質のフラグメントは、NK細胞を活性化することもできる。当業者は、本発明の説明を用いてこの活性化を簡単に行うことができる。従って、当業者は、更に骨を折ることなしに、組換え技術(この技術の標準方法は、 Sambrookら、 「Molecular Cloning、A Laboratory Manual」、2. edition 1989、CSH Press、Cold Spring Harbor、N. Y.に記載されている)により上記フラグメント384-641からフラグメントを調製し、かつ、求められる活性化の性質についてそれらを試験することもできる。
【００１２】
「誘導体」という用語は、これらの誘導体が本発明の機能を有する限り、Hsp70タンパク質誘導体とC末端フラグメントの誘導体の両方を含む。好ましくは、そのような誘導体は、Hsp70又はそのC末端フラグメントと同じ三次元構造を有し、かつ、例えば、ペプチドミメチックス（peptidomimetics ）(al-Obeidiら、Mol. Biotechnol. 9 (1998)、205-223; Wileyら、Med. Res. Rev. 13 (1993)、327-384; Bohm、J. Comput. Aided Mol. Des. 10 (1996)、265-272; Hrubyら、Biopolymers 43 (1997)、219-266)により調製することができる。
【００１３】
「NK細胞」(「ナチュラルキラー細胞」)という用語は、表面にCD45を発現しており、かつ、前刺激なしでもキラー活性を有する大きな、顆粒リンパ球を含む。それらは、CD16を発現し、及び／又はインターロイキン-2により刺激され、及び／又は、CD3を発現せず、及び／又は、α/β-又はγ/δ-T-細胞レセプターを持たないことにより特に特徴づけられる。
【００１４】
本発明の方法においてその効果を発揮するNK細胞は、更に下記の性質により特徴づけられる：
−それらは、10から10,000単位の量、例えば、100 1UのIL-2(IL-210はfirm Chi
ronから市販され、入手可能である)の添加の後、過渡人工粘着性（transien
t plastic-adherent）である；
−この粘着性は、新しく単離されたPBL(単球により涸渇された抹消血液リンパ球
)にIL-2を添加後3-18時間現われる；
−NK細胞はCD16dim発現を有している(弱い平均蛍光値)；
−NK細胞は典型的なNKマーカーとしてCD56及びCD57を発現する；
−NK細胞はCD94(C型レクチンキラー細胞レセプター)を発現する；
−NK細胞はHsp70及びサイトカインIFNガンマにより活性化された後、分泌する
；
−NK細胞はHsp70(精製されたタンパク質)の添加により刺激されることができる
(生育及び細胞毒素活性)；
−それらは、患者のMHC型に依存しない。
【００１５】
本発明によれば、他のNK細胞集団も使用することができる。しかしこの場合、それらは、本発明によって使用されるHsp70又は上記フラグメント若しくは誘導体により活性化することができることが予め必要となる。本発明によれば、単離されたNK細胞を使用することができる。更に、NK細胞を含む抹消単核血液細胞(PBMC)のような細胞混合物を使用することもできる。
【００１６】
本発明によれば、「Hsp70タンパク質のC末端領域と70％以上のアミノ酸配列相同性」という用語は、２つのアミノ酸配列が整列される時に少なくとも70％のアミノ酸が同一であり、一方の整列された（aligned）アミノ酸配列はHsp70のC末端領域の１つであることを意味する。更に、70％の同一アミノ酸を有するが、整列された時にギャップ（gaps）によって、Hsp70のC末端参照配列と異なる配列も含む。これらのギャップは、本発明によって使用される相同分子において、又は参照分子において発生し得る。通常、コンピューターにより行われる比較による整列は、従来技術において、そのような整列を行うことができるプログラムとして知られている。更に、Hsp70タンパク質のカルボキシ末端領域、即ち、アミノ酸384-641の領域と80 %以上、好ましくは90 %以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質又はフラグメントが好ましい。
【００１７】
ペプチドと複合体を形成することがなくても、又は、腫瘍細胞の細胞表面に存在しなくても熱ショックタンパク質、そのC末端フラグメント又はそれらから誘導された誘導体は、NK細胞の活性化により免疫性活性を誘発するという発見は、最も驚くべきことであると思われる。例えば、1998年6月(この明細書においては、専門家の意見として参照されている Srivastavaら、Immunity 8 (1998)、657-665参照)では、単離された熱ショックタンパク質は、CTL誘導のような免疫的効果を持たず( Blachereら、 J. Exp. Med. 186 (1997)、1315-1322)、かつ、数種類の癌に対しては保護免疫を誘発することができない(UdonoとSrivastava、J. Immunol. 152 (1994)、5398-5403)と依然として推察されていた。本発明を用いて、患者に左右されずにNK細胞のインビトロ又はインビボ活性化を誘発することが可能になり、これは、様々な疾患、例えば、腫瘍疾患に対して効果的に使用することができる。更に、単離された熱ショックタンパク質の使用は、活性化過程の標準化を改善することを可能にする。本発明は、量についての制限なくHCPを生成することを可能にするが、HSPペプチド複合体の患者特異的調製物の場合、HSP量は腫瘍の大きさにより制限される。
【００１８】
上記発見に加えて、Hsp70タンパク質のC末端フラグメントの使用は、更に、本発明の結果を導くことは驚くべきことである。特に、C末端がNK細胞に認識され、かつ、その活性化を導く同一の三次元構造を明らかに有することは予測できなかった。NK細胞活性化におけるHsp70 C末端フラグメントの使用の可能性は、更に、組換え体生成が、全タンパク質の組換え体プレゼンテーション（presentation）と比較して収率が増加するという利点を有する。
【００１９】
例えば、ペプチドミメチックスによる Hsp70誘導体又はそのC末端フラグメントの生成は、例えば、体内でこれらのポリペプチドの急な分解を回避すべきである場合には有用である。これは、例えば、薬剤学的調製物の経口投与によりその役割を演じることができる。
【００２０】
好ましくは、活性化は、NK細胞により仲介される免疫反応の誘発を含む。ここで、NK細胞により仲介される免疫反応はNK細胞の増殖の刺激及び/又はNK細胞の細胞溶解活性の増加を含むことが特に好ましい。Hsp70又はそのフラグメント若しくはその誘導体の(薬剤学的に)効果的な量は、上記態様の全てにおいて使用され、その結果、求められている活性化、好ましくは免疫反応が誘発される。免疫反応は、細胞表面にHsp70又はそのフラグメントを発現する細胞に対して独占的にではないが、主に向けられるものである。これは、ヒト及び動物細胞の両方を含む。細胞表面にHsp70を発現するヒト又は動物細胞は、例えば、腫瘍細胞及び感染症患者の細胞を含む。本発明によってHsp70により刺激されたNK細胞の細胞溶解活性は、明らかに増加し、そのため、細胞表面にHsp70を発現するこれらの細胞の免疫性除去が可能になる。
【００２１】
本発明の使用の特に好ましい態様では、腫瘍細胞及び／又は感染症患者の細胞に対する細胞溶解活性は増加する。
【００２２】
本発明の使用のもう一つの特に好ましい態様では、白血病細胞、リンパ球細胞、腫瘍細胞及び固体腫瘍の転移細胞、並びにウイルス性、真核性又は細菌性感染症患者の細胞に対する細胞溶解活性が増加する。ウイルス性疾患治療の一例は、HIV感染治療であり、細菌性感染の一例は、ミコバクテリアに起因する疾患治療である。本発明の免疫法により治療することができる転移細胞の固体腫瘍は、例えば、癌腫、肉腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫を含む。癌腫の例は、結腸癌腫及び肺癌腫である。
【００２３】
Hsp70タンパク質を使用することにより、このタンパク質の一部又は本発明の70 %以上の配列相同性を有するタンパク質、ウイルス、細菌及び／又は菌類に感染した細胞又は腫瘍により変化した細胞を溶解することができる。このような外界生物の抗原性部分を含む細胞又は腫瘍細胞の一部は、本発明のHsp70タンパク質の使用により活性化されたNK細胞を用いて溶解することもできる。
【００２４】
本発明は、更に、NK細胞のエクスビボ又はインビボ活性化方法であって、NK細胞を含む生理学的細胞懸濁液にHsp70タンパク質、そのC末端若しくはその誘導体又はHspタンパク質C末端領域(アミノ酸384-641)と70％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質を混合し、インキュベートしてNK細胞の活性化を行う方法に関する。
このインキュベイションは、室温、好ましくは、生理学的温度(37℃)で攪拌器(穏やかな攪拌)を用いて行うことができる。
【００２５】
本発明の方法の好ましい態様では、活性化は、NK細胞の増殖の刺激及び／又はその細胞溶解の増加を含む。細胞溶解活性のための好ましい標的細胞に関しては、上記説明を参照する。
【００２６】
本発明の方法の特に好ましい態様においては、NK細胞を含む抹消単核血液細胞(PBMC)又はそのフラクションは、NK細胞を含む生理学的細胞懸濁液として使用される。
【００２７】
適当な方法を用いることにより、NK細胞は、治療される患者又は健康なドナーから採血により得ることができる。好ましくは、NK細胞を含むバッフィーコート（buffy-coats）(濃縮リンパ球)が使用される。
【００２８】
バッフィーコート(濃縮リンパ球)は、静脈を介して患者から採取され、例えば、へパリンが細胞凝固を防ぐために添加される。へパリンが添加されたバッフィーコートは、滅菌容器(通常小さいプラスチック袋)へ集められ、その後、遠心分離して、血液細胞(= PBMC、抹消、単核血液細胞、例えば、リンパ球、赤血球、顆粒白血球等)を堆積させる。濃縮されたリンパ球は、容器(プラスチック袋)内で滅菌状態におかれる。健康な提供者（probands）の場合、バッフィーコートは、白血球及び赤血球(リンパ球、赤血球等)からなる。腫瘍患者の場合、バッフィーコートは白血球を含むばかりか、腫瘍細胞も含むことができる(白血病の場合、例えば、白血病細胞 = 芽細胞；固体腫瘍の場合、例えば、転移細胞)。
【００２９】
抹消、単核血液細胞を含むバッフィーコートは、好ましくは、へパリンを添加した生理学的細胞懸濁液の形態で使用される。へパリンは細胞の凝集を防ぐ。
【００３０】
本発明の方法のもう一つの特に好ましい態様においては、細胞懸濁液は、更に、細胞表面にHsp70を発現しているヒト及び動物細胞を含む。しかし、Hsp70タンパク質によるNK細胞の刺激は、細胞表面に発現されたHsp70が存在する標的細胞(腫瘍細胞、感染した細胞)なしに行うこともできる。
【００３１】
本発明の方法のもう一つの特に好ましい態様においては、腫瘍細胞、感染症患者の細胞は、ヒト又は動物細胞として使用される。
【００３２】
本発明の方法のもう一つの特に好ましい態様においては、白血病細胞、リンパ腫細胞、固体腫瘍の転移細胞及びウイルス性、真核性又は細菌性感染症患者の細胞は、ヒト又は動物細胞として使用される。
【００３３】
本発明の方法のもう一つの好ましい態様においては、細胞及びタンパク質を含む生理学的細胞懸濁液は、少なくとも３時間インキュベートされる。
この態様においては、ナチュラルキラー細胞の細胞溶解効果を増加させるために、ナチュラルキラー細胞の標的細胞は、好ましくは前記時間の間ナチュラルキラー細胞及び懸濁液中のHsp70と共に、好ましくはインキュベートされる。少なくとも４日間までは長期間のインキュベイションも可能である。従って、本発明の方法のもう一つの特に好ましい態様においては、インキュベイションは４日間行われる。
【００３４】
本発明の使用又は本発明の方法のもう一つの好ましい態様においては、サイトカインが付加的に使用される。サイトカイン及びNK細胞及び/又は熱ショックタンパク質、そのフラグメント若しくは誘導体は、別々に又は一回量を一緒に使用することができる。
【００３５】
本発明の使用又は方法の特に好ましい態様においては、インターロイキンは、サイトカインとして使用される。本発明によれば、更にNK細胞の活性化、例えば、NK細胞に仲介される免疫反応又はNK細胞増殖の刺激を強めるために、Hsp70タンパク質とインターロイキンの組み合わせも使用することができる。
【００３６】
本発明の使用又は方法のもう一つの特に好ましい態様においては、IL-2、IL-12及び／又はIL-15がインターロイキンとして使用される。
【００３７】
本発明は、例えば、高体温治療と組み合わせて毒性物質を回避することにより、NK細胞のエクスビボ活性化したNK細胞を患者に再注入することだけでなく、本発明により処理されたインビボNK細胞を用いることを可能にする。本発明のこの態様は、更に非常に貴重なかつ驚くべき利点、即ち、公知の治療法に耐性である標的細胞、例えば、腫瘍細胞までもNK細胞の細胞溶解効果により免疫学的に破壊することができる利点を有する。従って、本発明は、更に、薬剤学的有効量の上記方法により活性化されたNK細胞が、任意に薬剤学的有効量のHsp70タンパク質、そのC末端フラグメント若しくはその誘導体又はHsp70タンパク質のC末端領域(アミノ酸384-641)と70％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質と組み合わせて、又はその使用の前に、患者へ投与される免疫系のインビボ活性化方法に関する。
【００３８】
複数の物質が共に投与される場合、それらは、１つの容器に入れられるか又は幾つかの容器に別々に入れることができるが、連続的な工程の場合、それらは分離したままにされる。
【００３９】
NK細胞がHsp70タンパク質の前に投与される場合、Hsp70タンパク質投与前の間隔は少なくとも3-24時間とされる。
【００４０】
本発明の治療の例は、下記のとおりである：
抹消、単核血液細胞又は骨髄細胞及び腫瘍患者、例えば、白血病患者からの腫瘍細胞からなるバッフィーコート細胞(濃縮リンパ球)は、温度管理された水槽内でHsp70、Hsp70関連タンパク質及び／又は有効フラグメント若しくはその誘導体と共に滅菌シールされた容器、例えば、プラスチック製容器中で熱処理される。腫瘍細胞及び本発明の処理により刺激されたNK細胞の両方は、容器内に入れられる。本発明過程の完了の後、活性化したNK細胞及び溶解した腫瘍細胞を含む培養溶液は患者に再注入される。
【００４１】
本発明によれば、NK細胞は、任意に他の抹消、単核血液細胞、例えば、赤血球及び顆粒白血球及びT細胞と共に存在する。従って、好ましくは、NK細胞は単独で使用されず、末梢、単核血液細胞の混合物が、バッフィーコート細胞を単離することにより得られる。これらの蓄積物は、本発明の方法により免疫学的に除去される腫瘍患者の腫瘍細胞を更に含む。
【００４２】
更に、本発明は、患者に薬剤学的有効量のHsp70タンパク質、そのC末端フラグメント若しくはその誘導体又はC末端領域(アミノ酸384-641)と70％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質を与えられる、NK細胞のインビボ活性化方法に関する。
【００４３】
更に、本発明は、患者に薬剤学的有効量の本発明により活性化されたNK細胞及び／又はHsp70タンパク質、そのC末端フラグメント又はその誘導体又はHsp70タンパク質のC末端領域(アミノ酸384-641)と70％以上のアミノ酸配列相同性が有するタンパク質が与えられる、腫瘍、癌及び／又は感染症治療方法に関する。
【００４４】
本発明の方法の好ましい態様においては、腫瘍は固体腫瘍又は転移である。治療戦略は、本発明の方法により除去することができる単独転移細胞の除去を目的としている。Hsp70特異的細胞の増加された活性は、少ない一回量、例えば、１００I.U.のインターロイキン-2の添加により行うことができる。インターロイキン-２は、例えば、滅菌容器、例えば、プラスチック容器へHsp70と共に入られる。
【００４５】
本発明のもう一つの好ましい態様においては、癌は白血病又はリンパ腫である。
【００４６】
本発明のもう一つの好ましい態様においては、感染症はウイルス、真菌又は細菌由来のものである。
【００４７】
本発明は、更に、治療において有効である量のHsp70タンパク質、そのC末端フラグメント若しくはその誘導体又はHsp70タンパク質のC末端領域(アミノ酸384-641)と70％以上のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質及び/又は本発明の方法により活性化されたNK細胞を含み、更に、任意に一般的な担体及び／又はアジュバント物質を含む薬剤学的調製物、医薬的アジュバント、又は医薬品に関する。更に、上記に特定されたサイトカインが、任意に薬剤学的調製物に添加される。
【００４８】
薬剤学的調製物、医薬的アジュバント、又は医薬的調製物の好ましい態様においては、タンパク質は、少なくとも1 μg/ml、好ましくは1000 μg/ml以下、好ましくは1 ×106 から5 ×108 NK細胞の濃度で存在し、10 μgから600 μg/mlの量が好ましい。
【００４９】
適切な薬剤学的許容担体の例は、当業者に知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、滅菌溶液等を含む。そのような担体を含む薬剤学的組成物(薬剤学的調製物)は、一般的な方法により調製することができる。薬剤学的組成物は、各々の個体へ適当な投与量を投与することができる。投与方法は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所的又は皮内投与である。投与量は、多くの因子、例えば、患者の大きさ、性別、体重、年齢、更に、特に投与される組成の種類、投与の種類等に依存している。一般的に、一ヶ月に与えられる投与量は、10から1000 μgである。本発明の物質の静脈内投与に関しては、10から1000μgの投与量が通常である。組成物は、局所的又は全身に体系的に投与することができる。一般的には、投与は、非経口投与で行われる。従って、本発明によるHsp70により処理されたNK細胞は、好ましくは静脈内投与される。注射は、投与されるNK細胞の効果的な量を用いて腫瘍へ直接行われることもある。公知の、他の種類の応用も、もちろん可能である。
【００５０】
Hsp70そのものは、例えば、サイトカインと共に投与することができる。投与の１例は、静脈内、筋内、皮内若しくは腹腔内、又は足底における、例えば、サイトカインと共に行うHsp70タンパク質の投与である。
【００５１】
本発明の使用若しくは方法又は薬剤学的調製物若しくは医薬的生成物若しくは医薬的アジュバントのもう一つの好ましい態様においては、Hsp70タンパク質はヒトタンパク質である。本発明のタンパク質は、例えば、ヒトに由来し(細胞抽出物より単離される)又はヒトHsp70タンパク質のアミノ酸配列を有する(例えば、組換え体生成の後)。しかし、動物Hsp70タンパク質も使用することができる。
【００５２】
本発明により使用されるHsp70タンパク質又はそのフラグメントは、組換え体により生成するか、細胞抽出物から単離するか、又は化学合成を用いて生成することができる。
好ましくは、Hsp70タンパク質又はそのフラグメント若しくは誘導体は、組換えタンパク質である。そのような組換えタンパク質は、標準技術により生成することができる。
【００５３】
標準技術は、当業者に知られている(Sambrookら、ibid. とAusubel、"Current Protocols in Molecular Biology"、Green Publishing AssociatesとWiley Interscience、N.Y. (1989))。タンパク質の組換え体生成のために、Hsp70タンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子が使用される。これらは、様々な核酸分子、特にDNA又はRNA分子、例えば、cDNA、ゲノムcDNA、mRNA等である。そのような核酸分子は、天然分子及び／又は遺伝子的又は化学合成法により生成される分子であることができる。組換えタンパク質の生成には、当業者は、ベクター、特にプラズミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学における一般的な他のベクター(Sambrookら、ibid.)を使用する。ベクターに含まれる核酸分子は、原核細胞又は真核細胞における発現を保証する制御因子と連結していることができる。これに関連して、「発現」という用語は、転写並びに(転写及び)翻訳の両方の意味で用いられる。制御因子は、特にプロモーターを含む。原核細胞における核酸分子の発現のために、自由に使用できるプロモーター領域は、大腸菌lac-又はtrp-プロモーター、ラムダファージのPR-又はPL-プロモーター、lacI、lacZ、T3、T7、gpt等である。真核プロモーターは、例えば、CMVイミディエットアーリープロモーター（CMV immediate early promoter）、HSVプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルス由来LTRｓ及びマウスメタロチオニンIプロモーターである。原核又は真核細胞における発現のための様々な発現ベクター、例えば、真核生物pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals、Uppsala、Sweden)又はGEM1 (Promega Biotec、Madison、WI、USA)、pSV2CAT、pOG44及び原核生物pQE70、pQE60、pBluescript SK等については既に記載されている。プロモーター以外のこれらのベクターは、転写を更に向上する因子、例えば、いわゆる転写エンハンサーも含むことができる。例としては、SV40エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、サイトメガロウイルス  アーリープロモーターエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを挙げることができる。従って、組換えタンパク質は、例えば、上記ベクターが使用される場合、様々な原核及び真核ホスト細胞において発現される。そのようなホスト細胞の例は、細菌細胞（例えば、大腸菌、ストレプトミセス、バシラス、ネズミチフス菌）、真菌細胞（例えば、イースト細胞、特にサッカロミセル セレビシアエ）、昆虫細胞（例えば、キイロショウジョウバエ族又はSF9細胞）、動物細胞（例えば、CHO又はCOS細胞）又は、更に、植物細胞等である。そのようなホスト細胞は、組換えタンパク質発現可能な条件下で培養され、次いで、組換えタンパク質は細胞及び／又は培養液から採取することができる。生成されたタンパク質を得るための方法と同様に、様々なホスト細胞における外来タンパク質発現方法は当業者に知られている。
【００５４】
本発明の使用若しくは方法又は薬剤学的調製物若しくは医薬的生成物若しくは医薬的アジュバントのもう一つの好ましい態様においては、Hsp70タンパク質は、ヒトHsp70のC末端フラグメント（アミノ酸384-561）又は本発明の効果を有するもう一つのHsp70の対応する領域又はヒトHsp70のC末端フラグメント（アミノ酸454-460）を含む。本発明によれば、７アミノ酸（NLLGRFE）からなるこの最小配列を有するフラグメントは、抗体により阻害され、その結果NK活性化は妨げられるか又は停止することが驚くべきことに示された。この実験はMulthoffら、J. Immunol. 158 (1997)、4341-4350に記載されているように行われた。Amershamから入手可能な抗体RPN 1197が使用された。前記7アミノ酸は、天然隣接(naturally flanking)Hsp70配列又は他のアミノ酸により隣接させる(flank)ことができる。前記7アミノ酸は、その天然における状態に留まることが好ましい。他の隣接する(flanking)アミノ酸が使用される場合、前記7アミノ酸が自然に有する三次元状態が保存されることが好ましい。相同性が少なくとも70％に保たれる限り、前記7アミノ酸内で、更に、アミノ酸交換を行うことができる。しかし、これらの交換は、458の位置にあるアルギニンをリシンへ交換することを含まない。この交換は、構造における変化を導く。従って、構造の変化を導く7アミノ酸領域における交換は、求められる活性化の性質を有する場合にのみ本発明に含まれる。
【００５５】
本発明は、更に、腫瘍疾患及び／又は感染性疾患治療のための１以上の上記態様の方法により処理されたNK細胞の使用に関する。
【００５６】
本発明の使用の好ましい態様においては、治療は処理されたNK細胞の再注入により行われる。
【００５７】
前記インビボ方法は、記載されたインディケーターを処理するための処理方法として使用することもできる。
【００５８】
ここで引用されているそれぞれの文献(製造者の使用説明書、マニュアル等を含む)は、明細書に参照として含まれる。
実施例は本発明を例示する。
【００５９】
実施例１
Hsp70添加後のNK細胞の増加された増殖
Hsp70タンパク質rHsp70、DnaK、Hsc70、rHsp70-C term.及びrHsp70homC (アミノ酸384-561)により刺激された精製NK細胞及びT細胞の増殖は、3H-チミジン吸収標準試験(試験条件は後に記載)により決定された。更に、第一にボランティアのヒトドナーから採取された抹消血液リンパ球は、複数の段階方法及び続くIL-2含有培地(3参照)中での12時間のインキュベーションにより、非吸着CD3+T細胞及び過渡(12-24時間)粘着 CD3- (CD16+/CD56+) NK細胞副集団に分離された。これらの細胞は、別々にRPMI 1640培地 (Life Technologies、Eggenstein、ドイツ)を含むrIL-2 (100 IU、Chiron、Frankfurt、ドイツ)中で3-4日間培養された。増殖は、H-3吸収として測定された。
【００６０】
選別実験(Panning experiments)は、ヒト組換えHsp70(rHsp70、SPP-755、StressGen Biotechnologies、Victoria、カナダ)及びDnaK (大腸菌から採取されたHsp70-相同物 、SPP-630、StressGen)を用いて行われた。タンパク質は、ステム濃度(stem concentration) 1μg/mlに PBSを用いて希釈し、アリコートを−80℃で凍結した。T-25培養物フラスコは、3mlの氷冷カーボネート緩衝液(pH9．5)中で12時間、rHsp70又はDnaKタンパク質(10μg/ml)と共にインキュベートされた。PBS/5 % FKSを用いて非特異的結合サイトをブロッキングした後、1：2及び2:1の比でPBS/1 % FKS中に懸濁されたT及びNK細胞の混合物は、1時間室温で培養フラスコ内においてインキュベートされた。粘着性でない細胞は、インキュベイション後、上清から採取された。粘着細胞は、氷冷PBS/10 % FKS溶液を用いた一連の洗浄段階により採取された。一回の穏やかな洗浄段階を使用して、やや粘着性である細胞を除去し、一方、高度粘着性細胞は更なる激しい洗浄段階により採取された。それぞれの段階において得られた細胞集団は、別々にカウントされ、フローサイトメトリー及び表現型により特徴づけられた。
【００６１】
フローサイトメトリーは、(4)に記載されているようにFACScan装置(Becton Dickinson、Heidelberg、ドイツ)で行われた。陽性染色細胞のパーセントは、特異的染色、生体 (プロピジウムイオジド(propidiumiodide)陰性)細胞数から同位体に対応する参照抗体により染色された細胞数を引いたその差として特定された。下記の抗体は、表現型の特徴づけのために使用された：
同位体に対応する参照抗体(Dianova、Hamburg、ドイツ; Becton Dickinso、Heidelberg、ドイツ)、CD16(Dianova、Hamburg、ドイツ)、CD3(Dianova、Hamburg、ドイツ)。
【００６２】
様々なHsp70タンパク質に対するT又はNK細胞の増殖能力は、3H-チミジン吸収標準試験により決定された。生存能力のある細胞(5 ×104細胞/100 μl)は、100 IU IL-2を補充されたRPMI 1640倍地及び様々な組換えHsp70タンパク質(rHsp70、DnaK、Hsc70、ウシの脳から精製されたHsp70の構成性形態、SPP-750; Stressgen; rHsp70-C term. sie rek. Hsp70 (アミノ酸384-561)のC末端ペプチド結合ドメイン、rHsp70homC、Hsp70homの組換えC末端ペプチド結合ドメイン (Hsp70hom は、Hsp70、アミノ酸 384-561と高相同性を有するHsp70ファミリーの精巣特異的メンバーである))が入った平らな底を有する96ウェルマイクロタイタープレート (Greiner, Nurtingen、ドイツ)に入れられた。Hsp70タンパク質の様々な濃度(1−200 μｍg/ml)を試験することで、最終濃度100 μg/mlが刺激のためには理想的であることが分かった。IL-2 (100 IU)に対する増殖活性は、更なる参照として、並行して決定された。24時間又は48時間のインキュベーション後、細胞は、3H-チミジン(1 μCi/ウェル)により標識され、全吸収は37℃で18時間のインキュベーションの後、流体シンチレーションカウンター（Beckmann Instruments、Munich、ドイツ）を用いて決定された。更に、内部参照(internal control)として、増殖容量は同じドナーから採取したTリンパ球から決定された。投与量段階的上昇実験(dose escalation examinations)における濃度1-200μg/mlの様々なHsp70タンパク質／フラグメントの使用は、増殖容量の最大刺激は、100 μg/ml Hsp70タンパク質により達成されることができることを示した。単離されたNK及びT細胞の増殖活性は、rHsp70、DnaK、 Hsc70、 rHsp70-C term. 又は rHsp70homC (アミノ酸384-562)を用いてインビトロ刺激された後に試験された。図１Aに見られるように、rHsp70によるNK細胞の増殖は、顕著に刺激された。Hspのカルボキシ末端領域による及びアミノ酸384-561を有するC末端ドメインにおいてHsp70と94％の相同性を有するrHsp70homCによる刺激も可能である。それに対して、DnaK及びHsc70はNK細胞増殖を刺激しなかった。熱変性されたrHsp70は、その増殖に対する刺激性を完全に失った。
【００６３】
更に、CD3陽性Tリンパ球の増殖は、DnaKにより刺激されることができるが、rHsp70、 Hsc70及びrHsp70homC並びに熱変性されたrHsp70は、T細胞の増殖容量への効果を示さなかった(図１B)。
【００６４】
従って、まとめると、組換えヒトHsp70タンパク質によるNK細胞の増殖は、Hsp70のC末端領域(384-561)及びHsp70と相同性のタンパク質であるrHsp70homCを用いて誘発することができる一方、T細胞の増殖は、細菌性Hsp70(大腸菌DnaK)により選択的に刺激されることができた。
【００６５】
実施例２
Hsp70添加後のNK細胞の細胞溶解活性の増加
Hsp70を発現する(CX+)及びHsp70を発現しない(CX-)腫瘍細胞を用いたNK細胞の機能的分析により、Hsp70によるプラズマ膜発現はNK細胞に仲介される溶解に対する感受性増加と関連していることが示された。NK細胞により仲介されたこの溶解は、Hsp70のカルボキシ末端領域(アミノ酸504-617)に向けられたモノクローナル抗体及び抗体RPN1197と共に腫瘍細胞系を予めインキュベートすることによりブロックすることができる(1, 4)。次に自家由来のHsp70を発現する(CX+)及びHsp70を発現しない(CX-)腫瘍細胞についてNK細胞の細胞溶解活性における組換えHsp70タンパク質(rHsp70)の影響、が分析された。濃度5 μg/mlでHsp70タンパク質と4日間予めインキュベートされた高度精製されたNK細胞を用いた細胞毒性試験の結果は、図2A及びBにまとめられている。実験的なセットアップは、下記のとおりであった：細胞毒性活性刺激のためにNK細胞を10 μg/mlのrHsp70と共にインキュベートした。刺激は、4日後に繰り返された。
【００６６】
プラズマ膜におけるそのHsp70発現が異なっている、ヒト自家由来結腸癌腫副細胞系CX+及びCX-(Multhoffら、 J. Immunol. 158 (1997)、4341)は、10 % FKS (Life Technologies)、6 mM L-グルタミン並びに抗生物質 (100 IU/ml) ペニシリン及び100 μg/ml ストレプトマイシン (Life Technologies)が補充されたRPMI 1640培地中で培養された。二次関数的に増加している腫瘍細胞が、標的細胞として使用され、精製されたCD3-NK細胞は、FACStarplus 装置(Becton Dickinson、Heidelberg、ドイツ)を用いる細胞選別の後、エフェクター細胞として使用された。NK細胞により仲介される細胞毒性は、４時間51Cr-放射性アイソトープ試験(Multhoffら、J. Immunol. 158 (1997)、4341)を行うことにより決定された。特異的溶解のパーセントは、下記のように計算された：[(実験的放出−自然発生的放出)−最大放出−自然発生的放出]×100。Cr-51の実験的放出は、全ての実験において15％未満であった。
【００６７】
驚くべきことに、NK細胞を少なくとも４日間rHsp70タンパク質と共にインキュベーションした場合、増殖及びHsp70発現腫瘍細胞(CX+)に対するNK細胞の細胞溶解活性の両方が、刺激されることを示すことが可能であった。それに対して、rHsp70により処理されていない同じドナーから採取されたNK細胞は、10日後にこの反応性を失った(データは示されていない)。rHsp70により刺激されていないNK細胞の溶解活性は、rHsp70により処理されかつ刺激されたNK細胞と比較して低く、かつ、Hsp70を発現する及び発現しない腫瘍細胞の溶解においては、溶解性の顕著な相違は見ることができなかった。
【００６８】
本試験は、Hsp70のC末端部分(アミノ酸384‐641)は、NK細胞の細胞溶解及び増殖機能を刺激する役割を担っていることを示す。従って、本発明によれば、特にHsp70タンパク質のカルボキシ末端部分は、特にHsp70を特異的に発現している腫瘍細胞をインビトロで攻撃するNK細胞のための刺激信号として効果的である。
【００６９】
実施例３
Hsp70により刺激されたNK細胞による抗腫瘍効果
Hsp70発現腫瘍細胞と比較したNK細胞のインビボ関連性を試験するために、免疫欠陥SCID/ beigeマウスについて試験が行われた。初めに、様々な量の腫瘍細胞(CX+又は CX-細胞)がSCID/beigeマウスに注射された。2.5mio.細胞の量が3から5週間の期間内に腫瘍生育を誘発するため腫瘍細胞最適量であることが証明された。結腸癌腫細胞CX+ 及びCX-の i.p.(腹腔内)又はo.t.(同所(orthotope)、すなわち、ここでは腸壁内)注射が選択された。刺激後にNK細胞は、i.p.又はi.v. (静脈内)投与された。図3に示されているように、腫瘍生育は、i.p.及びo.t. 注射後、どちらについても全ての動物において行うことができた。i.p. 注射とは逆に、o.t.注射後の一次腫瘍生育に加えて、CX+ の転移も、特に、脾臓及び肺で観察された(o.t.注射後3匹のネズミで 3匹)。
【００７０】
ヒトNK細胞の注射(i.p.、しかし、i.v.も)は、腫瘍細胞注射の４日後でさえも、完全な腫瘍生育阻害に導いた。NK細胞により腫瘍細胞の一次生育(i.p.領域又は腸)のみを阻害することができるだけでなく、腫瘍の転移も阻害することができることは興味深い。
【００７１】
これらの発見は、予め活性化されたヒトNK細胞によるSCID/beigマウスの免疫再構成は、インビトロだけでなくインビボ(動物内)において溶解を導くことを明らかに示す。ヒトNK細胞によっても転移は抑制することができることは興味深いことである。
【図面の簡単な説明】
【図１】    図１Ａは、IL-2(100 IU/ml)培地又はIL-2培地(100IU/ml)に懸濁された他の組換えHsp70タンパク質(rHsp70, rHsp70-Cterm （アミノ酸384-561）、rHsp70homC、DnaK、Hsc70及び熱変性されたrHsp70)をそれぞれ用いた、濃度10 μg/mlにおいて刺激された、分離されたNK-(A)-細胞の増殖活性の比較。NK細胞の発現型の特徴は下記のとおりである。
CD3: ( 5 %; CD16/CD56: 46-87 %; CD94: 60-70 %; p58.1及びp58.2: (5% 及びT細胞: CD3: 85-92 %; CD16/CD56: 5-10 %; CD94: (29%; p58.1及びp58.2:試験されていない; p70:試験されていない、 フローサイトメトリーにより決定。細胞の増殖は、48時間後及び3H-チミジン (1 μCi/ml) と共に37 ℃で18時間インキュベートした後に決定された。NK-(A)およびT(B)細胞における3H -チミジン吸収の相対的なパーセントはIL-2単独の効果(100％)と比較された。値は、4から7の独立した実験(標準偏差の平均値を示している。
【図２】    図１Ｂは、IL-2(100 IU/ml)培地又はIL-2培地(100IU/ml)に懸濁された他の組換えHsp70タンパク質(rHsp70, rHsp70-Cterm （アミノ酸384-561）、rHsp70homC、DnaK、Hsc70及び熱変性されたrHsp70)をそれぞれ用いた、濃度10 μg/mlにおいて刺激された、分離されたT(B)-細胞の増殖活性の比較。NK細胞の発現型の特徴は下記のとおりである。
CD3: ( 5 %; CD16/CD56: 46-87 %; CD94: 60-70 %; p58.1及びp58.2: (5% 及びT細胞: CD3: 85-92 %; CD16/CD56: 5-10 %; CD94: (29%; p58.1及びp58.2:試験されていない; p70:試験されていない、 フローサイトメトリーにより決定。細胞の増殖は、48時間後及び3H-チミジン (1 μCi/ml) と共に37 ℃で18時間インキュベートした後に決定された。NK-(A)およびT(B)細胞における3H -チミジン吸収の相対的なパーセントはIL-2単独の効果(100％)と比較された。値は、4から7の独立した実験(標準偏差の平均値を示している。
【図３】    図２Ａは、処理されずに残された (連続した線、塗りつぶされていない符号)か、又はrHsp70 (A) -タンパク質(それぞれ5μg/mlを4日間)とNK細胞とのプレインキュベーション後に予めインキュベートされた(連続した線、塗りつぶされた符号)、高度精製されたNK細胞(CD3: ( 2 %; CD16/CD56; 75-80 %; CD94: 65-87 %; p58.1及びp58.2: 20-30 %; p70: (10%)と、発現プラズマ膜の能力により異なる51Cr標識された腫瘍細胞CX+ (A)との細胞毒性活性の比較。結果は、0.2 : 1から2 : 1の様々なE : T比における特異的細胞溶解のパーセントとして示されている。それぞれの点は、少なくとも3つの独立した実験(標準偏差の平均値を表している。それぞれの腫瘍標的細胞系の自発性放出のパーセントは常に15％未満であった。
【図４】    図２Ｂは、処理されずに残された (連続した線、塗りつぶされていない符号)か、又はrHsp70 (A) -タンパク質(それぞれ5μg/mlを4日間)とNK細胞とのプレインキュベーション後に予めインキュベートされた(連続した線、塗りつぶされた符号)、高度精製されたNK細胞(CD3: ( 2 %; CD16/CD56; 75-80 %; CD94: 65-87 %; p58.1及びp58.2: 20-30 %; p70: (10%)と、発現プラズマ膜の能力により異なる51Cr標識された腫瘍細胞CX- (B)との細胞毒性活性の比較。結果は、0.2 : 1から2 : 1の様々なE : T比における特異的細胞溶解のパーセントとして示されている。それぞれの点は、少なくとも3つの独立した実験(標準偏差の平均値を表している。それぞれの腫瘍標的細胞系の自発性放出のパーセントは常に15％未満であった。
【図５】    図３は、免疫欠陥マウスにおけるHsp70を担うCX+細胞の腫瘍生育。NK細胞のi.p.注射後、腫瘍生育は完全に阻害される(腫瘍細胞のi.p.注射)。腫瘍生育はcm2で表されている。CX+ 及びNK細胞のi.p.注射後21日目の腫瘍の生育。
【図６】    図４は、免疫欠陥マウスにおけるHsp70を担うCX+ 細胞の腫瘍生育。NK細胞のi.v.注射後、腫瘍生育は完全に阻害される。腫瘍生育はグラムで測定された。
CX+のo.t. 注射及びNK細胞のi.v.注射後、35日目の腫瘍生育。NK細胞は注射から3から5週間後、Hsp70を有するCX+細胞の腫瘍生育を阻害する(図3参照)。NK細胞の腹腔内及び静脈内投与の両方とも、同様の結果に導く。
【図７】    図５は、C末端領域を例示を含む完全Hsp70タンパク質。
【図８】    図６は、NK細胞により仲介される免疫反応におけるHsp70及び／又はサイトカインの影響の例示。サイトカインの添加は、T細胞の刺激も導く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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