(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
底部外表面及び底部内表面のそれぞれが、同軸に対して回転対称の非球面に形成された試料容器と、
前記試料容器の底部から出射した光を検出するための光検出器と、
前記試料容器と前記光検出器の間に位置するピンホール板と、
前記試料容器と前記ピンホール板の間に位置する集光レンズとを有し、
前記ピンホール板は、前記集光レンズの焦点に当該ピンホール板に設けられたピンホールの位置が一致するように設置されていることを特徴とする光検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の光検出装置において、励起光を実質的に平行光として前記試料容器の前記底部へ照射する光照射部を有することを特徴とする光検出装置。
【請求項３】
請求項２記載の光検出装置において、前記励起光は前記試料容器の底部によって前記試料容器に保持される試料溶液中に点状に集光されることを特徴とする光検出装置。
【請求項４】
請求項２記載の光検出装置において、前記試料容器と前記集光レンズの間にダイクロイックミラーが設けられ、前記光照射部は前記ダイクロイックミラーを介して前記試料容器中の試料溶液に励起光を照射することを特徴とする光検出装置。
【請求項５】
請求項１記載の光検出装置において、前記試料容器の底部は屈折率が１．５５以上であることを特徴とする光検出装置。
【請求項６】
請求項１記載の光検出装置において、前記試料容器と前記集光レンズの間に透明な仕切り板が設けられていることを特徴とする光検出装置。
【請求項７】
請求項１記載の光検出装置において、前記試料容器の上に、透明又は一部が光を吸収する部材のふたを備え、ふたの下面の少なくとも一部が前記試料容器中の試料溶液に接触することを特徴とする光検出装置。
【請求項８】
請求項１記載の光検出装置において、前記試料容器は、それぞれ独立して試料溶液を収容する複数のウェルを備え、前記試料容器を前記光検出器に対して２次元的に駆動する駆動部を有することを特徴とする光検出装置。
【請求項９】
請求項２記載の光検出装置において、前記試料容器の底部は、前記光照射部から照射される光により前記試料容器中の試料から放射される光が、前記底部から平行光として出射するように形成されていることを特徴とする光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識された生体分子を含有する試料溶液に、光を照射し、励起された蛍光を検出することにより生体分子を定量するのに好適な光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光標識された生体分子の定量においては、試料溶液に、溶液内部の点（以下では集光点と呼ぶ）に光が集束するよう光を照射して蛍光を励起し、溶液中の生体分子から放射され、試料容器を透過してきた蛍光を集光レンズで収集し、集光点の共役点に置かれたピンホール上に結像してピンホール内部を透過する光のみを検出する分析装置が広く用いられている。ピンホールの透過光のみを検出することにより、蛍光を検出する試料中の領域（検出領域）が集光点近傍に限定され、集光点近傍以外の溶液の発光や容器表面での散乱光などの背景光（バックグラウンド、Ｂ）が遮断されて、検出領域中にある生体分子からの蛍光（シグナル、Ｓ）を良好なシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）で検出することができる。
【０００３】
この種の装置の検出系は、一般に図１のような構成を有している。試料容器２中の試料１に励起光が集光され、その集光点３から発せられた蛍光４は、集光レンズ５によって集光点３と共役な位置に設けられたピンホール板６のピンホールに集光され、ピンホールを通過して光検出器７で検出される。実際にはレンズ５は複数のレンズの組レンズであり、レンズ間にフィルタやダイクロイックミラーなどが挿入されるが、図１は原理を示すための模式図であるので、簡略化して描いた。図１のような系ではＢが十分小さく押えられるので、蛍光検出のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は√Ｓに比例する。したがって、Ｓ／Ｎを大きくするには、Ｓそのものを大きくする必要がある。Ｓを大きくする方法としては、照射光の強度増大、もしくは、蛍光収集効率増大の二通りがある。照射光が強すぎると生体試料を標識した蛍光体が破壊されてしまうので、前者の方法には限界がある。そこで、検出系の蛍光収集効率をなるべく大きくする、すなわち検出系の開口数（ＮＡ）をなるべく大きくしなければならない。１分子からの蛍光をＳ／Ｎ良く検出するには、１より大きいＮＡが好ましい。しかしながら、一般的な平坦の底を有する試料容器２を用いてＮＡ＞１を達成するには、特許文献１に記載されているように、レンズ５を液浸にしなければならない。すなわちレンズ５と試料容器２の間に液体を充填しなければならない。液浸系では、レンズと試料容器の間に液体を充填するステップが発生するので、操作性が乾燥系より低下する。試料容器を動かしながら多数種の試料を分析する場合に、この操作の煩雑性は顕著である。また、充填液中に泡が発生して蛍光の伝播を阻害する危険が高い。特許文献１のように液体の充填や泡抜きを自動化したシステムは有るが、装置のコストアップは避けがたいし、充填液の補充や試料容器交換時の煩雑さが残る。
【０００４】
なお、試料中の集光点及びその共役点を焦点と呼んでいる文献もあるが、これは不正確な表現であり、本明細書では「焦点」を「平行光束が試料側からレンズに入射したとき、レンズに関して試料と反対側で集光する点」の意味でのみ用いる。この点を明確化するため、図１において、仮想的な平行光束の蛍光４’と焦点８を記してある。このように従来技術では焦点８がピンホール中に位置していない。
【０００５】
特許文献２〜５のように、試料容器の底部に曲面を設けることにより、非液浸系（乾燥系）でもＮＡ＞１を実現することができる。特許文献２〜５と図１のようなピンホールを有する検出系を組み合わせると図２に示すような系が考えられる。特許文献２〜５においては容器から出てきた光が発散光であるので、図２の系においてもピンホール板６のピンホールはレンズ５の焦点８に位置しない。この系では乾燥系でＮＡ＞１を実現できる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−８５４４３号公報
【特許文献２】特開平４−３６９４６３号公報
【特許文献３】特開平８−１７８８３１号公報
【特許文献４】特開２００４−１３８４２０号公報
【特許文献５】特開２００３−４６２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
図２に示した系では、試料容器２から発散する光を検出するため、試料容器２の中心軸と集光レンズ５の光軸が高精度で一致し、かつ試料容器２と集光レンズ５の距離がある所定の値に高精度で一致していない場合、収差が発生し、集光点３のピンホール上の像がぼける。その結果、蛍光の検出効率が低下すると同時にピンホールによるバックグラウンドの除去効率が低下し、Ｓ／Ｎが低下してしまう。図３に、試料容器２の中心軸９と集光レンズ５の光軸１０がずれて、集光点３の像がぼけた様子を表す。図では表現しにくいが、試料容器２と集光レンズ５の相対位置が光軸方向にずれても同様の影響がある。したがって図２のような系では、試料容器２と集光レンズ５の相対位置を非常に高い精度で制御する必要がある。これはコストの上昇を招くだけでなく、試料容器２は頻繁に交換する性質の物であるから、その交換のたびに精密な位置調製をするのは実用的でない。
【０００８】
このように、従来のピンホールを有する蛍光検出系では、ＮＡ＞１の明るさを得るには、集光レンズと試料容器の間に液体を充填するか、さもなくば試料容器をレンズに対して極めて高精度に位置決めしなければならない。いずれも多数試料の自動処理には適さない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、底部外表面が曲面になってレンズ作用をする試料容器を用いる。励起光を平行光として試料容器の底部から照射させ、試料溶液中で集光点に集光させる。励起光照射によって発生した蛍光を試料容器の底部から平行光として取り出し、集光レンズによって集光し、光検出器によって検出する。このとき、集光レンズの焦点にピンホールの位置が一致するようにして、試料容器と光検出器の間にピンホール板を設置する。あるいは、ピンホール板を用いず、集光レンズの焦点に光検出器の光電面が一致するようにして光検出器を設置する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、乾燥系でＮＡ＞１が実現でき、試料容器を高精度に位置決めすることなく、バックグラウンド除去効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図４は、本発明による光検出装置の検出系部分の構成図である。本発明では、図４に示すように、試料容器２の底を曲面形状として、集光点３から放射された蛍光が試料容器から射出されるとき平行光束となるようにし、さらにピンホールを蛍光集光レンズ５の焦点８に設置する。
【００１２】
図５は、図４に示した検出系において、試料容器と集光レンズの相対位置がベスト位置から光軸に垂直な方向にずれた場合の模式図である。このように試料容器と集光レンズの間を平行光束にした結果、両者に位置ずれが生じても収差が発生せず、蛍光がピンホールを通過する効率が高く維持される。
【００１３】
光を透過させる部材の代表的材質は、石英、ＢＫ７、アクリル系プラスチックであり、これらの材質の屈折率は約１．５（より詳しくは１．４６〜１．５４）である。光ディスク用のレンズなども上記の材質で構成されている。一方、本発明における試料容器では、内面が屈折率１．３〜１．４の液体と接するため、屈折率１．５では内面での屈折力が不足することが予想される。そこで、素材の屈折率と達成可能なＮＡについて光線追跡シミュレーションにもとづいて詳細な解析を行った。以下では容器材質の屈折率をｎで表す。
【００１４】
よく知られているように、一点からの光を実質無収差で平行にする形状は、外面頂点の曲率半径Ｒ１、試料容器を一種のレンズ系とみなしたときの焦点距離ｆ、中心軸上の厚さｔ１の３つのパラメータのみで一意的に定まる。相似な形状は同一形状とみなせば、試料容器の形状を表す独立なパラメータは規格化された曲率半径（Ｒ１／ｆ）と規格化された厚さ（ｔ１／ｆ）だけである。つまり試料容器形状はこれら２つの数値の組合せ（Ｒ１／ｆ、ｔ１／ｆ）で表される。また、試料容器外面の接平面と容器中心軸に直交する平面とのなす角度θが、ブリュースター角arctan(ｎ)より大きくなると、容器外面での蛍光の反射率が急激に増大し、実質的には光が通らなくなる。そこでθ＜arctan(ｎ)という条件を満たしつつ、ＮＡ＞１となる容器形状の範囲をシミュレーションにより求めた。その結果を図６に示す。黒く塗りつぶされた範囲がＮＡ＞１となる範囲である。このようにｎ＝１．５ではＮＡ＞１となる範囲が存在せず、ＮＡ＞１を得るには少なくともｎ≧１．５５が必要で、より広い範囲でＮＡ＞１を得るにはｎ≧１．６が好ましいことがわかる。したがって、本発明の試料容器の材質の条件として、屈折率１．５５以上が必要で、好ましくは屈折率１．６以上、より好ましくは１．７以上であることがわかる。
【００１５】
本発明の光検出装置は、低価格で簡便な蛍光相関分光装置、超高感度の蛍光プレートリーダー、フローサイトメーターなどに利用できる。
【００１６】
以下、図面に従って本発明の実施の形態を具体的に説明する。
【実施例１】
【００１７】
図７は、本発明による光検出装置の第一の実施例の構成図である。光源１１は波長５３２ｎｍ、出力１ｍＷのレーザである。光源１１から射出した平行な励起ビーム１２は、励起フィルタ１３を通してスペクトル純度を高めた後にダイクロイックミラー１４で反射され、平行光束のまま試料容器２の底部に照射され、試料１中の集光点３に集光される。励起光照射により集光点３に存在する生体分子から放射された蛍光４は、容器界面の屈折によって平行光束として容器２の底部から射出され、ダイクロイックミラー１４を透過し、蛍光フィルタ１５で、５３２ｎｍ励起ビームの散乱光など蛍光波長以外の波長を持つ成分を遮断した後に、集光レンズ５でピンホール板６に設けられたピンホールに集光される。ピンホールの位置は集光レンズ５の焦点８の位置に設定される。ピンホールによって、試料の集光点以外の部分や試料容器からの発光が遮断され、集光点からの蛍光のみがピンホールを通過後、光検出器７で検出される。本検出系のＮＡは１．１５であり、集光点における励起ビーム直径は１μｍ、集光レンズ５の結像倍率は１０倍、ピンホール直径は１０μｍとした。試料の溶媒は、屈折率１．３５１の６倍のＳＳＣバッファーである。試料容器の材質は屈折率１．７の樹脂である。試料容器と集光レンズの間は空気であり、このように集光レンズ底部に曲面を設けたことにより、乾燥系で１より大きいＮＡを実現できた。
【００１８】
試料容器２の外面及び内面はいずれも次式で表される非球面である。
【００１９】
【数１】
0004782593.tif 000002
【００２０】
ここで、r=√(x2+y2)、ｃは頂点の曲率、Ｋはコーニック定数、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈは非球面係数である。本実施例における試料容器２の外面及び内面を表すコーニック定数と非球面係数、及び中心軸での厚さを表１に示す。ｒ及びｚの単位はｍｍである。このように両面を非球面とすることにより、収差を波面収差０．０７λｒｍｓ以下の回折限界の分解能で集光点からの蛍光を平行光に変換することができる。本実施例で得られた検出ＮＡは１．１５である。
【００２１】
【表１】
0004782593.tif 000003
【００２２】
光源１１、光検出器７、及び光を透過又は反射する素子類は筐体２０の内部に固定されている。試料容器２とダイクロイックミラー１４の間には光が透過するよう筐体２０に穴が設けられており、この穴は透明な窓板１６でふさがれている。この窓板を設けることにより、試料容器からこぼれた試料や外気からの埃がダイクロイックミラー以下の光学素子に付着するのを防げるという効果がある。
【００２３】
試料容器２は、筐体２０上に固定された容器台２１の上に設置される。試料容器２には位置決め用の穴２３−１，２３−２が設けられており、これらの位置決め用の穴に、容器台２１上に固定された位置決めピン２２−１，２２−２が納まるように試料容器２を置くことにより、蛍光４及び励起光１２の光軸と試料容器２の対称軸との距離が０．１ｍｍ以内に収まるように、自動的に試料容器２が位置決めされる。図８は上方から見た、容器台２１より上の部分の図である。このように、試料容器２には位置決め用の穴２３−１、２３−２に、それぞれ位置決めピン２２−１と２２−２がはまっている。
【００２４】
図９は、本実施例と、本実施例の検出系を図２に示した従来の検出系におきかえた系における、容器位置の基準位置からのずれと、生体分子からの蛍光検出効率の関係を示す図である。この場合においては、試料容器の内面・外面はともに球面であり、第一の実施例とほぼ同じＮＡ１．１４である。Δｙは試料容器の理想位置からの検出系の光軸と直交する方向へのずれ、Δｚは光軸方向へのずれである。図９に示すように、図２のような系では試料容器位置が１０μｍずれただけで蛍光検出効率が激減するのに対し、本発明によれば、試料容器位置が０．１ｍｍずれても効率がほとんど変化しない。
【００２５】
以上のように、本発明によれば乾燥系によってＮＡ＞１を実現でき、しかも試料容器の位置がずれてもほとんど検出効率が低下しない蛍光検出系が実現される。この結果、試料容器を取り替えて多数の試料を分析するような場合、試料容器を設置する位置の調製が不要となり、実用上極めて有利である。また、試料容器の位置決め精度が厳しくないので、多数の試料容器を載せたプレートを自動の並進ステージで駆動して多数試料の連続自動分析を行うことも可能になる。特に、プレートを一定速度で駆動する場合、図２の方式では±０．０１μｍ程度の幅を移動する時間しか１試料の測定に使用できないのに対し、本発明によれば±０．１ｍｍ以上の幅を移動する時間を測定に使うことができる。すなわち測定時間を１０倍以上とれることになり、√１０〜３倍以上のＳ／Ｎ向上が見込まれる。
【実施例２】
【００２６】
図１０は、本発明の第二の実施例における試料容器の平面図及び断面図である。本実施例では複数の試料１−１〜１−９６を入れられるように試料容器２に複数のウェルを設け、各ウェルの底部に曲面を設けて第一の実施例と同様の効果が得られるようにした。本実施例では、市販の試料分注ロボットによる試料移送がしやすいよう、ウェルの配置を、一般的な試料調製プレートと同一の９ｍｍピッチ、８列１２行とした。もちろん４．５ｍｍピッチ、１６列２４行としても良い。第一の実施例と同様、試料容器２には２つの位置決め穴２３−１、２３−２が設けられている。
【００２７】
本実施例における、励起光の照射及び蛍光検出の光学系は基本的に第一の実施例と同一である。図１１は、光検出装置に取り付けた試料容器２の周辺の拡大図である。本実施例では試料容器２を置く台２１は自動ｘｙステージ３０に固定されており、試料容器２がｘｙ方向に移動される。自動ｘｙステージ３０の位置決め精度は±０．０５μｍであり、この精度で各ウェルの中心軸が検出光学系の光軸と一致するように試料容器２は位置決めされて静止し、そのウェルからの蛍光が検出される。コンピュータ制御により、この位置決め・蛍光検出のサイクルが各試料１−１〜１−９６に対して自動で行われる。このように本実施例では台２１上に試料容器２を１度セットするだけで、９６個の試料を自動で分析できるという効果が有る。もちろん、１６列２４行の試料容器を用いれば３８４個の試料を自動で分析できる。いうまでもなく、試料の行数、列数は以上に上げた数値に限定されない
【実施例３】
【００２８】
本発明の第三の実施例の構成は第二の実施例とほぼ同様であるが、ｘｙステージ３０を各ウェルの軸と蛍光検出系光軸と一致するたびに静止させることなく、一つの列にわたってほぼ一定速度で駆動し、ウェルの軸と検出系光軸が±０．１ｍｍの範囲で一致する間に蛍光を検出する。従来の光学系では±０．０１ｍｍで一致する間しか効率良く蛍光を検出できなかったが、図９に示すように本発明の光学系によれば±０．１ｍｍで一致する間は効率よく蛍光を検出できる。その結果、従来方式の約１０倍の時間、蛍光検出が可能となり、このような連続一定速度駆動でも十分なＳ／Ｎで蛍光検出が可能となる。本実施例では、試料容器２を高精度に位置決めする必要がないので、自動ｘｙステージを駆動するモーターとしてステッピングモーターが不要となり、安価なＤＣモーターで対応可能となり、その結果コスト低減が図れるという効果がある。
【実施例４】
【００２９】
図１２は、本発明の第四の実施例における試料容器２の断面図である。本実施例における試料容器２の形状は第二の実施例におけるそれとほぼ同一であるが、第二の実施例では試料容器が樹脂の一体成型であったのに対し、本実施例では２つの部材２Ａと２Ｂの貼り合わせで構成されている。図１３は本実施例の試料容器２の製造工程を示す図である。円柱状の貫通穴がアレイ状に設けられた部材２Ａを、下面に試料容器の底部となるレンズ状の凸部が部材２Ａと同様にアレイ状に設けられた部材２Ｂに位置決めして接着剤によって貼り合わせる。
【００３０】
このように２つの部材の貼り合わせによって試料容器を製造した結果、各部材の形状が簡単となって製造コストが大幅低減し、貼り合わせの工程が増えたにもかかわらずトータルでの製造コスト低減効果が得られた。特に部材２Ａは、単なる貫通穴付きの平面基板で極めて製造が容易であるばかりか、部材２Ｂと違って透明である必要性がないので、材料選択の幅が著しく広くなる。部材２Ｂに不透明な材料を採用することにより、外来光の遮光が容易になる。ここでは複数のウェルを有する試料容器について説明したが、図７に示すような、単一の試料収容部を有する試料容器を、２つの部材の貼り合わせによって製造することもできる。
【実施例５】
【００３１】
図１４は、本発明の第五の実施例における試料容器２近傍の断面の拡大図である。本実施例では、試料容器２に透明なふた２４を付け、ふた２４の下面の一部が試料液面に接触するようにした。この結果、励起光が試料／空気界面において散乱することなく試料容器上方に通りぬけ、試料表面での散乱光に起因する背景光の上昇が低減される。ふた２４の材質としては、屈折率が試料に近い材質が好適に利用できる。本実施例では試料屈折率が１．３６であったので、低屈折率のアクリル系樹脂（屈折率１．４２）を使用した。また、ふた２４の上面（空気／ふた界面）に反射防止膜を設けることにより、さらなる散乱低減をすることができる。
【実施例６】
【００３２】
図１５は、本発明の第六の実施例における試料容器２近傍の断面の拡大図である。本実施例では、第５の実施例と同様に試料容器２のふた２４を設けるが、その材質を透明な部材でなく、光吸収性の材質とすることで第５の実施例と同様の効果を得た。本実施例ではふた２４の材質として黒色のポリカーボネートを使用したが、光を良く吸収する部材なら何でも良い。ふた２４の光が照射される部分に円錐状のくぼみ２５を設けることにより、光が吸収される効率の向上を図っている。また、ふたの材質そのものは光を吸収しなくても、励起光が照射するエリアに光吸収性のコーティングを施すことにより同様の効果を得ることができる。
【実施例７】
【００３３】
図１６は、本発明の第七の実施例の光学系を示す図である。本実施例の構成は基本的には第一の実施例と共通であるが、光検出器７の光電面２６を集光レンズ５の焦点８を内包するように設置することにより、メカニカルなピンホール板６を省略している。この構成では、ピンホール無しで、光電面の有効径と等しい径の穴を有する遮光板を焦点位置に置いた場合と同一のバックグラウンド除去効果が得られる。本構成に固有の効果は機構部品を一点減らせることである。
【００３４】
本実施例の光学系を備える光検出装置に対しても、前記実施例１〜６で説明した構成をそれぞれ適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】従来のピンホールを有する蛍光検出系の構成図。
【図２】底面が曲面の試料容器と従来のピンホールを有する蛍光検出系とを組合せた構成図。
【図３】従来の光学系において試料容器と集光レンズの相対位置がずれた場合の様子を示す図。
【図４】本発明による検出光学系の構成図。
【図５】本発明の検出系において試料容器と集光レンズの相対位置がずれた場合の様子を示す図。
【図６】ＮＡ＞１となる試料容器形状の範囲を示す図。
【図７】本発明の第一の実施例の構成図。
【図８】上方から見た、容器台２１より上の部分の拡大図。
【図９】本発明と図２の系において、蛍光検出効率と集光レンズと試料容器との相対位置ずれとの関係を示す図。
【図１０】本発明の第二の実施例における容器の正面図及び断面図。
【図１１】本発明の第二の実施例における容器周辺の正面図。
【図１２】本発明の第四の実施例における容器の断面図。
【図１３】本発明の第四の実施例における容器の製造工程図。
【図１４】本発明の第五の実施例における容器近傍の断面図。
【図１５】本発明の第六の実施例における容器近傍の断面図。
【図１６】本発明の第七の実施例の構成図。
【符号の説明】
【００３６】
１，１−１〜１−９６：試料、２：容器、２Ａ、２Ｂ：容器部材、３：集光点、４：蛍光、４’：仮想的な平行化された蛍光、５：集光レンズ、６：ピンホール板、７：光検出器、８：焦点、９：容器中心軸、１０：レンズ光軸、１１：光源、１２：励起ビーム、１３：励起フィルタ、１４：ダイクロイックミラー、１５：蛍光フィルタ、１６：窓板、２０：筐体、２１：台、２２−１，２２−２：位置決めピン、２３−１，２３−２：位置決め用穴、２４：ふた、２５：円錐状のくぼみ、２６：光電面，３０：ｘｙステージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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