(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の遺伝子治療のためのベクターであって、そのＤＮＡ配列が
ａ）テロメラーゼの触媒サブユニットのプロモーターまたはサイクリン-Aのプロモーターである組織特異的プロモーターの制御下においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする第１配列；
ｂ）１番目のＴ７プロモーターの制御下にある少なくとも１個の治療遺伝子であって、当該治療遺伝子がシトシンデアミナーゼ（CD）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）のDNA結合ドメイン（DBD）、および細胞傷害性プロテアーゼ２Aおよび３Cの群から選択された少なくとも１種のタンパク質または前記タンパク群の中から選択された少なくとも２種からなる融合タンパク質をコードするものである；および
ｃ）２番目のＴ７プロモーターの制御下にあるＴ７RNAポリメラーゼをコードする第２配列；
よりなるベクター。
【請求項２】
前記の治療遺伝子が、シトシンデアミナーゼ（CD）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）のDNA結合ドメイン（DBD）、および細胞傷害性プロテアーゼ２Aおよび３Cの群から選択されたタンパク質をコードしている、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記の細胞傷害性プロテアーゼ２Aおよび３Cがピコルナウイルスに基づいた、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記の細胞傷害性プロテアーゼ２Aおよび３CがコクサッキーウイルスB群に基づいた、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
前記の細胞傷害性プロテアーゼ２Aおよび３CがB３血清型のものである、請求項２に記載のベクター。
【請求項６】
前記の治療遺伝子が前記タンパク質群の中から選択された少なくとも２種からなる融合タンパク質をコードしている、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
前記の治療遺伝子が２つのタンパク質の間にペプチドリンカーをコードしている、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記のリンカーがグリシンを含んでなる、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記のリンカーが８〜１０個のグリシンを含んでなる、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記の融合遺伝子が、CD-リンカー-ＨＳＶ−ＴＫ、CD-リンカー-ＤＢＤ、CD-リンカー-２Ａ、CD-リンカー-３C、HSV-TK-リンカー-ＤＢＤ、HSV-TK−リンカー-２A、HSV-TK−リンカー-３C、DBD-リンカー-２ＡおよびDBD-リンカー-３Cからなる群から選択されたものである、請求項６ないし９に記載のいずれかのベクター。
【請求項１１】
ウイルスベクターに基づいた、請求項１ないし１０に記載のベクター。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターに基づいた、請求項１ないし１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づいた、請求項１ないし１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のベクターをコードするレトロウイルス。
【発明の詳細な説明】
本発明は腫瘍の遺伝子治療のための、特に放射線療法に関してのベクターであって、そのDNA配列が少なくとも1つの組織特異的プロモーターと、その発現がそのプロモーターによって制御される少なくとも1つの治療遺伝子を有するベクターに関する。
【０００１】
DE4444949C1にはこの種のベクターが開示されている。
本発明の目的では、「腫瘍」とは悪性および良性腫瘍のいずれをも意味する。悪性腫瘍性疾患は先進国の死因の30%を占めており、ここ数十年の世界的な努力にも関わらず、現在のところどの腫瘍にも安全な治療法というものはまだない。すべてではないにしても多くの腫瘍がかろうじて治療できるというに過ぎない。
【０００２】
良性腫瘍の例として血管壁の腫瘍があり、これには癌などの悪性腫瘍の治療法がある程度用いられる。このような血管壁の腫瘍は、実質的に、器官への血液供給を制限する血管壁の局部的狭窄の治療用のいわゆる「バルーン拡張法」(PTCA)によって引き起こされた血管壁内での平滑筋細胞増殖の誘導によるものである再狭窄として生じる。このような動脈硬化症の治療はバルーン拡張法の他、バイパス手術、ステント法、および同様に再狭窄、すなわち処置した血管の管腔の、良性腫瘍による閉塞の問題を伴うその他の治療法がある。
【０００３】
悪性および良性腫瘍双方の外科的除去ならびに細胞増殖阻害剤によるその治療の他、現在の見地から放射線療法が最も重要な腫瘍治療の柱の1つである。これについては、腫瘍の破壊の確率は施与する線量に依存し、施与する線量は必然的に照射される正常組織の放射線感受性によって制限される。従って、治療の成否は付近の組織の細胞に対する腫瘍細胞の相対的な放射線感受性に依存している。結果として、腫瘍細胞の選択的放射線感受性による治療領域の拡大は腫瘍の治療に向けた重要なステップを意味し、治癒率を高めることになる。このため、放射線に対する腫瘍細胞の感受性を高くすべく薬理学的放射線増感剤がすでに臨床で用いられている。
【０００４】
遺伝子治療は、放射線療法または細胞増殖阻害剤による治療を増強するために治療遺伝子の使用を可能にすることで、癌を制御する上で重要な発展を達成する機会をはじめて与えるものである。
これについては、治療遺伝子を導入する際にはウイルスベクター系が大きな役割を果たす。ある程度まで増殖細胞を好み、細胞のゲノムに組み込まれることが多いレトロウイルスベクターの他、特に高力価のウイルス粒子を獲得できるようになり、かつ、良好な導入効率と極めて低い組み込み率を有するアデノウイルス系も議論に上っている(Ali et al., Gene Ther. (1991), Volume 1, 367-384)。
【０００５】
安全な遺伝子治療にとって重要なことは、その治療遺伝子が所望の標的細胞のみで使用されるということである。従って、種々の腫瘍種では活性であるがあらゆるタイプの正常組織では活性でない腫瘍細胞特異的プロモーターが腫瘍の遺伝子治療に用いるのには望ましい。しかしながら、このようなプロモーターはまだ見つかっていない。
これについて、最初に記載したDE4444949C1には、腫瘍を外科的に摘出した後通常の放射線照射および／または細胞増殖阻害法を用いた後処理を受けた患者の遺伝子治療用のベクターが記載されている。このベクターは腫瘍細胞において活性なプロモーターの後に置かれ、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)のDNA結合ドメイン(DBD)をコードする発現挿入DNAを含む。この文献が基にしている概念は、損傷を受けたDNAの修復が阻害されるようにDBD分子を付加することにより、DNA損傷を修復するのに必要な酵素PARPの活性を阻害することである。
【０００６】
組織特異的プロモーターの一例としてMVMP4プロモーターが挙げられる。このベクターはウイルスベクターであって、このウイルスには複製能がなく、トランスで相補されればDBDをコードするウイルスが得られるが、患者内では増殖できない。
P4プロモーターは安全な遺伝子治療に必要とされる組織特異性をまだ持っていないのでDNA修復は正常組織でも阻害されるということが既知のベクターの欠点だということが分かっており、このことはその理由についてさらに説明する必要はないし、それは望まれてもいない。
【０００７】
従ってほとんどの遺伝子治療のアプローチは、免疫応答の局部的増強腫瘍に限られたものではないので、組織特異的免疫応答(すなわち、それらは先天的なものである)の増強を含む。同時に、原則的にはこの治療法を用いて転移を阻害することもできるのでこれはまた望ましい利点である。
多少なりとも局部的遺伝子治療を可能とするために、分裂細胞だけに遺伝子を導入するレトロウイルスの使用がすでに議論されている。さらに、p53陰性腫瘍細胞でしか複製しないことになっているアデノウイルス変異株が提案されている; Heise et al., Net. Med. (1997), Volume 3, 639-645。ここではp53陽性細胞のすべてこのアデノウイルスの複製は抑制できるものと仮定されている。
【０００８】
さらに、Joki et al., Bum. Gene Ther. (1995), Volume 6, 1507-1513は放射線誘導性プロモーターを用いた提案をすでに行っており、Nettelbeck et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1998), Volume 451, 437-440は細胞周期特異的プロモーターを用いた提案をしている。
しかし、これら公知の問題はいずれも特定の欠点を持っている。免疫療法の概念は、免疫抑制患者はそれに応答できないという基本的な欠点を持っており、腫瘍性疾患自体はしばしばさらにその患者の免疫系に副作用を及ぼす。また、免疫治療遺伝子、すなわち標的細胞を死滅させる「自殺遺伝子」はそれだけではin vivo投与に十分ではないことが分かっている; Uckert et al., HUM. GENE THER. (1998), Volume 9, 855-865。適当であれば自殺遺伝子とともにいくつかの免疫刺激遺伝子を組み合わせることも、これまでのところは、ある腫瘍性疾患の標準適用となる突破口へ導くものではない。
【０００９】
さらに上記レトロウイルスは腫瘍にもっぱら特異的というわけではなく、適当な受容体が存在する限りすべての分裂細胞種に感染する。また、レトロウイルスは細胞ゲノムに組み込まれることから、健康な細胞の感染には挿入突然変異誘発の危険性が伴う。特異的腫瘍治療に対して提案されている複製能のあるアデノウイルスも、以前から分かっているように腫瘍細胞特異的ではなく、その効果もp53の状態に左右されないものである; Rothmenn et al., J. Virol. (1988), Volume 72, 9470-9478。
【００１０】
従前に記載した自殺遺伝子の使用も、これらの遺伝子が健康な増殖組織の副作用を増強することから欠点を持つ。この問題は自殺遺伝子が腫瘍特異的に発現した場合にのみ回避できよう。
上の点で、本発明の目的は腫瘍特異的に働き、正常な組織にはわずかな副作用しかない、最初に述べたタイプのベクターを提供することである。
本発明によれば、この目的はテロメラーゼの触媒サブユニットのプロモーターおよびサイクリン-Aのプロモーターからなる群より選択されるプロモーターにより、最初に述べたベクターを用いて達成される。
【００１１】
本発明が基にしている目的はこのようにして完全に達成される。
実際、本願の発明者らはテロメラーゼの触媒サブユニットのプロモーターが腫瘍特異的遺伝子治療に特に十分適合されていると認識している。すなわち、例えばHorikawa et al., Cancer Res. (1999), Volume 59, 826-830, およびTakakura et al., Cancer Res. (1999), Volume 59, 551-557により記載されたこのプロモーターは腫瘍細胞で極めて活性があり、全腫瘍の90%を上回るものがテロメラーゼ陽性である。また、該プロモーターはいくつかの増殖幹細胞、例えば生殖系細胞や血液幹細胞では活性が低く、例えば内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのような増殖細胞種の大多数では全く活性がない。
【００１２】
これについてWO98/11207は、癌治療という点で細胞増殖を阻害する産物を発現させるために、細胞トランスフェクションに関するテロメラーゼプロモーターの使用を開示している。しかし、この文献では放射線治療に関するテロメラーゼプロモーターの適用は述べられていない。
本発明に従って用いられるもう一つのプロモーターとしては、細胞周期のS期で活性化され、一方、休止細胞、すなわちG0期およびG1初期では抑制されるサイクリン-Aプロモーターがある; Henglein et al., PNAS (1994), Volume 91, 5490-5494。サイクリン-Aは細胞分裂のいくつかの調節経路に関与していることから、増殖細胞で治療遺伝子を発現させるのに例外的に十分適合している。ここで本願の発明者らは、腫瘍細胞が特に細胞周期の調節の欠損によって識別され、その結果、非制御的にS期に入るという発見に端を発する。この組織このようにサイクリン-Aプロモーターを選択すれば、治療遺伝子が腫瘍でのみ発現し、周辺の正常組織(たいていの場合、増殖活性がないか、低いものでしかないので)では発現しない。
【００１３】
治療遺伝子と組み合わせたサイクリン-Aプロモーターは良性腫瘍、特に最初に述べた再狭窄に関するものの治療に適しており、その治療法は本発明のベクターにより著しく改良される。これを背景に、本発明はまた良性腫瘍、特に再狭窄に関するものの治療法に関するサイクリン-Aプロモーターの使用に関する。
テロメラーゼの触媒サブユニットおよびサイクリン-Aの腫瘍特異的プロモーターによってもたらされる安全性の他、もう一つの安全性は、当技術分野で現在言われているように極めて局部的に腫瘍組織にのみ向けることができる放射線療法に関して、これらのプロモーターまたはそれによって制御される治療遺伝子を適用することによるものである。
【００１４】
腫瘍特異的に発現する種々の治療遺伝子と局部に向けられた放射線療法を組み合わせることで、腫瘍細胞をたとえ小さな倍率だけであっても隣接する組織より高い感受性で反応するようにすることが可能であり、結果として腫瘍は効果的に破壊することができる。
放射線療法で新しいベクターを用いることの他、化学療法に関してそれを使用することも、この方法で限局化されない転移を破壊することが可能となるので有利である。
【００１５】
これについては、以下のタンパク質群：シトシンデアミナーゼ(CD)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)のDNA結合ドメイン(DBD)、ピコルナウイルス、好ましくはエンテロウイルス、さらに好ましくはコクサッキーウイルスB群(CVB)、特にB3血清型の細胞傷害性プロテアーゼ2Aおよび3Cから選択されるタンパク質をコードしている治療遺伝子が好ましい。
【００１６】
シトシンデアミナーゼは5-フルオロシトシンを、複製中の細胞のDNAへ組み込まれ、次ぎにこれらの細胞を死滅させる5-フルオロウラシルへ変換する。局部的放射線療法に関する5-フルオロシトシンの全身処理は、腫瘍細胞でのみシトシンデアミナーゼが生じ、それによって隣接する細胞における壊死／線維形成、骨髄や腸粘膜の損傷などの懸念される副作用が避けられるので腫瘍の破壊の特異的増強がもたらされる。
【００１７】
HSV-TKも同様に働く。この酵素は、同様に複製中の細胞のDNAに組み込まれ、そのDNAを破壊するガンシクロビルを活性化し、その結果、局部的放射線療法に関してCDの場合と同様の利点が得られる。
CDおよびHSV-TKとは対照的に、DBD分子の発現は、DNA損傷の修復に必要なPARPの活性の阻害をもたらす。このように、局部的放射線療法に関しては「予め損傷された」腫瘍細胞に対して「修復」することはできないので、それらは死滅する。
【００１８】
これに対してプロテアーゼ2Aおよび3Cは細胞にアポトーシスを誘導することで細胞傷害性がある。
本願の発明者らは今般、第一に放射線療法、そして第二に上記2つのプロモーターによって組織特異的に発現される上記のタイプのタンパク質の組合せにより、腫瘍の選択的破壊が達成でき、これまで用いられてきた個々の方法よりも著しく効果的であることを見出した。
【００１９】
これについて、上記のタンパク質群から選択された少なくとも2つのタンパク質の融合タンパク質をコードする融合遺伝子が好ましく、好ましくは上記2つのタンパク質の配列領域間にあるこの治療遺伝子は、好ましくはグリシン、特に8〜10個のグリシンを含んでなるペプチドリンカーをコードしている。
ここで、治療遺伝子が特に共同作用的活性をもたらす融合タンパク質内で互いに異なる作用機構を有する2つの自殺遺伝子を含む場合に共同作用が達成され得るのが有利である。融合遺伝子を発現させる利点は、同時に2つの異なる治療因子を導入することができるので、その治療法において付加的な、またはしばしば共同作用的な効果をもたらすことができるということである。融合パートナーのタンパク質ドメインがこの適用にとって最適に折り畳むことができるよう、短いペプチドリンカー、好ましくは8〜10個のグリシンに関する情報をcDNAの間にクローニングすることが実際的であろう。
【００２０】
以下の融合タンパク質が特に好ましい：
CD-リンカー-HSV-TK、CD-リンカー-DBD、CD-リンカー-2A、CD-リンカー-3C、HSV-TK-リンカー-DBD、HSV-TK-リンカー-2A、HSV-TK-リンカー-3C、DBD-リンカー-2A、およびDBD-リンカー-3C。融合タンパク質内でのこれらの融合パートナーの順序は逆であってもよい。
全体として、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を基にしたベクターが好ましい。
【００２１】
本発明はさらに、新規なベクターをコードするレトロウイルスベクターに関する。
このように新規な遺伝子治療系は通常のウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれによっても、またレトロウイルスベクターによって生物に導入してもよく、そこでそれは実質的にこれまで可能であったものよりも腫瘍に対してより高い感受性を有する。
【００２２】
さらに、プロモーターと治療遺伝子の間に、プロモーターによって駆動され、かつ、それ自体で治療遺伝子の発現を制御する正のフィードバック系(この正のフィードバック系は好ましくはT7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含んでなる)を提供することが好ましく、プロモーターT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を制御し、T7プロモーターが治療遺伝子を制御することがさらに好ましく、T7プロモーターの制御下にT7 RNAポリメラーゼを含む第二の発現ユニットが提供されることがさらに好ましい。
【００２３】
この正のフィードバック系は、プロモーター、すなわちその正のフィードバック系が標的細胞のみで「誘発」されるよう確実を期すテロメラーゼまたはサイクリン-Aプロモーターによって標的細胞における治療遺伝子の高い発現を引き起こす。この正のフィードバックは、T7プロモーターがT7 RNAポリメラーゼを持たない真核細胞においてはサイレントであるので、副作用を示さずに治療効果を増幅する極めて安全な系となるという知見に基づくものである。
【００２４】
第一の発現ユニットでは、テロメラーゼプロモーターは、例えばT7 RNAポリメラーゼの発現を制御する。そして第二の発現ユニットはここでもまたT7 RNAポリメラーゼの発現を制御するT7プロモーターを含む。このように、T7 RNAポリメラーゼの産生は正のフィードバックによって増大する。第三の発現ユニットでは、治療遺伝子はT7プロモーターの制御下にあることから、正のフィードバックによるT7 RNAポリメラーゼの発現もまた治療遺伝子の発現を増強する。
【００２５】
上記および以下にもなお説明される特徴は各場合に示された組合せで使用できるだけでなく、本発明の範囲を離れない限り、その他の組合せまたはそれら単独でも使用できる。
本発明のさらなる特徴および利点は以下の好ましい実施形態の記載から明らかとなる。
以下、添付の図面を参照して実施例を説明する。
実施例1：ウイルスベクターの構成ブロックの作製
1.1  テロメラーゼプロモーター：テロメラーゼプロモーター配列は公知である; Horikawa et al., 同上およびTakakura et al., 同上。このプロモーターは例えば以下のプライマー：
フォワードプライマー：ATC AGC TTT TCA AAG ACA CAC
リバースプライマー：CGC GGG GGT GGC CGG GGC CAG
を用いてPCRにより細胞(例えば、HeLa腫瘍細胞)から増幅すればよい。
1.2  サイクリン-Aプロモーター：サイクリン-Aプロモーター配列も同様に公知である; Henglein et al., 同上。このプロモーターは以下のプライマー：
フォワードプライマー：CGT GTT AAA TAA TTT ATG CAC
リバースプライマー：CAC TGC TCC CGG GAG TGG ACG
を用いてPCRにより細胞、例えば、HeLa腫瘍細胞から増幅すればよい。
1.3  T7プロモーター：T7 RNAポリメラーゼプロモーター(約30bp)はプラスミドpCR-Script(Strategene)からBssHI/KpnI消化によって得ることができる。 T7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼプロモーターの配列は例えばDunn and Studier, J. Mol. Biol. (1983), Volume 166, 477-535; GenBank受託番号V01146, J02518, X00411に記載されている。
1.4  シトシンデアミナーゼ(CD)：CD遺伝子(1.3kb)は本出願人のプラスミドpcDNA3-CDからBamHI/NotI消化によって得ることができる。CD配列は例えばAustin and Huber, Mol. Pharmacol. (1993), Volume 43, 380-387; GenBank受託番号S56903により記載されている。
1.5  単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)：HSV-TK遺伝子(1.1kb)は本出願人のプラスミドpCDTKからBamHI/BglI消化によって得ることができる。HSV-TK配列はSuzutani et al., Microbiol. Immunol. (1995), Volume 39, 787-794; GenBank受託番号AB009255により記載されている。
1.6  ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)DNA結合ドメイン(DPD)：DBD(1.1kb)はプラスミドpPARP6からXbaI/SalI消化によって得ることができる; Kupper et al., J. Biol. Chem. (1990), Volume 265, 18721-18724。
1.7  CVB3プロテアーゼ2A：細胞傷害性プロテアーゼ2Aをコードする配列は本出願人のプラスミドpIND-2AからPme消化によって得られる。
1.8  CVB3プロテアーゼ3C：細胞傷害性プロテアーゼ3Cをコードする配列は本出願人のプラスミドpIND-3CからPme消化によって得られる。
【００２６】
Klump et al.はJ. Virol. (1990), Volume 64, 1573-1583; GenBank受託番号M33854; タンパク質2A: ヌクレオチド3304-3744; タンパク質3C: ヌクレオチド5362-5910でCVB3-cDNAの完全配列を記載している。
1.9  融合遺伝子：融合遺伝子とは、単一のプロモーターによって発現されて連続する融合タンパク質を与える数個、好ましくは2つのcDNAからなる治療遺伝子の連続配列を意味する。このようにして2つの治療因子を同時に導入することができ、この治療法では付加的または共同作用的な効果は得られる。
【００２７】
融合パートナーのタンパク質ドメインがこの適用にとって最適に折り畳むことができるよう、短いペプチドリンカー、好ましくはグリシン、特に8〜10個のグリシンに関する情報をcDNAの間にクローニングする。
このようにして以下の融合遺伝子が作製される：
CD-リンカー-HSV-TK、CD-リンカー-DBD、CD-リンカー-2A、CD-リンカー-3C、HSV-TK-リンカー-DBD、HSV-TK-リンカー-2A、HSV-TK-リンカー-3C、DBD-リンカー-2A、およびDBD-リンカー-3C。融合遺伝子内でのこれらの融合パートナーの順序は逆であってもよい。
1.10  T7 RNAポリメラーゼ(T7 Pol)：T7 Pol cDNA(2.6kb)は出願者のプラスミドpAR3132に由来し、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子のコドン11-883を含む。
【００２８】
構成ブロックの配列はthe National Library of MedicineのPubMed遺伝子バンク( HYPERLINK "http://ww4.ncbi.nlm.nih.gov/Pub-Med/)" http://ww4.ncbi.nlm.nih.gov/Pub-Med/)に寄託されている。
実施例2：組換えアデノウイルスの作製
組換えアデノウイルスは例えばVogelstein; He et al., PNAS (1998), Volume 95, 2509-2514のE1/E3欠損アデノウイルス-5系を用いて作製する。
【００２９】
発現させるcDNA、すなわち治療遺伝子はベクターpShuttle(6.7kb)にクローニングする。適用のために意図されるプロモーター(テロメラーゼまたはサイクリン-A)はこのcDNAの前にクローニングし、ポリアデニル化シグナルをそのcDNAの後にクローニングする。新たに得られたこのプラスミドをpAdBasylヘルパープラスミドとともに組換え能を有する菌株BJ5183へ形質転換する。
重複するシャトルおよびヘルパーベクター配列の相同組換えにより組換えアデノウイルスゲノムを得、これを細菌から単離して前処理のためにrecA-株HB101へ形質転換する。次ぎにこの細菌からプラスミド材料を前処理スケールで単離し、塩化セシウムによる遠心分離で精製する。
【００３０】
得られたプラスミド材料をE1を発現するヘルパー細胞系統911にトランスフェクトする; Fallaux et al., Hum. Gene Ther. (1996), Volume 7, 215-222。組換えアデノウイルスゲノムでトランスフェクションした後、細胞を軟寒天で覆う。その後ウイルスはトランスフェクト細胞で増殖してプラークを形成するが、このプラークから凍結-解凍溶解によって組換えウイルスを単離することができる。発現は2日後に検出できるが、細胞病理学的作用(CPE)はまだ明らかではない。ウイルス保存株は新たな911細胞に適当な組換えアデノウイルスを感染させることで得られる。約4日後、CPEが十分生じる。この細胞をDounceホモジナイザーで破砕し、細胞残渣を短時間の遠心分離でペレットとし、上清に存在しているウイルスを塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製する。
【００３１】
このようにして得られるアデノウイルスベクターは図1の上に示され、用いた略号は図面の凡例で説明されている。
実施例3：組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の作製
ここで用いられる系の例としては、2つのプラスミドとアデノウイルスを含んでなるSamulskiの系がある; Snyder et al., "Production of recombinant adeno-associated viral vectors", Current Protocols in Human Genetics. New York: John Wiley and Sons (1996), 12.1.1-12.1.24。
【００３２】
発現させるcDNA、すなわち治療遺伝子は調節配列(プロモーターおよびポリ-Aシグナル)とともにAAV-2末端反復のみを含むベクターにクローニングする。これらの反復は複製およびパッケージングに必要とされる最小のシス調節配列である; Xiao et al., J. Virol. (1997), Volume 71, 941-948。
このベクターはプラスミドpSub201(Human Gene Therapy Center, University of North Carolina, Chapel Hill, NC. USA)からXbaI消化によってrep/cap配列を切り出すことによって作製する。それぞれ0.18kbの末端反復がベクターに残存する。
【００３３】
次に、プロモーター、治療遺伝子のcDNAおよびポリアデニル化シグナルなどの特定の遺伝子導入系のために意図される構成ブロックを該ベクターにクローニングする。このようにして作製したベクタープラスミドを、それぞれAAV構造と非構造タンパク質(capおよびrep)をトランスで提供するヘルパープラスミドpAAV/Ad(Human Gene Therapy Center)293細胞へトランスフェクトとともにトランスフェクトする。翌日、野生型アデノウイルスをAAV複製のヘルパーとして細胞の3のMOIに加える。トランスフェクション／感染2ないし3日後、細胞病理学的作用(CPE)が十分顕在し、細胞から組換えAAVを得ることができる。
【００３４】
Snyder et al., 同上により記載されているように塩化セシウム精製法を行う。このAAV精製の必須要素は感染細胞の3回の凍結-解凍溶解とウイルスを遊離させる超音波処理、細胞内タンパク質を除去するための硫酸アンモニウム沈殿、超遠心分離によるCsCl勾配でのAAV粒子の精製、PBSによる精製AAV画分の透析、および56℃15分間のインキュベーションによる夾雑アデノウイルスの熱失活(AAVはこの処理では失活しない)である。
【００３５】
このようにして得られたAAVベクターは図1の中段で示されている。
実施例4：組換えレトロウイルスの作製
ここで用いられる系の例としては、Clonetech(Heidelberg)から得られる系である。この系はシャトルベクター、例えば細菌内へトランスフェクトすることで増殖させることができるpLNCX(6.2kb)、およびまたビリオンに対するベクターのトランス相補が可能なヘルパー細胞系統RetroPck PT67系統を含んでなる。
【００３６】
pLNCXシャトルベクターを用いる前にはこのベクターからCMVプロモーターを除去して、その後選択したプロモーター、すなわちテロメラーゼプロモーターまたはサイクリン-Aプロモーターで置き換える。次に、上記の治療遺伝子または融合遺伝子をポリアデニル化シグナルとともに多重クローニング配列へクローニングする。
この組換えベクターをパッケージング細胞系統PT67にトランスフェクトする。トランスフェクト細胞は抗生物質G418を用いることで選択することができる。その結果、組換えレトロウイルスが生じ、これは細胞および細胞培養上清から実施例2および3に記載されているものと同様の方法により得られ、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって精製することができる。
【００３７】
このようにして得られたレトロウイルスベクターは原則として図1の下に示されたものである。
実施例5：正のフィードバック系を有するアデノウイルスベクター
図2は実施例2に記載のようにして作製したアデノウイルスベクターを示す。ただし、単一のプロモーターと単一の治療遺伝子の代わりに、このベクターは3つの発現ユニットを含む。第一の発現ユニットはテロメラーゼプロモーターの制御下にあるT7 RNAポリメラーゼを含む。第二の発現ユニットもその独自のプロモーター、T7プロモーターの制御下にあるものであるが、同様にT7 RNAポリメラーゼを含む。最後に、第三の発現ユニットはT7プロモーターの制御下にある治療遺伝子を含む。
【００３８】
標的細胞が感染したとき、まずテロメラーゼプロモーターはT7 RNAポリメラーゼ(第一の発現ユニット)の発現を引き起こす。生じたT7 RNAポリメラーゼは第二の発現ユニットのT7プロモーターの「スイッチを入れ」、このT7プロモーターもT7 RNAポリメラーゼの産生を引き起こす。この結果、正のフィードバック系となり、T7 RNAポリメラーゼが生じれば生じるほどT7プロモーターのスイッチが入る。
【００３９】
このようにして、ここでT7プロモーターの制御下にある治療遺伝子の発現が増強する。
この系ではこのように、テロメラーゼプロモーターは治療遺伝子の発現を直接的ではないが、実施例2〜4のようにT7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼの正のフィードバック系の中間段階を介して間接的に制御する。
T7 RNAポリメラーゼを持たない真核細胞ではT7プロモーターはサイレントであってそこでは通常は見られないことから、その結果、治療遺伝子はテロメラーゼプロモーターが活性である細胞、すなわち特に腫瘍細胞のみで発現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  腫瘍細胞において治療遺伝子を発現するウイルスベクターを示す。
【図２】  腫瘍細胞において治療遺伝子の正のフィードバック発現を示すウイルスベクターを示す。
【図１】
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【図２】
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