(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス耐性である植物を産生するための方法であって、該方法は、該植物の細胞内にキメラ遺伝子を導入しトランスジェニック植物細胞を得ること、ここで、該キメラ遺伝子は、下記の動作可能に結合されたＤＮＡ領域：
（ａ）植物発現性プロモーター、
（ｂ）転写されたときにＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域であって、該ＲＮＡ分子は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子又はその相補物からの１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、及び
（ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含み、及び、
該トランスジェニック植物細胞から植物を再生すること、
ここで、該ストレスが、化学物質による処理で誘導されるストレス、寒冷ストレス、乾燥ストレス又は熱ストレスから選択される、
を含む方法。
【請求項２】
該キメラ遺伝子が、下記の動作可能に結合されたＤＮＡ領域：
（ａ）植物発現性プロモーター、
（ｂ）転写されたときにＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域であって、該ＲＮＡ分子は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができ、該ＲＮＡ分子は、
ｉ）該植物の内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンスヌクレオチド配列、及び
ii）該植物の内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列、
を含み、該センスヌクレオチド配列及び該アンチセンスヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡ領域内に結合することができ、
（ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含み、
該トランスジェニック植物細胞から植物を再生すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該キメラ遺伝子が、下記の動作可能に結合されたＤＮＡ領域：
（ａ）植物発現性プロモーター、
（ｂ）転写されたときにＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域であって、該ＲＮＡ分子は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができ、該ＲＮＡ分子は、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンスヌクレオチド配列、及び
ii）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の相補物と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列、
を含み、該センスヌクレオチド配列及び該アンチセンスヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡ領域内に結合することができ、
（ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＲＮＡ分子が、
ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号１０のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンスヌクレオチド配列、及び
ii）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号１０のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の相補物と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該植物発現性プロモーターが、構成プロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、交雑による該キメラ遺伝子を含むより多くの植物を産生する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該植物が、トウモロコシ、採油用セイヨウアブラナ、アマ、コムギ、イネ科植物、ムラサキウマゴヤシ、マメ科植物、アブラナ科植物、トマト、レタス、ワタ、イネ、オオムギ、ジャガイモ、タバコ、テンサイ、ヒマワリ、カーネーション、キク、バラ、チューリップからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
コントロールと比較したとき増加したストレス耐性を示すトランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物が、その細胞内に、下記の動作可能に結合されたＤＮＡ領域：
（ａ）植物発現性プロモーター、
（ｂ）転写されたときにＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域であって、該ＲＮＡ分子は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができ、該ＲＮＡ分子は、
ｉ）該植物の内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンスヌクレオチド配列、及び
ii）該植物の内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列、及び
（ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含むキメラ遺伝子を含み、ここで、該ストレスが、化学物質による処理で誘導されるストレス、寒冷ストレス、乾燥ストレス又は熱ストレスから選択される、トランスジェニック植物。
【請求項９】
該キメラ遺伝子が、下記の動作可能に結合されたＤＮＡ領域：
（ａ）植物発現性プロモーター、
（ｂ）転写されたときにＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域であって、該ＲＮＡ分子は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができ、該ＲＮＡ分子は、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンスヌクレオチド配列、及び
ii）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の相補物と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列、
を含み、該センスヌクレオチド配列及び該アンチセンスヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡ領域内に結合することができ、
（ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含む、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
該ＲＮＡ分子が、
ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号１０のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンスヌクレオチド配列、及び
ii）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号１０のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の相補物と１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列
を含む、請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
該植物発現性プロモーターが、構成プロモーターである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
該植物が、トウモロコシ、採油用セイヨウアブラナ、アマ、コムギ、イネ科植物、ムラサキウマゴヤシ、マメ科植物、アブラナ科植物、トマト、レタス、ワタ、イネ、オオムギ、ジャガイモ、タバコ、テンサイ、ヒマワリ、カーネーション、キク、バラ、チューリップからなる群より選択される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
該キメラ遺伝子を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の植物の種子。
【請求項１４】
植物の細胞内にヌクレオチド配列を導入することによってストレス耐性植物を産生するための植物ＰＡＲＰ遺伝子又はその相補物のヌクレオチド配列の使用であって、該ヌクレオチド配列又はその相補物が、該植物の内因性ＰＡＲＰ遺伝子からの１００連続ヌクレオチドと１００％の同一性を有する１００連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下するために用いられることを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）タンパク質、特にＰＡＲＰタンパク質突然変異体、又はその部分、及びそれをコードする遺伝子の、プログラムされた細胞死が改変された真核細胞及び生物、特に植物細胞及び植物を生成するための使用に関する。これらの細胞におけるＰＡＲＰタンパク質のレベル若しくは活性の調節によって、細胞、好ましくは選ばれた細胞の少なくとも一部で、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）が誘発されるか、又はその逆に、ある生物の細胞、若しくは細胞の少なくとも一部のＰＣＤが阻害されるかのいずれかである、真核細胞及び生物、特に植物細胞及び植物が与えられる。本発明は、そのような遺伝子を発現する、真核細胞及び生物、特に植物細胞及び植物にも関する。
【０００２】
（関連する技術の記載）
プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）は、動物・植物双方の選ばれた細胞の、発生過程の際の、又は環境的な合図に応答しての、排除に関連する生理学的な細胞死の過程である〔総説については、Ellis et al., 1991；Pennell & Lamb, 1997を参照されたい〕。ＰＣＤを生じている細胞の崩壊は、形態学的には、細胞質及び核の、しばしば小さく密閉されたパケットに至る、凝縮、収縮及び分断を伴う〔Cohen, 1993；Wang et al., 1996〕。生化学的には、ＰＣＤは、核ＤＮＡの、オリゴヌクレオソームを表す、一般的には約５０kbのフラグメントへの分断とともに、システインプロテイナーゼ及びエンドヌクレアーゼの誘導を特徴とする。ＤＮＡの分断は、細胞の切片におけるＤＮＡ３′−ＯＨ基の、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）によって検出することができる〔Gavrieli et al., 1992〕。ＰＣＤによる細胞死は、壊死とは明確に異なり、後者は、細胞の膨潤、溶解、及び細胞内容の漏出を伴う。
【０００３】
動物では、ＰＣＤは、変態におけるオタマジャクシの尾の細胞、脊椎動物の発生中の指の間の細胞、過剰生産された脊椎動物のニューロン、細胞特化の際の細胞、例えば角質細胞等々のような、望ましくない細胞の排除又は死に関連する。それ以後は適性に機能することができない損傷した細胞も、ＰＣＤによって排除され、それらが増殖及び／又は拡散するのが防止される。ＰＣＤ又はその欠如は、ヒトにおける数多くの病理学的状態（エイズ、アルツハイマー病、ハンチントン病、ルーゲーリッグ病、癌）にも関与している。
【０００４】
植物では、ＰＣＤは、例えば、胚の発生の際の胚柄細胞の除去、単子葉類の種子の発芽後の胚柄細胞の排除；種子発芽及び実生成長後の根冠細胞の排除；木部管状要素若しくは毛状突起、又は単性花で発育不全となる花器官の発生に見られるような細胞特化の際の細胞死のような、数多くの発生過程に関与することが立証され、又は考えられている。また、低酸素条件下の根における通気組織の形成、及びある種の植物における葉裂若しくは貫入の形成も、ＰＣＤを伴うと思われる。植物における大規模な細胞死は、葉その他の器官の老化の際に発生する。植物における過敏性応答、換言すれば悪性ではない病原体の進入部位に発生して、限定された病変へと導く急速な細胞死は、環境的な合図に応答してのＰＣＤのもう一つの例である。
【０００５】
懸濁培養、特に低密度細胞懸濁培養中に死ぬ、動物又は植物細胞も、ＰＣＤの特徴性を明らかに示す。
【０００６】
ＰＣＤ又はアポトーシスに関与することが示唆されている酵素は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼである。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）トランスフェラーゼ（ＡＤＰＲＴ）（EC2.4.2.30）としても知られていて、脊椎動物、節足動物、軟体動物、粘菌類、双鞭毛藻類、真菌類その他の、酵母を除く下等真核生物を包含する、ほとんどの真核生物に見出される核酵素である。酵素活性は、多数の植物でも立証されている〔Payne et al., 1976； Willmitzer & Wagner, 1982； Chen et al., 1994；O'Farrell, 1995〕。
【０００７】
ＰＡＲＰは、ＮＡＤ+に由来するＡＤＰ−リボース部分の、主として、標的タンパク質中のグルタミン酸残基のカルボキシル基への転移、及びその後のＡＤＰ−リボース重合を触媒する。主要標的タンパク質は、ＰＡＲＰ自身であるが、ヒストン、高移動度群染色体タンパク質、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼも、この修飾を受けることが示されている。
【０００８】
動物のＰＡＲＰタンパク質は、ほとんどの細胞種に多量に存在する１１３〜１２０kDaの核タンパク質であって、３個所の主要な機能的ドメイン：すなわち、２個所のジンクフィンガードメインを含む、アミノ末端ＤＮＡ結合ドメイン、カルボキシル末端の触媒性ドメイン、及び自己修飾される内部ドメインからなる〔de Murcia & Menissier de Murcia, 1994； Kameshita et al., 1984；Lindahl et al., 1995〕。in vitroでの酵素活性は、ＤＮＡの一本鎖切断に結合する際に非常に上昇する。in vivo活性は、結果的にＤＮＡ切断を生じる条件によって誘導される〔Alvarez-Gonzalez & Althaus, 1989； Ikejima et al., 1990〕。中央ドメインの自己修飾は、明らかに、ＰＡＲＰの負のフィードバック調節として役立つ。
【０００９】
植物細胞におけるＰＡＲＰ活性は、標識されたＮＡＤ+から根冠細胞の核への3Ｈの取込みを調べることによって、最初に立証された〔Payne et al., 1976；Willmitzer & Wagner, 1982〕。酵素活性は、トウモロコシの若芽からも部分的に精製され、１１３kDaという見かけ分子量のタンパク質に関連することが見出されて、植物ＰＡＲＰは、動物からの酵素に類似する可能性があることが示唆された〔Chen et al., 1994；O'Farrell, 1995〕。
【００１０】
ＰＡＲＰに対応するｃＤＮＡは、哺乳動物、ニワトリ、ツメガエル属、昆虫及びカエノラーブディチス・エレガンスCaenorhabditis elegansを包含する、いくつかの種から単離されている。Chenら（1994）は、トウモロコシの核におけるＰＡＲＰ活性を報告し、この酵素活性を、トウモロコシの核の抽出物中に存在する約１１４kDaのタンパク質の存在と結び付けた。O'Farrell（1995）は、トウモロコシから単離されたＲＮＡに対する、（最高度に保存された配列に基づく縮重プライマーを用いた）ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、３００bpのフラグメントを生じることを報告し、ヒトＰＡＲＰタンパク質とのアミノ酸レベルでの６０％の同一性を示した。Lepiniecら（1995）は、シロイヌナズナArabidopsis thalianaから、脊椎動物ＰＡＲＰの触媒ドメインに酷似する、７２kDaのタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡを単離し、クローニングしている。このタンパク質のＮ末端ドメインは、脊椎動物からの対応するＰＡＲＰとのいかなる配列類似性も示さないが、数多くの核タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質のＮ末端との類似性を示す、アミノ酸の４本の範囲（Ａ１、Ａ２、Ｂ及びＣと命名）で構築される。Ａ１及びＡ２の予測された二次構造は、らせん−ループ−らせん構造であった。
【００１１】
Genbankのデータベースは、トウモロコシZea maysからの２種類の配列を有するが、それに対する翻訳産物のアミノ酸配列は、従来のＰＡＲＰタンパク質（ＡＪ２２２５８９）、又はアラビドプシス属で同定されたような、非慣用的ＰＡＲＰ（ＡＪ２２２５８８）のいずれかとの相同性を有する。
【００１２】
真核細胞におけるＰＡＲＰ及びポリＡＤＰリボシル化の機能は、完全に明らかではない。ＰＡＲＰは、細胞分裂及び細胞分化でのＤＮＡの修復、複製及び組換えのような、多数の細胞性過程、又はゲノムの完全性の変化を感知する、シグナリング経路で直接にか、若しくは間接的にかのいずれかで関与しているか、或いは関与すると考えられている。ＰＡＲＰ活性は、細胞のＮＡＤ+プールを有意に減少させ得ることから、この酵素は、プログラムされた細胞死に決定的な役割を果たす可能性がある〔Heller et al., 1995；Zhang et al., 1994〕。更に、ＮＡＤ+加水分解から得られたニコチンアミド、又はポリＡＤＰ−リボースグリコヒドロラーゼによるポリＡＤＰ−リボースの代謝回転産物は、真核細胞におけるストレス応答シグナルであり得ることが示唆されている。
【００１３】
植物ＰＡＲＰの生物学的機能に関して現在入手できる情報は、ＰＡＲＰ阻害剤を関与させる実験から得られていて、タバコにおける相同染色体内組換え率が、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢＡ）の適用後に上昇することから、ＤＮＡ損傷の部位での相同組換えの妨害におけるin vivoでの役割が示唆される〔Puchta et al., 1995〕。更に、ヒャクニチソウ属又はキクイモHelianthus tuberosumへのＰＡＲＰ阻害剤、例えば３−ＡＢＡ、ニコチンアミド及び６（５Ｈ）−フェナストリジノンの適用は、管状要素の発生を妨害することが示され〔Hawkins & Phillips, 1983；Phillips & Hawkins, 1985；Shoji et al., 1997；Sugiyama et al., 1995〕、植物におけるプログラムされた細胞死の例であると見られている。
【００１４】
ＰＣＴ出願の国際公開特許第９７／０６２６７号公報は、真核細胞、特に植物細胞の形質転換を（質的にか、又は量的に）改良するための、ＰＡＲＰ阻害剤の使用を記載している。
【００１５】
Lazebnikら（1994）は、動物細胞のアポトーシスでの初期の事象である、ＰＡＲＰを切断できる、インターロイキン１−β転換酵素に類似する特性を有するプロテアーゼ同定した。
【００１６】
Kuepperら（1990）、及びMolinetteら（1993）は、トランスフェクションしたＣＶ−１サル細胞又はヒト繊維芽細胞における、４６kDaのヒトＰＡＲＰＤＮＡ結合ドメイン、及びその様々な突然変異体形態の過剰産生を記載し、これらの細胞における、常在ＰＡＲＰ活性のトランス優性阻害、及びその結果としての塩基除去ＤＮＡ修復の遮断を立証している。
【００１７】
Dingら（1992）、及びSmulsonら（1995）は、哺乳動物細胞におけるアンチセンスＲＮＡ発現によるＰＡＲＰの欠乏を記載し、ＤＮＡ鎖切断の結合の遅延、及び３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化の阻害を観察している。
【００１８】
Menissier de Murciaら（1997）、及びWangら（1995、1997）は、ＰＡＲＰ遺伝子が突然変異したトランスジェニック「ノックアウト」マウスを作り出して、ＰＡＲＰが必須タンパク質ではないことを示している。しかし、ＰＡＲＰ欠乏マウスの細胞は、よりＤＮＡ損傷に感受性であり、誘導された細胞死のいくつかの面で動物の正常細胞と異なる〔Heller et al., 1995〕。
【００１９】
（発明の要約及び目的）
本発明は、真核細胞におけるプログラムされた細胞死を調節する方法であって、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列、及びＮＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列を用いて、好ましくは、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させるか、内因性ＰＡＲＰ遺伝子がコードするタンパク質の見かけの活性を低下させるか、又は内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列を変更して、真核細胞のＰＡＲＰ活性全体の機能レベルを低下させることを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、第一及び第二のＰＣＤ調節キメラ遺伝子を真核細胞、好ましくは植物細胞に導入することを含む、真核細胞におけるプログラムされた細胞死を調節する方法であって、該第一ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、動作可能に結合されたＤＮＡ領域である：真核細胞内で機能的であるプロモーター；転写されたときに、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質を含むジンクフィンガーの機能レベルを低下させることができるか、又は発現されたときに、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質の機能レベルを低下させる、ペプチド若しくはタンパク質に翻訳されることができるかのいずれかのＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；並びに転写終結及びアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含み、
【００２１】
該第二ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、動作可能に結合されたＤＮＡ領域である：該真核細胞内で機能的であるプロモーター；転写されたときに、ＮＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質の機能レベルを低下させることができるか、又は発現されたときに、ＮＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質の機能レベルを低下させる、ペプチド若しくはタンパク質に翻訳されることができるかのいずれかのＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；並びに転写終結及びアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含み、そして該真核細胞における見かけのＰＡＲＰ活性全体を有意に（好ましくは、見かけのＰＡＲＰ活性全体を、真核細胞における正常な見かけのＰＡＲＰ活性から約７５〜約９０％低下させ、該真核細胞を、プログラムされた細胞死から防護する）か、又はほとんど完全に（好ましくは、見かけのＰＡＲＰ活性全体を、該真核細胞における正常な見かけのＰＡＲＰ活性から約９０〜約１００％低下させ、該真核細胞を、プログラムされた細胞死によって死滅させる）低下させる方法も提供する。
【００２２】
好ましくは、該第一の転写されるＤＮＡ領域、若しくは該第二の転写されるＤＮＡ領域、又はその双方は、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子のセンスＤＮＡ鎖と７５％同一である、少なくとも約１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができるセンスＲＮＡ分子をコードする。
【００２３】
本発明が提供する、プログラムされた細胞死を調節する代替的な一方法では、該第一の転写されるＤＮＡ領域、若しくは該第二の転写されるＤＮＡ領域、又はその双方は、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子のセンスＤＮＡ鎖の相補体と７５％同一である、少なくとも約１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの該内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができるＲＮＡ分子をコードする。
【００２４】
本発明が提供する、プログラムされた細胞死を調節する代替的なもう一つの方法では、該第一及び／又は第二の転写されるＤＮＡ領域は、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の転写の結果得られるｍＲＮＡと７５％同一である、少なくとも約１００ヌクレオチドのセンスヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をコードし、該ＲＮＡ分子は、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの該内因性ＰＡＲＰ遺伝子の転写の結果得られる該ｍＲＮＡの相補体と７５％同一である、少なくとも約１００ヌクレオチドのアンチセンスヌクレオチド配列を更に含み、該センス及びアンチセンスヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができ、かつ該ＲＮＡ分子は、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの該内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができる。
【００２５】
本発明が提供する、プログラムされた細胞死を調節する代替的な更に一つの方法では、該第一及び／又は第二の転写されるＤＮＡ領域は、ＺＡＰ若しくはＮＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子がコードするＰＡＲＰタンパク質の見かけの活性を低下させ得る、好ましくは、SEQ ID NO:４第１〜１５９番アミノ酸のアミノ酸配列、若しくはSEQ ID NO:６第１〜１３８番アミノ酸のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はSEQ ID NO:２第１〜３７０番アミノ酸のアミノ酸配列、SEQ ID NO:１１第１〜９８番アミノ酸のアミノ酸配列、又は第１〜８８番アミノ酸のアミノ酸配列が、SEQ ID NO:１１のアミノ酸配列で置きかえられた、SEQ ID NO:２第１〜３７０番アミノ酸のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む、優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体をコードする。
【００２６】
該第一及び第二ＰＣＤ調節キメラ遺伝子、又はその双方のプロモーターは、組織特異的性若しくは誘導可能プロモーター、例えば、真菌応答性プロモーター、線虫応答性プロモーター、葯選択的プロモーター、柱頭選択的プロモーター、裂開帯選択的プロモーターから選ばれるプロモーターであってよい。
【００２７】
本発明は、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を植物細胞に導入することを含む、植物細胞におけるプログラムされた細胞死を調節する方法であって、該ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、動作可能に結合されたＤＮＡ領域である：植物発現性プロモーター；転写されたときに、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができるか、又は発現されたときに、該植物細胞における見かけのＰＡＲＰ活性を低下させるペプチド若しくはタンパク質に翻訳されることができるかのいずれかである、ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；並びに転写終結及びアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含み、該植物細胞における見かけのＰＡＲＰ活性全体を、該植物細胞における正常な見かけのＰＡＲＰ活性から約７５〜約１００％低下させる方法も提供する。
【００２８】
該第一及び第二ＰＣＤ調節キメラ遺伝子はもとより、該第一及び第二ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を含む真核細胞、特に植物細胞、並びにそのような細胞を含む非ヒト真核生物、とくに植物を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００２９】
ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を植物の細胞に導入することを含む、植物の細胞におけるプログラムされた細胞死を調節する方法であって、該ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、動作可能に結合されたＤＮＡ領域である：植物発現性プロモーター；転写されたときに、ＺＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができる、ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；並びに転写終結及びアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含む方法提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００３０】
本発明は、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を植物の細胞に導入することを含む、植物の成長速度を上昇させる方法であって、該ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、動作可能に結合されたＤＮＡ領域である：植物発現性プロモーター；転写されたときに、ＺＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができる、ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；並びに転写終結及びアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含む方法にも関する。
【００３１】
ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を植物の細胞に導入することを含む、植物のストレス耐性細胞を生成する方法であって、該ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、動作可能に結合されたＤＮＡ領域である：植物発現性プロモーター；転写されたときに、ＺＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させることができる、ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；並びに転写終結及びアデニル化に関与するＤＮＡ領域を含む方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００３２】
本発明は、ＰＡＲＰ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、植物細胞若しくは植物におけるプログラムされた細胞死を調節するためか、ストレス耐性である植物細胞又は植物を生成するためか、又は植物細胞又は植物の成長速度を上昇させるための用途にも関する。
【００３３】
（好適実施態様の詳細な説明）
本発明を目的として、用語「植物発現性プロモーター」とは、植物細胞での転写を駆動し得るプロモーターを意味する。これは、植物起源のいかなるプロモーターも包含するが、植物細胞での転写を指令できる非植物起源のいかなるプロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ又はＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターのような、ウイルス若しくは細菌起源の一定のプロモーターも包含する。
【００３４】
用語「遺伝子の発現」とは、調節性領域、特にプロモーターの制御下にあるＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち別の核酸若しくはタンパク質との相互作用が可能であるか、又は生物学的に活性であるポリペプチド若しくはタンパク質へと翻訳され得るかのいずれかである、ＲＮＡへと転写される過程を意味する。遺伝子は、該遺伝子の発現の最終産物が、生物学的活性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムであるとき、ＲＮＡをコードすると言われる。遺伝子は、該遺伝子の発現の最終産物が、生物学的活性タンパク質又はポリペプチドであるとき、タンパク質をコードすると言われる。
【００３５】
用語「遺伝子」とは、適切な調節性領域、例えば植物発現性プロモーターの制御下にある細胞内で、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ（「転写されるＤＮＡ領域」）を含む、いかなるＤＮＡフラグメントも意味する。したがって、遺伝子は、プロモーター、５′リーダー配列、コーディング領域、及びポリアデニル化部位を含む３′領域のような、動作可能に結合されたいくつかのＤＮＡフラグメントを含んでよい。内因性植物遺伝子は、植物種に天然に見出される遺伝子である。キメラ遺伝子は、植物種に通常は見出されないいかなる遺伝子、或いはこれに代えて、プロモーターが、自然界では、転写されるＤＮＡ領域の一部若しくは全部にか、又は該遺伝子の少なくとも一つの別の調節性領域に付随しない、いかなる遺伝子でもある。
【００３６】
本明細書に用いられる限りで、「含む」は、言及された限りでの、記載された特徴、完全なもの、工程又は構築要素の存在を特定するとして解されるものとするが、一つ又はそれ以上の特徴、完全なもの、段階若しくは構築要素、又はそれらの集まりの存在を排除しない。したがって、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む、核酸又はタンパク質は、実際に引用されたものより多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含む、すなわち、より大きい核酸又はタンパク質に包埋されていてよい。機能的又は構造的に定義されたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域等々を含んでよい。
【００３７】
本発明は、一方では、真核細胞、特に植物細胞、格別にトウモロコシZea maysの細胞が、大きさ及びアミノ酸配列は異なるが、ともにＤＮＡ、特に一本鎖切断を有するＤＮＡと結合でき、ともにポリＡＤＰリボシル化活性を有する、機能的に重要な少なくとも二つのＰＡＲＰタンパク質イソ型（クラス）を同時に含むという発見に基づく。他方では、本発明者らは、真核生物、特に植物におけるプログラムされた細胞死は、ＰＡＲＰ遺伝子の発現レベルを変更するか、又はコードされるタンパク質の活性を遺伝的に変更することによって調節できること、及びこの目標を達成するには、両遺伝子の発現を変更する必要があるか、又はこれに代えて、両クラスのタンパク質の活性を変更する必要があることを理解している。
【００３８】
真核細胞、特に植物細胞が、異なるクラスの遺伝子によってコードされるＰＡＲＰタンパク質の二つの機能的イソ型を含むことを示す技術の不足が、組換えＤＮＡ法による、これらの細胞におけるＰＡＲＰ活性の効率的な調節を妨げてきたことは明らかである。この方法及び手段の様々な実施態様は、説明、実施例及び請求項によって示す。
【００３９】
したがって、本発明は、真核細胞、好ましくは植物細胞におけるプログラムされた細胞死若しくはアポトーシスの、ＰＡＲＰ遺伝子の発現レベルの変更によるか、又は該真核細胞内のＰＡＲＰタンパク質の活性、若しくは見かけの活性の変更による調節、すなわち増強又は阻害に関する。好都合にも、ＰＡＲＰ遺伝子の発現レベル、又はＰＡＲＰタンパク質の活性は、ＰＡＲＰ遺伝子の発現を変更するＰＣＤ調節キメラ遺伝子の導入、及び／又はＰＡＲＰタンパク質の見かけの活性を変更するＰＣＤ調節キメラ遺伝子の導入、及び／又は内因性のＰＡＲＰコーディング遺伝子の変更によって、遺伝的に制御される。
【００４０】
本明細書に用いられる限りで、指定された細胞に関する「増強されたＰＣＤ」とは、本発明の方法によって誘発され、そのため、本発明の方法によって調節されない正常植物の類似の細胞と比較して、類似の条件下でＰＣＤを蒙る運命にはなかったような細胞の死を意味する。
【００４１】
指定された細胞に関する「阻害されたＰＣＤ」とは、通常は（本発明の方法による干渉なしには）、特定の条件下で、プログラムされた細胞死を蒙るはずであったような細胞又は細胞群の、より大きい画分が、これらの条件下で生存する過程として解されるものとする。
【００４２】
したがって、導入されたＰＣＤ調節キメラ遺伝子、又は調節された内因性遺伝子の発現は、ＰＡＲＰタンパク質の機能レベルに影響を及ぼし、プログラムされた細胞死に間接的に干渉することになる。ＰＡＲＰタンパク質の機能レベルの程々の低下は、プログラムされた細胞死の阻害、特にプログラムされた細胞死の防止へと導くのに対し、ＰＡＲＰタンパク質の機能レベルの重大な低下は、プログラムされた細胞死の導入へと導く。
【００４３】
本発明によれば、真核細胞、特に植物細胞におけるプログラムされた細胞死を阻害又は防止するには、ＰＡＲＰタンパク質、及び／又はその活性若しくは見かけの活性の組み合せたレベルの両方を有意に低下させるが、（ＰＡＲＰに直接又は間接的に支配される）ＤＮＡ修復が、ＰＡＲＰタンパク質の機能が阻害された細胞が、ＤＮＡ損傷から回復できないようにしてか、又はそのゲノムの完全性を維持できないようにして阻害されることは回避するのが好ましい。好ましくは、標的細胞内のＰＡＲＰタンパク質のレベル及び／又は活性を、標的細胞における正常なレベル及び／又は活性から約７５％、好ましくは約８０％、特に約９０％低下させる結果、ＰＡＲＰの正常なレベル及び／又は活性の約２５％、好ましくは約２０％、特に約１０％が標的細胞内に保持されなければならない。更に、ＰＡＲＰタンパク質のレベル及び／又は活性の低下は、標的細胞における正常な活性及び／又はレベルの９５％を越えてはならず、好ましくは９０％を越えてはならないと考えられる。ＰＡＲＰタンパク質のような特異的タンパク質の含有量を決定する方法は、当業者には周知であり、特異的抗体を用いたそのようなタンパク質の（組織化学的）定量を包含するが、これらに限定されない。ＰＡＲＰ活性を定量する方法も、当技術に利用可能であり、上記のＴＵＮＥＬアッセイ（in vivoで）、又はポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成のためのCollinge & Althaus（1994）が記載したin vitroアッセイを包含する（実施例を参照されたい）。
【００４４】
本発明によれば、また、真核細胞、特に植物細胞にプログラムされた細胞死を誘発するには、ＤＮＡ修復、及びゲノムの完全性の維持がそれ以後は可能でなくなるように、ＰＡＲＰタンパク質、及び／又はその活性若しくは見かけの活性の組み合せたレベルの両方を、実質的に低下させ、好ましくはほとんど完全に低下させるのが好ましい。好ましくは、標的細胞内のＰＡＲＰタンパク質の組み合せたレベル及び／又は活性を、標的細胞内の正常なレベル及び／又は活性から少なくとも約９０％、好ましくは約９５％、より好ましくは約９９％低下させなければならず、特にＰＡＲＰ活性は、完全に阻害しなければならない。両クラスのＰＡＲＰタンパク質の機能レベルは、別個に、上記のレベルまで低下させるのが特に好ましい。
【００４５】
本発明を目的として、ＰＡＲＰタンパク質は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性を有し、好ましくはいわゆる「ＰＡＲＰシグニチャー」を含むタンパク質として定義される。ＰＡＲＰシグニチャーは、ＰＡＲＰタンパク質間で高度に保存されたアミノ酸配列であって、Murcia及びMenussier de Murcia（1994）によって、マウスMus musculusのＰＡＲＰタンパク質からの、第８５８番アミノ酸から第９０６番アミノ酸に達するとして定義された。このドメインは、トウモロコシの慣用的なＰＡＲＰタンパク質の第８１７〜８６５番のアミノ酸配列（ＺＡＰ１；SEQ ID NO:２）、トウモロコシの慣用的ＰＡＲＰタンパク質の第８２７〜８７５番のアミノ酸配列（ＺＡＰ２；SEQ ID NO:１１）、トウモロコシの非慣用的ＰＡＲＰタンパク質の第５００〜５４７番のアミノ酸配列（SEQ ID NO:４）、シロイヌナズナの非慣用的ＰＡＲＰの第４８５〜５３２番のアミノ酸配列（SEQ ID NO:６）に相当する。このアミノ酸配列は、異なる（約９０〜１００％の配列同一性を有する）ＰＡＲＰタンパク質間で高度に保存されている。特に保存されているのは、マウスのＰＡＲＰタンパク質の第８９１番のリシンであって（SEQ ID NO:２の第８５０番、SEQ ID NO:１１の第８６１番、SEQ ID NO:４の第５３２番、SEQ ID NO:６の第５１７番に相当）、ＰＡＲＰタンパク質の触媒活性に関与すると考えられる。特に、マウスのＰＡＲＰタンパク質の第８６５、８６６、８９３、８９８及び８９９番、又は他の配列について相当する位置のアミノ酸が通用する。ＰＡＲＰタンパク質は、Ｎ末端のＤＮＡ結合ドメイン、及び／又は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含んでもよい。
【００４６】
現在、２クラスのＰＡＲＰタンパク質が記載されている。本明細書で定義される限りでの第一のクラスは、いわゆる古典的な含ジンクフィンガーＰＡＲＰタンパク質（ＺＡＰ）を含む。これらのタンパク質は、大きさが１１３〜１２０kDaにわたり、該タンパク質のＮ末端ドメインに位置する、特に該タンパク質の初めの約３５５〜約３７５アミノ酸内に位置する、少なくとも一つ、好ましくは二つのジンクフィンガーの存在を更に特徴とする。ジンクフィンガーは、Ｚｎ原子を錯化できる配列CxxCxnHxxC（ｎは、２６〜３０に変動し得る）を有するペプチド配列として定義される。ＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質についてのアミノ酸配列の例は、ＰＩＲタンパク質データベース中に、登録番号Ｐ１８４９３（ウシBos taurus）、Ｐ２６４６６（ヤケイGallus gallus）、Ｐ３５８７５（キイロショウジョウバエDrosophila melanogaster）、Ｐ０９８７４（ヒトHomo sapiens）、Ｐ１１１０３（ハツカネズミMus musculus）、Ｑ０８８２４（マスOncorynchus masou）、Ｐ２７００８（ドブネズミRattus norvegicus）、Ｑ１１２０８（サルコファーガ・ペレグリナSarcophaga peregrina）及びＰ３１６６９（アフリカツメガエルXenopus laevis）で見出すことができる配列、並びにトウモロコシのＺＡＰ１及びＺＡＰ２タンパク質の現在同定されている配列（SEQ ID NO:２／SEQ ID NO:１１）を包含する。
【００４７】
対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬデータベース中に、登録番号Ｄ９００７３（ウシ）、Ｘ５２６９０（ニワトリ）、Ｄ１３８０６（キイロショウジョウバエ）、Ｍ３２７２１（ヒト）、Ｘ１４２０６（ハツカネズミ）、Ｄ１３８０９（マス）、Ｘ６５４９６（ドブネズミ）、Ｄ１６４８２（サルコファーガ・ペレグリナ）及びＤ１４６６７（アフリカツメガエル）の下に、並びにSEQ ID NO:１及び１０（トウモロコシ）に見出すことができる。
【００４８】
本明細書で定義される限りでの第二のクラスは、いわゆる非古典的ＰＡＲＰタンパク質（ＮＡＰ）を含む。これらのタンパク質は、類似しており（７２〜７３kDa）、該タンパク質のＮ末端でのジンクフィンガーの不在、及びＤＮＡ結合タンパク質との類似性を有するアミノ酸の範囲を含むＮ末端ドメインの存在を更に特徴とする。好ましくは、これらのクラスのＰＡＲＰタンパク質は、配列RGxxxxGxKxxxxxRL（アミノ酸は、標準的な一字コードで表され、ｘは、いかなるアミノ酸も意味する；SEQ ID NO:７）を含む約３０〜３２アミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。はるかに好ましくは、これらのＰＡＲＰタンパク質は、配列xLxVxxxRxxLxxRGLxxxGVKxxLVxRLxxAI（SEQ ID NO:８）（いわゆるＡ１ドメイン）を有する約３２アミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸配列、若しくは配列GMxxxELxxxAxxRGxxxxGxKKDxxRLxx（SEQ ID NO:９）（いわゆるＡ２ドメイン）を有する約３２アミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸配列、又はその双方を含む。特に、Ａ１及びＡ２ドメインは、らせん−ループ−らせん構造を形成することができる。これらのＰＡＲＰタンパク質は、塩基性の「Ｂ」ドメイン（約３５〜約５６アミノ酸のＫ／Ｒに富むアミノ酸配列、核に向けてのタンパク質の照準に関与）、及び／又は酸性の「Ｃ」ドメイン（約３６アミノ酸のＤ／Ｅに富むアミノ酸配列）を更に含んでもよい。ＮＡＰクラスのタンパク質配列の例は、シロイヌナズナのＡＰＰタンパク質（ＰＩＲタンパク質データベースから登録番号Ｑ１１２０７の下に情報が得られる；SEQ ID NO:６）、及びトウモロコシのＮＡＰタンパク質（SEQ ID NO:４）を包含する。対応するｃＤＮＡの配列は、ＥＭＢＬデータベース中に、登録番号Z48243の下に、及びSEQ ID NO:３に見出すことができる。第二のクラスのＰＡＲＰタンパク質が、実際にＰＡＲＰタンパク質であること、すなわちＤＮＡ依存ポリ（ＡＤＰ−リボース）重合を触媒できることは、本発明者らによって立証された（実施例２を参照されたい）。
【００４９】
本発明者らは、真核細胞、特に植物細胞が、両クラスのＰＡＲＰタンパク質をコードする遺伝子を同時に発現することを、更に立証した。
【００５０】
本発明を目的として、定義された限りでの両クラスのＰＡＲＰタンパク質をコードするその他の遺伝子若しくはｃＤＮＡ、又はその一部を、他の真核生物の種若しくは変種から、特に他の植物種若しくは変種から単離できることは明らかである。これらのＰＡＲＰ遺伝子又はｃＤＮＡは、例えば、上記のＰＡＲＰ遺伝子若しくはｃＤＮＡ、又はその一部（好ましくは、上記のＰＡＲＰシグニチャーをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子フラグメントのような保存された部分）のヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる、サザンハイブリダイゼーション（ＰＡＲＰ遺伝子を単離しようとする種と、プローブを最終的に派生させる種との間の関係に応じての、低厳密度又は高厳密度ハイブリダイゼーションのいずれか）によって、単離することができる。植物遺伝子がコードするＰＡＲＰタンパク質のＰＡＲＰシグニチャーに相当するヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:１ヌクレオチド第２５５８〜２７０４番のヌクレオチド配列、SEQ ID NO:３ヌクレオチド第１５９５〜１７４７番のヌクレオチド配列、又はSEQ ID NO:５ヌクレオチド第１５７５〜１７２４番のヌクレオチド配列である。ＰＡＲＰ遺伝子のクラス間で区別しなければならないならば、好ましくは、ＰＡＲＰ遺伝子の、そのクラスに特異的である部分、例えば、触媒ドメインに先行するＮ末端ドメイン、又はその一部を用いなければならない。
【００５１】
これに代えて、ＰＡＲＰタンパク質又はその一部をコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡは、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４に示される配列に対応するヌクレオチド配列を有する縮重プライマー、又はSEQ ID NO:１５〜２０に示される配列に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーのような、適切なプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって単離することができる。しかし、当業者が、ＰＣＲに用いるための代替的オリゴヌクレオチドを設計するか、又はＰＡＲＰ遺伝子のいずれかの、少なくとも２０、好ましくは少なくとも約３０、特に少なくとも約５０の連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子又はその一部をＰＣＲ増幅によって単離することができることは、明らかである。
【００５２】
これらの手法の組合わせ、又は部分的フラグメント、及び例えばＰＣＲ増幅を用いて得られるそのヌクレオチド配列に基づいて、遺伝子若しくはｃＤＮＡを単離するために当業者が利用できる、その他の手法（例えばＲＡＣＥ−ＰＣＲ）を用いて、本発明の方法に用いるのに適するＰＡＲＰ遺伝子又はその一部を単離できることは、明らかである。
【００５３】
その上、アミノ酸のいくつかが、その他の化学的に類似するアミノ酸と交換された（いわゆる保存的置換）、ＰＡＲＰタンパク質をコードするＰＡＲＰ遺伝子、又は合成ＰＡＲＰ遺伝子（天然ＰＡＲＰ遺伝子と類似のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に基づいて、異なるヌクレオチド配列を有する）、及びそれらの一部も、本発明の方法に適する。
【００５４】
本発明の一面では、真核細胞、特に植物細胞におけるＰＣＤを、これらの真核細胞内のＰＡＲＰの機能レベルの程々の低下によって阻害する。
【００５５】
本発明の第一の面の一実施態様では、真核細胞、特に植物細胞内のＰＡＲＰの機能レベルを、これらの細胞での転写を指令できるプロモーター、好ましくは植物発現性プロモーターと、転写されたときに、両クラスのＰＡＲＰ遺伝子がコードする内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させ得る、生物学的に活性であるＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域に動作可能に結合された、機能的３′転写終結及びポリアデニル化領域とを含む、少なくとも一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子のこれらの細胞への導入によって低下させる。
【００５６】
好適実施態様では、少なくとも二つのそのようなＰＣＤ調節キメラ遺伝子を細胞に導入し、それによって、第一のＰＣＤ調節キメラ遺伝子がコードする生物学的活性ＲＮＡは、ＮＡＰクラスの遺伝子がコードする内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させ、かつそれによって、第二のＰＣＤ調節キメラ遺伝子がコードする生物学的活性ＲＮＡは、ＺＡＰクラスクラスの遺伝子がコードする内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させるため、組み合せたＰＡＲＰ活性が、適度に低下する。
【００５７】
特に好適な実施態様では、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現レベルを低下させることによって、内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させる。このためには、転写されたＤＮＡ領域は、翻訳に利用できるＮＡＰ及びＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質をコードするｍＲＮＡを減少させる生物学的活性ＲＮＡをコードする。これは、アンチセンスＲＮＡ、共抑制又はリボザイム作用のような手法を通じて達成することができる。
【００５８】
本明細書に用いられる限りで、「共抑制」とは、ＲＮＡ蓄積を、配列特異的な方式で、転写及び／又は転写後抑制に付して、内因性相同遺伝子又はトランス遺伝子の発現の抑制を招く過程を意味する。
【００５９】
したがって、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現の抑制は、ＤＮＡ領域に動作可能に結合された強力なプロモーターを含む、トランス遺伝子を導入し、そのために、得られる転写されたＲＮＡが、その発現を抑制しようとするＰＡＲＰ遺伝子の部分の、コードする及び／若しくは転写されるＤＮＡ配列（センス）、又は相補体（アンチセンス）と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、特に８５％、より特に少なくとも９０％、特別には少なくとも９５％の同一性を有するか、或いは同一である、ヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡであることによって達成することができる。好ましくは、転写されるＤＮＡ領域は、機能的タンパク質をコードしない。特に、転写領域は、タンパク質をコードしない。更に、センス又はアンチセンス領域のヌクレオチド配列は、好ましくは、長さが少なくとも約１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２５０ヌクレオチド、特に少なくとも約５００ヌクレオチドでなければならないが、その発現を低下させようとする遺伝子のコーディング領域の全長にわたってもよい。
【００６０】
本発明を目的として、関連する二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の、百分率として表される「配列同一性」とは、最適に整列させた二つの配列中の、比較した位置の数で除した、同一残基を有する位置の数（ｘ１００）を意味する。間隙、すなわち整列させて、一方の配列には存在するが、他方には存在しない位置は、残基が同一でない位置と見なされる。二つの配列の整列は、ウィルバー−リップマンアルゴリズム〔Wilbur & Lipmann, 1983〕によって、２０ヌクレオチド又はアミノ酸というウィンドウサイズ、２アミノ酸という語長、及び４という間隙ペナルティーを用いて実施する。上記の配列の整列を包含する配列データのコンピュータ支援解析及び解釈は、好都合にも、Intelligenetics（登録商標）のSuite（Intelligenetics Inc., CA）というプログラムのような、商業的に入手できるソフトウェアパッケージを用いて実施することができる。
【００６１】
当業者には、一つ又はそれ以上のセンス若しくはアンチセンスＰＣＤ調節キメラ遺伝子を用いて、本発明の第一の面の目標を達成できることは明らかであると思われる。一つのセンス又はアンチセンスＰＣＤ調節キメラ遺伝子を用いたときは、この遺伝子は、両クラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を同時に低下させることが可能でなければならない。これは、例えば、キメラ遺伝子の転写領域を、両クラスの遺伝子の発現が、一つのセンス又はアンチセンスＲＮＡによって調節されるように選ぶ、すなわち両クラスのＰＡＲＰ遺伝子の最高の相同性を有するＤＮＡ領域に対応する標的領域を選び、センス及びアンチセンスＲＮＡについて上に記載した条件に合う、両標的領域に対応する転写センス又はアンチセンスＤＮＡ領域を組み込むことによって、達成することができる。これに代えて、それぞれ、ＰＡＲＰ遺伝子の一方のクラスの発現を調節するのに特異的である種々のセンス又はアンチセンスＲＮＡ領域を、一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子の一つの転写領域がコードする一つのＲＮＡ分子に組み合せることができる。明らかに、一方のクラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を調節するのに特異的である種々のセンス又はアンチセンスＲＮＡ領域は、別個のＰＣＤ調節キメラ遺伝子として導入することができる。
【００６２】
好適なセンス及びアンチセンスコーディング転写領域は、ＰＡＲＰ遺伝子のＮ末端ドメインから選ばれる少なくとも約１００の連続ヌクレオチドの配列に（上記の配列同一性の制約を有して）相当する、好ましくは、SEQ ID NO:１第１１３〜１１８９番ヌクレオチドの配列、SEQ ID NO:３第１０７〜５８３番ヌクレオチドの配列、SEQ ID NO:５第１３１〜５４２番ヌクレオチドの配列、又はSEQ ID NO:１０第８１〜１１８０番ヌクレオチドの配列から選ばれる、少なくとも約１００の連続ヌクレオチドの配列に相当するヌクレオチド配列に相当する。しかし、ＰＡＲＰ遺伝子のＮ末端ドメインの完全な配列に、又はＰＡＲＰ遺伝子の完全な配列、特にそのタンパク質コーディング領域にさえ相当する配列を含む、センス又はアンチセンスコーディング転写領域を用い得ることは、明らかである。更に好ましいのは、ＰＡＲＰ遺伝子のＣ末端触媒性ドメインから選ばれる、少なくとも約１００の連続ヌクレオチドの配列、好ましくは、ＰＡＲＰシグニチャーコーディングヌクレオチド配列、特に上記のＰＡＲＰシグニチャーコーディングヌクレオチド配列を含む、少なくとも１００ヌクレオチドの配列に（上記の配列同一性の制約を有して）相当する、転写センス及びアンチセンスコーディング領域である。やはり、ＰＡＲＰ遺伝子のＣ末端ドメインの完全配列に相当する配列を含む、転写センス又はアンチセンスコーディング領域を用い得ることは、明らかである。
【００６３】
もう一つの特に好適な実施態様では、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子は、両クラスの内因性ＰＡＲＰの見かけの活性レベルを低下させることによって、内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させる。このためには、転写されるＤＮＡ領域は、生物学的活性ＲＮＡをコードし、それが、ＮＡＰ若しくはＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質、又は両者を阻害するタンパク質若しくはペプチド、例えば不活性化抗体又は優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体へと翻訳される。
【００６４】
「ＰＡＲＰタンパク質の不活性化抗体」は、ＰＡＲＰタンパク質のいくつかのエピトープ、例えば、ＺＡＰ１の第１１１〜１１８位からのジンクフィンガーIIの部分、又はＺＡＰ２の対応するペプチドを対象とするエピトープに少なくとも特異的に結合し、標的タンパク質の活性を阻害する、抗体又はその部分である。
【００６５】
本明細書に用いられる限りで、「優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体」は、ＰＡＲＰタンパク質（又はその変化形）、好ましくは、真核標的宿主細胞に内因性であるＰＡＲＰタンパク質の少なくとも一部を含む、ＰＡＲＰ活性を保有せず、該宿主細胞内で発現されたとき、該内因性ＰＡＲＰタンパク質の活性に対して阻害効果を有するタンパク質又はペプチドである。好適な優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体は、機能性ＤＮＡ結合ドメイン（又はその変化形）を、触媒ドメインなしに含む（例えば、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰの約３５５〜約３７５アミノ酸のドメインを含むＮ末端ジンクフィンガー、特に、SEQ ID NO:２第１〜３７０番アミノ酸のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、SEQ ID NO:１１第１〜９８番アミノ酸のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、若しくは第１〜８８番アミノ酸のアミノ酸配列が、SEQ ID NO:１１の第１位のアミノ酸から第９８位のアミノ酸までのアミノ酸配列で置きかえられた、SEQ ID NO:２第１〜３７０番アミノ酸のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、又は例えば、ＮＡＰクラスのＰＡＲＰの約１３５〜約１６０アミノ酸のＮ末端ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、特に、SEQ ID NO:４第１〜１５９番アミノ酸のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、若しくはSEQ ID NO:６第１〜１３８番アミノ酸のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合タンパク質ドメイン）か、若しくは機能性触媒ドメインなしに含む（例えば、いわゆるＰＡＲＰシグニチャーが突然変異した、特にSEQ ID NO:２の第８５０位、SEQ ID NO:４の第５３２位、SEQ ID NO:６の第５１７位の保存されたリシンが突然変異した不活性ＰＡＲＰ突然変異体）か、又はそれからなるタンパク質である。好ましくは、優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体は、それらのＤＮＡ結合活性を保持しなければならない。優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体は、担体タンパク質、例えばβ−グルクロニダーゼと融合させることができる（SEQ ID NO:１２）。
【００６６】
また、１種類又はそれ以上の優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体をコードする一つ若しくはそれ以上のＰＣＤ調節遺伝子を用いて、本発明の第一の面の目標を達成することができる。一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子を用いたときは、この遺伝子は両クラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を同時に低下させることができなければならない。
【００６７】
本発明の第一の面のもう一つの実施態様では、これらの細胞内の内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列を、コードされる突然変異ＰＡＲＰタンパク質が、その活性の約１０％を保持するように調節することによって、真核細胞、特に植物細胞におけるＰＡＲＰの機能レベルを低下させる。内因性ＰＡＲＰ遺伝子のそのような調節を達成する方法は、例えば米国特許第５，５２７，６９５号明細書に記載された方法によって、内因性ＰＡＲＰ遺伝子を突然変異ＰＡＲＰ遺伝子と交換するための相同組換えを包含する。好適実施態様では、内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列の、そのような部位指向性調節は、国際公開特許第９６／２２３６４号公報又は米国特許第５，５６５，３５０号明細書に記載のとおり、キメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの導入によって達成される。
【００６８】
しかし、植物細胞に関しては、好ましくは、一方のクラスのＰＡＲＰ遺伝子、特にＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させる活性を有する生物学的活性ＲＮＡをコードする、一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子の導入は、本発明の第一の面によるこれらの植物細胞内のＰＡＲＰ活性全体の低下、すなわちこれらの植物細胞におけるプログラムされた細胞死を阻害又は予防するのに充分であり得る。
【００６９】
本発明のこの実施態様では、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子は、好ましくは、本明細書に述べた基準によれば、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の一方に対するセンスＲＮＡとして分類する、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドの長さの、少なくとも一つのＲＮＡ領域を含み、かつ本明細書に述べた基準によれば、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の一方に対するアンチセンスＲＮＡとして分類する、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドの長さの、少なくとも一つの別のＲＮＡ領域を含み、そのために、該アンチセンス及びセンスＲＮＡ領域が、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの距離にわたって、二本鎖領域へと組み合わせることが可能な、生物学的活性ＲＮＡのコードを有する転写領域を含む。
【００７０】
一方のクラスのＰＡＲＰタンパク質、特に、本明細書に記載されたようなＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質の機能又は見かけのレベルを低下させることができる、一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子の導入も、本発明の第一の面による、植物細胞におけるＰＡＲＰ活性全体の低下に同様に充分であり得ると予測される。
【００７１】
本発明の第一の面による、少なくとも一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子を含む、植物細胞におけるプログラムされた細胞死の低下又は阻害は、不都合な状態に対する増強された耐性、例えば、化学物質の投与が与えるストレスに対する耐性、寒冷ストレス耐性、病原体及び疫病が与えるストレスに対する耐性、乾燥耐性、熱ストレス耐性等々を生じることができる。
【００７２】
本発明のもう一つの面では、真核細胞、好ましくは選ばれた細胞、特に選ばれた植物細胞のプログラムされた死を、ＰＡＲＰの機能レベルの重大な低下、好ましくはＤＮＡ修復、又はゲノム完全性の維持がそれ以後不可能となるような、ほとんど完全な低下によって増強する。
【００７３】
本発明のこの面の一実施態様では、真核細胞、好ましくは植物細胞内のＰＡＲＰの機能レベルを、これらの細胞での転写を指令できるプロモーター、好ましくは植物発現性プロモーターと、転写されたとき、両クラスのＰＡＲＰ遺伝子がコードする内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させ得る生物学的活性ＲＮＡ分子を生じる、ＤＮＡ領域に動作可能に結合された、機能性３′転写終結及びポリアデニル化領域とを含む、少なくとも一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子をこれらの細胞に導入することによって、大幅に低下させ、特にほぼ完全に抑止する。
【００７４】
本発明の第二の面の好適実施態様では、少なくとも二つのそのようなＰＣＤ調節キメラ遺伝子を細胞に導入し、それによって、第一のＰＣＤ調節キメラ遺伝子がコードする生物学的活性ＲＮＡが、ＮＡＰクラスの遺伝子がコードする内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させ、かつそれによって、第二のＰＣＤ調節キメラ遺伝子がコードする生物学的活性ＲＮＡが、ＺＡＰクラスの遺伝子がコードする内因性ＰＡＲＰ活性の機能レベルを低下させる結果、組み合されたＰＡＲＰ活性を大幅に低下させ、特にほぼ完全に除去する。
【００７５】
本発明の第一の面について述べたとおり、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子の転写領域は、生物学的活性ＲＮＡをコードし、それが、（例えばアンチセンス作用、共抑制、又はリボザイム作用を通じて）内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現に干渉することができるか、又は該生物学的活性ＲＮＡが、ＮＡＰ若しくはＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質を阻害できるペプチド若しくはタンパク質、例えば不活性化する抗体、又は優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体に更に翻訳されることができる。
【００７６】
本発明の第二の面の特に好適な実施態様では、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子（ＰＣＤ増強キメラ遺伝子）の転写領域は、本明細書に述べた基準によれば、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の少なくとも一方に対するセンスＲＮＡとして分類する、（好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの）少なくとも一つのＲＮＡ領域と、本明細書に述べた基準によれば、内因性ＰＡＲＰ遺伝子の少なくとも一方に対するアンチセンスＲＮＡとして分類する、（好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの）少なくとも一つのＲＮＡ領域とを含み、そのために、該アンチセンス及びセンスＲＮＡ領域が（好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの距離にわたる）二本鎖領域へと組み合わせることができる、生物学的活性ＲＮＡのコードを有する。特に好適な実施態様では、一方は、ＮＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質の機能レベルを低下させるよう照準され、他方は、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰタンパク質の機能レベルを低下させるよう照準された、少なくとも二つのそのようなＰＣＤ調節遺伝子を、真核細胞又は生物、好ましくは植物細胞又は植物に導入する。
【００７７】
本発明のキメラ性ＰＣＤ調節遺伝子の転写されるＤＮＡ領域に関する、異なる実施態様を様々な組合せで用いて、本発明の目標に到達できることは明らかである。例えば、第一のキメラ性ＰＣＤ調節遺伝子は、ＺＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させるよう設計されたセンスＲＮＡをコードしてよく、一方、第二のキメラ性ＰＣＤ調節遺伝子は、ＮＡＰクラスの内因性ＰＡＲＰ遺伝子の発現を低下させるよう設計された優性ネガティブＰＡＲＰ突然変異体をコードしてよい。
【００７８】
真核細胞へのＰＣＤ調節キメラ遺伝子の導入が、最終的に、これらの細胞での組み合せたＰＡＲＰの程々に低下したか、又は大幅に低下した機能レベル（すなわち阻害されたＰＣＤのか、又は増強されたＰＣＤの）のいずれを招くことになるかは、これらのＰＣＤ調節遺伝子の（転写レベル又は組み合された転写／翻訳レベルのいずれかでの）発現レベルによって決定されることになる。ＰＣＤ調節遺伝子の発現レベルへの主な寄与因子は、プロモーター領域の選択であるが、他の因子（例えば、これらに限られないが、３′末端の選択、イントロンの存在、転写領域のコドン使用法、ｍＲＮＡの安定度、翻訳開始部位周辺の共通配列の存在、５′及び３′非翻訳ＲＮＡ領域の選択、ＰＥＳＴ配列の存在、安定に組み込まれたＰＣＤ調節遺伝子の挿入部位を囲む染色質構造の影響、導入されたＰＣＤ調節遺伝子のコピー数等々）、又はそれらの組合せも、ＰＣＤ調節遺伝子の最終的な発現レベルに寄与することになる。一般に、組み合されたＰＡＲＰの機能レベルの程々の低下は、比較的弱いプロモーターを含むＰＣＤ調節遺伝子によって達成できるが、組み合されたＰＡＲＰの機能レベルの大幅な低下は、比較的強いプロモーターを含むＰＣＤ調節遺伝子によって達成できると想定することができる。しかし、特定のプロモーターを含むＰＣＤ調節遺伝子の発現レベル、及び結果的にはＰＣＤに対するその効果は、既述のとおり、その他の寄与因子との相関として変動することができる。
【００７９】
本発明の特定の実施態様を目的として、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子は、構築性プロモーター、又は生物体内、特に植物体内の至るところの細胞型のすべて若しくは大部分で発現されるプロモーター、例えば、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子に由来するプロモーター領域、特にアグロバクテリウム属のＴｉ若しくはＲｉプラスミドのオパイン合成酵素遺伝子（例えばｎｏｓ、ｏｃｓプロモーター）、又はウイルス遺伝子のプロモーター領域（例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又はその変種）を含んでよい。
【００８０】
随意にか、又は環境的なきっかけに応じて、例えば、外部の刺激、例えば、これらに限られないが、化学的化合物（例えば毒性緩和剤、除草剤、グルココルチコイド）の適用、明条件、非生物的ストレス（例えば、傷害、重金属、極端な温度、塩分又は乾燥）若しくは生物的ストレス（例えば、真菌、ウイルス、細菌、昆虫、線虫、マイコプラズマ、及びマイコプラズマ様生物等々を包含する、病原体又は疫病の感染）によって活性化できる、誘導性プロモーターを含ませることによって、ＰＣＤ調節遺伝子の発現を制御するのが更に好都合であり得る。本発明に適する植物発現性の誘導性プロモーターの例は、線虫誘導性プロモーター（例えば国際公開特許第９２／２１７５７号公報に開示されたもの）、真菌誘導性プロモーター（国際公開特許第９３／１９１８８号、第９６／２８５６１号公報）、デキサメタゾンのようなグルココルチコイドの適用後に誘導できるプロモーター、又はテトラサイクリンの適用後に抑制若しくは活性化されるプロモーター〔Gatz et al., 1988；Weinmann et al., 1994〕である。
【００８１】
特に本発明の第二の面（すなわち増強されたＰＣＤ）に関する、本発明のいくつかの実施態様では、プログラムされた細胞死に対する効果を生物、特に植物の細胞の特定のサブセットに限定するのが好都合又は必要であり、そのため、ＰＣＤ調節遺伝子は、組織特異的又は細胞型特異的プロモーターを包含し得る。特定の組織又は細胞型で選択的に発現される、適切な植物発現性プロモーターの例は、当業者には公知であり、種子特異的プロモーター（例えば国際公開特許第８９／０３８８７号公報）、器官原基特異的プロモーター〔An et al., 1996〕、茎特異的プロモーター〔Keller et al., 1988〕、葉特異的プロモーター〔Hudspeth et al., 1989〕、葉肉特異的プロモーター（例えば、光誘導性のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター）、根特異的プロモーター〔Keller et al., 1989〕、塊茎特異的プロモーター〔Keil et al., 1989〕、維管束組織特異的プロモーター〔Peleman et al., 1989〕、分裂組織特異的プロモーター〔例えば無苗条分裂組織（ＳＴＭ）遺伝子のプロモーター、Long et al., 1996〕、原基特異的プロモーター〔例えばキンギョソウ属ＣｙｃＤ３ａ遺伝子、Doonan et al., 1998〕、葯特異的プロモーター（国際公開特許第８９／１０３９６号、第９２／１３９５６号、第９２／１３９５７号公報）、柱頭特異的プロモーター（国際公開特許第９１／０２０６８号公報）、裂開帯特異的プロモーター（国際公開特許第９７／１３８６５号公報）、種子特異的プロモーター（国際公開特許第８９／０３８８７号公報）等々を包含するが、これらに限定されない。
【００８２】
好ましくは、本発明のキメラ性ＰＣＤ調節遺伝子は、植物発現性プロモーター、好ましくは構築性プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又はリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小さい副単位をコードする遺伝子のプロモーターのような光誘導性プロモーターにその５′末端で動作可能に結合され、かつ適切な植物転写３′末端形成及びポリアデニル化シグナルにその３′末端で動作可能に結合された、マーカーＤＮＡを含む、マーカー遺伝子、好ましくはキメラマーマー遺伝子を伴う。マーカーＤＮＡの選択は、決定的に重要ではなく、適切ないかなるマーカーＤＮＡを用いることもできることが予測される。例えば、マーカーＤＮＡは、区別できる「色」を形質転換された植物細胞に与えるタンパク質をコードすることができるか（例えばＡ１遺伝子〔Meyer et al., 1987〕又は緑色蛍光タンパク質〔Sheen et al., 1995〕）、除草剤耐性を形質転換された植物細胞に与えることができるか（例えば、ホスフィノトリシンに対する耐性をコードするｂａｒ遺伝子：ヨーロッパ特許第０，２４２，２４６号公報）、又は抗生物質耐性を形質転換された細胞に与えることができる（例えばゲンタマイシンに対する耐性をコードするａａｃ（６′）遺伝子：国際公開特許第９４／０１５６０号公報）。
【００８３】
ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を真核細胞に導入する方法、とくに植物細胞を形質転換する方法は、当技術に周知であり、本発明の方法に決定的に重要ではないと考えられる。形質転換は、一時的にか、又は安定的にかのいずれかに形質転換された（そのために、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子が、細胞のゲノム、特に細胞の核ゲノムに安定的に挿入された）細胞を生じる。
【００８４】
真核細胞及び生物、特に植物細胞及び植物におけるプログラムされた細胞死を変更するための、本発明に記載された方法及び手段が、いくつかの重要な用途の可能性を有することは明らかである。本発明の方法及び手段によるＰＣＤの阻害は、国際公開特許第９７／０６２６７号公報に記載されたとおり、形質転換の際に細胞、特に植物細胞に賦課されるストレスを救済し、そのため、形質転換効率を高めるのに用いることができる。ＰＣＤの阻害も、真核細胞、特に植物細胞の細胞培養を改良するのに用いることができる。本発明の手段及び方法を用いて、特定の細胞型にＰＣＤを誘発することは、細胞毒素の利用を要する方法に用いることができる。ＰＣＤは、細胞を死なせる「自然な」方法であることから、本発明のＰＣＤ増強性キメラ遺伝子の利用は、細胞溶解へと導くＲＮアーゼ又はジフテリア毒素のような、その他の細胞毒性遺伝子の利用に優る改良を構築する。その上、標的細胞とは異なる細胞における、ＰＣＤ増強性遺伝子の低レベルの発現は、これらの細胞におけるＰＡＲＰ活性の大幅な低下に代えて、適度な低下へと導き、こうして、非標的細胞におけるＰＣＤを実際に阻害することになる。
【００８５】
植物に関しては、ＰＣＤ増強性キメラ遺伝子の好ましい適用は、
【００８６】
１．単数又は複数のＰＣＤ増強性キメラ遺伝子が、国際公開特許第９３／１９１８８号又は第９６／２８５６１号公報に記載されたような、真菌応答プロモーターを含むことによって、真菌の感染に対して防護された植物の生成；
【００８７】
２．単数又は複数のＰＣＤ増強性キメラ遺伝子が、国際公開特許第９２／２１７５７号公報に開示されたような、線虫誘導性プロモーターを含むことによる、線虫耐性植物の生成；
【００８８】
３．単数又は複数のＰＣＤ増強性キメラ遺伝子が、（国際公開特許第８９／１０３９６号、第９２／１３９５６号及び第９２／１３９５７号公報に開示されたような）葯特異的プロモーター、又は（国際公開特許第９１／０２０６８号公報に開示されたような）柱頭特異的プロモーターを含むことによる、雄又は雌の不稔植物の生成；
【００８９】
４．単数又は複数のＰＣＤ増強性キメラ遺伝子が、（国際公開特許第９７／１３８６５号公報に開示されたような）裂開帯特異的プロモーターを含むことによる、改良された種子破片の特徴性を有する植物の生成；
を包含するが、これらに限定されない。
【００９０】
意外にも、本発明の第一の面によるＰＣＤ調節キメラ遺伝子、好ましくは、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を調節するキメラ遺伝子、特に、転写領域が、本明細書に記載されたような、センス及びアンチセンスＲＮＡを同時に含む、生物学的活性ＲＮＡをコードする、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を調節するキメラ遺伝子の導入の際に、植物のカルス及び植物が、強化された成長を示すことが見出された。
【００９１】
本発明を特定の作用様式に限定するものではないが、増大した成長は、おそらく、細胞分裂を阻害しているシグナルに対する閾値を上昇させ、こうして、より活発に成長する植物へと導くことによる、プログラムされた細胞死を生じる細胞の数の減少の結果であると考えられる。これらの植物は、本願の別の個所で説明したとおり、よりストレス耐性でもある。
【００９２】
したがって、第三の面では、本発明は、本発明の第一の面による少なくとも一つのＰＣＤ調節キメラ遺伝子、好ましくは、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を調節するキメラ遺伝子、特に、転写領域が、センス及びアンチセンスＲＮＡを同時に含む生物学的活性ＲＮＡのコードを有する、ＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子の発現を調節するキメラ遺伝子を含む、植物細胞、植物組織及び植物の成長、好ましくは栄養成長を増大させる方法にも関する。
【００９３】
本発明は、本質的にはすべての植物種及び変種に適用できることは明らかであるが、本発明は、商業的価値を有する植物におけるプログラムされた細胞死を変更するのに特に適すると思われる。本発明を適用できる、特に好ましい植物は、トウモロコシ、採油用セイヨウアブラナ、アマニ、コムギ、イネ科植物、ムラサキウマゴヤシ、マメ科植物、アブラナ科植物、トマト、レタス、ワタ、コメ、オオムギ、バレイショ、タバコ、テンサイ、ヒマワリ、及びカーネーション、キク、バラ、チューリップなどの鑑賞植物である。
【００９４】
得られる形質転換された植物は、同じ特徴を有する、より形質転換された植物を生産するか、又は本発明の細胞分裂制御キメラ遺伝子を、同じであるか若しくは関連する植物種のその他の変種に導入するための、慣用の育種計画に用いることができる。形質転換された植物から得られた種子は、本発明のＰＣＤ調節遺伝子を、安定的なゲノム挿入断片として含有する。
【００９５】
下記の非限定的実施例は、アポトーシス制御キメラ遺伝子の構築、及びそのような遺伝子の、真核細胞及び生物におけるプログラムされた細胞死の調節のための用途を説明する。実施例中に別途記載されない限り、すべての組換えＤＮＡの手法は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、並びにAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第１及び２巻に記載されたとおりの標準的プロトコルに従って実施した。植物の分子的作業の標準的材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd. (UK)及びBlackwell Scientific Publications, UKが共同で出版した、R.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されている。
【００９６】
説明及び実施例の全体を通して、下記の配列が参照される：
SEQ ID NO:１：トウモロコシのＺＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列（zap1）
SEQ ID NO:２：トウモロコシのＺＡＰタンパク質のタンパク質配列（ZAP1）
SEQ ID NO:３：トウモロコシのＮＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列（nap）
SEQ ID NO:４：トウモロコシのＮＡＰタンパク質のタンパク質配列（NAP）
SEQ ID NO:５：シロイヌナズナのＮＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列（app）
SEQ ID NO:６：シロイヌナズナのＮＡＰタンパク質のタンパク質配列（APP）
SEQ ID NO:７：非慣用的ＰＡＲＰタンパク質のＡドメインに対する共通配列
SEQ ID NO:８：非慣用的ＰＡＲＰタンパク質のＡ１ドメインに対する共通配列
SEQ ID NO:９：非慣用的ＰＡＲＰタンパク質のＡ２ドメインに対する共通配列
SEQ ID NO:１０：トウモロコシの第二のＺＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列（Zap2）
SEQ ID NO:１１：トウモロコシの第二のＺＡＰタンパク質のタンパク質配列（ZAP2）
SEQ ID NO:１２：ＡＰＰのＤＮＡ結合ドメインとＧＵＳタンパク質との間の融合タンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO:１３：縮重ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:１４：縮重ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:１５：ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:１６：ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:１７：ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:１８：ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:１９：ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:２０：ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO:２１：ａｐｐプロモーター−ｇｕｓ翻訳融合
【００９７】
配列リストのフリーテキスト
下記のフリーテキストを、本願の配列リストの部に用いた：
＜２２３＞人工配列の記載：非慣用的ＰＡＲＰタンパク質のＡドメイン
＜２２３＞人工配列の記載：非慣用的ＰＡＲＰタンパク質のＡ１ドメイン
＜２２３＞人工配列の記載：非慣用的ＰＡＲＰタンパク質のＡ２ドメイン
＜２２３＞人工配列の記載：ＡＰＰのＮ末端ドメインとＧＵＳタンパク質との間の融合タンパク質
＜２２３＞人工配列の記載：縮重ＰＣＲプライマー
＜２２３＞人工配列の記載：ＰＣＲプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチド
＜２２３＞人工配列の記載：β−グルクロニダーゼ遺伝子とのＡＰＰプロモーターの融合
＜２２３＞翻訳開始コドン
【００９８】
【実施例】
実験の手順
酵母及び細菌の菌株
ＡＰＰタンパク質の発現には、サッカロミセス・セレビシエSaccharomyces cerevisiaeの菌株ＤＹ（MATa his3 can1-10 ade2 leu2 trp1 ura3::(3xSV40 AP1-lacZ)〔Kuge & Jones, 1994〕を用いた。酵母の形質転換は、Dohmenら（1991）に従って実施した。菌株は、最小ＳＤＣ培地（０．６７％酵母窒素ベース、０．３７％カザアミノ酸、２％グルコース、５０mg/lのアデニン、及び４０mg/lのトリプトファン）で増殖させた。ＡＰＰ発現の誘導には、ＳＤＣ中のグルコースを２％ガラクトースに置き換えた。
【００９９】
プラスミド操作及びライブラリースクリーニングには、大腸菌Escherichia coliの菌株ＸＬ−１（Stratagene, La Jolla, CA）を用い、標準的手順〔Ausubel et al., 1987；Sambrook et al., 1989〕に従って実施した。ＡＰＰタンパク質の発現には、大腸菌ＢＬ２１〔Studier & Moffat, 1986〕を、植物の安定形質転換には、アグロバクターAgrobacterium tumefaciensＣ５８Ｃ１ＲｉｆR株（pGV2260）〔Dablaere et al., 1985〕を、それぞれ用いた。
【０１００】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性のアッセイ
ＡＰＰの酵素活性は、下記のとおり調製した酵母菌株の全タンパク質抽出物中で検定した。ＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）又はＤＹ（ｐＹｅＤＰ１／８−２）を、旋回振盪機上のＳＤＣ培地５０ml中で、１５０rpm、３０℃で終夜増殖させた。1,000ｘｇでの遠心分離によって、酵母細胞を採集し、０．１Mリン酸カリウム緩衝液（pH６．５）１５０mlで３回洗浄し、ソルビトール緩衝液（１．２Mソルビトール、０．１２MＫ2ＨＰＯ4、０．０３３Mクエン酸、pH５．９）５ml中に再懸濁させた。リティカーゼ（Boehringer, Mannheim、ドイツ国）を細胞懸濁液に加えて、３０U/mlの最終濃度とし、３０℃で１時間、細胞を温置した。次いで、酵母のスフェロプラストを、ソルビトール緩衝液で３回洗浄し、氷冷溶菌緩衝液（１００mMトリスＨＣｌ、pH７．５、４００mMＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ、１０％グリセリン、１mMＤＴＴ）２ml中に再懸濁させた。音波処理の後、溶菌液を、20,000ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を、反応緩衝液（１００mMトリスＨＣｌ、pH８．０、１０mMＭｇＣｌ2、１mMＤＴＴ）で平衡させたEcono-Pack（登録商標）１０ＤＧカラム（Bio-Rad, Richmond, CA）上で脱塩した。タンパク質のタンパク質分解による分解を抑えるため、溶菌及び反応緩衝液は、５０mlあたり１錠のプロテアーゼ阻害剤反応混液（Boehringer）で強化した。核酸を、ＮａＣｌ及び硫酸プロタミンを、それぞれ、６００mM及び１０mg/mlの最終濃度まで加えることによって、全抽出物から取り出した。室温で１０分間の温置の後、20,000ｘｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって、沈澱を除去した。上清の緩衝液を、Econo-Pack１０ＤＧカラム上でのゲル濾過によって、反応緩衝液と交換した。
【０１０１】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成のアッセイは、Collinge及びAlthaus（1994）を適応させた。約５００μgの全酵母タンパク質を、32Ｐ−ＮＡＤ+３０μCi（５００Ci/mmol）、６０μMの最終濃度までの未標識ＮＡＤ+、及び１０μg/mlの音波処理したサケ精子ＤＮＡで補強した反応緩衝液中で温置した。室温で４０分間温置した後、停止緩衝液（２００mMトリスＨＣｌ、pH７．６、０．１MＮａＣｌ、５mMＥＤＴＡ、１％Ｎａ+−Ｎ−ラウロイル−サルコシン、及び２０μg/mlプロテイナーゼＫ）５００μlを加え、反応物を、３７℃で終夜温置した。フェノール及びフェノール／クロロホルム抽出の後、０．１MＮａＡｃ（pH５．２）とともに２．５容のエタノールを用いて、重合体を沈澱させた。ペレットを、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、７０％ホルムアミド、１０mMＥＤＴＡ、０．０１％ブロモフェノールブルー、及び０．０１％キシレンシアノールに溶解した。サンプルを、８０℃で１０分間加熱し、次いで、１２％ポリアクリルアミド／６M尿素の配列決定用ゲルに装荷した。ゲルを、３ＭＭ紙（Whatman International, Maidstone、英国）上で乾燥し、Kodak X-OmatＸ線フィルム（Eastman Kodak, Richmond, NY）に曝露させるか、又はPhosphorImager（登録商標）４４５ＳＩ（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて走査するかのいずれかに付した。
【０１０２】
免疫学的手法
アミノ酸Met310〜His637のＡＰＰポリペプチドをコードする断端ａｐｐのｃＤＮＡを、大腸菌ＢＬ２１（pETΔNdeSPA）の５００ml培養体を１mMイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導した後、Ｎ末端の６個のヒスチジン残基との翻訳融合として発現させた。ＡＰＰポリペプチドは、製造者（Qiagen, Chatsworth, CA）のプロトコルに従って、Ｎｉ2+−ＮＴＡ−アガロースカラムによる（６M塩酸グアニジウムの存在下での）変性条件下のアフィニティークロマトグラフィーによって、ほぼ均質となるまで精製した。ＰＢＳに対して透析した後、可溶性及び不溶性ＡＰＰポリペプチドの混合物を用いて、２羽のNew Zealand White系ウサギを、標準的免疫感作プロトコル〔Harlow & Lane, 1988〕に従って感作した。ウエスタンブロット分析のため、タンパク質を、変性用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって変化させ〔Sambrook et al., 1989；Harlow & Lane, 1988〕、Semi-Dry Blotter II（Kem-Em-Tec, Copenhagen, Denmark）を用いて、ニトロセルロース膜（Hybond-C, Amersham）に移した。
【０１０３】
酵母細胞におけるin situ抗原定位を、記載されたとおり〔Harlow & Lane, 1988〕実施した。酵母スフェロプラスト内のＡＰＰタンパク質を定位するため、抗ＡＰＰ血清を、トリス緩衝生理食塩水−ＢＳＡ緩衝液中で１：３，０００〜１：５，０００に希釈した。ポリ（ＡＤＰ−リボース）重合体を特異的に認識する１０Ｈモノクローナル抗体〔Ikajima et al., 1990〕を、ＰＢＳ緩衝液中で１：１００に希釈して用いた。マウス抗体を、フルオレセイン＝イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）（Sigma）と結合したヒツジ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ′）2フラグメントを１：２００の希釈で用いて検出した。ウサギＩｇＧを、ＣＹ−３と結合したヒツジ抗ウサギＩｇＧヒツジＦ（ａｂ′）2フラグメント（Sigma）を１：２００の希釈で用いて検出した。ＤＮＡの視覚化には、スライドを、１０μg/mlの４′，６′−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Sigma）とともにＰＢＳ中で１分間温置した。蛍光造影は、Axiskopという表面蛍光顕微鏡（Zeiss, Jena、ドイツ国）で実施した。ＦＩＴＣ及びＣＹ−３の観察には、それぞれ、２３及び１５のフィルターキューブを用いた。細胞は、フジカラー１００スーパープラスフィルムで撮影した。
【０１０４】
植物材料及び組織化学的分析
タバコNicotiana tabacumのＳＲ１系〔Maliga et al., 1975〕を用い、アグロバクターＣ５８Ｃ１ＲｉｆR株（pGV2260；pGCNSPAGUS）との葉盤共培養の手順〔De Block et al., 1987〕に従って、安定的な形質転換体を生成した。対照としては、３５ＳＣａＭＶの制御下での真正ＧＵＳタバコＳＲ１系を用いた。ａｐｐプロモーター−ＧＵＳ融合の形質転換には、シロイヌナズナの生態型Columbiaをin situ浸透の手順に従って用いた。
【０１０５】
ＧＵＳ活性のin situ組織化学的染色のため、植物サンプルを、氷冷９０％アセトン中で３０分間固定し、０．１MＫ2ＨＰＯ4（pH７．８）で洗浄し、次いで、染色緩衝液（０．１MＫ2ＨＰＯ4、pH７．８、２mMＸ−Ｇｌｕｃ、２０mMＦｅ3+−ＥＤＴＡ）中で３７℃で温置した。染色された植物組織は、７０％エタノール中で４℃で貯蔵した。必要なときは、フェノール性酸化による組織の褐変を、ラクトフェノールとの温置によって緩和した〔Beeckman & Engler, 1994〕。ＧＵＳ染色は、Jenalumar光学顕微鏡（Zeiss）下で検査した。植物組織を、フジカラー１００スーパープラスフィルムで撮影した。
【０１０６】
その他の方法
プラスミド構築工程は、UBS Biochemicals（Cleveland, OH）が提供するプロトコルに従って実施した、ＤＮＡ配列決定によって定型的に確認した。核酸ハイブリダイゼーションのための32Ｐ標識化ＤＮＡのプローブは、Ready-PrimeＤＮＡ標識化キット（Amersham）によって合成した。ＤＮＡ及びＲＮＡハイブリダイゼーション実験のために、Church及びGilbert（1984）の緩衝系（０．２５Mリン酸ナトリウム、pH７．２、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１mMＥＤＴＡ）を用いた。ウエスタンブロット分析のために、酵母全タンパク質を、植物組織について記載されたとおりに〔Hurkman & Tanaka, 1986〕、基本的にはフェノールで抽出した。ノーザンブロット分析のためには、全酵母ＲＮＡを、記載されたとおりに〔Ausubel et al., 1987〕、熱フェノールで抽出した。ＲＮＡは、グリオキサールで変性させた後に、１．５％アガロースゲル上で分離した〔Sambrook et al., 1989〕。Hybond-Nナイロンフィルター（Amersham）を、核酸ブロット分析に用いた。
【０１０７】
実施例１：トウモロコシのＰＡＲＰ相同体をコードする遺伝子の単離
単数又は複数のＰＡＲＰ相同体をコードするトウモロコシｃＤＮＡを単離する目的で、二つの取組み方に従った。第一に、トウモロコシｃＤＮＡライブラリーを、アラビドプシス属ａｐｐｃＤＮＡから調製したＤＮＡプローブを用いて、低厳密度ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングした。第二に、トウモロコシＰＡＲＰの部分のＰＣＲ増幅を、テンプレートとしての第一鎖ｃＤＮＡ、及び「ＰＡＲＰシグニチャー」の配列に基づいて設計した、すべての公知ＰＡＲＰタンパク質のうちで最も保存されたアミノ酸配列である、二つの縮重プライマーを用いて実施した。
【０１０８】
トウモロコシ（Zea mays L.）、同系繁殖系Ｂ７３４の葉からのλＺＡＰ（Stratagene）ｃＤＮＡ。標準的手順〔Sambrook et al., 1989〕に従って、プラーク（500,000）をスクリーニングした。アラビドプシス属のａｐｐプローブによるスクリーニングの後、１．４kbpの不完全長ｃＤＮＡを精製した。ａｐｐプローブによる最初のｃＤＮＡライブラリースクリーニング、及びその後のｃＤＮＡ末端の５′急速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲ分析の後、ｎａｐ遺伝子、すなわちアラビドプシス属ａｐｐのトウモロコシの相同体を同定した。５′ＲＡＣＥＰＣＲのために、Marathonキット（Clontech, Palo Alto, CA）、及び１週齢のトウモロコシの若芽の内鞘、外鞘および葉から単離したトウモロコシポリ（Ａ）+ＲＮＡ０．５μgを用いてテンプレートを調製した。ＰＣＲ増幅のための遺伝子特異的な、入れ子型nestedプライマーは、ｎａｐプライマーについては
5′-GGGACCATGTAGTTTATCTTGACCT-3′（SEQ ID NO:１５）及び
5′-GACCTCGTACCCCAACTCTTCCCCAT-3′（SEQ ID NO:１６）であった。増幅されたＰＣＲ産物を、サブクローニングし、配列決定した。８００bpのフラグメントを、ｎａｐ特異的プライマーで増幅したところ、ｎａｐ  ｃＤＮＡの２，２９５bp長の配列を再構築するのを可能にした（SEQ ID NO:３）。
【０１０９】
ＮＡＰタンパク質は、６５３アミノ酸長であり（分子質量：〜７３kDa；SEQ ID NO:４）、ＡＰＰに極めて似ていた（６１％の配列同一性、及び６９％の類似性）。最も重要なことに、ＮＡＰは、ＡＰＰに一致するＮ末端の構築を有し（図１Ａ）、植物におけるＡＰＰ様タンパク質の構造への非常に厳格な選別圧力を示唆する。ｎａｐ遺伝子は、トウモロコシゲノム内で独特であり（図２Ａ）、２．４kbの転写体をコードしていた（図２Ｃ）。
【０１１０】
「ＰＡＲＰシグニチャー」内の非常に高度に保存された領域に基づく縮重プライマーと、テンプレートとしてのトウモロコシからの第一鎖ｃＤＮＡとを用いて、３１０bpのフラグメントを増幅した。Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔでの縮重プライマー
5′-CCGAATTCGGNTAYATGTTYGGNAA-3′（SEQ ID NO:１３）、及び
5′-CCGAATTCACNATRTAYTCRTTRTA-3′（SEQ ID NO:１４）
でのＰＣＲのために、第一鎖のｃＤＮＡを、テンプレートとして用い、トウモロコシの若葉からのポリ（Ａ）+ＲＮＡ５μg、及びＭｕＭＬＶ逆転写酵素を用いて合成した。ＰＣＲ増幅を、１００μlの体積としたTaqＤＮＡポリメラーゼで、下記の条件を用いて実施した：９５℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分、次いで、９５℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分の３８周期、７２℃で１０分の最終温置。
【０１１１】
３１０bpフラグメントの配列は、同じ領域にわたるヒトＰＡＲＰとの５５％の配列同一性、及び６４％の配列類似性を示したが、しかし、ｎａｐｃＤＮＡの配列とは異なっていた。３個のｚａｐｃＤＮＡを、縮重プライマーとのＰＣＲによって得られた、３１０bpフラグメントによるスクリーニング後に同定した。これら３個の精製されたｃＤＮＡは、すべて、同じ３′非コーディング領域を有するため、同じ転写体に由来し；最長クローン（＃９）を両鎖について配列決定した（SEQ ID NO:１）。このｃＤＮＡは、６８９アミノ酸のＰＡＲＰ相同ポリペプチドをコードし（SEQ ID NO:２、分子質量：〜１０９kDa）、ＺＡＰ１と名付けた（図１Ｂ）。ＺＡＰ１の第一のジンクフィンガーは、第三のシステイン残基を含まないCKSCxxxHASVという配列を有するため、おそらく、非機能性であった。
【０１１２】
トウモロコシのＬＧ２０８０系からのｚａｐ転写体の５′ＲＡＣＥＰＣＲ分析（スクリーニングしたｃＤＮＡライブラリーは、同系繁殖系Ｂ７３４から作成した）を、下記のｚａｐ特異的プライマー：
5′-AAGTCGACGCGGCCGCCACACCTAGTGCCAGGTCAG-3′（SEQ ID NO:１７）、及び
5′-ATCTCAATTGTACATTTCTCAGGA-3′（SEQ ID NO:１８）
を用いて、上記のとおり実施した。４５０bpのＰＣＲ産物が、ｚａｐ特異的プライマーによるＰＣＲ後に得られた。５′末端での長さの僅かな違いのため独立である、ｚａｐ特異的プライマーで生成した８個の５′ＲＡＣＥＰＣＲフラグメントを配列決定した。ＬＧ２０８０のトウモロコシ植物体からのすべての転写体に、コーディング領域に追加の配列の挿入が存在し、それがＺＡＰタンパク質を１１アミノ酸だけ長くしていた（９８０アミノ酸、分子質量：〜１１０．４kDa）。ＺＡＰ２のジンクフィンガーＩは、標準的であり、CKSCxxxHARCと解読した（図１Ｂ；SEQ ID NO:１１）。配列の差は、トウモロコシの変種間の差、二つの相同遺伝子の発現、又は交番的スプライシングによると思われる。事実、トウモロコシは、少なくとも二つのｚａｐ遺伝子を有する可能性があり（図２Ｂ）、それらは、３．４〜３．５kbの転写体をコードしている（図２D）。ｚａｐｃＤＮＡから調製したプローブによるＤＮＡゲルブロットの実験は、アラビドプシス属に相同遺伝子が存在することを示した。
【０１１３】
構造上は、ＺＡＰは、動物からのＰＡＲＰに非常に類似した。二つのジンクフィンガーで構築される、充分に保存されたＤＮＡ結合ドメインを保有した（マウスＰＡＲＰのＤＮＡ結合ドメインとの３６％の同一性及び４５％の類似性）。下記のジンクフィンガーの配列のみを比較することによって、はるかに高い相同性が示された：マウスの酵素中のAla1−Phe162（４４％の同一性、及び５４％の類似性）、並びにマウスＰＡＲＰ中の核局在化シグナル（ＮＬＳ）から下流のドメインのLeu237〜Ser360（４０％の同一性、及び５０％の類似性）。哺乳動物ＰＡＲＰに特徴的な二極性核局在化シグナルが、ＺＡＰ中に同定できなかったのに対し、配列ＫＲＫＫは、一極性ＮＬＳに適合した（図１Ｂ）。推定される自己修飾ドメインは、ＺＡＰには僅かにのみ保存され、マウスＰＡＲＰにおけるより短かった。ＺＡＰ、ＮＡＰ、ＡＰＰ及びマウスＰＡＲＰ間の触媒ドメインの相同性の編成を、図２に示す。注目すべきことに、ＺＡＰのＮＡＤ+結合ドメインは、ＡＰＰ及びＮＡＰのそれ（それぞれ、４０％及び４２％の配列同一性）より、哺乳動物の酵素（４８％の同一性）に類似したのに対し、ＡＰＰ及びＮＡＰは、それらの触媒ドメインで６８％及び７６％類似した。
【０１１４】
実施例２．非慣用的ＰＡＲＰタンパク質は、ＤＮＡ依存性ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性を有する
ＡＰＰは、ＤＮＡ依存性ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼである。
ＮＡＰクラスのＰＡＲＰ様タンパク質の活性を理解するために、（酵母で発現された）ＡＰＰタンパク質の、より詳細な研究を実施した。アラビドプシス属ＡＰＰタンパク質の発現及び酵素分析のための生物としての、酵母の選択は、数多くの理由からなされた。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエは、他の真核生物の未変性タンパク質の発現に、より充分に適し、他のほとんどの真核細胞とは異なって、内因性ＰＡＲＰ活性を保有しない〔Lindahl et al., 1995〕。
【０１１５】
完全長ａｐｐｃＤＮＡを、下記のようにして、ガラクトース誘導性酵母プロモーターの制御下で、ｐＹｅＤＰ１／８−２に入れた。完全長ａｐｐｃＤＮＡは、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、ｐＣ３〔Lepiniec et al., 1995〕から切り出した。末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、このフラグメントを、酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ１／８−２〔Cullin & Pompon, 1988〕のSmaI部位にサブクローニングした。得られた発現ベクターｐＶ８ＳＰＡ（図４）を、サッカロミセス・セレビシエＤＹ株中に形質転換した。
【０１１６】
大腸菌でのＡＰＰ発現のために、ａｐｐｃＤＮＡの完全なコーディング領域を、プライマーの
5′-AGGATCCCATGGCGAACAAGCTCAAAGTGAC-3′（SEQ ID NO:１９）、及び
5′-AGGATCCTTAGTGCTTGTAGTTGAAT-3′（SEQ ID NO:２０）
を用いて、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）でＰＣＲ増幅し、BamHIフラグメントとしてｐＥＴ１９ｂ（Novagene, Madison, WI）にサブクローニングして、ｐＥＴＳＰＡを得た。ｐＥＴＳＰＡからの大腸菌ＢＬ２１での完全長ＡＰＰの発現は、非常に僅かであった。より充分な発現を得るために、ｐＥＴＳＰＡをＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ、又はＳｍａＩで消化し、末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、次いで、プラスミドを自己結合させた。得られたプラスミドのｐＥＴΔＮｄｅＳＰＡ及びｐＥＴΔＳｍａＳＰＡのうち、ｐＥＴΔＮｄｅＳＰＡのみが、大腸菌ＢＬ２１における断端ＡＰＰポリペプチド（Met310〜His637）の充分な発現を与えたにすぎなかった。
【０１１７】
酵母におけるＡＰＰの発現を、ノーザン及びウエスタンブロット分析によって確認した（図４）。ｐＶ８ＳＰＡ中のプロモーターは、細胞をグルコース上で増殖させ、ガラクトース含有培地で抑制したときに、不活性であるため、その発現は、炭素源によって厳しく調節されると予測された。しかし、空ベクターを含有する対照ＤＹ株と比較しての、ＲＮＡのノーザンブロット分析、及びＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）中のタンパク質の免疫ブロット分析は、ａｐｐのｍＲＮＡ及びＡＰＰのタンパク質は、グルコース含有培地で増殖させたときでさえ、酵母中に発現されることを示した（図４Ｂ、列２）。グルコース含有培地で観察された発現の特色は、ａｐｐｍＲＮＡ及びＡＰＰタンパク質は、双方とも、ガラクトースによる誘導後に検出されたそれより短かいことであった（図４Ｂの列２及び４を比較されたい）。より高分子量のＡＰＰポリペプチド（見かけ上は完全長タンパク質）は、ガラクトース含有培地でのみ検出されたにすぎないが、そのような細胞は、断端ｍＲＮＡ及びタンパク質も発現した。この所見についての最もあり得る説明は、ＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）株をグルコースで増殖させたとき、発現カセットからの漏出的発現が存在して、転写開始点から２００〜３００bp下流で始まる転写が、ガラクトース誘導後に観察されたということである。この比較的短いｍＲＮＡは、おそらく、ＡＰＰの第１メチオニン（Met1）に対するコードを保有せず、そのため、翻訳は、Met72で開始される。これは、グルコース又はガラクトースで増殖させた株からの、ＡＰＰポリペプチドの分子質量の−５kDaという、観察された差（算出された差は、７．５kDaである）を説明すると思われる。分子質量の差が、ポリ（ＡＤＰ−リボシル）化による自己修飾に帰され得るという可能性は、ＰＡＲＰ阻害剤、例えば３ＡＢＡ及びニコチンアミドの存在下での株の増殖によって、排除される（図４Ｂ；列６及び８を列４と比較されたい）。
【０１１８】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成を検出するために、全タンパク質を、異なる条件下で増殖させた酵母菌株から抽出し、放射性標識化ＮＡＤ+の存在下で温置した。in vivoでのポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成、及びＡＰＰのあり得る自己修飾を防ぐため、３ＡＢＡ、すなわちＰＡＲＰの可逆的阻害剤の存在下でも菌株を増殖させ、その後、阻害剤は、脱塩の際にタンパク質抽出物から除去した。図５は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）が、ガラクトースで増殖させたＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）のタンパク質抽出物によって合成されるが（図５Ａ、列１及び２）、空ベクターを有する株によっては合成されないことを示す（図５Ａ、列４）。アラビドプシス属のＡＰＰは、長さが４０残基までの重合体を合成することができて（図５Ａ、列１）、放射能の大部分は、１０〜１５量体に取り込まれたことも認めることができる。この所見は、他の著者が検出した重合体の大きさに一致する〔Chen et al., 1994〕。酵母菌株を３ＡＢＡとともに増殖させたときの方が、それなしのときより多くの放射能が重合体に取り込まれたが（図５Ａ、列２と比較した列１）；その理由は、阻害された培養体から抽出されたＡＰＰが、より少なく自己修飾されたか（自己修飾は、ＰＡＲＰの活性を阻害すると考えられる）、又は標識されたＮＡＤ+が、阻害されない培養体からの酵素によって、既存重合体の延長に用いられた結果、全体として、より低い比活性を生じたかのいずれかである可能性がある。同じ反応条件下で、ヒトＰＡＲＰによって、反応緩衝液のみでか、又はＤＹ（ｐＹｅＤＰ１／８−２）からの酵母の全タンパク質抽出物の存在下で合成されたポリ（ＡＤＰ−リボース）は（図５Ａ、それぞれ列５及び６）、おそらくは４００量体までの、はるかに長い鎖を示した〔de Murcia & Menissier de Murcia, 1994〕。
【０１１９】
ニックＤＮＡによる酵素活性の刺激は、動物からのＰＡＲＰの周知の特性である〔Alvarez-Gonzalez & Althaus, 1989〕。そのため、本発明者らは、ＡＰＰタンパク質の活性が、ＤＮＡ依存性であるか否かを試験した。ガラクトース増殖ＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）のタンパク質抽出物から、酵母核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）及び多少の塩基性タンパク質を除去した後、ポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成を、上昇する濃度の音波処理したサケ精子ＤＮＡの存在下で分析した。図５Ｂに認め得るとおり、反応物中に存在するＤＮＡの量と、32Ｐ−ＮＡＤ+の取込みとの間には、直接的相関が存在した。リン光画像の走査は、４０μg/mlのＤＮＡを含有する反応混合物中の方が、２μg/mlのＤＮＡのそれより〜６倍もの多くの放射能が、ポリ（ＡＤＰ−リボース）に取り込まれることを示した（図５Ｂ、それぞれ列４および２）。重合体の合成は、反応混合物中の３ＡＢＡに感受性であった（図５Ｂ、列５）。
【０１２０】
ＡＰＰは核タンパク質である
動物細胞では、ＰＡＲＰ活性は、核内に局在する〔Schreiber et al., 1992〕。ＡＰＰの細胞内局在は、それが核であるならば、ＡＰＰが真正の植物ＰＡＲＰであることの、重要な追加的指標を与えることができると思われる。このため、酵母細胞内のＡＰＰポリペプチドの局在を、抗ＡＰＰ抗血清を用いて分析した。ガラクトースで増殖させた酵母細胞内のＡＰＰポリペプチドは、主として、核内に見出された。この局在は、ＰＡＲＰ阻害剤の培地中の存在に影響されなかった。
【０１２１】
加えて、本発明者らは、ＡＰＰが、ヒトＰＡＲＰについて報告されたように〔Collinge & Althaus, 1994〕、酵母細胞内で構築的に活性であるか否かを試験した。ここでは、固定した酵母スフェロプラストを、ポリ（ＡＤＰ−リボース）重合体を特異的に認識する、モノクローナル抗体１０Ｈ抗体〔Kawamitsu et al., 1984〕とともに温置した。１０Ｈ抗体による、陽性の黄色がかった緑色の蛍光シグナルは、核内に局在し、ガラクトースで増殖させたＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）細胞でのみ観察された。陽性染色は、ＰＡＲＰ阻害剤の３ＡＢＡ及びニコチンアミドの存在下で増殖させた細胞では、大幅に減少した。
【０１２２】
植物細胞におけるＡＰＰの細胞内局在を同定するため、植物の研究で広汎に採用される取組み方、すなわち、タンパク質融合が、トランスジェニック植物又はトランスフェクション細胞内で生じたの値の、問題のタンパク質とレポーター遺伝子との間に形成される融合タンパク質の細胞下位置の検証〔Citovsky et al., 1994；Sakamoto & Nagatani, 1996；Terzaghi et al., 1997；von Arnim & Deng, 1994〕を用いた。ＧＵＳと、ＡＰＰポリペプチドのMet1〜Pro407に広がる部分との、Ｎ末端翻訳性融合を実施した。ＡＰＰと、細菌ＧＵＳとの翻訳性融合は、下記のとおり構築した。プラスミドｐＥＴＳＰＡをＳｍａＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＧＵＳ１からの平滑末端ＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントに結合した（Plant Genetic Systems N.V., Gent、ベルギー国）。結合ミックスを、ＥｃｏＲＩＸＬ−１中に形質転換し、細胞を、０．１mMイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、４０μg/ml５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−グルクロニド、及び１００μg/mlアンピシリンで強化した、ＬＢ培地上に平板播種した。このようにして、ｐＥＴＳＰＡＧＵＳを、青色のコロニーとして選別した。大腸菌における〜１１０kDa融合タンパク質の発現は、in situＧＵＳ活性ゲル〔Lee et al., 1995〕によって確認した。ＡＰＰ−ＧＵＳ融合体を、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの制御下に置き（ｐＥＴＳＰＡＧＵＳからのクレノウ平滑末端化ＢａｍＨＩフラグメントを、ＳｍａＩ消化したｐＪＤ３３０にサブクローニングした）〔Gallie & Walbot, 1992〕、得られた発現カセットを、XbaIフラグメントとして、ｐＣＧＮ１５４７というバイナリーベクター〔McBride & Summerfelt, 1990〕のXbaI部位にサブクローニングして、ｐＧＣＮＳＰＡＧＵＳを得た。最後に、ｐＧＣＮＳＰＡＧＵＳを、凍結解凍形質転換の手順によって、アグロバクターＣ５８Ｃ１ＲｉｆR（pGV2260）に導入した。
【０１２３】
融合タンパク質の発現は、大腸菌で確認した。３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下のキメラｃＤＮＡを、タバコゲノムに安定的に組み込んだ。独立した４種類のトランスジェニックタバコの植物体からの子孫を、in situでの組織化学的染色後に、ＧＵＳ活性の細胞下分布について解析した〔Jefferson et al., 1987〕。２日齢の若芽では、ＧＵＳ活性は、子葉及び根で検出できたが、胚軸及び根端では検出できなかった。根組織が透明なため、ＧＵＳ染色は、根毛及び表皮細胞の核内に明瞭に局限された。加えて、多少の拡散、すなわち他の根細胞の非局在性染色が、特に維管束環沿いに見られた。この非核内ＧＵＳ染色は、葉の組織では、更に傑出していた。若い真の葉又は子葉は、核の強い青色の染色を示すのに対し、細胞質の多少の拡散染色も存在した。しかし、充分に展開した葉では、ＧＵＳ染色は、均質になり、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でＧＵＳで形質転換した対照植物に類似したが、後者では、ＧＵＳは、細胞質で発現された。結果的に、より高齢の葉又は子葉は、ＧＵＳ染色が特定のいかなる細胞区画にも局限されない維管束を除いて、組織化学的に検出できるＧＵＳ活性を、実際上全く示さなかった。
【０１２４】
ＤＮＡリガーゼＩの欠乏は、ａｐｐ遺伝子の発現を誘導する
動物細胞内のＰＡＲＰは、最も豊富な核タンパク質の一つであり、その活性は、損傷したＤＮＡに結合した際のタンパク質でのアロステリックな変化によって調節される。本発明者らは、アラビドプシス属におけるａｐｐ遺伝子が、非常に低レベルの発現を有していて、この遺伝子の転写活性は、in vivoでのＡＰＰ機能に不可欠であり得るのを示唆することを見出した。この仮説を検定するため、ＤＮＡリガーゼＩの欠乏によって生じるin vivoゲノム不安定化の際に、ａｐｐ遺伝子の発現を調べた。アラビドプシス属ＤＮＡリガーゼＩ遺伝子における、Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異、すなわちＳＫ１Ｂ２系を、あらかじめ単離した〔Babiychuk et al., 1997〕。この突然変異は、同型接合状態では致死的であるが、突然変異した対立遺伝子は、配偶子からの正常な伝達を示す。そのため、本発明者らは、突然変異に関して同型接合である細胞は、突然変異した花粉による突然変異胚嚢の受精直後に、細胞周期のＳ期の間の不完全なＤＮＡ合成のために死ぬものと予測した。
【０１２５】
ＧＵＳのコーディング領域を、ＡＰＰの初めの５アミノ酸、及びａｐｐ５′フランキング配列の２kbと枠内融合させた、ａｐｐプロモーター−ＧＵＳ翻訳融合を構築した（SEQ ID NO:２１）。この融合タンパク質をコードする遺伝子を、アラビドプシス属へと形質転換した。野生型との２回の戻し交雑の後、ａｐｐプロモーター−ＧＵＳで形質転換した異型接合植物を、アラビドプシス属のＳＫ１Ｂ２系と交雑した。対照植物、及びリガーゼ突然変異について異型接合である植物の花序を、ＧＵＳの活性について染色した。加齢の組織でほとんどは検出される、ＧＵＳ染色のパターンは、おそらくａｐｐ遺伝子の発現を反映するが、本発明者らは、調節配列のすべてが、用いた構築体に存在することの確かな証拠は得ていない。このパターンは、突然変異リガーゼ遺伝子を保有しない対照植物と、突然変異について異型接合である植物との花序でも、ともに同じであった。融合タンパク質を有する突然変異植物の胚珠の約４分の１は、ＧＵＳ陽性であった。より精密な顕微鏡検査は、ＧＵＳ陽性の胚珠では、配偶体のみが染色されたにすぎない。対照植物と、突然変異植物との間の唯一の差は、ＤＮＡリガーゼ遺伝子における突然変異であった。そのため、本発明者らは、ａｐｐ遺伝子は、ＤＮＡ切断の蓄積か、又は突然変異した花粉で受精した突然変異胚嚢の死のいずれかのために、誘導されると結論した。胚嚢のＧＵＳ染色は、受粉後２４時間以内にか、又はそのため受精後の非常に早期に出現することが見出された。
【０１２６】
実施例３．ＰＣＤ調節キメラ遺伝子の構築、及びアグロバクター菌株へのそのようなＰＣＤ調節遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターの導入
３．１．ｐ３５Ｓ:(dsRNA-APP)及びｐ３５Ｓ:(dsRNA-ZAP)遺伝子の構築
標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、図６（構築体１及び５）に模式的に描いたとおり、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合した：
【０１２７】
ｐ３５Ｓ:(dsRNA-ZAP)キメラ遺伝子に対して
・ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域〔Odell et al., 1985〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＺＡＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（ハイブリダイゼーションによって単離された、SEQ ID NO:１０に対するシロイヌナズナ相同体）
・逆配向のＺＡＰ２コーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１２８】
ｐ３５Ｓ:(dsRNA-APP)キメラ遺伝子に対して
・ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域〔Odell et al., 1985〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＡＰＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（SEQ ID NO:５）
・逆配向のＡＰＰコーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１２９】
３．２．ｐＮＯＳ:(dsRNA-APP)及びｐＮＯＳ:(dsRNA-ZAP)遺伝子の構築
標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、図６（構築体２及び６）に模式的に描いたとおり、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合した：
【０１３０】
ｐＮＯＳ:(dsRNA-ZAP)キメラ遺伝子に対して
・ＮＯＳプロモーター領域〔Herrera-Estrella et al., 1983〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＺＡＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（ハイブリダイゼーションによって単離された、SEQ ID NO:１０に対するシロイヌナズナ相同体）
・逆配向のＺＡＰ２コーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１３１】
ｐＮＯＳ:(dsRNA-APP)キメラ遺伝子に対して
・ＮＯＳプロモーター領域〔Herrera-Estrella et al., 1983〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＡＰＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（SEQ ID NO:５）
・逆配向のＡＰＰコーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１３２】
３．３．ｐＴＡ２９:(dsRNA-APP)及びｐＴＡ２９:(dsRNA-ZAP)遺伝子の構築
標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、図６（構築体３及び７）に模式的に描いたとおり、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合した：
【０１３３】
ｐＴＡ２９:(dsRNA-ZAP)キメラ遺伝子に対して
・ＴＡ２９プロモーター領域（国際公開特許第８９／１０３９６号公報）
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＺＡＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（ハイブリダイゼーションによって単離された、SEQ ID NO:１０に対するシロイヌナズナ相同体）
・逆配向のＺＡＰ２コーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１３４】
ｐＴＡ２９:(dsRNA-APP)キメラ遺伝子に対して
・ＴＡ２９プロモーター領域（国際公開特許第８９／１０３９６号公報）
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＡＰＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（SEQ ID NO:５）
・逆配向のＡＰＰコーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１３５】
３．４．ｐＮＴＰ３０３:(dsRNA-APP)及びｐＮＴＰ３０３:(dsRNA-ZAP)遺伝子の構築
標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、図６（構築体４及び８）に模式的に描いたとおり、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合した：
【０１３６】
ｐＮＴＰ３０３:(dsRNA-ZAP)キメラ遺伝子に対して
・ＮＰＴ３０３プロモーター領域〔Wetering, 1994〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＺＡＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（ハイブリダイゼーションによって単離された、SEQ ID NO:１０に対するシロイヌナズナ相同体）
・逆配向のZAP2コーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１３７】
ｐＮＴＰ３０３:(dsRNA-APP)キメラ遺伝子に対して
・ＮＰＴ３０３プロモーター領域〔Wetering, 1994〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域〔Harpster et al., 1988〕
・ＡＰＰコーディングＤＮＡ領域（ほぼ完全）（SEQ ID NO:５）
・逆配向のＡＰＰコーディングＤＮＡ領域の５′末端の約５００bp
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１３８】
３．５．キメラ性マーカー遺伝子の構築
標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、図６に模式的に描いたとおり、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合した：
【０１３９】
ｇａｔマーカー遺伝子に対して
・Ａｃｔ２プロモーター領域〔An et al., 1996〕
・アミノグリコシド６′−アセチルトランスフェラーゼコーディングＤＮＡ（国際公開特許第９４／２６９１３号公報）
・ノパリンシンターゼ遺伝子の３′末端〔Depicker et al., 1982〕
【０１４０】
ｂａｒマーカー遺伝子に対して
・Ａｃｔ２プロモーター領域〔An et al., 1996〕
・ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコーディングＤＮＡ（米国特許第５，６４６，０２４号明細書）
・ノパリンシンターゼ遺伝子の３′末端〔Depicker et al., 1982〕
【０１４１】
３．６．ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターの構築
適切な制限酵素を用いて、３．１〜３．５の下に記載したキメラ性ＰＣＤ調節遺伝子を切り出し、ｇａｔマーカー遺伝子又はｂａｒマーカー遺伝子のいずれかとともに、ｐＧＳＶ５に由来するＴ−ＤＮＡベクター（国際公開特許第９７／１３８６５号公報）のＴ−ＤＮＡ境界間のポリリンカーに導入した。得られたＴ−ＤＮＡベクターを、図６に模式的に示す。
【０１４２】
３．７．アグロバクテリウム属へのＴ−ＤＮＡの導入
Walkerpeach及びVelten（1995）が記載したとおりの電気穿孔法によって、Ｔ−ＤＮＡベクターをアグロバクターＣ５８Ｃ１Ｒｉｆ株（pGV4000）に導入し、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンを用いて、形質転換体を選別した。
【０１４３】
実施例４．実施例３のＴ−ＤＮＡベクターによるシロイヌナズナのアグロバクター介在形質転換
アグロバクター菌株を用いて、シロイヌナズナ変種Ｃ２４を、Valvekensら（1992）が記載したとおりの根の形質転換法を適用して形質転換した。外植片を、それぞれ、ｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ及びｄｓＲＮＡ−ＺＡＰ構築体を含むアグロバクター菌株に同時感染させた。ｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ構築体は、ｐａｃｔ：ｂａｒ遺伝子と併用した。ｄｓＲＮＡ−ＺＡＰ構築体は、ｐａｃｔ：ｇａｔ遺伝子と併用した。形質転換体を、ホスフィノトリシン耐性について選別した。再生した根付いたトランスジェニック系統を、カナマイシン耐性についてのスクリーニングによって、他のＴ−ＤＮＡの存在について試験した。両Ｔ−ＤＮＡを含むトランスジェニック系統を、温室に移した。Ｔ０トランスジェニック系統の表現型を記録し、Ｔ１世代は、更に、より詳しく調べた。
【０１４４】
実施例５．実施例３のＴ−ＤＮＡベクターによるセイヨウアブラナBrassica napusのアグロバクター介在形質転換
アグロバクター菌株を用いて、セイヨウアブラナ変種Ｎ９０−７４０を、下記の変更を除いて基本的にはDe Blockら（1989）が記載したとおりの、胚軸形質転換法を適用して形質転換した。
【０１４５】
−胚軸外植片を、Ａ２培地〔ＭＳ、０．５g/lのＭｅｓ（pH５．７）、１．２％グルコース、０．５％アガロース、１mg/lの２，４−D、０．２５mg/lのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、及び１mg/lの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）〕で１日間前培養した。
【０１４６】
−感染培地Ａ３は、ＭＳ、０．５g/lのＭｅｓ（pH５．７）、１．２％グルコース、０．１mg/lのＮＡＡ、０．７５mg/lのＢＡＰ、及び０．０１mg/lのジベレリン酸（ＧＡ３）であった。
【０１４７】
−選別培地Ａ５Ｇは、ＭＳ、０．５g/lのＭｅｓ（pH５．７）、１．２％グルコース、４０ｍｇ/lのアデニン−ＳＯ4、０．５g/lのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．５％アガロース、０．１mg/lのＮＡＡ、０．７５mg/lのＢＡＰ、０．０１mg/lのＧＡ３、２５０mg/lのカルベニシリン、２５０mg/lのトリアシリン、５mg/lのＡｇＮＯ3に３週間であった。この期間後、選別をＡ５Ｊ培地で継続した（３％ショ糖以外はＡ５Ｇと同様）。
【０１４８】
−再生培地Ａ６は、ＭＳ、０．５g/lのＭｅｓ（pH５．７）、２％ショ糖、４０ｍｇ/lのアデニン．ＳＯ4、０．５g/lのＰＶＰ、０．５％アガロース、０．００２５mg/lのＢＡＰ、及び２５０mg/lのトリアシリンであった。
【０１４９】
−健康な苗条を、根付け培地に移したが、これは、１リットル入り容器中のＡ９：半濃度のＭＳ、１．５％ショ糖（pH５．８）、１００mg/lのトリアシリン、０．６％寒天であった。ＭＳは、ムラシゲ−スコーグ培地〔Murashige & Skoog, 1962〕を意味する。
【０１５０】
ｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ及びｄｓＲＮＡ−ＺＡＰの両Ｔ−ＤＮＡ構築体を同じ植物細胞に導入するには、基本的にはDe Block及びDebrouwer（1991）が記載したとおりの、共形質転換法を適用した。形質転換した植物系統を、ホスフィノトリシン含有培地で選別し、その後、再生した根付いた苗条を、カナマイシン耐性について試験することによって、第二のＴ−ＤＮＡの存在をスクリーニングした。共形質転換の実験では、ｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ構築体は、ｐａｃｔ：ｂａｒ遺伝子と併用した。ｄｓＲＮＡ−ＺＡＰ構築体は、ｐａｃｔ：ｇａｔ遺伝子と併用した。両Ｔ−ＤＮＡを含むトランスジェニック系統を、温室に移した。Ｔ０トランスジェニック系統の表現型を記録し、Ｔ１世代は、更に、より詳しく調べた。
【０１５１】
実施例６．植物系統の活力を試験するためのin vitroアッセイ
６．１．セイヨウアブラナについての適応度アッセイ
培地及び反応緩衝液
播種培地：
半濃度のムラシゲ−スコーグ塩類
２％ショ糖
pH５．８
０．６％寒天
カルス誘導培地：Ａ２Ｓ
ＭＳ培地、０．５g/lのＭｅｓ（pH５．８）、３％ショ糖、４０mg/lのアデニン−ＳＯ4、１mg/lの２，４−Ｄ、０．２５mg/lのＮＡＡ、１mg/lのＢＡＰ
温置培地：
２５mMリン酸カリウム緩衝液、pH５．８
２％ショ糖
培地２５mlに対して１滴のトゥイーン２０
反応緩衝液：
５０mMリン酸カリウム緩衝液、pH７．４
１０mM２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）（＝３．３５mg/ml）
緩衝液２５mlに対して１滴のトゥイーン２０
【０１５２】
種子の滅菌、及び苗条の栽培
種子を、７０％エタノールに２分間浸漬し、次いで、０．１％のトゥイーン２０を含有する次亜塩素酸ナトリウム溶液（約６％の活性塩素を有する）中で１５分間表面滅菌した。最後に、種子を、滅菌蒸留水１lで洗浄した。播種培地約７５mlを内容する１リットル入り容器（Weck）あたり７個の種子を入れた。種子を、２３℃、及び１６時間の光周期での３０μEinstein／秒・m2で発芽させた。
実験間の標準化のために、Ｎ９０−７４０系統を常に含めた。
【０１５３】
胚軸外植片の前培養
−播種の１２〜１４日後に、胚軸を約７mmの分節に切断した。Optiluxペトリ皿（FalconＳ１００５）１枚あたり胚軸２５個。
−胚軸外植片を、Ａ２Ｓ培地にて、２３〜２５℃で４日間培養した（３０μEinstein／秒・m2）。なお、アッセイを実施するには、１系統あたり約１５０〜３００個の胚軸外植片が必要であった。
−胚軸外植片を、温置培地３０mlを内容するOptiluxペトリ皿（FalconＳ１００５）に移した。
−暗所にて２４℃で約２０時間温置した。
【０１５４】
ＴＴＣ−アッセイ
−１５０個の胚軸外植片を、５０ml入りFalcon管に移した。
−反応緩衝液（ＴＴＣなし）で洗浄。
−管１本あたり２５〜３０mlの反応緩衝液を加えた。
管１：ＴＴＣ加えず。
＊バックグラウンド吸収測定のため。
＊１実験あたり１系統で充分。
管２：１０mMＴＴＣを添加（外植片を水没させなければならないが、減圧浸透はさせない）。
−管を上下反転させる。
−暗所にて、２６℃で約１時間温置（終結反応なし）。
−胚軸を脱イオン水で洗浄。
−水を除去。
−−７０℃で３０分間凍結。
−室温で解凍（暗所にて）。
−エタノール（技術用）５０mlを添加。
−還元したＴＴＣ−Ｈを１時間の振盪によって抽出。
−抽出物の吸光を４８５nmで測定。なお、還元ＴＴＣ−Ｈは、安定的でないため、暗中に保ち、できるだけ速やかにＯ．Ｄ．485を測定する。
Ｏ．Ｄ．485(TTC-H)＝（Ｏ．Ｄ．485＋ＴＴＣ）−（Ｏ．Ｄ．485−ＴＴＣ）  −異なる無関係の実験のサンプル間のＴＴＣ還元容量の比較は、異なる実験でのＮ９０−７４０のＴＴＣ還元能力を１００％に設定することによって、実施することができる。
−高いＴＴＣ還元能力の系統は、活力に富むが、低いＴＴＣ還元能力の系統は、弱かった。
【０１５５】
６．２．アラビドプシス属についての適応度アッセイ
培地及び反応緩衝液
植物培地：
半濃度のムラシゲ−スコーグ塩類
１．５％ショ糖
pH５．８
０．６％寒天
オートクレーブで１５分
フィルター滅菌した１００mg/lのｍｙｏ−イノシトールを添加
−０．５mg/lのピリドキシン
−０．５mg/lのニコチン酸
−１mg/lのチアミン
温置培地：
１０mMリン酸カリウム緩衝液、pH５．８
２％ショ糖
培地２５mlに対して１滴のトゥイーン２０
反応緩衝液：
５０mMリン酸カリウム緩衝液、pH７．４
１０mM２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）（＝３．３５mg/ml）
緩衝液２５mlに対して１滴のトゥイーン２０
【０１５６】
アラビドプシス属の植物体
−アラビドプシス属の種子の滅菌
７０％エタノールに２分間。
漂白剤（６％活性塩素）＋溶液２０mlに対して１滴のトゥイーン２０に１０分間。
滅菌水で５回洗浄。なお、滅菌は、２ml入りエッペンドルフ管中で実施。アラビドプシス属種子は、管底に沈んで、１ml入りピペットによる液体の除去を可能にする。
−アラビドプシス属の植物体の栽培
種子を、±１００mlの植物培地を内容する「Falcon格子間組織培養盤」（第３０２５番）に播種：１種子／格子。
植物体を２３℃で栽培、４０μEinstein／秒・m2、明１６時間−暗８時間で約３週間（植物体は、花芽の形成を開始）。
追記：
＊アッセイを実施するには、１系統あたり約９０〜１１０の植物体が必要。
＊較正のための対照系統（Ｃ２４；Columbia等々）を含む。
【０１５７】
前温置
−（鋏を用いて）根を切断することによって、アラビドプシス属の若芽を採集。
各若芽を、直ちに、温置培地に入れた（若芽は、水没させなければならないが、減圧浸透はさせない）。
温置培地：「Falcon格子間組織培養盤」（第３０２５番）中に±１５０ml。
（ａ）温置培地：バックグラウンド吸収の定量のため（ＴＴＣアッセイを参照されたい）。
（ｂ）温置培地
（ｃ）温置培地＋２mMナイアシンアミド
１ペトリ皿あたり３０〜３５の若芽（しかし、すべての系統及び各条件について同量の若芽）。
−暗中２４℃で±２０時間温置した。
【０１５８】
ＴＴＣアッセイ
−若芽を５０ml入りFalcon管に移した。
−反応緩衝液（ＴＴＣなし）で洗浄。
−管１本あたり３０〜３５mlの反応緩衝液を加えた。
（ａ）ＴＴＣ加えず（バックグラウンド吸収測定のため）。
（ｂ）及び（ｃ）＋１０mMＴＴＣ。
（若芽を水没させなければならないが、減圧浸透はさせない）。
−暗所にて、２６℃で約１時間温置（終結反応なし）。
−胚軸を脱イオン水で洗浄。
−水を除去。
−−７０℃で３０分間凍結。
−室温で解凍（暗所にて）。
−エタノール（技術用）５０mlを添加。
−還元したＴＴＣ−Ｈを１時間の振盪によって抽出。
−抽出物の吸光を４８５nmで測定。なお、還元ＴＴＣ−Ｈは、安定的でないため、暗中に保ち、できるだけ速やかにＯ．Ｄ．485を測定する。
−試験系統対対象系統の還元性質の比較（３０〜３５植物体の集団について）
Ｏ．Ｄ．485(TTC-H)＝（Ｏ．Ｄ．485＋ＴＴＣ）−（Ｏ．Ｄ．485−ＴＴＣ）
−異なる無関係の実験のサンプル間のＴＴＣ還元容量の比較は、異なる実験での対照系統（Ｃ２４；Columbia等々）のＴＴＣ還元容量を１００％に設定することによって、実施することができる。
−高いＴＴＣ還元能力の系統は、活力に富むが、低いＴＴＣ還元容量の系統は、弱かった。
−温置培地へのナイアシンアミドの添加が、より高いＴＴＣ還元容量を招くならば、それは、（Ｃ２４及びColumbiaについて示されたとおり）より低い適応度の指標となる。
【０１５９】
実施例７．ｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ及びｄｓＲＮＡ−ＺＡＰ構築体をともに含むトランスジェニック系統の表現型解析
タペータム組織又は花粉特異的プロモーターの制御下でｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ及びｄｓＲＮＡ−ＺＡＰを含む、Ｔ０系統の花の表現型、及び花粉の生存度（Alexander染色〔Alexander, 1969〕及び発芽アッセイ）を記録した。アラビドプシス属については、Ｔ１世代は、自家受粉によるか、又は植物が雄性不稔ならば、非形質転換野生型植物の花粉を用いた戻し交雑によって得た。セイヨウアブラナについては、Ｔ１世代は、常に、非形質転換植物の花粉を用いた戻し交雑によって得た。
【０１６０】
Ｔ１種子を、カナマイシン含有培地で発芽させ、その後、耐性植物を、ホスフィノトリシン耐性についてのアンモニウムマルチウェルアッセイ〔De Block et al., 1995〕によって記録した。両Ｔ−ＤＮＡを有する植物の半分を、温室に移して、植物の雄性不稔を記録したが、他の半分は、適応度アッセイによって、植物の活力を定量するのに用いた。
【０１６１】
３５Ｓ又はＮＯＳプロモーターの制御下で、ＰＣＤ調節遺伝子の組合せ（ＡＰＰ／ＺＡＰ）を含む植物については、多数のトランスジェニック系統で、高い活力が観察された。
【０１６２】
ＴＡ２９の制御下で、ＰＣＤ調節遺伝子の組合せ（ＡＰＰ／ＺＡＰ）を含む植物については、多数のトランスジェニック系統で、雄性不稔が観察された。ＮＴＰ３０３の制御下で、ＰＣＤ調節遺伝子の組合せ（ＡＰＰ／ＺＡＰ）を含む植物については、多数のトランスジェニック系統で、花粉不稔が観察された。
【０１６３】
実施例８．ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を含む植物の表現型解析
ｐ３５Ｓ：（ｄｓＲＮＡ−ＺＡＰ）キメラ遺伝子のもう一つの例を、標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合することによって構築した：
・ＣａＭＶ３５Ｓ２プロモーター領域〔Odell et al., 1985〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域コーディングＤＮＡ〔Harpster et al., 1988〕
・SEQ ID NO:１０の第２７９位〜第１，７２８位ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、HincII部位からSnaBI部位までの、トウモロコシのＺＡＰ２コーディングＤＮＡ領域
・逆配向のHincII部位からEcoRV部位までのＺＡＰ２コーディング領域の５′末端（SEQ ID NO:１０の第２７９位〜第７９２位のヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体を有する）
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１６４】
このキメラ遺伝子を、ｂａｒマーカー遺伝子とともに、ｐＧＳＶ５（国際公開特許第９７／１３８６５号公報に記載された）に由来するＴ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界間のポリリンカーに導入し、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＴＹＧ３３を得て、これを、記載のとおりの電気穿孔によって、アグロバクテリウム属のＣ５８Ｃ１Ｒｉｆ（pGV4000）に導入した。
【０１６５】
ｐＮＯＳ：：(dsRNA-ZAP)キメラ遺伝子のもう一つの例を、標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合することによって構築した：
・ノパリンシンターゼプロモーター領域〔Herrera-Estrella et al., 1985〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域コーディングＤＮＡ〔Harpster et al., 1988〕
・SEQ ID NO:１０の第２７９位〜第１，７２８位ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、HincII部位からSnaBI部位までの、トウモロコシのＺＡＰ２コーディングＤＮＡ領域
・逆配向のHincII部位からEcoRV部位までのＺＡＰ２コーディング領域の５′末端（SEQ ID NO:１０の第２７９位〜第７９２位のヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体を有する）
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１６６】
このキメラ遺伝子を、barマーカー遺伝子とともに、ｐＧＳＶ５（国際公開特許第９７／１８３６５号公報に記載された）に由来するＴ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界間のポリリンカーに導入し、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＴＹＧ３４を得て、これを、記載のとおりの電気穿孔によって、アグロバクテリウム属のＣ５８Ｃ１Ｒｉｆ（pGV4000）に導入した。
【０１６７】
ｐ３５Ｓ：：(dsRNA-APP)キメラ遺伝子のもう一つの例を、標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合することによって構築した：
・ＣａＭＶ３５Ｓ２プロモーター領域〔Odell et al., 1985〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域コーディングＤＮＡ〔Harpster et al., 1988〕
・SEQ ID NO:５の第１８９位〜第１，３４９位ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、ScaI部位からSmaI部位までの、シロイヌナズナのＡＰＰコーディングＤＮＡ領域
・逆配向のScaI部位からHaeIII部位までのＺＡＰ２コーディング領域の５′末端（SEQ ID NO:５の第１８９位〜第７８４位のヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体を有する）
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１６８】
このキメラ遺伝子を、ｂａｒマーカー遺伝子とともに、ｐＧＳＶ５（国際公開特許第９７／１３８６５号公報に記載された）に由来するＴ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界間のポリリンカーに導入し、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＴＹＧ２９を得て、これを、記載のとおりの電気穿孔によって、アグロバクテリウム属のＣ５８Ｃ１Ｒｉｆ（pGV4000）に導入した。
【０１６９】
ｐＮＯＳ：：(dsRNA-APP)キメラ遺伝子のもう一つの例を、標準的組換えＤＮＡの手順を用いて、下記のＤＮＡ領域を動作可能に結合することによって構築した：
・ノパリンシンターゼプロモーター領域〔Herrera-Estrella et al., 1985〕
・Ｃａｂ２２リーダー領域コーディングＤＮＡ〔Harpster et al., 1988〕
・SEQ ID NO:５の第１８９位〜第１，３４９位ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、ScaI部位からSmaI部位までの、シロイヌナズナのＡＰＰコーディングＤＮＡ領域
・逆配向のScaI部位からHaeIII部位までのＺＡＰ２コーディング領域の５′末端（SEQ ID NO:５の第１８９位〜第７８４位のヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体を有する）
・ＣａＭＶ３５Ｓ３′末端領域〔Mogen et al., 1990〕
【０１７０】
このキメラ遺伝子を、ｂａｒマーカー遺伝子とともに、ｐＧＳＶ５（国際公開特許第９７／１３８６５号公報に記載された）に由来するＴ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界間のポリリンカーに導入し、Ｔ−ＤＮＡベクターｐＴＹＧ３０を得て、これを、記載のとおりの電気穿孔によって、アグロバクテリウム属のＣ５８Ｃ１Ｒｉｆ（pGV4000）に導入した。
【０１７１】
得られたアグロバクテリウム属の菌株を用いて、異なるＰＣＤ調節遺伝子を、セイヨウアブラナ及びシロイヌナズナ（Columbia及びＣ２４）の植物に、実施例４及び５に記載されたとおりに導入した。
【０１７２】
Ｔ０世代の自家受粉によって得られたトランスジェニックシロイヌナズナの植物（Ｔ１世代）を、ホスフィノトリシンを含有する培地で発芽させた。耐性トランスジェニック植物を、更に栽培した。
【０１７３】
ｐＴＹＧ３３におけるようにｐＮＯＳ：：(dsRNA-ZAP)構築体を、又はｐＴＹＧ３４におけるようにｐ３５Ｓ:(dsRNA-ZAP)構築体を含む、トランスジェニックＴ１植物（ともにColumbia又はＣ２４に由来）の成長は、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子なしのＴ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡによって形質転換された、対照のトランスジェニック植物より有意に速かった（表１を参照されたい）。
【０１７４】
アラビドプシス属のＴ１トランスジェニック植物（Columbiaから派生）のストレス耐性を、１０若しくは５０mg/lのいずれかのサリチル酸溶液上の、又は対照用に単にＨ2Ｏ上の小型の浮水植物によって評価した。ストレス感受性植物は、温置１〜２日後に、漂白されたか、又は巻きあがった葉を発生したが、ストレス耐性植物は、少なくとも５日間健全なままであった。やはり、ｐＴＹＧ３３におけるようにｐＮＯＳ：：(dsRNA-ZAP)構築体を、又はｐＴＹＧ３４におけるようにｐ３５Ｓ:(dsRNA-ZAP)構築体を含むトランスジェニック植物は、対照トランスジェニック植物より有意にストレス耐性であった（表１を参照されたい）。
【０１７５】
ｐＴＹＧ２９、ｐＴＹＧ３０、ｐＴＹＧ３３又はｐＴＹＧ３４のｄｓＲＮＡ−ＺＡＰ若しくはｄｓＲＮＡ−ＡＰＰ構築体によって形質転換した、セイヨウアブラナから得られたＰＰＴ耐性トランスジェニックカルスを、５０mg/lのアスピリンを含有する培地で２日間温置した。２日後、カルスの重量を決定し、カルスを、アスピリンなしの培地に移し、更に５日間温置した。５日の期間の終点で、カルスの重量を決定し、重量の増加を、２日の期間の温置後の重量に対する百分率として表した。対照として、PCD調節キメラ遺伝子なしのＴ−ＤＮＡによって形質転換されたトランスジェニックカルスを、２日間の温置の際に全くアスピリンを加えなかった以外は、同じ手順に処した。結果を表２に要約し、ＰＣＤ調節キメラ遺伝子を含むセイヨウアブラナ細胞が、対照細胞よりストレス耐性であることを示す。
【０１７６】
【表１】
0004782925.tif 000002
【０１７７】
【表２】
0004782925.tif 000003
【０１７８】
【表３】
0004782925.tif 000004
【０１７９】
【表４】
0004782925.tif 000005
【０１８０】
【表５】
0004782925.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】  植物ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの推定されるＮ末端アミノ酸配列を示す図である。
（Ａ）シロイヌナズナＡＰＰ（A.th.APP；ＥＭＢＬ登録番号Z48243；SEQ ID NO:６）及びトウモロコシ相同ＮＡＰ（Z.m.NAP；ＥＭＢＬ登録番号AJ222588；SEQ ID NO:４）に見出されるＮＡＤ+結合ドメインの上流の配列の整合を示す。示したドメイン区分は、以前に報告されたとおりである〔Lepiniec et al., 1995〕。Ｂドメインに位置する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を、カッコによって示す。Ｂドメインの配列は、双子葉植物と単子葉植物との間で非常に良く保存されてはいない。Ｃドメインは、おそらく、動物のＰＡＲＰの自己修飾ドメインに、機能上匹敵する。トウモロコシＮＡＰには、不完全反復であるＡ１及びＡ２も存在する。反復配列内の内部的に不完全な二重対称性を示すため、アミノ酸残基の特性を、下記のとおり、配列の下に強調した：黒丸、疎水性残基；白丸、グリシン；（＋）、正に帯電した残基；（−）、負に帯電した残基；波線、何らかの残基。対称軸は、垂直な矢じりによって示し、矢じりの線は、アミノ酸側鎖の特性の逆向きの反復を有する領域を明示する。
（Ｂ）マウスＰＡＲＰとトウモロコシＺＡＰとのＤＮＡ結合ドメインと自動触媒ドメインとの整合を示す。トウモロコシＺＡＰ１及びＺＡＰ２（５′ＲＡＣＥＰＣＲによって発見された部分ｃＤＮＡ）を含むジンクフィンガーを、それぞれ、Ｚ．ｍ．ＺＡＰ（ＥＭＢＬ登録番号ＡＪ２２２５８９；SEQ ID NO:２）及びＺ．ｍ．ＺＡＰ(race)（第１位〜第９８位アミノ酸のSEQ ID NO:１１）として、またマウスＰＡＲＰをM.m.ADPRT（Swissprot登録番号Ｐ１１１０３）として示す。マウス酵素のジンクフィンガー及び二極性ＮＬＳをカッコによって、Caspase3切断部位を星印によって、ＺＡＰタンパク質中の推定されるＮＬＳを、トウモロコシ配列の下の太字のカッコによって示す。すべての配列で保存されているアミノ酸残基を、四角で囲み；類似の物理化学的特性を有するアミノ酸残基を、基準としての最上部の配列とともに影を付けた。
【図２】  マウスＰＡＲＰ及び植物ＰＡＲＰタンパク質のＮＡＤ+結合ドメインの比較を示す図である。「ＰＡＲＰシグネチャー」の範囲を、配列の上に示す。名称、及び配列の整合は、図１のとおりである。
【図３】  ｎａｐ及びｚａｐ遺伝子についての遺伝子コピー数、及び転写体の大きさの見積もりを示す図である。
（Ａ）及び（Ｂ）  示された制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ブロットし、ＮＡＤ+結合ドメインをコードしない、ｎａｐ及びｚａｐｃＤＮＡの５′ドメインから調製した、放射性標識化ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた、変種ＬＧ２０８０のトウモロコシゲノムＤＮＡである。ｎａｐプローブ（Ａ）で得られたハイブリダイゼーションパターンは、単純であり、トウモロコシゲノム中の単一のｎａｐ遺伝子を示す。ハイブリダイゼーションパターン（Ｂ）から認識できるとおり、少なくとも二つのｚａｐ遺伝子が存在する可能性がある。ｚａｐ及びｎａｐ遺伝子がコードする転写体の大きさを決定するため、６日齢の若芽の根（列１）及び苗条（列２）から抽出したポリ（Ａ）+ＲＮＡ約１μgを、グリオキサールによる変性後にアガロースゲル上で分離し、ブロットし、ｎａｐ（Ｃ）及びｚａｐ（Ｄ）の32Ｐ標識化ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。λＤＮＡの33Ｐ５′末端標識化ＢｓｔＥＩＩフラグメントを、分子量マーカーとして、ＤＮＡ及びＲＮＡ双方のゲルブロット実験で用い；それらの位置を、各パネルの左にkbで示した。
【図４】  酵母におけるＡＰＰ発現の解析を示す図である。
（Ａ）ｐＶ８ＳＰＡ内の発現カセットの模式図である。ａｐｐ  ｃＤＮＡの発現は、ｃｙｃｌ遺伝子（ＣＹＣ１）の最小ＴＡＴＡボックス含有プロモーター領域と、ガラクトースによるプロモーター活性化を与えるｇａｌ１０遺伝子（ＧＡＬ１０）の上流活性化プロモーター領域とからなる、キメラ酵母プロモーターによって駆動される。下流の調節配列は、ホスホグリセロールキナーゼをコードする遺伝子（３ＰＧＫ）に由来する〔Kuge & Jones, 1994〕。ａｐｐコーディング領域は、早くから提唱されたとおり〔Lepiniec et al., 1995〕、推定ドメインにおける区分を有して描かれ；Ａ１及びＡ２は、不完全な２７アミノ酸反復に相当し、その間に、正に荷電したアミノ酸に富み、数多くのＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに似た配列（Ｂドメイン）がある。Ｂドメインのアミノ酸配列は、地図の下に示され、ＮＬＳとして機能し得る、アルギニン及びリシン残基の範囲は、太字で描かれている。メチオニン残基（Ｍ1、Ｍ72）は、翻訳開始コドンとして機能し得るが、地図の上に示される。Ｃドメインは、グルタミン酸残基に富み、その配列ではなく組成が、動物のＰＡＲＰの自己修飾ドメインに似ている。
（Ｂ）それぞれ「ｖｅｃｔｏｒ」及び「ａｐｐ」として示した、ＤＹ（ｐＹｅＤＰ１／８−２）及びＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）株の免疫ブロット（ウエスタンブロット）及びノーザンブロット分析である。菌株を、グルコース（ＧＵＬ）、ガラクトース（ＧＡＬ）、ガラクトース及び３mM３ＡＢＡ（ＧＡＬ＋３ＡＢＡ）を追加したＳＤＣ培地で増殖させた。全ＲＮＡ又は全タンパク質は、同じ培養体から抽出した。全タンパク質１０μgを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での電気泳動によって分画し、電気泳動ブロットに付し、抗ＡＰＰ抗血清でプローブした。全ＲＮＡ５μgを、１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって分画し、ナイロン膜に転写し、ａｐｐｃＤＮＡに由来する32Ｐ標識化ＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせた。分子量マーカー帯の位置を、キロベース（kb）及びキロダルトン（kDa）で左に示す。
【図５】  ＡＰＰタンパク質のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性を示す図である。
（Ａ）全タンパク質抽出物を、２％ガラクトース（ｖｅｃｔｏｒ  ＧＡＬ）のＳＤＣで増殖させたＤＹ（ｐＹｅＤＰ１／８−２）、並びに２％グルコース（ａｐｐ  ＧＬＵ）、２％ガラクトース（ａｐｐ  ＧＡＬ）、又は２％ガラクトース及び３mM３ＡＢＡ（ａｐｐ  ＧＡＬ＋３ＡＢＡ）のいずれかのＳＤＣで増殖させたＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）から調製した。これらの抽出物におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成を検出するために、サンプルを、32Ｐ−ＮＡＤ+とともに室温で４０分間温置した。２例の対照反応を実施した：精製したヒトＰＡＲＰ１００ngを、反応緩衝液内でのみか（ＰＡＲＰ）（列５）、又はグルコース上で増殖させたＤＹ（ｐＹｅＤＰ１／８−２）の培養体から作成したタンパク質抽出物とともにか（ｖｅｃｔｏｒ  ＧＬＵ＋ＰＡＲＰ）（列６）のいずれかで温置した。X-Omatというコダックフィルムへの乾燥ゲルの曝露後に得られた、オートラジオグラフを示す。ＯＲｉは、配列決定用ゲルの始点に相当する。
（Ｂ）ＤＹ（ｐＶ８ＳＰＡ）からのタンパク質抽出物中のＤＮＡによるポリ（ＡＤＰ−リボース）合成の刺激を示す。核酸枯渇酵母抽出物に加えた、音波処理したサケ精子ＤＮＡの量を、μg/mlで示す。ポリ（ＡＤＰ−リボース）の合成は、反応の一つに３mMの濃度で加えた３ＡＢＡによって遮断された（列５）。ポリ（ＡＤＰ−リボース）の最大の回収を確保するするために、グリコーゲン２０μgを、沈澱段階の際の担体として含めたが；これは、認識できるとおり、取り込まれなかった標識の多量の持越を招いた。
【図６】  本発明のＰＣＤ調節キメラ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターの模式的表現を示す図である。Ｐ３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；Ｌ：ｃａｂ２２リーダー；ＺＡＰ：ＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子のコーディング領域；５′ＺＡＰ：逆配向でのＺＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子のコーディング領域のＮ末端部分；３′３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓの３′末端転写終結シグナル、及びポリアデニル化シグナル；ｐＡＣＴ２：アクチン遺伝子のプロモーター領域；ｐＮＯＳ：ノパリンシンターゼ遺伝子プロモーター；ｇａｔ：ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ；ｂａｒ：ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；３′ＮＯＳ：ノパリンシンターゼ遺伝子の３′末端転写終結シグナル及びポリアデニル化シグナル；ＡＰＰ：ＮＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子のコーディング領域；５′ＡＰＰ：逆配向でのＮＡＰクラスのＰＡＲＰ遺伝子のコーディング領域のＮ末端部分；ＬＢ；左Ｔ−ＤＮＡ境界；ＲＢ：右Ｔ−ＤＮＡ境界；ｐＴＡ２９：タペータム組織特異的プロモーター；ｐＮＴＰ３０３：花粉特異的プロモーター。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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