(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列により、エシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースと比較して、セリンによる阻害に対して減少した感受性を示し、その際、酵素活性が、エシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースの１０％を上廻る活性に相当するように維持されている、３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースにおいて、アミノ酸の３４９位に、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、ＮおよびＱの群から選択されたアミノ酸が存在することにより、配列番号２に記載のエシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースのアミノ酸配列とは異なることを特徴とする、３−ホスホグリセレートデヒドロゲネース。
【請求項２】
アミノ酸配列により、エシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースと比較して、セリンによる阻害に対して減少した感受性を示し、その際、酵素活性が、エシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースの１０％を上廻る活性に相当するように維持されている、３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースにおいて、アミノ酸の３７２位に、Ｉ、Ｄ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｐ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、ＭおよびＣの群から選択されたアミノ酸が存在することにより、配列番号２に記載のエシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースのアミノ酸配列とは異なることを特徴とする、３−ホスホグリセレートデヒドロゲネース。
【請求項３】
アミノ酸配列により、エシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースと比較して、セリンによる阻害に対して減少した感受性を示し、その際、酵素活性が、エシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースの１０％を上廻る活性に相当するように維持されている、３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースにおいて、アミノ酸の３４９位にＤ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、ＮおよびＱの群から選択されたアミノ酸が存在し、かつ、アミノ酸の３７２位にトレオニン以外の天然のアミノ酸が存在することにより、配列番号２に記載のエシェリヒア コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースのアミノ酸配列とは異なることを特徴とする、３−ホスホグリセレートデヒドロゲネース。
【請求項４】
コドン３４９が、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、ＮおよびＱの群から選択された天然のアミノ酸をコードすることにより、配列番号１に記載のエシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースのｓｅｒＡ−遺伝子とは異なることを特徴とする、請求項１に記載の３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースをコードするｓｅｒＡ−対立遺伝子。
【請求項５】
コドン３７２が、トレオニン以外の天然のアミノ酸をコードすることにより、配列番号１に記載のエシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースのｓｅｒＡ−遺伝子とは異なることを特徴とする、請求項２に記載の３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースをコードするｓｅｒＡ−対立遺伝子。
【請求項６】
コドン３４９が、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、Ｈ、ＮおよびＱの群から選択された天然のアミノ酸をコードし、かつ、コドン３７２が、トレオニン以外の天然のアミノ酸をコードすることにより、配列番号１に記載のエシェリヒア  コリ−野生型−３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースのｓｅｒＡ−遺伝子とは異なることを特徴とする、請求項３に記載の３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースをコードするｓｅｒＡ−対立遺伝子。
【請求項７】
請求項４から６までのいずれか１項に記載のｓｅｒＡ−対立遺伝子を、プロモーターでの機能的制御下に含有する、ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを、微生物株に挿入することを特徴とする、微生物株を製造するための方法。
【請求項９】
請求項１から３までのいずれか１項に記載の３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースを有する、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸またはその誘導体、またはＣ１物質代謝から誘導される化合物の発酵的製造に適した、請求項４から６までのいずれか１項に記載のｓｅｒＡ−対立遺伝子を有する微生物。
【請求項１０】
請求項９に記載の微生物を培養することによる、ホスホグリセレートファミリーのアミノ酸またはＣ１物質代謝から誘導される化合物を製造するための方法。
【請求項１１】
ホスホグリセレートファミリーのアミノ酸またはＣ１物質代謝から誘導される化合物を製造するための、請求項１から３までのいずれか１項に記載の３−ホスホグリセレートデヒドロゲネースの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−セリンによる阻害の減少を示す３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの変異体およびそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０種の天然のタンパク質分子構成アミノ酸の製造は、今日では、主に微生物での製造により達成されている。その際、天然のアミノ酸を合成するための、相当する生合成経路を有する微生物を使用する。
【０００３】
しかしながら、このような生合成経路は、野生株においては厳しい制御下にあり、アミノ酸は、細胞の自己要求量の製造が保証されているのみである。多くの生合成中の重要な制御機序は、たとえば、フィードバック阻害である（または最終産物阻害）。その際、生合成経路の大部分の酵素は、これらの生合成経路に導入された酵素反応を触媒するものであって、生合成経路の最終産物によって阻害される。この阻害は、その大多数が、最終産物の酵素へのアロステリック結合によって生じ、かつ、コンフォメーションの変化を生じさせることにより不活性な状態にする。このように、細胞中に最終産物が蓄積した場合には、さらなる合成が、誘発工程が阻害されることによって阻止されることが証明される。
【０００４】
したがって、物質代謝産物（たとえば、アミノ酸）の効率的な工業的製造は、物質代謝経路のフィードバック阻害によって制限が生じる場合にのみ可能であり、その際、野生型の微生物とは対照的に、望ましい物質代謝産物の生産に関して、著しく増加した生産性を示す微生物が使用可能である。
【０００５】
アミノ酸のホスホグリセレートファミリーは、その生合成中で３−ホスホグリセリン酸から導かれるアミノ酸であると定義される。その際、物質代謝の自然な流れは、まず、３−ホスホヒドロキシピルベートおよび３−ホスホ−Ｌ−セリンの２工程を介してＬ−セリンに導くものである。さらに、Ｌ−セリンは、グリシンまたはＯ−アセチル−セリンを介してＬ−システインに変換することができる。また、Ｌ−トリプトファンは、これらの群として選択され、それというのも、同様に、Ｌ−セリンからの生合成で誘導されるためである。同様に、天然由来でないアミノ酸は、この場合、ＵＳ２００２／００３９７６７Ａ１に記載された方法によって製造されたものであり、ホスホグリセレート−ファミリーに分類される。
【０００６】
Ｃ１−物質代謝に由来する化合物は、同様に、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の生合成への従属を示す。これは、実際には、Ｌ−セリンからグリシンへの変換の際に、テトラヒドロホレートがＣ１群受容体として働き、かつ、このテトラヒドロフレートは、Ｃ１−物質代謝中の中心的なメチル基供与体として、多くの生合成に関与する（たとえば、Ｌ−メチオニン、ヌクレオチド、パントテン酸等）。本発明によれば、Ｃ１−物質代謝に由来する化合物が好ましく、この場合、これらの化合物は、テトラヒドロ葉酸を介しての、Ｃ１−群トランスファーのその生合成中に従属するものである。
【０００７】
ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の生合成の前工程は、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸の３−ホスホヒドロキシピブレートへの酸化であり、かつ、これは、酵素３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）［ＥＣ１．１．１．９５］によって触媒される。反応の際に生じる還元等価物（Reduktionsaequivalent）のための受容体として、ＮＡＤ＋が使用され、この場合、これは、ＮＡＤＨ／Ｈ＋に変換される。
【０００８】
ＰＧＤ−酵素は、種々の微生物から知られている（たとえば、Rattus norbegicus, Arabidopsis thaliana, Escherichia coli, Bacillus subtilis）。その際、良好な特性を有する微生物の典型的なものは、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害に支配されている。
【０００９】
アミノ酸配列のレベルにおいて、微生物のＰＧＤ酵素は、Ｎ−末端部分で互いに極めて類似しているが、Ｃ−末端部分に関しては、わずかな類似性のみを示す。それというのも、これらのＣ−末端部分には、調節領域が局在しており、これは、セリン−阻害に関して重要な役割を示す（Peters-Wendisch et al., 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 437-441）。
【００１０】
最良の性質を示すＰＧＤは、エシェリヒア・コリからのものである。この酵素は、詳細に生物化学的に分析されており（Dubrow & Pizer, 1977, J. Biol. Chem. 252, 1527-1538）、かつ、Ｌ−セリンによるアロステリックフィードバック阻害を、阻害定数Ｋｉ  ５μＭで受ける。
【００１１】
これらのフィードバック−阻害は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の効率的製造の手段であり、したがって、すでに分子生物学的手段の対象である。
【００１２】
したがって、ＥＰ０６２０８５３Ａにおいて、エシェリヒア  コリＰＧＤの変異体が、セリンによる阻害に対して、減少した感受性を有することが記載されており、この場合、これらは、Ｃ−末端中で、野生型の２５％（たとえば、アミノ酸３０７〜４１０）の改変、好ましくは少なくとも５０残基（たとえば、アミノ酸３６１〜４１０）の範囲での改変を示す。この示された変異体は、リンカー突然変異誘発によって、たとえば、Ｅ．ＣｏｌｉｓｅｒＡ−遺伝子中に存在する制限酵素認識部位の簡単な利用によって、かつ、その後に、８〜１４塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチド−リンカーを挿入することによって達成される。
【００１３】
しかしながら、このようなリンカー突然変異誘発はその大部分に問題であり、それというのも、タンパク質構造の多くの残基が付加または欠失することによって、著しく変化し、したがって、タンパク質の全体の活性または安定性について、ネガティブな影響を与えるためである。事実、ＥＰ０６２０８５３Ａに記載された大多数の突然変異体は、かろうじて検出可能な程度の活性を示す。
【００１４】
さらに、コリネフォルム微生物中では、ｓｅｒＡ−遺伝子での突然変異誘発が試みられ、この場合、セリンによる阻害に対する感受性を減少させる目的が達成された：
−Ｐｅｒｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈら（2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 437-441）は、コリネバクテリウム  グルタミクムのＰＧＤのＣ−末端欠失が記載されている。さらに、この欠失が、酵素活性に部分的に強い損傷を与えている。
−ＥＰ０９４３６８７Ａ２では、グルタミン酸−残基を、ブレビバクテリム  フラブムのＰＧＤの３２５位で置換することが記載されている。これらの残基は、エシェリヒア  コリ  ＰＧＤに関しては、プログラムＧＣＧのアルゴリズムＧＡＰを含むアライメント（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中で、すでにタンパク質の可変のＣ−末端部分において含まれており、かつエシェリヒア  コリ  タンパク質のアスパラギン残基３６４と相関する。それというのも、ＰＧＤの可変のＣ−末端部分に含まれるこれらの改変から、エシェリヒア  コリ  タンパク質を逆に推論することは不可能であるためである。
【特許文献１】ＵＳ２００２／００３９７６７Ａ１
【特許文献２】ＥＰ０６２０８５３Ａ
【特許文献３】ＥＰ０９４３６８７Ａ２
【非特許文献１】Peters-Wendisch et al., 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 437-441
【非特許文献２】Dubrow & Pizer, 1977, J. Biol. Chem. 252, 1527-1538
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、エシェリヒア  コリ野生型と比較して、セリンによる阻害に対して減少した感受性を有する、エシェリヒア  コリのＰＧＤ変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の目的は、１位にメチオニンを有するエシェリヒア  コリ  野生型ＰＧＤのアミノ酸配列（配列番号：２）とは、３４９位にグリシン以外のアミノ酸が存在するか、あるいは３７２位にトレオニン以外のアミノ酸が存在することによって異なる、アミノ酸配列を有するＰＧＤによって達成された。
【００１７】
本発明によるＰＧＤは、さらに、配列番号：１において、前記２個の位置での変異を示すものであってもよい。
【００１８】
さらに本発明は、本発明によるＰＧＤをコードするＤＮＳ−配列に関する。これらのｓｅｒＡ−対立遺伝子は、エシェリヒア  コリ  ＰＧＤの遺伝子（ｓｅｒＡ−遺伝子、ＳＥＱ：番号１）とは、コドン３４９にグリシン以外の天然のアミノ酸をコードするか、あるいは、コドン３７２にトレオニン以外の天然のアミノ酸をコードすることによって異なる。
【００１９】
本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子は、さらに、２個の挙げられたコドンでの突然変異を有していてもよい。
【００２０】
本発明の範囲において、本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子として、前記に示した突然変異を有する限りは、アルゴリズムＧＡＰ（GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group(GCG) Madison, Wisconsin）で分析した場合に３０％を上廻る配列相同性を示す遺伝子であると解釈される。７０％を上廻る配列相同性を示す遺伝子であることは特に好ましい。
【００２１】
同様に、ＰＧＤ活性および前記に示したアミノ酸置換を示す限りにおいて、アルゴリズムＧＡＰを用いて算出された４０％を上廻る配列相同性を示すタンパク質は、本発明の範囲内において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＧＤから誘導されたタンパク質と解される。特に好ましくは、７０％を上廻る配列相同性を有するものである。
【００２２】
さらに、本発明による遺伝子として、ｓｅｒ−Ａ遺伝子の対立変異体が包含されるが、この場合、これらは、配列番号１で示された配列から、ヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって導かれ、その際、遺伝子産物の酵素的活性は、野生型遺伝子産物活性の１０％を上廻るものに相当し、かつコドン３４９で天然のアミノ酸グリシンに関してか、あるいはコドン３７２で天然のアミノ酸トレオニンに関しての変異が存在するか、あるいは、双方の変異の組合せが存在する。
【００２３】
３４９位または３７２位でのアミノ酸置換またはこれらの組合せを有するＰＧＤ−変異体は、分子生物学の標準的な技術によって製造される。さらに、相当するコドンでの変異は、ＰＧＤをコードするｓｅｒＡ−遺伝子中に取り込まれる。ＤＮＳ−フラグメントの範囲内で、特定の位置に変異を挿入するための相当する方法は、公知である。
【００２４】
突然変異誘発のための出発材料として、好ましくは、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｓｅｒＡ−遺伝子のＤＮＳを使用する。これは、突然変異すべきｓｅｒＡ−遺伝子を、染色体内または染色体外でコードするものであってもよい。しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、かつベクター中でクローニングされたｓｅｒＡ−遺伝子が好ましい。前記の突然変異誘発法を使用することによって、ＤＮＳ−配列の１個または複数個のヌクレオチドは、コードされたＰＧＤが、３４９位または３７２位でのアミノ酸置換を示すように変更され、その際、１位は、配列番号１からの開始メチオニンである。
【００２５】
これらの変異により、コードされたＰＤＧは、Ｌ−セリンによる阻害（＝フィードバック−耐性）に対して減少した感受性を有する。その際、特に好ましくは、本発明によるＰＧＤ−変異体が、Ｌ−セリンの不在下で、野生型−ＰＧＤと比較して１０％を上廻る活性、好ましくは、変わらない活性を示す。
【００２６】
本発明によるＰＧＤ−変異体のフィードバック−耐性の大きさを測定するために、種々の方法を使用することができ、この場合、これは、Ｌ−セリンの存在下での酵素活性の測定を可能にする。たとえば、ＰＧＤ−活性の測定は、ＭｃＫｉｔｒｉｃｋおよびＰｉｚｅｒ（1980, J. Bacteriol. 141:235-245）により記載された方法に基づいて実施することができる。この酵素活性は、出発材料、ホスホヒドロキシピルベートおよびＮＡＤＨ／Ｈ＋を含む逆反応に基づいて測定される。この反応は、酵素の添加によって開始され、かつ、ＮＡＤＨ／Ｈ＋の酸化によって引き起こされる３４０ｎｍでの吸光度の減少が、分光光度計中で観察される。ＰＧＤ−活性の阻害は、Ｌ−セリンの種々の濃度の存在下で、反応成分中で試験された。種々のＰＧＤ−変異体の触媒活性は、Ｌ−セリンの存在下および不在下で測定され、それにより阻害定数Ｋｉが算出された。Ｋｉは、活性が、インヒビターの不在下で測定された活性の５０％に達した場合のインヒビター濃度である。
【００２７】
本発明によるＰＧＤ−酵素は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸またはＣ１−物質代謝により誘導される化合物を製造するために、そのフィードバック耐性に基づいて使用される。さらに、本発明によるｓｅｒ−対立遺伝子はホスト株中で発現する。
【００２８】
本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子の発現は、適した、ｓｅｒＡ−遺伝子より上流に局在するプロモーターの制御下であるか、あるいは当業者に公知の他の適したプロモーター系を使用することによって実施することができる。その際、相当する対立遺伝子は、たとえば、このようなプロモーターの制御下で、１個または複数個のコピーで、ホスト微生物の染色体上で見出すことができる。染色体中への遺伝子のインテグレーション手段は技術水準である。しかしながら、好ましくは、発現させるべきｓｅｒＡ−対立遺伝子を、ベクター中で、好ましくはプラスミド中でクローニングする。
【００２９】
したがって、本発明は、本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子を、プロモーターの機能的制御下で含有することを特徴とするベクターに関する。
【００３０】
本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子をクローニングするために、ベクターを使用するが、この場合、このベクターはすでに、遺伝的要素（たとえば、構築性または調節可能なプロモーター、ターミネーター）を含有するものであり、これにより、ＰＧＤをコードする遺伝子の、連続的であるかまたは制御された、誘発可能な発現が可能である。さらに、発現ベクター上では、好ましくは他の調節エレメント、たとえばリボソーム結合部位および終止配列、ならびに、選択的マーカーおよび／またはレポーター遺伝子をコードする配列が存在する。このような選択マーカーの発現は、形質転換体の同定を確立するものである。選択マーカーとして適しているのは、たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたは他の抗生物質に対する耐性を有する遺伝子をコードするものである。本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子を、染色体外で複製すべき場合には、プラスミドベクターが、複製開始点を含有していることが好ましい。特に好ましくは、プラスミドベクター、たとえば、Ｅ．Ｃｏｌｉ−ベクターｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、ｐＱＥ−７０、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１およびその誘導体である。誘発可能なプロモーターとして適しているのは、たとえば、Ｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−、ｌａｍｂｄａ  ＰＬ、ａｒａ−またはｔｅｔ−プロモーターまたはそれから誘導される配列である。
【００３１】
さらに、すでに遺伝子／対立遺伝子を含有しているプラスミドベクターが特に好ましく、これらの使用により、同様に、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸が過剰生産されるか、あるいは、Ｃ１−物質代謝により誘導された化合物が過剰生産され、この場合、これは、たとえば、
−Ｌ−セリン（たとえば、ｓｅｒＢ−、ｓｅｒＣ−、輸送担体遺伝子、たとえば、ＤＥ１００４４８３１Ａ１に記載のもの）
−Ｎ−アセチル−セリン、Ｏ−アセチル−セリン、シスチン、システインまたはシステイン誘導体（たとえば、ｃｙｓＥ−対立遺伝子、たとえば、ＷＯ９７／１５６７３、Ｅｆｆｌｕｘ−遺伝子、たとえば、ＥＰ０８８５９６２Ａ１に記載のもの、ＣｙｓＢ−遺伝子、たとえばＤＥ１９９４９５７９Ｃ１、ｙｆｉｎＫ−遺伝子、たとえば、ＤＥ１０２３２９３０Ａ）、
−Ｌ−トリプトファン（たとえば、ｔｒｐＥ−対立遺伝子、たとえばＥＰ０６６２１４３Ａ）
−パントテン酸（たとえば、ＷＯ０２０６１１０８）を製造を導く。
【００３２】
このようなベクターは、本発明による高い生産性を有する微生物株を、任意の微生物株から直接的に製造することが可能であり、それというのも、このようなプラスミドは、さらに微生物中で物質代謝経路の他の制限の相殺する（Aufhebung）働きを有するためである。
【００３３】
適した形質転換法によって（たとえば、エレクトロポレーション）、微生物中に、本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子含有プラスミドを導入し、かつ、たとえば、抗生物質耐性を用いて、プラスミドを含むクローンを選別する。
【００３４】
したがって、さらに本発明は、本発明による微生物株を製造するための方法に関し、この場合、この方法は、微生物株中に本発明によるベクターを導入することを特徴とする。
【００３５】
さらに、微生物中に、本発明によるｓｅｒ−Ａ対立遺伝子を含む可能なベクターを導入することも可能であり、この場合、これは、たとえば、１個または複数個の前記に示された遺伝子／対立遺伝子をすでに染色体中に発現し、かつすでに、物質代謝産物の過剰生産を示すものである。このような場合には、本発明によるｓｅｒＡ−対立遺伝子の導入によって、生産性が再度増加する。
【００３６】
一般に、本発明によるベクターのためのホスト微生物として、すべての微生物が適しており、この場合、これは、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸のための生合成経路を有するものであり、組み換え法が使用可能なものであって、かつ、発酵により培養可能なものである。このような微生物は、たとえば、菌類、酵母または細菌である。好ましくは、真性細菌の系統分類群を使用する。特に好ましくは、腸内細菌ファミリーの微生物、特に好ましくはエシェリヒアコリ種である。
【００３７】
さらに本発明は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸またはその誘導体、あるいは、Ｃ１物質代謝から誘導される化合物の発酵的製造に適した微生物株に関し、この場合、この微生物は、本発明によるＰＧＤを有するものである。
【００３８】
さらに本発明の他の対象は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸またはＣ１物質代謝から誘導される化合物の製造に関し、この場合、これは、本発明による微生物株を培養することによって特徴付けられる。
【００３９】
さらに、本発明による微生物株は、たとえば、栄養媒体中での発酵により培養させ、この場合、この栄養媒体は、適した炭素原子、および適したエネルギー源、ならびに他の添加物を含有するものである。
【００４０】
発酵により形成される物質は、たとえば、Ｌ−ホスホセリン、Ｌ−セリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−トリプトファン、１，２，４−トリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニンまたはパントテン酸であり、この場合、これらは、その後に精製される。
【００４１】
以下の例は、本発明をさらに詳細に例証するものである。すべての使用された分子生物学的方法、たとえばポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＳの単離および精製、制限酵素、クレノーフィラメントおよびリガーゼによるＤＮＳの改変、形質転換等は、当業者に公知であり、この場合、これは、刊行物に記載されているか、あるいはそれぞれの製造において知られた技術および方法により実施される。
【実施例】
【００４２】
例１：ｓｅｒＡ−遺伝子のクローニング
エシェリヒア  コリ株Ｗ３１１０からのｓｅｒＡ−遺伝子（American Type CultureCollection, ATCC27325）を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅させた。特定のプライマーとして、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００４３】
【表１】
0004695855.tif 000002
【００４４】
得られたＤＮＳ−フラグメントを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、かつ５’−末端をクレノー酵素で処理した。その後に、ＤＮＳ−フラグメントを、アガローズゲル電気泳動を用いて精製し、かつ、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ法を用いて単離した（GenneClean Kit BIO101 P.O.BOX 2284 La Jolla, California, 92038-2284）。このようにして得られたｓｅｒＡ−フラグメントのクローニングは、発現ベクターｐＱＥ−７０（Qiagen, Hilden, D）中でおこなった。これに関して、最初にベクターを、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断し、かつ、３’−末端をクレノー酵素で処理するか、あるいは、５’−末端をクレノー酵素で処理した。その後に、ベクターフィラメントを精製し、かつｓｅｒＡ−フィラメントと一緒にライゲートした。得られたベクターは、ｐＦＬ２０９と呼称された。コンストラクトをシークエンシングで確認した後に、エシェリヒア  コリ株ＪＭ１０９（Ｓtrartagene, Amsterdam, NL）を形質転換し、かつ相当する形質転換体をアンピシリンを用いて選択した。細菌株  エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９／ｐＦＬ２０９は、ブタペスト条約にしたがって、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig）に番号ＤＳＭ１５６２８として寄託した。
【００４５】
例２：ｓｅｒＡ−遺伝子の部位特異的（Ortsgerichtete）突然変異誘発
コドン３４９および３７２でのｓｅｒＡ−遺伝子の部位特異的突然変異誘発を、逆ポリメラーゼ連鎖反応を用いておこなった。鋳型として、例１中に記載されたベクターｐＦＬ２０９を使用した。コドン３４９の突然変異誘発のために、以下のプライマーを使用した。
【００４６】
【表２】
0004695855.tif 000003
【００４７】
得られたＰＣＲ−産物を、ライゲーションによって環状化し、かつＥ．Ｃｏｌｉ−株ＪＭ１０９に形質転換した。シークエンシングによって、最終的に、コドン３４９での突然変異が確定され、かつ残りの配列の正確性を再度検査した。
【００４８】
コドン３７２での突然変異誘発に関しても、原則として同様におこなったが、プライマーは以下のものを使用した。
【００４９】
【表３】
0004695855.tif 000004
【００５０】
例３：ＰＧＤ−活性および阻害定数Ｋｉの測定
ＰＧＤ−酵素活性および活性上のＬ−セリンの影響を測定するために、付加的に１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する、１００ｍｌのＬＢ−培地（１０ｇ／ｌトリプトファン、５ｇ／ｌイーストエクストラクト、１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）上に、プラスミドをコードするｓｅｒＡ−対立遺伝子を含む菌株の、一晩培養したカルチャー２ｍｌを接種し、かつ３０℃で１５０ｒｐｍで、振とう器中でインキュベートした。１．０の光学的密度の場合には、ｓｅｒＡ−発現を０．４ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシドの添加によって誘発し、かつ、カルチャーをさらに３時間に亘ってインキュベートした。その後に、細胞は、遠心分離器によって回収され、洗浄され、かつ、２ｍｌの試薬（１００ｍＭ  Ｋ−ホスフェート  ｐＨ７．０；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ジチオトレイオール）中に再懸濁した。細胞破砕をフレンチプレスを用いて（Spectronic Instruments, Inc., Rochester NY, USA）、１８０００ｐｓｉの圧力でおこなった。粗抽出物を、３００００ｇでの遠心分離によって洗浄し、かつＰＧＤ−活性を、ＭｃＫｉｔｒｉｃｋおよびＰｉｚｅｒの試験（1980, J. Bateriol. 141: 235-245）を用いて測定した。
【００５１】
以下の表は、種々の変異体のＰＧＤ−活性ならびに阻害定数Ｋｉを示したものである。
【００５２】
【表４】
0004695855.tif 000005
【００５３】
【表５】
0004695855.tif 000006
【００５４】
例４；対立遺伝子ｓｅｒＡ２０およびｓｅｒＡ４０の突然変異の組合せ
コドン３４９または３７２の突然変異体の組合せは、この置換が、これらのフィードバック阻害上での相乗効果を有するかどうかを示す。これに関して、ＨｉｎｄＩＩ単独での制限酵素切断部位を、双方の突然変異種において使用した。したがって、ｓｅｒＡ−対立遺伝子を含むベクターのＨｉｎｄＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−制限酵素処理によって、１８３ｂｐ−フラグメントが単離され、この場合、これはｓｅｒＡ−遺伝子の３’−末端に相当し、かつコドン３７２での突然変異を包含していた。これらのフラグメントを、同様に、ｓｅｒＡ４０−対立遺伝子を含む、ＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩ−処理されたベクター中でクローニングし、このようにして得られたクローンは、二重の突然変異を達成していることが示された。以下の表は、付属の酵素データを示す。
【００５５】
【表６】
0004695855.tif 000007
【配列表】
0004695855000001.app