(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを生産し菌体内に蓄積する性質を有する遺伝子組換え大腸菌を、TRT10が40分以下になる条件及び熱殺菌後の該ニトリルヒドラターゼの生理活性能力の低下度が25%以下になる条件で熱殺菌する遺伝子組換え大腸菌の熱殺菌方法であって、
該熱殺菌の条件が、53〜63℃で保持時間が40分〜2分であることを特徴とする方法。
【請求項２】
TRT10の条件が25分以下であり、保持時間が25分〜2分であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子組換え大腸菌の宿主がEscherichia coli K-12由来W3110株（ATCC27325）、同HB101株（ATCC33694）、同JM109株（ATCC53223）または同WA802株（ATCC33526）であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
熱殺菌の条件が55〜57℃で保持時間が20分〜5分であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物の熱殺菌方法に関するものであり、例えばニトリルヒドラターゼ等の工業的に有用な酵素を産生する微生物の殺菌方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、酵素、酵素を産生する微生物を用いて有用物質を製造すること、例えばアクリロニトリル、メタクリロニトリル等のニトリル化合物を原料としてアクリルアミド、メタクリルアミド等のアミド化合物を製造することが研究されている。
【０００３】
酵素を産生する微生物として遺伝子組換え微生物を使用する方法も提案されている。遺伝子組換え微生物は環境・人体の保護等の観点から各種ガイドラインによりその取扱が定められている。遺伝子組換え微生物の組換えレベルによっては、生きた遺伝子組換え微生物の外部環境への漏洩及び人体への直接の接触を防止するために、当該微生物は閉鎖設備内で取り扱う必要があるとされているが、当該微生物を殺菌することにより閉鎖設備を最小限のものとすることができるという利点がある。
【０００４】
菌体の殺菌方法としては、熱殺菌法や菌体破砕法が一般的であるが、酵素の失活が問題となり、キレート剤と界面活性剤を併用する殺菌法（新潟県食品研究所・研究報告第30号17-21（1995））なども報告されているが、殺菌後に残留する薬剤を次工程以降で除去する必要があるなど、現在までのところ、その酵素活性を低下させることなく、例えばアミド化合物等の有用物質の工業的製法に利用できるような、効率的な殺菌方法については報告された例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、有用物質の工業的生産に利用できるような、微生物の殺菌方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
（１）目的とするタンパク質を生産し菌体内に蓄積する性質を有する微生物を、熱殺菌後の該タンパク質の生理活性能力の低下度が25%以下になる条件で熱殺菌することを特徴とする微生物の熱殺菌方法。
（２）微生物のTRT10が、60℃において0分以上5分以下であり、該タンパク質の生理活性能力の低下度が60℃×3分間の時40%以下である前記（１）に記載の方法、
（３）微生物が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする前記（２）に記載の方法、
（４）遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする前記（３）に記載の方法、
（５）遺伝子組換え大腸菌の宿主がEscherichia coli K-12由来W3110株（ATCC27325）、同HB101株（ATCC33694）、同JM109株（ATCC53223）または同WA802株（ATCC33526）株であることを特徴とする前記（４）に記載の方法。
（６）目的とするタンパク質が酵素であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、
（７）酵素がニトリルヒドラターゼであることを特徴とする前記（６）に記載の方法、
（８）熱殺菌の条件が53〜63℃であるとする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法、
（９）熱殺菌の条件が53〜63℃で保持時間が40分〜2分であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、目的とするタンパク質を生産し菌体内に蓄積する性質を有しており、この微生物には自然界より単離された微生物も遺伝子組換え微生物も含まれる。
目的とするタンパク質とは、例えば取得をめざす有用物質の生産に触媒として使用される酵素の他、インターフェロン、成長ホルモン、血清アルブミン等が挙げられる。
ここで酵素としては、特に制限されるものではないが、例えばニトリルヒドラターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、トリプトファンシンターゼ等を挙げることができる。
TRTは、加熱減少時間（TRT；Thermal reduction time）を意味し、TRT10とは、はじめの生菌数を10-10倍に減少させるのに必要とする時間を意味する。
本発明の微生物は、60℃におけるTRT10が、好ましくは0分以上5分以下、より好ましくは0分以上3.5分以下である。
ここでいう生理活性能力とは、単位微生物重量・単位時間あたりの、目的物質の変換（合成、または分解）速度や、目的物質への結合速度などを意味する。
本発明のタンパク質は、生理活性能力の低下度が60℃×3分の時好ましくは40％以下、より好ましくは30％以下である。
TRT10およびタンパク質の生理活性能力の低下度は、後述する実施例に記載の方法により、あるいはその方法に準じて測定することができる。
【０００８】
本発明の微生物としては、例えばニトリルヒドラターゼを産生する微生物を挙げることができる。
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の具体例としては、シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）JCM3095、アクロモバクター・キセロシス(Achromobacter xerosis)IFO12668等を挙げることができる。また該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も含まれる。ここでいう任意の宿主としては、大腸菌（Escherichia coli）の他、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属細菌、酵母や放線菌、糸状菌等が挙げられる。遺伝子組換え大腸菌の宿主としては、例えばEscherichia coli K-12由来W3110株（ATCC27325）、同HB101株（ATCC33694）,同JM109株（ATCC53223）,同WA802株（ATCC33526）株を挙げることができる。
【０００９】
また、組換えDNA技術を用いて該タンパク質の構成アミノ酸の1個または2個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、薬剤耐性、温度耐性等を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も本発明の微生物に含まれる。
【００１０】
本発明の微生物は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、LB培地やM9培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には20〜50℃であるが、好熱菌の場合は50℃以上でもよい。）で生育させ、続いて該微生物を遠心分離等によって培養液より分離することにより得られる。
【００１１】
本発明の熱殺菌方法は、熱殺菌後の該タンパク質の生理活性能力の低下度が25%以下になる条件で熱殺菌することを特徴とする。
本発明では、上記の条件を充たすように温度、保持時間等をコントロールする。
熱殺菌後の生菌数は、5cfu/ml以下であることが好ましい。
保持温度としては、53〜63℃、より好ましくは54〜60℃、更により好ましくは55〜57℃の範囲が好ましい。このような温度範囲であれば、殺菌が十分に行なわれ、かつタンパク質の生理活性能力の低下が少ないので好ましい。
また、保持時間は、特に制限されるものではないが、本発明においては、TRT10程度の殺菌が行うことができる時間が好ましい。
53〜63℃で殺菌を行う場合、40〜2分、より好ましくは54〜60℃で殺菌を行う場合、25〜3分、更に好ましくは55〜57℃で殺菌を行う場合、20〜5分の範囲が好ましい。
すなわち、このような条件であれば、殺菌が十分に行われ、また生理活性の低下を抑えることができるので好ましい。
熱殺菌の装置としては、例えばプレートヒータ式熱交換器や、２重管式熱交換器等の間接加熱手段の熱交換器を挙げることができる。
【００１２】
次いで、本発明では上記温度範囲の微生物を好ましくは30℃以下に、より好ましくは10℃以下に降温するのがよい。これは殺菌が終わった時点で余計な温度履歴をかけないよう素早く降温することで、活性の低下をより抑えようとするものである。
本発明においてこの温度降下は急冷状態とすること、即ちこの降温に要する時間はできるだけ短時間であることが好ましい。具体的には前記した50〜64℃の温度より30℃以下となる時間が、180秒以下であることが好ましい。より好ましくは20℃以下となる時間が180秒以下となるように急冷条件下で冷却することが好ましい。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例により本発明の殺菌方法を更に詳細に説明する。
（実施例１）
図３に示すようにSUS304の管を蛇管状に巻いた伝熱管を2つ直列につないだものを用意し、それぞれを水の入った浴槽につける。浴槽に入れられた伝熱管はそれぞれ加熱部と保温部であり、内径はそれぞれ6mmと10mm、長さはそれぞれ20mと12.8mある。特に保温部は3.2mごとに4本の管が連結されてできており、必要に応じて保温部の管長を変えることができるため、流量と管長から保温時間を変更することができる。
伝熱管には図に示すように熱電対が付けられており、各場所ごとの流体の温度を測定することができる。
【００１４】
伝熱管の入口側にはポンプが取り付けられ、培養された大腸菌を含む流体を伝熱管の中に任意の吐出流量(5.3〜21L/hr)で送ることができる。また入口からは菌体液を任意のタイミングでサンプリングできるよう分岐されたバルブを持つ。大腸菌としては、野生型酵素が大腸菌HB101株に導入され、三井化学株式会社が寄託しているMT-10822株（特開平11-253168参照）を用いた。
伝熱管出口より出た液体は、氷バスの中の容器に入り、急速に20℃程度まで冷却される。急速に冷却するのは、所定の温度と時間で殺菌された液が、その後の自身の熱で殺菌されたり酵素活性低下が生じるのを抑えるためである。
【００１５】
この装置を用いて以下の実験を行った。
培養した菌体を含む培養液を集菌機にかけて、固形分率が約15％となるように集菌処理する。処理液(以下、菌体液と言う)を直ちに氷バス内のステンレス容器に移し、緩やかに攪拌する。
一方上記の熱処理装置は一旦浴槽から出し、伝熱管内に高圧のスチームを通し、各部が120℃以上の温度になったことを確認後、15分間以上スチームを流し続けることで、伝熱管内を滅菌処理する。滅菌処理後、伝熱管を元通り浴槽につけ、各部が常温に下がるまで静置する。
【００１６】
浴槽の温度を殺菌しようとする温度に合わせて、昇温・安定させる。例えば目標とする殺菌温度を60℃とするならば、加熱部の浴槽温度を61℃、保温部の浴槽温度を60℃となるように、浴槽内を良く攪拌しながら水中のヒータを加熱し、熱電対により浴槽の温度を測定・記録して、浴槽の温度が一様に安定したことを確認する。
浴槽温度が安定し、熱処理装置の各部が常温に下がったら、ポンプを作動させて、ステンレス容器内の菌体液を熱処理装置の中に通す。装置内の菌体液の流れが安定するよう、装置出口側より菌体液が出始めてから約20分間、菌体液を流し続ける。
【００１７】
菌体液の流れが安定したところで、各部の温度、流量を測定する。温度は各部に取り付けられた熱電対で、流量は装置出口から出る菌体液を一定時間サンプリングし、その重量を測定して、サンプリング時間で割ることで算出する。また流量と伝熱管の容積（断面積×長さ）から保温部での菌体液の滞留時間を算出する。
【００１８】
次にステンレス容器内にある熱処理前の菌体液と、装置出口から出る熱処理後の菌体液をそれぞれ100mlづつサンプリングし、直ちに細かく砕いた氷の入った容器内で冷却する。
【００１９】
菌体液をポンプで送出し始め、出口から菌体液が出はじめてからさらに15分以上経って、流量や温度が安定したら実験を開始する。実験を開始したら、各部の温度を5分ごとに記録する。開始30分後および1時間後に殺菌前の菌体液および、殺菌後の液を100ml程度ずつ無菌のサンプリング容器に入れ、密閉した後、直ちに細かく砕いた氷の中に漬ける。
実験終了後直ちに生菌数および酵素活性の測定を行う。
【００２０】
（実施例２）
加熱部として内径φ8mm、外径φ10mmのSUS304管を蛇管状に15m巻いたものを充分に保温されたバスに漬け、バスの熱媒温度をコントロールできるようにする。また内側80A、外側100A、長さ1mの二重管を4本用意して菌体液の温度保持部として用いる。二重管は配管のつなぎ換えにより、1m, 2m, 4mと長さが可変である。また菌体液は温度保持部を通過した後に、加熱部と同じ仕様で熱媒の変わりに冷却水を入れた冷却部を通り、20℃以下にまで冷却される。殺菌後に冷却されるのは、所定の温度と時間で殺菌された液が、その後の自身の熱で殺菌されたり、酵素活性低下が生じるのを抑えるためである。
【００２１】
この装置を用いて、流量および温度保持部長さを変えることで、任意の時間殺菌処理を行うことができる。
また加熱部、温度保持部、冷却部の前後および、熱媒の温度が熱電対により測定できる。流量が安定したら、実際に冷却部出口より殺菌された菌体液をサンプリングし、重さとサンプリング時間から流量を測定する。
菌体液をポンプで送出し、出口から菌体液が出始めてからさらに15分以上経って、流量や温度が安定したら実験を開始する。実験を開始したら、各部の温度を5分ごとに記録する。開始30分後および1時間後に殺菌前の菌体液および、殺菌後の液を100ml程度ずつ無菌のサンプリング容器に入れ、密閉した後、直ちに細かく砕いた氷の中に漬ける。
実験終了後直ちに生菌数および酵素活性の測定を行う。
【００２２】
（測定方法）
サンプリングした処理前後の菌体液それぞれの、生菌数（cfu/ml）と酵素活性（kU/g-DC）を以下の手順で測定する。酵素活性は、1gの乾燥菌体あたりの活性量を意味し、活性量：1kUは、1分間に1mmolのアクリルアミドを生成するものと定義する。
【００２３】
生菌数の測定方法は以下の通り。
無菌的にサンプリングした培養液を、生理食塩水でコロニー数が30〜300になるよう適当な倍率に希釈する。
1サンプルあたり3枚のマッコンキー寒天培地にサンプリング液あるいは希釈液を100μlずつ播種し、35℃で24時間培養する。周囲に赤みがかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色のコロニー（大腸菌）の数を計測する。
生菌数（cfu/ml）＝コロニー数の平均値×サンプル希釈倍率÷0.1
【００２４】
また酵素活性の測定方法は、以下の方法によって行う。
各画分液をリン酸カリウム緩衝液により適当に希釈し、これに1重量%のアクリロニトリルを添加して10℃で10分間反応させる。反応液にこれと等量の1Mリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をHPLC分析により測定する。HPLCカラムはULTRON 80HG（50×8φmm）を用い、10mMリン酸水溶液を展開液として使用する。アクリルアミドは220nmの吸光度により検出する。
【００２５】
これらの結果より、TRT10の値および、この温度条件で殺菌したときの酵素活性の低下度を求める。
【００２６】
TRT10は、実験により得られた値を対数死滅曲線と呼ばれる曲線上にプロットすることで得られる。具体的には、ある温度Te（℃）において、温度の保持時間Ti（分）で熱処理を行ったときの、熱処理前の生菌数をN0（cfu/ml）、熱処理後の生菌数をN（cfu/ml）として、横軸に保持時間、縦軸に熱処理前後の生菌数の割合＝N/No（−）をとり、実験ごとのデータをこのグラフ上にプロットする。ただし測定された処理後の生菌数が0の場合は、グラフ化の便宜上生菌数1（cfu/ml）としてグラフ上にプロットする。
このグラフで保持時間0（分）、熱処理前後の生菌数の割合1の点（グラフの左上）から各プロット点に直線を引き、その直線を延長する。TRT10の値を求めるには、延長された直線がN/No＝10-10の横軸と交わるときの時間を読みとればよい。
【００２７】
また酵素活性の低下度は「（1−殺菌後の酵素活性／殺菌前の酵素活性）×100（%）」であらわされる。
【００２８】
実施例１と実施例２の結果を図１と図２には一緒にプロットした。
図１は横軸に殺菌温度、縦軸にTRT10の時間をプロットしたもの、図２は横軸に殺菌温度、縦軸に酵素活性低下度をプロットしたものである。
図２から読みとれるように、殺菌温度が高いと酵素活性の低下度が大きく、大体57℃よりも低い温度で殺菌することで酵素活性の低下度は約10%となる。また57℃よりも殺菌温度を低くしても酵素活性の低下度はもはや小さくならない。
また図１より殺菌温度が高い方がより短い時間で殺菌が可能であることが示され、より工業的には効率が高いと言える。
これらのことから、おおよそ55〜57℃と比較的マイルドな温度で、20〜5分間保持することで、酵素活性の低下を抑えてなおかつTRT10程度の殺菌を行うことができる。
【００２９】
【発明の効果】
以上の説明、特に実施例の結果からも明らかなように、本発明の殺菌方法によれば、そのタンパク質の生理活性の低下度は極めて小さく、しかも非常に効率的に殺菌し得る。従って本発明の熱殺菌方法は、特に、有用物質の生産に触媒として使用される微生物を、予め熱殺菌する方法として工業的に有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】殺菌温度とTRT10時間の関係を示すグラフ。
【図２】殺菌温度と活性低下度の関係を示すグラフ。
【図３】実施例１で使用した熱交換器の摸式図。
【図４】実施例２で使用した熱交換器の摸式図。
【符号の説明】
１…ポンプ
２…加熱部
３…保温部
４…氷バス
５…熱電対
【図１】
0004675512.tif 000002
【図２】
0004675512.tif 000003
【図３】
0004675512.tif 000004
【図４】
0004675512.tif 000005