(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１ａ）〜（１ｇ）の理化学的性質を有するジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）：
（１ａ）作用：酸素存在下にてＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（１ｂ）基質特異性：Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン及びＮ８−アセチルスペルミジンに対する活性よりもＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンに対する活性が高い；
（１ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５；
（１ｄ）安定ｐＨ：６．０〜８．０；
（１ｅ）至適温度：３７〜５５℃；
（１ｆ）熱安定性：３７℃以下［２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて３０分間処理した場合、９０％以上の残存活性］；
及び
（１ｇ）分子量：９２，０００（ゲルろ過法）；又は、
下記（２ａ）〜（２ｇ）の理化学的性質を有するジアセチルポリアミンオキシダーゼ（２）：
（２ａ）作用：酸素存在下にてＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（２ｂ）基質特異性：Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン及びＮ８−アセチルスペルミジンに対する活性よりもＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンに対する活性が高い；
（２ｃ）至適ｐＨ：７．０〜８．５；
（２ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５；
（２ｅ）至適温度：４５〜５５℃；
（２ｆ）熱安定性：３７℃以下［２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて３０分間処理した場合、９０％以上の残存活性］；
及び
（２ｇ）分子量：９０，０００（ゲルろ過法）。
【請求項２】
請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）の生産能を有するデバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、若しくは、請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（２）の生産能を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母、又は、それらの培養物から該酵素を回収することを特徴とする請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）又は（２）の製造方法。
【請求項３】
酵母がデバリオミセス  マラマ  （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒａｍａ）、デバリオミセス  マラムス  （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒａｍｕｓ）、デバリオミセス  ハンセニイ  （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、及び、キャンディダ  グラブラタ  （Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）からなる群から選ばれた１又は２以上の酵母である請求項２に記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）又は（２）の製造方法。
【請求項４】
請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）の活性を有する、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなる、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長と９０％以上の相同性を示し、かつ請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１から数個のＤＮＡが欠失、置換及び／又は付加され、かつ請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長と９５％以上の相同性を示し、かつ請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる、請求項７記載の遺伝子。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から請求項４又は５記載のタンパク質を回収することを特徴とする、ジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）の製造方法。
【請求項１２】
Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンに請求項１記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ（１）若しくは（２）、又は、請求項４若しくは５記載のタンパク質を作用させて、生成物となるＮ１−アセチルスペルミジンを回収することを特徴とする、Ｎ１−アセチルスペルミジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアセチルポリアミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、アミンとアルデヒドを生成する反応を触媒し、ジアセチルポリアミンに対する反応性がモノアセチルポリアミンに対する反応性よりも高いという新規な基質特異性を有する酵素、それをコードする遺伝子、及び該酵素の製造方法、さらに該酵素を用いるモノアセチルポリアミンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンとは、同一分子内に２個以上のアミノ基を有する化合物の総称であり、ヒトの体内には、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンの４種類のポリアミンとそれらのモノアセチル体及びジアセチル体が存在する。癌患者において、尿中ポリアミンの排泄量が増加することが１９７１年にＲｕｓｓｅｌによって報告されて以来、癌の診断を目的として尿中のポリアミン含量の測定が行われてきた（非特許文献１）。尿中ポリアミンの大部分はモノアセチル体で存在するため、従来はアセチル基を加水分解し、アセチルポリアミンとアセチル化されていない遊離型のポリアミンを区別しない総ポリアミン含量として測定されていた（特許文献１参照）。【０００３】
しかしながら、尿中総ポリアミンにおいては悪性腫瘍患者の中に偽陰性例が相当数認められることが明らかになっている。また、悪性腫瘍以外にも、炎症性疾患、心筋梗塞、肝硬変、創傷治癒過程など、種々の病態に関連して有意に上昇することが明らかになり、腫瘍マーカーとしては実用的でないと考えられるようになった。【０００４】
近年、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミン（化１）とＮ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジン（化２）の２種類のジアセチルポリアミンが尿中に排泄されていることが見出された（非特許文献２参照）。健常者の尿中においては、これらの成分は総ポリアミンのそれぞれ０．６％、１．４％を占めるにすぎないが、癌患者における増加の割合が総ポリアミンと比較して際立って高く、既存の腫瘍マーカーよりも真陽性率が高いことから、新たな腫瘍マーカーとして注目を集めている（非特許文献２参照）。【０００５】
【化１】
0004847456.tif 000002
【０００６】
【化２】
0004847456.tif 000003
【０００７】
ジアセチルポリアミンを定量する方法として、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法（非特許文献３、４参照）が挙げられるが、多数の検体を短時間で処理できない等の問題点を有していた。また、最近、ジアセチルスペルミンに対する特異性が高い抗体が取得され、本抗体を用いる間接競合ＥＬＩＳＡ法による測定法も開発された（非特許文献２参照）。しかしながらその操作は煩雑であり、測定値は試料の検体量に反比例するため、より簡単な操作で直接的に測定する方法が求められている。【０００８】
物質を簡便かつ安価に測定する方法としては、上記の方法以外に酵素法による測定法が広く知られているが、ジアセチルポリアミンを酵素法によって測定する試みは未だなされていない。ポリアミンを測定するための酵素としては、ポリアミンオキシダーゼ、ポリアミンデヒドロゲナーゼが用いられてきた。しかし、これまでにジアセチルポリアミンに対して基質特異性が高いオキシダーゼやデヒドロゲナーゼは見出されておらず、ジアセチルポリアミンとモノアセチルポリアミンとの分別定量ができていない。【０００９】
ポリアミンオキシダーゼとしては、例えばヒト（非特許文献５，６参照）、マウス（非特許文献７，８参照）、ラット（非特許文献９参照）、ブタ（非特許文献９参照）、ウシ（非特許文献１０参照）等の哺乳類由来、エンドウ（非特許文献１１参照）、カラス麦（非特許文献１２参照）、大麦（非特許文献１３参照）、とうもろこし（非特許文献１４参照）等の植物由来、トリコモナス属（非特許文献１５参照）、アカントアメーバ属（非特許文献１６参照）等の原生動物由来、アスペルギルス属（非特許文献１７参照）、ペニシリウム属（非特許文献１７，１８参照）等のカビ由来、サッカロマイセス属（非特許文献１９参照）、キャンディダ属（非特許文献２０参照）、イッサチェンキア属（特許文献４参照）、メチニコイア属（特許文献４参照）等の酵母由来、サーモモノスポラ属（特許文献４参照）等の放線菌由来、ミクロコッカス属（特許文献５参照）等の細菌由来が知られており、中でもジアセチルポリアミンに対して反応性を示す酵素としては哺乳類由来やペニシリウム属由来のポリアミンオキシダーゼが報告されている。【００１０】
しかしながら、ヒト及びマウス由来のポリアミンオキシダーゼについての各種ポリアミンに対する活性はＮ１−アセチルスペルミン（化３）＝Ｎ１−アセチルスペルミジン（化４）＞Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンであり（非特許文献６参照）、ラット由来のポリアミンオキシダーゼについてはＮ１−アセチルスペルミンに対する活性を１００％とすると、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンに対する活性は３０％程度であった（非特許文献９参照）。【００１１】
【化３】
0004847456.tif 000004
【００１２】
【化４】
0004847456.tif 000005
【００１３】
ペニシリウム属由来のポリアミンオキシダーゼに至っては、スペルミジンに対する活性を１００％とすると、モノアセチルポリアミン類に対しては１４〜４４％程度の活性を示すのに対し、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンには４％、Ｎ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジンには０．３％の活性を示すにすぎなかった（非特許文献１８参照）。
ポリアミンデヒドロゲナーゼとしては、例えばシュードモナス属（特許文献６参照、非特許文献２１参照）、シトロバクター属（非特許文献２１参照）及びセラチア属（非特許文献２２参照）の細菌由来等が知られているが、ジアセチルポリアミンに対する活性は示されていない。【００１４】
話題を転じるが、モノアセチルポリアミンは医薬品や農薬の原料として有用である。従来より、本化合物は有機合成法、酵素法により合成されている。有機合成法としては、遊離ポリアミンを非選択的にアセチル化する方法、若しくはジアセチルポリアミンを非選択的に加水分解する方法が知られているが、多量の副生成物が得られ、精製が煩雑であり収率が低いという問題点があった。特に非対称のモノアセチルポリアミンを得ようとすると、同量の構造異性体が生成してしまう。例えばＮ１−アセチルスペルミジン（化４）を得ようとすると、理論上、同量のＮ８−アセチルスペルミジン（化５）も得られることになる。【００１５】
【化５】
0004847456.tif 000006
【００１６】
これを解決すべく、遊離ポリアミンに保護基を導入し、選択的にアセチル化する方法も報告されているが、多くの工程を要するものであった。例えば本法では、Ｎ１−アセチルスペルミジンをスペルミジンから合成するためには９段階の反応が必要であり、総回収率は３５％である（非特許文献２３、２４参照）。【００１７】
また、簡便かつ選択的なモノアセチルポリアミンの合成法として酵素法があり、具体的にはジアセチルポリアミンに、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを作用させて選択的にアセチル基を加水分解する方法、及びポリアミンオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼを作用させて２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂させる方法がある。【００１８】
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼについては様々な生物種由来のものが知られており、特にミコプラナ属の放線菌由来、キャンディダ属の酵母由来、アルカリゲネス属の細菌由来の酵素はジアセチルポリアミンを基質とすることが報告されている。しかし、ミコプラナ属由来の酵素にジアセチルポリアミンを作用させても、一方のアセチル基のみを選択的に加水分解することは難しい（非特許文献４参照）。
また、キャンディダ属由来、アルカリゲネス属由来の酵素の最適な基質はジアミノアルカン類（プトレッシン、カダベリン等）のジアセチル体である。Ｎ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジンを基質とすると、生成物としてＮ１−モノアセチルスペルミジンが得られるが、その活性はジアセチルプトレッシンの５〜１０％程度にすぎなかった（特許文献７参照）。【００１９】
ポリアミンオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼを作用させて２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂させる方法については先に述べた、ヒト、マウス及びラット等の哺乳類由来のポリアミンオキシダーゼを用いることができ、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンを基質とするとＮ１−アセチルスペルミジンが生成するが、本酵素は生成物であるＮ１−アセチルスペルミジンに対してＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンよりも高い活性を示すため、容易にプトレッシンまで分解されてしまい、反応の制御が難しく、効率的にＮ１−アセチルスペルミジンを得ることは難しかった（非特許文献６参照）。【００２０】
【特許文献１】特開平１−８５０８０号公報
【特許文献２】特開２０００−７４９１７号公報
【特許文献３】特開平１１−７５８３９号公報
【特許文献４】特開平４−２０２８７号公報
【特許文献５】特開昭６０−９８９８２号公報
【特許文献６】特開昭６４−６０３７４号公報
【特許文献７】特開平４−２３４９９２号公報
【非特許文献１】「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，（米国），１９７１年，３１巻，ｐ．１５５５−１５５８
【非特許文献２】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），２００６年，１３９巻，ｐ．３１５−３２２
【非特許文献３】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），１９９４年，１１５巻，ｐ．５８４−５８９
【非特許文献４】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），１９９５年，１１７巻，ｐ．１０７−１１２
【非特許文献５】「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ」，（英国），２００２年，３６７巻，ｐ．６６５−６７５
【非特許文献６】「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ」，（英国），２００３年，３７０巻，ｐ．１９−２８
【非特許文献７】「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），２００３年，２７８巻，ｐ．５２７１−５２７６
【非特許文献８】「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），２００３年，２７８巻，ｐ．２０５１４−２０５２５
【非特許文献９】「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」，（蘭国），１９８１年，６７７巻，ｐ．１９０−１９３
【非特許文献１０】「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，（米国），１９８３年，９４巻，ｐ．３１４−３１８
【非特許文献１１】「Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」，（蘭国），１９７１年，４７巻，ｐ．６４４−６４８
【非特許文献１２】「Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（英国），１９７７年，１６巻，ｐ．１６４７−１６４９
【非特許文献１３】「Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（英国），２００１年，２６８巻，ｐ．３８１６−３８３０
【非特許文献１４】「Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（英国），１９９６年，４３巻，ｐ．３３９−３４１
【非特許文献１５】「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，（英国），２０００年，１４６巻，ｐ．２７１５−２７２２
【非特許文献１６】「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ」，（蘭国），１９９２年，５１巻，ｐ．９１−９８
【非特許文献１７】「Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），１９８０年，４４巻，ｐ．２９５５−２９６０
【非特許文献１８】「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」，（蘭国），１９８３年，７４３巻，ｐ．４３１−４３６
【非特許文献１９】「Ｂｉｏｃｈｅｍａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」，（米国），２００３年，３０３巻，ｐ．７７１−７７６
【非特許文献２０】「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」，（英国），２０００年，４７６巻，ｐ．１５０−１５４
【非特許文献２１】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，（日本），１９９０年，６９巻，ｐ．３３５−３４０
【非特許文献２２】「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），１９７０年，２４５巻，ｐ．５４２４−５４３３
【非特許文献２３】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｉ」，（英国），１９８８年，ｐ．１９０５−１９１１
【非特許文献２４】「Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｖａｖｉｃａ」，（デンマーク），１９８９年，４３巻，ｐ．９９０−９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明が解決しようとする課題は、種々の用途、特に臨床診断や有機合成に用いることのできる、ジアセチルポリアミンに対して高い基質特異性を有する新規酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、ジアセチルポリアミンに対して高い活性（基質特異性）を有する酵素を広く自然界より探索して見出した。そして本酵素の取得に成功し、本酵素がジアセチルポリアミンの測定やモノアセチルポリアミンの製造に有利な種々の新規な理化学的性質を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２３】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）ジアセチルポリアミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、モノアセチルポリアミンとアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素であり、Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン及びＮ８−アセチルスペルミジンに対する活性よりもジアセチルポリアミンに対する活性が高い、という基質特異性を有する新規酵素。
（２）ジアセチルポリアミンが、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンであることを特徴とする、上記（１）に記載の酵素。
（３）酵素反応の生成物が、Ｎ１−アセチルスペルミジンと３−アセトアミドプロパナールであることを特徴とする、上記（１）若しくは（２）のいずれかに記載の酵素。
（４）酵素がジアセチルポリアミンオキシダーゼであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵素。
（５）下記（ａ）〜（ｇ）の理化学的性質を有する新規酵素：
（ａ）作用：酸素存在下にてＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（ｂ）基質特異性：Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン及びＮ８−アセチルスペルミジンに対する活性よりもＮ１，Ｎ１２−ジアセチルポリアミンに対する活性が高い；
（ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５；
（ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５；
（ｅ）至適温度：３７〜５５℃；
（ｆ）熱安定性：３７℃以下［２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて３０分間処理した場合、９０％以上の残存活性］；
及び
（ｇ）分子量：約９０，０００から９２，０００（ゲルろ過法）。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素の生産能を有する微生物、細胞、又はそれらの培養物から該酵素を回収することを特徴とする、新規酵素の製造方法。
（７）微生物、細胞が酵母である、上記（６）に記載の酵素の製造方法。
（８）酵母がデバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、若しくはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母からなる群から選ばれた１又は２以上の酵母である、上記（７）に記載の酵素の製造方法。
（９）酵母がデバリオミセス  マラマ  （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒａｍａ）、デバリオミセス  マラムス  （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒａｍｕｓ）、デバリオミセス  ハンセニイ  （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、キャンディダ  グラブラタ  （Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、若しくはピキア  ミヌタ  （Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）からなる群から選ばれた１又は２以上の酵母である上記（８）に記載の酵素の製造方法。
（１０）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素活性を有する、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１１）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素活性を有する、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１２）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長と８０％以上の相同性を示し、かつ上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１から数個のＤＮＡが欠失、置換及び／又は付加され、かつ上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１３）上記（１１）又は（１２）記載の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（１４）上記（１３）記載の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
（１５）上記（１４）記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から上記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵素を回収することを特徴とする酵素の製造方法。
（１６）ジアセチルポリアミンに（１）〜（５）、若しくは（１０）のいずれかに記載の酵素を作用させて、モノアセチルポリアミンを回収することを特徴とする、モノアセチルポリアミンの製造方法。
（１７）Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンに上記（１）〜（５）、若しくは（１０）のいずれかに記載の酵素を作用させて、生成物となるＮ１−アセチルスペルミジンを回収することを特徴とする、Ｎ１−アセチルスペルミジンの製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、モノアセチルポリアミンであるＮ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、若しくはＮ８−アセチルスペルミジンよりもジアセチルポリアミンに対して高い活性をもって２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂する新規な酵素及びそれらの製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）の形態を観察したものである。
【図２】キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）の形態を観察したものである。
【図３】実施例３における酵素標品の至適ｐＨを示すためのグラフである。
【図４】実施例３における酵素標品の安定なｐＨ範囲を示すためのグラフである。
【図５】実施例３における酵素標品の至適温度を示すためのグラフである。
【図６】実施例３における酵素標品の安定な温度範囲を示すためのグラフである。
【図７】実施例５における酵素標品の至適ｐＨを示すためのグラフである。
【図８】実施例５における酵素標品の安定なｐＨ範囲を示すためのグラフである。
【図９】実施例５における酵素標品の至適温度を示すためのグラフである。
【図１０】実施例５における酵素標品の安定な温度範囲を示すためのグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
ポリアミンとは、同一分子内に２個以上のアミノ基を有する化合物の総称であり、第一級アミノ基を２個有するジアミン類や第一級アミンと第二級アミンを合わせて３個以上有する化合物群とされ、一般式化６のように表される。【００２７】
【化６】
0004847456.tif 000007
【００２８】
例えばジアミンとしては１，３−プロパンジアミン（３）、プトレッシン（４）、カダベリン（５）等が挙げられ、トリアミンとしてはスペルミジン（３−４）、ノルスペルミジン（カルジン；３−３）、ホモスペルミジン（４−４）、アミノプロピルカダベリン（３−５）等が挙げられ、テトラアミンとしてはスペルミン（３−４−３）、ノルスペルミン（テルミン；３−３−３）、テルモスペルミン（３−３−４）、カナバルミン（４−３−４）、アミノペンチルノルスペルミジン（３−３−５）、Ｎ，Ｎ’−ビス（アミノプロピル）カダベリン（３−５−３）等が挙げられ、ペンタアミンとしてはカルドペンタミン（３−３−３−３）、ホモカルドペンタミン（３−３−３−４）等が挙げられ、ヘキサアミンとしては例えばホモカルドヘキサミン（３−３−３−３−３）等が挙げられる（括弧内の数字はそれぞれの化学構造においてアミンの間に存在するメチレンの数、すなわち化６の式中のｌ，ｍ，ｎ等を示す）。ジアセチルポリアミンとはポリアミンの２つの第一級アミンがともにアセチル化した化合物である。【００２９】
まず、本発明の新規な酵素（以下、本発明酵素と記載する）の基質特異性について説明する。本発明酵素は例えば化７に示すとおり、ジアセチルポリアミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、モノアセチルポリアミンとアルデヒドを生成する反応を触媒するものであるため、本発明酵素の基質であるジアセチルポリアミンとは第一級アミン２個と第二級アミン１個以上を有するポリアミンの２つの第一級アミンがともにアセチル化した化合物をさす。【００３０】
【化７】
0004847456.tif 000008
【００３１】
従って、本発明酵素の基質の例として、例えば、Ｎ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジン、Ｎ１，Ｎ７−ジアセチルノルスペルミジン（Ｎ１，Ｎ７−ジアセチルカルジン）、Ｎ１，Ｎ９−ジアセチルホモスペルミジン、Ｎ１，Ｎ９−ジアセチルアミノプロピルカダベリン、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミン、Ｎ１，Ｎ１１−ジアセチルノルスペルミン（Ｎ１，Ｎ１１−ジアセチルテルミン）、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルテルモスペルミン、Ｎ１，Ｎ１３−ジアセチルカナバルミン、Ｎ１，Ｎ１３−ジアセチルアミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（アセトアミドプロピル）カダベリン、Ｎ１，Ｎ１５−ジアセチルカルドペンタミン、Ｎ１，Ｎ１６−ジアセチルホモカルドペンタミン、Ｎ１，Ｎ１９−ジアセチルホモカルドヘキサミン等が挙げられる。【００３２】
本発明酵素は、これらのいずれか１つのジアセチルポリアミンに対する活性が、Ｎ１−アセチルスペルミン（化３）、Ｎ１−アセチルスペルミジン（化４）、及びＮ８−アセチルスペルミジン（化５）に対する活性のいずれよりも高いという新規な基質特異性を有しており、このような基質特異性を有し、かつ化７の反応を触媒する酵素であれば、如何なる酵素も本発明に含まれ、開裂する２級アミンのＣ−Ｎ結合の位置については特に限定されない。なお、活性とは、例えば後述するような酵素活性の測定方法によって測定された値をさす。【００３３】
ジアセチルポリアミンの中でも特にＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミン（化１  以下、単にジアセチルスペルミンと記載する）が基質として好ましく用いられるが、これについても開裂する２級アミンのＣ−Ｎ結合の位置は特に限定されず、化８若しくは化９の反応を触媒することができる。【００３４】
【化８】
0004847456.tif 000009
【００３５】
【化９】
0004847456.tif 000010
【００３６】
よって、本発明酵素は「ジアセチルスペルミンに対する活性が、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジンに対する活性のいずれよりも高い」基質特異性を有することを特徴とし、化８若しくは化９の反応を触媒する酵素はすべて本発明に含まれると言える。特に本発明の新規な酵素は、化８の反応を好ましく触媒することができるため、ジアセチルポリアミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジンと３−アセトアミドプロパナールを生成する反応を触媒する酵素であり、ジアセチルスペルミンに対する活性が、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、及びＮ８−アセチルスペルミジンに対する活性のいずれよりも高い酵素であれば、本発明に含まれることとなる。【００３７】
次に本発明の新規な酵素の反応・作用様式について説明する。本発明の酵素は前述した新規な基質特異性を有し、かつジアセチルポリアミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、モノアセチルポリアミンとアルデヒドを生成する反応を触媒するものである。このような反応を触媒する酵素であればすべて本発明に含まれるが、より具体的には酸素存在下でジアセチルポリアミンを酸化して過酸化水素を生成するジアセチルポリアミンオキシダーゼとジアセチルポリアミンを脱水素することによって酸化することができるジアセチルポリアミンデヒドロゲナーゼの２種が挙げられる。【００３８】
オキシダーゼとデヒドロゲナーゼが有する補酵素については、フラビンアデニンジヌクレオチド（「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），２００２年，２７７巻，ｐ．２３９７３−２３９７６参照）、フラビンモノヌクレオチド（「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），２００４年，４３巻，ｐ．１０８００−１０８０８参照）、銅（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」，（英国），２００５年，３４６巻，ｐ．９９１−１００４参照）、ヘム鉄（「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），１９７０年，２４５巻，ｐ．５４２４−５４３３参照）、ピロロキノリンキノン（「Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），１９９２年，５６巻，ｐ．３１１−３１４参照）、リジルチロシルキノン（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」，（米国），１９９６年，２７３巻，ｐ．１０７８−１０８４参照）、２，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニンキノン（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」，（英国），２００５年，３４６巻，ｐ．９９１−１００４参照）、トリプトファントリプトフィルキノン（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」，（米国），１９９１年，２５２巻，ｐ．８１７−８２４参照）、システイントリプトフィルキノン（「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」，（米国），２００１年，９８巻，ｐ．１４２６８−１４２７３参照）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００３９】
本発明の新規な酵素は、より好ましくは酸素存在下でジアセチルポリアミンを酸化して２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、モノアセチルポリアミンとアルデヒドを生成するジアセチルポリアミンオキシダーゼであり、前述した新規な基質特異性を有するジアセチルポリアミンオキシダーゼはすべて本発明に含まれる。そしてさらに、ジアセチルポリアミンの中でも特にジアセチルスペルミンが基質として好ましく用いられるため、前述した新規な基質特異性を有し、化１０に示す反応を触媒するジアセチルスペルミンオキシダーゼはすべて本発明に含まれるとも言える。【００４０】
【化１０】
0004847456.tif 000011
【００４１】
また、本発明の新規な酵素の一形態として、例えば、以下の（１ａ）〜（１ｇ）に記載の理化学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せて有するジアセチルスペルミンオキシダーゼ等も本発明酵素として挙げられる。なお、下記の酵素の理化学的性質は、測定上不可避的な誤差を含んでいる。
（１ａ）作用：化１０に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する。
（１ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン
例えば、ｐＨ７．５の条件下において、ジアセチルスペルミンを基質として用いたときの活性を１００としたとき、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が９０以下、好ましくは６０以下、更に好ましくは５０以下、もっとも好ましくは４０以下である理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。本評価におけるｐＨの条件や緩衝液の種類と濃度についてはなんら制限されない。
（１ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ６．５〜８．５、好ましくはｐＨ７．０〜８．０の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｄ）安定ｐＨ：６．０〜８．０
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、３０℃で３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｅ）至適温度：３７〜５５℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として３７〜５５℃の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｆ）熱安定性：３７℃以下
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、夫々の温度において３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは９０％以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例えば、酵素が安定に存在できる範囲として、３７℃以下の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｇ）分子量：約９２，０００（ゲルろ過法）
分子量はゲルろ過法、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法等を用いて測定することができる。本発明酵素の分子量については特に限定されないが、例えば、分子量の一例として、分子量約９２，０００（ゲルろ過法）の本発明酵素などが挙げられる。
また、さらに本発明の新規な酵素の一形態として、例えば、以下の（２ａ）〜（２ｇ）に記載の理化学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せて有するジアセチルスペルミンオキシダーゼ等も本発明酵素として挙げられる。なお、下記の酵素の理化学的性質は、測定上不可避的な誤差を含んでいる。
（２ａ）作用：化１０に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する。
（２ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン
例えば、ｐＨ７．５の条件下において、ジアセチルスペルミンを基質として用いたときの活性を１００としたとき、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が９０以下、好ましくは６０以下、更に好ましくは５０以下である理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。本評価におけるｐＨの条件や緩衝液の種類と濃度についてはなんら制限されない。
（２ｃ）至適ｐＨ：７．０〜８．５
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ７．０〜８．５、好ましくはｐＨ７．５〜８．０の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、３０℃で３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐＨ５．５〜９．５、好ましくはｐＨ６．５〜９．０の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｅ）至適温度：４５〜５５℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として４５〜５５℃の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｆ）熱安定性：３７℃以下
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、夫々の温度において３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは９０％以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例えば、酵素が安定に存在できる範囲として、３７℃以下の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｇ）分子量：約９０，０００（ゲルろ過法）
分子量はゲルろ過法、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法等を用いて測定することができる。本発明酵素の分子量については特に限定されないが、例えば、分子量の一例として、分子量約９０，０００（ゲルろ過法）の本発明酵素などが挙げられる。【００４２】
本発明酵素等の酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成するモノアセチルポリアミン、アルデヒド、過酸化水素などの量を測定する方法、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法や電子伝達物質の量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、ジアセチルスペルミンオキシダーゼ活性を、生成する過酸化水素量から測定する方法について示す。【００４３】
（ジアセチルスペルミンオキシダーゼ活性の測定方法）
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌ、７．０ｍＭ  ジアセチルスペルミン溶液  ０．１ｍｌ、１５ｍＭ  Ｔｏｏｓ溶液  ０．０４ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（キッコーマン社製）溶液  ０．０４ｍｌ、１．７６％（ｗ／ｖ）  ４−アミノアンチピリン溶液  ０．０２ｍｌの混合液を３７℃で５分間インキュベートした。０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，シグマ社製）を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて適宜希釈した酵素サンプル  ０．０５ｍｌを反応液に添加、混合した。全容１．１５ｍｌを３７℃で３分間反応させ、反応開始から３分間の、反応溶液の５５５ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。ジアセチルスペルミンオキシダーゼの酵素１Ｕは、上記測定条件下において、ジアセチルスペルミンを基質とするときに１分間あたり１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量とした。なお本条件におけるミリモル分子吸光係数を１．５７ｃｍ２／μｍｏｌとした。なお、本測定方法は一例を示したものであり、活性測定の試薬の種類や濃度、ｐＨについては何ら制限するものではない。例えば、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の代わりに０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）等を用いることもできる。【００４４】
そして、ジアセチルスペルミンの代わりに各種ポリアミンを基質として用いればそれぞれのポリアミンに対する酵素活性を測定することができる。さらにジアセチルスペルミンに対する活性を１００％として、それぞれのポリアミンに対する相対活性値を算出することにより、基質特異性を評価することができる。【００４５】
本発明酵素等を用いる反応により生成するモノアセチルポリアミンの確認方法としては、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いる方法、ＨＰＬＣを用いる方法、生成物を単離精製してＮＭＲや融点等の物性を測定する方法などが挙げられる。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いる方法は簡便で、より好ましく用いることができる。展開溶媒としては、クロロホルム：メタノール：アンモニア水：水＝２：４：１：１が好ましく用いられる。【００４６】
本発明酵素等は、微生物や動物、植物起源の酵素を探索して、自然界より取得することができる。例えば、本発明酵素を生産する能力を有する微生物を探索する場合、ジアセチルポリアミン、例えばジアセチルスペルミンやＮ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジン（以下、単にジアセチルスペルミジンと記載する）などの酵素生産誘導物質を加えた培地で微生物を培養し、得られた微生物菌体を破砕し、ジアセチルポリアミンを基質として用い、ジアセチルポリアミンオキシダーゼ活性若しくはジアセチルポリアミンデヒドロゲナーゼ活性を調べることにより本発明酵素生産能を有する微生物候補株を取得できる。【００４７】
ここで用いる微生物は土壌や植物等の生物から新たに分離してもよく、さらには、微生物保存機関等より入手した微生物を用いることもできる。さらに、例えば、ジアセチルポリアミンに対する特異性に優れた目的の本発明酵素を得るには、上記のようにして得られた微生物菌体の破砕液を用いて各種ポリアミン、例えばジアセチルスペルミンやジアセチルスペルミジン等のジアセチルポリアミン、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン、スペルミン、スペルミジンを基質としたときの活性を測定し、特にジアセチルポリアミンに対する基質特異性が高いものを選抜することにより可能となる。【００４８】
本発明酵素生産能を有する生物としては、取り扱いの容易さ、生産性等の点から、例えば、微生物の生産する本発明酵素が好ましく、公知の変異誘導方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、エチルメタンスルホネートやＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異誘起剤による変異処理、遺伝子操作、又は交雑育種等を行った微生物などが生産する本発明酵素でもよい。【００４９】
微生物でも、例えば、酵母などの生産する本発明酵素が好ましく、酵母としては、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クリストフィロバシジウム（Ｃｌｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、エリスロバシジウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、エンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属、フェロミセス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、ジオトリウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ハンゼニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ハセガワエア（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ）属、イッサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クロッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、メチニコイア（Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉａ）属、ミクシア（Ｍｉｘｉａ）属、ナドソニア（Ｎａｄｓｏｎｉａ）属、パキゾーレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プロトミセス（Ｐｒｏｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロードスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロードトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、サッカロミコダス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、サカグチア（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シュバニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトミセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、シンビオタフリナ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ）属、シンポジミセス（Ｓｙｍｐｏｄｉｍｙｃｅｓ）属、タフリナ（Ｔａｐｈｒｉｎａ）属、トルラスポーラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、ウィッケルハミア（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）属、ウィロプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ウィンゲア（Ｗｉｎｇｅａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が代表的なものとして挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００５０】
好ましい酵母としてキャンディダ属、デバリオミセス属、ピキア属が挙げられる。さらに具体的には、デバリオミセス  マラマ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒａｍａ）、デバリオミセス  マラムス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｍａｒａｍｕｓ）、デバリオミセス  ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、キャンディダ  グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、ピキア  ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）などが好ましい微生物として挙げられ、さらに具体的にはデバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９、デバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）、キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）、ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５などが特に好ましい微生物として挙げられ、該菌株の変種又は変異株も用いることができる。
なかでも、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）及びキャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）は、本発明者らが茨城県内及び千葉県内の土壌よりそれぞれ分離して得た菌株であり、２００６年５月１０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託され、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３、及び、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２が付与されている。その菌学的性質は以下に示すとおりである。なお、菌学的性質の同定のための実験、および分類同定の基準として「ＴＨＥ  ＹＥＡＳＴＳ．  Ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｓｔｕｄｙ」、第４版（１９９８年，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．  Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｗ．  Ｆｅｌｌ）を参考にした。
デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）の菌学的性質
（Ａ）培養的・形態的性質
ａ）ＹＭ液体培地（表面発育の有無、培地の混濁状態）：表面発育は見られるが皮膜の形成なし。培地は混濁せず底部に生育。
ｂ）ＹＭ寒天培地（生育の様相、色、光沢、拡散性色素）：白色で周囲は滑らか。表面は滑らかでつや無し。色素生産無し。
ｃ）ダルモー平板培養法：偽菌糸の形成は見られないが、伸長した細胞の連鎖は見られる。
ｄ）形状（ＹＭ寒天培地２５℃  ３日間培養）：円型（０．６−１．２μｍ）−楕円形（１．０−１．２×１．２−２．１μｍ）あるいは連鎖した棍棒状（０．６−１．０×１．５−３．６μｍ）  図１参照
ｅ）増殖の形式（出芽・分裂の区別）：多極出芽
（Ｂ）胞子の形成
ａ）有性胞子：いずれの培地においても観察されない。
ｂ）射出胞子：いずれの培地においても観察されない。
（Ｃ）生理学的・化学分類学的性質
ａ）最適生育条件（ｐＨ）：５．５
ｂ）最適生育条件（温度）：２５℃
ｃ）生育の範囲（ｐＨ）：２．５−１１．０
ｄ）生育の範囲（温度）：５−３０
ｅ）硝酸塩の資化：−
ｆ）脂肪の分解：＋
ｇ）尿素の分解：＋（Ｗｅａｋ）
ｈ）ジアゾニウムブルーＢの呈色反応：−
ｉ）ゼラチンの液化：＋
ｊ）耐塩性：１８％
ｋ）カロチノイドの生成：−
ｌ）顕著な有機酸の生成：＋
ｍ）デンプン様物質の生成：−
ｎ）ビタミンの要求性：−
ｏ）資化性と発酵性 
【００５１】
【表１】
0004847456.tif 000012
【００５２】
（Ｄ）化学分類学的性質
ａ）ＧＣ含量（ＨＰＬＣ）：３２．８
ｂ）ユビキノン：Ｑ−９
ｃ）細胞壁の糖組成：ＮＴ
ｄ）近縁菌種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性：９３％  ｖｓ．  デバリオミセス  ハンセニイ（ＪＣＭ１９９０Ｔ）
ｅ）１８Ｓ  ｒＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ：９９．８％  ｖｓ．  デバリオミセス  ハンセニイ（ＪＣＭ１９９０Ｔ，ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＢ０１３５９０）
本菌株は、以上のごとき菌学的性質を有することから、デバリオミセス  ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）と同定した。【００５３】
キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）の菌学的性質
（Ａ）培養的・形態的性質
ａ）ＹＭ液体培地（表面発育の有無、培地の混濁状態）：表面発育は見られない。培地は混濁せず、底部のみに生育。
ｂ）ＹＭ寒天培地（生育の様相、色、光沢、拡散性色素）：クリーム色で周囲は滑らか。表面は滑らかでつや有り。色素生産無し。
ｃ）ダルモー平板培養法：偽菌糸の形成は見られない。
ｄ）形状（ＹＭ寒天培地２５℃  ３日間培養）：卵型〜楕円形（０．３−１．２×１．０−２．１μｍ）  図２参照
ｅ）増殖の形式（出芽・分裂の区別）：多極出芽
（Ｂ）胞子の形成
ａ）有性胞子：いずれの培地においても観察されない。
ｂ）射出胞子：いずれの培地においても観察されない。
（Ｃ）生理学的・化学分類学的性質
ａ）最適生育条件（ｐＨ）：６．０
ｂ）最適生育条件（温度）：３０℃
ｃ）生育の範囲（ｐＨ）：２．０−１１．０
ｄ）生育の範囲（温度）：１５−４４
ｅ）硝酸塩の資化：−
ｆ）脂肪の分解：−
ｇ）尿素の分解：−
ｈ）ジアゾニウムブルーＢの呈色反応：−
ｉ）ゼラチンの液化：−
ｊ）耐塩性：１４％
ｋ）カロチノイドの生成：−
ｌ）顕著な有機酸の生成：＋
ｍ）デンプン様物質の生成：−
ｎ）ビタミンの要求性：＋
ｏ）資化性と発酵性 
【００５４】
【表２】
0004847456.tif 000013
【００５５】
（Ｄ）化学分類学的性質
ａ）ＧＣ含量（ＨＰＬＣ）：３６．０
ｂ）ユビキノン：Ｑ−６
ｃ）細胞壁の糖組成：ＮＴ
ｄ）近縁菌種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性：８４％  ｖｓ．  キャンディダ  グラブラタ（ＮＲＲＬ  Ｙ−６５Ｔ）
ｅ）１８Ｓ  ｒＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ：１００％  ｖｓ．  キャンディダ  グラブラタ（ＮＲＲＬ  Ｙ−６５Ｔ，ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＹ０４６２３７）
本菌株は、以上のごとき菌学的性質を有することから、キャンディダ  グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）と同定した。【００５６】
さらに、本発明酵素等は、遺伝子工学的技術や変異処理などの方法により、従来公知の酵素遺伝子、例えばポリアミンオキシダーゼ遺伝子やポリアミンデヒドロゲナーゼ遺伝子を改変して、適当なベクター宿主系に導入して発現させることにより得ることもできる。【００５７】
次に本発明酵素等の製造方法について述べる。本発明では、本発明酵素等の活性を有する生物体より本発明酵素等を、通常用いられている種々の蛋白質分離方法を用いて、回収することにより製造することができる。例えば、前記した本発明酵素等の生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物から本発明酵素活性を有するタンパク質を回収することにより、本発明酵素等を製造できる。一例として、本発明酵素生産能を有する微生物を用いる以下の方法が、具体的な製造方法として採用できる。【００５８】
まず、探索の結果、得られた本発明酵素を生産する微生物（以下「微生物」と総称する）を培養する。この場合、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦麹の浸出液など１種以上の窒素源に、必要に応じてグルコースやグリセロールなどの炭素源、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄若しくは硫酸マンガンなどの無機塩類、ビタミンなどを適宜添加したものが用いられる。酵素生産誘導基質として、ポリアミン類、例えばジアセチルスペルミンやジアセチルスペルミジンなどの酵素基質やスペルミンやスペルミジンなどの基質に類似した物質を適宜添加してもよい。【００５９】
なお、培地の初発ｐＨは、４〜８、さらに好ましくは５〜６．５に調製するのが適当である。また培養は、２５〜４２℃、好ましくは３０℃前後で１〜７日間、通気攪拌深部培養、振とう培養、静置培養などにより実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明酵素を回収するには、通常の酵素回収手段を用いることができる。【００６０】
菌体の分離には、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌することができる。また、菌体から本発明酵素を回収するには、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノーミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法などにより、本発明酵素を回収することができる。【００６１】
このようにして得られた粗酵素液から本発明酵素を単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。このようにして、本発明酵素を単離精製することができる。また、上記精製方法を適宜組み合わせて、用途に応じた精製度合いの異なる酵素標品を調製することもできる。【００６２】
さらに、本発明酵素として、例えば、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）などが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む酵素。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む酵素。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む酵素。
ここで、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたことを意味する。
また、「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であれば特に制限がなく、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
上記本発明酵素として、例えば、デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９、デバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）、キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）、ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５などの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の酵素遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られる酵素なども挙げられる。
次に、本発明酵素をコードする遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）としては、例えば、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）などが挙げられる。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記本発明酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長と８０％以上の相同性を示し、かつ上記本発明酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９））を行った際、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、この条件は使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。このような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出してしまう場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような条件としては、例えば、後記実施例７の項目（３）において特異的なシグナルが観察できることから、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７〜４２℃で一晩行う。洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。洗いの温度は、４５℃以上、好ましくは５２℃以上、更に好ましくは５７℃以上である。このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、ＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡなどが挙げられる。本発明における、「塩基配列の全長と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ」の相同性は、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
本発明遺伝子として、例えば、デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９、デバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）、キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）、ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５などの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の酵素遺伝子やこれを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られる酵素をコードする遺伝子などが挙げられる。さらに、天然型の酵素タンパクをコードする遺伝子に遺伝子工学的技術や変異処理などの方法により種々の変異を導入した遺伝子も、本発明遺伝子に含まれる。
本発明遺伝子の取得方法としては、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、前述した本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。ついで、上記本発明酵素のアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列や取得した遺伝子の部分配列情報に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法、５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の本発明遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。また、上記プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを用いて、種々の生物から本発明オキシダーゼをコードする本発明遺伝子を得ることもできる。さらに、既知である類似酵素の遺伝子配列やその周辺の配列、アミノ酸の配列の情報を利用して適当な混合塩基プライマーを作製し、ＰＣＲ法により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させることもできる。
上記のようにして得られた本発明遺伝子を、大腸菌ラクトースオペロンやトリプトファンオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０を参照）を保有するベクターＤＮＡに挿入し、得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌等に形質導入して本発明酵素高生産株を得る。
用いられるベクターＤＮＡは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ若しくはバクテリオファージＤＮＡ等でもよい。プロモーターの種類についても特に限定はなく、ｌａｃ（ラクトースオペロン）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ（ｌａｃとｔｒｐオペロンを融合したもの）等、如何なるものを用いてもよい。ｐＢＲ系、ｐＵＣ系についても特に限定はされず、具体的には、ｔａｃプロモーターを有するｐＢＲ系ベクターであるｐＫＫ２２３−３やｐＵＴＥ１２０Ｋ’、ｌａｃプロモーターを有するｐＢＲ系ベクターであるｐＵＴＥ５００Ｋ’（特開平０８−２０５８６１号公報記載）、ｔｒｐプロモーターを有するｐＢＲ系ベクターであるｐＵＴＥ１１０Ｋ’、Ｔ７プロモーターを有するｐＥＴベクター（宝酒造社製）等を用いることができる。また得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、大腸菌のほか、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生物や動物細胞などを形質転換又はそれらに形質導入して夫々の菌株を得ることができる。好ましくは、大腸菌Ｋ−１２、さらに好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）、ＤＨ５α（宝酒造社製）、ＢＬ２１（宝酒造社製）等が用いられる。
さらに上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができるが、例えば、前記の組換え体ＤＮＡに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸などの化学変異剤を接触させる方法、またはＰＣＲ法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組換え体ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組換え体ＤＮＡを得ることができる。
次に、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から本発明酵素を回収する。一般に、形質転換体又は形質導入体の培養は、用いられた宿主の生育に適した培地を用いて培養される。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、培地の種類や組成は特に限定されないが、ＬＢ培地等が好ましく用いられる。酵素生産誘導基質として、適量のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を適宜添加してもよい。なお、培地の初発ｐＨは、例えば、７〜９に調整するのが適当である。また培養は、例えば、１０〜４２℃、好ましくは１５〜３７℃前後で６〜１２０時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明酵素を回収するには、通常の酵素回収手段を用いることができる。
培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明酵素を回収することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から本発明酵素を回収するのが好ましい。
このようにして得られた粗酵素液から本発明酵素を単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。【００６３】
このようにして得られた本発明酵素は、例えば、以下に述べるジアセチルポリアミンの測定などに有効に用いられる。先ず検体に、ウシ血清由来ポリアミンオキシダーゼ、ブタ腎臓由来ジアミンオキシダーゼ等の１級アミンに作用するポリアミンオキシダーゼ、ポリアミンデヒドロゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、若しくはジアセチルポリアミンに作用しにくいポリアミンオキシダーゼ、ポリアミンデヒドロゲナーゼなどを作用させることにより、ジアセチルポリアミン以外のポリアミン類を消去する（特開２０００−７４９１７号公報参照）。次にジアセチルポリアミンを本発明酵素により測定する。その際、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法や生成する過酸化水素量を測定する方法、電子伝達物質の量を測定する方法を用いることもできるし、さらに例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ−ＮＡＤ（Ｐ）＋を用いて生成するアルデヒドを測定する方法（特開平０１−２７４９９号公報参照）等の酵素サイクリング法を組み合わせて高感度測定することもできる。【００６４】
さらに、このようにして得られた本発明酵素は、例えば、以下に述べるモノアセチルポリアミンの製造などにも有効に用いられる。なおこれに用いられる酵素としては、酵素を生産する微生物菌体や細胞そのものでもよく、また、これらの微生物菌体や細胞の破砕抽出液でもよい。さらに破砕抽出液を適宜、硫安塩析やクロマトグラフィー等により精製したものを用いることもできる。さらに本発明酵素の遺伝子を組換えＤＮＡ技術により単離し、同じ属に属する宿主細胞又は異なる属に属する宿主細胞に導入することにより得られた形質転換体が産生する酵素を用いることもできる。【００６５】
本発明酵素を用いるジアセチルポリアミンからモノアセチルポリアミンへの物質変換反応は通常緩衝液中で行うが、必要に応じ、カタラーゼ等の過酸化水素消去酵素を添加してもよい。緩衝液としては、ｐＨ５〜９の通常の緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、各種グッドバッファー等を挙げることができる。酵素の至適ｐＨと安定性の点から、ｐＨ６〜８、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５で反応を行うことが好ましい。
本発明酵素を用いる反応時間はいかなる時間でもよいが、１時間から３日間、さらに具体的には３時間から２日間程度で反応を停止させるのが好ましい。【００６６】
上記の反応により、ジアセチルポリアミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合が開裂してモノアセチルポリアミンが生成する。反応終了後の反応系から、モノアセチルポリアミンを分離精製する方法は任意である。分離法としては、例えば、限外ろ過膜等を用いて酵素由来タンパクを除去する方法、分離反応液のｐＨを水酸化ナトリウム等でアルカリ性にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する方法、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いるクロマトグラフィーの方法、再結晶等を適宜用いることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
（本発明酵素生産能を有する微生物の探索）
探索には、土壌より分離した菌、植物より分離した菌、及び微生物保存機関から分与された保存菌を用いた。土壌由来菌については、千葉県野田市、茨城県筑波付近を中心とする土壌及び植物約９００サンプルを回収し、それぞれ小スパーテル１さじ若しくは断片を培地（酵母エキス０．３％、トリプトン０．３％、グルコース０．６％、ジアセチルスペルミン０．１％、ジアセチルスペルミジン０．１％、ｐＨ６．０）を用いて、３０℃、１日振とう培養したのち、平面培地（上記培地＋寒天１．２％）で分離した。分離した菌株は約１５，０００株で主にバクテリア、酵母であった。保存菌は酵母６５０株、糸状菌３５０株、バクテリア２００株を用いた。【００６８】
土壌由来菌及び保存菌株は上記培地１ｍｌにそれぞれ接種し、２〜５日、３０℃で振とう培養した。この培養液を３，０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して菌体を得た。その後、溶菌バッファー［１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム］に懸濁し、超音波処理（１〜３分）又はマルチビーズショッカー（２，０００ｒｐｍ、３０秒、８回、安井器械社製）等により菌体を破砕し、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素液とした。この粗酵素液について、前述の活性測定法にて、ジアセチルスペルミン及びジアセチルスペルミジンに対する活性の有無を調べたところ、ジアセチルスペルミンに対して高い活性を有するオキシダーゼを生産する酵母が９株得られた。すなわち、デバリオミセス属の酵母３株、キャンディダ属の酵母３株、ピキア属の酵母３株であった。これら９株について、ジアセチルスペルミン、ジアセチルスペルミジン、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、スペルミン、スペルミジンに対する活性を調べた結果、ジアセチルスペルミンに対する基質特異性が高い酵素を生産する酵母は５株であった。すなわち、デバリオミセス属の酵母３株、キャンディダ属の酵母１株、ピキア属の酵母１株であった。具体的には、デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９、デバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）、キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）、ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５であった。
【実施例２】
【００６９】
（酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９が生産する本発明酵素の製造）
デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９を１５０ｍＬ容三角フラスコに入れた培地（酵母エキス０．３％、トリプトン０．３％、グルコース０．６％、ｐＨ６．０）５０ｍＬに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。これを種培養として、５Ｌ三角フラスコに入れた上記培地１Ｌに１０ｍｌずつ接種し、３０℃、９０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。【００７０】
菌体（６Ｌ培養液分）を０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１Ｌに懸濁し、ダイノーミルにより破砕した。破砕液は８,０００ｒｐｍで、１５分遠心し、上清に７０％硫安を添加して、沈殿を回収した。沈殿を２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、あらかじめ上記緩衝液で平衡化したＱ−セファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラム（５ｃｍ×１８ｃｍ）に吸着させた。２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０〜４００ｍＭ  塩化ナトリウムを含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて直線濃度勾配法により溶出させ、約１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含有する緩衝液で溶出された活性画分を回収した。【００７１】
これに２Ｍとなるように硫安を添加し、２Ｍ  硫安を含有する２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したトヨパールブチル−６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。２Ｍ  硫安を含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、２〜０Ｍ  硫安を含有するリン酸カリウム緩衝液にて直線濃度勾配法により溶出した。
溶出された活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮し、ＨＰＬＣにて陰イオン交換クロマトグラフィー［ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（東ソー社製、７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）］を行った。２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０〜５００ｍＭ  塩化ナトリウムを含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて直線濃度勾配法により溶出させた。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行い、２２０ｎｍでモニターした。【００７２】
溶出された活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮し、ゲルろ過［ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）］を行った。溶媒は０．１Ｍ  硫酸ナトリウムを含有する０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行い、２２０ｎｍでモニターした。分子量マーカー（和光純薬工業社製）を指標とした結果、分子量約９２，０００であった。
得られた活性画分はマイクロコン１０（アミコン社製）で濃縮し、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。得られた酵素は以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
【実施例３】
【００７３】
（酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９が生産する本発明酵素の理化学的性質）
実施例２により得られた本発明酵素の理化学的性質は、下記のとおりであった。
（ａ）作用
反応産物を特定するために反応液をＴＬＣ解析した。５０μｌの反応液（７ｍＭ  ジアセチルスペルミン、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、本発明酵素  １Ｕ／ｍｌ）を３０℃で１日間インキュベートし、ＴＬＣで反応産物を解析した（クロロホルム：メタノール：アンモニア水：水＝２：４：１：１、ニンヒドリン発色）。各種ポリアミンのＲｆ値（移動率）は、ジアセチルスペルミン  ０．４９、ジアセチルスペルミジン  ０．７１、Ｎ１−アセチルスペルミン  ０．０７、Ｎ１−アセチルスペルミジン  ０．２０、Ｎ８−アセチルスペルミジン  ０．２９、スペルミン  ０、スペルミジン  ０．０３であり、反応液についてはジアセチルスペルミンのスポットが消失し、Ｎ１−アセチルスペルミジンに相当するスポットが検出された。このことから、本発明酵素はジアセチルスペルミンを分解してＮ１−アセチルスペルミジンを生ずることが確かめられた。ヒト由来等のポリアミンオキシダーゼはジアセチルスペルミンに対する活性は高くはないものの、化１０に示した反応を触媒し、Ｎ１−アセチルスペルミジンと３−アセトアミドプロパナールを生成することが知られている（非特許文献６参照）。よって本酵素は、従来のポリアミンオキシダーゼの反応様式と同様に、２級アミンのＣ−Ｎ結合を酸化的に開裂することが示唆された。また、本酵素による反応は、前述した過酸化水素を測定する活性測定法で活性測定可能であることから、本酵素はオキシダーゼであると言える。
従って本酵素は、化１０に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を酸化的に開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成することが示された。
（ｂ）基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてジアセチルスペルミン、ジアセチルスペルミジン、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、スペルミン、スペルミジンを用いて、本発明酵素の活性を測定した。なお活性測定においては、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のそれぞれを用いて評価した。本発明酵素のジアセチルスペルミンに対する活性を１００％としたときのジアセチルスペルミジン、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、スペルミンおよびスペルミジンに対する活性を表３に示す。このように本酵素は、ジアセチルスペルミンに比較して、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン類に作用しにくいという（ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン）、新規かつ有用な基質特異性を有することがわかった。
（ｃ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行った。結果を図３に示す。本発明酵素は、ｐＨ７．５において最も高い活性を示した。また、ｐＨ６．５〜８．５でもｐＨ７．５付近における活性値の５０％以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．５〜８．５であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．５であると判断した。
（ｄ）安定ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、３０℃で３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定した。結果を図４に示す。最も高い残存活性を示したｐＨである、ｐＨ７．０付近での残存活性に対して７０％以上の活性を残存するｐＨ範囲はｐＨ６．０〜８．０であった。
以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ６．０〜８．０であると判断した。
（ｅ）至適温度
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図５に示す。最も高い活性を示した温度である、５０℃付近での活性に対して８０％以上の活性を示す温度範囲は、３７〜５５℃であった。以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、３７〜５５℃であると判断した。
（ｆ）熱安定性
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、各温度で３０分間処理した時の熱安定性の結果は、図６に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、３７℃付近まで安定であった。
（ｇ）分子量
先に述べた条件にて、ゲルろ過［ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）、ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（和光純薬工業社製）］を行い、本発明酵素の分子量を約９２，０００と推定した。
また、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ［ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）、タンパク質分子量マーカー「第一」Ｉ（第一化学薬品社製）］で分子量を求めた。本発明酵素の分子量は約１１０，０００であった。
さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）］で分子量を求めた。本発明酵素のサブユニットの分子量は約５５，０００であった。従って、本発明酵素は分子量が約５５，０００のサブユニットから構成される、分子量が約１１０，０００の２量体であると推定された。
（ｈ）ジアセチルスペルミンに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質であるジアセチルスペルミンの濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、ジアセチルスペルミンに対するＫｍ値は０．１０ｍＭ［０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）］であることが判かった。
【実施例４】
【００７４】
（本発明酵素を生産する酵母デバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８及び酵母デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）の生産する本発明酵素の製造及びその理化学的性質）
実施例２に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９からの本発明酵素の製造法と同様の方法で精製が可能であった。また得られた精製酵素の理化学的性質についても酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９由来の酵素とほぼ同一の性質を示した。
【実施例５】
【００７５】
（本発明酵素を生産する酵母キャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  BP−１０６０２）の生産する本発明酵素の製造及びその理化学的性質）
実施例２に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９からの本発明酵素の製造法と同様の方法で精製が可能であった。得られた本発明酵素の理化学的性質は、下記のとおりであった。
（ａ）作用
実施例３に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９が生産する本発明酵素と同様の方法で反応産物を特定した結果、本発明酵素もジアセチルスペルミンを分解してＮ１−アセチルスペルミジンを生ずることが確かめられた。また、過酸化水素を測定する活性測定法で活性測定が可能であったことから、化１０に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を酸化的に開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する反応様式であることが示された。
（ｂ）基質特異性
実施例３に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９が生産する本発明酵素と同様の方法を用いて基質特異性を評価した。０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）および０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における各種ポリアミンに対する活性を表３に示す。このように本酵素は、ジアセチルスペルミンに比較して、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン類に作用しにくいという（ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン）、新規かつ有用な基質特異性を有することがわかった。
（ｃ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行った。結果を図７に示す。本発明酵素は、ｐＨ８．０において最も高い活性を示した。また、ｐＨ７．０〜８．５でもｐＨ８．０付近における活性値の５０％以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．５であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ８．０であると判断した。
（ｄ）安定ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、夫々のｐＨにおいて、３０℃で３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定した。結果を図８に示す。最も高い残存活性を示したｐＨである、ｐＨ６．５〜８．０付近での残存活性に対して７０％以上の活性を残存するｐＨ範囲はｐＨ５．５〜９．５であった。
以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ５．５〜９．５であると判断した。
（ｅ）至適温度
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図９に示す。最も高い活性を示した温度である、５０℃付近での活性に対して８０％以上の活性を示す温度範囲は、４５〜５５℃であった。以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、４５〜５５℃であると判断した。
（ｆ）熱安定性
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、各温度で３０分間処理した時の熱安定性の結果は、図１０に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、３７℃付近まで安定であった。
（ｇ）分子量
先に述べた条件にて、ゲルろ過［ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）、ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（和光純薬工業社製）］を行い、本発明酵素の分子量を約９０，０００と推定した。
また、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ［ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）、タンパク質分子量マーカー「第一」Ｉ（第一化学薬品社製）］で分子量を求めた。本発明酵素の分子量は約１３０，０００であった。
さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）］で分子量を求めた。本発明酵素のサブユニットの分子量は約６５，０００であった。従って、本発明酵素は分子量が約６５，０００のサブユニットから構成される、分子量が約１３０，０００の２量体であると推定された。
（ｈ）ジアセチルスペルミンに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質であるジアセチルスペルミンの濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、ジアセチルスペルミンに対するＫｍ値は０．１１ｍＭ［０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）］であることが判かった。
【実施例６】
【００７６】
（本発明酵素を生産する酵母ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５の生産する本発明酵素の製造及びその理化学的性質）
ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５を１５０ｍＬ容三角フラスコに入れた培地（酵母エキス０．３％、トリプトン０．３％、グルコース０．６％、ジアセチルスペルミン０．５％、ジアセチルスペルミジン０．５％、ｐＨ６．０）５０ｍＬに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。これを種培養として、５Ｌ三角フラスコに入れた上記培地１Ｌに１０ｍｌずつ接種し、３０℃、９０ｒｐｍで３日間回転振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。酵素の精製は実施例２に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９からの本発明酵素の製造法と同様の方法で可能であった。得られた本発明酵素の理化学的性質は、下記のとおりであった。
（ａ）作用
実施例３に示した酵母ピキア  ミヌタ  ＩＡＭ  １２２１５が生産する本発明酵素と同様の方法で反応産物を特定した結果、本発明酵素もジアセチルスペルミンを分解してＮ１−アセチルスペルミジンを生ずることが確かめられた。また、過酸化水素を測定する活性測定法で活性測定が可能であったことから、化１０に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を酸化的に開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する反応様式であることが示唆された。
（ｂ）基質特異性
実施例３に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９が生産する本発明酵素と同様の方法を用いて基質特異性を評価した。０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）および０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における各種ポリアミンに対する活性を表３に示す。０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の条件下では、ジアセチルスペルミン比較して、Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジンについてより高い反応性が認められ、新規な基質特異性は見出すことはできなかったものの、０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）条件下において本酵素は、ジアセチルスペルミンに比較して、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン類に作用しにくいという（ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン）、新規かつ有用な基質特異性を有することがわかった。
【実施例７】
【００７７】
（酵母デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび大腸菌における組換え発現）
（１）デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素のアミノ酸配列の分析
実施例４にて得られたデバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素を、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で、３７℃にて一晩、エンドプロテイナーゼ  Ａｓｐ−Ｎ（宝酒造社製）処理し、断片化した。上記断片を、Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８  ＳＧ３００（資生堂社製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分取した。３種の断片ペプチドについてアミノ酸配列を、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９２ プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、エドマン法により分析した。結果として、以下の３つの内部アミノ酸配列情報を得た。
（１）ＤＸＥＫＰＬＥＩＮＱＡＫＬＨＲＶＡＥＤＩＥＫＦＩＥＬＹＦＦＥＥ（配列番号３）
（２）ＤＬＩＴＱＬＳＧＥＨＧＣＧＬＳＥＫＮＩＲＦＡＧ（配列番号４）
（３）ＤＱＶＰＮＮＳＸＬＳＡＰＬＫＧＰ（配列番号５）
（Ｘは未同定）
（２）デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素をコードする遺伝子の部分断片の取得１
デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）を培地（酵母エキス０．３％、トリプトン０．３％、グルコース０．６％、ｐＨ６．０）３ｍＬに接種し、３０℃、１４０ｒｐｍで３日間往復振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。この菌体よりＧｅｎとるくん・酵母用（宝酒造社製）を用いて、染色体ＤＮＡを得た。
次いで、実施例項目（１）で得られたアミノ酸配列を基に、コドンが縮重している箇所を混合塩基とした複数個のＰＣＲ用プライマーを作製した。染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲマスターサイクラーグラジエント（エッペンドルフ社製）にて、熱変性９４℃，２分、アニール５８℃，３０秒、伸長反応７２℃，２分の条件下、３０サイクル行った。結果としてセンスプライマーが５’−ＧＡＲＡＡＲＣＣＮＹＴＮＧＡＲＡＴＤＡＡＹＣＡＲＧＣＮＡＡ−３’（配列番号６）（２９ ｍｅｒ，Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｒはアデニン又はグアニン、Ｎはアデニン、シトシン、グアニン又はチミン、Ｙはシトシン又はチミン、Ｄはアデニン、グアニン又はチミンを示す。）、アンチセンスプライマーが５’−ＡＴＲＴＴＹＴＴＹＴＣＮＳＷＮＡＲＮＣＣＲＣＡＮＣＣＲＴＧＹＴＣ−３’（配列番号７）（３２ｍｅｒ，Ｓはシトシン又はグアニン、Ｗはアデニン又はチミンを示す。）であるとき、１．０ｋｂｐ程度に相当する遺伝子断片が増幅された。
増幅したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。その結果、ＤＮＡ断片（１０２０ｂｐ）が、ＰＣＲのプライマー設計に用いたペプチドのアミノ酸配列を正しくコードする塩基配列を両端に有していた。また、決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配列中には、プロテインシークエンサーで決定した内部アミノ酸配列が存在した。従って、得られた増幅ＤＮＡ断片は、本発明酵素をコードする遺伝子の一部分（部分遺伝子）であることが判明した。
（３）デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）染色体ＤＮＡのサザンブロット解析
次いで、実施例項目（２）で調製した染色体ＤＮＡ２μｇを、各種制限酵素を用い、３７℃で５時間消化した。得られた制限酵素消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、サザンブロット法により、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にＤＮＡを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例項目（２）で得られたプラスミド遺伝子を鋳型とし、Ｍ１３プライマーを用いて、ＰＣＲ Ｄｉｇ ラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）存在下でＰＣＲ増幅させたものを使用した。ＰＣＲの反応条件等は、上記実施例項目（２）と同様に行った。
上記のナイロン膜を２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）で洗浄後、ＤＩＧシステムを用い、ユーザーガイド（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションを行った後のナイロン膜の洗浄は、０．１％ ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ（１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）で室温にて５分間、２回ののち、０．１％ ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣで６８℃にて１５分間、２回行った。その結果、ＢａｍＨＩの消化産物で約３．６ｋｂｐの位置にハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルが認められた。
（４）デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素をコードする遺伝子の部分断片の取得２
上記の結果に基づき、ＢａｍＨＩ消化した染色体ＤＮＡ１０μｇを１．０％アガロースゲル電気泳動で分離し、約３．６ｋｂｐの大きさに相当する位置のアガロースゲルを切り出し、ＤＮＡ断片を抽出した。該ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてセルフライゲーションさせた。上記のライゲーション産物を鋳型とし、次のとおり常法に従いインバースＰＣＲを行った。実施例項目（２）で決定した部分遺伝子配列をもとに、ＰＣＲ用プライマーとして５’−ＡＴＡＡＧＣＡＴＧＴＡＴＣＣＧＡＣＣＣＡＡＴＣＡＡ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号８）及び５’−ＡＴＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＴ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号９）を作製した。Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、熱変性９４℃，２分、アニール６２℃，３０秒、伸長反応７２℃，４分の条件下、３０サイクルのＰＣＲを行った。結果として約２．８ｋｂｐの増幅ＤＮＡを得ることができた。
本ＰＣＲ産物を鋳型とし、センスプライマー  ５’−ＣＣＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＡＴＣＡＣＣＣＡＡＴＴＧＴ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号１０）、アンチセンスプライマー  ５’−ＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号１１）を用いて、さらに同条件にてＰＣＲを行った。結果として約２．６ｋｂｐの増幅ＤＮＡを得ることができた。
増幅したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した結果、推定されるアミノ酸配列中には、プロテインシークエンサーで決定した内部アミノ酸配列が存在した。従って、得られた増幅ＤＮＡ断片は、本発明酵素をコードする遺伝子の一部分（部分遺伝子）であることが判明した。また、推定されたアミノ酸配列の上流側には終止コドンの２アミノ酸の後にメチオニンが存在していたことから、このメチオニンをコードするＡＴＧが本発明酵素をコードする遺伝子の５’末端であると推定された。さらに３’末端側に終止コドンであるＴＡＡが含まれていることがわかった。
（５）デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素をコードする全長遺伝子のクローニング
先ず、上記の操作で得られた塩基配列に基づき、本酵素遺伝子の５’末端あるいは３’末端を含むオリゴヌクレオチド（計３０塩基のオリゴヌクレオチド、３’末端側は相補鎖）を設計した。このプライマー中にＮｄｅＩ部位を組み込んでおき、ＰＣＲで増幅した産物を、ＮｄｅＩを作用させて消化することにより、コーディング領域が得られるようにしておいた。すなわち、５’−ＴＡＣＣＡＧＴＡＧＴＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＴＴ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号１２）、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＡＴＡＴ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号１３）を合成した。実施例項目（２）で調製した染色体遺伝子を鋳型とし、合成プライマー及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、熱変性９４℃，１５秒、アニール５０℃，３０秒、伸長反応６８℃，２分の条件下、３０サイクルのＰＣＲを行った。結果として増幅ＤＮＡ（約１．５ｋｂｐ）が得られ、これをＮｄｅＩで消化して、本発明酵素をコードする領域のＤＮＡを得ることができた。
得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ， ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０を参照）を保有するｐＵＣ系ベクターｐＵＴＥ３００Ｋ’（特開２００５−６５５８３号公報記載）のＮｄｅＩ部位に挿入し、組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ３００を得た。Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，ｐ．３２６−３３１，１９７９）に従い、組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ３００を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ３００）を得た。菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組み換え体プラスミドｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ３００を抽出して精製し、組み換え体プラスミドを１００μｇ得た。
該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。染色体ＤＮＡを鋳型とした複数ロットのＰＣＲを行うことにより、ｅｒｒｏｒが入っていないことを確認した。決定した本発明酵素遺伝子の塩基配列を配列番号２に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に夫々示した。ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ３００に挿入されている本発明酵素遺伝子のＯＲＦは、１４６１ｂｐ、４８７アミノ酸からなっていることが判明した。
（６）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いる、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素をコードする遺伝子のクローニング
デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）を培地（酵母エキス０．３％、トリプトン０．３％、グルコース０．６％、ｐＨ６．０）３ｍＬに接種し、３０℃、１４０ｒｐｍで２日間往復振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。この菌体よりＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（エアブラウン社製）を用いて、ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡから、さらにＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて精製ｍＲＮＡを得た。これを鋳型とし、実施例項目（５）記載のプライマー及びＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた増幅ＤＮＡ（約１．５ｋｂｐ）の塩基配列を解析した結果、実施例項目（５）で得られた塩基配列（配列番号２）と完全に一致した。よって、実施例項目（５）で得られた塩基配列中にはイントロンは含まれていないことがわかった。
（７）デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来の本発明酵素を生産する組換え菌の取得
本発明酵素遺伝子には２箇所のＥｃｏＲＶ部位が存在していたため、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる部位特異的変異によりこれらを消去した。用いたプライマーの組合わせは、１箇所目の消去では５’−ＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＡ−３’（２５ ｍｅｒ）（配列番号１４）と５’−ＴＧＣＧＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＴＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡ−３’（２５ ｍｅｒ）（配列番号１５）であり、２箇所目の消去では５’−ＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＧＴ−３’（２５ ｍｅｒ）（配列番号１６）と５’−ＡＣＣＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴ−３’（２５ ｍｅｒ）（配列番号１７）であった。
次にＥｃｏＲＶ部位を組み込んだセンスプライマー  ５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＡＣＣＡ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号１８）およびアンチセンスプライマー  ５’−ＴＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＴＡＴ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号１９）を合成した。２箇所のＥｃｏＲＶ部位が消去されたプラスミドｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ３００’を鋳型とし、上記プライマーおよびＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、熱変性９４℃，２分、アニール５０℃，３０秒、伸長反応７２℃，２分の条件下、３０サイクルのＰＣＲを行った。結果として増幅ＤＮＡ（約１．５ｋｂｐ）が得られ、これをＥｃｏＲＶで消化して、本発明酵素をコードする領域のＤＮＡを得ることができた。本遺伝子には２箇所のＥｃｏＲＶ部位が消去された以外のｅｒｒｏｒが入っていないことを確認した。
ｌａｃ（ラクトースオペロン）とｔｒｐ（トリプトファンオペロン）を融合したｔａｃプロモーターを保有するｐＢＲ系ベクターｐＵＴＥ１２０Ｋ’のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ１２０を得た。組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ１２０を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ１２０）を得た。
得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ１２０）を、ＬＢ−ＩＰＴＧ−ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ），酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）,  ＮａＣｌ  ０．５％（Ｗ／Ｖ），イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（１ｍＭ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕にて２０℃で１０時間振とう培養した後、酵素活性を測定したところ、０．２Ｕ／ｍｌであった。
（８）組換え本発明酵素の製造法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ｐＤＡＳｐｍＯＸ−Ｄ１２０）を実施例項目（７）の方法にて５ｌの培地で培養し、本発明酵素を生産させた。本培養液から、実施例２に記載の方法により、精製された本発明酵素を得た。
【実施例８】
【００７８】
（デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９及びデバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８由来の本発明酵素をコードする遺伝子のクローニング）
実施例７  項目（２）記載の方法にて、染色体遺伝子をそれぞれ調製した。次いで、実施例７  項目（４）で得られた構造遺伝子の開始コドンより上流および終止コドンより下流の塩基配列情報から、５’−ＴＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＡ−３’（２３ｍｅｒ）（配列番号２０）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＣＡ−３’（２５ｍｅｒ）（配列番号２１）のプライマーを作製した。染色体遺伝子を鋳型とし、上記プライマーおよびＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、熱変性９４℃，２分、アニール５０℃，３０秒、伸長反応７２℃，２分の条件下、３０サイクルのＰＣＲをそれぞれ行った結果、ともに増幅ＤＮＡ（約１．５ｋｂｐ）が得られた。塩基配列を解析した結果、ともに実施例７  項目（５）で得られた塩基配列（配列番号２）と完全に一致した。
【実施例９】
【００７９】
（キャンディダ  ボイディニイ  ＮＢＲＣ  １０５７４由来のポリアミンオキシダーゼをコードする遺伝子のクローニング、組換え酵素の製造及び基質特異性の評価）
非特許文献２０によれば、キャンディダ  ボイディニイ  ＮＢＲＣ  １０５７４が生産するポリアミンオキシダーゼはＮ１−アセチルスペルミジンに高い反応性を示すことが知られていたが、ジアセチル体を含むその他の各種ポリアミンに対する基質特異性についての詳細は知られていない。そこで本酵素の基質特異性を調べるために下記のとおりに精製酵素を作製した。まず実施例７  項目（２）記載の方法にて、染色体遺伝子を調製した。次いで既知の遺伝子配列情報から、ＥｃｏＲＶ部位を組み込んだプライマーである５’−ＡＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＡ−３’（３０ｍｅｒ）（配列番号２２）及び５’−ＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＧＡ−３’（３０ｍｅｒ）（配列番号２３）を設計した。染色体遺伝子を鋳型とし、上記プライマーおよびＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、熱変性９４℃，２分、アニール５０℃，３０秒、伸長反応７２℃，２分の条件下、３０サイクルのＰＣＲをそれぞれ行った結果、ともに増幅ＤＮＡ（約１．５ｋｂｐ）が得られた。これをＥｃｏＲＶで消化し、実施例７  項目（７）記載のｐＵＴＥ１２０Ｋ’のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＰＡＯＸ−ＣＢ１２０を得た。これを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＰＡＯＸ−ＣＢ１２０）を得た。該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した結果、非特許文献２０に記載の塩基配列と完全に一致し、ｅｒｒｏｒが入っていないことを確認した。
得られた組換え大腸菌を実施例７  項目（８）に記載の方法で２５℃にて培養し、酵素を精製した。得られた比較対照用の精製酵素について、実施例３に示した酵母デバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９が生産する本発明酵素と同様の方法を用いて基質特異性を評価した。０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）および０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における各種ポリアミンに対する活性を表３に示す。非特許文献２０によれば、本ポリアミンオキシダーゼはＮ１−アセチルスペルミジンオキシダーゼとされているが、ジアセチルスペルミン、ジアセチルスペルミジンにも比較的高い反応性を示した。しかしながら、Ｎ１−アセチルスペルミジンやＮ１−アセチルスペルミンに対する反応性と比較すると低いものであったため、本ポリアミンオキシダーゼは、「Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジンよりもジアセチルポリアミンに良く作用する」という、本発明で見出された新規な基質特異性を有していないことが確認された。
【実施例１０】
【００８０】
（本発明酵素を用いるモノアセチルポリアミンの製造）
ジアセチルスペルミン・２塩酸塩１５０ｍｇを、実施例２にて調製した本発明酵素  ２Ｕ／ｍｌ及びカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）  ０．５Ｕ／ｍｌを含む６０ｍｌの反応液［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、基質濃度７ｍＭ］に溶解し、３０℃で１日間インキュベートし、ＴＬＣでＮ１−アセチルスペルミジンの生成を確認した（クロロホルム：メタノール：アンモニア水：水＝２：４：１：１、ニンヒドリン発色）。セントリプレップ１０（アミコン社製）を用いて水で透析し、酵素タンパクを除去した。透析外液を陽イオン交換樹脂［ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗ−Ｘ４（Ｈ＋）］カラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に通し、反応生成物を吸着させた。水で洗浄後、１Ｍ  アンモニアで溶出させた。溶出液を減圧濃縮した後、クロロホルム：メタノール＝１：１の溶媒に溶解させて、シリカゲルカラムカラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）に吸着させた。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール（１：１〜０：１）を用いて溶出させ、Ｎ１−アセチルスペルミジン溶出画分に塩酸を添加した後減圧濃縮し、７８ｍｇのＮ１−アセチルスペルミジン２塩酸塩を得た（収率７２％）。これをエタノールで再結晶し、４５ｍｇのＮ１−アセチルスペルミジン２塩酸塩を得た（収率４１％）。融点と１Ｈ,１３Ｃ−ＮＭＲの測定値は文献既知の値（非特許文献２３参照）と一致した。【００８１】
【表３】
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【００８２】
※  ＤＡＳｐｍ：ジアセチルスペルミン、ＤＡＳｐｄ：ジアセチルスペルミジン、Ｎ１−ＡｃＳｐｍ：Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−ＡｃＳｐｄ：Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−ＡｃＳｐｄ：Ｎ８−アセチルスペルミジン、Ｓｐｍ：スペルミン、Ｓｐｄ：スペルミジン
なお、いずれの酵素もプトレッシンには反応しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、ジアセチルポリアミンを測定する診断用酵素として測定用キットに容易に利用されると同時に、医薬品・農薬中間体として有用なモノアセチルポリアミンを温和な条件で収率よく製造することができ、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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