(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンを主成分とし、カルシウムイオン源を０．０５〜２ｍＭの濃度で含有することを特徴とする、常温保存条件下において溶液状態で保存され得る液状フィブリノゲン製剤。
【請求項２】
前記カルシウムイオン源を０．２〜１ｍＭの濃度で含有する請求項１記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項３】
フィブリノゲンを主成分とし、０．０５〜２ｍＭの濃度のカルシウムイオン源、およびグアニジノ基を有する物質を含有することを特徴とする、室温および常温保存条件下において溶液状態で保存され得る液状フィブリノゲン製剤。
【請求項４】
前記カルシウムイオン源を０．２〜１ｍＭの濃度で含有する請求項３記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項５】
前記グアニジノ基を有する物質がアルギニンおよびグアニジンより選択される請求項３記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項６】
前記グアニジノ基を有する物質を０．１〜２．０Ｍの濃度で含有する請求項３記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項７】
前記グアニジノ基を有する物質を０．１〜１．０Ｍの濃度で含有する請求項３記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項８】
付加的に血液凝固第ＸIII因子を含有する請求項１または請求項３記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項９】
付加的に線溶阻害剤を含有する請求項１または請求項３記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項１０】
トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることにより、ヒトおよび動物組織の生物学的接着剤を構成することを特徴とする請求項１から請求項９のいずれかに記載の液状フィブリノゲン製剤。
【請求項１１】
塗布用装置中にあらかじめ分注される請求項１から請求項１０のいずれかに記載の液状フィブリノゲン製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は２成分製剤として存在する組織接着剤の構成成分であるフィブリノゲン含有製剤に関する。より詳細には、溶液状態で室温または常温保存が可能な液状フィブリノゲン製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】
線維素原（フィブリノゲン）は、いわゆる凝固カスケードの最終段階に存在する非常に重要な凝固因子である。フィブリノゲンは、例えば損傷後の凝固系の活性化において、トロンビンによりその可溶性形態から止血および損傷治癒に重要な寄与をする不溶性のフィブリンに変換される。
【０００３】
フィブリノゲンは止血および創傷治癒に対して重要性を有し、例えば先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法で静脈投与製剤として臨床的に使用され、血液中のフィブリノゲン濃度を高めることによって重篤な出血を阻止する。さらに、近年、フィブリノゲンはトロンビンと混合させることにより、外科手術において肝臓または脾臓のような軟部器官の縫合代用の接着剤として、または縫合補助剤として使用されていると同時に、幅広い臨床の現場で応用されている。
【０００４】
日本国特許公報  昭和63-40546号の特許請求の範囲並びに発明の詳細な説明の記載により明らかにされているように、フィブリノゲンおよび血液凝固第ＸIII因子（第ＸIII因子）を含有する組織接着剤の製造方法が公知である。凍結乾燥されたフィブリノゲンもしくはフィブリノゲンを高い割合で含有する血漿蛋白質混合物の凍結乾燥物は、溶解液による再構成の際、高められた温度においてのみ徐々に再溶解することが知られている。
【０００５】
フィブリン接着剤としての接着作用を十分に得るためには、フィブリノゲンを高濃度に溶解させることが必要であり、凝固しうるフィブリノゲン濃度は高濃度であるほど有利である。ところが、このような高濃度フィブリノゲン溶液をフィブリノゲン凍結乾燥物から調製するには時間を要し、緊急使用に対応できない。さらに、フィブリノゲン凍結乾燥物の溶解操作に要した時間が長くなった場合は患者に悪影響を及ぼすことも危惧される。
【０００６】
また、日本国特許公報  昭和63-40547号には上述の組成のフィブリノゲン溶液を低温氷結して安定性を高めようとする技術が開示されている。さらに高濃度のフィブリノゲンを含有する製剤を供するために、フィブリノゲンの溶解性を上昇させる溶媒に着目し、種々のフィブリノゲン溶解促進剤を添加した６〜１０％（ｗ／ｖ）のフィブリノゲン溶液を調製し、凍結状態で保存し、用時に融解して使用する技術が開発されている（日本国公開特許公報  昭和57-149229号）。上述の凍結製剤は凍結乾燥製剤に比較して使用上の利便性が向上したが、用時融解に際して時間を要する点、さらに、凍結状態で保存するための設備を必要とする点等、なお問題を含むものであった。
【０００７】
そこで、日本国公開特許公報  平成7-173073号には、組織接着剤の構成成分として、また、さらには静脈投与を想定したフィブリノゲン濃厚物として、緊急使用に対応できるように、凍結を避けた低温保存条件下において、溶液状態で安定に保存されうるフィブリノゲンを主成分とする製剤を調製する技術が開示されている。しかしながら、液状保存製剤は使用上の利便性が向上したとはいえ、用時に室温に戻す時間を要する点、さらに、低温で保存するための設備を必要とする点等、改善の余地を残していた。
【０００８】
このような状況下、本発明の課題は、室温または常温保存条件下において、溶液状態で安定に保存されうるフィブリノゲンを主成分とする製剤を調製することである。なお、室温および常温は、日本薬局方通則において、室温は１〜３０℃、常温は１５〜２５℃と定義されている。
【０００９】
上記課題において問題となるのは、フィブリノゲンは溶液状態での保存により経時的に分解が進行し、分解の程度が保存温度に依存する点である。各保存温度条件下におけるフィブリノゲンの分解の程度を、フィブリノゲン分解の指標となる凝固性蛋白質純度の変動により評価した結果を表１及び図１に示す。その結果、15℃以下の低温保存では、フィブリノゲン分解の程度を表す凝固性蛋白質の純度はほとんど変化しないが、25℃以上の保存では凝固性蛋白質の純度が経時的に低下し、その程度は保存温度が高温であるほど顕著である。このことから、フィブリノゲン溶液を、室温の温度幅（１〜３０℃）のうち、特に常温以上の高温域（１５℃以上）において長期に保存する場合、フィブリノゲンの分解を抑制することが重要な課題となる。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで、本願発明者等は上述の問題に鑑み鋭意検討した結果、フィブリノゲン溶液に微量のカルシウムイオン源を共存させると、室温の高温域（１５℃以上）での保存において、カルシウムイオン存在によるゲル化を生じることなくフィブリノゲンの分解を抑制させうる知見を得、塗布用装置中にあらかじめ無菌的にフィブリノゲン溶液を分注し保存することにより、常温以上の室温高温域（１５〜３０℃）保存において溶液状態で安定に、しかも簡便性を伴って保存されうるフィブリノゲンを調製することを可能にした。さらに、フィブリノゲン溶液は低温環境下ではゲル化が進行しやすいことから、上記のカルシウムイオン源添加フィブリノゲン溶液に、ゲル化抑制作用をもつグアニジノ基を有する物質を共存させた結果、カルシウムイオン源のフィブリノゲン安定化効果を有意に減じることなくゲル化を抑制させうる知見を得、常温未満の室温低温域（１〜１５℃）においても、フィブリノゲン溶液を安定に保存させうることを発見した。以上のことから、フィブリノゲン溶液に至適濃度のカルシウムイオン源を添加することにより常温で安定に保存されうる液状フィブリノゲン製剤を、さらに好ましくはゲル化抑制作用をもつ物質を至適濃度で共存させることにより低温条件をも含む室温という広範囲な温度域の環境下で安定に保存されうる液状フィブリノゲン製剤を提供する本発明を完成した。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
【発明の構成】
本発明の溶液状態で安定に保存されるフィブリノゲン製剤は、好適な緩衝液、例えばクエン酸緩衝液（具体例として、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０４Ｍクエン酸緩衝液）中の５％（ｗ／ｖ）以上の濃度のフィブリノゲン溶液にカルシウムイオン源を含有することを大きな特徴とする。カルシウムイオン源としては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、リン酸二水素カルシウム、硫酸カルシウム等が例として挙げられ、とりわけ塩化カルシウムは好適である。カルシウムイオン源の添加量は０．０５〜２ｍＭの濃度幅で選択され、特に０．２〜１ｍＭでの添加が好ましい。カルシウムイオン源によるフィブリノゲン分解抑制の作用機序は、カルシウムイオンがわずかなγ鎖の架橋形成もしくは構造変化を引き起こし、フィブリノゲン分子がプロテアーゼの攻撃に対して構造的に抵抗性を獲得するためと推定される。なお、フィブリノゲン溶液にカルシウムイオンが一定濃度以上存在するとゲル化することが既知であるが、上記の低濃度カルシウムイオン源を含有するフィブリノゲン溶液は、室温の高温域である常温以上（１５〜３０℃）での保存においてゲル化や粘性が上昇することなく、高温保存に伴う分解が抑制される。
【００１３】
また、上記フィブリノゲン溶液は低温環境下ではゲル化が進行するが、低温保存時のゲル化抑制剤としてグアニジノ基を有する物質の効果が公表されており（日本国公開特許公報  平成7-173073号）、これを室温の低温域（１〜１５℃）での保存に伴うゲル化を回避する目的で添加されうる。ここでいうグアニジノ基を有する物質とは特に限定されるものではないが、とりわけ、アルギニン、グアニジン等が好ましい態様であり、これらは単独あるいは組み合わせて添加することができる。添加量は０．１〜２．０Ｍの濃度が好ましく、０．１〜１．０Ｍの濃度での添加は最適な態様である。
【００１４】
なお、本発明に係る製剤の主成分であるフィブリノゲンは公知の方法で調製される。そのようなものとして、例えば冷エタノール沈澱法にグリシンによるフィブリノゲンの溶解度低下効果を組み合わせた方法（Blomback,B. and Blomback,M., Arkiv Kemi,10,p.415〜443,(1956)）およびグリシンを単独で使用するグリシン沈澱法（Kazal,L.A., et al., Proc.Soc.Exp.Med.,113,p.989〜994,(1963)）等が報告されている。
【００１５】
本発明のフィブリノゲン製剤は、さらにフィブリンゲル−マトリックス内の架橋形成および線溶阻害の目的で、付加的に血液凝固第ＸIII因子および線溶阻害剤を含有することができる。線溶阻害剤は特に限定されるものではないが、アプロチニン、α2プラスミンインヒビター、トラネキサム酸、εアミノカプロン酸等が好ましい。本発明に係る添加剤並びに付加的な添加剤の添加工程の順序については、最終製剤中に上記諸添加剤が所定の濃度で含有されるものであれば特別な制約はないが、例えば、夾雑ウイルス不活化のための凍結乾燥加熱処理を行った後、再溶解後の最終調製時に添加されるのが好ましい。
【００１６】
上記溶液組成において、フィブリノゲン溶液は室温保存条件下において溶液状態で安定に保存されうる。室温は１〜３０℃と定義され、季節や地域によりこの範囲内で変動するが、一般には常温（１５〜２５℃）付近である。
【００１７】
さらに、この液状フィブリノゲン製剤は注射器等の塗布用装置中にあらかじめ分注され使用することもできる。本発明のフィブリノゲン溶液を無菌濾過後、滅菌済みの注射器に分注し、先端をキャップしておくことにより臨床使用時に製剤を他の容器に移し換えることなく、直接使用することができる。この際の注射器はその利便性の観点からポリプロピレン等の合成樹脂性のものが好適に使用されうる。
【００１８】
また、本発明の上記液状フィブリノゲン製剤は、単独で使用されるのみならず、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることにより、ヒトおよび動物組織の生物学的接着剤を構成し、幅広い臨床の現場で応用される。
【００１９】
以下に、試験例並びに実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
試験例１
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０４Ｍクエン酸緩衝液に、８％（ｗ／ｖ）濃度で溶解されたフィブリノゲン溶液に対し、各種濃度の塩化カルシウムが添加され、３０℃の温度で経時的に安定性が試験された。安定性は、６カ月後までの３点の保存期間における目視による状態判定、濁度、凝固性蛋白質純度、および動粘度（２０℃での測定）を保存前の値と比較することによって評価された。凝固性蛋白質純度は、厚生省告示“生物学的製剤基準”収載の、乾燥人フィブリノゲン小分製品の試験である凝固性蛋白質含量及び純度試験に従って測定した。
【００２１】
その結果は表２（フィブリノゲン溶液を30℃保存した際の経時的性状変化）、表３および図２（フィブリノゲン溶液を30℃保存した際の凝固性蛋白質純度の経時的測定値）、表４および図３（フィブリノゲン溶液を30℃保存した際の動粘度の経時的測定値）のとおりである。３０℃での保存により、経時的に凝固性蛋白質純度が低下したが、塩化カルシウムの添加は濃度依存的にこの経時変化を抑制する効果を示し、フィブリノゲンの保存安定性に有効であることが判明した。目視での性状については、１ｍＭおよび２ｍＭ塩化カルシウム添加検体が経時的にゲル化が進行したが、それ以外の検体はいずれも経時的変化および塩化カルシウム添加濃度による差を認めなかった。しかし、動粘度測定値は０．５ｍＭ塩化カルシウム添加検体で経時的に上昇し、この検体では保存温度（３０℃）から動粘度測定条件（２０℃）に温度を低下させる際に粘性が上昇したことから、ゲル化に至らない塩化カルシウム添加上限濃度は保存温度に依存し、より低温保存ではより低濃度の塩化カルシウム添加検体もゲル化することが示唆された。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
【表３】
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【００２４】
【表４】
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【００２５】
試験例２
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０４Ｍクエン酸緩衝液に、８％（ｗ／ｖ）濃度で溶解されたフィブリノゲン溶液に対し、各種濃度の塩化カルシウムが添加され、１０℃の温度で経時的に安定性が試験された。安定性は、保存した検体の目視による状態判定によって評価された。
【００２６】
その結果は表５（フィブリノゲン溶液を１０℃保存した際の経時的性状変化）のとおりである。フィブリノゲン溶液は１０℃での保存によりゲル化し、塩化カルシウム添加は濃度依存的にゲル化の進行を促進した。また、ゲル化した検体を３７℃前後の温度で加温して溶液状態に復帰させるのに要する時間が、塩化カルシウム添加濃度依存的に延長したことから、塩化カルシウムがゲル化を増強することを確認した。
【００２７】
【表５】
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【００２８】
試験例３
試験例１および２において、塩化カルシウム添加によりゲル化が増強されることが示唆された結果を受け、ゲル化抑制作用をもつ物質の一態様であるアルギニンの添加効果について検討するため、以下の試験を実施した。０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０４Ｍクエン酸緩衝液に、８％（ｗ／ｖ）濃度で溶解されたフィブリノゲン溶液に対し、各種濃度の塩化カルシウムおよびアルギニンが添加され、１０℃および３０℃の温度で経時的に安定性が試験された。安定性は、１０℃保存検体については４週間後までの２点、３０℃保存検体については６カ月後までの３点の保存期間における目視による状態判定、凝固性蛋白質純度、および動粘度（２０℃での測定）を保存前の値と比較することによって評価された。
【００２９】
その結果は表６（フィブリノゲン溶液を１０℃保存した際の経時的性状変化）、表７（フィブリノゲン溶液を１０℃保存した際の凝固性蛋白質純度の経時的測定値）、表８（フィブリノゲン溶液を１０℃保存した際の動粘度の経時的測定値）、並びに、表９（フィブリノゲン溶液を３０℃保存した際の経時的性状変化）、表１０（フィブリノゲン溶液を３０℃保存した際の凝固性蛋白質純度の経時的測定値）、表１１（フィブリノゲン溶液を３０℃保存した際の動粘度の経時的測定値）のとおりである。
【００３０】
１０℃での保存では、いずれの塩化カルシウムおよびアルギニン濃度の検体も凝固性蛋白質純度の低下はなく、安定に保存できることが確認された。保存に伴うゲル化や動粘度の上昇は、１ｍＭ以下の塩化カルシウム存在下では、０．３Ｍ以上のアルギニンを添加することにより抑制できることが判明した。また、３０℃保存では、０．５ｍＭ以上の塩化カルシウムを添加することにより保存による凝固性蛋白質純度の低下を有効に阻止でき、これら検体中に０．３Ｍ以下の濃度のアルギニンが共存しても、この安定化効果に影響を及ぼさないことが確認された。各検体の動粘度の上昇は塩化カルシウム添加濃度依存性を示したが、１ｍＭ以下の塩化カルシウム添加に対しては０．３Ｍ程度のアルギニンの添加で回避できることが示唆された。
【００３１】
【表６】
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【００３２】
【表７】
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【００３３】
【表８】
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【００３４】
【表９】
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【００３５】
【表１０】
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【００３６】
【表１１】
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【００３７】
試験例４
試験例３において、塩化カルシウムおよびアルギニンの適当な組み合わせが広い温度範囲の条件下での液状フィブリノゲンの安定化に有効に作用することが示唆された結果を受け、塩化カルシウムとアルギニンの組み合わせに関し、室温最下限である１℃での安定性について検討した。０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の０．０４Ｍクエン酸緩衝液に、８％（ｗ／ｖ）濃度で溶解されたフィブリノゲン溶液に対し、０．５ｍＭの塩化カルシウムおよび０．３Ｍのアルギニンが添加され、１℃の温度で経時的に安定性が試験された。安定性は１カ月まで保存した検体の目視による状態判定、凝固性蛋白質純度、および動粘度（２０℃での測定）を保存前の値と比較することによって評価された。
【００３８】
その結果は表１２（フィブリノゲン溶液を１℃保存した際の経時的変化）のとおりである。性状、凝固性蛋白質純度ならびに動粘度のいずれについても保存前後での有意な変動はなく、安定に保存できることが確認された。
【００３９】
【表１２】
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【００４０】
実施例１
クエン酸塩血漿から得られた寒冷沈殿物を可溶化し、１．５Ｍグリシン溶液を用いて沈殿させたフィブリノゲン沈殿を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の０．０２５Ｍクエン酸緩衝液に３７℃で溶解させた。このフィブリノゲン溶液を−２℃に冷却した後、８％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し沈殿を回収した。得られた沈殿を０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、０．３Ｍアルギニンおよび１０００ＫＩＥ／ｍｌアプロチニンを含むｐＨ７．０の０．０４Ｍクエン酸緩衝液に３７℃で溶解させた。溶解しなかった部分は遠心分離して除去した。フィブリノゲン濃度を約８％（ｗ／ｖ）に調整した後、無菌濾過し、容器に分注した。
【００４１】
実施例２
クエン酸塩血漿から得られた寒冷沈殿物を可溶化し、１．５Ｍグリシン溶液を用いて沈殿させたフィブリノゲン沈殿を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の０．０２５Ｍクエン酸緩衝液に３７℃で溶解させた。このフィブリノゲン溶液を−２℃に冷却した後、８％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し沈殿を回収した。得られた沈殿を０．０７５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の１０ｍＭクエン酸緩衝液に３７℃で溶解させた。フィブリノゲン濃度を約２％（ｗ／ｖ）に調整した後、フィブリノゲン溶液１ｍｌあたり２５単位の第ＸIII因子が添加された。この溶液を無菌濾過し、凍結乾燥およびそれに続く乾燥加熱処理を行った後、得られた凍結乾燥粉末を０．５ｍＭ塩化カルシウム、０．３Ｍアルギニンおよび１０００ＫＩＥ／ｍｌアプロチニンを含むｐＨ７．０の溶液でフィブリノゲン濃度約８％（ｗ／ｖ）となるように可溶化した。この溶液を無菌濾過し、滅菌済みのポリプロピレン製５ｍｌ容注射器に３ｍｌ分注し、先端にキャップをつけ、注射器入りの液状フィブリノゲン製剤を得た。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の利点は、フィブリノゲンの溶解操作や注射器等への移し換えを要さない液状フィブリノゲン製剤の室温保存を可能とし、緊急時の使用における利便性を向上させることに加え、製剤を保存するための特別な設備を不要とすることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  フィブリノゲン溶液の各温度下（４℃、１５℃、２５℃、３０℃、３７℃）における保存に伴う凝固性蛋白質純度の経時的変化を示す図。
【図２】  各濃度の塩化カルシウム添加フィブリノゲン溶液を３０℃保存した際の凝固性蛋白質純度の経時的変化を示す図。
【図３】  各濃度の塩化カルシウム添加フィブリノゲン溶液を３０℃保存した際の動粘度（測定温度：２０℃）の経時的変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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