(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１
【化１】
0004695846.tif 000003
［式中、Ｒは-Ｈ又は１〜２価のカチオンを表す。］で表される構造を分子内ユニットとして含有するコンドロイチン硫酸を有効成分として含有するα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸が魚類軟骨に由来する請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項３】
コンドロイチン硫酸がサケ類またはマス類の魚類軟骨に由来する請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、食品、健康食品、特定保健用食品などとして使用することができるα−グルコシダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食事で摂取された糖質は糖質分解酵素により単糖まで分解されてから小腸より吸収される。例えば、ショ糖の場合には小腸までは分解されずに到達し、小腸上皮膜細胞に存在するα−グルコシダーゼによってグルコースとフルクトースに分解される。また、多糖ではアミラーゼによってマルトース、イソマルトースまで消化された後、小腸上皮で同様に単糖単位まで分解される。その後、分解された単糖は小腸壁より体内に吸収され、血糖値が上昇する。糖尿病の治療には食後の過血糖を予防し、血糖値を適正な範囲に保つ目的で、α−グルコシダーゼ阻害剤が医薬品（アカルボーズ、ボグリボーズ等）として利用されているが、糖尿病予備軍の域に位置する被験者を対象とした試験でも、アカルボーズの摂取が糖尿病発症リスクを軽減する効果があることが見出されている(非特許文献１)。すなわち、食後血糖値のコントロールが糖尿病予防策としても有効であることが示されている。食品由来の糖分解酵素阻害剤を摂取できれば、医療行為を必要としないレベルの人でも糖尿病発症リスクを低減できると考えられる。
食品に由来するα−グルコシダーゼ阻害剤には緑茶(非特許文献２)、杜仲茶(非特許文献３)、ネギ(非特許文献４)、イワシ筋肉分解物(非特許文献５)、トウチ(特許文献１)などから報告されている。しかし、これらの中には有効に機能するために食品として摂取するには非常に大量な摂取が必要であったり、有効成分を濃縮、精製するのが煩雑なものも含まれる。また、様々な応用形態を考慮すると素材としての選択の幅は広いほうが好ましいといえる。
【０００３】
食後の血糖値上昇を抑制するためには上記のように消化管内で糖質の分解を押える以外に生成したグルコースの腸管吸収そのものを阻害することも有効であるが、食品で利用されているものとして難消化性デキストリンが広く利用されている。しかし、阻害のメカニズムは良くわかっておらず、比較的多量の摂取が必要である。
【０００４】
コンドロイチン硫酸は軟骨組織等に含まれるプロテオグリカンを構成する主成分の一つで、古くから医療、化粧品、健康食品などの分野で利用され、関節炎の治療、スキンケアなどを初めとする様々な効果が知られているムコ多糖である。グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンが交互にβ−グリコシド結合で連なった多糖はコンドロイチンと呼ばれ、この繰り返し構造の２糖単位において１〜２個の硫酸基を持つものがコンドロイチン硫酸と呼ばれる。硫酸基の置換位置には数種のバラエティが知られ、Ｎ−アセチルガラクトサミンの４位水酸基が修飾されたもの（Ａユニット）、同じく６位が修飾されたもの（Ｃユニット）、４位及び６位の２カ所が修飾されたもの（Ｅユニット）、グルクロン酸の２位及びＮ−アセチルガラクトサミンの６位が修飾されたもの（Ｄユニット）などが存在する。このうちほぼＡユニットから構成されるものはコンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン４−硫酸）と呼ばれ牛や馬の鼻軟骨やクジラの鼻軟骨に含まれる。一般的に利用されているコンドロイチン硫酸はサメ由来のものが主流であるが、これはほぼＣユニットから構成されるものでコンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン６−硫酸）と呼ばれる。一方、Ｄ及びＥユニットを含むものはやや特殊でユニット当たりの置換数が多いことからこれらを含むコンドロイチン硫酸はユニット当たりの平均電荷数が１を越えるためコンドロイチンポリ硫酸などとも呼ばれる。ただし、これらはコンドロイチン硫酸Ａ及びＣなどとは異なり、試薬で入手できるものでもコンドロイチン硫酸ＥでＥユニットを６０％程度含み、コンドロイチン硫酸Ｄでは約２０％強のＤユニット含有量である。Ｄユニットを含むコンドロイチン硫酸は例えばコンドロイチン硫酸Ｄ（試薬:サメ軟骨由来）の他、エイの軟骨やニジマス、大西洋サケなどの鼻軟骨にも含まれている。武田らはラット空腸粘膜細胞を用いた実験より、コンドロイチン硫酸がグルコースの吸収を抑制することを報告しているが、この場合にはコンドロイチン硫酸の構造による活性の根本的な違いはなく、ショ糖ではなくグルコースの吸収を抑制していると報告していることから上述の難消化性デキストリンと同様な効果を示したものと考えられる(非特許文献６)。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−７２６８７号
【非特許文献１】Chiasson,J. L., et al. Lancet, 359, 2072-2077(2002)
【非特許文献２】Honda, M., Hara, Y. Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 123-124(1993)
【非特許文献３】Watanabe, J., Kawabata, J., Kurihara, H., Niki, R. Biosci.Biotechnol. Biochem., 61, 177-178(1997)
【非特許文献４】Nishioka, T., Watanabe, J., Kawabata, J., Niki, R. Biosci.Biotechnol. Biochem., 61, 1138-1141(1997)
【非特許文献５】Matsui, T., Oki, T., Osajima, Y. Z. Naturforsch., 54C, 259-263(1999)
【非特許文献６】武田忠明、真島光男、奥田拓道；日本栄養・食糧学会誌  Vol.51 No.4 213-217 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
食経験のある食品由来のα−グルコシダーゼ阻害剤であって、医薬品としてだけでなく健康食品等として摂取することができるものを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では鋭意検討の結果、Ｄユニット（式１）を含有するコンドロイチン硫酸にα−グルコシダーゼ阻害活性があることを見出した。
本発明は、式１
【化１】
0004695846.tif 000002
［式中、Ｒは-Ｈ又は１〜２価のカチオンを表す。］で表される構造を分子内ユニットとして含有するコンドロイチン硫酸を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤を要旨とする。該コンドロイチン硫酸は、魚類軟骨、例えば、サケ類、マス類の軟骨から得たものを使用することができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のコンドロイチン硫酸は魚類軟骨に多く含まれ、食経験も豊富な成分なので、糖尿病予防・治療のために、医薬品としてだけでなく、健康食品、特定保険健康食品等の食品として摂取することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
背景技術の欄で説明したように、コンドロイチン硫酸は軟骨組織等に含まれるプロテオグリカンを構成する主成分の一つで、ムコ多糖である。グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンが交互にβ−グリコシド結合で連なった多糖がコンドロイチンと呼ばれ、この繰り返し構造の２糖単位において１〜２個の硫酸基を持つものがコンドロイチン硫酸と呼ばれる。硫酸基の置換位置には数種のバラエティが知られ、Ｎ−アセチルガラクトサミンの４位水酸基が修飾されたもの（Ａユニット）、同じく６位が修飾されたもの（Ｃユニット）、４位及び６位の２カ所が修飾されたもの（Ｅユニット）、グルクロン酸の２位及びＮ−アセチルガラクトサミンの６位が修飾されたもの（Ｄユニット）などが存在する。このうちほぼＡユニットから構成されるものはコンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン４−硫酸）と呼ばれ牛や馬の鼻軟骨やクジラの鼻軟骨に含まれる。一般的に利用されているコンドロイチン硫酸はサメ由来のものが主流であるが、これはほぼＣユニットから構成されるものでコンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン６−硫酸）と呼ばれる。一方、Ｄ及びＥユニットを含むものはやや特殊でユニット当たりの置換数が多いことからこれらを含むコンドロイチン硫酸はユニット当たりの平均電荷数が１を越えるためコンドロイチンポリ硫酸などとも呼ばれる。ただし、これらはコンドロイチン硫酸Ａ及びＣなどとは異なり、試薬で入手できるものでもコンドロイチン硫酸ＥでＥユニットを６０％程度含み、コンドロイチン硫酸Ｄでは約２０％強のＤユニット含有量である。Ｄユニットを含むコンドロイチン硫酸は例えばコンドロイチン硫酸Ｄ（試薬:サメ軟骨由来）の他、エイの軟骨やニジマス、大西洋サケなどの鼻軟骨にも含まれている。本発明のコンドロイチン硫酸はこのＤユニットを含有するものである。
【００１０】
投与量との兼ね合いになるので、Ｄユニットの含有率を限定することは意味がないが、Ｄユニットを１％以上含有するコンドロイチン硫酸であれば有効に使用できる。
コンドロイチン硫酸を製造するには、軟骨等の組織を希アルカリで低温で抽出するか、タンパク分解酵素でタンパク質を分解し、コンドロイチン硫酸を抽出し、エタノールなどの沈澱剤を用いて分離する。工業的には、抽出、除タンパク、脱塩、回収の各方法を、適宜組み合わせて製造する。
式１の式中のＲのカチオンはＤユニットの硫酸基と結合するカチオンであれば何でも良い。代表的なものとしては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等があり、有機物のカチオンでもよい。
コンドロイチン硫酸は、魚類軟骨などに含まれ食経験の長い成分であり安全性は高いと考えられる。
コンドロイチン硫酸は、水溶性であり、各種食品、飲料に添加することが可能である。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１１】
養殖トラウト（ニジマス）由来コンドロイチン硫酸の調製
トラウト頭部約550gに約3倍量の水を加え、40分間ボイルした。放冷後、頭部を解体し鼻軟骨部を採取した。採取した鼻軟骨約60gを細断した後、水で洗浄を行なった。得られた鼻軟骨に100mLの0.2Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温で3.5時間撹拌した。酢酸を加えｐＨを中性付近まで戻し、プロテアーゼNアマノG（天野エンザイム（株）製）を100mg加え、37℃で一夜撹拌を行なった。不溶分をろ別し、酢酸3mL、酢酸ナトリウム6gを加え、冷却下、撹拌しながら約240mLのエタノールを徐々に加えた。4℃で一夜放置し、沈殿をろ別し、70%エタノール、エタノールで順次沈殿を洗浄し、水に再溶解した。不溶分をろ別し、凍結乾燥し、粗精製コンドロイチン硫酸1.0gを得た。
【実施例２】
【００１２】
アトランティックサーモン由来コンドロイチン硫酸の調製
アトランティックサーモン頭部約480gに約3倍量の水を加え、40分間ボイルした。放冷後、頭部を解体し鼻軟骨部を採取した。採取した鼻軟骨約58gを細断した後、水で洗浄を行なった。得られた鼻軟骨に100mLの0.2N水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温3.5時間撹拌した。酢酸を加えｐＨを中性付近まで戻し、プロテアーゼGアマノNを100mg加え、37℃で一夜撹拌を行なった。不溶分をろ別し、酢酸3mL、酢酸ナトリウム6gを加え、冷却下、撹拌しながら約240ｍLのエタノールを徐々に加えた。4℃で一夜放置し、沈殿をろ別し、70%エタノール、エタノールで順次沈殿を洗浄し、水に再溶解した。不溶分をろ別し、凍結乾燥し、粗精製コンドロイチン硫酸0.95gを得た。
【実施例３】
【００１３】
コンドロイチン硫酸の精製
実施例１及び２で得られた粗精製コンドロイチン硫酸をそれぞれ312mg、332mgを水に溶解し、ＤＥＡＥ-toyopearlカラム(1cm x 50cm)（東ソー（株）製）にアプライした。水120mL、0.3M  塩化ナトリウム水溶液120mLを順次通液し、1M塩化ナトリウム水溶液120mLで溶出した。溶出液に酢酸3.5mL、酢酸ナトリウム6gを加え、冷却下、撹拌しながら約250mLのエタノールを徐々に加えた。4℃で一夜放置し、沈殿をろ別し、70%エタノール、エタノールで順次沈殿を洗浄し、水に再溶解後、凍結乾燥した。トラウトコンドロイチン硫酸74.5mg、アトランティックサーモンコンドロイチン硫酸123mgを得た。
【実施例４】
【００１４】
各種コンドロイチン硫酸のα−グルコシダーゼ阻害活性
構造の異なる各種コンドロイチン硫酸のα−グルコシダーゼ阻害活性を比較した。試料として用いたコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ（Ｄユニット約20%）、コンドロイチン硫酸Ｅ（Ｅユニット約60％）は全て生化学工業製試薬。
活性測定は各種濃度のサンプルを含んだ試料液100μLに希釈液（10mMリン酸緩衝液、pH7.2）890μL、基質溶液（16mM p-ニトロフェニル-α-Ｄ-グルコピラノシド溶液）5μLを加え、5分間、37℃でプレインキュベートし、酵素溶液（5u/mL  α-グルコシダーゼ）5μLを加え、10分間、37℃でインキュベートした後、反応停止液（0.5M  Na2CO3）1mLを加えて酵素を失活させた。ブランクの測定は、上記手順で酵素液を加えずにインキュベートを行い、反応停止液を加えた後で酵素を加えることで各々のサンプルに対して対照とした。反応後の試料液は400nmの吸光度を指標とした。結果を図１に示す。コンドロイチン硫酸Ｄのみがα−グルコシダーゼ阻害活性を示した。
【実施例５】
【００１５】
コンドロイチン硫酸構成２糖（Ｄユニット）の分析
実施例３で得られたコンドロイチン硫酸試料２種を各々1.6mg/mLとなるように1mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解して試料液とした。試料液25μLにコンドロイチナーゼABC（生化学工業株式会社製）25μL（1U/mL、1mMリン酸緩衝液pH7.0）を加え、37℃、３時間インキュベートした。沸騰水中１分で酵素を失活し、４倍量のエタノールを加え、遠心分離した上清を減圧下で濃縮した。20μLの90%メタノールに溶解し、さらに20μLの0.75%トリクロロ酢酸-エタノール溶液、20μLの1%ダンシルヒドラジン-エタノール溶液を加えて混合した。混合液を40℃で2時間反応させた後、5倍量のイオン交換水を加えてHPLC用試料とし、以下のHPLC条件で分析を行なった。
【００１６】
HPLC条件
カラム  Chemcopac Pertisil カラム  4.6mmIＤ×500mm
溶出液A：アセトニトリル/100mM 酢酸緩衝液(pH 5.6)=85:15
溶出液B：アセトニトリル/100mM 酢酸緩衝液(pH 5.6)=70:30
グラディエント  0-30min  25%B
30-40min  100%B
40-50min  100%B
流  速  1.5mL/min
検出器  日立蛍光検出器  Ex 350nm, Em 530nm
【００１７】
ΔＤi-diSＤ（Ｄユニット）の含有量はそれぞれトラウト試料4.6%、アトランティックサーモン試料 11.0%であった。
【実施例６】
【００１８】
Ｄユニット含有コンドロイチン硫酸のα−グルコシダーゼ阻害活性
実施例３で得られたトラウト、アトランティックサーモンのコンドロイチン硫酸及び試薬コンドロイチン硫酸Ｄのα−グルコシダーゼ阻害活性を比較した。活性の測定方法は実施例４と同様。結果を図２に示す。いずれのコンドロイチン硫酸も濃度依存的なα−グルコシダーゼ阻害活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
医薬品としてだけでなく、食品として摂取することもできる糖尿病予防・治療に有効なコンドロイチン硫酸を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種コンドロイチン硫酸のα−グルコシダーゼ阻害活性の比較を示した説明図である。
【図２】Ｄユニットを含有するコンドロイチン硫酸のα−グルコシダーゼ阻害活性を示した説明図である。
【図１】
0004695846.tif 000004
【図２】
0004695846.tif 000005