(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆乳のビフィドバクテリウム・ブレーベによる醗酵物であって、大豆オリゴ糖を含まない醗酵物を有効成分とする腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進剤。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・ブレーベが、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）である請求項１記載の増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腸内に存在するビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進剤に関する。
背景技術
プロバイオティクスとは、生菌で、経口投与により宿主の腸内フローラを改善し、宿主の健康に寄与するものと定義されている（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．＆  Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，Ｍ．Ｂ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．１２５，ｐｐ１４０１−１４１２，１９９５年）。ビフィドバクテリウム属細菌は腸内フローラの主要な菌属であるとともに、ビフィドバクテリウム属細菌の少ないフローラが疾病と密接に関連しているために、ビフィドバクテリウム属細菌が多いフローラは健康維持に役立つ１つの指標とされている。投与菌がプロバイオティクスとして生きた状態で腸管内で働くためには、宿主の上部消化管バリアーを通過し、作用部位である下部消化管に達する必要があり、場合によっては消化管内で増殖する必要がある。従って、プロバイオティクスとしての生菌の関与を言及する場合、下部消化管での投与菌の生存を確認することが必須である。そのために、糞便からの投与菌の回収性を調査する方法が良く採用されている（松本一政ら、腸内フローラとプロバイオティクス、学会出版センター、１９９８年、５６−７３頁）。近年、腸内フローラを健全な状態に保つ効果を示す乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌を含む食品が特定保健用食品として認可されて市場に受け入れられてきた。しかし、生菌の関与を示す根拠の１つである投与菌の回収性について言及する例は少なく（田中隆一郎、大脇真、腸内フローラと食餌、学会出版センター、１９９４年、８５−１０４頁）、多くの場合、腸管内に生きた状態で届くことには全く触れていない。特にビフィドバクテリウム属細菌の場合、むしろ生きた状態で腸管内に届きにくいとさえいわれている。
このように、生菌含有食品であっても腸管内に生きて届くことが確認されないものやそのために生菌の効果が検証できないものがあり、プロバイオティクスとしての条件を満足させるものは少なかった。特に、ビフィドバクテリウム属細菌については消化管バリアーに対して抵抗性が低いので、生理効果を示し且つ糞便回収性を示した例は極めて限定されている。田中らは、糞便からの回収性が比較的良好なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ＹＩＴ４００６株を用いてガラクトオリゴ糖の併用効果を調査したところ、投与ビフィドバクテリウム属細菌の回収菌数の増加が大腸菌群やバクテロイデス属細菌の減少及び尿中インディカン排出量の低下に関連することを報告している（Ｔａｎａｋａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ１７−２４，１９８３年）。また同様の効果は、小林らにより、大豆オリゴ糖やコンニャクマンナン分解物の併用でも観察されている（小林洋一ら、腸内フローラと食物因子、学会出版センター、１９８４年、６９−９０頁）。これらの例では、投与ビフィドバクテリウム属細菌の回収菌数を増加させる方法としてガラクトオリゴ糖やコンニャクマンナン分解物が有効であったが、それらの有効量として１日あたり３ｇ以上の投与が必要であった。また、大豆オリゴ糖を用いた場合、１日あたり１０ｇの投与でも増加傾向を示すのみであり、その回収菌数は、高いボランティアサンプルでも糞便１ｇあたり１０８個程度に留まっていた。以上のように、大豆オリゴ糖に関する報告例では、大豆オリゴ糖による腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増加と投与ビフィドバクテリウム属細菌の回収性との間に関連性が認められておらず、またこの関連性を示す明確な事例もない。  大豆製品は、栄養的に優秀な食品であるばかりでなく、動脈硬化やがん、更年期症、骨粗鬆症等の成人病予防にも優れた効果を持っていることが確認されており、現在では、これら製品を西洋化した食生活の中に積極的に採り入れることが臨床栄養学的に推奨されている。また、古来より本邦では、大豆は重要な食材として、多くの食品に利用されている。特に、大豆タンパク質の特性を利用して、豆乳、豆腐、がんもどき、ゆばなどの大豆調製物、あるいは納豆、味噌、醤油などの大豆醗酵物、更にハム、ソーセージ、ハンバーグ、かまぼこ、はんぺん、ちくわなどの加工食品等が作られている。これまでに広範な食品に利用されている大豆であるが、乳製品とは異なり、乳酸産生菌、特にビフィドバクテリウム属細菌の生菌を含む食品として利用された例はあまり多くなかった（特開平９−２３８６４７号、特開平１０−１３０１６０号、特開平１１−７５６８７号、特開平１１−７５８２８号）。
本発明の目的は、ビフィドバクテリウム属細菌が生きたまま腸管内に到達するだけでなく、腸内に存在するビフィドバクテリウム属細菌の増殖を積極的に促進させる組成物を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、各種のビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物を調製し、それをヒトに投与して糞便から回収される菌について種々検討した結果、ビフィドバクテリウム属細菌による大豆醗酵物に、ヒト糞便からの投与ビフィドバクテリウム属細菌の回収性改善作用だけでなく、腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進作用があることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物を有効成分とする腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進剤を提供するものである。
また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物を有効成分とするビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度向上剤を提供するものである。
また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物を有効成分とする腸内環境改善剤を提供するものである。
また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物を投与することを特徴とする腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進方法を提供するものである。
また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物を投与することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達向上方法を提供するものである。
さらにまた本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物を投与することを特徴とする腸内環境改善方法を提供するものである。発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる醗酵物は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌醗酵物であってビフィドバクテリウム属細菌生菌を含有しているものである。
大豆又は大豆加工物としては、取扱の簡便さから大豆抽出液や大豆タンパク懸濁液などの液状の加工物が好ましく、豆乳は更に好ましい。また、大豆抽出液や大豆タンパク質懸濁液などの液状の大豆加工物は、予め糖質、脂質、タンパク質、ポリフェノール等に対する分解あるいは変換酵素によって処理することができるし、またイオン交換担体、疎水結合性担体、アフィニティクロマトグラフィー担体等の各種吸着剤によって処理することもできる。大豆又は大豆加工物の醗酵物としては、取扱の簡便さから大豆抽出液や大豆タンパク懸濁液などの液状の加工物の醗酵物が好ましく、特に豆乳醗酵物が好ましい。大豆又は大豆加工物の醗酵物には、大豆又は大豆加工物以外の植物性食品材料又は動物性食品材料を適宜割合、添加物として添加しても良い。更に食品又は経口医薬品に通常使用されている添加物を加えても良い。
ここで用いる添加物としては、糖類、タンパク質、ペプチド、脂質、ビタミン類、ミネラル類、野菜、穀物、果実などの植物成分、血液、乳、肝臓、骨、筋肉などの動物成分、細菌、カビ、酵母、キノコなどの微生物成分あるいは培養物成分、ゲル化剤、固化剤、増粘剤、香料、着色料、ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、乳酸菌増殖促進剤等が挙げられる。
より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、マルトース、ブドウ糖果糖液糖、蜂蜜、メイプルシロップ、甘酒等の各種甘味料、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の各種糖アルコール、スクラロース、アスパルテーム等の各種高甘味度甘味料、甘草、ステビア、グリチルリチン酸配糖体などの各種天然甘味料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の各種乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の各種増粘（安定）剤が挙げられる。
このほかにも、タガトース、ラクトース、トレハロース、トレハルロース、アガロオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラフィノース、スタキオース、ラクチュロース、マルトトリオース、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン等の各種糖質、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、フコイダン、サルガッサン、フルセラン、フノラン、ポルフィラン、アミナラン、プルラン、タラガム、コンニャクマンナン、イヌリン、キチン、キトサン、ポリデキストロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、β−グルカン、マンナン、ガラクタン、フルクタン、キシラン、アラビナン、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ビートファイバー、オート麦ファイバー、小麦ファイバー、大豆ファイバー、米ファイバー、大麦ファイバー、キサンタンガム、コーンファイバー、リンゴファイバー、シトラスファイバー、サイリュームファイバー、パインファイバー、プルーンファイバー、エンドウ豆ファイバー、バナナファイバー、酢酸菌バクテリアセルロース、乳酸菌菌体細胞壁、ビフィドバクテリウム属細菌菌体細胞壁、酵母菌体細胞壁、納豆フラクタン、コラーゲン、納豆ポリグルタミン酸等の各種食物繊維あるいはそれら食物繊維の各種加水分解物、小麦フスマ、大麦フスマ、米フスマ、カラス麦フスマ、オーツ麦フスマ、ライ麦フスマ、サイリュウム、米糠、玄米、チッコリー、大豆おから、アップルパルプ、レジスタントスターチ、大麦麦芽、トウモロコシ種子外皮、乳酸菌菌体、ビフィドバクテリウム属細菌菌体、ビール酵母菌体、ワイン酵母菌体、ワイン粕、酒粕、しょうゆ粕、ビール粕、米麹、麦麹、豆麹、紅麹、黄麹、納豆粘質物、ブドウ種子抽出物、ローヤルゼリー、プロポリス、クロレラ、スピルリナ、ユーグレナ、ワカメ、コンブ、ホンダワラ、アラメ、カジメ、アサクサノリ、アオノリ、ヒジキ、アオサ、モズク等の難消化性の食物繊維を多く含む各種素材が挙げられる。
さらに、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン、ヨウ素、セレン、銅、コバルト、ドロマイト等の各種ミネラル類あるいはそれらミネラルの各種塩類、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、ピルビン酸、グルコン酸、コハク酸、フマル酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、リン酸、クレアチン、メチオニン、システイン、グルタミン酸などのアミノ酸等の各種酸類あるいはそれらの酸類の各種塩類、グルタチオン、フィチン、フィチン酸、リグニン、ポリ−γ−グルタミン酸およびその分解物、サポニン、フェルラ酸、γ−アミノ酪酸、γ−オリザノール、カルコン、フラバノン、フラボン、フラボノール、イソフラボン、アントシアン、カテキン、プロアントシアニジン、茶葉ポリフェノール、クルクミド、カプサイシノイド、セサミノール、ゴマリグナン、テアフラビン、βジケトン類、カロチノイド類、アリルイオウ化合物、イソチオシアナート類、テルペン類、クロロフィル類、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、ｎ−３多価不飽和脂肪酸類、ｎ−６多価不飽和脂肪酸類、共役リノール酸類、リン脂質類、植物ステロール類等の各種成分、グリシニン、コングリシニン等の大豆タンパク、オボアルブミン、オボムコイド等の卵タンパク、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトフェリン等の乳タンパクおよび乳清タンパク、カゼインホスホペプチド、オリゼニン等の米タンパク、グルテニン、グリアジン等の小麦タンパク、魚肉タンパク等の各種タンパク類およびそれらの酵素分解ペプチドおよび酸分解ペプチド類、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、βカロチン、レチノイン酸、葉酸等の各種ビタミン類、ブラックコホッシュ、セイヨウカボチャ種子、ザクロ種子、セイヨウオトギリソウ、パッションフラワー、バレリアン、プエラリア・ミリフィカ、ローズマリー、ペパーミント、パセリ、マリーゴールド、レモンバーム、ヨモギ、サフラワー、ダイコン種子、コーヒーノキ、ウコギ、ユウガオ果実、ミカン科果皮、イチョウ葉、ナツメ、クコシ、甘草、霊芝、高麗ニンジン、ガラナ等の各種エキス類、緑茶、紅茶、ウーロン茶、ギムネマ茶、グァバ葉等の各種植物抽出物、コショウ、サンショウ、シナモン、ターメリック、セイジ、タイム、バジル、トウガラシ、ナツメグ等の各種香辛料が挙げられる。
また、米、玄米、大麦、小麦、オーツ麦、ライ麦、ハトムギ、アマランサス、アワ、キビ、ソバ、モロコシ、トウモロコシ等の各種穀物の成分あるいはそれら穀物の種子の各種発芽物成分、アズキ、シロアズキ、キントキマメ、インゲンマメ、エンドウマメ、ムラサキハナマメ、チャナマメ、クロダイズ、アオダイズ、リョクトウ、ソラマメ、ダイフクマメ、アシタバ、ケール、ウコン、ジャガイモ、サツマイモ、紫サツマイモ、ヤマイモ、カボチャ、ナス、トマト、ニガウリ、ピーマン、ゴマ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、レタス、エダマメ、ショウガ、ゴボウ、セロリ、ダイコン、ワサビ、アボカド、ニンジン、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ユリ、ラッキョウ、シソ、ネギ、ニラ、パースニップ、ワラビ、タケノコ、シイタケ、マッシュルーム等の各種野菜成分、レモン、リンゴ、ブドウ、イチゴ、オレンジ、カキ、グァバ、バナナ、ブルーベリー、ブラックベリー、クランベリー、キイチゴ、コケモモ、ヤマモモ、フェイジョア、タマリロ、アセロラ、ライム、シークワーサー、メロン、モモ、マンゴー、ユズ、パパイア、パインアップル、ナシ、プラム、グレープフルーツ、カリン、アンズ、ミカン、ザクロ、スイカ、プルーン、キウイ等の果実成分、ピーナッツ、アーモンド、ココナッツ、カシューナッツ、マカデミアナッツ、カカオ、クリ、ギンナン、クルミ等の各種ナッツ成分、牛乳、脱脂乳、乳清、クリーム、醗酵乳、ヨーグルト、乳タンパク、カゼイン、清乳タンパク等の各種乳製品およびそれらの成分、清酒、ブドウ酒、紹興酒、ビール等の醸造酒類、ウィスキー、ブランデー、ウォッカ等の蒸留酒類等が挙げられる。
本発明に用いる醗酵物の製造に用いるビフィドバクテリウム属細菌は、ビフィドバクテリウム属に属する微生物であれば種類は問わないが、人間の腸内フローラの主要なメンバーであるビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アンギュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ）などが好ましく、特にプロバイオティクスとして認められているＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ＹＩＴ４０６５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）であれば更に好ましい。そして更にＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ＹＩＴ４０６５を親株とする子孫株であっても十分に利用できる。ここで云う子孫株は自然変異株、変異処理による変異株、遺伝子操作による変異株等を含む。また人間の腸内から分離される経験を持つビフィドバクテリウム属細菌であるビフィドバクテリウム・ガリカム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）や食品に利用されているビフィドバクテリウム属細菌であるビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）なども利用できる。愛玩動物や家畜などに対しては、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ビフィドバクテリウム・スイス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）なども利用できる。
本発明に用いる醗酵物の製造には、ビフィドバクテリウム属細菌以外の微生物を併用することも可能である。ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー  サブスピーシーズ  ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・マルタロミクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｌｔａｒｏｍｉｃｕｓ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バリアント  ダイアセチルラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ｖａｒ  ｄｉａｃｅｔｉｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等のラクトコッカス属細菌、ロイコノストック・メセンテロイデス  サブスピーシーズ  クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等のロイコノストック属細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇ��ｌａｎｓ）等のバチルス属細菌、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）等のアセトバクター属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ユニスポラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トルラスポラ・デルブルッキー（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、キャンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母等が望ましい微生物として挙げられる。
本発明に用いる醗酵物は、例えば大豆又は大豆加工物を含む組成物にビフィドバクテリウム属細菌を接種し、培養して作製した生菌を含有する醗酵物として製造できる。その際の培養条件は、細菌が十分に増殖可能であれば特に限定されない。例えば、培養温度は３０℃〜３７℃、培養時間は１５時間〜４８時間が好ましい。また培養雰囲気は特に空気の有無を問わないが、培養中には通気性のない密封した容器を用いて培養することが好ましく、窒素などの不活性ガスを十分通過させた培地を入れた密封容器あるいは培地上の気相を不活性ガスで置換した密封容器を用いて培養することが更に好ましい。また培養の停止時期はｐＨ４．０〜ｐＨ６．０とすることがビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達性、腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進、腸内環境改善等の点から好ましく、ｐＨ４．５〜５．５であれば更に好ましい。また培養時に必要に応じて前記醗酵物に添加できるものとして列挙した糖質、植物成分、動物成分、微生物成分、栄養素、酸等の添加物を適宜割合添加してもよい。
本発明では、これらの醗酵物をそのまま用いても良く、また液状素材で希釈して用いることもできる。更に乾燥させて粉末状、顆粒状、錠剤状等の形状に加工して使用することもできる。また更に濃縮して濃縮液、高粘度液、ゲル状、固型等の形状に加工して使用することもできる。そしてまた凍結させて、アイス状、シャーベット状等の形状に加工して使用することもできる。すなわち、各種の操作、添加物等により、以上のような形態や形状に加工したものを食品として提供することができる。
本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤を使用する場合の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、容態によって異なるが、成人患者１日あたり醗酵物として、２０ｇ〜５００ｇとするのが好ましい。
本発明の醗酵物には、更に公知のビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤を添加することができる。当該促進剤としてはビフィドバクテリウム属細菌の増殖を促進する活性を持っているものであれば、特に指定はしないが、食品に使用されている難消化性糖質が好ましく、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖等のオリゴ糖であれば更に好ましい。これらビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤の添加量は、成人患者１日あたり０．１ｇ〜１０ｇとするのが好ましい。
また本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、そのまま食品として用いることもできるし、任意の範囲ですべての食品に添加することができる。好ましい食品としては、牛乳や乳酸菌飲料、ヨーグルト、醗酵乳、チーズ、プリン、アイスクリームなどの乳類、アルコール飲料や豆乳、ジュース、お茶、甘酒、野菜汁などの嗜好飲料類、生菓子や半生菓子などの菓子類、スープなどの調理加工品類、マヨネーズなどの卵加工品類や栄養ドリンクが挙げられる。これらの食品に添加する場合、前記醗酵物として、０．１重量％〜９９．９重量％、好ましくは５０重量％〜９９重量％含有させることができる。
本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、酸素透過性の低い密封容器、カプセル、包装用袋等に充填して提供することもできるし、また酸素透過性のある密封容器、カプセル、包装用袋等に充填して提供できる。またこれらの密封容器内を不活性ガスで充填させて提供できる。
本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、−１９６℃〜５０℃で保存することが可能であり、４℃〜１０℃程度で保存するのが好ましい。
本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、人間のみならず、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、カンガルー、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ライオン、トラ、キリン、ゾウ、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ等の家畜、愛玩動物、野生動物にも使用できる。
実施例
以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、菌数は、検出プレート上のコロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ、ＣＦＵ）を測定し、実数値あるいは対数値で表示した。
（実施例１）ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ４０６５株醗酵豆乳中での大豆オリゴ糖の変化
本実施例では、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ４０６５株（以下、単にＹＩＴ４０６５株という）で作製した醗酵豆乳に含まれる大豆オリゴ糖濃度と培養ｐＨとの関係を示す。
（１）方法
豆乳（四国化工機製、固形分１２％、タンパク含量５．４％）を１００℃９０分間蒸気滅菌後、豆乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを１％接種し、３７℃で静置培養し、経時的に培養物を採取し、ｐＨと大豆オリゴ糖（スタキオース及びラフィノース）を測定した。オリゴ糖の測定は、豆乳又は醗酵豆乳の遠心上清をＳｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２の本カラム（８ｍｍφ×３００ｍｍ，昭和電工製）及びＳｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−Ｇのガードカラム（６ｍｍφ×５０ｍｍ，昭和電工製）を装着した高速液体クロマトグラフィー装置にかけて、移動相として精製水、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃の条件下でサンプルを流し、示差屈折計ＲＩ−９８（ラボシステム機器製）を用いて糖を検出した。
（２）結果
図１で示すように、ラフィノースはｐＨの低下に伴って直線的に減少し、ｐＨ５になるとほぼ消滅した。またスタキオースは、ｐＨの低下とともに減少するが、ｐＨ５．７から５．４の間で激減し、ラフィノース同様にｐＨ５では殆ど残存していなかった。この結果、豆乳中の大豆オリゴ糖は、ＹＩＴ４０６５株により、効率的に利用されることが示された。
（実施例２）醗酵豆乳の３日間投与試験
本実施例では、ＹＩＴ４０６５株で培養した醗酵乳及び醗酵豆乳を同一ボランティアに投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリウム属細菌であるＹＩＴ４０６５株の菌数を調べた例を示す。
（１）投与サンプルの調製
３日間連続投与試験に用いるビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物としてのＹＩＴ４０６５株の醗酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分１２％）を１００℃９０分間蒸気滅菌後、豆乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーをそれぞれ０．１％接種し、３７℃１６時間培養して、ｐＨ４．８の醗酵豆乳を得た。この醗酵豆乳投与サンプルのビフィドバクテリウム属細菌菌数は、１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬであり、このサンプルには大豆オリゴ糖は含まれていなかった。投与時まで４℃で嫌気的に保存した。
（２）投与対照サンプルの調製
ビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物の３日間連続投与試験の対照サンプルとしてのＹＩＴ４０６５株の醗酵乳の調製方法を以下に示す。全脂粉乳（よつ葉乳業製）を１２％になるように水に溶かし、１００℃９０分間蒸気滅菌後、別に１２１℃１５分間蒸気滅菌した酵母エキスを終濃度０．０３％になるように添加した。これに全脂粉乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを接種し、３５℃１６時間培養して、ｐＨ５．６の醗酵乳を得た。この醗酵乳の投与サンプルのビフィドバクテリウム属細菌菌数は、１．４×１０９ＣＦＵ／ｍＬであり、投与時まで４℃で嫌気的に保存した。
（３）投与方法
ボランティアである健康成人男子１名には、投与前３日間及び投与期間中３日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。ボランティアは、１種類の試験品の投与試験を終了した後、１ヶ月の休止期間を経て、別の試験品の投与試験を行った。投与期間中、醗酵豆乳あるいは醗酵乳を昼食後及び夕食後それぞれ２００ｍＬずつ飲用してもらった。投与前日及び３日間の投与終了直後の糞便について、ＹＩＴ４０６５株の菌数を測定した（松本一政ら、腸内フローラとプロバイオティクス、学会出版センター、１９９８年、５６−７３頁）。
（４）結果
表１に示すように、醗酵豆乳投与では投与ビフィドバクテリウム属細菌であるＹＩＴ４０６５株が実数値として糞便１ｇあたり１．５×１０８ＣＦＵ回収され、また醗酵乳投与では８×１０７ＣＦＵ回収された。ＹＩＴ４０６５株は、遺伝的に類縁関係にある他株、例えばビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ４００６株（Ｔａｎａｋａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ１７−２４，１９８３年、及び小林洋一ら、腸内フローラと食物因子、学会出版センター、１９８４年、６９−９０頁）に比べて回収性が改善された菌株である。本試験例によると、ＹＩＴ４０６５のように回収性に優れた菌株を用いた場合でも醗酵豆乳は醗酵乳に比べて投与ビフィドバクテリウム属細菌が効率よく回収されることが分かった。すなわち、これは、投与ビフィドバクテリウム属細菌を生きて腸管に到達させるためには醗酵豆乳が極めて優れていることを示している。更に、この醗酵豆乳投与サンプルにはオリゴ糖が含まれていないので、醗酵豆乳による投与ビフィドバクテリウム属細菌回収性改善作用はオリゴ糖によるものではないことも示している。
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（実施例３）醗酵豆乳の単回投与試験
本実施例では、ＹＩＴ４０６５株で培養した醗酵乳あるいは醗酵豆乳に糖を加えた製品をそれぞれ調製し、それらを１０℃で保存したサンプルを同一ボランティアに単回投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリウム属細菌であるＹＩＴ４０６５株の菌数を調べた例を示す。
（１）投与サンプルの調製
１０℃保存製品の単回投与試験に用いるビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物としてのＹＩＴ４０６５株の醗酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分１２％）をＵＨＴ殺菌（１３５℃、３．５秒）したのち、豆乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを０．３％接種し、３４℃にて１７時間培養した。この醗酵豆乳に終濃度が６．５％になるようにショ糖溶液を加え、攪拌後、ガラス容器に分注してゴム栓で密封した。これを１０℃にて８日間保存したサンプルを醗酵豆乳の投与サンプルとした。この投与サンプルにはＹＩＴ４０６５株が２．２３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ含まれ、ｐＨ４．８５であり、大豆オリゴ糖は含まれていなかった。
（２）投与対照サンプルの調製
ビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物の単回投与試験に用いる対照サンプルとしてのＹＩＴ４０６５株の醗酵乳の調製方法を以下に示す。全脂粉乳（よつば乳業製）を１２％になるように水に溶解し、ＵＨＴ殺菌（１３５℃、３．５秒）した後、別滅菌した酵母エキスを終濃度０．０３％加えた。ここに１０％脱脂粉乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードを２％接種し、３４℃にて２０．５時間培養した。この醗酵乳に終濃度が６．５％になるようにショ糖溶液を加え、攪拌後、ガラス容器に分注してゴム栓で密封した。これを１０℃にて８日間保存したサンプルを醗酵乳の投与サンプルとした。この投与サンプルにはＹＩＴ４０６５株が３．２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ含まれ、ｐＨ５．４２であった。
（３）投与方法
ボランティアである健康成人男子１名には、投与前３日間及び投与当日の４日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。ボランティアには、昼食直後に醗酵豆乳２００ｍＬを飲用してもらった。この投与試験終了後、同一のボランティアに１週間の休止期間を経て、同様な条件で醗酵乳２００ｍＬを飲用してもらった。投与翌朝の糞便を回収し、ＹＩＴ４０６５株の菌数を測定した（松本一政ら、腸内フローラとプロバイオティクス、学会出版センター、１９９８年、５６−７３頁）。
（４）結果
表２に示すように、１回の醗酵豆乳投与では投与ビフィドバクテリウム属細菌であるＹＩＴ４０６５株が実数値として糞便１ｇあたり２．９×１０８ＣＦＵ回収され、また１回の醗酵乳投与では１．４×１０６ＣＦＵ回収された。またＹＩＴ４０６５株の回収率を投与ビフィドバクテリウム属細菌の総菌数に対する糞便に回収される投与ビフィドバクテリウム属細菌の総菌数の割合から算出したところ、醗酵豆乳は醗酵乳に比べて２６倍高い回収率を示すことが明らかとなった。この結果は、醗酵豆乳では１０℃に８日間密封保存した加糖タイプの製品を単回投与した場合でも便から高い割合で投与ビフィドバクテリウム属細菌が回収されることを示している。
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（実施例４）ヒト糞便培養系でのＹＩＴ４０６５株の増殖性
本実施例では、ヒト糞便培養におけるビフィドバクテリウム属細菌の増殖性が醗酵物によって異なることを示す。
（１）サンプルの調製
豆乳（四国化工機製、固形分１２％）を１００℃９０分間蒸気滅菌後、豆乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを０．１％接種し、３４℃２０時間静置培養後、ｐＨ５で培養を停止した菌液をそのまま醗酵豆乳サンプルとして用いた。また、全脂粉乳（よつ葉乳業製）を１２％になるように水に溶かし、１００℃９０分間蒸気滅菌後、別に１２１℃１５分間蒸気滅菌した酵母エキスを終濃度０．０３％になるように添加したものに、全脂粉乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを接種し、３４℃２０時間培養後、ｐＨ５で培養を停止した菌液をそのまま醗酵乳サンプルとして用いた。各醗酵サンプルは、培養実験開始まで１０℃で嫌気的に保存した。
（２）糞便培養の方法
糞便培地として、健康成人の新鮮糞便を嫌気水で４倍に希釈した後、１２１℃１５分間蒸気滅菌したものを４．５ｍＬ分注したものを調製し、培養は、同一新鮮糞便の未滅菌３００倍希釈液５０μＬ及び上記醗酵豆乳又は醗酵乳の各醗酵サンプルの１０倍希釈液５０μＬをそれぞれ接種し、嫌気的条件下で３７℃、２４時間で行った。培養終了後、投与ビフィドバクテリウム属細菌及び腸内ビフィドバクテリウム属細菌総菌数を測定した（石川文保ら、ビフィズス、９巻、５−１８頁、１９９５年、及び松本一政ら、腸内フローラとプロバイオティクス、学会出版センター、１９９８年、５６−７３頁）。
（３）結果
表３で示すように、醗酵豆乳を用いた場合、醗酵サンプルの保存期間の違いに拘わらずＹＩＴ４０６５株および糞便中に内在する腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖性はあまり変化しなかった。一方、醗酵乳では保存期間が長くなることにより増殖倍数の低下が観察され、１４日間の保存では保存なしに比べてＹＩＴ４０６５株の増殖倍数が６分の１に低下し、糞便中に内在する腸内ビフィドバクテリウム属細菌も２分の１に低下した。本例で採用した培養方法は糞便培養後のフローラ構成が用いた糞便のフローラ構成と同じであることを確認した諸富らの方法（Ｍｏｒｏｔｏｍｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｒｍｆｒｅｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｏｋａｉ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１年、２９３−３０１頁）に準じており、ここで観察されるＹＩＴ４０６５株および腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖性は腸管内での増殖性を反映しているものと考えられる。従って、本例で得られた結果は、醗酵豆乳中のビフィドバクテリウム属細菌が腸管内で良好に増殖すること、及びその腸管内増殖性が長期間保存した場合でも醗酵乳に比べて良好に保たれることを示唆している。また、この結果より、醗酵豆乳では腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖を良好に保つことが示された。
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（実施例５）醗酵豆乳の１４日間投与試験
本実施例では、ＹＩＴ４０６５株の醗酵豆乳及び豆乳を１４日間連続投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリウム属細菌であるＹＩＴ４０６５株及び腸内ビフィドバクテリウム属細菌を調べた例を示す。
（１）投与サンプルの調製法
１４日間連続投与試験に用いるビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物としてのＹＩＴ４０６５株の醗酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳７．５リッター（四国化工機製、固形分１２．３％）をジャーファメンター内で１００℃９０分間蒸気滅菌後窒素置換し、豆乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを０．５％接種し、３２℃１８時間、６０ｒｐｍで攪拌培養した。ｐＨ５．３で培養停止後、添加液（アスパルテーム２．１ｇ、食添用クエン酸１７．３ｇを滅菌水で１．６リッターにフルアップしたものを１０５℃１５分間蒸気滅菌）１．６リッターを攪拌しながら添加して、醗酵豆乳サンプル（ｐＨ４．８、１．６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を得た。培養終了後、投与時まで４℃で嫌気的に保存した。また、豆乳サンプルとしては、上記醗酵豆乳の醗酵前のものを用いた。
（２）投与方法
ボランティアである健康成人男子１５名には、投与前７日間及び投与期間中１４日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。投与期間中、８名に醗酵豆乳を７名に豆乳を昼食後及び夕食後それぞれ２５０ｍＬずつ飲用してもらった。投与前日及び１４日間の投与終了直後の糞便について、投与ビフィドバクテリウム属細菌菌数及び腸内ビフィドバクテリウム属細菌の菌数、糞便総菌数を測定した（石川文保ら、ビフィズス、９巻、５−１８頁、１９９５年、及び松本一政ら、腸内フローラとプロバイオティクス、学会出版センター、１９９８年、５６−７３頁）。
（３）結果
表４に示すように、醗酵豆乳投与により投与ビフィドバクテリウム属細菌が糞便１ｇあたり実数値で１．７×１０８〜２．１４×１０９ＣＦＵ回収され、平均１．０２×１０９ＣＦＵ（対数値で９．１）回収された。また醗酵豆乳の投与により、８名中７名で腸内のビフィドバクテリウム属細菌の菌数が増加し、減少した人はいなかった。一方、豆乳投与は、７名中４名で腸内ビフィドバクテリウム属細菌の菌数が増加したのみであり、統計的に菌の増加を示すことはできなかった（表５）。本実施例では、１４日間の醗酵豆乳連続投与において、すべてのボランティアで１０８ＣＦＵ／ｇ糞便以上の回収性が示され、更に平均１０９ＣＦＵ／ｇ糞便と云う極めて高い回収性を示すことが示された。またこの結果により、ビフィドバクテリウム属細菌生菌を含んだ醗酵豆乳は腸管内をビフィドバクテリウム属細菌優位な環境に改善できることが分かった。このことは、ビフィドバクテリウム属細菌を含んだ醗酵豆乳が投与菌の回収性改善作用のみならず、腸管内に存在する腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進作用を持っていることを示しており、腸内環境を改善できる製品であることを示唆している。
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（実施例６）オリゴ糖添加醗酵豆乳の３日間投与試験
本実施例では、ＹＩＴ４０６５株の醗酵豆乳にオリゴ糖を添加することにより調製したオリゴ糖添加醗酵豆乳又はオリゴ糖無添加醗酵豆乳をヒトに投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリウム属細菌であるＹＩＴ４０６５株及び腸内ビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス属細菌を調べた例を示す。（１）投与サンプルの調製
ビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物としてのＹＩＴ４０６５株の醗酵豆乳にオリゴ糖を添加したオリゴ糖添加醗酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分１２％）を１００℃９０分間蒸気滅菌後、豆乳で作製したＹＩＴ４０６５株のシードカルチャーを０．１％接種し、３４℃１７時間静置培養後、ｐＨが約６付近から攪拌してｐＨ５の醗酵豆乳菌液を得た。培養後、この菌液にアスパルテーム０．１％とクエン酸１％とミルクフレーバー少量含んだ添加液を混合してオリゴ糖無添加醗酵豆乳サンプル（ｐＨ４．８、３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を調製した。培養終了後、投与時まで４℃で嫌気的に保存した。投与直前に、この醗酵豆乳サンプル２５０ｍＬに対して、オリゴ糖として４′−ガラクトシルラクトース溶液（２０％）５ｍＬ混合することにより、オリゴ糖添加醗酵豆乳サンプルを調製した。
（２）投与方法
ボランティアである健康成人男子７名には、投与前７日間及び投与期間中３日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。３日間の投与期間中、４名にはオリゴ糖添加醗酵豆乳を昼食後及び夕食後それぞれ２５５ｍＬずつ飲用してもらった。この時の１日あたりのオリゴ糖摂取量は１人あたり２ｇである。また３名にはオリゴ糖無添加醗酵豆乳を昼食後及び夕食後それぞれ２５０ｍＬずつ飲用してもらった。投与前日及び３日間の投与終了直後の糞便について、ＹＩＴ４０６５株の菌数及び腸内ビフィドバクテリウム属細菌菌数、バクテロイデス属細菌菌数、糞便総菌数を測定した（石川文保ら、ビフィズス、９巻、５−１８頁、１９９５年、及び松本一政ら、腸内フローラとプロバイオティクス、学会出版センター、１９９８年、５６−７３頁）。
（３）結果
表６に示すように、オリゴ糖添加醗酵豆乳投与により、ＹＩＴ４０６５株が糞便１ｇあたり実数値で７．４×１０８〜３．５×１０９ＣＦＵ回収され、平均１．８×１０９ＣＦＵ（対数値で９．２）が回収された。更に、ボランティア全員において、腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増加とバクテロイデス属細菌の減少が観察され、両菌属ともに投与前後で統計的有意差が見られた。また、表７に示すように、オリゴ糖無添加醗酵豆乳投与でも、投与されたＹＩＴ４０６５株が糞便１ｇあたり実数値で１．８×１０８〜５．４×１０９ＣＦＵ回収され、平均２．７×１０９ＣＦＵ（対数値で９．４）回収された。
さらに、オリゴ糖無添加醗酵豆乳における腸内ビフィドバクテリウム属細菌の菌数も、ＹＩＴ４０６５株の回収菌数が非常に高かった２名のボランティア（糞便１ｇあたり２．５×１０９ＣＦＵ以上、対数値で９．４以上）において増加したが、投与菌の回収性が低かったボランティアでは増加しなかった。
これらの結果は、本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤は、オリゴ糖の添加および無添加の条件に関わらず、投与ビフィドバクテリウム属細菌の回収性を高めるとともに、腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増加を促進することを示している。また、本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤にオリゴ糖を添加することによって、腸内腐敗の原因菌を含むバクテロイデス属菌の菌数を効率的に低減させることも期待できる。
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（実施例７）耐性試験
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ＹＩＴ４０１４株（ＡＴＣＣ  １５７００。以下、単にＹＩＴ４０１４株という）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＹＩＴ４０２１株（ＡＴＣＣ１５７０７。以下、単にＹＩＴ４０２１株という）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＹＩＴ４０３７株（ＡＴＣＣ１５７０８。以下、単にＹＩＴ４０３７株という）の醗酵豆乳および醗酵乳の酸胆汁耐性を調べた。
（１）サンプルの調製法
ＹＩＴ４０１４株、ＹＩＴ４０２１株、ＹＩＴ４０３７株の醗酵豆乳および醗酵乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分１２％）を１００℃９０分間蒸気滅菌後窒素置換し、豆乳で作製したＹＩＴ４０１４株、ＹＩＴ４０２１株、ＹＩＴ４０３７株のシードカルチャーを０．５％接種し、３４℃１９時間培養し、ｐＨ４．６まで培養した。また全脂粉乳（北海道乳業）を固形分１２％になるように溶解し、豆乳と同様に滅菌した。別滅菌した酵母エキスを終濃度０．０５％添加した後、全脂粉乳で作製したＹＩＴ４０１４株、ＹＩＴ４０２１株、ＹＩＴ４０３７株のシードカルチャーを０．５％接種し、３４℃１９時間培養し、ｐＨ４．６まで培養した。これらの菌液に滅菌したブドウ糖溶液を終濃度５％になるように添加し混和後、ガラス試験管に分注し、ブチル栓をして、１０℃にて嫌気的に７日間保存した。
（２）酸処理液および胆汁処理液の調製法
トリプチケースペプトン１％、酵母エキス０．５％、トリプトース０．３％、塩化ナトリウム０．２％、クエン酸アンモニウム０．２％、システイン塩酸塩０．０５％、ラクトース１％、ピルビン酸０．１％、ツイーン８０  ０．１％、硫酸マグネシウム０．０５７５％、硫酸第一鉄０．００３４％、硫酸マンガン０．０１２％を含む水溶液に酸を添加して、ｐＨ４．３に調整し、１２１℃１５分間蒸気滅菌したものを酸処理液とした。また、トリプチケースペプトン１％、酵母エキス０．５％、トリプトース０．３％、リン酸水素二ナトリウム１２水塩２．０  ３％、リン酸二水素ナトリウム２水塩０．１５６％、クエン酸アンモニウム０．２％、システイン塩酸塩０．０５％、ラクトース１％、ピルビン酸０．１％、ツイーン８０  ０．１％、硫酸マグネシウム０．０５７５％、硫酸第一鉄０．００３４％、硫酸マンガン０．０１２％を含む水溶液にＯｘｇａｌｌを１％加えた後、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ８．０に調整し、１２１℃１５分間蒸気滅菌したものを胆汁処理液とした。
（３）生菌数の測定方法
保存サンプルを適宜希釈し、ＭＩＬＳ寒天平板に塗抹し、３７℃、３日間嫌気培養後、コロニーを計測した。
（４）酸胆汁耐性の測定方法
前述の酸処理液１０ｍＬに各保存サンプルを１ｍＬ加え、３７℃で３０分間培養した。次に、この培養液１ｍＬを前述の胆汁処理液１０ｍＬに加え、３７℃で３０分間培養した。ここで得られた培養液を適宜希釈し、生菌数を測定した。
（５）結果
各保存サンプルの酸胆汁耐性を図２〜４に示す。酸および胆汁の連続処理後の生菌数を醗酵豆乳と醗酵乳で比べると、ＹＩＴ４０１４、ＹＩＴ４０２１、ＹＩＴ４０３７のすべての菌で７日間保存において醗酵豆乳は生菌数が維持されているが、醗酵乳では検出限界以下であった。
これらの結果は、ビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度を評価できる方法である酸胆汁耐性試験において、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵豆乳が優れた耐性を持つことを示している。すなわち、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵豆乳はこれらのビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度を向上できる醗酵物であることを示唆している。さらに、実施例５および６で明らかなように、投与ビフィドバクテリウム属細菌の腸内到達度の向上が腸内ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進を引き起こすことから、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵豆乳は腸内ビフィドバクテリウム属細菌を増殖促進することが可能である。
産業上の利用可能性
本発明の腸内ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤によれば投与されたビフィドバクテリウム属細菌の腸管内への到達性を高め、腸内フローラをビフィドバクテリウム属細菌優勢の状態に変えるだけでなく、いわゆる悪玉菌を包含したバクテロイデス属細菌の腸管内菌数を低下させることができ、優れた腸内環境改善効果が期待できる。これに用いる醗酵物は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリウム属細菌による醗酵物であるので、安全性にも全く問題がなく、また官能的にも優れたビフィドバクテリウム属細菌生菌含有醗酵物であり、プロバイオティクス食品として健康の維持及び病気の予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ビフィドバクテリウム属細菌による醗酵豆乳中での大豆オリゴ糖の含量変化を示す図である。
図２は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ４０１４による醗酵豆乳と醗酵乳の保存日数と酸胆汁処理後の生菌数との関係を示す図である。
図３は、ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＹＩＴ４０２１による醗酵豆乳と醗酵乳の保存日数と酸胆汁処理後の生菌数との関係を示す図である。
図４は、ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＹＩＴ４０３７による醗酵豆乳と醗酵乳の保存日数と酸胆汁処理後の生菌数との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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