(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、哺乳類でアテローム性硬化症のリスクを判定する方法：
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む、前記哺乳類の生物学的サンプルを提供する工程；
前記高密度リポタンパク質を酸化リン脂質と接触させる工程；
さらに  酸化または非酸化リン脂質の量の変化を測定する工程であって、ここで酸化リン脂質の量に変化が存在しない場合は、前記哺乳類にアテローム性硬化症のおそれがあることが示される。
【請求項２】
前記酸化リン脂質が、単球の反応を惹起する酸化リン脂質である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リン脂質が、以下から成る群から選択される脂質の酸化形である請求項２記載の方法：１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）、および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【請求項４】
前記酸化リン脂質が低密度リポタンパク質の成分である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、蛍光測定法、放射性同位元素検出、抗体検出、および酸化リン脂質を示す標識に由来するシグナルの検出から成る群から選択される方法を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程が蛍光標識に由来するシグナルを検出することを含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記標識が、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ローダミン、ｃｉｓ−パリナリン酸、ＮＢＤ、ｃｉｓ−パリナリン酸コレステリルエステル、およびジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸から成る群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記検出工程が、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）から成る群から選択されるクロマトグラフィーの方法を含む請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが全血である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが分画血液である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記提供工程が血液サンプルからＨＤＬを単離することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記測定工程が、前記酸化リン脂質の量の変化を、酸化リン脂質レベルを減少させることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じた酸化リン脂質の量の変化と比較することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記測定工程が、前記酸化リン脂質の量の変化を、酸化リン脂質のレベルを減少させる能力が不足していることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じた酸化リン脂質の量の変化と比較することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記測定工程が、前記酸化リン脂質の量の変化を、ＨＤＬ非存在下で同じ実験を実施することによって生じた酸化リン脂質の量の変化と比較することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類がヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタおよびウサギから成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類が、ＨＤＬ：ＬＤＬ比が低いと診断されたヒトである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類がアテローム性硬化症のおそれがあると診断されたヒトである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む、哺乳類でアテローム性硬化症のリスクを判定する方法：  高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む、前記哺乳類の生物学的サンプルを提供する工程；
前記高密度リポタンパク質をリン脂質と接触させる工程；
前記リン脂質を酸化条件に付す工程；さらに  酸化または非酸化リン脂質の量の変化を測定する工程であって、ここで酸化または非酸化リン脂質の量の変化によって、前記哺乳類にアテローム性硬化症のおそれがあることが示される。
【請求項１９】
前記リン脂質が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に存在するリン脂質である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記リン脂質が、酸化されたときに単球の反応を惹起するリン脂質である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記リン脂質が、以下から成る群から選択される請求項２０記載の方法：１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）、および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【請求項２２】
前記リン脂質を酸化条件に付す工程が、過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、およびＨＥＴＥから成る群から選択される薬剤と前記リン脂質を接触させることを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記検出工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、蛍光測定法、放射性同位元素検出、抗体検出、および酸化リン脂質を示す標識に由来するシグナルの検出から成る群から選択される方法を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記検出工程が蛍光標識に由来するシグナルを検出することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
前記標識が、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ローダミン、ｃｉｓ−パリナリン酸、ＮＢＤ、ｃｉｓ−パリナリン酸コレステリルエステル、およびジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸から成る群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記検出工程が、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）から成る群から選択されるクロマトグラフィーの方法を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的サンプルが全血である請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的サンプルが分画血液である請求項１８記載の方法。
【請求項２９】
前記提供工程が血液サンプルからＨＤＬを単離することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項３０】
前記測定工程が、前記酸化または非酸化リン脂質の量の変化を、酸化リン脂質レベルを減少させることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じた酸化または非酸化リン脂質の量の変化と比較することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項３１】
前記測定工程が、前記酸化または非酸化リン脂質の量の変化を、酸化リン脂質のレベルを減少させる能力が不足していることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じた酸化または非酸化リン脂質の量の変化と比較することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項３２】
前記測定工程が、前記酸化または非酸化リン脂質の量の変化を、ＨＤＬ非存在下で同じアッセイを実施することによって生じた酸化または非酸化リン脂質の量の変化と比較することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳類がヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタおよびウサギから成る群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳類が、ＨＤＬ：ＬＤＬ比が低いと診断されたヒトである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳類がアテローム性硬化症のおそれがあると診断されたヒトである請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
１つもしくは２つ以上の酸化または非酸化リン脂質を入れた容器、および請求項１または１８記載のアッセイ方法を記載した指示物を含む、哺乳類でアテローム性硬化症のリスクを判定するキット。
【請求項３７】
さらに、酸化リン脂質を検出する標識を含む請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
さらに酸化剤を含む請求項３６記載のキット。
【請求項３９】
前記酸化剤が、過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、およびＨＥＴＥから成る群から選択される請求項３６記載のキット。
【請求項４０】
１つまたは２つ以上の酸化リン脂質を入れた容器を含み、さらに前記指示物が請求項１記載のアッセイ方法を記載している請求項３６記載のキット。
【請求項４１】
１つまたは２つ以上の非酸化リン脂質を入れた容器を含み、さらに前記指示物が請求項１８記載のアッセイ方法を記載している請求項３６記載のキット。
【請求項４２】
収容領域を有する不活性な多孔質の基質、前記多孔質の基質と並列する輸送媒体、前記輸送媒体と並列する酸化脂質検出用試薬を含むテストメンブレンを含むアテローム性硬化症のリスクを判定する検査装置。
【請求項４３】
前記テストメンブレン中に、さらに非酸化脂質および酸化剤を含む請求項４２記載の装置。
【請求項４４】
前記テストメンブレン中に、さらに酸化脂質を含む請求項４２記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、USSN09/541,468（2000年3月31日出願）およびUSSN09/539,569（2000年3月31日出願）（両文献は参照により本明細書に含まれる）に対して優先権を主張する。
連邦政府支援研究開発により達成された発明の権利に関する記述
本発明は、米国立衛生研究所のグラント番号HL30568の支援を受けて達成された。アメリカ合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本発明はアテローム性硬化症の診断に関する。特に本発明は改良アッセイを提供する。
【０００２】
【従来技術】
心脈管系疾患は、特に合衆国および西欧の国々において罹病および死亡の主要原因である。原因となるいくつかの因子は、心脈管系疾患に対する遺伝的素因、性別、ライフスタイルに関する因子（例えば喫煙および食事）、年齢、高血圧および高脂血症（高コレステロール血症を含む）を含む心脈管系疾患の発生と関連がある。これらの因子のいくつか、特に、高脂血症および高コレステロール血症（高い血中コレステロール濃度を示す）は、アテローム性硬化症と密接に関連する顕著な危険因子をもたらす。
コレステロールは、リポタンパク質粒子内の遊離エステル化コレステロールとして血中に存在する。前記リポタンパク質粒子は、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）として一般的に知られている。血中の総コレステロール濃度は、（１）消化管のコレステロール吸収（２）食物成分（例えば炭水化物、タンパク質、脂肪およびエタノール）からコレステロールの合成、および（３）組織（特に肝臓）による血液からコレステロールの除去、それに続くコレステロールの胆汁酸、ステロイドホルモンおよび胆汁コレステロールへの変換によって影響を受ける。
【０００３】
血中コレステロール濃度の維持は、遺伝因子および環境因子の両因子の影響を受ける。遺伝因子には、個体のコレステロール生合成における速度制限酵素の濃度、肝臓の低密度リポタンパク質に対するレセプターの濃度、コレステロール胆汁酸変換のための速度制限酵素の濃度、リポタンパク質の合成および分泌の速度、および性別が含まれる。ヒトの血中コレステロール濃度のホメオスタシスに影響を与える環境因子には、食事構成、喫煙の程度、運動および種々の薬剤の使用が含まれる。食事性変動因子には、脂肪の量およびタイプ（飽和および多不飽和脂肪酸）、コレステロールの量、線維の量およびタイプ、並びにおそらくはビタミン（例えばビタミンＣおよびＤ）およびミネラル（例えばカルシウム）の量が含まれる。
【０００４】
上記で示したように、高い血中コレステロール濃度は、ヒトの脈管系疾患および冠状動脈心疾患の主要な危険因子の１つである。低密度リポタンパク質コレステロール（“ＬＤＬ−コレステロール”）および総コレステロールの上昇は、冠状動脈心疾患リスクの増加に正比例する（Anderson et al.(1987) JAMA, 257:2176-80）。高レベルの総コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールはアテローム性硬化症および脈管系疾患発生の危険因子であるが、高密度リポタンパク質コレステロール（以下では“ＨＤＬ−コレステロール”）の不足は、前記疾患発生の危険因子であることが最近になって認識された。いくつかの臨床試験が、アテローム性硬化症に対抗するＨＤＬ−コレステロールの防御的役割を支持している。ある研究では、女性では血中ＨＤＬ−コレステロールが１ｍｇ／ｄＬ増加する毎に心脈管系疾患のリスクが３％減少することが示された（Gordon et al. (1989) Circulation, 79:8-15）。
【０００５】
ＨＤＬが“防御的”リポタンパク質であり（Vega and Grundy (1996) Curr. Opin. Lipidology, 7:209-216）、さらにＨＤＬの血漿レベルの増加がアテローム性硬化症の発生に対して直接的防御を提供することができると広く信じられている。多数の実験で、ヒトの冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）リスクおよび動物の実験的アテローム性硬化症の重篤度の両方が、血清のＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の濃度と反比例することが示された（Russ et al. (1951) Am. J. Med., 11:480-493; Gofman et al. (1996) Circulation, 34:679-697; Miller and Miller (1975) Lancet, 1:16-19; Gordon et al. (1989) Circulation, 79:8-15; Stampfer et al. (1991) N. Engl. J. Med., 325:373-381; Badimon et al. (1989) Lab. Invest., 60:455-461）。
ＨＤＬ／ＬＤＬ比が集団レベルでアテローム性硬化症および心臓疾患のリスクに対して良好なマーカーを提供することは明らかであるが、一方、ＨＤＬおよび／またはＬＤＬ測定値は、個体レベルでは良好な予後インジケーターではないことが判明した。高いＨＤＬ：ＬＤＬ比をもつ特定の個体で、重篤なアテローム性硬化症が観察されたが、一方、逆に非常に低いＨＤＬ：ＬＤＬ比をもつ個体でアテローム性硬化症の形跡は特定されなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アテローム性硬化症についての予後判定および／または診断、またはアテローム性硬化症のリスクを診断する新規なアッセイを提供する。本アッセイは、部分的には、ＨＤＬがプラーク形成を防止するメカニズムの解明に依拠している。特に、ＨＤＬまたはその成分は、脂質（例えばＬＤＬに存在する脂質）の酸化を防止することができ、さらにまた既に酸化された脂質を修復することも可能で、それによって、アテローム性硬化症のプラーク形成に付随し、さらにプラーク形成に特徴的な炎症性反応を減少させることができるということが本発明の発見である。さらにまた、ＨＤＬが前記の防御をもたらす能力は個体により変動するということも本発明の発見である。したがって、ＨＤＬの防御および／または修復活性のアッセイは、アテローム性硬化症およびそれに付随する病変のリスクに対する高度に有効なアッセイを提供する。
【０００７】
さらに、脂質の酸化を防止し、または既に酸化された脂質を修復しそれによって炎症性反応を減少させるＨＤＬ成分は、一般に炎症性過程（例えば慢性関節リウマチ、特発性肺線維症、狼瘡および他の慢性炎症性疾患）に付随する他の病変に対する感受性または重篤度を減少させることができると考えられる。
したがって、ある実施態様では、本発明は、動物のＨＤＬが酸化リン脂質を修復（還元）する能力を判定することによって哺乳類のアテローム性硬化症（または他の炎症性疾患）についてのリスクを判定する方法を提供する。本方法は、好ましくは、哺乳類の生物学的サンプル（高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）またはその成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼなど）を含む）を提供し、高密度リポタンパク質を酸化リン脂質と接触させ、さらに酸化または非酸化リン脂質の量の変化を測定することを含み、酸化リン脂質の量が変化しない場合は、前記哺乳類がアテローム性硬化症のおそれがあることが示される。
【０００８】
前記酸化リン脂質は、好ましくは単球反応を惹起する酸化リン脂質である。特に好ましいリン脂質には、以下から成る群から選択される脂質の酸化形が含まれる（ただしこれらに限定されない）：１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）、および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。特に好ましい実施態様では、酸化リン脂質は低密度リポタンパク質（に存在する）成分である。
【０００９】
酸化リン脂質（または還元リン脂質）は任意の都合のよい方法によって測定できる。そのような方法には、質量分析法、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、蛍光測定法、放射性同位元素検出、抗体検出、および酸化リン脂質を表示する標識由来のシグナルの検出が含まれるが、ただしこれらに限定されない。蛍光標識（例えば２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ローダミン、ｃｉｓ−パリナリン酸、ＮＢＤ、ｃｉｓ−パリナリン酸コレステリルエステル、ジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸）が特に好ましい。
ある種の実施態様では、前記検出は、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）から成る群から選択されるクロマトグラフィー方法を含む。
好ましいサンプルにはＨＤＬを含む液体サンプルまたは組織サンプルが含まれる。特に好ましいサンプルには全血または分画血液（例えば血清）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００１０】
サンプルは直接用いてもよいが、また別の選択肢としてＨＤＬをサンプルから単離してもよい。酸化リン脂質の変化および／または量は、対象集団の既知レベルと比較して、および／または種々のコントロールを参照して決定できる。そのようなコントロールには、酸化リン脂質レベルを減少させることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じる酸化リン脂質の量の変化；酸化リン脂質レベルを減少させる能力が不足していることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じる酸化リン脂質の量の変化；およびＨＤＬ非存在下または低濃度で存在するＨＤＬとともに実施した同じ実験で生じたリン脂質の変化が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
哺乳類はヒトまたはヒト以外の哺乳類であろう。特に好ましい哺乳類には、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタ、およびウサギが含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記ヒトは、ＨＤＬ：ＬＤＬ比が低いと診断されたか、および／またはアテローム性硬化症のおそれがあると診断されたヒトであろう。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、脂質を酸化から防御する哺乳類のＨＤＬの能力を測定することによって前記哺乳類のアテローム性硬化症のリスクを判定する方法を提供する。本発明は、好ましくは、哺乳類の生物学的サンプル（高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む）を提供し、前記高密度リポタンパク質をリン脂質と接触させ、前記リン脂質を酸化条件に付し、さらに酸化または非酸化リン脂質の量の変化を測定することを含み、酸化または非酸化リン脂質の量の変化によって、前記哺乳類がアテローム性硬化症のおそれがあることが示される。好ましい実施態様では、リン脂質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）として提供される。特に好ましいリン脂質は、酸化されたとき単球の反応を惹起させるリン脂質である。そのようなリン脂質には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）、および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【００１２】
ある種の実施態様では、リン脂質は、例えば過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、およびＨＥＴＥから成る群から選択される酸化剤とリン脂質を接触させることによって酸化条件に付される。酸化または還元リン脂質の検出は都合のよい任意の方法によって実施できるが、本明細書に記載する方法（例えば上記の方法）がもっとも好ましい。特に好ましい検出標識には、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ローダミン、ｃｉｓ−パリナリン酸、ＮＢＤ、ｃｉｓ−パリナリン酸コレステリルエステル、およびジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましいサンプルは上記および本明細書で述べるものである。血液または分画血液サンプルの場合、本方法は、前記血液もしくは分画血液サンプルを直接使用することも、または血液もしくは分画血液からＨＤＬを単離することも含むことができる。
【００１３】
酸化リン脂質の変化および／または量は、対象集団の既知レベルと比較して、および／または種々のコントロールを参照して決定できる。そのようなコントロールには、酸化リン脂質レベルを減少させることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じる酸化リン脂質の量の変化；酸化リン脂質レベルを減少させる能力が不足していることが分かっているＨＤＬと酸化リン脂質を接触させることによって生じる酸化リン脂質の量の変化；およびＨＤＬ非存在下または低濃度で存在するＨＤＬとともに実施した同じ実験で得られたリン脂質の変化が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明の方法にしたがってアッセイされる好ましい哺乳類は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類、例えば上記に記載したようなものであろう。特に好ましい対象は、ＨＤＬ：ＬＤＬ比が低いと診断されたか、および／またはアテローム性硬化症のおそれがあると診断されたヒトである。
【００１４】
さらに別の実施態様では、本発明は、哺乳類でアテローム性硬化症のリスクを判定するキットを提供する。本キットは、好ましくは１つもしくは２つ以上の酸化または非酸化リン脂質を入れた容器、および本明細書に記載するアッセイのためのプロトコルを提供する指示物を含む。キットは場合によって、酸化リン脂質検出用標識および／または、場合によって酸化剤（例えば、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥおよびＨＥＴＥ）を含む。ある種の実施態様では、キットは、１つまたは２つ以上の酸化リン脂質を入れた容器、および酸化リン脂質を還元する能力についてＨＤＬをアッセイするための指示物を含む。別の実施態様では、キットは、１つまたは２つ以上の非酸化（還元）リン脂質、および脂質（例えばＬＤＬ中の脂質）を酸化から防御する能力についてＨＤＬをアッセイするための指示物を含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明のアッセイ用検査装置を提供する。本検査装置は、好ましくは、収容領域を有する不活性の多孔質の基質を含み、前記多孔質の基質は輸送媒体と並列してあり、前記輸送媒体は、酸化脂質検出用試薬を含むテストメンブレンと並列している。
【００１５】
定義
“低密度リポタンパク質”または“ＬＤＬ”という用語の定義は、当業者が一般的に使用するものと一致する。一般に、ＬＤＬは、超遠心によって単離されたとき、ｄ＝１．０１９からｄ＝１．０６３の密度範囲で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
“高密度リポタンパク質”または“ＨＤＬ”という用語の定義は、当業者が一般的に使用するものと一致する。一般に、ＨＤＬは、超遠心によって単離されたとき、ｄ＝１．０６３からｄ＝１．２１の密度範囲で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
“Ｉ群ＨＤＬ”という用語は、（例えば低密度リポタンパク質中の）酸化脂質を還元するか、または酸化脂質を酸化剤による酸化から保護する高密度リポタンパク質またはその成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼなど）を指す。
“ＩＩ群ＨＤＬ”という用語は、酸化から脂質を保護する、または酸化脂質を修復する（例えば還元する）活性が低いかまたは全く活性をもたないＨＤＬを指す。
【００１６】
“ＨＤＬ成分”という用語は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を構成する成分（例えば分子）を指す。酸化からリン脂質を保護するか、または修復する（例えば酸化脂質を還元する）ＨＤＬのアッセイには、そのような活性を示すＨＤＬの成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼなど）のアッセイが含まれる。
本明細書で用いられるように、“単球の反応”という用語は、アテローム性硬化症のプラーク形成に付随する“炎症性反応”に特徴的な単球の活性を指す。前記単球の反応は、血管壁の細胞（例えば血管内皮細胞）への単球の付着、および／または内皮下腔への走化性、および／または単球のマクロファージへの分化という特徴を有する。
【００１７】
“変化が存在しない”という用語は、酸化リン脂質の量をいう場合は、検出可能な変化が存在しないこと、より好ましくは統計的に有意な変化（例えば８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは少なくとも９８％または９９％の信頼レベルの変化）が存在しないことを指す。（例えばＩ群のＨＤＬについて陽性結果が得られたとき）検出可能な変化が存在しないということは、酸化コレステロールレベルは変化するが、ＨＤＬの非存在下ほど、または他の陽性もしくは陰性コントロールと比較してもそれほど大きくはないアッセイもまた指すことができる。
【００１８】
本明細書では以下の略語が使用される：ＰＡＰＣ：Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＶＰＣ：１−パルミトイル−２−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＧＰＣ：１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ：１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＣｈＣ１８：２：コレステリルリノレート；ＣｈＣ１８：２−ＯＯＨ：コレステリルリノレートヒドロペルオキシド；ＤＭＰＣ：１，２−ジテトラデカノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＮ：パラオキソナーゼ；ＨＰＥ：標準化高出力野；ＰＡＰＣ：Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＶＰＣ：１−パルミトイル−２−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン；ＰＧＰＣ：１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ：１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＮ：パラオキソナーゼ；ＨＰＥ：標準化高出力野；ＢＬ／６：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ３Ｈ：Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ。
【００１９】
【課題を解決する手段】
本発明は、アテローム性硬化症の予後判定および／または診断、またはアテローム性硬化症のリスクの診断である新規なアッセイを提供する。これらアッセイは、部分的には、ＨＤＬがプラーク形成を防止するメカニズムの解明によるものである。
新しく単離された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は脂質ヒドロペルオキシドを含むことが記載された（Sevanian et al.(1997) J. Lipid Res., 38:419-428）。ＬＤＬの酸化には、ＬＤＬが酸化される前に反応種とともにＬＤＬが“播種される”ことが必要であると発明者らは考えている。酸化脂質の存在は、“炎症性反応”、すなわち単球結合、走化性、およびマクロファージへの分化の誘発をもたらす。この過程はアテローム性硬化症に特有のプラーク形成の基礎である。
【００２０】
より具体的には、特定の理論に拘束されないが、軽度に酸化されたＬＤＬ中の生物学的に活性を有する脂質（ｍ／ｚ５９４，６１０および８２８）は、一続きの３つの工程で形成されると考えられる。第一の工程は、リノール酸およびアラキドン酸の代謝生成物並びにコレステリルヒドロペルオキシドとともにＬＤＬが播種されることである。第二の工程は、内皮下腔中にＬＤＬが捕捉され、この捕捉されたＬＤＬに付近の動脈壁細胞に由来する別の反応性酸素種がデリバーされることを含む。第三の工程は、ＬＤＬリン脂質の非酵素的酸化であり、前記酸化は、“播種分子”（例えば１３−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸［１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］および１５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸［１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ］）の臨界閾値がＬＤＬ内で達成されたときに生じる。これによって、単球の結合、走化性およびマクロファージへの分化を誘発する固有の酸化脂質（ｍ／ｚ５９４，６１０，８２８）が生じる。本発明者らは、“播種分子”が臨界レベルに達したとき、それらは、主要なＬＤＬリン脂質、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）の非酵素的酸化では過酸化水素よりも約２オーダー強力な作用を示し、生物学的に活性を示す３種の酸化リン脂質（ｍ／ｚ５９４，６１０および８２８）が生成されることを示す証拠を提示した（Watson et al.(1997) J. Biol. Chem., 272:13597-13607; Watson et al.(1999) J. Biol. Chem., 274:24787-24798）。
【００２１】
また、本明細書に開示した実験は、血管造影によれば冠状動脈疾患の証拠があるが、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールおよびトリグリセリドレベルは正常であり、糖尿病ではなく、さらに低脂肪血症の投薬を受けていない、比較的稀な患者亜群から得られたＨＤＬは、正常なＨＤＬの場合とは対照的に、ヒト動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを保護せず、酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制できないことを示した。
したがって、我々は２組の対象者を特定した：１）そのＨＤＬが酸化脂質の形成に対して防御することができ、および／またはこれら酸化脂質を減少させまたは排除し、したがってアテローム性硬化症の付随する炎症性過程に対して防御を示す対象者（本明細書ではI群ＨＤＬと称する）；およびそのＨＤＬが酸化脂質の形成に対して防御することができず、および／またはこれら酸化脂質、特に酸化ＬＤＬを減少または排除しない対象者（本明細書ではＩI群ＨＤＬと称する）。また、これら２組の対象者間のＨＤＬ活性における相違が、少なくとも部分的には、通常のＨＤＬアッセイによる予想性の欠如の理由であると考えられる。これら２組の対象者（すなわちＩ群ＨＤＬを有する対象者とＩＩ群ＨＤＬを有する対象者）間を識別するアッセイは、重要な予防的および診断的価値を有する。
【００２２】
予防的アッセイとして、本発明の方法は、アテローム性硬化症に対して特に高いリスクを有する個体の特定を可能にする。そのような特定に基づいて、前記対象者はより頻繁な検査、食事の調節、血圧のモニタリングおよび調節などを採用することができる。診断的アッセイとして、本発明の方法は、従来の検査方法（例えばＨＤＬ：ＬＤＬ比など）を補って、通常の治療方式に抵抗性を示し、処方された治療を変更させる可能性がある対象者を特定する。したがって、例えば対象者がアテローム性硬化症の初期段階であると診断された場合は、本発明のアッセイを用いた陽性検査は、単なる食事／生活スタイルの変化よりは新たな別の薬剤治療を示唆することができる。
【００２３】
本発明は、そのようなアッセイの２つの好ましい実施態様を提供する。一方の実施態様では、本アッセイは、“Ｉ群ＨＤＬ”は実際に酸化リン脂質を減少および／または排除することができるという発見を利用する。したがって、その生物学的サンプルが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む前記哺乳類の生物学的サンプルを提供し、前記高密度リポタンパク質を酸化リン脂質と接触させ、さらに酸化または非酸化リン脂質の量の変化を測定することによってＩ群ＨＤＬは特定できる。ここで、酸化リン脂質の量に変化がない場合は、前記哺乳類はＩ群のＨＤＬを有し、したがってアテローム性硬化症のリスクが低いことを示している。逆に、酸化リン脂質の顕著な変化が観察されない場合は、対象者はＩＩ群のＨＤＬを有し、アテローム性硬化症のリスクが高い。
【００２４】
第二の実施態様では、本発明のアッセイは、Ｉ群ＨＤＬはＬＤＬおよび／またはＬＤＬのリン脂質含有成分の酸化を防止することができるという発見を利用する。これらのアッセイは、好ましくは、そのサンプルが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む哺乳類の生物学的サンプルを提供し、前記高密度リポタンパク質をリン脂質（例えば単離リン脂質または低密度リポタンパク質）と接触させ、前記リン脂質を酸化条件に付し、さらに酸化または非酸化リン脂質の量の変化を測定することを含む。酸化または非酸化リン脂質の量の変化は、ＨＤＬがＩＩ群ＨＤＬであり、脂質の酸化を防止していないことを示す。したがって、対象哺乳類はアテローム性硬化症について高いリスクを有する。酸化または非酸化リン脂質に実質的な変化が存在しない場合、前記ＨＤＬは脂質の酸化を防御することができ、対象者のアテローム性硬化症および付随する病変に対するリスクは低い。
【００２５】
さらにまた、脂質の酸化を防止するか、または既に酸化された脂質を修復し、したがって炎症性反応を減少させるＨＤＬ成分は、一般に炎症性過程（例えば慢性関節リウマチ、特発性肺線維症、狼瘡および他の慢性炎症性疾患）に付随する他の病変に対する感受性またはその重篤度を減少させることができると考えられる。したがって、本発明のアッセイは、慢性炎症に特徴的な病変をもつ対象者のリスクの表示または測定を提供する。
本発明のアッセイが診断的／予後判定的価値をもつためには、具体的な病変の存在またはそのリスクについて決定的である必要はない。典型的には、例えば本発明によって提供されるようなアッセイの結果は、当業者には公知の他の疾患インジケーター／危険因子を利用することができる種々の診断の１つとして用いられる。疾患の状態または予後の判定は、続いて生活スタイル、治療方式（例えばある種の予防薬を利用するか否かの決定など）に関する決定に情報を提供することができる。
本発明のアッセイは、迅速、簡単、安価であり、“家庭用テストキット”として容易に形態を整えることができる。
【００２６】
Ｉ．ＨＤＬ活性のアッセイ
上記で示したように、好ましい実施態様では、本発明のアッセイは１つまたは２つの好ましい様式をもつ。第一の様式では、ＨＤＬは、（例えば低密度リポタンパク質中の）酸化リン脂質のレベルを減少させる能力についてアッセイされる。第二の様式では、ＨＤＬは、酸化剤による酸化からリン脂質を保護する能力についてアッセイされる。
両アッセイ様式は、ＨＤＬ（またはその成分）を含む生物学的サンプルを脂質（アッセイに応じて酸化または非酸化脂質）と接触させ、さらに酸化脂質または酸化されていない脂質の量を検出することを前提条件として必要とする。これらアッセイは、第一のアッセイでは、ＨＤＬ（またはＨＤＬの成分）を酸化脂質（そのような脂質を含むＬＤＬ）と接触させ、一方、第二のアッセイでは、ＨＤＬを酸化されていない脂質と接触させ、さらに酸化剤と前記脂質を接触させてＨＤＬによって得られる酸化の防御を評価する。
【００２７】
Ａ．ＨＤＬを含む生物学的サンプルの提供
好ましい実施態様では、アッセイは、問題の生物／対象者の生物学的サンプルを用いて実施される。本アッセイはヒトで極めて有用であるが、ただしそのように限定されるものではない。ＨＤＬサブタイプは本質的に全ての哺乳類に存在し、したがって本発明のアッセイは獣医学的利用についても同様に意図される。したがって、適切な対象者には、ヒト以外の霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウサギなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
適切な生物学的サンプルには、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）またはその成分を含む任意の生物学的材料（例えば体液、細胞、組織、器官など）が含まれる。特に好ましい組織は肝臓組織である。もっとも好ましい実施態様では、生物学的サンプルは血液である。本明細書で用いられるように、血液サンプルには全血サンプルまたは分画血液サンプル（例えば血清）が含まれる。前記サンプルは新鮮な血液でも保存血（例えば血液バンクの）でも、または分画血液でもよい。サンプルは、特に本発明のアッセイのために得られた血液サンプルでも、別の目的で得られ本発明のアッセイのために分取された血液サンプルでもよい。
【００２８】
サンプルは、必要にしたがって適切な緩衝液で希釈によって予備処理するか、ヘパリンを添加するか、所望の場合は濃縮するか、または任意の多くの方法（超遠心、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、硫安によるアポリポタンパク質Ｂ含有タンパク質の沈殿または他の方法を含むが、ただしこれらに限定されない）によって分画することができる。多様な緩衝物質、例えばリン酸塩、トリスなどを生理学的ｐＨで利用する標準的な任意の水性緩衝溶液を用いることができる。
ある種の実施態様では、サンプルは直接アッセイされる。他の実施態様では、ＨＤＬはサンプルから単離される。ＨＤＬを単離する方法も同様に当業者には公知である（例えば以下を参照されたい：米国特許4,883,765号；5,118,613号；5,215,886号など）。しかしながら、好ましい実施態様では、抗アポＡ−Ｉ抗体を固相支持体（例えばガラスまたは樹脂または磁性ビーズ）に結合させる。抗体を結合させた基質をウェルの血漿に添加し、さらに血漿を除き、アッセイ用試薬を添加してシグナルを検出する。
【００２９】
Ｂ．ＨＤＬと脂質の接触
続いて、生物学的サンプルのＨＤＬを脂質（上記のようにアッセイにしたがって酸化または非酸化脂質）または脂質の集合物（単離脂質またはＬＤＬとして提供される）と接触させる。前記ＨＤＬは完全に単離されてあってもよいが、また完全な（例えば未分画）生物学的サンプルを前記脂質と接触させてもよい。部分的または完全にＨＤＬを単離する方法は当業者には公知である（例えば以下の文献を参照されたい：Havel et al. (1955) J. Clin. Invest., 43:1345-1353; Navab et al.(1997) J. Clin. Invest., 99:2005-2019; Carroll & Rudel (1983) J. Lipid Res., 24:200-207; McNamara et al. (1994) Clin. Chem. 40:233-239; Grauholt et al.(1986) Scandinavian J Clin. Lab. Invest. 46:715-721; Warnick et al.(1982) Clin. Chem. 28:1379-1388; Talameh et al.(1986) Clin. Chimica Acta 158:33-41）。
【００３０】
好ましい実施態様では、接触させる脂質は、酸化させることができる１つまたは２つ以上の脂質（好ましくはリン脂質）を含む。好ましい脂質には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：還元されている（酸化されていない）１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）、および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【００３１】
これらの脂質は例示であって、これらに制限しようとするものではない。当業者は他の適切な脂質を容易に特定できよう。前記は、問題の脂質を酸化剤（例えば過酸化水素、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、ＨＥＴＥなど）と接触させ、生じた酸化脂質の量を測定することによって簡単に達成される。また別には、酸化脂質／ＬＤＬは、アテローム性硬化症のプラーク形成に特徴的な反応（例えば単球付着、および／または走化性、および／または血管内皮細胞培養における分化の誘発）を誘発する能力についてアッセイすることができる。
脂質は“単離“または“部分的に単離”された脂質として提供してもよいが、また低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の形態で提供／接触させてもよい。ＬＤＬは生物から単離したＬＤＬであってもよいが、また合成により集合／創出したＬＤＬでもよい。脂質（例えばリン脂質）および／またはＬＤＬを単離または合成する手段は当業者には周知である（例えば以下の文献を参照されたい：Havel et al. (1955) J. Clin. Invest., 43:1345-1353; Navab et al.(1997) J. Clin. Invest., 99:2005-2019; Carroll & Rudel (1983) J. Lipid Res., 24:200-207）。
【００３２】
Ｃ）酸化脂質のレベルの検出
上記に示したように、前記アッセイは、酸化脂質または逆に酸化されていない脂質の量を検出することを含む。好ましい実施態様では、アッセイの脂質含有量は本質的に一定であるので、酸化脂質または酸化脂質の変化の測定は、酸化されていない脂質または酸化されていない脂質の量の変化の測定を提供し、逆の場合もまた然りである。
酸化脂質を測定する方法は当業者には周知である（例えば以下の文献を参照されたい：Vigo-Pelfrey et al. Membrane Lipid Oxidation, Volume I-III. CRC Press）。前記の方法には、質量分析法、吸収分光法（例えば２３４ｎｍのＵＶ吸収を用いる）、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、および種々の“酸化状態”感受性試薬の使用（例えば種々のレドックス反応において）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００３３】
酸化脂質（例えば過酸化脂質）を測定するこれまでに知られた方法には、ウィーラー法、チオシアン酸鉄法、チオバルビツル酸法などが含まれる。ウィーラー法（Wheeler (1932) Oil and Soap, 9:89-97）は、酸化脂質をヨウ化カリウムと反応させヨウ素を単離し、続いてこれをチオ硫酸ナトリウム標準液で定量するものである。チオシアン酸鉄法（Stine et al.(1954) J. Dairy Sci., 37:202）では、酸化された過酸化脂質をチオシアン酸アンモニウムおよび塩化第一鉄と混合し、生成したチオシアン酸鉄の青色を比色計で測定する。チオバルビツル酸法（Tappel & Zalkin (1959) Arch. Biochem. Biophys., 80:326）では、過酸化脂質を酸性条件下で加熱し、生じたマロンジアルデヒドをチオバルビツル酸と縮合させて赤色染料を生成し、続いてこれを比色計で測定する。
【００３４】
別のアプローチでは、ペルオキシダーゼが過酸化脂質を分解すること、および、適切な水素供与体が反応系に存在する場合は、生成反応系は量の増した過酸化脂質により強く着色することが示された（例えば米国特許4,367,285号を参照）。したがって、ある実施態様では、本発明のアッセイは、ペルオキシダーゼおよび水素供与体を利用することができる。
多くのペルオキシダーゼが適切である。好ましい実施態様では、本発明で用いられるペルオキシダーゼは、好ましくはいずれの市販のセイヨウワサビペルオキシダーゼでもよい。
【００３５】
好ましい実施態様では、本発明で用いられる水素供与体は、好ましくは酸化に際して発色するか、蛍光または発光を生じる酸化能力を有する公知の化合物のいずれでもよい。通常の着色、蛍光、発光試薬を用いることができる。使用することができる通常の着色試薬には、ガイヤコール、フェノールを含む４−アミノアンチピリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを含む４−アミノアンチピリン、ジメチルアニリンを含む３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン、オルト−ジアニシジンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。典型的に有用な蛍光試薬には、ホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な発光試薬にはルミノールなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらの試薬の全ては単に本発明の水素供与体の例示として記載され、これらに限定しようとするものではない。
【００３６】
使用される水素供与体の量は、好ましくはテストサンプル中に含まれる過酸化脂質１モルに対して少なくとも等モル濃度、好ましくは２モル未満である。前記の量は、サンプルのサイズおよびサンプル中の過酸化脂質含有量にしたがって変動可能である。
使用することができる適切な反応媒体には、ジメチルグルタレート−水酸化ナトリウム溶液、リン酸緩衝液、およびトリス−塩酸緩衝液（通常約ｐＨ５から約ｐＨ９）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００３７】
典型的な（高容量）アッセイ（３ｍＬ）は、５０ｍＭのジメチルグルタレート−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含み、前記緩衝液は、０．０３％（ｗ／ｗ）の４−アミノアンチピリン、０．０４％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジメチルアニリンおよび４．５ユニットのペルオキシダーゼを含む。典型的な測定では、アッセイ溶液を３７℃に予備加温し、過酸化脂質を含むテストサンプル５０μＬを添加する。混合物を３７℃で１５分インキュベートし、生じた色の濃さを分光光度計により例えば５６５ｎｍの波長で測定する。サンプル中の過酸化脂質の量は吸光値から計算する。
反応時のｐＨ、反応時間、測定波長などの因子は、使用される試薬にしたがって変動可能である。適切な条件は環境にしたがって選択できる。
【００３８】
酸化脂質についてのまた別の種類のアッセイは米国特許4,900,680号に開示されている。前記のアプローチでは、酸化脂質（例えばヒドロペルオキシド）を、２価の陽イオンを生じる遷移金属の塩または水酸化物、２価の遷移金属の複合体、ヘム、ヘムペプチド、ヘムタンパク質、またはヘム酵素と反応させる。生じた活性酸素および酸素ラジカルは発光物質と反応し、この反応によって放出された光を光学的に測定する。脂質ヒドロペルオキシドに作用して活性酸素種（例えば活性酸素または酸素ラジカル）を生じる触媒の例は、２価の陽イオンを生じる遷移金属塩（例えば塩化第一鉄、硫酸第一鉄、フェリシアン化カリウム、これらは各々Ｆｅ2+を生じる；塩化第一マンガン、硫酸第一マンガン、これらは各々Ｍｎ2+を生じる；または塩化コバルト、硫酸コバルト、これらの各々はＣｏ2+を生じる）；上記に述べた遷移金属の水酸化物；２価の遷移金属の複合体（例えば鉄（ＩＩ）−ポルフィリン複合体）；ヘムタンパク質（例えば、チトクロームＣ、ヘモグロビン、またはミオグロビン）；ヘムペプチド（例えばヘムタンパク質を例えばキモトリプシンまたはトリプシンのようなプロテアーゼで分解することによって得られる化合物）；およびヘム酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはプロスタグランジンペルオキシダーゼ）である。
【００３９】
好ましい触媒化合物には、ヘムタンパク質、ヘムペプチドまたはヘム酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。もっとも普通には、ヘムタンパク質、例えばチトクロームＣが操作の容易さから使用される。触媒化合物の濃度は、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬから約１０００μｇ／ｍＬの範囲で、通常は約１μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬの範囲内に入る。例えば、もっとも良好な発光効率は、濃度がチトクロームＣについては約１０μｇ／ｍＬ、チトクロームＣヘムペプチドについては約１２０μｇ／ｍＬ、さらにセイヨウワサビペルオキシダーゼについては約１０μｇ／ｍＬであるときに得られる。
【００４０】
発光物質は特定のものに限定されないが、ただし前記物質は活性酸素または酸素ラジカルと反応して光を放出することを条件とする。前記化合物の例には、ポリヒドロキシフェノール（例えばピロガロール、パープロガリンなど）、フタラジン誘導体（例えばルミノール、イソルミノールなど）、インドール誘導体（例えばインドール酢酸、スカトール、トリプトファンなど）、チアゾリジン誘導体（例えばキプリジナセア＝ルシフェリン（Cypridinacea luciferin）、ロフィンなど）、アクリジン誘導体（例えばルシゲニン）、シュウ酸誘導体（例えばビストリクロロフェニルオキサレート）、および１，２−ジオキサ−４，５−アジン誘導体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。発光物質の濃度は使用される化合物により変動する。濃度は、好ましくは０．１μｇ／ｍＬまたはそれ以上である。ルミノールを用いるときは、その濃度はもっとも好ましくは１μｇ／ｍＬである。
【００４１】
測定は、好ましくは、発光試薬（例えばヘムタンパク質およびルミノール）の弱塩基溶液中で実施される。好ましいｐＨ値は約ｐＨ９から約ｐＨ１０の範囲である。多くの緩衝液が適切である。好ましい緩衝液は、ホウ酸緩衝液（Ｈ3ＢＯ3--ＫＯＨ）、炭酸緩衝液（Ｎａ2ＣＯ3--ＮａＨＣＯ3）、グリシン緩衝液（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ--ＮａＯＨ）などである。ホウ酸緩衝液がもっとも好ましい。
発光試薬溶液に溶解した酸素が微量の酸化脂質の分析に緩衝するのを防ぐために、発光試薬溶液は、望ましくは不活性ガスでパージして酸素を除去し、安定な測定値を得る。不活性ガスの例は窒素ガスおよびアルゴンガスである。
サンプル中の酸化脂質の濃度は検量線から算出する。検量線は標準的な方法によって、例えばメチルリノレートヒドロペルオキシド、アラキドン酸ヒドロペルオキシド、ホスファチジルコリンヒドロペルオキシド、ホスファチジルエタノールアミンヒドロペルオキシド、およびトリアシルグリセロールヒドロペルオキシドから選択される物質を用いて作製できる。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明のアッセイは、その蛍光が酸化状態により変化する蛍光物質を利用する。そのような蛍光物質は当業者には周知で、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ローダミン、ｃｉｓ−パリナリン酸、ＮＢＤ、ｃｉｓ−パリナリン酸コレステリルエステル、ジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのようなインジケーターの使用は実施例で説明する。
酸化脂質を検出／定量する前述の方法は例示であって、前述の方法に限定しようとするものではないことは理解されよう。酸化脂質をアッセイする多数の他の方法が当業者に知られており、本出願の範囲内に含まれる。
【００４３】
Ｄ）脂質と酸化剤の接触
上記で述べた“第二の”アッセイ様式では、（単離されたまたはＬＤＬ中に存在する）脂質または脂質集合物を酸化剤と接触させ、前記脂質を酸化から保護する能力についてＨＤＬをアッセイする。本質的にリン脂質を酸化することができるいずれの薬剤も本発明での使用に適している。そのような薬剤には種々の過酸化物が含まれるが、ただしこれらに限定されず、特に好ましい実施態様では、酸化剤は過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ（ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸）、ＨＰＥＴＥ（ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸）、ＨＯＤＥ、ＨＥＴＥなどである。
他の酸化剤の適切性は容易に決定できる。これは、ＬＤＬおよび／または問題の単離リン脂質を酸化剤と接触させ、生成された酸化脂質の量を測定することによって容易に実施できる。また別には、酸化脂質／ＬＤＬは、アテローム性硬化症のプラーク形成に特徴的な反応（例えば単球の付着の誘発、および／または単球の走化性の誘発、および／または血管内皮細胞培養における分化の誘発）を誘発するその能力についてアッセイしてもよい。
【００４４】
Ｅ）アッセイの判定
本アッセイは、そのアッセイにおいてＨＤＬが酸化リン脂質の量を減少させるか、または脂質が酸化されるのを防ぐ場合には、“Ｉ群”ＨＤＬについて陽性と判定する（“ＩＩ群”ＨＤＬについては陰性）。逆に、本アッセイは、そのアッセイにおいてＨＤＬが酸化リン脂質の量を減少させないか、またはアッセイで脂質が酸化されるのを防ぐことができない場合、“Ｉ群”ＨＤＬについて陰性と判定する（“ＩＩ群”ＨＤＬについては陽性）。
最初の実験が、いくつかのＨＤＬは防御を提供し他のものはそうではないことを示した場合、集団レベルで反応の分布が二項性であることは予測できないし必要でもない。それとは反対に、ＨＤＬによる脂質の酸化に対する防御の程度または酸化脂質の修復の程度は、対象者における遺伝、性別、生理的成熟度、人種、（女性については妊娠の段階）、健康状態、免疫能力のようなパラメータにより変動することは予想される。
【００４５】
本発明のアッセイが商業的に使用されることを促進するために、ＨＤＬによって得られる防御に対するこれらの（および他の）パラメータの影響を日常的に決定することができる。したがって、例えば、ＨＤＬによる防御は、他の手段によってアテローム性硬化症のリスクが非常に低いと診断された老齢者、およびアテローム性硬化症が進行していると決定された老齢者でアッセイできる。これは、老齢者における“防御性ＨＤＬ”の活性または“非防御性ＨＤＬ”における活性の欠如の基準を提供し、若年者のＨＤＬ活性との比較を可能にする。これらの他のパラメータの影響も同様に決定可能で、そのような実験から、防御性および非防御性ＨＤＬについての集団のベースラインの“活性”レベルが決定できる。
【００４６】
そのような測定は、非常に重要な“絶対的”基準をもたらす必要はないことが強調される。相対的なリスク評価が極めて有用である。なぜならば、アテローム性硬化症のリスクが増しているという指摘は比較的小さな投資（例えば運動の増加、食事の変更、追跡検査の増加など）を呼びかけることができるので、擬陽性（すなわち個体のアテローム性硬化症のリスクがより高いという指摘）によるダウンサイドリスクは比較的重大ではない。同様に、アテローム性硬化症について他の診断因子／危険因子（例えばＨＤＬ：ＬＤＬ比、血圧追跡検査、行動因子および一般的健康因子など）が存在する場合、擬陰性（すなわち個体のＨＤＬは脂質酸化に対して防御を提供するという指摘）のダウンサイドリスクもまた比較的軽微である。
【００４７】
アッセイは、対応する集団に対して決定したレベル（例えば、上記で述べた種々のパラメータについて修正されている）とアッセイ結果を比較することによって、および／または陽性または陰性コントロールとの直接比較によって、陽性、陰性または連続体（例えば、個々のリスクレベルが非常に低いリスクから低いリスクへ、中等度のリスク高いリスク非常に高いリスクへと変化する）上の１つの判定に割り当てられる。したがって、例えば、脂質を対象者のＨＤＬと接触させることによって生じた酸化脂質の変化についてのアッセイの結果は、ＨＤＬ非存在下で（または低濃度のＨＤＬとともに）実施した“コントロール”アッセイと比較することができる。この例では、ＨＤＬの非存在下でのアッセイと比較してＨＤＬの存在下での酸化脂質の減少は、ＨＤＬが酸化脂質の保護／修復を提供したことを示している（すなわち、“Ｉ群ＨＤＬ”について陽性）。
【００４８】
同様に、ＨＤＬが酸化剤から脂質を保護する能力についてアッセイされるアッセイでは、アッセイ結果は、ＨＤＬを欠いている（または低濃度でＨＤＬが存在している）ということ以外は同一のコントロールアッセイと比較できる。ＨＤＬ非存在下で、または低濃度ＨＤＬ存在下でアッセイがより多くの酸化脂質を示す場合は、このアッセイはＩ群ＨＤＬについて陽性と判定される。
テストアッセイとコントロールアッセイとの間に相違が検出される場合、より好ましくは相違が統計的に有意である場合は（例えば、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは少なくとも９８％または９９％の信頼レベルで）、上記で述べたようにこのアッセイは陽性と判定される。
【００４９】
ＩＩ．アッセイ様式
本発明のアッセイは、手近な個々のニーズに応じてほとんど無制限に多様な様式で実施できる。前記の様式には、慣習的な“湿式化学反応”（例えば実験室で実施される）、高処理アッセイ様式（例えば病理検査室または他の臨床検査室で実施される）および“検査片”様式（例えば家庭または医院で実施される）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
Ａ）慣習的湿式化学反応
本発明のアッセイは慣習的な“湿式化学反応”のアプローチを用いて実施できる。基本的には、これは、それらが研究室で実施されるようにアッセイを実施することを含む。典型的には、アッセイは液相（例えば、必要に応じて反応混合物に添加された適切な試薬（例えば脂質、酸化脂質、酸化剤など）を含む緩衝液中）で実施される。酸化脂質の濃度は、標準的な方法および装置を用いてアッセイされる。
【００５０】
Ｂ）高処理アッセイ様式
集団の調査が実施される場合は、および／または臨床／商業的検査室で調査が実施される場合（このような場合には数十、数百、または数千のサンプルが（時には１日で）処理される）、高処理様式を用いてアッセイを実施することがしばしば好ましい。高処理アッセイ様式は高度な設備を有するアッセイで、サンプルの処理、アッセイの実施、アッセイデータの収集および（しばしば）結果の分析において人間の介在を最小限にする。好ましい実施態様では、高処理システムは、連続した“フロースルー”システムとして、および／または多数の並列システムとしてデザインされる。
【００５１】
フロースルーシステムは、典型的には連続した液体の流れが提供され、この流れに沿って種々の試薬／操作が種々の場所に配置される。したがって、例えば、血液サンプルは受容領域に適用され（ここでサンプルは緩衝液と混合される）、さらに流れは、大きな球状物質（例えば細胞）を除去する細胞分類装置に導かれ、得られた液体はさらに種々の試薬を通過する（例えば、その場合試薬は“インプットステーション”で添加されるか、または単純に液体が流れる導管の壁に試薬は固定されてある）。したがって、例えばサンプルは、連続して脂質（例えばＬＤＬとして提供される）、続いて酸化剤、酸化検出用薬剤と一緒にされ、さらに検出装置へ送られ、ここでシグナル（例えば比色シグナルまたは蛍光シグナル）が読み取られ、酸化脂質が測定される。
【００５２】
多数の並列的高処理システムでは、典型的には、サンプルは、コンピューター制御ロボットがサンプル処理、試薬操作およびデータ収集を調節する、マイクロタイタープレート様式（例えば９６ウェルプレート、１５３６ウェルプレートなど）で処理される。そのようなアッセイでは、種々の試薬は全て溶液として提供できる。また別の選択肢として、いくつかまたは全ての試薬（例えば酸化脂質、インジケーター、酸化剤など）は、マイクロタイタープレートの壁に固定された状態で提供することができる。
【００５３】
本発明のアッセイに容易に適合させることができる高処理スクリーニングは、市販されている（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MAなど）。これらのシステムは、典型的には全操作（全てのサンプルおよび試薬のピペット分注、液体の分散、時間設定インキュベーション、およびアッセイに適した検出装置での最終的なマイクロプレートの読み取りを含む）が自動化されている。これらの組み立て可能なシステムは、高処理性を有し始動が迅速であると同時に融通性が高くさらに個々のニーズへの対応性を提供する。そのようなシステムの製造業者は、種々の高処理のための詳細なプロトコルを提供している。したがって、例えばザイマーク社（Zymark Corp.）は、技術会報を提供し、これには、遺伝子転写の調節、リガンド結合などの調節を検出するスクリーニング系が記載されている。
【００５４】
Ｃ）“検査片”アッセイ様式
別の好ましい実施態様では、本発明のアッセイは、“検査ウェル”または“検査片”様式で提供される。“検査ウェル”または“検査片”様式では、生物学的サンプルはウェルに入れるか、または細片上の受容ゾーンに適用され、続いて蛍光または比色用インジケーターが生じる。この場合、インジケーターは対象者のＨＤＬまたはその成分によって達成できる保護または修復の測定値を提供する。
血液検査のための種々の物理的アレンジメントを開示した多くの特許が発行されている。これらの特許には、血漿検査と同様に血液の側面移動または水平移動を含むシステムが含まれている。例えば、米国特許4,876,067号、4,861,712号、4,839,297号および4,786,603号は、グラスファイバーなどを用いる血液から血漿を単離することを含む体液成分の分析的測定用検査キャリアーおよび方法を開示している。上記の特許は全て、使用中に検査パッドまたは検査パッドの一部分のある種の回転を必要とするシステムを開示している。米国特許4,816,224号は、全血から血漿または血清を分離し、さらにその後の反応のために全血から血漿を除去するために特有の容積および吸収を有するグラスファイバーを用いて血清を分析する装置を開示している。同様に、米国特許4,857,453号は、毛細管作用および封入液体試薬（目に見えるインジケーターを含む）を含む検査片を用いる装置を開示している。米国特許4,906,439号は、導管または溝による側面移動で液体のデリバリーを実施する、体液サンプルの効率的で正確な分析を実施する診断用装置を開示している。
【００５５】
上記の特許（これらは血液検査用システムの種々のタイプを示す従来技術の代表である）の他に、最近発行された特許は、ＨＤＬコレステロールの測定について特有の化学反応を目的としている。したがって、米国特許4,851,335号および4,892,815号（ともにKerscher et al）は、ＨＤＬコレステロールの測定について固有のタイプの処理および試薬を開示している。
米国特許5,135,716号は、全血から血漿を得て、血漿のＨＤＬコレステロールレベルを決定することによってＨＤＬコレステロールを決定する装置を開示している。
【００５６】
本発明は、血漿分離を含むサンプル処理、（所望する場合は）ＨＤＬの計測、脂質（酸化または非酸化）との接触、場合によって酸化剤との接触および酸化脂質の検出が細片中に構築されてあり、その結果、ユーザーの操作が最小限で、さらに全血および／または血清から直接、ＨＤＬの防御活性が１、２分で測定できる装置を目的とする。好ましい実施態様では、本方法は反応終末点を測定し、したがって正確な時間コントロールおよび温度コントロールを必要としない。
好ましい実施態様では、本装置は、米国特許5,135,716号に記載されたものと類似している。したがって、例えば、ある実施態様では（例えば図１）、本装置は、不活性または活性な基質支持体１を含む。受容領域／受容レザバー１１、および／またはろ過膜が場合によって存在する。アッセイ試薬（典型的には酸化または非酸化脂質および酸化剤）は検査装置に配置されている。脂質および／または、場合によってキャリア／検出膜。検査膜６は酸化脂質と反応する反応物を有し、定量された酸化脂質、非酸化脂質または酸化脂質：非酸化脂質比を示す。
【００５７】
使用時には、血液は物理的輸送媒体３の血液適用領域１１に添加される。血液は導管２および物理的輸送媒体３に沿って移動する。輸送媒体３は、例えば１７ミクロンのメッシュ開口を有するモノフィラメントポリエステルの織りメッシュ（Tetko, Briarcliff, N.Y.）で、約７５ミクロンの厚さを有する。織りファブリック、不織ファブリック、ガーゼ、およびモノフィラメントヤーンが、物理的輸送媒体３として示した輸送膜のための多くの選択の中でとりわけ挙げられる。血漿分離は沈殿と同様、多数の微小孔を有する血漿分離膜４（この事例では５ミクロンのニトロセルロース（Schleicher and Schuell, Keene, N.H.）によって処理される。
【００５８】
オプションのろ過膜５はＬＤＬおよびＶＬＤＬ沈殿物をろ過して除去し、それらが検査膜６に到達するのを防ぐ。配置されている場合は、ある実施態様では、ろ過膜５は、処置を施さずに使用される０．４ミクロンの疎水性のポリカーボネートメンブレン（Poretics Corp., Livermore, CA）、または０．２ミクロンのナイロン（Micron Separations, Inc., Westboro, M.A.）、または０．８ミクロンのポリスルホン（Gelman Sciences, Ann Arbor, M.I.）である。後者の２つは、５％または１０％のポリエチレングリコール（分子量１０００ダルトン）水溶液で飽和させ乾燥させる。
好ましい実施態様では、上記の検査膜６は、酸化脂質をアッセイする酵素および／または色素原および／または蛍光物質を含み、それにより、そこに到達したＨＤＬ含有サンプル（今やＬＤＬおよびＶＬＤＬを含まない）は、検査膜６中の試薬（例えば酸化脂質、非酸化脂質および酸化剤）と反応して着色反応を生じ、着色の強さは、酸化脂質および／または非酸化脂質（還元脂質）の濃度に比例する。
【００５９】
好ましい実施態様では、検査膜６は０．４５ミクロンのナイロン膜（Micron Separations, Inc. Westboro, M.A.）である。上部のシート７は開口部１２および透明領域２９を有し、矢印８および９で示すように他の成分の上部を覆って付着している。透明領域２９は、酸素透過性であってもなくてもよい透明な膜で覆われた割れ目を含む。
開口部１２から１滴の血液を、物理的輸送媒体３の血液適用領域１１に適用し、比色反応を透明領域２９から見ることができる。また別の選択肢として、不活性な基質支持体が存在しないとき、１枚または２枚以上の層は前記装置を支持するために十分な強度を有することができる。
そのような層状構造を有する装置をサンプルを適用する検査片として、サンプルに浸す“ディップスティック”として、またはサンプル受容容器の成分としてデザインできることは理解されよう。さらにまた、本実施態様は例示であって、これに限定しようとするものではないことは理解されよう。本明細書に提供した開示および“検査片”に付随する大量の文献にしたがえば、本発明の方法のＨＤＬ活性についてのアッセイは、当業者には容易に組み立てが可能であろう。
【００６０】
Ｖ．キット
別の実施態様では、本発明は、本明細書に開示したアッセイの１つまたは２つ以上を実施するキットを提供する。アッセイキットは、好ましくは、１つまたは２つ以上の酸化脂質（単離脂質またはＬＤＬとして提供される）を入れた１つまたは２つ以上の容器、および／または還元（酸化されていない）脂質、および酸化剤（例えば過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＯＤＥ、ＨＥＴＥ、ＨＰＥＴＥなど）を含む。キットは、好ましくは、酸化脂質を検出する１つまたは２つ以上の試薬（例えば２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ローダミン、ｃｉｓ−パリナリン酸、ＮＢＤ、ｃｉｓ−パリナリン酸コレステリルエスエル、ジフェニルヘキサトリエンプロピオン酸、および他の蛍光物質）を含む。キットは、場合によって、本明細書に記載したアッセイの実施のために１つまたは２つ以上の任意の装置および／または試薬を含むことができる。そのような装置および／または試薬には、マイクロタイタープレート、緩衝物質、蛍光定量用フィルターなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００６１】
さらにキットは、場合によって、標識および／または本アッセイ方法の実施の指示（すなわちプロトコル）を提供する指示用物質を含む。好ましい指示用物質には、脂質を酸化から保護する能力または酸化脂質を還元する能力についてＨＤＬ（またはその成分）をスクリーニングすることについて記載されている。指示物質には、場合によってアテローム性硬化症のリスクを検定するために前記のアッセイを使用することについての記載が含まれる。
指示物質は典型的には手書きまたは印刷物を含むが、そのようなものに限定されない。前記の指示を記録し、それらを末端ユーザーに伝達することができるいずれの媒体も本発明に包含される。前記媒体には、電子記録媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記媒体には、前記指示物質を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれる。
【００６２】
【実施例】
以下の実施例は例示を提供し、本発明を限定するものではない。
実施例１：正常なＨＤＬは軽度に酸化されたＬＤＬの生成における３つの工程を抑制する−工程１
アポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉペプチド擬似体は“播種分子”をヒトＬＤＬから除去し、ヒト動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを耐性にさせる。アポＡ−Ｉ関連“播種分子”には、１３−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸［１３−ＨＰＯＤＥ］および１５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸［１５−ＨＰＥＴＥ］が含まれる。脂肪線条病巣形成に遺伝的に感受性を有するマウスのＬＤＬは動脈壁細胞による酸化に対して高い感受性を有し、in vitroでアポＡ−Ｉとインキュベートした後では酸化に対して耐性となった。マウスにアポＡ−Ｉ（アポＡ−ＩＩではない）を注射することによって、そのＬＤＬは３時間以内に酸化に対して耐性になった。アポＡ−Ｉのヒトへの輸液によって、そのＬＤＬは６時間以内に酸化に対して耐性になった。ＨＤＬおよびその関連する酵素パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）もまた、ＬＤＬを酸化に対して耐性にした。発明者らは以下のように結論した：（１）動脈壁細胞によるＬＤＬの酸化は、１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥを含む“播種分子”を必要とする；（２）アテローム発生に遺伝的に感受性を有するマウスのＬＤＬは動脈壁細胞によってより容易に酸化される；（３）正常なＨＤＬおよびその成分は、ヒトの動脈壁細胞による酸化に必要な新しく単離されたＬＤＬ中の脂質を除去または不活化することができる。
【００６３】
序論
ＨＤＬおよびその主要なアポリポタンパク質（アポＡ−Ｉ）は、細胞からコレステロールおよびリン脂質を除去することが知られている（Oran & Yokoyama (1996) J. Lipid Res., 37:2473-2491; Forte et al. (1995) J. Lipid Res., 36:148-157; Bruce et al. (1998) Ann. Rev. Nutr., 18:297-330; Phillips et al. (1998) Atheroscler., 137(補遺):S13-S17）。Stockerおよびその共同研究者ら（Christison et al. (1995) J. Lipid Res., 36:2017-2026）およびFluiterら（J. Biol. Chem., 274:8893-8899(1999)）は、部分的にコレステリルエステル移転タンパク質によって仲介されて、コレステリルエステルヒドロペルオキシドがＬＤＬからＨＤＬに移されることを報告した。Fluiterおよび共同研究者ら（上掲書）はまた、ラット肝実質細胞によって酸化コレステリルエステルがＨＤＬから選択的に取り込まれることを示した。Stockerおよび共同研究者ら（Garner et al. (1998) J. Biol. Chem., 273:6080-6087）は、アポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩはともに、固有のメチオニン残基の酸化を伴うメカニズムを介してコレステリルエステルヒドロペルオキシドを還元することができることを報告した（Garner et al.(1998) J. Biol. Chem., 273:6088-6095）。しかしながら、酸化脂質をリポタンパク質および細胞から除去するアポＡ−Ｉの直接の役割はこれまで報告されていない。
【００６４】
Sevanianおよび共同研究者らは、彼らがＬＤＬ-と記載した新しく単離したＬＤＬの亜集団は脂質ヒドロペルオキシドを含むことを記載した（Sevanian et al. (1997) J. Lipid Res. 38:419-428）。Parthasarathyは、金属イオンによるＬＤＬのin vitoでの酸化を調べ、ＬＤＬはそれが酸化される前に反応性酸素種とともに“播種”される必要があると仮説をたてた（Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R.G. Landes   Co. pp.91-119; Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. H. Nohl, H. Esterbauer, & C. Rice Evans, Ed., Richelieu Press, London. pp.163-179; Witzum & Steinberg (1991) J. Clin. Invest., 88:1785-1792; Witzum (1994) Lancet 344:793-795; Chisolm (1991) Clin, Cardiol. 14:125-130; Thomas & Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256:1182-1188; Schwaery et al.(1999) Meth. Enz. 300:17-23; Polidori et al. (1998) Free Rad. Biol. Med., 25:561-567; Thomas et al.(1994) Arch. Biochem. Biopys. 315:244-254）。JacksonおよびParthasarathyは、ＬＤＬの“播種”におけるリポゲナーゼ（ＬＯ）の役割を提唱した（Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. H. Nohl, H. Esterbauer, & C. Rice Evans, Ed., Richelieu Press, London.  pp.163-179; Thomas & Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256:1182-1188）。彼らはまた、過酸化水素またはそのリポペルオキシド同等物がＬＤＬの“播種”に重要な役割を果たす可能性を提唱した（Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. H. Nohl, H. Esterbauer, & C. Rice Evans, Ed., Richelieu Press, London.  pp.163-179; Thomas & Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256:1182-1188）。
【００６５】
本発明者らは以前に脱脂アルブミンは軽度に酸化されたＬＤＬから生物学的に活性な脂質を取り除くことができることを報告した（Watson et al.(1995) J. Clin. Invest., 95:774-782）。アポＡ−Ｉの公知の脂質結合特性を基に、我々は、アポＡ−Ｉは、脂質との結合および脂質の除去において脱脂アルブミンよりもおそらく有効であると考えた。したがって、我々は、ＬＤＬを処理するためにアポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉ類似ペプチドを用いた。我々は、アポＡ−Ｉが酸化脂質に結合し、さらに“播種分子”が酸化脂質であるならば、アポＡ−ＩおよびＬＤＬをインキュベートし、続いて前記２つを分離した場合、“播種分子”がＬＤＬからアポＡ−Ｉへ移転され、アポＡ−Ｉから播種分子を抽出し、特定することが可能かもしれないと仮説をたてた。我々は、中性脂質および、ＬＤＬとのインキュベーション後にアポＡ−Ｉから抽出した脂質の脂肪酸分画の両方が“播種分子”を含んでいることを見出した。中性脂質分画は、コレステリルエステルヒドロペルオキシドが見出される分画である。リポキシゲナーゼ経路は、主に脂肪酸の酸化生成物およびアルファトコフェロールによって仲介される非酵素的プロセスの結果としてコレステリルエステルヒドロペルオキシドを生成するために機能するという証拠が存在するので（Neuzil et al. (1998) Biochem. 37:9203-9210; Upston et al. '1997）J. Biol. Chem. 272:30067-30074; Upston et al.(1999) FASEB J. 13:977-994）、我々は、新しく単離したＬＤＬとインキュベートした後、アポＡ−Ｉから抽出した脂質の脂肪酸分画に努力を集中させた。我々は、新しく単離したＬＤＬに存在する“播種分子”は、部分的にはリノール酸（１３−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸［１３−ＨＰＯＤＥ］）およびアラキドン酸（１５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸［１５−ＨＰＥＴＥ］）の細胞代謝物に由来するという証拠を本実施例で提示する。これは、最初にParthasarathy（１０，１１）によって予想されたとおりで、さらに、１２／１５−リポキシゲナーゼ遺伝子の破壊は、アポE−欠損マウスでアテローム性硬化症を減少させる（Cyrus et al.(1999) J. Clin. Invest., 103:1597-1604; Steinberg (1999) J. Clin. Invest., 103:1487-1488）という最近のCyrusらの発見と一致する。
【００６６】
本実施例で提示するこの実験はまた、新しく単離したＬＤＬの“播種分子”は正常なＨＤＬおよびその成分（すなわちアポＡ−Ｉおよびパラオキソナーゼ）によって除去され、および／または不活化されることを示した。本実施例および実施例２で詳述する実験から、我々は、軽度に酸化されているＬＤＬの生物学的に活性な脂質は一続きの３つの工程で形成されることを提唱する（Watson et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:13597-13607; Watson et al.(1999) J. Biol. Chem. 274:24787-24798）。第一の工程は、リノール酸およびアラキドン酸の代謝生成物並びにコレステリルヒドロペルオキシドとともにＬＤＬが播種されることである。第二の工程は、内皮下腔へのＬＤＬの捕捉および付近の動脈壁細胞に由来するさらに新たな反応性酸素種の蓄積である。我々は、第三の工程は、反応性酸素種が臨界閾値にたしたときに生じるＬＤＬリン脂質の非酵素的酸化であり、これは、単球結合、単球走化性およびマクロファージへの単球の分化を誘発する固有の酸化脂質を形成させると提唱する。本実施例の実験は、これら３つの工程の第一の工程に焦点を当て、実施例２は第二および第三の工程についてのデータを提示する。
【００６７】
方法
材料
組織培養の材料および他の試薬は先に記載した供給源から入手した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046; Navab et al.(1993) J. Clin. Invest. 91:1225-1230; Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）。アセトニトリル、クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、無水酢酸、トリエチルアミン、ｔ−ブタノール、ポリプロピレングリコール、ギ酸アンモニウム、ギ酸および水（全てオプティマグレード）は、フィッシャーサイエンティヒック社（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）から入手した。真性Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）およびリノール酸は、アバンチポーラーリピド社（Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL）から入手した。Ｏｘ−ＰＡＰＣを含むＰＡＰＣに由来する酸化リン脂質、および酸化リン脂質、１−パルミトイル−２−（５）オキソバレリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４）、１−パルミトイル−２−グルタリイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０）、および１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８）は、以前に記載したように調製し、単離した（２５，２６）。１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥおよび１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥはビオモル社（Biomol, Plymouth Meeting, PA）から入手した。ヒトアポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩ並びにダイズリポキシゲナーゼは、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）から入手し、in vitro実験およびマウスの注射に用いた。
【００６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約９０％の純度がアポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩについて示された。アポＡ−Ｉペプチド擬似体は先に記載したように合成した（３０−３２）。ヒトへの輸液用ヒトアポＡ−Ｉ／ホスファチジルコリンディスクは、先に記載したとおりＺＬＢセントラルラボラトリー（ZLB Central Laboratory, Bern, Switzerland）によって調製された（３３−３５）。精製パラオキソゲナーゼは、Bert La Du教授（University of Michigan）から贈与された。さらに２つの遺伝子組換え変異体パラオキソゲナーゼ調製物（パラオキソンを加水分解できない）（Sorenson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7187-7191）を用いた。
【００６９】
リポタンパク質
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ，ｄ＝１．０１９から１．０６３ｇ／ｍＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ，ｄ＝１．０６３から１．２１ｇ／ｍＬ）は、Havelと共同研究者らの記載したプロトコル（Havel et al.(1995) J. Clin. Invest. 43:1345-1353）にしたがって、委員会（Human Research Subject Protection Committee, University of California, Los Angeles）の承認するプロトコルにしたがい書面による同意を得た後で絶食健常ボランティアの血液から単離した。リポタンパク質欠損血清は、ＨＤＬの単離の後ペレットを除去し、透析しさらにタンパク質濃度を７．５ｇ／１００ｍＬに再調整して得られた。いくつかの実験では、エタノール中のブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）２０ｍＭを新しく単離した血漿に２０μＭの濃度に添加し、先に記載した方法（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest., 99:2005-2019）を用いてリポタンパク質をＦＰＬＣにより分離した。ＬＤＬ、ＨＤＬおよびＬＰＤＳのエンドトキシンレベルは２０ｐｇ／ｍＬ以下で、これは単球付着または走化性活性の誘発に対して必要な閾値より十分に低い。この実験で記載したリポタンパク質濃度はタンパク質含有量による。
【００７０】
共働培養
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）および平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）は先に記載したように単離した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest., 88:2039-2046）。マイクロタイタープレートのウェルを０．１％のゼラチンで３７℃で一晩処理した。ＨＡＳＭＣを１×１０5細胞／ｃｍ2のコンフルエント密度で添加した。細胞を２日間培養し、その間に細胞はウェルの表面全体を覆い、十分量の細胞外マトリックスを形成した。その後でＨＡＥＣを２×１０5細胞／ｃｍ2で添加し、増殖させて２日で１層のコンフルエントなＨＡＥＣを形成した。全ての実験で、ＨＡＥＣおよび自系（同じドナー由来）ＨＡＳＭＣを４から６代の継代レベルで使用した。
【００７１】
単球の単離
単球は先に記載した（Fogelman et al.(1988) J. Lipid Res., 29:1243-1247）リカルド（Recald）の方法を改変して用い、委員会（Human Research Subject Protection Committee, University of California, Los Angeles）の承認するプロトコルにしたがい書面による同意を得た後で健常ボランティアの血液から単離した。
単球走化性アッセイ
一般に、前記共働培養は、ＨＤＬの非存在下または存在下で天然のＬＤＬ（２５０μｇ／ｍＬ）で８時間処理した。上清を採集し、脂質のヒドロペルオキシドレベルの測定に用いた。続いて共働培養を洗浄し、さらに一切の添加物を含まない新しい培養メジウム１９９（Ｍ１９９）を添加し、さらに８時間インキュベートした。これによって、酸化ＬＤＬによる刺激の結果として細胞により放出された単球走化性活性の採集が可能になった。インキュベーションの最後に、上清を共働培養から採集して４０倍に希釈し、単球の走化性活性についてアッセイした。簡単に記せば、上清を標準的ニューロプローブ（Neuroprobe）チャンバー（Neuroprobe, Cabin John, MD）に加え、上部に単球を添加した。チャンバーを３７℃で６０分インキュベートした。インキュベーション後に、チャンバーを解体し移動していない単球を拭い取った。続いてメンブレンを風乾し、１％グルタールアルデヒドで固定し、０．１％のクリスタルヴァイオレット染料で染色した。移動単球数を顕微鏡で決定し、４つのウェルで数えた１２の標準化高倍率視野の平均±ＳＤとして表した。
【００７２】
単球付着アッセイ
簡単に記せば、４８ウェルの組織培養プレートのＨＡＥＣ単層培養を、文献に記載したように（Watson et al.(1995) J. Clin. Invest. 96:2882-2891）所望のＬＤＬまたはリン脂質と４時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、ヒト末梢血単球浮遊液を添加し、１０分間インキュベートした。緩やかに付着した単球を洗い流し、単球を固定して付着した単球の数を９つの高倍率顕微鏡視野で数えた。
ＬＤＬ酸化に対する１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの影響
新しく単離したＬＤＬ（２５０μｇ）をＭ１９９中の１０％ＬＰＤＳ中の１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ（１．０μｇ）とともに３７℃で４時間穏やかに攪拌しながらインキュベートした。ＬＤＬを遠心によって再度単離し、ヒトの大動脈内皮細胞の単層培養とともにインキュベートした。０〜５時間の間の時点で上清を取り出し、脂質ヒドロペルオキシド含有量についてアッセイした。前記内皮単層培養を各時点後に洗浄し、単球浮遊液を添加してインキュベートし、洗浄して付着単球の数を決定した。
【００７３】
ダイズリポキシゲナーゼによるＬＤＬの処理
セファローズビーズに結合させた純粋なダイズリポキシゲナーゼ１０単位とともに新しく単離したＬＤＬ（２５０μｇ）を３７℃で４時間穏やかに攪拌しながらインキュベートした。ＬＤＬを遠心によって再度単離し、ＨＥＡＣの単層培養とインキュベートした。上清を０〜４時間の範囲の時点で取り出し、脂質ヒドロペルオキシド含有量についてアッセイした。内皮の単層培養を各時点後に洗浄し、単球の付着を測定した。
ネズミ
Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスをJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）から購入した。全ての動物は雌であった（実験時には４−６ヶ月齢であった）。マウスを４％の脂肪を含む固形飼料、プリナチョウ（Purina Chow）( Ralston-Purina Co., St. Louis, MO)で維持した。ＬＤＬは、病変感受性Ｃ５７ＢＬ／６および病変耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪグループから、動物実験委員会（University of California Animal Research Committee）の規則にしたがい軽度のイソフルラン麻酔下で、抗凝固剤としてヘパリン（２．５Ｕ／ｍＬ血液）を用いながら後眼窩洞から得た血液から単離した。
【００７４】
アポＡ−Ｉのヒトへの輸液
書面によるインフォームドコンセントを得、さらに機関（St Bartholomew's and the Royal London School of Medicine and Dentistry）のＩＲＢ承認を得た後、アポＡ−Ｉ／ホスホチジルコリンディスクを、Nanjeeら（Nanjee et al.(1999) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 19:979-989; Nanjee et al.(1996) Arteroscler. Thromb. Vascul. Biol. 16:1203-1214）の記載した材料およびプロトコルを用いて４０ｍｇアポＡ−Ｉ／ｋｇ体重の用量で４時間にわたって６人の健常な男性対象者に輸液した。前記６人のボランティア（それぞれ対象者１、２、３、４、５および６）の脂質レベルは以下のとおりであった：総コレステロール：１４９、１６０、１６４、２０９、１５３、１６３；トリグリセリド：１７６、１６９、９５、１５０、１２１、１５３；ＬＤＬ−コレステロール：６９、７３、８８、１１７、７３、８２；およびＨＤＬ−コレステロール：４５、５４、５６、６２、５９、４７ｍｇ／ｄＬ。血漿は、文献（Havel et al.(1995) J. Clin. Invest., 43:1345-1353）のように輸液前２時間および輸液後６時間で調製して凍結保存し、ＬＤＬは、ロサンジェルスの著者らの研究室で実験の前にＦＰＬＣにより単離した。本プロトコルにしたがって血漿から単離したＬＤＬは、新しく単離したＬＤＬと区別できない態様でin vitroおよびin vivoで機能する（Rumsey et al.(1994) J. Lipid Res.35:1529-1598）。
【００７５】
高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
ＬＤＬの迅速で穏やかな単離のため、並びにインキュベーション後のＬＤＬおよびアポＡ−Ｉの再単離のための図２に示した高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を先に報告（Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）したように実施した。
固相抽出クロマトグラフィー
固相抽出クロマトグラフィーは、先に記載されたように実施した（Kaluzny et al.(1985) J. Lipid Res. 26:135-140）。簡単に記せば、２．０ｍｇを越えないＬＤＬタンパク質から得た脂質抽出物を２５０μＬのクロロホルムに再懸濁した。Vac-Elutマニホールド（Analytichem International, Harbor City, CA）を用いて、３．０ｍＬのメタノールを、続いて６．０ｍＬのヘキサンを添加することによって固相抽出アミノカラム（Fisher）を条件付けした。脂質を前記カラムに添加し、中性脂質（コレステロール、コレステリルエステル、コレステリルエステルヒドロペルオキシド、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリド）を３．０ｍＬのクロロホルム／イソプロパノール（２：１，ｖ／ｖ）で溶出させた。遊離脂肪酸はジエチルエーテル中の３％酢酸３．０ｍＬで溶出させ、リン脂質は３ｍＬのメタノールで溶出させた。溶媒を蒸発させ、脂質を０．０１％のＢＨＴを含むクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）中に再懸濁させ、アルゴンで覆って−８０℃で保存した、これらの分析では、内部標準として添加したＣ１７：０の回収は９２±３％であった。
【００７６】
逆相高処理液体クロマトグラフィー
逆相高処理液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、Amesおよび共同研究者らの方法（Yamamoto & Ames(19＿) Free Rad. Biol. Med., 3:359-361）、Kambayashiおよび共同研究者ら（Kambayashi et al.(1997) J. Biochem. 121:425-431）、およびAlex Sevanian（私的通信）にしたがって実施した。簡単に記せば、分析は、移動溶媒に再懸濁させた単離脂質をカラムに注入し、流速１．０ｍＬ／分で溶出させることにより実施した。脂肪酸酸化生成物の検出は、二極アレー検出装置（Beckman Instruments）を用い２００から３５０ｎｍでスキャンするか、または蒸発光分散検出装置（SEDEX55, France）を用いＵＶ吸収により実施した。ハイパーシル（Hypersil）ＭＯＳ−１Ｃ８（Alltech）またはスペルコシル（Supelcosil）ＬＣ−１８−ＤＢ(Supelco)カラムを脂肪酸酸化生成物の分離に使用し、オールチマ（Alltima）Ｃ１８カラム(Alltech)をコレステリルエステル酸化生成物の分離に用いた。メタノール／トリエチルアミン（９９．９９／０．０１，ｖ／ｖ）で構成された溶媒系を１３−ＨＰＯＤＥの溶出に用い、アセトニトリル／水／酢酸（６０／４０／０．１，ｖ／ｖ／ｖ）からアセトニトリル／水／酢酸（９８／２／０．１，ｖ／ｖ／ｖ）のグラジエントから成る溶媒系を１５−ＨＰＥＴＥの溶出に用い、アセトニトリル／２−プロパノール／水（４４／５４／２，ｖ／ｖ／ｖ）から成る溶媒系はコレステリルリノレートヒドロペルオキシドの溶出に用いた。
【００７７】
電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）
陽イオンまたは陰イオンモードにおける電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）は、先に報告（Watson et al(2997) J. Bio. Chem., 272:13597-13607）されたプロトコルおよび条件にしたがって実施した。
他の方法
リポタンパク質のタンパク質含有量は、ロウリーのアッセイ（Lowry et al.(1951) J. Biol. Chem. 183:265-275）の改変（Lehman et al.(1955) In Vitro Cell. Develop. Biol. Animal, 31:806-810）によって決定した。単球走化性タンパク質１のレベルは先に報告（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest., 88:2039-2046）されたようにＥＬＩＳＡを用いて測定した。脂質ヒドロペルオキシドレベルは、Auerbachらの報告（Anal. Biochem., 201:375-380(1992)）したアッセイを用いて測定した。表示したいくつかの実験では、動脈壁細胞共働培養によって酸化されたＬＤＬを含む培養上清中の脂質は、クロロホルム−メタノールによって抽出し、ヒドロペルオキシドは、Auerbachの方法によって決定した。パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）活性は、先に報告されたように（Gan et al.(1991) Drug Metab. Dispos. 19:100-106）測定した。統計的有意差はモデル１ＡＮＯＶＡによって決定した。この分析は、先ず最初にＥＸＣＥＬアプリケーションでＡＮＯＶＡを用いてグループの平均間に相違があるか否かを決定し、続いて適切な場合には対合スチューデントｔ検定を実施して顕著に異なる平均を特定した。有意差はｐ＜０．０５と規定される。
【００７８】
結果
アポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉペプチド擬似体は新しく単離したヒトＬＤＬから“播種分子”を除去し、このＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性にする
我々のヒト動脈壁共働培養系は広範囲に性状が決定された：Navab et al.(1991) J. Clin. Invest., 88:2039-2046; Navab et al.(1993) J. Clin. Invest., 91:1225-1230; Navab et al.(1997) J. Clin. Invest., 99:2005-2019; Shin et al.(1996) J. Clin Invest., 97:1630-1639; Ishikawa et al.(1997) J. Clin. Invest. 100:1209-1216; Castellani et al.(19＿) J. Clin. Invest., 100:464-474; Shin et al.(1998) Nature 394-284-287。
ＬＤＬをこの共働培養に添加すれると、それは内皮下腔に捕捉され動脈壁細胞によって酸化される。結果として、３種の生物学的に活性な酸化リン脂質、ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣ、ＰＥＩＰＣ（それぞれ特徴的なＭ／Ｚ比、５９４、６１０および８２８を有する）が産生される（Watson et al.(1997) J. Biol. Chem., 272:13597-13607; Watson et al.(1999) J. Biol. Chem., 274:24787-24798）。これら３種の酸化リン脂質は、内皮細胞を単球と結合させ、内皮細胞に強力な単球誘引物質ＭＣＰ−１および分化因子Ｍ−ＣＳＦを分泌させる軽度に酸化されたＬＤＬの能力を説明する（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest.,88:2039-2046; Berliner et al.(1990) J. Clin. Invest., 85:1260-1266; Rajavashisth et al.(1990) Nature 344:254-257）。ＬＤＬに暴露した共働培養から得られた条件付け培養液は、ＭＣＰ−１を含むことが判明した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest.,88:2039-2046）。ヒトの単球をＬＤＬ処理培養に添加したとき、単球は内皮細胞と結合し、内皮下腔に移動した（上掲書）。ＭＣＰ−１に対する中和抗体を前記培養に添加することによって、ＬＤＬ誘発単球走化性は完全に失われた（上掲書）。したがって、培養単球の走化性は、生物学的に活性な酸化リン脂質の生成およびそれに続くＭＣＰ−１の誘発に対する非常に鋭敏なバイオアッセイである(Navab et al.(1991) J. Clin. Invest., 88:2039-2046; Navab et al.(1993) J. Clin. Invest., 91:1225-1230; Navab et al.(1997) J. Clin. Invest., 99:2005-2019; Ishikawa et al.(1997) J. Clin. Invest. 100:1209-1216; Berliner et al.(1990) J. Clin. Invest., 85:1260-1266)。
【００７９】
アポＡ−Ｉは正常なＨＤＬの主要なタンパク質成分である。コレステロールおよびリン脂質に結合するというその公知の能力のために（Oram & Yokoyama (1996) J. Lipid Res. 37:2473-2491; Forte et al.(1995) J. Lipid Res. 36:148-157; Bruce et al.(1998) Ann. Rev. Nutr. 18:297-330; Phillips et al.(1998) Atheroscler. 137(補遺):S13-S17）、我々は、アポＡ−ＩもまたＬＤＬ中の“播種分子”と結合するという仮説をたてた。この仮説を調べるために、我々は図１に示したプロトコルを利用した。ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を新しく採取した血漿に添加し、ＬＤＬをＦＰＬＣによって分離し、アポＡ−Ｉと３７℃で２時間インキュベートした。続いてこのＬＤＬとアポＡ−Ｉを速やかに分離して調べた。我々は、分離後のＬＤＬおよびアポＡ−Ｉを、それぞれ“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”および“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”と呼ぶ。
【００８０】
図４Ａおよび図４Ｂは、“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”はヒト動脈壁細胞培養によって酸化されないことを示している。図３Ａから図３Ｃのデータは、７人の別々の健常な個体から採取したＬＤＬおよび別々のドナーから得た別個の共働培養および単球を用いた７つの実験で得られたものの平均±ＳＤを示している。したがって、これらの結果は、非常に再現性が高く、動脈壁細胞は“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”を酸化することができないということを図４Ａで示している。しかしながら、“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”由来の脂質抽出物が“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”に戻された場合は、それは容易に酸化された（図３Ａ）。さらにまた、図２で示したように、“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”は単球の付着を刺激せず（図３Ｂ）、走化性も刺激しなかった（図３Ｃ）。しかしながら、“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”由来の脂質抽出物を“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”に戻したとき、再構成されたＬＤＬは単球の付着（図３Ｂ）および走化性（図３Ｃ）を擬似処理ＬＤＬと同程度に誘発した。図３Ｃに示した結果と非常に類似する結果が、単球走化性タンパク質１のレベルをＥＬＩＳＡで測定したときに得られた（データは示されていない）。
【００８１】
アポＡ−Ｉが脂質に結合する能力は、その固有のα−ラセン構造の機能であると決定された（Palgunachari et al.(1996) Arterioscler. Thromb. Vascul. Bio. 16:328-338）。Anantharamaiahおよび共同研究者らは、徹底的に性状が調べられたアポＡ−Ｉペプチド擬似体を合成した（Garber et al.(1992) Arterioscler. Thromb. 12:886-894; Anantharamaiah (1986) Meth. Enz. 128:627-647）。これらのペプチド擬似体の１つは３７ｐＡとして知られ、以下のアミノ酸配列を有する：ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦＰＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列識別番号：１）。３７ｐＡと同じ配列をもつが、３つの余分なアミノ酸残基［アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）］をそのＮ末端に有し、脂質結合に必要なαラセン形成を妨げるペプチドもまた、発表された方法（; Anantharamaiah (1986) Meth. Enz. 128:627-647）を用いて前記のグループによって構築された。このコントロールペプチド（４０Ｐとして知られている）は、３７ｐＡと比べてほとんど脂質と結合しない。
【００８２】
図４Ａおよび図４Ｂに示したように、ＬＤＬをアポＡ−Ｉペプチド擬似体３７ｐＡとインキュベートし、続いてアポＡ−Ｉペプチド擬似体３７ｐＡから分離した後、ＬＤＬ（“ＬＤＬアフター３７ｐＡ”）は動脈壁細胞による酸化に耐性を示し（図４Ａ）、単球走化性活性を誘発しなかった（図４Ｂ）。しかしながら、リポタンパク質とのインキュベーションの後でペプチドから脂質抽出物（“３７ｐＡアフターＬＤＬ”）を“ＬＤＬアフター３７ｐＡ”に戻したとき、それは容易に酸化された（図4Ａ）。対照的に、“ＬＤＬアフター４０Ｐ”は動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化の減少を示さず（図４Ａ）、ＬＤＬ誘発単球走化性の低下も認められなかった（図４Ｂ）。したがって、アポＡ−Ｉおよびそのペプチド擬似体３７ｐＡも両方とも、新しく単離されたＬＤＬから脂質を除去することができ、ヒト動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを耐性にし、さらにＬＤＬ誘発単球走化性を防止した。
【００８３】
アポＡ−Ｉによって除去される新しく単離されたＬＤＬ中の“播種分子”は１３−ＨＰＯＤＥ１５−ＨＰＥＴＥを含む
図２に示したように２０μＭのＢＨＴの存在下でＦＰＬＣによって迅速に単離したＬＤＬに結合している生物学的に活性な脂質を特定するために、脂質を“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から抽出した。これらの脂質は固相抽出クロマトグラフィーによって分離した。続いて、中性脂質または脂肪酸分画を、ＰＡＰＣ（ＬＤＬに存在するリン脂質）または“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”のどちらかと一緒に共働培養に添加した。ＰＡＰＣまたは“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”の共働培養への添加は脂質ヒドロペルオキシド生成も単球の走化性も刺激しなかった（図５Ａ−図５Ｃ、白棒線）。しかしながら、“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から抽出した脂肪酸分画（図５Ａおよび図５Ｂ、黒棒線）または中性脂質分画（図５Ｃおよび図５Ｄ、黒棒線）のいずれもＰＡＰＣまたは“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”へ添加することにより、脂質ヒドロペルオキシド生成および単球走化性の用量依存的増加をもたらした。これらの実験は、アポＡ−Ｉは、動脈壁細胞がＰＡＰＣおよびＬＤＬの両者を酸化するために必要とする脂質を新しく単離したＬＤＬから除去することを示している。“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から回収した脂肪酸分画または中性脂質分画の添加は、動脈壁細胞によるＰＡＰＣおよび“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”の酸化をもたらした。
【００８４】
さらに脂肪酸を特定するために、新しく単離したＬＤＬをアポＡ−Ｉの存在下または非存在下でインキュベートし、続いて遠心によって分離した。アポＡ−Ｉとのインキュベーションに続いて、脂質をＬＤＬおよびアポＡ−Ｉから抽出した。脂質はまた、ＬＤＬの非存在下でインキュベートしたアポＡ−Ｉ（Ａ−Ｉ擬似）、およびアポＡ−Ｉの非存在下でインキュベートしたＬＤＬ（ＬＤＬ擬似）から抽出した。続いて、抽出脂質を逆相ＨＰＬＣによって分画した。ＬＤＬ存在下でインキュベートされなかったアポＡ−Ｉはほとんど１３−ＨＰＯＤＥ（図６Ａ）も１５−ＨＰＥＴＥ（図６Ｅ）も含んでいなかった。対照的に、アポＡ−Ｉ非存在下でインキュベートした新しく単離したＬＤＬ（ＬＤＬ擬似）は１３−ＨＰＯＤＥおよび近傍の未確認ピークを含んでおり（図６Ｂ）、さらに１５−ＨＰＥＴＥも含んでいた（図６Ｆ）。“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”は、近傍の未確認ピークと比較して実質的に少ない１３−ＨＰＯＤＥ（図６Ｂおよび図６Ｃの未確認ピークに対して１３−ＨＰＯＤＥを比較）、および極めて少ない１５−ＨＰＥＴＥを含んでいた（図６Ｇ）。図６Ｄおよび図６Ｈは、１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥはアポＡ−Ｉに移されることをそれぞれ示している。質量分析法を用いた更なる分析によって、新しく単離されたＬＤＬに顕著な量のＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥが存在し、その両方がアポＡ−Ｉとのインキュベーションによって効果的に除去されることが確認された（データは示されていない）。“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”の脂質抽出物の陰イオンモードでのＥＳＩ−ＭＳによる分析によって、ＨＰＯＤＥの存在を示唆するｍ／ｚ３１１を有するイオンの存在が示された（データは示されていない）。ＨＰＯＤＥのそれと比較してより少ない量で存在し、さらにｍ／ｚ３３５を有するイオンもまた観察され、“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”の脂質中にＨＰＥＴＥが存在することを示唆している（データは示されていない）。“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”の脂質抽出物はまた、ｍ／ｚ３１７を有する比較的大量のイオンを含み、ＨＰＥＴＥの脱水生成物（すなわち水１分子のロス）の存在を示唆している（データは示されていない）。アポＡ−Ｉで処理されていない新しく単離したＬＤＬの脂質抽出物のＭＳ／ＭＳによる分析によって、ＨＰＯＤＥの存在が確認された（データは示されていない）。しかしながら、ＨＰＥＴＥはこれらのサンプルでは検出されなかった（データは示されていない）。ＨＰＥＴＥは、ＨＰＬＣおよびＭＳ／ＭＳの両方によって“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”で容易に検出されたので、我々は以下のように推論した：１）アポＡ−Ｉの処置はＨＰＥＴＥを濃縮し、その検出を可能にしたのかもしれない；２）ＨＰＯＤＥは、ＨＰＥＴＥよりも高濃度で新しく単離されたＬＤＬに存在するのかもしれない。
【００８５】
方法の項で述べたように、真性の１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの新しく単離したＬＤＬへの添加は、ＬＤＬがＨＡＥＣに添加されたときは脂質ヒドロペルオキシドの生成を増加させ、さらにまたＨＡＥＣへの単球の付着も増加させた（データは示されていない）。
１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥはリノール酸に対するリポキシゲナーゼ活性の産物である（５５，５６）。ＬＤＬ中の主要な不飽和脂肪酸はリノール酸であるので、新しく単離したＬＤＬをダイズのリポキシゲナーゼの存在下または非存在下でインキュベートした。本明細書に記載したように、ダイズリポキシゲナーゼとインキュベートし、続いて前記リポキシゲナーゼから分離した後、ＬＤＬをＨＡＥＣに添加した。ダイズリポキシゲナーゼとインキュベートし、続いて前記リポキシゲナーゼから分離したＬＤＬは、ダイズリポキシゲナーゼの非存在下でインキュベートしたＬＤＬと比較して、培養上清中の脂質ヒドロペルオキシドの生成を顕著に増加させ、さらにＨＡＥＣへの単球の付着を増加させた（データは示さず）。
前記の実験を総合すれば、これらの実験は、新しく単離したＬＤＬ中の、アポＡ−Ｉによって除去される“播種分子”は、ＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むことができることを示している。
【００８６】
遺伝的にアテローム性硬化症に感受性を有するマウスから新しく単離したＬＤＬはヒト動脈壁細胞による酸化に強い感受性を示し、ヒトアポＡ−Ｉによって酸化に対して耐性となる
アテローム形成性飼料を与えたとき、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＢＬ／６）マウスは、大動脈に脂肪線条病変を生じ、一方、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ）マウスは同等のアポＢ含有リポタンパク質レベルにもかかわらず前記病変を生じない（Paigen et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3763-3767; Ishida et al.(1991) J. Lipid Res. 32:559-568）。我々は、以前に病変感受性ＢＬ／６マウスは酸化ストレス下にあるということを提唱する証拠を提供した（Shih et al.(1996) J. Clin. Invest. 97: 1630-1639; Shih et al.(1998) Nature 394:284-287; Liao et al.(1994) J. Clin. Invst. 94:877-884）。この仮説の論理的帰結は、病変耐性Ｃ３ＨマウスのＬＤＬと比較してＢＬ／６マウスのＬＤＬの酸化に対する感受性の増加であろう。低脂肪固形飼料により、この２ストレインのマウスは同じように低レベルのＬＤＬを有し、病変感受性ＢＬ／６マウスはより高レベルのＨＤＬを有する（Paigen et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3763-3767）。我々の仮説を調べるために、この２ストレイン（両方とも低脂肪固形飼料で維持された）から新しく単離したＬＤＬをヒトアポＡ−Ｉの存在下および非存在下でインキュベートし、続いてＬＤＬおよびアポＡ−Ｉを分離し、さらに、それらをヒトの動脈壁細胞とインキュベートした。図７Ａおよび図７Ｂに示したように、病変感受性ＢＬ／６マウスに由来し、アポＡ−Ｉの非存在下でインキュベートしたＬＤＬ（ＬＤＬ擬似）は、病変耐性Ｃ３ＨマウスのＬＤＬの場合よりもはるかに容易に動脈壁細胞によって酸化された（図７Ａ）。対照的に、病変感受性ＢＬ／６マウスおよび病変耐性Ｃ３Ｈマウスの“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”は両方とも動脈壁細胞による酸化に耐性であった（図７Ａ）。他方、脂質が“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から抽出され、“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”に戻された場合は、再構成ＬＤＬは、擬似処理ＬＤＬの場合と同じ程度に動脈壁細胞によって酸化された（図７Ａ）。同様な結果が、ＬＤＬ誘発単球走化性について得られた（図７Ｂ）。図７ＡおよびＢのデータは、Ｃ３ＨマウスのＬＤＬと比較して病変感受性ＢＬ／６マウスのＬＤＬを酸化する動脈壁細胞の能力の相違（これはアポＡ−Ｉによって除去されるＬＤＬ中の脂質による）を示している。これらのデータはまた、動物を低脂肪固形飼料で維持しても前記の相違は存在することを示している。
【００８７】
ヒトアポＡ−Ｉのマウスへの注射はマウスのＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に耐性にするが、ヒトアポＡ−ＩＩは耐性にしない
in vivoでＬＤＬの潜在的酸化状態を変化させるアポＡ−Ｉの能力をテストするために、マウスに１００μｇのアポＡ−ＩまたはアポＡ−ＩＩまたは食塩水のみを尾静脈から注射した。血液を直ちに（０時間）または注射後３、６もしくは２４時間して採取した。ＦＰＬＣによりＬＤＬを単離し、ヒト動脈壁細胞培養とインキュベートし、脂質ヒドロペルオキシドの生成および単球の走化性活性を調べた。図８Ａは、アポＡ−Ｉを３〜６時間前に注射されたＢＬ／６マウスから新しく単離したＬＤＬはヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性で、さらにこの耐性は２４時間まで持続することを示している（図８Ａ）。対照的に、食塩水のみの注射後直ちに、または６時間して得たＬＤＬも、アポＡ−ＩＩの注射後６時間してから得たＬＤＬもマウスＬＤＬを動脈壁細胞による酸化に対して耐性にしなかった（図８Ａ）。同様な結果が単球の走化性活性について得られた（図８Ｂ）。血漿およびＨＤＬ中のＰＯＮ活性は、アポＡ−Ｉ注射後６時間で約２０％増加したが、アポＡ−ＩＩの注射では変化しなかった（データは示されていない）。したがって、上記のin vitro実験の場合のように、in vivoで注射されたアポＡ−ＩはＬＤＬの酸化を劇的に減少させることができる（アポＡ−ＩＩはできない）。
【００８８】
ヒトアポＡ−Ｉのヒトへの輸液はそのＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性にする
上記の図８Ａで示されるように、アポＡ−Ｉのマウスへの注射はそのＬＤＬを動脈壁細胞による酸化に対して耐性にした。図９Ａおよび９Ｂはヒトの対応する実験について示している。６人の健常者からアポＡ−Ｉの輸液の２時間前および６時間後に血液を採取した（方法の項で示したように、1人はトリグリセリドレベルが軽度に上昇している、１７６ｍｇ／ｄｌ）。各時点の血漿からＬＤＬを単離し、ヒトの動脈壁細胞培養とともにインキュベートした。図９Ａに示したように、６人の対象者のうち６人において、アポＡ−Ｉの輸液後６時間で単離したＬＤＬは、輸液２時間前のＬＤＬと比較したとき動脈壁細胞による酸化に対してはるかに強い耐性を示した。同様な結果がＬＤＬ誘発単球走化性活性について得られた（図９Ｂ）が、ただし４人の対象者については酸化の減少は、ＬＤＬ誘発単球走化性活性の減少より小さかった。血漿およびＨＤＬにおけるＰＯＮの活性は、輸液２時間前と比較して輸液後６時間で約２０％増加した（データは示されていない）。これらのデータは、マウスの場合のように、アポＡ−Ｉのヒトへの注射はそのＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性にすることを示している。
【００８９】
ＨＤＬまたはＨＤＬ結合酵素はヒト動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを耐性にする
完全なＨＤＬおよびアポＡ−Ｉ以外のその成分（例えばＰＯＮ）がＬＤＬを動脈壁細胞による酸化に対して耐性にする能力を調べるために、本明細書に記載したようにＬＤＬをＨＤＬまたはＰＯＮの存在下もしくは非存在下でインキュベートし、続いてそれらから分離してヒト動脈壁細胞共働培養とインキュベートした。ＨＤＬまたはＰＯＮとのインキュベーションによって、ＬＤＬは、擬似処理ＬＤＬと比較して動脈壁細胞による酸化に対して耐性になった（図１０Ａ）。同様な結果が、ＬＤＬ誘発単球走化性活性について得られた（図１０Ｂ）。したがって、ＨＤＬおよびその付随酵素ＰＯＮは動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを耐性にすることができる。
【００９０】
考察
本実施例で提示したデータは、軽度に酸化されたＬＤＬの生成をもたらす３工程プロセスの第一の工程の調節におけるＨＤＬ並びにその成分アポＡ−ＩおよびＰＯＮの役割を示している。ＬＤＬは、それが酸化される前に反応性酸素種とともに“播種”される必要があるという仮説が提唱された（Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R.G. Landes Co. pp.91-119; Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Ed. H. Nohl, H. Esterbauer, and C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp.163-179; Wiztum and Steinberg (1991) J. Clin. Invest. 88:1785-1792; Wiztum (1994) Lancet 344:793-795; Chisolm (1991) Clin. Cardiol. 14:125-130; Thomas & Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256:1182-1188）。Spectorと共同研究者らは、リポキシゲナーゼ経路は動脈壁細胞で活発であることを示し（Spector et al.(1988) Prog. Lipid Res. 27:271-323; Alexander-North et al.(1994) J. Lipid Res. 35:1773-1785）、さらにParthasarathy     は、過酸化水素またはそのリポペルオキシド同等物は、ＬＤＬの“播種”で重要な役割を果たす可能性があることを強調した（Parthasarathy et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1046-1050; Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R.G. Landes Co. pp.91-119; Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Ed. H. Nohl, H. Esterbauer, and C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp.163-179）。１２／５−リポキシゲナーゼ遺伝子の破壊はアポＥ欠損マウスでアテローム性硬化症を減少させるというCyrusらによる最近の発見（Cyrus et al.(1999) J. Clin. Invest. 103:1597-1604）は上記の仮説および本実施例のデータと一致する。
【００９１】
我々は、遺伝的にアテローム性硬化症の発生に感受性を有する、固形飼料で維持したマウスから新しく単離したＬＤＬは、アテローム性硬化症の発生に遺伝的に耐性であるマウスから採取したＬＤＬの場合よりもはるかに容易に動脈壁細胞により酸化されることを見出した。両ストレインのマウスから得たＬＤＬは、アポＡ−Ｉ処理後に動脈壁細胞による酸化に対して耐性になり（図７Ａおよび図７Ｂ）、さらに、アポＡ−Ｉ処理後のＬＤＬの酸化レベルは２つのストレインについて顕著には相違しなかった（図７Ａおよび図７Ｂ）。アテローム性硬化症を発生する感受性における遺伝的相違は、部分的には、これら２ストレインのマウスのＬＤＬにおける“播種分子”レベルにおける相違によることを示しているのかもしれない。
【００９２】
動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを耐性にするアポＡ−Ｉ（図３および図７）およびアポＡ−Ｉペプチド擬似体（図４ＡおよびＢ）のin vitroの能力が、マウス（図８ＡおよびＢ）およびヒト（図９ＡおよびＢ）の両方でin vivo適用するために示された。マウスでは、アポＡ−Ｉを注射して３時間以内に、ＬＤＬは動脈壁細胞による酸化に対して耐性になり、この防御状態は２４時間持続した（図８ＡおよびＢ）。アポＡ−Ｉの場合と対照的に、アポＡ−ＩＩの注射は、動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを防御しなかった（図７Ａ）。ヒトでは、６人のうち６人においてアポＡ−Ｉの輸液は、輸液後６時間以内にそのＬＤＬを動脈壁細胞による酸化に対して耐性にした（図８Ａ）。
【００９３】
アポＡ−Ｉだけでなく、ＨＤＬ自体もさらにＨＤＬ付随酵素ＰＯＮも、動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬの感受性を有利に変更できる。Aviramおよび共同研究者らは、最近、ＰＯＮはペルオキシダーゼ活性を有することを示したが（Aviram et al.(1998) J. Clin. Invest. 101:1581-1590; Aviram et al.(1998) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol., 18:1617-1624）、これにより、マウスモデルにおいて（Shih et al.(1996) J. Clin. Invest. 97:1630-1639; Shih et al. (1998) Nature 394:284-287）、さらに疫学的研究において（Serrato and Marian (1995) J. Clin. Invest. 96:3005-3008; Mackness et al. (1998) Curr. Opin. Lipidol. 9:319-324; Heinecke and Lusis (1998) Amer. J. Hum. Genet. 62:20-24）アテローム性硬化症の防御におけるＰＯＮの役割を部分的に説明できるかもしれない。Danskyおよび共同研究者らの最近の報告（Dansky et al.(1999) J. Clin. Invest. 104:31-39）では、アポＥ欠損マウスではＰＯＮ活性を増加させることなくアポＡ−Ｉが過剰発現するという利点があることが提唱された。しかしながら、前記の研究で著者らが認めているように（上掲書）、彼らは実験を最初の８週間の生存期間に限定していた。Aviramと共同研究者らは、血清PON活性はアポE欠損マウスで３ヶ月齢後に減少し、これは大動脈の病変領域の増加と血清脂質の過酸化反応の増加と一致していると報告した（Aviram et al.(1998) J. Clin. Invest. 101:1581-1590）。Plumpと共同研究者らが調べたマウスは、AviramのデータがＰＯＮ活性の減少を示したときに、４または６ヶ月齢で殺されていた（Plump et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611）。Danskyと共同研究者らは、動脈壁内の脂質の保持と内皮への単球の付着は８週齢では違いがないことを報告し、アポＡ−Ｉの利点は病変の発生のより遅い時期に限られると結論した（Dansky et al.(1999) J. Clin. Invest. 104:31-39）。Danskyと共同研究者ら（上掲書）は、単球の付着を測定せず、代わりにＣＤ１１ａ付着を測定したが、これは単球に固有ではないことは留意されるべきである。さらにまた、Danskyと共同研究者ら（上掲書）は、遺伝的に混合したバックグラウンドをもつマウスを実験のほとんどで使用しており、さらに内皮下腔の単球／マクロファージを測定しなかった。我々のデータを基にすれば、アポＡ−Ｉの過剰発現は、ＰＯＮ活性のどのような変化とも無関係に、酸化に対するＬＤＬの感受性を減少させるであろうと我々は予想する。しかしながら、我々は、アポＡ−Ｉ（アポＡ−ＩＩではない）のマウスへの注射後６時間でＰＯＮ活性の約２０％の増加、およびアポＡ−Ｉのヒトへの輸液後６時間で同様な小さな増加を観察した。
【００９４】
Sevanianと共同研究者らは、ＬＤＬ-中の酸化コレステロールレベルの増加を報告した（Sevanian et al.(1997) J. Lipid Res. 38:419-428）。“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から抽出した中性脂質は“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”を酸化する動脈壁細胞の能力を復元することができないという我々の発見（図５）は、Sevanianらの観察と一致している。“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から抽出した脂肪酸分画における我々の結果（図５Ａ−Ｃおよび図６Ａ−Ｈ）は、リノール酸およびアラキドン酸の代謝産物はまた、ＬＤＬ“播種分子”として機能することを示している。図６Ａ−Ｈは、“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”はなお検出可能なレベルの１３−ＨＰＯＤＥを含んでいることを示している。しかしながら、このレベルは、“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”がヒト動脈壁細胞によって酸化されることを許容するほど十分な量ではなかった（図３、図５、図７、図８および図９）。中性脂肪または脂肪酸分画のいずれかを“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”に工程にしたがって添加することによって動脈壁細胞によって酸化されるその能力が回復したので（図５）、我々は、酸化に必要な、“播種分子”について臨界閾値が存在するとの結論に達した。
【００９５】
Stockerと共同研究者らは、アポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩはともに、特異的メチオニン残基の酸化を伴うメカニズムを介してコレステリルエステルヒドロペルオキシドを減少させることができることを示した（Garner et al.(1998) J. Biol. Chem. 273:6088-6095）。我々の実験では、アポＡ−Ｉだけがマウスに注射後ＬＤＬの酸化を低下させることができ、アポＡ−ＩＩは低下させることができなかった（図８）。これらの結果は、我々の実験におけるアポＡ−Ｉの防御メカニズムはStockerとその共同研究者らによって調べられたメカニズム（Garner et al.(1998) J. Biol. Chem. 273:6088-6095）とは別個であることを示している。ＨＤＬは、アテローム性硬化症のリスクに対する反対の強力な予測物質であることを示した（Miller and Miller(1975) Lancet. 1(7897):16-19）。ＨＤＬは、輸液されたとき（Badimon et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1234-1241）、およびアポＡ−Ｉの過剰発現を伴うとき（Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611）、動物モデルでアテローム性硬化症を減少させることが示された。しかしながら、アポＡ−ＩＩの過剰発現はアテローム性硬化症を増強することが示された（Castellani er al.(19＿) J. Clin. Invest. 100:464-474; Warden et al.(1993) Science 261:469-472; Hedrick et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:20676-20682）。本明細書で報告した実験は上記の公表された報告と一致し、アポＡ−ＩＩではなくアポＡ−Ｉが“播種”分子を新しく単離されたLDLから除去できることを示している。
実施例２では、我々は、正常なＨＤＬおよびその成分はまた、軽度に酸化されたＬＤＬの生成における第二および第三の工程も抑制できることを示す証拠を提示する。
【００９６】
実施例２：正常なＨＤＬは軽度に酸化されたＬＤＬの生成における３つの工程を抑制する−工程２および３
本実施例では、アポＡ−Ｉ、アポＡ−Ｉ擬似体、またはＨＤＬ、パラオキソナーゼによるヒト動脈壁細胞の処理によって、細胞はＬＤＬを酸化できなくなった（しかしアポＡ−ＩＩでは細胞はＬＤＬを酸化できた）。１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸［１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］および１５（Ｓ）−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸［１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ］の添加は、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）およびコレステリルリノレートの両方の非酵素的酸化を劇的に強化した。モル基準では、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥおよび１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥは、ＰＡＰＣから生物学的に活性な酸化リン脂質（ｍ／ｚ５９４、６１０および８２８）を生成させるについて、過酸化水素よりも約２オーダー強力であった。精製パラオキソナーゼはこれら酸化リン脂質の生物学的活性を抑制した。冠状動脈疾患をもち血中脂質が正常な１０人の患者（糖尿病ではなく、低脂肪血症の投薬を受けていない）のうち１０人に由来するＨＤＬが動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化を抑制できず、さらに酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制できなかったが、一方年齢および性別が一致する１０人のコントロールでは１０人のＨＤＬが抑制することができた。
我々は以下のように結論した：（ａ）軽度に酸化されたＬＤＬは３工程で形成され、各工程は正常なＨＤＬによって抑制できる；さらに（ｂ）正常な血中脂質レベルを有する少なくともいくらかの冠状動脈疾患患者は、動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化を防止する能力および酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制する能力の両能力において不完全である。
【００９７】
序論
我々は、ＨＤＬは、ヒト動脈壁細胞共働培養にＬＤＬと一緒に添加されたとき動脈壁細胞によるＬＤＬの酸化を妨げ、アポＡ−Ｉは妨げないことを見出した。これらの実験では、アポＡ−Ｉは動脈壁細胞およびＬＤＬと一緒に前記培養中で維持された（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046）。すぐ後で、ヒト動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを保護するＨＤＬの能力のメカニズムの解明で、我々は、アポＡ−Ｉを細胞とともにインキュベートし、続いてＬＤＬの添加前に除去するならば、動脈壁細胞は添加されたＬＤＬを酸化することができないことを発見した。これによって、我々は、アポＡ−Ｉはコレステロールおよびリン脂質だけでなくおそらく酸化脂質も同様に細胞から除去することができるかもしれないと考えた。これらの予備的発見は我々に本実施例で詳述する実験のヒントを与えた。
【００９８】
本実施例および実施例１で詳述する実験によって、我々は、軽度に酸化されたＬＤＬ中の生物学的に活性な脂質は一続きの３工程で形成されると提唱する。第一の工程は、コレステリルエステルヒドロペルオキシドと同様に、リノール酸およびアラキドン酸の代謝生成物と一緒にＬＤＬが播種されることである。第一の工程の立証は実施例１に提示した。本実施例では、我々は、第二の工程（すなわち内皮下腔中へのＬＤＬの捕捉および付近の動脈壁細胞に由来するさらに別の酸素種の前記捕捉ＬＤＬへの配布）に関する証拠を提示する。
【００９９】
Stockerとその共同研究者らは、リポキシゲナーゼはコレステリルリノレートの過酸化反応を主に非酵素的酸化によって仲介することを示す間接的な証拠を提示した（Neuzil et al.(1998) Biochem., 37:9203-9201; Upston et al.(1997) J. Biol. Chem., 272:30067-30074）。我々は、コレステリルリノレートの非酵素的酸化は、１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸［１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］の存在によって顕著に強化されることを本実施例で示す。我々はまた、軽度に酸化されたＬＤＬ生成における第三の工程は、“播種分子”（例えば［１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ］および１５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸［１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ］）の臨界閾値がＬＤＬ中で達成されたときに生じるＬＤＬリン脂質の非酵素的酸化であるということを本実施例で提唱する。我々は、これら“播種分子”が臨界レベルに達するとき、それらは主要なＬＤＬリン脂質、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）の非酵素的酸化を引き起こすことを示す証拠を本実施例で提示する。前記非酵素的酸化は、３つの生物学的に活性な酸化リン脂質：１−パルミトイル−２−オキソバレリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４）、１−パルミトイル−２−グルタリイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０）、および１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８）の生成をもたらす（Watson (1999) J. Biol. Chem. 274:24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272:13597-13607）。本実施例の実験はまた、正常なＨＤＬの場合と比較して、冠状動脈疾患患者で正常な血中脂質レベルを示し、さらに糖尿病でもなく低脂肪血症の投薬も受けていない患者から採取されたＨＤＬはヒト動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護せず、さらに酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制することができないことも示している。
【０１００】
方法
材料
アラキドン酸類似体、５，８，１１，１４−エイコサテトライノイック酸（ＥＴＹＡ）はビオモル（Biomol, Plymouth Meeting, PA）から入手した。コレステリルリノレートヒドロペルオキシド（ＣＨ１８：２：−ＣＯＯＨ）標準物質は、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いてコレステリルリノレートの過酸化反応によって調製した。７０％のｔ−ブチルヒドロペルオキシドを、１００ｍｇのコレステリルリノレートを含むクロロホルムおよびメタノール（２：１，ｖ／ｖ）に添加した。攪拌しながら室温で４８時間過酸化反応を実施した後、脂質をFolchの方法（Folch et al.(1957) J. Biol. Chem., 226:497-509）によって抽出し、逆相高処理液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって下記で述べるように分離した。他の全ての材料は、実施例１で述べた供給元から得られた。
【０１０１】
リポタンパク質、共働培養、単球の単離、単球走化性アッセイおよび単球付着アッセイ
これらは実施例１で述べたように調製および／または実施した。
患者および正常対象者
血液サンプルは、カリフォルニア大学ロサンゼルス分校保健科学センター心臓カテーテル挿入研究室（cardiac catheterization laboratory, Center for Health Sciences, University of California, Los Angeles）に照会された患者から採取した。同大学のヒト研究対象保護委員会（human research subject protection committee）によって承認された同意書式に署名した後、患者はヘパリン処理試験管に採取された絶食血液サンプルを提供した。ＬＤＬおよび／またはＨＤＬは以下の条件の患者から採取した血液サンプルからＦＰＬＣによって単離した：血管造影により冠状動脈アテローム性硬化症の証拠が認められるが、正常な総コレステロール（＜２００ｍｇ／ｄｌ）、ＬＤＬ−コレステロール（＜１３０ｍｇ／ｄｌ）、ＨＤＬ−コレステロール（男性で＞４５ｍｇ／ｄｌ、女性で＞５０ｍｇ／ｄｌ）、およびトリグリセリド（＜１５０ｍｇ／ｄｌ）を有し、低脂肪血症の投薬を受けておらず、さらに糖尿病ではない患者。以前に我々が報告した数人の患者および数人のコントロールのデータ（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）は、さらに別の新規なデータとともにここに含まれている。包含された先に報告した患者については、図の適切な説明文中に明瞭に示されている。ＨＤＬは各個体から単離し、先に報告したようにパラオキソナーゼ活性を測定した（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）。ヒト動脈壁細胞培養による酸化からＬＤＬを保護する、各対象者から得たＨＤＬの能力は、先に報告した技術を用いて決定した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046; Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）。ヒト動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護するＨＤＬの能力をテストするために用いるＬＤＬは正常なドナーから調製し、先に報告されたように（Rumsey et al.(1992) J. Lipid Res., 33:1551-1561）、小分けして凍結保存した。酸化リン脂質を不活化するＨＤＬの受容力を決定するために、いくつかの事例では、Ｍ１９９中の１０％ＬＰＤＳを含む試験管中で１００ｍｇ／ｍＬの酸化ＰＡＰＣ（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）を２５０μｇ／ｍＬのＨＤＬと３７℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートした。ＨＤＬ−Ｏｘ-ＰＡＰＣ混合物を続いて内皮単層培養に添加し、単球の結合を調べた。
【０１０２】
アポＡ−Ｉによる１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの除去に対する線維芽細胞中の１５−リポオキシゲナーゼ（１５−ＬＯ）の過剰発現の影響
ベクターのみをトランスフェクトした線維芽細胞、または１５−ＬＯを過剰発現している細胞は、Joe WitztumおよびPeter Reavenから提供された。本実験では、線維芽細胞は１００μｇ／ｍＬのアポＡ−Ｉの存在下または非存在下でインキュベートした。穏やかに攪拌しながら３７℃で３時間インキュベートした後、培養上清を取り出し、ＦＰＬＣによりアポＡ−Ｉを分離し、ヒドロペルオキシドレベルを培養上清の脂質抽出物およびアポＡ−Ｉの脂質抽出物で決定した。
【０１０３】
リポキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼ阻害物質の影響
１０％のＬＰＤＳを含むＭ１９９中の１０-8ｍｏｌ／Ｌの濃度のＥＴＹＡまたはシンナミル−３，４−ジヒヒドロキシ−α−シアノシナメート（ＣＤＣ，ビオモル（Biomol）より入手）とともにヒト動脈壁共働培養を予備インキュベートした。続いて、前記共働培養を洗浄し、ＬＤＬを２５０μｇ／ｍＬに加え、８時間インキュベートした。上清を取り出し、脂質ヒドロペルオキシドについてアッセイし、さらに単球走化性活性は実施例１で述べたように決定した。
【０１０４】
１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥまたは１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥまたは過酸化水素の添加によるＰＡＰＣから酸化リン脂質（ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＣ）の生成
１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥまたは１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥまたは担体のみを種々の濃度でＰＡＰＣに添加し、混合しさらに蒸発させて薄層を形成し、空気中で酸化させた。いくつかの実験では、ＰＡＰＣを蒸発させて薄層を形成し、種々の濃度で過酸化水素を含む１００μＬで空気中で酸化させた。サンプルをクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）で抽出し、過酸化水素の実験の場合は、クロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）５に対して水溶液１を添加して混合しさらに遠心した。クロロホルム相を採取し、陽イオンモードでＥＳＩ−ＭＳによって分析した。残存するＰＡＰＣのレベルおよび形成された酸化リン脂質を決定し、内部標準物質、１，２−ジテトラデカノイル−ｒａｃ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＤＰＭＣ，ｍ／ｚ６７８．３）との関連で表した。
【０１０５】
高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）および逆相高処理液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）および逆相高処理液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、実施例１で述べたように実施した。コレステリルリノレートヒドロペルオキシドの検出には、オールテックオールティマ（Alltech Alltima）２５０×４．６ｍｍ，５ミクロンＲＰ−ＨＰＬＣＣ１８カラムを用いて分離し、コレステリルリノレートヒドロペルオキシドは２３４ｎｍで、コレステリルリノレートは２０５ｎｍで検出した。移動溶媒は、１．０mL／分でアセトニトリル／２−プロパノール／水（４４：５４：２，ｖ／ｖ／ｖ）から成る。脂質は注入のために移動溶媒に再懸濁させた。
【０１０６】
エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）
陽イオンまたは陰イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）は、先に報告したプロトコルおよび条件に従って実施した（Watson (1999) J. Biol. Chem. 274:24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272:13597-13607）。ＥＳＩ−ＭＳは、API III triple-quadrupole生物分子質量分析装置（Perkin-Elmer）で実施した。前記装置は、連結式の空気圧を利用する噴霧化プローブおよび大気圧イオン化ソースを備えている（Watson (1997) J. Biol. Chem. 272:13597-13607）。陽イオンフローインジェクション分析は、アセトニトリル／水／ギ酸（５０／５０／０．１，ｖ／ｖ／ｖ）を用いて実施し、陰イオンフローインジェクション分析は、１０ｍＭの酢酸アンモニウムを含むメタノール／水（５０／５０）を用いて実施した。定量分析には、１，２−ジテトラデカノイル−ｒａｃ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）またはヘプタデカン酸を内部標準物質として用いた。イオンは、０．３Ｄａのステップサイズでスキャンした。データはPE Sciexが供給するソフトウェアにより処理した。
【０１０７】
他の方法
リポタンパク質のタンパク質含有量は、ロウリーのアッセイ（Lowry et al.(1951) J. Biol. Chem. 183:265-275）の変法（Lorenzen and Kennedy (1993) Anal. Biochem. 214:346-348）によって決定した。脂質ヒドロペルオキシドレベルは、Auerbachらの報告（Anal. Biochem., 201:375-380(1992)）したアッセイを用いて測定した。表示したいくつかの実験では、動脈壁細胞共働培養によって酸化されたＬＤＬを含む培養上清中の脂質は、クロロホルム−メタノールによって抽出し、ヒドロペルオキシドは、Auerbachの方法によって決定した。パラオキソナーゼ活性は、先に報告されたように（Gan et al.(1991) Drug Metab. Dispos. 19:100-106）測定した。統計的有意差はモデル１ＡＮＯＶＡによって決定した。この分析は、先ず最初にＥＸＣＥＬアプリケーションでＡＮＯＶＡを用いて、グループの平均間に相違があるか否かを決定し、続いて適切な場合には対合スチューデントｔ検定を実施して顕著に異なる平均を特定した。有意差はｐ＜０．０１と規定される。
【０１０８】
結果
実施例１は、ＬＤＬは動脈壁細胞によるＬＤＬの酸化に必要な“播種分子”を含むことを示した。以前に我々は、新しく単離したＬＤＬは内皮細胞への単球の付着を誘発せず、単球走化性も誘発しないが、一方、軽度に酸化したＬＤＬは両方を誘発することを報告した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046; Berliner et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1260-1266）。単球の付着および走化性を誘発する軽度に酸化されたＬＤＬの能力は、前記軽度に酸化されたＬＤＬ中に特徴的なＭ／Ｚ比（ｍ／ｚ５９４，６１０および８２８）を有する３つの酸化リン脂質が存在することによる（Watson (1999) J. Biol. Chem. 274:24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272:13597-13607）。我々は、新しく単離したＬＤＬにはこれら酸化リン脂質の形跡を認めなかった（データは示されていない）。したがって、我々は以下のように結論した：これら“播種分子”のレベルは臨界閾値未満であるためか、または、別の新たな異なる“播種分子”が生物学的に活性な酸化リン脂質の生成に要求されるために、新しく単離されたＬＤＬ中の“播種分子”はそれらだけでは３つの生物学的に活性な酸化リン脂質を生じるには不十分である。したがって、我々は、軽度に酸化されたＬＤＬの生成には、最初の“播種”以外に少なくとも１つの他の工程が必要であると結論した。
【０１０９】
工程２
アポＡ−Ｉはヒト動脈壁細胞がＬＤＬを酸化できないようにするが、アポＡ−ＩＩはしない
以前に我々は、ヒト動脈壁細胞とアポＡ−ＩおよびＬＤＬとの同時インキュベーションは、動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護しないことを報告した（Navab et al.(1991) J.Clin. Invest. 88:2039-2046）。図１１に示したように、これらの結果は確認された（同時インキュベーションＡ−Ｉを擬似処理培養と比較）。しかしながら、ヒト動脈壁共働培養を先ずアポＡ−Ｉとインキュベートし、続いてアポＡ−ＩをＬＤＬ添加前に前記共働培養から取り出したとき（Ａ−Ｉ後培養）、動脈壁細胞はＬＤＬを酸化できず（図１１Ａ）、さらに単球走化性も防止しなかった（図１１Ｂ）。アポＡ−Ｉの場合とは対照的に、培養を先ずアポＡ−ＩＩとインキュベートし、続いてアポＡ−ＩＩを取り出したとき、この動脈壁共働培養はＬＤＬを酸化するその能力を保持しており（図１１Ａ）、さらに単球の走化性も誘発した（図１１Ｂ）（Ａ−ＩＩ後培養）。
【０１１０】
別の実験では、アポＡ−Ｉを第一の共働培養セットとインキュベートし、続いて第一の共働培養セットからアポＡ−Ｉを取り出し、同一処理を施した第二の共働培養セットに添加した（すなわち第二の共働培養セットはアポＡ−Ｉで処理され、続いてアポＡ−Ｉは除去されている）。ＬＤＬをこの第二の共働培養セット（第一の共働培養セットに由来するアポＡ−Ｉを含んでいる）に添加したとき、これら再構成された共働培養はＬＤＬを容易に酸化し（図１１Ａ）、さらに単球走化性を誘発した（図１１Ｂ）（Ａ−Ｉ培養＋培養後Ａ−Ｉ）。
【０１１１】
同様な実験をアポＡ−ＩＩを用いて実施した。アポＡ−ＩＩを第一の共働培養セットとインキュベートし、続いて第一の共働培養セットからアポＡ−ＩＩを取り出し、同一処理を施した第二の共働培養セットに添加した（すなわち第二の共働培養セットはアポＡ−ＩＩで処理され、続いてこのアポＡ−ＩＩは除去されている）。ＬＤＬをこの第二の共働培養セット（第一の共働培養セットに由来するアポＡ−ＩＩを含んでいる）に添加したとき、動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化は顕著に増加し（図１１Ａ）、さらにＬＤＬ誘発単球走化性も顕著に増加した（図１１Ｂ）（Ａ−ＩＩ後共働培養＋培養後Ａ−ＩＩ）。
【０１１２】
ＬＤＬ酸化およびＬＤＬ誘発単球走化性のアポＡ−Ｉによる低下は、アポＡ−Ｉが前記細胞とのインキュベーション後およびＬＤＬ添加前に取り出されることが必要であるので（Ａ−Ｉ後培養を同時インキュベーションＡ−Ｉと比較）、我々は、アポＡ−Ｉは、ＬＤＬが共働培養によって酸化されるために必要で、さらに単球走化性を誘発するために必要な物質を動脈壁細胞共働培養から除去したと結論した。我々はまた、アポＡ−ＩＩはＬＤＬ酸化およびＬＤＬ誘発単球走化性を低下させることはできず（Ａ−ＩＩ後培養をＡ−Ｉ後培養と比較）、実際のところこれらを強化すると結論した。
【０１１３】
同様な結果が、共働培養をアポＡ−Ｉペプチド擬似体で処理したときに得られた（図１２）。共働培養を、アポＡ−Ｉペプチド擬似体３７ｐＡの存在下または非存在下でインキュベートし、続いて、前記ペプチドをＬＤＬの添加前に取り出した。別の共働培養をコントロールペプチド４０Ｐとインキュベートした。ＬＤＬの添加前に取り出したアポＡ−Ｉペプチド擬似体３７ｐＡとインキュベートした共働培養は、添加したＬＤＬを酸化できず（図１２Ａ）、さらに単球の走化性も誘発しなかった（図１２Ｂ）。共働培養をコントロールペプチド４０Ｐで処理したときは上記のようではなかった。コントロールペプチド４０Ｐで処理した後、ＬＤＬは、擬似処理共働培養と同程度に共働培養によって酸化され（図１２Ａ）、さらに単球走化性を誘発した（図１２Ｂ）。我々は、アポＡ−Ｉペプチド擬似体３７ｐＡは、ＬＤＬが共働培養によって酸化されるために必要であり、さらに単球走化性を誘発するために必要な物質を動脈壁細胞から除去したと結論した。
【０１１４】
ＨＤＬまたはＨＤＬ結合酵素はヒト動脈壁細胞がＬＤＬを酸化する能力を不能にする
我々はまた、完全なＨＤＬおよびその結合酵素パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）が、ＬＤＬを酸化する動脈壁細胞の能力を変化させることができるか否かを調べた。動脈壁細胞共働培養をＨＤＬまたは精製ＰＯＮとインキュベートし、続いてこれらを前記共働培養にＬＤＬを添加する前に取り出した。これら２つのどちらで動脈壁細胞を処理しても、動脈壁細胞はＬＤＬを酸化できなくなり（図１３Ａ）、さらにＬＤＬ−誘発単球走化性も防止した（図１３Ｂ）。我々は、アポＡ−Ｉの他に、ＨＤＬおよびＰＯＮもヒト動脈壁細胞がＬＤＬを酸化するのを妨げ、さらに単球走化性を誘発するのを防止すると結論した。
【０１１５】
リノール酸はヒト動脈壁細胞のＬＤＬ酸化を刺激するが、オレイン酸は刺激しない
上記に記載したように、我々は、軽度に酸化されているＬＤＬ中の“播種分子”は、単球の走化性を誘発する３つの生物学的に活性なリン脂質を生成するためにはそれだけでは不十分であると結論した。我々は、その理由を、これら“播種分子”のレベルが臨界閾値未満であるためか、またはさらに別の“播種分子”が生物学的に活性な酸化リン脂質をＬＤＬ中に生成させるために必要であるためと仮説をたてた。我々は、同じ“播種分子”が酸化リン脂質を生成し、したがって単球走化性を生じるために何らかの閾値が存在するならば、さらにこれら“播種分子”がリノール酸の代謝産物に部分的に由来するならば、ヒト動脈壁共働培養のリノール酸を豊富にすることによって、そのＬＤＬ酸化能力を強化し、単球走化性を誘発できると推論した。それゆえ、我々はヒト動脈壁共働培養をリノール酸（Ｃ１８：２）またはリノール酸（Ｃ１８：１）の存在下または非存在下でインキュベートし、前記細胞を洗浄し、さらに脂肪酸を補充していない新しい培養液中で３７℃で３時間インキュベートすることによって前記脂肪酸をこれらの細胞に代謝させた。その後、これらヒト動脈壁細胞共働培養がＬＤＬを酸化する能力および単球走化性を誘発する能力をテストした（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。動脈壁細胞をリノール酸とインキュベートすることによって、オレイン酸と比較して動脈壁細胞の酸化能力（図１４Ａ）および単球走化性の誘発能力は顕著に強化された。別の実験では、共働培養をＬＤＬの非存在下で、リノール酸（Ｃ１８：２）とともに（＋）またはリノール酸（Ｃ１８：２）無しに（−）インキュベートし、さらに細胞を洗浄してからアポＡ−Ｉの存在下または非存在下でインキュベートした（図１４Ｃ）。上清を取り出し、ＦＰＬＣでアポＡ−Ｉを分離し、脂質をアポＡ−Ｉから抽出した。アポＡ−Ｉ非存在下でインキュベートした培養上清の脂質抽出物もまた作製した。共働培養をリノール酸とインキュベートすることによって、アポＡ−Ｉの脂質抽出物中の１３−ＨＰＯＤＥ同等物は顕著に増加した（図１４Ｃ）（Ｃ１８：２とインキュベートした細胞のアポＡ−Ｉ脂質抽出物をＣ１８：２の非存在下でインキュベートした細胞のアポＡ−Ｉ脂質抽出物と比較）。我々は、ヒト動脈壁細胞をリノール酸とインキュベートすることによって、アポＡ−Ｉによって除去できる細胞の脂質ヒドロペルオキシド（すなわち１３−ＨＰＯＤＥ同等物）の生成は顕著に強化されると結論した。我々はさらに、ヒト動脈壁細胞とリノール酸とのインキュベーションは、動脈壁細胞によるＬＤＬの酸化を刺激し、さらにＬＤＬ誘発単球走化性を刺激し、オレイン酸では刺激されないと結論した。別の実験では、図１４Ａから図１４Ｃで述べた実験をアラキドン酸で実施した。その結果は、アラキドン酸は、動脈壁によるＬＤＬ酸化の刺激においてリノール酸よりもさらに強力であることを示した（データは示されていない）。
【０１１６】
リポキシゲナーゼ経路の役割に関する更なる証拠
Jackson & Parthasarathyは、ＬＤＬの“播種”におけるリポキシゲナーゼ（ＬＯ）の役割を提唱し（Thomas & Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256:1182-1181; Parthasarathy (1994) Modified Lopoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R.G. Landes Co. pp.91-119）、さらにSigariと共同研究者らは、１５−ＬＯを過剰発現している線維芽細胞は、ベクターのみをトランスフェクトされた線維芽細胞よりも容易にＬＤＬを酸化することを示した（Sigari et al.(1997) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 17:3639-3645）。ＬＯ経路の脂質ヒドロペルオキシド生成物を細胞から除去するアポＡ−Ｉの能力をさらに確立させるために、我々は、ＬＯを過剰発現している線維芽細胞およびベクターのみをトランスフェクトした細胞を、上記で述べたようにアポＡ−Ｉ存在下およびアポＡ−Ｉ非存在下でインキュベートした。上清を取り出し、アポＡ−ＩをＦＰＬＣによって分離し、脂質をアポＡ−Ｉから抽出した。アポＡ−Ｉの非存在下でインキュベートした培養上清の脂質抽出物もまた調製した。アポＡ−Ｉを添加されなかった、ＬＯを過剰発現している細胞の上清の脂質抽出物は、コントロール細胞と比較して極くわずか多い１３−ＨＰＯＤＥ同等物を含んでいた（データは示されていない）。対照的に、ＬＯを過剰発現している細胞とインキュベートしたアポＡ−Ｉの脂質抽出物は、コントロール細胞とインキュベートしたアポＡ−Ｉの脂質抽出物よりも顕著に多い（５．１倍以上）１３−ＨＰＯＤＥ同等物を含んでいた（データは示されていない）。
【０１１７】
方法の項で述べたように、ＬＤＬの添加の前に、リポキシゲナーゼ／シクロオキシゲナーゼ阻害物質ＥＴＹＡ（１×１０-8ｍｏｌ／Ｌ）で共働培養を予備処理したとき、脂質ヒドロペルオキシドレベルは８０±７％低下し、ＬＤＬ誘発単球走化性活性は７５±１０％低下した（ｐ＜０．００８、データは示されていない）。方法の項で述べたように、ＬＤＬの添加前にリポキシゲナーゼ阻害物質ＣＤＣ（１×１０-8ｍｏｌ／Ｌ）でヒト動脈壁共働培養を予備処理したとき、脂質ヒドロペルオキシドレベルは７３±６％低下し、ＬＤＬ誘発単球走化性活性は７４±１１％低下した（ｐ＜０．０１、データは示されていない）。
【０１１８】
総合すれば、これらの実験は、動脈壁細胞は、“播種された”ＬＤＬの酸化に必須の反応性酸素種（リノール酸およびアラキドン酸の代謝に由来するものを含む）を生成することを示唆している。これらの実験はまた、ＨＤＬ、アポＡ−ＩおよびＰＯＮはこれらの物質を除去または破壊することができ、さらに “播種された”ＬＤＬを動脈壁細胞が酸化できなくすることを提唱している。我々はまた以下の仮説を提唱する：動脈壁細胞によってさらに別の反応性酸素種が、“播種された”ＬＤＬに添加されてＬＤＬ中の臨界レベルが達成されるとき、主要なＬＤＬリン脂質ＰＡＰＣの非酵素的酸化は、単球結合および走化性を誘発する、３つの生物学的に活性なリン脂質（ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＶ）の生成をもたらす。
【０１１９】
工程３
１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥおよび１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥはＰＡＰＣおよびコレステリルリノレートの酸化を強化する
以前に我々は、ＰＡＰＣが空気に４８時間曝された場合、自己酸化を受けて３つの生物学的に活性なリン脂質、ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＣを生成することを報告した（Watson (1999) J. Biol. Chem. 274:24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272:13597-13607）。リポキシゲナーゼ経路の生成物が、初期の循環ＬＤＬの“播種”および、ＰＡＰＣの非酵素的酸化を惹起する臨界閾値に到達するために必要な動脈壁細胞による後期のＬＤＬ“播種”の両方に必要であるならば、リポキシゲナーゼ経路の生成物のＰＡＰＣへの添加は前記３つの生物学的に活性なリン脂質（ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＣ）の生成を増加させるはずである。この仮説を調べるために、我々は、ＰＡＰＣから生成される３つの生物学的に活性な酸化リン脂質を時間の関数として測定した。図１５Ａから図１５Ｃに示したように、１．０μｇの１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの１０μｇのＰＡＰＣへの添加は、標本抽出した各時点で３つの生物学的に活性な酸化リン脂質の生成を強化した（ＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４，図１５Ａ：ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０，図１５Ｂ；ＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８，図１５Ｃ）。
【０１２０】
図１６Ａのデータは、わずかに０．５μｇの１３（Ｓ）−ＰＯＤＥを１０μｇのＰＡＰＣに８時間添加したとき、ＰＡＰＣ（ｍ／ｚ７８２）の相対量は顕著に減少し、３つの生物学的に活性な酸化リン脂質（ｍ／ｚ５９４，６１０および８２８）の生成は顕著に強化されたことを示している。図１６Ｂは、わずかに０．５μｇの１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥを１０μｇのＰＡＰＣに８時間添加したとき、ＰＡＰＣ（ｍ／ｚ７８２）の相対量は顕著に減少し、３つの生物学的に活性な酸化リン脂質（ｍ／ｚ５９４，６１０および８２８）の生成は顕著に強化されたことを示している。
【０１２１】
図１６Ｃは、１０μｇのＰＡＰＣに８時間添加された８ｍＭの過酸化水素は、ＰＡＰＣの相対量を顕著に減少させ、生物学的に活性な酸化リン脂質の生成を顕著に強化したが、一方、２ｍＭおよび４ｍＭの過酸化水素は効果がないことを示している。ＰＡＰＣの分子量は７８２であるので、過酸化水素によるＰＡＰＣの酸化強化に必要なモル比は、図１６Ｃで示した実験では約６２：１（Ｈ2Ｏ2：ＰＡＰＣ）であった。１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ１５の分子量は３１１で、（Ｓ）−ＨＰＥＴＥの分子量は３３６．５であるので、これらのリポキシゲナーゼ経路の生成物がＰＡＰＣの酸化を促進したモル比は約１．８である。したがって、モル基準では、ＰＡＰＣを酸化する１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ１５および（Ｓ）−ＨＰＥＴＥの能力は、前記の条件下では過酸化水素のそれよりも２オーダー高い。これらのデータを総合すれば、それぞれリノール酸およびアラキドン酸代謝の生成物、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ１５および（Ｓ）−ＨＰＥＴＥは、強力な酸化剤として機能しＰＡＰＣの非酵素的酸化を促進して、軽度に酸化されたＬＤＬで見出される３つの生物学的に活性なリン脂質を生じる。
【０１２２】
Stockerおよび共同研究者らは、コレステリルリノレートのリポキシゲナーゼ仲介酸化は、主にリポキシゲナーゼ経路の生成物を必要とする非酵素的過程によって仲介されることを示唆する間接的証拠を提示した（Neuzil et al.(1998) Biochem. 37:9203-9210; Upston et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:30067-30074）。図１７の実験は、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの存在は、コレステリルリノレートヒドロペルオキシド（Ｃｈ１８：２−ＯＯＨ）の非酵素的生成を顕著に刺激することを示している。
【０１２３】
パラオキソナーゼは、３つの酸化リン脂質、ｍ／ｚ５９４、６１０および８２８の生物学的活性を破壊する
以前に我々は、抗酸化剤およびＨＤＬは生物学的に活性な軽度に酸化されたＬＤＬの生成を防止することができるが、いったん生成されたＨＤＬおよび抗酸化剤は軽度に酸化されたＬＤＬの生物活性を減少させることはできないことを報告した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046）。これらの実験では、上記で報告した実験（その場合ＨＤＬは、ＬＤＬが共働培養に添加される前に前記共働培養に添加された）とは対照的に、我々はＨＤＬをＬＤＬと一緒に共働培養に添加した。別の実験では、我々は、ＰＡＦ−ＡＨがＬＤＬと細胞添加前にインキュベートされる場合は、前記酵素は軽度に酸化されたＬＤＬの生物学的活性を破壊できることを報告した（Watson et al.(1995) J. Clin. Invest.96:2882-2891）。これらの実験は、特定の酸化リン脂質ではなく（すなわち酸化ＰＡＰＣまたはＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣ、ＰＥＩＰＣ）軽度に酸化されたＬＤＬを用いて実施した。パラオキソナーゼが前記３つの酸化リン脂質の各々の生物学的活性を破壊する能力を直接調べるために、我々は、方法の項で述べたように、酸化ＰＡＰＣ（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）またはＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４；ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０；またはＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８を精製パラオキソナーゼの存在下または非存在下でインキュベートした。酵素を前記混合物から分離し、混成物をヒトの動脈壁共働培養に添加した。Ｏｘ−ＰＡＰＣまたはＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４；ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０；またはＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８を精製パラオキソナーゼとインキュベートし、続いて動脈壁細胞共働培養に提供する前に前記混合物からパラオキソナーゼを分離した。各々の生物学的活性の破壊、すなわち単球走化性を誘発する能力の低下がもたらされた。（図１８）。２つの変異体リコンビナントＰＯＮ調製物（Robert SorensonおよびBert N. La Duから提供された（Sorenson et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7187-7191））は、このアッセイ系では生物学的に活性なリン脂質を不活化することはできなかった（データは示されていない）。１００℃で沸騰させて不活化したＰＯＮは、酸化リン脂質の活性に対して影響を示さなかった（データは示されていない）。
【０１２４】
冠状動脈疾患を有し、正常な血中脂質レベルを有し、糖尿病でもなく低脂肪血症の投薬も受けていない患者のＨＤＬは、動脈壁細胞によるＬＤＬの酸化を防止することができず、酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を破壊することもできない
我々は、血管造影によって冠状動脈疾患と確認された２５０人以上の患者のスクリーニング後に、正常な血中脂質レベルを有し、糖尿病ではないにもかかわらず冠状動脈疾患が血管造影により確認された１４人の患者を特定した（Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）。これら１４人は、年齢および性別が適合する１９人のコントロールと比較して、正常なＨＤＬ−コレステロールを有するにもかかわらず、平均してより低いレベルのパラオキソナーゼ活性を有していた（上掲書）。しかしながら、患者のパラオキソナーゼ活性と正常コントロールとの間の相違は統計的有意差には達しなかった（上掲書）。さらに我々は、正常な脂質レベルを有し（すなわち、総コレステロール＜２００ｍｇ／ｄｌ、ＬＤＬ−コレステロール＜１３０ｍｇ／ｄｌ、ＨＤＬ−コレステロール＞４５ｍｇ／ｄｌ（男性）および＞５０ｍｇ／ｄｌ（女性）、トリグリセリド＜１５０ｍｇ／ｄｌ）、血管造影により冠状動脈疾患が確認され、糖尿病ではなく低脂肪血症の投薬も受けていない、さらに１０人の患者を特定した。以前に報告したデータと新しいデータを合わせて、患者（ｎ＝２４）およびコントロール（ｎ＝２９）との間のパラオキソナーゼ活性において今や統計的に有意差が認められた（図１９Ａ）。
【０１２５】
以前には、我々の共働培養系をテストするために十分なサンプルは、最初の１４人の患者のうち５人からしか得ることができなかった（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）。これら５人のＨＤＬは、ヒト動脈壁共働培養系でＬＤＬ誘発単球走化性活性を防御せず、一方コントロールの４人は防御したことを報告した。我々の現在の実験では、血管造影では冠状動脈疾患を有する血中脂肪は正常な、糖尿病でもなく低脂肪血症の投薬も受けていないさらに別の１０人からＨＤＬが得られた。これら１０人の患者および年齢と性別が適合する正常対象者のコントロールＬＤＬ（すなわち、１人の正常対象者から得られたＬＤＬで、これは全ての実験で用いられた）の酸化を変化させるＨＤＬの能力は図１９Ｂに示されている。図１９Ｂに示したように、前記患者１０人のうち１０人から採取されたＨＤＬは、ヒト動脈壁細胞による酸化に対してコントロールＬＤＬを防御しなかった。実際のところ、患者のＨＤＬは、平均してコントロールＬＤＬの酸化を増強し、年齢と性別が適合する１０人の正常対象者のうち１０人のＨＤＬは、コントロールＬＤＬの動脈壁細胞による酸化を顕著に低下させた。
【０１２６】
以前に報告した５人の患者および年齢と性別が適合する４人の正常対象者の単球走化性に関するデータに１０人の新しい患者および１０人の正常対象者のそれを加えて、共働培養系で今やテストが完了した合計１５人の患者および１４人の正常対象者が得られた。図１９Ｃに示した実験では、これら患者１５人のうち１５人のＨＤＬはＬＤＬ誘発単球走化性活性を防御できなかったが、一方、１４人のコントロールのうち１４人が防御できるＨＤＬを有していた。
以前には、我々は、この患者サブセットから得たＨＤＬの酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を破壊する能力について直接テストすることはできなかった。図１９Ｄは、患者（以前に報告されなかった者）は、酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制できないＨＤＬを有していることを示している（１０人の患者のうち１０人が酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制しないＨＤＬを有していた）。実際のところ、１０人の患者のＨＤＬは、ＨＡＥＣへのＯｘ−ＰＡＰＣ誘発単球付着を平均して増強させた。対照的に、１０人の年齢と性別が適合する正常対象者のうち１０人のＨＤＬは、ＨＡＥＣへの単球付着を誘発するＯｘ−ＰＡＰＣの能力を顕著に低下させた。これらのデータを総合すれば、冠状動脈疾患をもつこの患者サブセットのＨＤＬは、これら患者の正常な血漿ＨＤＬ−コレステロールレベルにもかかわらず不完全のように思われる。
【０１２７】
考察
我々は、アポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉ擬似体はヒト動脈壁細胞に直接作用し、ＬＤＬを酸化するそれらの能力に重要な影響を与えることができることを本実施例で示した（図１１および図１２）。対照的に、アポＡ−ＩＩは、ヒト動脈壁細胞がＬＤＬを酸化するのを防ぐことができなかった（図１１）。ＬＤＬの場合と同様に（実施例１を参照されたい）、ヒト動脈壁細胞をＨＤＬまたはＰＯＮで処理することによって、動脈壁細胞はＬＤＬを酸化することができなくなった（図１３）。これらの実験は、ＨＤＬおよびその結合酵素はヒト動脈壁細胞がさらに新たな反応性酸素種を提供するのを抑制することができることを示している（前記反応性酸素種は、ＰＡＰＣが酸化して生物学的に活性なリン脂質を生じるために必要な臨界閾値に循環ＬＤＬが到達するために必要である）。
【０１２８】
本実施例のデータは、軽度に酸化されたＬＤＬ生成の第二の工程における、動脈壁細胞中のリポゲナーゼ経路の生成物の役割を支持し、さらに１２／１５−リポキシゲナーゼ遺伝子の破壊はアポＥ欠損マウスでアテローム性硬化症を減少させるというCyrusらの最近の発見（Cyrus et al.(1999) J. Clin. Invest., 103:1597-1604）と一致する。彼らは、いくつかのメカニズムが彼らの発見を説明できると結論したが、以下の１つのメカニズムを支持した：“リポキシゲナーゼ由来ヒドロキシペルオキシドまたは二次的反応性脂質種は細胞膜を通過して移され、細胞外ＬＤＬを“播種”し、このＬＤＬは脂質過酸化反応を促進させることができる多様なメカニズムにより感受性になるであろう”。
【０１２９】
３つの生物学的に活性なリン脂質（ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＣ）を生成するＰＡＰＣの非酵素的酸化は、１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥによって極めて強化された（図１５および図１６）。実際、ＰＡＰＣを酸化してこれら３つの生物学的に活性なリン脂質を生じる１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥの能力は、過酸化水素のそれよりも２オーダー以上強力であった（図１６）。これらの結果は、ＬＤＬを酸化するために必要な過酸化水素の量は、ＬＤＬを酸化する内皮細胞によって生成されるものより２オーダー大きいというMontgomery, Nathan & Cohnの発見と一致する（Montgomery et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6631-6635）。コレステリルリノレートヒドロペルオキシド（Ｃ１８：２−ＯＯＨ）の非酵素的生成を刺激する１３−ＨＰＯＤＥの能力は、Stockerと共同研究者らの結果と一致し（Neuzil et al.(1998) Biochem. 37:9203-9210; Upston et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:30067-30074）、さらに、Cyrusら（Cyrus et al.(1999) J. Clin. Invest. 103:1597-1604）の仮説のように、リポキシゲナーゼ経路の生成物は、多様な酸化脂質の生成にとって中核的なものであるかもしれないということを示唆する。
【０１３０】
Stockerと共同研究者らはまた、アポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩは、固有のメチオニン残基の酸化を必要とするメカニズムを介してコレステリルエステルヒドロペルオキシドを減少させることができることを示した（Garner et al.(1998) J. Biol. Chem. 273:6088-6095）。我々の実験では、アポＡ−ＩＩではなくアポＡ−Ｉのみがマウスに注射した後ＬＤＬの酸化を減少させることができた（実施例１を参照されたい）。さらにまた、アポＡ−ＩのみがＬＤＬを酸化するヒト動脈壁細胞の能力を減少させることができ、アポＡ−ＩＩはできなかった（実施例１１）。
Ｏｘ−ＰＡＰＣおよびその成分（ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＣ）の生物学的活性はＰＯＮ（図１８）および正常なＨＤＬによって破壊されるが、正常な血中ＨＤＬ−コレステロールレベルにもかかわらず血管造影ではアテローム性硬化症であることが確認された患者のＨＤＬでは破壊されない（図１９参照）ということは、ＨＤＬの異常性が、この比較的稀な患者亜群では少なくとも部分的にはアテローム性硬化症の原因であろうと提唱させる。アテローム性硬化症の発症におけるＰＯＮの役割は、先ずMacknessとDurringtonの実験によって提唱され（Mackness et al.(1998) FEBS Let., 423:57-60; Ayub et al.(1999) Arterioscler. Thromb Vascul. Biol. 19:330-335）、さらに我々を含む多数の研究室の実験によって支持された（Shih et al.(1996) J. Clin. Invest. 97:1630-1639; Shih et al.(1998) Nature 394:284-287; Castellani et al.(1997) J. Clin. Invest. 100:464-474）。本実施例で我々は、冠状動脈疾患をもち、糖尿病ではなく低脂肪血症の投薬を受けていない血中脂質が正常な患者は、年齢および性別が適合する正常対象者と比較して極めて低いPON活性レベルを有することを報告した（図１９Ａ）。しかしながら、患者と正常対象者のＰＯＮ活性にはオーバーラップがあった。対照的に、１０人の患者のうち１０人のＨＤＬは、ヒト動脈壁細胞による酸化に対してコントロールＬＤＬを保護することができず（図１９Ｂ）、さらに酸化ＰＡＰＣの生物学的活性を抑制することもできなかったが、一方、年齢および性別が適合する１０人の正常対象者のうち１０人のＨＤＬはできた。これらの発見によって、我々は、患者とコントロールＨＤＬの相違はＰＯＮ活性の相違によっては完全に説明することができないと考えた。
【０１３１】
本実施例および実施例１で提示したデータは、軽度に酸化されたＬＤＬを生成させる３工程プロセスにおける各工程および全工程を調節するＨＤＬおよびその成分、アポＡ−ＩおよびＰＯＮの役割を示した（これは図２０に示されている）。軽度に酸化されたＬＤＬの生成のメカニズム、並びに軽度に酸化されたＬＤＬ生成の防止およびその生物学的活性抑制におけるＨＤＬおよびその成分の役割を理解することによって、アテローム性硬化症およびこの炎症性過程から生じる臨床症状の予防および治療のための新規な治療手段が提供されるであろう。
【０１３２】
実施例２
ＨＤＬのイムノアフィニテースクリーニング
ここで述べるアッセイでは以下の材料およびプロトコルを用いた：
材料とプロトコル
抗ヒトアポＡ−Ｉ−セファロース４Ｂビーズの調製
材料
抗ヒトアポＡ−Ｉ−セファロース４Ｂビーズの調製では、以下の装置および材料を用いた：臭化シアン活性化セファロース４Ｂ、１ｍＭＨＣｌ、抗ヒトアポＡ−Ｉ（Roche/BM）、カップリング緩衝液（５００ｍＭＮＡＣｌ、１００ｍＭＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．３））、ラブクェイク（ミキサー）および４℃冷蔵庫、封鎖緩衝液０．２Ｍグリシン（ｐＨ８．０）（０．７５０７ｇ／５０ｍＬ＋ＴＲＩＳ数グレイン））、酢酸（０．１Ｍ）洗浄緩衝液，０．５ＭＮＡＣｌ，ｐＨ４．０（１．３６ｇの酢酸ナトリウム、２．９ｇのＮａＣｌ、酢酸でｐＨ４にし、２回蒸留水で１００ｍＬにする）、および遠心機。
【０１３３】
プロトコル
１．３５ｇのＣ９１４２シグマ臭化シアン活性化セファロース４Ｂを１ｍＭのＨＣｌ４５ｍＬと一緒にし、１５分膨潤させ（約４．７ｍＬの膨潤ビーズ）、続いて３００ｍＬの１ｍＭＨＣｌで洗浄した。カップリング緩衝液を４．５ｍＬまで添加し、２０μＬの抗ヒトアポＡ−Ｉを加えた。カップリング緩衝液中で洗浄ビーズおよび抗体を一緒にし、ひっくり返しながら４℃で一晩インキュベートした。ビーズを遠心し（２５０×ｇで５分）、上清を吸引で除いた。残存する部位を１０倍容積の０．２Ｍグリシンを加え、室温で２時間攪拌して封鎖した。
焼結ガラスフィルター上でビーズを洗浄することによって封鎖緩衝液を除去した。ビーズをカップリング緩衝液で、続いて酢酸緩衝液で、さらにカップリング緩衝液で洗浄した。前記洗浄サイクルをさらに４回繰り返して未結合タンパク質を除去した。続いてビーズを０．０１５Ｍ食塩水、２０ｍＭＴＲＩＳ、０．０２％ＮａＮ3（ｐＨ７．４）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１３４】
抗アポＡ−Ｉアフィニティー免疫吸着によって濃縮したＨＤＬのＤＣＦアッセイ
材料
ここで述べるＤＣＦアッセイでは以下の材料を用いる：ＤＣＦ（新しく開栓した脱気メタノール（遮光して−２０℃で保存）５．０ｍＬ中の１０ｍｇのＨ2ＤＣＦＤＡ（Ｄ−３９９，Molecular Probes, OR）、凍結バイアル、ミキサー、３７℃インキュベーター、抗アポＡ−Ｉセファロース４Ｂ（上記でのべたとおり）、ＦＰＬＣ緩衝液、蛍光読取装置およびプレート、血漿サンプル、および血漿標準物（ＨＤＬ、血漿）。
【０１３５】
プロトコル
血漿およびセファロースビーズを一緒にし（最終容積２．０ｍＬのアフィニティー抗アポＡ−Ｉでは１．０ｍＬのパックゲルにつき２００μＬのヒト血漿）、０．１５Ｍのトリス／食塩水（ｐＨ７．４）＋０．０２％ＮａＮ3中で４℃で一晩ひっくり返しながらインキュベートする。ビーズ＋血漿を０．０１５Ｍトリス，０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で１５ｍＬに希釈し、１５００ｒｐｍで５分室温で遠心することによって洗浄を実施する。ビーズをＦＰＬＣ緩衝液に２．０ｍＬの最終容積（５０％パックビーズ）に最懸濁する。１０μＬ（２０μｇ）のＤＣＦストック溶液をハミルトン注射筒を用いてブランクを除く各凍結バイアルに分注しＤＣＦをアルゴン下で蒸発させた。
ＤＣＦを含む凍結バイアルに表１に示すビーズ希釈シリーズを作製し、ボルテックスミキサーで攪拌する。
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５０μＬを広先端チップを用いてプレートに移す。プレートを穏やかに攪拌しながら３７℃で４時間インキュベートする。０、１、２および４時間でプレートを読み取る。データはブランクを差し引いて読み取る。血清およびＨＤＬコントロールで蛍光の阻害があるはずである。
【０１３６】
イムノアフィニティーによるＨＤＬの単離
ＨＤＬの主要タンパク質アポＡ−Ｉに対するポリクローナル抗体を臭化シアン活性化セファロース４Ｂビーズに結合させた。正常なヒト血漿（２００μＬ）を０．１５Ｍトリス／食塩水（ｐＨ７．４）＋０．０２％ＮａＮ3中の１．０ｍＬのパックしたアポＡ−Ｉ−セファロースビーズに添加し、室温で２時間混合した。続いてビーズと血漿を１５ｍＬに希釈し１５００ｒｐｍで５分室温で遠心してペレットにすることにより、この混合物を０．０１５Ｍトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で洗浄した。ペレットを通常の食塩水に２．０ｍＬの最終溶液（５０％のパックビーズ）に再懸濁した。部分標本を小さなカラムに充填し、ＨＤＬをｐＨ＝２．０の緩衝液を用いて溶出させた。このＨＤＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いてクマシービリリアントブルーで染色した（図２１）。分子量マーカーの他に、出発血漿およびイムノアフィニティー精製ＨＤＬ、市販の精製アポＡ−Ｉを含めた。
【０１３７】
ＤＣＦ蛍光の増加の抑制
ＨＤＬの主要タンパク質アポＡ−Ｉに対するポリクローナル抗体を臭化シアン活性化セファロース４Ｂビーズに結合させた。正常なヒト血漿（２００μＬ）を０．１５Ｍトリス／食塩水（ｐＨ７．４）＋０．０２％ＮａＮ3中の１．０ｍＬのパックしたアポＡ−Ｉ−セファロースビーズに添加し、室温で２時間混合した。続いてビーズと血漿を１５ｍＬに希釈し１５００ｒｐｍで５分室温で遠心してペレットにすることにより、この混合物を０．０１５Ｍトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で洗浄した。ペレットを通常の食塩水に２．０ｍＬの最終溶液（５０％のパックビーズ）に再懸濁した。ＤＣＦを凍結バイアルに分注し（２０μｇを含む１０μＬ）、アルゴン下で蒸発させた。パルミトリル−アラキドノイル−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）を２０μｇ／試験管で、１３（Ｓ）ヒドロペルオキシジデカエン酸（１３（Ｓ）ＨＰＯＤＥ）を１．０μｇ／試験管で添加し、アルゴン下で蒸発させた。続いてある範囲の濃度のＨＤＬ結合セファロースビーズを添加するか、または緩衝液のみで処理したビーズを添加した。蛍光は室温で４時間インキュベートした後読み取った。データはサンプル（×３）の平均値±ＳＤである（図２２）。
本明細書に記載した実施例および実施態様は例示を目的としており、前記の例示を参考にその多様な改変または変更が当業者によりを提案されるであろうが、それらは本発明の範囲内に包含されることは理解されよう。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は参照により本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、脂質を酸化から保護するＨＤＬの活性をアッセイするテストの実施態様の１つである。
【図２】  図２は、アポＡ−ＩによるＬＤＬから播種分子の除去を示す。ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を新しく単離した血漿に２０μＭの濃度で添加し、２つの連結させたスパーロース６カラムを有するＦＰＬＣを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで通常の食塩水で溶出させることによって分画した。ＬＤＬを含む分画を一緒にした。精製アポＡ−Ｉ（１００μｇ／ｍＬ）を前記ＬＤＬに添加し（１ｍｇ／ｍＬ）、通常の食塩水中で穏やかに混合しながら３７℃で２時間インキュベートした。続いて、ＬＤＬおよびアポＡ−ＩをＦＰＬＣによりまたは遠心により再度単離した。再単離ＬＤＬは“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”と呼び、再単離したアポＡ−Ｉは“Ａ−ＩアフタターＬＤＬ”と呼ぶ。
【図３】  図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、アポＡ−Ｉとインキュベートした後のＬＤＬの酸化に対する抵抗性を示す。ＬＤＬは７人の健常者ドナーからＦＰＬＣにより迅速に単離し、１ｍｇ／ｍＬのＬＤＬを１００μｇ／ｍＬのアポＡ−Ｉとインキュベートし、続いて図２で述べたようにＬＤＬおよびアポＡ−Ｉを再度単離した。動脈壁細胞共働培養を擬似処理ＬＤＬ（ＬＤＬ擬似）とともに、またはアポＡ−Ｉとインキュベートし再単離したＬＤＬ（ＬＤＬアフターＡ−Ｉ）とともに、または擬似処理アポＡ−Ｉ（Ａ−Ｉ擬似）とともにインキュベートした。別の共働培養ウェルには、“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”＋“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”から抽出した脂質をインキュベートすることによって再構成したＬＤＬ（Ａ−Ｉ脂質アフターＬＤＬ＋ＬＤＬアフターＡ−Ｉ）を添加した。この共働培養を１０％のＬＰＤＳの存在下で３７℃、８時間インキュベートした。上清を採取し、脂質ヒドロペルオキシドレベルを分析した。
単球付着は１組の共働培養で決定し、他は洗浄して血清またはＬＰＤＳを含まない培養液で１６時間インキュベートした。この条件付け培養液を採取し、単球走化性活性について分析した。図３Ａは上清の脂質ヒドロペルオキシドレベルを示している。図３Ｂは単球付着を示し、図３Ｃは単球走化性活性値を示している。図は、７人の別々の健常ドナーに由来するＬＤＬおよび別のドナーの共働培養および単球を用いた７つの別個の実験の代表的なものである。値は共働培養（×４）の平均±ＳＤである。
【図４】  図４Ａおよび図４Ｂは、ＬＤＬの酸化および走化性活性に対する、アポＡ−Ｉペプチド擬似体によるＬＤＬ予備処理の影響を示している。２５０μｇ／ｍＬの新しく単離したＬＤＬを、緩衝液（擬似ＬＤＬ）、１００μｇ／ｍＬのアポＡ−Ｉ擬似体ペプチド３７ｐＡまたは１００μｇ／ｍＬのコントロールペプチド４０Ｐで処理した。インキュベーションは、穏やかに混合しながらＭ１９９中で３７℃で２時間実施した。ＬＤＬおよびペプチドは、図１の場合のようにその後すぐに再単離した。動脈壁細胞共働培養は、擬似処理ＬＤＬ（擬似ＬＤＬ）、アポＡ−Ｉ擬似体ペプチドとインキュベートしたＬＤＬ（ＬＤＬアフター３７ｐＡ）、コントロールペプチドとインキュベートしたＬＤＬ（ＬＤＬアフター４０Ｐ）、擬似処理３７ｐＡ（３７ｐＡ擬似）、または擬似処理４０Ｐ（４０Ｐ擬似）とともにインキュベートした。別の共働培養ウェルには、“ＬＤＬアフター３７ｐＡ”および“３７ｐＡアフターＬＤＬ”から抽出した脂質をインキュべートすることによって再構成したＬＤＬ（３７ｐＡ脂質アフターＬＤＬ＋ＬＤＬアフター３７ｐＡ）を添加した。これら添加物をヒト動脈壁共働培養とともに１０％ＬＰＤＳの存在下で８時間インキュベートした。上清を採集し、脂質ヒドロペルオキシドレベルを分析した（図４Ａ）。続いてこの培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない培養液で８時間インキュベートした。続いて、前記条件付け培養液を採集し、単球走化性活性について分析した（図４Ｂ）。データは、別々の３つの実験の共働培養（×４）から得た値の平均±ＳＤを示している。星印はｐ＜０．００１４を示している。
【図５】  図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄは、アポＡ−Ｉによって抽出された脂質の生物活性を示している。新しく単離したＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）をアポＡ−Ｉ（１００ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートし、図１に示したように再度単離した。脂質を“Ａ−ＩアフターＬＤＬ”からクロロホルム−メタノールで抽出し、方法の項で述べたように固相抽出クロマトグラフィーで分離した。脂肪酸（ＦＡ）または中性脂肪（ＮＬ）分画を乾燥するまで蒸発させ、１０％ＬＰＤＳを含む２００μＬのＭ１９９と３７℃で５分間、断続的に穏やかにボーテックスミキサーで攪拌しながらインキュベートした。続いて、脂肪酸（ＦＡ−Ａ−ＩアフターＬＤＬ、図５Ａおよび図５Ｂ）、または中性脂質（ＮＬ−Ａ−ＩアフターＬＤＬ、図５Ｃおよび図５Ｄ）を表示の量で、１００μｇＰＡＰＣまたは２５０μｇ“ＬＤＬアフターＡ−Ｉ”のどちらかとともに、１０％のＬＰＤＳを含む最終容積１ｍＬのＭ１９９中で３７℃で３時間インキュベートした。１０％ＬＰＤＳを含むＭ１９９中の前記処理ＰＡＰＣまたはＬＤＬを、続いてＨＡＥＣとともに３７℃で４時間インキュベートした。上清を取り出し、本明細書に記載したように脂質ヒドロペルオキシド含有量（図５Ａおよび図５Ｃ）を分析した。細胞を洗浄し、単球付着を本明細書に記載したように決定した（図５Ｂおよび図５Ｄ）。
【図６】  図６Ａから図６Ｈは、アポＡ−ＩによるＬＤＬから１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥの除去を示している。新しく単離したＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）を、単独（ＬＤＬ擬似）またはＭ１９９中のアポＡ−Ｉ（１００ｍｇ／ｍＬ）とともに穏やかに混合しながら２時間インキュベートした。コントロールとして、アポＡ−Ｉ（１００μｇ／ｍＬ）をＭ１９９中で単独で（Ａ−Ｉ擬似、図６Ａおよび６Ｅ）、または新しく単離したＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）をＭ１９９中で単独で（ＬＤＬ擬似、図６Ｂおよび図６Ｆ）穏やかに混合しながら３７℃で２時間インキュベートした。続いて、ＬＤＬおよびアポＡ−Ｉをミリポア分子量カットオフフィルター（１００ｋＤａ）を用いて遠心により再単離した。脂質をアポＡ−ＩおよびＬＤＬから抽出し、逆相ＨＰＬＣで分析した。図６Ｃおよび図６Ｇは、アポＡ−Ｉとのインキュベーション後のＬＤＬ（ＬＤＬアフターＡ−Ｉ）における１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥピークにおける減少を示し、図６Ｄおよび図６Ｅは、ＬＤＬとインキュベートしさらに分離した後のアポＡ−Ｉ（Ａ−ＩアフターＬＤＬ）の脂質抽出物における１３−ＨＰＯＤＥおよび１５−ＨＰＥＴＥの増加をそれぞれ示している。
【図７】  図７Ａおよび図７Ｂは、固形飼料で維持したＣ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスストレインのＬＤＬ中の播種分子を示している。ＬＤＬは、病変感受性Ｃ５７ＢＬ／６（ＢＬ／６）および病変耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ）マウスの群から得た血漿から単離した。ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）をヒトアポＡ−Ｉ（１００μｇ／ｍＬ）とともに穏やかに混合しながら３７℃でインキュベートし、続いて図２に示したようにＦＰＬＣで再単離した。アポＡ−Ｉによって除去された脂質とともにＬＤＬの再構成を図３に示したように実施し、大動脈壁細胞の共働培養とともにインキュベートした。略語は図３の場合と同じである。図７Ａは、生成された脂質ヒドロペルオキシドについてのデータを示し、図７Ｂは、誘発された走化性活性を示している。表示の値は、共働培養（×４）の平均±ＳＤである。星印はｐ＜０．００１５を示している。
【図８】  図８Ａおよび図８Ｂは、アポＡ−Ｉのマウスへの注射はマウスＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に対して抵抗性にするが、アポＡ−ＩＩではしないということを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）の群に尾静脈から動物当たり１００μｇのアポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩまたは食塩水のみを注射した。血液サンプルを各時点で取り出し、ＬＤＬを単離し、共働培養とともに８時間インキュベートした。培養上清を脂質ヒドロペルオキシドについて（図８Ａ）、さらに単球走化性活性について（図８Ｂ）方法の項で述べたようにアッセイした。図は、代表的な実験から得たそれぞれのサンプルの4つの結果の平均±ＳＤを示している。星印は０時間と比較したときｐ＜０．０００１であることを示している。同一の結果が２つの別々の実験で得られた。
【図９】  図９Ａおよび図９Ｂは、ヒトアポＡ−Ｉのヒトへの輸液によってそのＬＤＬがヒト動脈壁細胞による酸化に対して抵抗性になることを示している。６人の個体（本文で説明されている）にヒトアポＡ−Ｉ／ホスファチジルコリンディスクを５０ｍｇアポＡ−Ｉ／ｋｇ体重で４時間にわたって輸液した。輸液開始前２時間および輸液開始後６時間（すなわち、輸液の完了後２時間）に血漿を調製した。ＬＤＬをＦＰＬＣで単離し、１００μｇ／ｍＬで共働培養とともに８時間インキュベートした。培養上清を採集し、脂質抽出に付し、ヒドロペルオキシド含有量についてアッセイした（図９Ａ）。前記共働培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない培養液で８時間インキュベートした。前記条件付け培養液を単球走化性活性について分析した（図９Ｂ）。共働培養（×４）の平均±ＳＤが示されている。星印はパネルＡについてはｐ＜０．０１７３、パネルＢについてはｐ＜０．００７７であることを示している。
【図１０】  図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＨＤＬまたはＨＤＬ結合酵素は、ＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に対して抵抗性にすることを示している。新しく単離したＬＤＬを２５０μｇ／ｍＬで緩衝液とともに（擬似処理ＬＤＬ）、３５０μｇ／ｍＬのＨＤＬとともに（ＨＤＬ処理ＬＤＬ）、または１×１０-2Ｕ／ｍＬの精製ＰＯＮとともに（ＰＯＮ処理ＬＤＬ）インキュベートした。前記インキュベーションは、穏やかに混合しながらＭ１９９中で３７℃で３時間実施した。続いてＬＤＬをミリポア分子量カットオフフィルター（１００ｋＤａ）を用いて遠心して再単離し、１０％ＬＰＤＳの存在下でヒト動脈壁細胞共働培養とともに８時間インキュベートした。上清を取り出し、脂質ヒドロペルオキシドについて分析した（図１０Ａ）。前記共働培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない培養液とともにインキュベートした。８時間後に培養液を集め、単球走化性活性について分析した（図１０Ｂ）。データは、３つの別個の実験の培養（×４）から得られた値の平均±ＳＤを示している。星印は、ｐ＜０．０００８のレベルの有意差を示している。
【図１１】  図１１Ａおよび図１１Ｂは、アポＡ−Ｉは、ヒト動脈壁細胞から物質を取り除き、前記細胞がＬＤＬを酸化できなくすることを示している。共働培養を５０μｇ／ｍＬのアポＡ−ＩまたはアポＡ−ＩＩとともに８時間インキュベートするか、または擬似処理した。アポＡ−ＩまたはアポＡ−ＩＩのどちらかを含む条件付け培養液を取り出し、いくつかの事例では、同一の処置を施してあって標的培養として機能する別の共働培養に移した。ＬＤＬを２５０μｇ／ｍＬで擬似処理されてある標的共働培養（擬似処理培養）に添加するか、またはアポＡ−Ｉで処理されてあり、そのアポＡ−Ｉは既に除去されてある標的培養（Ａ−Ｉ後培養）に添加するか、またはアポＡ−ＩＩで処理されてあり、そのアポＡ−ＩＩは既に除去されてある標的培養（Ａ−ＩＩ後培養）に添加する。ＬＤＬはまた、アポＡ−ＩまたはアポＡ−ＩＩで処理されてあり、さらに第一の共働培養セットからアポＡ−ＩまたはアポＡ−ＩＩを含む条件付け培養液が添加されている標的培養にも２５０μｇ／ｍＬで添加した（それぞれ（Ａ−Ｉ後培養＋培養後Ａ−Ｉ）および（Ａ−ＩＩ後培養＋培養後Ａ−ＩＩ））。標的培養は、１０％ＬＰＤＳおよびＬＤＬを含むＭ１９９中で、前記第一の共働培養セット由来の添加物（条件付け培養液）とともに、または非存在下で８時間インキュベートした。いくつかの共働培養には２５０μｇ／ｍＬのＬＤＬおよび５０μｇ／ｍＬのアポＡ−Ｉを8時間のインキュベーション開始時に加え、これを合計16時間継続させた（共働インキュベーションＡ−Ｉ）。上清を取り出し、脂質ヒドロペルオキシドについてアッセイし（図１１Ａ）、さらにこの共働培養を洗浄して、血清またはＬＰＤＳを含まない新しいＭ１９９を添加し、さらに８時間インキュベートし、単球走化性活性についてアッセイした（図１１Ｂ）。値は、別個のドナーに由来するＬＤＬを用いた３つの別々の実験から得られた平均値±ＳＤを示している。星印はｐ＜０．００１のレベルの有意差を示している。
【図１２】  図１２Ａおよび図１２Ｂは、アポＡ−Ｉペプチド擬似体は、ヒト動脈壁細胞から物質を取り除き、前記細胞がＬＤＬを酸化することができなくさせることを示している。ヒト大動脈壁共働培養を、培養液のみと（擬似処理）、１００μｇ／ｍＬのアポＡ−Ｉ擬似体ペプチドと（３７ｐＡ処理）、または１００μｇ／ｍＬのコントロールペプチドと（４０Ｐ処理）８時間インキュベートした。続いてこの共働培養を洗浄し、さらに新しく単離したＬＤＬを添加し、１０％ＬＰＤＳを含むＭ１９９でさらに８時間インキュベートした。培養液を取り出し、脂質ヒドロペルオキシドについてアッセイした（図１２Ａ）。前記共働培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない培養液でさらに８時間インキュベートし、単球走化性活性についてアッセイした（図１２Ｂ）。データは、３つの別個の実験の共働培養（×４）から得られた値の平均値±ＳＤを示している。星印はｐ＝０．０１１のレベルの有意差を示している。
【図１３】  図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＨＤＬおよびその結合酵素ＰＯＮはヒト動脈壁細胞がＬＤＬを酸化できなくすることを示している。ヒト大動脈壁共働培養を、培養液のみと（擬似処理）、３５０μｇ／ｍＬのＨＤＬと（ＨＤＬ処理）、または１×１０-2Ｕ／ｍＬの精製パラオキソナーゼと（ＰＯＮ処理）８時間インキュベートした。続いて、この共働培養を洗浄し、新しく単離したＬＤＬを２５０μｇ／ｍＬで加え、１０％ＬＰＤＳを含むＭ１９９中でさらに８時間培養した。培養液を採集し、脂質ヒドロペルオキシドについて分析した（図１３Ａ）。続いて、この共働培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない培養液とともに８時間インキュベートし、上清を採集して単球走化性活性について分析した（図１３Ｂ）。データは、３つの別個の実験の共働培養（×４）から得られた値の平均値±ＳＤを示している。星印はｐ＜０．０１１のレベルの有意差を示している。
【図１４】  図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、ヒト動脈壁細胞のリノール酸による予備処理によって、脂質ヒドロペルオキシドレベル、単球走化性活性およびアポＡ−Ｉによる１３−ＨＰＯＤＥの除去が増加することを示す。２セットの共働培養を１００μＭのオレイン酸（Ｃ１８：１）またはリノール酸（Ｃ１８：２）とともに１０％のＬＰＤＳを含むＭ１９９中で３７℃で１８時間インキュベートした。培養液を取り出し、培養を３回洗浄した。脂肪酸を含まない新しい培養液を添加し、さらに３時間３７℃でインキュベートした。続いて、２５０μｇ／ｍＬでＬＤＬを前記共働培養の１セットに加え１０％ＬＰＤＳを含むＭ１９９で８時間インキュベートした。続いて培養液を取り出し、脂質ヒドロペルオキシド（図１４Ａ）および単球走化性活性（図１４Ｂ）を決定した。共働培養の第二のセット（図１４Ｃ）には、アポＡ−Ｉを１００μｇ／ｍＬで添加しさらに３時間穏やかに混合しながら３７℃でインキュベートした。上清を取り出し、アポＡ−ＩをＦＰＬＣで分離し、アポＡ−Ｉを加えなかった上清（培養上清）の脂質抽出物およびアポＡ−Ｉの脂質抽出物（アポＡ−Ｉ脂質抽出物）のヒドロペルオキシド含有量を方法の項で述べたように決定し、ウェル当たりのｎｇとして表した。値は３つの測定値の平均±ＳＤである。星印はp＜０．００１を示す。
【図１５】  図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃは、１３−ＨＰＯＤＥはＰＡＰＣの生物学的に活性な酸化リン脂質の生成を促進することを示している。１０μｇのＰＡＰＣを１．０μｇの１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ（点描棒線）または担体のみ（白棒）と混合し、蒸発させて薄層を形成し、表示した時間空気中で酸化させた。クロロホルム−メタノールで抽出した後、サンプルを陽イオンモードでＥＳＩ−ＭＳで分析した。データは、ＰＡＰＣとともに添加された内部標準物質（０．１μｇのＤＭＰＣ）に対する１−パルミトイル−２−オキソバレリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４、図１５Ａ）、１−パルミトイル−２−グルタリイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０、図１５Ｂ）、および１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８、図１５Ｃ）のレベルを示している。値はサンプル（×３）の平均±ＳＤである。星印はｐ＜０．０１を示している。１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ単独ではｍ／ｚ５９４、６１０または８２８のシグナルを生じなかった（データは示されていない）。
【図１６】  図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃは、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥまたはＨ2Ｏ2は用量依存態様でＰＡＰＣの酸化リン脂質の生成を促進することを示している。１０μｇのＰＡＰＣを表示したマイクログラムの１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ（図１６Ａ）または１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ（図16Ｂ）と混合し、蒸発させて薄層を形成し、空気中で8時間酸化させた。図16Ｃでは、１０μｇのＰＡＰＣを蒸発させて薄層を形成し、さらにＨ2Ｏ2を表示の濃度で添加し、8時間酸化させた。クロロホルム−メタノールで抽出した後、サンプルを陽イオンモードでＥＳＩ−ＭＳで分析した。データは、ＰＡＰＣとともに添加された内部標準物質（０．１μｇのＤＭＰＣ）に対するＰＡＰＣ，ｍ／ｚ７８２；ＰＯＶＰＣ，ｍ／ｚ５９４；ＰＧＰＣ，ｍ／ｚ６１０；およびＰＥＩＰＣ，ｍ／ｚ８２８のレベルを示す。値はサンプル（×３）の平均±ＳＤである。１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ単独、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ単独では、またはＨ2Ｏ2はｍ／ｚ５９４、６１０または８２８のシグナルを生じなかった（データは示されていない）。星印はｐ＜０．００１の有意差を示している。
【図１７】  図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥはコレステリルリノレートヒドロペルオキシド（Ｃ１８：２−ＯＯＨ）の非酵素的生成を刺激することを示している。１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ０．５μｇ／ｍＬ（図１７Ａ）またはコレステリルリノレート１０μｇ／ｍＬ（図１７Ｂ）またはコレステリルリノレート１０μｇ／ｍＬとともに１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ５μｇ／ｍＬ（図１７Ｃ）を０．０１％のＢＨＴを含むクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）中で簡単にかき混ぜて混合し、アルゴン下で乾燥するまで蒸発させ、層状空気流フード内で６時間空気酸化させた。脂質を５０μＬのクロロホルムに溶解し、本文で述べたようにＲＰ−ＨＰＬＣによりコレステリルリノレートヒドロペルオキシド（Ｃｈ１８：２−ＯＯＨ）の存在について分析した。
【図１８】  図１８は、精製パラオキソナーゼは酸化リン脂質の生物学的活性を破壊することを示している。酸化ＰＡＰＣ（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、ＰＯＶＰＣ（ｍ／ｚ５９４）、ＰＧＰＣ（ｍ／ｚ６１０）またはＰＥＩＰＣ（ｍ／ｚ８２８）をＭ１９９中で、１×１０-2Ｕ／ｍＬの精製ヒトパラオキソナーゼ非存在下または存在下（＋ＰＯＮ）で穏やかに混合しながら試験管内で３７℃で３時間インキュベートした。パラオキソナーゼを混合物から取り除き、１０％ＬＰＤＳを含むＭ１９９で脂質をヒト大動脈壁共働培養とともに３７℃で８時間インキュベートした。続いて、前記共働培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない新しい培養液でさらに８時間３７℃でインキュベートした。上清を取り出し、単球走化性活性について分析した。データは共働培養液（×４）の平均±ＳＤである。星印はｐ＜０．０００１のレベルの有意差を示している。
【図１９】  図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃおよび図１９Ｄは、パラオキソナーゼ活性が不足し、正常なＨＤＬコレステロールレベルを有するにもかかわらず血管造影により冠状動脈のアテローム性硬化症と診断された患者のＨＤＬは、ＬＤＬを動脈壁細胞による酸化から保護せず、酸化リン脂質の生物学的活性を破壊しないことを示している。これらの患者は、正常な総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ−コレステロールおよびＨＤＬ−コレステロールレベルを有するにもかかわらず血管造影により冠状動脈のアテローム性硬化症と診断された。これらの患者は糖尿病でもなく低脂肪血漿の投薬も受けていなかった。パラオキソナーゼ活性は、方法の項で述べたように２４人の患者および年齢と性別が適合した２９人の正常対象者について決定した（図１９Ａ）。以前に報告した１４人の患者のデータおよび以前に報告した１９人の正常対象者のデータは、さらに新たな１０人の患者および年齢と性別が適合した正常対象者のデータとともに図１９Ａに含まれている。動脈壁細胞による酸化に対してコントロールＬＤＬを保護する、新たな１０人の患者のＨＤＬおよびコントロールのＨＤＬの能力は、本文で述べたように脂質ヒドロペルオキシド生成によって決定されたとおり図１９Ｂに、さらに本文で述べた単球走化性活性によって図１９Ｃに示されている。パネルＣのデータには、以前に報告した５人の患者および４人の正常対象者のデータと一緒に、新たな１０人の患者および前記患者と年齢と性別が適合する正常対象者についてのデータが含まれている。図１９Ｄのデータは、新規なアプローチ、すなわち酸化ＰＡＰＣ（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）の生物学的活性を抑制する患者および正常なＨＤＬ（各群に対してｎ＝１０）の能力を示している。各事例で、１００μｇ／ｍＬのＯｘ−ＰＡＰＣを２５０μｇ／ｍＬのＨＤＬと試験管で１０％ＬＰＤＳを含むＭ１９９中で穏やかに混合しながら３７℃で４時間インキュベートした。続いて、ＨＤＬ−Ｏｘ−ＰＡＰＣ混合物を内皮単層培養に添加し、単球の結合を測定した。データは、共働培養（×４）の平均±ＳＤである。星印は、パネルＡについてはｐ＜０．０１；パネルＢではＬＤＬ対ＬＤＬ＋患者ＨＤＬについてはｐ＜０．００１、ＬＤＬ＋コントロールＨＤＬ対ＬＤＬ＋患者ＨＤＬについてはｐ＜０．０００１；パネルＣではコントロールＬＤＬ対ＬＤＬ＋コントロールＨＤＬについてはｐ＜０．００９、ＬＤＬ＋コントロールＨＤＬ対ＬＤＬ＋患者ＨＤＬについてはｐ＜０．０００００８；パネルＤではＯｘ−ＰＡＰＣ対Ｏｘ−ＰＡＰＣ＋患者ＨＤＬについてはｐ＜０．００９、Ｏｘ−ＰＡＰＣ＋コントロールＨＤＬ対Ｏｘ−ＰＡＰＣ＋患者ＨＤＬについてはｐ＜０．０００１を示している。
【図２０】  図２０は、動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化のための３つの工程のモデルを示している：工程１−ＬＤＬが播種される；工程２−ＬＤＬは動脈壁に捕捉され、さらに新たな播種分子を受け取る；工程３−リン脂質に関する播種分子の臨界レベルがＬＤＬ内で達成されるとき、非酵素的酸化プロセスがＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＣおよびＰＥＩＰＣを生じる。循環内のＶＬＤＬの加水分解によって生じるＬＤＬは“播種分子”を含んでいるかもしれない。また別の選択肢として、ＬＤＬは内皮下腔（Ａ）に浸入するかもしれない。前記下腔内でＬＤＬは動脈壁細胞によって配られる反応性酸素種（ＲＯＳ）とともに播種される（工程１）。模式図では、内皮下腔でこれが生じるように示されているが、工程１は実際には毛細循環で生じるかもしれない。ＬＤＬが内皮下腔で播種される場合は、ＬＤＬはそこに留まり、細胞外マトリックス（Ｂ）に閉じ込められるか、または播種されたＬＤＬは循環内（Ｃ）に入って、再び内皮下腔の別の部位に侵入し、そこで細胞外マトリックス（Ｄ）に閉じ込められるであろう。工程２では、動脈壁細胞はさらに新たなまたは別のＲＯＳを生成し、これを捕捉された播種ＬＤＬに移動させる。この移動は細胞内、細胞表面または隣接する保護されたミクロドメインで発生する可能性がある。播種され捕捉されているＬＤＬへの反応性酸素種のこの移動の後、脂質酸化の非酵素的調製が惹起される（工程３）。これは、ＮＦ−κＢ活性化、単球結合、ＭＣＰ−１産生、およびＭ−ＣＳＦ産生を誘発する固有の酸化リン脂質の生成をもたらし、さらに前記酸化リン脂質は、軽度に酸化されたＬＤＬ（極めてわずか改変されたＬＤＬ（minimally modified LDL；ＭＭ−ＬＤＬ）中に存在する。提示したように、正常なＨＤＬは、ＭＭ−ＬＤＬ生成の各工程およびいずれの工程も封鎖することができる。
【図２１】  図２１は、イムノアフィニティーによるＨＤＬの単離を示す。ＨＤＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いてクマシービリリアントブルーで染色した。分子量マーカーの他に、出発血漿およびイムノアフィニティー精製ＨＤＬ、市販の精製アポＡ−Ｉも含めた。レーン１：分子量マーカー、レーン２：血漿、レーン３：純粋アポＡ−Ｉ、レーン４：精製ＨＤＬ。
【図２２】  図２２はＨＤＬの保護性能を示している。ＨＤＬの主要タンパク質アポＡ−Ｉに対するポリクローナル抗体を臭化シアン活性化セファロース４Ｂビーズと結合させた。正常ヒト血漿（２００μＬ）を１．０ｍＬのパックしたアポＡ−Ｉ−セファロース４Ｂビーズ（０．１５Ｍトリス／食塩水（ｐＨ７．４）＋０．０２％ＮａＮ3）に添加し、室温で２時間混合した。続いて、この混合物を０．０１５Ｍトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）でビーズを希釈し、１５００ｒｐｍで５分室温で遠心することによって洗浄した。ペレットを通常の食塩水に最終容積２．０ｍＬ（５０％パックビーズ）で再懸濁させた。ＤＣＦを各凍結バイアルに分注し（２０μｇを含む１０μｇ）、アルゴン下で蒸発させた。パルミトイル−アラキドノイル−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）（各試験管に２０μｇ）および１３（Ｓ）ヒドロペルオキシジデカエン酸（各試験管に１．０μｇ）（１３（Ｓ）ＨＰＯＤＥ）を試験管に加え、アルゴン下で蒸発させた。この後、セファロースビーズに結合させたＨＤＬまたは緩衝液のみで処理したビーズを一定範囲の濃度で添加した。室温で４時間インキュベーションした後蛍光を読み取った。データはサンプル（×３）の平均±ＳＤである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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