(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料における、糖尿病性腎症の検出のためのSmad1及び／又はリン酸化Smad1の発現を測定する方法。
【請求項２】
生体試料における、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのSmad1及び／又はリン酸化Smad1の発現を測定する方法。
【請求項３】
Smad1及び／又はリン酸化Smad1の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症を検出するためのキット。
【請求項４】
Smad1及び／又はリン酸化Smad1の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのキット。
【請求項５】
生体試料における、糖尿病性腎症の検出のためのＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定する方法。
【請求項６】
生体試料における、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定する方法。
【請求項７】
Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症を検出するためのキット。
【請求項８】
Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのキット。
【請求項９】
Smad1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療剤。
【請求項１０】
被験物質が、Smad1及びリン酸化Smad1からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法。
【請求項１１】
Smad1及びリン酸化Smad1からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療に有効な物質を同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、硬化をもたらす増殖性疾患の検出方法及びキット、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療剤、ならびに硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】  α１ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ４）は、血管内皮細胞と中膜平滑筋細胞の間に存在する血管基底膜の主要な構成成分であり、Ｃｏｌ４の過剰産生は糖尿病性血管障害、動脈硬化、老化に関連する疾患に決定的な役割を果たす。また、持続的な高血糖状態は糖尿病の合併症の主要な原因であると認識されている（非特許文献１及び２）。過剰なＡｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＡＧＥｓ）は高血糖によっておき、血管およびその他細胞において様々なイベントを誘導する事が知られており、おそらく数種類のＡＧＥｓレセプターを通じて病態に関わっていると考えられる（非特許文献３、４及び５）。ＡＧＥｓは近年では糖尿病合併症に関わるだけではなく、老化による動脈硬化にも関連するという考えが受け入れられている（非特許文献６及び７）。さらに、切断型の可溶性のＡＧＥｓレセプターが、糖尿病性の動脈硬化の進展を抑制するという報告がある（非特許文献８）。【０００３】  糖尿病性腎症の進行は、形態学的には腎糸球体基底膜（ＧＢＭ）の肥厚および細胞外基質（ＥＣＭ）の増大によって特徴付けられる。Ｃｏｌ４は糸球体基底膜肥厚および細胞外基質増大の主要な構成成分であるので、Ｃｏｌ４が糖尿病の状態においてどのように転写制御されるかを明らかにすることは重要である。Ｃｏｌ４の双方向性の１３０ｂｐのプロモーターは、いくつかのＤＮＡ結合タンパクと反応することが知られている大きなステムループ構造（ＣＩＶ）を持つ（非特許文献９）。本発明者らは、先の報告においてゲルシフトアッセイにより、未知のタンパクがＡＧＥｓへの暴露によりＣｏｌ４が誘導される場合のみにＣＩＶに結合することを示した（非特許文献１０）。
メサンギウム細胞の増殖と糸球体硬化は共に進行性の糸球体障害の主要な病理学的特徴である。多くの糸球体硬化を伴う疾患でメサンギウム細胞の増殖が見られる事は進行性の糸球体障害においてこのプロセスが重要である事を示唆している（非特許文献１１（Ａ１），非特許文献１２（Ａ２））。２つのイベントはほとんどの糸球体疾患で同時に見られるが、メサンギウム細胞の増殖がどのように糸球体硬化の進展に関与しているかは明らかではない。
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がメサンギウム細胞の重要な分裂促進因子である事がｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも示されている（非特許文献１３（Ａ３）、非特許文献１４（Ａ４））。ＰＤＧＦが糸球体硬化の進展の鍵となる役割を果たしている事については、実験モデルだけではなくヒトの糸球体疾患でもいくつかの証拠がある（非特許文献１３（Ａ３））。ＰＤＧＦ−ＢＢもまたメサンギウム細胞の増殖に重要であると報告されており（非特許文献１５（Ａ５））、残存腎モデルでは続いて糸球体硬化の進展が起きる（非特許文献１６（Ａ６））。ラットの糸球体腎炎モデルにおいてＰＤＧＦに対する中和抗体を投与したところ、メサンギウム細胞の増殖と糸球体硬化の両方が顕著に回復したが（非特許文献１７（Ａ７））、細胞増殖の抑制が糸球体硬化病変を抑制する機序はほとんど知られていない。【０００４】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９，９７７−９８６（１９９３）．
【非特許文献２】ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）Ｇｒｏｕｐ．Ｌａｎｃｅｔ  ３５２，８３７−８５３（１９９８）
【非特許文献３】Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１１７０４−１１７０８（１９９４）．
【非特許文献４】Ｍ．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８，１３１５−１３２１（１９８８）．
【非特許文献５】Ｔ．Ｄｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，２８７３−２８７７（１９９２）．
【非特許文献６】Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，１２０４３−１２０４７（１９９２）．
【非特許文献７】Ｍ．Ｓ．Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２，１４０７−１４１１（１９９３）．
【非特許文献８】Ｓ．Ｌ．Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９，１０２５−１０３１（１９９８）
【非特許文献９】Ｌ．Ａ．Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｐ．Ｅ．Ｋｌｏｔｍａｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７，１４９７−１５０２（１９９２）．
【非特許文献１０】Ｎ．Ｉｅｈａｒａ，Ｈ．Ｔａｋｅｏｋａ，Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｋｉｔａ，Ｔ．Ｄｏｉ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０，１１６６−１１７２（１９９６）．
【非特許文献１１】Ｆｏｇｏ  Ａ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９８９  Ｄｅｃ；９（４）：３２９−４２．
【非特許文献１２】Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＬＪ，Ｄｏｉ  Ｔ，Ｅｌｌｉｏｔ  Ｓ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＧＥ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９８９  Ｄｅｃ；９（４）：３１８−２８．Ｒｅｖｉｅｗ．
【非特許文献１３】Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＪ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ  ２１：２７１−２８２，１９９５
【非特許文献１４】Ｄｏｉ  Ｔ，Ｖｌａｓｓａｒａ  Ｈ，Ｋｉｒｓｔｅｉｎ  Ｍ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＧＥ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＬＪ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖｉａ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２８７３−２８７７，１９９２
【非特許文献１５】Ｂａｒｎｅｓ  ＪＬ，Ｈｅｖｅｙ  ＫＡ．Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０  Ｍａｒ；６２（３）：３７９−８２．
【非特許文献１６】Ｆｌｏｅｇｅ，Ｊ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｍ．Ｗ．，Ａｌｐｅｒｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｐｒｉｔｚｌ，Ｐ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｋ．，Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｒ．Ａ．，Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｃｏｕｓｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．：Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＤＧＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｍｎａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｏｄｅｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４１：２９７−３０９，１９９２
【非特許文献１７】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｒａｉｎｅｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｆｌｏｅｇｅ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７５：１４１３−１４１６，１９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  糖尿病性腎症は末期腎不全の主な原因である。ＩＶ型コラーゲンは血管基底膜や腎糸球体メサンギウム基質の主要な構成成分であり、糖尿病における血管障害に重大な役割を果たしているが、糖尿病の状態で何がＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっているかは知られていない。本発明は、ＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっている物質を同定し、その物質が糖尿病性腎症の病因として決定的な役割を持つことを示すことを目的とする。また、本発明は、ＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっている物質を利用した糖尿病性腎症の検出方法及びキットを提供することも目的とする。さらに、本発明は、ＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっている物質の発現を抑制する作用を有する物質の用途を提供することも目的とする。さらにまた、本発明は、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットを提供することも目的とする。
また、本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖による活性化を阻害するＰＤＧＦβ受容体抗体（ＡＰＢ５）投与の効果をラットの糸球体腎炎において示し、ＰＤＧＦシグナル伝達系が糸球体細胞増殖と糸球体硬化の両方を調節している事をｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏで示すことを目的とする。本発明は、糸球体細胞増殖と糸球体硬化に関わっている物質を利用した、硬化をもたらす増殖性疾患の検出方法及びキットを提供することも目的とする。さらに、本発明は、糸球体細胞増殖と糸球体硬化に関わっている物質の発現を抑制する作用を有する物質の用途を提供することも目的とする。さらにまた、本発明は、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、ＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっている物質としてＳｍａｄ１を同定し、Ｓｍａｄ１が糖尿病性腎症の病因として決定的な役割を持つことを示した。また、本発明者らは、健常人及び糖尿病性腎症の患者の腎糸球体におけるＳｍａｄ１及びアクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）の発現を調べたところ、糖尿病性腎症患者におけるＳｍａｄ１及びＡＬＫ１の発現は硬化性病変の重症度と比例するが、健常人ではＳｍａｄ１及びＡＬＫ１の発現がほとんど認められなかったことも見出した。さらに、Ｓｍａｄ１の発現を制御するＢＭＰ２及び４の発現がＡＧＥｓ刺激下で増加することも見出した。
ところで、多くの糸球体硬化を伴う疾患群において、メサンギウム細胞の増殖が認められることは、進行性の糸球体障害においてこのプロセスが重要である事を示唆しているが、細胞増殖と糸球体硬化の関連は明らかではない。最近本発明者らは糖尿病性の糸球体硬化において、糸球体硬化の主要な構成成分であるＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ４）の過剰発現がＳｍａｄ１により転写調節されている事を示した。本研究において、本発明者らはＰＤＧＦ−Ｂ鎖による活性化を阻害するＰＤＧＦβ受容体抗体（ＡＰＢ５）投与の効果をラットの糸球体腎炎において示し、ＰＤＧＦシグナル伝達系が糸球体細胞増殖と糸球体硬化の両方を調節している事をｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した。
メサンギウム増殖性糸球体腎炎の実験モデル（Ｔｈｙ１  ＧＮ）は抗ラットＴｈｙ−１．１モノクローナル抗体の一回の静脈注射によって誘発された。Ｔｈｙ１  ＧＮにおいてメサンギウム細胞の増殖とＣｏｌ４の発現は６日目で最大となった。Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１（ｐＳｍａｄ１）、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）に対する免疫組織染色を行なった結果、糸球体のＳｍａｄ１の発現ピークは６日目であり、メサンギウム増殖とピークが一致していた。糸球体のｐＳｍａｄ１の発現はＴｈｙ１  ＧＮの１日目より上昇し、発病後４日目に最大となった。ＡＰＢ５で処置したグループではメサンギウム細胞増殖も糸球体硬化も有意に減少した。Ｓｍａｄ１、ｐＳｍａｄ１、ｐＳＴＡＴ３の発現もまたＡＰＢ５の投与により調査した全てのポイントで有意に減少していた。ＡＰＢ５処理はｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐＳｍａｄ１、ｐＳＴＡＴ３の発現低下やＣｏｌ４タンパクの発現の減少と付随してメサンギウム細胞の増殖を減少させた。培養メサンギウム細胞で、ドミナントネガティブなＳＴＡＴ３の導入はＣｏｌ４の発現を有意に低下させた。これらのデータは、ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１の活性化がメサンギウム細胞増殖から糸球体硬化への進展に関与している事を示唆している。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。【０００７】  本発明の要旨は以下の通りである。
（１）生体試料における、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定することを含む、硬化をもたらす増殖性疾患の検出方法。
（２）生体試料における、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定することを含む、硬化をもたらす増殖性疾患の進行度及び／又は治療の有効性を評価する方法。
（３）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、硬化をもたらす増殖性疾患を検出するためのキット。
（４）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、硬化をもたらす増殖性疾患の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのキット。
（５）生体試料における、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定することを含む、糖尿病性腎症の検出方法。
（６）生体試料における、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定することを含む、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価する方法。
（７）Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症を検出するためのキット。
（８）Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのキット。
（９）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療剤。
（１０）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む、細胞外マトリックスの増殖を阻害する薬剤。
（１１）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む、α１ＩＶ型コラーゲンの発現を抑制する薬剤。
（１２）被験物質が、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法。
（１３）被験物質が、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法。
（１４）被験物質が、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、α１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法。
（１５）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定するためのキット。
（１６）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定するためのキット。
（１７）ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、α１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定するためのキット。
【発明の効果】
【０００８】  本発明により、ＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっている物質としてＳｍａｄ１が同定され、Ｓｍａｄ１が糖尿病性腎症の病因として決定的な役割を持つことが示された。これにより、糖尿病性腎症の検出が可能となり、さらに、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療剤、細胞外マトリックスの増殖を阻害する薬剤、α１ＩＶ型コラーゲンの発現を抑制する薬剤が提供された。また、本発明により、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットが提供された。
また、本発明により、ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１の活性化が進行性の糸球体障害時の２つの現象、細胞増殖と糸球体硬化の相互作用を調節する鍵となるパスウェイにある事が示された。これにより、硬化をもたらす増殖性疾患の検出が可能となり、さらに、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療剤、細胞外マトリックスの増殖を阻害する薬剤、α１ＩＶ型コラーゲンの発現を抑制する薬剤が提供された。また、本発明により、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットが提供された。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−３１９５３８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｓｍａｄ１によりＣｏｌ４プロモーターが活性化されることを示す。（Ａ）：ＡＧＥｓ存在下またはＢＳＡ存在下（対照）での培養メサンギウム細胞を用い、図に示した抗体を用いてクロマチン免疫沈降法を行なった。ＣＩＶ−１モチーフに対するプライマーを用いてＰＣＲを行なった。３回繰り返し行なった実験のうちの１回の結果を示す。（Ｂ）：ＣＩＶ−１−ＬａｃＺレポータープラスミドと野生型Ｓｍａｄ１を入れたベクター、またはベクターのみ（ｍｏｃｋ）をＣＭＶ−ＬＵＣを内部コントロールとして培養細胞に同時導入した。細胞抽出液をウェスタンブロット法で抗Ｓｍａｄ１抗体と抗ｐＳｍａｄ１抗体で解析した。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示す。（Ｃ）：４８時間後、培養細胞を溶解し、β−ガラクトシダーゼ活性とルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各３回行いＳＤを示す。
【図２】ＡＧＥｓへの暴露によりダイナミックに変動するＳｍａｄ１発現を示す。（Ａ）：ＡＧＥｓまたはＢＳＡに暴露したメサンギウム細胞のＳｍａｄ１とＣｏｌ４ｍＲＮＡ発現の経時的変化をＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙで見た。ＡＧＥｓへの持続的な暴露はＳｍａｄ１の発現を持続的に亢進し、Ｃｏｌ４の発現も平行して増える。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示した。（Ｂ）：ＡＧＥｓまたはＢＳＡ存在下で７２時間、１２０時間培養したメサンギウム細胞の免疫蛍光写真。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示す。（Ｃ）：ＡＧＥｓまたはＢＳＡ存在下で７２時間培養された際のＳｍａｄ１とｐＳｍａｄ１をウェスタンブロットで見た。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示した。
【図３】メサンギウム細胞におけるＳｍａｄ１に対する特異的アンチセンスオリゴの効果を示す。（Ａ）：７２時間のＡＧＥｓ処理後、メサンギウム細胞はＳｍａｄ１に対するアンチセンスオリゴ、または４ミスマッチオリゴ（対照）で１６時間処理した。アンチセンスオリゴで処理された細胞のメサンギウム細胞を抗Ｓｍａｄ１抗体（緑）で免疫蛍光染色し、さらにＤＡＰＩ染色した（ｂｌｕｅ）。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示す。（Ｂ）：ＡＧＥｓ暴露後のメサンギウム細胞にＳｍａｄ１に対するアンチセンスオリゴまたは４ミスマッチオリゴ（対照）を導入した。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示す。（Ｃ）：Ｓｍａｄ１に対するアンチセンスオリゴはＳｍａｄ１の発現亢進を阻害するが、同時にＣｏｌ４の発現亢進も阻害する。３回繰り返し行なった実験の１回の結果を示す。
【図４】Ｓｍａｄ１とＡＬＫ１の発現を糖尿病性腎症のヒトで検出した結果を示す。糖尿病５例、非糖尿病３例の糸球体を抗Ｓｍａｄ１抗体と抗ＡＬＫ１抗体を用いて免疫組織染色した。糸球体でのＳｍａｄ１とＡＬＫ１の発現は糖尿病では顕著に認められたが、非糖尿病では認められなかった。すべての切片はヘマトキシリンにより対比染色した。写真の拡大率はすべて４００倍である。
【図５】ＡＧＥｓ存在下にて培養したメサンギウム細胞におけるｍＲＮＡの発現量をＢＳＡ存在下での培養メサンギウム細胞のそれと比較した結果を示す。
【図６】糖尿病性腎症患者の尿中ＢＭＰ２をウェスタンブロット法で測定した結果を示す。
【図７】ＴＧＦ−βシグナルによる慢性的刺激下でのＢＭＰ２およびＢＭＰ４タンパクの発現をウェスタンブロット法で測定した結果を示す。
【図８】実施例１の結果に基づくシグナル伝達経路の模式図である。
【図９】Ｔｈｙ１  ＧＮラットがびまん性のメサンギウム基質の増殖とメサンギウム領域の拡大を形成している顕微鏡像である。抗Ｃｏｌ４抗体を用いた免疫組織染色でＴｈｙ１  ＧＮの腎糸球体の拡大したメサンギウム領域では、ＣｏｌＩＶ過剰発現が認められた。ＡＰＢ５はメサンギウムの増殖とＣｏｌＩＶ発現を減少させた。Ｔｈｙ１  ＧＮは糸球体でＰＤＧＦ−Ｂ鎖とＰＤＧＦβ受容体もまた有意に陽性であったが、ＡＰＢ５はこれらの過剰発現も減少させた。Ａ−Ｃ：ＰＡＭ、Ｄ−Ｆ：ＣｏｌＩＶＧ−Ｈ：ＰＤＧＦ−Ｂ鎖、Ｊ−Ｋ：ＰＤＧＦβ受容体、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ：正常対照ラット、Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｊ：６日目の疾患対照ラット、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ：６日目のＡＰＢ５処置されたラット
【図１０】Ｔｈｙ１  ＧＮにおける組織学的な変化とＡＰＢ５投与の効果の定量。Ａ：糸球体細胞数。Ｔｈｙ１  ＧＮ群では糸球体細胞数の増加が見られる。Ｂ：Ｔｈｙ１  ＧＮのＰＣＮＡ陽性細胞数。ＡＰＢ５処理されたラットの糸球体のＰＣＮＡ陽性細胞数はどの調査ポイントでも有意に減少した。Ｃ：メサンギウム基質の増殖。６日目のＴｈｙ１  ＧＮラットでメサンギウム基質の増殖が観察された。ＡＰＢ５は各調査ポイントでメサンギウム基質の増殖を有意に減少させた。Ｄ：ＩＶ型コラーゲンの発現。対照群では、Ｃｏｌ４は拡大したメサンギウム領域で強い陽性となった。ＡＰＢ５はＣｏｌ４の発現を有意に減少させた。＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ．対照群、＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ．ＡＰＢ５非処理疾患対照群
【図１１】Ｔｈｙ１  ＧＮにおけるＳｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、リン酸化ＳＴＡＴ３の免疫組織化学染色。Ｔｈｙ１  ＧＮラットの糸球体の免疫組織化学染色でＳｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、リン酸化ＳＴＡＴ３の発現は驚くべき上昇を示した。Ｔｈｙ１  ＧＮでリン酸化Ｓｍａｄ１は核と同じ場所に顕著に認められた。ＡＰＢ５処置はそれぞれの有意な減少をもたらした。Ａ−Ｃ：Ｓｍａｄ１、Ｄ−Ｆ：リン酸化Ｓｍａｄ１、Ｇ−Ｉ：リン酸化ＳＴＡＴ３、Ａ、Ｄ、Ｇ：正常対照ラット、Ｂ、Ｅ、Ｈ：６日目の未処置Ｔｈｙ１ラット、Ｃ、Ｆ、Ｉ：６日目のＡＰＢ５処置ラット
【図１２】Ｓｍａｄ１、ｐＳｍａｄ１、ｐＳＴＡＴ３発現のタイムコース。Ｔｈｙ１  ＧＮラットの、０、１、２、４、６、１２日目の腎切片に、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、リン酸化ＳＴＡＴ３に対する抗体を用いた免疫組織染色が行なわれた。Ａ：Ｔｈｙ１  ＧＮでのＳｍａｄ１発現。Ｓｍａｄ１発現は６日目で最大となり、１２日目で沈静した。Ｂ：糸球体細胞全体に対するｐＳｍａｄ１陽性細胞の割合のタイムコース。ｐＳｍａｄ１の発現は４日目で最大となった。Ｃ：ｐＳＴＡＴ３発現のタイムコース。メサンギウム領域のｐＳＴＡＴ３陽性部分の割合は６日目まで増大し、１２日目で沈静した。＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ．対照群、＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ．各調査ポイント
【図１３】Ｓｍａｄ１、ｐＳｍａｄ１、ｐＳＴＡＴ３発現におけるＡＰＢ５の効果。免疫組織染色とＳｍａｄ１、ｐＳｍａｄ１、ｐＳＴＡＴ３の発現の定量を行なった結果、これらのタンパクはメサンギウム基質と糸球体のＣｏｌＩＶ発現と同じようにＡＰＢ５処置によって減少した。Ａ：Ｓｍａｄ１の発現。Ｂ：ｐＳｍａｄ１の発現。Ｃ：ｐＳＴＡＴ３の発現。＊Ｐ＜０．０１  ｖｓ．ＡＰＢ５非処理疾患コントロール
【図１４】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＰＢ５の効果。Ａ：ＡＰＢ５のメサンギウム細胞増殖の抑制効果。ＢＤＧＦ−Ｂの添加はメサンギウム細胞増殖を増大させ、ＡＰＢ５はこの増大を有意に阻害した。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．対照、＊＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＰＤＧＦ−Ｂ刺激を受けた対照、Ｂ：ＡＰＢ５の添加によりｐＳＴＡＴ３、ｐＳｍａｄ１、Ｃｏｌ４タンパクの発現が減少した事を示すウェスタンブロット解析。３回の独立した実験のうちの１回を示した。
【図１５】遺伝子導入されたメサンギウム細胞のウェスタンブロット解析結果。ｐＳｍａｄ１とＣｏｌ４タンパクの発現はドミナントネガティブなＳＴＡＴ３により減少した。３回の独立した実験のうちの１回を示した。
【図１６】実施例１及び２の結果に基づくシグナル伝達経路の模式図である。
【図１７】患者および正常者の尿を用いて抗ＡＬＫ−１抗体を一次抗体としてウェスタンブロットを行なった結果である。レーン１−５：糖尿病性腎症患者、レーン６：糖尿病に硬化を伴う腎増殖性疾患を合併したミドコンドリア病患者、レーン７、８：糖尿病に硬化を伴わない腎疾患を合併した患者、レーン９−１０：正常者
【図１８】治療中の糖尿病性腎症患者尿を用いて抗ＡＬＫ−１抗体を一次抗体としてウェスタンブロットを行なった結果である。レーン左より、治療開始時より１週間毎の泳動像を示す。
【図１９】患者および正常者の尿を用いて抗Ｓｍａｄ１抗体を一次抗体としてウェスタンブロットを行なった結果である。レーン１−５：糖尿病性腎症患者、レーン６：糖尿病に硬化を伴う腎増殖性疾患を合併したミドコンドリア病患者、レーン７、８：糖尿病に硬化を伴わない腎疾患を合併した患者、レーン９−１０：正常者
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】１．糖尿病性腎症の検出方法及びキット
本発明は、生体試料におけるＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定することを含む、糖尿病性腎症の検出方法を提供する。【００１１】  生体試料は、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質が検出されうるいかなる生体試料であってもよい。生体試料の例としては、腎臓組織切片、血液、血清、尿などを挙げることができる。【００１２】  Ｓｍａｄは哺乳類で１から９まで同定されており、Ｓｍａｄ１は骨形成タンパク（ＢＭＰ）シグナル伝達系の一員として知られており、ＢＭＰはアクチビン受容体キナーゼ２、３、６（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６）を介して標的遺伝子転写を調節する（Ｚｗｉｊｓｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５４６，２００３，１３３−１３９）。ＢＭＰシグナルと特異的に関わるＳｍａｄは他にＳｍａｄ５および８がある。他にＴＧＦ−β／アクチビンシグナルと特異的に関わるとされているＳｍａｄがあり、Ｓｍａｄ２とＳｍａｄ３が挙げられる。一方、Ｓｍａｄ１は、内皮細胞および造血細胞等ではアクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）を介してＴＧＦ−βのシグナルを伝達し標的遺伝子の転写調節を行う事も明らかにされている（Ｇｏｕｍａｎｓ  ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００２，Ａｐｒ  ２，２１（７），１７４３−５３）。すなわち、Ｓｍａｄ１を活性化する事により標的遺伝子の転写調整を行なうシグナル伝達系は主なものとしてＢＭＰ系とＴＧＦ−β系の２通りが存在している（図８）。ただし、どの組み合わせによる経路が最も重要であるかは十分に検討されていない。【００１３】  「Ｓｍａｄ１活性化作用を有する物質」は、Ｓｍａｄ１を活性化することができる物質であればよく、アクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）、アクチビン受容体様キナーゼ３（ＡＬＫ３）のように直接的にＳｍａｄ１を活性化する物質、骨形成タンパク（ＢＭＰｓ）のようにアクチビン受容体キナーゼ（ＡＬＫｓ）を活性化することにより間接的にＳｍａｄ１を活性化する物質であってもよい。
ＰＤＧＦもまた、直接間接の別は不明であるが、本発明者らの研究（実施例２）より、Ｓｍａｄ１を活性化する事が明らかである。
「Ｓｍａｄ１を活性する」とは、Ｓｍａｄ１のセリン残基をリン酸化する事および／または核内へ移行させる事をいう。【００１４】  アクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）は、ＴＧＦ−βファミリーのタンパクに結合するｔｙｐｅＩレセプターの１つであり、Ｓｍａｄ１を活性化する作用を持つことが知られている（Ｃｈｅｎ  ＹＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｄ１  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＡＬＫ１  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．６，３６７２−３６７７，１９９９）。ＡＬＫ１はヒトでは胎盤、肺、血管内皮細胞で多く発現しており、ＡＬＫ１の変異はＯｓｌｅｒ−Ｒｅｎｄｕ−Ｗｅｂｅｒ症候群としても知られるタイプ２遺伝性出血性毛細血管拡張症を引き起こす（非特許文献１７）。
アクチビン受容体様キナーゼ３（ＡＬＫ３）は、別名ＢＭＰＲ−ＩＡで、アクチビン受容体様キナーゼ３（ＡＬＫ３）は、ＢＭＰファミリーのタンパクに結合するｔｙｐｅＩレセプターの１つであり、セリンースレオニン型のレセプターである。ＢＭＰｓと結合したＡＬＫ３は、Ｓｍａｄ１／５／８を活性化し、核内へのシグナル伝達を担っている。【００１５】  骨形成タンパク（ＢＭＰｓ）はＴＧＦ−βスーパーファミリーの一員であり、骨形成をはじめ発生期における四肢の発生や神経系の分化に関与している。しかし、近年、ＢＭＰｓが後腎の発生の調節に関わるという報告がいくつかされ、注目されている。腎臓は中間中胚葉から発生し、前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成される。前腎、中腎のほとんどは後に退行変性し、哺乳類成体において機能する腎臓は後腎である。ＢＭＰとそのレセプターの転写物は発生途上の後腎に局在し、ＢＭＰ２、４、７はＩｎ  ｖｉｔｒｏで尿管の分岐の形態形成と分岐の構造の調節に直接または間接の役割を持つ。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＢＭＰ７無発現変異ホモのミュ−タントマウスとＢＭＰ４無発現変異ヘテロのミュータントマウスで腎臓の表現型に変化があると報告されている。（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００２；４６（４）：５２５−３３）。
ＴＧＦ−βは、多岐にわたる作用を持ち、種々の細胞の増殖・分化、細胞外マトリックス産生、アポトーシス、免疫系などに重要な働きを持っている。ＴＧＦ−βは、細胞表面の受容体に結合し細胞内へそのシグナルを伝達する。細胞内でのシグナル伝達には一連のＳｍａｄタンパク分子群が重要な役割を果たしている。【００１６】  従来、糖尿病性腎症の発症および進展には高血糖状態下ＴＧＦ−βがＡＬＫ５を介してＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３を活性化しα１ＩＶ型コラーゲンを始めとする細胞外マトリックスを過剰に産生させる方向に働く経路が関連していると考えられていたが（Ｊｉｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６３，２００３，２０１０−２０１９）、本研究は高血糖状態下においてＳｍａｄ１を介して細胞外マトリックスの過剰産生をもたらす経路が存在することを初めて示すものである。【００１７】  Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現は、核酸レベル（すなわち、ｍＲＮＡの発現）及び／又はタンパク質レベルで測定することができる。【００１８】  核酸レベルでの測定については、生体試料から全ＲＮＡを抽出し、適当なプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質のｍＲＮＡを測定するとよい。適当なプライマー対は、例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００５９００のヒト由来のＳｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００００２０のヒト由来のアクチビン受容体様キナーゼ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００．１のＢＭＰ２のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号３）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２．２のＢＭＰ４のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号４）などの特定の領域を特異的に増幅できるように設計するとよい。適当なプライマー対の塩基配列を以下に示す。
Ｓｍａｄ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー  ：５’−ＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’−ＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号６）
ＡＬＫ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｃｃｇｔｃａａｇａｔｃｔ  ｔｃｔｃｃｔｃｇ−３’（配列番号７）、リバースプライマー：５’−ｔｃａｔｇｔｃｔｇａｇｇｃｇａｔｇａａｇ−３’（配列番号８）
ＢＭＰ２のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｃｃｃａｇｃｇｔｇａａａａｇａｇａｇａｃ−３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’−ｇａｇａｃｃｇｃａｇｔｃｃｇｔｃｔａａｇ−３’（配列番号１０）
ＢＭＰ４のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｔｇａｇｃｃｔｔｔｃｃａｇｃａａｇｔｔｔ−３’（配列番号１１）、リバースプライマー：５’−ｃｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｇｔａｔｃａ−３’（配列番号１２）
あるいは、生体試料から全ＲＮＡを抽出し、適当なプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼーション法によりＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質のｍＲＮＡを測定してもよい。適当なプローブは、例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００５９００のヒト由来のＳｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００００２０のヒト由来のアクチビン受容体様キナーゼ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００．１のＢＭＰ２のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号３）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２．２のＢＭＰ４のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号４）などを基にして、これらの配列の一部又は全部の領域に特異的にハイブリダイズするように設計するとよい。プローブは３２Ｐなどで標識されているとよい。【００１９】  タンパク質レベルでの測定については、例えば、Ｓｍａｄ１に対する抗体及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質に対する抗体を用い、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは免疫組織化学的解析などの方法で、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質を測定するとよい。Ｓｍａｄ１に対する抗体及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質に対する抗体は、蛍光色素、酵素、重金属などで標識されていてもよい（直接法）。あるいは、これらの抗体を標識する代わりに、これらの抗体（一次抗体）に特異的な抗体（二次抗体）を蛍光色素、酵素、重金属などで標識したものを用いてもよい（間接法）。抗体は、試験片またはラテックス粒子などの固相担体に固定されていることが好ましい。【００２０】  Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するとは、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現の有無を検出すること、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現量を定量することを包含する。【００２１】  本発明により、糖尿病性腎症を検出することができる。すなわち、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現は糖尿病性腎症の発症を示す。従来、糖尿病性腎症の診断には尿中ＩＶ型コラーゲン、尿中アルブミン測定測定が用いられているが、これらに代わる、あるいは補完する可能性がある。【００２２】  また、本発明により、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価することができる。すなわち、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現量は糖尿病性腎症の重症度に比例する。また、糖尿病性腎症の治療が有効であれば、患者の回復とともにＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現量が減少する。【００２３】  糖尿病性腎症とは、慢性的な高血糖状態により引き起こされる細小血管障害の一つである。病理学的には腎糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム領域の拡大、糸球体の硬化病変を呈し、臨床的には蛋白尿（微量アルブミン尿）、高血圧、浮腫などの症候を呈して最終的には腎不全に陥ることが多い。また、糖尿病では糸���体以外の組織にも、細動脈硬化症、尿細管間質の変性・線維化などの異常が認められ、糸球体の病変をより悪化させている。すなわち、一定期間の糖尿病罹患の後、蛋白尿、高血圧、腎機能障害が徐々に進行していく病態を腎症と定義できる。【００２４】  近年、末期腎不全状態となり、新規に透析療法に導入されるケースの原疾患のうち３０％以上が糖尿病性腎症であり、いまなお増加傾向にある。さらに、透析導入後の予後も必ずしも良好とはいえず、医療上、大きな問題となっている。したがって、糖尿病性腎症の発症・進展の機序を解明し、診断および治療の開発を行なうことは重要な課題となっている。（日本臨床５５巻・１９９７年増刊号「糖尿病」（１））
また、本発明は、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症を検出するためのキットを提供する。【００２５】  さらに、本発明は、Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬を含む、糖尿病性腎症の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのキットを提供する。【００２６】  Ｓｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するための試薬の例としては、Ｓｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列の特定の領域を特異的に増幅できるプライマー対、Ｓｍａｄ１活性化作用を有する物質のｍＲＮＡの塩基配列の特定の領域を特異的に増幅できるプライマー対、Ｓｍａｄ１のｍＲＮＡの一部又は全部の領域に特異的にハイブリダイズすることができるプローブ、Ｓｍａｄ１活性化作用を有する物質のｍＲＮＡの一部又は全部の領域に特異的にハイブリダイズすることができるプローブ、Ｓｍａｄ１に対する抗体、Ｓｍａｄ１活性化作用を有する物質に対する抗体などを挙げることができる。これらのプライマー対及び抗体は、前述した通りである。【００２７】  本発明のキットは、さらに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、バッファー、対照ｍＲＮＡ、対照プライマー対、ｄＮＴＰ混合物、キットの使用説明書などを含んでもよい（核酸レベルでプライマー対を用いてＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するキットの場合）。【００２８】  あるいはまた、本発明のキットは、さらに、転写用バッファー、ブロッキング試薬、洗浄液、キットの使用説明書などを含んでもよい（ウェスタンブロット法でＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するキットの場合）。【００２９】  別の態様において、本発明のキットは、さらに、標識された二次抗体、基質（二次抗体が酵素で標識されている場合）、希釈液、反応停止剤、キットの使用説明書などを含んでもよい（ＥＬＩＳＡでＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するキットの場合）。【００３０】  さらに別の態様において、本発明のキットは、さらに、発色剤、過酸化水素水、バッファー、カウンター染色用色素、キットの使用説明書などを含んでもよい（免疫組織化学的解析でＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ１活性化作用を有する物質の発現を測定するキットの場合）。
２．硬化をもたらす増殖性疾患の検出方法及びキット
本発明は、生体試料における、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定することを含む、硬化をもたらす増殖性疾患の検出方法を提供する。
硬化をもたらす増殖性疾患とは、臓器の硬化が観察される疾患をいい、硬化に先立って、あるいは並行して細胞増殖および／または細胞外基質の増加が認められる状態を言う。これには、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、巣状糸球体硬化症、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｌ鎖沈着病）、ループス腎炎、クリオグロブリン血症性腎炎、ＨＩＶ関連腎炎、紫斑病性腎炎などの糸球体を障害する腎疾患、肝線維化、動脈硬化などを含む。
慢性糸球体腎炎とは、糸球体の炎症と進行性の破壊を起こす、腎臓疾患が慢性に持続している状態を言う。膜性増殖性糸球体腎炎、巣状糸球体硬化症、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｌ鎖沈着病）、ループス腎炎、クリオグロブリン血症性腎炎、ＨＩＶ関連腎炎、紫斑病性腎炎などの疾患を含む症候群である。
糖尿病性腎症とは、糖尿病の代表的な合併症の１つであり、糖尿病による高血糖状態の持続により、腎機能が進行性に減少する状態を言う。
肝繊維化とは、肝硬変あるいは慢性肝炎などに見られ、肝類洞壁と肝細胞索の間（Ｄｉｓｓｅ腔）にコラーゲン等の細胞外基質の増加が認められる状態をいう。肝繊維化は肝細胞癌発生の危険因子であり、線維化が進むほど肝細胞癌の発生率が高くなる事が知られている。
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚あるいは硬化する病変の総称であるが、酸化ストレスなどによる内皮細胞の傷害に起因する慢性炎症性・増殖性病変であると考えられている。動脈硬化の進行により、動脈の狭窄・閉塞が起こると血圧上昇、心筋梗塞、脳梗塞等を引き起こすが、臓器障害を起こす前の自覚症状は乏しい。【００３１】  生体試料は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質が検出されうるいかなる生体試料であってもよい。生体試料の例としては、腎臓組織切片、血液、血清、尿などを挙げることができる。【００３２】  ＳＴＡＴ３は、ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）タンパクの１つである。ＳＴＡＴ３は、インターフェロン、上皮成長因子、インターロイキン５、インターロイキン６、肝細胞増殖因子、白血病抑制因子、骨成長因子２などの様々なサイトカインや増殖因子がその受容体に結合すると、受容体関連キナーゼによりチロシンリン酸化される事により活性化される（リン酸化ＳＴＡＴ３）。
リン酸化Ｓｍａｄ１は、Ｓｍａｄ１のセリン残基がリン酸化され活性化された状態のものである。【００３３】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現は、核酸レベル（すなわち、ｍＲＮＡの発現）及び／又はタンパク質レベルで測定することができる。【００３４】  核酸レベルでの測定については、生体試料から全ＲＮＡを抽出し、適当なプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質のｍＲＮＡを測定するとよい。適当なプライマー対は、例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿１３９２７６のヒト由来のＳＴＡＴ３のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１９）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００５９００のヒト由来のＳｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００００２０のヒト由来のアクチビン受容体様キナーゼ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００４３２９のヒト由来のアクチビン受容体様キナーゼ３のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２０）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００．１のＢＭＰ２のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号３）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２．２のＢＭＰ４のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号４）などの特定の領域を特異的に増幅できるように設計するとよい。適当なプライマー対の塩基配列を以下に示す。
ＳＴＡＴ３のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ａｇａｔｇｃｔｃａｃｔｇｃｇｃｔｇｇａ−３’（配列番号２１）、リバースプライマー：５’−ｔｃｃａａｔｇｃａｇｇｃａａｔｃｔｇｔｔ−３’（配列番号２２）
Ｓｍａｄ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’−ＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号６）
ＡＬＫ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｃｃｇｔｃａａｇａｔｃｔ  ｔｃｔｃｃｔｃｇ−３’（配列番号７）、リバースプライマー：５’−ｔｃａｔｇｔｃｔｇａｇｇｃｇａｔｇａａｇ−３’（配列番号８）
ＡＬＫ３のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｔｇｇｃａｃｔｇｇｇａｔｇａａａｔｃａ−３’（配列番号２３）、リバースプライマー：５’−ｔｇｇｔｔａｃａｔａａａｔｔｇｇｔｃｃｇａ−３’（配列番号２４）
ＢＭＰ２のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｃｃｃａｇｃｇｔｇａａａａｇａｇａｇａｃ−３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’−ｇａｇａｃｃｇｃａｇｔｃｃｇｔｃｔａａｇ−３’（配列番号１０）
ＢＭＰ４のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマー：５’−ｔｇａｇｃｃｔｔｔｃｃａｇｃａａｇｔｔｔ−３’（配列番号１１）、リバースプライマー：５’−ｃｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｇｔａｔｃａ−３’（配列番号１２）
あるいは、生体試料から全ＲＮＡを抽出し、適当なプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼーション法により、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質のｍＲＮＡを測定してもよい。適当なプローブは、例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿１３９２７６のヒト由来のＳＴＡＴ３のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１９）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００５９００のヒト由来のＳｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００００２０のヒト由来のアクチビン受容体様キナーゼ１のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆｓｅｑデータベースのＮＭ＿００４３２９のヒト由来のアクチビン受容体様キナーゼ３のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号２０）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２００．１のＢＭＰ２のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号３）、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１２０２．２のＢＭＰ４のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号４）などを基にして、これらの配列の一部又は全部の領域に特異的にハイブリダイズするように設計するとよい。プローブは３２Ｐなどで標識されているとよい。【００３５】  タンパク質レベルでの測定については、例えば、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質に対する抗体を用い、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは免疫組織化学的解析などの方法で、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質を測定するとよい。抗体は、蛍光色素、酵素、重金属などで標識されていてもよい（直接法）。あるいは、これらの抗体を標識する代わりに、これらの抗体（一次抗体）に特異的な抗体（二次抗体）を蛍光色素、酵素、重金属などで標識したものを用いてもよい（間接法）。抗体は、試験片またはラテックス粒子などの固相担体に固定されていることが好ましい。【００３６】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するとは、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現の有無を検出すること、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現量を定量することを包含する。【００３７】  本発明により、硬化をもたらす増殖性疾患を検出することができる。すなわち、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現は硬化をもたらす増殖性疾患の発症を示す。従来、糖尿病性腎症や慢性糸球体腎炎などの糸球体を障害する腎疾患の診断には尿中ＩＶ型コラーゲン、尿中アルブミン測定測定が用いられているが、これらに代わる、あるいは補完する可能性がある。【００３８】  また、本発明により、硬化をもたらす増殖性疾患の進行度及び／又は治療の有効性を評価することができる。すなわち、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現量は、硬化をもたらす増殖性疾患の重症度に比例する。また、硬化をもたらす増殖性疾患の治療が有効であれば、患者の回復とともに、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現量が減少する。【００３９】  また、本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、硬化をもたらす増殖性疾患を検出するためのキットを提供する。【００４０】  さらに、本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、硬化をもたらす増殖性疾患の進行度及び／又は治療の有効性を評価するためのキットを提供する。
硬化をもたらす増殖性疾患とは、前述の通りである。【００４１】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬の例としては、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質のｍＲＮＡの塩基配列の特定の領域を特異的に増幅できるプライマー対、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質のｍＲＮＡの一部又は全部の領域に特異的にハイブリダイズすることができるプローブ、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質に対する抗体などを挙げることができる。これらのプライマー対及び抗体は、前述した通りである。【００４２】  本発明のキットは、さらに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、バッファー、対照ｍＲＮＡ、対照プライマー対、ｄＮＴＰ混合物、キットの使用説明書などを含んでもよい（核酸レベルでプライマー対を用いて、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するキットの場合）。【００４３】  あるいはまた、本発明のキットは、さらに、転写用バッファー、ブロッキング試薬、洗浄液、キットの使用説明書などを含んでもよい（ウェスタンブロット法で、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するキットの場合）。【００４４】  別の態様において、本発明のキットは、さらに、標識された二次抗体、基質（二次抗体が酵素で標識されている場合）、希釈液、反応停止剤、キットの使用説明書などを含んでもよい（ＥＬＩＳＡで、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するキットの場合）。【００４５】  さらに別の態様において、本発明のキットは、さらに、発色剤、過酸化水素水、バッファー、カウンター染色用色素、キットの使用説明書などを含んでもよい（免疫組織化学的解析で、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１、アクチビン受容体様キナーゼ１、アクチビン受容体様キナーゼ３及び骨形成タンパクからなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するキットの場合）。【００４６】３．薬剤及び医薬組成物
本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療剤を提供する。
硬化をもたらす増殖性疾患とは、前述の通りである。【００４７】  また、本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む、細胞外マトリックスの増殖を阻害する薬剤を提供する。細胞外マトリックスとは、動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の会合体である。培養細胞が合成・分泌し、細胞周辺に沈着させた構造物も含む。細胞外マトリックスは結合組織に多く見られるが、基底膜も細胞外マトリックスの一種である。【００４８】  さらに、本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質を有効成分として含む、α１ＩＶ型コラーゲンの発現を抑制する薬剤を提供する。【００４９】  これらの薬剤は、医薬品として、あるいは実験用の試薬として用いることができる。【００５０】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質の例としては、Ｓｍａｄ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（その塩基配列の一例を配列番号１３に示す）、ＳＡＮＥ（Ｓｍａｄ１  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）（Ｒａｊｕ  ＧＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ  ３；２７８（１）：４２８−４３７）、ＰＤＧＦβ受容体抗体（ＡＰＢ５）、ＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。いずれのタンパク質も遺伝子組換え技術を用いて大腸菌、酵母菌、昆虫細胞、動物細胞、または無細胞タンパク合成系などで産生することが可能である。Ｓｍａｄ１又はＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、市販のＤＮＡ合成機を用いて公知の方法により合成することができる。抗マウスＰＤＧＦＲ−β抗体であるＡＰＢ５は以下のようにして作成することができる。マウスＰＤＧＦＲ−βの細胞外ドメインに相当するｃＤＮＡフラグメントをＣＤ４Ｒｇベクターに挿入し、ヒトＩｇＧ１との融合タンパクＰＤＧＦＲ−β／Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１をＣＯＳ−１細胞株にて発現させた。上清より融合タンパクを精製してウィスター種のラットに免疫し、その脾臓細胞とミエローマ細胞株との融合細胞を作成し、ＰＤＧＦＲ−βに対する抗体を産生する細胞を選別した。ＡＰＢ５に限らず、公知の方法により作成する事が可能な抗ＰＤＧＦＲ−β特異抗体をＡＰＢ５と同様に用いることも可能である。【００５１】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質は、１種類のみ用いてもよいし、複数種を組み合わせて使用してもよい。【００５２】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質は単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医��組成物として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、疾患の種類、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人に投与する場合には、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質（例えば、ＳＡＮＥ）を１回量として通常１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは６０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１か月に１〜２回程度、好ましくは治療開始時に同量を２〜３日連続して、静脈注射により投与するとよい。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。【００５３】  経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。【００５４】  非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわちＳｍａｄ１の発現を抑制する作用を有する物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、Ｓｍａｄ１の発現を抑制する作用を有する物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。【００５５】  上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。【００５６】  また、上記の医薬組成物は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の有効成分を含有してもよい。【００５７】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓ��ａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制する作用を有する物質がＳｍａｄ１又はＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合には、公知の遺伝子導入法により被験者または被験者の細胞に導入することができる。例えば、Ｓｍａｄ１又はＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（″Ｌｉｐｉｄｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ″（１９９７）Ｒ．Ｊ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｕａｎｇ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １４，１７３−２０６；中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１１，１５９０−１５９６（１９９９））、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。Ｓｍａｄ１又はＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接導入することもできる。【００５８】  Ｓｍａｄ１又はＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。【００５９】４．硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキット
本発明は、被験物質が、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法を提供する。
硬化をもたらす増殖性疾患とは、前述の通りである。【００６０】  また、本発明は、被験物質が、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキットも提供する。【００６１】  さらにまた、本発明は、被験物質が、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を抑制するか否かを判定することを含む、α１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットも提供する。【００６２】  本発明の上記方法の一実施態様について説明する。【００６３】  まず、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質を発現する能力を持つ細胞を用意する。ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質を発現する能力を持つ細胞としてはいかなる細胞を用いてもよいが、その例として、動物の腎糸球体由来のメサンギウム細胞（例えば、後述の引用文献Ｓ１に記載のもの）、血管平滑筋細胞などを挙げることができる。【００６４】  ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質を発現する能力を持つ細胞を被験物質の存在下及び非存在下でそれぞれ培養し、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定する。被験物質の例としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質を発現する能力を持つ細胞の培養は、その細胞の培養に適した条件で行えばよい。例えば、マウスの腎糸球体由来のメサンギウム細胞（後述の引用文献Ｓ１）は、後述の実施例１に記載のようにして培養することができる。ＳＴＡＴ３及びＳｍａｄ１の発現を測定する方法は前述の通りである。
リン酸化ＳＴＡＴ３及びリン酸化Ｓｍａｄ１の発現は、それぞれ、抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）及び抗リン酸化Ｓｍａｄ１抗体（カルビオケム）を一次抗体として用いる免疫染色により、測定することができる。【００６５】  被験物質の存在下で細胞を培養した場合のＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現量と、被験物質の非存在下で細胞を培養した場合のＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現量とを比較する。前者が後者より少なければ、被験物質が硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効であると判定する。あるいはまた、被験物質が細胞外マトリックスの増殖阻害に有効である、あるいは、α１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効であると判定する。反対に、前者が後者と同等であるか、あるいは前者が後者より多ければ、被験物質が硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効ではないと判定する。あるいはまた、被験物質が細胞外マトリックスの増殖阻害に有効でない、あるいは、α１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効でないと判定する。【００６６】  本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定するためのキットも提供する。【００６７】  また、本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定するためのキットも提供する。【００６８】  さらに、本発明は、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１及びリン酸化Ｓｍａｄ１からなる群より選択される少なくとも１種類の物質の発現を測定するための試薬を含む、α１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定するためのキットも提供する。
硬化をもたらす増殖性疾患とは、前述の通りである。【００６９】  ＳＴＡＴ３又はＳｍａｄ１の発現を測定するための試薬の例としては、ＳＴＡＴ３又はＳｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列の特定の領域を特異的に増幅できるプライマー対、ＳＴＡＴ３又はＳｍａｄ１のｍＲＮＡの一部又は全部の領域に特異的にハイブリダイズすることができるプローブ、ＳＴＡＴ３又はＳｍａｄ１に対する抗体などを挙げることができる。これらのプライマー対及び抗体は前述した通りである。
リン酸化ＳＴＡＴ３又はリン酸化Ｓｍａｄ１の発現を測定するための試薬の例としては、抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）及び抗リン酸化Ｓｍａｄ１抗体（カルビオケム）などを挙げることができる。これらの抗体は前述した通りである。【００７０】  本発明のキットは、さらに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、バッファー、対照ｍＲＮＡ、対照プライマー対、ｄＮＴＰ混合物、キットの使用説明書などを含んでもよい（核酸レベルでプライマー対を用いて、ＳＴＡＴ３又はＳｍａｄ１の発現を測定するキットの場合）。【００７１】  あるいはまた、本発明のキットは、さらに、転写用バッファー、ブロッキング試薬、洗浄液、キットの使用説明書などを含んでもよい（ウェスタンブロット法で、ＳＴＡＴ３又はＳｍａｄ１の発現を測定するキットの場合）。【００７２】  別の態様において、本発明のキットは、さらに、標識された二次抗体、基質（二次抗体が酵素で標識されている場合）、希釈液、反応停止剤、キットの使用説明書などを含んでもよい（ＥＬＩＳＡで、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１又はリン酸化Ｓｍａｄ１の発現を測定するキットの場合）。【００７３】  さらに別の態様において、本発明のキットは、さらに、発色剤、過酸化水素水、バッファー、カウンター染色用色素、キットの使用説明書などを含んでもよい（免疫組織化学的解析で、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｓｍａｄ１又はリン酸化Ｓｍａｄ１の発現を測定するキットの場合）。【００７４】  以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００７５】  マウスＣｏｌ４遺伝子のプロモーター領域のＣＩＶ部位に結合するタンパクを同定するために、ＡＧＥｓ処理されたマウスのメサンギウム細胞よりｃＤＮＡライブラリーを構築した。本実験ではＹｅａｓｔ  ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍを用い、ライブラリーより特異的な転写因子をコードするクローンを選択し、そのクローンがＳｍａｄ１をコードしていることを同定した。Ｓｍａｄ１のＣｏｌ４プロモーター領域への結合をｉｎ  ｖｉｖｏで確認するために、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）を行なった。沈降したＤＮＡを精製しＣｏｌ４のプロモーター領域をＰＣＲで検出した。抗Ｓｍａｄ１抗体は、ＡＧＥｓ処理された細胞より得たＣＩＶ−１部位を含むクロマチンを沈降させた（図１Ａ）。ＢＳＡ処理された細胞では沈降しなかった。Ｓｍａｄ４もまたＣＩＶ−１部位に結合することを見出した（図１Ａ）。次にＣｏｌ４の転写活性をレポーターアッセイにより検討した。ＬａｃＺの前にＣＩＶ−１プロモーターをつないだベクターを作成し、野生型Ｓｍａｄ１ベクターと共にＣＯＳ７細胞に同時導入した。まず、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりＳｍａｄ１の発現を確認し（図１Ｂ）、野生型Ｓｍａｄ１ベクターを導入した細胞上清にリン酸化Ｓｍａｄ１（ｐＳｍａｄ１）を検出した。野生型Ｓｍａｄ１の同時導入によりＣｏｌ４単独（Ｍｏｃｋ）の場合と比較してβ−ガラクトシダーゼ活性は１８倍であった（図１Ｃ）。β−ガラクトシダーゼ活性はルシフェラーゼ活性により補正し、Ｍｏｃｋベクターを同時導入した細胞での活性を基準とした。Ｍｏｃｋは同時導入細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性に全く影響を与えなかった。この結果は、Ｓｍａｄ１が確かにＣｏｌ４遺伝子転写を誘導することを示唆している。つまり、Ｓｍａｄ１はＣｏｌ４の転写を調節している。【００７６】  Ｓｍａｄ１がＡＧＥｓによりアップレギュレートされているのかを確認するために、ＡＧＥｓ存在下・非存在下でのメサンギウム細胞でのＳｍａｄ１の発現を調べた。ＡＧＥ存在下ではＳｍａｄ１のｍＲＮＡ量は経時的に上昇した（図２Ａ）。同様にＣｏｌ４のｍＲＮＡもＳｍａｄ１の転写が上昇するのとパラレルに上昇した。しかし、ＢＳＡ存在下ではＳｍａｄ１の転写もＣｏｌ４の転写も変化しなかった。Ｓｍａｄ１はリン酸化され、核内に移動し標的遺伝子の転写調節をすることで知られている（１１）（１２）。従って、次に本発明者らはＡＧＥｓによりＳｍａｄ１のリン酸化および細胞内の移動が影響を受けるかという事をメサンギウム細胞で検討した（図２Ｂ）。ｍＲＮＡの結果と一致し、ＡＧＥｓ存在下７２時間の培養で細胞質に優先的に存在した。さらに、ＡＧＥｓ存在下１２０時間の培養でＳｍａｄ１とｐＳｍａｄ１の核内への集積が認められた。ＢＳＡ存在下での培養ではＳｍａｄ１とｐＳｍａｄ１はわずかしか発現しない。同様にＡＧＥｓ処理細胞の抽出液にはＳｍａｄ１とｐＳｍａｄ１が認められたが、ＢＳＡ処理細胞の抽出液には認められなかった（図２Ｃ）。これらの知見は、Ｃｏｌ４の調節がＡＧＥｓ存在下においてＳｍａｄ１の発現と連動していることを示す。【００７７】  ＡＧＥ誘導性のＣｏｌ４の過剰産生を媒介するシグナル伝達系でのＳｍａｄ１の重要性を確認するた���に、本発明者らはアンチセンス遺伝子を用いて特異的にこの系を阻害した。Ｓｍａｄ１のＡＧＥによる誘導はアンチセンス遺伝子の存在により全く消失したが、コントロールオリゴ存在下では消失しなかった（４ミスマッチオリゴ）（図３Ａ、Ｂ）。そして、Ｓｍａｄ１の阻害によりＣｏｌ４の過剰発現が著しく減弱した。Ｓｍａｄ１のミスマッチオリゴはＣｏｌ４の発現には影響しなかった（図３Ｃ）。これらのデータはＳｍａｄ１がＣｏｌ４の発現制御に決定的な役割をになっていることを示す。糖尿病患者において糖尿病性腎症の発症・進行は罹患率・死亡率の両方において臨床上重大な問題である。現行の治療方法において血糖値のコントロールが良好であれば糖尿病性腎症の発症・進行を遅らせることはできるが、予防はすることができないことが明らかとなっている。（１）（２）Ｓｍａｄ１に対するアンチセンスオリゴはＡＧＥによるＣｏｌ４の過剰発現を著しく減弱させる。これらの知見はＳｍａｄ１シグナル系の阻害により、糖尿病性腎症におけるメサンギウム細胞のＥＣＭの産生を防げるという可能性を示唆している。本実験の効果はＡＧＥｓの持続的な刺激存在下において認められたので、Ｓｍａｄ１は糖尿病の合併症の新たなターゲットと示唆され、現行の治療法に組み合わせることにより効果を発揮するものと思われる。ＡＧＥｓ処理によるＳｍａｄ１発現のメカニズムをさらに解明するために、本発明者らはメサンギウム細胞におけるａｃｔｉｖｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｋｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＡＬＫ１）の発現を調べた。ＡＬＫ１はＴＧＦ−β受容体ファミリーのタンパク質の１つであり、Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ５を特異的にリン酸化する働きがある。ＡＬＫ１は血管内皮細胞で多く発現しており（１３）（１４）、血管の成熟と安定化に重要であるといわれている（１５）（１６）。ＡＬＫ１の変異は、Ｏｓｌｅｒ−Ｒｅｎｄｕ−Ｗｅｂｅｒ症候群としても知られるタイプＩＩ遺伝性出血性毛細血管拡張症を起こす（１７）。ＡＬＫ１はＴＧＦ−βからのシグナルをＳｍａｄ１を介して伝達し、ＴＧＦ−β反応性遺伝子群の調節をしているという最近の報告がある（１８）（１９）。本発明者らは、ＡＧＥｓ処理されたメサンギウム細胞におけるＡＬＫ１の発現をＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ法およびＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を用いてそれぞれｍＲＮＡ、タンパク質の両方を検出した（データは示さず）。最後に、ヒトの糖尿病性腎症における腎糸球体でのＳｍａｄ１およびＡＬＫ１の発現を調べた。糖尿病性腎症および健常腎のバイオプシーを試料として間接抗体法を実施したところ、腎糸球体でのＳｍａｄ１とＡＬＫ１抗体に対する反応性は、糖尿病性腎症である糸球体では硬化性病変の重症度と比例したが、健常腎ではほとんど発現が認められなかった（図４）。これらの組織学的な知見はＣｏｌ４の正の調節とＳｍａｄ１／ＡＬＫ１シグナル伝達系に関係があることを示唆している。ヒトの糖尿病性腎症は長年にわたってゆっくりと進行するものなので、この現象の詳細な評価のためには糖尿病とＳｍａｄ１およびＡＬＫ１の関係を明らかにしなければならなさそうだ。【００７８】  マウスでのＳｍａｄ１遺伝子の特異的な破壊は胎児期において致��性であることから、Ｓｍａｄ１は早期の胚発生に決定的な役割を果たすと考えられる（２０）。しかし、胎生期早期における致死性のために、Ｓｍａｄ１のｉｎ  ｖｉｖｏでの役割、とりわけ成人についてはあまりよくわかっていない。Ｓｍａｄ１はＢＭＰシグナルを伝達するものとして知られ（１２）、特に腎の発生において重要であるといわれている（２１）。しかし、Ｓｍａｄ１はａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅの糸球体では発現がみられない（２２）。本実験は、初めてａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅでＳｍａｄ１の発現がＡＧＥｓにより誘導されることを示した。本発明者らは、ＡＧＥｓへの慢性的な暴露がＳｍａｄ１発現の持続的な上昇、Ｃｏｌ４の過剰発現を観察し、Ｓｍａｄ１が糖尿病存在下では決定的な調節因子であることを示唆した。ＡＧＥｓは糖尿病の合併症に有意に関与しているため、本発明者らの研究結果はコラーゲンの沈着を伴う糖尿病や老化のような疾患に有用であると考えられる。ＧＭＢの構造の変化は糖尿病性腎症において、微量アルブミン尿がおきるより以前の初期に起きるため、Ｓｍａｄ１は糖尿病性腎症の最も初期的なマーカーになるであろう。最近の報告でＡＬＫ１がＳｍａｄ１を介してＴＧＦ−βのシグナル伝達を仲介することが示された（１８）（１９）。従って、本発明者らはマウスのメサンギウム細胞とヒトの腎組織でのＡＬＫ１の発現を検討した。その結果、ＡＬＫ１とＳｍａｄ１は腎糸球体において糖尿病の進行に対応して発現することを本実験で示した。これらの結果はコラーゲンの病的な産生を抑制することにより、さまざまな臓器で起きる糖尿病の合併症の治療につながる（１）。この結果は持続的な血糖値の上昇がＡＧＥｓの上昇をもたらし、長期的な糖尿病の合併症の進展に必須であることを確認するものである（２３）（２４）。糖化によりコラーゲンがクロスリンクし動脈硬化をすすめる（２５）。さらに、ＡＧＥｓと糖尿病の合併症と動脈硬化の相関がＡＧＥｓに特異的な阻害剤を使った研究により近年強調されている（２６）（２７）。Ｃｏｌ４は血管基底膜の主要な構成成分であるにもかかわらず、糖尿病や老化におけるＣｏｌ４の産生増進については、細胞レベルでも分子レベルでもメカニズムはほとんどわかっていない。従って、本発明者らはＡＬＫ１／Ｓｍａｄ１シグナル伝達系が糖尿病と老化の両方で、ＥＣＭを過剰発現させることにより動脈硬化の進展に関わっていると推測している。糖尿病や老化の動物モデルを用いてＡＬＫ１／Ｓｍａｄ１シグナル伝達系の解明をさらに進めるべく研究中である。【００７９】  さらに、ＡＧＥｓ存在下にて培養したメサンギウム細胞におけるｍＲＮＡの発現量をＢＳＡ存在下での培養メサンギウム細胞のそれと比較した（図５）。ＡＧＥｓ存在下ではＢＭＰＲＩＩ、ＢＭＰ４の顕著な転写増強が認められる。Ｓｍａｄ１の転写量に大きな変動は認められないが、Ｓｍａｄ１は転写因子であるため発現量の大きな変動は捕え難く、また、転写因子の作用に重要である細胞質から核内への移行やリン酸化などはマイクロアレイの結果に反映しないためであると考えられる。【００８０】  また、糖尿病性腎症患者の尿中ＢＭＰ２をウェスタンブロット法で測定したところ、治療による疾患の改善とともに尿中ＢＭＰ２の減��が認められた（図６）。【００８１】  また、ＴＧＦ−βシグナルによる慢性的刺激によりＢＭＰ２およびＢＭＰ４タンパクの著明な発現亢進が認められ（図７）、ＴＧＦ−βシグナル伝達系において中心的な機能をこれらＢＭＰｓが担っている可能性が示唆される。【００８２】実験に用いた材料と方法
Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ
正常な４週令のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＳＪＬ／Ｊ）の腎糸球体由来のメサンギウム細胞株を樹立し、以前に報告した方法にしたがってメサンギウム細胞であることを同定した（Ｓ１）。メサンギウム細胞株は１ｍＭグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０％ＦＣＳを加えてＢ培地（最少栄養培地と微量元素を添加したＦ１２培地の３：１混合培地）にて培養した。培養細胞は腎糸球体メサンギウム細胞と判定されるための一般的な基準を満たした（Ｓ２）。ＡＧＥｓまたはＢＳＡ処理は以前に報告した方法に従って行なった（Ｓ３）。
ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ＡＧＥｓ処理をしたマウス腎糸球体培養細胞よりｃＤＮＡを調製しｐＧＡＤベクターに挿入した。Ｙｅａｓｔ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇはＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）キットを用いて行なった。マウス由来Ｃｏｌ４遺伝子の２７ｂｐのタンデムリピート配列（ＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧ：ＣＩＶ−１）（配列番号１４）を酵母のｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒであるｐＨＩＳｉ（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはｐＬａｃＺｉ（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）につないでＣＩＶ−１−ｐＨＩＳｉとＣＩＶ−１−ｐＬａｃＺｉベクターを作成し、それを直線化して酵母株ＹＭ４２７１（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の染色体に挿入した。ＣＩＶ−１−ｐＨＩＳｉとＣＩＶ−１−ｐＬａｃＺｉを挿入した酵母を用いてＡＧＥｓ処理したマウスメサンギウム細胞由来のｃＤＮＡライブラリーのＯｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇを行なった。４５ｍＭ  ３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ）を添加したＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ培地でポジティブクローンを選択した。偽陽性クローンを除くためにβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｌｉｆｔ  ａｓｓａｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を行ない、残った酵母のコロニーより回収したプラスミドを大腸菌（ＤＨ５α）に導入した。
ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙ
ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙはＬｕｏ（Ｓ５）の方法に従った。抗Ｓｍａｄ１抗体、抗Ｓｍａｄ−４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、コントロールＩｇＧを使用して４℃でオーバーナイトした。ＣＩＶ−１領域をＰＣＲで増幅した。使用プライマーは５’側（５’−ＧＧＡＧＣＴＣＣＣＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧ−３’）（配列番号１５）、３’側（５’−ＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＡＣＣ−３’）（配列番号１６）である。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で１００ｂｐ前後であった。
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ
１．３×１０５ＣＯＳ７細胞を１０％ＦＢＳを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏのイーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて６穴プレートで培養した。８時間後に７５０ｎｇのＣＩＶ−１−ＬａｃＺと同量のＳｍａｄ−１を組み込んだベクター、あるいはダミーであるｍｏｃｋベクターを同時導入した。そして、内部コントロールとして７５ｎｇのＣＭＶ−ＬＵＣ（ＣＭＶプロモーターの下流に蛍ルシフェラーゼ遺伝子をつないだもの）も導入した。導入にはＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を使用した。４８時間後に細胞をｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに回収し、β−ガルクトシダーゼ活性とルシフェラーゼ活性ををれぞれβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とＬｕｃｉｆａｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて測定し、β−ガラクトシダーゼ活性はルシフェラーゼ活性の測定結果で補正した。
ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ
既報（Ｓ６）に従いＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを行なった。
このアッセイに用いたプローブの塩基配列はＡｃｃ  Ｎｏ．Ｕ５８９９２の１１７２−１４３３の配列で以下の通りである。
ｃｃｃａｃｃａｃｃ  ｇｔｃｔｇｃａａｇａ  ｔｃｃｃｃａｇｃｇｇ  ｇｔｇｃａｇｃｔｔｇ  ａａａａｔｃｔｔｃａ  ａｃａａｃｃａａｇａ  ｇｔｔｔｇｃｔｃａｇ  ｃｔａｃｔｇｇｃｇｃ  ａｇｔｃｔｇｔｇａａ  ｃｃａｃｇｇｇｔｔｃ  ｇａｇａｃｃｇｔｇｔ  ａｔｇａａｃｔｃａｃ  ｃａａａａｔｇｔｇｃ  ａｃｔａｔｔｃｇｇａ  ｔｇａｇｃｔｔｃｇｔ  ｇａａｇｇｇｔｔｇｇ  ｇｇａｇｃｃｇａａｔ  ａｃｃａｃｃｇｇｃａ  ｇｇａｔｇｔｔａｃｃ  ａｇｃａｃｃｃｃｃｔ  ｇｃｔｇｇａｔｔｇａ  ｇａｔｃｃａｔｃｔｇ  ｃａｔｇｇｃｃｃｔｃ  ｔｃｃａｇｔｇｇｃｔ  ｇｇａｔａａｇｇｔｔ  ｃｔｇａｃｃｃａｇａ  ｔｇｇ（配列番号１７）
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ
メサンギウム細胞をＡＧＥｓまたは対照としてＢＳＡ存在下で７２時間培養した。Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに細胞を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、ニトロセルロース膜にブロッティングし、５０１倍希釈した抗Ｓｍａｄ１抗体および抗ｐＳｍａｄ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を反応させ、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で検出した。
Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｃｙｔｏｓｅｃｔｉｏｎｓ
培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１００倍希釈した抗Ｓｍａｄ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１００倍希釈した抗ｐＳｍａｄ−１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。適量のフルオロセインイソチオシアネートを結合二次抗体をレーザー顕微鏡と蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
Ｓｍａｄ１  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｍａｄ１に対する２５塩基の長さのアンチセンスオリゴを合成した（Ｇｅｎｅｔｏｏｌｓ  ＬＬＣ，Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，Ｏｒｅｇｏｎ）。配列は５’−ＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＴＡＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号１３）である。対照として合成オリゴ５’−ＣＡｔＧＣＴｃＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡａＡＧＣｃＧＣＴ−３’（配列番号１８）を使用し、既報（Ｓ７）の通りｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行なった。
Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ
病理組織学的検討をヒト組織を用いて行なった。本実験はヘルシンキ宣言にもとづき倫理委員会の承認を得て行なった。患者様からは組織提供および研究に使用するための承諾を書面により得ている。５例の糖尿病性腎症の腎生検試料の提供を得た。対照とした正常組織は腎の悪性腫瘍により腎摘出手術を受けた患者様の腎の正常な皮質を腫瘍の反対側よりサンプリングした。腎組織は凍結し５μｍ厚の切片を切り出しアセトンで５分間固定した。内因性のペルオキシダーゼの影響を消すために１％過酸化水素メタノール中に入れ暗中で２０分間インキュベートした。さらに、非特異的な染色を防ぐため、適量の免疫前の血清を用いて室温で２０分間インキュベートした。抗Ｓｍａｄ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗ＡＬＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｃｋｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を一次抗体として免疫染色を行なった。
マイクロアレイによる発現量の解析
ＡＧＥｓ存在下にて培養したメサンギウム細胞及びＢＳＡ存在下で培養したメサンギウム細胞のぞれぞれにおける各ｍＲＮＡの発現量をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔを用いて測定した。
【実施例２】
【００８３】  糸球体硬化は細胞外基質（ＥＣＭ）の量的な増加によって特徴づけられる。ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ４）は糸球体疾患において、増量したＥＣＭの主要な構成成分の１つであるが、本発明者らの最近の報告まではＣｏｌ４遺伝子の転写調節の分子機構は明らかではなかった。本発明者らは、糖尿病性腎症においてＳｍａｄ１がＣｏｌ４の過剰発現を転写レベルで調節している事を示した（Ａ８）。Ｓｍａｄ１は下流の標的遺伝子へシグナルを直接伝達する。例えばオステオポンチン（Ａ９）、分化の阻止（Ａ１０）、Ｉ型コラーゲン（Ａ１１）、そして腎疾患の進展に本質的に重要である（Ａ１２）。これらの知見はＳｍａｄ１が糸球体硬化の進展に重大な意味を持つ転写因子である事を示唆している。
Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）タンパクはたくさんのサイトカインと増殖因子のシグナル伝達に関与している。ＳＴＡＴ３の活性化はＰＤＧＦが誘導する分裂促進の鍵となる制御因子である（Ａ１３）。Ｎａｋａｓｈｉｍａらはアストロサイトの分化において、転写のコアクチベーターであるｐ３００がＳＴＡＴ３およびＳｍａｄ１と物理的に相互作用し、続いて標的遺伝子の転写の活性化が起きる事を報告した（Ａ１４）。以上の知見から、ＰＤＧＦがメサンギウム細胞の増殖においてＳＴＡＴ３−Ｓｍａｄ１シグナル伝達経路を活性化し、この過程がメサンギウム細胞の増殖から糸球体硬化に進展するのに重要であるという仮説を立てた。
本研究において、本発明者らはラットの糸球体腎炎において、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖による活性化を阻害する抗ＰＤＧＦ−β受容体抗体の投与の効果を示し、糸球体の細胞増殖、糸球体硬化の両方を調節するシグナル伝達経路についてｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。【００８４】実験に用いた材料と方法
Ａｎｉｍａｌｓ
本研究には体重１８０〜２００ｇのオスのウィスターラット（日本クレア、日本）が使用された。ラットは特定病原体除去環境下で飼育された。本研究は徳島大学の倫理審査委員会の承認を受け、すべての動物実験は学内のガイドラインに沿って行なわれた。
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙ１  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｇｅｐｈｒｉｔｉｓ
実験的なメサンギウム増殖性糸球体腎炎（Ｔｈｙ１  ＧＮ）は抗ラットＴｈｙ−１．１モノクローナル抗体（セダーレーンラボラトリーズ社、オンタリオ、カナダ）の１回投与（１ｍｇ／ｋｇ）により、既報の通り（Ａ１５）誘発された。これらのラットは抗Ｔｈｙ−１．１抗体投与後１、２、４、６、１２日後（ｎ＝６／群）に屠殺された。６匹の齢数を合わせたラットに溶媒のみ投与して各群のコントロールとして屠殺した。
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＰＤＧＦ  β−Ｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｔｈｙ１  ＧＮ
ラットモノクローナル抗ＰＤＧＦ  β受容体抗体（ＡＰＢ５）と、そのＰＤＧＦ  β受容体シグナル伝達系における拮抗効果はｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで以前に報告されている（Ａ１６、Ａ１７）。ラットにＡＰＢ５（理化学研究所・西川伸一教授のご厚意により提供頂いた）またはＡＰＢ５と同じアイソタイプのＩｇＧ（理化学研究所・西川伸一教授のご厚意により提供頂いた）を４００μｇづつ、抗Ｔｈｙ−１．１の投与（０日）より毎日腹腔内投与し、１、２、４、６、１２日後（ｎ＝６／群）に屠殺した。
Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ
Ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
腎臓を摘出後、組織片は光学顕微鏡による研究のためにカルノア液（メタノール：氷酢酸＝３：１）で固定しパラフィン包埋した。切片（２μｍ）をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）、過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）、過ヨウ素酸メセナミン銀試薬（ＰＡＭ）で染色した。
Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
腎切片を通常の方法で免疫組織染色した。増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｃｏｌ４、Ｓｍａｄ１について調べるために、カルノア液で固定しパラフィン包埋した組織片を使用した。腎切片は再水和し、０．３％の過酸化水素加メタノールで３０分間、内因性ペルオキシダーゼ失活処理した。非特異的な染色を除くために、切片を適量の免疫前血清中で室温で２０分間インキュベーションし、アビジンＤブロッキング液とビオチンブロッキング液（ベクター、カリフォルニア、ＵＳＡ）でそれぞれ１５分間づつ処理した。切片を抗ＰＣＮＡ抗体（１：２００希釈）、抗Ｃｏｌ４抗体（１：２００希釈）、抗Ｓｍａｄ１抗体（１：１００希釈）（サンタクルスバイオテクノロジー社、カリフォルニア、ＵＳＡ）で室温で６０分間インキュベートし、適量のビオチン化二次抗体、続いてアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（ベクタスタチンＡＢＣシステム、ベクター社）とインキュベートし、ジアミノベンチジン四酢酸塩（ＤＡＢ）を用いて発色させた。リン酸化Ｓｍａｄ１（ｐＳｍａｄ１）とリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）について調べるために、切片を凍結切片用包埋剤ＯＣＴコンパウンド（マイルズ社、インディアナ、ＵＳＡ）に包埋し冷却したアセトンに入れ瞬間凍結した。４μｍ厚の切片を作成し、アセトンで５分間固定し、さらに０．３％過酸化水素加メタノールで３０分間、内因性ペルオキシダーゼ失活処理した。切片はＰＣＮＡと同様の方法で抗ｐＳｍａｄ１抗体（１：１００希釈）（カルビオケム、カリフォルニア、ＵＳＡ）、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（１：１００希釈）（サンタクルスバイオテクノロジー）を一次抗体として免疫染色を行なった。核数を調べるために切片をヘマトキシリン液で対比染色した。
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ＰＡＭ染色した組織を用いて糸球体の形態計測を行なった。糸球体面積に対する糸球体表面およびＰＡＭ陽性の面積（％）を、画像解析システム付顕微鏡（ＩＰＡＰ、住友化学工業社、大阪、日本）を用いて既報（Ａ１８−Ａ２０）の通り測定した。ラット１匹につき５０の糸球体を解析した。
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ＰＣＮＡ：増殖している細胞（ＰＣＮＡ陽性細胞）を定量するために、１標本につき５０の糸球体について観察者に試料の情報をつけないで計数してもらい、１糸球体あたりの平均値を算出した。ｐＳｍａｄ１：ｐＳｍａｄ１の発現を定量するために、糸球体細胞数に対するｐＳｍａｄ１陽性細胞数を計数し、ｐＳｍａｄ１陽性細胞の割合を算出した。Ｃｏｌ４、Ｓｍａｄ１、ｐＳＴＡＴ３について、切片上の糸球体間質全体に対して、免疫ペルオキシダーゼ染色で茶色く染色された部分をカラーレンジで選択し、その面積が全体の面積に占める割合をＩＰＡＰを用いて定量した。ラット１匹につき５０の糸球体を解析した。
Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
正常な４週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＳＪＬ／Ｊ）より摘出した糸球体より、既報の方法（Ａ２１）の通りメサンギウム細胞を分離し、糸球体メサンギウム細胞の細胞株を樹立した。メサンギウム細胞は微量元素、１ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＢ培地（最小栄養培地とＦ１２培地＝３：１混合培地）中で培養した。培養細胞は、一般的に受け入れられている糸球体メサンギウム細胞としての要件にあてはまった（Ａ２２）。培養メサンギウム細胞は２０％ＦＣＳを添加したＢ培地で１００ｍｍ径の培養皿に蒔かれた。２４時間後に、０．１％ＢＳＡを添加したＢ培地に交換し２日間飢餓状態に置き、その後２％ＦＣＳを添加したＢ培地に５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−Ｂ（カルビオケム）を加え、さらに１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＢ５またはコントロールとしてラットＩｇＧを加えて２４時間培養した。
Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｂｙ  ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡ
メサンギウム細胞の増殖は、細胞増殖を定量するための、ＤＮＡ合成の際のＢｒｄＵ取り込みの定量を原理とする比色イムノアッセイ（アマシャムファルマシアバイオテク、ニュージャージー、ＵＳＡ）によっても評価した。ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡはキット製造元のマニュアルの通り使用した。メサンギウム細胞は、９６穴の平底マイクロタイタープレートに１０％ＦＣＳ添加したＢ培地で低密度に蒔き、オーバーナイトでプレートに接着させた。準集密度的な０．１％ＢＳＡを添加したＢ培地に交換し２日間飢餓状態に置き、その後、２％ＦＣＳ、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−Ｂ、１０ｍＭＢｒｄＵを添加したＢ培地と交換し、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＢ５を添加した。６時間培養後、プレートを遠心し細胞を固定液で固定し１：１００希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体と３０分間インキュベーとした。標識抗体を洗浄した後、基質液を加えて１５分間置き、１Ｍ硫酸で反応を停止させた。５分以内に４５０ｎｍの吸光度を６９０ｎｍを対象波長としてＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した（モデル５５０、バイオラッドラボラトリーズ、カリフォルニア、ＵＳＡ）。ブランクは１００μＬのＢｒｄＵを添加しない培地とした。
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ
培養されたメサンギウム細胞は０．１％ＢＳＡ添加Ｂ培地で２４時間飢餓状態とした。１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＢ５またはコントロールＩｇＧを添加した５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢで、培養細胞を１２０分間刺激した。細胞を溶解バッファーに懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーし、１：１０００希釈抗ｐＳＴＡＴ３抗体、１：１０００希釈抗ｐＳｍａｄ１抗体、１：２０００希釈抗Ｃｏｌ４抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ケミルミネッセンス検出システム（アマシャムファルマシア）を用いて検出した。
Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
発現ベクターに組み入れた野生型のＳＴＡＴ３とドミナントネガティブなＳＴＡＴ３が入ったプラスミドはＪａｃｋｉｅ．Ｂｒｏｍｂｅｒｇ（ロックフェラー大学）の厚意により提供された（Ａ２３）。メサンギウム細胞（６０ｍｍ培養皿）に野生型またはドミナントネガティブなＳＴＡＴ３（８ｍｇ）を組み入れた発現ベクターを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用い元のマニュアルの通りに導入した。６時間後、培地を増殖培地（６０％ＤＭＥＭ、２０％Ｆ１２、２０％ウシ胎児血清）に交換した。４８時間後、細胞を溶解バッファーに懸濁し、先に述べた通りウェスタンブロット解析を行なった。
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ
全ての値は平均値±ＳＥで表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック解析、またはｔ検定を用いて片側の分散解析を行なった。Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
細胞増殖試験と培養メサンギウム細胞におけるＳｍａｄ１  ｍＲＮＡ発現データの統計解析にはｔ検定を用いた。免疫組織染色の定量化と糸球体のＳｍａｄ１  ｍＲＮＡ発現は片側ＡＮＯＶＡを行った後、多重比較した。Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。データはすべて平均値±ＳＤで表した。【００８５】実験結果
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｔｈｙ１  ＧＮ
Ｔｈｙ１  ＧＮでは、メサンギウム細胞の増殖が注射後２日目から始まり６日目で最大となり、１２日目で鎮静化した。図９に各群の６日目の代表的な光学顕微鏡像を示す。Ｔｈｙ１  ＧＮ群は糸球体間質が増加し、それは６日目にピークを迎えた（図９Ｂ）。糸球体細胞の増殖はＰＣＮＡの免疫染色で評価した。ＰＣＮＡ陽性細胞はＴｈｙ１  ＧＮ群で顕著に増加し、６日目に最大値となった（図９Ｅ）。
Ｃｏｌ４は糸球体硬化においてＥＣＭの主要な構成成分の１つである。Ｃｏｌ４は、正常対照群では、糸球体基底膜に沿って弱く染色されたが糸球体の部分ではほとんど陽性を示さなかった（図９Ｇ）。一方、Ｔｈｙ１  ＧＮ群では拡張したメサンギウム部分に強いＣｏｌ４陽性を示した（図９Ｈ）。
Ｔｈｙ１  ＧＮでは、糸球体でＰＤＧＦ−Ｂ、ＢＤＧＦ  β受容体も有意に陽性を示した（図１０）。これらの知見はメサンギウム細胞の過剰な増殖、糸球体の肥大、糸球体硬化病変が、抗Ｔｈｙ１抗体により誘発される糸球体腎炎において同時発生的に起きる事を示している。
Ａｎｔｉ−ＰＤＧＦ  β−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｏｔｈ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ
ＡＰＢ５は既報にも述べられているようにＰＤＧＦ  β受容体が仲介するシグナル伝達系を阻害する。Ｔｈｙ１  ＧＮにおいて、ＡＰＢ５処理は処理後のどの時点においても糸球体細胞数とＰＣＮＡ陽性細胞数の両方を減少させた（図９Ｃ、９Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ）。ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の過剰発現とＰＤＧＦ  β受容体はＡＰＢ５処理後で有意に減少した（図１０Ｃ、１０Ｆ）。ＡＰＢ５処理はＴｈｙ１  ＧＮにおけるメサンギウム間質増大も有意に減少させた。これは糸球体全体に占めるＰＡＭ陽性の面積の割合で評価したものである（図１１Ｃ）。また、Ｔｈｙ１  ＧＮにおけるメサンギウム細胞のＣｏｌ４発現はＡＰＢ５処理によって減少した（図１１Ｄ）。これらのデータはＴｈｙ１  ＧＮにおいて、ＡＰＢ５処理ががメサンギウム細胞の増殖とメサンギウム間質の増大の両方を減少させる事を示している。
Ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ１，ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓｍａｄ１（ｐＳｍａｄ１）ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）ｉｎ  Ｔｈｙ１  ＧＮ
本発明者らはＴｈｙ１  ＧＮラット腎におけるＳｍａｄ１の発現を免疫染色で検討した。Ｓｍａｄ１は正常対照の糸球体ではほとんど検出されなかったが（図１２Ａ）、６日目のＴｈｙ１  ＧＮ群の糸球体は典型的なメサンギウム肥大像を示しＳｍａｄ１が強く発現していた（図１２Ｂ）。Ｓｍａｄ１の発現を定量するためにＩＰＡＰ画像解析システムを使用した。糸球体のＳｍａｄ１発現は６日目に最大となり（図１３Ａ）、メサンギウム細胞の増殖のピークと一致した。図１２Ｃに示した通り、糸球体のＳｍａｄ１発現は６日目以降には急速に減少した。
本発明者らは次に、Ｔｈｙ１  ＧＮにおいてＳｍａｄ１の転写とＳｍａｄ１のリン酸化が起きているかどうかについて検討した。免疫組織染色の結果、ｐＳｍａｄ１は正常対照群ではほとんど認められなかった（図１４Ａ）。しかし、Ｔｈｙ１  ＧＮ群では、ｐＳｍａｄ１は核の部分に強い陽性を示した（図１４Ｂ）。ｐＳｍａｄ１の発現を定量するために、糸球体あたりのｐＳｍａｄ１陽性細胞を計測した（図１３Ｂ）。糸球体のｐＳｍａｄ１の発現はＴｈｙ１  ＧＮの１日目で上昇しており、細胞増殖の初期である４日目にピークを迎えた。
ＰＤＧＦ−ＢとＰＤＧＦ  βＲがＴｈｙ１  ＧＮで増加している事と、ＡＰＢ５がその過剰発現を抑制する事から、本発明者らはＰＤＧＦシグナル伝達系の転写因子であるリン酸化ＳＴＡＴ３の免疫染色を行った（Ａ２４）。Ｔｈｙ１  ＧＮにおいてｐＳＴＡＴ３の発現は広範に増加しており（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ）、６日目に最大となった（図１３Ｃ）。
ＡＰＢ５処理群ではＴｈｙ１  ＧＮにおける糸球体でのＳｍａｄ１およびｐＳｍａｄ１タンパクの発現が有意に減少していた（図１２Ｄ、１２Ｅ、１４Ｄ、１４Ｅ、１６Ａ、１６Ｂ）。ｐＳＴＡＴ３の過剰発現もまたＡＰＢ５投与後のどの調査点においても有意に減少していた（図１５Ｄ、１５Ｅ、１６Ｃ）。
Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤＧＦ  β−Ｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
ＡＰＢ５がメサンギウム細胞の増殖を阻害するかどうかを確認するために、本発明者らはＡＰＢ５存在下、あるいは非存在下でのメサンギウム細胞の増殖をＢｒｄＵ  ＥＬＩＺＡを用いて検討した。図１７Ａに示した通り、ＡＰＢ５の添加はＰＤＧＦによって糸球体で起きるＤＮＡ合成を抑制した。
ＡＰＢ５がＰＤＧＦ−Ｂで刺激されたメサンギウム細胞のｐＳＴＡＴ３、ｐＳｍａｄ１、Ｃｏｌ４の発現を抑制するかどうかをウェスタンブロット法を用いて検討した。ＡＰＢ５はＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１のリン酸化およびＣｏｌ４の発現を減少させた（図１７Ｂ）。
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  Ｓｍａｄ１
ＳＴＡＴ３とＣｏｌ４発現を増加させるＳｍａｄ１の相互作用を明らかにするために、ドミナントネガティブなＳＴＡＴ３を組み込んだベクターを培養メサンギウム細胞に導入した。
ドミナントネガティブなＳＴＡＴ３の導入は、野生型のＳＴＡＴ３を導入した時と比較して明らかにｐＳｍａｄ１とＣｏｌ４の発現を減少させた（図１８）。【００８６】考察
多くの糸球体障害はメサンギウム細胞の増殖と糸球体硬化を特徴としているが、この重要な病理所見２つに共通な機序については今まで解明されていない。本研究では、まず、ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１の活性化が進行性の糸球体障害時の２つの現象、細胞増殖と糸球体硬化の相互作用を調節する鍵となるパスウェイにある事を示した。これらの結果は２１世紀に世界中で主要な問題となっている慢性糸球体腎炎と糖尿病性腎症の病因研究と治療の新たな方向性がある事を支持するものである。
糸球体硬化は、慢性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症を含む進行性の糸球体障害の病理学的特徴である。多くの糸球体疾患の初期に糸球体細胞の増殖が起こり、続いて糸球体硬化の進展が起き、だんだんと糸球体障害の終期に進む（Ａ１、Ａ２）。この過程の例はＩｇＡ腎症、膜増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ヒトとＴｈｙ１  ＧＮ、ラットの腎切除モデルなどのような全身性軽鎖病に見られる（Ａ２５、Ａ２６）。糸球体細胞の増殖を抗ＰＤＧＦ抗体（Ａ７）、抗凝血剤のヘパリン（Ａ２７）、ビタミンＤ類縁体（Ａ１９）により阻害すると、続いて進展する進行性の糸球体硬化が起きなくなる事が示されているが、その機序は不明である。本研究で本発明者らはこれらの病理学的過程である、メサンギウム細胞の増殖と糸球体硬化の相互作用を調節する可能性があるメカニズムを提示した。
マウスとヒトメサンギウム細胞のＰＤＧＦ受容体は同定されている（Ａ２８）。ＰＤＧＦはメサンギウム細胞の強力な、鍵となる分裂促進因子であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのメサンギウム細胞で自己分泌型の細胞増殖因子として恒常的に合成されている（Ａ２８、Ａ２９）。ＰＤＧＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも糸球体腎炎、糖尿病性腎症、進行性糸球体硬化などの病理学的状態の進行に重要な役割を果たしている（Ａ３、Ａ４）。ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼが活性化されると、ＳＴＡＴ３タンパクがチロシンリン酸化される事は既報である（Ａ３０、Ａ３１）。この活性化は増殖の調節と分化を調節している（Ａ３２、Ａ３３）。発明者等は、リン酸化されたＳＴＡＴ３の過剰発現が、ＰＤＧＦとＰＤＧＦ  β受容体両方の過剰発現に伴って確認された事をｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏで示し、ＡＰＢ５がＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ  β受容体、ＳＴＡＴ３の発現量を減らし糸球体腎炎を回復させる事をｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した。
糸球体硬化は主としてメサンギウムのＥＣＭ量の増加によって特徴づけられる。糸球体硬化の主要な構成要素の１つがＣｏｌ４である（Ａ３４）。本発明者らは、Ｓｍａｄ１が糖尿病性腎症においてｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも鍵となる転写因子である事を最近報告した（Ａ８）。リン酸化されたＳｍａｄ１がＣｏｌ４の発現上昇および糸球体ＥＣＭの増量と並行して強く発現する事を示した。これらの知見はＳｍａｄ１が糖尿病性腎症における糸球体硬化だけではなく糸球体腎炎においても決定的な役割を果たしている事を明らかにしている。本研究では、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもＰＤＧＦが糸球体のリン酸化されたＳｍａｄ１の発現を誘導する事もまた示している。
本発明者らは、ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１の相互作用が糸球体硬化に重要な遺伝子の調節をする事を確認した。ドミナントネガティブなＳＴＡＴ３を導入する事によって、培養メサンギウム細胞でＣｏｌ４の発現が有意に減少した。ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１の活性化はそれぞれ独立しているようであるが、どちらもＰＤＧＦにより活性化された。さらに、ドミナントネガティブなＳＴＡＴ３を導入するとＳｍａｄ１のリン酸化が部分的に減少する事から、Ｓｍａｄ１の活性化はＳＴＡＴ３活性化機序の一部であると考えられた。これらの知見は、糸球体腎炎の実験モデルでは、ＰＤＧＦによるＳＴＡＴ３活性化はＳｍａｄ１発現と相互作用し、続いてＣｏｌ４の活性化が起きる事を示唆している。２つのシグナル伝達経路を理解する事は、進行性の糸球体障害の病理学的なプロセスを明らかにする上で重要である。
様々な臓器で起きる硬化に対する治療は、それらの臓器の機能が失われるのを減速するという補助的なものに限定されている。本発明者らの知見は、硬化を来たす他の増殖性の疾患の本質にも洞察を与えるものである。Ｓｍａｄ１とＳＴＡＴ３は正常な糸球体ではほぼ認められないため、Ｓｍａｄ１および／またはＳＴＡＴ３シグナルを阻害する事は、病的に活性化した細胞増殖およびＥＣＭ産生を抑制するという機序により、硬化を来たす様々な腎疾患の進展を抑制するのに有用であると考えられる。
【実施例３】
【００８７】  糖尿病性腎症患者５名、糖尿病に硬化病変を伴う腎炎を発症した患者１名、糖尿病に硬化病変を伴わない腎炎を発症した患者２名、正常者２名の尿をサンプルとして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、ニトロセルロース膜にブロッティングした。抗Ｓｍａｄ−１抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）および抗ＡＬＫ−１抗体（Ｒ＆Ｓシステムズ、ミネアポリス、米国）を一次抗体とし、ウェスタンブリーズキット（インビトロジェン、東京、日本）を用いてウェスタンブロット法を行なった。
糖尿病性腎症である入院患者の治療開始前の尿検体、その後治療開始後１週間毎に尿検体を採取し、抗ＡＬＫ−１抗体を一次抗体として同様にウェスタンブロット法を行なった。
Ｓｍａｄ−１およびＡＬＫ−３は糖尿病性腎症および腎に硬化が認められた患者尿において検出されたが、正常者および硬化を伴わない腎炎患者の尿では検出されなかった（図１７、図１９）。また、ＡＬＫ−１は糖尿病性腎症の治療と共に、尿中への排泄量が経時的に減少した（図１８）。【００８８】引用文献
１．Ｔｈｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９，９７７−９８６（１９９３）．
２．ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）Ｇｒｏｕｐ．Ｌａｎｃｅｔ  ３５２，８３７−８５３（１９９８）
３．Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１１７０４−１１７０８（１９９４）．
４．Ｍ．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８，１３１５−１３２１（１９８８）．
５．Ｔ．Ｄｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，２８７３−２８７７（１９９２）．
６．Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，１２０４３−１２０４７（１９９２）．
７．Ｍ．Ｓ．Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２，１４０７−１４１１（１９９３）．
８．Ｓ．Ｌ．Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９，１０２５−１０３１（１９９８）
９．Ｌ．Ａ．Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｐ．Ｅ．Ｋｌｏｔｍａｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７，１４９７−１５０２（１９９２）．
１０．Ｎ．Ｉｅｈａｒａ，Ｈ．Ｔａｋｅｏｋａ，Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｋｉｔａ，Ｔ．Ｄｏｉ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０，１１６６−１１７２（１９９６）．
１１．Ｃ．Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ，Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｐ．ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０，４６５−４７１（１９９７）．
１２．Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｄ  Ｗｏｔｔｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９，１７４５−１７５４（２０００）．
１３．Ｂ．Ａ．Ｒｏｅｌｅｎ，Ｍ．Ａ．ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｃ．Ｌ．Ｍｕｍｍｅｒｙ，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０９，４１８−４３０（１９９７）．
１４．Ｌ．Ａｔｔｉｓａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７５，６７１−６８０（１９９３）
１５．Ｌ．Ｄ．Ｕｒｎｅｓｓ，Ｌ．Ｋ．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｙ．Ｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２６，３２８−３３１（２０００）．
１６．Ｊ．Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０，１６６３−１６７３（２００１）．
１７．Ｄ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１３，１８９−１９５（１９９６）
１８．Ｓ．Ｐ．Ｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，２６２６−２６３１（２０００）．
１９．Ｙ．Ｇ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３６７２−３６７７（１９９９）．
２０．Ｋ．Ｄ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｎ．Ｒ．Ｄｕｎｎ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，３６０９−３６２１（２００１）
２１．Ａ．Ｄｉｃｋ，Ｗ．Ｒｉｓａｕ，Ｈ．Ｄｒｅｘｌｅｒ，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１１，２９３−３０５（１９９８）
２２．Ｓ．Ｈｕａｎｇ，Ｋ．Ｃ．Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇｅｎｅ，２５８，４３−５３（２０００）
２３．Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．９１，１１７０４−１１７０８（１９９４）．
２４．Ｚ．Ｍａｋｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５，８３６−８４２（１９９１）．
２５．Ｏ．Ｃｈａｐｐｅｙ，Ｃ．Ｄｏｓｑｕｅｔ，Ｍ．Ｐ．Ｗａｕｔｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｗａｕｔｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７，９７−１０８（１９９７）
２６．Ｖａｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，２７５−２７８（１９９６）
２７．Ｍ．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ａ．Ｋｏｏｎｅｙ，Ｐ．Ｕｌｒｉｃｈ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７，１６２９−１６３２（１９８６）．
２８．Ｗｅ  ｔｈａｎｋ  Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ  ｆｏｒ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ａ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｓｍａｄ１，ａｎｄ  Ｙ．Ｔａｋｉｓｈｉｔａ  ｆｏｒ  ｈｉｓ  ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｅ  ａｌｓｏ  ｔｈａｎｋ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｕｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．
Ｓｕｐｐｒｏｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｒａｎｔ−ｉｎ  Ａｉｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｐｏｒｔｓ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ．
Ｓ１．Ｃ．Ｗ．Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１，９４３６−９４４０（１９９４）．
Ｓ２．Ｍ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｔｈｅ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ：ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖｉｅｗ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４５，３２０−３２７（１９９４）．
Ｓ３．Ｎ．Ｉｅｈａｒａ，Ｈ．Ｔａｋｅｏｋａ，Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｋｉｔａ，Ｔ．Ｄｏｉ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０，１１６６−１１７２（１９９６）．
Ｓ４．Ｐ．Ｄ．Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ａ．Ｕｔａｎｉ，Ｚ．Ｑ．Ｐａｎ，Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０，１１５４３−１１５４７（１９９３）．
Ｓ５．Ｒ．Ｘ．Ｌｕｏ，Ａ．Ａ．Ｐｏｓｔｉｇｏ，Ｄ．Ｃ．Ｄｅａｎ，Ｃｅｌｌ  ９２，４６３−４７３（１９９８）．
Ｓ６．Ｈ．Ａｂｅ，Ｎ．Ｉｅｈａｒａ，Ｋ．Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ，Ｔ．Ｋｉｔａ，Ｔ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２０８７４−２０８７８（１９９９）．
Ｓ７．Ｄ．Ｇ．Ａｈｎ，Ｍ．Ｊ．Ｋｏｕｒａｋｉｓ，Ｌ．Ａ．Ｒｏｈｄｅ，Ｌ．Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｒ．Ｋ．Ｈｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７，７５４−７５８（２００２）．
Ａ１．Ｆｏｇｏ  Ａ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９８９  Ｄｅｃ；９（４）：３２９−４２．
Ａ２．Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＬＪ，Ｄｏｉ  Ｔ，Ｅｌｌｉｏｔ  Ｓ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＧＥ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９８９  Ｄｅｃ；９（４）：３１８−２８．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ａ３．Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＪ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ  ２１：２７１−２８２，１９９５
Ａ４．Ｄｏｉ  Ｔ，Ｖｌａｓｓａｒａ  Ｈ，Ｋｉｒｓｔｅｉｎ  Ｍ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＧＥ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＬＪ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖｉａ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２８７３−２８７７，１９９２
Ａ５．Ｂａｒｎｅｓ  ＪＬ，Ｈｅｖｅｙ  ＫＡ．Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０  Ｍａｒ；６２（３）：３７９−８２．
Ａ６．Ｆｌｏｅｇｅ，Ｊ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｍ．Ｗ．，Ａｌｐｅｒｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｐｒｉｔｚｌ，Ｐ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｋ．，Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｒ．Ａ．，Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｃｏｕｓｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．：Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＤＧＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｍｎａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｏｄｅｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４１：２９７−３０９，１９９２
Ａ７．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｒａｉｎｅｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｆｌｏｅｇｅ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７５：１４１３−１４１６，１９９２
Ａ８．Ａｂｅ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｔ．，Ｉｅｈａｒａ，Ｎ．，Ｎａｇａｉ，Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｒａｉ，Ｈ．，Ｋｉｔａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｏｉ，Ｔ．Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｍａｄ１  ｕｎｄｅｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＡＧＥｓ）ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４
Ａ９．Ｙａｎｇ  Ｘ，Ｊｉ  Ｘ，Ｓｈｉ  Ｘ，Ｃａｏ  Ｘ．Ｓｍａｄ１  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｏｘｃ−８  ｉｎｄｕｃｅ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｊａｎ  １４；２７５（２）：１０６５−７２．
Ａ１０．Ｋａｔａｇｉｒｉ  Ｔ，Ｉｍａｄａ  Ｍ，Ｙａｎａｉ  Ｔ，Ｓｕｄａ  Ｔ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，Ｋａｍｉｊｏ  Ｒ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＢＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｉｄ１，ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００２  Ｓｅｐ；７（９）：９４９−６０．
Ａ１１．Ｌｉｕ  Ｚ，Ｓｈｉ  Ｗ，Ｊｉ  Ｘ，Ｓｕｎ  Ｃ，Ｊｅｅ  ＷＳ，Ｗｕ  Ｙ，Ｍａｏ  Ｚ，Ｎａｇｙ  ＴＲ，Ｌｉ  Ｑ，Ｃａｏ  Ｘ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ｓｍａｄ１  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｏｘ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｍａｒ  １９；２７９（１２）：１１３１３−９．
Ａ１２．Ｄｉｃｋ  Ａ，Ｒｉｓａｕ  Ｗ，Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｈ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ１  ａｎｄ  Ｓｍａｄ２  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｒｇａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．１９９８  Ａｐｒ；２１１（４）：２９３−３０５．
Ａ１３．Ｖｉｇｎａｉｓ  ＭＬ，Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ＨＢ，Ｗａｔｌｉｎｇ  Ｄ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＮＣ，Ｇｉｌｍａｎ  Ｍ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＪＡＫ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＴＡＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ａｐｒ；１６（４）：１７５９−６９．
Ａ１４．Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｍ，Ａｒａｋａｗａ  Ｈ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｎ，Ｈｉｓａｔｓｕｎｅ  Ｔ，Ｋａｗａｂａｔａ  Ｍ，Ｍｉｙａｚｏｎｏ  Ｋ，Ｔａｇａ  Ｔ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ＳＴＡＴ３−Ｓｍａｄ１  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｂｙ  ｐ３００．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９  Ａｐｒ  １６；２８４（５４１３）：４７９−８２．
Ａ１５．Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒ  Ｄ，Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ  Ｔ，Ｋｕｎｔｅｒ  Ｕ，Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  Ｍ，Ｋｒａｍｅｒ  ＨＪ，Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｏａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｓａｎｇｉｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １１：２３２−２４０，２０００
Ａ１６．Ｓａｎｏ  Ｈ，Ｓｕｄｏ  Ｔ，Ｙｏｋｏｄｅ  Ｍ，Ｍｕｒａｙａｍａ  Ｔ，Ｋａｔａｏｋａ  Ｈ，Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｎ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＳＩ，Ｋｉｔａ  Ｔ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１，１０３：２９５５−２９６０
Ａ１７．Ｓａｎｏ  Ｈ，Ｕｅｄａ  Ｙ，Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｎ，Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｇ，Ｄｏｉ  Ｔ，Ｋａｔａｏｋａ  Ｈ，Ｍｕｒａｙａｍａ  Ｔ，Ｘｕ  Ｙ，Ｓｕｄｏ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈ，Ｋｉｔａ  Ｔ，Ｙｏｋｏｄｅ  Ｍ：Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２，１６１：１３５−１４３．
Ａ１８．Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｋａｔｏ  Ｉ，Ｄｏｉ  Ｔ，Ｙｏｎｅｋｕｒａ  Ｈ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｍ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｓ，Ｓａｋｕｒａｉ  Ｓ，Ｔａｋａｓａｗａ  Ｓ，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ＲＡＧＥ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００１  Ｊｕｌ；１０８（２）：２６１−８．
Ａ１９．Ｍａｋｉｂａｙａｓｈｉ  Ｋ，Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｈｉｒａｔａ  Ｍ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｎ，Ｋｕｓａｎｏ  Ｋ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｓ，Ａｂｅ  Ｈ，Ｋｕｚｅ  Ｋ，Ｆｕｋａｔｓｕ  Ａ，Ｋｉｔａ  Ｔ，Ｄｏｉ  Ｔ．Ａ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ａｎａｌｏｇ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｏｎ  ｒａｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００１  Ｍａｙ；１５８（５）：１７３３−４１．Ｍａｋｉｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｔｅｍａｔｓｕ，Ｍ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｋｕｓａｎｏ，Ｋ．，Ｏｈａｓｈｉ，Ｓ．，Ａｂｅ，Ｈ．，Ｋｕｚｅ，Ｋ．，Ｆｕｋａｔｓｕ，Ａ．，Ｋｉｔａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｏｉ，Ｔ．（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５８，１７３３−１７４１
Ａ２０．Ｎａｇａｉ  Ｋ，Ａｒａｉ  Ｈ，Ｙａｎａｇｉｔａ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｔ，Ｋａｎａｍｏｒｉ  Ｈ，Ｎａｋａｎｏ  Ｔ，Ｉｅｈａｒａ  Ｎ，Ｆｕｋａｔｓｕ  Ａ，Ｋｉｔａ  Ｔ，Ｄｏｉ  Ｔ：Ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ６  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：１８２２９−１８２３４：２００３
Ａ２１．Ｄａｖｉｅｓ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ：ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖｉｅｗ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９４  Ｆｅｂ；４５（２）：３２０−７．
Ａ２２．Ｓｔｒｉｋｅｒ  Ｇ  Ｅ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  Ｌ．Ｊ：Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，１９８５  ５３：１２２−１３１
Ａ２３．Ｂｒｏｍｂｅｒｇ  ＪＦ，Ｈｏｒｖａｔｈ  ＣＭ，Ｂｅｓｓｅｒ  Ｄ，Ｌａｔｈｅｍ  ＷＷ，Ｄａｒｎｅｌｌ  ＪＥ  Ｊｒ．Ｓｔａｔ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖ−ｓｒｃ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｍａｙ；１８（５）：２５５３−８．
Ａ２４．Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  Ｃ，Ｄａｒｎｅｌｌ  ＪＥ  Ｊｒ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ：ｔｈｅ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ  ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５；６４：６２１−５１．
Ａ２５．Ｋｌａｈｒ  Ｓ，Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ  Ｇ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｉ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８８  Ｊｕｎ  ２３；３１８（２５）：１６５７−６６．
Ａ２６．Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＬＪ，Ｄｏｉ  Ｔ，Ｅｌｌｉｏｔ  Ｓ，Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＧＥ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９８９  Ｄｅｃ；９（４）：３１８−２８．
Ａ２７．Ｏｌｓｏｎ  ＪＬ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｍａｓｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９８４  Ｆｅｂ；２５（２）：３７６−８２．
Ａ２８．Ｓｈｕｌｔｚ  ＰＪ，ＤｉＣｏｒｌｅｔｏ  ＰＥ，Ｓｉｌｖｅｒ  ＢＪ，Ａｂｂｏｕｄ  ＨＥ．Ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＤＧＦ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＰＤＧＦ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８  Ｏｃｔ；２５５（４  Ｐｔ  ２）：Ｆ６７４−８４．
Ａ２９．Ａｂｂｏｕｄ  ＨＥ，Ｐｏｐｔｉｃ  Ｅ，ＤｉＣｏｒｌｅｔｏ  Ｐ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｒａｔ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７  Ｓｅｐ；８０（３）：６７５−８３．
Ａ３０．Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ＧＧ，Ｍａｒｒａ  Ｆ，Ｋｉｙｏｍｏｔｏ  Ｈ，Ａｂｂｏｕｄ  ＨＥ．ＰＤＧＦ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９６  Ｊａｎ；４９（１）：１９−２５．
Ａ３１．Ｖｉｇｎａｉｓ  ＭＬ，Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ＨＢ，Ｗａｔｌｉｎｇ  Ｄ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＮＣ，Ｇｉｌｍａｎ  Ｍ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＪＡＫ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＴＡＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ａｐｒ；１６（４）：１７５９−６９．
Ａ３２．Ｍｅｌｏｃｈｅ  Ｓ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｓ，Ｓｅｒｖａｎｔ  ＭＪ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ａｎｄ  Ｊａｋ／ＳＴＡＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００  Ｓｅｐ；２１２（１−２）：９９−１０９．
Ａ３３．Ｙａｎａｇｉｔａ  Ｍ，Ａｒａｉ  Ｈ，Ｎａｋａｎｏ  Ｔ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｋ，Ｆｕｋａｔｓｕ  Ａ，Ｄｏｉ  Ｔ，Ｋｉｔａ  Ｔ．Ｇａｓ６  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｌａｔｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＳＴＡＴ３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｎｏｖ  ９；２７６（４５）：４２３６４−９．
Ａ３４．Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＪ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｋ，Ｉｉｄａ  Ｈ，Ｐｒｉｔｚｌ  Ｐ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｃ，Ａｌｐｅｒｓ  ＣＥ，Ｃｏｕｓｅｒ  ＷＧ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９１  Ｓｅｐ；４０（３）：４７７−８８．
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８９】  本発明により、ＩＶ型コラーゲンの過剰産生に直接関わっている物質としてＳｍａｄ１が同定され、Ｓｍａｄ１が糖尿病性腎症の病因として決定的な役割を持つことが示された。これにより、糖尿病性腎症の検出が可能となり、さらに、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療剤、細胞外マトリックスの増殖を阻害する薬剤、α１ＩＶ型コラーゲンの発現を抑制する薬剤が提供された。また、本発明により、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットが提供された。
また、本発明により、ＳＴＡＴ３とＳｍａｄ１の活性化が進行性の糸球体障害時の２つの現象、細胞増殖と糸球体硬化の相互作用を調節する鍵となるパスウェイにある事が示された。これにより、硬化をもたらす増殖性疾患の検出が可能となり、さらに、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療剤、細胞外マトリックスの増殖を阻害する薬剤、α１ＩＶ型コラーゲンの発現を抑制する薬剤が提供された。また、本発明により、硬化をもたらす増殖性疾患の予防及び／又は治療に有効な物質を同定する方法及びキット、細胞外マトリックスの増殖阻害に有効な物質を同定する方法及びキット、ならびにα１ＩＶ型コラーゲンの発現抑制に有効な物質を同定する方法及びキットが提供された。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】    ＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒト由来のＳｍａｄ１のｍＲＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒト由来のＡＬＫ１のｍＲＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒト由来のＢＭＰ２のｍＲＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒト由来のＢＭＰ４のｍＲＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、Ｓｍａｄ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、Ｓｍａｄ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、ＡＬＫ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、ＡＬＫ１のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、ＢＭＰ２のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ＢＭＰ２のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、ＢＭＰ４のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、ＢＭＰ４のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、Ｓｍａｄ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、マウス由来Ｃｏｌ４遺伝子の２７ｂｐのタンデムリピート配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙに使用した５’側のプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、ＣｈＩＰ  ａｓｓａｙに使用した３’側のプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙに使用したプローブの塩基配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、ヒト由来のＳＴＡＴ３のｍＲＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、ヒト由来のＡＬＫ３のｍＲＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、ヒト由来のＳＴＡＴ３のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、ヒト由来のＳＴＡＴ３のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、ヒト由来のＡＬＫ３のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、ヒト由来のＡＬＫ３のｍＲＮＡを特異的に増幅するＲＴ−ＰＣＲに用いるリバースプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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