(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたアンサミトシンの製法であって、
ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し；
ｂ．その培地を処理してアンサミトシンの溶媒抽出を容易にし；
ｃ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し；
ｄ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し；
ｅ．結晶化によりアンサミトシンを精製する
工程を含む、方法であって、該方法が濾過工程を含まない方法。
【請求項２】
精製されたアンサミトシンの製法であって、
ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し；
ｂ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し；
ｃ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し；
ｄ．結晶化によりアンサミトシンを精製する
工程を含む、方法であって、該方法が濾過工程を含まない方法。
【請求項３】
アンサミトシン産生微生物がアクチノシンネマ種である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
アクチノシンネマ種がアクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１５６５である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
アクチノシンネマ種がアクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１２８１である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
上記した処理が約７５℃で加熱することである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
溶媒がトルエンである、請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
トルエンの熱処理した培地に対する割合が約１：１である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抽出温度が約４５℃である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
溶媒がキシレンである、請求項１または２記載の方法。
【請求項１１】
キシレンの熱処理した培地に対する割合が約１：１である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抽出温度が約４５℃である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アンサミトシンが還元的切断を受けてマイタンシノールを形成することができるアシル化アンサミトシンを含む、請求項１または２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はアンサミトシン、特にマイタンシノールに変換することができるアンサミトシンの製法に関する。
【０００２】
（従来技術）
米国特許第５２０８０２０号には、細胞毒性の高いマイタンシノイド薬およびその治療用途が記載されている。これらの薬物はアクチノシンネマ（Actinosynnema）などの微生物を発酵させることで産生されるアンサミトシン先駆体から調製することができる。
アクチノシンネマ・プレチオサム（Actinosynnema pretiosum）などのアクチノシンネマ種は、所定の培養条件下で、多くの関連するアンサミトシンを産生する。主たる産物はＣ−３位にイソブチリル基を有するアンサミトシンＰ−３である。Ｃ−３アシル側鎖においてのみ異なる他のアンサミトシン、Ｐ−１（エチオニル基）、Ｐ−２（プロピオニル基）、Ｐ−３’（ブチリル基）、Ｐ−４（イソバレリル基）およびＰ−４’（バレリル基）も、副産物として産生される。これらの化合物はすべて還元的切断を受けて共通の産物であるマイタンシノール（形態Ｐ−０）を産生する。加えて、その分子の別の部位が修飾されている（ヒドロキシル化または脱メチル化されている）他の多くのアンサミトシンも低レベルで産生される。これらは脱アシル化で所望のＰ−０を産生しない。
【０００３】
アクチノシンネマ種からアンサミトシンＰ−３を産生する方法は、米国特許第４１６２９４０号；第４２２８２３９号；第４３５６２６５号；および第４４５０２３４号に記載されている。一般に、これらの方法は、濾過助剤および水混和性溶媒を全発酵ブロスに加え、固体を除去し、水性フラクションを水不混和性溶媒で抽出し、濃縮し、石油エーテルを用いて沈殿させ、その沈殿物をシリカクロマトグラフィーを用いて精製し、結晶化させ、つづいてさらにクロマトグラフィーまたは再結晶に付す必要がある。別法はシリカクロマトグラフィーの代わりにダイアイオンＨＰ−１０吸着を利用し、つづいてさらに溶媒抽出および結晶化を行う。
これらの方法により、アンサミトシンＰ−３を許容される収率で得ることができるが、特にアンサミトシン化合物は極めて毒性であり、該工程に従事している者の安全を確保する必要があるため、該方法は大規模な生産工程において多くの制限のある段階を含むこととなる。かくして、多少の制限を含む段階を利用するとしても、より安全な別の利用可能な方法に対する要求がある。
【０００４】
（発明の開示）
本発明の一の態様は、精製されたアンサミトシンの製法であって、
ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し；
ｂ．その培地を処理してアンサミトシンの溶媒抽出を容易にし；
ｃ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し；
ｄ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し；
ｅ．結晶化によりアンサミトシンを精製する
工程を含む、方法にある。
本発明のもう一つ別の態様は、精製されたアンサミトシンの製法であって、
ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し；
ｂ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し；
ｃ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し；
ｄ．結晶化によりアンサミトシンを精製する
工程を含む、方法にある。
【０００５】
本明細書中に引用されている、限定されるものではないが、特許および特許出願を含むすべての刊行物を、たとえ本発明が十分に開示されているとしても、その出典を明示することにより本明細書の一部とする。
濾過工程のない、精製されたアンサミトシンを調製する方法が提供される。該方法は、アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し、その培地を処理してアンサミトシンを微生物から培地中に放出させ、それにより溶媒抽出を促進させ、芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその処理培地から抽出し、抽出されたアンサミトシンを濃縮し、結晶化によりアンサミトシンを精製する、工程を含む。また、処理工程を省くこともできる。
精製されたアンサミトシンはマイタンシノールに還元することができ、それはアンサミトシンＰ−３、Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３’、Ｐ−４およびＰ−４’を包含する。精製されたアンサミトシンは分子中の別の部位が修飾された望ましくないアンサミトシンを極めて低いレベルで含有するだけである。アンサミトシン産生微生物はアクチノシンネマ種（Actinosynnema spp．）であることが好ましい。アクチノシンネマ・プレチオサム（Actinosynnema pretiosum）ＡＴＣＣ３１５６５であることが特に好ましい。アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１２８１であることも好ましい。微生物は、米国特許第４４５０２３４号に開示される方法のような、当業者に周知の発酵培養技法により増殖させることができる。
【０００６】
本発明の方法の一の具体例は、微生物の処理を用いて、細胞内のアンサミトシンの放出を助け、細胞結合したアンサミトシンを溶媒抽出に対してより敏感にすることである。例えば、処理方法として、音波、高圧または高温処理が挙げられる。好ましくは、その処理は熱処理である。その熱処理は約６０℃ないし約８０℃で行うことができる。好ましくは熱処理工程を、微生物が死滅し、アンサミトシンの溶媒抽出を容易にする、約７５℃で行う。もう一つ別の具体例においては、全体の約６０％のアンサミトシンを培地中に見つけることができるため、抽出前に処理工程を用いないものである。
【０００７】
アンサミトシンは芳香族炭化水素溶媒を用いて培地から抽出することができる。芳香族炭化水素は他のブロス成分に比べてアンサミトシンに対して特に選択性を有し、純粋な生成物を単離するのに、下流において簡単な工程を必要とするだけである。好ましくは、芳香族炭化水素溶媒はトルエンまたはキシレンである。これは低温蒸発の影響を受けやすいため、トルエンが特に好ましい。トルエンおよびキシレンの特性は、機械的分離を必要とせず溶媒および水層が重力で容易に分離することであり、したがって含有量が大きな工程で利用することができ、従事者のより高い安全性が得られる。抽出は約２０℃ないし約６０℃で行うことができる。好ましくは、抽出を約４５℃で行う。抽出前の水性溶液のｐHは３ないし９の範囲内になければならない。好ましくは、そのｐHは中性付近、すなわち、ｐH６ないし８である。
【０００８】
抽出は、一般に、溶媒が全ブロスに対して等容量（１：１）であることが好ましい。２：１ないし１：４の別の比率を用いることもできる。該溶液は、一般に、ゆっくりと攪拌しながら混合され、約＞８０％のアンサミトシンが有機層中に抽出されるまで混合物を攪拌する。該混合物は１５℃ないし５０℃の温度で重力下で放置することが好ましい。放置する好ましい温度は約４５℃である。
有機層を取りだし、溶媒の容量の減少による抽出液の濃縮を、真空下で、または当業者に周知の他の方法により行ってもよい。容量が減少した後、濃縮した抽出液を所望により極性溶媒、例えば、メタノールに溶かしてもよく、ＰＴＦＥなどの膜フィルターまたはシリカもしくはアルミナなどの厚みのあるフィルターを用いて浄化してもよい。
【０００９】
望ましくないアンサミトシンのレベルを減少させることにより、所望のアンサミトシン、特にＰ−３を精製するのに、結晶化操作を利用する。結晶化に用いる好ましい溶媒混合液は酢酸エチルとヘプタンである。結晶化のための固体の溶解を助成するために、少量のメタノールまたは類似する極性溶媒を酢酸エチルを添加する前に加え、ついで所望により攪拌および冷却しながら多量のヘプタンを用いて処理し、結晶化した生成物を得る。同じ操作に従って生成物を再結晶してもよい。
別法として、結晶化の前に、発酵ブロスから抽出された不純なアンサミトシンをシリカゲルを用いて、例えば、溶媒抽出液の溶液をセライト床を介することにより精製してもよい。クロマトグラフィーに用いる溶媒はトルエンおよびトルエン−メタノール混合液であってもよい。当業者に知られている別の溶媒を用いることもできる。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクションをプールし、減圧下で濃縮する。
【００１０】
ＨＰＬＣによるアンサミトシンの分析方法も提供される。該方法によりアンサミトシンＰ−３の定量およびアンサミトシン比の分析が行われる。これらの方法を下記の実施例において用いた。
ブロスおよび抽出サンプル中のアンサミトシンＰ−３の定量は、１０ｍｍガードカラムを用いて、Ｃ１９ウォーターＱスフェリソルブＳ５ ＯＤＳ２カラム、４．６ｘ２５０ｍｍで測定することができる。ＵＶ検出は２５２ｎｍおよび２０５ｎｍで行う。１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中６０％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）のイソクラティック移動相および２０μｌの注入容量を用いる。
下流の工程サンプル中のアンサミトシン比の分析は、ガードカラムなしで、Ｃ８ウォーターシンメトリーシールドカラム、３．９ｘ１５０ｍｍで測定することができる。ＵＶ検出は２５２ｎｍおよび２０５ｎｍで行う。４０℃で１０分間の平衡処理に付し、３０分間にわたる１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中３５−４５％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）の勾配移動相および１０μｌの注入容量を用いる。
【００１１】
クロマトグラフィーフラクションおよび最終生成物中のアンサミトシン比の分析は、ガードカラムなしで、ＬＣ−ＭＳ検出系、常圧電子噴射イオン化、＋ｖｅイオンモードを備えたＣ８ウォーターシンメトリーシールドカラム、３．９ｘ１５０ｍｍを用いて測定することができる。ピークを明確に同定するために３０Ｖ円錐状電圧質量検出をフルスキャンＭＳ（quad１で６００−７００ａｍｕをスキャン）で行う。アンサミトシンの種類を決定するためのＭＳ−ＭＳ分画化を同じ勾配系を用いて行う。４０℃で１０分間の平衡処理に付し、３０分間にわたる１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中３５−４５％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）の勾配移動相および１０μｌの注入容量を用いる。
高感度を必要とする除去液中のアンサミトシンＰ−３および低レベルのサンプルの定量を、１０ｍｍガードカラムおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳ常圧電子噴射イオン化検出系、＋ｖｅイオンモード、３０Ｖ円錐状電圧を用いて、Ｃ１８ウォーターＱスフェリソルブＳ５ ＯＤＳ２カラム、４．６ｘ２５０ｍｍで測定することができる。構造型を測定するために、主たる種類の分子イオンを選択し、分画パターンを観察し、５４７イオンが優勢であればＮ−メチル化であり、５３３イオンが優勢であればＮ−脱メチル化である。１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中６０％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）のイソクラティック移動相および２０μｌの注入容量を用いる。
【００１２】
本発明の方法を用いて、腫瘍活性化プロドラッグとして有用である、細胞結合剤／マイタンシノイド複合体を製造することができる。本発明の方法により調製されたアンサミトシンは還元的切断を受け、米国特許第５２０８０２０号に記載されているように、マイタンシノイド誘導体を含有するＮ−メチル−Ｌ−アラニンを製造するのに用いることができる、マイタンシノールとすることができる。ついで、これらの誘導体を、ジスルフィド結合などの種々のリンカーを介して、細胞結合剤、好ましくは抗体と接合させる。
一例としての細胞結合剤／マイタンシノイド複合体は、以下の工程：
（１）本発明の方法により調製されたアンサミトシンをマイタンシノールに還元し；
（２）マイタンシノールをＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体でエステル化してジスルフィド含有のマイタンシノイドエステルを形成し；
（３）工程（２）で調製されたジスルフィド含有のマイタンシノイドエステルをチオール含有のマイタンシノイドに還元し；
（４）ジチオピリジル基を細胞結合剤に導入し；および
（５）工程（３）で産生したチオール含有のマイタンシノイドを工程（４）のジチオピリジル細胞結合基にジスルフィド結合により結合させる
ことを含む方法により調製することができる。
【００１３】
本発明を次の具体的な、限定するものではない、実施例を参考にして説明する。
実施例１
アクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製
産生菌アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１５６５を含有する３７Ｌの全ブロス（アンサミトシンＰ−３の力価、８６．３ｍｇ／Ｌ）を７５℃で６０分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミトシンの溶媒抽出を容易にした。４０Ｌのトルエンを加え、その混合物を４５℃に加温した。上相のトルエンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または相が完全に均一とならないように、相を攪拌した。抽出を１６時間以内に終え、重力下、２時間以内に分離が生じた。
８０ｍｇ／ＬのＰ−３を含有する３９Ｌのトルエンをサイホンにより回収し、２０Ｌのロータリーエバポレーター（浴温度４０−４５℃、速度約９Ｌ／時間）を用いて蒸発させた。蒸発後に、３．１ｇのＰ−３（２７．６％ｗ／ｗ）を含有する１１．２ｇの移動油を得た。トルエンに溶かし、再び蒸発させることで得られた抽出物をフラスコに移した。（抽出段階の収率＝９７％）
その抽出物を１２０ｍｌのトルエンに溶かし、３７５ｍｌのトルエン（３ｂｖ）のシリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエンをパックした１２５ｍｌの床容量、４ｃｍ径ｘ１０ｃｍ）にローディングした。該カラムを２ｂｖのトルエンで洗浄し、ついで４ｘ２ｂｖのトルエン中２％ＭｅＯＨで溶出し、つづいて１２ｘ１ｂｖのトルエン中４％ＭｅＯＨで溶出した。該カラムを４０ｍｌ／分で溶出し、有色のタイトなバンドを得た。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクション７−１０をまとめ、蒸発させて、Ｐ−３を２．５ｇ含有する油状固体３．２ｇを得た。この物質をＬＣ−ＭＳおよびＭＳ−ＭＳで分析した。
【００１４】
この段階で、該生成物は８５．１％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９３．９％の所望のアンサミトシンを含有した（カラム段階収率＝８０．６％）。
シリカカラムからの生成物を４０℃に加温した２００ｍＬのＥｔＯＡｃに溶かした。ヘプタン（２００ｍＬ）を加え、該溶液を冷却した。該溶液に１ｍｇの純粋なＰ−３結晶を接種した（結晶化はまたフラスコの他の部位でも同時に起った）。外界温度で４時間経過後、上澄をＨＰＬＣにより分析し、０．８ｇのＰ−３（３０％）がまだ溶液中にあると測定された。さらにヘプタン（１５０ｍｌ）を加え、該フラスコをさらに３時間放置して、再び分析した。この分析は０．４ｇのＰ−３（１６％）が溶液中に残っていることを示した。該フラスコを4℃で一夜放置した。その後の分析で、わずかに７０ｍｇのＰ−３（３％）だけが溶液中に残っていることがかわった。焼結フィルターラインアセンブリーを用いて吸引して、母液を除去した。白色針状晶をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（１：３）（２ｘ１５ｍｌ）で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中、３０℃で１０時間、真空下で系内乾燥に付した。２．５ｇの結晶を得た（結晶化収率＝８６％）。
最終生成物は８６％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９８．４％の所望のアシル化アンサミトシン（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−３’、Ｐ−４、Ｐ−４’）を含有した。
【００１５】
実施例２
アクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製
産生菌アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１５６５を含有する１１００Ｌの全ブロス（アンサミトシンＰ−３の力価、７５．１ｍｇ／Ｌ、８２．６ｇのＰ−３）を７５℃で６０分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミトシンの溶媒抽出を容易にした。加熱死滅工程の後に、７７．６ｇのＰ−３が残った。予め４５℃に加温した等容量のトルエンを加え、その混合物を４５℃に維持した。上相のトルエンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または相が完全に均一とならないように、相を攪拌した。抽出を４５時間行い、つづいて重力下で３０分以内に分離が生じた。（抽出段階の収率＝９０．３％）。
アンサミトシン含有の１１２７Ｌのトルエン抽出物を流下フィルムエバポレーター（ＦＦＥ）を用いて２２Ｌに濃縮した。その濃縮物を５０Ｌのロータリーエバポレーターに移し、低容量にまで蒸発させた（蒸留速度１４．６Ｌ／時間）。ＦＦＥを２ｘ２Ｌのトルエンですすぎ、そのリンス液を該エバポレーターに通し、生成物を完全に移した。その濃縮物を蒸発乾固させた。
【００１６】
その乾燥抽出物を７．２Ｌのトルエン中４％メタノールに溶かし、シリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエン中４％メタノールをパックした４．８Ｌの床容量、１５．０ｃｍ径ｘ２７．０ｃｍ、ローディング速度１２０ｍＬ／分）にローディングした。該カラムを、トルエン中４％メタノールを用い、２２７−３８４ｍＬ／分の流速でイソクラティックに溶出させ、有色のタイトなバンドを得た。最初のフラクションは１床容量であった；フラクション３ないし６は１／２床容量で集めた。フラクションをＴＬＣ（キーゼルゲル６０ Ｆ２５４プレート、ジクロロメタン中５％メタノールで操作、２５４ｎｍでＵＶにより可視化）によりモニターし、アンサミトシンを含有するフラクションをＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳでモニターした。結晶化のためのフラクションの選択はフラクションのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ分析に基づいており、アンサミトシンＰ−３回収を最適化し、望ましくないアンサミトシンを最小とした。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクション５ないし１０をまとめ、蒸発させて、Ｐ−３を５４．６ｇ含有する固体を得た。この段階で、該生成物は７７．１％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９６．１％の所望のアンサミトシンを含有した（カラム段階の収率＝９２．５％）。
【００１７】
シリカカラムからの生成物を予め４６℃に加温した９１ｍＬのメタノールに溶かし、つづいて同じ温度に加温した５４６ｍｌの酢酸エチルに溶かした。さらにメタノールのアリコートを加え、固体の溶解を助成した。合計１６６ｍＬのメタノールを該混合物に加えた。５０℃に加温したヘプタン（１００ｍＬ）を最初の混濁の徴候のあるまで加え、ついで結晶化が生じるように、溶液を外界温度に冷却した。４時間後、さらに１３２４ｍＬのヘプタン（外界温度）を加えた。上澄をＨＰＬＣで分析し、６．６ｇのＰ−３がまだ溶液中にあると測定された。混合物を氷冷し、さらなるアリコートのヘプタン（２００および４００ｍＬ）を３．９ｇのＰ−３（６．８％）が母液中に残るまで加えた。焼結フィルターラインアセンブリーを用いて吸引して、母液を除去した。結晶をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（１：３）（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中、３０℃で８８．５時間、最初は低真空下、つづいて高真空下（１．０−１．３ミリバール）で系内乾燥に付した。７６．４ｇの結晶を得た。
最終生成物は７４．５％のアンサミトシンＰ−３（５６．９ｇ）を含有し、合計９７．８％の所望のアシル化アンサミトシンを含有した（全収率＝６９％）。
【００１８】
実施例３
シリカクロマトグラフィーおよびアンサミトシンの結晶化
６４．８ｍｇ／Lの力価のアンサミトシンＰ−３を含む１００８Lのアクチノシンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例１に記載されるように、熱処理し、トルエンで抽出して蒸発させた。
３４．５ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する濃縮物を３Ｌのトルエンに溶かし、シリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエンをパックした３．０Ｌの床容量、１３．８ｃｍ径ｘ１６．６ｃｍ）にローディングした。該カラムを４ｃｍの砂床で頂部を覆った。該カラムを５Ｌのトルエンで洗浄し、つづいて２０Ｌのトルエン中２％ＭｅＯＨで洗浄し、それを５Ｌのフラクションで集めた。ついで、該カラムをトルエン中４％ＭｅＯＨで溶出し、２．５Ｌのフラクションで集めた。アンサミトシンはフラクション９ないし１５で溶出した。結晶化のためにフラクションの選択はフラクションのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ分析を基礎とし、アンサミトシンＰ−３回収を最適とし、望ましくないアンサミトシンを最小とした。フラクション１０ないし１２をまとめ、蒸発乾固させて、３２．５ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する油を得た。
この段階の生成物は９１．８％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９５．３％の望ましいアシル化アンサミトシンを含有した（カラム段階の収率＝９４．２％）。
【００１９】
まとめたシリカフラクションからの濃縮物を５０℃の水浴中で加温し、最小容量の加温メタノール／酢酸エチル（５０℃）に溶かした。まず、６０ｍＬのメタノールを加え、つづいて３００ｍＬの酢酸エチルをゆっくりと添加した。さらに２００ｍＬの温メタノールを添加し、その時点で濃縮物は完全に溶解した。２００ｍＬの温ヘプタン（５０℃）を加え、水浴を結晶化溶液から取り外した。結晶化が始まり、総容量８００ｍＬのヘプタンが添加されるまで、さらにヘプタンを２００ｍＬのアリコートで添加した。その混合物を氷浴中で１８時間冷却した。母液をＨＰＬＣ分析に付すことで結晶化をモニターした。１８時間の時点で、６．３％のアンサミトシンＰ−３が母液中に残っていた。さらに２００ｍＬのヘプタンを添加し、混合物をさらに５時間冷却した。ＨＰＬＣ分析は４．０％のアンサミトシンが母液中に残っていることを示した。
暗褐色母液を吸引することで結晶を回収した。該結晶を５０ｍｌのヘプタン：酢酸エチル（３：１）で３回洗浄し、真空下（０．８ミリバール）で一夜乾燥させた。該結晶は２８．２ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する均一な細かい灰白色針状晶であった。（結晶化段階の回収率＝８６．９％）
最終生成物は９３．１％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９８．４％の望ましいアシル化アンサミトシンを含有した。
【００２０】
実施例４
アンサミトシンのトルエン抽出液からの精製および結晶化
７４．５ｍｇ／Lの力価のアンサミトシンＰ−３を含む１００１Lのアクチノシンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例１に記載されるように、熱処理し、トルエンで抽出して蒸発させ、５４．７ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する９．５Ｌの濃縮抽出物を得た。
その濃縮物を４５℃に加熱し、１４．５Ｌのヘプタンを３３分間にわたって添加し、アンサミトシンを沈殿させた。その混合物を氷冷した。さらに５Ｌのヘプタンを加え、混合物を一夜放置した。吸引により母液を取りだし、沈殿物をトルエン：ヘプタン（１：１）で洗浄した。ＨＰＬＣ分析は母液が６．５％のアンサミトシンＰ−３を含有することを、そして洗液が１．８％のＰ−３を含有することを示した。沈殿物を２Ｌのメタノールに溶かし、０．２ミクロンフィルターを介して濾過した。
【００２１】
そのメタノール溶液を蒸発乾固させ、５０℃の８５ｍＬのメタノールに再び溶かした。５１０ｍＬの酢酸エチルを該溶液に溶かし、つづいて２００ｍＬのヘプタンを添加した。該混合物を外界温度にまで冷却し、結晶化が始まるように、さらに９００ｍＬのヘプタンをゆっくりと添加した。４．１４ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残った。さらに４００ｍＬのヘプタンを添加し、混合物を氷冷した。２．７ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残った。
吸引により母液を取りだし、結晶を５０℃の１１０ｍＬのメタノールおよび５２０ｍＬの酢酸エチルに溶かした。ヘプタンを２回の７５ｍＬのアリコートにて添加し、その混合物を外界温度にまで冷却し、別の９００ｍＬを加えた。さらに４００ｍＬのヘプタンを加え、混合物を氷冷し、結晶化させるのに一夜放置した。ＨＰＬＣ分析は２．３ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残っていることを示した。その母液を吸引により取りだし、結晶をヘプタン：酢酸エチル（３：１）で洗浄し、真空下（０．６ミリバール）で一夜乾燥させた。４７．８ｇの結晶は８４．３％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９７．０％の望ましいアシル化アンサミトシンを含有した。
【００２２】
実施例５
キシレンを用いるアクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製
４４μｇ／ｍｌの力価のアンサミトシンＰ−３を含む、熱処理した２２０ｍＬのアクチノシンネマ・プレチオサムを４５℃の水浴中に置き、等容量のキシレンを加えた。キシレンの渦巻きが下相ブロスに引き込まれるが、エマルジョンを形成しないように、相を混合した。２０時間後には、６４％のアンサミトシンＰ−３がキシレン相に抽出された。
重力で混合物を分離し、１７０ｍＬのキシレンを取り出した。キシレン抽出液を蒸発乾固させた。キシレン抽出物をシリカクロマトグラフィーを用いて精製した。抽出物を２ｍＬのトルエン中４％メタノールに溶かしてローディングし、同じ溶媒混合液を用いて溶出させた。フラクション（０．５ｍＬ）を集め、ＴＬＣ（キーゼルゲル６０Ｆ２５４プレートをジクロロメタン：メタノール（２０：１）中で取り扱う）でアッセイした。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクションを上記した実施例に記載の操作を用いて結晶化させた。その結晶性生成物は、色相および純度の点で、発酵ブロスをトルエン抽出することで得られたものに匹敵する特性であった。
【００２３】
本発明はその精神または本質的な属性から逸脱することなく他の特定の形態にて具現化することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとして、明細書の記載よりもむしろ特許請求の範囲を参考とすべきである。