(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス細胞における長期の副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）接触応答を改変することができる化合物の同定方法であって、
ａ）該細胞を化合物の存在下もしくは非存在下でＣＲＨと接触させる工程、
ｂ）該細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定する工程、および
ｃ）該化合物の存在下と非存在下での該タンパク質の量を比較する工程を含んでなり、かつ、
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列からなる、上記方法。
【請求項２】
マウス細胞がマウス下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系ＡｔＴ−２０である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号２０のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を用いて決定される請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定される請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子転写のレベルが、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ技術を用いて分析される請求項４もしくは５に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子転写のレベルが、配列番号２０のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子転写のレベルが、配列番号１９の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、鬱病の治療および診断に関する。特に、本発明はポリペプチドならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンへの細胞性応答を媒介することにおいて中心的役割を果たすことが示されている。これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、鬱病の診断、処置および／もしくは予防において有用である。
【背景技術】
【０００２】
最近の社会経済分析により、鬱病は身体障害の主要原因且つ他の疾患の発症の主要危険因子であることが見出された。さらに、世界的規模で鬱病は過少診断され、そして過少治療されている。現在の抗鬱剤は有効であることが判明しているが、作用の遅い発現および副作用を抱える。この上に、どの薬理学的作用機序によりそれらがその臨床効果を及ぼすかはまだ明らかではない。鬱病のコルチコステロイド受容体仮説に基づく仮説駆動研究は、薬剤標的として脳神経ペプチド受容体、特に副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）受容体に焦点を当てる新しい概念をもたらしている。
【０００３】
４１アミノ酸ポリペプチドの副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）は、視床下部−下垂体−副腎系の調節において中心的役割を果たし、様々なストレス因子への内分泌応答を媒介する。視床下部ニューロンはストレスに応答してＣＲＨを下垂体門脈系に放出し、下垂体アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）の分泌および生合成を刺激し、増加した副腎グルココルチコイド生産をもたらす（非特許文献１）。いくつかの臨床および前臨床研究は、鬱病の発症におけるＣＲＨ系の改変の因果的役割を提示する（非特許文献２）。ヒトにおけるＣＲＨでの最初の研究は、ＣＲＨへのＡＣＴＨ応答が鬱病患者において鈍化しており、常に増加した視床下部ＣＲＨ分泌に伴うＣＲＨ受容体脱感作を反映することを示した（非特許文献３；非特許文献４）。増加したＣＲＨ放出の結果としての鈍化したＡＣＴＨ応答の裏づけとして、鬱病にかかっている患者の脳脊髄液における上昇したＣＲＨレベルの結果がある。鬱状態におけるＣＲＨ分泌過多のこの概念を強化する他の結果は、鬱病を患った自殺犠牲者における増加したＣＲＨ分泌ニューロン数および減少したＣＲＨ受容体数である（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００４】
ＣＲＨには２つの高親和性受容体が記述されており（ＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２）、これらの両方ともいくつかのスプライスバリアント形態で存在する。ＣＲＨによるこれらの受容体の活性化は、アデニルシクラーゼのＧｓ媒介性刺激をもたらし、増加した細胞内ｃＡＭＰレベルを引き起こす。これはそれ自体がｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化し、そして最終的にｃＡＭＰおよびＣａ２＋の増加したサイトゾルレベルをもたらす。増加したｃＡＭＰおよびＣａ２＋レベルは、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫＩＩ）およびｐ４２／ｐ４４マイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）のようないくつかの他の追加のキナーゼの活性化をもたらす。結果としてＣａ２＋／ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）がリン酸化され、そしてこれは、今度は、プロモーター領域にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を含有する遺伝子の転写を調節する。ＣＲＨシグナリングの調節に関与することが示されているそのような遺伝子の例には、ｃ−ｆｏｓ、マクロファージ遊走阻止因子遺伝子Ｍｉｆ、オーファン核受容体Ｎｕｒｒ７７およびＮｕｒｒ１が包含される。
【０００５】
慢性下垂体−副腎活性化の動物モデルを開発するために、ＣＲＦ過剰発現マウス（ＣＲＦ−ＯＥ）が作製されている（非特許文献７）。これらのトランスジェニックマウスは、これらの動物におけるＣＲＦの広範囲の過剰発現の結果としてＡＣＴＨおよびコルチコステロンの生涯にわたる過剰生産に起因するクッシング様表現型を提示する。ストレスへの内分泌、自律および行動応答を媒介することにおける脳ＣＲＦの役割と一致して、ＣＲＦ−ＯＥマウスは高められた情動性の自発的状態を示し、ストレス因子に過剰反応性であり、そしてＣＲＦ受容体アンタゴニストの中枢投与は、これらの不安惹起様行動を取り消す（非特許文献８）。これらのＣＲＦ−ＯＥは、中枢神経系へのＣＲＦの長期効果の研究を可能にし、そして不安およびストレス関連行動の遺伝モデルとして用いられている。
【０００６】
ＣＲＨ活性化受容体の下流経路は詳細に研究されそしてシグナリングカスケードに関与する多数の遺伝子の同定をもたらしたことにもかかわらず、主要な領域は探究されていない。従って、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体活性化遺伝子ネットワークに関与するさらなる遺伝子を同定するために全ゲノムレベルでＣＲＨ刺激への転写応答を探究することは、本発明の目的であった。このようにして同定されるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、スクリーニング技術による薬剤標的として薬剤開発の新しい機会を提供し、または鬱病の診断、予防および／もしくは処置において有用である。
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ＥＢ  １９９５  Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０：７８９−８１９
【非特許文献２】Ｈｏｌｓｂｏｅｒ  Ｆ  ２００１  Ｓｔｒｅｓｓ，ｈｙｐｅｒｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ａｆｆｅｃｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  ６２：７７−９１
【非特許文献３】Ｈｏｌｓｂｏｅｒ，Ｆ，Ｇｅｒｋｅｎ  Ａ，Ｓｔａｌｌａ  ＧＫ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＯＡ  １９８７  Ｂｌｕｎｔｅｄ  ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ＡＣＴＨ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｈｕｍａｎ  ＣＲＨ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｃｈｉａｔｒｙ  １４４：２２９−２３１
【非特許文献４】Ｈｏｌｓｂｏｅｒ  Ｆ，Ｇｅｒｋｅｎ  Ａ，ｖｏｎ  Ｂａｒｄｅｌｅｂｅｎ  Ｕ，Ｇｒｉｍｍ  Ｗ，Ｂｅｙｅｒ  Ｈ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＯＡ，Ｓｔａｌｌａ  ＧＫ  １９８６  Ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２１：６０１−６１１
【非特許文献５】Ｎｅｍｅｒｏｆｆ  ＣＢ，Ｏｗｅｎｓ  ＭＪ，Ｂｉｓｓｅｔｔｅ  Ｇ，Ａｎｄｏｒｎ  ＡＣ，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｍ  １９８８  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｉｃｔｉｍｓ．Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４５：５７７−５７９
【非特許文献６】Ｒａａｄｓｈｅｅｒ  ＦＣ，Ｈｏｏｇｅｎｄｉｊｋ  ＷＪ，Ｓｔａｍ  ＦＣ，Ｔｉｌｄｅｒｓ  ＦＪ，Ｓｗａａｂ  ＤＦ  １９９４  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ６０：４３６−４４４
【非特許文献７】Ｓｔｅｎｚｅｌ−Ｐｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：３３７８−３３８６）
【非特許文献８】Ｓｔｅｎｚｅｌ−Ｐｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：２５７９−２５８４
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
ＣＲＨシグナリングとこれまで関連付けられていなかった、従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を調節する化合物を同定する方法においてもしくは個体におけるＣＲＨ誘発性鬱病を同定するための診断方法において有用である多数の遺伝子を提供することは本発明の目的である。
【０００８】
１つの態様として、細胞、特にマウス下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系ＡｔＴ−２０におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法は、該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させることおよび配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含んでなる。このスクリーニング方法において、発現レベルは、典型的には上記のポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、好ましくはアレイ技術方法を用いて評価される。従って、特定の態様として、本発明は細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を調節する化合物を同定する方法を提供し、該方法は、該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０の核酸配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含んでなり、ここで、これらの配列の発現プロファイルの変化は、該細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物の指標となる。
［発明の詳細な記述］
本明細書において用いる場合、「化合物」もしくは「因子」という用語は、単純なもしくは複雑な有機分子、ペプチド、タンパク質もしくはオリゴヌクレオチドのような生物学的もしくは化学的化合物を意味する。「試験化合物」は、本明細書において用いる場合、該化合物がＣＲＨシグナリング活性を調節するかどうかを評価するために本発明の方法において使用する「化合物」もしくは「因子」をさす。
【０００９】
「ＣＲＨシグナリング」は、本明細書において用いる場合、該細胞におけるＣＲＨによる副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体の活性化の後の遺伝子転写の細胞性変化をさす。従って、それはＣＲＨ特異的遺伝子発現プロファイルを誘導する。転写レベルでの変化は、タンパク質レベルでもしくは遺伝子、ＲＮＡレベルで評価することができる。
【００１０】
「ＣＲＨ応答活性」は、本明細書において用いる場合、一般に、ＣＲＨに該細胞をさらすことの結果としての検出可能な細胞パラメーターの変化をさす。検出可能な細胞パラメーターには、とりわけ、膜電位の変化、該細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節する酵素の酵素活性の変化、本発明のタンパク質の発現レベルの変化またはｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋もしくはＩＰ３のような二次メッセンジャーの量の変化が包含される。
【００１１】
「アナログ」もしくは「機能的アナログ」という用語は、該アナログがインビボおよび／もしくはインビトロで未改変の哺乳類プリンパーミアーゼと実質的に同じ生物学的活性を保持するように少なくとも１個のアミノ酸置換が行われている哺乳類プリンパーミアーゼの改変形態をさす。
【００１２】
「サンプル」もしくは「生物学的サンプル」は、本明細書において用いる場合、血液、尿、唾液、組織生検もしくは検視解剖材料からのような細胞、細胞抽出物、体液もしくは組織サンプルをさす。
【００１３】
「機能的アナログ」という用語には、本発明のポリペプチドの「フラグメント」、「バリアント」、「縮重バリアント」、「アナログ」および「ホモログ」もしくは「化学的誘導体」が包含されるものとする。ポリペプチドの有用な化学的誘導体は当該技術分野において周知であり、そして例えば、二次的化学要素（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）によるポリペプチド内に含まれる反応性有機部位の共有結合修飾が包含される。周知の架橋試薬は、例えば、ビオチン、蛍光色素のようなアフィニティータグを導入するために、もしくはポリペプチドを固相表面に結合するために（例えばアフィニティー樹脂を作製するために）アミノ、カルボキシルもしくはアルデヒド残基に反応させるのに有用である。
【００１４】
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのバリアント（１つもしくは複数）は、該用語を本明細書において用いる場合、それぞれ、基準ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと異なるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドである。ポリヌクレオチドのバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントのような天然に存在するバリアントであることができ、もしくはそれは天然に存在することが知られていないバリアントであることができる。（１）ヌクレオチド配列が別の基準ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド。一般に、差異は、基準およびバリアントのヌクレオチド配列が全体的に極めて類似しそして多くの領域において同一であるように限定される。下記のように、バリアントのヌクレオチド配列の変化は、サイレントであることができる。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を改変しないことができる。改変がこのタイプのサイレント変化に限定される場合、バリアントは基準と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。また下記のように、バリアントのヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変することもできる。そのようなヌクレオチド変化は、上記に説明するように、基準配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーションをもたらすことができる。（２）アミノ酸配列が別の基準ポリペプチドと異なるポリペプチド。一般に、差異は、基準およびバリアントの配列が全体的に極めて類似しそして多くの領域において同一であるように限定される。バリアントおよび基準ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在することができる、１つもしくはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およびトランケーションによりアミノ酸配列が異なることができる。
【００１５】
「相補的な」もしくは「相補性」という用語は、本明細書において用いる場合、二本鎖核酸分子を形成するように水素結合によって結合するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの能力をさす。以下の塩基対は、相補性の関係にある：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシル。本明細書において用いる場合、「相補的な」は、上記の関係が該分子の全長にわたって２つの１本鎖核酸分子を含んでなる実質的に全ての塩基対に当てはまることを意味する。「部分的に相補的な」は、分子の一方の一部が一本鎖のままであるように２つの１本鎖核酸分子の一方がもう一方より長さが短い場合の上記の関係をさす。
【００１６】
「保存的置換」もしくは「保存的アミノ酸置換」という用語は、ある種のアミノ酸の当該技術分野で認められている置換可能性に基づく親分子の生物学的活性に影響を与えない親タンパク質における１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換をさす（例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐ．３，ｐｇ  ３４５−３５２，１９７８を参照）。
【００１７】
「そのフラグメント」は、該フラグメントが親タンパク質もしくは核酸分子において連続する５個もしくはそれ以上のアミノ酸、または１０個もしくはそれ以上のヌクレオチドを含んでなるような、その配列が本明細書に開示されている核酸もしくはタンパク質分子のフラグメント、断片もしくはサブ領域をさす。
【００１８】
「機能性フラグメント」は、本明細書において用いる場合、本明細書に開示するタンパク質もしくは例えば受容体の活性部位のような機能的に異なった領域を含んでなるアミノ酸の配列の単離されたサブ領域もしくはフラグメントをさす。機能性フラグメントは、クローニング技術により、もしくは選択的スプライシングメカニズムの天然生成物として製造することができる。
【００１９】
「ホモログ」もしくは「相同な」という用語は、異なる核酸分子もしくはアミノ酸配列間の関係を表し、ここで、該配列もしくは分子は、該分子もしくは配列内の１つもしくはそれ以上のブロックもしくは領域での部分的同一性もしくは類似性により関連している。「単離された核酸化合物」は、その天然の位置と位置的に異なる、いかに構築されもしくは合成されようとも（ｈｏｗｅｖｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ  ｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）、任意のＲＮＡもしくはＤＮＡ配列をさす。
【００２０】
「核酸プローブ」もしくは「プローブ」は、本明細書において用いる場合、別の核酸化合物とハイブリダイズする標識核酸化合物である。「核酸プローブ」は、一本鎖標的核酸配列とハイブリダイズする一本鎖核酸配列を意味する。核酸プローブは、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチドポリマーであることができる。「プローブ」は、通常、プローブの末端（１つもしくは複数）に結合しているかもしくはプローブの配列の内部にあることができる検出可能な部分を含有する。
【００２１】
「プライマー」という用語は、例えば核酸分子の酵素もしくは合成による伸長の開始基質として機能する核酸フラグメントである。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書において用いる場合、一本鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対合によって相補鎖と結合するプロセスをさす。
【００２３】
「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション条件をさす。高いストリンジェンシー条件は、非相同的塩基対合を退ける。低いストリンジェンシー条件は、逆の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば、温度および塩濃度により改変することができる。「ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性した剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液における４２℃で一晩のインキュベーション、続いて約６５℃で０．１ｘＳＳＣにおいてフィルターを洗浄することをさす。さらなる適当なハイブリダイゼーション条件は、実施例に記述されている。
【００２４】
「低いストリンジェンシー条件」には、６Ｘ  ＳＳＰＥ（２０Ｘ  ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％  ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含んでなる溶液における３７℃で一晩のインキュベーション；続いて５０℃で１Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄が包含される。さらに、いっそう低いストリンジェンシーを得るために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に行う洗浄をさらに高い塩濃度（例えば５Ｘ  ＳＳＣ）で行うことができる。ここで留意すべきは、上記の条件のバリエーションが、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑えるために用いられる代わりのブロッキング試薬の包含および／もしくは代用によって実施できることである。典型的なブロッキング試薬には、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性したサケ精子ＤＮＡおよび市販されている専売配合物が包含される。特定のブロッキング試薬の包含は、適合性の問題のために、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００２５】
「融合タンパク質」という用語は、本明細書において用いる場合、ドメインもしくはリンカー領域の組み合わされた機能を得る目的のために複数のタンパク質ドメインもしくはリンカー領域を組み合わせることの結果であるタンパク質構築物をさす。これは、所望の融合タンパク質をコードする新しいポリヌクレオチド配列を製造するためにそのようなドメインをコードするヌクレオチド配列の分子クローニングにより実施することができる。あるいはまた、融合タンパク質の作製は、２つのタンパク質を化学的に連結することにより実施することができる。
【００２６】
「リンカー領域」もしくは「リンカードメイン」という用語または同様のそのような記述用語は、本明細書において用いる場合、クローニングベクターもしくは融合タンパク質の構築において使用するポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列をさす。リンカー領域の機能には、ヌクレオチド配列へのクローニング部位の導入、２つのタンパク質ドメイン間のフレキシブル成分もしくはスペース作製領域の導入、または特異的分子相互作用のためのアフィニティータグの作製を包含することができる。リンカー領域は、ポリペプチドもしくはヌクレオチド配列構築中に行われる選択によりもたらされる融合タンパク質に導入することができる。
スクリーニング方法
本発明は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）誘発性鬱病およびストレスを調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。それは、ＣＲＨ活性化ＣＲＨ受容体の下流モジュレーターとしての多数の遺伝子の同定に基づく。特に、本発明は細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は；
ａ）該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；
ｂ）該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の転写レベルでの変化を決定すること；および
ｃ）該タンパク質の転写レベルを該化合物の有無で比較すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されている。）
を含んでなる。
【００２７】
転写の変化をタンパク質レベルで決定するために、当該技術分野で既知の技術を用いて該タンパク質の量を決定することができる。例えば、クーマシーもしくは銀染色のようなタンパク質染色技術と組み合わせて等電点電気泳動法もしくはＳＤＳ−ｐａｇｅのような分離技術を用いる。あるいはまた、酵素であるタンパク質では、既定溶液もしくは組織抽出物における量は、反応生成物へのその基質の転化である、酵素がもたらす触媒効果に関して測定するかもしくはアッセイすることができる。例えば、キナーゼでは、キナーゼ特異的リン酸化部位を含んでなる基質を用いてそして該基質への放射性ホスフェートの導入により基質のリン酸化を測定することによってキナーゼ活性を評価することができる。このアッセイは、試験する化合物の有無の両方で行うことができる。酵素ではないタンパク質では、他の定量方法が必要とされる。例えば、輸送タンパク質は、それらが輸送する分子へのそれらの結合により、そしてホルモンおよび毒素は、それらがもたらす生物学的効果により評価することができる。
【００２８】
転写の変化を遺伝子レベルで評価するために、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡを検出に直接用いることができ、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。好ましくは、該分析方法は、該細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする遺伝子の適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブの使用を含んでなる。従って、好ましい態様として、遺伝子転写のレベルは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価される。
【００２９】
別の態様として、遺伝子発現の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術方法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる（例えば：Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６）を参照）。
【００３０】
代わりの態様として、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法は；
ａ）該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；ならびに
ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現レベルを決定すること
を含んでなる。
【００３１】
発現レベルの変化を評価するために、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡを検出に直接用いることができ、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。好ましくは、該分析方法は、ポリヌクレオチドの適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブの使用を含んでなる。従って、好ましい態様として、遺伝子転写のレベルは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価される。
【００３２】
別の態様として、遺伝子発現の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。この態様として、本発明は、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は、該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０の核酸配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含んでなる。特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いる。アレイ技術法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる（例えば：Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６）を参照）。
【００３３】
ゲノムＤＮＡを直接使用しない場合には、ｍＲＮＡを単離し、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施することができる。２回目のＤＮＡ合成を第二鎖の生成のために実施することができる。次に、特異的ＰＣＲ増幅によって、単離されたｃＤＮＡを得ることができる。必要に応じて、二本鎖ｃＤＮＡを任意の適当なベクター、例えばプラスミドにクローン化し、それによりｃＤＮＡライブラリーを生成せしめることができる。上記と同様にして、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする遺伝子の任意の適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブでバクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが可能である。例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照。
【００３４】
原核もしくは真核細胞における増殖のためにプラスミドもしくはファージのような適当なベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者に周知である［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．上記を参照］。適当なクローニングベクターは周知であり、そして広く利用可能である。
【００３５】
さらなる態様として、遺伝子転写の変化はｍＲＮＡレベルで決定される。減少したもしくは増加した発現は、例えば；核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲによる）；ＲＮアーゼ保護；ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のような、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野において周知である方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。ホストから得られるサンプルにおける、本発明のポリペプチドのようなタンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが包含される。タンパク質誘導体もしくはバリアントの存在を決定するために用いることができるアッセイ技術は、とりわけ、質量分析法を含んでなる。
【００３６】
従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供することは本発明の目的であり、該方法は；
ａ）該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；
ｂ）該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定すること；および
ｃ）該タンパク質の量を該化合物の有無で比較すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されている。）
を含んでなる。
【００３７】
好ましくは、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量をアッセイする方法は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合する抗体を用いている。
【００３８】
従って、別の態様として、本発明はＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質と免疫学的に反応する単一特異性抗体を提供し、該タンパク質は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択される。
【００３９】
本発明のポリペプチドに対して作製される抗体は、日常的プロトコルを用いて、該ポリペプチドもしくはエピトープ保有フラグメント、アナログまたはこれらを発現する細胞を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の製造には、連続細胞系培養により生産される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が包含される。
【００４０】
米国特許第４，９４６，７７８号に記述されているもののような、一本鎖抗体の製造のための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。また、ヒト化抗体を発現するためにトランスジェニックマウス、もしくは他の哺乳類を包含する他の生物を用いることもできる。
【００４１】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するためもしくは同定するためにまたはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために用いることができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、とりわけ、ＣＲＨ誘発性ストレスもしくは鬱病のようなＣＲＨ代謝関連疾患を処置するために用いることもできる。
【００４３】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量を決定するために、本発明の抗体を通常の免疫学的技術において用いる。適当な免疫学的技術は当業者に周知であり、そして例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析、競合的もしくはサンドイッチイムノアッセイなどが包含され、別に周知であるようにそれらは全て抗原−抗体免疫複合体の形成に依存し、ここで、アッセイの目的のために、抗体を例えば放射性、酵素もしくは蛍光標識で検出可能に標識することができ、または不溶性担体上に固定することができる。
【００４４】
例えば、ＥＬＩＳＡスクリーニングフォーマットでは、担体（ＢＳＡのような）に結合しているタンパク質もしくはそのペプチドフラグメントのいずれかでコーティングされている固相（例えばマイクロプレートの底）に該抗体を加え、そして次に、酵素、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくは１２５Ｉのような放射性同位体のような検出可能な標識と結合した抗免疫グロブリン抗体（例えば、免疫付与をマウスにおいて行う場合、抗マウス免疫グロブリン抗体を用いる、例えばヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ））を加える。
【００４５】
従って、サンプルにおけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の決定もしくは検出のためのイムノアッセイを提供することは本発明の目的であり、該方法は、サンプルを本発明のタンパク質に対する抗体と接触させることおよび抗体と該タンパク質の間で免疫複合体が形成されるかどうかを決定することを含んでなる。これらの方法は、組織サンプルもしくは体液サンプルで行うことができ、そして一般に、被験体の体からサンプルを得ること；検出可能に標識した本発明の抗体のイメージング有効量と該サンプルとを接触させること；およびサンプルにおけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の存在を明らかにするために標識を検出することを含んでなる。
【００４６】
本発明の抗体を用いる測定方法は、特に限定されない。測定する抗原の量に対応する抗体、抗原もしくは抗原−抗体複合体の量が、化学的もしくは物理的手段により検出され、そして既知の量の抗原を含有する標準溶液の使用により作製される標準曲線から計算される限り、任意の測定方法を用いることができる。例えば、比濁法、競合法、免疫測定法およびサンドイッチ法を適切に用いる。感度および特異性に関して、下記のサンドイッチ法を用いることが特に好ましい。
【００４７】
ラベリング物質を用いる測定方法では、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質などをラベリング因子として用いる。放射性同位体の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃが包含される。酵素は、通常、次に検出可能な反応を触媒する適切な基質の結合により検出可能にする。その例には、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼが包含される。発光物質には、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼが包含される。さらに、アビジン−ビオチン系もまた、本発明の抗体および免疫原を標識するために用いることができる。
【００４８】
従って、さらなる態様として、本発明は：
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させること；および
ｂ）該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変する化合物を同定しそして得る方法を提供する。
【００４９】
膜電位の変化は、通常の電気生理学的技術を用いて、そして利用可能になる場合には、現在開発中の新規な高速大量処理方法を用いて測定することができる。膜電位の変化は、通常、イオン流動の結果であるので、代わりの方法として、膜電位の変化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを包含する供給業者からのｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎ、ｆｕｒａ  ｒｅｄ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＢＦＩおよび他の同様のプローブを包含するイオン感受性蛍光色素を用いて細胞内イオン濃度の変化によって間接的に測定することができる。ＤＩＢＡＣ４（３）もしくはＤｉ−４−Ａｎｅｐｐｓ他のような、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを包含する供給業者からの他の蛍光色素は、膜電位変化を検出することができる。例えば、カルシウムおよびナトリウムイオン流動は、画像解析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法の有無で、蛍光顕微鏡検査を包含する、蛍光光度法および蛍光イメージング技術を用いて、このようにしてリアルタイムで特性化することができる。
【００５０】
好ましい態様として、このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（（ＦＬＩＰＲ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置に基づく。その最も一般的な形態において、それはフルオレセインに基づく色素により出される蛍光を励起しそして測定する。それは、フルオロフォアの４８８ｎｍでの高出力励起をもたらすためのアルゴンイオンレーザー、９６／３８４ウェルプレートの底一面を迅速に走査するための光学系および出された蛍光を捕獲するための高感度の冷却したＣＣＤカメラを使用する。それはまた、装置が９６／３８４ウェルプレートのウェルに試験因子の溶液を送達することを可能にする９６／３８４ウェルピペッティングヘッドも含有する。ＦＬＩＰＲアッセイは、全ての９６／３８４ウェルから同時に、リアルタイムで、化合物の添加の前に、間にそして後に細胞の集団からの蛍光シグナルを測定するように設計される。
【００５１】
従って、細胞におけるＣＲＨ応答を調節することにおいて機能的に活性がある化合物をスクリーニングしそして特性化するために用いるＦＬＩＰＲアッセイを提供することは本発明の目的であり、該細胞は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるタンパク質を発現する。
【００５２】
代わりの態様として、細胞の活性は、電気生理学的方法を用いて評価することができる。従って、細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質は、全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて特性化することができる。
【００５３】
従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供することは本発明のさらなる目的であり、該方法は；
（ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるタンパク質を発現する宿主細胞を試験する化合物と接触させること；
（ｂ）電気生理学的技術を用いて該細胞の膜電位への試験化合物の影響を測定すること；ならびに
（ｃ）該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる。
【００５４】
好ましい態様として、宿主細胞はゼノパス卵母細胞であり、そして電気生理学的測定は、別個の膜電位で電圧固定技術を用いて膜電流を測定することからなる。
【００５５】
該細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節する酵素の酵素活性の変化は、一般に、反応生成物へのその基質の転化である、酵素がもたらす触媒効果に関して測定するかもしくはアッセイすることができる。例えば、キナーゼでは、キナーゼ特異的リン酸化部位を含んでなる基質を用いてそして該基質のリン酸化を測定することによりキナーゼ活性を評価することができる。同様にホスファターゼでは、リン酸化基質を用いてそして該基質の脱リン酸化を測定することによりホスファターゼ活性を評価することができる。これらのアッセイは、試験する化合物の有無の両方で行うことができる。
【００５６】
従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法を提供することは本発明の目的であり、該方法は；
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるキナーゼを含んでなる混合物をホスフェート源および適当なキナーゼ基質と接触させること；
ｂ）該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに；該試験化合物のない場合の該基質のリン酸化のレベルと比較して該化合物の存在下での該基質のリン酸化のレベルを測定すること
を含んでなる。
【００５７】
本発明のアッセイにおいて、キナーゼはタンパク質として提供することができ、もしくは該キナーゼをコードするｍＲＮＡとしてアッセイ混合物において提供することができる。アッセイが無細胞成分を含んでなる場合、キナーゼはタンパク質として提供される。アッセイが細胞の環境において行われる場合、キナーゼはタンパク質としてもしくは該キナーゼをコードするｍＲＮＡとして提供することができ、ここで、キナーゼがアッセイにおいて利用可能であるように、該ｍＲＮＡは翻訳され、そしてそれによりキナーゼタンパク質が生産される。キナーゼを特定するｍＲＮＡを得、そして該ｍＲＮＡをキナーゼタンパク質の生産のために細胞に注入するのが簡単な事であるのは、本明細書に提供する実施例から明らかである。キナーゼはまた、キナーゼタンパク質をコードするプラスミドの発現により提供することもできる。キナーゼタンパク質をコードする操作可能なプラスミドを構築するためにそして該プラスミドを細胞において発現するために標準的な分子生物学技術を用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００５８】
本明細書に説明するように、キナーゼモジュレーターを同定する方法は、アッセイ混合物が無細胞である場合のインビトロで、生細胞をアッセイに含む場合のインビトロで、もしくは動物においてインビボで行うことができる。従って、本発明の１つの態様として、混合物は真核細胞内に含まれ、そして本発明の方法を行うことができ、ここで、アッセイ混合物の成分のいくつかは、その中に成分の微量注入によって細胞に外因的に提供することができ、そして成分のいくつかは細胞において内在性であることができる。
【００５９】
「細胞において内在性である」という用語は、本明細書において用いる場合、該成分が対象細胞において生来生産されることを意味する。
【００６０】
「細胞に外因性である」という用語は、本明細書において用いる場合、該成分が対象細胞に生来存在しないか、もしくは低レベルでその中に存在し、そしてそこに加えられることを意味する。
【００６１】
本発明の方法が真核細胞を用いて行われる場合、１つもしくはそれ以上のキナーゼタンパク質、キナーゼ基質および試験化合物をインキュベーションの前に真核細胞に注入することができる。次に、そのように注入した細胞をプロテインキナーゼ活性を促進する条件下でインキュベーションし、そして次に、本明細書に記述するアッセイを用いてインキュベーション期間の後にプロテインキナーゼ活性のレベルを測定する。
【００６２】
本発明の方法において有用な真核細胞は、ゼノパス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、ゼノパス・レービス胚細胞、哺乳類細胞（ＩＯＴＩ／２細胞のような）、ドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓ２細胞、ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞および酵母細胞のいずれか１つであることができる。さらにより好ましくは、真核細胞はマウス下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系細胞ＡｔＴ−２０である。
【００６３】
本発明の方法に使用するホスフェート源は、ＡＴＰもしくはＧＴＰのようなしかしこれらに限定されるものではないヌクレオチド３リン酸が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の一般的なホスフェート源であることができる。好ましい態様として、ホスフェート源は、その上に検出可能な標識を結合しており、この標識は、反応中にキナーゼ基質にリン酸基とともに導入される。このように、リン酸化基質は検出可能な標識を含有し、一方、非リン酸化基質は標識を含有しない点においてリン酸化キナーゼ基質を非リン酸化キナーゼ基質と区別することができる。別の態様として、ホスフェート源は、その上に検出可能な標識を結合しておらず；その代わりに、リン酸化キナーゼ基質は、例えば、抗体により、基質の一方の形態を認識するが、もう一方を認識しないことにより、非リン酸化キナーゼ基質と区別することができる。
【００６４】
本発明の方法において有用な検出可能な標識には、プロテインキナーゼ活性の結果としてキナーゼ基質にそれへのリン酸基の導入の際に導入される任意の既知のもしくはこれまで知られていない検出可能な標識を包含することができる。有用な標識には、γ３２Ｐ、３１Ｓのような放射性標識、およびビオチンなどのような非放射性標識が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
好ましくは、キナーゼアッセイは細胞において行われ、そして；
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるキナーゼを含んでなる細胞をホスフェート源および適当なキナーゼ基質と接触させること；
ｂ）該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに；該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる。
【００６６】
同様に、ＣＲＨシグナリング応答の変化は、ホスファターゼアッセイを用いて評価することができ、該アッセイは；
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるホスファターゼおよび適当なリン酸化基質を含んでなる混合物を接触させること；
ｂ）該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに；該試験化合物のない場合の該基質のリン酸化のレベルと比較して該化合物の存在下での該基質のリン酸化のレベルを測定すること
を含んでなる。
【００６７】
キナーゼアッセイでのように、本発明のアッセイにおけるホスファターゼはタンパク質として提供することができ、もしくは該ホスファターゼをコードするｍＲＮＡとしてアッセイ混合物において提供することができる。リン酸化基質は、典型的に、検出可能なリン酸残基で標識される。有用な標識には、γ３２Ｐ、３１Ｓのような放射性標識、およびビオチンなどのような非放射性標識が包含されるがこれらに限定されるものではない。ホスファターゼ活性アッセイにおける使用には、基質は、好ましくは、典型的にはγ３２Ｐで標識される、チロシンもしくはセリン残基でリン酸化される、ペプチド基質からなる。一般に、リン酸化は様々な方法で実施することができる。典型的には、プロテインチロシンキナーゼを用いる。例えば、３２Ｐで標識したＡＴＰと組み合わせた可溶性ＥＧＦ受容体キナーゼを本発明のペプチド上のチロシン残基をリン酸化するために用いることができる。そのようなリン酸化反応は、典型的に、３０℃で約２時間もしくは室温で一晩にわたって進行させる。次に、以下に「ホスホペプチド」と称するリン酸化ペプチドをリン酸化反応混合物から精製する。例えば、ペプチドは、トリクロロ酢酸の添加および遠心分離により反応混合物から分離することができ、それにより、ペプチドは上清に残る。ペプチドは、一般に、カラムクロマトグラフィーにより、例えばＣ１８上でさらに精製される。精製されたリン酸化ペプチドを凍結乾燥し、そして使用前に−２０℃で保存することができる。
【００６８】
インキュベーション後に、脱リン酸化されないホスホペプチド（「非脱リン酸化ホスホペプチド」）をホスホペプチドの脱リン酸化により遊離される放射活性から（すなわち、脱リン酸化により遊離される遊離の放射性リンから）分離する。本明細書において用いる場合、「放射性リン」という用語には、放射性リン原子がチロシン残基上に存在しそして脱リン酸化によりそれを取り除くことができる全ての形態が包含される（例えばリン酸基として）。典型的に、ホスホペプチドの脱リン酸化により遊離される遊離の放射性リンからの非脱リン酸化ホスホペプチドの分離は、非放射性ホスフェートおよび木炭を含む物質の添加による脱リン酸化反応の停止後に、遠心分離によりもたらされる。上清における放射活性は、当業者に周知である手段により決定される。ホスホペプチドによって最初にアッセイ混合物に加えられる放射活性の量および脱リン酸化により遊離される放射活性としてアッセイの最後に検出される放射活性の量に基づいて、アッセイするサンプルのホスファターゼ酵素活性を計算することができる。
【００６９】
好ましくは、ホスファターゼアッセイは細胞において行われ、そして；
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるホスファターゼを含んでなる細胞を適当なリン酸化基質と接触させること；
ｂ）該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに；
ｃ）該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること（ここで、該細胞のＣＲＨ応答活性は、基質のリン酸化レベルの変化により決定される。）
を含んでなる。
【００７０】
また、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法を提供することも本発明の態様であり、該方法は；
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞を該試験化合物と接触させること；および
ｂ）該化合物の有無で、該細胞におけるｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ２＋もしくはＩＰ３のような二次メッセンジャーのレベルを比較すること
を含んでなる。
【００７１】
二次メッセンジャーのレベルは、上記のタンパク質の１つを含んでなる全細胞もしくは細胞抽出物のいずれかにおいて当該技術分野で既知の技術を用いて決定することができる。
【００７２】
細胞におけるＣＲＨシグナリングを改変することができる化合物を同定するさらなる方法は、遺伝子プロモーターもしくは調節配列要素が転写因子結合部位を含んでなることを特徴とする遺伝子プロモーターもしくはその調節配列要素に操作可能に連結された、レポーター遺伝子のような、遺伝子の使用に基づき、ここで、該転写因子は細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節することができる。好ましい態様として、細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節することができる転写因子は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１から選択されている。
【００７３】
従って、本発明は、上記に定義するような遺伝子プロモーター領域を含んでなる組み換えＤＮＡ分子を提供する。該組み換えＤＮＡ分子において、プロモーター領域は、レポーター遺伝子のような、検出可能な生成物をコードする核酸分子に操作可能に連結することができる。「操作可能に連結される」という用語は、本明細書において用いる場合、プロモーターの制御下の遺伝子を発現するために適切なフレームで遺伝子とプロモーターとを機能的に融合させることを意味する。本明細書において用いる場合、「レポーター遺伝子」という用語は、簡単な安価な方法もしくは試薬を用いて同定することができそしてプロモーター領域もしくはその活性フラグメントに操作可能に連結することができる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。例えば、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を本発明のスクリーニングアッセイにおいて転写活性を決定するために用いることができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１８５，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照；また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記も参照）。好ましい態様として、レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼ遺伝子である。本発明はまた、上記に定義するような組み換えＤＮＡ分子を含んでなるベクター、ならびにそのようなベクターでもしくは一般に本発明の組み換えＤＮＡ分子で安定に形質転換した宿主細胞も提供する。「ベクター」という用語は、宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製および／もしくは適切な発現のために宿主細胞にＤＮＡを導入するのに有用な外因性ＤＮＡの任意のキャリアをさす。従って、特定の態様として、該ベクターは、市販されているｐＧＬ３ｌｕｃ発現ベクターのような発現ベクターである。
ＣＲＨ誘発性遺伝子発現プロファイルの同定
別の態様として、本発明は、細胞におけるＣＲＨシグナリングのマーカーとしての、より高いレベルのＣＲＨに長期さらされた際にアップもしくはダウンレギュレーションされることが示された単離されそして精製された核酸分子の使用に関し、ここで、該核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかである。特に、本発明には：
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、該ポリヌクレオチドの全長にわたって、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、該ポリヌクレオチドの全コーディング領域にわたって、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１よりなる群から選択されるポリヌクレオチドヌクレオチド配列
よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる単離されそして精製された核酸分子が包含される。
【００７４】
同一性もしくは類似性は、当該技術分野において既知であるように、配列を比較することにより決定されるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によっては、そのような配列のストリング間のマッチにより決定されるような、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性および類似性は両方とも容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチドもしくは２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定する多数の方法があるが、両方の用語は当業者に周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３）。配列間の同一性もしくは類似性を決定するために一般に用いられる方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３に開示されているものが包含されるが、これらに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムにおいて体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）、３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）が包含されるが、これらに限定されるものでは��い。
【００７５】
ＣＲＨ活性を調節することができるタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする核酸配列は、脳、心臓、腎臓、膵臓、肝臓および皮膚のようなしかしこれらに限定されるものではない、該遺伝子が発現される組織から単離することができる。該配列はまた、ヒトおよびマウス以外の哺乳類から単離することもできる。適当な細胞の選択は、本明細書に記述するように、細胞抽出物においてもしくは全細胞アッセイにおいてＣＲＨ調節活性をスクリーニングすることにより行うことができる。これらのアッセイのいずれか１つにおいてＣＲＨ調節活性を保有する細胞は、本発明の核酸配列の単離に適当であることができる。
【００７６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを分子クローニングするために当該技術分野において既知である様々な方法のいずれかを用いることができる。１つの方法として、ｍＲＮＡを単離し、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施する。２回目のＤＮＡ合成を第二鎖の生成のために実施することができる。次に、ＣＲＨシグナリングを調節する精製されたタンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅によって、単離されたｃＤＮＡを得ることができる。必要に応じて、二本鎖ｃＤＮＡを任意の適当なベクター、例えばプラスミドにクローン化し、それによりｃＤＮＡライブラリーを生成せしめることができる。別の方法は、配列番号：１、配列番号：７もしくは配列番号：３の任意の適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブでバクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照。
【００７７】
原核もしくは真核細胞における増殖のためにプラスミドもしくはファージのような適当なベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者に周知である［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．上記を参照］。適当なクローニングベクターは周知であり、そして広く利用可能である。
【００７８】
他のタイプのライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞タイプから構築されるライブラリーが、本発明の核酸配列を単離するために有用であり得ることは当業者に容易に明らかである。他のタイプのライブラリーには、他の細胞由来の、ヒトおよびマウス以外の生物由来のｃＤＮＡライブラリー、ならびにＹＡＣ（酵母人工染色体）およびコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリーが包含されるが、これらに限定されるものではない。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野において周知である標準的な技術により行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．Ｃｈａｐ．１４（１９８９）に見出すことができる。
【００７９】
多くの場合において、単離されたｃＤＮＡ配列は、ポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡの５’末端で足りない点において、不完全であることを当業者は認識する。これは、第一鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成することができない、本質的に低い「伸長性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（重合反応中に鋳型に結合したままである酵素の能力の尺度）を有する酵素である逆転写酵素の結果である。
【００８０】
全長のｃＤＮＡを得るか、もしくは短いｃＤＮＡを伸長するために利用可能なそして当業者に周知であるいくつかの方法、例えば、ｃＤＮＡ末端の急速増幅法（ＲＡＣＥ）（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２）、もしくはＭａｒａｔｈｏｎＴＭ技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）により例示される、この技術の最近の改変に基づくものがある。
ポリペプチド
さらなる態様として、本発明は、ＣＲＨシグナリングを調節する実質的に純粋な形態のポリペプチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、本発明の単離されそして精製された核酸分子によりコードされる。好ましい態様として、ポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１ならびにその機能的アナログよりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８１】
本発明のタンパク質は、本発明の核酸によりコードされる、該分子によりコードされるポリペプチドを包含しそして保存的アミノ酸変化を有する、全ての可能なアミノ酸バリアントを含む。
【００８２】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅もしくはデノボＤＮＡ合成を包含する複数の組み換えＤＮＡ技術により得ることができることを当業者は認識する（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．Ｃｈａｐ．１４（１９８９）を参照）。
【００８３】
ＣＲＨシグナリングを調節する精製された生物学的活性タンパク質は、いくつかの異なる物理的形態を有することができる。本発明のポリペプチドは、全長の新生のもしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。全長の新生ポリペプチドは、とりわけ、全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異的タンパク質分解切断事象により、翻訳後に修飾されることができる。フラグメント、もしくは複数のフラグメントの物理的会合は、本発明のタンパク質と関連する完全な生物学的活性を有することができ；しかしながら、ＣＲＨ調節活性の程度は、個々のフラグメント間で異なり得る。
【００８４】
また、本発明のこの態様において好ましいのは、ポリペプチドの構造もしくは機能特性を特徴とするフラグメントである。この点において本発明の好ましい態様には、本発明のポリペプチドのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、高抗原性指数（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）領域を含んでなるフラグメントおよびそのようなフラグメントの組み合わせが包含される。好ましい領域は、本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。この点において最も非常に好ましいのは、同様の活性もしくは向上した活性を有するか、または減少した望ましくない活性を有するものを包含する、本発明の応答調節因子ポリペプチドの化学的、生物学的もしくは他の活性を有するフラグメントである。
ＣＲＨ活性を調節するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの組み換え発現
別の態様として、本発明のポリヌクレオチドは、適当なプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組み換え的に発現し、そしてＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質を製造するために原核もしくは真核宿主細胞に導入することができる。そのような操作の技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，上記に十分に記述されており、そして当該技術分野において周知である。
【００８５】
従って、さらなる態様として、本発明は、組み換え宿主におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現のための発現ベクターを提供し、ここで、該ベクターは、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸配列およびその機能的アナログを含有する。本発明のさらに好ましい態様として、この発現ベクターは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列ならびにその機能的アナログを有する、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸分子を含有するか、もしくはＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する。
【００８６】
発現ベクターは、適切な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と本明細書において定義する。そのようなベクターは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、シアノバクテリア、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞、および動物細胞のような様々な宿主において真核生物遺伝子を発現するために用いることができる。
【００８７】
特に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞もしくは細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力、および活性プロモーターを含有することができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合しそしてＲＮＡ合成を開始するように導くＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特に設計されたプラスミドもしくはウイルスを包含することができるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする、本発明の単離されそして精製された核酸分子は、組み換え宿主細胞における発現のために発現ベクターにクローン化することができる。組み換え宿主細胞は、エシェリキア・コリのような細菌、酵母のような真菌細胞、ゼノパス卵母細胞のような両生類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系が包含されるがこれらに限定されるものではない哺乳類細胞、ならびにドロソフィラおよびカイコ由来の細胞系が包含されるがこれらに限定されるものではない昆虫細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない、原核生物もしくは真核生物のものであることができる。適当であることができそして市販されている哺乳類種由来の細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ細胞、神経芽細胞腫、グリア細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
従って、さらなる態様として、本発明はＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする組み換え的にクローン化された核酸分子もしくはその機能的アナログを含有する組み換え宿主細胞に関する。さらなる態様として、本発明の組み換え宿主細胞は、ゲノムＤＮＡであるかもしくは配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子；ならびにその機能的アナログを含有する。
【００９０】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクションおよび電気穿孔が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の技術のいずれか１つによって宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に増やし、そしてそれらがＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質を生産するかどうかを決定するために分析する。パーミアーゼを発現する宿主細胞クローンの同定は、本発明のポリペプチドに対する抗体との免疫学的反応性および宿主細胞に関連する哺乳類プリンパーミアーゼ活性の存在が包含されるがこれらに限定されるものではない、いくつかの手段により行うことができる。
【００９１】
従って、本発明はまた、本明細書に概説するような発現ベクターからのＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含んでなる、組み換え宿主細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現の方法にも関する。本発明のタンパク質は、直接発現により、または自己、酵素的もしくは化学的切断により取り除くことができる別のタンパク質もしくはペプチドとの翻訳融合物として興味のあるタンパク質を含んでなる融合タンパク質として合成することができる。従って、特定の態様として、本発明は、該ポリペプチドが融合タンパク質の一部である本発明のタンパク質を提供する。
【００９２】
融合タンパク質としての発現は、寿命を延長し、所望のペプチドの収量を増加し、もしくは該タンパク質を精製する都合のよい手段を提供することが、組み換え系におけるある種のペプチドの製造においてしばしば認められる。これは、原核生物宿主において哺乳類タンパク質を発現する場合に特に該当する。特定の部位でポリペプチドを切断するか（例えば、エンテロキナーゼおよびトロンビン）、またはペプチドをペプチド鎖のアミノもしくはカルボキシ末端から消化する（例えば、ジアミノペプチダーゼ）様々なペプチダーゼが既知である。さらに、特定の化学物質（例えば、臭化シアン）は、ポリペプチド鎖を特定の部位で切断する。部位特異的内部切断部位を導入するためにアミノ酸配列（および組み換え手段を用いる場合には合成もしくは半合成のコーディング配列）に必要な改変を当業者は認識する。例えば、Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ，“Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９０）を参照。
【００９３】
さらに、例えば、上記のようなＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸分子をそのゲノムにすでに含んでなるが、それを発現しないかもしくは例えば弱いプロモーターのために適切に発現しない哺乳類細胞を用い、そしてその発現を誘導するために該哺乳類細胞に該プリンパーミアーゼポリペプチドをコードする内在性核酸分子のすぐ近くに強力なプロモーターのような調節配列を導入することができる。
【００９４】
異種の転写および／もしくは調節配列もしくはタンパク質の制御下のＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換え宿主細胞はそのようなものとして、本発明の別の態様である。
【００９５】
これに関連して、「調節配列」という用語は、ＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子のすぐ近くでの細胞のゲノムへのその組込みのために、プリンパーミアーゼポリペプチドの発現を増加するために用いることができる核酸分子を意味する。そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、不活性化サイレンサーイントロン配列、３’ＵＴＲおよび／もしくは５’ＵＴＲコーディング領域、タンパク質および／もしくはＲＮＡ安定化要素、ＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するかもしくは引き起こすことができる調節タンパク質、例えば転写因子をコードする核酸分子または遺伝子発現を活性化しそして／もしくは遺伝子産物の量を増加することが既知である他の遺伝子発現制御要素を含んでなる。該調節配列の導入は、ＣＲＨシグナリングを調節するポリペプチドの発現の増加および／もしくは誘導を引き起こし、最終的に細胞における該ポリペプチドの増加した量をもたらす。従って、本発明は、ＣＲＨシグナリングを調節するポリペプチドのデノボおよび／もしくは増加した発現を提供することを目的とする。
【００９６】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染もしくは他の方法によりもたらすことができる。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多数の標準的な実験室マニュアルに記述されている。特に、ＣＲＨシグナリングを調節するポリペプチドは、実際には、組み換えベクターを欠く宿主細胞により発現することができると考えられる。
【００９７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドの発現はまた、インビトロで製造された合成ｍＲＮＡを用いて行うこともできる。合成ｍＲＮＡもしくはＣＲＨシグナリングを調節することができる細胞から単離されたｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な無細胞系において効率よく翻訳することができ、同様にカエル卵母細胞への微量注入が包含されるがこれに限定されるものではない細胞に基づく系において効率よく翻訳することができ、カエル卵母細胞への微量注入が一般に好ましい。
トランスジェニック非ヒト動物
本発明はまた、生殖細胞、胚細胞、幹細胞もしくは卵またはそれら由来の細胞への本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターの導入を含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはトランスジェニックマウスの製造の方法にも関する。非ヒト動物は、本明細書に記述する本発明のスクリーニング方法に従って用いることができ、そして非トランスジェニックの健康な動物であることができ、またはリン酸摂取もしくは再吸収障害、好ましくはＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質における少なくとも１つの突然変異に起因する障害を有することができる。そのようなトランスジェニック動物は、例えば、上記のポリペプチドの突然変異体型と関連して薬剤の薬理学的研究によく適している。トランスジェニック胚の製造およびそれらのスクリーニングは、例えば、Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより記述されているように行うことができる。胚の胚膜のＤＮＡは、例えば、適切なプローブでのサザンブロットを用いて分析することができる；上記参照。
【００９８】
好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、対応する哺乳類ＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの不活性化された野生型対立遺伝子をさらに含んでなる；上記参照。この態様は、例えば、ＣＲＨ代謝の障害と関連する疾患の臨床症状の発現に関する本発明のポリペプチドの様々な突然変異体型の相互作用の研究を可能にする。トランスジェニック動物に関して以上に説明されている全ての適用はまた、２つ、３つもしくはそれ以上の導入遺伝子（例えば中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）をコードする）を保有する動物にも当てはまる。トランスジェニック動物の発生および／もしくは生涯のある段階でＣＲＨシグナリング発現もしくは機能を調節するタンパク質を不活性化することもまた望ましい可能性がある。これは、例えばＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードするＲＮＡ転写産物に対するアンチセンスもしくはリボザイムの発現を導く例えば組織特異的、発生および／もしくは細胞調節性および／もしくは誘導性プロモーターを用いることにより行うことができる；同様に上記参照。適当な誘導系は、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９  ＵＳＡ（１９９２），５５４７−５５５１）およびＧｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（１９９４），５８−６２）により記述されているような例えばテトラサイクリン調節性遺伝子発現である。同様に、ＣＲＨシグナリングを調節する突然変異体タンパク質の発現をそのような調節要素により制御することができる。
【００９９】
さらに、本発明はまた、本発明の核酸分子もしくはその一部を含有する（好ましくはそのゲノムに安定に組み込んだ）トランスジェニック哺乳類細胞にも関し、ここで、該核酸分子もしくはその一部の転写および／もしくは発現は、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の合成の減少をもたらす。
【０１００】
好ましい態様として、該減少は、アンチセンス、センス、リボザイム、共抑制および／もしくは優性突然変異体効果により行われる。「アンチセンス」および「アンチセンスヌクレオチド」は、天然に存在する遺伝子産物の発現を阻止するＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物を意味する。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドの提供は、上記のようなタンパク質の減少したレベルを有する、従って、リン酸代謝の欠損を有するトランスジェニック非ヒト動物を製造する可能性を広げる。これをいかにして成し遂げるかの技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムの、アンチセンスおよびリボザイム機能を組み合わせる分子の、そして／もしくは共抑制効果を与える分子の発現が包含される；同様に上記参照。細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量の減少にアンチセンス方法を用いる場合、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、好ましくは、形質転換に使用する動物種に関して相同な起源のものである。しかしながら、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする内生的に存在する核酸分子に高度の相同性を示す核酸分子を用いることもまた可能である。この場合、相同性は好ましくは８０％より高く、特に９０％より高く、そしてさらにより好ましくは９５％より高い。トランスジェニック哺乳類細胞における本発明のタンパク質の合成の減少は、例えばアデニン再吸収の改変をもたらすことができる。そのような細胞を含んでなるトランスジェニック動物において、これは様々な生理学的、発生的および／もしくは形態学的変化をもたらすことができる。
【０１０２】
従って、本発明はまた、上記のトランスジェニック細胞を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物にも関する。これらは、例えば、以下の特徴：
（ａ）ＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードする内在性遺伝子（１つもしくは複数）の破壊；
（ｂ）本発明のポリヌクレオチドを含んでなる転写産物に対する少なくとも（１つの）アンチセンスＲＮＡおよび／もしくはリボザイムの発現；
（ｃ）本発明のポリヌクレオチドのセンスおよび／もしくは非翻訳ｍＲＮＡの発現；
（ｄ）本発明の抗体の発現；
（ｅ）本発明の調節配列の機能性もしくは非機能性コピーの導入；または
（ｆ）本発明の組み換えＤＮＡ分子もしくはベクターの導入
の少なくとも１つをもたらす外来ＤＮＡの安定なもしくは一時的な存在のために野生型動物と比較してＣＲＨ代謝の欠損を示すことができる。
【０１０３】
本発明のポリペプチド、それらのコードポリヌクレオチドおよびベクターを用いて、今度は、患者および罹患表現型のＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質における特定の突然変異に関して薬剤の効能をインビボおよびインビトロで研究することが可能である。さらに、本発明のポリペプチドの突然変異体型は、ＣＲＨ代謝に関連する障害の処置に、特にＣＲＨ誘発性ストレスもしくは鬱病の改善に有効であることができる薬剤の薬理学的プロファイルを決定するためにそしてさらなる薬剤の同定および製造に用いることができる。
【０１０４】
従って、本発明はまた、本発明のＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードするポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくはベクターの治療的に有効な量を哺乳類被験体に投与することを含んでなるＣＲＨ受容体関連障害を包含するＣＲＨ代謝の障害に関連する病状を予防する、処置するもしくは改善する方法にも関すると理解される。
診断アッセイ
本発明はさらに、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害と関連する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０のポリヌクレオチドを特徴とする遺伝子の突然変異型の検出は、該遺伝子の不十分な発現、過剰発現または改変された空間的もしくは時間的発現に起因する疾患もしくは疾患へのかかりやすさの診断を加えるかもしくは特定することができる診断手段を提供する。該遺伝子に突然変異を保有する個体は、様々な技術によりＤＮＡレベルで検出することができる。
【０１０５】
従って、本発明は：
（ａ）本発明のポリヌクレオチドにおける突然変異の有無を決定すること；および
（ｂ）該突然変異の有無に基づいて病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断すること
を含んでなるＣＲＨ活性の障害に関連する被験体における病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断する方法を提供することが理解される。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検もしくは検視解剖材料のような、被験体の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出に直接用いることができ、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。ＲＮＡもしくはｃＤＮＡもまた、同様に用いることができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、本発明の標識したヌクレオチド配列に増幅ＤＮＡをハイブリダイズすることにより同定することができる。好ましくは、マッチする配列をミスマッチ二本鎖からＲＮアーゼ消化によりもしくは融点の違いにより区別することができる。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性剤の有無で、キャピラリー電気泳動カラムもしくはゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の改変により、またはダイレクトＤＮＡシーケンスにより検出することもできる（例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）。特定の位置での配列変化はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼおよびＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイもしくは化学切断方法により示すこともできる（Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１を参照）。別の態様として、例えば遺伝子突然変異の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨ活性を調節することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術方法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる（例えば：Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６））を参照）。
【０１０６】
診断アッセイは、記述する方法によるＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子における突然変異の検出によって疾患へのかかりやすさを診断するもしくは決定する方法を提供する。さらに、そのような疾患は、ポリペプチドもしくはｍＲＮＡの異常に減少したもしくは増加したレベルを被験体より得られるサンプルから決定することを含んでなる方法により、ならびに正常構造と比較してタンパク質誘導体の存在を該サンプルから決定することにより診断することができる（上記参照）。減少したもしくは増加した発現は、例えば；核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲによる）；ＲＮアーゼ保護；ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のような、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野において周知である方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。ホストから得られるサンプルにおける、本発明のポリペプチドのような、タンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが包含される。タンパク質誘導体もしくはバリアントの存在を決定するために用いることができるアッセイ技術は、とりわけ、質量分析法を含んでなる。
【０１０７】
従って、別の態様として、本発明は：
（ａ）生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドもしくはその誘導体の存在もしくはその発現の量を決定すること；および
（ｂ）ポリペプチドもしくはその誘導体の存在もしくはその発現の量に基づいて病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断すること
を含んでなる長期ＣＲＨ暴露の障害に関連する被験体における病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断する方法を提供する。
【０１０８】
特に、本発明は、個体におけるＣＲＨ誘発性遺伝子発現プロファイルを診断する方法を提供し、該方法は；
ａ）該個体の生物学的サンプルを得ること；および
ｂ）該生物学的サンプルにおける副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されている。）
を含んでなる。代わりの態様として、ＣＲＨ誘発性発現プロファイルを診断する方法は、本発明の少なくとも１つのタンパク質に限定されないが、ＣＲＨシグナリングに関与していると同定されるタンパク質、すなわち、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１のアミノ酸配列を有するタンパク質の群の発現レベルの同時評価を必要とする。
【０１０９】
好ましくは、該タンパク質の量は、好ましくはそれに結合する抗体を用いて、タンパク質レベルで、もしくは好ましくは配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて、遺伝子転写レベルで決定される。
【０１１０】
あるいはまた、ＣＲＨ誘発性遺伝子発現プロファイルは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定される。遺伝子転写のレベルを決定する方法は上文に記述されており、そして好ましい態様として配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０もしくはその相補物よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合する、好ましくは選択的に結合するプローブの使用を含んでなる。別の態様として、個体のサンプルにおける遺伝子転写のレベルの効率のよいスクリーニングを行うために本発明のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。
【０１１１】
さらなる態様として、本発明は：
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１のポリペプチドもしくはそのフラグメント；または
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する、好ましくは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１のポリペプチドに対する抗体ならびに場合により検出のための適当な手段
を含んでなる診断キットに関する。
【０１１２】
任意のそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は、実質的な成分を含んでなることができることが理解される。そのようなキットは、疾患もしくは疾患へのかかりやすさ、特にＣＲＨ誘発性ストレスもしくは鬱病のようなＣＲＨ代謝関連障害を診断することにおいて有用である。
【０１１３】
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体位置確認にも有用である。これらの配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、そしてそれとハイブリダイズすることができる。本発明による染色体への関連配列のマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾患と相関させることにおける重要な第一段階である。いったん配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の該配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能）に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされている遺伝子と疾患との関係を連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって同定する。本発明の遺伝子は、ヒト第１５染色体にマッピングする。
【０１１４】
罹患個体と非罹患個体の間のｃＤＮＡもしくはゲノム配列の違いもまた決定することができる。突然変異が罹患個体のいくらかもしくは全てにおいて認められるが、正常個体では認められない場合、該突然変異は該疾患の原因因子であると思われる。
【０１１５】
本発明のヌクレオチド配列はまた、組織位置確認にも有用である。そのような技術は、組織における本発明のポリペプチドの発現パターンの決定を、それらをコードするｍＲＮＡの検出により可能にする。これらの技術には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術およびヌクレオチド増幅技術、例えばＰＣＲが包含される。そのような技術は、当該技術分野において周知である。これらの研究からの結果は、生物におけるポリペプチドの正常機能の指標を提供する。
【０１１６】
本発明のポリペプチドもしくはそれらのフラグメントまたはそのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞はまた、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を製造するために免疫原として用いることもできる。「免疫特異的な」という用語は、抗体が、先行技術における他の関連ポリペプチドに対するそれらの親和性より本発明のポリペプチドに対して実質的に大きな親和性を有することを意味する。
【０１１７】
従って、別の態様として、本発明は、哺乳類プリンパーミアーゼと免疫学的に反応する単一特異性抗体を提供する。好ましい態様として、該抗体は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびにその機能的アナログと免疫学的に反応するか、もしくは該抗体は、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の活性を阻害する。
【０１１８】
本発明のポリペプチドに対して作製される抗体は、日常的プロトコルを用いて、該ポリペプチドもしくはエピトープ保有フラグメント、アナログまたはこれらを発現する細胞を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の製造には、連続細胞系培養により生産される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が包含される。
【０１１９】
米国特許第４，９４６，７７８号に記述されているもののような、一本鎖抗体の製造のための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。また、ヒト化抗体を発現するためにトランスジェニックマウス、もしくは他の哺乳類を包含する他の生物を用いることもできる。
【０１２０】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するためもしくは同定するためにまたはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために用いることができる。
【０１２１】
本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、ＣＲＨ代謝関連障害を処置するために用いることもできる。
【０１２２】
さらなる態様として、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはそのフラグメント、および様々なサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の様々な部分を含んでなる遺伝子工学によって作られた可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとして好ましいのは、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ  Ｉの重鎖の定常部分であり、この場合、融合はヒンジ領域で行われる。特定の態様として、Ｆｃ部分は、例えば血液凝固因子Ｘａで切断することができる切断配列の導入により簡単に取り除くことができる。さらに、本発明は、遺伝子工学によるこれらの融合タンパク質の製造方法に、そして薬剤スクリーニング、診断および治療のためのその使用に関する。本発明のさらなる態様はまた、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質技術の例は、国際特許出願第ＷＯ９４／２９４５８号およびＷＯ９４／２２９１４号に見出すことができる。
治療有用性
本発明のさらなる態様は、哺乳類ホストに導入した場合に、本発明のポリペプチドに対して該哺乳類において免疫学的応答を誘導する免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関し、ここで、該組成物は本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含んでなる。ワクチン製剤はさらに、適当な担体を含んでなることができる。ポリペプチドは胃において分解され得るので、それは好ましくは非経口的に投与される（例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは皮内注射）。非経口投与に適当な製剤には、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性もしくは非水性の滅菌した注射溶液；ならびに沈殿防止剤もしくは増粘剤を含むことができる水性および非水性の滅菌した懸濁剤が包含される。製剤は、単位用量もしくは複数用量容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルにおいて与えることができ、そして使用直前に滅菌した液状担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。ワクチン製剤はまた、水中油滴系および当該技術分野において既知である他の系のような、製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含むこともできる。投与量はワクチンの比活性により決まり、そして日常的な実験により容易に決定することができる。
【０１２３】
さらに別の態様として、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする遺伝子の発現は、発現ブロッキング技術を用いて阻害することができる。既知のそのような技術は、内部で作製されるかもしくは外部から投与されるいずれかの、アンチセンス配列の使用を伴う（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照）。あるいはまた、遺伝子と三重らせん（「トリプレックス」）を形成するオリゴヌクレオチドを提供することができる（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３７０３；Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を参照）。これらのオリゴマーは、それ自体投与することができ、もしくは関連オリゴマーをインビボで発現することができる。合成アンチセンスもしくはトリプレックスオリゴヌクレオチドは、修飾塩基もしくは修飾バックボーンを含んでなることができる。後者の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオエートもしくはペプチド核酸バックボーンが包含される。そのようなバックボーンは、ヌクレアーゼによる分解からの保護を与えるためにアンチセンスもしくはトリプレックスオリゴヌクレオチドに導入され、そして当該技術分野において周知である。これらのおよび／もしくは他の修飾バックボーンで合成されるアンチセンスおよびトリプレックス分子もまた、本発明の一部をなす。
【０１２４】
細胞における標的遺伝子の発現を阻害する別の方法として、部分的なもしくは完全に二本鎖の特徴を有するＲＮＡを細胞にもしくは細胞外環境に導入する。阻害ＲＮＡを製造するために標的遺伝子の一部からのヌクレオチド配列を選択する点において阻害は特異的である。該ＲＮＡは、重合したリボヌクレオチドの１本もしくはそれ以上の鎖を含んでなることができ；それはホスフェート−糖バックボーンもしくはヌクレオシドのいずれかへの修飾を含むことができる。二本鎖構造は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖もしくは２本の相補鎖により形成することができる。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝子阻害の標的となる点において配列特異的である。標的配列の一部と同一であるヌクレオチド配列を含有するＲＮＡが好ましい。ＲＮＡ阻害技術の例は、国際特許出願ＷＯ９９／３２６１９に見出すことができる。
【０１２５】
さらに、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現は、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを用いることにより阻害することができる。リボザイムは、天然もしくは合成のものであることができる触媒活性ＲＮＡである（例えば、Ｕｓｍａｎ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ（１９９６）６（４），５２７−３３を参照）。合成リボザイムは、選択した位置で上記のｍＲＮＡを特異的に切断するように設計され、それにより機能性ポリペプチドへの該ｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。リボザイムは、ＲＮＡ分子に通常存在するように、天然のリボースホスフェートバックボーンおよび天然の塩基で合成することができる。あるいはまた、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護を与えるために非天然のバックボーンで合成することができ（例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、そして修飾塩基を含有することができる。
【０１２６】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の不十分な発現と関連する異常な症状を処置するために、いくつかの方法もまた利用可能である。１つの方法は、製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて、本発明のポリペプチドを活性化する化合物、すなわち、上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を被験体に投与してそれにより異常な症状を軽減することを含んでなる。あるいはまた、被験体における関連細胞による哺乳類プリンパーミアーゼの内因的生産をもたらすために遺伝子治療を用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に説明するように、複製欠損性レトロウイルスベクターにおける発現用に設計することができる。次に、レトロウイルス発現構築物を単離し、そしてパッケージング細胞が今度は興味のある遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生産するように本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞に導入することができる。これらの生産細胞は、インビボで細胞を設計することおよびインビボでのポリペプチドの発現のために被験体に投与することができる。遺伝子治療の概略は、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中に引用される参考文献），Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ  Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ａ  Ｐ  Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）を参照。別の方法は、適当な製薬学的担体と組み合わせて本発明のポリペプチドの治療量を投与することである。
【０１２７】
さらなる態様として、本発明は、製薬学的に許容しうる担体もしくは賦形剤と組み合わせて、本発明のポリペプチドの可溶性形態のようなポリペプチド、アゴニスト／アンタゴニストペプチドもしくは小分子化合物の治療的に有効な量を含んでなる製薬学的組成物を提供する。そのような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明はさらに、本発明の上記の組成物の成分の１つもしくはそれ以上を詰めた１つもしくはそれ以上の容器を含んでなる製薬学的パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でもしくは治療化合物のような他の化合物とともに用いることができる。
【０１２８】
組成物は、例えば全身もしくは経口経路による、投与の経路に適合させる。全身投与の好ましい形態には、典型的には静脈内注射による、注射が包含される。皮下、筋肉内もしくは腹腔内のような他の注射経路を用いることができる。全身投与の代わりの手段には、胆汁塩もしくはフシジン酸もしくは他の溶剤のような浸透剤を用いる経粘膜および経皮投与が包含される。さらに、本発明のポリペプチドもしくは他の化合物を腸溶性もしくはカプセル化製剤に調合することができる場合、経口投与もまた可能であることができる。これらの化合物の投与はまた、パッチ、軟膏、泥膏、ゲルなどの形態で、局所的および／もしくは局部的であることもできる。
【０１２９】
必要な投薬量範囲は、本発明のペプチドもしくは他の化合物の選択、投与の経路、製剤の性質、被験体の症状の性質、および主治医の判断により決まる。しかしながら、適当な投薬量は、被験体のｋｇ当たり０．１〜１００μｇの範囲である。しかしながら、利用可能な化合物の多様性および様々な投与経路の異なる効率を考慮すると必要な投薬量の幅広いバリエーションが予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与より高い投薬量を必要とすると予想される。これらの投薬量レベルのバリエーションは、当該技術分野において十分に理解されているように、最適化のための標準的な実験ルーチンを用いて調整することができる。
【０１３０】
処置に用いるポリペプチドはまた、上記のような「遺伝子治療」と呼ばれることが多い治療法において、被験体中で内生的に作製することもできる。従って、例えば、被験体からの細胞をエクスビボでポリペプチドをコードするようにＤＮＡもしくはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターの使用により操作することができる。次に、これらの細胞を被験体に導入する。
【実施例１】
【０１３１】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによりさらによく理解されるが、これらはその後に続く請求項にさらに十分に記述されているような本発明を説明するにすぎないことを当業者は容易に理解する。さらに、本願の全体にわたって、様々な公開が引用される。これらの公開の開示は、本発明が関連する最新技術をさらに十分に記述するために本願に引用することにより本明細書に組み込まれる。
実験方法
動物飼育および処理−オスのトランスジェニックＣＲＦ過剰発現Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＣＲＦ−ＯＥもしくはＴＧ）およびそれらの野生型同腹子（ＷＴ）は、動物ケアのための全ての国および欧州の必要条件を満たす特別な無菌設備において維持した。マウスは、餌および水を自由に入手できる１２時間の明暗サイクル（７：００  ＥＳＴに点灯する）を有する温度と湿度が調節された動物コロニーに実験の開始４週前に個々に収容した。処理の前に３ヶ月齢のマウスを各々４匹の野生型および４匹のトランスジェニック動物を含んでなる３群にわたって無作為に選んだ。１つの群には処理を与えず、第二の群には賦形剤注射を５日、１日に２回（１０％シクロデキストラン（ＣＤ）、ｐＨ４）与え、そして第三の群には同じ処方計画に従って１０％のＣＤ中１０ｍｇ／ｋｇのＣＲＨ−Ｒ１特異的アンタゴニストＲ１２１９１９を与えた。最後の処理の１６時間後に動物を脳領域の切除およびその後のＲＮＡの単離のために殺した。
サンプル調製−トランスジェニックおよび野生型動物から肉眼的に以下の脳領域を切除した：下垂体、小脳、側頭領域、海馬、前頭皮質および側座核。脳組織は、Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５グラインダー（ＩＫＡ−ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を用いてトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において均質化した。全ＲＮＡを製造業者の説明書に従ってトリゾールを用いて抽出した。全ＲＮＡをカラム上でＤＮアーゼＩ処理とともにＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてさらに精製した。
マイクロアレイハイブリダイゼーション−ｃＲＮＡを下記のように調製した。逆転写は、Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）２４プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０μｇの全ＲＮＡで４２℃で１時間行った。第二鎖ｃＤＮＡ合成は、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１６℃で２時間行った。フェーズロックゲル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いたフェノール−クロロホルム抽出の後に、インビトロ転写をビオチン標識リボヌクレオチドでのＢｉｏａｒｒａｙ高収量ＲＮＡ転写産物ラベリングキット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて３７℃で６時間行った。ｃＲＮＡサンプルをＱｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙカラム上で精製し、続いて９５℃で３５分間断片化した。ｃＲＮＡ収量は、５０〜１００μｇの間であった。サンプルをＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で処理した。各サンプルの品質を調べるために、５μｇの標識ｃＲＮＡをＴｅｓｔ２アレイ上で行った。実際の実験は、ＵｎｉＧｅｎｅデータベース（Ｂｕｉｌｄ  ７４）からの約１２，０００個の全長マウス遺伝子およびＥＳＴクラスターを調べるプローブ組を含有するマウスゲノムＵ７４Ａｖ２アレイ上で行った。ハイブリダイゼーションは、１５μｇのｃＲＮＡを用いて連続回転下で４５℃で１６時間行った。アレイは、アフィメトリックスフルイディクスステーションにおいてストレプトアビジン／フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）を用いて染色し、続いて抗ストレプトアビジン抗体および二次ＳＡＰＥ染色で染色した。次に、アレイをＨＰ−レーザースキャナーで走査し、そしてデータをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で解析した。この段階でスケーリングもしくは正規化を行わなかった。実験の質は、提示コール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率に基づいて評価した（表を参照）。
【０１３２】
【表１】
0004733390.tif 000002
【０１３３】
ＲＮＡの低い収量もしくは低い提示コール率もしくは逸脱する３’／５’比を有するサンプルは、その後の解析から除いた。解析に使用した動物の数を表に示す。
【０１３４】
【表２】
0004733390.tif 000003
【０１３５】
データ解析および遺伝子の選択
各アレイ上の生強度は、以下のアルゴリズムを用いて正規化した：
【０１３６】
【数１】
0004733390.tif 000004
【０１３７】
基本的に、このアライメントは、測定される平均に対する１つのアレイの平均強度を定め、この正規化は、ハイブリダイゼーション、洗浄および染色におけるアレイごとのバリエーションを補正し、最終的にアレイ間の妥当な比較を可能にする。正規化の後に、データを加重スペクトルマッピング解析（ＳＭＡ）を用いて解析した（７）。加重スペクトルマッピングは、データセット内の分散の大部分を説明する２つの最も高い主成分を表す特殊化した視覚化と組み合わせたデータのダブルセンタリング（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）を含む非監視（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）多変量解析法である。ダブルセンタリングは、アレイデータの「サイズ」成分を取り除くが、この情報は、それぞれのサンプル（四角で示す）および遺伝子（丸で示す）のサイズを表す記号の面積によって視覚化において再導入される。残っているのは、データ表の異なる遺伝子間のコントラストおよび異なるサンプル間のコントラストである。これらのコントラストは、アルゴリズムにより行われる対数変換による比率として表すことができる。コントラストは、異なるサンプルに対する異なる遺伝子の特異性として理解することができる。逆に、それらはまた、遺伝子のいくつかに対する異なるサンプルの特異性もしくは優先もさす。従って、ＳＭＡは遺伝子とサンプルの間の相互作用の視覚化を提供すると言うことができる。この方法は、大きいマイクロアレイデータセットの減少を可能にし、そして視覚的に調べそしてそれによりデータにおける遺伝子および／もしくは対象のクラスターを同定する手段を提供する。従って、スペクトルマップにおいて一緒にクラスター化するサンプルは、類似していると解釈することができる。これに対して、軸もしくは中心の反対の場所に位置するサンプルは、異なっていると解釈することができる。
【０１３８】
この全体的分析に加えて、群間で異なる発現レベルを有する個々の遺伝子の同定は、マイクロアレイデータの有意性解析（ＳＡＭ）を用いて同定した（８）。ＳＡＭは、１組の遺伝子特異的ｔ検定を取り入れることにより発現の統計的に有意な変化を有する遺伝子を同定する。古典的なｔ検定と対照的に、この遺伝子特異的ｔ検定は、特定の遺伝子で認められる分散を考慮に入れるだけではなく、測定する全ての遺伝子にわたる全体的分散を対象とするいわゆる誤差も含む。閾値より大きいスコアを有する遺伝子は、潜在的に有意であると見なされる。これらの潜在的に有意に変化した遺伝子の中の偽陽性の数を概算するために、ＳＡＭは順列を使用して偽発見率を概算する。この目的のためにｔ値を測定の順列に対して反復して計算する。閾値は、遺伝子のより小さいもしくはより大きい組を同定するために調整することができ、そして対応するＦＤＲを計算する。有意に変化した遺伝子の数および対応するＦＤＲに影響を与える閾値差分に加えて、サンプル間で発現のほんの限られた差異のみを示す遺伝子を除くために変化倍数閾値を課すことができる。これらの変化は、おそらく、生物学的観点から見てほとんど重要ではない。
【０１３９】
既定の脳領域上で得られる発現データのＫ平均クラスタリングをＯｍｎｉＶｉｚプログラムを用いて実施した。全てのサンプルにおいて存在しなかった全ての記録を除き、そして２０未満の全てのシグナルを２０に設定した。これは、同様の挙動を有する遺伝子のクラスタリングを可能にした。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ−マイクロアレイデータを、リアルタイムＰＣＲ解析を用いて確かめた。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダムヘキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて０．５μｇの全ＲＮＡで行った。定量的ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲキットを用いてＡＢＩＰｒｉｓｍ  ７７００サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ｃＤＮＡの連続希釈物を用いてβ−アクチン、ＣＲＨ受容体１（Ｃｒｈ−Ｒ１）、ＣＲＨ受容体２（Ｃｒｈ−Ｒ２）、ニューロテンシン受容体１（Ｎｔｓｒ１）、ニューロテンシン受容体２（Ｎｔｓｒ２）、ニューロテンシン受容体３（Ｎｔｓｒ３）、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１（Ｈｓｄ１１Ｂ１）、血清／グルココルチコイド調節キナーゼ（Ｓｇｋ）および興味のある遺伝子（プライマーの配列は表を参照）の濃度の対数に対する閾値サイクルの標準曲線を作製した。標準曲線から計算される線形回帰直線は、各脳領域で異なる処理群からのＲＮＡサンプルにおける転写産物レベルの決定を可能にした。
【０１４０】
【表３】
0004733390.tif 000005
【０１４１】
オートラジオグラフィー−成体オストランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよびそれらの野生型同腹子の脳上での［１２５Ｉ］ニューロテンシン結合およびフィルムＸ線写真は、Ｍｏｙｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１２）により以前に記述されているように行った。２０ミクロン厚切片を０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのＥＤＴＡ、５Ｘ１０−５Ｍのバシトラシン、２μｇ／ｍｌのキモスタチンおよび４μｇ／ｍｌのロイペプチンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４において０．１ｎＭのモノヨード［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−ニューロテンシン（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とインキュベーションした。１μＭの天然のニューロテンシンの存在下で追加切片をインキュベーションすることにより非特的染色を評価した。Ｎｔｓ２を遮断した［１２５Ｉ］ニューロテンシン結合は、Ｎｔｓ２アンタゴニストの１μＭのレボカバスチンの存在下で海馬切片上で行った。フィルムＸ線写真のデンシトメトリー分析は、ＭＣＩＤ  Ｍ４デジタルアナライザー（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ  Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて行った。各切片上で構造を対話形式で描き、そして輪郭を描いた領域においてピクセルグレーレベルを測定した。共感光した１２５Ｉ−基準を用いてピクセルグレーレベルを組織のｍｇ当たりの放射活性に転化し、そして測定領域にわたって平均した。データは、ＳＰＳＳ  １１．０ソフトウェアを用いて二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）および付随するボンフェロニのポストホックテスト（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）により統計的に分析した。
結果および説明
中枢神経系への長期ＣＲＨ投与の影響を研究するために、ＣＲＨ過剰発現マウスから得られる脳領域における遺伝子発現プロファイルをそれらの野生型同腹子のものと比較した。さらに、これらの発現プロファイルへのＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニスト投与の影響を研究した。本研究において調べる脳領域には、下垂体、側座核、前頭皮質、側頭領域、海馬および小脳が包含される。ＣＲＨ受容体１（ＣＲＨ−Ｒ１）および２（ＣＲＨ−Ｒ２）の発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴｑ）を用いて脳領域において測定した。ＣＲＨ−Ｒ１は容易に検出可能であったが、これらの脳領域においてＣＲＨ−Ｒ２に対して信頼できる測定を得ることができなかった。これらの脳領域におけるＣＲＨ受容体の認められた発現レベルは、小脳および前頭皮質における高レベルのＣＲＨ−Ｒ１ならびに主に末梢受容体であるＣＲＨ−Ｒ２のより低い発現レベルの以前の報告と一致する（図１を参照）（９）。
【０１４２】
異なる動物由来の異なる脳領域から単離されたＲＮＡを１２０００個のマウスＥＳＴを含有するアレイ上で別個に処理した。正規化後にデータを脳領域ごとに解析した。データの第一通過試験（ｆｉｒｓｔ  ｐａｓｓ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）は、処理群および遺伝子型に関して遺伝子発現応答の全体的図式解釈を可能にする、スペクトルマップ解析（ＳＭＡ）を用いて行った。ＳＭＡは、下垂体を除く全ての領域に対して処理群間の発現のグロス変化（ｇｒｏｓｓ  ｃｈａｎｇｅ）を示さなかった。全ての脳領域においてトランスジェニック動物（Ｔｇ）由来の大部分のサンプルは、野生型動物（ＷＴ）由来のものと異なる位置でクラスター化している。これは下垂体のレベルで最も明らかであり、ここで、発現パターンの明瞭な違いがＴｇおよびＷＴ動物間で認められ、サンプルはスペクトルマップにおいて反対の位置でクラスター化している。総合するとこれらのデータは、ＣＲＨに生涯にわたってさらされることが全ての研究した脳領域における遺伝子発現プロファイルの変化を誘導し、最も顕著な影響が下垂体において認められることを示唆する。発現プロファイルのこれらの変化は、下垂体スペクトルマップにより例示されるようにＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストでの５日の処理により影響を受けない（もしくは限られた程度にのみ）。
【０１４３】
有意に変化した遺伝子を同定するために、マイクロアレイデータの有意性解析（ＳＡＭ）アルゴリズムを適用した。ＳＭＡと一致して、限られた数の遺伝子のみが大部分の脳領域において有意に変化したことが見出された（補足情報を参照）。しかしながら、下垂体では３００個より多くの遺伝子がＷＴとＴＧ動物間で異なって発現された。ＣＲＨ過剰発現マウスの研究した脳領域における遺伝子発現プロファイルは、これらの動物に存在するこれまで認識されていない恒常性維持機構を解明した。一般に、認められた発現プロファイルは、トランスジェニック動物（ＴＧ）において影響を受ける少数の経路を提示する。
【０１４４】
ＴＧ動物は、ＷＴ動物におけるより６〜８倍高い血漿グルココルチコイドレベルを有する（図３を参照）。結果として遺伝子発現プロファイルは、これらの高レベルのコルチコステロンへの適応を示す。これは、海馬における１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（１１β−ＨＳＤ１）のようなグルココルチコイド受容体シグナリングのエンハンサーのダウンレギュレーションおよびＦＫ５０６結合タンパク質５（Ｆｋｂｐ５）のようなこのシグナリング経路の推定上のリプレッサーのアップレギュレーションの両方により行われる（図４を参照）。
【０１４５】
組織グルココルチコイド濃度は、血漿ホルモンレベルによってだけでなく、活性グルココルチコイドおよび不活性１１−ケト型を局所的に相互転化する２つの細胞内１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１および２型）によっても決定される。脳における主要アイソフォームの１１β−ＨＳＤ１は、１１−ケト型から活性グルココルチコイドを再生する、主要１１β−還元酵素として機能するようである。１１β−ＨＳＤ１欠損マウスを研究することにより、１１β−ＨＳＤ１によるグルココルチコイドの細胞内再生はＨＰＡ系制御において重要な役割を果たすことが示された。拘束ストレスに応答してこれらのマウスは増大したＡＣＴＨおよびコルチコステロンレベルを示す。さらに１１β−ＨＳＤ１欠損マウスは、ＨＰＡ活性化の外因性コルチゾール抑制への感受性が低く、これらの動物における減少したグルココルチコイドフィードバックを示唆する。ＣＲＨ過剰発現体の海馬における１１β−ＨＳＤ１の有意なダウンレギュレーションを考慮するとこれらのマウスは改変されたグルココルチコイドフィードバックを有すると予想することができる。
【０１４６】
Ｆｂｐ５は、試験した全ての脳領域においてアップレギュレーションされているのが見出され、少数においてのみ有意であるが、全ての他のものは同様の傾向を示した（図４）。イムノフィリンＦｋｂｐ５のＦｋｂｐ４との交換は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の活性化のための重要な第一段階であるという結果は興味深い。リスザルおよび一般に新世界霊長類属において、Ｆｋｂｐ５はグルココルチコイド受容体結合の強力なインヒビターとして同定されている。Ｆｋｂｐ５の誘導の我々の結果は、持続する高レベルの循環グルココルチコイドに応答したＧＲの減衰として説明することができる。
【０１４７】
改変されたグルココルチコイドシグナリングの別の指標は、小脳、側座核および側頭領域における血清／グルココルチコイドキナーゼ（Ｓｇｋ）のアップレギュレーションである（図４）。Ｓｇｋはセリン／トレオニンプロテインキナーゼであり、その転写はグルココルチコイドおよび血清により誘導され、そして非等張および等張細胞容積変化により調節される。ラット脳において、Ｓｇｋ  ｍＲＮＡレベルは、海馬を包含する側頭葉における脱水により増加されたことが示されている。同じ研究において、ＳｇｋはニューロンＫ＋チャンネルＫｖ１．３の活性を著しく増加することが示され、Ｓｇｋがニューロン興奮性の調節に関与する可能性があることを示唆する。興味深いのは、ラットにおける空間学習の記憶の固定のＳｇｋによる促進に関する最近の報告である。Ｓｇｋは、習得の遅いものに対して習得の早いものにおいて異なって発現されることが示され、さらに、海馬のＣＡ１領域へのＳｇｋのトランスフェクションは、増加した水迷路成績をもたらすことが示された（１０）。その点に関して、注目すべきは、この研究はＣＲＨ過剰発現体が高レベルのＳｇｋ  ｍＲＮＡを示すことを明示するが、これらの動物は深刻な学習障害を示すことが報告されていることである（１１）。
【０１４８】
ニューロテンシン受容体２（Ｎｔｓｒ２）は、下垂体を除いた海馬および側座核を包含するいくつかの脳組織においてダウンレギュレーションされているのが見出された（図５を参照）。ニューロテンシン（ＮＴ）は、それが神経伝達物質および神経修飾物質として役割を果たすＣＮＳの多数の領域において高濃度で存在するトリデカペプチドである。ＮＴを脳室内注入により投与する場合、自発運動低下、低体温症、無痛覚症および減少した餌消費を包含する様々なＣＮＳ効果が認められる。ＮＴの３つの受容体が同定されている（Ｎｔｓｒ１、２および３）。Ｎｔｓｒ１欠損マウスの研究は、この受容体が体温、摂食行動および自発運動低下へのＮＴの効果に関与することを示した。一方、Ｎｔｓｒ２は、マウス脳においてアンチセンス戦略を適用することにより示されるようにＮＴの鎮痛効果を説明するように思われる。Ｎｔｓｒ２ダウンレギュレーションの結果は、ＲＴｑによるＮＴ受容体ファミリーの他のメンバーの発現レベルを調べることを促した。Ｎｔｓｒ３は、試験した全ての領域において発現のいかなる変化も示さなかった。対照的にＮｔｓｒ１は、ＣＲＨ過剰発現体において有意にダウンレギュレーションされ、該効果は海馬において最も顕著であった（図５）。ダウンレギュレーションのレベルは、Ｎｔｓｒ２でよりＮｔｓｒ１で高かった。特筆すべきは、未処理の動物と比較して賦形剤処理動物（ｔｇおよびＷｔの両方）におけるＮｔｓｒ１およびＮｔｓｒ２の両方のアップレギュレーションであった。発現レベルのこの増加はＲ１２１９１９処理動物において取り除かれ、繰り返されるストレスがＮｔｓｒ１（およびより少ない程度にＮｔｓｒ２）の発現を誘導したことおよびこの誘導はＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストにより取り消すことができる（最後の処理の１６時間後でさえ）ことを示唆する。我々のデータは、ＣＲＨ過剰発現動物におけるＣＲＨとＮＴ系の間の関連を初めて示し、そして繰り返されるストレスにおけるこれらのＮＴ受容体の役割を示唆する。
【０１４９】
Ｎｔｓ１およびＮｔｓ２  ｍＲＮＡの変化をタンパク質発現レベルで評価するために、脳切片上での［１２５Ｉ］ＮＴ結合のオートラジオグラフィーにより受容体発現（Ｎｔｓ１〜３）を評価した。作製データは、ＷＴ動物に対してＣＲＦ−ＯＥにおいて海馬のＣＡ１〜ＣＡ２領域に隣接する放線層（−２１．８±３．０％、ｐ＜０．０５）および前帯状皮質（−２２．２±２．７％、ｐ＜０．０５％）における［１２５Ｉ］ＮＴ結合能力の全体的に非選択的な（Ｎｔｓ１〜３）、遺伝的に決定されたダウンレギュレーションを示した（図６）。嗅球、側座核および中隔では変化は見られなかった。
【０１５０】
ＷＴおよびＣＲＦ−ＯＥ動物の両方において、賦形剤処理動物の［１２５Ｉ］ＮＴ結合能力は、未処理の動物に比較して改変されなかった。しかしながら、ＣＲＦ１アンタゴニストＲ１２１９１９の亜慢性投与は、ＷＴおよびＣＲＦ−ＯＥ動物の両方において、賦形剤処理動物と比較してＣＡ１〜ＣＡ２領域に隣接する放線層の［１２５Ｉ］ＮＴ結合能力の上昇傾向（ｐ＝０．０５７）をもたらした。さらに、Ｒ１２１９１９処理ＣＲＦ−ＯＥ動物における［１２５Ｉ］ＮＴ結合のレベルは、未処理のＷＴ動物において測定されるレベルに等しかった（図６）。
【０１５１】
異なる受容体間を区別するために［１２５Ｉ］ＮＴ結合実験をＮｔｓ２特異的アンタゴニストのレボカバスチンの飽和濃度の存在下で行った。以前の結合実験の結果に基づいて、海馬脳切片に焦点を当てた（図７）。［１２５Ｉ］ＮＴ結合能力は、放線層（−６３．８±６．５％、ｐ＜０．００１％）、脳梁膨大後部（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ）顆粒皮質（−４９．４±７．５％、ｐ＜０．００１％）および側頭皮質（−３４．８±３．５％、ｐ＜０．００１％）において、ＷＴ動物と比較した場合にＣＲＦ−ＯＥにおいてダウンレギュレーションされた。
【０１５２】
ＷＴおよびＣＲＦ−ＯＥ賦形剤処理マウスの海馬において、Ｎｔｓ１  ｍＲＮＡレベルはアップレギュレーションされたが（図５）、そのような改変は［１２５Ｉ］ＮＴ結合のレベルで賦形剤処理動物において認められなかった（図６および７）。全体的にＮｔｓ１〜３への［１２５Ｉ］ＮＴ結合能力は、ＷＴ動物に対して比較した場合にＣＲＦ−ＯＥにおける海馬の放線層および前帯状皮質でダウンレギュレーションされた（図６）。さらに、Ｎｔｓ２特異的アンタゴニストのレボカバスチンでＮｔｓ２受容体を遮断した場合に、［１２５Ｉ］ＮＴ結合能力のダウンレギュレーションは、ＷＴ同腹子に対してＣＲＦ−ＯＥ動物における海馬の放線層、脳梁膨大後部顆粒皮質および側頭皮質でさらにいっそう顕著であった（図７）。Ｎｔｓ３もまた記述した領域において発現されるが、Ｎｔｓ３のＮＴに対する親和性はＮｔｓ１のものよりかなり低く、［１２５Ｉ］ＮＴがＮｔｓ１に主に結合したことを示唆する。さらに、Ｎｔｓ３  ｍＲＮＡの改変はＲｔｑにおいて見られなかったので、このダウンレギュレーションを完全にＮｔｓ１に起因すると考える。
【０１５３】
際立って、Ｎｔｓ１（Ｎｔｓ２ではそれほど顕著ではない）ｍＲＮＡ発現は、賦形剤で処理したＣＲＦ−ＯＥおよびＷＴ動物においてアップレギュレーションされた。このｍＲＮＡ増加は、繰り返される注射ストレスにより誘導される可能性があり、そしてＣＲＦ１アンタゴニストＲ１２１９１９の亜慢性投与により相殺された。さらに、これは受容体レベルで翻訳されない。［１２５Ｉ］ＮＴは、未処理のおよび賦形剤で処理したＷＴおよびＣＲＦ−ＯＥマウスの海馬においてＮｔｓ１への等しい結合を示した（図６、７）。しかしながら、総ＮＴ結合レベルで、Ｒ１２１９１９は［１２５Ｉ］ＮＴ結合のダウンレギュレーションを相殺した。ＣＲＦ−ＯＥでは、Ｒ１２１９１９は、未処理の動物におけるものと等しい程度に放線層において［１２５Ｉ］ＮＴ結合レベルを増加した（図６）。これは、ＮＴ受容体発現の調節にＣＲＦ１受容体が関係していると見なすことができる。
【０１５４】
以前の報告は、グルココルチコイドが初代視床下部ニューロン培養物および室傍（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）視床下部核（ＰＶＮ）においてＮＴ  ｍＲＮＡ発現（＋９２％）およびＮＴ放出（＋１００％）を増加することを示す（Ｎｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓｃａｒｃｅｒｉａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓｏｕａｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。興味深いことに、冷水における強制水泳、固定化ストレスおよび尾ショックストレスのような異なるストレス因子もまた、ラットのＰＶＮおよび扁桃体中心核においてＮＴ  ｍＲＮＡの増加を導く。ＮＴは、次に、脳室内投与により示されるようにＨＰＡ系活性化をもたらすことができる。この活性化は、非特異的ＣＲＦアンタゴニストのαへリックスＣＲＦそしてＮｔｓ１〜２アンタゴニストのＳＲ−４８４５０の両方により阻止することができる（Ａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌｅｐｅｅ−Ｌｏｒｇｅｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｎｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。高ＮＴレベルはまた、Ｎｔｓ１およびＮｔｓ２もダウンレギュレーションする（Ｈｅｒｍａｎｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｔｅａｕｘ，１９９８）。ＣＲＦ−ＯＥにおけるＮｔｓ１〜２レベルの認められるダウンレギュレーションは、それらの増加したグルココルチコイドレベルに関連すると主張することができる。副腎皮質機能亢進もしくはデキサメタゾン投与がＰＶＮにおいてＮｔｓ１  ｍＲＮＡの選択的ダウンレギュレーションをもたらし（４０〜７０％）（Ｎｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）そしてデキサメタゾンが初代視床下部ニューロン培養物において［１２５Ｉ］ＮＴ結合を減少する（Ｓｃａｒｃｅｒｉａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）という結果は、この考えを裏付ける。従って、Ｎｔｓ１〜２ダウンレギュレーションは、それ故に、さらなるＮＴ誘発性ＣＲＦ放出を妨げる可能性がある。総合すると、これらのデータは、脳辺縁領域におけるＨＰＡ系とＮＴ系との間の明らかな関連を示す。従って、ＮＴ系は、統合失調症および疼痛抑制における以前に提示された役割に加えて、繰り返されるストレスおよび不安において調節的な役割を有する可能性がある。
【０１５５】
影響を受ける他の経路には、細胞内カルシウムシグナリング／センシング（ヒポカルシン様１、カルサイクリン、．．．）、髄鞘形成（ミエリン、ミエリン結合糖タンパク質、．．．）、細胞増殖およびニューロン新生（Ｅｄｇ２、Ｉｄ２、ＧＡＢ１、．．．）ならびに細胞外マトリックス形成（デコリン、ブレビカン、．．．）が包含される。
【０１５６】
ヒポカルシン様１（Ｈｐｃａｌ１）は、神経伝達物質放出の調節、サイクリックヌクレオチド代謝の制御、ホスホイノシチドの生合成およびイオンチャンネルの間接的調節を包含する多様なプロセスにおいて役割を果たすＣａ２＋結合タンパク質のファミリーのニューロンカルシウムセンサーファミリーに属する。ヒポカルシンは、アポトーシスのニューロンインヒビター（ＩＡＰ）タンパク質によりもたらされるアポトーシスからの保護を増強する可能性があることが示されている。
【０１５７】
髄鞘形成、細胞増殖および細胞外マトリックス形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子において認められる発現の変化は、ＣＲＨ過剰発現体におけるニューロン新生のダイナミクスの変化を示唆する。この裏付けとして、内皮分化リゾホスファチジン酸Ｇタンパク質共役受容体２（Ｅｄｇ２）、増殖因子受容体結合タンパク質２関連タンパク質１（Ｇａｂ１）、ＤＮＡ結合のインヒビター２（Ｉｄ２）および繊維芽細胞増殖因子受容体２（Ｆｇｆｒ２）を含む主に側座核において認められる発現の変化がある。
【０１５８】
下垂体はＣＲＨの主要標的器官であるので、ＣＲＨ発現体に存在するような長期のより高いレベルのＣＲＨは、トランスジェニック動物の下垂体における発現プロファイルの大きな変化を誘導することが予想される。下垂体の活性化状態は、いくつかのカリクレインの高発現レベルにより例示され、それらは下垂体から分泌される多様なホルモンのプロセシングにおいてプロタンパク質変換（ｃｏｎｃｅｒｔｉｎｇ）酵素として役割を果たす。特筆すべきは、プレプロエンケファリンＡ（Ｗｔに対してＴｇにおいて１０倍高い）のそしてより低い程度にプロジノルフィン（Ｗｔに対してＴｇにおいて２倍高い）のより高いレベルである。ＣＲＨ過剰発現体における内因性オピオイドのより高いレベルのこの結果は、これらのオピオイドが慢性ストレスへの生物の適応における主要な調節系であり、持続するストレス応答がもたらし得る潜在的に有害な効果を有するストレス因子が脳に課す応答のバランスをとるという考えと一致する。下垂体における他の興味深い結果には、脳における最も一般的な神経栄養因子の１つであるＢｄｎｆ  ｍＲＮＡレベルの、そして小胞性阻害アミノ酸輸送体（Ｖｉａａｔ）の上昇が包含される。Ｂｄｎｆのこの増加は、海馬におけるＢｄｎｆのレベルを減少する急性および慢性ストレスの報告と対照的である（１１）。
【０１５９】
要するに、ＣＲＨ過剰発現マウスのいくつかの脳領域の遺伝子発現プロファイリングは、これらの動物に存在するこれまで認識されていない恒常性維持機構を解明した。
【０１６０】
野生型同腹子と比較してＣＲＨ過剰発現マウスにおいて改変される遺伝子の同定は、慢性下垂体−副腎活性化のこの動物モデルのさらなる分子特性化を可能にする。我々は、ＣＲＨに長期さらすことの結果を遺伝子発現のレベルで評価するための手段を提供し、それは最終的に動物およびヒトの両方でストレス、不安もしくは鬱病における新規なマーカーの使用をもたらすことができる。さらに、ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストの投与は、下垂体レベルで該化合物のいくらかの効果が測定されるが、トランスジェニック動物において発現レベルの一般的な「正規化」をもたらさないことを示す。さらに、処理により課される繰り返されるストレスは、ニューロテンシン受容体１のような特定の遺伝子の遺伝子発現における応答を引き出すように思われる。この効果は、ＣＲＨ−Ｒ１特異的アンタゴニストにより取り消すことができ、ニューロテンシンとＣＲＨとの間の密接な関連を示唆する。
【０１６１】
【表４】
0004733390.tif 000006
【０１６２】
【表５】
0004733390.tif 000007
【０１６３】
【表６】
0004733390.tif 000008
［表１］  ＣＮＳにおけるＣＲＨ誘発性変化の重要なメディエーターであることが示される遺伝子の表。
【表７】
0004733390.tif 000009
［表２］  ＲＴ−ＰＣＲに使用するオリゴヌクレオチドの配列。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】異なるマウス組織におけるＣＲＨ−Ｒ１の発現レベル。脳領域の３匹の異なる動物由来の組織に定量的ＲＴ−ＰＣＲを適用した。
【図２】全ての調べた脳領域で得られるマイクロアレイデータのスペクトルマップ解析。四角は異なるサンプルを示し、一方、丸は遺伝子を示す。丸の直径は、遺伝子の平均強度に対応する。四角の間の距離は、サンプル間の類似性の尺度である。既定サンプルと遺伝子との正の関連（すなわち、その特定のサンプルにおけるその遺伝子のアップレギュレーション）は、図心（十字で示す）を通した共通線上の該遺伝子およびサンプルのポジショニングをもたらす。異なる領域を以下の順に示す（Ａ）小脳、（Ｂ）前頭皮質、（Ｃ）海馬、（Ｄ）側座核、（Ｅ）側頭領域、（Ｆ）下垂体。
【図３】マイクロアレイ解析に使用する動物におけるＨＰＡ系パラメーター。血漿コルチコステロンレベルは、野生型動物と比較してＣＲＨ過剰発現体において６〜８倍高い。ＡＣＴＨレベルにおいて有意な差異は認められなかった。
【図４】グルココルチコイドシグナリングに関与する遺伝子のマイクロアレイおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲデータ。（Ａ）海馬における１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（ＨＳＤ１１ｂ１）のダウンレギュレーションを示すアレイデータを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（レベルはβ−アクチンに対して正規化する）を用いて確かめた。（Ｂ）グルココルチコイド受容体活性化のモジュレーターのＦＫ５０６結合タンパク質５（Ｆｋｂｐ５）の海馬および前頭皮質における有意なアップレギュレーションを示すアレイデータ。（Ｃ）血清／グルココルチコイド調節キナーゼ（Ｓｇｋ）でのアレイデータを前頭皮質における定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確かめた。
【図５】ニューロテンシン受容体１および２のマイクロアレイおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲデータ。（Ａ）海馬で認められるＣＲＨ過剰発現マウスにおけるニューロテンシン受容体２（Ｎｔｓｒ２）のダウンレギュレーションを定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて確証した。ニューロテンシン受容体１（Ｎｔｓｒ１）のレベルは、マイクロアレイ分析において検出限界未満であった。（Ｂ）しかしながら、定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＣＲＨ過剰発現体におけるＮｔｓｒ１の同様のダウンレギュレーションを立証した。さらに、ｑＲＴ−ＰＣＲデータでの二元配置分散分析は賦形剤処理の有意な効果を示し、それはＲ１２１９１９での処理により明らかに取り除かれる。
【図６】凍結ガラス標本（ｇｌａｓｓ−ｍｏｕｎｔｅｄ）脳組織切片上で定量的オートラジオグラフィーによって決定される全てのＮＴＳ部位への［１２５Ｉ］ＮＴ結合（０．１ｎＭ、３０分、ＲＴ）。データは、各々少なくとも３つの異なるブレグマ切片上で決定される３匹の動物の平均ＩＯＤ±ＳＥＭとして表す。（＊）：ｐ＜０．０５を有する遺伝群間の差異。ＡＭＧ、ＡＣｅ、ＭｅＡ、ＢＭＡ、ＢＬＡを包含する扁桃；ＣＧ２、前帯状皮質；ＨＣ−ＳＲ、海馬−放線層；ＲＳＧ、脳梁膨大後部顆粒皮質；ＴＣ、側頭／頭頂葉皮質；Ｕ、未処理；Ｖｅ、賦形剤処理；Ｒ、Ｒ１２１９１９処理。
【図７】レボカバスチンによりＮｔｓ２部位を遮断した海馬切片内の構造上でのＮＴＳ１および３部位への［１２５Ｉ］ＮＴ結合。０．１ｎＭの［１２５Ｉ］ＮＴの結合（３０分、ＲＴ）は、凍結ガラス標本脳組織切片上で定量的オートラジオグラフィーによって決定した。データは、各々少なくとも３つの異なるブレグマ切片上で決定される３匹の動物の平均ＩＯＤ±ＳＥＭとして表す。（＊＊＊）：ｐ＜０．００１を有する遺伝群間の差異。ＳＮＣ；黒質緻密部；他の略語、図６の説明文を参照。
【図３】
0004733390.tif 000010
【図１】
0004733390.tif 000011
【図２Ａ】
0004733390.tif 000012
【図２Ｂ】
0004733390.tif 000013
【図２Ｃ】
0004733390.tif 000014
【図２Ｄ】
0004733390.tif 000015
【図２Ｅ】
0004733390.tif 000016
【図２Ｆ】
0004733390.tif 000017
【図４】
0004733390.tif 000018
【図５】
0004733390.tif 000019
【図６】
0004733390.tif 000020
【図７】
0004733390.tif 000021
【配列表】
0004733390000001.xml