(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素及びアセチルコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−４ｍｇ／ｍｌ及びアセチルコリンエステラーゼを５×１０−４〜１．５×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させて振動反応を起こし、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液に含まれるアセチルコリン濃度を算出するアセチルコリンの定量方法。
【請求項２】
前記半透膜は、透析膜である請求項１記載のアセチルコリンの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアセチルコリンの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリン（Acetylcholine,ACh）は神経伝達物質であり、副交感神経や運動神経の末端から放出され、神経刺激をある種のシナプスを通して伝える役目を果たしている。コリンの酢酸エステル化合物で化学式はCH3COOCH2CH2N+(CH3)3。アセチルコリンエステラーゼにより分解される。また血圧降下、また骨格筋収縮の作用もある。コリンとアセチルコエンチームAとからコリンアセチルトランスフェラーゼにより合成される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アセチルコリンをアセチルコリンエステラーゼで分解したのち得られるコリンを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それからアセチルコリンを定量するという３段階以上の操作が必要となる。また通常、酵素と基質である反応物を一緒の容器に入れ反応させると、生成物が時間とともに単調に増加し、最終的には平衡状態になる。従来はこの方法を用いて反応物に特異的に作用する酵素を使い生体物質の定量を行ってきた。これまでの酵素反応を利用したアセチルコリンの定量も例外ではなくこのような方法を利用している。
【０００４】
ところで、半透膜を用いて基質をゆっくりと酵素の溶液内に浸透させると、反応物や生成物の濃度が時間とともに周期的に増減する振動反応が起こる場合がある。例えば酵素としてカタラーゼを、基質として過酸化水素を用いると次の反応が起こって酸素が発生すると同時にこの逆反応も起ることがある。つまり溶存している酸素が振動する場合があるのである。但し、振動反応が起こるためには基質の適当な透過速度と生成物（この場合には酸素）の適度な排出が必要である。
【数１】
0004677558.tif 000002
なお、この系にもう一つの酵素であるグルコースオキシダーゼとこの酵素の基質であるグルコースを添加しておくとグルコースの濃度とともに振動の周期が長くなり、ある濃度範囲ではグルコース濃度と振動の周期が直線関係で、グルコースの定量に利用できることがわかっている。しかし、もともと非線形現象である振動反応をアセチルコリンの定量にまで適用することについては記載がない。
【０００５】
以上、本発明は、上記を鑑みアセチルコリンの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明に係るアセチルコリンの定量方法は、振動反応を利用する。これまでのコリンオキシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを利用した方法では、生成した過酸化水素をカタラーゼで分解させ生成した酸素量を測定するなど最低２段階の操作を必要とした。しかし振動反応を利用したこの方法では酸素量の振動を測定するだけで直接アセチルコリンの定量化が可能となる。また少量の試料で測定が可能となる。
【０００７】
また本発明に係るアセチルコリンの定量方法において、振動反応は過酸化水素を含む第一の溶液を、カタラーゼ、コリンオキシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含む第二の溶液に半透膜を介して浸透させることによって行う反応とすることも望ましい。また、半透膜は透析膜若しくはミリポアフィルターとすることも望ましい。
【０００８】
また本発明に係るアセチルコリンの定量方法において、第二の溶液は、カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−４ｍｇ／ｍｌ、アセチルコリンエステラーゼを５×１０−4〜１．５×１０−3ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることも望ましい。この範囲にすることにより、もともと非線形現象である振動反応を判別可能な程度の傾きを有する直線関係に近似させ、明確に定量化することができるようになる。カタラーゼが０．００５ｍｇ／ｍｌより小さい場合は振動反応の周期が不規則になってしまい、直線関係に近似することが難しくなる。また０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの場合であっても、コリンオキシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが５×１０−５ｍｇ／ｍｌおよび５×１０−４ｍｇ／ｍｌより小さいときは、直線関係に現した場合その傾きが小さく定量には不適当となり、１×１０−４ｍｇ／ｍｌおよび１．５×１０−3ｍｇ／ｍｌより大きいときにも振動反応の周期が不規則になってしまい、直線関係に近似することが難しくなる。
【０００９】
また本発明にかかるアセチルコリンの定量方法において、第一の溶液におけるアセチルコリン濃度は、２．５×１０−６〜２．５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内であることも望ましい。
【００１０】
また、本発明のアセチルコリンの定量方法は、過酸化水素及びアセチルコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ、コリンオキシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含む第二の溶液に半透膜を介して浸透させ、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第一の溶液に含まれるアセチルコリン濃度を算出するアセチルコリンの定量方法とする。なおこの場合において、半透膜は透析膜若しくはミリポアフィルターとすることも望ましい。
【００１１】
またこのアセチルコリンの定量方法においては、第二の溶液はカタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−４ｍｇ／ｍｌ、アセチルコリンエステラーゼを５×１０−４〜１．５×１０−3ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることも望ましい。この範囲にすることにより、もともと非線形現象である振動反応の周期とアセチルコリン濃度の関係を直線関係に近似させ、明確に定量化することができるようになる。
【００１２】
またこのアセチルコリンの定量方法においては、第一の溶液のアセチルコリン濃度は４×１０−５〜５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内であることが望ましい。
【００１３】
また本発明に係るアセチルコリンの定量装置は、過酸化水素及びアセチルコリンを含有する第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ、コリンオキシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含む第二の溶液を保持する第二の容器と、第一の容器と第二の容器との間に配置され、第一の溶液を第二の溶液に浸透させる半透膜と、第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、酸素電極に接続される溶存酸素計と、溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有することとする。
【発明の効果】
【００１４】
以上本発明は、振動反応を用いてその溶存酸素濃度を測ることにより簡単にアセチルコリンの定量を行うことができるため、その他途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
まず、本発明が利用する原理について図１を用いて説明する。
半透膜を挟んだ２つの容器の一方に、カタラーゼ、コリンオキシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを入れ、他方の容器に過酸化水素水溶液およびアセチルコリンの溶液を入れる。すると、過酸化水素水がゆっくりと半透膜を透過してカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。一方アセチルコリンもゆっくりと半透膜を透過し、アセチルコリンと反応してコリンを生成する。カタラーゼの反応により酸素が発生すると、コリンオキシダーゼがこの酸素を用いてアセチルコリンエステラーゼの作用によって生成したコリンを酸化し、過酸化水素を発生させる。即ちこの一連の流れが循環過程となり、しかもその過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。なおこの場合、酵素水溶液中に溶存している酸素の量を溶存酸素計で測定すると、溶存酸素の濃度は周期的に振動する。特にカタラーゼ等の諸条件が所定の濃度範囲にある場合は溶存酸素量の振動周期がアセチルコリンの濃度と直線関係になり、この関係を用いてアセチルコリンの定量に利用することができるようになる。即ちこれを利用してアセチルコリンが含まれている種々の状態に対しアセチルコリンの定量化が可能となる。なお、この場合においてカタラーゼの望ましい範囲としては、０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、アセチルコリンエステラーゼが５×１０−4〜１．５×１０−3ｍｇ／ｍｌの範囲であること、更にこの濃度範囲においてコリンオキシダーゼが５×１０−５〜１×１０−４ｍｇ／ｍｌであることが望ましい。この濃度範囲とすることにより、非線形な関係である振動反応の周期とアセチルコリンの濃度関係が直線関係になるためである。なお、過酸化水素水の濃度については、溶存酸素計の測定限度及び振動周期の規則性の観点から０．５〜１．０重量％の範囲であることが望ましい。なおこれより過酸化水素濃度が小さい場合、振動は不規則になるおそれがある。
【００１６】
以下本発明の実施例につき、図面を用いながら具体的に説明する。
【実施例１】
【００１７】
図２に本発明の実施例に係る装置（以下単に「本装置」という。）の図を示す。
図２に示すように本装置は、第一の容器１、第二の容器２、第一の容器と第二の容器とを繋ぐ接続管３、その接続管３の中に配置された半透膜４、第二の容器に挿入される酸素電極５、この酸素電極５に電気的に接続された溶存酸素計６、この溶存酸素計６に電気的に接続された情報処理装置７、を有して構成されている。
【００１８】
最初の状態において、第一の容器側には０．６％の過酸化水素水溶液２０ｍｌとアセチルコリン溶液０．１ｍｌが、第二の容器側にはカタラーゼ２．５ｍｇ、コリンオキシダーゼ０．０４５ｍｇ、アセチルコリンエステラーゼ０．５ｍｇを含む水溶液２５ｍｌが入れてある（カタラーゼ、コリンオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼを含む側の溶液を以下単に「酵素溶液」という。）。なお第一の容器１、第二の容器２のいずれもガラスにより構成されており、それぞれは上端が開いた円筒形状に形成され、内径は３ｃｍである。
【００１９】
接続管３は、第一の容器１、第二の容器２の間に配置され、これらの容器内を接続する。本実施例の接続管３も第一の容器１、第二の容器２と同様ガラスにより構成されており、第一及び第二の容器、接続管３は一体に構成されている。なお接続管の内径は１ｃｍである。
【００２０】
半透膜４は、溶液における成分の一部は通すが他の成分は通さない膜であって、本実施例では第一の容器１と第二の容器２との間に配置される流路３に設けられた透析膜を用いている（材質：αセルロース、分画分子量１２，０００〜１４，０００）。なお、半透膜４は、上記機能を奏する限りにおいて透析膜に限られることはなく、例えばミリポアフィルターなども好適に用いることができる。
【００２１】
酸素電極５は、第二の容器内、しかも第二の容器に保持される酵素溶液に浸されるよう配置されている。酸素電極５は酸素溶液中の溶存酸素がこの電極上で還元されて水になるときに生じる電子の量に応じ電位を発生させるものであって、一般に市販されている周知な酸素電極を用いることができる。
【００２２】
溶存酸素計６は、この酸素電極５の電位の発生を受け、この電位の値に基づいて溶存酸素の濃度を算出するものであって、これについても一般に市販されている周知な溶存酸素計を用いることができる。
【００２３】
情報処理装置７は、溶存酸素計７からの出力を受け、まずその出力から振動反応の周期を求める。具体的には、電位の値を経時的に取得し、時間に対する電位のデータを作成する。そしてこの経時的な電位のデータを解析することで振動反応の周期を計算する。そして更に、求めた周期と予め求めてある周期−アセチルコリン量の関係からアセチルコリンの定量を行う。
【００２４】
具体的に本実施例では、情報処理装置としてコンピュータを用いて上記処理を行う。より具体的に説明すると、本装置のコンピュータは、図３で示すように、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対応するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を受け付け、その溶存酸素濃度データをその濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに記録する溶存酸素データ取得手段７０１と、その時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、アセチルコリンの濃度と振動反応の周期との関係を予め記憶してある周期−アセチルコリン関係記録手段７０３と、振動反応の周期と、アセチルコリンの濃度と振動反応の周期との関係に基づいてアセチルコリンの定量を行うアセチルコリン定量手段７０４と、を実施させるためのプログラムが、記録媒体であるハードディスクに格納され、実行されることでアセチルコリンの定量を行うことができる。またこの場合において、アセチルコリンの濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやコリンオキシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なるため、周期−アセチルコリン関係記録手段はその条件の入力を受付け、記録する機能をも有すること、更にはその入力に対応する条件に合致した振動の周期とアセチルコリンの濃度との関係を読み出すようにする（もちろん予め当該関係を記憶しておくことが必要である）ことがより望ましい。なおもちろん上記各手段は、記録媒体であればハードディスク以外の記録媒体であっても差し支えはなく、上記の機能を実行することができる限りにおいてプログラムでなくても良い。これは、種々操作の容易性の観点からプログラムが望ましい、という実施例を示したものである。
【００２５】
次に上記の構成をもとに測定を行った。以下説明する。
この測定において、アセチルコリンの量（濃度）をさまざまに変化させて９種類の試料を用意し、そのそれぞれに対して測定を行った。なおアセチルコリンの量（濃度）以外は上述の条件（カタラーゼ：０．１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼ：７．２×１０−５ｍｇ／ｍｌ、アセチルコリンエステラーゼ：８×１０−４ｍｇ／ｍｌ）として固定した。表１に加えたアセチルコリンの量及びアセチルコリンの濃度を示す。そしてその溶液中の０．１ｍｌにおける濃度を下記表１のように調整し、カタラーゼ等を混合した溶液に加え、全体として２５ｍｌの酵素溶液にした。表１に溶液に溶かしたアセチルコリンの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。なお図４に表１における試料溶液番号２の場合の溶存酸素量の時間変化の例を示す。図４において横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示している。また本実施例における周期とは、振動反応が開始してから十分な時間が経過し、周期がほぼ一定になった場合における値を採用している。なおほぼ一定になるまでに要した十分な時間は反応を開始させてから概ね１〜２時間程度であった。
【表１】
0004677558.tif 000003
【００２６】
表１の結果に対し、アセチルコリンの濃度に対する振動反応の周期を求めたものを図５に示す。横軸はアセチルコリンの濃度（Ｍ）を、縦軸は振動の周期（分）を示す。
【００２７】
この結果、振動の周期とアセチルコリンの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではアセチルコリンの濃度は５．０×１０−６〜１．５×１０−４Mの範囲で非常によく説明できており、この範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。なお、アセチルコリンが５．０×１０−６Ｍより小さい場合、また１．５×１０−４Ｍより大きい場合は直線に載っておらず、アセチルコリンの範囲としても上記の範囲内であることが望ましいことが確認できた。
【００２８】
以上、カタラーゼ、コリンオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼを用いて振動反応を利用することで、アセチルコリンの濃度を定量することができる。特に、カタラーゼコリンオキシダーゼ及びコリン、オキシダーゼを所定の濃度範囲にすることで規則的な振動反応を起こし、その周期を求めることでアセチルコリンの濃度を定量することができる。
【００２９】
また、本実施例では、第一の容器１と第二の容器２、そしてその容器の間を繋げる流路３とを用いて構成されているが、容器形状はこれに限られず、例えば図６で示されるように、一つの容器を仕切板で仕切り、窓を開けて半透膜を配置する構成ももちろん可能である。
【００３０】
（比較例１）
一方、上記実施例において、コリンが共存する場合において、実施例１における範囲の適性を調べた。以下説明する。
【００３１】
溶液として、コリンオキシダーゼが７．２×１０−５ｍｇ／ｍｌ、アセチルコリンエステラーゼが８×１０−4ｍｇ／ｍｌの濃度のものを用いた。また第一の溶液に過酸化水素、アセチルコリンの他に一定量のコリン（０．２ｍMの溶液を０．１ｍｌ）を加えておく。
この結果を表２及び図７に示す。
【表２】
0004677558.tif 000004
【００３２】
この結果、アセチルコリン濃度が０．００００１ｍｏｌ／ｌから０．０００２５ｍｏｌ／ｌの範囲で、コリンの濃度に影響されずに直線が得られた。０．００００１ｍｏｌ／ｌ以下では周期が一定となった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】振動反応の反応機構を示す図。
【図２】実施例１におけるアセチルコリンの定量装置の概略図。
【図３】実施例１における情報処理装置７の機能ブロックを示す図。
【図４】実施例１における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図５】実施例１におけるアセチルコリン濃度と周期との関係を示す図。
【図６】アセチルコリンの定量装置における他の容器例を示す図。
【図７】比較例１におけるアセチルコリン濃度と周期との関係を示す図。
【符号の説明】
【００３４】
１…第一の容器、２…第二の容器、３…連絡管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置
【図１】
0004677558.tif 000005
【図２】
0004677558.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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