(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から４のいずれか１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
Ａｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の発現を抑制し得る、配列番号１または配列番号２のオリゴヌクレオチドを発現可能なように含んでなるベクターを含有する医薬組成物。
【請求項３】
大腸癌の転移抑制用医薬組成物である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
大腸癌の防止および／または治療用医薬組成物である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ａｓｅｆ遺伝子の発現を抑制し得る、配列番号１のオリゴヌクレオチドを発現可能なように含んでなるベクターを含有するＡｓｅｆ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｓｅｆ（ＡＰＣ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ）の機能阻害および／またはＡｓｅｆの発現阻害を特徴とする、大腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法に関する。さらに詳しくは、Ａｓｅｆの発現阻害、ＡｓｅｆとＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  Ｃｏｌｉ）遺伝子産物との結合阻害、またはＡｓｅｆのグアニンヌクレオチド交換因子（Ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＧＥＦと略称する）活性の阻害を特徴とする、大腸癌転移抑制剤、Ａｓｅｆ阻害剤、医薬組成物、大腸癌の防止剤および／または治療剤、大腸癌転移抑制方法、並びに大腸癌の防止方法および／または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｓｅｆは、本発明者らにより大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質Ｍ１として見出され、既に特許出願されて公開された蛋白質である（特許文献１および非特許文献１）。当該蛋白質は６１９アミノ酸残基からなる蛋白質であり、Ｄｂｌ相同（ＤＨ）ドメイン、プレックストリン（Ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同（ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインをそのアミノ酸配列中に保有する。
【０００３】
Ａｓｅｆの作用の１つとして、低分子量ＧＴＰ結合蛋白質ファミリーの１つであるＲｈｏファミリーに属するＲａｃに対する特異的なＧＥＦ活性をもつことが知られている。すなわち、Ａｓｅｆは、Ｒａｃに結合しＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲａｃを活性化し、Ｒａｃが関与する細胞内情報伝達の下流に位置するＮＦκＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＳＲＥ等に作用する。Ｒｈｏファミリーに属する蛋白質はアクチンネットワークの再構成に重要な役割を果たし、それにより細胞運動および細胞間接着を調節している。したがって、Ａｓｅｆは、細胞のラメリポディア（葉状仮足）や細胞膜のラッフリングを誘導し、細胞運動および細胞間接着に関与する可能性がある。
【０００４】
Ａｓｅｆは、癌抑制遺伝子ＡＰＣの遺伝子産物と、該遺伝子産物のアルマジロリピートドメインを介して結合することが明らかになっている。ＡｓｅｆはＡＰＣ遺伝子産物によりＧＥＦ活性が正に調節される。そのため、ＡＰＣ遺伝子産物によるＡｓｅｆを介した細胞膜のラッフリングやラメリポディア形成の誘導が、イヌ腎臓由来上皮様細胞であるＭＤＣＫ細胞で認められている。またＡｓｅｆは、細胞内においてＡＰＣ遺伝子産物と同様に、移動する細胞の微小管先端部位に集積している。このことから、細胞が大腸の絨突起先端（ｖｉｌｌｕｓ  ｔｉｐ）へクリプト（ｃｒｙｐｔ）から移動する際の移動制御の鍵をＡｓｅｆが握っている可能性がある。
【０００５】
一方、癌抑制遺伝子ＡＰＣ（非特許文献２）は、家族性腺腫性ポリポーシス（ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：ＦＡＰ）の原因遺伝子として単離され、散発性大腸癌の約７０％〜約８０％でその変異が認められている。ＡＰＣ遺伝子産物（以下、ＡＰＣと称する）は、２，８４３アミノ酸残基からなる約３００ｋＤａの巨大な蛋白質であり、そのアミノ酸配列中には、蛋白質間相互作用の役割を担うアルマジロリピートドメインが存在する。大腸癌細胞で認められる多くの体細胞ＡＰＣ変異は、変異クラスター領域（ＭＣＲ）と呼ばれるその中央領域内で生じ、例えば、マイクロチュブール、ＥＢ１、ｈＤＬＧへの結合部位、並びにβ−カテニンおよびアキシンに対する少なくとも幾つかの部位が切断された切断ＡＰＣ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＡＰＣ）を生じる（非特許文献４、５、６、７および８）。しかしながら、Ａｓｅｆへの結合に対応するＡＰＣの領域は、アルマジロリピートドメインであり、ほとんどの変異ＡＰＣ中でその配列が維持されている（非特許文献６、７および８）。ＡＰＣは、一種の癌遺伝子産物であるβ−カテニンに結合して分解を誘導する作用を有する（非特許文献２、３、４、５および６）。β−カテニンは、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達因子の１つであり、カドヘリンの細胞質側ドメインに結合して細胞接着に役割を果たすと同時に、発生過程や腫瘍形成において重要な役割を担っている（非特許文献９および１０）。
【０００６】
Ａｓｅｆのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＢ０４２１９９として登録されている。また、ＡＰＣのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ００００３８として登録されている。
【０００７】
以下、本明細書において引用した文献を列記する。
特許文献１：特開２００１−０５７８８８号公報。
非特許文献１：カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２８９巻、ｐ．１１９４−１１９７。
非特許文献２：キンツラー（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９６年、第８７巻、ｐ．１５９−１７０。
非特許文献３：ファーンヘッド（Ｆｅａｒｎｈｅａｄ）ら、「ヒューマン  モレキュラー  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００１年、第１０巻、ｐ．７２１−７３３。
非特許文献４：ビーンズ（Ｂｉｅｎｚ，Ｍ．）ら、「セル（Ｃｅｌｌ）」、２０００年、第１０３巻、ｐ．３１１−３２０。
非特許文献５：ペリファー（Ｐｅｒｉｆｅｒ，Ｍ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２８７巻、ｐ．１６０６−１６０９。
非特許文献６：アキヤマ（Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．）、「サイトカイン  アンド  グロースファクター  レビューズ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、２０００年、第１１巻、ｐ．２７３−２８２。
非特許文献７：ミヨシ（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．）ら、「ヒューマン  モレキュラー  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９２年、第１巻、ｐ．２２９−２３３。
非特許文献８：ナガワ（Ｎａｇａｗａ，Ｈ．）ら、「ヒューマン  ミューテーション（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、１９９３年、第２巻、ｐ．４２５−４３４。
非特許文献９：「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９６年、第８６巻、ｐ．３９１−３９９。
非特許文献１０：「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９６年、第３８２巻、ｐ．６３８−６４２。
非特許文献１１：ウォン（Ｗｏｎｇ，Ｍ．Ｈ．）ら、「プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ）」、１９９６年、第９３巻、ｐ．９５８８−９５９３。
非特許文献１２：オーシマ（Ｏｓｈｉｍａ，Ｈ．）ら、「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第５７巻、ｐ．１６４４−１６４９。
非特許文献１３：パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ  アンド  ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８。
【発明の開示】
【０００８】
Ａｓｅｆについては、上記のように腫瘍形成や発生過程において重要な役割を担う癌抑制遺伝子ＡＰＣの遺伝子産物と結合することが知られているが、細胞におけるその作用および疾患との関連は未だ明らかにされていない。Ａｓｅｆの作用を明らかにして、その機能を調節することにより、Ａｓｅｆに起因する疾患の防止および治療が可能になる。
【０００９】
本発明者らは、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性およびその細胞内局在から、細胞運動および細胞間接着へのＡｓｅｆの関与可能性を推察し、Ａｓｅｆが大腸癌、特にＡＰＣ変異が認められる大腸癌において、大腸癌細胞の運動性を高め、その転移に関与することを見出した。そして、この知見を利用し、Ａｓｅｆの機能阻害および／またはＡｓｅｆ遺伝子の発現阻害により大腸癌転移が抑制されることを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の一態様はＡｓｅｆの機能阻害および／またはＡｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
【００１１】
また本発明の一態様は、Ａｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
【００１２】
さらに本発明の一態様は、ＡｓｅｆのＡＰＣ遺伝子産物との結合阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
【００１３】
さらにまた本発明の一態様は、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性の阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤に関する。
【００１４】
また本発明の一態様は、Ａｓｅｆの機能阻害および／またはＡｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
【００１５】
さらに本発明の一態様は、Ａｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
【００１６】
さらにまた本発明の一態様は、ＡｓｅｆのＡＰＣ遺伝子産物との結合阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
【００１７】
また本発明の一態様は、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性の阻害を特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
【００１８】
さらに本発明の一態様は、Ａｓｅｆ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉を利用することを特徴とするＡｓｅｆ阻害剤に関する。
【００１９】
さらにまた本発明の一態様は、Ａｓｅｆ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を示すオリゴヌクレオチドを含んでなるＡｓｅｆ阻害剤に関する。
【００２０】
また本発明の一態様は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２１】
さらに本発明の一態様は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２２】
さらにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２３】
また本発明の一態様は、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２４】
さらに本発明の一態様は、配列表の配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含んでなる前記Ａｓｅｆ阻害剤に関する。
【００２５】
さらにまた本発明の一態様は、Ａｓｅｆ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉を利用することを特徴とするＡｓｅｆ阻害方法に関する。
【００２６】
また本発明の一態様は、Ａｓｅｆ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を示すオリゴヌクレオチドを利用することを特徴とするＡｓｅｆ阻害方法に関する。
【００２７】
さらに本発明の一態様は、配列表の配列番号１または３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを利用することを特徴とする前記Ａｓｅｆ阻害方法に関する。
【００２８】
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかのＡｓｅｆ阻害剤を含んでなる大腸癌転移抑制剤に関する。
【００２９】
また本発明の一態様は、配列表の配列番号１から４のいずれか１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含んでなる大腸癌転移抑制剤に関する。
【００３０】
さらに本発明の一態様は、前記いずれかのＡｓｅｆ阻害剤を用いることを特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
【００３１】
さらにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号１から４のいずれか１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする大腸癌転移抑制方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、または、前記いずれかのＡｓｅｆ阻害剤を含んでなる医薬組成物に関する。
【００３２】
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、または、前記いずれかのＡｓｅｆ阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤に関する。
【００３３】
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの大腸癌転移抑制剤、または、前記いずれかのＡｓｅｆ阻害剤を用いることを特徴とする大腸癌の防止方法および／または治療方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第２００２−３８２０８３号からの優先権を請求するものである。
【００３５】
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
【００３６】
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００３７】
本発明においては、Ａｓｅｆが上皮由来細胞の細胞間接着を低減させると共にその運動性を顕著に促進することを見出した。さらに、これらの作用が、ＡＰＣにより調節されており、特に大多数の大腸癌細胞で同定されている断片化した変異ＡＰＣがＡｓｅｆを効率よく活性化することを見出した。これらから、変異ＡＰＣとＡｓｅｆとの複合体形成が、大腸癌細胞の異常な運動性の原因の１つと考えた。つまり、腸管上皮細胞の上方への遊走、すなわちクリプトから絨突起先端への遊走に当該複合体が関与していると推定した。実際、ＡＰＣ遺伝子の強制発現が腸管上皮において細胞遊走の異常を引き起こすことが知られている（非特許文献１１）。ＡＰＣノックアウトマウスにおいて、初期腺腫細胞の増殖速度は正常クリプト上皮細胞のものと同じであるが、腺腫細胞はクリプト−絨突起軸に沿う有向遊走をしないことが知られている（非特許文献１２）。
【００３８】
このように、ＡＰＣ切断変異体によるＡｓｅｆの活性化に基づいた異常な遊走態様は、腺腫形成と同様に腫瘍の侵襲性悪性腫瘍への悪化に重要であると考えられる。また、ＡｓｅｆのＧＥＦ領域を欠失させた変異体は、細胞間接着を低減させたり細胞運動性を促進したりしないことから、ＧＥＦ活性がＡｓｅｆのかかる機能に重要であると推定した。
【００３９】
本発明においては、Ａｓｅｆと変異ＡＰＣの結合を阻害するドミナントネガティブ変異体、例えばＡｓｅｆのアミノ酸配列中のＡＰＣ結合領域（第７３番目から第１２６番目までのアミノ酸配列）からなる変異体またはＡｓｅｆのＧＥＦ領域を欠失させた変異体を用いて、変異ＡＰＣを発現する大腸癌細胞の運動性を阻害できることを明らかにした。また、Ａｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の発現阻害により、同様に、変異ＡＰＣを発現する大腸癌細胞の運動性を阻害できることを明らかにした。さらに、上記ドミナントネガティブ変異体を発現させたヒト大腸癌細胞の造腫瘍性、増殖性、さらに転移が、かかる変異体を発現させなかった細胞と比較して阻害されることを、重度複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）を用いたインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の検討において見出した。このような阻害は、ドミナントネガティブ変異体を発現させたヒト大腸癌細胞として、変異体発現後にクローン化して得た細胞を用いた検討においても、また標識化した変異体を発現させた後に該標識を指標にして変異体が発現された細胞をセルソーターにより９０％以上に濃縮して得たミックスポピュレーションを用いた検討（ｍｉｘ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ法）においても、同様に認められた。
【００４０】
このように、Ａｓｅｆの機能阻害により、細胞の運動性を阻害でき、さらには細胞の造腫瘍性並びに腫瘍細胞の増殖性および／または転移を抑制できる。細胞の運動性の阻害はＡｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の発現阻害によっても達成できるため、これら各遺伝子の発現阻害により細胞の造腫瘍性並びに腫瘍細胞の増殖性および／または転移の抑制が可能である。
【００４１】
上記知見に基づいて、本発明は、Ａｓｅｆの阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法を提供する。当該大腸癌転移抑制剤および大腸癌転移抑制方法は、Ａｓｅｆの機能阻害および／またはＡｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする。
【００４２】
Ａｓｅｆ遺伝子の発現阻害は、例えばＡｓｅｆ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果を利用することによって実現可能である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡを利用して遺伝子の発現を抑制する方法として、近年報告された方法である（非特許文献１３）。具体的には、Ａｓｅｆ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を示すオリゴヌクレオチドを使用して、Ａｓｅｆ遺伝子の発現阻害が可能である。かかるオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡが例示できる。また、当該ｃＤＮＡの相補的ＲＮＡ（配列表の配列番号３）も同様に使用できる。かかるｃＤＮＡを含むベクターまたはその相補的ＲＮＡを細胞に導入することにより、Ａｓｅｆ遺伝子の発現阻害を実現できる。ベクターまたはＲＮＡの細胞への導入は、自体公知の方法、例えばリポフェクション等を利用して実施可能である。したがって、上記オリゴヌクレオチドを含むＡｓｅｆ阻害剤も、本発明の範囲に包含される。かかるＡｓｅｆ阻害剤に含まれるオリゴヌクレオチドは、１種であってよく、また２種以上が含まれていてもよい。また、Ａｓｅｆ遺伝子の発現阻害は、Ａｓｅｆ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によっても、実現可能である。上記ＲＮＡ干渉効果を示すオリゴヌクレオチドまたは上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａｓｅｆ遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドから、Ａｓｅｆ遺伝子の発現系を用いて、その発現を特異的に阻害するものを選択することにより得ることができる。
【００４３】
Ａｓｅｆの機能阻害は、例えばＡｓｅｆとＡＰＣとの結合阻害、またはＡｓｅｆのＧＥＦ活性の阻害により実現可能である。阻害の対象となるＡｓｅｆとＡＰＣとの結合は、好ましくはＡｓｅｆと正常なＡＰＣとの結合、より好ましくはＡｓｅｆとＡＰＣ変異体との結合、さらに好ましくはＡｓｅｆとＡＰＣ切断変異体との結合、さらにより好ましくはＡｓｅｆとアルマジロリピートドメインを含むＡＰＣ切断変異体との結合である。アルマジロリピートドメインを含むＡＰＣ切断変異体としては、ＡＰＣのアミノ酸配列のＮ末端第１番目から第８７６番目の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド、またはＡＰＣのアミノ酸配列のＮ末端第１番目から第１３０９番目の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドを例示できる。これらポリペプチドは、ＡＰＣ切断変異体として、多くの大腸癌および家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）で同定されたものである。
【００４４】
ＡｓｅｆとＡＰＣとの結合阻害は、該結合に対するＡｓｅｆのドミナントネガティブ変異体を使用して実現できる。例えば、ＡＰＣと結合できるが、ＧＥＦ活性を示さないＡｓｅｆ変異体は、ＡｓｅｆとＡＰＣとの結合阻害剤として使用可能である。かかるＡｓｅｆ変異体は、Ａｓｅｆのアミノ酸配列に基づいて設計し、ＡＰＣとの結合活性を常法により試験することにより得られる。具体的には、ＡｓｅｆのＧＥＦ領域を欠失させた変異体が例示できる。あるいはＡｓｅｆのアミノ酸配列中のＡＰＣ結合領域（第７３番目から第１２６番目までのアミノ酸配列）からなるポリペプチドが好ましく用いられる。このポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計したポリペプチドから、ＡｓｅｆとＡＰＣの結合を阻害するものを選択して用いることも可能である。また、ＡＰＣ遺伝子の発現阻害によっても、ＡｓｅｆとＡＰＣとの結合阻害は達成できる。ＡＰＣ遺伝子の発現阻害は、ＡＰＣ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を示すオリゴヌクレオチドを用いて実現可能である。かかるオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡが例示できる。また、当該ｃＤＮＡの相補的ＲＮＡ（配列表の配列番号４）も同様に使用できる。あるいは、ＡＰＣ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によっても、ＡＰＣ遺伝子の発現阻害は実現可能である。上記ＲＮＡ干渉効果を示すオリゴヌクレオチドまたは上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＣ遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドから、ＡＰＣ遺伝子の発現系を用いて、その発現を特異的に阻害するものを選択することにより得ることができる。
【００４５】
ＡｓｅｆのＧＥＦ活性の阻害は、例えばＧＥＦ活性の阻害剤を、Ａｓｅｆを用いて同定し使用することにより実現できる。また、Ａｓｅｆ遺伝子の発現を阻害する化合物やＡｓｅｆとＡＰＣとの結合を阻害する化合物を、Ａｓｅｆ遺伝子を用いて、またはＡｓｅｆおよびＡＰＣを用いて同定して使用してもよい。化合物を同定するためのアッセイ系は、自体公知のスクリーニング系を利用して構築可能である。
【００４６】
Ａｓｅｆの機能および／または発現を阻害する上記物質を有効成分として含むＡｓｅｆ阻害剤を用いることにより、大腸癌の転移を抑制することが可能である。すなわち、Ａｓｅｆ阻害剤を含んでなる大腸癌転移抑制剤および上記Ａｓｅｆ阻害剤を用いることを特徴とする大腸癌転移抑制方法も、本発明の範囲に包含される。具体的には、例えば、配列表の配列番号１から配列番号４に記載のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含んでなる大腸癌転移抑制剤、並びにこれらオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを用いることを特徴とする大腸癌転移抑制方法を挙げることができる。
【００４７】
本発明に係る大腸癌転移抑制剤またはＡｓｅｆ阻害剤を適用することにより、大腸癌の造腫瘍性および転移を抑制することができる。すなわち、上記大腸癌転移抑制剤またはＡｓｅｆ阻害剤は、大腸癌および大腸癌転移の防止および／または治療に使用することができる。この観点から、上記大腸癌転移抑制剤またはＡｓｅｆ阻害剤を有効成分としてその有効量含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤も本発明の範囲に包含される。また、上記大腸癌転移抑制剤またはＡｓｅｆ阻害剤を使用することを特徴とする、大腸癌の防止方法および／または治療方法を提供可能である。
【００４８】
このように、本発明においては、上記大腸癌転移抑制剤またはＡｓｅｆ阻害剤を含む医薬組成物を提供することが可能である。
【００４９】
本発明に係る医薬組成物の必要な用量範囲は、含有される成分の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００５０】
Ａｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の発現を阻害し得るオリゴヌクレオチドを用いるときは、遺伝子治療を利用して、当該オリゴヌクレオチドを対象中の細胞内で生成させてもよい。遺伝子治療は公知の方法が利用でき、例えば、オリゴヌクレオチドを注射により直接投与する非ウイルス性のトランスフェクション法、あるいはウイルスベクターを利用したトランスフェクション法のいずれも適用することができる。非ウイルス性のトランスフェクション法においては、オリゴヌクレオチドを注射により直接投与する方法のほか、オリゴヌクレオチドをリポソーム等のリン脂質小胞に封入し、そのリポソームを投与する方法が推奨される。リポソームとしては、カチオン性リポソームの使用がより好ましい。ウイルスベクターを使用するトランスフェクション法においてオリゴヌクレオチドを組込んでトランスフェクションに使用するベクターとしては、好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のＤＮＡウイルスベクター、あるいはＲＮＡウイルスベクターが挙げられる。これらウイルスベクターを用いることにより効率良い投与が可能である。さらに、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法においても、該ベクターをリポソームに封入して、そのリポソームを投与する方法が推奨される。
【００５１】
本発明に係る医薬は、大腸癌転移抑制剤またはＡｓｅｆ阻害剤の有効成分のみを含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。
【００５２】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００５３】
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられる。担体はこれらに限らず、一般的な医薬の製造に用いられる物質であれば、所望に応じていずれを用いることもできる。
【００５４】
本発明に係る医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００５５】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００５６】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。あるいは、腫瘍に注射等により直接投与することができる。
【００５７】
投与形態は、当業者によく知られている形態から適宜選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００５８】
本発明に係る医薬組成物を遺伝子治療に使用する場合、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【００５９】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロースおよびマンニトール等の賦形剤、澱粉およびアルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレートおよびタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
【００６０】
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトールおよびフラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００６１】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００６２】
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００６３】
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油およびオリーブ油等の植物油並びにＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトールおよび果糖等）が例示される。
【００６４】
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【００６６】
まず、以下の実施例で用いたＡｓｅｆまたはＡＰＣ、あるいはそれらの変異体について説明する。当該蛋白質および当該変異体は、略称で記載する。
【００６７】
Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌは、野生型の全長Ａｓｅｆからなる蛋白質である。ヘマグルチニン（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＨＡ）タグを付加した融合蛋白質（ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ａｓｅｆ）、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）との融合蛋白質（ＧＳＴ−Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌ）として発現させた。
【００６８】
Ａｓｅｆ−ΔＡＰＣは、ＡｓｅｆのＮ末端側ＡＰＣ結合領域を欠失させた変異体である。この変異体は野生型Ａｓｅｆより強いＧＥＦ活性を有する。
【００６９】
Ａｓｅｆ−ΔＤＨは、ＡｓｅｆのＤＨ領域（ＧＥＦ領域）を欠失させた変異体である。該変異体はＧＥＦ活性を示さない。
【００７０】
Ａｓｅｆ−ＡＢＲは、Ａｓｅｆのアミノ酸配列中のＡＰＣ結合領域（第７３番目から第１２６番目までのアミノ酸配列）からなるポリペプチドである。マルトース結合たんぱく質（ＭＢＰ）との融合蛋白質（ＭＢＰ−Ａｓｅｆ−ＡＢＲ）として発現させた。
【００７１】
ＡＰＣ−ａｒｍは、ＡＰＣのアルマジロリピートドメインからなるポリペプチドであり、Ｍｙｃタグを付加した融合蛋白質（Ｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ  ＡＰＣ−ａｒｍ）として発現させた。
【００７２】
ＡＰＣ−８７６は、ＡＰＣのアミノ酸配列のＮ末端第１番目から第８７６番目までの連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、アルマジロリピートドメインを含んでいる。
【００７３】
ＡＰＣ−１３０９は、ＡＰＣのアミノ酸配列のＮ末端第１番目から第１３０９番目までの連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、アルマジロリピートドメインを含んでいる。
【００７４】
ＡＰＣ−８７６およびＡＰＣ−１３０９は、大腸癌および家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）で同定されたＡＰＣ切断変異体である。
【００７５】
これら蛋白質またはポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスの作製は、アデノ−ＸＴＭエクスプレッションシステム（クロンテック社）を用いて、各蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、アデノウイルスベクターｐＡｄｅｎｏ−Ｘにクローン化することにより行った。以下、ＡｄＡｓｅｆ−ｆｕｌｌとは、Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスを意味する。上記その他の蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスも同様に、各ＤＮＡの呼称にＡｄを付して表わす。
【００７６】
上記蛋白質またはポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むプラスミドの作製は、常法にしたがって行った。
【００７７】
細胞の培養および上記プラスミドのトランスフェクションは、以下のように行った。ＭＤＣＫ細胞（正常なイヌの腎から樹立された上皮様細胞株）およびＷｉＤｒ細胞はダルベッコ改変イーグル培地に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えて培養した。ＳＷ４８０細胞はレイボビッツＬ−１５培地に１０％ＦＣＳを加えて培養した。ＤＬＤ−１細胞およびＨＣＴ１５細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳを加えて培養した。ＨＣＴ１１６細胞はマッコイ５Ａ培地に１０％ＦＣＳを加えて培養した。これら細胞に、リポフェクトアミン２０００（ライフテクノロジー社）を用いて、上記プラスミドをトランスフェクションした。
【００７８】
蛋白質の発現および作製は、次のように行った。ＧＳＴとの融合蛋白質またはＭＢＰとの融合蛋白質は、大腸菌で合成し、グルタチオン−セファロース（ＧＳＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；ファルマシア社）またはアミロースレジン（ａｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ；ニューイングランドバイオラボズ社）への吸着により単離した。
【００７９】
ＲＮＡ干渉試験に用いるショートヘアピンＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと略称する）である、ｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆおよびｓｈＲＮＡ−ＡＰＣは、それぞれＡｓｅｆ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の発現を抑制するように設計した。ｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆおよびｓｈＲＮＡ−ＡＰＣの塩基配列は配列表の配列番号１および配列番号２にそれぞれ記載した。また、ｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆおよびｓｈＲＮＡ−ＡＰＣにそれぞれ変異を加え、Ａｓｅｆ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の発現を抑制しないｓｈＲＮＡである、ｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−Ａｓｅｆおよびｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−ＡＰＣを作成し、配列表の配列番号５および配列番号６にそれぞれ記載した。
【実施例１】
【００８０】
細胞間接着および細胞形態に対するＡｓｅｆの効果を検討するため、ＭＤＣＫ細胞に上記アデノウイルスを感染させた。使用したアデノウイルスは、ＡｄＡｓｅｆ−ｆｕｌｌ、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＡＰＣ、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＤＨおよびＡｄＡＰＣ−ａｒｍである。対照として、ＡｄＬａｃＺを用いた。ＭＤＣＫ細胞へのアデノウイルスの感染効率は、免疫蛍光染色での検討により、９０％以上であることを確認した。また、これらアデノウイルスはそれぞれ、ＭＤＣＫ細胞に感染させると予想通りの大きさの蛋白質を生産することを、イムノブロッティングにより確認した。
【００８１】
細胞形態は、細胞を１２ウエルの組織培養プレートの各ウエルに細胞数３．０×１０４となるように播種し、３７℃で３時間インキュベーションした後、アデノウイルスで感染させ〔感染多重度：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｍ．ｏ．ｉ）＝２００〕、さらに３６時間培養後、位相差顕微鏡で観察した。ＡｄＡｓｅｆ−ΔＡＰＣで感染させた細胞は基底上で平面状になり、膜のラッフリングおよびラメリポディアを示した。一方、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＤＨで感染させた細胞は、形態変化を示さず、未感染の細胞と変わりなかった。
【００８２】
細胞間接着は、感染させた細胞を０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でプレートから剥がし、２０回ピペッティングした後に、細胞クラスター（粒子）の数を計数した。細胞クラスターを総細胞数で割った値（Ｎｐ／Ｎｃ）で、細胞間接着を評価した。ピペッティングにより分散させると、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＡＰＣで感染させた細胞は効率よく分離したが、未感染細胞およびＡｄＡｓｅｆ−ΔＤＨまたはＡｄＬａｃＺで感染させた細胞は凝集塊のままであった（図１）。これらの結果から、Ａｓｅｆが細胞間接着を低減させる機能を持つこと、またそのＧＥＦ活性がこの機能に必須であることが明らかになった。
【００８３】
さらに、ＡｄＡｓｅｆ−ｆｕｌｌまたはＡｄＡｓｅｆ−ΔＡＰＣを過剰発現させると、細胞間接触部位に局在するＥ−カドヘリン量が減少し、細胞質に局在するＥ−カドヘリン量が増加することを、抗Ｅ−カドヘリン抗体を使用した免疫組織化学分析により明らかにした。免疫組織化学分析は、アデノウイルス感染３６時間後に、ＭＤＣＫ細胞をＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで固定して行った。固定した細胞はＥ−カドヘリンに対するラットモノクローナル抗体（ＥＣＣＤ−２；カルビオケム社）およびトリメチルローダミンイソチオシアネート結合ファロイジン（ＴＲＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ；モレキュラープローブス社）、またはＥ−カドヘリンに対するラットモノクローナル抗体およびβ−カテニンに対するウサギポリクローナル抗体（サンタクルスバイオテクノロジー社）で室温にて６０分間二重染色した。抗Ｅ−カドヘリン抗体および抗β−カテニン抗体により得られた染色パターンは、フルオレセインイソチオシアネート標識抗ラットＩｇＧ抗体およびＴＲＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて可視化した。細胞はカールツァイスＬＳＭ５１０  レーザースキャニングマイクロスコープを用いて撮影した。抗β−カテニン抗体で染色すると、細胞間接触部位に局在するβ−カテニン量が減少したことが明らかになったが、この減少はＥ−カドヘリンほど顕著ではなかった。一方、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＤＨまたはＡｄＬａｃＺで感染させた細胞は、Ｅ−カドヘリンまたはβ−カテニンの局在について変化を示さなかった。これらから、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性がこれら分子の局在の変化に重要であると考えられた。ＭＤＣＫ細胞の溶解物のイムノブロット解析によれば、Ｅ−カドヘリンまたはβ−カテニンの総量はＡｄＡｓｅｆ−ｆｕｌｌまたはＡｄＡｓｅｆ−ΔＡＰＣでの感染で著しい変化はなかった。これらから、Ａｓｅｆ遺伝子の発現の結果生じる細胞間接着の低減は、細胞間接触部位でのＥ−カドヘリンおよびβ−カテニンの減少によることが判明した。
【実施例２】
【００８４】
細胞の運動性に対するＡｓｅｆの効果を、上記プラスミドを用いてＡｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子、あるいはそれらの変異体遺伝子を発現させたＭＤＣＫ細胞を用いて検討した。細胞の運動性は、トランスウエルマイグレーションチャンバーを用いた細胞遊走試験により行った。該チャンバーは、ＭＤＣＫ細胞には直径１２ｍｍでポアサイズ１２μｍのものを用いた（コスター社）。トランスフェクション１８時間後に、細胞数３．０×１０４のＭＤＣＫ細胞をチャンバーの上室に加え、１８時間で上室の下側へ遊走させた。細胞遊走は、ポリカーボネートフィルターの低層側に遊走した細胞を計数して測定した。
【００８５】
Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌをコードするＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクションした細胞は、親細胞（ＭＤＣＫ）またはベクターをトランスフェクションした細胞（Ｍｏｃｋ）と比較して運動性が促進した（図２）。Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌ遺伝子と共に、ＡＰＣ−ａｒｍ遺伝子、ＡＰＣ−８７６遺伝子およびＡＰＣ−１３０９遺伝子のいずれか１つを共発現させた細胞は、Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌ遺伝子のみをトランスフェクションしたものよりも運動性が促進した。Ａｓｅｆの細胞運動性促進能に対するＡＰＣの効果は、ＡＰＣ−ａｒｍ、ＡＰＣ−８７６およびＡＰＣ−１３０９の方がＡＰＣ−ｆｕｌｌより強かった。一方、ＡＰＣ−ａｒｍのみでは遊走を刺激しなかった。また、Ａｓｅｆ−ΔＡＰＣ遺伝子をトランスフェクションした細胞は、Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌ遺伝子およびＡＰＣ−ａｒｍ遺伝子をコトランスフェクションしたものよりもさらに亢進した遊走反応を示した。これらから、ＡｓｅｆはＭＤＣＫ細胞の遊走を促進する能力を保有することが明らかになった。Ａｓｅｆのこのような能力は、ＡＰＣ、特にアルマジロリピートドメインを含むＡＰＣ切断変異体（ＡＰＣ−Ａｒｍ）によりさらに促進されることが判明した。さらに、Ａｓｅｆ−ΔＤＨがＭＤＣＫ細胞の遊走を促進しなかったことから、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性がこのような遊走刺激活性に必要であると考えられた。
【００８６】
一方、Ａｓｅｆ−ＡＢＲ遺伝子をＡＰＣ−１３０９遺伝子と共に発現させたとき、細胞遊走の促進はほぼ完全に阻害された。Ａｓｅｆ−ΔＤＨもＡＰＣ−１３０９が介する細胞遊走の促進を阻害した。これらから、大腸癌またはＦＡＰで同定されたＡＰＣ変異体であるＡＰＣ−８７９およびＡＰＣ−１３０９は、Ａｓｅｆと相互作用してその活性を促進し、それにより細胞遊走を促進すると考えられた。しかし、全長ＡＰＣ遺伝子をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションしても、Ａｓｅｆが誘導する遊走の促進はみられなかった（図２）。このことから、大腸癌細胞においてＡＰＣが変異による切断によって活性化されないと、ＡＰＣはＡｓｅｆの有効な活性剤にはならないと考えられた。
【００８７】
次に、ＡｓｅｆおよびＡＰＣ切断変異体を含むことが知られているＳＷ４８０細胞の運動性について検討した。Ａｓｅｆ−ＡＢＲをコードするＤＮＡを含むプラスミドをＳＷ４８０細胞にトランスフェクションしたところ、当該細胞の遊走は、親株またはＭｏｃｋより約５０％低減した（図２）。同様に、Ａｓｅｆ−ΔＤＨプラスミドをトランスフェクションしたＳＷ４８０細胞の遊走は約４０％に低減した。このことから、細胞で発現されたＡｓｅｆ−ＡＢＲまたはＡｓｅｆ−ΔＤＨが、ＡｓｅｆとＡＰＣ切断変異体の結合に対してドミナントネガティブに作用し、細胞遊走を阻害することが判明した。
【実施例３】
【００８８】
大腸癌細胞において、ＡＰＣ切断変異体とＡｓｅｆとの結合について検討した。まず、細胞数５．０×１０６のＳＷ４８０細胞を、１％トリトンＸ−１００を含むバッファーＡ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  バナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）、１０ｍＭ  フッ化ナトリウム〕５００μｌ中で溶解した。溶解物を２μｇの抗Ａｓｅｆ抗体で４℃にて１時間インキュベーションした後、４℃で２時間かけて免疫複合体をプロテインＧ−セファロース６Ｂに吸着させた。０．１％トリトンＸ−１００を含むバッファーＡで何度も洗浄した後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリデン  ジフルオリド膜フィルター（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ；ミリポア社）に転写した。ブロットは、アルカリホスファターゼを結合させたマウス抗ウサギＩｇＧ抗体（プロメガ社）を二次抗体として使用して、イムノブロッティング分析に付した。用いたウサギ抗Ａｓｅｆポリクローナル抗体は、従前の方法で作製した（非特許文献１）。
【００８９】
その結果、ＡｓｅｆはＡＰＣ切断変異体と共免疫沈降した（図３ａ）。また、ＡｓｅｆとＡＰＣ変異体との共沈は、抗体をその抗原の過剰量とともに４℃で２時間プレインキュベーションすることにより阻害された。これらから、ＡｓｅｆはＳＷ４８０細胞中でＡＰＣ変異体と協働することが判明した。
【００９０】
次に、インビトロにおいて、ＧＳＴ−Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌとＡＰＣ−ａｒｍとを共免疫沈降させ、Ａｓｅｆ−ＡＢＲ添加の影響を検討した。まず、ＡＰＣ−Ａｒｍをインビトロ翻訳により作製し（ＩＶＴ−ＡＰＣ−Ａｒｍ）、セファロースに結合させたＧＳＴ−Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌとＭＢＰ−Ａｓｅｆ−ＡＢＲの存在下でインキュベーションした。ＭＢＰ−Ａｓｅｆ−ＡＢＲに対するＡＰＣ−Ａｒｍ量の比は、図３ｂに示したように変化させた。ＧＳＴ−Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したＡＰＣ−ａｒｍは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに次いでオートラジオグラフィーを行って可視化した（図３ｂの上パネル）。また、反応混合物に添加したＭＢＰ−Ａｓｅｆ−ＡＢＲはゲルをクマシーブルー染色することにより可視化した（図３ｂの下パネル）。その結果、Ａｓｅｆ−ＡＢＲを加えるとその量の増加に伴って、ＧＳＴ−Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌとＡＰＣ−ａｒｍとの共免疫沈降物が用量依存的に減少した。すなわち、インビトロにおいて、Ａｓｅｆ−ＡＢＲがＡｓｅｆとＡＰＣ変異体との結合を阻害することが明らかになった。
このように、ＡｓｅｆとＡＰＣ変異体との結合をドミナントネガティブな形で阻害するＡｓｅｆ−ＡＢＲを用いて、ＳＷ４８０細胞の遊走を阻害することができた。
【実施例４】
【００９１】
各種大腸癌細胞株に、Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌ、Ａｓｅｆ−ΔＡＰＣ、またはＡｓｅｆ−ΔＤＨをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスを感染させ、実施例２と同様に細胞遊走試験を行った。用いた大腸癌細胞株は、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１５、ＷｉＤｒおよびＨＣＴ１１６である。ＳＷ４８０細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ１５細胞、およびＷｉＤｒ細胞は、ＡＰＣ切断変異体を含む。ＨＣＴ１１６細胞は、正常ＡＰＣを含むが、β−カテニンに変異が認められる。
【００９２】
結果を図４に示す。ＳＷ４８０細胞は、ＡｄＡｓｅｆ−ｆｕｌｌまたはＡｄＡｓｅｆ−ΔＡＰＣを感染させると、その運動性が促進した。また、ＳＷ４８０細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ１５細胞およびＷｉＤｒ細胞は、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＤＨで感染させると、その運動性が部分的に阻害された。一方、ＨＣＴ１１６細胞は、ＡｄＡｓｅｆ−ΔＤＨにより阻害されなかった。このことから、ＨＣＴ１１６中の全長ＡＰＣはＡｓｅｆを活性化できないと考えられた。これらの結果から、ＡｓｅｆはＡＰＣ切断変異体を含む大腸癌細胞で活性化されるが、正常ＡＰＣを含む細胞では活性化されないまたは活性化されにくいことが判明した。また、当該活性化は、Ａｓｅｆ−ΔＤＨにより阻害されることが明らかになった。
【実施例５】
【００９３】
大腸癌細胞の遊走におけるＡｓｅｆとＡＰＣ変異体との相互作用を、ＲＮＡ干渉試験により検討した。当該試験は、ｐＳＨＡＧ−１ベクターシステムを用いて行った（非特許文献１３）。用いた大腸癌細胞株は、ＳＷ４８０細胞、ＷｉＤｒ細胞、ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞である。ＳＷ４８０細胞およびＷｉＤｒ細胞は、ＡＰＣ切断変異体を含む。ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞は、正常ＡＰＣを含むが、β−カテニンに変異が認められる。
【００９４】
ｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆまたはｓｈＲＮＡ−ＡＰＣのいずれかを含む発現ベクターをトランスフェクションした各種大腸癌細胞について、実施例２と同様に細胞遊走試験を行った。その結果、ｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆまたはｓｈＲＮＡ−ＡＰＣのいずれかをトランスフェクションしたＳＷ４８０細胞およびＷｉＤｒ細胞は、ｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−Ａｓｅｆまたはｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−ＡＰＣをトランスフェクションした細胞に比べて、運動性が低減した（図５）。一方、ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞では、このような現象は認められなかった。
【００９５】
次に、ｓｈＲＮＡ−Ａｓｅｆ、ｓｈＲＮＡ−ＡＰＣ、ｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−Ａｓｅｆおよびｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−ＡＰＣのいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクションした細胞について、イムノブロッティング分析を実施例３と同様に実施した。このとき、対照として、α−チューブリンの変化を測定した。その結果、ｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆおよびｓｈＲＮＡ−ＡＰＣは、それぞれＡｓｅｆ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の発現をほぼ完全に阻害した。
【００９６】
これらから、Ａｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の発現阻害により、ＡＰＣ切断変異を有する大腸癌細胞の運動性が低減されることが判明した。すなわち、大腸癌細胞の遊走に、ＡＰＣ変異体とＡｓｅｆとの相互作用が重要な役割を果たすと考えられた。
【実施例６】
【００９７】
ヒトＳＷ４８０大腸癌細胞に、Ａｓｅｆドミナントネガティブ変異体であるＡｓｅｆ−ＡＢＲを発現させて作成した細胞を、それぞれＳＣＩＤマウスに移植し、造腫瘍性や増殖の変化を観察した。Ａｓｅｆ−ＡＢＲプラスミドは、ＳＷ４８０大腸癌細胞に、リポフェクションにより導入した。得られた３つのクローンをそれぞれ、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌ（終濃度）含有するＬ−１５培地を使用してインビトロで培養し、一群当たり２〜４匹のＳＣＩＤマウス（８週齢）の側腹部皮下に、細胞数１×１０７／０．１ｍｌ／マウス移植した。腫瘍移植後２０日目に腫瘍塊を摘出して重量を測定した。また、各クローンを移植したマウスの腫瘍塊の重量（Ｔ）を対照群の値（Ｃ）で割り、阻害比（ＩＲと略称する）として百分率で表した〔ＩＲ（％）＝Ｔ／Ｃ×１００〕。移植した細胞でＡｓｅｆ−ＡＢＲが発現されていることは、常法により確認した。
【００９８】
Ａｓｅｆ−ＡＢＲのみを安定的に発現する３クローンのうち、２クローンで造腫瘍性の低下や増殖の遅延が見られた（表１）。これらから、Ａｓｅｆが造腫瘍性や腫瘍細胞増殖に関与すると考えられた。
【表１】
【００９９】
0004733394.tif 000002
【実施例７】
【０１００】
ヒトＨＴ２９大腸癌細胞株で作製したＡｓｅｆ−ＡＢＲクローン（実施例６参照）をＳＣＩＤマウスに移植し、造腫瘍性や増殖の変化を観察した。Ａｓｅｆ−ＡＢＲプラスミド１５μｇは、細胞数５×１０６のＨＴ２９細胞に、リポフェクションにより導入した。得られた５つのクローンをそれぞれ、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌ（終濃度）含有するＤＭＥＭ培地を使用してインビトロで培養し、一群あたり４匹のＳＣＩＤマウス（８週齢）の脾臓内に、細胞数１×１０６／０．０５ｍｌ／マウス移植した。腫瘍細胞移植後１８日目に尾静脈内にインクを注入後、エーテル麻酔下で放血屠殺し、脾臓および肝臓を摘出して重量を測定した。
【０１０１】
ＨＴ２９細胞で作製したＡｓｅｆ−ＡＢＲドミナントネガティブ変異体安定発現株５クローン中４クローンにおいて、脾臓や肝臓での腫瘍形成が認められなかった（表２）。実施例６でＳＷ４８０大腸癌細胞を用いて作製した３クローンについても同様な現象が得られた。すなわち、Ａｓｅｆは造腫瘍性や腫瘍細胞増殖に関与することが判明した。またＡｓｅｆ−ＡＢＲドミナントネガティブ変異体安定発現株で、肝臓の腫瘍形成が認められなかったことから、Ａｓｅｆ−ＡＢＲドミナントネガティブ変異体が、腫瘍の転移を抑制することが判明した。
【表２】
【０１０２】
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【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明においては、Ａｓｅｆが細胞の運動性を促進し、さらに細胞間接着を低減すること、Ａｓｅｆのこの機能が癌抑制遺伝子ＡＰＣの遺伝子産物により活性化されることを見出した。また、大腸癌、特にＡＰＣ変異が認められる大腸癌において、Ａｓｅｆが大腸癌細胞の運動性を高め、その造腫瘍性および転移に関与することを見出した。これらに基づいて本発明において提供する、Ａｓｅｆの機能阻害および／またはＡｓｅｆ遺伝子の発現阻害を特徴とする大腸癌転移抑制剤並びに大腸癌転移抑制方法は、大腸癌および大腸癌の転移の防止および／または治療に多大な効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＡｓｅｆをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞の細胞間接着が低減したことを説明する図である。細胞間接着は、縦軸に示したように、凝集塊（Ｎｐ）数を総細胞（Ｎｃ）数で割った数値で示した。図中、Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌは全長Ａｓｅｆ遺伝子；ＡＰＣ−ａｒｍはＡＰＣ遺伝子のアルマジロリピートドメイン；Ａｓｅｆ−ΔＡＰＣはＡＰＣ結合部位を欠失させたＡｓｅｆ変異体遺伝子；Ａｓｅｆ−ΔＤＨはＤＨドメインを欠失させたＡｓｅｆ変異体遺伝子を含むアデノウイルスで細胞を感染させたことを示す。結果は３回の実験の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
【図２】Ａｓｅｆ遺伝子発現によるＭＤＣＫ細胞の細胞運動性の亢進が、アルマジロリピートドメインを含むＡＰＣ変異体（ＡＰＣ−ａｒｍ、ＡＰＣ−８７６およびＡＰＣ−１３０９）遺伝子の共発現によりさらに促進されたこと、並びにＡｓｅｆ遺伝子発現により亢進された運動性および細胞本来の運動性がＡｓｅｆ−ΔＤＨ遺伝子またはＡｓｅｆ−ＡＢＲ（ＡｓｅｆのＡＰＣ結合領域）遺伝子の発現により低減したことを説明する図である。結果は、親細胞の遊走に対する相対的遊走（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）で表した。図中Ｍｏｃｋとは、空ベクターを導入した細胞を意味する。
【図３ａ】ＳＷ４８０細胞中でＡｓｅｆとＡＰＣ切断変異体が結合したことを説明する図である。結合の解析は、抗Ａｓｅｆ抗体（Ａｎｔｉ−Ａｓｅｆ）を用いて免疫沈降により行った。図中、＋は免疫沈降前に抗原でプレインキュベーションした抗体を用いたことを示す。
【図３ｂ】Ａｓｅｆ−ＡＢＲ（ＡｓｅｆのＡＰＣ結合領域）が、インビトロでのＩＶＴ−ＡＰＣ−ａｒｍとＧＳＴ−Ａｓｅｆ−ｆｕｌｌの相互作用を、用量依存的に阻害したことを説明する図である。図中、ＭＷ．は分子量マーカーを示す。
【図４】Ａｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ結合部位を欠失させたＡｓｅｆ遺伝子（Ａｓｅｆ−△ＡＰＣ）の発現により大腸癌細胞ＳＷ４８０の運動性が亢進したが、ＧＥＦ領域を欠失させたＡｓｅｆ遺伝子（Ａｓｅｆ−△ＤＨ）を発現させても各種大腸癌細胞（ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１５、ＷｉＤｒおよびＨＣＴ１１６）の運動性は変化しないか、あるいは低減したことを説明する図である。結果は、対照であるＬａｃＺ遺伝子を発現させた各細胞の遊走に対する相対的遊走（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）で表した。
【図５】Ａｓｅｆ遺伝子およびＡＰＣ遺伝子の発現をそれぞれ阻害するショートヘアピンＲＮＡであるｓｈＲＮＡ−ＡｓｅｆおよびｓｈＲＮＡ−ＡＰＣが、いずれもＡＰＣ変異を有する大腸癌細胞（ＳＷ４８０およびＷｉＤｒ）の運動性を低減させたが、正常ＡＰＣを有する大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６およびＬＳ１８０）の運動性には影響しなかったことを説明する図である。比較対照として、Ａｓｅｆ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の発現を阻害しないショートヘアピンＲＮＡであるｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−Ａｓｅｆおよびｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−ＡＰＣを用いた。結果は、ｍｕｔ−ｓｈＲＮＡ−Ａｓｅｆを遺伝子導入した各細胞の遊走に対する相対的遊走（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）で表した。
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号１：Ａｓｅｆ遺伝子の発現を抑制するために、ヒトＡｓｅｆの塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号２：ＡＰＣ遺伝子の発現を抑制するために、ヒトＡＰＣの塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号３：Ａｓｅｆ遺伝子の発現を抑制するために、ヒトＡｓｅｆの塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ＡＰＣ遺伝子の発現を抑制するために、ヒトＡＰＣの塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号５：配列番号１に記載の塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号６：配列番号２に記載の塩基配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120>  An inhibitory agent for metastasis of colon carcinoma
<130>  GP03-1025J
<150>  JP P2002-382083
<151>  2002-11-24
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial
<220>
<223>  Designed oligonucleotide based on the base sequence of human Asef
to inhibit the expression of the Asef gene
<400>  1
aagccgactt ccagatctac tcggagtact g                                    31
<210>  2
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial
<220>
<223>  Designed oligonucleotide based on the base sequence of human APC
to inhibit the expression of the APC gene
<400>  2
aactgaggca tctaatatga aggaagtact t                                    31
<210>  3
<211>  31
<212>  RNA
<213>  artificial
<220>
<223>  Designed oligonucleotide based on the base sequence of human Asef
to inhibit the expression of the Asef gene
<400>  3
uucggcugaa ggucuagaug agccucauga c                                    31
<210>  4
<211>  31
<212>  RNA
<213>  artificial
<220>
<223>  Designed oligonucleotide based on the base sequence of human APC
to inhibit the expression of the APC gene
<400>  4
uugacuccgu agauuauacu uccuucauga a                                    31
<210>  5
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial
<220>
<223>  Designed oligonucleotide based on the base sequence of SEQ ID NO:
1
<400>  5
aagacgactt ccaaatctac tcagagtact g                                    31
<210>  6
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial
<220>
<223>  Designed oligonucleotide based on the base sequence of SEQ ID NO:
2
<400>  6
aactaaggca tataatatga aggaaatact t                                    31
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
0004733394.tif 000006
【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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