(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でCTGFの発現を抑制するためのポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは細胞内のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続したヌクレオチド配列を含み、かつ15ヌクレオチド〜100ヌクレオチド長であり、また該ポリヌクレオチドはCTGFターゲット核酸配列とハイブリダイズし、それによって、細胞内での非抑制レベルのCTGF発現に比較して、CTGFの発現を抑制するものであり、前記CTGFターゲット核酸配列が、
3' acu gga guc gau cau gga cag aaa g 5'（配列番号１３）；
3' agg acu gag ggc ugg uca cag uga c 5'（配列番号１４）；
3' gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a 5'（配列番号１５）；
3' aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g 5'（配列番号１６）；
3' agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g 5'（配列番号１７）；および
3' gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u 5'（配列番号１８）
からなる群から選択される、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドの長さが15ヌクレオチド〜80ヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドの長さが15ヌクレオチド〜60ヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、
tga cct cag cua gua ccu guc uuu c（配列番号７）；
tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g（配列番号８）；
ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u（配列番号９）；
tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c（配列番号１０）；
tca ctc agg uua cag uuu cca cug c（配列番号１１）；および
ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a（配列番号１２）
からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
細胞内でターゲット核酸に結合する請求項１に記載のポリヌクレオチドと細胞をin vitroで接触させることを含む、細胞内でのCTGFの発現を抑制するための方法であって、前記ポリヌクレオチドが細胞内でのCTGFの発現を抑制する、前記方法。
【請求項８】
細胞が真核細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
CTGFに関係がある細胞増殖性障害を改善するための医薬の製造における、細胞内のターゲット核酸に結合し、それによってCTGF活性をレギュレートする、請求項１に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
細胞増殖性障害が細胞の過剰増殖に起因する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
細胞増殖性障害が結合組織細胞の過剰増殖に起因する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
CTGF活性のレギュレーションがダウンレギュレーションである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
アンチセンスポリヌクレオチドが、
tga cct cag cua gua ccu guc uuu c（配列番号７）；
tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g（配列番号８）；
ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u（配列番号９）；
tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c（配列番号１０）；
tca ctc agg uua cag uuu cca cug c（配列番号１１）；および
ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a（配列番号１２）
からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
障害が、強皮症、関節炎、硬変症、肝線維症、腎線維症、アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着および手術瘢痕からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１８】
製薬上許容される担体；および
核酸に結合し、それによってCTGFの発現を抑制する、15ヌクレオチド〜100ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの治療上有効な量、
を含む、CTGFに関係がある障害の治療用の医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが結合する核酸が、
3' acu gga guc gau cau gga cag aaa g 5'（配列番号１３）；
3' agg acu gag ggc ugg uca cag uga c 5'（配列番号１４）；
3' gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a 5'（配列番号１５）；
3' aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g 5'（配列番号１６）；
3' agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g 5'（配列番号１７）；および
3' gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u 5'（配列番号１８）
からなる群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが、
tga cct cag cua gua ccu guc uuu c（配列番号７）；
tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g（配列番号８）；
ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u（配列番号９）；
tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c（配列番号１０）；
tca ctc agg uua cag uuu cca cug c（配列番号１１）；および
ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a（配列番号１２）、
またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
障害が、強皮症、関節炎、硬変症、肝線維症、腎線維症、アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着および手術瘢痕からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
障害が細胞の過剰増殖に起因する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
障害が結合組織細胞の過剰増殖に起因する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが発現ベクターから発現される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
1以上の容器を収容し得るように区画された運搬手段を有し、少なくとも1容器がCTGFに結合する15ヌクレオチド〜100ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド1種以上を含んでいる、CTGF発現の検出用キットであって、前記オリゴヌクレオチドが結合する核酸が、
3' acu gga guc gau cau gga cag aaa g 5'（配列番号１３）；
3' agg acu gag ggc ugg uca cag uga c 5'（配列番号１４）；
3' gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a 5'（配列番号１５）；
3' aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g 5'（配列番号１６）；
3' agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g 5'（配列番号１７）；および
3' gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u 5'（配列番号１８）
からなる群から選択される、前記キット。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドが、
tga cct cag cua gua ccu guc uuu c（配列番号７）；
tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g（配列番号８）；
ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u（配列番号９）；
tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c（配列番号１０）；
tca ctc agg uua cag uuu cca cug c（配列番号１１）；および
ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a（配列番号１２）、
またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に成長因子の分野に関し、さらに特定すると結合組織成長因子（CTGF）およびCTGFの活性を調節する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
成長因子とは、広い意味で、個体発生ならびに組織の形態および機能の維持の両方を制御する、多機能性、局所作用性、細胞内シグナル伝達性のポリペプチドとして定義することができる。多くの癌原遺伝子のタンパク質産物が成長因子および成長因子受容体として同定されている。哺乳動物中で最初に発見された多くの癌遺伝子の正常変異体も、酵母、ショウジョウバエおよびカエルなどの異種の生物体のゲノム中に存在し、胚発生中に機能する。
【０００３】
成長因子はターゲット細胞を刺激して、発生中の組織中で増殖、分化および組織化する。成長因子の作用は、細胞内でのシグナル伝達事象を刺激する特定の受容体への結合に依存する。成長因子の例として、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF-I、IGF-II）、トランスフォーミング成長因子ベ ータ（TGF-β）、トランスフォーミング成長因子アルファ（TGF-α）、表皮成長因子（EGF）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（aFGF、bFGF）および結合組織成長因子（CTGF）が含まれ、これらは細胞を刺激して増殖させることが知られている。
【０００４】
PDGFは循環血小板のアルファ顆粒中に発見されたカチオン性の熱安定性タンパク質であり、線維芽細胞および平滑筋細胞などの結合組織細胞に関するマイトジェンおよび走化性作用剤として知られている。この分子の活性によって、PDGFは創傷の正常な癒合に関与する主要な因子であり、またアテローム性動脈硬化症および線維形成性症状などの症状に病理学的に寄与するものと信じられている。PDGFはαおよび／またはβ鎖の組合せで構成される二量体分子である。この鎖はヘテロ二量体またはホモ二量体を形成し、今日まで単離されたすべての組合せが生物学的に活性である。
【０００５】
組織の再生および修復における各種の成長因子の役割の研究から、PDGF様タンパク質の発見がもたらされた。これらのタンパク質は免疫学的および生物学的活性の両方においてPDGFと共通しており、PDGFに特異的な抗体によってブロックすることができる。
【０００６】
ポリペプチド成長因子およびサイトカインは母体子宮と発生中の胚若しくは胎児間の成長シグナル伝達経路を形成するらしい重要なクラスの子宮タンパク質として明らかになってきている。多様な種における研究から、EGF、結合組織EGF様成長因子（HB-EGF）、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、プレイトロフィン（PTN）、白血病抑制因子、コロニー刺激因子-1（CSF-1）およびTGF-αがこれらのプロセスに関与する子宮成長調節性分子の中に入るらしいことが示唆された。
【０００７】
CTGFはM38,000のシステインに富むモノマー性ペプチドで、結合組織細胞に関するマイトジェンおよび走化性活性を持つ成長因子である。CTGFは細胞で分泌され、特異的な細胞表面受容体との相互作用に対して作用する。CTGFはPDGFのα若しくはβ鎖遺伝子には無関係な遺伝子の産物である。これは成長調節因子のファミリーのメンバーで、これとしてマウス（fisp-12若しくはβIG-M2としても知られている）およびヒトCTGF、Cyr61（マウス）、Cef10（ニワトリ）、ならびにNov（ニワトリ）が含まれる。配列の比較に基づいて、このファミリーのメンバーはすべて、(1)結合に関わるインスリン様成長因子ドメイン、(2)複合体形成に関わるvon Willebrand因子ドメイン、(3)おそらくマトリックス分子の結合に関わるトロンボスポンジンI型反復、および(4)マトリックスタンパク質中にみられ、受容体の結合に関わると仮定されるC-末端モジュール、で構成される、モジュール型構造を持っていることが示唆された。
【０００８】
ヒトCTGF（hCTGF）のためのcDNAの配列は1047ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、位置130に開始部位、および位置1177にTGA終止部位を持ち、349アミノ酸のペプチドをコードする。CTGF cDNAとPDGFのα若しくはβ鎖のいずれかのcDNA間には40％の配列相同性しかない。
【０００９】
hCTGFオープンリーディングフレームは39個のシステイン残基を含むポリペプチドをコードし、複数の細胞内ジスルフィド結合を持つタンパク質であることを意味している。このペプチドのアミノ末端は分泌されるタンパク質を示す疎水性シグナル配列を含み、アミノ酸配列中のアスパラギン残基28および225に２つのN-結合グリコシル化部位がある。CTGFポリペプチドとCEF-10 mRNA転写物によってコードされるポリペプチド間には全体で45％の配列相同性があり、推定上の選択的スプライシング領域を欠失させると、相同性は52％に達する。
【００１０】
ペプチド配列相同性はあるとしてもごくわずかであるが、CTGFはPDGFに抗原性について関連がある。抗PDGF抗体はPDGF若しくはCTGFの非還元型に対して高親和性で、生物学的活性を欠如したこれらのペプチドの還元型に対しては10倍親和性が少ない。このことは、PDGF異性体とCTGF分子間には共通する三次構造の領域があって、その結果共通の抗原エピトープがあることを示唆している。
【００１１】
CTGFの合成および分泌は、TGF-β、BMP-2およびおそらくTGF-βスーパーファミリーのタンパク質のその他のメンバーによって選択的に誘導される。TGF-βはソフトアガー中で正常な線維芽細胞の成長を刺激することができるが、CTGFのみでは線維芽細胞中でこの特性を誘導することができない。しかし、CTGFの合成および作用は、TGF-βにとって足場非依存性線維芽細胞の増殖を刺激するのに不可欠であることが示されている。
【００１２】
CTGFまたはその断片が創傷の癒合における成長因子として機能するものと見られる。病理学的には、全身性硬化症、癌、線維形成性症状およびアテローム性動脈硬化症などの結合組織細胞の過剰増殖がある症状にCTGFが関与するものと仮定されてきた。
【００１３】
CTGFポリペプチドの主要な生物学的活性はその分裂原性、またはターゲット細胞を刺激して増殖させる能力、および細胞外マトリックスの合成におけるその役割である。このin vivoでのマイトジェン活性の最終的な結果はターゲット組織の成長である。CTGFは走化性活性をも所有している。これは特定の分子との相互作用の結果として化学的に誘導される細胞の運動である。
【００１４】
発明の概要
本発明はラット結合組織成長因子（CTGF）として同定されたポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドを提供する。本発明の１態様によれば、新規な組換えCTGF、ならびにその活性な断片、類似体および誘導体が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む、本発明のCTGFをコードする単離された核酸分子、ならびにそのタンパク質の活性な類似体および断片が提供される。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含有する組換え原核および／または真核宿主細胞を、このタンパク質の発現およびその後のこのタンパク質の回収を促進するような条件下で培養することを含む、組換え技術によるCTGFポリペプチドの製造方法を提供する。本発明のさらなる態様において、CTGFに結合する抗体が提供される。
【００１７】
別の態様において、本発明は細胞中のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む、細胞中でのCTGFの発現を抑制するためのポリヌクレオチドを提供するが、この場合、該ポリヌクレオチドはCTGFターゲット核酸配列にハイブリダイズすることによって、細胞中で抑制されないCTGFの発現レベルに比較して、CTGFの発現を抑制する。
【００１８】
さらに本発明は、細胞中のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む、細胞中でのCTGFの発現を抑制するための方法を提供するが、この場合、該ポリヌクレオチドは細胞中でCTGFの発現を抑制する。
【００１９】
さらに別の本発明の態様によれば、細胞中のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを被験体に投与することを含む、被験体中でのCTGFの発現を抑制するための方法を提供するが、この場合、該ポリヌクレオチドは被験体中でCTGFの発現を抑制するのに十分なレベルで発現される。
【００２０】
別の実施形態において、本発明はCTGFに関係がある障害の治療用の医薬組成物を提供する。この医薬組成物は製薬上許容される担体とCTGF核酸に結合するオリゴヌクレオチドの治療上有効な量を含む。
【００２１】
図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照。）
以下の図面は本発明の実施形態を説明するためのものであって、特許請求の範囲によって包括される本発明の範囲を限定するつもりではない。
【００２２】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、単に説明のために掲載するものである。なぜならば、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の各種の変更および改変が当業者に明らかになるはずだからである。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明はラット結合組織成長因子（CTGF）の核酸配列およびそれにコードされるタンパク質を開示する。このタンパク質は哺乳動物組織の正常な発生、成長および修復において重要な役割を持つらしい。CTGFの生物学的活性はPDGFのものと類似しているが、CTGFはPDGFのα若しくはβ鎖遺伝子には無関係な遺伝子の産物である。CTGFは内皮および線維芽細胞によって産生され、これら両者は創傷の部位に存在するので、おそらくCTGFは創傷の癒合における成長因子として機能するものと見られる。病理学的には、CTGFは癌、線維形成性疾患およびアテローム性動脈硬化症などの結合組織細胞の過剰増殖がある疾患に関与するらしい。CTGFポリペプチドは皮膚の創傷の癒合障害があるか、または正常な癒合機構を強化する必要がある場合に、治療剤として有用になり得る。治療上は、CTGFが組織の過剰増殖を誘導している疾患において、CTGFの生物学的活性を中和するために、抗体または抗体分子の断片を使用することもできる。
【００２４】
CTGFポリペプチドの主要な生物学的活性の１つはその分裂原性、またはターゲット細胞を刺激して増殖させる能力である。このin vivoでのマイトジェン活性の最終的な結果はターゲット組織の成長である。CTGFポリペプチドの第２の活性は、このポリペプチドまたはその断片がコラーゲンの蓄積（ECM）を含む細胞外マトリックスの創出および発生において果たす役割に関係する。CTGFは走化性活性をも有している。これは特定の分子との相互作用の結果として化学的に誘導される細胞の運動である。好ましくは、本発明のCTGFは結合組織細胞について分裂原性および化学走性であるが、その他の細胞タイプも同様にCTGFポリペプチド応答性であり得る。
【００２５】
本明細書で使用する用語「実質的に純粋な」とは、天然で関係する別のタンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含まないCTGFを意味する。実質的に純粋なCTGFポリペプチドは非還元ポリアミドゲル上で単一の主要バンドを生成するはずである。CTGFの純度はアミノ末端アミノ酸配列分析によって判定することもできる。本明細書で定義するCTGFにはCTGFの生物学的活性（例えば、当分野で普通の、および本明細書中で教示する標準的なアッセイを使用して判定したときに、線維芽細胞中で生物学的応答を誘導すること）が維持されている限り、このポリペプチドの機能的な断片も含まれる。CTGFの生物学的活性を含有しているさらに小さいポリペプチドが本発明に含まれる。その他、例えばCTGFポリペプチドcDNAの部位特異的突然変異誘発によって産生される、さらに効果的なCTGFが含まれる。「組換え」CTGFとは、組換えDNA技術によって製造される、すなわち所望のCTGFポリペプチドをコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から産生されるCTGFポリペプチドを意味する。「合成」CTGFは化学合成によって調製されるものである。特定のCTGFポリペプチド「の配列をコードする」DNAまたは「をコードするヌクレオチド配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、転写されてCTGFポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。
【００２６】
本発明は、CTGFタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、結合組織成長因子をコードするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれる。CTGFの分裂原性ECMおよび／または走化性活性を有するポリペプチドをコードする限り、CTGFの全部または一部をコードするすべてのポリヌクレオチドも本発明に含まれるものと理解されたい。こうしたポリヌクレオチドとして、天然のポリヌクレオチド、および意図的に操作されたポリヌクレオチドの両方が含まれる。例えば、CTGFポリヌクレオチドに部位特異的突然変異を誘発することができる。本発明のポリヌクレオチドとして遺伝コードの結果として縮重した配列が含まれる。天然のアミノ酸はわずかに20種であり、その大部分は２以上のコドンによって特定される。したがって、CTGFのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。
【００２７】
ラットCTGFのためのcDNA配列（図１）は位置212に開始部位と位置1353にTAA終止部位を持つ2350ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、346個のアミノ酸のペプチドをコードする。
【００２８】
「単離された核酸」とは、由来源の生物の天然に生起するゲノム中に存在する場合に正常では直接連続している5'および3'隣接配列と、直接連続していない核酸、例えばDNAまたはRNA分子を意味する。したがって、この用語は、例えばプラスミド若しくはウイルスベクターなどのベクター中に組み込まれた核酸、異種細胞のゲノム（若しくは同種細胞のゲノムであるが天然に生起するものとは異なる部位にあるもの）中に組み込まれた核酸、ならびに別個の分子として存在する核酸、例えばPCR増幅若しくは制限酵素消化によって製造されたDNA断片、またはin vitro転写によって製造されたRNA分子、を示す。この用語は、例えば融合タンパク質の製造において使用することができる、追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の部分を形成する、組換え核酸をも示す。
【００２９】
本発明の核酸分子を、CTGF遺伝子産物（例えばCTGF RNAおよびCTGFポリペプチド）の製造のための標準的な方法における鋳型として使用することができる。その上、CTGFポリペプチドをコードする核酸分子（およびその断片）、さらに(1) 当分野で既知の非ラットCTGFをコードする配列以外の、CTGFポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、これらとハイブリダイズする配列を含有する核酸、またはその断片（例えば少なくとも10、12、15、20、若しくは25ヌクレオチド）ならびに(2)当分野で既知の非ラットCTGFをコードする配列以外の、CTGFポリペプチドをコードする核酸に相補的な配列とハイブリダイズする配列を含有する核酸、またはその断片（例えば少なくとも10、12、15、20、若しくは25ヌクレオチド)、などの関連核酸を、それらのハイブリダイズ特性に着目した方法において使用することができる。例えば、以下にさらに詳細に記載するように、こうした核酸分子を以下の方法において使用することができる：CTGF核酸を合成するためのPCR法、サンプル中のCTGF核酸の存在を検出するための方法、新規なCTGFファミリーメンバーをコードする核酸を同定するためのスクリーニング法。スクリーニング法のために有用なオリゴヌクレオチドプローブは長さが10から約150ヌクレオチドである。さらにこうしたプローブは好ましくは長さが10から約100ヌクレオチドであり、さらに好ましくは長さが10から約50ヌクレオチドである。
【００３０】
本発明には、配列番号１の他にCTGFポリペプチドファミリーのメンバーをコードする核酸分子を同定するための方法も含まれる。これらの方法において、CTGFポリペプチドをコードする核酸を含有するサンプル、例えばラットcDNAライブラリーなどの核酸ライブラリーをCTGF特異的プローブ、例えばCTGF特異的核酸プローブでスクリーニングする。CTGF特異的核酸プローブはCTGFポリペプチドをコードする核酸またはそれに相補的な配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子（例えば、DNA若しくはRNAヌクレオチド、またはそれらの組合せ若しくは改変体を含む分子）である。本発明のこの方法に関係した用語「CTGF特異的プローブ」は、ラットCTGFポリペプチドをコードする核酸またはそれに相補的な配列に、その他のタンパク質をコードする核酸またはそれに相補的な配列に対するよりも検出し得る程度に多く結合するプローブを称する。
【００３１】
本発明はCTGF特異的核酸プローブの製造を容易にする。こうしたプローブを取得するための方法は、図１に示すアミノ酸配列に基づいて設計することができる。少なくとも10、例えば15、25、35、50、100若しくは150ヌクレオチドを含有するプローブをいくつかの標準的な方法（例えばAusubelら、上記、参照）のいずれかを使用して製造することができる。例えば、好ましくはPCR増幅法を使用して、プローブを作成する。これらの方法において、CTGF特異的アミノ酸を含むCTGF保存配列（図１参照）に対応するプライマーを設計し、生成するPCR産物をプローブとして使用して、cDNAライブラリーなどの核酸ライブラリーをスクリーニングする。
【００３２】
本発明の全長遺伝子の断片をcDNA若しくはゲノムライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用して、全長DNAを単離し、またこの遺伝子に高度な配列類似性または同様の生物学的活性を持つ別のDNAを単離することができる。このタイプのプローブは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、およびさらに好ましくは少なくとも30塩基を持ち、また例えば少なくとも50若しくはそれ以上の塩基を含んでいてもよい。このプローブを使用して、全長転写物に対応するDNAクローン、さらに調節およびプロモーター領域、エキソンならびにイントロンを含む完全遺伝子を含有するゲノムクローンまたはクローン群を同定することができる。
【００３３】
本発明は、図１に開示するラットCTGFをコードする単離された核酸分子（配列番号１）の他に、実質的に同様の配列をも提供する。単離された核酸配列は、(i)以下に記載するストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズすることができるか、または(ii)配列番号１と縮重性であるDNA配列をコードし、こうした単離された核酸配列が既知の形態のCTGF（例えばヒトCTGF）をコードしないならば、実質的に同様である。縮重性DNA配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチドコード配列中に変異を持つ。本明細書で使用する「実質的に同様の」とは、本発明の配列と同様の同一性を持つ配列を称する。実質的に同様のヌクレオチド配列はハイブリダイゼーションまたは配列の比較によって同定することができる。実質的に同様のタンパク質配列は以下の１以上によって同定することができる：タンパク質分解消化、ゲル電気泳動および／またはマイクロシークエンシング。CTGFタンパク質をコードする核酸分子を単離するための１手段は、天然の、または当分野で認められた操作法を使用して人工的に設計したプローブで、ゲノム遺伝子ライブラリーをプローブするものである（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel F.M.ら(編)Green Publishing Company Assoc. and John Wiley Interscience,New York,1989,1992,参照)。配列番号１、または（少なくとも10連続ヌクレオチドを含み、ターゲット配列に少なくとも70％相補的な）その断片が特に有用なプローブであることは、当業者が認識し得るものである。この目的のために特に有用なその他のプローブは、配列番号１の配列にハイブリダイズし得る（すなわち、少なくとも10連続ヌクレオチドを含み、ターゲット配列に少なくとも70％相補的な）断片である。
【００３４】
適切なプローブが利用し得るならば、核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスクリーニング操作によって、任意の生物体から任意の遺伝子配列を単離することが可能になる。例えば、問題のタンパク質をコードする配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド区間が知られている必要がある。そのタンパク質をコードするDNA配列は遺伝コードから推定することができるが、コードの縮重性を考慮にいれなければならない。配列が縮重する場合は、混合添加反応を実施することが可能である。これには、変性二本鎖DNAの異種混合物が含まれる。こうしたスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションを一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNA上で実施するのが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目 的のポリペプチドに関係するmRNAが非常に少量存在する取得源に由来するcDNAクローンの検出において、特に有用である。換言すれば、非特異的結合を回避する目的で、選択的ハイブリダイゼーション条件を使用し、例えば、混合物中で完全に相補的な単一のプローブに対するターゲットDNAのハイブリダイゼーションによって、特異的cDNAクローンをオートラジオグラフィーで可視化させることが可能である（Wallaceら、Nucleic Acid Research,9:879,1981）。こうした選択的ハイブリダイゼーションプローブは、プローブの同定を容易にするために、分析において検出可能な試薬で標識することもでき、またそれが好ましいものと認められる。有用な試薬として、限定するわけではないが、放射能、蛍光染料、または検出し得る産物の形成を触媒することができる酵素が含まれる。このように、選択的ハイブリダイゼーションプローブは、別の起源からのDNAの相補的コピーを単離するため、または関係する配列のためのこうした起源をスクリーニングするために、有用である。
【００３５】
本明細書に開示する特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列に関して、ハイブリダイゼーションを、低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー条件、またはストリンジェント条件下でも実施することができる。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの１例として、固定化された変性核酸を含有するポリマー膜を最初に、0.9 M NaCl、50 mM NaH２PO４,pH7.0、5.0 mM Na２EDTA、0.5％SDS、10Ｘ Denhardtおよび0.5 mg/mLポリリボアデニル酸で構成される溶液中で、45℃で30分、予備ハイブリダイズする。次にこの溶液に、３２P 末端標識したオリゴヌクレオチドプローブを約2Ｘ10７ cpm（比活性 4ｘ10８ cpm/μg）添加する。12〜16時間のインキュベート後、オリゴヌクレオチドプローブについて、0.5％SDSを含有する1ＸSET（150 mM NaCl、20 mM Tris塩酸塩,pH7.8、1 mM Na２EDTA）中で、室温で30分、その後新たな1ＸSETで、Tm-10℃で30分、膜を洗浄する 。次に、ハイブリダイゼーションシグナルの検出のために、膜をオートラジオグラフフィルムに露出する。
【００３６】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために使用する条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に応じて変わるはずである。ハイブリダイゼーション条件を選択するにあたって、例えば、核酸のハイブリダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含量）および核酸の型（例えばRNA対DNA）を考慮することができる。もう一つの考慮点は、核酸の一方が例えばフィルター上に固定されているかどうかである。
【００３７】
漸次高度化するストリンジェンシー条件は以下のとおりである：室温付近で2 ｘSSC／0.1％SDS（ハイブリダイゼーション条件)；室温付近で0.2ｘSSC／0.1％SDS（低ストリンジェンシー条件)；42℃付近で0.2ｘSSC／0.1％SDS（中程度ストリンジェンシー条件)；および68℃付近で0.1ｘSSC（高ストリンジェンシー条件)。洗浄はこれらの条件の１つだけ、例えば高ストリンジェンシー条件を使用して実施するか、または各条件を上掲の順番で例えばそれぞれ10〜15分ずつ実施し、上記のステップのいずれかまたは全部を反復することができる。しかし、上に示したように、最適条件は関与する特定のハイブリダイズ反応に応じて異なるはずであり、経験的に決定することができる。
【００３８】
本明細書で使用する「選択的ハイブリダイゼーション」は、発生させるハイブリダイゼーションの近傍でのヌクレオチド配列間の同一性の程度に基づいて、関連性がないCTGFと関連性があるものを識別する、中程度ストリンジェントまたは高ストリンジェント生理学的条件下でのハイブリダイゼーションを称する（J.Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(Current Edition)参照、この全部を参照により、本明細書中に組み入れる）。また、長さが95 bpsである100 bpsの配列の断片は、これが取得された100 bps配列と95％の同一性を持つものと理解すべきである。本明細書で使用する場合、互いに適正に整列させた場合、例えばBLASTNによって整列したとき、第１配列の塩基と別の配列の塩基間で少なくとも70％、および好ましくは少なくとも80％若しくは90％の同一性がある場合は、第１DNA（RNA）配列は別のDNA（RNA）配列に対して、それぞれ少なくとも70％、および好ましくは少なくとも80％の同一性がある。
【００３９】
本明細書で使用する用語としての「同一性」は、参照ポリヌクレオチド（配列番号１）とある割合の同一の塩基を含むポリヌクレオチド配列を称する。例えば、参照ポリヌクレオチドと少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドを形成する塩基の90％と同一であるポリヌクレオチド塩基を持ち（すなわち、該配列を、当業者には普通の標準的な整列および相同性調整(例えばNetBlastまたはGRAIL)を使用して互いに適正に整列した場合）、そのポリヌクレオチド配列を含む塩基の10％について別の塩基を持つ。
【００４０】
本発明は、変化がサイレント変化である、例えば変化がそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を変更しないような、参照ポリヌクレオチドとの差異があるポリヌクレオチドにも関する。本発明は、参照ポリヌクレオチド（配列番号１）にコードされるタンパク質においてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断をもたらすヌクレオチドの変化にも関する。本発明の好ましい態様において、これらのタンパク質は参照ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質と同一の生物学的活性を保持している。
【００４１】
こうしたプローブは、プローブの同定を容易にするために、分析によって検出し得る試薬で標識することができ、またそれが好ましいものと認められる。有用な試薬として、限定するわけではないが、放射能、蛍光染料、または検出し得る産物の形成を触媒することができるタンパク質が含まれる。このように、該プローブは、別の動物起源からのDNAの相補的コピーを単離するため、または関連する配列についてこうした起源をスクリーニングするために、有用である。
【００４２】
本発明は、少なくとも１つのCTGF特異的活性またはエピトープを保持しているラットCTGFポリペプチドの断片をも含む。例として、CTGF特異的抗体の製造における免疫原として、例えば少なくとも8〜10アミノ酸を含むCTGFポリペプチド断片を使用することができる。この断片には、例えばCTGF中で保存されているアミノ酸配列を含ませることができる。ペプチド免疫原としてのその使用の他に、サンプル中のCTGF特異的抗体の存在を検出するために、上記のCTGF断片をELISAなどのイムノアッセイにおいて使用することができる。
【００４３】
本発明のCTGFポリペプチドはいくつかの標準的方法のいずれかを使用して取得することができる。CTGFポリペプチドを、例えば、標準的組換え発現系で製造するか（下記参照）、化学的に合成するか（この手法は小さなCTGFペプチド断片に限定されうる）、またはこれらを天然に発現する生物体から精製することができる。
【００４４】
図１の成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号１）として、限定するものではないが、以下のものが含まれる：成熟タンパク質のコード配列のみ；成熟タンパク質のコード配列およびリーダー配列若しくはプロタンパク質配列などの追加のコード配列；成熟タンパク質のコード配列（および場合によっては追加のコード配列）ならびにイントロンなどの非コード配列または成熟タンパク質のコード配列の5'および／もしくは3'非コード配列。
【００４５】
図１のタンパク質の断片、誘導体または類似体は、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存的若しくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されたもので、その置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされたものであってもコードされないものでもよい、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)成熟タンパク質がタンパク質の半減期を増大する化合物（例えばポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合したもの、あるいは(iv)リーダー配列若しくは分泌性配列、または成熟タンパク質配列若しくはプロタンパク質配列の精製のために使用する配列などの追加のアミノ酸が成熟タンパク質と融合したもの、でありうる。こうした断片、誘導体および類似体は、本明細書の教示から当業者が行いうる範囲内であるものとみなされる。
【００４６】
このように、「１タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、そのタンパク質のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。したがって、単離された核酸配列およびその他のタンパク質を、本発明のタンパク質に特徴的な生物学的活性の保持について、例えば酵素的CTGF活性を検出するためのアッセイにおいて、測定することができる。こうしたタンパク質としては、CTGFの末端切断型、ならびに欠失および挿入変異体などの変異体が含まれる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドはDNAの形態であってよく、そのDNAにはcDNA、ゲノムDNA および合成DNAが含まれる。DNAは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場合には、コード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。成熟タンパク質をコードするコード配列は、図１〜６に示すコード配列と同一であってもよく、または異なるコード配列であって、そのコード配列が、遺伝暗号の重複若しくは縮重の結果として、図１のDNA（例えば配列番号１）と同一の成熟タンパク質をコードする配列であってもよい。
【００４８】
本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列（例えば配列番号２）を有するタンパク質の断片、類似体および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は天然に存在する該ポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であってもよいし、または該ポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であってもよい。
【００４９】
このように、本発明には、図１に示すものと同一の成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにこうしたポリヌクレオチドの変異体であって、その変異体が図１のタンパク質の断片、誘導体若しくは類似体をコードするものが含まれる。こうしたヌクレオチド変異体としては、欠失変異体、置換変異体ならびに付加若しくは挿入変異体が含まれる。
【００５０】
上述したように、上記ポリヌクレオチドは図１に示すコード配列（配列番号１）の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。当分野で知られているように、対立遺伝子変異体はコードされたタンパク質の機能を実質的に変更しない、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失若しくは付加を有しうる、ポリヌクレオチド配列の改変形態である。
【００５１】
本発明には、成熟タンパク質のコード配列が、宿主細胞からのタンパク質の発現および分泌を促進するポリヌクレオチド配列、例えば該細胞からのタンパク質輸送を制御する機能を有するリーダー配列に、同一のリーディングフレーム内で融合しうるポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するタンパク質はプレタンパク質であり、そのリーダー配列が宿主細胞によって切断されてタンパク質の成熟形態を形成しうる。ポリヌクレオチドは成熟タンパク質と追加の5'アミノ酸残基からなるプロタンパク質をもコードしてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、かつそのタンパク質の不活性形態である。プロ配列が切断された後は、活性な成熟タンパク質が残る。
【００５２】
本発明はさらに、配列間で少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およびさらに好ましくは少なくとも95％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、その配列が当技術分野では以前に知られていなかったポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間で少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のDNAがコードする成熟タンパク質と実質的に同一の生物学的機能または活性のいずれかを保持しているタンパク質をコードする。
【００５３】
あるいは、上記ポリヌクレオチドは、上記のように本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、同一性を有する、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基、さらに好ましくは少なくとも50塩基を有するもので、これは活性を保持していてもよいし保持していなくてもよい。例えば、こうしたポリヌクレオチドを、例えばポリヌクレオチドの回収のために、またはPCRプライマーとして、配列番号１のポリヌクレオチドのプローブとして、使用してもよい。
【００５４】
CTGFポリペプチドの発現
CTGFポリペプチドをコードするDNA配列は、適切な宿主細胞中へのDNA導入によってin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」は本発明のベクター（例えば、クローニングベクターもしくは発現ベクターとすることができる）によって遺伝子操作された細胞(形質導入または形質転換もしくはトランスフェクトされた細胞)である。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態をとることができる。操作された宿主細胞は、従来の栄養培地をプロモーターの活性化、形質転換体の選択、もしくは本発明の遺伝子の増幅に適するように改変した培地中で培養することができる。温度、pH、およびその他の培養条件は、その発現のために選択した宿主細胞に以前から用いられているものであり、当業者であれば明らかであろう。その宿主細胞と言う用語には対象の宿主細胞の子孫をも含んでいる。子孫は複製の過程で生ずる突然変異が存在する可能性があるため全てが親の細胞と同一のものではないことは理解されよう。しかしそのような子孫は、「宿主細胞」という用語を用いる場合には含まれるものである。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストランで媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、もしくはその他の当業界の方法で行うことができる(Davis, L.ら, Basic Methods in Molecular Biology(現行版))。
【００５５】
本発明の核酸は、組換え技法によってCTGFを産生するために用いることができる。したがって例えば、上記ポリヌクレオチドをCTGFポリペプチドを発現させるための種々の発現ベクターのうちの任意の１つに導入することができる。そのようなベクターとしては、染色体DNA、非染色体DNA、および合成DNA配列、例えばSV40誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージDNAの組み合わせから誘導したベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスDNAが挙げられる。しかし、その他のベクターもそれが宿主中で複製かつ生存可能なものである限りは用いることができる。
【００５６】
適切なDNA配列を種々の方法でベクター中に挿入することができる。通常は、そのDNA配列は当業界で既知の方法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位へ挿入される。そのような方法およびその他の方法は当業者であれば理解しうる範囲内にあるものと見なされる。CTGFをコードするDNA配列は、原核生物もしくは真核生物のいずれかでin vivoにて発現させることができる。真核生物のコード配列を有するDNA配列を原核生物中で発現させる方法は当業界ではよく知られている。宿主としては微生物、酵母、および哺乳動物の生物が含まれる。
【００５７】
CTGFをコードするDNA配列は適切な宿主細胞中へのDNA導入によってin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」とはベクターがその中で増殖しそのDNAが発現される細胞である。この用語はまた、対象とした宿主細胞のいかなる子孫をも含んでいる。子孫は複製の過程で生ずる突然変異を有する可能性があるので全てが親の細胞と同一のものではないことは理解されよう。しかしそのような子孫は、「宿主細胞」という用語を用いる場合には含まれるものである。
【００５８】
CTGFをコードするDNA配列は、原核生物もしくは真核生物のいずれかでin vivoにて発現させることができる。真核生物のコード配列を有するDNA配列を原核生物中で発現させる方法は当業界ではよく知られている。宿主としては微生物、酵母、および哺乳動物の生物が含まれる。
【００５９】
λgt11などのcDNA発現ライブラリーは、少なくとも1個のエピトープを有するCTGFペプチドを、CTGFに対し特異的な抗体もしくはPDGFに対する抗体（CTGFと交差反応する）を用いて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体はポリクローナルで誘導したもの、もしくはモノクローナルで誘導したもののいずれでもよく、CTGF cDNAの存在を示す発現産物を検出するために用いることができる。
【００６０】
宿主中で発現および複製を行うことのできる、生物学的に機能的なウイルスベクターおよびプラスミドDNAベクターは当業界では既知である。そのようなベクターは本発明のDNA配列を組み込むために用いられる。通常は、挿入された真核生物の遺伝的配列の効率的な転写を促進するようなプロモーター配列を含む発現ベクターを宿主と関連させて用いる。発現ベクターは典型的には、複製起点、プロモーターおよびターミネーター、ならびに形質転換された細胞を表現型に関して選択できるようにする特異的な遺伝子を含んでいる。
【００６１】
RNAポリメラーゼが2つのコード配列を単一のmRNAに転写する場合には、1つのコード配列は、もう1つのコード配列と「機能しうる形で連結」され、次いでそれが翻訳されて双方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドとなる。それらのコード配列は、発現された配列が最終的に所望のタンパク質を産生するようにプロセシングを受ける限りは、互いが隣接している必要はない。
【００６２】
ある特定のタンパク質のDNA「コード配列」もしくはある特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合に転写され、タンパク質に翻訳されるDNA配列である。「プロモーター配列」は細胞中でRNAポリメラーゼと結合し下流(3'方向)の０コード配列の転写を開始させることのできるDNA調節領域である。プロモーターはDNA配列の一部である。この配列領域はその3'末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するために必要なエレメントのある、最小限の数の塩基を含んでいる。しかし、RNAポリメラーゼがその配列に結合されると、その後に転写が開始コドン(プロモーターのある3'末端)で開始し、転写は下流の3'方向へと進行する。プロモーター配列内には転写開始部位(ヌクレアーゼS1を用いたマッピングで都合よく明確に定められる)ならびにRNAポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が認められる。
【００６３】
発現ベクターとして当業界で既知の細菌、酵母、および哺乳動物の発現系に加えてバキュロウイルスベクターも用いることができる。外来遺伝子をこの無脊椎動物のウイルス発現ベクターを用いて発現させることの1つの利点は、組換えタンパク質を高レベルで発現することができ、そのタンパク質の抗原性および機能がそのタンパク質の天然のものと同様であることである。バキュロウイルスベクターおよびそのベクターと組み合わせて用いられる適切な昆虫宿主細胞は当業者には既知である。本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞の単離と精製は、例えば分離用クロマトグラフィーによる分離法、およびモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いることを含む免疫学的分離法などの慣例的な方法によって行いうる。
【００６４】
組換えDNAを用いる宿主細胞の形質転換は当業者には既知の慣例法で行うことができる。宿主が大腸菌(E.coli)などの原核生物の場合には、DNAを取り込むことのできるコンピテント細胞を、当業界では既知の方法を用いて対数増殖期後に回収し、続いてCaCl２法で処理した細胞から調製することができる。あるいはまた、MgCl２もしくはRbClを用いてもよい。
【００６５】
用いる宿主が真核生物の場合には、DNA導入の種々の方法を用いることができる。そのような方法としてはリン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクションなどの慣例的な機械的手法、リポゾーム封入プラスミドの挿入、またはウイルスベクターの使用などのDNAのトランスフェクションが挙げられる。
【００６６】
真核生物宿主細胞としては酵母も含まれる。例えば、DNAを適切な発現ベクター中に挿入し、その産物を宿主細胞中に導入することによって酵母中でDNAを発現させることができる。酵母中での外来遺伝子の発現のための種々のシャトルベクターが報告されている(Heinemann, J.ら, Nature, 340:205, 1989; Rose, M.ら, Gene, 60:237, 1987)。
【００６７】
CTGFに対する抗体
本発明はCTGFポリペプチドもしくはその断片と特異的に反応する抗体を提供する。このポリペプチドはPDGFもしくはCTGFに対する抗体と交差反応しうるとはいえ、CTGFに対する抗体の全てがPDGFと反応するわけではなく、また、CTGFに対する抗体の全てがCTGF類と反応するわけでもない。異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体をプールしたものから本質的に構成される抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製品が提供される。モノクローナル抗体は該タンパク質の断片を含む抗原を用いて当業界でよく知られた方法で作製される(Kohlerら, Nature, 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, 1989)。本発明のCTGFに対するポリクローナル抗体には、当業者にとっては一般的な方法を用いて作製したものが含まれる(HarlowおよびLane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 現行版を参照せよ)。CTGFに対し特異的なモノクローナル抗体は、例えば、CTGFポリペプチドとは反応するがPDGFとは反応しないハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって選択することができる。本発明によってCTGFに対して作製された抗体は、該ポリペプチドの動物への直接注射、または該ポリペプチドの動物、好ましくはヒト以外の動物への投与によって得ることができる。そのようにして得られた抗体は該ポリペプチド自体と結合する。このような方法では、該ポリペプチドの断片のみをコードする配列であっても、もとのポリペプチドと結合する抗体を作製するために用いることができる。そのような抗体を、該ポリペプチドを発現している細胞からそのポリペプチドを単離するために用いることができる。
【００６８】
モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養物によって産生される抗体を提供するいかなる技法も用いることができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のための方法の例としては、ハイブリドーマ技法(Kohlerら, Nature, 256:495, 1975)、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72)、およびEBV-ハイブリドーマ技法が挙げられる(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp77-96)。
【００６９】
一本鎖抗体の産生のための記載されている技法(米国特許第4,946,778号)は本発明の免疫原性ペプチド産物に対する一本鎖抗体産生に適用することができる。さらに、本発明の範囲に含まれるのものは、CTGFポリペプチドもしくはその断片に対する「ヒト」抗体および「ヒト化」抗体の双方の診断的および治療的用途で用いるための産生および使用である。ヒト化抗体は親の抗体(すなわち典型的にはマウス起源のもの)と同じ結合特異性を有するがヒト抗体の性質が増大している抗体もしくは抗体断片である。ヒト化抗体は、チェーン・シャフリングにより、またはファージディスプレイ技術を用いて得ることができる。例えば、CTGFに対して特異的な非ヒト抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをヒトの相補的な(軽もしくは重)鎖可変ドメインのレパートリーと結合させる。対象とする抗原に対し特異的なハイブリッド対合が選択される。選択された対合からのヒト鎖は、次いでヒトの相補的な可変ドメイン(軽もしくは重)のレパートリーと結合させ、ヒト化抗体ポリペプチド二量体をある抗原に対する結合特異性に関して選択することができる。そのような技法は米国特許第5,565,332号に記載されており、または市販品を入手することもできる(Scotgene, ScotlandまたはOxford Molecular, Palo Alto, 米国カリフォルニア州)。さらに、トランスジェニックマウスにおける「ヒト」抗体(すなわち、ヒト定常領域配列を有する新規の抗体)の産生について記載されている技法(米国特許第5,545,806号および米国特許第5,569,825号)も「ヒト」CTGF抗体もしくは抗体断片の産生に適用することができるし、または商業的な契約によって得てもよい(GenPharm International, Inc., Mountain View, 米国カリフォルニア州)。
【００７０】
本発明のポリペプチドに対して作製された抗体をその他の生物およびサンプルから得た類似のCTGFポリペプチドのスクリーニングに用いることができる。そのようなスクリーニング技法は当業界では既知である。
【００７１】
治療方法
本発明はまた、細胞増殖性障害を特徴とする疾患を、その疾患の部位を有効量のCTGF反応性作用剤を用いて治療することによって改善するための方法を開示する。「改善する」という用語は、治療を受けている患者において、疾患が誘発する応答の有害な影響を減少させることを意味する。その疾患が細胞の過剰増殖に起因する場合には、CTGFポリペプチドのアンタゴニストは細胞上のCTGF特異的受容体と結合できる成長因子の量を低減させることに有効である。そのようなアンタゴニストは、CTGF特異的抗体もしくはその機能的な断片(例えば、Fab、F(ab')２)とすることができる。この治療法には、そのアンタゴニストを疾患部位に接触させることが必要である。細胞増殖障害が細胞増殖の量の減少に起因する場合には、刺激性のCTGF反応性作用剤を疾患部位と接触させる。例えば、TGF-βはそのような反応性作用剤の1つである。その他の作用剤は当業者には既知である。
【００７２】
本明細書で用いている「治療する」「治療」および類似の用語は、所望の薬理学的および/もしくは生理学的効果が得られることを意味する。その効果は、障害またはその徴候もしくは症状を、完全にまたは部分的に防止するという点で予防的であり、ならびに/あるいは、障害および/またはその障害に帰することのできる有害作用を部分的にまたは完全に治癒させるという点で治療的でありうる。本明細書で用いている「治療する」とは、哺乳動物の障害のいかなる治療をも包含するものであり、次のものを含む：
(a) ある障害の素因を有している可能性があるがその障害を有するとの診断はまだ受けていない被験体においてその障害が生ずることを予防すること；
(b) ある障害を妨げること、すなわちその発症を阻止すること；または
(c) その障害を軽減もしくは改善すること、例えばその障害を退縮させること。
【００７３】
「細胞増殖性障害」という用語は、異常な数の細胞を特徴とする状態を意味する。そのような状態としては、過形成性(細胞の連続的増殖がある組織内における細胞集団の過剰増殖をもたらすこと)および低形成性(ある組織内の細胞の欠損もしくは欠乏)の細胞増殖または細胞から体のある領域への過剰な流入もしくは移動が挙げられる。その細胞集団は必ずしも形質転換された細胞である必要はなく、腫瘍原性、もしくは悪性腫瘍細胞である必要もないが、正常細胞をも含めることができる。例えば、CTGFは動脈壁の内膜層に増殖性病変を誘発させることによって病態に関与し、動脈硬化をもたらす。その状態のに対する危険因子を低減することを試みること、例えば血圧を下げる、もしくは高コレステロールレベルを下げることなどの代わりに、本発明のCTGFポリペプチドインヒビターもしくはアンタゴニストは、動脈硬化に伴うCTGFのin vivoでの活性を妨害することに有用であろう。CTGFポリペプチドアンタゴニストはまた、その他の結合組織の過剰増殖に関連する障害、例えば強皮症、関節炎、および肝硬変を含む種々の線維症の症状などの障害の治療にも有用である。
【００７４】
CTGFが関連する疾患、障害、および症状としては、限定はされないが、手術もしくは放射線療法を含む急性もしくは反復性外傷から生ずる過度の瘢痕化；強皮症、ケロイド、および過形成性瘢痕を含む、腎臓、肺、肝臓、眼球、心臓、および皮膚などの臓器の線維症が挙げられる。CTGFの異常な発現は、一般的な組織瘢痕化、皮膚の腫瘍様増殖、および血管の持続的瘢痕化に伴ってみられ、それは血液運搬能の悪化、高血圧症、肥大などを導く。また、CTGFは血管内皮細胞増殖もしくは移動によって生ずる種々の疾患、例えば皮膚線維腫を含む癌、内皮細胞異常発現に関連する症状、乳癌線維形成性腫（desmosplasis）、血管脂肪腫、および血管平滑筋腫にも関連する。その他の関連する症状としては、アテローム性動脈硬化症および全身性硬化症（アテローム硬化性斑、炎症性腸疾患、クローン病、新脈管形成および動脈硬化に中心的な役割を果たすその他の増殖過程など）、関節炎、癌、およびその他の疾患症状、緑内障に関与する新生血管形成、疾患もしくは傷害による炎症（関節の炎症など）、腫瘍増殖転移、間質性疾患、皮膚疾患、関節炎（慢性関節リウマチなど）、動脈硬化症、糖尿病（糖尿病性神経障害など）、高血圧症およびその他の腎障害、ならびに化学療法、放射線療法、透析、同種移植および移植片拒絶反応に起因する線維症が挙げられる。
【００７５】
細胞増殖性障害としてはまた、線維増殖性障害も挙げることができ、それは例えば細胞外マトリクスの過剰産生が関与する。そのような症状としては限定はされないが、肝線維症、腎線維症、アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着および手術瘢痕が挙げられる。
【００７６】
CTGFによってモジュレートされるこれらの疾患、障害、もしくは軽度の疾病には、関節炎、骨粗鬆症、およびその他の骨格障害を含む外傷性損傷もしくは症状ならびに火傷の後の組織修復が含まれる。これらの問題が生ずるのは、損傷部位の線維芽細胞、幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞もしくは線維芽細胞の増殖応答が不十分であることに起因し、これらの細胞の増殖を刺激するかもしくは誘発する活性な生物薬剤の添加は有益である。本明細書で用いている「誘発する」もしくは「誘発」という用語は、本明細書に記載する組織の形成、修復過程、もしくは発達のいずれかに関して必要な細胞機構もしくは過程の活性化、刺激、増強、開始および/もしくは維持を意味する。
【００７７】
本明細書で用いられている「モジュレートする」という用語は、現存の症状もしくは生物学的状態のモジュレーションを意味する。本明細書では、ある症状のモジュレーションとは現存の状態に影響を及ぼす決定因子の増加もしくは減少の双方を含む。例えば、CTGFの投与は増加させるために用いうる。
【００７８】
本発明はまた、治療上有効な量のCTGF反応性作用剤を用いて細胞増殖性障害を特徴とする症状を治療することによって該症状を治療するための方法も開示する。「治療する」という用語は、その反応性作用剤の投与を受ける被験体において該症状の有害な影響を減少させることを意味する。その症状が細胞の過剰増殖に起因する場合には、CTGFのアンタゴニストは細胞上のCTGF特異的受容体と結合できる成長因子の量を低減させることに治療上有効である。そのようなアンタゴニストはCTGF特異的抗体もしくはその機能的な断片(例えば、Fab、F(ab)２)とすることができる。この治療法はそのCTGFポリペプチドのアンタゴニストをその症状部位に接触させるかもしくは送達することが必要である。細胞増殖性障害が細胞増殖の量の減少に起因する場合には、刺激性のCTGF反応性作用剤を該症状部位と接触させるかもしくはそこへ送達する。例えば、TGF-β(もしくはTGF-βスーパーファミリーの別のメンバー)は、そのような反応性作用剤の1つである。その他の生物薬剤は当業者には既知である。
【００７９】
本発明の方法に有用な治療用作用剤は、注射もしくは時間をかけて徐々に灌流することにより非経口的に投与することができる。投与は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、もしくは経皮的に行うことができる。
【００８０】
非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液もしくは非水溶液、懸濁剤、および乳剤が挙げられる。非水性溶剤の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、食塩液および緩衝化培地を含む、水、アルコール性水溶液、乳剤もしくは懸濁剤が挙げられる。非経口用のビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲルが挙げられ、静注用ビヒクルには、流体および栄養素の補液、電解質補液(デキストロースリンゲル液をベースにしたものなど)などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性気体などの保存剤およびその他の添加剤も加えることができる。
【００８１】
本発明の範囲内に包含される別の治療的アプローチは、本発明のCTGFを含む試薬もしくは組成物を、慣例的な投与手法(例えば、限定はされないが、局所注射、吸入、もしくは全身投与)のいずれかによって、繊維性、硬化性、もしくは細胞増殖性障害、アテローム性動脈硬化症を患う被験体に対して直接的に投与することである。上述のとおり、CTGFの投与は、創傷治癒を促進し、組織修復もしくは再生の形成、または子宮内膜の増殖と発達を誘発することができる。CTGFをコードする遺伝子を送達し、ターゲティングし、発現させるための方法として本明細書に記載の方法もしくは当業界で既知の方法のいずれの方法を用いても、試薬、製剤、もしくは組成物を特定の細胞もしくは受容体にターゲティングさせることができる。線維症障害、硬化症障害、細胞増殖性障害、アテローム性動脈硬化症、もしくは創傷治癒をモジュレートする試薬、製剤、もしくは組成物の実際の投与量は、生物の大きさおよび健康状態を含む多数の因子によって変わる。しかし、当業者であれば、臨床的投与量決定のための、または用いるべき適切な投与量を定めるための方法および技法を記載した下記の教示を用いることができる(Spilker, B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, pp.7-13, 54-60; Spilker, B., Guide to Clinical Trials, Raven Press Ltd., New York, 1991, pp.93-101; Craig, C.およびR. Stitzel編, Modern Pharmacology, 第2版, Little, Brown and Co., Boston, 1986, pp.127-33; T. Speight編, Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 第3版, Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, pp.50-56; R. Tallarida, R. Raffa, およびP. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, pp.18-20)；しかし通常は、約0.5μg/mL〜500μg/mLの範囲であり、これは任意の製薬上許容しうる担体中に含有させて成人1日あたりに投与されるものの最終濃度である。
【００８２】
治療用途のポリヌクレオチド
別の1実施形態においては、被験体中でのCTGF発現を阻害する方法は、そのような発現を阻害する治療上有効な量のポリヌクレオチドを投与することを含む。「被験体」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。細胞増殖性障害がCTGFの発現に関連する場合には、CTGFのRNAへの転写もしくはCTGF mRNAのタンパク質への翻訳を直接妨害する治療的アプローチが可能である。本明細書で用いている「CTGFターゲット核酸配列」とは、CTGFタンパク質をコードする核酸もしくはその断片のいかなるものも包含する。例えば、CTGF転写体RNAと結合する、もしくはそれを開裂させるアンチセンス核酸もしくはリボザイムも本発明の範囲内に含まれる。アンチセンスRNAもしくはDNA分子は、ターゲットとなる遺伝子のRNAメッセージと特異的に結合し、その遺伝子のタンパク質産物の発現を遮断する。そのアンチセンスは転写体RNAと結合して、その細胞では翻訳し得ない二本鎖分子を形成する。約15〜25個のヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドは、容易に合成することができ、アンチセンスRNA分子とほぼ同じ阻害作用を有するので好ましい。さらに、鉄が連結したエチレンジアミン四酢酸(EDTA-Fe)などの化学的反応基をアンチセンスポリヌクレオチドに結合させてハイブリダイゼーションの部位でのそのRNAの開裂を起こさせることができる。遺伝子のin vivoでの翻訳を阻害する方法のためのこれらおよびその他のアンチセンス法の使用については当業界ではよく知られている(例えば、De Mesmaekerら, 1995, Backbone modifications in polynucleotides and peptide nucleic acid systems. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Gewirtz, A. M.ら, 1996b, Facilitating delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense deliver on its promise; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A. A discussion of
G-tetrads, 1996, Exploiting the potential of antisense:  beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Chem. and Biol. 3:319-323)。
【００８３】
本明細書で用いている「転写体RNA」とは、あるタンパク質産物をコードするヌクレオチド配列を含むRNAである。好ましくは、その転写体RNAはメッセンジャーRNA（mRNA）である。本明細書で用いている「mRNA」は、1つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖RNA分子である。さらに、転写体RNAはヘテロ核RNA(hnRNA)もしくはマスクされた(masked)RNAとすることができる。本明細書で用いている「hnRNA」という用語は、RNAポリメラーゼIIの一次転写産物を意味し、スプライシングによってイントロンが除去される全mRNAの前駆体が含まれる。hnRNAは大規模にプロセシングを受けて、タンパク質合成が行われる細胞質に運び出されるmRNAをもたらす。このプロセシングには、5'末端での5'に連結された7-メチル-グアニル酸「キャップ」の追加および3'末端でのアデニル酸基の配列（ポリA「テイル」）の付加、ならびに全てのイントロンの除去、およびスプライシングしてエクソンをまとめることが含まれうる。本明細書で用いている「マスクされたRNA」とは、不活性な形で存在するいかなる形態のmRNAをも意味する。より具体的に述べれば、マスクされたRNAは形態形成の初期段階の間にマスクを除去される(脱抑制される)タンパク質合成のための母方の情報の記憶を指令するものである。
【００８４】
アンチセンス核酸は、特定の転写体RNA分子の少なくとも1部分に対して相補的なDNAもしくはRNA分子である(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990)。細胞内でそのアンチセンス核酸は対応する転写体RNAとハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。例えば、その細胞は二本鎖となったmRNAを翻訳しないので、そのアンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害することになる。このアンチセンスアプローチによる治療法において関与する機構としては、例えば、ハイブリダイゼーション抑止機構(Millerら, Anti-Cancer Drug Design 2:117-128, 1987)もしくはハイブリダイズしたRNAの細胞内酵素であるリボヌクレアーゼH(RNase H)による開裂(Walder, R.ら, PNAS USA 85:5011-5015, 1988、およびSteinら, Nucleic Acids Research 16:3209-3221, 1988)を挙げることができる。アンチセンスオリゴマーとしては約15個のヌクレオチドからなるものが好ましいが、それは容易に合成され、より大きな分子よりも問題を生ずる可能性が低いためである。遺伝子のin vitroでの翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用については当業界ではよく知られている(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988)。
【００８５】
転写を止めるためのポリヌクレオチドの使用は、トリプレックス手法として知られており、それはそのオリゴマーが2重らせんDNAのまわりに巻き付き3重鎖らせんを形成するからである。従って、これらのトリプレックス化合物は、ある選択した遺伝子の特有部位を認識するために設計することができる(Maherら, Antisense Res. and Dev., 1(3):227,1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991)。
【００８６】
リボザイムはRNA分子であって、他の1重鎖RNAを、DNA制限エンドヌクレアーゼと類似のやり方で特異的に開裂させる能力を有している。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列を改変することによって、あるRNA分子の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを開裂させる分子を操作することができるようになる(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988)。このアプローチの主たる利点はそれらが配列特異的であるので特定の配列を有するmRNAのみが不活化されることである。
【００８７】
リボザイムには2種の基本的なタイプがあり、それらはテトラヒメナタイプ(Hasselhoff, Nature, 334:585, 1988)およびハンマーヘッドタイプである。テトラヒメナタイプのリボザイムは塩基4個の長さの配列を認識するのに対し、ハンマーヘッドタイプのリボザイムは塩基11〜18個の長さの塩基配列を認識する。認識する配列の長さが長くなるほど、ターゲットmRNA種の中でその配列が他にはないものである可能性が高くなる。その結果、特定のmRNA種を不活化するためにはテトラヒメナタイプよりハンマーヘッドタイプのリボザイムの方が好ましく、18個の塩基の認識配列がより短い認識配列よりも好ましい。
【００８８】
遺伝子のin vivoでの翻訳を阻害するこれらのおよびその他のアンチセンス法については当業界ではよく知られている(例えば、De Mesmaekerら, 1995, Backbone modifications in polynucleotides and peptide nucleic acid systems, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Gewirtz, A.M.ら, 1996b, Facilitating delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense deliver on its promise; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A. A discussion of G-tetrads 1996, Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides, Chem. and Biol. 3:319-323)。
【００８９】
CTGFの発現を阻害するために有用なアンチセンスポリヌクレオチドの配列は、例えば、オルソロガス(orthologous)な遺伝子、もしくはオルソロガスな遺伝子の転写産物の配列を比較し、そのオルソロガスな配列内の高度の保存された領域を同定することによって得ることができる。ラット、ヒト、およびマウスCTGFをコードする核酸配列中に含まれる高度に保存された領域を同定したものを用いて、CTGF発現の阻害のために有用なポリヌクレオチドのデザインできる。本明細書で用いている「オルソロガスな配列」とは、その配列内で配列の相同性が種の間で保持もしくは保存されているものをいう。2種の異なる生物体からの2つの遺伝子配列は、それら2種の生物体に最も近縁の祖先の同一の遺伝子から由来するものである場合にオルソロガスである。例えば、脊椎動物のグロビン遺伝子は全て相同であり、それはそれらの遺伝子が初期の無脊椎動物の単一のグロビン遺伝子から由来したものである。この結果、ヒトおよびウマのα-グロビン遺伝子、およびそれからコードされる転写物はオルソロガスであるが、それはそれらが共通の祖先を持ち、著しい配列相同性を共有しているからである。従って、ポリヌクレオチドはそれらが、例えば、オルソロガス配列から同定された保存されている配列に対して完全にまたは部分的に相補的な核酸配列を含むようにデザインすることができる。
【００９０】
本発明の方法で有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては次のものが挙げられる：
S10839    5'-tga cct cag cua gua ccu guc uuu c-3'   (配列番号7);
S10840    tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g        (配列番号8);
S10841    ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u        (配列番号9);
S10842    tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c        (配列番号10);
S10843    tca ctc agg uua cag uuu cca cug c        (配列番号11);および
S10844    ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a        (配列番号12)。
【００９１】
典型的なアンチセンスオリゴマーは、本明細書の実施例で示すとおり、検出可能なCTGF mRNAレベルを約50〜100%、65〜100%、70〜100%、もしくは80〜100%の範囲で阻害する。
【００９２】
本発明で同定されるアンチセンスオリゴマーによって認識されるターゲット配列の例としては次のものが挙げられる：
3'-acu gga guc gau cau gga cag aaa g-5'     (配列番号13);
agg acu gag ggc ugg uca cag uga c           (配列番号14);
gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a           (配列番号15);
aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g           (配列番号16);
agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g           (配列番号17);および
gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u           (配列番号18)。
【００９３】
配列番号7〜12に関しては、ターゲット配列がDNAまたはRNA配列である場合には、u(ウラシル)をt(チミン)と置換することができることは理解されよう。さらに、配列番号13〜18に関しては、ターゲット配列がDNA配列である場合にはtをuと置換することができることは理解されよう。さらに、典型的なターゲットは、そのターゲットと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書の実施例で示すとおり、検出可能なCTGF mRNAレベルを約50〜100%、65〜100%、70〜100%、もしくは80〜100%の範囲で阻害するものである限りは、より短いものまたはより長いものであってもよいことは理解されよう。核酸配列中の類似性は、当業界でよく知られた方法とアルゴリズムによって決定することができる。そのような方法およびアルゴリズムとしては、例えば、BLASTプログラム(National Center for Biological InformationにあるBasic Local Alignment Search Tool)、ALIGN、AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences)、AMPS(Protein Multiple Sequence Alignment)、ASSET(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(Biological Sequence Comparative Analysis Node)、BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、Las Vegasアルゴリズム、FNAT(Forced Nucleotide Alignment Tool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky Sequence Analysis Package)、GAP(Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN(Local Sequence Alignment)、LCP(Local Content Program)、MACAW(Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench)、MAP(Multiple Alignment Program)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA(Sequence Alignment by Genetic ALgorithm)、およびWHAT-IFが挙げられる。
【００９４】
ある与えられたポリヌクレオチドの好ましい長さの選択においては、最も好ましい特徴を持つようにするために種々の因子を考慮すべきである。1態様においては、本発明のポリヌクレオチドは少なくとも長さが15bpであり、好ましくは約15〜約100bpの長さである。より好ましくは、そのポリヌクレオチドは長さが約15bp〜約80bpであり、より一層好ましくは本発明のポリヌクレオチドは約15〜約60bpの長さである。10〜15個merよりも短いものなどのより短いポリヌクレオチドは、細胞への浸透性はより高いが、遺伝子特異性はより低い。これに対して、より長い20〜30個の塩基のポリヌクレオチドはより良い特異性を示すが、それらは細胞中への取り込み速度が減少する。Steinら, 「Oligodeoxy-nucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression」, Cohen編, McMillan Press, London(1988)を参照せよ。転写体RNAターゲット配列に対する到達性も重要であり、従って、ターゲットとするRNA中のループ形成領域およびオルソロガス配列が有望なターゲットを提供する。本開示において、「ポリヌクレオチド」という用語は、天然に見出される核酸と結合することができる、天然に見出されるタイプのオリゴマーの核酸部分（例えばDNAおよびRNAのデオキシリボヌクレオチド構造およびリボヌクレオチド構造など）、および人工の類似体を包含する。本質的には本発明のポリヌクレオチドは、所望の特性、例えば細胞の取り込みの増加、ターゲット配列へのアフィニティーの増加、およびヌクレアーゼの存在下でのオリゴヌクレオチドの安定性の増加などの特性を増強する、天然に生ずるオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドを改変もしくは置換した形のいかなるものも含まれる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結された、またはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、またはその他の結合で連結された類似体によって連結されたリボヌクレオチドモノマーもしくはデオキシリボヌクレオチドモノマーに基づくものとすることができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、改変された塩基構造またはその他の改変を有し、なお天然に生ずる転写体RNA構造に結合する能力を保持しているモノマー部分を含み得る。そのようなポリヌクレオチドは当業界でよく知られた方法、例えば、Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foster City, 米国カリフォルニア州)から入手可能なものなどの市販の機器及び試薬を用いて、調製することができる。例えば、ターゲットの転写産物に対して特異的なポリヌクレオチドは標準的な方法に従って合成することができる。ホスホロチオエートで改変したDNAポリヌクレオチドは典型的には、種々の製造者から入手可能な自動化DNA合成機で合成される。これらの機器はナノモル量のポリヌクレオチドを100ヌクレオチドの長さまで合成することができる。さらに精製を行うことなく用いるには、最新の機器で合成されたより短いポリヌクレオチドが好ましい場合が多い。必要であれば、ポリヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動または逆相クロマトグラフィーによって精製することができる。Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2巻, 第11章, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)を参照せよ。
【００９６】
ホスホジエステル結合で連結されたポリヌクレオチドは血清中または細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすく、従って、好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であると判明している、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートで連結された類似体である。当業者であれば本発明に用いうるその他の連結法を容易に選択できるであろう。またこれらの改変を、そのポリヌクレオチドの細胞への取り込みおよび安定性を改良するためにデザインすることもできる。
【００９７】
ターゲット細胞もしくは組織中のその配列の存在を豊富にするための、ポリヌクレオチドの投与用の適切な担体としては、例えば、ベクター、抗体、薬理学的組成物、結合性もしくはホーミングタンパク質、またはウイルス送達系などが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、内皮細胞または腫瘍細胞を認識する結合タンパク質と結合させることができる。投与後、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、サイトカイン、転写因子、G-タンパク質結合受容体、腫瘍抑制タンパク質およびアポトーシス開始タンパク質の発現が強く起こるように、レシピエントの細胞もしくは組織をターゲットとすることができる。
【００９８】
アンチセンス、トリプレックス薬剤、リボザイム、競合阻害剤などの送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターもしくはコロイド分散系を用いて行うことができる。本明細書に述べているような、遺伝子治療用に用いることのできる種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入しうるレトロウイルスベクターの例としては、限定はされないが、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーヴェイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が挙げられる。さらに別の多数のレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターの全てが、形質導入される細胞を同定し作製できるように、選択可能なマーカーの遺伝子を導入または組み込むことができる。対象のポリヌクレオチド配列をウイルスベクター中へ、例えばある特定のターゲット細胞上のある受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子と、共に挿入することによって、そのベクターはターゲット特異的なものとなる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによってターゲット特異的とすることができる。そのレトロウイルスベクターをターゲットとする抗体を用いることによって好ましいターゲティングが成し遂げられる。当業者であれば、レトロウイルスゲノム中に挿入できてアンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターのターゲット特異的送達を可能とする特定のポリヌクレオチド配列を知り得るか、または過度な実験を行うことなく容易に確認できるであろう。
【００９９】
組換えレトロウイルスには欠損があるため、感染性のあるベクター粒子を産生するためには助力を必要とする。この助力は、例えば、LTR内の調節配列の制御下にあるレトロウイルスの構造遺伝子全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いることによって提供することができる。これらのプラスミドは、カプシド化のためのRNA転写産物をパッケージングメカニズムが認識できるようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルを欠損しているヘルパー細胞系としては、2種に限定はされないが、例えばPA317およびPA12を挙げることができる。これらの細胞系はゲノムがパッケージされないので空のウイルス粒子を産生する。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルがインタクトである細胞中に導入されれば、構造遺伝子が対象とする他の遺伝子と置換されているが、そのベクターはパッケージ化されベクターウイルス粒子が産生される。
【０１００】
あるいはまた、NIH 3T3もしくはその他の組織培養細胞はレトロウイルス構造遺伝子のgag、pol、およびenvをコードするプラスミドを用いて従来法のリン酸カルシウムトランスフェクションによって直接的にトランスフェクトすることができる。次いでこれらの細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトする。この結果得られた細胞は培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０１０１】
アンチセンスポリヌクレオチドの別のターゲット送達システムはコロイド分散系である。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェアー、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは人工膜の小胞で、in vitroおよびin vivoでの送達ビヒクルとして有用である。大きな単層の小胞(LUV)、それはサイズが0.2〜4.0μmの範囲であるが、その小胞は大きな巨大分子を含有している水性バッファーの相当のパーセンテージをカプセル化することができることが示されている。RNA、DNA、およびインタクトなウイルス粒子を水性の内部の中にカプセル化することができ、生物学的に活性な形で細胞へ送達させることができる(Fraleyら, Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981)。哺乳動物細胞に加えて、植物細胞、酵母細胞、および細菌細胞中へポリヌクレオチドを送達させるためにリポソームは用いられてきた。リポソームを効率的な遺伝子移送ビヒクルとするためには下記の特徴があるべきである：(1) 対象の遺伝子のカプセル化がその生物学的活性を損なうことなく高効率で行われること；(2) 非ターゲット細胞に対しての結合と比較してターゲット細胞への結合が優先的かつ十分に行われること；(3) ターゲット細胞の細胞質への小胞の水溶性内容物の送達が高効率で行われること；および(4) 遺伝情報の正確かつ効果的な発現が行われること(Manninoら, Biotechniques, 6:682, 1988)。
【０１０２】
本明細書で用いている「有効量」または「治療上有効な量」という用語は、所望の生理学的効果、例えば障害の治療を得るために十分な量を意味する。例えば本発明のポリヌクレオチドを発現しているベクターの有効量は通常は各症例において担当医師によって決定され、それは通常は当業者が適切な用量を決定するために考慮する因子に基づいて行われ、そのような因子としては、年令、性別、および治療被験者の体重、治療しようとする状態、および治療しようとする医学的状態の重症度が上げられる。
【０１０３】
ポリヌクレオチドの被験者への投与は、裸の合成ポリヌクレオチドとして、もしくは発現ベクターの一部としてのいずれかで一般的な経路(経口、経鼻、バッカル、経直腸、経膣、もしくは局所)のいかなるものを経由させても行うことができ、または皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈注射によって行うことができる。しかし、本発明の医薬組成物は、注射可能な組成物の形での投与が有利である。そのような目的のための典型的な組成物は製薬上許容しうる溶媒または希釈剤およびその他の適切で生理学的な化合物を含む。例えば、その組成物は、ポリヌクレオチド、およびNaCl含有リン酸バッファー１mLあたり約10mgのヒト血清アルブミンを含有し得る。700mgまでのポリヌクレオチドを、毒性の徴候を示すことなく10日間のコースで１人の患者に静脈内投与することができる(すなわち0.05mg/kg/hour)(Sterling, 「Systemic Antisense Treatment Reported, Genetic Engineering News」 12:1, 28(1992))。
【０１０４】
リポソームの組成は通常はリン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み合わせで、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせる。その他のリン脂質またはその他の脂質も用いることができる。リポソームの物理的特性はpH、イオン強度、および2価の陽イオンの存在の如何による。
【０１０５】
リポソームの産生に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴリピッド、セレブロシド、およびガングリオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロールでその脂質部分が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含むもので、飽和されているものである。リン脂質の実例としては卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０１０６】
リポソームのターゲティングは解剖学的および機械学的因子に基づいて分類される。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、および細胞内小器官特異的のレベルに基づいて行われる。機械的ターゲティングはそれが受動的なものかまたは能動的なものかに基づいて区別される。受動的ターゲティングは、リポソームが洞様毛細血管を含んでいる臓器中の網内系(RES)の細胞に分布されるという自然な傾向を利用している。他方、能動的ターゲティングは、天然に生ずる局在部位以外の臓器および細胞タイプをターゲットとしうるようにするために、リポソームを特定のリガンド（例えばモノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質）と結合させることによる、またはリポソームの組成もしくはサイズを変更することによるリポソームの改変を含んでいる。
【０１０７】
ターゲットとする送達系の表面は種々の方法で改変することができる。リポソームのターゲット送達系の場合には、ターゲットを狙うリガンドをリポソームの2重層と安定に会合させておくために脂質基はリポソームの脂質2重層中に取り込むことができる。脂質鎖をターゲットを狙うリガンドと結合させるために種々の連結基を用いることができる。通常は、ターゲット送達システムの表面に結合させた化合物はリガンドまたは受容体でであり、それらはターゲット送達システムが所望の細胞を見つけ「目的地に着く(home in)」ことを可能と得るものである。リガンドは、受容体などの別の化合物と結合するような対象の化合物のいかなるものであってもよい。
【０１０８】
研究および診断への使用
本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究および診断の道具として用いることもできる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第2巻, p10-59、これは本明細書に参照により組み入れることとするが、ここに記載のとおり、5'末端の位置でポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２P 標識を行うことによって調製した放射能標識オリゴヌクレオチドを用いて細胞もしくは組織サンプル中のCTGFタンパク質特異的核酸の存在を検出するために用いることができる。その放射能標識オリゴヌクレオチドを、CTGFメッセンジャーRNAを含んでいるのではないかと考えられる細胞もしくは組織サンプルと接触させ、CTGFタンパク質およびサンプルを洗って未結合のオリゴヌクレオチドを除去する。サンプル中に残存する放射活性は結合したオリゴヌクレオチドの存在を示し、それは次いでそのオリゴヌクレオチドに対して相補的な核酸の存在を示す。そのような核酸はシンチレーションカウンター又はその他のルーティンに使用している方法を用いて定量することができる。これらのタンパク質をコードしている核酸の発現がこのようにして検出される。
【０１０９】
本発明の放射能標識オリゴヌクレオチドはまた、研究、診断、もしくは治療目的でCTGFタンパク質の局在、分布、および定量のための組織のオートラジオグラフィーを行うために用いることもできる。そのような研究では、組織切片を放射能標識オリゴヌクレオチドで処理し上述のとおり洗い、次いでルーティンのオートラジオグラフィー法に従って写真乳液へ暴露させる。この乳剤は、現像したとき、CTGFタンパク質遺伝子が発現している領域に銀粒子の像を作る。この銀粒子を定量することによってこれらのタンパク質をコードするmRNA分子の発現の検出ができることとなり、それらの領域へのオリゴヌクレオチドのターゲティングを可能とする。
【０１１０】
放射能標識の代わりにフルオレセインもしくはその他の蛍光タグをコンジュゲートさせた本発明のオリゴヌクレオチドを用いてCTGFタンパク質核酸の発現の蛍光による検出と類似のアッセイ法を開発することができる。そのようなコンジュゲーションは蛍光標識アミダイト（amidites）もしくはCPG(controlled pore glass)カラムを用いた固相合成の間にルーティンに行うことができる。オリゴヌクレオチドを標識する他の方法も当業界では既知である。例えばRuth, Methods in Molecular Biology, 第26巻, 第6章: Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Agrawal編, Human Press Inc., Totowa, 米国ニュージャージー州, 1994, pp.167-185を参照せよ。
【０１１１】
本発明の材料はキットの調製に申し分なく適している。そのようなキットはバイアル、試験管、および類似のものなどの1つ以上の容器手段を容れるように区分けされたキャリアー手段を含んでいてもよく、その各容器手段はその方法で用いられる別々のエレメントのうちの1つを含んでいる。
【０１１２】
例えば、容器手段の1つには検出し得るように標識することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。第2の容器は、もしそれがあるとするならば、ハイブリダイゼーションバッファーを含んでいてもよい。またこのキットには、標識されていてもいなくてもよいターゲット核酸配列の増幅のためのヌクレオチドが含まれていてもよく、および/またはある容器にはレポーター手段、例えば酵素的、蛍光、もしくは放射性核種などのレポーター分子と結合させたアビジンもしくはストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質などを含んでいる。
【０１１３】
そのようなキットには適切な遺伝子、すなわちCTGFタンパク質をコードする遺伝子をターゲットとするオリゴヌクレオチドが含まれる。適切なキットと例えば「サンドイッチ」アッセイ法などのアッセイフォーマットは当業界ではよく知られており、本発明のオリゴヌクレオチドで用いるために容易に適用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドとCTGFタンパク質をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、例えばそのオリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射能標識、もしくはその他の適合する検出システムを含む、当業界で既知の方法によって検出することができる。
【０１１４】
下記の実施例は当業者に本発明のCTGFの作製および使用法の完全な開示および説明を提供するために示すものであり、本発明者らが本発明の内容とみなしていることの範囲を限定することを意図したものではなくまたそのように考えられるべきではない。ここに用いた数値(例えば、量、時間、温度その他)に関して正確性を確保しようとの努力は払ってきたが、いくつかの実験誤差および偏差は斟酌されるべきである。特に述べない限りは、比率は重量比、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、および圧力は大気圧もしくはその近傍である。
【０１１５】
実施例1
ラットCTGFクローンをポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によってクローン化することを方策とした。4種類のオリゴヌクレオチド、センス(F1およびF2)2種とアンチセンス(R1およびR2)2種をマウスとヒトCTGFの間の相同な領域に基づいてデザインした。F2オリゴヌクレオチドの配列は5'-GAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGG-3'(配列番号5)である。R1オリゴヌクレオチドの配列は5'-ATGTCTCCGTACATCTTCCTGTAGT-3'(配列番号6)である。これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、NRKライブラリー(正常ラット腎臓線維芽細胞)からラットCTGFの領域を増幅するためにPCRを行った。PCR産物を分析し、F2/R1およびF2/R2のプライマーの組み合わせからの産物をpCRベクター(InVitrogen)中に使用説明書に従ってクローン化した。F2/R1反応からの2つのクローンの配列を調べ、それらはヒトCTGFおよびfisp 12との相同性を示した。完全長のcDNAをオリジナルのNRKライブラリーから限定希釈によってクローン化した。プレートのライセートはNRKライブラリーの1/50,000希釈から作製した。これらのプレートのライセートのうちの2つはF2/R1 PCR陽性で、それらは#2および#4であった。これらのライセートをプレートし、10個のプラークの10個のプールを取りF2/R1 PCRによりスクリーニングした。ライセート #2からの2つのプールは陽性であり、それらは#2と#4であった。プール2-2とプール2-4をプレートし、単一のプラークを取り、F2/R1 PCRでスクリーニングした。単一のプラーク2-4-7がPCR陽性で、それを製造者(Stratagene)の使用説明書に従ってプラスミド中に入れ換えた。DNAを調製し配列を調べたものが図1である。クローン2-4-7の配列はヒトCTGFおよびマウスCTGF(fisp 12)と相同であったことを図2に示す。
【０１１６】
実施例2
アンチセンスオリゴマーのデザイン
CTGFをターゲットとするアンチセンスオリゴマーは、バイオインフォーマティックスプログラムを用いてデザインしてアクセス可能な部位を定める。オリゴマーにはロット番号を割り当てたがそれらはS10839(配列番号7)、S10840(配列番号8)、S10841(配列番号9)、S10842(配列番号10)、S10843(配列番号11)、およびS10844(配列番号12)である。
【０１１７】
アンチセンスCTGFオリゴマーを用いたNRK細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの前日に、NRK細胞を6ウエルのプレートに1ウエルあたり120Kの密度で蒔いた(60mmのディッシュで1プレートあたり36万個の細胞)。翌日、蛍光オリゴマー(S10532)を用いて細胞をトランスフェクトした。NRK細胞をオリゴフェクチンG(2.5μg/mL)およびアンチセンスオリゴマー40nMの存在下で4時間トランスフェクトさせた。10XのオリゴフェクチンG溶液(12.5μLのオリゴフェクチンGストック溶液を1mLのOpti-MEM(無血清培地)中に希釈して10X 溶液とした)を調製した。さらに、オリゴマーの10X 溶液を調製した(4μLオリゴマーを1mLのOpti-MEM中に含有させて終濃度を400nMとした)。10X オリゴフェクチンG溶液および10Xオリゴマー溶液の等量を混合し、室温で15分間静置して複合体化させた。この結果得られた混合液は5Xである。次いで60mmディッシュの培地を2mLの完全増殖培地(DMEM、高濃度のブドウ糖と5%FBSおよび2mM L-グルタミンを含む)と置換した。次いでオリゴマー/オリゴフェクチン複合体を細胞に添加し(プレートの各ウエルに5Xのオリゴマー/オリゴフェクチンG複合体を0.5mL)、プレートを37℃で4時間インキュベートした。細胞をTGF-βで刺激した。完全増殖培地中に2X TGF-β(50 ng/mL)を含有するもの2.5mLを各プレートに添加し、細胞を37℃で1晩インキュベートした。TGF-βの添加によって脂質およびオリゴマーの濃度は50%減少した。
【０１１８】
トランスフェクションの効率は蛍光顕微鏡でモニターした。蛍光オリゴマーでのトランスフェクションを陽性対照として含めた。トランスフェクション後、細胞の生存率を調べるためにエチジウムホモダイマー1で染色した。エチジウムホモダイマーは死細胞には蓄積されるが生細胞では排除される赤色の蛍光色素である。トランスフェクションは細胞の約90%で行われており、オリゴマーは核に濃縮され、全体としての細胞の生存率は約95%であった。
【０１１９】
アンチセンスオリゴマーでトランスフェクトされた細胞中のCTGFのノーザンブロット分析
CTGF特異的プローブ断片をベクターからXhoIおよびEcoRIを用いて制限酵素消化によって切り出した。次いでその断片をゲルで精製し、ランダムプライミングによって３２P-dCTPで標識した。ランダムプライミングはStartageneのPrime-Itを製造者の仕様書に従って用いて行った。次いで標識されたプローブをNRK細胞の全RNAのノーザンブロットとハイブリダイズさせた。細胞からの全RNAはAmbionのRNAqueousキットを製造者の仕様書に従って用いて調製した。
【０１２０】
図3はアンチセンスオリゴマーで処理した後のCTGF発現のノーザンブロット分析結果を示す。全RNAはアンチセンスオリゴマーでトランスフェクションした24時間後にNRK細胞から調製した。ノーザンブロットは、1%変性アガロースゲル上で各処理からの全RNAの5μgを電気泳動させることによって調製した。電気泳動後、そのRNAを陽性に荷電した膜に移し、膜と架橋させ、放射性標識されたCTGFおよびGAPDH(内部対照品)プローブで探索した。その結果はCTGFをターゲットとした6種のアンチセンスオリゴマーの6種ともターゲットmRNAの開裂をもたらしたことを示している。CTGFの安定な5'開裂断片(矢印)がブロット上に明瞭に見てとれる(図3、パネルA)。ローディングおよび導入効率の内部対照として、そのブロットを放射性標識マウスGAPDH断片で探索した。ごくわずかなGAPDH発現の変化が観察されたのみであった(図3、パネルB)。CTGFの発現とGAPDHの発現との比較に基づけば、アンチセンスオリゴマーS10843(配列番号11)が最も有効であると思われる(完全長のメッセージの80-85%の低減)。
【０１２１】
図3に示したデータは、CTGFをターゲットとした6種のオリゴマー(配列番号7-12)の6種ともターゲットRNAの顕著な阻害をもたらすことを示している。NRK細胞集団の約90%がトランスフェクトされ、CTGFメッセージはノーザンブロット分析で容易に検出可能であった。典型的には、あるトランスフェクト可能な細胞タイプ中の1つのメッセージ内の3-6個のオリゴマーターゲット部位をスクリーニングすることによって66-90%の阻害が得られる。前述のとおり、アンチセンスを用いない対照のトランスフェクションと比較して、CTGFに対してデザインされた6種のアンチセンスオリゴマー(配列番号7-12)のうちの6種ともトランスフェクション24時間後の時点でCTGF mRNAの発現を阻害した(図3)。ターゲット遺伝子の最適な阻害はアンチセンスオリゴヌクレオチドS10843(配列番号11)で認められた(約80%)。注目すべきことに、RNaseHでメディエートされたRNA開裂断片はノーザンブロット上で可視性であった(通常は開裂断片は細胞内の酵素で分解される)。この開裂断片が観察されたことはアンチセンス(RNaseH)機構を確認するものである。
【０１２２】
さらに、下記の表1に示したデータは、CTGFをコードする核酸をターゲットとした同じオリゴマーの細胞中への導入が細胞増殖の検出可能な増殖阻害を起こすことを示している。
【０１２３】
【表１】
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当業者であれば、本発明の化合物と方法に種々の改変および変更を行いうることは明白であろう。従って、本発明はそのような改変および変更を、それらが特許請求の範囲およびそれと同等のものの範囲内にあるものであるならば、包含することを意図している。すなわち、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラットCTGFクローン2-4-7の核酸配列およびその核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２】  ラット（rCTGF)(配列番号２)、ヒト(Hctgf)(配列番号３)およびマウス(Mctgf)(配列番号４)CTGFポリペプチドのアミノ酸配列の比較を示す。
【図３】  アンチセンスオリゴマーで処理した後のCTGF mRNA発現のノーザンブロット分析を示す。ノーザンブロットの結果は、CTGFをターゲットとした6アンチセンスオリゴマーの6個がターゲットmRNAを切断する結果となったことを示している。CTFGの安定な5'切断断片（矢印）がブロット上で明確に見られる（図３、パネルＡ)。負荷および泳動効率の内部対照用に、ブロットを放射性標識マウスGAPDH断片でプローブした（図３、パネルＢ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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