(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことを含む、マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出方法であって、
リアルタイムＰＣＲで用いられるプローブが、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号819〜841に相当する塩基配列の全てもしくは少なくとも15塩基を含む塩基配列またはその相補的塩基配列、あるいは配列番号１に示す塩基配列の塩基番号620〜654に相当する塩基配列の全てもしくは少なくとも15塩基を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を有し、プローブの長さは15〜35塩基であり、
リアルタイムＰＣＲで用いられるプライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域において少なくともマイコプラズマ・ジェニタリウムに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されている方法。
【請求項２】
プローブが配列番号５または６に示す塩基配列からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマー対が、配列番号４に示す塩基配列を有するもの及び配列番号７に示す塩基配列を有するものからなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことによるマイコプラズマ・ジェニタリウムの検出用のキットであって、
16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたプローブであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号819〜841に相当する塩基配列の全てもしくは少なくとも15塩基を含む塩基配列またはその相補的塩基配列、あるいは配列番号１に示す塩基配列の塩基番号620〜654に相当する塩基配列の全てもしくは少なくとも15塩基を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を有し、長さが15〜35塩基であるプローブ、及び、
16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域において少なくともマイコプラズマ・ジェニタリウムに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されたプライマー対を含むキット。
【請求項５】
プローブが配列番号５または６に示す塩基配列からなる請求項４記載のキット。
【請求項６】
プライマー対が、配列番号４に示す塩基配列を有するもの及び配列番号７に示す塩基配列を有するものからなる請求項４または５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウム(M. genitalium)の細菌の検出方法及びその方法のためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
M. genitalimは、非淋菌性尿道炎（NGU)患者から初めて分離され、チンパンジーを用いた接種実験では、尿道炎症状が惹起され、尿道分泌物中の多核白血球の増加が認められ、抗体価も有意に上昇したことから、ヒトにおけるNGUの起炎菌である可能性が示唆されている。しかしながら、臨床検体からの培養法による検出が極めて困難なため、最近まで尿路性器感染症におけるその病原的意義は必ずしも明確にはされていなかった。
【０００３】
PCR法と遺伝子系統解析によるマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の検出および同定法の開発により、クラミジア陰性NGU患者の約20%の尿中からM. genitalimが検出されている（日本性感染症学会第１３回学術大会(平成12年12月2〜3日)において発表）。また、治療による尿道炎症状の推移をM. genitaliumの検出結果とあわせてみると、M. genitalium陽性NGUでは、キノロン系抗生物質の２週間投与により症状および尿道スメアの白血球数が一旦正常化した例でも、M. genitaliumは陰性化せず、その後４週間以内に症状が再発する症例が散見されている（日本性感染症学会第１３回学術大会(平成12年12月2〜3日)において発表）。これらのことから、M. genitaliumの尿路性器感染症における病原的意義は明確にされつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
尿道炎患者の尿中M. genitaliumの定量的な検出が容易になれば、治療によるM. genitaliumの消長が詳細にモニタリングでき、その結果得られる消長と臨床症状との相関は病原的意義の更なる解明につながることが期待される。
【０００５】
従って、本発明は、試料中のM. genitaliumの迅速で特異的な定量ができるM. genitaliumの検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、M. genitaliumのＤＮＡにおける特定の塩基配列に基づいて作成されたプローブとプライマー対とを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、上記課題が解決されることを見い出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、以下のものを提供する。
【０００７】
（１）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことを含む、M. genitaliumの検出方法であって、リアルタイムＰＣＲで用いられるプローブが、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、リアルタイムＰＣＲで用いられるプライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されている方法。
【０００８】
（２）プライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定される（１）記載の方法。
【０００９】
（３）プローブが配列番号５または６に示す塩基配列を有する（１）または（２）記載の方法。
【００１０】
（４）プライマー対が、配列番号４に示す塩基配列を有するもの及び配列番号７に示す塩基配列を示すものからなる（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１１】
（５）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことによるM. genitaliumの検出用のキットであって、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたプローブ、及び、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されたプライマー対を含むキット。
【００１２】
（６）プライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定されたものである（５）記載のキット。
【００１３】
（７）プローブが配列番号５または６に示す塩基配列を有する（５）または（６）記載のキット。
【００１４】
（８）プライマー対が、配列番号４に示す塩基配列を有するもの及び配列番号７に示す塩基配列を示すものからなる（５）〜（７）のいずれかに記載のキット。
【００１５】
なお、配列番号１に示す塩基配列は、Mycoplasma genitalim標準株の16S rRNA遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. X77334）であり、当業者であれば、16S rRNA遺伝子に変異を有する株であっても、個体間等に存在し得る塩基配列の相違を考慮して、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号により特定された領域に相当する領域を容易に特定・認識することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、マイコプラズマ・ジェニタリウム(M. genitalium)を迅速かつ特異的に検出することを可能にする方法であり、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲを行うことを含み、リアルタイムＰＣＲで用いられるプローブが、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定され、リアルタイムＰＣＲで用いられるプライマー対が、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されていることを特徴とする。
【００１７】
試料は、M. genitaliumを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、尿、尿道擦過物、子宮頚管擦過物などの尿路性器系材料を挙げることができる。これらの試料から、ＤＮＡの調製のための通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。
【００１８】
本発明検出方法におけるリアルタイムＰＣＲは、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、特定のプローブ及びプライマー対を使用する他は、通常の、プローブを用いるリアルタイムＰＣＲの方法に従って行うことができる。プローブを用いるリアルタイムＰＣＲでは、一般に、増幅される領域の塩基配列の一部とアニールする、標識を付したプローブが使用され、ＰＣＲの伸長反応の際にポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性により遊離する標識を検出することにより、目的の増幅産物が検出される（Christian A. Heid et al., Rear Time Quantitative PCR, GENOME RESEARCH, 6: 986-994）。標識の例としては、プローブの5'末端にリポーター蛍光色素、3'末端にクエンチャー蛍光色素を結合させることが挙げられる（Livak, k. J. et al., PCR Methods and Applications, 4: 357-362 (1995)）。リアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＲの条件は、当業者であれば適宜最適化することができる。
【００１９】
本発明において用いられるプローブは、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域（以下、便宜のため、それぞれＡ領域及びＢ領域ともいう）の塩基配列に基づいて設定される。Ａ領域及びＢ領域の塩基配列は、M. genitaliumに特異的なものであり、M. genitaliumに特異的なプローブを設計可能な領域である。本発明者らは、PCR法と遺伝子系統解析によるマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の同定法により17症例で、M. genitaliumを検出しており、うち12症例ではM. genitalium標準株G-37と同一の塩基配列を持つものが検出され、残り５症例では標準株と異なる塩基配列を持つものが検出されているが、上記Ａ領域及びＢ領域は、これら検出された全てのM. genitaliumの株で塩基配列が共通し、かつ、マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の、M. genitalium以外の菌種とは異なる塩基を含むことを確認している。
【００２０】
プローブは、通常には、この二つの領域のいずれかにおいて設定される。プローブの長さは通常には15〜35塩基である。プローブの具体例としては、配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号819〜841に相当）またはその相補的塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号６に示す塩基配列に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号620〜654に相当）またはその相補的塩基配列を有するプローブが挙げられる。
【００２１】
本発明において用いられるプライマー対は、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定される。
【００２２】
プライマー対は、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜547、610〜664、792〜869及び1012〜1051に相当する領域（以下、便宜のため、それぞれ、Ｐ１領域、Ａ領域、Ｂ領域、Ｐ２領域ともいう）において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定されたものであることが好ましい。プライマーの長さは、通常には、15〜30塩基である。プライマーの具体例としては、配列番号４に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号520〜545に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、配列番号６に示す塩基配列に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号620〜654に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、配列番号５に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号819〜841に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマー、及び、配列番号７に示す塩基配列（配列番号１に示す塩基配列において塩基番号1036〜1012に相当）またはその相補的塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２３】
プライマー対は、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように、すなわち、プローブの塩基配列の両側に位置し、かつ、一方がセンスプライマーとなり他方がアンチセンスプライマーとなるように設定される。従って、プローブを、Ａ領域において場合には、一方のプライマーをＰ１領域において、他方のプライマーをＢ領域またはＰ２領域においてそれぞれ設定することが好ましい。また、プローブを、Ｂ領域に基づいて設定した場合には、一方のプライマーを、Ｐ１領域またはＡ領域において、他方のプライマーを、Ｐ２領域においてそれぞれ設定することが好ましい。例えば、プローブとして、配列番号５に示す塩基配列を有するものを用いた場合には、プライマー対として、配列番号４に示す塩基配列を有するものと配列番号７に示す塩基配列を有するものの対、または、配列番号６に示す塩基配列を有するものと配列番号７に示す塩基配列を有するものの対を用いることができる。
【００２４】
上記の特定の領域におけるプローブ及びプライマー対の設定は、リアルタイムＰＣＲに用いる条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プローブ及びプライマー対の設定は、コンピューター検索に基づいて行うことでより効率的となる。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲのプローブの設計に際しては、Tm値をプライマーのTm値よりも8〜10℃高く設定することが好ましいとされている。この条件を満たすようにプローブを設定した場合、Ａ領域はＧＣ含量が低いため、Ａ領域に設定したものはプローブ長がＢ領域に設定したものよりも10塩基程度長くなる。このようにプローブが長くなると、特異性および検出感度の低下が起こることがあるため、Ｂ領域にプローブを設定することが好ましい。
【００２６】
プライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方又は両方について、複数のプライマーを混合したミックスプライマーとして設定してもよい。プライマー設定部分に塩基の変異が存在する場合には、ミックスプライマーを用いることで検出効率を上げることができる。
【００２７】
本発明検出方法によれば、検出感度が高く、培養を経ずに例えば尿等の臨床材料から直接にＤＮＡ増幅を行うことが可能であり、迅速な検出が可能となる。特に、プローブだけでなくプライマーも特定の領域に基づいて選択されているので、M. genitaliumに特異的な定量的検出を行うことができる。
【００２８】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明検出方法に用いることのできるキットであり、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号610〜664または792〜869に相当する領域の塩基配列に基づいて設定されたプローブ、及び、16S rRNA遺伝子の、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号497〜1051に相当する領域において少なくともM. genitaliumに保存されている塩基配列に基づいて設定され、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定されたプライマー対を含むことを特徴とする。
【００２９】
プローブ及びプライマー対については、本発明検出方法に関し、上記に説明した通りである。
【００３０】
本発明キットにおいてプローブ及びプライマー対は、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。
【００３１】
本発明キットは、プローブ及びプライマー対の他に、リアルタイムＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
【００３２】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００３３】
【参考例１】
M. genitalium陽性検体の選択
ヒトからの分離が報告されているマイコプラズマ属細菌１３種（M. buccale、M. faucium、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. lipophilum、M. orale、M. penetrans、M. pirum、M. pneumoniae、M. primatum、M. salivarium、M. spermatophilum）およびウレアプラズマ属細菌２種（U. parvum、U. urealyticum）を国立感染研究所またはAmerican Type Culture Collectionより入手した。また、男子尿道炎患者（148例）及び無症候性男子（42例）から尿を採取し、使用時まで-80℃で凍結保存した。
【００３４】
これらの試料からＤＮＡの抽出を以下の様に行った。凍結しておいた尿を37℃で30分加温した。尿1 mlを15,000×ｇで30分遠心し、上清を除去した。リン酸緩衝食塩水(pH 7.4)を1 ml加えて沈殿物を十分に懸濁し、再度同条件で遠心した。上清を除去した後、Lysis buffer（10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01%ゼラチン, 0.45% NP-40, 0.45% Tween 20, 0.5% SDS, 0.7 mg/ml Proteinase K）を500μl加え、55℃で２時間インキュベートした。フェノール/クロロホルム処理後、エタノールを加え-20℃に一晩放置した。遠心後、風乾させたＤＮＡを50μlのTE buffer（10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 1 mM EDTA）に溶解した。標準株培養菌液からの抽出は、培養菌液５μlを直接Lysis bufferに添加し、以下同様に操作を行った。
【００３５】
抽出されたＤＮＡを鋳型として以下のようにＰＣＲを行った。16S rRNA領域のセミネステッド(semi-nested)PCRを行うため、Kuppeveldら（Appl. Environ. Microbiol., 58, 2606-2615, 1992）により16S rRNA領域内に設計されたプライマーGPO-1（配列番号２）およびMGSO（配列番号３）、並びに、プライマーMy-ins（配列番号４）を使用した。
【００３６】
第１段階のＰＣＲ（1st PCR）は、PCR反応液（10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001%ゼラチン, 0.2 mM dNTPs, プライマー[GPO-1, MGSO]各0.5μM, Ampli Taq DNA polymerase[Roche Diagnostic Systems] 1.25 units）40μlに抽出ＤＮＡ10μlを加えて、GeneAmp PCR Systems 9600(PERKIN ELMER)を使用し、94℃30秒で変性、64℃30秒でアニーリング、72℃60秒で伸長の条件で40サイクル行った。第２段階のＰＣＲ（2nd PCR）は、プライマーにMy-insおよびMGSOを使用したPCR反応液48μlに1st PCRの産物２μlを加え、94℃30秒で変性、60℃30秒でアニーリング、72℃60秒で伸長の条件で35サイクル行った。反応後、PCR産物10μlを３％アガロースゲル電気泳動に付し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射により約500 bpのバンドを確認した。
【００３７】
得られたPCR産物はスピンカラムで精製し、その塩基配列を、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（PE Biosystems）を使用したダイレクトシークエンス反応後、373A DNAオートシークエンサー（PE Biosystems）で解読した。
【００３８】
解読した標準菌株の塩基配列について、2-パラメータを用いた近隣結合法（SINCA,富士通）で系統解析を行い、系統樹を得た。系統樹の分岐の信頼性は、1000回繰り返しのブートストラップ法を用いて確認した。得られた系統樹により臨床分離株（尿道炎患者の尿から検出されたもの）の菌種を同定した。
【００３９】
この結果、男子クラミジア陰性NGU患者46名中９名（19.6％）がM. genitalium陽性であった。
【００４０】
【実施例１】
M. genitaliumの定量
以下のようにリアルタイムＰＣＲを行った。TaqManプローブとしてMgen-P1（配列番号５）を使用し、プライマーとしてMGSO-2（配列番号７）及びMy-ins（配列番号４）を使用した。
【００４１】
マスターミクスチャー（１×TaqMan buffer A 5.0μl, MgCl2 5.0 mM, dNTPs各0.2 mM, プライマー各200 nM, TaqManプローブ100 nM, AmpliTaq Gold 1.25 unit, AmpErase 0.5 unit）40μlにＤＮＡ溶液10μlを加えて、Prism7700を使用し、50℃２分＋95℃10分＋（95℃15秒／66℃60秒）×60サイクルの条件で増幅反応を行い、反応中経時的に蛍光を測定し、コントロールとの比較からM. genitaliumを定量した。定量コントロールとしては、M. genitaliumおよびM. pneumoniae 16S rRNA遺伝子の一部を挿入した組換えプラスミドをそれぞれ構築し、吸光度（260 nm）からコピー数を算出した。
【００４２】
定量性について検討したところ、M. genitaliumコントロールを102〜108コピー／チューブの測定レンジで定量的に検出することができた。M. genitaliumと塩基配列の相同性が高いM. pneumoniaeのコントロールを用いて、上記定量の特異性を評価した結果、交差反応は認められず、M. genitaliumの特異的な定量が可能なことが確認された。
【００４３】
さらに、参考例１でM. genitalium陽性とされた患者の尿を検査材料として上記のリアルタイムＰＣＲを行った。検査材料からのＤＮＡの抽出は参考例１に記載の方法で行った。
【００４４】
NGU患者の治療開始時およびその後の来院時に採取した尿中M. genitaliumを定量した結果、治療経過とともに菌量が減少する、治療開始から菌量に変化が見られない、あるいは一度菌量が減少した後に再び増加するというような症例が見られた。これらは概ね臨床症状との相関がみられ、尿道炎におけるM. genitaliumの病原的意義につながる興味深いデータであると思われる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、M. genitaliumに特異的なＤＮＡを迅速に高感度で定量的に検出することが可能になる。抗菌剤投与による治療効果の迅速のモニタリングなどに、本発明の方法は極めて有用である。
【００４６】
【配列表】
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