(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）電極支持体；
（ｂ）酵素、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン又はその誘導体であるメディエイター、及びバリウム、マグネシウム及びストロンチウムから成る群より選択される少なくとも１つの金属イオンを含み、前記少なくとも１つの金属イオンが前記メディエイターと錯体の形態であって、導電性物質に沈着した作業インクを含む作業電極である、前記電極支持体上に配置された第一電極；
（ｃ）標準電極である、前記電極支持体上に配置された第二電極；及び
（ｄ）導電性物質を含む対電極である、前記電極支持体上に配置された第三電極
を含むバイオセンサストリップ。
【請求項２】
前記の少なくとも１つの金属イオンが塩の形態である、請求項１に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項３】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、請求項１に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項４】
前記酵素がＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性デヒドロゲナーゼである、請求項１に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項５】
前記第一、第二及び第三電極上の囲まれた空所の中に試料を受け入れるための開口部を有する、前記電極上の囲まれた空所を規定するカバー層をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項６】
前記カバー層と前記第一、第二及び第三電極の間の囲まれた空所に挟まれたメッシュの少なくとも１つの層をさらに含む、請求項５に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項７】
前記対電極が、前記作業電極及び前記標準電極に対して、液体試料が前記対電極に接触する前に前記作業電極及び前記標準電極に接触するように位置づけられている、請求項１に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項８】
（ａ）請求項１に記載のバイオセンサストリップを提供すること；
（ｂ）前記バイオセンサストリップを分析物モニターに挿入すること；
（ｃ）生体液を前記バイオセンサストリップに適用すること；
（ｄ）標準電極に対して作業電極に電圧をかけること；
（ｅ）作業電極と対電極の間を流れる電流を測定すること；及び
（ｆ）測定された電流を前記分析物の濃度に相関させること
の工程を含む、生体液の試料中の分析物の濃度を測定するための方法。
【請求項９】
（ａ）電極支持体；
（ｂ）酵素、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン又はその誘導体であるメディエイター、及びバリウム、マグネシウム及びストロンチウムから成る群より選択される少なくとも１つの金属イオンを含み、前記少なくとも１つの金属イオンが前記メディエイターと錯体の形態であって、導電性物質に沈着した作業インクを含む作業電極である第一電極；及び
（ｃ）二元用途標準／対電極である第二電極
を含むバイオセンサストリップ。
【請求項１０】
前記の少なくとも１つの金属イオンが塩の形態である、請求項９に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項１１】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、請求項９に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項１２】
前記酵素がＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性デヒドロゲナーゼである、請求項９に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項１３】
前記電極装置がトリガー電極をさらに含む、請求項９に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項１４】
（ａ）請求項９に記載のバイオセンサストリップを提供すること；
（ｂ）生体液を前記バイオセンサストリップに適用すること；
（ｃ）前記バイオセンサストリップを分析物モニターに挿入すること；
（ｄ）二元用途標準／対電極に対して作業電極に電圧をかけること；
（ｅ）作業電極と二元用途標準／対電極の間を流れる電流を測定すること；及び
（ｆ）測定された電流を前記分析物の濃度に相関させること
の工程を含む、生体液の試料中の分析物の濃度を測定するための方法。
【請求項１５】
（ａ）電極支持体；
（ｂ）少なくとも２つの電極を含み、前記の少なくとも２つの電極の一方が、酵素、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン又はその誘導体であるメディエイター、及びバリウム、マグネシウム及びストロンチウムから成る群より選択される少なくとも１つの金属イオンを含み、前記少なくとも１つの金属イオンが前記メディエイターと錯体の形態である反応層を備える、前記電極支持体上に配置された作業電極である、電極装置；
（ｃ）前記電極支持体上に配置された対電極である、前記の少なくとも２つの電極のもう一方
を含むバイオセンサストリップ。
【請求項１６】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼから成る群より選択される、請求項１５に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項１７】
前記酵素がＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性デヒドロゲナーゼである、請求項１５に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項１８】
（ａ）請求項１５に記載のバイオセンサストリップであって、バイオセンサーが前記電極支持体上に配置された標準電極を更に含むバイオセンサストリップを提供すること；
（ｂ）前記バイオセンサストリップを分析物モニターに挿入すること；
（ｃ）生体液を前記バイオセンサストリップに適用すること；
（ｄ）標準電極に対して作業電極に電圧をかけること；
（ｅ）作業電極と対電極の間を流れる電流を測定すること；及び
（ｆ）測定された電流を前記分析物の濃度に相関させること
の工程を含む、生体液の試料中の分析物の濃度を測定するための方法。
【請求項１９】
前記酵素がＮＡＤ（Ｐ）＋依存性デヒドロゲナーゼである、請求項１５に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項２０】
前記電極装置が標準電極をさらに含む、請求項１５に記載のバイオセンサストリップ。
【請求項２１】
前記電極装置がトリガー電極をさらに含む、請求項１５に記載のバイオセンサストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、より特定すると、生体試料中の分析物の濃度を測定するためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液試料中の分析物の濃度を測定するためのすべてのバイオセンサが、ある程度のヘマトクリット感受性であるという問題を抱える。試料のヘマトクリットが高いほど、バイオセンサの反応は低下する。このシグナルの低下の理由は１つではないが、試料中の分析物の低い拡散低下及び高い溶液抵抗性という理由が含まれる。ヘマトクリット感受性を排除するために提案された方法の１つは試料から赤血球をろ過することである。赤血球をろ過するための膜技術は、アッセイの時間と測定の不正確さの両方を上昇させる。酸素感受性も課題を提起してきた。グルコースデヒドロゲナーゼ酵素を用いるバイオセンサは酸素感受性ではないと期待される。しかし、メディエイター（又は補酵素）の酸化−還元反応はフリーラジカル中間体を含みうる。これらの中間体は寿命が長いときは、分子酸素がそれらをクエンチングし、それによって化学的性質を酸素圧感受性にすることがある。
【０００３】
米国特許第５，７０８，２４７号及び同第５，９５１，８３６号は、使い捨て試験ストリップと患者からの血液試料を受け入れて、電気化学的分析を実施するタイプの試験計量器において使用するための使い捨てグルコース試験ストリップを記述している。作業製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、充填剤、グルコースを酸化するために有効な酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、及び酵素から電子を運搬するために有効なメディエイターを含む。作業製剤は、作業電極を形成する伝導性基層上に印刷される。充填剤、例えばシリカ充填剤は、乾燥時に伝導性基層の表面に二次元ネットワークを形成するように、疎水性と親水性のバランスを保持するように選択される。試験ストリップの反応は関連温度範囲にわたって温度非依存性であり、実質的に患者のヘマトクリットに感受性がないとクレームされている。
【０００４】
光度計測バイオセンサにおいては、全血の試料から赤血球を分離するために膜が典型的に使用される。膜の使用は反応時間を上昇させる。米国特許第６，２７１，０４５号はヘマトクリット感受性を相殺するために補正法を用いる光度計測バイオセンサを記述している。このバイオセンサは、展着層と試薬層を含む支持体成員、及び体液の試料をそこに運搬するために支持層と展着層に連結されたキャピラリー管を含む。キャピラリー管は支持体成員上に配置されており、試験する分析物を含む液体が管に導入され、管を通って展着層へと流れ、試薬層と接触する。全血の場合はヘマトクリットレベルを相殺するために、キャピラリー管チャネルの起始部と末端のそれぞれ１つの付加的なセンサが試験装置内のキャピラリー管を検査するように働きうる。このバイオセンサでは、全血をキャピラリー管チャネルに適用する。全血がセンサの間を移動するときに全血の流入時間が測定される。血液がキャピラリー管の長さを通過するのに要する時間が血液のヘマトクリットの指標である。その情報を利用して、ヘマトクリットレベルによって生じる装置の反射率読取り値のシフトを補正する。また、ヘモグロビンの吸光度を測定できることが知られており、その測定値を使用して、ヘモグロビンに対する測定の感受性を証明することができる。
【０００５】
大部分の電気化学的バイオセンサは膜技術を使用していない。そのため、電気化学的バイオセンサはヘマトクリット感受性の問題を抱える。米国特許第６，２８４，１２５号は、赤血球が血漿から分離されている、ヘマトクリットに非感受性のバイオセンサを述べている。米国特許第６，２８７，４５１号は、ヘマトクリットレベルを電気化学的に測定することができ、ヘマトクリットレベルに対するバイオセンサの感受性に応じた係数と合わせて、分析物の測定濃度から分析物の補正濃度を決定することができる。ヘマトクリット感受性の程度は、バイオセンサの種類と測定のタイプに依存する。例えば反応を完了まで進行させる場合は、長い反応時間が試料中の分析物の完全な酸化を生じさせ、それによってヘマトクリットに対する測定の感受性を低下させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書中に参考として援用されている、２０００年６月７日出願の米国特許出願第０９／５２９，６１７号は、グルコース、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸塩、乳酸塩、エタノール及びコレステロールなどの、臨床的価値のある基質を有するＮＡＤ＋−依存性及びＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性酵素を記述している。このクラスの酵素を組み込み、還元型補酵素ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを介した酸化によって電極と電気接続を確立することにより、これらの基質や他の分析物の検出のための電流測定電極を設計することができる。ＮＡＤ＋−依存性グルコースデヒドロゲナーゼは酵素として使用することができ、及び１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン異性体はメディエイターとして使用できる。この組合せはヘマトクリット感受性及び酸素感受性を示す。前記酵素は酸素に依存せず（グルコースオキシダーゼの場合と異なって、酸素は共基質として働かない）、それ故酸素に非感受性であると予想される。しかし、メディエイター反応は緩やかであると思われ、それ故酸素の存在によって影響を受ける。仲介（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ）反応はフリーラジカル中間体を含む。反応が緩やかであれば、フリーラジカル中間体はより長い半減期を有する。それ故、分子酸素によってクエンチングされる確率が高い。従って、前記酵素・メディエイターの組合せは酸素依存性を示す。１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンメディエイターのヘマトクリットバイアスは明瞭には理解されていない。しかし、メディエイターの緩慢な反応速度が有意のヘマトクリット感受性の原因であると推測される。４，７−フェナントロリン−５，６−ジオンは、ヘマトクリット又は酸素の変動に対して１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンほどには感受性を示さない。しかし、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの構造は４，７−フェナントロリン−５，６−ジオンの構造よりも合成が容易である。１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの合成のための出発物質は、４，７−フェナントロリン−５，６−ジオンのための出発物質よりもはるかに安価である。その上に、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの合成のための反応条件は４，７−フェナントロリン−５，６−ジオンについての反応条件に比べてはるかに厳格でない。従って、ヘマトクリット及び酸素に対する１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの感受性を低下させることが望ましい。
【０００７】
グルコース監視装置は正常ヘマトクリットで検定される。より低いヘマトクリットを有する試料では、バイオセンサは適切な血中グルコースレベルよりも高いレベルを読み取り、高いヘマトクリットを有する試料では、バイオセンサは適切な血中グルコースレベルよりも低いレベルを読み取る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、バイオセンサのヘマトクリットバイアス及び酸素バイアスを改善するために、メディエイター、すなわちフェナントロリンキノンの異性体である１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン、及び、例えばマンガン、鉄、オスミウム、ルテニウム等のような遷移金属イオン及び、例えばカルシウム、バリウム等、のような重アルカリ土類金属イオンから成る群より選択される少なくとも１つの金属イオンを、例えばグルコースデヒドロゲナーゼのような、ＮＡＤ（Ｐ）＋に依存する酵素と共に使用するバイオセンサを含む。このメディエイターと前記金属イオンを使用するバイオセンサの電極は、約２０％から約７０％にわたるヘマトクリット範囲及び約１ｋＰａから約２０ｋＰａにわたる酸素圧範囲で正確な臨床応答を提供する。
【０００９】
グルコースデヒドロゲナーゼによって触媒されるグルコースの酸化は酸素感受性ではないが、前記メディエイターは酸素に感受性でありうる。１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンメディエイターは、構造式：
【００１０】
【化１】
0004695879.tif 000002
を有する。グルコースバイオセンサにおける１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンメディエイターの使用は、本明細書中に参考として援用されている、２０００年６月７日出願の米国特許出願第０９／５２９，６１７号に述べられている。
【００１１】
一の態様では、本発明は、バイオセンサが、メディエイターとしてのＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性酵素、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン及び遷移金属イオン及び重アルカリ土類金属イオンから成る群より選択される少なくとも１つの金属イオンを含む作業インクを含む作業電極を備える、ストリップの形態のバイオセンサを提供する。１つの実施態様では、バイオセンサは２つの電極を備えた電極装置を含む。前記バイオセンサは、
電極支持体；
導電性物質に沈着した作業インクを含む作業領域を含む第一電極；及び
第一電極から間隔を置いて、電極支持体上に配置された二元用途標準／対電極
を含む。
【００１２】
もう１つの実施態様では、バイオセンサは３つの電極を備えた電極装置を含む。前記バイオセンサは、
（ａ）電極支持体；
（ｂ）導電性物質に沈着した作業インクを含む作業電極である、前記電極支持体上に配置された第一電極；
（ｃ）標準電極である、前記電極支持体上に配置された第二電極；及び
（ｄ）導電性物質を含む対電極である、前記電極支持体上に配置された第三電極
を含む。
【００１３】
ここで述べる本発明は、ヘマトクリット又は酸素に対して実質的に非感受性であるメディエイターを提供し、それにより、極端なヘマトクリット範囲（２０％から７０％）及び酸素圧（新生児、静脈、毛細管及び動脈）を有する試料に遭遇する病院及び小売市場でのこのメディエイターの使用を可能にする。このメディエイターを使用するストリップの形態のバイオセンサは、例えばグルコース、ケトン体、乳酸塩及びアルコールなどの、数多くの分析物のために使用できる。
【００１４】
ここで述べる本発明は、現在同様の目的に使用されている他のバイオセンサに比べていくつかの利点／有益性を示す。これらの利点／有益性は以下を含む：
１．膜又は何らかの架橋ネットワークの必要性の排除、
２．動的測定を用いる能力、及びその結果として、反応を完了まで推進する必要性をなくし、それによってヘマトクリット感受性を排除すること、
３．適切な試薬の組合せ−酵素／メディエイター／金属又は酵素／メディエイターの金属錯体−の選択は低いヘマトクリット感受性の原因となる、
４．メディエイター／金属の組合せ又はメディエイターの金属錯体の触媒及び電気化学的作用は酸素及びヘマトクリット非感受性の原因となる、
５．改善された性能は、メディエイターと金属イオンの組合せの選択に関係する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ここで使用するとき、「遷移金属」の表現は、一般的に起こる酸化状態において不完全なｄ殻又はｆ殻を有する、金属の性質を備えた元素を意味する。「重アルカリ土類金属」の表現は、周期表ＩＩＡ族であり、２０又はそれ以上の原子番号を有する、金属の性質を備えた元素を意味する。
【００１６】
メディエイター、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの構造式を以下に示す。
【００１７】
【化２】
0004695879.tif 000003
【００１８】
メディエイターを酵素によって還元するとき、還元された１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン分子の間の分子間水素結合のために二量体又はオリゴマー又はその両方が形成される。これらのオリゴマーは反応媒質に可溶性ではなく、それ故継続的な仲介作用のために容易に再生されない。還元１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの二量体の分子間水素結合を以下に示す。
【００１９】
【化３】
0004695879.tif 000004
【００２０】
いくつかの方法で二量体化又はオリゴマー化を最小限に抑えることができる。窒素原子を化学修飾によって遮断することができる。水素結合の形成を防ぐために、置換基、例えばアルキル基を窒素原子の一方又は両方に付加することができる。水素結合の形成を妨げることはまた、酸化及び還元形態のメディエイターの溶解度を上昇させる。１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンのメチル誘導体は高い溶解度を示す。この化合物は、本明細書中に参考として援用されている、２０００年６月７日出願の米国特許出願第０９／５２９，６１７号に述べられているように、バイオセンサストリップにおいてＮＡＤＨの酸化を仲介する。以下の構造式は、モノアルキル化１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの構造式［式中、Ｒは、例えば−ＣＨ３などのアルキルを表わし、及びＸは、ＢＦ４−などの陰イオンを表わす］を示す。
【００２１】
【化４】
0004695879.tif 000005
【００２２】
アルキル化化合物の合成はいくつかの工程を必要とする。１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンを形成した後、アルキル基を導入する。アルキル化１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの酸化−還元特性は金属イオン濃度に依存せず、アルキル化工程が分子間水素結合の形成を阻害したことを示す。
【００２３】
窒素原子はまた、配位子と金属イオンの間に配位結合を有する錯体の形成によっても遮断できる。錯体は、ストリップの製剤において使用する前に形成することができる。あるいは、単に金属イオンを、メディエイターを含むインク製剤と混合することができる。本発明のための好ましい金属イオンは、マンガン、亜鉛、カルシウム、鉄、ルテニウム、コバルト、オスミウム、ニッケル、銅、レニウム、ロジウム、イリジウム、クロミウム、テクネチウム、バリウム、ストロンチウムを含むが、これらに限定されない。これらの錯体の結合効率は、使用する個々の金属イオンに依存する。例えば、Ｍｎ（ＩＩ）イオンはＭｇ（ＩＩ）イオンよりも強い結合を提供する。１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの金属錯体を以下に示す。
【００２４】
【化５】
0004695879.tif 000006
【００２５】
錯体陽イオンの一般式を以下に示す。配位子ａ、ｂ、ｃ及びｄは、２個の１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン分子又は、例えば塩化物、水、アンモニア等のような他の単座配位子又は、例えばビピリジル等のような多座配位子を表わしうる。
【００２６】
【化６】
0004695879.tif 000007
【００２７】
本発明に適するバイオセンサストリップを図１及び２に例示する。図１を参照すると、バイオセンサストリップ１０は電極支持体１２を含み、好ましくはポリマー材料（例えばポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエステル等）の長い細片が、好ましくは炭素を含む、導電性インクの３本のトラック１４ａ、１４ｂ及び１４ｃを支える。これらのトラック１４ａ、１４ｂ及び１４ｃは、電気接点１６ａ、１６ｂ及び１６ｃ、二元用途標準／対電極１８、作業電極２０及びトリガー電極２２の位置を決定する。電気接点１６ａ、１６ｂ及び１６ｃは、電流の測定のために適切な測定装置（示していない）に挿入することができる。
【００２８】
伝導性トラック１４ａ、１４ｂ及び１４ｃの長い部分の各々を、場合により、好ましくは銀粒子と塩化銀粒子を含む混合物で作られた、伝導性材料のトラック２４ａ、２４ｂ及び２４ｃで覆うことができる。トラック２４ｂの引き伸ばされた露出領域２５は二元用途標準／対電極１８に重なる。疎水性絶縁材料２６の層が、さらにトラック１４ａ、１４ｂ及び１４ｃに重なる。二元用途標準／対電極１８、作業電極２０、トリガー電極２２及び電気接点１６ａ、１６ｂ及び１６ｃの位置は、疎水性絶縁材料２６によって覆われない。この疎水性絶縁材料２６は短絡を防ぐのに役立つ。この絶縁材料は疎水性であるため、試料を露出電極に限局することができる。好ましい絶縁材料は、「ＰＯＬＹＰＬＡＳＴ」（Ｓｅｒｉｃｏｌ  Ｌｔｄ．，Ｂｒｏａｄｓｔａｉｒｓ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）として市販されている。
【００２９】
場合により、第一メッシュ層２８、第二絶縁層３０、第二メッシュ層３２、第三絶縁層３４及びテープ３６を疎水性絶縁材料に重ねることができる。テープ３６は、適用された試料をその下にあるメッシュ層２８及び３２に送達するための小さな穴３８を含む。第二絶縁層３０及び第三絶縁層３４は、適用された試料がその下にあるメッシュ層２８及び３２と接触することを可能にする開口部を含む。
【００３０】
作業電極２０は、作業領域２０ａを含む伝導性材料の層を含む。作業領域２０ａは、作業電極２０の伝導性材料の層に印刷された、作業インクから形成される。作業インクは、酸化−還元メディエイター、金属イオン、酵素及び、場合により、伝導性材料の混合物を含む。
【００３１】
作業領域２０ａは、酸化−還元メディエイター、金属イオン、酵素及び、場合により、伝導性材料の混合物を含む印刷インクから形成される。あるいは、酵素の代わりに、作業領域２０ａは、検定する酵素と触媒反応性である基質を含みうる。それぞれの印刷インクは、作業電極２０及び二元用途標準／対電極１８に一定の長さの分離した領域として適用される。好ましい実施態様では、伝導性材料は炭素の粒子を含み、及び酸化−還元メディエイターは１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンを含む。
【００３２】
印刷インクは、伝導性材料、酸化−還元メディエイター及び金属イオンの水性懸濁液を含む。作業電極２０に関しては、印刷インクは酵素も含む。例えば、測定する分析物が血液中のグルコースであるとき、酵素は、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼであり、酸化−還元メディエイターは、好ましくは１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンである。あるいは、作業電極２０に関して、測定する分析物が酵素であるときは、印刷インクは酵素の代わりに基質を含みうる。
【００３３】
印刷インクはスクリーン印刷することができる。印刷インクは、多糖類（例えばグアーガム又はアルギネート）、加水分解ゼラチン、酵素安定剤（例えばグルタミン酸塩又はトレハロース）、薄膜形成ポリマー（例えばポリビニルアルコール）、伝導性充填剤（例えば炭素）、消泡剤、緩衝剤又は前記の組合せをさらに含みうる。
【００３４】
電極は、作業電極２０及び二元用途標準／対電極１８の両方が試料によってカバーできないほど離れて位置付けることはできない。試料が横切る経路（すなわち試料通路）の長さは、必要な試料の容量を最小限に抑えるためにできる限り短く保たれることが望ましい。試料通路の最大長はバイオセンサストリップの長さと同じでありうる。しかし、対応する試料の抵抗の上昇は、試料通路の長さを必要な反応電流が生成される距離に制限する。試料の抵抗はまた、二元用途標準／対電極１８の領域の端から作業電極２０の作業領域の端までの距離によっても影響される。二元用途標準／対電極１８を作業電極２０の下流に位置付けることによってこの距離を短縮することは試料の抵抗を上昇させる。電極を隣接して位置付けるのが慣例的である。
【００３５】
トリガー電極２２は標準電極の下流に位置付けることができる。トリガー電極２２は、試料がストリップに適用された時点を判定し、それによってアッセイプロトコールを活性化するために使用できる。本明細書中に参考として援用されている、２０００年６月７日出願の米国特許出願第０９／５２９，６１７号参照。
【００３６】
本発明に適するバイオセンサストリップ１１０を図２に例示する。図２を参照すると、好ましくはポリマー材料（例えばポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエステル等）の長い細片である電極支持体１１１が、好ましくは炭素を含む、導電性インクの３本のトラック１１２ａ、１１２ｂ及び１１１２ｃを支える。これらのトラック１１２ａ、１１２ｂ及び１１２ｃは、電気接点１１４ａ、１１４ｂ及び１１４ｃ、標準電極１１６、作業電極１１８及び対電極１２０の位置を決定する。電気接点１１４ａ、１１４ｂ及び１１４ｃは、電流の測定のために適切な測定装置（示していない）に挿入することができる。
【００３７】
伝導性トラック１１２ａ、１１２ｂ及び１１２ｃの長い部分の各々を、場合により、好ましくは銀粒子と塩化銀粒子を含む混合物で作られた、伝導性材料のトラック１２２ａ、１２２ｂ及び１２２ｃで覆うことができる。トラック１２２ｂの引き伸ばされた露出領域は標準電極１１６に重なる。疎水性絶縁材料１２４の層が、さらにトラック１１２ａ、１１２ｂ及び１１２ｃに重なる。標準電極１１６、作業電極１１８、対電極１２０及び電気接点１１４ａ、１１４ｂ及び１１４ｃの位置は、疎水性絶縁材料１２４によって覆われない。この疎水性絶縁材料１２４は短絡を防ぐのに役立つ。疎水性絶縁材料１２４の層は、その中に形成された開口部１２６を有する。この開口部１２６は、バイオセンサストリップ１１０の反応帯域の境界を提供する。この絶縁材料は疎水性であるので、試料を反応帯域内の電極の部分に制限することができる。作業電極１１８は、酸化−還元反応を実施するための作業インクを含む層１２８に沈着した、非反応性導電性材料の層を含む。メッシュ１３０の少なくとも１つの層が電極を覆う。このメッシュ層１３０は、印刷された成分を物理的損傷から保護する。メッシュ層１３０はまた、試料の表面張力を低下させることによって試料が電極をぬらすのを助け、それにより、試料が電極上に均一に広がることを可能にする。カバー１３２は、電極支持体１１１と接触していない電極の表面を囲む。このカバー１３２は液体不透過膜である。カバー１３２は、適用された試料がその下にあるメッシュ層１３０に接触することを可能にする小さな穴１３４を含む。
【００３８】
作業インク１２８の層は、試料がバイオセンサストリップ１１０に導入されたとき酸化−還元反応が起こる作業電極１１８の導電性材料の部分に沈着している。作業インク１２８の層は、一定の長さを有する分離した領域として作業電極１１８に適用することができる。典型的な対象分析物は、例えばグルコース及びケトン体を含む。典型的な非反応性導電性材料は、例えば炭素、白金、パラジウム及び金を含む。酸化インジウムスズなどの半導性物質が非反応性導電性材料として使用できる。好ましい実施態様では、作業インクは、酸化−還元メディエイター及び酵素の混合物を含む。あるいは、酵素の代わりに、作業インクは、検定する酵素と触媒反応性である基質を含みうる。本発明のバイオセンサストリップにおいては、試薬は、好ましくは粒子物質を含み結合剤を有するインクの形態で適用され、従って、試料に供されたとき急速には溶解しない。この特徴に鑑みて、酸化−還元反応は作業電極１１８と試料の界面で起こる。グルコース分子は、作業電極１１８の表面に拡散し、酵素／メディエイター混合物と反応する。
【００３９】
作業電極１１８に適用されることに加えて、作業インクの層は、所望するときは、一定の長さを有する分離した領域として他の電極のいずれにも適用することができる。
【００４０】
他の可能なバイオセンサストリップのデザインは、メッシュ層１３０を排除して、フローチャネルを、バイオセンサストリップが毛細管引力によって液体試料を取り込むような寸法にしたものを含む。本明細書中に参考として援用されている、２００２年２月１日出願の米国特許出願第１０／０６２，３１３号参照。
【００４１】
メディエイターは、いかなるＮＡＤ（Ｐ）＋依存性酵素にも使用できる。これらの酵素の代表的な例を表１に示す。
【００４２】
【表１】
0004695879.tif 000008
【００４３】
メディエイターと共に使用できる他の酵素系は、オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ）を含むが、これらに限定されない。電極上のスクリーン印刷試薬の製剤は表２及び表３に示す成分を含み、前記表中、％は重量％を意味する。
【００４４】
【表２】
0004695879.tif 000009
【００４５】
【表３】
0004695879.tif 000010
【００４６】
電気化学的ケトン体を測定するためのバイオセンサの性能はまた、この化学物質の使用によっても増強されうる。ケトン体の測定のための典型的製剤を表４に示す。
【００４７】
【表４】
0004695879.tif 000011
【００４８】
一般に、ＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性酵素は、以下の関係：
ＲＨ２＋ＮＡＤ（Ｐ）＋  →  Ｒ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋
に従って基質と反応する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、本発明の中で述べるメディエイターによってＮＡＤ（Ｐ）＋へと再び酸化される。この酸化反応の速度は、他の異性体（１，７−フェナントロリン−５，６−ジオン及び４，７−フェナントロリン−５，６−ジオン）よりも緩やかである。この緩やかな反応速度は補酵素の迅速な再生を防ぎ、それ故試料中のヘマトクリット又は酸素の変化に対して感受性にする。メディエイターは分子酸素と反応する確率がより高く、それ故酸素に対して感受性になる。試料中のメディエイターの拡散はヘマトクリットの変化によって影響され、緩やかに反応するメディエイターは、急速に反応するメディエイターと比べて限られた運動性によってより大きな影響を受ける。ここで述べる金属イオンは補酵素の迅速な再生を可能にし、それ故試料中のヘマトクリット又は酸素の変化に対する感受性を低下させる。
【００４９】
金属イオンは、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンによるＮＡＤＨ酸化の効率的な仲介のために必要である。溶液中では、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンは生理的ｐＨ条件下で電気化学的酸化を示さない。マンガンなどの金属イオンの存在下では、メディエイターは酸化及び還元の両方の電流を示す。図３は、塩化マンガンの存在下（曲線２）と塩化マンガンの不在下（曲線１）での１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの電気化学的性質を示す、
バイオセンサの最適性能のために必要な金属イオンの濃度は、金属と１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの結合定数に依存する。錯体形成の効率及び錯体の安定性は金属イオンに依存する。例えば、わずか１０ｍＭの塩化マンガンは、製剤中３０ｍＭの１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンに関して３６０ｍＭの塩化マンガンによって達成される性能を実現するのに十分である。１０ｍＭ塩化マンガンは、金属錯体を形成する製剤中、金属イオン１対１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン３の比率に相当する。Ｐｂ（ＩＩ）と１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの結合定数は、Ｍｎ（ＩＩ）又はＭｇ（ＩＩ）と１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの結合定数よりも大きい。しかし、酵素はＰｂ（ＩＩ）によって不活性化される。他の遷移金属イオン及び重アルカリ土類金属イオンの存在下での１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンによるＮＡＤＨ酸化の仲介を明らかにした。
【００５０】
遷移金属イオン及び重アルカリ土類金属イオンはまた、ＮＡＤＨ酸化の仲介のための錯体としても使用できる。製剤中に混合した遊離イオンＭｎ（ＩＩ）の性能は、インク製剤に添加する前に形成した錯体の性能と同じである。
【００５１】
Ｍｎ（ＩＩ）を含む製剤のヘマトクリット及び酸素バイアスは、Ｍｇ（ＩＩ）を含む製剤と比べて有意に改善される。図４は、３つの仲介化学に関するグルコースの濃度の関数としてのバイオセンサ反応の相関を示す。図５は、４０％ヘマトクリットでのシグナルに基準化した、ヘマトクリットの関数としての１５ｍＭ試料の相対シグナルを示す。図６は、７ｋＰａに基準化した、３つの化学的なバイオセンサの酸素感受性を示す。同様のヘマトクリット及び酸素バイアスの利点は、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンのＦｅ（ＩＩ）錯体に関しても認められる。言い換えると、製剤中に遷移金属イオン又は重アルカリ土類金属イオンを使用することは、化合物の電気化学的性質を改善する。遷移金属イオン及び重アルカリ土類金属イオンの一部は、他の遷移金属イオン及び重アルカリ土類金属イオンに比べて改善された酸素及びヘマトクリット感受性を示す。
【００５２】
錯体は、ストリップにおける使用の前に形成するか又は金属イオンをインクと混合した。使用した金属イオンは遷移金属イオン及び重アルカリ土類金属イオンであった。
【００５３】
本発明の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明白であり、また本発明がここで述べる例示的実施態様に不当に限定されないことは了解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】作業電極及び二元用途標準／対電極を有するバイオセンサストリップの透視図を例示する概略図である。
【図２】作業電極、標準電極及び対電極を有するバイオセンサストリップの透視図を例示する概略図である。
【図３】塩化マンガンの不在下（曲線１）と塩化マンガンの存在下（曲線２）での１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンの電気化学的性質を示すグラフである。
【図４】バイオセンサの反応を、メディエイターを含む３つの製剤に関するグルコースの濃度の関数として示すグラフである。
【図５】グルコースについてのバイオセンサの相対シグナル（１５ｍＭ試料）を、メディエイターを含む３つの製剤に関するヘマトクリットの関数として示すグラフである。データは４０％ヘマトクリットでのシグナルに基準化している。
【図６】メディエイターを含む３つの製剤に関するバイオセンサの相対的酸素感受性を示すグラフである。データは７ｋＰａに基準化している。
【図１】
0004695879.tif 000012
【図２】
0004695879.tif 000013
【図３】
0004695879.tif 000014
【図４】
0004695879.tif 000015
【図５】
0004695879.tif 000016
【図６】
0004695879.tif 000017