(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト軟骨細胞と、軟骨細胞増殖能を支持するフィーダー細胞として胎生１３日齢マウスの第１鰓弓軟骨・メッケル軟骨周辺細胞とを共培養してヒト軟骨細胞を培養することを特徴とし、さらに該フィーダー細胞の増殖能を共培養前に喪失させて使用することを特徴とする、ヒト軟骨細胞を迅速かつ大量に培養しうる、ヒト軟骨細胞培養方法。
【請求項２】
培養細胞を重層的に１回または２回以上播種して培養し、ゲル状の軟骨細胞塊を得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によりヒト軟骨細胞を培養することを特徴とする正常ヒト軟骨細胞の製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法によりヒト軟骨細胞を培養することを特徴とする、軟骨細胞がコンドロカルシンおよび／またはＩＩ型コラーゲンを含む軟骨基質で包まれている正常ヒト軟骨細胞の製造方法。
【請求項５】
軟骨細胞が基質を介して結合して、ゲル状の細胞塊を形成している、請求項３または４に記載の正常ヒト軟骨細胞の製造方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法によりヒト正常軟骨細胞を製造し、包埋材料に該ヒト正常軟骨細胞を包埋することを特徴とする軟骨治療材の製造方法。
【請求項７】
前記材料が、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび／またはヒトの真皮である請求項６に記載の軟骨治療材の製造方法。
【請求項８】
ヒト軟骨細胞と共培養することにより、軟骨細胞増殖能を支持して迅速かつ大量にヒト軟骨細胞を培養するために使用するフィーダー細胞であって、該フィーダー細胞が胎生１３日齢マウスの第１鰓弓軟骨・メッケル軟骨周辺細胞であり、そして該フィーダー細胞の増殖能を喪失させているフィーダー細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、新規な正常ヒト軟骨細胞の培養方法およびかかる方法により得られた正常ヒト軟骨細胞に関する。本発明はまた得られた正常ヒト軟骨細胞を用いた軟骨治療材に関する。
【０００２】
背景技術
軟骨細胞は生体では基質の中に細胞が包埋された状態で存在しており、酵素、例えばコラゲナーゼ、で軟骨組織を処理して、基質成分から軟骨細胞を単離することができる。また、軟骨に関わる疾病の治療では、単離した軟骨細胞の移植、特に軟骨細胞の自家移植による治療方法が考えられていた。このため、動物実験において単離した軟骨細胞を関節軟骨欠損部に移植する試みがなされてきた（Bently, et. al., Nature 230, 385-388 (1971); William, Clin. Orthop. 124; 237-250 (1977); Aston et. al., J. Bone Joint Surg. 68-B, 29-35 (1986); Wakitani, et. al., J. Bone Joint Surg. 71-B; 74-80 (1989)）。
【０００３】
しかし、ヒトでは、正常な軟骨細胞が大量に必要であるにもかかわらず、自家移植において僅かの量の軟骨しか採取できないため、移植に必要な十分な量の軟骨細胞を得ることができない。このため、ヒトにおいて関節軟骨、耳介軟骨および肋軟骨について軟骨細胞の培養が試みられてきた。しかしながら、培養に僅かな軟骨細胞数しか用いることができない上に、ヒトの軟骨細胞について効果的な培養方法が知られていないために、初代培養を維持できないか、初代培養に成功したとしても、培養に６〜８週間と非常に長い時間がかかるという問題があった（Brittberg, et. al., New Engl. J. Med. 331; 889-895 (1994); Aulthouse, et. al., In vitro Cell.＆ Develop. Biol. 25; 659-668 (1989); Ting, et. al., 40, 413-421 (1998); Rodriguez, et. al., Plast. Reconstr. Surg. 103; 1111-1119 (1999)）。
【０００４】
一方、ヒト以外の動物（マウス、ウサギ、ニワトリ、ウシなど）では、初代培養の際に大量の軟骨細胞を得ることが可能であり、また、胎児および幼獣では軟骨が極めて柔らかいので軟骨細胞の単離が容易であることから、軟骨細胞の培養に成功している（Bently, et. al., Nature 230, 385-388 (1971); Langer, Clin. Orthop. 124; 237-250 (1977); Aston et. al., J. Bone Joint Surg. 68-B, 29-35 (1986); Wakitani, et. al., J. Bone Joint Surg. 71-B; 74-80 (1989)）。
【０００５】
発明の開示
従って、本発明は、ヒトの軟骨細胞を迅速かつ大量に培養して正常な軟骨細胞またはその細胞塊を得る方法を提供することを目的とする。また、本発明は得られた正常ヒト軟骨細胞またはその細胞塊を用いた軟骨治療材を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、軟骨形成期の軟骨周辺細胞がヒト軟骨細胞の増殖能を支持することを見出した。また、かかる細胞をフィーダー細胞としてヒト軟骨細胞と共培養することにより、特に初代培養において、迅速かつ大量にヒト軟骨細胞が得られることを見出した。さらに、そのように培養したヒト軟骨細胞を重層的に播種して培養することによって得られた軟骨細胞塊が正常な性質を保持していることを見出した。
【０００７】
従って、本発明は、ヒト軟骨細胞と軟骨細胞増殖能を支持するフィーダー細胞と軟骨形成期の軟骨周辺細胞とを共培養することにより、迅速かつ大量にヒト軟骨細胞を培養する方法を提供する。さらに、本発明の方法により得られたヒト軟骨細胞を重層的に１回または２回以上播種して培養することによって、ゲル状の軟骨細胞塊を得ることができる。重層的に播種する回数は、所望する培養軟骨組織の大きさによって異なるが、一般的には３〜４回が好ましい。
【０００８】
本発明のヒト軟骨細胞の培養方法において、フィーダー細胞は、哺乳類胎児の軟骨形成期の軟骨周辺細胞であるのが好ましく、第１鰓弓軟骨・メッケル軟骨周辺細胞であるのがさらに好ましい。特に好ましくは、胎生１３日齢マウスの軟骨形成期の軟骨周辺細胞である。
【０００９】
本発明において、哺乳類の胎児は、何れの哺乳類の胎児でも良く、例えばげっ歯類（マウス、ラット、ウサギなど）の他に、イヌ、サル、ウシ、ヤギおよびヒツジがあるが、発生生物学的に胎生期の研究が詳細に行われている哺乳類、例えばマウスが特に好ましい。
【００１０】
本発明はまた、本発明の方法により得られる正常ヒト軟骨細胞またはその細胞塊を提供する。本発明の方法により得られるヒト軟骨細胞は、コンドロカルシン、II型コラーゲン等を含む軟骨基質で包まれている。さらに、培養された軟骨細胞は軟骨基質を介して結合して、ゲル状の細胞塊を形成している。なお、本発明において、正常ヒト軟骨細胞とは、起源の軟骨細胞の性質を保持した軟骨細胞を意味する。
【００１１】
本発明はまた、前記ヒト軟骨細胞または細胞塊を包埋した材料からなる軟骨治療材を提供する。ヒト軟骨細胞または細胞塊を包埋する材料としては、人工素材または天然素材の何れでも良いが、移植する軟骨細胞が分散・吸収されるのを防ぐために軟骨細胞を周囲からブロックしうるものである。好ましくは移植する軟骨細胞の足場となりうるものである。そのようなものの例には、コラーゲン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ；polyglycolic acid）、ポリ乳酸（polylactic acid）、アルギン酸塩（例えばカルシウム塩）、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン(proteoglycan)、グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）およびヒトの真皮が挙げられる。なお、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンは硫酸化されていてもよい。
なお、本発明は、かかる軟骨治療材を用いることを特徴とする軟骨関連疾病治療方法を含むものである。
本発明はまた、前記治療方法における、軟骨細胞増殖能を支持する軟骨形成期の軟骨周辺細胞のフィーダー細胞としての使用に関する。
【００１２】
ヒト軟骨細胞
本発明の培養方法は、ヒトの任意の軟骨組織、例えば耳介軟骨、肋軟骨、関節軟骨、椎間軟骨および気管軟骨の軟骨細胞の培養に用いることができるが、特に耳介軟骨、肋軟骨、関節軟骨の軟骨細胞の培養に適している。関節軟骨には、下顎関節、上腕関節、肘関節、肩関節、手関節、股関節、腰関節および足関節が包含されるが、何れの関節軟骨でもよい。
【００１３】
また、本発明の培養方法に供される軟骨細胞は、公知の方法によりヒト軟骨組織から単離することができる。一般的には摘出した軟骨組織を剪刀等を用いて細切してトリプシンやコラゲナーゼ（例えばII型コラゲナーゼ）で処理し、フィルターで濾過して単離した軟骨細胞を得るが、例えば、以下の手順で軟骨細胞を得るのが好ましい。
【００１４】
（１）摘出した軟骨組織を抗生物質（例えばペニシリン、カナマイシン）や抗真菌剤（例えばアムホテリシンＢ）で除菌し、メス・剪刀等を用いて軟骨組織を細切する、
（２）細切した軟骨組織をＥＤＴＡで処理した後に、トリプシンを含む培地にて（好ましくは約４℃で）およそ１晩静置し、次にII型コラゲナーゼを含む培地に移し（必要があれば１〜６時間静置してもよい）、３７℃で１〜６時間インキュベートする、
（３）ウシ胎仔血清含有培地中に移し、該培地中で数時間穏やかに攪拌し、培地をフィルター（例えば、１００μｍフィルター）で濾過して、単離された軟骨細胞を得る。
【００１５】
このような方法により、１cm3のヒト軟骨組織から０.５〜１.０×１０6細胞個の軟骨細胞を得ることができる。また、本発明の培養方法において、公知の増殖因子、特に軟骨の増殖を刺激するもの、例えばＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）、ＩＧＦ（例えばＩＧＦ−Ｉ）および／または骨形成因子９（ＢＭＰ９）と組合わせることができる。
【００１６】
フィーダー細胞
フィーダー細胞は、特定の組織または細胞の増殖能と分化能を支持することによりその細胞の培養に寄与する細胞である。例えば、繊維芽細胞由来の３Ｔ３細胞が、表皮の角化細胞（keratinocyte）の増殖能を支持するフィーダー細胞として知られている（Greenら, Cell 6: p.331-344 (1975)）が、軟骨細胞、特にヒト軟骨細胞の培養に適するフィーダー細胞は知られていない。
【００１７】
本発明の培養方法に使用されるフィーダー細胞はヒト軟骨細胞と共培養することによってヒト軟骨細胞の増殖能を支持し、且つ増殖した軟骨細胞にその起源の軟骨組織、即ち初代培養に用いる軟骨組織の性質を保持させるという特性を有する細胞である。
【００１８】
そのようなフィーダー細胞は、前記特性、即ちヒト軟骨細胞の増殖能の支持、さらに増殖した軟骨細胞の性質を指標としてスクリーニングすることによって得ることができる。具体的には、被検細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、軟骨細胞が増殖するか否か、さらに増殖した細胞の細胞外基質が軟骨基質であるかを検査する。スクリーニングに供する細胞としては、生体（胎児、胚を含む）もしくはその組織から単離した細胞、またはクローン化されている細胞の何れでもよい。本発明におけるフィーダー細胞として、例えば動物、特に哺乳類の軟骨形成期の軟骨周辺細胞を挙げることができる。
【００１９】
好ましくは、胎生期の発生生物学が詳細に研究されている哺乳類の軟骨形成期の軟骨周辺細胞であり、具体的にはげっ歯類（マウス、ラット、ウサギ）、特にマウスの軟骨形成期の軟骨周辺細胞が好ましい。また、軟骨形成期としては、第１鰓弓軟骨・メッケル軟骨が分化・形成される時期が好ましく、例えばマウスにおいては胎生１３日齢前後に該当する。さらに本発明において、哺乳類以外の脊椎動物、例えば鳥類（ニワトリなど）の胚の第１鰓弓軟骨・メッケル軟骨周辺細胞をフィーダー細胞として使用することも可能である。
【００２０】
フィーダー細胞は、胎児または胚から単離した後、そのまま播種して使用することができるが、通常は適当な培地中にて１０〜１４日程度培養してから使用する。また、該フィーダー細胞を継代培養（５継代程度まで、好ましくは１〜３継代）することもでき、また凍結保存することもでき、好ましくは細胞内小器官が破壊されずに生存可能な条件・温度で保存する。そのような保存方法としては、例えば１０％ＦＢＳ、１０％グリセリン等のクライオプロテクタント（凍結防止剤）含有ＤＭＥ培地中で−１３０℃以下で保存する方法が挙げられる。継代培養において、培地は週に３回程度交換するのが好ましい。凍結保存した細胞は、適時解凍してフィーダー細胞として使用する。
【００２１】
本発明において、フィーダー細胞は、初代培養時に軟骨細胞と共培養して使用するが、軟骨細胞の増殖が弱い場合には１継代のみに共培養して用いることができ、特に初代培養時に使用することが最も効果的であり好ましい。また、軟骨細胞との共培養に際し、該フィーダー細胞を予め放射線処理（例えばガンマ線やコバルト照射）または薬剤処理してフィーダー細胞自体の増殖能を喪失させて使用してもよい。該薬剤としては、例えばマイトマイシンＣやアクチノマイシンＤ等の抗癌剤やアンピシリン等の抗生物質を挙げることができる。
【００２２】
ヒト軟骨細胞培養方法
ヒト軟骨細胞とフィーダー細胞との共培養（主に初代培養）は、軟骨細胞の培養に適した公知の培地を用いることができる。また、培地にはヒドロコルチゾン（ＨＣ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の他に、ヒトｂＦＧＦ、ヒトＩＧＦ−Ｉ等の増殖因子を適宜添加する（Cuevasら, Biochem, Biophys, Res, Commun. 156, 611-618 (1988) ; Froger-Gaillardら, Endocrinology, 124, 2365-2372）。そのような培地の例として、Ｆ−１２とＤＭＥ（Ｈ）培地の１：１混合物に、ＦＢＳ（好ましくは１０％程度）、ヒトｂＦＧＦ（好ましくは１０ng／ml程度）、ＨＣ（好ましくは４０ng／ml程度）、ヒトＩＧＦ−Ｉ（好ましくは５ng／ml程度）を添加した培地を例示することができる。
【００２３】
１）初代培養
あらかじめ放射線処理したフィーダー細胞をフラスコに播種（底面積７５cm2の場合１.０×１０6個の濃度が好ましい）し、次に軟骨細胞を播種（好ましくは０.５〜１.０×１０6個の濃度）し、各軟骨細胞の培養に適した条件（例えば３７℃，１０％ＣＯ2条件下）にて培養する。培養は、増殖した細胞が単層で集密的（confluent）になるまで行う（通常１０〜１４日間）。
２）継代培養
継代培養は初代培養と同じ培地で行うことができる（通常、１継代７日間）。初代培養で得られた細胞を継代した場合、耳介軟骨ではＰ０（初代培養）→Ｐ６において、細胞数が３０〜７４６倍にまで増加する。肋軟骨ではＰ０→Ｐ４において、細胞数が６５〜１６１倍にまで増加する。さらに多数の軟骨細胞を所望する場合には継代回数を適宜増加させることができる。
３）重層培養
継代培養により得られたヒト軟骨細胞を重層的に１回または２回以上、好ましくは３〜４回播種して培養することによって、ゲル状の軟骨細胞塊を得ることができる。得られた軟骨細胞塊中において、ヒト軟骨細胞はコンドロカルシン等を含む軟骨基質で包まれており、軟骨細胞同士がコンドロカルシン、II型コラーゲン等の軟骨基質を介して結合してゲル状の細胞塊を形成する。
【００２４】
上述したように、本発明の培養方法により得られる軟骨細胞は、その軟骨組織のその起源の軟骨組織、即ち初代培養に用いる軟骨組織の性質を保持している。具体的には、培養した細胞の形態および細胞外基質の組成（例えば、コンドロカルシン、II型コラーゲン、他にヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラト硫酸）から、起源の軟骨組織の性質を保持していることが示されている。
【００２５】
軟骨治療材
本発明により得られた前記ヒト軟骨細胞または細胞塊を適する生体材料に包埋し、これを軟骨治療材として移植に供することができる。ヒト軟骨細胞または細胞塊を包埋する材料の例としては、上述したようにコラーゲン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ；polyglycolic
acid）、ポリ乳酸（polylactic acid）、アルギン酸塩（例えばカルシウム塩）、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン(proteoglycan)、グリコサミノグリカン(glycosaminoblycan)およびヒトの真皮が挙げられ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。なお、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンは硫酸化されていてもよい。これらの生体材料は、移植する軟骨細胞が分散・吸収されるのを防ぐために軟骨細胞を周囲からブロックしうるものであり、好ましくは移植する軟骨細胞の足場となりうるものである。
【００２６】
生体材料の形状は、シート等の膜、スポンジ等の多孔体、編物等のメッシュ、織布、不織布、綿等、任意の形状のものを使用することができる。多孔性の材料の使用は、軟骨細胞が生体材料に容易に接着するとともに内部に浸透し、軟骨組織の新生を促進することが可能となるため好ましい。
【００２７】
生体材料としてコラーゲンを使用する場合は、コラーゲンを架橋処理してもよい。コラーゲンを架橋処理すると物理的強度が増し、軟骨治療材を生体にステープル等を用いて固定する際に欠損することがない上に、軟骨組織が新生するまでの間、必要な強度を保持しながら軟骨細胞または細胞塊を支持することができる。
【００２８】
また、コラーゲンを可溶化したコラーゲン液と培養軟骨細胞または細胞塊とを混合し、必要に応じてゲル化したものを軟骨治療材として使用することもできる。コラーゲン液としては、公知の任意のものを使用することができるが、酵素により可溶化したコラーゲン液は、免疫原性を有するテロペプチドが除去されるため特に好ましい。また、コラーゲン液と軟骨細胞の混合物を上記生体材料からなるスポンジや不織布等により包埋し、または接着させて軟骨治療材を構成することも可能である。
【００２９】
また、該軟骨治療材は、軟骨細胞を包埋する材料としての支持体を適宜選択し、組合わせることにより、軟骨組織ばかりか軟骨性骨化を誘導することができる。そのような軟骨性骨化を誘導し得る材料としては例えばヒト真皮が挙げられるが、さらに骨形成を促進する成長因子、例えば骨形成因子（ＢＭＰ）を用いて骨化を促進させることができる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
【００３０】
発明を実施するための最良の形態
実施例
実施例１  軟骨細胞培養
培地組成：Ｆ−１２とＤＭＥ（Ｈ）培地を１：１に混合したものに１０％  ＦＢＳ，１０ng／ml  ヒトｂＦＧＦ（科研製薬研究所）、および４０ng／ml  ＨＣ，および５ng／ml  ヒトＩＧＦ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。
軟骨細胞：耳介軟骨として耳介後部（約１×１cm）、および肋軟骨として前胸部（約１×１cm）から、それぞれ軟骨細胞を単離した。
フィーダー細胞：胎生１３日齢のマウス第１鰓弓軟骨・メッケル軟骨周囲の細胞を採取し、そして培養して得られた細胞をフィーダー細胞として用いた。このフィーダー細胞をＣＳ２１細胞と名付けた。
【００３１】
（ａ）軟骨細胞の単離
軟骨片をペニシリンＧ（１００ｕ／ml）およびカナマイシン（０.１mg／ml）で除菌し、そして０.０２％ＥＤＴＡで１５分間処理した。次に軟骨片をメスと剪刀で細切し、０.２５％トリプシンを含む培地にて４℃で１晩静置し、次に０.３％  II型コラゲナーゼ／ＤＭＥ培地中にて３７℃で１〜６時間インキュベートした。次いで１０％ＦＣＳ／ＤＭＥ培地中に移し、室温で２時間スターラーでゆっくり撹拌し、そして１００μｍフィルターで濾過して、単離した軟骨細胞を得た。
【００３２】
（ｂ）フィーダー細胞
ｉ) フィーダー細胞の単離
胎生１３日齢（軟骨形成期）Ｂａｌｂマウスから、第１鰓弓軟骨（メッケル軟骨）周囲の細胞をマイクロサージェリー（microsurgery）技術を用いて多数採取し、得られた細胞塊を０.１２５％トリプシンを含むカルシウム無添加培地に移し、４℃の冷蔵庫に４時間静置し、スターラーで穏やかに１０分振盪した後、フィルターで漉過して単細胞を単離した。
ii) 培養条件
５〜１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）添加したＤＭＥ培地を使用し、フィーダー細胞を培養した。初代培養では３〜４日で集密的になり、継代培養においても１継代でも３〜４日で集密的になった。２継代目からは１週間に１回継代し、１継代から３継代までを凍結保存した。このようにして得られた細胞（ＣＳ２１細胞）をフィーダー細胞として用いた。
【００３３】
（ｃ）初代培養
前日に６０グレイの放射線（コバルト）で処理したＣＳ２１細胞を底面積７５cm2のフラスコに１.０×１０6個／cm2の密度で播種した。これに単離したヒト軟骨細胞を０.５〜１×１０6個／cm2の密度で播種し、３７℃、１０％ＣＯ2条件下で培養した。対照として、３Ｔ３細胞とヒト軟骨細胞を同様に培養した。初代培養において、培地を１週間に２回交換した。その結果、ＣＳ２１細胞と共培養した軟骨細胞は、１０〜１４日間の培養により単層で集密的になったが、３Ｔ３細胞の場合ではほとんど増殖しなかった（図１）。得られた細胞を次の継代培養に使用した。
【００３４】
（ｄ）継代培養
フィーダー細胞を用いないこと、および１継代が７日間であること以外は、初代培養と同じ条件で継代培養を実施した。初代培養で得られたヒト軟骨細胞を１.０×１０6個／底面積１７５cm2フラスコの密度で播種し、７日ごとに継代し、各継代後に細胞を凍結保存し、増殖した軟骨細胞数を計測した。
・耳介軟骨（ｎ＝２０）の場合、耳介軟骨細胞の初代培養（ｎ＝２０）Ｐ０→Ｐ１（ｎ＝２０）Ｐ１→Ｐ２（ｎ＝１３）Ｐ２→Ｐ３（ｎ＝１２）Ｐ３→Ｐ４（ｎ＝９）Ｐ４→Ｐ５（ｎ＝６）Ｐ５→Ｐ６（ｎ＝３）で培養を行い、それらはすべて各継代に凍結保存した。細胞は約３０〜７４６倍に増殖した。
・肋軟骨（ｎ＝１２）の場合、肋軟骨細胞の初代培養（ｎ＝１２）Ｐ０→Ｐ１（ｎ＝１２）Ｐ１→Ｐ２（ｎ＝６）Ｐ２→Ｐ３（ｎ＝４）Ｐ３→Ｐ４（ｎ＝２）で培養を行い、同様に凍結保存した。細胞は約６５〜１６１倍に増殖した。
【００３５】
また、軟骨基質であるコンドロカルシンの培地中の濃度を、抗コンドロカルシン抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）で測定したところ、耳介軟骨、肋軟骨共に７日間の継代培養において１００ng／ml以上のコンドロカルシンが測定された。これに対し、初代培養の際にフィーダー細胞と共培養せずに、各軟骨細胞を培養をしたところ、３Ｔ３細胞との共培養の場合と同様に細胞増殖はほとんど観察されなかった。細胞培養の結果を下記の表１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
上述の結果から、従来の方法では初代培養が困難であるため培養系が維持できず、また成功しても培養期間が６〜８週間かかるが、本発明の方法では、２週間で初代培養が可能であり、細胞増殖率も高く迅速かつ大量に正常細胞が培養できることが明らかとなった。さらに、軟骨基質のコンドロカルシンが培地中に多量に存在していたことから、増殖した細胞は軟骨細胞であることが示唆された。
【００３８】
（ｅ）重層培養
継代培養において得られた軟骨細胞を１×１０6個／cm2の密度で３回播種し重層させ重層培養を実施した。２週間の培養後、シート状のゲル塊が形成された（図２）。このゲル状の軟骨細胞塊についてＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色したところ、細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合していることが示された（図３）。また、軟骨組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行ったところ、細胞外基質に染色を呈し、該細胞外基質が軟骨に特異的な基質であることが示された（図４）。
【００３９】
実施例２  軟骨細胞の移植
（ａ）先ず、軟骨細胞を包埋する材料（支持体）の影響をなくすため、得られたヒト軟骨細胞塊をグラスファイバー（フィルター）にはさんでヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ  Ｓｉｃ／ｎｕ，１０週令２５ｇ）の背部皮下に移植し、軟骨が形成されるか検討した（ｎ＝１０）。その結果、３／１０検体で軟骨組織が形成されていることが確認された。ただ、あまり大きな組織は形成されないため、細胞がグラスファイバーに安定ではなく、周囲組織に拡散したと推測される。また、軟骨細胞塊のみを移植すると、該軟骨細胞が皮下で分散することが観察され、移植する軟骨細胞塊を周囲からブロックする必要があることが明らかとなった。
【００４０】
（ｂ）次に支持体として、ＰＧＡ（ｎ＝１０）でヒト軟骨細胞塊を挟み、各支持体に包埋した状態で同様にヌードマウスに移植した。その結果、１００％（１０／１０）の検体について軟骨組織の形成が観察された。移植前の軟骨細胞塊を図５に、移植後３ヶ月のマウスを図６に、そして移植組織の摘出標本を図７に示す。
また、支持体としてアルギン酸カルシウム（ｎ＝５）を用いた場合でも１００％（５／５）の検体について軟骨組織の形成が観察された。そこで、支持体としてＰＧＡおよびアルギン酸カルシウムを用いた摘出標本のプレパラートを調製し、トルイジンブルー染色した。その結果、軟骨組織に特異的なトルイジンブルー異染性が観察された（図８）。しかし、形成される軟骨組織はＰＧＡの方が大きく、支持体としてＰＧＡがより適していると推測される。
【００４１】
（ｃ）次に、形成される軟骨組織が骨化される条件について検討した。ヒト軟骨細胞塊をＰＧＡに包埋し、その周囲をフィブリンで覆ったもの（第１群）、またはヒト軟骨細胞塊をＰＧＡに包埋し、その外側にヒト真皮を巻き、さらにフィブリンで周囲を覆ったもの（第２群）、これらをヌードラット（Ｆ３４４／Ｎ  ｒｎｕ／ｒｎｕ，６週令２５０ｇ）の背部皮下に移植し、両群において軟骨組織が形成されるか検べた。３ヶ月後、６ヶ月（ｎ＝６）の摘出した標本は軟骨組織に特異的なトイルイジンブルー染色で染色性を呈し、両群とも軟骨細胞が形成されていることが確認された（図９）。また、軟骨細胞塊をＰＧＡのみで包埋した第１群では軟骨組織のみ形成されたが、真皮で巻いた第２群では軟骨膜と間質内に血管新生が認められ、さらに軟骨の一部に軟骨性骨化が観察された（図１０）。
【００４２】
（ｄ）移植後に形成された軟骨組織が、起源（培養に用いた軟骨組織）の性質を発現しているかを検討した。上記標本のプレパラートを調製し、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色、トルイジンブルー染色、アルシアンブルー＋ＰＡＳ染色およびＥＶＧ（Elastica
von Gieson）染色を行った。なお、ＨＥ染色では、細胞膜と間質が染色され、その細胞の形態および軟骨小腔から軟骨組織が形成されていることを確認することができる。トルイジンブルー染色での異染性は軟骨特異性を示す。また、アルシアンブルー＋ＰＡＳ染色では、多糖が染色され、軟骨基質、特に弾性軟骨のエラスチン（糖蛋白質）を多く含むことを確認することができる。ＥＶＧ染色では弾性繊維が染色されるため、弾性軟骨（耳介軟骨）の形成を確認することができる。
培養耳介軟骨細胞を移植した軟骨組織ではＥＶＧ染色で弾性繊維が強く染色され、アルシアンブルー＋ＰＡＳ染色でＰＡＳ陽性であったことから耳介軟骨細胞と同定された。培養肋軟骨細胞移植後の組織ではＥＶＧ染色で弾性繊維の染色は弱く、アルシアンブルーＰＡＳ染色でＰＡＳ弱陽性であったことから肋軟骨細胞と同定された。
【００４３】
（ｅ）また、支持体としてＰＧＡの代わりにコラーゲンスポンジを用いて同様に移植実験を行った結果、耳介軟骨の場合では１００％（５／５）の検体について軟骨組織の形成が観察された。その移植標本のプレパラートを調製し、ＨＥ染色またはアルシアンブルー ＋ ＰＡＳ染色を行ったところ、軟骨組織が形成されていること（ＨＥ染色陽性）および形成された軟骨組織が耳介軟骨であること（アルシアンブルー＋ＰＡＳ染色陽性）が確認された（図１１）。肋軟骨についても同様の実験を行ったところ、軟骨組織の形成が確認された。
【００４４】
（ｆ）さらに、移植後の組織がヒト由来であるかを確認するために、抗ヒトII型コラーゲン抗体を用いてＡＢＣ−ＰＣ（ペルオキダーゼ）法により抗体染色を行った。その結果、耳介軟骨および肋軟骨共にヒトII型コラーゲンの発現が観察され、これら軟骨組織がヒト由来であることが確認された（図１２）。これらの結果を下記の表に示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
（ｇ）さらに形成された軟骨組織がヒト由来であることを確認するために、II型コラーゲンについてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ヒトまたはマウスのII型コラーゲンに特異的なヌクレオチド配列を有するプライマー；
ヒト；
前方プライマー：5'-ACATACCGGTAAGTGGGGCAAGAC-3' (SEQ ID NO: 1)
後方プライマー：5'-AGGTCTTACAGGAAGACAATAAAT-3' (SEQ ID NO: 2)
マウス；
前方プライマー：5'-ATTTTGCAGTCTGCCCAGTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 3) および
後方プライマー：5'-AGGTCTTACAGGAAGACAATAAAT-3' (SEQ ID NO: 4)
を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、そのＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した。ヒト由来のII型コラーゲンはＥｃｏＲＩで切断されるため、ヒト由来かマウス由来かを容易に識別することができる。ＲＴ−ＰＣＲ用試料としてはマウスに移植して３ヶ月後の培養ヒト軟骨組織、フィーダー細胞のみ、およびフィーダー細胞＋培養ヒト軟骨細胞を、対照としてマウス細胞を試験した。試料からのＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子操作技術マニュアル、医学書院（1995年出版）に従って実施した。
【００４７】
その結果、移植軟骨組織では２本のバンドが観察され、ヒトのII型コラーゲンのみが検出された。フィーダー細胞ではＥｃｏＲＩでは切断されず、マウスのII型コラーゲンのみが検出された。そしてフィーダー細胞＋培養ヒト軟骨細胞では、該制限酵素で切断されたバンドと切断されないバンドが観察され、マウスとヒトのII型コラーゲンが検出された。一方、対照であるマウス細胞ではＥｃｏＲＩでは切断されず、マウスのII型コラーゲンのみが検出された。以上の結果から、移植後に形成された軟骨組織がヒト由来であることが確認された。この結果を図１３に示す。
【００４８】
産業上の利用可能性
本発明の方法により、ヒト軟骨細胞と、軟骨細胞増殖能を支持するフィーダー細胞として軟骨形成期の軟骨周辺細胞とを共培養することにより、迅速かつ大量にヒト軟骨細胞を培養することが可能である。さらに、前記方法により得られたヒト軟骨細胞を重層的に１回または２回以上播種して培養し、ヒト軟骨細胞塊を得ることができる。また、ヒト軟骨細胞（または細胞塊）が包埋された材料からなる軟骨治療材が得られる。該軟骨治療材は、軟骨細胞を包埋する材料を適宜選択することにより、軟骨組織のみならず軟骨性骨化を誘導することができ、軟骨および骨に関連する疾病の治療に有効である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト軟骨細胞と、（Ａ）本発明のフィーダー細胞（ＣＳ２１細胞）または（Ｂ）３Ｔ３細胞との初代培養の結果を示す写真である。
図２は、培地のみ（左）または重層培養の結果（右）を示す写真である。
図３は、重層培養で得られたゲル状の細胞塊のＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色の顕微鏡写真である。
図４は、重層培養で得られたゲル状の細胞塊の組織における抗ＩＩ型コラーゲンを用いた免疫染色の顕微鏡写真である。
図５は、支持体としてＰＧＡ上にヒト軟骨細胞塊を載せたもの（Ａ）、さらにＰＧＡで挟んだ移植用軟骨細胞塊（Ｂ）の写真である。
図６は、軟骨細胞塊の移植後３ヶ月の移植マウスである。
図７は、軟骨細胞塊の移植後３ヶ月のマウスから摘出した標本を示す写真である。
図８は、支持体として（Ａ）ＰＧＡおよび（Ｂ）アルギン酸カルシウムを用いた摘出標本のトルイジンブルー染色の顕微鏡写真である。
図９は、軟骨細胞塊をＰＧＡで包埋した群（第１群）およびさらにヒト真皮で巻いた群（第２群）の移植後の摘出標本である。
図１０は、ヒト真皮で巻いた第２群の組織を示す顕微鏡写真である。
図１１は、支持体としてコラーゲンスポンジで包埋した組織の移植後の耳介軟骨組織のＨＥ染色（Ａ）、アルシアンブルー＋ＰＡＳ（Ｂ，Ｃ）染色の顕微鏡写真である。
図１２は、移植後の耳介軟骨組織における抗ＩＩ型コラーゲンを用いた免疫染色の顕微鏡写真である。
図１３は、移植された軟骨組織のＩＩ型コラーゲンについてＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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