(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的なチミジンキナーゼ遺伝子を有するアデノウィルスを含有することを特徴とする、腫瘍の切除により生じる脳腫瘍の腫瘍腔の壁にアデノウィルス（3×1010pfu/10ml）を、0.1〜0.3mlの量で、10mmの深さで30〜70回注入/患者で投与することにより該腫瘍腔を処置するための医薬。
【請求項２】
アデノウィルスに天然で関連しているタンパク質以外のタンパク質を含有していない、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記チミジンキナーゼ遺伝子が単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
安定剤をも含有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
前記安定剤がグリセロールである、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記脳腫瘍が悪性神経膠腫である請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬と、リン酸化された場合に細胞傷害性誘導体を形成する化合物とを含有する、腫瘍の切除により生じる脳腫瘍の腫瘍腔の壁に投与することにより該腫瘍腔を処置する際に同時、連続してまたは別個に使用するための製品。
【請求項８】
化合物がガンシクロビルである、請求項７に記載の製品。
【請求項９】
（ｉ）請求項１〜６いずれか１項に記載の医薬を、脳腫瘍の腫瘍腔の壁に投与する工程；ならびに
（ii）リン酸化された場合に細胞傷害性誘導体を形成する化合物を投与する工程を含む、脳腫瘍の腫瘍腔の処置の際に使用するための請求項７または８に記載の製品。
【請求項１０】
前記工程（ii）の化合物がガンシクロビルである、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
前記工程（ｉ）、または各工程に注入を含む、請求項９または１０に記載の製品。
【請求項１２】
前記工程（ｉ）、または各工程に複数回の注入を含む、請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
前記工程（ｉ）が40〜70回の注入を含む、請求項１２に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子治療を用いた脳腫瘍の処置に関する。
【０００２】
発明の背景
悪性神経膠腫の処置は、依然として臨床医および科学者にとって難題であり続けている。単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（HSVtk）遺伝子を用いるチミジンキナーゼ遺伝子治療は、悪性神経膠腫の患者の生存を変更することを意図する、最も成功率の高い治療モダリティーのうちの１つである。HSVtk遺伝子治療は、ガンシクロビル(GCV)のリン酸化を触媒するチミジンキナーゼの能力に基づく。リン酸化されたGCVは、標的細胞の死を導く毒性のヌクレオチドアナログとして作用する。さらに、トランスフェクションされていない周囲の細胞さえもまた破壊されるという周囲への影響により、この現象はさらに増強される。この効果は、トランスフェクトされた細胞から周囲の細胞へとギャップ結合を介して毒性のヌクレオチドアナログが放出されることが原因であると考えられている。
【０００３】
レトロウィルスおよびアデノウィルスは、遺伝子治療のためのベクターとして使用されてきた。両方のベクターは、特定の利点と限界を有する。脳腫瘍にはレトロウィルス媒介性遺伝子移入が特に適している。なぜならば、レトロウィルスは増殖細胞にのみ感染することができ、正常な分裂していない脳組織は無傷なままで残るからである。レトロウィルスの遺伝子移入効率は比較的低いが、単離したウィルスの代わりにレトロウィルスパッケージング細胞を使用することにより改善することができる。形質導入時間は理論的に長期化することができ、そしてトランスフェクトされる細胞の数も増加させることができる。レトロウィルスを用いる場合、トランスフェクトした遺伝子は標的細胞のゲノム中に一体化することにより長期遺伝子発現を達成することができる。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、チミジンキナーゼ遺伝子治療を使用する脳腫瘍の処置が、遺伝子を腫瘍細胞へと輸送するビヒクルとしてアデノウィルスを使用すると、より効率よく達成されうるという驚くべき知見に基づく。
【０００５】
本発明によると、アデノウィルスはチミジンキナーゼをコードする遺伝子を有し、そしてこれを含む医薬は脳腫瘍の処置に有用である。特に、腫瘍はガンシクロビルまたは等価な化合物の投与に続いて処置される。
【０００６】
代表的には、チミジンキナーゼ遺伝子は単純ヘルペスウィルス（HSVtk）に由来するものである。
【０００７】
アデノウィルス／チミジンキナーゼ遺伝子構築物は、レトロウィルス移入よりも有益であることが示されている。
【０００８】
本発明の説明
本発明の構築物は、腫瘍を処置するために使用しうる。処置は、以下の工程：
（ｉ）チミジンキナーゼをコードする遺伝子を有するアデノウィルスを腫瘍腔（tumour cavity）の壁に投与する工程；および
（ii）リン酸化された場合に細胞傷害性化合物を形成する化合物を投与する工程、を含みうる。
【０００９】
工程（ii）で使用する化合物は、ガンシクロビルまたはその誘導体でありうる。この方法は、任意の腫瘍を処置するために使用し得るが、脳腫瘍、例えば悪性神経膠腫が好ましい。工程（ｉ）で使用する組成物は、反復的に投与することができ、40〜80回の適用に分けて投与することが好ましい。
【００１０】
本発明に使用する組成物は、好ましくは、（アデノウィルスに関連するタンパク質以外の）タンパク質を添加せずに処方される。これは、活性成分に対する分解酵素の影響を減少させるためにアルブミンを添加される組成物よりも、好ましい点であると考えられる。好ましくは、この組成物は、安定剤としてグリセロールを含有する。
【００１１】
本発明での使用における、患者に投与されるべき活性物質の量は、本明細書中で提供される情報、および投与経路、処置されるべき状態および段階などのような有用な考察に基づき、当業者が決定することができる。
以下の実施例により本発明を例示する。
【００１２】
実施例
本実施例において、レトロウィルスパッケージング細胞媒介性HSVtk遺伝子治療と、アデノウィルス媒介性HSVtk遺伝子治療との安全性および有効性を、悪性神経膠腫の処置に関して比較した。この試行では、レトロウィルスパッケージング細胞遺伝子治療は、lacZをトランスフェクトした対照群と比較して悪性神経膠腫患者の生存を改善しなかった。腫瘍の進行は、腫瘍切除および遺伝子移入の３ヶ月後に磁気共鳴映像法（MRI）により評価した全ての患者に存在した。しかしながら、アデノウィルス遺伝子治療は患者の結果を有意に改善した。また、アデノウィルスで処置した患者７人のうちの３人では、腫瘍に変化がないことがMRIにより示された。
【００１３】
（レトロウィルスおよびレトロウィルスパッケージング細胞株）
Poptaniら、Cancer Gene Ther. 5: 101-109（1998）に記載されているように、PA317/tkパッケージング細胞株を調製した。簡単に述べると、1.2 kb HSV1-TK cDNA (McKnight、Nucleic Acid Res. 8: 5949-5964 (1980））を、pLXSNレトロウィルスプラスミド（Millerら、Mol. Cell. Biol.、5：2985-3902 (1986））にサブクローニングしてpLTKSNプラスミドを作製した。HSV1-TKの発現は、５’モロニーマウス肉腫ウィルスLTRにより駆動される。また、このベクターはネオマイシン耐性（NEO）遺伝子を駆動する内部SV40プロモーターを含有する。PA317細胞株を、pLTKSNプラスミドを用いてリン酸カルシウム沈殿法でトランスフェクトした。PA317/3.0D5細胞株（PA317/tk）は、209F繊維芽細胞アッセイで測定すると10６cfu/mlのレトロウィルスを生成した（Yla-Herttualaら、J. Clin. Invest.95：2692-2698 (1995））。注入（注射）前にパッケージング細胞を増殖させ、トリプシン処理し、そして10９細胞/10 ml Ｏptimem（Gibco BRL）まで希釈した。細胞は、マイコプラズマ、他の微生物混入および野生型ウィルスを含有していないこと示した。
【００１４】
β-ガラクトシダーゼ（lacZ）含有BAG-レトロウィルスを、φpCRIP中で生産した。力価６×1O５cfu/mlの生成物を濃縮していない培養上清として使用した（DMEM、0.5％NCS、Gibco）。
【００１５】
（アデノウィルス）
HSVtkアデノウィルスでは、ヒトサイトメガロウィルス（hCMV）エンハンサーおよびプロモーターエレメント-HSV 1-TK cDNA-シミアンウィルス40（SV40）ポリアデニル化シグナルから構成される発現カセットを、pAdenogalプラスミド（Barrら、Gene Ther. 1: 51-58 (1994））にサブクローニングしてpAdCMVTKプラスミドを作製した。線状化したpAdCMVTKおよびsub360アデノウィルス性DNA（McClane ら、Hum. Gene Ther. 8: 739-746 (1997））を、293細胞（ATCC CRL1573）にコトランスフェクトし、相同的組換えを介して組換えアデノウィルスであるAdCMVTKを作製した。ウィルスクローンを、３回のプラークアッセイにより精製し、各精製段階毎にアデノウィルスゲノム中のTK発現カセットの存在についてPCRで確認した。AdCMVTKのラージスケールでの調製は293細胞中で行い、ウィルス溶解物をCsCl勾配中で精製および濃縮し、透析し、-80℃で保存した。ウィルス力価は293細胞でのプラークアッセイにより決定した。アデノウィルス調製物を、制限酵素消化、続いてサザンブロット分析を使用してTK発現カセットの一体性について分析した。HeLa（ATCC CCL-2）細胞およびA549（ATCC CC 185）細胞に対する細胞変性アッセイにより野生型複製コンピテントウィルスが存在しないことを確認した。また、ウィルス調製物が、微生物夾雑物およびリポ多糖を含んでいないことも試験した（Limulusアッセイ、Sigma）。
【００１６】
lacZでは、β-アクチンプロモーターおよびCMVエンハンサー制御下のアデノウィルス核標的型β-ガラクトシダーゼcDNAを、相同的組換えを使用してアデノウィルスゲノムのEl欠損領域にクローニングした。アデノウィルスを３×10１０pfu/mlの力価まで超遠心により濃縮した。精製したウィルスを回収し、５mM Hepes（pH 7.8）そして最終的に20％グリセロールを含有する５mM Hepes（pH 7.8）中で透析した。
【００１７】
（患者）
14人の患者の14個の腫瘍を、HSVtk遺伝子治療を用いて処置した。さらに、切除の４〜５日前に、７人の対照患者を対照lacZマーカー遺伝子をもちいてトランスフェクトした。全患者は、70を超えるKarnofskyスコアを有していた。患者の平均年齢は、51歳だった（範囲は20歳〜70歳）。腫瘍は13症例で再発性であった（59％）。全ての患者はコルチコステロイドおよび抗癲癇薬を投与されており、そして新規な（デノボ）腫瘍では放射線療法を使用した。
【００１８】
（手術および遺伝子移入）
患者は全員、開頭術および腫瘍切除を受けた。切除は、顕微鏡下で可能な限り徹底的に行った。悪性神経膠腫の診断は、手術の時点で凍結切片により確認した。腫瘍切除の後に、HSVtkレトロウィルスパッケージング細胞（10９細胞/10ml）またはアデノウィルス（3×10１０pfu/lOml）を、0.1-0.3mlの量で、10mmの深さで30-70注入/患者で、腫瘍腔の壁に注入した。GCV処置（５mg/kg/d）を鎖骨下静脈に１日に２回、14日間静脈内投与した。腫瘍切除および、レトロウィルスまたはアデノウィルス処置患者それぞれへの遺伝子移入の14日後または５日後から投薬を開始した。定位的に腫瘍に挿入したカテーテルを用いて７人の対照患者群にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を移入した。腫瘍を開頭術で切除するまでカテーテルはその場に残した。遺伝子移入ベクター（BAGレトロウィルス、力価６×10５cfu、および、アデノウィルス、力価３×10８〜３×10１０pfu）を連続３日間、腫瘍に注入し、続いて１〜２日後に腫瘍を切除した。β-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を保有する患者はGCVで処置しなかった。全ての患者を、放射線療法をもちいる標準的な臨床業務に従って処置した。
【００１９】
（磁気共鳴映像法）
HSVtkで処置した患者に、手術後１日目、遺伝子移入の後４、８、１２週間目、そしてそのあと２ヶ月毎に、MRIを行った。MRI画像化は、1.5 T Magnetom Vision (Siemens）で行い、そしてＴ１強調（580/14/1=繰り返し時間／エコー時間／収集（aquicition））アキシャル（軸）、コロナル（冠状）およびサジタル（矢状）系列、ならびに、造影剤（ガドペンテト酸ジメグルミン、0.1 mmol/kg）の投与後、高速Ｔ２強調（5400/99/2）およびFLAIR（流体緩和反転回復法（fluid attenuated inversion recovery）；TR=9000、TE=119、AC=1）系列から構成されていた。画像は全て、５mmの厚さの連続断片で、256×256マトリックスで収集した。手術後１日目のMRIにより、外科切除は、腫瘍体積の98％より多くが取り除かれた場合は全切除（total resection）；66％より多く、しかし98％未満の場合には準全切除（subtotal resection）、そして腫瘍容量の66％未満が取り除かれている場合には部分切除（partial resection）として段階分けした。追跡調査MRIにより、腫瘍の挙動に関しては、わずかでも腫瘍再増殖の徴候があれば進行（progressive）、腫瘍の状態が同じままであれば安定（stable）、そして腫瘍体積が減少していれば後退（regressive）として段階分けした。
【００２０】
（血液、尿および組織サンプルの分析）
白血球差示的側定（leucocyte differential count）を除いて（これはGCV投薬の間は２日毎に測定した）、手術後１日目、及び病院収容の間は１週間毎に、血液および尿サンプルを遺伝子移入の前に常法に従い分析した。遺伝子移入の前および２週間後に、抗ウィルス抗体を測定した。遺伝子移入の前ならびに３、５、７および21日後に血漿サンプルおよび尿サンプルでPCRおよび野生型ウィルスアッセイを行った。
【００２１】
手術時の凍結切片を用いて組織学的診断を行い、そしてその後にヘマトキシリン-エオシン染色およびGFAP（Boehringer）染色を使用してパラフィン切片を用いて組織学的診断を確認した。腫瘍の増殖活性はKi67（Dako）染色で測定した。切除後、lacZをトランスフェクトした腫瘍を、Puumalainenら、Hum. Gene Ther.、9：1769-1774（1998）に記載されるように、X-gal染色により分析した。
【００２２】
（神経心理学）
認知機能および生活の質（quality of life）を決定するため、手術前および処置後２ヶ月毎に神経心理学試験を行った。記憶機能の評価には、ウェクスラー記憶尺度検査法（Wechsler Memory Scale）(WMS) （これは、学習試験、遅延思い出し、注意力および感情処理の融通性に関連する短期記憶能力に関する７つのサブ試験を含む）を使用した。生活の質は、睡眠困難、疲労、記憶機能、身体傷害、気分、感覚機能および運動機能、緊張、活発さ、鬱、いらだち、無能および不信の基準化された評価に従って決定した。LacZをトランスフェクトした患者は、神経心理学試験に供さなかった。
【００２３】
（統計）
MRIの結果の統計分析を、SPSSのKruskal Wallis試験を用いて行った。SPSSのフィッシャーの直接法を用いて患者の結果を分析した。実験室および神経分析学的分析の統計は、SPSSのAnovaを用いて評価した。
【００２４】
（結果）
遺伝子治療研究の結果を表１に示す。
全患者を腫瘍切除により処置した。７人の患者にレトロウィルスパッケージング細胞（PA317/tk）を使用し、７人の患者にアデノウィルス（Adv/tk）を使用した。１人の患者（＃）には２つの異なる腫瘍に対してPA317/tk細胞を用いて繰り返し処置した。これらの症例のうち６人がデノボ腫瘍であり、その他は、先の手術（op)、放射線療法（rd）または化学療法（ch）から再発したものであった。腫瘍は側頭部（temp）、後頭部（occ）、前頭部（front）または頭頂部（pariet）の突出部分に位置した。（sin）は左側を示し、（dx）は右側を示す。遺伝子治療の前および２週間後にウィルス抗体を抹消血から測定した。８２％の患者で膠芽腫（gb）との診断を確認し、２人の患者は未分化の星状細胞腫（aa）を有しており、そして２人の患者が未分化の稀突起神経膠腫（ao）を有していた。腫瘍の増殖活性はki67免疫組織化学染色により測定した。腫瘍の同一性に関しては、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）免疫染色で確認した。結果を数ヶ月間測定し、（＊）は患者が死亡したことを示す。フィッシャーの直接法によると、レトロウィルスで処置した患者とアデノウィルスで処置した患者との生存率による差異は、有意であった（p＜0.05）。１回目の手術後MRIは腫瘍切除および遺伝子治療の手施術後１日または２日目に行い、２回目の手術後MRIは３ヵ月目に行った。切除は、98％より多くの腫瘍質量が切除された場合にはtotalとし、66〜98％の間で切除されているならばsubtotalとし、66％未満の腫瘍が切除されている場合にはpartialとした。追跡調査MRIでは、腫瘍再増殖の徴候がわずかでも存在すれば、増殖が進行中である（prog）とした。レトロウィルスで処置した患者とアデノウィルスで処置した患者との、MRIの結果による進行性増殖の差異は有意であった（ｐ＜0.05）；Kruskal Wallis検定。NA＝分析せず。
【００２５】
重篤な副作用を生じないレトロウィルスおよびアデノウィルスベクターの両方を用いる遺伝子移入は、臨床上安全である。しかしながら、アデノウィルスを投与した患者のうちの２人では、これらの患者は２人とも癲癇症状を以前から示していたが、癲癇の発作が増加した。１人の患者では、二焦点性前頭部腫瘍切除の合併症として、部分的に可逆的な不全麻痺および失語症を示した。その患者は、腫瘍切除と合わせてレトロウィルスパッケージング細胞遺伝子治療を受けていた。２人の患者は、アデノウィルス媒介性遺伝子移入と脳室開口の後に発熱反応を示した。体温が39.0℃まで上昇したが、反応は短期間のものであり、残留する症状はなく可逆的なものであった。
【００２６】
慣用的な実験室での測定では主要な変化は観察されなかった。GCV処置の間、１人の患者のみが軽い、治癒可能な白血球減少症に罹患したが、症状は現れなかった。Adv/tkで処置した７人の患者のうち３人でアデノウィルス抗体が顕著に上昇し、また、二人は発熱反応を示した。肝機能および腎機能には有意な変化は現れなかった。PCRおよび野生型ウィルスアッセイでは、血漿サンプルおよび尿サンプル中にウィルスの全身性送達は検出されなかった。一人の患者からの死亡後のサンプルをPCRで分析すると、遺伝子移入の６ヶ月後には腫瘍および他の分析した組織はトランスジーンに関しては陰性であることが示された。
【００２７】
MRIでの追跡調査の結果は、レトロウィルスパッケージング細胞遺伝子治療は効果がほとんどないか、または非常に限定されていることを示した。全ての患者が、腫瘍切除および遺伝子治療の３ヵ月後に進行性の疾患を有していた。アデノウィルス媒介性遺伝子治療に関しては、MRIの結果は、７人の患者のうち３人が処置の３ヵ月後に疾患が進行しておらず、有意に良好であること（p＜0.05）を示した。
【００２８】
lacZで処置した対照群と比較して、レトロウィルス処置群の患者の生存率には何ら改善を認めなかった。レトロウィルスで処置した患者の結果とアデノウィルスで処置した患者の結果との差異は有意であった（p＜0.05）。
【表１】
0004733833.tif 000002