(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル混合物から微生物を回収するための方法であって、
（i）界面活性剤で前処理された多数の中空繊維フィルターメンブレンを含むフィルターデバイスのサンプル投入口を介して前記サンプル混合物を通す工程であって、前記メンブレンは、第１の端部および第２の端部、ならびに外側表面、および内腔を規定する内側表面を有し、前記メンブレンのそれぞれの第１の端部は開口しており、かつ前記サンプル投入口と連絡し、そして前記サンプル混合物が前記メンブレンによってろ過され、ろ過残留物が前記メンブレンの前記内腔内に残るように、第２の端部からの流れが制限される工程と、
（ii）溶解剤の溶液を前記メンブレンの内腔に通すことにより前記ろ過残留物を前記メンブレン内で再懸濁する工程と
（iii）前記ろ過残留物内の何らかの微生物の存在を検出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記メンブレンの前記第２の端部からの流れが、前記サンプル混合物が前記メンブレンによるろ過によってもっぱら前記フィルターデバイスから流出するように制限される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が酵母を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が細菌を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記メンブレンが０．２μｍの平均細孔直径を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記メンブレンがポリプロピレンを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記メンブレンがポリスルホンを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤がツイーン−２０を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出工程（ｉｉｉ）の前に、前記フィルターデバイス内の前記ろ過残留物内の何らかの微生物を少なくとも１２時間の期間にわたって培養する工程をさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物は、前記検出工程（ｉｉｉ）の前に少なくとも２４時間〜３６時間にわたって培養される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、混合物（例えば、ビール）中の微生物（特に、酵母および細菌）を検出するための改善された方法に関する。
【０００２】
食品および飲料物（ビールなど）の製造には、最終製品の品質を保証するために、ある種の微生物の存在について試験することが伴う。例えば、醸造プロセスは、少なくとも２５ｍｌの容量を有するサンプル（好ましくは、例えば２５０ｍｌのサンプル容量）を数時間毎にインライン試験することが求められることがある。そのとき、微生物（すなわち、酵母および細菌）を含み得る粒状物をサンプルから分離して、その後、特定の微生物の存在の有無を決定するために試験しなければならない。これを達成するために使用されるデバイスには、平均細孔直径が０．４５μｍの平坦なフィルターを有するＢｉｂｂｙディスポーザブル真空フィルターユニット、および受器を有し、平均細孔直径が０．４５μｍまたは０．２μｍの平坦なフィルターを有するＮａｌｇｅｎｅフィルターホルダーが含まれる（例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｒｓカタログ１９９８、４８２頁を参照のこと）。そのようなデバイスは、１００ｍｌのみの最大サンプル容量をろ過することができ、５０ｃｍ２の平坦な表面積を有し、そしてそれらの複雑な使用のためにサンプルを試験するために３０分までの時間を要し得る。その最大容量がろ過されると、デバイスは、サンプル流体（例えば、ラガービール）に存在するタンパク質などの粒状物によって詰まり、そして何らかのその後のろ過には、微生物の検出を妨げ、かつ誤った結果をもたらす細胞溶解を生じさせるほどの大きな圧力が必要になる。
【０００３】
下記に詳しく記載されている実験の結果によって明らかにされるように、先行技術のデバイスは、本発明のデバイスおよび方法を使用したときに必要とされるよりも実質的に長い時間が、サンプルから微生物を分離して検出するためにかかる。さらに、微生物のその後の回収、従って微生物に対する試験は、本発明の場合には比較的簡便であり、かつ容易である。これは、微生物が、メンブレンのすき間への最少量の侵入を伴って、容易に動かせる「ケーク」（粒状物の比較的圧縮されていない低密度の塊）としてメンブレン表面に提供されるからである。比較において、他のデバイスは、固い「ビスケット」（粒状物の比較的大きく圧縮された高密度の塊）としてメンブレン表面に粒状物をもたらし、微生物および他の粒状物がメンブレンのすき間に詰まり、捕捉されている。このビスケットは、取り出すことが困難であり、そして微生物の存在についてビスケットを試験することができるように処理することが困難である。さらに、密集したビスケットの形成を防止することによって、本発明のデバイスは、より低い圧力で操作することができる。より大きな圧力で操作された場合、細菌の溶解が生じることがあり、これにより誤った結果がもたらされることがある。高圧はまた、細菌の変形を生じさせることがあり、これにより、細菌がメンブレンを通過して、誤った結果がもたらされる。
【０００４】
本発明により、サンプル混合物から微生物を回収するための方法が提供される。この方法は下記の工程を含む：
ｉ）界面活性剤で前処理された多数の中空繊維フィルターメンブレンを含むフィルターデバイスのサンプル投入口を介して前記サンプル混合物を通す工程であって、前記メンブレンは、第１の端部および第２の端部、ならびに外側表面、および内腔を規定する内側表面を有し、前記メンブレンのそれぞれの第１の端部は開口しており、かつ前記サンプル投入口と連絡し、そして前記サンプル混合物が前記メンブレンによってろ過され、ろ過残留物が前記メンブレンの前記内腔内に残るように、第２の端部からの流れが制限される工程：
ｉｉ）前記ろ過残留物を前記メンブレン内で再懸濁する工程；
ｉｉｉ）前記ろ過残留物内の何らかの微生物の存在を検出する工程。
【０００５】
再懸濁工程（ｉｉ）は、溶解剤の溶液を前記メンブレンの内腔に通すことを含んでもよい。これは、例えば、シリンジをデバイスの一方の端部に取り付けて、溶解緩衝液をメンブレンの内腔に通すことによって行うことができる。あるいはメンブレンを溶解溶液内に置き、そしてデバイスに取り付けられたシリンジを使用して、溶解溶液をメンブレンの内腔内に引き込むことができる。
【０００６】
前記メンブレンの前記第２の端部からの流れは、前記サンプル混合物が、前記メンブレンによるろ過によってもっぱら前記フィルターデバイスから流出するように制限される。
【０００７】
先行技術のろ過デバイスおよび方法には、英国特許ＧＢ２１３５９０２、欧州特許ＥＰ３０２９４９、国際特許公開ＷＯ９４／００２２２、国際特許公開ＷＯ８４／０００１５、米国特許第５８６３５０１号、米国特許第５８１４１７９号、米国特許第４５０１７９３号、日本国特許ＪＰ４−１３５４７８（ＷＰＩアブストラクト１９９２−２０５００１）、日本国特許ＪＰ６３−１０４６１５（ＷＰＩアブストラクト１９８８−１６５５６６）、日本国特許ＪＰ６３−０８８００７（ＷＰＩアブストラクト１９８８−１４５０６０）および日本国特許ＪＰ６１−１３３１０５（ＷＰＩアブストラクト１９８６−２００９０８）のろ過デバイスおよび方法が含まれる。しかし、これらはどれも、それらが提供し得る結果を得るために必要な工程のそれぞれを含む本発明の方法を開示も、教示もしていない。特に、先行技術は、より密集した「ビスケット」ではなく、再懸濁可能な「ケーク」の形態でろ過残留物を作製することを示唆しておらず、またその後の処理工程の一部としての第１のろ過工程のろ過残留物を再懸濁することを示唆していない。例えば、日本国特許ＪＰ６３−１０４６１５には、多数の多孔性中空セルロース繊維を含む、例えばウイルスを流体から分離するためのデバイスが開示されている。この場合、繊維の一方の端部がフィラー材に埋め込まれ、大気に通じており、そして反対側の端部がシールされている。しかし、メンブレンを界面活性剤で前処理することは示唆されておらず、あるいはポリプロピレンメンブレンを使用することも示唆されておらず、あるいは微生物（特に、細菌および酵母）がろ過残留物においてどのようにして検出され得るか、またはろ過残留物を再懸濁することについては何ら示唆されていない。
【０００８】
微生物の検出工程は、所望する微生物を検出する任意の検出方法を含むことができる。例えば、簡便な一般的な微生物試験は、下記に記載されるＡＴＰ試験である。この試験では、微生物を溶解し、そして放出されたＡＴＰが、ルシフェラーゼアッセイを使用して検出される。あるいは、微生物に特異的な抗体を使用してもよく、またはろ過残留物を一般的な栄養培養において平板培養して、何らかの微生物コロニーの増殖を検出することができる。
【０００９】
メンブレンを界面活性剤で（例えば、界面活性剤をメンブレンに流し、そしてその後、必要に応じてメンブレンを乾燥させることにより）前処理することによって、メンブレンを通過する混合物の流速が甚だしく増大することが見出された。これは、乾燥させた界面活性剤処理メンブレンを乾燥した未処理のメンブレンと比較したときには特に当てはまる。この増大した流速により、微生物の溶解を伴うことなく、または無理やりメンブレンを通過させることなく、微生物が確実に集められる。
【００１０】
有用な界面活性剤には、非イオン性の界面活性剤（特に、ツイーン２０）が含まれ、より好ましくは２０％ツイーン２０の溶液が含まれる。
【００１１】
多数の中空繊維フィルターメンブレンの使用はまた、平坦なメンブレンを有する類似した全体的な大きさ（すなわち、サイズ）の単デバイスによって提供される表面積と比較した場合、ろ過が行われ得る相対的に大きな表面積をもたらす（典型的には、少なくとも３倍大きい）。これによりまた、存在する細孔が詰まる前に比較的多量のサンプルをろ過することが可能になる。このことは、平坦なフィルターメンブレンを急速に詰まらせ得る多量の粒状物を含有する濁ったサンプル（例えば、スタウトビール）の場合には特に有用である。
【００１２】
フィルターメンブレン材料の厳密性もまた重要であることが見出されている。平均細孔直径が０．２μｍであり、界面活性剤で前処理された市販のポリプロピレン中空繊維メンブレンは、界面活性剤でまた前処理された場合でさえ、例えば、平均細孔直径が０．２μｍのポリスルホンメンブレンよりもはるかに大きな流速を可能にすることが見出された。従って、本発明の好ましい実施形態において、中空繊維メンブレンはポリプロピレンメンブレンであり得る。当然のことではあるが、他のメンブレンもまた使用することができ、特に、類似した物理的特性（例えば、メンブレン表面の単位面積あたりの類似した細孔面積）を有するメンブレンを使用することができる。
【００１３】
本発明において使用される中空繊維メンブレンは、０．２μｍの平均細孔直径を有し得る。
【００１４】
本発明により、微生物をサンプル混合物から分離するためのフィルターデバイスもまた提供される。このフィルターデバイスは、界面活性剤で前処理された多数の中空繊維フィルターメンブレンを含み、それぞれのメンブレンは、外側表面と、内腔を規定する内側表面とを有し、それぞれのメンブレンの端部の一方は開口しており、フィルターデバイスのサンプル投入口とつながり、そして反対側の端部が閉じている。
【００１５】
本発明の方法およびデバイスを使用して微生物の試験が容易であることは、ろ過速度によって満たされる。下記の実験結果から理解され得るように、本発明は、他のデバイスによって要求される時間の一部で所与容量のサンプル流体から粒状物を回収することを可能にし、そして多くの場合、少なくとも１０倍早い。
【００１６】
本発明はまた、非常に濁った混合物がろ過されている場合でさえ、所与サンプルに対して一貫した結果をもたらすという重要な改善をもたらす。少なくとも９９％の一貫性が種々の結果集団の間において容易に達成され得る。このことは、平坦なメンブレンを使用して得られる、比較的矛盾し得る結果と比較して優れている。
【００１７】
本発明は、フィルターデバイスの１つの形態が例としてだけで示されている添付された図面のいくつかの図を参照して、下記の説明からさらに明らかになる。
【００１８】
図１から理解され得るように、第１のフィルターデバイス１０は、平均細孔直径が０．２μｍの６８本の中空ポリプロピレン繊維メンブレン３０につながっているルアーロックフィッティング２１を有するサンプル投入口２０を含む。メンブレン３０の開放端部は、それらを所定の位置に保ち、かつそれらをサンプル投入口２０と連絡させるＵＶ硬化性接着剤４０に埋め込まれている。メンブレン３０の反対側の端部は、それらを閉じるＵＶ硬化性接着剤４１に埋め込まれている。メンブレン３０は、２０％ツイーン２０からなる溶液をそれらに通し、その後、それらを乾燥させることによって前処理されている。
【００１９】
使用において、サンプル混合物６０が入れられたシリンジ５０がサンプル投入口２０につながれ、サンプル混合物６０がメンブレン３０によってろ過され、ろ液７０およびろ過残留物７１が得られる。その後、メンブレン３０は再懸濁溶液８０に入れられ、シリンジ５０のプランジャー９０が引き戻される。これにより、再懸濁溶液８０の流れがメンブレン３０の内腔内に生じ、メンブレン３０内に保持されたろ過残留物７１が再懸濁されて、シリンジ５０内に引き込まれる。
【００２０】
ろ過残留物７１が再懸濁されて、シリンジ５０に集められると、ろ過残留物７１を試験することができる。表４に詳しく示されているように、種々の長さのメンブレン３０を有する様々なフィルターデバイスが製造されている。１つの具体的な実施形態において、メンブレン３０は、全長が５５ｍｍであり、そのうちの４０ｍｍが通じており、ろ過が行われ得る表面を提供し得る。メンブレン３０は、ろ過が行われ得る５１．２ｃｍ２の総表面積を提供する。
【００２１】
第２のフィルターデバイス１００は、平均細孔直径が０．２μｍの６８本の中空ポリプロピレン繊維メンブレン３０につながっているルアーロックフィッティング２１を有するサンプル投入口２０を含む。サンプル投入口２０において、メンブレン３０の端部は、それらを所定の位置に保ち、かつそれらをサンプル投入口２０と連絡させるＵＶ硬化性接着剤に埋め込まれている。流出口１１０において、メンブレン３０の端部は、それらを所定の位置に保ち、かつそれらを流出口１１０と連絡させるＵＶ硬化性接着剤に埋め込まれ、そしてプラグ１２０によって閉じられている。メンブレン３０は、５％ツイーン２０からなる溶液をそれらに通し、その後、それらを乾燥させることによって前処理されている。
【００２２】
使用において、段階Ｉ（図６）において、１００ｍｌ容量のラガービール６０がペリポンプ１３０によって１００ｍｌ／分の速度で管１４０を介してデバイス１００に送られる。デバイス１００がラガービール６０で満たされると、出口１１０を塞いでいるプラグ１２０は、デバイス１００からの唯一の出口をメンブレン３０の細孔にし、従って、ラガービール６０はメンブレン３０でろ過され、ろ液が廃液回収容器１５０に集められ、廃棄される。段階ＩＩにおいて、４００ｍｌの滅菌水１６０が管１４０を介して１８７ｍｌ／分で送られ、メンブレン３０でろ過され（プラグ１２０はその位置に置かれたままである）、廃液容器１５０に集められ、そして廃棄される。水１６０の全量がデバイス１００を通り抜けたとき、ポンプ１３０は、空気を管１４０およびメンブレン３０に送り、過剰な流体をメンブレン３０から除くために、さらに１０秒間運転が続けられる。その後、ポンプ１４０が停止させられ、デバイス１００が管１４０およびポンプ１３０から分離される。段階ＩＩＩにおいて、プラグ（すなわち、端部キャップ）１２０が除かれ、そして清浄なティッシュペーパー（示されず）にデバイス１００を軽くうちつけて、過剰な流体１６０が除かれる。その後、０．５ｍｌの溶解緩衝液１６０（０．２ＭのＮａＯＨ）を含有する１ｍｌの滅菌シリンジ５０がサンプル投入口２０に取り付けられ、そしてシャント管１６５が出口１１０に取り付けられる。湿潤化／溶解工程が行われる。この工程は、液体（溶解緩衝液１６０）がシャント管１６５に認められるまでシリンジ５０のプランジャー５５を注意深く押し下げ、その後、溶解緩衝液１６０をシリンジ５０に引き戻すためにプランジャー５５を戻し、それにより、メンブレン３０を溶解緩衝液１６０で再び湿らすことを含む。この湿潤化／溶解工程はさらに２回行われる。その後、デバイス１００を１．５ｍｌの滅菌チューブ１７０の上に保ち、プランジャー５５を３回押し下げることによって、液体１６０のすべてがデバイス１００から除かれる。段階ＩＶにおいて、シャント１６５がデバイス１００から除かれ、そして端部キャップ１２０がデバイス１００に付けられる。その後、プランジャー５５を戻して、溶出液のすべて（メンブレン上の溶出液を含む）が集められる。その後、溶出液はチューブ１７０に移される。その後、９滴の中和緩衝液（０．２ＭのＴｒｉｓリン酸塩）がチューブ１７０に加えられる。その後、蓋がチューブ１７０に置かれ、そしてチューブを２回〜３回反転させることによって、その内容物が混合される。最後に、段階Ｖにおいて、ＡＴＰアッセイが、バイオトレース社のＵｎｉｌｉｔｅルミノメーターおよびＳｉｇｍａ社のＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ試薬を使用してサンプルに対して行われる。
【００２３】
実験
ＡＴＰアッセイ
すべてのＡＴＰアッセイは、アルカリ変性／中和法に従って行われた。
【００２４】
滅菌エッペンドルフチューブに５０μｌの２Ｍ水酸化ナトリウムを入れ、２００μｌのサンプルを加えて、ピペッティングを２回〜３回行うことによって混合する。５０μｌの２ＭのＴｒｉｓリン酸塩緩衝液を加え、反転することによって混合する（サンプル混合物）。
【００２５】
１００μｌの適切に希釈したＡＴＰアッセイ混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ）をキュベット（Ｕｎｉ−Ｌｉｔｅキュベット）に入れる。３分間静置した後、バックグラウンドの光出力をルミノメーター（Ｕｎｉ−Ｌｉｔｅ）で３５秒間読み取る。バックグラウンドの光出力を測定した後、１００μｌのサンプル混合物をキュベットに加え、３５秒間読み取りを行う。バックグラウンドとサンプルとの読み取り値の差は、サンプルに存在するＡＴＰのためである。
【００２６】
メンブレン捕捉
約１ｘ１０７個のＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ細胞を含有する２５ｍｌのラガービールを、２５ｍｌシリンジをフィルターデバイスのルアーフィッティングにつなぐことによってそれぞれのデバイスに通した。その後、フィルターデバイスを１０ｍｌの水で洗浄して、過剰のラガービールを除いた（ラガービールはＡＴＰアッセイに対するわずかな阻害作用を有する）。その後、フィルターデバイスのメンブレン領域を滅菌水に入れ、デバイスからの逆洗水を得て、捕捉された細胞が取り出され、集められた濃縮物に存在した。上記に記載されているようにＡＴＰアッセイを行い、ろ液および濃縮物における微生物ＡＴＰの存在について測定した。
【００２７】
捕捉の安定性
Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓまたはＰ．ｄａｍｎｏｓｕｓの１０ｍｌの一晩培養物の１ｍｌを２４ｍｌのラガービールに加え、その後、上記に記載されているようにこの添加サンプルをフィルターデバイスに通した。微生物の％回収を、ろ過前およびろ過後のサンプルを微生物ＡＴＰレベルについて比較することによって濃縮物において測定した。合計で５つのデバイスを１つの微生物株について試験して、変動係数を回収レベル間で決定した。
【００２８】
微生物の汚染を測定する最も一般的で迅速な方法は細胞ＡＴＰの測定である。これは、細胞内に存在するＡＴＰを放出させるために細胞膜／壁の破壊（細胞溶解）を必要とする。放出されたＡＴＰが、その後、基質（ルシフェリン）およびＡＴＰを、光を含む多数の生成物に変換する酵素反応を使用して測定され得る。その後、光の量が、標準的なルミノメーターを使用して測定され得る。
【００２９】
上記の原理に基づく多数のＡＴＰ試験が市販されている。ＡＴＰ生物発光アッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ）は、細胞溶解を促進する緩衝液を全く含んでいなかった。細胞膜の溶解は細胞タイプに依存して異なることに留意しなければならない。本研究は、製造段階にあるビールにおいて見出される細胞タイプに集中している。これらは、アセトバクター・パスツリアヌスおよびペジコックス・ダムノススの２つの細菌株ならびにサッカロミセス・カールスベルゲンシスの酵母株である。この酵母株は、発酵を行わせるための開始株であるので異なり得る。ほとんどの醸造所は、サッカロミセス科に由来する開始株を使用しており、従って、この株は試験において使用することができる。
【００３０】
細胞溶解法
熱変性：サンプルを１０分間煮沸して、冷却して、そのｐＨを調節し、その後、ＡＴＰ試験を行った。いくつかの細胞は熱耐性である。
【００３１】
アルカリ変性：水酸化ナトリウムなどの強塩基は細胞を溶解することができる。しかし、ＡＴＰアッセイにおいて使用されるルシフェラーゼなどの酵素は中性ｐＨ近くで機能する。従って、サンプルのｐＨ調節をＡＴＰ試験の前に行わなければならない。塩基の濃度により、細胞溶解の程度が決定され得る。
【００３２】
細胞培養物溶解試薬：細胞溶解について発表された方法。
【００３３】
アルカリ変性／酸中和：細胞溶解が、水酸化ナトリウム（２Ｍで最適化）を使用して、その後、酸性緩衝液を使用して水酸化ナトリウムを直ちに中和して達成される。これにより、酵素の機能的喪失を伴うことなく、サンプルをＡＴＰ試験において直接使用することができる。
【００３４】
様々な溶解方法の結果が表１に示されており、開発されたアルカリ変性／酸中和法は、試験する前に細胞を増殖培地から取り出す必要がなく、すべての生物の細胞溶解が可能であることを示している。
【００３５】
ＡＴＰ標準曲線
ＡＴＰアッセイの感度を決定するために、ＡＴＰが１０−７モル〜１０−１６モルの範囲にあるＡＴＰ標準品について濃度曲線を決定した。結果を図２に示す。
【００３６】
本発明のデバイスを使用してサンプルが試験されたときに得られるＲＬＵは、ＡＴＰ標準曲線と比較することができ、そして所与サンプルに存在する細胞数を決定することができる。１個の酵母細胞は約１０−１４モルのＡＴＰを含有するが、細菌細胞は１／１００のＡＴＰが存在する。
【００３７】
メンブレン捕捉
種々の化学的組成および分子サイズカットオフのメンブレンを、本発明のデバイスを製造する際に使用して、この研究に含まれる微生物の捕捉能について、類似する条件のもとで試験した。多数のデバイス様式を、様々な細孔直径／分子量カットオフを有するポリプロピレンメンブレンを使用して調べた。本発明者らは、捕捉することができ、かつ低い圧力で操作され、それによってサンプル適用時の細胞損傷が回避される様式およびメンブレンタイプを確認した。実験において使用されたＹ型デバイス（表２参照）は、本発明のデバイスと類似し、サンプル投入口２０、ルアーフィッティング２１、メンブレン３０およびＵＶ硬化性接着剤４０を有する。しかし、Ｙ型デバイスは、それぞれのメンブレン３０が、各端部が開口しているループ形態であり、ＵＶ硬化性接着剤４０に埋め込まれ、そしてサンプル投入口２０と連絡し得る点で本発明のデバイスとは異なる。
【００３８】
デバイス内におけるメンブレンの配置は、この研究で使用されたすべての微生物の捕捉能において重要な役割を有していることが示された。メンブレンの分子量が小さいほど、大きな圧力が、サンプルのデバイス通過には必要である。増大した圧力は、細胞がメンブレンを通過し（ろ過され）て捕捉されないように細胞構造を変化させるようであった。結果を表２に示す。
【００３９】
捕捉の安定性
研究を、フィルターデバイスによる微生物の捕捉が安定していることを確保するために行った。それぞれの試験について、５個のデバイスを、それぞれの微生物を捕捉するその能力について調べ、捕捉された総細胞をＡＴＰアッセイにより測定した。結果を表３に示す。
【００４０】
捕捉濃度曲線
それぞれの生物の一晩培養物の１０倍希釈物を分析することにより、デバイスによって捕捉され得る細胞数を決定することができた。それぞれの生物を適切な増殖培地に置床して、各希釈物の正確な細胞数を測定した。結果を図３〜図５に示す。
【００４１】
すべてのデータ点は、三連のデバイスを使用して調べられ、二連のＡＴＰ試験が各サンプルに対して行われた。データは、遊離ＡＴＰの影響を除くために補正されている。ＲＬＵ出力の増大をより低濃度のサンプルにおいて検出することができる。これは、酵素希釈物が変化して、感度の増大をもたらしたためである。
【００４２】
汚染の検出／定量
試験を、６８個のメンブレンを有し、総表面積が５１．２ｃｍ２であるデバイスで、２．５リットルのラガービールがろ過され得るかどうかを明らかにするために行った。三連のデバイスにおいて、この容量が、メンブレンの詰まりを何ら伴うことなくフィルターを通過することが示された。
【００４３】
デバイスの表面積を低下させて、ろ過され得る未汚染ラガービールの容量を測定した。デバイスあたりのメンブレンの数を一定に保ち、全長を変化させた。各サイズの３つのデバイスを調べた。結果を表４に示す。圧力が大きくなりすぎて、デバイスを通過できなくなったときに、より多量のサンプル適用を終えた。
【００４４】
さらなる実験を下記のように行った：
第２のろ過デバイス（図６）によって例示されるろ過デバイスを使用した。
【００４５】
装置
１．平均細孔直径が０．２μｍのポリプロピレン中空繊維メンブレン（５％ツイーン２０で前処理）。
２．圧力が０．２ｂａｒに設定され、デジタル出力が３５．０に設定され、手持ちアプリケーターおよび足踏みスイッチが組み込まれているＬｏｃｔｉｔｅ（ＲＴＭ）２１半自動化制御装置。
３．タイマーが４０秒に設定されたＢｏｎｄｍａｔｉｃ８５０ＵＶ光源
４．内径が７．０ｍｍで、外径が１２．４ｍｍであるカラー（図７、２００）（ポリカーボネート棒）。
５．カラーを収容するための広い端部（内径：１２．４ｍｍ）およびルアー型シリンジノズルと接続するための狭い端部（内径：４．１ｍｍ）を有する、２ｍｍのポリプロピレンポリマーから作製されたＹ形状の端部キャップ（図７、２１０）。
【００４６】
フィルターデバイスは下記のように調製された：
１．すべての作業面をＩＰＡ（イソプロピルアルコール）で清浄化する。
２．様々な長さのポリプロピレン中空繊維メンブレンの適切な数からなる束を取り、束の回りに多数のカラーを付ける。
３．中空繊維メンブレンの束の端部から約３０ｍｍの位置において、接着剤アプリケーターのノズルをメンブレン束の中心部に置き、そして接着剤がメンブレン束に浸透するように接着剤を付け、そして接着剤が領域内のメンブレンのすべてに付くようにノズルを操作する。接着剤をその位置で束の外側にさらに付ける。その後、接着剤と接触するように、カラーを、その位置でメンブレンを覆って滑らせ、回転させる。
４．束の接着剤被覆部分をＵＶ光源の下に置き、接着剤を硬化させる。
５．以前のカラーから束に沿って約３０ｍｍの位置に、工程３（上記）に詳しく記載されているように接着剤を付ける。最初に接着剤を覆って、次に第２のカラーを覆って滑らせ、回転させて、それらが互いに接触するようにし、その後、それらを１ｍｍ〜２ｍｍ離して、工程４を繰り返す。
６．メンブレン長の全体が所定位置にカラーを有するまで工程５を繰り返す。
７．カラー対間の１ｍｍ〜２ｍｍのすき間で繊維を切断して、多数の中空繊維デバイスを得る。繊維は、開いた開口部をいずれか一方の端部に有し、いずれか一方の端部がその外側でカラーによりシールされる。
８．デバイスを５５℃で一晩インキュベーションして、残っている接着剤モノマーを除く。
９．デバイスの１つおよび１対の端部キャップを取り、ｌｏｃｔｉｔｅ  ｐｒｉｏｍｅｒ７７０を端部キャップの内側周縁部およびデバイスカラーの外側の回りに付ける。約１分間そのままにし、その後、Ｌｏｃｉｔｅの速硬化接着剤４０３を各カラーの外側の回りに付け、端部キャップを、接着されるまでカラーにしっかり押し付ける。
【００４７】
実験
最初に、上記試験の結果を、試験実施法（下記）に従って本発明の第２のデバイス（図６）を使用して評価した。サッカロミセス・カールスベルゲンシスに対する検出限界はアッセイあたり３０細胞〜１００細胞であり、アセトバクター・パスツリアヌスについてはアッセイあたり１００００細胞〜２００００細胞であり、ペジオコックス・ダムノススについてはアッセイあたり＞１０００細胞であった。多量の液体をろ過することができるシステムの能力は、最終的なＣＩＰ（その場での洗浄）洗浄水の衛生状態を試験することに対するその特定の可能性を明らかにしている。
【００４８】
第２に、試験を、ビールの微生物汚染に対するその感度を増大させるためにわずかに改変した。これは、ろ過されたビールサンプルに由来する捕捉された少数の微生物をフィルター内で培養することによって達成された。２４時間のインキュベーション期間の後、ろ過ビールの１ｍｌあたり１個の細胞を検出することが可能であった。この結果は、ＡＴＰに基づく現在利用可能な他の検出システムと少なくとも同じくらい良好であり、そして本システムは、そのような検出システムよりも都合よく使用することができる。さらに、本発明のシステムは、従来の平坦床のメンブレンろ過と比較して、より大きな容量のビールをろ過することができるという利点（およびスタウトビールをろ過する能力）を有し、その結果、増大した検出感度がもたらされる。類似した感度はまた、この分野で知られているアデニル酸キナーゼ検出キットの使用により、フィルター内で培養することを必要とすることなく（またはより短い培養期間を用いて）達成され得る。
【００４９】
これらの試験は、本発明の使用には、醸造産業、製薬産業、清涼飲料産業および乳製品産業における製造プロセスに対するその場での洗浄（ＣＩＰ）試験が含まれることを特に示している。さらに、本発明はまた、ビール（ビタービール、ラガービールおよびスタウトビールを含む）およびシードルの汚染試験に対して特に好適である。
【００５０】
この場合、ＡＴＰアッセイを行う前に少数の細胞を含有するフィルターデバイスを培養液培養でインキュベーションする効果を調べた。この研究のために、異なる生物を使用した：ラクトバチルス・ブレビス（ＢＳＯ４６４）。この生物は、以前から数多くのＡＴＰ検出試験のために広く使用されているために選ばれた。従って、結果を、他のシステムから得られた結果と容易に比較することができる。
【００５１】
ＢＳＯ４６４をＭＲＳ培養液において定常期まで増殖させた。顕微鏡で細胞数の計数を行った後、適切な希釈を滅菌脱イオン水で行い、約１００細胞／ｍｌを得た。この培養物の１ｍｌを使用して、９９ｍｌのラガービールに接種した。これを、それぞれのラガービールサンプルについて三連で行った。非接種のラガービールコントロールもまた作製した。平板培養計数を行い、接種レベルを調べた。それぞれのラガービールを、下記に記載されているようにろ過し、そして試験実施法を工程７まで従った。
【００５２】
この工程の後、デバイスを管から取り外し、そして滅菌シリンジを使用して、マイクロ繊維の内側をＭＲＳ培養液で満たした。シリンジを除き、別の滅菌した端部キャップをデバイスのこの端部に付け、捕捉された生物をデバイス内に保持した。その後、デバイス全体を様々なインキュベーション時間にわたって２０ｍｌのＭＲＳ培養液に浸けた。インキュベーション後、デバイスを培養液から注意深く取り出して、端部キャップの一方を除いた。その後、シリンジを使用して、１０ｍｌの滅菌脱イオン水をデバイスに通して廃液容器に集めた。その後、シリンジを使用して空気をデバイスに注入して、過剰な液体をメンブレンから除いた。その後、試験実施法（下記）を工程９からのプロトコルに従って続けた。
【００５３】
試験実施法：
１．シールされたバッグからデバイスおよび管を取り出す。
【００５４】
２．１８７ｍｌ／分または２２０ｒｐｍで運転することができる適切なポンプシステムに管を取り付ける（管は、内径が３．２ｍｍであり、外径が６．４ｍｍである）。
【００５５】
３．デバイスの下に廃液回収容器を置く。
【００５６】
４．ポンプを１００ｍｌ．分または１１７ｒｐｍに設定する。
【００５７】
５．１００ｍｌのラガービールを通過させ（最大で１リットルを通過させることができる）、ろ液を廃液容器に行かせる。
【００５８】
６．ポンプの設定を１８７ｍｌ／分または２２０ｒｐｍに調節して、４００ｍｌの滅菌（蒸留）水をろ過することによって過剰なラガービールをデバイスから洗浄する。
【００５９】
７．水洗いが完了した後、空気を管に１０秒間通して、過剰な液体をメンブレンから除く。
【００６０】
８．ポンプを停止させ、デバイスおよび管をポンプから取り出す。
【００６１】
９．デバイスの端部キャップを除く。清浄なティッシュペーパーの上で、デバイスを軽く打ちつけて、過剰な液体を除く。
【００６２】
１０．デバイスの一方の端部にシャント管を取り付け、反対側の端部には、０．５ｍｌの溶解緩衝液（０．２ＭのＮａＯＨ）を含有する１ｍｌの滅菌シリンジを付ける。
【００６３】
１１．液体がシャント管に認められるまでシリンジのプランジャーを注意深く押し下げる。溶解緩衝液をシリンジに引き戻し、それによってメンブレンを溶解緩衝液で再び湿らすためにプランジャーを戻す。
【００６４】
１２．工程１１を２回繰り返す。
【００６５】
１３．滅菌した１．５ｍｌチューブの上にデバイスを保持し、シリンジのプランジャーを３回押し下げることによって液体のすべてをデバイスから取り出す。
【００６６】
１４．シャント管を除き、端部キャップをデバイスに付ける。シリンジのプランジャーを戻して、溶出液のすべて（メンブレン上の溶出液を含む）を集め、そして溶出液を１．５ｍｌチューブに入れる。
【００６７】
１５．直ちに９滴の中和緩衝液（０．２ＭのＴｒｉｓリン酸塩）を、溶出液を含むチューブに加える。チューブに蓋を取り付けて、チューブを２回〜３回反転させることによって穏やかに混合する。
【００６８】
１６．Ｂｉｏｔｒａｃｅ  ＵｎｉＬｉｔｅルミノメーターおよびＳｉｇｍａ生物発光（ＡＴＰアッセイ）試薬を使用して、サンプルについてＡＴＰアッセイを行う。ＡＴＰアッセイは下記のように行われる。
【００６９】
ＡＴＰアッセイ：
１．清浄なＵｎｉＬｉｔｅキュベットに５０μｌのＡＴＰアッセイ混合物を入れる。
【００７０】
２．室温で３分間インキュベーションする。
【００７１】
３．ＵｎｉＬｉｔｅ  ＨｏｌｄＴｉｇｈｔをキュベットに置き、ルミノメーターに入れ、蓋を閉め、そして測定ボタンを押す。１０秒遅れて、装置により、光出力が３５秒間にわたって測定される。
【００７２】
４．アッセイ混合物単独に対するＲＬＵのプリンター出力がスクリーンに表示され、プリンター出力が得られる。これは、アッセイのバックグラウンド読取り値であり、３０ＲＬＵ以下でなければならない。これよりも大きな読取り値は汚染を示す。
【００７３】
５．キュベットをサンプル室から取り出して、１００μｌの溶出液サンプルをキュベットに加える。穏やかに振とうすることによって混合して、キュベットをサンプル室に戻す。
【００７４】
６．サンプル室を閉めて、測定ボタンを押す。光出力がスクリーンに表示され、印字される。
【００７５】
結果
１．初期結果の確認
表５および図８は、アッセイあたり約３０個の酵母細胞（またはろ過されたビールサンプルあたり３００個の細胞）が、本システムを使用して容易に検出され得ることを示している。すなわち、アッセイあたり約３０個の酵母細胞により、非接種のラガービールサンプルから得られたＲＬＵ出力と容易に識別され得るＲＬＵ出力が得られる。
【００７６】
表６および図９は、アッセイあたり３０００個のＡ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ細胞により、バックグラウンドレベルよりも大きな平均光出力が得られることを示している。アッセイの（信頼できる）検出限界は、アッセイあたり１００００個〜２００００個のＡ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ細胞であると考えられる。
【００７７】
表７および図１０は、アッセイあたり１５０個のＰ．ｄａｍｎｏｓｕｓ細胞により、バックグラウンドレベルよりも大きな平均光出力が得られることを示している。アッセイの信頼できる検出限界は、アッセイあたり＞１０００個のＰ．ｄａｍｎｏｓｕｓ細胞であると考えられる。
【００７８】
２．改善されたシステム
表８および図１１は、本発明の第２のデバイスを使用してろ過されたビールにおける少数のラクトバチルス・ブレビスについて検出時間に対するフィルター内濃縮培養の効果を示している。結果は、ろ過後の２４時間のフィルター内濃縮により、本発明の試験およびデバイスを使用して１６０個のＬ．ｂｒｅｖｉｓ細胞の検出が可能であることを示している。ストレスを受けた少数の生物を検出するために、この濃縮段階を３０時間〜４０時間にわたって続けることが望ましい場合がある。
【００７９】
考察
フィルター内の濃縮培養を行うことによって、２４時間のインキュベーションの後、ろ過ビールの１ｍｌあたり約１個のＬ．ｂｒｅｖｉｓ細胞を検出することが可能であった（これは、元のサンプルにおいてアッセイあたり＜１個の細菌細胞に匹敵する）。しかし、ストレスを受けた少数の生物を検出するために、試験を行う前に濃縮を３０時間〜４０時間続けることが、「実際」の状況では薦められる。この結果は、ＡＴＰに基づく現在利用可能な検出システムと少なくとも同じくらい良好であり、そして本システムは、そのようなシステムよりも使用が容易である。さらに、本発明のシステムは、従来の平坦床のメンブレンろ過と比較して、より大きな容量のビールをろ過することができるという利点（およびスタウトビールをろ過する能力）を有する。この結果、増大した検出限界がもたらされる。さらに、本デバイスの設計は、サンプル段階および抽出段階がフィルターデバイスに含まれることを意味しており、ＡＴＰに基づくアッセイがより容易に行われるようにする。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
【表２】
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【００８２】
【表３】
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【００８３】
【表４】
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【００８４】
【表５】
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【００８５】
【表６】
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【００８６】
【表７】
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【００８７】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明による第１のデバイスおよび微生物の検出方法におけるその使用を示す。
【図２】  図２はＡＴＰ標準曲線を示す。Ｙ軸はＲＬＵ（相対的光量ユニット）であり、Ｘ軸はＡＴＰモル量である。黒菱形は１：６２５酵素を示し、黒四角は１：９酵素を示し、黒三角は１：１酵素を示す。
【図３】  図３は、Ｐ．ｄａｍｎｏｓｕｓに対する捕捉濃度曲線を示す。Ｙ軸は総ＲＬＵであり、Ｘ軸は細胞数である。黒菱形は１３７０９９−１に対するものであり、黒四角は０３７０９９−１に対するものである。
【図４】  図４は、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓに対する捕捉標準曲線を示す。Ｙ軸は総ＲＬＵであり、Ｘ軸は細胞数である。黒菱形は２６６０９９−１に対するものであり、黒三角は０９７０９９−１に対するものである。
【図５】  図５は、Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓに対する捕捉濃度曲線を示す。黒菱形は１４７０９９−１に対するものであり、黒丸は０２７０９９−１に対するものである。
【図６】  図６は、本発明による第２のデバイスおよび微生物の検出方法におけるその使用を示す。
【図７】  図７は、端部キャップの断面図およびカラー部の上面図を示す。
【図８】  図８は、第２のデバイスを使用してろ過されたビールサンプルにおけるＳ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓの検出を示す。Ｙ軸はＲＬＵであり、Ｘ軸はアッセイあたりの細胞数である。
【図９】  図９は、第２のデバイスを使用してろ過されたビールサンプルにおけるＡ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓの検出を示す。Ｙ軸はＲＬＵであり、Ｘ軸はアッセイあたりの細胞数である。
【図１０】  図１０は、第２のデバイスを使用してろ過されたビールサンプルにおけるＰ．ｄａｍｎｏｓｕｓの検出を示す。Ｙ軸はＲＬＵであり、Ｘ軸はアッセイあたりの細胞数である。
【図１１】  図１１は、潜伏時間と相対的光量ユニットとの関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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