(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸シーケンスを含む単離した変異体Ｂ型肝炎表面抗原において、Ｂ型肝炎野生型ａｙｗ２株からの変異が、配列番号７の配列に示されるように、位置７１においてイソロイシンがメチオニンの代わりに存在し、位置８６においてリジンがトレオニンの代わりに存在し、位置８８においてグルタミンがプロリンの代わりに存在し、位置１４３においてセリンがロイシンの代わりに存在し、位置１８１においてセリンがロイシンの代わりに存在するように生じる変異体Ｂ型肝炎表面抗原。
【請求項２】
組換え型ホスト内において変異体Ｂ型肝炎表面抗原を発現するための発現ベクターであって、請求項１に記載の変異体Ｂ型肝炎表面抗原をコード化する組換え型遺伝子を含有しているベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＨＢＶの新規な表面変異体に関し、特に、ダウン症候群を有する症候性患者から単離した変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
小形の二重鎖または二本鎖ＤＮＡウイルスであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は無症候保菌者状態、急性の自己限定性肝炎、劇症肝炎、および慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を含む慢性肝臓病のような広範囲の臨床的現象を生じ得る。このウイルスは３１８２個乃至３２２１個の塩基対（ｂｐ）の円形ゲノムを有している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
４種類の主な亜類型（subtypes）が同定されていて、ＨＢＶ表面上の異なるエピトープを認識する抗体により分化できる。ＨＢｓ・Ａｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）粒子は共通の決定因子「ａ」、ならびに、「ｄ」または「ｙ」および「ｗ」または「ｒ」の亜類型決定因子を担持しており、４種類の主な亜類型、すなわち、ａｄｗ，ａｄｒ，ａｙｗおよびａｙｒに分類される。稀な血清において、これら全ての４種類の亜類型決定因子（ａｄｙｗｒ）を含むＨＢｓ・Ａｇ粒子が含有されている。これらの主なＨＢＶ亜類型ａｄｗ，ａｄｒ，ａｙｗおよびａｙｒに対応する抗原性決定因子は表面すなわち「Ｓ」ポリペプチド内に存在している。特に、コドン位置１２２およびコドン位置１６０においてＳ遺伝子によりコード化される２種類のアミノ酸残基がこれらの異なる抗原性亜類型を決定すると考えられてきた。一方、プレＣ（preC）領域がＨＢｅ・Ａｇ陰性を生じる変異を示すことが頻繁に報告されている。このウイルスはそのプレゲノム（pregenomic）ＲＮＡの逆トランスクプターゼによる複製モードにより、その他のＤＮＡウイルスに比較して高い変異速度を示す。この新規な変異体の重要性はワクチン・エスケープ（vaccine escape）およびＨＢｓ・Ａｇ検出不全、公共衛生問題との関わりにおいて反映できる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者はＨＢＶの新規な表面変異体を同定して特徴付けた。この変異体はＨＢｓ・Ａｇおよび同等に長期に持続する抗ＨＢコア（ｃ）ＩｇＭ抗体（Ａｂ）を伴う抗ＨＢｓ・Ａｂ（抗Ｂ型肝炎表面抗体）の両方に対して一定して陽性であることが知られているダウン症候群を有する症候性の患者から単離した。ＨＢｓ・Ａｇに対する６種類のモノクローナル抗体（ｍ・Ａｂ（ｓ））のパネルにより、本発明者は「ａ」決定因子の抗原性の主要エピトープにおける変異の影響を評価した。
【０００５】
【発明の実施の形態】
１９９９年３月にベイルート・メディカル・センターのアメリカン・ユニバーシティに対して黄疸症状を示していたダウン症候群を有する４３才の白人男性の患者からサンプルを採取した。この患者はＨＢＶに対する免疫の経験が無く、輸血、静脈内薬物、ホモセクシュアル、家族のＨＢＶ感染または血液透析を含む感染性の危険因子を有していない。調査中において、この患者は上昇した肝機能検査（ＬＦＴ）結果、すなわち、ＡＬＴ：４５０ＩＵ／Ｌ（範囲１０ＩＵ／Ｌ乃至３５ＩＵ／Ｌ）、ＡＳＴ：２５０ＩＵ／Ｌ（範囲１０ＩＵ／Ｌ乃至４０ＩＵ／Ｌ）、ガンマ−ＧＴ：３８３ＩＵ／Ｌ（範囲１０ＩＵ／Ｌ乃至５０ＩＵ／Ｌ）を有しており、ビリルビン（Bilirubin）は３．８／２．６ｍｇ／ｄＬ（合計／直接値）（範囲、合計：０．１ＩＵ／Ｌ乃至１．２ＩＵ／Ｌおよび直接値：０．０ＩＵ／Ｌ乃至０．２ＩＵ／Ｌ）であることが分かった。さらに重要なことは、本発明者はＨＢＶ血液検査における不調和性を発見したことである。また、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によるＨＢＶマーカー検査結果は、ＨＢｓ・Ａｇ：陽性（＞２／０．０５１）、抗ＨＢｓ・Ａｂ：陽性（０．４１７／０．２０６）、抗ＨＢｃ・ＩｇＭ・Ａｂ：低度の陽性（０．３７１／０．２０８）、抗ＨＢｃ・ＩｇＧ・Ａｂ：高度の陽性（＞２／０．４１２）、ＨＢｅ・Ａｇ：陰性、および抗ＨＢｅ・Ａｂ：陽性（０．１９７／０．８３０、競合検定）であった。抗Ａ型肝炎Ａｂ（抗体）および抗Ｃ型肝炎抗体Ａｂ（抗体）の両方は陰性であった。ＨＢＶマーカーにおける不一致性により、ＨＢＶ抗原（Ａｇ）を確認するために分子法（molecular methods）を使用した。
【０００６】
患者をＬＦＴ検査について継続的に調べて、ＡＳＴ結果：８０ＩＵ／Ｌを含み、後続の１０ヶ月間に渡り一定に減少したことが分かった。しかしながら、初期的な表示の後に１０ヶ月間繰り返して用いられたＨＢＶマーカーはＨＢｓ・Ａｇ：陽性（＞２／０．０５６）（DiaSorin、イタリア国）および抗ＨＢｓ・Ａｂ：陽性（５６／５）（BioMerieux、Mini-Vidas、フランス国）であることを示し、持続して低度の陽性の抗ＨＢｃ・ＩｇＭ・Ａｂ（０．３０３／０．２２１）（DiaSorin、イタリア国）が保たれていることを示した。
【０００７】
実施例１：ＨＢｓ・ＤＮＡの抽出および増殖
グアニジニウム−チオシアネート（ＧｕＳＣＮ）溶解法に基づいて４０μＬのサンプルからＤＮＡを単離して精製した。酸／グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出処理によるＲＮＡ単離の単一工程処理方法を一部変更して採用した。５倍容量の溶解溶液［５．７５モルのＧｕＳＣＮ、５０ミリモルのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ミリモルの２−メルカプトエタノールおよび１５μｇ／ｍＬのポリ（Ａ）］を１倍容量の血清に加えた。短時間の渦混合処理の後に、この混合物を６０℃で１０分間加熱した。その後、イソプロパノール沈降処理によりＤＮＡペレットを得て、７５％エタノールにより洗浄した。さらに、乾燥したＤＮＡペレットを５０μＬのＰＣＲ反応溶液の中にそれぞれ４０マイクロモルの第１回目プライマー（Ｆ１−６およびＲ１−６）と共に再懸濁した。この混合物を９５℃で３分間加熱した後に、サーマル・サイクラー（thermal cycler）（米国、Perkin Elmer社、GeneAmp PCR System 9600）において９４℃／４５秒間、５５℃／４５秒間および７２℃／４５秒間から成る３０回のＰＣＲ工程により処理した。次に、０．５μＬの第１回目ＰＣＲ生成物を、アニーリング温度を６０℃まで上昇させたことを除いて、同一の処理工程から成るＦ１−７およびＲ１３−２ｄの各プライマーによる第２回目ＰＣＲ増殖処理のためのテンプレートとして用いた。予想したような６０４塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ帯域である陽性のＰＣＲ生成物がアガロース・ゲル電気泳動において検出できた。
【０００８】
ＨＢＶ・ＤＮＡ（受け入れ番号（accession number）Ｊ０２２０３）から誘導した上記のＰＣＲプライマー・シーケンス（ヌクレオチド・シーケンス）は以下のようである。
第１回目プライマーの組
Ｆ１−６（２３１乃至２５２）：配列番号１の配列 CCTCACAATACCGCAGAGTCTA
Ｒ１−６（８１６乃至８４２）：配列番号２の配列 AGGGTTTAAATGTATACCCAAAGACAA
第２回目プライマーの組
Ｆ１−７（２４６乃至２６８）：配列番号３の配列 GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTT
Ｒ１３−２ｄ（８２２乃至８４３）：配列番号４の配列 ccgaattcTAGGGTTTAAATGTATACCCA
クローニングの目的でＥｃｏＲ−Ｉ部位をＲ１３−２ｄの５’端部に添加した。
【０００９】
実施例２：シーケンス位置合わせおよび系統分析
増殖したＰＣＲ生成物をＱＩＡクイック・スピン・カラム（Qiagen）により洗浄し、これに続いて、ＤＮＡシーケンスおよび蛋白発現に対応してクローニングした。信頼性の高いＤＮＡシーケンス決定を行なうためにＤＮＡシーケンス用の５種類のクローンを準備した。ABI 377 ＤＮＡ  シーケンサー（米国、PE Applied Biosystems社）においてBigDye Terminator Ready Reaction kit装置（米国、PE Applied Biosystems社）により両方のストランド（鎖）に対応してヌクレオチド・シーケンスを決定した。その後、Lasergeneパッケージ（米国、ウィスコンシン州、マディソンのDNAStar社）のSeqMan 4.00モジュールを用いてシーケンス分析を行なった。さらに、Lasergeneパッケージ（米国、ウィスコンシン州、マディソンのDNAStar社）のMegAlign 4.00モジュールによりシーケンスの位置合わせおよび系統樹の構成を計算処理した。収集した多数個のシーケンス位置合わせ結果をシーケンスの重み付けにおいて用いた。遺伝子型類別処理用の２８個の対照標準株を文献に記載されているシーケンスから誘導した。
【００１０】
実施例３：Ｓ−ＨＢｓ・Ａｇクローニングおよび過渡的蛋白発現
上記のＰＣＲ生成物をＸｂａ−Ｉ／ＥｃｏＲ−Ｉ制限酵素により消化した。５９５個の塩基対フラグメントによりアミノ酸のロイシン（３２）から端部（イソロイシン（２２６））までＳ−ＨＢｓＡｇ蛋白の８６％をコード化した。その後、このフラグメントを予め構成しておいた哺乳類の発現ベクターに結合して、ＣＭＷプロモーターの下流側に配置されていた野生型ａｙｗ・Ｓ−ＨＢｓ・Ａｇフラグメントと置き換えた。次に、LIPOFECTAMINE Plus試薬（米国、メリーランド州のLife technologies社）を用いてＣＯＳ−７細胞系についてトランスフェクションを行なった。その後、ＣＯＳ−７細胞感染により分泌した変異体Ｓ−ＨＢｓ・Ａｇを含有している培養液の上澄み液を収集して、新鮮な培地をトランスフェクション後の７２時間おきに加えた。野生型ａｙｗ（ｗｔ（ａｙｗ））・Ｓ−ＨＢｓ・Ａｇ（GeneBank受け入れ番号Ｊ０２２０３）もまた対照として使用するために発現した。
【００１１】
実施例４：組換え型ＨＢｓ・Ａｇ抗原免疫測定およびエピトープ分析
組換え型ｗｔ（ａｙｗ）およびＬＢＮ変異体Ｓ−ＨＢｓ・Ａｇの発現をサンドイッチ形式における固相ＥＩＡ（酵素免疫測定）により決定した。１種類のポリクローナル抗体および６種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））のパネルを用いてこの調査を行なった。これらはヤギの抗ＨＢｓ・Ａｇ（ａｙ／ａｄ）（米国、マサチューセッツ州、フィッツジェラルド社）、ＨＢ−１、ＨＢ−８、ＨＢ−９、ＨＢ−１３、ＨＢ−１４およびＨＢ−１６である。６種類全てのモノクローナル抗体ｍＡｂ（ｓ）を血清誘導した野生型のＨＢｓ・Ａｇに対応して培養し、これらはａｄおよびａｙの両方の亜類型に対して反応性を有していた。ＥＩＡ（酵素免疫測定）により血清および組換え型ＨＢｓ・Ａｇの反応性を測定した。基本的に、精製したモノクローナル抗体ｍＡｂ（ｓ）またはポリクローナル抗ＨＢｓ・Ａｇをマイクロタイター・プレート上に塗布して使用時まで４℃に維持した。酵素免疫測定（ＥＩＡ）を行なう前に、各プレートをＢＳＡを含有するＰＢＳにより２５℃で２時間遮断した。さらに、５０μＬのＨＲＰ接合体の各モノクローナル抗体と混合した１５０μＬのサンプル（血清または希釈した組換え型ＨＢｓ・Ａｇ培養体）により抗体酵素免疫測定（ＥＩＡ）を１工程のサンドイッチ形式で行なった。各プレートを３７℃で９０分インキュベートした後に、０．００５％のTween 20を含有するＰＢＳにより６回洗浄した。次に、２００μＬのＯＰＤ溶液（米国、シグマ社）を伴う３０分間の最終的なインキュベーションにより各プレートを現像した。その後、５０μＬの４規定（４Ｎ）硫酸により着色現像を停止した。この吸光度を自動マイクロタイター・プレート読取装置（米国、Molecular Devices社）上で読み取り、これらの結果を４９０ｎｍ（ナノメートル）における光学密度（ＯＤ）として表現した。未変性または原生のＨＢｓ・Ａｇおよび合成ペプチドに対する各モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の反応性を評価するために、直接酵素免疫測定（direct EIA）法を行なった。すなわち、精製して量的に調節した各モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の一連の希釈物をプレート上でインキュベートし、これらの各プレートは精製した未変性のＨＢｓ・Ａｇまたは酸化処理したペプチドにより予め塗布していた。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合したラビット抗マウスＩｇＧを伴う次のインキュベーションにより結合したマウスＩｇＧを検出した。この反応性を酵素触媒化ＯＰＤ着色現像処理により確認した。組換え型変異体および野生型Ｓ−ＨＢｓ・Ａｇもウエスタン免疫ブロット法により分析した。ＨＢｓ・Ａｇの培養液の上澄み液を遠心フィルター（米国、Millipore社、Biomax-100）により１５倍に濃縮した。この濃縮物をNuPAGE１０％ビス−トリスＳＤＳゲル（米国、サンデイエゴ、Novex社）上で展開した後に、ニトロセルロース膜に移した。移した蛋白をＨＢｓ・Ａｇモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により免疫ブロット処理した。この結合は免疫ブロット・システム（米国、BioRad, GAM-AP社）を用いて検出した。
【００１２】
実施例５：ＨＢｓ変異体ＤＮＡシーケンスおよびアミノ酸シーケンスの分析
新規なLebanese（ＬＢＮ）変異体のＨＢｓ・ＤＮＡシーケンスを遺伝子型について分析した。変異体のＨＢｓ・ＤＮＡシーケンスとその他の２８種類の特定のＨＢｓ遺伝子型株との間のシーケンス比較によりこの変異体ＨＢｓを遺伝子型Ｄ群に分類した（図１）。この患者の血清についての血清学的な型の類別は行なわなかったが、このＨＢｓ変異体のアミノ酸シーケンスはａｙｗ２・ＨＢｓ亜類型に対して最も高い相同性を示した。５種類の全てのクローン体において上記ＬＢＮ変異体の位置３２乃至位置２２６内における５種類のアミノ酸変異が見られた。これらは、位置１０３のＭ（メチオニン）（ＡＴＧ）→Ｉ（イソロイシン）（ＡＴＴ）、位置１１８のＴ（トレオニン）（ＡＣＧ）→Ｋ（リジン）（ＡＡＧ）、位置１２０のＰ（プロリン）（ＣＣＡ）→Ｑ（グルタミン）（ＣＡＡ）、位置１７５のＬ（ロイシン）（ＴＴＡ）→Ｓ（セリン）（ＴＣＡ）および位置２１３Ｌ（ロイシン）（ＴＴＡ）→Ｓ（セリン）（ＴＣＡ）である。アミノ酸位置１２２においては、３種類のクローン体がＡｒｇ（アルギニン）（ＡＧＡ）のシーケンスを有していたが、２種類のクローン体はＬｙｓ（リジン）（ＡＡＡ）のシーケンスを有していた。組換え型ＬＢＮのＨＢｓ・Ａｇ発現においては、Ａｒｇ（アルギニン）（位置１２２）を有するシーケンスを用いた。
102 - 110 - 120 - 130 - 140 - 150
配列番号５の配列
wt(ayw2) GMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCI
配列番号６の配列
LBN -I--------------K-Q------------------------------
【００１３】
野生型ＨＢｓ・Ａｇのコンセンサス・シーケンス（共通配列）を遺伝子型Ｄ群の別の３種類の株（X02496、M32138およびS7）から誘導した。太字は「ａ」決定因子領域を示している（Stirk HJ、Thornton JM、Howard CRの「Ｂ型肝炎の表面抗原に対応するトポロジカル・モデル（A topological model for hepatitis B surface antigen）」（Intervirology、１９９２年、３３（３）、第１４８頁乃至第１５８頁））。
【００１４】
実施例６：ＣＯＳ−７細胞における組換え型ＨＢｓ・Ａｇの過渡的発現
分泌した組換え型ＨＢｓ・Ａｇ発現は精製した野生型の組換え型ＨＢｓ・Ａｇで換算して０．１ｍｇ／リットル乃至０．２ｍｇ／リットルの範囲内であった。培養液の上澄み液内の分泌したＨＢｓ・Ａｇのみの発現について調べた。この結果、７２時間および１４４時間の各時点における発現量において有意差はなかった。７２時間および１４４時間において収集した上澄み液に比較して２１６時間において収集した培養液の上澄み液は１／５のみの発現したＨＢｓ・Ａｇを示した。
【００１５】
実施例７：免疫反応性の分析
組換え型ＨＢｓ・Ａｇ（ａｙｗ）および新規な変異体ＨＢｓ・Ａｇ（ＬＢＮ）の各培養液の上澄み液を６種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））から成るパネルによりそれぞれの反応性について調べた。各培養液の上澄み液を１：４０または４０倍に希釈して同量の抗原濃度を確保した。この結果、各アミノ酸変異体は野生型（ｗｔ）ＨＢｓ・Ａｇに対する４種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））の結合親和性に明らかに影響を及ぼした。ＨＢ−１６が最も影響を受けて、約９０％の結合強度が失われた。一方、予想外に、２種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））、すなわち、ＨＢ−１３およびＨＢ−１４のＬＢＮ変異体に対する結合強度は５倍乃至６倍に有意差をもって増加した。ペプチド・マッピングにより、上記の２種類の抗体が最初のループ領域内の線形シーケンスに対して特異的であり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＨＢ−９は第２のループ領域に配置されている位置１３７乃至位置１４７のシーケンスに対して特異的であることが分かった。さらにＨＢ−１，ＨＢ−８およびＨＢ−１６の３種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））は全て一致した特異性を示した。これらは免疫ブロット処理においてＳＤＳ変性したＨＢｓ・Ａｇに対して反応しないが、直接酵素免疫測定（ＥＩＡ）において比較的高い希釈タイター（滴定量または力価）を示した。一方、モノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））のＨＢ−１３およびＨＢ−１４は野生型およびＬＢＮ型の両方のＨＢｓ・Ａｇに対して良好にブロットされ、これら２種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ｓ））が変異部位に関係なく変性した各エピトープを認識していることを示した。
【表１】
0004772199.tif 000002
【表２】
0004772199.tif 000003
【００１６】
本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）組換え型ホスト内において変異体Ｂ型肝炎表面抗原を発現するための発現ベクターであって、請求項１に記載の変異体Ｂ型肝炎表面抗原をコード化する組換え型遺伝子を含有しているベクター。
（２）請求項１に記載の変異体Ｂ型肝炎表面抗原に対応して培養したモノクローナル抗体。
（３）実施態様（２）のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系。
（４）Ｂ型肝炎表面抗原に対して特異的に結合する少なくとも１種類のモノクローナル抗体を含有するコンテナを備えている検査サンプル中のＢ型肝炎の存在を決定するための検定装置であって、前記モノクローナル抗体が実施態様（３）に記載のハイブリドーマ細胞系により分泌されたモノクローナル抗体である装置。
【００１７】
【発明の効果】
従って、本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ・Ａｇ）の新規な表面変異体が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＢｓ・Ａｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）ゲノムの系統樹および受け入れ番号（accession numbers）を示す図である。一連のＳ１株乃至Ｓ１３株を文献（Norder H、Hammas B、Lofdahl S、Courouce AM、およびMagnius LOの「Ｂ型肝炎の９種類の異なる血清型のアミノ酸シーケンスの比較および対応するＢ型肝炎ウイルス株のゲノム分類」（J Gen Virol.１９９２年５月、７３（第５部）、第１２０１頁乃至第１２０８頁）に基づいて入手した。
GenBank受け入れ番号を残りの各株に対して記載した。
【図１】
0004772199.tif 000004