(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号６のアミノ酸配列；ならびに
ｂ．配列番号６に対する同一性が、配列番号６の少なくとも６９アミノ酸について少なくとも９０％であるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、
ＴＨＰ−１細胞において、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションするか、または形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションする活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は配列番号６に対する同一性が、配列番号６の少なくとも６９アミノ酸について少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は配列番号６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションする活性を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションする活性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
自然状態で鳥類の卵の卵白および卵黄の両方に存在するタンパク質であって、以下の同定特徴：
ａ．水溶性であること；
ｂ．非ステロイド性であること；
ｃ．ｐＨ７．５の緩衝剤において負荷電であること；
ｄ．実質的に非極性であること；
ｅ．λmaxを２５４ｎｍに有すること；
ｆ．８，８３９Ｄａの分子量を有すること；
ｇ．少なくとも５０℃までの温度で安定であること；および
ｈ．２から１０までのｐＨで安定であること；
を含み、ＴＨＰ−１細胞において、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションするか、または形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションする活性を有することを特徴とする、前記タンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションする活性を有することを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションする活性を有することを特徴とする、請求項６または７に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載されるタンパク質に選択的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載されるタンパク質を含む組成物。
【請求項１１】
請求項６〜８のいずれか１項に記載されるタンパク質を含む組成物。
【請求項１２】
動物における免疫応答を調節するためのものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
動物におけるガンを処置するためのものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
動物における免疫応答を調節するためのものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
動物におけるガンを処置するためのものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
薬剤として許容される担体を含む、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記薬剤として許容される担体は、
ａ．前記タンパク質について富化されるように選択される過免疫卵生成物；および
ｂ．過免疫卵生成物の少なくとも１つの分画成分を用いて製造された食品生成物であって、前記分画成分が、前記過免疫卵生成物と比較して富化量の前記タンパク質を含む食品生成物
からなる群から選択される食品生成物であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記薬剤として許容される担体は、前記過免疫卵生成物と比較して、富化量の前記タンパク質を含有する過免疫卵生成物の１つの分画成分を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記分画成分は、液状の卵黄、液状の卵白、粉末化卵黄、粉末化卵白、および前記過免疫卵生成物の水溶性分画成分からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、液体、エアロゾル剤、カプセル剤、錠剤、ピル剤、粉末剤、ゲル剤および顆粒剤からなる群から選択される形態にあることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記薬剤として許容される担体は制御放出配合物を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記薬剤として許容される担体は、水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性の生理学的に平衡化された溶液、オイル、エステル、グリコール、生体適合性ポリマー、ポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポ球体、細胞および細胞膜からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、前記タンパク質が前記動物の体重１ｋｇあたり１ナノグラムから４００ミリグラムの用量で投与されるものであることを特徴とする、請求項１０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、吸入、カテーテルの注入、坐薬による投与、および組織内への直接的な注入からなる群から選択される経路で投与されるものであることを特徴とする、請求項１０〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、前記タンパク質を含有する食品生成物を含むことを特徴とする、請求項１０〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記動物の細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションさせるための、請求項１３または１５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記動物の細胞による形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションさせるための、請求項１３または１５に記載の組成物。
【請求項２８】
動物が哺乳動物であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、前記ガン組織内または前記ガンに隣接する組織内への直接的な注入によって投与されるものであることを特徴とする、請求項１３または１５に記載の組成物。
【請求項３０】
ガン症状の軽減、ガンに関連する腫瘍の減少、ガンに関連する腫瘍の除去、転移ガンの防止、ガンの防止、およびガンに対するエフェクター細胞免疫性の刺激からなる群から選択される結果を得るための、請求項１３または１５に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項３２】
配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１または３２に示される核酸分子を含むことを特徴とする組換え核酸分子。
【請求項３４】
請求項３１または３２に示される核酸分子を含み、前記核酸分子を発現することを特徴とする組換え細胞。
【請求項３５】
請求項３１または３２に示される核酸分子を含むことを特徴とする組換えウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
補酵素、補助因子およびビタミンなどの生物学的因子は、様々な生物学的変換プロセスにおいて重要な役割を果たしている。そのような因子は、通常、すべての細胞において少ない量で産生されている（１×１０-5〜１×１０-6）。しかし、正常な細胞からそのような生物学的因子の単離および精製を行うことは困難なことである。
【０００２】
過免疫化された卵が開発されており、そのような卵では、抗体およびある種の生物学的因子が過剰に産生されていることが示されている。過免疫化は、多価の細菌抗原を標的動物に注入することによって行われるので、これらの過免疫化動物に由来する卵に見出される生物学的因子の量を１桁以上増大させることができない。従って、過免疫化された卵における生物学的因子の量が少ないことは、生物学的因子の精製を困難にする。そのため、そのような生物学的因子の単離、精製、またはそれ以外にはそのような生物学的因子の製造を行うための効率的なプロセスが求められている。
【０００３】
正常な免疫系は、前炎症性および抗炎症性の細胞および分子が、宿主組織の破壊を伴うことなく、宿主の正常な免疫防御を促進するために慎重に調節されている釣り合った状態にある。この慎重な調節のバランスが乱れた場合、非特異的な刺激および活性化により、強力な破壊能を有する免疫学的分子および炎症性分子の産生量および放出量が増大され得る。したがって、前炎症性サイトカインの過剰な産生または誤った生物学的関係におけるサイトカインの産生は、特にマラリア、敗血症、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、ガンおよびＡＩＤＳなどの広範囲の疾患における死亡および病理学と関連している。
【０００４】
サイトカインは、特定の細胞受容体に結合することによってオートクリン／パラクリン様式で作用する多能性ポリペプチドである。サイトカインの分泌は、免疫応答の継続時間および強度を決定することにおいて重要である。例えば、マウスでは、異なるサブセットのＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）クローンはＴｈ１およびＴｈ２サイトカインと慣行的に記載されるものを分泌する。Ｔｈ１細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を産生し、細胞性免疫応答を促進する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を産生し、免疫グロブリン分泌細胞の活性化を助ける。炎症プロセスのときに、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインが炎症部位に放出される。これらのサイトカインは多形質発現性作用を有し、炎症に関連する広範囲の症状を媒介している。
【０００５】
重要なサイトカインであるＴＮＦ−α（これはまたカケクチンとしても知られている）は、１５７アミノ酸から構成され、単球および活性化されたマクロファージによって主に産生される１７キロダルトンのタンパク質である。ＴＮＦ−αは、ほとんどの主要な器官系について様々な生理学的作用だけでなく、殺腫瘍活性を有することが示されている。中枢神経系において、ＴＮＦ−αは、発熱、食欲不振、および下垂体ホルモン放出における変化に関わっている。心臓血管系では、ＴＮＦ−αは、ショック、急性呼吸窮迫症候群および毛細管漏出症候群（凝血促進）における役割を果たしている。ＴＮＦ−αは、腎臓における急性尿細管壊死および腎炎、ならびに胃腸管系における虚血、大腸炎および肝臓壊死のプロセスに寄与している。ＴＮＦ−αはまた、炎症プロセスに関与する重要なサイトカインでもある。
【０００６】
ニワトリ（ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、七面鳥およびアヒルなどの鳥綱の様々な属は、トリに病気を引き起こす免疫原に対して、そしてまた他の免疫原に対しても、抗体を血液および卵に産生する。例えば、ＬｅＢａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ他（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：６８３（９７４））およびＬｅｓｌｉｅ，Ｇ．Ａ．他（Ｊ．Ｍｅｄ．、１３０：１３３７（１９６９））はニワトリの免疫グロブリンを定量的に分析している。Ｐｏｌｓｏｎ他（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、９：４９５〜５１４（１９８０））は、いくつかのタンパク質に対して、そしてタンパク質の天然の混合物に対して雌鳥を免疫化して、ＩｇＹ抗体を卵黄に検出した。Ｆｅｒｔｅｌ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１０２：１０２８：１０３３（１９８１））は、プロスタグランジンで雌鳥を免疫化して、抗体を卵黄に検出した。Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ他（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４６：６３〜６８（１９８１））は、免疫診断で使用される卵黄ＩｇＧを単離する方法を提供している。Ｐｏｌｓｏｎ他（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、９：４７５〜４９３（１９８０））は、様々な植物ウイルスで免疫化された雌鳥の卵黄から単離された抗体を記載している。
【０００７】
米国特許第４，３５７，２７２号には、過免疫化された雌鳥に由来する卵の卵黄から抗体を単離することが開示されている。抗体応答が、植物ウイルス、ヒトＩｇＧ、破傷風抗毒素、抗蛇毒素およびセラメバ（Ｓｅｒａｍｅｂａ）に由来する免疫原を反復的に注射することによって誘発された。
【０００８】
米国特許第４，５５０，０１９号には、少なくとも３０，０００の分子量または粒子重量を有する免疫原による過免疫化によって雌鳥に生じた抗体を卵黄から単離することが開示されている。ニワトリを過免疫化するために使用された免疫原は、植物ウイルス、ヒト免疫グロブリン、破傷風毒素および蛇毒の中から選択された。
【０００９】
米国特許第４，７４８，０１８号には、対応する抗原に対して免疫化されたトリの卵から得られた精製抗体を非経口投与することを含む哺乳動物の受動免疫方法が開示されている。この方法で、哺乳動物は、卵に対する免疫性を獲得した。
【００１０】
米国特許第５，７７２，９９９号（これはＤＣＶ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓに帰属する）には、過免疫化された卵および／またはミルクまたはその分画成分を対象体に投与することによる対象体における慢性胃腸障害または非ステロイド抗炎症薬誘導（ＮＳＡＩＤ誘導）胃腸損傷の防止方法、処置方法または軽減方法が記載されている。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、対象動物（特に、哺乳動物）に投与されたとき、そのような対象動物におけるサイトカインの産生を活性化する特異的な免疫調節活性が、卵に、特に、過免疫化された動物から得られた卵に存在するという本発明者らの発見に基づく。
【００１２】
より詳細には、本発明は、トリの卵から得ることができる高度に精製されたサイトカイン活性化因子に関する。このサイトカイン活性化因子は、卵黄および卵白の両方から単離された分画成分から高度に精製することができる。このサイトカイン活性化因子はまた、組換えまたは化学合成で製造することができる。
【００１３】
本発明の１つの実施形態は、単離されたサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパク質に関する。そのようなタンパク質は、（ａ）配列番号１および配列番号６の群から選択されるアミノ酸配列；ならびに（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの少なくとも９個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の単離されたＣＡＦタンパク質は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションし、かつ／または形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションする。好ましい実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの少なくとも約１５個の連続したアミノ酸残基、より好ましくは（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの少なくとも約２０個の連続したアミノ酸残基、さらにより好ましくは（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの少なくとも約２５個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、配列番号６の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、（ａ）のアミノ酸配列に対する同一性が（ａ）のアミノ酸配列の少なくとも１５アミノ酸について少なくとも約６５％であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明のタンパク質は、（ａ）のアミノ酸配列に対する同一性が（ａ）のアミノ酸配列の少なくとも１５アミノ酸について少なくとも約７５％であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、配列番号６に対する同一性が配列番号６の６６アミノ酸について少なくとも約６０％であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、本発明のタンパク質は、配列番号１および配列番号６の群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列に高ストリンジェンシーの条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされる。最も好ましい実施形態において、本発明の単離されたＣＦＡタンパク質は、配列番号１および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明の単離されたＣＦＡタンパク質は、１つまたは複数の下記の生物学的特徴を有する：（ａ）３０００ＭＷカットオフフィルターを通過する少なくとも１つの生物学的に活性なサブユニットを有すること；（ｂ）少なくとも約５０℃までの温度で安定であること；（ｃ）約２から約１０までのｐＨで安定であること；（ｄ）水溶性であること；（ｅ）非ステロイド性であること；（ｆ）負荷電であること；（ｇ）実質的に非極性であること；および／または（ｈ）λmaxを約２５４ｎｍに有すること。本発明の単離されたタンパク質は、経口投与されたときに生物学的に活性である。本発明の単離されたタンパク質は、自然状態で鳥類の卵の卵白および卵黄の両方に存在する。上記に議論されているように、本発明の単離されたＣＡＦタンパク質は、好ましくは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションする。１つの実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションする。
【００１６】
本発明の１つの実施形態は、本発明の単離されたＣＦＡタンパク質に選択的に結合する単離された抗体に関する。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態は組成物に関する。そのような組成物は、下記に記載されているように、薬剤として許容される担体と、本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパク質とを含む。１つの実施形態において、薬剤として許容される担体は、下記の（ａ）および（ｂ）からなる群から選択される食品生成物である：（ａ）ＣＡＦタンパク質について富化されるように選択される過免疫卵生成物；および（ｂ）過免疫卵生成物の少なくとも１つの分画成分を用いて製造された食品生成物であって、前記分画成分が、過免疫卵生成物と比較して富化量のＣＡＦタンパク質を含む食品生成物。好ましくは、薬剤として許容される担体は、過免疫卵生成物と比較して、富化量のＣＡＦタンパク質を含有する過免疫卵生成物の分画成分の１つを含む。過免疫卵生成物の好ましい分画成分には、液状の卵黄、液状の卵白、粉末化卵黄、粉末化卵白、および過免疫卵生成物の水溶性分画成分が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、液体、エアロゾル剤、カプセル剤、錠剤、ピル剤、粉末剤、ゲル剤および顆粒剤からなる群から選択される形態にある。別の実施形態において、薬剤として許容される担体は制御放出配合物を含む。さらに別の実施形態において、薬剤として許容される担体は、水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性の生理学的に平衡化された溶液、オイル、エステル、グリコール、生体適合性ポリマー、ポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポ球体、細胞および細胞膜からなる群から選択される。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、動物における免疫応答を調節するための方法に関する。そのような方法は、本明細書中前記に示されているように本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパク質を含む組成物を動物に投与するステップを含む。好ましくは、組成物は、薬剤として許容される担体を含む。１つの実施形態において、組成物は、ＣＡＦタンパク質が動物の体重１ｋｇあたり約１ナノグラムから約４００ミリグラムの用量で投与される。好ましい投与経路には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、吸入、カテーテルの注入、坐薬による投与、および組織内への直接的な注入が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、組成物は、ＣＡＦタンパク質を含有する食品生成物を含む。好ましい実施形態において、動物は哺乳動物である。
【００２０】
好ましくは、本発明の組成物を投与することによって、動物の細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現がアップレギュレーションされる。１つの局面において、本発明の組成物を投与することによって、動物の細胞による形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現がダウンレギュレーションされる。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、動物におけるガンを処置する方法に関する。そのような方法は、本明細書中前記に示されているように本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパク質を含む組成物を、ガンを有する動物またはガンを発症する危険性を有する動物に投与するステップを含む。好ましくは、組成物は、ＣＡＦタンパク質が動物の体重１ｋｇあたり約１ナノグラムから約４００ミリグラムの用量で投与される。好ましい投与経路には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、吸入、カテーテルの注入、坐薬による投与、およびガン組織内またはガン隣接組織内への直接的な注入が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、組成物は、ＣＡＦタンパク質を含有する食品生成物を含む。
【００２２】
好ましくは、本発明の組成物を投与することによって、ガン症状の軽減、ガンに関連する腫瘍の減少、ガンに関連する腫瘍の除去、転移ガンの防止、ガンの防止、およびガンに対するエフェクター細胞免疫性の刺激からなる群から選択される結果がもたらされる。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態は、単離された核酸分子に関する。そのような核酸分子は、（ａ）（ｉ）配列番号１および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列；および（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列の少なくとも９個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ鎖配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｂ）（ａ）の核酸配列に対して完全に相補的である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。好ましくは、（ａ）の核酸配列によってコードされるタンパク質は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーションする。好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号１および配列番号６の群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【００２４】
本発明の１つの実施形態は、本明細書中前記に示されているように本発明の単離された核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中前記に示されているように本発明の単離された核酸分子を含む組換え細胞で、その核酸分子を発現する組換え細胞に関する。本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中前記に示されているように本発明の単離された核酸分子に関する。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般には、新規なサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）、サイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）を含む組成物、およびそのような組成物を使用して免疫系を調節するための方法に関する。本発明の組成物は、組換え製造されたＣＡＦ、合成的に（すなわち、化学的に）製造されたＣＡＦ、または精製されたＣＡＦを含む組成物を含むことができ、かつ／あるいは、本発明の組成物は、ＣＡＦを含有する天然の食品生成物であり得るし、好ましくは、選択プロセスまたは富化分画成分の製造などによってＣＡＦの存在が富化された天然の食品生成物またはその分画成分を含む。そのような天然の食品生成物には、ＣＡＦが富化された過免疫卵生成物の分画成分を含む過免疫卵生成物が含まれる。本発明者らは、新規なタンパク質であるＣＡＦが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の発現をアップレギュレーションし、形質転換増殖因子（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションすることを発見した。したがって、本発明のＣＡＦタンパク質は、一般には、これらのサイトカインの発現、およびこれらのサイトカインを産生する細胞、またはこれらのサイトカインにより影響を受ける細胞を調節することによって免疫系を調節（すなわち、調整）するために使用することができる。さらに、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６は典型的には前炎症性サイトカインであると見なされているために、そしてＴＧＦβは典型的には抗炎症性サイトカインであると見なされているために、本発明のＣＡＦタンパク質は、免疫応答の刺激、および前炎症性サイトカインに応答する細胞の刺激が望ましい状態（細菌感染、敗血症およびガンが含まれるが、これらに限定されない）を処置するのに有用である。
【００２６】
本発明のＣＡＦは、過免疫化された卵の生成物で産生される成分であると、本発明者らによって最初に発見された。免疫応答を誘導し、かつ本発明のサイトカイン活性化因子を含有する過免疫卵生成物を製造するために、卵産生動物に、好ましくは注射によって投与される好ましい免疫原混合物は、特定のサイトカインを活性化することによって、または特定のサイトカインを誘導する因子の産生を誘導することによって免疫系を調節することが知られている特定の免疫原を含有することを必要としない。したがって、そのようなサイトカイン活性化因子が、対象体に投与されたときに免疫系を調節することにおいて効果的であることが予想される混合抗原ワクチンに対して免疫化された動物から得られる過免疫卵生成物に見出されることは驚くべきことである。さらに、本発明以前には、卵産生動物の過免疫化が、動物におけるサイトカイン産生および免疫系の細胞分化を調節し得る性質を有する本発明の新規なサイトカイン活性化因子の産生をもたらすことは知られていなかった。本発明者らが知る限り、本発明以前には、本明細書中に記載されているサイトカイン活性化因子は同定、精製、特徴付けまたは配列決定が行われていなかった。
【００２７】
本発明のサイトカイン活性化因子は、限外濾過、Ｑセファロースイオン交換クロマトグラフィ、固相抽出、分配抽出および逆相Ｃ18ＨＰＬＣの技術を使用して卵から分離され、高度に精製され得る（実施例１を参照のこと）。分析的ＨＰＬＣ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン発現研究、およびバイオアッセイデータはすべて、生物学的に活性なサイトカイン活性化因子が精製されたことを明らかにしている。さらに、本明細書中に記載されているように、サイトカイン活性化因子は、本明細書中に提供された配列情報を使用して単離し、クローン化して、組換え的に製造することができ、あるいは合成的に製造することができる。
【００２８】
（定義）
下記の定義は、別途示されていない限り、本明細書中に適用される：
用語「過免疫化」は、自然の予想されない状態を越えて免疫応答が上昇し、かつ維持されるように１つまたは複数の免疫原（例えば、抗原）にさらされることを意味する。
【００２９】
用語「免疫原」は、免疫学的寛容性ではなく、体液性抗体応答および／または細胞媒介免疫応答を誘導し得る物質を意味する。この用語は、免疫応答を刺激し、そしてまたその生成物（例えば、抗体）と反応する能力を意味する。
【００３０】
用語「コンビナトリアル的誘導免疫原」は、コンビナトリアル合成のために免疫原における分子的多様性が生じるプロセスをいう。
【００３１】
用語「生物工学的免疫原」は、遺伝子クローニング技術および遺伝子操作または化学合成のプロセスによって得られる免疫原をいう。
【００３２】
用語「遺伝子ワクチン」は、一般には組換え技術により作製され、かつ免疫応答を誘発し得る核酸ワクチンをいう。
【００３３】
用語「卵」または用語「卵生成物」はそれぞれ、任意の全卵（テーブル、過免疫化またはその他の方法による）あるいはそれに由来する任意の生成物または分画成分を意味する。
【００３４】
用語「テーブル卵」または用語「テーブル卵生成物」はそれぞれ、過免疫状態に維持されていない卵産生動物から得られた任意の全卵あるいはそれに由来する任意の生成物または分画成分を意味する。
【００３５】
用語「過免疫卵」または用語「過免疫卵生成物」はそれぞれ、過免疫状態に維持されている卵産生動物から得られた任意の全卵あるいはそれに由来する任意の生成物または分画成分を意味する。
【００３６】
用語「正常域を越えたレベル」は、過免疫状態に維持されていない卵産生動物の卵に見出されるレベルを超えるレベルを意味する。
【００３７】
用語「免疫調節卵」は、本明細書中に開示されているサイトカイン活性化因子を含有する卵または卵分画成分を意味する。
【００３８】
用語「免疫応答」は、一般には、細胞媒介免疫応答もしくは細胞免疫応答（すなわち、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびマクロファージを含む免疫系の細胞によって媒介される免疫応答）および／または体液性免疫応答（すなわち、抗体によって媒介される免疫応答）をいう。
【００３９】
用語「動物」は、動物界の任意の種をいう。本発明に従って免疫化される好ましい動物には、ニワトリ、七面鳥およびアヒル（これらに限定されない）を含む鳥綱の脊椎動物の任意の動物が含まれる。本発明に従って処置される好ましい動物には、鳥綱および哺乳綱（霊長類、齧歯類、家畜および飼育ペット（これらに限定されない）を含む）の脊椎動物の任意の動物が含まれる。家畜には、消費される哺乳動物または有用な生成物をもたらす哺乳動物（例えば、羊毛生産用のヒツジ）が含まれる。疾患または状態から保護される好ましい哺乳動物には、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが含まれるが、ヒトが特に好ましい。
【００４０】
用語「標的動物」は、卵産生動物として機能する動物をいう。
【００４１】
用語「対象動物」は、精製されたＣＡＦ、合成的に製造されたＣＡＦ、組換え的に製造されたＣＡＦ、あるいは標的動物により産生されたＣＡＦ富化卵またはＣＡＦ富化卵生成物を含む本発明のＣＡＦ含有組成物が投与される動物をいう。対象動物は患者としても参照され得る。
【００４２】
用語「サイトカイン活性化因子」または用語「ＣＡＦ」は、（卵の分画成分として、半精製されたタンパク質として、高度に精製されたタンパク質として、組換えタンパク質として、または化学合成されたタンパク質として）精製度の任意の段階にある本発明の因子で、サイトカイン活性化因子について本明細書中に記載されている生化学的、物理的、構造的および／または機能的な特徴（例えば、生物学的活性）を有する本発明の因子を示すために一般に使用されている。本発明による高度に精製されたＣＡＦが「ＣＡＦｂ」として参照され得ることには留意すること（実施例１を参照のこと）。
【００４３】
用語「高純度のサイトカイン活性化因子」または用語「高純度ＣＡＦ」は、ＣＡＦｂについて実施例１に記載されている純度を少なくとも有するサイトカイン活性化因子を意味する。
【００４４】
用語「サイトカイン活性化因子富化（された）」または用語「ＣＡＦ富化（された）」生成物または組成物は、精製段階、処理段階および／または製造段階の前の生成物または組成物におけるサイトカイン活性化因子のレベルと比較して、より大きなレベルのサイトカイン活性化因子が、富化された生成物または最終的な生成物に含有するように精製され、処理され、かつ／または製造された生成物または組成物をいう。したがって、１つの実施形態において、ＣＡＦは最初の生成物または組成物に存在し、精製、処理および／または製造の各段階は、生成物または組成物におけるＣＡＦの量が、最初の生成物からいくつかの成分の量を除くか、または低下させることによって、生成物または組成物におけるそれ以外の成分に対して増大している。別の実施形態において、最初の生成物または組成物は、ＣＡＦを含有しないか、または最初の量のＣＡＦを含有するかのいずれかであり、ＣＡＦ富化された生成物または組成物は、精製されたＣＡＦ、組換え的に製造されたＣＡＦまたは合成的に製造されたＣＡＦを最初の生成物または組成物に加えることによって製造される。そのようなＣＡＦ富化組成物は、下記においてより詳しく議論されている。ＣＡＦについて組成物または生成物を富化する別の方法は当業者には明かである。
【００４５】
用語「単離（された）」は、化合物（例えば、本発明のタンパク質または核酸分子）に関して、その自然の環境から取り出されている（すなわち、人の操作にさらされている）化合物をいう。そのため、「単離（された）」は、化合物が精製されている程度を反映していない。
【００４６】
用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と交換可能に使用され得るが、後者は典型的には、実質的に線状の二次構造を有する比較的小さいタンパク質を示すために使用される。用語「タンパク質」または用語「ポリペプチド」には、全長のタンパク質、融合タンパク質、またはそのようなタンパク質の任意のホモログが含まれる。
【００４７】
用語「ＣＡＦタンパク質のホモログ」（すなわち、「ＣＡＦホモログ」）には、少なくとも１個または数個（１個または数個に限定されない）のアミノ酸の欠失（例えば、ペプチドまたはフラグメントなどのタンパク質の短縮化体）、挿入、反転、置換および／または誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトール付加による）を有するＣＡＦタンパク質が含まれる。好ましくは、ＣＡＦホモログはＣＡＦの生物学的活性を有する。
【００４８】
用語「生物学的に活性」または用語「生物学的活性」は、本発明のＣＡＦタンパク質に関して、ＣＡＦタンパク質の任意の機能的活性、典型的には、天然に存在するＣＡＦタンパク質の機能的活性をいう。特に、ＣＡＦタンパク質の生物学的活性に対する参照は、好ましくは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）を誘導するサイトカインの発現をアップレギュレーション（誘導、刺激、増強、増大）するＣＡＦタンパク質の能力が参照される。本明細書中に詳しく記載されているように、天然に存在するＣＡＦにより、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のそれぞれの発現がアップレギュレーションされ得ることは注目される。ＣＡＦの生物学的活性はまた、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーション（阻害、低下、抑制）する能力を誘導することができる。ＣＡＦタンパク質の生物学的活性にはまた、上記に示された生物学的活性の１つを生じさせるか、またはそれに寄与する、受容体、あるいは別のタンパク質、ＤＮＡ、炭水化物成分または脂質成分に結合するＣＡＦの能力（これに限定されない）が含まれ得る。
【００４９】
タンパク質の「生物学的に活性なサブユニット」は、全長型タンパク質または多量体の生物学的活性を有するタンパク質の一部（すなわち、フラグメント、ドメインまたはモノマー）である。
【００５０】
用語「模倣体」は、多くの場合、天然に存在するペプチドの基本的な構造を模倣する基本的な構造を有し、かつ／または天然に存在するペプチドの突出した生物学的性質を有するために、天然に存在するペプチドの生物学的活性を模倣することができる任意のペプチドまたは非ペプチド化合物を示すために使用されている。模倣体には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：天然に存在するペプチドと類似する側鎖を有しないなどの元のタイプからの相当の改変を有するペプチド（そのような改変は、例えば、分解に対するその感受性を低下させることができる）；抗イディオ型抗体および／または触媒抗体、またはそのフラグメント；単離されたタンパク質の非タンパク質性部分（例えば、炭水化物構造体）；あるいは合成または天然の有機分子、これには、例えば、コンビナトリアル化学によって同定された核酸および薬物が含まれる。
【００５１】
用語「安定な」は、本発明のタンパク質に関して、温度の上昇または低下によって、ｐＨの上昇または低下によって、塩濃度の増大または減少によって、酸化および／または還元によって、脱アミド化によって引き起こされる分解に対して抵抗性であるタンパク質の能力、および／または化学的分解の他の形態およびタンパク質分解的な分解に対して抵抗性であるタンパク質の能力をいう。より詳細には、タンパク質は、タンパク質の生物学的活性の何らかの測定可能なレベルを検出することによって、好ましくは、細胞によるＴＮＦα、ＩＬ−１βまたはＩＬ−６の発現における何らかの測定可能な増大に影響を及ぼすタンパク質の能力を検出することによって、任意の所与条件のもとで安定であると決定される。好ましくは、安定であると見なされるタンパク質は、所与の条件にさらされた後で、その条件にさらされる前の生物学的活性（例えば、通常的な条件のもとでのその生物学的活性）と比較して、その生物学的活性の少なくとも１０％（好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％）を維持する。タンパク質の安定性は、貯蔵時または使用時のいずれかで、上記に記載されているように、安定であるタンパク質の能力が参照され得る。
【００５２】
用語「核酸分子」は、主として物理的な核酸分子を示し、用語「核酸配列」は、主として核酸分子のヌクレオチド配列をいう。しかし、この２つの用語は、特に、タンパク質をコードし得る核酸分子または核酸配列に関しては交換可能に使用され得る。
【００５３】
用語「組換え分子」または用語「組換え核酸分子」は、主として、転写制御配列に機能的に連結された核酸分子を示す。
【００５４】
用語「機能的に連結された」は、核酸分子が宿主細胞にトランスフェクション（すなわち、形質転換、形質導入、トランスフェクション、接合または伝達）されたときに発現し得るような様式で核酸分子が転写制御配列に連結されていることをいう。
【００５５】
用語「転写制御配列」は、転写の開始、伸長および終結を制御する任意の配列をいう。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列およびリプレッサー配列などの、転写開始を制御する配列である。
【００５６】
用語「トランスフェクション」は、外因性核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）を細胞内に挿入することができる任意の方法を示すために使用されている。用語「形質転換」は、そのような用語が、細菌および酵母などの微生物細胞への核酸分子の導入を示すために使用される場合には用語「トランスフェクション」と交換可能に使用することができる。微生物系において、用語「形質転換」は、微生物が外因性核酸を獲得することにより遺伝する変化を記載するために使用され、本質的には用語「トランスフェクション」と同意義である。しかし、動物細胞では、形質転換は、例えば、ガン性になった後の培養中の細胞の増殖性における変化を示し得る別の意味を有している。したがって、混乱を避けるために、用語「トランスフェクション」は、好ましくは、外因性核酸を動物細胞に導入することに関して使用され、そして用語「トランスフェクション」は、これらの用語が外因性核酸の細胞への導入に関するという程度に、動物細胞のトランスフェクションおよび微生物細胞の形質転換の両方を一般には包含するように本明細書中では使用される。したがって、トランスフェクション技術には、形質転換、エレクトロポレーション、顕微注入、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書中に記載されている核酸配列またはアミノ酸配列に関して、用語「切れ目のない」または用語「連続した」は交換可能に使用され、切れていない配列において連結されていることを示す。例えば、第１の配列が第２の配列の３０個の切れ目のない（または連続した）アミノ酸を含むことは、第１の配列が、第２の配列における３０個のアミノ酸残基からなる切れていない配列に対する同一性が１００％である３０個のアミノ酸残基の切れていない配列を含むことを意味する。同様に、第１の配列が第２の配列と「１００％の同一性」を有することは、第１の配列が、ヌクレオチド間またはアミノ酸間にギャップを伴うことなく第２の配列と正確に一致していることを意味する。
【００５８】
パーセント（％）同一性に対する参照は、別途示されていない限り、下記を使用して行われる２つ以上のアミノ酸配列間または核酸配列間における相同性の評価を表す：（１）アミノ酸検索の場合にはｌａｓｔｐが、そして核酸検索の場合にはｂｌａｓｔｎが設定省略時の標準的なパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴ２．０ＢａｓｉｃＢＬＡＳＴ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）、この場合、質問配列は設定省略時の既定値によって低複雑性領域についてふるい分け処理される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、Ｓｃｈａａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）「ギャップ処理のＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、これは参考としてその全体が本明細書中に組み込まれる）；（２）ＢＬＡＳＴ２アラインメント（下記に記載されるパラメーターが使用される）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）；または（３）ＢＬＡＳＴ２．０およびＢＬＡＳＴ２の両方。ＢＬＡＳＴ２．０ＢａｓｉｃＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２の間における標準的なパラメーターにおけるいくつかの差のために、２つの特定の配列が、ＢＬＡＳＴ２プログラムを使用して有意な相同性を有すると認識されることがあり、一方、配列の１つを質問配列として使用してＢＬＡＳＴ２．０ＢａｓｉｃＢＬＡＳＴで行われた検索により、最大に一致した第２の配列が同定されないことがあるこことには留意すること。したがって、パーセント同一性は、これらのプログラムのいずれかまたは両方を使用することによって決定され得るが、好ましくはＢＬＡＳＴ２．０ＢａｓｉｃＢＬＡＳＴを使用することによって決定され得ることを理解しなければならない。２つの特定の配列は、ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ２配列−タンパク質配列およびヌクレオチド配列を比較するための新しい道具」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７〜２５０（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、ＢＬＡＳＴ２の配列を使用して互いにアラインメントされ得る。ＢＬＡＳＴ２の配列アラインメントは、得られるアラインメントにおけるギャップ（欠失または挿入）の導入を考慮する２つの配列間のギャップ処理ＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ２．０）を行うためにＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用するｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで行われる。本明細書中において明瞭にするために、ＢＬＡＳＴ２の配列アラインメントは、下記の設定省略時の標準的なパラメーターを使用して行われる：
ｂｌａｓｔｎの場合、０ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用：
一致に対する値＝１
不一致に対する値＝−２
オープンギャップ（５）および伸長ギャップ（２）のペナルティー
ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ（５０）ｅｘｐｅｃｔ（１０）ｗｏｒｄサイズ（１１）ｆｉｌｔｅｒ（オン）
ｂｌａｓｔｐの場合、０ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用：
オープンギャップ（１１）および伸長ギャップ（１）のペナルティー
ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ（５０）ｅｘｐｅｃｔ（１０）ｗｏｒｄサイズ（３）ｆｉｌｔｅｒ（オン）
【００５９】
「ハイブリダイゼーション条件」に対する参照は、核酸分子が、類似する核酸分子を同定するために使用される標準的なハイブリダイゼーション条件をいう。そのような標準的な条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（同書）は、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる（特に、９．３１頁〜９．６２頁を参照のこと）。さらに、ヌクレオチドの様々な程度のミスマッチを許容するハイブリダイゼーションを達成する適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を決めるための処方が、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８、２６７〜２８４に開示されている（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他（同書）はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。当業者は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他（同書）における処方を使用して、特定レベルのヌクレオチドのミスマッチを達成する適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を決めることができる。そのような条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡのハイブリッドが形成されているかどうかに依存して変化する。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対して計算される融解温度は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合よりも１０℃低い。例として、特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、６ＸＳＳＣ（０．９ＭのＮａ+）のイオン強度で、約２０℃〜約３５℃の温度（例えば、あまりストリンジェントでない条件）、より好ましくは約２８℃〜約４０℃の温度（例えば、よりストリンジェントな条件）、さらにより好ましくは約３５℃〜約４５℃の温度（さらによりストリンジェントな条件）におけるハイブリダイゼーションが含まれる。特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、６ＸＳＳＣ（０．９ＭのＮａ+）のイオン強度で、約３０℃〜約４５℃の温度、より好ましくは約３８℃〜約５０℃の温度、さらにより好ましくは約４５℃〜約５５℃の温度におけるハイブリダイゼーションが含まれる。これらの値は、約１００ヌクレオチドよりも大きな分子に対する融解温度の計算、０％のホルムアミド、および約４０％のＧ＋Ｃ含有量に基づいている。あるいは、Ｔmを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）、９．３１頁〜９．６２頁に示されているように経験的に計算することができる。
【００６０】
「低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション」（および洗浄の条件）に対する参照は、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするために使用されている核酸分子と少なくとも約４０％の核酸配列同一性を有する核酸配列の単離を可能にする条件（すなわち、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他（同書）における処方を使用して決定されるように、ヌクレオチドの約６０％以下のミスマッチを可能にする条件）に対する参照である。
【００６１】
「適度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション」（および洗浄の条件）に対する参照は、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするために使用されている核酸分子と少なくとも約６０％の核酸配列同一性を有する核酸配列の単離を可能にする条件（すなわち、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他（同書）における処方を使用して決定されるように、ヌクレオチドの約４０％以下のミスマッチを可能にする条件）に対する参照である。
【００６２】
「高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション」（および洗浄の条件）に対する参照は、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするために使用されている核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸配列の単離を可能にする条件（すなわち、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他（同書）における処方を使用して決定されるように、ヌクレオチドの約２０％以下のミスマッチを可能にする条件）に対する参照である。
【００６３】
「非常に大きなストリンジェンシーのハイブリダイゼーション」（および洗浄の条件）に対する参照は、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするために使用されている核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸配列の単離を可能にする条件（すなわち、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ他（同書）における処方を使用して決定されるように、ヌクレオチドの約１０％以下のミスマッチを可能にする条件）に対する参照である。
【００６４】
用語「調節する」またはそのような用語の派生形は、１つの状態から別の状態への変化、調整または変動を意味し、１つの特性から別の異なる特性への何らかの測定可能な特性および／または変化における測定可能または識別可能な増大または減少を含む。
【００６５】
用語「薬剤として許容される担体」は、本発明の組成物を好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位、ｅｘ  ｖｉｖｏ部位またはｉｎ  ｖｉｖｏ部位に投与する際の使用に好適な薬剤として許容される賦形剤、配合物および／または薬剤として許容される送達ビヒクルをいう。薬剤として許容される担体により、本発明の組成物は、液体剤、エアロゾル剤、カプセル剤、錠剤、ピル剤、粉末剤、ゲル剤および顆粒剤（これらに限定されない）を含む、使用に好適な任意の形態で製造／提供され得る。いくつかの薬剤として許容される担体には、細胞、膜、脂質配合物（患者に投与されたときに固体またはゲルをその場で形成する液体を含む）、抗体配合物、食品生成物（例えば、任意の食用の生成物または調製物）および組換えウイルスが含まれる。好ましい担体は、生分解性（すなわち、生物崩壊性）でもある。
【００６６】
「薬剤として許容される賦形剤」には、組成物を細胞に輸送するか、またはそのような輸送を助けるが、組成物を細胞に特異的に標的化しない賦形剤または配合物が含まれる（これはまた、非標的化担体と本明細書中では呼ばれる）。薬剤として許容される賦形剤の例には、水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性の生理学的に平衡化された溶液、オイル、エステルおよびグルコールが含まれるが、これらに限定されない。水性担体は、例えば、化学的安定性および等張性を高めることによって受容者の生理学的な条件に近づけるために必要とされる好適な補助物質を含有することができる。好適な補助物質には、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ならびにリン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液および重炭酸塩緩衝液を作製するために使用される他の物質が含まれる。補助物質にはまた、チメロサール、−、ｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンゾールアルコールなどの保存剤をも含むことができる。
【００６７】
「制御放出ビヒクル」は、本発明の組成物またはタンパク質を制御された様式で患者または培養物に放出することができるタイプの薬剤として許容される担体である。制御放出配合物は、本発明の化合物（例えば、ＣＡＦタンパク質（ホモログを含む）、抗体、核酸分子または模倣体）を制御放出ビヒクル中に含む。好適な制御放出ビヒクルには、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポ球体および経皮送達システムが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
「薬剤として許容される送達ビヒクル」は、本発明の組成物またはタンパク質を標的部位に送達することができる薬剤として許容される担体である。好ましくは、薬剤として許容される送達ビヒクルは、組成物を標的部位に標的化（すなわち、指向、選択的に送達）することができる。「標的部位」は、組成物を送達することが望まれる患者の部位をいう。例えば、標的部位は、人工脂質含有送達ビヒクルおよび天然脂質含有送達ビヒクル（例えば、リポソーム）、抗体、ウイルスベクターまたは他の送達ビヒクル（リボザイムを含む）を使用する直接的な注入または送達によって標的化される任意の細胞または組織であり得る。天然脂質含有送達ビヒクルには、細胞および細胞膜が含まれる。人工脂質含有送達ビヒクルには、リポソームおよびミセルが含まれる。化合物がタンパク質（例えば、ＣＡＦタンパク質）である場合、好適な送達ビヒクルには、抗体、リポソームおよび細胞（例えば、タンパク質を発現する組換え細胞）が含まれるが、これらに限定されない。化合物が組換え核酸分子である場合、好適な送達ビヒクルには、リポソーム、ウイルスベクター、金粒子、ポリＬ−リシン／ＤＮＡ分子結合体、人工染色体または他の送達ビヒクル（リボザイムを含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
用語「リポソーム」は、核酸分子またはタンパク質を特定の患者部位または選択された患者部位に送達することができる脂質組成物を含む送達ビヒクルをいう。リポソームは、標的化細胞の原形質膜と融合して、核酸分子を細胞内に送達することができる脂質組成物を含む。本発明とともに使用される好適なリポソームには、任意のリポソームが含まれる。本発明の好ましいリポソームには、例えば、当業者に知られている遺伝子送達法において広く使用されているそのようなリポソームが含まれる。より好ましいリポソームは、ポリカチオン性脂質組成物を有するリポソーム、および／またはポリエチレングリコールに結合したコレステロール骨格を有するリポソームを含む。リポソームを本発明の核酸分子と複合体化することが、この分野における標準的な方法を使用して達成され得る。
【００７０】
用語「ウイルスベクター」は、核酸分子が、細胞内へのＤＮＡの進入を可能にするウイルスコートにパッケージされる本発明において有用な単離された核酸分子をいう。多数のウイルスベクターを使用することができる。これには、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルスおよびレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
用語「投与する」は、対象体に物質を提供する（すなわち、物質を対象体に導入する）任意の方法を意味し、これには、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与またはエキスビボ投与による方法が含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の方法には、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、心臓内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈内への投与）、皮下投与、経皮送達、気管支内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入（例えば、エアロゾル）、脳内、鼻腔、経口、眼内、肺投与、カテーテルの注入、坐薬による投与、および組織内への直接的な注入が含まれるが、これらに限定されない。ｅｘ  ｖｉｖｏは、患者から取り出された細胞集団を、本発明によるＣＡＦタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え分子で、組換え分子がトランスフェクションされた細胞によりその後発現されるような条件のもとでトランスフェクションして、そのトランスフェクションされた細胞を患者に戻すことなどによって患者の体外で調節ステップの一部を行うことをいう。そのようなトランスフェクションを達成する方法には、トランスフェクション、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、細菌移入、スフェロプラスト融合および吸着が含まれるが、これらに限定されない。ｅｘ  ｖｉｖｏ方法は、標的細胞が患者から容易に取り出すことができ、かつ患者に戻すことができる場合には特に好適である。
【００７２】
用語「治療的利益」は、特定の疾患または状態に対する治療を必ずしも示さないが、むしろ、好ましくは、疾患または状態の緩和、疾患または状態の除去、疾患または状態に関連する症状の軽減、一次的な疾患または状態の発症から生じる二次的な疾患または状態（例えば、原発性ガンから生じる転移ガン）の防止または緩和、および／あるいは疾患または状態の防止を含み得る結果を包含する。
【００７３】
疾患または状態に関連して、用語「保護」は、疾患の症状を低下させること；疾患の発症を低下させること；および／または疾患の重篤度を低下させることをいう。患者または対象体を保護することは、患者に投与されたとき、疾患を発症させない本発明の組成物の能力、および／または疾患の症状、徴候もしくは原因を治療するか、もしくはそれらを緩和する本発明の組成物の能力が参照され得る。そのため、患者を疾患から保護することには、疾患の発症を防止すること（予防的処置）、および疾患を有する患者を処置すること（治療的処置）の両方が含まれる。
【００７４】
用語「防止」は、疾患の進行が低下および／または除去されること、あるいは疾患の発症が除かれること（予防的処置）を意味する。
【００７５】
用語「処置」は、障害の症状（痛みを含む）の発症および／または障害の病理学的起源が遅らされ、低下し、または完全に防止されること、あるいは存在する場合には、症状が改善され、または完全に除かれることを意味する。例えば、ＣＡＦ組成物は、ヒトおよび他の哺乳動物における障害の症状を抑制するだけでなく、受容者における障害の存在を妨げる予防剤として作用することによってガンを処置する。
【００７６】
用語「疾患」は、哺乳動物の正常な健康状態からの何らかの異常が参照され、疾患の症状が存在するときの状態、ならびに異常（例えば、感染、遺伝子の変異、遺伝子的欠陥など）が存在するが、症状が未だ発現していない状態を含む。
【００７７】
用語「ａ」または「ａｎ」実体物は、１つまたは２つ以上のそのような実体物が参照される。そのため、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は本明細書中では交換可能に使用され得る。
【００７８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」の用語は本明細書中では交換可能に使用され得る。
【００７９】
（発明の説明）
本発明の１つの実施形態は、単離されたサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパク質に関する。単離されたＣＡＦタンパク質に対する参照には、全長型タンパク質、短縮化タンパク質（すなわち、全長型タンパク質のフラグメント）、融合タンパク質、またはそのようなタンパク質の任意のホモログが含まれる。ＣＡＦホモログは上記に定義されている。好ましくは、ＣＡＦホモログはＣＡＦの生物学的活性（これもまた上記に定義されている）を有する。詳細には、本発明のＣＡＦタンパク質は好ましくは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）α、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現をアップレギュレーション（増大、刺激、誘導、増強）する能力、および／または形質転換壊死因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーション（低下、阻害、防止、減少）する能力を含む生物学的活性を有する。そのような生物学的活性は、免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（すなわち、ＥＬＩＳＡ）を含む）、放射免疫アッセイおよびＲＮＡアッセイ（これらに限定されない）を含む、サイトカイン活性を測定するこの分野における任意の好適な方法で測定することができる（実施例を参照のこと）。ＣＡＦタンパク質の生物学的活性にはまた、上記に示される生物学的活性の１つを生じさせるか、またはその１つに寄与する、受容体、あるいは別のタンパク質、ＤＮＡ、炭水化物成分または脂質成分に結合するＣＡＦの能力が含まれ得るが、これに限定されない。別の成分に結合するタンパク質の能力を測定する方法は当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。さらに、本明細書中に提供された指針を使用して、野性型のＣＡＦの核酸配列および／またはアミノ酸配列（例えば、アミノ酸配列番号１または６）における改変体を作製すること、およびそのような改変を含むホモログをＣＡＦの１つまたは複数の生物学的活性について調べることは当業者の範囲内である。例えば、サイトカインの発現を誘導するか、またはサイトカインの発現を阻害するＣＡＦの能力を決定する方法が実施例の節に記載されている。
【００８０】
単離されたＣＡＦタンパク質に対する参照には、天然の供給源（例えば、本発明による過免疫卵）から実質的に精製されたＣＡＦタンパク質、組換え的に製造されたＣＡＦ、および／または合成的に製造されたＣＡＦが含まれ得る。本発明の特に好ましいＣＡＦタンパク質は、配列番号１および／または配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含む。配列番号１は、配列番号６のアミノ酸１〜３０に広がり、配列番号６のＮ末端フラグメントである。配列番号６は、過免疫卵から精製された本発明のＣＡＦタンパク質の全長のアミノ酸配列であると考えられる。
【００８１】
１つの実施形態において、ＣＡＦタンパク質には、配列番号１または配列番号６の少なくとも９個の切れ目のないアミノ酸残基（すなわち、配列番号１または配列番号６の９個の切れ目のないアミノ酸と１００％の同一性を有する９個の切れ目のないアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。そのようなタンパク質は、配列番号１および／または配列番号６を含むタンパク質のホモログ（例えば、ＣＡＦホモログ）として示され得るが、そのようなタンパク質にはまた、配列番号１および／または配列番号６を含むタンパク質（例えば、天然に存在するＣＡＦタンパク質）が含まれる。好ましい実施形態において、ＣＡＦタンパク質のホモログは、配列番号１および／または配列番号６の少なくとも１２個（より好ましくは少なくとも約１５個、より好ましくは少なくとも約２０個、より好ましくは少なくとも約２５個）の切れ目のないアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態において、ＣＡＦホモログは、配列番号６の少なくとも約３０個（より好ましくは少なくとも約３５個、より好ましくは少なくとも約４０個、さらにより好ましくは少なくとも約４５個、より好ましく少なくとも約５０個、より好ましくは少なくとも約５５個、より好ましく少なくとも約６０個、より好ましくは少なくとも約６５個）の切れ目のないアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む。
【００８２】
ＣＡＦタンパク質ホモログには、配列番号１および／または配列番号６をコードする核酸配列の少なくとも２７個（より好ましくは少なくとも３６個、より好ましくは少なくとも４５個、より好ましくは少なくとも６０個、より好ましくは少なくとも７５個）の切れ目のないヌクレオチドを含む核酸配列によってコードされるタンパク質が含まれ得る。別の実施形態において、ＣＡＦタンパク質ホモログには、配列番号６をコードする核酸配列の少なくとも９０個（より好ましくは少なくとも１０５個、より好ましくは少なくとも１２０個、より好ましくは少なくとも１３５個、より好ましくは少なくとも１５０個、より好ましくは少なくとも１６５個、より好ましくは少なくとも１８０個、より好ましくは少なくとも１９５個）の切れ目のないヌクレオチドを含む核酸配列によってコードされるタンパク質が含まれ得る。
【００８３】
上記に議論されているように、ＣＡＦタンパク質ホモログは好ましくは、測定可能なＣＡＦの生物学的活性を有する（すなわち、生物学的活性を有する）。しかし、いくつかの実施形態において、ＣＡＦホモログを含むＣＡＦタンパク質は、ＣＡＦタンパク質およびＣＡＦ関連タンパク質を同定するために有用な抗体の調製およびオリゴヌクレオチドの開発を行うために（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドの場合におけるＣＡＦ富化分画成分に対して過免疫卵をスクリーニング／選択するために）、ＣＡＦをコードする核酸配列をクローニングするために（オリゴヌクレオチドの場合）、かつ／またはＣＡＦに結合するタンパク質もしくは核酸を同定するために使用される。これらの実施形態において、ＣＡＦタンパク質が生物学的活性を有するかどうかは、そのような方法に有用なＣＡＦタンパク質がＣＡＦの生物学的活性を固有的に有するという程度以外に特に問題ではない。
【００８４】
１つの実施形態において、ＣＡＦタンパク質（例えば、ＣＡＦタンパク質ホモログ）は、配列番号１および／または配列番号６に対する同一性がそれぞれ、配列番号１および／または配列番号６の少なくとも約１５個の切れ目のないアミノ酸について、より好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸について、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸について少なくとも約６５％であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＣＡＦタンパク質は、配列番号１および／または配列番号６に対する同一性がそれぞれ、配列番号１および／または配列番号６の少なくとも約１５アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸について少なくとも約７０％（より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％）であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＣＡＦタンパク質は、配列番号６に対する同一性が、配列番号６の少なくとも約３０アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約３５アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約４５アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約５５アミノ酸について、さらにより好ましくは少なくとも約６０アミノ酸について少なくとも約６５％（より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％）であるアミノ酸配列を含む。
【００８５】
別の実施形態において、ＣＡＦタンパク質は、配列番号６に対する同一性が、配列番号６の少なくとも６６アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約６７アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約６８アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約６９アミノ酸について少なくとも約６０％であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＣＡＦタンパク質は、配列番号６に対する同一性が、配列番号６の少なくとも６６アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約６７アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約６８アミノ酸について、より好ましくは少なくとも約６９アミノ酸について少なくとも約６５％（より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％）であるアミノ酸配列を含む。パーセント同一性を決定する方法は上記に記載されている。
【００８６】
別の実施形態において、ＣＡＦタンパク質ホモログを含むＣＡＦタンパク質には、ホモログをコードする核酸配列が、適度なストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは非常に大きなストリンジェンシーの条件（これらは上記に記載されている）のもとで、天然のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子に（すなわち、そのような核酸分子と）（すなわち、天然のＣＡＦアミノ酸配列をコードする核酸鎖の相補体に）ハイブリダイゼーションすることができるように天然のＣＡＦアミノ酸配列に対して十分に類似しているアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。そのような条件は上記に定義されている。好ましくは、ＣＡＦタンパク質のホモログは、配列番号１または配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体に、適度なストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは非常に大きなストリンジェンシーの条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸配列の核酸配列相補体は、ＣＡＦをコードする鎖に対して相補的である核酸鎖の核酸配列をいう。所与のアミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡと、その一本鎖ＤＮＡに対して相補的である配列を有するその相補鎖とを含むことが理解される。そのため、本発明の核酸分子は二本鎖または一本鎖のいずれかであり得るし、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで、配列番号１および／または配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、かつ／または配列番号１および／または配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補体と安定なハイブリッドを形成するそのような核酸分子を含む。相補的な配列を推定する方法は当業者には知られている。アミノ酸配列決定および核酸配列決定の技術は完全に誤りがないことはないので、本明細書中に示されている配列は、本発明のＣＡＦタンパク質の明らかな配列を最も良い状態で表していることに留意しなければならない。
【００８７】
ＣＡＦタンパク質ホモログは、天然の対立遺伝子変化または天然の変異の結果であり得る。本発明のＣＡＦタンパク質ホモログはまた、この分野で知られている技術を使用して製造することができる。そのような技術には、例えば、ランダム変異誘発または標的化変異誘発を行うための古典的な技術または組換えＤＮＡ技術を使用する、タンパク質に対する直接的な改変またはタンパク質をコードする遺伝子に対する改変が含まれるが、これらに限定されない。ＣＡＦをコードする核酸の天然に存在する対立遺伝子変化体は、配列番号１および／または配列番号６のアミノ酸配列をコードするが、例えば変異または組換えによって引き起こされる天然の変化のために、同一ではないが、類似する配列を有する遺伝子としてゲノム内の本質的には同じ遺伝子座（１つまたは複数）に存在する遺伝子である。天然の対立遺伝子変化体は、典型的には、対立遺伝子変化体が比較されている遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似する活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子変化体の１つのクラスは、同じタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のために異なる核酸配列を有し得る。対立遺伝子変化体はまた、（例えば、調節的な制御領域において）遺伝子の５’非翻訳領域または３’非翻訳領域に変化を含む。対立遺伝子変化体は、当業者には十分に知られており、そしてゲノムがハプロイドであるので特定の細菌種において、かつ／または２つ以上の細菌種の群の中に見出されることが予想される。
【００８８】
ＣＡＦタンパク質にはまた、遺伝子融合物（例えば、組換えタンパク質の可溶性の活性形態を過剰発現させるために使用される遺伝子融合物）の発現産物、変異処理された遺伝子（遺伝子の転写および翻訳を増強するためのコドン改変を有する遺伝子など）の発現産物、および短縮化遺伝子（例えば、全長型タンパク質の生物学的に活性なフラグメントまたはサブユニットを作製するためにドメインが除かれている遺伝子など）の発現産物が含まれる。本発明のＣＡＦタンパク質およびＣＡＦタンパク質ホモログには、ＣＡＦ活性を有しないタンパク質が含まれることに留意されたい。そのようなタンパク質は、例えば、抗体を製造するために有用である。
【００８９】
本発明の単離されたＣＡＦタンパク質（全長型タンパク質、短縮化タンパク質、他のホモログおよび融合タンパク質を含む）は下記の直接的な方法で同定することができる：（１）実施例に例示されているように、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−６の発現をアップレギュレーションし、かつ／またはＴＧＦβの発現をダウンレギュレーションするタンパク質の能力による方法；（２）タンパク質の生化学的性質および構造的性質（例えば、分子量、一次構造、安定性）による方法；（３）ＣＡＦタンパク質に対する抗体へのタンパク質の選択的な結合による方法；および／または（４）過免疫卵以外の供給源に由来するＣＡＦのアミノ酸配列および核酸配列などに対する他のＣＡＦアミノ酸配列およびＣＡＦ核酸配列とのタンパク質の相同性による方法。本発明のタンパク質および／またはホモログの最小サイズは、ＣＡＦの生物学的活性を有するのに十分なサイズであり、あるいはタンパク質がそのような活性を有することが必要でない場合には、天然に存在するＣＡＦタンパク質に結合する抗体を製造するためなどの、本発明のＣＡＦタンパク質に関連する別の目的に有用である十分なサイズである。そのため、本発明のＣＡＦタンパク質および／またはＣＡＦホモログの最小サイズは、抗体によって認識され得る少なくとも１つのエピトープを形成するのに好適なサイズであり、典型的には少なくとも８アミノ酸から３０アミノ酸の長さ（１アミノ酸の増分で８アミノ酸〜３０アミノ酸の間の任意の長さ）であり、好ましいサイズは、そのようなタンパク質の全長部分、多価部分（すなわち、それぞれが機能を有する２つ以上のドメインを有する融合タンパク質）または機能的部分が所望されるかどうかに依存する。実用的な限界を除いて、そのようなタンパク質の最大サイズに関して、タンパク質がＣＡＦタンパク質（ＣＡＦホモログを含む）または全長型ＣＡＦの一部分を含む点で制限はない。
【００９０】
本発明にはまた、１つまたは複数の融合セグメントに結合した（ＣＡＦタンパク質のホモログを含む）ＣＡＦ含有ドメインを含む融合タンパク質が含まれる。本発明とともに使用される好適な融合セグメントには、タンパク質の安定性を増強し得るセグメント；他の望ましい生物学的活性を提供し得るセグメント（例えば、サイトカイン）；および／またはＣＡＦタンパク質の（例えば、アフィニティークロマトグラフィによる）精製を助けるセグメントが含まれるが、これらに限定されない。好適な融合セグメントは、所望する機能を有する（例えば、増大した安定性、溶解性、作用または生物学的活性を付与し、かつ／またはタンパク質の精製を単純化する）任意のサイズのドメインであり得る。融合セグメントは、ＣＡＦタンパク質の直接的な回収を可能にするために、タンパク質のＣＡＦ含有ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に結合させることができ、そして切断されやすくすることができる。融合タンパク質は好ましくは、ＣＡＦ含有ドメインのカルボキシル末端および／またはアミノ末端のいずれかに結合した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸分子でトランスフェクションされた組換え細胞を培養することによって製造される。
【００９１】
本発明にはまた、ＣＡＦタンパク質の模倣体が含まれる。本明細書中で使用されているように、用語「模倣体」は、多くの場合、天然に存在するペプチドの基本的な構造を模倣する基本的な構造を有し、かつ／または天然に存在するペプチドの突出した生物学的性質を有するために、天然に存在するペプチドの生物学的活性を模倣し得る任意のペプチドまたは非ペプチド化合物を示すために使用されている。模倣体には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：天然に存在するペプチドと類似する側鎖を有しないなどの元のタイプからの相当の改変を有するペプチド（そのような改変は、例えば、分解に対するその感受性を低下させることができる）；抗イディオ型抗体および／または触媒抗体、またはそのフラグメント；単離されたタンパク質の非タンパク質性部分（例えば、炭水化物構造体）；あるいは合成または天然の有機分子、これには、例えば、コンビナトリアル化学によって同定された核酸および薬物が含まれる。
【００９２】
そのような模倣体は、この分野で知られている様々な方法を使用して設計し、選択して、かつ／またはそれ以外に同定することができる。本発明において有用な模倣体または他の治療化合物を設計するために有用な薬物設計の様々な方法が、Ｍａｕｌｉｋ他、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている。ＣＡＦ模倣体は、例えば、分子的多様性方法（大きな化学的に多様な分子ライブラリーの迅速な構築を可能にする関連した方法の組合せ）、天然化合物または合成化合物のライブラリーから、特に化学ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列またはサイズが異なるが、類似する組み立てブロックを有する化合物のライブラリー）から、あるいは合理的で指向的な薬物設計またはランダムな薬物設計によって得ることができる。例えば、Ｍａｕｌｉｋ他（上記）を参照のこと。
【００９３】
分子的多様性方法では、大きな化合物ライブラリーが、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物および／または合成有機分子から、生物学的、酵素的および／または化学的な方法を使用して合成される。分子的多様性方法を開発する際の重要なパラメーターには、サブユニットの多様性、分子サイズ、およびライブラリーの多様性が含まれる。そのようなライブラリーをスクリーニングする一般的な目的は、コンビナトリアル選択の連続的な適用を用いて、所望する標的に対する高親和性リガンドを得ることであり、その後、ランダムな設計方法または指向的な設計方法のいずれかによってリード分子を最適化することである。分子的多様性の方法は、Ｍａｕｌｉｋ他（同書）に詳しく記載されている。
【００９４】
Ｍａｕｌｉｋ他はまた、例えば、適切に選択されたフラグメントのフラグメントライブラリーから新規な分子を作製する過程が使用者によって行われる指向的な設計方法；候補リガンドの適合度を評価する選択規準を同時に適用しながら、フラグメントおよびその組合せを無作為に変異させる遺伝的アルゴリズムまたは他のアルゴリズムが使用者によって使用されるランダム設計；および三次元の受容体構造と小さなフラグメントプローブとの相互作用エネルギーが使用者によって計算され、その後、有利なプローブ部位が連結されるグリッド型方法を開示している。
【００９５】
本発明により、ＣＡＦタンパク質は任意の動物に由来し得るが、特に、哺乳綱または鳥綱の脊椎動物における任意の動物に由来し得る。好ましくは、ＣＡＦタンパク質は、鳥綱の脊椎動物に由来する卵産生動物に由来する。好ましいＣＡＦタンパク質には、過免疫化されたニワトリ、七面鳥またはアヒルに由来する単離されたＣＡＦタンパク質が含まれる。特に好ましい単離されたＣＡＦタンパク質は、過免疫化されたニワトリの卵に由来するＣＡＦタンパク質である。
【００９６】
上記に議論されているように、本発明のＣＡＦタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドを製造するのに好適な任意の方法で製造することができる。本発明のＣＡＦタンパク質を製造するために特に好ましい方法は化学合成法による。例えば、そのような方法には、液相または固相のペプチド合成、あるいは従来の溶液法によって結合させられたタンパク質フラグメントで開始される溶液における半合成などのよく知られた化学的手法が含まれる。そのような方法は、この分野では十分に知られており、例えば、下記のようなこの分野における一般的な教本および論文に見出され得る：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９７７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３〜１３；Ｗａｄｅ他、１９９３、Ａｕｓｔｒａｌａｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（６）：３３２〜３３６；Ｗｏｎｇ他、１９９１、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４７（１１−１２）：１１２３〜１１２９；Ｃａｒｅｙ他、１９９１、Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．１５８：１８７〜２０３；Ｐｌａｕｅ他、１９９０、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１８（３）：１４７〜１５７；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、１９８５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２５（５）：４４９〜４７４；Ｈ．ＤｕｇａｓおよびＣ．Ｐｅｎｎｅｙ、ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９８１）、５４頁〜９２頁（これらはすべてその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。例えば、ペプチドは、市販のペプチド合成機および製造者により提供される合成サイクルを利用する固相方法論によって合成することができる。当業者は、固相合成がＦＭＯＣ法およびＴＦＡ／スカベンジャー切断混合物を使用してもまた達成され得ることを認識している。
【００９７】
大量のＣＡＦタンパク質が所望される場合、タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を使用して製造することができるが、このより小さいサイズのタンパク質（すなわち、ペプチド）の場合には、ペプチド合成が一般に好まれ得る。タンパク質は、タンパク質を発現し得る細胞を、タンパク質を産生させるのに効果的な条件のもとで培養し（すなわち、下記に詳しく記載されている、タンパク質をコードする組換え核酸分子を発現させ）、タンパク質を回収することによって組換え的に製造することができる。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、本発明のＣＡＦタンパク質を産生させるために細胞が培養される任意の培地をいう。そのような培地は、典型的には、資化性の炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（ビタミンなど）を有する水性培地を含む。組換え細胞（すなわち、ＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子を発現する細胞）は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は、当業者の専門的知識の範囲内である。そのような技術は、この分野では十分に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）および増補に記載されている。
【００９８】
製造のために使用されるベクターおよび宿主系に依存して、得られる本発明の組換えＣＡＦタンパク質は、組換え細胞の内部に留まり得るか、あるいは培養培地に分泌され得るか、あるいは大腸菌における周辺腔などの２つの細胞膜の間に分泌され得るか、あるいは細胞膜またはウイルス膜の外側表面に保持され得る。用語「タンパク質を回収する」は、タンパク質を含有する培養培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなるステップを意味することを必要としない。本発明のＣＡＦタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、コンカナバリンＡクロマトグラフィ、クロマトフォーカシングおよび示差的な可溶化（これらに限定されない）などの様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。本発明のタンパク質は、好ましくは、「実質的に純粋な形態」で回収される。本明細書中で使用されているように、「実質的に純粋」は、生物触媒または他の試薬として、あるいは対象体に投与するためにタンパク質の効果的な使用を可能にする純度をいう。例えば、実施例１に記載されているように、ＣＡＦを含む水溶性画分は、実質的に純粋であると見なされ、患者への投与に適する。
【００９９】
さらに別の実施形態において、本発明のＣＡＦタンパク質は、１つまたは複数の免疫原で、特に細菌の抗原またはその合成された等価体で過免疫化されている鳥類の卵（これに限定されない）を含む好適な供給源から高度に精製することができる。本発明者らは、本発明のサイトカイン活性化因子が過免疫卵に正常域を超えるレベルで存在することを発見した。高度に精製されたサイトカイン活性化因子は、全卵、卵黄および卵白から単離することができる。卵黄から高度に精製されたＣＡＦは、卵白から高度に精製されたＣＡＦよりも大きな免疫調節活性を示す。
【０１００】
卵からのＣＡＦの大規模精製プロセスは、出発時において、典型的には、４０ｋｇの過免疫卵卵黄（例えば、米国特許第５，７７２，９９９号に記載されているＰＬ−１００またはＳ−１００の卵黄）を用いる。ＣＡＦは、下記に簡単に記載され、そして実施例の節に詳しく記載されているように、限外濾過、Ｑセファロースイオン交換クロマトグラフィ、固相抽出およびさらなる方法を使用して高度に精製される。
【０１０１】
サイトカイン活性化因子は卵全体、卵黄または卵白から高度に精製することができる。好ましい高度な精製方法の一例は以下のようなものである。
１．卵黄の脂質を取り除く
２．卵黄の分子量３０００ダルトン透過物を調製する
３．イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィによって分画成分を分離する
４．固相抽出を行う
５．固相抽出分画成分の分配抽出を行う
６．ＨＰＬＣ分離を行う
７．サイトカイン誘導活性に関するバイオアッセイを行う。
【０１０２】
この方法のより詳細な記述を以下に示す。
ステップ１：
サイトカイン活性化因子は卵全体、卵黄または卵白から高度に精製することができる。好ましい一実施形態では、卵黄から組成物を精製する。当業者によく知られている方法によって、卵全体または卵黄から脂質部分を取り除く。たとえば、スプレー乾燥した卵黄パウダーの場合は、溶媒（プロパン、ブタンまたはヘキサンまたはバイナリー溶媒）、超臨界のＣＯ2、酵素などを用いて脱脂を行うことができ、液状卵黄の場合は、Ｌｅｅ（米国特許第５，３６７，０５４号）によって開示されるカプリル酸分離法（ＣＡＰＳ）によって、脱脂を行うことができる。卵白については脂肪の除去は必要なく、したがって液体またはパウダー形の卵白は、従来の方法によってまたは以下に示す実施例中に記載されるように、直接加熱または溶解することができる。したがって卵全体、卵黄または卵白は液体またはパウダー形に加工され、水溶性成分を得るためにさらに加工されることが好ましい。（実施例を参照のこと）
【０１０３】
ステップ２：
卵全体、卵黄または卵白から結果として生じる水溶性成分を、３０００ダルトンの分子量のカットオフ膜を備える限外濾過システムを使用して限外濾過にかける。限外濾過法によって、分子量が約３０００ダルトンを超える分子を、分子量が約３０００ダルトン未満である分子から分離する。３０００ダルトンのカットオフというのは近似的なものであることを示しておく。なぜなら、その二次構造が許す場合（すなわちほぼ線状のポリペプチド／タンパク質）、非常に大きなタンパク質がフィルターを通過することができるからである。ひとたび濾過すると、結果として生じる限外濾過液は分子量が約３０００ダルトン未満である分子（またはこれより大きいか、ほぼ線状のポリペプチド）を含み、次いでこれらを凍結乾燥し、重量を量り、バイオアッセイ試験および他の分離のために調製する。
【０１０４】
ステップ３〜７：
これらのステップは実施例１および図中で詳細に述べるものであり、ここでは繰り返さない。
【０１０５】
本発明の非常に純度の高いサイトカイン活性化因子は、以下の物理的／化学的特性（すなわち同定特性）を有する。
ａ．３０００ダルトン分子量カットオフの限外濾過フィルタを通過する、少なくとも１つの生物学的に活性のあるサブユニットを有する
ｂ．少なくとも約５０℃までの温度において安定性がある（すなわち測定可能な生物学的活性を有する）
ｃ．約２から約１０のｐＨにおいて安定性がある（すなわち測定可能な生物学的活性を有する）
ｄ．水溶性である
ｅ．非ステロイド性である
ｆ．負荷電である
ｇ．実質的に非極性である
ｈ．約２５４ｎｍでλmaxを有する。
【０１０６】
さらに本発明の非常に純度の高いサイトカイン活性化因子は、以下の生化学的／機能的特性を有する。
ａ．対象動物中で免疫調節活性を有する
ｂ．鳥類の卵黄および卵白中に存在する
ｃ．卵黄から単離するとき、卵白から単離するときよりも典型的には高い免疫調節活性を有する
ｄ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン発現、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および／またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）を誘導し、かつ／または
ｅ．形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の発現をダウンレギュレーションさせる。
【０１０７】
さらに本発明のＣＡＦタンパク質は、マクロファージおよび／または単球族の細胞の分化を誘導する能力を有する可能性がある。
【０１０８】
組成物の単離および精製から３０００ダルトンの分子量が導かれ、その単離および精製方法は３０００ダルトンより大きい分子種の通過を許さない限外濾過膜を使用する。充分に精製されたサイトカイン活性化因子は最初はタンパク質性でもステロイド性でもないと考えられていた。なぜなら、それはサイズが小さく、タンパク質を分解する酵素によって分解されないからである（ｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイに基づき、経口的に投与された後にタンパク質が生物学的活性を示し、従って消化酵素に暴露される）。さらに、組成物は経口的に活性がある。理論によって縛られることなく、小さく安定性のある形の充分に精製されたサイトカイン活性化因子（はるかに大きな大部分のタンパク質から分化したものと同様の）は消化管からの吸収を促進すると本発明者は考える。最後に、充分に精製されたサイトカイン活性化因子は熱安定性があり、これは大部分のタンパク質では典型的には見られない特性である。しかしながら現在は、充分に精製されたサイトカイン活性化因子は実際は前に同定された安定性を有するタンパク質であることが知られている。このような発見は驚くべきものであり、本発明のサイトカイン活性化因子は配合物、加工された食品、および経口ワクチンおよび配合物を含めたワクチンを封入するのに非常に適しているという利点をさらに証明する。
【０１０９】
本発明の他の実施形態は、ＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子を含む。本発明の核酸分子は、前述のＣＡＦホモログを含めて、単離される任意のＣＡＦタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む。本発明の好ましいＣＡＦの核酸分子は、アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含み、このアミノ酸配列は配列番号１および／または配列番号６の少なくとも９個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは少なくとも約１５個、さらに好ましくは少なくとも約２０個、さらに好ましくは少なくとも約２５個の切れ目のないアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、好ましいＣＡＦの核酸分子は、アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含み、このアミノ酸配列は配列番号６の少なくとも約３０個、より好ましくは少なくとも約３５個、さらに好ましくは少なくとも約４０個、さらに好ましくは少なくとも約４５個、さらに好ましくは少なくとも約５０個、さらに好ましくは少なくとも約５５個、さらに好ましくは少なくとも約６０個、さらに好ましくは少なくとも約６５個の切れ目のないアミノ酸残基を含む。
【０１１０】
一実施形態では、このような核酸分子は、適度なストリンジェンシーの条件下、より好ましくはストリンジェンシーが高い条件下、さらに好ましくはストリンジェンシーが非常に高い条件下で、天然に存在するＣＡＦをコードする核酸配列の相補体（すなわち、天然に存在するＣＡＦをコードする対立遺伝子の変異体）とハイブリダイズする単離された核酸分子を含む。本発明のＣＡＦタンパク質をコードする単離される核酸分子は、適度、高度または非常に高度な条件下で、配列番号１および／または配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、核酸配列の相補体とハイブリダイズする核酸配列を含むことが好ましい。
【０１１１】
本発明の一実施形態では、本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子は、少なくとも約１５個の切れ目のないアミノ酸、より好ましくは配列番号１および／または配列番号６それぞれの少なくとも２０個を超えるアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５個を超えるアミノ酸に関して配列番号１および／または配列番号６と少なくとも約６５％の相同性があるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１および／または配列番号６それぞれの少なくとも約１５個を超えるアミノ酸、より好ましくは２０個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは２５個を超えるアミノ酸と少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性があるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことが好ましい。一実施形態では、本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号６の少なくとも約３０個を超えるアミノ酸、より好ましくは少なくとも３５個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも４０個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも４５個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５５個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも６０個を超えるアミノ酸と少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性があるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０１１２】
他の実施形態では、本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号６の少なくとも６６個を超えるアミノ酸、より好ましくは少なくとも約６７個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約６８個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約６９個を超えるアミノ酸と少なくとも約６０％の相同性があるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号６の少なくとも６６個を超えるアミノ酸、より好ましくは少なくとも約６７個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約６８個を超えるアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約６９個を超えるアミノ酸と少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性があるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことが好ましい。相同性の％を判定するための方法は、前に記載するものである。
【０１１３】
本発明によれば、単離される核酸分子は、その自然環境から取り除かれ（すなわち、人間による操作にかけられている）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡを含めたＤＮＡまたはＲＮＡの誘導体を含むことができる核酸分子である。このように「単離される」とは、核酸分子が精製されている程度を反映するわけではない。単離されるＣＡＦの核酸分子は、本発明のＣＡＦタンパク質をコードし、厳しい条件下で天然の遺伝子単離体と安定性のあるハイブリッドを形成する核酸分子の能力が改質によってほとんど害されないような方法で、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または逆位によって改質される、たとえばＣＡＦ遺伝子、ＣＡＦ遺伝子の天然の対立遺伝子の変異体、ＣＡＦをコードしている領域またはその部分、ＣＡＦコードおよび／または調節領域を含むことができる。本発明の単離される核酸分子は、ＣＡＦ遺伝子より大きい天然に存在する分子は含まない。したがって、ＣＡＦ遺伝子およびさらなる側面配列を含む染色体および分子は、本発明には包含されない。本発明の核酸分子の最小サイズは、ＣＡＦの生物学的活性を有するタンパク質をコードし、抗体に結合する少なくとも１つのエピトープを含むＣＡＦタンパク質をコードし、または天然のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子の相補的な配列と安定性のあるハイブリッドを形成する能力がある（たとえばストリンジェンシーが低い、適度または高い条件下で）、プローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを形成するために充分なサイズである。このように、このようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸の組成および核酸分子と相補的配列の間の相同性または同一性の％、およびハイブリダイゼーション条件そのもの（たとえば温度、塩の濃度、およびホルムアミド濃度）に依存する可能性がある。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用される最小サイズの核酸分子は、核酸分子がＧＣが豊富である場合典型的には少なくとも約１２個から約１５個のヌクレオチド分の長さであり、ＡＴが豊富な場合は少なくとも約１５個から約１８個の塩基分の長さである。
【０１１４】
単離されるＣＡＦの核酸分子は、縮退物を含む可能性がある。本明細書で使用されるように、ヌクレオチドの縮退とは、１つのアミノ酸が異なるヌクレオチドコドンによってコードされる可能性がある現象のことである。したがって、本発明のＣＡＦタンパク質をコードする核酸分子の核酸配列は、縮退のため変化する可能性がある。本発明の単離されるＣＡＦの核酸分子は、ＣＡＦ活性を有するタンパク質をコードすることが必ずしも必要ではないことが示される。ＣＡＦの核酸分子は、たとえば切断型、突然変異型または不活性タンパク質をコードすることができる。このような核酸分子によってコードされているこのような核酸分子およびタンパク質は、ＣＡＦをコードする他の核酸分子のクローニング、たとえばサンプル中のＣＡＦの存在の検出において、または抗体産生などの他の目的のために有用である。
【０１１５】
本発明によればＣＡＦ遺伝子に関する参照文献は、この遺伝子によってコードされているＣＡＦタンパク質の生成を調節する調節領域（転写、翻訳または翻訳後調節領域などであるがこれらに限られない）、およびコード領域それ自体などの天然（すなわち野生型）ＣＡＦ遺伝子に関係があるあらゆる核酸配列を含む。他の実施形態においてＣＡＦ遺伝子は、所与のＣＡＦタンパク質をコードする核酸配列と類似ではあるが同一ではない配列を含む、天然に存在する対立遺伝子の変異体である可能性がある。
【０１１６】
本発明の単離されるＣＡＦの核酸分子はその天然源から単離することができ、または組換えＤＮＡ技術（たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、クローニング）または化学合成を使用して生成することができる。合成核酸分子を生成するための方法は、当分野ではよく知られている。たとえば、ＣＡＦタンパク質は比較的小さなタンパク質なので、従来型の市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を生成させることができる。代替方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法または他のクローニング技法を使用することによって、多くの種のゲノムＤＮＡから、特に卵生動物のその卵から、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを生成させることもできる。このような方法論は当分野ではよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、ｓｕｐｒａ）。
【０１１７】
当業者に知られているいくつかの方法（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ他を参照のこと）を使用して、ＣＡＦの核酸分子のホモログ（すなわち、ＣＡＦタンパク質のホモログをコードする）を生成することができる。たとえば、古典的な突然変異導入法および組換えＤＮＡ技法によって（たとえば、位置指定突然変異導入法、化学的処置、制限酵素による切断、核酸カットオフの連結および／またはＰＣＲ増幅）、または核酸分子の混合物およびその組み合わせを「構築」するためのオリゴヌクレオチド混合物の合成および混合物グループの連結を含めた（これらだけには限られないが）さまざまな技法を使用して、核酸分子を改質することができる。ＣＡＦタンパク質をコードする組換え核酸分子を改質するための他の方法は、遺伝子のシャッフリング（すなわち、分子の品種改良）である（たとえばＳｔｅｍｍｅｒに付与された米国特許第５，６０５，７９３号；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ；１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２８４〜２９０；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１を参照のこと、これらはすべて参照によりその全容が本明細書に組み込まれている）。この技法を使用して、ＣＡＦタンパク質の作用に同時に多数の明確な変化を効率よく導入することができる。ＣＡＦ遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、または核酸分子によってコードされているタンパク質の機能（たとえば、Ｂ細胞の増殖を増大させるための能力）のスクリーニングによって、核酸分子のホモログを選択することができる。
【０１１８】
核酸分子は組換え核酸分子の一部であることが好ましい。このような組換え核酸分子は、核酸分子に動作可能に結合している発現ベクターを含む。組換え核酸分子は、以下で詳細に記載する。この実施形態では、核酸分子によってコードされているＣＡＦタンパク質は、ＣＡＦの生物学的活性を有することが好ましい。このような核酸分子は、ＣＡＦタンパク質のホモログをコードする核酸配列を含むことができ、したがって天然に存在するＣＡＦをコードする核酸配列のホモログ（すなわち核酸配列ホモログ）と呼ぶことができる。
【０１１９】
したがって本発明の一実施形態は、少なくとも１つの本発明の単離される核酸分子を含む組換え核酸分子を含み、、この単離される核酸分子はクローニング、シークエンシング、および／またはこれ以外の場合は組換え細胞を形成するための発現および／または核酸分子の宿主細胞への送達などの核酸分子の操作に適した、任意の核酸ベクター（たとえば組換えベクター）に挿入される。このようなベクターは非相同な核酸配列、すなわち元来本発明の核酸分子と隣接しては見られない核酸配列を含むが、元来本発明の核酸分子と隣接しては見られる調節核酸配列（たとえばプロモーター、非翻訳領域）をベクターは含むこともできる（以下で詳細に記載する）。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかであってよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外要素（たとえばプラスミド）として維持することができ、またはこれを染色体に組み込むことができる。ベクター全体は宿主細胞中の適切な位置に留まることができ、またはある条件下では、本発明の核酸分子を残してプラスミドＤＮＡが欠失する可能性がある。染色体プロモーターの調節下、元のまたはプラスミドのプロモーターの調節下、またはいくつかのプロモーター調節の組み合わせの下で、組み込まれた核酸分子は存在することができる。核酸分子の１つまたは複数のコピーを、宿主細胞中の染色体に組み込むことができる。
【０１２０】
組換え分子は、１つまたは複数の転写調節配列に動作可能に結合している本発明の核酸分子を典型的には含む。このような語は前に定義している。本明細書で使用されるように、「組換え分子」または「組換え核酸分子」とは主に、転写調節配列に動作可能に結合している核酸分子または核酸配列のことであるが、このような核酸分子が本明細書で論じるような組換え分子であるときは、「核酸分子」というフレーズと交換可能で使用することができる。適切な転写調節配列は、本発明のＣＡＦタンパク質を発現するために有用な組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能することができる、任意の転写調節配列を含む。さまざまなこのような転写調節配列が当業者に知られている。好ましい転写調節配列は、細菌、真菌（たとえば酵母菌）、昆虫、植物または動物細胞中で機能する配列を含む。
【０１２１】
本発明の組換え分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい）は、組換え細胞と適合性がある翻訳調節配列、複製の起点、および他の調節配列などのさらなる調節配列を含むこともできる。一実施形態では、宿主細胞の染色体に組み込まれる分子を含めた本発明の組換え分子は、分泌シグナル（すなわち、シグナルカットオフ核酸配列）を含み、発現されるＣＡＦタンパク質をタンパク質を生成する細胞から分泌させることを可能にする。適切なシグナルカットオフには、本発明のＣＡＦタンパク質、または本発明のＣＡＦタンパク質の分泌を指示する能力がある任意の非相同なシグナルカットオフと自然に結びつくシグナルカットオフがある。他の実施形態では、本発明の組換え分子はリーダー配列を含み、発現されるＣＡＦタンパク質を送達し宿主細胞の膜内に挿入することを可能にする。適切なリーダー配列には、本発明のＣＡＦタンパク質、またはＣＡＦタンパク質を送達し宿主細胞の膜内に挿入することを指示する能力がある任意の非相同なリーダー配列と自然に結びつくリーダー配列がある。
【０１２２】
本明細書で組換えウイルスと呼ばれる組換え分子の１つのタイプは、ウイルス被覆中に包まれておりウイルスが細胞に送達された後に細胞内で発現される可能性がある、本発明の組換え核酸分子を含む。アルファウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスをベースとする粒子を含めた、いくつかの組換えウイルス粒子を使用することができるが、これらだけには限られない。
【０１２３】
本発明の１つまたは複数の組換え分子を使用して、本発明のコード型生成物（たとえばＣＡＦタンパク質）生成することができる。一実施形態では、タンパク質を生成するために効果的な条件下で、本明細書に記載される核酸分子を発現させることによって、コード型生成物を生成する。コード型生成物を生成するための好ましい方法は、宿主細胞を１つまたは複数の組換え分子でトランスフェクトすることによって組換え細胞を形成することである。トランスフェクトするための適切な宿主細胞には、トランスフェクトすることができる任意の細菌、真菌（たとえば酵母菌）、昆虫、植物または動物細胞があるが、これらだけには限られない。宿主細胞はトランスフェクトされていない細胞であるか、すでに少なくとも１つの核酸分子でトランスフェクトされている細胞のいずれかであってよい。
【０１２４】
本発明は、本発明のＣＡＦタンパク質（ＣＡＦのホモログを含めて）またはその模倣体（たとえばＣＡＦの抗体）に選択的に結合する能力がある単離された（すなわち、その自然環境から取り除かれた）抗体も含む。本明細書で使用するように、「〜に選択的に結合する」とは本発明の指定されるタンパク質およびその模倣体に優先的に結合する、本発明の抗体の能力のことである。酵素によるイムノアッセイ（たとえばＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなどを含めた当分野で標準的なさまざまな方法を使用して、結合を測定することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ他の上記を参照のこと。一実施形態では、タンパク質の活性を低下させるような方法で、たとえばタンパク質が受容体（すなわちＣＡＦの受容体）、他のタンパク質または核酸分子に結合する能力を妨げることにより、またはこれ以外の場合はタンパク質の作用のメカニズムを破壊することにより、ＣＡＦの抗体がＣＡＦタンパク質に選択的に結合することが好ましい。
【０１２５】
本発明の単離された抗体は、このような抗体、またはさまざまな程度に精製されている抗体を含む血清を含むことができる。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、単鎖抗体またはキメラ抗体を含めた（２つ以上のエピトープに結合することができる二重特異性抗体を含む）抗体フラグメントおよび遺伝子工学的に処理した抗体などの機能的な均等物であってよい。
【０１２６】
本発明の抗体を生成するための好ましい方法は（ａ）有効量の本発明のタンパク質、ペプチドおよびそれらの模倣体を動物に投与して抗体を産生すること（ｂ）その抗体を回収することを含む。他の方法では、ここに記載される技法を使用して本発明のＣＡＦタンパク質を生成し、組換えによって本発明の抗体を生成する。定義されるタンパク質または模倣体に対して生じる抗体は有利である可能性がある。なぜならこのような抗体は、これ以外の場合診断アッセイ、スクリーニングアッセイにおいて干渉を引き起こし、治療的組成物において使用される場合は副作用を引き起こす可能性のある、他の物質に対する抗体で汚染されていることはほとんどないからである。
【０１２７】
本発明の他の実施形態は、本発明のサイトカイン活性化因子を含む組成物に関する。組成物は、前に定義した薬剤として許容される担体も含むことが好ましい。本発明によれば、「組成物」は本発明のサイトカイン活性化因子を含む任意の組成物（配合物、生成物）を含み、精製され、組換えによって生成され、化学的に生成され、ほぼ精製され、（すなわち、卵生成物の他の成分と比較してＣＡＦ量を増加させるために、任意の程度まで精製された任意の過免疫卵）、または特に任意のＣＡＦ選択またはスクリーニング法（たとえば米国特許第５，７７２，９９９号に記載される）の不在下で過免疫卵生成物と比較した任意の他のＣＡＦ富化形で、ＣＡＦが組成物中に存在する。したがって、過免疫卵生成物中の平均量のＣＡＦと比較して富化量のＣＡＦに関する選択またはスクリーニングの不在下、または卵生成物中のＣＡＦの含有量を富化させるための任意の他の手段の不在下では、過免疫卵生成物は本発明の組成物には包含されない。このように、本発明のＣＡＦを含む過免疫卵生成物を含む組成物は、たとえば以下のことによって選択、スクリーニング、または生成して富化されなければならない。免疫化方法をスクリーニングして、平均的な過免疫卵生成物よりも統計的に有意な多量のＣＡＦを含む過免疫化動物および／または過免疫卵生成物を選択する；過免疫卵生成物の平均量のＣＡＦと比較して統計的に有意な高度のＣＡＦ含有率の過免疫化生成物をスクリーニングする；またはＣＡＦのために過免疫卵生成物を富化させる（たとえば分別、精製、または外因性ＣＡＦの補充によって）。
【０１２８】
したがって一実施形態では、本発明の組成物は特に、過免疫卵およびそれから生成される任意の生成物（すなわち食品生成物または非食品生成物）を含む組成物の生成を対象とし、これらは本発明のサイトカイン活性化因子のために富化され、免疫系の調整において有用である。天然であるので、副作用を心配することなく、これらの食品生成物を使用して免疫系を調整することができる。ただし、当然ながら卵に寛容性のない人々が苦しむアレルギー反応は除く。卵生動物、より好ましくは少なくとも１つの免疫原によって過免疫化されている鳥類から、過免疫卵が得られることが好ましい。過免疫卵生成物を選択、スクリーニング、または生成して、同じまたは異なる免疫原によって免疫化される同じ種族の卵生動物からの過免疫卵の平均的な含有量よりも、統計的に有意な高度のＣＡＦ含有率（たとえばｐ＞０．０５）を有することができる。過免疫卵生成物は、実施例１に記載するものと同様なＣＡＦ富化型分画成分にさらに分離されることが好ましい。
【０１２９】
たとえば、いくつかの過免疫卵生成物のバッチをスクリーニングして、卵生成物の乾燥重量あたりのサイトカイン活性化因子のレベルが高い過免疫卵生成物を選択することができる。代替方法として、過免疫化プロセスを監視することができ（たとえば免疫化プロセス中に卵生成物をサンプリングすることによって）、したがってサイトカイン活性化因子の最大限の生成が達成される。サイトカイン活性化因子を検出する方法は、たとえば任意の適切なタンパク質精製および定量化法による（典型的な精製方法に関しては実施例セクションを参照のこと）生成物中の因子の精製および定量化を含むが、これらだけには限られない。一実施形態では、卵サンプル中のタンパク質に選択的に結合する本発明の抗体を使用して、過免疫卵生成物中のサイトカイン活性化因子の量を検出する。
【０１３０】
さらに、卵生成物を分画および／または精製して、卵生成物中の他の成分と比較した本発明のサイトカイン活性化因子の存在を富化させることができ、または最初の卵生成物中のＣＡＦの量と比較して最終生成物中のＣＡＦの量（たとえば重量）を増大させることができる。分画成分または精製された生成物中のサイトカイン活性化因子の量は、未精製の過免疫食品生成物中に存在するサイトカイン活性化因子の量と比較して、少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なくとも約２５％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約１００％富化させることが好ましい。最初の生成物中のサイトカイン活性化因子の量と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、さらに好ましくは少なくとも約５倍、さらに好ましくは少なくとも約１０倍、さらに好ましくは少なくとも約５０倍、さらに好ましくは少なくとも約１００倍、さらに好ましくは少なくとも約５００倍、分画成分または精製された生成物中のサイトカイン活性化因子の量が富化されることがさらに好ましい。一実施形態では、本発明のサイトカイン活性化因子をほぼ１００％の純度まで精製し、したがってそれをほぼ純粋な因子として、本明細書に記載される任意の組成物に加えることができる。他の実施形態では、本明細書の他の部分で論じるように、組換えまたは合成によって本発明のサイトカイン活性化因子を生成する。
【０１３１】
卵生動物を過免疫化するための方法を、以下に簡潔に記載する。任意の卵生動物によって、過免疫卵または卵生成物を生成することができる。卵生動物はＡｖｅｓクラス、すなわち鳥類のメンバーであることが好ましい。Ａｖｅｓクラスの中では家畜用のニワトリが好ましいが、七面鳥、アヒル、およびガチョウなどのこのクラスのほかのメンバーも過免疫卵生成物の適切な源である。
【０１３２】
たとえば免疫原の周期的な追加投与によって、このような卵生動物が免疫化の特異的な状態になるとき、サイトカイン活性化因子の過剰レベルを含めて対象物中の免疫系の調整に効果的である、有益な特性を有する（対象物によって消費されるとき）卵を動物は産む。
【０１３３】
卵生動物において免疫感度のみを誘導することは、卵中の過剰レベルのサイトカイン活性化因子の出現を引き起こすには不充分である。このことは、鳥類の疾患に対する正常な免疫化中および環境因子への正常な暴露中に、鳥類がさまざまな免疫原に対して感作されていても、食卓の卵はこのような過剰レベルを含まないという事実によって示される。特異的な過免疫化状態においてのみ卵がサイトカイン活性化因子の所望の過剰レベルを有することは、本発明者達の発見である。
【０１３４】
卵が高レベルのサイトカイン活性化因子を含む過免疫化のこの特別な状態は、一次免疫を投与し、次に非常に多量の特異的な免疫原または免疫原の混合物を周期的に追加することによって得られることが好ましい。好ましい追加の投与量は、鳥類の一次免疫を生み出すために必要な投与量の５０％以上であるべきである。したがって、境界の追加投与量が存在し、それ未満では鳥類が正常では免疫状態と呼ばれる状態にあっても、鳥類の卵中で性質が生み出されない。過免疫化状態を進展させ維持するための要件の知識を有しているので、動物を過免疫化状態で維持するために、使用する卵生動物属および族に応じて、投与する免疫原の量を変化させることは当分野の範囲内である。さらに、本発明によって提供されるＣＡＦの知識によって、たとえば追加の数または投与量を増加することによって、または特異的な免疫原を選択することによって、免疫化方法をさらに改質することができ、これによってこのような選択／スクリーニング方法にさらされていない平均的な過免疫卵と比較して、ＣＡＦの生成を増大させる結果となる。
【０１３５】
任意の免疫原または免疫原の組み合わせによって、過免疫化状態が生み出されることが好ましい。多数の免疫原への多数の暴露、１つの免疫原への多数の暴露、または免疫原のライブラリーへの１回の暴露によって、過免疫化が達成されることが好ましい。細菌性、ウイルス性、原生動物、アレルゲン、真菌または細胞の物質を含めて（これらだけには限らないが）、ほぼすべての免疫原を使用して過免疫化状態を誘導することができる。
【０１３６】
天然に存在する免疫原を用いる免疫化に加えて、組み合わせた化学物質によって合成的に誘導される免疫原を使用して免疫化を行うこともできる。この基本的戦略は、多様性のある分子群を生み出すために、化学的構成単位の多数の組み合わせを集めることである。オリゴマーのライブラリーの固体および溶液相の組み合わせ合成に関するいくつかの方法が、近年開発されている（Ｆｏｄｏｒ、Ｓ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２（１９９１）および小さな有機分子（Ｂｕｎｉｎ、Ｂ．＆  Ｅｌｌｍａｎ、Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９９７（１９９２））。迅速な多数のペプチドおよびオリゴマー合成は、誘導型免疫原を組み合わせるための源として機能することができる。さらに、代替的戦略によって、免疫性を高めるために、組み合わせた形の有機構成単位を主鎖分子に加えることが可能になるはずである。
【０１３７】
免疫性ワクチンの代わりに、代替的な形態の過免疫化卵生動物の代替的な形態を使用することができ、これは遺伝的ワクチンの使用を含む。特に任意のＤＮＡ構築体（一般にプロモーター領域および抗原をコードする配列からなる）が、免疫応答を引き起こすはずである。遺伝的ワクチンは抗原をコードしているベクター、裸のＤＮＡのカットオフ、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ抗原、ＤＮＡ−タンパク質共役体、ＤＮＡ−リポソーム共役体、ＤＮＡ発現ライブラリー、および免疫応答を生み出すために送達されるウイルスおよび細菌のＤＮＡからなる。ＤＮＡ送達の方法には、粒子のボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接的注入、ウイルス性ベクター、リポソームおよびジェット注入などがある。これらの送達方法が適用されるとき、より少量が必要となる可能性があり、一般により永続的に免疫原が生成される結果となる。このような遺伝的方法を使用するとき、鳥類にＤＮＡを導入するための好ましい方法は、ＤＮＡの胸筋への筋肉内注入によるものである。
【０１３８】
ＤＮＡ送達の方法には、粒子のボンバードメント、直接的注入、リポソーム、ジェット注入（Ｆｙｎａｎ、Ｅ．Ｆ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１４７８〜１１４８２（１９９３））があるが、これらだけには限られない。知られている（または知られていない）免疫原、プロモーター領域（ＣＭＶ、カリフラワーモザイクウイルスのものが有名）およびＳＶ４０細菌性起点をコードしている核酸を細菌中で複製して、ＤＮＡ注入において使用するためのプラスミドＤＮＡを生成することができる。ＤＮＡの非経口投与のいくつかの経路はニワトリにおいては効果的であるが、好ましい方法は胸筋への筋肉内注入である。ワクチントライアルは卵を産む鳥類、好ましくはニワトリに実施する。６カ月間にわたって１から２週間間隔で、繰り返し免疫化を行う。
【０１３９】
使用するＤＮＡの量は一般に、直接的注入用の生理食塩水中に約５０〜３００マイクログラムのＤＮＡがあることが好ましい。粒子のボンバードメント用には、２．５ＭのＣａＣｌ2の添加によって金のビーズ上に共沈殿される４〜１００ミリグラムのＤＮＡが好ましい。ＤＮＡ被覆された粒子の生きている動物中への速度を速めるこの方法によって、皮内で繰り返し免疫化を行うことができる。
【０１４０】
産卵性動物より得られた過免疫状態の卵または卵生成物を対象体に投与することができる、産卵性動物を免疫が高められた状態に導くために用いられる好ましい方法の詳細な内容は米国特許第５，７７２，９９９号に記載されており、全体は参照として本明細書に組み込まれる。簡単には、ＣＡＦの精製に用いるためにまたは対象体に投与するためのＣＡＦ富化食品を生産するために、産卵性動物を免疫が高められた状態に導くために用いられる方法の一例は、以下の通りである。このような手順を上記のように変更して、より増強されたＣＡＦの製造について選択またはスクリーニングできることは理解されよう。一般的に、過免疫化方法は、以下のステップを含む：
１．１つまたは複数の抗原を選択すること。
２．一次免疫により産卵性動物に免疫応答を誘発すること。
３．過免疫化状態を誘発し維持するために適切な用量の抗原の追加免疫ワクチンを投与すること。
４．過免疫化状態が維持された産卵性動物から過免疫化卵生成物を生産するために、卵を採集し加工すること。
【０１４１】
ステップ１    如何なる抗原または抗原の組み合わせも使用することができる。抗原は、細菌性の、ウイルス性の、原生動物の、真菌の、細胞性の、またはいかなる他の物質であってもよく、これに産卵性動物の免疫系が応答する。このステップにおける臨界点は、抗原が産卵性動物を免疫化および過免疫化状態に導くことができるべき点である。好ましいワクチンの１つは、シリーズ１００（Ｓ−１００）ワクチンと言われる（ＰＬ−１００とも言われる）多価細菌性抗原の混合物である。Ｓ−１００ワクチン（ＰＬ−１００）に含まれる細菌は、米国特許第５，７７２，９９９号に記載されている（表１）。このワクチンは米国特許第５，１０６，６１８号および５，２１５，７４６号に既に記載されており、全体は参照として本明細書に組み込まれる。使用される他の好ましいワクチンはＥＢ−１００Ｅワクチンであり、この詳細も米国特許第５，７７２，９９９号の実施例１に記載されている。
【０１４２】
ステップ２    ワクチンは死菌または生菌弱毒化ワクチンであってもよく、免疫応答を誘発するいかなる方法によっても投与できる。筋肉注射で抗原を投与することにより免疫化を行うことが好ましい。鳥類において注射する好ましい筋肉は胸筋肉である。抗原ワクチンの好ましい用量は０．５〜５ミリグラムである。使用できる他の投与方法は、静脈注射、腹腔内注射、直腸に入れる座薬、または経口投与を含む。ＤＮＡ技術を過免疫化プロセスに用いる場合は、より少量が必要であり、通常１〜１００マイクログラムである。免疫学の分野における技術を有する当業者に知られている多くの方法により、ワクチンが産卵性動物に免疫応答を誘発するかどうかを確かめることができる。これらの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、刺激抗原に対する抗体の存在試験、および抗原への応答に対する宿主からの免疫細胞の能力を評価するために設計された試験を含む。一般的に、ワクチンでの免疫化後、卵抗体は免疫応答を示す。免疫応答を誘発するのに必要な抗原の最低用量は、使用するワクチン接種方法に依存し、使用する抗原型と同様宿主として使用される産卵性動物の型にも依存する。
【０１４３】
ステップ３    過免疫化状態は、定時間間隔で適切な用量の追加免疫投与を繰り返し行うことにより好ましくは誘発され維持される。好ましい時間間隔は、６カ月にわたり２週間間隔である。しかしながら、追加免疫投与は免疫寛容を導かないことが重要である。例えば一次免疫のための筋肉注射およびブースタ注射のための静脈注射などの、他の過免疫化維持方法または方法の組み合わせを用いることができる。別の手順には、マイクロカプセル化および液体抗原の同時投与、または一次免疫のための筋肉注射、およびマイクロカプセル化方法による経口投与または非経口投与による追加抗原投与を含む。一次免疫化と過免疫化とのいくつかの組み合わせが当業者に知られている。
【０１４４】
ステップ４    過免疫卵を対象投与するため、または多くの方法で精製するために加工することができる。これらは、（例えばカプセル中）実質的に単独で過免疫卵生成物を含む組成物を調製すること、および対象体に投与するための食品中に過免疫卵生成物を組み込むこと、または本明細書に記載するようにサイトカイン活性化因子のための精製手順に従うことを含む。
【０１４５】
他の実施形態において、本発明の組成物は、精製された、組み換えられた、化学的に合成された、充分精製された、または他の何れでも富化された形態でのＣＡＦを、薬剤として許容できる適切な担体と組み合わせて含むことができる。本発明に従う薬剤として許容できる適切な担体は、上述のように、薬剤として許容できる賦形剤、徐放性媒体、および薬剤として許容できる送達媒体を含む。組成物は送達に適切な如何なる形態であってもよく、液剤、煙霧剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、ゲル剤および顆粒剤を含むがこれらに限定されるものではない。非経口投与に特に適切なＣＡＦの調製は、無菌水溶液または非水溶液、懸濁液、または乳濁液を含む。非水溶性溶媒または媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。
【０１４６】
固体剤形において、ＣＡＦタンパクは、ショ糖、乳糖またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合することができる。このような剤形は、通常の慣行であるように、不活性希釈剤以外の他の物質をさらに含むこともできる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤、ｐＨ−感応性ポリマー、または食品産業および製薬業において組成物をカプセル化するためまたは他の除放性配合物をカプセル化するために通常用いられる他の除放性カプセル材料（即ち、除放性媒体）を含んでもよい。錠剤および丸剤はさらに、腸溶コーティングして調製することができる。
【０１４７】
経口投与のためのサイトカイン活性化因子の液体剤形は、薬剤分野で通常用いられる不活性希釈剤を含み、薬剤として許容できる乳濁液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。不活性希釈剤の他に、組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、および甘味剤を含むこともできる。
【０１４８】
１つの実施形態において、組成物は食品の形態である。この実施形態において、１つの側面では、ＣＡＦ富化卵、このＣＡＦ富化分画成分、高度に精製されたＣＡＦ、組み替え型ＣＡＦ、および／または化学的に合成されたＣＡＦを栄養剤に組み込む。栄養剤に組み込むように卵または卵の任意の分画成分を調製する好ましい方法の一つは、卵を粉末に乾燥することを含む。卵を乾燥する多くの方法が知られているけれども、スプレー乾燥が好ましい方法である。卵をスプレー乾燥する方法は当技術分野で知られている。このように乾燥された卵の粉末は、例えばタンパク質粉末、精力飲料、タンパク質補助剤および他の栄養あるスポーツ関連製品の形態で飲料に取り入れることができる。加えて、卵粉末は、ベークミックス、パワーバー、キャンディ、クッキーなどに用いることができる。卵を加工する他の例は、オムレツ、半熟卵または固ゆで卵、または卵焼きを調理することを含み、または所望であれば、卵を生でまたは液体卵として食することができる。本発明のＣＡＦ富化卵生成物の好ましい分画成分は、該過免疫化卵生成物の液状卵黄、液状卵白、粉末状卵黄、粉末状卵白、および／または水溶性分画成分を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
本発明の１つの実施形態において、組成物は、本明細書に既述したように（ＣＡＦのホモログを含む）ＣＡＦタンパクをコード化する核酸配列を含む組み替え型核酸分子、および／またはＣＡＦタンパクに選択的に結合する抗体を含む。
【０１５０】
本発明の組成物は、多くの適切な方法により、（サイトカインアッセイ中などの）細胞培養液にまたは患者に送達（即ち投与）することができる。このような方法の選択は、投与または送達される化合物（即ち、タンパク質、核酸、模倣体）のタイプ、送達様式（即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ）、および化合物または組成物を投与／送達することにより得られる目標により変化する。本発明によれば、効果的な投与手順（即ち、効果的な方法で組成物を投与すること）は、所望の部位に（即ち、所望の細胞に）組成物を送達することになるおよび／または対象体に免疫応答を調整することになる、適切な用量パラメータおよび投与様式を含む。好ましくは、本発明の組成物は、対象動物に免疫システムを調節する如何なる方法によっても、対象動物に投与される。
【０１５１】
投与経路は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ経路を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ経路は、経口、鼻腔、気管注射、吸入、経皮、直腸、カテーテルの注入、座薬、組織への直接注射、および非経口経路を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい非経口経路は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内および腹腔内経路を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の１つの実施形態において、本発明のＣＡＦタンパク、抗体、模倣体、または核酸を含む組成物を非経口経路で投与する。静脈内、腹腔内、皮内、皮下および筋肉内投与は、当技術分野での標準方法を用いて行うことができる。噴霧（吸入）送達も当技術分野での標準方法を用いて行うことができる（例えば、ＳｔｒｉｂｌｉｎｇらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９巻、１１２７７〜１１２８１頁、１９９２年を参照のこと。これは全体を参照として本明細書に組み込まれる。）。他の実施形態において、本発明のＣＡＦタンパクを含む組成物を、経口投与する。経口送達は、動物の内臓中での消化酵素による分解に耐えることができる担体と本発明の治療用組成物とを複合化することにより行うことができる。本発明のＣＡＦタンパクは消化酵素に対して特に耐性があり、それゆえこのような担体は重要ではないことに留意されたい。このような担体の例は、当技術分野で知られている担体などの、樹脂製カプセル剤または錠剤を含む。この種の経路は、上述のように薬剤として許容できる担体を使用することを含む。ｅｘ  ｖｉｖｏは、組換え型分子が形質移入した細胞により続いて発現されるような条件下で本発明に従うタンパク質をコード化する核酸配列を含む組換え型分子で患者から除去した細胞の集合を形質移入することによる、および患者に形質移入した細胞を戻すことによるなどの、患者の外部で調整ステップの部分を行うことを言う。宿主細胞の培養液へ組成物を投与するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ経路は、形質移入、形質転換、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション、吸着、プロトプラスト融合、タンパク質搬送剤の使用、イオン搬送剤の使用、細胞透過化処理のための洗浄剤の使用、および培養液中の化合物を標的細胞と単純に混合すること（例えば、コンバインすること）を含む方法により行われるが、これらに限定されるものではない。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明のサイトカイン活性化因子が富化され、過免疫化動物から採集された過免疫卵またはこの分画成分を、実質的に対象動物に投与できる過免疫卵生成物を生産するために加工する。１つの実施形態において、対象動物に卵またはその誘導体を直接飼料として与えることにより投与する。卵は無毒で安全な天然食品材料であることを認識することは重要である。同様に、他の実施形態において、実質的に精製され、組み替え型として生産され、または合成的に生産されたサイトカイン活性化因子を、続いて動物に投与できる様態で調製（例えば、配合化）することが好ましい。
【０１５３】
免疫システムの調節を行う場合、本発明の組成物は、サイトカイン（即ち、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−６）発現および好ましくはサイトカイン活性化および免疫調節を行うのに免疫学的に効果的な量を対象体に投与することが好ましい。処置の持続時間および強度は、特定の対象体および対象体の状態、および存在するかどうかという状態、そして存在する場合の対象体における状態の進歩に依存する。組成物は、状態および症状を処置および／または予防する如何なる量でも提供される。例えば、ＣＡＦ富化過免疫卵またはこれから生産された生成物を投与する場合、１日当たり１未満から数個の範囲である量の免疫化全卵（または１未満から数個の範囲である量の免疫化全卵を当量含む免疫化卵生成物）を特定の状態環境に依存して対象体に投与できる。本明細書に記載の方法と同様当技術分野で知られている他の方法により、より強力な分画成分を分離し濃縮することができる。ＣＡＦ富化過免疫卵または卵生成物を対象体に投与することに関して、対象体に与えられる過免疫卵または卵生成物の好ましい用量範囲は、対象体の重量１Ｋｇ当たり１００ミリグラムから１０グラムの間であるとされている。
【０１５４】
高度に精製したＣＡＦ、組み替え型ＣＡＦおよび／または化学的に合成したＣＡＦを含む、本発明の単離されたサイトカイン活性化因子に関して、高純度化した組成物の好ましい用量範囲は、対象体の重量１Ｋｇ当たり１ナノグラムと４００ミリグラムの間であるとされている。好ましい実施形態において、好ましい用量範囲は、対象体の重量１Ｋｇ当たり約０．０１マイクログラムと約１００ミリグラムの間である。他の実施形態において、タンパク質または抗体は、患者の体重１Ｋｇ当たり約０．１μｇと約１０ｍｇの間、より好ましくは対象体の重量１Ｋｇ当たり約０．１μｇと約１００μｇの間の量を投与する。
【０１５５】
送達される化合物が核酸分子である場合、適切な単一用量は、送達される核酸１μｇ当たりの全組織タンパク質１ｍｇ当たり、発現したタンパク質が少なくとも約１ｐｇとなる量である。より好ましくは、適切な単一用量は、送達される核酸１μｇ当たりの全組織タンパク質１ｍｇ当たり、発現したタンパク質が少なくとも約１０ｐｇとなる量であり、そしてさらにより好ましくは、送達される核酸１μｇ当たりの全組織タンパク質１ｍｇ当たり、発現したタンパク質が少なくとも約５０ｐｇとなる量であり、そして最も好ましくは、送達される核酸１μｇ当たりの全組織タンパク質１ｍｇ当たり、発現したタンパク質が少なくとも約１００ｐｇとなる量である。核酸ワクチンそのものの好ましい単一用量は、当業者が決めることが出来るように、投与経路および／または送達方法に依存して、約１ナノグラム（ｎｇ）から約１００μｇの範囲である。適切な送達方法は、例えば、注射により、ドロップとして、エアロゾル化して、および／または局所的を含む。１つの実施形態において、純粋なＤＮＡ作成物は金粒子（直径１から３μｍ）表面を被覆し、「遺伝子銃」で皮膚細胞または筋肉に取り込ませる。患者に投与する多くの用量が投与目的（例えば、疾患の程度および処置に対する個々の患者の応答性）に依存することは、当業者に明らかである。それゆえ、適切な用量数は、動物における免疫応答を調整するために、または炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）のアップレギュレーションによりおよび／またはＴＧＦβのダウンレギュレーションにより、処置または予防されると期待される疾患または状態を調整するために必要な如何なる数をも含み、このことは本発明の範囲内である。ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的な用量パラメータは、当技術分野における標準の方法を用いて決めることができる。このような方法は、例えば、生存率の測定、副作用（即ち、毒性）、細胞性および体液性免疫応答効果の測定、および／またはこの種の免疫応答効果に関連する状態への効果を含む。
【０１５６】
動物での免疫応答を調節する方法を提供することは、本発明の１つの実施形態である。本実施形態は、本明細書に既述したように、本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパクを含む組成物を動物に投与するステップを含む。好ましい実施形態において、組成物は、本明細書にも既述したように、薬剤として許容できる担体を含む。この実施形態において、本発明の組成物は、免疫システムの局所的なまたは全身の刺激剤として使用することができる。局所的なまたは全身の細菌性感染症を予防および／または処置することもでき、一般的な抗癌剤として用いることができた。細菌性感染症または腫瘍形成の特異部位に静脈経路によって送達するように、組織特異性抗体などの特異的送達剤で標識することもできる。細胞の細胞質および核膜を通して送達し、それによってＲＮＡレベルでＴＮＦα、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−６発現の調整を行うように、市販されている特異的リポソームまたは送達媒体と混合することもできる。好ましい経路および用量を含む適切な投与形態は上述している。好ましくは一用量で、およびＴＮＦα、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−６の発現を増加させることによっておよび／またはＴＧＦβの発現を減少させることによって免疫応答を調整するのに適切な経路により、本発明の組成物を動物に投与する。
【０１５７】
本発明の１つの実施形態は、動物における癌を処置する方法に関し、本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパクを含む組成物を、癌が発達しているまたはする危険性がある動物に投与することを含む。投与の方法および組成物の詳細は既に詳細に記載している。好ましくは、組成物を投与すると、癌の症状の減少、癌に伴う腫瘍の減少、癌に伴う腫瘍の消去、転移性癌の予防、癌の予防および癌に対する効果細胞免疫の刺激、の群から選択される結果となる。
【０１５８】
また、本発明の他の実施形態は、動物での敗血症および／または敗血症性ショックを処置または予防する方法に関する。このような方法は、本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）タンパクを含む組成物を、敗血症または敗血症性ショックが発達しているまたはする危険性がある動物に投与するステップを含む。投与の方法および組成物の詳細は既に詳細に記載している。好ましくは、組成物を投与すると、敗血症または敗血症性ショックの症状の減少、敗血症または敗血症性ショックの予防、および敗血症または敗血症性ショックに伴う細菌性抗原に対する効果細胞免疫の刺激、の群から選択される結果となる。
【０１５９】
本発明の有利な性質は、本発明を例証する以下の実施例に参照により観察することができる。これらの実施例は例証を目的とするものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【０１６０】
（実施例）
実施例１
以下の実施例は、本発明のサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）の精製、単離および配列決定を示す。
【０１６１】
サイトカイン活性化因子の精製
ＣＡＦ精製の全般的な要約
ＣＡＦは最初に、７つのステップでＰＬ−１００全卵から６００，０００倍に精製したが（図１６）、これはＨＰＬＣクロマトグラムで均一成分であることが示された。プロセスを通してＣＡＦの精製は、分画成分をサイトカインアッセイ（下記に示す）によりＣＡＦ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性についてアッセイすることにより追跡した。全卵を最初のステップで卵黄に分画した。卵黄を脱脂した後、限外濾過法を用いて３，０００ダルトン（またはそれ未満）透過物分画成分としてＣＡＦを濃縮した。二次構造が許容される場合（即ち、実質的に直線のポリペプチド／タンパク質）、極めて大きなタンパク質はフィルターを通過できるので、３，０００ダルトンカットオフは概算であることは注意すべきである。３，０００ＭＷカットオフフィルターを通過した透過物を、さらに分離するためにＱセファロースクロマトグラフィにかけた。ＣＡＦは強い負電荷分子であると思われ、これはＱセファロースカラムに強く結合し、そして０．３ＭのＮａＣｌにより溶出できる。次のステップにおいて、多量のＮａＣｌを除去するために固相抽出を用いた。このステップでも他のより極性の成分を除去することによりＣＡＦ精製が向上した。ＳＰＥのＣＡＦ活性分画成分は水不溶性成分を含み、これは酢酸エチルおよびエタノールで抽出され、ＣＡＦを水溶性成分にする。最後に、ＣＡＦを逆相Ｃ18ＨＰＬＣおよびゲル濾過ＨＰＬＣにより均一成分に分離した。ＣＡＦ精製の全収率は約２％と見積もられた。全卵中のＣＡＦ量は３〜５ｐｐｍと計算される（表１）。
【０１６２】
【表１】
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【０１６３】
精製工程における個々のステップを以下により特に記載する。
【０１６４】
卵黄脱脂
スプレー乾燥したＰＬ−１００卵黄は、ＣＡＦを含み、脂質、タンパク質、炭水化物、灰分、および多くの生物学的因子を含む。脂質および水不溶性タンパク質を除去するために、卵黄をカプリル酸相抽出により処置し、続いて遠心分離した。ＣＡＦおよび他の水溶性成分を水相中に得た。
【０１６５】
超純水９リットル中に氷酢酸３．０ｍｌおよびカプリル酸１００ｍｌを溶解することにより、ＰＬ−１００卵黄用の脱脂緩衝剤を調製した。緩衝剤のｐＨはおおよそ５．０である。卵黄物質（１．０Ｋｇのスプレー乾燥した卵または２．０リットルの殻付き卵黄）を緩衝剤に添加し、混合物を室温下２４，０００ｒｐｍで５分間混合することにより更に均質化した。フォームを除去し、カプリル酸を補うために更にカプリル酸２０ｍｌを混合物に添加した。相分離するために、卵混合物を室温で２時間以上保持した。凝集物を除去し、卵混合物の水相を室温下２，１９０×ｇで２０分間遠心分離した。卵黄の上清をワットマン濾紙（１１３Ｖ、４０μｍ）を通して濾過した。上清のｐＨを２．０ＭのＮａＯＨで７．５に合わせた。
【０１６６】
卵黄の３，０００ダルトンＭＷ透過物の調製
脱脂した卵黄の上清は、水溶性タンパク質およびＣＡＦを含む。ＣＡＦは限外濾過法により大分子量成分から分離できる。この調製において、卵黄上清液体を、濾過ユニット（３Ｋ  ＭＷＣＯ、ＡｍｉｃｏｎモデルＣＨ２ポンプケースおよびスパイラルカートリッジアダプターキット）に取り付けた２２Ｌ容器に注ぎ入れた。ポンプ圧を濾過の注入口および出口の両方でおよそ０．２１ＭＰａ（３０ｐｓｉ）に維持した。およそ３，０００ダルトン未満（３０００Ｄａカットオフフィルターを透過するというその性能に基づいて）の明らかな分子量を有する成分を透過物として収集し、貯蔵のため凍結乾燥またはＣＡＦ精製のため凍結した。全卵黄のおよそ２％が３，０００ダルトン透過物（「３Ｋ透過物」とも本明細書に言う）として得られる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでＴＮＦαおよびＩＬ−１βに対するＣＡＦ活性を測定して、ＣＡＦタンパクの存在を追跡した（図１および２）。卵黄の３，０００ダルトンＭＷ透過物も、コラーゲンＩＩ誘発関節炎および空気嚢動物アッセイを用いて試験した（データは示していない）。純度決定のため、３Ｋ透過物を逆相Ｃ18ＨＰＬＣにより分析した（図３）。
【０１６７】
Ｑセファロースイオン交換クロマトグラフィ
３０００ダルトン透過物中のＣＡＦを、アニオン交換Ｑセファロースクロマトグラフィにより更に精製した。３，０００ダルトン透過物中のほとんどの成分は正電荷を有する分子であり、Ｑセファロースに結合しなかった。しかしながら、本実施例では、ＣＡＦはＱセファロースに結合し、強い負電荷を有する分子であると考えられた。ＱセファロースによるＣＡＦの精製は、極めて効果的な方法であった。Ｑセファロースカラムを設置するため、２，０００ｍｌのＱセファロースを１，０００ｍｌのｄＨ2Ｏで希釈し、ガラスカラム（８×４０ｃｍ）にロードした。長さに対するＩ．Ｄ．の比は１：５であった。クロマトグラフィは室温で行った。流速２，５００ｍｌ／時間、ｐＨ７．５で、水４，０００ｍｌおよび２０ｍＭの酢酸アンモニウム８，０００ｍｌを用いてカラムを平衡化した。３，０００ダルトン透過物２０〜３０Ｌを１，５００ｍｌ／時間の流速でＱセファロースカラムにかけた。Ｑセファロースを２，０００ｍｌ／時間の流速で以下の緩衝剤を用いて段階的な溶出により洗浄した：（１）カラムを洗浄して結合していない分子を溶出するため、２０ｍＭの酢酸アンモニウム４，０００ｍｌ、ｐＨ７．５、（２）弱く結合している分子を溶出するため、３００ｍＭの酢酸アンモニウム４，０００ｍｌ、ｐＨ６．５、（３）ＣＡＦおよび他の分子を溶出するため、０．３ＭのＮａＣｌ  ４，０００ｍｌ、（４）最も強く結合している分子を溶出し、Ｑセファロースカラムを再生するため、１．５ＭのＮａＣｌ  ４，０００ｍｌ。１，２００ｍｌ溶出後、０．３ＭのＮａＣｌの画分をフラスコに採集した。更にＣＡＦを精製するために、０．３ＭのＮａＣｌの画分を固相抽出にかけた。ＴＮＦαおよびＩＬ−１βｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに対するＣＡＦ活性を測定した。（図４）。３，０００ダルトンＭＷ透過物も逆相Ｃ18ＨＰＬＣにより分析した（図５）。
【０１６８】
固相抽出（ＳＰＥ）
Ｑセファロースからの０．３ＭのＮａＣｌの画分は、ＣＡＦおよび大量の塩を含む。固相抽出（ＳＰＥ）法を、塩を除去しＣＡＦ純度を高めるために導入する。固相抽出は、液／液抽出に代わって、便利で、安価で、そして時間節約的である。本方法は通常、分析または単離目的のため化合物をきれいにし濃縮するために使用される。ＳＰＥへのＣＡＦの結合を向上するために、Ｑセファロース分画成分をトリフルオロ酢酸を用いてｐＨ２．０に合わせた。酸性画分を相互作用条件下カラム（５×２２ｃｍ）中逆相Ｃ18樹脂にかける。Ｑセファロース分画成分を流速４０ｍｌ／分で室温下ＳＰＥカラムにロードした。２５４ｎｍの波長でクロマトグラフィを監視した。ＣＡＦおよび他の成分は充填物質に保持され、ほとんどの汚染物質はカラムを通過した。ｐＨ２．０の水８００ｍｌおよびｐＨ２．０の１５％アセトニトリル水溶液１，２００ｍｌでカラムを洗浄した。充填カラムに保持されたＣＡＦおよび他の成分を、ｐＨ２．０の１００％アセトニトリルで選択的に洗い流した（図６）。ＣＡＦ分画成分（ＳＰＥ分画成分とも言う）を少量採集した。高度に精製したＣＡＦを凍結乾燥し、更に精製の準備をした。ＴＮＦαおよびＩＬ−１βｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに対するＣＡＦ活性を測定した（図７）。ＳＰＥ分画成分も逆相Ｃ18ＨＰＬＣにより分析した（図８）。
【０１６９】
固相抽出成分の分配抽出
第１の分配抽出ステップ（図１６）：  Ｑセファロースの固相抽出画分は水不溶性成分（即ち、溶剤可溶性成分）を含むことが示された。この成分を酢酸エチルおよびエタノールで抽出し、ＣＡＦを水溶性分画成分（即ち、ＳＰＥ水溶性分画成分）にした。簡単には、１００ｍｇの固相抽出画分を酢酸エチル１０ｍｌに添加し、室温下２０分間保持した。混合物をガラス製遠心管に移して２，１９０×ｇで２０分間回転させた。白色ペレット（ＳＰＥ水溶性成分）を遠心分離後に得た。酢酸エチルを除去し、次に酢酸エチル１０ｍｌを添加してもう一度本ステップを繰り返した。その後、エタノール５．０ｍｌをペレットと混合し、２，１９０×ｇで２０分間遠心分離した。
【０１７０】
ＳＰＥ水溶性分画成分は、動物関節炎モデルで炎症を阻害した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＳＰＥ水溶性分画成分（回転後の白色ペレット）は、ＴＨＰ−１細胞中のＴＮＦαおよびＩＬ−１βを刺激した。対照的に、ＳＰＥ水不溶性分画成分はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてこのような活性を示さなかった。
【０１７１】
第２の分配抽出ステップ（図１６）：  ｐＨ７．０の２０％アセトニトリルを含む２０ｍＭのＮＨ4ＯＡｃ水溶液５．０ｍｌでＳＰＥ分画水溶性成分を更に洗浄し、２，１９０×ｇで２０分間回転させた。中性ｐＨでは、水溶性分画成分（図１６、中性ｐＨ  ＷＳＦ）および水不溶性成分がある。以下に記載するように分離用ＨＰＬＣでＣＡＦを精製するため、（中性ｐＨで）水不溶性分画成分を凍結乾燥した。この中性ｐＨの水不溶性分画成分は、中性ｐＨで実質的に水に不溶であるけれども、低ｐＨでは水に可溶であることを本発明者らは見出し、それゆえ酸性ｐＨ水溶性成分と称する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＮＦαおよびＩＬ−１βに対するＣＡＦ活性（図９）は、酸性ｐＨ  ＷＳＦで確かめられ、このＣＡＦ活性分画成分（即ち、図１６、酸性ｐＨ  ＷＳＦ）を逆相Ｃ18ＨＰＬＣで更に分析した（図１０）。ＳＰＥ水溶性分画成分（回転後のペレット）は、ｐＨ２．０の０．１％ＴＦＡを含む水にまたは高いｐＨ１２．０での水に可溶であるが、ｐＨ７．０の水にはほとんど溶解しない（１．０ｍｇ／ｍｌ）。このことは、ＳＰＥ水溶性分画成分は、ペプチドに通常存在するアミン基およびカルボン酸基の両方を有していることを示している。
【０１７２】
Ｃ18ＨＰＬＣ分離
固相抽出の酸性ｐＨ水溶性分画成分は、ＨＰＬＣクロマトグラムで示すように、単一成分を含むことが分かった（図１１）。既述したように、この単一ピークはサイトカイン誘発研究においてＣＡＦ活性を有すると同定された。このＣＡＦ富化分画成分を逆相Ｃ18ＨＰＬＣにより更に３つの成分に分離した。この分離において、島津ＨＰＬＣユニットを使用した。ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ  ＶＰダイオードアレイ検出、ＬＣ−６ＡＤ液体クロマトグラフィ、ＳＣＬ−１０Ａ  ＶＰ脱気装置、ＬＰＭ−６００低圧混合、およびＣＴＯ−１０Ａ  ＶＰカラムオーブンを装備している。０．１％ＴＦＡを含む純水中１．０ｍｇ／ｍｌとして酸性ｐＨ水溶性成分を調製した。サンプル３．０ｍｌを２９℃でおよび流速１２．０ｍｌ／分でＢＴＲ  ＩＭＰＡＱ  Ｃ18カラム（１０μｍ、２２×２５０ｍｍ）にかけた。０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むｄＨ2Ｏ中のメタノールの２０％〜１００％の直線勾配を移動相として使用した。直接上記に参照した３つの画分をＣＡＦ単離のために採集した。これらをＣＡＦｏ、ＣＡＦａおよびＣＡＦｂと名付けた。画分中のアセトニトリルをロータリーエバポレーションにより除去し、水を凍結乾燥で除去した。画分ＣＡＦｂ（４７分〜４９．５分）はＨＰＬＣクロマトグラムで同定された単一ピークを含むことを測定した（図１２）。この画分もｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＮＦαおよびＩＬ−１β活性を示し、このことはＣＡＦがＣＡＦｂとして均一成分に精製されたことを示している（図１３）。
【０１７３】
ゲル濾過ＨＰＬＣ分離
上述のように島津ＨＰＬＣ装置でのゲル濾過ＨＰＬＣを用いて、上記ＳＰＥおよびＣ18ＨＰＬＣからの多くの成分を更に精製した。簡単には、運転条件下（緩衝剤：５０ｍＭのＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ８．０、流速：１．０ｍｇ／ｍｌ、２０℃、２０分）、ゲル濾過ＨＰＬＣカラム（２５０×９．４ｍｍ、Ｚｏｒｂｏｘ  ＧＦ−２５０バイオシリーズ）にサンプルをロードした。サンプルを１．０ｍｇ／ｍｌ未満で運転緩衝剤に溶解させ、それぞれの運転時間で３０μｌを注入した。
【０１７４】
ＳＰＥ−水溶性画分：  ＳＰＥ−水溶性画分を、１．０ｍｇ／ｍｌ未満、ｐＨ８．０で５０ｍＭのＮＨ4ＯＡｃ緩衝剤に溶解させた。簡単には、ＳＰＥ−水溶性成分１．０ｍｇを緩衝剤と混合した。１０，０００ｒｐｍで５分間回転後、上清を採集した。そしてペレットを再び緩衝剤と混合した。最初の上清を分子量決定のためにＧＦ２５０  ＨＰＬＣにかけた。ＧＦ２５０カラム分離で３種の主な成分があった。これらは５３０，０００Ｄａ、１２２，０００Ｄａおよび１，２４０Ｄａである。３つの成分を採集して、サイトカインアッセイのために凍結乾燥した。５３０，０００Ｄａおよび１２２，０００ＤａのＭＷは、最初の溶解緩衝剤によく溶けていたが、第２の溶解緩衝剤中には見られなかった。しかしながら、１，２４０Ｄａピークは第２の溶解によりよく溶けており、このことは、５３０，０００Ｄａおよび１２２，０００Ｄａの分子は、緩衝剤中にＳＰＥ水溶性分画成分１．０ｍｇを溶解させることによりほとんど除去できることを示している。残った不溶性ペレット（即ち、ＳＰＥ−ＧＦＩＩ）は実際、１，２４０ＤａのＭＷである極めて高純度の化合物である。
【０１７５】
ＣＡＦｂ画分：  Ｃ18ＨＰＬＣ分離からのＣＡＦｂ画分も、その分子量を試験するためゲル濾過ＨＰＬＣカラム（ＧＦ２５０）にかけた。ＧＦ２５０カラムで３種の主な画分が見られ、これらはそれぞれ５３０，０００Ｄａ、１２２，０００Ｄａおよび４０，０００Ｄａであった。５３０，０００Ｄａおよび１２２，０００Ｄａの分子は、２−メルカプトエタノールおよび沸騰により７００，０００Ｄａの大分子に還元することができる。このことは、酸化−還元状態が変化することにより凝集が起こることを示している。
【０１７６】
ＣＡＦｏ、ＣＡＦａ、ＣＡＦｂ：  ＧＦ２５０ＨＰＬＣカラムでの酸性ｐＨ  ＷＳＦからの全てのサイトカイン−陽性ＣＡＦ成分の分子量を比較するため、ＣＡＦｏ、ＣＡＦａおよびＣＡＦｂを分析した。ＣＡＦｏは８．６２１分（ＭＷ１２２，０００Ｄａ）に単一ピークを有している。ＣＡＦａは７．２７分（ＭＷ  ５３０，０００Ｄａ）と８．３９１分（ＭＷ  １２２，０００Ｄａ）に２つのピークを有している。上述のように、ＣＡＦｂはさらに９．４８３分（ＭＷ  ４０，０００Ｄａ）にピークを有している。ＭＷ  ５３０，０００Ｄａおよび１２２，０００Ｄａの分子は、ＳＰＥ水溶性成分で見られたのと同様に、７００，０００Ｄａ分子に還元することができる。しかしながら、ＣＡＦｂの固有の４０，０００Ｄａ成分は還元条件下に安定である（表２）。理論による裏付けはないが、ＣＡＦｂのＮＷ４０，０００Ｄａ分子はＣＡＦの活性部位をまだ保有しており、これが活性ＣＡＦの小分子から凝集できることを示唆している。ＧＦ−２５０  ＨＰＬＣから単離されたＣＡＦｂ成分ＩＩＩ（図１６）（ＭＷ  ４０，０００Ｄａ）をＣＡＦｂ−ＧＦＩＩＩと名付けた。
【０１７７】
【表２】
0004763193.tif 000003
【０１７８】
ＳＰＥ−ＧＦＩＩ：  ＳＰＥ水抽出の上清もＧＦ−２５０  ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣクロマトグラフィにより２つの主要なピークが見られた（８．４０分および１２．２２分）。２つのピークのＭＷは、それぞれ約１２０，０００Ｄａと２，０００Ｄａであった。２，０００Ｄａ分子はＣＡＦｏ、ＣＡＦａおよびＣＡＦｂでは見られなかった。このことは異なる化合物であることを示している。これをＳＰＥ−ＧＦＩＩと名付けた。
【０１７９】
分画成分の生物活性
上述のように、精製工程を通して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカイン活性（ＴＮＦαおよび／またはＩＬ−１βの誘発を測定）を、精製工程を監視するため、および活性分画成分を選択するために使用した。ほとんどの実験において、ＳＰＥ水溶性分画成分は強いＣＡＦサイトカイン活性化活性を有することが測定された。驚くべきことに、高度に精製されたＣＡＦｂは、ＳＰＥ水溶性成分と同等またはそれ以上の活性を示さなかった。理論による裏付けはないが、ＣＡＦｂは引き続く精製工程によりその形態が変化し、サイトカインへのその活性が減少し、そして凝集プロセスが起こっていることを示唆している。
【０１８０】
ＣＡＦ分画成分の特性
Ｃ18ＨＰＬＣ分析
ＣＡＦを含む画分を逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した（島津ユニット、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ  ＶＰダイオードアレイ検出、ＬＣ−６ＡＤ液体クロマトグラフィ、ＳＣＬ−１０Ａ  ＶＰ脱気装置、ＬＰＭ−６００低圧混合、およびＣＴＯ−１０Ａ  ＶＰカラムオーブン）。全ての成分は純水中５．０ｍｇ／ｍｌに調製し、０．２μｍフィルターユニットを通して濾過した。それぞれのサンプル２０μｌを２９℃でおよび流速１．０ｍｌ／分でＷａｔｅｒ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ18カラム（３．９×１５０ｍｍ）にかけた。０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むｄＨ2Ｏ中のアセトニトリル０％〜６０％の直線濃度勾配を移動相として使用した。
【０１８１】
脱脂されたＰＬ−１００卵黄からの３，０００ダルトンＭＷ透過物の分離のマックスプロットクロマトグラフィを図３に示す。同じ分析条件を用いて、上述した精製ステップで生じた画分も得られた（図５、８、１０および１２）。
【０１８２】
ＣＡＦ構造分析
タンパク質ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いてＣＡＦｂの分子量を測定した。その結果、ＣＡＦｂは約６，６７０ＤａのＭＷを有する小ペプチドであることが示された。しかしながら、ＳＤＳ  ＰＡＧＥの可変性のため、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いたＣＡＦｂの分子量は正確な値であるとは考えられず、分子量の目安でしかない。
【０１８３】
質量分析（ＭＳ）
ＳＰＥ水溶性分画成分を酸性水（酸性ｐＨ  ＷＳＦ）に溶解させ、ＣＡＦを分離するために逆相Ｃ18分離用カラムにかけた。３つの画分を採集した。これらはＣＡＦｏ、ＣＡＦａおよびＣＡＦｂである。活性ＣＡＦｂ画分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＮＦαおよびＩＬ−１β活性を刺激した。分子量を決定するためにＣＡＦｂの質量分析を行った。ＥＳＩ−ＭＳの結果、ＣＡＦｂは１５，５００ＤａのＭＷを有するタンパク質であることが示された。ＣＡＦｂ成分の大きなＭＷ分子は、精製プロセス中に天然分子が凝集した結果であり、これは脱塩の結果として発生する。
【０１８４】
赤外分光光度法（ＩＲ）
赤外分光光度法の結果は、ＣＡＦｂは乳タンパク質であるカゼインと同様のパターンを有するポリペプチドであることを示した（図１４）。ＩＲのＩＲの結果はＣＡＦｂが純粋な化合物であることも示した。
【０１８５】
Ｎ末端アミノ酸配列決定
ＨＰ  Ｇ１３１４Ａ可変波長検出器を装備した機能強化型ヒューレット−パッカードＧ１００５Ａ  Ｎ末端配列決定装置を用いてＮ末端アミノ酸配列決定を行った。使用した技術は、ピコモル以下からナノモルレベルまでの範囲のサンプルに効果的である。ＣＡＦｂ−ＧＦＩＩおよびＳＰＥ−ＧＦＩＩのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
【０１８６】
ＣＡＦｂ
簡単には、ＣＡＦｂを水５０μｌと８ＭのＧｕＨＣｌ  ５０μｌとに溶解させた。およそ５０μｌのサンプルをヒューレット−パッカードローディングプロトコル（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて逆相サンプルカラムにロードした。サンプルカートリッジを２％ＴＦＡ１ｍｌで洗浄した。初期の配列決定において、主要なＮ末端配列は３０のアミノ酸の極めて重要な配列であり、本明細書には配列ＩＤ番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と示す。２つのより小さい配列もＣＡＦｂ−ＧＦＩＩ中に測定され、これらは１つまたは２つのＮ末端残基がなくなっている以外は主要配列と同一であった（それぞれ配列ＩＤ番号２および配列ＩＤ番号３と表示した）。初期の配列データを以下に示す。
【０１８７】
ＣＡＦｂ−ＧＦＩＩ
９００ｐｍｏｌ  Ｈ2Ｎ−  ＡＧＳＳＨＥＶＶＰＳＬＬＱＴＬＬＥＧＳＩＥＱＬＹＡＧＰＩＳＲ（配列ＩＤ番号１）
９０ｐｍｏｌ  Ｈ2Ｎ−  ｓ・ｈｅｖ・ｐｓｌ・ｑｔ・・ｅｇｓｉ・ｑｌｙ（ａ）ｇｐｌ（ｓ）ｒ・ｎ（配列ＩＤ番号２）
９０ｐｍｏｌ  Ｈ2Ｎ−  ・・・ｈｅｖ・ｐｓｌ・・ｔ・・・・ｓ・・ｑ・・・・ｐ（配列ＩＤ番号３）
【０１８８】
続いて、更に配列を得、７０のアミノ酸ポリペプチドと決定し、これを本明細書では配列ＩＤ番号６と表示した。これは完全長のＣＡＦｂタンパク質を示すと信じられている。
【０１８９】
ＣＡＦｂ−ＧＦＩＩ
９００ｐｍｏｌ  Ｈ2Ｎ−  ＡＧＳＳＨＥＶＶＰＳＬＬＱＴＬＬＥＧＳＩＥＱＬＹＡＧＰＩＳＲＹＮＶＤＥＭＴＳＡＡＬＡＥＬＫＫＣＩＤＥＬＰＰＸＨＬＫＡＬＶＮＬＸＫＱＩＲＴＥＡ（配列ＩＤ番号６）
【０１９０】
表３に示すように、ＣＡＦｂは７０のアミノ酸を有するポリペプチドであると考えられ、ＣＡＦｂの分子量は８，８３９Ｄａと計算される。配列部位５４および６３が不確かなため、主要な配列（配列ＩＤ番号６）はこれらの部位で確信しての決定はされていない。このポリペプチドは二量体であり、質量分析（ＭＳ）研究で見られるように１５，０００Ｄａまでのタンパク質を形成している。配列データも、初期のＣＡＦｂは細胞性代謝プロセスにおける免疫化中、小さな活性ペプチドにタンパク分解されていることを示唆した。卵黄に存在する小さなＣＡＦｂは、精製プロセスの間に大きな分子に凝集できた。
【０１９１】
当業者が遺伝子コードおよびその縮退を行うことにより、配列ＩＤ番号６をコード化する核酸配列を還元することができることは理解されるであろう。配列ＩＤ番号６をコード化する全ての核酸配列は本発明により熟考され包含される。ＣＡＦタンパクのアミノ酸配列が知られている現在、当業者は容易に、当技術分野で知られている技術を用いてＣＡＦタンパクをコード化する核酸分子を同定し、複製しそして配列決定できることも理解されるであろう。例えば、当業者はＣＡＦアミノ酸配列に基づくプライマーを縮退させ、そしてポリメラーゼ連鎖反応により適切なライブラリまたは他の適切なソースからの全部または一部の核酸配列を増幅させることができる。例えば、完全長分子において、必要であれば、プローブを調製しｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより、核酸分子を更に複製することができる。核酸配列決定技術は当業者によく知られている。
【０１９２】
【表３】
0004763193.tif 000004
【０１９３】
【表４】
0004763193.tif 000005
【０１９４】
【表５】
0004763193.tif 000006
【０１９５】
ＳＰＥ−ＧＦＩＩ
ＳＰＥ−ＧＦＩＩもＮ末端から配列決定した。本サンプルに２つの主要な配列があることは、１０回循環でのデータを見ることにより明らかであった。本明細書で配列ＩＤ番号４として示されている１つの配列は、知られているニワトリのビテロゲニンＩＩ前駆体のフラグメントであると同定された。複数のｘは糖鎖形成がこの部位で起こっていることを示している。
【０１９６】
ＳＰＥ−ＧＦＩＩ
Ｈ2Ｎ−ＡＶｉＥＮＬＫＡＲＸｘＶＳｘＮｘＩｘＴＦＮｑＶｘＦｘＹＳＭＰＡ（配列ＩＤ番号４）
【０１９７】
ペプチド配列を、ＮＩＨより提供されているＢＬＡＳＴデータベース（新型ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴｐ、ｎｒ、期待値＝１０、濾過済）で、他の知られている配列と比較した。
【０１９８】
データベースでのホモロジー検索
７０のアミノ酸ＣＡＦｂ−ＧＦＩＩ（配列ＩＤ番号６）についての同等性検索において、５１８，３１３のタンパク質配列および１６２，６５３，９４８文字を比較した。結果は、ＣＡＦｂ−ＧＦＩＩのこの部位が特異な配列であり、どの主要なホモロジーとも配列が一致するものはないことを示した。ＣＡＦに最も近い同一性を有するタンパク質は、推定リガンド結合タンパクＲＹＤ５のアミノ酸配列であり、これはノルウェーラットから単離された（登録番号Ｓ１７４４９）。この９４のアミノ酸タンパク質は、配列ＩＤ番号６のアミノ酸残基Ｉ−６６に対して配列ＩＤ番号６と５１％同一であった。２つの配列に分割されている最も長い連続したアミノ酸のストレッチは５であった。推定リガンド結合タンパクＲＹＤ５の機能は、ノルウェーラットの嗅粘膜の小領域におけるリガンド結合タンパクであると考えられる。それゆえ、本発明のＣＡＦおよびＲＹＤ５タンパクは構造的または機能的に関連しないと思われる。
【０１９９】
ＳＰＥ−ＧＦＩＩもＢＬＡＳＴデータベースで検索した。１５７２から１６０２の部位でニワトリのビテロゲニンＩＩ前駆体の修飾フラグメント（配列ＩＤ番号５）であると確かめられた（図１５）。ＣＡＦのための仮定として同じ現象により、ＳＰＥ−ＧＦＩＩの大きさは分解および凝集のプロセスによって変化する。ビテロゲニンＩＩ前駆体は、分化プロセスに多くのタンパク質を調整するために重要なタンパク質であり、サイトカインを含む。修飾ビテロゲニンＩＩ前駆体フラグメントは抗炎症機能にも重要な役割を担っている。
【０２００】
実施例２
以下の実施例は、サイトカインプロファイルおよび活性化に対するサイトカイン活性化因子（ＣＡＦ）の効果を例示する。
【０２０１】
サイトカインアッセイは以下のように行った。
【０２０２】
細胞刺激
ヒトＴＨＰ−１細胞（マクロファージ／単核球性起源）を洗浄し、２５ｍｌフラスコ中異なる卵成分を含む無血清のＲＰＭＩ培養液１０ｍｌに、１×１０6細胞の濃度で蒔いた。細胞を４時間加湿したＣＯ2培養器中で成長させ、その後５０ｍｌの遠心管にこすり取って採集した。細胞を１０分間４００×ｇで遠心分離によりペレット化し、７５０μｇのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解し、そして以下に記載するように全ＲＮＡを抽出するために使用した。
【０２０３】
処置細胞からのＲＮＡの抽出
ＴＲＩｚｏｌ試薬手順（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に従い、ＰＢＬ細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出した。抽出された全ＲＮＡを紫外線分光光度法により定量化し、調製した品質をＴＢＥ緩衝剤中１．０％アガロースゲルで２８ｓおよび１８ｓのバンドを分析することにより決定した。
【０２０４】
全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成
ＲＴ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ  Ｃｙｃｌｅ（登録商標）Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いてそれぞれのサンプルからの全ＲＮＡ５μｇから、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。比較の目的で、遍在性のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを半定量的な個々のｃＤＮＡ調製に使用する。
【０２０５】
図１７は、部分的に精製された各種卵の成分で処置されたＴＨＰ−１細胞のサイトカインプロファイルを示す。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）発現レベルは、食用卵の３ｋ成分と比較して、ＰＬ−１００卵の３ｋ成分（２ｍｇ／ｍｌ）で処置された細胞で高かった。また、インターロイキン−１β（ＩＬ−β）レベルは高かったが、食用卵と比較してＰＬ−１００であったよりもより少ない程度であった。３ｋ成分を用いたアッセイにおいて、これらの細胞中でのインターロイキン−６（ＩＬ−６）またはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の誘発は検知できるほどではなかった。続いて行った高度に精製したＣＡＦｂを用いてのアッセイにおいては、ＩＬ−６の誘発がはっきり検知されたことは注目すべきである。ＰＬ−１００全卵中のＴＮＦ−αのレベル（１０ｍｇ／ｍｌ）は、食用卵中のレベルよりも若干高かったが、３ｋ成分のレベルよりは濃度の点ではるかに高かった。
【０２０６】
過免疫卵の３ｋ成分によるＴＮＦ−α活性化の動力学
図１８は、ＰＬ−１００卵黄の３ｋ成分によるＴＨＰ−１細胞中のＴＮＦ−α活性化の動力学を示す。ＰＬ−１００  ３ｋ成分によるＴＮＦ−αの誘発は３０分後に開始し、２時間でピークに達した。その後低下し、８時間後には基準レベルにまで達した。食用卵３ｋ成分によるＴＮＦ−αの誘発は、細胞中で見られる通常のレベルと同等かまたは若干高かった。
【０２０７】
過免疫卵の精製成分によるＴＨＰ−１細胞中への分化の誘発
単核球性／マクロファージ起源の形質転換ヒト細胞であるＴＨＰ−１細胞を、過免疫卵黄から誘導された３ｋ成分で処置して分化させた。通常、これらの細胞はクラスターとして懸濁液中で成長し、樹脂表面には付着しない。しかしながら、過免疫卵（以降ＰＬ−１００と言う）からの３ｋ成分（１ｍｇ／ｍｌ）を含む無血清培地で成長させると、繊維芽細胞様の細胞に分化し、樹脂表面に付着した。イオン交換カラム（Ｑ−セファロース）で更に精製し、２００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出させると、３ｋ成分は、より低濃度（０．０１ｍｇ／ｍｌ）で分化するＴＨＰ−１細胞となった。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの生産は、単核球性／マクロファージ起源の細胞の反増殖および分化に関連していることを示唆する文献がいくつか報告されている。
【０２０８】
ＣＡＦｂによるサイトカイン発現の誘発
上述のように、ＳＰＥ水溶性成分および実施例１で記載した高度に精製したＣＡＦｂ成分を用いて、サイトカインアッセイを行った。図１９は、ＳＰＥ水溶性成分およびＣＡＦｂ調製の両方がＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の発現を誘発することを示している。
【０２０９】
ＣＡＦｂによるＴＧＦβの阻害
上述のように、ＳＰＥ水溶性成分および実施例１で記載した高度に精製したＣＡＦｂ成分を用いて、サイトカインアッセイを行った。図２０は、ＣＡＦｂが形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の誘発を阻害するが、ＳＰＥ水溶性成分は阻害しないことを示している。
【０２１０】
本発明の多くの実施形態を詳細に記載してきたが、これらの実施形態の改良および適応が当業者に行われることは明白である。しかしながら、このような改良および適応は、以下の特許請求の範囲にて記載するように、本発明の範囲内であることを特に理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるサイトカイン誘導に対する３，０００ダルトンＭＷ透過物の作用を示すデジタル化像である。
【図２】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＴＮＦα誘導に対する３，０００ダルトンＭＷ透過物の作用を示すデジタル化像である。
【図３】  ＰＬ−１００の３，０００ダルトンＭＷ透過物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】  ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα誘導に対する３０００ＤａＭＷ透過物のＱセファロース分画物の作用を示すデジタル化像である。
【図５】  Ｑセファロースカラムに由来するＣＡＦ活性画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】  ＱセファロースカラムにおけるＣＡＦ１活性画分の固相抽出クロマトグラムである。
【図７】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＴＮＦα誘導に対する固相抽出分画物の作用を示すデジタル化像である。
【図８】  固相抽出のＣＡＦ活性画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＴＮＦα誘導に対する分配抽出分画物の作用を示すデジタル化像である。
【図１０】  分配抽出による水溶性画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】  水溶性画分のＣ18ＨＰＬＣ分離のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】  精製されたＣＡＦのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＩＬ−１β誘導に対するＣＡＦの作用を示すデジタル化像である。
【図１４】  ＣＡＦの赤外分光測定を示すロマトグラムである。
【図１５】  ＳＰＥ−ＧＦＩＩ配列のニワトリビテロゲニンＩＩ前駆体とのアラインメントおよび位置を示す図である。
【図１６】  ＣＡＦの精製ステップを例示する概略図である。
【図１７】  卵の種々の分画物で処置されたＴＨＰ−１細胞におけるサイトカインＲＮＡレベルを示すデジタル化像である。
【図１８】  卵の３０００Ｄａ透過物画分によるＴＮＦα活性化の速度論を示すデジタル化像である。
【図１９】  ＣＡＦｂによる３つのサイトカインの誘導を示すデジタル化像である。
【図２０】  ＣＡＦｂによる形質転換増殖因子βの阻害を示すデジタル化像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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