(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２分子に結合し細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を誘発する、式：ＳＬＬＭＷＩＴＱＸ（配列番号１０）［式中、ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅである］の単離されたノナペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕである請求項１の単離されたノナペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸がＳｅｒである請求項１の単離されたノナペプチド。
【請求項４】
互いに特異的な第１および第２結合パートナーを含む、細胞溶解性Ｔ細胞の単離に役立つ単離された複合体であって、前記第２結合パートナーがＨＬＡ−Ａ２分子、β２−ミクログロブリン分子および請求項１のノナペプチドから構成される複数の複合体に結合される複合体。
【請求項５】
前記複合体が四量体である請求項４の単離された複合体。
【請求項６】
配列番号１０のＸがＳｅｒ（配列番号１９）である請求項５の単離された複合体。
【請求項７】
請求項１の単離されたノナペプチドおよび佐剤を含む、細胞溶解性Ｔ細胞応答の誘発に役立つ組成物。
【請求項８】
請求項１のノナペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項９】
前記ノナペプチドが配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなる請求項８の単離された核酸分子。
【請求項１０】
ＭＨＣ分子に結合するペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記ペプチドの少なくとも１つが請求項１のペプチドである発現ベクター。
【請求項１１】
前記ペプチドの少なくとも１つが配列番号１９のアミノ酸配列からなる請求項１０の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項８の単離された核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１３】
請求項１０の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１４】
ある細胞がＨＬＡ−Ａ２分子をその表面に提示するかどうかを決定する方法であって、前記細胞を含む試料を請求項１のペプチドと接触させて、それらの間の結合を決定することを含み、前記結合が前記細胞の表面上のＨＬＡ−Ａ２の指標である方法。
【請求項１５】
さらに少なくとも１つの追加ペプチドを含む請求項７の組成物。
【請求項１６】
少なくとも一部分が請求項１のアミノ酸配列を含む単離されたポリトープ分子。
【請求項１７】
ＨＬＡ−Ａ２分子およびペプチドの複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞が試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、前記試料をＨＬＡ−Ａ２分子および請求項１のノナペプチドと混合し、前記細胞溶解性Ｔ細胞の特異性を決定するために、前記細胞溶解性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２分子および前記ペプチドの複合体との間の相互作用を決定することを含む方法。
【請求項１８】
さらにラベルを含む請求項４の単離された複合体。
【請求項１９】
前記第1 結合パートナーがアビジンであり、前記第2 結合パートナーがビオチンである請求項１８の単離された複合体。
【請求項２０】
ＭＨＣ分子、β２−ミクログロブリンおよびペプチドの複合体を含む請求項１９の単離された複合体。
【請求項２１】
試料中の細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離する方法であって、前記試料を請求項４の複合体と混合し、それに結合する細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離することを含む方法。
【請求項２２】
腫瘍の状態を監視する方法であって、腫瘍を持つ患者から採取した試料を請求項４の単離された複合体と接触させることによって、前記試料中の細胞溶解性Ｔ細胞を決定し、得られた値を先に決定した値と比較することによって、前記腫瘍の状態を決定することを含む方法。
【請求項２３】
配列番号６中のＣ末端アミノ酸以外の１アミノ酸がアラニンで置換されている、配列番号６の類似体である単離されたノナペプチド。
【請求項２４】
配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７からなる群より選択される請求項２３の単離されたノナペプチド。
【請求項２５】
配列番号２７からなる請求項２４の単離されたノナペプチド。
【請求項２６】
請求項２３のノナペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２７】
少なくとも１つが請求項２６のヌクレオチド配列である複数のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２６の単離された核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項２９】
請求項２７の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項３０】
ある細胞がＨＬＡ−Ａ２分子をその表面に提示するかどうかを決定する方法であって、前記細胞を含む試料を請求項２３のペプチドと接触させて、それらの間の結合を決定することを含み、前記結合が前記細胞の表面上のＨＬＡ−Ａ２の指標である方法。
【請求項３１】
請求項２３の単離されたノナペプチドおよび佐剤を含む、細胞溶解性Ｔ細胞応答の提供に役立つ組成物。
【請求項３２】
少なくとも１つの追加ペプチドを含む請求項３１の組成物。
【請求項３３】
少なくとも一部分が請求項２３のアミノ酸配列を含む単離されたポリトープ分子。
【請求項３４】
ＨＬＡ−Ａ２分子およびペプチドの複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞が試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、前記試料をＨＬＡ−Ａ２分子および請求項２３のノナペプチドと混合し、前記細胞溶解性Ｔ細胞の特異性を決定するために、前記細胞溶解性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２分子および前記ペプチドの複合体との間の相互作用を決定することを含む方法。
【請求項３５】
互いに特異的な第１および第２結合パートナーを含む、細胞溶解性Ｔ細胞の単離に役立つ単離された複合体であって、前記第２結合パートナーがＨＬＡ−Ａ２分子、β２−ミクログロブリン分子および請求項２３のノナペプチドから構成される複数の複合体に結合される複合体。
【請求項３６】
前記ノナペプチドが配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７である請求項３５の単離された複合体。
【請求項３７】
第１結合パートナーがアビジンであり、第２結合パートナーがビオチンである請求項３５の単離された複合体。
【請求項３８】
試料中の細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離する方法であって、前記試料を請求項３５の単離された複合体と混合し、それに結合する細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離することを含む方法。
【請求項３９】
式：ＳＬＬＭＷＩＴＱＸＸ（配列番号１８）［式中、第１のＸはシステインであり、第２のＸはＩｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕである］の単離されたデカペプチド。
【請求項４０】
第２のＸは、Ｉｌｅ（配列番号１４）である請求項３９の単離されたデカペプチド。
【請求項４１】
請求項３９の単離されたデカペプチドおよび佐剤を含む、細胞溶解性Ｔ細胞応答の誘発に役立つ組成物。
【請求項４２】
さらに少なくとも１つの追加ペプチドを含む請求項４１の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、特許出願第０８／７２５，１８２号（１９９６年１０月３日出願、現米国特許第５，８０４，３８１号）の一部継続出願である特許出願第０８／９３７，２６３号（１９９７年９月１５日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／０６２，４２２号（１９９８年４月１７日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／１６５，５４６号（１９９８年１０月２日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／４４０，６２１号（１９９９年１１月１５日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／５１４，０３６号（２０００年２月５日出願）の一部継続出願である。これらの出願は全て、参考文献として本明細書の一部を構成する。また本願は、特許出願第０９／０４９，８５０号（１９９８年３月２７日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／２７５，９９３号（１９９９年３月２５日出願）の一部継続出願でもある。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、癌関連抗原由来のＨＬＡ結合ペプチドに関する。これらのペプチドはクラスＩ分子に結合し、これらのペプチドが結合した細胞の細胞溶解性Ｔリンパ球による溶解を誘発する。
【０００３】
（背景技術および従来技術）
例えば感染症、癌、自己免疫疾患などといった多くの病理学的状態が、一定の分子の不適切な発現を特徴とすることは、かなり確立された事実である。したがってこれらの分子は、特定の病理学的状態または異常状態の「マーカー」として役立つ。これらの分子は、診断上の「ターゲット」（すなわちこれらの異常状態を診断するために同定されるべき物質）として使用される他、診断薬および／または治療薬を創出するために使用できる試薬としても役立つ。癌マーカーを使って特定のマーカーに特異的な抗体を産生させることはその一例であるが、決してこれに限るわけではない。また、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドを使って、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を生成させることも、その限定されない一例である。
【０００４】
このような物質の製造は、もちろん、それら物質の製造に使用される試薬の供給源を前提としている。細胞からの精製は面倒で確実というには程遠い方法である。もう一つの好ましい方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離した後、単離されたコード分子を使って所望の分子を発現させることである。
【０００５】
今までのところ、例えばヒト腫瘍中のような抗原の検出には、２つの戦略が使用されてきた。以下、これらの戦略を遺伝子的アプローチおよび生化学的アプローチと呼ぶことにする。遺伝子的アプローチは、例えば参考文献として本明細書の一部を構成するｄｅＰｌａｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２２７５（１９８８）などに、その例を見ることができる。このアプローチでは、腫瘍から得たｃＤＮＡライブラリーのプラスミド数百プールをＣＯＳ細胞などの受容細胞または腫瘍細胞系の抗原陰性変異株にトランスフェクトし、それらの細胞を特異的抗原の発現について調べる。生物学的アプローチは、例えば参考文献として本明細書の一部を構成するＯ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６９（１９９４）などにその例を見ることができるが、このアプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ分子に結合しているペプチドを酸溶出した後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことに基づいている。抗原ペプチドは、抗原処理能力が欠損した突然変異細胞株の空のＭＨＣクラスＩ分子に抗原ペプチドが結合し、細胞傷害性Ｔリンパ球との特異的反応を誘発することによって同定される。これらの特異的反応には、ＭＴＴアッセイや51Ｃｒ放出アッセイで測定することができる例えばＣＴＬ増殖の誘導、ＴＮＦ放出およびターゲット細胞の溶解などがある。
【０００６】
抗原の分子的定義を目的とする上記２つのアプローチには次の欠点がある。第１に、これらの方法は著しく煩雑であり、時間と費用を要する。第２に、これらの方法は、所定の特異性を持つ細胞傷害性Ｔ細胞株（ＣＴＬ）の樹立に依存している。
【０００７】
抗原の同定および分子的定義を目的とする２つの既知のアプローチが本質的に抱えている課題は、どちらの方法でもヒト腫瘍中の新規抗原を今までにごく少数しか定義づけることに成功していないという事実が如実に物語っている。例えばｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）、Ｂｒｉｃｈａｒｄら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５（１９９３）、Ｃｏｕｌｉｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４）、Ｋａｗａｋａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５−３５１９（１９９４）などを参照されたい。
【０００８】
さらにまた上記の方法論は、問題にしている癌タイプの樹立永久細胞株が入手できることを前提としている。癌タイプによっては細胞株を樹立することが極めて困難であることは、例えばＯｅｔｔｇｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１０：６０７−６３７（１９９０）などに示されているとおりである。また、一部の上皮細胞タイプの癌はインビトロでＣＴＬに対する感受性に乏しいため、常法による分析は不可能であることも知られている。これらの課題に触発されて、当技術分野では、癌関連抗原の新たな同定方法の開発が行われてきた。
【０００９】
重要な方法論の一つは、参考文献として本明細書の一部を構成するＳａｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１９１３（１９９５）に記載されている。また米国特許第５，６９８，３９６号および米国特許出願第０８／４７９，３２８号（１９９６年１月３日出願）も参照されたい。これら３つの参考文献はいずれも本明細書の一部を構成する。要約すると、この方法ではｃＤＮＡライブラリーを原核宿主中で発現させる。（ライブラリーは腫瘍試料から取得される）。次に、高力価の体液性応答を惹起する抗原を検出するために、発現させたライブラリーを希釈吸収血清によるイムノスクリーニングにかける。この方法論はＳＥＲＥＸ法（「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）」）と呼ばれている。この方法論は、新しい腫瘍関連抗原の検出に使用されていると共に、先に同定された腫瘍関連抗原の発現を確認するためにも使用されている。上記特許出願およびＳａｈｉｎら（前掲）ならびにＣｒｅｗら，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４４：２３３３−２３４０（１９９５）を参照されたい。
【００１０】
ＳＥＲＥＸ法は食道癌試料に応用されて現在一つの抗原が同定されており、それをコードする核酸分子が単離、クローニングされている。例えば、前掲の米国特許第５，８０４，３８１号を参照されたい。この抗原とその切断型は、癌患者の血清中の抗体と反応することが見出されている。また、この分子に由来するペプチドはＭＨＣ分子と結合して、細胞溶解性Ｔ細胞応答とヘルパーＴ細胞応答の両方を誘発することも見出されている。これらのペプチドの変異体も同様に使用できることがわかっている。
【００１１】
癌免疫学分野における問題点の１つは、インビボの細胞溶解性Ｔリンパ球応答を同定し定量するために使用することができる確かなプロトコールがないことである。そのため、免疫応答を特徴づけ、ワクチン試験を監視することは困難である。細胞溶解性Ｔ細胞の解析は、複数のＴ細胞ターゲットを含む複合体を使用することによって著しく容易になることが見いだされた。より具体的に述べると、これらの複合体は２つの結合パートナー、例えばアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン間の既知のアビディティーに基づいている。各アビジン／ストレプトアビジンの分子が４つのビオチン分子に結合できることはよく知られている。アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン系を使って複数の細胞溶解性Ｔ細胞ターゲット、すなわちＨＬＡ分子などのＭＨＣ分子、β２−ミクログロブリンおよびＨＬＡ分子に結合するペプチドを含んでなる複数の免疫複合体を含む複合体が形成される構築物は、参考文献として本明細書の一部を構成する特許出願第０９／０４９，８５０号（１９９８年３月２７日出願）などに教示されている。この複合体を標識して、試料中の目的とする細胞溶解性Ｔ細胞を単離または決定するために使用することができる。以下に説明する発明ではこのような複合体を利用した。
【００１２】
（好ましい態様の詳細な説明）
実施例１
例えば米国特許第５，８０４，３８１号などに論じられているＮＹ−ＥＳＯ−１の解析により、この抗原を提示する分子はＨＬＡ−Ａ２であることがわかった。そこで、参考文献として本明細書の一部を構成するＤ’Ａｍａｒｏら，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１３−１８（１９９５）およびＤｒｉｊｆｈｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１−１２（１９９５）に記載のモデルを使って、このＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを満たすペプチドを全て同定するために、ＮＹ−ＥＳＯ−１アミノ酸配列のスクリーニングを行った。これによって推定されたアミノ酸配列に相当するペプチドを全て標準的方法で合成し、参考文献として本明細書の一部を構成するＫｎｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５１１−３５１５（１９８４）にならって、それらのペプチドを細胞傷害性アッセイに使用した。具体的に述べると、細胞株ＣＥＭＸ７２１．１７４．Ｔ２（以下「Ｔ２」という）を使用した。なぜなら、この細胞株はＨＬＡ−Ａ２を発現させるが、抗原をＭＨＣ複合体化ペプチドにはプロセシングしないため、ここに述べるタイプの実験には理想的だからである。Ｔ２細胞の試料を標準的方法により１００μＣｉのＮａ（51Ｃｒ）Ｏ4 で標識した後、３回洗浄し、次に１０μｇ／ｍｌのペプチドおよび２．５μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンと共にインキュベートした。インキュベーションは室温で１時間行った。次に、９０：１のエフェクター／ターゲット比でレスポンダー細胞（ＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１の懸濁液１００μｌ）を加え、５％ＣＯ2 の水飽和雰囲気下に３７℃で４時間インキュベートした。次に、プレートを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清１００μｌを取り出し、放射能を測定した。51Ｃｒ放出率を既知の方法で決定したところ、ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号１）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２）およびＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番号３）の３つが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬのもっともよい刺激因子であることがわかった。ＮＷ−ＭＥＬ−３８ならびに細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−３７およびＭＺ−ＭＥＬ−１９をターゲットとして使用した場合も、同様の結果を得た。
【００１３】
実施例２
次の実験群では、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、ＣＴＬ溶解を誘発する配列番号１、２および３の能力を確認した。
【００１４】
同じ脊椎傍領域に局在した再発性転移を伴う緩徐進行性メラノーマを呈する患者から、リンパ節または転移巣の試料を採取した。被験者の腫瘍から採取したＲＮＡの逆転写により、その腫瘍はＮＹ−ＥＳＯ−１を発現させることがわかった。さらに患者の血清は、高力価の抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を示した。
【００１５】
外科的に切除したリンパ節または転移巣を、１０％ウシ胎仔血清を補足した滅菌ＲＰＭＩ１６４０培地中で、細断した。０．２４ｍＭ  Ａｓｎ、０．５５ｍＭ  Ａｒｇ、１．５ｍＭ  Ｇｌｎ、１０％ヒトＡ＋プール血清、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を補足したイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）のダルベッコ培地２ｍｌが入っている２４穴組織培養プレートに、細胞の懸濁液を入れた。細胞を２〜３週間培養した後、参考文献として本明細書の一部を構成するＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ  １１０：２９（１９９８）に従って、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによるアッセイを行った。簡単に述べると、短期培養物２×１０3 細胞／ウェルを５×１０4 細胞／ウェルのＴ２細胞または同じ数のＴ２細胞＋１μＭの配列番号１〜３の一つと混合した。各培養は二連で行った。
【００１６】
平均スポット数は、対照培養では１９スポット、配列番号２では４２４スポット、配列番号３では３５８スポット、配列番号１では３９６スポットだった。上昇したこれらの数値は、腫瘍浸潤リンパ球２０個につきＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞約１個の頻度に相当する。次に、参考文献として本明細書の一部を構成するＶａｌｍｏｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：６９５６（１９９８）に従って反応性Ｔ細胞を培養して、単クローン性にした。ＴＩＬに由来する２４個のＴＩＬ由来クローンのうち５個のクローンは、上記のＣＴＬアッセイで試験すると、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドと反応することがわかった。
【００１７】
実施例３
本実施例の実験では、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現させるＡ２+ 細胞またはＮＹ−ＥＳＯ−１を発現させないＡ２+ 細胞を溶解する能力について、上記ＣＴＬ  ＥＳＯ５を調べた。上述した51Ｃｒ放出アッセイで細胞株ＮＡ８−ＭＥＬ（Ａ２+ ，ＮＹ−ＥＳＯ−１- ）、ＳＫ−ＭＥＬ３７（Ａ２+ ，ＮＹ−ＥＳＯ−１+ ）およびＭｅ２７５（Ａ２+ ，ＮＹ−ＥＳＯ−１+ ）を試験した。
【００１８】
その結果、ＮＡ８−ＭｅｌはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド配列番号２を加えると溶解されるが、配列番号２が存在しないと溶解されないことがわかった。配列番号２の有無はＳＫ−ＭＥＬ３７とＭｅ２７５の溶解とは無関係であり、これらの細胞株はどちらも全ての条件で溶解された。これらの結果は、外から加えられた配列番号２または内在する配列番号２をＣＴＬ  ＥＳＯ５が認識することを示している。
【００１９】
実施例４
次に、配列番号１、２および３のうちのどれがＣＴＬによる認識に最適なＴ細胞エピトープを構成するかを決定するための実験を行った。この決定を行うために、配列番号１、２および３に相当する合成ペプチドを機能競合結合アッセイで試験し、次に特異的ＣＴＬによる認識について試験した。
【００２０】
使用した機能競合結合アッセイは、参考文献として本明細書の一部を構成するＶａｌｍｏｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６９５６−６９６２（１９９８）に教示されているものであるが、本明細書でも詳しく説明する。
【００２１】
ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号４）はＨＬＡ−Ａ* ０２０１分子に結合し、ＬＡＵ  １３２／２として知られるＨＬＡ−Ａ* ０２０１拘束性ＣＴＬクローンによる溶解を誘発することが知られている。Ｖａｌｍｏｒｉら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５９：２１６７（１９９９）を参照されたい。Ｔ２細胞を抗クラスＩモノクローナル抗体Ｗ６／３２の存在下に51Ｃｒで標識した。様々な濃度の配列番号１、２または３（５０μｌ）を標識細胞の試料５０μｌ（１０００細胞／ウェル）と共に室温で１５分間インキュベートした。次に、最適用量未満（１ｎＭ）の配列番号４（５０μｌ）を５０μｌのＴ細胞（５０００細胞／ウェル）と共に加えた。３７℃で４時間のインキュベーション後に51Ｃｒ放出を測定した。次に、ターゲット細胞溶解の５０％阻害を達成するのに必要な各ペプチドの濃度を［ｎＭ］５０％として決定した。比較を容易にするために、既知の高親和性ＨＬＡ−Ａ* ０２０１結合剤である基準ペプチドＦｌｕＭＡ５８−６６（配列番号５：ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）の［ｎＭ］５０％を、試験ペプチドに関して決定された［ｎＭ］５０％値で割った値として、各ペプチドの相対的競合活性を計算した。
【００２２】
その結果、配列番号３は競合剤として配列番号４の１／１００の効力を持つことがわかった。また配列番号２の効力は１／２５０だった。意外なことに、それぞれのペプチド長を考えると、配列番号１は配列番号２より１０倍強い競合性を持っていた。
【００２３】
これらの結果から、配列番号２のカルボキシ末端にあるシステインは、ＨＬＡ−Ａ２分子に対する弱い結合の原因であることが示唆された。この点を調べるために、アラニン、ロイシンまたはバリンなどの非極性側鎖を持つ様々な疎水性アミノ酸（それぞれ配列番号６〜８）でカルボキシ末端システインを置換することにより、配列番号２の誘導体を３つ作製した。これらのペプチドのそれぞれを使って上記の機能競合アッセイを行った。結果を下記表１に示す。置換は全てペプチド結合を明確かつ劇的に増大させたことから、これら３つの置換ペプチドの全てに関して、この位置の疎水残基はいずれも同様の効果を持つことがわかる。
【００２４】
【表１】
0004615805.tif 000002
実施例５
上記のように、本明細書に記載のペプチドを特異的ＣＴＬによる認識に関して試験した。これらの実験では、ターゲットＴ２細胞を３７℃にて１時間51Ｃｒで標識した後、２回洗浄した。次に試料（５０μｌ中に１０００標識細胞）を様々な濃度のペプチドと共に１５分間インキュベートした。次にエフェクター細胞（５０μｌ）を加えた。加えたエフェクター細胞はＥＳＯ１特異的ＣＴＬクローンＥＳＯ５である。リンパ球：ターゲット比は３０：１とした。３７℃で４時間のインキュベーション後に、１００μｌの上澄み試料を調べることによってクロム放出を測定した。
【００２５】
特異的溶解率は次式のように計算した：
１００×［（実験値−自発的放出）］／（総量−自発的放出）
結果を、５０％最大活性を与えるペプチドのナノモル濃度として、下記の表２に記載する。また表２には、ペプチド配列番号２の［ｎＭ］５０％を試験ペプチドの［ｎＭ］５０％で割った値として計算される「相対的抗原活性」も記載する。ＣＴＬによる類似体ペプチドの認識は親ペプチドと同等以上だった。これらの結果は、天然ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドのなかでは配列番号２が最適に認識される抗原ペプチドであることを示している。また、置換ペプチドの中では、配列番号８が配列番号２と同じ程度に効率よく認識され、他の置換ペプチドは配列番号２より効率よく認識された。配列番号６は配列番号２よりも１０００倍効率よく認識された。
【００２６】
【表２】
0004615805.tif 000003
実施例６
本実施例の実験では、後述の実施例で使用する抗原の四量化複合体を作製するための基本的技術を説明する。所望の四量体を作製するには、最初に、改変ＨＬＡ−Ａ* ０２０１分子をコードする構築物を作製する必要があった。これを行うために、ＨＬＡ−Ａ* ０２０１陽性細胞から全ＲＮＡを抽出し、次に同分子に特異的なプライマーと逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＨＬＡ−Ａ* ０２０１をクローン化した。参考文献として本明細書の一部を構成するＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６（１９９６年１０月４日）に従った。ただし新しい３’プライマー、すなわち５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＡ  ＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣ−３’（配列番号９）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲと同時に、使用するベクターでのタンパク質発現を最適化するために、アミノ末端ヌクレオチド配列を改変した。参考文献として本明細書の一部を構成するＧａｒｂｏｃｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３４２９（１９９２）を参照されたい。これを終えてから、当該分子の細胞外コード部分を、再び特異的プライマーを用いて増幅した。得られた構築物を、ＨＬＡ−Ａ* ０２０１重鎖の３’末端にＢｉｒＡビオチン化認識部位をインフレームに生成するベクターに再クローニングした。改変ＨＬＡ−Ａ* ０２０１とβ２−ミクログロブリンを別個の大腸菌培養物で過剰発現させた。得られた封入体を精製し、ＨＬＡ組換えタンパク質とβ２−ミクログロブリン組換えタンパク質を尿素溶液に可溶化した後、リフォールディング溶液中、４℃でリフォールディングさせることにより、複合体を形成させた。（リフォールディング溶液は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、Ｌ−アルギニン４００ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、還元型グルタチオン５ｍＭ、酸化型グルタチオン０．５ｍＭ、ＰＭＳＦ０．１ｍＭ、ＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリン１μＭならびに対象ペプチド１０μＭを含んだ。）リフォールディング溶液を標準的技術で７．５ｍｌに濃縮した。次に、リフォールディング緩衝液をＢｉｒＡ反応緩衝液（Ｔｒｉｓ  １００ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ2   ５ｍＭ、ＰＭＳＦ  １００μＭ、ロイペプチン１μＭおよびペプスタチン１μＭ）と交換した（最後の３つは使用直前に加えた）。
【００２７】
次に、ＨＬＡ−Ａ２複合体を含むリフォールディング混合物を酵素５０μＭ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ中の１００ｍＭビオチンおよび１００ｍＭアデノシン三リン酸と混合することにより、複合体をビオチンホロ酵素シンターゼ（ＢｉｒＡ酵素）でビオチン化した。混合物を一晩、室温でインキュベートした。次に、ビオチン化複合体を精製し、フィコエリトリン標識ストレプトアビジンと混合して、四量体構造を形成させた。これらを単離し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で少量ずつ再構成した。
【００２８】
実施例７
本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞の頻度を評価するために計画した。ビオチン、ＨＬＡ−Ａ２およびペプチドの蛍光四量体は、特許出願第０９／２７５，９９３号（１９９９年３月２５日出願）および第０９／０４９，８５０号（１９９８年３月２７日出願）（どちらも参考文献として本明細書の一部を構成する）と同様に上記実施例６に記載のＲｏｍｅｒｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：６４１（１９９８）およびＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：９４（１９９６）に従って調製した。抗原ペプチドとして、Ｆｌｕ  Ｍａ  ５８−６６（配列番号５）と、アラニンをカルボキシ末端とするＥＳＯ−１誘導体（配列番号６）を使用した。この誘導体を選択した理由は、その親和性が高いからである。というのも、ＨＬＡ−Ａ２への結合親和性が高ければ、安定な四量体の作製が容易になるからである。
【００２９】
四量体を組み立てた後、各ペプチドに特異的なＣＴＬクローンを２％ＦＣＳを含む２０μｌのＰＢＳ中で適当な四量体と混合し、室温で１時間インキュベートした後、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ８抗体またはＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ８抗体と「ＣＹＣ」で標識した抗ＣＤ４５ＲＡ抗体との混合物２０μｌを加えた。その混合物を４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を上記と同じ緩衝液で洗浄し、次にフローサイトメトリーによって解析した。
【００３０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１誘導体（配列番号６）の四量体はＥＳＯ５を特異的に染色したが、ＦｌｕＭａに特異的なＴ細胞は染色せず、逆もまた同様だった。
【００３１】
実施例８
本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを含む四量体を使ったＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞の検出および単離を検証するために計画した。
【００３２】
配列番号２またはアラニン末端置換体（配列番号６）で刺激した濃縮ＣＤ８+ Ｔ細胞試料。（刺激は、自家抗原提示細胞に対象ペプチドを負荷することによって行った。）
上記のように四量体を作製し、それを使って、刺激の１４日後にＣＤ８+ 細胞を染色した。細胞を選別し、上記のようにＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで試験した。
【００３３】
ＣＤ８+ 四量体+ 細胞だけがＩＦＮ−γ産生細胞を含むことがわかった。
【００３４】
選別したＣＤ８+ 四量体+ 細胞とＣＤ８+ 四量体- 細胞をＰＨＡ刺激によって２週間増殖させ、両細胞集団を、配列番号２をパルスしたまたは配列番号２をパルスしていないＭｅ２７５およびＴ２細胞での51Ｃｒ放出アッセイ法で、上述のようにアッセイした。
【００３５】
ＣＤ８+ 四量体+ 細胞だけが、配列番号２をパルスした細胞とアラニン類似体をパルスした細胞の両方を効果的に殺滅した。
【００３６】
実施例９
本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原が細胞内でプロセシングされて、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるペプチドを生成し、その結果としてＣＴＬによる溶解を刺激するかどうかを決定するために計画した。
【００３７】
上記実施例６に記載の四量体を、配列番号２のペプチドを使って調製した。次に、これらの四量体を使って、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性メラノーマを持つと以前に診断されたことがある患者から採取した細胞の試料を染色した。詳しくは、参考文献として本明細書の一部を構成するＤｕｎｂａｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２（１２）：６９５９−６２（１９９９）および特許出願第０９／０４９，８５０号（１９９８年３月２７日）を参照されたいが、簡単に述べると、四量体を使って末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）試料を３７℃で１５分間染色した後、３７℃のＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で洗浄し、次に標識抗ＣＤ８抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞を氷冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で３回洗浄した後、フローサイトメトリーによって解析した。陽性細胞に１０μＭの配列番号２のペプチドをパルスし、ＩＬ−２（２００ｕ／ｍｌ）中で５日間培養することにより、陽性細胞をクローン化した。
【００３８】
これらの陽性ＣＴＬのうち、４つを増殖させ、下記の実験で試験した。
【００３９】
実施例１０
次に、上記ＣＴＬを殺細胞特異性について試験した。この試験を行うために、先にＮＹ−ＥＳＯ−１陽性と型別されている細胞株、先にＮＹ−ＥＳＯ−１陰性と型別されている細胞株、１μＭの配列番号２のペプチドをパルスしたＴ２細胞の試料、およびパルスを行っていないＴ２細胞の試料を、ＣＴＬと１：１および０．３：１のエフェクター／ターゲット比で混合した。細胞の殺滅は上記の51Ｃｒ放出アッセイ法で決定した。
【００４０】
その結果、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性細胞と配列番号２をパルスしたＴ２細胞はどちらも殺滅され、他の細胞は殺滅されないことがわかった。このことから、ＮＹ−ＥＳＯ−１の細胞内プロセシングは、配列番号２特異的ＣＴＬによって認識されるペプチドの生成をもたらすことが実証された。
【００４１】
実施例１１
この実施例に記載する実験は、異なるＣＴＬの混合物が配列番号１、２および３で得られた陽性結果の原因であるかどうか、または単一のＣＴＬクローンが全てのペプチドを認識するかどうかを決定するために計画した。これらの実験では、配列番号２、配列番号１、またはＮＹ−ＥＳＯ−１アミノ酸１５７〜１６６からなるペプチド、すなわちＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１１）のいずれか一つをＴ２細胞にパルスした。配列番号１の最初の８アミノ酸から構成されるペプチドなので、配列番号３も試験した。様々な濃度のペプチドをＴ２細胞へのパルス添加に使用した。対照として配列番号５を使用した。上記と同じ51Ｃｒ放出アッセイを使用した。ＣＴＬを試験する前に、それらがそれぞれ単一のＴ細胞受容体を発現させているかどうかを決定するためのアッセイを行った。
【００４２】
その結果、全てのＴ細胞は配列番号２、３および１１を認識するが、配列番号１または切断型ペプチド１５７〜１６４、すなわち配列番号１１の最初の８アミノ酸から構成されるペプチドは認識できないことがわかった。これらは、３つのペプチドは全てクローンＣＴＬによって認識されたことを示している。
【００４３】
実施例１２
この実施例に記載する実験は、配列番号２のペプチドを生成させるために必要な細胞内プロセシングの条件を決定するために計画した。
【００４４】
Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５（６２７４）：４４９−５２（１９９０）には、ＭＨＣ  Ｉプロセシング経路に明確な遮断点を持つことを特徴とする突然変異型プロセシング細胞が記載されている。これらの実験ではこれらの細胞を使用した。具体的に述べると、親細胞株すなわち「細胞株４５」、ＴＡＰ、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７陰性である「細胞株１７４」、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２をコードするベクターがトランスフェクトされている細胞株１７４のトランスフェクタント、ならびにＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＬＭＰ７をコードするベクターがトランスフェクトされている細胞株１７４のトランスフェクタントを使用した。（「ＴＡＰ」という略号は「ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（抗原プロセシング関連輸送タンパク質）」を表し、「ＬＭＰ」という略号は「ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ（低分子量ポリプロテイン）」を表す）。
【００４５】
上述したトランスフェクタントの他に、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするワクシニアウイルス構築物を、全ての細胞に感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）５で９０分間トランスフェクトした。
【００４６】
対照として、ワクシニアウイルス構築物を添加する１時間前に、１００μＭのラクタシスチンを含む５０μｌの培地に同数の細胞（１０6 細胞）を懸濁した。９０分の感染期間後に細胞を洗浄し、１μＭのラクタシスチンを含む５ｍｌの培地に懸濁し、一晩生育してワクシニアベクターの発現を許した。ＬＭＰ２とＬＭＰ７はプロテアソームサブユニットである。
【００４７】
次に、上述したタイプの51Ｃｒ放出アッセイで、細胞をＣＴＬと混合した。
【００４８】
その結果、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするワクシニアをＴＡＰ欠損細胞で発現させても、それらの細胞はＣＴＬ溶解感受性にならないことがわかった。一方、プロテアソームサブユニットＬＭＰ２およびＬＭＰ７の有無はＣＴＬによって認識されるエピトープの提示を損なわなかった。このことは使用した対照によって裏付けられる。なぜなら、１７４／ＴＡＰ細胞は、ＬＭＰ７に依存して提示されることがわかっている配列番号５のペプチドを提示せず、一方、ＬＭＰ７をコードするベクターのトランスフェクションまたはラクタシスチンの添加により、提示に関する遮断は排除されたからである。
【００４９】
これらの結果から、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの提示には非プロテアソームプロテアーゼが関与することが極めて強く示唆される。
【００５０】
実施例１３
本実施例の実験は、Ｃ末端システイン残基の改変によって調製した配列番号２のペプチド類似体が変化した免疫原性を持つかどうかを決定するために計画した。上述したタイプの51Ｃｒ放出アッセイを行った。このアッセイでは、ペプチド（配列番号２）およびターゲット細胞を２００μＭのジチオスレイタール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシメチル）ホスフィン）と混合した。
【００５１】
その結果、還元剤の存在下で配列番号２の抗原性は１０倍増大することがわかった。配列番号８を使って並行実験を行ったが、抗原性の増大はみられなかった。
【００５２】
実施例１４
上記実施例１３で観察された結果を見て、改変ペプチドを試験することにした。配列番号７および８の他に、式：
ＳＬＬＭＷＩＴＱＩ
（配列番号１２）を合成し、以下の１０ｍｅｒも同様に合成した：
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＶ（配列番号１３）
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１１（上記））
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＩ（配列番号１４）
ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＬ（配列番号１５）
ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＩ（配列番号１６）
ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＦ（配列番号１７）。
さらに、Ｃ末端システインが−ＮＨ2 −ＣＯ−ＣＨ2 側鎖で修飾されている配列番号２も調製した。これらのペプチドは全て上述したタイプのＣＴＬアッセイで試験した。配列番号７、８および１２のペプチドは全て、ＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７−１６５特異的ＣＴＬによる認識を、配列番号２と比較して約１０００倍増大させる。配列番号１４のペプチドも配列番号２より効率よく認識された。
【００５３】
実施例１５
本実施例の実験では、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬの増殖を刺激する能力を様々なペプチド類似体について調べた。
【００５４】
簡単に述べると、一般的なアッセイ方法で高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１特異抗体を示す２人のメラノーマ患者からＰＢＬを採取した。次に、標準的なプロトコールに従って、これらのＰＢＬを１００ｎＭまたは１０ｎＭの配列番号２または配列番号８で刺激した。配列番号８は２週間で１４倍大きいＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬの増殖をもたらした。３週間では増殖は配列番号２を使った場合の５４倍に達した。これらのＣＴＬを、配列番号２を使って、上述したタイプの四量体で染色したところ、染色は陽性であったことから、上記ＣＴＬは問題のＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを認識することがわかった。
【００５５】
１０ｎＭの配列番号８がＣＴＬを刺激したこと、そして天然ペプチドの必要量が実際にこれより高かったことは、注目に値する。さらに、標準的な方法論による追加実験では、この実施例に記載の増殖ＣＴＬがＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍細胞を殺滅する能力を持つことが確認された。
【００５６】
実施例１６
本実施例の実験は、上記ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドを使った四量体の反応性を評価するために計画した。
【００５７】
配列番号２または配列番号６のペプチドを使って、実施例６および７に記載した四量体を調製した。次にこれらを、ＨＬＡ−Ａ２とＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドとの複合体と反応することがわかっているＣＴＬクローンを染色する能力について調べた。例えば参考文献として本明細書の一部を構成するＶａｌｍｏｒｉら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（２０００）を参照されたい。染色は上述のように行った。
【００５８】
その結果、どちらの四量体もＣＴＬクローンを用量依存的に染色することがわかった。試験した最高のペプチド用量（１００μｇ／ｍｌ）では、蛍光強度はバックグラウンドより１０3 高かった。中間強度の蛍光シグナルに必要な四量体の濃度は、配列番号２を使った四量体では約１２μｇ／ｍｌ、配列番号６では３μｇ／ｍｌだった。
【００５９】
さらに、上述のように配列番号２で刺激した後、末梢血リンパ球を１４日間バルク培養した物の染色を検討した。数個の異なるポリクローナル集団に対して、２つの四量体による平均蛍光強度は同等だった。以下の説明で言及する四量体は配列番号２を使った四量体である。
【００６０】
実施例１７
この実施例では、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列番号２との複合体に特異的なさらなる細胞溶解性Ｔリンパ球の単離について説明する。
【００６１】
末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を、ＨＬＡ−Ａ* ０２０１陽性である２人のメラノーマ患者から単離した。ＣＤ８特異抗体で被覆した磁気ビーズを用いる磁気細胞選別法によって、ＣＤ８+ 細胞を分離した。ＣＤ８- 細胞を放射線照射（３０００ラド）した後、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）として使用した。ＣＤ８+ 細胞の刺激は、約１×１０8 細胞／ウェルを２〜４×１０6 個のＡＰＣおよび１μＭの配列番号２のペプチドと混合することによって行った。０．２４ｍＭ  Ａｓｎ、０．５５ｍＭ  Ａｒｇ、１．５ｍＭ  Ｇｌｎ、８％ヒトＡ+ プール血清、ヒト組換えＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）およびヒト組換えＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）を補足した２ｍｌのイスコフのダルベッコ培地で、細胞とペプチドを培養した。細胞は毎週刺激した。週に一度の刺激を２ラウンド行った後、試験した２つの培養物は９．８％および２．５％のＣＤ８+ ＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１四量体陽性リンパ球を示した。
【００６２】
次に、配列番号２および配列番号６を含む四量化複合体に対して陽性なＣＴＬを見いだすために、陽性培養物を試験した。両者に対して陽性なものを選別し、限界希釈法によってクローン化した。２つのクローンを全集団の代表として選択した。以下、これらのクローンをＬＡＵ１５５／１８およびＬＡＵ５０／１３と呼ぶことにする。下記の実験では、これらのクローンをＶａｌｍｏｒｉら（前掲）に記載の細胞株ＬＡＵ１５６／５と共に使用する。
【００６３】
実施例１８
上記実施例に記載した３つのＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬクローンを、そのターゲット細胞溶解能力について、上記実施例１および３に記載した51Ｃｒ放出アッセイで試験した。３つの細胞株は全て、飽和濃度の配列番号２でパルスされた上記ＴＡＰ欠損Ｔ２細胞を効率よく溶解することができた。半最大溶解は３：１のリンパ球／ターゲット細胞比で観察された。
【００６４】
上記３つのクローンはメラノーマ細胞株Ｍｅ２７５も効率よく溶解することができた。この細胞株は３つのＣＴＬ株の一つを得た患者と同じ患者から採取したリンパ節転移巣から得られた。すなわちこの細胞株は３つのＣＴＬ株の１つにとって自家細胞である。このメラノーマ細胞株は十分なレベルのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質、ｍＲＮＡを発現させると共に、参考文献として本明細書の一部を構成するＬｅｔｈｅらの米国特許第５，８１１，５１９号に記載されている相同遺伝子ＬＡＧＥ−１も発現させる。
【００６５】
これらのＣＴＬはいずれも、同様に上述した同種異系細胞株Ｍｅ２４２を認識しなかった。この細胞株もＮＹ−ＥＳＯ−１とＬＡＧＥを発現させるが、ＨＬＡ−Ａ２陰性である。
【００６６】
総合すると、これらのデータは、上記３つのＣＴＬクローンがＮＹ−ＥＳＯ−１／ＨＬＡ−Ａ２特異的であり、腫瘍反応性であることを示している。
【００６７】
実施例１９
本実施例の実験では、ＨＬＡ−Ａ２分子に対するペプチド結合を評価するために使用した機能競合アッセイを説明する。このアッセイは参考文献として本明細書の一部を構成するValmori ら，J. Immunol 160:1750-1758（1998）に記載されている。このアッセイは、上記実施例４で説明したように配列番号４の認識の阻害に基づいている。下記のペプチドを試験した。競合アッセイの結果を記載する。
【００６８】
0004615805.tif 000004
これらの結果は、５０％競合活性には約０．３μＭの配列番号２が必要であるのに対して、配列番号３および１ではそれぞれ１／９および１／１３の量しか必要でないことを示している。配列番号６および７のペプチドはペプチド結合の著しい増加をもたらし、配列番号８および１９も同様であることはわかるだろう。
【００６９】
ＭＨＣ分子への結合およびＴ細胞受容体相互作用における単一アミノ酸の役割を決定する第一段階として、配列番号２０〜２７の単一Ａｌａ置換ペプチドを合成した。Ｃ末端システインが結合にとって不利であることは上に示した通りなので、Ａｌａ置換ムテイン配列番号６を基本ペプチドとして使用した。その結果を上に示した。２位の置換は予想通りペプチド結合を１／１００に低下させた。５位および６位の置換も結合をかなり低下させた。意外にも、配列番号２３のペプチドは格段に高い結合能力を持っていた。
【００７０】
実施例２０
本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬによる抗原認識の効率を評価するために計画した。これを行うために、上述したタイプの４時間51Ｃｒ放出アッセイを使用し、同様に上述したＴ２細胞株を使って、ペプチド滴定を行った。測定の基準は、配列番号２によって達成される５０％最大溶解とした。５０％溶解に必要な配列番号２の量は試験した３つのＣＴＬクローン、すなわち上述したクローンＬＡＵ５０／１３、ＬＡＵ１５５／１８および１５６／５によって異なった（７ｎＭ、１２ｎＭおよび３ｎＭ）。この結果を図１に示す。図１から、配列番号１および３は、３つのクローンのいずれに対しても、抗原として効率が低いことがわかる。１つのクローン（ＬＡＵ１５６／５）は配列番号３を検出さえしなかった。
【００７１】
Ｃ末端に変異を持つ類似体は、概して配列番号２より良い抗原だった。配列番号６は最も効率的な抗原ペプチドであるようだった。最大溶解の５０％を得るのに必要な濃度は、これら３つのクローンのいずれについても、配列番号２より３〜４桁低かった。配列番号７および１９も配列番号２よりも高い効率で認識されたが、抗原活性の増加率は様々だった。ある例では、配列番号７によって相対的抗原活性は１０5 倍増加したが、別のＣＴＬにはわずかな効果しかなかった。
【００７２】
配列番号８は、３つのクローンのうちの２つによって、より効率よく認識された。
【００７３】
配列番号２０〜２７の単一アラニン置換に関して、各クローンは認識の微細特異性を示した。配列番号２７はこれを最も明確に示した。クローンのうちの２つは配列番号２７を配列番号２と同程度かそれ以上に認識し、クローンのうちの１つは配列番号２７を全く認識しなかった。クローンのうちの２つは、同様の認識パターンを示した。３〜７位のペプチドは全てどのＣＴＬクローンによる認識にとっても極めて重要であるらしかった。
【００７４】
実施例２１
本実施例の実験は、様々なペプチドの特異的応答誘発能力を評価するために行った。メラノーマ患者のＰＢＭＣから取得した高濃縮ＣＤ８+ 細胞を、先の実施例で説明したように配列番号１、２、３、６、７、８または１９の一つを使ってインビトロで刺激した。刺激の１週間後に、それらの細胞を、上述のように配列番号２を含有する四量体と抗ＣＤ８抗体とを使って染色した。
【００７５】
１週間後、培養物中のＣＤ８+ リンパ球の約０．１〜０．２％は四量体陽性だった。配列番号３は弱い刺激因子だったが、配列番号１および全てのカルボキシ置換誘導体は、この細胞集団を、配列番号２よりも増殖させた。これらの結果を図２Ａに示す。
【００７６】
追加実験では、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、製造者の使用説明書に従って、培養物を試験した。簡単に述べると、プレートをＩＦＮ−γ特異抗体で一晩コーティングし、６回洗浄した。Ｔ２細胞（５×１０4 細胞／ウェル）をレスポンダーＴ細胞（２×１０4 細胞／ウェル）および１μＭペプチドと一緒に加えた。正副一対の培養物を調製し、３７℃で２０時間インキュベートした。次に細胞を除去し、第２のビオチン化ＩＦＮ−γ抗体およびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体を使ってプレートを発色させた。立体顕微鏡を使用してスポット数を数えた。このアッセイを行った理由は、四量体を使用してペプチド類似体によるＴ細胞増殖を試験する方法では、親配列と交差反応しない特異的Ｔ細胞を検出できないかもしれないからである。
【００７７】
図２Ｂにこれらの結果を示す。配列番号２を使ってもペプチド類似体を使っても、同等な数の特異的細胞が得られた。この結果から、配列番号３は免疫原性に乏しいこと、およびカルボキシ置換ペプチドで誘発された特異的Ｔ細胞の大半は配列番号２と完全に交差反応することが裏付けられる。
【００７８】
上記の説明からわかるように、本発明は、
ＳＬＬＭＷＩＴＱＸ（配列番号１０）
［ここに、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは非極性側鎖を持つ疎水性アミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＴｒｐまたはＧｌｙであるか、または非荷電極性側鎖を持つアミノ酸、例えばＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり、最も好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＳｅｒである］という配列を持つペプチドに関する。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり病変を伴ってＮＹ−ＥＳＯ−１を発現させる患者への投与によって治療的に使用することができ、また診断的に、すなわちＨＬＡ−Ａ２陽性細胞が存在するかどうか、関連ＣＴＬが存在するかどうかなどを決定するために使用することもできる。
【００７９】
もう一つの態様では、Ｘは２つのアミノ酸であって、その第１アミノ酸はシステインまたはアラニンであり、かつ第２アミノ酸は任意のアミノ酸である。第２アミノ酸はＰｈｅ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕであることが好ましい。この態様では、配列番号１１または１４の場合のように、第１アミノ酸がシステインであり、第２アミノ酸がＰｈｅまたはＩｌｅであることが最も好ましい。
【００８０】
本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号６に記載のペプチドの類似体、すなわち配列番号６中のアミノ酸のうちＣ末端アミノ酸以外の少なくとも１つがアラニンで置換されているペプチドである。配列番号２７は特に好ましいが、配列番号２０〜２６に記載の他のペプチドも本発明の一部である。
【００８１】
ＨＬＡ−Ａ２分子はＭＨＣクラスＩ分子であり、ペプチドとクラスＩ分子との複合体に応答するＴ細胞は一般にＣＤ８+ 細胞である。
【００８２】
配列番号６によって定義されるペプチドは、配列番号１０のコア配列によって定義されるペプチドの典型例である。このペプチドは、上述のようにＨＬＡ−Ａ２分子に結合する。したがって、これはＨＬＡ−Ａ２の「マーカー」であると共に、上述のようにＣＴＬの増殖を刺激するペプチド／ＭＨＣ複合体の一成分でもある。同様に、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌが配列番号１０の構造におけるカルボキシ末端であるペプチドも使用することができる。
【００８３】
ペプチドを佐剤と混合することにより、治療用組成物を形成させることができる。また、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子（いわゆる「ミニ遺伝子」）も本発明の一部である。これらのミニ遺伝子は、プロモーターと作動可能に連結した状態で発現ベクター中に組み込むことができる。１または複数のペプチドの多重コピーを含む２以上の本発明ペプチドをコードする構築物も本発明の一部である。これらの構築物は、例えば組換えベクターまたはいわゆる「裸のＤＮＡ」、すなわち１または複数の所望のペプチドをコードする小さい核酸分子などの形をとることができる。同様に、ＤＮＡまたはベクターを含む真核細胞または原核細胞などの組換え細胞も、本発明の一部である。
【００８４】
これらのペプチドはＨＬＡ分子に結合する能力を持つので、本ペプチドが試料中の細胞に結合するかどうかを決定することによってＨＬＡ−Ａ２陽性細胞（ＨＬＡ−Ａ* ０２０１陽性細胞など）の有無を決定するための試薬として役立つ。この「リガンド／受容体」タイプの反応は当技術分野ではよく知られており、その決定には様々な方法論を利用することができる。
【００８５】
本発明のさらなる一側面は、トランスフェクトされた細胞によるペプチドの合成を指図するのに必要な情報を保持している、いわゆる「ミニ遺伝子」である。１または複数の抗原ペプチドをコードするミニ遺伝子を設計し、それをプラスミドを使ったトランスフェクションまたはワクシニアもしくはアデノウイルスへのクローニングによって、宿主細胞ゲノムに導入することができる。例えば参考文献として本明細書の一部を構成するＺａｊａｃら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１：４９６（１９９７）を参照されたい。組換えワクシニアウイルスベクターなどのこれらの組換えベクターは、融合タンパク質が生成するように構築することができる。例えば上記のように、融合タンパク質の一部分が望ましい腫瘍拒絶抗原前駆体または腫瘍拒絶抗原である融合タンパク質を構築することができ、これに追加のタンパク質またはペプチドセグメントを含めることができる。融合タンパク質に加えることができる追加タンパク質またはペプチドセグメントの典型例は、決してこのタイプに限るわけではないが、レポータータンパク質またはレポーターペプチド、すなわち発現が起こったことがわかるように観察可能なシグナルを与えるタンパク質またはペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質である。他のレポータータンパク質には、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ｄｈｆｒ、および参考文献として本明細書の一部を構成するＣｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：６０６（１９９６）に記載の「ｅＧＦＰ」すなわち強化緑色蛍光タンパク質などがあるが、これらに限らない。当業者が入手できる様々なレポータータンパク質は様々な方法で使用することができ、また実際、様々な方法で使用されている。例えば「ＧＦＰ」および「ｅＧＦＰ」を使って感染細胞を可視化することにより、フローサイトメトリーを使った場合の追跡と感染細胞の単離を容易にすることができる。ウェスタンブロッティング、免疫沈降などの方法を使用する場合は、他のレポータータンパク質が役立つ。これらの技術は当技術分野では標準的な技術であり、ここに繰り返して説明する必要はない。融合ペプチドからの腫瘍拒絶抗原前駆体または腫瘍拒絶抗原の切断を容易にするタンパク質またはペプチドセグメントも、含めることができる。融合タンパク質は上述のように２以上の腫瘍拒絶抗原を含むことができ、１または複数の腫瘍拒絶抗原の関連ＭＨＣ分子への送達を促進するタンパク質またはペプチドを含むこともできる。そのようなタンパク質およびペプチドは当技術分野ではよく知られており、ここで詳しく説明する必要はない。
【００８６】
本明細書に記載の組換えレポーターベクターをトランスフェクトした組換え細胞も本発明の一部である。これらの細胞は例えば任意のタイプの真核細胞であることができ、ヒト細胞は特に好ましい。これらの細胞は、例えば腫瘍拒絶抗原前駆体または腫瘍拒絶抗原の製造などに使用することができる。また、これらの細胞はエクスビボで、特定のＭＨＣ分子と腫瘍拒絶抗原との複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を生成させるためにも使用することができる。これは、融合タンパク質の発現およびＴＲＡ（すなわち腫瘍拒絶抗原）のプロセシング後に生成するＭＨＣ分子とＴＲＡとの複合体に特異的な試料中の細胞の増殖が誘発されるように、トランスフェクト細胞をＴ細胞の供給源（例えば血液試料）に接触させるだけで行うことができる。これらの細胞は、本明細書に示すようにその表面に適当な複合体を提示しインビボで同じタイプのＴ細胞応答を誘発するので、非増殖性にした場合はワクチン物質として使用することもできる。同様に、ベクターをワクチン物質そのものとして使用して、細胞表面上のＭＨＣ分子とペプチドとの複合体に対するＴ細胞応答を必要とする患者に投与することもできる。もちろんエクスビボで生成させたＴ細胞を患者の処置に使用することもできる。
【００８７】
上記のペプチドを他の腫瘍拒絶抗原に由来するペプチドと組み合わせて「ポリトープ」を形成させることができる。代表的なペプチドには、いずれも参考文献として本明細書の一部を構成する米国特許出願第０８／６７２，３５１号、第０８／７１８，９６４号（現米国特許第    号）、第０８／４８７，１３５号（現米国特許第    号）、第０８／５３０，５６９号および第０８／８８０，９６３号に記載されているものがある。
【００８８】
使用することができる他のペプチドには、いずれも参考文献として本明細書の一部を構成する次の文献に記載されているものがある：米国特許第５，４０５，９４０号、第５，４８７，９７４号、第５，５１９，１１７号、第５，５３０，０９６号、第５，５５４，５０６号、第５，５５４，７２４号、第５，５５８，９９５号、第５，５８５，４６１号、第５，５８９，３３４号、第５，６４８，２２６号および第５，６８３，８８６号、ＰＣＴ国際公開第９２／２０３５６号、第９４／１４４５９号、第９６／１０５７７号、第９６／２１６７３号、第９７／１０８３７号、第９７／２６５３５号および第９７／３１０１７号ならびに係属中の米国特許出願第０８／７１３，３５４号。
【００８９】
ポリトープは、このタイプの分子が免疫応答を刺激しかつ／または誘発することができるかどうかを決定するために様々な方法で一つに連結することができる、２以上の潜在的に免疫原性または免疫刺激性のペプチド群である。
【００９０】
これらのペプチドは直接連結することもできるし、隣接配列を使って連結することもできる。関連エピトープ配列の直接結合を教示しているＴｈｏｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１３）：５８４５−５８４９（１９９５）を参照されたい。ポリトープのワクチンとしての使用はよく知られている。例えばＧｉｌｂｅｒｔら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１２）：１２８０−１２８４（１９９７）、Ｔｈｏｍｓｏｎら（前掲）、Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（２）：８２２−８２６（１９９６）、Ｔａｍら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１（１）：２９９−３０６（１９９０）（いずれも参考文献として本明細書の一部を構成する）を参照されたい。特に前記Ｔａｍの文献は、マウスモデルで使用した場合にポリトープが抗体および防御免疫の両方の生成に有用であることを示している。さらにこの文献は、ポリトープが消化されると、ＭＨＣによって提示されることが可能であり実際にＭＨＣによって提示されるペプチドが生成することを示している。Ｔａｍは、ポリトープ「ストリング」からプロセシングされた個々のエピトープがＣＴＬによって認識されることを示すことによって、これを示している。このアプローチは、例えばどのくらいの数のエピトープであれば１つのポリトープに連結しても認識を誘発することができるかを決定する際に、また様々な組合わせのエピトープの効力を決定するためなどに使用することができる。様々な組合わせは腫瘍拒絶抗原の特定のサブセットを発現させる患者に合わせて「テーラーメード」することができる。これらのポリトープは、ポリペプチド構造として導入するか、核酸送達システムを使って導入することができる。詳しく述べると、当技術分野では、個々のエピトープまたは上述したようなポリトープをコードするＤＮＡを導入するために数多くの様々な方法を利用することができる。例えば参考文献として本明細書の一部を構成するＡｌｌｓｏｐｐら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（８）：１９５１−１９５９（１９９６）を参照されたい。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙウイルス様粒子、プラスミド、細菌などを使用することができる。これらのシステムは、ある与えられた同様の状況下でヒトにはどのシステムが最も適当であるかを決定するために、マウスモデルで試験することができる。またヒト臨床試験で試験することもできる。
【００９１】
また、試料中の細胞溶解性Ｔ細胞の有無を決定するために上記のペプチドを使用することも、本発明の特徴である。上述したように、試料中のＣＴＬはペプチド／ＭＨＣ複合体と反応する。したがって試料中にＣＴＬが存在することがわかっている場合は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２陽性細胞、例えばＨＬＡ−Ａ* ０２０１陽性細胞に加え、次に例えば放射活性クロム放出、ＴＮＦ産生などを決定するか、またはＴ細胞活性を決定する他の任意の方法を実施することにより、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞を「溶解」することができる。同様に、本発明ペプチドの１つをＨＬＡ−Ａ２陽性細胞と共に試料に加え、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞の溶解を、例えば51Ｃｒ放出、ＴＮＦの存在などによって決定することにより、試料中に特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が存在するかどうかを決定することができる。また、ＣＴＬはＥＬＩＳＰＯＴ解析によって検出することもできる。例えばＳｃｈｍｉｔｔｅｌら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１０：１６７−１７４およびＬａｌｖａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２６：８５９を、またはＭＨＣクラスＩ／ペプチドの蛍光原性四量化複合体のＦＡＣＳ解析（Ｄｕｎｂａｒら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：４１３−４１６、Ｒｏｍｅｒｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１６４１−１６５０（１９９８））（前記の文献は全て本明細書の一部を構成する）参照されたい。詳しく述べると、前記複合体は第１結合パートナーと第２結合パートナーを含み、第１および第２結合パートナーは互いに特異的である。これらは、例えばアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン、ビオチンに特異的な抗体またはその結合部分などであることができる。重要な特徴は第２結合パートナーが、ＭＨＣ分子、β２−ミクログロブリン分子および前記ＭＨＣ分子に特異的に結合するペプチドから構成される複数の複合体に結合されなければならず、前記多成分複合体が標識されなければならないということである。ＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ２分子であることが好ましいが、任意のＨＬＡ分子を使用できることは当業者には理解されるだろう。
【００９２】
第２結合パートナーはビオチンであることが好ましいが、例えばＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体の一成分に特異的な抗体、例えばＨＬＡ特異抗体、β２−ミクログロブリン特異抗体などであってもよい。同様に、第１結合パートナーは例えば組換えまたは天然プロテインＬ、組換えまたは天然プロテインＡ、さらには第２の抗体であることができる。複合体は可溶型であるか、または除去可能な固相、例えば磁気ビーズに結合した形をとることができる。
【００９３】
本発明の大分子中のＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体の数は様々である。これは少なくとも２つの複合体を含み、好ましくは少なくとも４つの複合体を含むが、それ以上の複合体が存在してもよい。
【００９４】
結合パートナーとＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチドとの複合体は、当技術分野で知られている任意のラベルを使って標識することができる。蛍光ラベルの例は上述した。アルカリホスファターゼなどの酵素ラベル、金属粒子、合成物質製の着色プラスチック、放射性ラベルなどは、全て使用することができる。
【００９５】
第１結合パートナーに特異的に結合する第３結合パートナーを使用してもよい。例えば第１結合パートナーがストレプトアビジンであり、かつ第２結合パートナーがビオチンである場合、第３結合パートナーはストレプトアビジン特異抗体であることができる。３以上の結合パートナーを使用する場合は、ＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体との結合が妨害されない限り、上記のラベルはどの結合パートナーに結合させてもよい。
【００９６】
上記複合体は、例えば試料中に存在する、ＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離するために使用することができる。このような細胞溶解性Ｔ細胞は、本発明の免疫複合体に結合する。好ましい一態様では、被験試料を細胞溶解性Ｔ細胞に特異的に結合する反応物で処理する。この場合、前記ラベルは検出可能なシグナルを与える。次に、標識されたＣＴＬを含む試料を上記複合体と接触させ、結合させる。標識されたＣＴＬは周知の標準的細胞分離法によって分離することができる。好ましくはＦＡＣＳを使用するが、他の分離方法も当業者には同様に知られている。使用するペプチドは当業者の必要に応じて選択され、問題にしている特定のＭＨＣ系の性質などに依存するだろう。
【００９７】
また、本方法は、ワクチンなどの特定の治療薬を投与した後の腫瘍の状態を監視するためにも使用することができる。さらに本方法論は、上述のように細胞溶解性Ｔ細胞前駆体を同定するためにも使用することができるので、考えうる治療法の候補者を、彼らが適当なＴ細胞前駆体を持つかどうかを決定することによって同定することもできる。
【００９８】
もちろん、本ペプチドはＣＴＬの産生を誘発するために使用することもできる。上述のように、ＣＴＬ前駆体は適当な複合体に直面するとＣＴＬになる。このようないわば「直面」を引き起すことにより、ＣＴＬを生成させることができる。これは、このようなＣＴＬを生成させるためにインビボでもエクスビボでも有用である。
【００９９】
複数の異なるペプチドを含みそのうちの少なくとも１つが本発明のペプチドであるいわゆる「カクテル」ならびに「ポリトープ」分子およびそれらをコードする核酸分子も本発明の一部である。本明細書で使用する「ポリトープ」という用語は、細胞内プロセシング後にＭＨＣ分子によって提示される複数のペプチド配列を含有するように設計された組換え分子を指す。このようなポリトープは、例えば１つのエピトープの繰返しからなったり、いくつかの異なるエピトープからなったりすることができる。
【０１００】
本発明の他の特徴と応用は当業者には明らかであり、本明細書に記載する必要はないだろう。
【０１０１】
本明細書で使用した用語および表現は、限定ではなく説明のために使用されている。これらの用語および表現の使用に、本明細書に示し説明した特徴またはその一部の等価物を排除する意図はなく、本発明の範囲内で様々な変更態様が可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＮＹ−ＥＳＯ−１に関連するペプチドおよびペプチド類似体の抗原性に関するデータ。
【図２】  図２Ａおよび図２Ｂはそれぞれ、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドおよび同類似体のインビトロ免疫原性に関する結果（２Ａ）およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（２Ｂ）を示す。
【配列表】
0004615805.tif 000005
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0004615805.tif 000008
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【図１】
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【図２】
0004615805.tif 000012