(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性薬剤を含有する水溶液と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質を超臨界状態または亜臨界状態の二酸化炭素中に含んでなる溶液とを、超音波を照射しながら混合するリポソーム含有製剤の製造方法であって、
リポソームの懸濁液に含まれるリポソームが、前記の転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質からなるリン脂質膜内に、水溶性薬剤を含有する水相を内包してなり、
前記超音波照射する際の温度が、二酸化炭素の臨界温度もしくはリン脂質の転移温度のいずれか高い温度〜転移温度＋５０℃であり、
前記水溶性薬剤が、前記の転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質に対して、１〜１０の重量比となる量で内包されていることを特徴とするリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項２】
超音波が照射された前記リポソームの懸濁液を、０．０５〜０．４μｍの孔径を有する濾過膜に通過させて濾過することを特徴とする請求項１に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項３】
実質的に溶解助剤を使用しないことを特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項４】
カチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類およびグリコール類から選択される少なくとも１種の脂質膜安定化物質を、前記の転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質に混合することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム含有製剤の製造方法によって製造されたことを特徴とするリポソーム含有製剤。
【請求項６】
前記リン脂質膜内に内包された水相には、少なくとも非イオン性ヨウド化合物および製剤助剤を含有することを特徴とする請求項５に記載のリポソーム含有製剤。
【請求項７】
前記非イオン性ヨウド化合物の５〜３５質量％が、リポソーム内に内包されていることを特徴とする請求項６に記載のリポソーム含有製剤。
【請求項８】
前記製剤助剤が、緩衝剤、キレート剤、粘度調整剤、および安定剤よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上であることを特徴とする請求項６に記載のリポソーム含有製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入物質の内包化率が高く、かつ微細化されたリポソームを含有するリポソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、主にリン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の閉鎖小胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有するため、従来から様々な研究材料として用いられてきている。このリポソームは、内部に有する水相には水溶性の封入物質を、二分子膜の内部には油溶性の封入物質を保持するという、いわゆるカプセル構造を構築できることから、診断、治療、化粧などの様々な分野で用いられてきている。さらに、近年では、薬物送達システム（ＤＤＳ）への応用が盛んに研究されている。
【０００３】
このような封入物質を内包したリポソームは、通常、分散液の状態で製剤として用いられているが、封入物質の保持効率（リポソーム膜構成成分に対する封入物質の内包化率）が高いリポソームを得ることは容易ではなく、所望の効果を得るためには、リポソームが高濃度に分散されたリポソーム含有製剤を用いるか、または多量のリポソーム含有製剤を用いる必要があった。リポソーム含有製剤が高濃度であると製剤粘度が高くなるため、リポソーム含有製剤を生体内に投与する際には、患者に与える負担が大きく、また、リポソーム含有製剤を多量に投与する場合にも同様の問題があった。特に、リポソームが有する薬物内包機能を用いた造影剤は、血管などを介して生体内に投与（注射）するものであるため、投与するリポソーム含有製剤が高濃度であったり、または多量に投与する必要があると、患者に負担を与えるのみならず副作用の懸念があった。したがって、造影剤への応用を考えた場合、造影物質の保持効率（内包化率）が高いリポソーム含有製剤が求められていた。
【０００４】
この薬物送達システム（ＤＤＳ）においては、封入物質を体内の所望の部位に効率よく到達させる必要があり、リポソームを微細化することが重要である。そのために、従来から、Bangham法や逆相蒸発法（ＲＥＶ法）などで調製されたリポソームの懸濁液を、超音
波照射や機械的せん断力を用いて微細化する方法や、リポソームの懸濁液をメンブランフィルターに高圧下で通すエクストルージョン法などが行われている。しかしながら、従来の方法では、膜物質を溶解する際に使用した有機溶媒が、どうしても微量残留してしまうため、リポソーム膜の強度が低下する傾向があった。そのため、超音波処理やエクストルーダー処理を行うと膜の一部が破壊されて内包化率が低下する問題や、また壊れた膜物質がミセルを形成し、生体内で予期せぬ作用を生じる懸念があった。
【０００５】
また、リポソームを含有する化粧料、皮膚外用剤を、超臨界二酸化炭素を用いて製造する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この方法は、製造条件を種々設定することが可能であり、従来のリポソームの懸濁液の製造方法に比べ、比較的容易に粒子径分布が均一なリポソームを調製することができる。したがって、超臨界二酸化炭素を用いた方法は、ＤＤＳ製剤を調製する上で有効な方法である。この方法においては、超臨界二酸化炭素を主要な溶媒として用いるものの、溶媒助剤として使用する有機溶媒の混入が避けられず、この有機溶媒により膜強度が低下する傾向があった。そのため、上記と同様に、内包化率が低下する問題や、生体内で予期せぬ作用を生じる懸念があった。
【特許文献１】特開２００３−１１９１２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、封入物質の内包化率が高くかつ微細化されたリポソームを含有するリポソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
リポソーム含有製剤の製造方法は、水溶性薬剤を少なくとも含有する水溶液と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質を超臨界状態または亜臨界状態の二酸化炭素中に含んでなる溶液とを、超音波を照射しながら混合する方法であって、
リポソームの懸濁液に含まれるリポソームが、前記の転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質からなるリン脂質膜内に、水溶性薬剤を含有する水相を内包してなり、
前記超音波照射する際の温度が、二酸化炭素の臨界温度もしくはリン脂質の転移温度のいずれか高い温度〜転移温度＋５０℃であり、
前記水溶性薬剤が、前記の転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質に対して、１〜１０の重量比となる量で内包されていることを特徴とする。
【００１０】
超音波が照射された前記リポソームの懸濁液を、０．０５〜０．４μｍの孔径を有する濾過膜に通過させて濾過することが好ましい。
実質的に溶解助剤を使用しないことが好ましい。
カチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類およびグリコール類からなら群から選択される少なくとも１種の脂質膜安定化物質を、前記の転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質に混合することが好ましい。
【００１１】
本発明に係るリポソーム含有製剤は、前記の方法によって製造されたことを特徴とし、リン脂質膜内に内包された水相には、少なくとも非イオン性ヨウド化合物および製剤助剤を含有することが好ましい。
【００１２】
前記非イオン性ヨウド化合物の５〜３５質量％が、リポソーム内に内包されていることも好ましく、さらに、前記製剤助剤が、緩衝剤、キレート剤、粘度調整剤、および安定剤よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上であることも好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
リポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液を調製する際に、所定の条件で超音波を照射することにより、リポソームの封入物質の内包化率が向上するとともにリポソームが微細化されたリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明のリポソーム含有製剤の製造方法について詳細に説明する。
【００１５】
リポソーム含有製剤の製造方法は、超臨界二酸化炭素を反応媒体としたリポソームの調製方法（以下、超臨界二酸化炭素法）によりリポソームの懸濁液を調製する際に超音波を照射する方法、である。
【００１６】
このような方法により製造されるリポソーム含有製剤は、水溶性封入物質が内包されたリポソームが水性溶媒中に分散している水性分散液として得られる。
【００１７】
リポソームとしては、多重層膜からなるリポソーム（Multilamellar vesicles; ＭＬＶ）、粒径が大きい一枚膜のＬＵＶからなるリポソーム（Large unilamellar veislcles）
、粒径が５０ｎｍ未満の小さい一枚膜のＳＵＶからなるリポソーム（Small unilamellar vesicles）が挙げられ、これらは混在していてもよい。
【００１８】
リポソームは、二分子膜小胞体であり、一般には脂質二重膜で構成される。本発明の製造方法に用いられるリポソーム膜構成物質は、膜構成物質として一般に使用されるものであれば特に限定されない。通常は、リポソーム用脂質であるリポソーム形成能を有するリン脂質および／または糖脂質を必須の主要成分とし、それ以外に任意成分として、次の物質を共存させてもよい。任意成分には、脂質膜安定化剤としてのステロール類などのほか、荷電物質としての脂肪酸またはその塩、脂質混合乳化物など、従来から小胞体の形成成分として用いられているものも含まれる。
【００１９】
以下、リポソーム含有製剤を調製する際に用いられる各成分について説明する。
【００２０】
（水溶性薬剤）
本発明で用いられる水溶性薬剤としては、造影性物質、抗がん性物質、抗酸化性物質、抗菌性物質、抗炎症性物質、血行促進性物質、美白物質、肌荒れ防止物質、老化防止物質、発毛促進性物質、保湿性物質、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などの水溶性薬剤が挙げられる。本発明のリポソーム含有製剤は、水溶性薬剤として造影性物質、抗がん性物質を用いることが好ましい。
【００２１】
造影性物質としては、水溶性ヨウド系化合物を用いることができる。水溶性ヨウド系化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず、特に規定されない。一般的には非イオン性ヨウド化合物の方が、イオン性ヨウド化合物よりも浸透圧が低く、投与された人体に対する負荷が小さいためにより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物としてヨウ化フェニルを含み、例えば2,4,6−トリヨードフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。
【００２２】
そのような非イオン性ヨウド化合物として、具体的には、イオパミドール（Iopamidol
）、イオメプロール(Iomeprol)、イオヘキソール(Iohexol)、イオペントール(Iopentol)
、イオプロミド（Iopromide）、イオシミド(Iosimide)、イオベルソール(Ioversol)、イ
オトロラン(Iotrolan)、イオタズル(Iotasul)、イオジキサノール(Iodixanol)、イオデシノモール(Iodecimol)、（1,3−ビス−（Ｎ−3,5−ビス−［２，３−ジヒドロキシプロピ
ルアミノカルボニル］−2,4,6−トリヨードフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセチルアミノ
）プロパンなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
また、抗がん化合物としては、具体的には、メトトレキサート、ドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトボシド、エリブシチン、カプトデシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスブラチン、ブレドニゾンなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
なお本明細書において、上記化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。
【００２５】
本発明のリポソーム含有製剤をＸ線検査用造影剤として用いる場合、好適なヨウド系化合物としては、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールが好ましい。特にイオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨウド化合物では、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧をさらに低下させる利点がある。
【００２６】
本発明のリポソーム含有製剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、典型的にはＸ線造影剤における全ヨウド化合物の５〜４０質量％、好ましくは５〜３５質量％、より好ましくは１０〜２５質量％であることが望ましい。この内包化率はリポソーム粒子の細密充填の限界を下回るため、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。
【００２７】
（リン脂質）
また、リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンなどに代表されるリン脂質が挙げられる。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００２８】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。
【００２９】
上記中性リン脂質のほかに、アニオン性リン脂質、カチオン性リン脂質といった荷電リン脂質、さらには重合性リン脂質、ならびにカチオン性（正荷電）脂質を含んでもよい。
【００３０】
負に荷電したリン脂質として、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファ
チジルセリン（DSPS）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジミリストイルホスファチジン酸などを挙げることができる。
【００３１】
カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどが挙げられる。
【００３２】
本発明において用いられるリン脂質には、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含むことが望ましい。リン脂質の「（相）転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用する示差熱分析による。
【００３３】
相転移点を有するリン脂質としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度（以下同じ）：23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5℃）、水
素添加大豆レシチン（53℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（54℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（54.1〜58.0℃）などが例示される。
【００３４】
これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。
【００３５】
カチオン性脂質の例としては、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS
）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、
２、３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）およびＮ−［１
−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）などが挙げられる。
【００３６】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００３７】
必要に応じリポソームの膜構成成分として、上記脂質成分の他に他の成分を加えることもできる。その例として、膜安定化剤またはポリアルキレンオキシド基導入用アンカーとしてコレステロール、コレステロールエステルなどのステロール類、荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなどが挙げられる。
【００３８】
本発明における好ましいリポソームの別の態様として、膜構成成分としてホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群より選ばれるリン脂質を用いることができ、両者を組み合わせてもよい。
【００３９】
（製剤助剤）
またリポソームの懸濁液には、製剤助剤が溶解または分散していることが好ましい。「製剤助剤」とは、製剤化に際し封入物質とともに添加されるものであり、各種の物質が適宜使用される。具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、キレート化剤、粘度調節剤、安定剤、浸透圧調節剤、α‐トコフェロールなどの抗酸化剤、パラオキシ安息香酸メチルといった保存剤などが挙げられる。本発明においては、緩衝剤、キレート剤、粘度調整剤、および安定剤よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上用いることが好ましい。
【００４０】
このような各成分を用いて、以下のようにして、本発明のリポソーム含有製剤を調製する。
【００４１】
リポソーム含有製剤の製造方法
リポソーム含有製剤の製造方法としては、実施態様１および実施態様２を挙げることができる。実施態様１は、調製されたリポソームの懸濁液に所定条件で超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する方法であり、実施態様２は、超臨界二酸化炭素法によりリポソームの懸濁液を調製する際に超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する方法である。まず、実施態様１から説明する。
【００４２】
（実施態様１）
リポソーム含有製剤の製造方法は、その実施態様１においては、まずリポソームの懸濁液を調製する。
【００４３】
実施態様１においてリポソームの懸濁液は、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有する脂質膜構成物質などを含有する超臨界二酸化炭素と、水溶性薬剤などの封入物質等を含有する水溶液とを混合することにより形成される。二酸化炭素は、その臨界温度が３１．１℃、臨界圧力が７５．３ｋｇ／ｃｍ2と比較的扱いやすく、そのガスは不活性である
ため残存しても人体に無害であり、さらに高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由により好適である。本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、通常３２〜１００℃、好ましくは３２〜８０℃である。かかる温度範囲の中でも特に好適な温度は、使用するリン脂質の相転移温度またはそれより上である。圧力は、通常５０〜５００ｋｇ／ｃｍ2、好ましくは９０〜１５０ｋｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１００〜１２０ｋｇ／ｃｍ2範囲である。また、高温下に脂質類を水中で強制的に
融和させる方法でないために、高温による脂質類の変性、たとえばリン脂質が加水分解してリゾ体を生じたり、不飽和成分の過酸化が起きるといった問題もない。
【００４４】
リポソームの懸濁液の調製は、具体的には以下のように行なわれる。
【００４５】
まず、圧力容器に、リポソームの脂質膜構成物質としてリン脂質および脂質膜安定化物質などを仕込む。脂質膜構成物質として上記リン脂質を、好ましくはカチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類、グリコール類から少なくとも１種選ばれた化合物とともに混合して仕込む。脂質膜構成物質を仕込んだ後、この圧力容器に備えられた加熱手段により所定の温度に加熱して全体を融解させた後、マグネティックスターラー等の攪拌手段により攪拌させながら、液体二酸化炭素を加える。さらに、圧力容器内を上記の圧力および温度として、液体二酸化炭素を超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。次いで、超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素に、リポソームの脂質膜構成物質としてリン脂質および脂質膜安定化物質などを混合する。
【００４６】
次いで、この超臨界二酸化炭素を攪拌しながら、その中に、封入物質、必要に応じて前記製剤助剤を含む水溶液を２回以上に分けて添加し、あるいは少量ずつ連続的に添加して混合する。具体的には該水溶液を、１分当り該超臨界二酸化炭素容量の１／１０００〜１／５容量、好ましくは１／５００〜１／１０容量、より好ましくは１／２００〜１／２０容量の割合で添加することがよい。
【００４７】
封入物質のリポソーム内への内包化の効率は、リポソーム用脂質の脂質総量と封入物質などを含む水溶液との比率によっても左右される。ここでいう脂質総量とは、リポソーム膜を構成するリン脂質類、ステロール類、その他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。上記水溶液１リットル（Ｌ）に対し脂質総量が１５〜１５０ｍmoles 、好ましくは３０〜１２０ｍmolesの範囲、より好ましくは５０〜１００ｍmolesの範囲の割合で混合すると、水溶性封入物質のリポソーム内への内包化が良好に進行し、結果的にその封入物質の保持効率も向上する。
【００４８】
上記のようにして超臨界二酸化炭素と水溶液とが混合された混合溶液を調製した後に、圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出すると、封入物質を内包するリポソームが分散しているリポソームの懸濁液が生成する。
【００４９】
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する物質の内包化率、封入物質のリポソーム内の保持率が高い。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、有機溶剤を使用せずに非イオン性かつ水溶性の物質を効率よくリポソームに封入することができる本法は、本発明のリポソーム含有製
剤の製造には有用な方法である。
【００５０】
本発明におけるリポソームの多くは、通常、多重層膜リポソームとして存在するが、一枚膜リポソームもまた混在していてもよい。ここにいう一枚膜リポソームとは、リン脂質二重層が実質的に1つの層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。ここで「実質的に」とは、以下の凍結かつ断（Freeze fracture ）レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察において、レプリカが概ね1つの層として認められ
るリン脂質二重層によりリポソームが構成されていることをいう。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを一枚膜と判定し、２つ以上の段差が認められるものを「多重層膜」と判定している。多重層膜からなるリポソーム（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）は、リポソーム膜の二分子膜を剥がしてその多重層をなるべく薄くすることが望ましい。一枚膜リポソームは、多重層膜リポソームに比べ、封入容量が大きく、さらに封入効率が高い。したがって、投与する脂質量も大きくならないため、一枚膜リポソームの割合が多い方が望ましい。
【００５１】
このように調製されたリポソームの懸濁液に、所定の条件で超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する。
【００５２】
（超音波照射）
このように調製されたリポソームの懸濁液を、前記リン脂質の転移温度〜転移温度＋５０℃（ただし１００℃を超えない）に加熱したのち、その温度±１０℃（ただし１００℃を超えない)に保持しながら所定の条件で超音波を照射する。
【００５３】
照射条件は、リポソームの懸濁液に含有されるリポソームの形態、粒子径分布、内包化率等により適宜選択される。
【００５４】
このようにリン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となって流動性が高まり、さらに、その状態で超音波処理を行うことにより、実質的に有機溶媒などの溶解助剤を用いなくても、効率的にリポソームの封入物質の内包化率を向上させることができ、かつリポソームを微細化することができる。さらに、溶解助剤により膜強度が低下することがないため、その後の工程においても内包化率が低下することがない。
【００５５】
本発明に用いられるリポソームの懸濁液としては、上記したように超臨界二酸化炭素法で調製したリポソームの懸濁液を用いることが好ましい。この方法で調製されたリポソームの懸濁液は、粒子径分布が均一なリポソームを含有しているため、本発明の上記超音波処理によって、上記と同様にリポソームの封入物質の内包化率が向上するとともにリポソームがより微細化され、さらに粒子径分布が均一なリポソーム含有製剤が得られる。
【００５６】
リポソームの懸濁液の超音波処理は、具体的には、次のようにして行うことができる。
【００５７】
上述のようにリポソームの懸濁液を調製した後、
（１）得られたリポソームの懸濁液を容器内で攪拌しながら、上記条件で超音波を照射する方法、
（２）得られたリポソームの懸濁液を循環させて、上記条件で超音波が照射されている箇所を通過させる方法、
（３）得られたリポソームの懸濁液を容器内で攪拌しないで、上記条件で超音波を照射す
る方法、などによりリポソームの懸濁液の超音波処理を行うことができる。上記（２）の方法により行う場合は、超音波処理時間は超音波が照射されていた累積時間から求める。本発明においては、製造工程が簡易である上記（１）の方法で超音波処理を行うことが好ましい。
【００５８】
上記のように超音波が照射されたリポソームの懸濁液を、さらに濾過することが好ましい。
【００５９】
（濾過）
超音波が照射されたリポソームの懸濁液の濾過は、所定の孔径を有する濾過膜を通過させて濾過することが好ましく、エクストルーダーを使用して濾過することが望ましい。この濾過膜としては、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができ、その孔径は０．０５〜０．４μｍ、好ましくは０．１〜０．４μｍ、さらに好ましくは０．１５〜０．２μｍの範囲が望ましい。
【００６０】
具体的には、上記孔径を有するフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより、最適寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。この静圧式押出し装置としては、各種の静圧式押出し装置、たとえば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイエンス製）などを挙げることができる。これにより脂質分子の配向が均一であり、水分散性が良好なリポソーム用脂質が得られる。押出し濾過法については、たとえばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9ページ(1979)に記載されている。
【００６１】
望ましい態様として、前記押出し濾過は、リポソームの懸濁液を転移温度を有するリン脂質の転移温度以上、好ましくは“ 転移温度＋１０℃”以上に加温し、その後、細孔のある膜を通すことが好ましい。この「転移温度＋１０℃以上」とは、用いるリン脂質の種類と組成にもよるが、３５℃から６５℃程度である。
【００６２】
加圧押出し濾過の操作では、このようにリン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となり、流動性が高まる。本発明の製造方法によるリポソーム用脂質は、規則正しい配向を有する均一な脂質膜を構成しているため、水溶性封入物質を封入した粘度の高いリポソーム懸濁液であっても、フィルターの目詰まりを起こすことなく粒径の揃ったリポソームを作製することができる。
【００６３】
このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。引き続きリポソームを、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法により未保持の封入物質を除去して精製してもよい。濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、リポソーム含有製剤が調製される。
【００６４】
次に、本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法の実施態様２について説明する。
【００６５】
（実施態様２）
本発明の実施態様２は、上述した実施態様１の超臨界二酸化炭素法によるリポソーム懸濁液の調製法において、水溶性薬剤を少なくとも含有する水溶液と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質を超臨界状態の二酸化炭素中に含んでなる溶液とを混合する際に、所定条件で超音波を照射するリポソーム含有製剤の製造方法である。実施態様２におけるリポソーム含有製剤の製造は、基本的には実施態様１と同様の条件で行い、実質的に溶解助剤を使用しない。
【００６６】
実施態様２においては、超音波照射する際の温度（すなわち、超臨界二酸化炭素を生成させる温度）が、二酸化炭素の臨界温度もしくはリン脂質の転移温度のいずれか高い温度〜転移温度＋５０℃、の範囲であることが好ましい。また、超音波照射条件は、リポソームの形態、粒子径分布、内包化率等により適宜選択される。
【００６７】
超音波処理を行うことにより、実質的に有機溶媒などの溶解助剤を用いなくても、効率的にリポソームの封入物質の内包化率を向上させるとともに、リポソームを微細化することができる。さらに、溶解助剤により膜強度が低下することがないため、その後の工程においても内包化率が低下することがない。
【００６８】
本発明においては、上記のように超音波が照射してリポソームの懸濁液を調製した後、実施態様１と同様にして濾過することが好ましく、さらに濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のリポソーム含有製剤が調製される。
【００６９】
リポソーム含有製剤
本発明のリポソーム含有製剤は、リポソームの平均粒子径が５０〜８００ｎｍであることが望ましい。リポソームの粒径は、体内の特定部位に取り込ませる場合には、２００ｎｍよりも小さくすることが好ましく、体内の捕食細胞に取り込ませる場合には２００ｎｍ以上が望ましい。
【００７０】
さらに、リポソーム含有製剤中のリポソームは、封入物質がリポソーム膜構成成分に対して、１〜１０、好ましくは２〜８、より好ましくは３〜６の重量比となる量で内包されていることが望ましい。
【００７１】
このように、リポソーム含有製剤は、リポソームの封入物質の内包化率が向上しているため、生体内に投与するリポソーム含有製剤は少量で済み、患者に与える負担が小さく、特に、薬物送達システム（ＤＤＳ）を用いた造影剤に適用される場合においては、患者に与える負担がさらに軽減される。
【００７２】
このような本発明のリポソーム含有製剤は、特に限定されず、化粧料、皮膚外用剤、内服薬、造影剤などに適用することができる。本発明においては、上記効果が得られることから造影剤に好適に用いることができる。
【００７３】
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７４】
なお、非イオン性ヨウド化合物としては以下のものを用いた。
【００７５】
非イオン性ヨウド化合物
商品名：オイバロミン150（コニカミノルタエムジー（株）製Ｘ線造影剤：イオパミドールを306.2mg/ml含有（ヨード含有量150mg/ml））
【００８２】
［実施例１］
ステンレス製の圧力容器内に、28kHzの振動子（4392C．（株）カイジョー）を入れ、その上にジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）860mgと、コレステロール384mgとを入れ、蓋をした。その後、圧力容器全体を電熱ヒーターにて、60℃に加熱した後、圧力容器内をさらにマグネティックスターラーで攪拌しながら、圧力50kg/cm2の液化二酸化炭素130ｇを圧力容器内に注入した。注入後、超音波発信機（4021型、（株）カイジョー）のスイッチを入れた。さらに、圧力容器の体積を減少させることにより、二酸化炭素を超臨界状態にし、さらに120kg/cm2まで加圧した。その後、100ｍｌのオイバロミン150をHPLCの送液ポンプを利用し、1ml/minの流速で圧力容器内に注入した。
【００８３】
注入終了後、超音波振動子のスイッチを切り、圧力容器内の二酸化炭素を約20分かけて徐々に抜き、大気圧に戻した後、中の溶液を取り出した。得られた溶液の一部を生理食塩水１Ｌにて３回透析を行い、少量のエタノールを加えてリポソームを壊し、遠心分離後、分光光度計で242nmのイオパミドールの吸収を測定することにより、リポソーム中に内包されていたイオパミドールの定量を行った。その結果、内包化率は16％であった。さらに、得られた溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.3μmの混合セルロースメンブランフィルターで６回濾過して、リポソーム含有製剤（造影剤）を調製した。この造影剤の内包化率を測定したところ16％で変化がなかった。また、得られたリポソーム含有製剤の粒径を、光散乱粒径測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー1000）にて測定したところ、平均粒径は220nmであった。
【００８５】
［造影剤の投与］
実施例１で得られた造影剤を、2mg/kg用量となるように肝癌発癌ラットにそれぞれ尾静脈から投与した。投与後、１時間後にラットをジエチルエーテルで麻酔し、ラット全身のＸ線画像を撮影したところ、腫瘍部分がいずれもはっきり識別できた。12時間後に再度ジエチルエーテルで麻酔し、ラット全身のＸ線画像を撮影したところ、造影剤によるコントラスト補強が認められず、かろうじて識別できるレベル（造影剤を入れなくても識別できるレベル）であった。
【００８６】
（肝癌発癌ラットの作製）
特開2002-95382号公報に従い、肝癌発癌ラットを作製した。Ｆ３４４系雄ラット（５週齢）にCDAA食にて１週間飼育後に、DEN 20mg/kg体重を腹腔内に単回投与し、CDAA食にて
通算で64週間飼育し、さらに普通食（CRF-1）にて8週間以上飼育することにより、肝癌発癌ラットを作製した。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
リポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液を調製する際に、所定の条件で超音波を照射することにより、リポソームの封入物質の内包化率が向上するとともにリポソームが微細化されたリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適に使用することができる。