(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の天然または人工化学物質を含む溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加し、該溶液に紫外線（２５４ｎｍ、８６０μＷ／ｃｍ２）を９０分間照射した後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記天然または人工化学物質の有害性を評価することからなる、天然または人工化学物質の生物学的評価法。
【請求項２】
天然または人工化学物質を含む食品を含有する溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加し、該溶液に紫外線（２５４ｎｍ、８６０μＷ／ｃｍ２）を９０分間照射した後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記食品の有害性を評価することからなる、天然または人工化学物質からなる食品の生物学的評価法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡ損傷指標を利用する天然および人工化学物質の簡易生物学的評価法に関し、より詳しくはＤＮＡの構成成分である２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）が酸化型の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）に変化する反応、あるいは生体細胞由来産物中に含有する８ＯＨｄＧ／ｄＧ比について被検物質投与群と対照群とを比較することにより、医薬品や農薬等の天然および人工化学物質の有害性や有効性、あるいは各種機能性食品等の有害性や有効性を簡便に評価する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
各種の人工化学物質、例えば医薬品、農薬、洗剤、食品添加物、防腐剤、各種発癌物質、内分泌攪乱物質等の生物学的に許容される安全濃度は、
１）実験動物に投与したときの致死量
２）実験動物に投与したときの発癌や神経障害等の明らかな臓器障害を発生する量
３）生殖能力に影響を与える量
等を参考にし、これらの最低有効量に１００倍から１０００倍の安全率を乗じた濃度が参考とされてきた。
しかしながら、評価対象となる人工化学物質の種類が約１０万種以上とあまりにも多いこと、生物毒性をマウスやラットを使用して定量化する場合、一世代の成立でも約２カ月、世代を超えた影響を評価する場合は少なくともその２倍以上の月日が必要となること、そして評価システムを維持するために膨大な費用を要すること、等の理由から、全ての物質の生物学的毒性を従来の方法で評価するには、時間的および費用的な規制から現段階では事実上不可能といえる。
また、現在市販されている多くの健康食品や機能性食品等の食品類は、天然素材をエキス化したもの、あるいは特定の物質を安全許容量の範囲内で添加したもの等が主流である。しかしながら、
１）天然素材の中にも有害成分が存在する可能性がある、
２）特にエキス化した場合、その生物毒性が増強される可能性がある、
３）各種成分が相乗的に作用して有毒となる可能性がある、
４）健康食品の有効性（実効性）に関する客観的な評価システムが確立されていない、
等の問題点がある。
上記人工化学物質や食品類は人間が日常、摂取もしくは投与または接触する可能性があり、それらの生物学的毒性や有効性、特に毒性を確認することは急務であるにもかかわらず、現況は上記のとおり、長期間および高い費用等を必要とする問題があった。そこで、人工化学物質の生物学的毒性または食品類の有害性・有効性を簡便かつ低コストで評価する方法の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこの要望に応えるためになされたものであり、膨大な種類の天然物質や人工化学物質および食品類の生物学的有害性や有益性を合理的でかつ簡便に評価する方法の提供を課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、鋭意研究の結果、被検物質である天然または人工化学物質や食品類を含有する溶液に２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）を添加し、一定時間経過後の上記混合溶液中の酸化型８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）の濃度を測定すれば、被検物質の酸化能または抗酸化能の有無およびその程度を知ることができ、それを指標として、被検物質の生物学的有害性や無毒性ないしは有益性を評価し得ることを見いだし、さらに検討を加え、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、特定の天然または人工化学物質を含む溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加した後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記天然または人工化学物質の有害性または有益性の有無を評価することからなる、天然または人工化学物質の生物学的評価法に関するものである。
また、本発明は、特定の天然または人工化学物質を含む溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加し、該溶液に紫外線照射および／または活性酸素種発生剤の添加を行った後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記天然または人工化学物質の、活性酸素に由来する遺伝子核酸の酸化損傷に対する相加、相乗または相殺効果の有無を指標とした、天然または人工化学物質の有害性または有益性を評価することからなる、天然または人工化学物質の生物学的評価法に関する。
さらに、本発明は、天然または人工化学物質からなる食品を含有する溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加した後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記食品の有害性または有益性を評価することからなる、天然または人工化学物質からなる食品の生物学的評価法、および天然または人工化学物質からなる食品を含有する溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加し、該溶液に紫外線照射および／または活性酸素種発生剤の添加を行った後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記食品の、活性酸素に由来する遺伝子核酸の酸化損傷に対する相加、相乗または相殺効果の有無を指標とした、天然または人工化学物質の有害性または有益性を評価することからなる、天然または人工化学物質からなる食品の生物学的評価法に関する。
本発明はまた、天然または人工化学物質からなる食品と遺伝子核酸の酸化損傷作用を有する物質とを含有する溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加した後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記食品成分の遺伝子核酸の酸化損傷予防作用の有効性を評価することからなる、天然または人工化学物質からなる食品の生物学的評価法に関する。
本発明はさらに、特定しない化学物質を含む被検溶液中に既知量の２’−デオキシグアノシンを添加した後、上記溶液中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンを定量し、該８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの量に応じて上記被検溶液の抗酸化能または酸化能を評価することからなる、被検溶液の生物学的評価法に関する。
さらに本発明は、特定の化学物質または食品を一定期間投与したヒトを含む動物、植物、細菌または真菌から採取した生体細胞由来産物（例えば血液，尿，その他の体液，組織破砕液，細胞破砕液等）中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンと２−デオキシグアノシンの含有比に応じて、上記化学物質または食品の有害性または有益性を評価することからなる、化学物質または食品の生物学的評価法に関する。
本発明において「有害性または有益性（の有無）を評価する」とは、被検物質が生物学的有害性（酸化的ストレスの付与，発癌性，催奇形性，生殖能への悪影響等）を有するか否か、または有害性もしくは有益性（有効性）を有するかの判断基準および上記有害性または有益性の程度を提示することを意味する。また、「抗酸化能または酸化能を評価する」とは、被検溶液が抗酸化能、換言すれば還元力を有するか否かの判断基準または被検溶液が酸化能（酸化力）を有するか否かの判断基準およびそれらの程度を提示することを意味する。
なお、上記被検溶液の生物学的評価法において、ｄＧを添加し、上記溶液に紫外線照射および／または活性酸素種発生剤の添加を行った後に上記溶液中の８ＯＨｄＧを定量することにより、上記被検溶液の活性酸素に由来する遺伝子核酸の酸化損傷に対する相加、相乗または相殺効果の有無を評価することもできる。
【０００５】
本発明において使用する２’−デオキシグアノシンはＤＮＡの構成成分であるデオキシプリンヌクレオシドの一種である。ほとんど全ての遺伝子情報はアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対により暗号化されているが、この遺伝子情報は、自然突然変異（紫外線照射やＤＮＡの複製エラー等による）や人工産物による突然変異（各種の発癌物質，活性酸素等による）により一定頻度で損傷を受け、究極的には遺伝子情報の欠失、重複、逆位、挿入、転座、点変異等が起こり、細胞や個体の死滅を導いたり、逆に新たな生物種の誕生の引き金となっている。
活性酸素は体内に取り込まれた酸素から生成される以外に、生体に摂取された天然および人工化学物質がその材料や誘導因子となって生成され、生体成分であるタンパク質、脂質、遺伝子核酸等に酸化損傷を与えることが知られている。上記ｄＧの場合、活性酸素種であるヒドロキシラジカル（・ＯＨ）等と結合すると、酸化型の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）が生じる。この８ＯＨｄＧは本来のＧ−Ｃの塩基対をＴ−Ａの塩基対に変換させてしまう。つまり、このＧ−ＣからＴ−Ａへの変換は個々の細胞の遺伝子が一定の頻度で損傷していることを意味し、その頻度の多寡は、必然的にその個体の自己保存能力や種保存能力を評価する有力な指標となると考えられ、実際、８ＯＨｄＧはＤＮＡの代表的な酸化的損傷指標として、例えば発癌率や脳の変性疾患の発症と有意な相関があること（『実験医学』第１３巻，第１５号，第３１−３７頁，１９９５）や、細胞死（アポトーシス）と密接な関係があること（『最新医学』第５１巻，第３号，第４２−４７頁，１９９６）等が報告されている。
本発明は８ＯＨｄＧのＤＮＡ酸化的損傷指標としての使用をさらに進め、被検物質がｄＧを８ＯＨｄＧに酸化する能力の有無およびその程度を測定することにより、該被検物質の有害性や安全性を評価するというものである。換言すれば、本発明は被検物質がｄＧを８ＯＨｄＧに変換する能力を当該物質の有害性の有無等の判断基準としようというものであり、生体試料等の中に既に存在する８ＯＨｄＧを癌や脳疾患の発症の危険性の尺度としていた従来のシステムとは技術的思想が基本的に相違する。本発明の生物学的評価法におけるｄＧ→８ＯＨｄＧの変化は、生命現象の設計図であるＤＮＡの損傷の程度を反映しており、人間を含む生物の各個体の自己保存能や種保存能に対する影響を評価するための非常に合理的な客観指標といえる。
【０００６】
本発明により生物学的評価を行う被検物質としては、天然および人工化学物質、例えば医薬品、農薬、洗剤、食品添加物、防腐剤、各種発癌物質、内分泌攪乱物質等の他、大気汚染物質や水質汚染物質等、および天然および人工化学物質を含む健康食品または機能性食品の食品類等を挙げることができる。該食品類には、一般食品類や健康食品類そのものの他、その一部の成分等が包含される。また、本発明の上記被検物質には、特定しない物質を含む水溶液（組成が不明の溶液であり、本明細書では被検溶液とも記載する）、例えば水道水、浄化水、天然水、河川水、海水、湖水等も含まれる。
本発明の方法は、被検物質である人工化学物質や食品類または水道水等の被検溶液等とｄＧとを一緒に一定時間放置後、生成される８ＯＨｄＧを測定することにより通常行われるが、他に、活性酸素種発生剤を添加したり、紫外線を照射する等して、自然界や生体内で暴露する可能性のある酸化誘導因子をさらに負荷することにより、これらと被検物質との相互作用を評価することもできる。
このようにして本発明の方法は医薬品や農薬等の人工化学物質や天然物質または食品類の有害性または有益性を簡便かつ合理的に、しかも低コストで評価し得るものであるが、上記方法により大まかな許容量や有効量の目安がついた物質で、なおかつその重要性が高いものに対しては、さらに下記のような細胞培養評価法、生体内評価法でさらに厳密に評価することもでき、本発明はそれらの方法も提供する。
細胞培養評価法：被検物質を添加した培養液中の動物細胞（例えばマウスのリンパ球の細胞系であるＢ９細胞系）、植物細胞（例えばタバコＢＹ−２細胞）、真菌（例えば酵母菌）に必要に応じて酸化剤の添加および／または紫外線の照射を行い、一定時間経過後、処理前後の培養細胞由来のＤＮＡのｄＧおよび８ＯＨｄＧ濃度を測定する。下等な動植物細胞ほど、それ自身が一つの生命単位として多様な環境に適応する能力（人工化学物質の解毒や活性酸素消去機能等）を有しているが、生細胞を扱う有用性は、この生物が有している恒常性維持機能に被検物質がどの程度の影響を及ぼすかを評価できる点にある。この意味で、細胞評価法は最も手軽に使用し得るバイオマーカー（生物指標）といえる。培養細胞は世代交代が非常に早く、細胞分裂時に生じやすいＤＮＡ損傷の頻度を高感度に反映することができ、また、ｄＧおよび８ＯＨｄＧの定量も１０8 〜１０9 個程度の細胞数があれば、十分に測定可能であるので、通常の恒温槽により比較的多数の検体を扱うシステムを構築することができる。
生体内評価法：実験動物（例えばマウス）に被検物質を一定期間投与し、尿中および生殖器官（卵巣または精巣）中のｄＧおよび８ＯＨｄＧ濃度を測定する。従来、人工化学物質等の生物毒性は多様な側面（例えば寿命，体重変化，血液生化学データ，疾患の発症頻度等）から評価されてきたが、個々の指標を全て網羅して総合的に判断することは不可能に近かった。しかしながら、ＤＮＡ損傷指標は生命活動の設計図の質を表すものであり、その生成量は全ての病態に共通するものと考えられる。その意味から、本発明におけるｄＧから８ＯＨｄＧへの生成量の測定は、生命体（健康度）を推定することができる最も単純で、かつ合理的な総合指標といえる。生命活動の本質は自己保存と種の保存とに集約されるので、生殖毒性を評価する意義は大きく、本発明の方法によれば、雄と雌の生殖臓器である精巣と卵巣のみに標的を絞り、次世代の生命の設計図（ＤＮＡ）がどの程度損傷しているかにより、被検物質の基本的な危険性を評価するものである。なお、生体内評価法は一連の評価法の中では、一番手間と時間を要するものであり、暴露する濃度が高い物質や低濃度でも有害性の高い物質等は、最終的にヒトに準ずる動物（哺乳類動物）での検証が必要とされてきたが、本発明では、ＤＮＡ損傷能の一点に焦点を当てた評価法であることから、従来の方法に比べ時間や経費が格段に軽減される。
【０００７】
本発明の方法における８ＯＨｄＧ濃度の測定は、例えば試料溶液中に含まれるｄＧと８ＯＨｄＧとを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離し、これと連結したＵＶ検出器と電気化学的検出器により行うことができる。なお、この方法によれば、ｄＧと８ＯＨｄＧの濃度を同時に検出することが可能である。また、８ＯＨｄＧ濃度は、８ＯＨｄＧに特異的に反応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体等を使用して測定することもできる。
なお、被検物質として生体試料を使用する場合、ｄＧから８ＯＨｄＧへのような活性酸素による酸化が試料採取直後から始まり、評価結果に採取直後の状態が正確に反映されないことがある。このような場合、陽イオンキレート剤、抗酸化剤およびグリセリンを主成分とする抗酸化保存液に生体試料を浸漬することにより、試料採取後の酸化進行を防ぐことができる。陽イオンキレート剤は各種の生体反応や酵素反応を効率的に停止する作用を有し、例えばエチレンジアミン四酢酸ナトリウム等が使用される。抗酸化剤はヒドロキシラジカルの発生・遊離を予防するもので、例えばアジ化ナトリウム等が使用され、そしてグリセリンはヒドロキシル基による酸化防止効果の他、生体試料を−２０℃〜４℃の条件（通常の生体試料が使用時まで保存される条件）で安定して保存する作用を有し、例えば２０〜５０％水溶液が使用される。
また、上記抗酸化保存液は、生体試料だけでなく、被検物質にｄＧを添加した後、一定時間放置してから添加することにより、８ＯＨｄＧ測定までの間の酸化を抑え、一定時間経過後の正確な（抗）酸化能を測定することができる。
また、生体試料を使用する場合、マイクロダイアリシス法（透析膜灌流法）により効率的に低分子のＤＮＡ構成成分（ｄＧや８ＯＨｄＧ等）を回収した後、８ＯＨｄＧ等の測定を行うことが好ましい。具体的には２０ｋＤ〜５０ｋＤの高分子量成分をカットオフし得る透析膜を用いて灌流を行う。生体試料が液性試料（血漿，尿，骨髄等）の場合、所望により添加される上記抗酸化保存液を含んだまま、上記のような膜を用いて透析を行い、透析後の混合液が８ＯＨｄＧ等の測定に供され、細胞成分を含む試料（全血，細胞浮遊液，組織等）の場合、これも上記抗酸化保存液を添加後、細胞破砕装置により組織や細胞を破砕し、細胞質や核内に存在する核酸成分を溶出させ、遠心分離により固形成分を分離した後、その上澄み液を上記のような透析膜を用いて透析し、その回収された透析液中のｄＧおよび８ＯＨｄＧを測定する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の生物学的評価法は例えば以下のように行われる。まず、被検物質を多段階に稀釈した溶液または被検溶液中に既知濃度の２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）を添加して、氷温から約５０℃、好ましくは室温で一定時間放置後、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）の生成量を測定する（この値をＡとする）。これとは別にｄＧの超純水溶液を上記と同様の条件で一定時間放置した後の８ＯＨｄＧの量を測定する（この値をＢとする）。Ｂに比べＡが大きければ被検物質は酸化誘導能を有し、逆にＢに比べＡが小さければ被検物質は抗酸化能を有すると評価される。また、いずれの場合も、その差が大きい程、酸化誘導能または抗酸化能の程度が大きいと判断される。
活性酸素の発生は生命活動を行う上で避けられない現象である。しかしながら、その生理活性を消去するシステムが十分機能しない時は、ＤＮＡの酸化損傷が増加し、発癌や細胞活動性の低下（老化）、ひいては細胞死（アポトーシス）が誘導されることがわかっている。本発明により、被検物質が活性酸素の毒性をＤＮＡ核酸レベル、単一細胞レベル、一個体レベルで、どれだけ消去できるか（有効性を有するか）、またはどれだけ増加させるか（有毒であるか）を簡便に評価することができる。
また、各種健康食品や機能性食品等の食品類の有効性は別言すれば生体内で発生する活性酸素の毒性をどの程度効率的に消去できるかに依存するといえるので、本発明により、各種食品類の抗酸化能を、ＤＮＡ酸化損傷を指標として客観化することができる。
紫外線は、核ＤＮＡに直接作用し、ＤＮＡの酸化損傷を引き起こす有力な因子で、地球上に棲息する生物はその影響から逃れることはできず、また、自然環境中に排出された合成物質または自然に存在する天然物質も紫外線照射によって、より活性化（ラジカル化）する可能性があり、これらの活性化された合成物質等を摂取するか、または該合成物質等と接触することにより生じる生物学的毒性も無視できない。本発明によれば、このような合成物質等の被検物質と紫外線との相加、相乗または相殺効果を簡便に評価することもできる。また、活性酸素種発生剤と被検物質との相加、相乗または相殺効果の簡便な評価法も本発明は提供する。さらに、本発明によれば、遺伝子酸化損傷作用を有することが確認されている物質と被検物質とを含む溶液に、既知量のｄＧを添加して、上記溶液中の８ＯＨｄＧを定量し、その量に応じて上記被検物質の遺伝子損傷予防作用の有効性の有無を評価することもできる。ここで、遺伝子酸化損傷作用を有することが確認されている物質としては、日常生活で暴露する可能性の高いものを選択することによって、より現実に近い状態での被検物質の作用を評価することができる。特に、被検物質を食品類とすることにより、該食品類と遺伝子酸化損傷性物質との混在による影響を評価することができる。
本発明の生物学的評価法において、化学物質または食品を投与するか、または摂取もしくは接触させたヒトを含む動物、植物、細菌または真菌等から採取した生体細胞由来産物、例えば血液、尿、他の体液、組織破砕液または細胞破砕液等を被検対象として、該被検対象中の８ＯＨｄＧとｄＧとの含有比（８ＯＨｄＧ／ｄＧ）を算出し、該含有比の大きさに応じて、上記化学物質または食品の有害性または有益性を評価することができる（上記化学物質または食品は上記含有比が高い程、有害性は高く、低い程、有益性が高い）。
【０００９】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ，除草剤）、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ，樹脂原料）またはレスベラトロール（ＲＶＴ，ポリフェノールの一種）の各種濃度溶液（０．０００５ｐｐｍ，０．００５ｐｐｍ，０．０５ｐｐｍ，０．５ｐｐｍ，５ｐｐｍ）を作成し、２枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、一方のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、他方のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）を９０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、ＨＰＬＣ［使用カラム：ＣＡ−５ＯＤＳ（エイコム社製），移動相溶液：０．１Ｍリン酸緩衝液，３〜１０％メタノール，ＳＯＳ９０〜１００ｍｇ］により、ｄＧと８ＯＨｄＧとを分離し、該ＨＰＬＣに連結したＵＶ検出器と電気化学的検出器により、両ヌクレオシドを定量する。なお、比較のため、超純水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果は以下のとおりであった。測定は両ヌクレオシドに対して行ったが、下の表には８ＯＨｄＧの濃度（ｎｇ／ｍｌ）のみを示す（以下の実施例でも同様）。
0004702504.tif 000002
ＰＣＰは現在でも国によって使用が許可されている農薬または皮の柔軟剤であり、５ｍｇ／ｋｇが許容範囲であると報告されているが、上記の結果から５ｍｇ／ｋｇに相当する５ｐｐｍで明らかに紫外線による酸化損傷作用が極端に上昇し、有害性が高まっていることがわかる。
ＢＰＡは代表的な内分泌攪乱物質（環境ホルモン）であるが、０．５ｐｐｍ以上で明らかに紫外線による酸化損傷作用が上昇し、有害性が高まっている。参考のために実際に暴露される可能性のあるＢＰＡ濃度は以下のとおりである。
河川や湖沼中：多いところで０．００１ｐｐｍ程度
一般産業廃棄物処理場からの侵出水：最大２０ｐｐｍ程度
ＰＣ製食器（９５℃で３０分）：０．００５〜０．１ｐｐｍ
飲料用缶のコーティング剤からの溶出：０．１ｐｐｍ程度
歯科用セメント剤からの溶出：虫歯治療後の唾液中から１ｐｐｍ程度
魚：０．０２〜０．３ｐｐｍ程度
なお、ＢＰＡに対する我が国における基準は溶出分で２．５ｐｐｍ以下、材質分で５００ｐｐｍ以下であり、許容摂取量は各国共通で０．０５ｍｇ／ｋｇ／日となっている。本発明の方法はこれらの基準を見直すための一助になり得る。
ＲＶＴは代表的なポリフェノールで赤ワイン中に２〜１０ｐｐｍ程度溶存しているといわれ、抗動脈硬化作用等が近年報告されているが、０．５ｐｐｍ以上で明らかに紫外線による酸化損傷作用が上昇し、有害性が高まっている。このように、本発明の方法は従来有効であるといわれている物質の有効性（または有害性）を簡単に見直すこともできる。
上記の試験において１回の測定に必要なサンプル量は１０〜１００μｌと少なく、サンプル注入後５〜１０分以内に測定ピークが検出でき、１５分／１サンプルのペースで連続測定が可能である。従って、上記システムを採用した場合、１台のＨＰＬＣを週１２０時間のペースで稼働した場合、４８０検体／１週、そして約２０００検体／１カ月の測定が可能となる。これは、本発明によれば、これまで報告されたことのないハイペースで被検物質の毒性等を評価することができることを意味する。
また、上の例ではｄＧと８ＯＨｄＧとを同時にＵＶ検出器および電気化学的検出器により測定したが、８ＯＨｄＧのみの測定を行ってもよい。その場合、モノクローナル抗体を用いた測定キット［例えば商品名８−ＯＨｄＧ  Ｃｈｅｃｋ（日本老化制御研究所製）］を使用することにより、短時間で多量のサンプル測定を高感度で行うことができる。
【００１０】
実施例２
ビタミンＣ（ＶＣ）、ビタミンＥ（ＶＥ）、カテキン（Ｃａｔｅ）またはタンニン酸（Ｔａｎ）の所定濃度の溶液を作成し、２枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、一方のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、他方のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）を９０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では蒸留水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000003
上記の結果から以下の結論を導くことができる。
ＶＣは強力な抗酸化物質であるといわれているが、水溶性のｄＧに対しては非常に強い酸化誘導物質として作用する。
ＶＥは非常に安定した抗酸化物質である。
Ｃａｔｅは紫外線照射の有無に関係なく、非常に強力に８ＯＨｄＧを誘導する。この酸化能が殺菌作用や抗ウイルス作用と関連しているものと考えられる。また、Ｃａｔｅが示すこの８ＯＨｄＧ誘導能を、殺菌・静菌効果や抗ウイルス効果等の指標（有効濃度指標）とし得る可能性が高い。
Ｔａｎは高い遺伝子損傷誘導作用を示す。
【００１１】
実施例３
グリセロール（Ｇｌｙ）またはメタノール（Ｍｅｔｈ）の所定濃度の溶液を作成し、５枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、１枚のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、別の１枚を同様に室温で２４時間放置し、そして残りの３枚のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）をそれぞれ６０分間、９０分間または１２０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では超純水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000004
ＧｌｙおよびＭｅｔｈは共にヒドロキシラジカルによるＤＮＡ損傷の予防効果を有することが報告されているが、本実施例の結果からも、これらの抗酸化能が確認される。特に、Ｇｌｙは室温放置時のみ抗酸化能が確認されたが、Ｍｅｔｈは室温放置時および紫外線照射時の両方で強力な抗酸化能が確認された。
【００１２】
実施例４
グルコース（Ｇｌｕ）、ラフィノース（Ｒａｆｆｉ）またはショ糖（Ｓｕｃ）の所定濃度の溶液を作成し、４枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、１枚のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、そして残りの３枚のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）をそれぞれ６０分間、９０分間または１２０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では超純水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000005
上記の結果から以下の結論を導くことができる。
抗酸化能の強さは、室温放置および紫外線照射のいずれの場合も、Ｇｌｕ＞Ｒａｆｆｉ≒Ｓｕｃと評価することができる。
正常の血糖値を約５０〜１００ｍｇ／ｄｌ（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ）とすると、血液中に存在するＧｌｕは紫外線照射に対する非常に有効な抗酸化物質といえる。
Ｒａｆｆｉは天然オリゴ糖の一種で清涼飲料、健康飲料、健康食品等多くの食品に添加されているが、抗酸化能はＧｌｕ程ではないものの、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度であれば有効である。
ＳｕｃはＲａｆｆｉと同程度の抗酸化能を示す。
【００１３】
実施例５
いずれもプロタミン関連物質である１−アルギニン（Ａｒｇ）、１−シトルリン（Ｃｉｔ）またはスペルミン（Ｓｐｅ）の所定濃度の溶液を作成し、２枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、一方のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、他方のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）を９０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では超純水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000006
プロタミンは遺伝子の立体構造を支持するタンパク質であり、代表的な塩基性アミノ酸であるアルギニン含量が極端に高い（２０〜７０％）。
Ａｒｇ、ＣｉｔおよびＳｐｅのいずれも抗酸化能が認められ、ＣｉｔおよびＳｐｅは、高濃度（１ｍｇ／ｍｌ）の場合、その抗酸化能は特に高い。
データは示していないが、一般的に、酸性アミノ酸は酸化誘導、塩基性アミノ酸は酸化予防の傾向を有することが本発明の方法で確認されている。
【００１４】
実施例６
尿酸の各種濃度の溶液（溶解液：蒸留水＋０．０２５％ＦＢＳ）を作成し、２枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、一方のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、他方のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）を９０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では上記溶解液のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000007
尿酸は生体内における代表的な抗酸化物質といわれているが、上記の結果から、生体内の実際の血漿濃度（４０〜８０μｇ／ｍｌ）では、強い酸化的環境でなければ、８ＯＨｄＧの誘導は抑制されるものの、紫外線共存によるＤＮＡ酸化損傷の程度は高く、その毒性が増強される。
【００１５】
実施例７
臭素酸カリウム（ＫＢｒＯ3 ）の各種濃度の溶液を作成し、２枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１８０μｌずつ注入し、次に２００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）２０μｌを各ウエルに添加し、そのまま室温で、一方のプレートを１５分間放置し、他方のプレートを６０分間放置する。放置終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では超純水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000008
臭素酸カリウムはパンの漂白剤や防腐剤として汎用されている食品添加物であるが、上の結果から、濃度に依存して８ＯＨｄＧの誘導がみられる。１５分放置と６０分放置とに大差がないことから、臭素酸カリウムによる酸化反応は速やかに起こった後に、安定化するものと考えられる。従来の評価試験では安全であるとされている臭素酸カリウムも、本発明の方法では毒性があることが示唆される。このように、日常的に経口摂取している各種食品添加物の許容濃度を本発明の評価法に従って再検討することができる。
【００１６】
実施例８
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）溶液、１０％グリセロール（Ｇｌｙ）溶液、１％または２．５％メタノール（Ｍｅｔｈ）溶液、１０％Ｇｌｙと２．５％Ｍｅｔｈとの混合溶液または１０％Ｇｌｙと２．５％Ｍｅｔｈと１ｍＭ  ＥＤＴＡとの混合溶液を９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに１７０μｌずつ注入し、次に４００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）１０μｌおよび５０ｍｇ／ｍｌの臭素酸カリウム（ＫＢｒＯ3 ）溶液２０μｌを各ウエルに添加し、そのまま室温で３０分間放置した後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。なお、比較のため、本例では超純水のみに同様の処理を施したものに対してもｄＧと８ＯＨｄＧの測定を行った。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000009
活性酸素発生剤として作用する臭素酸カリウムの存在下で、１０％Ｇｌｙと２．５％Ｍｅｔｈと１ｍＭ  ＥＤＴＡとの混合溶液が最も高い抗酸化能を示した。このことから、これら３種の成分からなる溶液が各種被検溶液や被検試料の抗酸化保存液として有効であることがわかる。
【００１７】
実施例９
被検物質として超純水または所定濃度のビタミンＣ（ＶＣ）、ビタミンＥ（ＶＥ）もしくはグルコース（Ｇｌｕ）１７０μｌを２枚の９９ウエル・プラスチックプレートの各ウエルに添加し、添加液として超純水または所定濃度のビスフェノールＡ（ＢＰＡ）２０μｌを各ウエルに注入し、次に４００μｇ／ｍｌのｄＧ（超純水に溶解）１０μｌを各ウエルに添加し、一方のプレートはそのまま室温で９０分間放置し、他方のプレートは紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）を９０分間照射する。放置または照射終了後、各ウエルの溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000010
上記の結果から以下の結論を導くことができる。
ＢＰＡ添加により、紫外線照射時の８ＯＨｄＧが濃度依存的に増加する。
ＶＥおよびＧｌｕは、ＢＰＡ添加と紫外線照射とによる８ＯＨｄＧの増加を有意に抑制する。
０．００１％のＶＣは、単独では８ＯＨｄＧを強力に誘導するが、ＢＰＡの共存により、その作用は打ち消される。しかしながら紫外線照射時、ＶＣはＢＰＡによる８ＯＨｄＧの誘導を打ち消すことはない。
以上のように、ＢＰＡの遺伝子酸化能は共存する物質により、様々に影響を受ける。
従って、本測定法を利用することにより、遺伝子の酸化損傷を誘導する物質を同定できるだけでなく、その酸化毒性を打ち消すことのできる当該物質に特異的な抗酸化物質を同定し、さらにそれらの抗酸化能を定量的に評価することができる。
【００１８】
実施例１０
各種の飲料水を被検物質（被検溶液）としてその抗酸化能ないしは酸化能を測定した。
ｄＧをその濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように各種の飲料水に溶解した溶液２００μｌを２つの試験容器（溶液の表面積３６ｍｍ2 ）に注入し、一方の容器は室温で９０分間放置し、他方の容器は紫外線照射箱中で紫外線（２５４ｎｍ，８６０μＷ／ｃｍ2 ）を９０分間照射する。放置または照射終了後、各容器の溶液を等量の２０％グリセロール溶液と混和し、実施例１と同様にｄＧと８ＯＨｄＧを定量する。
試験した飲料水は以下のとおりである。
超純水：比抵抗１８メグオームの水（ミリポアシステム製），酸化還元電位は３６０ｍＶ。
水道水：福岡県春日市の一般水道水（１９９９年７月に採取），酸化還元電位は７２７ｍＶ。
処理水：上記水道水を市販の浄水器（活性炭、強磁石およびセラミック等に水を通過させることにより浄化する）により浄化した水，酸化還元電位は５１８ｍＶ。
天然水：大分県日田市から採取した地下水（酸性雨や肥料等の地表の汚染から隔絶された水，溶存する窒素酸化物濃度０．０１ｐｐｍ以下），酸化還元電位は２８０ｍＶ。
結果を以下にまとめて示す。
0004702504.tif 000011
上記の結果から以下の結論を導くことができる。
水道水が有する酸化力は殺菌・抗菌という観点から非常に合理的であると判断される。
浄水器で処理した水（処理水）は８ＯＨｄＧの誘導を顕著に抑制し、紫外線照射時の８ＯＨｄＧの誘導は室温放置に比べ、低値になっている。
天然水は、室温放置および紫外線照射共に８ＯＨｄＧの誘導を有意に抑制している。
このように、本測定法によれば、水の還元性（抗酸化能）または酸化能を定量化することが可能である。この方法を利用して、飲用水と各種疾病との相関（重傷度，病気の経過，治療効果，予防効果等）を検討することができる他、未知の物質を含む水溶液の遺伝子損傷誘導作用を総合評価することができる。
【００１９】
実施例１１
健康な人から採取した随時尿を実施例８に示した３成分からなる抗酸化保存液と容量比１：１に混和し、速やかに冷凍（約−２０℃）保存する。試験時に解凍した上記混和液を分子量５０ｋＤカットオフ機能を有する透析膜を使用するマイクロダイアリシスシステムにより灌流（１μｌ／分）し、これにより抽出された低分子のＤＮＡ関連成分（回収率は約３０〜４０％）を、実施例１と同様にｄＧおよび８ＯＨｄＧを定量する。また、該定量と併せて本実施例では、同じ被検試料中に含まれる硝酸イオン（ＮＯ3 - ）を高感度窒素酸化物検出器（ＥＮＯ−１０，エイコム社製）にて定量する。
結果を図１のグラフに示すが、該グラフにおけるＸ軸は検出されたＮＯ3 - 濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とｄＧ濃度（ｎｇ／ｍｌ）との比（ＮＯ3 - ／ｄＧ）であり、Ｙ軸は検出された８ＯＨｄＧ濃度（ｐｇ／ｍｌ）とｄＧ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の比（８ＯＨｄＧ／ｄＧ）の対数値である。なお、尿中のｄＧ濃度が尿の濃縮率と相関するため、ＮＯ3 - および８ＯＨｄＧの各濃度値をｄＧの濃度値で除すことにより、尿の濃縮率の違いに依存するデータの誤差を排除することができ、さらに、遺伝子の酸化損傷のリスク（Ｙ軸）を酸化型（８ＯＨｄＧ）／還元型（ｄＧ）で表すことにより、より合理的な指標となっている。参考のため下の表１１に上記と同様の測定システムで検出される生体試料中の概略の８ＯＨｄＧ濃度およびｄＧ濃度を示す。
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図１に示す結果から、８ＯＨｄＧ／ｄＧの対数値とＮＯ3 - ／ｄＧ比とが正の相関（ｐ＜０．０５）を示すことが明らかである。これは、８ＯＨｄＧ／ｄＧの対数値が生体で産生される代表的な酸化物である硝酸イオン濃度と正の相関関係にあることを意味し、８ＯＨｄＧ／ｄＧの対数値が生体の酸化ストレスの指標となり得ることを示している。
また、データは示していないが、これまでの研究から、（１）進行癌の患者や先天性の遺伝子異常の患者では、８ＯＨｄＧ／ｄＧの値が健常人でプロットされる近似線から上方に変位している（ＮＯ3 - ／ｄＧ比で表される個体全体の酸化指標よりも、遺伝子の酸化損傷をより強く反映していると推測される８ＯＨｄＧ／ｄＧ比のほうが比較的高い値を示す）こと、（２）喫煙者では、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比、ＮＯ3 - ／ｄＧ比が共に高い値を示す傾向にあること、そして（３）同一人であっても、非日常的な状態（例えば二日酔い，かぜ，過剰な運動後等）の際は、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比、ＮＯ3 - ／ｄＧ比の値が右上がりに変位すること等がわかっている。
以上の結果から、以下の結論を導くことができる。
（１）８ＯＨｄＧ／ｄＧ値は有力な生体酸化の指標となり得る。
（２）被検者の日常生活（食事，運動，休養等）等により、８ＯＨｄＧ／ｄＧ値は変化し、心理社会的因子を包含する広い意味でのストレス指標になり得る。
（３）定期的に生体に摂取される天然および人工化学物質や食品類がこれらの指標に及ぼす影響を定量することにより、該天然および人工化学物質や食品類の有害性（発癌性，催奇形性，生殖毒性等）や有益性（生体酸化や遺伝子核酸酸化損傷が原因となる各種疾患の治療や予防効果，疲労回復効果，老化防止効果等）を合理的に評価できる。
【００２０】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明のＤＮＡ損傷指標を利用する天然および人工化学物質の簡易生物学的評価法は、天然もしくは人工化学物質または食品類等の被検物質の生物学的毒性、有益性または安全性等を試験管内で非常に簡便に、かつ安価に評価することができ、そして当該被検物質の重要度に応じて培養細胞、さらには実験動物等の生体内での評価を行うことができる。
主なものだけでも１０万種以上あるといわれている人工化学物質の各々に対し、従来の本格的な動物実験や臨床実験を実施することは事実上不可能であるが、それらの個々の化学物質に対して具体的なＤＮＡ損傷指標を簡便に提示することができる本発明の上記方法は、大まかな安全基準濃度を設定したり、また、本格的な動物実験や臨床実験の必要性を検討する上での非常に有用な情報を提示することができる。このことから、本発明の上記生物学的評価法は、種々の天然または人工化学物質の生物学的毒性や食品類の有害性・有益性を簡便にスクリーニングするシステムをも提供するものである。
また、本発明の方法は、市販の、または開発中の健康食品や機能性食品の有益性や有害性を客観的に定量化することができる。従って、本発明に従って、開発中の食品類には必須である有益性や安全性の評価を確実かつ簡便に行うことができるだけでなく、現在市場で出回っている食品類の有益性や安全性を再確認することができる。
さらに、ある物質（被検物質）への紫外線照射の影響や、活性酸素種発生剤または遺伝子酸化損傷性物質との共存による該物質への影響も本発明によれば簡便に評価することができ、自然界における被検物質の毒性等をより正確に評価することが可能である。
また、本発明の方法によれば、未知の物質を含む水溶液を被検溶液とすることにより、該水溶液の遺伝子損傷誘導作用を総合評価することができ、組成が判明していない、水道水や天然水等に対する生物毒性指標を正確かつ簡易に得ることができる。
本発明によれば、化学物質または食品を投与したヒトを含む動物等から採取した尿や血液等の生体細胞由来産物中の８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンと２−デオキシグアノシンの含有比から、上記化学物質または食品の有害性または有益性を正確かつ簡易に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト尿中のＮＯ3 - ／ｄＧの濃度比と８ＯＨｄＧ／ｄＧの濃度比との関係を示すグラフである。
【図１】
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