(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸1-348を含むポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸1-348を含むポリペプチドからなる群から選択される参照ポリペプチドと少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド、ここで該ポリペプチドはNogoレセプター仲介神経突起伸長阻害を阻害する。
【請求項２】
ポリペプチドが、参照ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有する、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸1-348を含むポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸1-348を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸1-348を含むポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸1-348を含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド、ここで、該ポリペプチドは異種ポリペプチドに融合しており、また、該ポリペプチドは、Nogoレセプター仲介神経突起伸長阻害を阻害する。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、１以上の発現制御エレメントに作動可能なように連結している、請求項１〜４の何れかのポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかのポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項１〜５の何れかのポリヌクレオチドまたは請求項６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
真核細胞である、請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
請求項７または８の宿主細胞により発現されるNogoレセプターポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸1-348および配列番号４のアミノ酸1-348からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、Nogoレセプター仲介神経突起伸長阻害を阻害する該単離ポリペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、請求項１０のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸1-348を含むポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸1-348を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１３】
異種ポリペプチドに融合している、配列番号２のアミノ酸1-348および配列番号４のアミノ酸1-348からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、Nogoレセプター仲介神経突起伸長阻害を阻害する、該単離ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
ポリクローナル抗体である請求項１４の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である請求項１４の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
ヒト化抗体である請求項１４〜１６のいずれかの抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
ヒト抗体である請求項１４〜１７のいずれかの抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜５の何れかのポリヌクレオチド、請求項７または８の何れかの宿主細胞、請求項９〜１３の何れかのポリペプチド、または請求項１４〜１８の何れかの抗体、および担体を含む、組成物。
【請求項２０】
ニューロンと、Nogoレセプター（ＮｇＲ）アンタゴニストを接触させることを含む、神経突起伸長を促進するインビトロの方法であって、該ＮｇＲアンタゴニストが請求項９−１３の何れかのポリペプチドである方法、
ここで、該ＮｇＲアンタゴニストはＣＮＳミエリン誘導神経突起伸長阻害を阻害する。
【請求項２１】
ニューロンと、Nogoレセプター（ＮｇＲ）アンタゴニストを接触させることを含む、軸索再生を促進するインビトロの方法であって、該ＮｇＲアンタゴニストが請求項９−１３の何れかのポリペプチドである方法、
ここで、該ＮｇＲアンタゴニストはＣＮＳミエリン誘導神経突起伸長阻害を阻害する。
【請求項２２】
ＮｇＲアンタゴニストを含む神経突起伸長を促進する医薬組成物であって、該ＮｇＲアンタゴニストが請求項９−１３の何れかのポリペプチドである医薬組成物、
ここで、該ＮｇＲアンタゴニストはＣＮＳミエリン誘導神経突起伸長阻害を阻害する。
【請求項２３】
ＮｇＲアンタゴニストを含む軸索再生を促進する医薬組成物であって、該ＮｇＲアンタゴニストが請求項９−１３の何れかのポリペプチドである医薬組成物、
ここで、該ＮｇＲアンタゴニストはＣＮＳミエリン誘導神経突起伸長阻害を阻害する。
【請求項２４】
ＮｇＲアンタゴニストを含む哺乳類における中枢神経系(ＣＮＳ)疾患、異常、または損傷の治療のための医薬組成物であって、該ＮｇＲアンタゴニストが請求項９−１３の何れかのポリペプチドである医薬組成物、
ここで、該ＮｇＲアンタゴニストはＣＮＳミエリン誘導神経突起伸長阻害を阻害するか、または、軸索再生を促進する。
【請求項２５】
さらに担体を含む請求項２２〜２４のいずれかの医薬組成物。
【請求項２６】
非経口投与、皮下投与、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮的投与、口内投与、経口投与、微量注入投与、経腸投与および局所投与からなる群から選択される経路による投与用に製剤される、請求項２５の医薬組成物。
【請求項２７】
該ＮｇＲポリペプチドフラグメントがさらに異種ポリペプチドを含む、請求項２０または２１の方法。
【請求項２８】
該異種ポリペプチドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
該ニューロンが哺乳類細胞である請求項２０または２１のいずれかの方法。
【請求項３０】
該哺乳類細胞がヒト細胞である請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＣＮＳ疾患、異常、または損傷が、頭または大脳の外傷、脊髄損傷、脳卒中、または脱髄疾患からなる群から選択される、請求項２４の組成物。
【請求項３２】
脱髄疾患が、多発性硬化症、単相性脱髄、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、全脳炎、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病、橋角部ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、海綿状変性、アレクサンダー病、キャナヴァン病、異染色性白質萎縮およびクラッベ病からなる群から選択される、請求項３１の組成物。
【請求項３３】
該ＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントがさらに異種ポリペプチドを含む、請求項２２〜２６のいずれかの組成物。
【請求項３４】
該異種ポリペプチドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)である、請求項３３の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明者）
Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ
（関連出願の引用）
この出願は、２０００年１月１２日に出願された米国仮特許出願６０／１７５，７０７；２０００年５月２６日に出願された６０／２０７，３６６および２０００年９月２９日に出願された６０／２３６，３７８に関連しており、これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（米国政府の支持）
本発明は、国立衛生研究所の助成金５−Ｒ０１−ＮＳ３３０２０の元で、部分的に政府の支持で行なわれた。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、Ｎｏｇｏタンパク質についてのレセプターをコードする新規のヒトおよびマウス遺伝子に特に関連し、このレセプターは、軸索成長を調節し得る。これらのＮｏｇｏレセプター遺伝子は、軸索、および軸索成長の間に中枢神経系のニューロンの樹状突起において選択的に発現される。本発明はまた、Ｎｏｇｏレセプターを用いてＮｏｇｏの相互作用をブロックすることによる、軸索の成長のＮｏｇｏレセプター媒介性阻害の選択的な妨害のための組成物および方法に関する。Ｎｏｇｏレセプターを用いるＮｏｇｏの相互作用の妨害は、軸索成長において引き続く増加を引き起こす軸索成長に対するＮｏｇｏの阻害的な効果の妨害を生じる。
【０００４】
（発明の背景）
ニューロンの軸索および樹状突起は、ニューロンからの長い細胞性伸長である。伸長する軸索または神経突起の遠位の先端は、特殊化した領域であって、成長円錐体として公知である。成長円錐体は、局所的な環境を感知することおよびニューロンの標的細胞に向って移動することを担う。成長円錐体は手の形をしており、胚中の表面に差次的に付着するいくつかの長い糸状足を有する。成長円錐体は、いくつかの誘導手掛かり（例えば、表面接着性、増殖因子、神経伝達物質および電場）に対して感受性であり得る。円錐体における成長の誘導は、種々のクラスの付着分子、細胞間シグナル、ならびに成長円錐体を刺激および阻害する因子に依存する。成長する神経突起の末端に位置する成長円錐体は、種々の割合で進行するが、代表的に、１日に１〜２ミリメートルの速度で進行する。この円錐体は、広範かつ平らな広がりからなり、スパイクのように伸長する多数の長い微小突起または糸状足を有する。これらの糸状足は、連続的に活性である。いくつかの糸状足は、成長円錐体へと引っ込むが、他の糸状足は、基層を通って伸長し続ける。異なった糸状足の間の伸長は、膜状仮足を形成する。
【０００５】
成長円錐体は、その膜状仮足および糸状足を用いて、いずれかの側で、その前にある領域を探索する。伸長が都合の悪い表面と接触すると、伸長は撤退する。伸長が都合のよい表面と接触する場合、伸長を続け、その方向に移動する成長円錐体を操作し得る。従って、成長円錐体は、基層の表面性質における小さいバリエーションによって誘導され得る。成長円錐体が、適切な標的細胞に達する場合、シナプス結合が生成される。
【０００６】
損傷したニューロンは、外傷および疾患に起因する傷害後、中枢神経系（ＣＮＳ）において再生しない。傷害後の軸索再生の非存在が、軸索成長インヒビターの存在に起因し得る。これらのインヒビターは、主にミエリンと関連し、そして、再生に対して重要な障害を構成する。軸索成長インヒビターは、ＣＮＳ由来のミエリンおよび希突起膠細胞の原形質膜に存在し、これは、ＣＮＳ中でミエリンを合成する（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６，５６５−５９５）。
【０００７】
ＣＮＳミエリンは、希突起膠細胞細胞膜の精巧な伸長である。単一の希突起膠細胞は、３０もの多数の異なったＣＮＳ軸索セグメントを有髄化する。希突起膠細胞膜伸長は、ミエリン鞘を形成する同心性の様式で、軸索の周囲を覆う。密接に詰まった成熟ミエリンは、水和タンパク質の層に並んだ、二分子脂質の並行した層からなる。活性ミエリン合成は、子宮内で開始し、そして、ヒトの生涯の最初の二年間続く。より緩徐な合成が幼児期および青年期を通して続くが、成熟ミエリンの代謝回転は、成人期に渡ってより緩徐な速度で続く。ミエリンの発達および成熟形態は、疾患または物理的外傷に由来する傷害に感受性であり、軸索を囲むミエリンの分解を生じる。
【０００８】
ミエリン関連のインヒビターは、軸索連続性の中断後、インビボのＣＮＳ軸索再生の不全に主に起因しているようであるが、ＣＮＳにおける他の非ミエリン関連軸索成長インヒビターは、より少ない役割を果たし得る。これらのインヒビターは、外傷、発作、またはウイルス感染に起因するニューロン傷害後の軸索再生をブロックする。
【０００９】
多数のミエリン由来の軸索成長インヒビターが特徴付けられている（総説としては、Ｄａｖｉｄら、（１９９９）ＷＯ９９５３９４５４７；Ｂａｎｄｍａｎら、（１９９９）米国特許第５，８５８，７０８号；Ｓｃｈｗａｂ、（１９９６）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２１，７５５−７６１を参照のこと）。ＣＮＳ白質のいくつかの成分、ＮＩ３５、ＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）およびミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）（これらは、軸索伸長に対して阻害活性を有する）がまた記載されている（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９０）ＷＯ９００５１９１；Ｓｃｈｗａｂら、（１９９７）米国特許第５，６８４，１３３号）。特に、Ｎｏｇｏは、クローニングされそして特徴付けられた、２５０ｋＤａのミエリン関連軸索成長インヒビターである（Ｎａｇａｓｅら、（１９９８）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．５，３５５−３６４；Ｓｃｈｗａｂ，（１９９０）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０９，２−５）。Ｎｏｇｏ  ｃＤＮＡは、脳のｃＤＮＡのランダム分析を介して最初に同定され、そして、示唆された機能を有さなかった（Ｎａｇａｓｅら、（１９９８）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．５，３５５−３６４）。
【００１０】
Ｓｃｈｗａｂおよび同僚らは、推定されるウシＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）タンパク質のタンパク分解性のランダムな消化に由来する６つのペプチドの配列を公開した（Ｓｐｏｌｌｍａｎｎら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１９２８３−１９２９３）。最近、このタンパク質についてのありうる全長ｃＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋに登録した。この４．１キロベースのヒトｃＤＮＡクローン（ＫＩＡＡ０８８６）は、Ｋａｚｕｓａ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｉｔｉｔｕｔｅのランダムな高分子量の脳由来のｃＤＮＡを配列決定する努力に由来する（Ｎａｇａｓｅら、（１９９８）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．３１，３５５−３６４）。この新規なｃＤＮＡクローンは、ウシＮｏｇｏに由来する全６つのペプチド配列を含む１３５ｋＤａのタンパク質をコードする。
【００１１】
ヒトＮｏｇｏ−Ａ配列は、Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ（Ｒｔｎ）タンパク質ファミリーと、そのカルボキシルの３分の１に渡って高い相同性を共有する。Ｒｔｎ１はまた、神経内分泌細胞において排他的に発現されるので、神経内分泌特異的細胞（ＮＳＰ）と呼ばれている（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。全てのＰｔｎタンパク質は、このタンパク質のカルボキシル末端において２００アミノ酸残基の配列相同性の領域を共有する（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６；Ｒｏｅｂｒｏｅｋら、（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３２，１９１−１９９；Ｒｏｅｂｒｏｅｋら、（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１，９８−１０６；Ｍｏｒｅｉｒａら、（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５８，７３−８１；Ｍｏｒｒｉｓら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４５０，６８−７６）。関連した配列は、ハエおよびムシ（ｗｏｒｍ）のゲノムにおいて認識されている（Ｍｏｒｅｉｒａら、（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５８，７３−８１）。この領域は、Ｒｔｎファミリーに渡って、約７０％同一である。アミノ末端領域は、お互いに関連しておらず、そして、種々の代替的なＲＮＡスプライシング事象に由来する。
【００１２】
ＧｅｎＢａｎｋに登録された配列の分析および公開されたＲｔｎ１のイソ型との相同性による分析から、３つの型のＮｏｇｏタンパク質が予想される（Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ、Ｎｏｇｏ−Ｃ）。３７ｋＤａのＮｏｇｏ−Ｂは、おそらくＮＩ３５に対応し、そして、ＮＩ３５およびＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ−Ａ）軸索成長阻害活性の抗原性関連性を説明し得る。Ｎｏｇｏ−Ｃ−Ｍｙｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって２５ｋＤａの電気泳動易動度を示し、そして、Ｒｔｎ４およびｖｐ２０１５として以前に記載されている。軸索再生を阻害するＮｏｇｏ−Ａタンパク質の能力は、ごく最近認識された（ＧｒａｄｎＰｒｅら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３９−４４４；Ｃｈｅｎら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３４−４３９；Ｐｒｉｎｊｈａら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４８３−４８４）。
【００１３】
傷害後のＣＮＳにおける外傷を横切る軸索の再伸長の非存在は、外傷、発作および脱髄性の障害に関連した永続的な有害な影響の原因に起因する。ＮＩ２５０の調節は、外傷、梗塞およびＣＮＳの変性障害（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９４）ＷＯ９４１７８３１；Ｔａｔａｇｉｂａら、（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４０，５４１−５４６）ならびにグリア芽細胞腫のようなＣＮＳにおける悪性腫瘍（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９３）米国特許第５，２５０，４１４号；Ｓｃｈｗａｂら、（２０００）米国特許第６，０２５，３３３号）によって損傷されたニューロンの再生の処置のための手段として記載されている。
【００１４】
ＮＩ２５０を認識する抗体は、外傷、梗塞およびＣＮＳの変性障害から生じる神経損傷の診断および処置において有用であると報告されている（Ｓｃｈｎｅｌｌ＆Ｓｃｈｗａｂ，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，２６９−２７２；Ｓｃｈｗａｂら、（１９９７）米国特許第５，６８４，１３３号）。有髄化する軸索において、ミエリンの発生およびＮｏｇｏの出現との相関が存在する。Ｎｏｇｏが抗体によってブロックされた後、ニューロンは、再び、神経損傷によって引き起こされた外傷を横切って伸長し得る（Ｖａｒｇａら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，１０９５９−１０９６３）。
【００１５】
それによってＮｏｇｏが軸索成長を阻害する作用の機構は、まだ解明されていない。この作用機構の同定および特徴付けならびにＮｏｇｏの効果に関連した生化学的経路は、軸索傷害および軸索脱髄に関連した疾患状態の処置において有用である。
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質および生物学的に活性のＮｏｇｏタンパク質（リガンド）フラグメントの発見に基づく。本発明は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０の少なくとも６個、例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個または７０個のアミノ酸のフラグメントをコードする単離された核酸分子；高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７または１９の相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸分子；ならびに配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に、少なくとも７５％、例えば、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離された核酸分子からなる群より選択される単離された核酸分子を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１６６〜１５８４または配列番号３の１７８〜１５９６を含む単離された核酸分子を含む。
【００１７】
本発明は、単離された核酸分子を含むベクターを含む、１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結された核酸分子をさらに含む。本発明は、本発明の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞、およびタンパク質を産生するための方法をさらに含み、この方法は、タンパク質が発現される条件下で、本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００１８】
本発明は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０の少なくとも６個、例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個または７０個のアミノ酸のフラグメントを含む単離されたポリペプチド；少なくとも１個、例えば、５個、１０個、１５個または２０個の保存的なアミノ酸置換を含む、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；少なくとも１個、例えば、５個、１０個、１５個または２０個の天然に存在するアミノ酸配列置換を含む、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；ならびに配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に、少なくとも７５％、例えば、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチドからなる群より選択される単離されたポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドを含む。
【００１９】
本発明は、Ｎｏｇｏタンパク質に結合する抗体およびＮｏｇｏレセプタータンパク質に結合する抗体をさらに提供する。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。さらに、この抗体は、ヒト化され得る。本発明はまた、抗原結合活性を示す抗体フラグメントを含む。
【００２０】
本発明は、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の発現を調節する因子を同定する方法を含み、この方法は、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質を発現する細胞を提供する工程、候補因子とこの細胞を接触させる工程、および、この候補因子の非存在下でのＮｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の発現のレベルに対する候補因子の存在下でのＮｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の発現のレベルの増加または減少を検出する工程を包含する。
【００２１】
本発明はまた、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の少なくとも１つの活性を調節する因子を同定する方法を含み、この方法は、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質を発現する細胞を提供する工程、候補因子とこの細胞を接触させる工程、および、この候補因子非存在下でのＮｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の活性のレベルに対する候補因子の存在下でのＮｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の活性のレベルの増加または減少を検出する工程を包含する。本発明の１つの実施形態において、この活性は、成長円錐の移動（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）である。別の実施形態において、この因子は、Ｎｏｇｏタンパク質フラグメント、抗Ｎｏｇｏ抗体および抗Ｎｏｇｏレセプター抗体からなる群より選択される。
【００２２】
本発明はさらに、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質についての結合パートナーを同定する方法を含み、この方法は、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質を提供する工程、候補結合パートナーとこのＮｏｇｏレセプターを接触させる工程、および、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質への候補結合パートナーの結合を検出する工程を包含する。１つの実施形態において、この結合パートナーは、Ｎｏｇｏタンパク質フラグメント、抗Ｎｏｇｏ抗体、抗Ｎｏｇｏレセプター抗体フラグメント、およびヒト化抗Ｎｏｇｏレセプター抗体からなる群より選択される。
【００２３】
本発明は、哺乳動物における中枢神経系の障害を処置する方法を含み、この方法は、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の発現を調節する因子の有効量を投与する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、この発現は減少し、一方、他の実施形態において、この発現は増加する。
【００２４】
本発明はさらに、哺乳動物における中枢神経系の障害を処置する方法を含み、この方法は、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の活性を調節する因子の有効量を投与する工程を包含する。この活性は、増加し得るかまたは減少し得るかのいずれかである。この活性が減少する場合、この因子は、以下であり得る：例えば、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１８、または配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドか；全長のＮｏｇｏレセプタータンパク質か；Ｎｏｇｏレセプタータンパク質フラグメントか；可溶性Ｎｏｇｏレセプタータンパク質フラグメントか；または抗Ｎｏｇｏレセプター抗体もしくはその活性フラグメント。この活性が増加する場合、この因子は、配列番号１４および配列番号１６からなる群より選択されるポリペプチドである。
【００２５】
可溶性Ｎｏｇｏレセプタータンパク質は、以下を含み得る：配列番号２または配列番号４の少なくとも６個、例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、または７０個のアミノ酸のフラグメント；配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０のアミノ酸配列；少なくとも１個（例えば、５個、１０個、１５個、または２０個）の連続したアミノ酸の置換を含む配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０のアミノ酸配列；１個、例えば、５個、１０個、１５個、もしくは２０個の天然に存在するアミノ酸配列の置換を含む配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０のアミノ酸配列。
【００２６】
いくつかの実施形態において、中枢神経系の障害は、頭蓋損傷もしくは大脳損傷、脊髄損傷、発作もしくは脱髄疾患の結果である。脱髄疾患の例としては、多発性硬化症、単語症脱髄、脳脊髄炎、多発性白質脳症、汎脳炎、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病、橋ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、海綿状変性、アレグザンダー病、キャナヴァン病、異染性白質萎縮症およびクラッベ病である。
【００２７】
本発明はさらに、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質に特異的に結合する単離されたペプチドを含む。Ｎｏｇｏレセプタータンパク質へのこのペプチドの特異的結合は、好ましくは、少なくとも１つの以下の作用を有する：Ｎｏｇｏレセプタータンパク質へのＮｏｇｏタンパク質の結合の阻害、軸索成長のＮｏｇｏ媒介阻害の妨害、Ｎｏｇｏタンパク質の発現の調節、またはＮｏｇｏレセプタータンパク質の発現の調節。いくつかの実施形態において、単離されたペプチドは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、もしくは配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、または１個以上（例えば、５個、１０個、１５個、もしくは２０個）の連続したアミノ酸の置換あるいは天然に存在するアミノ酸の置換を有する前述のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に規定しない場合、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似かまたは等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、記載される。
【００２９】
本明細書中に使用される場合、用語「軸索」は、ニューロンからの長い細胞の突出をいい、遠心性の（出て行く）活動電位は、細胞体から標的の細胞へ向かって伝導する。
【００３０】
本明細書中に使用される場合、用語「軸索成長」は、長い突起または軸索の伸長をいい、細胞体に発しおよび成長円錐に続く。
【００３１】
本明細書中に使用される場合、用語「中枢神経系障害」は、中枢神経系（ＣＮＳ）の異常な機能に関連する任意の病理学的状態をいう。この用語は、脳組織に対する物理的外傷、ウイルス感染、自己免疫機構、遺伝的変異および神経変性疾患または障害の結果である改変されたＣＮＳ機能を含むが、これに限定されない。
【００３２】
本明細書中に使用される場合、用語「キメラタンパク質」は、野生型の配列とアミノ酸レベルでは完全には相同でないか、または核酸の２つの異なる供給源をつなぎ合わせることに由来する核酸によってコードされる、任意のポリペプチドをいう。この用語は、融合タンパク質、およびそのアミノ酸配列を野生型の配列から区別する１以上のアミノ酸置換を含むように設計されたタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書中に使用される場合、用語「脱髄性疾患」は、希突起膠細胞の細胞膜のミエリン鞘の変性によって特徴付けられる病理学的障害をいう。
【００３４】
本明細書中に使用される場合、用語「成長円錐」は、局所的環境の感知およびその適切なシナプスの標的細胞への軸索の移動を担う、成長する神経突起の先端の特定の領域をいう。
【００３５】
本明細書中に使用される場合、用語「成長円錐移動」は、ニューロンの標的細胞へ向かう成長円錐の伸長または崩壊をいう。
【００３６】
本明細書中に使用される場合、用語「神経突起」は、ニューロンから成長する突起のことをいう。培養物中で樹状突起と軸索を区別することは時折困難であるので、この用語、神経突起は両方のために使用される。
【００３７】
本明細書中に使用される場合、用語「希突起膠細胞」は、機能がＣＮＳ軸索の有髄化であるＣＮＳの神経膠の細胞をいう。
【００３８】
本明細書中に使用される場合、用語「ポリペプチド」は、加水分解によって２より多いアミノ酸を生じるペプチドをいう（ポリペプチドに含まれるアミノ酸の数に応じてトリペプチド、テトラペプチド等と呼ばれる）。用語「ポリペプチド」は、本明細書を通じて、用語「タンパク質」および「ペプチド」と同義語として使用される。
【００３９】
（ＩＩ．特定の実施形態）
（Ａ．Ｎｏｇｏレセプタータンパク質についてＮｏｇｏレセプタータンパク質およびペプチド因子）
本発明は、単離されたタンパク質、そのタンパク質の対立遺伝子改変体およびタンパク質の保存的アミノ酸置換を提供する。本明細書中に使用される場合、タンパク質またはポリペプチドは配列番号２に記載のヒトアミノ酸配列または配列番号４に記載のマウスアミノ酸配列を有するＮｏｇｏレセプタータンパク質をいう。このタンパク質またはポリペプチドはまた、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に記載のアミノ酸配列を有するＮｏｇｏレセプターペプチド因子として同定されたペプチドをいう。本発明はまた、上記に詳細に列挙されたアミノ酸配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有する、天然に存在する対立遺伝子改変体およびタンパク質を含む。対立遺伝子改変体は、上記に列挙されたものとはわずかに異なるアミノ酸配列を有するが、ヒトおよびマウスのＮｏｇｏレセプタータンパク質および配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に示されるこのＮｏｇｏレセプターペプチド因子に関連する、同じまたは類似の生物学的機能をなお有する。
【００４０】
本明細書中に使用される場合、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質に関連するタンパク質のファミリーは、ヒトおよびマウス以外の生物から単離されたタンパク質をいう。Ｎｏｇｏレセプタータンパク質に関連するタンパク質のファミリーの他のメンバーを同定および単離するために使用される方法は、以下に記載される。
【００４１】
本発明のＮｏｇｏレセプタータンパク質およびペプチド因子は、好ましくは単離された形態である。本明細書中に使用される場合、通常このタンパク質と関連付けられる細胞成分からタンパク質を除去するために物理的、機械的または化学的方法が使用される場合に、タンパク質またはリガンドは、単離されたと言われる。当業者は、単離されたタンパク質またはリガンドを得るための標準的な精製方法を容易に使用し得る。
【００４２】
本発明のタンパク質はさらに、本明細書中に記載されるこのタンパク質およびリガンドの保存的改変体を含む。本明細書中に使用される場合、保存的改変体は、このタンパク質の生物学的機能に不利な影響を与えない、アミノ酸配列における改変をいう。置換、挿入または欠失は、この改変された配列がタンパク質に関連付けられる生物学的機能を阻害または破壊する場合に、タンパク質に不利な影響を与えたと言われる。例えば、このタンパク質の全体の電荷、構造または疎水性−親水性特性が、生物学的活性に不利な影響を与えることなく改変され得る。従って、このアミノ酸配列は、このタンパク質の生物学的活性に不利な影響を与えることなく、例えば、ペプチドをより疎水性または親水性にするために改変され得る。
【００４３】
通常、対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびこのタンパク質ファミリーのメンバーは、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に示されたヒトおよびマウスの配列と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有する。このような配列に関する同一性または相同性は、配列同一性の一部としていかなる保存的置換をも考慮せず、相同性のパーセントの最大化を達成するために、配列を整列させ、そして必要な場合にはギャップを導入した後での、既知のペプチドと同一な候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして本明細書では定義される。このペプチド配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失、または挿入は、相同性に影響するものとして解釈されない。
【００４４】
従って、本発明のこのタンパク質およびペプチドは、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のアミノ酸配列；Ｎｏｇｏレセプタータンパク質およびペプチド因子の少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基の連続した配列を有するそのフラグメント；少なくとも１つのアミノ酸残基が、開示された配列のＮ末端またはＣ末端に、あるいは開示された配列中に挿入されたこのような配列のアミノ酸配列改変体；開示された配列のアミノ酸配列改変体または別の残基によって置換された上記に定義されたそのフラグメントを含む分子を含む。意図される改変体はさらに、例えば、相同組み換え、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ変異誘発による予め決定付けられた変異を含む改変体、およびウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよび非ヒト霊長類種を含むがこれらに限定されない他の動物種の対応するタンパク質、タンパク質ファミリーの対立遺伝子改変体または他の天然に存在する改変体；および誘導体を含む。ここでこのタンパク質は、置換、化学的、酵素的または他の適切な手段によって、天然に存在するアミノ酸（例えば、酵素または放射性同位体のような検出可能な部分）以外の部分と共有結合的に改変されている。
【００４５】
以下に記載されるように、このタンパク質ファミリーのメンバーは、（１）このタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定するために、（２）このタンパク質に対する結合パートナーを同定する方法において、（３）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を惹起するための抗原として、および（４）治療用薬剤として用いられ得る。
【００４６】
（Ｂ．核酸分子）
本発明は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のアミノ酸配列を含むタンパク質およびペプチド、ならびに本明細書中に記載される関連タンパク質を、好ましくはその単離形態でコードする核酸分子をさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、「核酸分子」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンス分子、ならびに代替の骨格に基づく核酸か、あるいは天然の供給源かまたは合成かのどちらかに由来する代替の塩基を含む核酸を含む。
【００４７】
相同性または同一性は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（これらは、配列類似性調査のために変更される）によって用いられるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析により決定される（Ｋａｒｌｉｎら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０−３００，これらの文献は、全体を参考として援用されている）。ＢＬＡＳＴプログラムによって用いられるアプローチは、まず問い合わせ配列とデータベース配列との間の類似のセグメントを判断し、次いで同定される全ての一致の統計的な有意性を評価し、そして最終的に予め設定しておいた有意性の閾値を満足するこれらの一致のみを要約することである。配列データベースの類似性調査における基本的な論点の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，１１９−１２９を参照のこと。この文献は、全体を参考として援用されている。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（すなわち、データベースの配列に対する一致を報告するための統計的な有意性の閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘ、およびｆｉｌｔｅｒに対する調査パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより用いられるデフォルトスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９，この文献は全体を参考として援用されている）。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを、以下のように調節した：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（これは問い合わせに沿ったｗｉｎｋｔｈ位ごとにワードヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（これは分離したアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメータの設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較（ＧＣＧパッケージヴァージョン１０．０として利用可能）は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティー）を用い、そしてタンパク質の比較における等価な設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、「高ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド存在下における４２℃でのハイブリダイゼーション、続く１％ＳＤＳナトリウムを含有する２×ＳＳＣを用いた６５℃での１回目の洗浄、続く０．１×ＳＳＣを用いた６５℃での２回目の洗浄を意味する。
【００４９】
本明細書中で用いられる場合、核酸分子が、その核酸の供給源由来の他のポリペプチドをコードする混入核酸から実質的に分離されている場合、この核酸分子は「単離」されているといわれる。
【００５０】
本発明は、コード核酸分子のフラグメントをさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、コード核酸分子のフラグメントとは、タンパク質全体をコードする配列部分をいう。フラグメントの大きさは、意図される用途により決定される。例えば、そのフラグメントが、このタンパク質の活性部分をコードすることために選択される場合、このフラグメントは、このタンパク質の機能領域をコードするのに十分な大きさである必要がある。そのフラグメントが、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる場合、このフラグメントの長さは、プロービング／プライミングの際に、比較的少数の偽陽性を獲得するよう選択される。
【００５１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用にかまたは本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するためのプローブまたは特異的なプライマーとして用いられる本発明のコード核酸分子のフラグメント（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）は、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，３１８５−３１９１のホスホトリエステル法によってか、または自動合成法を用いて容易に合成され得る。さらに、一群のオリゴヌクレオチドの合成（この方法は、種々の遺伝子のモジュラーセグメントを規定し、その後オリゴヌクレオチドを連結して完全な改変された遺伝子を構築する）のような周知の方法によって、より大きなＤＮＡセグメントが容易に調製され得る。
【００５２】
本発明のコード核酸分子は、診断および探査目的のための検出可能な標識を含むようさらに改変され得る。種々のこのような標識は、当該分野において公知であり、そして本明細書中に記載されるコード分子に容易に使用され得る。適切な標識として、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、当該分野で公知の任意の標識を使用して、標識されたコード核酸分子を獲得し得る。
【００５３】
翻訳の際にタンパク質配列に組み込まれたアミノ酸の欠失、付加、変更による一次構造自体の改変は、このタンパク質の活性を壊すことなくなされ得る。このような置換または他の変更により、本発明の想定される範囲内に含まれる、核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質が生成される。
【００５４】
（Ｃ．他の関連の核酸分子の単離）
上述のように、配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９を有するヒト核酸分子の同定は、当業者が、本明細書中に記載される配列に加えて、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質ファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することを可能にする。さらに、ここで開示された核酸分子は、当業者が、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質およびペプチド因子のファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することを可能にする。
【００５５】
本質的に、当業者は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０のアミノ酸配列またはこれらのエピトープ含有フラグメントを容易に用いて、適切な細胞から調製された発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを作製し得る。代表的に、（以下に記載されるように）精製されたタンパク質で免疫されたラットのような哺乳動物由来のポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体は、哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリー（例えば、λｇｔ１１ライブラリー）を探索して、このタンパク質ファミリーの他のメンバーに対する適切なコード配列を獲得するために用いられ得る。クローン化されたｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として発現され得るか、独自の制御配列を用いて直接的に発現され得るか、またはこの酵素の発現のために用いられる特定の宿主に適切な制御配列を用いる構築物によって発現され得る。
【００５６】
あるいは、本明細書中に記載されるコード配列の一部は、任意の哺乳動物由来のこのタンパク質ファミリーのメンバーをコードするＤＮＡを検索するためのプローブとして合成および使用され得る。例えば、およそ１８〜２０ヌクレオチド（およそ６〜７アミノ酸ストレッチをコードする）を含むオリゴマーは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ストリンジェントな条件下、すなわち過度のレベルの偽陽性を排除するのに十分ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うために調製および使用され得る。
【００５７】
さらに、オリゴヌクレオチドプライマー対は、コード核酸分子を選択的にクローン化するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用のために調製され得る。このようなＰＣＲプライマーを用いるためのＰＣＲの変性／アニール／伸長サイクルは、当該分野において周知であり、そして他のコード核酸分子の単離における使用のために容易に適応され得る。
【００５８】
（Ｄ．核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子）
本発明は、コード配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）をさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、ｒＤＮＡ分子は、分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作製する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列およびベクター配列に作動可能に連結されている。
【００５９】
本発明のタンパク質ファミリーコード配列の１つと作動可能に連結されるベクターおよび発現制御配列の選択は、当該分野で周知のように、所望される機能的特性（例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に直接的に依存する。本発明のベクターは、少なくともｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製または宿主染色体への挿入、そして好ましくは発現もまた指向することが可能であり得る。
【００６０】
作動可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現制御エレメントは、当該分野において公知であり、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、誘導性プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養に対して応答性であるように、容易に制御される。
【００６１】
１つの実施形態において、コード核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコン、すなわち自己複製および原核生物宿主細胞（例えば、このベクターで形質転換された細菌宿主細胞）中での染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を指向する能力を有するＤＮＡを含む。このようなレプリコンは当該分野で周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、発現により薬物耐性のような検出可能なマーカーを与える遺伝子を含み得る。細菌の代表的な薬物耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子である。
【００６２】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でのコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指向し得る原核生物またはバクテリオファージのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、代表的に本発明のＤＮＡセグメントの挿入のために便利な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなベクタープラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主が、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために用いられ得る。
【００６３】
真核生物細胞に適合する（好ましくは、脊椎動物細胞に適合する）発現ベクターもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するために用いられ得る。真核細胞発現ベクターは、当該分野において周知であり、そして種々の販売元から入手可能である。代表的に、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のために便利な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）などの真核生物発現ベクターである。
【００６４】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために用いられる真核生物発現ベクターは、真核生物細胞において有効な選択マーカー（好ましくは、薬物耐性選択マーカー）をさらに含み得る。好ましい薬物耐性マーカーは、発現によりネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）。あるいは、選択マーカーは別々のプラスミドに存在し得、この２つのベクターが宿主細胞の同時トランスフェクションにより導入され、そして形質導入体がその選択マーカーに対する適切な薬物中での培養により選択される。
【００６５】
（Ｅ．外来性の供給されたコード核酸分子を含む宿主細胞）
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞をさらに提供する。この宿主細胞は、原核生物かまたは真核生物のいずれかであり得る。本発明のタンパク質の発現に有用な真核生物細胞は、その細胞株が細胞培養法に適合し、かつ発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現に適合する限り、限定されない。好ましい真核生物宿主細胞として、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル、またはヒト細胞株由来の細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。有用な真核生物宿主細胞の例として、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）などの真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
【００６６】
適切な細胞宿主の、本発明のｒＤＮＡ分子での形質転換は、使用されるベクターおよび使用される宿主系の型に代表的に依存する周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換については、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｈｅｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０〜２１１４を参照のこと）。脊椎動物細胞の、ｒＤＮＡを含むベクターでの形質転換については、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２、４５６〜４６７；Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６、１３７３〜１３７６を参照のこと）。
【００６７】
首尾良く形質転換された細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択マーカーについての選択を含む、周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入によって生じた細胞は、クローニングされてシングルコロニーを産生し得る。これらのコロニー由来の細胞は、収集され溶解され、そしてこれらのＤＮＡ内容物は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３〜５１７に記載されるような方法を使用してｒＤＮＡの存在について試験され得るか、または細胞から産生されたタンパク質は免疫学的方法を介してアッセイされ得る。
【００６８】
（Ｆ．ｒＤＮＡ分子を使用した組換えタンパク質の産生）
本発明はさらに、本明細書中に記載される核酸分子を使用する本発明のタンパク質を産生する方法を提供する。大まかに言えば、組換え形態のタンパク質の産生は、代表的に以下の工程を包含する：
第１に、配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９、または配列番号１のヌクレオチド１６６〜１５８４および配列番号３のヌクレオチド１７８〜１５９６に記述される核酸分子のような、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を得る。コード配列がイントロンによって中断されていない場合、これは直接、任意の宿主中で発現するのに適する。
【００６９】
次いで核酸分子は、上記に記載されるように好ましくは適切な制御配列と作動可能に配置され、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現ユニットを形成する。この発現ユニットは適切な宿主を形質転換するために使用され、そして形質転換された宿主は、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。必要に応じて、組換えタンパク質は培地または細胞から単離される；タンパク質の回収および精製は、いくらかの不純物が耐えられ得るいくつかの場合、必要でないかもしれない。
【００７０】
前述の工程のそれぞれは、種々の方法によって行われ得る。例えば、所望のコード配列はゲノムフラグメントから得られ、そして直接、適切な宿主に使用され得る。種々の宿主中で作動可能な発現ベクターの構築は、上記のように適切なレプリコンおよび制御配列の使用によって達成される。この制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞の型に依存し、そして以前に詳細に議論された。適切な制限部位は、通常利用可能でなければ、コード配列の末端に付加され得、それによってこれらのベクターに挿入する切除可能な遺伝子を提供し得る。当業者は、当該分野で公知である任意の宿主／発現系を組換えタンパク質を産生するための本発明の核酸分子を用いた使用に容易に適応させ得る。
【００７１】
（Ｇ．結合パートナーを同定する方法）
本発明は、本発明のタンパク質の結合パートナーの単離および同定において使用するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質は潜在的な結合パートナーまたは細胞の抽出物もしくは細胞分画と、本発明のタンパク質と潜在的な結合パートナーとの会合を可能にする条件下で、混合される。混合の後、本発明のタンパク質と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の分子は、混合物から分離される。次いで、本発明のタンパク質と結合したこの結合パートナーは、取り出されそしてさらに分析され得る。結合パートナーを同定および単離するために、全体のタンパク質、例えば配列番号２もしくは４いずれかの全体のＮｏｇｏレセプタータンパク質、または配列番号６の全体のＮｏｇｏタンパク質が使用され得る。あるいは、このタンパク質のフラグメントが使用され得る。有用なＮｏｇｏレセプタータンパク質フラグメントの例は、膜貫通ドメインの欠損した可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドである（図７）。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、細胞抽出物は、溶解した細胞または破壊した細胞から作製した調製物または分画をいう。細胞抽出物の好ましい供給源は、ヒトの脳または脊髄組織、例えば、ヒト大脳組織由来の細胞である。あるいは、細胞の抽出物は、ニューロン組織または入手可能なニューロン細胞株、特に希突起神経膠細胞由来の細胞株の任意の供給源から調製され得る。
【００７３】
種々の方法を使用して、細胞の抽出物を入手し得る。物理的または化学的のいずれかの破壊方法を使用して、細胞を破壊し得る。物理的な破壊方法の例としては、超音波処理および機械的な剪断が挙げられるが、これらに限定されない。化学的な溶解方法の例としては、界面活性剤溶解および酵素溶解が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本方法において使用するための抽出物を得るために、細胞抽出物を調製するための方法を容易に適応させ得る。
【００７４】
一旦細胞の抽出物が調製されると、結合パートナーとの本発明のタンパク質との会合が起こり得る条件下で、この抽出物は本発明のタンパク質と混合される。種々の条件が使用され得、ヒト細胞の細胞質中で見出される条件に非常に似通った条件が、もっとも好ましい。容量オスモル濃度、ｐＨ、温度、および使用される細胞抽出物の濃度のような特徴は、結合パートナーとこのタンパク質との会合を最適化するために変更され得る。
【００７５】
適切な条件下での混合の後、結合した複合体は混合物から分離される。種々の技術が、混合物を分離するために利用され得る。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を使用して、結合パートナー複合体を免疫沈降させ得る。あるいは、標準的な化学分離技術（例えば、クロマトグラフィーおよび密度沈降遠心分離）が使用され得る。
【００７６】
抽出物中に見出される非会合の細胞構成物筧の除去の後、従来の方法を使用して、結合パートナーは複合体から解離され得る。例えば、混合物の塩濃度またはｐＨを変更することによって、解離が達成され得る。
【００７７】
会合した結合パートナー対を混合抽出物から分離することを補助するために、本発明のタンパク質は、固体支持体上で固定化され得る。例えば、このタンパク質は、ニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに結合され得る。固体支持体に対するこのタンパク質の結合は、抽出物中に見出される他の構成物筧からペプチド−結合パートナー対の分離を補助する。同定された結合パートナーは、１つのタンパク質または２つ以上のタンパク質からなる複合体のいずれかであり得る。あるいは、結合パートナーは、ＦｌａｎａｇａｎおよびＶａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、３０９〜３４５またはＴａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９、５９〜６９の手順に従ったアルカリホスファターゼ融合アッセイ；Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９、１７１〜１８４またはＳａｕｄｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７７、９９１〜９９６の手順に従ったＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して同定され得るか、またはエピトープタグタンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質の使用を介して同定され得る。
【００７８】
あるいは、本発明の核酸分子は、酵母２ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）において使用され得る。この酵母２ハイブリッドシステムは、他のタンパク質パートナー対を同定するために使用されており、そして容易に、本明細書中に記載の核酸分子を使用するために適応され得る（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｙｂｒｉｚａｐ（登録商標）２ハイブリッドシステムを参照のこと）。
【００７９】
（Ｈ．発現を調節する因子を同定する方法）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質をコードする核酸の発現を調節する因子を同定する方法を提供する。本発明はまた、Ｎｏｇｏタンパク質をコードする核酸の発現を調節する因子を同定する方法を提供する。このようなアッセイは、本発明の核酸の発現レベルの変化をモニターする、任意の利用可能な手段を利用し得る。本明細書中で使用される場合、ある因子が、細胞中の本発明の核酸（例えば、配列番号２、４または６の配列を有するタンパク質をコードする核酸）の発現を上方調節または下方調節し得る場合、その因子は核酸の発現を調節するといわれる。
【００８０】
１つのアッセイ形式において、配列番号１のヌクレオチド１６６〜１５８４、または配列番号３のヌクレオチド１７８〜１５９６、または配列番号５のヌクレオチド１３５〜３７１３によって規定されるオープンリーディングフレームと任意のアッセイ可能な融合パートナーとの間のレポーター遺伝子融合物を含む細胞株が調製され得る。多くのアッセイ可能な融合パートナーが公知であり、そして容易に入手可能である（ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（Ａｌａｍら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８、２４５〜２５４）を含む）。次いで、レポーター遺伝子融合物を含む細胞株は、適切な条件および時間下で、試験されるべき因子に曝露される。その因子に曝露されたサンプルとコントロールサンプルとの間のレポーター遺伝子の示差的発現は、配列番号２、４または６の配列を有するタンパク質をコードする核酸の発現を調節する因子を同定する。
【００８１】
さらなるアッセイ形式を使用して、その因子が配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を有するタンパク質などの本発明のＮｏｇｏレセプタータンパク質、または配列番号６のアミノ酸配列を有するＮｏｇｏタンパク質をコードする核酸の発現を調節する能力をモニターし得る。例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸に対するハイブリダイゼーションによって直接モニターされ得る。細胞株は、適切な条件および時間下で、試験されるべき因子に曝露され、そして総ＲＮＡまたはｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにおいて開示される手順のような標準的な手順によって単離される。
【００８２】
因子に曝露された細胞とコントロール細胞との間のＲＮＡ発現レベルの違いの検出のためのプローブは、本発明の核酸から調製され得る。高いストリンジェンシーの条件下で標的核酸のみにハイブリダイズするプローブを設計することは、好ましいが必要ではない。非常に相補的な核酸ハイブリッドのみが、高いストリンジェンシーの条件下で形成される。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するために２本の核酸鎖の間に存在すべき相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的なプローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性における違いを最高にするように選択されるべきである。
【００８３】
プローブは、本発明の核酸から当該分野で公知の方法を介して設計され得る。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含有量およびプローブの長さは、標的配列へのプローブの結合に影響し得る。プローブの特異性を最適化する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓまたはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにおいて通常に利用可能である。
【００８４】
ハイブリダイゼーション条件は、それぞれのプローブについて必要である場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）に記載されるような方法）を使用して改変される。総細胞性ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡが富化されたＲＮＡのハイブリダイゼーションは、任意の利用可能な形式において達成され得る。例えば、総細胞性ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡが富化されたＲＮＡは、固体支持体に付着され得、そしてその固体支持体は、プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で、本発明の配列の少なくとも１つまたは１つの一部分を含む少なくとも１つのプローブに曝露され得る。あるいは、本発明の配列の少なくとも１つまたは１つの一部分を含む核酸フラグメントは、ケイ素ベースのウエハまたは多孔性ガラスのウエハのような固体支持体に付着され得る。次いでこのウエハは、付着された配列が特異的にハイブリダイズする条件下で、サンプルからの総細胞性ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡに曝露され得る。このようなウエハおよびハイブリダイゼーション方法は広く利用可能であり、これらはＢｅａｔｔｉｅ（１９９５）ＷＯ９５１１７５５によって開示されている。所定のプローブが未処理の細胞集団および因子に曝露された細胞集団由来のＲＮＡサンプルに特異的にハイブリダイズする能力を試験することによって、配列番号２または４の配列を有するＮｏｇｏレセプタータンパク質をコードする核酸の発現を上方調節または下方調節する因子が、同定される。
【００８５】
ｍＲＮＡの定性的および定量的分析のためのハイブリダイゼーションはまた、ＲＮａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（すなわち、ＲＰＡ、Ｍａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６）１０、２７３〜２３８を参照のこと）を使用して実行され得る。簡単に言えば、遺伝子産物およびファージ特異的ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）をコードするｃＤＮＡを含む発現ビヒクルは、ファージプロモーターの下流のｃＤＮＡ分子の３’末端で直鎖化され、ここでこのような直鎖化された分子は次いで、インビトロ転写によるｃＤＮＡの標識されたアンチセンス転写産物の合成のためのテンプレートとして使用される。次いで、この標識された転写産物は、単離されたＲＮＡ（すなわち、総ＲＮＡまたは分画されたＲＮＡ）の混合物に、４５℃一晩、８０％ホルムアミド、４０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ６．４）、０．４Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中でインキュベートすることによってハイブリダイズされる。次いでこの生じたハイブリッドは、４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡおよび２μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼを含む緩衝液中で消化される。外来性タンパク質の不活化および抽出の後、このサンプルは尿素−ポリアクリルアミドゲル上に分析のためにロードされる。
【００８６】
別のアッセイ形式において、本遺伝子産物の発現をもたらす因子である、生理学的にこの遺伝子産物を発現する細胞または細胞株が、まず、同定される。そのように同定された細胞および細胞株は、必要な細胞機構を含むことが期待され、結果として、適切な表面誘導メカニズムおよびサイトゾルカスケードと因子の外因的な接触に関して転写装置の調節の確実性が維持される。さらに、このような細胞または細胞株は、１以上の抗原性フラグメント（これは、本遺伝子産物に特有である）に融合される本遺伝子産物をコードする構造遺伝子の末端を含む作動可能な非翻訳５’プロモーターを含む発現媒体（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）構築物を用いて形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。ここで、このフラグメントは、プロモーターの転写制御下にあり、そして天然に存在するポリペプチドから区別され得る分子量のポリペプチドとして発現されるか、または免疫学的に異なるタグをさらに含み得る。このようなプロセスは当該分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００８７】
上記概略されるように形質導入されるかまたはトランスフェクトされた細胞または細胞株は、次いで、適切な条件下で因子と接触させられる；例えば、この因子は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み、水性生理学的緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（生理学的ｐＨで）、イーグルの平衡化塩溶液（ＢＳＳ）（生理学的ｐＨで）、血清を含むＰＢＳもしくはＢＳＳ、またはＰＢＳもしくはＢＳＳを含む馴化培地）および３７℃でインキュベートされた血清中で細胞と接触させられる。上記条件は、当業者によって必要と判断されるように調節され得る。因子と細胞との接触に続いて、この細胞を破砕し、破砕物のポリペプチドを分画し、その結果、ポリペプチド画分がプールされ、免疫学的アッセイによるさらなる処理のために抗体と接触させられる（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、またはウェスタンブロット）。「因子を接触させた」サンプルから単離されたタンパク質のプールは、賦形剤のみを細胞と接触させたコントロールサンプルと比較され、そして「因子を接触させた」サンプルから免疫学的に生じたシグナルのコントロールと比較した増加または減少は、因子の有効性を区別するために使用される。
【００８８】
（Ｉ．活性を調節する因子の同定方法）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質の少なくとも１つの活性を調節する因子を同定する方法を提供する。本発明はまた、Ｎｏｇｏタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する因子を同定する方法を提供する。このような方法またはアッセイは、所望される活性をモニタリングまたは検出する任意の手段を利用し得る。
【００８９】
１つの形式において、標準単位に規格化されたＮｏｇｏレセプタータンパク質またはＮｏｇｏタンパク質の比活性が、試験されるべき因子に曝露されていない細胞集団と比較して試験されるべき因子に曝露された細胞集団間で、アッセイされ得る。細胞株または細胞集団は、試験されるべき因子に、適切な条件下で適切な時間曝露される。細胞溶解物は、曝露された細胞株または集団およびコントロール（曝露されていない細胞株または集団）から調製され得る。次いで、細胞溶解物は、プローブで分析される。
【００９０】
抗体プローブは、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質、Ｎｏｇｏタンパク質、Ｎｏｇｏレセプターペプチド因子または上記任意の抗原含有フラグメントを使用する適切な免疫化プロトコルを利用して適切な哺乳動物宿主を免疫化することにより調製され得る。免疫原性を高めるために、これらのタンパク質またはフラグメントは、適切なキャリアに結合させられ得る。キャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）を有する免疫原性結合体を調製する方法は、当該分野で周知である。いくつかの環境において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的結合体が有効であり得る；他の例において、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．により供給されるような連結因子は、ハプテンとの接触性が提供されることが望まれ得る。ハプテンペプチドは、システイン残基を有するアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかで伸長され得るか、または例えば、キャリアへの連結を容易にするためにシステイン残基とともに分散され得る。免疫原の投与は、一般的に、適切な期間にわたって、当該分野で一般的に理解されるような適切なアジュバンドの使用を伴って、注射により行われる。免疫化スケジュール間、抗体の力価を取り、抗体形成の妥当性を決定する。
【００９１】
この方法で産生されたポリクローナル抗血清は、いくつかの適用について、良好であり得るが、薬学的組成物については、モノクローナル調製物の使用が好ましい。望ましいモノクローナル抗体を分泌する不朽細胞株は、標準的な方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４、５２４−５２６を参照のこと）または一般的に知られている改変（リンパ球または脾臓細胞の不朽化をもたらす）を使用して調製され得る。望ましい抗体を分泌する不朽化細胞株は、イムノアッセイ（ここで、抗原はペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタンパク質である）によってスクリーニングされ得る。所望される抗体をスクリーニングする適切な不朽化細胞培養物が同定される場合、この細胞は、インビトロでまたは腹水中での産生によってのいずれかで培養され得る。
【００９２】
所望されるモノクローナル抗体は、培養上清または腹水上清から回収され得る。インタクトな抗Ｎｏｇｏ抗体または抗Ｎｏｇｏレセプター抗体または免疫学的に有意な部分を含むそれらのフラグメントは、例えば、Ｎｏｇｏ（リガンド）とＮｏｇｏレセプターとの間の結合のアンタゴニストとして使用され得る。免疫学的に反応性のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ’）の使用は、特に、これらのフラグメントが一般的に全免疫グロブリンより少ない免疫原性であるので治療的状況において、しばしば好ましい。
【００９３】
抗体またはフラグメントはまた、組換え手段による最新の技術を使用して産生され得る。所望されるタンパク質の領域に特異的に結合する抗体領域はまた、複数の種の起源を有するキメラの状況において産生され得る。
【００９４】
所望されるタンパク質の領域に特異的に結合する抗体領域はまた、複数の種の起源を有するキメラの状況（例えば、ヒト化抗体）において産生され得る。従って、抗体は、米国特許第５，５８５，０８９号またはＲｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３−３２７に記載されるようにヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。
【００９５】
上記方法においてアッセイされる因子は、ランダムに選択されるかもしくは合理的に選択されるか、または設計され得る。本明細書中で使用される場合、因子が、単独で、またはその関連の基質、結合するパートナーなどとともに本発明のタンパク質の結合に関連する特定の配列を考慮することなしにランダムに選択された場合、この因子は、ランダムに選択されたと言われる。ランダムに選択された因子の例は、化学的ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリー、または生物の増殖ブロスの使用である。
【００９６】
本明細書中で使用されるように、因子が標的部位の配列または因子の作用に関するそのコンホメーションを考慮して非ランダムに選択される場合、この因子は、合理的に選択または合理的に設計されたと言われる。これらの部位を構成するペプチド配列を利用することにより、因子は、合理的に選択または合理的に設計され得る。例えば、合理的に選択されたペプチド因子は、Ｎｏｇｏレセプターと相互作用するＮｏｇｏの結合ドメイン（配列番号２０）と同一であるアミノ酸配列のペプチドであり得る。あるいは、それは、結合ドメインのフラグメントであり得る（例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８）。
【００９７】
本発明の因子は、例えば、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、低分子、ビタミン誘導体、および炭水化物であり得る。本発明のペプチド因子は、当該分野で公知である標準的な固相（または液相）ペプチド合成方法を使用して調製され得る。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成され得、そして標準的な組換え体産生系を使用して組換え的に産生され得る。固相ペプチド合成を使用する産生は、遺伝子にコードされていないアミノ酸が含まれる場合に、必要とされる。
【００９８】
本発明の別のクラスの因子は、Ｎｏｇｏタンパク質またはＮｏｇｏレセプタータンパク質に結合する抗体またはそれらのフラグメントである。抗体因子は、抗体によって標的化されることが意図されるタンパク質の部分を抗原領域として含むペプチドを用いて適切な哺乳動物被験体の免疫化によって得られ得る。
【００９９】
（Ｊ．ハイスループットアッセイ）
ハイスループットスクリーニングの能力は、Ｎｏｇｏレセプタータンパク質と相互作用し得る新規化合物のための検索に利用される。ハイスループットスクリーニングの一般的な情報は、例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、（１９９８）、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；米国特許第５，７６３，２６３号である。ハイスループットアッセイは、１以上の異なるアッセイ技術を利用する。
【０１００】
（免疫診断およびイムノアッセイ）
特定の生化学的因子（一般的に、低濃度で生物学的流体のような複合混合物中に存在する）の測定に使用される技術のグループがあり、これらは、相補的な抗原に対して、適切に調製および選択された抗体によって示される特異性および高親和性に依存する。測定されるべき因子は、必ず、抗原性の免疫原性巨大分子または免疫原性のハプテン低分子のいずれかでなければならない。各サンプルに、既知の限られた量の特定の抗体を添加し、そしてそれと結合する抗原の画分（しばしば、結合：遊離の比として表される）を、ラジオアイソトープ（ラジオイムノアッセイ）、蛍光分子（蛍光イムノアッセイ）、安定なフリーラジカル（スピンイムノアッセイ）、酵素（酵素イムノアッセイ）、または他の容易に区別可能な標識を用いて標識化された抗原の形態をインジケーターとして使用して推定する。
【０１０１】
抗体は、以下に挙げられる種々の方法で標識化され得る：酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）；化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）；およびコロイド状金粒子を用いる抗体の標識化（イムノゴールド（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ））。
【０１０２】
一般的なアッセイ形式として、サンドイッチアッセイ、競合または競合的アッセイ、ラテックス凝集アッセイ、同種アッセイ、マイクロタイタープレート形式および微粒子に基づくアッセイが挙げられる。
【０１０３】
（酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
ＥＬＩＳＡは、放射性化学因子の危険性および蛍光検出系の高費用を回避する免疫化学的な技術である。換言すれば、このアッセイは、酵素をインジケーターとして使用する。ＥＬＩＳＡは、不溶性キャリア表面に連結される抗体（または抗原）の使用に基づく定量的イムノアッセイの形態であり、この抗原（または抗体）は、次に、試験溶液中の関連する抗原（または抗体）を「捕捉」するために使用される。この抗原−抗体複合体は、次に、予め抗原（または抗体）に共有結合した適切な酵素の活性を測定することにより検出される。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡ技術の情報は、例えば、以下を参照のこと。Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、（１９９５）、ＥＬＩＳＡ−Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅおよびＫｅｍｅｎｙ、（１９９８）、ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｋｅｍｅｎｙ、（１９９１），Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＥＬＩＳＡ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｓｈｉｋａｗａ、（１９９１）、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｅｌｉｓｅｂｉｅｒ。
【０１０５】
（酵素についての比色アッセイ）
比色定量は、化合物の濃度または量は、化合物の標準量および試験量の両方と試薬との反応によって生成された色を（例えば、比色計または分光光度計を使用して）比較することによって決定される定量的化学分析の任意の方法である。
【０１０６】
β−ガラクトシダーゼ酵素活性の標準的な比色アッセイは、当業者に周知である（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、２８１−２９０）。比色アッセイを、標準的な比色β−ガラクトシダーゼアッセイにおいて、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｓｉｇｍａ）を基質として使用して全細胞溶解物について行い得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。自動化された比色アッセイはまた、β−ガラクトシダーゼ活性の検出に利用され得る（例えば、米国特許第５，７３３，７２０を参照のこと）。
【０１０７】
（免疫蛍光アッセイ）
免疫蛍光または免疫蛍光検鏡法は、抗原または抗体が蛍光色素に結合し、次いで組織断片もしくはスメア中の相補的な抗体または抗原と反応することにより蛍光が生じる技術である。次に、抗原または抗体の場所を、紫外線下で顕微鏡によって蛍光を観察することにより決定し得る。
【０１０８】
免疫蛍光技術についての一般的な情報に関して、例えば、Ｋｎａｐｐら（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ａｌｌａｎ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｕｌ，（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。本発明に適用可能な免疫蛍光技術の詳細な説明に関して、米国特許第５，９１２，１７６号；米国特許第５，８６９，２６４号；米国特許第５，８６６，３１９号；および米国特許第５，８６１，２５９号を参照のこと。
【０１０９】
（Ｋ．活性を調節する薬剤の使用）
実施例に提供されるように、ＮｏｇｏおよびＮｏｇｏレセプタータンパク質ならびに核酸（例えば、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有するタンパク質）は、軸索および樹状突起に由来するミエリンに発現する。ＮｏｇｏまたはＮｏｇｏレセプタータンパク質の発現を調節またはアップレギュレーションあるいはダウンレギュレーションする薬剤あるいは、例えばＮｏｇｏまたはＮｏｇｏレセプタータンパク質の少なくとも１つの活性のアゴニストまたはアンタゴニストといった薬剤は、タンパク質の機能および活性に関連する生物学的なプロセスおよび病理的なプロセスを調節するのに使用され得る。本発明は、ヒト被験体の処置に特に有用である。
【０１１０】
病理的なプロセスは、有害な効果を生じ生物学的なプロセスの範疇を示す。例えば、本発明のタンパク質の発現は、頭側の外傷、大脳の外傷または脊髄の外傷、脳卒中あるいは脱髄疾患に続く軸索の再生の阻害に関連され得る。このような脱髄疾患としては、以下に挙げられるがそれらに限定されない：多発性硬化症、単相性脱髄（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、全脳炎、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病、橋角部ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、海綿状変性、アレグザンダー病、キャナヴァン病、異染色性白質萎縮およびクラッベ病。本明細書中に使用されるように、薬剤が、病理的なプロセスの程度および重症度を軽減する場合、この薬剤は、病理的なプロセスを調節すると言われる。例えば、脱髄疾患は、薬剤の投与によって予防され得、また疾患の進行は、調節される。この薬剤は、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性または発現をどうにかして軽減、促進、調節する。
【０１１１】
１つの例において、配列番号８、１０、１２，１４、１６、１８および２０に示されるＮｏｇｏペプチド薬剤の投与は、ＮｏｇｏまたはＮｏｇｏレセプタータンパク質に関連する脱髄疾患を処置するのに用いられ得る。別の例において、本発明のペプチド薬剤を発現する細胞は、損傷した部位全体にわたって軸索の成長を容易にするために脊髄の損傷部位に移植され得る。このような移植された細胞は、創傷および外傷に続く脊髄機能を回復するための手段を提供する。
【０１１２】
なお別の例において、Ｎｏｇｏに結合する可溶性Ｎｏｇｏレセプタータンパク質の投与は、ＮｏｇｏまたはＮｏｇｏレセプタータンパク質に関連する脱髄疾患を処置するのに使用され得る。この薬剤は、細胞に結合したＮｏｇｏレセプターへのＮｏｇｏの結合を防止するために使用され得、そしてＮｏｇｏのアンタゴニストとして作用する。可溶性レセプターは、サイトカインまたは他のリガンドの機能を制御するために、これらを結合するのに使用される（Ｔｈｏｍｓｏｎ，（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。可溶性レセプターは、溶液中、または膜の外側において生じる。膜を繋ぐまたは膜に結合する分子のセグメントが存在しないので、可溶性レセプターは生じ得る。このセグメントは、通常、遺伝子の膜貫通ドメインまたはタンパク質の膜結合セグメントとして当該分野で称される。従って、本発明のいくつかの実施形態において、可溶性レセプターは、膜結合性レセプターのフラグメントまたはアナログを含む。フラグメントが所望の活性を保持するという条件で、フラグメントは、好ましくは少なくとも６つのアミノ酸、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０または７０アミノ酸を含む。
【０１１３】
本発明の他の実施形態において、膜に結合するセグメントの構造は、改変され（例えば、ＤＮＡ配列多型または遺伝子における変異）、その結果、レセプターは、膜に挿入されないか、またはレセプターは、挿入されるが、膜内において保持されない。従って、対応する膜結合形態とは対照的に、可溶性のレセプターは、膜に結合するのに重要な１つまたはそれより多い遺伝子のセグメントまたはレセプタータンパク質が異なる。
【０１１４】
本発明の薬剤は、単独で、または組み合わせて、あるいは特定の病理学的なプロセスを調節する他の薬剤を連続的に組み合わせて提供され得る。例えば、本発明の薬剤は、さらなる神経の創傷をブロック、および軸索の再生を防止するための手段として、発作の後に抗炎症剤と組み合わせて投与され得る。本明細書中で使用されるように、２つの薬剤が、同時に投与されるか、または薬剤が同時に作用するような様式で独立的に投与される場合、２つの薬剤は、組み合わせて投与されると言われる。
【０１１５】
本発明の薬剤は、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経皮的に、または口内を介して投与され得る。例えば、薬剤は、微量注入を介して損傷の部位に局所的に投与され得る。典型的な部位としては、創傷により生じた脊髄の損傷した領域、または、発作により生じた脳における損傷した部位が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、または同時に、投与は、経口によってであり得る。投与された用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時処置の種類（もしあれば）、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
【０１１６】
本発明は、さらに本発明のタンパク質の発現または少なくとも１つの活性を調節する１つまたはそれより多い薬剤を含有する組成物を提供する。個体によって変更が必要であるが、各成分の効果的な量の最適な範囲の決定は、当該分野の技術の範囲内である。典型的な用量は、１ｐｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。全身性の投与のための好ましい用量は、１００ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。微量注入を介した部位への直接的な投与のための好ましい用量は、１ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ体重を含む。
【０１１７】
薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、作用部位に送達するのに薬学的に使用され得る調製物への活性な化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。非経口的な投与のための適切な処方物は、水溶性形態（例えば、水可溶性塩）の活性な化合物の水溶液を含む。さらに、適切な油性注入懸濁液として活性な化合物の懸濁液は、投与され得る。適切な親油性の溶媒またはビヒクルは、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、エチルオレアートまたはトリグリセリド）を含む。水性注入懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大する基質を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、安定剤を含み得る。リポソームはまた、細胞への送達のための薬剤のカプセル化に使用され得る。
【０１１８】
本発明に従う全身性投与のための薬学的な処方物は、腸内の、非経口の、または局所的な投与のために処方され得る。実際は、全ての３つの型の処方物は、活性な成分の全身性投与を達成するために同時に使用され得る。経口投与のための適切な処方物は、硬質または軟質のゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（コートされた錠剤を含む）、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸入薬、およびそれらの制御された放出形態を含む。
【０１１９】
本発明の方法の実施において、本発明の薬剤は、単独または組み合わせて、あるいは他の治療的なまたは診断的な薬剤と組み合わせて使用され得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般に受け入れられる医学的な実施に従うこれらの条件について典型的に記載される他の化合物（例えば、抗炎症薬剤、抗凝血剤、抗血栓剤（血小板凝縮インヒビター、組織プラスミノゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アスピリンおよびヘパリンを含む））と共に、同時投与され得る。本発明の化合物は、インビボで、通常、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス）においてまたはインビトロで使用され得る。
【０１２０】
（Ｌ．ペプチド模倣物）
本発明はまた、Ｎｏｇｏの３次元構造を模倣し、そしてＮｏｇｏレセプターに結合するＮｏｇｏをブロックするペプチド模倣物を含む。このようなペプチド模倣物は、天然に存在するペプチドより有意な利点を有し得る（例えば、より経済的な産生、より高い化学安定性、増強された薬理学的な性質（半減期、吸収、効力、有効性など）、改変された特異性、（例えば、生物学的な活性の広域スペクトル）、軽減された抗原性、および他の性質を含む）。
【０１２１】
１つの形態において、模倣物は、タンパク質二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏら，（編者）Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌを参照のこと）。ペプチド模倣物の使用の裏にある根拠となる原理は、タンパク質のペプチド骨格が、主に、分子相互作用（例えば、抗体と抗原の相互作用）を容易にするように、アミノ酸側鎖を位置づけるように存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子と同様の分子相互作用を可能にすることが予想される。
【０１２２】
別の形態において、ペプチドアナログは、通常、テンプレートペプチドの性質に類似する性質を有する非ペプチド薬剤として、製薬産業において使用される。非ペプチド化合物のこれらの型はまた、「ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５，２９−６９；Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，３９２〜３９６；Ｅｖａｎｓら，（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，１２２９〜１２３９，これらは、本明細書中に参照として援用される）と称され、そして通常コンピューター化された分子モデリングの助けを借りて開発される。
【０１２３】
治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣品は、等価の治療的な、または予防的な効果を産生するのに使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、例えば、Ｎｏｇｏの細胞外ドメインといった、系列ポリペプチド（ｐａｒａｄｉｇｍ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（すなわち、生物学的な性質または薬理学的な活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、ペプチド模倣物は、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択される結合によって、当該分野で公知の方法、ならびに以下の参考文献：Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，（１９８３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；Ｍｏｒｌｅｙ，（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１，４６３〜４６８（一般的な概説）；Ｈｕｄｓｏｎら，（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１４，１７７〜１８５（−ＣＨ２ＮＨ−，ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら，（１９８６）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８，１２４３〜１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，３０７〜３１４（−ＣＨ−ＣＨ−，シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら，（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３，１３９２〜１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら，（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３，２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら，（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４．４４０１〜４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ，（１９８２）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１，１８９〜１９９（−ＣＨ２Ｓ−）；各参考文献は、本明細書中に参照として援用される）にさらに記載される方法によって、必要に応じて、置換される１つまたはそれより多いペプチド結合を有する。
【０１２４】
ペプチドの模倣物の標識化は、定量的な構造活性データおよび分子モデリングによって予想されるペプチド模倣物上の非妨害位置への、直接的の、またはスペーサー（例えば、アミド基）を介する１つまたはそれより多い標識の共有結合を通常含む。このような非妨害位置は、一般に、治療学的な効果を生じるためにペプチド模倣物が結合する高分子と直接的な結合を形成しない位置である（例えば、ＮｏｇｏＮｏｇｏレセプター複合体における結合点ではない）。ペプチド模倣物の誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、標識化）は、本質的に、ペプチド模倣物の所望の生物学的なまたは薬理学的な活性を妨害するべきでない。
【０１２５】
Ｎｏｇｏペプチド模倣物は、有機性モチーフによるアミノ酸の置換を介して構造に基づく薬剤設計によって作製され得る（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ，（１９８０）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２９０，３８７〜３９４；Ｈｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，１９〜２１；Ｓｕｃｋｌｉｎｇ，（１９９１）Ｓｃｉ．Ｐｒｏｇ．７５，３２３〜３５９を参照のこと）
ペプチド模倣物の使用は、薬物ライブラリーを作製するためにコンビナトリアル化学の使用を介して、増強され得る。ペプチド模倣物の設計は、ＮｏｇｏレセプターへのＮｏｇｏの結合を増大または減少するアミノ酸変異を同定することによって助けられ得る。使用され得るアプローチは、酵母ツーハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９５７８〜９５８２を参照のこと）およびファージディスプレイ法の使用を含む。ツーハイブリッド法は、酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する（Ｆｉｅｌｄｓら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，２４５〜２４６）。ファージディスプレイ法は、例えば、固定されたタンパク質とλ（ラムダ）およびＭ１３といったファージの表面上に発現されるタンパクとの間の相互作用を検出する（Ａｍｂｅｒｇら，（１９９２）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ６，２〜４；Ｈｏｇｒｅｆｅら，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８，１１９〜１２６）。これらの方法は、タンパク質−タンパク質相互作用について陽性選択および陰性選択、そしてこれらの相互作用を決定する配列の同定を可能にする。
【０１２６】
ペプチド合成およびペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）に関する一般的な情報は、例えば、Ｊｏｎｅｓ、（１９９２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｇ、（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、（１９９３）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ．を参照のこと。
【０１２７】
（Ｍ．トランスジェニック動物）
本明細書中で使用される用語「動物」は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含む。これはまた、胚および胎児の段階を含む発生の全ての段階における個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」は、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスでの感染のような細胞内レベルにおける意図的な遺伝子操作により直接的または間接的に、受け取った遺伝情報を保持する、一つ以上の細胞を含む動物である。この導入されたＤＮＡ分子は、染色体内に組込まれ得るか、またこれは、染色体外で複製するＤＮＡであり得る。用語「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝情報が生殖系細胞に導入され、これにより子孫にこの情報を伝達する能力を与える、トランスジェニック動物をいう。このような子孫が実際にその情報のいくつかまたは全てを保持する場合、これらもまたトランスジェニック動物である。変異遺伝子、ノックアウト遺伝子、改変された遺伝子または遺伝子構築物を含んで配列番号１もしくは３のｃＤＮＡ配列、または関連する配列に対応する遺伝子を過剰発現するかまたは条件的に発現するトランスジェニック動物は、本発明に包含される。
【０１２８】
この情報は、このレシピエントが属する動物の種に対して外来性であり得るか、特定の個体レシピエントに対してのみ外来性であり得るか、またはレシピエントにより既に保持されている遺伝情報であり得る。最後の場合、導入された遺伝子は、ネイティブの内因性遺伝子と比較して差次的に発現され得る。これらの遺伝子は、ゲノムの供給原からこれらを単離することによるか、単離されたＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを調製することによるか、または直接的な合成によるか、あるいはこれらのいくつかの組合せにより得られる。
【０１２９】
発現させるために、遺伝子は調節領域へ作動可能に連結される。調節領域（例えば、プロモーター）を使用して、特定の組織または特定の発生段階に対して、遺伝子の発現を増大、減少、調節、または指定し得る。このプロモーターは天然に存在するプロモーターである必要はない。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、「導入遺伝子」を非ヒト動物の生殖系列に導入することにより産生される。細胞へのＤＮＡの導入を可能にするこの方法は一般に利用可能であり、そして当該分野で周知である。導入遺伝子を導入する種々の方法が使用され得る。一般に、接合体がマイクロインジェクションにとって最良の標的である。マウスにおいて、雄性前核は、直径にして約２０ミクロンの大きさに達し、これは１〜２ピコリットルのＤＮＡ溶液の再現可能な注入を可能にする。遺伝子移入のための標的としての接合体の使用は、際立った利点を有する。多くの場合において、注入されたＤＮＡは、最初の卵割前に宿主遺伝子に組み込まれる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、４４３８〜４４４２）。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の殆ど全ての細胞は、その組み込まれた導入遺伝子を保持する。一般に、これはまた、この始祖（ｆｏｕｎｄｅｒ）の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達を生じる。なぜならば、生殖細胞の５０％が、この導入遺伝子を保有しているからである。接合体のマイクロインジェクションは、本発明の実施における導入遺伝子を組み込む好ましい方法である。
【０１３０】
レトロウイルス感染はまた、非ヒト動物へ導入遺伝子を導入するために使用し得る。発生中の非ヒト胚は、インビトロで胚盤胞段階まで培養され得る。この期間中、割球がレトロウイルス感染の標的であり得る。割球の効率的な感染は、透明帯を除去する酵素処理により得られる。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、代表的には、導入遺伝子を持つ複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６９２７−６９３１；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、６１４８−６１５２）。トランスフェクションは、この割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することにより、容易かつ効率的に培養される（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、６１４８−６１５２；Ｓｔｅｗａｒｔら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６、３８３−３８８）。あるいは、感染はさらに後の段階で実施され得る。ウイルスまたはウイルス産生細胞を、胞胚腔に注入し得る（Ｊａｈｎｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８、６２３〜６２８）。殆どの始祖動物は、導入遺伝子についてモザイクである。なぜなら、組み込みは、トランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにおいてのみ起こるからである。さらに、始祖動物はゲノム内の種々の位置に導入遺伝子のレトロウイルスの挿入を含み得る；これらは一般に子孫の中で分離する。さらに、低い効率ではあるが、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染により、導入遺伝子を生殖系列に導入することもまた可能である（Ｊａｈｎｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８、６２３〜６２８）。
【０１３１】
導入遺伝子を導入するための標的細胞の第三の型は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養した着床前の胚から得られる（Ｅｖａｎｓら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２、１５４〜１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９、２５５〜２５６；Ｇｏｓｓｌｅｒら、（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３、９０６５〜９０６９）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介形質導入により、ＥＳ細胞内に効率的に導入され得る。生じた形質転換したＥＳ細胞は、その後非ヒト動物由来の胚盤胞と合わせられ得る。ＥＳ細胞は、胚にコロニー形成し、そして得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【０１３２】
導入されたＤＮＡの存在および発現を評価する方法は、容易に利用可能であり、当該分野で周知である。このような方法としては、外因性ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を検出するためのウェスタンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、Ｎｏｇｏレセプター遺伝子の発現を検出する免疫学的技術および組織化学的技術を含む。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、「導入遺伝子」は、以下に記載の実施例のようなヒトによる介入により、非ヒト動物の生殖系列に導入されるＤＮＡ配列である。この導入遺伝子の核酸配列は、この配列番号１または３の形態の場合、その特定の核酸配列がさもなければ正常には見出されない、ゲノム上の遺伝子座、またはその導入遺伝子の正常な遺伝子座のいずれかに組み込まれ得る。この導入遺伝子は、同じ種のゲノム由来の核酸配列からなり得るか、または標的動物の種とは異なる種のゲノム由来の核酸配列からなり得る。例えば、Ｎｏｇｏを欠くマウスにおける軸索再生は、ＭＡＧを欠くかまたはＭＡＧおよびＮｏｇｏの両方を欠くマウスの軸索の再生と比較され得る。抗Ｎｏｇｏ抗体の効果がＮｏｇｏの妨害に起因しているか否かを決定するために、抗体の効果をＮｏｇｏ発現を欠く動物において研究し得る。
【０１３４】
上で議論したように、本発明の核酸は、ベクターを使用して宿主細胞にトランスフェクトされ得る。好ましいベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクター（例えば、レトロウイルス）である。ウイルスベクターを使用して、本発明に従うトランスジェニック動物を産生し得る。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損であり、すなわち、これらは標的細胞中で自律的に複製し得ない。一般的に、本発明の範囲内で使用される複製欠損のウイルスベクターのゲノムは、感染した細胞内でこのウイルスが複製するのに必要な領域の少なくとも一つを欠く。これらの領域は（全体的または部分的に）除去され得るか、または当業者に公知な任意の技術により非機能的にされ得る。これらの技術は全体の除去、（他の配列、特にその挿入された核酸配列による）置換、（複製にとって）必須の領域に対する一つ以上の塩基の部分的な欠失または付加を含む。このような技術は、遺伝子操作の技術を用いることにより、または突然変異誘発剤による処理により、インビトロ（単離されたＤＮＡに対して）でかまたはインサイチュで実施され得る。
【０１３５】
好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子をカプセル化するために必要なそのゲノム配列を保持する。このレトロウイルスは、分裂している細胞に感染するウイルスを統合する。レトロウイルスゲノムは、二つのＬＴＲ、カプセル化配列および三つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターの構築は、記載されている（例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、（１９８５）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７、２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、６８９−６９１を参照のこと）。組換えレトロウイルスベクターにおいて、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子は、一般に、全体的または部分的に欠失され、そして目的の異種の核酸配列により置換される。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー白血病ウイルス）、ＭＳＶ（マウスモロニー肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ（ハーヴェイ肉腫ウイルス）；ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）；ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）およびフレンドウイルス）から構築され得る。
【０１３６】
一般に、核酸配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、ＬＴＲ、カプセル化配列およびこれらのコード配列を含むプラスミドを構築する。この構築物を用いて、パッケージング細胞株をトランスフェクトする。この細胞株は、このプラスミドが欠損しているレトロウイルス機能をトランスで供給する。従って、一般に、このパッケージング細胞株は、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を発現し得る。このようなパッケージング細胞株は、先行技術として、特に細胞株ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ９００２８０６）；およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞株（ＷＯ８９０７１５０）について記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の改変およびｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広範なカプセル化配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１、１６３９〜１６４６）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準技術により精製される。
【０１３７】
一つの局面において、この核酸は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードする。この実施形態において、この核酸はこの核酸配列の発現を可能にする（上記で議論した）適切な調節配列に作動可能に連結され、そして好ましくは、組換えベクター構築物を使用して核酸は細胞に導入され、このベクター構築物は一旦このベクターが細胞に導入されるとこのアンチセンス核酸配列を発現する。適切なベクターの例としては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号）、レトロウイルス（上記参照のこと）およびヘルペスウイルスが挙げられる。治療遺伝子の送達について、このベクターは好ましくはアデノ随伴ウイルスである。
【０１３８】
アデノウイルスは、種々の細胞型へ本発明の核酸を効率的に送達するように改変され得る真核生物のＤＮＡウイルスである。アデノウイルスの様々な血清型が存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲において、ヒトアデノウイルスの２型もしくは５型（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデウイルスの使用（ＷＯ９４２６９１４を参照のこと）が与えられる。本発明の範囲内で用いられるこれらの動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、鳥類，およびサル起源のアデノウイルスを含む。
【０１３９】
本発明に従う複製欠損の組換えアデノウイルスは、当業者に公知である任意の技術により調製され得る。特に、これらは、アデノウイルスと特に本発明のＤＮＡ配列を保持するプラスミドとの間の相同組換えにより調製され得る。この相同組換えは適切な細胞株への上記のアデノウイルスおよびプラスミドの同時トランスフェクションの後にもたらされる。この使用される細胞系は、好ましくは、（ｉ）上記のエレメントにより形質転換が可能であり、そして（ｉｉ）組換えの危険性を回避するために好ましくは組み込まれた形態、複製欠損アデノウイルスのゲノムの部分を補完することが可能である配列を含む。組換えアデノウイルスは、当業者にとって周知である標準的な分子生物学技術を使用して回収および精製される。
【０１４０】
多くの組換えマウスまたはトランスジェニックマウスが作製され、これらには以下が挙げられる：活性化された癌遺伝子配列を発現するマウス（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ  ４０  Ｔ−抗原を発現するマウス（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現を欠くマウス（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作用性機能不全を提示するマウス（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧制御に関与する少なくとも一つのヒト遺伝子を発現するマウス（米国特許第５，７３１，４８９号）；天然に存在するアルツハイマー疾患において存在する状態に高い類似性を示すマウス（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力が減じられたマウス（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を保持するマウス（Ｃｌｕｔｔｅｒら、（１９９６）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３，１７５３〜１７６０）、または完全なヒト抗体の応答を生じ得るマウス（Ｚｏｕら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１２７１−１２７４）。
【０１４１】
マウスまたはラットが、殆どのトランスジェニックの実験に対しての最適な動物であるが、いくつかの例において、代替の動物の種を使用することが好ましくあり、または必要でさえある。トランスジェニックの手順は、以下を含む種々の非マウスの動物において首尾よく使用されている：ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ハムスター、ウサギ、ウシ、およびモルモット（以下を参照のこと：Ａｉｇｎｅｒら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７、８４３〜８５０；Ｃａｓｔｒｏら、（１９９９）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５、１７９〜１８７；Ｂｒｉｎｋら、（２０００）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５３、１３９〜１４８；Ｃｏｌｍａｎ、（１９９９）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５、１６７〜１７３；Ｅｙｅｓｔｏｎｅ、（１９９９）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５１、５０９〜５１７；Ｂａｇｕｉｓｉら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、４５６〜４６１；Ｐｒａｔｈｅｒら、（１９９９）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５１、４８７〜４９８；Ｐａｉｎら、（１９９９）Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６５、２１２〜２１９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、（１９９９）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３７、１０８５〜１０９２；米国特許第５，９０８，９６９号；米国特許第５，７９２，９０２号；米国特許第５，８９２，０７０号；米国特許第６，０２５，５４０号）。
（Ｎ．診断方法）
本発明の核酸分子またはタンパク質を用いて脱髄疾患を診断する１つの方法は、生きている被験体から組織サンプルを入手する工程を包含する。生きている供給源から組織サンプルを入手する工程は、中枢神経系の組織のような組織については問題を含んでいる。脱髄疾患を患っている患者において、診断方法のための組織サンプルは、より侵襲性の少ない手順で入手され得る。例えば、サンプルは全血液および血清から入手され得る。
【０１４２】
分子生物学的手段の使用は、法医学的技術において慣例になってきている。例えば、法医学の病理学標本において、核酸プローブが使用され、配列番号１の配列の全部または少なくとも一部を含む核酸分子の発現を決定し得る。さらに、核酸アッセイは、転写プロファイリング分析を行う任意の方法によって行われ得る。核酸分析に加え、本発明の法医学的方法は、配列番号１によってコードされるタンパク質を標的にして、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを決定し得る（Ｓｈｉｖｅｒｉｃｋら、（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９３，１２４−１３３）。
【０１４３】
本発明の方法は、コラーゲナーゼまたは他のプロテアーゼを用いた組織の処理を伴い、組織を細胞溶解の影響を受けやすくさせ得る（Ｓｅｍｅｎｏｖら、（１９８７）Ｂｉｕｌｌ．Ｅｋｓｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０４，１１３−１１６）。さらに、分析のために、脳の異なる領域から生検サンプルを入手し得る。
【０１４４】
本発明の核酸分子またはタンパク質分子を検出するためのアッセイは、任意の利用可能な形式であり得る。核酸分子のための代表的なアッセイは、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲに基づく形式を含む。本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの検出のための代表的なアッセイは、インサイチュ結合アッセイなどのような任意の利用可能な形式における、抗体プローブの使用を含む。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。好ましい実施形態において、アッセイは、適切なコントロールを用いて行われる。
【０１４５】
さらなる説明をしなくとも、当業者が先の説明および以下に説明される実施例を用いて本発明の化合物を製造かつ利用し得、そして特許請求の範囲に記載される方法を実施し得ると考えられる。それゆえ、以下の実用的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を明確に示すが、本開示の残りを何れの方法でも制限するものとして解釈されない。
【０１４６】
（実施例）
（実施例１−タンパク質のＲｅｔｉｃｕｌｏｎファミリーのメンバーとしてのＮｏｇｏの同定）
成体哺乳動物の軸索再生は、一般的に末梢において好首尾であるが、ＣＮＳにおいてはひどく不十分である。しかしながら、ＣＮＳ軸索の多くのクラスは、末梢神経移植片中の長い距離にわたり伸び得る（Ｂｅｎｆｙ＆Ａｇｕａｙｏ（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，１５０−１５２）。ＣＮＳと末梢神経系（ＰＮＳ）ミエリンとの比較によって、ＣＮＳ白色物質が、軸索生長に対して選択的に阻害することが明らかになった（Ｓｃｈｗａｂ＆Ｔｈｏｅｎｅｎ（１９８５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５，２４１５−２４２３）。軸索伸長に対して阻害活性を有するＣＮＳ白色物質のいくつかの成分であるＮＩ３５、ＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）およびＭＡＧが、記載せれる（Ｗａｎｇら、（１９９９）Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｘｏｎａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅ，ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ，Ｋａｌｂ＆Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（編集者）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｒｏｎｉ＆Ｓｃｈｗａｂ，（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６，１２８１−１２８８；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１９２８３−１９２９３；ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら、（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ１３，８０５−８１１；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ１３，７５７−７６７）。ＮＩ３５およびＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）に対して惹起されるＩＮ−１抗体が、脊髄損傷後の軸索の再生および機能回復の程度を調節し得ると報告された（Ｂｒｅｇｍａｎら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，４９８−５０１；Ｔｈａｌｌｍａｉｒら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１，２４−３１）。本発明はＮｏｇｏをＲｅｔｉｃｕｌｏｎタンパク質ファミリーのメンバーとして同定する。
【０１４７】
Ｎｏｇｏは、希突起神経膠細胞によって発現されるが、シュワン細胞によっては発現されず、そして主に小胞体と結合する。Ｎｏｇｏの６６アミノ酸管腔−細胞外ドメイン（ｌｕｍｅｎａｌ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）（配列番号：２０）は、軸索伸長を阻害し、かつ脊髄神経節の成長円錐を崩壊する。他のＲｅｔｉｃｕｌｏｎタンパク質は、希突起神経膠細胞によって発現されず、また他のＲｅｔｉｃｕｌｏｎタンパク質由来の６６アミノ酸管腔−細胞外ドメインは、軸索再生を阻害しない。これらのデータは、成体ＣＮＳにおける軸索再生の失敗へのＮｏｇｏの寄与を評価するための分子基準を提供する。
【０１４８】
組換えＮｏｇｏ−Ａの発現およびタンパク精製について、全長配列（ＫＩＡＡ０８８６）は、寛大にもＫａｚｕｓａ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された。全長コード配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、そしてｐＣＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ連結し、カルボキシル末端でＭｙｃエピトープへ融合したＮｏｇｏ−Ａをコードするプラスミド（Ｎｇｏ−Ａ−Ｍｙｃ）を生成した。あるいは、最初の残基に対してすぐアミノ末端でインフレームのＭｙｃエピトープおよびカルボキシル末端で終止コドンをコードするプライマーを使用して、コード配列を増幅した（Ｍｙｃ−Ｎｇｏ−Ａ）。Ｎｏｇｏ−Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ発現ベクターおよびＲｔｎ１Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ発現ベクターを、同様の方法（成体ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをＮｏｇｏ−ＣまたはＲｔｎ１Ｃ配列に基づくプライマーを用いるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用したこと以外）で得た（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。これらのプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）法またはＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）法によって、ＣＯＳ−７またはＨＥＫ２９３Ｔへトランスフェクションした。
【０１４９】
Ｎｏｇｏ−Ａの６６アミノ酸管腔−細胞外フラグメントをコードするＮｏｇｏ−Ａの一部を、ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドへ連結し、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ融合タンパク質についての原核生物発現ベクターを生成した。Ｒｔｎ１、Ｒｔｎ２およびＲｔｎ３の類似する領域を、テンプレートとして成体ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを使用するネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＸ−２Ｔへ連結した。これらのプラスミドを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、ＩＰＴＧで誘導した。可溶性のネイティブなＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン樹脂を用いて精製し、そしてそれは約７５％のＧＳＴおよび約２５％の全長ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質またはＧＳＴ−Ｒｔｎタンパク質を含んでいた。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質の大部分は、非変性条件下からは抽出可能ではなく、ＰＢＳに対して透析された８Ｍ尿素抽出によって９８％以上の純粋なＧＳＴ−Ｎｏｇｏを含んでいた。
【０１５０】
Ｍｙｃ免疫反応性を、還元する条件下で２２５ｋＤａの範囲内の明瞭な大きさで検出し得る（データは示さない）。従って、そのｃＤＮＡは適切な電気泳動移動度を有するタンパク質の発現を示し、そしてそのアミノ酸配列はヒトＮｏｇｏ−Ａ（ｈＮｏｇｏ−Ａ）と称されるＮｏｇｏである。
【０１５１】
Ｒｔｎファミリータンパク質の保存されたカルボキシルテイルは、６６アミノ酸残基親水性セグメントによって分けられる２つの疎水性ドメインを含む。その配列のいずれもシグナルペプチドを含まない。これらのタンパク質に対して予想される位相は、細胞質ゾル中に存在するためのアミノ末端およびカルボキシ末端、ならびに脂質２重層と相互作用するための保存された領域に対するものである。Ｒｔｎ１−Ａについては、ポリペプチドが完全な膜タンパク質としてふるまうこと、および保存されたドメインの疎水性セグメントがこの性質の原因であることを実証する実験的証拠がある（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。Ｍｙｃタグ化されたＮｏｇｏはまた、特定の画分と結合し、そして界面活性剤によって抽出されるが、高イオン強度ではない（データは示さない）。
【０１５２】
腎細胞において過剰発現される場合、Ｒｔｎ１タンパク質は、微細に粒状化されたパターンで主に小胞体（ＥＲ）に局在し、それ故Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎという名称である（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。ＮｏｇｏおよびほとんどのＲｔｎタンパク質のカルボキシ末端でジ−リジン（ｄｉ−ｌｙｓｉｎｅ）ＥＲ保持モチーフが存在する（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６；Ｊａｃｋｓｏｎら、（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．９，３１５３−３１６２）。ニューロンにおいて、Ｒｔｎ１はプロセスの間中発現し、かつ成長円錐に集中している（Ｓｅｎｄｅｎら、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９６，１９７−２１３）。トランスフェクションされた腎細胞におけるその局在は、Ｒｔｎ１がタンパク質のソーティングまたはＥＲ機能の他の局面を調節し得るという示唆を導いた（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。ＮｏｇｏのＡおよびＣスプライス型の両方は、ＣＯＳ−７細胞において発現するとき、Ｒｔｎ１−Ｃの分布に類似して、網様の分布を示す。
【０１５３】
（実施例２−Ｎｏｇｏに対するポリクローナル抗体）
Ｎｏｇｏの２つの疎水性ドメインの予想される膜内位相は、これらのセグメント間の膜の６６アミノ酸残基が膜の管腔−細胞外表面に局在することを示す。このことをさらに調べるために、６６アミノ酸ドメインに対する抗血清を生成した。
【０１５４】
抗体作製および免疫組織学のために、抗−Ｍｙｃイムノブロットおよび９Ｅ１０抗体を用いた免疫組織学を、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１，４８７−４９３およびＴａｋａｈａｓｈｉら、（１９９９）Ｃｅｌｌ，９９，５９−６９に記載されるように入手した。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ融合タンパク質を免疫源として使用し、抗−Ｎｏｇｏウサギ抗血清を生成した。抗体をアフィニティー精製し、そして免疫組織学のために３μｇ／ｍｌ、そしてイムノブロットのために１μｇ／ｍｌ利用した。抗血清の特異性を評価するために、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在化で染色を行った。生きている細胞染色について、細胞を、０．０５％ＢＳＡおよび２０ｍＭ  Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）を含むハンクスバランス塩溶液中の１次抗体希釈液中で、４℃で１時間インキュベートした。固定後、結合した抗体を、蛍光標識された２次抗体とインキュベートすることによって検出した。
【０１５５】
その抗体は、このエピトープの低いレベルの表面発現を検出するが、一方発現したＮｏｇｏのカルボキシ末端でのＭｙｃエピトープは、細胞が透過化処理されない限り、検出されない。この表面染色は、ＥＲ膜よりもむしろ原形質膜に結合する少数のＮｏｇｏタンパク質に帰するものであった。このデータは、タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端が細胞質中に存在し、そしてタンパク質の６６アミノ酸がＥＲまたは原形質膜の管腔−細胞外側上に突き出ている、形態モデルを支持する。
【０１５６】
（実施例３−中枢神経系におけるＮｏｇｏ発現）
Ｎｏｇｏが、ＰＮＳミエリンと比較したときのＣＮＳミエリンの軸索成長阻害の特徴の主な一因である場合（Ｃａｒｏｎｉ＆Ｓｃｈｗａｂ、（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６，１２８１−１２８８；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１９２８３−１９２９３；Ｂｒｅｇｍａｎら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，４９８−５０１）、Ｎｏｇｏは成体ＣＮＳミエリンにおいて発現するが、ＰＮＳミエリンにおいては発現しないはずである。Ｎｏｇｏ発現のノーザンブロット分析を、ｃＤＮＡの５’Ｎｏｇｏ−Ａ／Ｂ−特異的領域由来のプローブおよび３’Ｎｏｇｏ共通領域由来のプローブを用いて、行った。成体ラットの視神経の全ＲＮＡサンプルにおいて、５’プローブを用いて約４．１キロベースの一本のバンドを検出したが、坐骨神経サンプルにおいては検出されなかった。この結果は、Ｎｏｇｏ−Ａクローンが全長のｃＤＮＡであり、そしてＮｏｇｏのＣＮＳ−ミエリン特異的な軸索成長インヒビターとしての役割と一致することを示す。３’プローブを用いたノーザンブロット分析によって、視神経が、高いレベルのＮｏｇｏ−Ａ  ｍＲＮＡならびに非常に低いレベルのＮｏｇｏ−ＢおよびＮｏｇｏ−Ｃを発現することが明らかになる。全脳は、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＮｏｇｏ−Ｃの両方を発現するが、多数の辺縁組織（座骨神経を含む）は、Ｎｏｇｏをほとんど発現しないか、または全く発現しない。Ｎｏｇｏ−Ｃ／Ｒｔｎ４−Ｃ発現は、骨格筋および脂肪細胞、ならびに脳において実証された（Ｍｏｒｒｉｓら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４５０，６８−７６）。Ｒｔｎファミリー内において、視神経発現は、Ｎｏｇｏに対して選択的（Ｒｔｎ１またはＲｔｎ３の検出可能な発現を伴わない）のようである。Ｒｔｎ２は実験されていない。
【０１５７】
インサイチュハイブリダイゼーションによって、成体ラットの視神経および錐体路における希突起神経膠細胞の形態学を用いて、細胞中のＮｏｇｏ  ｍＲＮＡを示す。脳内において、Ｎｏｇｏ発現をまた、特定の神経集団において検出する。Ｎｏｇｏと対照的に、Ｒｔｎ１およびＲｔｎ３は視神経において発現されないが、ｍＲＮＡは特定の神経集団において検出される。Ｎｏｇｏタンパク質局在を、希突起神経膠細胞の分化を誘導するためのＰＤＧＦおよび少量の血清で処理された脊髄培養物中で、抗Ｎｏｇｏ抗体および希突起神経膠細胞特異的Ｏ４モノクローナル抗体を使用して、分析した。生きている細胞中で、Ｎｏｇｏの管腔−細胞外６６アミノ酸ループおよびＯ４抗原の両方を、希突起神経膠細胞の表面上で検出する。これらの培養物中で、約半分のＯ４−陽性細胞はＮｏｇｏ表面染色を示す。
【０１５８】
（実施例４−Ｎｏｇｏ媒介性成長円錐崩壊）
細胞培養に関する全ての実験については、以下の方法を用いた。ニワトリ胚性Ｅ１０およびＥ１２の脊髄神経節（後根神経節）の移植片ならびに解離したニューロンの培養は、Ｅ７脊髄神経節（後根神経節）培養について記載される方法を利用した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１、４８７〜４９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９、５９〜６９；Ｇｏｓｈｉｍａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６、５０９〜５１４；ＪｉｎおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７、６２５６〜６２６３）。ＮＧＦ分化型ＰＣ１２細胞を、記載されるように培養した（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、２３２７〜２３３８）。胚性脊髄移植片（ラットのＥ１０またはニワトリのＥ５）を、ＰＤＧＦ−ＡＡの存在下で７〜１４日培養し、成熟希突起神経膠細胞内にいくつかの細胞の分化を誘導した（Ｖａｒｔａｎｉａｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、７３１〜７３５）。成長円錐崩壊アッセイのための手順は、Ｓｅｍａ３Ａ誘導性成長円錐崩壊の分析のための手順と同様である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１、４８７〜４９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９、５９〜６９；Ｇｏｓｈｉｍａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６、５０９〜５１４；ＪｉｎおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、６２５６〜６２６３）。全軸索成長の分析方法はまた、記載されている（Ｇｏｓｈｉｍａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６、５０９〜５１４；ＪｉｎおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、６２５６〜６２６３；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、２３２７〜２３３８）。成長アッセイにおいて、タンパク質およびペプチドを、プレート後１時間添加し、付着細胞の総数に対する任意の影響を最小限度にした。基質結合ＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｎｏｇｏの影響を試験するために、タンパク質溶液を、ガラスでコーティングされたポリ−Ｌ−リジン上で乾燥し、洗浄し、次いでラミニンでコーティングした。Ｅ１２培養については、細胞のニューロン同一性を、坑神経フィラメント抗体（２Ｈ３、Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）で染色することによって確認し、そして軸索を、プロセスにおけるＦ−アクチンのローダミン−ファロイジン染色の観察によって確認した。
【０１５９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えＮｏｇｏの発現は、このタンパク質が軸索成長を阻害する効力を有するか否かの厳密な試験を許容する。ベクター−またはｈＮｏｇｏ−Ａ−Ｍｙｃ−トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の洗浄した膜画分を、ニワトリのＥ１２脊髄神経節（後根神経節）の移植片培地に添加した。成長円錐形態学を、固定法およびローダミン−ファロイジン染色によって、３７℃で３０分間のインキュベーション後に評価した。
【０１６０】
このコントロールＨＥＫ膜は、成長円錐形態学への検出可能な影響を有さない。このＮｏｇｏ−Ａ含有膜画分は、多数の脊髄神経節（後根神経節）の成長円錐の崩壊を誘導した。この成長円錐崩壊は、軸索成長の阻害活性を示し、そして軸索伸長のＮｏｇｏ阻害はまた明らかである（以下を参照のこと）。Ｎｏｇｏ−Ｃ形成はまた、崩壊活性を示し、これは、タンパク質の共有カルボキシル末端（疎水性セグメントおよび６６個のアミノ酸の管腔−細胞外ドメインを含む）が機能的に重要な残基を含むことを示す。Ｎｏｇｏ−Ａのアミノ末端領域におけるさらなる阻害性活性を、これらの研究によって排除しない。Ｅ１０ニワトリ胚由来の、またはＥ１５ラット胎児（データを示さない）由来のさらに未成体な移植片培養の感受性は、実質的にはほとんどない。感受性の発生的な調節は、部分的に精製されたＮｏｇｏを用いた実験に一致する（Ｂａｎｄｔｌｏｗら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９、２７４３〜２７５２）。
【０１６１】
成長円錐崩壊のＮｏｇｏ−Ｃタンパク質内において、親水性の６６個の管腔−細胞外ドメインは、膜包埋した疎水性ドメインと相互作用するよりも、脊髄神経節（後根神経節）ニューロンの表面とより相互作用しそうに見える。この仮説を試験するために、ｈＮｏｇｏの６６個のアミノ酸領域を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＥ．ｃｏｌｉから精製した。多数のＧＳＴ−Ｎｏｇｏ融合タンパク質は、封入体に蓄積するが、尿素抽出によって回収され得る。Ｎｏｇｏの制限領域は、ニワトリのＥ１２脊髄神経節（後根神経節）ニューロン（データを示さない）についての強力な（ＥＣ５０＝５０ｎＭ）成長円錐の崩壊活性を有する。尿素抽出タンパク質の調製物は、活性な立体配座におけるＮｏｇｏ配列の小さな画分のみを示し得る。従って、Ｅ．ｃｏｌｉに可溶な１０％のＧＳＴ−Ｎｏｇｏを、グルタチオン−セファロース樹脂を用いて精製した。この調製物は、崩壊因子として、尿素抽出タンパク質よりもさらに強力であり、１ｎＭほどの低い濃度において成長円錐形態学を急性的に変化させる。
【０１６２】
ナノモルの力価は、軸索誘導の最も公知な生理学的制御因子と同様である。脊髄神経節（後根神経節）ニューロンおよびＮＧＦ分化型ＰＣ１２細胞由来の軸索成長をまた、ｎＭ濃度におけるこの可溶性ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質によってブロックする（データを示さない）。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏを、基質表面に結合する場合、脊髄神経節（後根神経節）ニューロンまたはＰＣ１２細胞由来の軸索の成長を、検出不可能なレベルまで減少する。これらは、細胞生存よりもむしろ軸索成長に対する選択的な影響である。なぜなら、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏは、神経フィラメントの積極的癒着性細胞（１３７±２４％のＧＳＴ処理された培地）の数を減少しないか、またはＤＡＰＩ染色（コントロール培地に４．０±１．７％およびＧＳＴ−Ｎｏｇｏ処理された標本に５．２±１．１％）によって同定されたアポトーシスのコアの数を有意に変化しないからである。
【０１６３】
希突起神経膠細胞は、Ｒｔｎタンパク質のなかでも、Ｎｏｇｏを選択的に発現することが明らかである。軸索再生の阻害におけるＮｏｇｏの役割の選択性を調査するために、他のＲｔｎタンパク質の軸索成長の阻害活性を考慮した。Ｒｔｎ１、Ｒｔｎ２およびＲｔｎ３の予測される管腔−細胞外の６６個のアミノ酸フラグメントはＧＴＳ融合タンパク質として発現され、そしてそれを、ネイティブ形態において精製した。このＮｏｇｏフラグメントが、主要なＥ１２脊髄神経節（後根神経節）の成長円錐を崩壊する濃度において、他のＲｔｎタンパク質は成長円錐形態学を変化しない（データを示さない）。従って、この軸索再生の阻害活性は、ＲｔｎファミリーにおけるＮｏｇｏについて特異的である。
【０１６４】
（実施例５−Ｎｏｇｏレセプターペプチド因子）
Ｎｏｇｏの活性ドメインをさらに規定するために、６６個のアミノ酸配列のセグメントに対応する２５個のアミノ酸残基ペプチドを合成した。Ｎｏｇｏの細胞外フラグメントの残基の３１〜５５個に対応するペプチドは、成長円錐崩壊を示し（図２）、そして４μＭの濃度において成長阻害活性を示す（データを示さない）。この配列は、阻害性ドメインのコアを提供し得るが、６６個のアミノ酸フラグメントを完全な力価のために明らかに必要とする。興味深いことに、これは、他のＲｔｎタンパク質とほとんど類似性を共有していない６６個のアミノ酸ドメインの範囲内であり、軸索再生のインヒビターとして不活性である他のファミリーメンバーと一致する。実際には、Ｒｔｎ１の３１〜３５個のアミノ酸管腔−細胞外ペプチドは、成長円錐崩壊活性を与えない（データを示さない）。
【０１６５】
上述の実験データは、Ｒｔｎファミリーの希突起神経膠細胞の特異性メンバーとしてＮｏｇｏを同定し、そしてＮｏｇｏの個々のドメインが軸索成長を阻害し得ることを実証する。他のＲｔｎタンパク質は、この活性を持たない。従って、シュヴァン細胞ではなく希突起神経膠細胞におけるＮｏｇｏの発現は、成体ＰＮＳと比較されるような成体哺乳類のＣＮＳにおいて軸索再生の低下の一因となる。ＣＮＳ白質の非許容性本質に対する他のＣＮＳミエリン成分と比較した、Ｎｏｇｏの相対的な寄与を、分子レベルで特徴づけ得る。
【０１６６】
正確な実験データは、病理的損傷の後に、成体ＣＮＳ軸索再生をブロックするＮｏｇｏの役割と一致しているが、これはまた、非病理的状態におけるＮｏｇｏの生理学的役割と関連し得る。局在的研究に基づいて、他のＲｔｎタンパク質は、ＥＲ機能において役割を果たすと考えられる（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｌｄｅら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７、２４０３〜２４１６）。大多数のＮｏｇｏを、ＣＯＳ−７細胞中に網状様式において分配し、そして小数のＮｏｇｏのみが、細胞表面において接近可能であるようである。
【０１６７】
（実施例６−Ｎｏｇｏ活性の阻害）
前記の例は、Ｎｏｇｏのカルボキシル末端に近位の６６個のアミノ酸領域が、軸索成長を阻害し、そして細胞表面において発現されることを示している。このドメインのより短い２５個のアミノ酸セグメントは、成長インヒビターのためか、またはより低い力価のインヒビターのためのいずれかのために不活性である（ＧｒａｎｄＰｒｅら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３、４３９〜４４４）。この６６個のアミノ酸セグメント由来の３１〜５５個の領域は、弱い成長円錐崩壊および軸索成長の阻害活性を有する。インビボでＮｏｇｏの活性をブロックするために、同じレセプター部位に結合するが、それ自体の右の部位においては生物学的効果を及ぼさないＮｏｇｏの競合的なアンタゴニストが大いに望まれる。６６個のアミノ酸領域の種々のフラグメントを、Ｎｏｇｏ媒介性軸索成長阻害のブロッカーとして試験した。この目的のために２つのアッセイを用いた。１つ目は、成長円錐崩壊アッセイであり、２つ目は、結合アッセイである。
【０１６８】
成長円錐崩壊アッセイにおいて、Ｎｏｇｏに対する応答を、種々の強力な拮抗性ペプチドの存在下で測定した。６６個のアミノ酸領域由来の２５個のアミノ酸ペプチドのうち３個（１〜２５、１１〜３５および２１〜４５）は、μＭ濃度においてブロッキング活性を有する（図２）。３個のペプチド全ての組み合わせは、基底条件下で成長円錐形態学を変化しないが、１５ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏによる崩壊を、全面的に防止する。ペプチドの同じ混合物はまた、低い用量のＣＮＳミエリン誘導性成長円錐崩壊をブロッキングし得る。この妨害は、ＮｏｇｏがＣＮＳミエリンの主要なインヒビター成分であるという仮説を支持する。さらに、この妨害は、競合性アンタゴニストについて予期される特性を有し、この特性は、ＣＮＳミエリンの高い用量において無効性である。
【０１６９】
より高い特異性および力価を有するアンタゴニストを開発するために、Ｎｏｇｏのより長いフラグメントを試験した。優先的に、このようなペプチド自体は、それ自体における軸索成長の阻害活性を有さないが、競合的にＮｏｇｏの作用をブロックする。Ｎｏｇｏの２〜４１のフラグメントを、カルボキシ末端においてアセチル化し、そしてアミノ末端においてアミド化し、そしてこのフラグメントは、データに規定されるＮｏｇｏの最も有効なブロッカーである。Ｐｅｐ２〜４１は、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ誘導性成長円錐崩壊を破壊し、そして結合アッセイにおいて、１５０ｎＭの見かけのＫｉを有する（図３）。この２〜４１個のフラグメントはまた、精製されたＮｏｇｏ−６６タンパク質および粗ＣＮＳミエリンの両方が、培養されたニューロンにおいて軸索成長を阻害する能力をブロックする（図４）。
【０１７０】
（実施例７−Ｎｏｇｏレセプターの同定）
Ｎｏｇｏ結合アッセイを発展する。この方法は、セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）およびエホリン（ｅｐｈｒｉｎ）の軸索誘導機能を試験する際に広く使用される方法を利用する（ＦｌａｎａｇａｎおよびＶａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、３０９〜３４５；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９、５９〜６９）。これは、非常に感応な比色定量アッセイを用いて検出され得る、生物学的に活性なレセプター結合因子を供給するために、該当のリガンドに、分泌した胎盤のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）部分を融合することに関与する。Ｎｏｇｏについては、発現ベクターが単一ペプチド、精製のためのＨｉｓ６タグ、ＡＰおよびＮｏｇｏの６６個のアミノ酸活性ドメインのコードを引き起こした。この融合タンパク質を、ミリグラム量においてトランスフェクトした細胞の馴化培地から精製し得る（図５）。このタンパク質は、１ｎＭのＥＣ５０を有する、成長円錐崩壊の因子として生物学的に活性である。ＡＰ−Ｎｏｇｏは、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏよりも実際にはわずかにより強力であり、これはおそらく、このタンパク質が、原核生物細胞よりもむしろ真核生物細胞において合成されるためである。初期の研究は、軸索に対して過飽和な、高い親和性部位を明らかにした。結合を、ニューロンのレセプター部位との競合的な結合に一致する、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏおよび拮抗性の２５個のアミノ酸ペプチドによってブロックする。これらの部位についての見かけのＫｄ（３ｎＭ）は、崩壊アッセイにおけるＡＰ−ＮｏｇｏのＥＣ５０に近位なので、この部位は、おそらく生理学的に関連したＮｏｇｏレセプターである。
【０１７１】
このアッセイを、Ｎｏｇｏレセプターのクローニングの発現のために利用した。２５０，０００個の独立したクローンを表す、マウス成体脳のｃＤＮＡ発現ライブラリーのプールを、非ニューロンのＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞は、ＡＰ−Ｎｏｇｏを結合しないが、５，０００個のクローンの２つのプールを用いたトランスフェクションは、強いＡＰ−Ｎｏｇｏ結合を有するわずかの細胞を示した。Ｎｏｇｏ結合部位をコードする単一ｃＤＮＡクローンを、２つの陽性プールの各々からの同胞選択によって単離した。この２つの独立的に単離したクローンは、一方のクローンにおける５’の非翻訳領域の１００ｂｐの伸長を除いて、互いに同一である。ＣＯＳ−７細胞へのこれらのクローンのトランスフェクションは、Ｅ１３脊髄神経節（後根神経節）ニューロンにおいて観察された親和力と同一の、ＡＰ−Ｎｏｇｏについての親和力を有する結合部位を生じる；結合のためのＫｄは、約３ｎＭである（図６）。ＡＰ単独は、これらのトランスフェクトした細胞に対して、任意の検出可能な親和力を有して結合せず、これは、親和力がＮｏｇｏに由来する６６個のアミノ酸に起因することを示す。さらに、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏは、これらの部位からＡＰ−Ｎｏｇｏを置換する。
【０１７２】
このｃＤＮＡは新規の４７３のアミノ酸タンパク質をコードする。ＧｅｎＢａｎｋにおいて、有意な相同性を有するｃＤＮＡは報告されていない。予測されるタンパク質は、単一ペプチド、その後８つのロイシンの豊富な反復領域、特異性ドメインおよび予測されるＧＰＩ固定部位を含む（図７）。８９％アミノ酸同一性を共有する、マウスｃＤＮＡのヒト相同体を同定した。このｃＤＮＡの存在をマウスｃＤＮＡ構造体およびＨｕｍａｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔの一部であるＧｅｎＢａｎｋにおいて堆積されるヒトゲノム配列の分析から予測した。ヒトｃＤＮＡの軸索は、３５キロベースにわたって分配され、そしてｃＤＮＡは、ゲノム配列において明らかに認識されなかった。このタンパク質構造体は、Ｎｏｇｏの結合可能な細胞表面タンパク質と一致する。このタンパク質のＧＰＩ連結の本質は、原形質膜にまたがり、そしてＮｏｇｏ単一形質導入を媒介する、第二レセプターサブユニットであり得ることを示唆する。
【０１７３】
（実施例８  Ｎｏｇｏレセプターの組織分布）
このＮｏｇｏレセプターについてのｍＲＮＡの分布は、成人のＣＮＳにおける軸索再生および軸索可塑性を調節におけるタンパク質の役割と一致する。ノザン分析は、成人の脳において２．３ｋｂの単一バンドを示し、単離されたＮｏｇｏレセプタークローンが全長であることを示す（図８）。このｍＲＮＡの低いレベルは、心臓および腎臓において観察されるが、他の末梢組織においては観察されない。脳において、発現は、広範でありそして灰白質に最も富んだ領域は、このｍＲＮＡを最も高いレベルで発現する。
【０１７４】
（実施例９  異なるＮｏｇｏドメインの生物学的影響）
Ｎｏｇｏ−Ａ機能のアッセイは、基質は結合した可溶性タンパク質調製物を用いる成長円錐の崩壊、神経突起の成長、および繊維芽細胞の拡散を含む（Ｃａｒｏｎｉ＆Ｓｃｈｗａｂ，（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６，１２８１〜１２８８；ＧｒａｎｄＰｒｅら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３９〜４４４；Ｃｈｅｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３４〜４３９；Ｐｒｉｎｊｈａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４８３〜４８４）。３Ｔ３繊維芽細胞の形態学的アッセイにおいて、基質に結合したＮｏｇｏ−６６は、拡散を阻害しない（図１ｂ、ｅ）。ＮＩ２５０調製物および全長のＮｏｇｏ−Ａが３Ｔ３の拡散に許容的でないので、Ｎｏｇｏの異なるドメインがこのインビトロ活性を促進し得るか否かを考慮する必要があった。異なるＮｏｇｏ−Ａドメインの比較を促進するために、この酸性アミノ末端１０４０アミノ酸フラグメント（アミノ−Ｎｏｇｏ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭｙｃ−ｈｉｓ標識タンパク質として発現した（図１ｄ）。Ｎｏｇｏタンパク質は、細胞質内画分に存在する。精製されたアミノ−Ｎｏｇｏタンパク質を用いてコートされた表面は、３Ｔ３繊維芽細胞の拡散を支持しない（図１ｂ、ｅ）。同様の結果が腎臓由来細胞株であるＣＯＳ−７について観察された（図１ｆ）。したがって、アミノ末端ドメインは、繊維芽細胞上の全長Ｎｏｇｏ−Ａの影響の原因となるようである。Ｎｏｇｏ−６６ドメインは、ニューロンに特異的である；これは、非ニューロン細胞に影響しない。
【０１７５】
脊髄神経節培養をまた、アミノ−Ｎｏｇｏタンパク質に曝した（図１ｃ、ｇ〜ｉ）。３Ｔ３繊維芽細胞に関しては、脊髄神経節培養中の繊維芽細胞様細胞は、この基質上に拡散しない。さらに軸索の成長は、アミノ−Ｎｏｇｏコートされた表面上で低レベルに減じられる。したがって、Ｎｏｇｏ−６６の影響が神経特異的でる一方、アミノ−Ｎｏｇｏドメインの阻害作用はより全身的である。以前に記載されるように、１００ｎＭにおいて可溶性形態で存在する場合、Ｎｏｇｏ−６６ポリペプチドは、ニワトリのＥ１２脊髄神経節の成長円錐を崩壊し、そして軸索の伸展をほぼ消滅させる（ＧｒａｎｄＰｒｅら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３９〜４４４）。著しく対照的に、可溶性アミノＮｏｇｏタンパク質は、非活性のようであり、そして脊髄神経節の成長円錐の形態または脊髄神経節の軸索伸展または非ニューロン細胞の拡散を有意に調節しない（図１ｃ、ｇ〜ｉ）。
【０１７６】
Ｗａｌｓｈおよび同僚の実験において（Ｐｒｉｎｊｈａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４８３〜４８４）、小脳顆粒ニューロンが研究され、そして可溶性ＮｏｇｏがＦｃ融合タンパク質（おそらく２量体の形態で）として提示された。したがって、これらの相違が可溶性アミノＮｏｇｏの非活性を説明し得るか否かを考慮する必要があった。Ｎｏｇｏ調製物に応答するマウスＰ４小脳顆粒ニューロンは、ニワトリＥ１３脊髄神経節ニューロンと識別不能な様式である（図１ｉ）。抗Ｍｙｃ抗体と２量体化したアミノ−Ｎｏｇｏは、３Ｔ３およびＣＯＳ−７の拡散を阻害し（図１ｅ、ｆ）、そして小脳の軸索成長を減ずる傾向がある（図１ｉ）。抗マウスＩｇＧ抗体の添加によってさらに凝集する場合、アミノ−Ｎｏｇｏは、脊髄神経節および小脳軸索の成長の両方を有意に減ずる（図１ｈ、ｉ）。アミノ−Ｎｏｇｏタンパク質がかなり酸性であるのに対し、静電的荷電のみでは、その阻害効果を説明しない。なぜならポリ−Ａｓｐは、細胞の拡散または軸索の成長を変化させないからである（図１ｅ、ｆ、ｈ）。したがって、Ｎｏｇｏ−６６ドメインは、強力なニューロン特異的阻害剤であるが、細胞内アミノ−Ｎｏｇｏドメインは、複数の細胞型を阻害し、そして凝集した状態においてのみ機能するようである。
【０１７７】
（実施例１０  Ｎｏｇｏレセプターの局在）
Ｎｏｇｏ‐６６レセプタータンパク質の発現をさらに特徴付けるために、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質に対する抗血清を開発した。この抗血清は、Ｎｏｇｏ−６６レセプターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において８５ｋＤａタンパク質を選択的に検出し（図９ａ）、Ｎｏｇｏ−６６レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞を特異的に染色する（図９ｂ）。ニワトリの胚の脊髄の培養物の免疫組織学的染色は、そのタンパク質を軸索に局在させ、これは、Ｎｏｇｏ−６６に誘導される軸索が成長阻害を媒介することと一致する。Ｎｏｇｏ−６６レセプター発現は、Ｎｏｇｏ−６６を発現するＯ４陽性希突起神経膠細胞において見出されない。免疫応答性８５ｋＤａタンパク質は、ニワトリＥ１３脊髄神経節由来のＮｏｇｏ−６６応答性ニューロン調製物において発現されるが、ニワトリＥ７脊髄神経節およびニワトリＥ７網膜由来の弱い応答性の組織においては非常に少ない程度発現される（図９ａ）。全体的に、Ｎｏｇｏ−６６発現パターンは、Ｎｏｇｏ−６６軸索阻害を媒介するタンパク質と一致する。
【０１７８】
この抗体はまた、組織切片におけるＮｏｇｏ−６６レセプタータンパク質の局在を決定することにおいて有効である（図９ｃ）。このタンパク質が複数の分類のニューロンにおいて発現されることが、インサイチュハイブリダイゼーション研究から明らかである一方、免疫組織学は、軸索に一致するプロフィールにおいてＣＮＳの白質におけるこのタンパク質の高レベルを明らかにする。タンパク質は、神経細胞体および神経網においてより低いレベルで検出可能である。これは、希突起神経膠細胞との相互作用を媒介するこのタンパク質の仮説された機能をさらに支持する。
【０１７９】
（実施例１１  Ｎｏｇｏレセプターは、Ｎｏｇｏ−６６応答を媒介する）
Ｎｏｇｏ−６６レセプタータンパク質は、Ｎｏｇｏ−６６の作用のために必要であり、そして軸索の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）の阻害に関連しない機能を有する、単なる結合部位ではない。第１の予測は、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質をニューロン表面からのぞくためのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）処置が、ニューロンにＮｏｇｏ−６６感受性を与えることである。この予測は、ニワトリＥ１３の脊髄神経節ニューロンについては、正しい；ＰＩ−ＰＬＣ処置は、ＡＰ−Ｎｏｇｏ結合およびＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６で誘導された成長円錐の崩壊の両方を無効にする（図１０ａ〜ｃ）。コントロールとして、並行の培養物におけるＳｅｍａ３Ａ応答は、ＰＩ−ＰＬＣ処置によって変らない。当然、ＰＩ−ＰＬＣ処置は、軸索の表面から多くのタンパク質を除くことが予測されることから、この結果は、この結果、他のＧＰＩ結合タンパク質が、未処置の培養物においてＮｏｇｏ−６６応答を媒介する可能性は議論されないままである。
【０１８０】
Ｎｏｇｏ−６６レセプターがＮｏｇｏ−６６媒介を介する軸索成長の阻害をいえることを示すために、このタンパク質を、Ｎｏｇｏ−６６応答を欠くニューロン中に発現させた。Ｅ７ニワトリ胚由来の脊髄神経節および網膜のニューロンの両方を試験した。発育段階からの脊髄神経節ニューロンにおけるＮｏｇｏ応答は、弱いが、わずかな応答が、いくつかの培養物において検出され得る（データは示していない）。Ｅ７網膜神経節細胞成長円錐は、Ｎｏｇｏ−６６誘導性成長円錐の崩壊に対して均一に非感受性であり（図１０ｅ）、ＡＰ−Ｎｏｇｏを結合せず（データは示していない）、８５ｋＤａの抗Ｎｏｇｏ−６６レセプター免疫応答性タンパク質を提示しない（図９ａ）。組換えＨＳＶ調製物での感染による、これらのニューロンにおけるＮｇＲの発現は、網膜神経節細胞成長円錐をＮｏｇｏ−６６で誘導された崩壊に対して感受性にする。コントロールＰｌｅｘｉｎＡ１を発現するコントロールＨＳＶ調製物での感染は、Ｎｏｇｏ応答を変化しない。まとめると、これらのデータは、本明細書において同定されたＮｏｇｏレセプターは、Ｎｏｇｏ−６６の軸索再生阻害に関与することを示す。
【０１８１】
（実施例１２  Ｎｏｇｏ−６６レセプターの構造分析）
Ｎｏｇｏ−６６レセプター構造を、この領域がＮｏｇｏ−６６結合を媒介するかを決定するために調べた。このタンパク質を、ロイシンリッチリピート領域および非ロイシンリッチリピート領域に単純に分ける。欠失分析は、ロイシンリッチリピートがＮｏｇｏ−６６結合に必要であるが、タンパク質のその残りは必要でないことを明確に示す（図１１）。ロイシンリッチリピートドメイン内で、２つのドメインを別個に欠失させた。これは、ロイシンリッチリピートドメイン構造全体が維持されることが予測され、そして同様のアプローチがロイトロピン（ｌｅｕｔｒｏｐｉｎ）レセプターについて利用した。Ｎｏｇｏ−６６結合が全ての８つのロイシンリッチリピートを必要とすることが明らかであり、そして平面の表面の重要なセグメントがロイシンリッチリピートの線状のβシートによって生じることを示唆する。ロイシンリッチリピートの各末端での、保存されたロイシンリッチリピートのアミノ末端およびロイシンリッチリピートのカルボキシ末端にシステインリッチ領域もまた、Ｎｏｇｏ−６６の結合に必要であり、恐らくこれらは、適切なロイシンリッチリピートの高次構造を生じるための必要である。
【０１８２】
（実施例１３  可溶性Ｎｏｇｏレセプター外部ドメインタンパク質のよるＮｏｇｏの阻害）
Ｎｏｇｏ−レセプターへのＮｏｇｏ−６６結合によって開始されるシグナル伝達カスケードを阻害する１つの方法は、このレセプターの可溶性の外部ドメインを過剰に提供することである。Ｎｏｇｏレセプタータンパク質の分泌されたフラグメントは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生される。マウスＮｏｇｏレセプターのアミノ酸残基１〜３４８をコードするｃＤＮＡを真核生物細胞発現ベクター中に連結し、そしてこのＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。これらの細胞由来の馴化培地は、抗ＮｇＲ抗体を用いたイムノブロットによって示されるように、高レベルのこのＮｏｇｏレセプターフラグメントを含む（ＮｇＲ−ｅｃｔｏ）。馴化培地は、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質を約１ｍｇ／Ｌを含む。全長Ｎｏｇｏレセプタータンパク質を発現するＣＯＳ−７細胞または脊髄神経節ニューロンに対するＡＰ−Ｎｏｇｏ結合アッセイにおいて、ＮｇＲ−ｅｃｔｏ馴化培地の添加は、０．５ｎＭ  ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６の結合を８０％減じた。可溶性ＮｇＲ−ｅｃｔｏとＮｏｇｏ−６６との間の複合体は、細胞表面レセプターへの結合を妨げる。いくつかのレセプター系について、このような可溶性レセプターリガンド複合体は、有効でない相互作用を生じることによってシグナル伝達を阻害し得る。例えば、Ｔｒｋの可溶性外部ドメインは、ニューロトロフィンのシグナル伝達を阻害する役目をし、そしてこの目的のために広範に用いられる（Ｓｈｅｌｔｏｎら，（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，４７７〜４９１）。あるいは、Ｎｏｇｏ−６６／ＮｇＲ−ｅｃｔｏの可溶性複合体は、Ｎｏｇｏレセプターの推定上の第２の膜貫通サブユニットに結合し得、そして刺激し得る。ＧＤＮＦファミリーレセプターの研究からこの型の影響については、先行するものがある（Ｃａｃａｌａｎｏら，（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，５３〜６２）。Ｎｏｇｏ−６６／ＮｇＲ−ｅｃｔｏ複合体は、これらのニューロン（ニワトリＥ７網膜神経節細胞）（Ｎｏｇｏ−６６レセプターを欠損するが、Ｎｏｇｏシグナル伝達経路の他の構成要素を含む）において成長円錐の崩壊の原因とならない。このことは、Ｎｏｇｏ−６６シグナル伝達の阻害剤としてＮｇＲ−ｅｃｔｏが機能することを示す。
【０１８３】
直接の試験において、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質は、Ｎｏｇｏ−６６の阻害効果から軸索を保護する。ＮｇＲ−ｅｃｔｏは、Ｎｏｇｏ−６６に誘導される成長円錐の崩壊を妨げ、そしてＮｏｇｏ−６６に誘導される、ニワトリＥ１３  ＤＲＧニューロン由来の軸索成長の阻害をブロックする（図１２）。さらに、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質の存在は、インビトロにおける軸索の成長を阻害するＣＮＳミエリンの能力を阻害する（図１２）。これらのデータは、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質が、インビボにおいて軸索の再生を促進することを示す。
【０１８４】
本発明は、上に記載する実施例を参考にして、詳細に記載されるが、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、上の特許請求の範囲のみによって限定される。本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、本明細書において、その全体が参考として援用される。本明細書において開示される実験に関する部分の結果は、本願が優先権を主張する米国仮特許出願６０／１７５，７０７の出願日の後に公開された（ＧｒａｎｄＰｒｅ’ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０３，４３９〜４４４）。この刊行物は、本明細書において、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｎｏｇｏドメインの比較を示す。図１ａは、本研究において、用いられるＮｏｇｏタンパク質の形態を説明する概略図である。図１ｂは、アミノ−Ｎａｇｏでか、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６でか、またはタンパク質無しでコートされた表面上で培養されて糸状アクチンを染色したＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞の写真である（スケールバー、４０μｍ）。図１ｃは、アミノ−Ｎａｇｏ、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６、またはタンパク質無しでコートされた（基板結合）表面上でか、あるいは１００ｎＭのＮｏｇｏタンパク質（可溶性）とともに培養されたニワトリＥ１２後根神経節の写真である（スケールバー、４０μｍ）。図１ｄは、ゲルおよびイムノブロットの写真であり、ここでは、精製したアミノ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらして、クマシーブリリアントブルー（ＣＣＢ）を用いて染色するか、または抗Ｍｙｃ抗体（Ｍｙｃ）（左にあるのが、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７ｋＤａ、６５ｋＤａ＆４５ｋＤａの分子量マーカーである）を用いてイムノブロットした。図１ｅは、実験データを表示したグラフであり、ここでは、１２００μｍ２（拡張）よりも大きい面積を有する３Ｔ３線維芽細胞のパーセンテージを、Ｎｏｇｏコートした表面（黒）上でかまたは１００ｎＭの可溶性Ｎｏｇｏ調製物（青）を用いた図１ｂのような実験から測定した（ＡＭはアミノ−Ｎｏｇｏ；ＡＭ＋Ｍｙｃは抗Ｍｙｃ抗体とともにプレインキュベートしたアミノ−Ｎｏｇｏ；ＡＭ＋Ｍｙｃ＋Ｍｏは抗マウスＩｇＧ抗体とともにプレインキュベートしたＡＭ＋Ｍｙｃ；Ｍｙｃ＋Ｍｏは抗Ｍｙｃ抗体プラス抗マウスＩｇＧ抗体）。図１ｆは、実験データを表示したグラフであり、ここでは、拡張したＣＯＳ７細胞のパーセンテージを、Ｎｏｇｏコートした表面上でかまたは１００ｎＭの可溶性Ｎｏｇｏ調製物とともに培養した後に測定した。図１ｇは、実験データを表示したグラフであり、ここでは、成長円錐の形態学におけるＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６またはアミノ−Ｎｏｇｏの精製した調製物の作用を、３０分後の指示された濃度でのＥ１２後根神経節培養において評価した。これは、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６がこのアッセイにおいてアミノ−Ｎｏｇｏよりも２倍強力であることを実証する。図１ｈは、実験データを表示したグラフであり、ここでは、Ｅ１３後根神経節培養における細胞あたりの神経突起伸長を、Ｎｏｇｏコートした表面上でかまたは１００ｎＭの可溶性Ｎｏｇｏ調製物を用いた図１ｃのような実験から定量した。図１ｉは、実験データを表示したグラフであり、ここでは、小脳顆粒神経の神経突起伸長におけるＮｏｇｏ調製物の作用を測定した。
【図２】  図２は、ＮｏｇｏおよびＣＮＳミエリン作用に拮抗するＮｏｇｏフラグメントを示す。図２Ａは、培養されたニワトリＥ１２後根神経節外植片および図４において記載されるように評価した成長円錐衰退の写真である。培養物を、固定化してローダミン−ファロイジンを用いて染色する前に３０分間、以下の調製に曝露した：緩衝液のみ（コントロール）；１５ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏ（Ｎｏｇｏ）；１μＭのそれぞれのＰｅｐ１、Ｐｅｐ２、およびＰｅｐ３（Ｐｅｐ）；１５ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏプラス１μＭのそれぞれのＰｅｐ１、Ｐｅｐ２、およびＰｅｐ３（Ｎｏｇｏ＋Ｐｅｐ）。ここで留意すべき点は、Ｎｏｇｏによる成長円錐衰退がペプチド添加によって阻害されることである。Ｐｅｐ１は１〜２５残基の細胞外ドメイン；Ｐｅｐ２は１１〜３５残基；およびＰｅｐ３は２１〜４５残基。図２Ｂは、図２Ａにおけるような成長円錐衰退アッセイからの結果を定量したグラフである。個々のペプチドを、４μＭで含み、そしてこれらのペプチド１〜３の混合物は、１μＭの各ペプチドであった。ＣＮＳミエリンを、記載されるように調製し、そして示した総ミエリンタンパク質濃度を、培養物中に含んだ。全ての結果は、４回〜７回の定量から算出された平均±標準誤差である。これらの値は、同じ濃度のＮｏｇｏまたはミエリンを用いた対応する値とはペプチド非存在下を除いて顕著に異なる（＊はｐ＜０．００５（スチューデント両側ｔ検定））。
【図３】  図３は、ＮｏｇｏアンタゴニストＰｅｐ２−４１を示す。図３Ａは、ニワトリＥ１２後根神経節の成長円錐衰退アッセイの結果を表示したグラフである。これらのアッセイを実施して、ＧｒａｎｄＰｒｅら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４３９−４４４のように定量した。アッセイを、無添加（コントロール）、１５ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏ（Ｎｏｇｏ）、または１５ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏプラス１μＭのＰｅｐ２−４１（Ｎｏｇｏ＋Ｐｅｐ）を用いて行った。これらの値は、４回の定量から算出された平均±標準誤差である。図３Ｂは、結合実験の結果を表示したグラフであり、ここでは、ニワトリＥ１２後根神経節のニューロンへの１０ｎＭのＡＰ−Ｎｏｇｏの結合を、示した濃度のＰｅｐ２−４１の添加を用いて、図４において示されるように測定した。
【図４】  図４は、神経突起伸長のＮｏｇｏ＆ＣＮＳミエリン阻害を両方とも抑制するＮｏｇｏ  Ｐｅｐ２−４１を示す。この図は、伸長アッセイの結果を示すグラフであり、ここでは、ニューロンを、示した濃度のＰｅｐ２−４１、精製したＧＳＴ−Ｎｏｇｏ（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６）タンパク質および粗ＣＮＳミエリンタンパク質の存在下で培養した。ニワトリＥ１３後根神経節のニューロンを標準条件下で培養した。伸長アッセイについて、ニューロンを、示した濃度のＰｅｐ２−４１、精製したＧＳＴ−Ｎｏｇｏ（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６）タンパク質および粗ＣＮＳミエリンタンパク質の存在下で培養した。これは、Ｐｅｐ２−４１がＧＳＴ−Ｎｏｇｏまたは総ＣＮＳミエリンのいずれかによって神経突起伸長の阻害を覆し得ることを実証する。
【図５】  図５は、軸索のＮｏｇｏレセプターについてのリガンド結合アッセイを示す。図５Ａは、ゲルの写真およびイムノブロットであり、ここでは、Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｎｏｇｏ（６６個のアミノ酸）タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させてＨｉｓタグを介してニッケル含有樹脂における調製した培地から精製した。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらして、ＣＢＢを用いて総タンパク質について染色するかまたは抗Ｎｏｇｏ抗体（抗Ｎｏｇｏ）を用いてイムノブロットした。左側に、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７ｋＤａ、６５ｋＤａ、および４５ｋＤａの分子量マーカーを示し、そして右側に、ＡＰ−Ｎｏｇｏの移動を示す。図５Ｂは、２３℃にて６０分間、１０ｎＭのＡＰ−Ｎｏｇｏまたは１０ｎＭのＡＰ−Ｎｏｇｏ＋１６０ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏとともにインキュベートした解離性ニワトリＥ１２後根神経節ニューロンの写真である。内因性ＡＰを不活化するために、これらの細胞を洗浄して固定し、そして６０℃にてインキュベートした。結合したＡＰ−Ｎｏｇｏは、ニトロブルーテラゾリウムを用いたインキュベーションによって検出された。ここで留意すべき点は、未標識リガンドによって示されるＡＰ−Ｎｏｇｏによる強力なニューロンの染色である。図５Ｃは、実験データを表示したグラフであり、ここで、Ｅ１２ニワトリ後根神経節の成長円錐衰退アッセイにおけるＡＰ−ＮｏｇｏおよびＧＳＴ−Ｎｏｇｏの作用強度を実施例の節において記載されるように評価した。ＡＰ−ＮｏｇｏのＥＣ５０は、１ｎＭ以下になることを測定した。５回〜８回の測定から算出された平均±標準誤差を例証した。図５Ｄは、実験データを表示したグラフであり、ここで、１０ｎＭのＡＰ−ＮｏｇｏのニワトリＥ１２後根神経節ニューロンに対する結合を、単独、または１００ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏの存在下もしくは４μＭのＰｅｐ２の存在下において評価し、この結合を、実施例の節において記載される方法によって図５Ｂのような実験から定量した。８回の測定から算出した平均±標準偏差を示す。図５Ｅは、実験データを表示したグラフであり、ここで、後根神経節ニューロンに対するＡＰ−Ｎｏｇｏｎの結合を、ＡＰ−Ｎｏｇｏ濃度の機能として測定した。これは、類似結果を伴う６回の実験のうちの１回である。図５Ｆは、スキャッチャード分析のために図５Ｅを再プロットしたデータを要約したグラフである。Ｅ１２ニワトリ後根神経節ニューロンに結合するＡＰ−Ｎｏｇｏについての見かけのＫｄは、３ｎＭである。
【図６】  図６は、Ｎｏｇｏレセプターを発現するＣＯＳ−７に対して結合するＮｏｇｏを示す。この図は、マウスＮｏｇｏレセプターをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の写真である。トランスフェクションの２日後、ＡＰ−ＮｏｇｏまたはＡＰの結合を、実施例の節において記載されるように、後根神経節ニューロンについて評価した。ここで留意すべき点は、ＡＰ−ＮｏｇｏのＮｏｇｏレセプター発現細胞に対する選択的結合である。結合は、ＡＰと融合していない過剰なＮｏｇｏペプチドの存在下で非常に減少する。
【図７】  図７は、Ｎｏｇｏレセプターの構造を示す。この模式図は、Ｎｏｇｏレセプターの主な構造上の特徴を示す。
【図８】  図８は、ＮｏｇｏレセプターｍＲＮＡの分布を示す。この図は、左の示されたマウス組織からのポリＡ＋ＲＮＡサンプルについてのＮｏｇｏレセプターｍＲＮＡのノーザンブロットの写真、および右の種々のラットの脳の領域からの総ＲＮＡサンプルについてのＮｏｇｏレセプターｍＲＮＡのノーザンブロットの写真である。ＲＮＡサイズマーカーの移動は、左に示される。
【図９】  図９は、Ｎｏｇｏ−６６レセプターの免疫組織学を示す。（ａ）は、示された細胞またはニワトリ組織からの膜分画（１０μｇのタンパク質）が抗Ｎｏｇｏ−６６レセプター免疫ブロットによって分析された、免疫ブロットの写真である（ｋＤａで表した分子量マーカーは、右である）。（ｂ）は、Ｍｙｃ−Ｎｏｇｏ−６６レセプターを発現したＣＯＳ−７細胞またはニワトリＥ５脊髄外植片（インビトロで８日間）を、抗Ｎｏｇｏ−６６レセプター抗体、抗Ｍｙｃ抗体または希突起膠細胞特異的Ｏ４抗体で染色した写真である。下の３つのパネルは、同じ視野の二重標識免疫組織化学を示す（縮尺バーは、上の３つのパネルに関しては４０μｍ、そして下のパネルに関しては８０μｍ）。（ｃ）は、抗Ｎｏｇｏ−６６レセプター調製物で染色した成体の脳または脊髄の、パラホルムアルデヒドで固定したビブラトーム切片の写真である。これは、橋および脊髄の両方における軸索プロフィール（矢印）の染色を実証する。染色は、１０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６レセプター抗原の存在下で、劇的に減少する。
【図１０】  図１０は、Ｎｏｇｏ−６６による成長円錐の崩壊を媒介するＮｏｇｏ−６６レセプターを示す。（ａ）は、ＰＩ−ＰＬＣまたは緩衝液で前処理し、続いてＮｏｇｏ−６６に曝露したニワトリＥ１２  ＤＲＧ外植片の写真である。軸索におけるＦ−アクチンの染色が、例示される（縮尺バーは、４０μｍ）。（ｂ）は、３ｎＭのＡＰまたはＡＰ−Ｎｏｇｏの、ニワトリＥ１２後根神経節を分離したニューロンへの結合の実験結果をまとめたグラフである。ここで、示された培養物は、ＰＩ−ＰＬＣで前処理されたか、または１５０ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６は、ＡＰ−Ｎｏｇｏとのインキュベーションに含まれた。（ｃ）は、（ａ）におけるような実験からの成長円錐崩壊の測定を要約するグラフである。ニワトリＥ１２  ＤＲＧ培養物は、３０ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６または１００ｐＭのＳｅｍａ３Ａに曝露される前にＰＩ−ＰＬＣありまたはなしで処理された。（ｄ）は、コントロールウイルス（ＨＳＶ−ＰｌｅｘｉｎＡ１）またはＨＳＶ−Ｍｙｃ−Ｎｏｇｏ−６６レセプターによって感染され、次いで、Ｎｏｇｏ−６６と共にまたはＮｏｇｏ−６６なしでインキュベートされたＥ７網膜神経節細胞外植片の写真である。軸策成長円錐のファロイジン染色が、例示された（縮尺バー、２５μｍ）。（ｅ）は、感染されていないかまたは（ｄ）におけるようにウイルス感染されたＥ７網膜ニューロンにおける成長円錐の崩壊を定量化したグラフである。
【図１１】  図１１は、Ｎｏｇｏ−６６レセプターの構造機能分析を示す。（ａ）は、異なるＮｏｇｏ−６６レセプター欠損変異体の模式図である。これらの変異体は、免疫ブロットによって発現レベルに関して評価され、そしてＡＰ−Ｎｏｇｏ結合に関して評価された。ロイシンリッチリピートおよびロイシンリピートカルボキシ末端は、Ｎｏｇｏの結合に必要であるが、このタンパク質の残りは必要でないことに留意のこと。この第２のタンパク質は、精製および固定の後に試験された。（ｂ）は、Ｎｏｇｏ−６６レセプターの最初の７つのロイシンリッチリピートについて予想される三次元構造の図である。これは、ロイトロピン（Ｌｅｕｔｒｏｐｉｎ）レセプターの関連するロイシンリッチリピートの予想された構造に基づいて、コンピューターモデリングから導き出された（Ｊｉａｎｇら，（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３，１３４１−１３５３）。モデリングは、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｄｂｖでＳｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌによって実行された。βシートおよびαへリックスの二次構造を有するこれらの領域もまた、示される。
【図１２】  図１２は、Ｎｏｇｏ−６６をブロックする可溶Ｎｏｇｏレセプターを示す。ニワトリＥ１３  ＤＲＧニューロンは、標準的な条件下で培養された。成長円錐崩壊アッセイにおいて、マウスＮｏｇｏレセプターの１〜３４８アミノ酸の外部ドメインフラグメントを分泌するＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞由来の馴化培地、またはコントロール馴化培地は、１００ｎＭのＮｏｇｏ−６６と共に添加された。左下のパネルにおいて、グラフ中のデータは、Ｎｏｇｏが誘導する崩壊が、可溶レセプターフラグメントによってブロックされることを示す。成長アッセイのために、ニューロンは、コントロールまたはＮｏｇｏレセプター外部ドメインの馴化培地の存在下で、Ｎｏｇｏ−６６タンパク質（５０ｎＭ）または中枢神経系ミエリン（１５μｇ総タンパク質／ｍｌ）と共に培養された。上の４つのパネルは、中枢神経系ミエリンが成長を阻害すること、およびこれがＮｏｇｏレセプター外部ドメインタンパク質の存在によって阻害されることを実証する写真を示す。成長は、右下のパネルにおいてグラフで定量化される。
【配列表】
0004763207.tif 000002
0004763207.tif 000003
0004763207.tif 000004
0004763207.tif 000005
0004763207.tif 000006
0004763207.tif 000007
0004763207.tif 000008
0004763207.tif 000009
0004763207.tif 000010
0004763207.tif 000011
0004763207.tif 000012
0004763207.tif 000013
0004763207.tif 000014
0004763207.tif 000015
0004763207.tif 000016
0004763207.tif 000017
0004763207.tif 000018
0004763207.tif 000019
0004763207.tif 000020
0004763207.tif 000021
0004763207.tif 000022
0004763207.tif 000023
0004763207.tif 000024
0004763207.tif 000025
【図１】
0004763207.tif 000026
【図２】
0004763207.tif 000027
【図３】
0004763207.tif 000028
【図４】
0004763207.tif 000029
【図５】
0004763207.tif 000030
【図６】
0004763207.tif 000031
【図７】
0004763207.tif 000032
【図８】
0004763207.tif 000033
【図９】
0004763207.tif 000034
【図１０】
0004763207.tif 000035
【図１１】
0004763207.tif 000036
【図１２】
0004763207.tif 000037