(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）板状のチップと、
（２）複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
（３）前記複数の試薬収容部の出口から送り出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
（４）外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
（５）前記試薬混合部から送り出される混合試薬と前記試料受容部から送り出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、前記試薬混合部、前記試料受容部および前記反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記試薬混合部は、前記複数の試薬収容部から送液された試薬が混合された混合試薬の先頭部を前記反応部に送り出すのを防止する送出防止機構を有し、
前記試薬混合部は混合流路を形成し、前記混合流路の中間部に前記反応部へ混合試薬を送り出す送出流路が分岐されていて、前記複数の試薬収容部から送液された試薬が混合された混合試薬の先頭部は該混合流路の中間部と下流末端の間に収容されて、前記送出流路から前記反応部に送り出されるのを防止されることを特徴とする試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項２】
前記試薬混合部は、前記混合流路と前記送出流路の接続部に、前記混合流路内の圧力が所定圧以上になった時に前記送出流路へ混合試薬を送り出す送液制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項３】
前記送液制御部は前記分岐流路の断面積より小さい断面積の細流路であることを特徴とする請求項２に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項４】
前記各試薬収容部は駆動液を収容室に注入するための注入口と注入された試薬により収容室から試薬を押し出すための出口とを有していることを特徴とする請求項１に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項５】
前記注入口は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部と連接されていて、外部ポンプにより駆動液が注入口から収容室に注入されることを特徴とする請求項４に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項６】
前記注入口と前記ポンプ接続部の連接部には末端が開放された空気抜き流路が設けてあることを特徴とする請求項５に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項７】
前記空気抜き流路は流路径が１０μｍ以下であり、且つ流路内面の水との接触角が３０°以上であることを特徴とする請求項６に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項８】
前記各試薬収容部の出口には試薬が流出するのを防止する封止剤が充填してあることを特徴とする請求項４に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項９】
前記封止剤は所定温度以下では固化し、室温では溶解し流動状態となることを特徴とする請求項８に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１０】
前記封止剤の融点は８℃〜２５℃であることを特徴とする請求項８に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１１】
前記封止剤は油脂あるいはゼラチンの水溶液であることを特徴とする請求項８に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１２】
更に、前記試薬混合部と前記反応部との間に混合試薬を充填して、所定量の混合試薬を送液する試薬充填部を有することを特徴とする請求項１に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１３】
前記試薬充填部は混合試薬を充填する充填流路と該充填流路の入口に設けられた逆流防止部と、該充填流路の出口に設けられた送液制御部と、該充填流路の入口近傍に設けられた分岐流路とを有し、前記分岐流路は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部に連接されていて、充填流路に混合試薬が充填された後、外部ポンプにより分岐流路を介して、駆動液にて充填流路内の液圧が所定以上になるよう加圧して充填された混合試薬の所定量を送液制御部より送液することを特徴とする請求項１２に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１４】
前記逆流防止部は逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁、または弁体変形手段により弁体を流路開口部に押圧して該開口部を閉止する能動弁であることを特徴とする請求項１３に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１５】
前記マイクロリアクタは遺伝子検査用マイクロリアクタであることを特徴とする請求項１に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１６】
前記複数の試薬収容部は遺伝子増幅反応に用いる試薬を収容し、前記試料受容部には検体もしくは検体から抽出したＤＮＡが注入されることを特徴とする請求項１５に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１７】
さらに、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイゼーションするプローブＤＮＡが収容されるプローブＤＮＡ収容部とを有することを特徴とする請求項１５に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１８】
前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＤＮＡと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、その下流側の流路へ、この反応液を処理した処理液と、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡとを送液し、流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に、試薬収容部に収容された試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡと流路内でハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行うように構成されていることを特徴とする請求項１６に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【請求項１９】
前記検体収容部に検体もしくは検体から抽出したＲＮＡを注入するとともに、これに含まれるＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素が収容される逆転写酵素収容部が設けられ、
検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＲＮＡと、逆転写酵素収容部に収容された逆転写酵素とを流路へ送液し、流路内で混合してｃＤＮＡを合成した後、前記増幅反応およびその検出を行うように構成されていることを特徴とする請求項１６に記載の試料検査用マイクロリアクタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロリアクタ、特に遺伝子検査に好適に適用できるバイオリアクタを含む遺伝子検査装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。【０００３】
例えばヒト、家畜に見られる新型感染症の突発的流行にあっては、原因となるウィルス、細菌の特定が、一刻を争う予防対策における最初の障壁となる。菌の培養が律速となりがちな従来の検出法に対し、場所を選ばず迅速に結果を出す遺伝子検査技術は、こうした急務の要請に応えるものである。さらには遺伝子による病気の診断、生活習慣病などの発症リスク予測、遺伝子医療においてもニーズが高い。【０００４】
臨床検査ではこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題である。精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献１および２）。【０００５】
また、大量の臨床検体を対象とするチップに対しては、ディスポーサブルであることが望まれ、さらに多用途対応性、製造コストなどの問題点を克服する必要がある。【０００６】
多数のＤＮＡ断片を高密度で固定化したＤＮＡチップでは、搭載する情報の内容、かさむ作製コスト、さらに検出精度、再現性などが未だ充分でないといった問題点が存在する。しかしながら、遺伝子検査の目的と種類によっては、チップ基板上に多数のＤＮＡプローブを網羅的に配置する方式よりも、適宜変更できるプライマーを使用してＤＮＡ増幅反応の効率をリアルタイムで追跡する方が、簡便かつ迅速な検査法を提供する可能性もある。
【特許文献１】特開2001-322099号公報
【特許文献２】特開2004-108285号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質  核酸  酵素」43巻、13号（1998年）君塚房夫、加藤郁之進、共立出版（株）発行
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ディスポーサブルタイプで低コストであり、シンプルな構成と高精度の送液システムを有し、精度の高い検出を可能とするマイクロリアクタ、特に、遺伝子検査用のマイクロリアクタの提供を行うことを目的とする。併せてクロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションといった問題が生じにくい構成を有するバイオマイクロリアクタを提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の遺伝子検査装置は、上記の実状に鑑みてなされたものであり、汎用性、高感度を確保するため、用いるプライマー、バイオプローブを適宜変更する方式のＤＮＡ増幅を行うことを特徴とする。
上記目的は次の構成によって達成できる。
【０００９】
（１）板状のチップと、
（２）複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
（３）前記複数の試薬収容部の出口から送り出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
（４）外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
（５）前記試薬混合部から送り出される混合試薬と前記試料受容部から送り出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、前記試薬混合部、前記試料受容部および前記反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記試薬混合部は、前記複数の試薬収容部から送液された試薬が混合された混合試薬の先頭部を前記反応部に送り出すのを防止する送出防止機構を有し、
前記試薬混合部は混合流路を形成し、前記混合流路の中間部に前記反応部へ混合試薬を送り出す送出流路が分岐されていて、前記複数の試薬収容部から送液された試薬が混合された混合試薬の先頭部は該混合流路の中間部と下流末端の間に収容されて、前記送出流路から前記反応部に送り出されるのを防止されることを特徴とする試料検査用マイクロリアクタ。
【００１１】
更に、上記マイクロリアクタにおいて、前記試薬混合部は、前記混合流路と前記送出流路の接続部に、前記混合流路内の圧力が所定圧以上になった時に前記送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を有す。
【００１２】
試料検査用マイクロリアクタが、
（１）板状のチップと、
（２）複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
（３）前記複数の試薬収容部の出口から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
（４）外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
（５）前記試薬混合部から送出される混合試薬と試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記各試薬収容部は駆動液を収容室に注入するための注入口と注入された試薬により収容室から試薬を押し出すためえの出口とを有し、前記注入口は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部と連接されていて、外部ポンプにより駆動液が注入口から収容室に注入され、前記注入口と前記ポンプ接続部の連接部には末端が開放された空気抜き流路が設けてある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態における遺伝子検査用マイクロリアクタの概略図である。
【図２】図１のマイクロリアクタと装置本体とからなる遺伝子検査装置の概略図である。
【図３】試薬収容部とこれに連通する流路との間に封止剤を充填した状態を示した図である。
【図４】ピエゾポンプを示し、（ａ）は、このポンプの一例を示した断面図、（ｂ）は、その上面図である。（ｃ）は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図である。
【図５】ポンプの圧電素子に印加する駆動電圧波形と、液体の位置変位との関係を示したグラフである。
【図６】（ａ）は、駆動液を送液するポンプ部の構成を示した図であり、（ｂ）は試薬を送液するポンプ部の構成を示した図である。
【図７】空気抜き用の流路を示した図である。
【図８】（ａ）、（ｂ）は、Ｙ字の分岐流路の上流から試薬と検体とを送液することにより、流路でこれらを混合する様子を示した図であり、（ｃ）は、送液ポンプの駆動の様子を示したグラフである。
【図９】（ａ）、（ｂ）は、送液制御部の流路軸方向に沿った断面図である。
【図１０】（ａ）、（ｂ）は、流路中に設けられる逆止弁の一例を示した断面図である。
【図１１】流路中に設けられる能動弁の一例を示した断面図であり、（ａ）は開弁状態を、（ｂ）は閉弁状態を示す。
【図１２】試薬定量部の構成を示した図である。
【図１３】この先頭部分を切り捨てて、混合比率が安定してから混合液を次工程へ送液するようにした流路構成を示した図である。
【図１４】本発明の一実施形態におけるマイクロリアクタの試薬混合部の構成を示した図である。
【図１５】図１４の流路から連通する、検体と試薬との増幅反応、検出を行う部分の構成を示した図である。
【図１６】図１４の流路から連通する、ポジティブコントロールと試薬との増幅反応、検出を行う部分の構成を示した図である。
【図１７】図１４の流路から連通する、ネガティブコントロールと試薬との増幅反応、検出を行う部分の構成を示した図である。
【図１８】流路中に設けられる能動弁の一例を示した断面図であり、（ａ）は開弁状態を、（ｂ）は閉弁状態を示す。
【図１９】流路中に設けられる能動弁の一例を示した断面図であり、（ａ）は開弁状態を、（ｂ）は閉弁状態を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、上記目的を達成できる本発明の好ましい構成を説明する。【００１５】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、
一つのチップ内に、
検体もしくは検体から抽出したＤＮＡが注入される検体収容部と、
遺伝子増幅反応に用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイゼーションするプローブＤＮＡが収容されるプローブＤＮＡ収容部と、
これらの各収容部に連通する流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部とが設けられ、
前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＤＮＡと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、その下流側の流路へ、この反応液を処理した処理液と、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡとを送液し、流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に、試薬収容部に収容された試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡと流路内でハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行うように構成されていることを特徴としている。【００１６】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
前記検体収容部に検体もしくは検体から抽出したＲＮＡを注入するとともに、これに含まれるＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素が収容される逆転写酵素収容部が設けられ、
検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＲＮＡと、逆転写酵素収容部に収容された逆転写酵素とを流路へ送液し、流路内で混合してｃＤＮＡを合成した後、前記増幅反応およびその検出を行うように構成されていてもよい。【００１７】
また上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
前記流路に、
正方向への送液圧力が予め設定された圧に達するまで液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する、前記マイクロポンプのポンプ圧により液体の通過を制御可能な送液制御部と、
流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部とが設けられ、
前記マイクロポンプ、送液制御部および逆流防止部によって、流路内における液体の送液、定量および各液体の混合を制御することを特徴としている。【００１８】
さらに、上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
前記送液制御部が、両側に隣接する流路を直列に連結するようにこれらの流路の間に形成された、これらの隣接流路の断面積よりも小さい断面積を有する細流路からなることを特徴とするマイクロリアクタである。【００１９】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
前記逆流防止部が、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁、または弁体変形手段により弁体を流路開口部に押圧して該開口部を閉止する能動弁であることを特徴としている。【００２０】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタにおいて、
前記逆流防止部と送液制御部との間の流路で構成され、所定量の試薬を充填可能な試薬充填流路と、
この試薬充填流路から分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプと接続されるポンプ接続部に連通する分岐流路とが設けられ、
前記逆流防止部側から、前記送液制御部から先へ試薬が通過しない送液圧力で試薬充填流路に試薬を供給することにより試薬を充填した後、前記送液制御部から先へ試薬が通過することを許容する送液圧力で、前記マイクロポンプにより分岐流路から試薬充填流路に向かう方向へ駆動液を送液することにより、試薬充填流路内に充填された試薬を前記送液制御部から先へ押し出し、これにより試薬を定量的に送液するように構成された試薬定量部が設けられている。【００２１】
さらに上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
各試薬が送液される複数の流路と、
これらの複数の流路に接続され、これらの流路からの各試薬が混合される混合流路と、
該混合流路から分岐し、試薬混合液を次工程へ送液する分岐流路と、
混合流路における分岐流路との分岐点よりも先の位置に配置された第１の送液制御部と、
分岐流路における混合流路との分岐点の近傍位置に配置され、試薬混合液が通過可能な送液圧力が第１の送液制御部よりも小さい第２の送液制御部とが設けられ、
混合流路内へ送液された試薬混合液の先端部が第１の送液制御部に達するまで試薬混合液を送液した後、第１の送液制御部を試薬混合液が通過しない送液圧力で第２の送液制御部から分岐流路へ試薬混合液を通過させ、試薬混合液を次工程へ送液するように構成されている。【００２２】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
第１の送液制御部における前記細流路の断面積が、第２の送液制御部における前記細流路の断面積よりも小さいことを特徴としている。【００２３】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、前記ポンプ接続部と、このポンプ接続部に接続されるマイクロポンプにより送液される内容液が収容された前記収容部との間の流路に、この流路から分岐し、末端が開放された空気抜き用の流路が設けられていることを特徴としている。【００２４】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタにおいて、
遺伝子増幅反応に用いる試薬、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが前記収容部に収容されていることが好ましい。【００２５】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、遺伝子増幅反応に用いる試薬、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを収容する各収容部と、これに連通する流路との間に、使用前に収容部内の内容液が流路へ漏出することを防止する封止剤が充填されていることを特徴としている。【００２６】
前記封止剤は、好ましくは水に対する溶解度が１％以下の油脂からなる。【００２７】
前記封止剤は、水に対する溶解度が１％以下であり、且つ融点が８℃〜室温（２５℃）である油脂からなることが望ましい。【００２８】
前記封止剤として、ゼラチンの水溶液が好ましい。【００２９】
上記遺伝子検査用マイクロリアクタは、
遺伝子増幅反応に用いる試薬が、検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼを含むことを特徴としている。【００３０】
本発明の遺伝子検査方法は、
上記のいずれかに記載のマイクロリアクタを用い、
検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、または検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、ビオチン修飾したプライマーとをこれらの収容部から流路へ送液し、流路内で遺伝子増幅反応を行う工程と、
増幅された遺伝子を含む反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理する工程と、
増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ストレプトアビジンを吸着させた流路に送液し、増幅された遺伝子を固定化する工程と、
増幅された遺伝子を固定化した流路に、末端をＦＩＴＣで修飾したプローブＤＮＡを送液し、固定化した遺伝子にプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程と、
前記流路にＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイドを送液し、固定化した遺伝子にハイブリダイズしたプローブに金コロイドを吸着する工程と、
前記流路における金コロイドの濃度を光学的に測定する工程とを含むことを特徴としている。【００３１】
前記各工程の間に、必要に応じてストレプトアビジンを吸着させた前記流路内に洗浄液を送液する工程を含むことが望ましい。【００３２】
本発明の遺伝子検査装置は、上記マイクロリアクタのいずれかと、該マイクロリアクタのポンプ接続部に接続されるマイクロポンプとを備えている。【００３３】
上記遺伝子検査装置は、
前記マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えている。【００３４】
上記遺伝子検査装置は、
試薬が収容された各試薬収容部の上流側にポンプ接続部が設けられ、これらのポンプ接続部にマイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより試薬収容部から試薬を流路へ押し出して遺伝子増幅反応を開始するように構成されていることを特徴としている。【００３５】
上記遺伝子検査装置は、
前記マイクロポンプの駆動装置からの駆動信号で前記アクチュエータの作動を制御することにより所望の比率で各試薬を混合するように構成されている。【００３６】
上記遺伝子検査装置は、好ましくは増幅された遺伝子とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションによる反応生成物に基いて増幅反応の検出を行う検出装置を備えている。【００３７】
上記遺伝子検査装置は、好ましくはマイクロリアクタの流路内における各反応の反応温度を制御する温度制御装置を備えている。【００３８】
上記遺伝子検査装置は、前記マイクロポンプ、検出装置および温度制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能なマイクロリアクタとからなり、装置本体にマイクロリアクタを装着することにより遺伝子増幅反応および該増幅反応の検出を自動的に行うことを特徴としている。【００３９】
本発明のマイクロリアクタは大量生産に向く構成であり、しかも多目的に対応する汎用性があるため低コストで製造できる。またポンプおよびバルブを含む流路系がシンプルな構成であるため、気泡が入りにくく、デッドボリュームも小さいため送液精度が高い。検出に際してはＤＮＡ増幅工程を組み込むため、検出感度の高い検出が可能となるマイクロリアクタである。【００４０】
ＤＮＡ分析のみならず、ＲＮＡ分析に対応する逆転写工程を含め得る分析リアクタであるため、試料の調製が容易であり、かつ微量でも精度が高く、短時間の分析を可能とする。【００４１】
また、本発明の遺伝子検査装置は、検体ごとの試薬類・送液系エレメント搭載コンポーネントと、制御・検出コンポーネントとを別個にするシステム構成のため、微量分析、増幅反応に対し、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションといった深刻な問題が生じにくい。検体ＤＮＡとプライマー、プローブとの結合（または相互作用）以外の非特異的な結合物の洗浄除去が容易であるために、バックグラウンドの低いマイクロリアクタ・チップを提供することができる。【００４２】
本発明は遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、１遺伝子多型解析（ＳＮＰ）、医薬スクリーニング、医薬、農薬あるいは各種化学物質の安全性・毒性の検査、医療の臨床診断、食品検査、法医学、化学、醸造、農林業、漁業、畜産、農産製造等の分野で適用可能である。【００４３】
以下、本発明のマイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタと各制御装置、検出装置とからなる遺伝子検査装置、本装置を用いる遺伝子増幅工程および検出工程を含む遺伝子検査方法について説明する。【００４４】
マイクロリアクタおよび遺伝子検査装置
図面を参照しながら本発明のマイクロリアクタ、遺伝子検査装置について説明する。図１は、本発明の一実施形態における遺伝子検査用マイクロリアクタの概略図、図２は、本発明の一実施形態における前記マイクロリアクタと装置本体とからなる遺伝子検査装置の概略図である。【００４５】
図１に示したマイクロリアクタは、樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどで作製される一枚のチップからなる。そのチップには、検体収容部、試薬収容部、プローブＤＮＡ収容部、コントロール収容部、流路、ポンプ接続部、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部の各部が、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。さらに必要であれば、逆転写酵素部を設置してもよい。検体収容部は、検体注入部に連通し検体の一時収容および混合部への検体供給を行う。場合によっては血球分離の作用を担わせてもよい。試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合しても構わない。【００４６】
血液などの検体をマイクロリアクタの上記検体収容部に注入することにより、チップ内で遺伝子増幅反応およびその検出に必要な処理を自動的に行い、多項目について同時に、且つ短時間で遺伝子検査ができるように構成されている。本発明のマイクロリアクタを使用する好ましい遺伝子検査装置の態様では、必要な試薬類があらかじめ所定の量、封入されており、検体のＤＮＡまたはＲＮＡと所定の増幅反応、ならびに増幅産物の検出を行うユニットとして、該マイクロリアクタが検体ごとに使用される。【００４７】
これに対し、送液、温度、反応の各制御に関わる制御系、光学検出、データの収集および処理を受け持つユニットは、マイクロポンプおよび光学装置とともに本発明の遺伝子検査装置の本体を構成する。この装置本体は、これに上記チップを装着することにより検体サンプルに対して共通で使用される。したがって多数の検体があっても、効率よく迅速に処理できる。従来技術では、内容の異なる分析または合成などを行う場合に、変更される内容に応じたマイクロ流体デバイスをその都度構成する必要があった。これとは異なり、本発明では脱着可能な上記チップのみ交換すればよい。各デバイスエレメントの制御変更も必要であれば、装置本体に格納された制御プログラムを適宜改変すればよい。【００４８】
本発明の遺伝子検査装置は、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所および時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。【００４９】
以上、本発明のマイクロリアクタおよび検査装置の概要を述べたが、本発明は、種々の実施の形態において、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。すなわち、本発明のマイクロリアクタおよび検査装置の全体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。【００５０】
遺伝子増幅工程・試料
本発明の測定対象となる検体は、遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡである。このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものであってよい。そのような試料から遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する方法は、特に限定されず、従来技術を使用することができる。最近、ＤＮＡ増幅のために生体試料から遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する技術が開発され、キットなどの形態でも利用可能である。【００５１】
試料自体にも特に制限はないが、例えば全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰など生体由来のほとんどの試料；細胞培養物；ウィルス、細菌、カビ、酵母、植物、動物などの核酸含有試料；微生物などが混入または含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能性のあるあらゆる試料などが対象となる。【００５２】
ＤＮＡは、試料から常法に従い、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、分離精製できる。核酸を遊離するために、飽和濃度に近いグアニジン塩酸塩、イソチオシアン酸塩のような高濃度カオトロピック試薬を使用することは一般的に知られている。上記のフェノール−クロロホルム抽出法などを適用せず、代わりに検体を、界面活性剤を含むタンパク質分解酵素液で直接処理する方法（斉藤隆、「ＰＣＲ実験マニュアル」ＨＢＪ出版局、１９９１年、ｐ３０９）は簡便で迅速な方法である。得られたゲノムＤＮＡまたは遺伝子が大きい場合には、適当な制限酵素、例えばBamHI、BgLII、DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII、PvuIIなどを用いて常法に従い、フラグメント化してもよい。このようにして検体用のＤＮＡおよびそのフラグメントの集合体を調製することができる。【００５３】
ＲＮＡの場合、逆転写反応に使用されるプライマーの作製が可能であれば特に制限はない。例えば試料中の全ＲＮＡのほか、遺伝子として機能しているレトロウィルスのＲＮＡ、発現される遺伝子の直接の情報伝達担体であるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのＲＮＡ分子群が対象となる。これらのＲＮＡは、適当な逆転写酵素を利用してｃＤＮＡに変換してから分析すればよい。ｍＲＮＡの調製方法は、公知の技術に基づいて行うことができ、逆転写酵素は容易に入手することができる。【００５４】
本発明のマイクロリアクタは、従来の装置を使用して行う手作業の場合に比べて、必要とされる検体量は極めて少ない。例えば、遺伝子の場合、ＤＮＡとして0.001〜100ｎｇである。このため、微量の試料しか得られない場合も含めて、本発明のマイクロリアクタは、検体面からの制約は少なく、必然的に試薬類も少ない量で済み、検査コストの低減となる。試料は、上記「検体収容部」の注入部から導入される。
・増幅法
本発明のマイクロリアクタでは、増幅方法を限定されない。例えばＤＮＡ増幅技術は、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、改良点も含めて各種文献などに記載されている。ＰＣＲ増幅においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開2004−108285号）。このデバイスシステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業によりマイクロチューブ、マイクロバイアルなどで行なう従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。【００５５】
ＰＣＲ反応のように複雑な温度管理を必要としない、最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第3433929号）。したがって、ＩＣＡＮ法は、本発明のマイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済むために好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のバイオリアクタにおいては、10〜20分、好ましくは、15分で解析まで終わる。【００５６】
ＤＮＡ増幅反応は、その他のＰＣＲ変法であってもよく、本発明のマイクロリアクタは、流路の設計変更などによりいずれにも対応できる柔軟性がある。いずれのＤＮＡ増幅反応を使用する場合にも、その技術の詳細は開示されており、当業者は容易に導入することができる。
・試薬類
(ｉ)  プライマー
ＰＣＲプライマーは、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種のオリゴヌクレオチドである。その設計は、すでに専用のアプリケーションが開発されており、当業者であればＤＮＡシンセザイザー、化学合成などにより容易に作成できる。ＩＣＡＮ法用のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡのキメラプライマーであるが、このものの調製法もすでに技術的に確立されている（特許第3433929号）。プライマーの設計、選択は、増幅反応の成否、効率を左右するため最も適切なものを使用することが重要である。【００５７】
また、プライマーにビオチンを結合させておくと、増幅産物のＤＮＡを、基板上のストレプトアビジンとの結合を介して基板上に固定化でき、増幅産物の定量に供し得る。その他のプライマー標識物質としてジゴキシゲニン、各種蛍光色素などが例示される。
(ii)  増幅反応用試薬類
増幅反応に使用する酵素をはじめとする試薬類は、ＰＣＲ用、ＩＣＡＮ法のいずれも容易に入手できる。【００５８】
ＰＣＲ法における試薬類として、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸のほか、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Vent ＤＮＡポリメラーゼまたはPfu ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。【００５９】
ＩＣＡＮ法における試薬類は、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸、検出したい遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼのＲＮaseを含む。
(iii)  コントロール
インターナルコントロールは、標的核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）について、増幅のモニタリング、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブリダイズできる配列を有するために検体と同様に増幅できるものである。ポジティブコントロールの配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用する核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、公知技術文献に記載されているものを使用すればよい。ネガティブコントロールは、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
(iv)  逆転写用試薬
ＲＮＡの試料の場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、逆転写プライマーなどであり、これらも市販され容易に入手できる。【００６０】
これらの増幅用基質（２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸）、遺伝子増幅用試薬などは、一枚のマイクロリアクタの上記試薬収容部に、それぞれ予め所定量封入されている。したがって本発明のマイクロリアクタは使用時にその都度、試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。【００６１】
検出工程
本発明において増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は、特に限定されず、必要に応じて好適な方法が使用される。そうした方法には、可視分光側光法、蛍光測定法、発光ルミネッセンス法といった検出方法が主流である。さらに、電気化学的方法、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランスなどの手法も挙げられる。【００６２】
本発明の遺伝子検査装置は、上記マイクロリアクタとともに、増幅された遺伝子とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションによる反応性生物に基づいて増幅反応の有無、規模などの検出を行う検出装置を備えている。【００６３】
上記マイクロリアクタを用いる本発明の方法は、具体的には以下の工程で行なわれる。すなわち上記マイクロリアクタを用い、（１）検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、ビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から流路へ送液し、微細流路内で、遺伝子を増幅する工程、（２）微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理する工程、（３）増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ストレプトアビジンを吸着させた微細流路内に送液し、前記の増幅された遺伝子を固定化する工程、（４）増幅された遺伝子を固定化した微細流路内に、末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダイゼーションする工程、（５）上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合するＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化した遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる工程、（６）上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する工程、とを含む方法である。【００６４】
上記方法において、ビオチン化ＤＮＡ、ビオチン−ストレプトアビジン結合による固定化、ＦＩＴＣ蛍光標識などは、ＦＩＴＣ抗体などは公知技術である。【００６５】
好ましくは、前記各工程の間に、必要に応じてストレプトアビジンを吸着させた前記流路内に洗浄液を送液する工程を含む。そのような洗浄液としては、例えば各種の緩衝液、塩類水溶液、有機溶媒などが好適である。【００６６】
本発明の上記検出法は、最終的に可視光により、高感度で測定できる方式が好ましい。蛍光測光より、機器が汎用的であり、妨害因子が少なくデータ処理も容易である。好ましくは、そのための光学検出装置が、上記マイクロポンプを含む送液手段およびマイクロリアクタの流路内における各反応の反応温度を制御する温度制御装置とともに組み込まれて、一体化した構成を有している本発明の遺伝子検査装置を用いて検出が行われる。【００６７】
上記工程において、変性液は、遺伝子ＤＮＡを１本鎖にするための試薬で、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。プローブは、オリゴデオキシヌクレオチドなどが挙げられる。またＦＩＴＣの他に、ＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアネート）などの蛍光物質が挙げられる。【００６８】
上記の増幅および検出は、予め送液順序、容量、タイミングなどに関して設定された諸条件を、マイクロポンプおよび温度の制御とともにプログラムの内容として有するソフトウェア、前記マイクロポンプ、前記検出装置および温度制御装置とが一体化された遺伝子検査装置本体と、この装置本体に対し脱着可能な上記マイクロリアクタとを接合させるとマイクロリアクタの流路も作動状態となる。試料注入により、好ましくは自動的に分析が開始され、試料および試薬類の送液、混合に基づく遺伝子増幅反応、遺伝子検出反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。【００６９】
遺伝子検査
増幅反応に使用するプライマーとして、ある特定の遺伝子に特異的な配列を有するプライマーを用いることにより、増幅の有無または増幅効率を測定することにより、試料中の遺伝子由来のＤＮＡが、その特別の遺伝子と同一か、異なるかの判定に利用することができる。特に、感染病の原因ウィルス、細菌を遺伝子から迅速に同定するのに有効である。【００７０】
癌遺伝子、遺伝性高血圧遺伝子などの発現の程度を、本発明の遺伝子検査により診断するデータを得ることができる。具体的には、そうした遺伝子の発現の証であるｍＲＮＡの種類、発現レベルの分析である。【００７１】
あるいは、特定の疾患に対する罹患感受性、医薬に対する副作用などに関与する遺伝子変異、コーディング領域のほか、調節遺伝子のプロモーター領域における変異も本発明のマイクロリアクタを用いる遺伝子検査により検出することができる。その場合、変異の部分を含む核酸配列を有するプライマーを利用する。なお、上記遺伝子変異とは、遺伝子のヌクレオチド塩基における変異の意味である。さらに本発明の遺伝子検査装置を使用することによる遺伝子多型の解析は、疾患感受性遺伝子の同定にも役立つ。【００７２】
本発明の遺伝子検査装置を用いる遺伝子検査法は、従来の核酸配列分析、制限酵素分析、核酸ハイブリダイゼーション分析と比べ、はるかに少ない検体量、僅かな手間と簡便な装置により高い精度の結果を得ることができることは装置の構成と分析原理から明らかである。【００７３】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタ、遺伝子検査用装置などは、遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、１遺伝子多型解析（ＳＮＰ）、臨床検査・診断、医薬スクリーニング、医薬、農薬あるいは各種化学物質の安全性・毒性の検査、環境分析、食品検査、法医学、化学、醸造、漁業、畜産、農産製造、農林業等の分野で利用可能である。【００７４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。図１は、本発明の一実施形態における遺伝子検査用マイクロリアクタの概略図、図２は、このマイクロリアクタと装置本体とからなる遺伝子検査装置の概略図である。【００７５】
図１に示したマイクロリアクタは、樹脂製の一枚のチップからなり、血液などの検体を注入することにより、チップ内で遺伝子増幅反応およびその検出を自動的に行い、多項目について同時に遺伝子診断ができるように構成されている。例えば、縦横の長さが数ｃｍのチップに２〜３μｌ程度の血液検体を滴下するだけで、図２の装置本体２にチップを装着することにより増幅反応およびその検出ができるようになっている。【００７６】
図１の検体収容部２０に注入された検体と、試薬収容部１８ａ〜１８ｃに予め封入された遺伝子増幅反応に用いる試薬は、図２の装置本体に組み込まれたマイクロポンプ（図示せず）によって各収容部に連通する流路へ送液され、Ｙ字流路を介して流路内で検体と試薬とが混合され、増幅反応が行われる。流路は、例えば幅１００μｍ、深さ１００μｍ程度に形成され、増幅反応は、図２の装置本体２に組み込まれた光学検出装置（図示せず）によって検出される。例えば、検査項目毎の流路に対してＬＥＤから測定光を照射し、フォトダイオード、光電子増倍管などの光検出手段で透過光もしくは反射光を検出することによって、プローブＤＮＡをハイブリダイズすることにより標識された増幅ＤＮＡ（遺伝子）を検出できるようになっている。【００７７】
装置本体２には、反応温度を制御する温度制御装置も組み込まれており、送液ポンプ、光学検出装置および温度制御装置が一体となった小型ユニットに、予め試薬が封入されたチップを装着するだけで簡便に遺伝子診断をすることができる。このように、場所、時間を問わず迅速に測定することができるので、緊急医療での利用や、在宅医療での個人的な利用も可能である。送液に使用する多数のマイクロポンプユニットなどが装置本体側に組み込まれているので、チップはディスポーサブルタイプとして使用できる。【００７８】
以下、図１４〜１７に示した本発明の一実施形態におけるマイクロリアクタに基いて、マイクロリアクタのさらに具体的な構成について説明する。本実施形態のマイクロリアクタは、好ましくはＩＣＡＮ法により増幅反応を行うものであり、マイクロリアクタ内で、血液もしくは喀痰から抽出した検体と、検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼを含む試薬とにより遺伝子増幅反応を行う。反応液は、変性処理した後にストレプトアビジンを吸着させた流路に送液され、増幅された遺伝子が流路に固定化される。次いで、末端をフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)で修飾したプローブＤＮＡと固定化した遺伝子とをハイブリダイゼーションさせ、ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイドを、固定化した遺伝子にハイブリダイズしたプローブに吸着させ、金コロイドの濃度を光学的に測定することにより増幅された遺伝子を検出する。【００７９】
本実施形態では、１枚のチップで高精度且つ迅速に信頼性の高い遺伝子検査を行うために、次のようにマイクロリアクタを構成している。第１に、１枚のチップにコントロールをすべて一体化され、インターナルコントロール、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが予めマイクロリアクタに封入され、検体の増幅反応および検出操作と同時に、これらのコントロールの増幅反応および検出操作が行われる。これによって、迅速に信頼性の高い遺伝子検査を行うことができる。【００８０】
第２に、流路の各位置に、正方向への送液圧力が予め設定された圧に達するまで液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する、マイクロポンプのポンプ圧により液体の通過を制御可能な送液制御部と、流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部とを配設している。後述するように、マイクロポンプ、送液制御部および逆流防止部によって、流路内における液体の送液が制御され、試薬などを高精度に定量送液することができ、分岐流路から導入された複数の試薬を迅速に混合することができる。【００８１】
本実施形態のマイクロリアクタを用いた増幅反応およびその検出操作について説明する前に、このマイクロリアクタの主要な構成要素について説明する。【００８２】
試薬収容部
マイクロリアクタには、各試薬を収容するための複数の試薬収容部が設けられ、遺伝子増幅反応に用いる試薬、増幅された遺伝子を変性する変性液、増幅された遺伝子とハイブリダイゼーションさせるプローブＤＮＡなどが収容される。【００８３】
試薬収容部には、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試薬が収容されていることが望ましい。チップ内に内蔵される試薬類などは、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その試薬部の表面が密封処理されている。さらにマイクロリアクタの保管時に、試薬収容部から試薬が微細流路内に勝手に漏出して試薬が反応してしまうことなどを防止するために封止材により封入されている。これらの封止剤は、使用前、μ−ＴＡＳ（マイクロリアクタ）が保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となるものである。図３に示したように、試薬３１と、試薬収容部１８に連通する流路１５との間に封止剤３２を充填することにより、試薬を試薬収容部に封入することが好ましい。なお、封止剤と試薬との間には空気が介在しても差し支えないが、定量送液の観点から介在する空気の量は（試薬量に対して）充分に少ないことが好ましい。【００８４】
このような封止剤としては、水に対して難溶性の可塑性物質を使用することができ、好ましくは水に対する溶解度が１％以下の油脂が好適である。このような油脂は、油脂ハンドブックなどで調べることができ、例えば表１に示す油脂を挙げることができる。【００８５】
マイクロリアクタに予め試薬を収容しておく場合、試薬の安定性上、マイクロリアクタを冷蔵保管することが望ましいが、封止剤として、冷蔵時には固体状態であり室温では液状となる物質を使用することにより、冷蔵保管時には固体状態で試薬を封止するとともに、使用時には液状となり流路から容易に排出することができる。このような封止剤としては、水に対する溶解度が１％以下であり、且つ融点が８℃〜室温（２５℃）である油脂、およびゼラチンの水溶液が挙げられる。ゼラチンの水溶液は、ゼラチンの濃度を変えることによりゲル化温度を調整することができ、例えば10℃前後でゲル化させるためには、約１％の水溶液とするとよい。【００８６】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを収容する各収容部とこれに連通する流路との間にも、同様に封止剤を充填してもよい。【００８７】
本実施形態では、試薬収容部の上流側にマイクロポンプが接続され、マイクロポンプにより駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。【００８８】
【表１】
0004784508.tif 000002
【００８９】
ポンプ接続部
本実施形態では、検体収容部、試薬収容部、ポジティブコントロール収容部、およびネガティブコントロール収容部のそれぞれについて、これらの収容部の内容液を送液するマイクロポンプが設けられている。マイクロポンプは、マイクロリアクタとは別途の装置本体に組み込まれており、マイクロリアクタを装置本体に装着することによって、ポンプ接続部からマイクロリアクタに接続されるようになっている。【００９０】
本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いている。図４（ａ）は、このポンプの一例を示した断面図、図４（ｂ）は、その上面図である。このマイクロポンプには、第１液室４８、第１流路４６、加圧室４５、第２流路４７、および第２液室４９が形成された基板４２と、基板４２上に積層された上側基板４１と、上側基板４１上に積層された振動板４３と、振動板４３の加圧室４５と対向する側に積層された圧電素子４４と、圧電素子４４を駆動するための駆動部（図示せず）とが設けられている。【００９１】
この例では、基板４２として、厚さ５００μｍの感光性ガラス基板を用い、深さ１００μｍに達するまでエッチングを行なうことにより、第１液室４８、第１流路４６、加圧室４５、第２流路４７および第２液室４９を形成している。第１流路４６はその幅を２５μｍ、長さを２０μｍとしている。また、第２流路４７は、その幅を２５μｍ、長さを１５０μｍとしている。【００９２】
ガラス基板である上側基板４１を、基板４２上に積層することにより、第１液室４８、第１流路４６、第２液室４９および第２流路４７の上面が形成される。上側基板４１の加圧室４５の上面に当たる部分は、エッチングなどにより加工されて貫通している。【００９３】
上側基板４１の上面には、厚さ５０μｍの薄板ガラスからなる振動板４３が積層され、その上に、例えば厚さ５０μｍのチタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）セラミックスなどからなる圧電素子４４が積層されている。【００９４】
駆動部からの駆動電圧により、圧電素子４４とこれに貼付された振動板４３が振動し、これにより加圧室４５の体積が増減する。第１流路４６と第２流路４７とは、幅および深さが同じで、長さが第１流路よりも第２流路の方が長くなっており、第１流路４６では、差圧が大きくなると、流路内で渦を巻くように乱流が発生し、流路抵抗が増加する。一方、第２流路４７では、流路幅が長いので差圧が大きくなっても層流になり易く、第１流路に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。【００９５】
例えば、圧電素子４４に対する駆動電圧により、加圧室４５の内方向へ素早く振動板４３を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室４５の体積を減少させ、次いで加圧室４５から外方向へゆっくり振動板４３を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室４５の体積を増加させると、液体は同図のＢ方向へ送液される。逆に、加圧室４５の外方向へ素早く振動板４３を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室４５の体積を増加させ、次いで加圧室４５から内方向へゆっくり振動板４３を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室４５の体積を減少させると、液体は同図のＡ方向へ送液される。図５に、圧電素子４４に印加する駆動電圧波形と、液体の位置変位との関係の一例を示した。図５（ｂ）に示す液体の移動量のグラフは、ポンプ動作によって得られる流量を模式的に示したものであり、実際にはこれに流体の慣性力による時間遅れや慣性振動が重畳した挙動になる。なお、第１流路と第２流路における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなく、他の形状的な相違に基づくものであってもよい。【００９６】
上記のように構成されたピエゾポンプによれば、ポンプの駆動電圧および周波数を変えることによって、液体の送液方向、送液速度を制御できるようになっている。図４（ｃ）に、このポンプの他の例を示した。この例では、ポンプをシリコン基板７１、圧電素子４４、および図示しないフレキシブル配線から構成している。シリコン基板７１は、シリコンウエハを公知のフォトリソグラフィー技術により所定の形状に加工したものであり、エッチングにより加圧室４５、ダイヤフラム４３、第１流路４６、第１液室４８、第２流路４７、および第２液室４９が形成されている。第１液室４８にはポート７２が、第２液室４９にはポート７３がそれぞれ設けられ、このポートを介してマイクロリアクタのポンプ接続部と連通する。例えば、ポートが穿孔された基板７４と、マイクロリアクタのポンプ接続部近傍とを上下に重ね合わせることによって、ポンプをマイクロリアクタに接続することができる。また、１枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場合、マイクロリアクタと接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンクが接続されていることが望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに接続されていてもよい。【００９７】
ポンプ接続部周辺の構成を図６に示した。同図（ａ）は駆動液を送液するポンプ部の構成を示し、同図（ｂ）は試薬を送液するポンプ部の構成を示している。ここで、駆動液２４は鉱物油などのオイル系、あるいは水系のいずれであってもよく、試薬を封止する封止液２５は、図３のように流路中に充填してもよく、あるいは封止液用に設けられた貯留部に充填してもよい。ポンプ接続部１２と、試薬収容部１８との間の流路には、空気抜き用の流路２６が設けられている。図７に示したように、この空気抜き用の流路２６は、ポンプ接続部と試薬収容部との間の流路１５から分岐し、その末端が開放されている。この空気抜き用の流路２６から、例えばポンプ接続時などに流路１５内に存在する気泡を除去するようにしている。【００９８】
この空気抜き用の流路２６は、流路１５を通過する例えば水などの水性液体２７が漏出することを防止する点から、流路径が１０μｍ以下であり、且つ流路内面の水との接触角が３０°以上であることが好ましい。【００９９】
試薬と試薬、あるいは検体と試薬とを微細流路内で迅速に混合するために、これらを送液する各マイクロポンプの駆動が次のように制御されている。図８（ａ）に示したように、Ｙ字の分岐流路の上流から、Ａ方向へ試薬３１を送液し、Ｂ方向へ検体３３を送液することにより、流路１５でこれらを混合する場合、試薬３１を送液するポンプの駆動と、検体３３を送液するポンプの駆動とを図８（ｃ）に示したように制御する。すなわち、試薬３１をＡ方向へ送液している間、検体３３の送液を停止し、検体３３をＢ方向へ送液している間、試薬３１の送液を停止する。この操作を交互に繰り返すことによって、図８（ａ）に示したように、試薬３１と検体３３とが流路１５内で輪切り状に交互に充填される。ポンプ送液の切り替え速度を高めることで、例えばこの輪切り層の幅を１〜２μｍとすることができる。層の幅が短くなるほど、試薬３１と検体３３との間の拡散が迅速に進み、素早く混合されることになる。例えば、流路径１００μｍの流路で１：１の一定の割合で流路１５に試薬３１と検体３３とを送液した場合、図８（ｂ）に示したように、概ね５０μｍ幅の試薬層と検体層とが形成され、図８（ａ）の場合と比べて拡散が進みにくく、混合が遅くなる。【０１００】
このように、複数の分岐流路から各液体を混合流路に送液する場合、各分岐流路ごとに流速を切り替えながら送液することによって、迅速に混合することができるとともに、所望の比率でこれらの液体を混合することができる。なお、図８（ａ）の方が迅速に混合できると述べたが、流路幅を狭くしたり時間をかけたりすれば、図８（ｂ）の方式でも混合することができる。【０１０１】
送液制御部
本実施形態のマイクロリアクタには、その流路に、図９（ａ）に示したような送液制御部が多数設けられている。この送液制御部は、正方向への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する。【０１０２】
図９（ａ）、（ｂ）に示したように、送液制御部１３は、流路径を絞った部分からなり、これにより、一端側からこの絞り流路（細流路）５１に達した液体が、他端側へ通過することを規制している。この絞り流路５１は、例えば、両側に直列に連結された縦横が１５０μｍ×１５０μｍの流路に対して、縦横が３０μｍ×３０μｍ程度となるように形成される。【０１０３】
液体を、細径の絞り流路５１の端部５１ａから太径の流路１５へ押し出すには、表面張力のために所定の送液圧力を要する。したがって、マイクロポンプからのポンプ圧により、液体の停止と通過を制御することができるので、例えば流路の所定箇所において液体の移動を一時止めておき、所望のタイミングでこの箇所から先の流路へ送液を再開することができる。【０１０４】
必要に応じて、絞り流路５１の内面に、撥水性のコーティング、例えばフッ素系のコーティングを施してもよい。【０１０５】
このように、両側に隣接する流路を直列に連結するようにこれらの流路の間に形成された、これらの隣接流路における流路軸方向と垂直な断面による断面積よりも小さい断面積を有する細流路からなる送液制御部を設けることによって、送液のタイミングを制御することができる。【０１０６】
逆流防止部
本実施形態のマイクロリアクタには、その流路に、液体の逆流を防止する逆流防止部が多数設けられている。この逆流防止部は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、あるいは弁体変形手段により弁体を流路開口部へ押圧して該開口部を閉止する能動弁からなる。【０１０７】
図１０（ａ）、（ｂ）は、本実施形態のマイクロリアクタの流路に使用される逆止弁の一例を示した断面図である。図１０（ａ）の逆止弁では、微小球６７を弁体として、基板６２に形成した開口６８をこの微小球６７の移動により開閉することによって、液体の通過を許容および遮断している。すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって微小球６７が基板６２から離反して開口６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、微小球６７が基板６２に着座して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断される。【０１０８】
図１０（ｂ）の逆止弁では、基板６２上に積層され、その端部が開口６８の上側に延び出した可撓性基板６９が、液圧により開口６８の上側を上下動することにより開口６８を開閉している。すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって可撓性基板６９の端部が基板６２から離反して開口６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、可撓性基板６９が基板６２に密着して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断される。【０１０９】
図１１は、本実施形態のマイクロリアクタの流路に使用される能動弁の一例を示した断面図であり、図１１（ａ）は開弁状態を、図１１（ｂ）は閉弁状態を示す。この能動弁では、下方に突出した弁部６４が形成された可撓性基板６３が、開口６５が形成された基板６２の上に積層されている。【０１１０】
閉弁時には、図（ｂ）に示したように、可撓性基板６３を上側から空気圧、油圧、水圧ピストンや圧電アクチュエータ、形状記憶合金アクチュエータなどの弁体変形手段により押圧することによって、弁部６４を基板６２に対して開口６５を覆うように密着させ、これによりＢ方向への逆流を遮断するようにしている。また、能動弁は外部の駆動装置により作動するものに限らず、弁体が自ら変形して流路を塞ぐ構成でもよい。例えば図１８に示したように、バイメタル８１を使用して通電加熱により変形するようにしてもよく、あるいは図１９に示したように、形状記憶合金８２を使用して通電加熱により変形するようにしてもよい。【０１１１】
試薬定量部
上記した送液制御部および逆流防止部を用いて、試薬を定量的に送液することができる。図１２は、このような試薬定量部の構成を示した図であり、逆流防止部１６と、送液制御部１３ａとの間の流路（試薬充填流路１５ａ）には、所定量の試薬が充填される。また、この試薬充填流路１５ａから分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプ１１に連通する分岐流路１５ｂが設けられている。【０１１２】
試薬の定量送液は、次のように行われる。最初に、逆流防止部１６側から、送液制御部１３ａから先へ試薬３１が通過しない送液圧力で試薬充填流路１５ａに試薬３１を供給することにより試薬３１を充填する。次いで、送液制御部１３ａから先へ試薬３１が通過することを許容する送液圧力で、マイクロポンプ１１により分岐流路１５ｂから試薬充填流路１５ａに向かう方向へ駆動液２５を送液することにより、試薬充填流路１５ａ内に充填された試薬３１を送液制御部１５ａから先へ押し出し、これにより試薬３１を定量的に送液する。分岐流路１５ｂには、空気、封止液などが存在していることがあるが、この場合でもマイクロポンプ１１で駆動液２５を送液してこの空気、封止液などを試薬充填流路１５ａに送り込むことによって試薬を押し出すことができる。なお、試薬充填流路１５ａに、大容積の貯留部１７ａを設けることによって、定量のバラツキが小さくなる。【０１１３】
試薬の混合
２つの試薬をＹ字流路により混合する場合、各試薬を同時に送液したとしても、液の先頭部分では混合比率が安定しない。図１３は、この先頭部分を切り捨てて、混合比率が安定してから混合液を次工程へ送液するようにした流路構成を示した図である。同図において、混合する試薬３１ａおよび３１ｂは、それぞれ流路１５ａ、１５ｂから混合流路１５ｃへ送液される。【０１１４】
混合流路１５ｃから、試薬混合液３１ｃを次工程へ送液する分岐流路１５ｄが分岐され、混合流路１５ｃにおける分岐流路１５ｄとの分岐点よりも先の位置には、第１の送液制御部１３ａが設けられている。分岐流路１５ｄにおける混合流路１５ｃとの分岐点の近傍位置には、試薬混合液３１ｃが通過可能な送液圧力が第１の送液制御部１３ａよりも小さい第２の送液制御部１３ｂが設けられている。【０１１５】
流路１５ａおよび流路１５ｂから混合流路１５ｃ内へ送液された、試薬３１ａと試薬３１ｂとの試薬混合液３１ｃは、その先端部３１ｄが第１の送液制御部１３ａに達するまで混合流路１５ｃ内を送液される。試薬混合液３１ｃの先端部３１ｄが第１の送液制御部１３ａに達した後、さらに１５ｃ内に送液することにより、第２の送液制御部１３ｂから分岐流路１５ｄへ試薬混合液３１ｃを通過させ、試薬混合液３１ｃを次工程へ送液する。【０１１６】
例えば、第１の送液制御部１３ａにおける前記細流路の断面積を、第２の送液制御部１３ｂにおける前記細流路の断面積よりも小さくすることによって、第２の送液制御部１３ｂにおける試薬混合液３１ｃが通過可能な送液圧力を、第１の送液制御部１３ａのそれよりも小さくすることができる。【０１１７】
以下、上述した各構成要素を備えた本実施形態のマイクロリアクタを用いた遺伝子増幅反応およびその検出の具体例について、図１４〜図１７を参照しながら説明する。検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼなどの試薬は、図１４の試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃに収容され、各試薬収容部の上流側には、マイクロリアクタとは別途の装置本体に内蔵されたピエゾポンプ１１がポンプ接続部１２で接続され、各試薬収容部から下流側の流路１５ａへこれらのポンプにより試薬が送液される。【０１１８】
流路１５ａと、流路１５ａから分岐した次工程への流路と、送液制御部１３ａ、１３ｂは、図１３で説明した流路を構成し、各試薬収容部から送液された試薬の混合液の先端部を切り捨て、混合状態が安定した後に試薬混合液を次工程へ送液するようにしている。各試薬収容部には、合計で７．５μｌ超の試薬が収容されており、先端を切り捨てた計７．５μｌの試薬混合液が、２．５μｌずつ３本に分岐した流路１５ｂ、１５ｃ、１５ｄへ送液される。流路１５ｂは検体との反応、検出系へ（図１５）、流路１５ｃはポジティブコントロールとの反応、検出系へ（図１６）、流路１５ｄはネガティブコントロールとの反応、検出系へ（図１７）、それぞれ連通している。【０１１９】
流路１５ｂに送液された混合試薬は、図１５の貯留部１７に充填される。なお、貯留部１７ａの上流側の逆止弁１６と、下流側の送液制御部１３ａとの間で、図１２で説明した試薬充填流路が構成され、駆動液を送液するポンプ１１に連通する分岐流路に設けられた送液制御部１３ｂとともに、前述した試薬定量部を構成している。【０１２０】
血液もしくは喀痰から抽出した検体は、検体収容部２０から注入され、貯留部１７ｂに、上記の試薬定量部と同じ機構で検体が定量に充填され（２．５μｌ）、後続する流路へ定量送液される。各貯留部１７ａ、１７ｂに充填された検体と試薬混合液は、Ｙ字流路を介して流路１５ｅ（容積５μｌ）に送液され、この流路１５ｅ内で混合およびＩＣＡＮ反応が行われる。ここで、検体と試薬との送液は、図８で説明したように交互に各ポンプ１１を駆動して流路１５ｅへ輪切り状に検体と試薬混合液とを交互に導入し、迅速に検体と試薬とが拡散、混合するようにしている。【０１２１】
増幅反応は、５μｌの反応液と、停止液収容部２１ａに収容された１μｌの反応停止液とを容積６μｌの流路１５ｆに送液してこれらを混合することにより停止される。次いで、変性液収容部２１ｂに収容された変性液（１μｌ）と、反応液と停止液との混合液（０．５μｌ）とを、容積１．５μｌの流路１５ｇへ送液して混合し、増幅された遺伝子を１本鎖に変性する。【０１２２】
次いで、プローブＤＮＡ収容部２１ｃに収容された、末端をＦＩＴＣで蛍光標識したプローブＤＮＡ溶液（２．５μｌ）と、変性処理した処理液（１．５μｌ）とを、容積４μｌの流路１５ｈへ送液して混合し、一本鎖の増幅遺伝子にプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションさせる。【０１２３】
次いで、この処理液を、流路内にストレプトアジビンを吸着させたストレプトアジビン吸着部２２ａ、２２ｂに２μｌずつ送液し、プローブで標識した増幅遺伝子をこの流路内に固定化する。【０１２４】
この増幅遺伝子が固定化された流路２２ａ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｄ、２１ｆ、２１ｅに収容された洗浄液、インターナルコントロール用プローブＤＮＡ溶液、およびＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。同様に、増幅遺伝子が固定化された流路２２ｂ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｄ、２１ｇ、２１ｅに収容された洗浄液、ＭＴＢ用プローブＤＮＡ溶液、およびＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。【０１２５】
金コロイド溶液を送液することにより、固定化された増幅遺伝子にＦＩＴＣを介して金コロイドが結合され、固定化される。この固定化された金コロイドを光学的に検出することにより、増幅の有無または増幅効率を測定する。【０１２６】
図１４の流路１５ｃ、１５ｄは、それぞれ図１６に示したポジティブコントロールの反応、検出系、および図１７に示したネガティブコントロールの反応、検出系に連通され、試薬混合液をこれらに送液することにより、上述した検体の反応、検出系における場合と同様に、試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡと流路内でハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応が検出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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