(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の存在を検出するための組成物であって、
化学的または酵素的改変に影響を受けやすいアクリジニウムエステル標識を含む、検出プローブ、および
前記改変から前記標識を保護する、保護プローブ、
を含み、
ここで前記検出プローブおよび前記保護プローブは検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を形成するよう互いにハイブリダイズしていて、
ここで前記保護プローブは前記標識と加水分解保護付加物を形成せず、
ここで前記アクリジニウムエステル標識は、前記ハイブリダイゼーション複合体中では前記改変の影響を受けにくく、そして
ここで前記検出プローブおよび前記保護プローブの間に形成される前記ハイブリダイゼーション複合体は、前記検出プローブが前記保護プローブとよりも前記標的核酸とより安定な複合体を形成するよう偏向されるように、前記検出プローブおよび完全に相補的な標的核酸の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体より低いＴｍを有する、
組成物。
【請求項２】
水性溶液をさらに含む、請求項１の組成物であって、前記アクリジニウムエステル標識は前記溶液中で前記改変に影響を受けやすく、そして前記改変は前記標識からシグナル検出可能性の損失を引き起こす、前記組成物。
【請求項３】
前記検出プローブおよび前記保護プローブの間に形成される前記ハイブリダイゼーション複合体が、０．０５  Ｍ  コハク酸リチウム、ｐＨ  ５．０、０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ｗ／ｖ  ＬＬＳ、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０  ｍＭ  ＥＧＴＡを含む溶液中で、前記検出プローブおよび前記の完全に相補的な標的核酸の間に形成される前記ハイブリダイゼーション複合体より、少なくとも４℃低いＴｍを有する、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記検出プローブおよび前記保護プローブの間に形成される前記ハイブリダイゼーション複合体が、前記溶液中で、前記検出プローブおよび前記の完全に相補的な標的核酸の間に形成される前記ハイブリダイゼーション複合体より、少なくとも５℃低いＴｍを有する、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記標識が、０．０５  Ｍ  コハク酸リチウム、ｐＨ  ５．０、０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ｗ／ｖ  ＬＬＳ、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０  ｍＭ  ＥＧＴＡからなる溶液中で、３７℃で加水分解されることが可能であり、そして前記保護プローブが、加水分解から前記標識を保護する、請求項２ないし４のいずれか１つの組成物。
【請求項６】
前記検出プローブが、修飾された検出オリゴヌクレオチドであり、各修飾が：
２’−修飾リボース、
修飾ヌクレオチド間結合、
修飾窒素性塩基、
ペプチド核酸、および
３’ブロッキング基
からなる群より独立に選択される、請求項１−５のいずれか１つの組成物。
【請求項７】
前記の修飾された検出オリゴヌクレオチドに対する各修飾が：２’−メトキシリボ−ス、２’−ハロリボース、メチルホスホン酸結合、ホスホロチオ酸結合、アルキルブロッキング基、３’−３’逆転ヌクレオチド、および３’デオキシヌクレオシドからなる群より独立に選択される、請求項６の組成物。
【請求項８】
前記保護プローブが前記検出プローブより短い、請求項１−７のいずれか１つの組成物。
【請求項９】
前記保護プローブが、前記検出プローブに完全には相補的でない、請求項１−７のいずれか１つの組成物。
【請求項１０】
前記保護プローブが、前記検出プローブに対し、少なくとも２倍過剰で存在する、請求項１−９のいずれか１つの組成物。
【請求項１１】
前記保護プローブが、前記検出プローブに対し、少なくとも４倍過剰で存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
前記標的核酸の酵素的増幅反応を通じて存在するとき、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記検出プローブと前記標的核酸とのハイブリダイズを阻害することによってさらに特徴づけられる、請求項１−１１のいずれか１つの組成物。
【請求項１３】
標的核酸配列が試料に存在するか決定する方法であって：
ａ）前記試料および請求項１−１２のいずれか１つの組成物を含む反応混合物を製造し、；そして
ｂ）前記反応混合物をインキュベートし、そして前記標的配列が前記試料に存在する指標として、前記検出プローブが、検出条件下で、前記標的配列にハイブリダイズしているか検出する、
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記標的配列が、もし存在する場合は、増幅された核酸を製造するように、検出工程ｂ）前に前記反応混合物を前記標的核酸と共に増幅条件に曝露し、ここで前記増幅条件下で前記検出プローブは前記保護プローブとハイブリダイズし、そして検出工程において前記検出プローブが前記増幅された標的核酸配列にハイブリダイズしているか検出する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記増幅条件が、転写に基づく増幅条件である、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、化学的または酵素的改変から検出可能標識を保護する組成物、並びに増幅および検出法におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
本明細書に記載される参考文献はいずれも、請求される発明に対し先行技術であると認められない。
【０００３】
標的核酸配列は、試料に存在する可能性がある他の配列より、標的配列に優先的にハイブリダイズするよう設計された検出プローブを用いた、多様な方法により、検出することが可能である。標的配列の例には、元来試料に存在していた配列または増幅法の一部として製造された配列が含まれる。
【０００４】
検出プローブの例には、試料に存在する可能性がある他の核酸より、標的核酸配列を含む標的核酸に優先的にハイブリダイズすることが可能な、オリゴヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。標的核酸配列に対する検出プローブのハイブリダイゼーションは、適切な条件下で、検出可能プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の形成を生じる。
【０００５】
検出可能プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標識化検出プローブを用い、促進される。異なる標識およびアッセイ形式を用い、試料中の解析物（ａｎａｌｙｔｅ）の存在または量を検出することが可能である。検出可能標識の例には、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、発色団、酵素、酵素基質およびリガンドが含まれる。蛍光および化学発光分子を用いた核酸の検出を記載する参考文献の例には、共に本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号およびＢｅｃｋｅｒら、米国特許第５，７３１，１４８号が含まれる。
【０００６】
標的核酸配列の検出を促進するため、核酸増幅技術を用い、試料中の標的配列の数を増加させてもよい。核酸増幅は、増幅しようとする核酸配列に相補的な配列を含む核酸の酵素的合成を伴う。核酸増幅は、転写に基づく増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）を伴うものなど、異なる技術を用い、行うことが可能である。
【０００７】
核酸配列の転写に基づく増幅は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用する。プロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される５’配列、および増幅しようとする配列の３’の位置でテンプレート核酸にハイブリダイズする３’配列を含む。テンプレートに対するプロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、二本鎖プロモーターが標的核酸配列の上流に形成される。二本鎖プロモーター形成は、一般的に、ＤＮＡポリメラーゼ活性を伴う。一般的に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、二本鎖プロモーター形成を促進する。
【０００８】
転写に基づく増幅は、通常二本鎖であるプロモーター領域に対するＲＮＡポリメラーゼの結合を伴う。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーター領域から下流へ進行し、そして５’から３’方向にリボ核酸を合成する。単一のテンプレートを用いた転写に基づく増幅により、多数のＲＮＡ転写物が製造される。
【０００９】
転写に基づく増幅を行うのに、異なる形式を使用してもよい。異なる形式の例は、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，５５４，５１６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、米国特許第５，７６６，８４９号；Ｒｙｄｅｒら、米国特許第５，７８６，１８３号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｋａｃｉａｎら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４０１５号、国際公開第ＷＯ  ９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０１９６６号、国際公開第ＷＯ  ８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１０８号、国際公開第ＷＯ  ８８／１０３１５号；ＤａｖｅｙおよびＭａｌｅｋ、欧州出願第８８１１３９４８．９号、欧州公開第０  ３２９  ８２２  Ａ２号；並びにＵｒｄｅａ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２１３号、国際公開第ＷＯ  ９１／１０７４６号（これらの参考文献は各々、本明細書に援用される）などの刊行物に提供される。
【００１０】
ＰＣＲ増幅は、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号により、そしてＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５５：３３５−３５０（１９８７）（これらの参考文献は各々、本明細書に援用される）に記載される。
【００１１】
ＬＣＲの例は、本明細書に援用される、欧州特許公開第３２０  ３０８号に記載される。ＬＣＲは、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用いる。該オリゴヌクレオチドのうち２つは、１つのオリゴヌクレオチドの３’端およびもう一方のオリゴヌクレオチドの５’端が連結のため配置されるように、核酸テンプレートにハイブリダイズする。ハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドをその後、連結し、標的核酸配列に対する全長相補体を形成する。その後、二本鎖核酸を変性させ、そして第三および第四のオリゴヌクレオチドを相補鎖にハイブリダイズさせ、そして共に連結する。ハイブリダイゼーション、連結、および変性のさらなる周期により増幅を達成し、標的核酸配列および標的核酸配列に相補的な配列の多数のコピーを製造する。
【００１２】
ＳＤＡは、制限酵素がその認識部位のヘミホスホロチオ酸エステル型の非修飾鎖にニック（ｎｉｃｋ）をつける能力、およびＤＮＡポリメラーゼが該ニックで複製を開始し、そして下流の非テンプレート鎖を置換する能力に基づく、等温増幅反応である（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ３：２５−３０（１９９３）、Ｗａｌｋｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｄｉｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：１６９１−１９９６（１９９２）、およびＷａｌｋｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８９：３９２−３９６（１９９１）を参照されたい。これらの参考文献は各々、本明細書に援用される）。自己触媒的ＳＤＡ増幅を行うための断片を生成するのに用いられる工程は、転写に基づく増幅またはＱ−ベータ技術を用いて行われる増幅のための断片を生成するのに適用可能であることが示されている（Ｗａｌｋｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：１６９１−１６９６（１９９２）、本明細書に援用される）。
【００１３】
発明の概要
本発明は、標識化検出プローブを保管し、そして標的核酸配列が試料に存在するか検出するのに有用な、組成物および方法を特徴とする。好ましい組成物は、化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を含む検出プローブ、および改変から標識を保護し、そして／または検出プローブが核酸増幅を阻害する能力を減少させる保護プローブで構成される。こうした組成物を用い、例えば、検出プローブ標識を安定化し、そして検出プローブが時期尚早に、増幅または標的核酸にハイブリダイズするのを妨げてもよい。
【００１４】
検出プローブ標識の化学的および酵素的改変は、未改変標識から製造されるシグナルに比較し、改変標識から製造されるシグナルに影響を与える、化学的同一性または結合における変化である。化学的および酵素的改変の例には、酸化、還元、酸加水分解、塩基加水分解、アルキル化および酵素的な切断若しくは加水分解が含まれる。好ましくは、化学的または酵素的改変は、標識からのシグナル検出可能性の損失を引き起こす。
【００１５】
化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識は、本明細書において「影響を受けやすい標識」とも称され、通常、不安定基に作用することが可能な剤を含む水性溶液中で、こうした改変を経験する、不安定基を含む。好ましくは、不安定基は、約ｐＨ  ４および約ｐＨ  ９の間のｐＨを有する水性溶液中で加水分解にさらされる。不安定基の例には、エステル結合およびチオエステル結合が含まれる。
【００１６】
保護プローブは、改変から標識を保護し、その際、標識は、保護プローブの非存在下よりも、保護プローブの存在下で、より少ない度合いに改変される。好ましい態様において、保護プローブの存在下および非存在下の、改変速度の相違は、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、および少なくとも約４０倍である。
【００１７】
検出および保護プローブは、プリン類、ピリミジン類、またはその誘導体である、窒素性塩基を含む分子である。窒素性塩基は、プローブ上に位置し、したがって、核酸上に存在するプリンまたはピリミジン塩基と水素結合し、ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能である。こうした配置はまた、検出プローブ窒素性塩基が、保護プローブ窒素性塩基と水素結合し、ハイブリダイゼーション複合体を形成することも可能にする。
【００１８】
検出プローブは、標的核酸配列とのハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能である。検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体を検出し、標的配列の存在を示すことが可能である。好ましい検出プローブは、１つまたはそれ以上の検出可能標識を含み、これを用い、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体が存在するか決定するのを促進することが可能である。
【００１９】
保護プローブを用い、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を形成することにより、化学的または酵素的改変に影響を受けやすい検出プローブ標識を、こうした改変から保護することが可能である。保護プローブは、後に、検出プローブから除去し、検出プローブを標的配列の存在を検出するのに使用できるようにしてもよい。
【００２０】
検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体はまた、増幅中の、増幅核酸に対する検出プローブのハイブリダイゼーションを減少させるのに用いてもよい。核酸増幅技術を用い、標的核酸配列数を増加させ、標的核酸配列の検出を促進してもよい。しかし、核酸増幅中に存在する検出プローブは、増幅が完了する前に、増幅産物にハイブリダイズすることにより、増幅を阻害する可能性がある。
【００２１】
検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体に存在する検出プローブは、増幅核酸に自由にハイブリダイズできない。増幅後、ストリンジェンシー条件を上昇させ、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を不安定化する一方、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にしてもよい。さらに、増幅により製造される、過剰標的核酸の存在は、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の形成を進めるのを補助する。
【００２２】
したがって、本発明の第一の側面は、（１）化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を含む、検出プローブ、および（２）こうした改変から該標識を保護する、保護プローブ、を含む、組成物を記載する。検出プローブおよび保護プローブの間に形成されるハイブリダイゼーション複合体は、検出プローブおよび完全に相補的な標的核酸の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体より低いＴｍを有する。
【００２３】
「ハイブリダイズしている」および「ハイブリダイゼーション複合体」は、安定ハイブリダイゼーション複合体を指す。安定ハイブリダイゼーション複合体は、溶液温度またはそれ以上のＴｍを有する。
【００２４】
好ましくは、保護プローブは、標識と「加水分解保護付加物」を形成しない。「加水分解保護付加物」は、加水分解から標識を保護する、保護付加物形成分子および影響を受けやすい標識の間に形成される付加物を指す。
【００２５】
検出プローブの「完全に相補的な標的核酸」への言及は、ＤＮＡ相補体またはＲＮＡ相補体のどちらかまたは両方を、検出プローブが記載される特性を有するか決定する参照オリゴヌクレオチドとして用いることが可能であることを示す。ＤＮＡ相補体は、検出プローブと同じ長さのデオキシリボ核酸であり、存在する各ヌクレオチドは、ワトソン−クリック（例えばＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ）水素結合により、検出プローブに水素結合することが可能である。ＲＮＡ相補体は、検出プローブと同じ長さのリボ核酸であり、存在する各ヌクレオチドは、ワトソン−クリック水素結合により、検出プローブに水素結合することが可能である。
【００２６】
好ましくは、組成物は、影響を受けやすい標識を化学的または酵素的に改変することが可能な水性溶液、および改変から標識を保護する保護プローブをさらに含む。より好ましくは、影響を受けやすい標識は、水性溶液中で加水分解されることが可能であり、そして保護プローブは、加水分解から標識を保護する。
【００２７】
好ましい態様において、影響を受けやすい標識は、化学発光標識であり；影響を受けやすい標識は、所望により置換されたアクリジニウムエステルであり；そして影響を受けやすい標識由来の化学発光は、電子的に励起された、所望により置換されたＮ−アルキルアクリドンを介して進行する。
【００２８】
さらなる好ましい態様において、保護プローブおよび検出プローブは、標的核酸を含まない水性溶液に存在し、そして組成物は、保護プローブ、検出プローブおよび水性溶液「から本質的になる」または「からなる」。請求項の移行句において、「から本質的になる」は、該請求項の範囲を（１）明記された成分または工程および（２）請求される発明の基本的特質に実質的に影響を及ぼさない成分または工程に限定する。
【００２９】
本発明の別の側面は、（１）水性溶液、（２）該水性溶液中で化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を含む、検出プローブ、および（３）改変から該標識を保護する、保護プローブ、を含む組成物を記載する。検出プローブおよび保護プローブは、該水性溶液中で、少なくとも１日間（すなわち２４時間）、保管される。好ましくは、保護プローブは、標識との「加水分解保護付加物」を形成しない。
【００３０】
本発明の別の側面は、（１）水性溶液、（２）核酸配列の存在を検出するための検出手段、ここで該検出手段は、該水性溶液中で化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を含む、および（３）該標識の改変を阻害するための標識保護手段、を含む、組成物を記載する。検出手段および標識保護手段の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体は、該水性溶液中で、検出手段および完全に相補的な標的核酸の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体より低いＴｍを有する。好ましくは、標識保護手段は、標識との加水分解保護付加物を形成しない。
【００３１】
「検出手段」は、核酸標的配列の存在を検出するための本出願に記載される成分およびその均等物を指す。
「標識保護手段」は、検出プローブ標識の化学的または酵素的改変を阻害するための本出願に記載される成分およびその均等物を指す。
【００３２】
本発明の別の側面は、（１）水性溶液、（２）核酸配列の存在を検出するための検出手段、ここで該検出手段は、該水性溶液中で、化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を含む；および（３）該標識の改変を阻害するための標識保護手段、但し、検出手段および標識保護手段は、少なくとも１日間、保管される、を含む、組成物を記載する。好ましくは、標識保護手段は、標識と加水分解保護付加物を形成しない。
【００３３】
本発明の別の側面は、（１）標的核酸配列の存在を検出するための検出手段、（２）検出手段が、等温増幅反応中、標的配列にハイブリダイズする能力を阻害するための阻害手段、および（３）所望により存在する水性溶液、から本質的になる、組成物を記載する。検出手段および阻害手段の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体は、検出手段および検出手段の完全に相補的な標的核酸の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体より低いＴｍを有する。好ましくは、阻害手段は、検出手段と加水分解保護付加物を形成しない。
【００３４】
「阻害手段」は、等温増幅反応中、検出手段が、標的核酸配列にハイブリダイズする能力を阻害するための本出願に記載される成分およびその均等物を指す。
等温増幅は、本質的に一定の温度の条件下で起こり、ここで温度は、ＰＣＲで起こるように、核酸の融解、その後、アニーリングを達成するため、二者択一的に上昇し、そして低下しない。１つの態様において、温度は、約５℃以上変化しない。好ましくは、等温増幅は、温度が外部影響力、例えば加熱または冷却により、変化しない条件下で、行われる。
【００３５】
本発明の別の側面は、標的核酸配列が、試料に存在するか決定する方法であって、増幅標的核酸配列の製造を伴う前記方法を記載する。該方法は：
ａ）該試料、および保護プローブにハイブリダイズした検出プローブを含む組成物を含む、反応混合物を製造し；
ｂ）該標的配列が存在する場合、該配列を用い、増幅核酸を製造する増幅条件に、該反応混合物を曝露し；そして
ｃ）該標的配列が該試料に存在する指標として、検出プローブが、検出条件下で、該増幅核酸にハイブリダイズしているか検出する、
工程を含む、前記方法を記載する。
【００３６】
増幅条件下で、検出プローブは、保護プローブにハイブリダイズしている。検出条件下で、検出プローブは保護プローブに安定してハイブリダイズしていないが、増幅核酸が存在する場合、それにハイブリダイズすることが可能である。「安定してハイブリダイズしていない」とは、ハイブリダイゼーション複合体は、存在する場合、溶液温度より低いＴｍを有することを意味する。
【００３７】
好ましい態様において、検出プローブは、影響を受けやすい標識、および反応混合物中で、または増幅条件下で、化学的または酵素的改変から標識を保護する保護プローブを含む。より好ましくは、保護プローブは、標識との加水分解保護付加物を形成しない。
【００３８】
本発明の別の側面は、標的核酸配列が試料に存在するか決定する方法であって：
ａ）保護プローブにハイブリダイズしている検出プローブを含む反応混合物を製造し、ここで検出プローブは、化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を含み、そして保護プローブは、改変から該標識を保護する；そして
ｂ）該反応混合物を該試料に提供し、そして該標的配列が該試料に存在する指標として、検出プローブが、検出条件下で、該標的配列にハイブリダイズしているか検出する、
工程を含む、前記方法を記載する。好ましくは、保護プローブは、標識との加水分解保護付加物を形成しない。
【００３９】
本明細書に多様な実施例が記載される。これらの実施例は、いかなる点でも、請求される発明を限定することを意図しない。したがって、請求項に他に明記されない限り、本明細書中の１つ以上の実施例への言及は、請求される発明を示される実施例に限定しない。
【００４０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図、本発明の説明、実施例、および請求項から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、検出プローブを保管し、そして試料中の標的核酸配列の存在を検出するのに有用な組成物および方法を特徴とする。好ましい組成物は、化学的または酵素的改変に影響を受けやすい標識を、こうした改変から保護し、そして／または検出プローブが核酸増幅を阻害する能力を減少させる保護プローブを含む。
【００４１】
標識保護ハイブリダイゼーション複合体
本明細書に提供される手引きに基づき、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を製造し、検出プローブ上に存在する、１つまたはそれ以上の影響を受けやすい標識を、化学的または酵素的に該標識を改変することが可能な剤を含む水性溶液中で、改変から保護することが可能である。影響を受けやすい標識の改変からの保護は、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体により製造される保護的ハイブリダイゼーション微小環境により、達成される。
【００４２】
好ましくは、影響を受けやすい標識を、水素結合に関与する基、例えばヌクレオチド塩基の間の、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体の内部に配置する。異なる態様において、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体は、ハイブリダイゼーション複合体に存在するいかなる影響を受けやすい標識の各側にも、少なくとも３、少なくとも５、または少なくとも７の水素結合に関与する基を含む。
【００４３】
プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体における標識の安定性に関する要因は、異なる参考文献、例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号、およびＮｅｌｓｏｎら，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  Ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”：Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，中，（Ｋｒｉｃｋａ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９２）ｐｐ．２７５−３１１（共に本明細書に援用される）に論じられる。本明細書に提供される開示に基づき、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体における標識保護に、こうした要因を適用してもよい。
【００４４】
保護プローブは、標識との加水分解保護付加物を形成することなく、化学的または酵素的改変から標識を保護することが可能である。検出法前に改変から標識を保護するための付加物形成の使用は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第４，９５０，６１３号に記載され、該参考文献は、本明細書に援用される。検出プローブ標識を保護するのに、付加物形成剤を用いて保護付加物を形成するより、ハイブリダイゼーション複合体を形成することの利点には、検出プローブ標識を保護基（保護プローブ）から除去し、標的核酸の存在を検出する検出プローブの使用を促進することが可能であるという容易さが含まれる。
【００４５】
増幅
本発明を用い、保護プローブにハイブリダイズした検出プローブを、増幅前に試料に提供してもよい。検出プローブが増幅に干渉する能力は、検出プローブが保護プローブにハイブリダイズしている際、阻害されている。
【００４６】
好ましくは、本発明の本側面は、等温増幅を使用する。より好ましくは、等温増幅は、検出プローブ：保護プローブＴｍ以下の温度で行われる。等温増幅技術は当該技術分野において周知であり、そして例は、上記の「発明の背景」に提供される。より好ましくは、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体は、転写に基づく増幅と組み合わせて用いられる。
【００４７】
より好ましくは、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体に存在する検出プローブは、ハイブリダイゼーション複合体により、化学的または酵素的改変から保護される標識を含む。
【００４８】
検出プローブを増幅前に試料に提供すると、試薬を添加する必要がある工程の数を減少させることにより、検出法が簡単になる。しかし、増幅核酸に対するハイブリダイゼーションに利用可能な検出プローブの存在は、増幅された核酸のさらなる増幅を阻害する可能性がある。検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体に存在する検出プローブは、増幅された核酸にハイブリダイズするのに利用不可能である。
【００４９】
増幅後、増幅された核酸を含む環境のストリンジェンシーを上昇させ、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体から検出プローブを分離する。例えば、熱を適用し、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を不安定化させる一方、安定な検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体に適した環境を提供してもよい。さらに、増幅により製造された標的核酸数の増加は、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の形成を進めるのを補助する。
【００５０】
検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、好ましくは、増幅条件中用いられる温度より、少なくとも約２℃高い。異なる態様において、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、増幅条件中用いられる温度より、少なくとも約５℃、または少なくとも約１０℃高い。
【００５１】
標的配列偏向
検出プローブは、ハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与える異なる設計考慮を用い、保護プローブとより、標的配列と、より安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するよう、標的核酸配列に偏向させてもよい。こうした考慮には、相補性の度合い、相補認識基の種類、および骨格構造が含まれる。これらの考慮の影響は、環境条件に応じ、異なる。
【００５２】
相補性の度合いは、保護プローブ上および標的核酸上に存在する基と水素結合する、検出プローブ上に存在する基の数を考慮する。異なる技術を用い、保護プローブに対するより、標的核酸に対し、より高い度合いの相補性を有するよう、検出プローブを設計してもよい。こうした技術には、例えば、検出プローブが保護プローブとミスマッチを有するが、標的核酸とミスマッチを持たない検出プローブの設計、および非ヌクレオチドリンカーの使用が含まれる。異なる態様において、保護プローブは、検出プローブより短く、そして保護プローブは、検出プローブに完全には相補的でない。
【００５３】
非ヌクレオチドリンカーの例には、多糖、ペプチド、ポリペプチド、および核酸に水素結合することが可能なヌクレオチド窒素性塩基を欠く、糖リン酸ヌクレオチド骨格が含まれる。さらなる例は、Ａｒｎｏｌｄら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０３１７３号、国際公開ＷＯ  ８９／０２４３９、および米国特許第５，５８５，４８１号に提供され、これらは共に、本明細書に援用される。
【００５４】
検出プローブおよび保護プローブに存在する基の種類は、異なる窒素性塩基の間の水素結合の度合いなどの要因も考慮することにより、標的核酸配列に対し、検出プローブを偏向させるよう、選択してもよい。例えば、Ｇ−Ｃ対形成または２，６ジアミノプリン−チミン対形成は、Ａ−Ｔ対形成およびイノシンなどの普遍的塩基との対形成より強い。検出プローブは、保護プローブと比較し、標的核酸配列に存在するヌクレオチドと、増加したＧまたはＣ対形成を有するよう、設計してもよい。
【００５５】
保護および検出プローブ骨格の組成は、標的核酸配列に対し、検出プローブを偏向させるよう、異なる方式で調整してもよい。こうした骨格の例には、糖−ホスホジエステル型結合、例えばリボおよびデオキシリボ核酸またはその誘導体に存在するもの；並びにペプチド結合、例えばペプチド核酸に存在するものが含まれる。
【００５６】
ペプチド核酸は、対応するＤＮＡ配列とよりも、ＲＮＡと、より安定したハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能である。したがって、検出プローブは、例えば、ペプチド核酸基を含む検出プローブおよびＤＮＡで構成される保護プローブを用いることにより、ＲＮＡ標的核酸配列に対し、偏向させることが可能である。
【００５７】
糖−ホスホジエステル型結合の場合、糖基および２つの糖基を連結する結合は、ハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与えるであろう。糖が有する可能性がある影響の例は、２’−メトキシ置換ＲＮＡで見られるものである。２’−メトキシ含有核酸は、一般的に、対応するＤＮＡ配列とより、ＲＮＡと、より安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する。別の例は、２’−フルオロ置換ＲＮＡであり、これは２’−メトキシ置換ＲＮＡと同じ種類の影響を有する。
【００５８】
骨格がハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与える可能性がある方式の例には、電荷密度および２つの鎖の間の物理的会合に影響を与えることが含まれる。大きな（ｂｕｌｋｙ）基由来の立体相互作用は、ハイブリダイゼーション複合体安定性を減少させる可能性がある。ホスホロチオ酸エステルなどの基は、ハイブリダイゼーション複合体安定性を減少させる可能性があり、一方、非荷電基、例えばメチルホスホン酸エステルは、ハイブリダイゼーション複合体安定性を増加させる可能性がある。
【００５９】
検出条件
検出条件を用い、保護プローブ：検出プローブハイブリダイゼーション複合体を不安定化し、そして検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする環境を提供する。適切な検出条件の選択は、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍ、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体Ｔｍ、およびこうしたハイブリダイゼーション複合体のＴｍ間の相違などの要因を考慮する。
【００６０】
アッセイの組成に応じ、ハイブリダイゼーション複合体のＴｍは異なるであろう。アッセイ要因、例えば塩濃度および変性剤の存在は、既定のハイブリダイゼーション複合体のＴｍに影響を与える。こうした要因は当業に周知である。
【００６１】
検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、好ましくは、検出条件中に用いられる温度より、少なくとも約３℃高い。異なる態様において、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、検出条件中に用いられる温度より、少なくとも約５℃、または少なくとも約１０℃高い。
【００６２】
検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、好ましくは、検出条件中に用いられる温度より、少なくとも約２℃低い。異なる態様において、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、検出条件中に用いられる温度より、少なくとも約５℃、または少なくとも約１０℃低い。
【００６３】
好ましくは、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍより、少なくとも約５℃高い。異なる態様において、検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体Ｔｍは、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体Ｔｍより、少なくとも約８℃、少なくとも約１０℃、または少なくとも約１５℃高い。
【００６４】
標識が存在するかの決定は、存在する検出可能標識と適合する技術を用いて行い、そして検出条件の変化を伴う可能性がある。検出可能標識、例えばアクリジニウムエステルが存在するか決定するための技術例は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号、およびＢｅｃｋｅｒら、米国特許第５，７３１，１４８号に提供され、これらは共に、本明細書に援用される。異なる種類の標識を検出するのに用いてもよい、さらなる技術は、当該技術分野において周知である。
【００６５】
保管および安定性
保護プローブを用い、化学的または酵素的改変に影響を受けやすい検出プローブ標識を安定化し、標識化検出プローブの保管を促進することができる。保管中の検出プローブへの保護プローブの効率的なハイブリダイゼーションは、適切な条件およびプローブ濃度を用い、達成することが可能である。
【００６６】
好ましくは、保護プローブは、検出プローブに対し、過剰量で用いられる。異なる態様において、保護プローブは、検出プローブに対し、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍、過剰である。
【００６７】
好ましくは、保管は、保護プローブ：検出プローブＴｍより、少なくとも約１０℃、または少なくとも約２０℃低い温度で、溶液中で行われる。
検出プローブに対する保護プローブの効率的なハイブリダイゼーションを達成するためのさらなる考慮には、ｐＨ、緩衝剤の存在、塩濃度、および温度が含まれる。アクリジニウムエステル標識のための保管条件の例は、ｐＨ約５．１に緩衝され、そして約４℃の温度の２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液（以下の実施例項を参照されたい）である。本出願に基づき、アクリジニウムエステルおよび他の種類の標識の他の適切な保管条件が容易に得ることが可能である。
【００６８】
１つの態様において、保管条件は、約４℃および約４２℃の間の温度を使用する。一般的に、検出プローブ標識安定性を増加させるには、より低い温度が有用である。より低い温度を使用する不都合な点は、冷蔵の必要性である。保護プローブを用い、より低い温度を使用することなく、検出プローブ標識を安定化することが可能であり、そして室温で検出プローブ標識を安定化することが可能である。異なる態様において、保護および検出プローブは、約１６℃ないし約３０℃、約１６℃ないし約２５℃、約１８℃ないし約３０℃、および約１８℃ないし約２５℃の温度範囲を有する環境で保管する。
【００６９】
保護プローブを用い、将来の使用のために、検出プローブ標識を保管することが可能な時間を増加させることが可能である。異なる態様において、保護および検出プローブは、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約２週間、少なくとも約２ヶ月、および少なくとも約６ヶ月、共に保管される。さらなる態様において、保護および検出プローブは、６ヶ月以内、４ヶ月以内、２ヶ月以内、１ヶ月以内、および２週間以内、保管される。
【００７０】
プローブ構築
保護および検出プローブは、骨格により共に連結されているヌクレオチド塩基認識基で構成される、核酸結合領域を含む。ヌクレオチド塩基認識基は、核酸に存在するヌクレオチドに水素結合することが可能であるように配置される。
【００７１】
保護および検出プローブはまた、核酸結合領域の一部でない基も含んでもよい。こうした基の例は、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体または検出プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体に加わらない、保護および検出プローブの末端に位置するヌクレオチド、または他の種類の基である。
【００７２】
検出または保護プローブに存在する、既定のヌクレオチド塩基認識基は、特定のヌクレオチド（例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル）に相補的であり、そしてしたがって、そのヌクレオチドと水素結合することが可能であってもよい。ヌクレオチド塩基認識基はまた、異なるヌクレオチド類と水素結合することが可能であってもよい。例えば、イノシンがヌクレオチド塩基認識基である場合、異なるヌクレオチド塩基類と水素結合することが可能である。
【００７３】
好ましいヌクレオチド塩基認識基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルと水素結合することが可能な、窒素性プリンまたはピリミジン塩基、あるいはその誘導体である。こうした認識基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびその誘導体が含まれる。誘導体の例には、修飾プリンまたはピリミジン塩基類、例えばＮ4−メチルデオキシグアノシン、天然プリンおよびピリミジン塩基類の代わりに用いられるデアザまたはアザプリンおよびピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、並びに２、６または８位に改変されたまたは置き換えられた置換基を有するプリン塩基類が含まれる。例えばＣｏｏｋ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号、国際公開第ＷＯ  ９３／１３１２１号（本明細書に援用される）を参照されたい。さらなる例には、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、Ｏ４−アルキル−ピリミジン類が含まれる（例えば、本明細書に援用されるＴｈｅ  Ｇｌｅｎ  Ｒｅｐｏｒｔ、第１巻（１９９３）を参照されたい）。
【００７４】
保護および検出プローブ骨格は、各々、同一の、または異なる基で構成されていてもよい。骨格基の例には、糖−ホスホジエステル型骨格基およびペプチド核酸骨格基が含まれる。
【００７５】
構造Ｉは、糖基がペントフラノシル基である、糖−ホスホジエステル型骨格を例示する。糖基は、ホスホジエステル結合または他の適切な結合などの結合により、共に連結されている。
【００７６】
構造Ｉ
【００７７】
【化１】
0004772966.tif 000002
【００７８】
Ｘは２つの糖を連結する基を表す。Ｘの例には、−ＯＰ（Ｏ）2Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）2ＮＨ−、−ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ3）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）2ＮＨ−が含まれる。本明細書に提供される他の例のように、当該技術分野において周知のまたは入手可能となる、他の均等物もまた用いてもよい。
【００７９】
Ｙ1およびＹ2は、独立に選択される基である。Ｙ1およびＹ2の例には、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、ハロゲン、およびＣ1−Ｃ6アルキルが含まれる。好ましくは、Ｙ1およびＹ2は、独立に、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、またはＯＣＨ3のいずれかである。Ｃ1−Ｃ6アルキルおよびＣ1−Ｃ4アルコキシは直鎖、分枝、または環状である基を含んでもよい。
【００８０】
塩基1および塩基2は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、または相補的な核酸に隣接する塩基の相補的塩基対形成を阻害しない基に水素結合することが可能なヌクレオチド塩基認識基である。好ましくは、塩基1および塩基2は：アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル、あるいは相補的な核酸に隣接する塩基の相補的塩基対形成を阻害しない基からなる群より独立に選択される。相補的塩基対形成を阻害しない基の例には、より小さい基、例えば水素、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ1−Ｃ4アルコキシが含まれる。
【００８１】
Ｒ1およびＲ2は独立に選択される基を表す。Ｒ1およびＲ2の例には、さらなる糖−ホスホジエステル型基、水素、ヒドロキシ、ペプチド核酸、リン酸、チオリン酸、Ｃ1−Ｃ6アルキル、逆転（３’−３’）ヌクレオチド、３’−デオキシヌクレオチド、多糖、ポリペプチド、ペプチド、およびＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６９６，２５１号に記載されるものなどの非ヌクレオチドリンカーが含まれる。
【００８２】
構造Ｉ分子の誘導体もまた、検出または保護プローブの構成要素として用いることが可能である。例えば、検出および保護プローブは、結合部分により連結しているシクロブチル部分を有してもよく、ここで該シクロブチル部分は、それに結合する複素環式塩基を有する。例えば、Ｃｏｏｋら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１５７９号、国際公開第ＷＯ  ９４／１９０２３号（本明細書に援用される）を参照されたい。
【００８３】
本発明の態様において、保護および検出プローブは、各々、ポリヌクレオチドまたはその誘導体である。「ポリヌクレオチドまたはその誘導体」は、Ｘが−ＯＰ（Ｏ）2Ｏ−であり；Ｙ1およびＹ2がＨ、ＯＨ、ＯＣＨ3、およびＦからなる群より独立に選択される基であり；塩基1および塩基2が：アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より独立に選択され；そして該分子の末端部分が、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、リン酸、チオリン酸、逆転ヌクレオチド、および３’デオキシヌクレオシドからなる群より独立に選択されるＲ1およびＲ2を含む、構造Ｉ反復単位で構成される。
【００８４】
別の種類の骨格はペプチド核酸に存在するものである。ペプチド核酸はＤＮＡ類似体であり、デオキシリボースリン酸骨格が、偽ペプチド骨格により置き換えられている。ペプチド核酸は、各々本明細書に援用される、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：５−２３（１９９６）、およびＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１９５号、国際公開第ＷＯ  ９５／３２３０５号に記載されている。
【００８５】
ペプチド核酸の例は、構造ＩＩに例示されるようなＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位で構成される。
構造ＩＩ
【００８６】
【化２】
0004772966.tif 000003
【００８７】
Ｒ1、Ｒ2、および塩基1は、構造Ｉ型分子に関し記載される通りである。
保護および検出プローブは、標準的技術を用い、製造することが可能である。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの有機合成を記載する刊行物には、オリゴヌクレオチドの有機合成を概説する、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１−５章（１９９１）；標準的ホスホロアミダイト固相化学反応を用いたオリゴヌクレオチドの有機合成法を記載する、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ中，１５４：２８７（１９８７）；ホスホロチオ酸エステル結合を含む修飾オリゴヌクレオチドの有機合成法を記載する、Ｂｈａｔｔ、米国特許第５，２５２，７２３号；およびメチルホスホン酸エステル結合を含む、異なるヌクレオチド間結合を有する修飾オリゴヌクレオチドの有機合成を記載する、Ｋｌｅｍら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７６３０号、国際公開第ＷＯ  ９２／０７８６４号（これらの参考文献は各々本明細書に援用される）が含まれる。
【００８８】
異なる種類の保護および検出プローブを製造するのに用いることが可能な技術を記載するさらなる参考文献には、Ｃｏｏｋ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号、国際公開第ＷＯ  ９３／１３１２１号；Ｍｉｌｌｅｒら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１５７号、国際公開第ＷＯ  ９４／１５６１９号；ＭｃＧｅｅら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６８０７号、国際公開第ＷＯ  ９４／０２０５１号；Ｃｏｏｋら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１５７９号、国際公開第ＷＯ  ９４／１９０２３号；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４：５−２３（１９９６）；およびＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１９５号、国際公開第ＷＯ  ９５／３２３０５号（これらの参考文献は各々本明細書に援用される）が含まれる。
【００８９】
本発明の好ましい態様において、保護プローブおよび検出プローブは、各々、所望により修飾されたオリゴヌクレオチドで構成される。所望により修飾されたオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸、改変糖基、改変ホスホジエステル結合、および／または改変窒素性塩基を含んでもよい。好ましい修飾には、アデニン、グアニン、チミンまたはシトシンに水素結合することが可能な、異なるプリンまたはピリミジン窒素性塩基、あるいはその誘導体；異なる糖部分、例えば２’アルコキシリボース、２’ハロリボースおよびシクロブチル；異なるヌクレオチド間結合、例えばメチルホスホン酸エステル、およびホスホロチオ酸エステル；およびブロッキング基が含まれる。好ましくは、存在する場合、２’アルコキシリボースは２’メトキシリボースであり、そして存在する場合、２’ハロリボースは２’フルオロリボースである。
【００９０】
より好ましくは、保護プローブおよび検出プローブは：２’−メトキシリボース、２’−ハロリボース、メチルホスホン酸エステル結合、ホスホロチオ酸エステル結合、および３’ブロッキング基からなる群より独立に選択される、１つまたはそれ以上の修飾を含む、各々、所望により修飾されたオリゴヌクレオチドである。
【００９１】
増幅中に存在する保護および検出プローブは、好ましくは、ポリメラーゼブロッキング基である。ブロッキング基は、典型的には、ブロッキング基の添加または形成前に３’ＯＨを含む、ヌクレオチドまたはその誘導体で構成されるプローブの末端３’端に位置する。末端３’ＯＨにブロッキング基を結合させることにより、３’ＯＨ基は、もはや、重合反応においてヌクレオシド三リン酸を受け入れるのに利用可能でなくなる。ブロッキング基は、例えば、末端ヌクレオチドから３’ＯＨを除去することにより、形成することが可能である。
【００９２】
多くの異なる基を付加し、プローブの３’端が重合反応に用いられるのを妨げてもよい。こうした基の例には、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオ酸エステル、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸、３’デオキシヌクレオシド（例えばコルジセピン）、および逆転ヌクレオチドが含まれる。
【００９３】
アルキルブロッキング基は、直鎖、分枝、および／または環状であってもよい、長さ１２炭素までの飽和炭化水素である。より好ましくは、アルキルブロッキング基は、直鎖、分枝、および／または環状であってもよい、Ｃ2−Ｃ6アルキルである。
【００９４】
保護および検出プローブの全体の長さに関する異なる態様において、プローブは、好ましくは、長さ約８ないし約４０、約８ないし約３５、約８ないし約２５、約８ないし約２０のヌクレオチドおよび／または所望により修飾されたヌクレオチドである。
【００９５】
検出可能標識
標的核酸配列の存在を検出するのに、多くの異なる標識を用いてもよい。こうした標識の例には、発光分子、酵素、補因子、酵素基質、およびハプテンまたは他のリガンドが含まれる。
【００９６】
検出プローブが標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするのを妨げない、適切な標識を選択すべきである。したがって、標識は、検出プローブが、標的配列および試料に存在する他の核酸の間を区別することを妨げるべきでない。
【００９７】
本発明で使用するための好ましい標識は、発光標識、例えば蛍光または化学発光標識である。より好ましくは、化学発光標識を用いる。
化学発光標識は、加熱および酸化などの化学反応により、引き起こされ光を発することが可能であり、一方、蛍光標識発光は、光により誘発されることが可能である。化学反応により引き起こされ光を発することが可能な標識は、一般的に蛍光を発することが可能であるが、いくつかの場合、光により「化学発光」標識を誘発すると、化学発光より少ない発光が生じる可能性がある。したがって、化学発光標識はまた、一般的に、蛍光標識でもある。発光標識の例およびその使用は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号、およびＢｅｃｋｅｒら、米国特許第５，７３１，１４８号（共に、本明細書に援用される）に記載される。
【００９８】
化学発光標識は、崩壊し、それにより光を発する励起状態分子の形成を引き起こす、誘発剤により、光を発するよう、化学的に誘導される。発光を促進するため、化学発光標識は、化学反応が誘引する発光中、切断される不安定基を通じ、発光分子に連結されている脱離基を含む可能性がある。こうした不安定基の例には、エステル結合およびチオエステル結合が含まれる。
【００９９】
化学発光標識、こうした標識の製造、検出プローブへの標識の連結、および一般的に化学発光標識安定性に影響を与える要因の例は、当該技術分野において周知である。これらの要因には、化学発光分子の構造、分子の化学発光部分および脱離基上の置換基の種類および位置、並びに分子の発光部分に脱離基を連結する結合基の構造が含まれる。Ｂｅｈｅｓｈｔｉら、米国特許第５，２９０，９３６号；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、米国特許第４，９４６，９５８号；Ｌａｗら、米国特許第４，９１８，１９２号、第４，７４５，１８１号、第５，１１０，９３２号および第５，２４１，０７０号；ＭｃＣａｐｒａら、米国特許第５，２８１，７１２号；並びにＭｃＣａｐｒａら、欧州特許出願第８８１２１９１５．８号、欧州特許公開第０  ３２２  ９２６号（これらの出願は各々、本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１００】
好ましい化学発光分子は、標識検出可能性に影響を与える化学的または酵素的改変から保護プローブにより保護されることが可能な不安定基を有するものであり、そして以下の構造を有する：
構造ＩＩＩ
【０１０１】
【化３】
0004772966.tif 000004
【０１０２】
式中、アリール環系は、１つないし４つの環状基を含み、そして該基の１つは、結合炭素「ｃ」に連結し、より好ましくは、アリール環系は、陽性に荷電し、より好ましくは、アリール環系は、「ｃ」に連結した陽性荷電複素環式アリールを含み；複素環式アリールの例には、アクリジニウム、ベンズ[ａ]アクリジニウム、ベンズ[ｂ]アクリジニウム、ベンズ[ｃ]アクリジニウム、ベンズイミダゾールカチオン、キノリニウム、イソキノリニウム、キノリジニウム、環状置換キノリニウム、ピリジニウム、ピリミジニニウム、ピリダジニウム、ピラジニニウム、フェナトリジニウムおよびキノザリニウムが含まれ；
Ｒ2は、Ｓ、Ｏ、およびＮＨからなる群より選択され、好ましくは、Ｒ2はＯであり；
Ｒ3は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換リン、置換硫黄からなる群より選択され、好ましくは、Ｒ3は、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、より好ましくは、Ｒ3は、ＯまたはＳであり、最も好ましくは、Ｒ3は、Ｏであり；
Ｒ4は、アルキル、アルケニル、アリールからなる群より選択され、またはＲ3がハロゲンである場合、存在せず、好ましくは、Ｒ4は、アリールであり、より好ましくは、Ｒ4は、所望により置換されたフェニルであり；そして
Ｒ5は、Ｒ3がＮでない限り、存在せず；Ｒ3がＮである場合、Ｒ5は、水素、アルキル、アルケニル、およびアリールからなる群より選択され、好ましくは、Ｒ5は、存在しない。
【０１０３】
一般的に、標識は、Ｒ4に結合しているリンカーを通じ、検出プローブに連結されるであろう。しかし、標識は、Ｒ4以外の基に結合しているリンカーを通じ、検出プローブに連結されてもよい。
【０１０４】
陽性荷電構造ＩＩＩ分子は、対イオンとイオン的に関連している。多様な異なる陰イオン、例えばハロゲン、硫酸エステル、アルキル硫酸エステル、ハロ硫酸エステル、ハロホウ酸エステル、ハロ酢酸エステル、ハロリン酸エステル、およびリン酸エステルが対イオンとして働くことが可能である。
【０１０５】
「アセチル」は、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3を指す。
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含む、所望により置換された炭化水素を指し、直鎖、分枝鎖、および環状アルケニル基が含まれる。好ましくは、アルケニルは、２ないし１０の炭素を含み、そして１より多いヘテロ原子を含まない。ヘテロ原子は、好ましくは、窒素、硫黄、リン、および酸素からなる群より選択される。より好ましくは、アルケニルは、２ないし６炭素、より好ましくは、２ないし４炭素由来の低級アルケニルである。
【０１０６】
「アルキル」は、所望により置換された飽和脂肪族炭化水素を指し、直鎖、分枝鎖、および環状アルキル基が含まれる。好ましくは、アルキルは、１ないし１０の炭素を有し、そして１より多いヘテロ原子を含まない。ヘテロ原子は、好ましくは、窒素、硫黄、リン、および酸素からなる群より選択される。より好ましくは、アルキルは、１ないし６炭素、より好ましくは、１ないし４炭素由来の低級アルキルである。
【０１０７】
「アルコキシ」は、「−Ｏ−アルキル」を指し、ここで「アルキル」は上に定義された通りであり、そして「Ｏ」は酸素である。好ましくは、アルコキシはＯ−低級アルキルである。
【０１０８】
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含む、所望により置換された不飽和炭化水素を指し、直鎖、分枝鎖、および環状アルキニル基が含まれる。好ましくは、アルキニルは、２ないし１０の炭素を有し、そして１より多いヘテロ原子を含まない。ヘテロ原子は、好ましくは、窒素、硫黄、リン、および酸素からなる群より選択される。より好ましくは、アルキニルは、２ないし６炭素、より好ましくは、２ないし４炭素由来の低級アルキニルである。
【０１０９】
「アミド」はＣ（＝Ｏ）−ＮＨ2を指す。
「アミノ」は−ＮＨ2を指す。
「アリール」は、少なくとも１つの環を有する、所望により置換された芳香族基を指し、そして炭素環および複素環式アリール構造が含まれる。アリール置換基の例には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミド、アセチル、置換アセチル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、所望により置換されたフェニル、および所望により置換されたフェノキシが含まれ；所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたフェノキシは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミド、アセチル、置換アセチル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、およびハロゲンからなる群より、各々、独立に選択される、５つまでの置換基を有してもよい。
【０１１０】
「アリールオキシ」は、「−Ｏ−アリール」を指し、ここで「アリール」は上に定義された通りであり、そして「Ｏ」は酸素である。好ましくは、アリールオキシは、フェノキシである。
【０１１１】
「炭素環」は、芳香族環上の原子がすべて炭素原子である環構造を指す。炭素原子は、アリールに関し上述されるように、所望により置換されてもよい。好ましくは、炭素環アリールは、所望により置換されたフェニルである。
【０１１２】
「複素環式アリール」は、１またはそれ以上、好ましくは１ないし３のヘテロ原子を、芳香族環の環原子として有し、そして環原子の残りが炭素原子である、アリールを指す。適切なへテロ原子には、酸素、硫黄、および窒素が含まれる。複素環アリールの例には、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、およびイミダゾリルが含まれる。複素環式アリールは、アリールに関し上述されるように、所望により置換される。
【０１１３】
「ニトロ」はＮＯ2を指す。
「置換アセチル」は、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ（Ｒ）2、式中、各Ｒは単数または複数の非反応性化学原子である、但し、少なくとも１つのＲは水素でない、を指す。Ｒの例には、水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、フェニル、アミノ、カルボキシ、およびアルコキシが含まれる。
【０１１４】
「置換アミノ」は、Ｒが単数または複数の非反応性化学原子である−ＮＨ−Ｒを指す。Ｒの例には、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、フェニル、アミノ、カルボキシ、およびアルコキシが含まれる。
【０１１５】
「置換リン」は、Ｒが単数または複数の非反応性化学原子である−Ｐ（Ｒ）3を指す。Ｒの例には、Ｏ、＝Ｏ、Ｓ、ＣＨ3、およびアルコキシが含まれる。
「置換硫黄」は、化学量論にしたがい、そして非反応性である、水素以外の単数または複数の原子の存在を指す。
【０１１６】
「スルホニル」は、Ｒが単数または複数の非反応性原子であるＳ（Ｏ）2−Ｒを指す。Ｒの例には、低級アルケニル、低級アルキニル、フェニル、ハロゲン、アミノ、および置換アミノが含まれる。
【０１１７】
より好ましくは、化学発光標識は、構造ＩＶに例示されるような脱離基に連結した、所望により置換されたアクリジニウムで構成される。
構造ＩＶ
【０１１８】
【化４】
0004772966.tif 000005
【０１１９】
式中、Ｒ1は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリールからなる群より選択され：好ましくは、Ｒ1は低級アルキル、より好ましくはメチルであり；
ｎは、０、１、２、３、または４であり；好ましくは、ｎは０、１または２いずれかであり；
ｍは、０、１、２、３、または４であり；好ましくは、ｍは０、１または２いずれかであり；
各Ｘは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオール、アミド、アセチル、置換アセチル、所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたフェノキシからなる群より選択され；所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたフェノキシは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミド、アセチル、置換アセチル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、およびハロゲンからなる群より、各々、独立に選択される、５つまでの置換基を有してもよい。異なる態様において、各Ｘは、独立に、アルキルまたはアルコキシであり、各Ｘは、独立に低級アルキルまたは低級アルコキシであり、そして各Ｘは、独立に、メチルまたはメトキシであり；
各Ｙは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオール、アミド、アセチル、置換アセチル、所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたフェノキシからなる群より選択され；所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたフェノキシは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミド、アセチル、置換アセチル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、およびハロゲンからなる群より、各々、独立に選択される、５つまでの置換基を有してもよい。異なる態様において、各Ｙは、独立に、アルキルまたはアルコキシであり、各Ｙは、独立に低級アルキルまたは低級アルコキシであり、そして各Ｙは、独立に、メチルまたはメトキシであり；そして
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、構造ＩＩＩ分子に関し、上述された通りに定義される。
【０１２０】
さらなる態様は：ベンズ[ａ]アクリジニウム、ベンズ[ｂ]アクリジニウム、ベンズ[ｃ]アクリジニウム、ベンズイミダゾールカチオン、キノリニウム、イソキノリニウム、キノリジニウム、環状置換キノリニウム、ピリジニウム、ピリミジニニウム、ピリダジニウム、ピラジニニウム、フェナトリジニウムおよびキノザリニウムからなる群より選択される、複素環系を有する脱離基に連結された化学発光分子を提供し；ここで、環系の各環は、利用可能な各炭素が、各々、独立にＸ／Ｙ置換基を有することが可能であるように、構造ＩＶの分子と同じ方式で置換され、より好ましくは、各環は、０ないし２の置換基を含み、そして環の１つは、Ｒ1に連結しているＮおよび結合基に連結された炭素を含む、陽性荷電複素環であり；そして該分子は、保護プローブにより、化学的または酵素的改変から保護されることが可能である。
【０１２１】
【実施例】
本発明の異なる側面および態様を例示する実施例が以下に提供される。実施例は、異なる標識、保護プローブおよび検出プローブの適切性を決定するのに用いることが可能な技術を含む。これらの実施例は、請求される発明を限定することを意図しない。
【０１２２】
転写に基づく増幅条件
標的濃度が変化することを除き、標準的な転写に基づく増幅反応は、別に特記されない限り、１００μｌ反応体積中に、３０  ｐｍｏｌ／反応の明記されるＴ７プロモーター−プライマー、３０  ｐｍｏｌ／反応の明記されるプライマー、３５  ｍＭ  ＫＣｌ、７５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５、９  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．５、２０  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１  ｍＭ  ｄＡＴＰ、１  ｍＭ  ｄＣＴＰ、１  ｍＭ  ｄＧＴＰ、１  ｍＭ  ｄＴＴＰ、４  ｍＭ  ＡＴＰ、４  ｍＭ  ＣＴＰ、４  ｍＭ  ＧＴＰ、４  ｍＭ  ＵＴＰ、５％  ｗ／ｖ  ＰＶＰ、１０％  ｖ／ｖ  グリセロール、１２．５  ｍＭ  ＮＡＬＣ、０．７５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２（Ｓｉｇｍａ）、０．００２５％  フェノールレッド、１００−２００  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ単位の逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）および約５００  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を含んだ。
【０１２３】
Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐの転写に基づく増幅条件は、およそ０．１  ｐｍｏｌの明記されるアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識化プローブを添加した以外、上記と同一であり、該プローブは、酵素試薬と共に、転写に基づく増幅反応に添加した。保護プローブを用いる場合、ＡＥ標識化プローブは、転写に基づく増幅反応に、酵素試薬を添加する前に、明記される量の示される保護プローブにハイブリダイズさせた。
【０１２４】
１００μｌ増幅反応には、２５μｌの増幅試薬を個々の試験管に分注した後、２００μｌのミネラルオイルを添加した。標的ＲＮＡ（標的生物から単離したｒＲＮＡ）を、水で適切なコピー数に希釈し、そして５０μｌ体積中に添加した。反応を９５℃で（水槽中で）１０分間インキュベーションした後、４２℃に移し、５分間インキュベーションした。その後、標識化検出プローブまたは保護プローブを含むまたは含まない、逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む酵素試薬（２５μｌ）を添加し、そしてその後、反応試験管を４２℃でさらに６０−１２０分間インキュベーションした。反応は、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．０５  Ｍ  コハク酸リチウム  ｐＨ  ５、０．６  Ｍ  塩化リチウム、１％  ｗ／ｖ  ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０  ｍＭ  ＥＧＴＡ）の添加により終結させ、これがアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）検出法の最初の工程であった。
【０１２５】
ＨＰＡ検出
アンプリコン製造は、増幅反応後に添加されるか、または増幅酵素試薬と共に含まれる（Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ）、ＡＥ標識化オリゴヌクレオチド検出プローブとのハイブリダイゼーションにより検出した（例えば、本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号を参照されたい）。いくつかの例では、１つまたはそれ以上の非標識化ヘルパーオリゴヌクレオチドを用い、標的配列を有する核酸に対するハイブリダイゼーションを促進した。（例えば、Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，０３０，５５７号を参照されたい。）
転写に基づく反応後、添加した標識化検出プローブのハイブリダイゼーションは、またはＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐに関しては、ハイブリダイゼーション緩衝液を含む溶液中で、６０℃で１０分間行った。ハイブリダイゼーション緩衝液は、通常、標識化検出プローブを含む２Ｘ  ストックとして作成し、そして等体積を各増幅反応に添加した。プローブを含まない同一のハイブリダイゼーション試薬を、保護プローブを含みまたは含まず、ＡＥ標識化プローブを含むＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ反応に添加し、その後、ハイブリダイゼーションを上述のように行った。６０℃１０分間のハイブリダイゼーション後、０．１５  Ｍ  四ホウ酸ナトリウム  ｐＨ  ８．５、および１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む選択試薬３００μｌ（３Ｘ反応体積）を各試験管に添加し、そして反応を６０℃でさらに１５分間インキュベーションした。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション複合体の検出および定量化は、発光測定装置（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用い達成した。該発光測定装置は、２つの試薬を自動的に注入し、第一の試薬は１  ｍＭ  硝酸および０．１％過酸化水素（ｖ／ｖ）で構成され、第二の試薬は１  Ｎ  水酸化ナトリウムで構成される。該試薬は、ＡＥ標識化オリゴヌクレオチドに存在する未改変アクリジニウムエステル由来の化学発光の形成を引き起こす。アッセイ結果は、発光測定装置により検出される光子の数の相対的測定値である、相対光単位（ＲＬＵ）で表した。
【０１２７】
核酸配列
【０１２８】
【化５】
0004772966.tif 000006
【０１２９】
配列番号１、２、９、１２および１５のオリゴヌクレオチドは、ＡＥ標識を含んだ。以下の実施例で用いた、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１および２と共に、保護プローブ、配列番号７、８、および１４は、ｎ−プロピル基により、末端３’ＯＨをブロッキングした。
実施例１：ＡＥ標識化プローブは、転写に基づく増幅条件中、安定である
ＲＮＡ骨格、配列番号１、またはＤＮＡ骨格、配列番号２いずれかを持つ、およそ０．１  ｐｍｏｌのＡＥ標識化プローブを、４２℃で、標準的な転写に基づく増幅条件中、６０分までインキュベーションした（増幅が起こらないように、混合物からＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを除いたことを除く）。増幅プライマー、配列番号３および４を各反応に含んだが、標的ＲＮＡはまったく添加しなかった。
【０１３０】
プローブを含む、転写に基づく増幅混合物のアリコットを多様な時点で抜き取り、そして発光測定装置で直接検出し、投入ＲＬＵに比較して残ったＲＬＵの量を決定し、そしてこのように、ＡＥ標識化プローブの安定性を概算した。本実験の結果（データ未提示）は、１時間後、ＲＬＵ約１０％の減少があったというものであった。
実施例２：Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ対プローブを含まない転写に基づく増幅
本実施例は、増幅反応完了後、ＡＥ標識化プローブを添加し、そしてハイブリダイズさせることにより検出される、通常の転写に基づく増幅を、Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ増幅と比較する。Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ増幅は、酵素試薬と共に添加されるＡＥ標識化プローブを含み、そしてしたがって、ＡＥ標識化プローブが増幅反応中に存在した。
【０１３１】
本実施例では、転写に基づく増幅条件は、最終体積が５０μｌであり、３０  ｐｍｏｌの代わりに各プライマー（配列番号３および４）１５  ｐｍｏｌを用い、そして増幅が０．０２％  ＢＳＡを含んだ以外、上述の標準的条件と同様であった。
【０１３２】
増幅反応（各６反復）は、ヒト型結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｒＲＮＡ標的０、５  ｆｇまたは２５  ｆｇ（０、２０００または１０，０００コピー）を用い、調製した。Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ反応では、０．１  ｐｍｏｌのＲＮＡプローブ、配列番号１を、酵素試薬と共に反応混合物に添加し、そしてしたがって、該プローブが増幅反応中に存在した。
【０１３３】
増幅後、１０μｌの通常またはＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ反応各々を、水で１００μｌに希釈し、そして上述のように、ＨＰＡにより検出した。Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ反応中の単位増幅物を増幅前に添加した標識化検出プローブのみを用いて検出した。通常増幅反応における単位増幅物は、０．１  ｐｍｏｌのＲＮＡプローブ、配列番号１またはＤＮＡプローブ、配列番号２に加え、２．５  ｐｍｏｌのＤＮＡヘルパープローブ、配列番号５および６を添加することにより、上述のプロトコルにしたがい、検出した。
【０１３４】
表１の結果は、Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ（ＰｉＡ）増幅反応で、有意な増幅および検出が起こるが、シグナルは、通常増幅反応後、別個にＨＰＡ検出した場合の約５−１０％であることを示す。
【０１３５】
表１
【０１３６】
【表１】
0004772966.tif 000007
【０１３７】
ＲＮＡプローブはまた、通常増幅およびＨＰＡより、Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐでより高いバックグラウンドシグナルを生じる。ＲＮＡプローブのみおよびＤＮＡプローブに加えヘルパープローブは、通常増幅／ＨＰＡ反応で、同様のＲＬＵ値を生じ、Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ反応からは、増幅効率の減少、または増幅中のプローブの損失のため、より低いシグナルが生じることが示された。
実施例３：ＡＥ標識化プローブのための保護プローブの設計および選択
本実施例は、ＡＥ標識と共に使用するための保護プローブの設計用の異なる要因の使用を例示する。こうした要因は、他の種類の標識に適用してもよい。
【０１３８】
保護プローブは、標的へのプローブのハイブリダイゼーションまで、通常、６０℃で、ＡＥ標識化プローブにハイブリダイズしつづけるよう、設計した。保護プローブの機能は、必要とされるだけ高い温度まで、ＡＥ標識を安定化するが、標的へのハイブリダイゼーションに干渉し、そしてＨＰＡ中、高いバックグラウンドシグナルを生じるのを避けることである。
【０１３９】
保護プローブは、好ましくは、保護するであろうＡＥ標識化プローブより短くなるよう設計され、ＡＥ標識化プローブが、ＨＰＡ中、保護プローブより、より容易に標的にハイブリダイズするであろうことを確実にするのを補助する。保護プローブは、好ましくは、計算ＴｍおよびＡＥ標識から５’および３’両方のＧ：Ｃ含量をつりあわせる。検出プローブに対する保護プローブの全体のＴｍは、必要な安定性を提供するのに十分に高いが、標的とプローブのＨＰＡ中、干渉しないのに十分に低いであろう。さらに、保護プローブがＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐに用いられる場合、３’端は、好ましくは遮断され、したがって、ＡＥ標識化プローブにハイブリダイズしている間、逆転写酵素により、伸長されることが不可能である。保護プローブは、通常、ＡＥ標識化プローブに対し、モル過剰で存在し、安定なハイブリダイゼーションを確実にする。
【０１４０】
いくつかのアッセイを行い、特異的ＡＥ標識化検出プローブのための保護プローブを性質決定する。第一は、プローブに対する最大の保護を生じる、ＡＥ標識化プローブに対する保護プローブのモル過剰を決定することである。これは、例えば、（上述されるように）計算されたＴｍ以下の温度で、多様な比の検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体のＨＰＡにより、行ってもよい。
【０１４１】
表２は、上述のように、保護プローブ、配列番号１４（本アッセイで標的として作用する）を用い、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２に対して、４２℃で行った、定量的ＨＰＡアッセイの結果を例示する。保護プローブ、配列番号１４は、ＡＥ標識化プローブに対し、ゼロから１００倍モル過剰の濃度範囲であった。
【０１４２】
表２
【０１４３】
【表２】
0004772966.tif 000008
【０１４４】
表２は、モル過剰の保護プローブ対ＲＬＵを比較し、シグナルが２倍過剰保護プローブで飽和することを示し、この濃度が、これらの条件下では、ほぼ最大の保護を生じることを示す。低濃度で最大安定化効果を持つ、優れた保護プローブが好ましく；２倍過剰は、非常に優れているとみなされる。
【０１４５】
次に、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体における標識の安定性を、保護プローブ候補の間で概算し、そして比較するべきである。ハイブリダイゼーション複合体における標識の安定性は、概算Ｔｍより低い温度で行われるＨＰＡの選択工程中、ＲＬＵが投入ＲＬＵの半分に達する時間を測定することにより、概算することが可能である。保護プローブがＡＥ標識化プローブよりモル過剰であり、そしてＡＥ標識化プローブの量が発光測定装置の直線範囲内でＲＬＵを生じるであろうように、条件を選択する。
【０１４６】
ＡＥ標識化プローブは、上述のように、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、過剰保護プローブにハイブリダイズさせ、その後、選択試薬を添加し、そして同一温度でインキュベーションする。アリコットをいくつかの時点で除去し、そして残存するＲＬＵのパーセントの対数を時間に対しプロットする。点の直線範囲を通りプロットされた直線が、対数（５０％）を通過する点を、標識加水分解のＴ1/2と呼ぶ。加水分解のＴ1/2の値がより大きいと、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体中で標識がより安定であることが示される。
【０１４７】
図１は、標識加水分解のＴ1/2を決定する例を提供する。ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２（０．２５  ｐｍｏｌ）を、標的として１０倍過剰の保護プローブ、配列番号１４と共に用いた。４２℃で加水分解を行い、そしてアリコットを除去し、そして０、５、１０、１５、３０、および４５分で発光測定装置を読み取った。「コントロール」は、同一ＡＥ標識化プローブであるが、保護プローブの非存在下のものを指す（標的なし）。コントロールのＴ1/2は、直線範囲を通りプロットされた直線が、対数（５０％）を通過する点である。
【０１４８】
図１で計算される標識加水分解のＴ1/2は、約５４分である。他のより短い保護プローブは、５分より短い、標識加水分解のＴ1/2値を生じ、したがって、保護プローブ、配列番号１４は、かなり、より安定であり、そしてしたがって好ましい。
【０１４９】
許容できる濃度の保護プローブおよび標識加水分解のＴ1/2値が同定された後、ＡＥ標識化プローブに対する保護プローブのＴｍを決定するべきである。これは、上述のように、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を形成し、希釈し、そしてアリコットに分け、アリコットを多様な温度でインキュベーションし、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体が融解温度で変性するのを可能にし、その後、概算Ｔｍより低い温度で選択試薬とインキュベーションし、非ハイブリダイズプローブを加水分解することにより、達成する。アリコットは、発光測定装置で読み取り、投入ＲＬＵのパーセント（１００ｘＲＬＵ／投入ＲＬＵ）対温度を各点に対しプロットし、そしてＲＬＵが投入ＲＬＵの５０％に達する温度をＴｍと呼ぶ。
【０１５０】
図２は、１０倍過剰保護プローブ、配列番号１４を標的として用いたＡＥ標識化プローブ、配列番号１２（０．２５  ｐｍｏｌ）のＴｍ決定を例示する。該方法は、２．５℃段階で、４０℃から５７．５℃の融解温度を用い、ハイブリダイゼーション緩衝液中で行った。図２は、パーセント投入ＲＬＵが本アッセイでは５０％に達したのみであり、したがって、Ｔｍは試験した最高温度より高いことを示す。推測を行い、Ｔｍを約５８℃と概算することが可能である。
【０１５１】
図２から概算される高Ｔｍにより、検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体が安定であり、そしてより高い温度で、安定性が優れていると予測されることが示唆された。しかし、保護プローブが、実際の標的に対するプローブの通常ＨＰＡに干渉しないことを確認すべきである。これを試験するため、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２（０．０１  ｐｍｏｌ）を、ハイブリダイゼーション緩衝液中、等モルから１００倍過剰の濃度範囲の保護プローブ、配列番号１４と、ハイブリダイズさせた。その後、上述のように、６０℃での通常ＨＰＡ反応で検出プローブ：保護プローブハイブリダイゼーション複合体を用い；陰性反応は、添加標的を含まず、そして陽性反応は、過剰の配列番号１３のオリゴヌクレオチド標的を含んだ。許容しうる結果は、陽性および陰性ＨＰＡシグナルが、保護プローブの存在下または非存在下で、ほぼ同じであり；特に陰性反応が、保護プローブの存在により、有意に増加しないものであろう。
【０１５２】
表３は、保護プローブ、配列番号１４が、通常ＨＰＡ条件において、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２に関し、陽性または陰性ＨＰＡに干渉しなかったことを示す結果を提供する。陽性ＨＰＡシグナルは、保護プローブの存在下または非存在下でほぼ同じであり、そして陰性ＨＰＡシグナルは、保護プローブなしに比べ、１００倍過剰までの保護プローブで、有意に増加しなかった。
【０１５３】
表３
【０１５４】
【表３】
0004772966.tif 000009
【０１５５】
最適実行には、表１−３並びに図１および２に立証されるように、必要な機能に一致した保護プローブを設計し、そして選択することが非常に有用である。保護プローブ、配列番号１４は、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２に関し、これらのアッセイでよく機能を果たし、そしてＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐにおいて、または液体ハイブリダイゼーション緩衝液中の長期保管のため、プローブを安定化させるのに、よく機能を果たすと期待されるであろう。
実施例４：Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐの転写に基づく増幅の効率は、保護プローブで改善される
反応のいくつかで、増幅開始時に含まれるＡＥ標識化プローブを、増幅反応に添加する前に、５倍または１０倍過剰の保護プローブとプレハイブリダイズさせること以外、実施例２と同様にＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ実験を行った。使用した保護プローブは、増幅中、ＡＥ標識化プローブにハイブリダイズしつづけるよう設計した。保護プローブへの検出プローブのハイブリダイゼーションは、検出プローブが、転写に基づく増幅中、アンプリコンにハイブリダイズするのを妨げ、したがって、検出プローブは、アンプリコンテンプレートに対する逆転写酵素伸長反応に干渉しないであろう。
【０１５６】
転写に基づく増幅のプライマー、配列番号１０および１１で生成された、鳥型結核菌（Ｍ．  ａｖｉｕｍ）ｒＲＮＡ単位増幅物に特異的なＡＥ標識化ＲＮＡプローブ、配列番号９は、ａ）通常ＨＰＡ検出では、増幅後、ハイブリダイゼーション緩衝液中に添加し；ｂ）増幅前に、それ自体を、酵素試薬中、反応混合物に添加し；またはｃ）増幅前に、酵素試薬中、反応混合物に添加する前に、５倍または１０倍過剰の保護プローブ、配列番号７または８に４２℃で３０分間プレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよび検出は、上述の通常ＨＰＡまたはＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐに関し、行った。結果を表４に示す。
【０１５７】
表４
【０１５８】
【表４】
0004772966.tif 000010
【０１５９】
「ＰＰＯ１」は、配列番号８を指し、そして「ＰＰＯ２」は、配列番号７を指す。「標的投入」は、増幅される鳥型結核菌ｒＲＮＡの量を指す。
保護プローブが、Ｐｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ増幅の阻害を減少させる有効性は、特に、２５  ｆｇ標的レベルで増幅された１０倍過剰のプローブにプレハイブリダイズさせた場合、明らかである。保護プローブを含まないＰｒｏｂｅ−ｉｎ−Ａｍｐ由来のシグナルは、約２７，０００  ＲＬＵであったが、ＡＥ標識化プローブが、保護プローブ１または保護プローブ２を用いて保護される場合、シグナルは、約３５０，０００ないし約５００，０００  ＲＬＵに上昇し、これは増幅効率の２０倍の増加であった。２５０  ｆｇのｒＲＮＡ標的でのシグナルは、おそらく、プローブがアンプリコンとの飽和に達してしまったため，それほど、より高くなかった。比較のため、通常ＨＰＡシグナルを示す。
実施例５：保護プローブは、保管中、ＡＥ標識化プローブの安定性を拡大する
相補的保護プローブにハイブリダイズしたＡＥ標識化プローブは、溶液中での保管の間、より安定である。本実施例は、実施例３で性質決定され、そして許容しうると予測された、標識化プローブ／保護プローブの組み合わせを用いた、標識化検出プローブの長期保管における安定性の増加を例示する。
【０１６０】
ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２（０．０１  ｐｍｏｌ）は、２倍過剰の保護プローブ、配列番号１４に、４２℃で３０分間プレハイブリダイズさせ、そして２ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で、４℃および２５℃で、６ヶ月まで保管した。−２０℃、４℃および２５℃で、２ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で保管した、保護プローブにハイブリダイズした標識化プローブの安定性を、標識化プローブなしのプローブに比較した。
【０１６１】
アリコットを多様な時点で抜き取り、そして標識化プローブの安定性を、過剰相補的標的（配列番号１３）を用いたＨＰＡにより、定量的に測定した。残存ＲＬＵの量を、第０日の最初のシグナルに比較した、残存ＲＬＵの割合としてプロットした。各保管条件由来のプローブの２つの異なるアリコットを維持し、そして各々に関し３反復を、各時点でＨＰＡによりアッセイした（各条件に関し、６反復由来のＲＬＵを平均した）。６ヶ月安定性研究の結果を図３に示す。
【０１６２】
保護プローブにハイブリダイズしたＡＥ標識化プローブに対し、ＡＥ標識化プローブ単独の時点を比較することにより、ＡＥ標識化プローブの安定性の劇的な増加が明らかである。ＡＥ標識化プローブは、−２０℃では、保護プローブなしで比較的安定であった。しかし、４℃では、保護プローブを含まない標識化プローブは、約１週間後、元来のシグナルの８０％に分解し、一方、保護プローブを含む場合、同じＡＥ標識化プローブは、６ヶ月後、元来のＲＬＵの８０％以上が保持された。さらに、保護プローブにハイブリダイズさせた場合、ＡＥ標識化プローブは、２５℃でも、６ヵ月後、元来のＲＬＵの８０％以上が保持された。保護プローブなしでは、プローブは、２５℃で、３日（最初の時点）以内に元来のシグナルの５０％を失った。
実施例６：２つの異なる保護プローブを用いたＡＥ標識化プローブの安定性
本実施例は、実施例５と類似であるが、異なるＡＥ標識化プローブを用いた実験を示し、そして２つの相補的保護プローブの１つにハイブリダイズさせた場合の、溶液中の安定性を比較する。ＡＥ標識化プローブ、配列番号１５（０．０１  ｐｍｏｌ）を、２０倍過剰の保護プローブ、配列番号１６（図４のＰＰＯａ）または１０倍過剰の保護プローブ、配列番号１７（図４のＰＰＯｃ）に、５０℃で８分間プレハイブリダイズさせた後、４２℃で８分間ハイブリダイズさせ、そして４℃および２５℃で、６ヶ月まで、２ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で保管した。
【０１６３】
−２０℃、４℃および２５℃で、２ｘハイブリダイゼーション緩衝液に保管した、保護プローブにハイブリダイズした標識化プローブの安定性を、保護プローブなしの標識化プローブに比較した。アリコットを多様な時点で抜き取り、そしてプローブの安定性を、過剰相補的標的（配列番号１８）を用いたＨＰＡにより、定量的に測定した。残存ＲＬＵの量を、第０日の最初のシグナルに比較した、残存ＲＬＵの割合としてプロットした。各保管条件由来の２つの異なるプローブのアリコットを維持し、そして各々に関し３反復を、各時点でＨＰＡによりアッセイした（各条件に関し、６反復由来のＲＬＵを平均した）。６ヶ月安定性研究の結果を図４に示す。
【０１６４】
保護プローブにハイブリダイズしたＡＥ標識化プローブは、保管中、保護プローブを含まない標識化プローブより、はるかに安定であった。保護プローブ（図４の「ＰＰＯａ」）を含む標識化プローブは、４℃または２５℃で、６ヶ月後、元来のシグナルの８０％以上を保持した。保護プローブ（図４の「ＰＰＯｃ」）を含む標識化プローブは、４℃で、６ヶ月後、元来のシグナルの８０％以上を保持したが、２５℃で、約３週間後、８０％以下に落ちた。これらの結果を、保護プローブを含まない標識化プローブに比較すると、この場合、２５℃で、１週間未満のうちに、そして４℃で、約３週間後に、元来のシグナルの８０％が失われた。
【０１６５】
本研究において、保護プローブ「ａ」は、保護プローブ「ｃ」より、有意に優れてＡＥ標識化プローブを安定化し；そして標識化プローブは、２５℃で保護プローブ「ａ」を用いた場合、４℃で保護プローブ「ｃ」を用いた場合とほぼ同程度に安定であった。これはおそらく、保護プローブ「ａ」が、保護プローブ「ｃ」よりも、より長く、そして検出プローブとハイブリダイズした場合、より高いＴｍを有したためであった。
【０１６６】
他の態様が請求項の範囲内である。したがって、いくつかの態様が記載されてきているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な修飾を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２を、標的としての過剰保護プローブ、配列番号１４と共に用いた、時間につれた検出可能シグナルの損失を例示する。パーセント投入ＲＬＵの対数を、時間に対しプロットした。
【図２】  図２は、標的として過剰保護プローブ、配列番号１４を用いた、ＡＥ標識化プローブ、配列番号１２のＴｍ測定を例示する。パーセント投入ＲＬＵを温度に対しプロットした。
【図３】  図３は、保護プローブが、異なる温度での保管中、標識化プローブの安定性に影響を与える能力を例示する。括弧内に提供される温度は、℃で表される。「−ＰＰＯ」は、保護プローブの非存在下での標識化プローブを指す。「ＰＰＯｃｃ」は、保護および検出プローブの存在を指す。
【図４】  図４は、異なる保護プローブが、異なる温度での保管中、標識化プローブの安定性に影響を与える能力を例示する。括弧内に提供される温度は、℃で表される。「−ＰＰＯ」は、保護プローブの非存在下での標識化プローブを指す。「ＰＰＯａ」は、標識化プローブおよび配列番号１６の保護プローブの存在を指す。「ＰＰＯｃ」は、標識化プローブおよび配列番号１７の保護プローブの存在を指す。
【配列表】
0004772966.tif 000011
0004772966.tif 000012
0004772966.tif 000013
0004772966.tif 000014
0004772966.tif 000015
0004772966.tif 000016
【図１】
0004772966.tif 000017
【図２】
0004772966.tif 000018
【図３】
0004772966.tif 000019
【図４】
0004772966.tif 000020