(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなることを特徴とする核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸と、または該核酸に相補的な核酸配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス抵抗性を高める機能を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸であって、
前記高ストリンジェントな条件は、洗浄工程における塩濃度が０．２×ＳＳＣであり、洗浄工程における温度が６５℃である、核酸。
【請求項３】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有することを特徴とする核酸。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
【請求項５】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス下で発現量が増加することを特徴とするタンパク質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、塩ストレス下で発現量が増加する新規タンパク質及びそれをコードする新規遺伝子に関する。
背景技術
地球上の乾燥地帯あるいは臨海部において、その多くの土壌中に塩が含まれ、植物の生育にとっては良好な環境とは言えない。こういった土地では作物の生育が不可能であったり、可能であっても満足のいく収穫が得られない等の問題がある。しかしながら、地球の温暖化による乾燥地帯の拡大や発展途上国の人口増加に対応するために、このような土地でも生育可能な作物の開発が強く望まれており、育種や遺伝子組換えによる耐塩性の作物の開発が急務である。
一方、地球上で生育するほとんどの植物は、様々な環境ストレス、例えば、高温、低温、乾燥、高塩等に曝されており、何らかの方法でこれらのストレスに対する抵抗性を発揮することにより生育を続けている。具体的には、植物がこれらの環境ストレスに曝された場合に、様々なストレス応答遺伝子が働き、細胞レベルで生理的な応答を行うことにより環境ストレスに対する抵抗性を示すことが知られており、植物がこれらのような機能を呈するために働くと考えられる遺伝子が、すでにサブトラクションハイブリダイゼーション法やディファレンシャルスクリーニング法により単離されている。
しかしながら、こうした環境ストレスに応答する遺伝子は、環境ストレス因子の違いや植物種の違いにより異なった発現誘導や抑制パターンを示すため非常に多くの種類の遺伝子が存在すると考えられており、未だこのような遺伝子が全て単離されるという状況には程遠く、現在これらの遺伝子の単離が精力的に行われている。
一方、塩ストレス抵抗性植物を作出又は育種するには、塩ストレス抵抗性に関与する遺伝子を植物細胞に人為的に導入することによって塩ストレス抵抗性形質転換植物を作出するかまたは塩ストレス抵抗性を示す植物から交配技術によって育種対象植物に前記の遺伝子を導入するかの方法がある。そのためには、塩ストレス抵抗性に関与する遺伝子を単離しその機能を明らかにする必要がある。
これまでに、塩ストレス下で発現誘導されるいくつかの遺伝子の存在が知られているが（Ｙａｏ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓａｌｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ−ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４９，９１５−９２９（１９９８），Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｈｅｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｏｈｎｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．Ｓａｌｉｎｉｔｙ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ−ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０，１５３−１７６（１９９８））、より高度な抵抗性を有する植物を開発するためには塩ストレス抵抗性に関与する遺伝子をさらに単離し、機能解析を進めることが重要であると考えられる。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされてものであり、塩ストレス下で発現量が増加し、植物に塩ストレス抵抗性を付与する機能を有する新規タンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供することを目的とする。
本発明者らは、このような目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、塩ストレス下で発現量が増加する新規遺伝子であるＳｕｂ４遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の塩ストレス下で発現が誘導される核酸は、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなることを特徴とする核酸である。
また、本発明の塩ストレス下で発現が誘導される核酸は、配列表の配列番号１に記載の核酸配列の一部からなることを特徴とする核酸である。
ここで、本発明の塩ストレス下で発現が誘導される核酸は、上記のいずれかに記載の核酸と、または該核酸に相補的な核酸配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸であってもよい。
さらに、本発明の塩ストレス下で発現が誘導される核酸は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有することを特徴とする核酸である。
また、本発明の塩ストレス下で発現が誘導されるタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質である。
ここで、本発明の塩ストレス下で発現が誘導されるタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス下で発現量が増加することを特徴とするタンパク質であってもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
また、本発明における「核酸」とは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又は誘導化された活性なＤＮＡもしくはＲＮＡでありうるポリヌクレオチドを指し、好ましくは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡをいう。
また、本発明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、２つの核酸断片が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることをいう。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することをいう。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
まず、本発明の核酸について説明する。
本発明の核酸は、塩ストレス抵抗性が高いオオムギ品種の根から見出され、単離されたものであり、塩ストレス下において発現量が増加する、または特異的に発現することを特徴とし、１３７７個の塩基を有する配列表の配列番号１に記載の核酸配列である。ここで、「単離された」とは、組換えＤＮＡ技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。
本明細書中、「塩ストレス下」とは、自然界において土壌中の塩化ナトリウム濃度が上昇し、植物の生育にとって不利な条件であることをいう。また、実験室においては、植物を育成するための培養液中に、通常の培養液に含まれる塩化ナトリウム濃度より高濃度の塩化ナトリウムを含む条件であることをいい、例えば１〜２０重量％の塩化ナトリウムを含む条件であることが好ましく、１〜１０重量％の塩化ナトリウムを含む条件であることがより好ましい。
また、本明細書中、「塩ストレス下において発現量が増加する」とは、通常の塩濃度から上記の塩ストレス下に曝露した場合にタンパク質または遺伝子の発現量が増加することをいう。この場合、通常の塩濃度下では前記タンパク質または遺伝子が全く発現しておらず、塩ストレス下で特異的に発現が見られる場合も含まれる。ここで、前記タンパク質または遺伝子の発現量の増加の多少は特に限定されない。
また、本発明の核酸は前記配列表の配列番号１に記載の核酸配列の一部からなる核酸であってもよい。ここで、「配列表の配列番号１に記載の核酸配列の一部からなる」とは、配列表の配列番号１に記載の核酸配列の一部を含めばその塩基数は特に限定されない。
さらに、本発明の核酸は、前記配列表の配列番号１に記載の核酸配列を有する核酸またはその一部からなる核酸と、若しくは前記核酸に相補的な核酸配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸配列であってもよく、この条件を満たす核酸であればその核酸配列は特に限定されない。具体的には、例えば、配列表の配列番号１に記載の核酸配列を構成する塩基において、一若しくは複数の欠失、置換、挿入、付加等がある核酸が挙げられる。ここで、欠失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い欠失、置換、挿入、付加も含む。
さらに、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸をコードする核酸配列を有することを特徴とする核酸であり、前記アミノ酸をコードする限りはその核酸配列は特に限定されない。
次に、本発明のタンパク質について説明する。
本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とし、３３１個のアミノ酸を有するタンパク質である。ここで、本発明のタンパク質は、前記配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス下で発現量が増加することを特徴とするタンパク質であってもよい。
すなわち、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸が置換、または欠失されたアミノ酸配列からなるタンパク質、或いは一若しくは複数のアミノ酸が挿入、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質にも塩ストレス下で発現量が増加する特徴を有するものがある。これらのタンパク質は本発明にかかる配列表の配列番号２に記載のタンバク質の変異タンパク質であり、前述の塩ストレス下で発現量が増加する特徴を有する限り本発明のタンパク質に包含される。
また、多くのタンパク質には糖鎖が付加され、アミノ酸を一若しくは複数変換することにより糖鎖の付加を調節することができる。配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の付加を調節されたタンパク質も上述の塩ストレス下で発現量が増加する特徴を有する限り本発明のタンパク質に包含される。
次に、本発明にかかる新規遺伝子を単離する好適な方法について説明する。
本発明にかかる新規遺伝子は、以下の（１）〜（７）のステップを経て単離することができ、（８）のステップにおいて、単離された遺伝子が塩ストレス抵抗性を示すことを確認することが可能である。
（１）塩ストレス下において発現量が増加するｃＤＮＡ断片の単離
塩ストレス下において発現量が増加するｃＤＮＡ断片を単離するには、対象となる植物の中で比較的塩ストレスに対して抵抗性が高いと考えられる品種（例えばオオムギのＫ３０５）及び比較的塩ストレスに対して抵抗性が低いと考えられる品種（例えばオオムギのＩ７４３）の遺伝子の発現量を比較することにより、塩ストレスに対して抵抗性が高いと考えられる品種において特異的にまたは強く発現している遺伝子を単離するという方法を採ればよい。また、これらの植物をさらに高塩濃度下にて塩ストレス下に曝すことにより、発現量が増加するような遺伝子を単離してもよい。具体的には、例えば、植物の種子を発芽させた後、培養液に５０〜１０００ｍＭの塩化ナトリウムを添加し１２時間生育させ、根を回収して試料として用いることができる。
次に、準備された試料から全ＲＮＡ及びｍＲＮＡを調製する。遺伝子を単離する対象となる植物組織（例えば根、葉、茎等）から全ＲＮＡを調製するには公知の方法で行えばよく、例えば（植物のＰＣＲ実験プロトコール、第５６頁、１９９９、秀潤社）に記載の方法を用いることができる。またこうして得られた全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法も公知の方法を用いることができ、例えば「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５」（ベリタス社製）に添付されたプロトコールに従って行うことができる。
こうして得られた全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを用いて、例えば、サブトラクションハイブリダイゼーション法やディファレンシャルスクリーニング法によって目的とする遺伝子の単離を行うことができる。前記サブトラクションハイブリダイゼーション法及びディファレンシャルスクリーニング法は公知の方法を用いて行えばよく、例えば「ＰＣＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（クローンテック社製）に添付されたプロトコール等に従って行うことができる。
（２）ノーザンハイブリダイゼーション解析（以下、ノーザン解析という）
単離した塩ストレス抵抗性オオムギ特異的遺伝子が実際に塩ストレス抵抗性オオムギにおいて発現量が増加しているかまたは特異的に発現しているかを確認するためには、単離した塩ストレス抵抗性オオムギ特異的遺伝子をプローブとしたノーザン解析を行うことができる。ノーザン解析は公知の方法で行うことができ、例えば（脱アイソトープ実験プロトコール▲１▼  ＤＩＧハイブリダイゼーション、第４５頁、１９９４、秀潤社）に記載された方法等に基いて行うことができる。
（３）塩ストレス下における塩ストレス抵抗性植物に特異的に発現するｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーは、（１）で準備したｍＲＮＡより公知の方法で作製することができ、例えば「Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（クローンテック社製）に添付されたプロトコール等に従って行うことができる。
（４）塩ストレス抵抗性植物特異的ｃＤＮＡの単離
塩ストレス抵抗性植物特異的ｃＤＮＡの単離は、上記のように塩ストレス抵抗性植物を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを塩ストレス抵抗性植物特異的プローブを用いてスクリーニングすることによって行うことができる。前記スクリーニングは公知の方法で行うことができ、例えば「ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ」（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添付されたプロトコールに記載の方法を用いればよい。
また、プローブとして用いる塩ストレス抵抗性植物特異的ｃＤＮＡ断片の標識は３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ等の放射性同位体または蛍光標識剤等を用いればよく、例えば、前記「ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ」に添付されたプロトコールに記載の方法を用いて標識すればよい。
（５）塩基配列の決定及び相同性検索
単離された遺伝子の塩基配列は公知の方法で決定することができ、例えば「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（パーキンエルマー社製）に添付されたプロトコール等に従って行うことができる。ここで決定された塩基配列に基いて、得られた塩基配列をデータベース（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等）を用いて相同性検索を行うことにより他の植物種から得られた既知遺伝子との相同性の有無やその程度を知ることが可能となり、得られた遺伝子が新規遺伝子であるか否かの判断を行うことが可能でなる。
（６）塩ストレス抵抗性植物特異的ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの単離
上記のｃＤＮＡからオープンリーディングフレームのみを単離するには、前記ｃＤＮＡにおいて開始コドン（ＡＴＧ）を含むオリゴヌクレオチドプライマー及び終始コドンを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅すればよい。このとき、前記２種のオリゴヌクレオチドプライマーの５’側に適当な制限酵素認識部位を導入したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、後述の発現ベクターへの導入が容易になる。ここで、「オープンリーディングフレーム」とは、ｃＤＮＡの核酸配列のうち、開始コドン（ＡＴＧ）から終始コドン（ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ）の距離が最も長い領域を意味する。前記のオープンリーディングフレームの単離方法は、例えば（植物のＰＣＲ実験プロトコール、第６９頁、１９９５、秀潤社）に記載の方法で行うことができる。
（７）塩ストレス抵抗性植物特異的ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの発現
（６）で単離された塩ストレス抵抗性植物特異的ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム領域を大腸菌発現ベクター（例えばｐＥＴ１５ｂ等のｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ）に導入したプラスミドを構築し、このプラスミドを大腸菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等）に導入し、形質転換した大腸菌株の培養液中にＩＰＴＧを添加することにより前記オープンリーディングフレームにコードされたタンパク質の発現誘導を行うことができる。前記の発現誘導は公知の方法で行うことができ、例えば「ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ」（ノバジェン社製）または（植物のタンパク質実験プロトコール、第９頁、１９９８、秀潤社）に記載された方法等を用いることができる。
（８）形質転換された大腸菌の塩ストレス抵抗性の測定
（７）で示したように、塩ストレス抵抗性に関与すると考えられる遺伝子産物が発現誘導された形質転換大腸菌を、塩化ナトリウム濃度を例えば１〜１０重量％含む培地中で培養し、その生育速度を測定することにより、前記の遺伝子が塩ストレス抵抗性に関与するか否かを確認することが可能である。
次に、上記で得られた遺伝子を植物に導入したトランスジェニック植物の作製について説明する。
上記で得られた遺伝子は、塩ストレス下によって発現が増加することにより、その遺伝子が存在する植物に塩ストレス抵抗性を付与する効果を有すると考えられる。したがって、本来塩ストレス抵抗性を有しない植物に遺伝子工学的手法を用いて前記の遺伝子を導入することができれば、塩ストレス抵抗性を有する植物を開発することが可能となる。
このようなトランスジェニック植物を作製する方法としては、まず、上記で得られた遺伝子を植物細胞用のクローニングベクターに挿入し、得られたプラスミドを塩ストレス抵抗性を付与したい植物に導入すればよい。ここで用いられるクローニングベクターとしては、例えば、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ及びｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ及びｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドが挙げられる。バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ）間に目的遺伝子を挿入し、大腸菌に導入して増幅させた後、プラスミドを精製しアグロバクテリウム属に属する細菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０１株等）に導入し、植物の形質導入用に用いればよい。前記プラスミドを前記細菌に導入する方法としては凍結融解法またはエレクトロポレーション法等が好ましく用いられる。
こうして得られた形質転換アグロバクテリウムを植物に感染させることにより植物の形質転換を行うことができる。前記形質転換の方法としては、リーフディスク法及びプロトプラスト法等によって行えばよい（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．，Ｆｒｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．Ｌ．，Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ，Ｄ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，１２２９−１２３１（１９８５），Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｊ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｍｏｔ，Ｋ．，Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｐ  ｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｉｃｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｎｕｒｓｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６，４０８−４１３（１９８７））。
一方、アグロバクテリウムを使用せず、目的とする遺伝子を直接植物に導入する方法を使用してもよく、これらの方法としては具体的には、例えば、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法及びマイクロインジェクション法等が挙げられる。
また、上記の遺伝子を導入する植物宿主としては、例えばオオムギ、イネ、トウモロコシ、タバコ、シロイヌナズナ、コムギ、ダイズ、トマト等の作物が挙げられるのみならず、これらの培養細胞、植物器官（例えば根、葉、花弁、根茎、種子等）及び植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）も挙げられる。
上記のようにして本発明の核酸を植物宿主に導入することにより、塩ストレス抵抗性を有するトランスジェニック植物を作出することが可能となる。
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（塩ストレス抵抗性オオムギの根及び塩ストレス感受性オオムギの根の調製）
塩ストレス抵抗性オオムギ品種であるＫ３０５及び塩ストレス感受性オオムギ品種であるＩ７４３の種子をそれぞれ発芽させ、１日静置した後、０．２５ｍＭ硫酸カルシウム溶液の入ったポットで２日間生育させ、さらに培養液（４ｍＭ  ＫＮＯ３、１ｍＭ  ＮａＮＯ３、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｐｐｍ  Ｆｅ、０．５ｐｐｍ  Ｂ、  ０．５ｐｐｍ  Ｍｎ、０．０５ｐｐｍ  Ｚｎ、０．０２ｐｐｍ  Ｃｕ、０．０１ｐｐｍ  Ｍｏ）で１日幼植物を生育させた。その後、培養液に最終濃度が１００ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、さらに１２時間生育させた後、根を収穫し液体窒素で凍結した。
（塩ストレス抵抗性オオムギの根及び塩ストレス感受性オオムギの根から全ＲＮＡ及びｍＲＮＡの調製）
塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５の根及び塩ストレス感受性オオムギ品種Ｉ７４３の根からの全ＲＮＡ及びｍＲＮＡの調製は以下のとおり行った。各オオムギの根を液体窒素中で凍結粉砕し、グアニジンイソチオシアン酸溶液（４Ｍ  グアニジンイソチオシアン酸、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％  Ｎ−ラウリルザルコシンナトリウム、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール）に懸濁して遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分、２０℃）した。得られた上清を塩化セシウム溶液に重層しさらに遠心分離（１００，０００ｒｐｍ、３時間、２０℃）した。ここで得られた沈殿をＴＥＳ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ）に溶解し、フェノール・クロロホルム抽出を行った後、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．５倍量のエタノールを加え、−２０℃で一晩放置した。一晩放置した溶液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後、得られた沈殿を水に溶解し全ＲＮＡサンプルとした。この全ＲＮＡサンプルを「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５」（ベリタス社製）を用いて、添付されたプロトコールに従ってｍＲＮＡを調製した。
（塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡ断片の単離）
塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５の根から得られたｍＲＮＡと塩ストレス感受性オオムギ品種Ｉ７４３の根から得られたｍＲＮＡとの差分となるｍＲＮＡを採取し、これを使用して塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡ断片を調製した。前記の塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡ断片の調製には「ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（クローンテック社製）を用い、以下に示すとおり前記ｃＤＮＡ断片の調製を行った。
まず、塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５の根から得られたｍＲＮＡ及び塩ストレス感受性オオムギ品種Ｉ７４３の根から得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次に、合成されたｃＤＮＡそれぞれを制限酵素ＲｓａＩで消化した。得られた塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５のｃＤＮＡを２つに分け、それぞれ異なった核酸配列を有するアダプターを前記ｃＤＮＡの両端にライゲーションした。前記ライゲーションが終了したｃＤＮＡそれぞれに過剰量の塩ストレス感受性オオムギ品種Ｉ７４３のｃＤＮＡを加えてハイブリダイゼーションを行った後、これらのハイブリダイゼーション終了溶液を混合し、さらに変性させ一本鎖になった塩ストレス感受性オオムギ品種Ｉ７４３のｃＤＮＡを加えてハイブリダイゼーションを行った。得られたハイブリダイゼーション終了溶液についてアダプター特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、塩ストレス抵抗性オオムギＫ３０５の根だけに存在するｃＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物であるｃＤＮＡ断片は「ｐＧＥＭ−Ｔ  ａｎｄ  ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（プロメガ社製）を用いてｃＤＮＡ断片ライブラリーを作製した。このライブラリーからｃＤＮＡ断片を調製し、「ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ」（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて標識したものをプローブとしてノーザン解析を行った。
前記ノーザン解析は以下のようにして行った。すなわち、塩ストレス抵抗性オオムギの根と塩ストレス感受性オオムギの根の全ＲＮＡを上記の方法で調製し、得られた全ＲＮＡを変性アガロースゲル（１．２％アガロース、６．３％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０））を用いて電気泳動を行った。アガロースゲル内で分画されたＲＮＡをナイロンメンブランに転写した後、上記で標識したｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。
前記ハイブリダイゼーションは以下のようにして行った。先ず、ハイブリダイゼーションバッファーでＲＮＡが転写されたナイロンメンブランをブロッキングした。その後、上記ハイブリダイゼーションバッファーに上記プローブを加え、５５℃で１６時間保温した。保温後、洗浄液（２Ｍ  Ｕｒｅａ、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて５５℃で１０分間の洗浄処理を２回、さらに、洗浄液により室温で５分間の洗浄処理を２回行った。洗浄後、ナイロンメンブランをＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液に室温で５分間浸した後、ｃＤＮＡと結合したバンドの検出を行った。その結果を図１に示す。図１中、レーン１は塩ストレス処理をしていないオオムギ品種Ｋ３０５の根から得られた全ＲＮＡを、レーン２は塩ストレス処理を１２時間行ったオオムギ品種Ｋ３０５の根から得られた全ＲＮＡを、レーン３は塩ストレス処理をしていないオオムギ品種Ｉ７４３の根から得られた全ＲＮＡを、レーン４は塩ストレス処理を１２時間行ったオオムギ品種Ｉ７４３の根から得られた全ＲＮＡを泳動した。
図１に示すとおり、塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡ断片（Ｓｕｂ４遺伝子）のｍＲＮＡは塩ストレス感受性オオムギ品種Ｉ７４３の根には存在せず、塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５の根に特異的に強く発現していた。また、塩ストレスに１２時間暴露した塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５の根において、Ｓｕｂ４遺伝子のｍＲＮＡは塩ストレスに暴露する前と比較して約２倍量の発現増加が認められた。これは、上記において単離された塩ストレス抵抗性オオムギｃＤＮＡ断片が、塩ストレス抵抗性オオムギＫ３０５の根で特異的に発現、機能し、かつ塩ストレスによって発現量が増加することを示している。
実施例２
（塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡの単離）
「Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（クローンテック社）及び「ｐＧＥＭ−Ｔ  ａｎｄ  ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（プロメガ社）を用いて、塩ストレス抵抗性オオムギ品種Ｋ３０５の根から得られたｍＲＮＡよりｃＤＮＡライブラリーを作製した。得られたＳｕｂ４遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ｃＤＮＡのスクリーニングを行った。
ハイブリダイゼーションは以下の条件で行った。すなわち、上記ｃＤＮＡライブラリーにおける各コロニーをナイロンメンブランに転写し、このナイロンメンブランをハイブリダイゼーションバッファーを用いてブロッキングした。上記Ｓｕｂ４遺伝子断片を「ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ」（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて標識したプローブを準備し、ブロッキングが終了したナイロンメンブランと５５℃で１６時間保温した。上記洗浄液を用いて５５℃で１０分間の洗浄処理を２回、さらに、洗浄液により室温で５分間の洗浄処理を２回行った。その後、ナイロンメンブランをＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液に室温で５分間浸した後、ｃＤＮＡと結合した陽性のコロニーを検出することにより、塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡを単離した。
実施例３
（塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳産物のアミノ酸配列の決定）
次に、得られた塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡであるＳｕｂ４遺伝子の塩基配列を決定した。塩基配列を配列表の配列番号１に示す。塩基配列の決定は「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（パーキンエルマー社）及びジェネティックアナライザー・ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０（パーキンエルマー社）を用いて行った。
ここで決定された塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡであるＳｕｂ４遺伝子の塩基配列により推定される翻訳産物のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。なお、この配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１の６４番目の開始コドン（ＡＴＧ）から１０５７番目の終始コドン（ＴＧＡ）までの塩基配列に相当する。
実施例４
（ホモロジー検索）
得られた塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡであるＳｕｂ４遺伝子及びこの塩基配列より推定されるアミノ酸配列を既知の遺伝子及びアミノ酸配列とデータベース上で比較し相同性の比較を行った。その結果、得られた遺伝子は核酸レベル及びアミノ酸レベルのいずれにおいても他の核酸やアミノ酸と高い相同性を示さず、新規遺伝子及び新規タンパク質であることが明らかとなった。
実施例５
（塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの単離）
上記Ｓｕｂ４遺伝子のオープンリーディングフレームの単離は、Ｓｕｂ４遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とし、６４番目の開始コドン（ＡＴＧ）を含むプライマー及び１０５７番目の終始コドン（ＴＧＡ）を含むプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することにより行った。ここで用いたプライマーはＥＸＮ１／Ｓｕｂ４：ｇｃａｇｃｔｇｃｔｇ  ｃｔｃａｔａｔｇｇａ  ａｃａａａａｔ（配列表の配列番号３）及びＥＸＣ１／Ｓｕｂ４：ｔｔｇａａｇｇｃａｇ  ｇａｔｃｃｔｃａｇｇ  ａａｇｔｃｃａ（配列表の配列番号４）である。なお、ＥＸＮ１／Ｓｕｂ４は、配列番号１に記載の４９番目から６０番目、６４番目から７５番目の配列に相補的であり、６１番目のＧがＣに、６２番目のＴがＡに、６３番目のＡがＴにそれぞれ置換されたものである。また、ＥＸＣ１／Ｓｕｂ４は、配列番号１に記載の１０４８番目から１０５９番目、１０６３番目から１０７４番目の配列に相補的であり、１０６０番目のＡがＧに、１０６１番目のＡがＧに、１０６２番目のＧがＡにそれぞれ置換されたものである。
上記ＰＣＲ反応は「Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ」（クローンテック社製）を用いて、添付されたプロトコールに従って行った。ここで、ＰＣＲの反応条件は（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、６８℃で６０秒）を３０サイクル行った後、６８℃で５分間である。その結果、１０２８塩基対のＳｕｂ４遺伝子のオープンリーディングフレーム領域を単離することができた。Ｓｕｂ４遺伝子のオープンリーディングフレーム領域は「ｐＧＥＭ−Ｔ  ａｎｄ  ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（プロメガ社）を用いて、ベクターｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。
実施例６
（塩ストレス抵抗性オオムギ特異的ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの発現）
上記で単離された塩ストレス抵抗性オオムギ特異的遺伝子Ｓｕｂ４のオープンリーディングフレーム領域を「ｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｐｌｕｓ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」（ノバジェン社）を用いて大腸菌発現ベクターに導入したプラスミドを作製し、タンパク質の発現誘導を行った。
まず、上述のＳｕｂ４遺伝子のオープンリーディング領域をｐＧＥＭ−Ｔに導入したプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ断片を「ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ」（ノバジェン社）に従いｐＥＴ１５ｂのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ認識部位に挿入した。得られたプラスミドｐＥＸｓｕｂ４を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、前記Ｓｕｂ４遺伝子のオープンリーディングフレームの転写産物を発現させた。すなわち、形質転換させたＥ．ｃｏｌｉをＬＢ培地中で６００ｎｍの吸光度が０．４になるまで生育させた。その後、培養液にＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、さらに３７℃で８時間振盪培養した。前記の培養液を遠心分離し、得られた大腸菌菌体をサンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、１０分間煮沸した後、発現誘導されたタンパク質の検出を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。その結果を図２に示す。図２中、レーン１は対象としてｐＥＴ１５ｂのみを導入した大腸菌菌体の泳動パターンを示し、レーン２はｐＥＸｓｕｂ４を導入した大腸菌菌体の泳動パターンを示す。
図２に示すとおり、Ｓｕｂ４遺伝子のオープンリーディングフレームを発現させた大腸菌には分子量約３３，０００のタンパク質のバンドが確認された。この分子量は配列番号２に記載のアミノ酸配列から計算されるタンパク質の分子量３６，６６３に極めて近い値であり、形質転換された大腸菌中で目的とするタンパク質が発現していることが確認されたといえる。
実施例７
（形質転換された大腸菌の塩ストレス抵抗性）
上記Ｓｕｂ４遺伝子が、塩ストレス抵抗性に直接的に関与しているかどうか検討するため、実施例６で作出した形質転換大腸菌の塩ストレス抵抗性について調査した。対象としてＳｕｂ４遺伝子を含まないプラスミドであるｐＥＴ１５ｂで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ１５ｂ））を使用した。
前記の大腸菌をアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で前培養後遠心分離して集菌し、新たなアンピシリンを含むＬＢ培地に懸濁し、２５℃で１時間１６０ｒｐｍで振盪培養した。次に、前記培養終了液にＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）を添加して導入遺伝子の発現を誘導し、さらに１時間振盪培養した。吸光度（６００ｎｍ）を測定し、ＩＰＴＧ及びアンピシリンを含む同培地に吸光度６００ｎｍ＝０．１になるように懸濁した。同時に、ＬＢ培地に含まれるＮａＣｌをそれぞれ１、３、５、７％になるようにさらに添加し、２５℃で振盪培養した後、生育速度を測定した。その結果を図３に示す。図中、Ｓｕｂ４遺伝子を含む形質転換大腸菌をｐＳｕｂ４−ＥＸと示し、ｐＥＴ１５ｂのみで形質転換した大腸菌をｐＥＴ１５ｂと示す。
その結果、Ｓｕｂ４遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＸｓｕｂ４））は、いずれのＮａＣｌ濃度においても対象である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ１５ｂ））と比較し速やかに生育を開始し、その生育速度も速かった。これは、Ｓｕｂ４遺伝子が大腸菌中で発現することにより大腸菌の塩ストレス抵抗性を高めたことを示しており、Ｓｕｂ４遺伝子産物が植物において塩ストレス抵抗性を高める機能を有する分子として働いていることが強く示唆された。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明の塩ストレス下で発現誘導される核酸及びタンパク質によれば、塩ストレス下で発現量が増加することを特徴とし、植物に塩ストレス抵抗性を付与する機能を有する新規タンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供することが可能となる。従って、このような新規遺伝子を用いることにより、塩ストレス抵抗性を有するトランスジェニック植物を作出することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、塩ストレス抵抗性オオムギ特異的に発現する遺伝子をノーザン解析により確認した結果を示す電気泳動写真である。
図２は、塩ストレス抵抗性オオムギ特異的に発現するＳｕｂ４遺伝子の転写産物を大腸菌中で発現させた場合の発現パターンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した電気泳動写真である。
図３は、塩ストレス抵抗性オオムギ特異的に発現するＳｕｂ４遺伝子を有する形質転換大腸菌の、各種塩濃度下における培養時間と生育速度との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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