(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）霊長類動物の胚性幹細胞とＳＴ２細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群ＡとＯＰ９細胞とを共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群ＢとＯＰ９細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｃを得るステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた細胞群Ｃを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、
を含む、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法。
【請求項２】
ステップ（Ａ）において、霊長類動物の胚性幹細胞とＳＴ２細胞との共培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来し、かつ中胚葉系細胞に分化した細胞を含有した細胞群として、細胞群Ａを分離する、請求項１記載の分化方法。
【請求項３】
ステップ（Ｄ）の後、（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養を行なうステップを行なう、請求項１又は２に記載の分化方法。
【請求項４】
（Ａ）霊長類動物の胚性幹細胞とＳＴ２細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群ＡとＯＰ９細胞とを共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群ＢとＯＰ９細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｃを得るステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた細胞群Ｃを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、及び
（Ｅ’）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、霊長類動物の胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法。
【請求項５】
ステップ（Ｅ’）に代えて、
（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で得られた培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を行なう、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
ステップ（Ａ）を行なうに先立ち、霊長類動物の胚性幹細胞に導入対象の遺伝子を含む核酸を導入する、請求項４又は５記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法、霊長類動物胚性幹細胞から樹状細胞の製造方法、該製造方法により得られる樹状細胞、該樹状細胞、免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療のための医薬の製造のための該樹状細胞の使用、及び該疾患の治療のための細胞医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】  樹状細胞は、抗原タンパク質を貪食し、ペプチドに分解し、生じたペプチドを、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）との複合体としてＴ細胞に提示（以下、「抗原提示」ともいう）してＴ細胞を刺激し、抗原特異的に該Ｔ細胞を活性化する。また、前記樹状細胞は、生体内において抗原提示能力が最も高い細胞である。一方、前記樹状細胞は、自己抗原に反応性を有するＴ細胞の機能を抑制し、免疫学的な自己寛容の維持にも関与している。このように、樹状細胞は、生体内において免疫応答を制御する中心的な役割を果たしている。【０００３】  樹状細胞は、生体内では、骨髄中で造血幹細胞から分化され、産生される。また、骨髄中の造血幹細胞は、増殖因子の存在により樹状細胞以外に、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、リンパ球等に分化する。【０００４】  従来、末梢血中から、存在する樹状細胞を単離すること、骨髄中の造血幹細胞を分化誘導すること（例えば、特許文献１）等により樹状細胞が得られることが知られている。しかしながら、末梢血中の樹状細胞の存在量は少ないため、樹状細胞を大量に得ることは困難であるという欠点がある。また、前記特許文献１に記載の方法では、マウスの造血幹細胞を分化誘導し樹状細胞を得ることが開示されている。しかしながら、造血幹細胞は長期間培養して増殖させることは困難であり、また、この方法で作製した樹状細胞に遺伝子導入を行なうためにはウイルスベクターを用いる必要があるという欠点がある。【０００５】  また、マウス胚性幹細胞を分化誘導して樹状細胞を得ることが試みられている（非特許文献１）。しかしながら、前記非特許文献１に記載の方法を、他の生物、例えば、霊長類動物に適用した場合、成熟樹状細胞が生じないという欠点がある。
【特許文献１】特開２００４−１６６９７号公報
【非特許文献１】千住覚（Ｓ．Ｓｅｎｊｕ）ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、第３５０１頁〜第３５０８頁、２００３年５月１日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の１つの側面は、霊長類動物に由来する樹状細胞を効率よく得ること、霊長類動物の樹状細胞を安定的に供給すること、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する手段（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する手段等）を供給すること、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等）の治療手段を供給すること、臓器移植における拒絶反応と移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｈｏｓｔ  Ｄｉｏｓｅａｓｅ）を予防または治療する手段を供給すること等の少なくとも１つを可能にする、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法を提供することに関する。【０００７】  さらに、本発明の他の側面は、霊長類動物に由来する樹状細胞を大量に得ること、霊長類動物に由来する樹状細胞を効率よく得ること、霊長類動物の樹状細胞を安定的に供給すること、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する樹状細胞（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する樹状細胞等）を得ること等の少なくとも１つを可能にする、霊長類動物の胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法を提供することに関する。【０００８】  本発明のさらに他の側面は、個体の免疫反応を抗原特異的に制御すること（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活すること等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療効果を得ること等の少なくとも１つを可能にする、樹状細胞を提供することに関する。【０００９】  本発明の別の側面では、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療等の少なくとも１つを可能にする医薬の製造のための前記樹状細胞の使用を提供することに関する。【００１０】  また、本発明のさらに別の側面では、免疫応答を抗原特異的に制御すること、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等の疾患の治療を行なうこと等の少なくとも１つを可能にする、免疫応答制御剤を提供することに関する。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載からも明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕（Ａ）霊長類動物の胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する新たに準備した細胞とを共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有するさらに新たに準備した細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｃを得るステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた細胞群Ｃを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、
を含む、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法、
〔２〕ステップ（Ａ）において、霊長類動物の胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞との共培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来し、かつ中胚葉系細胞に分化した細胞を含有した細胞群として、細胞群Ａを分離する、前記〔１〕記載の分化方法、
〔３〕ステップ（Ａ）における血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞が、ＳＴ２細胞であり、ステップ（Ｂ）における血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する新たに準備した細胞が、ＯＰ９細胞であり、かつステップ（Ｃ）における血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有するさらに新たに準備した細胞が、ＯＰ９細胞である、前記〔１〕又は〔２〕記載の分化方法、
〔４〕ステップ（Ｄ）の後、（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養を行なうステップを行なう、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の分化方法、
〔５〕（Ａ）霊長類動物の胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する新たに準備した細胞とを共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有するさらに新たに準備した細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｃを得るステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた細胞群Ｃを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、及び（Ｅ’）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、霊長類動物の胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法、
〔６〕ステップ（Ｅ’）に代えて、
（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で得られた培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を行なう、前記〔５〕記載の製造方法、
〔７〕ステップ（Ａ）を行なうに先立ち、霊長類動物の胚性幹細胞に導入対象の遺伝子を含む核酸を導入する、前記〔５〕又は〔６〕記載の製造方法、
〔８〕導入対象の遺伝子が、免疫抑制のための遺伝子である、前記〔５〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔９〕導入対象の遺伝子が、免疫賦活のための遺伝子である、前記〔５〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔１０〕核酸の導入が、非ウイルスベクター媒介核酸導入法により行なわれる、前記〔７〕〜〔９〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔１１〕前記〔５〕〜〔１０〕いずれか１項に記載の製造方法により得られる樹状細胞、
〔１２〕免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療のための医薬の製造のための、前記〔５〕〜〔１０〕いずれか１項に記載の製造方法により得られる樹状細胞の使用、並びに
〔１３〕前記〔５〕〜〔１０〕いずれか１項に記載の製造方法により得られる樹状細胞を有効成分として含有してなる、免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療のための細胞医薬、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】  本発明の霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法によれば、霊長類動物に由来する樹状細胞を効率よく安定的に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の分化方法によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する手段（例えば、霊長類動物の樹状細胞を、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する手段等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等）の治療手段等を供給することできるという優れた効果を奏する。【００１３】  さらに、本発明の霊長類動物の胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法によれば、霊長類動物に由来する樹状細胞を、大量に効率よく安定的に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の製造方法によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する樹状細胞（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する樹状細胞）を得るこができる。【００１４】  本発明の樹状細胞によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活すること）することができ、個体の免疫反応を抗原特異的を制御することや免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療効果を得ることができるという優れた効果を奏する。【００１５】  本発明の医薬の製造のための前記樹状細胞の使用によれば、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療を可能にする医薬を提供することができる。【００１６】  また、本発明の免疫応答制御剤によれば、免疫応答を抗原特異的に制御することができ、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等の疾患の治療を行なうことができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法の１例の概略図を示す。
【００１８】
【図２】図２は、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞に分化させた際の経時的な細胞の顕微鏡写真を示す図である。図中、パネルＡは分化誘導開始前、パネルＢは、分化誘導開始後３日目、パネルＣ及びＤは、６日目、パネルＥ及びＦは、９日目、パネルＧは、１６日目、パネルＨは、２２日目、パネルＩは、２６日目、パネルＪ、Ｋ及びＬは、２８日目の細胞を示す。スケールバーは、１００μｍを示す。
【００１９】
【図３】図３は、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞に分化させた際の培養液中の浮遊細胞における細胞表面分子ＤＲ、ＣＤ４０及びＣＤ８６それぞれの発現を解析した結果を示す図である。図中、「Ｄａｙ１６」は、図１における工程（Ｂ）終了時、「Ｄａｙ２２」は、工程（Ｃ）終了時、「Ｄａｙ２６」は、工程（Ｄ）終了時、「Ｄａｙ２８」は、工程Ｅ終了時の細胞の解析結果を示す。また、各パネル中、太い実線のヒストグラムが、解析の対象とする分子に特異的な抗体による染色を施したものの蛍光強度を示し、細い点線のヒストグラムは、陰性対照であり、非特異的な抗体染色の場合の蛍光強度を示す。
【００２０】
【図４】図４は、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＣＤ８０およびＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。図中、ＨＰＲＴのｍＲＮＡは、解析に用いたＲＮＡ試料の相対的な量を示す。
【００２１】
【図５】図５は、霊長類動物の胚性幹細胞から分化誘導された細胞によるＴ細胞刺激活性を解析した結果を示す図である。図中、ひし形は、ステップ（Ｄ）終了後の培養液中の浮遊細胞、白丸は、ステップ（Ｅ）終了後の培養液中の浮遊細胞、四角は、未分化の胚性幹細胞を示す。
【００２２】
【図６】図６は、外来遺伝子を導入した霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導された細胞における該外来遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。パネルＡは、ＨＬＡ−ＤＲ５３分子β鎖をコードするプラスミドＤＮＡベクターの構造図である。パネルＢは、導入遺伝子由来のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により検出した結果を示す。図中、「ｃＥＳ」は、未分化の胚性幹細胞、「ｃＥＳ−５３−２３」は、遺伝子導入した未分化の胚性幹細胞、「ｃＥＳ−ＤＣ」は、胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞、「ｃＥＳ−ＤＣ−５３−２３」は、遺伝子導入した胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞を示す。ＨＰＲＴのｍＲＮＡは、解析に用いたＲＮＡ試料の相対的な量を示す。
【００２３】
【図７】図７は、ＤＲ５３β遺伝子を導入した胚性幹細胞より分化誘導された樹状細胞による抗原提示能を調べた結果を示す図である。パネルＡは、ＤＲ５３β遺伝子導入胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞に、ＧＡＤ６５抗原由来ペプチド（濃度１．２５，２．５，５．０μＭ）を負荷し、Ｘ線を照射し、それにより増殖能力を欠損させ、ＤＲ５３分子上に提示されたＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを認識するＴ細胞株ＳＡ３２．５とともに培養した場合のＳＡ３２．５の増殖反応を示す。パネルＡ中、ＳＡ３２．５による、［３Ｈ］−チミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した値を示す。また、陰性対照として、遺伝子が導入されていない胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞にＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを負荷したもの及びＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞にＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを負荷していないものそれぞれをＳＡ３２．５とともに培養した場合の結果を示す。パネルＢは、ＤＲ５３β遺伝子を導入した胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞に、遺伝子組換えにより作製したＧＳＴ融合ＧＡＤ６５抗原（ＧＳＴ−ＧＡＤ）を負荷し、Ｘ線を照射し、それにより増殖能力を欠損させ、Ｔ細胞株ＳＡ３２．５とともに培養した場合のＳＡ３２．５の増殖反応を示す。パネルＢにおいて、パネルＡと同様に、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより、増殖反応を定量化した値を示す。陰性対照として、遺伝子が導入されていない胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞にＧＳＴ−ＧＡＤを負荷したもの及びＤＲ５３β遺伝子を導入した胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞に、ＧＳＴを負荷したものそれぞれをＳＡ３２．５とともに培養した場合の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】  本発明は、１つの側面では、（Ａ）霊長類動物の胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化を誘導する性質を有する新たに準備した細胞とを共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有するさらに新たに準備した細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｃを得るステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた細胞群Ｃを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、
を含む、霊長類動物の胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法に関する。【００２５】  本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分化方法によれば、生体から樹状細胞を単離する場合や造血幹細胞から分化させる場合に比べ、大量に供給させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の分化方法によれば、前記ＥＳ細胞が用いられているため、必要により、治療効果を示すことが期待される遺伝子（以下、「治療用遺伝子」ともいう）を容易に導入し、発現させることができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明によれば、霊長類動物のＥＳ細胞が用いられているため、いわゆる細胞治療等への応用に好適である。【００２６】  また、本発明の分化方法は、マウスのＥＳ細胞から樹状細胞への分化の場合とは異なり、最初に、前記ステップ（Ａ）において、霊長類動物のＥＳ細胞を、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞と共培養することに１つの大きな特徴がある。本発明の分化方法によれば、前記ステップ（Ａ）を行なうことにより、ＥＳ細胞を、中胚葉系の細胞に分化させることができる。【００２７】  本明細書において、「霊長類動物」とは、ヒト、サル等をいう。前記サルとしては、例えば、カニクイザル、アカゲザル、ニホンザル、マーモセット、チンパンジー等が挙げられる。【００２８】  本発明に用いられる霊長類動物のＥＳ細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば、カニクイザルＥＳ細胞系ＣＭＫ６細胞、ヒトＥＳ細胞等が挙げられる。前記ＥＳ細胞は、得られる樹状細胞の使用目的等に応じて、適宜選択されうる。【００２９】  前記「血液細胞の分化と増殖を誘導する性質を有する細胞」（フィーダー細胞）としては、例えば、ＯＰ９細胞（理研バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ  ＢＩＯＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＣＥＮＴＥＲ：〒３０５−００７４  茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１）細胞番号：ＲＣＢ１１２４）、ＳＴ２細胞（理研バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ  ＢＩＯＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＣＥＮＴＥＲ）細胞番号：ＲＣＢ０２２４）、ＰＡ６細胞（理研バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ  ＢＩＯＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＣＥＮＴＥＲ）細胞番号：ＲＣＢ１１２７）等が挙げられる。これらの中でも、血球細胞への分化誘導効率を向上させる観点から、好ましくは、ＳＴ２細胞が望ましい。【００３０】  本発明において、前記「霊長類動物のＥＳ細胞」と、前記「フィーダー細胞」との共培養の際、前記「フィーダー細胞」は、適切な培地の入った培養容器において、当該フィーダー細胞に応じた培養条件下に培養し、該培養容器の底面をほぼ覆う程度まで増殖させて、それにより、フィーダー細胞層を形成させて用いられうる。【００３１】  前記フィーダー細胞の作製に用いられうる培地としては、付着性の哺乳動物細胞の培養に適した培地であればよく、フィーダー細胞として用いる細胞の種類などに応じて適宜選択され得、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ〔ダルベッコ改変イーグル培地（培養液）〕等が挙げられる。【００３２】  前記ステップ（Ａ）に用いられる培養容器は、ＥＳ細胞から中胚葉系の細胞への分化を促進させる観点、フ���ーダー細胞を長期間安定的に接着させる観点等から、組織培養に適したコーティングが施された培養容器であればよい。前記コーティングは、例えば、ゼラチン、フィブロネクチン等により行なわれうる。【００３３】  前記フィーダー細胞の培養条件としては、フィーダー細胞として用いる細胞の種類などに応じて適宜設定されうる。例えば、ＳＴ２細胞、ＯＰ９細胞等の場合、０．１重量％ゼラチン溶液等でコーティングされた培養容器上、１０容量％ウシ胎仔血清を添加した培地で３７℃、５体積％ＣＯ２で培養する条件等が挙げられる。【００３４】  前記ステップ（Ａ）において、ＥＳ細胞の細胞密度は、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培地（培養液）あたりに得られる中胚葉性細胞の数を最大にする観点等から、好ましくは、５×１０４〜１×１０５細胞／直径１００ｍｍ培養容器であることが望ましい。【００３５】  前記ステップ（Ａ）におけるＥＳ細胞とフィーダー細胞との共培養に用いられる培地としては、哺乳動物細胞の培養に適した培養液であればよく、用いられるＥＳ細胞の種類などに応じて適宜選択され得、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）等が挙げられる。なお、かかる培地は、以下のステップ（Ｂ）〜（Ｅ）においても用いられうる。【００３６】  前記ステップ（Ａ）におけるＥＳ細胞とフィーダー細胞との共培養の際の培養気相の条件は、用いられるＥＳ細胞の種類、培養液の組成等に応じて、適宜設定されうるが、例えば、３７℃前後（特に、３７℃）、５体積％ＣＯ２等の条件が挙げられる。【００３７】  なお、前記ステップ（Ａ）におけるＥＳ細胞とフィーダー細胞との共培養の時間は、ＥＳ細胞を、中胚葉系へ分化した細胞に十分に分化させ、中胚葉系に分化した細胞の数を最大にするため、９日〜１１日程度が望ましい。【００３８】  なお、ステップ（Ａ）においては、培養開始の後４日目以降は、隔日の培地交換を行なう。【００３９】  前記ステップ（Ａ）において得られる細胞群Ａは、中胚葉系細胞の性質を示すものであり、用いられるＥＳ細胞の起源となる動物の種類により異なる場合もあるが、丸い形態を示す細胞の塊を含有する細胞群として得られうる。【００４０】  また、前記ステップ（Ａ）を行なった後、中胚葉系へ分化した細胞を選択的に回収し、樹状細胞への分化の効率を向上させる観点から、霊長類動物の胚性幹細胞と、当該フィーダー細胞との共培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来し、かつ中胚葉系細胞に分化した細胞を含有した細胞群として、細胞群Ａを分離することが好ましい。【００４１】  前記共培養物からの細胞群Ａの単離は、例えば、０．２５重量％トリプシン／１ｍＭ  エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水を、共培養物に添加し、３７℃で、中胚葉系細胞に分化した細胞を分離するに適切な時間、例えば、８〜１５分間処理することにより行なわれうる。【００４２】  本発明の分化方法においては、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａを、血球細胞の分化と増殖とを誘導する新たに準備した細胞（フィーダー細胞）と共培養する〔ステップ（Ｂ）〕ことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分化方法によれば、かかるステップ（Ｂ）において、中胚葉系細胞、特に、血球系細胞の割合をより向上させることができるため、霊長類動物に由来する樹状細胞をより効率よく得ることができ、安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。【００４３】  前記「血球細胞の分化と増殖とを誘導する新たに準備した細胞」（フィーダー細胞）としては、前記ステップ（Ａ）で挙げたフィーダー細胞を用いることができ、例えば、ＯＰ９細胞が望ましい。【００４４】  前記ステップ（Ｂ）において、前記細胞群Ａと前記「フィーダー細胞」との共培養の際、前記「フィーダー細胞」は、前記ステップ（Ａ）で用いられる「フィーダー細胞」と同様に、培養容器の底面をほぼ覆う程度まで増殖させて、それにより、フィーダー細胞層を形成させて用いられうる。【００４５】  また、前記ステップ（Ｂ）に用いられる培養容器、前記「フィーダー細胞」の培養条件は、前記ステップ（Ａ）の場合と同様である。【００４６】  なお、前記ステップ（Ｂ）においては、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培養液あたりの産生細胞数を最大にする観点等から、ステップ（Ａ）から回収した細胞群Ａを、ステップ（Ａ）の場合よりも広い面積、具体的には、ステップ（Ａ）における培養容器の４〜８倍程度〔例えば、フィーダー細胞層の面積として、ステップ（Ａ）の場合の４〜８倍程度〕にすることが望ましい。【００４７】  前記ステップ（Ｂ）における細胞群Ａとフィーダー細胞との共培養の際の培養気相の条件は、用いられるＥＳ細胞の種類、培養液の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）の場合と同様に適宜設定されうる。【００４８】  前記ステップ（Ｂ）に用いられる培地は、前記ステップ（Ａ）の共培養に用いられる培地と同様である。【００４９】  なお、前記ステップ（Ｂ）におけるＥＳ細胞とフィーダー細胞との共培養の時間は、ＥＳ細胞を、中胚葉系細胞、特に、血球系細胞に十分に分化させ、中胚葉系細胞、特に、血球系細胞の割合を十分に向上させる観点、用いる培養液あたりの産生細胞数を最大にする観点、最終的にＴ細胞刺激活性の強い樹状細胞を作製する観点等から、好ましくは、４〜６日間であることが望ましい。【００５０】  なお、ステップ（Ｂ）においては、培養期間中、適宜培地交換又は培地の追加を行なってもよい。【００５１】  前記ステップ（Ｂ）において得られる細胞群Ｂは、中胚葉系細胞、特に、血球系細胞の性質を示すものであり、用いられるＥＳ細胞の起源となる動物の種類により異なる場合もあるが、例えば、図２のパネルＧに示されるような、比較的均一で小さくて丸い形態を示す浮遊細胞を含有する細胞群として得られうる。かかるステップ（Ｂ）においては、浮遊細胞をピペッティング操作等により回収することにより、分化が不十分な細胞と血球系細胞以外の方向に分化した細胞（例えば、上皮性細胞を含む）とから、血球系細胞の方向に分化した細胞群を効率よく回収することができる。【００５２】  本発明の分化方法においては、前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有するさらに新たに準備した細胞（フィーダー細胞）とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養する〔ステップ（Ｃ）〕ことに１つの大きな特徴が���る。したがって、本発明の分化方法によれば、かかるステップ（Ｃ）を行なうことにより、ミエロイド（骨髄球）系への分化を誘導することができ、樹状細胞様細胞への分化をより効率よく行なうことができるため、霊長類動物に由来する樹状細胞をより効率よく得ることができ、安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。【００５３】  前記ステップ（Ｃ）に用いられる培養容器は、フィーダー細胞を長期間安定的に接着させる観点等から、ゼラチン、フィブロネクチン等によりコーティングしたものであることが望ましい。【００５４】  前記「血球細胞の分化と増殖とを誘導するさらに新たに準備した細胞」（フィーダー細胞）としては、前記ステップ（Ａ）で挙げたフィーダー細胞を用いることができ、例えば、ＯＰ９細胞が望ましい。【００５５】  前記ステップ（Ｃ）における共培養の際の培養気相の条件は、用いられるＥＳ細胞の種類、培地の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の場合と同様に適宜設定されうる。【００５６】  前記ステップ（Ｃ）に用いられる培地は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含有することを除き、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の共培養に用いられる培地と同様である。【００５７】  前記ステップ（Ｃ）における培地中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量は、用いる培養液と刺激因子の量あたりの産生細胞数を最大にする観点から、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００５８】  前記ステップ（Ｃ）においては、細胞群Ｂの細胞密度は、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培養液と刺激因子の量あたりの産生細胞数を最大にする観点から、（３×１０５〜６×１０５／８ｍｌ培地／直径１００ｍｍ培養皿）であることが望ましい。【００５９】  なお、前記ステップ（Ｃ）における共培養の時間は、細胞群Ｂを、突起を有する不規則な形状の樹状細胞様細胞に十分に分化させ、最終的に産生される細胞中かかる樹状細胞様細胞の割合を十分に向上させる観点、用いる培養液と刺激因子の量あたりの産生細胞数を最大にする観点等から、４〜６日間が望ましい。【００６０】  前記ステップ（Ｃ）においては、骨髄球（ミエロイド）系細胞への分化を促進させる観点から、マクロファージコロニー刺激因子を用いてもよい。【００６１】  前記ステップ（Ｃ）における培地中のマクロファージコロニー刺激因子の含有量は、Ｔ細胞刺激活性の強い樹状細胞を産生する観点から、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００６２】  なお、ステップ（Ｃ）においては、最終的に産生される細胞中かかる樹状細胞様細胞の割合を十分に向上させる観点から、好ましくは、３日目又は４日目に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含有し、かつマクロファージコロニー刺激因子を含有しない培地を、元の培地の半量（４ｍｌ／直径１００ｍｍ培養皿）の培養物に添加することが望ましい。【００６３】  なお、前記ステップ（Ｃ）においては、マウスのＥＳ細胞の場合とは異なり、樹状細胞への分化誘導の際に一時的にマクロファージコロニー刺激因子を加えることにより、樹状細胞の分化誘導効率をより向上させることができる。前記ステップ（Ｃ）において、培養期間中に、培地を、前記培地において、顆粒��マクロファージコロニー刺激因子を含み、かつマクロファージコロニー刺激因子を含まない培地に交換、あるいは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含み、かつマクロファージコロニー刺激因子を含まない培地を追加することも可能である。【００６４】  前記ステップ（Ｃ）において得られる細胞群Ｃの一部は、樹状細胞の性質、例えば、ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ８０の発現等を示すものであり、用いられるＥＳ細胞の起源となる動物の種類により異なる場合もあるが、例えば、図２のパネルＨに示されるような、形態的に不均一で、突起を有する形態を示す浮遊細胞を含有する細胞群として得られうる。【００６５】  本発明の分化方法においては、前記ステップ（Ｃ）で得られた細胞群Ｃを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４（ＩＬ−４）との存在下に培養する〔ステップ（Ｄ）〕ことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分化方法によれば、かかるステップ（Ｄ）を行なうことにより、樹状細胞様細胞の割合をより向上させ、かつＴ細胞に対する刺激活性および抗原提示活性の高い樹状細胞を作製することができるため、霊長類動物に由来する樹状細胞をより効率よく得ることができ、安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の分化方法によれば、かかるステップ（Ｄ）を行なわれるため、前記ステップ（Ｃ）の段階に比べ、より選択的に樹状細胞へ誘導することができる。【００６６】  前記ステップ（Ｄ）に用いられる培養容器は、細胞の付着性が低いもの、例えばコーティングされていないポリスチレン製容器等が望ましいが、細胞培養用のコーティングがなされた培養容器も使用可能である。【００６７】  前記ステップ（Ｄ）における培養の際の培養気相の条件は、用いられるＥＳ細胞の種類、培養液の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の場合と同様に適宜設定されうる。【００６８】  前記ステップ（Ｄ）に用いられる培地は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４とを含有することを除き、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の共培養に用いられる培地と同様である。【００６９】  前記ステップ（Ｄ）においては、細胞群Ｃの細胞密度は、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培養液と刺激因子あたりの樹状細胞の収量を最大にする観点等から、３×１０５−６×１０５細胞／２．５ｍｌ培養液／直径６０ｍｍ培養容器であることが望ましい。【００７０】  なお、前記ステップ（Ｄ）における培養時間は、細胞群Ｃにおける樹状細胞様細胞の割合をより向上させ、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、２〜５日間で、細胞の形態により分化の進行程度を評価し適宜決定することが望ましい。【００７１】  前記ステップ（Ｄ）における培地中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量は、用いる刺激因子あたりの樹状細胞の収量を最大にする観点から、５０−２００ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００７２】  前記ステップ（Ｄ）における培地中のインターロイキン−４の含有量は、Ｔ細胞刺激活性のより強いより強い樹状細胞を作製する観点から、５〜２０ｎｇ／ｍｌが望ましい。【００７３】  また、前記ステップ（Ｄ）においては、最終��に産生される樹状細胞のＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲ）の発現が上昇させる観点から、前記顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びインターロイキン−４に加え、好ましくは、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）を用いることが望ましい。【００７４】  なお、マウスのＥＳ細胞の場合は、樹状細胞の分化誘導にはＩＬ−４は必須ではなく、また、未成熟段階の樹状細胞にＩＬ−４を加えると樹状細胞の最終的な成熟が妨げられるが、前記ステップ（Ｄ）においては、樹状細胞に分化誘導させるまでの過程で、ＩＬ−４が必須である。【００７５】  前記ステップ（Ｄ）により、樹状細胞の性質、例えば、ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８６等の発現、形態的に不均一で、突起を有する形態等を示す樹状細胞を得ることができる。【００７６】  本発明の分化方法により得られる樹状細胞は、抗原タンパク質を貪食し、分解し、生じたペプチドをＴ細胞に提示することによりＴ細胞を強く刺激する活性を有する。前記Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識するキラーＴ細胞（Ｔｃ）及びＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識するＴヘルパー細胞である。Ｔｈ細胞は、樹状細胞から抗原を提示されて活性化すると、各種のサイトカインを産生し、それによりＢ細胞やマクロファージを活性化させうる。【００７７】  なお、前記ステップ（Ａ）〜（Ｄ）を行なうことにより得られる樹状細胞は、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養を行なうステップを行なう〔ステップ（Ｅ）〕ことにより、Ｔ細胞刺激性の向上した樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができる。【００７８】  前記ステップ（Ｅ）においては、前記ステップ（Ｄ）におけるインターロイキン−４と任意のｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンドとに加え、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とが用いられているため、Ｔ細胞刺激性の向上した樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができるという優れた効果を発揮する。【００７９】  前記ステップ（Ｅ）に用いられる培養容器、培養気相の条件は、用いられるＥＳ細胞の種類、培養液の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の場合と同様に適宜設定されうる。【００８０】  前記ステップ（Ｅ）に用いられる培地は、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン−４と腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）とリポ多糖と任意にＦＬＴ−３Ｌとが添加されていることを除き、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の共培養に用いられる培地と同様である。【００８１】  なお、前記ステップ（Ｅ）における培養時間は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、１〜２日であればよい。【００８２】  前記ステップ（Ｅ）においては、樹状細胞の成熟を促す因子であれば、ＴＮＦ−αの代わりに、ＣＤ４０リガンド等を用いてもよい。【００８３】  前記ステップ（Ｅ）において、ＴＮＦ−αの添加量は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、好ましくは、培養液１ｍｌに対し、５〜２０ｎｇとすることが望ましい。【００８４】  また、前記ステップ（Ｅ）においては、樹状細胞の成熟を促す因子であれば、リポ多糖の代わりに、細菌抽出物、真菌類抽出物、マイコプラズマ抽出物、二本鎖ＲＮＡ等を用いてもよい。【００８５】  ��記ステップ（Ｅ）において、リポ多糖の添加量は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、培養液１ｍｌに対し、３〜５μｇが望ましい。【００８６】  本発明の分化方法によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する手段（例えば、霊長類動物の樹状細胞を用いた、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する手段等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等）の治療手段、臓器移植に伴う拒絶反応を予防および治療する手段等を供給することができる。【００８７】  なお、本明細書において、免疫反応の「制御」とは、免疫反応の抑制及び賦活のいずれをも包含する概念を意図する。【００８８】  本発明は、他の側面では、前記分化方法におけるステップ（Ａ）〜（Ｄ）、及び（Ｅ’）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、霊長類動物の胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法に関する。【００８９】  本発明の製造方法によれば、前記ステップ（Ａ）〜（Ｄ）が行なわれるため、本発明の分化方法と同様の観点から、霊長類動物に由来する樹状細胞を、大量に効率よく安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。【００９０】  また、本発明の製造方法としては、別の実施態様では、前記ステップ（Ｅ’）に代えて、
（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で得られた培養物に、インターロイキン−４と腫瘍壊死因子αとリポ多糖と任意にｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンドとを添加し、さらに培養するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で得られた培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を行なう方法が挙げられる。ここで、前記ステップ（Ｅ）は、本発明の分化方法におけるステップ（Ｅ）と同様である。かかる実施態様によれば、より高い効率で、より安定的に、樹状細胞を供給することが可能になる点で有利である。【００９１】  前記ステップ（Ｅ’）及び（Ｆ）のそれぞれにおいて、培養物から、霊長類動物の胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離する手段としては、例えば、樹状細胞に特異的なマーカーに対する抗体を用いたアフィニティーカラム、該抗体を用いたフローサイトメトリーによるセルソーティング、該抗体をコーティングした磁性マイクロビーズを用いたセルソーティング等が挙げられる。【００９２】  前記樹状細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０及びＣＤ８６、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３等が挙げられる。【００９３】  前記抗体は、樹状細胞に特異的なマーカーであるポリペプチド又はその断片を用い、慣用の方法により容易に作製されうる。また、かかる抗体は、市販された抗体であってもよい。【００９４】  本発明の製造方法においては、治療用遺伝子等の遺伝子を原材料であるＥＳ細胞に予め導入することにより、樹状細胞に所望の性質を発揮させることもできる。したがって、本発明の製造方法は、他の実施態様では、ステップ（Ａ）を行なうに先立ち、霊長類動物の胚性幹細胞に導入対象の遺伝子を含む核酸を導入する。【００９５】  前記導入対象の遺伝子としては例えば、前記治療用遺伝子、具体的には、例えば、免疫抑制のための遺伝子、免疫賦活のための遺伝子等が挙げられ、より具体的には、特に、抗原をコードする遺伝子、Ｔ細胞の遊走を誘導する因子の遺伝子、Ｔ細胞の反応を増強する因子の遺伝子、Ｔ細胞の反応を抑制する因子の遺伝子等が挙げられる。【００９６】  かかる導入対象の遺伝子を樹状細胞に発現させることにより、生体内で免疫応答の制御に中心的な役割を果たしている樹状細胞の機能を強化することもできる。【００９７】  本発明においては、例えば、抗原をコードする遺伝子を含む核酸が導入されたＥＳ細胞を用いた場合、得られる樹状細胞は、極めて高い抗原特異的Ｔ細胞刺激活性あるいは抗原特異的にＴ細胞反応を抑制する活性を発現する点で有利である。【００９８】  本明細書において、抗原とは、治療や診断のターゲット対象となるタンパク質又はペプチドであり、例えば、各種細菌、各種ウイルス、これらを構成するタンパク、癌細胞に特異的に発現するタンパク質（腫瘍抗原タンパク質）、腫瘍抗原タンパク質の一部であるペプチド、自己免疫疾患やアレルギー疾患において免疫系による認識の標的となっている分子等が挙げられる。【００９９】  核酸の導入は、慣用の方法、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、等により行なわれうる。ＥＳ細胞の分化性能を十分に発揮させる観点から、エレクトロポレーション法が望ましい。【０１００】  また、前記核酸は、いわゆるｎａｋｅｄ核酸であってもよく、ベクター（ウイルスベクター又は非ウイルスベクター）に連結されたものであってもよい。前記ベクターとしては、ファージ、プラスミド等が挙げられる。【０１０１】  なお、前記ベクターは、必要に応じ、各種プロモーター、エンハンサー、ター��ミネーター等の転写促進に有効なエレメントを含有してもよい。【０１０２】  本発明においては、操作の容易性、治療用途等の観点から、非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクターのエレクトロポレーションによる導入が望ましい。【０１０３】  本発明の製造方法は、ＥＳ細胞の段階で、プラスミドベクターをエレクトロポレーションにより導入し、樹状細胞へ分化させるため、従来の末梢血単球あるいは造血幹細胞等から分化誘導して作製した樹状細胞にウイルスベクター用いて遺伝子導入する方法と比較して、以下のような点において優れている。
１）従来の末梢血単球あるいは造血幹細胞等から分化誘導して得られた樹状細胞にウイルスベクター用いて遺伝子導入する方法の場合、樹状細胞を使用する度に遺伝子導入を行なう必要がある。また、ウイルスベクター用いた遺伝子導入は、導入効率が不安定であり、かつ、遺伝子導入樹状細胞をクローンとして得ることは極めて困難である。一方、本発明に用いられるＥＳ細胞は、クローンとして単離・増殖・凍結保存することが容易である。そのため、適切な遺伝子改変を行なったＥＳ細胞のクローンを単離したうえで増殖させ凍結保存したストックを作製しておけば、必要時に、樹状細胞へ分化させることにより、遺伝的に均一な樹状細胞を安定して治療に用いることが可能である点で優れる。
２）ウイルスベクターを用いる場合、導入できる遺伝子の数（種類）と大きさ（サイズ）に制限がある。一方、ＥＳ細胞の場合、通常のプラスミドベクターを使用でき、遺伝子の共導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は複数の薬剤耐性遺伝子を用いた段階的導入により複数の遺伝子を導入できる点で優れる。さらに、本発明においては、遺伝子の標的破壊・改変・導入を行なうこともできる点で優れる。これらの特性は、単に免疫効果の増強を目的として用いるのみでなく、免疫応答の抑制的あるいは質的な制御を行なうなどの目的で、より複雑な遺伝子改変が必要な場合に特に有用である。
３）ＥＳ細胞を用いる方法では、遺伝子改変ＥＳ細胞クローンを樹立した時点で病原微生物の混入や発がん遺伝子の活性化等の有無を検査し、さらに樹状細胞へ分化した段階での特性を十分に検討したうえで治療に用いることが可能である点で優れる。従って、ウイルスベクターを用いる方法に比べ、治療用途等に有用である。【０１０４】  本発明は、別の側面では、前記製造方法により得られる樹状細胞に関する。本発明の樹状細胞によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御すること（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活すること等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療効果を得ること等が可能になる。【０１０５】  したがって、本発明によれば、免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療のための医薬の製造のための、前記製造方法により得られる樹状細胞の使用も提供される。【０１０６】  前記医薬の製造の際には、本発明の樹状細胞を安定に保持しうる助剤、例えば、培地等を適宜用いてもよい。【０１０７】  また、本発明によれば、被験体に前記製造方法により得られる樹状細胞の治療有効量を投与することを特徴とする、被験体における、免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療方法が提供される。【０１０８】  前記「免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患」としては、例えば、自己免疫疾患、腫瘍、アレルギー疾患、感染症、臓器移植にともなう拒絶反応と移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等が挙げられる。【０１０９】  また、前記「被験体」としては、好ましくは、前記のような免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療を必要とするヒトであるが、前記のような免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療を必要とする生物、例えば、イヌ、ネコなどのペット動物等であってもよい。【０１１０】  また、前記「治療有効量」とは、前記製造方法により得られる樹状細胞を上記被験体に投与した場合に、該樹状細胞を投与していない被験体と比較して、免疫応答を抗原特異的に制御することができ、従って前記のような疾患に対して治療効果を得ることができる該樹状細胞の量である。具体的な治療有効量としては、樹状細胞の投与形態、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定されればよく、一概には決定されないが、例えば、前記樹状細胞の細胞数で、ヒト（例えば成人）の１回の治療あたり、２００，０００〜１，０００，０００個／ｋｇ体重が好ましい。【０１１１】  本発明の治療方法における、被験体への前記製造方法により得られる樹状細胞の治療有効量の投与方法としては、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、あるいは悪性腫瘍の局所への直接注射などが挙げられるが、これらに限定されない。【０１１２】  また、本発明によれば、前記製造方法により得られる樹状細胞を有効成分として含有した、免疫応答制御剤も提供される。【０１１３】  本発明の免疫応答制御剤によれば、本発明の樹状細胞を含有しているため、免疫応答を抑制又は賦活させること���できる。【０１１４】  本発明の免疫応答制御剤は、有効成分である樹状細胞を安定に保持しうる前記助剤を含有していてもよい。【０１１５】  本発明の免疫応答制御剤の薬理評価は、Ｔ細胞増殖アッセイによる測定されるＴ細胞刺激活性等を指標として評価されうる。【０１１６】  以下、実施例などにより本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例などにより限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１７】  生体外分化誘導により、カニクイザル胚性幹細胞からの樹状細胞の産生を試みた。図１に、ＥＳ細胞から樹状細胞への分化誘導培養の概略を示す。なお、以下の各ステップで回収した細胞について、一部凍結保存した。また、各ステップにおける細胞を、倒立顕微鏡（商品名：ＩＸ７０、オリンパス社製）を用いて分析した。【０１１８】（１）ステップ（Ａ）
霊長類動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）として、カニクイザルより樹立されたＥＳ細胞系であるＣＭＫ６細胞を用いた。【０１１９】  まず、予め０．１重量％ゼラチン溶液でコーティングした培養皿（直径１０ｃｍ、ファルコン社製）上、１０容量％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭで、ＳＴ２細胞（理化学研究所供給）を、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養した。前記ＳＴ２細胞が、培養皿の底面をほぼ覆うようになるまで増殖させた。【０１２０】  前記ＥＳ細胞を、２０容量％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したαＭＥＭ（α必須培養液）に、８×１０４細胞／８ｍｌ培養液の密度で懸濁させた。得られた細胞懸濁液を、前記培養皿のＳＴ２細胞上に播き、３７℃、５体積％ＣＯ２培養して、該ＥＳ細胞の分化誘導を開始した。分化誘導開始の４、６、８、９日後、培養液を除去し、新たな培養液と交換した。図２のパネルＡ〜Ｆに、ＥＳ細胞の分化誘導により生じる細胞について、経時的に形態を観察した結果を示す。【０１２１】  図２のパネルＡは、未分化なＥＳ細胞であり、パネルＢ〜Ｆは、ステップ（Ａ）において分化しつつあるＥＳ細胞由来の細胞の形態を示す。パネルＢは、分化誘導開始後３日目、パネルＣ及びＤは、６日目、パネルＥ及びＦは、９日目の細胞を示す。図２に示されるように、培養日数が経過するほど、未分化のＥＳ細胞が中胚葉系の細胞への分化が進み、中胚葉系へ分化した細胞の密度が増加していた。また、直径１０ｃｍ培養皿、１枚あたり、ＥＳ細胞８×１０４個で分化培養をはじめた結果、分化誘導開始後６日目までにはフィーダー層の表面は、ほぼＥＳ細胞由来の上皮細胞様細胞で覆われた。パネルＢに示されるように、分化誘導開始後３日目の時点では、多くの細胞が、丸い細胞に囲まれた上皮細胞様の大きく平らな細胞の塊を形成していた。また、パネルＣ及びＤに示されるように、分化誘導開始後４日目において、中胚葉に分化した細胞であると思われる丸い細胞の塊が、上皮細胞様細胞塊の周辺に現れていた。一日おきに培地を交換し続けると、中胚葉様の丸い細胞の塊は徐々に大きくなって融合した。パネルＥ及びＦに示されるように、分化誘導開始後１０日目において、中胚葉様の丸い細胞の塊によって、フィーダー層の表面の４０〜６０％が覆われていた。【０１２２】  培養開始１０日後、前記培養皿に、０．２５重量％トリプシン（ギブコ−インビトロジェネン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含むリン酸緩衝生理食塩水１．５ｍｌを添加し、３７℃で１０分間維持し、ＳＴ２細胞層からＥＳ細胞由来の細胞を分離した。その後、前記培養皿に、新しい培地を添加して、ＥＳ細胞由来の細胞を、遠心チューブに移した。その結果、中胚葉に分化した細胞は分離して単細胞となり、分化しなかった細胞と上皮に分化した細胞とのほとんどは塊になり、数分のうちにチューブの底に沈殿した。そこで、上清の単細胞の懸濁液を新しいチューブに移した。【０１２３】（２）ステップ（Ｂ）
前記（１）のステップ（Ａ）において、１枚の培養皿から回収されたＥＳ細胞由来の細胞を、別の培養皿４〜８枚に準備しておいたＯＰ９細胞層上にそれぞれ移植し、２０容量％ウシ胎仔血清を含むαＭＥＭで、さらに３７℃、５体積％ＣＯ２で培養した。なお、前記ＯＰ細胞層は、前記ＳＴ２細胞と同様に、培養皿の底面をほぼ覆うようになるまで増殖させることにより得られたものである。【０１２４】  移植１日目又は２日目には、フィーダー細胞層上に小さな丸い細胞の塊ができていた。かかる細胞の塊は、はじめはまばらであったが、徐々に増加した。移植後４日目に、新しい培養液４ｍｌを前記培養皿に添加した。移植後６日目、ピペッティング操作により、ＥＳ細胞に由来する球形の浮遊する細胞を回収した。図２のパネルＧに、ステップ（Ｂ）で得られたＥＳ細胞から分化した細胞（移植後６日目、分化誘導開始後１６日目）の形態を示す。図２のパネル（Ｇ）に示されるように、ＥＳ細胞由来の細胞のほとんどは小さくて丸い形態であった。【０１２５】（３）ステップ（Ｃ）
前記（２）のステップ（Ｂ）において４枚の培養皿から回収されたＥＳ細胞由来の細胞を、終濃度１００ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と終濃度１００ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）との存在下、２０容量％ウシ胎仔血清を含むαＭＥＭに浮遊させた。得られた細胞を、１枚の別の培養皿（直径１０ｃｍ）に準備しておいたＯＰ９細胞層上に移植し、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養した。【０１２６】  移植後４日目、前記培養皿に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦを含み、かつＭ−ＣＳＦを含まない新しい培養液〔組成：２０容量％ウシ胎仔血清を含むαＭＥＭ〕４ｍｌを添加した。【０１２７】  移植後６日目、ピペッティング操作により、ＥＳ細胞に由来する球形の浮遊する細胞を回収した。図２のパネルＨに、ＥＳ細胞から分化した細胞（移植後６日目、分化誘導開始後２２日目）の形態を示す。【０１２８】  その結果、パネルＨに示されるように、浮遊細胞がさらに増えていた。また、パネルＨに示されるように、培養細胞中、形態的に不均一になり、突起を持った不規則な形の樹状細胞様細胞が含まれていた。浮遊細胞の総数は、未分化ＥＳ細胞の数の２０倍前後であった。なお、本ステップ（Ｃ）では、前記培地において、Ｍ−ＣＳＦを含まず、ＧＭ−ＣＳＦを含む培地を最初から用いた場合にも、前記と同様な細胞が得られる。【０１２９】（４）ステップ（Ｄ）
前記（３）のステップ（Ｃ）で回収したＥＳ細胞由来の細胞を、５×１０５個／２．５ｍｌ培養液の密度で懸濁させた。得られた細胞懸濁液２．５ｍｌを、ストローマ細胞なしの１枚の培養皿（直径６ｃｍ）に移植し、３７℃、５体積％ＣＯ２でさらに培養した。なお、前記培養液として、終濃度１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と終濃度１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と終濃度１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＬＴ−３Ｌ（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と２０容量％ウシ胎仔血清とを含むαＭＥＭを用いた。【０１３０】  その結果、いくつかの（＜３０％）細胞は、マクロファージのように培養皿の表面に付着した。また、かかる段階において、浮遊細胞は、球形細胞の群と、パネルＩに示される突出部のある不規則な形状を示す細胞（樹状細胞様細胞）群との２つのタイプの細胞群に分かれていた。なお、本ステップ（Ｄ）では、前記培養液において、ＦＬＴ−３Ｌを含まない培養液を最初から用いた場合にも、前記と同様な細胞が得られる。【０１３１】（５）ステップ（Ｅ）
前記（４）のステップ（Ｄ）における移植後３〜４日目に、培養物中に、終濃度１０ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と終濃度３μｇ／ｍｌ  リポ多糖（ＬＰＳ、大腸菌由来；ＳＩＧＭＡ社製）と添加し、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養することにより、前記（４）のステップ（Ｄ）で得られた培養物中の浮遊細胞を刺激した。【０１３２】  その結果、浮遊細胞中に含まれる樹状細胞様細胞の比率が増加し、付着していた細胞のうち一部が浮遊細胞となった。【０１３３】  刺激後１〜３日目、ピペッティング操作により、細胞を回収した。この培養段階におけるＥＳ細胞由来樹状細胞様細胞の細胞数は、分化誘導開始時の未分化ＥＳ細胞の数の２０倍前後であった。また、図２のパネルＪ〜Ｌに、ＥＳ細胞から分化した細胞（分化誘導開始後２６日目）の形態を示す。【０１３４】  その結果、図２のパネルＪ〜Ｌに示されるように、突起をもった不規則な形の細胞が得られることがわかる。
【実施例２】
【０１３５】
前記実施例１における（１）ステップ（Ａ）において、ＳＴ２細胞の代わりにＯＰ９細胞又はＰＡ６細胞を用いて、該ＳＴ２細胞の場合と同様にステップ（Ａ）を行なった。なお、実施例２は参考例である。
【０１３６】  その結果、実施例１のＳＴ２細胞を用いた場合に比べ、ＯＰ９細胞又はＰＡ６細胞を用いた場合には、上皮様細胞がより多く現れ、丸い細胞の塊は少なかった。【０１３７】  また、前記実施例１における（１）ステップ（Ａ）において、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞刺激因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等のサイトカインを、単独で又は様々な組み合わせで用いた場合の効果を調べた。【０１３８】  その結果、ステップ（Ａ）において、前記サイトカインを用いた場合であっても、ＥＳ細胞から中胚葉系の細胞への分化を促進する顕著な効果は見られなかった。
【実施例３】
【０１３９】
前記実施例１の（２）のステップ（Ｂ）及び（３）のステップ（Ｃ）それぞれにおいて、ＯＰ９細胞の代わりに、ＳＴ２細胞又はＰＡ６細胞を用い、ＯＰ９細胞の場合と同様に、ステップ（Ｂ）及びステップ（Ｃ）を行なった。なお、実施例３は参考例である。
【０１４０】  その結果、実施例１のＯＰ９細胞を用いた場合に比べ、ＳＴ２細胞又はＰＡ６細胞を用いた場合には、ステップ（Ｃ）後に得られる浮遊細胞が少なかった。
【実施例４】
【０１４１】細胞表面分子解析
フローサイトメータ（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン−ディキンソン社製）を用いて、生理的に存在している樹状細胞に発現している細胞表面分子が、前記実施例１におけるＥＳ細胞由来の細胞にも発現しているかどうかを調べた。【０１４２】  前記実施例１で得られたＥＳ細胞由来の樹状細胞様細胞を、Ｆｃブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）中５分間処理した。その後、得られた産物を、下記フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）〔Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製〕：抗ヒト組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ（クローンＬ２４３、マウスＩｇＧ２ａ）、抗ヒトＣＤ８６（クローンＦＵＮ−１、マウスＩｇＧ１）及び抗ヒトＣＤ４０（クローン５Ｃ３，マウスＩｇＧ１）を用いて染色した。前記抗ヒトｍＡｂは、カニクイザル細胞と交差反応する。また、アイソタイプ適合対照として、マウスＩｇＧ２ａ（クローンＧ１５５−１７８）とマウスＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ−２１）を用いて染色した。とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。【０１４３】  その後、細胞を、ＰＢＳ／２容量％ＦＣＳで３回洗浄した。【０１４４】  洗浄後の細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを備えた細胞解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。【０１４５】  その結果、図３に示されるように、ステップ（Ｂ）後の細胞（図３中、「ｄａｙ１６」）及びステップ（Ｃ）後の細胞（図３中、「ｄａｙ２２」）では、これらの分子をほとんど発現していなかった。また、図３の「ｄａｙ２６」に示されるように、ステップ（Ｄ）で回収されたＥＳ細胞由来の樹状細胞様細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０及びＣＤ８６それぞれを、低いレベルで発現していた。一方、図３中、「ｄａｙ２８」に示されるように、ステップ（Ｅ）で、ＴＮＦ−αとＬＰＳとによる刺激を行なった細胞は、これらの分子を、高いレベルで発現していた。
【実施例５】
【０１４６】ＲＴ−ＰＣＲ解析による遺伝子発現解析
商品名：Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で細胞をホモジナイズして、商品名：ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。【０１４７】  得られた全ＲＮＡ  １μｇ相当量と、ランダムヘキサマープライマー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製社製）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）とを用い、４２℃で５０分間インキュベーションする条件で、ｃＤＮＡを合成した。【０１４８】  得られたｃＤＮＡを鋳型とし、下記プライマー対を用いて、生理的に存在している樹状細胞に発現している分子の前記実施例１におけるＥＳ細胞由来の細胞における発現の有無を調べた。なお、前記ｃＤＮＡについて、ＰＣＲによって、相対量をヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子で標準化した。【０１４９】  ＰＣＲプライマーとして、下記プライマー対：
ＨＰＲＴをコードする核酸：
５’−ｇｃｔｇｇａｔｔａｃａｔｃａａａｇｃａｃｔｇａａ−３’（配列番号：１）、及び
５’−ｃａａｃａａａｇｔｃｔｇｇｃｔｔａｔａｔｃｃａａ−３’（配列番号：２）、
ＣＤ８０をコードする核酸：
５’−ｃｔｃｔｃｃａｔｔｇｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇ−３’（配列番号：３）、及び
５’−ａｃｃａｇｇａｇａｇｇｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｇａａ−３’（配列番号：４）、
ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットをコードする核酸：
５’−ｇｃｔｃａａｇｔａｔｇａａａａｃｔａｃａｃｃａｇ−３’（配列番号：５）、及び
５’−ｃａｇａｔｇａｃｃｇｔｇｇｃｔｇａｇｇｔｃｔｔｇｔ−３’（配列番号：６）、
カニクイザルＣＤ８０をコードする核酸：前記配列番号：３及び４
カニクイザルＩＬ−１２ｐ４０（４０ｋＤサブユニット）をコードする核酸：前記配列番号：５及び６
を用いた。【０１５０】  なお、ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９５℃５分のインキュベーションの後、９５℃１分と５６℃１分と７２℃１分とを１サイクルとする３５サイクルを行ない、７２℃５分インキュベーションする条件である。【０１５１】  得られたＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイド含有１．２５重量％アガロースゲル電気泳動に供し、可視化した。結果を図４に示す。【０１５２】  その結果、図４に示されるように、ステップ（Ｃ）（ｄａｙ２２）以降の細胞では、ＣＤ８０の発現が認められた。また、図４に示されるように、ステップ（Ｅ）で、ＴＮＦ−αとＬＰＳとにより刺激を与えた細胞は、Ｔ細胞を活性化する作用を有するサイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）も発現していた。したがって、前記実施例１で得られた細胞は、樹状細胞であることが示唆された。
【実施例６】
【０１５３】混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によるＴ細胞刺激活性の解析
ＥＳ細胞由来の樹状細胞が、Ｔ細胞を刺激し増殖反応を起こさせる活性を有しているかどうか、アロ（同種異系）のＴ細胞と共培養した場合の、Ｔ細胞増殖を定量することにより、検討した。反応性Ｔ細胞として、ＥＳ細胞の樹立に用いられたものとは別個体のカニクイザルの末梢血Ｔ細胞を用いた。また、刺激細胞として、未分化状態にあるＥＳ細胞（陰性対照）、ステップ（Ｄ）後のＥＳ細胞由来樹状細胞及びステップ（Ｅ）後のＥＳ細胞由来樹状細胞それぞれをＸ線照射（４０Ｇｙ）して得られた細胞を用いた。【０１５４】  化学及血清療法研究所で飼育されたカニクイザルのヘパリン添加血液から、商品名：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、単核細胞を単離した。【０１５５】  ついで、抗ヒトＣＤ１４抗体をコートした磁性ビーズ（商品名、ｓｕｐｅｒｍａｇｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、単核細胞からＣＤ１４−細胞を単離し、これを、組織培養皿上、培地〔組成：２容量％  熱不活生化ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地〕中、３７℃で１時間培養した。【０１５６】  その後、培養皿に接着しない細胞を採取し、ナイロンウールカラム（和光純薬社製ナイロンウールを１０ｍｌプラスチック注射筒に充填して作製したもの）中で３７℃、５体積％ＣＯ２で１時間静置した。前記ナイロンウールカラムに接着しなかった細胞を、キラーＴ細胞として使用した。【０１５７】  種々の細胞数の前記刺激細胞を、９６ウェル丸底培養皿（ファルコン社製）において、１０容量％熱不活性化ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％ＣＯ２で５日間キラーＴ細胞とともに共培養した。最後の８時間、［３Ｈ］−チミジン（２４７．９Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ）を前記培地に、０．０３７Ｍｂｑ／ウェルとなるように添加した。培養後に、細胞を、ガラス繊維ろ紙（Ｗａｌｌａｃ社製）に取り、細胞における［３Ｈ］−チミジンの取込みをシンチレーション計測した。結果を図５に示す。【０１５８】  その結果、図５に示されるように、ＥＳ細胞由来樹状細胞を刺激細胞とした場合にのみ、反応性Ｔ細胞の強い増殖反応が認められた。また、図５に示されるように、ステップ（Ｅ）後の成熟刺激を加えた後の樹状細胞がより強いＴ細胞刺激活性を有していることがわかる。
【実施例７】
【０１５９】（１）プラスミドベクターを用いたＥＳ細胞由来樹状細胞の遺伝子改変
ヒトの組織適合白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩβ鎖の遺伝子の一種であるＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１０３のｃＤＮＡを、ＣＡＧプロモーターによって働き、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）−ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含む哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ中にクローニングして、ｐＣＡＧ−ＤＲＢ４−ＩＮを得た。図６のパネルＡに、前記ｐＣＡＧ−ＤＲＢ４−ＩＮの概略図を示す。【０１６０】  未分化状態のカニクイザルＥＳ細胞１．０×１０７個を、０．４ｍｌのダルベッコ改良イーグル培養液（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に懸濁した。得られた懸濁液と前記ｐＣＡＧ−ＤＲＢ４−ＩＮ  ５０μｇとを混合した。得られた混合物を、４ｍｍギャップのキュベット（商品名：ＢＭ６４００、ＢＴＸ社製）に入れ、該キュベットを、商品名：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にセットした。その後、２５０Ｖ、５００μＦの条件で電気穿孔法による遺伝子導入を行なった。【０１６１】  遺伝子導入したＥＳ細胞を、１０ｃｍ培養皿上のＰＥＦ（マウス胎仔性線維芽細胞）層上で、培地〔組成：２０容量％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）含有ＤＭＥＭ中、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養した。遺伝子導入後２日目より、選択薬剤であるＧ４１８（１５０μｇ／ｍｌ）を培地に添加することにより、薬剤耐性細胞すなわち遺伝子導入細胞を選択した。【０１６２】  遺伝子導入後１１日目にＧ４１８耐性細胞のコロニーとして、遺伝子導入細胞（トランスフェクタント）クローンを採取し、予めＰＥＦを培養している２４ウェル培養プレートに移した。さらに、Ｇ４１８（１５０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養を継続することにより細胞を増殖させ、その一部を凍結保存した。また、残りの一部を３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８含有培地〔組成：２０容量％  ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）含有ＤＭＥＭ〕中、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養し、このような高濃度のＧ４１８存在下でも増殖できるトランスフェクタントクローン、すなわち導入遺伝子の発現レベルが高いと予測されるクローンを、選択した。【０１６３】  また、ＲＴ−ＰＣＲにより、導入遺伝子の発現を調べた。得られた細胞から、商品名：ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ  １μｇ相当量と、ランダムヘキサマープライマー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）とを用い、４２℃５０分間インキュベーションする条件で、ｃＤＮＡを合成した。【０１６４】  得られたｃＤＮＡを鋳型とし、５’−ｃｔｇａｃｔｇａｃｃｇｃｇｔｔａｃｔｃｃｃａｃａ−３’（配列番号：７）と５’−ｔｔｇｇｔｔａｔａｇａｔｇｔａｔｃｔｇａｔｃａｇｇｔ−３’（配列番号：８）とを用いて、ＰＣＲを行ない、導入遺伝子の発現を調べた。なお、対照として、ＨＰＲＴ遺伝子の発現を調べた。なお、ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９５℃５分のインキュベーションの後、９５℃１分と５６℃１分と７２℃１分とを１サイクルとする３５サイクルを行ない、７２℃５分インキュベーションする条件である。【０１６５】  前記Ｇ４１８耐性と、ＲＴ−ＰＣＲの結果に基づいて、トランスジーンの発現が比較的高いＥＳ細胞のトランスフェクタントクローン１２個を選択した。【０１６６】  ついで、前記実施例１と同様に、得られたＥＳ細胞から、樹状細胞を分化誘導させた。【０１６７】（２）ＲＴ−ＰＣＲ解析による導入遺伝子の発現解析
前記（１）と同様に、ＲＴ−ＰＣＲ解析により、導入遺伝子の発現を確認した。結果を図６のパネルＢに示す。【０１６８】  その結果、図６のパネルＢに示されるように、遺伝子導入を行ない、Ｇ４１８による薬剤選択を行なった細胞では、導入遺伝子由来のＤＲ５３βのｍＲＮＡが発現していることがわかる。また、遺伝子導入ＥＳ細胞から分化誘導した樹状細胞においても、同様に導入遺伝子由来のＤＲ５３βのｍＲＮＡが発現していることがわかる。
【実施例８】
【０１６９】抗原提示能力の評価
前記実施例７で得られたＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞について、ＤＲ５３分子上に提示されたＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを特異的に認識して増殖反応を示すヒトのＴ細胞株ＳＡ３２．５に対する抗原提示能力を調べた。【０１７０】（１）合成ペプチドの作製
ヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ｐ１１１−１３１（ＬＱＤＶＭＮＩＬＬＱＹＶＶＫＳＦＤＲＳＴＫ；配列番号：９）に相当するオリゴペプチドを合成し、精製した。【０１７１】（２）抗原提示アッセイ
合成ペプチドを用いたアッセイにおいて、実施例１で得られた樹状細胞を、前記（１）で得られた合成ペプチド存在下（０〜５μＭ）、３７℃、５体積％ＣＯ２で３時間インキュベーションし、培地で４回洗い、Ｘ線照射（４０Ｇｙ）し、増殖能力を失わせた。【０１７２】  ＨＬＡ−ＤＲ５３分子（ＤＲＡ＊０１０１＋ＤＲＢ４＊０１０３）に結合したＧＡＤ６５  ｐ１１１−１３１を認識するヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンであるＳＡ３２．５（５×１０４／ウェル）と、抗原（前記合成ペプチド）が負荷された樹状細胞（２×１０４／ウェル）とを、９６ウェル平底培養プレート上、１０容量％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養することにより、Ｔ細胞増殖アッセイを行なった。【０１７３】  培養４８時間後、培地に、［３Ｈ］−チミジンを添加し、さらに１６時間培養した。その後、細胞を採取し、ＳＡ３２．５の増殖に伴う［３Ｈ］−チミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した。なお、陰性対照として、遺伝子導入を行なっていないＥＳ細胞由来の樹状細胞にペプチドを負荷した細胞及びペプチドを負荷していないＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞を用い、前記と同様に、ＳＡ３２．５とともに培養した。結果を図７のパネルＡに示す。【０１７４】  その結果、パネルＡに示されるように、ＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞にペプチドを負荷したもののみが、ＳＡ３２．５の増殖を誘導するという結果が得られた。この結果から、ＥＳ細胞の段階で導入した遺伝子に由来するＤＲ５３βが樹状細胞分化後に機能していること、さらに、ＤＲ５３β鎖の遺伝子を導入したＥＳ細胞由来の樹状細胞は、ＧＡＤ６５抗原由来ペプチドをＤＲ５３分子上に提示し、ＳＡ３２．５Ｔ細胞株を刺激して増殖反応を誘導することがわかった。また、ＤＲ５３β遺伝子を導入したＥＳ細胞由来の樹状細胞では、カニクイザル遺伝子にコードされるカニクイザルのＤＲα鎖と導入遺伝子由来のＤＲ５３β鎖が会合してＤＲ５３分子を形成し、細胞表面に発現することが示唆される。
【実施例９】
【０１７５】ＥＳ細胞由来樹状細胞による抗原の限定分解と提示
前記実施例７で得られたＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞が、タンパク質抗原を細胞内に取込み、これを限定分解してペプチドを産生し、細胞表面上のＤＲ分子上に提示する活性を有しているかどうか検討した。【０１７６】（１）組換えタンパク質の作製
ＧＡＤ６５  ｐ９６−１７４タンパク質断片をコードするＤＮＡ断片を、原核生物の発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に連結し、ついで、得られたベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、それにより、該Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合ＧＡＤ６５タンパク質（ＧＳＴ−ＧＡＤ）を発現させた。Ｆｒａｇｉｏｎｉ及びＮｅｅｌが報告した方法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１０、１７９−１８７（１９９３）〕により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α中での組換えタンパク質産生を誘導し、組換えタンパク質を細菌封入体から抽出した。グルタチオン−アガロース（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、組換えタンパク質を精製した。なお、融合タンパク質の純度及び量は、硫酸ラウリルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。得られた組換えタンパク質を、商品名：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、低分子量のペプチド断片から分離し、透析によってバッファーを培地に置換した。【０１７７】（２）抗原提示アッセイ
組換えタンパク質を用いたアッセイにおいては、前記実施例７で得られたＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞を、ＧＳＴ又は前記（１）で得られたＧＳＴ−ＧＡＤタンパク質の存在下（１８μＭ）、終濃度１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αと終濃度３μｇ／ｍｌ  ＬＰＳとともに、３７℃、５体積％ＣＯ２で２０時間インキュベーションし、培地で３回洗い、Ｘ線照射（４０Ｇｙ）し、増殖能力を失わせた。【０１７８】  前記ＳＡ３２．５（５×１０４／ウェル）と、抗原（前記組換えタンパク質）が負荷された樹状細胞（２×１０４／ウェル）とを、９６ウェル平底培養プレート上、１０容量％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養することにより、Ｔ細胞増殖アッセイを行なった。【０１７９】  ４８時間後、培養物に、［３Ｈ］−チミジンを添加し、さらに１６時間培養した。ＳＡ３２．５の増殖に伴う［３Ｈ］−チミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した。陰性対照として、遺伝子導入を行なっていないＥＳ細胞由来の樹状細胞にＧＡＤ６５タンパク質を負荷したもの、および、ＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞にＧＳＴタンパク質を負荷したものも、ＳＡ３２．５とともに培養した。結果を図７のパネルＢに示す。【０１８０】  その結果、パネルＢに示されるように、ＤＲ５３β遺伝子導入樹状細胞にＧＳＴ融合ＧＡＤ６５タンパク質を負荷したもののみが、ＳＡ３２．５の増殖を誘導した。これらの結果は、ＥＳ細胞由来樹状細胞は溶解している抗原タンパク質を細胞内に取込み、分解し、ペプチドとしてＤＲ分子上に提示する能力があることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】  本発明によれば、霊長類動物に由来する樹状細胞を大量に効率よく安定的に供給することができ、かつ、ウイルスベクターを使用すること無く通常のプラスミドベクターを電気穿孔法により導入することによる遺伝子改変が可能になる。本発明により樹状細胞の遺伝子改変が容易に効率良く、かつ安全に行なうことが可能になる。このような遺伝子改変樹状細胞を生体に投与することにより、個体の免疫反応を抗原特異的に制御することが可能になるため、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される種々の疾患に対する治療等が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８２】  配列番号：１は、ＨＰＲＴプライマーの配列である。【０１８３】  配列番号：２は、ＨＰＲＴプライマーの配列である。【０１８４】  配列番号：３は、ＣＤ８０プライマーの配列である。【０１８５】  配列番号：４は、ＣＤ８０プライマーの配列である。【０１８６】  配列番号：５は、ＩＬ−１２ｐ４０プライマーの配列である。【０１８７】  配列番号：６は、ＩＬ−１２ｐ４０プライマーの配列である。【０１８８】  配列番号：７は、ＨＰＲＴプライマーの配列である。【０１８９】  配列番号：８は、ＨＰＲＴプライマーの配列である。【０１９０】  配列番号：９は、ＧＡＤ６５の部分配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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