(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒツジアデノウイルスOAV287のゲノムまたは機能的に同等な核酸配列と、細胞において発現される遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列とを含むDNA分子を含むウイルスベクターの、ヒト患者における遺伝子治療のための医薬の調製における使用であって、前記ウイルスベクターが少なくとも一つの前記ヒト患者の細胞に感染し、感染された細胞が前記遺伝子を発現する、使用。
【請求項２】
前記細胞内で全くウイルスの複製が起こらない請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記細胞内で全く早期または後期ウイルス遺伝子の発現が起こらない請求項1に記載の使用。
【請求項４】
前記遺伝子がガン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスおよびリボザイムRNA、酵素をコードする遺伝子、サイトカインまたは他の免疫調節高分子をコードする遺伝子、組換え抗体をコードする遺伝子、細胞溶解性ペプチドをコードする遺伝子、ワクチン抗原をコードする遺伝子、体細胞における遺伝的欠陥を相補する高分子をコードする遺伝子および細胞を死に導くプロセスを触媒する高分子をコードする遺伝子より成るグループから選択されたものである請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記遺伝子がプロドラッグを代謝する酵素をコードし、前記プロドラッグの存在下で、前記感染された細胞が前記遺伝子を発現し、プロドラッグを細胞を死に導く毒生産物に代謝するような前記酵素を形成する請求項4に記載の使用。
【請求項６】
前記遺伝子が原核生物のプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPアーゼ）をコードし、前記プロドラッグが6-メチル-プリン-2’-デオキシリボヌクレオシド（6MPDR）である請求項5に記載の使用。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが前記遺伝子に発現可能なように結合した細胞特異的プロモーターを含み、前記遺伝子が望ましい標的細胞においてのみ発現する請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記細胞特異的プロモーターがラットプロバシン、ヒトPSA、PSMA、erbB-2またはCEAプロモーターから成るグループより選択されたものである請求項7に記載の使用。
【請求項９】
前記標的細胞が前立腺または胸部ガン細胞である請求項7に記載の使用。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターがOAV211である請求項1から9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ヒツジアデノウイルスベクターが、ファイバー、ヘキソンおよびペントンベースタンパク質より成るグループから選択されたウイルスの改変されたコートタンパク質を導く修飾を有する請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記修飾が特異的なヒツジアデノウイルスコートタンパク質DNA領域を、他の動物またはヒトアデノウイルス由来のコートタンパク質DNA領域での置換を含む請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
前記修飾が望ましい標的細胞に対して結合特異性を持つベクターを導く請求項11に記載の使用。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターがOAV206/Ad5fである請求項11から13のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターがOAV206/Ad5pである請求項11から13のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターがOAV206/Ad5fおよびOAV206/Ad5p由来の両修飾を運ぶものである請求項11から13のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが104から1014のml当たりのプラーク形成ユニットの濃度で投与される請求項1から16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ウイルスが106から1010のml当たりのプラーク形成ユニットで投与される請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが局所的に、経口的にまたは注射により投与される請求項1から18のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新しいヒツジアデノウイルスベクターを用いたヒトにおける遺伝子治療の方法に関する。特に本発明は遺伝子が細胞によって機能的に発現されるようなヒト細胞内への遺伝子の導入法に向けられている。
【０００２】
【従来の技術】
ガン、嚢胞性繊維症、筋ジストロフィーのような病気および多くの他の疾患を引き起こす遺伝的欠陥は、ヒトのヘルスケアのコストに多大なる寄与をしている。従って体細胞のレベルで効果的な遺伝的治療を供給するための新しいアプローチを開発するために世界的に主要な研究努力が行われている。
【０００３】
この研究の中心はレトロ、ポックス、アデノ関連性およびアデノウイルスのようなウイルス由来の様々な遺伝子ベクターである。これらのベクターが由来するウイルスは低い病原性であり、ベクターはホスト細胞内に治療上の遺伝子を運ぶためにデザインされている。適切なコンディションの下ではこれらはホストを予防接種し、細胞表現型を変え、免疫応答を刺激し、遺伝的欠陥を補いまたは細胞を死へ導くことができる産物を生産し得る。
【０００４】
単一のウイルスベクターで全ての治療上の場面に対して望ましい全ての特質を持つものはない。あるベクターはその生物学的性質のため特定の課題に対して他のものよりよく適している。例えばレトロウイルスはホストのゲノム内に挿入できるので、これらのベクターは造血細胞系列の幹細胞のような分裂している細胞に遺伝子を運ぶのによく適している。これに対してアデノウイルスベクターは通常そのDNAを挿入しないが、非分裂細胞に効率よく感染できる。ヒトアデノウイルスベクターは例えば肺、筋肉、肝臓、血管および脳細胞等のヒトおよび動物モデルにおける様々な組織に遺伝子を運ぶために用いられている。ヒトアデノウイルスを使用する上での主要な不都合は、これらのウイルスは天然でヒトに感染するため、ヒトアデノウイルスベクターを用いて治療されたヒトが循環抗体を持っており、ベクターが標的細胞に到達する前にそれを中和してしまい得ることである。免疫性はまた細胞免疫系によってホスト細胞からウイルスの効率的なクリアランスをも引き起こし、それによって遺伝子発現のためいかなる治療上の効果も急速に消失してしまう。それゆえ先在する免疫系の問題を解決するために、通常ヒトに感染しないウイルス由来のベクターを開発する必要がある。ヒツジとヒトのアデノウイルスは血清学的に別個のものであるので、ベクターとしてのヒツジアデノウイルス（OAV）の使用はこの目標を達成し得るかもしれない。免疫応答がより厳しくなく、遺伝子発現がより許容されやすいために、ホスト細胞におけるその存在が隠されているベクターを開発することも本質的なことである。ヒツジアデノウイルスはほとんどの非ヒツジ動物細胞においてでさえ生産的に複製されないので（1）、ヒト細胞に感染できたとしてもそこにおいて複製不能であると期待された。早期の段階で複製がブロックされることは感染された細胞においてウイルス産物の最小限の発現を導き、結果として細胞の免疫応答の低レベル誘導を引き起こすであろう。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はヒツジアデノウイルスOAV287由来のアデノウイルスベクターを開発した。それら由来のウイルスおよびウイルスベクターはCommonwealth Scientific and Industrial Research Organisationの名の下で1995年7月26日に提出された国際特許出願番号WO96/03508に十分に記述されている（以下では「PCT出願」として示し、参考としてここで取り込まれる）。PCT出願で開示されたアデノウイルスベクターは様々な非ヒト細胞特にヒツジ細胞内に外来DNAを導入するためのベクターとしての使用に適していると発見された。OAV287のゲノム配列および配置は国際特許出願番号WO91/11525およびWO94/26914に記述されたイヌアデノウイルス、国際特許出願WO95/16048に記述されたウシアデノウイルスおよびトリCELO単離物（2）を含むあらゆる既知のヒト、動物およびトリアデノウイルスとも異なっている。OAVはまた血清学的にも別個であり（1）、血清ヒトAd5によっても中和されない。これはヘキソン、ペントンおよびファイバー抗原における特徴的なアミノ酸配列に一致する。他の既知のアデノウイルスと比較して、OAVのキャプシドタンパク質には他の主要な差異も存在する。OAVはキャプシドタンパク質同族体VおよびIXを欠いているが、少なくとも2つの他の構造タンパク質を含む（3）。OAVと他のアデノウイルス間の低い核酸配列相同性のため、感染性組換えウイルスを形成するためにホスト内に共感染する間にOAVともう一つのアデノウイルス間で組換えを起こす機会はほとんど存在しない。
【０００６】
ヒトの遺伝子治療に対してOAVベクターを使用することについて決定的なことは、OAVが現実にヒト細胞に入ることができるかどうかという問題である。ヒト細胞内へのヒトアデノウイルスの侵入はファイバーおよびペントンベースタンパク質における特異的なアミノ酸配列が関与する二段階の工程経由で生ずる（4,5）。第一にウイルスはウイルスの表面から突き出た三量体ファイバータンパク質経由で未同定の表面受容体に付着する。第二にファイバースパイクの基部でペントンタンパク質複合体の部分を形成するαvβvクラスインテグリンおよびArg/Gly/Asp（RGD）トリペプチド間の相互作用が（最初に）生ずる。それからウイルスはエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。ヒツジアデノウイルスOAV287ファイバータンパク質の細胞結合ドメインは比較的小さく、そのヒトアデノウイルス同族体に対して完全に異なる配列を持つ。それが異なる一次受容体に結合することはほぼ確かであろう。ヒトアデノウイルスと比較してOAVペントンタンパク質は決定的なRGDモチーフおよび側面の配列も欠いている（3）。それゆえOAV287を含むOAVがヒト細胞に感染しうるかどうかは未知であったし予想され得ることもなかった。
【０００７】
本発明はその細胞付着タンパク質における主要な差異にも関わらず、ヒツジアデノウイルスOAV287由来のベクターが全てではないが様々なヒト細胞系に感染し得るという驚くべき発見をなした。この発見はヒト遺伝子治療ベクターとしてのOAVの使用を可能にする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
第一の面として、本発明はヒツジアデノウイルスのゲノムまたは機能的に同等な核酸配列またはその一部をコードする核酸配列、およびウイルスベクターが少なくとも一つのヒト患者の細胞に感染し感染された細胞が遺伝子を発現するような細胞において発現される遺伝子を含む少なくとも一つの核酸配列を含むDNA分子を含むウイルスベクターを、ヒト患者に投与することを含むヒト患者における遺伝子治療の方法にある。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様として、ヒツジアデノウイルスのゲノムはOAV287またはそれから由来した核酸分子である。
【００１０】
細胞内で実質的に全くウイルスの複製が生じないのが好ましい。また細胞内で実質的に全く早期のまたは後期の遺伝子発現が生じないのがより好ましい。
【００１１】
ここで用いられている「機能的に同等な核酸配列」なる語は、DNAコードにおける縮重のため天然のヒツジアデノウイルスとは実質的に異なる生物学的活性を持つウイルスを引き起こさないヒツジアデノウイルス配列における少量のバリエーションを企図している。コードされたアデノウイルスタンパク質は天然のウイルス配列から改変されたアミノ酸配列を持ち得るが、天然のウイルスタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を維持すべきである。これはウイルスを実質的に改変しない範囲で挿入、欠失および保存的であれ非保存的であれ置換のような配列内の様々な変化によって成し遂げられよう。
【００１２】
遺伝子は機能的な分子をコードするいかなる核酸配列としても定義される。遺伝子はガン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子であるかもしれないし、アンチセンスまたはリボザイムRNA、酵素をコードする遺伝子、サイトカインまたは他の免疫調節高分子をコードする遺伝子、組換え抗体をコードする遺伝子、細胞溶解性ペプチドをコードする遺伝子、ワクチン抗原をコードする遺伝子、体細胞における遺伝的欠陥を相補する高分子をコードする遺伝子または細胞を死に導くプロセスを触媒する高分子をコードする遺伝子を含む治療上の高分子をコードするであろう。細胞死は遺伝子発現の結果として直接的に、発現された外来高分子に対する免疫応答の結果として間接的に生ずるであろう。好ましくは遺伝子はヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはプロドラッグを代謝する非哺乳動物シトシンデアミナーゼをコードし、より好ましくは遺伝子は原核生物プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする。適切なプロドラッグの存在下で、感染細胞による遺伝子の発現およびプロドラッグの代謝は細胞を死に導く毒性産物を引き起こす。
【００１３】
本発明の第一の面のさらに好ましい実施態様として、ウイルスベクターは遺伝子が望ましい標的細胞内でのみ発現するような遺伝子と意義深くリンクした細胞特異的プロモーターを含む。該プロモーターは本分野でよく知られている。例えば前立腺ガンの治療に対して、プロモーターはプロバシン、前立腺特異的抗原（PSA）または前立腺特異的膜抗原（PSMA）から由来したプロモーターを含むグループから制限されることなく選択され得る。同様に胸部ガンに対しては、erbB-2プロモーターが有用であろう。肺のような他のガンに対しては、ガン胎児性抗原（CEA）プロモーターが用いられ得る。
【００１４】
本発明の第一の面のより好ましい実施態様はウイルスベクターOAV211である。
【００１５】
第二の面として本発明は、本発明の第一の面にしたがったヒツジアデノウイルスベクターが修飾されたアデノウイルスゲノムの一つ以上のコード領域を持つ遺伝子治療の方法にある。修飾は好ましくはウイルスの改変されたコートタンパク質を引き起こす。より好ましくは改変されたコートタンパク質はファイバー、ヘキソンおよびペントンベースタンパク質から成るグループより選択される。
【００１６】
修飾は好ましくは特異的なヒツジアデノウイルスDNAを他の動物またはヒトアデノウイルス由来の同等なコード領域で置換することを含む。
【００１７】
ヒトアデノウイルス5/lacZ型組換え体はCSL503細胞に感染できる。それゆえAd5ペントンおよびファイバータンパク質由来の細胞結合ドメインを、CSL503細胞において複製するハイブリッドOAVの能力を維持したままOAVタンパク質のその領域で置換することは可能である。該ハイブリッドウイルスはヒト細胞において未だ複製不能であろう。例えばヒツジアデノウイルスファイバータンパク質の細胞結合ドメインをヒトまたは動物アデノウイルス由来の同等なドメインで交換することは、ハイブリッドOAVが天然のOAVと比較して細胞の異なるスペクトルに感染することを可能にする。同様にヒトアデノウイルス由来のペントンベースRGDモチーフまたは動物アデノウイルス由来の同等の領域を運ぶハイブリッドヒツジアデノウイルスは、きっと野生型OAVより広い様々なヒトおよび動物細胞に侵入することができるだろう。ファイバーおよびペントンの両タンパク質修飾を運ぶハイブリッドヒツジアデノウイルスは、非ヒツジ細胞におけるヒツジアデノウイルスの複製不能性質を維持したまま、きっと細胞結合配列が由来するアデノウイルスとして同じスペクトルの細胞に効率よく結合し侵入するであろう。
【００１８】
本発明の第二の面のより好ましい実施態様は、ウイルスベクターOAV206/Ad5fおよびOAV206/Ad5pである。さらに好ましい実施態様として、OAV206/Ad5fおよびOAV206/Ad5p由来の両修飾を運ぶウイルスベクターである。
【００１９】
本発明のウイルスベクターは104から1014、好ましくは106から1010のml当たりのプラーク形成ユニットの濃度で局所的に、経口的にまたは注射により投与される。投与量および投与経路は必要とされる治療に依存するであろうことが認められよう。
【００２０】
第三の面として本発明は本発明の第一および第二の面の方法における使用のためのワクチンにある。
【００２１】
本発明の性質をより明らかに理解し得るために、以下の実施例および図面を参考として好ましい形態が記述されるであろう。
【００２２】
【発明の実施の形態】
方法
感染性プラスミドの構築
DNA配列の操作およびプラスミドの修飾の技術は、本分野でよく知られておりSambrook等（7）のような出版物に記述されている。プラスミドpOAV100は以前に記述されているように（PCT出願）HindIIIおよびSmaIサイト間の配列を取り除くために修飾されているBluescript M13-（Stratagene）のKpnI内に、OAV287ゲノムのフルレングスコピーをクローニングすることによって構築された。pOAV100は8292位でOAV287の野生型配列に存在するSphIサイトを欠いている。さらにpOAV100はMuta-gene Phagemid（Biorad Labs,Ca）またはAlteredサイトII（Promega,Wi）ミュータジェネシスキットを用いて、pVIIIおよびファイバー遺伝子の間の位置のゲノムの22,129と22,130核酸の間のApaIおよびNotIサイトを含む20の核酸配列の挿入によって修飾された。結果として生じたプラスミド、pOAV200はApaI/NotIサイトを用いたOAV287ゲノム内に挿入される遺伝子発現カセットのためのアクセプターであった。例えばHCMV/VP7scプロモーター/遺伝子カセットは別々のプラスミドで組み立てられ、プラスミドpOAV206を形成するためにApaI/NotI側面サイトを用いてpOAV200内に取り込まれた。
【００２３】
修飾されたファイバータンパク質を運ぶウイルスOAV206/Ad5fは、以下のように構築された。OAVファイバータンパク質のC末端で提案された細胞結合ドメインを修飾するために、OAV287ゲノム配列の21,527-28,644ベース由来のSphI/SalI断片をSphI/SalIカットプラスミドpAlter-1（Promega）内にサブクローン化した。ミュータジェニックオリゴヌクレオチドおよびAlteredサイトII（Promega,Wi）ミュータジェネシスキットを、配列の23,454および23,894位でNcoIおよびCelIIサイトをそれぞれ導入するために用いた。NcoIとCelIIサイトを取り込んだオリゴヌクレオチドプライマーを、Ad5細胞結合ドメイン（5）をコードする32,156および32,776核酸位間のヒトアデノウイルス5型ゲノムの同等な部分をPCR増幅するために用いた。PCR断片をNcoIとCelIIを用いて切断し、OAV配列を置換するためにNcoI/CelIIカット組換えpAlter-1プラスミド内にクローン化した。それから修飾ファイバータンパク質遺伝子を含むAgeI/SalI断片を、プラスミドpOAV206/Ad5fを作出するためにAgeI/SalIカットプラスミドpOAV206内にサブクローン化した。作出された修飾タンパク質の配列は図3に示されている。
【００２４】
ペントンタンパク質を修飾するために、ペントン遺伝子を含むOAV287の13kb XmaI/SphI断片（9,224-21,527ベース）をXmaI/SphIカットpAlter-1内にサブクローン化し、12,654および12,674位でAatIIおよびXhoIサイトをそれぞれ導入することによってミューテートした。これらの制限サイトを含むミュータジェニックオリゴヌクレオチドプライマーを、ヘリックスループヘリックスモチーフ（8）を含むヒトAd5ペントン遺伝子の同等な部分をPCR増幅するために用いた。他のアデノウイルス由来の同等な配列も用いられ得た。この断片（279bp）をOAV配列を置換するためにミューテートされたAatII/XhoIカットpAlter-1プラスミド内にサブクローン化した。それからXmaI/SphI断片を潜在的な感染性プラスミド、pOAV206/Ad5pを構築するために、XmaI/SphIカットpOAV206内にサブクローン化した。このプラスミドは修飾ペントンタンパク質を運ぶウイルス（OAV206/Ad5p）を回収するために用いられ得る。ハイブリッドペントンタンパク質配列の派生体は図4に示されている。
【００２５】
PSA/PNPアーゼ/ポリAカセットを含む組換えウイルス、OAV211は以下のように構築された。620bpPSAプロモーター断片をPCR増幅によって白血球DNAから単離し、pGem-Tベクター（Promega Corp,Madison,WI）内にサブクローン化した。同様に、大腸菌DeoD遺伝子（Genbank Accession Number M60917）をGenbank配列の105および849ベースでSpeIおよびBamHIをそれぞれ導入し、それらの酵素で切断したPCRプライマーを用いてゲノムDNAから増幅した。SV40ポリアデニル化シグナルを含む513bp断片を、BamHIおよびSalIを用いてpJC119（9）を切断することによって調製した。この断片をSpeIおよびSalIを用いてカットしたpGem/PSAベクター内にDeoDPCR断片を用いた三方向ライゲーションによってクローン化した。それからPSA/PNPアーゼカセットをXbaIおよびSalIを用いて摘出し、SpeIおよびSalIを用いてカットしたアデノウイルス5型ベースプラスミドpXCX3内にサブクローン化した。（pXCX3はKpnISpeIEcoRVBglIISalIおよびサイトを含むポリリンカーをXbaIサイト内にクローニングすることによってpXCX2（10）から由来した）。これらからカセットはpOAV211を形成するために、pOAV200のApaI/NotIサイト内にpGem11zf+経由でサブクローン化した。
【００２６】
ウイルスの回収
KpnIを用いたpOAV100,pOAV200およびpOAV206/Ad5fの切断は、直線状のOAV287または修飾されたウイルスゲノムを放出した。これらをリポフェクトアミン（GibcoBRL）および以前に記述された方法（PCT出願）を用いてCSL503細胞にトランスフェクトした。成育可能なゲノムはこれらのコンディションの下でCSL503細胞において感染性であり、ウイルスが生産され、細胞に対して細胞変性効果を引き起こした。しかしながらpOAV206およびpOAV211はKpnI切断無しで回収された。フリーゲノム末端が回収のため必要であると一般的に考えられていたので（11,12）、これにはいくぶん驚かされた。回収されたウイルスをそのゲノム構造が正しいことを確認するために制限酵素切断によって特性指摘した。代わりにOAVのDNA-Terminalタンパク質複合体を、ヒトAd5（13）に対して記述されているようにTi80ローターで20-22時間40,000rpmで4Mグアニジン-HCl/2.5MCsClを含む勾配で遠心分離して調製した。感染性ウイルスのような大きなプラスミドの回収は、例えばBglII/StuIを用いた切断の後、それらをOAVDNA末端タンパク質複合体の断片と共にCSL503細胞内でコトランスフェクトすることによって改良しうるであろう。
【００２７】
細胞の感染、RT-PCR分析および抗原の発現
CSL503ヒツジ肺、ウサギ腎臓およびヒト細胞系を偽感染しまたは以前に記述されているように（14）20pfu/細胞の非常に多くの感染でウイルスを用いて感染した。感染は細胞系に依存して12-96時間行われることを許容した。標準的な方法を用いてポリアデニル化RNAを〜107細胞から調製した。トータルcDNAをオリゴ（dT）をプライマーにしてまたは特異的なプライマーでAMV逆転写酵素を用いて合成した。cDNAを興味ある遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRによって増幅し、アガロースゲル上で分析した。タンパク質発現を分析するため、新しく合成されたタンパク質をラベルするための35S-メチオニンの存在下で細胞をメチオニンフリー培地でインキュベートした。興味あるタンパク質を、発現されたタンパク質に対する特異的な抗血清を用いて（14）免疫沈降法によって細胞溶解物から回収した。回収されたタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、オートラジオグラフィーまたはPhosphorimager（Molecular Dynamics）を用いて検出した。
【００２８】
結果
OAV287ウイルスのホストの範囲は未知であるが、ウイルスがウサギ腎臓、ウシ（MDBK）およびサル（CV-1）細胞（1）においては成長しないため、主にヒツジ細胞に制限されていると考えられる。生産的なウイルス感染はヒツジ肺細胞（CSL503系）においてのみ本発明で観察されており、ウシ鼻甲介細胞系で非常にわずかな量見受けられた。
【００２９】
ヒツジアデノウイルスは異種の細胞においては生産的に複製しないので、ウイルスが細胞に侵入したが複製の早期の段階でブロックされたのかどうか、またはウイルスが全く侵入しなかったのかどうかを決定することは容易なことではない。この問題を調べ、ヒツジアデノウイルスのホスト範囲を決定するために、本発明はロタウイルスVP7sc抗原と機能的にリンクしたヒトサイトメガロウイルスIE94（HCMV）エンハンサー/プロモーターエレメントおよびポリアデニル化シグナル（PCT出願）を運ぶ組換えウイルスOAV206を用いた。発現カセットをpVIIIおよびファイバータンパク質（図1）をコードする遺伝子の間でヒツジアデノウイルス内に挿入した。このウイルスを様々なヒト細胞に感染させるために用い、VP7scタンパク質の発現をラジオラベルされたタンパク質の免疫沈降法によってモニターした。VP7sc発現が2つの胸部細胞系（T47D2およびMcF7）,1つの前立腺ガン系（PC3）およびヒト肺繊維芽細胞系MRC5において検出されたことは明らかである（図2A,BおよびC）。それゆえその独特の細胞接着タンパク質にもかかわらず、OAV206はこれらの細胞に感染した。感染は効率的でもあった。McF7細胞においては、例えばわずかに20のMOIで細胞の〜30-50％が免疫蛍光法によって示されるようにVP7scを発現した。しかしながら全てのヒト細胞系が感染されたわけではない。VP7sc発現はヒトメラノーマ細胞系MM418Eまたは前立腺細胞系LNCaPでは検出されなかった。後者の結果は前立腺PC3細胞系は効率的に感染されるために驚くべきことだった。
【００３０】
OAV211による細胞殺傷
OAV211はPSA/PNPアーゼ/SV40ポリAカセットを含む。このPSAプロモーター断片は組織特異的態様で発現されず、CATレポーター遺伝子を用いたアッセイで示されるように、いくつかの細胞タイプで比較的低い活性しかもたない。PNPアーゼはプロドラッグ6-メチル-プリン-2’-デオキシリボヌクレオシド（6MPDR）を細胞にとって毒性である毒性産物6MP（15）に代謝する酵素である。ヒト前立腺PC3および胸部ガン系細胞McF7およびT47D2を10のMOIでOAV211を用いて感染させた。他の細胞は非感染のままであった。感染および非感染の両者を20日までの期間0-100μM6MPDRの存在下でインキュベートした。細胞における代謝活性をAlamar Blue（Alamar Biosciences Inc.,Sacramento.CA.）を用いてモニターした。OAV感染はPC-3,McF7およびT47D2細胞では感染後13日で検出可能な効果はなかった。プロドラッグ（0-100μM）はT47D2細胞では効果がなかった（図5A）。ほとんどの細胞が薬剤を除去すると回復したが、McF7細胞は代謝活性がいくらか減少を示した（図5B）。しかしながら50-100μM6MPDRの存在下でOAV211を用いた感染に引き続いて、PSAプロモーター断片がこれらの細胞で低いレベルの活性しかもたないという我々の最近の研究が明らかにした事実にもかかわらず、両胸部ガン細胞系を感染後13日で殺傷した。同様の結果は前立腺PC3細胞系を用いても得られた。OAVベクターが特定のヒトガン細胞に感染し得るという証明は、それらを酵素-プロドラッグ治療の輸送において有用なものにさせる。細胞殺傷において考慮すべき改良が、より強いプロモーターを用いることで期待され得る。アラビノフラノシル-2-フルオロアデニン（Fludarabine）のような他の化合物もまたPNPアーゼに対する基質として用いられ得る。
【００３１】
OAVの改変された細胞親和性
ファイバータンパク質の先端の細胞結合ドメインは、細胞表面の未知の受容体とのアデノウイルスの最初の付着部位である（5）。このドメインを変えることによって、もし三量体ファイバータンパク質の完全性が維持されるならば、アデノウイルスの細胞親和性を改変することがきっと可能であろう。OAVのファイバータンパク質上の細胞結合ドメインを、図3に記述されているようにヒトアデノウイルス5型由来の同等な領域を用いて変換した。OAV206Ad5fウイルスをCSL503細胞内への相当するプラスミドのトランスフェクションに引き続いて回収した。ウイルスOAV206およびOAV/Ad5fを、ヒトLNCaPおよびMcF7細胞を感染させるために用いた。VP7scの発現をウイルスが細胞内に侵入したかどうかの指標として感染の12,24および48時間後にこれらの細胞でモニターした。偽感染細胞は感染後24時間でモニターした。図2Aおよび2Bのデータで一貫しているが、OAV206はVP7sc発現に示されるようにMcF7には感染できたがLNCaP細胞には感染できなかった（図6,レーン2-4およびレーン8,10および11）。しかしながらOAV206Ad5fはLNCaPおよびMcF7細胞の両方に感染し、VP7scを効率よく発現した（図6,レーン5-7およびレーン12-14）。（これらの細胞タイプにおけるVP7scのサイズの差異は、タンパク質に付着した炭水化物の差異を反映している（14））。それゆえAd5f由来のものにOAVファイバータンパク質の細胞付着ドメインを変換することは、OAV206/Ad5fがOAVでは感染できないヒトLNCaP細胞に感染することを許容した。他のアデノウイルスから細胞結合ドメインを選択することによって、特定の細胞タイプに感染するOAVの能力を変化させることが可能であろう。図4に記述されているようにペントンタンパク質において配列を変化させることによっても、OAVの細胞親和性をさらに明確にすることが可能であろう。ハイブリッドウイルスはその複製不能な性質を維持し続けるであろう。
【００３２】
これらのデータはヒツジアデノウイルスがある細胞には侵入できるが、全てのヒト細胞タイプに侵入できるわけではなく、活性なプロモーターから外来遺伝子を発現しうることを明らかに示す。ウイルスによって運ばせるプロモーターおよび発現カセット中の遺伝子を変えることは可能である。例えばプロバシン（15）またはPSMA（17）のような前立腺特異的プロモーター、ある胸部ガンで特異的に活性なerbB-2プロモーターまたは腫瘍特異的CEAプロモーターを、酵素/プロドラッグ系によって特的な細胞殺傷を達成するために用い得る。他の組織に適して活性なプロモーターも適切なように用い得る。輸送し得る遺伝子には、ガン遺伝子または腫瘍抑制遺伝子またはアンチセンスあるいはリボザイム（触媒性）RNA、サイトカインおよび他の免疫調節タンパク質、ワクチン抗原、細胞を死に導くプロセスを触媒するタンパク質および体細胞における遺伝的欠陥を相補する他のものをコードする治療上の遺伝子が含まれる。OAVおよびその組換え誘導体は異種細胞においては生産的に複製しないので、それらは非標的細胞へのウイルスの拡大の危険なく、ホストに対する最小限の副作用のみで遺伝子の輸送と発現を許容する。
【００３３】
OAVプロモーター機能の分析
感染に引き続いて、OAVゲノムはあるヒト細胞においてかなりの時間ほとんど検出可能な効果なく生き残り得る。例えばPC3細胞は20のMOIでOAVを用いて感染され、3週間までの期間カルチャーを維持する。この期間中細胞は非感染PC3細胞と比較して最小限の表現型変化しか示さない。感染後三週間でPC3細胞からDNAを抽出し、その一部をPCRによって増幅した。ウイルスゲノムは未だ検出可能であり、それが生き残っていることを示した。これと比較してLNCaP細胞を使用した場合、ウイルスゲノムは感染後2-5日で既に検出不能であった。LNCaP細胞はOAVによって感染されないので、これはゲノムがPC3細胞内で生き残るに違いないことを示し、感染がほとんど影響しなかったことを確認する。ゲノム持続性および細胞生存性はOAVプロモーターの不活性なために生じ、結果としてウイルスタンパク質の合成の欠如のためであろう。ヒトアデノウイルスベクターにおいては、残余のMLP機能が免疫応答を刺激する高い免疫原性ウイルスキャプシドタンパク質の低レベルの合成を引き起こすので、この結果は遺伝子治療のために有利であろう。それは細胞免疫系によってウイルスのクリアランスを引き起こすので、これは望ましくない。非複製許容細胞におけるOAVゲノムの持続性は、きっと継続して治療上の遺伝子発現を許容するであろう。
【００３４】
OAV感染細胞におけるプロモーター活性は、ラジオラベルタンパク質への35［S］メチオニンを用いた細胞のインキュベーションによって間接的に最初に調べられた。MLP/TLS/VP7scカセットを運ぶ組換えウイルス（OAV204）は、CSL503細胞においてVP7scを容易に発現するが（PCT出願）、ウサギ腎細胞またはヒト前立腺PC3細胞（図2D）においてはそれを発現しなかった。ヘキソン,ファイバータンパク質およびペントンのような後期ウイルスタンパク質の合成もまた、複製許容CSL503では容易に検出できたが、これらの細胞においてはラジオラベルによって検出できなかった。
【００３５】
CSL503および非ヒツジ細胞におけるプロモーター機能のより感度のよい研究では、RNA転写産物を探すため逆転写およびPCRを用いて実施された。トータルポリアデニル化RNAをOAV206を用いた感染後（MOI20pfu/細胞）様々な時間でCSL503,PC3,MRC5,McF7,T47D2,RK15およびLNCaPから調製した。オリゴ（dT）をプライマーにして、cDNAを逆転写酵素を用いて合成した。それから選択したcDNAをTLSのエキソン2由来の5’プライマー（PCT出願）および興味ある転写産物と相補的な3’プライマーを用いて増幅した。ペントンおよびヘキソンに対するPCR産物（それぞれ606および740bpのサイズと期待される）を、OAV206感染細胞から増幅したが、感染後24および48時間で集められた非感染CSL503細胞RNAからはしなかった（図7）。期待されたサイズの産物はまた、ファイバータンパク質およびIIIa転写産物からも増幅された。しかしながらヘキソンおよびペントンPCR産物は、いかなるヒトまたは動物細胞系由来のRNAをRT-PCRで分析しても検出可能に増幅されなかった（図7）。予想される産物は全てのサンプルでハウスキーピング酵素GAPDHに対して増幅された。それゆえOAVMLPは、非ヒツジ細胞においては検出可能に機能しなかった。これはこれらの細胞タイプでの複製不能の理由を十分に説明する。
【００３６】
同様な観察は、早期プロモーター由来の転写産物に対してもなされた。未知の機能のオープンリーディングフレームのグループ（仮にPCT出願でE3?領域として名付けられた）が、ゲノムの極端に右腕末端に位置づけられている。RT-PCRと26,700および29,220位で始まるプライマーを用いて、〜750および〜550bpの産物をOAV感染細胞から単離したポリアデニル化RNAから増幅したが、非感染CSL503細胞からはしなかった（図8）。〜2,500bpの産物もまた感染後48時間で検出された。これを複製されたゲノムDNAから増幅した。核酸配列から、750および550bp産物は異なる位置でのスプライシングから生産されたことが示された。それゆえこれらのRNAは、このストランドの最初のメチオニンコドン（29,425-29,427ベース）とゲノムの末端の間に位置するに違いない未同定のプロモーターから右から左方向で転写される。転写産物はRT-PCRによって感染後12時間と同じように早期に検出でき、感染後24時間でより顕著である（図8）。同じプライマーを用いて、図7に記述されている感染および非感染ヒトおよびウサギ細胞から調製したRNAでRT-PCRを実施した。CSL503細胞で検出されたPCR産物は、ほとんどの他のOAV感染細胞において検出されず（図8）、この早期のプロモーターは様々なヒトおよび非ヒツジ細胞において検出可能に機能していないことを示す。より小さいPCR産物がMRC5細胞において感染後96時間で検出されたが、これはプロモーターがこの時間で活性であることを示した（図8）。細胞RNAから由来した〜900bpの産物もまた見られた。しかしながら2.5kb産物の不存在は、DNA複製がこれらの細胞で起こっていないことを示した。このデータはほとんどの非ヒツジ細胞で早期および後期プロモーター機能が検出できなかったことを示す。OAVは外来プロモーターから発現された遺伝子を輸送することができるままである一方で、ある細胞では良性なベクターであると思われる。
【００３７】
OAV287組換えベクターが動物に感染し、それらの動物の細胞に外来ゲノムを輸送し得ることがPCT出願に示されている。さらにOAV287由来のベクターがヒト細胞に感染し、その細胞に治療上の遺伝子を輸送し得ることが本明細書で示されている。これらの結果から、ヒツジアデノウイルス由来のウイルスベクターおよび特にOAV287由来のベクターが、ヒトに対して遺伝子を輸送するための方法において記述されているように機能することが認められよう。
【００３８】
要約すると、様々なヒト細胞系においてOAV287アデノウイルスの複製は不能であり、検出可能なウイルスは生産されない。複製不能性は早期および後期プロモーター機能の欠如によって説明される。ある細胞タイプにおけるウイルスプロモーター活性のさらなる減少は、ヒトアデノウイルスベクターに対して示されたように（21）、DNA Binding Proteinに対する遺伝子のミューテーションを導入することによって成し遂げられよう。ヒト細胞に感染しないが治療上の遺伝子を機能的に発現するヒツジアデノウイルスベクターは、特にそれらはヒトアデノウイルスに対する抗体によって中和されないので、遺伝子治療における使用に対して利点があるであろう。その独特の核酸配列のため、OAVベクターはまた、循環しているヒトアデノウイルスとの相同的組換えを被りそうもない。
【００３９】
組換えヒツジアデノウイルスベクターを用いた本発明の遺伝子治療の方法は、遺伝子治療におけるヒトまたは非ヒトアデノウイルスの使用に対して以下の利点がある：
-ウイルスベクターがヒト細胞に感染し得る：
-ウイルスベクターがヒト細胞において複製欠陥がある：
-ヒト細胞において低い残余のウイルスベクター遺伝子の発現しかない：
-他の非ヒツジアデノウイルスとウイルスベクターの組換えはありそうにない：
-ヒツジアデノウイルスに以前にさらされる可能性は低く、それゆえウイルスベクターに対する以前に形成された抗体は存在しない。
【００４０】
非常に多くのバリエーションおよび/または修正が、広く記述されている本発明の精神および範囲からそれることなく特別の実施態様において示された本発明になし得ることは、当業者によって認められ得るであろう。それゆえ本実施態様は全ての点で実例となり、制限するものではないと考えるべきである。
【００４１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】図1はpOAV206プラスミドのマップおよびHCMVプロモーターからのVP7sc抗原を発現する相当する組換えウイルスを示す。
【図２】図2はOAV206を用いた様々な細胞タイプの感染に引き続くHCMVプロモーターからのVP7scレポータータンパク質の発現を示す。（A）CSL503ヒツジ肺およびヒト胸部MCF7細胞、（B）ヒト前立腺PC3とLNCaPおよび胸部T47D2、（C）ヒトMM418EメラノーマおよびMRC5肺細胞。（U）および（I）はそれぞれ非感染と感染細胞を示す。（D）ではCSL503,PC3およびウサギ腎細胞がOAV MLP/TLSからVP7scを発現するOAV204を用いて感染された（「PCT出願」参照）。
【図３】図3はOAV配列（アンダーライン）およびAd5細胞結合ドメインの間の接合部でOAV206/Ad5fにおけるハイブリッド繊維状タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４】図4はAd5RGDモチーフの挿入に引き続くOAV206Ad5pにおける修飾されたペントンタンパク質のアミノ酸配列を示し、アンダーライン残基はOAVとAd5配列の間の接合部を示す。
【図５】図5はプロドラッグ6MPDRの存在下でin vitroで（A）T47D2および（B）McF7胸部ガン細胞を用いた、OAV211を用いた感染の代謝活性に対する効果を示す。
【図６】図6はOAV206またはOAV206Ad5fを用いた感染に引き続くLNCaPおよびMCF7細胞におけるVP7scの発現を示す。（U）は非感染細胞を示す。時間は感染後の時間（hour）を示す。
【図７】図7は（A）ペントン、（B）ヘキソンおよび（C）GAPDH遺伝子に対するRNA転写のRT-PCRによる分析を示す。RNAサンプルは非感染（点で示されている）および感染細胞から指示された時間で調製された。ペントン転写産物は全ての細胞タイプから24および48時間で分析された。ヘキソン転写産物は示された時間で分析された。
【図８】図8は様々な細胞タイプにおけるOAVゲノムの極端な右腕末端に位置するプロモーターから由来した転写産物のRT-PCR分析を示す。RNAは示された時間で回収された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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