(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法において、式（Ｉ）
0004733335.tif 000008
（式中、ｎは１〜６の整数、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜６の置換又は非置換アルキルを示す。）で表される基を有する化合物を用いることを特徴とする凝集イムノアッセイ法。
【請求項２】
式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体を重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項３】
式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と、該式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体とを重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項４】
式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体が、ビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項３記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項５】
ビニル基を有する単量体が、メタクリル酸−ｎ−ブチルであることを特徴とする請求項４記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項６】
式（Ｉ）で表される基を有する単量体が、式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される基が、ホスホリルコリン基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項８】
式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであることを特徴とする請求項６記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項９】
抗体が抗ヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体である請求項１〜８のいずれかに記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項１０】
抗体複合体が、抗原性物質に特異的に反応する抗体と、これに選択的に反応する第二抗体からなる請求項１〜９のいずれかの凝集イムノアッセイ法。
【請求項１１】
不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスである請求項１〜１０のいずれかに記載の凝集イムノアッセイ法。
【請求項１２】
抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法に用いる、式（Ｉ）
0004733335.tif 000009
（式中、ｎは１〜６の整数、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜６の置換又は非置換アルキルを示す。）で表される基を有する化合物を含有することを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体を重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１２記載の免疫測定試薬。
【請求項１４】
式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と、該式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体を重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１２記載の免疫測定試薬。
【請求項１５】
式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体が、ビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項１４記載の免疫測定試薬。
【請求項１６】
ビニル基を有する単量体が、メタクリル酸−ｎ−ブチルであることを特徴とする請求項１５記載の免疫測定試薬。
【請求項１７】
式（Ｉ）で表される基を有する単量体が、式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載の免疫測定試薬。
【請求項１８】
式（Ｉ）で表される基が、ホスホリルコリン基であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の免疫測定試薬。
【請求項１９】
式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである請求項１７記載の免疫測定試薬。
【請求項２０】
抗体が抗ヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２〜１９のいずれか記載の免疫測定試薬。
【請求項２１】
抗体複合体が、抗原性物質に特異的に反応する抗体と、これに選択的に反応する第二抗体からなることを特徴とする請求項１２〜２０のいずれか記載の免疫測定試薬。
【請求項２２】
不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスであることを特徴とする請求項１２〜２１のいずれか記載の免疫測定試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体試料などの水溶性媒体中の抗原性物質を、凝集反応を利用して免疫学的に測定する凝集イムノアッセイ法や、それに用いる免疫測定試薬に関する。
背景技術
近年、病院、検査センター等において、人手不足、コスト削減、あるいは多量の検体処理等の点から、臨床検査等の諸検査の自動化、測定時間の短縮化が図られている。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定量する凝集イノムアッセイ法が注目されている。例えば、特開平７−３５７５２号公報には、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法が記載されている。
しかし、不溶性担体粒子と、抗原又は抗体とが凝集反応を起こす際の凝集の不均一化によって、再現性良く反応を起こさせることが難しく、特に、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法においては、抗体の不溶性担体粒子への直接結合等の問題もあり、さらなる再現性の向上が求められていた。
本発明の課題は、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法において、凝集を安定化・均一化させ、非特異的吸着を防止し、再現性を改善する方法やそれに用いる免疫測定試薬を提供することにある。
発明の開示
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法において、ホスホリルコリン類似基を有する化合物が、抗原抗体反応による担体粒子の凝集を促進、均一化する作用を有することを見い出し、この作用によって凝集イムノアッセイにおける凝集量の安定化・均一化と再現性の改善が達成されることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法において、式（Ｉ）（式中、ｎは１〜６の整数、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜６の置換又は非置換アルキルを示す。）で表される基を有する化合物を用いることを特徴とする凝集イムノアッセイ法（請求項１）や、式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体を重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１記載の凝集イムノアッセイ法（請求項２）や、式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と、該式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体とを重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１記載の凝集イムノアッセイ法（請求項３）や、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体が、ビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項３記載の凝集イムノアッセイ法（請求項４）や、ビニル基を有する単量体が、メタクリル酸−ｎ−ブチルであることを特徴とする請求項４記載の凝集イムノアッセイ法（請求項５）や、式（Ｉ）で表される基を有する単量体が、式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の凝集イムノアッセイ法（請求項６）や、式（Ｉ）で表される基が、ホスホリルコリン基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の凝集イムノアッセイ法（請求項７）や、式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであることを特徴とする請求項６記載の凝集イムノアッセイ法（請求項８）や、抗体が抗ヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体である請求項１〜８のいずれかに記載の凝集イムノアッセイ法（請求項９）や、抗体複合体が、抗原性物質に特異的に反応する抗体と、これに選択的に反応する第二抗体からなる請求項１〜９のいずれかの凝集イムノアッセイ法（請求項１０）や、不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスである請求項１〜１０のいずれかに記載の凝集イムノアッセイ法（請求項１１）に関する。
0004733335.tif 000002
また、本発明は、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法に用いる、式（Ｉ）（式中、ｎは１〜６の整数、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜６の置換又は非置換アルキルを示す。）で表される基を有する化合物を含有することを特徴とする免疫測定試薬（請求項１２）や、式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体を重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１２記載の免疫測定試薬（請求項１３）や、式（Ｉ）で表される基を有する化合物が、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と、該式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体を重合させて得られる化合物であることを特徴とする請求項１２記載の免疫測定試薬（請求項１４）や、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体が、ビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項１４記載の免疫測定試薬（請求項１５）や、ビニル基を有する単量体が、メタクリル酸−ｎ−ブチルであることを特徴とする請求項１５記載の免疫測定試薬（請求項１６）や、式（Ｉ）で表される基を有する単量体が、式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載の免疫測定試薬（請求項１７）や、式（Ｉ）で表される基が、ホスホリルコリン基であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の免疫測定試薬（請求項１８）や、式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである請求項１７記載の免疫測定試薬（請求項１９）や、抗体が抗ヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２〜１９のいずれか記載の免疫測定試薬（請求項２０）や、抗体複合体が、抗原性物質に特異的に反応する抗体と、これに選択的に反応する第二抗体からなることを特徴とする請求項１２〜２０のいずれか記載の免疫測定試薬（請求項２１）や、不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスであることを特徴とする請求項１２〜２１のいずれか記載の免疫測定試薬（請求項２２）に関する。
0004733335.tif 000003
発明を実施するための最良の形態
本発明の凝集イムノアッセイ法としては、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法において、以下に示す式（Ｉ）（式中、ｎは１〜６の整数、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜６の置換又は非置換アルキルを示す。）で表される基を有する化合物を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の免疫測定試薬としては、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法に用いる、式（Ｉ）で表されるホスホリルコリン類似基を有する化合物を含有するものであれば特に制限されるものではないが、ここで結合とは、物理吸着、化学結合の両方を意味する。
0004733335.tif 000004
上記本発明における不溶性担体粒子としては、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態で被検試料中の抗原性物質を結合させることができる不溶性粒子であれば特に制限されるものではなく、例えば特公昭５８−１１５７５号公報等に記載されている従来公知の有機高分子物質の微粒子や、無機酸化物の微粒子や、あるいは核となるこれらの物質の表面を有機物等で表面処理した微粒子を挙げることができ、具体的には、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、（メタ）アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂（ラテックス）；ニトロセルロース、セルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；金属、セラミック、ガラス、シリコンラバー等の無機物を例示することができ、これらの中でもポリスチレン系の合成高分子、特に、電荷を与える為に成分としてアクリル酸系のモノマーやスルホン酸をもつモノマーなどを共重合したポリスチレン系の合成高分子が好ましい。
上記のように本発明においては、不溶性担体粒子として、ポリスチレンラテックス等のラテックス粒子が特に好ましく用いられる。例えばポリスチレンラテックス等の表面の疎水性が強いラテックスを用いると、タンパク質やペプチドの吸着をスムーズにすることができる。また、ソープフリーによって得られるポリスチレン粒子は、表面の負電荷同士の反発に基づき、界面活性剤なしでも安定に存在できるので特に好ましく用いることができる。その他、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス）等を必要に応じて用いることもできる。
定量的にイムノアッセイを行う場合、通常は、不溶性担体粒子の大きさの均一性、表面状態の制御、内部構造の選択などが高度の次元で要求されるが、このような試薬向けの良好なラテックス等の不溶性担体粒子は、市販品の中から選択して用いることが可能である。また、不溶性担体粒子の形状としては、特に制限されるものではないが、例えば、球状等を挙げることができ、球状の場合の粒子系としては、例えば平均粒径０．０３〜０．８μｍが好ましく、平均粒径０．０６〜０．２μｍがより好ましい。そして、本発明における不溶性担体粒子の反応液中の濃度としては特に制限されるものではないが、例えば、０．００１〜１０重量％、好ましくは０．００５〜５重量％、より好ましくは０．０１〜２重量％の濃度で使用することが、不溶性担体粒子の凝集反応をより安定化・均一化することができるので好ましい。
上記本発明の式（Ｉ）で表される基を有する化合物としては、式（Ｉ）中のｎが１〜６の整数であって、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一又は異なっていてもよく、水素、炭素数１〜６の置換又は非置換アルキルを示す式（Ｉ）で表される基を有する化合物であれば特に制限されるものではなく、式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２及びＲ３のアルキル部分としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等を挙げることができる。また、置換アルキルの置換基としては、置換数１〜３の、例えばヒドロキシ、アリル等を挙げることができ、アリルとしては、ベンジル、ナフチル等を例示することができる。
また、式（Ｉ）で表される基を有する化合物としては、式（Ｉ）で表される基を有する単量体、好ましくは式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体を重合させて得られる化合物や、式（Ｉ）で表される基を有する単量体、好ましくは式（Ｉ）で表される基とビニル基を有する単量体と、かかる式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体とを重合させて得られる化合物を挙げることができる。また、式（Ｉ）で表される基を有する単量体と重合可能な他の単量体としてはビニル基を有する単量体が好ましい。
本発明における式（Ｉ）で表される基としてはホスホリルコリン基（以下、ＰＣ基と略する）を好適に例示することができ、したがって、本発明における式（Ｉ）で表される基を有する化合物としては、ＰＣ基を有する化合物が好ましい。また、ＰＣ基を有する化合物としては特に制限されるものではないが、ＰＣ基を有する単量体、好ましくはＰＣ基とビニル基を有する単量体を重合させて得られる高分子化合物や、ＰＣ基を有する単量体、好ましくはＰＣ基とビニル基を有する単量体と、かかるＰＣ基を有する単量体と重合可能な他の単量体とを重合させて得られる高分子化合物が好ましい。
上記ＰＣ基とビニル基を有する単量体としては特に制限がないが、例えば、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと略す）、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を具体的に挙げることができる。また、これら単量体は、例えば、特開昭５４−６３２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示された公知の方法によって製造することができる。
前記のＰＣ基を有する単量体と重合可能な他の単量体、好ましくはビニル基を有する他の単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル；（メタ）アクリレート；スチレン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン等のスチレン系単量体；塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン等の置換又は非置換炭化水素系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体；エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；ジエチルイタコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネート等を挙げることができるが、これらの中でも、メタクリル酸エステル、スチレン等が好ましく、特にメタクリル酸−ｎ−ブチル（以下、ＢＭＡと略す）が好ましい。
ＰＣ基含有重合体を調製するには、前記ＰＣ基を有する単量体を含む重合成分を、例えば重合開始剤を用いたラジカル重合等の通常の重合方法により重合させることにより得ることができる。また、重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤であれば特に限定されるものではなく、２，２′−アゾビス−（２−メチルプロピオノアミヂン）二塩塩、４，４′−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）、２，２′−アゾビス−（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン二塩酸塩、２，２′−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキネオデカノエートや、これらの混合物等を好適に例示することができる。特に、前記ＭＰＣを単独重合させる際、あるいはＭＰＣとビニル基を有するＢＭＡ等の他の単量体とを重合させる際には、重合性などの点からして重合開始剤として２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（以下、ＡＩＢＮと略す）を用いることが好ましい。
これら重合開始剤の使用量は特に制限されるものではないが、用いる全単量体１００重量部に対して０．０１〜１０重量部が好ましく、０．１〜５重量部が特に好ましい。また、重合条件は、好ましくは３０〜８０℃、特に好ましくは４０〜７０℃において２〜７２時間重合させるのが望ましい。この際、重合反応をより円滑に行なうために溶媒を用いてもよく、かかる溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルムや、これらの混合物等を挙げることができる。特に、前記ＭＰＣを単独重合させる際、あるいはＭＰＣとビニル基を有する他の単量体とを重合させる際には、溶解性、重合性などから水、エタノールを用いることが特に好ましい。得られた重合体の精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
また、ＰＣ基含有重合体中のＰＣ基含有割合は、ＰＣ基含有重合体に対し、１〜１００モル％、特に５〜１０モル％が好ましい。含有割合が１モル％未満の場合には、非特異的吸着を防止することが困難になるので好ましくない。またＰＣ基含有重合体は、重合温度、重合開始剤使用量、重合度調整剤の使用等によっても異なるが、数平均分子量（Ｍｎ）１００〜１，０００，０００、特に１，０００〜５００，０００の重合体が好ましい。本発明のＰＣ基を有する化合物の反応液中の濃度としては特に制限されるものではないが、０．０００１〜１０％が好ましく、０．００１〜５％がより好ましく、０．０１〜１％が特に好ましい。０．０００１％未満では、再現性の改善効果が弱く、また、１０％以上では泡立ちが激しく、気泡による測定誤差を招く恐れがあり好ましくない。そして、ＰＣ基を有する化合物としては特に限定されるものではないが、ＭＰＣの単独重合体あるいは、ＭＰＣとＢＭＡの共重合体が特に好ましい。
本発明において凝集イムノアッセイ法とは、抗原又は抗体を実質的に結合していない状態にある不溶性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を結合させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体又は抗体複合体を結合させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集させる方法をいうが、本発明において使用する抗体又は抗体複合体が、不溶性担体粒子に結合された抗原性物質のみならず、未結合の抗原性物質とも反応し測定値に影響を与えるようなときは、被検試料中の抗原性物質を不溶性担体粒子に結合させた後に該不溶性担体を洗浄して未結合の抗原性物質を除去する方法、不溶性担体粒子に結合される抗原性物質の比率を高くする方法、また不溶性担体粒子に結合された抗原性物質とは反応するが、液相中の抗原性物質と実質的に反応しない抗体又は抗体複合体を使用する方法等を用いることができる。
本発明において、不溶性担体粒子は緩衝液等の水性媒体中に懸濁させた、いわゆるラテックスとして通常用いられる。かかる緩衝液調製用の緩衝剤としては、例えば、リン酸、炭酸、有機酸緩衝剤の他、グッド緩衝剤と呼ばれるものを使用することができる。これらを含有する液のｐＨを調節する酸類としては通常の塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸の他、酢酸等の有機酸を用いることができ、またｐＨを調節するアルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウムなどを用いることができる。また、本発明においては、検体中の脂質の可溶化に効果のある界面活性剤も使用することができ、特にポリオキシエチレングリコール基を持ったノニオン系界面活性剤やその他カチオン系、アニオン系の界面活性剤も必要に応じて使用することができる。
本発明の凝集イムノアッセイ法の測定対象である被検試料中の抗原性物質としては、不溶性担体への結合が可能で、且つ該抗原性物質に対応するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が入手あるいは調製可能であるものが好ましいが、上記ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体調製の容易性の点からは、上記抗原性物質は分子量１０，０００以上の蛋白質、糖蛋白質等の物質であることが好ましい。かかる被検試料中の抗原性物質としては、血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す）を好適に例示することができる。また、本発明における抗原性物質に特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を用いることができるが、モノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの報告した細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７、１９７５）により得ることができる。そして、上記ＨｂＡ１ｃに対応する抗体としては、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を例示することができる。
ところで、ＥＬＩＳＡ法で選別して得たハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体の中に、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のように、抗原と抗体とを液相中で反応させるアッセイ系では反応しないという抗体が存在することはよく知られているが、本発明の凝集イムノアッセイ法においては、このようなモノクローナル抗体を用いることは、液相中の抗原性物質とは反応せず、不溶性担体粒子に固相化された抗原性物質と特異的に反応させることが可能となる点で好ましい。
本発明による凝集イムノアッセイ法においては、抗原性物質をラテックス等の不溶性担体粒子に結合させた後、モノクローナル抗体を反応させてもラテックス等の不溶性担体粒子が凝集しない可能性が考えられるが、そのような場合でも、抗体複合体を用いて凝集を起こさせることが可能である。すなわち、かかるモノクローナル抗体と、これに選択的に反応する第二抗体とを反応させてモノクローナル抗体複合体をあらかじめ形成させ、かかる抗体複合体をラテックス等の不溶性担体粒子に吸着した抗原性物質と反応させることにより、ラテックス等の不溶性担体粒子同士を凝集させることができる。上記の他に、抗体複合体を形成する方法としては、ビオチン標識したモノクローナル抗体にアビジンを加えて複合体とする方法や、例えば抗体を酵素標識する際に用いられる化学結合による方法等を挙げることができる。
不溶性担体粒子に結合させた抗原性物質に、該抗原性物質に特異的な抗体又は抗体複合体を反応させることにより、不溶性担体の選択的な凝集を起こすことができる本発明によれば、免疫測定試薬の製造が単純、容易であるため、保存安定性の高い免疫測定試薬とすることができる。すなわち、ラテックス等の不溶性担体粒子に抗原や抗体が実質的に結合されていないため、該不溶性担体粒子として市販の未結合ラテックス粒子等の不溶性担体粒子をそのまま使用することが可能となる。更に抗体についても必ずしも精製品である必要はなく、また試薬が単純なため保存安定性を高く保つことが可能となる。
また、被検試料中の抗原性物質を、水性媒体中でラテックス等の不溶性担体粒子に結合・吸着させた後、該抗原性物質に対して特異的に結合する抗体又は抗体複合体をホスホリルコリン基等の式（Ｉ）で表される基を有する化合物を含有する水性媒体中で結合させたものを用いる場合、上記ラテックス等からなる不溶性担体粒子を凝集させ、凝集の程度を測定する際に用いる上記水性媒体としては、上記抗体又は抗体複合体のラテックス等からなる不溶性担体粒子への非特異的吸着・結合を防止しうるものが好ましく、かかる抗体又は抗体複合体の不溶性担体への吸着・結合を防止しうる水性媒体としては、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の界面活性剤を０．１〜０．３％程度含んでいる水性媒体を具体的に例示することができる。
本発明の凝集反応を行う容器としては特に限定されないが、この種の凝集反応に通常用いられる例えばポリスチレン製試験管等のチューブ状の容器を用いることができる。また、多数検体の同時処理が容易な点を考慮すれば、複数のウエルを有するＥＬＩＳＡ用プレート（例えば、ナルジェヌンクインターナショナル社製９６−ウエルＥＬＩＳＡ用プレート「ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ」等）を用いることが可能である。そして、光学的手法によるラテックス等不溶性担体粒子の凝集の測定を容易とする点からは、実質的に透明な容器を用いて反応を行うことが好ましく、また、自動分析機を利用してラテックス等の不溶性担体粒子の凝集を測定する場合には、通常は、該分析機中の反応槽中で凝集反応を行わせることとなる。
不溶性担体粒子の凝集の程度を測定する方法としては、特に制限されるものではなく、例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、上記不溶性担体粒子の凝集の程度を目視によって判定することができる（例えば、凝集の少ないものは透明感がある）。一方、該凝集を定量的に測定する場合は、例えば光学的に測定することが簡便性の点から好ましい。かかるラテックス等からなる不溶性担体粒子の凝集の光学的測定法としては、公知の光学的測定法が利用可能であり、具体的には、凝集塊の形成を濁度の増加として捉えるいわゆる比濁法、凝集塊の形成を粒度分布ないし平均粒径の変化として捉える粒度分布による測定法、凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を測定する積分球濁度法等の種々の光学的測定法を利用することができ、また、これらの測定法のそれぞれについて、速度試験（レートアッセイ；異なる時点で少なくとも２つの測定値を得て、これらの時点間における該測定値の増加分、すなわち増加速度に基づき凝集の程度を求める）と、終点試験（エンドポイントアッセイ；通常反応の終点と考えられる特定の時点で１つの測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める）を用いることもできるが、測定の簡便さ、迅速性の点からは、比濁法を用いた速度試験を行うことが好ましい。
不溶性担体粒子の凝集の光学的測定においては、ラテックス等からなる不溶性担体粒子の平均粒径が０．０４〜０．８ミクロン程度の範囲では、４００〜１４００ｎｍ程度の波長の光を用いて測定することが好ましい。
前記本発明の免疫測定試薬としては、目的の抗原性物質を測定する試薬とホスホリルコリン基等の式（Ｉ）で表される基を有する化合物を含有するものであれば、その試薬構成は特に制限されるものでなく、例えば不溶性担体粒子、緩衝剤、試料中の抗原に結合する抗体及び式（Ｉ）で表される基を有する化合物を含有し、必要に応じて界面活性剤、防腐剤、試料中の抗原に結合する抗体に結合する抗体等を含有する試薬キットを挙げることができ、特に、不溶性担体粒子及び緩衝剤を含む第一試薬と、式（Ｉ）で表される基を有する化合物及び抗原に結合する抗体を含む第二試薬からなる試薬キットを具体的に例示することができ、かかる試薬キットにおける第一試薬及び第二試薬には、必要に応じてさらに界面活性剤、防腐剤、試料中の抗原に結合する抗体、該抗体に結合する抗体複合体形成用抗体等を含有しておくこともできる。
（実施例）
以下、本発明を実施例、比較例、参考例により、更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、かかる実施例等により何ら制限を受けるものではない。
実施例１
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ポリマー２（参考例２で製造）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体（製造例１）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例２
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ポリマー３（参考例３で製造）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
比較例１
実施例１におけるポリマー２や実施例２におけるポリマー３に代えてツイーン２０を含む下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
比較例２
実施例１におけるポリマー２や実施例２におけるポリマー３に代えてブリッジ３０を含む下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ブリッジ３０（シグマ社製）                                    ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
比較例３
実施例１におけるポリマー２や実施例２におけるポリマー３に代えてブリッジ５６を含む下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ブリッジ５６（シグマ社製）                                    ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例３
人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管テルモ社製）で採血後、２時間放置して沈殿した血球層１０μＬをとり、精製水１ｍＬで希釈して、これを−２０℃で凍結保存し使用直前に融解したものを検体とし、実施例１、実施例２、比較例１、比較例２及び比較例３でそれぞれ作製したＲ１試薬とＲ２試薬を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定を行った。また、検量線は、自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ（東ソー社製）による測定でＨｂＡ１ｃ値が、０．０％、４．２％、７．７％、１１．３％、１４．８％であった標準検体を開封直後の試薬を用いて作成した。検体中のＨｂＡ１ｃの測定は、Ｒ１試薬溶液２４０μＬに上記調製した検体を８．０μＬ添加し、３７℃、５分間反応させた後、Ｒ２試薬溶液８０μＬを添加し、３７℃５分後に２ポイントエンド法（測光ポイント１６−３４）、主波長４５０ｎｍ、副波長８００ｎｍで吸光度変化量を、日立自動分析装置７１７０型を使用して行い、検量線より求めた。この操作を繰り返し、合計１０回づつ測定し、平均値、標準偏差、及び同時再現性［（標準偏差×１００）／平均］を求めた。結果を表１に示す。表１から、本発明の実施例１及び実施例２においては、比較例１〜３と比べ、凝集量が安定化し、再現性の改善が認められる。
0004733335.tif 000005
実施例４
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
ポリマー４（参考例４で製造）                                  １ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例５
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
ポリマー５（参考例５で製造）                                  １ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例６
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
ポリマー１（参考例１で製造）                          ０．００２ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
比較例４
実施例４におけるポリマー４や実施例５におけるポリマー５や実施例６におけるポリマー１を含まない下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス粒子（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例７
人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管テルモ社製）で採血後、２時間放置して沈殿した血球層１０μＬをとり、精製水１ｍＬで希釈して、これを−２０℃で凍結保存し使用直前に融解したものを検体とし、実施例４〜実施例６、比較例４で作製したＲ１試薬とＲ２試薬をそれぞれ用いて、ＨｂＡ１ｃ濃度の測定を実施例３と同様に行った。結果を表２に示す。表２から、本発明の実施例４〜実施例６においては、比較例４と比べ、凝集量が安定化し、再現性の改善が認められる。
0004733335.tif 000006
実施例８
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１（ラテックス）溶液の調製］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
ポリマー４（参考例４で製造）                                  ２ｇ／Ｌ
［Ｒ２（抗体）溶液の調製］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例９
下記組成の試薬を調製した。
［Ｒ１試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．８）            ４．７７ｇ／Ｌ
ラテックス（粒径０．０７７５μｍ、積水化学社製）
０．０３３重量％／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
ポリマー４（参考例４で製造）                                  ５ｇ／Ｌ
［Ｒ２試薬］
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（同仁化学社製、ｐＨ７．０）            ４．７７ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                              １５ｇ／Ｌ
ツイーン２０（和光純薬社製）                                  ２ｇ／Ｌ
ＮａＮ３（関東化学社製）                                  ０．１ｇ／Ｌ
抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）
０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）／Ｌ
実施例１０
人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管テルモ社製）で採血後、２時間放置して沈殿した血球層１０μＬをとり、精製水で全量を１ｍＬとしたものを検体１とした。また、人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管テルモ社製）で採血後、２時間放置して得られた上澄み液４μＬと、沈殿した血球層１０μＬをとり、精製水で全量を１ｍＬとしたものを検体２とした。これら検体と実施例４、実施例８、実施例９及び比較例４で作製したＲ１試薬とＲ２試薬をそれぞれ用いて、ＨｂＡ１ｃ濃度の測定を実施例３と同様に行った。各検体についての３回の測定結果を結果を表３に示す。表３から、本発明の実施例４、実施例８及び実施例９、特にポリマー含量が多い実施例８及び実施例９においては、比較例４と比べ、検体に血漿成分が混入した検体２においても凝集量が安定化し、再現性の改善が認められる。
0004733335.tif 000007
参考例１（ポリマー１の合成）
ＭＰＣ（日本油脂社製）３５．７ｇ、ＢＭＡ（和光純薬工業社製）４．３ｇをエタノール１６０ｇに溶解し、４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹込んだ後、６０℃で重合開始剤ＡＩＢＮ（和光純薬工業社製）０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、ＭＰＣ０．８モル、ＢＭＡ０．２モルの比率からなる共重合体（ポリマー１）の粉末を得た。このポリマー１の分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（以下、ＧＰＣと略す）により分析した結果、重量平均分子量１５３，０００であった。なお、分析条件はリン酸バッファー（ｐＨ７．４、２０ｍＭ）を溶離液とし、ポリエチレングリコールを標準物質とし、ＵＶ（２１０ｎｍ）及び屈折率にて検出した（参考例２〜５も同じ）。
参考例２（ポリマー２の合成）
ＭＰＣ２０．３ｇ、ＢＭＡ９．７５ｇをエタノール１２０ｇに溶解し、４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹込んだ後、６０℃でＡＩＢＮ０．３５ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、ＭＰＣ０．５モル、ＢＭＡ０．５モルの比率からなる共重合体（ポリマー２）の粉末を得た。このポリマー２の分子量をＧＰＣにより分析した結果、重量平均分子量２２４，０００であった。
参考例３（ポリマー３の合成）
ＭＰＣ１４．１ｇ、ＢＭＡ１５．９ｇをエタノール１２０ｇに溶解し、４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹込んだ後、６０℃でＡＩＢＮ０．３５ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、ＭＰＣ０．３モル、ＢＭＡ０．７モルの比率からなる共重合体（ポリマー３）の粉末を得た。このポリマー３の分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析した結果、重量平均分子量１３０，０００であった。
参考例４（ポリマー４の合成）
ＭＰＣ５０．０ｇをエタノール１６０ｇに溶解し、４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹込んだ後、６０℃でＡＩＢＮ０．２４ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、ＭＰＣのホモポリマー（ポリマー４）の粉末を得た。このポリマー４の分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析した結果、重量平均分子量５２９，０００であった。
参考例５（ポリマー５の合成）
ＭＰＣ３０．０ｇをエタノール１２０ｇに溶解し、４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹込んだ後、６０℃でＡＩＢＮ０．４８ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、ＭＰＣのホモポリマー（ポリマー５）の粉末を得た。このポリマー５の分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析した結果、重量平均分子量１８３，０００であった。
参考例６（ヘモグロビンＡ１ｃβ鎖Ｎ末端のグリコペプチドエピトープに対するモノクローナル抗体の作製）
特開平７−３５７５２号公報記載の製造例１の記載に従って、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端アミノ酸配列に相当するペプチドＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを合成し、Ｎ末端アミノ酸残基であるＶａｌのα−アミノ基にグルコースを非酵素的に結合させて、グリコペプチドを合成し、更にスペーサーを介してキャリアー蛋白に結合させ、それを免疫原とすることにより、常法により、ＨｂＡ１ｃと反応し、ＨｂＡ０と反応しないモノクローナル抗体を得た。該モノクローナル抗体は、遊離のＨｂＡ１ｃとは反応せず、不溶性担体粒子に結合したＨｂＡ１ｃと反応する抗体であった。
産業上の利用可能性
Ｐｃ基等の式（Ｉ）で表される基を有する化合物を用いる本発明によると、ラテックス等からなる不溶性担体粒子を用いた免疫凝集反応が安定化・均一化し、再現性の良い測定結果を得ることができる。