(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(c)又は(d)のＤＮＡからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(d) 配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活
性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の遺伝子により形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の遺伝子により形質転換された酵母サッカロマイセス・セレビシエを培地に培養し、培養物中に生成蓄積されたユビキノン−10を採取することを特徴とする、ユビキノン−10の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子、及び該遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエなどの微生物宿主に導入してユビキノン−10を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキノン(Ubiquinone)は、微生物から高等動物に至るまで広く生物界に存在し、細胞内のミトコンドリア内膜にある電子伝達系（呼吸鎖）において補酵素としての役割を果たすことからコエンザイムＱ（Coenzyme Q)とも呼ばれている。ユビキノンは、ベンゾキノン骨格と、炭素数５のイソプレン単位を直列に鎖延長させるプレニル二リン酸合成酵素（プレニルトランスフェラーゼ）によって供給されるイソプレン側鎖とで構成されている。イソプレン側鎖を構成するイソプレン単位の繰り返し数（n)は、生物に固有であり、例えば、ヒトでは10、マウスでは９、大腸菌では８、ハンセヌラ（Hansenula）酵母では７、サッカロマイセス（Saccharomyces）酵母では６であることが知られている。ヒト体内に存在するイソプレン単位が10であるユビキノン−10（コエンザイムQ−10）は、主に心臓、腎臓、肝臓、筋肉、脳などの大量のエネルギーを要する臓器の細胞に多く、加齢、ストレス、疲労、免疫力低下などにより減少する。ユビキノン−10の作用としてはエネルギー産生のほか、抗酸化物質として脂質の過酸化やDNAの酸化・損傷を有意に抑制することが知られている。従って、ユビキノン−10は、近年では心臓疾患治療用医薬のほか、老化防止を目的としてあらゆる機能性食品、化粧品にも用いられており、市場価値が高く、その需要は益々拡大する傾向にある。よって、ユビキノン−10を大量に製造する系が望まれている。
【０００３】
これまでユビキノン−10の生産には半合成法や微生物発酵法が用いられている。ユビキノン−10の生産においては、その前駆体であるデカプレニル二リン酸（DPP)の合成反応に関与するデカプレニル二リン酸合成酵素（decaprenyl diphosphate synthase：DPS)遺伝子がキー酵素となる。
【０００４】
これまでにParacoccus denitrificans由来（特許文献１）、Rhodobacter capsulatus由来（特許文献２）、Schizosaccharomyces pombe由来（特許文献３）、Gluconobacter suboxydans由来（特許文献４）、Bulleromyces albus由来（特許文献５）、Aspergillus属又はLeucosporidium属由来（特許文献６）、Saitoella complicata由来（特許文献７）など、種々の微生物由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子が単離されており、大腸菌を宿主としてユビキノン−10の微生物学的生産が試みられているが、生産性が十分とはいえない。また、Phaffia rhodozymaからは種々のカロテノイド生合成経路に関与する酵素遺伝子が単離されているが（特許文献８）、デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子に関する報告はない。
【０００５】
一方、酵母を宿主とした場合、サッカロマイセス・セレビシエはユビキノン−６しか生産できないので、ユビキノン−10を生産させるためには、イソプレン単位が10であるイソプレン側鎖を供給できるデカプレニル二リン酸（DPP)の合成反応に関与するデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子の導入が必要である。しかしながら、例えば、Paracoccus denitrificans由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいては機能しないため、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいて該遺伝子を発現させるためには、ミトコンドリア移行シグナル配列を人為的に当該遺伝子に付加する必要がある（特許文献３）。しかながらこのような融合遺伝子は、構築する作業が煩雑であるばかりか、本来有する酵素活性の低下を招いている可能性もある。
【０００６】
【特許文献１】特開平11-178590号
【特許文献２】特開平11-56372号
【特許文献３】特開平9-173076号
【特許文献４】特開平10-57072号
【特許文献５】特開2002-345469号
【特許文献６】特開2002-191367号
【特許文献７】特開2001−61478号
【特許文献８】特表2000−507087号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいて単独で機能し、ユビキノン−10を生産させることの可能なデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)が酵母サッカロマイセス・セレビシエとは異なってユビキノン−10を生成することに着目し、当該酵母にデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子が存在すると考えてそのクローニングを試みたところ、当該遺伝子を取得することに成功した。また、このデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエで発現させたところ、ミトコンドリア移行シグナルの人為的付加をせずとも単独で機能し、当該遺伝子を導入した酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいてユビキノン−10の生産も確認した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
(2)  以下の(c)又は(d)のＤＮＡからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(d) 配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
(3)  以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
(4)  (1)又は(2)に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
(5)  (1)又は(2)に記載の遺伝子により形質転換された形質転換体。
(6)  形質転換体が酵母である、(5)に記載の形質転換体。
(7)  酵母が、サッカロマイセス・セレビシエである、(6)に記載の形質転換体。
(8)  酵母が、ファフィア・ロドザイマである、(6)に記載の形質転換体。
(9)  (5)〜(8)のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に生成蓄積されたユビキノン−10を採取することを特徴とする、ユビキノン−10の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)由来の新規なデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子が提供される。本発明のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、酵母ミトコンドリア移行シグナルの人為的付加なしに、酵母サッカロマイセス・セレビシエで単独に機能し、医薬品等に利用されるユビキノン−10を、効率的かつ簡便に合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子
本発明のデカプレニル二リン酸合成酵素（decaprenyl diphosphate synthase：DPS)をコードする遺伝子(以下、DPS遺伝子という）は、後記実施例に示すように、まず公知の真菌のデカプレニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子配列を比較し、その相同性の高い領域についてプライマーを各種合成し、これらのプライマーを種々組み合わせて酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)の染色体ゲノムをPCRによって増幅することによって、目的とする遺伝子の部分遺伝子断片を得る。
【００１２】
次に、全長遺伝子を取得するために、5'末端側塩基配列、3'末端側塩基配列の決定をそれぞれ5’RACE法、3’RACE法にて行う。具体的には、RACE法は、酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)の菌体から常法により調製したmRNAを鋳型とし、上記の部分遺伝子断片の内部配列を基に設計・作成したプライマーと、市販のRACE cDNA増幅用キット（例えば、SMART-RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)）添付のユニバーサルプライマーを用いて、PCR反応を行う。
【００１３】
取得した遺伝子の塩基配列の決定は、マキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシークエンサー、TAKARA社製BcaBESTジデオキシシークエンシングキット等）を用いて行う。決定した塩基配列は、DNASIS（日立ソフトウエアエンジニアリング社）等のDNA解析ソフトによって解析し、得られたDNA鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出すことができる。
【００１４】
本発明のDPS遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１５】
また、本発明の遺伝子には、配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
【００１６】
ここで、欠失、置換若しくは付加されてもよい「１若しくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１７】
また、本発明の遺伝子には、配列番号２に示すアミノ酸配列と70％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。上記70％以上の相同性は、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性をいう。
【００１８】
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、上記のタンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００１９】
上記の「デカプレニル二リン酸合成酵素活性」とは、ファルネシル二リン酸（FPP、C15）に７分子のイソペンテニル二リン酸（IPP、C5)がE型に縮合し、ユビキノン−10のプレニル側鎖のもとになるデカプレニル二リン酸（DPP、C50）を合成する活性をいい、「デカプレニル二リン酸合成酵素活性を有する」とは、該活性が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
【００２０】
また、実質的に同等の活性とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いた場合の40％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上の収率でデカプレニル二リン酸を合成する能力をいう。この活性測定は、ファルネシル二リン酸（FPP）と14C−IPP（イソペンテニル二リン酸）を対象酵素に反応させ、生成した14C−DPP（デカプレニル二リン酸）をホスファターゼにより加水分解後、TLCにて分離し、各鎖長のスポットへの取り込みを確認することによって行うことができる（Okada et al., Eur.J.Biochem., 255, 52-59)。
【００２１】
本発明の遺伝子はまた、配列表の配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【００２２】
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１で表わされる塩基配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましく65℃での条件をいう。
【００２３】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２４】
本発明はまた上記DPS遺伝子の発現産物であるタンパク質（以下、「DPSタンパク質」という）をも包含する。本発明のDPSタンパク質は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。また、本発明のDPSタンパク質には、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質も含まれる。「１若しくは数個」の範囲は上記と同じである。
【００２５】
本発明のDPSタンパク質にはさらに、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と相同性を有するタンパク質も含まれる。相同性を有するタンパク質とは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するタンパク質を意味する。タンパク質の相同性を決定するには、文献（Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc.Natl.Acad., Sci. USA(1983) 80, 726-730)に記載のアルゴリズムに従えばよい。
【００２６】
本発明のDPSタンパク質は、該タンパク質を発現している酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)の培養細胞からの抽出・分離によって、あるいは該タンパク質をコードするDNAを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【００２７】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
(1) 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のDPS遺伝子を連結することにより得ることができる。本発明のDPS遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。プラスミド DNAとしては、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pUC118等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。
【００２８】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２９】
上記ベクターには複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００３０】
複製開始点としては、酵母用ベクターには、例えば2μm DNA、ARS1由来のものが、大腸菌用ベクターには、例えばColE1、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、動物細胞用ベクターには、SV40、アデノウイルス由来のものが用いられる。
【００３１】
プロモーターとしては、酵母用ベクターには、gal1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が、大腸菌用ベクターには、T7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等が、動物細胞用ベクターには、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられる。
【００３２】
選択マーカーとしては、酵母用ベクターには、His3、Ade2、Lys2、Leu2、Trp1、Ura3遺伝子等の栄養要求性マーカー遺伝子、オーレオバシジン、セルレニン、カナバニン、ゼオシン、シクロヘキシミド、テトラサイクリン等の薬剤耐性遺伝子等が、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が、動物細胞用ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が用いられる。
【００３３】
ベクターは商業的に入手可能なものを使用することができるが、そのようなベクターには、宿主細胞が酵母である場合は、例えばpESP-1発現ベクター(STRATAGENE社製) 、pAUR123ベクター（宝酒造社製）、pPICベクター(Invitrogen社製)、pYES2ベクター(Invitrogen社製)、pRSベクター(STRATAGENE社製)等が、宿主細胞が大腸菌である場合は、例えばpETベクター(Novagen社製) 、pTrxFUSベクター(Invitrogen社製) 、pCYBベクター(NEW ENGLAMD Bio Labs社製) 等が、また宿主細胞が動物細胞である場合は、例えばpMAM-neo発現ベクター (CLONTECH社製) 、pCDNA3.1ベクター(Invitrogen社製) 、pBK-CMVベクター (STRATAGENE社製) 等がそれぞれ挙げられる。
【００３４】
(2) 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではなく、酵母、細菌、動物細胞のいずれでもよいが、酵母が好ましい。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)等が挙げられる。また、細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、動物細胞としては、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞等が挙げられる。
【００３５】
上記宿主のなかでもサッカロミセス・セレビシエが好ましく、本発明の遺伝子を導入することよって形質転換された酵母サッカロミセスは、本来は生産しないユビキノン−10を生産できるように変換される。また、ファフィア・ロドザイマも好ましく、本発明の遺伝子を導入することよって形質転換された酵母ファフィア・ロドザイマは本来有するユビキノン−10の生産能をさらに増強することができる。
【００３６】
酵母を宿主とする場合、酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168)等が挙げられる。
【００３７】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合、細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
動物細胞を宿主とする場合、動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３９】
３．ユビキノン−10の製造
上記の形質転換体を培地に培養し、培養物中から生成蓄積されたユビキノン−10を採取することにより、ユビキノン−10を製造することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。
【００４０】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４１】
酵母菌や大腸菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。また、培地には、選択マーカーの種類に応じ、オーレオバシジン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を添加するか、あるいは、栄養要求性を相補する遺伝子（Leu、Ura、Trp等）によって供給可能となるアミノ酸を除く。
【００４２】
培養条件は菌株や培地の種類によっても異なるが、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、培養温度は20〜40℃、培地のpHは3.0〜7.5、培養時間は6〜24時間とすればよい。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
【００４３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００４４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、5％CO2存在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
培養後、ユビキノン−10が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより、目的のユビキノン−10を採取する。また、ユビキノン−10が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等によりユビキノン−10を採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製すればよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）  酵母ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)由来ポリプレニル二リン酸合成酵素遺伝子のクローニング
(1) 部分遺伝子断片の取得
ファフィア・ロドザイマ（ATCC 66270)をマルチビーズショッカー（安井機械社製）によって破砕後、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用い、製造元が提供する方法に従って染色体ゲノムを調製した。
【００４８】
既知の真菌由来ポリプレニル二リン酸合成酵素遺伝子のアミノ酸配列を比較し、相同性の高い領域について下記のPCRプライマー（配列番号3〜12）を設計及び合成した。なお、下記のPCRプライマーの配列において、Iはイノシン、RはA又はG、YはC又はT、DはA又はT又はG、HはA又はC又はT、NはA又はG又C又はTを示す。
【００４９】
PCOQ1-de-1-1f (forward)：GI YTI GCN GAR ATH GTN GAR ATG (配列番号３）
PCOQ1-de-1-2f (forward)： GCI GAR ATH GTN GAR ATG ATH CA (配列番号４）
PCOQ1-de-1-3f (forward)： CAI GCI WSI YTI YTN CAY GAY GA (配列番号５）
PCOQ1-de-1-4f (forward)： TI YTI CAY GAY GAY GTN ATH GA (配列番号６）
PCOQ1-de-2-1f (forward)： GCI AAY YTI GTN GAR GGN GAR TT (配列番号７）
PCOQ1-de-2-2f (forward)： TI GTN GAR GGN GAR TTY ATG CA (配列番号８）
PCOQ1-de-2-1r (reverse): AAY TCI CCY TCN ACI ARR TTN GC (配列番号９）
PCOQ1-de-2-2r (reverse): TCI CCY TCN ACI ARR TTN GCD AT (配列番号１０）
PCOQ1-de-3-1r (reverse): GCR AAI ARI ACI GGN GCN TGN GC(配列番号１１）
PCOQ1-de-3-2r  (reverse): GCI ATI CCI ARY TTN ARR TCN GC (配列番号１２）
【００５０】
精製した染色体ゲノムを鋳型とし、先に合成したプライマーの種々の組合せを用いて、PCRを行った。得られた約250bpのPCR産物をゲルより切り出して、MiniElute Gel Extraction Kit （QIAGEN社製）を用いてアガロースゲルより精製した後、pT7 Blue T-Vector（Novagene社製）にクローニングし、phDPSp/pT7を得た。クローニングしたDNAの塩基配列をDye Terminator Cycle Sequence Kit, ABI PRIZM 3100 Gene Analyzer（共にアプライドバイオシステムズ製）及び遺伝子情報処理プログラムGENETYX-WIN Ver.7 （ソフトウェア開発株式会社製）を用いて解析した。その結果、ファフィア・ロドザイマからは配列番号１の６２１から８４９までの塩基配列を有するDNA断片が得られた。これらDNA断片は、翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル二リン酸合成酵素に特徴的な領域のアミノ酸配列「ＧＤＦＬＬＸＲＡ」（Ｘは、Ａ又はＧ）が見出せたことにより、デカプレニル二リン合成酵素の遺伝子の一部であることが確認された。
【００５１】
(2) 3'側非翻訳領域を含む遺伝子断片の取得
ファフィア・ロドザイマ（ATCC 66270)をマルチビーズショッカー（安井機械社製）によって破砕後、RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用い、製造元が提供する方法に従って全RNAを調製した。
【００５２】
この得られた全RNAを鋳型とし、フォワードプライマーとして(1)で得たDNA断片の塩基配列を元に設計した下記のプライマー（配列番号13〜16）、リバースプライマーとしてRNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（Takara社製）添付のユニバーサルプライマーを用いて、該キットの製造元が提供する方法に従ってRT-PCRを行った。
【００５３】
PDPS-3’-1 （forward）: TCG CCC GAG GTA GTC G (配列番号13）
PDPS-3’-2 (forward): TTCT TGC TCG GTA GAG C (配列番号14）
PDPS-3’-3 (forward): ACC TTC AGC ACC CAA TC (配列番号15）
PDPS-3’-4 (forward): CGA TGA TGT GAT TGA TGT TTC TC (配列番号16）
【００５４】
PCRは、94℃の熱処理後、94℃30秒, 60℃30秒, 72℃１分のサイクルを30回繰り返すことにより行い、 ２％アガロースゲル電気泳動により分析した。得られた約750bpのPCR産物をゲルより切り出して、MiniElute Gel Extraction Kit （QIAGEN社製）を用いてアガロースゲルより精製した後、pT7 Blue T-Vector（Novagene社製）にクローニングし、3' phDPSp/pT7を得た。クローニングしたDNAの塩基配列をDye  Terminator Cycle Sequence Kit, ABI PRIZM 3100 Gene Analyzer（共にアプライドバイオシステムズ製）及び遺伝子情報処理プログラムGENETYX-WIN Ver.7 （ソフトウェア開発株式会社製）を用いて解析した。その結果、(1)で得られた部分遺伝子を含む3'側非翻訳領域の塩基配列を有するDNA断片が得られた。
【００５５】
(3) 5'側非翻訳領域を含む遺伝子断片の取得
(2)で得た全RNAを鋳型とし、 リバースプライマーとして(1)で得たDNA断片の塩基配列を元に設計した以下のプライマー（配列番号17〜19）、フォワードプライマーとしてSMART RACE cDNA Amplification Kit (BD Bioscience社製）添付のユニバーサルプライマーを用いて、該キットの製造元が提供する方法に従ってRT-PCRを行った。
PDPS-5’-1 （reverse） GAG AAA CAT CAA TCA CAT CAT CG (配列番号17）
PDPS-5’-2 （reverse） ACC TTG TTG CCG AAA AGA TTG G (配列番号18）
PDPS-5’-3 （reverse） TCT GGC TAG CGC GGC TGA G (配列番号19）
【００５６】
PCRは、94℃の熱処理後、94℃30秒, 60℃30秒, 72℃１分のサイクルを30回繰り返すことにより行い、 ２％アガロースゲル電気泳動により分析した。得られた約800bpのPCR産物をゲルより切り出して、MiniElute Gel Extraction Kit （QIAGEN社製）を用いてアガロースゲルより精製した後、pT7 Blue T-Vector（Novagene社製）にクローニングし、5' phDPSp/pT7を得た。クローニングしたDNAの塩基配列をDye  Terminator Cycle Sequence Kit, ABI PRIZM 3100 Gene Analyzer（共にアプライドバイオシステムズ製）及び遺伝子情報処理プログラムGENETYX-WIN Ver.7 （ソフトウェア開発株式会社製）を用いて解析した。その結果、(1)で得られた部分遺伝子を含む5'側非翻訳領域の塩基配列を有するDNA断片が得られた。
【００５７】
(4) 全長遺伝子の取得
酵母ファフィア・ロドザイマ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子の全長を得るために、上記（2)及び(3)で得られた配列を元に以下のプライマー(配列番号20、21）を設計・合成した。
PDPS-F(NotI) （forward）：GAG AAA CAT CAA TCA CAT CAT CG (配列番号20）
PDPS-R(XhoI) （reverse）：ACC TTG TTG CCG AAA AGA TTG G (配列番号21）
(2)で得た全RNAを鋳型とし、上記のプライマー及びRNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（Takara社製）を用いて、製造元が提供する方法に従って、RT-PCRを行った。
【００５８】
PCRは、94℃の熱処理後、94℃30秒, 60℃30秒, 72℃１分のサイクルを30回繰り返すことにより行い、２％アガロースゲル電気泳動により分析した。得られた約１.２kbのPCR産物をゲルより切り出して、MiniElute Gel Extraction Kit （QIAGEN社製）を用いてアガロースゲルより精製した後、pT7 Blue T-Vector（Novagene社製）にクローニングし、phDPS/pT7を得た。クローニングしたDNAの塩基配列をDye  Terminator Cycle Sequence Kit, ABI PRIZM 3100 Gene Analyzer（共にアプライドバイオシステムズ製）及び遺伝子情報処理プログラムGENETYX-WIN Ver.7 （ソフトウェア開発株式会社製）を用いて解析した。その結果、目的遺伝子の全長の塩基配列が得られた。その大きさは1398bpであり、465アミノ酸をコードしており（塩基配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２）、真核生物由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子と高い相同性を示した。
【００５９】
（実施例２）  発現ベクターの構築
実施例１で得られたプラスミドphDPS/pT7を制限酵素NotI及びXhoIで処理した後、酵母サッカロマイセス・セレビシエ用発現ベクターpRS433GAPに挿入し、phDPS/pRS433GAPを作製した。得られた発現ベクターを図１に示す。
【００６０】
（実施例３）酵母ファフィア・ロドザイマ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子の機能解析
酵母ファフィア・ロドザイマ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子の機能を調べるために、実施例２で得たphDPS/pRS433GAPを、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素遺伝子（YBR003w)を相同組換えにより破壊した酵母サッカロマイセス・セレビシエ（以下Y03Wd株と記載）にFrozen Yeast Transformation II（ZYMO RESERCH社製）を用いて導入し、YphDPS株を作製した。
【００６１】
次に、このYphDPS株（Y03Wd株にphDPS/pRS433GAPを導入した株）、Y03W-433株（Y03Wd株に空ベクターを導入した株）、Y2N14907株（Y03Wd株にCoq2(N35）-DPS融合遺伝子を導入した株）の３種類の株についてグリセロール資化能の比較実験をYPD培地及びYPGlycerol培地にて行った。
【００６２】
YPD培地は、20g/L グルコース、20g/L Bacto Pepton、10g/L Yeast Extraxt、20g/L 寒天を水に溶かし、オートクレーブ（121℃、20分）滅菌後、適量をプラスチックプレートに添加して使用した。YPGlycerol培地は、30g/L グリセロール、20g/L Bacto Pepton、10g/L Yeast Extraxt、20g/L 寒天を水に溶かし、オートクレーブ（121℃、20分）滅菌後、適量をプラスチックプレートに添加して使用した。
【００６３】
グリセロール資化能の比較実験結果を図２に示す。空ベクターのみを導入したY03W-433株がYPGlycerol培地で生育できない呼吸欠損の表現系を示したのに対し（図２Ｂ、２）、YphDPS株はYPGlycerol培地で生育可能な呼吸機能の回復した表現型を示した（図２Ｂ、１）。このことから、phDPS遺伝子によってY03Wd株のユビキノンの生合成能が回復したため、YPGlycerol培地で生育可能になったものと考えられた。即ち、phDPS遺伝子が酵母サッカロマイセス・セレビシエの細胞内でYBR003wの機能を相補することが可能であることが明らかとなった。
【００６４】
（実施例４）  組換え酵母によるユビキノン−10の製造
得られた組換え体酵母YphDPS株を5mlのSD-Ura、His培地で30℃,72時間振盪培養した後、培養液の一部を100mlのSG-Ura、His培地（+0.1mM PHB）に植菌した。それを30℃,72時間培養し、遠心分離（1500rpm, 5分）により菌を集菌した。
【００６５】
なお、上記のSD-Ura、His培地は、20g/L グルコース、1.7g/L Yeast Nitrogen Base without amino acid、5g/L 硫酸アンモニウム、0.6g/L CMS-Ura-His-Trp-Leu（BIO101社製）、100mg Leucin、50mg Tryptophan、0.013g/Lパラヒドロキシ安息香酸を水に溶かし、NaOHでpHを中性に合わせた後、オートクレーブ（121℃、20分）滅菌後、使用した。また、SG-Ura、His培地（+0.1mM PHB)培地は、20g/Lガラクトース、1.7g/L Yeast Nitrogen Base without amino acid、5g/L 硫酸アンモニウム、0.6g/L CMS-Ura-His-Trp-Leu（BIO101社製）、100mg Leucin、50mg Tryptophan、0.013g/Lパラヒドロキシ安息香酸を水に溶かし、NaOHでpHを中性に合わせた後、オートクレーブ（121℃、20分）滅菌後、使用した。
【００６６】
集めた菌体に2.5mgのWestase（宝酒造社製）を0.5mlのMcIlveine Buffer pH6.0（0.1M クエン酸溶液及び0.2Mリン酸２水素ナトリウム溶液を36.8：63.2の混合比で混ぜ、pHを6.0に調整した）と共に添加し、37℃で約１時間反応させた。その後、約1gのガラスビーズ（0.5mm)及び70μlの100μM ユビキノン−９（内部標準）を添加し、マルチビーズショッカー（安井機械社製）による破砕（2500rpm、２分間）を行った。次に、ユビキノンを含む有機物を抽出する為に、6 mlのメタノール及び4mlのペンタンを添加し、２分間激しく攪拌した。遠心分離（1500rpm、５分）により分離した有機層（上層）を新しい試験管に移した。新たに4mlのペンタンを加え、２分間激しく攪拌し、遠心分離により得られた有機層を先程の試験管に移した。得られた有機層をSpeed vac Plus SC210A（Savant社製）又はドラフト内で乾燥・濃縮した。これを0.5mlのエタノール／ヘキサン（9:1）溶媒で再溶解した後、HPLC SERIES 1100（ヒューレットパッカード社製）に供し、275nmの吸光度を測定することでユビキノンの分析を行った。HPLCの分析条件は、エタノールを溶媒とし、流速は最初の2分間は1ml／分、それ以降は0.5ml／分で行った。また、カラムはODS-UG-3 4.6Dx150（野村化学社製）を用い、25℃に保って実施した。標準として用いたユビキノン−10と同位置に検出されたピーク（Restriction time：約８分）について解析を行った。内部標準として用いたユビキノン−９の抽出効率から求められるユビキノン−10の生産量を算出した。その結果、比較対照のY03W-433株にユビキノン−10の生産が確認できなかったのに対し、phDPS遺伝子を導入したYphDPS株ではユビキノン−10の生産が確認できた（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】発現ベクターphDPS/pRS433GAPの構造を示す。
【図２】YphDPS株、Y03W-433株、Y2N14907株のグリセロール資化能試験（各株について３回実施）の結果を示す（１：YphDPS株、２：Y03W-433株、３：Y2N14907株）。
【図３】YphDPS株、Y03W-433株のユビキノン−10生産量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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