(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の染色剤が細胞学的サンプルにおいて用いられたことを確認する方法であって、
該細胞学的サンプルを、複数のスペクトル吸収ピークを有する染色剤で染色する工程と、
該染色剤の第１の吸収ピークによって実質的に吸収される第１の狭幅域波長を有する第１の光源で、該サンプルを照明することによって該染色剤を確認する工程と、
該染色剤の第２の吸収ピークによって実質的に吸収される第２の狭幅域波長を有する第２の光源で、該サンプルを照明することによって該サンプルを撮像する工程と、を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１の狭幅域波長が、約６９０〜７５０ｎｍの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の光源は、赤色ＬＥＤを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の狭幅域波長が、約５００〜６００ｎｍの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の光源は、緑色ＬＥＤを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
この米国特許出願は、明細書中、３つの米国特許出願を参考として援用する。これらの３つの米国特許出願は、本出願と同じ日、すなわち、１９９９年１０月２９日に出願され、それぞれ、Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ、Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ、およびＶｅｒｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｅａｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍという名称であり、代理人認可証番号ＣＹＭ−０３１、ＣＹＭ−０３２、およびＣＹＭ−０３４、米国特許出願第０９／４３０，１１６号、第０９／４３０，１１７、および第０９／４３０，１９８号としてそれぞれ識別される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細胞学的材料の分析に関する。具体的には、本発明は、染色剤、および染色剤を製造する方法、細胞学的または組織学的分析のために、細胞を染色して、細胞の核部分を細胞質部分と対比させる方法、および細胞学的サンプルを照明するシステムおよび方法に関する。この分析は、自動または手操作で行われ得る。
【０００３】
（背景についての情報）
細胞学は、生物学から派生し、細胞の形成、構造、および機能について論じる。細胞学は、実験室設備で適用されて、細胞学者、細胞検査技師、および他の医学的な専門家が、患者の細胞の視覚的な検査に基づいて、患者の状態についての医学的な診断を行う。典型的な細胞学的技術として、細胞を、女性の子宮頸部からこすり取り、異常な細胞、すなわち、初期の子宮頸ガンにおける前駆体があるかどうかを検出するために分析する、「パパニコロー塗沫標本」試験がある。また、細胞学的技術は、人間の体の他の部分における異常な細胞および疾病を検出するためにも用いられる。
【０００４】
細胞学的技術は、分析用の細胞サンプルの収集が、概して、従来の外科的病理学上処置、例えば、組織標本を、バネ付き移動可能スタイレット、固定カニューレなどを有する専用の生検用針を用いて患者から切除する生検よりも侵襲性が低いので、幅広く採用される。細胞サンプルは、様々な技術を用いて、患者から採取され得る。この様々な技術には、例えば、領域をこすること、または綿棒で集めること、あるいは、針を用いて、胸部の体腔、膀胱、脊髄管、または他の適切な領域から体液を吸引することが含まれる。細胞サンプルは、溶液に入れられ、その後、収集され、ガラススライドに移されて、拡大して観察される。定着および染色溶液は、典型的には、ガラススライド上の細胞に塗布され、これは、細胞塗沫標本と呼ばれる場合がある。それにより、検査が容易になり、長期保存のための標本が保存される。
【０００５】
従来の多色染色は、細胞塗沫標本を、ある特定の細胞学的分析のために染色することにおいて望ましい。標本の核と細胞質とを異なる色で染色して、核質と細胞質とが、視覚的にも、また、自動撮像機器によっても容易に区別され得るようにすることが有用である。ある染色の実施において、細胞質は、透明であり、核は、透明から不透明である。この染色パターンは、細胞学者が、例えば、非常に大きいか、かつ／または色が濃い核質によって示される、形態学的に異常な細胞を区別することを可能にする。さらに、細胞学者は、従来の染色、特に、パパニコロー染色の各種の色が、眼精疲労の軽減に役立ち、診断を助けることを見出している。
【０００６】
従来の染色は、パパニコロー染色も含めて、分析するための自動システムにおいて用いるのは難しかった。人間の眼でも簡単に区別できる従来の染色による細胞質の各種の色は、自動撮像システムでは、従来の核のブルーヘマトキシリン染色に対して、対比の度合いがばらついているので、容易には分析されない。ばらついている対比によって、自動分析が信頼できなくなる。
【０００７】
導入されてから約７０年間、パパニコロー染色の原型は、様々な改良がされてきた。現在では、染料、試薬、および方法は、核実験室の好みによって、大きく異なっている。パパニコロー様の染色の標準化が、何年もの間求められてきたが、実験室にとって、標準化をする刺激はほとんどなかった。このばらつきは、現在の撮像技術に影響し、多くのスライドが、従来のパパコロニー塗沫標本調整に固有の問題点のため、または、画像獲得および解析のためには不十分な核と細胞質との対比を生み出す、不十分な染色のため、撮像されないことにつながり得る。
【０００８】
複数の研究者が、パパコロニー染色で多色に染色された細胞の自動分析を試みようとして、アルゴリズムを開発してきた。このような技術は、異なる色の光線、フィルタ、およびカラーテレビカメラなどの様々な人工機器の使用を含む。多くは、ハードウェアおよびソフトウェアに関して、ある程度の高度化を必要とし、費用がかかる。さらに、これらのアプローチは、臨床細胞学および組織学診断において幅広く用いられるために十分なほど、正確、かつ信頼性があるということが証明されていない。
【０００９】
従来の機械視覚照明源は、低効率広帯域源、例えば、タングステン−ハロゲンランプ、ハロゲン化ナトリウムランプ、またはキセノンランプなどである。これらのソースは、入力されたエネルギーのうち、わずかな部分を、広帯域の光線に変換する。従って、効率は、狭帯域光源を必要とする細胞学的用途において、大幅に落ちる。典型的には、これらのデバイスは、大量の熱を生成し、正しい波長を得るためにフィルタリングすることが必要であり、比較的大型になる。
【００１０】
本発明の目的は、細胞の核と細胞質との間に、はっきりした対比を形成する染色剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、細胞学的材料を、細胞質が、自動機械視覚システムに対して、相対的に透明になるが、観察者にとっては見えるように染色することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、２つの別個の光波長にさらされる場合に、二重ピーク反応性を有する染色剤、および、特定の染色剤が用いられたことを、二重ピーク反応性に基づいて確認するシステムを提供することである。
【００１２】
また、本発明のさらに別の目的は、細胞が多色に染色され、核部分が、細胞質部分から、自動撮像機器と、および人間の視覚分析との両方を用いて、容易に区別され得る細胞学的分析方法を提供することである。
【００１３】
さらに他の目的は、手動および自動分析手順の両方を用いて、染色された細胞の性質が正確に判定される細胞学的分析の方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、照明が、２つの異なる光源から、２つの異なる波長で供給される、細胞学的サンプルを照明するシステムおよび方法を提供することである。１つの光源は、染色剤を確認し、他の光源は、細胞学的サンプルの分析を容易にする。
【００１５】
（発明の要旨）
概して、本発明は、独自の染色剤、細胞学的材料を染色する方法、および照明システムによって、上記の問題に対処する。従来のパパニコロー染色の欠点の一部に対処する他の技術が、米国特許第５，１６８，０６６号に記載されている。この特許は、本願と同一譲受人に譲り受けられ、この開示内容は、本明細書中で参考として援用される。
【００１６】
ある局面において、本発明は、細胞学的染色溶液に関する。この溶液は、メタノール、フェノール、およびチオニンを含む。いくつかの実施形態においては、酸が存在していてもよい。酸は、溶液のｐＨを調節するために従来用いられる酸のうち、ほとんどいずれであってもよい。例えば、酢酸、硝酸、塩酸、リン酸、蟻酸、硫酸、またはクエン酸が用いられ得る。様々な実施形態において、メタノールは様々なグレードで用いられ得、フェノール源は、少なくとも約９５％のＡＣＳグレードを有するゆるい（ｌｏｏｓｅ）結晶であり、チオニンは、認可された染料粉末であり、酸は、各種のグレードの氷酢酸であってもよい。ＡＣＳグレードは、成分の純度を表す指標である。成分は、均等なグレード付けシステムに従っていればよい。さらに、チオニンは、合成され得る。ある実施形態において、染色溶液は、酸性のｐＨ値、好ましくは、約５〜７を有し、より好ましくは、約６．７０＋／−０．０５である。ある実施形態において、フェノールは、重量対容量比が、約０．８％から約１．２％であり、好ましくは、約１．０％である。他の実施形態において、チオニンは、重量対容量比が、約０．２％から約０．５％であり、好ましくは、約０．３％から約０．４％であり、より好ましくは、約０．３４５％である。重量対容量比は、ｗｔ／ｖで表され、任意の１成分の重量の測定値を、溶液全体容量の割合として表したものである。
【００１７】
他の局面において、本発明は、染色溶液を作製する方法に関する。この方法は、メタノール、フェノール、およびチオニンを混合する工程と、この混合物を攪拌する工程と、この混合物を濾過する工程と、酸を加えて混合物のｐＨ値を約６．７に調節する工程とを包含する。酸は、好ましくは、攪拌されている間に、ゆっくりと加えられる。上述したように、酸は、溶液のｐＨを調節するために従来用いられていた酸のほとんどいずれであってもよい。ある実施形態において、混合物は、約１リットルのメタノールに対して、約１０グラムのフェノール、および約３．４５グラムの有機または合成チオニンを均等な比率で含む。混合物は、フィルタを用いて、約１〜２０ミクロンの粒子が残留するように濾過され得る。混合物は、少なくとも約１時間攪拌され得る。
【００１８】
さらに他の局面において、本発明は、細胞学的対比染色溶液に関する。対比染色において、細胞は、主に細胞質によって吸収される１種類以上の染料で染色される。溶液は、試薬アルコール、エオシンＹ、チオニン、ならびにライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む。様々な実施形態において、試薬アルコールは、２００プルーフであり、エオシンＹ、チオニン、ならびにライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローは、認可された染料粉末であり、ＡＣＳグレード９９％の氷酢酸などの酸があってもよい。チオニンは、有機チオニンであってもよいし、合成チオニンであってもよい。ある実施形態において、染色溶液は、酸性のｐＨ値、好ましくは、約５〜６、より好ましくは、約５．５０＋／−０．０５である。他の実施形態において、試薬アルコールは、エタノール約９０％、イソプロポナル（ｉｓｏｐｒｏｐｏｎａｌ）５％、およびメタノール約５％からなる。ある実施形態において、エオシンＹは、ｗｔ／ｖ比が、約０．０５％から約０．１％であり、好ましくは、約０．０６７％から約０．０８％であり、より好ましくは、約０．０７２１％である。他の実施形態において、チオニンは、ｗｔ／ｖ比が、約０．０１％から約０．０３％であり、好ましくは、約０．０１５％から約０．０２５％であり、より好ましくは、約０．０１７１％である。他の実施形態において、ライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローは、ｗｔ／ｖ比が、約０．０１５％から約０．０３％であり、好ましくは、約０．２３１％である。
【００１９】
さらに他の局面において、本発明は、対比染色溶液を作製する方法に関する。この方法は、試薬アルコール、エオシンＹ、チオニン、ならびにライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローを混合する工程と、その混合物を攪拌する工程と、その混合物を濾過する工程と、酸を加えて、その混合物のｐＨを約５．５に調節する工程とを包含する。上述したように、酸は、溶液のｐＨを調節するために従来用いられる任意の酸のほとんどいずれであってもよい。ある実施形態において、混合物は、約１リットルの試薬アルコールと、約０．７２１グラムのエオシンＹと、約０．１７１グラムの有機または合成チオニンと、約０．２３１グラムのライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローとの均等な量を含む。他の実施形態において、混合物は、フィルタを用いて、約１〜２０ミクロンの粒子が残留するように濾過される。混合物は、少なくとも約１時間攪拌され得る。
【００２０】
さらに他の局面において、本発明は、細胞学的材料をチオニン−フェノール溶液で染色する方法に関する。チオニン−フェノール溶液は、細胞質細胞学的材料に対して、優先的に、核細胞学的材料に結合する。溶液は、メタノール、フェノール、およびチオニンを含んでもよく、約０．３％チオニン溶液であってもよい。チオニンは、有機チオニンであってもよいし、合成チオニンであってもよい。ある実施形態において、細胞学的材料は、染色の前に、塩浴に浸漬される。塩浴は、１０％の塩の溶液であってもよい。他の実施形態において、この方法は、チオニン−フェノール溶液で染色する工程の後に、細胞学的材料を対比染色する工程を包含する。
【００２１】
本発明のこの局面における様々な実施形態は、以下の特徴を含み得る。細胞学的材料は、試薬アルコール、エオシンＹ、チオニン、ならびにライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローを含む対比染色溶液で対比染色される工程の前に、アルコール浴において、リンスされるか、または、浸漬され得る。チオニンは、有機チオニンであってもよいし、合成チオニンであってもよい。対比染色溶液は、核細胞学的材料に対して、優先的に、細胞質細胞学的材料に結合する。対比染色溶液は、チオニン−フェノール染色剤の少なくとも１つの成分、ある実施形態においては、リンスの間に低減されたチオニンを実質的に補給するように、チオニンを含んでもよい。チオニン−フェノール染色溶液と対比染色溶液のうちの少なくとも１つが、細胞学的材料を、可視光幅で認識できるように染色するか、または、チオニン−フェノール染色溶液および対比染色溶液の両方が、細胞学的材料を、可視光幅で認識できるように染色する。さらに、細胞学的材料は、対比染色する工程の後に、アルコール浴においてリンスされるか、浸漬され得る。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、以前に染色された材料を対比染色する工程であって、対比染色剤が、以前の染色剤からの成分を含む工程に関する。以前に染色された材料を対比染色するプロセスは、以前の染色剤成分による初期の染色工程の後に、例えば、材料を染色工程の後にリンスすることによって失われ得る成分を補給する。この方法のある実施形態において、以前に染色された材料は、対比染色工程の前にリンスされる。リンスは、アルコール浴であってもよい。
【００２３】
本発明の他の局面は、第１の光源および第２の光源を有する光学機械照明システムに関する。第１の光源は、約６９０〜７５０ｎｍの範囲内であり得る第１の波長を有する。第１の光源は、細胞学的材料において用いられた染色剤を確認するために用いられる。第２の光源は、第１の波長と異なる約５００〜６００ｎｍの範囲内であり得る第２の波長を有する。第２の光源は、細胞学的サンプルを観察するために照明するように用いられる。様々な実施形態において、第１の光源は、赤色発光ダイオード（ＬＥＤ）であり得、第２の光源は、緑色のＬＥＤ、あるいは、８個まで、またはそれ以上の緑色のＬＥＤのアレイであり得る。光源は、低電圧、例えば、５ボルトＤＣで動作し得る。ＬＥＤは、明るく、安定し、広い範囲の照明波長において利用可能である。さらに、ＬＥＤは、効率的に、狭帯域の照明（典型的には、１５ｎｍ）を生成し、狭帯域フィルタの必要性をなくし、全てのエネルギー（熱）を所望の照明波長にする。タングステン−ハロゲンバルブのような従来の照明は、狭帯域照明が望まれる場合に多量の無駄な光および熱を消耗する。ＬＥＤは、従来の撮像光源より、生成する熱が有意に少なく、必要とする電力が実質的により少ない。実際、標準的な光源は、しばしば、必要なシャッター時間を得るためには、不十分ある。さらに、ＬＥＤは、比較的小さい。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、システムとともに用いられる細胞学的サンプルを撮像するシステムを用いるためのＬＥＤアレイに関する。ＬＥＤアレイは、染色されたサンプルが所定の染色剤で染色されたことを確認するための赤色のＬＥＤと、撮像するために細胞学的サンプルを照明する緑色のＬＥＤとを含む。アレイは、８個まで、またはそれ以上の緑色のＬＥＤを含み得、５ボルトＤＣのような低電圧で動作し得る。
【００２５】
本発明のさらに別の局面は、核材料と細胞学的材料とを含む細胞学的サンプルを撮像するシステムに関する。システムは、光学機器と、第１および第２の光源とを含む。第１の光源は、特定の染色剤が、細胞学的サンプル上で用いられたことを確認するため第１の波長を有する。この特定の染色剤は、約７２０ｎｍの波長の光を透過させる。第２の光源は、撮像するために細胞学的サンプルを照明する第２の波長を有する。このサンプルの染色された核は、約５７０ｎｍの波長の光を透過させ、細胞質は、システムにとって、実質的に見えない状態である。ある実施形態において、染色剤は、チオニン−フェノール溶液であり、好ましくは、約０．３％チオニン溶液である。他の実施形態において、細胞質は、観察者にとって見える状態である。様々な実施形態において、第１の光源は、赤色のＬＥＤであり、第２の光源は、緑色のＬＥＤ、あるいは８個まで、またはそれ以上の緑色のＬＥＤのアレイである。光源は、低電圧、例えば、５ボルトＤＣで動作し得る。
【００２６】
さらに他の局面において、本発明は、細胞を撮像する方法に関する。この方法は、細胞の核材料を染色する工程と、細胞の細胞質材料を染色する工程と、特定の染色剤が用いられたことを確認するための第１の波長を有する第１の光源で細胞を照明する工程と、核材料を撮像するための第２の波長を有する第２の光源で細胞を照明する工程とを包含する。
【００２７】
本発明の上記の局面に従うさらなる実施形態は、以下の特徴を含み得る。第１の波長は、約６９０〜７５０ｎｍの範囲内であり、第２の波長は、約５００〜６００ｎｍの範囲内であり得る。第１の光源は、赤色のＬＥＤであってもよく、第２の光源は、緑色のＬＥＤ、あるいは８個まで、またはそれ以上の緑色のＬＥＤのアレイであり得る。光源は、低電圧、例えば、５ボルトＤＣで動作し得る。用いられた染色剤は、核材料と細胞質材料との間にはっきりした対比を生成し、細胞質材料が、細胞を観察する撮像システムにとって相対的に透明、または見えないようにするが、観察者にとっては見えるようにする。特に、細胞の核材料は、チオニン−フェノール溶液、好ましくは、約０．３％チオニン溶液で染色され得る。
【００２８】
さらに他の局面において、本発明は、特定の染色剤が細胞学的サンプルにおいて用いられたことを確認する方法に関する。この方法は、細胞学的サンプルを、第１および第２の波長で２つのスペクトルピークを有する染色剤で染色する工程と、サンプルを第１および第２の光源で照明する工程とを包含する。第１の光源は、第１の波長を有し、特定の染色剤が、約７２０ｎｍの波長の光を透過させる。第２の光源は、第２の波長を有し、特定の染色剤は、約５７０ｎｍの波長の光を透過させる。
【００２９】
本発明の上記の局面に従うさらなる実施形態は、以下の特徴を含み得る。第１の波長は、約６９０〜７５０ｎｍの範囲内であり、第２の波長は、約５００〜６６０ｎｍの範囲内である。第１の光源は、赤色のＬＥＤであってもよく、第２の光源は、緑色のＬＥＤ、あるいは、８個まで、またはそれ以上の緑色のＬＥＤのアレイであり得る。光源は、５ボルトＤＣで動作し得る。細胞学的サンプルは、チオニン−フェノール溶液、好ましくは、約０．３％チオニン溶液で、染色され得る。
【００３０】
これらの目的および他の目的は、以下に記載する本発明の利点および特徴と共に、本発明の実施形態の以下の説明、添付の図面、および特許請求の範囲を参照することによって明らかになる。
【００３１】
図面において、同一の参照符号は、概して、異なる図を通じて、同一の部分を指す。また、図面は、縮尺されるものではなく、概して、本発明の原理を説明するために強調される。本発明の好適で例示的な実施形態は、図面を参照しながら、以下にさらに詳細に説明される。
【００３２】
（詳細な説明）
本発明の実施形態を以下に示す。しかし、本発明がこれらの実施形態に限定されるものではなく、当業者にとって明らかである改良例およびその均等物が含まれることに特に留意されたい。
【００３３】
染色剤のある実施形態は、メタノール、フェノール、およびチオニンを含むチオニン−フェノール溶液である。また、染色剤は、染色溶液のｐＨを調節する酸も含んでもよい。メタノール（メチルアルコール）成分の純度は、様々なグレードでああってもよい。フェノール成分は、ＡＣＳグレード純度が少なくとも約９５％のゆるい結晶として、供給される。フェノールは、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩのＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．から市販されているｃｈａｏｔｒｏｐｈｉｃ剤である。しかし、均等物が代わりに用いられてもよい。チオニン成分は、認可された染料粉末、具体的には、ＢＳＣ認可済、異染性カチオンチアジン染料として供給される。図１は、本発明において用いられるチオニン染料のある実施形態の特徴を表す。このチオニン染料は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、または、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのＳＩＧＭＡから市販されているものであるが、均等物が用いられてもよい。染料のｐＨを調節する酸は、最も一般的な酸、例えば、酢酸、クエン酸、硝酸、塩酸、リン酸、硫酸、または蟻酸のうちのいずれであってもよい。
【００３４】
許容されるチオニンの溶液への重量対容量（ｗｔ／ｖ）比は、約０．２〜０．５％ｗｔ／ｖであり、好ましくは、約０．３〜０．４％ｗｔ／ｖであり、より好ましくは、約０．３４５％ｗｔ／ｖである。フェノールの比は、約０．８〜１．２％ｗｔ／ｖであり、好ましくは、約１．０％ｗｔ／ｖである。
【００３５】
図２に、染色剤を作製するある方法を表す。工程５の混合工程は、フェノール結晶およびチオニン染料をメタノールに加える工程を必要とする。次に、工程１０で、混合物が攪拌され、必要に応じて、１５時間まで激しく攪拌される。その後、工程１５で、混合物が濾過される。混合物は、フィルタを通して、約１〜２０ミクロンの粒子、好ましくは、約２ミクロンの粒子を保持するように、重力濾過される。フィルタの一例として、Ｗｈａｔｍａｎｎから市販されているｎｏ．４ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒがある。最終的に、工程２０で、混合物のｐＨレベルが、酸を溶液に加えることによって調節される。混合物は、酸が加えられている間、連続的に攪拌され得る。その後、ｐＨは、約５〜７、好ましくは、約６．７＋／−０．００５に調節される。あるいは、工程２５で、溶液の正確な組成を確認するために公知の任意の手段によって、溶液の導電性を測定してもよい。
【００３６】
対比染色剤、または第２の染色剤のある実施形態は、試薬アルコール、エオシンＹ、チオニン、ならびにライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローを含む。対比染色剤のｐＨを調節する酸も存在し得る。試薬アルコールは、２００プルーフであり、約９０％のエタノール、５％のイソプロパノール、および５％のメタノールを含み得る。エオシンＹ、チオニン、ならびにライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローは、認可済染色粉末である。エオシンＹは、蛍光（黄色）であり、２’、４’、５’、７’−四臭化フルオレセインによって構成される赤色キサンチン染料である。エオシンＹは、ＢＳＣによって、ヘマトキシリンに対する対比染色剤として用いられることが認可されている。図３は、本発明において用いられる、エオシンＹ染料のある実施形態の特徴を表す。このエオシンＹ染料は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、または、ＳＩＧＭＡから市販されているものであるが、均等物が用いられてもよい。チオニンは、チオニン−フェノール溶液において用いられるチオニンと同じ組成である。ライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローは、青みがかった緑であり、水への溶解度が非常に高く、エタノールへの溶解度が低いアニオントリフェニルメタン染料である。ライトファストグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローは、細胞学的対比染色剤に用いられることがＢＳＣに認可されている。図４は、本発明で用いられるライトグリーンＳＦイエロー染料のある実施形態の特徴を表している。このライトグリーンＳＦイエロー染料は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、または、ＳＩＧＭＡから市販されているものであるが、均等物が用いられてもよい。染料のｐＨを調節する酸は、最も一般的な酸、例えば、酢酸、クエン酸、硝酸、塩酸、硫酸、リン酸、または蟻酸のうちのいずれであってもよい。
【００３７】
エオシンＹの溶液に対する比は、約０．０５％〜０．１％ｗ／ｔｖであり、好ましくは、約０．０６〜０．０８％ｗ／ｔｖであり、より好ましくは、０．０７２１％ｗ／ｔｖである。チオニンの比は、約０．０１〜約０．０３％ｗ／ｔｖであり、好ましくは、約０．０１５〜０．０２５％ｗ／ｔｖであり、より好ましくは、約０．０１７１％ｗ／ｔｖである。ライトグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエローは、約０．０１５％〜０．０３％ｗ／ｔｖであり、好ましくは、０．０２３１％ｗ／ｔｖである。
【００３８】
対比染色剤を生成するある方法を図５に示す。工程３０の混合工程は、エオシンＹと、チオニンと、ライトグリーンＳＦイエローまたはファストグリーンＳＦイエロー染料を試薬アルコールに加える工程を含む。次に、工程３５において、混合物が、必要に応じて激しく、好ましくは、１５時間まで攪拌される。その後、工程４０で、混合物が濾過される。混合物は、フィルタを通して、約１〜２０ミクロンの粒子、好ましくは、約２ミクロンの粒子を保持するように、重力濾過される。フィルタの一例として、Ｗｈａｔｍａｎｎから市販されているｎｏ．４ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒがある。最終的に、工程４５で、混合物のｐＨレベルが、酸を溶液に加えることによって調節される。混合物は、酸が加えられている間、連続的に攪拌され得る。その後、ｐＨは、約５〜６、好ましくは、約５．５＋／−０．０５に調節される。あるいは、工程２５で、溶液の正確な組成を確認するために公知の任意の手段によって、溶液の導電性を測定してもよい。
【００３９】
本発明による、細胞学的材料を染色する方法は、従来の染色方法と比較して、細胞質に対する核の対比を高める。この方法は、細胞を、手動分析に適すると同時に、自動分析システムにおいて効率が高くなるように多色染色する。この方法は、細胞学的材料を、チオニン−フェノール染色する工程と、対比染色する工程と、染色された材料を照明する工程と、染色された細胞学的材料を撮像する工程とを含む。
【００４０】
ある実施形態において、細胞は、図６に示す方法によって染色される。細胞学的標本は、工程５５で、約１０％の塩溶液の塩浴に浸漬されるか、またはリンスされる。この溶液は、約５０％がアルコールで、アルコールは、２００プルーフであり、エタノール約９０％、イソプロパノール約５％、およびメタノール約５％からなる。工程６０は、チオニン−フェノール染色剤で細胞を染色する工程を含む。この染色剤は、約０．３％チオニン溶液であってもよい。工程６５は、細胞を第２の染色剤で対比染色する工程を含む。第２の染色剤は、チオニンを含み得る。
【００４１】
他の実施形態において、細胞は、図７に示す方法によって染色される。細胞学的標本は、工程５５で、約１０％の塩溶液の塩浴において浸漬されるか、またはリンスされる。次に、細胞は、工程７０で、アルコールにおいて浸漬されるか、またはリンスされる。工程６０は、細胞を、チオニン−フェノール染色剤で、染色する工程を含み、工程７５は、細胞をアルコールにおいて浸漬またはリンスする工程を含む。最終的に、工程６５は、細胞を第２の染色剤で染色する工程を含む。
【００４２】
本発明のある実施例によると、細胞は、図８に示す一般的な方法によって染色される。細胞は、工程８０で、スライドに固定され、工程８５で、アルコールおよび／または水浴においてリンスされ、工程５５で、塩浴においてリンスされ、工程７０で、アルコールにおいてリンスされ、工程６０で、チオニン−フェノール染色溶液で染色される。染色された細胞は、工程７５で、アルコール浴においてリンスされ、工程６５で、対比染色される。対比染色工程の後、染色された細胞は、工程９０で、アルコールにおいてリンスされ、工程９５において、キシレン、または市販されているキシレン代替物においてリンスされる。
【００４３】
図９に示すように、細胞は、まず、工程８０で、アルコールおよびワックスを用いて、あるいは当該技術において公知の他の方法で、スライドに固定される。その後、染色の準備において、工程８６で、スライドは、２つの浴のうちのそれぞれに、１０〜２０回浸漬される。２つの浴のうち、一方は、濃度が高く、分子量が低いアルコール、好ましくは、エタノールであり、他方は、アルコール浴または水浴である。次に、細胞は、工程５５で、約５〜約１５分、概して約１０分浸漬される。その後、細胞は、工程７０で、アルコール浴においてリンスされる。その後、細胞は、工程６０で、チオニン−フェノール染色溶液において、チオニン染料を核に組み込むために十分な時間、例えば、３〜約３０分の間、典型的には、約１０分の間、染色される。当業者であれば、染色時間は、いくつかの要素、例えば、細胞のタイプまたは用いあれる観察システムに適切な染色の所望の濃さを考慮に入れることによって決定され得ることを理解する。自動撮像システムは、概して、人間の視覚評価より濃い染色を必要とし、ある特定のタイプの細胞は、他の細胞よりも早く染色される。また、染色剤におけるチオニンの量も、染色時間に影響を及ぼし得る。チオニンの濃度がより低くなることによって、概して、染色時間がより長くなる。チオニン染色剤は、ほとんどの細胞に対して、わずかに酸性であり、典型的には、約６．７である。
【００４４】
工程７６で、細胞を、高濃度、低分子量の２〜３のアルコール浴のそれぞれに、１０〜２０回浸漬することによって、リンスし、その後、高濃度、低分子量アルコールの第３の浴に約５分間浸漬した後、工程６５で、細胞は、細胞質および核に染料を組み込むために十分な時間、例えば、約２〜約３０分間、概して、約４分間、対比染色される。当業者であれば、上述したように、染色時間が変動し得ることを認識する。また、対比染色は、浸漬する工程およびリンスする工程の間用いられたチオニンを補給するために十分な量のチオニンを含み、チオニン染色された核材料から、異なる波長で光を吸収するように選択される。染色工程および対比染色工程の後、工程９１で、スライドは、２〜４つの高濃度、低分子量アルコール浴に浸漬することによって、リンスされ、工程９６で、２つ以上のキシレン浴または市販のキシレン代替物に浸漬することによって、リンスされる。ここで、細胞は、分析される準備が整う。
【００４５】
可視光線の下で観察される場合、細胞の核は、透明から不透明であり、濃い青に染色される。細胞質は、透明で、用いられた対比染色剤に依存して、特定の色のパターンで、多色染色される。細胞がこのようにして染色される場合、色パターンは、細胞学者にとってよく知られているものであり、分析が、手動、すなわち、人間が見ることによって、容易に実行され得る。この方法は、撮像システムによって観察される場合、それぞれの核が透明であり、細胞質がほぼ見えないので、細胞質と核との間にはっきりとした対比があり、高解像度を提供するというさらなる利点がある。細胞質は、ほとんど見えず、上に重なる細胞は、核と混同され、正確な細胞の数は、容易に、手動またはコンピュータによって達成され得る。
【００４６】
次に、図１０および１１に示すように、本発明による光学機器照明システムのある目的は、細胞学的標本を顕微鏡スライド１５０に撮像するための高輝度狭帯域光線を提供することである。この目的は、高輝度ＬＥＤを、１つの別個のＬＥＤ、１つの別個のＬＥＤの組合せ、または、カスタムマルチチップＬＥＤモジュール構成１５２の形態で用いて実現される。ＬＥＤは、少量の熱を生成し、この熱により、出力波長がシフトされる前に駆動され得る時点の電流の量が制限され、結果としてこれらの装置が発する光の量が制限される。装置から出力される光を増大させるため、ＬＥＤは、撮像システム１６４のカメラ１５６と同期化されたパルス回路１６０と共に駆動され得、カメラに組み込む（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）期間の間、カメラに短い強いパルスの光を伝える。
【００４７】
ＬＥＤパルスは、例えば、方形波発生器１５８を用いて、カメラ／フレームグラバー１６２およびＬＥＤパルスドライバ１６０の両方をトリガする外部トリガを設けることによって、カメラフレームへの組み込みと同期化される。カメラ１５６は、トリガに対して、瞬時には応答しない。この遅延を補償するため、パルス駆動回路１６０は、システムを同期化させるために用いられるプログラマブル遅延を有する。他の同期化方法も、カメラのタイプおよび実際の実現例に依存して、可能である。
【００４８】
ＬＥＤは、本質的に、空間的に非均一な光の出力を生成し、いくつかの機械観察撮像適用例は、サンプルの合理的に均一な照明を必要とする。均一性が問題となる状況について、二種類のタイプの空間的に均一な照明を生成するシステム、すなわち、ケーラーおよび光ファイバシステムは、ＬＥＤとともに用いられ得る。これらのシステムのうち、いずれかにおいて用いられるＬＥＤは、近傍でパッケージされるか、または、マルチプルＬＥＤダイが、１つの基板上に組み込まれて、より高密度な構成を生成し得る。
【００４９】
ケーラー照明（図１０を参照）は、従来の顕微鏡照明において用いられる白熱ランプの空間的に非均一なフィラメントから顕微鏡スライド１５０の均一な照明を生成する標準的な技術である。検査することによって判定されるように、この技術は、ＬＥＤ源とともに採用される場合に、均一性を得ることにおいて等しく有効である。ＬＥＤ照明のこの実施形態において、個別のＬＥＤは、互いに近傍でパッケージングされ、従来のケーラー照明１５４内のランプフィラメントの一般的な位置に配置され、ケーラー照明について配置される。
【００５０】
均一性を得るための他の実施形態において、マルチプルＬＥＤは、大きいコア（５００〜６００μｍ）の光ファイバ１６６に、レンズまたは他の光学装置とともに結合される（図１１参照）。ファイバの長さは、ＬＥＤの空間の非均一性が、互いに混合され、ファイバ１６６から比較的均一な空間的出力が得られる用に選択される。実際には、ファイバ１６６の出力は、空間的プロファイルにおいて、ほぼガウス曲線である。ファイバ１６６は、顕微鏡スライド１５０から、出力の中央の比較的平坦な部分のみが用いられるように移動され得る。
【００５１】
マルチチップＬＥＤモジュール１５２が２つのＬＥＤを含む場合を考慮する。８度の全角広がりを有する２つの別個のＬＥＤは、両方のエミッタが直径４ｍｍにおさまるように、並列に配置される。レンズは、光を集め、両方のエミッタをファイバ１６０の６００μｍのコアに撮像する（図１２参照）。個々のＬＥＤのパッケージ直径は、典型的には、３〜５ｍｍのオーダーである。従って、標準的な別個のＬＥＤ上の重要でないプラスチックのパッケージングの一部を、２つの並列エミッタを４ｍｍの範囲内にするために除去することが必要となり得る。
【００５２】
個々のＬＥＤの代替例として、マルチプルＬＥＤダイ１６８が、１つの基板１７０上に配置され得る（図１３Ａおよび１３Ｂ参照）。個々のレンズ１７２が、各ダイ１６８上に配置されて、各ダイ１６８からの放射が、２πステラジアンに拡散するのではなく、狭いコーンに収集され得る。約１ｍｍの直径のマイクロレンズは、市販されている。１ｍｍのレンズの六角形パターンは、約１２個のＬＥＤダイ１６８を、直径約４ｍｍで、１つの基板１７０にパッケージし得る。例えば、高い熱伝導性を有する基板１７０が、マルチプルＬＥＤダイ１６８を保持するために用いられ得る。基板１７０上の導電性パターンは、ダイ１６８を、電気的接続のため、基板１７０にワイヤー結合するように用いられる。ダイ１６８は、ポリマー、例えば、エポキシで埋め込まれて、水分および他の要素から保護される。個別のマイクロレンズ１７２は、上面に配置されて、光を狭いコーンに集光する。
【００５３】
この概念の拡張は、異なる波長のＬＥＤを結合して、多重狭帯域波長帯を放射する光源を生成することからなる。この技術は、複数の波長で、顕微鏡スライド上の目的物、例えば、細胞学的標本を同時に照明する方法を提供する。さらに、出力帯域は、適切なＬＥＤを調節することによって、用途に対して調節され得る。各帯域からのエネルギーは、各波長について、必要に応じて、パルスされたものか、または連続的なものである、別個の駆動システムを採用することによって、調節され得る。
【００５４】
ある実施形態において、７個のＬＥＤのクラスタまたはアレイは、標準的な白熱顕微鏡照明の代わりに用いられる。ＬＥＤは、図１４Ａに示すように、方向付けされる。異なる空間的な方向付けが用いられて、２色を得ることができる。図１４Ｂに示すように、「Ｘ」が一方の色のＬＥＤを表し、「Ｏ」が他方の色のＬＥＤを表す、ＬＥＤのトリプレットが２つ設けられ得る。２つの波長は、一方が赤の細胞質において最適な核検出を可能にし、他方が緑の細胞質において最適な核検出を可能にするように選択される。図１４Ｃに示すように、第２の方向付けは、９個のＬＥＤのうち、４つが一方の色を照明し、５つが他方の色を照明することを可能にする。さらなる実施形態において、ＬＥＤアレイは、本質的に、２つの異なる色のＬＥＤの任意の組合せ、例えば、１つの赤色ＬＥＤと８つの緑色ＬＥＤとの組合せを含む。ＬＥＤの色と数との選択は、所望の明度、選択された波長でのカメラ応答、特定の放射角（例えば、３５度および６５度の放射角ＬＥＤなど）を有するＬＥＤの利用可能性に依存する。典型的な角度の範囲は、約２４〜約７２度である。赤色ＬＥＤは、染色された細胞質材料を、約６９０〜７５０ｎｍの波長を有する光源に露光させて、特定の染色剤が用いられたことを判定するために用いられ得る。波長約５００〜約６００ｎｍを有する緑色ＬＥＤは、撮像する細胞学的材料を照明するために用いられ得る。増加した照明で、増大した撮像応答時間が達成され得るので、複数の緑色ＬＥＤが望ましい。
【００５５】
図１５〜１７に、溶液中の染色剤の個々の成分の吸収スペクトルの様々な例を示す。グラフから２つのピークが明らかである。一方のピークは、赤色光に関連し、他方は、緑色光に関連する。概して、細胞学的材料を、緑色光と赤色光とが最小限に透過される波長、すなわち、２つのスペクトルピークの間に形成された谷における波長（この例においては、約５６８ｎｍ）で、撮像することが望ましい。
【００５６】
図１８は、典型的なスライド３００において見られるような状態の細胞学的材料の模式図である。各セル３０５は、核３１０と細胞質３１５とからなる。典型的な異常な核３２０も示されている。
【００５７】
図１９は、実験室設備における、撮像システムと、関連するコンポーネントの模式図である。全体システム２００は、観察する細胞学的材料のスライド１５０を用意するシステム２１０、細胞学的材料を撮像して、関係するデータを処理する画像装置／プロセッサ２２０、データを格納し、処理するコンピュータサーバ２３０、画像装置２２０によって収集されたデータに基づいてスライドを手動で観察する観察ステーション２４０を含み得る。
【００５８】
本発明のある好適な実施形態および例示的な実施形態について説明してきたが、当業者にとって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に開示した概念を含む他の実施形態が明らかである。説明した実施形態は、全ての局面において、例示的なものであり、限定するものではないと考えられる。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ、限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】    図１は、チオニン染料の特徴および仕様を表す図である。
【図２】  図２は、チオニン−フェノール染色剤を作製する一方法のフローチャートである。
【図３】  図３は、エオシンＹ染料の特徴および仕様を表す図である。
【図４】  図４は、ライトグリーンＳＦイエロー染料の特徴および仕様を表す図である。
【図５】  図５は、対比染色剤を作製する、一方法のフローチャートである。
【図６】  図６は、細胞学的材料を染色する、一方法のフローチャートである。
【図７】  図７は、細胞学的材料を染色する、他の方法のフローチャートである。
【図８】  図８は、細胞学的材料を染色する、他の方法のフローチャートである。
【図９】  図９は、細胞学的材料を染色する、他の方法のフローチャートである。
【図１０】  図１０は、ＬＥＤファイバ照明システムの模式図である。
【図１１】  図１１は、ＬＥＤケーラー照明システムの模式図である。
【図１２】  図１２は、２つのＬＥＤを光ファイバケーブルに結合する光学系の模式図である。
【図１３Ａ】  図１３Ａは、ＬＥＤマルチチップモジュールの模式的な平面図である。
【図１３Ｂ】  図１３Ｂは、ＬＥＤマルチチップモジュールの模式的な側面図である。
【図１４Ａ】  図１４Ａは、ＬＥＤクラスタのある実施形態の模式図である。
【図１４Ｂ】  図１４Ｂは、ＬＥＤクラスタの別の実施形態の模式図である。
【図１４Ｃ】  図１４Ｃは、ＬＥＤクラスタのさらに別の実施形態の模式図である。
【図１５】  図１５は、溶液中の染色剤の個々の成分の吸収スペクトルの一例を表すグラフである。
【図１６】  図１６は、溶液中の染色剤の個々の成分の吸収スペクトルの別の例を表すグラフである。
【図１７】  図１７は、溶液中の染色剤の個々の成分の吸収スペクトルのさらに別の例を表すグラフである。
【図１８】  図１８は、細胞学的材料の模式図である。
【図１９】  図１９は、撮像システムおよび実験室環境において協働するコンポーネントの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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