(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法であって、
気化したヨウ素を、過酸化水素の存在下で、タンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製するか、あるいは気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させ、次いで気化したヨウ素を作用させたタンパク質結晶を過酸化水素の存在下に置くことで重原子誘導体を作製することを特徴とする方法。
【請求項２】
ヨウ素をヨウ素含有水溶液から気化させる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ヨウ素を固体ヨウ素から気化させる請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
タンパク質結晶の重原子誘導体化の程度を、タンパク質結晶の気化ヨウ素による着色の程度で評価する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヨウ素を用いる重原子誘導体の製造方法、この製造方法により得られた重原子誘導体を用いる位相情報の収集方法、さらに、この方法により収集された位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、各種生物のＤＮＡの塩基配列が急速に明らかにされ、ゲノム配列情報から遺伝子の塩基配列が明らかにされている。そして、各遺伝子でコードされたタンパク質の立体構造を体系的に解明し、構造と機能の関係を明確にしようとする試みがなされている。タンパク質のような生体高分子の立体構造（三次元構造）は、生体高分子を結晶化し、Ｘ線回折試験に付すことにより解析される。【０００３】
タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法として、タンパク質の重原子誘導体を作製し、この重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、位相情報を収集し、この位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定することが行われている。【０００４】
タンパク質の重原子誘導体の作製には、白金、水銀、金などの重原子化合物溶液にタンパク質結晶を浸積（ソーキング）する方法が一般的である（特開２００２−２６２８６７号公報、特許文献１）。しかし、どの種類の重原子化合物がタンパク質結晶中に効果的に結合するかは、重原子試薬の種類、濃度、時間などのパラメーターを変化させつつ、基本的には試行錯誤するしかない。【０００５】
また、重原子化合物としてヨウ素を用いる方法も知られている（Acta Cryst.(2002). D58, 976-991、非特許文献1）。ヨウ素を用いる方法では、ヨウ素溶液をタンパク質結晶に直接加えることにより、ヨウ素ラベルされた結晶を作製することは行われてきた。しかし、ヨウ素（ヨウ化カリウムKIと固体ヨウ素I2の水溶液）はタンパク質に対して非常に反応性が高く、ヨウ素溶液を加えた瞬間にタンパク質結晶が崩壊して、その後の解析に使えなくなる傾向があった。【０００６】
上記方法では、崩壊を防ぐために、ヨウ素溶液の濃度を薄くすること、あるいは、加える量を少なくすることなどは、効果がある。しかし、ヨウ素溶液を加えて結晶に導入されるヨウ素は、主にI3-やI5-またはIn-等の分子構造をとっており、分子体積が大きい状態にあり、結晶浸透時に結晶にダメージを与え易い傾向があった。また、ポリヨウ素分子イオンは鎖状分子構造をとっているが、この状態で結晶中に結合した異常分散因子は、位相計算の際に温度因子が大きくなりやすく、十分な位相情報を与えにくいという更に本質的な欠点を持つ。【０００７】
このような状況下、本発明者らは、簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得る方法、及びこの方法を用いて作製したタンパク質結晶の重原子誘導体を用いた、位相情報の収集方法及びタンパク質結晶の三次元構造決定方法を提供するために種々検討した。その結果、タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法において、気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製することで、簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得ることを見いだし、さらに、この方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集すること、さらには、収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定することができることを見いだし、先に特許出願した(特願2004-118333号(特開２００５−２９８４２６号公報参照))。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許出願した方法は、ヨウ素の蒸気拡散する性質を利用したタンパク質結晶のヨウ素ラベル化方法である。この方法では、ヨウ素がタンパク質結晶中に浸透するとタンパク質分子中のチロシンとヨウ素原子が共有結合するために、ヨウ素の置換率が上がりやすく、また、結晶に対するダメージも少ないなどの特徴を持つ。しかし、タンパク質結晶の種類によっては、Ｘ線結晶構造解析に十分なヨウ素ラベル化反応が進行しない場合もあった。【０００９】
そこで本発明の目的は、簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得る方法であって、タンパク質結晶の種類によらずより高い確率で重原子誘導体を作製し得る方法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、この方法を用いて作製したタンパク質結晶の重原子誘導体を用いた、位相情報の収集方法及びタンパク質結晶の三次元構造決定方法を提供することにある。【００１０】
［１］タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法であって、
気化したヨウ素を、過酸化水素の存在下で、タンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製するか、あるいは気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させ、次いで気化したヨウ素を作用させたタンパク質結晶を過酸化水素の存在下に置くことで重原子誘導体を作製することを特徴とする方法。
［２］ヨウ素をヨウ素含有水溶液から気化させる[１]に記載の製造方法。
［３］ヨウ素を固体ヨウ素から気化させる[１]に記載の製造方法。
［４］タンパク質結晶の重原子誘導体化の程度を、タンパク質結晶の気化ヨウ素による着色の程度で評価する[１]〜[３]のいずれかに記載の製造方法。
［５］[１]〜[４]のいずれかに記載の方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法。
［６］[５]に記載の方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヨウ素溶液（またはヨウ素固体）中からヨウ素分子気化する性質を利用し、かつその作用を過酸化水素により増強することにより、非常に高い確率で効果的な重原子誘導体を作製することができる。そして、この方法で作製した重原子誘導体を用いることで、 単一波長異常分散法 (SAD法)、多波長異常分散法 (MAD法)、多重同型置換法 (MIR法)等の方法による、結晶構造解析に費やす時間を大幅に短縮化することができる。【００１２】
目的とするタンパク質結晶が沈殿剤由来の低分子結晶か判断つかないことがあるが、原則として低分子結晶にはヨウ素は浸透しない。従って、Ｘ線回折実験を行う前に、着色の有無により、タンパク質結晶であるか否かを判断することができる。【００１３】
ヨウ素溶液を直接タンパク質結晶に加える方法と異なり、本発明の方法では、過酸化水素の存在下で、ヨウ素溶液をタンパク質結晶の近傍に置くだけであるので、充分なヨウ素が導入された判断された段階でヨウ素溶液を取り除くことにより、ヨウ素の導入を停止することができ、過剰量のヨウ素が導入されて結晶が崩壊する危険を回避することができる。また、ヨウ素の導入が不足していると判断された場合は、再度、ヨウ素溶液をタンパク質結晶の近傍に配置し、ヨウ素の導入を再度行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法では、従来法であるヨウ素溶液を直接結晶に加える方法と異なり、ヨウ素が２原子分子であるI2の状態で結晶中に導入されるため温度因子が上がりにくく、位相計算の際に十分な位相情報が得られる確率が高くなる。また、I2は気化によって結晶に導入されるため、ヨウ素溶液の濃度、分量、周囲の温度等のパラメーターを変化させることによって自由に結合速度を調節して、結晶へのダメージを最小化することが容易に可能である。また、ヨウ素が結晶に結合した割合を、ヨウ素置換に伴って徐々に結晶が無色→黄色→茶色に変色していく現象を利用して、容易に追跡することが可能であることも、本発明の方法の大きな特徴である。【００１５】
[タンパク質結晶の重原子誘導体作製方法]
本発明のタンパク質結晶の重原子誘導体作製方法は、タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法であって、気化したヨウ素を、過酸化水素の存在下で、タンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製するか、あるいは気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させ、次いで気化したヨウ素を作用させたタンパク質結晶を過酸化水素の存在下に置くことで重原子誘導体を作製することを特徴とする。本発明の方法において重原子誘導体を作製する対象となるタンパク質結晶は、特に限定されず、どのようなタンパク質結晶にも適用できる。【００１６】
本発明の方法は結晶に対して、重原子誘導体作製時に通常見られるような浸透圧変化に伴う物理的な衝撃をほとんど与えないために、適用可能な結晶の種類は、通常の可溶性タンパク質結晶は勿論のこと、膜タンパク質や、超分子複合体結晶、あるいはウイルス結晶などの、浸透圧変化に対して脆弱な結晶にも適用できる。【００１７】
本発明の作製方法において、ヨウ素はヨウ素含有水溶液から気化させて、タンパク質結晶にヨウ素を作用させることができる。ヨウ素含有水溶液は、例えば、KI/I2溶液であることができ、KI及びI2の濃度は、例えば、結晶の気化ヨウ素に対する感受性に応じて、例えば、数μ(micor) M(マイクロモル/リットル)〜数M (モル/リットル)とすることができる。また、ヨウ素含有水溶液は、例えば、上記KIの代わりに、ヨウ化ナトリウムNaIを用いることもできる。【００１８】
ヨウ素を、ヨウ素含有水溶液から気化させる場合、温度は、結晶の気化ヨウ素に対する感受性に応じて、０℃〜３０℃とすることができる。温度が高い方が結合は早く有利であり、２０〜３０℃の範囲であることが好ましい。時間は、数分〜数日とすることができる。置換の程度は、結晶の黄色あるいは茶色の着色により見積りが可能である。【００１９】
本発明の作製方法において、ヨウ素は固体ヨウ素から気化させて、タンパク質結晶にヨウ素を作用させることができる。固体ヨウ素を用いる場合、ヨウ素含有水溶液を用いる場合に比べて、ヨウ素の気化（昇華）速度が速い。固体ヨウ素量を数マイクログラムに抑えるなどして、固体ヨウ素からの気化（昇華）速度は、適宜調整することができる。尚、ヨウ素の気化速度は、一般には、溶液を用いた方がコントロールしやすい場合が多い。ヨウ素を固体ヨウ素から気化（昇華）させる場合には、温度は０℃〜室温とすることができる。時間は、数分から、数日とすることができる。【００２０】
タンパク質結晶の重原子誘導体化の程度は、タンパク質結晶の気化ヨウ素による着色の程度で評価することができる。【００２１】
本発明によるタンパク質結晶の重原子誘導体の作製方法は、例えば、タンパク質結晶と、ヨウ素含有水溶液及び/または固体ヨウ素、並びに過酸化水素を密閉系中に共存させることで行うことができる。あるいは、例えば、タンパク質結晶と、ヨウ素含有水溶液及び/または固体ヨウ素を密閉系中に共存させて気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させ、次いで気化したヨウ素を作用させたタンパク質結晶を過酸化水素の存在下に置くことで重原子誘導体を作製する。【００２２】
ヨウ素溶液の量、濃度などは、あらかじめ予備実験で密閉空間に１マイクロリットルほどのヨウ素溶液を結晶と共存させ、結晶が直ちに崩壊しない程度のヨウ素溶液濃度を見積もっておくことができる。例えば、1M(モル/リットル)で直ちに崩壊する場合には、0.1Mに希釈するなどして、適宜調整できる。結晶のヨウ素との親和性、重原子誘導体の形成のし易さ、ヨウ素との反応による崩壊が起きるヨウ素濃度等は、タンパク質の種類により異なるので、ヨウ素含有水溶液及び/または固体ヨウ素の密閉系中への共存量等は、タンパク質結晶ごとに適宜決定する。【００２３】
例えば、KI/I2溶液を結晶化ウエル中に同封すると、時間経過に伴って、ウエル内でヨウ素分子I2が昇華し、結晶に浸透する。ヨウ素の置換率は、結晶が徐々に赤茶色を呈してくるので、その濃さで概算可能である。結晶中には次亜ヨウ素酸(HOI-)が生成し、主にタンパク質中のチロシンと共有結合する。その際、過酸化水素を封入すると、H2O2がウエル中に 蒸気拡散し、結晶中のI+と反応して、より多くの次亜ヨウ素酸(HOI-)を生成するため、チロシンのヨウ素化反応がより多く進行する。例えば、サウマチン結晶に対して過酸化水素を適用したところ、チロシン残基のヨウ素化サイトは４から９に増加した。【００２４】
過酸化水素は、KI/I2溶液を設置した密閉系内に過酸化水素水を満たした容器を設置することで、密閉系内に供給することができる。例えば、図1に示すように、密閉容器内に、KI/I2溶液とヨウ素ドロップを共存させ、さらには、過酸化水素水を配置することで、本発明の方法を実施できる。あるいは、図2に示すように、密閉容器内でタンパク質結晶にKI/I2溶液及びヨウ素ドロップを共存させ(A〜D)、気化ヨウ素を作用させた後に、過酸化水素ドロップを密閉容器内に設置して過酸化水素を作用させることもできる(E〜F)。【００２５】
本発明の方法で使用する過酸化水素水の濃度は特に制限はなく、通常は３０％過酸化水素水をそのまま使用することができる。ただし、場合によっては、過酸化水素によって、結晶が劣化する（結晶性が低下する）ことがあり、そのような場合は、過酸化水素水の濃度を低くしたり（例えば、１〜３０％の範囲で）、あるいは過酸化水素水の使用量を少なくしたりして、調整することができる。過酸化水素水の使用量は、通常は、３０％過酸化水素水の場合１μｌ程度であるが、これを例えば、０．１〜１μｌの範囲で適宜変更することができる。【００２６】
(ヨウ素誘導体結晶作製法)
図2に本発明の方法によるヨウ素誘導体結晶作製法の概略図を示す。
A: 目的結晶は予めハンギングドロップ蒸気拡散法によって調製される。
B: カバーガラスを結晶化ウエルから剥離、反転させ、少量( 例えば、0.1〜1.0 μl) のヨウ素ドロップ (例えば、250 mg KI + 135 mg I2 /1 ml 水の混合比により調製)をカバーガラス上にて結晶化ドロップの近傍に置く。
C: カバーガラスを再び結晶化ウエルに密着させると、ヨウ素ドロップから結晶化ウエル中に気化ヨウ素が充満し、気化ヨウ素が徐々に結晶化ドロップ中に浸透する。
D: しばらくすると（30分〜数日）、目的結晶は茶色に着色し、ヨウ素が結晶中に浸透したことが分かる。更に時間が経過すると、結晶中でヨウ素がタンパク質分子と反応した結果、茶色が薄い黄色に、あるいは完全に無色になる場合もある。
E: 更に、結晶化ブリッジ上に30% 過酸化水素を少量 (1〜2 μl)程度のせ、結晶化ウエル中に密閉すると、ただちに過酸化水素蒸気が結晶化ウエル中に充満し、結晶化ドロップ中に徐々に浸透する。
F: その結果、結晶化ドロップ中に於いて化学反応が進行し、次亜ヨウ素酸（HOI-）がより多く生成し、目的タンパク質のチロシン残基がより多くヨウ素化される。【００２７】
(位相情報収集方法)
本発明は、上記本発明の方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法を包含する。【００２８】
重原子誘導体のＸ線回折試験及びＸ線回折試験からの位相情報の収集は、常法により行うことができる。例えば、重原子誘導体からのＸ線回折試験及びＸ線回折試験からの位相情報の収集は、ヨウ素の異状分散効果が高まる、長波長領域のＸ線を用いると位相情報が格段に得られやすくなる。例えば、（株）理学電機社製Cr-Kα回転陰極型高輝度Ｘ線発生装置から得られる、2.2908オングストロームのＸ線を用いる。検出器は２次元のものが適しており、例えば、(株)理学電機社製R-AXIS IVなどのイメージングプレートタイプのものを用いて回折点を測定する。【００２９】
(タンパク質結晶の三次元構造決定方法)
本発明は、上記本発明の方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法を包含する。位相情報に基づいたタンパク質結晶の三次元構造の決定方法は、常法により行うことができる。例えば、SHELXDやSnB、SOLVEなどの、ヨウ素位置を決定するプログラムを用いて初期ヨウ素位置を決定し、autoSHARPなどの位相計算プログラムにそれらの位置を入力して計算することにより、電子密度図を得ることができ、分子構造を決定することができる。【００３０】
タンパク質結晶の位相決定方法としては、例えば、SAD法（single-wavelength anomalous diffraction: 単一波長異常分散法）及びSIRAS法（single isomorphous replacement anomalous scattering法）を挙げることができる。但し、これらの方法に限定される意図ではない。【００３１】
SAD法は、重原子誘導体からのデータだけで位相を決定する方法である。SAD法では、重原子誘導体化していないネイティブ結晶のデータは必要ない。SAD法では、回折データから重原子由来の異常分散項を抽出し、擬似的にネイティブ結晶のデータと重原子誘導データに分解して両者を比較することにより位相情報を計算する。そのため、重原子誘導体からの異常分散効果がかなり大きく、また、実験精度も高い場合に良好な結果が得られる方法である。ヨウ素は長いＸ線波長（> 1.5 オングストローム）で特に強い異常分散効果を発生するために、本発明ではヨウ素化したサウマチン、リゾチウムを 1.542オングストロームのＸ線（Cr-Kα Ｘ線）で回折データを収集することにより十分な位相情報を得た。しかし、トリプシンについては、SAD法では十分な位相情報を得ることができなかった。【００３２】
一方、SIRAS法は、ネイティブ結晶のデータも収集して、重原子誘導体のデータと比較して位相情報を得る方法である。SIRAS法では、SAD法よりも弱い異常分散効果から位相情報が得られる場合が多い。本発明分では、SIRAS法によりトリプシンの位相決定に成功した。但し、ネイティブ結晶のデータを測定する手間がかかることと、ネイティブ結晶のデータと重原子誘導体の同型性（格子定数や、結晶内の分子の形が細部まで同じであること）が保たれた状態で測定することに留意しなければならない。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例
１） テスト結晶の調製
Thaumatococuus deniellii由来の乾燥粉末サウマチン、ウシ由来トリプシンそして鶏卵卵白リゾチウムはシグマ社から購入した。液体状キシラナーゼおよびグルコースイソメラーゼ試料は、ハンプトンリサーチ社から購入した。これらのテスト結晶は、それぞれハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、293 K（20 ℃）の温度下、1-2 μlのタンパク質溶液と等量の沈殿剤溶液を混合し、24穴プレート中に入れられた500μlの沈殿剤溶液に対して平衡化することにより調製した。それぞれの試験タンパク質の性質および結晶化条件は表1にまとめた。【００３４】
【表１】
0004847457.tif 000002
【００３５】
２）−１  ヨウ素ストック溶液
固体ヨウ素（I2）の溶解度を向上させるために、250 mgのヨウ化カリウム（KI）を1 mlの水（H2O）に溶解し、その後135 mgの固体ヨウ素（I2）を溶解した。結果として得られたヨウ素ストック溶液は、ヨウ化カリウム（KI）濃度がおよそ0.67M、固体ヨウ素（I2）濃度がおよそ0.47Ｍである。ヨウ素ストック溶液中の主な成分は、I2および三ヨウ素酸（I3-）であるが、VIL過程においては、I2成分のみがKI/I2ドロップから目的結晶に蒸気拡散することに注意を要する。ヨウ素ストック溶液は、10 μlずつ小さなチューブに小分し、243 K（-30 ℃）で保存した。ヨウ素化実験を行う際に、必要な分量だけ室温で溶解して用いた。【００３６】
２）−２  テスト結晶のヨウ素化
正方晶系に属する、サウマチン結晶に本発明の方法を適用した例を図２(A)-(F)に示す。サウマチン結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法で調製した（図2(A)）。0.2 μlの小さなKI/I2溶液ドロップを、カバーガラス上の結晶化ドロップの近傍に置いた（図2(B)）。そして、カバーガラスを再びひっくり返し、それで結晶化ウエルを密閉した（図2(C)）。すると、直ちにI2分子が結晶化ウエル中に広がり、結晶化ドロップ中に浸透した（図2(C)）。結晶化ドロップ中のサウマチン結晶は直ちに黄色を帯び始め、最後には結晶の外観に目だった損傷なく茶に着色した（図2(D)）。このサウマチンのヨウ素の場合は、ヨウ素によるインキュベーション時間（図1(D)）は、293 Kで0.5時間である。サウマチンのヨウ素化をより進めるために、過酸化水素をさらに適用した（図2(E)-(F)）。カバーガラス上からヨウ素ドロップを取り除いた後、少量（1 μl）の過酸化水素（H2O2）ドロップを0.5時間結晶化ウエル中に封入した（図2(E)）。すると、すぐに過酸化水素ガスが結晶化ウエル中に充満し、同様に結晶化ドロップ中に浸透した。その結果、結晶中でヨウ素化反応が促進した。ヨウ素化反応の副反応として、酸素（O2）ガスの発生が観察された（図2(F)）。他のテスト結晶のヨウ素化反応は、上記と同様の過程により、それぞれ異なるインキュベーション時間、インキュベーション温度を適用しながら行った。各テストタンパク質のヨウ素化条件を表2に示す。【００３７】
【表２】
0004847457.tif 000003
【００３８】
［結果］
３）−１  サウマチン
図3に本発明の方法(過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法: Hydrogen Peroxide Vaporizing Iodine Labeling (HYPER-VIL))でヨウ素ラベルしたサウマチン分子図(B)と、過酸化水素水を用いない方法(蒸気拡散ヨウ素ラベル法:VIL) でヨウ素ラベルしたサウマチン分子図(A)を示す。【００３９】
図3Aでは、Y57とY169のオルソ位はそれぞれ１カ所ヨウ素化されており、また、フリーなヨウ素イオンは３個（I1-I3）分子表面にイオン結合している。それに対して、図3B(過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法によってヨウ素化されたサウマチン分子図)では、Y11, Y57, Y95, Y99のオルソ位がすべて２重にヨウ素化され、Y169は１カ所ヨウ素化された。さらに、フリーなヨウ素イオン(I1-I5)は５個に増加し、5つのヨウ素酸イオン（I-）I1、I2、I4、I5、I6が分子表面に結合していた。大幅にヨウ素化ラベル反応が進行したことが分かる。【００４０】
その結果、Cu-KαＸ線を用いて収集した、過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法ではサウマチン回折データから得られた位相決定能(phasing power)は、蒸気拡散ヨウ素ラベル法-サウマチンよりも大きく、そのために自動分子構築プログラムArp/wArpによって、側鎖も含めて２０４残基を自動構築することができた。この結果は、目的結晶が過酸化水素の曝露に耐性がある場合には、過酸化水素はヨウ素ラベル反応を促進させることができることを示している。【００４１】
３）−２  トリプシン
トリプシン（２１９残基からなる）は、蒸気拡散ヨウ素ラベル法を303Kの温度下、20時間適用してもヨウ素化されなかった。そのため、ヨウ素化を促進させる目的で、303Kの温度で、さらに過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法が用いられた。その結果、チロシン４８とチロシン１３７が1重にヨウ素化され、チロシン１７１は2重にヨウ素化された（図４）。2つのヨウ素酸イオン（I1、I2）が分子表面に水素結合および疎水結合によって結合していた。しかし、SAD法による位相決定は成功しなかった。そこで、トリプシンの未ラベル結晶の回折データをさらに追加し、SIRAS法によって位相計算を行ったところ、219残基すべてを自動構築することができた。この結果は、VIL法やHYPER-VIL法は、SAD法による位相決定に対してのみ有効なのではなく、同様にSIRAS法、MIRAS法にも有効であることを示している。【００４２】
３）−３  リゾチウム
リゾチウム結晶は、蒸気拡散ヨウ素ラベル法ではヨウ素化しなかった。そこで、過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法が採用された。しかし、VIL法に引き続いてHPER-VIL法を適用すると、6時間程で結晶が溶解してしまった。そこで、HYPER-VIL法の適用は3時間にとどめた。すると、チロシン残基は依然としてヨウ素化されなかったが（これはおそらく、チロシン残基が分子表面の、ヨウ素イオンまたはヨウ素分子が接近できない部分に位置しているからであろう）、２つのヨウ素イオン（I1、I2）が分子表面に結合していた（図５）。この結晶から得られた回折データにより、解釈可能な電子密度図が得られ、自動分子構築によって８６残基が構築された。EvansとBricognueの報告（(2002) Acta Cryst. D58, 976-991）によると、KI/I2溶液にリゾチウム結晶をソーキングすることによっても、過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法リゾチウムと同じ位置にヨウ素イオンが結合することが示されている（PDB ID: 1gwd）。しかし、この場合2つのヨウ素イオンの占有率は0.36と0.23であり、それぞれの位置に対応するHYPER-VILリゾチウムのヨウ素イオンの占有率は、0.82と0.5であり、大幅に高い。これは、VIL法やHYPER-VIL法では、従来のソーキング法と比較して、多くの場合、より高い占有率が得られるという今までの結果と一致した結果である。この結果は、同様に、目的タンパク質内にヨウ素が接近することのできるチロシンが存在しない場合でも、（ヨウ素酸が結合することによって）、有効なヨウ素化結晶を調製できる場合があることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得る方法を提供する。さらに本発明は、この方法を用いて作製したタンパク質結晶の重原子誘導体を用いた位相情報の収集方法及びタンパク質結晶の三次元構造決定方法を提供する。これら方法により、タンパク質結晶の三次元構造決定が従来に比して容易かつ確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の方法による気化ヨウ素及び過酸化水素を用いた誘導体結晶作製法の一実施態様の概略説明図。
【図２】本発明の方法による気化ヨウ素及び過酸化水素を用いた誘導体結晶作製法の一実施態様の概略説明図。
【図３】本発明の方法(過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法)でヨウ素ラベルしたサウマチン分子図(B)と、過酸化水素水を用いない方法(蒸気拡散ヨウ素ラベル法) でヨウ素ラベルしたサウマチン分子図(A)。
【図４】本発明の方法(過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法)でヨウ素ラベルしたトリプシン分子図。
【図５】本発明の方法(過酸化水素蒸気拡散ヨウ素ラベル法)でヨウ素ラベルしたリゾチウム分子図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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