(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な物質を患者の体の選択された部位に送達するための配合物であって、
前記患者の循環の中に注入され、封じ込められた生理学的に許容されるガスを運ぶミクロスフェアと前記生物学的に活性な物質を充填したリポソームの小胞とをキャリヤー液中に懸濁液として含む有効量の投与可能な配合物を含み、
前記配合物は、前記患者の循環を通して選択された部位に到達され、そして
キャリヤー液中でミクロスフェアの破裂および封じ込められたガスの膨張を引き起こし、前記ガスの膨張エネルギーがリポソームの小胞の開封および前記部位での生物学的に活性な物質の放出を引き起こすように前記部位が超音波で照射され、
該リポソームの小胞と該ガスを充填したミクロスフェアとが互いに親和力を有するように構成される、前記配合物。
【請求項２】
ミクロスフェアを０．３から３ＭＨｚの周波数を有する超音波パルスの照射により破裂させる、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
超音波パルスが、反響信号を同時に監視するように改造された標準型または改変型超音波検査用プローブにより供給され、それにより照射された部位の影像を供給される、請求項２に記載の配合物。
【請求項４】
キャリヤー液中に生物学的に活性な物質で充填されたリポソームの水性懸濁液を含む、患者の器官の中の選択された標的部位に前記活性物質を送達するための配合物であって、前記配合物がさらに生理学的に許容されるガスまたは空気を充填されたミクロスフェアを含むことを特徴とし、該リポソームの小胞と該ガスまたは空気を充填したミクロスフェアとが互いに親和力を有するように構成される、前記配合物。
【請求項５】
ミクロスフェアが、液体／ガスの界面により境界を接するミクロバブルまたは実体的な膜により境界を接するミクロバルーンである、請求項４に記載の配合物。
【請求項６】
キャリヤー液が、早過ぎる崩壊に抗してガス含有ミクロスフェアを安定化させるために両親媒性の化合物を含む、請求項４に記載の配合物。
【請求項７】
両親媒性の化合物がホスホリピドである、請求項６に記載の配合物。
【請求項８】
前記両親媒性の化合物が、飽和ホスホリピドである、請求項７に記載の配合物。
【請求項９】
ミクロバブルの安定化が、ガス／液体の界面で単層のホスホリピドによりもたらされる、請求項７または８に記載の配合物。
【請求項１０】
ミクロバルーンの膜が天然または合成ポリマーから作成される、請求項５に記載の配合物。
【請求項１１】
ミクロスフェア中のガスが、ＳＦ6 、ＣＦ4 、Ｃ2Ｆ6 、Ｃ3Ｆ6 、Ｃ3Ｆ8 、Ｃ4Ｆ6 、Ｃ4Ｆ8 、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ10、Ｃ5Ｆ12、Ｃ6Ｆ14、空気、酸素、窒素、二酸化炭素、貴ガス類、およびその混合物から選択される、請求項４に記載の配合物。
【請求項１２】
ホスホリピドが、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイル、ジステアロイル、およびジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＡＰＣ）から選ばれる中性のホスホリピド；ジパルミトイルおよびジステアロイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルおよびジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳ）、およびジパルミトイルおよびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ）から選ばれる負に帯電したホスホリピド；並びに、ポリエチレングリコール、ビオチニル、グルタリル、カプロイル、またはスクシニルアミンと結合したホスファチジルエタノールアミン誘導体から選ばれる反応性ホスホリピド、から選択される、請求項７または８に記載の配合物。
【請求項１３】
リポソームの小胞とミクロスフェアの各々が、複合ペアーのそれぞれの成分を備え、該ペアーが、抗原と抗体とからなり、あるいはムスカリン受容体および基質、ドーパミン受容体および基質、並びにベンゾジアゼピン受容体および基質からなる群より選ばれるドナーと受容体とからなる、請求項１または４に記載の配合物。
【請求項１４】
抗原と抗体の複合がリポソームの小胞とミクロスフェアとを寄せ集めることになるように、抗原がリポソーム膜の中に存在し、抗体がミクロスフェアの中に存在するか、または抗原がミクロスフェアの中に存在し、抗体がリポソーム膜の中に存在する、請求項１３に記載の配合物。
【請求項１５】
前記ミクロスフェアおよび前記リポソームの小胞の無菌の別個の形態で前駆体成分を含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の配合物を提供するためのキットであって、
該前駆体成分が、
（ａ）生物活性物質をカプセル化したリポソームの懸濁液と、
（ｂ）生理学的に許容される空気またはガスを含有するミクロスフェアのキャリヤー液中の懸濁液
とである、前記キット。
【請求項１６】
前記ミクロスフェアおよび前記リポソームの小胞の無菌の別個の形態で前駆体成分を含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の配合物を提供するためのキットであって、
該前駆体成分が、
（ａ）安定化した粉末の形態でその中にカプセル化された生物活性物質を有する乾燥したリポソームの粉末と、
（ｂ）生理学的に許容される空気またはガスを含有するミクロスフェアのキャリヤー液中の懸濁液
とである、前記キット。
【請求項１７】
前記ミクロスフェアおよび前記リポソームの小胞の無菌の別個の形態で前駆体成分を含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の配合物を提供するためのキットであって、
該前駆体成分が、
（ａ）安定化した粉末の形態でその中にカプセル化された生物活性物質を有する乾燥したリポソームの粉末と、
（ｂ）乾燥した粉末の形態のガス充填ミクロバルーン、あるいは空気または生理学的に許容されるガスと接触させて貯蔵された微粉で薄片状の飽和ホスホリピドとしてのミクロバブル前駆体、および水溶性安定剤と、
（ｃ）投与可能な水性キャリヤー液
とである、前記キット。
【請求項１８】
リポソームが、天然または合成の脂質および／または水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、リソリン酸エステル、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびコレステロールから選択されたホスホリピドから作成される、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
ミクロスフェア中のガスが、ＳＦ6 、ＣＦ4 、Ｃ2 Ｆ6 、Ｃ3 Ｆ6 、Ｃ3 Ｆ8 、Ｃ4 Ｆ6 、Ｃ4 Ｆ8 、Ｃ4 Ｆ10、Ｃ5 Ｆ10、Ｃ5 Ｆ12、Ｃ6 Ｆ14、空気、酸素、窒素、二酸化炭素、貴ガス類、およびその混合物から選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
治療の処置または遺伝子治療および／または患者の器官または組織の画像化に用いる、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の配合物。
【請求項２１】
治療の処置または遺伝子治療および／または患者の器官または組織の画像化に用いる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物学的に活性な物質または媒質を患者の体の選択された部位、例えば器官または組織に投与および制御可能に送達するための方法、および組成物あるいは配合物に関する。配合物は、その中にカプセル化した薬剤または診断用薬などの活性な物質を運ぶリポソームの経口摂取可能なまたは注射可能な水性の懸濁液を含む。また、配合物はキットの形で入手可能であり、キットには無菌の前駆体成分が含まれる。
【０００２】
（背景技術）
器官の選択域へ向けた治療用または診断用物質などの生物学的に活性な媒質をカプセル化したリポソームの循環を通しての標的化した送達は、それを助ける特定の部位における前記物質の放出と組み合わされて医学分野で多くの注目を集めている。例えば、Ｎ．Ｓｈｏｕｃｈｅｎｇ等の論文、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．」２９（１９９４）、８２７〜８３４には、実験動物の循環中にドキソルビシンを含有する長命のリポソーム（ステルス性）を注入し、その後標的に合わせた超音波エネルギーにより生ずる局部的過温を介して体の中の選択された部位でドキソルビシンの制御された放出を誘発させることが開示されている。同様に、Ｂｅｄｍａｒｋｉ等の論文、「Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ」２０４（１９９７）、２６３〜２６８には、体の中の特定領域に向けて薬物を組み込んだリポソームの小胞を磁気共鳴で誘導するターゲッティング法と、その後に続く前記薬剤の組織中への超音波制御による放出が開示されており、その作用はリポソーム膜の過温崩壊によるものである。
【０００３】
国際特許出願公開第ＷＯ９４／２８８７３号および第ＷＯ９６／３９０７９号には、リポソームの２層の膜壁内に埋め込まれた薬剤を含む注射可能な標的用のガス充填ミクロスフェア、例えばガス充填リポソームを特定の器官に誘導し、そこで前記埋め込まれた薬用物質を放出させるためにそれを超音波の照射により破裂させる技術が開示されている。ガス充填リポソームの中に薬剤を組み込む（すなわち、気相または表面膜で）ことは、安定性に影響することなしには困難である。たとえ薬剤をこの種の小胞中に装填することができたとしても、それは疎水性であるに違いなく、有効装填量はきわめて低いはずである。したがって、この方法はきわめて限られた実用的用途しかもたない。また、破裂後、治療用物質はそれらが埋め込まれていた壊れたリポソーム膜の成分にしばらくくっつく可能性があるため、あるいはリポソーム膜の破片が簡単に血流により「洗い流され」て、活性物質が標的部位で放出されずにどこか違った場所で放出される可能性がある。
【０００４】
国際特許出願公開第ＷＯ９３／２５２４１号には、ミクロスフェアの懸濁液を体の器官の標的に向かわせ、超音波エネルギーによる刺激で崩壊させ、それにより広帯域の音響信号パルスを発生させ、カラー・ドップラーシステムにより反響を検知する超音波画像技術が開示されている。
この従来技術の技法には長所もあるが、リポソームの膜を破壊し、標的域でその内容物を放出するのに必要となるエネルギーのレベルによっては問題が起こる可能性があり、その領域が体の深部に位置する場合はエネルギービームの透過が間に存在する組織に損傷作用を与える可能性がある。こうして、特に害を与えずにリポソーム膜の破壊およびその封じ込められた内容物の放出を助ける、リポソームの小胞と密接に関連した非侵害性エネルギー放出剤の発見のために調査が企てられた。云いかえれば、その近傍あるいは間に存在する組織を損なうことなくリポソームの小胞を開封するための、中に十分に蓄えられた潜在エネルギーを含有し、前記エネルギーが、選択された部位でリポソームでカプセル化された生物学的に活性な媒質を解放するように外部の引きがね手段により意のままに解放される薬品が使用可能になることが強く望まれている。考えられる効果は、遠く離れたところで引金が引かれるような仮定の予め着装したばねにたとえることができ、そのエネルギーが放出されたとき、リポソームの内容物を意のままに排出することになる。本発明は、この所期の効果を達成するために詳述される。
【０００５】
（発明の概要）
要約すれば本発明の方法には、薬剤を含有するリポソームを生物体の選択域に向かわせ、続いてリポソームを破壊し、所与の部位でリポソームを開封してカプセル化された内容物を放出することが含まれる。この方法において、リポソームの小胞と一緒に用いられ、またそのエネルギーをリポソームでカプセル化した内容物の放出を助けるために意のままに解放することができる潜在エネルギーを含有する薬品は、閉じ込められた空気またはガスを伴う微粒子（ミクロボディー）からなる。微粒子は、好ましくは空気またはガスを充填したミクロスフェア、微小胞、またはミクロカプセルであり、より好ましくは空気またはガスで充填したミクロバブルまたはミクロバルーンである。リポソームの小胞に密接して近傍に存在する空気またはガスで充填したミクロスフェアの破壊または破裂が起こったとき、解放されたキャビテーションエネルギーが周囲に拡がり、リポソーム膜を開封してカプセル化された内容物が自由になるのを助けるか、または膜の透過性を変えることにより薬剤の拡散の向上を助けることになる。例えば放射性または音響エネルギーの、閉じ込められたガスで充填されたミクロスフェアあるいはミクロカプセルを破裂する引金となるパルスは、直接リポソーム膜に作用するのに必要とされるものほど強力である必要はなく、したがって近傍の組織に対する衝撃は少ない。
【０００６】
本発明の方法は、その中にカプセル化された治療または診断に役立つ薬品を運ぶリポソーム（任意に、特定の部位あるいは器官を標的にした）と、空気またはガスを充填したミクロスフェア、すなわち任意にリポソームと結合することができるミクロバブルまたはミクロバルーンとを含む注射可能な組成物または配合物を介して実施される。ミクロバブルまたはミクロバルーンには、欧州特許出願公開第０４７４８３３号、第０４５８７４５号、第０５０２８１４号、第０５５４２１３号、第０６１９７４３号、および第０６８２５３０号に開示されているものがあり、全てを参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
また本発明には、生物活性物質をカプセル化したリポソームの懸濁液および空気またはガスを含有するミクロスフェア（安定なミクロバブルまたはミクロバルーン）の懸濁液；あるいは安定化した粉末の形態でその中にカプセル化された生物活性物質を有する乾燥したリポソーム、ならびに空気またはガスを含有する安定なミクロバブルまたはミクロバルーンのキャリヤー液中の懸濁液；あるいはその中にカプセル化した生物活性物質を有する乾燥したリポソームおよび乾燥した粉末の形態のミクロバルーン；あるいは空気または生理的に許容できるガスと接触させて貯蔵された微粉薄片状ホスホリピドとしてのミクロバブル前駆体；を含むことができる前駆体システムあるいはキットが含まれる。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
添付の特許請求の範囲で述べるように本発明の主な態様は、生物学的に活性な成分をきわめて効率的に標的に送達することが、（ａ）カプセル化した治療または診断に役立つ薬品を含有するリポソームと、（ｂ）空気またはガスを充填したミクロスフェア、すなわちミクロバブルまたはミクロバルーンとを含む注射可能な組成物を患者に投与する方法を通して達成できるという予期せざる発見に基づいている。注入された配合物は、循環を介して選択された／所望する器官または組織に達し、ついでガスまたは空気で充填したミクロスフェアを破裂または破裂の原因を生じさせるために標的の器官または組織にエネルギービーム（好ましくは超音波の）を照射し、それにより放出されたガスエネルギーが隣接するリポソームの小胞を開封し、こうして患者の生体中の所望の部位でカプセル化した生物学的に活性な物質を分配する。
【０００９】
前記患者の血管系またはリンパ管系にこのような配合物の有効量を投与する場合、音響破壊または他の方法によるガスを充填したミクロスフェアの照射およびその後に続く破裂が、配合物が所望の部位に達しあるいはその上方またはその中を通過するときにのみ行われるように、選択された部位に向かう投与された配合物の循環の推移を超音波またはＭＲＩ影像化手段により監視することができる。照射のプロセスは、標的部位を通るあるいはその側を通る配合物の各周期的循環の間に連続的または間欠的に行うことができることは明らかである。
【００１０】
超音波照射は、反響信号を監視し、同時にそれによる照射部位の影像を提供するように改造された改変型の超音波検査プローブにより行うことができる。これにより、さらにこの方法の有効性を改善することができる。
器官の部位で排出されたエネルギーの全量は、ガスで充填されたミクロスフェアを破壊し、生物活性物質を放出するのに必要な量を超える必要がなく、したがって標的の器官または部位における組織の照射を極力少なくすることができることは明らかである。ミクロスフェアを破壊するのに必要な超音波照射の周波数は、約０．３から３ＭＨｚまで変えることができる。本発明によれば、任意の血液またはリンパ液が灌流する組織を標的とすることもできるが、最も有効に治療される病気は、内皮の病巣、腫瘍周囲のマクロファージ、腫瘍の血管組織、血栓症などに関係するものであると考えられることに留意されたい。
【００１１】
広く認められているように、リポソーム溶液は、顕微鏡で見て球形をした小胞の水性懸濁液であり、その核はリポソームのキャリヤー液中に溶解した物質の水溶液を封じ込めて保持することができる。通常これらの小胞は、１または複数の同心円状に配置された分子の二重の層（ラメラ）から形成され、その層は両親媒性化合物、すなわち水相の方を向いた疎油性で親水性の部分と、両層を連携した状態に保つ親油性で疎水性の部分とを有する（例えば、Ｌ．Ｄ．Ｌｅｓｅｒｍａｎ等の編集による「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ」，Ｉｎｓｅｒｍ  １３６，２〜８，Ｍａｙ，１９８２を参照されたい）。生物活性物質はリポソームの小胞の核の水相内にカプセル化することができ、またその懸濁液は体に注入することができ、それにより血液またはリンパ液中を循環させることができ、次いで前述のようにカプセル化された物質の放出がリポソームの小胞の膜の開封、または破裂、または崩壊の結果として起こる。
【００１２】
標的化法は、標的をしぼらない場合に他の器官に顕著な副作用を引き起こす可能性がある（ことになる）毒性物質の局部投与に特に適している。このような薬剤には、例えば、アムホテリシンＢまたはＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬）またはデキサメタゾン、インスリン、ビタミンＥなど投与が長期間にわたって必要な薬剤が含まれる。また、この方法は、ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどの血栓溶解剤、あるいはタキソールなどの抗腫瘍化合物の投与に適している。
【００１３】
本明細書で用いる用語「ミクロバブル」および「ミクロバルーン」の定義は、上記参照の刊行物中で示されてる。例えば、本発明の開示において「ミクロバブル」とは、特に、一般に分かれた形で空気またはガスをその中に導入する結果得られる、液状キャリヤー相中の懸濁液の空気またはガスを充填されたミクロスフェアを指し、またその液相は好ましくはその表面特性および泡の安定性を制御するために界面活性剤または界面活性物質を含有する。ミクロバブルにおいては、ガスの核の周囲の境界または外皮はほとんどないに等しく、単に通常わずか数ナノメートルの厚さのガス／液体の界面層からなる。
【００１４】
用語「ミクロバルーン」とは、好ましくは懸濁液の液体とは別の分子から形成されたはっきり分かる材料の境界または外皮、例えばタンパク質、あるいは高分子または脂質の膜を備えた空気またはガスのミクロスフェアを指し、その殻の厚さは数十もしくは数百ナノメートルである。
本発明においてより具体的には、ミクロバブルの内部容積はガス／液体の界面により限定され、あるいは言いかえればミクロバブルは単にガスと液体の界面または境界でゆるく結合した液体と界面活性剤との分子を含む外皮により境を接していると考えられる。本発明においては、好ましくは界面活性剤は薄片または層状の形態の少なくとも一部に、１または複数種のホスホリピドを含む。用語「層状の形態」とは、界面活性剤が１または複数の分子層を含む薄膜の形態（「積層物」の形）であることを指す。このような薄膜形成性ホスホリピド界面活性剤を層状の形態に変えることは、リポソームの手順により、例えば圧力均質化により、または可聴音もしくは超音波の周波数の下での音波処理により容易に行うことができる。これに関連して、前述のようにリポソームの小胞の膜自身が層状の形態のホスホリピドから作成されることを思い出して頂きたい。
【００１５】
脂質、特にホスホリピドを含む多くの界面活性剤または界面活性物質は、この種の構造に対応するように層状化することができる。本発明においては、好ましくはリポソームの製造に通常用いられる脂質、例えば天然または好ましくは合成の飽和ホスホリピド、ならびにその他の界面活性剤あるいは層または薄膜にすることのできるグリセリドが用いられる。
【００１６】
特に好ましくは、中性のホスホリピド、例えば、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイル、ジステアロイル、およびジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＡＰＣ）；負に帯電したホスホリピド、例えば、ジパルミトイルおよびジステアロイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルおよびジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳ）、ジパルミトイルおよびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ）；反応性ホスホリピド、例えば、ポリエチレングリコール、ビオチニル、グルタリル、カプロイル、またはスクシニルアミンと結合したホスファチジルエタノールアミン誘導体から選択されたホスホリピドである。
【００１７】
本発明にとって有用なミクロバルーンは、欧州特許出願公開第０４５８７４５号に記載されている。これらは自立材料、例えば一定の機械的強度を備えたポリマーの膜から作成された実体的な外皮を有する。言いかえれば、これらは、空気またはガスがある程度しっかり閉じ込められている柔軟性の固体材料のミクロスフェアである。５％の血清アルブミンのような粘性タンパク質溶液の超音波処理により作成され、１〜２０μｍの範囲の径を有し、膜形成性タンパク質の変性により安定化させたミクロバルーンを用いることもできる。
【００１８】
本発明にとって好ましい注射可能なミクロバルーンの外皮または境界膜を構成するポリマーは、親水性で生分解性の生理学的に適合性のあるほとんどのポリマーから作成することができる。天然または合成のこのようなポリマーの中では、水溶解度の低い多糖類、ポリシアノアクリレート、ポリラクチドおよびポリグリコリド並びにそれらのコポリマー、ラクチドとラクトン、例えば、γ−カプロラクトン、δ−バレロラクトンのコポリマー、ポリペプチド並びにタンパク質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、グロブリン、およびアルブミンを挙げることができる。アレルギー性患者などの場合には、米国特許第４，２７６，８８５号あるいは欧州特許出願公開第０３２４９３８号のような天然のタンパク質（アルブミン、ヘモグロビン）から作成されたミクロバルーンの使用は避けることが好ましいので、合成ポリマーの選択の自由度が大きいことが本発明のもう一つの利点である。
【００１９】
その他の好適なポリマーには、ポリ（オルトエステル）類（例えば、米国特許第４，０９３，７０９号、第４，１３１，６４８号、第４，１３８，３４４号、第４，１８０，６４６号を参照されたい）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、および例えばＤＥＸＯＮなどのそれらのコポリマー（Ｊ．Ｈｅｌｌｅｒの論文，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １（１９８０），５１）；ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−γ−カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−δ−バレロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−γ−ブチロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート；ポリアミド；ポリヒドロキシブチレート；ポリジオキサノン；ポリ−β−アミノケトン（Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２３（１９８２），１６９３）；ポリホスファゼン（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３（１９７６），１２７４）；およびポリ酸無水物；がある。生分解性ポリマーに関する参考文献は、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ等の論文、「Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．」Ｃ２３（１９８３），６１〜１２６に見出すことができる。
【００２０】
ポリアミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸ならびにその誘導体、すなわち低級アルコールまたはグリコールによる部分エステルも用いることができる。このようなポリマーの有用な一例は、ポリ−（ｔ−ブチルグルタメート）である。他のアミノ酸、例えば、メチオニン、ロイシン、バリン、プロリン、グリシン、アラニンとのコポリマーも可能である。制御された生分解能力を備えたポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸のその他の誘導体（国際特許出願公開第ＷＯ／０３８９１号、米国特許第４，８８８，３９８号、および欧州特許出願公開第０１３０９３５号を参照されたい）が報告されており、その全てを参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
本発明のミクロスフェアに充填されるガスには、空気、エコー源性ガスの分野では普通のほとんどのガス、例えばＳＦ6 、ＣＦ4 、Ｃ2 Ｆ6 、Ｃ3 Ｆ6 、Ｃ3 Ｆ8 、Ｃ4 Ｆ6 、Ｃ4 Ｆ8 、Ｃ4 Ｆ10、Ｃ5 Ｆ10、Ｃ5 Ｆ12、空気、酸素、窒素、二酸化炭素、貴ガス類、およびその混合物がある。またＣ6 Ｆ14のような、体温または遠く離れたところで加えられるエネルギーパルスの作用により蒸発するであろう無害の低沸点の液体も本発明の揮発性で閉じ込めることのできる微粒子成分として使用可能である。
【００２２】
閉じ込められたガスは、大気圧、あるいは大気圧より高いまたは低い圧力下であってもよく、例えば閉じ込められたガスは、リポソームおよびガスを充填されたミクロスフェアを保持するキャリヤー液の静水圧に等しい圧力であってもよい。
本発明においては、ガスを充填されたミクロスフェアはリポソームとある程度密に結合することができ、すなわちこれらはリポソームの小胞と簡単に混ぜ合わせることができ、それによって互いに統計学的に間隔をあけることになる。
【００２３】
別の方法においては、リポソームの小胞とガスを充填したミクロスフェアを互いに親和性を有するように構成することができ、例えばそれらが各々複合対となる分子成分を備えてもよい。一例として、抗原と抗体の複合はミクロスフェアとリポソームの小胞を互いに結合させることになるので、抗原をリポソームの膜に、抗体をミクロスフェアに組み込むことができ、またはその逆も同様に可能である。下記に列挙した種類の物質のドナーと受容体を含むその他の結合システムもまた可能である。すなわち、アンフェタミン、バルビツレート、スルホンアミド、モノアミンオキシダーゼ阻害物質、ホルモン、酵素、脂質、細胞膜特異的リガンド、抗高血圧性剤、神経伝達物質、アミノ酸、オリゴペプチド、放射線増感剤、ステロイド（例えばエストロゲンおよびエストラジオール）、モノおよびポリクローナル抗体ならびにそのフラグメント、炭水化物（グルコース誘導体など）、脂肪酸、ムスカリン受容体および基質（ベンジル酸３−キヌクリジニルなど）、ドーパミン受容体および基質（スピペロンなど）、ビオチン、特異的受容体と結合することのできるペプチドおよびタンパク質、ベンゾジアゼピン受容体および基質である。
【００２４】
多結合部位を含むシステムも可能である。例えば、本発明の方法および配合物の特定の態様において、リポソームの小胞とガスのミクロスフェアの両者の外皮はビオチン結合部位を備え、その水性キャリヤー液中の懸濁液はアビジンと混ぜ合わされ、それによってリポソームの小胞とガスのミクロスフェアの両者は、アビジンと結合することにより合体することになる。
【００２５】
本発明に用いられるリポソームは、好ましくは長命（ステルス）型で、すなわちＲＥＳ（細網内皮系）による捕獲に耐性がある。ステルス型リポソームは、「Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」３９（１９８７），ｐ．５２；欧州特許出願公開第０３５４８５５号、国際特許出願公開第ＷＯ９１／０５５４５号；欧州特許出願公開第０７５９７８５号；欧州特許出願公開第０７３１６９０号；「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」１１２６（１９９２），２５５〜２６０、およびＤ．ＬａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ編（１９９５）による「Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）などの文献に開示されており、これら全ての刊行物を参照により本明細書に組み込む。
【００２６】
本発明の特に好ましい態様には、３種類の成分、すなわち、Ａ．中性の脂質、例えば非イオンまたは両性イオン脂質あるいはその誘導体と、Ｂ．負または正に帯電した脂質と、Ｃ．機能性成分を運ぶ脂質、例えばＮ−ビオチニル−ＰＥまたはＰＥＧ−ＰＥとを含むリポソームが含まれる。当業技術者に一般に知られているように、コレステロールまたはコレステロール誘導体を、成分Ａの一部を置換するために用いることができる。
【００２７】
リポソームを製造するために用いられる脂質は、脂質およびホスホリピド、例えば、大豆レシチン、部分的に精製したレシチン、水素化ホスホリピド、リソリン酸エステル、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、セレブロシド、セラミド、ホスファチジルコリンに類似のその他のエステル（ＰＡＦ、リソＰＡＦ）；合成ホスホリピド、例えば、Ｌ−α−レシチン（ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジリノロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン）；ホスファチジルエタノールアミン誘導体、例えば、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン、１−アシル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ジニトロフェニルカプロイルホスファチジルエタノールアミン，ジニトロフェニルアミノカプロイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、Ｎ−ビオチニル−ＰＥ、Ｎ−カプロイルアミン−ＰＥ、Ｎ−ドデシルアミン−ＰＥ、Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ、Ｎ−ＰＤＤ−ＰＥ、Ｎ−スクシニル−ＰＥ、Ｎ−グルタリル−ＰＥ；ホスファチジルグリセロール類、例えば、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジン酸類（１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩、１−アシル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩）；ホスファチジルセリン、例えば、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−〔ホスホ−Ｌ−セリン〕のナトリウム塩、１−アシル−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−〔ホスホ−Ｌ−セリン〕のナトリウム塩、リソホスファチジン酸；カチオン性脂質、例えば、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−トリメチルアンモニウムの塩化物（ＤＯＴＭＡ）；重合性の脂質、例えば、ジインＰＣ、ジインＰＥ、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；多種類の変化に富む先端基を備えたホスホリピド類、例えば、ホスファチジルエタノール、ホスファチジルプロパノール、ホスファチジルブタノール、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−モノメチル、１，２−ジステアロイル（ジブロモ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；部分的にまたは全体的にフッ素化した脂肪酸鎖を備えたホスホリピド類；を含む群から選択することができる。
【００２８】
また、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）、Ｂｒｉｇ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎｓ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）と、Ｚｏｎｙｌ（登録商標）等のフッ素化した界面活性剤などの乳化剤または界面活性剤をリポソームに取り込み、あるいはリポソームの調製用に用いることができる。
【００２９】
本発明に有用なリポソームの懸濁液を調製するには、当分野の従来技術、例えば前述の文献およびＧ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ著の「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ」，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されているものを適用することができる。
例えば、英国特許出願公開第２，１３４，８６９号に開示されているように、水溶性キャリヤー固形物（ＮａＣｌ、ショ糖、乳糖、およびその他の炭水化物）のミクロスフェア（１０μｍ以下）をホスホリピドの混合物でコーティングし、ついでこのコーティングされたキャリヤーを水相に溶解することによってリポソームの小胞が得られるはずである。英国特許出願公開第２，１３５，６４７号では、不溶性の粒子、例えばガラスまたは樹脂のミクロビーズを、有機溶剤に溶かした脂質溶液中で湿らすことによりコーティングし、続いて蒸発により溶剤を除去する。その後、脂質でコーティングされたミクロビーズを水性のキャリヤー相と接触させ、それによってそのキャリヤー相の中にリポソームの小胞が形成することになる。
【００３０】
本発明において、ミクロバブルの生成とリポソームの小胞の膜の分裂を助けカプセル化された内容物を開放させる、最終の破裂とが、リポソームの形成に直接（部分的ではあるが）関係していることに注目することは格別興味深い。実際には欧州特許出願公開第０４７４８３３号に開示されているように、リポソームの懸濁液に空気またはガスを取り込むと、約１０7 から１０10個／ｍｌ以上のミクロバブルを含有する安定なミクロバブル懸濁液が得られるはずである。また、この同じ文献によれば、類似のバブル懸濁液が、乾燥した薄片状ホスホリピドの配合物（これは乾燥状態で貯蔵されたリポソームにたとえることができる）を空気またはガスにしばらく暴露し、その後キャリヤー液と混ぜ合わせる結果として得られる。
【００３１】
したがって、任意の既知の技術により調製されたリポソームの懸濁液または溶液から出発し、その後空気またはガスを導入し、それによってミクロバブルの安定な懸濁液が界面活性剤の存在により安定化されて層状の形態で形成することになることは、本発明において（必須ではないが）興味深いことである。もちろん、リポソームの壁を構築する材料を、本発明の範囲内、すなわち例えばそれらを混ぜ合わせることによりあるいは前述のように結合用に設計された異種分子を共有結合によりグラフトさせることにより改変してもよい。
【００３２】
また別の方法では、「装填されていない」リポソームの小胞、すなわちその中に未だ生物活性物質をカプセル化していない小胞から出発してもよい。ついで所期のミクロバブルの懸濁液を得るためにリポソーム溶液中にに空気またはガスを導入する前または後に、欧州特許出願公開第０５１４５２３号の開示に従ってリポソームの小胞の装填を行うことができる。
【００３３】
一態様において、その中にカプセル化された生物活性媒質を含有するリポソームの乾燥した粉末配合物を、米国特許第４，２２９，３６０号の文献に従って調製することができ、そのリポソームの壁形成材料は作動薬結合性前駆体（例えばビオチン）を含有する。ついで、リポソーム懸濁液を拮抗薬を含有する水性キャリヤー液（例えばアビジン）を用いて再生し、それによってバブルが、ビオチンを含有する脂質により安定化されるのと溶液中のアビジンを介して結合するのとの両者によりリポソームの小胞と共に形成することになる。
【００３４】
一変形態様において、リポソームの調製およびガスを充填したミクロスフェアの配合物を別々に調製し、投与する前に混ぜ合わせることももちろん可能である。また、それらを別々に投与してもよく、この場合投与は注入の間の遅れがあってもなくても任意の順序で、すなわちミクロバブルとリポソームの小胞との間の干渉を遅らせるように逐次行われる。ある用途あるいは治療方式において、ミクロバブルの数回の注入は、数カ所の部位でリポソームの内容物が放出されるのを助け、あるいは同一部位でリポソームの活性成分を繰り返し放出するのを助けることが想像される。
【００３５】
また前述のように、リポソームの小胞の開封を助けるために、閉じ込められた空気またはガスを備えたミクロバルーンを本発明に従って使用することができる。この場合は、ミクロバルーンは、好ましくは欧州特許出願公開第０４５８７４５号に開示された手法に従ってリポソームとは別個に調製し、その後に注目のリポソームの懸濁液と混ぜ合わせる。当然、またミクロバルーンの外皮は、好ましくはリポソーム膜の受容体と最後に結合するように設計された結合用前駆体を含有することになる（またはその逆も同様である）。このような態様を実際に実現することは、後述の実験の部で開示する。
【００３６】
本発明の方法を実施するためには、調製物は通常の経路、例えば、静脈内、灌流等に従って投与され、例えば生物活性の媒質を封じ込めたリポソームと、中に空気またはガスを閉じ込めたミクロスフェア（ミクロバブルまたはミクロバルーン）とを混合物中に含有する上記の標的化（または非標的化）調製物を、通常の手段（ＩＶまたは別の手段）によって、例えば被験者の循環中に注入することができる。しばらくして、注入された材料が体の中の標的器官または組織の部位に達したとき、エネルギーパルスが外部（例えばその部位と関係する皮膚の上方または表面）から加えられてガスを含有する粒子を破裂させる。こうして破裂により放出されたキャビテーションエネルギーが、リポソームの外皮の開封と、カプセル化された材料の排出を引き起こす。
【００３７】
ガスで充填されたミクロスフェアの破裂に必要なエネルギーパルスは、好ましくは音波または超音波パルスである。この関係では、「Ｍｅｄ．＆  Ｂｉｏｌ．」２２（１９９６），１１３１〜１１５４の中でのＭ．Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ等により発表された『Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ』を参照されたい。広義には、トランスデューサ・システムを直接体に適用するか、または約０．３から３ＭＨｚまでの範囲の周波数をもつ水路用カップラントを通して適用してもよい。好ましい態様においては、投与後のバブルの移動および適用部位でその破壊をいつ行うのが適切かを監視するために改変型の超音波プローブが用いられる。ついで、バブルの崩壊が反響信号の劇的な変化により検知される。監視用信号は１ＭＨｚから１０ＭＨｚの範囲、好ましくは２と７ＭＨｚの間にある。
【００３８】
本発明で用いることが可能な様々な処方の態様を考慮して、開発された前駆体システムには、使用前に混ぜ合わされ、また商品化という視点から見て、例えばより容易に貯蔵および輸送を行なうためにキットの形態で引き渡される成分が含まれる。これらの前駆体システムは下記の態様を含むことができる。すなわち、
（Ａ）その中にカプセル化された生物活性物質を有するリポソーム溶液（または懸濁液）。ついで溶液は、例えばシリンジまたは別の手段により適用前に注入される空気またはガスで処理される。
【００３９】
（Ｂ）その中にカプセル化された生物活性物質を有するリポソーム溶液（または懸濁液）、およびそれと混ぜ合わされる空気またはガスを含有するミクロスフェア（安定なミクロバブルまたはミロバルーン）の懸濁液。
（Ｃ）安定化した粉末の形態で、その中にカプセル化された生物活性物質を有する乾燥したリポソームと、空気またはガスを含有するミクロバブルまたはミクロバルーンのキャリヤー液中の懸濁液とを含むキット。両成分は使用前に混ぜ合わされる。
【００４０】
（Ｄ）安定化した粉末の形態で、その中にカプセル化された生物活性物質を有する乾燥したリポソーム、乾燥した粉末の形態のミクロバルーン、または空気またはガスと接触させて貯蔵された微粉で薄片状ホスホリピドとしてのミクロバブル前駆体と、投与可能のキャリヤー液とを含むキットであって、前記成分は使用前に混ぜ合わされるキット。
【００４１】
（ｅ）単純化した変形態様においては、キットは空気またはガスと接触させて安定化した粉末の形態で貯蔵され、中にカプセル化された生物活性物質を有する乾燥したリポソームと、投与可能のキャリヤー液とを含んでもよく、それは使用前に混ぜ合わすことができ、それによって安定なミクロバブル懸濁液がホスホリピドの安定化作用により形成される。
【００４２】
すでに述べたとおり、音響の（acoustic) キャビテーションによるミクロバブルの破壊に基づく本発明の方法は、薬剤の送達および超音波画像化におけるコントラストの向上のためにリポソームの溶解を促進するためだけでなく、遺伝子の移入または発現のために細胞透過性を改変するために用いることができる。リポソームは、熱に敏感で、溶解による製作に適し（fusogenic)、ｐＨに敏感で、特異的ホーミング（目的地に導く）因子を有するまたは有しないステルス性（例えばＰＥ−ＰＥＧ）で、また様々な治療用、画像化用物質、または遺伝物質を装填してもよい。好ましくは、リポソームは単一層で、高い薬剤カプセル化能力（すなわち、高い活性物質／脂質比）と音響のキャビテーション下で低せん断安定性とを可能にする構造である。
【００４３】
さらに本発明を下記の例により例示する。
例１
Ａ）ビオチンで標識したＬＵＶ（大型で単一層の小胞）のリポソーム
水素化した大豆のホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ、Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ  Ｃｈｅｍｉｅ、独国から入手）０．７５ｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、Ｓｙｇｅｎａ、スイス国から入手）５０ｍｇ、およびＮ−ビオチニルでキャップしたＰＥ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ）１０ｍｇを、クロロホルムとメタノールの混合物（１：２）１５０ｍｌに５０℃で溶解した。これに１ｍｍのガラスビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を加え、全体をホモジナイザーで均一化した。ロータベーパで溶剤を取り除いた後、残分を１０％の光学的トレーサー用薬剤（カルボキシフルオレセイン）を含有する緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ＋０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ７．２）２００ｍｌ中に懸濁させ、混合物を６０℃に加熱して脂質を水和した。ビーズを取り除き、このリポソーム溶液を１μｍのポリカーボネート濾過膜を５回通して押し出し、ついでこの溶液を同じ緩衝液に対して透析して捕捉されなかった物質を取り除いた。透析後、溶液を検査（コールター計数器）した結果、リポソームの小胞の平均径は約１．３μｍであった。
【００４４】
Ｂ）ビオチンで標識したミクロバブル
緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ＋０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１５０ｍｌに、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）２００ｍｇ、とジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）２００ｍｇ（これらはＳｙｇｅｎａから入手）、ｎ−ビオチニルでキャップしたＰＥ１０ｍｇ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８の５ｇを６５℃で分散させた。室温まで冷却させた後、溶液をＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）のヘッドを装着した乳化装置中に置き、ペルフルオロブタン（Ｃ4 Ｆ10）の雰囲気中で２分間乳化（１０，０００ｒｐｍ）してミルク状のバブル懸濁液を形成させた。上部の泡の層を捨て、溶液を沈降させた。バブル懸濁液の上層を回収し、ＴＲＩＳ−ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁させた。その後、デカンテーション操作を２回繰り返し、それによって精製された最終の懸濁液中のバブルの、濃度がバブル数５×１０8 個／ｍｌで、平均サイズが２．６μｍであった。
【００４５】
Ｃ）超音波によるリポソームからカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出
下記のとおり３種類の異なる試料２０５μｌを調製した。
ａ）リポソーム溶液（Ａ）２０μｌ＋ＴＲＩＳ−ＮａＣｌ緩衝液１８５μｌ。
ｂ）リポソーム溶液（Ａ）２０μｌ＋ＴＲＩＳ−ＮａＣｌ緩衝液５μｌ＋ミクロバブル溶液（Ｂ）１８０μｌ。
【００４６】
ｃ）リポソーム溶液（Ａ）２０μｌ＋アビジン溶液（ＴＲＩＳ緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ）５μｌ＋ミクロバブル溶液（Ｂ）１８０μｌ。
エッペンドルフ管の中に置いた試料を、Ｂｒａｎｓｏｎ  ５２００の装置（４７ＫＨｚ、０．２Ｗ／ｃｍ2 ）中で１０分間、超音波作用を受けさせた。処理後、試料を遠心分離し、上清中に放出されたトレーサーの蛍光をＫｏｎｔｒｏｎ  ＳＦＭ−２５蛍光分析器（４８０ｎｍで励起、５２０ｎｍで発光）で測定した。同一の試料（未処理）を対照として用いた。この結果を下記の表に集約した。
【００４７】
【表１】
0004772958.tif 000002
【００４８】
上記の結果から分かるとおり、リポソームに封じ込められた物質の最高の送達は、バブルがアビジンとの複合を介してリポソームと結合するときに起こる。
例２
ＭＬＶリポソーム（ＭＬＶ＝多層の小胞）を、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＰＰＡ（７５：２０：５（ｗ／ｗ））の混合物を用いて、（水性の相）１ｍｌ当たり（脂質混合物）１０ｍｇの濃度で調製した。水相は、緩衝液中ＣＦの１０ｍＭ溶液であった。脂質混合物の水和（リポソームの小胞の形成）は、６５℃で１０分間軽く撹拌しながら加熱することにより行われた。
【００４９】
試験される試料は、リポソーム混濁液１００μｌと種々な量の例１に記載のミクロバブル調製物（Ｂ）から作成された（下記の表を参照されたい）。ついで試験用に試料をさらにＴＲＩＳ緩衝液で希釈して６ｍｌとし、一定の３７℃の浴に浸漬した壁の薄いプラスチック管（ｆ＝４ｍｍ）の中を蠕動ポンプにより循環させた。Ａ−１５０  ＥＮＩ  ＲＦ増幅器で増幅した８５５０Ｔａｂｏｒ発生器からのパルスが、管から９ｃｍのところに置かれた１ＭＨｚの焦点を合わせたトランスジューサ（Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で印加された。音圧を管の中でデジタルスコープ（ＤＬ−４１００、横河、日本から入手）に接続した水中聴音機により測定した。さらに下記の実験変数を適用した。すなわちパルス幅１０μｓ、バースト数１００、管内圧力の振幅（ピークからピーク）１．６Ｍｐａ、露出時間３分、流速１５ｍｌ／分である。結果を下記の表に集約した。
【００５０】
【表２】
0004772958.tif 000003
【００５１】
例３
ＭＬＶリポソームの懸濁液を例２と同様に調製した。その一部（ＬＵＶ−１）は、凍結と解凍を繰り返し、ついで１μｍの膜を５回押出すことによりＬＵＶに転換した。さらに別の部分（ＬＵＶ−２）は、連続して０．６、０．４、および０．２μｍの膜を通して押出された。試験される試料は、体積比１：５のリポソーム／ミクロバブルを生成するためにミクロバブル懸濁液（Ｂ）と混ぜ合わされた。試料を、例１と同様にＣＦの放出について試験した。結果を下記の表に集約した。
【００５２】
【表３】
0004772958.tif 000004
【００５３】
例４
この例は、ガスのミクロバブルと超音波により誘発されるリポソームの溶解におよぼすトランスジューサの周波数、出力パワー、流量、露出時間などの様々な変数の影響を説明する。
例２を、一定なバブル／リポソーム濃度および異なる超音波暴露で繰り返した。その結果は、全ての他の変数が一定に保たれるという条件の下で、トランスジューサの周波数を１から２．２５ＭＨｚへ変えると、リポソームからのＣＦの放出度が低下することを示している。同様の考察が流量の変化に対してもなされた。流れが速いほど、破裂あるいは破壊されるミクロバブルの数は低下する。
【００５４】
ミクロバブルの破壊は、より高い音響出力では、それが直接の結果として、より高いリポソームからのＣＦの放出をもたらすので、より効率的であることが分かっている。したがって、リポソームの溶解度は、印加される振幅の増加に比例したということができる。
露出時間の影響は、明らかに出力、周波数、および流量の様々な設定値に左右される。リポソームの溶解は、懸濁液中の全てのミクロバブルが破壊されたとき完結する。しかしながら、ミクロバブルの連続的な注入の間中、全体のリポソームの溶解は増加し、ミクロバブルの注入が維持される限り高いままである。
【００５５】
実験結果（超音波照射３分、リポソーム５００μｌ、バブル２．５ｍｌ）は下記のとおりである。すなわち、
【００５６】
【表４】
0004772958.tif 000005
【００５７】
＊  コールターにより求めた超音波照射により破壊されたバブルの％
＊＊  ＣＦの放出から求められたリポソームの溶解
これらのデータは、リポソームの溶解が、超音波により破壊（音響分解）されたバブルの量と密接に関係することを示す。
例５
大型の単層のリポソーム（ＬＵＶ）を、Ｍ．Ｈ．Ｇａｒｂｅｒ等の論文、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏ．Ｐｈｙｓ．」３６，５（１９９６），１１７７〜１１８７に従って調製した。ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール１９００で誘導体化されたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）の混合物（モル比１００：５０：３０：６）を有機溶剤に溶解（例１参照）した後、得られた溶液を表面接触させて蒸発するに任せ、その表面にホスホリピドのフィルムを形成させた。ついでリポソームの５ｍｇ／ｍｌ溶液を形成するのに必要な量の、ＴＲＩＳ（１０ｍＭ＋ＮａＣｌ０．９％）中のＣＦの１０ｍＭ溶液を加え、転移点を超える温度まで加熱することにより水和を行い、そのリポソーム溶液を５回膜を通して押し出して気孔サイズを低下させた。光散乱法（Ｎｙｃｏｍの装置）により測定したバブルの平均サイズは約１４０ｎｍであった。
【００５８】
試料は、例１のミクロバブル配合物と混ぜ合わせることにより調製し、その割合もまた同一であった。下記の表４に、試料を種々の温度で１０分間、例１と同様に超音波エネルギーにさらした後のＣＦの放出を示す。また、示したようにこのデータには、対照（バブル無し、超音波無し）が含まれる。明らかにこれらは温度の影響を示す。また、ガスを含有するミクロボディの「触媒」作用の不在下では、超音波の効果は温度の効果を越すほどではないことに注目されたい。
【００５９】
【表５】
0004772958.tif 000006
【００６０】
ガスを充填したミクロボディの破裂により媒質中に開放されたキャビテーションエネルギーを用いる別の態様は、キャリヤー相中の、薬剤として許容できる液体の乳濁液の液滴に作動することに基づいて行うものである。したがって、乳濁液とミクロバブルの混合物を体の選択域に運ぶことができ、その場合、遠隔操作されたバブルの崩壊により、液滴の破壊の引金をひくことになる。液滴中の液体は、溶解させた生物活性物質を有することができ、ついでそれが関心のある領域に分配することになる。一変形態様において、十分低い沸点の場合、この液体は簡単に蒸発し、おびただしい量の新しいバブルと、増大された音響信号を生成することになる。バブルの破裂によるエネルギーの局所的供給を用いた多くの他の態様を想像することができる。
【００６１】
例６
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ、Ｓｙｇｅｎａ、スイス国）１ｇと、Ｎ−ビオチニルでキャップしたＰＥ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ）１０ｍｇを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）−Ｆ１０８（非イオン性界面活性剤）３ｇを含有する蒸留水１００ｍｌに溶解した。撹拌下６０℃で透明な溶液が得られた。この溶液を高速ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）、１０，０００ｒｐｍ）中で数分間、ガス（例えば、Ｃ4 Ｆ10）とともに混合した。０．７μｍ〜２０μｍの間のサイズ分布を有する、１０8 〜１０9 個／ｍｌのガスのミクロバブルを含有する不透明な懸濁液が得られた。
【００６２】
界面活性剤および遊離（取り込まれていない）のビオチニル分子を取り除き、ミクロバブルのサイズ分布を狭めるために、懸濁液中の全ての界面活性剤が取り除かれるまで（これはＩＲまたはＨＰＬＣで制御される）、懸濁液を繰り返し数回水でデカント（洗浄）した。サイズ分布およびミクロバブルの数は、デカンテーションの持続時間および回収された上清（バブル相）の体積を制御することにより同等に仕立てることができる。一般には３回のデカンテーションで十分である。ホーミングあるいは生体分子が水溶液中で不安定である場合は、ミクロバブル懸濁液を凍結（例えば−１８℃未満）し、使用するまで貯蔵した。
【００６３】
界面活性剤または洗浄剤は脂質の可溶化およびガスのミクロバブルの形成を容易にするためにのみ用いられたので、これらはミクロバブルの形成後取り除かれた。水媒体中にホスホリピドを溶解させ、共可溶化し、または分散させることが可能なあらゆる界面活性剤を利用することができる。これらの界面活性剤の例には、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｐｏｌａｘｍｅｒ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）、Ｃｈａｐｓ（膜生化学によく用いられる非変性双性洗浄剤）、および多数の炭化水素系界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム等）、フッ化炭化水素系界面活性剤（例えばペルフルオロアルキルポリオキシエチレン）、イオン系あるいは非イオン系がある。ミクロバブルを安定化させる殻の最も重要な要素として、多くのホスホリピド分子を利用することができる（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等）が、この例の方法に対しては、負に荷電したホスホリピドが、これらが他の界面活性剤の存在下で水に共溶解性を示すので好ましい。
【００６４】
合成の脂質を含有する多くの過フッ化炭化水素もミクロバブル調製のためのこの技術に用いることができる。さらに、２種類以上あるいは数種類の脂質分子の混合物をこの調製に用いることができ、それは興味深い特性を備えた、また高収率のミクロバブルをもたらすことがよくある。この例は、「界面活性剤または洗浄剤の消耗」法（リポソームの調製に用いられた方法と同様）が、ミクロバブルの中に、生体内ターゲッティングのために特異的特性を付与したホーミング因子を組み込むために使用することができることを示す。