(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス・エルジノサ由来の抗原性蛋白質であって、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって求めた分子量が約４５ｋＤａであり、
M   R   A   E   L   N   Q   G   L   I   D   F   L   K   A
Met Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala （配列番号２）
なるアミノ末端配列を有する蛋白質。
【請求項２】
医薬に使用する請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
シュードモナス・エルジノサ感染の処置、予防又は診断に使用する請求項２に記載の蛋白質。
【請求項４】
シュードモナス・エルジノサに対するワクチンとして使用する請求項２に記載の蛋白質。
【請求項５】
（ａ）請求項２に記載の蛋白質を試験すべき試料と接触させることと、
（ｂ）シュードモナス・エルジノサに対する抗体の存在を検出すること
を特徴とするシュードモナス・エルジノサの検出方法。
【請求項６】
請求項２に記載の蛋白質を用いることを特徴とするシュードモナス・エルジノサ感染の処置、予防または診断用の薬剤の調製方法。
【請求項７】
請求項２に記載の蛋白質を、医薬として許容しうる賦形剤とともに含有する医薬組成物。
【請求項８】
ワクチン組成物であり、さらにアジュバントを含有する請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項２に記載の蛋白質に特に結合する抗体。
【請求項１０】
請求項２に記載の蛋白質を用いることを特徴とするシュードモナス・エルジノサに対するワクチン用の薬剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、シュードモナス・エルジノサ（以下、Ｐ．エルジノサ）由来の抗原蛋白質およびこれらの蛋白質の医療における使用、とくにＰ．エルジノサ感染の処置、予防および診断における使用に関するものである。
【０００２】
Ｐ．エルジノサはグラム陰性の好気性の運動能力のある細菌である。それは、環境中に遍在する細胞外日和見病原体であって、免疫不全者においてかなりの罹患率、死亡率をもたらす。それに感染することは、嚢胞性線維症、熱傷、慢性気管支炎、気管支拡張症および癌をもつ患者において、とくに重大事である。
【０００３】
Ｐ．エルジノサのゲノムは最近配列が決定されており、そのプロジェクトの詳細はインターネットに出ている(http://www.pseudomonas.com)。しかしながら、本発明の優先日には、その情報は完全ではなく、確認されてもいなかった。この情報は今や完全であり、確認されている。
【０００４】
免疫応答の確認、ワクチン候補および診断検査に適当な成分の探求は、Ｐ．エルジノサの外膜成分に焦点を当ててきた。Ｐ．エルジノサの外膜は、リポ多糖内毒素（エンドトキシン）を含む毒素や、リン脂質および外膜蛋白質（ＯＭＰs(outer membrane proteins)）を含んでいる。
【０００５】
それら種々のＰ．エルジノサ外膜蛋白質（ＯＭＰｓ）には、アルファベット命名システムが適用されている。数種の蛋白質がこの体系によって特性を記述されているが、いくつかのものの発現は一過性であるにすぎず、栄養の利用可能性、培養条件および抗生物質の存在に高度に依存する。現在のところ、Ｆ、Ｈ２およびＩと命名された３つの主要なＯＭＰｓが、Ｐ．エルジノサのすべての系統において、抗原として共通していると認められており、高いコピー数で発現される。
【０００６】
本発明者らは、ＯＭＰｓ及び細胞質蛋白質の両者の均一な標品を単離するべく、種々の蛋白質精製法を採用してきた。液体カラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動段階に改良を加えて、ツヴィッタジェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）抽出法を用いて、数種の蛋白質が単離、同定され、ワクチンとしての可能性が評価されている。それら蛋白質は、それらの分子量によって表示され、それらの同一性はアミノ末端の配列によって確認された。
【０００７】
本発明者らは、あるＰ．エルジノサ標本から蛋白質を単離し、同定した。これらの蛋白質を、Ｐａ１３、Ｐａ２０（ＡＣＰ）、Ｐａ４０（アミダーゼ）、Ｐａ４５およびＰａ８０と名付ける。Ｐａ１３、Ｐａ２０（ＡＣＰ）、Ｐａ４０（アミダーゼ）、Ｐａ４５およびＰａ８０について、アミノ末端の配列が得られている。配列分析に続いて、得られたデータを、ＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール、国立生物工学情報センター、合衆国メリーランド州ベセスダ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５  ３３８９−３４０２（１９９７））を用いての検索に付した。Ｐａ２０は、シュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびシュードモナス・エルジノサ（Ｐ．エルジノサ）からのある蛋白質と相同性を有していたので、ＡＣＰに属するもとの考えられた。Ｐａ４０は、既知のＰ．エルジノサの脂肪族アミダーゼと相同性を有していた。この検索では、Ｐａ１３、Ｐａ４５およびＰａ８０と名付けた蛋白質は見出されなかった。
【０００９】
本発明によれば、シュードモナス・エルジノサ由来の抗原性蛋白質が提供され、特に、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって求めた分子量が約４５ｋＤａであり、
M   R   A   E   L   N   Q   G   L   I   D   F   L   K   A
Met Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala （配列番号２）
なるアミノ末端配列を有する蛋白質が提供される。
【００１１】
当業者ならば、本発明の蛋白質またはポリペプチドの相同体または誘導体も本発明の枠内（即ち、抗原性／免疫原性の物質として）で利用できるであろうことを認識するであろう。例えば、一つの又はそれ以上の付加、欠失、置換又はそのようなものを含む蛋白質またはポリペプチドは本発明に包含される。更に加えて、あるアミノ酸を類似「タイプ」の別のアミノ酸によって置換することも可能である。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換することである。アミノ酸配列を比較するためには、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用することができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、いずれかの配列の適切な位置にスペースを挿入することによって最上のアライメント(alignment) を見出す。ある最上のアライメントについて、同一性または相似性（同一性に加えてアミノ酸タイプの維持）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘなどのプログラムは、最長範囲の類似配列を整列させ、その適合状態に値を割り当てる。かくして、各々に異なるスコア（点数）を有するいくつかの類似領域が見出される場合の比較を得ることができる。本発明では、両タイプの分析が考えられる。
【００１２】
本発明の目的では、上記アルゴリズムの一つを用いたときに、かなりの数の構成アミノ酸が相同性を示すならば、ある蛋白質配列は別の蛋白質配列と実質的に相同であるとみなすことができる。アミノ酸の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、さらには９９％が相同であればよく、この順に好ましさが増す。
【００１３】
本明細書において、蛋白質の分子量は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定している。当業者ならば理解するであろうが、この方法によって得られる分子量の値の正確さは、約±１０％にすぎない。
【００１４】
ここで論じるように、本発明の蛋白質は、抗原性物質として有用である。かかる物質は、「抗原性」及び／又は「免疫原性」でありうる。一般に、「抗原性」は、当該蛋白質が抗体を産生させるために使用できるものであるか、または実際に生体内で免疫応答を惹起できることを意味するために採用される。「免疫原性」は、当該蛋白質が生体内で防御免疫応答を惹起できることを意味するために用いられる。従って、後者の場合には、該蛋白質は、抗体応答を生じさせうるだけでなく、さらに非抗体ベースの免疫応答をも生じさせうる可能性がある。
【００１５】
本発明による蛋白質は、Ｐ．エルジノサからの抽出によって得ることができ、従って、本発明の更なる側面では、以下の工程を包含する単離・精製された蛋白質の調製方法が提供される。
【００１６】
（ａ）Ｐ．エルジノサの培養物を調製し、それらを適切な条件下で増殖させ、それらを採取し、続いて、遠心分離により洗浄して、洗浄ずみの細胞ペレットを生じさせる工程
【００１７】
（ｂ）洗浄ずみの細胞を適当な緩衝液に再懸濁させ、続いて細胞を破壊する工程
【００１８】
（ｃ）遠心分離で細胞破砕片を除去して、可溶性の細胞蛋白質を含有する上清を得る工程
【００１９】
（ｄ）得られた溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付し、塩化ナトリウム勾配で溶出させ、個々のピークに対応する画分をプールする工程
【００２０】
（ｅ）２８ｍｍ（内径）カラム中で重合させた４％Ｔ−０．３６％Ｃアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドスタッキングゲルを備えた１０％Ｔ−１．４２％Ｃアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド分離用ゲルを用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、蛋白質画分を精製する、泳動は１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０２５Ｍトリス、０．２Ｍグリシン緩衝液ｐＨ８．３を用い、上部及び下部チャンバー中、４０ｍＡ、１０Ｗで１４時間行い、ｐＨ８．３の０．０２５Ｍトリス緩衝液を用いて溶出させ、１ｍｌ／分の流速で６ｍｌずつの画分を集める工程
【００２１】
（ｆ）分子量４５ｋＤａの蛋白質を含有する画分を選び、選んだ画分から蛋白質を単離する工程。
【００２２】
別法として、適当なＤＮＡを発現させて、それらの蛋白質を調製してもよい。
【００２３】
それゆえ、本発明のさらなる側面において、本発明による蛋白質をコードする組換えまたは単離核酸もしくはそれに相補的な核酸が提供される。
【００２４】
発現のためには、その核酸（ＤＮＡであってよい）をベクター（プラスミド、コスミドまたはファージであってよい）に挿入すればよい。このベクターを宿主生物（原核生物であっても真核生物であってもよい）のゲノム中に組込む。
【００２５】
その核酸または核酸含有ベクターは、処置されるべき被検体内で本発明の蛋白質を発現するのに適したものであってもよい。すなわち、それは、ＤＮＡワクチンの形であってもよい。ＤＮＡワクチンを調製するのに適した方法および薬剤は、当業者にはよく知られているところである。
【００２６】
前述の蛋白質とともに、本発明者らは、さらなるＰ．エルジノサ蛋白質を単離・精製した。これらの蛋白質のいくつかは、抗原性であり、従って、Ｐ．エルジノサ感染の処置または予防のための方法に有用であると思われる。その方法とはかかる処置の必要な患者に、それら蛋白質のいずれかまたはそれの抗原性画分を有効量投与することからなる。
【００２７】
それらの蛋白質は、Ｐ．エルジノサ感染の診断にも有用である。
【００２８】
それゆえ、本発明のさらなる側面では、医療において、特にＰ．エルジノサ感染の処置、予防又は診断において、使用するための蛋白質または該蛋白質をコードする核酸が提供され、該蛋白質はＰ．エルジノサ由来のものであり、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって求めた分子量が約４５ｋＤａであり、
M   R   A   E   L   N   Q   G   L   I   D   F   L   K   A
Met Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala （配列番号２）
なるアミノ末端配列を有する蛋白質、または該蛋白質の構成アミノ酸配列に対してアミノ酸の少なくとも９０％が相同のアミノ酸配列を有すると共に該蛋白質の抗原性を保持した相同体である。
【００４２】
Ｐ．エルジノサ感染の処置または予防に加えて、本発明の蛋白質は、かかる感染の診断にも有用である。かくして、本発明のさらなる側面は、
【００４３】
（ａ）上に定義した抗原性蛋白質またはその相同体を試験すべき試料と接触させ；
【００４４】
（ｂ）Ｐ．エルジノサに対する抗体の存在を検出すること
からなるＰ．エルジノサの検出方法を提供する。
【００４５】
本発明の更なる一側面においては、Ｐ．エルジノサ感染の処置、予防または診断としての薬剤を調製するに際しての蛋白質又はその蛋白質をコードする核酸の用途が提供され、該蛋白質はＰ．エルジノサ由来のものであって、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって求めた分子量が約４５ｋＤａであり、
M   R   A   E   L   N   Q   G   L   I   D   F   L   K   A
Met Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala （配列番号２）
なるアミノ末端配列を有する蛋白質、または該蛋白質の構成アミノ酸配列に対してアミノ酸の少なくとも９０％が相同のアミノ酸配列を有すると共に該蛋白質の抗原性を保持した相同体である。
【００５１】
すでに述べたように、本発明者らによって単離された蛋白質は抗原性であることが示されており、従って、それら及び／又はそれらの断片は、Ｐ．エルジノサ感染の処置または診断のためのワクチンまたは薬剤として使用できる。
【００５２】
かくして、本発明は、上に定義した蛋白質またはその相同体を医薬として許容できる賦形剤とともに含有してなる医薬組成物をも提供する。
【００５３】
この組成物はワクチン組成物であってもよく、その場合、それはアジュバントをも含んでいてよい。当該技術において周知のアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル又は不完全フロイントアジュバントなどの油中水型乳剤が挙げられる。他の有用なアジュバントは当業者には周知である。
【００５４】
上述の通り、本発明者らによって単離された蛋白質は抗原性であり、それゆえ、本発明は、上に定義した蛋白質またはその相同体に特異的に結合する抗体をも提供する。該抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナルおよびポリクローナル両抗体の調製手法は当業者には周知である。
【００５５】
抗原性または免疫原性の蛋白質またはポリペプチドのスクリーニングによってエピトープ領域、すなわち蛋白質またはポリペプチドの抗原性または免疫原性に寄与している領域を確認できることは、周知である。当業者に周知の諸方法を用いて、断片及び／又は相同体及び／又は誘導体の抗原性をテストすることができる。従って、本発明の断片は、かかるエピトープ領域の一つ以上を包含しているはずであり、またはそれらの抗原性／免疫原性を保持するのに充分なだけ係る領域に類似しているはずである。例えば、本発明の断片の場合には、同一性の度合いは恐らく重要ではないであろう。それらがここに記載した蛋白質またはポリペプチド、相同体または誘導体の特定の部分と１００％同一でありうるのだから。必要不可欠なのは、繰り返すが、当該断片がそれを誘導するもととなった蛋白質の抗原性／免疫原性を保持していることである。
【００５６】
該蛋白質は、経腸、たとえば経口、経鼻、口腔内、局所または経肛門投与あるいは非経口投与を含む種々の経路によって投与すればよい。
【００５７】
前記組成物がとる形態およびそれが含有する賦形剤は、当然のことながら、選択した投与経路に依存する。例えば、経口処方は、シロップ剤、エリキシル剤、錠剤の形態であってよく、錠剤は、胃内での分解から蛋白質を保護するために腸溶性のコーティングが施されていてもよい。経鼻または経皮処方は、通常、それぞれ噴霧剤または貼付剤である。注射用処方は、蒸留水またはその他の医薬として許容しうる溶媒または懸濁剤中の溶液または懸濁液であってよい。
【００５８】
さらなる一面では、本発明は、ここで定義した蛋白質の有効量を被験者に投与する段階を包含するところのＰ．エルジノサに対する被験者に予防接種を行う方法を提供する。
【００５９】
ワクチン接種の場合の本発明の蛋白質の適切な用量は、非経口的に投与するとき、約５〜１００マイクログラムであろう。しかし、経鼻および経口投与の場合には、この用量は、処方、アジュバント、患者のプロフィールなどにもよるが、１０〜１００倍になるであろう。
【００６０】
当業者ならば理解するであろうが、上記用途のいずれにおいても、全長蛋白質にかえて、それら蛋白質の上記抗原性断片を使用することができる。
【００６１】
本発明の各面の好ましい特徴は、各々の面について相通じるものである。本明細書中で述べた先行文献を、法の許す限りにおいて引用によりここに挿入する。
【００６２】
以下の実施例および図面により、本発明をさらに詳細に説明する。
【００６３】
実施例１−Ｐ．エルジノサからの蛋白質の単離
菌株
精製のため、免疫化と相同試験のために、ムコイド型（粘液状）Ｐ．エルジノサ単離株３８５、血清型２を用いた。この菌株は、もともとは、嚢胞性線維症の慢性罹患患者から単離されたものである。細菌株は、１０％グリセリン（ｖ／ｖ）を添加したニュートリエント・ブロス（オキソイド・ユニパス（株）、英国ハンプシャー州ベイシングストーク）中、−８５℃で貯蔵した。
【００６４】
細菌培養条件
各々の抽出に、ニュートリエント寒天平板培地（オキソイド・ユニパス（株）、英国ハンプシャー州ベイシングストーク）２００枚を使用した。ローン（ｌａｗｎ）培養用寒天平板に細菌を画線接種し、３７℃で一夜インキュベートした。細菌をかきとって集め、遠心分離（１２０００ｘｇ、１４分間、４℃、ベックマン遠心分離機）によって３回洗った。各々の遠心分離工程に続いて、細菌ペレットを確保し、つぎに新鮮な無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。
【００６５】
蛋白質精製
洗った細菌ペレットを２０ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウムおよび１ｍＭβ―メルカプトエタノール（ｐＨ４）中に再懸濁させた。懸濁液を室温で４５分間攪拌したのち、８０ｍｌの５００ｍＭ塩化カルシウム、５％ｗ／ｖツヴィッタジェント(Zwittergent )３―１４ＴＭ（カルビオケム、オーストラリア、ＮＳ、アレキサンドリア）を加えた。これを室温で９０分間攪拌状態においたのち、２０％（ｖ／ｖ）無水エタノールを加えた。溶液を４℃で２時間放置した。この懸濁液を、１７０００ｘｇで、４℃において１５分間遠心分離して、上清を最終濃度８０％（ｖ／ｖ）エタノールに調整した。この溶液を４℃で一夜保持した。溶液を、１７０００ｘｇで、４℃において２５分間遠心分離し、蛋白質ペレットを３０ｍｌの緩衝液Ｚ（５％ツヴィッタジェント３―１４ＴＭ（ｗ／ｖ）、５０ｍＭトリスおよび０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に再懸濁させ、室温で４５分間インキュベートした。溶液を、１２０００ｘｇで、４℃において１５分間遠心分離し、上清を確保し、蒸留水に対して４℃で一夜透析した。粗製蛋白質抽出液を−７０℃で凍結し、凍結乾燥した。
【００６６】
陰イオン交換クロマトグラフィー
バイオ・スケール(Bio-scale)Ｑ２ＴＭおよびＱ５ＴＭ（バイオ・ラド(Bio-Rad)）を用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。それらのカラムは、負に荷電した蛋白質の結合を促進するために、強塩基性第四級アンモニウム基（-Ｎ＋(ＣＨ３)３）で誘導体化したＭＰ１０保持体マトリックスであった。カラムを２０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）により、流速２ｍｌ／分で平衡化した。凍結乾燥した粗製蛋白質抽出物を＜５ｍｇ／ｍｌ（Ｑ２）または＜２０ｍｇ／ｍｌ（Ｑ５）の濃度になるよう緩衝液Ａに懸濁させた。緩衝化塩化ナトリウム（緩衝液Ｂ、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム）を濃度を増しながら、流速１ｍｌ／分で導入して、蛋白質をカラムから溶出させた。ピーク頂部の画分をそれぞれ一夜透析し、−７０℃で凍結し、凍結乾燥して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。異なるピークに相当する画分を別々にプールして、さらに精製した。
【００６７】
ＳＤＳ−分取(preparative)用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いての精製
部分精製した蛋白質を、分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてさらに精製した。陰イオン交換カラムからのプールした画分を凍結乾燥し、極小量の蒸留水に再懸濁させ、さらに４倍量のＳＤＳ還元性緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８；１０％ｖ／ｖグリセリン；２％ｗ／ｖＳＤＳ；５％ｖ／ｖβ―メルカプトエタノール；１．２ｘ１０−３％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）に溶解させた。この調製物を３７℃で少なくとも３０分間インキュベートしたのち、電気泳動カラムのスタッキングゲルに装填した。
【００６８】
分取用ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２８ｍｍ（内径）カラム中で重合させた４％Ｔ−０．３６％Ｃアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドスタッキングゲル１０ｍｌを備えた１０％Ｔ−１．４２％Ｃアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド分離用ゲル２０ｍｌを含むバイオ−ラドの４９１プレプ・セルを用いて実施した。スタッキングおよび分離用のゲルは、３０％／２．６７ｗ／ｖアクリルアミド／ビス−アクリルアミド単量体貯蔵液（バイオ−ラド）から調製した。上部及び下部チャンバーで、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０２５Ｍトリス、０．２Ｍグリシン緩衝液ｐＨ８．３を用いて蛋白質を移動させた。泳動条件は、４０ｍＡ、１０Ｗ、１４時間であった。０．０２５Ｍトリス、ｐＨ８．３を用いて蛋白質を溶出させ、流速１ｍｌ／分で６ｍｌずつの画分を集めた。集めた画分を−７０℃で凍結し、凍結乾燥し、５画分ごとにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。同じ蛋白質を含有する確認ずみの一連の画分をつぎにプールした。
【００６９】
電気溶出
いくつかの精製では、分取用ゲル電気泳動に代えて電気溶出を用いた。プロテアンＩＩＴＭｘｉセル（バイオ−ラド）および垂直スラブ電気泳動セットアップを用いての電気泳動により、粗製蛋白質または部分精製画分を分離した。電気泳動は、１６ｃｍ（ｗ）ｘ１６ｃｍ（ｈ）、１．０ｍｍ（ｄ）のユニット中で重合させた１０％Ｔ−１．４２％Ｃアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド分離用ゲルと４％Ｔ−０．３６％Ｃアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドスタッキングゲルを用いて行った。スタッキングゲルを通しての泳動の間は１６ｍＡ、分離用ゲル中での分離には２４ｍＡで電気泳動を行った。
【００７０】
スラブゲルからの蛋白質バンドの溶出は、Ｇｅｌ  ＥｌｕｔｅｒＴＭ（バイオ−ラド）全体を用いて達成した。溶出は、ゲルの厚みを横切る方向に、２５０ｍＡで４５分間実施した。狭いチェンバー内に溶出した蛋白質を真空下に１２ｍｍｘ７５ｍｍのチューブに集めた。
【００７１】
ＳＤＳの除去
電気泳動条件下で単離した蛋白質はＳＤＳを含有しており、これをその後に除去した。これは、濃縮した蛋白質画分に燐酸カリウムを２０ｍＭ濃度になるよう添加することを含んでいた。試料を６０分間氷の上に置いておき、沈殿したＳＤＳを、６０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離して除去した。試料を透析により脱塩した。
【００７２】
画分分析
液体カラムクロマトグラフィーおよび分取用ゲル電気泳動または電気溶出の両者からの画分の蛋白質含量を、分析用ＳＤＳ―ＰＡＧＥおよび銀またはクーマシー染色によって評価した。特定溶出画分中の関心の対象である蛋白質の存在は、分析用染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって確認した。均一な（単一の）バンドのみを含有する画分をプールし、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ蛋白質アッセイ試薬およびＰｉｅｒｃｅＴＭアルブミン標準（ラボラトリーサプライズ、オーストラリア、ＮＳＷ、マリックヴィル）を用いて、蛋白質濃度を求めた。
【００７３】
分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）が記載しているところに準じて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、関心の対象である蛋白質の存在について画分を分析した。１０μｌの画分試料を、ＳＤＳおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する等量の試料緩衝液に加え、５分間煮沸した。ＢｉｏｒａｄＴＭシステムを用い、ミニゲルで、１０−１５％の勾配の電気泳動を行った。分子量マーカー（ファルマシア）を同じゲル上で泳動させて、蛋白質の分子量を求めた。
【００７４】
ＳＤＳの除去
この方法は、濃縮した蛋白質試料に燐酸カリウムを２０ｍＭ濃度になるよう添加することを含んでいた。つぎに、試料を６０分間氷の上に置いておき、沈殿したＳＤＳを、６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離して除去し、蒸留水に対する透析を用いた。
【００７５】
ポリアクリルアミドゲルの染色
分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、クーマシー染色または銀染色を行った。４００ｍｌのメタノール、１００ｍｌの酢酸および５０ｍｌの脱イオン水に溶解させた１．０ｇのクーマシーブルーＲ−２５０（バイオラドＴＭ）からなるクーマシー染色液中で、ゲルを６０分間染色した。４００ｍｌのメタノール、１００ｍｌの酢酸および５００ｍｌの脱イオン水からなる脱色液中で、脱色を行った。
銀染色は、３０％メタノール、１０％酢酸およびホルムアルデヒド中で四時間ゲルを固定することを含んでいた。５０％エタノールで洗ったのち、０．８ｍＭチオ硫酸ナトリウムで１分間、ゲルの前処理を行った。３回水で洗ったのち、銀染色液中で２０分間インキュベートした。さらに２回水で洗ったのち、現像液（１８％炭酸ナトリウム、ホルムアルデヒドおよびチオ硫酸ナトリウム）中でのインキュベーションを行った。５０％メタノールおよび１２％酢酸の溶液で反応を停止させた。
【００７６】
蛋白質濃度の測定
蛋白質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ蛋白質アッセイ試薬およびＰｉｅｒｃｅアルブミン標準（ラボラトリーサプライズ、オーストラリア、ＮＳＷ、マリックヴィル）を用いて、求めた。
【００７７】
リポ多糖の測定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色およびＥ−ＴＯＸＡＴＥカブトガニ溶解物試験（シグマ、合衆国ミズーリ州セントルイス）によるアッセイの両者によって、リポ多糖（ＬＰＳ）の存在を評価した。
【００７８】
結果
【００７９】
図１は、Ｐ．エルジノサのツヴィッタジェント抽出物の陰イオン交換クロマトグラフィーによる溶出プロフィルを示している。７つのピークが明瞭に見られる。最初の５つのピークを個々にプールして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、それら蛋白質の分子量を求めた（図２）。実施例４で論じる免疫化研究のために、分取用電気泳動によって蛋白質をさらに精製した。図３は、免疫化研究に用いた精製蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【００８０】
実施例２
Ｐａ８０の精製
免疫化研究に用いるのに十分な量の蛋白質を単離するための精製プロトコールを、Ｐ．エルジノサからの蛋白質のために開発した。ツヴィッタジェント界面活性剤抽出、液体カラムクロマトグラフィーおよび分取用ＳＤＳ−ＰＡＧＥからなる３工程プロセスを、分離のために利用した。抗原Ｐａ８０をＰ．エルジノサ３８５（血清型２）から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製した試料の均一性が確認された。Ｐａ８０（８０ｋＤａ）を単離し、内毒素汚染がないこと、従ってそれのワクチンとしての可能性を検討するのに適していることが確認した。
【００８１】
材料および方法
Ｐ．エルジノサ株３８５（血清型２）の菌体を用いて、免疫化のためのＰａ８０を精製した。細菌を一夜培養し、集菌し、洗い、先に記載したようにして（実施例１）、界面活性剤で抽出可能な粗製の試料を得た。凍結乾燥した粗製の抽出物を、極小量の蒸留水およびＳＤＳ−還元性緩衝液に再懸濁させた。Ｐａ８０の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび分取用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行った。
Ｐａ８０特異的抗血清を用いて、ウェスタンブロットおよびドットブロットを行った。ウェスタンブロットのためには、Ｐ．エルジノサ株３８５の細胞溶解物を、分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、１０−２０％勾配のポリアクリルアミドゲルを用いての電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄＴＭ）に半乾式転移装置（ＢｉｏＲａｄＴＭ）を用いて転移させた。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の１％ｖ／ｖスキムミルク中で６０分間ブロックしたのち、膜を、プールした免疫血清の１／１０００希釈液とともに、室温で９０分間インキュベートした。ついで、膜をＴＢＳおよび０．０５％のトゥイーン２０（ＴＴＢＳ）で洗い、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ラットＩｇＧの１／１０００希釈液中で９０分間インキュベートした。ＨＲＰ現像試薬（ＢｉｏＲａｄＴＭ）を用いてブロットを現像し、ＧＳ５７０濃度計（ＢｉｏＲａｄＴＭ）を用いてスキャンした。Ｐａ３８５（血清型２）細胞溶解物のドットブロットを直接ニトロセルロース膜に適用した。その後の工程はウェスタンブロットの通りであった。
【００８２】
結果
ツヴィッタジェント抽出によるＰａ８０の精製
この研究により、Ｐａ８０特異的抗血清を用いて、細胞溶解物内のＰａ８０の免疫認識が確認された。（図４および図５）
【００８３】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてのＰａ８０の精製
ツヴィッタジェント抽出液からの粗製蛋白質を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに分離した。バイオスケールＱ２（ＢｉｏＲａｄＴＭ）は、複合抽出物を概ね７つの個々の蛋白質ピークに分離した（図１）。Ｐａ８０は、第五ピーク中にあると思われたので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量により確認した（図２）。陰イオンカラムからのＰａ８０の抽出条件は、８０％緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）および２０％緩衝液Ｂ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）、ＵＶ（ＡＵ）０．２２８、伝導率（ｍＳ／ｃｍ）０．６７４であった。
【００８４】
分取用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてのＰａ８０の精製
ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｅｐセル４９１型およびプロテアンＩＩ分取用ＳＤＳ−ＰＡＧＥの両者を用いて、Ｐａ８０含有画分から変性条件下に蛋白質をさらに精製した。
銀染色したゲルを点検して、ＬＰＳ汚染の有無を評価したところ、無しと考えられた。Ｅ−ＴＯＸＡＴＥカブトガニ溶解物試験を用いての定量では、すべての標品について検出レベル（限度０．０１５ＥＵ／ｍｌ）未満であることが見出された。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
考察
Ｐａ８０の同定
Ｐａ８０は、ツヴィッタジェント抽出と陰イオン交換クロマトグラフィーとの組合せを用いて均質性となるまで精製されている。この蛋白質は、免疫化ラットからの血清によって認識され、肺への生きたＰ．エルジノサのチャレンジに対して保護作用があることが示される（実施例４参照）。この蛋白質は、Ｐ．エルジノサ感染に対する免疫化のために以前には試験されていなかった抗原である。
【００８７】
実施例３−精製蛋白質の配列決定
オーストラリア国立大学分子構造・機能センター生体分子資源施設および英国リバプール大学において、Ｐａ８０について、ＮＨ２-末端および内部の両アミノ酸配列の分析が行われた。配列決定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ適合性のＳ−２−カルボキシアミドエチル化法を用いて行った。蛋白質のこのアルキル化反応は、１０％グリセリン（ｖ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２５ＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  １，４−ジチオスレイトール（１，４−ＤＴＴ）の溶液、ｐＨ８．３中で行った。蛋白質を、最初にこの混合物を９０℃で１５分間インキュベートすることにより還元した。つぎに、試料を３７℃に冷却し、アクリルアミドを最終濃度３Ｍまで加え、混合物を、アルゴン気流中、遮光して３０〜６０分間インキュベートした。ＳＤＳ還元性緩衝液を加え、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、クーマシー染色によって蛋白質を可視化し、ゲルから切出した。配列分析に続いて、得られたデータをＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール、国立生物工学情報センター、合衆国メリーランド州ベセスダ）検索に付した。
【００８８】
Ｐａ８０の場合、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させ、ＰＶＤＦ上にウェスタンブロットした。バンドを切出し、直接シークエンサーにかけた。Ｎ末端分析は、エドマン分解によって行った。
【００８９】
蛋白質抗原の精製およびそれらの確認
上記のように、Ｐ．エルジノサ３８５から蛋白質を精製した。蛋白質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）およびアミノ酸配列決定によって評価したが、ともに成功裏に均質な蛋白質標品を同定確認した。蛋白質標品中のＬＰＳレベルの評価では、Ｅ−ＴＯＸＡＴＥキットのカブトガニ試験により評価したところでは、検出可能なレベルの内毒素は示されなかった（試験の検出限界は０．０１５内毒素単位／ｍｌであった）。
【００９０】
Ｎ末端アミノ酸配列分析に続いて、Ｇｅｎｂａｎｋの配列およびＰＡ０１データベース中のインターネットに掲示されている配列の電子データベース検索を「Ｅｎｔｒｅｚ」を用いて行い、蛋白質を同定しようとした（表２参照）。Ｐａ１３のＮ−末端配列は、ＡＥＴＩＶＮＴＴＫＡ（配列番号１）であると決定された。この１０残基の配列は、Ｐ．エルジノサに相当する配列が見つからず、この蛋白質が未だ配列決定されていないことが示唆された。
【００９１】
Ｐａ２０のＮ末端配列は、ＳＴＩＥＥＲＶＫＫＩＶＡＥＱＬ（配列番号４）であると決定された。これは、Ｐ．エルジノサ由来のアシルキャリヤー蛋白質（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｏ５４４３９）およびシュードモナス・シリンガエ由来のそれ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｐ８０９２３）と１５アミノ酸が重複して１００％の同一性を示した。
【００９２】
Ｐａ４０のＮ末端配列は、ＭＲＨＧＤＩＳＳＳＮＤＴＶＧ（配列番号５）であると決定された。これは、Ｐ．エルジノサ由来のアミダーゼ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｐ１１４３６およびＭ２７６１２）と１４アミノ酸が重複して１００％の同一性を示した。
【００９３】
Ｐａ４５のＮ末端配列は、ＭＲＡＥＬＮＱＧＬＩＤＦＬＫＡ（配列番号４）であると決定された。
【００９４】
Ｐａ８０のＮ末端配列は、ＭＳＥＱＮＮＥＱＲＳＱＡＡ（配列番号３）であると決定された。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
実施例４−ラットモデルにおける免疫化に続いての細菌クリアランス
雄性ＤＡ系ＳＰＦラットに、実験第１日にパイエル板内（ＩＰＰ）免疫を行い、第１４日に気管内（ＩＴ）追加免疫を行い、第２１日に生きた細菌による攻撃感染（チャレンジ）を行った。動物は麻酔によって鎮静化した。正中腹部切開によって小腸を暴露し、２７ゲージの針を用いて、各パイエル板に抗原を漿膜下注射した。免疫用蛋白質は、１ｍｌ当り１００または２００μｇ（それぞれラット一匹あたり接種材料の総量５または１０μｇに相当）の蛋白質を１：１比の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）とに乳化させて調製した。ＩＰＰ免疫から１４日後に、５０μｌのＰＢＳ中の５または１０μｇの蛋白質を動物に追加ＩＴ投与した。ＩＰＰ免疫から２１日後に、動物に、生きたＰ．エルジノサ（細菌数５ｘ１０８ ＣＦＵ）を４時間にわたりチャレンジさせた。細菌は、栄養寒天平板上で５％ＣＯ２ 中３７℃で一夜培養してから、回収し、洗浄し、ＰＢＳに所要濃度になるよう懸濁させた。ＩＴ追加免疫用の蛋白質またはチャレンジ用の細菌を、経口的に気管に挿入したカニューレを介して鎮静化ラットの肺に導入した。細菌によるチャレンジから４時間後に、動物を安楽死させた。血液を集め、血清のアリコートを−２０℃で保存して、抗体分析に備えた。肺を、５ｘ２ｍｌのＰＢＳで洗い流しにより洗浄し、プールした洗浄液（ＢＡＬ）を細菌数について評価した。肺洗浄に続いて、肺を切除し、ホモジナイズして、細菌数について評価した。実験は、実施例１で単離した蛋白質のすべてを用いて実施した。しかし、結果は、保護効果を示した蛋白質についてのみ示す。
【００９７】
結果―肺クリアランスに対する免疫の効果
表３は、一次ＩＰＰおよび二次ＩＴ免疫のための用量および処置した動物の数（Ｎ）を示している。表４は、免疫ラットおよび対照ラットで得られた細菌クリアランスレベルを示している。結果は、細菌負荷は減少したが統計的有意には至らなかったＰａ２０（ＡＣＰ）免疫群における回収率を除いて、ＢＡＬおよび肺ホモジネートの両者におけるクリアランスレベルの有意な差を示している。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
【表４】
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【０１００】
表４において、攻撃感染から４時間後のＰ．エルジノサのＣＦＵ（ｌｏｇ１０）として示した値は、生きたＰ．エルジノサによる肺への同種攻撃感染から４時間後のラットのＢＡＬ液または肺ホモジネートの平均±標準誤差である。
【０１０１】
Ｐａ４０（アミダーゼ）、Ｐａ４５およびＰａ８０のＢＡＬ値は、非免疫群とは、ｐ＜０．０１で有意差がある。
【０１０２】
Ｐａ１３のＢＡＬ値およびＰａ１３、Ｐａ２０（ＣＡＰ）、Ｐａ４０（アミダーゼ）、Ｐａ４５およびＰａ８０の肺ホモジネート値は、非免疫および単回免疫群とは、ｐ＜０．０５で有意差がある。
【０１０３】
実施例５−フローサイトメトリー
Ｐ．エルジノサ菌株３８５を、ニュートリエント・ブロス中、対数期の中間まで増殖させ、１０００ｘｇで、４℃において１０分間遠心分離して集菌した。つぎに、細菌を、１：５０希釈（ＰＢＳ中）して、非免疫血清、免疫血清またはＰＢＳとともに、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、上清を除き、細菌を、抗ラットＩｇＧに結合させたフルオレセインイソチオシアネートの１：５０ＰＢＳ希釈液２００μＬ中に懸濁させた。３７℃で３０分間のインキュベーションののち、１．８ｍｌのＰＢＳを加えて、細菌細胞をフローサイトメトリー（コールターＺＬ−ＭＣＬ）により分析した。計２００００の細胞を計数し、前方散乱、側方散乱および蛍光について対数モードの計器状態で、データを得た。
【０１０４】
結果
非免疫ラット血清を対照として用いたが、Ｐ．エルジノサへの非特異的結合は示さなかった（図６の曲線１）。蛋白質免疫ラットからの抗血清の結合の程度は、図６の曲線２に示されている。結合度は、グラフにおける蛍光曲線の右へのシフトの程度によって求める。かくして、抗Ｐａ１３は表面結合を示さなかった。一方、Ｐａ２０（ＡＣＰ）、Ｐａ４０（アミダーゼ）、Ｐａ４５およびＰａ８０に対する抗血清は、Ｐ．エルジノサに対する有意の表面結合を示した。
【０１０５】
実施例６−Ｐａ４０およびＰａ４５遺伝子のクローニング
Ｐ．エルジノサＰａ３８５の染色体ＤＮＡの精製
Ｐ．エルジノサを、実施例１に記載の通りにして培養した。細菌をＰＢＳ３０ｍｌ中で洗い、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収し、この操作を反復した。洗浄したペレットを、１０ｍｌの５０ｍＭトリスＨＣｌおよび０．４ｍｌの０．４Ｍ  ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、３７℃で２０分間インキュベートとした。つぎに、０．４ｍｌの２０ｍｇリゾチーム／ｍｌを加え、混合物を３７℃で１０分間さらにインキュベートし、５４０μｇのプロテアーゼＫ、０．４ｍｌの１０％ｗ／ｖＳＤＳおよび１０μｌの１０ｍｇリボヌクレアーゼＡ／ｍｌを加えた。混合物をつぎに３７℃で２時間または懸濁液が澄明になるまでインキュベートした。最初の抽出のために、１０ｍＭトリスＨＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡで飽和させたフェノール８ｍｌを３７℃で３０秒間混合し、ＤＮＡ相を抽出した。第２の抽出のため、ＤＮＡ相を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）が５ｍｌはいった第２のチューブに移し、氷上で３０秒間混合した。混合物をつぎに８０００ｒｐｍで、４℃において１５分間遠心分離した。第３の抽出のため、ＤＮＡ相を、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）が５ｍｌはいったチューブへ移し、８０００ｒｐｍで、４℃において１５分間遠心分離した。第四の抽出には、第３の抽出工程を繰返した。２倍容の冷無水エタノールを用いて、ＤＮＡを沈殿させた。巻き取ったＤＮＡを７０％ｖ／ｖエタノールに浸漬し、１−２ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁させて、４℃で保存した。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドの設計
リーディングフレームへの正確な指向（オリエンテーション）を確保するために、位置指定クローニングを選択した。ＧＣ含量を極大化して、オリゴヌクレオチドをＧＩＢＣＯ  ＢＲＬカスタムプライマー類（ライフ・テクノロジーズ、メリーランド州ロックヴィル）から得て、つぎのように設計した：
Ｐａ４０ＢＦ、アミダーゼ遺伝子の始まりをコードする５′オリゴヌクレオチド。配列（５′から３′へ向けて）GGC GGA TCC CGT CAC GGC GAT ATT TCC AGC AGC A。
このオリゴヌクレオチドの長さは３４量体であり、ＢａｍＨＩ制限部位に挿入した。カップリング効率は９９％と推定され、ＧＣ含量は６１％であった。
Ｐａ４０ＨＲ、アミダーゼ遺伝子の３′末端をコードする３′オリゴヌクレオチド。配列（５′から３′へ向けて）GGC AAG CTT GGC CTC CTT CTC CAG TCC CTC。このオリゴヌクレオチドの長さは３０量体であり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入した。カップリング効率は９９％と推定され、ＧＣ含量は６３％であった。Ｐａ４５ＢＦ、Ｐａ４５遺伝子の始まりをコードする５′オリゴヌクレオチド。配列（５′から３′へ向けて）GGC GGA TTC CGC GCA GAA CTC AAC CAG GGC CTG。このオリゴヌクレオチドの長さは３３量体であり、ＢａｍＨＩ制限部位に挿入した。カップリング効率は９９％と推定され、ＧＣ含量は６７％であった。
Ｐａ４５ＨＲ、Ｐａ４５遺伝子の３′末端をコードする３′オリゴヌクレオチド。配列（５′から３′へ向けて）GGC AAG CTT GGG CAG CTC GCT GCT GGC GTA GAA。このオリゴヌクレオチドの長さは３３量体であり、ＨｉｎｄIII制限部位に挿入した。カップリング効率は９９％と推定され、ＧＣ含量は６３％であった。
【０１０７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲ反応混合物は、反応混合物全体で５０μｌ中、１ｎｇのＰａＤＮＡ、１５ｐｍｏｌの（各）プライマー、７．５μＭの（各）ｄＮＴＰおよび１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）からなっていた。増幅に用いた条件は、サイクル１［９４℃−３分間、５５℃―１０秒間、７２℃―１５秒間］ｘ１サイクル；サイクル２［９４℃―１０秒間、５０℃―１０秒間、７２℃―１５秒間］ｘ３５サイクル；サイクル３［７２℃―５分間、２５℃−１分間］ｘ１サイクルで、コーベットＦＴＳ４０００サーマルシークエンサー（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃ、オーストラリア、ＮＳＷ、シドニー）を使用した。ＰＣＲ生成物のサイズおよび非特異的生成物は、１％寒天ゲルでの電気泳動により評価した。
【０１０８】
Ｐａ４０およびＰａ４５遺伝子のクローニング
ＰＣＲに続いて、使用されなかったｄＮＴＰを、シリカマトリックス法（プロジェン・インダストリーズ）を用いて除去し、精製物をアガロースゲルで可視化して、回収をチェックした。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクター系（プロメガ、合衆国）に連結（ライゲート）した。挿入断片とベクターとのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、製造者が推奨している標準的条件のもとで実施した。試料を４℃で一夜放置した。
【０１０９】
連結したＤＮＡを、ＣａＣｌ２法によって形質転換に用いた。ＪＭ１０９コンピテント細胞を氷の上で５分間かけて融解させ、９００μｌの０．１Ｍ  ＣａＣｌ２を加えた。各２００μｌのアリコートに、１μｌのＤＮＡを加えた。挿入断片のない陽性対照プラスミドおよびＤＮＡの代わりに水を用いた陰性対照を実施した。細胞を氷上で３０分間インキュベートしたのち、４５℃で４５秒間熱ショックを加えた。細胞を１ｍｌアリコートのＬＢ培地に入れて回収し、３７℃に置き、１５０ｒｐｍで１時間振盪した。形質転換混合物の１：１００および１：１０希釈物（ＬＢブロスで希釈）ならびに未希釈の形質転換混合物を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天平板で培養した。プラスミド１μｇ当りの形質転換体の数を求めた。
【０１１０】
小培養の迅速スクリーニング
形質転換体の個々のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを含有するＬＢブロス５ｍｌ中に入れ、３７℃、１８０ｒｐｍで、一夜インキュベートした。ベクターを線状化後アガロースゲル上で可視化して、白いコロニーで挿入断片をチェックした。
【０１１１】
ＤＮＡ配列の決定
組換えプラスミドからの二本鎖ＤＮＡは、ＮＳＷ（ニュー・サウス・ウェールズ）大学で配列決定された。配列決定のための製品は、ｐＵＣ／Ｍ１３前進または逆戻りプライマーおよびビッグ・ダイ・ターミネーター混合物を用い、３．２ｐｍｏｌのプライマーと１００ｎｇの鋳型を滅菌水で体積１０μｌとして、調製した。カーベット・ＦＴＳ４０００サーマルシークエンサーで、サイクル系列［９６℃―１０秒間、５０℃―５秒間、６０℃―４分間］ｘ２５サイクルを実施した。配列分析には、ＤＮＡストライダー（Ｓｔｒｉｄｅｒ）１．３を用いた。
【０１１２】
結果
Ｐａ４０の配列および交差株の存在の証明
Ｐ．エルジノサ３８５由来のＰａ４０の配列解析を図７に示す。決定された核酸配列のＮ末端領域のアミノ酸翻訳は、Ｎ末端アミノ酸配列決定で得られた配列番号５のアミノ酸と相同である。他のＰ．エルジノサ株、また他の血清型中にＰａ４０遺伝子が存在するかどうかを、特定のプライマー：Ｐａ４０ＢＦおよびＰａ４０ＨＲを用いて評価した。結果は、試験したすべての菌株および血清型に正確なサイズのＰＣＲ産物を証明している（下記表５参照）。
【０１１３】
Ｐａ４５の配列および交差株の存在の証明
Ｐ．エルジノサ３８５由来のＰａ４５の配列解析を図８に示す。決定された核酸配列のＮ末端領域のアミノ酸翻訳は、Ｎ末端アミノ酸配列決定で得られた配列番号２のアミノ酸と相同である。他のＰ．エルジノサ株、また他の血清型中にＰａ４０遺伝子が存在するかどうかを、特定のプライマー：Ｐａ４５ＢＦおよびＰａ４５ＨＲを用いて評価した。結果は、試験したほとんどの菌株および血清型に正確なサイズのＰＣＲ産物を証明している（下記表５参照）。血清型Ｐａ３７３、血清型１２、血清型１４および血清型１７の場合には、ＰＣＲ産物が得られなかった。
【０１１４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  粗製のツヴィッタジェント抽出液から陰イオン交換クロマトグラフィーによるＰ．エルジノサ蛋白質の溶出プロフィルを示す。
【図２】  Ｐ．エルジノサの粗製ツヴィッタジェント抽出液の陰イオン交換クロマトグラフィーからのピーク画分のＳＤＳ―ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３】  精製Ｐ．エルジノサ抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。試料は４−１５ポリアクリルアミドゲル上で分析し、クーマシー染色した。レーン：１−分子量標準（左の値の単位はｋＤａ）；２−Ｐａ１３；３−Ｐａ２０（ＡＣＰ）；４−Ｐａ４０（アミダーゼ）；５−Ｐａ４５；６−Ｐａ８０。
【図４】  抗原特異的抗血清によるＰ．エルジノサ（菌株３８５）細胞中のＰａ８０の認識を証明するウェスタンブロットを示す。
【図５】  抗原特異的抗血清によるＰａ８０の認識を証明するＰ．エルジノサ３８５（血清型２）のドットブロットを示す。
【図６】  Ｐ．エルジノサに結合する抗原特異的抗体（ＩｇＧ）を検出するためのカウント（縦軸）とｌｏｇ蛍光（横軸）のグラフを示す。曲線１は、非免疫血清によるネガティブ結合を示し、曲線２は、蛋白質抗血清による結合に続く蛍光の検出を示す。
Ａ：抗Ｐａ１３；Ｂ：抗Ｐａ２０（ＡＣＰ）；Ｃ：抗Ｐａ４０（アミダーゼ）；Ｄ：抗Ｐａ４５；Ｅ：抗Ｐａ８０。
【図７】  Ｐａ４０の場合のＤＮＡと翻訳されたアミノ酸配列を示す。
【図８】  Ｐａ４５の場合のＤＮＡと翻訳されたアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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