(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＲ６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６１６）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
ハイブリドーマＨＲ６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６１６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘリコバクター・ヘパティカスの特異的抗原及びそのモノクローナル抗体及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌においてはヘリコバクター・ピロリが発癌に強く関与していることが疫学的調査から明らかになっている。スナネズミを用いたモデルにおいてもヘリコバクター・ピロリ感染が化学発癌剤による腺胃癌の発生を増強し、除菌によりその効果が減弱することが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリ感染と胃疾患に関する検討が進むにつれて、ほかのヘリコバクター属の感染と臓器の病変との関係が検討されるようになってきた。
ヒト肝臓癌におけるＢ型、Ｃ型肝炎ウィルス感染との係わりは、発癌にいたる種々の遺伝子変異やウィルスの持つ発癌要因について様々なモデルを用いた検討から次第に明らかになりつつある。しかし、このような肝炎ウィルスに感染していないヒトにおいても肝癌の発生が認められている。
【０００４】
ヒト肝臓癌の発生過程は慢性肝炎から肝硬変、肝臓癌へ進行することから、肝炎の発生原因についての検討も重要視されている。Ａ／ＪＣｒマウスに肝炎と肝腫瘍が高率に発生することから、この原因について検討が進められた。その結果、肝臓に感染したヘリコバクター・ヘパティカスに起因していることが同定された（非特許文献２）。
【０００５】
ヘリコバクター・ヘパティカスの検出方法としては糞便、バイオプシーを採取してＰＣＲや培養による確認が行われており、なかでも糞便を用いた１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特異配列をＰＣＲにより増幅して検出する感染診断法がマウスの感染を診断するために用いられている（非特許文献３、非特許文献４）。また、マウスの盲腸内容物や糞便を用いて、蛍光ＰＣＲにより定量的にヘリコバクター・ヘパティカス感染を測定した報告もある（非特許文献５）。ヒトにおいては、肝臓組織のＰＣＲによる１６Ｓ  ｒＲＮＡの感染診断が報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
しかし、肝臓のバイオプシーの採取は侵襲的な手技のため、非侵襲的な糞便や血漿（あるいは血清）を用いた簡便な方法の確立が望まれている。血中の抗体価を測定する方法は、特にヒトの場合、ヘリコバクター・ピロリ感染者が多いため、交差反応性によりヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物を用いて測定した血中抗体価と感染は一致しない。そこで、血中の抗体価の測定はヘリコバクター・ピロリ菌の抽出物で血中の共通抗体を吸収させた後に抗ヘリコバクター・ヘパティカス抗体価を測定している（非特許文献７）。
【０００７】
抗体価を特異的に検出する抗原として、ヘリコバクター・ピロリにおいては２６ｋＤａ（非特許文献８）のタンパク質が報告されている。病態との関連ではヘリコバクター・ピロリで血中抗体によるイムノブロットで検出されるバンドの中で１２５ｋＤａ（ＣａｇＡ）、８７ｋＤａ（ＶａｃＡ）、３５ｋＤａ（ｕｎｋｎｏｗｎ）と胃潰瘍の関係が検討され、１２５ｋＤａおよび８７ｋＤａのバンドで８３．３％（ｎ＝１２）、３５ｋＤａは１００％の割合で胃潰瘍患者から検出されたと報告されている（非特許文献９）。
しかし、ヘリコバクター・ヘパティカスでは、どの特異抗原に対する抗体価の上昇が感染あるいは病態と一致するかは確認されていない。
【０００８】
特許文献１にヘリコバクター・ピロリあるいはヘリコバクター・ヘパティカスの免疫学的測定について記載しているが、相互の交差反応性について何等記載していない。また、ＲＯＢＥＲＴ  Ｓ  ．ＬＩＶＩＮＧＳＴＯＮ等は１８ｋＤａのタンパク質が特異性に優れていると記載しているが、この抗原の抗体がヘリコバクター・ヘパティカス感染マウスを検出することに成功していない（非特許文献１０）。
Ｉｒｙｎａ  Ｋｏｒｎｉｌｏｖｓ｀ｋａ等（特許文献２）は２７種のタンパク質とそれらを認識する抗体を記載しているが、本発明の抗原及び抗体とは異なるものである。また、Ｉｎｇｒｉｄ  Ｎｉｌｓｓｏｎ等（非特許文献１１）にはヘリコバクター・ヘパティカスに特異的な７６、３０、２１ＫＤａの３種のタンパク質が記載されているが、本発明の抗原とは異なるものである。
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５２９７０５
【特許文献２】国際公開第０２／１０２８４２号パンフレット
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｎ．ら，「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ」，２０００年，６０巻，p.１５１２−１５１４
【非特許文献２】Ｗａｒｄ  ＪＭ．ら，「Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ」，１９９４年，８６巻，p.１２２２−１２２７
【非特許文献３】Ｓｈａｍｅｓ  Ｂ．ら，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」，１９９５年，  ３３巻，p.２９６８−２９７２
【非特許文献４】Ｂａｔｔｌｅｓ  ＪＫ．ら，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」，１９９５年，３３巻，p.１３４４−１３４７
【非特許文献５】ＺＨＯＮＧＭＩＮＧ  ＧＥ．ら，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」，２００１年，３９巻，p. ２５９８−２６０２
【非特許文献６】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｈ−Ｏ．ら，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」，２０００年，３８巻，p.１０７２−１０７６
【非特許文献７】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｉ．ら，「Ｇｕｔ」，２０００年，４６巻，p. ４１０−４１４
【非特許文献８】Ｏ'Ｔｏｏｌｅ  ＰＷ．ら，「Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ」，１９９１年，１７３巻，２号，p.５０５−１３
【非特許文献９】Ａｕｃｈｅｒ  Ｐ．ら，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」，１９９８年，３６巻，p. ９３１−９３６
【非特許文献１０】Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＳ．ら，「Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」，１９９９年，１６巻，p.７４５−７５０
【非特許文献１１】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｉ．ら，「Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」，２００３年，５２巻，p.９４９−９５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記現状に鑑みヘリコバクター・ピロリに代表されるヘリコバクター属の細菌を含む細菌抗原と交差反応性を有しないヘリコバクター・ヘパティカスの抗原及びこの抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体の作製と、生体中のヘリコバクター・ヘパティカス感染を検出するための方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヘリコバクター・ヘパティカスに特異的な抗原の探索のため、ヘリコバクター・ヘパティカス菌体を抗原として、ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清とマウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清によるウエスタンブロティングを行った。その結果、ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清では、３５ｋＤａ以下のバンドは検出されなかったが、マウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清では検出された。このことより、ヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物は３５ｋＤａ以下に交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。そこでヘリコバクター・ヘパティカスの抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、その中から３５ｋＤａ以下の抗原と反応し、かつヘリコバクター・ヘパティカス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しないモノクローナル抗体を発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明はヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原である。また第２の発明はヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体である。この抗原及び抗体は、Ｉｒｙｎａ  Ｋｏｒｎｉｌｏｖｓ｀ｋａ等（特許文献２）の発表した２７種の蛋白と異なる抗原及び抗体である。さらに本発明はヘリコバクター・ヘパティカス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しないモノクローナル抗体を含むものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗原による抗体価の測定は抗ピロリ抗体に影響されないヘリコバクター・ヘパティカスに特異的な抗原であった。
本発明の抗原を用いて製造できるモノクローナル抗体はヘリコバクター・ヘパティカスのみと反応し、交差反応性の可能性のある他のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しなかった。
以上のことからヘリコバクター・ヘパティカスの特異的な免疫診断法が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上述のようにヘリコバクター・ヘパティカスをウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清とマウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清によるウエスタンブロティングを行ったところ、ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清では３５ｋＤａ以下のバンドは検出されなかったが、マウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清では検出された。このことより、ヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物は３５ｋＤａ以下に交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。そこで、モノクローナル抗体を作製し、３５ｋＤａ以下の抗原を認識する抗体を選抜した。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体はヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａ、好ましくは１４ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマより産生することができ、例えば本発明のハイブリドーマを培養し、その培養液から得ることが出来る。しかし本発明のモノクローナル抗体の製造方法としては特に限定されず、例えば、遺伝子工学的に得られたものであっても、ヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に特異的に反応することが出来る限り本発明の範囲に含まれる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ヘパティカス以外の細菌の抗原と反応しないという特徴を備えている。ここで細菌とは特に制限は無いが、好ましくはヘリコバクター属の細菌であり、より好ましくはヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ビリス、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ムステラエまたはヘリコバクター・シナエディである。本発明者らは本発明のモノクローナル抗体がその他の細菌としてバクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレベまたはキャンピロバクター・ジェジュニの抗原と反応しないことも確認している。
本発明の上記モノクローナル抗体の認識するヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原の製造方法は特に限定されず、例えば遺伝子工学的に得られたものであっても分子量１０〜１６ｋＤａでヘリコバクター・ヘパティカスを検出することが出来る限り本発明の範囲に含まれる。実施例５−（５）に示したように、ヒト血清を一次抗体としたウェスタンブロッティングでもバンドが検出された（図２、レーン４）。この抗原に対する抗体がヒトで作られていることからヘパティカス感染を抗体価から測定できることが確認できた。
また、この抗原がアルカリ処理・熱処理・酸処理に対し安定であり、エタノール処理に対しては不安定であることを、抗原とモノクローナル抗体との反応性から確認している。
【００１７】
本発明のハイブリドーマは、ヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体を産生するもので、ヘリコバクター・ヘパティカスで免疫した動物の脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞を融合して得られるものである。
本発明のハイブリドーマは、公知の細胞融合法により作製できる。即ち、ヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原を免疫原としてヒト以外の動物を免疫し、その脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中からヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、本発明のハイブリドーマを得ることができる。
上記ヒト以外の動物は特に制限は無いが、マウス・ラットが好ましい。
【００１８】
また上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、マウスを免疫する場合、1回に１〜１００μｇ、好ましくは５０〜１００μｇの免疫用抗原を同容量の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント等で乳化して、上記被免疫動物背部、腹部の皮下又は腹腔内に２〜７週ごとに３〜６回接種する方法等を挙げることができる。
本発明においては、上記被免疫動物を免疫後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、融合促進剤（例えばポリエチレングリコール：ＰＥＧ）の存在下で、これらの組織に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。
【００１９】
特に好ましいハイブリドーマは、ヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物を投与したラットの脾細胞とミエローマ細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）の融合を行い、融合細胞のスクリーニング、限界希釈法によるクローニングを行なったハイブリドーマＨＲ６３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１６）である。
以下に実施例を含めて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
【実施例】
【００２０】
実施例１．マウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清・ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清の調製
（１）菌体の培養法  
ヘリコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）は、５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）を用いて３７℃で微好気性環境下にて３〜４日培養した。
ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）は、５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）を用いて３７℃で微好気性環境下にて３〜４日培養後、更に３７℃で嫌気性環境下にて７日間インキュベートし、球状化させた。
【００２１】
（２）菌体抽出法    
実施例１−（１）で得られたヘリコバクター・ヘパティカスのコロニーを白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。懸濁液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返して菌体を洗浄し、０．６％Ｎ−ラウロイルサルコシン−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁した。その後、超音波破砕機（超音波破砕機  東湘電機社製、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）を用いて氷冷下１サイクル３０秒超音波、６０秒休止の条件で３０分間超音波処理して菌体を破砕し１時間室温でインキュベーションした。ついで４℃１５分間１００００ｘｇで遠心分離し、上清を菌体抽出物とした。
【００２２】
（３）菌体破砕法    
実施例１−（１）で得られたヘリコバクター・ピロリのコロニーを白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。懸濁液を４℃にて１００００×ｇで１０分間遠心分離し、０．５％ホルマリンに懸濁して４℃にて一晩放置し不活化した。不活化した懸濁液をＰＢＳに懸濁し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返して菌体を洗浄し、ＰＢＳに懸濁した。その後、菌体懸濁液を超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ  ７２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ  ３．５０％  ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を破砕し、菌体破砕物とした。
【００２３】
（４）マウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清の作製
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物をフロイントの完全アジュバントで乳化して、菌体タンパク濃度が２０μｇ／ｍＬになるように調製した。これをＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌマウスの腹腔内に免疫毎０．２ｍＬずつ投与した。初回免疫後１４日目と２８日目にヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物をフロイントの不完全アジュバントで乳化して追加免疫を行った。最終免疫から３日目に心臓採血により血液を採集し、３０分静置した後４℃１５分間１００００×ｇで遠心分離し上清をマウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清とした。
【００２４】
（５）ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清の作製
実施例１−（３）により調製した免疫原（ヘリコバクター・ピロリ菌体破砕物）と炭酸水素ナトリウム水溶液、フロイント完全アジュバントの混合物を３度ウサギに皮下投与を行った。その血液を採集し、遠心分離して得た上清をウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清とした。
【００２５】
実施例２．マウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清及びウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清を用いたヘリコバクター・ヘパティカス特異的な抗原の探索
（１）菌体抽出物の電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行った。サンプルは、実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物を、還元剤で処理しない常法に従い調製した。バッファ−は、ＭＥＳバッファーを、分子量マーカーはＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）を用いた。
【００２６】
（２）セミドライウエスタンブロッティング法
実施例２―（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、セミドライウェスタンブロッティング法によりニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和した溶液に１時間浸してマスキングを行った後、一次抗体としてマウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清、ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清と２時間反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄後、各々二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００２７】
（３）ヘリコバクター・ヘパティカス特異的な抗原の探索の結果  
実施例２−（２）のウエスタンブロッティングの結果を図１に示した。ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清で染色された交差反応性を示すと思われる抗原は、３５ｋＤａ以上に認められた（図１  レーン２）。マウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清では３５ｋＤａ以下にもバンドが検出された。このことより、ヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物は、３５ｋＤａ以下にヘリコバクター・ピロリと交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。
【００２８】
実施例３．ヘリコバクター・ヘパティカスの抗原を認識するモノクローナル抗体の作製と選択
（１）ヘリコバクター・ヘパティカスの免疫及び細胞融合
Ａ．脾臓法
実施例１―（２）にて調製した免疫原（菌体抽出物）をフロイントの完全アジュバントで乳化して、菌体タンパク濃度が２０μｇ／ｍＬになるように調製した。これをＳＤラットの腹腔内に０．２ｍＬ投与した。初回免疫後１４日目と３２日目に菌体抽出物をフロイントの不完全アジュバントで乳化して追加免疫を行った。最終免疫から１６日目にラット脾細胞を摘出し、脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）を１０：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ４０００を用いて融合した後、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択培養した。
【００２９】
Ｂ．ラットリンパ節法
実施例１―（２）にて調製した免疫原（菌体抽出物  タンパク質濃度０．５μｇ／ｍＬ）とフロイントの完全アジュバントを１：２で混合した。これをＳＤラット（５Ｗ、♂）の足蹠に７５μＬを皮内投与した。免疫から１５日目にラット腸骨リンパ節を摘出し、腸骨リンパ節細胞を得た。得られた腸骨リンパ節細胞と骨髄腫細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）を２：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ４０００を用いて融合した後、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択培養した。
【００３０】
（２）ＥＬＩＳＡ方法；
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）に、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置し、その後一次抗体として各穴に融合細胞の培養上清液１００μＬを添加し、２時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、二次抗体としてぺルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ（ダコ社製、１：４０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００３１】
（３）抗ヘリコバクター・ヘパティカスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択
細胞融合後１４日目に、実施例３−（２）のＥＬＩＳＡと同様の方法で培養上清中の抗体活性を測定した。免疫原に反応する抗体を産生するハイブリドーマクローンをＥＬＩＳＡの吸光値が０．８以上を目安として選択した。各クローンを限界希釈法により２度クローニングを行い、その都度抗体活性の有無をＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。陽性クローンに対して、シングルセルクローニングを行い、抗体産生が安定である抗ヘリコバクター・ヘパティカス抗体を産生している多くのハイブリドーマクローンを得た。その後、得られたハイブリドーマを２５ｃｍ２、７５ｃｍ２フラスコに移し、培養した。
【００３２】
実施例４．抗ヘリコバクター・ヘパティカスの３５ｋＤａ以下の抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択
（１）菌体抽出物の電気泳動、セミドライウエスタンブロッティング
実施例２−（１）に従ってヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、  実施例２−（２）に従いセミドライウェスタンブロッティングを行なった。ハイブリドーマの培養上清と２時間反応させた後、ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００３３】
（２）ハイブリドーマの選択結果
抗ヘリコバクター・ヘパティカス抗体産生が陽性であったハイブリドーマは１２０株であった。その中で実施例４−（１）のウェスタンブロッティングの結果から３５ｋＤａ以下の抗ヘリコバクター・ヘパティカス抗原を認識するモノクローナル抗体を安定に産生しているハイブリドーマを選別した。その結果、ＨＲ１６、ＨＲ６３、ＨＲII４４、ＨＲII５１の４種のハイブリドーマが得られた。
【００３４】
実施例５．免疫沈降法による抗ヘリコバクター・ヘパティカスモノクローナル抗体の認識する抗原の分子量の検証
（１）ハイブリドーマ培養液の硫安分画
ハイブリドーマＨＲ６３及びＨＲII５１の培養上清各々に飽和硫酸アンモニウムを５０％飽和になるよう滴下し、１．５時間攪拌した。その後、１３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、モノクローナル抗体ＨＲ６３及びＨＲII５１を含む沈渣を４０％硫酸アンモニウム２０ｍＬで２回洗浄し、ＰＢＳ２ｍＬに溶解した後、ＰＢＳで透析を行った。
【００３５】
（２）免疫沈降物の作製
プロテインＬアガロース（サンタ  クルズ  バイオテクノロジー社製）２０μＬに、硫安分画を行ったモノクローナル抗体ＨＲ６３のＰＢＳ溶液１０μＬを添加・懸濁し、４℃で一晩振盪した。その後、ＰＢＳで２回洗浄し、ヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物を１００μＬ添加し、４℃で一晩振盪した後に、１３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。得られた免疫沈降物をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ２０μＬに溶解し、免疫沈降物ＰＢＳ溶液とした。
【００３６】
（３）免疫沈降物のウェスタンブロッティング
実施例２−（１）に従い、免疫沈降物ＰＢＳ溶液のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。対照としてモノクローナル抗体を添加せずに免疫沈降を行ったものも同様に電気泳動を行った。泳動後、ウェスタンブロッティング法によりニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和した溶液に１時間浸してマスキングした後、硫安分画後のモノクローナル抗体ＨＲ６３の培養上清あるいはヒト血清(Ｎｏ．１９)と２時間反応させた。ヒト血清は、文献に従い血中抗体をヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物で吸収を行った後に抗ヘパティカス抗体価を測定し、抗体価の高かった血清を用いた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００３７】
（４）分子量及び特異性の検証結果
免疫沈降によって得られた、モノクローナル抗体に結合した抗原のウェスタンブロッティングの結果を図２に示した。
ＰｒｏｔｅｉｎＬに、菌体抽出物のみを添加した場合はバンドが検出されず（図２  レーン１）、菌体抽出物とＨＲ６３培養上清の双方を添加したもののみ１４ｋＤａ付近にバンドを検出した（図２  レーン２）。また、文献に従ってヒト血清をヘリコバクター・ピロリで吸収を行った後にヘリコバクター・ヘパティカスに対する抗体価を測定し、抗体価の高かった血清を一次抗体としたウェスタンブロッティングでも同様に、矢印で示した位置にバンドが検出された（図２  レーン４）。
【００３８】
（５）ＨＲII５１抗体カラムによる部分精製とセミドライウェスタンブロッティング
硫安塩析により得られた抗体を活性化セファロースに結合させ、ヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物から抗原の精製を行なった。この抗原を実施例２−（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、実施例２−（２）に従いセミドライウェスタンブロッティングを行なった。
【００３９】
（６）ＨＲII５１抗体の認識する抗原の分子量の検証結果
ウェスタンブロッティングを行なった結果を図２（レーン３）に示した。ＨＲII５１抗体の認識する抗原であると推測されるバンドは１４ｋＤａ付近に検出され、ＨＲ６３の免疫沈降後のウェスタンブロッティングにより検出されたバンドと分子量は一致していた。
【００４０】
（７）分子量の推定
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬａｄｄｅｒとＢｅｎｃｈＭａｒｋ    Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（共にインビトロジェン社製）の２種の分子量マーカーを実施例２−（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、銀染色により染色した結果を図３に示した。マーカーごとに推定される分子量に違いが認められた。ウェスタンブロッティング（図２）の結果からＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（図３  レーン１）を用いた場合には分子量は約１４ｋＤａと推定され、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（図３  レーン２）を用いたときには約１２ｋＤａと推定された。抗原の分子量は分子量マーカーのバンドの幅を考慮して１０〜１６ｋＤａと推定した。
【００４１】
実施例６．モノクローナル抗体ＨＲ６３及びＨＲII５１の認識抗原における安定性
（１）ヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物の処理条件
実施例１−（１）により調製したヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物を以下のＡ〜Ｄのように処理を行った。
Ａ．酸処理
０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ(ｐＨ ２．５)に懸濁し、１０分間室温で放置させた後、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)にて中和させた。
Ｂ．アルカリ処理
０．０１Ｎ ＮａＯＨに懸濁し、１０分間室温で放置させた後、１Ｎ ＨＣｌにて中和させた。
Ｃ．熱処理
沸騰水中に５または１０分間放置し、氷冷した。
Ｄ．エタノール処理
８０％ エタノールにて処理した。その後１００００×ｇで２分間遠心分離し、上清を回収した。また沈殿物は、エタノールと同量のＰＢＳにて懸濁した。
【００４２】
（２）ＥＬＩＳＡ法
Ａ〜Ｄに従い調製した抗原を、ＰＢＳで２．０μｇ／ｍＬに調製し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）に０．２μｇ／ｗｅｌｌで固相化した。マスキングは、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置した。その後ＨＲ６３抗体及びＨＲII５１を添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、二次抗体としてぺルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ（ダコ社製、１：４０００）１００μＬを添加した。室温で１時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で３分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４３】
（３）認識抗原の安定性
モノクローナル抗体ＨＲ６３及びＨＲII５１の認識抗原の安定性を検討した結果を図４に示した。どちらもアルカリ処理・酸処理・熱処理には安定であった。しかし、エタノール処理には不安定で抗原性が失われた。この結果より、  モノクローナル抗体ＨＲ６３及びＨＲII５１の認識抗原の安定性は類似し、また実施例５より分子量もほぼ同じであったことから、モノクローナル抗体ＨＲ６３及びＨＲII５１の認識抗原は同じであることが推測された。
【００４４】
実施例７．他菌体との交差反応性の検討
（１）  菌体の培養法
ヘリコバクター・ビリス（ＡＴＣＣ５１６３０）、ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）、ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ  ４９１７９）、ヘリコバクター・ムステラエ（ＡＴＣＣ  ４３７７２）、ヘリコバクター・シナエディ（ＡＴＣＣ  ３５６８３）、及びキャンピロバクター・ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ２９４２８）は５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上で３７℃で４日間微好気培養した。ビフィドバクテリウム・インファンティス（ＪＣＭ  １２２２）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（ＪＣＭ  １１９２）、バクテロイデス・ブルガタス（ＩＦＯ  １４２９１）は５％馬脱繊血を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で、３７℃で４日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（ＡＴＣＣ２５９２２）はブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で３日間、好気培養した。
得られたコロニーを実施例１−（２）に従い集菌・破砕し、各菌体抽出物を調製した。
【００４５】
（２）ＥＬＩＳＡ法
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物、及び実施例７−（１）により調製したヘリコバクター・ビルス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・シナエディ、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ムステラエ、キャンピロバクター・ジェジュニ、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、バクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリの菌体破砕物をＰＢＳで０．５μｇ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに固相化を行い、実施例３−（２）と同様の方法でＥＬＩＳＡを実施した。一次抗体として、実施例５−（１）に従い硫安塩析した抗体（ハイブリドーマＨＲ１６、ＨＲ６３、ＨＲII４４、ＨＲII５１の産生する抗体）を添加した。
【００４６】
（３）結果
表１に示した。ＨＲ６３、ＨＲII４４、ＨＲII５１では、ヘリコバクター・ヘパティカス以外の菌体では発色が認められなかった。従って、ＨＲ６３、ＨＲII４４、ＨＲII５１の認識する抗原は、ヘリコバクター・ピロリを含む他菌体との交差反応性がないことが確認できた。
【表１】
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【００４７】
実施例８．マウス血清のヘリコバクター・ヘパティカス抗体価の測定
（１）ＥＬＩＳＡ方法
ＨＲII５１抗体でヘリコバクター・ヘパティカス認識抗原を捕捉し、その認識抗原に対する血中の抗体価を測定した。ＨＲII５１（０．２μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ  ヌンク社製）に、１％ＢＳＡ液と１０％アマルティを１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置し、４０℃で１時間乾燥させた。その後実施例１−（２）により調製した、ヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、マウス血清を１／２００で添加し室温で1時間反応させた。なお、マウス血清は、実施例１−（４）で調製したマウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清、実施例７−（１）で培養し、実施例１−（４）と同様の免疫方法で調製したマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清、マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清を用いた。その後上記洗浄液で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（ザイメド社製、１：１０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（スミロン社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４８】
（２）マウス血清のヘパティカス抗体価の測定結果
結果を図５に示した。ＨＲII５１で捕捉した抗原は抗ピロリ血清・抗ビリス血清とは反応せず、抗ヘパティカス血清と特異的に反応することが分かった。本モノクローナル抗体を用い、上記の測定方法によりヘリコバクター・ヘパティカス抗体価を特異的に測定することが可能であった。従って、この方法は血清を用いたヘリコバクター・ヘパティカス感染診断として有用であることが示唆された。
【００４９】
実施例９．糞便中のヘリコバクター・ヘパティカス抗原量の測定
（１）ＨＲII５１（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ  ヌンク社製）に、１％ＢＳＡ液と１０％アマルティを１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置し、４０℃で１時間乾燥させた。その後糞便添加あり（５０倍懸濁）、なしの２種の希釈液（１％ＢＳＡ、０．１％プロクリン／ＰＢＳ）に、実施例１−（１）により調製したヘリコバクター・ヘパティカス菌体抽出物を７.５−５００ｎｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ＨＲII５１ビオチン化抗体（０．１μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で１時間反応させた。上記洗浄液で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン（ピアス社製、１：２００００）を添加し、室温で１時間反応させた。再度上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００５０】
（２）糞便中のヘリコバクター・ヘパティカス抗原量の測定結果
結果を図６に示した。濃度依存的に吸光度は上昇し、ヘリコバクター・ヘパティカス抗原を定量的に測定することが可能であった。また、糞便を添加しても濃度依存的に吸光度は上昇し、糞便中の抗原も測定することが可能であった。従って、この方法は糞便を用いたヘリコバクター・ヘパティカス感染診断として有用であることが示唆された。
また、抗原検査のサンプルとしては、糞便だけでなく、胆汁なども考えられ、それらへの応用も期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のヘリコバクター・ヘパティカスの抗原及び抗体はヘリコバクター・ピロリ抗体及び抗原と反応せずヘリコバクター・ヘパティカスに特異的に反応する。このことはヘリコバクター・ヘパティカス感染による疾病の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ウサギ抗ヘリコバクター・ピロリ血清及びマウス抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清のヘリコバクター・ヘパティカスに対する反応性のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】免疫沈降によって得られた、モノクローナル抗体に結合した抗原のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。ＨＲ６３の認識する抗原を矢印で示した。
【図３】２種の分子量マーカーを電気泳動後、銀染色により染色した結果を示す写真である。
【図４】ＥＬＩＳＡにて各条件化でのＨＲ６３およびＨＲII５１認識抗原の安定性を調べた結果を示すグラフである。
【図５】マウス血清のヘリコバクター・ヘパティカスに対する抗体価を、モノクローナル抗体を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【図６】糞便中に含まれるヘリコバクター・ヘパティカスの抗原量を、モノクローナル抗体を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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