(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法であって、
１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）を導入すること；
２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること；
３）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させること；
４）酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させること；及び
５）酵母細胞の形質転換によって、酵母のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）を高発現させること
を含む、前記製造方法。
【請求項２】
酵母が、サッカロミセス属の酵母から選択される、請求項１に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の最外層には、水分を保持する保湿機能と外部刺激から肌を保護するバリア機能を司る角質層という組織が存在する。角質層は角質細胞と天然保湿因子、そして細胞間脂質から構成されているが、その中でも特に細胞間脂質の約半分を占めるセラミドが、それらの機能に極めて重要な役割を担っている。例えば、アトピー性皮膚炎や老人性乾皮症に共通する特徴は保湿能の著しい低下であるが、その主因は脂質代謝酵素異常によるセラミド量の減少であることが知られている。またセラミドはバリア機能の増強・美白作用やメラニンの生成を抑制する作用があることも確認されている。セラミドは外部から補給することが可能な物質である。
【０００３】
J Invest Dermatol. 96:523-526, 1991（非特許文献１）、Arch Dermatol Res. 283:219-223,1991（非特許文献２）は、「アトピー性皮膚炎や老人性乾皮症におけるセラミド量の減少」について、J Dermatol Sci. 1:79-83, 1990（非特許文献３）、Acta Derm Venereol. 74:337-340, 1994（非特許文献４）は、「セラミド量の減少と脂質代謝酵素異常」について、Contact Dermatitis. 45:280-285, 2001（非特許文献５）、J Eur Acad Dermatol Venereol. 16:587-594, 2002（非特許文献６）は、「セラミドによるバリア機能の回復」について、そして、Cell Signal 14:779-785, 2002（非特許文献７）は、「セラミドによるメラニン生成の抑制」について開示している。
【０００４】
近年では、乾燥敏感肌を伴う皮膚疾患に対する治療薬あるいは化粧品・美容健康食品の素材として大変注目されている。実際、化粧品、食品・サプリメント等として、セラミドを配合した多くの製品がすでに市販されており、さらに、セラミド原料市場規模は拡大傾向が続いている。
【０００５】
セラミドの原料としては、これまで牛などの動物由来のものが使われていたが、感染症の問題が指摘され、現在では米、小麦、大豆や芋などの植物性セラミドが主流である。最近の基礎的研究（J. Clin. Invest. 112:1372-1382, 2003（非特許文献８））により、セラミドの構造が皮膚の保湿・バリア能に極めて重要であることが明らかとなり、ヒトのセラミドと構造が異なる植物性セラミドが機能性の高い脂質であるかどうか疑問が残る。しかも動植物に存在するセラミドは微量で抽出・精製が困難であり、生産性が悪い上コストが高いことから、それらを克服することが可能な新しい生産技術の開発が強く望まれている。
【０００６】
図１に示したように、スフィンゴ脂質合成・代謝経路においてジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳ）生合成以降の反応は、ヒトを含む高等動物細胞と酵母の間で大きく異なることが知られている。また、スフィンゴ脂質合成・代謝経路において、各工程において機能する各酵素タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子についても、ある程度知見が得られている（Biochemistry. 41:15105-15114. 2002（非特許文献９）；J Biol Chem. 277:25512-25518,2002（非特許文献１０）；Yeast 9: 267-277,1993（非特許文献１１）；J Biol Chem 272:29704-29710,1997（非特許文献１２）；J Biol Chem 275:31369-31378, 2000（非特許文献１３）；J Biol Chem 275:39793-39798, 2000（非特許文献１４））。
【非特許文献１】J Invest Dermatol. 96:523-526, 1991
【非特許文献２】Arch Dermatol Res. 283:219-223,1991
【非特許文献３】J Dermatol Sci. 1:79-83, 1990、
【非特許文献４】Acta Derm Venereol. 74:337-340, 1994
【非特許文献５】Contact Dermatitis. 45:280-285, 2001、
【非特許文献６】J Eur Acad Dermatol Venereol. 16:587-594, 2002
【非特許文献７】Cell Signal 14:779-785, 2002
【非特許文献８】J. Clin. Invest. 112:1372-1382, 2003
【非特許文献９】Biochemistry. 41:15105-15114. 2002
【非特許文献１０】J Biol Chem. 277:25512-25518,2002
【非特許文献１１】Yeast 9: 267-277,1993
【非特許文献１２】J Biol Chem 272:29704-29710,1997
【非特許文献１３】J Biol Chem 275:31369-31378, 2000
【非特許文献１４】J Biol Chem 275:39793-39798, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法を目的とする。本発明の製造方法は、
１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）を導入すること；及び
２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること
を含む。
【０００８】
本発明において、好ましくは、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【０００９】
本発明において、好ましくは、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）が、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【００１０】
本発明の方法の好ましい一態様において、さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させることを含む。
【００１１】
本発明の方法の好ましい一態様において、さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させることを含む。
本発明の方法の好ましい一態様において、さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）を高発現させることを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、本発明を想到した。
セラミドの構造は細胞が持っている酵素の種類によって決定されており生物種で異なる。酵母は、高等動物の主なセラミドであるセラミドＮＳを合成する酵素を持っていない。そのため酵母でセラミドＮＳを合成させるためには、それに必要な酵素を酵母に導入する必要がある。さらに、宿主細胞には宿主由来のセラミド合成経路が存在する。よって、宿主由来のセラミド合成経路を抑制することにより、セラミドＮＳを効率よく選択的に合成させる。
【００１３】
具体的には、図１に示したように、スフィンゴ脂質合成・代謝経路においてジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳ）生合成以降の反応は、ヒトを含む高等動物細胞と酵母の間で大きく異なる。即ち、出芽酵母（サッカロミセス属）では、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）が存在しないことから、ＤＨＳのＣ−４位に二重結合を有するヒト型スフィンゴイド塩基（スフィンゴシン）は合成されない（図２）。その代わりスフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）がコードする酵素によってＤＨＳのＣ−４位が水酸化されフィトスフィンゴシン（ＰＨＳ）が合成される。次いでそれらのスフィンゴイド塩基はセラミドへと変換される。
【００１４】
本発明者らは、まずヒト型セラミドを酵母細胞内で製造させるために、酵母細胞内には存在しないスフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ酵素を酵母細胞内で発現させること、及び、スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ酵素活性を完全に又は部分的にでも破壊することが重要であること考えた。そこで先ず、酵母の形質転換により、１）上述したＳＵＲ２遺伝子破壊株を作成し、その変異株に２）ヒトＤＥＳ１遺伝子を導入し、本発明を想到した。これにより、従来不可能であったヒト型セラミドの酵母細胞内での製造が初めて可能になった。
【００１５】
さらに、ヒト型セラミドＮＳを効率的に生産させるシステムを構築するために、上記のシステムの最適化を行った。具体的な方法としては、酵母の形質転換によって、以下の３）−５）のいずれか、あるいはこれらの組み合わせを行い、ヒト型セラミドをより効率よく製造することに成功した：
３）セラミドＮＳが水酸化されないように酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させること；
４）酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させること；あるいは
５）酵母のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）を高発現させること。
【００１６】
よって、本発明は、上記１）及び２）を必須要件とし、３）−５）を好ましい態様の追加要件として行うことにより、ヒト型セラミドを酵母細胞内で簡便かつ効率よく製造する方法を提供するものである。
【００１７】
よって、本発明は、ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法であって、
１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）を導入すること；及び
２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること
を含む、前記製造方法に関する。
【００１８】
本発明において、ヒト型セラミドは、例えば図２の「目的生産物」に示された構造式を有する、セラミドＮＳを意味する。これに対して酵母型セラミドであるフィトセラミドは、ヒト型セラミドの４位の二重結合部分が水酸基で置換されている点で相違する（図３）。
【００１９】
スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）
本発明の方法は構成要件１）として、酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）を導入することを含む。
【００２０】
限定されるわけではないが、ＤＥＳ１は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【００２１】
本発明に利用可能な遺伝子（核酸）は、ゲノムＤＮＡ（その対応するｃＤＮＡも含む）、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００２２】
ＤＥＳ１は、好ましくは配列番号１の塩基配列を有する。これは配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト  スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、ＧｅｎＢａｎＫＴＭ：  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ４６６３７５に開示されている
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号１とは完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号２と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００２３】
ＤＥＳ１は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号２と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号２に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
【００２４】
ＤＥＳ１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００２５】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００２６】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２７】
本発明の方法において、好ましくは、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼが、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有する。
【００２８】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有する限り、ＤＥＳ１は、配列番号１の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。配列番号２のヒト  スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼタンパク質以外にも、例えばマウス（Ｍ．  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）やショウジョウバエ（Ｄ．  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等で同様の活性を示すタンパク質をコードする遺伝子の存在が知られている（非特許文献１０）。
【００２９】
「スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有する」とは、例えば図２又は図３に示されているように、ジヒドロスフィンゴシンのＣ−４にニ重結合を導入し、スフィンゴシンを合成する活性を意味する。あるいは、ジヒドロセラミドのＣ−４にニ重結合を導入し、セラミドＮＳを合成する活性を意味する。ＤＥＳ１の導入により、形質転換酵母細胞内では、酵母の天然の代謝経路では合成されない、スフィンゴシン及び／又はセラミドＮＳの合成が行われる。
【００３０】
本発明の好ましいスフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子はまた、配列番号１の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、フィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有する核酸を含む。
【００３１】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００３２】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【００３３】
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００３４】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００３５】
同様に、本発明のスフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号１の塩基配列とは異なるが、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし数千個、より好ましくは１個ないし千個、さらにこのましくは１個ないし５００個、さらにより好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。
【００３６】
既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００３７】
酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）
本発明の方法は構成要件２）として、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させることを含む。
【００３８】
限定されるわけではないが、ＳＵＲ２は、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【００３９】
ＳＵＲ２は、好ましくは配列番号５の塩基配列を有する。これは配列番号６のアミノ酸配列を有する酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。
【００４０】
ＳＵＲ２は、好ましくは配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号６と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号６に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
【００４１】
「スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有する」とは、例えば図２又は図３に示されているように、ジヒドロスフィンゴシンのＣ−４に水酸基を導入し、フィトスフィンゴシンを合成する活性を意味する。あるいは、ジヒドロセラミドのＣ−４に水酸基を導入し、フィトセラミドを合成する活性を意味する。本発明では、酵母細胞の形質転換によって、ＳＵＲ２の発現を部分的又は完全に欠失させることによって、酵母の天然の代謝経路では合成される、フィトスフィンゴシン及び／又はフィトセラミドの合成を部分的又は完全に抑制させる。ＳＵＲ２遺伝子発現の抑制と、ＤＥＳ１遺伝子発現により、スフィンゴシン及び／又はセラミドＮＳの効率的な合成が可能になる。
【００４２】
ＳＵＲ２にコードされるアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００４３】
本発明の好ましい酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）はまた、配列番号５の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有する核酸を含む。
【００４４】
同様に、本発明の酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号５の塩基配列とは異なるが、スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。
【００４５】
「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。
【００４６】
酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）
本発明の方法はさらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させることを含んでもよい。ＳＣＳ７は、例えば図３又は図７のフィトセラミド、ジヒドロセラミド、セラミドＮＳのスフィンゴイド塩基にアミド結合した脂肪酸のα位の炭素に水酸基を付加し、各々Ｃｅｒ（ＡＰ）、Ｃｅｒ（ＡＳａ）、Ｃｅｒ（ＡＳ）を合成する活性を有する。ＳＣＳ７活性の存在により、所望のジヒドロセラミド、セラミドＮＳが合成されても、さらに水酸化されてしまう。よって、本発明は好ましくは、ＳＣＳ７の発現を欠失させることを含む。
【００４７】
限定されるわけではないが、ＳＣＳ７は、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【００４８】
ＳＣＳ７は、好ましくは配列番号７の塩基配列を有する。これは配列番号８のアミノ酸配列を有する酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。
【００４９】
ＳＣＳ７は、好ましくは配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号８と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号８に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
【００５０】
「スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ活性を有する」とは、例えば図７に示されているように、フィトセラミド、ジヒドロセラミド、セラミドＮＳのスフィンゴイド塩基にアミド結合している脂肪酸のα位の炭素に水酸基を付加し、各々Ｃｅｒ（ＡＰ）、Ｃｅｒ（ＡＳａ）、Ｃｅｒ（ＡＳ）を合成する活性を有する、ことを意味する。本発明では、好ましくは、酵母細胞の形質転換によって、ＳＣＳ７の発現を部分的又は完全に欠失させることによって、ジヒドロセラミド、セラミドＮＳの好ましくない水酸化を抑制する。
【００５１】
ＳＣＳ７にコードされるアミノ酸配列は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００５２】
本発明の好ましい酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）はまた、配列番号７の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ活性を有する核酸を含む。
【００５３】
同様に、本発明の酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号７の塩基配列とは異なるが、スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。
【００５４】
「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。
【００５５】
酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）
本発明の方法はさらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させることを含んでもよい。
【００５６】
ＹＤＣ１は、例えば図１−図３に示されているようにジヒドロセラミドを分解してジヒドロスフィンゴシンを合成する活性を有するタンパク質をコードする。ＹＤＣ１活性は、セラミド合成のいわば反対方向の反応を促進する活性であり、セラミドＮＳ合成の材料となるジヒドロセラミドを減少させる。よって、本発明は好ましくは、ＹＤＣ１の発現を欠失させることを含む。
【００５７】
限定されるわけではないが、ＹＤＣ１は、好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【００５８】
ＹＤＣ１は、好ましくは配列番号９の塩基配列を有する。これは配列番号１０のアミノ酸配列を有する酵母アルカリジヒドロセラミダーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。
【００５９】
ＹＤＣ１は、好ましくは配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号１０と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号１０に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
【００６０】
「アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有する」とは、例えば図１−図３に示されているようにジヒドロセラミドを分解してジヒドロスフィンゴシンを合成する活性を有する、ことを意味する。本発明では、好ましくは、酵母細胞の形質転換によって、ＹＤＣ１の発現を部分的又は完全に欠失させることによって、好ましくないジヒドロセラミドの分解を抑制する。
【００６１】
ＹＤＣ１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００６２】
本発明の好ましい酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）はまた、配列番号９の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有する核酸を含む。
【００６３】
同様に、本発明の酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号９の塩基配列とは異なるが、アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。
【００６４】
「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。
【００６５】
酵母イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）
本発明はさらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）を高発現させることを含んでもよい。
【００６６】
ＩＳＣ１は、例えば図１、図２に示されているようにイノシトールリン酸セラミド（ＩＰＣ）からジヒドロセラミドを合成する活性を有するタンパク質をコードする。ＩＳＣ１活性は、セラミドＮＳ合成の材料となるジヒドロセラミドを増加させる。ＩＳＣ１は、酵母細胞内に天然に存在する遺伝子であるが、酵母細胞の形質転換によって、当該遺伝子を導入し高発現させることによって、ヒト型セラミドの合成を促進することができる。
【００６７】
限定されるわけではないが、ＩＳＣ１は、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ活性を有するタンパク質をコードする。
【００６８】
ＩＳＣ１は、好ましくは配列番号３の塩基配列を有する。これは配列番号４のアミノ酸配列を有する酵母イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。
【００６９】
ＩＳＣ１は、好ましくは配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号４と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号４に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
【００７０】
「イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ活性を有する」とは、図１、図２に示されているようにイノシトールリン酸セラミド（ＩＰＣ）からジヒドロセラミドを合成する活性を有する、ことを意味する。本発明では好ましくは、酵母細胞の形質転換によって、ＩＳＣ１を高発現させることによって、セラミドＮＳ合成の材料となるジヒドロセラミドを増加させ、ヒト型セラミドの合成を促進させる。
【００７１】
ＩＳＣ１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００７２】
本発明の好ましい酵母イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）はまた、配列番号３の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ活性を有する核酸を含む。
【００７３】
同様に、本発明の酵母イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号３の塩基配列とは異なるが、イノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。
【００７４】
「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。
【００７５】
本発明はより好ましい態様において、ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法であって、
１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）を導入すること；
２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること；
３）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させること；
４）酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させること；及び
５）酵母細胞の形質転換によって、酵母のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）を高発現させること
を含む、前記製造方法を提供する。
【００７６】
酵母の形質転換による遺伝子の導入及び発現方法
本発明において、酵母細胞内におけるＤＥＳ１の発現及びＩＳＣ１の高発現は限定されず、公知の方法を用いて行うことが可能である。好ましくは、ＤＥＳ１及び／又はＩＳＣ１を含む発現ベクターで宿主酵母細胞を形質転換し、そして、核酸の発現を可能にする条件下で形質転換酵母細胞を培養する、ことを含む。
【００７７】
本発明の方法に利用可能な酵母は、限定されるわけではないが、好ましくは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来の酵母である。より好ましくは、サッカロミセス・セレビジエ、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・バイヤヌス、サッカロミセス・クルベリである。サッカロミセス属を含む出芽酵母は、遺伝子レベルでセラミドの合成・代謝の解析が最も進んでいる。そのため、本発明のヒト型セラミドの製造方法を迅速に最適化することが可能である。また酵母細胞は培養が容易で、また、伝統的に食品製造に利用されている。簡便、安全、安価にセラミドを大量に抽出・精製する方法を確立することが可能である。
【００７８】
本発明において、遺伝子の導入・発現のために公知の酵母発現ベクターを使用可能である。本発明の実施例では、公知の酵母用遺伝子発現ベクターｐＲＳ  ｓｅｒｉｅｓ（ｐ４ＸＸ）（Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １５６，  １１９，  １９９５）及びｐＹＥ２２ｍ（Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３０，  ５１５，  １９８９）を使用した。
【００７９】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４  (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983)、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０  (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987)、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５(K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979)等多数の酵母用発現ベクターが当業者に公知であり、本発明の方法に利用可能である。
【００８０】
発現ベクターは、各遺伝子の他に、一般的に、宿主における増殖のため、選択可能マーカーおよび複製起点を含むベクター内に含有されることが可能である。ベクターにはさらに、好ましくは酵母由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により本発明の核酸に連結されて、含まれる。
【００８１】
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。宿主細胞において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子やＨＩＳ３、ＴＲＰ１などの栄養要求性遺伝子などが例示される。
【００８２】
酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。
【００８３】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができるプラスミドなどのベクターに遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。
【００８４】
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）（上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００８５】
酵母の形質転換による各遺伝子の欠失方法
本発明の方法は、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること、を含む。
【００８６】
本発明の方法はさらに、好ましい態様において、
酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させること；及び
酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させること
のいずれか、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【００８７】
本発明において、各遺伝子の発現を欠失させるとは、各遺伝子によってコードされるタンパク質活性が発揮されないことを意味する。酵母細胞のゲノム上の各遺伝子を破壊する、遺伝子の転写が阻害する、遺伝子からタンパク質の翻訳を阻害する、タンパク質が翻訳されても活性が発揮を阻害する、など結果的に遺伝子によってコードされるタンパク質活性が発揮されなければ、本発明の方法における目的を達成するため、本発明の範囲に含まれる。欠失は、部分的な欠失であっても完全な欠失であってもよい。典型的には、母細胞のゲノム上の各遺伝子を破壊し、遺伝子を部分的又は完全に欠失させる。
【００８８】
ＳＵＲ２、ＳＣＳ７、ＹＤＣ１の各遺伝子の発現の欠失は公知の方法によって行うことができる。
例えば、本明細書中の実施例では各遺伝子の上流及び下流の塩基配列、及び選択マーカーを連結させたＤＮＡ断片を用い、酵母の天然のゲノム配列との相同組換えによって、各遺伝子を欠失させた。
【００８９】
遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Yeast 10, 1793 (1994)、Yeast 15,1541(1999)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)など参照）。
【００９０】
遺伝子破壊以外にも、本発明の目的のために、各遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス法（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）、RNAi法（特表2002-516062号公報; 米国特許公開公報第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000などを参照）、リボザイムによる方法（FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989などを参照）、共抑制による方法（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）などが挙げられる。
【００９１】
セラミド合成の確認方法
本発明の方法によって、製造されたヒト型セラミド（セラミドＮＳ）は、公知の方法を用いることによって、抽出・精製することができる。本発明の方法は、酵母細胞を使用するため、大量の培養、セラミドの簡便かつ迅速な抽出・精製が可能である。実施例で使用した抽出・精製のための好ましい態様の１つを図４に示した。
【００９２】
精製されたセラミドは、公知のスフィンゴイド分析のための方法を用いて確認することが可能である。分析方法は、例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、マススペクトル（例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ、ＦＴ−ＭＳ）等を含む。
【発明の効果】
【００９３】
本発明の形質転換酵母を用いるセラミドの製造法によれば、ヒトの皮膚で機能性の高いヒト型セラミドを安価に製造することが可能となる。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９５】
実施例１：ヒト  スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）発現ベクターの作製
公開されているデータベース中のヒト  スフィンゴイド  Δ４−デサチュラーゼ（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ  Δ４−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子（ＤＥＳ１）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎＫＴＭ：  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ４６６３７５）（配列番号１）を参考にプライマーｄｅｓ１Ｆ（配列番号１１）およびｄｅｓ１Ｒ（配列番号１２）を作製した。
【００９６】
配列番号１１：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧＡＡＧＡＣ−３’
配列番号１２：５’−ＣＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＴＣ−３’
上記プライマー対を利用して、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（約１．１ｋｂ）のＢａｍＨＩとＳｍａＩサイトを利用して酵母用遺伝子発現ベクターｐＫＯ１１  （Ｋａｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３，２８３４１，１９９８；Ｄｒ．Ｋ．Ｔａｎａｋａより提供）にクローニングした。
【００９７】
サンガー法による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列がデータベースと一致することを確認した。ＢａｍＨＩとＸｈｏ１サイトを利用して酵母用遺伝子発現ベクターｐＲＳ  ｓｅｒｉｅｓ（ｐ４ＸＸ）（Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １５６，  １１９，  １９９５）にサブクローニングした。
【００９８】
実施例２：酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ遺伝子（ＩＳＣ１）発現ベクターの作製
公開されている酵母ゲノムデータベース中の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイノシトール  ホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパーゼＣ（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ）遺伝子（ＩＳＣ１）の塩基配列（SGD(Saccharomyces Genome Database, 
1133784537468_0
)）（配列番号３）を参考にプライマーｉｓｃ１Ｆ（配列番号１３）
およびｉｓｃ１Ｒ（配列番号１４）を作製した。
【００９９】
配列番号１３：５’−ＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＧ−３’
配列番号１４：５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴ−３’
上記プライマー対を利用して、常法により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（約１．４ｋｂ）をｐＣＲ−ＢｌｉｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、サンガー法（Ｆ．  Ｓａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４，  １２１５，  １９８１）による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列がデータベースと一致することを確認した。
【０１００】
ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩサイトを利用して酵母用遺伝子発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３０，  ５１５，  １９８９）にサブクローニングした。
【０１０１】
実施例３：酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）破壊株の作製
公開されている酵母ゲノムデータベース中の酵母スフィンガニン  Ｃ４−ヒドロキシラーゼ（ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ  Ｃ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子（ＳＵＲ２）の塩基配列（SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)）（配列番号５）を参考にプライマーｓｕｒ２Ｆ（配列番号１５）およびｓｕｒ２Ｒ（配列番号１６）を作製した。
【０１０２】
配列番号１５：５’−ＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧ
Ｇ−３’
配列番号１６：５’−ＧＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧ
Ｇ−３’
上記プライマー対を利用して、プラスミドｐＹＤｐ―Ｌ（Ｂｅｒｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ，７，４７５，１９９１）を鋳型としてＰＣＲを行い、ＳＵＲ２遺伝子上流２９５ｂｐ、選択マーカーおよびＳＵＲ２遺伝子下流７５ｂｐが連結したＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を用いてＦＫ１１３株（ＭＡＴａ，ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｌｙｓ２，ｔｒｐ１，ｂａｒ１−１）の形質転換を常法に従って行い、栄養要求性培地で形質転換体を選抜し、ＳＵＲ２遺伝子破壊株を得た。
【０１０３】
正常遺伝子と破壊遺伝子で増幅する断片の長さが異なるように設計した確認用のプライマー（配列番号１７および１８）を用いて、ＰＣＲ法によりＳＵＲ２遺伝子破壊の確認を行った。
【０１０４】
配列番号１７：５’−ＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣ−３’
配列番号１８：  ５’−ＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧ−３’
実施例４：酵母ＳＵＲ２、および酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）二重破壊株の作製
公開されている酵母ゲノムデータベース中の酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子（ＳＣＳ７）の塩基配列（SGD(Saccharomyces Genome Database, 
1133784537468_1
)）（配列番号７）を参考にプライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆ（配列番号１９）
およびｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｒ（配列番号２０）、ｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｆ（配列番号２１）およびｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｒ（配列番号２２）を作製した。
【０１０５】
配列番号１９：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴ−３’
配列番号２０：５’−  ＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＣ−３’
配列番号２１：５’−  ＧＧＴＧＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣ−３’
配列番号２２：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＡＡ−３’
上記プライマー対を利用して、常法により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＳＣＳ７遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２８０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を得た。プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｒとｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｆはそれぞれ相補的な配列を共有しており、ＳＣＳ７遺伝子の上流域と下流域の境界にＢａｍＨＩサイトを含む。ＳＣＳ７遺伝子の上、下流域約２８０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を混合し、プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆとｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｒを用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩサイトをはさんでＳＣＳ７遺伝子の上下流域を含むＰＣＲ産物を得た。これをあらかじめｐＵＣ１９をＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる平滑末端化を行った後にセルフライゲーションして得たベクターに、プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆとｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｒに含まれるＥｃｏＲＩサイトを利用してクローニングした。サンガー法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４，  １２１５，１９８１）による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列がデータベースのＳＣＳ７上下流域とそれぞれ一致することを確認した。
【０１０６】
また、プラスミドｐＹＤｐ−Ｕ（Ｂｅｒｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ，  ７，  ４７５，  １９９１）をＢａｍＨＩで切断し、ＵＲＡ３遺伝子を含む約１．１ｋｂの断片を上記のＳＣＳ７遺伝子の上下流域を含むプラスミドのＢａｍＨＩサイトに挿入した。
【０１０７】
得られたＹＤＣ１遺伝子の上下流域にＵＲＡ３遺伝子をはさんだ領域を含むプラスミドをＥｃｏＲＩで切断して得られた断片を用い、上記実施例３で得たＳＵＲ２遺伝子破壊株の形質転換を常法に従って行った。ウラシルを含まない最少完全平板培地（ＳＣ−Ｕｒａ）でスクリーニングを行うことにより、ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株を得た。後のプラスミド導入を可能にするため、本ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株を０．１％  ５−ｆｌｉｏｒｏ−ｏｒｏｔｉｃ−ａｃｉｄを含む最少平板培地に播菌し、ウラシル要求性を喪失した株を選抜した。
【０１０８】
実施例５：酵母ＳＵＲ２、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）、およびＳＣＳ７三重破壊株の作製
公開されている酵母ゲノムデータベース中の酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｅｒａｍｉｄａｓｅ）遺伝子（ＹＤＣ１）の塩基配列（SGD(Saccharomyces Genome Database, 
1133784537468_2
)）（配列番号９）を参考に、プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｆ（配列番号２３）
および  ｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｒ（配列番号２４）、ｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｆ（配列番号２５）およびｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｒ（配列番号２６）を作製した。
【０１０９】
配列番号２３：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＡ−３’
配列番号２４：５’−ＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＴＴＡＴＧＧ−３’
配列番号２５：５’−ＴＧＴＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣ−３’
配列番号２６：５'−ＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＣＴＧＣＴ−３’
上記プライマー対を利用して、常法により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＹＤＣ１遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２５０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を得た。プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｒとｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｆはそれぞれ共通に相補的な配列を共有しておりＹＤＣ１遺伝子の上流域と下流域の境界にＢａｍＨＩサイトを含む。
【０１１０】
ＹＤＣ１遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２５０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を混合し、プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｆとｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｒを用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩサイトをはさんでＹＤＣ１遺伝子の上下流域を含むＰＣＲ産物を得た。これをあらかじめｐＵＣ１９をＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる平滑末端化を行った後にセルフライゲーションして得たベクターに、プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｆとｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｒに含まれるＥｃｏＲＩサイトを利用してクローニングした。サンガー法（Ｆ．  Ｓａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４，  １２１５，  １９８１）による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列がデータベースのＹＤＣ１上下流域とそれぞれ一致することを確認した。
【０１１１】
また、プラスミドｐＹＤｐ−Ｈ（Ｂｅｒｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ，  ７，  ４７５，  １９９１）をＢａｍＨＩで切断し、ＨＩＳ３遺伝子を含む約１．２ｋｂの断片を上記のＹＤＣ１遺伝子の上下流域を含むプラスミドのＢａｍＨＩサイトに挿入した。
【０１１２】
得られたＹＤＣ１遺伝子の上下流域にＨＩＳ３遺伝子をはさんだ領域を含むプラスミドをＥｃｏＲＩで切断して得られた断片を用い、上記ＳＵＲ２遺伝子破壊株の形質転換を常法に従って行った。ヒスチジンを含まない最少完全平板培地（ＳＣ−Ｈｉｓ）でスクリーニングを行うことにより、ＳＵＲ２／ＹＤＣ１二重破壊株を得た。
【０１１３】
次に、公開されている酵母ゲノムデータベース中の酵母スフィンゴ脂質  α−ヒドロキシラーゼ（ＳＣＳ７）の塩基配列（SGD(Saccharomyces Genome Database, 
1133784537468_3
)）（配列番号７）を参考に、プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆ（配列番号１９）
およびｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｒ＿Ｇ４１８（配列番号２７）、ｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｆ＿Ｇ４１８（配列番号２８）およびｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｒ（配列番号２２）を作製した。
【０１１４】
配列番号１９：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴ−３’
配列番号２７：５’−ＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＣ−３’
配列番号２８：５’−ＣＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡ  −３’
配列番号２２：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＡＡ−３’
上記プライマー対を用いて、常法により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＳＣＳ７遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２８０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を得た。
【０１１５】
また、プライマーＧ４１８ＰＣＲ２Ｆ（配列番号２９）およびＧ４１８ＰＣＲ２Ｒ（配列番号３０）を作製し、プラスミドｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ４（ＥＭＢＬ  ＡＪ００２６８０）を鋳型にＰＣＲを行い、カナマイシンおよびジェネティシン（Ｇ４１８）抵抗性遺伝子を含むＰＣＲ産物を得た。
【０１１６】
配列番号２９：５’−ＧＴＧＧＴＡＡＧＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣ−３’
配列番号３０：５’−ＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＴＡＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡ−３’
プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｒ＿Ｇ４１８（配列番号２７）とＧ４１８ＰＣＲ２Ｆ（配列番号２９）、およびプライマーｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｆ＿Ｇ４１８（配列番号２８）とＧ４１８ＰＣＲ２Ｒ（配列番号３０）はそれぞれ共通に相補的な配列を共有しており、上記３種類のＰＣＲ産物を混合し、プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆとｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０ＲによりＰＣＲを行い、ＳＣＳ７遺伝子上流２８０ｂｐ、カナマイシンおよびＧ４１８抵抗性遺伝子およびＳＣＳ７遺伝子下流２８０ｂｐが連結したＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を直接鋳型にすることによりサンガー法（Ｆ．  Ｓａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４，  １２１５，  １９８１）による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列がデータベースと一致することを確認した。
【０１１７】
このＰＣＲ産物を用いて上記ＳＵＲ２／ＹＤＣ１二重遺伝子破壊株の形質転換を常法に従って行い、Ｇ４１８  ３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）で形質転換体を選抜し、ＳＵＲ２／ＹＤＣ１／ＳＣＳ７遺伝子三重破壊株を得た。
【０１１８】
実施例６：ヒトＤＥＳ１発現プラスミドをもつ酵母セラミド合成系・代謝系形質転換株の作製
上記実施例３−５で得られた各遺伝子の破壊株を用いてＤＥＳ１遺伝子（実施例１）発現株又はＤＥＳ１遺伝子発現・ＩＳＣ１遺伝子（実施例２）高発現株を作製した。
【０１１９】
I．ＳＵＲ２破壊（実施例３）  ＋  ヒトＤＥＳ１遺伝子発現（実施例１）
II．ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例４）  ＋  ヒトＤＥＳ１遺伝子発現
III．ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例５）  ＋  ヒトＤＥＳ１遺伝子発現
IV．ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例５）  ＋  ヒトＤＥＳ１遺伝子発現・ＩＳＣ１遺伝子高発現（実施例１及び２）
実施例１のヒトＤＥＳ１発現プラスミド、及び実施例２のＩＳＣ１発現プラスミドによって、実施例３−５で得られた破壊株の形質転換を常法に従って行った。ＤＥＳ１遺伝子形質転換体の選抜はウラシルを、また、ＤＥＳ１およびＩＳＣ１遺伝子形質転換体の選抜はウラシルおよびトリプトファンを含まない最少完全平板培地（それぞれＳＣ−Ｕｒａ、およびＳＣ−Ｕｒａ，Ｔｒｐ）を用いて行った。
【０１２０】
得られた形質転換株におけるヒトＤＥＳ１遺伝子の発現は、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した総ＲＮＡをプライマーＨｄｅｓ１＿Ｒ（配列番号３１）を用いたＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による逆転写反応と反応物のＨｄｅｓ１＿Ｆ（配列番号３２）とＨｄｅｓ１＿Ｒ（配列番号３１）を用いたＥｘ−ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）によるＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行って確認した。
【０１２１】
配列番号３１：５’−ＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
配列番号３２：５’−ＡＧＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧ−３’
ＩＳＣ１遺伝子の高発現は同様に、プライマーｉｓｃ１Ｒ（配列番号１４）を用いた逆転写反応とプライマーｉｓｃ１Ｆ（配列番号１３）とｉｓｃ１Ｒ（配列番号１４）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【０１２２】
実施例７  ヒトＤＥＳ１発現プラスミドをもつ酵母セラミド合成系・代謝系形質転換株のスフィンゴイド分析
実施例６で得られたI．ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２破壊株、II．ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株、III．ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株をトリプトファン、ヒスチジン、ロイシンおよびリジンを含む最少液体培地（ＳＤ＋Ｔｒｐ，  Ｈｉｓ，  Ｌｅｕ，  ａｎｄ  Ｌｙｓ）で、また、IV．ヒトＤＥＳ１発現・ＩＳＣ１高発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株をヒスチジン、ロイシンおよびリジンを含む最少液体培地（ＳＤ＋Ｈｉｓ，  Ｌｅｕ，  ａｎｄ  Ｌｙｓ）で３０℃、２４時間培養した。次いで、３７℃、９０分のヒートショック培養を行い、菌体からスフィンゴイドを文献（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７３，  ２８５９０，  １９９８）に従って、スフィンゴイド抽出、ジニトロフェノール化した。
【０１２３】
上記スフィンゴイドを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行った。以下に簡潔にその方法を示す。
菌体（湿重量３５０ｍｇ）を直接、１０％（ｗ／ｖ）Ｂａ（ＯＨ）２を含む１，４−ジオキサン／水，１：１（ｖ／ｖ）  ３ｍｌ中で、１１０℃、２４時間、加水分解した。遊離したスフィンゴイドをクロロホルム／１，４−ジオキサン／水，８：３：８（ｖ／ｖ／ｖ）で層分離することによって抽出した。有機層を等量の０．１Ｍ  ＫＯＨ、０．５Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、０．５％（ｖ／ｖ）  １−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン  メタノール溶液  ０．２ｍｌと２Ｍ  ホウ酸／ＫＯＨ（ｐＨ１０．５）０．８ｍｌを６０℃、３０分間反応させてスフィンゴイドをジニトロフェノール化合物化（ＤＮＰ化）した。反応後、回収した有機層を真空乾燥させて得られたＤＮＰ化スフィンゴイドをクロロホルムに溶解した後、シリカゲル  ６０ＴＬＣプレート上でクロロホルム／メタノール，９：１（ｖ／ｖ）を用いて展開した。ＤＮＰ化スフィンゴイドは黄色（ＵＶ照射下では暗青色）を呈しており、これを観察した。
【０１２４】
次に、ＤＮＰ化ｓｐｈｉｎｇｏｉｄをＴＬＣプレートから回収し、クロロホルム／メタノール，２：１（ｖ／ｖ）で抽出後、クロロホルム／メタノール／０．１  Ｍ  ＫＯＨ，  ２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）で層分離を行った。有機層を回収し、真空乾燥した後、メタノールに溶解させてＨＰＬＣサンプルとして供試した。ＨＰＬＣはシリカゲルＯＤＳカラムを用い、８０％  メタノール／アセトニトリル／２−プロパノール（１０：３：１，ｖ／ｖ／ｖ）、および２０％水から０％水への直線勾配溶出（流速  １ｍｌ／分、４０分）を行い、３５０ｎｍ  紫外線吸収をモニタリングした。
【０１２５】
理解を容易にするために、ＴＬＣ、ＨＰＬＣによるスフィンゴイド分析のためのスキームを図４に示した。
Ｓｉｇｍａ社から購入した既定量の合成スフィンゴシンを同様に分析したＨＰＬＣデータを基準値にして菌体内のスフィンゴシンの定量を行った。表１に菌体１００ｍｇあたりに蓄積したスフィンゴシンの計算値を示した。ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２破壊株、ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株、ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株、およびヒトＤＥＳ１発現・ＩＳＣ１高発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株の順に、菌体内のスフィンゴシン量は順次増加した。
【０１２６】
表１．酵母菌体１００ｍｇ中のスフィンゴシン量
【０１２７】
【表１】
0004737531.tif 000002
【０１２８】
実施例８  ＬＣ−ＭＳ解析のための酵母脂質抽出
実施例６のセラミド合成系遺伝子形質転換酵母を、ヒスチジン、ロイシン、リジン、およびトリプトファンを添加した最少液体培地（ＳＤ＋Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ及びＴｒｐ、ただし、ＩＳＣ１高発現のものはトリプトファンは含まない）２５０ｍｌで３０℃、１４０ｒｐｍで２４時間振盪培養した後、３７℃、９０分ヒートショック培養を行った。菌体を回収し、滅菌水で２度洗浄し、１００ｍｇの菌体を５００μｌの滅菌水に懸濁させた懸濁液を調製した。本懸濁液にグラスビーズを加え、室温で５分間、激しく攪拌することにより菌体を破砕した。これにクロロホルム、メタノール、懸濁液の比が１０：１０：３になるようにクロロホルム、メタノールを加え、脂質を抽出した。抽出反応液の遠心分離を行い、得られた上清を回収した後、窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。
【０１２９】
実施例９  ＬＣ−ＭＳ解析によるセラミド分子種の決定
実施例８で抽出した酵母脂質をヘキサン／イソプロパノール（３：２ｖ／ｖ）で抽出し、６．６７％硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、特開２００３−２８８４９に記載の装置を用いてセラミド分子種の決定を行った。ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株のセラミド分子種の同定結果を図５に示す。
【０１３０】
図５に示したように、ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株で、セラミドＮＳ（Ｃｅｒ（ＮＳ））（分子量６７８）が合成されていることが確認された。
同様にヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株でもセラミドＮＳ（Ｃｅｒ（ＮＳ））（分子量６７８）が合成されていることが確認され、菌体１００ｍｇあたりに蓄積したセラミドＮＳ（Ｃｅｒ（ＮＳ））は、図８に示すようにヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株で６．５ｎｍｏｌ、ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株で９．２ｎｍｏｌと順次増加した。
【０１３１】
実施例１０  ＳＵＲ２破壊株のスフィンゴイドの分析
ＳＵＲ２破壊株について、ＴＬＣ及びＨＰＬＣを用いてスフィンゴイドの分析を行った。ＴＬＣ分析及びＨＰＬＣ分析は、実施例８に記載した方法に従って行った。結果を図６に示す。
【０１３２】
ＳＵＲ２破壊株より抽出したスフィンゴイド（サンプル５）はＨＰＬＣのピークの位置がサンプル２と一致することからジヒドロスフィンゴシンと同定された。これに対し、野生型酵母より抽出したスフィンゴイド（サンプル４）はＨＰＬＣのピークの位置がサンプル１と一致することからフィトスフィンゴシンと同定された。このことからＳＵＲ２破壊株では、野生型酵母と異なり、ジヒドロスフィンゴシンが優先的に合成されていることがあきらかとなった。
【０１３３】
このＳＵＲ２破壊株においてＤＥＳ１を導入し発現させることにより、セラミドＮＳの材料となるスフィンゴシンが合成される。
実施例１１  ＳＵＲ２／ＳＣＳ７破壊株のセラミド分析
ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株について、実施例８に記載した方法に従って、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図７に示す。ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株では、スフィンゴイド塩基にアミド結合した脂肪酸のα位の炭素に水酸基が付加された態様（Ｃｅｒ（ＡＳａ）又はＣｅｒ（ＡＰ））ではなく、ジヒドロセラミド（Ｃｅｒ（ＮＳａ））が蓄積していることが確認された。この破壊株にＤＥＳ１を発現させればヒト型セラミドが合成される。
【０１３４】
実施例１２：トリチウム標識（３Ｈ）したＤ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  を用いたセラミドの解析
上述のセラミド合成系遺伝子形質転換酵母をヒスチジン、ロイシン、リジン、およびトリプトファンを添加した最少液体培地（ＳＤ＋Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ及びＴｒｐ、ただし、ＩＳＣ１高発現のものはトリプトファンは含まない）で２５℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した後、酵母を回収し、最少液体培地に懸濁させた懸濁液５ｍｌ（ＯＤ６００＝０．５）を調製した。トリチウム標識（３Ｈ）したＤ−エリスロ−ジヒドロスフィンゴシンを１０μｌ（１０μＣｉ）加え、一晩２５℃で培養を行った（Ｚａｎｏｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １９，  ２８２４，２０００）。２５０ｍＭのＮａＦと２５０ｍＭのＮａＮ３を２００μｌ加え、反応を停止させた後、氷冷した滅菌水で３度洗浄し、菌体を６６μｌの滅菌水に懸濁させた。
【０１３５】
本懸濁液にグラスビーズを加え、激しく攪拌することにより菌体を破砕した。これにクロロホルム、メタノール、懸濁液の比が１０：１０：３になるようにクロロホルム、メタノールを加え、脂質を抽出した。抽出液の遠心分離を行い、得られた上清を回収した後、窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。試料を１００μｌのクロロホルム−メタノール−水（１０：１０：３）に溶解し、０．６Ｎ  ＮａＯＨメタノール溶液を２０μｌ加え、３０℃、９０ｍｉｎ反応させた後、０．６Ｎ  酢酸溶液で中和させた。ブタノール抽出により塩を除去し、得られたブタノール層（上層）を窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。
【０１３６】
脂質を２０μｌのクロロホルム−メタノール（１：１）に溶解させ、ｂｏｒａｔｅ処理した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにスポットし、クロロホルム−メタノール（９：１）で展開した（Ｔｒｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ６６，  １６７１，  ２００４）。展開後、放射能標識セラミドをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ）で分析した。結果を図９に示す。
【０１３７】
ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株のジヒドロセラミド（ＣｅｒＮＳａ）を１００％とした場合、ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株のセラミドＮＳ（ＣｅｒＮＳ）は３０％、ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株のセラミドＮＳ（ＣｅｒＮＳ）は６４％，ヒトＤＥＳ１発現・ＩＳＣ１高発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株のセラミドＮＳ（ＣｅｒＮＳ）は３０９％と順次増加した。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、酵母及び高等動物細胞におけるスフィンゴ脂質合成代謝経路を示す。
【図２】図２は、本発明のヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法の好ましい態様の概要を示す。
【図３】図３は、酵母及び高等動物のスフィンゴイド及びセラミドの分子種とその構造式を示す。
【図４】図４は、本発明の酵母菌体の培養からＴＬＣ及びＨＰＬＣによる分析までの工程を模式的に示したものである。
【図５】図５は、ＬＣ−ＭＳ解析によるヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株のセラミド分子種の同定結果を示す。
【０１３９】
左上から；
ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株セラミド領域の全陽イオンクロマトグラム
上記のうち、質量数680のみで書かせたクロマトグラム(ピーク位置ＲＴ１３．３５)
上記のうち、質量数678のみで書かせたクロマトグラム(ピーク位置ＲＴ１３．６9)
標準セラミドＮＳの陽イオンクロマトグラム
右上から；
質量数680のピークにおけるマススペクトル
質量数678のピークにおけるマススペクトル
ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株でセラミドＮＳ（Ｃｅｒ（ＮＳ）（分子量６７８）が合成されていることが確認できた。
【図６】図６は、ＳＵＲ２破壊株のＴＬＣ，及びＨＰＬＣによるスフィンゴイドの分析結果を示す。
【０１４０】
サンプル１；フィトスフィンゴシン標準
サンプル２；ジヒドロスフィンゴシン標準
サンプル３；スフィンゴシン標準
サンプル４；野生型酵母より抽出したスフィンゴイド
サンプル５；ＳＵＲ２破壊株より抽出したスフィンゴイド
左から
可視光により観察したＴＬＣ（ＤＮＰ化したｓｐｈｉｎｇｏｉｄは黄色のスポットとして観察される）、
ＵＶ照射により観察したＴＬＣ（ＤＮＰ化したｓｐｈｉｎｇｏｉｄは暗青色のスポットとして観察される）、
ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１４１】
ＳＵＲ２破壊株より抽出したスフィンゴイド（サンプル５）はＨＰＬＣのピークの位置がサンプル２と一致することからジヒドロスフィンゴシンと同定された。これに対し、野生型酵母より抽出したスフィンゴイド（サンプル４）はＨＰＬＣのピークの位置がサンプル１と一致することからフィトスフィンゴシンと同定された。
【図７】図７は、ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株のＬＣ−ＭＳ分析結果（質量数５００から８００のイオンクロマトグラム）を示す。ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株では、ジヒドロセラミド（Ｃｅｒ（ＮＳａ））が蓄積していることが確認された。この破壊株にＤＥＳ１を発現させればヒト型セラミドが合成される。
【図８】図８は、ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株、ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株のセラミド量を示す。
【図９】図９は、トリチウム標識（３Ｈ）したＤ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  を用いた酵母のセラミドのＴＬＣによる分析結果とバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ）を用いた放射能標識セラミドの定量結果を示す。左から    サンプル１；ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株    サンプル２；ヒトＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株    サンプル３；ヒトＤＥＳ１発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株    サンプル４；ヒトＤＥＳ１発現・ＩＳＣ１高発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株順次セラミドＮＳの合成量は増加していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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