(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
0004794788.tif 000007
［式中、
Ｙ１およびＹ２は、開鎖形態のグルコースであり；
Ｒ１およびＲ２は、同一または異なっていてもよく、
ａ）Ｃ１４−１８アルキル基；または
ｂ）１の炭素／炭素二重結合を有する炭素数１８の炭素鎖；から選択され；
およびｎは１ないし１０を意味する］
で示される界面活性剤の化合物またはその塩の使用であって、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドをインビトロにて真核生物または原核生物細胞に導入することを促進するための使用。
【請求項２】
塩が医薬上許容される塩である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｎが２ないし８である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
ｎが４または６である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
界面活性剤の化合物が対称性を有する、すなわちＲ１およびＲ２基が同一である、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
ポリヌクレオチドを細胞に導入し、アンチセンスノックアウト効果を得る、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを遺伝子療法のために細胞に導入する、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
ポリヌクレオチドを生物全体における遺伝的免疫処置のために細胞に導入する、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
遺伝的免疫処置が抗体の産生である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドを培養中の細胞に導入する、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１１】
請求項１に記載の界面活性剤の化合物。
【請求項１２】
ｎが２ないし８である、請求項１１に記載の界面活性剤の化合物。
【請求項１３】
ｎが４または６である、請求項１２記載の界面活性剤の化合物。
【請求項１４】
界面活性剤の化合物が、Ｒ１およびＲ２が同じであるジェミニ化合物である、請求項１１ないし１３のいずれか１つに記載の界面活性剤の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ２が１の炭素／炭素二重結合を有する炭素数１８の炭素鎖である、請求項１１ないし１４のいずれか１つに記載の界面活性剤の化合物。
【請求項１６】
ヒトを除く動物の抗感染性療法に用いる、ポリヌクレオチドを導入された原核生物または真核生物を調製するに際し、当該導入を促進するための、請求項１１ないし１５のいずれか１つに記載の界面活性剤の化合物の使用。
【請求項１７】
グルコース基をアルキルジアミン化合物のアミノ末端に付加してなる、請求項１１に記載の界面活性剤の化合物の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は炭水化物をベースとする界面活性剤の化合物についての新規な使用に関する。かかる使用は、ドラッグデリバリーのために化合物の細胞への導入を容易にすること、および遺伝子発現の研究または遺伝子療法のためにオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの細胞への導入を容易にすることを包含する。本発明は炭水化物をベースとする新規な界面活性剤の化合物およびその製法にも関する。
【０００２】
（従来技術）
界面活性剤は低濃度であっても液体の表面特性に著しい影響を与える物質である。例えば、界面活性剤を水または水溶液に溶かすと、その表面張力が著しく減少し、２種の液体または液体と固体の間の界面張力が減少する。界面活性剤分子のこの特性は、産業、特に洗剤および石油産業において広く利用されている。１９７０年代には、一の疎水性架橋によって連結した、頭部が極性の２つの疎水性鎖により特徴付けられる、一連の新規な界面活性剤分子が報告された（Deinega,Yら、Kolloidn.Zh. ３６、６４９、１９７４）。これらの分子を「ジェミニ（gemini）」と称し（Menger,FMおよびLittau,GA、J.Am.Chem.Soc. １１３、１４５１、１９９１）、これらの分子はそのモノマー等価物と比べて非常に望ましい特性を有する。例えば、この新規な界面活性剤は、油と水をベースとする液体の間の界面張力を減少させるのに極めて効果的であり、臨界ミセル濃度は非常に低い。最近、Pestmanらは、非イオン性の炭水化物をベースとするジェミニ界面活性剤の合成および特徴化を報告した（Pestman,JMら、Langmuir １３、６８５７−６８６０、１９９７）。
カチオン性界面活性剤が、とりわけ、ポリヌクレオチドを培養中の細胞にトランスフェクトするのに用いられ、そのような試剤として、例えば、遺伝的技法に関わる科学者が商業上利用できるもの（例えば、USA、WI、Promega Corp.から入手可能な、真核生物細胞をトランスフェクションするためのＴｆｘＴＭ−５０試薬）がある。
【０００３】
遺伝子療法のため、またはアンチセンス療法のために、ＤＮＡの細胞へのインビボにおける効率的デリバリーが何年間もの大きな目標であった。のう胞性繊維症（ＣＦ）の調整的遺伝子療法を得るために、デリバリービヒクルとしてのウイルス、例えば、呼吸器の上皮細胞に関するアデノウイルスを使用することに多くの試みが集中した。しかしながら、ＣＦ患者において遺伝子導入が成功したという証拠があるにも拘わらず、アデノウイルスの経路は、炎症性副作用および導入遺伝子の一時的発現の制限などの、問題点が残ったままである。カチオン性界面活性剤を用いる研究を含め、インビボにおける遺伝子デリバリーのためのいくつかの別の方法が研究された。Gao,Xらは、Gene Ther. ２、７１０−７２２（１９９５）において、アミンを有するカチオン性脂質を用い、ＣＦトランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）についての正常なヒト遺伝子をＣＦマウスの呼吸器上皮に導入してこの方法の実行性を明らかにした。このグループはリポソームＣＦ遺伝子療法実験の追跡調査を行い、その成功は部分的であるにすぎないが、この方法がヒトにおいて成功する可能性のあることを明らかにした（Caplen,NJら、Nature Medicine １、３９−４６、１９９５）。さらに最近では、別のグループが他のカチオン性脂質、例えば、コレステロール誘導体（Oudrhiri,Nら、Proc.Natl.Acad.Sci. ９４、１６５１−１６５６、１９９７）の遺伝子デリバリーの可能性を調査した。この限定された実験はこれらコレステロールをベースとする化合物がインビトロおよびインビボの両方で遺伝子の上皮細胞への導入を促進する能力のあることを明らかにし、この一般的方法の妥当性を支持している。
【０００４】
これらの研究および他の研究は、この新しい研究の分野において、細胞ベースの実験におけるトランスフェクションのためにインビトロにて、および遺伝子療法およびアンチセンス処置のためにインビボにて、ポリヌクレオチドの細胞への効果的な導入を促進する新たな毒性の低い界面活性剤分子を開発する必要が引き続きあることを示すものである。本発明は現存する化合物によって明らかにされた困難を解決しようとするものである。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、一般式：
【化３】
0004794788.tif 000002
［式中、
Ｙ１およびＹ２は、同一または異なっていてもよく、炭水化物基、好ましくは糖類であり；
Ｒ１およびＲ２は、同一または異なっていてもよく、
ａ）水素；
ｂ）Ｃ１−２４アルキル基；
ｃ）Ｃ１−２４アルキルカルボキシ基；または
ｄ）１またはそれ以上の炭素／炭素二重結合を有する炭素数２ないし２４の炭素鎖；から選択され；
およびｎは１ないし１０を意味する］
で示される炭水化物をベースとする界面活性剤の化合物またはその塩、好ましくは医薬上許容される塩の使用であって、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドあるいはそのアナログをインビボまたはインビトロにて真核生物または原核生物細胞に導入することを促進するための使用に関する。
【０００６】
該化合物は対称的、すなわちＲ１およびＲ２基が同一であり、Ｙ１およびＹ２が同一であることが好ましい。その分子対称性から、これらの化合物を「ジェミニ」界面活性剤と称する。
好ましい具体例において、炭水化物基Ｙ１およびＹ２は、還元されたイミン結合を介して窒素に結合した、糖類である。かかる糖類はグルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースなどの二糖類およびさらに複雑な糖類、例えばセルロースをベースとする糖類を包含する。
【０００７】
特に好ましい具体例において、Ｙ１およびＹ２はグルコースであり、一般構造式（ＩＩ）：
【化４】
0004794788.tif 000003
［式中、ＧｌｕはＣ−１（アルデヒド炭素）を介して結合した開鎖形態のグルコース（グルシトール）であり、Ｒ１、Ｒ２およびｎは上記と同意義である］
で示される。
【０００８】
さらに好ましい具体例において、Ｒ１およびＲ２は鎖長がＣ１０−２０、最も好ましくはＣ１２−１８のアルキル基であり、ｎは２と８の間、最も好ましくは４または６である。
さらに別の好ましい具体例において、Ｒ１およびＲ２は１またはそれ以上の炭素／炭素二重結合を有するＣ１２−２４、好ましくはＣ１６−２０、最も好ましくはＣ１８炭素鎖である。
かかる化合物は新規であり、本発明の一部を形成する。
本発明は、炭水化物をベースとする界面活性剤がポリヌクレオチドの細胞への導入を促進するための極めて効率的な試薬であるという意外な研究結果を示す。
【０００９】
Ｒ１およびＲ２が共にＣ１−２４アルキルカルボニル基でない式（Ｉ）の化合物は新規である。したがって、さらなる態様において、本発明はＲ１またはＲ２の一方が鎖長Ｃ１−２４のアルキル基であり、他方がＣ１−２４アルキルカルボキシ基である、式（Ｉ）の化合物を提供する。
本発明の化合物は、当業者に周知の合成化学手段を用いて容易に入手可能な出発物質より調製することができる。炭水化物をベースとする界面活性剤の化合物を製造する一般的方法は、アルキルジアミン化合物のアミノ末端に炭水化物基を付加することを含む。次に、グルコースをベースとする化合物について説明する、本発明の糖類をベースとする化合物の合成に関する一般的なスキーム（スキーム１）を示す。
【００１０】
【化５】
0004794788.tif 000004
【００１１】
Ｒ１がＣ１−２４アルキルカルボキシの場合、第２工程で、適当なアシル化剤、例えば対応する酸の活性化誘導体を用いてアミド結合を形成する。
好ましくは、グルコースをベースとする化合物について説明する、本発明の糖類をベースとする化合物の合成に関するスキームをスキーム２に示す。
【００１２】
【化６】
0004794788.tif 000005
【００１３】
さらなる態様において、２ないし２４個の炭素原子の炭素鎖を含み、１またはそれ以上の炭素／炭素二重結合を有する本発明の化合物は、Ｃ１８オレイル化合物について説明する、スキーム３（図３）に従って調製することができる。当業者は、この情報を用いて、炭素数２ないし２４の炭素鎖を含み、１またはそれ以上の炭素／炭素二重結合を有する他の化合物を調製する類似する方法を考案することができる。
上述した方法は、対称な、すなわち、「ジェミニ」な、炭水化物をベースとする界面活性剤の合成についてのものである。本発明の非対称な炭水化物をベースとする界面活性剤は、異なる保護基を用いることで、例えばジアミンの第１アミンに非対称性を導入することにより調製することができる。
【００１４】
さらなる態様において、炭水化物をベースとする界面活性剤の化合物を用いてオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの細胞への導入を促進し、生物全体における遺伝子療法および遺伝的免疫処置（抗体の産生）のための、アンチセンスノックアウト効果を得る。さらなる好ましい態様において、例えば、とりわけ、遺伝子発現の研究およびアンチセンス制御実験にてポリヌクレオチドの細胞への導入が必要とされる場合に、炭水化物をベースとする界面活性剤の化合物を用いてポリヌクレオチドの培養中の細胞へのトランスフェクションを促進する。ポリヌクレオチドを化合物と混合して細胞に加え、インキュベートしてポリヌクレオチドを取り込むことができる。さらにインキュベートした後、トランスフェクトしたＤＮＡにより得られる表現型の特徴についてアッセイしてもよく、あるいはかかるＤＮＡによって発現されたｍＲＮＡのレベルをノーザンブロッティング法によりまたはＰＣＲを基礎とする定量方法、例えばタックマン（Taqman）方法（USA、Connecticut、Perkin Elmer）を用いることで測定することができる。本発明の化合物は、従来技術における化合物と比較して、培養中の細胞におけるＤＮＡの細胞性取り込みの効率において、典型的には３ないし６倍の有意な改良特性を有する。トランスフェクションプロトコルにおいて、該ジェミニ化合物を１またはそれ以上の補足体と組み合わせて用い、トランスフェクションの効率を上げることもできる。かかる補足体は、例えば：
（ｉ）中性キャリア、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Farhood,H.ら、Biochem.Biophys,Acta １２３５、２８９（１９８５））；
（ｉｉ）錯形成剤、例えば、市販のＰＬＵＳ試薬（USA、Maryland、Life Technologies Inc.）あるいはペプチド、例えば、ポリリシンもしくはポリオルニチンペプチドまたは、限定するものではないが、リシン、オルニチンおよび／またはアルギニンなどの塩基性アミノ酸を主に含むペプチド；
から選択することができる。上記のリストは厳密であることを意図とするものではなく、トランスフェクションの効率を上げる他の補足体も本発明の範囲内にある。
【００１５】
本発明は、もう一つ別の態様において、本発明の化合物を用いる遺伝子療法における遺伝的物質の導入に関する。
本発明のさらにもう一つ別の態様は、本発明の化合物を用いて、非ヌクレオチドをベースとする薬物の化合物をインビトロまたはインビボにて細胞中にデリバリーする方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、抗感染療法にて用いるために、ポリヌクレオチドまたは抗感染性化合物の原核生物または真核生物への導入を促進するための方法に関する。
【００１６】
本明細書中に汎用されている特定の用語の理解を容易にするために以下の定義を記載する。
「ポリヌクレオチド」は、一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、および単鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポリヌクレオチドなる語はまた、１またはそれ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基またはイノシンなどの通常でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており；すなわち、「ポリヌクレオチド」は、典型的には自然に見出されるような、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００１７】
「トランスフェクション」とは、化学的または物理的手段によって細胞膜を修飾することを含む方法を用いてポリヌクレオチドを培養中の細胞に導入することをいう。かかる方法は、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.（１９８９）に記載されている。ポリヌクレオチドは線状または環状、一本鎖または二本鎖であってもよく、ポリヌクレオチドの複製または該ポリヌクレオチドの一部を含む同種または異種遺伝子の発現を調節する因子を包含することができる。
【００１８】
（実施例）
次に、本発明を以下の実施例によって記載する。
実施例１−  炭水化物をベースとする化合物を用いる、ルシフェラーゼを発現する組換えプラスミドの、培養中の細胞へのトランスフェクション
一般的な構造式（ＩＩ）：
【化７】
0004794788.tif 000006
で示される炭水化物をベースとする界面活性剤の化合物を、上記した方法に従って合成した。以下の化合物を製造した：
【００１９】
化合物番号          Ｒ１ −ｎ−Ｒ２
ＧＳ Ｇ １：      １６−６−１６
ＧＳ Ｇ ２：      １８−６−１８（不飽和（オレイル）Ｒ鎖）
ＧＳ Ｇ ３：      １２−６−１２
ＧＳ Ｇ ４：      １４−６−１４
ＧＳ Ｇ ５：      １４−４−１４
ＧＳ Ｇ ６：      １６−４−１６
ＧＳ Ｇ ７：      １２−４−１２
ＧＳ Ｇ ８：      １８−４−１８
ＧＳ Ｇ ９：      １８−６−１８
【００２０】
接着性細胞系（Puckら、１９５８）を用いてトランスフェクション実験を行った。完全培地は１０％ｗ／ｗウシ胎児血清および１ｘＬ−グルタミンを補足したＭＥＭα培地からなる。培地および補足体はすべて、Life Technologiesから得た。
β−ガラクトシダーゼを発現する適当なトランスフェクトされた細胞系を、プラスミドｐＳＶ−β−Galactosidase Control Vector（Promega）とプラスミドSelecta Vecta−Neo（R&D Systems）を一緒に１０：１の割合でトランスフェクトすることで生成した。Ｇ４１８（Life Technologies）の選択（０．８ｍｇ・ｍｌ−１）に付した後、候補細胞系をβ−ガラクトシダーゼ活性について試験した（β−Gal Receptor Gene Assay、化学ルミネセンス；Roche Diagnostics）。
【００２１】
インビトロ遺伝子トランスフェクション
トランスフェクトする１６−１８時間前に、細胞を９６−ウェルプレート（Beckton Dicksinson）に１ウェル当たり約１ｘ１０４細胞の密度で播種した。トランスフェクションには、１ウェル当たり６４ｎｇのルシフェラーゼ（luciferase）受容体遺伝子プラスミド、ｐＧＬ３−Control Vector（Promega）を種々の濃度の炭水化物をベースとするジェミニ化合物と一緒にインキュベートした。室温で３０分インキュベートした後、OPTI-MEM（登録商標）培地（Life Technologies）をそのトランスフェクション混合物に加え、その溶液を細胞上に置いた（１ウェル当たりの最終容量：１００μｌ）。３７℃で３時間または一夜インキュベートした後、そのトランスフェクション溶液を完全培地と置き換え、細胞をさらに３７℃でインキュベートした。約４８時間トランスフェクトした後、製造主（Roche Diagnostics）の指示に従って受容体遺伝子アッセイを行った。ルミネセンスをPackard TopCount NXT Microplate ScintillationおよびLuminescence Counterで測定した。標準化する目的で、β−ガラクトシダーゼ活性（β−Gal Reporter Gene Assay、化学ルミネセンス；Roche Diagnostics）を測定し、β−ガラクトシダーゼ活性に対するルシフェラーゼ活性を算定した。結果を図１および２に示す。
【００２２】
実施例２−  ＧＳ Ｇ ２のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在または不存在下でのトランスフェクション効率
上述したようにＧＳ Ｇ ２を調製し、実施例１に記載した化合物のトランスフェクション効率を試験するための実験に使用した。２種の実験を行い、その実験において、ＰＬＵＳ試薬の存在または不存在の下で、４μＭ、８μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび３０μＭの試験化合物を試験した。第１の実験においては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をウシ胎児血清（ＦＣＳ）なしで一夜インキュベートし、第２の実験においては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＦＣＳの存在下で一夜インキュベートした。その結果、ウシ胎児血清と一緒に予めインキュベートしてもＧＳ Ｇ ２化合物のトランスフェクション効率に何の効果もないことがわかった。当該分野においては血清がトランスフェクション効率を減少させることが周知であるため、この結果は意外であった。ＰＬＵＳ試薬の有無はいずれの実験においてもトランスフェクション効率に対して何の有意な効果もなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣＨＯ−Ｋ１細胞（β−ガラクトシダーゼで安定したトランスフェクトした）の炭水化物をベースとするジェミニ化合物、ＧＳ−Ｇ−３、ＧＳ−Ｇ−４、ＧＳ−Ｇ−５、ＧＳ−Ｇ−６、ＧＳ−Ｇ−７、ＧＳ−Ｇ−８およびＧＳ−Ｇ−９でのトランスフェクションを示す。化合物の濃度（μＭ）をｘ軸で示す。棒は８回の実験の平均ｃｐｓ（数／秒）±平均の標準偏差を表す。
【図２】  ＣＨＯ−Ｋ１細胞（β−ガラクトシダーゼで安定したトランスフェクトした）の炭水化物をベースとするジェミニ化合物、ＧＳ−Ｇ−１でのトランスフェクションを示す。化合物の濃度（μＭ）をｘ軸で示す。棒は８回の実験の平均ｃｐｓ（数／秒）±平均の標準偏差を表す。
【図３】  本発明のオレイル化合物を調製する一般的方法を示す。
【図１】
0004794788.tif 000008
【図２】
0004794788.tif 000009
【図３】
0004794788.tif 000010