(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法であって、
前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体である
ことを特徴とする検査方法。
【請求項２】
消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するための検査試薬であって、
ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体を構成成分とする
ことを特徴とする検査試薬。
【請求項３】
消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、イムノクロマトグラフィー法によるヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するカセット型検査キットであって、
前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体であり、
カセット内にメンブレンが収納され、該メンブレン上の一端に上記モノクローナル抗体が固相化されており、メンブレン上の逆の一端には展開液が装着され、その近傍の下流側に、標識剤の基質が添加されたパッドが配置され、メンブレンの中間部には上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体が添加されたパッドが配置されている
ことを特徴とするカセット型検査キット。
【請求項４】
消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、競合法によるヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するカートリッジ型検査キットであって、
前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体であり、
（ａ）上記モノクローナル抗体が収納されたウェル、（ｂ）標識剤で標識されたヘリコバクター・ピロリを含む液状試薬が収納されたウェル、および（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジを有する
ことを特徴とするカートリッジ型検査キット。
【請求項５】
消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、サンドイッチ法によるヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するカートリッジ型検査キットであって、
前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体であり、
（ａ）上記モノクローナル抗体が固相化された不溶性担体が収納されたウェル、（ｂ）標識剤で標識されたモノクローナル抗体を含む液状試薬が収納されたウェル、および（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジを有する
ことを特徴とするカートリッジ型検査キット。
【請求項６】
ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、
ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）である
ことを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項７】
ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、
ハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）である
ことを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項８】
ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体であって、
ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）により産生される
ことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項９】
ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体であって、
ハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生される
ことを特徴とするモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）はヒトの胃粘膜に見られる細菌である。ヘリコバクター・ピロリへの感染率は、社会経済状態と密接に関連しており、発展途上国ほど感染率が高く、先進国ほど感染率が低くなる傾向がある。しかしながら、日本人の感染率は先進国の中でも際立って高く、４０歳以上では８０％の人が感染しているとも言われている。近年、ヘリコバクター・ピロリが胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、更には胃癌等のさまざまな胃、十二指腸疾患の原因となりうることが明らかにされてきた。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリを除菌することにより、これらの疾患に罹患する危険性を低減できることが明らかになり、このため、ヘリコバクター・ピロリの除菌対象疾患について国際的な議論がなされた。現在では胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫、早期胃癌切除後胃等が除菌の適応対象疾患として認知されている。
【０００４】
ヘリコバクター・ピロリの除菌療法が胃、十二指腸疾患の新しい治療法として認知されるのに伴い、我が国でも日本消化器病学会により治験ガイドラインが作成され、ヘリコバクター・ピロリ感染の存在診断と除菌判定法が示された（日本消化器病学会雑誌、９６巻、１９９−２０７、１９９９年）。上記治験ガイドラインでは、存在診断は侵襲的検査法である胃部生検組織の培養、鏡検、ウレアーゼ試験にて行い、除菌判定は胃部生検組織の培養と鏡検及び非侵襲的検査法である尿素呼気試験を必須とすることが示されている。また、被験者が小児である等の特殊な場合、血中抗ヘリコバクター・ピロリ抗体検査と存在診断とを併用して判定を行うことが示されている。
【０００５】
しかし、これらのヘリコバクター・ピロリ感染の検査法には以下の問題点がある。侵襲的検査法は、胃内視鏡の挿入及び生検等により被験者が多大な苦痛を強いられることとなる。非侵襲的検査法では、被験者の苦痛は大幅に改善されるが、尿素呼気試験では、検査前の絶食が必要である。また、尿素呼気試験は、マススペクトルや赤外分光高度計等の装置が必要であり、特定の施設でしか実施できず、コストも高くなるという欠点がある。抗体検査は、除菌後も血中抗体価が長期にわたり高値であるので、除菌判定には適さない。従ってこれらの検査に代わる、非侵襲的で且つヘリコバクター・ピロリ感染を直接、特異的に精度良く検出できる検査方法が望まれている。
【０００６】
従来、消化管感染菌の直接検査法として消化管排泄物、特に糞便からの感染菌の選択培地を用いた分離培養が行われてきた。しかし、ヘリコバクター・ピロリに関しては数多くの試みにも拘らず、糞便から分離培養された報告はほとんどない。その理由として、ヘリコバクター・ピロリはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、低温、栄養欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化することから、下部消化管においても分離培養不能な球状体に変化していることが考えられる。
【０００７】
一方、抗原抗体反応に基づく免疫学的方法による糞便からのヘリコバクター・ピロリの直接検出に関して、ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより糞便等の排泄物検体中のヘリコバクター・ピロリを検出する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３巻、２１６２−２１６５、１９９５年、特開平１０−１０１２８号公報（特許第３０４３９９９号））。
【０００８】
しかし、ポリクローナル抗体は、一般に交差反応性があり、特異性が劣るうえ、抗血清のロット毎に抗体価や特異性が変動する欠点があるので、ポリクローナル抗体を用いた診断薬の製造は、本質的に品質管理が難しいという問題点がある。現実に、特許第３０４３９９９号の特許権者であるメリディアン社により製造されたポリクローナル抗体を用いた糞便中ヘリコバクター・ピロリ抗原検出キット「ＨｐＳＡ」に関しては、偽陰性の出現や特異性の低さが問題となっている（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｒｉｂｕｎｅ、４−５、１９９９年６月３日号；Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９４巻、１８３０−１８３３、１９９９年）。
【０００９】
特開平１０−１０１２８号公報には、ヘリコバクター・ピロリは菌株の変異を起こすので、単一の抗原のみとしか反応できないモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリの検出には不適であり、逆に、多様な抗原やエピトープに対応し得る点で、ポリクローナル抗体の方がヘリコバクター・ピロリの検出には適していると記載されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要とせずに、安価にヘリコバクター・ピロリの感染が診断でき、交差反応性がなく特異性に優れ、優れた感度を有する検査方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法であって、前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体である検査方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１２】
従来、ヘリコバクター・ピロリの菌体は下部消化管では破砕された状態にあり、そのタンパク質は消化管中でタンパク質分解酵素により分解されてしまうと考えられていた。
しかしながら、本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、ヘリコバクター・ピロリ感染者の糞便中にはヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼが存在していることを見出し、これがヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するための指標になり得ることに想到し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明の検査方法は、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを検出するものである。
上記消化管排泄物としては特に限定されないが、採取が容易で被験者への負担が少ない点で、糞便が検体として好適に用いられる。
【００１４】
上記Ｎａｔｉｖｅなカタラーゼとは、ほぼ生理的な条件でとっている固有の構造を保持しているカタラーゼを指し、全てのサブユニットを有し、かつ、活性を有しているカタラーゼであるが、本発明においてはハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体が認識するエピトープが保持されているものであれば特に限定されずに検出することができる。
【００１５】
本発明の検査方法では、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクローナル抗体が用いられる。
本発明で用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２９）により産生されたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体３１Ａ３ともいう）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）により産生されたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体８２Ａ３ともいう）であり、モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３には、これらの分解物であるＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ等も含まれる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００１６】
本発明で用いられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）は、平成１３年５月１０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託されたものである。ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）の製造方法は実施例１において示すとおりである。
【００１７】
モノクローナル抗体３１Ａ３とモノクローナル抗体８２Ａ３とは、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを抗原とするものである。
【００１８】
本発明者らが、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３をそれぞれ用いてヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物に対して抗体固定アフィニティークロマトグラフィーを行ったところ、ヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物に含まれていた２７０ｋＤａの分子量を有するタンパク質が検出された。このタンパク質に対してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ５９ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが検出された。また、このタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を調べたところヘリコバクター・ピロリのカタラーゼのアミノ酸配列と一致した。ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼは２００ｋＤａの分子量を有し、５０ｋＤａの分子量を有するサブユニットが４個集合した４量体の構造を有することが知られている（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６１）。
【００１９】
以上の結果より、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３が検出したタンパク質は４個のサブユニットを有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼであると同定され、上記の各モノクローナル抗体は、４個のサブユニットを有するカタラーゼを認識するものであることが明らかとなった。
【００２０】
上記抗体固定アフィニティークロマトグラフィーで検出されたカタラーゼの活性を測定したところ、活性を有しており、このカタラーゼがいわゆるＮａｔｉｖｅな酵素であったことも判明した。
モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３はいずれも、解離したカタラーゼのサブユニットとは反応しなかった。
【００２１】
ヘリコバクター・ピロリの菌体中の総タンパク質のうちカタラーゼの占める割合は、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６１に記載されたカタラーゼの精製過程における比活性の上昇度から概算して、重量換算でたかだか０．５％である。
この点に鑑みると、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３が、４個のサブユニットを有するカタラーゼを認識するものであったということは驚くべきことであり、到底予見しえない事項であった。
【００２２】
カタラーゼは異なる種の間でも極めてよく保存されており、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼも他の細菌のカタラーゼと相同性が高いことが知られている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９６），１７８（２３），６９６０−６９６７）。しかしながら、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、ヘリコバクター・ピロリ以外の細菌のカタラーゼとは全く反応しなかった。
【００２３】
一方、ヘリコバクター・ピロリには多様な変異株が存在することが知られているが（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６），２０，８３３−８４２）、驚くべきことに、実施例３に示すとおり、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、いずれのヘリコバクター・ピロリに対しても良好に反応した。
【００２４】
モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３がヘリコバクター・ピロリの多様な変異株に対して良好に反応することに鑑みると、これらのモノクローナル抗体が認識するエピトープは変異株同士のカタラーゼの間で極めてよく保存されている部位であると思われる。
【００２５】
以下に詳述するように、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、糞便を検体として、極めて高い精度でヘリコバクター・ピロリへの感染の有無を判定することができるものである。
【００２６】
モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３を用いて、糞便を検体として免疫学的測定を行ったところ、上記の各モノクローナル抗体はヘリコバクター・ピロリに感染している被験者の糞便のみと反応した。これにより、ヘリコバクター・ピロリに感染している被験者の糞便中には、４個のサブユニットを有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼが存在していることが明らかになった。糞便中に存在するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼがサブユニットごとに解離したものではなく、４個のサブユニットを保有するものであるということは今まで全く知られておらず、このことは、通常タンパク質は消化管中でタンパク質分解酵素により分解されてしまうことに鑑みても全く驚くべきことである。
【００２７】
また、ヘリコバクター・ピロリの感染者の糞便を試料として、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３を固定したカラムを作製し、アフィニティークロマトグラフィーを行い、その溶出画分について、ＥＬＩＳＡとカタラーゼ活性測定を行ったところ、カタラーゼ活性と抗原性とは一致した。
【００２８】
以上のことから、ヘリコバクター・ピロリの感染者の糞便中には４個のサブユニットを有し、カタラーゼ活性も有するＮａｔｉｖｅなカタラーゼが含まれることがわかった。ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼが消化管内で消化されずに、活性を有するＮａｔｉｖｅな酵素として排出され、糞便中に存在していたということは全く予想できないことであった。
【００２９】
モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３を大量に調製する方法としては特に限定されず、例えば、あらかじめプリスタンを投与したマウスの腹腔にハイブリドーマを移植して、回収した腹水から得る方法等を挙げることができる。腹水中のモノクローナル抗体は、プロテインＡやプロテインＧカラム等を使用する公知の方法等により精製することができる。
【００３０】
本発明で用いられるハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）、ハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）、モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３もまた、本発明の１つである。
【００３１】
本発明の検査方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフィー法等を挙げることができる。上記の各種検査方法は、競合法やサンドイッチ法等により、標識剤で標識された抗原又は抗体を用い、目的とする抗原又は抗体を測定することができるものである。
上記の各種検査方法のなかでも、ＥＬＩＳＡ法及びイムノクロマトグラフィー法が好ましい。
【００３２】
上記競合法は、例えば、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと、既知の量の標識されたヘリコバクター・ピロリのカタラーゼとの、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３に対する結合の量的な競合反応によるものである。上記で例示した競合法においては、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを含む検体液に、担体上に保持された一定量の抗体を加え、更に標識剤で標識した一定量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを加える。その後、担体上に保持された標識剤又は担体上に保持されなかった標識剤の活性を測定する。この際、抗体と標識された抗原の添加はほぼ同時に行うことが好ましい。
【００３３】
上記サンドイッチ法は、例えば、固相化されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３と、標識剤で標識されたこれらのモノクローナル抗体とで、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼをサンドイッチするものであり、酵素等の標識剤に対する基質等を加え発色等させることにより、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを検出するものである。
【００３４】
上記標識剤としては、１２５Ｉ等の放射性同位元素（以下、ＲＩと記す）、酵素、酵素基質、発光物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等を挙げることができる。これら標識剤と抗原又は抗体との結合には、マレイミド法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７９，２３３］、活性化ビオチン法［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７８），１００，３５８５］、疎水結合法等が用いられる。
【００３５】
上記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。この際用いる基質としては、選択した酵素に適したものを選べばよく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ２Ｏ２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ２Ｏ２（ペルオキシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウンベリフェリルホスフェート、３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３"−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（アルカリホスファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース（β−ガラクトシダーゼ用）等を挙げることができる。
【００３６】
上記測定は、４〜４０℃で１分〜１８時間反応させ、生じた発色、蛍光量、発光量又は着色量を測定することにより行うことができ、他にも、４〜４０℃の範囲で加温しながら行ういわゆるレート法を採用してもよい。
【００３７】
上記抗原又は抗体への放射標識は、市販されているボルトンハンター試薬により容易に行うことができる。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かした抗原又は抗体溶液にボルトンハンター試薬を加え１〜２時間後に、Ｇ−２５の脱塩カラム等を用いて未反応のボルトンハンター試薬を除去することにより実施することができる。
この他、クロラミンＴ法やヨードジン法等を採用することにより容易に１２５Ｉによる放射標識を行うことができる。
【００３８】
上記発光物質としては、例えば、イソルミノールやアクリジンエステル等を挙げることができ、上記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインやローダミン等を挙げることができる。この際、標識の方法は活性化エステル法やイソシアネート法を採用することにより容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」医学書院、１９８７年）。上記着色物質としては、例えば、着色ラテックス粒子、金コロイド等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の検査方法として、上記競合法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的にモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を結合させた固相に加えて反応させる。また、同時に標識剤で標識したヘリコバクター・ピロリのカタラーゼの一定量を加えて反応させる。
【００４０】
本発明の検査方法として、上記サンドイッチ法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的にモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を結合させた固相に加えて反応させる。その後標識剤で標識したモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を加えて反応させる。
【００４１】
次いで、いずれの方法においても、必要な場合には固相をよく洗浄した後で、固相上に結合している標識剤の活性を測定する。上記標識剤がＲＩである場合、ウェル・カウンター又は液体シンチレーション・カウンターを用いて測定する。標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質、着色物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。
【００４２】
本発明の検査方法は、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いるものであるので、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼに特異的に存在するエピトープを認識することができ、他の物質を、交差反応を原因として誤って検出してしまうことがなく、特異性が極めて高い測定を行うことができるという極めて優れた特色を有する。
【００４３】
本発明の検査方法を実施するためには、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を構成成分とする検査試薬を用いることができる。このような検査試薬もまた、本発明の１つである。
上記検査試薬において用いられるモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３としては、それらの分解物であるＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ等であってもよい。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００４４】
上記検査試薬では、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３はあらかじめ固相化されていてもよく、また、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３はあらかじめ上記標識剤で標識されていてもよい。
【００４５】
上記検査試薬において用いる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の不溶性担体を挙げることができる。
【００４６】
上記検査試薬は、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査キットの１構成品として用いられてもよい。このような検査キットもまた、本発明の１つである。
上記検査キットに含まれる他の成分としては特に限定されず、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができ、これらとしては上述のものを用いることができる。
【００４７】
上記検査キットの形態としては特に限定されないが、迅速かつ簡便に診断を行うためには検査キットの構成成分が一体となった一体型の検査キットであることが好ましい。
上記一体型の検査キットとしては特に限定されず、例えば、カセット型、カートリッジ型等を挙げることができる。
【００４８】
上記カセット型の態様としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用い、反応カセット内にメンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端（下流側）にはモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されており、メンブレン上の逆の一端（上流側）には、展開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部には上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が添加されたパッドが配置されている態様等を挙げることができる。
【００４９】
上記に例示したカセット型の態様を有する検査キットを使用する場合、上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が添加されたパッド上に検体を添加し、検体に含まれるヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３との結合体を形成した後、上記展開液を展開させると、形成された結合体はモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されている箇所まで移送され、そこでヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３と固相化されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３との複合体が形成される。次いで、上記標識剤と上記基質が反応し、発色等する。この発色等を感知することによって、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定することができる。
【００５０】
検体を充分な量の展開液で希釈してからメンブレン上に滴下する態様を採用する場合は、あらかじめメンブレン上に展開液を装着しておかなくともよい。また、上記標識剤として着色ラテックス粒子等の着色物質を用いる場合は、基質は不要であり、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されている箇所で上記複合体が形成されたか否かは、着色物質による着色により判断される。
【００５１】
上記カートリッジ型の態様としては、例えば、反応が上記競合法である場合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識されたヘリコバクター・ピロリ等を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができ、反応がサンドイッチ法である場合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が固相化された不溶性担体が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができる。
【００５２】
上記に例示したカートリッジ型の検査キットを使用する場合は、通常、競合法やサンドイッチ法を実施する際と同様に、反応及び測定を行うことができる。
上記検査キットは、上記競合法と上記サンドイッチ法のいずれの方法を実施するものであってもよいが、上記サンドイッチ法を実施するものであることが好ましい。上記サンドイッチ法は、感度が高く、反応時間が短くてすみ、精度に優れるという利点を有する。上記サンドイッチ法としてイムノクロマトグラフィー法を用いると、試験操作が簡便で、結果の判定も目視で容易に行うことのできるキットを作製することができる。また、ＥＬＩＳＡとして上記サンドイッチ法を用いると、測定対象物質の量に依存して酵素反応生成物が生じるので、ヘリコバクター・ピロリへの感染が陽性である場合の発色等を目視で確認できるような系の設定が容易である。
【００５３】
上記検査キットは、除菌治療前に感染の有無を調べるために用いられてもよく、除菌治療後にその成否の判定を行うために用いられてもよい。
上記検査キットは、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いるためロット毎の差がなく、検出感度が高く、偽陰性や偽陽性の問題を生じない。
【００５４】
本発明によれば、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いることによって、検体中の他の物質による影響を排除できるので、極めて高感度かつ特異的に、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出することができる。また、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが樹立されたことにより、同一のモノクローナル抗体を半永久的に製造することが可能となる。モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いた検査キットは、消化管排泄物を検体とするので、被験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よくヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。また、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いた検査キットは、１種のみのモノクローナル抗体を用いる場合であっても、極めて優れた精度を呈し、ロット毎の差がなく、安定しているので、常に特異的かつ精度良くヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。また、本発明の検査キットは、測定が簡便であり、医療現場で非常に有用である。
【００５５】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１）
［モノクローナル抗体の作製］
（１）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体懸濁液（免疫原）の調製
５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）上にヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）を筋状に画線した。このプレートを３７℃微好気性環境下にて３〜４日培養後、更に３７℃嫌気性環境下にて７日間インキュベートし、球状化させた。得られたコロニーを白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離したヘリコバクター・ピロリの菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃にて４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返し、上記菌体を洗浄した後、ＰＢＳに懸濁した。
【００５７】
（２）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体破砕物（免疫原）の調製
（１）で得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ  ７２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ  ３、５０％  ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を破砕した。
【００５８】
（３）免疫及び細胞融合
（１）、（２）にて調製した免疫原（ヘリコバクター・ピロリ球状菌体懸濁液又はヘリコバクター・ピロリ球状菌体破砕物）とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバント（カルビオケム社製）を当量混合し、オイルエマルジョンとした。これをＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレア社製、６週齢、雌）の背部皮下に０．２ｍＬずつ投与した。初回免疫後７日目と１４日目に追加免疫を行い、更に細胞融合３日前に上記免疫原を０．２ｍＬずつ腹腔内に投与した。最終免疫から３日目のマウス脾細胞を摘出し、骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３株、ＲＣＢ０１４６、理研ジーンバンク）と１０：１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて融合した後、ＨＡＴ培地（ギブコ社製）によりハイブリドーマを選択培養した。
【００５９】
（４）ハイブリドーマの選択
細胞融合後１２日目に培養上清中の抗体活性をＥＬＩＳＡにより測定した。免疫原１０μｇ／ｍＬを固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（コースター社製）の各穴に融合細胞の培養上清液２００μＬを添加し、３７℃で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製、１：２００００）２００μＬを添加した。３７℃で１時間反応後、上記洗浄液で洗浄した。洗浄後、基質液（０．１Ｍ  ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素水）を各穴に２００μＬずつ添加し、室温で１５分反応させた。反応後、各穴に３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光値を測定した。吸光値が０．１５以上を示した、上記免疫原に反応する抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。各クローンを限界希釈法により２回クローニングを行った。クローニング後のハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃＡマウスに移植した結果、腹水として回収できるモノクローナル抗体を産生したハイブリドーマは３２クローンであった。
【００６０】
（実施例２）
［サンドイッチＥＬＩＳＡによる消化管排泄物中のヘリコバクター・ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択］
（１）モノクローナル抗体固相化プレートの作製
３２クローンの腹水各１ｍＬをＰＢＳで２倍に希釈し、飽和硫酸アンモニウム２ｍＬを滴下して４℃で４時間放置した。その後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、沈査をＰＢＳ２ｍＬに浮遊し透析を行った。これらのモノクローナル抗体を以下の方法により９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固相化した。即ち、各モノクローナル抗体を５μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴に０．２ｍＬ加え、４℃で一夜放置した後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、１％スキムミルク−ＰＢＳを各穴に０．２５ｍＬ加え、４℃で１時間放置してマスキングを行った。マスキング後、上記洗浄液で洗浄した。
【００６１】
（２）ビオチン標識モノクローナル抗体の作製
（１）にて調製した３２クローンのモノクローナル抗体３ｍｇとビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ザイメッド社製）１０ｍｇを混合し、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８）中、室温で、３時間攪拌しながら反応させた。反応液をＰＢＳ  ５Ｌに対して４℃で一夜透析し、ビオチン標識モノクローナル抗体を得た。
【００６２】
（３）消化管排泄物中のヘリコバクター・ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択
尿素呼気試験によりヘリコバクター・ピロリ陽性者及び陰性者と判定された各１名の糞便検体２５０ｍｇを０．１％スキムミルク−ＰＢＳ  ０．５ｍＬに懸濁後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を集め、糞便抽出液とした。糞便抽出液０．２ｍＬを（１）にて調製した各モノクローナル抗体固相化プレートの各穴に添加した。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて５回洗浄し、（２）にて調製した各ビオチン標識モノクローナル抗体０．２ｍＬを添加した。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン０．２ｍＬ（ザイメッド社製）を添加した。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて洗浄後、基質液（０．１Ｍ  ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素水）を各穴に０．２ｍＬずつ添加し、室温で１０分反応させた。反応後、各穴に３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光値を測定した。結果を表１に示した。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１に示した通り、２種のモノクローナル抗体３１Ａ３、８２Ａ３を単独又は組合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヘリコバクター・ピロリ感染者の糞便検体に対して高い反応性を示すことがわかった。各モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそれぞれ３１Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２９）、８２Ａ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２８）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託されている。尚、各モノクローナル抗体のイムノグロブリンサブクラスをイムノグロブリンタイピングキットマウス（和光純薬工業社製）により調べた結果、３１Ａ３はＩｇＧ２ｂ、８２Ａ３はＩｇＧ１であった。
【００６５】
（実施例３）
［菌株による反応性の比較及び他菌種との反応性］
（１）ヘリコバクター・ピロリ菌体懸濁液の調製
５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上にヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４；東海大学病院臨床分離株Ｎｏ．１３０、及び、Ｎｏ．１１２）を筋状に画線した。このプレートを３７℃で３〜４日間微好気性培養して得られたらせん状菌のコロニー、又は、更に３７℃で嫌気性環境下にて７日間放置して得られた球状菌のコロニーを白金耳等でかきとり、ＰＢＳに懸濁した。４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離した菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃にて４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返し、菌体を洗浄した後、再度、ＰＢＳに懸濁し、ヘリコバクター・ピロリらせん状菌体懸濁液及び球状菌体懸濁液を得た。
【００６６】
（２）ヒト腸内菌の菌体懸濁液の調製
ヒト糞便から分離される代表的な腸内菌バクテロイデス・ブルガタス、及び、エシェリヒア・コリの２菌種を以下の方法で培養し、得られたコロニーから（１）と同様の方法により各菌の菌体懸濁液を調製した。即ち、バクテロイデス・ブルガタス（ＩＦＯ１４２９１）は５％馬脱繊血を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で３７℃で２日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（ＡＴＣＣ２５９２２）はブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で１日間、好気培養した。
【００６７】
（３）他のヘリコバクター属の菌体懸濁液調製
ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ４９１７９）、ヘリコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）、ヘリコバクター・ムステラエ（ＡＴＣＣ４３７７２）及びヘリコバクター・シナエディ（ＡＴＣＣ３５６８３）を５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上で（１）と同様に培養して、得られたらせん状菌のコロニーから（１）と同様にしてらせん状菌体懸濁液を得た。
【００６８】
（４）菌体破砕物の調製
（１）、（２）及び（３）で得られた各菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ  ７２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ  ３、５０％ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を破砕した。
【００６９】
（５）サンドイッチＥＬＩＳＡ
（４）で得られた各菌体破砕物（タンパク質濃度１０μｇ／ｍＬ）０．２ｍＬをそれぞれ、実施例２（３）の方法によりサンドイッチＥＬＩＳＡ（下表２に示したモノクローナル抗体３１Ａ３同士、８２Ａ３同士及びメリディアン社製ＨｐＳＡ）を行った。結果を表２に示した。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
表２に示した通り、モノクローナル抗体３１Ａ３、８２Ａ３は、ヘリコバクター・ピロリの各菌株のらせん状菌体、球状菌体に対して高い反応性を示すことがわかった。一方、バクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリ、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・ムステラエ、及び、ヘリコバクター・シナエディに対しては全く反応しなかった。これに対して、メリディアン社製ＨｐＳＡは、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・ムステラエ、及び、ヘリコバクター・シナエディに対して反応性を示した。
【００７２】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、被験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よく、極めて優れた精度で、安定して特異的にヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。