(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の免疫応答を調節するための薬学的組成物を調製するための、Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）の使用。
【請求項２】
被検体のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を増強又は刺激するための薬学的組成物を調製するための、Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）の使用。
【請求項３】
（１）Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）と、
（２）少なくとも一つの生物学的に活性な分子と
を含む、被検体の免疫応答を調節するための薬学的組成物。
【請求項４】
ヘマグルチニンノイラミニダーゼとともに、Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）を含むワクチン。
【請求項５】
（１）Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）と、
（２）被検体の免疫応答を調節することができる生物学的に活性な分子と
を含む複合体。
【請求項６】
（１）Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）と、
（２）被検体の免疫応答を調節することができる生物学的に活性な分子と
を含む複合体。
【請求項７】
Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）と、
被検体の免疫応答を調節するための前記抱合体の使用説明書と
を備えた、被検体の免疫応答を調節するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性な物質、特に抗原性分子の効果的な送達のための、スフィンゴ脂質のポリアルキルアミン抱合体（conjugate）を使用するワクチン接種に関する。
【従来技術のリスト】
【０００２】
以下は、本発明の分野に属する技術水準を記述するのに適すると考えられる従来技術のリストである。
米国特許第5,334,761号：“Cationic lipids”；
US2001/048939：“Cationic reagents of transfection”；
米国特許第5,659,011号：“Agents having high nitrogen content and high cationic charge based on dicyanimide dicyandiamide or guanidine and inorganic ammonium salts”；
米国特許第5,674,908号：“Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids”；
米国特許第6,281,371号：“Lipopolyamines, and the preparation and use thereof”；
米国特許第6,075,012号：“Reagents for intracellular delivery of macromolecules”；
米国特許第5,783,565号：“Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules”；
Marc Antoniu Ilies & Alexandru T. Balaban, Expert Opin. Ther. Patents. 11(11):1729-1752(2001)；
Miller AD. Chem. Int. Ed. Eng. 37: 1768-1785(1998)；
Nakanichi T. et al. J. Control Release 61:233-240(1999)；
Brunel F. et al. Vaccine 17: 2192-2193 (1999)；
Guy B. et al. Vaccine 19:1794-1805(2001)；
Lima KM et al. Vaccine 19:3518-3525(2001)。
【発明の背景】
【０００３】
細胞以下又は分子レベルで細胞機能に影響を与えることができる、タンパク質及びポリヌクレオチド、外来物質並びに薬物など、多くの天然の生物分子及びそれらの類縁体は、それらの効果を発揮するために、好ましくは細胞内に取り込まれる。これらの物質に対して、細胞膜は、これらの物質に非透過性である選択的な障壁となる。細胞膜の複雑な組成には、リン脂質、糖脂質及びコレステロール、並びに内在性及び外在性タンパク質が含まれ、その機能は、Ｃａ＋＋及びその他の金属イオン、陰イオン、ＡＴＰ、微小繊維、微小管、酵素並びにＣａ＋＋結合タンパク質などの細胞質成分によって影響を受け、細胞外グリコカリックス（プロテオグリカン、グリコースアミノグリカン及び糖タンパク質）によっても影響を受ける。構造的細胞要素と細胞質内細胞要素の間の相互作用及び外部シグナルに対するそれらの応答は、細胞タイプ内及び細胞タイプ間に見られる膜選択性を担う輸送プロセスを構成する。
【０００４】
自然の状態では細胞によって取り込まれない物質を細胞内へ上手く送達することも、研究されている。天然の細胞膜の脂質組成に極めてよく似た脂質調合物に、複合体状の物質を会合させることによって、膜障壁を克服することができる。これらの調合物は、接触すると、細胞膜と融合することができ、あるいは、より一般的には、ピノサイトーシス、エンドサイトーシス及び／又はファゴサイトーシスによって取り込まれる。これらの全てのプロセスでは、会合された物質が細胞内へ送達される。
【０００５】
脂質複合体は、細胞表面間の電荷的反発（多くの場合、負に帯電している。）を克服することによっても、細胞内輸送を促進することができる。当該調合物の脂質は、細胞膜のリン脂質など両親媒性の脂質を含んでおり、水系中で、様々な層または凝集物、たとえばミセルまたは中空の脂質小胞（リポソーム）を形成する。リポソームは、リポソーム内に送達すべき物質を捕捉するために使用することができ；他の用法では、目的の薬物分子は、中空の水性内部に捕捉されるというよりむしろ、内在性膜成分として脂質小胞中に取り込まれるか、又は凝集物表面に静電的に付着させることができる。しかしながら、使用される多くのリン脂質は、両性イオン（中性）であるか、負に帯電しているかのいずれかである。
【０００６】
細胞内送達の分野における進歩は、リポソーム又は小胞の形態の、正に帯電した合成陽イオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム・クロリド（ＤＯＴＭＡ）が、ＤＮＡと自発的に相互作用し、脂質−ＤＮＡ複合体を形成できるという発見であり、この複合体は、細胞膜に吸着して、融合によって、又はおそらくは吸着性エンドサイトーシスによって、細胞に取り込まれ、導入遺伝子の発現をもたらすことができる［Felgner, P. L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 7413-7417 (1987) and U. S. Pat. No. 4,897,355 to Eppstein, D. et al.］。その他、ＤＮＡ複合体化小胞を形成するために、リン脂質と組み合わせて、ＤＯＴＭＡ類縁体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）を使用して成功した者もある。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ試薬（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD.）は、高度に陰イオン性のポリヌクレオチドを生きた組織培養細胞中に送達するのに有効な物質であり、正に帯電した脂質ＤＯＴＭＡと、ヘルパー脂質と称される中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とから構成される、正に帯電したリポソームを含む。これらのリポソームは、負に帯電した核酸と自発的に相互作用して、リポプレックスと称される複合体を形成する。ＤＮＡ負電荷に比して正に帯電したリポソームを過剰に使用すると、得られた複合体上の正味電荷も正になる。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着するか、又は、吸着的エンドサイトーシス若しくは形質膜との融合のうち何れかによって（両プロセスは、機能的ポリヌクレオチドを、例えば、組織培養細胞中に送達する。）、細胞中に導入される。ＤＯＴＭＡとＤＯＴＡＰは、モノ陽イオン性脂質のよい例である［Illis et al. 2001, ibid.］。
【０００７】
多価陽イオン単独（ポリアミン、無機塩及び複合体及び脱水溶媒を含む。）も、巨大分子の細胞内への送達を促進することが示されている。特に、多価の陽イオンは、オリゴ及びポリ陰イオン（核酸分子、アミノ酸分子など）のコンパクトな構造形態への崩壊を誘発し、これらのポリ陰イオンのウイルス中へのパッケージング、リポソーム中へのそれらの取り込み、細胞中への輸送などを促進する［Thomas T. J. et al. Biochemistry 38:3821-3830(1999)］。ＤＮＡをコンパクトにすることができる最も小さなポリ陽イオンは、ポリアミンであるスペルミジン及びスペルミンである。リンカーを介して、疎水性アンカーをこれらの分子に付着させることによって、新しいクラスのトランスフェクションベクターであるポリ陽イオン性リポポリマーが開発された。
【０００８】
陽イオン性脂質及び陽イオン性ポリマーは、ＤＮＡ（又は他の任意のポリ陰イオン性巨大分子）の陰イオン基と静電的に相互作用して、ＤＮＡ−脂質複合体（リポプレックス）又はＤＮＡ−ポリ陽イオン複合体（ポリプレックス）を形成する。複合体の形成には、脂質又はポリマーの対イオンの放出を伴い、この放出が、リポプレックス及びポリプレックスの自発的形成のための熱力学的駆動力である。陽イオン性脂質は、４つのクラスに分けられる。（ｉ）四級アンモニウム塩脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）及びＤＯＴＡＰ）及びホスホニウム／アルソニウム同属体；（ｉｉ）リポポリアミン；（ｉｉｉ）四級アンモニウムとポリアミン部分を両方有する陽イオン性脂質；および（ｉｖ）アミジニウム、グアニジニウム及び複素環塩脂質。
【発明の概要】
【０００９】
その側面の一つによれば、本発明は、被検体の免疫応答を調節するための薬学的組成物を調製するための、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の使用、に関する。
好ましい実施形態によれば、前記スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、カルバモイル結合を介して、少なくとも一つのポリアルキルアミン鎖を有するスフィンゴイド骨格を含む。
【００１０】
本明細書において使用される「スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体」という用語は、スフィンゴイドベース（本明細書においては、「スフィンゴイド骨格」という用語によっても表される。）と少なくとも一つのポリアルキルアミン鎖間の、化学的抱合（連結）を表す。スフィンゴイドベースと少なくとも一つのポリアルキルアミン鎖間の抱合は、以下にさらに詳述されているように、カルバモイル結合を介して行われる。
【００１１】
本明細書において使用される「スフィンゴイドベース／骨格」には、２又は３個のヒドロキシル基を含有する長鎖脂肪族アミンが含まれ、当該脂肪族鎖は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和スフィンゴイドベースの一例は、４位に特徴的なトランス−二重結合を含有するものである。
【００１２】
本明細書において使用される「調節する（modulating）」という用語は、抱合体によって送達される生物学的に活性な物質によって引き起こされる、対象の免疫応答（細胞性応答及び／又は液性応答を含む。）に対する任意の測定可能な調節的又は生化学的効果を表す。調節には、生物学的に活性な物質とともにスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体を前記対象に投与したときの、一方又は両方の種類の応答を阻害すること、又は、逆に、刺激若しくは増強することが含まれる。調節とは、好ましくは、抱合体なしに投与された生物活性分子によって引き起こされるものと比較して、２桁以上刺激又は増強することを表す。本発明は、このような応答を生じる上で、抱合体なしに投与された生物学的に活性な物質が実質的に無効である場合に、免疫応答を調節することにも関する。
【００１３】
さらに、調節は、例えば、自己免疫疾患の治療及びアレルギーの治療のために、被検体の免疫応答を阻害又は抑圧することにも関する。
このように、本明細書において使用される「生物学的に活性な分子」とは、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体と組み合わせて投与したときに、被検体の免疫系に対して影響を及ぼす任意の物質を表す。生物学的に活性な分子は、好ましくは、抗原性タンパク質、抗原性ペプチド、抗原性ポリペプチド又は抗原性炭水化物である。
【００１４】
別の側面によれば、本発明は、生物学的に活性な分子とともに、被検体にスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体を与えることを含み、前記スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体が、カルバモイル結合を介して、少なくとも一つのポリアルキルアミン鎖を有するスフィンゴイド骨格を含む、被検体の免疫応答を調節する方法に関する。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は、（１）少なくとも一つのスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体と、（２）前記抱合体に会合した少なくとも一つの生物学的に活性な分子と、を含む、被検体の免疫応答を調節するための薬学的組成物に関する。
さらに別の実施形態によれば、本発明は、（１）スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体と、（２）被検体の免疫応答を調節することができる、生物学的に活性な分子と、を含む複合体を提供する。
【００１６】
最後に、本発明は、の使用に関する。
最後に、本発明は、生物学的に活性な分子（例えば、抗原性分子）の捕捉剤としての、上記定義のスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の使用に関する。この文脈において、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、生物学的に活性な分子（好ましくは、抗原性分子及び／又は免疫賦活剤及び／又は免疫抑制剤）を捕捉するためのキットの一部を形成することができ、前記キットは、前記抱合体に加え、前記生物学的に活性な分子を捕捉するための前記抱合体の使用説明書を備える。前記キット中の前記抱合体は、乾燥形態をとることができ、この場合には、前記キットは、懸濁液若しくはエマルジョン若しくは溶液を形成するために、使用前に前記抱合体と混合される適切な液体を含むことができ、あるいは、すでに液体（懸濁液、エマルジョン、溶液など）の形態をとることもできる。前記キットは、数多くの用法を有し得る。例えば、前記キットは、免疫応答を調節する様々な免疫調節分子の機能を調べるために、活性な生物分子の単離のため、及びそれらの同定のために使用することができる。当業者であれば、研究目的のために、このような捕捉剤を使用する方法を知っているであろう。
【００１７】
本明細書において使用される「捕捉剤」という用語は、生物学的に活性な分子と会合することができる抱合体を表し、後者は、抱合体のポリ陽イオン構造によって、負の電荷、負の双極子又は局所的な負電荷（正味負の電荷を有する分子内の領域）を有する。捕捉それ自体は、前記負電荷、負の双極子又は局所的な負電荷を有する、捕捉すべき分子と本発明の正電荷抱合体との間の静電的相互作用を含む。
【００１８】
本発明の抱合体は、生物学的に活性な分子をこれに捕捉することによって、該分子を標的部位及び標的細胞中に運搬する、デリバリー媒体として使用することもできる。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
本発明を理解し、本発明が実際にどのように実施され得るかを把握するために、ここで、添付の図面を参照しながら、非限定的な例によって、幾つかの実施形態について説明する。
本発明は、被検体の免疫応答を調節するのに有効である、生物学的に活性な分子を運搬するための捕捉剤としての、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の使用に関する。
【００２０】
スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、以下の方式で合成され得る、脂質様陽イオン性（ＬＬＣ）化合物である。Ｎ−置換された長鎖ベース、特に、Ｎ−置換されたスフィンゴイド又はスフィンゴイドベースを、様々なポリアルキルアミン又はそれらの誘導体と連結して、ポリアルキルアミン−スフィンゴイド体を形成し、これはそのまま使用されるか、又はさらにアルキル化される。
【００２１】
形成されたポリアルキルアミン−スフィンゴイド体の適切なｐＨでのプトロン化又はアルキル化は、標的細胞中に送達すべき生物学的に活性な生物分子との相互作用及び標的とされる細胞との相互作用のために望ましい陽性電荷を前記脂質様化合物に与える。スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、生物学的に活性な分子の陰イオン特性と抱合体のポリアルキルアミン部分との静電的相互作用によって、生物学的に活性な分子と効率的に会合して、複合体（リポプレックス）を形成することができる。
【００２２】
あるいは、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、生物学的に活性な分子とともに負荷された集合物を形成することができる。
スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、個別の脂質様分子の形態とし、又は集合物の形態とすることができる。適切な集合物の一例には、ミセル又は小胞、特に、リポソームの形成が含まれる。集合物の他の例には、逆相、立法相などのミセルの形成が含まれる。明らかに、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、組み合わされた小胞／ミセルの形態とすることができ、又は集合物の他の任意の組み合わせとすることができる。
【００２３】
本明細書において使用される「脂質集合物」とは、特にミセル及びリポソームを形成する、脂質分子の組織化された集合物を表す。脂質集合物は、好ましくは、安定な脂質集合物である。本明細書において使用される安定な脂質集合物とは、保存条件下（４℃、生理的溶媒中）で、少なくとも一ヶ月間、化学的及び物理的に安定である集合物を表す。
【００２４】
集合物が小胞の形態（例えば、リポソーム）であるときには、生物学的に活性な分子は、小胞、小胞の脂質二重層の一部中にカプセル化することができ、又は小胞の表面に吸着させることができる（又は、これら３つの選択肢を任意に組み合わせることができる）。集合物がミセルであるときには、生物学的に活性な分子は、安定な様式で、ミセルを形成する両親媒性物質中に挿入することができ、及び／又は静電的にそれと会合することができる。
【００２５】
このように、本明細書において使用される「中にカプセル化される」、「中に含有される」、「上に負荷される」、「と会合される」という用語は、抱合体と生物学的に活性な分子との物理的な付着を表す。物理的付着は、前記抱合体から形成された集合物（例えば、小胞、ミセル又はその他の集合物）中への分子の封じ込め又は封入；かかる集合物の表面への生物分子の非共有結合；又は、このような集合物を形成するスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体間への生物分子の埋め込みの何れとすることもできる。生理的条件下でのスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の正電荷又は正の双極子のために、抱合体と生物学的に活性な物質との間の好ましい会合は、静電的、双極子又は酸−塩基相互作用によるものであることに留意すべきである。
【００２６】
上記にかかわらず、本発明は、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体と生物学的に活性な分子との間で形成された会合の具体的種類によっては、限定されない。このため、会合とは、抱合体又は該抱合体から形成される集合物と、所望の治療効果を達成することができる生物学的に活性な物質との間の、任意の相互作用を意味する。
【００２７】
生物学的に活性な分子と抱合体は、本分野において公知の任意の方法によって会合させることができる。これには、生物学的に活性な分子とともに、前記抱合体を後凍結乾燥又は同時凍結乾燥すること、予め形成されたスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体を生物分子と単に混合することが含まれるが、これらに限定されるものではない。同時凍結乾燥の方法は、特に、米国特許第６，１５６，３３７号及び６，０６６，３３１号に記載されており、ポストカプセル化方法は、特にＷＯ  ０３／０００２２７に記載されている。全て、本明細書に参考文献として援用される。
【００２８】
このように、その第一の側面によれば、本発明は、被検体の免疫応答を調節するための薬学的組成物を調製するための、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の使用であって、前記スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体が、カルバモイル結合を介して、少なくとも一つ、好ましくは一又は二のポリアルキルアミン鎖を有するスフィンゴイド骨格を含む、使用に関する。
【００２９】
上述したように、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、スフィンゴイド骨格と少なくとも一つのポリアルキルアミン鎖との間の連結を含み、該連結は、対応するカルバモイル結合を介する。より好ましくは、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、一般式（Ｉ）：
【化１】
0004782675.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、水素、分枝又は直鎖のアルキル、アリール、アルキルアミン、又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ５基を表し；
Ｒ２及びＲ５は、独立に、分枝又は直鎖のＣ１０−Ｃ２４アルキル、アルケニル又はポリエニル基を表し；
Ｒ３及びＲ４は、独立に、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ６Ｒ７基を表し、Ｒ６及びＲ７は、Ｒ３及びＲ４について同一であるか又は異なっており、独立に、水素、又は飽和若しくは不飽和の分枝若しくは直鎖ポリアルキルアミンを表し、前記ポリアルキルアミン中の一以上のアミン単位は第四級アンモニウムであり得る；又は
Ｒ３は、水素であり；又は
Ｒ３及びＲ４は、それらが結合している酸素原子とともに、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ９−［Ｒ８−ＮＲ９］ｍ−Ｃ（Ｏ）−を含む複素環を形成し、Ｒ８は、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ４アルキルを表し、Ｒ９は、水素又は式−［Ｒ８−ＮＲ９］ｎ−のポリアルキルアミンを表し、前記Ｒ９又は各アルキルアミン単位Ｒ８ＮＲ９は、前記ポリアルキルアミン中において同一であっても異なっていてもよく；
ｎ及びｍは、独立に、１から１０まで、好ましくは３から６までの整数であり；
Ｗは、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−から選択される基を表す。）を有する。
【００３０】
本発明のさらに具体的な態様に従って使用され得るスフィンゴイド又はスフィンゴイドベースの非限定的な例には、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、デヒドロフィトスフィンゴシン及びそれらの誘導体が含まれる。このような誘導体の非限定的な例は、それぞれ、セラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）、ジヒドロセラミド、フィトセラミド及びジヒドロフィトセラミドのような、アシル誘導体、並びにセラミン（Ｎ−アルキルスフィンゴシン）及び対応する誘導体（例えば、ジヒドロセラミン、フィトセラミンなど）である。適切にＮ−置換されたスフィンゴイド又はスフィンゴイドベースは、遊離のヒドロキシル基を有し、これは活性化された後、ポリアルキルアミンと反応して、ポリアルキルアミン−スフィンゴイド体を形成する。活性化剤の非限定的な例は、Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート、ジ−若しくはトリ−ホスゲン又はイミダゾール誘導体である。これらの活性化剤をスフィンゴイド又はスフィンゴイドベースと反応させると、それぞれ、一方又は両方のヒドロキシル部分に、スクシニミジルオキシカルボニル、クロロギ酸又はカルバミン酸イミダゾールを生じる。活性化されたスフィンゴイドとポリアルキルアミンとの反応は、図１に示されているように、分枝、直鎖（非分枝）又は環状抱合体を得ることができる。
【００３１】
一つの好ましい実施形態によれば、スフィンゴイド骨格は、１個（図１Ａ）又は２個（図１Ｂ又は１Ｃ）のポリアルキルアミン鎖に連結されたセラミド、又は２個のヒドロキシル部分を介して連結されて、環状ポリアルキルアミン部分を形成する（図１Ｄ）セラミドである。
【００３２】
形成されたスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、四級アミンを形成させるために、さらに、メチル化剤と反応させることができる。生じた化合物は、形成された抱合体内の四級、一級及び／又は二級アミン間の比に応じて、異なる程度で、正に帯電される。このように、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、四級塩化アンモニウム、四級ヨウ化アンモニウム、四級フッ化アンモニウム、四級臭化アンモニウム、四級アンモニウムオキシアニオン及びそれらの組み合わせ（これらに限定されない。）などの四級化（quaternized）窒素塩として存在する。
【００３３】
スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、好ましくは、生物学的に活性な分子とともに使用される。生物学的に活性な物質は、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体とともに投与されたときに、被検体の免疫系に対する効果（一実施形態によれば、刺激又は増強効果）を有する任意の分子である。この効果は、前記抱合体なしに被検体に与えた場合における、前記生物学的に活性な分子の効果（効果が存在する場合）に比べて、二桁以上であることが好ましい。
【００３４】
一実施形態によれば、前記生物学的に活性な物質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は炭水化物である。具体的には、生物学的に活性な分子は、抗原性タンパク質又は抗原性ペプチド、免疫賦活薬及び／又は免疫抑制薬などの、免疫調節物質であり得る。抗原性タンパク質及びペプチド、免疫賦活薬並びに免疫抑制薬は全て、本分野において周知である。好ましくは、前記生物学的に活性なタンパク質又はペプチド又は炭水化物は、生理的ｐＨにおいて、正味負の双極子モーメントもしくは正味負の電荷を有するか、又は正味負の電荷を有する少なくとも一つの負に帯電した領域を含有する。
【００３５】
別の実施形態によれば、前記生物学的に活性な物質は、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）などの核酸分子である。
スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体と生物学的に活性な物質の好ましい重量比は、１０００：１から１：１の重量比である。
【００３６】
スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、抗原性分子と併用されることが知られている他の活性物質と組み合わせることもできる。このような物質には、例えば、免疫賦活剤（「免疫刺激剤」又は「アジュバント」という用語でも知られている。）が含まれる。これには、ワクチンに添加したときに、より大きな応答を生じるために必要とされるワクチンが少なくなるように、免疫応答を向上させる任意の物質が含まれる。免疫賦活剤は、抱合体／生物学的に活性な物質とともに与えることができ、又は特定の時間間隔内に（抱合体／生物学的に活性な分子の投与前又は投与後、数時間又は数日）与えることができる。
【００３７】
好ましい免疫賦活剤には、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、インターフェロン（ＩＦＮα、β、γ）などのサイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、トキシン（例えば、コレラトキシン（ＣＴ）、ブドウ球菌のエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ））、易熱性Ｅ．コリ  エンテロトキシン（ＨＬＴ）、並びに、抗原性分子に対する免疫応答を増強又は刺激するために、本分野で使用されることが知られている他の任意のアジュバントが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
前記集合物には、唯一の脂質様成分として、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体（非メチル化又はメチル化）を含んでいてもよいし、又は他のヘルパー脂質物質と組み合わせてもよい。このようなヘルパー脂質物質は、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、コレステロール、オレイン酸その他などの、非陽イオン性脂質を、脂質様化合物に対して種々のモル比で含んでいてもよい。コレステロールは、インビボ用の好ましい添加物質の一つであるが、インビトロ用には、ＤＯＰＥが好ましいヘルパー脂質であり得る。この特定の実施形態において、陽イオン性脂質に対するコレステロールのモル比は、０．０１から１．０、好ましくは０．１から０．４の範囲にある。
【００３９】
前記集合物は、増強物質（ＣａＣｌ２及び可溶性ポリアルキルアミンなどの、本分野で公知のもの）を含むこともできる。
脂質集合物中に含まれることができ、同様の構造物中に使用されることが知られている他の成分は、立体安定化物質（steric stabilizer）である。一般的に使用される立体安定化物質の一例は、リポポリマーのファミリー、例えば、ポリエチレングリコール誘導体化脂質（ＰＥＧ−脂質抱合体）である。化合物のこのファミリーは、とりわけ、脂質の循環時間を増加（延長する）ことが知られている。
【００４０】
一実施形態によれば、前記形成されたリポソームは、約５０から５０００ｎｍの直径を有する、サイズの異なる異種及び異層小胞（ＵＨＶ；unsized heterogeneous and heterolamellar vesicles）として形づくられてもよい。形成されたＵＨＶは、さらなるプロセシングによって、サイズを小さくして、約５０から１００ｎｍの直径を有する巨大な（より均一な）単層小胞（ＬＵＶ；large unilamellar vesicle）に変換されてもよい。小胞の構造及び大きさ（例えば、それらの形状及びサイズ）は、活性な生物学的な物を標的に送達するための媒体としてその効率性に対して重大な影響を及ぼすことができ、すなわち、これらは小胞の送達特性を決定する。
【００４１】
スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の一部を形成するポリアルキルアミン鎖の好ましい基は、式（Ｉ）に関連して、構造的に上に定義されている。本実施形態によれば、前記ポリアルキルアミン鎖（式（Ｉ）の抱合体中において同一であっても異なっていてもよい。）は、スペルミン、スペルミジン、ポリアルキルアミン類縁体又はそれらの組み合わせから選択される。ポリアルキルアミン類縁体という用語は、任意のポリアルキル鎖を表すために使用され、一実施形態では、１から１０個のアミン基、好ましくは３から６個のアミン基、より好ましくは３又は４個のアミン基を含むポリアルキルアミンを表す。ポリアルキルアミン鎖内の各アルキルアミンは、同一であっても異なっていてもよく、一級、二級、三級又は四級アミンとすることができる。
【００４２】
ポリアルキルアミン鎖内で同一であっても異なっていてもよい前記アルキル部分は、好ましくはＣ１−Ｃ６脂肪族反復ユニットである。ポリアルキルアミンの幾つかの非限定的な例には、スペルミジン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパン−ジアミン、３，３’−イミノビスプロピルアミン、スペルミン及びスペルミンのビス（エチル）誘導体、ポリエチレンイミンが含まれる。
【００４３】
最も好ましい本発明のスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（ＣＣＳ）である。この抱合体には、カルバモイル結合を介してスペルミンに連結されたセラミドが含まれる。
本発明のスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体は、好ましくは、ワクチンの調製のために使用される。
【００４４】
一実施形態によれば、前記スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体、及び好ましくはＣＣＳは、インフルエンザワクチンの調製のために使用される。  本実施形態において、前記生物学的に活性な物質は、インフルエンザウイルスに由来し、又はインフルエンザウイルスに由来する分子の生物学的に活性な類縁体である。このような類縁体には、インフルエンザに由来する、免疫応答を誘発する抗原性断片などの、任意の物質が含まれる。
【００４５】
具体的なインフルエンザ由来の抗原性物質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）分子であり、この組み合わせは、ＨＮと称される。
本発明は、生物学的に活性な物質とともに、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体で被検体を処置することを含む、被検体の免疫応答を調節する方法にも関する。
【００４６】
併用治療には、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体と生物学的に活性な物質は、（必要に応じて、免疫賦活剤と組み合わせて）一緒に、又は予め定義された時間間隔内に（数時間又は数日など）投与することが含まれる。しかしながら、好ましい実施形態によれば、前記抱合体及び生物学的に活性な物質は、被検体に投与する前に、一緒に混合される。
【００４７】
生物学的に活性な物質とともに、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体を投与することは、本発明の別の側面に関する。従って、生理的に許容される担体と、生物学的に活性な物質とともに有効量のスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体とを含む、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、必要に応じて、免疫賦活薬を含む。
【００４８】
生物学的に活性な物質と組み合わせて抱合されるスフィンゴイド−ポリアルキルアミンは、適切な医療基準に従って、各患者の臨床症状、投与の部位及び方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重及び医療従事者に公知の他の因子を考慮に入れて、投与及び投薬され得る。
【００４９】
本明細書において、「有効量」とは、スフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体なしに、生物学的に活性な物質を被検体に与えた場合に得られる効果と比べて、被検体の免疫応答を調節する（上記定義のように、増強又は刺激する）のに有効な量を表す。好ましくは、前記量は、特定の疾病又は疾患に対して、被験者の有効な免疫化を達成するのに有効である。
【００５０】
上記にかかわらず、前記量は、例えば、アレルギー又は自己免疫応答を治療する目的で、免疫応答の抑圧又は阻害を達成するのに有効であり得る。
生物学的に活性な物質と会合されたスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体を含む本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。投与経路の非限定的な例には、経口、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、直腸内（ｉ．ｒ．）及び鼻内（ｉ．ｎ．）投与を含む非経口、並びに、目への注入技術、眼内が含まれる。好ましくは、投与の様式は、鼻内又は筋肉内投与である。
【００５１】
本発明において、生理的に許容される担体とは、好ましくは生物学的に活性な前記物質又は前記抱合体と反応せず、生物学的に活性な分子との前記抱合体の効果的な送達に必要とされる、不活性な無毒の固体又は液体物質を一般に表す。
生理的に許容される担体の非限定的な例には、単独の、又は、微量な（最大１０％）アルコール（エタノールなど）を加えた、水、生理的食塩水、５％デキストロース（グルコース）、１０％スクロースなどが含まれる。
【００５２】
好ましくは、本発明の組成物は、懸濁液、水溶液などの液体調合物、又はエアロゾルの形態であり、これらは全て当業者に公知である。エアロゾル調合物は、プロパン、窒素などの、加圧された許容される噴射剤中に収容することができる。それらは、噴霧器又は霧吹きに適した担体中などに、加圧されていない調製物用の医薬として調合することもできる。
【実施例】
【００５３】
インフルエンザ
ＨＮ抗原が搭載された陽イオン性リポソームの性質決定
コレステロール（Ｃｈｏｌ）を加えて、又は加えずに、様々な脂質／タンパク質  ｗ／ｗ比（３／１−３００／１）で、様々な陽イオン性リポソーム調合物上に搭載されたＨＮ（インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンとノイラミニダーゼの市販の調製物）のカプセル化効率を調べた。表１は、陽イオン性脂質ＤＯＴＡＰとＣＣＳを用いた、このような実験の結果を示している。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
Ｃｈｏｌあり又はなしで、５０／１から３００／１の脂質／タンパク質  ｗ／ｗ比を使用すると、ＤＯＴＡＰについては、負荷のパーセントは７５−９０％であった。３０／１から３００／１の脂質／タンパク質  ｗ／ｗ比では、約９０％の抗原負荷が達成され、１０／１及び３／１のｗ／ｗ比では、それぞれ、７９％及び３５％に減少した。調合物へのＣｈｏｌの添加は、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌのモル比が１／１及び２／１では、ローディングに影響を与えず、４／１の比率では、カプセル化が若干低下した（８０％）。ＣＣＳの場合、Ｃｈｏｌあり又はなしで、ローディング効率は、これより低かった（１００／１から３００／１のｗ／ｗ比で、６４−７３％）。
【００５６】
可溶性抗原を、予め形成された空のリポソームと単に混合した際の、ＨＮのリポソームとの会合も測定した。このような場合、１００／１から３００／１の脂質／タンパク質  ｗ／ｗ比を使用すると、調合物とは無関係に、抗原の４０から６０％がリポソームと会合した。
これらの知見を総合すると、全ての調合物で、簡易且つ迅速な（５分）手順を用いて、極めて高いローディング効率（＞６０％）が得られることが示唆される。さらに、水性懸濁液中に予め形成されたリポソームでさえ、インフルエンザウイルスの表面抗原と効果的に会合できた。
【００５７】
様々な脂質／抗原  ｗ／ｗ比（コレステロールの添加あり、又は添加なし）の免疫原性も評価した。
第一の実験では、若い（２ヶ月齢）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＮが負荷された中性、陰イオン性又は陽イオン性リポソームを鼻内ワクチン接種した後の、ＨＩ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体の血清レベルを測定した（表２Ａ）。ＨＮ抗原は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株に由来する一価サブユニットワクチンであった。同じ実験において、ＨＩ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体の肺及び鼻のレベル、脾臓細胞によって産生されたＩＮＦγレベルも調べた（表２Ｂ及び２Ｃ）。
【００５８】
【表２Ａ】
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【００５９】
特に、２回の鼻内投与後に局所及び全身応答を誘発するために、ＨＮ抗原をカプセル化している、中性（ＤＭＰＣ）、陰イオン性（ＤＭＰＣ／ＤＭＩＧ、９／１モル比）及び陽イオン性（６つの調合物）集合物（Ｌｉｐ）の間で比較を行った。全ての調合物で、脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比は３００／１であり、陽イオン性脂質／Ｃｈｏｌ又は陽イオン性脂質／ＤＯＰＥモル比は１／１であった。遊離抗原（Ｆ−ＨＮ）、及びアジュバントとしてコレラ毒素（ＣＴ、１μｇ）と同時投与されたＦ−ＨＮを平行して調べた。第０日及び第７日に、３μｇ／投薬（１０μＬ／鼻腔）のワクチンを与え、二度目のワクチン投薬から４ないし６週後に応答を測定した。
【００６０】
【表２Ｂ】
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【００６１】
【表２Ｃ】
0004782675.tif 000006
【００６２】
表２Ａ−２Ｃに示されているように、遊離の抗原、並びに中性及び陰イオン性Ｌｉｐ−ＨＮは、実質的に無効な粘膜ワクチンであった。これに対して、陽イオン性Ｌｉｐ−ＨＮ、特にＤＯＴＡＰ−ＨＮ、ＤＭＴＡＰ−ＨＮ及びＣＣＳ−ＨＮと表記されるものは、高レベルのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体とともに、強固な全身及び粘膜性の液性応答を誘発した（すなわち、混合Ｔｈ１＋Ｔｈ２応答）。ＩｇＥ抗体は、検出されなかった。ＤＯＴＡＰ−ＨＮ、ＤＭＴＡＰ−ＨＮ及びＣＣＳ−ＨＮを含む、陽イオン性リポソームワクチンは、抗原刺激された脾臓細胞中で、高レベルのＩＦＮγも誘導した（但し、ＩＬ−４は誘導しなかった。）。ＣＣＳ−ＨＮによって生じた応答は、ＣＴをアジュバントとして加えたＦ−ＨＮによって誘導された応答より、ずっと強かった。これらの知見に基づき、陽イオン性リポソーム調合物：ＤＯＴＡＰ−ＨＮ、ＤＭＴＡＰ−ＨＮ及びＣＣＳ−ＨＮのみをさらに使用した。
【００６３】
第二の実験では、ＨＮが負荷された陽イオン性リポソームの免疫原性及び可溶性抗原と単に混合されただけの、予め形成されたリポソームの免疫原性に対する脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比の影響を調べた。表３Ａ−３Ｃに示されたデータは、３つの調合物が全て、強力な全身性（血清）及び局所性（肺）応答を誘導すること、並びに、脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比が１００／１未満に低下すると、この応答が顕著に弱まることを示している。
【００６４】
【表３Ａ】
0004782675.tif 000007
【００６５】
【表３Ｂ】
0004782675.tif 000008
【００６６】
【表３Ｃ】
0004782675.tif 000009
【００６７】
高レベルの血清及び肺のＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体によって反映されているように、ここでも、他のワクチン調合物に対するＬｉｐ  ＣＣＳ−ＨＮワクチン（グループ１２−１６）の優越性が見られる。興味深いことに、可溶性抗原を、予め形成されたリポソームと単に混合するだけで、抗原をカプセル化しているリポソームに匹敵する極めて強力なワクチン（グループ１８−２０）が生成された。このことは、陽イオン性集合物／リポソームのアジュバント活性には、抗原を実際にカプセル化する必要がない場合があることを示唆している。
【００６８】
さらなる実験では、ＨＮを負荷したリポソームの免疫原性に対するコレステロールの影響を調べた。表４Ａ−４Ｃは、この実験の結果を示しており、Ｃｈｏｌの添加は、２／１及び４／１のモル比で（グループ４、５）、ＤＯＴＡＰ−ＨＮに対する全身性ＨＩ応答を僅かに低減させたが、１／１モル比では低減させず（グループ３）、全ての比で（グループ７−９）、ＤＭＴＡＰ−ＨＮに対する総合的な応答を、１／１の比で（グループ１１）、ＣＣＳ−ＨＮの比で、ＣＣＳ−ＨＮに対する局所（肺）応答を穏やかに増強することを示唆している。
【００６９】
【表４Ａ】
0004782675.tif 000010
【００７０】
【表４Ｂ】
0004782675.tif 000011
【００７１】
【表４Ｃ】
0004782675.tif 000012
【００７２】
それぞれ、１μｇ及び２μｇのサブユニット（ＨＮ）ワクチン（Ａ／パナマ［Ｈ３Ｎ２］ウイルスに由来）を筋肉内（第０日に、一度）又は鼻内（第０日及び第７日に、二度）投与した後、ＣＣＳ−ＨＮワクチンの免疫原性を高齢（１８月齢）のＣ５７ＢＬ／６マウスでも調べた。脂質集合物は、ＣＣＳ／コレステロール（３：２モル比）から構成され、脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比は２００：１であった。市販のワクチンの活性がゼロであったのに対して、ＣＣＳ−ＨＮワクチンは、表５Ａ及び５Ｂから明らかなように（データは、平均力価を示している。）高レベルの血清ＨＩ及びＩｇＧ２ａ抗体（ワクチン接種から４週後に検査）並びに肺（ワクチン接種から６週後に検査）ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体を誘発した。
【００７３】
【表５Ａ】
0004782675.tif 000013
【００７４】
【表５Ｂ】
0004782675.tif 000014
【００７５】
さらに、様々なワクチン調合物による細胞応答の誘導を調べた。特に、様々な陽イオン性リポソーム調製物を鼻内に与えて、若いマウスを免疫し、ワクチン接種から６週後に、脾臓細胞の細胞応答（細胞毒性、増殖及びＩＦＮγ産生）を測定した。本実験では（結果は表６に示されている。）、ＨＮをロードされたリポソーム（グループ３−１０）及び単独で与えた遊離抗原（Ｆ−ＨＮ）（グループ２）又は予め形成された空のリポソームと混合された（グループ１１−１３）遊離抗原（Ｆ−ＨＮ）の間で、比較を行った。様々な脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比（３０／１−３００／１）で調製されたＬｉｐ（ＤＭＴＡＰ）−ＨＮ及びＬｉｐ（ＣＣＳ）−ＨＮの免疫原性も測定した。
【００７６】
【表６】
0004782675.tif 000015
【００７７】
特異的な標的細胞（インフルエンザペプチドでパルスされたＰ８１５）に対する選択的細胞毒性は、１００／１の脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比でＣＣＳ−ＨＮを用いた場合と（グループ８）、遊離抗原を同時投与した、予め形成された３つの全てのリポソーム（ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ及びＣＣＳ）を用いた場合にのみ得られた。最大の増殖応答は、５０／１及び３０／１の脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比でＤＭＴＡＰ−ＨＮを用いた場合と、３００／１、１００／１及び５０／１の比でＣＣＳ−ＨＮを用いた場合に観察された。最も有効なリポソーム調合物によって惹起される増殖応答及び細胞毒性応答は、遊離抗原によって誘発されるものより２から３倍大きかった。
【００７８】
これらの知見は、測定されたあらゆるタイプの抗体の最高レベルが１００／１から３００／１の脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比で得られた液性反応の場合と比べて（表３）、細胞性応答については、これより低いｗ／ｗ比（例えば、３０／１から１００／１）が最適であり得ることを示唆している。さらに、ＤＭＴＡＰ−ＨＮは、強力な液性応答を惹起するのに対して、この調合物は、ＣＣＳ−ＨＮと比べて、細胞毒性活性を誘導する能力が弱い。興味深いことに、予め形成された陽イオン性リポソーム（３つの調合物全て）と遊離抗原の懸濁液中混合物を用いてワクチンを接種すると、カプセル化された抗原によって引き起こされるものと同規模の、優れた細胞性応答が惹起される。このように、遊離抗原を予め形成された陽イオン性リポソームと単に混合するだけで、強力な液性（表３Ａ−３Ｃ）及び細胞性（表６）応答をともに誘導するのに十分であり得る。
【００７９】
さらなる実験では（その結果は、表７Ａ−７Ｃに示されている。）、免疫原性と生ウイルスによる攻撃誘発に対する防御免疫の誘導について、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ又はＣＣＳを含み、ＨＮが負荷された一価陽イオン性リポソームを１回筋肉内投薬、１又は２回鼻内投薬及び２回経口投薬した場合の比較を行った。この実験では、脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比は３００／１であり、陽イオン脂質／Ｃｈｏｌ比は、ＤＯＴＡＰとＤＭＴＡＰ系では１／１であり、ＣＣＳ系では３／２であった。３つの経路のうち、２回の鼻内投与が、最も強い液性及び細胞性応答と防御免疫を生じさせる。３つの調合物のうち、特に、ＩｇＧ２ａとＩｇＡ抗体に関して、ＣＣＳが最も高い応答を誘導する。
【００８０】
【表７Ａ】
0004782675.tif 000016
【００８１】
【表７Ｂ】
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【００８２】
【表７Ｃ】
0004782675.tif 000018
【００８３】
表８から１０に記載されている実験では、市販の三価ワクチンを検査し、ＣＣＳをベースとしたワクチンの単回投薬（各ウイルス株の抗原［ＨＮ］を２又は４μｇ使用）、及び３、７又は１４日の投与間隔で与えた、ワクチンの２回投薬（２μｇ／株／投薬）の間で、比較を行った。脂質集合物は、３／２モル比でＣＣＳ／Ｃｈｏｌ（コレステロール）から構成され、脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比は全ての調合物につき１００／１であった。対照として、標準的な三価の市販ワクチン（ＨＮ）を、単独で、又は粘膜アジュバントとして使用される１μｇのコレラ毒素（ＣＴ）と組み合わせて投与した。血清、肺ホモジネート及び鼻洗浄液のＨＩ抗体（表８）並びに抗原特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩＧＡ及びＩｇＥ抗体（表９）を、最初のワクチン投薬から５ないし６週後に調べた。さらに、選択したグループから得た５匹のマウスの鼻内を生ウイルスで攻撃し（再集合体Ｘ−１２７ウイルスに適応されたマウスを使用）、４日後に、肺のウイルス力価を定量することによって、防御を評価した（表１０）。
【００８４】
市販のインフルエンザワクチン（ＨＮ）の免疫原性が乏しく、又は存在しなかったのと比べて（グループ２−６）、ＣＣＳ／Ｃｈｏｌ−インフルエンザワクチンは、検査した全ての種類の抗体（検出されなかった、ＩｇＥを除く。）、特に２つのＡ型ウイルス株（グループ８−１１；表８、９）に対する抗体を高い力価で誘導した。２回投薬計画の場合、１週間の間隔が最適なようである（グループ１０）。単回投薬計画の場合、２μｇでなく、４μｇの抗原が（グループ８対グループ７）が、高い力価の血清ＨＩ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体及び肺ＩｇＧ１抗体を誘導した。しかしながら、２回投薬計画と比べて、単回投薬計画は、肺ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体並びに鼻の抗体を誘導しなかった（表９）。
【００８５】
防御アッセイでは（表１０）、鼻内に、単回（４μｇ）又は２回（２μｇ／投薬）の何れかを投与したＣＣＳ−インフルエンザワクチンは、ウイルス感染に対して完全な防御を与えたのに対して（肺のウイルス力価が６対数減少）、標準的なワクチンは、ウイルス力価を０．５から１対数しか減少させなかった。このように、ＣＣＳ−インフルエンザワクチンによる単回投薬計画は、幾つかの抗体のイソタイプについて、２回投薬計画より劣っているが、２つの投薬計画は同程度の防御を与える。
【００８６】
本実験において、本発明者らは、ワクチン担体として、ＣＣＳ／Ｃｈｏｌに対してＣＣＳ単独も比較したが、２つの調合物の間には、免疫原性に全く差は認められなかった（データは図示せず。）。調合物の別の改変は、押し出しによるＣＣＳ／Ｃｈｏｌ脂質集合物（直径０．０５−５μｍ）のサイズの縮小（直径０．０２μｍ）であった。押し出しが施されたワクチンによって誘導される抗体力価は、押し出しが施されていないワクチンによって生じた抗体力価より５０から８０％低かった（データは図示せず。）。このように、標準的なサイズでないＣＣＳ脂質集合物は、コレステロールの有無に関わらず、三価のインフルエンザワクチンに対するワクチン担体として極めて効率的である。
【００８７】
【表８】
0004782675.tif 000019
【００８８】
【表９】
0004782675.tif 000020
【００８９】
【表１０】
0004782675.tif 000021
【００９０】
表１１及び１２に記載されている実験では、様々な量のＨＮ抗原及び脂質を用いて、三価のインフルエンザワクチンを、ＣＣＳ／Ｃｈｏｌ脂質集合物とともに調合した。本実験では、（ａ）脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比を１００／１で一定に保ちながら、様々な量の抗原（０．２５から２μｇ／ウイルス株）と脂質（０．０７５から０．６ｍｇ）；（ｂ）漸増量の抗原（０．２５から２μｇ）と一定量の脂質（０．６ｍｇ）によって、脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比を１００／１から８００／１まで変化させて、ワクチンを調製した。表１１（ＨＩ力価）及び表１２（アイソタイプ力価）から明らかなように、それぞれ、２又は１μｇの各株の抗原と０．６又は０．３ｍｇの脂質とを用いて、１００／１  脂質／ＨＮ  ｗ／ｗ比で調製されたワクチンは、３つのウイルス株に対して、同じような高レベルの抗体を産生した（グループ２、３）。これより少ない抗原（０．５、０．２５μｇ／株）と脂質（０．１５、０．０７５ｍｇ）用量では、応答、特に粘膜応答（肺、鼻）は、顕著に減少した（グループ４、５）（表１２）。一定用量の脂質（０．６ｍｇ）を使用したときには、さらに低い２つの用量の抗原（０．２５、０．５μｇ／株）を用いた場合でさえ、高レベルの抗体が得られた（グループ６−８）。このように、ＣＣＳ脂質の量は極めて重要であり、適切な脂質用量を用いると、抗原用量を１／４から１／８に（１−２μｇから０．２５−０．５μｇまで）減らすことができる。
【００９１】
【表１１】
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【００９２】
【表１２】
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【００９３】
さらなる実験では、遊離（ＨＮ）の、又はＣＣＳ／Ｃｈｏｌ脂質集合物（Ｌｉｐ  ＨＮ）が会合したサブユニットインフルエンザワクチンが、ワクチンに含まれていない様々なインフルエンザＡ及びＢ亜株と交叉反応するＨＩ抗体を誘導する能力について調べた。表１３に示されているデータは、ＣＣＳをベースとした一価又は三価のインフルエンザワクチンの何れかを、一度又は二度投与された、鼻内（ｉ．ｎ．）及び筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種によって、免疫を与える株に対して誘導された高血清力価のＨＩ抗体のほか、１９８６から１９９９年にかけて流行し、前記ワクチンには含まれていない数個のＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＢ株と交叉反応するＨＩ抗体が誘導されることを示している。単回の鼻内ワクチン投与後に、僅かに低いＨＩ力価が見出された（グループ６対グループ７）。肺ホモジネートＨＩ力価（グループ４、８）は、対応する血清力価より低かった。このように、ＣＣＳをベースとスルワクチンの非経口又は鼻内ワクチン接種によって、広いスペクトルのＡ及びＢウイルス株に対する防御が与えられる可能性がある。このような抗原変異株は、抗原連続変異の結果として、インフルエンザの蔓延／流行中に、発生し得る。これに対して、鼻内投与された標準的な市販のワクチン（グループ１、５）は、相同及び異種株の両方に対する抗体を誘導する効果は全くなかった。
【００９４】
【表１３】
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【００９５】
ＨＮが負荷され、鼻内投与された陰イオン及び陽イオン性リポソームの生体分布
生体分布実験では、インフルエンザＨＮ抗原が負荷されていない、又は負荷されている、脂質集合物の三つの調合物：ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（陰イオン性），  ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ（陽イオン性）及びＣＣＳ／Ｃｈｏｌ（陽イオン性）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻内投与した（マウス当たり２００μｇ脂質、２μｇ抗原）。次いで、２４時間にわたって（投与から１時間後、５時間後及び２４時間後の時点で）、様々な組織のホモジネート中で、蛍光標識された脂質を追跡した。
【００９６】
下表１４及び図２Ａ−２Ｆから明らかなように、１及び５時間後に、検査した３つの調合物全ての投与された脂質が７５−１００％回収された。しかしながら、この回収は、ＣＣＳ調合物を除く全ての調合物中において、２４時間の時点で有意に低下した。ＨＮ抗原を含有するＣＣＳ調合物は、３つの標的臓器（鼻、肺、消化管）中で、最も長い保持（＞２４時間）を示したのに対して、脳には脂質の蓄積が存在せず、検査した他の臓器（肝臓、腎臓、心臓、脾臓）には、有意な蓄積が存在しなかった。
【００９７】
【表１４】
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【００９８】
１２５Ｉ標識されたＨＮを使用すると、その生体分布は、蛍光脂質の生体分布と類似していた（データは示さず。）。気道及び消化管へのＣＣＳワクチン成分の、このような長期の保持は、他のリポソーム調合物に比べて免疫原性が優れていることを部分的に説明し得るかもしれない。これは、ワクチンの抗原成分を追跡した以下の研究において示された。ＨＮタンパク質に１２５Ｉを標識し、遊離の状態で、又は蛍光生体分布実験で使用した脂質調合物の一つと会合した状態で、鼻内に投与した。様々な組織の放射能を、滴下注入から１、５及び２４時間の時点で測定した。
【００９９】
表１５は、抗原の回収が本実験でも高かったことを教示している。図３Ａ−３Ｄから明らかなように、１２５Ｉ標識されたＨＮの生体分布パターンは、脂質の生体分布パターンと類似しており（図２Ａ−２Ｆ）、（ａ）ＨＮタンパク質と脂質集合物がインビボでも実際に会合していること、（ｂ）可溶性形態のタンパク質を単独で投与すると、ＨＮの保持が全く存在しないので、陽イオン性脂質集合物と会合した場合に、抗原が鼻内に長期間保持されのは、陽イオン性脂質集合物によるものであり、ＨＮタンパク質の固有の特性によるものではないことが、さらに確定される。
【０１００】
本実験は、単独で、又は脂質集合物と会合させて投与したときに、ＨＮタンパク質の脳内への蓄積（鼻内ワクチン接種に伴う、安全上の主要な懸念）が存在しないことを教示するものであり得る。放射能追跡法は、蛍光法よりずっと感度が高いので、この結果には、より高い信頼を置くことができる。
【０１０１】
【表１５】
0004782675.tif 000026
【０１０２】
様々な組織中で、類似の動態又は異なる動態によって、タンパク質及び脂質が保持及び／又は除去されるかどうかを調べる試みで、様々な時点における、様々な組織中の（投与された総用量の）％抗原保持と％脂質保持との比を求める、前記データの別の解析を行った。比が一定であり、１に等しいか、１に近い場合には、両成分が同一臓器中に同様に保持されていることを意味し、この比が１より大きいか、又は１より小さい場合には、各成分のクリアランス速度が異なり、一方の成分が他方の成分より早く除去されることを示唆する。
【０１０３】
下表１６から明らかなように、時とともに一定を保った唯一の比は、鼻内のＣＣＳ／Ｃｈｏｌ−ＨＮの比であった（比＝約０．４５）。このことは、（ａ）ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧとは異なり、ＣＣＳ及びＤＯＴＡＰを用いた場合の、鼻内への抗原の高い保持は、会合のレベルに相関しており、鼻粘膜へのこれらの調合物の結合によるものであること、（ｂ）ＣＣＳ以外の調合物の成分は体内で解離し、異なる速度で除去されるのに対して、ＣＣＳ−ＨＮをベースとした調合物は、特に鼻内において安定であり、これは、ＣＣＳをベースとしたワクチンを用いた際に見られる免疫原性の増強に寄与し得ることが示唆される。
【０１０４】
【表１６】
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【０１０５】
鼻内インフルエンザワクチンの予備的安全性試験
毒性（局所、全身）は、筋肉内及び鼻内ワクチンに伴う主要な懸念であるため、予備的な毒性研究を行った。インフルエンザ抗原ヘマグルチニン＋ノイラミニダーゼ（ＨＮ）が負荷された陽イオン性脂質調合物（ＤＭＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＣＣＳベース）を、マウス（ｎ＝４／グループ）に鼻内（１週間の間隔を置いて、２回）投与し、血球数（総数、差）、血液の化学検査および組織学的検査（鼻、肺切片）を７２時間後に実施した。マウスは、明瞭な毒性の徴候を一切示さなかった。血球数及び血液化学は、正常な範囲内にあり、予想通り、陽イオン性調合物で処置されたマウスの鼻及び肺には、最小限ないし弱い炎症応答が見られた。程度はさらに低いが、同様の炎症応答が、生理的食塩水のみ又は非カプセル化抗原で処置されたマウスの一部にもみられた。
【０１０６】
ＣＣＳ−インフルエンザワクチンのマウス中での免疫調節活性
これらの実験では、様々なリポソーム調合物（ＤＭＰＣ、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ、ＣＣＳ／Ｃｈｏｌから構成される。）、０．５から１ｍｇの脂質を、ＨＮ抗原あり又はなしで、マウスに腹腔内注射した。マウスには、処置を施さないか、又はリポソーム調合物の注射から２日前に、チオグリコレート（ＴＧ）、マクロファージ産生を増加させるため）とともに腹腔内注射した。リポソームの投与から２４ないし４８時間後に、腹腔細胞を採集し、そのまま使用するか、又はプラスチック皿に、３７℃で、４時間吸着させ、非付着性細胞を除去した後に使用した。別の実験では、ＴＧ処置されたマウスから腹腔細胞を採集し、リポソーム調合物とともに、２４から４８時間インキュベートした。ＭＨＣ  ＩＩ並びに同時刺激分子ＣＤ４０及びＢ７の発現について、細胞をフローサイトメトリーによって調べた。サイトカイン：インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターロイキン１２（ＩＬ−１２）並びに一酸化窒素（ＮＯ）について、上清を検査した。
【０１０７】
全ての陽イオン性調合物（ＣＣＳ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＴＡＰ／Ｃｈｏｌ）は、他の調合物（ＤＭＰＣ［中性］、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ［陰イオン性］より、Ｂ７及びＣ４０の発現を上方制御し、より高いレベルのＩＦＮγとＩＬ−１２を誘導した。幾つかの事例では、ＣＣＳ／Ｃｈｏｌ調合物が、他の陽イオン性調合物より有効であった。何れの調合物によっても、有意なレベルのＴＮＦα及びＮＯは誘導されなかった。抗原提示細胞上への同時刺激分子の発現の増加並びに陽イオン性調合物によるＩＬ−１２及びＩＦＮγの誘導は、これらの調合物のアジュバント活性がより大きいことを一部説明することができる。鼻内投与後、気道内にＣＣＳ−インフルエンザワクチンが長く保持される（図２Ｃ及び２Ｆ及び図３Ａ−３Ｄ）ことと合わせると、これらの知見は、ＣＣＳがこれほど効率的な粘膜ワクチン担体／アジュバントである理由を説明できるかもしれない。
【０１０８】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）
インフルエンザに加えて、鼻内（ｉ．ｎ．）及び直腸内（ｉ．ｒ．）投与されたＨＡＶワクチンについても、ＣＣＳ脂質集合物の免疫増強能を調べた。
２週間隔で、ＨＡＶワクチン（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ）、１０ＥＵ（約１．５μｇタンパク質）を２回投与し、２度目のワクチン投薬から３週後に、ＥＬＩＳＰＯＴ技術によって、応答を調べた。粘膜アジュバントとして使用されるＣｐＧ−ＯＤＮを、１回の投薬当たり１０μｇ与えた。ＨＡＶ−ＣＣＳ脂質集合物は、インフルエンザワクチンについて上述したように調製した（表１）。
【０１０９】
表１７に記されているデータは、市販のＨＡＶワクチンが、両投与経路（鼻内、直腸内）ともに、両被検組織（固有層、パイエル板）中にＩｇＡ反応を誘導できなかったのに対して、ＣＣＳ又はＣｐＧ−ＯＤＮとともに調合されたワクチンは、多くの事例で有意な反応を生成したことを示している。ＨＡＶ−ＣＣＳ脂質集合物とＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは、全ての事例で、相乗的な反応をもたらした。このように、ＣＣＳ脂質集合物単独、及び特にＣｐＧ−ＯＤＮと組み合わせたＣＣＳ脂質集合物は、ＨＡＶに対する粘膜ワクチン接種に対する担体／アジュバントとしても有効である。
【０１１０】
【表１７】
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【０１１１】
ボツリヌス菌（Ｃ．  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）
さらなる実験では、０．４μｇ用量の市販のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍトキソイド（バイオテロ剤のモデル、ウルグアイ、アルミナなし）を用いて、マウスの鼻内に免疫し、２回目のワクチン投薬から４週後に、ＥＬＩＳＡによって、抗体力価を調べた。
Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍトキソイドを用いた実験の結果は表１８に要約されており、鼻内への滴下注入後に、特に小腸及び糞便中のＩｇＡレベルに関して、ＣＣＳ−トキソイド調合物が標準的なワクチンより優れていることを示している。このような抗体は、経口曝露時に、毒素を中和することが予想される。ワクチンを単独で鼻内に免疫化したマウスは、ＩｇＡを産生しなかった。
【０１１２】
【表１８】
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【０１１３】
材料
化学
Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシル−１−カルバモイルスペルミン（ＣＣＳ）の合成
（ｉ）Ｎ−パルミトイルスフィンゴシン（１．６１ｇ、３ｍｍｏｌ）を、加熱しながら、無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中に溶解した。透明な溶液を室温とし、Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（１．９２ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を添加した。攪拌しながら、ＤＭＡＰ（０．８１ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応をさらに１６時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、ｎ−ヘプタンから再結晶された残留物から、融点７３−７６℃の白色粉末として、ジスクシニミジルセラミジルカーボネート１．３ｇ（６８％）を得た。
【０１１４】
（ｉｉ）スペルミン（０．５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）及びジスクシニミジルセラミジルカーボネート（０．３９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら、無水ジクロロメタン中に溶解した後、触媒量の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）で処理した。室温で１６時間、この溶液を攪拌し、溶媒を蒸発させ、残留物を水で処理し、濾過し、真空中で乾燥させると、０．４ｇ（８２％）の未精製物質が得られ、６０：２０：２０のブタノール：ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ溶出液を用いた、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって、これをさらに精製した。
【０１１５】
（ｉｉｉ）前記化合物内の第四級アミンを得るために、ＤＭＳ又はＣＨ３Ｉで工程（ｉｉ）の生成物をメチル化することができる。
ＣＣＳの構造は、１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分光法によって確認した（データは示さず。）。分析の詳細な説明は、同時係属の国際特許出願第 号に記載されている。
【０１１６】
他の合成手順
上記手順と同様に、以下の手順を適用することができる。
図１Ａに図示されている直鎖一置換セラミド−スペルミン抱合体の合成
対応する１，３−ジ−Ｏ−スクシニミジル誘導体を得るために、ＤＭＡＰの存在下で、１当量のセラミドを、２．５当量のジスクシニミジルカーボネートと反応させる。
このようにして得られたジスクシニミジル誘導体を、触媒量のＤＭＡＰを用いて、室温で、当量のスペルミンと反応させて、図１Ａの１−一置換−セラミド−スペルミン抱合体を得る。
【０１１７】
図１Ｂに図示されている直鎖二置換セラミド−スペルミン抱合体の合成
上述したように調製された一当量の１，３−ジ−Ｏ−スクシニミジルスフィノギド誘導体を、触媒量のＤＭＡＰの存在下において、８０°で、２．５当量のスペルミンと反応させる。１，３−二置換ＣＣＳが、このようにして得られる。
【０１１８】
図１Ｃに図示されている直鎖二置換セラミド−分枝スペルミン抱合体の合成
上述のように調製された一当量の１，３−ジ−Ｏ−スクシニミジルセラミド誘導体を、触媒量のＤＭＡＰの存在下において、８０°で、２．５当量のα−ω−ジプロテクトスペルミンと反応させる。
プロテクションを除去し、１，３−「分枝」二置換セラミド−スペルミン抱合体を得る。
【０１１９】
図１Ｄに図示されている直鎖二置換セラミド−環状スペルミン抱合体の合成
上述のように調製した一当量の１，３−ジ−Ｏ−スクシニミジルセラミド誘導体を、触媒量のＤＭＡＰの存在下において、８０℃で、０．７５当量のスペルミンと反応させる。
【０１２０】
インフルエンザ抗原
インフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９類似（Ｈ１Ｎ１）株由来の一価サブユニット抗原調製物は、Drs. Gluck及びZurbriggen, Berna Biotech, Bern、Switzerlandから頂いた。この調製物（本明細書ではＨＮと表記する。）は、８０から９０％のヘマグルチニン、５から１０重量％のノイラミニダーゼ並びに微量のＮＰ及びＭＩタンパク質から構成された。Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）及びＢ／山東／７／９７由来のＨＮを含有する、２００３／２００４シーズン向けの市販の三価サブユニットワクチン（Ｆｌｕｖｉｒｉｎ（Ｒ））は、Evans Vaccines Ltd.,Liverppol.UKから購入した。このワクチンは、カプセル化の前に、約８倍に濃縮した（Eppendorf Concentrator 5301, Eppendorf AG, Hamburg, Germany）。インビトロ刺激のために、幾つかの実験では、完全な不活化ウイルスを用いた。
【０１２１】
脂質
リン脂質（ＰＬ）  ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germanyから購入する。ＤＭＰＣ（中性）およびＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９／１モル比、陰イオン性）リポソームに加え、陽イオン性リポソーム／脂質集合物の６つの調合物を調製した。モノ陽イオン性脂質ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＳＴＡＰ）、ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）およびジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＭＴＡＰ）は、Avanti Polar Lipids（Alabaster, AL, USA）から購入する。一陽イオン性脂質ジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ｓｉｇｍａから購入する。新しい、独自のポリ陽イオン性スフィンゴ脂質Ｎ−パルミトイル  Ｄ−エリスロスフィンゴシルカルバモイル−スペルミン（酢酸塩）（セラミドカルバモイル−スペルミン、ＣＣＳ）は、Biolab Ltd., Jerusalem, Israelから購入する。表記されている場合には、１／１から４／１のモル比の脂質／ヘルパー比で、ヘルパー脂質（ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ）を使用した。
【０１２２】
マウス
特定病原体除去（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス、６から８週齢、及びＣ５７ＢＬ／６マウス、１８月齢を使用した（５から１０匹／グループ）。動物は、ＳＰＦ条件下で飼育した。
【０１２３】
方法
インフルエンザ抗原のリポソーム／脂質集合物中へのカプセル化
巨大な（平均直径０．１から５μｍ）異種（標準的なサイズでない）小胞中に、ＨＮ抗原（上記参照）をカプセル化した。全てのワクチン調合物の調製のために、以下の手順を一般に使用した。１ｍＬの第３ブタノール中に脂質（１０から３０ｍｇ）を溶かした後、ろ過（GF92, Glasforser, Vorfilter no. 421051, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）によって滅菌した。無菌脂質溶液を−７０℃で凍結した後、２４時間凍結乾燥して、乾燥を完了した。乾燥された脂質は、有意な（＜５％）脂質分解又は「カプセル化」能を失わずに、２年超、４℃で保存することができた。必要となった時点で、３／１から８００／１の脂質：抗原（タンパク質）ｗ／ｗ比で、脂質粉末を抗原溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２中）で水和した。２０から５０μＬずつ増量しながら、抗原溶液を段階的に添加し、０．５から１ｍＬの最終容量になるまで、各添加後に激しくボルテックス攪拌を行った。一部の実験では、乾燥された脂質をＰＢＳで水和し、あらかじめ形成された「空の」脂質集合物を、抗原溶液と混合した。この混合物を１から２分間ボルテックス攪拌し、３０から６０分以内に使用した。
【０１２４】
「カプセル化」効率を決定するために、調合に応じて、二つの手順を使用し、遊離抗原と脂質会合抗原の間で、８０％以上の分離を得た。ＣＣＳを除く、全てのワクチン調合物で、以下の分離技術を使用した。ＨＮ抗原（５０から１００μｇのタンパク質）を含有する脂質集合物（１から３０ｍｇの脂質）を０．５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、０．５ｍＬのＤ２Ｏ（99.9%, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA）上に慎重に負荷した。次いで、この試料を、１時間、３０℃、４５，０００ｒｐｍで遠心した。遊離の、カプセル化されていないＨＮは沈殿するのに対して、集合した（リポソーム）ＨＮと無タンパク質集合物／リポソームは上清中に残存する。上清全体を集め、上清とペレット画分の両方に、温かい１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．２ｍＬ添加することによって、集合物／リポソームを溶かした。改変されたＬｏｗｒｙ技法によって、両画分中のタンパク質濃度を求めた。ＣＣＳ調合物の場合、ＣＣＳ−ＨＮを、０．５ｍＬのＰＢＳ−Ｄ２Ｏ（１容量のＰＢＳ  Ｘ１０＋９容量のＤ２Ｏ）に懸濁した後、０．５ｍＬのＰＢＳと混合した。次いで、この混合物を、１０分間、２０℃、１０，０００ｒｐｍで遠心した。ＣＣＳ＋／−抗原は沈殿するのに対して、遊離のＨＮは上清中に残存する。両画分中の脂質溶解とタンパク質の測定は、上述したとおりに実施した。両分離技術で、ＨＮ抗原の総合回収率は９５％を上回っていた。
【０１２５】
免疫化
遊離（Ｆ−ＨＮ）および集合された／リポソームの（Ｌｉｐ−ＨＮ）ワクチン（０．２５−４μｇ抗原／株／投薬および０．０７５−１．２ｍｇ脂質／投薬）を、筋肉内に一回（ｉ．ｍ．、３０μＬ中）、３、７若しくは１４日の間隔を置いて鼻内に一回若しくは二回（ｉ．ｎ．、５−５０μＬ／鼻孔）、又は１週間の間隔を置いて経口に二回（５０μＬ中）投与した。全ての事例において、ＰＢＳ中の４％抱水クロラール０．１５ｍＬを腹腔内に与え、マウスに軽い麻酔をかけた。経口ワクチン接種の場合、ワクチン接種の３０分前に、０．５ｍＬの酸中和剤溶液（８部のＨａｎｋｓ平衡塩類溶液＋２部の７．５％炭酸水素ナトリウム）をマウスに経口的に処置した。比較のために、標準的な粘膜アジュバントとして、全ての実験で、１μｇの／投薬のコレラ毒素（CT, Sigma, USA）を使用した。２つの実験では、遊離およびリポソームのＣｐＧ−ＯＤＮ（ODN 1018,Dr. E. Raz, University of California, San Diego, CA, USAから頂いた。）、１０μｇ／投薬を、  アジュバントとして使用した。
【０１２６】
液性応答の評価
１／１０又は１／２０試料希釈から開始し、ワクチン接種から４ないし６週後に、個別に又はプールして、血清、肺ホモジネートおよび鼻洗浄液を検査した。血球凝集反応阻害抗体は、１／１０の試料希釈から始めて、標準的な血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイによって測定した。４０以上のＨＩ力価（ヒトにおいて防御力価と考えられる。）を有するマウスを、血清変換されたものと定義した。抗原特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ及びＩｇＥレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定した。対照（抗原＋正常なマウス血清、ＯＤ＜０．１）を０．２  ＯＤ上回る吸光度を与える最高の試料希釈を、ＥＬＩＳＡ抗体力価と考えた。
【０１２７】
細胞応答の評価
ワクチン接種から５ないし６週後に取得した脾細胞を、抗原でインビトロ刺激した後の、増殖性応答、ＩＦＮγ及びＩＬ−４産生、並びに細胞毒性活性について、検査した。５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを加えて（細胞毒性の場合）、又は加えずに、５％（増殖、サイトカインの場合）又は１０％（細胞毒性の場合）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した濃縮ＲＰＭＩ  １６４０又はＤＭＥＭ培地中において、３７℃で培養を行った。細胞培養は、以下のように行った。（ｉ）増殖：０．２ｍＬの最終容量中、抗原を加え又は加えずに（０．５から５μｇ／ウェル）、三つ組みで、０．５×１０６細胞／ウェルをＵ字型９６ウェルプレート中においてインキュベートした。７２から９６時間後、１μＣｉの３Ｈチミジンで、培養物を１６時間標識した。結果は、Δｃｐｍ＝（抗原を加えて培養された細胞の平均カウント／分）−（抗原を加えずに培養された細胞の平均カウント／分）で表す。（ｉｉ）サイトカイン：１ｍＬの最終容量中、抗原を加え又は加えずに（５から１０μｇ／ウェル）、二つ組みで、２．５×１０６から５×１０６個の細胞／ウェルを２４ウェルプレート中においてインキュベートした。４８から７２時間後に上清を集め、Opt EIA Set（Pharmingen, USA）を用いて、マウスのＩＦＮγとＩＬ−４についてＥＬＩＳＡによって調べた。（ｉｉｉ）細胞毒性：応答している脾細胞（２．５×１０６）を、（ｉｉ）と同様に、Ｘ／１２７（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを感染された同数の刺激性ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞とともに、７日間インキュベートした（下記参照）。感染のために、１５０血球凝集ユニット／１×１０６脾細胞のウイルスを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地（ＦＣＳなし）中にて、３時間３７℃で、時折攪拌しながら、脾細胞をインキュベートした後、洗浄した。続いて、１０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２の存在下、１／４のエフェクター／刺激細胞比で、感染された放射線照射（３，０００ｒａｄ）脾細胞を用いて、初回刺激を受けたエフェクター細胞を、５日間、再度刺激した。標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、１００／１のエフェクター／標的細胞比で、細胞毒性を測定した。使用した被標識標的細胞は、非修飾Ｐ８１５及びＨＡ２  １８９−１９９ペプチド（ＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬ、２０μｇ／１ｘ１０６細胞）で、９０分間３７℃でパルスされたＰ８１５であった。
【０１２８】
防御免疫の測定
マウスを麻酔し、マウスに対して感染性であり、Ａ／ニューカレドニアと交叉反応する、再集合体ウイルスＸ−１２７（Ａ／北京／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）×Ｘ−３１（Ａ／香港／１／６８×Ａ／ＰＲ／８／３４）を用いて、２５μＬの生ウイルス懸濁液／鼻孔（約１０７  ＥＩＤ  ５０（ｅｇｇ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ  ５０％））を投与した。第４日目に肺を取り出し、冷ＰＢＳ中で三回洗浄し、ＰＢＳ（１．５ｍＬ／肺／マウス、１／１０希釈と称する。）中でホモジナイズした。各グループのホモジネートをプールし、２０００ｒｐｍで、３０分間、４℃にて遠心し、上清を集めた。段階的な１０倍希釈を行い、１１日齢の孵化したニワトリの卵の尿嚢中に、二つ組みで、各希釈０．２ｍＬを注射した。３７℃で４８時間後及び４℃で１６時間後、０．１ｍＬの尿膜腔液を取り出し、ニワトリ赤血球（０．５重量％、０．１ｍＬ）を用いた血球凝集（室温で３０分）によって、ウイルスの存在をチェックした。肺のウイルス力価は、尿膜腔液中にウイルスを産生する（陽性の血球凝集）肺ホモジネートの最高希釈として求める。
【０１２９】
さまざまな蛍光標識脂質調合物及び放射性標識ＨＮ抗原の生体分布及び薬物動態
空の、又は三価のサブユニットインフルエンザワクチン（ＨＮ）と会合したリスサミン−ローダミン標識脂質集合調合物を、２０μＬの容量でマウスに接種した。１、５又は２４時間後にマウスを屠殺し、様々な臓器を取り出した。−２０℃で、臓器を一晩保存し、翌朝、溶解緩衝液中でホモジナイズした。得られたホモジネート０．２ｍＬを、エッペンドルフチューブに移し、０．８ｍＬのイソプロパノールを添加し、蛍光プローブを上清中に放出させるために、１５分間回転させた。５０μＬの上清を、３８４ブラックプレート上に載せ、蛍光を読み取った（Ｅｍ：５４５、Ｅｘ：５９６）。
【０１３０】
さらなるアッセイでは、４５０μｇの三価ＨＮワクチン（５ｍＬ中）を、（塩を除去するために）ＤＤＷに対して透析した後、５μＬまで、１０００倍に濃縮した。次いで、このタンパク質を、０．１Ｍ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で希釈し、１５μＬ中、４５０μｇの原液とした。次いで、Ｂｏｌｔｏｎ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用い、製造業者の指示に従って、１２５Ｉでタンパク質を標識した。１２５Ｉ標識ＨＮ（２μｇ）を、１、５及び２４時間の時点でマウスに与え、マウスを屠殺し、様々な臓器（図３参照）をバイアル中に取り出し、１２５Ｉに対して較正されたγカウンターを読み取った。
【０１３１】
ここで、添付の特許請求の範囲によって、本発明を定義する。特許請求の範囲の内容は、本明細書の開示の中に含まれるものとして読まなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、式（Ｉ）のスフィンゴイド−ポリアルキルアミン抱合体の一般的な定義に包含される、複数の可能な化学構造、「直鎖」、「分枝」又は「環状」の脂質様陽イオン性（LLP, lipid like cationic）化合物を示している。図１Ａは、単一のポリアルキルアミン鎖に連結されたスフィンゴイド骨格（セラミド）を示し、図１Ｂ及び図１Ｃは、２つのポリアルキルアミン鎖に連結された同一のスフィンゴイド骨格を示し、図１Ｄは、同一の骨格を示すが、２つのヒドロキシル部分を介して、単一のポリアルキルアミン鎖が連結されて、環状ポリアルキルアミン抱合体を形成している。
【図２−１】図２Ａ−２Ｆは、ＧＩ−黒四角−、肺−黒菱形−又は脾臓−−−、非回収−白菱形−の、様々な蛍光標識脂質調合物の生体分布及び薬物動態を示す。図２Ａは、空のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ（モル比９：１）の分布を示し；図２Ｂは、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：ＨＮの分布を示し、図２Ｃは、空のＤＯＴＡＰ：コレステロールの分布を示し、図２Ｄは、ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＨＮの分布を示し、図２Ｅは、空のＣＣＳ：コレステロールの分布を示し、最後に、図２Ｆは、ＣＣＳ−コレステロール：ＨＮの分布を示す。
【図２−２】図２Ａ−２Ｆは、ＧＩ−黒四角−、肺−黒菱形−又は脾臓−−−、非回収−白菱形−の、様々な蛍光標識脂質調合物の生体分布及び薬物動態を示す。図２Ａは、空のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ（モル比９：１）の分布を示し；図２Ｂは、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：ＨＮの分布を示し、図２Ｃは、空のＤＯＴＡＰ：コレステロールの分布を示し、図２Ｄは、ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＨＮの分布を示し、図２Ｅは、空のＣＣＳ：コレステロールの分布を示し、最後に、図２Ｆは、ＣＣＳ−コレステロール：ＨＮの分布を示す。
【図２−３】図２Ａ−２Ｆは、ＧＩ−黒四角−、肺−黒菱形−又は脾臓−−−、非回収−白菱形−の、様々な蛍光標識脂質調合物の生体分布及び薬物動態を示す。図２Ａは、空のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ（モル比９：１）の分布を示し；図２Ｂは、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：ＨＮの分布を示し、図２Ｃは、空のＤＯＴＡＰ：コレステロールの分布を示し、図２Ｄは、ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＨＮの分布を示し、図２Ｅは、空のＣＣＳ：コレステロールの分布を示し、最後に、図２Ｆは、ＣＣＳ−コレステロール：ＨＮの分布を示す。
【図３−１】図３Ａ−３Ｄは、ＧＩ−黒四角−、肺−黒菱形−又は脾臓−白菱形−、非回収−×−の、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された様々な脂質集合調合物の生体分布を示す。具体的には、図３Ａは、遊離の１２５Ｉ−ＨＮの生体分布を示し；図３Ｂは、ＤＯＴＡＰ：コレステロールから構成される、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された脂質集合物を示し；図３Ｃは、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧから構成される、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された脂質集合物を示し；図３Ｄは、ＣＣＳ：コレステロールから構成される、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された脂質集合物を示す。
【図３−２】図３Ａ−３Ｄは、ＧＩ−黒四角−、肺−黒菱形−又は脾臓−白菱形−、非回収−×−の、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された様々な脂質集合調合物の生体分布を示す。具体的には、図３Ａは、遊離の１２５Ｉ−ＨＮの生体分布を示し；図３Ｂは、ＤＯＴＡＰ：コレステロールから構成される、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された脂質集合物を示し；図３Ｃは、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧから構成される、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された脂質集合物を示し；図３Ｄは、ＣＣＳ：コレステロールから構成される、１２５Ｉ−ＨＮが負荷された脂質集合物を示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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