(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列において１から１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列において１から１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号４又は８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号４又は８に記載の塩基配列において、１から３０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつフォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のＤＮＡ又は請求項４に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載の蛍光蛋白質からなるフォトクロミック材料。
【請求項７】
請求項１に記載の蛍光蛋白質を含んでいて光照射により情報の記録及び読取が可能な記録層を有する光記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、蛍光の放出と消失を波長の異なる２つの光照射によって制御することが可能な新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、キッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）由来の新規蛍光蛋白質、並びにこれに変異を導入することにより単量体化した新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
【背景技術】  クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。また、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｍａ  ｓｐ．）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、ＤａｓＲｅｄが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
【発明の開示】
オワンクラゲ由来の改変体である黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）には、４８８ｎｍの光照射によって徐々に暗くなる傾向、かつその後、４０５ｎｍの光照射によって僅かに蛍光が回復（せいぜい２０％）する傾向が認められている。しかし、ＹＦＰのフォトクロミズム（ｐｈｏｔｏｃｈｒｏｍｉｓｍ）減少（即ち、蛍光の消失と回復）は不完全であるため、実用化には程遠い状況である。本発明は、上記した問題を解消することを解決すべき課題とするものであり、具体的には、蛍光のオンとオフを波長の異なる２つの光照射によって制御することが可能な新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、キッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）由来の新規の蛍光蛋白質を用いて、上記したフォトクロミズム効果を完全に実現できる蛋白質を作製することに成功した。即ち、本発明の蛍光蛋白質においては、４８８ｎｍと４０５ｎｍの光を照射することによって蛍光強度を０％と１００％の間でコントロールすることができる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質。
本発明の別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２又は６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２又は６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号４又は８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号４又は８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつフォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質からなるフォトクロミック材料が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質を含んでいて光照射により情報の記録及び読取が可能な記録層を有する光記録媒体が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、２２Ｇの吸収スペクトル及び蛍光・励起スペクトルを示す。
図２は、２２Ｇの蛍光強度のｐＨ感受性を測定した結果を示す。
図３は、ｍ２２Ｇ３の吸収スペクトル及び蛍光・励起スペクトルを示す。
図４は、ｍ２２Ｇ３の蛍光強度のｐＨ感受性を測定した結果を示す。
図５は、ｍ２２Ｇ３に吸収極大波長５１８ｎｍ付近の光を照射すると、吸収と蛍光が減弱し、代わりに３８０ｎｍ付近の吸収が現れることを示す図である。
図６は、ｍ２２Ｇ３に３８０ｎｍ付近の光を照射すると、３８０ｎｍの吸収が消失して、５１８ｎｍの吸収及び蛍光が完全に回復することを示す図である。
図７は、２２Ｂの吸収スペクトルを示す。
図８は、２２Ｂの蛍光・励起スペクトルを示す。
図９は、ｍ３ｍ４の吸収スペクトルを示す。
図１０は、ｍ３ｍ４の蛍光・励起スペクトルを示す。
図１１は、ｍ３ｍ４とｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）の蛍光特性の比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛍光蛋白質
本発明の第一の蛍光蛋白質は、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに示す蛋白質である。
（ａ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質（２２Ｇ）は、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）吸収極大波長が５０７ｎｍであり、蛍光極大波長は５１８ｎｍである；
（２）５０７ｎｍにおけるモル吸光係数が、１１０，０００である；
（３）量子収率が０．６７である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＝４．７である。
配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質（２２Ｂ）の吸収極大波長は３８０ｎｍであり、蛍光極大波長は４６７ｎｍである。
本明細書中の実施例においては、本発明の第一の蛍光蛋白質のうち配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、キッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）を出発材料としてクローニングされた。キッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）は刺胞動物門花虫綱六放サンゴ亜綱イシサンゴ目ウミバラ科に属するサンゴの一種であり、固着性で被覆状または薄板状や葉状の群体を形成することが多い。なお、キッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）以外の蛍光を発するサンゴから本発明の蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような蛋白質も本発明の範囲内である。
本明細書中の実施例においては、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを鋳型にして、ＭｎＣｌ２を加えた状態でＰＣＲを行って無作為に変異を導入し、無作為変異導入によって得られたクローンから選択することによって取得されたものである。
本発明の第二の蛍光蛋白質は、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに示す蛋白質である。
（ａ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質。
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質（ｍ２２Ｇ３）は、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）吸収極大波長が５０３ｎｍであり、蛍光極大波長は５１８ｎｍである；
（２）５０３ｎｍにおけるモル吸光係数が、５７０，０００である；
（３）量子収率が０．６２である；及び
（４）蛍光特性のｐＨ感受性がｐＫａ＝５である。
（５）フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する。具体的には、吸収極大波長５１８ｎｍ付近の光の照射によって吸収と蛍光が減弱し、代わりに３８０ｎｍ付近の吸収が現れるが、３８０ｎｍ付近の光を照射すると、３８０ｎｍの吸収が消失して、５１８ｎｍの吸収及び蛍光が完全に回復する。
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質（ｍ３ｍ４）は、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）吸収極大波長が４８６ｎｍであり、蛍光極大波長は５１３ｎｍである；
（２）４８６ｎｍにおけるモル吸光係数が、５６０，０００である；
（３）量子収率が０．２８である；及び
（４）フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する。
本明細書中の実施例においては、本発明の第二の蛍光蛋白質のうち配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを鋳型にして、ＭｎＣｌ２を加えた状態でＰＣＲを行って無作為に変異を導入し、無作為変異導入によって得られたクローンのうち、単量体のサイズを有するものを選択することによって取得されたものである。また、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを鋳型にしてＭｎＣｌ２を加えた状態でＰＣＲを行って無作為に変異を導入し、無作為変異導入によって得られたクローンから選択することによって取得されたものである。本発明の第二の蛍光蛋白質は、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有することを特徴とする。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「蛍光特性」とは、励起光の照射により蛍光を発することができる能力のことを言う。配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の蛍光特性は、配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の蛍光特性と同等のものでもよいし、異なるものでもよい。蛍光特性の指標としては、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、ｐＨ感受性などが挙げられる。
本明細書で言う「フォトクロミズム効果を示す蛍光特性」とは、吸収極大波長付近の波長などのような所定の波長の光の照射によって吸収と蛍光が減弱又は消失し、別の波長域に吸収が現れること、更に、新たに現れた吸収波長の光を照射すると、上記で減弱又は消失した吸収及び蛍光が回復するという蛍光特性のことを言う。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１、３、５又は７に記載したアミノ酸配列並びに配列番号２、４、６又は８に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて、キッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）から調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の第一の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。また、本発明の第一の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡに基づいてこれに所定の変異を導入することにより本発明の第二の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明の第一の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号１又は５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質。
本発明の第一の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた挙げられる。
（ａ）配列番号２又は６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２又は６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本発明の第二の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｂ）配列番号３又は７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質。
本発明の第二の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡもまた挙げられる。
（ａ）配列番号４又は８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号４又は８に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつフォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から５０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性蛋白プロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の蛍光蛋白質の蛍光標識物質としての利用
本発明の蛍光蛋白質は、蛍光標識物質として利用することができる。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモータ活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモータの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモータの活性を測定することが可能である。被検プロモータとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモータ活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．ＭＯｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビドロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ１１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社  アキシオフォト  フィルターセット  ０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯ  デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質は、吸収極大波長が５０７ｎｍであり、蛍光極大波長は５１８ｎｍであることから、励起光５００〜５１０ｎｍ、蛍光５１０〜５３０ｎｍ程度のフィルターを使用することができる。同様に、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質は、吸収極大波長が５０３ｎｍであり、蛍光極大波長は５１８ｎｍであることから、励起光５００〜５１０ｎｍ、蛍光５１０〜５３０ｎｍ程度のフィルターを使用することができる。同様に、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質は、吸収極大波長が３８０ｎｍであり、蛍光極大波長は４６７ｎｍであることから、励起光３７０〜３９０ｎｍ、蛍光４６０〜４８０ｎｍ程度のフィルターを使用することができる。同様に、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質は、吸収極大波長が４８６ｎｍであり、蛍光極大波長は５１３ｎｍであることから、励起光４８０〜４９０ｎｍ、蛍光５００〜５２０ｎｍ程度のフィルターを使用することができる。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
（６）本発明の蛍光蛋白質のフォトクロミズム効果を利用した記録媒体等における利用
さらに、本発明の第二の蛍光蛋白質は、フォトクロミズム効果を示す蛍光特性（フォトクロミックな蛍光特性）を有することから、ＣＤ、ＤＶＤ、ホログラフィー記録媒体、スマートカードなどの光記録媒体、広告板、蛍光板、ＴＶ、コンピュータモニターなどの表示素子、レンズ、バイオセンサー、バイオチップ、フォトクロミック繊維素材など多様な用途に適用することができる。
本発明の光記録媒体は、基板上に本発明によるフォトクロミズム効果を示す蛍光特性を有する蛍光蛋白質を含有する記録層を形成することによって製造することができる。書きこみ、再生のための光学系に水浸式のレンズを用いることによってＮＡ（開口数）を大きくできる。これにより高解像度が期待できる。
光記録媒体の製造のために用いられる基板の材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスチック、紙、アルミニウム等の金属（板状でも箔状でもよい）などが挙げられ、特にはプラスチックが好ましい。プラスチックの材料も特に限定されるものではないが、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、酢酸ビニル樹脂、塩化ビニル樹脂、ニトロセルロース樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリイミド樹脂、ポリサルホン樹脂等が挙げられる。
本発明の蛍光蛋白質を、必要に応じバインダーとともに適当な溶媒に溶解し、ドクターブレード法、キャスト法、スピナー法、浸漬法等の手段により、上記基板上に膜厚１ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５０μｍの薄膜となるように塗布することにより、基板上に記録層を形成することができる。ここで用いるバインダーとしては、ポリエステル、ポリスチレン、ポリビニルブチラール、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリ酢酸ビニル、酢酸セルロース、エポキシ樹脂、フェノール樹脂等が挙げられる。また、溶媒としては、トルエン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、エチルアセテート等が適当である。
成膜された薄膜中の、本発明の蛍光蛋白質の含有量は特に限定されず、使用する蛍光蛋白質の吸光度や、発生する蛍光の強度等に応じて適宜決定することができる。記録層は基板の両面に設けてもよいし、片面だけに設けてもよい。
上記のようにして製造された本発明の光記録媒体への記録は、基体の両面又は片面に設けた記録層に収束した光を当てることにより行うことができる。光照射された部分は光エネルギーの吸収により、蛍光特性の変化が起こり、情報が記録される。記録された情報の再生は、光照射による蛍光の差を読みとることにより行うことができる。
本発明の蛍光蛋白質は、上記の通りフォトクロミズム分野に応用可能であり、例えば、国際公開ＷＯ９８／４７１４８（Ｐｈｏｔｏｃｈｒｏｍｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）及び国際公開ＷＯ０２／９６９２４（Ｋｉｎｄｌｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ）などに記載の応用例が挙げられる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例１：サンゴからの新規蛍光蛋白質遺伝子（２２Ｇ）の単離
蛍光を放つキッカサンゴ（Ｅｃｈｉｎｏｐｈｙｌｉａ  ｓｐ．）から、蛍光蛋白質遺伝子を以下の手順で単離した。
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。凍結したキッカサンゴをＭｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井器機）を用いて変性溶液中で砕き、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを加え、遠心してＲＮＡを蛋白質・ＤＮＡ複合体から分離した。ＲＮＡを含む水層をｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌに加え、遠心すると、沈殿としてｔｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。
（２）ＲＮＡの精製
ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｍＲＮＡを分離した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡにＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉を加え、加熱してＲＮＡの２次構造を壊してから、３７℃でＲＮＡとＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を結合させる。洗浄後、加熱、遠心すると、ｍＲＮＡが溶出された上清が得られる。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を取り除いた上、ｅｔｈａｎｏｌとＮａＣｌでｍＲＮＡを沈殿させ、水に溶した。
（３）ｃＤＮＡの合成
ＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭとＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＴｏｏｌｂｏｘＴＭ（共にＡｍａｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｍＲＮＡを加熱して２次構造を壊した後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＭｉｘにＤＴＴとＮｏｔ  Ｉ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（５’ｄ（ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  Ｔ１８）ｐ３’（配列番号９））と共に加え、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄを合成する。更にそれをＳｅｃｏｎｄ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘに加え、ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄを合成し、付属のスパンカラムで精製する。精製したｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏ  ＲＩ  ａｄａｐｔｏｒを付け、Ｎｏｔ  Ｉで３’側のみカットする。もう一度スパンカラムで精製して、ｃＤＮＡを取得した。
（４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
ｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＥｃｏ  ＲＩ、Ｎｏｔ  Ｉサイトを設け、合成したｃＤＮＡを挿入、大腸菌のＪＭ１０９  ＤＥ３株に導入してライブラリー化した。この大腸菌株では蛋白質が合成されるため、コロニーが光の照射によって蛍光を発するかどうかで、蛍光蛋白質のクローンを選別できる。その結果、約８万個から１個のポジティブコロニーを得、クローン２２Ｇと命名し、塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。２２Ｇのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号１及び２に示す。
大腸菌を用いて蛍光蛋白質２２ＧにＨｉｓ−Ｔａｇを付加した蛋白質を常法により発現させ、Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅを用いて精製した。
実施例２：蛍光蛋白質（２２Ｇ）の蛍光特性の解析
（１）吸収スペクトル及び蛍光・励起スペクトル
吸収スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用いて測定した。蛍光・励起スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用い、４８０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５４０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。蛍光蛋白質２２Ｇの吸収スペクトルを図１の左側に示し、蛍光・励起スペクトルを図１の右側に示す。
（２）ｐＨ感受性の特性
以下のバッファーを用いて、４８０ｎｍで励起した時の５１８ｎｍの蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。
ｐＨ４，４．５，５，５．５：５０ｍＭ  ＡｃＯＮａ−ＡｃＯＨ
ｐＨ６．５：５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ
ｐＨ８，８．５：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ９，９．５，１０，１０．５：５０ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ
ｐＨ１１：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨ
（３）２２Ｇの蛍光特性のまとめ
以上の結果から求められた２２Ｇの性質を表１に示す。
【表１】
0004695073.tif 000002
実施例３：蛍光蛋白質（２２Ｇ）の単量体化
実施例１で取得した蛍光蛋白質（２２Ｇ）に以下の方法でランダム変異誘発により変異を導入し、単量体化した。
クローニングした２２ＧのＤＮＡを鋳型に、ＭｎＣｌ２を加えた状態でＰＣＲをして無作為に変異を導入した。ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＴＡＫＡＲＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ｐｒｉｍｅｒにはｆｏｒｗａｒｄとして５’側にＢａｍＨＩサイトを加えたもの（ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＧＡＣ）（配列番号１０）と、ｒｅｖｅｒｓｅとして３’側にＥｃｏＲＩサイトを加えたもの（ＡＴＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＧＧ  ＣＡＧ）（配列番号１１）を用いた。増幅されたＤＮＡはＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでカットしてｐＲＳＥＴＢに挿入、ＪＭ１０９  ＤＥ３株に導入してＬＡプレートで培養した。Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓによって得られたクローンのうち、ｐｓｅｕｄｏ−ｎａｔｉｖｅ  ｐａｇｅで単量体のものと同じくらいのサイズになったものに関して、超遠心で分子量を確認した。確かに単量体化されていたクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定し、ｍ２２Ｇ３と命名した。単量体クローン（ｍ２２Ｇ３）のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号３及び４に示す。
大腸菌を用いて蛍光蛋白質ｍ２２Ｇ３にＨｉｓ−Ｔａｇを付加した蛋白質を常法により発現させ、Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅを用いて精製した。
実施例４：変異体ｍ２２Ｇ３の蛍光特性の解析
（１）吸収スペクトル及び蛍光・励起スペクトル
吸収スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用いた。蛍光・励起スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用い、４８０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５４０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。蛍光蛋白質ｍ２２Ｇ３の吸収スペクトルを図３の左側に示し、蛍光・励起スペクトルを図３の右側に示す。
（２）ｐＨ感受性の特性
以下のバッファーを用いて、４８０ｎｍで励起した時の５１８．５ｎｍの蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。
ｐＨ４，４．５，５，５．５：５０ｍＭ  ＡｃＯＮａ−ＡｃＯＨ
ｐＨ６．５：５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ
ｐＨ８，８．５：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ９，９．５，１０，１０．５：５０ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ
ｐＨ１１：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨ
（３）ｍ２２Ｇ３の蛍光特性のまとめ
以上の結果から求められたｍ２２Ｇ３の性質を表２に示す。
【表２】
0004695073.tif 000003
（３）ｍ２２Ｇ３のフォトクロミズム効果
さらに、この変異体（ｍ２２Ｇ３）の特徴として、フォトクロミズムを起こすことが挙げられる。まず、吸収極大波長５１８ｎｍ付近の光の照射によって吸収と蛍光が減弱し、代わりに３８０ｎｍ付近の吸収が現れる（図５）。しかし、３８０ｎｍ付近の光を照射すると、３８０ｎｍの吸収が消失して、５１８ｎｍの吸収及び蛍光が完全に回復する（図６）。つまり、波長の異なる２つの光によって、明状態と暗状態との間を行き来できるのがこの変異体ｍ２２Ｇ３の大きな特徴である。
実施例５：蛍光蛋白（２２Ｇ）の変異体の作製
実施例１で取得した蛍光蛋白２２Ｇに以下の方法でさらに変異を導入し、性質の異なるものを得た。
＜方法＞Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
２２ＧのＤＮＡを鋳型に、ＭｎＣｌ２を加えた状態でＰＣＲをして無作為に変異を導入した。
ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＴＡＫＡＲＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、プライマーにはｆｏｒｗａｒｄとして５’側にＢａｍＨＩサイトを加えたものと、ｒｅｖｅｒｓｅとして３’側にＥｃｏＲＩサイトを加えたものを用いた。増幅されたＤＮＡはＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでカットしてｐＲＳＥＴＢに挿入、ＪＭ１０９  ＤＥ３株に導入してＬＡプレートで培養した。
Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓで得られたクローンのうち、２２Ｇと大きく性質の異なるものを取り出し、クローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。このクローンを２２Ｂと命名した。２２Ｂのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号５及び６に示す。
大腸菌を用いて蛍光蛋白質２２ＢにＨｉｓ−Ｔａｇを付加した蛋白質を常法により発現させ、Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅを用いて精製した。
実施例６：変異体２２Ｂの蛍光特性の解析
（１）吸収スペクトル及び蛍光・励起スペクトル
吸収スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用いた。蛍光・励起スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用い、３８０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと４７０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。蛍光蛋白質２２Ｂの吸収スペクトルを図７に示し、蛍光・励起スペクトルを図８に示す。吸収極大は３８０ｎｍであり、蛍光極大は４６７ｎｍである。
実施例７：蛍光蛋白質ｍ２２Ｇ３の変異体の作製
実施例３で取得した蛍光蛋白質ｍ２２Ｇ３（蛍光蛋白２２Ｇの変異体）（Ｄｒｏｎｐａとも称する）に以下の方法でさらに変異を導入し、性質の異なるものを得た。
＜方法＞Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）のＤＮＡを鋳型に、ＭｎＣｌ２を加えた状態でＰＣＲをして無作為に変異を導入した。
ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＴＡＫＡＲＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ｐｒｉｍｅｒにはｆｏｒｗａｒｄとして５’側にＢａｍＨＩサイトを加えたものと、ｒｅｖｅｒｓｅとして３’側にＥｃｏＲＩサイトを加えたものを用いた。増幅されたＤＮＡはＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでカットしてｐＲＳＥＴＢに挿入、ＪＭ１０９  ＤＥ３株に導入してＬＡプレートで培養した。
Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓで得られたクローンのうち、ｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）と大きく性質の異なるものを取り出し、クローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。このクローンをｍ３ｍ４と命名した。ｍ３ｍ４のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号７及び８に示す。
大腸菌を用いて蛍光蛋白質ｍ３ｍ４にＨｉｓ−Ｔａｇを付加した蛋白質を常法により発現させ、Ｎｉ−Ａｇａｒｏｓｅを用いて精製した。
実施例８：変異体ｍ３ｍ４の蛍光特性の解析
（１）吸収スペクトル及び蛍光・励起スペクトル
吸収スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用いた（図９、黒）。４８０ｎｍの強い光を３分間当てると、４８６ｎｍのピークが低くなり３９０ｎｍに吸収が現れる（図９、灰色）。
蛍光・励起スペクトルは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用い、４７０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５３０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した（図１０）。
ｍ３ｍ４の性質を表３に示す。
【表３】
0004695073.tif 000004
（２）ｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）とｍ３ｍ４の比較
ｍ３ｍ４は、ｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）と同じ強度の４８０ｎｍの強い光を当てると約５倍の速さで暗くなり、暗くなったものに同じ強度の４００ｎｍの光を当てるとほぼ同じ速さで明るくなる（図１１の左図）。
また、４８０ｎｍの強い光で暗くしたｍ３ｍ４とｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）を約１０分間室温で放置すると、ｍ２２Ｇ３（Ｄｒｏｎｐａ）はほとんど変化がないが、ｍ３ｍ４は８割程度蛍光が回復する（図１１の右図）。
【産業上の利用可能性】  本発明の蛍光蛋白質は、光の制御により蛍光を獲得又は消失することができることから、情報記録又は画像表示の技術分野におけるフォトニクスデバイスのための材料として有用である。本発明の蛍光蛋白質は、例えば、書き換え可能な光メモリー素子として実用化することができる。さらに、本発明の蛍光蛋白質またはそれをコードする遺伝子は、複写防止用印刷材料、光照射によりカラー画像情報の書き込みと消去の繰り返しが可能な可逆画像表示用媒体、ホログラム材料、特定波長用の遮光材料、又は光スイッチング素子用材料などとして利用することができる。
【図１】
0004695073.tif 000005
【図２】
0004695073.tif 000006
【図３】
0004695073.tif 000007
【図４】
0004695073.tif 000008
【図５】
0004695073.tif 000009
【図６】
0004695073.tif 000010
【図７】
0004695073.tif 000011
【図８】
0004695073.tif 000012
【図９】
0004695073.tif 000013
【図１０】
0004695073.tif 000014
【図１１】
0004695073.tif 000015
【配列表】
0004695073000001.xml