(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培養かつ担体を必要としない浮遊培養が可能なイヌ腎細胞由来のＭＤＣＫ細胞の誘導株であるＢ−７０２株。
【請求項２】
ワクチン用ウイルスの製造に適した請求項１ に記載の細胞。
【請求項３】
当該ウイルスが、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、フラビウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、アレナウイルス科、及びポックスウイルス科からなる群から選ばれるウイルスである請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
当該ウイルスが、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、レオウイルス３型、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、アデノウイルス１型〜４７型、ポリオウイルス、ラッサウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選ばれるウイルスである請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
下記の工程に従う、無血清培養かつ担体を必要としない浮遊培養が可能なＭＤＣＫ細胞誘導株の調製方法：
ａ）ＭＤＣＫ細胞を無血清培地へ馴化し、無血清培地で増殖可能な細胞を調製し、
ｂ）無血清培養が可能な細胞を、担体を用いた浮遊培養に適用し、担体を用いた浮遊培養で増殖可能な細胞を調製し、ついで
ｃ）担体に付着して浮遊培養可能な細胞を、担体を用いない浮遊培養に適用し、担体を必要としない浮遊培養が可能な細胞を調製する。
【請求項６】
無血清培養に用いる無血清培地が動物種由来の成分を含まないことを特徴とする請求項５に記載の調製方法。
【請求項７】
当該ＭＤＣＫ細胞誘導株がＢ−７０２株である請求項５または６に記載の調製方法。
【請求項８】
無血清培養かつ担体を必要としない浮遊培養が可能なＭＤＣＫ細胞誘導株であるＢ−７０２株にウイルスを接種し、当該細胞を担体を用いずに無血清浮遊化培養することを特徴とするワクチン用ウイルスの製造法。
【請求項９】
無血清培養に用いる無血清培地が動物種由来の成分を含まないことを特徴とする請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
当該ウイルスが、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、フラビウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、アレナウイルス科、及びポックスウイルス科からなる群から選ばれるウイルスである請求項８または９に記載の製造法。
【請求項１１】
当該ウイルスが、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、レオウイルス３型、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、アデノウイルス１型〜４７型、ポリオウイルス、ラッサウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選ばれるウイルスである請求項１０に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、無血清培養かつ担体無しの浮遊培養可能な細胞、及び当該細胞を用いたワクチン製造に関する。さらに詳細には、血清を使用しないで培養可能でかつ、細胞が何の担体に付着することも必要とせず浮遊状態で培養可能な細胞株の樹立、及び当該細胞株によるワクチンの製造法に関する。
背景技術
一般にワクチンの製造には、発育鶏卵やマウスの脳、あるいは鶏やサルを初めとする種々の動物由来の初代細胞や株化細胞が広く使用されている。しかしながら、これらの方法には下記のような種々の問題が含まれている。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
まず、発育鶏卵等の使用は、鶏の飼育管理やワクチンの製造時期に合わせた受精卵の管理作業や、製造における卵蛋白由来の成分を完全に除去するための徹底した精製行程等の煩雑な作業が必要であり、さらに、動物愛護の観点からも問題を含んでいる。
また、株化細胞においては、通常、細胞増殖因子として牛胎児血清を添加する必要があるが、品質間にばらつきや、マイコプラズマ、ウイルスあるいはプリオンなどの感染性蛋白の混入の危険性を伴うことから、厳重な品質管理が要求されるなどの問題がある。このため、ニュージーランド産の牛胎児血清のような高品質の血清の使用が要求されるが、この血清は非常に高価なため、工業レベルでの製造には不適当である。
さらに、多種のウイルスが増殖可能な株化細胞としては、実験室レベルではＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞が広く用いられている（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２２，ｐｐ．９３１−９３５（１９６６））。しかしながら、この細胞は壁付着性が非常に強いため、ＭＤＣＫ細胞を工業レベルでの大規模培養に応用することは、大量の培地、広大な面積の培養容器や培養用の担体を必要とすることから、１）設備や担体などの多大なコストがかかる、２）担体から付着した細胞をはがす行程が必要であるとともに、細胞の回収ロスも生じる、及び３）培養条件によっては担体（ビーズ）同士がこすれ合うことにより細胞が障害を受ける、などの欠点がある。このように、ＭＤＣＫ細胞をそのままワクチン製造へ用いるのは、コストや設備の面から実用的ではない。
従って、ワクチン製造に当たって、安価で、高い安全性を有し、かつ安定的なワクチン製造法の確立が強く望まれていた。
（その解決方法）
このような状況下、上記の如き従来技術の欠点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明らは、牛胎児血清を使用しないで培養できる細胞でかつ、製造スケールにおいてタンク培養が可能なように浮遊化した細胞で、さらに浮遊状態においては何の担体も必要としない新規な細胞株を樹立するとともに、牛胎児血清を使用しない新規なワクチンウイルスの製造法を確立し、安価で安全性の高いワクチンを提供することを可能とし、本発明を完成するに至った。
発明を実施するための最良の形態
本発明の無血清培養可能且つ担体なしで浮遊培養可能なＭＤＣＫ細胞誘導株は、下記の工程に従い調製された：
ａ）ＭＤＣＫ細胞を無血清培地へ馴化し、無血清培地で増殖可能な細胞を調製し、
ｂ）無血清培養が可能な細胞を、担体を用いた浮遊培養に適用し、担体を用いた浮遊培養で増殖可能な細胞を調製し、
ｃ）担体に付着して浮遊培養可能な細胞を、担体を用いない浮遊培養に適用し、担体を必要としない浮遊培養が可能な細胞を調製する。
より具体的には下記の通りである。
まず、ＭＤＣＫ細胞を１０％の牛胎児血清（以下、「ＦＣＳ」と略す）と非必須アミノ酸（ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ギブコ社、カタログ番号１１１４０−０５０）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（以下、「Ｄ−ＭＥＭ」と略す；ギブコ社、カタログ番号１１９６５−０９２）で２５ｃｍ２培養フラスコ内で単層培養した。細胞が十分に進展した時点で、上記培地に無血清培地を２５％含有する培地で培養し、細胞に異常のないことを確認した後に継代した。ここで使用される無血清培地としては、安全性の観点から動物種由来の成分を含まないものが好ましい。そのような無血清培地の一例として、本発明ではＶＰ−ＳＦＭ（ギブコ社、カタログ番号１１６８１−０２０）を使用した。継代後に細胞が十分に進展した時点で、培地を、ＶＰ−ＳＦＭを５０％含有するＤ−ＭＥＭに変更した。以下同様の手順でＶＰ−ＳＦＭ含有比率を７５％、１００％となるように細胞を馴化させ、最終的に無血清培地馴化細胞を樹立した。次に２通りの方法で細胞の浮遊化を試みた。
第１は無血清培地に馴化した細胞を直接スピナーフラスコ（スピンナーフラスココンプリートＢＥＬＬＣＯ社、カタログ番号１９６５−００１００）内で、４０ｒｐｍの条件下で培養を開始した。この間、培地は常にＶＰ−ＳＦＭを用い、培地のｐＨが低下した際には中の細胞を残し培地のみを半分量交換して培養を継続した。約２カ月の維持培養の後に、この条件下で増殖する細胞集団を得ることができたが、細胞の到達密度が５×１０５個／ｍｌまでしかなく、工業化を考えた場合に必要と考える１×１０６個／ｍｌには到達できなかった。
第２は、まず回転培養条件下で増殖可能な細胞を作出するため、無血清培地馴化細胞を一旦ビーズ培養用担体ＣｙｔｏｄｅｘＩ（ファルマシア・バイオテック社、カタログ番号１７０４４８０１、ビーズ濃度；乾燥重量１ｇ／ｍｌ）に付着させ、スピナーフラスコ（スピンナーフラスココンプリートＢＥＬＬＣＯ社、カタログ番号１９６５−００１００）内で、４０ｒｐｍの条件下で培養を開始した。その結果、培養開始後約２カ月でビーズ表面で進展増殖可能な細胞集団を得た。その後、ビーズから細胞をトリプシン等で消化分離することなく必要量のＶＰ−ＳＦＭ培地とＣｙｔｏｄｅｘＩを添加するだけで２５０ｍｌ、５００ｍｌ、１０００ｍｌのスピナーフラスコ（スピンナーフラスココンプリートＢＥＬＬＣＯ社、カタログ番号１９６５−００２５０、１９６５−００５００、１９６５−０１０００）まで培養規模を拡張可能な細胞株を得た。そこで、この細胞株を、ＣｙｔｏｄｅｘＩを添加せず担体無しの条件下でＶＰ−ＳＦＭ培地を用い、スピナーフラスコ（スピンナーフラスココンプリートＢＥＬＬＣＯ社、カタログ番号１９６５−００１００）内で培養を開始した。その結果、約１カ月後に担体無しの条件下で増殖可能な株が得られた。この新規な樹立株をＢ−７０２株と命名した。Ｂ−７０２株は、浮遊培地中において、殆どの細胞が単細胞の状態で浮遊するという特性を有する。本願出願人は、当該Ｂ−７０２株を産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９（１９９９年１２月２２日（原寄託日）に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１７６８２より移管（国際寄託への変更日：平成１３年２月９日））として寄託している。
次に、Ｂ−７０２株の増殖性について検討した。その結果、通常の株化細胞は拡張培養する際には細胞数として約３倍程度の拡張が至適とされているが、Ｂ−７０２は１×１０５個／ｍｌの細胞密度で培養を開始すると、約１週間で１×１０６個／ｍｌの細胞密度まで増殖可能、即ち１０倍の拡張が可能であることが判明した。更に、この１０倍拡張を実施し、１００ｍｌのスピナーフラスコから出発し最終的に１０００ｍｌのスピナーフラスコにおいて３×１０６個／ｍｌの細胞密度まで到達可能であった。
次に、このＢ−７０２株のウイルス産生能について調べた。１００ｍｌスピナーフラスコ内で１×１０６個／ｍｌの細胞密度に増殖させたＢ−７０２株へ、１９９８年冬から１９９９年春のシーズン用に用いられた３種のインフルエンザワクチン株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５［Ｈ１Ｎ１］，Ａ／Ｗｕｈａｎ／３５９／９５［Ｈ３Ｎ２］，Ｂ／Ｍｉｅ／１／９３）を各々Ｍ．Ｏ．Ｉ．が０．００１、０．００００３、０．０００２で接種した。培養には１％濃度のトリプシン（ギブコ社、カタログ番号２５２００−０７２）が添加されたＶＰ−ＳＦＭ培地を用いた。３４℃で３日間培養した結果、培養上清中にはいずれも１×１０８ＰＦＵのウイルスが増殖し、発育鶏卵や１０％牛胎児血清で培養したＭＤＣＫ細胞と同等のウイルスの増殖性を示した。このように、Ｂ−７０２株は牛胎児血清や細胞の担体を使用しなくてもウイルス産生が可能であることを見いだした。
更に、このＢ−７０２株は、ＤＮＡウイルスであるヒトヘルペスウイルス１型及び２型、ＲＮＡウイルスである麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス及び風疹ウイルスについてもウイルス産生能を有しており、ＭＤＣＫ細胞に馴化するウイルスであれば種類を特に限定されないことを確認した。
このようなウイルスとしては、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、フラビウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、アレナウイルス科、及びポックスウイルス科のようなあらゆるタイプの動物ウイルスが挙げられる。好ましいウイルスには、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、レオウイルス３型、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、アデノウイルス１型〜４７型、ポリオウイルス、ラッサウイルス及びワクシニアウイルスが含まれる。さらに好ましいウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ヒトヘルペスウイルス１型及び２型、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス及び風疹ウイルスが挙げられる。
このようにＢ−７０２株はウイルス産生用の細胞として広い有用性を有することが見いだされた。
本発明のＢ−７０２株に代表されるＭＤＣＫ細胞誘導株を用いて製造されたウイルスまたはウイルス抗原は、ワクチンの原料として使用することが可能である。
以下に実施例を示し、更に詳しく本発明について説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
実施例１
Ｂ−７０２株の増殖性を検討した。対照としてＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）を用いた。培地及び培養温度等の条件は以下の通りとした。
培地組成：ＶＰ−ＳＦＭ（ギブコ社、カタログ番号１１６８１−０２０）
添加物：Ｌ−グルタミン（ギブコ社、カタログ番号２５０３０−０８１）２％（
ｖ／ｖ）
ゲンタマイシン溶液（シグマ社、カタログ番号Ｇ−１３９７）０．１％
（ｖ／ｖ）
培養条件：３７℃、５％炭酸ガス、湿潤下
スピナーの回転数：４０ｒｐｍ
培養開始時の細胞密度：約１×１０５個／ｍｌ
継代拡張条件：細胞密度が約１×１０６個／ｍｌに到達時点でスピナーフラスコを１００ｍｌから、２５０ｍｌ、５００ｍｌ、１０００ｍｌへとスケールアップした。スケールアップ時の開始細胞密度は約１×１０５個／ｍｌに調製して行った。
その結果、図１に示すように、ＭＤＣＫ細胞を牛胎児血清を使用せず、かつ細胞の担体無しで培養した場合は、細胞数は全く増加せず、培養開始後３日目から生細胞数は急速に減少し始め、約６日で全て死滅した。一方、Ｂ−７０２株は順調な増加が認められ、培養規模、即ちスピナーフラスコの容積を拡大しスケールアップしても順調に生育した。
実施例２
Ｂ−７０２株を用いてウイルスの増殖を試みた。使用ウイルスは、１９９８年冬から１９９９年春のシーズン用に用いられた３種のインフルエンザワクチン株で、接種Ｍ．Ｏ．Ｉ．数は表１の通りである。
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培養条件は以下の通りである。
細胞密度：１×１０６個／ｍｌ
培養規模：１００ｍｌのスピナーフラスコ
培地：実施例１に準じるが、さらにトリプシン（ギブコ社、カタログ番号２５２００−０７２）を１％添加
スピナーの回転数：４０ｒｐｍ
培養温度等：３４℃、５％炭酸ガス、湿潤下
培養日数：３日
インフルエンザウイルスの培養において、培養温度は３７℃よりも３４℃の方がウイルスの増殖が良いことは一般的であり、現行のワクチン製造においても培養温度は３４℃で実施されているため、この試験においてもウイルスの培養は３４℃で実施した。また、株化細胞でのインフルエンザウイルスの培養においては、ウイルス感染に赤血球凝集素（ＨＡ）を開裂させるプロテアーゼが必要であることも周知の事実（米国特許第４５００５１３）で、今回もプロテアーゼとして培地中にトリプシンを添加した。ウイルスの力価測定は、インフルエンザウイルスの力価測定で実施されているプラークカウント法で実施した（第２版  微生物学実習提要、東京大学医科学研究所学友会編、丸善株式会社、ｐ．２０５〜２０６）。すなわち、６穴培養プレートに一般に使用されているＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−３４）を培養し、上記のウイルス培養上清を１００万倍希釈したものを接種した。接種後、この単層の細胞上へアガロースを重層し、炭酸ガス培養器内で４日間静置培養する。培養後、ホルマリンを添加して細胞を固定化した後にアガロース層を除去、トリパンブルー色素で細胞を染色し、ウイルスにより形成されたプラーク数を計測する。
３日の培養で全ての細胞が死滅し、培養上清を回収しウイルス力価を測定した。その結果、表２に示すようにワクチンウイルス３株いずれの培養上清もウイルス力価は１×１０８ＰＦＵ／ｍｌ以上であり、発育鶏卵でウイルスを増殖させた場合の尿膜腔液でのウイルス力価と同等のウイルス増殖能であることを示した。
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実施例３
ＭＤＣＫ細胞は本来多種のウイルスの増殖が可能な細胞である。Ｂ−７０２細胞もこの感受性を保持していることを確認するために、ＤＮＡウイルスとしてヒトヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、同２型（ＨＳＶ−２）の接種試験を行った。培養条件は実施例２に準ずるが、培地中へトリプシンは添加しなかった。また、培養期間は５日であった。接種条件は表３の如く行った。
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培養５日目には全ての細胞が死滅した。培養上清を回収し、ウイルス力価を測定した。ウイルス力価の測定は、アフリカミドリザル腎細胞由来のＶｅｒｏ細胞へ培養上清を１０００倍希釈し、形成されるプラークの数をカウントすることにより、ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）を算出した。その結果、表４に示したように、Ｂ−７０２株ではＤＮＡウイルスの増殖能も良いことが示された。
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実施例４
次に、ＭＤＣＫ細胞がインフルエンザウイルス以外のＲＮＡウイルスにも増殖能があることを確認するために、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルスについて接種試験をおこなった。培養条件は実施例３に準じた。また、培養期間は５日であった。培養条件は表５の如く行った。
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培養５日目には全ての細胞が死滅した。培養上清を回収し、ウイルス力価の測定を行った。ウイルス力価の測定はＶｅｒｏ細胞を２４穴培養プレートへ培養し、各ウイルスの培養上清を１０００倍、１万倍、１０万倍希釈して上記の培養プレートへ６穴ずつ接種し、炭酸ガス培養器の中に静置して培養した。２週間静置培養した後に、各希釈段階においてウイルスにより細胞が変成したもの、即ちＣＰＥが出現した穴の数を数え、ケルバー法により５０％感染価（ＴＣＩＤ５０）を算出した（第２版  微生物学実習提要、東京大学医科学研究所学友会編、丸善株式会社、ｐ．２０５〜２０６）。その結果、表６に示したように、Ｂ−７０２株はＲＮＡウイルスにおいても良い増殖能を示した。
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（発明の効果）
このように本発明のＢ−７０２株は、その増殖に牛胎児血清や細胞の担体を必要としないため、ワクチンをはじめとする種々の有用物質を、安価な培地で、安定的に、かつ安全に製造することを可能とするものである。特にインフルエンザワクチンの製造に当たっては、近年その発生が危惧される新型ウイルスの世界的な大流行（汎流行）が発生した際に、現在国内には緊急に必要量を確保可能な大規模な製造技術や設備はないことから、本発明のＢ−７０２株を用いたワクチン製造が極めて有効な手段となりうる。
【図面の簡単な説明】
図１はＢ−７０２株の増殖性を示した図である。
【図１】
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