(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式 (1)：
【化１】
0004733901.tif 000008
の化合物の製造方法であって、
a) 式 (2)：
【化２】
0004733901.tif 000009
の化合物を立体選択的に還元して、式 (3)：
【化３】
0004733901.tif 000010
の化合物を製造すること、及び
b) 式 R''-O-COR'の化合物及びリパーゼ又はヒドロラーゼ酵素の存在下、式 (3)の化合物をエステル化して、これにより式 (1)の化合物を形成すること；又は
c) 式 R''-O-COR'の化合物及びリパーゼ又はヒドロラーゼ酵素の存在下、式 (2)の化合物をエステル化して、これにより式 (4)：
【化４】
0004733901.tif 000011
の化合物を形成すること、及び
d) 式 (4)の化合物を立体選択的に還元して、式 (1)の化合物を製造すること、
のいずれかを含む製造方法
［上記式中、Xは置換された又は置換されていないヒドロカルビル連結基を表し、R及びR''は各々独立して置換された又は置換されていないヒドロカルビル基を表し、R'は置換された又は置換されていないヒドロカルビル、好ましくは置換された又は置換されていないアルキル基を表し、ここで、X、R、R''、R'に定義したヒドロカルビル連結基またはヒドロカルビル基の置換基は、ハロ、アルコキシ及びオキソから選択される］。
【請求項２】
Xは式 -CH2-の基を表す、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
R''はビニル又はイソプロペニル基を表す、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
R'は置換された又は置換されていないC1-6アルキル基を表す、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
R'はメチル基を表す、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
式(2)又は(4)の化合物がビアウベリア（Beauveria）、ピチア（Pichia）、カンジダ（Candida）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）若しくはトルラスポラ（Torulaspora）属又はこれらから抽出される酵素から選択される微生物の性質を有する有機体と接触することによって還元される請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
式(2)又は(4)の化合物がピチア・オングスタ（Pichia angusta）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・ギラーモンジイ（Candida guillermondii）、サッカロマイセス・カールスバーグエンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、ピチア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、クルイベロマイセス・ドロソプリアルム（Kluyveromyces drosopliarum）及びトルロスポラ・ハンセンニイ（Torulospora hansenii）又はこれらから抽出される酵素からなる群から選択される有機体と接触することによって還元される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
ホールセル（whole cell）が用いられる、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
式(2)又は(4)の化合物がpH4〜5で還元される、請求項６、７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
式(2)又は(3)の化合物が豚膵臓リパーゼ（Porcine pancreatic lipase）、カンジダ・シリンドラセア・リパーゼ（Candida cylindracea lipase）、シュードモナス・フルオレセンス・リパーゼ（Pseudomonas fluorescens lipase）、カンジダ・アンタクチカ・フラクションＢ（Candida antarctica fraction B）及びヒュミコラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa）からのリパーゼからなる群から選択される酵素の存在下、エステル化される、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
式 R''-O-COR'の化合物がビニルアセテートである、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
式 (5)：
【化５】
0004733901.tif 000012
の化合物の製造方法であって、
a) 請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法によって式 (1)の化合物を調製し;
b) 式 (1)の化合物と2,2-ジメトキシプロパンとを反応させてアセトニド（acetonide）を形成し;
c) R'-(C=O)-基を除去する;
ことを含む製造方法
［上記式中、Xは置換された又は置換されていないヒドロカルビル連結基を表し、Rは置換された又は置換されていないヒドロカルビル基を表し、R'は置換された又は置換されていないヒドロカルビル、好ましくは置換された又は置換されていないアルキル基を表し、ここで、X、R、R'に定義したヒドロカルビル連結基またはヒドロカルビル基の置換基は、ハロ、アルコキシ及びオキソから選択される］。
【請求項１３】
R'-(C=O)-が塩基性、アルコール性の溶液で処理されることにより除去される、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
式 (1) の化合物
【化６】
0004733901.tif 000013
［式中、R'はCH3であり、Rは置換された又は置換されていないヒドロカルビルであり、Xは-(CH2)n-であり、nは1〜4であり、ここで、Rに定義したヒドロカルビル基の置換基は、ハロ、アルコキシ及びオキソから選択される］。
【請求項１５】
Rはt-ブチルであり、Xは-CH2-である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
式 (1)：
【化７】
0004733901.tif 000014
の化合物の製造方法であって、式 R''-O-COR'の化合物及びリパーゼ又はヒドロラーゼ酵素の存在下、式 (3)：
【化８】
0004733901.tif 000015
の化合物をエステル化して、これにより式 (1)の化合物を形成することを含む製造方法［式中、Xは置換された又は置換されていないヒドロカルビル連結基を表し、R及びR''は各々独立して置換された又は置換されていないヒドロカルビル基を表し、R'は置換された又は置換されていないヒドロカルビル、好ましくは置換された又は置換されていないアルキル基を表し、ここで、X、R、R''、R'に定義したヒドロカルビル連結基またはヒドロカルビル基の置換基は、ハロ、アルコキシ及びオキソから選択される］。
【請求項１７】
式 (4)：
【化９】
0004733901.tif 000016
の化合物の製造方法であって、式 R''-O-COR'の化合物及びリパーゼ又はヒドロラーゼ酵素の存在下、式 (2)：
【化１０】
0004733901.tif 000017
の化合物をエステル化して、これにより式 (4)の化合物を形成することを含む製造方法［式中、Xは置換された又は置換されていないヒドロカルビル連結基を表し、R及びR''は各々独立して置換された又は置換されていないヒドロカルビル基を表し、R'は置換された又は置換されていないヒドロカルビル、好ましくは置換された又は置換されていないアルキル基を表し、ここで、X、R、R''、R'に定義したヒドロカルビル連結基またはヒドロカルビル基の置換基は、ハロ、アルコキシ及びオキソから選択される］。
【請求項１８】
R'はCH3であり、Rはt-ブチルであり、Xは-CH2-である、請求項１６又は１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
R''はビニル又はイソプロペニル基である、請求項１６、１７又は１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
酵素が豚膵臓リパーゼ（Porcine pancreatic lipase）、カンジダ・シリンドラセア・リパーゼ（Candida cylindracea lipase）、シュードモナス・フルオレセンス・リパーゼ（Pseudomonas fluorescens lipase）、カンジダ・アンタクチカ・フラクションＢ（Candida antarctica fraction B）及びヒュミコラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa）からのリパーゼからなる群から選択される、請求項１６〜１９のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ジヒドロキシエステル及びその誘導体の立体選択的な製造方法に関する。
【０００２】
本発明の第一の面によれば、式 (1)：
【０００３】
【化１１】
0004733901.tif 000002
【０００４】
の化合物の製造方法であって、
a) 式 (2)：
【０００５】
【化１２】
0004733901.tif 000003
【０００６】
の化合物を立体選択的に還元して、式 (3)：
【０００７】
【化１３】
0004733901.tif 000004
【０００８】
の化合物を製造すること、及び
b) 式 R''-O-COR'の化合物及びリパーゼ又はヒドロラーゼ酵素の存在下、式 (3)の化合物をエステル化して、これにより式 (1)の化合物を形成すること；又は  c) 式 R''-O-COR'の化合物及びリパーゼ又はヒドロラーゼ酵素の存在下、式 (2)の化合物をエステル化して、これにより式 (4)：
【０００９】
【化１４】
0004733901.tif 000005
【００１０】
の化合物を形成すること、及び
d) 式 (4)の化合物を立体選択的に還元して、式 (1)の化合物を製造すること、
のいずれかを含む製造方法が提供される［上記式中、Xは任意に置換されたヒドロカルビル連結基を表し、R及びR''は各々独立して任意に置換されたヒドロカルビル基を表し、R'は任意に置換されたヒドロカルビル、好ましくは任意に置換されたアルキル基を表する］。
【００１１】
X、R、R'又はR''により表されるヒドロカルビル基は、１以上の置換基で置換されていてもよく、過-置換（例えばパーハロゲン化）されていてもよい。置換基の例は、ハロ（特にフルオロ及びクロロ）、アルコキシ（例えば、C1-4アルコキシ）、及びオキソを含む。
【００１２】
好ましくは、Xは式 -(CH2)n- の基（ここで、nは1〜4である）であり、最も好ましくは、Xは式 -CH2- の基である。
R''はアルキル基（例えばC1-6アルキル基）、又はアルキルカルボニル基（例えば、CH3(C=O)- 又はCF3(C=O)- 基などのC1-6アルキルカルボニル基）でもよい。R''は最も好ましくはビニル又はイソプロペニル基である。
【００１３】
Rは好ましくはC1-6アルキル基を表し、これは線状又は分枝状でもよく、１以上の 置換基で置換されていてもよい。最も好ましくは、Rはt-ブチル基を表する。
【００１４】
R'は置換されたアルキル、しばしばC1-6アルキル基、例えばCF3-又はCF3CH2-基、を表してもよいが、好ましくは置換されていないC1-6アルキル基、最も特別にはメチル基である。
【００１５】
式(2)又は(4)の化合物の立体選択的還元は、好ましくは化学的又は微生物的な還元法、例えば、水素添加、転移水素添加、金属ヒドリド還元又はデヒドロゲナーゼなど、を用いる。例えばHelv. Chim. Acta 69, 803, 1986(レファレンスによって本明細書に組み込まれる)に記載されているような、好適な水素添加プロセスの例は、1〜10 barで、溶媒（例えば、メタノール、エタノール、t-ブタノール、ジメチルホルムアミド、t-ブチルメチルエーテル、トルエン又はヘキサン）中で、分子性水素を使用した、0.01〜10% (w/w)の触媒、例えば、不均一支持体（例えば、炭素、アルミナ、シリカなど）上の白金、パラジウム又はロジウムの使用を含む。代わりになるものとして、均一水素添加触媒、例えばEP0583171(レファレンスによって本明細書に組み込まれる)に記載されているようなもの、を使用してもよい。
【００１６】
好適な化学的転移水素添加プロセスの例は、Zassinovich, Mestroni 及び Gladialiの Chem. Rev. 1992, 92, 1051(レファレンスによって本明細書に組み込まれる) 又は Fuji らによるJ. Am. Chem. Soc. 118, 2521, 1996(レファレンスによって本明細書に組み込まれる)に記載されているものを含む。より好ましい化学的転移水素添加プロセスは、例えば、ルテニウム又はロジウムなどの遷移金属のキラルリゲート錯体（Chiral ligated complexes）、特にキラルジアミン−リゲート中性芳香族ルテニウム錯体を用いる。好ましくは、そのような化学的転移水素添加は、酸、特にホルメート塩（formate salt）、例えばトリエチルアンモニウムホルメートを水素源として用いる。
【００１７】
金属ヒドリド試薬は、例えば、Tet.1993, 1997, Tet. Asymm. 1990, 1, 307, (リファレンスによって本明細書に組み込まれる)、又は J. Am. Chem. Soc. 1998, 110, 3560 (リファレンスによって本明細書に組み込まれる) に記載されているようなものが使用できる。
【００１８】
好適な微生物的還元の例は、式(2)又は(4)の化合物を、ビアウベリア（Beauveria）好ましくはビアウベリア・バシアナ（Beauveria bassiana）、ピチア（Pichia）好ましくはピチア・オングスタ（Pichia angusta）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）、トレハロフィラ（trehalophila）、ハプロピラ（haplophila）又はメンブランファシエンス（membranefaciens）、カンジダ（Candida）好ましくはカンジダ・ヒュミコラ（Candida humicola）、ソラニ（solani）、ギラーモンデイ（guillermondii）、ジデンシアエ（diddenssiae）又はフリエドリチイ（friedrichii）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）好ましくはクルイベロマイセス・ドロソフィラルム（Kluyveromyces drosophilarum）、又はトルラスポラ（Torulaspora）好ましくはトルラスポラ・ハンセニイ（Torulaspora hansenii）から選択される微生物の性質を有する有機体と接触させることを含む。この還元は、式(2)又は(4)の化合物を、上記微生物から抽出される酵素と接触させることによって達成されてもよい。最も好ましくは、式(2)又は(4)の化合物は、ピチア・オングスタ（Pichia angusta）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・ギラーモンデイ（Candida guillermondii）、サッカロマイセス・カールスバーグエンシス（Saccharomyces carisbergensis）、ピチア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、クルイベロマイセス・ドロソプリアルム（Kluyveromyces drosopliarum）及びトルロスポラ・ハンセニイ（Torulospora hansenii）から選択される微生物又は上記有機体からの抽出物と接触させる。
【００１９】
本発明は、好ましくは、上述した微生物、好ましくはピチア・オングスタ（Pichia angusta）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・ギラーモンデイ（Candida guillermondii）、サッカロマイセス・カールスバーグエンシス（Saccharomyces carisbergensis）、ピチア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、クルイベロマイセス・ドロソプリアルム（Kluyveromyces drosopliarum）及びトルロスポラ・ハンセニイ（Torulospora hansenii）のホールセル又はからの抽出物を使用して、式(2)の化合物を選択的に還元することによって式 (3)の化合物を製造することを含む。
【００２０】
本発明は、最も好ましくは、有機体のホールセルを使用して行う。これは、望ましい酵素を分離する必要性を回避し、反応に対する補助因子（co-factors）を与える。
【００２１】
上記の種のいずれを使用してもよいが、多くの態様において、ピチア・オングスタ（Pichia angusta）の酵素又はホールセルの使用によって高い転化及び高い選択性を達成できることがわかっている。
【００２２】
一般に、補助因子、通常、NAD(P)H(ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド又はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・ホスフェート)、及びその補助因子を再生するためのシステム、例えば、グルコース及びグルコース・デヒドロゲナーゼは、その反応を進行させるために酵素とともに使用される。好適な補助因子及び還元機構がホールセルに存在するとき、好適な炭素源を含む栄養素培地中でホールセルを使用することが好ましい。好適な炭素源は、次の：シュガー、例えば、マルトース、スクロース又は好ましくはグルコース、ポリオール、例えば、グリセロール又はソルビトール、クエン酸、又は低級アルコール、例えば、メタノール又はエタノール、の１以上を含んでもよい。
【００２３】
ホールセルがその反応の間成長しようとする場合、窒素及びリン源及び微量元素は、その培地中に存在するべきである。これらは、通常、その有機体の培養に使用されるものでよい。
【００２４】
プロセスは、式(2)又は(4)の化合物を、成長を支持することができる培地中の成長している有機体の培養物に又は成長に必要な１以上の栄養を欠くが炭素源を好ましくは含む培地中の生きているセルのサスペンジョンに、加えることにより行ってもよい。必要な酵素及び補助因子が存在する場合、死んだセルも使用してよい。必要ならば、それらは死んだセルに加えてもよい。
【００２５】
所望により、セルは、好ましくは前記したような好適な炭素源の存在下、式(2)又は(4)の化合物と接触させる支持体上に固定してもよい。
pHは、好適には3.5〜9、例えば、4〜9、好ましくは6.5以下、及びより好ましくは5.5以下である。非常に好適には、4〜5のpHが使用される。プロセスは、好適には、10〜50℃、好ましくは20〜40℃、より好ましくは25〜35℃の温度で行われる。前述した有機体の生きたホールセルが存在する場合、好気性条件下で操作することが好ましい。標準の温度及び圧力で、培養培地の体積あたり、毎分、測定される、エアーの0.01〜1.0体積に等しいエアレーション速度は、前述したｐH及び温度の条件で好適に採用されるが、多くの変形が可能であることが理解されるだろう。これはプロセスから分離して行われる場合、同様なｐH、温度及びエアレーション条件は、有機体が成長する間使用してもよい。
【００２６】
精製された酵素は、公知の手段、好適には、破壊されたセルのサスペンジョンを遠心分離し、残骸から澄んだ溶液を分離し、この溶液から所望の酵素を分離することによって、例えば、イオン強度を増大させる液体でのカラムからの溶出を好適には伴うイオン交換クロマトグラフィーにより及び／又はイオン性材料（例えばアンモニウムスルフェート）の添加により選択的に析出させることによって、単離してもよい。そのような操作は、純度を高めることが望まれる場合、繰り返されてもよい。
【００２７】
式(2)又は(4)の化合物の微生物的還元は特に好ましく、このプロセスは、本発明の第二の面を形成する。
式(2)又は(3)の化合物のエステル化において、別のエステルとエステル交換することが好ましい。この別のエステルは、アルコールに関して少なくともモル当量において存在し、好適にはビニルエステル(副生成物として、バックリアクションにおけるアセトアルデヒドは含まれない)である。代わりになるものとして、無水物、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸など、又はエステル、例えば、 エチルアセテート、フッ素化エステル 例えば、トリフルオロエチルアセテートを使用してもよい。レジオ特異的エステル化反応は、1%(w/w)未満の水を含む有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エチルアセテート、テトラヒドロフラン、tert-ブチルメチルエーテル、トルエン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノンなど、において、好ましくは20〜75℃、より好ましくは25〜50℃の温度で行われることが好ましい。エステルは、好ましくは、2〜8の炭素原子を有する低級アルカノイック酸のエステル、又はその置換された誘導体である。任意に、不活性雰囲気が採用されてもよい。例えば、窒素流がその溶液を通されてもよい。
【００２８】
酵素は、酵素として、又はそれらを含むホールセルとして提供されてもよい。それらは、生成物からのそれらの分離を容易とするために、所望により再使用するために、固定されていることが好ましい。
【００２９】
好ましい酵素は、例えば、豚膵臓リパーゼ（Porcine pancreatic lipase）、カンジダ・シリンドラセア・リパーゼ（Candida cylindracea lipase）、シュードモナス・フルオレセンス・リパーゼ（Pseudomonas fluorescens lipase）などのリパーゼ類、例えばChirazyme L2の商標下で入手できるようなカンジダ・アンタクチカ・フラクションＢ（Candida antarctica fraction B）、例えばLipolaseの商標下で販売されるヒュミコラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa）からのもの、又は、例えばSAM IIの商標下で販売されるシュードモナス（Pseudomonas）からのもの、及びより好ましくは例えばChirazymeの商標下で販売されるカンジダ・アンタクチカ（Candida antarctica）からのものを含む。
【００３０】
式(1)の化合物（ここで、R'はCH3、Rは任意に置換されたヒドロカルビル、Xは-(CH2)n-及びnは1〜4である）は、本発明の第三の面を形成する。好ましくはRはt-ブチル及び最も好ましくはXは-CH2-である。
【００３１】
式(1)の化合物は、医薬化合物の調製のための有用な中間体である。一般に、それらは、1,3-ジヒドロキシ部分、例えば2,2-ジメトキシプロパンのための保護基と反応させられて、Synthesis 1998, 1713に記載されているようなアセトニドを形成する。基 R'-(C=O)- は、US 5,278,313に記載されているような弱塩基性アルコール性溶液、例えばK2CO3溶液、又は水溶液中又は加水分解を支持するのに十分な水を含む有機溶液中のいずれかにおけるリパーゼで処理されることによってその後選択的に除去されて、式(5)：
【００３２】
【化１５】
0004733901.tif 000006
【００３３】
の化合物を形成する。
式(5)の化合物の調製のためのこのプロセスは、本発明の第四の面を形成する。
【００３４】
実施例 1
(3R,5S) t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエートの調製
攪拌されている250mlの丸底フラスコに、20mlのアセトニトリル、0.405g(0.662mmol)のジ-mu-クロロビス[(p-シメン)クロロルテニウム(II)]、及び0.492g(1.34mmol) (1S,2S)-(+)-N-(4-トルエンスルホニル)-1,2-ジフェニルエチレンジアミンを仕込んだ。この溶液は、窒素で散布しその後、小流（trickle）を維持することによって酸素を除去した。15mlのアセトニトリル中26g(0.119mol)の光学的に純粋な(5S) t-ブチル 3-ケト-5,6-ジヒドロキシヘキサノエートの酸素を除去された溶液が反応容器に仕込まれ、そしてこの溶液は、周囲温度で20分間攪拌された。蒸留されたギ酸及びトリエチルアミンの65mlの5:2 (mol/mol) 混合物がその後10分間にわたり加えられ、そして反応混合物は周囲温度で48時間攪拌された。この溶液に、80mlのジクロロメタン及び120mlの飽和炭酸水素ナトリウムをゆっくりと加えた。70gのアンモニウムクロライドが、分離した水層及び有機層に仕込まれた。この水層は、90mlのエチルアセテートでもう３回洗浄された。有機フラクションが組み合わされ、硫酸ナトリウムで乾燥され、溶媒が除去されて、主に(3R,5S) t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエートを含む21.1gの粗油状物を与えた。ジアステレオマーの比は、13CNMRによって5.2: 1 (3R:5S): (3S:5S)であると決定された。材料は、次の反応において粗製のまま使用されたが、カラムクロマトグラフィーによって精製できた。
【００３５】
(3R,5S) t-ブチル-6-アセトキシ-3,5-ジヒドロキシヘキサノエートの調製
攪拌された1リットルの丸底フラスコに、700mlのテトラヒドロフラン及び70.7g(0.32mol)の(3R,5S) t-ブチル-3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエート、41 ml(0.46mol)のビニルアセテート及び6.3gの支持されたリパーゼ Chirazyme L2（商標）が仕込まれた。周囲温度で3時間攪拌した後、このリパーゼはスクリーニングによって除去され、揮発性物質は減圧蒸留により除去された。粗油状物の質量は78.7gであり、その主要成分は(3R,5S) t-ブチル-6-アセトキシ-3,5-ジヒドロキシヘキサノエートであることが決定された。この材料は、次の段階に直接に使用された。
【００３６】
(4R,6S)-6-[(アセチルオキシ)メチル]-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-4-酢酸, 1,1-ジメチルエチルエステルの調製
攪拌された1リットル丸底フラスコに、78.7gの(3R,5S) t-ブチル-6-アセトキシ-3,5-ジヒドロキシヘキサノエート、800mlの2,2-ジメトキシプロパン及び5.7gのp-トルエンスルホン酸を仕込んだ。35分後、３つの反応物をその半分の体積に濃縮し、300mlのジクロロメタン及び300mlの1M 炭酸水素ナトリウムを加えた。有機層を分離し、水層を150mlのエチルアセテートでもう３回洗浄した。有機フラクションを組合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、揮発性物質を減圧蒸留によって除去した。92gの粗油状物が得られた。これは、最初にフラッシュシリカのショートカラムを通してヘキサンで溶出し、その後、ヘキサン:エチルアセテート 85:15 (v/v)で溶出し、その後、ヘキサンから３回その材料を結晶化させることによって精製して、22.17gの(4R,6S)-6-[(アセチルオキシ)メチル]-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-4-酢酸, 1,1-ジメチルエチルエステルを与えた（この材料は、キラルGCにより99.9%deであると決定された）。
【００３７】
(4R,6S)-6-(ヒドロキシメチル]-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-4-酢酸, 1,1-ジメチルエチルエステル
500mlの攪拌された丸底フラスコに、22.17gの(4R,6S)-6-[(アセチルオキシ)メチル]-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-4-酢酸, 1,1-ジメチルエチルエステル、250mlのメタノール及び5.05gの粉砕された炭酸カリウムを仕込んだ。この反応物は、加水分解が完了するまで、35分間攪拌された。その後、炭酸カリウムはスクリーニングによって除去された。反応物は濃縮され、150mlの5%(w/w)ブライン及び150mlのトルエンが加えられた。有機層が分離され、水層は250mlのトルエンでもう２回洗浄した。有機層を組み合わせて、15%(w/w)ブラインで３回洗浄し、溶媒を減圧蒸留で除去して、17.78gの澄んだ油状物を与えた。これは、>99%の(4R,6S)-6-(ヒドロキシメチル]-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-4-酢酸, 1,1-ジメチルエチルエステルであると決定された。
【００３８】
実施例 2
(5S) tert-ブチル 6-アセトキシ-5-ヒドロキシ-3-ケトヘキサノエートの調製
攪拌された250mlの丸底フラスコに、2.32g(0.0106mol)の(5S)tert-ブチル 5,6-ジヒドロキシ-3-ケトヘキサノエート、40mlのテトラヒドロフラン、0.98ml(0.0106 mol)のビニルアセテート及び0.22gの支持されたリパーゼ Chirazyme L2（商標）を仕込んだ。20分後、このリパーゼはスクリーニングによって除去され、揮発性物質は減圧蒸留によって除去されて、2.96gの粗油状物を与えた。これは、NMRによって(5S)tert-ブチル 6-アセトキシ-5-ヒドロキシ-3-ケトヘキサノエートとしてキャラクタライズされた。
【００３９】
実施例 3
(3R,5S) t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエートの調製
ピチア・オングスタ（Pichia angusta）NCYC R230 (ブダペスト条約の規定の下で１９９５年５月１８日に寄託された）は、Braun Biostat Q マルチ発酵槽システムにおいて、次の培地(リットルあたり):グルコース 40g; MgSO4 1.2g; K2SO4 0.21g; KH2PO4 0.69g; H3PO4 (濃縮されたもの) 1 ml; イースト抽出物(オキソイド) 2g; FeSO4.7H2O, 0.05g; アンチフォーム（antifoam）(EEA 142 Foammaster), 微量元素溶液 1ml (この溶液は、リットルあたりCuSO4.5H2O, 0.02 g; MnSO4.4H2O, 0.1g; ZnSO4.7H2O, 0.1g; CaCO3, 1.8g含んでいた）中で成長した。
【００４０】
４つの発酵槽の各々に250 mlの培地を仕込み、オートクレーブによって殺菌した。pHは7 molarのアンモニウムヒドロキシド溶液を使用して4.5に調整され、温度は28℃に設定され、エアーフローは300ml/分に設定され、攪拌機の速度は1200 rpmに設定された。発酵槽に、グルコース濃度が20g/リットルだったことを除いて上記と同様にした培地を含む寒天プレート(2% 寒天)から採取したセルを植え付けた。これら発酵槽において22 時間成長した後、バイオ還元反応が (5S) t-ブチル 3-ケト-5,6-ジヒドロキシヘキサノエートの添加によって開始された。これら発酵槽のうちの２つには3.75mlを各々仕込み、他の２つには5mlを各々仕込んだ。
【００４１】
反応は、基質の100% 転化まで、さらに78時間続けられた。この間、培養物は、1〜3グラム グルコース／リットル 培養物／時間の割合で、グルコースの50%溶液を供給されて、セルの生存力が維持され還元力の源が供給された。反応は、遠心分離によってセルが除去されることによって終了した。回収されたセルフリーな上清に、20%w/vの最終濃度に塩化ナトリウムを加え、混合物を等しい体積のアセトニトリルで３回抽出した。プールしたアセトニトリル抽出物は無水硫酸ナトリウムで乾燥し、この溶媒はロータリーエバポレーターにおいて減圧下で除去されて(水浴温度 45℃)、粘性の薄黄色の油状物を得た。各々の反応の生成物の同定は、(3R,5S) t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエートとして確認され、各々のサンプルのジアステレオマー過剰率は以下の表に示す。
【００４２】
0004733901.tif 000007
実施例 4
(3R,5S) t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエートの調製
ピチア・オングスタ（Pichia angusta）NCYC R320 (ブダペスト条約の規定の下で１９９５年５月１８日に寄託された）は、Braun Biostat Q マルチ発酵槽システムにおいて、次の培地(リットルあたり含む):グルコース 20g;硫酸アンモニウム 10g; イースト抽出物(オキソイド) 2g; MgSO4.7H2O, 1.2g; KH2PO4 0.69g; K2SO4 0.21g; FeSO4.7H2O, 0.05g; H3PO4 (濃縮されたもの) 1 ml; EEA 142 "Foammaster" アンチフォーム（antifoam）0.5ml; 微量元素溶液 1ml (この溶液は、リットルあたりCa(CH3CO2)2, 2.85g; ZnSO4.7H2O, 0.1g; MnSO4.H2O, 0.075g; CuSO4.5H2O, 0.02g;硫酸（濃縮されたもの）1 mlを含んでいた）中で成長した。
【００４３】
１つの発酵槽に250 mlの培地を仕込み、オートクレーブで殺菌した。pHは、2 molar の水酸化ナトリウムを使用して、5.0に調整した。温度は28℃に設定し、エアーフローは250 ml/分に設定し、攪拌機の速度は1200 rpmに設定した。この発酵槽に、ピチア・オングスタ（Pichia angusta） NCYC R320の寒天プレートから調製した無菌脱イオン水中のセルのサスペンジョンの2.5mlを植え付けた。17 時間の成長後、バイオ還元が6.36gの5(S) t-ブチル 3-ケト-5,6-ジヒドロキシヘキサノエートを水溶液として添加することによって始められた。同時に、この発酵槽へのグルコース供給が2gグルコース L-1 h-1の割合で開始された。
【００４４】
反応は、基質の96%転化が達成された時点で更に78時間続けられた。原料及び生成物は、HPLC (Hichrom S5 CN-250A カラム, 温度 35℃, 移動相: 水性TFA (0.1%)：アセトニトリル 95:5, フローレート 1 ml/分, 注入体積 5 ml, 屈折率検出器)によって検出された。
【００４５】
反応は、4000 x g、20分間の遠心分離によってセルを除去することによって終了された。回収されたセルフリーな上清のpHは、2M NaOHを使用して、7.5に調整された。MgSO4.1.6H2O (15 % w/v 無水物基準)をこのセルフリーな上清に溶解し、得られた溶液を等しい体積の2-ペンタノンで２回抽出した。溶媒相を集めて、溶媒をロータリーエバポレーター中45℃で減圧下除去して、オレンジ色の粘性の油状物を得た。これは、50 mlの乾燥、蒸留2-ペンタノンに再溶解され、再び、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去して、t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエートを与えた(5.08 g, 80% 単離収率)。ジアステレオマー過剰率は次のように決定された。t-ブチル 3,5,6-トリヒドロキシヘキサノエート(30 mg)のサンプルを過剰量の無水トリフルオロ酢酸中、室温で、少なくとも10分間反応させることにより誘導体化し、過剰の無水物を乾燥窒素の流れの下で除去し、残留油状物をジクロロメタン(1 ml)で希釈した。サンプルは、Chiralcel Dex CB カラム (25 メートル)を用いて140℃(等温)の温度で分析した。ジアステレオマーが、14.4 分(3R,5S ジアステレオマー)及び15.7 分(3S,5S ジアステレオマー)で溶出した。サンプルのジアステレオマー過剰率は、この方法により、99.7%であることがわかった。