(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（２）のいずれかに記載のタンパク質を含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
（１）配列番号：２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号：２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを保持したベクターを含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
（ａ）配列番号：１記載の塩基配列を有するDNA
（ｂ）配列番号：１記載の塩基配列と高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質をコードする、DNA
（ｃ）配列番号：１記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、アディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質をコードする、DNA
【請求項３】
請求項１または２に記載のアディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、代謝性疾患または心疾患の予防・治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアディポネクチン発現誘導剤に関して、特にKLF9を介してアディポネクチンの発現を誘導し得る薬剤およびこれを応用した代謝性疾患または心疾患の予防・治療用医薬品に関する。さらには、本発明はアディポネクチンの発現を誘導し得る物質およびこれを応用した代謝性疾患または心疾患の予防・治療用薬剤のスクリーニング方法およびこれに用いる細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満症は、脂肪組織の量の増加として定義され、糖尿病、高脂質血症及び冠動脈心疾患のような心血管性及び代謝性障害を発症する危険性が高い（非特許文献１、２）。しかし、肥満症とこれら疾患との関連性を説明し得る分子機構は解明されていない。脂肪組織自体は、変化するエネルギー要求に応じて、トリグリセリド（ＴＧ）貯蔵及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）／グリセロール放出を行う組織として機能する（非特許文献１）。また脂肪組織は、ＦＦＡ（非特許文献３）、アジプシン（非特許文献４）、腫瘍壊死因子α（非特許文献５）、レプチン（非特許文献６）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（非特許文献７）及びレジスチン（非特許文献８）などの「アディポカイン」と呼ばれる数多くの生物学的活性物質を分泌する重要な内分泌器官でもあり、様々な種類のエネルギー恒常性調節を行っている。【０００３】
アディポネクチン又はＡｃｒｐ３０（非特許文献９−１２）は、複数の生物学的機能を有する脂肪組織由来のホルモンである。肥満症、インスリン抵抗性及び２型糖尿病では、血漿アディポネクチンレベルが低下する（非特許文献１３）。アディポネクチンの投与は、血中グルコース濃度を低下させ、インスリン抵抗性が改善されることをマウスを用いた実験から確認されている（非特許文献１４−１６）。逆にマウスでアディポネクチンを欠損させると、インスリン抵抗性及び糖尿病の病態が表れることも報告されている（非特許文献１７、１８）。【０００４】
アディポネクチンによるインスリン感受性誘導活性は、ＰＰＡＲα活性化を通じ（非特許文献１９、２０）、また急性的にはＡＭＰキナーゼを通じて（非特許文献２１、２２）、脂肪酸酸化の増大により誘導されると予想されている。内皮細胞（Human aortic endothelial cells: ＨＡＥＣ）及びマクロファージでは、抗炎症効果のような抗アテローム特性を有する可能性がある（非特許文献２３、２４）。アポＥ欠損マウスにおいてアディポネクチンを高発現させると、炎症に関与する分子の発現が低下し、これに付随してアテローム性動脈硬化症の改善が示された（非特許文献１９、２５）。アディポネクチン欠損マウスでは、新たな脈管内膜の形成増大が見られた（非特許文献１７、２６）。【０００５】
最近、アディポネクチンレセプター（ＡｄｉｐｏＲ）１、２をコードしているｃＤＮＡがクローニングされたことが報告されている（非特許文献２７、特許文献１）。ＡｄｉｐｏＲ１は、骨格筋で豊富に発現されるのに対して、ＡｄｉｐｏＲ２は、主として肝臓で発現される。ＡｄｉｐｏＲ１及びＲ２は、７個所の貫膜通ドメインを含むが（非特許文献２７）、Ｇタンパク質結合レセプターとは構造的にも機能的にも区別できる（非特許文献２８−３０）と予測されている。ＡｄｉｐｏＲ１及びＲ２は、球状（globular）及び全長アディポネクチンに対するレセプターとして働き、ＡＭＰＫ（非特許文献２１、２２）、ＰＰＡＲαリガンド活性化（非特許文献１９、２０）及びアディポネクチンによる脂肪酸酸化やグルコース摂取（非特許文献２７）の増大を誘導する。
【特許文献１】WO2004/061108
【非特許文献１】Spiegelman, B.M. & Flier, J.S., Cell 87, 377-389 (1996).
【非特許文献２】Friedman, J.M., Nature 404, 632-634 (2000).
【非特許文献３】White, R.T. et al., J. Biol. Chem. 267, 9210-9213 (1992).
【非特許文献４】Hotamisligil, G.S. et.al., Science 259, 87-91, (1993).
【非特許文献５】Zhang, Y. et al., Nature 372, 425-432, (1994).
【非特許文献６】Shulman, G.I., J. Clin. Invest. 106, 171-176 (2000).
【非特許文献７】Shimomura, I. et al., Nat. Med. 2, 800-803 (1996).
【非特許文献８】Steppan, C.M. et al., Nature 409, 307-312 (2001).
【非特許文献９】Scherer, P.E. et al., J. Biol. Chem. 270, 26746-26749 (1995).
【非特許文献１０】Hu, E., Liang, P. & Spiegelman, B.M., J. Biol. Chem. 271, 10697-10703 (1996).
【非特許文献１１】Maeda, K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-296 (1996).
【非特許文献１２】Nakano, Y., et al., J. Biochem. (Tokyo) 120, 802-812 (1996).
【非特許文献１３】Hotta, K. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20, 1595-1599, 2000.
【非特許文献１４】Fruebis, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 2005-2010 (2001).
【非特許文献１５】Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 7, 941-946 (2001).
【非特許文献１６】Berg, A.H. et al., Nat. Med. 7, 947-953 (2001).
【非特許文献１７】Kubota, N. et al., J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002).
【非特許文献１８】Maeda, N. et al., Nat. Med. 8,731-737 (2002).
【非特許文献１９】Kersten, S. et al., Nature 405, 421-424 (2000).
【非特許文献２０】Yamauchi, T. et al., J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003).
【非特許文献２１】Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 8, 1288-1295 (2002).
【非特許文献２２】Tomas, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16309-16313 (2002).
【非特許文献２３】Ouchi, N. et al., Circulation 103, 1057-1063 (2001).
【非特許文献２４】Yokota, T. et al., Blood 96, 1723-1732 (2000).
【非特許文献２５】Okamoto, Y. et al., Circulation 106, 2767-2770 (2002).
【非特許文献２６】Matsuda, M. et al., J. Biol. Chem. 277, 37487-37491 (2002).
【非特許文献２７】Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).
【非特許文献２８】Wess, J., FASEB. J. 11, 346-354 (1997).
【非特許文献２９】Yokomizo, T. et al., Nature 387, 620-624 (1997).
【非特許文献３０】Scheer, A. et al., EMBO. J. 15, 3566-3578 (1996).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肥満症で見られるアディポネクチン産生の低下は、インスリン抵抗性、糖尿病、心血管疾患のような肥満症関連疾患の発症を決定付ける要因となると考えられている。しかし、その根底にある分子的決定因子は、未だに解明されていない。そこで、本発明は、第一に、脂肪細胞肥大に依存したアディポネクチン産生抑制の作用機作を解明すること、第二に、アディポネクチン遺伝子の発現を上昇させ得る因子を解明すること、第三にアディポネクチン発現誘導剤およびこれを用いた肥満症およびこれに関連する疾患、例えば、心血管疾患または代謝性疾患の治療薬を提供すること、第四に、アディポネクチン発現誘導剤の探索方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の通り、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０は脂肪細胞より分泌されるホルモンであり、抗糖尿病性及び抗アテローム性アディポカインとして作用する。アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０の転写は、肥満症の脂肪組織で低下し、この低下は肥満症におけるインスリン抵抗性への発展に関与する。本発明者らは、アディポネクチン遺伝子の転写制御を担うメカニズム解明のために、アディポネクチン遺伝子のプロモータ領域の位置を特定するための肥大脂肪細胞モデルを作成した。このモデル細胞を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として備えたプロモータの−１３６７塩基対（bp）から＋３５bpまでを含む領域のプロモータ活性を調べた。アディポネクチンプロモータの僅か１５６bpを含むプラスミドを導入した脂肪細胞で高レベルのルシフェラーゼ活性が検出された。一方、肥大脂肪細胞では、アディポネクチン遺伝子の上流調節領域の２１７bpを備えたリポーター遺伝子のみ発現の抑制が示された。【０００８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）では、アディポネクチン遺伝子の転写開始点から−１８８位から−１５７位までの３２bpフラグメントが、脂肪細胞および脂肪組織との双方からそれぞれ調製した核抽出物中のタンパク質と結合することが示された。大型脂肪細胞に比して小型脂肪細胞において、又は肥満したマウスに比して痩せたマウスの脂肪組織において、これら細胞または組織より調製された核抽出物に、３２bpエレメントの電気泳動度を遅延させる物質が多く存在していた。酵母one-hybridスクリーニング法を用いて、上記３２bpフラグメントに結合する核内因子を特定した。one-hybridスクリーニングで得られた６個の陽性因子をさらにＥＭＳＡ及び染色質免疫沈降アッセイにより解析し、クルッペル（Kruppel）様因子９（以下、「ＫＬＦ９」と略す）を同定した。このKLF９は上記エレメントに結合し、その結合量は、in vitro及びin vivoでのＫＬＦ９の発現レベルと相関していた。加えて、コトランスフェクション実験から、ＫＬＦ９の一過的な過剰発現によりアディポネクチンプロモータ活性を用量依存的かつ特異的に増強させることが示された。in vitroでのｓｉＲＮＡによるＫＬＦ９発現抑制並びにＫＬＦ９過剰発現及びin vivoでのＫＬＦ９ノックアウトによって、内在性アディポネクチンｍＲＮＡが変化するという結果が得られた。このことよりＫＬＦ９によりアディポネクチンの転写調節が行われていることを確認した。これら結果は、大型化した肥大脂肪細胞にKLF９を補足することにより、肥満症またはこれに関連する疾患、例えば、インスリン抵抗性及び２型糖尿病などの代謝性疾患や心血管疾患の予防・治療薬となり得ることを示唆する。さらに、KLF９が上記疾患に対する創薬のターゲットとして重要であることを示す。本発明はこれら知見に基づくものであり、具体的には以下に示す通りである。
【０００９】
１．下記（１）または（２）記載のタンパク質を含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
（１）配列番号：２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号：２記載のアミノ酸配列において、一以上のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
２．下記（１）または（２）記載のDNAまたは該DNAを保持したベクターを含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
（ａ）配列番号：１記載の塩基配列を有するDNA
（ｂ）配列番号：１記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA。
３．上記１または２に記載のアディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、代謝性疾患または心疾患の予防・治療用医薬組成物。
４．下記（１）または（２）からなるエンハンサーエレメントを少なくとも備えたレポーター遺伝子を保持した、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング用細胞。
（１）配列番号：５記載の塩基配列からなるDNA
（２）配列番号：５記載の塩基配列において、1塩基以上の欠失、付加、置換または挿入を有する塩基配列からなるDNA
５．さらにKLF9をコードしたDNAを保持した、上記４記載の細胞。
６．脂肪細胞である、上記４または５記載の細胞。
７．肥大脂肪細胞である、上記４または５記載の細胞。
８．下記（１）から（３）の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング方法。
（１）上記４記載の細胞に被検物質を作用させる工程
（２）レポーター遺伝子の発現を検出する工程
（３）被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
９．下記（１）から（３）の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング方法。
（１）上記５記載の細胞に被検物質を作用させる工程
（２）レポーター遺伝子の発現を検出する工程
（３）被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
１０.下記（１）から（３）の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防・治療用薬剤のスクリーニング方法。
（１）上記４記載の細胞に被検物質を作用させる工程
（２）レポーター遺伝子の発現を検出する工程
（３）被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
１１.下記（１）から（３）の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防・治療用薬剤のスクリーニング方法。
（１）上記５記載の細胞に被検物質を作用させる工程
（２）レポーター遺伝子の発現を検出する工程
（３）被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】脂肪細胞の分化及び肥大過程の３Ｔ３Ｌ１細胞におけるトリグリセリド含有量（ＴＧ）（ａ）、グルコース摂取（ｂ）、並びにアディポネクチン及びレジスチンのｍＲＮＡレベル（ｃ）を示すグラフである。（ｃ）脂肪細胞の分化及び肥大過程における３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞中のアディポネクチン及びレジスチンのｍＲＮＡレベルは、TaqManリアルイム逆転写−ＰＣＲ分析より測定した。結果は３６Ｂ４ｍＲＮＡレベルを基準としてアディポネクチン又はレジスチンの発現レベルを標準化した相対値として示した。データは、３回の独立した一連の実験から得られた平均的な結果を表す。脂肪細胞肥大は３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチンｍＲＮＡレベルを低下させ、このｍRNAの低下に伴ってグルコース取込が低下する。
【図２】脂肪細胞の分化及び肥大過程の３Ｔ３Ｌ１細胞におけるアディポネクチンプロモータ活性を測定した結果を示す図である。ａ：脂肪細胞の分化及び肥大過程の３Ｔ３Ｌ１細胞におけるアディポネクチンプロモータ活性、ｂ：分化誘導後１０日目の３Ｔ３Ｌ１細胞を指示した濃度のＴＮＦαとともにインキュベーションした後のアディポネクチンプロモータ活性、ｃ：ＴＮＦα(３ng/ml)処理または非処理の分化誘導後１０日目および分化誘導後１９日目の３Ｔ３Ｌ１細胞を抗ＴＮＦα抗体とともにインキュベーションした後のアディポネクチンプロモータ活性の結果をそれぞれ示す。３Ｔ３Ｌ１細胞には、アディポネクチンプロモータの(-1367/+35)-ルシフェラーゼ遺伝子（Luc）発現ベクターを一時的に導入した。（ｂ）における結果は、ＴＮＦ-α非添加時の活性を１００％とした場合の相対値として示す。（ｂ）におけるバーは、それぞれ、平均±ＳＥ（ｎ＝５〜７）を表す（非処理細胞と比較）。肥大脂肪細胞におけるアディポネクチンプロモータ活性の低下の原因は、ＴＮＦα以外のシグナル伝達経路が存在する。
【図３】アディポネクチンプロモータ領域の解析結果を示す図である。ａ：誘導１０又は１９日後（それぞれ、第１０日又は第１９日）の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞にアディポネクチンプロモータ５’欠失体を備えたレポーター遺伝子をベクターに載せて一時的に導入した際のレポーター（ルシフェラーゼ）活性を検討した結果を示すグラフである。ｂ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日又は第１９日）から核タンパク質抽出物を調製し、図示したアディポネクチンプロモータ５’欠失配列を32Ｐ標識化プローブとして、ＥＭＳＡ分析した結果を示す写真である。示したデータは、３回の独立した一連の実験から得られた代表的な結果を表す。ｃ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日又は第１９日）から核タンパク質抽出物又は痩せた対照Ｃ５７若しくは肥満モデルｏｂ／ｏｂマウスからＷＡＴ（White Adipose Tissue；白色脂肪組織）を調製し、アディポネクチンプロモータ（−１８８／−１５７）配列を32Ｐ標識化プローブとして用いたＥＭＳＡ分析に付した結果を示す写真である。ｄ：エンハンサーなしのベクターpGL2-tK-Lucの上流に−１８８／−１５７フラグメントを挿入し、このベクターを３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日及び第１９日）に導入してルシフェラーゼ活性を検定した結果を示すグラフである。パネルｄの結果は対照ベクターの値の比として表す。結果におけるバーは３回の別個の実験の平均±ＳＥを表す。パネルｂ、ｃのデータは、３回の独立した一連の実験から得られた代表的な結果を表す。肥大脂肪細胞では、近位３２bpプロモータエレメントを通じてアディポネクチンプロモータが調節される。
【図４】３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）の核抽出物中のアディポネクチンプロモータ領域に結合する因子を解析した結果を示す写真である。パネルａ〜ｄ、ｆはＥＭＳＡ分析結果を示す。ａ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）および２９３Ｔ細胞からの核抽出物と、放射性標識化ＮＦ−κＢ共通配列（p65部位）とを、ＫＬＦ９又はＮＦ−κＢp65を特異的に認識する抗体存在下または不存在下でインキュベーションした際のＥＭＳＡ分析結果、ｂ：（右パネル）３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（左側２レーン：第１０日、右側２レーン：第１９日）の核抽出物とアディポネクチンプロモータ領域（−１８８／−１５７）の標識３２ｂｐオリゴヌクレオチドプローブとを抗KLF３抗体存在下、非存在下でインキュベーションした結果、（左パネル）２９３Ｔ細胞からの核抽出物とＫＬＦオリゴ（ＫＬＦコンセンサス配列）とを抗KLF３抗体存在下、非存在下でインキュベーションした際のＥＭＳＡ分析結果、ｃ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）からの核抽出物をＫＬＦ９コンセンサス配列（ＢＴＥ）とを抗ＫＬＦ９抗体存在下、非存在下で反応させた結果、ｄ：痩せた対照Ｃ５７ＢＬ６（Ｂ６）若しくは肥満モデルｏｂ／ｏｂマウスからのＷＡＴを３２ｂｐフラグメントおよび抗ＫＬＦ９抗体と反応させた結果、ｆ：Ｂ６若しくは肥満モデルｏｂ／ｏｂマウスからのＷＡＴまたは精製ＦＬＡＧ−ｔａｇＫＬＦ９を３２ｂｐフラグメントとインキュベーションした結果を示す。各図面中の矢印は、スーパーシフトした特異的複合体を示す。ｅ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）内の内在性アディポネクチンプロモータに結合しているＫＬＦ９の染色質免疫沈降アッセイの結果を示す写真である。データは、３回の独立した一連の実験から得られた代表的な結果を表す。ＥＭＳＡ分析により、３２bp結合複合体にはin vitro及びin vivoでＫＬＦ９を含むことが明らかにされた。
【図５】脂肪細胞内のＫＬＦ３およびＫＬＦ９の発現レベルを解析した結果を示す写真および図である。ａ、ｂ：分化誘導から示された日数を経過した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞、痩せた対照Ｃ５７ＢＬ６若しくは肥満モデルｏｂ／ｏｂマウスからのＷＡＴ（ａ〜b）中に存在するＫＬＦ３ｍＲＮＡ（ａ、上段）またはＫＬＦ９ｍＲＮＡ（ａ、下段）の発現量をノーザン分析により解析した写真およびそのバンド強度を数値化したグラフ、ｍＫＬＦ９タンパク質（ｂ）の発現量をウェスタン分析により解析した結果を示す写真である。パネルｂにおける矢印はＫＬＦ９を示す。パネルａに示すグラフにおけるバーはそれぞれ、平均±ＳＥ（ｎ＝３〜５）を表す。ＫＬＦ９発現は、脂肪細胞分化の際に増大したが、脂肪細胞肥大の際には低下した。
【図６】ＫＬＦ９過剰発現によるアディポネクチン発現に与える効果を解析した結果を示す図および写真である。ａ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）にＫＬＦ９を発現するベクター（KLF9/pcDNA3.1）と、アディポネクチンプロモータ（（−１３６７／＋３５）の下流にレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子を備えたベクター（「1367bp-Ｌｕｃ」）を導入し、KLF9高発現の影響を解析した結果を示す。結果は「Mock」（pcDNA3.1のみ）を１とした場合の比活性として示した。PDGFはKLF認識配列を備えKLFファミリーの発現を誘導する陽性のコントロールである。ｂ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）にKLF9/pcDNA3.1をリポフェクション法により導入した際のKLF９ｍRNA発現量をTaq-manPCRにより測定した結果を示す。１/３０００、１／１０００はリポフェクション法でベクター導入した際の希釈率を示し、「０」は非導入の場合を示す。ｃ：レポーターとしてPDGF−tk−Lucまたは３２ｂｐ-tk-lucを保持した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）にｍＫＬＦ5/ｐｃＤＮＡ3.1またはｍＫＬＦ９/ｐｃＤＮＡ3.1を導入した際のレポーター遺伝子の発現上昇率を、非導入の場合の活性比として示す。ｄ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）にレトロウイルスベクターを用いてＫＬＦ９遺伝子を安定的に導入した際のＫＬＦ９の発現量を測定した結果を示す。縦軸「ｍＫＬＦ９／３６Ｂ４」は、３６Ｂ４ｍRNA発現量で補正したＫＬＦ９ｍRNA発現率を意味する。ｆ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）にレトロウイルスベクターを用いてＫＬＦ９遺伝子を安定的に導入した際のアディポネクチン発現量を測定した結果を示す。ｅ：ＫＬＦ９をレトロウイルスを用いて導入された３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）からの核タンパク質抽出物を調製し、アディポネクチンプロモータ（−１８８／−１５７）配列を32Ｐ標識化プローブとして用いたＥＭＳＡ分析に付した結果を示す写真である。図中に示すバーは、それぞれ平均±ＳＥ（ｎ＝５〜７）を表す。ＫＬＦ９は、エンハンサー及びアディポネクチンプロモータの活性、３２bp結合タンパク質の量、並びにアディポネクチンの発現を増大させた。
【図７】ｓｉＲＮＡによりＫＬＦ９をノックダウンしたした際のアディポネクチン発現への影響を解析した結果を示す図および写真である。ａ：ＫＬＦ９に対するｓｉＲＮＡを３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）に導入後、７２時間経過後のＫＬＦ３、ＫＬＦ９及びアディポネクチンｍＲＮＡの量を示す。結果はそれぞれｓｉＲＮＡを導入していない際の活性を１００％とした際の相対割合で示した。ｂ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）にｓｉＲＮＡを導入後７２時間または９６時間経過後の細胞から核タンパク質抽出物を調製し、アディポネクチンプロモータ（−１８８／−１５７）配列を32Ｐ標識化プローブとして用いたＥＭＳＡ分析結果を示す写真である。ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ９発現の抑制は、３２bp結合タンパク質の量及びアディポネクチンの発現をin vitroで低下させた。
【図８】ＫＬＦ９ノックアウトマウス又は対照の野生型同腹仔のＷＡＴから核タンパク質抽出物を調製し、ＫＬＦ９共通配列（ＢＴＥ）又はアディポネクチンプロモータ（−１８８／−１５７）配列を32Ｐ標識化プローブとして用いてＥＭＳＡ分析を行った結果を示す写真である。ＫＬＦ９のノックアウトは、ＫＬＦ９タンパク質を消失させ、３２bp結合タンパク質も消失させた。
【図９】脂肪細胞肥大が脂肪細胞におけるＫＬＦ９発現を調節する機序を示す図である。ａ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日又は第１９日）におけるＴＲα（甲状腺ホルモンレセプターα）ｍＲＮＡ発現量、ｂ：痩せたマウスC５７ＢＬおよび肥満マウスｏｂ／ｏｂにおけるＴＲαｍＲＮＡ発現量を示す。ｃ：図示された濃度のＴ３で処理した際のＫＬＦ９ｍＲＮＡ発現量を３６Ｂ４ｍＲＮＡ発現量との比として示す。ｄ、ｅ：３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第６日、第１３）、抗酸化剤のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（２０mM）、ＪＮＫインヒビターのＳＰ６００１２５またはＮＡＣ（ＳＰ）で処理した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）におけるＫＬＦ９またはアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量を示す。なお図において、ＮＡＣ（ＳＰ）は、ＮＡＣおよびＳＰ６００１２５で処理した群である。
【図１０】脂肪細胞の肥大化に伴い酸化ストレスが上昇することを示す図である。
【図１１】脂肪細胞の肥大化に伴い抗酸化活性が低下することを示す図である。バーは、それぞれ、平均±ＳＥ（ｎ＝６）を表す（**：Ｐ＜０．０１；非処理細胞と比較）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、実施形態に挙げて本発明を説明する。本発明は、第一にアディポネクチン発現誘導剤を提供する。本願発明者らにより、ＫＬＦ９がアディポネクチンの発現を誘導することが見出された。すなわち、本発明のアディポネクチン発現誘導剤は、ＫＬＦ９タンパク質またはＫＬＦ９を発現し得るＤＮＡ等を構成成分とする。【００１２】
ＫＬＦ９はクルッペル様ジンクフィンガータンパク質と称されるスーパーファミリーに属するタンパク質の一種である。ＫＬＦ９の具体的なアミノ酸配列の一例を配列番号：２に示すが、本発明のＫＬＦ９はこれに限定されない。タンパク質には同一の機能を有する類似の配列からなる異種ホモログや変異体が存在し、また、配列番号：２記載のアミノ酸配列を人為的に適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得ることもできる。従って、配列番号：２に示すアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質も本発明のＫＬＦ９に包含される。【００１３】
ＫＬＦ９はヒト、マウスなどの細胞、組織より得ることができる。例えば、脂肪細胞でも小型のものはKLF9の発現が高いことから、分化が進んでいない脂肪細胞、組織を材料として単離することができる。また簡便には配列番号：１記載のDNAを発現ベクターに接続し、細胞系、無細胞系で発現させて得ることもできる。【００１４】
一方、配列番号：２記載のアミノ酸配列からなるKLF9と機能的に同等なタンパク質を得る手法として、アミノ酸を人為的に置換することが挙げられる。性質的に似たアミノ酸同士の置換はタンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。逆にアミノ酸配列の非保存的置換も場合によっては有効である。例えば、非保存的置換によって、KLF９タンパク質におけるアディポネクチン発現誘導活性を上昇等し得る改良を加えることも可能であり、該改良KLF９タンパク質も本発明に含まれる。【００１５】
KLF9と機能的に同等なタンパク質を得る他の方法として、配列番号：２記載のDNAと類似するDNAをハイブリダイゼーションによりクローニングして、得られたDNAからタンパク質を得る方法を挙げることができる。具体的には、配列番号：１に示すKLF9をコードするDNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズするDNAを単離する。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば塩基配列としては相同性の高いDNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはKLF9と機能的に同等なタンパク質が得られる可能性が高い。相同性の高い塩基配列とは、たとえば70%以上、望ましくは90%以上の同一性を示すことができる。
なお、上記ストリンジェントな条件とは、例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。【００１６】
ハイブリダイゼーションを利用することによって、例えば、配列番号：２記載のアミノ酸配列に示すようなマウス由来のKLF9、マウス以外の動物種、すなわちヒト、ラット、ウサギ、ブタ、あるいはヤギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするKLF9のホモログは、機能的に同等なタンパク質を構成するであろう。【００１７】
上記手法以外にもKLF9と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、配列番号：１記載のDNAを改変し、改変したDNAを基にタンパク質を合成する方法などが挙げられる。マウスKLF9（配列番号：２）に人為的に改変を加えたタンパク質や、上記のようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、通常、ヒトKLF9とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも30％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、および SSEARCH 等の相同性検索が利用できる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis）のページ ; http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/Welcome-j.html］。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うことができる（例えばNCBIのホームページのウェブサイトのBLASTのページ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402）］。
KLF9と機能的に同等なタンパク質が、実際に配列番号：２記載のKLF9と同等な機能、すなわち、アディポネクチン発現誘導活性を有するかを確認は、本願実施例に示すルシフェラーゼ解析などを用いて実施し得る。
【００１８】
本発明のアディポネクチン発現誘導剤のもう一つの構成成分は、KLF9をコードしたDNAまたは該DNAを保持したベクターである。KLF9をコードしたDNAの例として、配列番号：１に示す塩基配列からなるDNAを挙げることができる。DNAもタンパク質と同様に同一の機能を有する類似の塩基配列からなるホモログや改変体が存在し、また、配列番号：１記載の塩基配列を人為的に改変することによって、あるいは同一の機能を有する変異体をクローニングすることによっても得ることもできる。こうした配列番号：１に類似する配列を備えたDNAは、例えば、配列番号：１記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAと定義することができる。【００１９】
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA」とは、上述した通り、配列番号：１に示すKLF9をコードするDNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズし得るDNAである。また、上記ストリンジェントな条件とは、一例を示せば、上述した通り、例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件などであるがこれに限定されない。
KLF9をコードしたDNAは断片の状態で用いてもよく、またベクターに接続しても用いてもよい。ベクターは目的に応じて適宜選択し得る。例えば、ヒト細胞、組織内のアディポネクチン遺伝子の発現を誘導する目的では、ヒトなどの哺乳動物細胞等で機能し得るベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、pcDNAI、pcDNAI/Amp（Invitrogen社）等がある。【００２０】
上記本発明のアディポネクチン発現誘導剤の使用態様は、（１）実験動物における内因性あるいは外来性アディポネクチン遺伝子発現の誘導、（２）培養細胞内に存在する内因性あるいは外来性アディポネクチン遺伝子発現の誘導、（３）無細胞系でのアディポネクチン遺伝子の発現誘導などが挙げられる。
上記使用態様（１）、（２）の場合には、例えば、ベクターに保持させたKLF9をコードしたDNAを構成成分としたアディポネクチン発現誘導剤を用いることが好適である。細胞、組織等への遺伝子導入は、ウイルスベクターの投与や既存の導入技術（エレクトロポーレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法等）を用いて行うことができる。また、使用態様（３）の場合には、DNAを保持したベクターまたはKLF9タンパク質のいずれを構成成分とするものであってもよい。【００２１】
上記本発明のアディポネクチン発現誘導剤は、実験動物、培養細胞さらには無細胞系においてアディポネクチンの発現を誘導し得ることから、アディポネクチンの機能解析の有効な薬剤となる。また、アディポネクチンは肥満症またはこれに関連する疾患、例えば、糖尿病などの代謝疾患および動脈硬化症などの心血管性疾患に関与する重要な因子である。従って、本薬剤はこうした疾患の研究に大きく寄与する。【００２２】
また、本発明は第二に上記アディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、肥満症またはこれに関連する疾患の予防・治療用医薬組成物に関する。上述した通り、アディポネクチンは肥満症またはこれに関連する疾患、例えば２型糖尿病、インスリン抵抗性などの代謝疾患および動脈硬化症などの心血管性疾患に関与する重要な因子である。これら疾患の多くでは低アディポネクチン血症がみられる。従って、上記アディポネクチン発現誘導剤を有効成分として、適宜、薬学的に許容され得る担体と配合することにより、肥満症またはこれに関連する疾患の治療用医薬組成物として応用することができる。【００２３】
本発明の医薬組成物が対象とする疾患は、肥満症またはこれに関連する疾患、例えば、代謝性疾患、心疾患などである。具体的には、インスリン抵抗性、糖尿病及び高脂血症などの代謝性疾患、動脈硬化症、高血圧、脂肪肝などの心血管性疾患などである。さらに言えば、これら疾患のうち、特に低アディポネクチン血症を伴う場合あるいは低アディポネクチン血症を生じるおそれがある場合に本発明の医薬組成物が有効となる。これら疾患の原因またはこれら疾患に伴って生じる低アディポネクチン血症を本医薬組成物中に含まれるアディポネクチン発現誘導剤により改善することにより、上記疾患の予防、治療、病体の緩和などを図ることができる。【００２４】
アディポネクチン発現誘導剤は上記で説明した通りである。「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤あるいはその他の添加剤等を意味する。そのような担体の一つ以上を用いることにより、経口あるいは非経口製剤を調製し得る。本発明による医薬組成物の投与量は、対象疾患や病態に応じて適宜調整することができるが、一般的には、体重1kgあたり通常1μgから20g、より一般的には10μg〜500mgとすることができる。また注射剤の場合は経口投与の10分の１〜100分の１程度を投与量の目安とすることができる。【００２５】
本発明は、第三にアディポネクチン発現誘導剤のスクリーニングのための細胞を提供する。本発明者らは、アディポネクチン遺伝子の制御領域内にＫＬＦ９が結合するエレメントを同定している。そして、このエレメントにＫＬＦ９が結合することによりアディポネクチンの発現が促進される。したがって、ＫＬＦ９と同様な活性を有する物質を探索することによりＫＬＦ９に代わるアディポネクチン発現誘導因子をスクリーニングすることが可能となる。この因子がKLF9などのようなタンパク質であってもよいが、好ましくは低分子化合物である。低分子化合物であれば、そのまま創薬のリード化合物として利用し得る可能性が高い。【００２６】
本発明の細胞の第一の態様は、KLF9が結合し得るエレメント（以下、「KLF9結合エレメント」と称する）を少なくとも上流に備えたレポーター遺伝子を保持した細胞である。すなわち、第一の態様の細胞内には、KLF9によるアディポネクチン遺伝子の発現を促進するエンハンサーエレメント（シス因子）であるKLF9結合エレメントがレポーター遺伝子の上流に備えられている。【００２７】
KLF9結合エレメントは、好適には、アディポネクチン遺伝子の上流−１８８から−１５７の領域に対応する配列番号：５記載の塩基配列を挙げることができる。しかし、この配列に限定されるものではなく、配列番号：５記載の塩基配列を有するアディポネクチン遺伝子の制御領域の全長（配列番号：３）あるいはその一部（一例として挙げれば、配列番号：４）がレポーター遺伝子の上流に備えられているものであってもよい。さらにはKLF9が結合し、且つ、KLF9によるアディポネクチン遺伝子発現を誘導し得る活性を保持している配列であれば、配列番号：５記載の塩基配列を改変することもできる。配列番号：５記載の塩基配列の改変体をより具体的に定義すると、配列番号：５記載の塩基配列において1塩基以上の欠失、付加、置換または挿入を有する塩基配列とすることができる。なお、こうした配列番号：５記載の塩基配列の改変は点変異導入技術を用いて実施し得る。【００２８】
レポーター遺伝子は、その発現を確認し得る遺伝子であれば特に限定なく、一般に用いられている用語よりも広い概念として本書では用いる。具体的には、本書におけるレポーター遺伝子は、発光を指標に発現を検出し得る遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、YFP遺伝子など）、酵素活性を指標に発現を検出し得る遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子など）、薬剤の感受性を指標に発現を検出し得る遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）など一般的なレポーター遺伝子（マーカー遺伝子）の他に、アディポネクチン遺伝子そのものもレポーター遺伝子の概念に含めることができる。なお、本書においては、特に断りがない限り「リポーター遺伝子」は広義に解する。【００２９】
すなわち、「KLF9結合エレメントを上流に備えたレポーター遺伝子」として、固有の制御領域（例えば、配列番号３など）を備えたアディポネクチン遺伝子、例えば、配列番号：６を用いることができる。この構成におけるアディポネクチン遺伝子を他の上述したような一般的なレポーター遺伝子に置換してもよい。さらに、これら構成において、制御領域のうちKLF9結合エレメント（例えば、配列番号：５）のみ残すように他の制御領域を欠失させてもよい。また、一般のレポーター遺伝子が搭載されたプラスミドを基に、レポーター遺伝子の上流配列をアディポネクチン遺伝子の制御領域につなぎ変えて構築してもよく、また、一般のレポーター遺伝子の上流にKLF9結合エレメントを挿入して構築してもよい。なお、アディポネクチン遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合には、アディポネクチン遺伝子は細胞に内在する遺伝子あるいは外来から導入された遺伝子のいずれであってもよい。【００３０】
本発明の細胞の第二の態様は、上記第一の態様にさらにKLF9をコードしたDNAを保持した細胞である。第一の態様にさらにKLF9遺伝子を保持させた第二の態様の細胞は、KLF9遺伝子の発現誘導を介してアディポネクチン遺伝子の発現を誘導し得る物質のスクリーニングに有用となる。本願発明者らは、脂肪細胞の肥大化の過程でアディポネクチンの発現が低下することと相関してKLF9遺伝子の発現、特に、転写レベルの発現が低下することを見出している。従って、第二の態様の細胞は、第一の態様の細胞の有用性に加えて、大型あるいは肥大脂肪細胞においてKLF9遺伝子の発現を抑制している物質を阻害する物質の探索などに有用となる。【００３１】
「KLF9をコードしたDNA」は、上記アディポネクチン発現誘導剤の説明において記載したKLF9をコードしたDNAと同一であり、この用語が意味する範囲も同様である。要するに、KLF9をコードしたDNAの一例として配列番号：１記載の塩基配列からなるDNAを挙げることができるが、アディポネクチンの発現を誘導し得る活性を保持する範囲で、配列番号：１の塩基配列にこの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAが含まれる。なお、KLF９をコードしたDNAは細胞に内在しているものであっても、外来から導入したDNAであってもよい。これらKLF9をコードしたDNAは、上流にKLF9遺伝子元来の制御領域を備えていることが好ましい。
【００３２】
上記第一および第二の態様における細胞種は、特に限定はないが、例えば、哺乳動物細胞由来であることが好ましく、さらに通常生体内でアディポネクチンを発現している細胞種であることがより好ましい。生体内でアディポネクチンを発現している細胞は、一例を挙げれば、脂肪細胞である。脂肪細胞を用いる場合には、小型脂肪細胞、大型化した肥大脂肪細胞を適宜選択して用いることができる。例えば、第二の態様の細胞で、KLF9の発現を抑制している生体分子を阻害する物質の探索を行う場合には、アディポネクチンの発現が低下している大型化脂肪細胞を用いることができる。大型脂肪細胞の調製は、ｏｂ／ｏｂマウスなどから脂肪細胞を単離調製する以外に、分化が進んでいない脂肪細胞（例えば、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞など）を出発材料として、実施例を参照して分化誘導を行い調製することもできる。脂肪細胞の分化誘導は、分化誘導培地で細胞を培養することにより実施することができる。【００３３】
また、第一、第二の態様の細胞における「KLF9結合エレメントを上流に備えたレポーター遺伝子」や第二の態様の細胞における「KLF9をコードする遺伝子」を外来から細胞に導入する場合、このDNAをベクター等に担持させて細胞に導入することができる。この場合のベクターは適宜選択して使用することができる。【００３４】
本発明は第四に、アディポネクチンの発現を誘導し得る物質のスクリーニング方法に関する。第一の態様のスクリーニング方法は、上記第一の態様の細胞を用いた方法である。具体的には、次の（１）から（３）の工程が含まれる。
（１）上記第一の態様の細胞に被検物質を作用させる工程
（２）レポーター遺伝子の発現を検出する工程
（３）被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程【００３５】
第二の態様のスクリーニング方法は上記第二の態様の細胞を用いた方法であり、具体的には、次の（１）から（３）の工程が含まれる。
（１）上記第二の態様の細胞に被検物質を作用させる工程、
（２）レポーター遺伝子の発現を検出する工程
（３）被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程【００３６】
いずれの態様も目的であるアディポネクチン遺伝子の発現を誘導し得る物質を探索し得る点で共通するが、用いる細胞の機能に応じた特徴を有する。例えば、第一の態様では、ＫＬＦ９結合エレメントを備えたレポーター遺伝子を保持した細胞を用いていることから、ＫＬＦ９に代わってKLF9結合エレメントに作用しアディポネクチンの発現を誘導し得る物質をスクリーニングすることが可能となる。また、第二の態様では、さらにKLF9をコードしたDNAを保持した細胞を用いていることから、例えば、肥大脂肪細胞においてKLF9の発現抑制を阻害する物質をスクリーニングすることができる。【００３７】
上記第一および第二の態様における被検物質は、タンパク質、核酸、低分子化合物などを挙げることができるが、特に限定はない。また、これらは天然、合成の別は問わない。核酸には、KLF9タンパク質の全体をあるいは一部を模倣した核酸（DNA、RNA）デコイを含めることができる。また、核酸は天然に存在する塩基のほか、天然には存在しない人工的な塩基により合成したものも含めることができる。低分子化合物には、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物ライブラリーなどを含めることができる。【００３８】
細胞への被検物質の作用は、一例として、細胞を培養している培地に被検物質への添加することが挙げられる。被検物質が核酸の場合には、通常の遺伝子導入技術、例えば被検物質をリポソームなどの脂質分子、リン酸カルシウムなど塩で覆い細胞の食作用を利用して導入する方法、電気的な刺激などにより細胞へ導入する方法、マイクロインジェクション、ジーンガンなどを用いることができる。【００３９】
レポーター遺伝子の発現の検出は、転写レベル、翻訳レベルの発現のいずれを検出してもよい。転写レベルの発現検出は、ノーザンブロッティング、RT-PCR法、リアルタイムPCRなどを用いることができる。これら手法に用いるプライマー、プローブは、当業者であればレポーター遺伝子の塩基から適宜デザインして作成することはできる。翻訳レベルの発現検出は、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ELISA、RIAなど特異抗体を用いた検出方法の他に、レポーター遺伝子産物の性質に応じた方法を用いることができる。ルシフェラーゼ、GFPなどの蛍光を発する場合には、その蛍光を検出することにより、β-ガラクトシダーゼなどの酵素の場合には、基質との反応に基づき検出することができる。さらに、薬剤耐性マーカーの場合には、薬剤含有培地中に培養し、生育することを指標に発現を検出することができる。発現量を定量化する場合には、上記特異的な抗体を用いたいずれかの検出手法や、強度を測定し得る蛍光を指標とする方法を用いることが好ましい。【００４０】
第一、第二の態様のいずれも、最終的には、被検物質存在下と非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量を測定し、被検物質非存在下に比して被検物質存在下においてレポーター遺伝子の発現が高い結果をもたらす被検物質が選択される。ここで選択された被検物質は、アディポネクチン遺伝子の発現を促進し得る物質として重要な候補となる。
また、上記本発明のスクリーニング方法は、アディポネクチン発現誘導物質をスクリーニングし得るのみならず、さらには、肥満症またはそれに関連した疾患の予防・治療用の薬剤の候補物質を探索するために応用することができる。肥満症に関連した疾患としては、上記において繰返し記載している通り、例えば、糖尿病、インスリン抵抗性などの代謝性疾患、動脈硬化症などの心疾患などである。これら疾患では、低アディポネクチン血症が見られる場合多く存在する。低アディポネクチン血症が、これら疾患の発症を決定づける一要素、あるいは病態の進行を進める要因等となっている場合には、上記スクリーニング方法により得られる物質は、患者における低アディポネクチン血症を改善させ、肥満症またはこれに関連する疾患の予防、治療、病体の緩和を誘導し得ることが期待される。【００４１】
なお、上記スクリーニング方法の他に簡便なスクリーニング方法として、配列番号：５に示すようなKLF9結合エレメントと相互作用活性を指標に被検物質を選択する方法もある。相互作用活性は、例えば実施例に示された免疫沈降アッセイや、EMSAなどを用いて測定し得る。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本実施例で用いた材料および方法について以下に説明する。
〔材料及び方法〕
１．  材料及び一般的方法
３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びデキサメタゾン（ＤＥＸ）、ＮＡＣ並びにＳＰ６００１２５は、シグマ社から購入した。その他の材料は、すべて、引用文献（２７、３５及び３６）に示された供給源から購入した。ＤＮＡ配列決定は、ＰＲＩＳＭ染料ターミネーターサイクル配列決定キット及びＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナライザー（Applied Biosystems社）で実施した。【００４３】
２．  動物及び血液サンプルアッセイ
ＫＬＦ９欠損マウスは既に報告されている（Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).）。１５週齢のｏｂ／ｏｂマウス及びその野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスは、Charles River Breeding Laboratories（Wilmington, MA）から入手した。マウスは、コロニーケージ内に収容し、光源下１２時間／暗所１２時間の周期を維持した。血漿グルコースレベルは、グルコースＢ試験（和光純薬化学、大阪市）を用いて決定した。血漿アディポネクチンレベルは、マウスアディポネクチン・ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット（LINCO Research Inc.）によって決定した。【００４４】
３．  ｃＤＮＡライブラリー
ｃＤＮＡライブラリーは、A. Saltielから提供されたものを用いた。このライブラリーは完全に分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から採取したｃDNAをpGAD-GH GAL4ベクター内に挿入することにより構築された（Ribon, V. et al., Mol. Cell. Biol. 18, 872-879 (1998).）。ライブラリーにはすべてが１．５〜３kbの大きさのｃＤＮＡインサートを有する、10,000,000個体の形質転換体が含まれていた。【００４５】
４．  酵母におけるone-hybridクローニング
酵母におけるone-hybridクローニングの一般的方法及び関連する実験的操作は、すでに報告されている手順で実施した（Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).）。one-hybridクローニングのためにＹＭ４２７１（Clontech社）の酵母誘導株を構築した。具体的には、プラスミドpHISi（Clontech社）のXbaI部位（クレノウＤＮＡポリメラーゼで末端充填）とEcoR1部位との間に、下記に示すアディポネクチンプロモータ配列由来の３２塩基（−１８８位〜−１５７位、図３ｂ、配列番号：５）からなるトップ鎖オリゴヌクレオチドとその相補鎖とのアニーリングによって生成されたＤＮＡフラグメントを挿入した。
5'-GAAGCCCAAGCTGGGTTGTACCAGGTTCCCTA-3'（トップ鎖）
上記反応産物をＹＭ４２７１（Clontech社）に形質転換し、上記アニーリング断片が三量体となったインサートを含むＨＩＳ３リポーター遺伝子コンストラクト（（Ｇ４ＨＳＥ）ｘ３：：ＨＩＳ３）を含むクローンを得た。
one-hybridスクリーニングのため、1,660,000のプライマリークローンの増幅後に、胚ｃＤＮＡライブラリーから調製したＤＮＡで（３２bp）ｘ３：：ＨＩＳ３リポーター酵母株を形質転換した。５００万の酵母形質転換体を１５mM３−アミノトリアゾール（ＳＤ−、Ｈｉｓ−、Ｌｅｕ＋）上で培養した。３０℃で４〜８日間増殖させた後、２２の陽性と推定される酵母クローンを選び、更に分析した。二つのｃＤＮＡが、同じＫＬＦ９をコードしていた。【００４６】
５．  ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイは、以前に報告した方法に従い１２ウエルプレートで培養した細胞を用いて実施した（Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).、Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).）。それぞれ指定量の発現プラスミドとともに、ルシフェラーゼリポータープラスミド（０．２５μg）及びpSV-βgal（０．１〜０．４μg）を同時に導入した。各トランスフェクションでのＤＮＡの総量を、対照のベクターＤＮＡで１．５μg／ウェルに調整した。形質転換体のルシフェラーゼ活性の量を標準的キット（Promega）により測定した。測定値はβ−ガラクトシダーゼ活性を基準に標準化した。【００４７】
６．  ゲル移動度シフトアッセイ（Electrophoresis mobility shift assay: EMSA）
ゲル移動度シフトアッセイは、以前に記載したとおりに実施した（Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).）。
２９３Ｔ細胞若しくは３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞又は白色脂肪組織から核酸抽出物を報告されている方法に従い調製した（Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).）。ゲル移動度シフトアッセイに用いた二本鎖オリゴヌクレオチドは、両鎖をアニーリングすることによって調製した。標識化プローブ（３，０００〜１０，０００cpm）および核酸抽出物を反応液（２０μl：１０mMトリスＨＣｌ（pH７．６）、５０mMＫＣｌ、０．０５mMＥＤＴＡ、２．５mMＭｇＣｌ2、８．５％グリセリン、１mMジチオトレイトール、０．５μg/mlのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、０．１％トリトンＸ及び１mg/mlの脱脂乳）中で混合し、氷上で３０分間インキュベーションした。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、４．６％ポリアクリルアミド上、１４０V、４℃で１時間分画した。ゲルを乾燥し、BAStationソフトウェア付きのＢＡＳ２０００フィルター（富士写真フィルム）に露光させた。
競合実験の場合には、標識化ＤＮＡに対して少なくとも１００倍過剰モルの非標識化ＤＮＡを先ず上記反応液に加え、その後、標識化プローブを加えた。スーパーシフト実験では、最初に、ＫＬＦ９、ＫＬＦ３又はＮＦ−κＢｐ６５に対するポリクローナル抗体（２〜１０μg）とともに氷上でインキュベーションして、ゲルシフト反応を行った。【００４８】
７．  レトロウイルスの生成及び感染
１０7個のＰｌａｔ−Ｅパッケージング細胞（Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000).）に１０μgのマウスＫＬＦ９をLipofectamine PLUS（Life Technology）を用いて一時的に導入し、２４時間のインキュベーションの後に上清（１０ml）を採集した。１０μg/mlのポリブレン（臭化ヘキサジメトリン、Sigma社）を添加して２０倍希釈した上清を用い、推定多重感染度０．３にて３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を感染させた。【００４９】
８．  プラスミド
アディポネクチンプロモータの１３６７bp（−１３６７から＋３５；配列番号：４）、５２７ｂｐ（−５２７から＋３５）、２１７bp（−２１７から＋３５）及び１２７bp（−１２７から＋３５）のフラグメントを有するルシフェラーゼ遺伝子構成体（それぞれ、「pAdiponectin1367-Luc」、「pAdiponectin527-Luc」、「pAdiponectin217-Luc」及び「pAdiponectin127-Luc」）をpGL2ベーシック又はpGL２プロモータベクター（Promega社）内にサブクローニングした。【００５０】
９．  哺乳動物細胞での発現
pCDNA３．１のＥｃｏＲ１/Not部位に結合することによって、ＫＬＦ３又はＫＬＦ９発現ベクターを構成した。２９３Ｔ又は３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞へのＤＮＡトランスフェクションは「Lipofectamine PLUS」（Gibco BRL）を用いたリポフェクション法によって実施した。【００５１】
１０．  ３Ｔ３Ｌ１細胞による研究
３Ｔ３Ｌ１細胞を１０％ウシ胎児血清とともにＤＭＥＭ中で培養し、すでに報告されている方法に従って（Yamauchi, T. et al., Nat. Genet. 30, 221-226 (2002).）、脂肪合成性細胞への分化誘導を行った。簡略的に説明すると、先ず、３Ｔ３Ｌ１細胞を培養し、密集するまで増殖させた。２日後、培地を標準分化誘導培地（０．５mMＩＢＭＸ、１μMＤＥＸ、５μg/mlのインスリン、１０％ＦＢＳ、５０単位／mlのペニシリン及び５０μg/mlのストレプトマイシン含有）に交換し、一両日ごとに培地交換を行った。既知の方法でグルコース摂取を決定した（Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 8, 1288-1295 (2002).）。細胞溶解物を抽出し、そのＴＧ含量を、既知の方法（Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 7, 941-946 (2001).）で決定した。【００５２】
１１．  ＲＮＡ干渉
相補的な一本鎖ＲＮＡをそれぞれ化学的に合成し、互いにアニーリングしてsiRNAを調整した。６０〜７０％程度まで密集した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞にLipofectamine PLUS（Life Technology）を用いてsiRNAを導入した（Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).）。これらＫＬＦ９及びＫＬＦ３に対するｓｉＲＮＡ配列は、それぞれ予めその導入によりKLF９およびKLF３の発現を抑制し得ることが確認できているものを用いた。siRNAのトランスフェクション７２、９６時間後に、細胞を溶解して発現産物等の解析を行った。【００５３】
１２．  リアルタイムＰＣＲによる転写体のノーザンブロット分析及び定量的分析
細胞又は組織からのトータルＲＮＡの調製は、TRIzol（Gibco/BRL）を用い、製造者のインストラクションに従って行った。ノーザンブロット分析のために、各群のトータルＲＮＡを等量づつ分取し、これらをプールして（総量１０μg）、ホルマリン変性アガロース電気泳動にかけた。泳動後、ナイロン膜（Hybond N；Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。フィルターは、マウスＫＬＦ９及びマウスＫＬＦ３ｃＤＮＡを［32Ｐ］ｄＣＴＰで標識化したｃＤＮＡプローブそれぞれとハイブリダイズさせた。得られたバンドをBAStationソフトウェア付きのＢＡＳ２０００フィルター（富士写真フィルム）に感光させ視覚化した。ｍＲＮＡの定量は、リアルタイムＰＣＲ法により実施した（Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).）。プライマーセット及びプローブは、ソフトウェア「Primer Express 1.5a」を用いて設計し、ＡＢＩ（ABI Prism；Perkin-Elmer Applied Biosytems, Foster City, California）から購入した。相対的な量は同じｃＤＮＡ中のアクチン転写物の量で標準化した（Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).）。【００５４】
１３．  核抽出物の調製及び免疫ブロット分析
既知の方法に従って（Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).）、核抽出物を調製した。核タンパク質（３０μg）のサンプルは、ＫＬＦ９（Zhang, D. et al., Endocrinology 143, 62-73 (2002).）又はＫＬＦ3（Crossley, M. et al., Mol. Cell Biol. 16, 1695-1705 (1996).）に対するウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合マウス又はウサギＩｇＧ及びＥＣＬキット（Amersham Pharmacia Biotech）による免疫ブロット法により解析された。【００５５】
１４．  染色質免疫沈降アッセイ
休止状態の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を１％ホルムアルデヒド中で固定化した。固定化された染色体サンプルは既知の免疫沈降法（Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).）に多少の変更を加えた方法で解析した。沈降物を回収するためにプロテインＡ（Upstate）を用いた。【００５６】
１５．抗酸化活性の測定
カイマン化学抗酸化性解析（Cayman Chemical Antioxidant Assay）を血漿（plasma）、血清、尿、便あるいは細胞溶解物のトータル抗酸化能を測定するために使用した。水溶性および脂溶性抗酸化剤はこのプロトコールで分けることができない。そのため、ビタミン、タンパク質、脂質、グルタチオン、尿酸などを含む成分全てを組合わせた抗酸化活性が分析される。解析は、試料中の抗酸化剤がメトミオグロビン（metmyoglobin）によるABTSR (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate])から ABTSR・+への酸化を阻害する活性を測定することに基づいている。試料の量は、その濃度に従い750nmにおける吸収阻害を誘導する。試料中におけるABTSの酸化を阻害し得る抗酸化活性は、水溶性トコフェロール類似体であるTroloxの抗酸化活性と対比し、ミリモル濃度のTrolox,で標準化することより定量化する。【００５７】
〔実施例１〕アディポネクチンｍＲＮＡレベルは、肥大した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞で低下している
アディポネクチンｍＲＮＡレベルは、肥満症で低下しており、それが、肥満症関連インスリン抵抗性の発達の原因となる役割を果たすことが報告されている。本発明の課題は、肥満症におけるアディポネクチン発現の低下の原因となる、転写因子を単離することである。この課題に検討するために、in vitroでの肥大脂肪細胞モデルを用い、脂肪細胞肥大化がアディポネクチン遺伝子の発現に与える影響を解析した。
興味深いことに、脂肪細胞分化の誘導１９日後（第１９日）の３Ｔ３Ｌ１の脂肪細胞は、トリグリセリド含量が増大し（図１ａ）、インスリンに応答してグルコース摂取の低下のようなインスリン抵抗性を示し（図１ｂ）、レジスチンのようなアディポカインを誘導する一層高度なインスリン抵抗性を発現し（図１ｃ）、さらには、脂肪細胞分化の誘導１０日後（第１０日）の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞と比較して、アディポネクチンｍＲＮＡ発現が低下する（図１ｃ）ことが見出された。ｍＲＮＡレベルで観察された変化と同様に、脂肪細胞肥大はアディポネクチンのタンパク発現レベルも低下していた（データ示されず）。これらより肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の発現低下の原因は、転写レベルの低下であることを示唆する。【００５８】
〔実施例２〕肥大脂肪細胞で低下したアディポネクチンの発現の原因には、ＴＮＦα以外のシグナル伝達経路が関与する
以前のアディポネクチン遺伝子の５’フランキング領域のプロモータ分析によって、脂肪細胞特異的な発現を誘導するＣ／ＥＢＰ転写因子が特定された（Schaffler, A. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1399, 187-197 (1998).、Saito, K. et al., Biol. Pharm. Bull. 22, 1158-1162 (1999).）。しかし、肥満症で観察される肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン発現低下を決定づける上流因子がどこにあるかは、同定されていない。興味深いことに、ルシフェラーゼ遺伝子に連結させたアディポネクチンプロモータ領域の−１３６７から＋３５までを含む領域のプロモータ活性は、前駆脂肪細胞（第０日）又は大型脂肪細胞（第１９日）と比較して、小型の脂肪細胞（第１０日）の方が高く（図２ａ）、それはアディポネクチンの発現レベルと相関した。
アディポネクチン発現を低下させることが示されているＴＮＦαは肥大脂肪細胞で増加する。そのため、ＴＮＦαが肥大脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現を低下させる原因因子であるとの予測は合理的である（Barth, N. et al., Diabetologia 45, 1425-1433 (2002).）。
小型脂肪細胞（第１０日）をＴＮＦαとともにインキュベーションすることは、実際に、アディポネクチン遺伝子のプロモータ活性を低下させた（図２ｂ）。しかし、ＴＮＦαを抗体により中和した場合の効果は、肥大脂肪細胞（第１９日）で低下したアディポネクチン遺伝子のプロモータ活性に対して何ら影響を与えなかった（図２ｃ）。これらデータは、肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の低下の原因となるシグナル伝達経路として、ＴＮＦα以外が存在し得ることを示唆した。【００５９】
〔実施例３〕肥大脂肪細胞は、近位３２bpプロモータエレメントを通じてアディポネクチンプロモータを調節している
肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の不応答性に関与するプロモータ領域を特定するために、ファンクショナル５’ディリーション解析を実施した。これまでの研究で−１３６７から−２１７領域の欠損は、第１９日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチンプロモータ活性に対して実質的に影響しないことが明らかにされた（図３ａ）。対照的に、第１９日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞において、さらに９０ヌクレオチドを欠質させると、アディポネクチンプロモータ活性が回復した。このことから−２１７／−１２７に必須の調節エレメントが含まれることが示唆された。
転写因子が結合するエレメントを同定するために、ＥＭＳＡを用いて、ファンクショナル５’ディリーション解析を更に実施した。ＥＭＳＡを用いた−２１７／−１２７プロモータ領域の解析において、第１９日の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞よりも第１０日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞で一つの主要な複合体がこのエレメントに多く結合することが示された（図３ｂ）。−２１７から−１８９領域の欠失は、第１０日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞由来の核抽出物中の結合タンパク質の量に実質的に影響しなかった（図３ｂ）。対照的に、さらに３２ヌクレオチドを欠質させると、第１０日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞内での結合タンパク質の量を顕著に減少させ（図３ｂ）、−１８８／−１５７が必須結合エレメントを含むことを示唆した。重要なことに、３２bpのエレメント（−１８８／−１５７）に結合した主要複合体は、痩せた対照のＣ５７Ｂ６マウスおよび第１０日の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞よりも、肥満モデルであるｏｂ／ｏｂマウスおよび第１９日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞では少なかった（図３ｃ）。
このプロモータ領域のエンハンサー特性を詳細に調べるために、このエレメントをプロモータ系に組み込み、機能解析を行った（図３ｄ）。この−１８８／−１５７エレメントの存在は、第１０日目の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞では、対照であるpGL-2-tk-Lucベクターのみと比較して基底転写活性を５倍上昇させたが、第１９日目の細胞では同様の上昇は観察されなかった（図３ｄ）。【００６０】
〔実施例４〕３２bpエレメント結合タンパク質の酵母one-hybridクローニング
肥大脂肪細胞においてアディポネクチン遺伝子プロモータの下方調節しているトランス因子を単離するために、酵母one-hybridクローニングアプローチを用いた（Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).）。３２bpをバイトとして用いた。この配列を三量体化してHIS3レポーター遺伝子の上流に組み込み、酵母細胞に導入して（３２bp）ｘ３：：ＨＩＳ３リポーター酵母株を作成した。
２２の陽性コロニーを得た。これらクローンは、異なる群が含まれていた。ヌクレオチド及び推定アミノ酸の配列から、二つの群に分けられた。一つの群は、１０個の独立したｃDNA単離体と２個の独立したｃＤＮＡ単離体とでそれぞれ、クルッペル様転写因子（ＫＬＦ）ファミリー（Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).、Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).）３及び９に属する転写因子をコードしていた。他の一群は、４個の独立したｃＤＮＡ単離体によるもので、転写因子であるＮＦ−κＢｐ６５（Suzawa, M. et al., Nat. Cell Biol. 5, 224-230 (2003).）をコードしている。【００６１】
〔実施例５〕ＥＭＳＡにより、３２bpの結合複合体は、ＫＬＦ９を含むことがin vitro及びin vivoで明らかにされた
３２bpに結合する核内因子を更に特定するために、ＫＬＦ３、ＫＬＦ９又はＮＦ−κＢｐ６５を認識する特異的な抗体を用いて、ＥＭＳＡ超シフト実験を実施した。これらの研究で、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）内で複合体Ｉが、ＫＬＦ９タンパク質を含むことが特定された（図４ａ右、レーン１及び２）。対照的に、ＫＬＦ３（図４ｂ）はもとよりＮＦ−κＢｐ６５（図４ａ右、レーン１及び３）も、in vitroでは小型脂肪細胞内では検出されなかった。対照ＥＭＳＡでは、２９３Ｔ細胞の核抽出物をプローブである標識KＬＦ９コンセンサス部位とともに用いることにより、ＫＬＦ９抗体の特異性が確認された（図４ｃ）。ＫＬＦ３抗体（図４ｂ左）又はＮＦ−κＢｐ６５抗体（図４ａ左）の機能は、コグネイトタンパク質である核抽出物を発現する２９３Ｔを、それぞれ、放射性標識プローブとしてＫＬＦ３コンセンサス部位又はＮＦ−κＢコンセンサス部位（ｐ６５部位）とともに用いたスーパーシフトアッセイにより確認された。重要なことに、ＫＬＦ９抗体は３２bp結合タンパク質の量を減少させ（図４ｄ）、in vivoでも３２bp結合タンパク質（複合体）にＫＬＦ９が含まれることを示唆した。
これらの結果を確認するために、ＥＭＳＡ競合解析を実施した。複合体Ｉは、過剰量のＫＬＦ共通配列であるＢＴＥによって完全に競合阻害されることが見出された。（データ示されず）。対照的に、ＮＦ−κＢ共通配列は、明らかに、効果的ではなかった（データ示されず）。
これらの知見を更に確認するために、染色質免疫沈降アッセイを実施した。ＫＬＦ９は、実際に、３２bp部位を含む内在性アディポネクチンプロモータ領域に結合することが見出された（図４ｅ）。さらに、精製したＫＬＦ９によっても、脂肪細胞又は脂肪組織から調製した核抽出物による３２bpフラグメントの阻害とほぼ同じ阻害が見られた（図４ｆ）。
【００６２】
〔実施例６〕ＫＬＦ９の発現は脂肪細胞の分化に従い増大し、一方、脂肪細胞の肥大に従い低下した
次に、脂肪細胞の分化の過程、及び脂肪細胞の肥大化の過程におけるＫＬＦ３及び９の発現を調べた。ＫＬＦ９の発現は、脂肪細胞の分化の過程で増大したが、脂肪細胞の肥大の過程では逆に低下した（図５ａ、下）。対照的に、ＫＬＦ３の発現レベルは、脂肪細胞の分化と肥大との双方の過程で低下した（図５ａ、上）。さらに、ＫＬＦ９のｍＲＮＡレベル（図５ａ）及びタンパク質レベル（図５ｂ）は肥満したｏｂ／ｏｂマウスよりも、痩せた対照Ｃ５７ＢＬ６マウスで高かった。この結果は３２bp結合タンパク質の量と相関すると予想され、ＫＬＦ９の発現レベルがアディポネクチンのプロモータ活性、及びアディポネクチンの発現レベルを調節し得るという可能性が強く示唆された。【００６３】
〔実施例７〕ＫＬＦ９の発現は、エンハンサー及びアディポネクチンプロモータ活性、３２bp結合タンパク質の量、並びにアディポネクチン発現を増大させた
３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）（図６ａ〜ｃ）又はレトロウイルスを用いて３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）内で（図６ｄ〜ｆ）、ＫＬＦ９を一過的に過剰発現させ、エンハンサー活性、アディポネクチンプロモータ活性、３２bp結合タンパク質量、およびアディポネクチン発現量を解析した（図６）。３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）でのＫＬＦ９の過剰発現は、アディポネクチンプロモータ活性（−１３６７／＋３５）（図６ａ）、３２bp（−１８８／−１５７）エンハンサー活性（図６ｃ右パネル）及び３２bp結合タンパク質の量（図６ｅ）を増大させた。ＫＬＦ９は、アディポネクチンプロモータ活性を増大し得ること（図６ａ）及び３２bpエレメントがＫＬＦ９に高い反応性を有すること（図６ｃ、ｅ）を立証した。
さらに、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞内でのレトロウイルスによるＫＬＦ９の定常的な過剰発現（図６ｄ）は、アディポネクチン発現を増大させた（図６ｆ）。これらのデータは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）におけるＫＬＦ９の過剰発現が、３２bp結合タンパク質の量、３２bpエンハンサー活性、アディポネクチンプロモータ活性及びアディポネクチン発現を３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）で観察されたレベルまで回復できることを示唆した。【００６４】
〔実施例８〕ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ９発現の抑制は、３２bp結合タンパク質の量及びアディポネクチン発現をin vitroで低下させた
次に、アディポネクチン発現に対するＫＬＦ９の機能的重要性を調べるために、ＫＬＦ９発現を低下させた際の効果を検討した。ＫＬＦ９発現抑制の手法として、ｓｉＲＮＡ（Miyagishi, M. & Taira, K. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).）を用いた。ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ９発現の抑制（図７ａ）は、ＫＬＦ３発現には大きな影響はなかった（図７ａ）。一方、３２bp結合タンパク質の発現レベルは、ＫＬＦ９発現抑制により、顕著に低下し（７ｂ）、これと同時に、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１０日）におけるアディポネクチン発現を大幅に低下させた（図７ａ）。これらのデータは、ＫＬＦ９が３２bpエンハンサー結合タンパク質複合体の形成及びアディポネクチン発現に必要であることを示す。【００６５】
〔実施例９〕遺伝子ターゲティングによるＫＬＦ９発現の破壊は、３２bp結合タンパク質の量及び血漿アディポネクチンレベルをin vivoで低下させた
次に、in vivoでのアディポネクチン発現とＫＬＦ９との機能的関連性を調べるために、ＫＬＦ９ノックアウトマウスの表現型を解析した（図８）（Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).）。興味深いことに、３２bp結合タンパク質は、ＫＬＦ９ノックアウトマウス「ＷＡＴ」由来の核抽出物中には検出されなかった（図８）。重要なことに、ＫＬＦ９ノックアウトマウスの体重は対照の野生型同腹仔よりも少なかったにもかかわらず、ＫＬＦ９ノックアウトマウスの血漿アディポネクチンレベルは対照の野生型同腹仔よりも低かった（図８）。対照的に、ＫＬＦ３ノックアウトマウスとその対照の野生型同腹仔との間では、血漿アディポネクチンレベルの差は無かった（データ示されず）。これらのデータは、ＫＬＦ９がin vivoでアディポネクチンレベルの調節に重要な役割を果たすことを示唆した。
【００６６】
〔実施例１０〕脂肪細胞の肥大化が脂肪細胞におけるＫＬＦ９発現を調節する機序
次に、脂肪細胞の肥大化が脂肪細胞におけるＫＬＦ９発現を調節する機序であるか否かを解析した。ＫＬＦ９発現は、エネルギー消費に関与することが知られている甲状腺ホルモンにより誘導されると報告されている（Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).）。そのため、先ず甲状腺ホルモンレセプターαの発現をin vitro及びin vivoで調べた。興味深いことに、甲状腺ホルモンレセプターαの発現レベルは、３Ｔ３Ｌ１大型脂肪細胞（第１９日）又は肥満モデルｏｂ／ｏｂマウスでは、それぞれ、３Ｔ３Ｌ１小型脂肪細胞（第１０日）又は痩せた対照のＣ５７ＢＬ６マウスと比較すると低下していた（図９ａ、ｂ）。その上、甲状腺ホルモンと３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（第１９日）とのインキュベーションは、ＫＬＦ９発現を増大させた（図９ｃ）。
ＫＬＦ９プロモータがＡＰ−１部位を含むと報告されている（Chen, A. et al., Mol. Cell. Biol. 20, 2818-2826 (2000).）ことから、酸化ストレスが脂肪細胞肥大によるＫＬＦ９の発現制御に関与し得るとの仮説を立てた。興味深いことに、ｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）のインヒビターは、また抗酸化性Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）とともに、ＫＬＦ９（図９ｄ）と同時にアディポネクチン（９ｅ）の発現を増大させた。これらの発現増大には甲状腺ホルモンレセプターαの関与はなかった（データ示されず）。これらのデータは、ＫＬＦ９発現を増大させる上流の機序が、少なくとも部分的には、二つの経路（一方は、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）αシグナル伝達経路であり、他方は、ＴＲαの発現とは無関係であるが、酸化ストレスに依存する）からなる可能性があることが示唆された。【００６７】
上記仮説をさらに確認するために、脂肪細胞の肥大化過程における酸化ストレスの推移を測定した。３T３−L1細胞（第１０日目および第１９日目）から抽出したゲノムDNAを分解し、ゲノムDNA分解産物中に存在する8-OHdG（ｄGの酸化型）の量を特異抗体によるELISAによって測定した。8-OHdGの量は分化に伴い増加していた（図１０）。肥大化に伴う8-OHdGの増加の原因を解析するために、脂肪細胞肥大化に伴う抗酸化活性の推移を調べた。抗酸化活性は、3T3-L1細胞（第１０日目および第１９日目）の融解物中における、メトミオグロブンによるABTSのラジカル化を防ぐ活性として検出した。脂肪細胞の肥大化に伴い抗酸化活性が低下することが示された（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
ＫＬＦ９の分子的特定は、肥満症及び糖尿病やアテローム性硬化症のような肥満症関連疾患におけるアディポネクチン／Ａｃｒｐ３０の下向調節の分子的機序の理解と、ＫＬＦ９を分子的標的とする新規な抗糖尿病及び抗アテローム性硬化症薬の設計を促進するはずである。
【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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