(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｖを有する、ジ−又はトリペプチド、
【化１】
0004798930.tif 000014
（ここで、Ｒ1は、アルキルオキシであり、Ｒ3は、ＮＨ2、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2、ＮＯ2、Ｆ又はＨであり、Ｒ4は、天然環状アミノ酸又はＨである）又は薬理学的に受容可能なその塩。
【請求項２】
医薬として使用する為の、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
悪性腫瘍の治療用医薬の製造の為の、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項４】
Ｒ3がＦである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｌ−メルファラニル−ｐ−Ｌ−フルオロ−フェニルアラニンエチルエステル又は薬理学的に受容可能なその塩である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｌ−メルファラニル−ｐ−Ｌ−フルオロ−フェニルアラニンイソプロピルエステル又は薬理学的に受容可能なその塩である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｌ−プロリニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステル又は薬理学的に受容可能なその塩である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
悪性腫瘍の治療用薬理学的組成物であって、請求項１又は４〜７の何れか一項に記載の少なくとも一種のペプチド化合物と、少なくとも一種の薬理学的に受容可能な担体及び／又は賦形剤を含む事を特徴とする組成物。
【請求項９】
乳癌、肺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫の治療の為の、請求項８に記載の薬理学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アルキル化された癌の化学治療薬として有用な新規なメルファラン誘導体に関する。
（発明の背景）
癌は、重大で、且つ時には致命的な病気である。従って、癌の治療の為の新しい治療方法を開発する為の努力は、研究分野の常に変わらぬ努力の一つである。癌の巨大な主要部は固体腫瘍、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌として存在し、一方、残りの部分は血液学的且つリンパ系悪性腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫である。
化学療法は、病気を治療又は軽減しようとする時に使用される。殆どの場合、この治療法は、作用形態の異なる二種以上の薬が、抗腫瘍効果を最大限にし、且つ、副作用を最小限にする為に一緒に使用される時に、組合わせ化学療法の形態で行われる。化学療法で得られる結果は腫瘍のタイプによって変動する。幾つかの腫瘍は非常に敏感で、従って、その治療は治癒に繋がる可能性が高い。このタイプの腫瘍の例としては、急性白血病、悪性リンパ腫、精巣癌、睾丸癌及びウイルムス腫瘍がある。腫瘍の別のグループにおいては、化学療法は良好な治癒と長期の生存をもたらす事ができる。その様な腫瘍の例としては、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、小細胞肺癌、膀胱癌、多発性骨髄腫及びリンパ系及び骨髄系の両方の慢性白血病がある。主要な薬剤抵抗性腫瘍には、例えば、悪性神経膠腫、メラノーマ、前立腺癌、肉腫及び結腸直腸癌以外の胃腸腫瘍がある。
【０００２】
アルキル化剤、例えば、ビス（２−クロロエチル）アミン誘導体であるナイトロジェンマスタードから誘導された薬剤は、広範囲の腫瘍性疾患の治療において化学療法薬として使用される。これらの薬剤は、全て、ＤＮＡ又は蛋白質中で求核的ヘテロ原子との共有相互反応によって作用する。これらの二官能性試薬は、ストランド間の二重らせん内でＤＮＡ鎖を架橋し、或いは、ＤＮＡと蛋白質との間を架橋することができる。この架橋は、ＤＮＡの複製及び、その後の細胞死を伴う転写に抑制効果をもたらす。この薬剤は、単独試薬として、或いは、その他の抗腫瘍薬との組合わせで使用する事ができる。アルキル化剤は、早く成長する組織に対して幾らかの性向を有する様に思われる。それらは、広範囲の腫瘍において効果を発揮する。副作用は、主として、骨髄に限定され、非常に高い投与量では胃腸管に限定される。
【０００３】
メルファラン、又は、ｐ−ビス−（２−クロロエチル）−アミノフェニル−アラニンは、ナイトロジェンマスタードとアミノ酸フェニルアラニンの接合体であり、１９５０年の半ばに合成された（ＵＳＡ−３，０３２，５８４）。この古いアルキル化物質は、間もなく、化学療法分野において有益な薬剤となり、今尚、例えば、骨髄腫の治療にとって重要なものである。メルファランは、初め、メラニン合成において多量のフェニルアラニンを利用するメラノーマ細胞に対する選択的細胞毒剤として開発されたものである。転移性メラノーマの治療でのメルファランの臨床使用は、然しながら、限定された効力を持つものであった。
悪性細胞に対する更なる選択的作用を研究する段階で、メルファラン誘導体が合成された。
【０００４】
サルコリシン(sarcolysine)、即ち、ｍ−ビス−（２−クロロエチル）アミノフェニルアラニンは、ビス−（２−クロロエチル）アミノ基をフェニルアラニンのパラ位からメタ位に移動させる事によって得られた。サルコリシンのアミノ基及びカルボキシレート基における異なるアミノ酸の共有結合によって、Peptichemio(PTC)として公知のペプチド混合物が調製された。ＰＴＣは、６個の異なるペプチドから成っていた(de Barpieri, "Proceedings of the symposium on Peptichemio", Milan, November 18, 1972)。ＰＴＣは、次いで、幾つかの腫瘍タイプ及びメルファランを含むアルキル化剤での治療に抵抗する腫瘍に活性である事が示され、見込みのある結果を伴う臨床試験に組み込まれた。ＰＴＣの効果及び用法を理解するに当って、それが６個のペプチドの混合物であると言う事が重大な欠点であった。ＰＴＣ中に含まれる異なるペプチドのそれぞれの細胞毒効果が、従って、別々に測定され(Lewensohn et al., Anticancer Research 11: 321-324 (1991))、そして、このペプチドの細胞毒性には広い変動があることが分かった。このペプチドの一つである、Ｌ−プロリル−ｍ−Ｌ−サルコリシル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（Ｐ２）は、その他のペプチドよりもＲＰＭＩ８３２２メラノーマ細胞にとってより毒性であることが判明した。
【０００５】
Lopatin et al., (CA 79:100709, Farmakol. Toksikol. (Moscow), 1973, 36(4), 479-480)は、メルファラン誘導体のアサリー(asaley)及びアスチロン(astyron)の投与が、ラットでの肉腫４５の成長を抑制した事を開示している。アスチロン、即ち、Ｎ−アセチル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−チロシン、及び、アサリー、即ち、Ｎ−アセチル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−バリンエチルエステルは、一般的に、腫瘍に対するこの化合物の細胞毒性が、非アセチル化形態に比べて著しく減少している事を意味するアセチル化アミノ基を有する。
Romanova et al.(CA 66:27517, Vopr. Med. ZKhim, 1966, 12(6), 586-91)は、サルコリシン又はサリン(salin)（西側の命名法によれば、Ｌ−メルファラニル−Ｌ−バリンと命名されるべきものである）と呼ばれる化合物に言及している。この化合物は、ラットのレバーホモジネートとジェンセン(Jensen)肉腫細胞由来のミトコンドリア中の酸化的リン酸化反応を中断させた。
【０００６】
メルファラン誘導体の命名法に関しては少しだけ混乱が存在する。１９５５年に、英国の研究グループが、芳香族環のパラ−位においてビス−（２−クロロエチル）アミノ基で置換されたフェニルアラニン誘導体の合成と細胞毒活性を報告した時、ＤＬ、Ｌ及びＤ異性体は、それぞれ、メルファラン(merphalan)、メルファラン(melphalan)及びメドファラン(medphalan)と命名された。同じ頃に、ロシアのグループは、単独に、４−［ビス−（２−クロロエチルアミノ）］−フェニルアラニンサルコリシンのラセミ体（ＤＬ）を命名した。その後、この「サルコリシン」と言う用語は、又、メタ−フェニルアラニンマスタードの為に使用され始めた。この命名の混乱は続いているが、今日、メルファラン(melphalan)とサルコリシンは、普通、それぞれに、パラ−及びメタ−誘導体に対して使用される。
【０００７】
Kupczyk-Subotkowska et al. (Journal of Drug Targeting, 1997, 4(6), 359-370)は、癌細胞中へのメルファランの蓄積を高める為に設計されたメルファランの誘導体を開示している。メルファランとバリン又はグルタミン酸を含む多数のジペプチドがテストされた結果、前記のジペプチド及びそのエステルの細胞摂取は、恐らく、アミノ酸又はオリゴペプチドトランスポーターによるのではなく、受動拡散を介して生起したものと結論付けられた。
二官能性アルキル化剤の用法における一つの問題は、第一の、即ち、固有の、そして、第二の、即ち、後天的の治療に対する腫瘍抵抗である。患者に投与されるアルキル化剤の投与量を増加させる事によって抵抗を回避する試みが為されている。然しながら、腫瘍細胞水準において有効な投与量をどの程度増加させれば良いのかが明確ではない。
【０００８】
様々な腫瘍疾患、特に、通常の治療に対して第一の抵抗を示す腫瘍、及び／又は、通常の癌化学療法での治療に応答した後に、抵抗、即ち、第二の抵抗を発達された腫瘍疾患において新しい抗腫瘍薬に対する緊急要請が存在する。
（発明の開示)
本発明の目的は、ヒト腫瘍細胞において、改善された細胞毒活性を有するメルファラン誘導体を提供することである。
本発明は、メルファラン単位及び、１個又は2個の付加アミノ酸又はアミノ酸誘導体を含むジペプチド及びトリペプチド、医薬としての前記ペプチドの使用、及び、医薬、特に、様々な悪性腫瘍の治療の為の医薬として使用する為の、本発明のペプチドを含む薬理学的組成物に関する。
【０００９】
本発明のメルファラン誘導体は、様々な腫瘍のタイプに多大な効力を示す。本発明のペプチドの腫瘍細胞の摂取及び細胞間の蓄積が増加すると言うのが本発明者の考えである。
本発明は、アルキル化ジ−又はトリペプチドを形成する、１種又は２種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体に共有結合した、ｐ−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンマスタード、即ち、Ｌ−ＰＡＭ、及び、ｐ−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｄ−フェニルアラニンマスタード、即ち、Ｄ−ＰＡＭを含むフェニルアラニンマスタードの新規なペプチドに関する。然しながら、Ｌ−形態が好ましい。
【００１０】
本発明は、新規なメルファラン誘導体、特に、式Ｉ：
【化５】
0004798930.tif 000002
［ここで、Ｒ1は、アルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、ＮＨ2、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ又はアリールアミノであり、Ｒ2は、
【００１１】
【化６】
0004798930.tif 000003
（ここで、Ｒ3は、独立的に、ＮＨ2、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アシル、ＮＨ−アシル、Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2、ＮＯ2、Ｆ、ＣＦ3又はＨであり、ｎは１又は２である）であり、Ｘは、
【００１２】
【化７】
0004798930.tif 000004
（ここで、Ｒ5はＨである）であり、Ｒ4は、天然又は変性された環状又は芳香族アミノ酸、又はＨである）である］を有するジ−又はトリペプチド及び薬理学的に受容可能なその塩に関する。
【００１３】
前記式において、アルキルは、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルである。
式Ｉのｎが１である場合は、置換体Ｒ3は、オルト−、メタ−又はパラ−位にあることができる。ｎが２の場合は、二つの置換体Ｒ3は、同じである事もできれば、異なる事もできる。
天然アミノ酸とは、生物中に普通に存在しその機能を発揮するアミノ酸を意味する。変性アミノ酸とは、幾つかの方法で、天然アミノ酸とは異なる化学構造及び化学組成に変性されたアミノ酸を意味する。天然の環状アミノ酸の例としては、プロリンがあり、芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンがある。
【００１４】
メルファラン分子のＮ−末端は、アミド又はカルバメートとして保護されるべきではない。この事は、この化合物の保護された形態は、一般的に、相当する遊離形態よりも細胞毒活性が低いので、Ｒ4は、保護基、例えば、ホルミル、アセチル又はプロピオニル、又はベンゾイルの様な保護基であるべきではない事を意味する。
薬理学的に受容可能な塩は、例えば、酸付加塩、例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ及びメタンスルホン酸の塩である。
本発明の好ましいジ−又はトリペプチドは、式Ｖ：
【００１５】
【化８】
0004798930.tif 000005
（ここで、Ｒ1は、アルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、ＮＨ2、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ又はアリールアミノ基であり、Ｒ3は、ＮＨ2、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アシル、ＮＨ−アシル、Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2、ＮＯ2、Ｆ、ＣＦ3又はＨであり、Ｒ4は、天然又は変性された環状又は芳香族アミノ酸、又はＨである）及び薬理学的に受容可能なその塩を有する。
【００１６】
本発明のペプチドで特に興味のあるグループは、式Ｉ又はＶ（ここで、Ｒ3はＦである）のペプチドである。
本発明のジペプチドは、式Ｉ又はＶ（ここで、Ｒ1はアルキルオキシであり、Ｒ3は、Ｆ、ＣＦ3、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＮＯ2、Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2、ＮＨ−アシル又はＮＨ2であり、Ｒ4はＨである）のペプチドである。
好ましいジペプチドの例は、Ｌ−メルファラニル−ｐ−Ｌ−フルオロ−フェニルアラニンエチルエステル（Ｊ１）、Ｌ−メルファラニル−ｐ−Ｌ−フルオロ−フェニルアラニンイソプロピルエステル（ＪＶ２８）及び薬理学的に受容可能なその塩である。
【００１７】
本発明のトリペプチドは、式１又はＶ（ここで、Ｒ1はアルキルオキシであり、Ｒ3は、Ｆ、ＣＦ3、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＮＨ−アシル、ＮＯ2、Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2又はＮＨ2であり、Ｒ4は、天然又は変性された環状又は芳香族アミノ酸である）のペプチドである。
好ましいトリペプチドの例は、Ｌ−プロリル−Ｌ−メルファラニル−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステル（Ｊ３）及び薬理学的に受容可能なその塩である。
【００１８】
本発明の全てのジペプチド誘導体は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）−保護のメルファランから合成できる。Ｂｏｃ−メルファランの、異なるエステル又はアミドへのカップリングは、カップリング剤として、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）／トリエチルアミン、又は１−［３−ジメチルアミノ］プロピル］−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）／Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使用して行われた。シリカゲルクロマトグラフィーを使用する精製方法で純粋生成物を単離した。Ｂｏｃ基の脱離は、ＨＣｌ飽和エチルアセテート中で行った。ジペプチドハイドロクロライド塩は、エタノール／ジエチルエーテル中で再結晶化によって精製された。
【００１９】
トリペプチド誘導体の合成において、Ｂｏｃ−保護アミノ酸は、カップリング剤としてＥＤＣ／ＮＭＭ／ＨＯＢｔを使用してジペプチド誘導体を含むメルファランにカップリングされた。ＨＣｌ飽和エチルアセテートを使用する脱保護と、それに続く再結晶化（ＥｔＯＨ／ジエチルエーテル又はＥｔＯＡｃ／ジエチルエーテル）によって、純粋なトリペプチドハイドロクロライド塩が単離された。
又、本発明は、医薬として、及び悪性腫瘍の治療用医薬の製造の為の上述のペプチドの使用に関する。
本発明のアルキル化ペプチドは、異なる組織の腫瘍細胞系及びＬ−ＰＡＭ抵抗を示す腫瘍細胞系において、メルファラン及びＬ−プロリル−Ｌ−サルコリシル−ｐ−Ｌ−フルオロフェニルアラニンエチルエステル（Ｐ２）に比べて、効力の増加と共に広範囲の活性を示すことが分かった。更に、このアルキル化ペプチドは、以下で与えられるサンプルにおいて示される様に、血液学的及び固体の両方の、異なる組織から新たに得られたヒト腫瘍サンプルにおいて、メルファラン及びＰ２に比べて、著しく有効であることが分かった。
【００２０】
本発明のペプチドは、以下の腫瘍疾患及び／又はそれぞれの疾患の段階の第一線の治療として、又は、放射線治療を併用した治療として、単独で、或いは、その他の薬剤との組合わせ、或いは、併用で使用されても良い。
（Ｉ）固体腫瘍：新アジュバント又はアジュバントとして、手術可能な乳癌及び進行した手術不可能な乳癌の治療に対して、ＬＤ（限定疾患）又はＥＤ（拡大疾患）タイプの小細胞肺癌に対して、新アジュバント治療として非小細胞肺癌の手術可能な段階に対して、非小細胞肺癌の手術不可能なＩＩＩＢ又はＶ段階に対して、手術可能な（新アジュバント）及び手術不可能な頭部と頚部の癌及び食道癌に対して、アジュバント治療として手術可能な卵巣癌と進行した卵巣癌に対して、進行した頚部癌に対して、手術による修正が出来ない皮膚の偏平上皮細胞及び基底細胞癌及び神経芽細胞腫に対して。上述の腫瘍タイプは、（１）アルキル化剤での治療には感応性を示すが、通常の治療では十分有効ではない腫瘍、或いは、（２）最初の緩解後にしばしば再発し、その段階で通常の治療に殆ど感応性を示さない（抵抗性）腫瘍を表す。新規なペプチドで治療することが妥当であると思われる腫瘍のその他のグループは、膀胱癌のそれぞれの段階、進行した前立腺癌、悪性メラノーマ、結腸直腸癌及び、アルキル化剤で一時的な結果がしばしば得られる軟組織肉腫である。治療する為の腫瘍の更にその他のグループは、腎臓癌の様な一般的に薬剤抵抗性の腫瘍及び脳腫瘍である。
【００２１】
（ＩＩ）血液及びリンパ性腫瘍：多発性骨髄腫、高度及び低度のリンパ腫、Ｍｂ．Ｈｏｄｇｋｉｎ、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性又はリンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病。
本発明のその他の目的は、悪性腫瘍の治療の為の薬理学的に受容可能な組成物であり、この組成物は、少なくとも一種の上述のペプチドを、少なくとも一種の薬理学的に受容可能な担体及び／賦形剤と一緒に含む。
本発明の薬理学的組成物は、乳癌、肺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫の治療の為に使用することができる。
この薬理学的組成物は、薬剤分野の熟練者に公知の方法で調製される。担体又は賦形剤は、固体、半固体又は、活性成分の為のビヒクル又は媒体として役立つ事のできる液体物質であることができる。適当な担体又は賦形剤は当該技術分野において公知である。この薬理学的組成物は、非経口、経口又は局所使用の為に適用することが出来、患者には、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、軟膏等で投与することができる。
【００２２】
非経口投与の為には、本発明のペプチドは、溶液又は懸濁液の中に導入することができる。非経口投与は、注射による投与、例えば、静脈内、関節内、くも膜下腔内、胸膜内、腫瘍内、又は、腸腔内注射による投与又は膀胱内注射による投与を意味する。静脈内投与が好ましい。又、骨髄はin vitroで治療されてもよい。この薬理学的組成物は、本発明の活性ペプチドを、少なくとも０．００１質量％、好ましくは０．１〜１０質量％含むべきである。
又、溶液又は懸濁液は、次のアジュバントを少なくとも一種含むことができる：注射用の無菌希釈液、例えば水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール又はその他の合成溶剤、アスコルビン酸又はナトリウムビサルファイトの様な耐酸化剤、アセテート、シトレート又はホスフェートの様な緩衝液及び、塩化ナトリウム又はデキストロースの様な緊張調整の為の試薬。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス或いはプラスチックで造られた多重投与量容器の中に封入することができる。
【００２３】
静脈内注射の為には、本発明の薬理学的組成物は、バイアルＩが塩酸塩としてのペプチドと、任意に、担体又は、溶解度を増加するか安定性に有効な化合物を含み、バイアルＩＩが、プロピレングリコール／エタノールの混合物を含む二つのバイアルで投与されても良い。ペプチドは投与の直前に溶解され、５％グルコール又は生理食塩水と混合される。指定の投与量は、短時間注入の為には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であっても良い。
局所投与の為には、本発明のペプチドは、溶液又は懸濁液中、或いは軟膏中に導入することができる。前記組成物は、活性ペプチドを、少なくとも０．１質量％、好ましくは０．１〜１０質量％含むことができる。
【００２４】
本発明のその他の目的は、上述のペプチドの薬理学的に有効な投与量を投与する事を含む、それを必要とする対象物における悪性腫瘍の治療方法である。対象は、哺乳類、好ましくはヒトである。
（実施例）
実施例−化合物の合成
本発明のメルファラン誘導体の合成についての以下の実施例及び比較例において、全ての溶剤は分析又は合成グレードのものである。
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＨＯＢｔ；Ｎ−メチルモルフォリン、ＮＭＭ；及び／又は１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド、ＥＤＣ；又は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＰｙＢＯＰ；及びトリエチルがカップリング剤として使用された。融点は、Buchi Melting Point B-540装置で測定された。1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ４００ ＮＭＲ分光計で測定された。1Ｈ−スペクトルは、４００ＭＨｚで記録され、13Ｃ−スペクトルは１００ＭＨｚで記録された。反応は、アルミニウムシートを基板としたシリカ上で、紫外線及び／又はエタノール中の２％ニンヒドリンによる斑点の検出と、その後の加熱により、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターされた。カラムクロマトグラフィーは、フラッシュクロマトグラフィーを使用して、湿潤充填シリカ（シリカゲル ６０（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）、E. Merck）上で行われた。
【００２５】
出発化合物として使用されたＬ−メルファランは、Sigma社から得たもので、使用前にエタノールから再結晶化された。中間体のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファランは、Pai, N.N.; Miyawa, J.H.; Perrin, J.H.. Drug Dev. Industr. Pharm. 1996, 22, 181-184によって合成された。Ｌ−メルファラン（５００ｍｇ、１．６４ミリモル）をＴＨＦの５０％水溶液（５ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２０１μｌ、１．４４ミリモル）を添加した。この溶液を０℃に冷却し、ＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解したジ−ｔ−ジブチル−ジカーボネート（２１０ｍｇ、０．９６ミリモル）を滴加した。この溶液を０℃で３０分間攪拌し、次いで、室温（ＲＴ）で１８時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、水を加え、この溶液を１０％クエン酸でｐＨ５に酸性化した。酢酸エチルで三回抽出した後、一緒にした有機抽出物をＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を蒸発させ、残さを、溶出剤として、３：１と１９：１のクロロホルム：メタノールを使用して、シリカ上でフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、４８％の純粋生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．05（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．５８（ｄ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），4．98（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．４７（ｂｒ ｓ，1Ｈ，α−Ｈ），３．６９−３．４９（ｍ，8Ｈ，４ ＣＨ2−マスタード），３．１２−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ）， １．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ）。
【００２６】
実施例１
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（Ｊ１）
Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニン（２１７ｍｇ、１．１８ミリモル）を、前以って塩酸で泡立たせたＥｔＯＨ（５ｍｌ）に溶解した。反応を１００℃に設定し、１８時間還流させた。溶媒を蒸発させ、生成物を高真空下で乾燥し、乾燥白色結晶として、Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライドを得た（９８％）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ 7．３０−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），７．１３−７．０６（ｍ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），4．２９−４．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），３．３１−３．１０（ｍ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3，α−Ｈ）， １．２４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（１５７ｍｇ、０．３８７ミリモル）を、ジクロロメタン（４ｍｌ）に溶解した。ＰｙＢＯＰ（２０１ｍｇ、０．３８７ミリモル）とトリエチルアミン（５４μｌ、０．３８７ミリモル）を添加し、溶液を室温で１時間攪拌した。Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（９２ｍｇ、０．３８７ミリモル）とジクロロメタン（４ｍｌ）中のトリエチルアミン（５４μｌ、０．３８７ミリモル）の溶液を添加し、一晩中攪拌しながら反応を行った。飽和ＮａＨＣＯ3で、次いで、１０％クエン酸での抽出によって反応を停止した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発させ、２００ｍｇの黄色油を得た。これを、溶出剤として、エーテル：ペンタン（１：２、１：１、１：０）を使用して、勾配カラムクロマトグラフィーによって精製し、１０２ｍｇ（収率４３％）のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルを得た。これを、更に精製する事無しに、次の工程に使用した。
【００２７】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステル（６４ｍｇ、０．１１ミリモル）を、前以って塩酸（ガス）で泡立たせた５ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。この混合物を、室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去し、残さをＥｔＯＨ／Ｅｔ2Ｏから再結晶化した。白色結晶として、Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（Ｊ１）が単離された。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ 7．２３（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ， Ｐｈｅ），７．１３（ｄ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．０１（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），４．６８（ｄｄ，8Ｈ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），４．１２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）， ３．８０−３．６２（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．２２−２．８６（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ），１．２１（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
元素分析：ＣＨＮ ５３．７；５．８；７．９（計算値：５４．１；６．１；７．９）。
【００２８】
実施例２
Ｌ−プロリニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（Ｊ３）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリン（１２ｍｇ、０．０５４ミリモル）、Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（２４ｍｇ、０．０４５ミリモル）、ＨＯＢｔ（８ｍｇ、０．０５４ミリモル）及びＮＭＭ（７μｌ、０．０４５ミリモル）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、この溶液を０℃に冷却して、ＥＤＣハイドロクロライド（１１ｍｇ、０．０４５ミリモル）を添加した。この溶液を０℃で１時間攪拌し、次いで、室温で一晩攪拌した。反応混合物を１０ｍｌのジクロロメタンで希釈し、１０％のクエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3及びブラインで順次抽出して反応を停止した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させ、２７ｍｇ（８６％）のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルを得た。これを、更に精製する事無しに、次の工程に使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．０８−６．８９（ｍ，６Ｈ，Ｐｈ−Ｈ， Ｐｈｅ，Ｍｅｌ），６．６７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．５５（ｄ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．７２（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．５５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．２０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．１０（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）， ３．７４−３．５４（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．４２−３．２０（ｍ，２Ｈ，プロリン δ），３．１０−２．８６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），２．２０−１．７４（ｍ，２Ｈ，プロリン β、γ），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．１８（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００２９】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステル（２５ｍｇ）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（３ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去し、酢酸エチルとジエチルエーテルからの再結晶化によって、殆ど白色に近い結晶として、純粋なＪ３を９４％の収率（Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライドから計算した）で得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ 7．２６−６．９４（ｍ，６Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ，Ｍｅｌ），６．６８（ｄ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．６２−４．５５（ｍ，２Ｈ，α−ＣＨ），４．２０−４．０５（ｍ，３Ｈ，α−ＣＨ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７４−３．５４（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2−マスタード）， ３．２５−２．７５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ，プロリン δ），２．４０−１．８５（ｍ，４Ｈ，プロリン β、γ），１．２３（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３０】
実施例３
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２２）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（１５０ｍｇ、０．３７ミリモル）を、２．６ｍｌのジクロロメタンに溶解した。ＰｙＢＯＰ（１９９ｍｇ、０．３８ミリモル）とトリエチルアミン（１０４μｌ、０．７５ミリモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、２．６ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（１０４μｌ、０．７５ミリモル）と、フェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（８９ｍｇ、０．３９ミリモル）の溶液を添加した。４時間、室温で攪拌後、この反応を急冷した。２０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と２０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、ジクロロメタンを、２０ｍｌの合計容量まで添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、エーテル：ペンタンの勾配（２：２→３：１）、次いで、エーテルで、その後、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１９：１）を使用して、シリカ上でカラムクロマトグラフィーで精製した。適当画分を収集し濃縮して、白色固体の純粋なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルを得た（１１０ｍｇ、５１％）。Ｍｐ：１１７−１２０℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．２９−７．１６（ｍ，３Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），7．０６−６．９５（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．５７（ｄ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．２８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｐｈｅ），４．９２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｍｅｌ），４．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），４．１０（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７４−３．５０（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．１２−２．８４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．１８（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．０５（２ Ｃ：ｓ）（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５５．１０（Ｃ＝Ｏ，Ｂｏｃ），１４５．１０（Ｃ−４′），１３５．８４（Ｐｈ），１３０．７５（Ｐｈ），１２９．３９（２ Ｃ：ｓ），１２８．５４（2 Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２７．１３（Ｐｈ），１２５．０７（Ｃ−１′），１１２．２７（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），７９．８２（Ｃ−Ｂｏｃ），６１．５４（ＣＨ2ＣＨ3），５５．５１（α−ＣＨ），５３．５５（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．３２（α−ＣＨ），４０．５１（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３８．１３，３６．７３（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３５（３ Ｃ：ｓ）（ＣＨ3−Ｂｏｃ），１４．１７（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３１】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル（１００ｍｇ、０．１７ミリモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（６ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去し、酢酸エチルとジエチルエーテルからの再結晶化によって、僅かに黄色／褐色の固体として、純粋なＪＶ２２を得た（３７ｍｇ、４２％）。Ｍｐ：１２３−１２５℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．３１−７．１３（ｍ，７Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．７２（ｄ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），４．７３−４．６６（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ−Ｐｈｅ），４．１２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．９９−３．９２（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．７７−３．６４（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．２０−２．８５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．１８（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．０５，１６８．４２（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１４５．９６（Ｃ−４′），１３６．５５（Ｐｈ），１３０．４３（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−３′），１２８．９０（２ Ｃ：ｓ），１２８．２７（２ Ｃ：ｓ），１２６．１０（Ｐｈ），１２２．３５（Ｃ−１′），１１２．５８（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），６１．２３（ＣＨ2ＣＨ3），５４．２９，５４．２５（α−ＣＨ），５３．０６（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），４０．２６（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．１２，３６．２９（ＣＨ2−Ｐｈ），１３．１０（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３２】
実施例４
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−チロシンエチルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２４）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（１５０ｍｇ、０．３７ミリモル）を、ジクロロメタン（３ｍｌ）に溶解した。ＰｙＢＯＰ（１９９ｍｇ、０．３８ミリモル）とトリエチルアミン（１０４μｌ、０．７５ミリモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、３ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（１０４μｌ、０．７５ミリモル）と、チロシンエチルエステルハイドロクロライド（９４ｍｇ、０．３８ミリモル）の溶液を添加した。室温で１００分攪拌後、この反応を急冷した。２０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と２０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、ジクロロメタンを、２０ｍｌの合計容量まで添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、エーテル：ペンタン（２：１→４：１→１：０）、次いで、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１９：１→９７：３）の勾配溶出システムを使用して、シリカ上でカラムクロマトグラフィーで４回精製した。無色の油として純粋なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−チロシンエチルエステルが単離された（５９ｍｇ、２７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．０５−６．９２（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ−Ｍｅｌ），６．８６−６．７４（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ−Ｐｈｅ），６．５９−６．４３（ｍ，2Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．４２−６．３６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ，Ｐｈｅ），５．００（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｍｅｌ），４．８１−４．７０（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），４．１２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７０−３．５３（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．０３−２．８５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．２１（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．２１（２ Ｃ：ｓ）（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５５．３１（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ＝Ｏ Ｂｏｃ及びＣ−４″），１４４．９６（Ｃ−４′），１３０．７０（２ Ｃ：ｓ），１３０．４７（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２７．１２（Ｐｈ），１２５．２１（Ｃ−１′），１１５．５２（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１２．３１（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），８０．０９（Ｃ−Ｂｏｃ），６１．６１（ＣＨ2ＣＨ3），５５．８４（α−ＣＨ），５３．５６（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．２５（α−ＣＨ），４０．５５，４０．５０（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．３２（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３６（３ Ｃ：ｓ）（ＣＨ3−Ｂｏｃ），１４．２２（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３３】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−チロシンエチルエステル（４８ｍｇ、８１μモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（４ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去し、酢酸エチルとジエチルエーテルからの再結晶化によって、僅かに褐色な固体として、純粋なＪＶ２４を得た（１３ｍｇ、３０％）。Ｍｐ：１５０−１５４℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．１６−６．８６（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．７５−６．６５（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），４．６８−４．５９（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ−Ｐｈｅ），４．１３（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），４．０２−３．９４（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．７７−３．６０（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．２１−２．７１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２０（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７０．９４，１６８．０８（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５６．１２（Ｃ−４″），１４５．６８（Ｃ−４′），１３０．４１（２ Ｃ：ｓ），１２９．６８（２ Ｃ：ｓ），１２７．０３（Ｐｈ及びＣ−３′），１２５．８６（Ｃ−１′），１１４．９８（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１２．３４（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），６０．８０（ＣＨ2ＣＨ3），５４．４８，５４．２７（α−ＣＨ），５３．０７（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），４０．１９（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３６．３２（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｐｈ），１２．６４（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３４】
実施例５
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２５）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−チロシンエチルエステル（２２８ｍｇ、０．７４ミリモル）を、１５ｍｌのアセトンに溶解し、Ｋ2ＣＯ3（１２３ｍｇ、０．８９ミリモル）を添加した。硫酸ジメチル（７７．５μｌ、０．８１ミリモル）を注意深く添加し、溶液を２０時間還流させた。濾過によって固体Ｋ2ＣＯ3を除去し、アセトンを真空で除去した。溶出剤として、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ヘプタン（４：１：５）を使用して、シリカ上でカラムクロマトグラフィーでの精製により、透明な油として、２１４ｍｇ（９０％）のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンエチルエステルを得た。この中間体を、更に精製する事無しに、次の工程に使用した。
【００３５】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンエチルエステル（１６５ｍｇ、０．５１ミリモル）を、ＣＨＣｌ3（８．５ｍｌ）に溶解し、ヨードトリメチルシラン（１６８μｌ、１．２２ミリモル）を添加した。溶液を室温で４０分間攪拌した。この反応を、ＭｅＯＨ（１７５μｌ、４．３ミリモル）を添加して急冷した。溶媒並びに過剰のヨードトリメチルシランを真空で除去し、褐色−オレンジ色の固体として、１６９ｍｇ（１４９％）の粗生成物（Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンエチルエステル）得た。これを、更に精製する事無しに、次の工程に使用した。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ ７．１６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．９０（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），４．２８−４．１８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3，α−ＣＨ），３．７８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），３．２１−３．０８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（１５０ｍｇ、０．３７ミリモル）を、３ｍｌのジクロロメタンに溶解した。ＰｙＢＯＰ（１９９ｍｇ、０．３８ミリモル）とトリエチルアミン（１０４μｌ、０．７５ミリモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、３ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（１０４μｌ、０．７５ミリモル）と、Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニン（１２４ｍｇ、０．５５ミリモル）の溶液を添加した。溶液を一晩中、室温で攪拌した。２０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と２０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、ジクロロメタンを、２０ｍｌの合計容量まで添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、エーテル：ヘプタン（３：１）で２回、そして、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１９：１）で２回使用して、シリカ上でフラッシュカラムクロマトグラフィーで４回精製した。白色固体として、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンエチルエステルを得た（１５０ｍｇ、６６％）。Ｍｐ：１２５−１２７．５℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．０６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．９０（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），６．５９（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．３１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｐｈｅ），４．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｍｅｌ），４．７１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．２７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），４．１０（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），３．６９−３．５６（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．００−２．８５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．１９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．１１，１７０．９１（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５８．７２（Ｃ−４″），１５５．３０（Ｃ＝Ｏ，Ｂｏｃ），１４５．０３（Ｃ−４′），１３０．７６（２ Ｃ：ｓ），１３０．３９（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２７．７５（Ｐｈ），１２５．３６（Ｃ−１′），１１３．９６（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１２．２８（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），８０．１２（Ｃ−Ｂｏｃ），６１．５０（ＣＨ2ＣＨ3），５５．８１（α−ＣＨ），５５．２７（ＯＣＨ3），５３．５５（２ Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．４６（α−ＣＨ），４０．５２（２ Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．３３，３７．２３（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３４（３ Ｃ：ｓ）（ＣＨ3−Ｂｏｃ），１４．２０（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３６】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンエチルエステル（１４０ｍｇ、０．２３ミリモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（１７ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去した。粗生成物をエタノールに溶解し、次いで、ジエチルエーテル中で沈殿させ、白色の固体として、ＪＶ２５を得た（４５ｍｇ、３６％）。Ｍｐ：１７０−１７３℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．１７−７．０７（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．８３（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），４．６８−４．６１（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．１３（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．９９−３．９４（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．７７−３．５９（ｍ，１１Ｈ，ＯＣＨ3及びＣＨ2−マスタード），３．１７−２．８２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．１９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．１１，１６８．４１（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５８．９１（Ｃ−４″），１４６．１０（Ｃ−４′），１３０．４４（２ Ｃ：ｓ），１２９．９４（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２８．３８（Ｐｈ），１２２．１８（Ｃ−１′），１１３．６７（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１２．１８（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），６１．１９（ＣＨ2ＣＨ3），５４．４５，５４．３７，５４．２９（α−ＣＨ及びＯＣＨ3），５２．９９（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），４０．３１（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３６．３４，３６．２９（ＣＨ2−Ｐｈ），１３．１４（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３７】
実施例６
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２６）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニン（３９５ｍｇ、１．２７ミリモル）を、塩酸で飽和したエタノール（２０ｍｌ）に溶解した。溶液を２０時間還流しながら加熱した。混合物はＣＨＣｌ3と１ＭＨＣｌ（ｐＨ４）に分配された。水性層を５％ＫＯＨでｐＨ１０に塩基性化し、次いで、ＣＨＣｌ3で４回抽出した。有機層を一緒にし、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮して、薄い黄色状油として、Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニンエチルエステルを得た（１９５ｍｇ、６５％）。これを、更に精製する事無しに、次の工程で使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ８．１４（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），４．１４（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７１（ｔ，１Ｈ，α−ＣＨ），３．１６−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２２（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３８】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（８６ｍｇ、０．２１ミリモル）を、３ｍｌのジクロロエタンに溶解した。ＰｙＢＯＰ（１１５ｍｇ、０．２２ミリモル）とトリエチルアミン（５８μｌ、０．４２ミリモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、３ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（２９μｌ、０．２１ミリモル）と、Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニンエチルエステル（５５ｍｇ、０．２３ミリモル）の溶液を添加した。溶液を一晩中、室温で攪拌した。１０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と１０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、ジクロロメタンを、１０ｍｌの合計容量まで添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（９：１と１９：１）を使用して、シリカ上でフラッシュカラムクロマトグラフィーで２回精製した。明るい黄色の固体として、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニンエチルエステルを得た（９０ｍｇ、６９％）。Ｍｐ：１５２−１５５℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ８．０９−８．０２（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．２１−７．０１（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．５７（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．５０−６．４４（ｍ，１Ｈ，ＮＨ，Ｐｈｅ），４．９２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｍｅｌ），４．７７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），４．１１（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７０−３．５３（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．２５−３．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ，Ｐｈｅ），２．９７−２．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ，Ｍｅｌ），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．１９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．３１，１７０．４０（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５５．４６（Ｃ＝Ｏ，Ｂｏｃ），１４７．１４（Ｐｈ），１４５．１０（Ｃ−４′）、１４３．８５（Ｐｈ），１３０．６８（２ Ｃ：ｓ），１３０．４１（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２５．２１（Ｃ−１′），１２３．６２（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１２．４０（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），８０．４５（Ｃ−Ｂｏｃ），６１．９５（ＣＨ2ＣＨ3），５５．９８（α−ＣＨ），５３．５４（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．０３（α−ＣＨ），４０．４６（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．８６，３７．００（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３３（３Ｃ：ｓ），１４．２０（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００３９】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニンエチルエステル（８０ｍｇ、０．１３ミリモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（６ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を真空で除去した。粗生成物をエタノールに溶解し、次いで、ジエチルエーテル中で沈殿させ、明るいオレンジ色の固体として、ＪＶ２６を得た（５５ｍｇ、７６％）。Ｍｐ：１３８−１４２℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ８．２０−８．０６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．５２−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．１７−６．８５（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．７７−６．６０（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），４．１６（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），４．００−３．９４（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．７９−３．５４（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．１９−２．７１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２１（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７０．４６，１６８．２９（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１４７．１６（Ｐｈ），１４５．６１（Ｃ−４′），１４４．６７（Ｐｈ），１３０．９６（２ Ｃ：ｓ），１３０．２４（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２６．７２（Ｃ−１′），１２３．２６（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１５．４５（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），６１．５３（ＣＨ2ＣＨ3），５４．７６，５４．０８（α−ＣＨ），５３．５４（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），３９．２２（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３６．７５，３６．３３（ＣＨ2−Ｐｈ），１３．１６（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００４０】
実施例７
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−メルファランエチルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２７）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（３５ｍｇ、８６μモル）を、ジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解した。ＰｙＢＯＰ（４３ｍｇ、８３μモル）とトリエチルアミン（２３μｌ、１６２μモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、２ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（２３μｌ、１６２μモル）と、Ｌ−メルファランエチルエステルハイドロクロライド（３２ｍｇ、８７μモル）の溶液を添加した。室温で一晩攪拌し、１０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と１０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、更にジクロロメタン（１０ｍｌまで）を添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ヘプタン（４：１：７）と、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１９：１）を使用して、シリカ上でカラムクロマトグラフィーで精製し、褐色ゴムとして、純粋なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−メルファランエチルエステルを得た（２９ｍｇ、４９％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７．０６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．８７（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．６１−６．４６（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．９９（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．６８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．１２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７２−３．４７（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．０２−２．８７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．２１（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．１６，１７０．７１（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１５４．８７（Ｃ＝Ｏ， Ｂｏｃ），１４５．９１（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−４′及びＣ−４″），１３０．７９（２ Ｃ：ｓ），１３０．６８（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−３′及びＣ−３″），１２５．０８，１２４．３３（Ｃ−１′，Ｃ−″），１１２．３０（２ Ｃ：ｓ），１１２．０４（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′及びＣ−２″），７９．６５（Ｃ−Ｂｏｃ），６１．５０（ＣＨ2ＣＨ3），５５．８３（α−ＣＨ），５３．５７（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．５３（α−ＣＨ），４０．５５，４０．４７（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．０４，３６．９８（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３６（３ Ｃ：ｓ）（ＣＨ3−Ｂｏｃ），１４．２４（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００４１】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−メルファランエチルエステル（２０ｍｇ、２８μモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（３ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を真空で除去し、粗生成物をエタノールに溶解し、次いで、ジエチルエーテル中で沈殿させて、僅かに褐色な固体として、純粋なＪＶ２７を得た（１１ｍｇ、６２％）。Ｍｐ：１５７−１６０℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ 7．１９−７．０１（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．８０−６．６３（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），４．６６−４．６１（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．１３（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），４．０２−３．９６（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ），３．８３−３．５４（ｍ，１６Ｈ，８ ＣＨ2−マスタード），３．１８−２．８１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．１７（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００４２】
実施例８
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンイソプロピルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２８）
Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニン（２６６ｍｇ、１．４５ミリモル）を、塩酸で飽和したイソプロパノール（１０ｍｌ）に溶解した。溶液を２．５時間還流しながら加熱した。溶媒を蒸発させ、白色の綿状固体の生成物を得た（３５０ｍｇ、９１％）。生成物を、更に精製する事無しに、次の工程で使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ ７．３１−７．２３（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），７．１２−７．０３（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），５．１０−５．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−イソプロピル），４．２２（ｔ，１Ｈ，α−ＣＨ），３．２２−３．１１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２５（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3−イソプロピル），１．１８（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3−イソプロピル）。
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（５２ｍｇ、０．１３ミリモル）を、２ｍｌのジクロロメタンに溶解した。ＰｙＢＯＰ（７１ｍｇ、０．１４ミリモル）とトリエチルアミン（３８μｌ、０．２７ミリモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、２ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（３８μｌ、０．２７ミリモル）と、Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンイソプロピルエステル（３９ｍｇ、０．１５ミリモル）の溶液を添加した。溶液を一晩中、室温で攪拌した。１０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と１０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、ジクロロメタンを、１０ｍｌの合計容量まで添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（１９：１）を使用して、シリカ上でフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、薄オレンジ色の半固体として、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンイソプロピルエステルを得た（５７ｍｇ、７１％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７．０６−６．８５（ｍ，６Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．５６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｐｈｅ），５．００−４．８５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ−イソプロピル，ＮＨ，Ｍｅｌ），４．６８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．２７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．６９−３．５２（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．０２−２．８５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．１８（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3−イソプロピル），１．１４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3−イソプロピル）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．００，１７０．４３（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１６１．９５（ｄ，Ｊ＝245．0Ｈｚ，Ｃ−４″），１５５．３５（Ｃ＝Ｏ，Ｂｏｃ），１４５．１２（Ｃ−４′）、１３１．６０（Ｃ−１″），１３０．９９（２ Ｃ：ｓ）（ｄ，Ｊ＝７．７５Ｈｚ，Ｃ−２″），１３０．７２（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−３′），１２５．２６（Ｃ−１′），１１５．２９（２ Ｃ：ｓ）（ｄ，Ｊ＝２０．６Ｈｚ，Ｃ−３″），１１２．２７（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），８０．２４（Ｃ−Ｂｏｃ），６９．５２（ＣＨ−イソプロピル），５５．８２（α−ＣＨ），５３．５３（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．４０（α−ＣＨ），４０．４８（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．２９（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３３（３Ｃ：ｓ）（ＣＨ3−Ｂｏｃ），２１．８１，２１．７３（ＣＨ3−イソプロピル）。
【００４３】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンイソプロピルエステル（４８ｍｇ、７９μモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（４ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去した。粗生成物をエタノールに溶解し、次いで、ジエチルエーテル中で沈殿させ、白色の固体として、ＪＶ２８を得た（２２ｍｇ、５０％）。Ｍｐ：１９２−１９５℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７．２８−７．１７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．１４（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．０４−６．９６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．７７−６．６７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），４．６８−４．６０（ｍ，１Ｈ，α−Ｈ，Ｐｈｅ），４．００−３．９３（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．７６−３．５８（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．１８−２．８０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3−イソプロピル），１．１５（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3−イソプロピル）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７０．４９，１６８．４２（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１６２．０６（ｄ，Ｊ＝２４２．４Ｈｚ，Ｃ−４″），１４６．１３（Ｃ−４′）、１３２．４８（Ｃ−１″），１３０．７２（２ Ｃ：ｓ）（ｄ，Ｊ＝７．６４Ｈｚ，Ｃ−２″），１３０．４０（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−３′），１２２．１０（Ｃ−１′），１１５．８７（２ Ｃ：ｓ）（ｄ，Ｊ＝２１．２Ｈｚ，Ｃ−３″），１１２．４５（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），６９．２７（ＣＨ−イソプロピル），５４．２８（2 Ｃ：ｓ）（α−ＣＨ），５２．９７（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），４０．２６（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３６．３１（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｐｈ），２０．７０，２０．５６（ＣＨ3−イソプロピル）。
【００４４】
実施例９
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（ＪＶ２９）
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニン（５１０ｍｇ、１．６４ミリモル）を、８０％エタノール（１２．５ｍｌ）に溶解した。水（１ｍｌ）中のＣａＣｌ2（１５０ｍｇ、１．３５ミリモル）溶液を、粉末亜鉛（３．７９ｇ、５８ミリモル）と共に添加した。還流で３．５時間加熱後、懸濁液を濾過し、亜鉛粉末を過剰のエタノールで洗浄した。濾過物を真空で濾過して、薄黄色の固体（未だ、幾らかのエタノールを含む）として、６００ｍｇ（１３０％）のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニンを得た。この生成物を、更なる精製無しに次の工程に使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ ６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．６３（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），４．１６−４．０７（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ），３．０５−２．７６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ）。
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニン（２０１ｍｇ、０．７２ミリモル）を、塩酸で飽和したエタノール（１０ｍｌ）に溶解した。溶液を３時間還流しながら加熱した。混合物はＣＨＣｌ3と１ＭＨＣｌ（ｐＨ４）に分配された。水性層を５％ＫＯＨでｐＨ１０に塩基性化し、次いで、ＣＨＣｌ3で４回抽出した。有機層を一緒にし、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、真空で濃縮して、黄色状油として、Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニンエチルエステルを得た（９０ｍｇ、６０％）。これを、更に精製する事無しに、次の工程で使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ６．９７（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．６１（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），４．１３（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７１（ｔ，１Ｈ，α−ＣＨ），３．０４−２．７８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．２３（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００４５】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（４４ｍｇ、０．１１ミリモル）を、２ｍｌのジクロロメタンに溶解した。ＰｙＢＯＰ（５５ｍｇ、０．１１ミリモル）とトリエチルアミン（２８μｌ、０．２０ミリモル）を添加し、室温で３０分間攪拌した後、２ｍｌのジクロロメタン中のトリエチルアミン（１４μｌ、０．１０ミリモル）とＬ−ｐ−アミノフェニルアラニンエチルエステル（２１ｍｇ、０．１０ミリモル）の溶液を添加した。溶液を一晩中、室温で攪拌した。１０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と１０ｍｌの１０％クエン酸での抽出前に、ジクロロメタンを、１０ｍｌの合計容量まで添加した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、真空で濃縮した。粗生成物を、溶出剤として、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（９：１と１９：１）を使用して、シリカ上でフラッシュカラムクロマトグラフィーで２回精製した。褐色−オレンジ色の油として、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニンエチルエステルを得た（２８ｍｇ、４７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７．０３（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），６．５９−６．５２（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），６．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｐｈｅ），４．９６（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ，Ｍｅｌ），４．６８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），４．１０（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７０−３．５３（ｍ，8Ｈ，ＣＨ2−マスタード），２．９７−２．８８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ，ＣＨ3−Ｂｏｃ），１．１９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ １７１．２１，１７０．８３（アミド及びエステル中のＣ＝Ｏ），１４５．３７，１４４．９６（Ｃ−４′，Ｃ−４″）、１３０．７８（３ Ｃ：ｓ），１３０．２１（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ及びＣ−３′），１２５．３７（Ｃ−１′），１１５．２２（２ Ｃ：ｓ）（Ｐｈ），１１２．２６（２ Ｃ：ｓ）（Ｃ−２′），８０．０９（Ｃ−Ｂｏｃ），６１．４２（ＣＨ2ＣＨ3），５５．６１（α−ＣＨ），５３．５６（2 Ｃ：ｓ）（Ｎ−ＣＨ2），５３．４８（α−ＣＨ），４０．５６（2 Ｃ：ｓ）（ＣＨ2−Ｃｌ），３７．３７，３７．１７（ＣＨ2−Ｐｈ），２８．３４（３Ｃ：ｓ）（ＣＨ3−Ｂｏｃ），１４．２１（ＣＨ2ＣＨ3）。
【００４６】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−アミノフェニルアラニンエチルエステル（２０ｍｇ、３４μモル）を、塩酸で飽和された酢酸エチル（３ｍｌ）に溶解した。この混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去した。粗生成物をエタノールに溶解し、次いで、ジエチルエーテル中で沈殿させ、明るい褐色の固体として、ＪＶ２９を得た（４ｍｇ、２２％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７．４６−７．２９（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ），７．１８−７．０７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．８−６．６６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），４．７３−４．６６（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｐｈｅ），４．１０（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），４．０６−３．９９（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ，Ｍｅｌ），３．７９−３．５６（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．２２−２．８３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．１５（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００４７】
実施例１０
Ｌ−メルファラニル−Ｄ−フェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（Ｔ４）
Ｄ−フェニルアラニン（２５０ｍｇ、１．５２ミリモル）を、前以って塩酸（ガス）で泡立たせたＥｔＯＨ（５ｍｌ）に溶解した。溶液を１００℃にまで持って行き、一晩中還流させた。溶媒を蒸発させ、２８０ｍｇの粗生成物を得た。ＥｔＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ペンタンから再結晶化によって、白色結晶として、２３９ｍｇ（８１％収率）のＤ−フェニルアラニンエチルエステルを得た。1Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤ3ＯＤ）δ 7．４−７．２２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），4．３１−４．１４（ｍ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3，α−Ｈ），３．３５−３．０８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ）， １．２５−１．２０（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラン（６５ｍｇ、０．１６ミリモル）、Ｄ−フェニルアラニンエチルエステル（５３ｍｇ、０．２３ミリモル）、ＨＯＢＴ（３２ｍｇ、０．２４ミリモル）及びＮＭＭ（２５μｌ、０．２３ミリモル）を、ジクロロメタン（４ｍｌ）に溶解した。この溶液を０℃に冷却し、ＥＤＣ（４４ｍｇ、０．２３ミリモル）を添加した。溶液を０℃で０．５時間攪拌し、次いで、室温で３時間攪拌した。次いで、反応混合物をジクロロメタンで２０ｍｌに希釈し、１０％のクエン酸水溶液（２５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２５ｍｌ）及びブライン（２５ｍｌ）で順次抽出して反応を停止した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させ、６０ｍｇの黄色油を得た。
この粗生成物は、次いで、エーテル：ペンタン（２：３→１：１→１：０）の勾配溶出系を使用して、フラッシュクロマトグラフィーによって分離された。精製画分を集め、溶媒を蒸発させて、白色結晶として、２５ｍｇ（２５％）のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｄ−フェニルアラニンエチルエステルを得た。
【００４８】
Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−メルファラニル−Ｄ−フェニルアラニンエチルエステル（９０ｍｇ、０．１６ミリモル）を、前以って塩酸（ガス）で泡立たせた５ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解した。この混合物を、室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空で除去し、残さをＥｔＯＨ／Ｅｔ2Ｏから再結晶化した。白色結晶として、Ｌ−メルファラニル−Ｄ−フェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（Ｔ４）が、６２％の収率で単離された（４６ｍｇ）。
【００４９】
比較例
Ｎ−アセチル−Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステル（ＡｃＪ１）
Ｌ−メルファラニル−Ｌ−ｐ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド（１０ｍｇ、０．０１９ミリモル）を、ジクロロメタン（０．５ｍｌ）とピリジン（４μｌ、０．０４４ミリモル）に溶解した。無水酢酸（２μｌ、０．２２ミリモル）を添加し、混合物を室温で１時間攪拌した。更にピリジン（２μｌ、０．０２２ミリモル）と無水酢酸（２μｌ、０．２２ミリモル）を添加し、１時間攪拌後に透明な溶液を得た。この溶液を１０％クエン酸水溶液とブラインで抽出した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下で溶媒を蒸発させた。固体残さをＥｔＯＨ／ジエチルエーテル中で再結晶化させ、白色結晶としてＡｃＪ１を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７．０９−６．９０（ｍ，６Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｐｈｅ，Ｍｅｌ），６．６０（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ，Ｍｅｌ），６．２５（ｂｒ ｄ，１Ｈ，ＮＨ），６．０４（ｂｒ ｄ，１Ｈ，ＮＨ），４．７３（ｄｄ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．５５（ｄｄ，１Ｈ，α−ＣＨ），４．１４（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3），３．７６−３．５８（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2−マスタード），３．１２−２．８８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3ＣＯ），１．２２（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2ＣＨ3）。
【００５０】
生物学的テスト
以下のテストにおいて、本発明のペプチドの細胞分裂阻止活性が分析され、メルファラン（ハイドロクロライドとして、アルケラン注射物質、Glaxo WEllcome）、Ｐ２（Ｌ−プロリル−ｍ−Ｌ−サルコリシル−ｐ−Ｌ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド；Istituto Sieroterapico Milanese, Milan, Italyから）、サルコリシン(Istituto Sieroterapico Milanese, Milan, Italyから)及び患者からヒト腫瘍細胞（ＰＨＴＣ）及びヒト腫瘍細胞系の異なる一次培養における多数の標準薬の活性が比較された。テストされた標準薬は、ファルマシアアップジョン（Pharmacia & Upjohn）社のアラック（サイトサル）（AraC(Cytosar)）、5-FU（フルラブラスチン）(Flurablastin)及びドキソルビシン（アドラマイシン）（doxorubicin(Adramycin)）、ピエールファブレ（Pierre Fabre）社のビンクリスチン（オンコビン）（vincristine(Oncovin)）及びビノレルビン（ナベルビン）（vinorelbine(Navelbine)）、ローンプーランロレアル（Rhone Poulenc Rorer）社のドセタクセル（タクシテル）（docetaxel(Taxotere)）及びブリストルマイヤースクイプ（Bristol-Myers Squibb）社のシスプラチン（プラチノール）（cisplatin (Platinol)）及びエトポシド（ベペシッド）（etoposide(Vepesid)）、及びスミスクラインビーチャム（SmithKline Beecham）社のトポテカン（topotecan）であった。
蛍光微小培養細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ）(Larsson, R., et al.,-1992: Int. J. Cancer, 50, 177-185)が、この化合物を評価する為に使用された。簡単に言えば、９６−ウエルマイクロタイタープレート(NUNC, Roskilde, Denmark)が、所望濃度の１０倍で、２０μｌの薬剤溶液で調製され、−７０℃で二ヶ月までの間貯蔵された。一般的に、物質を、初めに、無水又は酸性エタノールに、４．０〜８．２ｍＭの濃度に溶解し、更に、滅菌水又は滅菌リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ、シグマケミカル社（Sigma chemicals）)で希釈する。水での希釈は全て、マスタード加水分解の影響を最小限にする為に、実験前に直接に行われる。最終のエタノール濃度は１％ｖ／ｖを超えない。この実験のゼロ日で、１８０μｌの適当な濃度の細胞懸濁液が、解凍されたプレートのウエルに添加され、六つのウエルが対照（細胞懸濁液のみ）とされ、六つのウエルがブランク（細胞媒体のみ）とされた。７２時間の培養後、細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、１００μｌの生理緩衝液中の蛍光ジアセテート（１０μｇ／ｍｌ）が添加された。更に４５分後に、発生した蛍光（ex ４８５ｎｍ； em ５２８ｎｍ）が、９６−ウエル走査蛍光光度計(Fluoroscan II, Labsystem Oy, Helsinki, Finland)で測定される。発生した蛍光は生きている細胞の数に比例し、データは、生存指数（ブランクの値を引き算した対照ウエルにおけるテストウエル中の蛍光のパーセント）及びＩＣ５０(Inhibitory Concentration 50%、ソフトウエアのGraphPad Prism(Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA)で計算される)として示される。合格アッセイの為の品質判定基準は、ブランク（六つのウエル）、対照（六つのウエル）及びテストウエル（三つ）それぞれにおける３０％未満の変動係数、ブランクの１０倍より多い対照のシグナル及び、最後に、トリパンブルー排除テストで判定される、７０％（一次のヒト腫瘍培養物）又は９０％（培養細胞株）より多い初期細胞生存率を含む。
【００５１】
蛍光ジアセテート（ＦＤＡ、Sigma）がＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌで溶解され、暗所において貯蔵溶液として凍結保存された。１０％の熱失活されたウシ胎児血清（ＦＣＳ、Sigma chemical Co., St. Louis, MO）、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００μｇ／ｍｌのペニシリンで補足された細胞成長媒体 ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)が使用された。
ＦＭＣＡでの多くの作業は、個々の患者に対する抗癌剤の臨床活性の予測に焦点が合わされた。本願のこのアッセイの予測可能性は、それぞれに、８０〜９０及び６０〜７０の範囲の感度及び特異度で、多くのその他の臨床的に受入れられるテスト方法と比肩できる事を示した。
【００５２】
テスト１：新鮮なヒト腫瘍試料における細胞毒活性
ヒト腫瘍サンプルでの、メルファラン、Ｐ２（Ｌ−プロリル−ｍ−Ｌ−サルコリシル−ｐ−Ｌ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド）及びＪ１（Ｌ−メルファラニル−ｐ−Ｌ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド）の細胞毒活性が、蛍光微小培養細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ）を使用して比較された。それぞれの薬剤は、８２〜０．１３１μＭの範囲で六つの濃度で、それぞれ三通りの濃度でテストされた。
【００５３】
異なる組織の、合計で２７個の新鮮なヒト腫瘍試料が分析された：１４個の血液（その内の少なくとも５個は前以って、クリニックで細胞毒薬剤で処理されたもの）と１３個の固体腫瘍（５個が前以って処理されている）サンプルが分析された。濃度−応答曲線がプロットされて、ＩＣ５０が決められた。この結果は図２で示され、対角線の実線は対等を表し、この線の上の点は、Ｘ−軸上の薬剤を奨励し、その逆も同様である。この結果は、全ての場合においてＪ１はＰ２よりも活性であり、次いでＰ２はメルファランよりも活性である事を示す。
【００５４】
同じＦＭＣＡアッセイを使用して、メルファラン、Ｐ２及びＪ１の細胞毒活性が、今度は、合計６４個の新鮮なヒト腫瘍試料について再度テストされた。この腫瘍は異なる組織のものである：４２個の血液と、２２個の固体腫瘍サンプルが分析された。平行して、幾つかの臨床的に良く知られ且つ使用される標準物質の活性が、０．９２〜１０．３μＭの濃度で評価された。この標準薬剤は、アラック、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドセタクセル、シスプラチン、ドキソルビシン及びエトポシドであった。活性の比較は、以下の表１において、定義された濃度での生存指数として表される。Ｊ１は、０．６６μＭにおいて優れた活性を示す。
【００５５】
【表１】
表１：ＰＨＴＣにおける、Ｊ１、メルファラン、Ｐ２及び標準薬剤の活性
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【００５６】
テスト２：１０個のヒト腫瘍細胞株のパネルにおける細胞毒活性
本発明の９種の異なるペプチドの細胞毒活性を、ＦＭＣＡ法を使用して、１０の培養細胞株において、メルファラン、Ｐ２（Ｌ−プロリル−ｍ−Ｌ−サルコリシル−ｐ−Ｌ−フルオロフェニルアラニンエチルエステルハイドロクロライド）、サルコリシン及び標準薬剤のドキソルビシ、ビンクリスチン、シスプラチン、５−ＦＵ及びトポテカンと比較した。それぞれの薬剤は、それぞれ二通りの濃度で、４０〜０．０１３μＭ（メルファランは１．６ｍＭ〜０．５１μＭ）の範囲で六つの濃度でテストした。実験は三回繰返され、全ての生存データが、それぞれの培養細胞株上のそれぞれの薬剤のＩＣ５０を計算するのに使用された。
【００５７】
培養細胞株パネルにおける細胞の選択は、以前に開示されている(Dhar, S., et al., 1996: Br J Cancer, 74, 888-896)。異なる組織の四つの親株（リンパ腫 Ｕ−９３７ ＧＢＴ；骨髄腫 ＲＰＭＩ ８２２６；小細胞肺癌 ＮＣＩ−Ｈ６９；及び白血病 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）、様々な薬剤の為に選択された五つのサブライン及び一つの一次抵抗細胞株（腎癌 ＡＣＨＮ）が含まれた。サブラインＵ−９３７−ｖｃｒは、ビンクリスチン抵抗用に選択され、サブライン８２２６Ｄｏｘ４０及びＨ６ＡＲは、ドキソルビシン抵抗用に選択され、サブライン８２２６ＬＲ５は、メルファラン抵抗用に選択された。増殖細胞の成長及び形態は、週単位で、２〜３ヶ月毎に抵抗についてモニターされた。
【００５８】
この結果は表２で示され、細胞毒活性が、ペプチドの内では変動し、そして、メルファラン、ｍ−Ｌ−サルコリシン及びＰ２と有利に比較される事を示している。更に、幾つかのペプチドは、或種の増殖細胞株については、テストされた標準化学療法物質よりも高い活性を示す。
【００５９】
【表２】
表２：細胞毒薬剤抵抗の定義された形態を表示する増殖細胞株パネルにおいて、メルファラン、サルコリシン、Ｐ２及び標準薬剤と比較された本発明のペプチドの活性、ＩＣ５０（μＭ）
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【００６０】
【表３】
表２（続き）
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【００６１】
【表４】
表２（続き）
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【００６２】
テスト３：肺癌増殖細胞株におけるＪ１の細胞毒活性
又、肺癌増殖細胞株のパネルにおけるＪ１の細胞毒活性がテストされ、ＦＭＣＡを使用して、メルファラン及び幾つかの標準化学療法剤と比較した。合計で４つの小細胞肺癌増殖細胞株（Ｕ−１９０６ Ｌ及びＥ、Ｕ−１２８５及びＵ−１６９０）及び７つの非小細胞肺癌増殖細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｕ−１７５２、ＮＣＩ−Ｈ６１１、ＮＣＩ−Ｈ１５７、Ｕ−１８１０、ＮＣＩ−Ｈ１２５及びＵ−１５６８）が分析された。結果は表３に示される。
【００６３】
【表５】
表３：肺細胞癌株における細胞毒活性
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【００６４】
この結果は、Ｊ１は、モル基準において、メルファランと肺癌の臨床治療で使用された殆どの標準試薬と有利に比較される事、及び、後に肺癌治療に導入されたチュブリン活性薬剤であるドセタクセルに対して観察されたものに類似の全体的な活性を示す事を示す。Ｊ１とその他のメルファラン誘導体は、タキサンを伴う非交雑抵抗体であるので（活性パターンの相関分析から判定された）、これらの二つの薬剤クラスは、魅力のある治療の組合わせを形成するかも知れない。
【００６５】
テスト４：患者由来のヒト腫瘍細胞（ＰＨＴＣ）の一次培養物におけるＪ１とＪＶ２８の細胞毒活性
別設定の実験で、Ｊ１、Ｊ３及びＪＶ２８の活性が、ＦＭＣＡを使用して、３１のＰＨＴＣ培養物において、メルファラン、サルコリシン及びＰ２の活性と比較された。結果は表４で示される。
【表６】
表４：ＰＨＴＣにおける薬剤の細胞毒活性（腫瘍細胞生存指数（％））
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【００６６】
この結果は、Ｊ３とＪＶ２８は、メルファランとサルコリシンの両方よりも血液学的ＰＨＴＣサンプルに対して著しく（Ｐ＜０．００１ 学生 ｔ−テスト）活性である事を示す。Ｊ３とＪＶ２８は、又、メルファランとサルコリシンだけではなく、Ｐ２との比較においても、固体使用サンプルに対して著しく（Ｐ＜０．０１）活性である。Ｊ１とメルファラン及びサルコリシンとＰ２との間の差は、血液学的腫瘍と固体腫瘍の両方に対して統計的に顕著であった。この結果は、参照化合物とは共有される事のなかったグループとして、固体腫瘍に対する新規なペプチドの予期せぬ高い活性を証明するものである。
【００６７】
テスト５：異なる腫瘍モデルにおける細胞毒活性
抗腫瘍活性の腫瘍タイプの特定の範囲が、細胞株及び、患者からのヒトの使用細胞の一次培養物において分析された。メルファランは、全ての血液学的診断に対して活性があるものとして分類されなかったが、活性、即ち、腫瘍細胞の生存において＜５０％の減少は、固体腫瘍タイプに対して観察されなかった。一方、Ｊ３、Ｊ１及びＪＶ２８は、乳癌、卵巣癌及び肺癌を含む幾つかのタイプの固体腫瘍に対して活性を示した。Ｊ１、Ｊ３及びＪＶ２８対Ｐ２の間の腫瘍タイプの特定の活性における相違は、表５で示される。
【表７】
表５：異なる腫瘍モデルにおける細胞毒活性
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【００６８】
Ｐ２は、表５に記載の診断において不活性であると決定されたが、Ｊ３は活性である事が分かった。Ｊ１とＪＶ２８は、これらの診断の殆どにおいて活性である事が分かった。これらのデータは、Ｊ１、Ｊ３及びＪＶ２８に対する活性の、腫瘍タイプの特定の範囲が、参照化合物よりも広く、固体腫瘍の重要なタイプを含む事を示す。
【００６９】
テスト６：メルファラン抵抗の包囲
メルファラン抵抗を回避する為の能力が、血液学的腫瘍の9人の患者と、固体腫瘍の１８人の患者からの２７のＰＨＴＣサンプルにおいて研究された。このサンプルを、メルファランに対して前以ってテストされた数百のＰＨＴＣサンプルのＦＭＣＡテスト結果（生存指数）を基準として、メルファラン抵抗によって分類した。これらのデータは、そのデータベースから中央値及び中央値＋１の標準偏差を使用して、サンプルを３つの範疇：低度、中庸又は極度な薬剤抵抗（ＬＤＲ、ＩＤＲ及びＥＤＲ）に分割する為の分岐線を確立する為に使用された。メルファラン及び新規な化合物のＪ１、Ｊ３及びＪＶ２８は、順次に、これらのグループに分類された。メルファラン抵抗の分類は、Larsson and Nygren, Anticancer Research 13; 1825-1830, 1993に記載されている原理によって行われた。新規なペプチドとＰ２は、４μＭの濃度で、そしてメルファランは１０μＭの濃度でテストされた。研究の結果は以下の表６に示される。
【００７０】
【表８】
表６：メルファラン抵抗の包囲
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【００７１】
この結果は、新規なペプチドの極少ないサンプルが、メルファラン抵抗を回避する為の能力を有する事を示すＩＤＲとＥＤＲとして分類された事を示す。この分析で、メルファラン濃度の少なくとも半分は、新規なペプチドを以って臨床設定に到達する事が考えられる。
【００７２】
テスト７：Ｊ１とＡｃＪ１の活性の比較
Ｎ−末端に遊離のアミノ基を有する化合物と、前記アミノ基が保護されている同じ化合物間の活性の差を研究する為に、Ｊ１のアセチル化体が合成され、Ｕ−９３７とＲＰＭＩ８２２６Ｓ増殖細胞株について、上述のＦＭＣＡ方法を使用して比較した。この結果は、遊離のアミンを有するＪ１に比べて、アセチル化体は数倍低い効力（高いＩＣ５０；０．６１と２．９μＭ）を示し、抗癌活性に関してＪ１の優先性を示した。
【００７３】
結論
全体の結果は、全ての参照化合物（メルファラン、サルコリシン及びＰ２）に対して、本発明を構成する新規な化合物の著しく高い活性を証明するものである。更に、又、この新規な化合物は、多くの固体腫瘍診断で観察された実証済の活性を持つ参照化合物と比較して、より広い範囲の腫瘍タイプの特定の活性を証明した。これらの化合物は、又、悪性（慢性リンパ性白血病）／正常なリンパ球で得られるＩＣ５０の比によって判定される、悪性対正常細胞における類似の或いは僅かに良好な相対的活性を示すので、これらの新規な化合物の臨床的可能性は高いと考えられねばならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  公知の化合物のメルファラン、サルコリシン及びＰ２の化学式、及び、本発明の化合物のＪ１、Ｊ３及びＪＶ２８の化学式を示す。
【図２】  ２７個のヒト腫瘍サンプルにおけるメルファラン、Ｊ１及びＰ２に対するＩＣ５０の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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