(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、
前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、
前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であり、
前記グラフト高分子は、ポリアクリル酸塩、または、ｐＨ／イオン強度感受性ポリマーを含むことを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセル。
【請求項２】
前記グラフト高分子の疎水性側鎖および前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、同一の繰り返し単位を含む、請求項１に記載の高分子ミセル。
【請求項３】
前記ブロック共重合体はジブロック共重合体である、請求項１または２に記載の高分子ミセル。
【請求項４】
前記ジブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、５００〜２５００の数平均分子量を有し、親水性重合体セグメントは、２０００〜１００００の数平均分子量を有する、請求項３に記載の高分子ミセル。
【請求項５】
前記ジブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、生体再吸収性である、請求項３または４に記載の高分子ミセル。
【請求項６】
前記ジブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、ポリ（エステル）、ポリ（ラクチド）、ポリ（乳酸）、およびポリカプロラクトンから選択される少なくとも１つを含む、請求項５に記載の高分子ミセル。
【請求項７】
前記ジブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、ポリ（ラクチド）である、請求項６に記載の高分子ミセル。
【請求項８】
前記ｐＨ／イオン強度感受性ポリマーは、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ブテン二酸）、ポリヒスチジン、またはポリ（ビニルイミダゾール）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項９】
前記ジブロック共重合体の親水性重合体セグメントは、ポリ（エステル）、ポリ（エチレングリコール）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）から選択される少なくとも１つを含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項１０】
前記ジブロック共重合体は、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項１１】
コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、
前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、
前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であり、
前記グラフト高分子の骨格構造は、親水性の第１の繰り返し単位を含み、前記疎水性側鎖は前記第１の繰り返し単位に結合し、
前記第１の繰り返し単位はカルボキシル基を含み、前記疎水性側鎖は生体再吸収性であることを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセル。
【請求項１２】
前記グラフト高分子の骨格構造は、ポリアクリル酸塩、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(ブテン二酸)、ポリヒスチジン、およびポリ（ビニルイミダゾール）から選択される少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の高分子ミセル。
【請求項１３】
前記グラフト高分子の骨格構造は、ポリ(メタクリル酸)である、請求項１２に記載の高分子ミセル。
【請求項１４】
前記疎水性側鎖は、ポリ(ラクチド)、ポリ(乳酸)、またはポリカプロラクトンから選択される少なくとも１つを含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項１５】
前記疎水性側鎖は、ポリ(ラクチド)を含む、請求項１４に記載の高分子ミセル。
【請求項１６】
前記グラフト高分子の骨格構造は、前記第１の繰り返し単位と異なる第２の繰り返し単位を含み、前記第２の繰り返し単位は、温度変化に応じてコア崩壊を引き起こす、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項１７】
前記グラフト高分子の骨格構造の前記第２の繰り返し単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのモノマーから誘導される、請求項１６に記載の高分子ミセル。
【請求項１８】
前記グラフト高分子の骨格構造は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよびメタクリル酸の共重合体である、請求項１７に記載の高分子ミセル。
【請求項１９】
５０〜２００ｎｍの直径を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項２０】
前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体に結合しうる配位子である、請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項２１】
前記配位子は、ガラクトース残基である、請求項２０に記載の高分子ミセル。
【請求項２２】
コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、
前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、
前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であり、
前記末端官能基は、蛍光性基であることを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセル。
【請求項２３】
前記蛍光性基は、フルオレセインイソチオシアネートである、請求項２２に記載の高分子ミセル。
【請求項２４】
コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、
前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、
前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であり、
前記末端官能基は、色素であることを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセル。
【請求項２５】
前記色素は、近赤外色素である、請求項２４に記載の高分子ミセル。
【請求項２６】
コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、
前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、
前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であり、
前記構造は複数の異なるブロック共重合体を含み、各ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
前記複数の異なるブロック共重合体は、それぞれ、疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含むジブロック共重合体であり、
前記異なるブロック共重合体の親水性重合体セグメントは、異なる繰り返し単位を有することを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセル。
【請求項２７】
前記異なるブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、同一の繰り返し単位を有する、請求項２６に記載の高分子ミセル。
【請求項２８】
コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、
前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、
前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であり、
前記構造は複数の異なるブロック共重合体を含み、各ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、
前記複数の異なるブロック共重合体は、それぞれ、疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含むジブロック共重合体であり、
前記複数の異なるブロック共重合体は、前記親水性重合体セグメントの末端に結合する、異なる末端官能基を有することを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセル。
【請求項２９】
前記末端官能基の１つは、腫瘍細胞の表面の受容体に結合しうる配位子である、請求項２８に記載の高分子ミセル。
【請求項３０】
前記末端官能基の１つは、蛍光性基である、請求項２８または２９に記載の高分子ミセル。
【請求項３１】
前記末端官能基の１つは、色素である、請求項２８または２９に記載の高分子ミセル。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の高分子ミセル、および疎水性内部コアに封入された疎水性の薬剤を含む、薬剤をロードした多機能性ミセル。
【請求項３３】
前記疎水性の薬剤がドキソルビシンである、請求項３２に記載の薬剤をロードした多機能性ミセル。
【請求項３４】
以下の段階；
ａ）グラフト高分子およびブロック共重合体を有機溶媒に溶解する段階；この際、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、この際、前記ブロック共重合体は親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基、または色素に結合しうる配位子である；
ｂ）段階ａ）で得られたポリマー溶液を、水に対して透析処理をし、溶液中の有機溶媒を水で置換する段階；
を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のコア−シェル構造を有する高分子ミセルの製造方法。
【請求項３５】
ｃ）段階ｂ）で得られた水溶液を凍結乾燥して乾燥した高分子ミセルを得る段階；をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記段階ａ）において、１以上の異なるブロック共重合体が前記有機溶媒に溶解される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
以下の段階；
ａ）薬剤、グラフト高分子およびブロック共重合体を有機溶媒に溶解する段階；この際、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、この際、前記ブロック共重合体は親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基、または色素に結合しうる配位子である；
ｂ）段階ａ）で得られたポリマー溶液を、水に対して透析処理をし、溶液中の有機溶媒を水で置換する段階；
を含む、請求項３２または３３に記載の薬剤をロードした多機能ミセルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コア−シェル構造を有する高分子ミセル、特に、グラフト共重合体および少なくとも１つのジブロック共重合体からの自己組織化によるコア−シェル構造を有する多機能ミセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学的応用のための多成分ミセルについての研究は、一般に、事実上あらゆる型および類のミセルが、特定の機能性、特定の腫瘍照準の向上、ナノ粒子の安定化、さまざまな材料の欠陥の克服、および多機能の発揮など、有用な特性を与えることを示している（Ｘ．Ｇａｏ，Ｙ．Ｃｕｉ，Ｒ．Ｍ．Ｌｅｖｅｎｓｏｎ，Ｌ．Ｗ．Ｋ．Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｎｉｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，２２，９６９．；Ｎ．Ｋａｎｇ，Ｍ．Ｅ．Ｐｅｒｒｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｇａｕｃｈｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｌｅｒｏｕｘ，Ｎａｎｏ  ｌｅｔｔ．２００５，５，３１５．；Ｅ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｎａ，Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５，５，３２５．；Ｃ．Ｌ．Ｌｏ，Ｋ．Ｍ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｋ．Ｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｈ．Ｈｓｉｕｅ，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．（ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｆｍ．２００５００６２７）。高分子分野では、多成分ミセル（混合ミセルともいう）が、ジ−ジブロック共重合体、ジ−トリブロック共重合体、トリ−トリブロック共重合体、およびグラフト−ジブロック共重合体の系において広く研究されてきた（Ｎ．Ｋａｎｇ，Ｍ．Ｅ．Ｐｅｒｒｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｇａｕｃｈｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｌｅｒｏｕｘ，Ｎａｎｏ  ｌｅｔｔ．２００５，５，３１５．；Ｅ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｎａ，Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５，５，３２５．；Ｃ．Ｌ．Ｌｏ，Ｋ．Ｍ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｋ．Ｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｈ．Ｈｓｉｕｅ，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．（ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｆｍ．２００５００６２７）；Ｄ．Ｆ．Ｋ．Ｓｈｉｍ，Ｃ．Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ｅ．Ｃａｔｅｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９１，２４，５３０９．；Ｃ．Ｈｏｎｄａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎｏｓｅ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  １９９６，３７，１９７５．；Ａ．Ｌ．Ｂｏｒｏｖｉｎｓｋｉｉ，Ａ．Ｒ．Ｋｈｏｋｈｌｏｖ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９８，３１，７６３６．；Ｃ．Ｋｏｎａｋ，Ｍ．Ｈｅｌｍｓｔｅｄｔ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，３６，４６０３．；Ｗ．Ｍｉｎｇｖａｎｉｓｇ，Ｃ．Ｃｈａｉｂｕｎｄｉｔ，Ｃ．Ｂｏｏｔ，ＰＣＣＰ  ２００２，４，７７８．；Ｔ．Ｌｉｕ，Ｖ．Ｎ．Ｎａｃｅ，Ｂ．Ｃｈｕ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９９，１５，３１０９．）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、グラフト共重合体およびジブロック共重合体またはいくつかのジブロック共重合体に基づく混合ミセルの系を記載した研究はなかった。過去１０年間で、ほとんどの研究は、混合ミセルのミセル形成理論に関するものであった（Ｄ．Ｆ．Ｋ．Ｓｈｉｍ，Ｃ．Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ｅ．Ｃａｔｅｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９１，２４，５３０９．；Ｃ．Ｈｏｎｄａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎｏｓｅ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  １９９６，３７，１９７５．；Ａ．Ｌ．Ｂｏｒｏｖｉｎｓｋｉｉ，Ａ．Ｒ．Ｋｈｏｋｈｌｏｖ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９８，３１，７６３６．；Ｃ．Ｋｏｎａｋ，Ｍ．Ｈｅｌｍｓｔｅｄｔ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，３６，４６０３．；Ｗ．Ｍｉｎｇｖａｎｉｓｇ，Ｃ．Ｃｈａｉｂｕｎｄｉｔ，Ｃ．Ｂｏｏｔ，ＰＣＣＰ  ２００２，４，７７８．；Ｔ．Ｌｉｕ，Ｖ．Ｎ．Ｎａｃｅ，Ｂ．Ｃｈｕ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９９，１５，３１０９．）。しかしながら、ドラッグデリバリーを調べた研究はわずかである（Ｅ．Ｓ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｎａ，Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００５，５，３２５．；Ｃ．Ｌ．Ｌｏ，Ｋ．Ｍ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｋ．Ｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｈ．Ｈｓｉｕｅ，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．（ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｆｍ．２００５００６２７））。混合ミセルは非常に複雑であり、完全なコア−シェル構造は明瞭に観察できない。これは生物医学的応用におけるボトルネックを生じさせる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、機能性の内部コアとグラフト高分子および１以上のジブロック共重合体から自己組織化された親水性の外部シェルとを有する新規の混合ミセル構造を開示する。本発明において合成されるミセルは、細胞内ドラッグデリバリーにおける応用に有用な、約５０〜２００ｎｍのサイズを有する（Ｃｈｕｎ−Ｌｉａｎｇ  Ｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６，１６，２３０９−２３１６．；Ｃｈｕｎ−Ｌｉａｎｇ  Ｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（２００７）１２２５−１２３５．）。
【０００５】
本発明は、機能性の内部コア、ならびにグラフト高分子および１以上のブロック共重合体、好ましくはグラフト共重合体および２以上のジブロック共重合体から自己組織化された親水性の外部シェルを有する、新規の混合ミセル構造を開示する。この際、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含む。前記ブロック共重合体のうち少なくとも１つは前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基、または色素に結合しうる配位子である。本発明において合成されるミセルは、約５０〜２００ｎｍのサイズを有する。
【０００６】
具体的には、本発明は、コアシェル構造を有する高分子ミセルであって、前記構造はグラフト高分子およびブロック共重合体を含み、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、この際、前記グラフト高分子の疎水性側鎖は凝集しており、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、グラフト高分子の凝集した疎水性側鎖に、そこから突き出したブロック共重合体の親水性重合体セグメントとともにパッキングされ結合されて疎水性の内部コアおよび親水性の外部シェルを形成し、前記ブロック共重合体は前記親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基または色素に結合しうる配位子であることを特徴とする、コアシェル構造を有する高分子ミセルを提供する。
【０００７】
また、本発明は、上述の高分子ミセル、および疎水性内部コアに封入された疎水性の薬剤を含む、薬剤をロードした多機能性ミセルを提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、以下の段階；
ａ）グラフト高分子およびブロック共重合体を有機溶媒に溶解する段階；この際、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、この際、前記ブロック共重合体は親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基、または色素に結合しうる配位子である；
ｂ）段階ａ）で得られたポリマー溶液を、水に対して透析処理をし、溶液中の有機溶媒を水で置換する段階；
を含む、本発明のコア−シェル構造を有する高分子ミセルの製造方法を提供する。
【０００９】
さらに本発明は、以下の段階；
ａ）薬剤、グラフト高分子およびブロック共重合体を有機溶媒に溶解する段階；この際、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、この際、前記ブロック共重合体は親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基、または色素に結合しうる配位子である；
ｂ）段階ａ）で得られたポリマー溶液を、水に対して透析処理をし、溶液中の有機溶媒を水で置換する段階；
を含む、本発明の薬剤をロードした多機能ミセルの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の混合ミセルは、癌の診断薬および抗癌剤のドラッグデリバリーの担体として広く用いられうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明では、多成分ミセルがグラフト共重合体（グラフト高分子）およびブロック共重合体（好ましくはジブロック共重合体）から調製され、共重合体のＣＭＣの差が粒子サイズの制御に用いられる。さらに、この構造の混合ミセルは、各成分を操作し、注意深く設計することで多くの応用に拡張されうる。このような応用の１つは、抗癌剤の担体としてのものである。細胞内ドラッグデリバリーは、癌の治療に用いられる重要な経路の１つである。この経路は、照準細胞に対する薬剤の細胞毒性を高め、正常な組織における副作用を最小にする。細胞に取り込まれた後で担体からの薬剤の放出を誘起するメカニズムは、リソソーム酵素および担体を変形させる細胞内ｐＨの変化を含む。本発明以前にも、この経路を達成するために、さまざまな材料が研究され、合成されてきた。しかしながら、このうちのいくつかは、疎水性基または大きな電荷を有し、単核食細胞系（ＭＰＳ）によって認識され、腫瘍領域では容易に蓄積されず、したがって静脈注射における使用にさえも適さず、細胞内ドラッグデリバリーにはさらに適さない。したがって、粒子の表面に伸びた親水性セグメントが必要である。
【００１２】
本発明においては、多機能のコアおよびシェルを有する混合ミセルは、グラフト共重合体およびブロック共重合体から調製され、前記グラフト共重合体は、骨格構造および前記骨格構造に結合する側鎖を含む。前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含む。グラフト高分子の疎水性側鎖およびブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは同一の繰り返し単位を含んでもよい。好ましくは、前記ブロック共重合体はジブロック共重合体である。
【００１３】
好ましくは、前記ジブロック共重合体の前記疎水性重合体セグメントは、５００〜２５００の数平均分子量を有し、好ましくは、前記親水性重合体セグメントは、２０００〜１００００の数平均分子量を有する。
【００１４】
前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、特に制限されない。好ましくは、前記疎水性重合体セグメントは、生体再吸収性である。より好ましくは、前記ブロック共重合体の疎水性重合体セグメントは、ポリ（エステル）、ポリ（ラクチド）、ポリ（乳酸）、およびポリカプロラクトンから選択される少なくとも１つを含む。ポリ（ラクチド）（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド））が特に好ましい。
【００１５】
好ましくは、前記グラフト高分子は、ポリアクリル酸塩またはｐＨ／イオン強度感受性ポリマーを含む。前記ｐＨ／イオン強度感受性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ブテン二酸）、ポリヒスチジン、およびポリ（ビニルイミダゾール）などが挙げられる。
【００１６】
前記ブロック共重合体の親水性重合体セグメントは、特に限定されないが、好ましくは、ポリ（エステル）、ポリ（エチレングリコール）、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）から選択される少なくとも１つを含む。
【００１７】
前記グラフト高分子の骨格構造は、好ましくは、親水性の第１の繰り返し単位を含み、好ましくは、前記疎水性側鎖は前記第１の繰り返し単位に結合する。より好ましくは、前記第１の繰り返し単位はカルボキシル基を含み、前記疎水性側鎖は生体再吸収性である。
【００１８】
前記グラフト高分子の骨格構造は、好ましくは、ポリアクリル酸塩、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(ブテン二酸)、ポリヒスチジン、およびポリ（ビニルイミダゾール）から選択される少なくとも１つを含む。中でも、ポリ(メタクリル酸)が特に好ましい。
【００１９】
前記グラフト高分子の前記疎水性側鎖は、好ましくは、ポリ(ラクチド)、ポリ(乳酸)、およびポリカプロラクトンから選択される少なくとも１つを含む。中でも、ポリ(ラクチド)が特に好ましい。
【００２０】
前記グラフト高分子の骨格構造は、前記第１の繰り返し単位と異なる第２の繰り返し単位をさらに含みうる。好ましくは、前記第２の繰り返し単位は、温度変化に応じてコア崩壊を引き起こす。例えば、前記グラフト高分子の骨格構造の前記第２の繰り返し単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのモノマーから誘導される。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよびメタクリル酸の共重合体が特に好ましい。
【００２１】
本発明の高分子ミセルは、好ましくは、５０〜２００ｎｍの直径を有する。
【００２２】
本発明においては、前記ブロック共重合体は親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は、腫瘍細胞の表面の受容体に結合しうる配位子、蛍光性基、および色素からなる群から選択される少なくとも１つである。腫瘍細胞の表面の受容体に結合しうる配位子としては、例えば、ガラクトース残基が用いられうる。蛍光性基としては、任意の公知の蛍光性基が用いられうる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が好ましく用いられうる。色素としては、特に制限されないが、近赤外色素が好ましく用いられうる。
【００２３】
本発明においては、高分子ミセルは、複数の異なるブロック共重合体を含み、各ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含みうる。前記ブロック共重合体は、好ましくは、ジブロック共重合体である。
【００２４】
前記異なるブロック共重合体の疎水性重合体セグメントに含まれる繰り返し単位は同一であっても互いに異なっていてもよい。また、前記異なるブロック共重合体の親水性重合体セグメントに含まれる繰り返し単位は、同一であっても互いに異なっていてもよい。
【００２５】
前記異なるブロック共重合体は、それぞれ、前記親水性重合体セグメントの末端に結合する、同一または異なった末端官能基を有しうる。好ましくは、前記異なったブロック共重合体の末端官能基は、互いに異なる。好ましくは、前記末端官能基の１つは、腫瘍細胞の表面の受容体に結合しうる配位子、蛍光性基、または色素である。より好ましくは、本発明の高分子ミセルは、腫瘍細胞の表面の受容体に結合しうる配位子を有するブロック共重合体と、末端官能基として蛍光性基を有するブロック共重合体とを含む。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、上述の高分子ミセル、および疎水性内部コアに封入された疎水性の薬剤を含む、薬剤をロードした多機能性ミセルである。本発明で用いられる疎水性の薬剤は、特に制限されない。任意の既知の抗癌剤が好ましく用いられ、中でも、ドキソルビシンが特に好ましい。
【００２７】
本発明においては、多機能性コアおよびシェルを有する混合ミセルは、例えば、環境感受性グラフト共重合体であるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）−ｇ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ）、ならびに２つのジブロック共重合体である、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ）およびポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＥＯｚ−ＰＬＡ）から調製されうる。このナノ構造は、特殊なコア−シェル構造を有するために、グラフト共重合体の大きな負の電荷を完全に遮蔽し、多機能性を示す。細胞内ドラッグデリバリーにおけるこのミセル構造の例は、薬剤の放出と混合ミセルの機能性との間の強い関係を示した。さらに、スクリーニング特性の効率はまた、細胞毒性にも現れる；混合ミセルは、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ（［ＮＩＰＡＡｍ］／［ＭＡＡｃ］／［ＰＬＡ］＝８４：５．９：２．５ｍｏｌ／ｍｏｌ）からのミセルよりも、より高い薬剤活性およびより低い物質細胞毒性を示す。この例は、グラフト−ジブロック共重合体系を用いて生じる新たなミセル構造を与えるだけでなく、単一または多数のジブロック共重合体を伴うグラフト共重合体からの多機能ミセルの調製が、ドラッグデリバリーにおける応用の基礎となりうるという概念を明らかにする。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態においては、癌細胞照準、分布イメージング、および抗癌剤デリバリーのための多機能ミセルは、環境感受性グラフト共重合体であるＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ、ジブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ＰＬＡならびに２官能基（ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ジブロック共重合体であるガラクトサミン−ＰＥＧ−ＰＬＡ（Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）およびフルオレセインイソチオシアネート−ＰＥＧ−ＰＬＡ（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）から調製された。多機能ミセルは、アシアログリコプロテイン（ＨｅｐＧ２細胞）−Ｇａｌ（多機能ミセル）受容体−媒介腫瘍照準メカニズムによって、特定の腫瘍を照準とする。細胞内ｐＨ変化は、したがって、多機能ミセルの内部コアのＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡグラフト共重合体の構造変化を誘導し、これによって、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）の放出によってＨｅｐＧ２細胞の細胞毒性を増加させる。共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）は、多機能ミセルの明確な分布を明らかにする。注意深く設計され、高度に操作されれば、本発明で合成された高分子ミセルは、癌の診断、癌の照準、および癌の治療に同時に用いられうる。
【００２９】
本発明のコア−シェル構造を有する高分子ミセルは、例えば、以下の段階；
ａ）グラフト高分子およびブロック共重合体を有機溶媒に溶解する段階；この際、前記グラフト高分子は骨格構造および前記骨格構造に結合する疎水性側鎖を含み、前記ブロック共重合体は疎水性重合体セグメントおよび親水性重合体セグメントを含み、この際、前記ブロック共重合体は親水性重合体セグメントの末端に結合する末端官能基を有し、前記末端官能基は腫瘍細胞の表面の受容体、蛍光性基、または色素に結合しうる配位子である；
ｂ）段階ａ）で得られたポリマー溶液を、水に対して透析処理をし、溶液中の有機溶媒を水で置換する段階；
を含む方法で調製されうる。
【００３０】
任意で、上記ｂ）の段階の後、以下の段階ｃ）をさらに行ってもよい；
ｃ）段階ｂ）で得られた水溶液を凍結乾燥して乾燥した高分子ミセルを得る段階。
【００３１】
１以上の異なるブロック共重合体が用いられる場合、前記ブロック共重合体は、好ましくは、段階ａ）で同時に前記有機溶媒に溶解される。本発明の薬剤をロードした多機能ミセルは、例えば、上記ａ）の段階で、薬剤を前記グラフト高分子および前記ブロック共重合体とともに前記有機溶媒に溶解させることを除いては、上記と同様の方法を実施することによって調製されうる。
【実施例】
【００３２】
本発明は、以下の実施例によってよりよく理解されるであろう。しかしながら、以下の実施例は説明のためのものに過ぎず、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００３３】
実施例１
原料
Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびメタクリル酸（ＭＡＡｃ）をＬａｎｃａｓｔｅｒ社から購入した。ｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＭｅＯＴｓ）、オクタン酸第１スズ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ピレン、および２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）をＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）および２−エチル−２−オキサゾリンをＴＣＩ社から購入した。ｍＰＥＧ（重量平均分子量Ｍｗ＝５０００Ｄａ）をＳｉｇｍａ社から購入した。Ｄ，Ｌ−ラクチドは、使用前に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）から２回再結晶することによってさらに精製した。ＮＩＰＡＡｍおよびＡＩＢＮは、それぞれ、ヘキサンおよびアセトンから再結晶することによって精製した。ＭＡＡｃおよびＨＥＭＡは、真空下で蒸留することによって精製した。２−エチル−２−オキサゾリンおよびＭｅＯＴｓは、ＣａＨ２で一晩処理し、真空下で蒸留することによって精製した。他の試薬は、市販のものをそのまま用いた。
【００３４】
グラフト共重合体Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ（グラフトＩ，Ｇ１）の調製
はじめに、エンドキャッピングとしてメタクリレート基を有するＰＬＡ（ＰＬＡ−ＥＭＡ）を開環重合によって合成した。Ｄ，Ｌ−ラクチド（４ｇ）、ＨＥＭＡ（０．２６ｇ）およびトルエン（５ｍＬ）を二口丸底フラスコに、磁気撹拌子とともに入れた。フラスコをオイルバスに入れ、窒素下で１３０℃で撹拌した。次いで、オクタン酸第１スズ（１重量％）を添加して重合を開始させ、１００℃で１６時間継続した。重合後、生成物を０．１Ｎ  ＫＯＨメタノール溶液を加えて停止させ、次いで、ジエチルエーテルから２回沈殿させた。１つの末端がメタクリレート基でエンドキャッピングされたＰＬＡ−ＥＭＡ（Ｍｎ＝２０００）が得られた。Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡグラフト共重合体は、通常のフリーラジカル共重合によって合成した。ＰＬＡ−ＥＭＡ（０．３５ｇ）、ＮＩＰＡＡｍ（１．１５ｇ）、ＭＡＡｃ（０．１６ｇ）およびＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）を二口丸底フラスコに、磁気撹拌子とともに入れ、混合物をアセトン（１５ｍＬ）に溶解させた。反応を窒素下で７０℃で２４時間行った。重合後、生成物をジエチルエーテルからの沈殿によって２回、および蒸留水からに沈殿によって２回精製し、最終的にグラフト共重合体である（Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ（［ＮＩＰＡＡｍ］：［ＭＡＡｃ］：［ＰＬＡ］＝８４：５．９：２．５ｍｏｌ／ｍｏｌ（グラフトＩ，Ｇ１）を得た。
【００３５】
ジブロック共重合体  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ（ブロックＩ，Ｂ１）の合成
ｍＰＥＧ−ＰＬＡジブロック共重合体は開環重合によって合成した。Ｄ，Ｌ−ラクチド（１ｇ）、ｍＰＥＧ（Ｍｗ＝５０００Ｄａ）（１０ｇ）およびトルエン（４ｍＬ）を二口丸底フラスコに、磁気撹拌子とともに入れた。混合物をオイルバスで加熱し、窒素下で１３０℃で撹拌した。次いで、オクタン酸第１スズ（１重量％）を添加して重合を開始させ、１３０℃で１６時間継続した。重合後、生成物を０．１Ｎ  ＫＯＨメタノール溶液を加えて停止させ、−２０℃でジクロロメタンとジエチルエーテルとの共溶媒から再結晶した。このようにｍＰＥＧ−ＰＬＡ（［ＥＧ］：［ＬＡ］＝１１３：７ｍｏｌ／ｍｏｌ）を得た（ブロックＩ，Ｂ１）。
【００３６】
ジブロック共重合体  ＰＥＯｚ−ＰＬＡ（ブロックＩＩ，Ｂ２）の合成
ＰＥＯｚ−ＰＬＡを、以下のように、文献［Ｇ．Ｈ．Ｈｓｉｕｅ，Ｃ．Ｃｈ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｌ．Ｌｏ，Ｃ．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｌｉ，Ｊ．Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００６，３１７，６９］の手順を改良して調製した。はじめに、２−エチル−２−オキサゾリン（１０ｍＬ）、開始剤であるｐ−トルエンスルホン酸メチル（０．２３２ｍｇ）、およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を二口丸底フラスコに磁気撹拌子とともに入れた。フラスコをオイルバスに移動させ、混合物を窒素下で１００℃で３０時間撹拌した。室温まで冷却した後、０．１Ｎ  ＫＯＨメタノール溶液を加えて反応を停止させ、ジエチルエーテルから２回沈殿させてＰＥＯｚ−ＯＨを得た。次いで、ＰＥＯｚ−ＯＨ（２ｇ）およびＤ，Ｌ−ラクチド（０．４２６ｇ）を、オクタン酸第１スズ（１重量％）を用いて窒素下で１３０℃で１６時間重合させた。重合後、生成物を０．１Ｎ  ＫＯＨメタノール溶液を加えて停止させ、ジエチルエーテルから２回沈殿させてＰＥＯｚ−ＰＬＡ（［ＥＯｚ］：［ＬＡ］＝５２．５：９．７ｍｏｌ／ｍｏｌ）（ブロックＩＩ，Ｂ２）を得た。
【００３７】
上記で調製したそれぞれの共重合体の化学構造および多分散性指数は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＡＭＸ−５００，Ｂｒｕｋｅｒ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を溶出溶媒として用いたＧＰＣによって確認した。グラフトのＭｎは、ｍＰＥＧ（Ｍｎ  ２０００）を標準として用いて、１Ｈ−ＮＭＲ（ＡＭＸ−５００，Ｂｒｕｋｅｒ）から計算した。さらに、それぞれの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、ピレンを疎水性プローブとして用い、蛍光分光光度計を用いて同定した。共重合体の濃度は０．０００１〜１０ｍｇ／ｍＬで変化させた。蛍光スペクトルは、蛍光分光光度計（Ｆ−２５００，Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて取得した。発光スペクトルの励起波長は３３９ｎｍであり、励起スペクトルは３９０ｎｍで測定した。これらの結果を表１にまとめる。
【００３８】
【表１】
0004824710.tif 000002
【００３９】
Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ、ｍＰＥＧ−ＰＬＡおよびＰＥＯｚ−ＰＬＡからのミセルの調製
ブロックＩＩを含む、または含まない、さまざまな組成比のグラフトＩおよびブロックＩを合わせてＤＭＳＯに溶解させ、重合体溶液を調製した。次いで重合体溶液を、セルロース膜の袋（分子量カットオフ６０００〜８０００、ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手）を用いて、蒸留水に対して２０℃で４８時間透析した。蒸留水を３時間ごとに交換した。透析後、ミセルまたは混合ミセルの溶液を回収し、凍結乾燥システム（Ｈｅｔｏ−Ｈｏｌｔｅｎ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて凍結して、乾燥生成物を得た。
【００４０】
図１Ａは、混合ミセルＧ１Ｂ１の平均直径および多分散性指数を、グラフトＩ（１０．０ｍｇ／Ｌ）の濃度を固定したときのブロックＩのモル比の関数として示したプロットである。図１Ｂは、混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２の平均直径および多分散性指数を、グラフトＩ（１０．０ｍｇ／Ｌ）およびブロックＩ（５．６２５ｍｇ／Ｌ）の濃度を固定したときのブロックＩＩのモル比の関数として示したプロットである。
【００４１】
表１に、図１Ａおよび１Ｂに示す２つのミセルの調製に用いたグラフトＩ、ブロックＩ、およびブロックＩＩの濃度を示す。
【００４２】
【表２】
0004824710.tif 000003
【００４３】
混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２［Ｇ１：Ｂ１：Ｂ２＝３３．９：５５．７：１０．４  ｍｏｌ／ｍｏｌ］の３つの共重合体は、自己組織化し、疎水性ＰＬＡとパッキングし、結びついて混合ミセルを形成し、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の試料からの動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定すると、均一な粒子サイズ（１８２．３±１．５ｎｍ）および狭い分布（多分散性指数、ＰＤＩ＝０．０３８±０．０１４）を得た。ジブロック共重合体の遮蔽効果に及ぼす影響を同定するために、混合ミセルのゼータ電位が、ＰＢＳ中で、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ドップラーマイクロ電気泳動法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定された。グラフトＩから構成されるミセルを比較サンプルとして用いた。そのゼータ電位は、−１５．５±０．９ｍＶと測定された。ＭＡＡｃのカルボキシル酸基のわずかなイオン化によってもたらされる大きな負電荷が、混合ミセルのジブロック共重合体によって遮蔽された。混合ミセルのゼータ電位は、親水性セグメントであるｍＰＥＧおよびＰＥＯｚが混合ミセルの表面に広がり、ＭＡＡｃのカルボキシル酸基を隠すため、−７．８±１．３ｍＶと測定された。図２に示すように、混合ミセル構造の最も直接的な証拠は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ；Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−６００顕微鏡、加速電圧＝１００ｋＶ）によって得られる。ＴＥＭは、混合ミセルのコア−シェル構造を同定するために、メタクリル酸基を酢酸ウラニル（２重量％）で染色することによって、広く採用される。混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２のＴＥＭイメージは、グラフトＩ共重合体の暗い領域は内部コアであること、およびｍＰＥＧおよびＰＥＯｚの親水性セグメントはグラフトＩコアの外側に広がっていることを示唆する。さらに、Ｂｉｏｓｃｏｐｅ  ＡＦＭを混合ミセルの形状の観察に用い、その結果は、混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２は均一なサイズで、球形であることを示した。粒子のサイズは、ＤＬＳで決定されたものと同様であった。
【００４４】
ジブロック共重合体の組成が混合ミセルの調製におよぼす影響を比較するために、グラフトＩとブロックＩ（Ｇ１Ｂ１）およびグラフトＩおよびブロックＩとブロックＩＩ（Ｇ１Ｂ１Ｂ２）から混合ミセルを透析した。３つの共重合体は、異なるＣＭＣを示した：ブロックＩのＣＭＣは、ブロックＩＩおよびグラフトＩのＣＭＣと大きく異なった（表１）。固定された濃度のグラフトＩを、さまざまなモル比のブロックＩ（ＣＭＣグラフトＩ＜＜ＣＭＣブロックＩ）で処理した場合、Ｇ１Ｂ１混合ミセルの平均直径は、図１Ａに示すように、ＤＬＳによって決定すると、単一のグラフトＩまたは単一のブロックＩの平均直径よりも小さく、約１６０ｎｍで一定のままであった。混合ミセルＧ１Ｂ１のサイズ分布は狭かった。しかしながら、ブロックＩＩを固定された濃度のＧ１Ｂ１に添加し、この際ブロックＩＩのＣＭＣがグラフトＩのＣＭＣに近接しており、しかしブロックＩのＣＭＣより小さい場合、Ｇ１Ｂ１Ｂ２混合ミセルの平均直径は、図１Ｂに示すように、ブロックＩＩに依存しなかった；サイズは、１つの共重合体からのミセル、またはグラフトＩとブロックＩＩとの混合ミセルのサイズ（３３０．２±０．９ｎｍ；ＰＤＩ＝０．０７２±０．０１１）とは大きく異なった。しかしながら、これらは、Ｇ１Ｂ１混合ミセルから得られたサイズに近接していた。ブロックＩＩのモル比が０．５４を超えると、Ｇ１Ｂ１Ｂ２混合ミセルは得られなかった。透析が始まると共重合体が凝集し、沈殿した。これらの結果は、最も高いＣＭＣを有する共重合体が粒子サイズを決定することを示す。すなわち、例えばこの系におけるブロックＩのような、グラフト−ジブロック共重合体系におけるジブロック共重合体の高いＣＭＣは、粒子サイズを制御し、減少させ、混合ミセルの形成の規則化および制御を助ける。したがって、相対的なＣＭＣは、グラフト共重合体およびジブロック共重合体からの、小さいサイズで低いＰＤＩの混合ミセルの調製において重要な検討事項である。
【００４５】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）は、水溶液中で下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）より低い温度で延長された鎖状の立体配座を示す、水溶性である親水性のポリマーとして知られている。ＰＮＩＰＡＡｍはまた、そのＬＣＳＴを超えると、不溶性である疎水性の凝集体に相転移しうる。ＰＮＩＰＡＡｍ共重合体中のＭＡＡｃの一部をランダムに共重合すると、ＬＣＳＴは３７℃（すなわち、体温）を超える温度に上昇し、ポリマーはｐＨ感受性になる。Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）は、中性環境で延長された鎖を示す。これは、イオン化したＭＡＡｃがＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）の親水性を高めるためである。酸性環境では、脱イオン化したＭＡＡｃがＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）の親水性を低下させそのＬＣＳＴを３２℃に低下させるため、共重合体は凝集して沈殿する。ＭＡＡｃのｐＨ感受性の性質およびＰＮＩＰＡＡｍの熱感受性の性質が、相互に関連している。本発明者らの以前の研究は、低ｐＨでの温度変化に対応する、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）外部シェルの凝集および崩壊によって、グラフトＩミセルが構造変化を示すことを明らかにした［Ｃ．Ｌ．Ｌｏ，Ｋ．Ｍ．Ｌｉｎ，Ｇ．Ｈ．Ｈｓｉｕｅ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００５，１０４，４７７］。図３は、混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２［Ｇ１：Ｂ１：Ｂ２＝３３．９：５５．７：１０．４ｍｏｌ／ｍｏｌ］の構造変化を、ｐＨ４．０での温度の関数として表す。混合ミセルの構造変化は、ピレンを疎水性プローブとして用いた蛍光分光分析によって決定された。第１振動バンドの強度と第３振動バンドとの強度の比であるＩ１／Ｉ３は、したがって、環境の極性の指標として用いられうる［Ｋ．Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｊ．Ｋ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，９９，２０３９］。比が大きいほど、ピレンプローブがより極性の環境にあることに対応する。混合ミセルの構造変化の前後のＩ１／Ｉ３の変化を比較するための参照としてピレン緩衝液が用いられた。ピレン緩衝液のＩ１／Ｉ３比は、熱崩壊によって、温度が上昇するにつれて１．８１から１．７４まで徐々に減少した。ｐＨ４．０での混合ミセルでは、ピレンのスペクトルのＩ１／Ｉ３は、約３１℃で減少しはじめた。これはおそらく、ピレン分子がｍＰＥＧとＭＡＡｃとの間の水素結合領域で分離されたためである。温度が３７℃を超えて上昇すると、Ｉ１／Ｉ３は速やかに１．２５から１．４６まで上昇し、構造変化によってピレンの環境が混合ミセルの内部コアから緩衝液に変化したことを示した。
【００４６】
本発明者らはまた、構造変化の前後の混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２［Ｇ１：Ｂ１：Ｂ２＝３３．９：５５．７：１０．４ｍｏｌ／ｍｏｌ］を、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を用いて分析した。誘起された構造変化の前後の混合ミセルの表面の層の化学組成を、ポジティブおよびネガティブのＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルから決定した。ＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルからの結果は、誘起された構造変化の後、混合ミセル中のグラフトＩは延長されて表面の層に近づくことを示す。構造変化後の混合ミセルを酢酸ウラニルで処理し、ＴＥＭで観察し、この発見のさらなる証拠を得た。図４Ａおよび４Ｂに示すように、ＴＥＭイメージは、混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２［Ｇ１：Ｂ１：Ｂ２＝３３．９：５５．７：１０．４ｍｏｌ／ｍｏｌ］のコア−シェル構造が破壊されたことを示す。グラフトＩの暗い領域は、構造変化後の混合ミセルの内部コアおよび外部シェルの両方に存在した。
【００４７】
実施例２
本実施例では、その構造が封入された薬剤が血液中を循環する間コアに残ることを可能にする、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ  ジブロック共重合体およびＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡグラフト共重合体から構成される混合ミセルが、疎水性抗癌剤である遊離塩基のドキソルビシン（Ｄｏｘ）の封入に用いられた。
【００４８】
ドキソルビシン（Ｄｏｘ）をロードした混合ミセルはまた、透析によって調製された。調製手順は、実施例１で調製した混合ミセルの手順と同様であった。２０ｍｇのＤｏｘ−ＨＣｌを、８ｍｌのＤＭＦおよび２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。２ｍｇのｍＰＬＡ−ｂ−ＰＥＧ（ブロックＩ）および２０ｍｇのＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）−ｇ−ＰＬＡ（グラフトＩ）を、８ｍｌのＤＭＦおよび２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。Ｄｏｘ−ＨＣｌ溶液を０．３ｍｌのトリエチルアミンと混合し、塩酸を除去した。次いで、遊離塩基のＤｏｘ溶液を、重合体溶液に添加して室温で２時間撹拌した。混合溶液を水に対して２０℃で７２時間透析した。蒸留水を３時間ごとに交換した。透析後、ミセルの溶液を回収し、凍結乾燥システムを用いて凍結し、乾燥ミセルを得た。秤量した混合ミセルを室温でＤＭＳＯに１２時間溶解させた；その後限外ろ過（限外ろ過膜  ＭＷＣＯ  １０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を行い、試料を除去し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて、４８５ｎｍで、ＤｏｘのＤＭＳＯ中での検量線を参照して、Ｄｏｘの含有量を決定するための分析を行った。このように、混合ミセル中のＤｏｘの含有量が決定された。混合ミセル中の薬剤含有量は、以下の式を用いて算出された：薬剤含有量（％ｗ／ｗ）＝（混合ミセル中のＤｏｘの合計質量）／（混合ミセル中のＤｏｘの合計質量＋混合ミセル中の重合体の合計質量）×１００。
【００４９】
Ｄｏｘを組み込んだ混合ミセル（Ｄｏｘをロードした混合ミセル）は、ＡＦＭイメージに示されるように、約１６５ｎｍの均一な粒子サイズに形成された。
【００５０】
薬剤放出アッセイ 
ｐＨ５．０およびｐＨ７．４の緩衝液中の、３７℃および２５℃でのＤｏｘをロードした混合ミセルの放出がそれぞれ試験された。混合ミセルから放出されたＤｏｘは、限外ろ過（限外ろ過膜ＭＷＣＯ  １００００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって混合ミセル緩衝液（５０ｍｇ／Ｌ）から単離された。単離された溶液は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて４８５ｎｍで経時的な方法で測定された。
【００５１】
細胞毒性評価
各サンプルの細胞毒性を、テトラゾリウム色素（ＭＴＴ）アッセイを用いた細胞増殖阻害の測定によって決定した。Ｄｏｘをロードした混合ミセルおよびＤｏｘをロードしたグラフトＩミセルを、使用前にＰＢＳで２回洗浄して捕捉されていないＤｏｘを除去した。対数増殖期に採取されたＨｅＬａ細胞（５×１０３細胞／ｍＬ）は、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で９６ウェルにシードされた。ＨｅＬａ細胞が対数増殖期においてインキュベートされた後、４８時間の共培養のためにさまざまな濃度のＤｏｘを含む試料が添加された。実験の最後に、ＭＴＴアッセイが行われ、細胞生存率のパーセンテージが計算された。さらに、物質の細胞毒性がＨｅＬａ細胞（５×１０３細胞／ｍＬ）を用いて測定された。実験的なプロセスは上記と同様であった。
【００５２】
インターナリゼーション評価
ＨｅｐＧ２細胞に蓄積されたＤｏｘを、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５  ＰＡＳＣＡＬ共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって位置決定した。ＨｅＬａ細胞をカバースライド上に２４時間シードし、次いで遊離ＤｏｘまたはＤｏｘをロードした混合ミセルで処理した。Ｄｏｘをロードした混合ミセルを使用前にＰＢＳで２回洗浄して捕捉されていないＤｏｘを除去した。Ｄｏｘの濃度は約１０μｇ／ｍＬであった。一定時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを、ＦＢＳを含まない培地に添加した。３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＬＳＭ観察のために、４重量％のパラホルムアルデヒドとともにスライド上に設置した。Ｄｏｘの検出のために、４８８ｎｍ励起、５９０ｎｍのＬＰ（ロングパス）フィルターを用いて共焦点顕微鏡で蛍光観察を行った。さらに、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ観察もまた、５０４ｎｍ励起、検出に５１１ｎｍのＬＰフィルターを用いて共焦点顕微鏡で行った。
【００５３】
ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度法によって、Ｄｏｘを組み込んだ混合ミセルの薬剤含有量は、約１９％であることが示された。混合ミセルから放出されたＤｏｘは、限外ろ過膜を用いて、ミセル緩衝液から単離された。図５は、異なるｐＨ値で混合ミセルから放出されたＤｏｘの量を示す。中性環境では、Ｄｏｘを有する混合ミセルは、３７℃または２５℃でＤｏｘの約１５％を放出する初期のバーストを示した。２５℃の酸性環境では、混合ミセルはその完全なコアを維持し、Ｄｏｘの放出は２５％に達した。おそらく、ＭＡＡｃとｍＰＥＧとの間に水素結合が生じ、コアを圧迫しＤＯＸを放出したためである。対照的に、ｐＨ５．０および３７℃では、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＭＡＡｃ）は酸性環境で崩壊し凝集し、内部コアを変形させ、これによって混合ミセルからＤｏｘが放出されるため、Ｄｏｘのほぼ５０％がはじめの２時間で混合ミセルから放出された。これらの結果は、構造変化が薬剤の放出を制御することを強く示している。
【００５４】
ＨｅＬａ細胞（５×１０３細胞／ｍｌ）は、テトラゾリウム色素（ＭＴＴ）アッセイを用いて細胞増殖阻害を測定することによる、遊離ＤｏｘおよびＤｏｘをロードした混合ミセルの細胞毒性の研究に用いられた。グラフトＩ共重合体からの、Ｄｏｘを組み込んだミセル（ＤｏｘをロードしたグラフトＩミセル）であり、粒子サイズが１７６．２ｎｍであって、薬剤含有量が約１７％であるミセルが比較のために用いられた。図６に示すように、遊離Ｄｏｘは、Ｄｏｘをロードした混合ミセルおよびＤｏｘをロードしたグラフトＩミセルよりも強い活性を示した。これは、４８時間のインキュベーション後の混合ミセルまたはグラフトＩからのＤｏｘの累積放出は、６５％に達し、活性Ｄｏｘの総量は、Ｄｏｘをロードした混合ミセルまたはＤｏｘをロードしたグラフトＩミセルのものを超えたためである。さらに、ＤｏｘをロードしたグラフトＩミセルのＩＣ５０（５０％最大阻害濃度）は、約６μｇ／ｍＬであり、Ｄｏｘをロードした混合ミセルの場合（約３μｇ／ｍＬ）よりも高いことがわかった。これは、ＭＡＡｃの大きな負の電荷がグラフトＩミセルの表面を覆い、ミセルとＨｅＬａ細胞との間の反発力を生じさせ、ＨｅＬａ細胞における取り込みおよび蓄積を減少させるためである。空の混合ミセルおよびグラフトＩミセルもまた、ＨｅＬａ細胞で処理され、それぞれＩＣ５０が評価された：これらは、それぞれ、約２．５ｍｇ／ｍＬおよび約１．５ｍｇ／ｍＬであることがわかった。グラフトＩミセルの細胞毒性と混合ミセルのそれとの差は、混合ミセル中のグラフトＩの組成比は、同様の処理濃度でのグラフトＩミセルのものよりもわずかに少ないことによる。これらの結果は、空のグラフトＩミセルは有毒であることを示す。すなわち、癌の治療および細胞内ドラッグデリバリーにおけるグラフトＩミセルの応用は、限られている。立体的なおよび安定化されたジブロック共重合体を、ＭＡＡｃの負の電荷が隠されるミセル構造に導入すると、細胞の取り込みが増加し細胞毒性が減少するだけでなく、静脈注射に用いられるポリイオンの制限を克服する。
【００５５】
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）は、混合ミセルの細胞内薬剤放出の観察に用いられた。共焦点イメージは、混合ミセルがＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌）細胞とともにインキュベートされた後のＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒおよびＤｏｘの時間依存性蛍光強度を観察するために撮影された。Ｄｏｘからの赤色の蛍光と、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒからの緑色の蛍光とが細胞内区画の中で検出された。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ分子は、酸性区画に存在する間、指標となる。ＨｅｐＧ２をＤｏｘとともに１時間および８時間の両方のインキュベーションの後、遊離Ｄｏｘからの蛍光は、核に集中した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒからの蛍光は、塩酸ドキソルビシンによって酸性化されるため、核および細胞質の両方で生じた。Ｄｏｘをロードした混合ミセルが１時間照射された後、少量のＤｏｘが混合ミセルから放出され、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ分子もまた位置する細胞質中に観察され、混合ミセルがエンドサイトーシスによって外液から細胞に取り込まれたことを示した。そしてエンドソームコンパートメントのｐＨが変化し、Ｄｏｘの放出を示した。８時間後、Ｄｏｘは、強い信号を伴って混合ミセルから放出された。Ｄｏｘは、細胞質に局在するだけでなく、核にも蓄積された。同様の結果が、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）をＤｏｘをロードした混合ミセルで処理した場合に得られた。
【００５６】
本実施例で調製されたＤｏｘをロードした混合ミセルは、細胞内ｐＨが変化すると急速にダメージを受け、Ｄｏｘを放出することができる；また、大きな負の電荷を遮蔽しその溶解度を向上させる、親水性の外部シェルを有する。
【００５７】
実施例３
実施例１と同様の方法で、ブロックＩＩＩ（ｍＰＥＧ５０００−ＰＬＡ１０８８，ＰＤＩ＝１．１５，ＣＭＣ＝１６ｍｇ／Ｌ）およびブロックＩＶ（ｍＰＥＧ５０００−ＰＬＡ１７５０，ＰＤＩ＝１．２０，ＣＭＣ＝５．４ｍｇ／Ｌ）共重合体を、オクタン酸第１スズを触媒として用いて、メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ，Ｍｎ  ５０００）およびＤ，Ｌ−ラクチドからの開環重合によって合成した。これらのジブロック共重合体は、同一の化学的性質を有するが組成比が異なる。
【００５８】
グラフト共重合体（実施例１で調製したグラフトＩ）およびジブロック共重合体（ブロックＩ、ブロックＩＩＩまたはブロックＩＶ）から構成される二成分混合ミセルを、ジブロック共重合体の鎖長およびＣＭＣが、混合ミセルのモルフォロジーおよび構造に及ぼす影響を調べるために採用した。はじめに、グラフト共重合体およびジブロック共重合体を共にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４／１  ｖ／ｖ）共溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製した。ＤＭＦ／ＤＭＳＯ溶媒混合物は、これが最も小さい混合ミセルを製造するために用いられた。グラフト共重合体の濃度を１０ｍｇ／ｍＬに固定した。グラフト共重合体のジブロック共重合体に対するモル比は、１：９であった。次いで、実施例１で記載した方法を用いて、混合ミセルを透析によって調製した。グラフト共重合体およびジブロック共重合体（ブロックＩ，ブロックＩＩＩまたはブロックＩＶ）からの３つの混合ミセルのコア−シェル構造および粒子サイズを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した。ＴＥＭ観察は、３つの結果を与えた。（１）すべての混合ミセルにおいて、グラフト共重合体の暗い領域は内部コアであり、ｍＰＥＧの親水性セグメントはコアの外側に広がっていた。（２）コア領域の半径は、ジブロック共重合体のＰＬＡの鎖長が長くなるほど小さくなった（ＰＬＡ５００＞ＰＬＡ１０８８＞ＰＬＡ１７５０）。（３）混合ミセルの粒子サイズは、ジブロック共重合体のＰＬＡの鎖長が長くなるほど大きくなった（ＰＬＡ１７５０＞ＰＬＡ１０８８＞ＰＬＡ５００）。短いＰＬＡ長は、より小さい混合ミセルを製造する。
【００５９】
血清または血清アルブミンの存在下でのミセルの安定性の試験が行われた。この試験では、混合ミセル（２５ｍｏｌ％のグラフト共重合体（グラフトＩ）および７５ｍｏｌ％のｍＰＥＧ５０００−ＰＬＡ１７５０（ブロックＩＶ））が選択された。混合ミセルの安定性は、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ）によって決定された。ＰＢＳ中の混合ミセル（２ｍｇ／ｍＬ）は、ＰＢＳに溶解された等容量の４重量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合された。混合物は３７℃でインキュベートされ、時間間隔で動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、ｔｉとして定義された。ＣＯＮＴＩＮ解析法が用いられた。ＢＳＡ処理の前のＰＢＳ中のミセル（１ｍｇ／ｍＬ）の平均直径ｔ０もまた測定された。粒子サイズの比がｔｉ／ｔ０として算出された。結果は、親水性の外部シェルであるｍＰＥＧが混合ミセル上のアルブミンの吸着を防ぐため、混合ミセルは７２時間後も安定であったことを示した。これは、混合ミセルは、静脈注射の後、循環を長引かせうることの１つの現われである。
【００６０】
実施例４
２官能基でエンドキャップされたジブロック共重合体であるガラクトサミン（Ｇａｌ）−ＰＥＧ３４００−ＰＬＡ８３０（Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡ，［Ｇａｌ］：［ＰＥＧ］：［ＬＡ］＝８．４．：７．６：８４ｍｏｌ／ｍｏｌ）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ３４００−ＰＬＡ８３０（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡ，［ＦＩＴＣ］：［ＰＥＧ］：［ＬＡ］＝４：８：８８ｍｏｌ／ｍｏｌ）を、チオール−マレイミドカップリング反応によって合成した。
【００６１】
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡジブロック共重合体の合成
ＰＬＡ−ＮＨ２
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニノール（ａｌａｎｉｎｏｌ）は、カリウム／ナフタレンを用いて、対応するアルコキシド（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニノール−ＯＫ）に変換された。次いで、Ｄ，Ｌ−ラクチド（２ｇ）は、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニノール−ＯＫ（０．３５ｇ）を開始剤として、トルエン（２ｍＬ）を溶媒として用いて、１００℃で１２時間重合され、ＰＬＡ−ＮＨＢｏｃを得た。重合は、反応混合物に酢酸を添加することによって停止され、ＰＬＡ−ＮＨＢｏｃはジエチルエーテルから沈殿された。Ｂｏｃ基は、ギ酸（２０ｍＬ）とＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）との混合溶媒で処理することによって、ＰＬＡ−ＮＨＢｏｃ（２．１ｇ）から除去された。室温での９時間の処理後、溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、沈殿を得た。沈殿を室温で真空乾燥した。その後、生成物（１．５ｇ）を、トリエチルアミン（２０ｍＬ）とＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）との混合溶媒中で、室温で８時間脱プロトン化した。ＰＬＡ−ＮＨ２は、ＰＬＡ−ＮＨＢｏｃと同様の方法で精製された。
【００６２】
ＰＬＡ−ＳＨ
チオール化されたＰＬＡは、スルヒドリル部分を付加することによる、ＰＬＡ−ＮＨ２の一級アミノ基の共有結合修飾によって合成された。合成には、ＰＬＡ−ＮＨ２（２ｇ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解させ、次いで、過剰の２−イミノチオラン塩酸塩（０．４５８ｇ）と、室温で１５時間反応させた。未反応の２−イミノチオランは、５ｍＭ  ＨＣｌ溶液、次いで１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に対する、各２４時間の繰り返しの透析によって除去された。精製されたＰＬＡ−ＳＨは、真空乾燥された。
【００６３】
マレイミド−ＰＥＧ−ＮＨ２
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ｍＬ）中のＮ−メトキシカルボニルマレイミド（０．２ｇ）の一定量を、室温でポリエチレンビス（アミン）（１ｇ）の水溶液に添加した。混合物を６時間反応させた。反応後、得られたマレイミド−ＰＥＧ−ＮＨ２を、ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（１／１  ｖｏｌ／ｖｏｌ）から−２０℃で再結晶することによって精製した。
【００６４】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２
ＰＬＡ−ＳＨ（０．８ｇ）を０．１Ｍのトリス／アセトニトリル（１／３  ｖ／ｖ）（ａｑ，ｐＨ６．５，０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液で調整）（１５ｍＬ）に溶解させ、次いでマレイミド−ＰＥＧ−ＮＨ２（２ｇ）のトリス溶液（１０ｍＬ）に添加した。反応混合物を振とうし、室温で６時間持続させた。反応後、生成物を、セルロース膜の袋（分子量カットオフ６０００−８０００；ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手）を用いてＰＢＳおよびＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して透析して精製し、次いで凍結乾燥システム（Ｈｅｔｏ−Ｈｏｌｔｅｎ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で凍結し、乾燥生成物を得た。乾燥生成物をジクロロメタンに溶解させ、ジエチルエーテルから沈殿させて未反応のＰＬＡ−ＳＨを除去した。ＮＨ２−ＰＥＧ−ＰＬＡは真空下で得られた。
【００６５】
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡ
ＮＨ２−ＰＥＧ−ＰＬＡ（１ｇ）をメタノール（４０ｍＬ）に溶解させ、次いでフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（０．１５ｇ）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、反応混合物を０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液に対して透析し、その後Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に対して２日間透析し、溶媒のメタノールおよび未反応の低分子を除去した。乾燥ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡ生成物を凍結乾燥システムによって得た。
【００６６】
Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡ  ジブロック共重合体の合成
Ｇａｌ−マレイミド
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ｍＬ）中の一定量のＮ−メトキシカルボニルマレイミド（０．６８ｇ）を、ガラクトサミン塩酸塩（０．５ｇ）水溶液に室温で添加した。混合物を６時間反応させた。得られたＧａｌ−マレイミドをジエチルエーテルからの沈殿によって精製した。
【００６７】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＳＨ
チオール化されたＰＬＡは、スルヒドリル部分の付加によってＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２から合成された。合成として、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１ｇ）をアセトニトリル（１５ｍＬ）に溶解させ、過剰の２−イミノチオラン塩酸塩（０．１ｇ）と室温で１５時間反応させた。未反応の２−イミノチオランは、５ｍＭ  ＨＣｌ溶液、次いで１ｍＭ  ＨＣｌ溶液に対する２４時間の繰り返しの透析によって除去された。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水は３時間ごとに交換された。精製されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＳＨは真空乾燥された。
【００６８】
Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡ
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＳＨ（１ｇ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、次いでＧａｌ−マレイミド（０．１ｇ）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、反応混合物を０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液に対して透析し、その後Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に対して２日間透析し、溶媒のメタノールおよび未反応の低分子を除去した。乾燥したＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡ生成物は凍結乾燥システムによって得られた。
【００６９】
実施例５
Ｄｏｘを組み込んだ多機能ミセルを透析法を用いて調製した。はじめに、ＤｏｘをＤＭＳＯ／ＤＭＦ（４／１  ｖ／ｖ）に溶解させた１．２モル過剰のトリエチルアミンで中和した。この混合物を撹拌して薬剤を溶解させた。次いで、５０ｍｏｌ％のグラフトＩ、２０ｍｏｌ％のブロックＩＶ、１５ｍｏｌ％のＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡおよび１５ｍｏｌ％のＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡを薬剤溶液に溶解させた。混合物は、室温で、分子量のカットオフが６０００〜８０００の膜を用いてＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して透析された。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水は３時間ごとに交換した。凍結乾燥工程によって多機能ミセルを得た。ＤＯＸのロード量は、約３１重量％であり、これはＤＭＳＯに溶解させた多機能ミセルとしてＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で決定された。図７に、酢酸ウラニル（２重量％）で染色したＤｏｘをロードした多機能ミセルのＴＥＭイメージを示す。これらの結果は、コア−シェル構造の完全性を示す。Ｄｏｘをロードした多機能ミセルの粒子サイズは約１６０ｎｍであった。上述したように、高分子の血管を横切る移送は、間隙（内皮間接合および内皮転換接合）、カベオラ、小胞状液胞細胞小器官、および開窓を介して生じることが示された。ほとんどの腫瘍の研究におけるポアカットオフサイズは、３８０〜７８０ｎｍであった。この実施例のＤｏｘをロードした多機能ミセルは、２００ｎｍより小さく、上記の通路を通って浸出する。粒子サイズはまた、ＰＥＧがコートされたナノ粒子の器官内分布に有意に影響を与えることが明らかになった。２００ｎｍより小さい直径が、脾臓のフィルタリング効果を避けるために要求される。粒子サイズはまた、細胞内移行のメカニズムを決定しうる。大きな粒子（５００ｎｍまで）は、受容体およびクラスリン非依存性エンドサイトーシスによって細胞に入るが、小さい粒子（＜２００ｎｍ）は、非特異的なクラスリン依存性過程を通して、コートされたピットを介して内部移行されうる。したがって、本実施例のＤｏｘをロードした多機能ミセルは、生理条件下での典型的な要求されるサイズに近い、約１６０ｎｍのサイズであった。
【００７０】
制御ドラッグデリバリーにおける刺激応答挙動の効果を評価するために、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルのインビトロの薬剤放出挙動が、２つの異なる緩衝液（ｐＨ７．４および５．０）中で研究された。図８に結果を示す。中性環境（ｐＨ７．４）では、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルは、３７℃で、約１５重量％を失う初期のバースト効果を示した。放出挙動は１４０時間後一定に保たれた。酸性環境（ｐＨ５．０）では、放出挙動は明らかに２つの期間に分かれた。第１期の速い放出の後、物理的に封入されたインテリジェンスドラッグの担体の、１００時間までの長期間にわたる、持続する遅い放出がみられた。初期の速い放出（３５重量％）がはじめの２時間で観察され、次いで７０重量％の放出プロファイルに達するまで、１４０時間の持続放出が観察された。図８に示す薬剤放出挙動の結果は、本発明のＤｏｘをロードした多機能ミセルがｐＨ感受性であり、ｐＨの変化がコア構造を変形させてＤｏｘを放出するという特許請求の範囲の記載を裏付ける。
【００７１】
Ｄｏｘを含まない多機能ミセルもまた、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡ、Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡ、ブロックＩＶ（ｍＰＥＧ５０００−ＰＬＡ１７５０）およびグラフトＩ共重合体を含む４つの成分で、Ｄｏｘを用いないことを除いてはＤｏｘをロードした多機能ミセルの調製の手順を繰り返すことによって調製された。多機能ミセル中のグラフト共重合体（グラフトＩ）は、抗癌剤を封入でき、ｐＨまたは温度の変化に応じて薬剤の放出を制御できる。ミセル中のブロックＩＶは、コアシェル構造の制御および均一なミセル分布の取得を助ける。ミセル中の蛍光色素が結合したジブロック共重合体であるＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＬＡは、細胞取り込み後にミセルが蓄積する位置の直接的な証拠を与えた。一方、照準部位（Ｇａｌ）が結合したジブロック共重合体であるＧａｌ−ＰＥＧ−ＰＬＡは、活性腫瘍照準においてＨｅｐＧ２細胞のアシアログリコプロテインと結合しうる。
【００７２】
Ｄｏｘをロードした多機能ミセルおよび遊離Ｄｏｘについて、テトラゾリウム色素アッセイ（ＭＴＴ）法を用いてインビトロの細胞毒性を試験した。Ｄｏｘをロードした多機能ミセルおよび遊離ＤｏｘのＭＴＴを用いた細胞毒性を、ＨｅＬａ細胞を用いた２４時間および７２時間のインキュベーションの後で比較した。Ｄｏｘをロードした多機能ミセルの阻害濃度（ＩＣ５０）は、２４時間で２５μｇ／ｍＬであったが、７２時間で４μｇ／ｍＬに減少した。Ｄｏｘをロードした多機能ミセルの７２時間での細胞毒性は、遊離Ｄｏｘ（ＩＣ５０＝１．２μｇ／ｍＬ）と同等であった。一方、空の多機能ミセルのＩＣ５０は、７２時間のインキュベーション後、７９２μｇ／ｍＬであった。これは、ＨｅＬａ細胞の細胞毒性は、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルによって放出されたＤｏｘによることを示す。
【００７３】
バイオマーカーの応用におけるＤｏｘをロードした多機能ミセルの機能を評価するために、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）が、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルおよびＨｅＬａ細胞の取り込み（６時間のインキュベーション）後の放出されたＤｏｘの蛍光イメージを観察するために用いられた。ほとんどの粒子状の担体のトリガをかけるメカニズムは、エンドソームで生じ、細胞質に薬剤を放出する。ＣＬＳＭ蛍光イメージは、ＨｅＬａ細胞が細胞質中で、多機能ミセルがそこに位置することを表す、緑色の蛍光を与えることを示す。さらに、赤色の蛍光を伴う放出されたＤｏｘは、細胞質および核に局在した。粒子状の担体が運搬された明瞭な経路が、ＦＩＴＣ標識ミセルによって観察された。
【００７４】
実施例６
特定の腫瘍照準における多機能ミセルの機能を評価するために、実施例５で調製されたＤｏｘをロードした多機能ミセルおよび実施例２で調製されたＤｏｘをロードした混合ミセルをＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞とともにインキュベートした。
【００７５】
腫瘍照準評価
ＨｅｐＧ２細胞（２×１０４細胞／ｍＬ）を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地の２５−Ｔフラスコにシードした。ＨｅｐＧ２細胞を対数増殖期においてインキュベートした後、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルまたはＤｏｘをロードした混合ミセルを、４℃で、２時間で添加した。ＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄し、新しい培地を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃での２４時間および４８時間のインキュベーションのために添加した。実験の最後に、位相差顕微鏡を用いてトリパンブルー染色によって細胞生存率を算出した（ポジティブコントロール）。同様の工程を、ネガティブコントロールとして全工程を３７℃で繰り返した。阻害アッセイの実施のためには、ガラクトース（１５０ｍＭ）もまた系に添加することを除いてこの手順を繰り返した。
【００７６】
肝細胞は、その表面に、ガラクトース残基を認識する多数のアシアログリコプロテイン受容体を有する。その特異的な配位子−受容体結合のため、Ｄｏｘをロードした多機能ミセル（照準部分Ｇａｌを含む）の癌細胞への内部移行は、受容体媒介エンドサイトーシス過程（活性腫瘍照準）によって行われ、リソソームに運搬されうる。Ｄｏｘをロードした多機能ミセルの、２４時間および４８時間のインキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞の生存率（生存する細胞のパーセンテージ）を、Ｄｏｘをロードした混合ミセルと比較した。図９は、受容体媒介エンドサイトーシスにおけるミセルの特異的腫瘍照準および非特異的腫瘍照準の効果を示す。ポジティブコントロールについては、細胞をミセルとともに４℃でインキュベートし、２時間、結合（内在化はせず）を生じさせた。その後、これらを新しい培地と交換し、さまざまな時間の長さで３７℃に加熱した。ネガティブコントロールとして、細胞をミセルとともに３７℃でインキュベートし、ポジティブコントロールと同様の手法を行った。Ｄｏｘをロードした多機能ミセルは、Ｇａｌを含まないＤｏｘをロードした混合ミセルよりも、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのいずれにおいても、より低い細胞生存率を有した。これは、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルはアシアログリコプロテインに結合し、そして癌細胞に内在化して細胞内ｐＨの変化によってＤｏｘを放出するためである。さらに、３７℃で、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルとともにインキュベートしたすべての細胞の生存率は、４℃でインキュベートした細胞のそれよりも低く、エンドサイトーシス過程および大きな蓄積を示唆した。特異的なアシアログリコプロテイン−多機能ミセル相互作用は、阻害アッセイによって検証された。阻害アッセイの結果を図１０に示す。１５０ｍＭのガラクトースを含む細胞のインキュベーションは、ミセルと細胞との結合を完全に破壊し、含まれる過程の糖特異性を示した。
【００７７】
実施例５および６から、癌の診断剤および癌のドラッグデリバリーの担体として用いられうる、Ｄｏｘを封入した多機能ミセルが、透析によって正常に調製されたことがわかる。ＴＥＭイメージは、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルが、球形であり、静脈注射に適し、生理条件下で典型的に要求されるサイズに近い、約１６０ｎｍのサイズであることを明らかにする。腫瘍照準アッセイおよびＣＬＳＭ測定は、Ｄｏｘをロードした多機能ミセルが、受容体媒介エンドサイトーシスによって高い細胞毒性を示し、その分布の明瞭な蛍光イメージを示すことを明らかにする。これは、概念立証：すなわち、長い循環時間を有する理想的なミセルの製造、腫瘍認識および組み合わせた癌の診断および癌の治療のための制御ドラッグデリバリー：を示す。ＦＩＴＣの代わりに近赤外色素（例えばＣｙ５．５）と結合した多機能ミセルは、動物モデルに延長されて体内における分布を評価され、さらに癌の治療に延長されうることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】本願実施例１で調製した混合ミセルＧ１Ｂ１の平均直径および多分散性指数を、グラフト共重合体グラフトＩの濃度（１０．０ｍｇ／Ｌ）を固定してジブロック共重合体ブロックＩのモル比の関数として示したプロットである。
【図１Ｂ】本願実施例１で調製した混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２の平均直径および多分散性指数を、グラフト共重合体グラフトＩの濃度（１０．０ｍｇ／Ｌ）およびジブロック共重合体ブロックＩの濃度（５．６２５ｍｇ／Ｌ）を固定してジブロック共重合体ブロックＩＩのモル比の関数として示したプロットである。
【図２】本願実施例１で調製した混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージである（スケールバーは５００ｎｍである）。
【図３】本願実施例１で調製した混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２のピレンの蛍光スペクトルの振動バンドの強度比（Ｉ１／Ｉ３）を、ｐＨ４．０で温度の関数としてプロットした図である。
【図４Ａ】本願実施例１で調製した混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２の、構造変化前のＴＥＭイメージである（スケールバーは２００ｎｍである）。
【図４Ｂ】本願実施例１で調製した混合ミセルＧ１Ｂ１Ｂ２の、構造変化前のＴＥＭイメージである（スケールバーは２００ｎｍである）。
【図５】２５℃および３７℃で、酸性および中性の条件下で、本願実施例２で調製したＤｏｘをロードした混合ミセルから放出されたＤｏｘの量を示す。
【図６】さまざまな濃度の、本願実施例２で調製したＤｏｘをロードした混合ミセル、遊離Ｄｏｘ、およびＤｏｘをロードしたグラフトＩミセルで処理したＨｅＬａ細胞の増殖阻害を示す。
【図７】本願実施例５で調製したＤｏｘをロードした多機能ミセルのＴＥＭイメージを示す。
【図８】３７℃で、酸性（ｐＨ５．０）および中性（ｐＨ７．４）の条件下で、本願実施例５で調製したＤｏｘをロードした多機能ミセルから放出されたＤｏｘの量を示す。平均±ｓｄ（ｎ＝３）。
【図９】本願実施例５で調製したＤｏｘをロードした多機能ミセルおよび実施例２で調製したＤｏｘをロードした混合ミセルで処理したＨｅｐＧ２細胞の、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおける２４時間後および４８時間のインキュベーションの後の増殖阻害を示すプロットである。
【図１０】本願実施例５で調製したＤｏｘをロードした多機能ミセルおよび実施例２で調製したＤｏｘをロードした混合ミセルで処理したＨｅｐＧ２細胞の、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおけるインキュベーションアッセイを伴う（１５０ｍＭのガラクトースの存在下で）２４時間後および４８時間のインキュベーションの後の増殖阻害を示すプロットである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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