(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の質量ラベルを含むセットであって、
セット内の各ラベルが、開裂可能なリンカーを介して質量規格化部分に結合した質量マーカー部分を含み、
各質量規格化部分は、質量ラベルが所望する総質量を有することを確保するための部分であり、
該セットは、共通した総質量を有するラベル群を含み、
ここで、ラベル群においては、各ラベルは、その群内の他のすべての質量マーカー部分の質量とは異なる質量を有していて、
その結果、セット内の質量ラベルのすべてが質量分析法によって互いに識別することができる、質量ラベルのセット。
【請求項２】
前記セット内の各質量マーカー部分が共通した基本構造を有し、かつセット内の各質量規格化部分が、質量マーカー部分の共通した基本構造と同じまたは異なり得る共通した基本構造を有し、
そしてセット内の各質量ラベルが１つ以上の質量調節部分を含むとともに、セット内のすべての質量マーカー部分が異なる数の質量調節部分を含んでいて、
且つセット内のすべての質量ラベルが同じ数の質量調節部分を有するように、質量調節部分が質量マーカー部分の基本構造および／または質量規格化部分の基本構造に結合しているか、あるいは質量マーカー部分の基本構造内および／または質量規格化部分の基本構造内に存在している、請求項１に記載の質量ラベルのセット。
【請求項３】
前記セット内の各質量ラベルが、下記の構造：
【化１】
0004608171.tif 000022
（式中、Ｍは質量規格化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量調節部分であり、Ｌは開裂可能なリンカーであり、ｙおよびｚは０以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である）
を有する、請求項２に記載の質量ラベルのセット。
【請求項４】
質量調節部分が、
（ａ）質量マーカー部分の基本構造内および／または質量規格化部分の基本構造内に存在する同位体置換基、ならびに
（ｂ）質量マーカー部分の基本構造に結合し、及び／または質量規格化部分の基本構造に結合している置換原子または置換基
から選択される、請求項２または請求項３に記載の質量ラベルのセット。
【請求項５】
前記質量調節部分が、ハロゲン原子置換基、メチル基、および2Ｈまたは13Ｃの同位体置換基から選択される、請求項４に記載の質量ラベルのセット。
【請求項６】
前記質量調節部分がフッ素原子置換基である、請求項５に記載の質量ラベルのセット。
【請求項７】
前記質量マーカー部分を質量規格化部分に結合する開裂可能なリンカーが、衝突により開裂可能なリンカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の質量ラベルのセット。
【請求項８】
前記開裂可能なリンカーがアミド結合を含む、請求項７に記載の質量ラベルのセット。
【請求項９】
前記質量マーカー部分および／または質量規格化部分がフラグメンテーション抵抗性の基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の質量ラベルのセット。
【請求項１０】
前記質量規格化部分がフェニル基を含む、請求項９に記載の質量ラベルのセット。
【請求項１１】
前記質量マーカー部分が、予めイオン化された基を含んでいる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の質量ラベルのセット。
【請求項１２】
前記質量マーカー部分がＮ−メチルピリジル基を含むか、または下記の基：
【化２】
0004608171.tif 000023
（式中、Ｒは水素であるか、あるいは置換または非置換の脂肪族基または芳香族基または環状基または複素環状基である）
から選択される基を含む、請求項１１に記載の質量ラベルのセット。
【請求項１３】
前記セット内のラベルのそれぞれが、下記の構造：
【化３】
0004608171.tif 000024
（式中、Ｒは水素であるか、或いは置換若しくは非置換の脂肪族基、芳香族基、環状基または複素環状基であり；Ｌは開裂可能なリンカーであり；Ａは質量調節部分であり；各ｐは同じであって、０以上の整数であり；各ｙ’は同じまたは異なってもよく、かつ０〜４の整数であり、任意の１つのラベルに対するすべてのｙ’の和はｙに等しく；各ｚ’は同じまたは異なってもよく、かつ０〜４の整数であり、任意の１つのラベルに対するすべてのｚ’の和はｚに等しく；ｙ＋ｚは１以上の整数である）
を有する、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の質量ラベルのセット。
【請求項１４】
Ｒが水素原子であり、Ｌがアミド結合であり、ｐ＝０で、Ａがフッ素原子である、請求項１３に記載の質量ラベルのセット。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットを２セット以上含む質量ラベルのアレイであって、
該アレイ内の任意のセットの質量ラベルのそれぞれの総質量が、アレイ内のどの他のセットの質量ラベルのそれぞれの総質量とは異なる、質量ラベルのアレイ。
【請求項１６】
少なくとも１つのセットにおける各質量ラベルが、共通した質量の質量系列修飾基を含み、任意の１つのセットの質量ラベルのそれぞれにおける質量系列修飾基が、アレイ内のどの他のセットの質量ラベルのそれぞれにおける質量系列修飾基とは異なる質量を有する、請求項１５に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項１７】
質量ラベルの開裂可能なリンカーが切断されたときに、質量系列修飾基が質量マーカー部分から脱離するように、質量系列修飾基が質量ラベルに結合している、請求項１６に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項１８】
前記アレイ内の各セットの質量系列修飾基が共通した基本構造を有し、前記アレイ内の任意のセットの各質量ラベルが、当該セットのそれ以外の質量ラベルと同じ数の質量系列修飾基を有し、かつアレイ内のどの他のセットの質量ラベルとも異なる数の質量系列修飾基を有する、請求項１６または請求項１７に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項１９】
前記アレイ内の各質量ラベルが、下記の構造のいずれか：
【化４】
0004608171.tif 000025
（式中、Ｓは質量系列修飾基であり、Ｍは質量規格化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量調節部分であり、Ｌは開裂可能なリンカーであり、ｘは０以上の整数であり、ｙおよびｚは０以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である）
を有する、請求項１８に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２０】
前記質量系列修飾基がアリールエーテル基を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２１】
前記アレイ内の各質量ラベルが、下記の構造のいずれか：
【化５】
0004608171.tif 000026
（式中、Ｒは水素であるか、あるいは置換または非置換の脂肪族基または芳香族基または環状基または複素環状基であり；各ｐは同じで、０以上の整数であり；ｘは０以上の整数であり、そしてｘは、アレイ内の任意の１つのセットにおける各質量ラベルについては同じであり、かつ任意の１つのセットのｘは、アレイ内のどの他のセットのｘとは異なり；各ｙ’は同じまたは異なってもよく、かつ０〜４の整数であり、任意の１つのラベルに対するすべてのｙ’の和はｙに等しく；各ｚ’は同じまたは異なってもよく、かつ０〜４の整数であり、任意の１つのラベルに対するすべてのｚ’の和はｚに等しく；ｙ＋ｚは１以上の整数である）
を有する、請求項１９または請求項２０に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２２】
前記アレイ内のすべてのセットの質量系列修飾基が共通した基本構造を有し、そして少なくとも１つのセットの質量ラベルの質量系列修飾基が１つ以上の質量調節部分を含み、該質量調節部分が質量系列修飾基の基本構造に結合しているか、または質量系列修飾基の基本構造内に存在している、請求項１６または請求項１７に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２３】
前記アレイ内のすべてのセットのすべての質量ラベルが同じ数の質量系列修飾基を有していて、
任意のセットの各質量ラベルにおける質量系列修飾基が、当該セットのどの他のラベルにおける質量系列修飾基と同じ数の質量調節部分を有している
また任意のセットの質量ラベルにおける質量系列修飾基が、アレイ内のどの他のセットのラベルにおける質量系列修飾基とは異なる数の質量調節基を有している、
請求項２２に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２４】
前記アレイ内のセットのそれぞれが、下記の構造のいずれか：
【化６】
0004608171.tif 000027
（式中、Ｓは質量系列修飾基であり、Ｍは質量規格化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量マーカー部分および質量規格化部分の質量調節部分であり、Ａ*はＡと同じまたは異なっていてもよく、質量系列修飾基の質量調節部分であり、Ｌは開裂可能なリンカーであり、ｒは０以上の整数で、アレイ内の質量ラベルのセットが１セット以上のときには少なくとも１であり、ｙおよびｚは０以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である）
を有する質量ラベルを含む、請求項２３に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２５】
前記アレイ内のセットのそれぞれが、下記の構造のいずれか：
【化７】
0004608171.tif 000028
（式中、Ｒは水素であるか、或いは置換若しくは非置換の脂肪族基、芳香族基、環状基または複素環状基であり；各ｐは同じで、０以上の整数であり；ｘは０以上の整数であり、そしてｘは、アレイ内のすべて質量ラベルについては同じであり；各ｙ’は同じまたは異なってもよく、かつ０〜４の整数であり、任意の１つのラベルに対するすべてのｙ’の和はｙに等しく；各ｚ’は同じまたは異なってもよく、かつ０〜４の整数であり、任意の１つのラベルに対するすべてのｚ’の和はｚに等しく；ｙ＋ｚは１以上の整数であり；各ｒ’は同じまたは異なってもよく、任意の１つのラベルに対するすべてのｒ’はｒに等しく；ｒは０以上の整数で、アレイ内の質量ラベルの１つ以上については少なくとも１である）
を有する質量ラベルを含む、請求項２４に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２６】
任意の１つのセットの質量ラベルは、４ダルトン以上で、アレイ内のどの他のセットの質量ラベルとは質量が異なる、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の質量ラベルのアレイ。
【請求項２７】
２つ以上のプローブを含むセットであって、
該セット内の各プローブが異なり、かつ請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する固有の質量ラベルまたは質量ラベルの固有の組合せに結合している、プローブのセット。
【請求項２８】
２セット以上のプローブを含むプローブのアレイであって、
ここで、任意のセットにおける各プローブが、請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する固有の質量ラベルまたは質量ラベルの固有の組合せに結合していて、
また任意のセットにおけるプローブが、同一の質量ラベルセットからの質量ラベルに結合していて、
かつプローブの各セットが、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の質量ラベルのアレイに由来する固有の質量ラベルのセットに由来する質量ラベルに結合している、プローブのアレイ。
【請求項２９】
各プローブが質量ラベルの固有の組合せに結合し、各組合せが、質量ラベルのセットにおける各質量ラベルの存在および非存在によって、及び／またはプローブに結合した各質量ラベルの量によって識別される、請求項２７または請求項２８に記載のプローブのセットまたはアレイ。
【請求項３０】
各プローブが生体分子を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のプローブのセットまたはアレイ。
【請求項３１】
前記生体分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、タンパク質および／またはアミノ酸から選択される、請求項３０に記載のプローブのセットまたはアレイ。
【請求項３２】
質量分析法によって、２つ以上の分析物を、それらの質量ラベルまたは質量ラベルの組合せを同時に同定することによって検出することを含む方法であって、
前記質量ラベルが、請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する質量ラベルである分析方法。
【請求項３３】
各分析物が、質量ラベルのセットまたはアレイに由来する質量ラベルの固有の組合せによって同定され、
各組合せが、セットまたはアレイにおける各質量ラベルの存在および非存在によって、及び／又は各質量ラベルの量によって、識別される、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
分析物がその質量に従って分離され、その後、質量分析法によって質量ラベルが検出される、２つ以上の分析物を同定するための請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
分離がクロマトグラフィー法または電気泳動法によって行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
質量ラベルを検出するために用いられる質量分析計は、１つ以上の質量アナライザーを含んでいて、
該質量アナライザーは、特定の質量のイオンまたは特定の質量範囲のイオンを、検出のために通過させることができるもの、及び／またはイオンを解離させることができるものである、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記質量アナライザーを使用して、１つ以上の既知の質量ラベルに対して特異的な特定の質量または特定の質量範囲のイオンが選択され、
選択されたイオンが解離させられ、
得られた解離生成物を検出して、前記選択された質量ラベルを示すイオンパターンが同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
質量分析計が３つの四極質量アナライザーを含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第１の質量アナライザーが、特定の質量のイオンまたは特定の質量範囲のイオンを選択するために使用され、
第２の質量アナライザーが、選択されたイオンを解離させるために使用され、
第３の質量アナライザーが、得られたイオンを検出するために使用される、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）１つ以上の分析物を、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載されるプローブのセットまたはプローブのアレイと接触させる工程、
（ｂ）該分析物に関連し得るプローブを検出することによって、当該分析物を同定する工程
を含む、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
質量ラベルがプローブから切断され、その後、質量ラベルが質量分析法によって検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１つ以上の核酸をハイブリッド形成用プローブのセットと接触させる工程を含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ハイブリッド形成用プローブのセットが、２５６個までの４マー（４ｍｅｒ）のセットを含み、セット内の各プローブが核酸塩基の異なる組合せを有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する質量ラベルまたは質量ラベルの組合せを用いて各分析物を標識した２つ以上の分析物を提供する工程、
（ｂ）該質量ラベルを当該分析物から切断する工程、
（ｃ）該質量ラベルを検出する工程、
（ｄ）該質量ラベルを質量分析計で解離させて、質量マーカー部分を質量規格化部分から遊離させる工程、
（ｅ）該質量マーカー部分を検出する工程、および
（ｆ）該質量ラベルの質量スペクトルおよび質量マーカー部分の質量スペクトルに基づいて分析物を同定する工程
を含む二次元質量分析による分析法。
【請求項４５】
工程（ｃ）において、選ばれた質量または選ばれた質量範囲の質量ラベルが検出のために選択され、及び／または工程（ｅ）において、特定の質量または特定範囲の質量を有する質量マーカー部分が検出のために選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）標識された分析物の混合物を、該分析物の第１の性質に基づく第１の分離処理に供する工程、
（ｂ）得られた分離分析物を、分析物の第２の性質に基づく第２の分離処理に供する工程、および
（ｃ）標識を検出することによって、前記分析物を検出する工程
を含む分析方法であって、
前記分析物が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する質量ラベルで標識される、請求項３２に記載の分析方法。
【請求項４７】
工程（ａ）および／または工程（ｂ）において、分析物がその長さまたは質量に従って分離される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ａ）および／または工程（ｂ）において、分析物がその等電点に従って分離される、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
分析物が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸または核酸あるいはそれらの断片を含む、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４６〜４９のいずれか１項に従った２次元ゲル電気泳動の方法。
【請求項５１】
（ａ）断片の特徴を同定するために、請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する質量ラベルが、各断片に、開裂可能に結合している核酸断片の集団を提供する工程、
（ｂ）複数の断片をその長さに基づいて分離する工程、
（ｃ）各断片を切断して、その質量ラベルを遊離させる工程、および
（ｄ）質量分析法によって各質量ラベルを測定して、各断片の特徴を当該断片の長さに関連させる工程
を含む、核酸を特徴付けるための請求項３２に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）１つ以上のｃＤＮＡまたはその断片の集団を含むサンプルを、所定の配列を認識して、各ｃＤＮＡまたはその断片の末端に近い所定の配列から既知の距離にある参照部位で切断する切断剤にさらして、末端断片の集団を得る工程、
（ｂ）サンプリングした切断剤に対する認識部位を含むアダプターオリゴヌクレオチドを各参照部位に連結する工程、
（ｃ）認識部位に結合して、当該認識部位から既知の距離のサンプリングした部位で切断するサンプリングした切断剤に、前記末端断片の集団をさらして、各末端断片中に６塩基までの所定長さで配列が未知である付着末端配列を得る工程、
（ｄ）末端断片の集団を配列の長さに従ってサブ集団に分ける工程、および
（ｅ）（ｉ）所定の長さのすべての可能な塩基配列を含有する、標識されたハイブリッド形成用プローブのアレイでプローブすること、
（ｉｉ）前記粘着末端配列を、該粘着末端とハイブリダイゼーションするようなプローブに連結させる工程、および
（ｉｉｉ）ラベルの同定、好ましくはラベルの定量によって、どのプローブが連結されているかを決定することによって、各付着末端配列を決定する工程
を含む方法であって、
前記ラベルが、請求項１〜１４のいずれか１項に記載されるセットに由来する質量ラベルである、ｃＤＮＡを特徴付けるための請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
末端断片の集団が、キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動によって分けられる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
１つ以上の核酸を鋳型としてサンガーラダー核酸断片を、少なくとも１つの標識された末端塩基の存在下で生じさせる工程、および
断片の長さ及び断片の末端塩基を同定する工程
を含み、ラベルが末端塩基に関連し得、かつ請求項１〜１４のいずれか１項に記載されるセットに由来する質量ラベルである、核酸を特徴付けるための請求項３２に記載の方法。
【請求項５５】
すべての４つの末端塩基が同じ反応域に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
同じ反応域に存在する複数の核酸を鋳型としてサンガーラダー核酸断片を生成する工程、及び
生成した各核酸断片について、断片の長さ、断片が生じた鋳型の正体、断片の末端塩基を同定する工程を含む方法であって、
前記断片を生成させる前に、標識されたプライマーヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが各鋳型とハイブリッドを形成し、各プライマーにおけるラベルが、鋳型の同定を可能にするために、そのプライマーがハイブリッドを形成する鋳型に対して特異的である、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
鋳型を同定するラベルが、請求項１〜１４のいずれか１項に記載されるセットに由来する質量ラベルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
核酸の配列を決定するための請求項３２に記載の方法であって、
（ａ）それぞれが固有の量で存在し且つそれに連結するための核酸の二本鎖部分を提供するプライマーを有する一本鎖ＤＮＡを１つ以上の含む標的核酸の集団を得る工程、
（ｂ）該核酸集団をハイブリッド形成用プローブのアレイと接触させる工程であって、
各プローブが所定の長さの既知の塩基配列に開裂可能に結合したラベルを含み、前記アレイがその所定の長さのすべての可能な塩基配列を含有するともに該塩基配列は互いに連結することができず、
前記接触が、各核酸の二本鎖部分に連結する条件のもとでリガーゼの存在下で行われ、
プローブが、二本鎖部分に隣接する一本鎖核酸に対して相補的な塩基配列を有し、それにより、さらなるプローブに対する連結ができない伸長した二本鎖部分が形成される工程；
（ｃ）連結されていないすべてのプローブを除く工程；その後、
（ｄ）連結されたプローブを切断して、各ラベルを遊離させる工程；
（ｅ）マススペクトルにより各ラベルの量を記録する工程；および
（ｆ）伸長した二本鎖部分を活性化して、それに対する連結を可能にする工程；そして、
（ｇ）工程（ｂ）〜（ｆ）を、各ラベルの遊離の配列を決定することによって、その一本鎖核酸または各一本鎖核酸の配列を決定するために十分な回数のサイクルで繰り返す工程を含み、ハイブリッド形成用プローブのラベルそれぞれが、請求項１〜２６のいずれか１項に記載されるセットまたはアレイに由来する方法。
【請求項５９】
ハイブリッド形成用プローブが２５６個の４マー（４ｍｅｒ）のセットであり、セット内の各プローブが核酸塩基の異なる組合せを有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を含むサンプルを特徴付けるための請求項３２に記載の方法であって、
（ａ）ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を含むサンプルを提供すること、この場合、それぞれのペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質は、これらに対して開裂可能に結合した請求項１〜１４のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットに由来する質量ラベルまたは質量ラベルの組合せを有し、それぞれのペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質はそのラベルまたはラベルの組合せに関連し得る；
（ｂ）標識されたペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質をマススペクトルにより分析して、ラベルを検出すること
を含む方法。
【請求項６１】
サンプルが、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を含むサンプルに対する切断剤の作用からペプチドを形成させることによって提供される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
標識されたペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質が、分析前にクロマトグラフィー法または電気泳動法によって分離される、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
複数のサンプルが提供される、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
複数のサンプルが分析前にまとめられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
サンプル中のペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質の１つ以上が翻訳後修飾されるとともに糖鎖を含んでいて、修飾されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、前記糖鎖のカルボニル基を介してビオチンを結合させることによってビオチン化することを含む、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
サンプル中のペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質の１つ以上がチロシンのリン酸化により翻訳後修飾されており、そしてそのような修飾されたペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を、抗ホスホチロシン抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって分離することを含む、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
１つのペプチド断片をそれぞれのペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質から単離することを含む、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
単離された各断片が末端断片である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
（ａ）複数のポリペプチドの集団を含むサンプルを、特異的なアミノ酸残基またはアミノ酸配列をポリペプチド鎖において認識して、切断部位において切断することが知られている切断剤で処理し、それにより集団を切断して、ペプチド断片を得る工程；
（ｂ）前記断片が断片化されたポリペプチドのＮ末端またはＣ末端を参照末端として有するペプチド断片の集団を単離する工程、ここで、各ペプチド断片は参照末端に近い切断部位を反対側の末端に有する；
（ｃ）ペプチド断片の単離前または単離後に、請求項１〜２６のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットまたはアレイに由来する質量ラベルまたは質量ラベルの組合せでポリペプチドの各参照末端を標識する工程、この場合、各参照末端がそのラベルまたはラベルの組合せに関連し得る；および
（ｄ）切断部位からの範囲が所定数のアミノ酸残基の配列である、単離された１つ以上の断片の特性配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を質量分析法によって測定する工程
を含み、前記特性配列により各ポリペプチドが特徴付けられる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
（ａ）１つ以上のポリペプチドを含むサンプルを第１の切断剤と接触させて、ポリペプチド断片を得る工程；
（ｂ）各断片が断片化されたポリペプチドのＮ末端またはＣ末端を含むポリペプチド断片を１つ以上、単離する工程；
（ｃ）前記ポリペプチド断片の単離前または単離後に、請求項１〜２６のいずれか１項に記載される質量ラベルのセットまたはアレイに由来する質量ラベルまたは質量ラベルの組合せでポリペプチドの各末端を標識する工程であって、各末端がそのラベルまたはラベルの組合せに関連し得る工程；および
（ｄ）単離された断片を質量分析法によって同定する工程；
（ｅ）第１の切断剤とは異なる部位で切断する第２の切断剤を使用してサンプルに対して工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程；および
（ｆ）工程（ｄ）および工程（ｅ）で同定された断片から、サンプル内の１つ以上のポリペプチドを特徴付ける工程
を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
マススペクトルによる分析方法における、請求項１〜２６のいずれか１項に記載されるラベルのセットまたはアレイの使用。
【請求項７２】
２次元電気泳動分析の方法における、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
２次元質量分析による分析の方法における、請求項７１に記載の使用。
【請求項７４】
１つ以上の核酸を配列決定する方法における、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７５】
遺伝子発現プロフィル分析の方法における、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７６】
タンパク質発現プロフィル分析の方法における、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７７】
核酸分類分析の方法における、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、とりわけ核酸及び蛋白質のような生体分子といった分析しようとする物（分析物：ａｎａｌｙｔｅ）を標識するために有用な化合物に関するものである。特に本発明は、特異的質量ラベルを用いた質量分析法による分析の方法に関する。
（背景技術）
対象分子を標識する様々な方法として、放射性原子、蛍光染料、発光試薬、電子捕獲試薬及び光吸収染料を用いる方法を含めて、当該技術において知られている。これらの標識系の各々が、特定の適用には適するが他のものには適さなくする特徴を備えている。安全性の理由から、非放射性標識系へ関心がもたれ、特に遺伝子分析用に蛍光標識スキームが広汎に商業的開発されるようになった。蛍光標識系は比較的少ない数の分子を同時に標識することができ、典型的には４個のラベルが同時に使用され、８個までが可能である。しかし、検出装置のコストと生じたシグナルを分析することの難しさから蛍光検出体系において同時に使用できるラベルの数を制限している。
【０００１】
最近になって、対象とする会合分子に開裂可能に結合したラベルを検出する方法として、質量分析の領域が開発されるようになってきた。多くの分子生物学の適用において、分析の前に対象分子を分離できることが必要である。一般に、液相分離が実施される。近年、質量分析法により液相分離のためのいくつかのインターフェイスが発達し、それによって質量分析法はこれらの種類の適用のための検出系として特に有効となっている。最近まで、分析物イオン又はそれらのフラグメントイオンを直接検出するために液体クロマトグラフィー質量分析が使用されていた。しかし、核酸分析のような多くの応用に対しては、間接ラベルから分析物の構造を決定することができる。間接ラベルは、質量分析法の使用に関して特に有利である。ＤＮＡのような複雑な生体分子は複雑な質量スペクトルを有し、比較的低い感度でしか検出されないからである。間接検出とは、結合させたラベル分子を使用して元の分析物を同定することを意味し、ラベルは感受性の高い検出用に設計されており、単純な質量スペクトルを有する。単純な質量スペクトルは、多くの分析物を同時に分析するために多数のラベルを使用することを可能にする。
【０００２】
ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７号は、質量分析によって検出できる開裂可能なラベルに共有結合した核酸プローブのアレイを記述しており、これは共有結合した核酸プローブの配列を同定する。この特許出願のラベルプローブはＮｕ−Ｌ−Ｍ構造を有し、Ｎｕは開裂性リンカーたるＬに共有結合した核酸であり、Ｌは質量ラベルであるＭに共有結合している。この特許出願における好ましい開裂性リンカーは、質量分析計のイオン源内で開裂する。好ましい質量ラベルは置換ポリアリールエーテルである。この特許出願は、質量分析によって質量ラベルを分析する特異的方法として、様々なイオン化法、ならびに四極質量分析計、飛行時間型（ＴＯＦ）分析計及び磁気セクター装置による分析を開示している。
【０００３】
ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１６７５号は、質量ラベル分子に開裂可能に連結されたリガンド、特に核酸を開示している。好ましい開裂性リンカーは光開裂性である。この特許出願は、質量分析によって質量ラベルを分析する特異的方法として、マトリックス援用レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＴＯＦ質量分析を開示している。
【０００４】
ＰＣＴ／ＵＳ９７／２２６３９号は、遊離可能な不揮発性質量ラベル分子を開示している。好ましい実施態様では、これらのラベルは、反応基又はリガンド、すなわちプローブに開裂可能に結合されたポリマー、典型的にはバイオポリマーを含む。好ましい開裂性リンカーは、化学的又は酵素的に開裂可能であると思われる。この特許出願は、質量分析によって質量ラベルを分析する特異的方法としてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析を開示している。
【０００５】
ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０７０号、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４６号及びＰＣＴ／ＵＳ９７／０１３０４号は、質量ラベル分子に開裂可能に連結されたリガンド、特に核酸分子を開示している。好ましい開裂可能リンカーは、化学的又は光開裂性であると思われる。これらの特許出願は、質量分析によって質量ラベルを分析する特異的方法として、様々なイオン化法、ならびに四極質量分析計、ＴＯＦ分析計及び磁気セクター装置による分析を開示している。
【０００６】
分析される物質に関して生じる質量スペクトルは夾雑物に対して非常に敏感である。
【０００７】
本質的に、イオン化することができる質量分析計に導入されたいかなる物質も質量スペクトルに現われる。これは、多くの分析に関して、質量分析計に導入する前に分析物を注意深く精製する必要があることを意味する。質量ラベルを通しての分析物の間接分析のための高流量系のためには、不必要な試料調製工程を避けることが望ましいであろう。すなわちバックグラウンドにおいて夾雑物質のラベルを検出することができ、検出されるピークが実際にラベルに対応することが確実であることが望ましい。先行技術は、質量分析に基づく検出系において達成し得るシグナル対ノイズ比を改善することができる、又はスペクトルの質量ピークが質量ラベルの存在によって生じたということの確証を提供することができる方法又は組成物を開示していない。
【０００８】
液体クロマトグラフィー又は電気泳動分離後の分析物の検出のためには、使用するラベルが分離工程にできる限り干渉しないことが望ましい。そのようなラベルのアレイを使用する場合には、アレイの各構成要素がその結合している分析物に及ぼす作用は他のいずれのラベルとも同じであることが望ましい。このことは、質量に基づいて質量分析計で分離することができるラベルのアレイを作製するという質量マーキングの目的とはある程度相容れない。質量ラベルは、１つのラベルからの同位体ピークがもう１つ別のラベルの同位体ピークに干渉するのを防ぐために、好ましくは４ダルトンまで分解されるべきである。正確に４ダルトンで分離されるラベルの大きなアレイを作製することは容易ではないので、これは、２５０個の異なる質量ラベルを作製するためには約１０００ダルトン、おそらくはそれ以上の範囲にわたるラベルを必要とすることを意味する。この質量範囲は、ほぼ確実に、質量分析による検出に先立つ何らかの分離工程に異なる作用を及ぼす質量ラベルを生じるであろう。それはまた、質量分析計がイオンを検出することができる質量範囲が上昇すると共に装置のコストも上昇するという意味で、装置のデザインにも関係する。
（発明の開示）
従って、本発明の目的は、上記の先行技術に関連した問題を解決し、かつ夾雑物のバックグラウンドの中で検出することができ、そしてその正体が質量ラベルとして確認することができる質量ラベルを提供することである。さらに、本発明の目的は、ラベルが分離プロセスをそれほど妨害しないように狭い質量範囲で分けることができ、そして限定された範囲の質量対電荷比でイオンを検出する質量分析計で容易に検出することができるラベルのアレイを提供することである。
【０００９】
また、本発明の目的は、特に遺伝学的分析、より詳細には、タンパク質を分析するために使用される２次元ゲル電気泳動におけるそのようなアッセイの処理能、シグナル対ノイズ比および感度を最大限にするために本発明のラベルを利用する、生体分子を分析する方法を提供することである。
【００１０】
さらに、下記に開示される質量ラベルの設計により、単純化されたタンデム質量分析計を、質量ラベルを検出するために設計することができる。第１の質量アナライザーは、その質量が比較的低いイオンの限られた数を選択しなければならないだけである。
【００１１】
第２の質量アナライザーは、少数のフラグメンテーション生成物を検出しなければならないだけである。
【００１２】
従って、本発明は、開裂可能なリンカーを介して質量規格化部分に結合した質量マーカー部分をセット内の各ラベルが含む、２つ以上の質量ラベルのセットを提供する。この場合、各質量規格化部分は、質量ラベルが所望する総質量を有することを確保するための部分である。該セットは、共通した総質量を有するラベル群を含む。ラベル群において、各ラベルは、その群内のすべての他の質量マーカー部分の質量とは異なる質量を有する質量マーカー部分を有し、その結果、セット内の質量ラベルのすべてが質量分析法によって互いに識別することができる。
【００１３】
本発明に関連して使用される質量マーカー部分の用語は、質量分析法によって検出され得る部分を示すものである。また本発明に関連して使用される質量規格化部分の用語は、質量分析法によって必ずしも検出され得ないが、質量ラベルが所望する総質量を有することを確保するために存在する部分を示すものとする。セット内のラベルの数は、セットが複数のラベルを含むならば特に限定されない。しかし、セットが２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上のラベルを含むことは好ましい。
【００１４】
本発明はまた、上記に規定されるような質量ラベルの２つ以上のセットを含む質量ラベルのアレイを提供する。この場合、任意の１つのセットにおける質量ラベルのそれぞれの総質量は、アレイ内のどの他のセットにおける質量ラベルのそれぞれの総質量とは異なる。
【００１５】
さらに、本発明により、分析物に対して固有の質量ラベルまたは質量ラベルの組合せを質量分析法によって同定することにより分析物を検出することを含む分析方法が提供される。この場合、質量ラベルは、上記に規定されるような質量ラベルのセットまたはアレイに由来する質量ラベルである。
【００１６】
以下、添付の図面を参照しながら、あくまで例示として本発明をさらに詳細に説明する。
（実施形態）
１つの好ましい実施様態において本発明は、以上で定義したような、質量ラベルのセットを提供し、そこで、前記セットにおけるそれぞれのラベルは、共通の質量を有する質量マーカー部分を有し、前記セットにおけるそれぞれのラベルは、固有の総質量を有する。この第１の型のラベルのセットの例は図４に示されている。
【００１７】
他のより好ましい実施様態において、前記セットのそれぞれのラベルは、共通の総質量を有し、前記セットにおけるそれぞれのラベルは、固有の質量の質量マーカー部分を有する。この第２の型のラベルセットの例は図３に示されている。
【００１８】
ラベルのセットは、上述した２つの好ましい実施様態に限定される必要はなく、すべてのラベルが、以上で概略したように、質量分析法によって識別可能である限り、たとえば両方の型のラベルを含んでよい。
【００１９】
第２の型のラベルのセットにおいて、前記セット中のそれぞれの質量マーカー部分は、共通の基本構造を有し、前記セット中のそれぞれの質量規格化部分は、共通の基本構造を有し、前記セット中のそれぞれの質量ラベルは、１つ以上の質量調節部分を含み、前記質量調節部分は、前記質量マーカー部分の基本構造および／または前記質量規格化部分の基本構造に結合するか、あるいは前記質量マーカー部分の基本構造および／または前記質量規格化部分の基本構造内に位置する。本実施態様において、前記セット中のすべての質量マーカー部分は、異なる数の質量調節部分を含み、前記セット中のすべての質量ラベルは同数の質量調節部分を有する。
【００２０】
本明細書を通して、共通基本構造という表記により、２つ以上の部分が、実質的に同一の構造骨格、基幹、コアを有する構造を共有することを意味する。この骨格または基幹は、たとえばフェニルエチル部分であってよい。骨格または基幹は、共通基本構造を変更しない限り、基本構造にぶら下がった置換基を有していてもよく、または基本構造内に原子又は同位体の置換が行われていてもよい。
【００２１】
典型的には、以上で言及した第２の型の質量ラベルのセットは、以下の式、
【００２２】
【化８】
0004608171.tif 000002
【００２３】
を有する質量ラベルを含んでいる。式中、Ｍは質量規格化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量調節部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、ｙおよびｚは０以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である。好ましくは、Ｍはフラグメンテーション抵抗性基であり、Ｌは他の分子または原子との衝突によるフラグメンテーションを受けやすいリンカーであり、Ｘは好ましくは前もってイオン化されたフラグメンテーション抵抗性基である。ＭおよびＸの質量合計は、そのセットのすべての構成物に対して同一である。好ましくは、ＭおよびＸは、同一の基本構造またはコア構造を有し、この構造は、質量調節部分によって改変される。質量調節部分は、ＭおよびＸの質量の合計が、１つのセットにおけるすべての質量ラベルに対して同一であることを保証するが、それぞれのＸが異なる(固有の)質量を有することをも保証する。
【００２４】
上記構造を有する質量ラベルの好ましいセットは、セット中でそれぞれのラベルが、以下の構造を有している。
【００２５】
【化９】
0004608171.tif 000003
【００２６】
式中Ｒは水素、または置換若しくは非置換脂肪族、芳香族、環状または複素環であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、Ａは質量調節部分であり、それぞれのｐは同一であって、０以上の整数であり、それぞれのｙ'は、同一であっても異なっていてもよく且つ０〜４の整数であって、すべてのｙ’の合計はｙと等しく、それぞれのｚ’は、同一であるかまたは異なってもよく且つ０〜４の整数であって、全ｚ’の合計はｚと等しい。好ましくは、ＲはＨ原子であり、Ｌはアミド結合であり、ｐ＝０であり、ＡはＦ原子である。
【００２７】
本明細書において、Ｒ基上での置換様式はまったく限定されていない。置換基または置換基（群）には、任意の有機基および／または、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、ＯまたはＳ原子またはハロゲン原子（たとえばＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）のような、周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡまたはＶＩＩＡ族からの１つまたはそれ以上の原子を含んでもよい。
【００２８】
置換基が有機基を含む場合、前記有機基は、炭化水素基を含んでよい。炭化水素基は、直鎖、分岐鎖、または環状基を含んでよい。独立して、炭化水素基は、脂肪族基、または芳香族基を含んでよい。さらに独立して、炭化水素基は、飽和または不飽和基を含んでもよい。
【００２９】
前記炭化水素基が不飽和基を含む場合、１つ以上のアルケン官能基および／または１つ以上のアルキン官能基を含んでよい。前記炭化水素が直鎖または分岐鎖基を含む場合、１つ以上の第一級、第二級および／または第四級アルキル基を含んでよい。前記炭化水素が、環状基を含む場合、芳香族環、脂肪族環、複素環、および／またはこれらの基の縮合環誘導体を含んでよい。したがって、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾールおよび／またはオキサゾール基、ならびに上記基の部位異性体を含んでもよい。
【００３０】
炭化水素基内の炭素原子の数は、特に限定はされないが、一般的に炭化水素基は、１〜４０個のＣ原子を含む。したがって、炭化水素基は、低級炭化水素（１〜６個のＣ原子）または高級炭化水素（７個のＣ原子、またはそれ以上、たとえば７〜４０個のＣ原子）であり得る。環状基の環を構成する原子数は特に限定しないが、環状基の環は、３、４、５、６または７原子のように３〜１０原子を含んでよい。
【００３１】
以上で定義したヘテロ原子を含む基、ならびに以上で定義した基のいずれも、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、ＯまたはＳ原子またはハロゲン原子（たとえばＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）のような、周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡまたはＶＩＩＡ族のヘテロ原子を１つ以上含んでよい。したがって、置換基は、ヒドロキシ基、カルボキシル酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸基、スルホン酸基、およびリン酸基等の有機化学における共通の官能基を任意に１つ以上含んでもよい。置換基はまた、カルボキシル酸無水物、およびカルボキシル酸ハロゲン化物等の、上記官能基の誘導体を含んでもよい。
【００３２】
さらに、任意の置換基が、上記で定義した置換基および／または官能基の２種以上の組合せを含んでよい。
【００３３】
本発明の質量ラベルのアレイは、本発明にしたがった多数の質量ラベルのセットを含む限り、特に限定はされない。アレイが、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の質量ラベルのセットを含むことが望ましい。好ましくは、アレイ中の各質量ラベルが、以下の構造のいずれかを有している。
【００３４】
【化１０】
0004608171.tif 000004
【００３５】
式中、Ｓは質量系列修飾基であり、Ｍは質量規格化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量調節部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、ｘは０以上の整数であり、ｙおよびｚは０以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である。
【００３６】
上記型の質量ラベルのアレイは、質量ラベルが以下の構造のいずれかを有していることが好ましい。
【００３７】
【化１１】
0004608171.tif 000005
【００３８】
式中Ｒは水素であるか、または置換または非置換脂肪族、芳香族、環状または複素環であって、各ｐは同一で且つ０以上の整数であり、ｘは０以上の整数であり、任意の１つのセットに対するそれぞれのｘは当該アレイ中のいずれの他のセットのｘとも異なり、それぞれのｙ’は同一であっても異なっていてもよく且つ０〜４の整数であり、すべてのｙ’の合計はｙに等しく、それぞれのｚ’は同一であっても異なっていてもよく且つ０〜４の整数であり、すべてのｚ’の合計はｚに等しい。この型のアレイは、図７に示されている。
【００３９】
他の好ましい態様では、質量ラベルのアレイは、以下の構造のいずれかを有している。
【００４０】
【化１２】
0004608171.tif 000006
【００４１】
式中Ｓは質量系列修飾基であり、Ｍは質量規格化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量マーカー及び質量規格化部分の質量調節部分であり、Ａ*はＡと同一であっても異なっていてもよく、質量系列修飾基の質量調節部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、ｒは０以上の整数であって、アレイ中に質量ラベルのセットを１セット以上含むときには少なくとも１であり、ｙおよびｚは０以上の整数であり、ｘ＋ｙは１以上の整数である。好ましくは、Ｍはフラグメンテーション抵抗性基であり、Ｌは他の分子または原子との衝突によってフラグメンテーションを受けやすいリンカーであり、Ｘは好ましくは予めイオン化された、フラグメンテーション抵抗性基である。Ｓは典型的には、アレイの構成要素であるラベルセットが、前記アレイの他のすべての構成物要素である、他のすべてのＳから、好ましくは４ダルトン分だけ分離されるような質量であるＳを含むような基である。したがって、質量ラベルの異なるセットはそれぞれ異なった(固有の)質量を持っている。
【００４２】
上記後者の型の質量ラベルの好ましいアレイは、そのアレイ中の質量ラベルが、以下の構造のいずれかを有している。
【００４３】
【化１３】
0004608171.tif 000007
【００４４】
式中Ｒは水素であるか、または置換または非置換脂肪族、芳香族、環状または複素環であって、それぞれのｐは同一であって且つ０以上の整数であり、ｘは０以上の整数であって且つアレイ中の全ての質量ラベルについて同じであり、それぞれのｙ’は同一であっても異なっていてもよく且つ０〜４の整数であり、すべてのｙ’の合計はｙに等しく、それぞれのｚ’は同一または異なっていてもよく且つ０〜４の整数であり、すべてのｚ’の合計はｚに等しく、それぞれのｒ’は同一であっても異なっていてもよく、すべてのｒ’の合計はｒに等しい。この型のアレイは、図６に示されている。
【００４５】
本発明の上記セットおよびアレイにおいて、Ｍ、ＸおよびＳ基の共通の基本構造は特に限定しないが、環状および／または非環状基を含んでよい。Ｍ、ＸおよびＳの特性は特に限定されてはいない。しかしながら、Ｍおよび／またはＸ、および／またはＳが、基礎(コア)構造として、アリール、シクロアルキル、または複素環のような環状基を含むことが好ましい。これらの基は置換されていなくてもよいが、好ましくは置換されている。Ｍ、Ｘおよび／またはＳはそれぞれ、上記環状モノマーから形成されたオリゴマーまたはポリマーを含み、環状モノマーは、フラグメンテーション抵抗性の結合または基によって連結されている。
【００４６】
フェニルエーテル基並びにそのオリゴマーおよびポリマー等のアリールエーテル、とりわけ置換アリールエーテルが、Ｍ、ＸおよびＳに対する好ましい共通の基本構造である。
【００４７】
開裂可能リンカー基Ｌは特に限定されない。しかしながら、Ｌが、衝突によって開裂可能であり、および／または質量分析計内で開裂可能である基を含むことが好ましい。好ましくは、基Ｌはアミド結合を含む。
【００４８】
さらに好ましい態様では、本発明は、分析される分子と反応可能である質量ラベルのセットおよびアレイを提供し、前記質量ラベルは、以下の形を有している。
【００４９】
【化１４】
0004608171.tif 000008
【００５０】
式中、Ｒｅは限定はしないが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドのような、分析しようとする分子中の適切な官能基に共有結合的に質量ラベルと反応する反応性官能基または反応性基であり、Ｌ'は開裂可能であっても開裂可能ではなくてもよいリンカーであり、本ラベルは、上記任意のセットまたはアレイからの質量ラベルである。Ｓは上記で定義したものと同義である。
【００５１】
Ｌ’は所望により、上記で定義した開裂可能リンカーＬのような、開裂可能リンカーであってよい。
【００５２】
本発明の上記態様のうちの好ましい実施様態において、Ｌおよび／またはＬ'は質量分析計内、好ましくは質量分析計のイオン供給源内で開裂可能である。
【００５３】
（リンカー基）
以上および以下の議論において、対象の分子を本発明の質量ラベル化合物に連結するのに使用し得るリンカー基が作製される。本発明の質量ラベルとこれに共有結合した分析物との間に導入され得る、さまざまなリンカーが本技術分野で公知である。これらのリンカーのいくつかは開裂可能であり得る。１９９２年、Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ.  ＆  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０；１６７９−１６８４ページにて開示されたもののような、オリゴ−またはポリエチレングリコールまたはその誘導体をリンカーとして使用し得る。
【００５４】
一般的に塩基変化しやすく、したがって多くのオリゴヌクレオチド合成において使用される塩基が仲介する脱保護工程に不適合であるので、オリゴヌクレオチドの標識に関する適用にはあまり好ましくはないものの、コハク酸を基本としたリンカーもまた広く使用されている。
【００５５】
プロパギル酸アルコールは、オリゴヌクレオチド合成の条件下で安定な連結を提供する二官能性リンカーであり、オリゴヌクレオチド適用に本発明が関連した使用に対して好ましいリンカーである。同様に６−アミノヘキサノールは、望ましく官能化された分子を連結するのに有用な二官能性試薬であり、また好ましいリンカーである。
【００５６】
光開裂可能リンカーのような、さまざまな公知の開裂可能リンカー基を、本発明の化合物と一緒に使用してよい。オルト−ニトロベンジル基、とりわけ２−ニトロベンジルエステル、および２−ニトロベンジルアミン類は、光開裂可能リンカーとして知られており、ベンジルアミン結合の部位で開裂する。開裂可能リンカーの総論に関しては、さまざまな光開裂可能、および化学的に開裂可能なリンカーを含んでいる、１９９３年、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９、１１０６５−１１１３３ページを参照のこと。
【００５７】
ＷＯ００／０２８９５号は、開裂可能リンカーとしてビニルスルフォン化合物を開示しており、これはまた、本発明での使用、とりわけ、ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の標識にかかわる適用において利用可能である。本明細書の内容は参考文献にて組み込まれている。
【００５８】
ＷＯ００／０２８９５号は、気相での塩基による開裂が可能であるリンカーとして、シリコン化合物の使用を開示している。これらのリンカーはまた、本発明での使用、とりわけオリゴヌクレオチドの標識にかかわる適用にて利用可能である。本明細書の内容は、参考文献にて組み込まれている。
【００５９】
以下の議論において、本発明の化合物が他の化合物、レポーター基または分析しようとする物質のいずれかに連結するように、反応性官能基Ｒｅが言及される。さまざまな反応性官能基が本発明の質量ラベル内に導入され得る。
【００６０】
表１は、２つの物質間で共有結合的連結を生成するために、生体分子中で見られる求核官能基と反応し得る、いくつかの反応性官能基を列挙している。合成オリゴヌクレオチドに関与する適用に対しては、一級アミンまたはチオールが分子の末端にしばしば導入されて、標識を可能にする。以下に列記された任意の官能基を、質量マーカーを対象の分子に結合可能にするために、本発明の化合物内に導入することができた。反応性官能基は、望む場合に、さらなる反応性官能基とともにさらなるリンカー基を導入するために使用できる。表１は、網羅的であるつもりはなく、本発明は、列記された官能基のみの使用に限定はされない。
【００６１】
【表１】
0004608171.tif 000009
【００６２】
本発明の質量マーカーでのオリゴヌクレオチドの標識にかかわる適用において、上記反応性官能基又はこれらの結果物である連結基は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーに導入する前に、保護されなければならない可能性があることを考慮すべきである。通常オリゴヌクレオチドシンセサイザー内で安定ではないので、好ましくは、未保護エステル、チオエーテルおよびチオエステル、アミンおよびアミド基は避けるべきである。広く種々の保護基が、望まない副次反応から結合を保護するのに使用可能であるとして、本技術分野で公知である。
【００６３】
以下の議論において、「帯電官能基（ｃｈａｒｇｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）」および溶解性基が言及される。これらの基は、イオン化および溶解性を促進するために、本発明の質量マーカー内のような質量ラベル内への導入可能である。マーカーの選択は、陽イオンまたは陰イオンいずれかの検出を使用するかどうかに依存する。以下の表２は、陽イオン化または陰イオン化いずれかを促進するために、質量マーカー内に導入し得るいくつかの官能基を列記している。本表は、網羅的であるつもりはなく、本発明は、列記された官能基のみの使用に限定はされない。
【００６４】
【表２】
0004608171.tif 000010
【００６５】
ＷＯ  ００／０２８９３号は、質量マーカーのイオン化を改善する目的のための、クラウンエーテルまたはポルフィリンのような金属イオン結合部分の使用を開示している。これらの部分も、本発明の質量マーカーとの使用に適用可能である。
【００６６】
本発明の質量マーカーの構成成分は、マーカーのフラグメンテーション部位が、衝突誘導乖離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって簡単に壊れる連結の導入によって制御可能であるように、好ましくはフラグメンテーション抵抗性である。アリールエーテルが、本発明で使用可能であるフラグメンテーション抵抗性化合物のある種の例である。これらの化合物はまた、化学的に不活性であり、温度に安定である。ＷＯ第９９／３２５０１号は、より詳細に質量分析法でのポリエーテルの使用を議論しており、本明細書の内容は、参考文献にて組み込まれている。
【００６７】
過去に、アリールエーテルの合成に関する一般的な方法は、約２００℃での、銅粉末の存在下、アリールブロマイドのフェノールとのウルマン（Ｕｌｌｍａｎｎ）カップリングに基づいていた(代表的な参考文献：Ｈ．Ｓｔｅｔｔｅｒ、Ｇ．Ｄｕｖｅ、Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｂｅｒｉｃｈｔｅ  ８７（１９５４年）１６９９ページ)。アリールエーテルの合成に関するミルダー（Ｍｉｌｄｅｒ)法が、異なる金属触媒を用いて発展したが、反応温度はまだ１００から１２０℃の間である（Ｍ．Ｉｙｏｄａ、Ｍ．Ｓａｋａｉｔａｎｉ、Ｈ．Ｏｔｓｕｋａ、Ｍ．Ｏｄａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６（１９８５年）４７７ページ）。これは、ポリエーテル質量ラベルの生成に対して好ましい工程である。以下の例で示されたＦＴ７７の合成を参照のこと。最近発行された方法によって、先行する方法よりもより穏やかな条件で実施されるために、ポリエーテル質量ラベルを生成するのにより好ましい経路が提供される（Ｄ．Ｅ．Ｅｖａｎｓ、Ｊ．Ｌ．Ｋａｔｚ、Ｔ．Ｒ．Ｗｅｓｔ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９（１９９８年）２９３７ページ）。
【００６８】
本発明はまた、２つまたはそれ以上のプローブのセットを提供し、前記セットにおけるそれぞれのプローブは異なり、以上で定義したような質量ラベルのセットに由来する固有の質量ラベルまたは質量ラベルの固有の組合せに結合している。
【００６９】
さらに、２つ以上のプローブのセットを含むプローブのアレイが提供され、そこで、任意の1つのセット内のそれぞれのプローブは、以上で定義したような質量ラベルのセットから、固有の質量ラベル、または質量ラベルの固有の組合せに結合し、任意の１つのセット内のプローブは、同一の質量ラベルセットからの質量ラベルに結合し、それぞれのプローブのセットは、以上で定義した質量ラベルのアレイからの質量ラベルの固有のセットからの質量ラベルに結合する。
【００７０】
１つの実施様態において、それぞれのプローブは、好ましくは、固有の質量ラベルの組合せに結合し、それぞれの組合せは、質量ラベルのセット内のそれぞれの質量ラベルの存在または不在によって、および／またはプローブに結合したそれぞれの質量ラベルの量によって見分けられる。このことは、プローブが質量ラベルの混合物に結合可能であることから、本発明の「混合モード（ｍｉｘｉｎｇ  ｍｏｄｅ）」と呼ばれる。
【００７１】
以上の態様において、プローブの性質は特に限定はされない。しかしながら、好ましくは、それぞれのプローブは生体分子を含む。任意の生体分子を利用できるが、好ましい生体分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびアミノ酸より選択される。
【００７２】
１つの好ましい実施様態において、本発明は、以下の形態を有するヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのような、質量ラベルで標識した（質量ラベル化：ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌｅｄ）分析物のセットおよびアレイを提供する。
【００７３】
【化１５】
0004608171.tif 000011
【００７４】
式中Ｌ’およびＳは上記で定義された通りであり、ラベルは上記で定義した任意のセットおよびアレイからの質量ラベルである。
【００７５】
以上の態様において、分析物の特性は特に限定されてはいない。しかしながら、好ましくはそれぞれの分析物は生体分子を含む。任意の生体分子を利用できるが、生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびアミノ酸より選択されることが好ましい。
【００７６】
1つの実施様態において、それぞれの分析物は、質量ラベルの固有の組合せに結合し、それぞれの組合せは、質量ラベルのセット内のそれぞれの質量ラベルの存在または不在によって、および／またはプローブに結合したそれぞれの質量ラベルの量によって識別される。
【００７７】
以上で言及したように、このことは、プローブが質量ラベルの混合物に結合可能であることから、本発明の「混合モード（ｍｉｘｉｎｇ  ｍｏｄｅ）」と呼ばれる。
【００７８】
以上で言及したように、本発明は解析の方法を提供し、前記方法には、質量分析計によって質量ラベル、または分析物に固有の質量ラベルの組合せを同定することによって分析物を検出することが含まれ、そこで質量ラベルは、以上で定義したような質量ラベルのセットまたはアレイからの質量ラベルである。方法が、分析物を同定するために、本発明の質量ラベルの使用から恩恵を受ける限り、方法の型はとくに限定されない。本方法は、たとえば核酸を配列決定する方法、または試料中のタンパク質の量を検出することによって１つまたはそれ以上の遺伝子の発現をプロファイルする方法であり得る。同時に多量な分析物の簡単な解析のために使用できることから、本方法はとりわけ利点がある。しかしながら、本方法はまた、従来のスペクトルよりも明瞭である、本質量ラベル、質量スペクトルの使用を提供し、方法が正確に、感受性よくなるために、単一の分析物を個々に解析することにも利点がある。
【００７９】
さらに好ましい実施様態において、本発明は、
（ａ）1つ以上の分析物を、プローブのセット、またはプローブのアレイと接触させる工程、ここで、セットまたはアレイ中のそれぞれのプローブは、少なくとも１つの分析物に特異的であるとともに、プローブは以上で定義したようなものである、
（ｂ）分析物に特異的なプローブを検出することによって、分析物を同定する工程、
を含む方法を提供する。
【００８０】
本実施様態において、質量分析による質量ラベルの検出の前に、プローブから質量ラベルが開裂することが好ましい。
【００８１】
本特定実施様態の方法の特徴は、特に限定はされない。
【００８２】
しかしながら、本方法が、1つまたはそれ以上の核酸をハイブリッド形成用プローブのセットと接触させる工程を含むことが好ましい。ハイブリッド形成用プローブのセットは、典型的には、２５６個までの４マー（４ｍｅｒ）のセットを含み、前記セット中のそれぞれのプローブは、核酸塩基の異なった組合せを有する。本方法は、標的核酸の存在を同定するために好適であり得、または1つ以上の核酸を鋳型として、プライマー伸張配列決定の逐次的方法において使用することが可能である。
【００８３】
本発明の質量ラベルは、主に多数のラベルが同時に識別可能であるために、特に、２次元解析の方法での使用に好適である。したがって、ラベルは、2次元ゲル電気泳動の方法において、又は２次元質量分析の方法において使用可能である。
【００８４】
したがって、本発明の１態様によれば、本発明は、２次元質量分析解析の方法を提供する。この方法は、
（ａ）各分析物が、当該分析物に固有の質量ラベルまたは質量ラベルの組合せによって標識されているような分析物を１つ以上提供する工程、ここで質量ラベルは、上記で定義したような質量ラベルのセットまたはアレイ由来のものである、
（ｂ）質量ラベルを分析物より開裂する工程、
（ｃ）質量ラベルを検出する工程、
（ｄ）質量マーカー部分を質量規格化部分より放出するために、質量分析計内で質量ラベルを解離させること、
（ｅ）質量マーカー部分を検出する工程、および
（ｆ）第一次元での質量ラベルの質量スペクトル、および第二次元での質量マーカー部分の質量スペクトルに基づき分析物を同定すること、
を含む。
【００８５】
本方法において、好ましくは、工程（ｃ）で、選択した質量または選択した質量範囲の質量ラベルが検出のために選択される。工程（ｅ）において、特定の質量または特定の質量範囲を有する質量マーカー部分を検出のために選択することもまた好ましい。
【００８６】
他の態様において、本発明は、
（ａ）分析物の第１の特性に基づいて、標識した分析物の混合物を第１の分離処理にかける工程、
（ｂ）得られた分離分析物を、分析物の第２の特性に基づいて、第２の分離処理にかける工程、および
（ｃ）その標識を検出することによって、前記分析物を検出する工程、
を含む方法であって、分析物が、上記で定義したような質量ラベルのセットまたはアレイからの質量ラベルを用いて標識される方法を提供する。
【００８７】
分析物の特性は特に限定はされない。しかしながら、本実施様態において、工程（ａ）および／または工程（ｂ）で、分析物は、好ましくはその長さまたは質量にしたがって分離される。工程（ａ）および／または工程（ｂ）において、分析物は、その等電点にしたがって分離されることがさらに好ましい。典型的に、分析物は１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸または核酸、またはそれらの断片を含む。ゲル電気泳動を、それぞれの分離工程で利用することがとりわけ好ましい。
【００８８】
本実施様態において、本方法は２次元ゲル電気泳動の方法である。
【００８９】
さらなる観点において、本発明は、核酸を特性化するための方法を提供する。その方法は、
（ａ）核酸断片の集団を提供する工程、ここで、それぞれの断片は、その断片の特性を同定するために、上記で定義したような質量ラベルのセットまたはアレイからの質量ラベルに開裂可能に結合している、
（ｂ）断片の長さに基づいて、前記断片を分離する工程、
（ｃ）前記質量ラベルを放出させるために、それぞれの断片を開裂させる工程、および、
（ｄ）質量分析計によってそれぞれの質量ラベルを検出して、それぞれの断片の特性をその断片の長さと関連付ける工程、
を含む。
【００９０】
典型的には、本発明のこの態様の方法は、ｃＤＮＡを特徴づけるために使用される。
【００９１】
好ましくは、本方法は、
（ａ）末端断片の集団を作製するために、1つまたはそれ以上のｃＤＮＡまたはその断片の集団を含む試料を、所定配列を認識し、それぞれのｃＤＮＡまたはその断片の末端に所定配列から既知の距離にある参照部位で切断する切断剤にさらす工程、
（ｂ）それぞれの参照部位を、切断剤のサンプリングのために、認識部位を含むアダプターオリゴヌクレオチドと連結する工程、
（ｃ）認識部位に結合して当該認識部位から既知の距離にあるサンプリング部位にて切断するサンプリング切断剤に、末端断片の集団を曝露して、各末端断片中に所定の６塩基までの長さを有し且つ配列が未知である粘着末端を作製する工程、
（ｄ）配列の長さにしたがって、末端断片の集団をサブ集団に分離する工程、
（ｅ）（ｉ）標識したハイブリッド形成用プローブのアレイでプローブ化する工程、本アレイは、所定長さのあらゆる可能な塩基配列を含んでいる、
（ｉｉ）ハイブリッドを形成したそれらのプローブを、粘着末端配列に連結する工程、
（ｉｉｉ）標識を同定し、好ましくは定量することによって、どのプローブが連結したかを決定することによってそれぞれの粘着末端配列を決定する工程
を含む方法であって、前記標識は、上記で定義したようなセットまたはアレイ由来の質量ラベルである。
【００９２】
本方法において、末端断片の集団は、好ましくはキャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動によって分離される。
【００９３】
本発明のまたさらなる態様において、核酸及び断片の末端塩基を特徴づけるための方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの標識した末端塩基の存在下で、1つ以上の核酸を鋳型としてサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ラダー核酸断片を作製すること、及び断片の長さを同定する工程を含み、ここで前記ラベルは、末端塩基に特異的であり、以上で定義したようなセットまたはアレイからの質量ラベルである。
【００９４】
本発明のこの態様において、すべての４つの末端塩基が同一の反応領域に存在することが好ましい。本方法は典型的に、同一の反応領域において存在する多数の核酸を鋳型としてサンガーラダー核酸断片を作製する工程、並びに生成されたそれぞれの核酸断片に関して、断片の長さ、断片が由来する鋳型のアイデンティティおよび断片の末端塩基を同定する工程を含む方法であって、断片を作製する前に、標識されたプライマーヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはそれぞれの鋳型とハイブリッドを形成し、それぞれのプライマー上のラベルは、プライマーがハイブリッドを形成して鋳型の同定を可能にする鋳型に特異的である。鋳型を同定する標識のタイプは特に限定はされない。しかしながら、鋳型を同定する標識は、以上で定義したようなセットまたはアレイからの質量ラベルであることが好ましい。
【００９５】
本発明の方法のさらなる態様は、核酸を配列決定する方法を提供する。この本方法は、
（ａ）配列決定すべき１つ以上の一本鎖ＤＮＡを含む標的核酸集団を得る工程、ここで、１本鎖ＤＮＡはそれぞれ固有の量で存在し且つプライマーを有していて、連結のために核酸の二本鎖部分を提供している
（ｂ）前記核酸集団を、ハイブリッド形成用プライマーのアレイと接触させる工程、ここでそれぞれのプライマーは、所定の長さを有する公知の塩基配列に開裂可能に結合したラベルを含み、アレイは、そのような所定長さのあらゆる可能な塩基配列を含み、塩基配列は、お互いに連結不可能であり、また、この接触工程は、リガーゼの存在下で、二本鎖部位に隣接した一本鎖部位に相補的な塩基配列を有するプローブに、それぞれの核酸の二本鎖部位に連結して、それによって、更なるプローブへの連結が不可能となる伸張された二本鎖部分を形成する条件下で、実施される、
（ｃ）連結しなかったすべてのプローブを除去する工程、続いて
（ｄ）それぞれのラベルを放出させるために、連結したプローブを開裂させる工程、
（ｅ）それぞれのラベルの量を記録する工程、および
（ｆ）連結を可能にするために、伸張二本鎖部位を活性化する工程、
を含み、
（ｇ）それぞれのラベルを放出した配列を決定することによって、その配列または各一本鎖核酸の配列を決定するために十分な回数、工程（ｂ）から（ｆ）を繰り返す、
ここでハイブリッド形成用プローブは、それぞれ、以上で定義したセットまたはアレイからのものである。
【００９６】
本発明のこの態様では、ハイブリッド形成用プローブは、２５６個の４マー（４ｍｅｒ）のセットであることが好ましく、セット内のそれぞれのプローブは異なる組合せの核酸塩基を持っている。
【００９７】
すでに言及したように、本発明の上記態様のすべてにおいて、質量分析法によって、質量ラベルまたは質量ラベルの組合せを同時に同定することによって、２つ以上の分析物が、検出されることが好ましい。
【００９８】
本発明の混合モードは、以上の方法すべてに適用し得る。本実施態様において、それぞれの分析物は、質量ラベルのセットまたはアレイからの質量ラベルの固有の組合せによって同定され、それぞれの組合せは、前記セットまたはアレイ中のそれぞれの質量ラベルの存在または不在により、および／またはそれぞれの質量ラベルの量によって区別される。
【００９９】
本方法が同時に２つまたはそれ以上の分析物に適用される場合、いくつかの態様において、質量解析法によって質量ラベルを検出する前に、分析物の質量によって分析物を分離しておくことが好ましい。好ましくは、分離工程は、液体クロマトグラフィーまたはゲルクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーを用いた工程である。本発明の第２の型のラベルは、とりわけこれらの実施様態で有用である。前記セット内のすべてのラベルの総質量が同一であるから、クロマトグラフィーによる工程の間、すべての分析物の移動度がラベルによって等しく影響を受けているからである。
【０１００】
典型的に、本方法において、質量ラベルを検出するために使用する質量分析計は、１つ以上の質量アナライザーを含んでいて、このアナライザーは、特定の質量または質量範囲のイオンを、検出のために通過させることができる、および／またはイオンが原因となって解離させることができる。好ましくは、1つ以上の公知の質量ラベルに特異的な特定の質量または質量範囲のイオンを、質量アナライザーを用いて選択し、前記選択したイオンを解離し、解離生成物を、選択した質量ラベルを示唆するイオンパターンを同定するために検出する。とりわけ好ましい方法において、質量分析計は、３つの四極質量アナライザーを含む。本実施様態において、一般的に第１の質量アナライザーは、特定の質量または質量範囲のイオンを選択するために使用し、第２の質量アナライザーは、選択したイオンを解離させるために使用し、第３の質量アナライザーは、生成されたイオンを検出するために使用する。
【０１０１】
上述の方法の好ましい実施様態によって、質量ラベルで標識した分析物分子を解析する方法が提供される。この方法は下記工程を含む。
１．対象となる関連ある分子から質量ラベルを開裂させる工程、
２．開裂した質量ラベルをイオン化する工程、
３．質量アナライザー内で、公知の質量ラベルの好ましいイオンの質量対電荷比に相当する、所定の質量対電荷比のイオンを選択する工程、
４．これらの選択したイオンの解離を、衝突によって誘導する工程、
５．衝突生成物を検出して、選択した質量ラベルを示唆する衝突生成物イオンを同定する工程。
【０１０２】
その連結した核酸から質量ラベルを開裂する工程を、質量分析計内、好ましくはイオン供給源内で実施することが好ましい。質量ラベルが先にイオン化されていることもまた好ましい。本実施様態において、ラベルは、液相または固相から気相に移動させることが必要なだけである（質量ラベルが液相または固相にある場合）。典型的に、質量ラベルのイオン化の工程は、質量分析計のイオン供給源内の質量ラベルの開裂の結果である。
【０１０３】
好ましくは、所定の質量対電荷比のイオンを選択する第３の工程が、連結した機器の第１の質量アナライザー内で実施される。ついで選択されたイオンが、分離衝突セル内に導かれ、そこで以上の4つの工程にしたがった気体または固体表面で衝突する。ついで衝突生成物は、さらに連結した機器の質量解析器内に導かれ、以上の第５の工程にしたがって、衝突生成物を検出する。本発明での使用のための典型的な連結した機器には、三重四極子質量アナライザー、タンデムセクター器、および四極子飛行時間質量分析計が含まれる。
【０１０４】
他の好ましい観点において、所定の質量対電荷比のイオンを選択する上記第３の工程、気体によって選択したイオンを衝突させる第４の工程、および衝突生成物を検出する第５の工程は、質量分析計の同一のゾーンにて実施される。このことは、たとえば、イオン捕獲質量アナライザーおよびホリアー・トランスフォーム・イオン・サイクロトロンレゾナンス（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）質量分析計において実施され得る。
【０１０５】
さらに好ましい実施様態において、本発明は、質量ラベルで標識した分析物分子を分析する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む。
１．関連ある分析分子から、質量ラベルを開裂する工程、
２．開裂した質量ラベルをイオン化する工程、
３．質量アナライザー内で、公知の質量ラベルの好ましいイオンの質量対電荷比に相当する、所定の質量対電荷比のイオンを選択する工程、
４．これらの選択したイオンの解離を、衝突によって誘導する工程、
５．１つ以上の衝突生成物を検出して、選択した質量ラベルを示唆する、言い換えれば標識した核酸を示唆するイオンパターンを同定する工程。
【０１０６】
本発明の本実施様態の好ましい態様において、その連結された核酸からの質量ラベルを開裂する工程は、質量アナライザー内、好ましくはイオン供給源内で実施される。
【０１０７】
本実施様態の特定の好ましい態様において、質量ラベルは、先にイオン化されており、単に液相または固相から気相に移す必要があるだけである(質量ラベルが、液相または固相にある場合)。
【０１０８】
他の好ましい態様において、質量ラベルのイオン化の工程は、質量分析計のイオン供給源内での質量ラベルの開裂の結果として起こる。
【０１０９】
特定の態様において、所定の質量対電荷比のイオンを選択する第３の工程が、連続した計器の第１の質量アナライザー内で実施される。ついで選択されたイオンが、分離衝突セル内に導かれ、そこで上記第４の工程にしたがって気体または固体表面で衝突する。ついで衝突生成物は、連続機器のさらなる質量アナライザー内に導かれ、上記第５の工程にしたがって、衝突生成物を検出する。典型的な連続機器には、三重四極子質量分析計、タンデムセクター計器、および四極子飛行時間質量分析計が含まれる。
【０１１０】
他の好ましい態様では、所定の質量対電荷比のイオンを選択する上記第３の工程、気体によって選択したイオンを衝突させる第４の工程、および衝突生成物を検出する第５の工程は、質量分析計の同一のゾーンにて実施される。
【０１１１】
このことは、たとえば、イオン捕獲質量アナライザーおよびホリアー・トランスフォーム・イオン・サイクロトロンレゾナンス（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）質量分析計において実施され得る。
【０１１２】
（タンデム質量分析計）
感受性が若干損なわれるという犠牲をはらっても、本発明の質量ラベルを検出するために、タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の使用により、選択性という大きな見返りを得ることができる。本発明の説明の目的のために、タンデム質量分析計に関していくつかの議論を、本明細書で提供し、三重四極子質量分析計と比較して例示する。三重四極子は、ＭＳ／ＭＳの原理の簡単な例示を可能にする。
【０１１３】
四極質量分析計は、本質的に、特定の質量対電荷比のイオンのみを通過させるように、任意の時点で設定可能である質量フィルターである。四極子には、チャンネルを形成する４つの平行ロッド成型電極が含まれる。正弦電流周波数電位によって重ねられた直流電圧をロッド電極に印加する。平行ロッドによって形成されたチャンネル内へのイオン流入が、複雑な軌道に続き、特定のＤＣ電位および比周波数電位に対して、所定の質量対電荷比のイオンのみが、それらをチャンネルを通して導く安定軌道を有する可能性がある。印加電圧を変更することによって、四極は、約４０００までの電荷比の質量の全範囲を 通してスキャンすることを可能にする。
【０１１４】
三重四極（Ｑ）レイアウトを図１に示す。３つの分離した四極子質量アナライザーが連続して連結されている。第１の四極子は、以下、Ｑ１と表わし、同様に第２の四極子をＱ２、第３の四極子をＱ３と表わす。四極子Ｑ１およびＱ３は典型的にスキャニングモードにて使用する。スキャンの速度は超高速である。あるいは、Ｑ１またはＱ３は、「ゲート（ｇａｔｅ）」として使用でき、選択したイオンのみを通す。四極子Ｑ２は、非スキャニングモードにて使用し、そこでＱ２はイオンフォーカシング計器として働く。すべてのイオンが、高吸引時に、Ｑ２を通過する。気体がＱ２内に導入された場合に、流入するイオンが気体と衝突し、イオンの多くが、断片化するために十分なエネルギーを得る。これが「衝突誘導解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）」である。
【０１１５】
三重四極子のある特定の使用を考える。イオンがイオン供給源（Ａ+、Ｂ+、Ｃ+、Ｄ+など）で生成されると仮定する。これらのイオンの多くをＱ１を通過させ、Ｑ２およびＱ３がスキャニングモードで働いている場合に、完全な質量スペクトルが生成される（図１１−質量スペクトル１）。質量スペクトル１は、分子イオンＡ＋からＤ＋まで、および分類されたフラグメントイオンを含むスペクトルを示している。
【０１１６】
ここで、Ｑ１がＡ+イオンのみを通過させ、Ｑ２が低圧であるように設定することを仮定する。Ａ+イオンはＱ２およびＱ３を通過し、検出される（図１２−質量スペクトル２）。ここで新規の質量スペクトルでは、Ｑ１によって除去された他のイオン（Ｂ+、Ｃ+など）が「除去される（ｃｌｅａｎｅｄ）」。対象の分析物の特定のイオン種に相当する限定された質量系列にわたってスキャンするようにＱ１を設定することによって、質量分析計内に導入した同一の試料から、多重分析物が検出され得る。これは「選択的イオンモニタリング（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔａｒｉｎｇ）」と呼ぶ。
【０１１７】
三重四極子は、さらなる選択性を得るために使用することができる。Ａ+イオンをいくつかの供給源から得るようにすることが可能である（たとえば、いくつものイオンが、同一の質量対電荷比１００を有することができるが、またＣ7Ｈ16、Ｃ6Ｈ12Ｏ、Ｃ5Ｈ8Ｏなどのような異なる組成を有することができる）。２つのＡ+イオンの組成（Ａ1+、Ａ2+）が存在し、両方とも同一の名目上の質量を有していると仮定する（図１３および１４−質量スペクトル３および４）。Ａ+イオンがＱ１にて選択され、ＣＩＤがＱ２で実施される場合、Ｑ３のスキャンにより、図１５−質量スペクトル５で示されたスペクトルがえられる。これは「混合（ｍｉｘｅｄ）」スペクトルである。
【０１１８】
Ｐ+、Ｑ+（またはただ単にＰ+）が、Ａ1+が存在することを明らかにし得ることが公知であると仮定する。すなわちフラグメンテーション（反応）Ａ1+→Ｐ+＋Ｑ+が起こることが知られているとする。Ｑ３でのすべてのイオンをスキャンする代わりに、Ｐ+イオンのみを検出するように設定する。したがって、イオン供給源を取り去った後、イオンＡ+Ｂ+….が、Ｑ２に進入するＡ+（＝Ａ1+、Ａ2+）イオンのみに減少する。
【０１１９】
ＣＩＤの後、フラグメントイオンＰ+のみが選択され、これらはただ単にＡ1+のみの特徴である。
【０１２０】
このことは高い選択性である、「単一または選択性反応モニタリング（Ｓｉｎｇｌｅ  ｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）」であるといわれる。より一般的にいうと、Ｑ１進入イオンの全スペクトル（図１１−質量スペクトル１）が、Ｑ３においてＰ+まで減少し（図１６−質量スペクトル６）、これらのイオンはただＡ1+に関連することが知られている。
【０１２１】
いくつかの確認議論において、本例は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを同定するための、本発明の質量ラベルの使用を言及している。本発明のラベルは、タンパク質またはペプチドまたは他の分析物と共に使用することができ、オリゴヌクレオチドは例示の目的にて言及されることが等しく可能である。オリゴヌクレオチドを分析するために、質量ラベルは、開裂可能リンカーを介して、共有結合的にオリゴヌクレオチドに結合すると推定される。リンカーは、温度開裂、化学的開裂、コーン電圧開裂または光開裂を含む、種々の機構によって開裂可能であり得る。質量ラベルの挙動に関する以下の議論において、ラベルがイオン化する間またはイオン化の前に、その連結された核酸より開裂されると仮定する。好ましい開裂可能リンカーおよびその使用の方法は英国特許出願第ＧＢ  ９８１５１６３．２号および第ＧＢ ９８１５１６４．０にて開示されている。好ましい開裂工程は、図２０に略図的に示されている。
【０１２２】
本発明の第１の態様にしたがって、選択反応モニタリング（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＲＭ））にカップリングした選択イオンモニタリング（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ））の原理を、二次元検出工程を与える質量マーク技術に適用可能である。Ａ1+が質量ラベルからのイオンであり、したがって、たとえ多くのイオンが、イオン化工程で生成されようとも、公知の組成およびフラグメンテーションパターンからのイオンである場合、質量ラベルは、三重四極子の第１の四極子においてＡ+イオンにゲートをかけ、Ａ1+フラグメンテーション産物を検出することによって他のイオンからの干渉なしで同定することが可能である。すなわち３つの四極子のうちの第３の四極子において、Ｐ+のみにゲートをかけることによって、他のイオンの干渉をなくすことができる。どのＭ／Ｚ範囲を調べたかは問題ではなく、質量スペクトル中の「きれいな（ｃｌｅａｎ）」窓を探す必要はもはやない。
【０１２３】
以上で言及したように、本発明の１つの態様は、式Ｍ−Ｌ−Ｘによって略図的に表わすことが可能な質量ラベルを提供する。例として、Ａ1+は以下に示すラベルであり得る。
【０１２４】
【化１６】
0004608171.tif 000012
【０１２５】
式中、Ｍはベンジル基、Ｌはアミド結合、およびＸはピリジニル基である。ベンジル環をピリジル環に連結しているアミド結合は、とりわけ衝突による開裂を受けやすい。したがって、衝突に際して、Ａ1+は以下のフラグメントイオンを生成し、これはＰ+を表わす。
【０１２６】
【化１７】
0004608171.tif 000013
【０１２７】
したがって、Ｐ+の検出は、Ａ1+が存在し、ラベルの１つが存在することを意味している。ラベルは、すべての他のイオンから選択的に同定され、このことは、効果的に「バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）」汚染を減少させる。このことは、ラベルに関連ある分析物は、完全に精製される必要がなく、ラベルは開裂し、質量解析器の外側で分析物から分離される必要がないことを意味する。この原理は、質量ラベルとしての使用のための有用な種類の化合物を提供するために一般化することができ、そのすべては、一般構造式Ｍ−Ｌ−Ｘをもち、Ｍは 、アミド結合のような、きれやすい結合Ｌを介してＸに連結し、ＸはＳＲＭによって検出されるイオンである。したがって、Ｘは上記で示され、Ｐ+として表される開裂産物と同類である。
【０１２８】
本発明の１つの態様によれば、以上で例示した質量ラベル構造は、すべてが同一の質量をもつが、簡単にＳＲＭによって分解される質量ラベルの有用なセットを提供するために一般化できる。Ｍ0、Ｍ1….Ｍ4およびＸ0、Ｘ1….Ｘ4がＭ−Ｌ−Ｘの半分の同位体形態であり、式中ＬはＭおよびＸに連結しているアミド結合であるとする。この例は再び使用できる。この構造がフッ素原子で置換される場合、図２で示した構成物が生成され得る。これらのラベル構成物は、以下のような質量ラベルＭＸ（この時点では開裂可能な結合Ｌは無視する）を形成するように連結することが可能である。
【０１２９】
【化１８】
0004608171.tif 000014
【０１３０】
これらの５つの基質は、実際に同一の質量を有している（図３）。したがって、もし質量ラベルが三重四極子Ｑ１において選択された場合に、質量＝ＭmＸn（ｍ＝０〜４、ｎ＝４〜０）のイオンのみが選択され得る。Ｑ１はＭＸイオンのみを「探す（Ｌｏｏｋ）」ために設計することができる。ＣＩＤがＱ２において実施される場合、Ｑ３を、図２１にて示したように、イオンＸ0、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4のみを通過させるように設定できる。
【０１３１】
したがって、すべて同一の質量において、Ｑ１において選択された５つの質量ラベルが存在し、以下で示した開裂反応がＱ３において同定される。質量１３９がＱ３で検出された場合、それはＭ3Ｘ1からのものに違いなく、他も同様である。
【０１３２】
【化１９】
0004608171.tif 000015
【０１３３】
本方法の選別過程は、図１７の質量スペクトル７で示した二次元質量スペクトルとして視覚化されることができる。
【０１３４】
他のアプローチにおいて、異なるセットの質量ラベルが合成可能である。このモードの解析において、ＳＲＭが「選別イオンモニタリング（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ））と組み合わされる。解析のＳＩＭモードにおいて、第１の四極（Ｑ１）が選択的に、所定の質量を有するイオンのみをゲートを通して、所定の質量をスキャンする。
【０１３５】
図２および図３からのＭ0、Ｍ1、Ｍ2、Ｍ3、Ｍ4およびＸ0を再び考えると、これらのラベル構成物は、異なる質量を有する５つのラベル、Ｍ0Ｘ0、Ｍ1Ｘ0、Ｍ2Ｘ0、Ｍ3Ｘ0、Ｍ4Ｘ0を与えるように連結可能である。ここで、三重四極子のＱ１が、これらの５つの質量を選別するように設定すると仮定すると、Ｑ３が図４でのように、１つの質量（Ｘ0）を検出するようにのみ設定する必要がある。
【０１３６】
したがって、質量分析計は、１つの固定イオン（Ｘ0）のみを同定する。Ｘ0はＭ0Ｘ0、Ｍ1Ｘ0、Ｍ2Ｘ0、Ｍ3Ｘ0、Ｍ4Ｘ0のみから由来しこれらはＱ１で選別された時に明らかであり、このことは、質量マーキングの他のモードを提供する。５つの異なる分析物は、ここで、５つの特定の「単一反応（ｓｉｎｇｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」の１つによって同定可能である。
【０１３７】
【化２０】
0004608171.tif 000016
【０１３８】
これにより、図１８の質量スペクトル８で示されるような、異なる二次元質量スペクトルが得られる。
【０１３９】
以上の２つのアプローチを組み合わせることが可能である。Ｍ0、Ｍ1、Ｍ2、Ｍ3を、ジヌクレオチドの第１の塩基を表わすように選ぶ。第２の塩基を、Ｘ0、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3によって特性化し、以下の表３で示したような１６の異なる質量ラベルをえる。
【０１４０】
【表３】
0004608171.tif 000017
【０１４１】
それぞれの質量ラベルは、タンデム計器の第１の質量アナライザー中で選択可能である７つの異なる質量のうちの１つを有することができる。第２の質量アナライザー内で同定された衝突生成物は、ダイマーを同定する。したがって８つの質量ラベル構成要素によって、１６個の質量ラベルを生成することが可能である。すべてのこれらのラベルに対する全質量２次元質量スペクトルを、図１９の質量スペクトル９にて示している。同様に、２５６個の質量ラベルが必要な場合、２組の１６構成物、すなわちＭ0−Ｍ15およびＸ0−Ｘ15が十分なラベルを生成し、それぞれのラベルは３１個の異なった質量のうちの１つを有する。
【０１４２】
本発明の他の態様によれば、質量系列修飾基を用いて、質量ラベルのセットのアレイを作製することも可能である。本発明のこの態様によれば、前記セット内のそれぞれのラベルは同一の質量を有するがＳＲＭによって分解可能であるようなラベルのセットは、前記セット内のそれぞれの構成物を、質量系列修飾基に連結することによって、ラベルの更なるセットにまで広げることができる。ここで、所定量によって前記セット内のそれぞれの構成要素の質量を移動させ、これにより、最初のセットとは異なる総質量を有する第２のラベルのセットを作製する。したがって、質量ラベルのイオンの２つの異なるセットを、質量アナライザーの第１の四極子中でのＳＩＭによってゲートにかけ、ついで衝突生成物を、ラベルの両方のセットに対して同一のフラグメント種をモニタすることによって、第３の四極子において解析する。質量分析計内で十分に解析可能であるほどの多くの異なるセットのラベルは、異なる質量系列修飾基を用いることによって作成することが可能である。
【０１４３】
質量系列修飾基（Ｓ）は、ラベルセットの各構成要素に連結した場合に、それぞれのＳ基が、そのようなラベルのアレイ中の他のすべてのものから完全に分解可能である新規のラベルを作り出すように、フラグメンテーション抵抗性基であることが好ましい。本明細書において、分解可能とは、アレイ中のラベルセットそれぞれが、少なくともおよそ４ダルトン分だけ、他のすべてのセットから好ましく分離されることを意味する。このことは、質量スペクトルにおいて、１つのラベルからの同位体ピークが、他のラベルのピークと重なり合わないことを保証する。本発明のこの態様の好ましいし実施様態において、Ｓ基はアリール基、シクロアルキル基および複素環のような飽和または不飽和環状基であり、好ましくはエーテル結合によって、ＳＲＭ分解可能な質量マーキング基の構成要素に連結する。アレイ中のそれぞれのセットは同一のＳ基を持ってよいが、異なるレベルの置換であって、それぞれのセットが他のすべてのセットから区別されることを保証している。そのようなラベルのアレイの例は、図６に示している。このアレイにおいて、Ｆ原子が置換基（調節部分）として使用されるが、メチル基のような他の置換基も使用できた。そのようなラベルのアレイは、任意の連結されている分析物分子の移動度に対して、まさに類似の効果を有する可能性があることを明らかにすべきである。
【０１４４】
ラベルのさらなるセットを、メチル置換フェニル基、およびまたメチルとフルオロ基の両方によって置換されたフェニル基を用いて、そのようなアレイに加えることができる。メチル基の質量は、フルオロ基の質量から、たった４ダルトン未満異なっているだけであり、そのためラベルの有意義なアレイを、連結した分析物の移動度における効果が最小であるように生成できる。
【０１４５】
本発明のこの態様の他の好ましい実施様態において、Ｓ基は、アリール基、シクロアルキル基および複素環のような環状基のオリゴマーまたはポリマーであり、また置換されていてよい。とりわけ、好ましいＳ基はポリアリールエーテルである。そのようなアレイの例は図７に示している。
【０１４６】
本発明のさらなる態様にしたがって、以上で記述した原理は、さらに、本発明の質量ラベルの異なる組合せを用いて、分析物を標識することによって、実施可能である。以上で言及したように、本実施様態は、混合モード標識と呼ばれる。
【０１４７】
たとえばコンビナトリアル・ケミストリーにおいてのように、大量の独立した分析物を同定しなければならない場合、ラベルの混合物、たとえばＭ0Ｘ3、Ｍ1Ｘ2、Ｍ2Ｘ1、Ｍ3Ｘ0などが選択される。
【０１４８】
それぞれのラベルが特定量で存在するように、ラベル混合物が分析物に結合する。たとえば、ａＭ0Ｘ3＋ｂＭ1Ｘ2＋ｃＭ2Ｘ1＋ｄＭ3Ｘ0であり、式中ａ＝ｂ＝ｃ＝ｄ＝１である(図５)。４つの質量ラベルの等しい部分（ａ＝ｂ＝ｃ＝ｄ＝０．２５）が同一の反応中で分析物にカップリングされる場合、化学的連結反応はこれらの間で識別できない。オリゴヌクレオチドが標識されている場合、そのオリゴはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドあたり１つ以上のマスラベルでマークされている。
【０１４９】
以下表４で示された型の３つの質量ラベルを考慮すること。
【０１５０】
【表４】
0004608171.tif 000018
【０１５１】
式中「*」は、表示した位置において2Ｈまたは13Ｃアイソトープを現し得る。異なる置換基、たとえばフッ素またはメチル基を使用することが可能であることを明らかにすべきである。
【０１５２】
１つの混合モードは、図８で示したようなものである。８つの異なるパターンが、分析物分子にカップリングされたこれから先におこる混合物中での異なるラベルの有無の組合せによって作製され得る。
【０１５３】
下記表５で示したように、ラベルが分析物にカップリングされたときで、５つのラベルそれぞれの比が変化する場合に、異なる種類のパターンが考慮される。
【０１５４】
【表５】
0004608171.tif 000019
【０１５５】
３つの異なる比、すなわち、０、１または２で存在可能であるような、４つの質量ラベルＰ、Ｑ、ＲおよびＳを用いると、それぞれのラベルに対して３つの異なる存在が効果的にあり、このことは、生成される８１の異なる質量スペクトルパターンが可能であることを意味する。また、これらのラベルの１つが、他の構成物に対するその比が一定（Ｔ）のままであるように存在することが好ましく、質量解析器データシステムが、それに対してＰ、Ｑ、ＲおよびＳの相対比を比較できるような内部ラベルとして働くことが好ましい。このことは、５つのラベルの混合物を用いることで、３マー（３ｍｅｒ）オリゴヌクレオチドにおける天然のヌクレオチドの全６４の組合せを同定することが可能であることを意味する。
【０１５６】
以上の例において、Ｐ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴは、図３で示した型式のラベルであり得、したがって５つのラベルは同一の質量を有し、たとえば三重四極子からなる第１の四極子またはＱ−ＴＯＦ計器におけるバックグラウンド汚染からゲートをかけることが可能である。フラグメンテーションパターンが、三重四極子の第２の四極子中のバス気体との衝突の結果として形成され、第３の四極子での検出は図９に示されている。
【０１５７】
本発明の原理が拡張可能であることは明らかである。本発明のいくつかの態様において、以上の戦略を用いて２５６個の可能な４マー（４ｍｅｒ）を標識することが望ましい。以上で示した可能な比の組合せすべてで混合可能である７つの異なるラベルを作製することが必要である。あるいは、ラベルが図６または７で示した型式のものである場合、以上の例で示した種類の８１のコードの４つのセットを、図６で示したような５つのラベルの異なるセットを作製するために、４つの異なる質量系列修飾基を用いて作成することができる。このことは、可能な２５６の４マー（４ｍｅｒ）すべてをコードするのに十分なラベルを生成する。
【０１５８】
本発明のこの態様の原理は、さらに拡張可能である。天然のヌクレオチドの２５６の可能な組合せすべてを含んでいるＤＮＡ４マー（４ｍｅｒ）のライブラリーを考慮する。前記群中のそれぞれの４マー（４ｍｅｒ）は、１〜２５６の番号で表記可能である。すなわちＡＡＡＡは１であり、ＡＡＡＣは２であり、ＴＴＴＴは２５６である。
【０１５９】
番号１〜２５６は、たとえば数字が、コンピュータのメモリレジスタにおいて表示可能である方法で、２進法で表すことができる。レジスタにおいて、２8、２7、２6、２5、２4、２3、２2、２1および２0の番号をあらわすスイッチ系列が存在する。１〜２５６までの数字の任意のものを表すために、以下の表６で示すように、二進法の合計が本来の十進法の数を表すように、スイッチをオンおよびオフにする。
【０１６０】
【表６】
0004608171.tif 000020
【０１６１】
これらの数字のアナログ表示は、レジスター内のそれぞれのスイッチが、特定の分子の存在または不在によって表される場合、質量ラベル分子によって成し遂げられ得る。したがって、４マー（４ｍｅｒ）を同定するために、その４マー（４ｍｅｒ）を同定する数字をあらわすラベルの混合物によって４マー（４ｍｅｒ）をラベルできる。たとえば、ＡＡＣＧが数字７で表される場合、２2をあらわす分子と、２1および２0をあらわす分子との混合物を用いて４マー（４ｍｅｒ）を標識することによって、当該４マー（４ｍｅｒ）を同定できる。
【０１６２】
事実上、これらの分子は、異なる数の特定の置換基またはアイソトープ、たとえばフッ素原子または異なる重水素アイソトープのような、異なる数の質量調節部分によって置換されたコア分子に基づく分子のシリーズとしてあらわすことができる。したがって、２0はフッ素置換のないコア分子をあらわし、２1は１つのフッ素置換基を有するコア分子を表し、同様に２8は、８つのフッ素置換基を有するコア分子をあらわすことができる。これらの分子が質量分析計によって分析されるとき、これらの分子は、タンデム計器において解析できる９つの等圧タグをあたえるように、相補的な成分と組み合わせることが可能である。
【０１６３】
したがって、４マー（４ｍｅｒ）ＡＡＣＧの場合、このオリゴは、以上で示したラベルからのラベル０、１および２を用いて標識することが可能である。明らかに、すべての他の可能性のある４マー（４ｍｅｒ）を、この二進法様式にて表すことができ、図１０で示したようにそれらを同定するためにただ８つの基礎ラベルが必要なだけである。
【０１６４】
（ＳＲＭを用いたＤＮＡの配列決定）
サンガー配列決定ラダーズ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌａｄｄｅｒｓ）の分析は、以上で議論した型式の質量ラベルを用いて効果的に達成され得る。サンガー法にしたがった従来のＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーに多くのジオキシ／デオキシヌクレオチドを添加し、鋳型特異的様式で、一本鎖ＤＮＡを鋳型としてアニールする。末端ヌクレオチド、すなわちジデオキシヌクレオチドが相補的鋳型に組み込まれたときに、本工程のランダム末端化が起こる。
【０１６５】
ランダムに末端化された鎖が変性ポリアクリルアミドゲル上またはキャピラリー内で分離される時に、「ＤＮＡラダー（ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ）」が生成される。配列情報は、一般的に、長さによって末端化断片を分離するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、続いて「ＤＮＡラダー」を検出することによって集められる。パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）からのＡＢＩ３７７、またはモレキュラー  ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｎａｍｉｃｓ）からのＭｅｇａＢＡＣＥのような、従来の半自動化および自動化ＤＮＡシークエンサーにおいては、蛍光ラベルＦ1、Ｆ2、Ｆ3、Ｆ4を使用して、反応系に用いられる末端化ヌクレオチドまたはプライマーのいずれか一方に、その蛍光ラベルを組み込むことを介して、４つの末端塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔを同定する。ついでこのラダーを、ゲルまたはキャピラリーをスキャンする検出器を通過した４つの色素を検索することによって読みとる。他の蛍光検出形態も可能である。
【０１６６】
（単一鋳型の配列決定）
質量分析方法では、蛍光ラベルが、質量ラベルに変換される(たとえば、図３で示したＭ0Ｘ4、Ｍ1Ｘ3、Ｍ2Ｘ2、Ｍ3Ｘ1、Ｍ4Ｘ0)。アデニンに対するジデオキシ末端はここでＭ1Ｘ3によって標識される。同様に、シトシンに対するジデオキシ末端はここでＭ2Ｘ2によって標識され、グアノシンに対する末端はＭ3Ｘ1によって標識され、そしてチミジンに対する末端はＭ4Ｘ0で標識される。キャピラリーからバンドが溶出されるときに、これらは、本発明の態様によれば、質量でマークされた核酸を解析する三重の四極子のような好適なタンデム質量解析器のイオン供給源に、一列に噴霧される。典型的に、イオン供給源に置いて、ラベルが、ラダー中のそれぞれの断片の末端塩基より開裂され、第１の質量解析器、三重四極子のＱ１に入る。Ｑ１はＭXの分子イオンのみをゲートにかけるように設定され、一方でＱ３はＸ0−Ｘ4のラベルを検出するように設定される。質量の１つであるＸ4が、内部標準として使用されるべきであり、つまり常に存在し、Ｘ0、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3はＸ4に関して試験されることが望ましい。
【０１６７】
他のアプローチにおいては、４つの末端ヌクレオチドを、図４で示した４つのラベルにて標識することが可能であり、アデニンに対するジオキシ末端はＭ1Ｘ0で標識される。同様に、シトシンに対するジオキシ末端はここでＭ2Ｘ0で標識され、グアノシンに対する末端はＭ3Ｘ0で標識され、チミジンに対する末端はＭ4Ｘ0で標識される。ラベルＭ0Ｘ0は、望むのならば内部標準として使用することができる。この実施様態において、三重四極子のＱ１はラベルＭ4Ｘ0からＭ0Ｘ0までの分子イオンをゲートにかけるように設定され、一方でＱ３はラベルＸ0を検索するように設定される。
【０１６８】
ヌクレオチド末端を標識した配列決定に加えて、プライマーを標識した配列決定も実施可能である。本発明の質量ラベルを利用可能である、プライマーを標識した配列決定の詳細は、ＰＣＴ／ＧＢ９８／０２０４８号にて提供されている。
【０１６９】
（質量ラベルを用いた鋳型の多重配列決定）
本発明の質量ラベルは、４つ以上のラベルを展開できるので、１つ以上の鋳型を同時に解析可能にする。このことは、もともとサンガーによって考案された方法に基づき、以上で記述した方法論にしたがって、多重鋳型の解析を可能にするように、４つのラベルの多重セットを作製できることを意味する。本発明の質量ラベルを利用することができる核酸を鋳型とする多重化シークエンスに関わる詳細は、ＰＣＴ／ＧＢ９８／０２０４８号で提供されている。
【０１７０】
図６または図７で示した形態の質量ラベルが、多重ＤＮＡ配列の解析を多重化するために使用することができる。質量系列修飾基の区別によって、他のすべてのセットから質量分析計内で分解可能である、５のラベルのそれぞれのセットを、もし望むのならば、大きさ／量標準としての使用のために残しておくスペアラベルとともに、単一の鋳型を同定するのに使用できる。しかしながら、４つのラベルのセットが配列決定には十分であり、サイズ標準は必要ない。したがって、たとえば、５つの鋳型のサンガー反応産物を同時に解析するために、図６で示した２０のラベルのアレイを使用することが可能である。
【０１７１】
（遺伝子発現プロフィル分析）
ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡから由来した相補的ＤＮＡの集団を解析する種々の方法が発展してきた。これらの多くの方法は、増幅したｃＤＮＡライブラリーの電気泳動的分離による、異なる大きさの増幅または制限産物の検出に基づいている。一般的に、これらの技術は、ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡから由来した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の構成要素からの固有の制限断片または増幅産物を合成することに基づいている。
【０１７２】
ディファレンシャルディスプレイ（Ｌａｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７、９６７−９７１，１９９２）は、電気泳動を基にした遺伝子発現プロフィル分析の古典的な方法である。本技術の概念の発展が、結果として、本技術の改良後継法を導いた。Ｓｈｉｂｓｏｎ（ＰＣＴ／ＧＢ９３／０１４５号)またはＫａｔｏ（欧州特許第ＥＰ０  ７３５  １４４  Ａ１号）のような、ＩＩＳ型またはＩＰ型制限エンドヌクレアーゼを用いた「分子指標付け（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｄｅｘｉｎｇ）」に基づいた発現プロフィル分析方法が、後継の１つの種類の例である。とりわけＷＯ９８／４８０４７号は、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥＭＳ）に基づいた分子指標付け方法を開示している。
【０１７３】
この方法において、ｃＤＮＡが、固定された、ビオチン化ポリチミジンプライマーを用いて合成され、これはすべてのｃＤＮＡが固定長の短いポリＡテールで末端化されることを保証する。「固定されたプライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）」ｃＤＮＡ分離において、ポリ−Ａを有するｍＲＮＡが捕獲され、ポリＡ区域の末端にてプライマーを固定化するために、３’末端にて３つの残った塩基の１つにて、約１８のデオキシチミジン残基のオリゴヌクレオチドを用いてプライム化する。プライマーのビオチン化によって、ｃＤＮＡをアビジン化固相支持体上に固定化できる。これらの捕獲されたｃＤＮＡは、通常ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼで切断され得る。これによって、他の断片が洗い流される一方で、３’末端制限断片が、固相支持体上に残る。アダプターを、得られた公知の粘着末端に連結する。このアダプターは、ＩＩＳ型タイプの制限エンドヌクレアーゼのための結合部位に、運ばれるようにデザインされている。これらの酵素は、その標的配列に結合するが、結合部位から離れた定義された数の塩基の場所で、存在しているＤＮＡを切断する。これらの酵素のうちのあるものは、付着切断を生成する。たとえば、ｆｏｋ１は、およそ４ｂｐの粘着末端を生成する。ｃＤＮＡの集団を、そのような酵素で処理した場合、粘着末端は、その集団中のそれぞれのｃＤＮＡのアダプタがつけられた末端部分に曝露される。アダプタ分子のファミリーが、そのような４つの曝露された塩基をプローブ化するのに使用される。４ｂｐのあいまいな粘着末端を用いると、２５６個の可能性ある候補が存在する。プローブを同定するために、開裂可能リンカーを用いて質量ラベルにてタグ付けし、固有の質量ラベルが、２５６個の可能性のある４ｂｐアダプタのそれぞれを同定する。この結果、もともとのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが切断した場所にしたがった種々の長さを有し、且つｃＤＮＡの５’末端での２５６の可能な質量ラベルで標識したアダプタの１つを有する断片の集団ができる。
【０１７４】
ついで質量ラベルで標識した３’制限断片を、キャピラリー電気泳動を用いて、その長さに基づいて分離し、続いて、ｃＤＮＡ断片の末端に連結した質量ラベルの解析を行う。ＣＥカラムを、電子噴霧質量分析計、または等価の質量分析計内に直接挿入する。質量分析計内でのイオン化の際に、ラベルが連結された制限断片より開裂する。キャピラリー電気泳動カラムより溶出される、異なる制限断片長に相当する、それぞれのバンド内に存在するそれぞれの質量ラベルの量を測定する。この工程により、データベースを検索するのに使用可能なそれぞれのｃＤＮＡのサインがえられる。
【０１７５】
本技術は、好ましくは２５６の質量ラベルを使用する。質量ラベルに対する従来のアプローチを用いることで、結果として、約４ダルトンで分離され、１０００ダルトン以上の質量範囲に広がる、質量タグのアレイができる。そのようなラベルのアレイは、すべてのタグが、連結されたｃＤＮＡ制限断片の移動度に対する同一の効果を有するところで合成できるという見込みはない。このことは、複合補正アルゴリズムが、移動度の違いに対して計算をし、断片長の正確な決定を許容するために使用されなければならないことを意味している。しかしながら、本発明の質量マーカーおよび連結された質量ラベルは、連結された分析物分子の移動度に対する効果が同一である質量マーカーのアレイを生成し、高い感受性、およびノイズ比に対する優れたシグナルを伴って、断片長の直接の決定を可能にすることに関して、上記方法において著しく好適である。
【０１７６】
電気泳動技術の第２の種類は、通常のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに依存しており、ｃＤＮＡ制限断片内に、プライマー配列を導入するために使用する。標識したプライマーを用いてのＰＣＲ増幅により、異なった制限断片を生成することにより、その関連したｍＲＮＡを同定するために使用することができる。そのような方法には、選択的な増幅および３’末端ｃＤＮＡ断片の標識を可能にする、制限エンドヌクレアーゼで消化させたｃＤＮＡ断片内へアダプターを導入する方法を開示している米国特許第５，７１２，１２６号で記述されているものが含まれる。同様に、ＷＯ  ９９／０２７２７号は、固相支持体および公知の制限部位に隣接する未知の配列をプローブするＰＣＲプライマーを用いた、３’末端制限断片を増幅する方法を開示している。本技術において、ｃＤＮＡは、すべてのｃＤＮＡが、固定された長さの短いポリ−Ａテールで末端化され、固相基質上で固定化可能であることを保証するビオチン化固定プライマーを用いて調製される。ポリ−Ｔプライマーはさらに、その５‘末端にてプライマー配列を付加的に有することができる。捕獲されたｃＤＮＡは、ついで通常のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼで切断される。アダプターを得られた公知の粘着末端に連結する。このアダプターは、プライマー配列を有するようにデザインされている。得られる２本鎖構成を、次に変性させる。固定化されなかった鎖は、必要であれば、洗い流すことが可能である。アダプタープライマーに隣接する未知の配列内に４塩基の重なりを有するアダプタープライマーに相補的なプライマーのファミリーを、変性した混合物内に加える。４塩基のかさなりによって２５６個の可能なプライマーが存在する。プローブを同定するために、開裂可能なリンカーを用いて質量ラベルでタグづけし、それぞれの２５６個の可能な４ｂｐのかさなりは、質量分析計内で同定可能な固有性を有するラベルによって同定する。この結果、通常のＩＩ型制限酵素が切断する場所にしたがった種々の長さ、およびｃＤＮＡの５’末端での２５６の可能な質量ラベルで標識したプライマーのうちの１つをもつ断片の集団ができる。変性およびプライマー伸長のサイクルは望むだけ多くの回数実施できる。アダプタープライマー部位のみを使用する場合、直線的増幅が達成される。このことにより、指数関数的増幅よりも、ｃＤＮＡ定量のゆがみがより小さくなる。指数関数的増幅が望まれる場合、ｍＲＮＡを捕獲するために使用するポリ−Ｔオリゴは、同様にプライマー部位を持たなければならない。
【０１７７】
指数関数的増幅は、ｃＤＮＡ頻度のゆらぎの可能性にもかかわらず、小さな組織試料を解析しなければならない場合に望まれる可能性がある。
【０１７８】
ここでまた、質量ラベルで標識した３’制限断片を、キャピラリー電気泳動を用いて、制限断片の長さに基づいて分離し、続いて、ｃＤＮＡ断片の末端での質量ラベルを解析する。この技術は、ＷＯ９８／４８０４７号にて開示されたもののように、２５６の質量ラベルで好ましく実施され、したがって、本発明の質量ラベルの有益な特徴と同様に、有用であろう。
【０１７９】
したがって、本発明のさらなる態様では、以下の工程を含む解析の方法が提供される。
１．異なる長さを有する、質量ラベルで標識されたヌクレオチド断片の集団を提供する工程、ここで、質量ラベルは標識した核酸の特徴を示す、
２．断片のサイズに基づいて、前記標識した断片を分離する工程、
３．前記標識した断片より質量ラベルを脱着する工程、
４．質量分析計内で前記質量ラベルを検出する工程
本発明のこの態様のある実施様態において、アッセイにより、核酸または核酸の系列の配列を決定する。サンガーラダーの合成に基づいた配列決定の実施様態において、質量ラベルは、それぞれの断片の末端ヌクレオチドを同定し、それぞれの断片は、４つのラベルのセットによって同定される。サンガーシークエンシング実施様態において、ラベルは、質量ラベルで標識したプライマーまたは標識した末端ヌクレオチドとして導入される。
【０１８０】
本発明のこの態様の他の実施様態において、アッセイは、発現したＲＮＡ分子のアイデンティティおよび量を決定するために使用する。好ましい実施様態において、質量標識核酸は、ＷＯ９８／４８０４７号または第ＷＯ９９／０２７２７号で開示された方法に従って作製する。これらの方法を用いた実施様態において、それぞれ質量ラベル化アダプターの連結によって、または質量ラベル化プライマーの伸長によって、質量ラベルを核酸断片内に導入する。当業者に対して、ＰＣＴ／ＧＢ９３／０１４５号、欧州特許第ＥＰ−Ａ−０  ７３５  １４４号または米国特許第ＵＳ  ５，７１２，１２６号で開示されたもののような、核酸断片の大きさに依存した遺伝子発現プロフィル分析の他の方法が、本発明のラベルと一緒の使用に適応可能であることが明らかであろう。
【０１８１】
本発明の好ましい実施様態において、サイズに基づく分析物の分離の工程は、たとえば、トランスジェノミック社（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）によって提供されたようなシステム、および米国特許第５，５８５，２３６号、米国特許第５，７７２，８８９号および他の明細書にて開示されたシステムを用いて、キャピラリー電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを用いて実施される。好ましくは、分離は質量分析計とオンラインで実施される。
【０１８２】
好ましい実施様態において、その関連した分析物から、質量ラベルを遊離する工程は、質量分析計のイオン供給源内で実施される。質量ラベルが、質量分析計イオン供給源内で、その関連した分析物より簡単に開裂されるようにするリンカーは、ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７号にて開示されている。質量分析計による質量ラベルの検出の感度を改善する化合物は、ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７号にて開示されている。
【０１８３】
当業者に対して、たとえば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９４年１０月２５日；２２（２１）：４５２７−３４頁にてＧｒｏｓｓｍａｎ  Ｐ．Ｄ．らによって開示された多重化遺伝子型決定アッセイを含む、他のサイジングアッセイが、本発明の質量ラベルと一緒の使用に適合可能であることが明らかであろう。本アッセイは、より高いオーダーまで多重化する能力より大きな利益をえ、簡単に断片の大きさを決定する。
【０１８４】
（タンパク質発現プロフィル分析および２次元ゲル電気泳動）
タンパク質をプロフィル分析するための技術、言い換えれば、組織内に発現しているすべてのタンパク質のアイデンティティおよび量の一覧を作製することは、自動化またはスループットに関して、よく発展してはいない。タンパク質の集団をプロフィル分析する古典的な方法は、二次元電気泳動によるものである（Ｒ．Ａ．Ｖａｎ  Ｂｏｇｅｌｅｎ．，Ｅ．Ｒ．Ｏｌｓｏｎ，「生化学における二次元タンパク質ゲルの適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．，１；６９−１０３頁、１９９５年）。本方法において、生物学的試料から抽出されたタンパク質試料は、狭いゲルストリップ上で分離される。この第１の分離は、通常その等電点に基づいてタンパク質を分離する。ついで全ゲルストリップを、ポリアクリルアミドゲルのような、長方形ゲルの一端に対して重ねる。次いでストリップ中の分離されたタンパク質を、たとえばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）によって、その大きさに基づいて、第２のゲル内で電気泳動的に分離する。本方法論は、遅く、自動化することが極めて困難である。そのもっとも簡単な具体化においてもまた、相対的に意味がない。いったん分離が完了したならば、タンパク質は視覚化しなければならない。これには、典型的に、視覚的に、または蛍光によって検出されうる薬剤によるゲルの染色が含まれる。放射ラベルおよびオートラジオグラフィーもまた、使用される。他の方法においては、蛍光色素を分離の前に、試料中のタンパク質に共有結合させる。色素の共有結合による付加は、タンパク質の移動度を変化させるため、しばしば好まれず、とりわけ二次元ゲルイメージの公的データベースとの間での比較を行う場合に、好まれない。ゲル中でタンパク質を視覚化すること、通常、ゲル上の特定のスポットにおいてタンパク質を同定することが必要である。このことは、一般的に、ゲル外にスポットを切り出し、ゲルマトリックスよりタンパク質を抽出することによって実施される。ついで抽出したタンパク質は、さまざまな技術によって同定できる。好ましい技術には、タンパク質の消化、続いてマイクロシークエンシングが含まれる。多くの改善により、２Ｄゲル電気泳動によるタンパク質の分解が増加し、本システムの感受性が改善されてきた。２Ｄゲル電気泳動の感度およびその分離を改善するための１つの方法は、質量分析法によってゲル上の特定のスポットでタンパク質を解析することである（Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  Ｐ．，Ｔｈｉｅｄｅ  Ｂ．「ＭＡＬＤＩ質量分析法による二次元ゲルからのタンパク質の同定」、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．１６，１４５−１６２頁、１９９７年）。１つのそのような方法は、ペプチド質量フィンガープリントを作製するための、ゲル内（ｉｎ−ｇｅｌ）トリプシン消化と、それに続く、質量分析計によるトリプシン断片の解析である。配列情報が必要な場合、タンデム質量分析計解析を実施できる。
【０１８５】
現在、２Ｄ解析は比較的低速の「バッチ（ｂａｔｃｈ）」工程である。これはまた、あまり再現性があるものではなく、ゲルを解析するためには高価である。ゲルに基づく解析におけるほとんどのコストが、それぞれのゲルの取り扱いであるので、２Ｄゲル上の多くの試料を同時に多重処理することができることが望ましい。異なる、独立して検出可能なタグで異なる試料中のタンパク質を標識することが可能であれば、それぞれの試料中のタンパク質を同一のゲルで同時に解析することができる。このことは、特定の器官での同一のタンパク質の振る舞いを、多くの時点で追うことが望ましい研究、たとえば、所定時間経過にわたって、薬剤に対する細菌の応答をモニタする場合などに特に価値がある。同様に、同一の疾患の多数の患者からの生検物質を、相当する対照と比較することは、異なる試料からの同一のタンパク質を、ゲル上で同一スポットとなることを保証することが望ましい。同一のゲル上ですべてのタンパク質を走らせることによって、異なった試料を、ゲルの分離の再現性に関して考慮することなしに比較することを可能にする。このことを達成するために、それぞれの試料中で異なるラベルによって標識された特定のタンパク質が、そのラベルに関わり無く、ゲル中で同一の位置でとまるような、異なる試料中のタンパク質の移動度におけるその効果が同一であるラベルのセットが必要である。
【０１８６】
さらに最近、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動によって画分化された全タンパク質を解析するために質量分析法を利用する試みがなされてきた（Ｄｏｌｉｎｋ  Ｖ．「タンパク質のキャピラリーゾーン電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８，２３５３−２３６１頁、１９９７年）。キャピラリー電気泳動質量分析法を利用したインラインシステムが試されてきた。しかしながら、質量分析法による全タンパク質の解析には、多くの困難があった。第１の困難は、個々のタンパク質の多重イオン化状態許容性による複合質量スペクトルの解析である。第２の主な不都合は、質量分析計の質量分解が、現在、高分子量種に対して、すなわち質量にして約４キロダルトン以上のイオンに対して、貧弱であり、質量が近いタンパク質を分解することは困難である。第３の不都合は、全タンパク質のフラグメンテーションパターンがとても複雑であり、解析することが困難であることから、タンデム質量分析法での全タンパク質のさらなる解析が困難であることである。
【０１８７】
ＰＣＴ／ＧＢ９８／００２０１号およびＰＣＴ／ＧＢ９９／０３２５８号は、混合物中のタンパク質からＣ−末端ペプチドを単離すること、および質量分析法によってそれらを解析することによって、タンパク質の複合混合物を特性化する方法を記述している。記述された方法は、タンパク質が試料中に存在するか、または存在しないかを決定するためには使用できるが、試料間の比較データを得ることはできない。本方法は、多重試料中のタンパク質発現レベルの定量的比較に関して必要でありうる、多重の試料の同時の解析に対する技術を記述してはいない。
【０１８８】
欧州特許第ＥＰ−Ａ−０  ５９４  １６４号は、Ｎ末端シークエンシング薬剤を用いたＣ末端ペプチドの配列決定を可能にする方法における、タンパク質からのＣ末端ペプチドを単離する方法を記述している。本方法においては、対象のタンパク質をリシン残基のＣ末端部位にて切断するエンドペプチダーゼによって消化する。得られたペプチドを、すべての遊離アミノ基と反応する、ＤＩＴＣポリスチレンで処理する。ＤＩＴＣポリスチレンと反応したＮ末端アミノ基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて開裂することができ、したがってすべてのペプチドのＮ末端が放出される。しかしながら、リシンのイプシロン−アミノ基は開裂されず、したがって、すべての末端ではないペプチドは支持体上に残り、Ｃ末端ペプチドのみが放出される。この内容にしたがって、Ｃ末端ペプチドをマイクロシークエンシングのために回収する。
【０１８９】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９９４−９９９頁（１９９９年）は、タンパク質発現解析を可能にするために、タンパク質からのペプチドの捕獲のための、「アイソトープエンコードアフィニティタグ（ｉｓｏｔｏｐｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ）」の使用を開示している。本記事において、著者は、その中のシステインでペプチドを捕獲するために、チオールに対して反応性である、ビオチンリンカーの使用を記述している。１つの供給源からのタンパク質の試料は、ビオチンリンカーと反応し、エンドペプチダーゼで開裂する。次いでビオチン化されたシステイン含有ペプチドは、続く質量分析計による解析のために、アビジン化されたビーズ上に単離することができる。２つの試料を、１つの試料をビオチンリンカーでラベルし、第２の試料をビオチンリンカーの重水素化形態で標識することによって定量的に比較することができる。次いで、試料中のそれぞれのペプチドは、相対的ピーク高がその相対的発現レベルを示唆する、質量スペクトル中のピークの対としてあらわされる。
【０１９０】
本論文の方法は、多くの制限がある。この「アイソトープコード」方法に対する種々の制限のうち、第１のものは、タンパク質内のチオールの存在に依存することであり、他のものがいくつか含んでいる一方で、多くのタンパク質はチオールを持たない。本方法の変法において、リンカーが、アミンのような他の側鎖と反応するように設計されうるが、しかし多くのタンパク質は１つ以上のリシン残基をもっており、タンパク質あたり多数のペプチドが本アプローチにて単離される。これは、質量分析計による解析に必要な試料の複雑度を減少させないであろう。多くの種を含む試料は、複雑さが少ない試料における質量スペクトルで通常現れる他の種よりも、特定の種が優先的にイオン化されるという「イオン抑制（ｉｏｎ  sｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」を受ける可能性がある。一般的に、その側鎖によってタンパク質を捕獲することは、タンパク質あたりとても多くのペプチドかまたは特定のタンパク質をすべて失う可能性がある。
【０１９１】
本アプローチの第２の制限は、本方法において、異なる試料からのタンパク質の発現レベルを比較するために使用することである。それぞれの試料を、アフィニティタグの異なるアイソトープ変異体で標識することにより、結果として、それぞれの試料中のそれぞれのペプチドに対する質量スペクトルに追加的なピークが現れ、このことは、２つの試料を一緒に解析すると、スペクトル中に２倍のピークが現れることを意味する。同様に、３つの試料を一緒に解析する場合、スペクトルは、１つの試料のみのときよりも３倍複雑になる。本アプローチによって２または３の試料の比較を試みることは、可能ではあるが、ピークの数の増加は、２つの異なったペプチドが質量スペクトル中で重なったピークを有する見込みを増加させることになる。
【０１９２】
上記論文の著者によって報告されたさらなる制限は、タグによって引き起こされる移動度の変化である。著者は、重水素化ビオチンタグで標識されたペプチドは、重水素化されていないタグによって標識された同一のペプチドよりもわずかに後に溶出されると報告している。
【０１９３】
以上の観点から、本発明のさらなる目的は、複合ポリペプチド混合物の多数の試料中のポリペプチドのアイデンティティおよび相対量を、同時に検出する改善方法を提供することである。本発明の本観点のさらなる目的は、すべてのタンパク質が解析によって現れることを保証することである。単一試料のみからえられるスペクトルと比較するときに、質量スペクトルの複雑さを有意に増加させることなく、多重サンプルを同時に、定量的に解析可能である、質量ラベルおよび技術を提供することもまた、本発明の本観点の目的である。異なるタグで標識した同一のペプチドの試料が、クロマトグラフィー分離の後一緒に溶出されるように、標識したペプチドの移動度において同様に影響を与えるラベルを提供することが、本発明の本観点の最終の目的である。
【０１９４】
したがって、本発明のさらなる好ましい実施様態は、１つ以上のタンパク質を含むタンパク質試料を解析する方法を提供し、前記方法には、以下の工程を含む。
【０１９５】
１．それぞれのペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質が、そのタンパク質に固有のラベルまたはラベルの組合せによって、標識されるように、試料中のペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を、本発明のセットおよびアレイからの、少なくとも１つの個々に分離可能である質量ラベルで標識する工程、
２．タンパク質に結合したラベルを検出するために、質量分析法によって、好ましくは本発明の観点にしたがって、たとえばランダム質量分析法によって、標識されたペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質を解析する工程。ついで試料中の標識されたペプチドを同定してもよく、その相対発現レベルを決定する。
【０１９６】
多重試料を上記工程に適用することが好ましい。それぞれの多数の試料に対して、上記標識工程（１）の前に、切断剤、とりわけ配列特異的切断剤を用いて、混合物中のポリペプチドより、ペプチドを単離することがさらに好ましい。標識工程（１）の後、必要であれば、試料をためる。任意に、標識工程（１）および／または試料の保存の後、試料中、または試料(群)中のペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を、ゲル電気泳動、等電点フォーカシング、液体クロマトグラフィーまたは他の適切な方法によって分離し、好ましくは個別の画分を生成してよい。これらの画分は、ゲル上のバンドまたはスポット、またはクロマトグラフィー分離からの液体画分でありうる。１つの分離からの画分をさらに第２の分離技術を用いて分離してよい。同様に、さらなる画分を、タンパク質が続いて行う解析工程のために十分分離されるまで再び分画してもよい。
【０１９７】
したがって、本発明の本観点は、以上で記述した本発明のラベルおよび方法のさらなる適用を提供する。本発明のラベルのセットまたはアレイは、有機体中のタンパク質の２Ｄゲル電気泳動解析のスループットを増加させるのに使用することができる。それぞれの質量ラベルは、同一の方法で連結されたタンパク質の移動度を変化させるが、独立して検出可能である。ペプチド質量フィンガープリンティングのような、２Ｄゲルからのタンパク質を解析するための質量分析法の公知の使用においては、ＳＤＳのような界面活性剤およびゲルからの他の汚染物質を除去するために、タンパク質をゲルから抽出し、精製することが要求される。本発明のラベルは、ゲルからの比較的未精製な抽出物を直接質量分析計に導入することを可能にし、ついで連結したラベルは、物質を汚染しているバックグラウンドにおいて、本発明の方法によって同定することができる。
【０１９８】
本発明の本観点のとりわけ好ましい実施様態において、多重試料を以下の工程にかける。
【０１９９】
１．多くの試料のそれぞれに対して、配列特異的切断剤を用いて、混合物中のポリペプチドからペプチドを単離する工程、
２．それぞれの試料が固有のラベルによって同定されるように、本発明のラベルで、それぞれの試料中の単離したペプチドを標識する工程、
３．標識した試料をまとめる工程、
４．まとめた標識したペプチドを、随意にクロマトグラフィーまたは電気泳動的に分離する工程、
５．これらの標識した試料を、タンデム質量分析法によって解析し、試料中の標識ペプチドを同定し、その相対的発現レベルを決定する工程。
【０２００】
本発明の本観点の他の好ましい実施様態は、各試料に１つ以上のタンパク質が含まれるタンパク質試料のセットを解析する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。
【０２０１】
１．それぞれの試料のタンパク質が、他のすべての試料のタンパク質と反応したラベルとは別の、１つまたはそれ以上の質量ラベルで標識されるように、それぞれの試料のタンパク質を、本発明のセットおよびアレイからの、個別に分離可能な質量ラベルと共有的に反応させる工程、
２．質量ラベルで標識した試料をまとめる工程、
３．個々の画分を生成するために、ゲル電気泳動、等電点フォーカシング、液体クロマトグラフィーまたは他の適切な方法によって、まとめた試料を分離する工程。これらの画分は、ゲル上のバンドまたはスポット、またはクロマトグラフィー分離からの液体画分であってよい。１つの分離からの画分を、さらに第２の分離技術を用いて分離してよい。同様に、さらなる画分を、タンパク質が続く解析工程のために十分分離されるまで、再び画分化してよい。
【０２０２】
４．タンパク質に結合したラベルを検出するために、好ましくは本方法の観点にしたがって、質量分析法により当該画分を解析すること。
【０２０３】
本発明の本観点のまたさらに好ましい実施様態は、１つ以上のタンパク質を含む試料中のタンパク質を同定する方法を提供し、本方法は以下の工程を含む。
【０２０４】
１．試料のタンパク質を、本発明のセットおよびアレイからの、個別に分離可能な質量ラベルと共有的に反応させること、
２．個々の画分を生成するために、ゲル電気泳動、等電点フォーカシング、液体クロマトグラフィーまたは他の適切な方法によって、タンパク質を分離すること。これらの画分は、ゲル上のバンドまたはスポット、またはクロマトグラフィー分離からの液体画分であってよい。
【０２０５】
１つの分離からの画分を、さらに第２の分離技術を用いて分離してよい。
【０２０６】
同様に、さらなる画分を、タンパク質が続く解析工程のために十分分離されるまで、再び画分化してよい。
【０２０７】
３．配列特異的切断剤にて、画分中のタンパク質を消化すること、
４．随意に、試料中のタンパク質をさらなる質量ラベルと反応させること、
５．液体クロマトグラフィーカラム工程からの質量ラベルで標識したペプチドの溶出時間が、ペプチドに結合している質量ラベルを検出することで決定される、液体クロマトグラフィー質量分析法により、消化した画分を解析すること。タンパク質に結合したラベルを検出するために、質量分析法による解析（質量分析解析）を、好ましくは本発明の観点にしたがって、実施する。
【０２０８】
６．工程５の液体クロマトグラフィー質量分析解析からの標識したぺプチドの溶出プロフィールを、データベースと比較し、当該タンパク質がすでに同定されているかどうかを決定する。
【０２０９】
本発明の本観点のさらにまた好ましい実施様態は、１セットのタンパク質試料からタンパク質を同定する方法を提供し、前記試料は１つ以上のタンパク質を含み、本方法は以下の工程を含む。
【０２１０】
１．それぞれの試料のタンパク質が、他のすべての試料のタンパク質と反応したラベルとは別の、１つまたはそれ以上の質量ラベルで標識されるように、それぞれの試料のタンパク質を、本発明のセットおよびアレイからの、個別に分離可能な質量ラベルと共有的に反応させる工程、
２．質量ラベルで標識した試料をためる工程、
３．個々の画分を生成するために、ゲル電気泳動、等電点フォーカシング、液体クロマトグラフィーまたは他の適切な方法によって、タンパク質を分離する工程。これらの画分は、ゲル上のバンドまたはスポット、またはクロマトグラフィー分離からの液体画分であってよい。
【０２１１】
１つの分離からの画分を、さらに第２の分離技術を用いて分離してよい。同様に、さらなる画分を、続いて行う解析工程のためにタンパク質が十分分離されるまで、再び画分化してよい。
【０２１２】
４．配列特異的切断剤を用いて、画分中のタンパク質を消化して、該試料中の各タンパク質に特徴あるペプチドを生成させる工程、
５．任意に、試料中のタンパク質をさらなる質量ラベルと反応させる工程、
６．液体クロマトグラフィーカラム工程からの質量ラベルで標識したペプチドの溶出時間が、ペプチドに結合している質量ラベルを検出することで決定される、液体クロマトグラフィー質量分析法により、消化した画分を解析する工程。タンパク質に結合したラベルを検出するために、質量分析解析を、好ましくは本発明の観点にしたがって、実施する。
【０２１３】
７．工程６の液体クロマトグラフィー質量分析解析からの標識したぺプチドの溶出プロフィールを、データベースと比較し、当該タンパク質がすでに同定されているかどうかを決定する。
【０２１４】
本発明の上記好ましい実施様態の工程１には、本発明の質量ラベルをタンパク質の集団の反応性側鎖と共有反応させることが含まれる。反応性側鎖官能基は選択的に反応させることができることが、本技術分野でよく公知である。反応性側鎖にはリシン、セリン、スレオニン、チロシンおよびシトシンが含まれる。
【０２１５】
シトシンはしばしば、それ自身架橋し、ジスルフィド架橋を形成する。本発明の目的のために、これらの架橋が壊れる必要はないが、システイン側鎖は、高い反応性をもち、種々の薬剤と簡単に反応する。ジスルフィド架橋が存在する場合、これらは、ジスルフィド架橋をメルカプトエタノールによってチオールの対に還元することで壊すことができる。チオールは、チオレートイオンの形成を促進する穏やかな塩基性条件下で、ヨウ化酢酸（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））によって選択的にキャップされる（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２２９３頁、１９９１年）。好ましい穏やかな塩基は炭酸塩である。本発明の目的のために、その反応官能基がヨウ化アセチル基である本発明の質量ラベルは、分析物タンパク質のチオールと反応することが可能である。他の実施様態において、タンパク質の集団は、その反応官能基がイソシアネート基である質量マーカーと反応しうる。イソシアネートは、穏やかな条件下、すなわち中性溶媒中、室温にて、タンパク質のＮ末端のアルファアミノ酸、およびリシンイプシロンアミノ基、すなわち一級アミンとほとんど独占的に反応し、尿素誘導体を与える。これらの薬剤はまた、ピリジンまたはジブチルステニルラウリン酸塩のようなスズ化合物などの好ましい触媒の存在下、高温にて、セリン、スレオニンおよびチロシン側鎖のような、任意の水酸基を有する側鎖と反応させるために作製可能であり、ウレタン誘導体を与える。他の実施様態において、タンパク質の集団を、その反応性官能基が、クロロシランのようなシリル基である質量マーカーと処理させることが可能である。これらの化合物は、ほとんどの反応性官能基と簡単に反応する。アミン誘導体は、水性条件で安定ではなく、よって、もし望むのならば、遊離アミンに加水分解して戻すことができる。塩化スルホニルもまた、リシンのような遊離アミンと質量ラベルを選択的に反応させるために、質量ラベル上の反応基として使用できる。カルボキシル酸側鎖はまた、通常、それらが反応する事を保証するために、これらの側鎖を活性化する必要があるけれども、本発明のラベルと反応させることができる。無水酢酸が通常本目的のために使用される。このことにより、ついでアミンのような求核官能基と反応可能である、遊離カルボキシル酸にて混合無水物が形成される。
【０２１６】
上記の特定の実施様態は、質量ラベルとの側鎖官能基の選択的反応の好ましい方法を例示するための例としてのみのつもりである。広範囲のさまざまな反応性基が本技術分野で公知であり、これらの多くが、本発明のこれらの観点の第１の工程を完了するのに使用することができる。異なった質量ラベルを有する試料中の１タイプ以上のタンパク質側鎖と反応することも望ましい。多重試料を、同時に解析しなければならない場合、２つまたはそれ以上のラベルを、それぞれの試料を標識するために使用することができる。このことにより、より多くの情報が、その同定の役に立つように、それぞれのタンパク質から導かれる。
【０２１７】
本発明の本観点の後者２つの実施態様の工程３および工程４において、ついでＣ末端修飾タンパク質を、配列特異的切断剤で処理する。
【０２１８】
いくつかの実施様態において、トリプシン、キモトリプシン、トロンビンのような配列特異的エンドプロテアーゼまたは他の酵素を使用してよい。あるいは、開裂剤は有機薬剤であってよい。これらは、未反応薬剤の除去を簡単にするために、揮発性であることが好ましい。適切な化学切断薬剤には、メチオニン残基にて切断する臭化シアン、トリプトファン残基にて切断するＢＮＰＳ−スカトールが含まれる（Ｄ．Ｌ．Ｃｒｉｍｍｉｎｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７：２７−３８頁、１９９０年）。
【０２１９】
本発明の本観点の上記好ましい実施様態において、タンパク質の分画工程は、好ましくは、一次元で等電点フォーカシングを、二次元でＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いる、二次元ゲル電気泳動を実施することによって、好ましく実施される。ついでゲルを、視覚化して、タンパク質がゲル上でどこに移動したかを同定する。ついでスポットをゲルより摘出し、ついでタンパク質をその抽出したゲルスポットより抽出する。ついでこれらの抽出したタンパク質を、電子噴霧質量解析法、または他の好適なイオン化手順によって直接的に解析してよい。あるいは、さらなる分画を、ＨＰＬＣ質量分析計のような質量分析計とインラインに実施してよい。
【０２２０】
本発明の本観点の後者２つの好ましい実施様態の工程３および工程４において、消化したタンパク質を、任意に、本発明のさらなる質量ラベルと反応させる。このことは、本発明の後者の好ましい実施様態でより重要であり、そこで多重試料が同時に解析される。ほとんどの酵素消化、およびいくつかの化学的解析法により、質量ラベルと反応可能なタンパク質を消化により分画した結果産物であるペプチド上に遊離アミンが残る。このことは、同一のラベルがすべてのペプチド上に現れる可能性があり、この解析の感受性を選択的に最大化するために検出できる。
【０２２１】
本発明の本観点の後者２つの好ましい実施様態の工程６および工程７において、画分化したタンパク質を消化することによって生成されたペプチドの溶出プロフィールを、当該タンパク質が、すでに同定されているかどうかを決定するために、先に形成されているデータベースを検索するために使用する。液体クロマトグラフィーカラムから、質量分析計内に溶出したペプチドを、さらに、タンデム質量分析法によって解析し、タンパク質を同定するために使用することができる配列情報を決定する。ペプチド配列データは、タンパク質配列データベースを検索するために使用でき、または核酸配列データベースを検索するために、核酸配列データに翻訳することができる。
【０２２２】
（翻訳後修飾ペプチドの単離）
糖鎖がしばしばタンパク質の翻訳後修飾として存在する。これらの糖鎖はしばしばカルボニル基である。カルボニル基を、そのような修飾を有するタンパク質を、検出するか、または単離することが可能なように、タグづけできる。ビオシチンヒドラジド（ピアス・アンド・ワーナー社（Ｐｉｅｒｃｅ  ＆  Ｗａｒｒｉｎｅｒ  Ｌｔｄ，  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  英国）は、多くの糖鎖種内のカルボニル基と反応する（Ｅ．Ａ．Ｂａｙｅｒら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｐｈｅｍ．  １７０，  ２７１―２８１頁、「アビジン・ビオチン技術を用いた、複合糖鎖内のビオシチンヒドラジド−シアル酸、ガラクトースおよび他の糖に対する選択的ラベル（Ｂｉｏｃｙｔｉｎ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ  −  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌ  ｆｏｒ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ，  ｇａｌａｃｔｏｓｅ，  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｕｇａｒｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９８８年）。したがって、複合混合物内の糖鎖修飾を有するタンパク質はビオチン化できる。ついでタンパク質混合物を、トリプシンのようなエンドプロテアーゼで処理して、タンパク質からペプチドを生成する。ついで、ビオチン化により糖鎖修飾ペプチドをアビジン化固体支持体を用いて単離する。試料のセットをこの方法にて処理してよく、得られたペプチドを、それぞれの試料からのペプチドが、その試料からのペプチドまたはペプチド類と関連付け可能な質量ラベル、または質量ラベルの組合せを有するように、本発明の質量ラベルと反応させてよい。ついで、これらの質量でタグづけした糖鎖含有ペプチドを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によって解析してよい。
【０２２３】
多くの調査グループが、広範囲のさまざまなタンパク質中のりん酸チロシン残基に結合する抗体の生成に関して報告している（たとえばＡ．  Ｒ．  Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎら．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０１，  ７９―９２「りん酸チロシンに対するモノクローナル抗体の生成と、りん酸チロシン含有タンパク質のアフィニティー精製のためのその使用（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ａｆｆｉｎｉｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、１９９１、およびＭｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．の本巻の他の記事を参照のこと）。このことは、チロシンりん酸化によって翻訳後修飾されたタンパク質の重要な部分が、アフィニティカラムリガンドとしてこれらの抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって単離されうることを意味している。
【０２２４】
これらのりん酸チロシン結合抗体は、りん酸チロシン残基を含有しているペプチドを単離するために、本発明の内容にて使用可能である。したがって、複合混合物内のタンパク質を、遊離ペプチドを生成するために、配列特異的エンドペプチダーゼで処理してよい。ついでこれらを、抗りん酸チロシン抗体カラムを通過させてよく、りん酸チロシン基を含むペプチドが残る。試料のセットをこの方法にて処理してよく、得られたペプチドを、それぞれの試料からのペプチドが、その試料からのペプチドまたはペプチド類と関連付け可能な質量ラベルまたは質量ラベルの組合せを有するように、本発明の質量タグと反応させてよい。各試料からのペプチドが異なる質量ラベルを有することが好ましい。ついで、これらの質量ラベルで標識したリン酸チロシンを有するペプチドを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によって解析してよい。
【０２２５】
（タンパク質からの末端ペプチドの単離）
本発明によれば、タンパク質発現プロフィル分析の好ましい方法は、試料中のそれぞれのタンパク質からのただ１つのペプチドを単離することである。単離したペプチド断片が十分な長さである限り、断片は、その親タンパク質に特有である。
【０２２６】
本発明の本観点の第１の工程において、ペプチドを、複合タンパク質混合物の多数の試料のそれぞれにおけるタンパク質より単離する。本観点のいくつかの実施例において、末端ペプチドを単離することが好ましい。末端ペプチドの単離により、タンパク質あたり少なくとも１つの、そしてただ１つのペプチドが単離することが保証される。
【０２２７】
ポリペプチドの末端からペプチドを単離するための方法は、ＰＣＴ／ＧＢ９８／００２０１号およびＰＣＴ／ＧＢ９９／０３２５８号にて議論されている。
【０２２８】
したがって、本発明の本観点は、タンパク質プロフィル分析の方法を提供し、本方法は、以下の工程を含む。
（ａ）多数のポリペプチドの集団を含む試料を、ポリペプチド鎖内で、特定のアミノ酸残基または配列を認識し、開裂部位で開裂させることが知られている開裂剤で処理する工程、それによって前記集団が開裂され、ペプチド断片が生成される、
（ｂ）それより断片化されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端を、対照末端として含有するペプチド断片の集団を単離する工程、ここでそれぞれのペプチド断片は、他の末端で、対照末端に近接した開裂部位を含有する。
（ｃ）ペプチド断片を単離する前または後に、ポリペプチドのそれぞれの対照末端を、本発明の質量ラベルのセットまたはアレイからの質量ラベルまたは質量ラベルの組合わせで標識する工程、そこでそれぞれの対照末端は、そのラベルまたはラベルの組合わせに関連づけることができる、
（ｄ）質量分析法によって、１つまたはそれ以上の単離した断片の特性配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を決定する工程、ここで前記特性配列は、切断部位からの所定数のアミノ酸残基の配列であり、形跡配列はそれぞれのポリペプチドを特性化する。
【０２２９】
本発明の本観点によって提供される他の好ましい方法により、さらなる断片を生成するために第２の開裂剤の使用が考慮され、当該断片はそれ自身同定されてもよく、その親ポリペプチドまたはタンパク質を特性化するのに使用してよい。本方法は、以下の工程を含む。
（ａ）１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む試料を、第１の切断剤と接触させ、ポリペプチド断片を合成する工程、
（ｂ）１つまたはそれ以上のポリペプチド断片を単離する工程、それぞれの断片は、各断片から断片化されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端を含む、
（ｃ）ポリペプチド断片を単離する前または後に、ポリペプチドのそれぞれの末端を、本発明の質量ラベルのセットまたはアレイからの、質量ラベルまたは質量ラベルの組合せで標識する工程、ここでそれぞれの末端は、そのラベルまたはラベルの組合せに関連づけることができる、
（ｄ）質量分析法によって、単離した断片を同定する工程、
（ｅ）第１の切断剤とは異なる部位で切断する第２の切断剤を用いて、上記試料について、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）および（ｅ）にて同定された断片から、試料中の１つまたはそれ以上のポリペプチドを特性化する工程、
を含む。
【０２３０】
以上の両方の方法において、対照末端を標識する工程は、所望ならば、断片を単離する前または後に実施可能であり、またはそれらの親ポリペプチドまたはタンパク質から断片を切断する前に実施できる。
【０２３１】
本発明の本観点の好ましい実施様態において、以下の工程を含む方法を用いて、タンパク質の複合混合物より末端ペプチドを単離する。
【０２３２】
１．Ｌｙｓ−Ｃ特異的開裂酵素、すなわち、その残基のＣ末端上のリシン残基に隣接するペプチド結合部位で切断する薬剤で、タンパク質の複合混合物を消化する工程、
２．得られたペプチドを、遊離アミノ基と反応する活性化固体支持体に接触させる工程、
３．任意に、捕獲されたペプチドを、少なくとも１つのアミノ酸反応官能性を有する二官能性薬剤と反応させる工程、
４．捕獲したペプチドを、支持体上のそれぞれのペプチドのアルファアミノ酸基で切断する薬剤に接触させる工程、Ｃ末端ではないすべてのぺプチドは、固体支持体にそのペプチドを共有結合させているリシン残基を有する。したがって、遊離Ｃ末端ペプチドが選択的に放出される。
【０２３３】
５．任意に、放出したペプチドを、第１の支持体と先に反応しなかった任意のペプチドを捕獲するために、工程３で使用した二官能性薬剤の第２の反応性官能基と反応する、第２の固体支持体と接触させる工程、
６．溶液中に遊離したままであるペプチドを回収する工程。
【０２３４】
本方法の好ましい実施様態において、複合混合物中のタンパク質を変性させ、還元し、タンパク質中のチオールをキャップするために薬剤で処理する。典型的なプロトコールには、還元剤として、過剰のメルカプトエタノールまたはジチオスレイトール、そしてビニルピリジンのような過剰のキュッピング剤の存在下、変性剤として、高濃度の塩化水素グアニジン（６―８Ｍ）でｐＨ８．５の緩衝液中でタンパク質を変性させることが含まれる。
【０２３５】
本方法の工程１において、タンパク質の複合混合物を、たとえばリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）エンザイモジーンからのエンドペプチダーゼＬｙｓ―Ｃ（ベーリンガー・マンハイム）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））でありうる、Ｌｙｓ−Ｃ特異的切断酵素によって完全に消化する。
【０２３６】
本方法の工程２において、得られたペプチドを、アミンと反応する固体支持体と接触させる。好ましい実施様態において、固体支持体は、イソチオシアネート化合物によって誘導化する。１つの実施様態において、ペプチド集団を、塩基の存在下で、イソチオシアネートガラス（ＤＩＴＣガラス、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ）Ｄｏｒｓｅｔ，  イギリス）と反応させる。これによって、すべてのペプチドが、任意の遊離アミノ基を介して支持体に捕獲される。
【０２３７】
工程３は任意であるが、好ましい。すべての非Ｃ末端ペプチドが、リシン側鎖アミノ基およびＮ末端アルファアミノ基両方で、第１の固体支持体と完全に反応することを保証することは難しい可能性がある。リシン側鎖アミノ基を介してのみ反応するペプチドは、続く工程で、支持体に結合したまま残る。
【０２３８】
そのアルファアミノ基を介してのみ反応するペプチドは、Ｃ末端ペプチドにそって支持体より開裂する。この工程は、非Ｃ末端ペプチドを、Ｃ末端ペプチドから区別することを可能にする。本任意の工程において、二官能性薬剤はＮ−スクシミジル[４―ビニルスルホニル]ベンゾエート（ピアス・アンド・ウォーリー社（Ｐｉｅｒｃｅ  ＆  Ｗａｒｒｉｎｅｒ  Ｌｔｄ．）  Ｃｈｅｓｔｅｒ，英国）からのＳＶＳＢ）であってよい。この化合物は、チオール反応性ビニルスルホン部分に連結したアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。本化合物は、ビニルスルホンの反応なしに、エステル官能性を介してアミンと非常に簡単に反応し、より後期のステージにおいて、チオールと別々に反応しうる。したがって、ＳＶＳＢは、わずかに塩基性条件下で、支持体上の任意の遊離アミンと反応する。大過剰のＳＶＳＢ化合物の存在下、支持体上のペプチドを固定化する場合、ＳＶＳＢは、さらなる反応のために、ビニルスルホン部分を残した、スクシンイミド官能基のみを介してペプチドと反応する。他の実施様態において、任意の未反応アミンが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ビオチン（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ）、Ｄｏｒｓｅｔ、  Ｅｎｇｌａｎｄ）のようなアミン反応性官能基とカップリングするビオチンと反応しうる。このことにより、不完全に反応したペプチドを、アフィニティ捕獲カラム中のアビジン化ビーズ上またはアビジン化樹脂上で後に捕獲することが可能になる。
【０２３９】
本方法の工程４において、捕獲したペプチドを、支持体上のそれぞれのペプチドのアルファアミノ基において開裂する薬剤で処理する。ＤＩＴＣガラスを、アミン反応性支持体として使用する実施様態において、ペプチドを、支持体上のそれぞれのペプチドからのＮ末端アミノ酸を開裂する、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような適切な揮発性酸で処理する。Ｃ末端ではないすべてのペプチドは、固体支持体にそれ自身を共有結合させるリシン残基を有する。したがって、遊離Ｃ末端ペプチドが選択的に放出される。
【０２４０】
任意工程５は、任意工程３を実施した場合にとりわけ好ましい。アミノ酸反応性支持体と完全には反応しない、非Ｃ末端ペプチドをこの工程で除去する。ＳＶＳＢを、そのアルファアミノ基を介して反応するのみの非Ｃ末端ペプチドをタグづけするために使用する場合、適切な求核原子、好ましくはチオールにて誘導される固体支持体と反応させることを可能にする利用可能な反応性官能基を有する。ＤＩＴＣガラスを工程４で使用する場合、これは好ましいが、ここで、ペプチドは、ＴＦＡを用いて支持体から放出されうる。放出されたペプチドを、ＴＦＡを蒸発させることによって、トリフルオロ酢酸塩として回収してよい。ついでペプチドを、約７のｐＨをもつ緩衝液中、またはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または水と酢酸の混合物のような、適切な中性溶媒中に再懸濁してよい。ついでペプチドをチオール誘導化支持体に添加する。ｐＨ７において、ＳＶＳＢ処理したペプチド上の残っているビニル官能基は、ＤＩＴＣガラス支持体のペプチドの開裂によって現れた遊離アミンとよりも、チオール支持体とほとんど独占的に反応すべきである。チオール誘導化テンタジェルズ（Ｔｅｎｔａｇｅｌｓ）が、ラップ・ポリマーＧｍｂＨ（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ：  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）から入手可能であり、または、チオール誘導化支持体が、３―メルカプトプロピルトリメトキシシランとともにシリカゲルのインキュベーションによって調製できる。
【０２４１】
本方法の工程６において、放出されたペプチドを回収する。任意工程３および５を使用した場合、ペプチドは、種々の溶媒または緩衝液中に存在する。これらは、好ましい実施様態において、揮発性であるように選択する。ペプチドを、好ましい実施様態においてＤＩＴＣガラスである、第１の支持体から直接回収する場合、ペプチドは、揮発性であるＴＦＡ中である可能性がある。ペプチドは、好ましくは、溶媒または緩衝液を蒸発させることによって、これらの揮発性溶媒または緩衝液から回収する。本方法にて単離したペプチドは、本発明のラベルとの反応のために利用可能である遊離アルファアミノ基を有する。
【０２４２】
（単離ペプチドのラベル化）
本発明の任意の質量ラベルは、本発明の本観点で記述したタンパク質発現プロフィル分析で使用できる。図２２および図２３で図示した質量ラベルが、本発明、とりわけ本発明の本観点での使用にとりわけ好適である。これらの化合物は、当該化合物を、遊離アミンおよびチオールとの添加反応を受けさせることを可能にするビニルスルホン反応基を有する。ペプチドあたりただ１つのラベルが望ましい場合、複合混合物内のタンパク質は、配列特異的エンドペプチダーゼでの開裂の前に、キャッピング剤で処理して良い。フェニル、エチルおよびメチルビニルスルホンが、遊離アミンと反応し、チオールがそれらをキャッピングし、一方でキャッピングされたタンパク質のトリプシンによる開裂を許容する。リシンのイプシロンアミン残基は、ビニルスルホン部分が隠れていない場合、２つのビニルスルホン部位、とりわけ、エチルおよびメチルビニルスルホンと反応する。
【０２４３】
マーカーの結合の後、これらの標識されたペプチドは、ラベルの質量によって移動する質量を有する。ペプチドの質量は、タンパク質供給源を同定するのに十分でありうる。この場合、ラベルは検出される必要があるのみであり、三重四極子による選択された反応モニタリングによって実施でき、以下でより詳細に議論する。
【０２４４】
簡単に記すと、三重四極子の第１の四極子を、その質量対電荷比が、マーカーの質量に対して調整した、対象のペプチドのものに相当するイオンを通過させるように設定する。選択されたイオンをついで、第２の四極子における、衝突誘導解離（ＣＩＤ）にかける。ペプチドの解析で使用した条件の分類下、イオンは、ほとんど、前記分子中のアミド結合部分で断片化する。図２２および２３でのマーカーはアミド結合を有しており、開裂におけるタグの末端の先にイオン化した部分を放出する。タグがすべて同一の質量を持っているけれども、いずれかの側のアミド結合における置換基が異なることから、末端部分は異なる。したがって、マーカーは、互いに区別することができる。特定の質量のイオンと関連したマーカー断片の存在は、イオンがペプチドであり、異なる試料からのタグの相対ピーク高さが、その試料中のペプチドの相対量に関する情報を与え得ることを支持する。試料中の多数の末端ペプチドが、同一の末端質量を持っていないか、ペプチドが公知でないためにのいずれかによって、質量がペプチドを同定するのに十分ではない場合、配列情報は、完全なＣＩＤスペクトルの解析によって決定してよい。図２４は、配列Ｈ2Ｎ−ｇｌｙ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ＣＯＯＨを有するペプチドの２つの試料に対する理論的スペクトルを示しており、そこでそれぞれの試料は、図２３で示した式を有する１つのラベルに結合している。
【０２４５】
スペクトルは、ｂ―シリーズ断片を示しているのみであり、他の断片または任意のノイズピークは示していないので理想化される。しかしながら、スペクトルが、ペプチド断片ピークに相当するより高い質量領域と、質量ラベルピークに相当するより低い質量領域に明らかに分けられることを示している。望むのならば、ペプチド断片ピークは、質量タグピークがペプチドの相対量に関する情報を与える一方で、ペプチドを同定するために使用することができる。
【０２４６】
（クロマトグラフィーまたは電気泳動によるラベル化されたペプチドの分離）
好ましくは、本発明の本観点において、質量分析解析の前の工程で、標識した末端ペプチドを、質量分析法による解析に先だってクロマトグラフィー分離にかける。これは、好ましくは、クロマトグラフィーカラムから溶出するので、ペプチドのインライン解析のために質量分析計に直接つなげることができる、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。種々の分離技術がＨＰＬＣによって実施され得るが、逆相クロマトグラフィーが、質量分析法の前のペプチドの分離に関して一般的な方法である。キャピラリーゾーン電気泳動が、試料の溶出の自動化解析のために、質量分析計に直接連結し得る他の分離方法である。これらおよび他の画分化技術を質量分析法による解析の前に、ペプチド混合物の複雑性を減少させるために適用してよい。
【０２４７】
（タンデム質量分析法によるタンパク質の定量および同定）
本発明の本観点の方法において、標識した単離ペプチドは、タンデム質量分析法によって解析される。
【０２４８】
先に議論したように、タンデム質量分析計は、先に決定した質量対電荷比を有するイオンを、たとえば衝突誘導分離（ＣＩＤ）によって、選択し、断片化することを可能にする。ついで断片を選択したイオンについての構造情報を提供して検出できる。ペプチドをタンデム質量分析計内でＣＩＤによって解析する場合、固有の開裂パターンが観察され、ペプチドの配列を決定可能にする。天然のペプチドは典型的に、ペプチドの特徴であるイオンのセットを与えるために、ペプチド骨格のアミド結合にて、ランダムに断片化される。ＣＩＤ断片群は、通常、第ｎ番目のペプチド結合での開裂に関してａn、ｂn、ｃnなどと示され、ここでイオンの電荷は、イオンのＮ末端断片上に保持される。同様に、断片群は、ｘn、ｙn、ｚnなどと表わされ、電荷はイオンのＣ末端断片上に保持される。この表示は、以下の概略図１（Ｓｃｈｅｍｅ１）で描写されている。
【０２４９】
【化２１】
0004608171.tif 000021
【０２５０】
分子の両端で塩基性基を有するペプチド、すなわちＮ末端におけるアルファアミノ基及びＣ末端でのリシンまたはアルギニン側鎖を生成するので、トリプシンおよびトロンビンが、タンデム質量分析法に対する好ましい開裂剤である。このことは、分子の反対の末端に電荷中心が存在している、二重帯電イオンの形成を好む。これらの二重電荷イオンは、ＣＩＤの後、Ｃ末端およびＮ末端イオン群の両方を生成する。このことは、ペプチドの配列を決定することで支持される。一般的に言及すると、ただ１つまたは２つの可能性あるイオン群が、与えられたペプチドのＣＩＤスペクトル中で観察される。低エネルギー衝突において、計器に基づいた典型的な四極子は、Ｎ末端断片のｂシリーズまたはＣ末端断片のｙシリーズが有用である。二重帯電イオンを解析する場合、そこで両方のシリーズがしばしば検出される。一般的に、ｙシリーズイオンがｂシリーズよりも優れている。
【０２５１】
本発明の方法で使用した単離ペプチドが、以上で議論したようなＤＩＴＣガラスを用いて単離されたＣ末端ペプチドである場合、前記ペプチドは、本発明のラベルによる標識を促進するそのＮ末端にて、単離の後に遊離アミンをもつ可能性がある。以上で言及したように、これらのラベルは、解析するそれぞれの試料中の等しいペプチドが同一の質量づつで移動するように、すべて同一の質量をもつ。これらのペプチドのＣＩＤは、ラベルからのフラグメントを生成する。ラベルフラグメントの強度は、それぞれの試料中の等しいペプチドの相対量を決定することを可能にするであろう。
【０２５２】
単離したペプチドのＮ末端へ、本発明の質量ラベルを共有結合させることは、電荷がラベル上に残っている限り、ラベルの質量まで、フラグメントイオンのｂシリーズの質量を移動させるであろう。解析において、それぞれの試料に関して使用したラベルの質量が等しいので、標識されたペプチドの衝突誘導分離がペプチド骨格内で実施される限り、すべての試料に対して生成された、ただ1つのイオンシリーズだけが存在するであろう。このことは、そのフラグメントイオンによってラベル化ペプチドを同定することができ、任意の与えられたペプチドに関して、同時に解析する試料の数に関係なく、そのペプチドに対してただ1つのフラグメントシリーズが存在するであろうことを意味している。
【０２５３】
ラベルそれ自身内のフラグメンテーションによって、それぞれの試料に固有のピークが生成される。これらのピークは、比較的低質量範囲で起こり得る(図２４を参照のこと)。三重四極子計器によって、これらのピークのもっとも感度のよい検出を実行するために、選択した反応モニタリングを使用することが好ましい。
【０２５４】
これらのピークの相対強度は、もともとの試料に、そのペプチドが由来する供給源タンパク質の相対量の指標となるであろう。天然のペプチドにおいて、フラグメントイオンのｂシリーズは、ｙシリーズよりもより低い強度である傾向にある。たとえば四級アンモニウム中心を含む、適切な基礎質量ラベルまたは「先にイオン化した」質量ラベルによって、イオンフラグメントのｂシリーズの強度が増強され得る。不運なことに、Ｃ末端ペプチドを使用している場合、Ｃ末端アミノ酸が塩基性であることは保証されず、よってｙシリーズのフラグメントイオンが弱くなり得る。ｙシリーズを用いた構造情報の決定は、これらのペプチドのＣ末端が、塩基性基か、または「先にイオン化された」基であることを必要とする。
【０２５５】
タンデム質量分析法によるタンパク質の解析、とりわけタンパク質の混合物は、得られたスペクトルの「ノイズ」によって複雑化する。生物学的試料から単離したタンパク質は、通常緩衝剤、変性剤、および界面活性剤が混合しており、これらすべてが、質量スペクトル内でピークを引きおこす。結果として、しばしば、ペプチドのピークよりもより汚染ピークが存在し、ペプチドに相当するピークを同定することは、とりわけ単離することが難しいタンパク質の小試料で、主要な問題である。結果として種々の方法が、詳細なＣＩＤ解析が実施される前に、どのピークがペプチドに相当するか決定するために使用される。三重四極子に基づく計器によって、「前駆体イオンスキャニング（ｐｒｅｓｕｒｓｏｒ  ｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）」が許容される（Ｗｉｌｍ  Ｍ．ら．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６８（３）  ５２７―３３頁、「分離されていないペプチド混合物の、親イオンスキャン（Ｐａｒｅｎｔ  ｉｏｎ  ｓｃａｎｓ  ｏｆ  ｕｎｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ）」、（１９９６年）を参照のこと）。三重四極子が「単一反応モニタリング」モードで扱われ、そこで、第１の四極子は全質量範囲上をスキャンし、それぞれのゲートを通ったイオンは、第２の四極子内でＣＩＤにかけられる。第３の四極子は、ただ1つのフラグメントイオンを検出するように設定され、通常アンモニウムイオンのようなペプチドからの特徴的なフラグメントイオンである。
【０２５６】
四極子／飛行時間質量スキャンを用いた他の方法は、ＣＩＤにかけたときに、親イオンよりも高い質量対電荷比を有する娘イオンを生成するイオンを同定することによって、二重帯電イオンに対してスキャンする。二重に帯電しているイオンを同定するさらなる方法は、そのイオンは、分子内で13Ｃの存在の割合によってのみ異なることを示す、適切な強度比を有するたった０．５ダルトンしか離れていないスペクトルにおけるピークのセットを見つけることである。
【０２５７】
本発明の質量ラベルでペプチドを標識することによって、前駆体イオンスキャニングの新規形態が、標識したペプチドをＣＩＤにかけた後に、本発明の質量ラベルに相当する断片の存在によって同定されるペプチドピークの中で観察され得る。とりわけ、本発明の方法によってそれぞれの試料から単離したペプチドは１つ以上の質量ラベルで標識してよい。すべての試料中で使用されている、「前駆体イオンスキャニング」ラベルの等モル混合物、および試料特異的ラベルを、それぞれの試料中のペプチドを標識するのに使用してよい。本方法において、異なる試料中のペプチドのレベルの変化は、前駆体イオンスキャンにおけるペプチドピークの同定に逆効果を有することはない。
【０２５８】
ペプチドイオンを同定し、選択して、好ましくは、ＣＩＤに適用する。ＣＩＤスペクトルデータはしばしばとても複雑であり、ＣＩＤスペクトルにおけるどのピークが、意味のあるペプチド断片シリーズに相当するかどうかを決定することは、質量分析法によるペプチドの配列を決定することにおいて、さらなる問題である。Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．  １１  １０１５―１０２４（１９９７年）は、解析のために、タンパク質を16Ｏ／18Ｏが１：１の水中でトリプシンで処理することを含む、さらなる方法を記述している。加水分解反応は、結果として2つのペプチド集団となり、第１の末端カルボキシルは16Ｏを含み、第２の末端カルボキシル基が18Ｏを含む。したがって、試料中のそれぞれのペプチドに関して、二重ピークが２ダルトン離れている、それぞれのペプチドに対して等しい強度を有する二重ピークであるべきである。このことは、固有のペプチド同位体ピークによってわずかに複雑化されるけれども、二重線（ｄｏｕｂｌｅｔ）に対するＣＩＤスペクトルの自動化スキャニングを許容する。二重線間の質量の差は、異なる２つの断片によってアミノ酸を同定するために決定することができる。本方法は、Ｎ末端ペプチドが単離された場合に、本発明の方法にて適用可能であり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、三重四極質量分析計の体系的レイアウトを示す。
【図２】  図２は、本発明に従ったラベルのセットを形成するための、５つの質量規格化部分（Ｍ0−Ｍ4）及び５つの質量マーカー部分（Ｘ0−Ｘ4）を含む１０個のフラグメントを示し、ここではフッ素原子置換基が質量調節部分として使用されている。
【図３】  図３は、図２の質量規格化部分と質量マーカー部分から形成された、本発明に従った５個のラベルのセットを示す。
【図４】  図４は、すべてのラベルが異なる質量を有するが、セットの質量マーカーはすべて同じ質量を有する、本発明に従った５個の質量ラベルのセットを示す。
【図５】  図５は、質量ラベルの組合せが分析物を同定する固有の質量スペクトルを備えるように、オリゴヌクレオチドのような分析物を質量ラベルの組合せで標識した例を示す。
【図６】  図６は、質量ラベルセットのアレイを示し、各々のセットは同じ質量系列修飾基（Ｓ）を有し、塩基性フェニル基上のフッ素置換基の数によって他のすべてのセットと異なる。
【図７】  図７は、質量ラベルセットのアレイを示し、各々のセットは同じ質量系列修飾基（Ｓ）を有し、質量系列修飾基内のフェニルエーテル単位の数によって他のすべてのセットと異なる。
【図８】  図８は、本発明の「混合モード」の実施態様であって、３個の質量ラベルＰ、Ｑ及びＲが、０又は１の相対量で存在するとき、それらのすべての組合せについて８つのあり得る固有の質量スペクトルのうちの４つを示す。
【図９】  図９は、本発明の「混合モード」の実施態様であって、３個の質量ラベルＰ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴが、０、１又は２の相対量で存在するとき、それらのすべての組合せについて２４３個のあり得る固有の質量スペクトルのうちの８つを示す、を例示する（Ｔが内標準として不変のままである場合には８１の可能なスペクトルが存在する）。
【図１０】  図１０は、より大きな置換の範囲を可能にするために、質量規格化部分と質量マーカー部分を拡大することによってどのようにしてより大きなラベルのセットを形成できるかを示しており、このラベルのセットは９個の構成要素を有し、フッ素原子置換基を質量調節部分として使用しているが、このような少なくとも８個の構成要素を有するラベルのセットは、本発明の混合モードを使用してオリゴヌクレオチドのアレイにおいて２５６個の四量体すべてを標識するために好都合である。
【図１１】  図１１は、すべてのイオン、Ａ+、Ｂ+、Ｃ+及びＤ+からのピークを含む完全なスペクトルである、質量スペクトル１を示す。
【図１２】  図１２は、質量分析計（Ｑ１）の第１の四極においてＡ+イオンを選択することによって生じる、Ａ+だけのスペクトルである、質量スペクトル２を示す。
【図１３】  図１３は、第１のイオンＡ1+（Ａ+と同じ質量／電荷比）ならびにＡ1+、Ｐ+及びＱ+のフラグメンテーション産物のスペクトルである、質量スペクトル３を示す。
【図１４】  図１４は、第二イオンＡ2+（Ａ+と同じ質量／電荷比）ならびにＡ2+、Ｘ+及びＹ+のフラグメンテーション産物のスペクトルである、質量スペクトル４を示す。
【図１５】  図１５は、２種類のそのようなイオン、Ａ1+及びＡ2+が存在するときＡ+イオンを選択することによって形成されるスペクトルである、質量スペクトル５を示す。
【図１６】  図１６は、２種類のそのようなイオン（Ａ1+及びＡ2+）が存在するときＱ１でＡ+イオンを選択し、Ｑ２で衝突によって選択したイオンの解離を誘導して、Ｑ３ではＡ1+（Ｐ+）の既知の衝突生成物を選択することにより、三重四極質量分析計において形成されるスペクトルである、質量スペクトル６を示す−そのような手順はＡ1+及びＡ2+の分離を可能にする。
【図１７】  図１７は、本発明に従った５個の質量ラベルのセットの二次元スペクトルであり、質量ＭＸがＱ１（一次元）で選択され、５つの異なる質量、Ｘ0、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4がＱ３（二次元）で選択される、質量スペクトル７を示す。
【図１８】  図１８は、本発明に従った４個の質量ラベルのセットの二次元スペクトルであり、４つの異なる質量、Ｍ0Ｘ0、Ｍ1Ｘ0、Ｍ2Ｘ0及びＭ3Ｘ0がＱ１（一次元）で選択され、単一質量Ｍ0がＱ３（二次元）で選択される、質量スペクトル８を示す。
【図１９】  図１９は、Ｍ0−Ｍ3とＸ0−Ｘ3のすべての組合せから形成されるラベルを含む質量ラベルのセットの二次元スペクトルであり、７つの異なる質量がＱ１（一次元）で選択され、４つの異なる質量Ｘ0−Ｘ3がＱ３（二次元）で選択される、質量スペクトル９を示す。
【図２０】  図２０は、本発明の質量ラベルを使用して、熱によって又は電子噴霧イオン化を用いてそれらをそれらの分析物から開裂する、典型的な開裂工程の概要図を示す。
【図２１】  図２１は、本発明に従った５個の質量ラベルのセットを使用した二次元質量分析における選択手順の概要図を示す。
【図２２】  図２２は、本発明に従った重水素化された質量ラベルを示す。
【図２３】  図２３は、本発明に従ったさらなる重水素化質量ラベルを示す。
【図２４】  図２４は、各々の試料が図２３に示す式を有するラベルの１つに結合されている、配列Ｈ2Ｎ−ｇｌｙ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ＣＯＯＨを有するペプチドの２つの試料についての理論上のスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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