(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
N1,N12-ジアセチルスペルミンを含む早期癌マーカー。
【請求項２】
N1,N12-ジアセチルスペルミンに対する抗体と生体試料とを反応させることを特徴とする早期癌の検出方法。
【請求項３】
N1,N12-ジアセチルスペルミンに対する抗体と生体試料とを反応させてN1,N12-ジアセチルスペルミンを検出し、得られる検出結果を指標として早期癌の有無を評価する方法。
【請求項４】
生体試料が尿である請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
癌が尿路悪性腫瘍、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、子宮頸癌、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンを含む腫瘍マーカー、該腫瘍マーカーを用いた腫瘍の状態の評価方法、ジアセチルスペルミンに対する抗体、該抗体を用いた腫瘍の検出方法、及び腫瘍の検出用キットに関する。
【背景技術】  ポリアミンは２個以上のアミノ基をもつアルキルアミンの総称である。ヒトの体内には、プトレッシン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ２）、カダベリン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）５ＮＨ２）、スペルミジン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２）及びスペルミン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２）の４種類とそれらのアセチル体が存在する。
比較的近年になって、わずかな量ではあるがＮ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジン（以下「ＤｉＡｃＳｐｄ」という）、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミン（以下「ＤｉＡｃＳｐｍ」という）という２種類のジアセチルポリアミンが尿中に排泄されていることが見いだされた。健常者の尿中では、これらの成分はそれぞれ総ポリアミンの１．４％、０．６％を占めるにすぎないが、癌患者においては、他のポリアミン成分と比較して増加の割合が際だって高く、また、そのほかにも腫瘍マーカーとしての特性を示す物質であることが示されてきた（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２１，３１７−３１９（１９９５）；Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２３，５３９−５４５（１９９７））。
ＤｉＡｃＳｐｄ、ＤｉＡｃＳｐｍは、当初はＨＰＬＣによる分画測定系と酵素法による検出系を組み合わせた方法（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１０７−１１２（１９９５））によって定量されたが、その後簡便な測定法の開発が進められ、特に、ＤｉＡｃＳｐｍの測定に関しては、最近、特異的抗体を利用したＥＬＩＳＡ法が開発された（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））。しかし、ＥＬＩＳＡ測定系のキット化はまだ達成されていない。
また、ＤｉＡｃＳｐｍの測定に関して、ＤｉＡｃＳｐｍをイムノアッセイにより測定する手法が開発されているが（特開平１１−７５８３９号公報、特開２０００−７４９１７号公報）、さらに測定感度及び交差反応性を改良する余地がある。
ポリアミンの代謝が細胞増殖と関連して活性化されることはよく知られている。事実、種々の癌組織で正常組織と比較してポリアミン含量が増加する傾向がある。これらはいずれも、活発に増殖する組織に多量に含まれ、癌患者の尿中に健常者と比較して多量に排泄されることから、腫瘍マーカーとして位置づけられている。酵素的定量法による総ポリアミン含量測定キットとして、尿中のアセチル体と遊離ポリアミンを区別せず、また、４種類のポリアミンの違いも区別せずに、簡単に測定することができるキットが市販されており（ラボサーチポリアミンオート；（株）エイアイティー）、このキットは臨床検査法の一つとして利用されている。しかし、尿中総ポリアミンに関しては、悪性腫瘍患者の中に偽陰性例が相当数認められること、また、悪性腫瘍以外にも炎症性疾患、心筋梗塞、肝硬変、創傷治癒過程など、種々の病態に関連して有意に上昇することが明らかになり、悪性腫瘍に特異的なマーカーであるとは評価できないと考えられている（久保田俊一郎：日本臨床，５３，増刊号，ｐｐ．５０１−５０５（１９９５））。これに対し、総ポリアミンについて指摘されてきた問題点のいくつかは、ジアセチルポリアミン（ＤｉＡｃＳｐｄおよびＤｉＡｃＳｐｍ）を個別に測定することによって回避できることが明らかにされつつある（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２１，３１７−３１９（１９９５））。
【発明の開示】
本発明は、腫瘍マーカーとしてのＤｉＡｃＳｐｍを提供することを目的とする。また、本発明はＤｉＡｃＳｐｍの類似物質との交差反応性が極めて小さく、かつ微量のＤｉＡｃＳｐｍと特異的に結合する抗体を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＤｉＡｃＳｐｍが腫瘍マーカーとして有用である点を見出し、また、ＤｉＡｃＳｐｍ類似物質であるその他の尿中ポリアミンには交差反応せず、ＤｉＡｃＳｐｍに対してのみ特異的に反応する抗体を作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＤｉＡｃＳｐｍを含む腫瘍マーカー。
（２）ＤｉＡｃＳｐｍに対する抗体と生体試料とを反応させてＤｉＡｃＳｐｍを検出し、得られる検出結果を指標として腫瘍の状態を評価する方法。
上記方法において、生体試料としては尿が挙げられる。また、腫瘍としては例えば尿路悪性腫瘍、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、子宮頸癌、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。腫瘍の状態は、癌の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無からなる群から選ばれる少なくとも１つである。
本発明においては、早期癌（例えば大腸癌の場合はＳｔａｇｅ０〜Ｉ、乳癌の場合はＳｔａｇｅＩ〜ＩＩ）を評価することが可能である。
（３）以下の（ａ）及び（ｂ）の性質の少なくとも１つを有する、ＤｉＡｃＳｐｍに対する抗体。
（ａ）Ｎ１−ＡｃＳｐｄとの交差反応性：０．１％以下
（ｂ）尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和：５％以下
上記抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が挙げられる。
（４）上記抗体と生体試料（例えば尿）とを反応させることを特徴とするＤｉＡｃＳｐｍの検出方法。
（５）上記抗体と生体試料（例えば尿）とを反応させることを特徴とする腫瘍の検出方法。癌としては、尿路悪性腫瘍、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、子宮頸癌、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。本発明においては、早期癌（例えば大腸癌の場合はＳｔａｇｅ０〜Ｉ、乳癌の場合はＳｔａｇｅＩ〜ＩＩ）を検出することが可能である。
（６）Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンに対する抗体を含む、腫瘍の検出用キット。
本発明のキットに使用される抗体としては、例えば以下の（ａ）及び（ｂ）の性質の少なくとも１つを有するものが挙げられる。
（ａ）Ｎ１−ＡｃＳｐｄとの交差反応性：０．１％以下
（ｂ）尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和：５％以下
抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
また、検出の対象となる腫瘍としては、例えば尿路悪性腫瘍、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、子宮頸癌、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
さらに、本発明のキットは、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの性質を有するものである。
（ａ）最低検出実測値：９．０６ｎＭ
（ｂ）同時再現性：ＣＶ＝１０％以下
（ｃ）測定日間再現性：ＣＶ＝１０％以下
【図面の簡単な説明】  図１は、ポリアミンの尿中排泄量（基準値に対する比）を示す図である。
図２は、ポリアミンとそのモノおよびジアセチル体を示す図である。
図３は、段階的親和性精製の工程を示す図である。
図４は、抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体の交差反応性を示す図である。
図５は、希釈性試験の結果を示す図である。
図６は、希釈性試験の結果を示す図である。
図７は、希釈性試験の結果を示す図である。
図８は、ＨＰＬＣとの相関を示す図である。
図９は、大腸癌および乳癌の検出結果を示す図である。
図１０は、尿中ＤｉＡｃＳｐｍのカットオフ値を示す図である。
図１１は、膵・胆道疾患と尿中ＤｉＡｃＳｐｍの量との関係を示す図である。
図１２は、良・悪性疾患における腫瘍マーカーの陽性率の関係を示す図である。
図１３は、悪性腫瘍再発に対する腫瘍マーカーの陽性率を示す図である。
図１４は、膵・胆道癌のステージと尿中又は血清中マーカーとの関係を示す図である。
図１５は、膵・胆道癌のステージと尿中ＤｉＡｃＳｐｍ濃度との関係を示す図である。
図１６は、脳原発悪性リンパ腫患者の病勢と治療効果を反映する尿中ＤｉＡｃＳｐｍレベルの経時変化を示す図である。
図１７は、脳原発悪性リンパ腫患者の病勢と治療効果を反映する尿中ＤｉＡｃＳｐｍレベルの経時変化を示す図である。
図１８は、星状細胞腫患者の病勢と治療効果を反映する尿中ＤｉＡｃＳｐｍレベルの経時変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＤｉＡｃＳｐｍを腫瘍マーカーとして使用することを特徴とするものである。また、本発明は、ＤｉＡｃＳｐｍ類似物質である、ＤｉＡｃＳｐｍ以外の尿中ポリアミン（Ｎ１−ＡｃＳｐｄ、Ｎ８−ＡｃＳｐｄ、Ｎ１，Ｎ８−ＤｉＡｃＳｐｄ、ＡｃＳｐｍ等：表１参照）には反応せず、ＤｉＡｃＳｐｍに対してのみ特異的な反応を示す抗体に関する。
本発明の抗体は、（ｉ）ＤｉＡｃＳｐｍの類似物質として尿中に約３０倍多く存在するＮ１−ＡｃＳｐｄとの交差反応性が０．１％以下、又は（ｉｉ）尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和が５％以下であるか、あるいはこれらの両者の性質を有するものである。ここで、上記（ｉ）に記載の数値は、抗体の性質を表すときの数値であり、上記（ｉｉ）に記載の数値は、交差反応性そのものに、尿中のａｂｕｎｄａｎｃｅを掛け合わせた数値であって、実際にＤｉＡｃＳｐｍの定量がこれらの類似物質でどれくらい妨害されるかという指標となる数値を意味する。
１．尿中ポリアミン
図１は、尿中ポリアミン量をＨＰＬＣによって分析・定量し、成分ごとに整理した結果を健常者、泌尿器良性疾患患者、尿路悪性腫瘍（前立腺癌、腎癌、精巣腫瘍など）患者の３群に分類した結果である。尿中ポリアミン量は、通常、随時尿についての測定値のクレアチニン補正値として表示される。ここでは、そのようにして測定した各成分測定値の健常者平均値±２Ｓ．Ｄ．を基準値として、各成分の基準値に対する比をプロットしてある。例えば、ＤｉＡｃＳｐｄ、ＤｉＡｃＳｐｍの場合、健常者レベルとしてそれぞれ０．３０±０．１１μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、０．１５±０．０５μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅの値を得ている。そして、これらの値に基づき、ＤｉＡｃＳｐｄ，０．５２μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ；ＤｉＡｃＳｐｍ，０．２５μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅを基準値と考えている。この図に見るとおり、アセチルプトレッシン（ＡｃＰｕｔ）、Ｎ１−およびＮ８−（モノ）アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳｐｄ，Ｎ８−ＡｃＳｐｄ；これらは尿中にもっとも多量に見いだされる主要成分である）並びに総ポリアミンは、癌患者でも高値を示さない偽陰性例が多く、偽陽性を示す良性疾患の患者と区別がつかないケースもまた多い。これに対して、ＤｉＡｃＳｐｄ、ＤｉＡｃＳｐｍは癌患者で高値を示す患者の割合が高い。特にＤｉＡｃＳｐｍには、偽陰性率が低く、異常を検出できる割合が非常に高いという大きな特徴がある。また、ＤｉＡｃＳｐｄは、良性疾患患者ではほとんど増加せず、偽陽性率がきわめて低いという点が特徴である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２１，３１７−３１９（１９９５））。尿路悪性腫瘍だけではなく、大腸癌、乳癌でも、患者の尿中ＤｉＡｃＳｐｍは高い頻度で上昇する。
このことは、ジアセチルポリアミンを簡単、正確に測定する方法を開発することができれば、新規の腫瘍マーカーとして癌診療の臨床において、大きな需要が見込まれることを示している。
表１に健常者の尿中に含まれる各種のポリアミン成分（ジアセチルポリアミン及びその類似物質）についての分析結果を示す。
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ヒト尿中ポリアミンの主成分は各種のモノアセチルポリアミンである。ＤｉＡｃＳｐｍは明らかに微量成分に属し、その量は総ポリアミンの０．６％を占めるにすぎない。尿中ポリアミンの主成分の中にはＤｉＡｃＳｐｍときわめてよく似た構造をもつモノアセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳｐｄ、Ｎ８−ＡｃＳｐｄ）があり（図２）、これらの含量は通常ＤｉＡｃＳｐｍの２５−３０倍量に達する。構造上の類似性を考慮すると、抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体はこれらのモノアセチルスペルミジンとも交差反応性を示すことに対して、十分の配慮が必要であると考えられる。ＤｉＡｃＳｐｍ量に対して約３０倍の量のモノアセチルスペルミジンが妨害物質として存在する尿中において、その妨害を避けてＤｉＡｃＳｐｍを正確に定量するためには、目的の物質と妨害物質を低い交差反応性で厳密に識別する特異抗体が必要である。従って、そのような特異性を示し、さらに、平均的な健常者の尿中ＤｉＡｃＳｐｍ濃度である０．１μＭ程度の濃度のＤｉＡｃＳｐｍを正確に定量できる抗体を作製することが要求されている。
２．腫瘍マーカー
本発明のＤｉＡｃＳｐｍを腫瘍マーカーとして使用するには、測定サンプルに含まれるＤｉＡｃＳｐｍを高感度に検出することが重要である。その検出手段として、本発明においてはＤｉＡｃＳｐｍに対する抗体を採用することができる。
ＤｉＡｃＳｐｍ特異的抗体を精製する方法として、ウシ血清アルブミンのＡｃ−Ｓｐｅｒｍｉｎｅ誘導体を用いてウサギを免疫し、得られた抗血清からＤｉＡｃＳｐｍ特異的抗体を精製する方法が知られている（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））。本発明においては、その方法に準拠して新たにＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体を作製し、その抗体を用いたＤｉＡｃＳｐｍ測定キットを作製するものである。
抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体のようなハプテン抗体を作製する場合、ハプテン−担体結合物の分子構造のデザインは、特異抗体の性能に対して非常に大きな影響を与える。グルタルアルデヒドによってＢＳＡに結合させたＳｐｅｒｍｉｎｅをハプテンとして用いて作った抗体では、競合的ＥＬＩＳＡにおけるＳｐｅｒｍｉｎｅやＳｐｅｒｍｉｄｉｎｅに対する反応性がアセチルポリアミンに対する反応性よりもむしろ高いことが報告されている。従って、ハプテン−担体結合物の中にアシルアミド結合が存在することは、アセチルポリアミンと優先的に反応する抗体を作る上で不可欠である。
ポリクローナル抗血清がＮ１−ＡｃＳｐｄと約５−６％の交差反応性を示す場合は、直ちにＤｉＡｃＳｐｍ定量の目的でそのような抗血清を利用することはできず、何らかの方法で抗血清中に含まれている高度特異的抗体成分を精製する必要がある。その精製手法として、親和性樹脂のリガンドの分子構造デザインが重要であると考えられる。すなわち、免疫抗原のデザインと同様、ポリアミンリガンドと樹脂の結合部にアシルアミド結合を形成させ、アセチルポリアミン類似の構造をつくることが有効である。例えば、Ｎ８−ＡｃＳｐｄ、Ｓｐｄ、ＡｃＳｐｍを用いてカルボキシトヨパールを誘導体化したときには、それぞれ、ＤｉＡｃＳｐｄ、Ｎ１−またはＮ８−ＡｃＳｐｄ、ＤｉＡｃＳｐｍによく似た構造の親和性リガンドをもつ親和性樹脂が作られる。この親和性樹脂を用いて、モノアセチルスペルミジンおよびＤｉＡｃＳｐｄ、ＤｉＡｃＳｐｍに対する親和性の違いに基づいて抗体を精製することにより、ＤｉＡｃＳｐｍに対してきわめて特異性の高い抗体を得ることができる（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））。
尿中のジアセチルポリアミンを定量するために必要な高度の特異性を持った抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体を粗血清中の抗体の中から精製することにより、抗体の力価は当然かなり減少する。しかしながら、上記抗血清の場合、この精製抗体の力価はまだ十分に高く、標準的な競合的酵素免疫測定法によるＤｉＡｃＳｐｍの定量に用いるには十分であると考えられる。
上述のとおり、モノアセチルスペルミジンに代表される類似構造物質が多量に存在する尿検体中に微量に含まれるＤｉＡｃＳｐｍを、類似構造物質による妨害を避けて酵素免疫法によって正確に定量するためには、ＤｉＡｃＳｐｍに対して高度の特異性を示す抗体を得ることが測定キットの確立のために最も重要である。本発明は、ＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体の開発、および尿中ＤｉＡｃＳｐｍ測定キットの開発の技術を確立し、ＤｉＡｃＳｐｍを腫瘍マーカーとして活用する方法を提供するものである。
３．抗原の調製
ＤｉＡｃＳｐｍは、低分子量のアルキルアミンであるため、これを直接ウサギに免疫してもＤｉＡｃＳｐｍに特異的な抗体を得ることはできない。そこで、キャリア蛋白質である牛血清アルブミンとＡｃＳｐｍをアシルアミド結合させ、ＤｉＡｃＳｐｍ類似構造物を側鎖として多数持つ免疫抗原を作製する。
本発明において免疫抗原は、川喜田らの方法に準じて作製することができる（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））。まずキャリア蛋白質であるＢＳＡとＳ−アセチルメルカプト琥珀酸を反応させ、反応生成物であるＳ−アセチルメルカプト琥珀酸（ＡＭＳ）−ＢＳＡ複合体を作製する。さらにＡＭＳ−ＢＳＡに二価性架橋試薬であるＧＭＢＳ（Ｎ−（４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を介して、ＡｃＳｐｍをアシルアミド結合させ、免疫抗原ＡｃＳｐｍ−ＧＭＢ−ＢＳＡを作製する。
４．ＤｉＡｃＳｐｍに対する抗体の作製
本発明において「抗体」とは、抗原であるＤｉＡｃＳｐｍに結合し得る抗体分子全体（ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい）またはその断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）もしくは、抗原抗体反応活性を有する活性フラグメント、具体的には、Ｆａｂ、Ｆｖ、組替えＦｖ体、１本鎖Ｆｖを意味する。
本発明の抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体および活性フラグメント）は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である。
以下、抗体作製について、実験および実施例を具体的に説明するが、これらに限定されるものではない。
（１）ＤｉＡｃＳｐｍに対するポリクローナル抗体の作製
上記の通り作製した抗原を哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定されるものではなく、例えばラット、マウス、ウサギなどが挙げられるが、ウサギが好ましい。
抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは５〜２ｍｇであり、アジュバントを用いるときは５〜２ｍｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
その後は、ＢＳＡなどを用い、これらタンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。前述の通り、ＤｉＡｃＳｐｍはＤｉＡｃＳｐｄ、Ｓｐｄ、Ｓｐｍなどの混合物中に微量存在するものである。そこで、本発明においては、ＤｉＡｃＳｐｍに反応する抗体をさらに高精度に選択する。
すなわち、ＤｉＡｃＳｐｍに強い反応性を示す抗体であって、（ｉ）Ｎ１−ＡｃＳｐｄとの交差反応性が０．１％以下、及び／又は（ｉｉ）尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和が５％以下（好ましくは３％以下）であるものを選択する。
（２）ＤｉＡｃＳｐｍに対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製した抗原を、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは５００〜２００μｇであり、アジュバントを用いるときは５００〜２００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０６〜１×１０７個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０５〜２×１０６個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ＤｉＡｃＳｐｍに反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。この場合も、ポリクローナル抗体の項で説明したのと同様に、ＤｉＡｃＳｐｍに強い反応性を示す抗体であって、（ｉ）Ｎ１−ＡｃＳｐｄとの交差反応性が０．１％以下、及び／又は（ｉｉ）尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和が５％以下（好ましくは３％以下）である抗体を産生するハイブリドーマを選択し、樹立する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。
上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
５．腫瘍の検出方法
ＤｉＡｃＳｐｍは、癌の臨床マーカー（腫瘍マーカー）として利用することができるため、本発明の抗体を生体試料と反応させ、生体試料中のＤｉＡｃＳｐｍを測定することにより、その測定結果を指標として腫瘍を検出することができる。ＤｉＡｃＳｐｍの測定は、一般に行われるハプテン免疫測定法として知られている方法のいずれの方法によっても行うことができ、特に制限されない。腫瘍としては、以下に示すものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）口腔、鼻、咽頭
舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫（メラノーマ）、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌
（２）脳神経系
神経膠腫、髄膜腫
（３）甲状腺
甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌
（４）呼吸器
肺癌（扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド）
（５）乳房
乳癌、乳房ページェット病、乳房肉腫
（６）血液
急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫（リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病）、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症
（７）消化器
食道癌、胃癌、胃・腸悪性リンパ腫、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌
（８）女性性器
子宮癌、卵巣癌、子宮肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ肉腫、細網肉腫）
（９）泌尿器
尿路悪性腫瘍（前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、尿道癌）
（１０）運動器
横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫
（１１）皮膚
皮膚癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫
本発明において検出又は評価の対象となる癌の種類は、上記のうち１種類でもよく、２種類以上が併発したものでもよい。好ましくは、大腸癌、尿路悪性腫瘍（例えば前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍）、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、肝臓癌、子宮頸癌、脳腫瘍、骨髄性白血病及び悪性リンパ腫から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
後述のように、本抗体を用いた腫瘍の検出方法の実施例を示すが、本抗体の使用について、特に規定するものではない。
癌が疑われる患者、あるいは健康診断受診者から生体試料を採取し、ＤｉＡｃＳｐｍ測定試料を調製する。生体試料としては、血液、尿、組織等が挙げられるが、取り扱いが容易で患者への負担が少ない点で尿が好ましい。
次いで、前記測定試料と前記抗体とを反応させる。ＤｉＡｃＳｐｍの測定は、一般に行われるＥＬＩＳＡにより行うことができる。まず、マイクロプレートに抗原（ＤｉＡｃＳｐｍ）をコートしておく。一方、あらかじめ生体試料及び標準液中のＤｉＡｃＳｐｍと抗ＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体を反応させた後、この反応液をプレートにまく。未反応のまま残った抗体はプレート上のＤｉＡｃＳｐｍと結合する。そして、２次抗体であるＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体をプレートに添加して反応させる。最後に、ＨＲＰにより触媒される発色反応により生体試料中のＤｉＡｃＳｐｍを定量する。
６．腫瘍の評価
前記５に示す検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断する。検出結果が所定の基準値を超えるものをＤｉＡｃＳｐｍ陽性、所定の基準値以下のものをＤｉＡｃＳｐｍ陰性とし、陽性の場合には、癌を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。
腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、癌発症の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無等が挙げられる。上記評価に際し、これらの腫瘍の状態は１つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。癌の有無を評価するには、癌に罹患しているか否かを判断する。癌の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価したり、いわゆる早期癌、進行癌を分類して評価することも可能である。癌の転移は、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。再発は、間欠期又は寛解の後に再び癌が現れたか否かにより評価する。
本発明においては、例えば大腸癌の場合は、Ｓｔａｇｅ０及びＩ（早期癌）であってもＳｔａｇｅＩＩ〜ＩＶ（進行癌）と同様に癌を検出し、評価することができる。また、乳癌の場合は、ＳｔａｇｅＩ及びＩＩ（早期癌）であってもＳｔａｇｅＩＩＩ〜ＩＶ（進行癌）と同様に癌を検出し、評価することができる。
７．本発明の抗体を含む腫瘍検出用試薬、キット
本発明においては、ＤｉＡｃＳｐｍに対する抗体を腫瘍検出用試薬として使用することができる。
従来から一般生化学検査としてポリアミン類を測定する場合は、尿中のポリアミン類は類似構造体として数種類がひとまとめで測定され、類似構造体の各々と各種の病態との関連の検討は皆無に等しかった。そこで、ポリアミン測定法の中でも、尿中のポリアミン量を区別して測定する方法が確立され、特にポリアミンの一種であるＤｉＡｃＳｐｍが前立腺癌又は大腸癌の発症時、及び治療後の再発時に非常に高値になることを確認した。このことは、ジアセチルポリアミンを簡便かつ正確に測定する方法を開発することができれば、新規の腫瘍マーカーとして癌診療の臨床において、大きな需要が見込まれることを示している。
従来の測定方法では、一般的に、安価な測定機器での多検体処理を可能とする免疫学的手法が用いられており、すでにポリクローナル抗体を用いた簡易測定法が知られている（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））。しかし測定系のもっとも重要な部品であるＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体の大量製造を含め、ＥＬＩＳＡ測定系のキット化はまだ達成されていない。
本発明において、ＤｉＡｃＳｐｍ測定キットのシステムとして、本発明者は、川喜田らが作製した簡易な免疫学的測定法をモデルにし、ＤｉＡｃＳｐｍ抗体を用いた、競合ＥＬＩＳＡ測定法による尿中ＤｉＡｃＳｐｍの測定系を考えた。固相化抗原として、モノアセチルスペルミンを配し、アシルアミド結合によりＤｉＡｃＳｐｍ類似構造体をもつもの（ＡｃＳｐｍ−ＨＭＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用することができる。この抗原は、任意の水溶性ポリペプチドに、二価性架橋試薬（ＨＭＣＳ）を用いてアシルアミド結合させるものである（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８）。
本発明のＤｉＡｃＳｐｍ測定キットは、ＤｉＡｃＳｐｍを高感度に測定できることが必要であるが、癌診療の臨床において用いるためには、キット性能としての再現性がさらに要求される。このような前提を踏まえ、本発明においては、診断マーカーとしてのＤｉＡｃＳｐｍ測定系の確立を目指した。
本発明のＤｉＡｃＳｐｍ測定ＥＬＩＳＡキットは、固相化抗原濃度を低濃度側に調整することで、スタンダード領域を４．５３〜１４５ｎＭに設定することができる。固相化抗原濃度としては、１〜０．１μｇ／ｍＬ、好ましくは０．０７μｇ／ｍＬである。その結果、尿中ＤｉＡｃＳｐｍを測定するのに、十分な感度及び測定精度を達成することができる。
測定精度とは、同一の試料を複数の試験管又はウェルに分けて１回のアッセイを行ったときに、それぞれの測定値がどの程度ばらつくかを示す指標となるものであり、統計学的には、変動係数（ＣＶ：Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）、すなわち平均値に対する標準偏差の割合（％）として表現される。本発明においては、この変動係数（ＣＶ）を再現性という。再現性は１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。
本発明のキットの性能は、最低検出実測値：９．０６ｎＭ、検体測定検出感度：３６．２ｎＭ（９．０６ｎＭ×４）である。また、同時再現性は１０％以下、好ましくは５％前後であり、日間再現性は１０％以下、好ましくは約８〜１０％である。いずれの再現性もＣＶ＝１０％以下である。共存物質の影響については、抱合型ビリルビン、グルコース、ヘモグロビン、アスコルビン酸において、ＤｉＡｃＳｐｍ測定に影響は無い。
本発明のキットには、本発明の抗体のほかに、抗原固相化マイクロプレート、ＤｉＡｃＳｐｍ標準品（ＳＴＤ）、抗体希釈液、ＨＲＰ標識−抗ウサギＩｇＧ抗体、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液などを適宜選択して含めることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞抗体の作製
（１）免疫抗原の作製および免疫
本実施例では、抗ＤｉＡｃＳｐｍポリクローナル抗体の作製において、親和性精製によるポリクローナル抗体中の特異的成分の抽出という手法の実用化を図るため、抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体製造の効率化を検討する。親和性精製によりポリクローナル抗体中の特異的成分を抽出するという手法の実用化を図るためには、高度の特異性を示す抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体が再現的に得られるかどうかを明らかにすること、及び同一の抗原で免疫した際にそのような抗体を産生する哺乳動物がどのような頻度で得られるかを見極めることがきわめて重要である。そこで、測定キットの工業製造に向け抗体製造の再現性および効率化を検討する上で、以下の３点に注目した。
（ａ）目的抗原が低分子であるため抗体価が上昇する確率が低い
（ｂ）免疫するウサギの種により抗体価上昇率が異なる
（ｃ）免疫抗原のＬｏｔにより抗体価上昇率が異なる
上記（ａ）の条件を検討するため、作成した免疫抗原Ｌｏｔ１を日本白色種ウサギ（♂：規格．．．２．５〜３．０ｋｇ、以下略：ＪＰＷ）８羽に同じ条件下で免疫を行い、それぞれの個体間で抗体価上昇率が異なるか調べた。
上記（ｂ）の条件を検討するため、免疫する動物種として、ニュージーランド白色
種ウサギ（♂：規格．．．２．５〜３．０ｋｇ、以下略：ＮＺＷ）９羽と日本白色種ウサギ（♂：規格．．．２．５〜３．０ｋｇ、以下略：ＪＰＷ）１０羽の２種を用い、種間差により抗体価の上昇率が異なるか調べた。
上記（ｃ）の条件を検討するため、それぞれＬｏｔの異なる免疫抗原ＡｃＳｐｍ−ＧＭＢ−ＢＳＡ５種を新しく作製し、免疫抗原と免疫した固体の抗体価上昇率が異なるか調べた。
免疫抗原は、川喜田らの方法に準じて以下の通り作製した（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））。ＤｉＡｃＳｐｍは、低分子量のアルキルアミンであり、これを直接ウサギに免疫してもＤｉＡｃＳｐｍに特異的な抗体を得ることはできない。そこで、キャリア蛋白質である牛血清アルブミン（以下略：ＢＳＡ）とＡｃＳｐｍをアシルアミド結合させ、ＤｉＡｃＳｐｍ類似構造物を側鎖として多数持つ免疫抗原ＡｃＳｐｍ−ＧＭＢ−ＢＳＡを作製した。まずキャリア蛋白質となるＢＳＡとＳ−アセチルメルカプト琥珀酸を反応させ、反応生成物であるＳ−アセチルメルカプト琥珀酸−ＢＳＡ（以下略：ＡＭＳ−ＢＳＡ）を作製した。さらにＡＭＳ−ＢＳＡに二価性架橋試薬であるＧＭＢＳを介して、ＡｃＳｐｍをアシルアミド結合させ、免疫抗原ＡｃＳｐｍ−ＧＭＢ−ＢＳＡを作製した。
免疫は、免疫抗原とアジュバント（初回免疫：コンプリートアジュバント、追加免疫：インコンプリートアジュバント）を等量混和したエマルジョンを背部皮下に免疫する方法で行った。免疫は２週間おきに、初回免疫１ｍｇ／羽、追加免疫０．３ｍｇ／羽の条件下で行った。また、３回目免疫後７日目に部分採血を行い、ＥＬＩＳＡ法にて抗血清中の抗体価をチェックした（表２）。
抗体価は、川喜田らが得た抗血清を基準とし、抗血清希釈倍率２７，０００倍での川喜田らの抗血清の反応性を１００とした時の、それぞれのウサギ抗血清の反応性を百分率で表した。
その結果、抗原Ｌｏｔ  Ｎｏ．１を免疫したＪＰＷ１〜ＪＰＷ８およびＮＺＷ１では抗体価の上昇は、最大でＪＰＷ７における抗体価１２．５％と低い結果であった。一方、抗原Ｌｏｔ  Ｎｏ．２を免疫したＪＰＷ９とＮＺＷ２は６９．１％および８８．１％と両種ともに高い抗体価を得ることができた。
この実験により、抗原Ｌｏｔによる抗体価の上昇の差が認められた。しかし、部分採血による抗体価のチェックではウサギの個体間もしくは種間差による抗体価上昇の著しい差は認められなかった。
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（２）抗ＤｉＡｃＳｐｍポリクローナル抗体の精製
得られた１９羽の抗血清の内、高い抗体価を示した３種の抗ＤｉＡｃＳｐｍポリクローナル抗血清ＪＰＷ９、ＮＺＷ２、ＮＺＷ９より、尿中ＤｉＡｃＳｐｍ測定系に使用できる精度の特異抗体が得られるか、段階的な親和性精製を行い検討した。親和性精製については、川喜田らの方法に準じて（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））、ＡｃＳｐｍおよびＮ８−ＡｃＳｐｄでカルボキシトヨパールを誘導化したＤｉＡｃＳｐｍカラム、ＤｉＡｃＳｐｄカラムを用いて、段階的な親和性精製を行った（図３）。
その結果、ＮＺＷ２の抗血清は、ＤｉＡｃＳｐｍの類似物質として尿中に約３０倍多く存在するＮ１−ＡｃＳｐｄとの交差反応性が０．１％以下となる抗体であった。また、尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和は２．９％であり、交差性５％以下を達成することができた（図４、表３）。
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今回新たに作製した免疫抗原ＡｃＳｐｍ−ＧＭＢ−ＢＳＡをウサギに免疫することで、尿中ＤｉＡｃＳｐｍ測定に使用できる特異性を備えた抗ＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体を作製することができた。これにより川喜田らが抗ＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体を得るために考案した、ＤｉＡｃＳｐｍ類似構造体を側鎖として持つ、免疫抗原の有効性が証明された。
＜実施例２＞キットを用いたＤｉＡｃＳｐｍの測定
１．測定部品の確立およびＥＬＩＳＡ測定系の基礎データ
測定系としては、川喜田らの方法に準じて（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４，２３１−２３６（１９９８））、固相化抗原ＡｃＳｐｍ−ＨＭＣ−ｐｅｐｔｉｄｅを用いた競合ＥＬＩＳＡ法を行った。１次抗体は、実施例１で作製した抗ＤｉＡｃＳｐｍ特異抗体を用い、２次抗体として市販のヤギ由来ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）を用いた。固相化抗原濃度は、尿中ＤｉＡｃＳｐｍ正常値がおよそ１００ｎＭ程度であることから、スタンダード領域６．２５ｎＭ〜２００ｎＭを想定し、この領域において最も理想的な競合曲線を描く固相化濃度０．０７μｇ／ｍＬを求めた。抗ＤｉＡｃＳｐｍ抗体濃度については、固相化条件０．０７μｇ／ｍＬにおいて、最大反応効率の５０％となる条件で定めた結果、０．０２μｇ／ｍＬとなった。
２次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧについては、希釈倍数２０００倍から５０００倍の間で検討を行ったところ、希釈倍数２０００倍が最も感度がよかった。よって、ＨＲＰ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ希釈率２０００倍を２次抗体の条件とした。
また、ＤｉＡｃＳｐｍ測定ＥＬＩＳＡの精密度および性能を評価するため、異なる２種の管理検体（検体Ａ，検体Ｂとする）を用いた日内再現性・日間再現性をそれぞれＮ＝２０で評価した。また、添加回収試験では、健常者尿に既知濃度のＤｉＡｃＳｐｍ標準品を添加し、ＥＬＩＳＡ測定法にて回収率をもとめた。同じく、キット性能評価のため、ＤｉＡｃＳｐｍ濃度の異なる３種の尿検体で希釈性試験を実施した。
尿中ＤｉＡｃＳｐｍを測定する方法としてすでに確立されているＨＰＬＣと本キットを比較するため、Ｎ＝３０の検体について相関を見た。また、尿中に存在するＤｉＡｃＳｐｍ以外の共存物質である抱合型ビリルビン、グルコース、ヘモグロビン、アスコルビン酸が本測定系に及ぼす影響を確認した。
２．結果
本発明のキットに関するアッセイ系の性能として、スタンダードカーブは６．２５〜２００ｎＭの範囲で直線性が得られており、日内再現性、日間再現性ともにＣＶ＝１０％以下と良好であった。希釈性試験においては、ＤｉＡｃＳｐｍ濃度の異なる３種の尿について、それぞれ段階希釈した検体を測定した結果、いずれの尿検体においても良好な希釈曲線が得られた（図５〜７）。
添加回収試験では、尿の希釈は４倍以上で個体差なく添加回収率９６．３〜１０８％と良好な結果が得られたため、尿の希釈は、４倍以上から行うこととした。
本発明のキットの性能は、最低検出実測値：１２．５ｎＭ、検体測定検出感度：５０ｎＭ（１２．５ｎＭ×４）であった。同時再現性は、検体ＡがＣＶ＝４．８７％、検体Ｂが５．２０％であり、日間再現性は検体ＡがＣＶ＝７．５３％、検体Ｂが９．４６％であった。
従って、いずれの検体についても、再現性はそれぞれ目標値のＣＶ＝１０％以下であることを確認した（表４）。共存物質の影響については、抱合型ビリルビン（１０ｍｇ／ｄＬ以下）、グルコース（１０００ｍｇ／ｄＬ以下）、ヘモグロビン（４００ｍｇ／ｄＬ以下）、アスコルビン酸（１００ｍｇ／ｄＬ以下）において、ＤｉＡｃＳｐｍ測定に影響の無いことを確認した。
また、ＤｉＡｃＳｐｍ測定ＥＬＩＳＡキットを評価するために、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとなるＨＰＬＣ測定法で測定された尿検体を、ＥＬＩＳＡキットで測定し、ＨＰＬＣ測定法と比較検討した。その結果、ＨＰＬＣとの相関はＹ（ｎＭ）＝１．０１Ｘ＋７３．２、Ｒ２＝０．９７８であり、大変良好な結果が得られた。これらの結果より、本発明のＤｉＡｃＳｐｍ測定キットが、尿中ＤｉＡｃＳｐｍを高い精度で測定し得るものであることが示された。
今回得られた基礎データの詳細について表４及び図５〜８に示す。
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＜実施例３＞大腸癌の検出
大腸癌患者２５０例について、大腸癌の病期（大腸癌研究会：「大腸癌取り扱い規約」による）と尿中ＤｉＡｃＳｐｍ値（随時、尿中の濃度のクレアチニン補正値）との間の関係について検討した。ＤｉＡｃＳｐｍの値の基準値を０．２５μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（健常者平均＋２ＳＤ）とし、基準値を超えるものを陽性、基準値以下のものを陰性とした。その結果、２５０例中ＤｉＡｃＳｐｍ陽性例は１８５例（７４．０％）、ＣＥＡ陽性例は９４例（３７．６％）、ＣＡ−１９−９陽性例は３６例（１４．４％）であり（表５〜７）、ＤｉＡｃＳｐｍは既存の腫瘍マーカーと比較して著しく高い検出感度を示した。さらに、病理検査の所見に基づいて患者の病期と陽性率の関連について検討した結果、表５に示す通り、早期癌及び進行癌のいずれにおいても、尿中ＤｉＡｃＳｐｍは高い陽性率を示した。このことは、尿中ＤｉＡｃＳｐｍが、大腸癌患者の尿中で早期癌の段階においても高頻度で上昇することを示している。
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表５において、「ｓｔａｇｅ  ０」とは壁深達度がｍ、すなわち病巣が腸管粘膜層に限局するものであり、「ｓｔａｇｅ  Ｉ」とは壁深達度がｓｍ（粘膜下層）又はｍｐ（筋層）まで、かつ、ｎ０（リンパ節転移を示さない）腫瘍であることを意味する。「ｓｔａｇｅ  ０」及び「ｓｔａｇｅ  Ｉ」は早期癌に分類され、この段階で発見されれば全例において予後良好を期待することが臨床的に確立されている。
また、比較のため上記同一患者群について、大腸癌の病期と、現在実用に供されている血清ＣＥＡ値又は血清ＣＡ１９−９値との間の関係を検討した。ＣＥＡについては、その基準値を５ｎｇ／ｍｌとし、基準値を超えるものを陽性、基準値以下のものを陰性とした。血清ＣＡ１９−９ついては、その基準値を３７Ｕ／ｍｌとし、基準値を超えるものを陽性、基準値以下のものを陰性とした。
その結果、表６及び表７に示す通り、血清ＣＥＡ及び血清ＣＡ１９−９のいずれにおいても、早期癌ではＤｉＡｃＳｐｍの陽性率は低かった。
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早期大腸癌に対する尿中ＤｉＡｃＳｐｍの陽性率は約６０％であるのに対し、血清ＣＥＡ及び血清ＣＡ１９−９の陽性率はそれぞれ約１０％、約５〜８％であった。このことは、大腸癌診療の臨床において、現在実用に供されている既存腫瘍マーカーであるＣＥＡ及びＣＡ１９−９の早期大腸癌に対する陽性率と比較して、ＤｉＡｃＳｐｍは格段に優れていることを示すものである。したがって、尿中ジアセチルスペルミンを腫瘍マーカーとして利用し、本発明の抗体を用いてジアセチルスペルミンを検出することにより、大腸癌を現在より高感度に、しかも早期に検出することが可能となり、早期に治療を開始することによって完全治癒例の割合を増加させることができるため、大腸癌診療の臨床において大きな貢献をすることができる。
さらに、尿中ジアセチルスペルミンを健康診断項目の一つとして追加することによって、大腸癌を含む消化器癌の早期診断を現在よりも格段に高感度、高精度化することが可能である。
＜実施例４＞乳癌の検出
乳癌患者１７例について尿中ジアセチルスペルミン値を測定し、以下の結果を得た。ジアセチルスペルミン排泄量の基準値を０．２５μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（健常者平均値＋２Ｓ．Ｄ．）とするとき、尿中ジアセチルスペルミン値は全例が基準値以上であった。特に、１７例中９名は基準値の２倍を超える値を示した（図９）。これは、乳癌の腫瘍マーカーとして多用されているＣＡ１５−３と比較しても高い陽性率を有しており、尿中ジアセチルスペルミンが、尿中ジアセチルスペルミンが乳癌を高感度に検出するための腫瘍マーカーとして有用であることを示している。
＜実施例５＞膵・胆道癌の検出
膵・胆道疾患の入院・外来通院患者１２５名を対象として、癌の検出を行った。但し、膵内分泌腫瘍、肝細胞癌、急性炎症（胆嚢炎・膵炎など）、術後早期（３ヶ月）の患者は対象から除外した。
対象患者は以下の通りである。
男性：７０例、女性：５５例、年齢：２８−８６歳（６３．５±１２．２）
このうち、良性疾患の術前又は術後の患者は５２例であり（コントロール）、悪性疾患の術前患者は２２例、悪性疾患の術後患者は５１例（そのうち１０例に再発あり）とした。
また、腺癌は３２例、腺腫例は８例であった。
ＥＬＩＳＡ法により、尿中ジアセチルスペルミン、血清ＣＥＡ（高感度、２．５ｎｇ／ｍｌ）及びＣＡ１９−９（高特異度、３７Ｕ／ｍｌ）を検出した。
そして、尿中ジアセチルスペルミンのカットオッフの設定、良悪性診断と尿・血清腫瘍マーカーとの関係、再発診断と尿・血清腫瘍マーカーとの関係、Ｓｔａｇｅと尿・血清腫瘍マーカーとの関係、切除・非切除と尿・血清腫瘍マーカーとの関係について、検討を行った。
結果を表８〜１１及び図１０〜１５に示す。
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上記表８〜１１、図１０〜１５に示す通り、膵・胆道癌に対して尿中ジアセチルスペルミンは、高感度な腫瘍マーカーといわれる血清ＣＡ１９−９とほぼ同程度の高い感度を示し、採血を必要とせず、臓器特異性のない“汎”腫瘍マーカーであるといえるそして、尿中ジアセチルスペルミンは、マススクリーニングや高危険群の検討に有用な腫瘍マーカーである。
また、比較的早期のＳｔａｇｅＩＩｂでも５０％に尿中ジアセチルスペルミンは陽性を示し、早期膵・胆道癌の発見にも有効であることが示された。
＜実施例６＞乳癌の病期別ジアセチルスペルミンの測定
本実施例では、乳癌患者８３例について、乳癌の病期と尿中ＤｉＡｃＳｐｍ値（随時、尿中の濃度のクレアチニン補正値）との間の関係について検討した。乳癌の場合、各病期とその内容は表１２の通りである。
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上記乳癌患者中「ｓｔａｇｅ  Ｉ」は１５例、「ｓｔａｇｅ  ＩＩ」は１５例、「ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ」は４例、「ｓｔａｇｅ  ＩＶ」は４７例であった。ＤｉＡｃＳｐｍの値の基準値を０．２５μｍｏｌ／ｇ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（健常者平均＋２ＳＤ）とし、基準値を超えるものを陽性、基準値以下のものを陰性とした。
結果を表１３に示す。
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同一患者群について、乳癌病期と血清ＣＥＡ値との間の関係を検討した。ＣＥＡの基準値を５ｎｇ／ｍｌとし、基準値を超えるものを陽性、基準値以下のものを陰性とした。
結果を表１４に示す。
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同一患者群について、乳癌病期と血清ＣＡ１５−３値の間の関係を検討した。ＣＡ１５−３の基準値を２３Ｕ／ｍｌとし、基準値を超えるものを陽性、基準値以下のものを陰性とした。
結果を表１５に示す。
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上記表１３〜１５に示す通り、早期癌及び進行癌のいずれのｓｔａｇｅにおいても、尿中ＤｉＡｃＳｐｍ値が乳癌患者の尿中で高い陽性率を示した。特に、「ｓｔａｇｅ  Ｉ」、「ｓｔａｇｅ  ＩＩ」で２０〜３５％の陽性率はＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）で検査したときの陽性率に匹敵する値である。得られた値について、比較的早期の段階（ｓｔａｇｅ  Ｉおよびｓｔａｇｅ  ＩＩを合わせた群）と進行癌の段階（ｓｔａｇｅ  ＩＩＩおよびｓｔａｇｅ  ＩＶを合わせた群）について、ＤｉＡｃＳｐｍ値、ＣＥＡ値およびＣＡ１５−３値について比較した。
結果を表１６に示した。
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表１６に示すとおり、比較的早期の段階における陽性率はそれぞれＤｉＡｃＳｐｍ値で２８．１％、ＣＥＡ値で３．１％、ＣＡ１５−３値で０％であった。そして、ＤｉＡｃＳｐｍ値とＣＥＡ値との間ではｐ＝０．００６４、ＤｉＡｃＳｐｍ値とＣＡ１５−３値との間ではｐ＝０．００１０であり、どちらも有意差が認められた。同様に、進行癌の段階における陽性率はそれぞれＤｉＡｃＳｐｍ値で８０．３％、ＣＥＡ値で５８．８％、ＣＡ１５−３値で６０．８％であった。そして、ＤｉＡｃＳｐｍ値とＣＥＡ値との間ではｐ＝０．０１８、ＤｉＡｃＳｐｍ値とＣＡ１５−３値との間ではｐ＝０．０３０であり、どちらも有意差が認められた。全体でみると、陽性率はＤｉＡｃＳｐｍ値で６０．２％であり、ＣＥＡ値及びＣＡ１５−３値は共に３７．３％であり、ＤｉＡｃＳｐｍ値とＣＥＡ値またはＣＡ１５−３値との間では、いずれもｐ＝０．００３２で有意差が認められた。したがって、臨床において現在使用されている既存の腫瘍マーカーであるＣＥＡ及びＣＡ１５−３と比較しても、ＤｉＡｃＳｐｍは格段に高感度で検出することが示された。
＜実施例７＞各種癌の検出
本実施例では、膵・胆道、肺、肝臓、子宮及び血液における癌の検出を行った。
カットオフ値は３２５（ｎｍｏｌ／ｇ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）と設定した。なお、膵臓癌、胆道癌については、実施例５とは別の被験サンプルについて測定した。
結果を表１７に示す。
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表１７に示すとおり、本発明のキットを用いることにより、大腸癌や乳癌だけでなく、肺癌、肝臓癌、子宮頸癌、骨髄性白血病（慢性、急性）においても高い陽性率で検出することができた。
＜実施例８＞各脳腫瘍の検出
本実施例では、各脳腫瘍における尿中ＤｉＡｃＳｐｍの陽性率を測定した。
結果を表１８に示す。
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転移性脳腫瘍の陽性率は、かなり高率であった。グリオーマではＧｒａｄｅが２、３、４と上がるにつれて、すなわち悪性度が上昇するにつれて陽性率も上昇した。また、このときのＤｉＡｃＳｐｍの値自体がかなり高値になった。
＜実施例９＞脳原発性悪性リンパ腫の検出
本実施例では、脳原発性悪性リンパ腫患者から採取した尿を用いてＤｉＡｃＳｐｍの検出を行ったものである。
（１）症例１（５６歳女性、脳原発悪性リンパ腫）
この症例は、脳原発悪性リンパ腫に対して、初期治療として全脳照射とメソトレキセート（ＭＴＸ）大量療法を施した患者である。ＤｉＡｃＳｐｍの測定開始時は、初発病巣は完全寛解（ＣＲ）の状態であったが、図１６の▲１▼及び▲２▼の時点において骨髄転移及び脾臓転移が画像上及び症状として明らかになり、それに伴いＤｉＡｃＳｐｍの急激な上昇が認められた。この上昇度は、現在一般に使用されているマーカーであるβ−２ミクログロブリンよりも高いものであった。▲２▼の時期以降から治療（表１９）に対する反応が見られ、ＤｉＡｃＳｐｍの値は減少した。▲３▼及び▲４▼の時期は、再発に対する治療が困難になってきた頃であり、しかも部分寛解（ＰＲ）の期間が次第に短くなり、ＤｉＡｃＳｐｍの値も完全に下がっていない。▲５▼の時期は、治療に対して腫瘍が完全に抵抗性を示しており、ＤｉＡｃＳｐｍの値も急激に上昇した。
再発と治療及び反応（転帰）との関係を表１９に示す。表１９中、▲１▼〜▲５▼及びａ）〜ｆ）は、図１６に示したものに対応する。
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（２）症例２（６０歳男性、脳原発悪性リンパ腫）
治療開始まではＤｉＡｃＳｐｍの値は高値であったが、その後右側頭葉の腫瘍組織を外科的摘出し、全脳照射４０Ｇｙ、及び５サイクルのＭＴＸ大量療法を行うことにより、完全寛解となった。これに伴い、ＤｉＡｃＳｐｍの値はカットオフ値以下となった。
従って、脳腫瘍の初期治療の治療効果に関して、ＤｉＡｃＳｐｍが明確なマーカーとなり得ることが分かった。
（３）まとめ
悪性リンパ腫の場合の診断上の問題点は、
（ｉ）画像上ＣＲと判断することができても、細胞学的には増殖能を有する腫瘍細胞が中枢神経内に残存している可能性が高いこと、
（ｉｉ）画像上、病変が残存していることが把握できたとしても、腫瘍細胞が消失している場合があること、
（ｉｉｉ）脳以外の他の臓器に転移する可能性があること
などが挙げられる。
本発明は、上記問題点を解決するものであり、ＤｉＡｃＳｐｍの陽性率を測定することにより、画像上把握できる病変にかかわらず、腫瘍細胞の有無を検出することができるため、悪性リンパ種に対する化学療法をどの時点でどの程度行うかという判断をすることができる。また、癌の治療経過中に悪性化するようなケースをＤｉＡｃＳｐｍを指標として把握することができるため、癌の再発を診断し、あるいは予後を予測することができ、的確な治療方針を立てることができる。さらに、本発明のキットは、癌のスクリーニングや術前診断をすることができるだけでなく、組織診断が確定したものであって治療効果、再発、悪性転化などを検出することもできる。
＜実施例１０＞星状細胞腫の検出
本実施例は、グリオーマの一種であるｇｒａｄｅ３アストロサイトーマ（星状細胞腫）患者（３６歳、男性）について、再発手術後にＤｉＡｃＳｐｍを測定したものである（図１８）。
手術後、腫瘍は残存した状態が続くが、尿中ＤｉＡｃＳｐｍはそれほど高値を示さなかった。
放射線治療、化学療法後にも大きな変化はなく、放射線壊死を起こしてもＤｉＡｃＳｐｍの上昇は認められなかった。これに対し、再発により脳梁部が増大して明らかに腫瘍の臨床的な悪性度が加速した時点から、ＤｉＡｃＳｐｍの値は急上昇した。グリオーマの場合、ｇｒａｄｅ３から４への転化はしばしば起こり、この転化を画像診断や病理組織で証明すること、例えば放射線壊死なのか再発病巣なのかを画像診断で区別することが困難な場合も多いのが問題点である。本発明においては、尿中ＤｉＡｃＳｐｍの検出により上記放射線壊死と再発病巣の有無との区別をすることができた。従って、ＤｉＡｃＳｐｍの検出は悪性度の指標として臨床的に極めて有用であることが分かった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、腫瘍マーカーとしてのＤｉＡｃＳｐｍが提供される。また、本発明により、ＤｉＡｃＳｐｍの交差反応による測定結果への干渉の総和が極めて小さく、かつ微量のＤｉＡｃＳｐｍと特異的に結合する抗体、及び当該抗体を含むキットが提供される。本発明のキットは、ＤｉＡｃＳｐｍの陽性率を指標として各種癌の有無、悪性度、再発の有無等を検出することができるため、極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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