(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫凝集反応により抗原を測定するための試薬において、
検体中に含まれる遊離型の抗原および該遊離型の抗原と共存物質とで複合体を形成する複合体型の抗原に対する少なくとも３種類の抗体を含み、
該抗体のうち少なくとも２種類の抗体は、担体に感作され、かつ、該両抗原に反応するものであり、
該抗体の混合比率は、該両抗原と所定のモル反応性を示すように調整されている、抗原の測定試薬。
【請求項２】
所定のモル反応性が等モル反応性である請求項１に記載の抗原の測定試薬。
【請求項３】
抗体が３種類である請求項1又は２に記載の抗原の測定試薬。
【請求項４】
抗体が全て担体に感作されている請求項１〜３のいずれかに記載の抗原の測定試薬。
【請求項５】
１種類の抗体が感作された担体と、他の１種類の抗体が感作された担体の粒径が異なる請求項1〜４のいずれかに記載の抗原の測定試薬。
【請求項６】
共存物質が蛋白質である請求項１〜５のいずれかに記載の測定試薬。
【請求項７】
蛋白質が、遊離型の抗原と複合体を形成することにより該遊離型の抗原が有する活性を阻害するもの、又はアルブミンである、請求項６に記載の測定試薬。
【請求項８】
遊離型の抗原と複合体を形成することにより該遊離型の抗原が有する活性を阻害するものが、プロテアーゼインヒビター、又は遊離型の抗原の輸送蛋白である請求項７に記載の測定試薬。
【請求項９】
遊離型の抗原が、プロテアーゼ、ホルモン、又は薬物である請求項１〜８のいずれかに記載の測定試薬。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜９のいずれかに記載の抗原の測定試薬。
【請求項１１】
免疫凝集反応によりＰＳＡを測定するための試薬において、
ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｆＰＳＡの両方に反応し、認識部位の異なる３種類のモノクローナル抗体を感作したラテックスを含み、
そのうち２種類の抗体をそれぞれ感作したラテックスが、他の１種類の抗体を感作したラテックスよりもその粒径が大きく、
各抗体の混合比率が、該両抗原と等モル反応性を示すように調製されている、ＰＳＡの測定試薬。
【請求項１２】
抗体をそれぞれ感作した担体が１の試薬に含まれている請求項１１に記載のＰＳＡの測定試薬。
【請求項１３】
他の１種類の抗体を感作したラテックスの粒経が０．０２〜０．２２μmである請求項１１又は１２に記載のＰＳＡの測定試薬。
【請求項１４】
免疫凝集反応によるＰＳＡ測定試薬の製造方法において、
ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原及びｆＰＳＡ抗原の両方に反応し認識部位の異なる３種類の抗体を感作した担体を用意し、
あらかじめ３種類の抗体のうち２種類の抗体をそれぞれ感作した担体の混合比率を所定の範囲に設定し、
次に、他の１種類の抗体を感作した担体を前記２種類の抗体の混合物に添加し、両抗原と抗体が所定のモル反応性を示すように調整することを特徴とするＰＳＡ測定試薬の製造方法。
【請求項１５】
所定のモル反応性が等モル反応性である請求項１４に記載のＰＳＡ測定試薬の製造方法。
【請求項１６】
免疫凝集反応によるＰＳＡの測定方法において、
ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｆＰＳＡの両方に反応し、認識部位の異なる３種類の抗体を感作した担体を含み、
そのうち２種類の抗体を感作した担体が、他の１種類の抗体を感作した担体よりもその粒径が大きく、かつ
３種類の各抗体の混合比率が、該両抗原と抗体が所定のモル反応性を示すように調整されている測定試薬を用いて検体中のＰＳＡを測定する方法。
【請求項１７】
所定のモル反応性が等モル反応性である請求項１６に記載の検体中のＰＳＡを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、免疫凝集反応により抗原を測定するための測定試薬及び抗原の測定方法に関する。詳しくは、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ法）により抗原を測定するにあたり、遊離型の抗原（例えばｆＰＳＡ）と検体中の共存物質と複合体を形成している複合体型の抗原（例えばＰＳＡ−ＡＣＴ）の反応性を調整して測定する抗原の測定試薬および測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  前立腺癌は男性にみられる悪性疾患であり、特に米国及び日本において、急激に増加している腫瘍である。前立腺癌は増殖の遅い腫瘍であること、放射線療法や抗男性ホルモン療法が奏効しやすいという特徴があることから、早期発見が重要な課題である。【０００３】  ここで、前立腺上皮細胞から分泌され前立腺癌細胞によっても産生される前立腺特異抗原（以下単にＰＳＡということがある）は、セリンプロテアーゼの一種で、分子量３３、０００〜３４、０００ダルトンの糖蛋白である。そして、ＰＳＡには、血中でプロテアーゼインヒビターと結合する複合体型と、非結合の遊離型前立腺癌特異抗原（以下ｆＰＳＡということがある）が存在するが、血中のＰＳＡの多くは複合体型であり、α１−アンチキモトリプシン複合前立腺特異抗原（以下ＰＳＡ−ＡＣＴということがある）やα２−マクログロブリン複合前立腺特異抗原等がある。このうち、免疫法で測定できるのは、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの２種類であり、日本で現在実用化されている２０種を超える血清中ＰＳＡの総量を測定するキットにおいて、被検液によってその測定値と真の値との乖離の程度が異なることが問題となっている。この主な原因は、個々のキットで、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに対する測定試薬の反応性に違いがあることによるものと考えられている。【０００４】  すなわち、免疫法のうちでもラテックス等を用いた凝集反応によるいわゆる免疫凝集反応測定法では、抗原抗体反応が１段階で行われるため、ＰＳＡに対するモノクローナル抗体の、ｆＰＳＡと反応性及びＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が異なり、その結果測定結果に誤差が生じるという問題があった。【０００５】  このような問題を解決する従来技術として、例えば特許文献１には、ｆＰＳＡにおけるα１−アンチキモトリプシンと結合可能な領域に抗体を結合させ、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの分子量を近づけ、エピトープの数を揃えることでＰＳＡに対する抗体に対する、ｆＰＳＡの反応性とＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を近づけることで、該抗体を感作した担体と両者のＰＳＡとを等モル対応で測定することを可能としたことが記載されている。【特許文献１】特開２００１−３１１７３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  しかし、上記従来の測定方法は、あらかじめｆＰＳＡとのみ反応するという特殊な抗体を必要とするという問題があった。また、該特殊な抗体を用いてｆＰＳＡと反応させるという前処理をした後に、両ＰＳＡに対する抗体を感作した担体を用いてＰＳＡの総量を測定するものであり、２段階の反応を行わせる必要があった。  従って、より簡便かつ正確にＰＳＡの総量を測定する方法の開発が望まれていた。なお、特に断らない限りはＰＳＡの測定とは、ＰＳＡの総量を測定することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、免疫凝集法を用いた抗原の測定法について鋭意検討を行ったところ、検体中に含まれる遊離型の抗原および該遊離型の抗原と共存物質とで複合体を形成する複合体型の抗原について認識部位の異なる少なくとも３種類の抗体を含み、該抗体のうち少なくとも２種類の抗体は、担体に感作され、かつ、両抗原に反応するものを測定用試薬として構成したところ、各抗体の混合比率を調整することで、該両抗原の反応性を調整することができることを見出し、本発明を完成した。  すなわち、本発明は以下の構成を有する。（１）免疫凝集反応により抗原を測定するための試薬において、  検体中に含まれる遊離型の抗原および該遊離型の抗原と共存物質とで複合体を形成する複合体型の抗原について認識部位の異なる少なくとも３種類の抗体を含み、  該抗体のうち少なくとも２種類の抗体は、担体に感作され、かつ、該両抗原に反応するものであり、  該抗体の混合比率は、該両抗原と所定のモル反応性を示すように調整されている、抗原の測定試薬。（２）所定のモル反応性が等モル反応性である請求項１に記載の抗原の測定試薬。（３）抗体が３種類である前記（２）に記載の抗原の測定試薬。（４）抗体が全て担体に感作されている前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗原の測定試薬。（５）１種類の抗体が感作された担体と、他の１種類の抗体が感作された担体の粒径が異なる前記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗原の測定試薬。（６）共存物質が蛋白質である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の測定試薬。（７）蛋白質が、遊離型の抗原と複合体を形成することにより該遊離型の抗原が有する活性を阻害するもの、又はアルブミンである、前記（６）に記載の測定試薬。（８）遊離型の抗原と複合体を形成することにより該遊離型の抗原が有する活性を阻害するものが、プロテアーゼインヒビター、又は遊離型の抗原の輸送蛋白である前記（７）に記載の測定試薬。（９）遊離型の抗原が、プロテアーゼ、ホルモン、又は薬物である前記（１）〜（８）のいずれかに記載の測定試薬。（１０）抗体がモノクローナル抗体である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の抗原の測定試薬。（１１）免疫凝集反応によりＰＳＡを測定するための試薬において、  ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｆＰＳＡの両方に反応し、認識部位の異なる３種類のモノクローナル抗体を感作したラテックスを含み、  そのうち２種類の抗体をそれぞれ感作したラテックスが、他の１種類の抗体を感作したラテックスよりもその粒径が大きく、  各抗体の混合比率が、該両抗原と等モル反応性を示すように調製されている、ＰＳＡの測定試薬。（１２）抗体をそれぞれ感作した担体が１の試薬に含まれている前記（１１）に記載のＰＳＡの測定試薬。（１３）他の１種類の抗体を感作したラテックスの粒経が０．０２〜０．２２μmである前記（１１）又は（１２）に記載のＰＳＡの測定試薬。（１４）免疫凝集反応によるＰＳＡ測定試薬の製造方法において、ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原及びｆＰＳＡ抗原の両方に反応し認識部位の異なる３種類の抗体を感作した担体を用意し、  あらかじめ３種類の抗体のうち２種類の抗体をそれぞれ感作した担体の混合比率を所定の範囲に設定し、  次に、他の１種類の抗体を感作した担体を前���２種類の抗体の混合物に添加し、両抗原と抗体が所定のモル反応性を示すように調整することを特徴とするＰＳＡ測定試薬の製造方法。（１５）所定のモル反応性が等モル反応性である前記（１４）に記載のＰＳＡ測定試薬の製造方法。（１６）免疫凝集反応によるＰＳＡの測定方法において、  ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｆＰＳＡの両方に反応し、認識部位の異なる３種類の抗体を感作した担体を含み、  そのうち２種類の抗体を感作した担体が、他の１種類の抗体を感作した担体よりもその粒径が大きく、かつ  ３種類の画抗体の混合比率が、該両抗原と抗体が所定のモル反応性を示すように調整されている測定試薬を用いて検体中のＰＳＡを測定する方法。（１７）所定のモル反応性が等モル反応性である前記（１６）に記載の検体中のＰＳＡを測定する方法。
【発明の効果】
【０００８】  本発明の抗原の測定試薬は、特殊な反応性を有する抗体を用いることなく、常法により得られる抗体を適宜組み合わせることにより簡便かつ安価に試薬を調整することができる。また、抗体を全て担体に感作させた場合には、試薬としての安定性に優れ、品質管理も簡便になり、安定した試薬の供給が期待できる。さらに、この場合、抗体を感作させた試薬を１試薬として用いることができ、測定も１段階の反応で行わせることができ、測定が簡便で、測定時間の短縮を図ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各抗体のｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴに対する反応性（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法）を示す画像である。
【図２−１】ｃ／ｆ比に対する＃１６Ｌｘ添加の効果を示すグラフである（試験例１−１）。
【図２−２】ｃ／ｆ比に対する＃１６Ｌｘ添加の効果を示すグラフである（試験例１−２）。
【図３】ｃ／ｆ比に対するフリーの抗体＃１６添加の効果を示すグラフである。
【図４】＃１６Ｌｘのラテックスサイズによるｃ／ｆ比の改善効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】（対象試料）  本発明の抗原測定試薬の対象試料としては、抗原が含まれている試料であり、例えば血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは臓器の抽出液等が挙げられる。抗原がＰＳＡの場合、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が含まれる可能性のある前記生体試料であればいずれも対象となる。【００１１】（抗原）  本発明で測定の対象とする抗原とは、免疫凝集法により測定できるものであれば、いずれも対象とできる。例えば、対象試料となる検体中で、遊離型及び共存物質と複合体を生成する複合体型の両者の存在形態を有するような抗原を対象とする。共存物質としては、遊離型の抗原と複合体を形成することにより該遊離型の抗原が有する活性を阻害するような、プロテアーゼインヒビター、遊離型の抗原の輸送蛋白、アルブミン等の蛋白質が挙げられる。より具体的には、遊離型の抗原として、プロテアーゼ（ＰＳＡ、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシン）、ホルモン（Ｔ３（トリヨードサイロニン）及びＴ４（サイロキシン）等）、薬物等が挙げられる。例えば、ＰＳＡでは、前記の如くｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが存在し、Ｔ３及びＴ４では、サイロキシン結合グロブリン（輸送蛋白）と結合した複合体型と遊離型とが存在し、血中薬物についても、アルブミンと結合した複合体型と遊離型とが存在する。【００１２】（抗体）  本発明で用いる抗体は、測定対象の抗原の遊離型と複合体型の両方に反応する抗体を少なくとも２種類用いる。抗体は、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等に免疫して得られるポリクローナルな抗体やモノクローナルな抗体を用いることができる。そのうちでもモノクローナル抗体が特に望ましい。また、抗体全体でもかまわないが、常法に従い酵素で切断したフラグメントであってもよい。なお、使用するモノクローナル抗体は、常法により得ることができる。  本発明ではモノクローナル抗体を用いる場合、サンドイッチ法、競合法などによりその組み合わせに適した抗体を適宜選択することができる。  本発明で用いる抗体は抗原との反応性が異なる必要がある。ここで反応性が異なるとは、抗原に対する抗体の親和性、結合力、エピトープ等が異なることをいう。エピトープが異なるとは、認識部位が一部重複したり、近接するような場合も含むものとする。【００１３】（担体）  本発明で使用する抗体を感作する担体は、特に限定されないが、ラテックスが好ましい。ラテックスとしては、免疫学的測定法で用いられる物理的吸着法で使用されるポリスチレンからなる一般的なラテックスが使用可能であり、材質は感作方法に適したものなら特にこだわらない。材質は他に、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。ラテックスに抗体を感作する方法は一般的に使用されている物理的吸着法が採用できるが、化学結合法も採用できる。  本発明で用いるラテックスは同一種類、あるいは２種類以上を用いることができ、粒径の異なる２種類以���を用いることが望ましい。さらに、異なる粒子径を混合したラテックスを用いることもできる。【００１４】（抗体の選択）  抗体は次のようにして選択する。抗原がＰＳＡであり、抗体を３種類選択する場合を例に説明する。抗体は、まずＥＬＩＳＡ法などにより、ＰＳＡ−ＡＣＴとｆＰＳＡ  との反応性が高い、つまり力価の高い抗体を選択することが望ましく、また、担体は、十分な測定感度が得られるものを選択することが望ましい。次に、選択された力価の高い抗体から、２種類の抗体を適当に選んでそれぞれ担体に感作し、ＰＳＡ−ＡＣＴとｆＰＳＡを試料として測定したとき、両試料との反応性の差が小さく、かつ十分な測定感度の得られる抗体の組み合わせを選択する。これらの抗体を主反応用の抗体とする。  次に、別の抗体を主反応中に共存させたときに、主反応に用いる抗体のＰＳＡ−ＡＣＴ及びｆＰＳＡとの反応性を調整することができる抗体を選択する。これを反応調整用の抗体とする。なお、反応調整用の抗体は担体に感作させてもよいが、感作させる場合の担体は、主反応用の抗体を感作させる担体よりも小さいサイズが好ましい。  反応調整用の抗体は、ＰＳＡ−ＡＣＴとｆＰＳＡ  との反応性に差があるものが好ましい。【００１５】（抗体の混合比率）  抗体の混合比率は、遊離型の抗原及び複合体型の抗原の両抗原に対し所定のモル反応性を示すように調整することが必要である。本発明では抗体の混合比率を調整することで、抗原のモル反応性を調整することに特徴があり、測定の目的、必要精度に応じて所定の範囲に調整することができる。このうちでも等モル反応性を示すように調整すれば、遊離型および複合体型の抗原濃度を等しく測定することができる。  ここで、等モル反応性とは、抗原と抗体とを反応させ、抗体を感作させた担体同士が凝集反応を起こすことによって凝集する反応性が、遊離型と複合体型とで実質的に等しくなることをいう。具体的には、抗原がＰＳＡの場合、ＰＳＡとして同濃度のｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが存在する場合、凝集反応により測定されるＰＳＡ濃度が実質的に等しくなることをいう。また、実質的に等しいとは、両抗原の凝集シグナルの比が８０−１２０％、好ましくは９０−１１０％となることをいう。【００１６】  本発明では、両抗原の免疫凝集反応において、抗体の混合比率を適宜調整することにより、抗原と抗体の反応が所定のモル反応性を示すことを見出した。例えば、ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原及びｆＰＳＡ抗原の両方に反応する認識部位の異なる３種類の抗体をそれぞれ担体に感作させ、等モル反応性を示す試薬を得る場合、各抗体の混合比率は、次のようにして調整することになる。まず、２種類の抗体をそれぞれ感作した担体を用い、両抗原が示す等モルあたりの凝集シグナルの比（ＰＳＡ−ＡＣＴ／ｆＰＳＡ比、以下単にｃ／ｆ比ということがある）を求め、次に、該ｃ／ｆ比が８０−１２０％、好ましくは９０−１１０％となるように別の１種類の抗体を感作した担体を添加することにより行う。【００１７】  ｃ／ｆ比の調整は、担体に感作させた抗体を用いることもでき、また、担体に感作しないフリーの抗体を用いて行うこともできる。また、調整用の抗体は１種類でもよく、２種類以上であってもよい。なお、フリー���抗体を用いる場合は、必要に応じて他の抗体を感作した担体と凝集反応を起こさないように試薬を別にする必要がある。【００１８】  調整用の抗体を担体に感作させる場合は、主反応に用いた抗体を感作させた担体よりも粒径の小さな担体を用いることが望ましい。その方が調整しやすいからである。具体的には０．０２〜０．２２μｍの範囲が望ましく、より好ましくは、０．０５〜０．０９μｍの範囲が望ましい。また、主反応に用いた抗体を感作させた担体の粒径は０．１〜０．５μｍであることが好ましい。更に好ましくは、調整用の抗体を感作させる担体の粒径は、主反応の抗体を感作させる担体の粒径の２／３〜１／１０、好ましくは１／５〜１／８である。  ここでいう、抗体の混合比率とは、抗体の濃度比率でもあり、また、抗体を一定割合で担体に感作させた場合は、担体の濃度比率がこれに相当する。【００１９】（緩衝液）  本発明における抗原抗体反応は緩衝液中で行われ、その緩衝液は、抗原抗体反応が最適に行われる種類、濃度、ｐＨが選択され、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液等を用いる事ができる。その測定液中の緩衝剤の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭ程度で用いられ、また、そのｐＨは中性域から塩基性域で用いられることが多く、通常７．０〜９．５の範囲で用いられる。【００２０】（凝集シグナルの測定方法）  凝集シグナルの測定は、通常凝集反応測定に用いられる測定方法であればいずれでもよく、吸光度、粒子数、粒子サイズ測定、散乱光測定などがあげられる。  例えば、ＰＳＡの測定方法は、次の様に行われる。測定試薬には少なくとも３種類以上の抗体が含まれ、そのうち２種類以上はラテックス等の担体に結合し、かつｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの両方に反応する抗体である。従って、このような抗体と抗原とを反応させると、ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴは担体に感作させた抗体と反応することで凝集することになる。これは、担体に感作した抗体を用いる凝集反応の場合、抗原１分子に対して２つ以上の担体に感作した抗体が結合すれば、原理上、凝集として観察することができるからである。従って、その凝集の程度を測定し、ＰＳＡ濃度の判っている標準液の凝集の程度と比較することで、試料中の総ＰＳＡ濃度を定量することができる。【００２１】  凝集シグナルの検出は、種々の方法があるが、汎用の生化学分析装置を用いる方法が便利である。例えば、抗原を含む試料に試薬を加え一定温度で一定時間放置し、この間の吸光度を測定し、吸光度の変化量を検出し、標準液の検量線から被検体液の濃度を算出することができる。ラテックス凝集法では、通常５００〜９００ｎｍの波長の吸光度が用いられ、反応の吸光度の変化量を定量に用いるのが一般的である。【００２２】（試薬の製造方法）  本発明のＰＳＡ測定試薬の製造は、以下のようにして行う。  ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原及びｆＰＳＡ抗原の両方に反応し認識部位の異なる３種類の抗体を感作した担体を用意し、あらかじめ３種類の抗体のうち２種類の抗体をそれぞれ感作した担体の混合比率を所定の範囲に設定し、次に、他の１種類の抗体を感作した担体を前記２種類の抗体の混合物に添加し、両抗原と抗体が所定のモル反応性を示すように調整することにより製造することができる。
【実施例】
【００２３】[モノクローナル抗体の作成]１．免疫（１）免疫原  免疫原としてヒト精液由来精製ＰＳＡ（ＳＣＩＰＡＣ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｐ１１７−７  精製度９６％）を用いた。精製ＰＳＡは、ＰＢＳで透析後に使用した。（２）免疫方法  上記ＰＳＡ溶液とＣＦＡ（完全フロイントアジュバント：ＧＩＢＣＯ社製）とを１対１で混和乳化し、６週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背部皮下に２５μｇＰＳＡ／匹となるように投与した。２週間間隔で追加免疫を３回行い、更に細胞融合の３日前にＰＳＡ溶液（２５μｇ／匹）をマウスの腹腔内に投与した。【００２４】２．細胞融合  上記ＰＳＡを免疫した後のマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞を取り出した。この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４とを６対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０（和光純薬社製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２．５×１０６個となるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に０．２ｍｌずつ分注した。これを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２週間培養した。【００２５】３．スクリーニング  融合細胞を分注した培養プレートの各ウェルの培養上清を用い、次に示すＥＬＩＳＡ法にてｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの両者と反応するウェルを選択した。（１）材料：抗原１）ＰＳＡ（ＰＲＯＳＴＡＴＥ  ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ）：ＳＣＩＰＡＣ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｐ１１７−７２）ＰＳＡ−ＡＣＴ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＳＡ−α１−ＡＮＴＩＣＨＹＭＯＴＲＹＰＳＩＮ）：  ＳＣＩＰＡＣ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｐ１９２−３（２）方法１）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）５μｇ／ｍｌをＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ）にコートし（５０μｌ／ｗｅｌｌ）、４℃で一夜静置した。２）洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄後（４００μｌ／ｗｅｌｌ）、ブロッキング液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）を各ウェルに２００μｌとなるように分注し、室温で１時間静置した。３）ブロッキング液を除去した後、融合細胞を分注したプレートの各ウェルの培養上清をＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに５０μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。４）洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ  で５ｎｇ／ｍｌに希釈したｆＰＳＡ、またはＰＳＡ−ＡＣＴを各ウェルに５０μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。５）洗浄液で３回洗浄後、ＨＲＰ−ウサギ抗ヒトＰＳＡ抗体（ｘ５００）を各ウェルに５０μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。なお、ＨＲＰ−ウサギ抗ヒトＰＳＡ抗体は、ウサギ抗ヒトＰＳＡ抗体（ＤＡＫＯ社）及びペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を用い、過ヨウ素酸法にて作製した。６）３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を各ウェルに５０μｌずつ分注し、室温で１０分間静置した。７）停止液（１．５Ｎ硫酸）を各ウェルに５０μｌずつ分注し、反応を停止した後、プレートリーダーを用い４９２ｎｍの波長で吸光度を測定した。【００２６】４．クローニング  上記スクリーニングにより、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両者に反応したウェルの細胞株を限界希釈法によりクローン化を行い、ハイブリドーマを樹立��た。この結果、樹立したハイブリドーマは２０種類得られた。【００２７】５．モノクローナル抗体の調製  予め２週間前にプリスタン０．５ｍｌを腹腔内に注射しておいた８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、前記クローニングにより得られた各ハイブリドーマを細胞数０．５×１０６個の量で腹腔内に投与した。２週間後腹水を採取し、プロテインＡカラム（アマシャム社製）にてＩｇＧ画分を精製した。この結果２０種類の各モノクローナル抗体の精製画分が得られた。【００２８】［モノクローナル抗体および担体の選択］  上記で得られた２０種類のモノクローナル抗体について、抗体をラテックスに感作してラテックス凝集の検討を以下の通り行い、シグナルが大きい３種類の抗体＃１４ＭｏＡｂ、＃１６ＭｏＡｂ  、＃１７ＭｏＡｂ（各々の定義は後記）、及びそれらのラテックッスとの組合せを得た。１．抗体の一次選択（１）２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）で希釈した１％  の０．３１２μｍラテックス溶液と２０種のＭｏＡｂ溶液（０．６Ａｂｓ）を１ｖｏｌ：１ｖｏｌで混合し、４℃、２ｈｒ攪拌した。（２）０．４％  ＢＳＡ  ｉｎ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）を２ｖｏｌ添加し、４℃、１ｈｒ攪拌した。（３）遠心分離にて上清を除去し、５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）でけん濁し、Ａｂｓ６００ｎｍで  ２Ａｂｓ  に調整した。（４）２０種類から選ばれた２種類のＭｏＡｂ−Ｌｘ（抗体感作ラテックス）を１ｖｏｌ：１ｖｏｌで混合し試薬２とする（全組合せについて同様に調製し検討した）。（５）試薬１（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．０、０．１％ＢＳＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）と試薬２を用い、２６ｎｇ／ｍｌのｆｒｅｅ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴを日立７１７０形自動分析装置で測定した。（６）凝集するMoAbの組合わせ（吸光度の高いもの）１２種類、ＭｏＡｂとしては８種類を選択した。【００２９】２．抗体の二次選択（７）２．９、８．７、２６ｎｇ／ｍｌのｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴを日立７１７０形自動分析装置で測定し、吸光度が高く、各濃度でのＰＳＡ−ＡＣＴ／ｆＰＳＡ比が１に近くなる組合わせを主反応用の抗体として選択した（＃１４ＭｏＡｂ、＃１７ＭｏＡｂ）。なお、二次選択した組合わせの抗体のそれぞれとの組合わせにおいて、反応に強弱があるモノクローナル抗体を反応調整用の抗体として選択した（＃１６ＭｏＡｂ）。【００３０】３．ラテックスの選択（８）ラテックスの種類：０．３９、０．３１、０．３０、０．２３μｍ（高反応性用：吸光度が高くなるラテックス）、０．２２、０．０８７、０．０５５μｍ（反応調整用）を用い、上記（１）〜（４）に準じて抗体感作ラテックスを調製した。（９）２．９、８．７、２６ｎｇ／ｍｌのｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴを日立７１７０形自動分析装置で測定し、吸光度が高く、各濃度でのＰＳＡ−ＡＣＴ／ｆＰＳＡ比が１に近くなる組合わせを選択した。（１０）＃１４ＭｏＡｂ−０．２２９μｍ、＃１７ＭｏＡｂ−０．３８５μｍ、＃１６ＭｏＡｂ−０．０５５μｍを選択した。（１１）それぞれの組合わせでＭｏＡｂ濃度、ラテックス濃度、抗体感作ラテックス濃度、感作条件（緩衝液、ｐＨ、時間）、抗体感作ラテックス混合比率の至適条件を設定し、以下の試験例に用い���。【００３１】［ウエスタンブロッティング法による各モノクローナル抗体の解析］  前記で得られた３種類のモノクローナル抗体（＃１４ＭｏＡｂ、＃１６ＭｏＡｂ、＃１７ＭｏＡｂ）のｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴに対する反応性について次に示すウエスタンブロット法による解析を行った。【００３２】１．材料（１）抗原１）ＰＳＡ（ＰＲＯＳＴＡＴＥ  ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ）：ＳＣＩＰＡＣ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｐ１１７−７２）ＰＳＡ−ＡＣＴ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＳＡ−α１−ＡＮＴＩＣＨＹＭＯＴＲＹＰＳＩＮ）：ＳＣＩＰＡＣ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｐ１９２−３【００３３】（２）抗体１）Ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＭｏＡｂ（６３２１４（＃１４と略す））：上記「モノクローナル抗体の作成」に従って得られた抗体２）Ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＭｏＡｂ（６３２１６（＃１６と略す））：同上３）Ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＭｏＡｂ（６３２１７（＃１７と略す））：同上４）Ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＭｏＡｂ（Ｎｏ．５６）：(株)日本医学臨床検査研究所製、ｌｏｔ．０３１−０２−００３５）Ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＭｏＡｂ（４Ｄ１０）：(株)日本医学臨床検査研究所製、ｌｏｔ．０３１−０１−００４６）Ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ：（自社調製）７）Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＰＳＡ（Ｒｂ抗ＰＳＡ  ＰｏＡｂ）：ＤＡＫＯ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ａ０５６２８）Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＡＣＴ（Ｒｂ抗ＡＣＴ  ＰｏＡｂ）：ＤＡＫＯ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ａ００２２（３）標識抗体１）Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、ＡＬＩ３４０４、ｌｏｔ．５７０１２）Ｇｏａｔ（Ｆ（ａｂ’２）  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、ＡＭＩ４４０４（４）その他３）ブロッキング液、希釈液：１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０）洗浄液：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０）４）ＯＰＤ発色液、停止液（ＥＬＩＳＡ）：常法５）ＤＡＢ染色液（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法）：常法【００３４】２．方法１）各抗原（ｆＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ）をＳＤＳ処理液（２−メルカプトエタノールフリー）と混和し、５分間煮沸処理した。２）これをＰＡＧミニ１０／２０に添加し（２μｇ／レーン）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（４０ｍＡ，１ｈｒ．）。３）泳動後、セミドライブロッターを用い定法に従い、ゲルからＰＶＤＦ膜へ蛋白質を転写した。４）転写後の膜を５％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでブロッキングした（４℃／ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）。５）５μｇ／ｍｌ濃度に希釈した各ＭｏＡｂを室温で２時間反応させた。６）３回洗浄後、Ｇｏａｔ（Ｆ（ａｂ’２）  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（５０００倍希釈）を室温で１時間反応させた。７）３回洗浄後、ＤＡＢ染色液を用い定法で染色した。８）適度な染色像が得られた時点で洗浄し、乾燥させた。【００３５】３．結果  ウエスタンブロッティング法による染色画像を図１に示す。図１によれば、本発明のモノクローナル抗体＃１４、＃１６、＃１７のいずれもｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴと反応することが確認できた。【００３６】抗体感作ラテックスの調製方法  前記で得られた３種類のモノクローナル抗体（＃１４、＃１６、＃１７）を次に示す材料、方法により担体に感作させた。１．材料（１）抗ＰＳＡモノクローナル抗体       ６３２１４（＃１４）    ６３２１７（＃１７）    ６３２１６（＃１６）      （上記モノクローナル抗体は全てＰＢＳ溶液である）（２）ラテックス      ＃１４用：ポリスチレンラテックス  平均粒子径０．２３μｍ（積水化学社製）    ＃１７用：ポリスチレンラテックス  平均粒子径０．３９μｍ（積水化学社製）    ＃１６用：ポリスチレンラテックス  平均粒子径０．０５μｍ（積水化学社製）【００３７】２．抗体−ラテックス複合体含有液の調整方法（１）＃１４抗体−ラテックス複合体（＃１４Ｌｘ）含有液の調製方法１）ラテックス、抗体をそれぞれ２０ｍＭ  グリシン  ｐＨ９で希釈し、１％ラテックス液、０．４ｍｇ／ｍｌ＃１４抗体液を調製した。これらを１：１（１容＋１容）で混合し、約１時間攪拌した。２）上記混合液２容に、ブロッキング液（１０％  ＢＳＡ）を０．１容添加し、約１時間攪拌した。３）５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液に透析後、３Ａｂｓ／ｍｌ（６００ｎｍ）となるように希釈して＃１４抗体−ラテックス複合体（＃１４Ｌｘ）含有液を得た。（２）＃１７抗体−ラテックス複合体（＃１７Ｌｘ）含有液の調製方法１）ラテックス、抗体をそれぞれ２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０で希釈し、０．３％ラテックス液、０．１ｍｇ／ｍｌ＃１７抗体液を調製した。これらを１：１（１容＋１容）で混合し、約１時間攪拌した。２）上記混合液２容に、ブロッキング液（１０％  ＢＳＡ）を０．０３容添加し、約１時間攪拌した。３）５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液に透析後、２．７Ａｂｓ／ｍｌ（６００ｎｍ）となるように希釈して＃１７抗体−ラテックス複合体（＃１７Ｌｘ）含有液を得た。（３）＃１６抗体−ラテックス複合体（＃１６Ｌｘ）含有液の調製方法１）ラテックス、抗体をそれぞれ２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．５で希釈し、５％ラテックス液、０．６ｍｇ／ｍｌ  ＃１６抗体液を調製した。これらを１：１（１容＋１容）で混合し、約二時間攪拌した。２）上記混合液２容に、ブロッキング液（１０％  ＢＳＡ）を０．４容添加し、約一時間攪拌した。３）５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液に透析後、３Ａｂｓ／ｍｌ（６００ｎｍ）となるように希釈して＃１６抗体−ラテックス複合体（＃１６Ｌｘ）含有液を得た。【００３８】〔試験例１〕＃１６抗体−ラテックス複合体（＃１６Ｌｘ）添加によるｃ／ｆ比の調整（１−１）  同濃度（４０ｎｇ／ｍｌ）のｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴを測定試料とし、下記ＰＳＡ測定試薬の基本処方に第二試薬として＃１４Ｌｘ及び＃１７Ｌｘのみを用いて、凝集反応を行い、ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの濃度を測定し、その濃度比ＰＳＡ−ＡＣＴ／ｆＰＳＡ（ｃ／ｆ比）を求めたところ、約８０％であった。ここで、＃１４Ｌｘと＃１７Ｌｘの混合比を変動させても、ｃ／ｆ比にあまり変化は無かったため、至適条件として、＃１４Ｌｘ含有液：＃１７Ｌｘ含有液＝２：１を選択し、これに＃１６Ｌｘを０、０．２４、０．３２、０．４１、０．４９、０．５７  ｍｇ／ｍｌとなるように添加して＃１６Ｌｘの��添加量におけるｃ／ｆ比を測定した。結果を図２−１に示す。  これによれば、＃１６Ｌｘの添加量に伴って、ｃ／ｆ比は約８０％から１１０％へと増加した。ｃ／ｆ比が１００％となる条件、すなわち、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モル反応性を示す条件を選択したところ、担体の混合比率は、計算上、＃１４Ｌｘ含有液：＃１７Ｌｘ含有液：＃１６Ｌｘ含有液＝２：１：約０．２７であった。【００３９】（１）ＰＳＡ測定試薬の基本処方  第一試薬（緩衝液）      ０．５Ｍ  ＫＣｌ、      ０．１％  ＢＳＡ（プロリアント）、      ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  緩衝液ｐＨ７．０  第ニ試薬（抗体感作ラテックス液）      抗ＰＳＡ・マウスモノクローナル抗体感作ラテックス粒子（＊）、      ５ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０      ＊３種類の抗体感作ラテックス粒子の混合比        ＃１４Ｌｘ含有液：＃１７Ｌｘ含有液：＃１６Ｌｘ含有液＝２：１：約０．２７（２）測定条件    測定装置：Ｈ７１７０    パラメータ：      分析法    ２ポイントエンド（測定ポイント１９−３４）      液量      ８／１００／１００      測定波長  ５７０（主）／８００（副）      キャリブレーション    スプライン（３）測定試料  ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ（ともにＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）を、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３／ＰＢＳに溶解して試料とした。【００４０】〔試験例１−２〕＃１６抗体−ラテックス複合体（＃１６Ｌｘ）添加によるｃ／ｆ比の調整（１−２）  上記試験例１−１の＃１６Ｌｘ添加によるｃ／ｆ比の調整に関し、＃１６Ｌｘ添加量が低い場合について水準を増やし試験を行った。  試験例１−１の測定試料の濃度（４０ｎｇ／ｍｌ）を３６ｎｇ／ｍｌとし、＃１６Ｌｘの添加量の水準を０、０．１６、０．２４、０．３２、０．４０  ｍｇ／ｍｌとした以外は試験例１と同様にし、＃１６Ｌｘの各添加量におけるｃ／ｆ比を測定した。結果を図２−２に示す。  図２−１及び図２−２より、＃１６Ｌｘの添加量を適宜調整することにより、ｃ／ｆ比は９０〜１１０％間で調整可能であることが明らかとなった。【００４１】［試験例２］  保存安定性  試験例１で求められたｃ／ｆ比が１００％となる条件下、４℃で保存しｃ／ｆ比の経時変化を測定したところ、７ヶ月以上の保存期間中ｃ／ｆ比９０−１１０％を持続した。【００４２】〔試験例３〕フリーの抗体＃１６添加の効果  ＃１６を担体に感作させずにフリーの状態で添加した場合以外は、試験例１と同様にｃ／ｆ比を測定した。結果を図３に示す。試験例１に挙げられたＰＳＡ測定試薬の基本処方を用い、第二試薬として＃１４Ｌｘ、＃１７Ｌｘとともに、＃１６（０．４３ｍｇ／ｍｌ）を加えた。  同濃度（各８．７ｎｇ／ｍｌ）のｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴをサンプルとして、ｆＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの示すシグナルの比、ｃ／ｆ比を求めた。この結果、担体に感作していないフリーの抗体＃１６も、ｃ／ｆ比を１００％付近に改善する効果があることがわかった。【００４３】〔試験例４〕他のモノクローナル抗体の組み合わせ  モノクローナル抗体＃１４と＃１７の組み合わせに代わり、モノクローナル抗体＃１７と＃３６の組み合わせを用い体外は試験例１と同様に、ｃ／ｆ比を求めた。同濃度（各３０ｎｇ／ｍｌ）のｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴをサン���ルとして、これに抗体＃１６（０．４３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。結果、本試験例の抗体の組み合わせを用いた場合もｃ／ｆ比を増加させることが確認された。【００４４】〔試験例５〕ラテックスの粒経サイズによるｃ／ｆ比への影響  モノクローナル抗体＃１６を下記サイズのラテックスに感作したものを０、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、それぞれについて試験例１と同様にｃ／ｆ比を測定した。結果を図４に示す。  この結果より、０．０５５〜０．２２μｍのラテックスに感作したものは、いずれも濃度依存的にｃ／ｆ比は改善され、１００％とする効果があった。  ラテックスのサイズ：０．０５５、０．０８６、０．０８７、０．２２μｍ
【産業上の利用可能性】
【００４５】  本発明の抗原の測定試薬は、特殊な抗体を用いることなく、常法により得られる抗体を適宜組み合わせることによる得ることができる。従って、本発明の測定試薬を用いれば、簡便かつ正確に抗原を測定することが可能であり、また、汎用の自動分析装置に適用可能であることから、検査における患者の経済的、時間的、身体的負担の軽減に大いに貢献できる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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