(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸にＣ−Ｃ２重結合を導入したヒアルロン酸誘導体がメルカプト基含有化合物で化学架橋されていることを特徴とした薬物徐放担体を含む薬剤組成物であって、化学架橋が薬物としてのタンパク質またはペプチド共存下の溶液中で形成されることを特徴とする前記薬剤組成物。
【請求項２】
メルカプト基含有化合物が、ジチオトレイトールである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸誘導体が、式（ＩＶ）：
【化１】
0004636883.tif 000012
［式中、Ｘ０は、−Ｏ−、または−Ｎ（−Ｒ１）−であり、
Ｘ３は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ４、または−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ４であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｙ２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、または−Ｎ（−Ｒ４）−であり、
Ｙ３は、単結合、−ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ５）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ５）−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｑ１は、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｑ４は、直鎖もしくは分枝Ｃ２−１０アルケニル基である］
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である、請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸中のグルクロン酸当たりの、Ｃ−Ｃ２重結合を有する基の導入率が５モル％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
ヒアルロン酸誘導体が、式（ＩＩＩ）：
【化２】
0004636883.tif 000013
［式中、Ｒａ１は、水酸基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ基、または直鎖または分枝Ｃ１−６アルコキシ基であり、あるいはナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオンもしくは置換されていてもよいアンモニウムイオンからなる群から選ばれる陽イオンとカルボン酸塩を形成していてもよく、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨである］
で示される繰り返し構造Ａと、請求項３に定義した式（ＩＶ）で示される繰り返し構造Ｃを含み、
上記繰り返し構造ＡとＣの存在比率が、９５：５〜１０：９０であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
薬物としてのタンパク質またはペプチド共存下の溶液中で、請求項３に定義したヒアルロン酸誘導体を、メルカプト基含有化合物で化学架橋することを特徴とする、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体を含む薬剤組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項３に定義したヒアルロン酸誘導体を以下の工程により製造する、請求項６に記載の製造方法：
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有するＮ−置換アミド基またはエステル基に変換することにより、式（Ｉ）：
【化３】
0004636883.tif 000014
［式中、Ｘ０は、−Ｏ−、または−Ｎ（−Ｒ１）−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｘ１は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−ＮＨ−Ｒ２、または−ＮＨ−Ｒ２であり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｙ２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、または−Ｎ（−Ｒ４）−であり、
Ｑ１は、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である］
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程、
（ｂ）上記ヒアルロン酸誘導体に、Ｃ−Ｃ２重結合を有する基を導入し、式（ＩＶ）で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程。
【請求項８】
ヒアルロン酸中のグルクロン酸当たりの、Ｃ−Ｃ２重結合を有する基の導入率が５モル％以上であることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
ヒアルロン酸誘導体が、請求項５に定義した式（ＩＩＩ）で示される繰り返し構造Ａと、請求項３に定義した式（ＩＶ）で示される繰り返し構造Ｃを含み、
上記繰り返し構造ＡとＣの存在比率が、９５：５〜１０：９０であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
メルカプト基含有化合物が、ジチオトレイトールである請求項６〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質またはペプチドを徐放するヒアルロン酸ハイドロゲル薬物徐放担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤が盛んに実用化されているが、一般にこうした薬物は血中半減期が短く、またその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっている。したがって、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。
【０００３】
薬効を持つタンパク質またはペプチドの徐放製剤は、製剤調製時または徐放中の、タンパク質またはペプチドの変性あるいは凝集による回収率低下が、実用化への大きな障害となっている。ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤が試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、ｐＨの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．第８８巻、第１６６−１７３頁、１９９９年、およびＪ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  第１５巻、第６９９−７１３頁、１９９８年を参照のこと）。一方、こうした問題が低減される親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが、やはり実用化には至っていない。また、安全性の面からは、徐放基材として用いる素材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならず、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放型製剤は現在のところ実現していない。
【０００４】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単
離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である（式（ＶＩ））。
【０００５】
【化１】
0004636883.tif 000002
【０００６】
ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）である。近年、微生物による高分子量ＨＡの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。
【０００７】
ヒアルロン酸を基材に用いた架橋方法、ヒアルロン酸ゲルからのタンパク質やペプチド薬物の徐放も多数報告されている。ＨＡを化学架橋でゲル化させる方法としては、カルボジイミド法（国際公開第９４／０２５１７号パンフレットを参照のこと）、ジビニルスルフォン法（特開昭６１−１３８６０１号公報を参照のこと）、グリシジルエーテル法（特開平５−１４０２０１号公報を参照のこと）等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する際、架橋後にタンパク質またはペプチドを導入する方法では、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を行うと、高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうしたｉｎ  ｓｉｔｕ架橋により、ヒアルロン酸誘導体ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入し、徐放させる製剤についての報告されている（例えば、米国特許第５８２７９３７号明細書を参照のこと）。しかし、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下でヒアルロン酸をｉｎ  ｓｉｔｕ架橋すると、回収率の点で問題がある。例えば、ヒドラジド基（ＨＺ）を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）をＮ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる架橋剤で架橋する方法（国際公開９５／１５１６８号パンフレットを参照のこと）が報告されているが、生理条件下での ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を目的として
いるため、ｐＨ７.４〜ｐＨ８．５で架橋形成反応を行っているが、本発明者らによる検
討では、この方法で得られるヒアルロン酸誘導体ゲルからの、タンパク質またはペプチドの回収率は低い。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にアミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。またゲル中に残った変性したタンパク質またはペプチドは、生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であり、タンパク質またはペプチドを反応させずにヒアルロン酸を化学架橋、ゲル化させる方法は知られていない。また、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（国際公開第００／４４８０８号パンフレットを参照のこと）、生分解性でないポリエチレングリコールの断片が残存する問題がある。
【発明の開示】
【０００８】
上述した如く、タンパク質またはペプチドの存在下でその生物活性を維持したままｉｎ
ｓｉｔｕで化学架橋し、ハイドロゲル中にタンパク質ペプチドを封入することで、高封入率、高回収率、安全性を満たす生分解性ゲル調製方法、これを用いたタンパク質またはペプチド徐放製剤は知られていない。
【０００９】
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、タンパク質またはペプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸に不飽和結合を有する基を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合を有する化合物で化学架橋、ハイドロゲル化することで、タンパク質またはペプチドの生物活性を維持したままこれらを効率よく封入でき、生分解性で安全なタンパク質またはペプチド徐放担体となることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明の一つの側面によれば、タンパク質またはペプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸に不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を不飽和結合を有する化合物で化学架橋、ハイドロゲル化することを特徴とした薬物徐放担体が提供される。
【００１１】
本発明の一つの側面によれば、
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する、Ｎ−置換アミド基またはエステル基に変換することにより、ヒドラジル基またはアミノ基を導入する工程、
（ｂ）上記ヒドラジル基またはアミノ基が導入されたヒアルロン酸誘導体に、メルカプト基を導入する工程、
を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法が提供される。
【００１２】
当該製造方法において、工程（ａ）により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（Ｉ）：
【００１３】
【化２】
0004636883.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｘ０は、−Ｏ−、または−Ｎ（−Ｒ１）−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、ま
たは−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｘ１は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−ＮＨ−Ｒ２、または−ＮＨ−Ｒ２であり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｙ２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、または−Ｎ（−Ｒ４）−であり、
Ｑ１は、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。
【００１５】
また式（Ｉ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。
【００１６】
さらに、式（Ｉ）において、好ましくはＸ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−である。式（Ｉ）において、好ましくはＲ１は、水素原子である。式（Ｉ）において、好ましくはＸ１は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−ＮＨ−Ｒ２である。式（Ｉ）において、好ましくはＹ１は、単結合、または、−Ｎ（−Ｒ３）−である。式（Ｉ）において、好ましくはＹ２は、単結合である。式（Ｉ）において、好ましくはＱ１は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。式（Ｉ）において、好ましくはＲ２およびＲ３は、水素原子である。
【００１７】
当該製造方法において、工程（ｂ）により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（ＩＩ）：
【００１８】
【化３】
0004636883.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｘ２は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ２−ＳＨ、または−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ２−ＳＨであり、
Ｘ０、Ｒ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５、Ｒａ６、Ｙ１、Ｙ２、Ｑ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記式（Ｉ）で定義したとおりであり、
Ｙ３は、単結合、−ＣＯ−、−Ｃ６Ｈ４−、−ＣＯ２−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−、−ＣＳＮＨ−、または−ＣＯＮ
Ｈ−であり、
Ｑ２は、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。
【００２０】
さらに、式（ＩＩ）において、好ましくはＸ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−である。式（ＩＩ）において、好ましくはＲ１は、水素原子である。式（ＩＩ）において、好ましくはＸ２は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ２−ＳＨである。式（ＩＩ）において、好ましくはＹ１は、単結合、または、−Ｎ（−Ｒ３）−である。式（ＩＩ）において、好ましくはＹ２は、単結合である。式（ＩＩ）において、好ましくはＱ１は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。式（ＩＩ）において、好ましくはＲ２およびＲ３は、水素原子である。式（ＩＩ）において、好ましくはＹ３は、−ＣＯ−である。式（ＩＩ）において、好ましくはＱ２は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。
【００２１】
本発明の別の側面によれば、有機溶媒中において、ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、メルカプト基を含む置換基を有するＮ−置換アミド基に変換する工程を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法が提供される。
【００２２】
当該製造方法において、生成するメルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（ＩＩａ）：
【００２３】
【化４】
0004636883.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｘ０は、−Ｏ−、または−Ｎ（−Ｒ１）−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｘ２ａは、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｑ３−Ｙ３−Ｑ２−ＳＨ、または−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ２−ＳＨであり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｙ２、Ｙ３は、それぞれ独立して、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、
−Ｎ（−Ｒ４）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯ−、または−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯＮ（−Ｒ５）−であり、
Ｑ１、Ｑ２およびＱ３は、それぞれ独立して、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。
【００２５】
また式（ＩＩａ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。
【００２６】
さらに、式（ＩＩａ）において、好ましくはＸ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＲ１は、水素原子である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＸ２ａは、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｑ３−Ｙ３−Ｑ２−ＳＨである。式（ＩＩａ）において、好ましくはＹ１は、単結合、または、−Ｎ（−Ｒ３）−である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＹ２は、単結合である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＹ３は、単結合である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＱ１、Ｑ２およびＱ３は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＲ２およびＲ３は、水素原子である。式（ＩＩａ）において、好ましくはＹ３は、−ＣＯ−である。
【００２７】
本発明の別の側面によれば、上記方法により作製された、メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体が提供される。
さらに、該メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（ＩＩＩ）：
【００２８】
【化５】
0004636883.tif 000006
【００２９】
（式中、Ｒａ１は、水酸基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルコキシ基であり、あるいはナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオンもしくは置換されていてもよいアンモニウムイオンからなる群から選ばれる陽イオンとカルボン酸塩を形成していてもよく、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝
Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨである。）
で示される繰り返し構造Ａと、上記式（ＩＩ）または（ＩＩａ）で示される繰り返し構造Ｂを含み、上記繰り返し構造ＡとＢの存在比率は、好ましくは９５：５〜１０：９０、より好ましくは、９０：１０〜１０：９０、更に好ましくは、８０：２０〜２０：８０である。
【００３０】
本発明のさらに別の側面によれば、
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有するＮ−置換アミド基に変換することにより、ヒドラジル基またはアミノ基を導入する工程、
（ｂ）上記ヒドラジル基またはアミノ基が導入されたヒアルロン酸誘導体に、不飽和結合を有する基を導入する工程、
の工程を含む、上記不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法が提供される。
【００３１】
当該製造方法において、工程（ａ）により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、上記式（Ｉ）で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。
【００３２】
当該製造方法において、工程（ｂ）により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（ＩＶ）：
【００３３】
【化６】
0004636883.tif 000007
【００３４】
（式中、Ｘ０は、−Ｏ−、または−Ｎ（−Ｒ１）−であり、
Ｘ３は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ４、または−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ４であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｙ２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、または−Ｎ（−Ｒ４）−であり、
Ｙ３は、単結合、−ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ５）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ５）−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｑ１は、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｑ４は、直鎖もしくは分枝Ｃ２−１０アルケニル基、または、直鎖もしくは分枝Ｃ２−１０アルキニル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。
【００３５】
また式（ＩＶ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。
【００３６】
さらに、式（ＩＶ）において、好ましくはＸ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−である。式（ＩＶ）において、好ましくはＲ１は、水素原子である。式（ＩＶ）において、好ましくはＸ３は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ４である。式（ＩＶ）において、好ましくはＹ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、または、−Ｎ（−Ｒ３）−であり、さらに好ましくは、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−である。式（ＩＶ）において、好ましくはＹ２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ３）−であり、さらに好ましくは−ＣＯＮ（−Ｒ３）−である。式（ＩＶ）において、好ましくはＹ３は単結合、−ＣＯ−、または、−Ｎ（−Ｒ３）−であり、さらに好ましくは、−ＣＯ−である。式（ＩＶ）において、好ましくはＱ１は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。式（ＩＶ）において、好ましくはＲ２およびＲ３は、水素原子である。式（ＩＶ）において、好ましくはＱ４は、直鎖または分枝Ｃ２−１０アルケニル基である。
【００３７】
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により作製された、不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体が提供される。
さらに、該不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは上記式（ＩＩＩ）で示される繰り返し構造Ａと上記式（ＩＶ）で示される繰り返し構造Ｃを含み、上記繰り返し構造ＡとＣの存在比率は、９５：５〜１０：９０、好ましくは、９０：１０〜１０：９０、更に好ましくは、８０：２０〜２０：８０である。
【００３８】
本発明のさらに別の側面によれば、上記不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合含有化合物で化学架橋して得られる、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体が提供され、また、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合含有化合物で化学架橋して得られる、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体が提供される。  
【００３９】
該化学架橋されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（Ｖ）：
【００４０】
【化７】
0004636883.tif 000008
【００４１】
（式中、Ｘ０は、−Ｏ−、または−Ｎ（−Ｒ１）−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｘ４は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｑ２−Ｓ−Ｌ、または−Ｎ（−Ｒ２）−Ｙ３−Ｑ２−Ｓ−Ｌであり、
Ｘ５は、−Ｑ３−または−Ｎ（−Ｒ２）−であり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｙ２は、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（−Ｒ４）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯ−、または−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯＮ（−Ｒ５）−であり、
Ｙ３は、単結合、−ＣＯ−、−Ｃ６Ｈ４−、−ＣＯ２−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−、−ＣＳＮＨ−、または−ＣＯＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２およびＱ３は、それぞれ独立して、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｌは、他の繰り返し構造のＬと一緒になって分子内または分子間架橋を形成する、場合によっては主鎖の末端または途中にＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５を含んでいてもよい、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルケニレン基、またはポリエチレンオキサイド基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（−Ｒ４）−、−ＣＨ（−Ｒ６）−、−Ｃ（−Ｒ６）（−Ｒ７）−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（−Ｒ４）−、−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯ−、または−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯＮ（−Ｒ５）−であり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水酸基、直鎖または分枝Ｃ１−４アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミド基、またはエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有する、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体である。
【００４２】
また式（Ｖ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、またはポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。
【００４３】
さらに、式（Ｖ）において、好ましくはＸ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−である。式（Ｖ）において、好ましくはＲ１は、水素原子である。式（Ｖ）において、好ましくはＸ４は、−Ｙ１−Ｑ１−Ｙ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｑ２−Ｓ−Ｌである。式（Ｖ）において、好ましくはＸ５は、−Ｎ（−Ｒ２）−である。式（Ｖ）において、好ましくはＹ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、または、−Ｎ（−Ｒ３）−であり、さらに好ましくは、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−である。式（Ｖ）において、好ましくはＹ２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ３）−であり、さらに好ましくは−ＣＯＮ（−Ｒ３）−である。式（Ｖ）において、好ましくはＹ３は単結合、−ＣＯ−、または、−Ｎ（−Ｒ３）−であり、さらに好ましくは、−ＣＯ−である。式（Ｖ）において、好ましくはＱ１は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。式（Ｖ）において、好ましくはＲ２およびＲ３は、水素原子である。式（Ｖ）において、好ましくはＱ２およびＱ３は、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。式（Ｖ）において、好ましくはＬは、一つまたはそれ以上の水酸基、カルボキシル基、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよい、直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基であり、さらに好ましくは直鎖または分枝Ｃ１−４アルキレン基である。
【００４４】
さらに、該化学架橋されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは上記式（ＩＩＩ）で示される繰り返し構造Ａと上記式（Ｖ）で示される繰り返し構造Ｄを含み、上記繰り返し構造ＡとＤの存在比率は、好ましくは９５：５〜１０：９０、より好ましくは、９０：１０〜１０：９０、更に好ましくは、８０：２０〜２０：８０である。
【００４５】
発明を実施するための好ましい形態
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明の薬物徐放担体は、タンパク質またはペプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸に不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を不飽和結合含有化合物で化学架橋、ハイドロゲル化することを特徴とする。
【００４６】
本発明の薬物徐放担体は、以下のような優れた特徴を有している。
１．完全生分解性、生体に対する安全性を付与できる。
２．ＨＡに架橋可能な官能基をグラフトすることで、架橋点間距離を非常に小さく（グル
クロン酸当たり３３モル％グラフトで約３ｎｍ）することが可能であり、長期徐放を実現する上で有利である。
３．高架橋密度である。
４．タンパク質の変性を防ぐことができる。
【００４７】
化学架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。
架橋時のｐＨは特に限定されないが、タンパク質またはペプチドを変性させずに不飽和結合とメルカプト基の選択的反応を優先させ、タンパク質またはペプチド含有アミノ基との反応を防ぐｐＨが好ましい。そのようなｐＨは当業者が適宜選択することが可能であるが、例えばｐＨ３．０〜９．０、好ましくはｐＨ６.０〜８．５である。
【００４８】
ヒアルロン酸に導入、あるいは架橋剤に含まれる不飽和結合は、Ｃ−Ｃ２重結合またはＣ−Ｃ３重結合のほか、Ｃ＝Ｏ結合、−Ｃ＝Ｎ−結合であってもよい。不飽和結合を有する基としては、特に限定されないが、例えば、メタクリロイル基、アクリロイル基、マレイミド基、ビニルスルフォン基、アセチレンカルボニル基等が挙げられる。
【００４９】
ヒアルロン酸に不飽和結合を有する基を導入した場合に用いられる架橋剤としては、不飽和結合と求核付加反応で反応するメルカプト基を２つ以上同一分子に含む化合物が用いられる。例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システインを２つ以上含むペプチド等が挙げられる。
【００５０】
ヒアルロン酸にメルカプト基を導入した場合に用いられる架橋剤としては、メルカプト基と求核付加反応で反応する不飽和結合を有する基を２つ以上同一分子に含む化合物が用いられる。例えば、エチレングリコールジメタクリレート、エチレンビスアクリルアミド、トリス−２−マレイミドエチルアミン、１，８−ビスマレイミドトリエチレングリコール、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタンなどを挙げることができる。
【００５１】
また、架橋反応時のタンパク質またはペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為に塩基性化合物を添加することが好ましい。用いる塩基性化合物としては特に限定されるものではないが、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、水酸化ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの水酸化物、アンモニア水、ピリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類が挙げられ、好ましくはアミン類が用いられ、さらに好ましくは、トリエタノールアミンが用いられる。
【００５２】
この際好ましい濃度としては、１０〜２０μＬ／ｍＬである。
また、架橋反応終了後、未反応のメルカプト基が長時間残存しているとタンパク質の変性を促すため、ゲル調製後は速やかに未反応のメルカプト基を洗い流したり、ヨード酢酸等のメルカプト基と選択的に反応する化合物を添加する等して、未反応のメルカプト基を除去することが好ましい。また、架橋剤の片末端のみがヒアルロン酸誘導体にグラフトされ、反応性を有するメルカプト基が残存し、これがタンパク質の変性に繋がる可能性があるため、このフリーなメルカプト基を除去する意味でもメルカプト基と選択的に反応する化合物を添加することが好ましい。
【００５３】
不飽和結合を有する基を導入したヒアルロン酸誘導体の調製方法は、特に限定されないが、例えば、メタクリル酸グリシジルエーテルや、無水メタクリル酸等をＨＡの水酸基に直接反応させる方法（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．５４、１１５−１２１、２００１）では高い導入率は得難い。これは、ヒアルロン酸が水溶液中で水素結合、疎水性相
互作用による高次構造を形成し、ヒドロキシル基、カルボン酸基等の官能基の反応性が低いためと考えられる。タンパク質やペプチドの徐放期間を延ばすには、高い架橋密度が望ましい。このためには、グルクロン酸部分のカルボキシル基に置換基を導入するのが望ましい。例えば、ヒアルロン酸を３級アンモニウム塩にして、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性有機溶媒に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカップリング剤存在下、不飽和結合を有するアミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。
【００５４】
不飽和結合を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、アリルアミン、ジアリルアミン、４−アミノ−１−ブテン、アクリルヒドラジド、メタクリルヒドラジド等を挙げることができる。
【００５５】
また上述の高い架橋密度を実現できるという点において、アミノ基やヒドラジド基を導入し、その後、このアミノ基やヒドラジド基に不飽和結合を有する基を導入する方法が好ましい。
【００５６】
例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、あるいはエチレンジアミン等の２価のヒドラジドまたはアミノ基含有化合物とを、ＥＤＣ等の縮合剤で縮合させ、ヒドラジド基修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）、またはアミノ基修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−アミノ基）を合成し、これに無水メタクリル酸を反応させる方法などが挙げられる。
【００５７】
メルカプト基導入ヒアルロン酸誘導体の調製方法は、特に限定されないが、例えば、ヒアルロン酸を３級アンモニウム塩にして、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性有機溶媒に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカップリング剤存在下、メルカプト基を有するアミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。
【００５８】
メルカプト基を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、２−アミノエタン−１−チオール、３−アミノプロパン−１−チオール、チオグリコール酸ヒドラジド、などを挙げることができる。
【００５９】
また高い架橋密度を実現できるというの理由で、まずアミノ基やヒドラジド基を導入し、その後このアミノ基やヒドラジド基にメルカプト基を導入する方法が好ましい。例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、あるいはエチレンジアミン等の２価のヒドラジドまたはアミノ基含有化合物とを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等の縮合剤で縮合させ、ヒドラジド基修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）、またはアミノ基修飾されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−アミノ基）を合成し、これに例えばＮ−スクシニミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プルピオネイト（ＳＰＤＰ）を反応させ、ＤＴＴ等の還元剤で還元、メルカプト基とする方法などが挙げられる。
【００６０】
ヒドラジド基のヒアルロン酸誘導体における導入率は特に制限されないが、通常、流動性のないゲルを得るためにヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸当たり５モル％以上が好ましく、１０モル％以上が特に好ましい。
【００６１】
アミノ基のヒアルロン酸誘導体における導入率は、流動性のないゲルを得るためにＨＡのグルクロン酸当たり５モル％以上、好ましくは１０モル％以上である。
不飽和結合を有する基のヒアルロン酸誘導体への導入率は、特に限定されないが、流動性のないゲルを得るためにヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸当たり５モル％以上が好ま
しく、１０モル％以上が特に好ましい。
【００６２】
メルカプト基のヒアルロン酸誘導体における導入率は、特に限定されないが、流動性のないゲルを得るためにヒアルロン酸のグルクロン酸当たり５モル％以上、好ましくは１０モル％以上である。
【００６３】
ヒアルロン酸に不飽和結合を有する基を導入後、メルカプト基で架橋する場合、メルカプト基の、不飽和結合を有する基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、タンパク質およびペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和結合を有する基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、メルカプト基：不飽和結合＝３：１〜１：１が好ましい。更に好ましくは、２：１〜１．５：１である。
【００６４】
ヒアルロン酸にメルカプト基を導入後、不飽和結合を有する基で架橋する場合、不飽和結合を有する基のメルカプト基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和結合を有する基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、不飽和結合：メルカプト基＝３：１〜１：１が好ましい。更に好ましくは、２：１〜１．５：１である。
【００６５】
ＨＡ誘導体と薬理作用を持つタンパク質、ペプチドとからなるハイドロゲルの調製方法としては、例えば、ＨＡ誘導体とタンパク質またはペプチドをリン酸緩衝生理食塩水に溶解した後、ここに架橋剤を加えて均一分散させ室温、または４℃で反応させればよい。本架橋方法は比較的反応速度が遅いため、より均一にＨＡを架橋、均一なゲルを調製できる利点がある。これは徐放性能の安定化、長期化に有効である。
【００６６】
本発明に用いられるヒアルロン酸は、どのようにして得られたヒアルロン酸でもよく、動物組織から抽出されたヒアルロン酸、発酵法で得られたヒアルロン酸、化学合成で得られたヒアルロン酸など、その由来は限定されない。さらに、加水分解処理など、ヒアルロン酸にさらなる処理を行ってもよい。
【００６７】
本発明のＨＡには、様々な方法で修飾された修飾ＨＡや、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩なども含有される。ＨＡはカルボキシル基とハイドロキシル基が修飾されることが多いが、本発明において修飾ＨＡはどの部分が修飾されていてもよい。修飾ＨＡは特に限定されず、どのような修飾がされていてもよいが、例えば、硫酸化されたＨＡ（国際公開第９５／２５７５１号パンフレット）、Ｎ−硫酸化されたＨＡ（国際公開第９８／４５３３５号パンフレット）、エステル化されたＨＡ（欧州特許出願公開第０２１６４５３号明細書、国際公開第９８／０８８７６号パンフレット、欧州特許出願公開第０３４１７４５号明細書）、過沃素酸酸化されたＨＡ、アミド修飾されたＨＡなどを挙げることができる。
【００６８】
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は特に限定されず、いかなる分子量のヒアルロン酸でも使用することが可能であるが、通常５０００〜３５０万ダルトン、好ましくは１万〜２００万ダルトンのヒアルロン酸を用いることができる。
【００６９】
薬効を持つタンパク質、ペプチドとしては特に限定されないが、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニューロトロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＦＧ）、インターロイキン−１レセプ
ターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー等が挙げられる。
【００７０】
本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、特に限定されないが、例えば、ハイドロゾルまたはオルガノゾルであってもよく、好ましくはハイドロゾルである。
本発明の徐放担体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
【００７１】
インジェクション可能な微粒子状にするためには、例えば、ゲル化後に乾燥、凍結粉砕する方法、エマルジョン法で微粒子状のゲルを調製した後、乾燥させる方法、スプレードライ法や、超臨界溶液法などの乾燥微粒子調製法、また、本組成物を架橋反応終了前に溶液状態で投与、体内で架橋させる方法など、既知の方法を採用することができる。
【実施例】
【００７２】
ＥＰＯ封入ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体ハイドロゲルの調製
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７３】
ＮＭＲ測定は、核磁気共鳴装置  ＪＮＭ−ＥＣＡ５００（日本電子株式会社製）を用いて重水を溶媒に用いて測定した。また置換基の導入率の決定は、導入した置換基特有のピークとヒアルロン酸由来のピークの積分比より決定した。
【００７４】
逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析は、Ｗａｔｅｒｓ６００Ｓコントローラ、７１７ｐｌｕｓオートサンプラー、４８６紫外光吸収測定器（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、以下の測定条件より行った。
【００７５】
カラム：Ｃ４（粒子径  ５μm、サイズ  ４．６×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝４００／１００／１、Ｂ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝１００／４００／１
流速：１ｍＬ／分、移動相Ａ／Ｂ＝６５／３５〜０／１００のグラジエント溶出
カラム温度：室温付近
サンプル温度：４℃
検出波長：ＵＶ  ２８０ｎｍ
解析ソフト：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ｖｅｒ．３．２１
【００７６】
［実施例１］
〔実施例１−１〕  ヒドラジド基（ＨＺ）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量１．９×１０５ダルトンのヒアルロン酸（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）２００ｍｇを０．５％濃度で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調製した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．３：４０（バッチ１−１）、１：１：４０（バッチ１−２）、１：５：４０（バッチ１−３）モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で攪拌下２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液で透析（スペクトラポア７、分画
分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のＨＡ−ＨＺを得た。
【００７７】
得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、それぞれ、ＨＡのカルボン酸の２６％（バッチ１−１）、４６％（バッチ１−２）、６９％（バッチ１−３）がＨＺ化されていた（ＨＡおよびＨＡ−ＨＺのＮ−アセチル基、２．１ｐｐｍ（３Ｈ）、ＨＡ−ＨＺのアジピン酸由来部分のメチレン基、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ（各２Ｈ）を比較）。
【００７８】
〔実施例１−２〕  メタクリロイル基（ＭＡ）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＭＡ）の合成
実施例１−１のバッチ１〜３のＨＡ−ＨＺ、各々９０ｍｇを０．４５ｍＬの１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８に溶かし（ＨＡ−ＨＺ２％ｗ／ｖ）、０．５４ｍＬの無水メタクリル酸を加え、室温で攪拌下１日反応させた。エタノールで沈殿、洗浄し、乾燥させた。また、得られたＨＡ−ＭＡ中のＭＡ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した結果を表１に示す。（ＨＡおよびＨＡ−ＭＡのＮ−アセチル基、２．１ｐｐｍ（３Ｈ）、ＨＡ−ＭＡのメタクリロイル基のビニルプロトン、５．５−６．０ｐｐｍ（２Ｈ）を比較）。
【００７９】
【表１】
0004636883.tif 000009
【００８０】
〔実施例１−３〕  ＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲル調製
実施例１−２のバッチ３の、ＭＡの導入率が２９％であるＨＡ−ＭＡ１１ｍｇと、ＥＰＯ１００μｇを０．２５ｍＬのリン酸食塩水バッファーｐＨ７．４（ＰＢＳ）に溶かした（室温、１時間攪拌）。これに、３．５μＬのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、１０μＬのジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液（９２．５５ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ）を加えた。室温で３時間反応させるとゲルになった。このゲルを４００ｍＬのＰＢＳに対して３時間透析し、未反応のＤＴＴを洗浄した。
【００８１】
［実施例２］
実施例１−３でゲル調製後透析せずに１０μＬのヨード酢酸溶液（２２３．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ、ＤＴＴの２倍モル）を加えたこと以外は実施例１−３と同様の方法でＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルを調製した。
【００８２】
［実施例３］in situ 架橋ＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲル
実施例１−２のバッチ２の、ＭＡの導入率が２９％であるＨＡ−ＭＡ２２ｍｇと、ＥＰＯ４００μｇを０．４８ｍＬのリン酸食塩水バッファーｐＨ７．４（ＰＢＳ）に溶かした（室温、１時間攪拌）。これに、３．５μＬのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、２０μＬのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（９２.５５ｍｇ/ｍＬ）を加えた。室温で１０分間攪拌した後、１ｍＬシリンジに詰め、ＤＴＴ添加１２０分後、ラット皮下に１００μＬ投与（２２ゲージ針使用）した。４時間後に皮下からゲルを回収した。図２にラットの皮下へ注入した状態および回収されたゲルの写真を示す。皮下で本組成の溶液は架橋、ゲル化することがわかる。
【００８３】
比較例１
実施例１のＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲル調製において、２０μＬのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（９２.５５ｍｇ／ｍＬ）を加え、ｐＨ８．０のＰＢＳ中で反応させ、ＴＥＡ
を加えなかったこと以外は実施例１−３と同様の方法でＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルを調製した。
【００８４】
比較例２
実施例１のＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲル調製において、５μＬのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（９２.５５ｍｇ／ｍＬ）を加え、ｐＨ８．０のＰＢＳ中で反応させ、ＴＥＡを
加えなかったこと以外は実施例１と同様の方法でＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルを調製した。
【００８５】
比較例３
実施例１のＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲル調製において、１０μＬのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（９２.５５ｍｇ／ｍＬ）を加え、ｐＨ８．０のＰＢＳ中で反応させ、ＴＥＡ
を加えなかったこと以外は実施例１と同様の方法でＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルを調製した。  
【００８６】
試験例１：ＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルのＥＰＯ回収率測定
実施例１、２、および比較例１〜３のゲル（１００μｇ／ｍＬ  ＥＰＯ含有０．２５ｍＬゲル）にＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ＳＤ（生化学工業製）０．５ユニットを含むＰＢＳｐＨ７．４を０．７５ｍＬ加え、２５℃で３時間、酵素処理を行い、ゲルを完全に分解させた。酵素処理後の溶液０．１５ｍＬを、試料溶液とした。試料溶液は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）測定を行い、０．１ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークエリア比から試料溶液中ＥＰＯ濃度を算出した。添加したＥＰＯ量（０．１ｍｇ／ゲル１個）に対してＲＰ−ＨＰＬＣより求めたＥＰＯ量を回収率として算出した。
【００８７】
ゲル化に要する時間、仕込みのＥＰＯに対するゲルから回収されたＥＰＯの回収率を表２に示す。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
試験例２：ＥＰＯ封入ＨＡヒドロゲル調製からのＥＰＯ徐放
実施例２のゲルを２ｍＬのＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、経時的に２００μＬサンプリングした。ＲＰ−ＨＰＬＣでバッファー中に放出されたＥＰＯを定量した。
【００９０】
ゲル調製直後にヒアルロニダーゼで分解、回収されたＥＰＯを１００％とした時のゲルからのＥＰＯ放出性を図１に示す。尚、１２日後にヒアルロニダーゼを添加した。ゲル内のＥＰＯは変性せず、９０％以上が徐放されることが分かる。
【００９１】
上記実施例に例示された、ヒアルロン酸架橋方法を用いることで、タンパク質またはペプチドの生物活性を維持したままこれらをｉｎ  ｓｉｔｕ架橋し、ハイドロゲルの中に封入したタンパク質またはペプチド徐放製剤を調製することが可能である。
【００９２】
試験例３：in situ 架橋ＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルからのＥＰＯ徐放性能
実施例３の調製液をＤＴＴ添加後、室温で１５０分間放置した後、１２０μＬをラット皮下に投与した。血清中のＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡキット（Roche Diagnistics GmbH, Mannheim, Germany）で測定した。表３にWinNonlin ver. 2.1 (Pharsight社)を用いてノン
コンパートメントモデルで解析した平均滞留時間（ＭＲＴ）を示す。対象として、ＥＰＯ溶液、ＥＰＯ＋ＨＡ（分子量２００万ダルトン、１％濃度）溶液のＭＲＴを示す。ＥＰＯ溶液の解析データは、文献値（加藤基浩, 遺伝子組換えヒト型エリスロポエチン (EPOCH)
皮下投与後の体内動態(1): 非標識EPOCH単回投与時のラット、イヌにおける動態; 薬物
動態, 8[4], 471-479, 1933）を基に投与量を補正したシミュレーションデータより算出
した値を表３に示す。本架橋ゲルからのＥＰＯ放出期間が延長された。
【００９３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の薬物徐放担体は、タンパク質またはペプチドの生物活性を維持したままこれらをｉｎ  ｓｉｔｕ 化学架橋、ＨＡハイドロゲル中に封入でき、優れた回収率でタンパク
質、ペプチドの徐放を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、実施例２のゲルを２ｍＬのＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、経時的に２００μＬサンプリングし、ＲＰ−ＨＰＬＣでバッファー中に放出されたＥＰＯを定量した結果の１例を示す図である。
【図２】図２は、本発明のヒアルロン酸誘導体を含む溶液をラットの皮下へ注入した状態および回収されたゲルの１例を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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