(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された圧力で溶媒組成を確立する高圧液体クロマトグラフィ・システムであって、
ケーソン・チャンバと、
前記ケーソン・チャンバ内を往復運動し、かつ前記ケーソン・チャンバの内部圧力を生み出すピストンと、
前記ピストンに連絡し、かつ前記ピストンを駆動するモータと、
前記ケーソンの内部圧力を感知するセンサと、
前記システムに移動相を提供する溶媒組成物生成器と、
前記溶媒組成物生成器に流体連絡し、かつ前記移動相を受容する貯蔵マトリックスと、
前記貯蔵マトリックスに流体導管によって接続された流体アキュムレータとを含み、
前記流体アキュムレータが前記ケーソン・チャンバの内部に配置されるシステム。
【請求項２】
前記流体アキュムレータへの体積排出量を検出する液量変位センサをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ケーソン・チャンバから前記溶媒組成物生成器を切り離す弁をさらに含み、前記弁が、流体導管を介して前記ケーソン・チャンバに前記溶媒組成物生成器を連結する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ピストンと前記ケーソン・チャンバの間に液圧による封止をもたらす封止材をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
プロセッサにして、前記液量変位センサから伝達された情報を処理するプロセッサをさらに含み、前記情報を使用して、前記流体アキュムレータへの前記体積排出量を少なくとも１つの流体計量ユニットからの溶媒の体積送出により校正する、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記液量変位センサが、線形可変差動変圧器、静電容量式変換器、線形光学式エンコーダ、および抵抗変換器からなる群から選択される、請求項２に記載のシステム。
【請求項７】
前記封止材が、前記ケーソン・チャンバ内のキャビティに存在し、かつ前記ピストンの外径に整合する、請求項４に記載のシステム。
【請求項８】
前記貯蔵マトリックスに接続されたインゼクタをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記モータが回転運動をもたらし、前記回転運動が、ねじスピンドルおよびナット構成によって直線運動に変換される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ねじスピンドルが軸受によって前記ピストンに連結される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ケーソン・チャンバに充填するために前記ケーソン・チャンバに接続された注入口をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記溶媒組成物生成器が、
少なくとも１つの計量ユニットと、
前記少なくとも１つの計量ユニットを独立に作動させる少なくとも１つのモータと、
前記少なくとも１つの計量ユニットに流体連絡する少なくとも１つの溶媒貯蔵部と、
前記少なくとも１つの溶媒貯蔵部に前記少なくとも１つの計量ユニットを連結する少なくとも１つの弁と
をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの計量ユニットが、
シリンダと、
前記シリンダ内に配置されたピストンと、
前記ピストンと前記シリンダとの界面を封止するピストン封止材と、
前記ピストンを駆動させるピストン・アクチュエータと
を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの計量ユニットが圧力センサをさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの弁が、流体導管を介して一緒に接続された複数の弁を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの溶媒貯蔵部からの流体の体積送出を制御するプロセッサをさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
前記液量変位センサが、前記流体アキュムレータの変位と前記溶媒組成物生成器からの体積送出との関係を校正するのに使用される前記流体アキュムレータへの流体排出量に対応する信号を生成する、請求項２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記液量変位センサが、前記位置センサのコアとハウジングの間に配置された肉厚非磁性ステンレス鋼チューブを含み、前記コアのみが前記ケーソン・チャンバ内に存在するようになされている、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
選択された圧力で溶媒組成を確立するためのケーソン・チャンバであって、
貯蔵マトリックスと、
前記貯蔵マトリックスに流体連絡する流体アキュムレータと、
前記ケーソン・チャンバに流体を導入する前記ケーソン・チャンバの流体口と
を含むケーソン・チャンバ。
【請求項２０】
前記流体アキュムレータに排出されまたは前記流体アキュムレータから排出される液量を測定する液量変位センサをさらに含む、請求項１９に記載のケーソン・チャンバ。
【請求項２１】
前記ケーソン・チャンバが、前記流体口を介し遠隔加圧源に接続される、請求項１９に記載のケーソン・チャンバ。
【請求項２２】
前記加圧源が、前記液量変位センサから得られる制御信号に応答して圧力を提供する、請求項１９に記載のケーソン・チャンバ。
【請求項２３】
選択された圧力で溶媒組成物を形成するための方法であって、
選択された圧力で溶媒組成物を形成すること、
ケーソン・チャンバを減圧することによって少なくとも１つのポンピング・ユニットに正圧を形成し、それによって、前記ポンピング・ユニットから貯蔵マトリックスに、選択された圧力で溶媒を放出すること、および
前記ケーソン・チャンバに圧力を加え、それによって前記貯蔵マトリックスから前記溶媒を放出すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記貯蔵マトリックスに導入された最初のボリュームの溶媒が前記貯蔵マトリックスから放出される最後のボリュームの溶媒になるように、前記貯蔵マトリックスから前記溶媒を逆の順序で引き出す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記貯蔵マトリックスから放出された溶媒が、高圧下でクロマトグラフィ・カラム内に放出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記貯蔵マトリックスから放出された溶媒が、低圧下でクロマトグラフィ・カラム内に放出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
選択された圧力で溶媒組成を確立する高圧液体クロマトグラフィ・システムであって、
ケーソン・チャンバと、
前記ケーソン・チャンバを加圧するための手段と、
前記ケーソン・チャンバを加圧するための前記手段に連絡しかつ前記ケーソン・チャンバを加圧するための前記手段を駆動する駆動手段と、
前記システムに移動相を提供する流体組成物形成システムと、
前記流体送出システムに流体連絡し、前記移動相を受容する貯蔵マトリックスと、
流体導管によって前記貯蔵マトリックスに接続される流体アキュムレータとを含み、
前記流体アキュムレータが前記ケーソン・チャンバの内部に配置されるシステム。
【請求項２８】
前記ケーソン・チャンバの内部圧力を感知するセンサをさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記流体アキュムレータへの流体排出量を検出する液量変位センサをさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
プロセッサにして、前記液量変位センサから伝達された情報を処理するプロセッサをさらに含み、前記情報を使用して、前記流体アキュムレータへの流体排出量を少なくとも１つの流体計量ユニットからの溶媒の体積送出により校正する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記ケーソン・チャンバから前記流体送出システムを切り離す弁をさらに含み、
前記弁が、流体導管を介して前記流体送出システムを前記ケーソン・チャンバに連結する、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３２】
前記ピストンと前記ケーソン・チャンバの間を封止する封止材をさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３３】
前記貯蔵マトリックスに流体連絡するインゼクタをさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３４】
前記インゼクタによって低圧でサンプルを注入する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記インゼクタによって高圧でサンプルを注入する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
前記ケーソン・チャンバに充填するために前記ケーソン・チャンバに接続された注入口をさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３７】
前記流体組成物形成システムが、
少なくとも１つのシリンジ・ユニットと、
前記少なくとも１つのシリンジ・ユニットを独立に作動させる少なくとも１つのモータと、
前記少なくとも１つのシリンジ・ユニットに流体連絡する少なくとも１つの溶媒貯蔵部と、
前記少なくとも１つのシリンジ・ユニットを前記少なくとも１つの溶媒貯蔵部に連結する少なくとも１つの弁と
をさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのシリンジ・ユニットが、
シリンダと、
前記シリンダ内に配置されたピストンと、
前記ピストンと前記シリンダとの界面を封止するピストン封止材と、
前記ピストンを駆動させるピストン・アクチュエータと
を含む、請求項３７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に高圧キャピラリ液体クロマトグラフィに関し、より詳細には、液体クロマトグラフィの分野で役立つような、溶媒または溶媒混合物を高圧送出するための方法および装置に関する。
【０００２】
（関連技術の背景）
ＨＰＬＣを実施するには、一般に、分離されまたは分析される分子種を、移動相である液体に溶解し、その液体によって固定相内を移送させる必要がある。固定相では、その表面積が大きく、移動層と密に接触している。移動相に溶解させた検体化合物の混合物は、検体種ごとに様々に作用する吸着または保持プロセスによって、カラム通過中に分離することができる。保持率に差があるので、検体は、時間および体積に対してカラムから溶離される。溶離する検体は、一般にイン・ライン式検出器内を通過するが、そこでは検体の定量的および／または定性的な試験が行われる。
【０００３】
高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）溶媒送出システムは、単一成分の液体または液体の混合物を、選択された圧力で、すなわち実質上大気圧から平方インチ当たり１万ポンド程度までの圧力範囲で得るために使用される。上記圧力は、固定相保持の流体通路に移動相を押しやり、そこで、溶解している検体を分離させることが可能であることが必要である。固定相保持体には、粒子の充填層、膜または膜の集合体、一般に固体保持体にエッチングされた流体通路のアレイを含む微細加工構造、あるいはオープン・カラムまたはチューブを含めることができる。
【０００４】
しばしば、分析条件によれば、「勾配溶離」と呼ばれる分析中に移動相組成が変化する。勾配溶離では、移動相の粘度が変化する可能性があり、必要とされる体積流量を維持するのに必要な圧力もそれに応じて変化することになる。
【０００５】
検体分子の溶離挙動は、固定相と移動相の両方の特性に関係がある。固定相の性質が分析の始めから終わりまで実質上固定されたままである限り、溶離挙動の変動は主に移動相の性質の変動によってもたらされる。クロマトグラフィの「定組成モード」では、溶媒組成は時間に対して実質上一定のままであり、サンプル中の検体は、所定の移動相体積がカラムを移動したときに溶離する傾向がある。クロマトグラフィの「勾配モード」では、ユーザ定義のプロフィルを追跡しつつ、溶媒組成を時間に対して変化させる必要がある。このモードでは、検体は、送出された溶媒の組成と体積の両方に応答して溶離することになる。
【０００６】
液体クロマトグラフィで行われる分離プロセスによって、注入されたサンプル混合物をその構成成分に分離することができる。これらの構成成分は、カラムから、別個のゾーンまたはバンドへと溶離される。これらのバンドが検出器を通過するとき、それらの存在をモニタすることができ、検出器の出力を生成することができる。この出力は、時間的に変化する電気信号によって表すことが可能な溶離バンド中の検体濃度のパターンを含んでおり、「クロマトグラフィ・ピーク」という名称が付けられている。これらのピークは、その保持時間、すなわち注入の時間に対してバンドの中心が検出器を通過する時間に関し、特徴付けることができる。多くの適用例では、標準または校正物質を組み込んだ関連分析に基づいて、溶離する検体の実体を推測するために、ピークの保持時間を使用する。ピークの保持時間は、固定相を通過する移動相の組成および移動相の体積による強い影響を受ける。
【０００７】
クロマトグラフィの有用性は、実験ごとの再現性に大きく依拠しており、その結果、得られたデータに自信を持って、所与の分析を標準または校正物質の分析と比較することができる。既知のポンピング・システムは、非理想的な特性を示し、分離性能を低下させ、実行ごとの再現性も低下させる。
【０００８】
既知のポンピング・システムで示される非理想的なポンプ特性には、一般に、溶媒組成の変動および／または体積流量の変動がある。現在の、また既知のＨＰＬＣポンピング・システムにおけるそのような体積流量の変動によって、不都合なことに、所与の検体の保持時間にばらつきが生じる。すなわち検体が固定相内に保持される時間は、望ましいことではないが、望ましくない体積流量の変動に応じて変動する。このため、成分の保持挙動からサンプルの実体を推測することが困難になる。体積流量が変動すると、多連ポンプの出力を合わせて溶媒組成物を得るときに、その溶媒組成に変動をもたらす可能性がある。
【０００９】
現在の、また既知のＨＰＬＣシステムにおける溶媒組成の変動によって、不都合なことに、システム検体検出器との相互作用が生じて乱れが生じ、これが、あたかもサンプルの存在から生じたように検出される。実際に、妨害信号が発生する。未知のサンプルの量を溶離サンプル・ピークの面積から計算するとき、この妨害信号が、検体に起因する実際の信号と合わせられ、誤差が生じる。
【００１０】
上記事項に照らしてみると、ＨＰＬＣ送出システムに課される要件は厳しい。ＨＰＬＣポンプは、一般に平方インチ当たり数ポンドの圧力から平方インチ当たり１０，０００ポンド程度に及ぶ圧力で、溶媒を送出する必要がある。荷重を受けて封止材が変形し、また完全に封止材から漏れることも含め、高圧に対しクロマトグラフィ用の液体を送出することに関する問題および非理想的な影響がある。ＨＰＬＣポンプは、移動相溶媒を、精密に制御された流量でスムーズにかつ均一に出力することが期待される。勾配クロマトグラフィの場合、または定組成クロマトグラフィの場合、すなわち固定溶媒組成物が分離中にリアルタイムでブレンドされる場合は、送出中に、移動相の組成ならびに流量を精密にかつ正確に制御するという別の要件がある。しかしシステム動作圧は、分離中に非常に大きく変化している可能性があり、構成移動相溶媒の圧縮率は全く異なる可能性がある。
【００１１】
大量の流体の圧縮または緩和に関連する大きな誤差は、クロマトグラフィによる分離期間を通じて溶媒を送出するために多重シリンジ行程を利用する、容積が小さいシリンジ・ポンプを使用することによって、最小限に抑えることができる。しかし、これらのポンプは一般に、流体送出が１つのシリンジ・サイクルから次のシリンジ・サイクルに移行することに伴う流れの乱れの影響を受ける。
【００１２】
クロマトグラフィによる分離および分析の新たな領域は、極めて小さい口径の分離カラムの使用を中心に発達しつつある。そのようなカラムは「キャピラリ・カラム」と呼ばれており、その直径は、一般に３０〜８００ミクロンの範囲の内径である。そのようなカラムには粒子状の充填材料を充填することができ、あるいは最小の直径範囲では、固定相を、カラムの壁面そのものによって設け、またはカラムの壁面に施されたコーティングによって設けることができる。そのような粒子状物質が充填されたキャピラリ・カラムに関する移動相の流量は、一般に、分当たり約１ナノリットルから分当たり約１０マイクロリットルまたはそれ以上の範囲にすることができる。これらの数字は、例えば広く市販されている内径４ミリメートルのカラムで現在実施されているよりも、流量が３〜６桁少ないことを表し、したがって分離体積も同様に減少することを表している。キャピラリ・カラムを中心として設計されるＨＰＬＣシステムは、ＨＰＬＣ分離と下流のプロセス、すなわち大量のＨＰＬＣ移動相を容易に取り扱うことができないプロセスとを組み合わせたとき、または著しく高価な移動相を使用することが望まれる場合に、特に有用である。そのようなプロセスの例には、（１）質量分析前の高真空条件でサンプルが気相中に存在する必要がある質量分析法、（２）ＨＰＬＣ用の有機溶媒は電磁スペクトルの赤外領域での検体検出を妨害することから、このＨＰＬＣ用の有機溶媒を無くさなければならない赤外分光法、（３）ＨＰＬＣ移動相による関連バックグラウンドの汚染を最小限に抑えた状態で、検体を収集基板上に少量堆積させることを必要とするミクロフラクション収集、および（４）プロトンＮＭＲの場合の重水置換移動相など、若干珍しい移動相を使用することによって著しく信号バックグラウンドが低下することから利益を得ることが可能な核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）がある。
【００１３】
実質上、溶媒組成および流量送出の精度および正確度に関してはより大規模なクロマトグラフィの場合と同様の要件が存在するが、送出を制御するメカニズムは、従来の体積規模の約１０００分の１またはそれ以下で機能しなければならない。特に、非常に大きい体積規模では見逃されていた可能性のある所与の実装例での非理想的な性質によって、この規模のキャピラリＨＰＬＣのシステムに、圧倒的に大きい乱れが引き起こされる。
【００１４】
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ヒューレット・パッカード）から入手可能であり製品名ＨＰ１０９０／ＤＲ５で販売されている標準的な分析規模のＨＰＬＣ（カラム内径１〜４ｍｍ）用連続送出ポンピング・システムの既知の実装例では、適度な中間圧力に対して作動する複数の容積式ピストン・ポンプを使用して、実行時間に勾配を形成した。合わせた出力を低圧アキュムレータに供給し、次いでダイヤフラムの原理に基づいて構成された直列またはイン・ライン式のブースタ・ポンプ・ステージに供給した。ブースタ・ポンプは約１０Ｈｚという固定周波数で作動したが、その可変行程容積は、溶媒計量／比例ステージの出力流れに適応したものであった。ブースタ・ステージは、従来の（５０００〜６０００ＰＳＩＧ（３５１．４〜４２１．６ｋｇ／ｃｍ2））ＨＰＬＣ範囲内の中間圧力から完全システム動作圧で、比例混合物を得た。直列構成を使用したので、ポンプの遅延体積は約３００マイクロリットル以上であった。この遅延体積は、内径２ｍｍおよび内径４ｍｍのカラムの動作では完全に許容されるものであるが、内径１ｍｍのカラム・サイズではかなり大きいものであり、キャピラリの領域では不適当であり、特に、キャピラリの内径が３０〜５０ミクロンにまで小さくなりその流量が分当たりナノリットルという場合、不適当である。
【００１５】
この実装例の別の欠点は、ダイヤフラム・ブースタ・ステージが、行程周波数１０Ｈｚで１００ＰＳＩＧ（７．０ｋｇ／ｃｍ2）の範囲内の相当なＡＣ圧力脈動を下流システムに与えたことである。このＡＣ脈動が存在したために、ダイアフラム・ポンプの出力流に連通するコンプライアント・パルス・ダンパを使用する必要があったが、これはいくつかの観点から望ましいものではなかった。最後に、このシステムは、内径４ｍｍのカラムで必要とされる分当たり最大５ミリリットルの流量で連続溶媒送出が実行されるように設計されていたので、中間圧力溶媒ポンプのそれぞれは、それ自体が、２つのシリンダおよびそれに関連付けられた弁を備えた連続送出往復ポンプであり、その結果、複雑で高価なシステムになった。
【００１６】
Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｔ．他、Ｊ．Ａｍ  Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、６、５７１〜５７７（１９９５）には、キャピラリ・サイズの規模で動作可能になるよう設計された、溶媒送出システムの代替の実装例が記載されている。Ｄａｖｉｓ他によって開示された手法は、２つの低圧シリンジ・ポンプを使用して、開放した管材のループ内に一時的に存在する溶媒組成物を生成することにより、勾配を形成することを含む。このループは、外部ループ・インゼクタにならい、各端部で市販の６ポート切換弁に接続されている。切換弁を作動させると、外部ループの流体分は、カラムに、また高圧対応シリンジ・ポンプに連通するように配置される。シリンジ・ポンプは、キャピラリ分析カラムを通して外部ループの流体分が放出されるように、圧力源として動作する。定圧動作モードについて論じるにあたり、著者は、自身のシステムでは定流動作が実質上できないことを以下のように認めている。「カラムからの実際の流れを直接測定する方法はなく、その流量を維持するためのポンプへのフィードバックもない。ピストンは単に定速で動くだけであり、システムが平衡に達するのに驚くほど長い時間がかかる可能性があり、測定された流量は、実行中にかなり変化する可能性がある。」Ｄａｖｉｓ他が述べたシステムは、直径が比較的小さい、したがってかなりの制約を受けるキャピラリ・カラムに接続された、容積が非常に大きいシリンジ、すなわち液圧容量が大きいことを表すシリンジを含む。そのようなシステムは確かに、分析カラムの抵抗変化またはシリンジ・ポンプの流量変化に応答して、液圧時定数または流量修正時間が非常に長くなることが予想される。この修正時間は、何分から何時間にも及ぶと考えられる。したがって、全ての実用的な目的で、クロマトグラフィを実行する過程において、シリンジ・ポンプ送出流量とカラム流量の間に予想される相関はほとんどないと考えられる。著者は、「ペプチドとタンパク質をキャピラリＨＰＬＣによって分離するとき、定圧と定流動作の間に著しい差はない」と主張しているが、それでも、定圧動作の過程では、勾配溶離中の溶媒粘度の変化から流量変化が生じ、定圧動作が「サンプルの沈殿あるいは管材内またはカラム上でのその他の閉塞によって生じる流動に関する問題」の影響を受けやすいことを認めている。
【００１７】
実際、生物学的マトリックスから引き出されたサンプルをキャピラリ・クロマトグラフィによって分離する場合、１回目の実験から次の実験まで、測定できるほどにカラム抵抗変化を見ることは珍しいことではない。この影響は、物理的構成および充填のわずかなばらつきに起因する、１つのカラムから別のカラムに一般的に観察されるカラム抵抗の変動に重ねられる。流量の変化が小さいとしても、検出器のピーク面積からサンプル量を定量するというユーザの能力は損なわれるが、それは面積測定が一定の流量を前提とするからである。流量変化が大きいと、電気スプレイ／ナノスプレイの界面で安定したスプレイ挙動を首尾よく維持することができるというシステムの特性に影響を与える。これらの例は、定圧とは対照的に、定体積流量でＨＰＬＣがなぜ最適に実施されてきたかを示している。Ｄａｖｉｓのシステムは、ユーザに対し、カラムに与えられた実際の送出流量に関する定量的測度を実質上提供していない。
【００１８】
最後に、Ｄａｖｉｓ他によって開示された手法は、勾配貯蔵装置として、開放した管材のループを使用することを教示している。Ｄａｖｉｓの参考文献の図３は、開放管材のループを貯蔵装置として使用する場合、求められる勾配組成プロフィルと分析カラムに送出された実際の勾配組成プロフィルとの間には、非常に大雑把な関係しかないことを示している。この挙動は、開放管材貯蔵装置が、流体の投入中および放出中に開放管内で実現されたポアズイユの流動プロフィルに起因する組成バンドまたはゾーンの広がりと、溶媒組成勾配が管内に存在する間に密度で推進される流体の運動との影響を受け易いことに照らして見ると、驚くことではない。
【００１９】
最近、直径が極めて小さい充填材料、すなわち直径が３ミクロン未満の充填材料と、それに付随した高い移動相圧力、すなわちそのような充填粒子が充填された層を通して液体を推進させるのに必要な圧力を使用してＨＰＬＣ分離を行う能力に、関心が集まっている。ＨＰＬＣの分離特性が高められたことが実証されているが、特に、分離の絶対ピーク容量、または単位時間当たりの溶離されたピークで表される分離処理能力は、小さい充填粒子および高いシステム圧力を正しく使用することによって、かなり改善することができる。直径１ミクロン程度の小さい粒子と１０，０００〜１００，０００ＰＳＩＧ（７０２．７〜７０２７．２ｋｇ／ｃｍ2）の範囲のシステム圧力の有用性が実証されてきた。しかし、そのような分析では、カラムの長さ全体にわたる圧力低下が極めて大きい条件下で、カラムの自己発熱の形の電力損失が著しい可能性がある。したがって、カラムの直径を可能な限り小さく維持することが望ましく、その内径はしばしば３０〜７５ミクロンの範囲である。これらの小さいカラムの直径は、これに相応した少量流量要件と共に、発生した全ての熱を比較的小さい値に維持するのを助け、また、放熱用の熱の通路を比較的短く保つのを助ける。
【００２０】
そのような小さい直径のカラム（内径が３０〜７５ミクロン）を使用する場合、分離の実際の体積は、移動相の流量が一般に分当たり５〜２００ナノリットルの範囲であると極めて小さくなる。勾配を形成するには、移動相の個々の成分を、全システム流量の０．１％程度という低いレベルで必ず送出させる必要がある。さらに、高圧勾配形成ポンプは、全システム動作圧に対し、乱れを引き起こすことなく、再現性ある方法で、成分の流れを送出しなければならない。上述の分析上の要件は、１００，０００ＰＳＩＧ（７０２７．２ｋｇ／ｃｍ2）程度の高い圧力に対し、分当たり１０ピコリットル程度の小さい成分流量を定量的に送出できることを意味する。既知のＨＰＬＣシステムは、上述の要件に必要とされる封止およびアクチュエータ技術を、意図される市場での妥当なコストで提供しない。
【００２１】
したがって上記事項に照らし、充填粒子の層を通して流体を推進させるために極めて小さい充填粒子とそれに付随した高い移動相圧力を使用して分離を行うため、分流ベース・システムについて調査を行った。これらの分流システムは、溶媒組成の生成と、都合の良いサイズ規模での圧力の増大を使用する。このより大きい規模の流れは、直線で著しく抵抗のある分路に向けられる。上述の、内径が３０〜７５ミクロンのカラムに必要とされる小規模の勾配流は、より大きい規模の流れからＴ管継手を用いて引き出され、その後、注入手段によってカラムへと運ばれる。そのようなシステムは、キャピラリ・クロマトグラフィにおいて適度な圧力（０〜５，０００ＰＳＩＧ（０〜３５１．４ｋｇ／ｃｍ2））で大々的に使用されており、その動作は６，０００〜２０，０００ＰＳＩＧ（４２１．６〜１４０５．４ｋｇ／ｃｍ2）の範囲のより高い圧力で調査されている。これらの分流システムの欠点は、分路内の放熱に起因してシステム圧力が１０，０００〜１００，０００ＰＳＩＧ（７０２．７〜７０２７．２ｋｇ／ｃｍ2）レベルに達したときに明らかになる。極端な場合、発生した熱は、所定の液体を蒸気に変換するのに十分であり、または少なくとも、かなりの蒸気成分を有する液体に変換するのに十分である。
【００２２】
したがって、極めて小さい充填粒子および高い移動相圧力と共に使用することが意図されるシステムの実装例は、厳しい設計上の問題を含んでいることが明らかである。
【００２３】
（概要）
本発明は、選択された圧力で、例えば実質上の大気圧で、低体積溶媒組成物形成を実現するＨＰＬＣ溶媒送出システムを提供する。そのような低体積、低圧溶媒組成物形成の後、その形成された溶媒組成物を加圧し、その後、形成された溶媒組成物を、より高い圧力で、カラムなどの受容装置内に放出する。低圧での溶媒組成物の形成は、溶媒組成物形成に含まれるステップまたはプロセスとして、サンプル検体の導入を含むこともできる。
【００２４】
本発明によれば、高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ溶媒送出装置および方法は、選択された圧力、例えば実質上の大気圧での低体積溶媒組成物形成を使用し、その後、形成された溶媒組成物の加圧を行う。溶媒組成物形成は、かなり小さい体積および選択された圧力で、例えば実質上の大気圧で行い、次いで加圧を行う。形成された溶媒組成物の放出は、このより高い圧力で、カラムなどの受容装置内に向けて行われる。溶媒組成物は、溶媒組成物生成器または流体計量システムから形成されるが、これは、低圧で、遮断弁を介して受容溶媒組成物貯蔵マトリックスへと液体を送出するよう最適化することができるものである。貯蔵マトリックスに送出された溶媒組成物は、貯蔵マトリックスに送出された最初のボリュームの溶媒組成物が、排出される最後のボリュームの溶媒組成物になるように、逆の順序になる。このように形成された溶媒組成物は、低圧インゼクタを介して導入されたサンプル検体を含むことができるが、このサンプル・ボリュームは、形成された溶媒組成物内のバンドまたはゾーンとして存在するものである。貯蔵マトリックス内に既に存在する液体は、貯蔵マトリックスに流体連絡するプリーツ形ベローやダイアフラムなどのコンプライアントな可変体積流体アキュムレータへと排出される。流体アキュムレータは、圧力ケーソンまたはチャンバ内に包封されるが、この圧力ケーソンまたはチャンバは、溶媒組成物サイクルの形成に従い、流体アキュムレータの体積変化に応答して液量変位変換器（またはセンサ）から得られたセンサ信号に応答し、またケーソンに流体連絡する圧力センサに応答して、加圧されまたは減圧されるものである。遮断弁を閉じることによって、溶媒組成物生成器、および存在する場合には低圧インゼクタを、システム動作の溶媒組成物加圧段階および放出段階中に生じる圧力から切り離す。ケーソンが加圧されると、流体アキュムレータおよびその流体分に作用する圧力によって、貯蔵マトリックス内の溶媒組成物は遮断弁を通過して排出される。次いで溶媒組成物は、高圧対応インゼクタを含むことができる通路を介してクロマトグラフィのカラムに送出される。
【００２５】
本発明の利点には、分離の絶対容量および／または単位時間当たりの溶離されたピークで表される分離の処理能力の改善も含めたクロマトグラフィ・システムの高められた分離特性を得るために、より小さいクロマトグラフィ充填粒子を利用することができると共に、標準的なＨＰＬＣ動作圧よりも高い圧力で動作可能であることが含まれる。このシステムおよび方法は、その規模を縮小拡大することが可能であり、より適度な圧力およびカラム内径で使用することができる。適当に小さいカラムおよび体積流量で使用すると、カラム内に熱を発生させる原因となる全電力損を比較的小さく維持することができ、それに関連する放熱用経路を比較的短くすることができる。
【００２６】
高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ溶媒送出システムの別の利点とは、高圧に曝されて破損によって組成に変化をもたらしたり誤差を引き起こしたりする運動用封止材を使用することなく、高圧で動作可能なことである。むしろこのシステムは、単一の運動用封止材を圧力ケーソンに使用して構成することができるが、この封止材の性能は、ケーソンを加圧するピストンに加えられるアクチュエータ速度が送出流量の推測に使用されないという点で、重要ではない。
【００２７】
クロマトグラフィの勾配モードでは、ピーク保持挙動が溶媒組成によって主に決定され、本発明によれば、溶媒組成プロフィルを維持する精度は、このプロフィルが、流体計量挙動を最適化することができる実質上一定で比較的低い圧力という条件下で生成されることにより高められる。この低圧流体計量機能を発揮させるためにシリンジ・ポンプを使用する場合、シリンジ・ポンプのピストンにかかる低軸荷重によって比較的低いコストでマイクロメータ品質のねじ山を備えた打込みねじを使用することが可能になり、またシリンジ・ピストン線形並進メカニズムの精度を低下させる可能性のある重いスラスト軸受を使用する必要がなくなるので、ポンプの挙動を最適化することができる。シリンジ・ポンプの封止材には大きい荷重がかからないので、過度の封止漏れまたは著しい封止材変形が生じない。溶媒組成物形成をもたらす流体計量が低圧で行われることにより、通常なら大気圧付近の圧力での動作に制約されるような技術も含めた代替の流体計量技術を使用することができ、例えば、典型的にはソレノイドまたは圧電アクチュエータで作動する１つまたは複数のダイアフラム式ポンピング要素を利用する一体化された微量流体分与または送出システムを使用することができる。
【００２８】
クロマトグラフィ・カラムを通る短期流量は、フィードバック・ループを介してモニタされ制御されるケーソン圧力に左右されるので、ケーソン・ピストンを作動させる親ねじまたはジャック機構に課される並進精度に関する要件は、比較的単純である。これは、現行のキャピラリ液体クロマトグラフィ・システムで使用される高圧溶媒組成物生成メカニズムに対する親ねじの要件とは対照的である。
【００２９】
開示されている本クロマトグラフィ・システムおよび方法の別の利点には、ストップドフロー分光走査に向かう特徴が含まれる。このシステムは、溶媒液の流れ、したがってクロマトグラフィのピークの溶離を断続的に停止させることを可能にし、その後すぐに、ケーソンを、新たに生じる溶媒組成物の組成上の特性を大幅に変化させることなく圧力サーボ制御下で急速に減圧・再加圧する。
【００３０】
本発明の追加の利点は、溶媒送出プロセスの昇圧段階に関連する遅延体積が最小限に抑えられるように直列のポンプ構成を使用することから得られる。形成された溶媒組成物は、アキュムレータ内に以前から滞留している流体を再導入することによって貯蔵マトリックスから押し出された状態で、貯蔵マトリックスから分析カラムへと直接流出する。さらに、本発明の溶媒組成物は、使用するプロトコルに都合のよい流量で形成することができる。典型的な場合、溶媒組成物形成流量は分当たり複（多）数マイクロリットルであるが、放出流量は分当たりわずか数ナノリットルである可能性がある。これら２つのプロセスはその後切り離され、流体計量要素は、その挙動がより理想に近い流動レジームで動作することが可能になる。
【００３１】
本発明に付随する別の特徴は、単一の運動用封止材のみがシステムの加圧部分に維持されることである。さらに、その漏れ特性は、全くの封止材の破損を除いてクロマトグラフィ送出から切り離され、ケーソン圧力と、流体が貯蔵マトリックスに流入しかつ貯蔵マトリックスから流出する間の体積送出は、共に独立に測定される。さらに、流体アキュムレータによって、ケーソン内の動作流体とクロマトグラフィの流れとの間に気密性の障壁を実現しながら、貯蔵マトリックスに流体を排出しまたは貯蔵マトリックスから流体を排出させる。
【００３２】
本発明のさらに別の利点とは、小規模のキャピラリ・クロマトグラフィであることに起因して、クロマトグラフィ全体を実行する間に溶媒組成物を生成して貯蔵することができることであり、したがって他の商用システムのように、実行時間で溶媒組成物を形成するための連続流体計量ポンプを必要としない。これは、現行のクロマトグラフィ・システム全体の簡略化に寄与する。
【００３３】
本明細書で述べる高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ溶媒送出システムおよび方法は、妥当な溶媒送出動作を、現在のＨＰＬＣシステムでは実現されない極端に低い圧力および高い圧力で行うことができる。本発明は、特に、結合型の液体クロマトグラフィ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）などで使用される高ピーク容量分離を対象とするシステムに十分適するものである。
【００３４】
本発明の前述およびその他の特徴および利点は、以下の例示的な実施形態の詳細な記述を添付図面と併せて読むことから、より完全に理解されよう。
（詳細な説明）
本明細書に開示する装置および方法の例示的な実施形態を、液体クロマトグラフィ、特に高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ用の溶媒組成物形成および送出に関して論じる。しかしその開示は、溶離液体制御、流体計量、混合および組成制御システム、多成分溶媒送出、分光学的研究、溶媒組成物生成器などを含むがこれらに限定することのない、広く様々な手順および装置に適用可能であると考えられる。
【００３５】
以下の考察において、「シリンジ」または「シリンジ・ユニット」という用語は、本明細書では１つまたは複数のシリンダであって、そのそれぞれが関連するピストン、ピストン封止材、ピストン・アクチュエータ、および任意選択で圧力センサを備えるものと定義される。シリンジは、それに関連して弁および弁アクチュエータを含む弁手段を備え、「ポンピング・ユニット」を構成する。本発明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ本願の譲受人が所有する米国特許第５，８９７，７８１号および第５，６３７，２０８号に記載されるように、低圧流体計量機能を果たす１つまたは複数のポンピング・ユニットを使用することができる。本願では、「計量ユニット」という用語を「ポンピング・ユニット」という用語と同義に使用する。
【００３６】
図１に示すように、高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ溶媒送出システム５０は、溶媒組成物生成器４０と、ピストン１２により動作する加圧ケーソン・チャンバ１４との間に連結された、遮断弁２２を含む。ピストン１２の直線運動は、ケーソン１４内の容積全体をさっと通過する。ピストン１２とケーソン１４の間の耐水性封止は、ケーソン１４内のキャビティに存在してピストン２１の外径に整合する、運動用封止材１６によってもたらされる。ピストン１２を駆動する力は、ステッピング・モータ１８、およびこれに関連する米国特許第５，６３７，２０８号に記載された回転駆動から線形駆動への変換要素を含む、動力化機構から得られる。ステッピング・モータ１８は、好ましくはマイクロステップ・モードで駆動され、達成される最小増分ピストン運動の大きさをさらに減少させるために、減速ギア・モジュールを含むことができる。ステッピング・モータ１８は、親ねじスピンドルおよびナット構成（図示せず）によって直線運動に変換される回転運動をもたらす。ステッピング・モータ１８は、半径方向と軸方向の両方でナットを支持する軸受（図示せず）によって支持されるナットを回転させ、それによって、親ねじおよびナット上に軸方向にかかる液圧の力がステッピング・モータ１８から切り離される。親ねじは、画定された範囲内で軸方向に自由に運動するが回転防止要素によってその回転が防止される。そのような技法は、当業者に一般に知られるものである。親ねじは、ピストン１２の駆動端に沿った比較的精密な軸の位置合わせを維持しながら、軸方向の力を伝達する軸受によって、ピストンに連結される。
【００３７】
引き続き図１を参照すると、ケーソン１４は、薄い回旋状の金属など非常にコンプライアントな材料で構成された軸方向に伸縮可能なアコーディオン状ベロー２４の周りに、流体耐密な封じ込めをもたらす。ベロー２４は運動用封止材または滑り封止材なしで構成され、したがって流体移送中に変形しにくいことから、かなりの圧力に対してポンピングまたは計量ユニット１０のポンピング動作を行う必要がない。高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ溶媒送出システム５０は、高圧に曝される多数の運動用封止材、すなわちその封止材が破損することによって組成に変動または誤差をもたらすような多数の運動用封止材を使用することなく、高圧での動作が可能である。それどころかこのシステム５０は、高圧に曝される単一の運動用封止材１６を使用して構成してもよく、その封止性能は、ピストン１２がケーソン１４を加圧するときにピストン１２に加えられる動作速度がクロマトグラフィ送出流量の推測に使用されないという点で、重要ではない。
【００３８】
圧力ケーソン１４は、溶媒組成物サイクル形成と、圧力変換器３４、および線形可変差動変圧器（ＬＶＤＴ）２６など流体アキュムレータの体積変化に応答する液量変位変換器（またはセンサ）から得られるセンサ信号とに応答して、加圧または減圧することができる。流体アキュムレータ２４は、貯蔵マトリックスに最も近い位置にある１つの固定端と、アキュムレータに移送されまたはアキュムレータから移送される液量に応答して移動する一端とを有する。ＬＶＤＴ２６のコアは流体アキュムレータ２４の可動端に連結され、ＬＶＤＴ２６から得られる信号は、計量ユニット１０の体積送出も制御するプロセッサ３２に向けられる。アキュムレータ２４の膨張運動により、ＬＶＤＴ２６から得られた信号を使用して、アキュムレータの変位と計量ユニット１０の体積送出との関係を校正することが可能になる。この信号は、計量ユニット１０およびピストン１２を精密に制御するために、溶媒組成物サイクル形成情報と組み合わせることができる。アキュムレータ２４は、形成された溶媒組成物、すなわち貯蔵マトリックス２０の流体分と、圧力ケーソン１４の流体分との分離エンベロープとしての役割をすることに留意することが重要である。このため浸漬流体２５の組成は、形成された溶媒組成物６０と異ならせることができる。本発明には注入口６１も含まれる。この注入口により、ケーソンには最初に液体を充填することができる。さらに、この注入口によれば、ケーソンからの漏れが原因でいくらか液体が失われた場合に、経時的に液体を補充することが可能になる。任意選択で、逆止め弁を注入口６１に位置決めすることができ、それによって注入口６１を浸漬流体２５の貯蔵部に接続する。この配置構成により、ケーソンの減圧サイクル中に、浸漬流体の補充を自動的に行うことが可能になる。
【００３９】
線形可変差動変圧器またはＬＶＤＴは、変位測定の「非接触」の形をとる。本明細書において、「非接触」という用語は、ＬＤＶＴ（一般には、短いアクチュエータ・ロッドによって流体アキュムレータの可動端に取着されたニッケル・鉄シリンダ）のコアを、励起コイルおよびセンス・コイルが位置付けられたＬＶＤＴのハウジングに機械的に接触させる必要がないという概念を伝えるために使用する。具体的には、励起コイルとコア、センス・コイルとコアは、電磁的に連結されている。本発明では、厚い壁面で囲まれた非磁性ステンレス鋼チューブ６３がＬＶＤＴコアとＬＶＤＴハウジングの間に介在し、変換器のコアだけが高圧ケーソン内に存在して残りの変換器の全ての構成要素がケーソンの外側に位置付けられるようになされている。変位測定のサポートに際し運動用封止材を不要にするため、間に挿入されている厚い壁面で囲まれたステンレス鋼チューブ６３をケーソン構造の一部で形成する。
【００４０】
反応性に富む溶媒などのクマトグラフィの流れとケーソンの浸漬流体とは切り離されているので、クロマトグラフィの流れの組成物とは無関係にケーソン内の浸漬流体を選択することが可能になる。浸漬流体、例えば非腐食性の非導電性液体を適切に選択することによって、ケーソン内に変位変換器を配置することができ、次いで当技術分野で知られるように、静的に封止された隔壁継手を通して電気接点の経路を定めることができる。ＬＶＤＴの場合、ハウジングに通気孔を空けることができ、ＬＶＤＴを、当技術分野で知られる「ウェット・コイル」を用いて作動させることができる。あるいは、浸漬流体の適切な選択によって、静電容量式変換器、線形光学式エンコーダ、抵抗／電位差変換器などを含めたその他の形をとる変位測定が可能である。これらの中には、変位測定を行うためにケーソン壁を通して高圧運動用封止材を保持する必要があるものは何もないと考えられる。最後に、ＬＶＴＤは、貯蔵マトリックス内への、または貯蔵マトリックスからの流体移送に応答する円筒状ベローの伸縮を測定するのに十分適するが、エラストマー性ダイアフラムなどその他の流体アキュムレータの幾何形状および材料を、歪みゲージなど液量変位を推測する代替手段により良好に結合できることが、理解されよう。
【００４１】
圧力ケーソン１４は、封止材１６を通してピストン１２を変位させる動力化機構（上述の）などの圧力源によって、加圧・減圧することが可能であり、それによって、ケーソン１４内の浸漬流体２５を圧縮する。ケーソン１４内の圧力は、当技術分野で知られている適切な規模の圧力センサ３４によってモニタされる。運動用封止材または滑り封止材１６を圧力ケーソン１４へのピストン１２の入口点で利用する場合、ケーソン圧力が、小さくまた変動する可能性のある封止漏れ速度とは実質上無関係の設定点の値に維持されるように、ピストン１２の作動を圧力サーボ・モードで制御することによって、封止漏れの影響を緩和できることに留意することが重要である。
【００４２】
図２を参照すると、前に述べた、当技術分野で知られている複数の計量ユニット１０を有する溶媒組成物生成器４０が開示されている。計量ユニット１０は、現在キャピラリ・クロマトグラフィに適用されている既知のシリンジ制御技法の利用が本明細書に開示する計量ユニットにも適用されるという本発明の開示に関連して、低体積・低圧力で溶媒組成物６０を形成するために低圧で液体を送出するように構成される。計量ユニット１０は、実質上の大気圧に対して、または約１気圧から数気圧というわずかに高い圧力に対して駆動されるが、この圧力は、ピストン１２に作用する圧力サーボ制御により、溶媒組成物形成プロセス全体を通して実質上一定に保たれるものである。
【００４３】
各計量ユニット１０は低圧弁３８を含み、この低圧弁３８はそれぞれの溶媒貯蔵部３６から溶媒を取り入れ、その後、噴射弁２８を通して高圧対応遮断弁２２へと放出することができるように設計されている。遮断弁２２は、比較的小さい内容積および高圧封止特性を含み、例えば、回転式または線形端面封止弁、回転式スプール弁、またはニードル弁などの原理に基づいて構成することができる。弁は、当技術分野で知られているように、空気式増幅器／アクチュエータによって、または電子機械的手段によって、作動させることができる。極めて少量の勾配形成を対象とするシステムの場合、凍結融解流を管理する技法によって遮断弁の機能を実現することができ、その一例が、Ｂｅｖａｎ，Ｃ．Ｄ．およびＭｕｔｔｏｎ，Ｉ．Ｍ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７、１４７０〜１４７３（１９９５）に記載されている。この手法を使用することにより、任意の追加の機械弁ハードウェアを湿潤状態の溶媒経路に介在させる必要性が除去され、弁誘導による小規模な組成上の特徴の広がりまたは注入されたサンプルのバンドの広がりを最小限に抑えることに関して利点がもたらされる。
【００４４】
図１を再び参照すると、溶媒組成物６０は、計量ユニット１０から低圧で、高圧対応遮断弁２２を介して受容貯蔵マトリックス２０へと放出される。例示的な実施形態では、貯蔵マトリックス２０は、直径約５ミクロンの融解石英のビーズが充填された層を含む。貯蔵マトリックス２０には、石英やセラミックの固体球体などの実質上化学的に不活性な粒子を充填することができ、あるいは、クロマトグラフィ充填材料のように、結合相で被覆された多孔質シリカ粒子で得ることが可能な、拡張されかつクロマトグラフフィを行う際に活性な表面を含むことができる微粒子を充填することができる。別法として、層に多孔質または透過性の膜要素を充填し、あるいはその他のマトリックス、すなわち流体移送中またはマトリックス内に流体が滞留している間、形成された溶媒組成プロフィルを安定化し保存するその他のマトリックスを充填することができる。極めて小さいボリュームの勾配形成を対象とするシステムの場合には、貯蔵マトリックス２０が、中実の保持体または基板と一体化された１つまたは複数の流体通路アレイを組み込んだ、微細加工構造を含むことができる。
【００４５】
溶媒組成物６０は、貯蔵マトリックス２０に送出される最初のボリュームの溶媒組成物６０が、貯蔵マトリックス２０から放出される最後のボリュームの溶媒組成物６０になるように、逆の順序で貯蔵マトリックス２０に送出される。貯蔵マトリックス２０内に既に存在している液体は、貯蔵マトリックス２０に流体連絡するアキュムレータ２４に排出される。高圧から超高圧のシステムでは、できる限り多くの封止面が高圧に曝される状態から解放されまたは隔離されることが有利である。これは、噴射弁の場合に特に言えることであるが、それは、噴射弁が、一般に分析の流れの中にイン・ラインで位置付けられ、バンドの広がりに寄与する性質が極めて小さく、化学的不活性の程度が高く、かつ封止シェディング速度が遅い（分析キャピラリ・カラムが微粒子で詰まるのを避けるため）という性質を有する必要があるからである。システムの他の部分の調水弁に課される要件、例えば作動流体２５のみに関連付けられた弁に課される要件は厳しくなく、これらの目的で代替の弁の幾何形状を利用することができる。本発明により、システム低圧側の計量ユニット１０のすぐ下流に噴射弁２８を位置付けることが選択可能になり、それによって、低圧注入動作が可能になる。低圧での使用に適する様々な弁の材料および弁の幾何形状がある。さらに、注入ループ（サンプルの取込みが行われる）が高圧に曝されないことによって得られる、動作上の利点がある。従来のインゼクタを作動させる場合、サンプル・ループはシステム圧力と大気圧に交互に曝され、その結果ループの内容物が著しく圧縮しかつ膨張し、そのためインゼクタが少量のサンプルの取込みを定量的に行う能力が損なわれる可能性がある。
【００４６】
本発明では、インゼクタ・ハードウェアを配置することによって、サンプルを取り込みかつクロマトグラフィ溶媒にサンプルを導入する環境を、実質上大気圧のレジームで発生させることが可能になる。サンプルおよびその溶媒環境は、その後、貯蔵マトリックス２０に移送され、そこで加圧ステップが引き起こされる。加圧は、サンプル全体が流体の流れに導入された後にのみ、また注入ハードウェアが遮断弁２２の作動によって高圧環境から隔離された後にのみ生じる。したがって噴射弁２８は、実質上ループ内容物の減圧を必要としない状態でそのループ・ローディング状態に自由に戻り、すなわち別の定量的なサンプルの取込みを行う準備が整う。勾配クロマトグラフィの別の利点とは、多くの場合、注入されたサンプルを、勾配の初期条件下または弱溶媒和条件下で分解カラムの上部または入口端部で濃縮できることであり、その結果、サンプルが分散する体積の観点から、注入されたバンドが集束しまたは狭くなる。この集束のメカニズムは、高圧遮断弁２２を通してサンプルが移行する間に生じる可能性がある任意のバンドの広がりを最小限に抑えように、使用することができる。
【００４７】
特に定組成クロマトグラフィでは、最も狭くなり得るサンプル注入バンドをカラム上に配置することが望まれ、オン・カラム集束メカニズムを使用することができなくなる可能性がある動作モードが存在し得る。この場合、高圧対応遮断弁２８’は、図示される代替の位置（図１）、すなわち貯蔵マトリックスと分析カラムの間にイン・ラインで配置することができる。クロマトグラフィ・カラムのすぐ上流にあるこの配置は、インゼクタの配置に関し、従来のクロマトグラフィ・システムの液圧配置構成に類似する。
【００４８】
上述の条件下、溶媒組成物６０を含む極めて少量の移動相は、１つまたは複数の計量ユニット１０から、極めて細かく分割して排出することができる。これらの複数の計量ユニット１０を使用して、従来の高圧勾配形成に似ている液圧式構成で、溶媒組成物６０を形成することができる。しかし、計量ユニット１０は、遮断弁２２を介し、貯蔵マトリックス２０内の比較的小さい実質上固定され受容圧力へと流体を送出することができる。この液圧式構成は、上記参照されるサイズの規模で動作可能ではない従来規模の「低圧勾配形成」とは異なっている。計量ユニット１０を用いて非常に低い受入れ圧力に送出させる利点とは、関連する弁、弁アクチュエータ、ピストン駆動要素、封止材などを、低圧動作用に特別に設計することができ、数千ＰＳＩＧの圧力で動作可能になるよう設計された既知の装置よりも簡単に、低コストで、または長い寿命にすることができることである。貯蔵マトリックス２０を低受容圧力にすることによって可能になる流体計量の代替の形の一例は、当技術分野で知られるように、共通基板上に実現されかつソレノイドまたは圧電アクチュエータよって作動される１つまたは複数のダイアフラム式流体ポンプのチャネルを含んだ微細加工された流体分与技法を使用することと考えられる。
【００４９】
経時的に制御速度で動作する１つまたは複数の計量ユニット１０の送出により、時間の関数として、したがって送出される体積の関数として制御された組成物特性を有するある体積の液体が生成される。小規模なキャピラリ・クロマトグラフィの利点とは、所与のクロマトグラフィ分離の絶対的または全ての体積がそれ相応に小さく、したがって液体クロマトグラフィのその他の知られている形に比べて扱い易いことである。計量ユニット１０で送出し、その後、溶媒組成物６０を形成して貯蔵マトリックス２０に入れると、形成された溶媒組成物６０の空間特性が十分に保たれる。特に、組成に空間的なばらつきをもたらす経時的な組成変化のパターンは、使用可能な期間、すなわち何分から何時間の間、貯蔵マトリックス２０に保つことができる。
【００５０】
組成上のゾーンまたはバンドの忠実度を保つことは、クロマトグラフィの実施に欠かせないことである。貯蔵マトリックス２０の全体寸法が適切に選択され、このマトリックスの流体透過性が適切に選択されると、所望の貯蔵マトリックス充填速度を満足するソース圧力要件は、適度に低い値に保たれる。この特定の実施形態では、溶媒組成物６０が、「逆の順序で」貯蔵マトリックス２０内に形成されるが、これは、動作の順序によって、貯蔵マトリックス２０への液体の流れおよび貯蔵マトリックス２０からの液体の流れが「後入れ」および「先出し」になるからである。溶媒組成物６０を逆の順序で貯蔵マトリックス２０内に形成すると、貯蔵マトリックス２０に現在滞留している液体が、流体アキュムレータ２４へと排出される。流体アキュムレータ２４の非常にコンプライアントな性質に起因して、計量ユニット１０は、追加の著しい圧力に対してポンピング動作を行う必要がなく、したがって流体アキュムレータ２４は、圧力ケーソン１４の囲まれた容積内に膨張することができる。アキュムレータの膨張によって変位した圧力ケーソン内の液量は、貯蔵マトリックス・ローディング・プロセス全体を通してケーソン圧力が実質上一定に維持されるように圧力サーボ・モードで動作可能なピストン１２の引き込みに順応する。あるいはケーソンは、貯蔵マトリックス・ローディング・プロセス中に、例えば充填口６１に流体連絡する通気弁を使用することによって、単に大気中への排気を行うことができる。
【００５１】
計量ユニット１０およびピストン１２によって引き起こされる動作の組合せにより、溶媒組成物６０が形成される。溶媒組成物６０の形成が終了すると、各計量ユニット１０は、それぞれの低圧弁３８を切り換えて、それぞれの溶媒貯蔵部３６からその液体分を補充する充填サイクルを行う。このとき高圧対応遮断弁２２を切り換えて、計量ユニット１０および噴射弁２８を、貯蔵マトリックス２０からオフラインになるよう切り離す。計量ユニット１０および噴射弁２８を切り離したら、形成された溶媒組成物６０を貯蔵マトリックス２０から排出させるため、圧力ケーソン１４を加圧する。前に述べたように、ケーソン１４の圧力は、封止材１６を通るピストン１２の運動によって流体２５が排出されることから得られる。
【００５２】
ケーソン１４を加圧すると、流体アキュムレータ２４およびその流体分に作用する圧力によって、貯蔵マトリックス２０内の溶媒組成物６０が圧縮される。このように加圧すると、溶媒組成物６０は遮断弁２２を通過して、一般にクロマトグラフィ・カラム３０を含み高圧対応インゼクタ２８を含むことができる受容システムに向かって送出され始める。溶媒組成物６０がまず圧縮され、その後放出されると、圧力ケーソン１４内の流体アキュムレータ２４は、その非膨張形状に戻り始める。ＬＶＤＴ２６は、アキュムレータの可動端の変位を示すことによって応答する。次いで制御器３２は、時間に対するＬＶＤＴ出力をモニタすることができる。
【００５３】
図３は、溶媒組成物形成サブ区間５０、溶媒圧縮サブ区間５２、溶媒放出サブ区間５４、および溶媒減圧サブ区間５６を含む時間全体にわたる、ＬＶＤＴの調整済み電圧出力を示す。形成された溶媒組成物６０の放出に備えてケーソンを最初に加圧するとき、流体アキュムレータ２４および貯蔵マトリックス２０の流体分の初期圧縮に関連するアキュムレータの運動がＬＶＤＴに反映されるサブ区間５２があることがわかる。この初期流体圧縮ステップを実現するケーソンの加圧は、一般に、クロマトグラフィ・カラムの抵抗によって送出される体積流量よりも非常に速い、ピストン１２の体積変位の速度を使用して行われる。その結果、ケーソン内が初期圧力設定点に達し、圧力がサーボ制御下で安定化すると、時間に対してＬＶＤＴ出力が変化する率で検出される、かなり急激な変曲がある。すなわち、初期溶媒圧縮ステップは、分当たり何百マイクロリットルという体積流量に対応するピストン１２の変位速度を使用して、ほぼ任意の速い速度で行うことができる。ケーソン圧力設定点が実現されて圧力値が安定化するのとほぼ同時に、この初期流体圧縮の事象に関連して流体アキュムレータがさらに変位することはなくなり、したがって後続の流体アキュムレータ変位は、クロマトグラフィ・カラムを通して外に向けられた溶媒流に関連するものである。
【００５４】
ひだが付いた金属ベローから構成されたアキュムレータであって、ベローの長さに比べて短いストローク長で動作するアキュムレータである場合、ベローの長さとベローの内容積の間には、実質上線形の関係がある。したがって定圧条件下では、ＬＶＤＴ出力と、アキュムレータに送出されまたはアキュムレータから送出される液量との間に、対応するほぼ線形の関係がある。この条件下、時間に対するＬＶＤＴ出力の変化率は、計量ユニットが貯蔵マトリックス２０に溶媒を計りとるときに、貯蔵マトリックス・ローディング相の実行中に構成することが可能な校正曲線を介し、ベローへの体積流量またはベローからの体積流量を反映する。この動作は実質上一定の圧力で行われ、ベローの膨張が生じ、ＬＶＤＴの出力から制御器３２によってモニタされる。
【００５５】
溶媒放出相の実行中、時間に対するＬＶＤＴ出力の変化率を使用して、分析キャピラリ・カラムを通る移動相の送出流量を計算することができる。この送出流量は、以下に詳述するようにフィードバック制御の方策に組み入れることができ、それによって、定圧溶媒送出システムとは対照的に、システム全体を容積式溶媒送出システムとして機能させることができる。
【００５６】
流量計算は、溶媒圧縮に関連するアキュムレータの運動と、分析カラムを通る移動相送出に関連するアキュムレータの運動が、区別されるように行わなければならない。ケーソン圧力が変化するときはいつでも、アキュムレータ内に滞留する流体のカラムおよび貯蔵マトリックスが対応する圧縮または緩和を必ず受け、それによって、ＬＶＤＴにより検出される変位が影響を受けることが理解される。この流体のカラムは、アキュムレータの可動端と、分析カラムに強制的に通される溶媒前部との間に介在するばねのように作用する。ケーソン圧力が実質上変動しない値に保たれる任意の時間中、流体のカラムは圧縮も緩和されず、すなわち非常に剛性の高いばねのように振る舞う。勾配クロマトグラフィに共通の変化圧力レジーム中に分析カラム流量を認識するため、制御器３２は、少なくとも２つの技法を利用することができる。第１の技法では、制御器は、そのＬＶＤＴ出力観察のタイム・スライシングを行い、流れを測定する間隔が、圧力制御器の設定点が変化する間隔と交互になるようにする。この手法は、マイクロプロセッサをベースとした制御を実現する際に、圧力制御ループ設定点または基準レベルの更新が、マイクロプロセッサのプログラミングによって確立された不連続な時間間隔で行われることを利用する。圧力制御ループ自体は速い修正時間で実現することができ、圧力設定点または基準レベルの変化に対する応答は、クロマトグラフィの時間枠に対して極めて早くなる。このため制御器は、設定点を変化させ、圧力ループ修正のため指定されたウィンドウの持続期間を遅らせ、次いで定圧条件下でアキュムレータの変位の測定が行われる後続のウィンドウ中に流量を記録することが可能になる。この構成では、制御器は、実質的にリアルタイムで利用可能な別々に更新される流量測定値のストリームにアクセスし、この流量測定値は、以下に詳述するように流れ制御ループに送られる。
【００５７】
第２の技法では、制御器は、液圧キャパシタンスの直接的な測定を利用するが、これは、クロマトグラフィの実験操作５４の開始前にケーソンを加圧するとき（５２、図３）、かつ／またはクロマトグラフィの実験操作の終わりにケーソンを減圧するとき（５６）に、観察される。具体的には、制御器は、ケーソン圧力センサ出力およびアキュムレータ変位センサ出力を使用することにより、アキュムレータ、貯蔵マトリックス、およびクロマトグラフィ・カラムに含まれる流体分の合計によって示される液圧容量を特徴付けることができる。実際、アキュムレータおよび貯蔵マトリックスの流体分によって示される液圧容量は、一般に全容量測定を支配し、特定の実施形態では、アキュムレータ単独の流体分が、主な液圧容量を示す。制御器は、ケーソン圧力とアキュムレータ変位との関係を、アキュムレータが最大の封じ込め液量を有する場合には実験操作開始時に、アキュムレータが最小の封じ込め液量を有する場合には実験操作の終わりに記録することができる。次いで制御器は、これら２つの極端な動作のそれぞれで示される液圧容量を画定するルックアップ・テーブルをエンコードすることができ、実験操作中の任意の中間点で示される可能性がある容量の補間によって抽出することができる。特定の実施では、ケーソン圧力とアキュムレータ変位とを画定することができるほぼ線形の関係があり、これは勾配値によって特徴付けられる。特定のシステムでは、直線性からの小さな逸脱が見られる程度まで、意図される圧力動作点付近での勾配値を具体的に計算することができ、それによって、直線性からの逸脱を実質上意味の無いものにする。クロマトグラフィ送出の始まりや終わりなど、特定のアキュムレータの変位位置に関連するこのように計算された勾配値は、メモリに記憶することができる。次いで補間法を使用して、クロマトグラフィの実験操作の任意の中間点で示される液圧容量を示す妥当な勾配値を抽出することができる。この液圧容量の特徴付けが利用可能な状態で、制御器は、ケーソン圧力が変化する区間内であっても、妥当な流量測定値を計算することができる。具体的には、アキュムレータ変位測定が行われる区間内で生じる圧力変化を記録することによって、制御器は、測定されたアキュムレータ変位から、圧力変化に応答した流体分の圧縮または緩和に寄与した分を引くことができる。得られた値は、貯蔵マトリックスを離れる実際の移動相の流れに寄与したアキュムレータの変位を反映する。この第２の技法を使用することにより、ケーソン圧力設定点が調整される区間内であっても、妥当な流れの測定を行うことが可能になる。上述の第１の技法と同様に、制御器は、実質上のリアルタイムで利用可能な別々に更新される流量測定値のストリームにアクセスし、この流量測定値は、以下に詳述するように流れ制御ループに送られる。
【００５８】
マイクロプロセッサをベースとするシステムでは、流体アキュムレータの変位または膨張と、アキュムレータに移送されまたはアキュムレータから移送される流体の体積との関係が線形校正曲線に対応することは要件にならないことに留意されたい。非線形校正曲線は、ルックアップ・テーブルを用いてまたは当技術分野で知られている曲線適合技法によって、容易に適応させることができる。
【００５９】
制御器３２は、クロマトグラフィによる送出中、定圧モード、すなわち一定の設定点圧力をケーソン１４内に維持したモードで、または制御器３２が上述のように得られた流量情報をさらに利用する場合には体積送出モードで動作させることによって、システム５０を随意に動作させる。体積送出モードでは、システム５０は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｕｒｄｅｖｉｌｌｅおよびＴｒｕｍｐｅｒの米国特許第４，７６７，２７９号に記載されているものと同様に機能し、操作者によって確立された流れ設定点に従って推定流量が押し出されるように内部フィードバック・ループ用の基準レベルの設定を担う外部推定流れフィードバック・ループに包含された、短期流量安定性のための内部圧力フィードバック・ループがある。
【００６０】
別の例示的な実施形態では、現在開示されているクロマトグラフィ・システム５０は、ストップドフロー分光走査に向かう動作上の特徴を含む。この動作モードでは、溶媒組成物６０の流れを止めることができ、その場合、生じる溶媒組成物６０の組成上の特性を実質上変化させることなく圧力サーボ制御下でケーソン１４を急速に減圧し再度加圧する。組成プロフィルを維持する精度は、計量ユニット１０の計量動作を最適化することができる実質上一定で比較的低い圧力の条件下、組成プロフィルを発生させることにより高められる。同様に、クロマトグラフィ・カラム３０を通る短期流量は、圧力センサ３４に応答する閉ループ・サーボ制御下のケーソン圧力によって支配されるので、ケーソン・ピストン１２を作動させる機構に課される並進精度要件は、比較的最小限に抑えられる。
【００６１】
図４に示す、別の例示的な実施形態では、遮断弁２２、貯蔵マトリックス２０、流体アキュムレータ２４、液量変位センサ２６、流体ポート６１、および任意選択で圧力センサ３４のみ含む、ケーソン１４を構成することができる。ケーソン１４は、その流体ポート６１を介して遠隔加圧源８０に接続することができる。この例示的な実施形態では、遠隔加圧源８０が、ピストン１２、封止材１６、回転から線形への駆動変換要素（図示せず）を通してピストン１２を駆動するステップ・モータ１８、および圧力センサ８１を含む。加圧源８０には、液量変位変換器２６の出力をモニタする制御器３２から得られる制御信号に応答して圧力を供給するようコマンドが出される。液圧式遮断弁９０は、流体ポート６１と遠隔加圧源８０の間の流体経路内に配置することができる。例示的な実施形態では、遮断弁９０により、流体ポート６１と加圧源８０または大気ベントとの流体連絡が選択的に可能になる。
【００６２】
上記ケーソン構成要素は、溶媒組成物形成サブアセンブリ４０および加圧サブアセンブリ８０に対するサブアセンブリまたはモジュールの実施形態を表す。記述した構成要素の切り離しまたはモジュール化を含むこの実施形態の利点とは、そのような複数のケーソン１４を単一の溶媒組成物形成サブアセンブリ４０に接続できるということであり、ｎ個の貯蔵マトリックス２０のそれぞれには同時に（並行に、実質上同一の溶媒組成物を）または連続的に（同じかまたは異なる溶媒組成物を）充填することができるようにされている。これらのｎ個の貯蔵マトリックス２０のそれぞれは、対応するクロマトグラフィ・カラム３０に接続することができる。単一の加圧サブアセンブリは、液圧遮断弁９０を利用することによってｎ個のケーソンのいずれか１つが独立に加圧されるよう使用することができ、または単一の加圧サブアセンブリで、液圧式遮断弁９０の使用を必要とせずにｎ個のケーソン１４の全てを同時に加圧することができる。後者の場合、同じ圧力または加圧プロフィルがｎ個のケーソン１４の全てに同一の手法で与えられると考えられる。当技術分野で知られている電気的多重化を介する制御器３２は、ｎ個のケーソン１４のそれぞれで体積送出を独立にモニタすることができる。任意選択の圧力センサ３４は各ケーソン１４内に設置され、制御器３２はｎ個のケーソンのそれぞれで圧力を独立にモニタすることもでき、これは独立の加圧モード動作が選択されるときに有用である。
【００６３】
液圧式遮断弁９０を使用する場合、動作モードを交代にすることが可能であり、第１のケーソンを、圧力源８０によって供給された圧力に応答して溶媒組成物放出に有効に関与させることができ（すなわちクロマトグラフィによる分離を行う）、一方、第２のケーソンは、次のクロマトグラフィによる分離に備え、貯蔵マトリックス・ローディング相の実行中に溶媒組成物形成サブアセンブリ４０に係合させる。さらに、液圧式遮断弁９０を使用する場合、単一の加圧源８０で、多数のケーソン１４を独立の圧力に同時に加圧することが可能である。この独立した並行動作は、ケーソン１４の流体容量が一般にクロマトグラフィ送出の体積に比べて大きいことを利用する。したがって、特定の圧力が加えられたケーソン１４は、分当たり数ナノリットルの液体の流れが貯蔵マトリックスから放出されるにもかかわらず、妥当な期間、実質上その圧力が加えられたままになる。ケーソンの流体容量の大きさ（本質的には貯蔵されているエネルギーの大きさ）に応じ、圧力源は、意図する体積送出を実現するために、その圧力を必要とされるレベルに更新して、各ケーソン１４を定期的な間隔で再び加圧する必要があると考えられる。単一の溶媒組成物形成サブアセンブリ４０の出力が複数のケーソン１４に与えられる、上述の多数のケーソン動作モードのいずれかでは、各ケーソンに専用溶媒形成サブアセンブリ４０を割り当てることも可能であることが、当業者には明らかであろう。
【００６４】
本明細書に記載される例示的な実施形態は、高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ用のシステムについて述べているが、液相または超臨界流体相化学分析に詳しい者なら、本明細書に記載したシステムを、制御された圧力出力または制御された体積送出出力を組み込んだ流体送出機能が望まれる分析の任意の領域で使用できることを理解されたい。
【００６５】
本明細書に記載された例示的な実施形態は、各貯蔵マトリックス２０に関連付けられた単一のクロマトグラフィ３０を使用することを含むが、当業者なら、システム５０は複数本のカラム３０を含んでよいことを理解するであろう。
【００６６】
本明細書で述べる例示的な実施形態は、実質上の大気圧下で溶媒組成を確立することを含むが、溶媒組成を確立するために、任意の選択された圧力を使用することができることを理解されたい。
【００６７】
本明細書に記載する例示的な実施形態は、単一の連続マトリックスとして実装される貯蔵マトリックス２０を含むが、貯蔵マトリックス２０は、流体が直列に流れるように、または流体が並行して流れるように、またはそれらを組み合わせて配置された、いくつかのまたは多くの離散的なマトリックスを含んでよく、いくつかのまたは多くの離散的なマトリックスは、その多孔度や表面の化学的性質など、物理的または化学的性質が異なるものでよいことを理解されたい。さらに、マトリックスは、一体型の微量流体構造として実装できることを理解されたい。
【００６８】
本明細書に記載する例示的な実施形態は、一端が流体アキュムレータ２４のみと流体連絡し、他端が遮断弁２２およびカラム３０と流体連絡する貯蔵マトリックス２０を含むが、単一の連続マトリックスまたは多数の離散型の相互接続されたマトリックスとして存在する貯蔵マトリックス２０は、その長さに沿って配置された１つまたは複数の流体タップを有し、それによって、貯蔵マトリックス２０とケーソン１４の外側のポイントとの連絡が可能になることを理解されたい。１つまたは複数の流体タップであって、それぞれがタップ内に流体を流すことを可能にし、または流すことができないようにする手段を有する流体タップの存在によって、貯蔵マトリックス２０の流体分を、１つまたは複数の画定されたポイントでタップ内に逸らしまたはタップから逸らすことが可能になる。マトリックス２０の一部または全てを含む材料が、検体種を取り込みまたは他の方法で一時的に保持する能力を有する場合、溶媒組成物形成およびサンプル注入プロセスの一部として比較的高い流量でサンプルを予め濃縮しまたはサンプルの洗浄を行うために、選択的に流れを分流させることができる。あるいは、貯蔵マトリックス２０を単一方向に流れる溶媒でパージするために、流れの分流を使用することができる。
【００６９】
本明細書に記載する例示的な実施形態は、流体アキュムレータ２４の機能を実現するアコーディオン状ベローを含むが、当業者なら、流体計量源によって排出することが可能な様々なタイプの溶媒組成物６０を封じ込めた装置のいずれかを使用できることが理解されよう。
【００７０】
本明細書に記載する例示的な実施形態では、単一のケーソン１４内に、単一の貯蔵マトリックス２０、遮断弁２２、流体アキュムレータ２４、および流体体積変位変換器２６が組み込まれるが、単一のケーソン１４は、複数の貯蔵マトリックス２０であってそのそれぞれが、関連する遮断弁２２、流体アキュムレータ２４、および液量変位変換器２６を有するものを包含することができ、それによって、クロマトグラフィ分離の多重チャネルが生じ、共通の圧力または圧力プロフィルにかけられる並行動作モードが提供されることが理解されよう。
【００７１】
本明細書に開示される実施形態には、様々なその他の修正を加えることができることが理解されよう。例えばケーソン１４内の流体２５の加圧は、複数の動力化機構（ピストン１２およびモータ１８）を含むことによって、ケーソン１４内の加圧気体の浸潤によって、または流体２５の加熱によって、引き起こすことができる。
【００７２】
本明細書に記載する実施形態は、後入れ先出しの組成順序で貯蔵マトリックス２０内の溶媒組成物を形成し放出することを含むが、貯蔵マトリックスにアクセスする追加の弁動作および流体タップを実装することにより、貯蔵マトリックス２０内の溶媒組成物の形成および放出が先入れ先後出しの順序で可能になることを理解されたい。
【００７３】
本発明を、その例示的な実施形態に関して図示し記述してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その形および詳細に様々なその他の変更、省略、および追加をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  溶媒組成物成サブシステム、低圧サンプル・インゼクタ、遮断弁、ケーソン、貯蔵マトリックス、流体アキュムレータ、液量変位変換器、圧力センサ、ピストンおよびピストン・アクチュエータ、および任意選択の高圧サンプル・インゼクタを含む、本発明による高圧キャピラリ液体クロマトグラフィ溶媒送出システムのブロック図である。
【図２】  ３つの流体計量ユニットを含む、三成分対応溶媒組成物形成サブシステムのブロック図である。
【図３】  図１の実施形態で液量変位変換器として実装された線形可変差動変圧器（ＬＶＤＴ）の調整済み電圧出力を示す図である。
【図４】  本発明の代替の実施形態を示すブロック図である。
【図１】
0004713043.tif 000002
【図２】
0004713043.tif 000003
【図３】
0004713043.tif 000004
【図４】
0004713043.tif 000005