(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性心筋炎の予防または治療薬剤。
【請求項２】
２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性心筋炎により惹起されるウイルス性疾患の予防または治療薬剤。
【請求項３】
ウイルス性心筋炎またはそれに惹起されるウイルス性疾患がＲＮＡウイルスまたは肝炎ウイルスによって引き起こされるものである請求項１または２記載の予防または治療薬剤。
【請求項４】
ＲＮＡウイルスがオルトミクソウイルスまたはピコルナウイルスである請求項３記載の予防または治療薬剤。
【請求項５】
ウイルス性疾患がウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、Ｇ型、ＴＴＶ型）、アデノウイルス感染症、インフルエンザ、ヘルペス感染症、ウイルス性脳炎、サイトメガロウイルス感染症、ウイルス性腸炎またはウイルス性心膜炎である請求項２記載の予防または治療薬剤。
【請求項６】
２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性の細胞傷害の改善または予防用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性心筋炎またはウイルス性心筋炎により惹起されるウイルス性疾患の予防または治療薬剤、更にはウイルス性の細胞傷害の改善または予防用薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ウイルス性疾患の予防にはウイルスワクチンが主として用いられているが、ワクチンは各々のウイルスに特異的なもので個々のウイルスに対してのみ有効である。しかし、ウイルスの種類は多く、現在、極めて限られたウイルスに対してのみ実用化されている。また、ウイルスは変異株が多く、同一のウイルスに対してもワクチンが有効でないことも多い。さらに副作用の少ないワクチンを数多く開発することは極めて困難である。
【０００３】
一方、種々の抗ウイルス剤（アシクロビル、ガンシクロビル、アラＡなど）も開発され、実用化されているが、極めて限られたウイルス感染症にのみ有効で、広範なウイルス性疾患に有効な薬剤は見当たっていない。また、これらの抗ウイルス剤は副作用が強く、広く臨床に用いることは困難である。近年、インターフェロンがウイルス性肝炎等の治療に応用されているが、発熱などの副作用が高頻度に出現している。また、インターフェロンはウイルスの増殖を抑制するが、細胞傷害を直接防御するとの報告はみられない。ガンマグロブリンは、広くウイルス性疾患の治療に用いられているが、その成績は必ずしも一定ではない。
【０００４】
２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール・塩酸塩を含む２−アミノプロパン−１，３−ジオール化合物は、臓器または骨髄移植における拒絶反応の抑制剤として、また乾癬、ベーチェット病などの様々な自己免疫疾患およびリウマチ疾患の治療薬であることが知られている（国際公開ＷＯ９４／０８９４３号）。
しかし、先行技術には、２−アミノプロパン−１，３−ジオール化合物が、ウイルス性疾患の治療に有効であるとの記載はされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、ウイルスには数多くの種類があり、各ウイルスに対する特異的な治療を行うのは困難である。従って、多くのウイルス性疾患において発生する種々の臓器における細胞傷害を予防または治療することが極めて重要である。ウイルス性疾患における細胞傷害はウイルスの増殖による直接的な傷害のほか、ウイルス感染によって引き起こされる種々の免疫反応が関与すると考えられている。本発明は、ウイルスの種類にかかわらず種々の臓器における細胞傷害の発症予防および治療を行うことによりウイルス性心筋炎およびウイルス性心筋炎により惹起されるウイルス性疾患の予防または治療を行おうとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、ウイルス性心筋炎またはウイルス性心筋炎により惹起されるウイルス性疾患の予防または治療薬剤について鋭意研究を重ねてきたところ、意外にも２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩が有効であることを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下のとおりである。
▲１▼  ２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性心筋炎の予防または治療薬剤。
▲２▼  ２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性心筋炎により惹起されるウイルス性疾患の予防または治療薬剤。
▲３▼  ウイルス性心筋炎またはそれに惹起されるウイルス性疾患がＲＮＡウイルスまたは肝炎ウイルスによって引き起こされるものである▲１▼または▲２▼記載の予防または治療薬剤。
▲４▼  ＲＮＡウイルスがオルトミクソウイルスまたはピコルナウイルスである▲３▼記載の予防または治療薬剤。
▲５▼  ウイルス性疾患がウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、Ｇ型、ＴＴＶ型）、アデノウイルス感染症、インフルエンザ、ヘルペス感染症、ウイルス性脳炎、サイトメガロウイルス感染症、ウイルス性腸炎またはウイルス性心膜炎である▲２▼記載の予防または治療薬剤。
▲６▼  ２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するウイルス性の細胞傷害の改善または予防用薬剤。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明における２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールは、公知化合物であり、例えば、国際公開ＷＯ９４／０８９４３号に開示の方法等により製造することができる。
【０００８】
２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールは、必要に応じて適当な溶媒（水、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなど）中、酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸など）と処理することにより、上記の酸との塩などの薬理学的に許容される塩とすることができる。
【０００９】
本発明において、２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩は、低毒性で、動物とりわけ哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ウサギ、マウス、ラットなど）に対するウイルス性心筋炎またはそれから惹起されるウイルス性疾患の予防または治療薬剤として有用である。本発明で対象とするウイルス性心筋炎、またはそれから惹起されるウイルス性疾患には、ＤＮＡウイルスあるいはＲＮＡウイルスのいずれに属する病原ウイルスによって引き起こされる疾患も含まれる。そのような病原ウイルスを以下に例示する。
ＤＮＡウイルス：  ポックスウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルスなど）、アデノウイルス、パルボウイルス
ＲＮＡウイルス：  レオウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス
【００１０】
とりわけ、本発明の薬剤は、ＲＮＡウイルスまたは肝炎ウイルスによって引き起こされるウイルス性心筋炎またはそれから惹起されるウイルス性疾患に罹患した患者の治療または予防に好ましく適用し得る。ここで、特にＲＮＡウイルスとしてオルトミクソウイルスあるいはピコルナウイルスが挙げられる。
【００１１】
ウイルス性心筋炎から惹起されるウイルス性疾患の疾患名としては、具体的には、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、Ｇ型、ＴＴＶ型）、アデノウイルス感染症、インフルエンザ、ウイルス性肺炎、ウイルス性気管支炎、ヘルペス感染症（単純ヘルペス、ＥＢウイルス（伝染性単核症）、帯状疱疹）、ポリオ、エイズ（ＨＩＶ感染症）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、パピローマ、麻疹、風疹、突発性発疹、伝染性紅斑、ウイルス性脳炎、ウイルス性髄膜炎、サイトメガロウイルス感染症、流行性耳下腺炎、水痘、狂犬病、ウイルス性腸炎、ウイルス性心膜炎、コクサッキーウイルス感染症、エコーウイルス感染症、腎症候性出血熱、ラッサ熱などが挙げられる。
【００１２】
さらに上記に挙げたウイルス性疾患の中でも、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、Ｇ型、ＴＴＶ型）、アデノウイルス感染症、インフルエンザ、ヘルペス感染症、ウイルス性脳炎、サイトメガロウイルス感染症、ウイルス性腸炎、ウイルス性心膜炎に対して好ましく適用可能である。
【００１３】
２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩は、経口的に、非経口的に、吸入法、直腸投入、あるいは局所投与により用いることができ、医薬品組成物あるいは製剤（例えば、粉末、顆粒、錠剤、ピル剤、カプセル剤、注射剤、シロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤など）として用いることができ、それらは本発明の２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは医薬として許容される担体（アジュバント剤、賦形剤、補形剤及び／又は希釈剤など）と混合して用いることができる。医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。
【００１４】
本発明明細書において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法などを含むものである。注射用調剤、例えば無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物は、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤を用いて当該分野で知られた方法で調製されうる。その無菌注射用調剤は、また、例えば水溶液などの製剤上許容される非経口投与可能な希釈剤あるいは溶剤中の無菌の注射のできる溶液または懸濁液であってもよい。使用することのできるベヒクルあるいは溶剤として許されるものとしては、水、リンゲル液、等張食塩液などが挙げられる。さらに、通常溶剤または懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油も用いられうる。このためには、いかなる不揮発性油も脂肪酸も使用でき、天然あるいは合成あるいは半合成の脂肪油または脂肪酸、そして天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類も包含される。
【００１５】
直腸投与用の座剤は、その薬物と適当な低刺激性の補形剤、例えばココアバターやポリエチレングリコール類といった常温では固体であるが腸管の温度では液体で、直腸内で融解し、薬物を放出するものなどと混合して製造できる。
【００１６】
経口投与用の固形投与剤型としては、上記した粉剤、顆粒剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤などが挙げられる。そのような剤型において、活性成分化合物は、少なくとも一つの添加物、例えばショ糖、乳糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、寒天、アルギネート類、キチン類、キトサン類、ペクチン類、トラガントガム類、アラビアゴム類、ゼラチン類、コラーゲン類、カゼイン、アルブミン、合成または半合成のポリマー類またはグリセリド類と混合することができる。そのような剤型物は、通常の剤型のようにさらに別の添加物を含んでもよい。別の添加物としては、例えば不活性希釈剤、マグネシウムステアレートなどの滑沢剤、パラベン類、ソルビン酸などの保存剤、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合化剤、増粘剤、緩衝化剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パフューム剤などが挙げられる。錠剤およびピル剤は、さらにエンテリックコーティングすることもできる。
【００１７】
経口投与用の液剤としては、医薬として許容されるシロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤などが挙げられる。これらは、当該分野で普通用いられる不活性希釈剤、例えば水を含んでいてもよい。
【００１８】
ある特定の患者の投与量は、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行っている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩は、低毒性で安全に使用することができる。当該化合物の１日の投与量は、患者の状態や体重、投与経路などによって異なるが、例えば成人のウイルス性心筋炎またはそれから惹起されるウイルス性疾患の治療薬剤として投与する場合、経口投与では、一日量約０．０１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、静注では、一日量約０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜２０ｍｇを１回または２回ないし３回に分けて投与するのが好ましい。
【００１９】
【実施例】
以下に、試験例によって本発明の効果を明らかにするが、これらは単なる例示であり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２０】
試験例１
ウイルス性心筋炎に対する効果
化合物１：２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール塩酸塩
（１）生存率
方法
４週齢ＤＢＡ／２マウスを３グループに分け、ＥＭＣ（Encephalomyocarditis）ウイルス１０ｐｆｕを腹腔内接種し、接種後から、対照として蒸留水（溶媒）（グループＡ、ｎ＝１１）、化合物１を１ｍｇ／ｋｇ／日（グループＢ、ｎ＝１０）、３ｍｇ／ｋｇ／日（グループＣ、ｎ＝１０）を、連日１４日後までゾンデを用いて強制経口投与した。１４日後の各グループの生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって比較した。
結果
対照群（グループＡ、ｎ＝１１）は、８日後までに全て死亡した（生存率０％）が、化合物１投与群の１４日後の生存率は、グループＢ（ｎ＝１０）で１匹（生存率１０％）、グループＣ（ｎ＝１０）で３匹（生存率３０％）であり、３ｍｇ／ｋｇ／日群で統計的に有意な生存率の改善がみられた（ｐ＜０．０５）。
【００２１】
（２）心臓の病理組織学的所見
方法
４週齢ＤＢＡ／２マウスを３グループに分け、ＥＭＣ（Encephalomyocarditis）ウイルス１０ｐｆｕを腹腔内接種し、接種後から、対照として蒸留水（溶媒）（ｎ＝９）、化合物１を３ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝８）を、連日５日後までゾンデを用いて強制経口投与した。５日後に心臓を採取し、ホルマリン固定後ヘマトキシリン−エオジン染色を行い、心臓壊死、細胞浸潤の２項目につき、以下のようにスコア化した。
０；病変なし、１＋；心臓の２５％以下の病変、２＋；２５％より多く、５０％以下の心臓の病変、３＋；５０％より多く、７５％以下の心臓の病変、４＋；７５％より多く、１００％以下の心臓の病変
結果
心臓の病理組織学的所見の結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表１より、ＥＭＣウイルス接種５日後の心臓の心筋細胞壊死、細胞浸潤は１０ｍｇ／ｋｇ／日投与群で用量依存的に改善がみられた。
【００２４】
以上の結果から、２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール塩酸塩は、ＥＭＣウイルス感染によるマウスの死亡率を改善し、ウイルス性心筋炎を改善し、ウイルス感染に有効であることが明らかになった。
【００２５】
上記拡張型心筋症の動物モデルについては、Circulation. 65:1230-1235, 1982またはCirculation. 66:355-360, 1982に記載されている。
【００２６】
試験例２
化合物１と免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（以下、ＣｓＡという）とのウイルス性心筋炎に対する効果を比較した。化合物１は滅菌蒸留水に溶解して投与し、ＣｓＡはオリーブ油に溶解したものを投与した。
（１）生存率
方法
４週齢雄性ＤＢＡ／２マウスを３グループに分け、ＥＭＣウイルス１０ｐｆｕを腹腔内接種し、接種後から、対照として蒸留水（溶媒）（対照群、ｎ＝２１）、ＣｓＡを４０ｍｇ／ｋｇ／日（ＣｓＡ群、ｎ＝９）、化合物１を１０ｍｇ／ｋｇ／日（化合物１群、ｎ＝２２）の投与量で、連日１４日後までゾンデを用いて強制経口投与した。１４日後の各グループの生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって比較した。
結果
結果を図１に示す。対照群（黒四角）は、１０日目までに全て死亡した（生存率０％）。ＣｓＡ群（黒丸）は７日目までに全て死亡し、対照群と比べて生存率が有意に悪化した。これに対して、化合物１群（白丸）の１４日後の生存率は２７％（２２匹中６匹生存）であった。ＣｓＡ群と対照群との生存率には有意差があった（*ｐ＜０．０５）。
【００２７】
（２）心臓の病理組織学的所見
方法
４週齢雄性ＤＢＡ／２マウスを３グループに分け、ＥＭＣウイルス１０ｐｆｕを腹腔内接種し、接種後から、対照として蒸留水（溶媒）（ｎ＝９）、ＣｓＡを４０ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝６）、化合物１を１０ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝８）の投与量で、連日５日後までゾンデを用いて強制経口投与した。５日後に心臓を採取し、ホルマリン固定後ヘマトキシリン−エオジン染色を行い、心筋細胞壊死、細胞浸潤の２項目につき、試験例１に記載した基準に従ってスコア化した。
心筋細胞壊死および細胞浸潤のスコアは、２人の観察者によって独立して評価し、平均した。統計学的分析はone way analysis of variance (ANOVA)、Fisher's protected least significant difference testにより行った。結果
結果を図２（細胞浸潤）、図３（心筋細胞壊死）および表２に示す。
【００２８】
【表２】
0004627356.tif 000003
【００２９】
ＣｓＡ群における細胞浸潤のスコアは対照群のスコアと比べて低かったが、有意差はなかった。ＣｓＡ群における心筋細胞壊死のスコアは対照群のスコアよりわずかに高かったが、有意差はなかった。これに対して、化合物１群においては、細胞浸潤、心筋細胞壊死のスコアはともに対照群のスコアと比べて有意に低かった。従って、化合物１の投与により心筋細胞壊死、細胞浸潤について有意な改善効果が認められた。
【００３０】
（３）心臓のウイルス力価
方法
４週齢雄性ＤＢＡ／２マウスを３グループに分け、ＥＭＣウイルス１０ｐｆｕを腹腔内接種し、接種後から、対照として蒸留水（溶媒）（ｎ＝８）、ＣｓＡを４０ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝５）、化合物１を１０ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝７）の投与量で、連日５日後までゾンデを用いて強制経口投与した。５日後にマウスから無菌的に採取した心室の重量を測定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，１ｍｌ）中でホモジナイズした。４℃、１，５００ｇにて１５分間遠心分離した後、上清から０．１ｍｌをとり、ヒト羊膜ＦＬ細胞単層に接種し、５％ＣＯ2中、３７℃で６０分間培養した。この細胞を、４％ウシ胎児血清および１％メチルセルロースを含有する培地（３ｍｌ）でおおった。５％ＣＯ2含有湿潤雰囲気下、３７℃にて２０時間培養後、細胞を酢酸−メタノール（１：２）で固定し、１％クリスタルバイオレットで染色し、倒立顕微鏡下でプラーク数をカウントした(Circulation. 89:846-851, 1994)。プラーク数が多すぎてカウントできない場合は、上清をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）により適当に希釈した後、同様のアッセイを繰り返した。試験を２回行い、その平均を算出した。ウイルス力価はｐｆｕ／ｇ心臓として表した。統計学的分析はone way ANOVA、Fisher's protected least significant difference testにより行った。結果
結果を図４および表３に示す。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
ＣｓＡは心臓におけるウイルス複製を対照群と比べて約２０倍増加させた。これに対して、化合物１はＣｓＡのようなウイルス複製を増加させる効果を示さなかった。
【００３３】
（４）心臓サイトカインアッセイ
方法
上記（３）で５日目に採取したマウス心室を、超音波ホモジナイザーを用いてＰＢＳ（１ｍｌ）中でホモジナイズし、４℃、１４，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上清をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのアッセイの試料として使用した。各サイトカインの蛋白濃度は、市販のキットを使用してＥＬＩＳＡにより測定した(Circulation. 100:1102-1108, 1999)。マウスＩＬ−２およびＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡキットはGENZYME Corporation, Cambridge, U.S.A.から、マウスＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡキットはENDOGEN Inc., Cambridge, U.S.A.から購入した。
各上清中の総蛋白濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により測定し、総蛋白濃度に対するサイトカイン濃度の割合を算出した(J. Am. Coll. Cardiol. 33:1400-1407, 1999)。各サイトカイン蛋白濃度はｐｇ／ｍｇ総蛋白またはｎｇ／ｍｇ総蛋白として表した。統計学的分析はone way ANOVA、Fisher's protected least significant difference testにより行った。
結果
結果を図５〜８および表４に示す。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
Ｔ細胞増殖に関連することが知られているＩＬ−２濃度は、ＣｓＡ群および化合物１群の両方において抑制された。しかし、化合物１群におけるＩＬ−２抑制の程度は、ＣｓＡ群と比べて弱かった。ウイルス複製を阻害する効果を有するＩＦＮ−γの濃度(Jpn. Circ. J. 51:661-664, 1987)は、ＣｓＡ群では著しく減少したが、化合物１群では減少の程度が少ない。同様に、Ｔｈ１（１型ヘルパーＴ細胞）特異的サイトカインであるＩＬ−１２の濃度は、ＣｓＡ群では著しく減少しているが、化合物１群では減少の程度が少ない。これとは逆に、炎症性サイトカインの一つであるＴＮＦ−αの濃度は、ＣｓＡ群では対照群と比べて上昇しているが、化合物１群では影響がなかった。
【００３６】
（５）心臓内一酸化窒素（ＮＯ）アッセイ
心臓内ＮＯ含量を、サイトカインアッセイに使用したのと同じ上清を使用して、Griess法の変法(J. Am. Coll. Cardiol. 33:1400-1407, 1999; Anal. Biochem. 224:502-508, 1995)により測定した。簡単に説明すると、上清または標品亜硝酸塩（５０μｌ）を１０μＭ  βＮＡＤＰＨ（１０μｌ）と混合し、予め混合しておいたマスターミックス（５００μＭグルコース−６−ホスフェート、１６０Ｕ／ｌグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、８０Ｕ／ｌニトレートレダクターゼ、０．２ｍＭリン酸緩衝液）（４０μｌ）を添加して、２０℃で４５分間インキュベートした。５％Ｈ3ＰＯ4中の１％スルファニルアミド（５０μｌ）および０．１％ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（５０μｌ）をさらに添加し、２０℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍにおける光学密度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。標品に基づいて各サンプルの亜硝酸塩濃度を算出した。各サンプルと標品の測定を２回ずつ行った。心臓内ＮＯ含量の値は、各亜硝酸塩濃度を各上清中の総蛋白濃度で割ることにより決定し、μＭ／ｍｇ総蛋白として表す。統計学的分析はone way ANOVA、Fisher's protected least significant difference testにより行った。結果
結果を図９および表５に示す。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
ＣｓＡ群では対照群と比較して心臓内ＮＯ含量が有意に増加したが、化合物１群では対照群と有意な差はなかった。
【００３９】
上記の結果をまとめると、心臓におけるＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γの発現は化合物１群およびＣｓＡ群の両方において対照群と比べて抑制されるが、化合物１群においては抑制の程度が弱かった。ＴＮＦ−αおよびＮＯはＣｓＡ群で有意に増加したが、化合物１群では対照群と有意差はなかった。ＩＬ−２はＴ細胞増殖に関連し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γの産生を誘導する作用を有する。Ｔｈ１特異的サイトカインであるＩＬ−１２はＴ細胞、ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γの産生を誘導する作用を有する。ＩＦＮ−γはマクロファージを活性化することによりウイルス増殖阻害作用を示す。従って、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γの発現抑制の程度が、化合物１群に比べて、ＣｓＡ群において高いという上記の結果は、ＣｓＡはウイルス複製を増加させるが、化合物１にはそのような作用がなかったという上記（３）の結果と一致する。また炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αは細胞傷害活性があり、ＮＯは心筋損傷を引き起こすことが知られている。上記の結果から、ＣｓＡはＴＮＦ−α、ＮＯを増加させるが、化合物１はＴＮＦ−α、ＮＯを増加させないことが判明した。従って、化合物１はウイルス性の細胞傷害の改善に有効である。
【００４０】
以上の結果から、化合物１（２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオール塩酸塩）は、ウイルス複製を誘導することなく、ウイルス性心筋炎の治療に有効であることが明らかになった。
【００４１】
シクロスポリンなどの免疫抑制剤は、臓器移植または骨髄移植後の免疫抑制療法に使用されているが、サイトメガロウイルスなどのウイルスによる重篤な感染症を引き起こすことが問題となっている。上記の試験結果から明らかなように、本発明に係る２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールは、従来の免疫抑制剤と異なり、ウイルス増殖を誘導する作用がないため、臓器移植または骨髄移植後の免疫抑制療法においても、サイトメガロウイルスのようなウイルスによる感染症を誘発する可能性が極めて低いと考えられる。
【００４２】
処方例
（１）錠剤
下記組成物の化合物１含有錠剤を製造する。
化合物１                                      １ｍｇ
乳糖                                        ９０ｍｇ
結晶セルロース                              ２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ４ｍｇ
【００４３】
（２）ソフトカプセル剤（１カプセル中）
化合物１                                    ３０ｍｇ
ポリエチレングリコール−３００            ３００ｍｇ
ポリソルベート８０                          ２０ｍｇ
製造方法
化合物１にポリエチレングリコール−３００およびポリソルベート８０を加え、ソフトカプセルに充填して製造する。
【００４４】
（３）注射剤（１アンプル  １０ｍｌ中）
化合物１                                    ０．３％（３０ｍｇ）
ポリエチレングリコール−３００                ２０％（２ｇ）
エタノール                                    ６０％（６ｇ）
注射用蒸留水で全量１０ｍｌとする。
製造方法
化合物１にエタノールおよびポリエチレングリコール−３００を加えて溶解し、注射用蒸留水を加えて全量１０ｍｌとする。
１アンプル中化合物１を３０ｍｇ含有した注射剤を得る。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によると、ウイルスに起因する細胞傷害に対して２−アミノ−２−（２−（４−オクチルフェニル）エチル）プロパン−１，３−ジオールまたはその薬理学的に許容される塩の投与によって改善効果が認められ、ウイルス性心筋炎またはウイルス性心筋炎により惹起されるウイルス性疾患の治療効果があり、また該疾患の予防にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例２における生存率の結果を示すグラフである。黒四角は対照群、黒丸はＣｓＡ群、白丸は化合物１群を示す。
【図２】試験例２における細胞浸潤のスコアを示すグラフである。
【図３】試験例２における心筋細胞壊死のスコアを示すグラフである。
【図４】試験例２における心臓のウイルス力価の結果を示すグラフである。
【図５】試験例２における心臓サイトカインアッセイのＩＬ−２の結果を示すグラフである。
【図６】試験例２における心臓サイトカインアッセイのＩＬ−１２の結果を示すグラフである。
【図７】試験例２における心臓サイトカインアッセイのＩＦＮ−γの結果を示すグラフである。
【図８】試験例２における心臓サイトカインアッセイのＴＮＦ−αの結果を示すグラフである。
【図９】試験例２における心臓内ＮＯアッセイの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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