(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、ミトコンドリアの膜電位を変化させるミトコンドリアＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル開口剤の評価方法。
（ａ）ヒト株化細胞である培養細胞と被験物質とを接触させる工程
（ｂ）２０−９０ｍＭのカリウムイオン濃度下で培養細胞と０．１μＭ−３ｍＭのウアバインとを接触させる工程
（ｃ）培養細胞のミトコンドリア膜電位変化を測定する工程、及び
（ｄ）培養細胞のミトコンドリア膜電位を変化させるミトコンドリアＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル開口剤を選択する工程。
【請求項２】
培養細胞が、Ｇｉｒａｒｄｉ細胞である請求項１に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアの膜電位を変化させる物質の評価方法に関するものである。または、ミトコンドリア内へのカルシウム流入を抑制する物質の評価方法に関するものである。更には、ミトコンドリア内膜におけるATP感受性K+チャンネル（ミトコンドリアATP感受性K+チャンネル、以下mitoKATPchannelと記す。）開口剤の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜ATP感受性K+チャネル（以下、sarcKATPchannelと記す。）は、心筋細胞膜、平滑筋細胞膜および膵臓β細胞膜に存在し、細胞質中のカルシウム濃度を調節することが知られている（非特許文献１参照）。従来、心筋細胞膜および平滑筋細胞膜のKATPchannelの開口薬は狭心症や高血圧の治療薬として研究されてきた。また、膵臓β細胞膜のKATP channel遮断薬は糖尿病治療薬として上市されている。【０００３】
近年、mitoKATP channelの存在、及びこのチャネルを開口することにより細胞の虚血傷害が抑制されることが薬理学的、生理学的に示された（非特許文献２参照）。【０００４】
虚血時、細胞ではエネルギー産生途絶により細胞膜上のNa-K ATPase活性が低下し、細胞内Na濃度が上昇する。血流の再開通（再灌流）により、虚血時に増加した細胞内Naが細胞外のCaと交換して細胞内Caが上昇する。このCaはミトコンドリア内にも流入し、ミトコンドリア内Ca濃度上昇とミトコンドリア内膜の脱分極が起きる。さらに、再灌流によって生じる活性酸素種もミトコンドリア内膜の脱分極を促進する。【０００５】
再灌流時、mitoKATP channelを予め開口させておくと、ミトコンドリア内へのCa流入が抑制され、ミトコンドリア内膜の脱分極も抑制される（非特許文献３参照）。【０００６】
mitoKATP channel開口作用と病態の関係を検討するため、（１）株化細胞であるGirardi細胞、PC12細胞、SHSY-5Y細胞、human neuroblastoma細胞、又はrat心筋初代培養細胞等を用いた評価方法、（２）遠心分離により細胞から単離したミトコンドリアを用いた評価方法、又は（３）摘出心臓に対する効果を評価する方法等が一般的に知られている。【０００７】
さらにGriardi細胞（GIRARDI HEART: ECACC No.9312082）を用いた以下の評価方法が報告されている。
（１）Griardi細胞を２４ウエルの培養プレートに播種し、アデノシンあるいはmitoKATP channel開口薬ジアゾキサイドを添加後、虚血状態を再現するため代謝阻害剤などを含む酸性化した培養液にて低酸素条件で細胞を3時間培養しさらに正常酸素濃度下で正常培養液にて1時間培養した。この後、細胞死の程度を検討するため、細胞死指示薬PI（Propidium iodide）を加え、細胞をトリプシンとＥＤＴＡで処理し、細胞を浮遊させ、フローサイトメトリーにPIを取り込んだ死細胞が発する 565-640nmの蛍光を測定し、その細胞数の分布を測定した。また、細胞をPIおよびトリプシン処理せずに、培養上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ濃度を測定した。その結果、アデノシンは細胞死を強力に抑制し、その作用はp38MAP kinase系活性化を介したmitoKATP channel開口作用に由来することが明らかとなった。（非特許文献４参照）。【０００８】
または、（２）Griardi細胞を６又は２４ウエルの培養プレートに播種後、ミトコンドリア膜電位感受性色素JC-1を含む培養液で所定期間培養した後、ミトコンドリア脱分極剤CCCPを添加した培養液で培養し、フローサイトメトリーによりミトコンドリア膜電位の指標である赤色蛍光の強度変化を検討したところ、蛍光強度が低下し、ミトコンドリアの脱分極が観察された。（非特許文献５参照）。【０００９】
一方、細胞膜のNa-K ATPaseの阻害剤であるウアバインが有する、細胞内Ca濃度及びミトコンドリア内のCa濃度を上昇させる性質を利用し、ジアゾキサイドのmitoKATPchannel開口作用をラット新生児の心筋初代培養細胞において確認した報告がある（非特許文献６参照）。【００１０】
しかし、従来の方法には改善すべき問題があった。【００１１】
すなわち、前記の方法においては、（１）低酸素条件で培養する際、培養環境を一定にするのが難しく、傷害の程度がウェル間でばらつきやすい。（２）細胞傷害の判定をフローサイトメトリー法、あるいは乳酸デヒドロゲナーゼ濃度測定法で行うため、大量の細胞を準備する必要がある。（３）フローサイトメトリー法においては、蛍光検出までの作業が繁雑である。（４）乳酸デヒドロゲナーゼ濃度の測定においても吸光度の測定に煩雑な作業を要するというものである。【００１２】
一方、蛍光変化を測定することにより、ミトコンドリアの酸化還元電位に影響を与える化合物のスクリーニング方法が報告されている（特許文献１）。しかし、特許文献１に記載された方法によっても、一検体を評価するには、煩雑な操作と多大な作業時間を要するものであった。【００１３】
このように、従来法は一定した条件を再現するのが困難であり、また、評価に要する時間と労力が多大なため、多数の薬剤を一度に評価するには不向きであった。
【特許文献１】PCT国際公開WO99/53024号公報
【非特許文献１】Kidney Int.57,838,2000
【非特許文献２】Circ Res. 84,973,1999
【非特許文献３】Cardiovasc.Res.55,534,2002
【非特許文献４】Basic Res.Cardiol.95,243,2000
【非特許文献５】Cardiavasc.Res.51,691,2001
【非特許文献６】Circ.Res.89,856,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、培養細胞におけるミトコンドリア膜電位を指標とした簡便で精度の高いミトコンドリアの膜電位を変化させる薬剤の評価方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、Girardi細胞を培養し、ミトコンドリアにミトコンドリア膜電位感受性色素JC-1を取り込ませた後、蛍光プレートリーダーにより、励起光に対して発生するJC-1のmonomer蛍光とJ-aggergate蛍光の強度比（monomer/J-aggergate）を求め、この蛍光強度比を指標にしてミトコンドリア膜電位を測定したところ、ウアバイン(Ouabain)にKClを併用添加すると、短時間で再現性よくミトコンドリア脱分極が起きることを見出した。そして更に、この試験系に被験物質を添加することにより、ミトコンドリア脱分極を抑制する活性、すなわちmitoKATPchannel開口剤としての活性を被験物質が有しているか否か、またその活性の強度を評価できることを見出し、さらに鋭意研究を行った結果本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち  本発明は以下（１）から（２７）の評価方法に関する。
（１）本発明は、細胞膜のイオン透過性調節剤の添加によってミトコンドリアの膜電位を変化させる物質の評価方法である。カルシウムがミトコンドリア内へ流入することでミトコンドリアの膜電位は変化しうるため、本発明にはミトコンドリア内へのカルシウム流入を抑制する物質の評価方法も含まれる。
（２）本発明は、下記工程を含む前述（１）に記載の評価方法である。【００１７】
(a) 培養細胞と被験物質とを接触させる工程
(b) 培養細胞と細胞膜のイオン透過性調節剤を接触させる工程
(c) 培養細胞のミトコンドリア膜電位変化を測定する工程
したがって、本発明は（a）と(b)の工程の順は問わず、（a）工程が先でも(b)工程が先でも本発明に含まれ、また（a）工程と（b）工程が同時に行われてもよい。
（３）本発明は、前述（２）の発明の（a）〜（c）の工程に、更に（d）培養細胞のミトコンドリア膜電位を変化させる被験物質を選択する工程を含む前述（２）に記載の評価方法である。
（４）本発明は、（d）の物質が、細胞のアポトーシスを抑制する物質であることを特徴とする前述（３）に記載の評価方法である。
（５）本発明は、（d）の物質が、ミトコンドリア内へのカルシウム流入を抑制する物質であることを特徴とする前述（３）又は（４）に記載の評価方法である。
（６）本発明は、（d）の物質が、ミトコンドリアATP感受性K+チャンネルに作用する物質であることを特徴とする前述（３）から（５）のいずれかに記載の評価方法である。
（７）本発明は、培養細胞が、細胞膜のイオン透過性調節剤に感受性の高い培養細胞である前述（２）から（６）のいずれかに記載の評価方法である。
（８）本発明は、培養細胞が、Na/K  ATPアーゼ阻害剤に感受性の高い培養細胞である前述（７）に記載の評価方法である。
（９）本発明は、培養細胞が、ウアバインに感受性の高い培養細胞である前述（８）に記載の評価方法である。
（１０）本発明は、培養細胞が、株化細胞である前述（２）から（９）のいずれかに記載の評価方法である。
（１１）本発明は、培養細胞が、ヒト株化細胞である前述（１０）に記載の評価方法である。
（１２）本発明は、培養細胞が、ヒトの心臓、脳、神経、肝臓又は膵臓由来の前述（１１）に記載の評価方法である。
（１３）本発明は、培養細胞が、Girardi細胞である前述（１２）に記載の評価方法である。
（１４）本発明は、培養細胞が光学的測定方法に使用することのできるプレート上で培養されることを特徴とする前述（２）から（１３）のいずれかに記載の評価方法である。
（１５）本発明は、細胞膜のイオン透過性調節剤が、ミトコンドリア膜電位変化を誘起するものである前述（２）から（６）のいずれかに記載の評価方法である。
（１６）本発明は、細胞膜のイオン透過性調節剤が、細胞膜のイオントランスポーター調節剤、又はイオン透過性チャンネル調節剤である前述（１５）に記載の評価方法である。
（１７）本発明は、細胞膜のイオントランスポーター調節剤、又はイオン透過性チャンネル調節剤が、Na+/Ca++交換系阻害剤、Na+/H+交換系阻害剤、Ca++モジュレータ、又はNa/K  ATPアーゼ阻害剤である前述（１６）に記載の評価方法である。
（１８）本発明は、細胞膜のイオントランスポーター調節剤、又はイオン透過性チャンネル調節剤が、Na/K  ATPアーゼ阻害剤である前述（１７）に記載の評価方法である。
（１９）本発明は、Na/K  ATPアーゼ阻害剤がウアバインである前述（１８）に記載の評価方法である。
（２０）本発明は、カリウムイオン濃度が高濃度の条件下で(b)培養細胞と細胞膜のイオン透過調節剤を接触させる工程を行うことを特徴とする前述（２）から（６）のいずれかに記載の評価方法である。
（２１）本発明は、カリウムイオン濃度が20−90mMであることを特徴とする前述（２０）に記載の評価方法である。
（２２）本発明は、細胞膜のイオン透過調節剤がウアバインである前述（２０）又は（２１）に記載の評価方法である。
（２３）本発明は、ウアバインの濃度が0.1μM-3mMであることを特徴とする前述（２２）に記載の評価方法である。
（２４）本発明は、細胞に取り込ませた蛍光色素の蛍光色によって膜電位変化を測定することを特徴とする前述（１）から（６）のいずれかに記載の評価方法である。
（２５）本発明は、蛍光色素が２色に発色をする色素である前述（２４）に記載の評価方法である。
（２６）本発明は、２色の蛍光色の比により膜電位変化を測定することを特徴とする前述（２５）に記載の評価方法である。
（２７）本発明は、蛍光色素がJC-1である前述（２４）から（２６）のいずれかに記載の評価方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の評価方法を使用することにより、mitoKATP channelに選択的に作用する薬剤を評価することができる。【００１９】
本発明の評価方法を使用することにより、ミトコンドリア膜電位を変化させる薬剤を、簡便で精度高く評価することができる。【００２０】
本発明の評価方法を使用することにより、ミトコンドリア膜電位を変化させる薬剤を、短時間で評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】BMS-191095の濃度と蛍光強度比の差を指標にしたBMS-191095のミトコンドリア脱分極作用の評価を示したものである。（実施例１）
【図２】ジアゾキサイドの濃度と蛍光強度比の差を指標にしたジアゾキサイドのミトコンドリア脱分極作用の評価を示したものである。（実施例１）
【図３】レブクロマカリムの濃度と蛍光強度比の関係を示したものである。（実施例１）
【図４】ジルチアゼムの濃度と蛍光強度比の関係を示したものである。（実施例１）
【図５】BMS-191095の濃度と蛍光強度比の差を指標にしたBMS-191095のミトコンドリア脱分極作用の評価を示したものである。（実施例２）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、細胞膜上のイオン透過性調節剤を培養細胞と接触させることによりもたらされるミトコンドリアの膜電位変化を、蛍光色素の蛍光強度変化として測定し、これを指標として被検物質が有するミトコンドリアの膜電位の変化能を評価するものである。更には、カリウムイオンが高濃度の条件下で本発明を実施することが好ましい。【００２３】
本発明により、ミトコンドリア膜電位を変化させる物質を選択することができ、これにより、細胞のアポトーシスを抑制する物質、ミトコンドリア内へのカルシウム流入を抑制する物質、ミトコンドリアATP感受性K＋チャンネルに作用する物質を選択することができる。【００２４】
本発明に用いる培養細胞は、細胞膜のイオン透過性調節剤、特にNa/K  ATPアーゼ阻害剤に感受性の高い培養細胞が好ましく、より好ましくはウアバインに感受性の高い培養細胞である。この「感受性の高い」細胞とは、イオン透過性調節剤、Na/K  ATPアーゼ阻害剤又はウアバインを加えたときに十分な膜電位変化が起きる細胞をいい、たとえばイオン透過性調節剤、Na/K  ATPアーゼ阻害剤又はウアバインを加えた場合に、これらを加えない培養条件に対して、有意な蛍光強度比の差が認められる細胞をいう。【００２５】
本発明に用いる培養細胞とは、株化細胞もしくは初代培養細胞のことをいう。好ましいの例として、株化細胞が挙げられる。より好ましくはヒト株化細胞である。この「ヒト株化細胞」とは、ヒト組織を由来とし、無限増殖能を獲得し株化された細胞のことをいう。このヒト株化細胞の中でも、ヒト心臓、脳、神経、肝臓又は膵臓等の臓器や組織由来のヒト株化細胞がより好ましい。【００２６】
本発明に用いる「Girardi細胞」とは、ヒト心臓由来Girardi 細胞（GIRARDI HEART、ECACC No.9312082）であり、European Collection of Cell Cultureにより入手することができる。
本発明に用いる「被験物質」とは、本発明の評価系に添加できる物質であれば特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製もしくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、核酸、合成低分子化合物、又は天然化合物等が挙げられる。【００２７】
本発明に用いる「細胞膜のイオン透過性調節剤」とは細胞膜のイオン透過性に影響を与える物質を意味する。細胞膜のイオン透過性調節剤の好ましい具体例として、「イオントランスポーター調節剤」、又は「イオン透過性チャンネル調節剤」等が挙げられる。これら調節剤の、好ましい具体例として、Na+/Ca++交換系阻害剤（ジクロロベンザミル等）、Na+/H+交換系阻害剤（アミロライド又はカリポライド等）、Ca++チャネルモジュレータ（ニフェジピン、 ニカルジピン、 ジルチアゼム、ベラパミル、 Bay K 8644、又はマイトトキシン等）、Na+チャネルモジュレータ(テトロドトキシン、ベラトリジン、バトラコトキシン、又はモネンシン等)、 K+チャネルモジュレータ(5-ヒドロキシデカン酸、HMR-1098、レブクロマカリム、ピナシジル、4-アミノピリジン、テトラエチルアンモニウム、又はバリノマイシン等)、又はNa-K  ATPase阻害剤（ウアバイン、ジゴキシン、又はジギトキシン等）等が挙げられる。例えばウアバインを用いる場合の濃度は、好ましくは0.1μM-3mMであり、より好ましくは100μM-2mMである。【００２８】
本発明中の「培養細胞と被験物質を接触させる工程」は、結果として培養細胞と被験物質が接触できる工程であれば特に制限はなく、例えば、培養中の細胞培養液に被験物質を添加する工程や、予め被験物質を添加して調整した細胞培養液で細胞を培養する工程等のように細胞培養液中に被験物質を存在する工程等が挙げられる。【００２９】
本発明中の「培養細胞と細胞膜のイオン透過性調節剤を接触させる工程」は、結果として培養細胞と細胞膜のイオン透過性調節剤が接触できる工程であれば特に制限はなく、例えば、培養中の細胞培養液に細胞膜のイオン透過性調節剤を添加する工程や、予め細胞膜のイオン透過性調節剤を添加して調整した細胞培養液で細胞を培養する工程等が挙げられる。【００３０】
本発明の実施の形態として、被験物質を添加した細胞培養液および細胞膜のイオン透過調節剤を添加した細胞培養液をそれぞれ準備して、これらの細胞培養液をそれぞれ、細胞に加えて培養することや、被験物質と細胞膜のイオン透過調節剤を含む細胞培養液を調節し、それを細胞に加えて細胞を培養する形態が挙げられる。【００３１】
本発明に用いる「細胞培養液」とは、目的の細胞が培養できる溶液であれば特に制限がなく、任意の血清培地、無血清培地や緩衝液等が挙げられる。【００３２】
本発明中の「カリウムイオン濃度が高濃度」とは、一般的に細胞培養に用いるカリウムイオン（5〜10mM）より高い濃度であることを意味し、好ましくはカリウム濃度が20-90mMである。カリウムイオンの調整方法としては、例えば所定の量のKClを添加することが挙げられるがこれに限定されない。【００３３】
本発明中の「光学的測定法に使用することのできるプレート」とは、主として96ウェルのクリアボトムブラックプレートあるいはブラックプレートを指す。このほか、蛍光プレートリーダーで測定することが可能な細胞培養用プレートとして、例えば384, 48, 24, 12, 6ウェルのプレート等が挙げられる。【００３４】
本発明中の「蛍光色素」とは、ミトコンドリア膜電位変化に感受性がある蛍光色素であり、例えばJC-1が挙げられる。
「JC-1」とは（「ミトコンドリア膜電位感受性色素JC-1」と記すこともある）、5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide    (Molecular Probes T-3168)である。この化合物は細胞内に取り込まれた後、ミトコンドリア内に移行し、ミトコンドリアが正常状態にあって外部との電位差が-180mV付近を示す場合、J-aggregateと呼ばれる凝集体を形成する。この凝集体は、488-490nmで励起した場合、590-600nmにピークを示す赤色蛍光を発する。一方、細胞質のJC-1はmonomerとなり、527nmにピークを示す緑色蛍光を発する。ミトコンドリアが脱分極した場合、JC-1はJ-aggregateを形成できないため、赤色蛍光が減少し緑色蛍光が増加する。この性質を用い、monomer/J-aggregateの蛍光強度比を検出することにより、ミトコンドリア膜電位の状態を観測することができる。【００３５】
以下に本発明の評価方法の概略を示す。【００３６】
まず、光学的測定法に使用することのできるプレートにGirardi細胞を播種し、正常培地（MEM培地に添加剤、例えば非必須アミノ酸又はウシ胎児血清等を添加したもの）で細胞培養する。次いで、JC-1を含む正常培地に交換しJC-1を細胞に取り込ませた後、被験物質を含む正常培地に交換し、培養する。その後、脱分極誘発培地（ウアバインとKClを含む正常培地をいう。本発明の評価方法においては、ウアバインは0.1μM-3mM、KClは20mM-90mMの濃度を用いることができる。）を添加する。なお、この被験物質は、JC-1に細胞を取り込ませた後、脱分極誘発培地とともに、あるいは脱分極誘発培地の添加後に添加してもよい。脱分極誘発培地を添加後、培養時間は1-24hrとすることができる。その後、蛍光プレートリーダー（JC-1の励起波長である488-490nm付近で励起することが可能で、JC-1のmonomer蛍光波長ピークである527nm付近およびJ-aggregateの蛍光波長である590-600nm付近で蛍光検出が可能なもの。）にてJC-1のmonomerの蛍光とJ-aggregateの蛍光を測定し、その蛍光強度比（monomer蛍光強度/J-aggregate蛍光強度）を算出する。
なお、同一プレート上に、以下の４種のウェルを設定し、以下のように活性を算出する。
（１）無処置：脱分極誘発培地のかわりに正常培地を添加するウェル、
（２）コントロール：被験物質を添加しないウェル、
（３）被験物質：各種、各濃度の被験物質を添加するウェル、
（４）ブランク：JC-1を添加しないウェル。
それぞれのウェルのmonomer蛍光強度とJ-aggregate蛍光強度を、(1)mあるいは(1)Jの様に示すとき、
A: 無処置の蛍光強度比 = [(1)m-(4)m]/[(1)J-(4)J]
B: コントロールの蛍光強度比 = [(2)m-(4)m]/[(2)J-(4)J]
C: 被験物質の蛍光強度比 =[ (3)m-(4)m]/[(3)J-(4)J]
とし、AよりもＢが上昇して脱分極が確認された際に、Cの値がBに比べてどの程度低下したかにより被験物質のmitoKATPchannel開口活性を検出する。
以下、本発明を実施例により、さらに具体的の説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
本評価方法で評価した薬剤（化合物）は以下のとおりである。
BMS-191095：J. Med. Chem., vol.40, 24-34(1997)に準じて合成し実験に使用した。
レブクロマカリム(levcromakalim, GlaxoSmithKline)：J. Med. Chem., vol.29, 2194-2201(1986)に準じて文献記載化合物２を合成して実験に使用した。
ジアゾキサイド (Diazoxide) : SIGMA D9035を購入して実験に使用した。
ジルチアゼム(Diltiazem hydrochloride) ：SIGMA D2521を購入して実験に使用した。【００３８】
正常培地[（MEM( GIBCO 11095-098)に1% 非必須アミノ酸（MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10mM 100X GIBCO 11140-050）、および10%ウシ胎児血清 (BIOFLUIDS DIVISION Lot No.302030) を添加）]に懸濁したGirardi細胞を96 ウェルクリアボトムブラックプレート（MATRIX MT4940）に200μL/wellで播種し、培養した。【００３９】
JC-1(Molecular Probes T-3168, 1mg/mL DMSO溶液)を10μL/mLの割合でフェノールレッド非含有正常培地［MEM（ GIBCO 51200-038）に1%非必須アミノ酸（MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10mM 100X GIBCO 11140-050）、1% L-グルタミン(L-Glutamine-200mM 100X: GIBCO 25030-149)および10%ウシ胎児血清(BIOFLUIDS DIVISION: Lot No.302030)を添加］に加え、ボルテックスミキサーで攪拌したのち、3000rpm, 1分間遠心し、上清をシリンジフィルター（0.22μm, MILLIPORE）で濾過した。96ウェルプレートの培地を除き、JC-1溶液を細胞の播種されたウェルに50μL/wellずつ分注した。ブランクのウェルにはJC-1を含まないフェノールレッド非含有正常培地を分注した。プレートをCO2インキュベーターに戻し、20分間インキュベーションした。【００４０】
次に、各ウェルをフェノールレッド非含有正常培地 200μLにて１回洗浄し、種々の濃度の各被験物質を含む同培地を50μL/wellずつ分注した。なお、各被験物質はDMSO(Dimethyl Sulfoxide: SIGMA D-8779)に溶解し、DMSOの最終濃度が0.1%になるように調製した。
無処置およびコントロールのウェルにはDMSO 0.1%を含む培地を50μL/wellずつ分注した。プレートをCO2インキュベーターに戻し、25分間インキュベーションした。【００４１】
次に、ウワバインを1mM、KClを60mM、および各濃度の被験物質を含む脱分極誘発培地（フェノールレッド非含有正常培地をベースに調製）を被験物質のウェルに50uL分注した。
無処置のウェルにはDMSO 0.1%を含む正常培地を、また、コントロールのウェルにはDMSO 0.1%を含む脱分極誘発培地を50μL/wellずつ分注した。
プレートをCO2インキュベーターに戻し、2時間インキュベーションした。【００４２】
脱分極誘発後、プレートを37℃に加温した蛍光プレートリーダー（TECAN, SpectraFluor）に装着し、まず、励起波長485nmでJ-aggregate蛍光を595nmで測定した。次に、励起波長485nmでmonomer蛍光を535nmで測定した。測定は、フラッシュ回数20回、50マイクロ秒のインターバルで行った。各群は４ウェルとした。monomer蛍光、J-aggregate蛍光それぞれについて、ブランクのウェルの蛍光強度の平均値を無処置、コントロール、被験物質の各ウェルの値から引き、各蛍光強度の比monomer/J-aggregateを求めた。【００４３】
結果を図１から図４に示す（平均値±標準誤差、各N=4）。【００４４】
本発明の評価方法を用いて実験を行った結果、mitoKATP channel開口作用を有することが他の評価方法によって確認されているBMS-191095（図１）およびジアゾキサイド（図２）について、ミトコンドリア脱分極を抑制する作用を簡便に評価することができた。【００４５】
一方、sarcKATP channelの開口剤であるレブクロマカリム（図３）やカルシウム拮抗薬のジルチアゼム（図４）はミトコンドリア脱分極を抑制しなかった。【００４６】
これらのことから、本発明の評価方法は、従来の評価方法と比べて簡便な作業によりmitoKATPchannel開口剤を特異的に検出できることがわかる。
【実施例２】
【００４７】
正常培地[（MEM( GIBCO 11095-098)に1% 非必須アミノ酸（MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10mM 100X GIBCO 11140-050）、および10%ウシ胎児血清 (BIOFLUIDS DIVISION Lot No.302030) を添加）]に懸濁し、1×105 cells/mLとしたGirardi細胞を96 ウェルクリアボトムブラックプレート（MATRIX MT4940）に200μL/well播種し、培養した。
プレート毎の蛍光ブランク値を測定するため、一部のウェルには細胞を播種しなかった。【００４８】
JC-1(Molecular Probes T-3168, 1mg/mL DMSO溶液)を10μL/mLの割合でフェノールレッド非含有正常培地［MEM（ GIBCO 51200-038）に1%非必須アミノ酸（MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10mM 100× GIBCO 11140-050）、1% L-グルタミン(L-Glutamine-200mM 100X: GIBCO 25030-149)および10%ウシ胎児血清(BIOFLUIDS DIVISION: Lot No.302030)を添加］に加え、ボルテックスミキサーで攪拌したのち、3000rpm, 2分間遠心し、上清をシリンジフィルター（0.22μm, MILLIPORE）で濾過した。96ウェルプレートの培地を除き、JC-1溶液を細胞の播種されたウェルに50μL/wellずつ分注した。ブランクのウェルにはJC-1を含まないフェノールレッド非含有正常培地を分注した。プレートをCO2インキュベーターに戻し、20分間インキュベーションした。【００４９】
次に、ウアバイン1mM、KCl 60mMおよび各濃度のBMS-191095を含む脱分極誘発培地（フェノールレッド非含有正常培地をベースに調製）を被験物質のウェルに100uL分注した。【００５０】
なお、BMS-191095はDMSO(Dimethyl Sulfoxide: SIGMA D-8779)に溶解し、DMSOの最終濃度が0.1%になるように調製した。【００５１】
無処置およびコントロールのウェルにはDMSO 0.1%を含む培地を100μL/wellずつ分注した。プレートをCO2インキュベーターに戻し、インキュベーションした。【００５２】
2時間後、プレートを37℃に加温した蛍光プレートリーダー（Molecular Divices, SpectraMax  GEMINI EM）に装着し、Bottom read, Lm1 Ex:485nm Em:530nm, Lm2 Ex:535nm Em:590nm, Read/Well:6回の条件で測定した。各群は４ウェルとした。monomer蛍光、J-aggregate蛍光それぞれについて、ブランクウェルの蛍光強度の平均値を無処置、コントロール、被験物質の各ウェルの値から引き、各蛍光強度の比monomer/J-aggregateを求めた。
結果を図５に示す（平均値±標準誤差、各N=4）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の評価方法を使用することにより、mitoKATP channelに選択的に作用する薬剤を評価することができる。本発明の評価方法を使用することにより、ミトコンドリア膜電位を変化させる薬剤を、簡便で精度高く評価することができる。本発明の評価方法を使用することにより、ミトコンドリア膜電位を変化させる薬剤を、短時間で評価することができる。【００５４】
なお本出願は、２００４年５月１８日付で出願された日本特許出願（特願２００４−１４７４１８号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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