(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞増殖因子５、若しくは配列番号１あるいは２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはそれらの塩を含むチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白剤。
【請求項３】
請求項１に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ阻害剤、美白剤および美白外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor）の中で、繊維芽細胞増殖因子５（以下、「ＦＧＦ−５」という）は、毛の成長に関与していることが報告されている（非特許文献１、特許文献１）。また、繊維芽細胞増殖因子５Ｓ（以下、「ＦＧＳ−５Ｓ」という）などのＦＧＦ−５アンタゴニストは、ＦＧＦ−５による毛の成長を抑制する効果を阻害することが知られ、育毛剤として記載されている（非特許文献２）。さらに、ＦＧＦ−５の一部からなるポリペプチドで、毛の生育に対するＦＧＦ−５の抑制作用を阻害するポリペプチドがＦＧＦ−５アンタゴニストとして報告されている（特許文献２、非特許文献３）。
このようにＦＧＦ−５は、毛の成長およびその阻害に大きく関与していることが知られている。
【０００３】
一方、皮膚のシミやソバカスは、日光の紫外線暴露による刺激等を原因としてメラノサイトが活性化され、メラノサイト中のチロシナーゼによってチロシンが活性化されメラニン色素が皮膚内に多量に生成され、異常沈着することにより発生する。このようなシミ・ソバカスの予防・治療には、コウジ酸や胎盤抽出物が広く用いられている。
しかしながら、コウジ酸を用いた化粧品については、コウジ酸による発ガン性が報告され、現在では、コウジ酸を用いた化粧品の製造及び輸入が中止されている。また、胎盤抽出物についても、安全性の面での課題が残っている。
すなわち、新しい種類の美白効果を有する美白剤が求められている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２９３７２０号公報
【特許文献２】特開２０００−３４４７９６号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｅｌｌ ７８：１０１７−１０２５．
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅａｒｍａｔｏｌ． １１４：４５６−４６３．
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９７,２７２−２８３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は前記課題を解決することを目的としたものであって、チロシナーゼ阻害剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題の下、発明者が鋭意検討した結果、ＦＧＦ−５またはＦＧＦ−５Ｓ由来の特定のアミノ酸配列を有するペプチド等がチロシナーゼ阻害作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、以下の手段により達成された。
（１）繊維芽細胞増殖因子５若しくは繊維芽細胞増殖因子５Ｓの、全部若しくは一部からなるペプチド、該ペプチドの修飾ペプチドであってチロシナーゼ阻害活性を有するペプチド、またはそれらの塩を含むチロシナーゼ阻害剤。
（２）下記のアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、該ペプチドの修飾ペプチドであって前記ペプチドと同様のチロシナーゼ阻害活性を有する修飾ペプチド、またはそれらの塩を含むチロシナーゼ阻害剤。
（ａ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列：または
（ｂ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、チロシナーゼ阻害活性を有するアミノ酸配列。
（３）配列番号１若しくは２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、該ペプチドの修飾ペプチドであって前記ペプチドと同様のチロシナーゼ阻害活性を有する修飾ペプチド、またはそれらの塩を含むチロシナーゼ阻害剤。
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、前記ペプチドの修飾ペプチドであって前記ペプチドと同様のチロシナーゼ阻害活性を有する修飾ペプチド、またはそれらの塩を含むチロシナーゼ阻害剤。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白剤。
（６）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白外用剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、チロシナーゼの作用を阻害させることができる。従って、チロシンから生成されるメラニン色素の生成を抑止することが可能になった。このため、メラニン色素の生成を抑止する美白剤として用いることが可能となった。具体的には、日焼け等によるシミ・ソバカスの予防または治療を目的とする、化粧料や医薬品、医薬部外品として用いることが可能になった。
さらに、本発明で用いるペプチドは、脱毛効果も有することから、脱毛効果を併せ持つ美白剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
【０００９】
本発明におけるチロシナーゼ阻害剤は、チロシナーゼの作用を阻害することにより、メラノサイトにおけるメラニン色素の合成を阻害するものである。
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、特定のペプチドを含有する。
本発明で用いるペプチドは、例えば、ＦＧＦ−５またはＦＧＦ−５Ｓの、全部または一部からなり、チロシナーゼ阻害作用を有するペプチドである。ここで、本発明でいうペプチドとは、アミノ酸がペプチド結合したものをいい、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、ポリペプチド及びタンパク質も含む趣旨である。
本発明で用いるペプチドは、好ましくは、下記のアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、または、前記ペプチドの修飾ペプチドであって、前記ペプチドと同様のチロシナーゼ阻害活性を有する修飾ペプチドである。
（ａ）配列番号１（Leu Ser Gln Val His Arg）もしくは配列番号２（Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser His Glu Ala Asn Met）に記載のアミノ酸配列：または
（ｂ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、チロシナーゼ阻害活性を有するアミノ酸配列。
ここで、本発明のチロシナーゼ阻害活性剤は、上記いずれかのアミノ酸配列が本発明で用いるペプチドのアミノ酸配列の一部として含まれていればよく、チロシナーゼ阻害活性を発揮する限りは、上記（ａ）又は（ｂ）に記載のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に追加のアミノ酸配列が付加されていてもよい。但し、本発明の一実施態様としては、上記（ａ）又は（ｂ）に記載のアミノ酸配列のみから成るペプチドが提供される。
【００１０】
上記した本発明で用いるペプチドの修飾ペプチドであって、上記した本発明で用いるペプチドと同様のチロシナーゼ阻害活性を有する修飾ペプチドも本発明の範囲内のものである。上記の修飾ペプチドにおいて、「修飾」という用語は、化学的修飾及び生物学的修飾を含めて最も広義に解釈しなければならない。修飾の例としては、例えば、アルキル化、エステル化、ハロゲン化、又はアミノ化などの官能基導入、酸化、還元、付加、又は脱離などによる官能基変換、糖化合物（単糖、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖）又は脂質化合物などの導入、リン酸化、あるいはビオチン化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１１】
また、上記の「１〜数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個程度を意味する。
また、本発明で用いるペプチドにおいて、挿入又は置換されるアミノ酸の種類は特に限定されないが、Ｌ-アミノ酸であることが好ましい。挿入又は置換されるアミノ酸の個数及び位置も特に限定されない。
このように、アミノ酸で置換して得られるペプチドが置換前のペプチドと同様のチロシナーゼ阻害活性を有するためには、置換されるアミノ酸同士は互いに類似した性質を有するアミノ酸であることが好ましい場合がある。具体的には、ヒドロキシアミノ酸に属するアミノ酸同士、脂肪族アミノ酸に属するアミノ酸同士、酸性アミノ酸に属するアミノ酸同士、塩基性アミノ酸に属するアミノ酸同士の間で置換することが挙げられる。もちろん、チロシナーゼ阻害活性を有する限り他のアミノ酸で置換することも可能である。
本発明で用いるぺプチドのアミノ酸残基の数は、チロシナーゼ阻害活性を有する限り特に定めるものではないが、好ましくは５〜２０であり、より好ましくは６〜１５である。
【００１２】
上記した（ｂ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列を含むペプチド、又は修飾ペプチドがチロシナーゼ阻害活性を有するかどうかは、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によって、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、当業者が容易に確認可能である。
【００１３】
本発明で用いるペプチドを化学合成する場合、ペプチド合成の常法手段によって合成できる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。すなわち、本発明で用いるペプチドを構成し得るアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドを合成することができる。縮合方法や保護基の脱離としては、公知のいずれの手法を用いてもよい。
【００１４】
反応後は、通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明で用いるペプチドを精製することができる。また、本発明で用いるペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド(−ＣＯＮＨ２)またはエステル(−ＣＯＯＲ)であってもよい。さらに、本発明で用いるペプチドとしては、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖ペプチドなどの複合ペプチド等も採用できる。
【００１５】
本発明で用いるペプチドの別の製造方法としては、本発明で用いるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して、遺伝子工学的手法により微生物細胞、植物細胞、動物細胞などの宿主において組み換えタンパク質（ペプチド）として生産する方法が挙げられる。得られた粗ペプチドは、ゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換カラム精製など通常のタンパク質又はペプチド精製に用いられる手段を用いて精製することが可能である。
特に、ＦＧＦ−５のアミノ酸配列およびそれらをコードするＤＮＡの塩基配列が明らかであるので、これらの配列に基づいて、遺伝子組み換え技術を利用して作製することができる。ＦＧＦ−５またはＦＧＦ−５Ｓとしては、本発明の趣旨を逸脱しない限り特に定めるものではないが、例えばヒト、マウス及びラット由来のＦＧＦ−５またはＦＧＦ−５Ｓが挙げられる。これらの中では、ヒト由来のＦＧＦ−５またはＦＧＦ−５Ｓが好ましい。
【００１６】
ヒト、マウス又はラット由来のＦＧＦ−５をコードするＤＮＡは、公知の塩基配列（Zhan X. et al., Mol. Cell. Biol 8:3487-3495, 1988; Haubo. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8022-8026, 1990; Hattori Y. et al., Biochim. Biophys. Acta 1306:31-33, 1996）に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション等の当業者によく知られた遺伝子のクローニング法によって、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから、取得することができる。ＦＧＦ−５は、ＦＧＦ−５遺伝子によってコードされている。
一方、ヒト又はマウス由来のＦＧＦ−５ＳをコードするＤＮＡは、公知の塩基配列（Ozawa K et al., J. Biel. Chem. 273:29262-29271, 1998）に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション等の当業者によく知られた遺伝子のクローニング法によって、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから、取得することができる。ＦＧＦ−５Ｓは、ＦＧＦ−５遺伝子に遺伝子のエクソン１およびエクソン３によってコードされている。
より具体的には、本発明のチロシナーゼ阻害剤が含有するペプチドは、例えば、特開２００２−２９３７２号公報の段落番号００１６〜００１８の記載を参酌して合成することができる。
【００１７】
本発明におけるチロシナーゼ阻害剤は、メラニン色素の合成を阻害することから、美白剤として用いることができる。美白剤として利用する場合、本発明のチロシナーゼ阻害剤自体を投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な他の成分を含む美白剤として投与することができる。
例えば、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。具体的には、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。さらに、本発明の美白剤には、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の美白剤を１種又は２種以上配合してもよい。
本発明の美白剤の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに使用者の体重や年齢、種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。
また、美白剤は、美白内用剤であっても、美白外用剤であってもよいが、美白外用剤であることが好ましい。
【００１８】
美白内用剤としては、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。美白内用剤の場合、成人一日あたり、例えば、０．０００１〜１００００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇの範囲で用いることができる。
具体的には、医薬品、医薬部外品、美白を目的とした食品・飲料等として用いることができる。この場合の、本発明のチロシナーゼ阻害剤の配合量は、該美白内用剤全量に対して、固形分換算で、０．０００００００００１〜１０．０重量％の範囲内で含有するのが好ましく、０．００００００００１〜５．０重量％の範囲内で含有するのがより好ましく、０．０００００００１〜１．０重量％の範囲内で含有するのがさらに好ましい。
【００１９】
美白外用剤としては、噴霧剤、塗布剤または貼付剤等として用いることができる。外用剤として用いる場合、成人一日あたり、例えば、０．０００１〜１００００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇの範囲で用いることができる。
具体的には、医薬品、医薬部外品、化粧料等として用いることができる。この場合の、本発明のチロシナーゼ阻害剤の配合量は、該美白外用剤全量に対して固形分換算で、０．０００００００００１重量％〜１０．０重量％の範囲内で含有するのが好ましく、０．０００００００１重量％〜５．０重量％の範囲内で含有するのがより好ましく、０．００００１重量％〜１．０重量％の範囲内で含有するのがさらに好ましい。
【００２０】
特に本発明の美白剤は化粧料に用いることが好ましい。本発明の美白剤を、化粧料として用いる場合、通常の化粧料等に用いられる成分を必要に応じて適宜配合することができる。このような成分としては、上述したものの他、例えば、水、エタノール、油性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、薬効成分、粉体、紫外線吸収剤、香料、乳化安定剤等が挙げられる。また、その剤型も任意に選択することができ、クリーム、軟膏、乳液、ローション、溶液、ゲル等が例示される。また、パック、パウダー、スティック等の形態とすることもできる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００２２】
リコンビナント（recombinant）ＦＧＦ−５タンパク質の調製
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むリコンビナントＦＧＦ−５タンパク質（以下、「リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質」という）は、文献J. Biol. Chem. 273，29262-29271に記載の方法により調整した。
具体的には、ＩＣＲマウス６週令メス個体（日本クレア製）より脳を摘出し、ここからＲＮＡを抽出した。このＲＮＡに、ランダムヘキサオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Moloney Murine Leukemia Virus、Invitrogen製、２８０２５−０１３）によりｃＤＮＡ混合物を得た。次に、得られたｃＤＮＡ混合物から目的とする遺伝子をＰＣＲ反応により増幅した。この結果、リコンビナンＦＧＦ−５タンパク質に相当する大きさのＤＮＡフラグメントを得た。これを、ゲル電気泳動によって分離して、ゲルから切り出した。得られたＤＮＡフラグメントを、クローニングベクターとしてｐＥＴ−３を用い、そのクローニングサイトに組み込むことによってプラスミドを構築した。このプラスミドをベクターとし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（カルビオバイオケム・ノババイオケム  コーポレーション製、６９４５１−３）を宿主として形質転換体を得た。該形質転換体を４０ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）に植菌し、３７℃、１６時間培養し、その後新たなＬＢ培地に移植して更に培養した。インヂューサーとして１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（Isopropyl thiogalactoside (ＩＰＴＧ) ）を添加し、更に３時間培養した。培養後、６０００回転１５分間遠心し、菌体を得た。菌体を試験管にとり、氷浴中で、２分間超音波破砕を行なった。その後、１２０００回転で、１時間遠心し、リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質を含有する上清液を採取した。
【００２３】
次に、得られたリコンビナントＦＧＦ−５タンパク質を以下のようにして精製した。
ヘパリンセファロースを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、同溶液で洗浄した。この懸濁液に、最終濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌを添加し、前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質を含有する上清液を添加し、４℃で、３時間穏やかに攪拌した。１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、カラムに詰め、０．７ＭのＮａＣｌ含有１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、溶離液として２ＭのＮａＣｌ含有１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて目的とするリコンビナントＦＧＦ−５タンパク質を溶出した。大腸菌４Ｌの培養液より、３００μｇのリコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品を得ることができた。精製標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、純度を検定した後、−８０℃で保存した。
【００２４】
チロシナーゼ阻害活性
マウスＢ１６メラノーマ細胞（大日本製薬（株）製、０９−６３２２）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（キャンサーインターナショナル製、ＣＣ３００８−５０４）および０．５ｍＭテオフィリン（和光純薬（株）、２０１−０９９３１）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）に懸濁した後、９６穴の細胞培養用プレートに１ウエルあたり２ｘ１０3個加え、炭酸ガスインキュベーター（５％、ＣＯ２、３７℃）中で２日間培養した。２日後、テオフィリンを含まないＤＭＥＭ培地に交換し、前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品を添加して更に３日間培養した。培養後、培養液を吸引することによって除去し、各ウエルに、１％トライトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）（ＩＣＮバイオメディカルス製、１９４８５４）含有（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（−））を９０μｌ添加し、ウエルを十分振動させた後、４７５ｎｍにおける吸光度を測定した（このサンプルの前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品の最終濃度は、１．５ｘ１０−９Ｍであった。）。測定後、１０ｍＭのＬ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）を加えて１時間反応させ、同様に４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量よりチロシナーゼ阻害活性を定量した（１）。
前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品のメラノーマ細胞に対する細胞毒性は、前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品を添加して３日間培養した後、各ウエルにＷＳＴ−８液（和光純薬工業（株）製）５μｌを添加し、更に３時間培養し、ＷＳＴ−８ホルマザンの産生量に伴う４５０ｎｍの発色を測定して求めた（２）。
前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品のチロシナーゼ阻害活性は、（１）の測定により得られたチロシナーゼ阻害活性について、（２）の測定により得られた披験サンプルの細胞毒性値で除すことによって、披験サンプルによる細胞毒性を補正して算出した。
【００２５】
配列番号１および配列番号２に示す、ペプチド１およびペプチド２を、ペプチド合成機を用いた化学合成法により合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ペプチドのアミノ酸配列は、プロテインシークエンサーにより解析し、最終純度８０％以上の標品を得た。
これらのペプチドおよびコウジ酸（シグマ製、Ｋ３１２５−５Ｇ）についても同様にチロシナーゼ活性を測定した。これらのチロシナーゼ阻害活性測定サンプル中における最終濃度は、ペプチド１、ペプチド２、コウジ酸の順に、１ｍＭ、１ｍＭ、４．４ｍＭとした。
【００２６】
チロシナーゼ阻害活性結果を図１に示した。図１から明らかなとおり、前記リコンビナントＦＧＦ−５タンパク質の部分精製品（図１中に、ＦＧＦ−５と表記）は、１．５ｘ１０−９Ｍの濃度で測定したにもかかわらず、２６％の阻害活性を示した。また、１ｍＭの濃度で測定したペプチド１では７５％、１ｍＭの濃度で測定したペプチド２では６２％の阻害活性をそれぞれ示した。
一方、４．４ｍＭの濃度で測定したコウジ酸では５３％活性を阻害した。
すなわち、本発明におけるペプチドは、コウジ酸よりも著しく低い濃度でも高いチロシナーゼ阻害活性を示すことが明らかになった。
【００２７】
ＤＮＡ合成促進活性の測定
Ｂａｌｂ/ｃ３Ｔ３細胞（アメリカン  タイプカルチャーコレクション製（ＡＴＣＣ）、ＣＣＬ−１６３）４ｘ１０４ｃｅｌｌｓ/５００μｌを４８ウエル培養プレートに播種し、１０質量％牛胎児血清（ＦＢＳ）存在下、ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。次に、細胞を同培地で洗浄後、０．３質量％の活性炭処理ウシ血清（ＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地を添加してさらに４８時間培養し、細胞を同調させた。反応液中にヘパリン５μｇ/ｍl（最終濃度）を添加した後、ＦＧＦ−５を含有する被験液を添加し、１６時間培養後、３ＨＴｄＲ（3 H-methyl thymidine）（Moravek Biochemicals製）を添加し、更に４時間３７℃、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養上清を吸引し、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、１ウエルあたり、２００μｌの０．０２５％ トリプシン（Trypsin）−０．０２％ ＥＤＴＡ２Ｎａ−ＰＢＳを加え、３０℃、１５〜２０分間反応させて細胞をはがした。セルハーベスターで細胞をろ紙に回収し、ろ紙を乾燥後、トルエン系シンチレーター２ｍｌ／切片を添加して、細胞へのトリチウムチミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターで測定した（ＦＧＦ−５の最終濃度は、２×１０−７ｍＭであった。）。
また、ＦＧＦ−５を、ヘパリン（５μｇ／Ｍ）、ペプチド１（１．０ｍＭ）またはペプチド２（１．０ｍＭ）に変えて同様に行った。
その結果、図２に示すとおり、ＦＧＦ−５、ペプチド１またはペプチド２は、それぞれ、ＤＮＡ合成を促進した。
この結果、ペプチド１またはペプチド２は、ＦＧＦ−５様の活性があることが明らかとなった。一方、ＦＧＦ−５が毛周期を制御し、マウス皮下に投与することによって毛成長を阻害することは、上記非特許文献３（J. Cell. Physiol. 197,272-283）等によって示されている。従って、本発明におけるチロシナーゼ阻害剤は、脱毛効果を併せ持つ美白剤であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明で用いるペプチドのチロシナーゼ活性阻害率を示す図である。
【図２】本発明で用いるペプチドのトリチウムチミジンの取り込み率を示す図である。
【図１】
0004742365.tif 000002
【図２】
0004742365.tif 000003
【配列表】
0004742365000001.app