(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 26、43、50、53、68、73、110、115、116、122、125および131からなる群より選択される核酸配列からなり、IGF-IRの発現を阻害する、長さが20ヌクレオベースのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 160のヌクレオチド配列の全長に90％相補的である、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３】
SEQ ID NO: 160のヌクレオチド配列の全長に100％相補的である、請求項2記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】
DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチドまたはキメラオリゴヌクレオチドである、請求項2または3記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
20の連結したヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 125に記載のヌクレオベース配列の改変オリゴヌクレオチドからなる、IGF-IRの発現を阻害するアンチセンス化合物であって、該改変オリゴヌクレオチドは10デオキシヌクレオチド領域からなり、該10デオキシヌクレオチド領域の5’および3’末端の両端に5つの2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドが隣接し、該改変オリゴヌクレオチドにおける各々のインターヌクレオシド結合はホスホロチオエート結合であり、該改変オリゴヌクレオチドにおける各々のシトシンは5-メチルシトシンであるアンチセンス化合物。
【請求項６】
SEQ ID NO: 125の核酸配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドがキメラである、請求項6記載のアンチセンス化合物。
【請求項８】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの改変インターヌクレオシド結合、糖部分、またはヌクレオベースを有する、請求項7記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合、2'-O-メトキシエチル糖部分、または、5-メチルシトシンを有する、請求項8記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの2'-デオキシヌクレオチドを含む中心のギャップ部分であって、該ギャップ部分の両側に少なくとも一つの2'-O-メトキシエチルヌクレオチドを有するウイング部分が隣接する該ギャップ部分を有するギャップマーである、請求項9記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
インターヌクレオシド結合の全てがホスホロチオエートであり、全てのシチジンが5-メチルシチジンである、請求項10記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項に記載のアンチセンス化合物および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載のアンチセンス化合物を含む、IGF-IRに関連する疾患、病態または障害を有する動物を治療するために用いられる組成物。
【請求項１４】
アンチセンスがIGF-IR mRNAまたはタンパク質の発現を阻害またはそうでなければ減少させる、請求項13記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、増殖因子受容体遺伝子の発現を調節する組成物および方法を提供する。特に、本発明は、好ましい態様において、インスリン様増殖因子I受容体（IGF-I受容体またはIGF-IR）をコードする核酸分子とハイブリダイズする化合物、特にオリゴヌクレオチド化合物に関する。そのような化合物は、本発明において増殖性および炎症性の皮膚障害および癌の治療に関連する増殖を調節するために例示される。しかし、化合物は、炎症病態を含む、IGF-IRが関与している如何なる他の疾患にも用いることができると理解されるであろう。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において著者らによって引用される出版物の参考書目の詳細は説明文の末尾にまとめてある。
【０００３】
本明細書における如何なる先行技術に対する参照も、この先行技術が如何なる国においても共通の一般的知識の一部を形成すると認めた、または如何なる形でも示唆したと見なされず、見なしてはならない。
【０００４】
乾癬および他の類似の病態は一般的で、しばしば集団の有意な割合に罹患するまたは罹患する可能性がある苦痛を伴う増殖性および／または炎症性の皮膚障害である。この病態は、基礎となる真皮の炎症に関連した皮膚の表皮層における基底ケラチノサイトの過剰増殖によって生じる。広範な治療が開発されているが、いずれも完全に有効ではなく、有害な副作用を有する。乾癬の基礎原因は依然としてつかまえどころがないが、病態は少なくとも部分的に局所増殖因子の過剰発現およびその受容体との相互作用によって生じるという意見に関して何らかの合意があり、乾癬の際により豊富であるように思われるケラチノサイト受容体を通してのケラチノサイト増殖を支持する。
【０００５】
増殖因子の一つの重要なグループは、ケラチノサイト増殖を支持する皮膚由来インスリン様増殖因子（IGF）である。特に、IGF-IおよびIGF-2はそれぞれが広範囲の細胞に対して強力なマイトゲン作用を有する。IGFタイプの分子はまた、DNA合成を通して「コンピテント」細胞を促進する「進行因子」としても知られる。IGFは、チロシンキナーゼに結合しているI型受容体またはIGF-IRとして知られる一般的な受容体を通して作用する。それらは、真皮を含む間葉細胞において合成され、中胚葉、内胚葉、または外胚葉起源の隣接細胞に作用する。その合成の調節には、肝臓における成長ホルモン（GH）が関係しているが、ほとんどの組織においてあまり明確ではない（Sara、Physiological Reviews 70：591〜614、1990）。
【０００６】
IGF結合タンパク質（IGFBP）と呼ばれる特定のタンパク質が、組織IGF利用のオートクライン／パラクライン調節に関与するように思われる（Rechler and Brown、Growth Regulation 2：55〜68、1992）。IGFBP 6個がこれまでに同定されている。IGFBPの正確な作用は明確ではなく、インビトロで認められた作用は、用いた実験法に応じて阻害性または刺激性であった（Clemmons、Growth Regn. 2：80、1992）。しかし、特定のIGFBPがその細胞表面受容体へのIGF-Iのターゲティングに関与するといういくつかの証拠がある。
【０００７】
表皮とその基礎にある真皮とを含む皮膚は、皮膚線維芽細胞上にGH受容体を有する（Oakes et al.、J. Clin. Endocrinol. Metab. 73：1368〜1373、1992）。線維芽細胞はIGF-Iのみならず、IGFBP-3、-4、-5、および-6を合成し（Camacho-Hubner et al.、J. Biol. Chem. 267：11949〜11956、1992）、これは隣接細胞のみならずその上の表皮へのIGF-Iのターゲティングに関与する可能性がある。主な表皮細胞タイプであるケラチノサイトは、IGF-Iを合成しないが、IGF-I受容体を有し、IGF-Iに反応性である（Neely et al.、J. Inv. Derm. 96：104、1991）。
【０００８】
過去10年間に、遺伝子機能を探求するため、および核酸に基づく薬剤を開発するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた多くの報告があった。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNアーゼHの動員による標的mRNAの破壊、またはRNAプロセシング、核輸出、折りたたみ、もしくはリボソームスキャンの干渉を含む多数の代わりの方法を通してmRNA翻訳を阻害する。より最近、様々なアンチセンス様相の細胞内作用部位がよりよく理解されたこと、そしてオリゴヌクレオチド化学が改善したことから、発現阻害を確認したという報告数が増加した。
【０００９】
本発明に至る研究において、本発明者らは、特に乾癬のようなヒト表皮増殖障害において、ヒト表皮ケラチノサイトの増殖を阻害するためにアンチセンスアプローチを用いることに重点を置いた。乾癬は、重度の表皮過形成に関連するよくある外観を損なう皮膚病態である。既存の乾癬治療はごく部分的に有効であるに過ぎないが、表皮を標的とする治療は有望であることが示された（Jensen et al.、Br. J. Dermatol. 139：984〜991、1998；van de Kerkhof、Skin Pharmacol. Appl. Skin. Physiol. 11：2〜10、1998）。一つの戦略は、IGF-IR発現のアンチセンス阻害剤を開発することであり、表皮におけるIGF-Iに刺激された細胞分裂および生存を遮断するためにこれらを用いることである。
【００１０】
IGF-IRは、多くの細胞タイプにおいて細胞分裂、トランスフォーメーション、およびアポトーシスを調節する（LeRoith et al.、Endocr. Rev. 16：143〜163、1995；RubinおよびBaserga、Laboratory Investigation 73：311〜331、1995）チロシンキナーゼ結合細胞表面受容体である（Ullrich et al.、EMBO J. 5：2503〜2512、1986）。ヒト表皮ケラチノサイトはIGF-IR活性化に対して非常に反応性であり（RistowおよびMessmer、J. Cell Physiol. 137：277〜284、1988；Neely et al.、J. Invest. Dermaol. 96：104〜110、1991；Wraight et al.、J. Invest. Dermaol. 103：627〜631、1994）、いくつかの研究から、乾癬の発病においてIGF-IR活性化が重要な役割を果たすことが指摘されている
0004753863.tif 000002
IGF-IRは、トランスフォーメーションおよび細胞周期進行におけるその役割を調べるために、線維芽細胞、造血細胞、および神経膠芽腫においてアンチセンスアプローチによってこれまで標的とされてきた
0004753863.tif 000003
【００１１】
ケラチノサイトの核に効率よく輸送された場合に、IGF-IR mRNAレベルを減少させることができるプロピニル化ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの同定が報告されている（White et al.、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10：195〜203、2000；Wright et al.、Nat. Biotechol. 18：521〜526、2000）。これらのオリゴヌクレオチドはまた、インビトロでのIGF-IR結合の減少、受容体の活性化および細胞分裂、ならびにインビボでの表皮の増殖において有効であった（Wraight et al.、2000、上記）。
【００１２】
プロピン改変ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標的mRNAに対するその親和性の増加によって、非改変ホスホロチオエートより低い濃度（Wagner et al.、Science 260:1510-1513、1993）およびより短いオリゴヌクレオチドの長さ（Flanagan、Nucleic Acids Res. 24：2936〜2941、1996a）でmRNAを阻害でき、そして、標的細胞に対するアプタマーの影響が発生することを理論的には減少させることから選択された(Flanagan et al., Nat. Biotechnol. 14: 1139-1145, 1996b; Flanagan and Wagner, Mol. Cell Biochem. 172: 213-225, 1997)。
【００１３】
プロピン改変ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについて成功が示されているが、毒性を減少させる、安定性を増加させる、特異性プロフィールを増加させる、浸透を改善させる、および／または有効性、生物、化学、もしくは物理的特性を増強するために、別の化学を検討する必要がある。別の化学のオリゴヌクレオチドはまた、既知の大規模製造、ヒトの臨床開発のノウハウ、および／または薬剤として既に承認されていることを含む他の長所を提供する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本明細書を通して、内容物がそうでないことを必要としている限り、「含む（comprise、comprises、comprising）」という用語またはその変化形は、記述の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含めるが、他の任意の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外しないことを意味すると理解されるであろう。
【００１５】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列同定子番号（SEQ ID NO：）によって参照される。SEQ ID NO：は、配列同定子＜400＞1（SEQ ID NO：1）、＜400＞2（SEQ ID NO：2）等に数字で対応する。配列同定子の要約を表1に示す。配列表を請求の範囲の後に記載する。
【００１６】
本発明は、増殖因子受容体および特にインスリン様増殖因子I受容体（IGF-IR）、さらにより特にヒトIGF-IRをコードする核酸を標的として、IGF-IRの発現を調節する化合物、特に核酸および核酸様オリゴマーに向けられる。本発明の化合物を含む薬学的および他の組成物も同様に提供される。IGF-IR遺伝子発現の調節物質をスクリーニングする方法、および細胞、組織、または動物を本発明の一つまたは複数の化合物または組成物に接触させることを含む、細胞、組織または動物におけるIGF-IR遺伝子の発現を調節する方法もさらに提供される。動物、特に、IGF-IRまたはそのリガンドであるIGF-Iの発現に関連した疾患または病態を有するまたは感受性があることが疑われる人を治療する方法も同様に、本明細書に記述される。そのような方法は、治療を必要とする人に本発明の一つまたは複数の化合物または組成物の治療的または予防的有効量を投与することを含む。
【００１７】
本発明の好ましい化合物は、本明細書においてアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはASOと呼ばれる。本明細書において言及されるASOを表1に記載する。ASOは、配列番号と共に「ISIS」番号によって同定される。
【００１８】
特に好ましいASOの一つの群には、
0004753863.tif 000004
が含まれる。
【００１９】
特に好ましいASOに関するもう一つの群には、
0004753863.tif 000005
が含まれる。
【００２０】
さらにより特に好ましいASOは、ISIS 175317（SEQ ID NO：125）である。
【００２１】
（表１）核酸分子の要約
0004753863.tif 000006
0004753863.tif 000007
0004753863.tif 000008
0004753863.tif 000009
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
A．発明の概要
本発明は、インスリン様増殖因子I受容体、および特定の態様においてヒトインスリン様増殖因子I受容体（IGF-IR）をコードする核酸分子の機能または作用を調節するために用いられる化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドおよび類似の種を用いる。本発明は、IGF-IRをコードする一つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって得られる。本明細書において用いられるように、「標的核酸」および「IGF-IRをコードする核酸分子」という用語は、IGF-IRをコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA（プレ-mRNAおよびmRNAまたはその一部を含む）、および同様にそのようなRNAに由来するcDNAを含むために便宜上用いられている。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションは一般的に、「アンチセンス」と呼ばれる。その結果、本発明のいくつかの好ましい態様の実践において含まれると考えられる好ましいメカニズムを、本明細書において「アンチセンス阻害」と呼ぶ。そのようなアンチセンス阻害は典型的に、少なくとも一つの鎖またはセグメントが切断、分解、またはそうでなければ操作不可能となるように、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づく。この点において、現在、そのようなアンチセンス阻害のために特異的核酸分子およびその機能を標的とすることが好ましい。
【００２３】
干渉されるDNAの機能には複製および転写が含まれうる。例えば、複製および転写は、内因性の細胞鋳型、ベクター、プラスミド構築物またはそれ以外に由来しうる。干渉すべきRNAの機能には、タンパク質翻訳部位へのRNAの転座、RNA合成部位とは離れた細胞内部位へのRNAの転座、RNAからのタンパク質の翻訳、一つまたは複数のRNA種を生じるRNAのスプライシング、およびRNAに関与するまたはそれによって促進される可能性があるRNAを含む複合体形成が含まれうる。標的核酸機能をそのように干渉した場合の一つの好ましい結果は、IGF-IRの発現の調節である。本発明の意味において、「調節」および「発現の調節」は、遺伝子をコードする核酸分子、例えばDNAまたはRNAの量またはレベルの増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。阻害はしばしば発現の調節の好ましい形であり、mRNAはしばしば好ましい標的核酸である。
【００２４】
本発明の状況において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の好ましいメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（ヌクレオベース）のあいだのワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合であってもよい水素結合を含む。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対を形成する相補的ヌクレオベースである。ハイブリダイゼーションは、多様な状況において起こりうる。
【００２５】
アンチセンス化合物は、標的核酸に化合物が結合すると、標的核酸の正常な機能を妨害して活性の喪失を引き起こし、特異的結合が望ましい条件、すなわちインビボアッセイまたは治療的治療の場合には生理的条件で、およびインビトロアッセイの場合にアッセイが行われる条件で、非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が存在する場合に特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２６】
本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という句は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列とのハイブリダイゼーションが最小限である条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況および本発明の状況において異なり、オリゴマー化合物が標的配列とハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の特性および組成、ならびにそれらを調べるアッセイによって左右される。
【００２７】
本明細書において用いられるように「相補的」とは、オリゴマー化合物の二つのヌクレオベース間の正確な塩基対形成能を指す。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置でのヌクレオベースが、DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子である標的核酸の特定の位置のヌクレオベースと水素結合を形成することができる場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の水素結合の位置は、相補的な位置であると見なされる。オリゴヌクレオチドとさらなるDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子とは、それぞれの分子における相補的位置の十分数が互いに水素結合することができるヌクレオベースによって占有されている場合、互いに相補的である。このように、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドと標的核酸のあいだに安定かつ特異的結合が起こるように、十分数のヌクレオベースに対して十分な程度の正確な塩基対形成または相補性を示すために用いられる用語である。
【００２８】
アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズされるその標的核酸の配列と100％相補的である必要はないと理解される。その上、オリゴヌクレオチドは、介入または隣接するセグメント（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）がハイブリダイゼーション事象に関与しないように、一つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。本発明のアンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域に対する少なくとも70％の相補性を含むことが好ましいく、より好ましくは90％の配列相補性を含み、さらにより好ましくはそれらがターゲティングされる標的核酸配列内の標的領域に対して95％の配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の20ヌクレオベース中18個が標的領域と相補的であって、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90％の相補性を表すであろう。この例において、残りの非相補的ヌクレオベースは集合していてもよく、またはそのあいだに相補的ヌクレオベースが散在してもよく、互いにまたは相補的ヌクレオベースに隣接している必要はない。そのため、標的核酸との完全な相補性領域2個が隣接する非相補的ヌクレオベース4個を有する長さが18ヌクレオベースのアンチセンス化合物は、標的核酸と77.8％の全体的な相補性を有し、このように本発明の範囲に入るであろう。アンチセンス化合物と標的核酸の領域との％相補性は、当技術分野で既知のBLASTプログラム（基本局所アラインメント検索ツール）およびPowerBLASTプログラム（Altschul et al.、J. Mol. Biol. 215：403〜410、1990；Zhang and Madden、Genome Res. 7：649〜656、1997）を用いて普通に決定することができる。
【００２９】
B．本発明の化合物
本発明に従って、化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部誘導配列（EGS）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が含まれる。そのため、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンオリゴマー化合物の形で導入してもよく、内部もしくは末端隆起またはループのような構造要素を含んでもよい。系に導入されると、本発明の化合物は、標的核酸の改変を行うために一つまたは複数の酵素または構造タンパク質の活性を誘発してもよい。
【００３０】
そのような酵素の一つの非制限的な例は、RNA：DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるRNアーゼHである。「DNA様」である一本鎖アンチセンス化合物がRNアーゼHを誘発することは当技術分野で既知である。したがって、RNアーゼHの活性化によってRNA標的の切断が起こり、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチドによる阻害効率は大きく増強される。類似の役割は、RNアーゼIIIおよび酵素のリボヌクレアーゼLファミリーのような他のリボヌクレアーゼについて仮定されている。
【００３１】
アンチセンス化合物の好ましい形は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種において二本鎖RNA（dsRNA）分子のような二本鎖構造を導入すると、遺伝子またはその関連する遺伝子産物の機能のアンチセンスによる強力かつ特異的な減少を誘導することが示されている。この現象は植物および動物の双方において起こり、ウイルス防御およびトランスポゾン沈黙化に対する進化的関連を有すると考えられている。
【００３２】
dsRNAが動物において遺伝子沈黙化を引き起こしうるという最初の証拠は、1995年に線虫、C.エレガンス（Caenorhabditis elegans）における研究（Guo and Kempheus、Cell 81：611〜620、1995）から得られた。Montgomery et al.は、dsRNAの主な干渉作用が転写後であることを示した（Montgomery et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：15502〜15507、1998）。C.エレガンスにおいて定義された二本鎖RNA（dsRNA）に対する曝露に起因する転写後のアンチセンスメカニズムは、以降RNA干渉（RNAi）と呼ばれている。この用語は、内因性の標的化mRNAレベルの配列特異的減少が起こるdsRNAの導入を伴うアンチセンス媒介遺伝子沈黙化を意味するために一般化されている（Fire et al.、Nature 391：806〜811、1998）。最近、実際にdsRNAsのアンチセンス極性を有する一本鎖RNAオリゴマーがRNAiの強力な誘導物質であることが示されている（Tijsterman et al.、Science 295：694〜697、2002）。
【００３３】
本発明の状況において、「オリゴマー化合物」という用語は、複数の単量体単位を含むポリマーまたはオリゴマーを指す。本発明の状況において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）のオリゴマーもしくはポリマー、またはその模倣体、キメラ、類似体、および相同体を指す。この用語には、天然に存在するヌクレオベース、糖、およびヌクレオシド間共有結合（骨格）からなるオリゴヌクレオチドと共に、類似に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変または置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増加のような所望の特性のために天然型よりしばしば好ましい。
【００３４】
オリゴヌクレオチドは、本発明の化合物の好ましい形であるが、本発明は、本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチド類似体および模倣体が含まれるがこれらに限定されない他のファミリーの化合物も同様に含む。
【００３５】
本発明に従う化合物は、好ましくは約8〜約80ヌクレオベース（すなわち、連結したヌクレオシド約8〜約80個）を含む。当業者は、本発明が長さが
0004753863.tif 000010
ヌクレオベースの化合物を含むことを認識するであろう。
【００３６】
一つの好ましい態様において、本発明の化合物は、長さが12〜50ヌクレオベースである。当業者は、本発明が長さが
0004753863.tif 000011
ヌクレオベースの化合物を含むことを認識するであろう。
【００３７】
もう一つの好ましい態様において、本発明の化合物は、長さが15〜30ヌクレオベースである。当業者は、本発明が長さが
0004753863.tif 000012
ヌクレオベースの化合物を含むことを認識するであろう。
【００３８】
特に好ましい化合物は、約12〜約50ヌクレオベースのオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは約15〜約30ヌクレオベースを含むオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
例としてのアンチセンス化合物から選択される少なくとも8個の連続ヌクレオベースの鎖を含む長さが8〜80ヌクレオベースのアンチセンス化合物も同様に、適したアンチセンス化合物であると見なされる。
【００４０】
例としての好ましいアンチセンス化合物には、例としての好ましいアンチセンス化合物の一つの5'末端から少なくとも8連続ヌクレオベースを含むオリゴヌクレオチド配列が含まれる（残りのヌクレオベースは、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるアンチセンス化合物の5'末端の直ちに上流から始まって、オリゴヌクレオチドが約8〜約80ヌクレオベースを含むまで続く同じオリゴヌクレオチドの連続鎖である）。同様に好ましいアンチセンス化合物は、例としての好ましいアンチセンス化合物の一つの3'末端から少なくとも8連続ヌクレオベースを含むオリゴヌクレオチド配列によって示される（残りのヌクレオベースは、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるアンチセンス化合物の3'末端の直ちに下流から始まってオリゴヌクレオチドが約8〜約80ヌクレオベースを含むまで続く同じオリゴヌクレオチドの連続鎖である）。本明細書に記載の好ましいアンチセンス化合物を有する当業者は、過度の実験を行うことなく、さらに好ましいアンチセンス化合物を同定することができるであろう。
【００４１】
本発明の候補化合物は、本明細書においてISIS番号または配列番号によって参照される。好ましい化合物を表1に示す。
【００４２】
候補化合物はまた、本明細書において「リード」化合物とも呼ばれる。
【００４３】
特に好ましいASOの一つの群には、
0004753863.tif 000013
が含まれる。
【００４４】
特に好ましいASOに関するもう一つの群には、
0004753863.tif 000014
が含まれる。
【００４５】
さらにより特に好ましいASOは、ISIS 175317（SEQ ID NO：125）である。
【００４６】
C．本発明の標的
本発明の状況において、アンチセンス化合物を特定の核酸分子に「ターゲティング」することは、多段階プロセスとなりうる。プロセスは通常、その機能を調節すべき標的核酸を同定することによって始まる、この標的核酸は、例えばその発現が特定の障害または疾患状態に関連している細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたmRNA）、または感染因子からの核酸分子であってもよい。本発明において、標的核酸はIGF-IRをコードする。
【００４７】
ターゲティングプロセスには通常、所望の効果、例えば発現の調節が得られるようにアンチセンス相互作用が起こるために、標的核酸内の少なくとも一つの標的領域、セグメント、または部位を決定することが含まれる。本発明の状況において、「領域」という用語は、少なくとも一つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部であると定義される。標的核酸の領域内ではセグメントである。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さいまたは一部の領域であると定義される。本発明において用いられる「部位」は、標的核酸内の位置であると定義される。
【００４８】
当技術分野で既知であるように、翻訳開始コドンは典型的に5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA分子では5'-ATG）であることから、翻訳開始コドンはまた「AUGコドン」、「開始コドン」、または「AUG開始コドン」と呼ばれる。少数の遺伝子が、RNA配列5'-GUG、5'-UUG、または5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、5'-AUA、5'-ACG、および5'-CUGはインビボで機能することが示されている。このように、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、それぞれの場合における開始のアミノ酸が典型的にメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、多くのコドン配列を含みうる。真核生物および原核生物遺伝子は二つ以上の選択的開始コドンを有すること、そのいずれを特定の細胞タイプまたは組織において、または特定の組の条件において、翻訳開始のために選択的に用いてもよいこともまた、当技術分野において既知である。本発明の状況において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列によらず、IGF-IRをコードする遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を開始するためにインビボで用いられるコドンまたは複数のコドンを指す。遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、三つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAG、および5'-UGA（対応するDNA配列はそれぞれ、5'-TAA、5'-TAG、および5'-TGA）の一つを有してもよいことは当技術分野で既知である。
【００４９】
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、5'または3'）の約25〜約50隣接ヌクレオチドを含むそのようなmRNAまたは遺伝子の一部を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、5'または3'）における約25〜約50隣接ヌクレオチドを含むそのようなmRNAまたは遺伝子の一部を指す。その結果、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物によって有効にターゲティングされる可能性がある全ての領域である。
【００５０】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンのあいだの領域を指すことが当技術分野において既知であるオープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」も同様に、有効にターゲティングされる可能性がある領域である。本発明の状況において、好ましい領域は遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始または終止コドンを含む遺伝子内領域である。
【００５１】
他の標的領域には、当技術分野において翻訳開始コドンから5'の方向のmRNAの一部を指すことが知られており、このように、mRNA（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）の5'キャップ部位と翻訳開始コドンのあいだのヌクレオチドを含む5'非翻訳領域（5'UTR）、および当技術分野において翻訳開始コドンから3'の方向のmRNAの一部を指すことが知られており、このように翻訳終止コドンとmRNAの3'末端とのあいだのヌクレオチドを含む3'非翻訳領域（3'UTR）が含まれる。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'トリホスフェート結合を通してmRNAの最も5'側の残基に結合したN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域には、キャップ部位に隣接する最初の50ヌクレオチドと共に5'キャップ構造自身が含まれると考えられる。5'キャップ領域を標的とすることも同様に好ましい。
【００５２】
いくつかの真核生物mRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは「イントロン」と呼ばれる一つまたは複数の領域を含み、それらは翻訳される前に転写物から切除される。残りの（従って翻訳された）領域は「エキソン」と呼ばれ、共にスプライシングされて連続的なmRNA配列を形成する。ターゲティングスプライス部位、すなわちイントロン-エキソン接合部、またはエキソン-イントロン接合部はまた、異常なスプライシングが疾患に関係している状況、または特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関係している状況では特に有用となる可能性がある。再配列または欠失による異常な融合接合部はまた、好ましい標的部位である。異なる遺伝子起源の二つ（またはそれ以上）のmRNAのスプライシングのプロセスによって産生されたmRNA転写物は、「融合転写物」として知られる。同様に、イントロンは、例えばDNAまたはプレ-mRNAにターゲティングされるアンチセンス化合物を用いて、有効にターゲティングされうることが知られている。
【００５３】
選択的RNA転写物をDNAの同じゲノム領域から産生できることも同様に、当技術分野で既知である。これらの選択的転写物は一般的に「変種」として知られる。より詳しく述べると、「プレ-mRNA変種」は、その開始または終止位置のいずれかが同じゲノムDNAから産生された他の転写物とは異なるが、イントロンおよびエキソン配列の双方を含む同じゲノムDNAから産生された転写物である。
【００５４】
スプライシングの際の一つまたは複数のエキソンまたはイントロン領域、またはその一部の切除によって、プレ-mRNA変種はより小さい「mRNA変種」を生じる。その結果、mRNA変種はプレ-mRNA変種にプロセシングされ、それぞれの独自のプレ-mRNA変種は、スプライシングの結果として必ず独自のmRNA変種を生じるはずである。これらのmRNA変種はまた、「選択的スプライス変種」とも呼ばれる。プレ-mRNA変種のスプライシングが起こらない場合、プレ-mRNA変種はmRNA変種と同一である。
【００５５】
変種は転写を開始または終止するためにもう一つのシグナルを用いて産生できること、そしてプレ-mRNAおよびmRNAは二つ以上の開始コドンまたは終止コドンを処理できることも同様に、当技術分野で既知である。選択的開始コドンを利用するプレ-mRNAまたはmRNAに由来する変種は、そのプレ-mRNAまたはmRNAの「選択的開始変種」として知られる。選択的終止コドンを用いるそれらの転写物は、そのプレ-mRNAまたはmRNAの「選択的終止変種」として知られる。選択的終止変種の一つの特定のタイプは、産生された多数の転写物が転写機構による「ポリA終止シグナル」の一つの選択的選択に起因し、それによって独自のポリA部位で終止する転写物を生じる「ポリA変種」である。本発明の状況において、本明細書に記述のタイプの変種も同様に、好ましい標的核酸である。
【００５６】
好ましいアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸の位置を、以降、「好ましい標的セグメント」と呼ぶ。本明細書において用いられるように、「好ましい標的セグメント」という用語は、それに対して活性なアンチセンス化合物がターゲティングされる標的領域の少なくとも8-ヌクレオベース部分として定義される。理論に拘束されたくはないが、現在のところ、これらのセグメントはハイブリダイゼーションを行うために近づくことができる標的核酸の一部を表すと考えられている。
【００５７】
特定の好ましい標的セグメントの特定の配列を本明細書において記述するが、当業者は、これらが本発明の範囲に含まれる特定の態様を説明および記述するために役立つことを認識するであろう。さらに好ましい標的セグメントが当業者によって同定される可能性がある。
【００５８】
例となる好ましい標的セグメントから選択される少なくとも8連続ヌクレオベースの鎖を含む長さが8〜80ヌクレオベースの標的セグメントも同様に、ターゲティングのために適していると考えられる。
【００５９】
標的セグメントには、説明される好ましい標的セグメントの一つの5'末端からの少なくとも8連続ヌクレオベースを含むDNAまたはRNA配列が含まれうる（残りのヌクレオベースは、標的セグメントの5'末端の直ちに上流から始まり、DNAまたはRNAが約8〜約80ヌクレオベースを含むまで続く同じDNAまたはRNAの連続的な鎖である）。同様に好ましい標的セグメントは、説明される好ましい標的セグメントの一つの3'末端から少なくとも8連続ヌクレオベースを含むDNAまたはRNA配列によって表される（残りのヌクレオベースは、標的セグメントの3'末端の直ちに上流から始まり、DNAまたはRNAが約8〜約80ヌクレオベースを含むまで持続する同じDNAまたはRNAの連続的な鎖である）。本明細書に記述の好ましい標的セグメントを有する当業者は、過剰な実験を行うことなく、さらに好ましい標的セグメントを同定することができるであろう。
【００６０】
一つまたは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定された後、標的に対して十分に相補的な、すなわち十分に良好におよび十分な特異性でハイブリダイズして、所望の効果を生じるアンチセンス化合物を選択する。
【００６１】
D．スクリーニングおよび標的のバリデーション
さらなる態様において、本明細書において同定された「好ましい標的セグメント」を、IGF-IR遺伝子の発現を調節するさらなる化合物のスクリーニングにおいて用いてもよい。「調節物質」は、IGF-IRをコードする核酸分子の発現を減少または増加させ、および好ましい標的セグメントに対して相補的な少なくとも8-ヌクレオベース部分を含む化合物である。スクリーニング法は、IGF-IRをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを一つまたは複数の候補調節物質に接触させる段階、およびIGF-IRをコードする核酸分子の発現を減少または増加させる一つまたは複数の候補調節物質を選択する段階を含む。候補調節物質または複数の調節物質がIGF-IRをコードする核酸分子の発現を調節できる（すなわち、減少または増加させる）ことが示された場合、調節物質を、IGF-IRの機能をさらに調べる研究に用いてもよく、または本発明に従って研究、診断、もしくは治療物質として用いてもよい。
【００６２】
本発明の好ましい標的セグメントはまた、本発明のそれぞれの相補的アンチセンス化合物と組み合わせて、安定化された二本鎖（二本鎖）オリゴヌクレオチドを形成してもよい。
【００６３】
そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、標的発現を調節して翻訳を調節すると共にアンチセンスメカニズムによってRNAプロセシングを調節することが当技術分野において示されている。その上、二本鎖部分は化学改変を受けてもよい
0004753863.tif 000015
例えばそのような二本鎖部分は、標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖の古典的なハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、それによって標的の酵素的分解を誘発することが示されている（Tijsterman et al.、2002、上記）。
【００６４】
本発明の化合物はまた、薬物輸送および標的のバリデーションの領域に応用することができる。本発明は、IGF-I、IGF-IR、またはIGF-I/IGF-IR相互作用と、疾患状態、表現型、または病態とのあいだに存在する関係を解明するための医薬品発見努力において、本明細書において同定された化合物および好ましい標的セグメントを用いることを含む。これらの方法には、試料、組織、細胞、または生物を本発明の化合物に接触させる段階、IGF-IRの核酸またはタンパク質レベルおよび／または関連する表現型または化学エンドポイントを治療後の何らかの時期に測定する段階、および選択的に、測定された値を無処置試料または本発明のさらなる化合物によって処置した試料と比較する段階を含む、IGF-IRを検出または調節することが含まれる。これらの方法はまた、標的バリデーションのプロセスに関して未知の遺伝子の機能を決定するために、または特定の疾患、病態、もしくは表現型の治療または予防の標的として特定の遺伝子産物の有効性を決定するために、他の実験と平行して、または組み合わせて行うことができる。
【００６５】
E．キット、研究用試薬、診断薬、および治療薬
本発明の化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、ならびに研究試薬およびキットとして利用することができる。さらに、すばらしい特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドはしばしば、特定の遺伝子の機能を解明するため、生物経路の様々なメンバーの機能を区別するために、当業者によって用いられる。
【００６６】
キットおよび診断薬として用いる場合、本発明の化合物は単独または他の化合物もしくは治療物質と併用して、細胞および組織内で発現された遺伝子の一部または完全な相補体の発現パターンを解明するために示差および／または組み合わせ分析におけるツールとして用いることができる。
【００６７】
非制限的な実施例として、一つまたは複数のアンチセンス化合物によって処置した細胞または組織内の発現パターンを、アンチセンス化合物によって処置していない対照細胞または組織と比較して、生じたパターンを、それらが例えば調べる遺伝子の疾患との関連、シグナル伝達経路、細胞の局在、発現レベル、大きさ、または機能に関連することから、遺伝子発現の異なるレベルに関して分析する。これらの分析は、刺激または非刺激細胞について行うことができ、発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在下または非存在下で行うことができる。
【００６８】
当技術分野で既知の遺伝子発現分析の方法の例には、DNAアレイまたはマイクロアレイ（Brazmaoyobi
Vilo、FEBS Lett. 480：17〜24、2000；Celis et al.、FEBS Lett. 480：2〜16、2000）、SAGE（遺伝子発現連続分析）（Madden et al.、Drug Discov. Today 5：415〜425、2000）、READS（消化cDNAの制限酵素増幅）（PrasharおよびWeissman、Methods Enzymol. 303：258〜272、1999）、TOGA（総遺伝子発現分析）（Sutcliffe et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：1976〜1981、2000）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Celis et al.、2000、上記；Jungblut et al.、Electrophoresis 20：2100〜2110、1999）、発現された配列タグ（EST）シークエンシング（Celis et al.、2000、上記；Larsson et al.、J. Biotechnol. 80：143〜157、2000）、サブトラクティブRNAフィンガープリンティング（SuRF）（Fuchs et al.、Anal Biochem. 286：91〜98、2000；Larsson et al.、Cytometry 41：203〜208、2000）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（DD）（JurecicおよびBelmont、Curr. Opin. Microbiol. 3：316〜321、2000）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Carulli et al.、J. Cell Biochem. Suppl.31：286〜296、1998）、FISH（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）技術（GoingおよびGuesterson、Eur. J. Cancer 35：1895〜1904、1999）、および質量分析法（To、Comb. Chem. High Throughput Screen 3：235〜241、2000）が含まれる。
【００６９】
本発明の化合物は、これらの化合物がIGF-IRをコードする核酸とハイブリダイズすることから研究および診断にとって有用である。例えば、本明細書においてIGF-IR遺伝子発現阻害剤の有効なIGF-IR阻害剤であると開示される効率および条件でハイブリダイズすることが示されているオリゴヌクレオチドはまた、遺伝子増幅または検出に都合がよい条件でそれぞれ、有効なプライマーまたはプローブとなるであろう。これらのプライマーおよびプローブは、IGF-IRをコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法において有用であり、IGF-IRまたはその遺伝子を検出するため核酸分子の増幅において、またはそのさらなる研究において用いるために有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にプライマーおよびプローブと、IGF-IRをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当技術分野で既知の手段によって検出することができる。そのような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射標識、または他の任意の適した検出手段が含まれてもよい。試料中のIGF-IRのレベルを検出するためにそのような検出手段を用いるキットも同様に調製してもよい。
【００７０】
アンチセンスの特異性および感受性はまた、当業者によって治療的用途のために利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物において疾患状態の治療における治療部分として利用されている。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、ヒトに安全かつ有効に投与されており、多数の臨床試験が現在行われている。このように、アンチセンス化合物は、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療レジメにおいて有用となるように形成されうる有用な治療様相となりうることが確立されている。
【００７１】
治療物質の場合、動物、好ましくはIGF-IR遺伝子の発現を調節することによって治療することができる疾患または障害を有することが疑われるヒトは、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することによって治療される。例えば、一つの非制限的な態様において、方法は、IGF-IR遺伝子発現阻害剤の治療的有効量を、治療を必要とする動物に投与する段階を含む。本発明のIGF-IR遺伝子発現阻害剤は、IGF-IRタンパク質の活性を有効に阻害する、またはIGF-IR遺伝子の発現を阻害する。一つの態様において、動物におけるIGF-IRまたはその遺伝子の活性または発現は、約10％阻害される。好ましくは、動物におけるIGF-IRまたはその遺伝子の活性または発現は、約30％阻害される。より好ましくは、動物におけるIGF-IRまたはその遺伝子の活性または発現は、50％またはそれ以上阻害される。
【００７２】
例えば、IGF-IR遺伝子の発現の減少は、血清、脂肪組織、皮膚細胞、肝臓、または動物の他の任意の体液、組織、もしくは臓器において測定してもよい。好ましくは、分析される該液体、組織または臓器に含まれる細胞は、IGF-IRタンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００７３】
本発明の化合物は、適した薬学的に許容される希釈剤または担体に化合物の有効量を加えることによって薬学的組成物において利用することができる。本発明の化合物および方法を用いることはまた、予防的に有用となる可能性がある。
【００７４】
F．改変
当技術分野で公知であるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基である。そのような複素環塩基の二つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合した燐酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、燐酸基は、糖の2'、3'、または5'ヒドロキシル部分のいずれかに結合させることができる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、燐酸基は隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直線状のポリマー化合物を形成する。次に、この直線状のポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに結合させて、環状化合物を形成させることができるが、直線状の化合物が一般的に好ましい。さらに、直線状の化合物は、内部ヌクレオベース相補性を有してもよく、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物を産生するように折り畳んでもよい。オリゴヌクレオチドにおいて、燐酸基は、一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると呼ばれる。RNAおよびDNAの通常の結合または骨格は3'から5'ホスホジエステル結合である。
【００７５】
改変インターヌクレオシド結合（骨格）
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、改変骨格または非天然インターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義されるように、改変骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格において燐原子を保持するオリゴヌクレオチド、および骨格に燐原子を有しないオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書の目的に関して、および時に当技術分野において参照されるように、そのヌクレオシド間骨格に燐原子を有しない改変オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
【００７６】
その中に燐原子を含む好ましい改変オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、カイラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネートおよびカイラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、および通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'-結合類似体、ならびに一つまたは複数のインターヌクレオチド結合が3'から3'、5'から5'、または2'から2'結合である逆方向極性を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。逆方向極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も3'側のインターヌクレオチド結合で単一の3'から3'結合、すなわち塩基性であってもよい（ヌクレオベースは欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）一つの逆方向ヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩、および遊離の酸も同様に含まれる。
【００７７】
上記の燐含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、そのいくつかが本出願によって一般的に所有され、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
0004753863.tif 000016
号が含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
その中に燐原子を含まない好ましい改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、または一つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環インターヌクレオシド結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルフォリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合N、O、S、およびCH2成分を有するその他を有する骨格が含まれる。
【００７９】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、そのいくつかが本出願によって一般的に所有され、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
0004753863.tif 000017
号が含まれるがこれらに限定されない。
【００８０】
改変糖およびインターヌクレオシド結合模倣体
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびインターヌクレオシド結合（すなわち、骨格）はいずれも、新しい基に置換される。ヌクレオベース単位は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような化合物の一つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（PNA）と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。ヌクレオべースは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,539,082；5,714,331；および5,719,262号が含まれるがこれらに限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.、Science 254：1497〜1500、1991に認められうる。
【００８１】
本発明の好ましい態様は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチド、特に先に参照した米国特許第5,489,677号の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[メチレン（メチルイミノ）またはMMI骨格として知られる]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、および-O-N(CH3)-CH2-CH2-[未変性のホスホジエステル骨格は-O-P-O-CH2-として表される]、および先に参照した米国特許第5,602,240号のアミド骨格である。先に参照した米国特許第5,034,506号のモルフォリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも同様に好ましい。
【００８２】
改変糖
改変オリゴヌクレオチドはまた、一つまたは複数の置換糖部分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の一つ：OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-、もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキルを含み、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは置換または非置換C1-C10アルキルまたはC2-C10アルケニルおよびアルキニルであってもよい。特に好ましいのはnおよびmが1〜約10である、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位で以下の一つを含む：C1-C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、またはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレート剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動力学特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基を含む。好ましい改変には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られる(2'-O-CH2CH2OCH3)）（Martin et al.、Helv. Chim. Acta. 78：486〜504、1995）、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい改変には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち下記の実施例に記述されるように2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において2'-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2'-DMAEOEとしても知られる）、すなわち下記の実施例に記述されるように2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が含まれる。
【００８３】
他の好ましい改変には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）、2'-アリル（2'-CH2-CH=CH2）、2'-O-アリル（2'-O-CH2-CH=CH2）、および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。2'-改変は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってもよい。好ましい2'-アラビノ改変は2'-Fである。類似の改変はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位、または2'-5'結合オリゴヌクレオチド、および5'末端ヌクレオチドの5'位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣体を有してもよい。そのような改変糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、そのいくつかが本出願によって一般的に所有され、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
0004753863.tif 000018
号が含まれるがこれらに限定されない。
【００８４】
糖のさらに好ましい改変には、2'-ヒドロキシル基が糖環の3'または4'炭素原子に結合して、それによって二環糖部分を形成するロックド核酸（LNA）が含まれる。結合は好ましくは、2'酸素原子と4'炭素原子を架橋し、nが1または2であるメチレン(-CH2-)n基である。LNAおよびその調製はWO98/39352およびWO99/14226に記述されている。
【００８５】
天然および改変ヌクレオベース
オリゴヌクレオチドにはまた、ヌクレオベース（当技術分野においてしばしば単純に「塩基」と呼ばれる）改変または置換が含まれてもよい。本明細書において用いられるように、「非改変」または「天然」のヌクレオベースには、プリン塩基アデニン（A）およびグアニン（G）、およびピリミジン塩基チミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）が含まれる。改変ヌクレオベースには、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび2-デアザアデニンのような他の合成および天然ヌクレオベースが含まれる。さらなる改変ヌクレオベースには、フェノキサジンシチジン（1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン）のようなG-クランプ、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド[4,5-b]インドル-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド[3',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン）のような三環系ピリミジンが含まれる。改変ヌクレオベースにはまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンに置換されているヌクレオベースが含まれてもよい。さらなるヌクレオベースには、米国特許第3,687,808号に開示されるヌクレオベース、「The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、Kroschwitz, J.I.編、John Wiley & Sons、1990に開示されるヌクレオベース、English et al.、Angewandte Chemie、国際版、30：613、1991に開示されるヌクレオベース、およびSanghvi, Y.S.、第15章、「Antisense Research and Applications」、289〜302頁、Crooke, S.T,およびLebleu, B.編、CRC出版、1993に開示されるヌクレオベースが含まれる。これらのヌクレオベースのいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含む5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されており、現在好ましい塩基置換であるが、2'-O-メトキシエチル糖改変と組み合わせるとさらにより特に好ましい。
【００８６】
上記の改変ヌクレオベースと共に他の改変ヌクレオベースのいくつかの調製を教示する代表的な米国特許には、そのいくつかが本出願によって一般的に所有され、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、上記の米国特許第
0004753863.tif 000019
号、ならびに本出願によって一般的に所有され、同様に参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,750,692号が含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
結合体
本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する一つまたは複数の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに化学結合させることを含む。これらの部分または結合体には、一級または二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合した結合基が含まれうる。本発明の結合基には、インターカレート剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的な結合基には、コレステロール、脂質、燐脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナンスリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本発明の状況において薬物動力学特性を増強する基には、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増強する、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明の状況において、薬物動態特性を増強する基には、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。代表的な結合基は、その全開示が参照として本明細書に組み入れられる、1992年10月23日に提出された国際特許出願であるPCT/US92/09196、および米国特許第6,287,860号に開示される。結合体部分には、コレステロール部分、胆汁酸、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール、またはウンデシル残基、燐脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミン、またはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分のような脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性な薬物、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、葉酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤、または抗生物質に結合させてもよい。オリゴヌクレオチド-薬物結合体およびその調製は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許出願第09/334,130号（1999年6月15日に提出）に記述されている。
【００８８】
そのようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する代表的な米国特許には、そのいくつかが本出願によって一般的に所有され、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
0004753863.tif 000020
号が含まれるがこれらに限定されない。
【００８９】
キメラ化合物
所定の化合物における全ての位置が均一に改変される必要はなく、実際に、上記の一つより多い改変を、単一の化合物、またはオリゴヌクレオチド内の一つのヌクレオシドに組み入れてもよい。
【００９０】
本発明にはまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物が含まれる。本明細書の状況において、「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、それぞれが少なくとも一つの単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドで構成される、二つ以上の化学的に異なる領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増加、細胞の取り込みの増加、安定性の増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが改変される、少なくとも一つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA：DNAまたはRNA：RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質として役立つ可能性がある。例として、RNアーゼHはRNA：DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化によって、RNA標的の切断が起こり、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチドによる阻害効率は大きく増強される。RNA：RNAハイブリッドの切断は、同様に、細胞とウイルスRNAの双方を切断するRNアーゼLのようなエンドリボヌクレアーゼの作用を通して行うことができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば当技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって普通に検出することができる。
【００９１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記の二つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成されてもよい。そのような化合物はまた、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーと呼ばれている。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、そのいくつかが本出願によって一般的に所有され、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
0004753863.tif 000021
号が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
G．製剤
本発明の化合物はまた、取り込み、分布、および／または吸収を補助するために、例えばリポソーム、受容体ターゲティング分子、経口、直腸、局所、または他の製剤として、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、結合、またはそうでなければ会合させてもよい。そのような取り込み、分布、および／または吸収補助製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
0004753863.tif 000022
号が含まれるがこれらに限定されない。
【００９３】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与した場合に生物学的に活性な代謝物またはその残留物を提供する（直接または間接的に）ことができる他の任意の化合物を含む。したがって、例えば本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物についても開示される。
【００９４】
「プロドラッグ」という用語は、内因性の酵素または他の化学物質および／または条件の作用によって、体またはその細胞内で活性型（すなわち薬物）に変換される、不活性型で調製された治療物質を指す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、1993年12月9日に公表されたGosselin et al.に対するWO93/24510またはImbach et al.に対するWO94/26764および米国特許第5,770,713号に開示される方法に従って、SATE[(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【００９５】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的および薬学的に許容される塩、すなわち親化合物の所望の生物活性を保持しているが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す。オリゴヌクレオチドに関して、薬学的に許容される塩およびその用途の好ましい例は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。
【００９６】
本発明にはまた、本発明のアンチセンス化合物が含まれる薬学的組成物および製剤が含まれる。本発明の薬学的組成物は、局所または全身治療が望ましいか否か、および治療すべき領域に応じて多くの方法で投与してもよい。投与は局所（眼内、ならびに膣内および直腸内輸送を含む粘膜への輸送を含む）、肺内、例えばネブライザーを含む粉末またはエアロゾルの吸入（inhalation）または吸入（insufflation）；気管内、鼻腔内、上皮、および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射または注入、または頭蓋内、例えばくも膜下、または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル改変を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与にとって特に有用であると考えられる。局所投与のための薬学的組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ剤、坐剤、スプレー、液体、および粉剤が含まれてもよい。通常の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、濃化剤等も必要または望ましい可能性がある。コーティングしたコンドーム、手袋等も同様に有用である可能性がある。
【００９７】
単位投与剤形として簡便に表してもよい本発明の薬学的製剤は、製薬工業において周知の通常の技術に従って調製してもよい。そのような技術には、活性成分を薬学的担体または賦形剤に会合させる段階が含まれる。一般的に、製剤は、活性成分を液体担体または微細固体担体またはその双方に均一かつ完全に会合させて、必要であれば製品に成形することによって調製される。
【００９８】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸のような、しかしこれらに限定されない多くの可能性がある投与剤形のいずれに調製してもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性、または混合媒体に浮遊液として調製してもよい。水性浮遊液はさらに、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、浮遊液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。浮遊液はまた、溶解剤を含んでもよい。
【００９９】
本発明の薬学的組成物には、溶液、乳液、フォーム、およびリポソーム含有製剤が含まれるがこれらに限定されない。本発明の薬学的組成物および製剤は、一つまたは複数の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の活性もしくは不活性成分を含んでもよい。
【０１００】
乳剤は典型的に、通常、一つの液体が直径0.1μmを超える小滴の形で他の液体に分散される不均一な系である。乳剤は分散相の他にさらなる成分、および水相、油相、または分離相そのものに溶液として存在してもよい活性薬を含んでもよい。微小乳剤は、本発明の態様として含まれる。乳剤およびその用途は、当技術分野で周知であり、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。
【０１０１】
本発明の製剤には、リポソーム製剤が含まれる。本発明において用いられるように、「リポソーム」という用語は、球状の二重層または二重層に整列した両親媒性脂質からなる小胞を意味する。リポソームは、親油性材料で形成された膜と、輸送すべき組成物を含む水性の内層とを有するユニラメラまたはマルチラメラ小胞である。陽イオン性リポソームは、陰性荷電DNA分子と相互作用して、安定な複合体を形成すると考えられる陽性荷電リポソームである。pH感受性または陰性荷電であるリポソームは、複合体を形成するよりむしろDNA分子を捕獲すると考えられている。陽イオンおよび非イオン性リポソームは、DNAを細胞に輸送するために用いられている。
【０１０２】
リポソームにはまた、本明細書において用いられるようにリポソームに組み入れられると、そのような特殊な脂質を欠損するリポソームと比較して循環中の寿命が増強される一つまたは複数の特殊な脂質を含むリポソームを指す用語である「立体的に安定化された」リポソームが含まれる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分が一つまたは複数の糖脂質を含む、またはポリエチレングリコール（PEG）部分のような一つまたは複数の親水性ポリマーによって誘導体化されたリポソームである。リポソームおよびその用途は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。
【０１０３】
本発明の薬学的製剤および組成物にはまた、界面活性剤が含まれてもよい。医薬品、製剤、および乳剤における界面活性剤の使用は、当技術分野で周知である。界面活性剤およびその用途は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。
【０１０４】
一つの態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な輸送を行うために様々な浸透増強剤を用いる。非親油性の薬剤の細胞膜を超える拡散を助けることの他に、浸透増強剤はまた親油性薬剤の浸透性を増強する。浸透増強剤は、広い五つの範疇、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート性界面活性剤の一つに属すると分類することができる。浸透増強剤およびその用途は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。
【０１０５】
当業者は、製剤がその意図する用途、すなわち投与経路に従って普通に設計されることを認識するであろう。
【０１０６】
局所投与のための好ましい製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤のような局所輸送物質と混合されている製剤が含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG）および陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）が含まれる。
【０１０７】
局所または他の投与の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入してもよく、または特に陽イオン性リポソームと複合体を形成してもよい。または、オリゴヌクレオチドは、脂質、特に陽イオン脂質と複合体を形成してもよい。好ましい脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるその塩、およびその用途は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。
【０１０８】
経口投与のための組成物および製剤には、粉剤または顆粒剤、微粒子、ナノ微粒子、懸濁剤、または水もしくは非水性媒体での溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ、錠剤、またはミニ錠剤が含まれる。濃化剤、着香料、希釈剤、乳剤、分散補助剤または結合剤も望ましい可能性がある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが一つまたは複数の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート剤と共に投与される製剤である。好ましい界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸、および／またはその塩が含まれる。好ましい胆汁酸／塩および脂肪酸およびその用途は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。浸透増強剤との併用、例えば脂肪酸／塩と胆汁酸／塩との併用もまた好ましい。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびUDCAのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形で、または複合体を形成して微粒子もしくはナノ微粒子を形成して経口輸送してもよい。オリゴヌクレオチド複合剤およびその用途は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,287,860号にさらに記述される。オリゴヌクレオチドの経口製剤およびその調製は、そのそれぞれの全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許出願第09/108,673号（1998年7月1日に提出）、第09/315,298号（1999年5月20日に提出）、および2002年2月8日に提出された第10/071,822号に詳細に記述されている。
【０１０９】
非経口、くも膜下、または脳室内投与のための組成物および製剤には、緩衝液、希釈剤、および浸透増強剤、担体化合物、ならびに他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤のような他の適した添加剤を含んでもよい滅菌水溶液が含まれてもよい。
【０１１０】
本発明の特定の態様は、一つまたは複数のオリゴマー化合物と、非アンチセンスメカニズムによって機能する一つまたは複数の他の化学療法剤とを含む薬学的組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミスラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコフォルミシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メソトレキセート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲンシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（DES）のような癌化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない。本発明の化合物と共に用いる場合、そのような化学療法剤は、個々に（例えば、5-FUとオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレオチドを投与して一定期間の後にMTXおよびオリゴヌクレオチド）、または一つもしくはそれ以上の他のそのような化学療法剤、例えば、5-FU、MTX、およびオリゴヌクレオチド、または5-FU、放射線療法、およびオリゴヌクレオチド）と併用して用いてもよい。非ステロイド性抗炎症剤およびコルチコステロイドが含まれるがこれらに限定されない抗炎症薬、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルが含まれるがこれらに限定されない抗ウイルス薬も同様に、本発明の組成物において併用してもよい。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス薬剤との併用もまた本発明の範囲に含まれる。二つ以上の併用化合物を、同時または連続的に用いてもよい。
【０１１１】
もう一つの関連する態様において、本発明の組成物は、一つまたは複数のアンチセンス化合物、特に第一の核酸にターゲティングされるオリゴヌクレオチドと、第二の核酸標的にターゲティングされる一つまたは複数のさらなるアンチセンス化合物とを含んでもよい。または、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域にターゲティングされる二つ以上のアンチセンス化合物を含んでもよい。アンチセンス化合物の多数の例が当技術分野において既知である。二つ以上の併用化合物は同時または連続して用いてもよい。
【０１１２】
H．投与
治療組成物の調製およびその後の投与（投与）は、当業者の範囲内であると考えられる。投与は、治療すべき病態の重症度および反応性に依存し、治療コースは数日から数ヶ月間、治癒が得られるまで、または病態の減少が得られるまで持続する。最適な投与スケジュールは患者の体内での薬物蓄積の測定から計算することができる。当業者は、最適な用量、投与方法論、および繰り返し数を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的強度に依存して変化してもよく、一般的にインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが判明したEC50に基づいて推定することができる。一般的に、用量は、0.01ug〜100g/kg体重であり、毎日、毎週、毎月、毎年1回またはそれ以上、または2〜20年毎に1回投与してもよい。当業者は、体液または組織における薬物の測定された残留時間および濃度に基づいて、投与の繰り返し数を容易に推定することができる。治療の成功後、病態の再発を予防するために、患者に、オリゴヌクレオチドを0.01ug〜100g/kg体重の範囲の維持用量で毎日1回またはそれ以上から20年に1回投与する、維持治療を受けさせることが望ましいかも知れない。
【０１１３】
本発明は、その好ましい態様のいくつかに従って特に説明してきたが、以下の実施例は本発明を説明するために限って提供され、本発明を制限すると解釈されない。
【０１１４】
実施例
実施例1
ヌクレオシドホスホロアミダイトの合成
アミダイトおよびその中間体を含む以下の化合物は、米国特許第6,426,220号および公表されたPCT出願WO02/36743に記述された通りに調製した；5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン最後から2番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（5-メチルdCアミダイト）、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-(2-メトキシエチル)改変アミダイト、2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン中間体、5'-O-DMT-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン最後から2番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（MOE Tアミダイト）、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジン最後から2番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（MOE 5-Me-Cアミダイト）、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（MOE Aアミダイト）、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-イソブチリルグアノシン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（MOE Gアミダイト）、2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-[(2-フタルイミドオキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドオキシミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,Nジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]、2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル]-5-メチルウリジン、および5'-O-ジ��トキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル]-5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト。
【０１１５】
実施例2
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成に関する周知の技術を通して簡便かつ普通に作製してもよい。そのような合成のための設備は、例えばアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州）を含むいくつかの販売元によって販売されている。当技術分野で既知のそのような合成の他の手段を、さらにもしくはまたは用いてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために類似の技術を用いることは周知である。
【０１１６】
オリゴヌクレオチド：非置換および置換ホスホジエステル（P=O）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素による酸化による標準的なホスホロアミダイト化学を用いて、自動DNAシンセサイザー（アプライドバイオシステムズモデル394）において合成される。
【０１１７】
ホスホロチオエート（P=S）は、以下を例外としてホスホジエステルオリゴヌクレオチドと類似のように合成される：チア化は、亜燐酸塩結合を酸化するために、10％w/v 3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドのアセトニトリル溶液を利用することによって行った。チア化反応段階の時間を180秒に増加させて、通常のキャッピング段階によって進行させる。CPGカラムから切断して濃水酸化アンモニウムにおいて55℃（12〜16時間）で脱ブロッキングした後、オリゴヌクレオチドを1M NH4OAc溶液からエタノールの>3量で沈殿させることによって回収した。亜燐酸塩オリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,508,270号に記述されるように調製した。
【０１１８】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,469,863号に記述されるとおりに調製する。
【０１１９】
3'-デオキシ-3'-メチレンホスフェートオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,610,289号または第5,625,050号に記述されるとおりに調製する。
【０１２０】
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,256,775号または米国特許第5,366,878号に記述されるとおりに調製する。
【０１２１】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、公表されたPCT出願PCT/US94/00902、およびPCT/US93/06976（それぞれ、WO94/17093およびWO94/02499として公表）に記述されるとおりに調製する。
【０１２２】
3'-デオキシ-3'-アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,476,925号に記述されるとおりに調製する。
【０１２３】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,023,243号に記述されるとおりに調製する。
【０１２４】
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,130,302号および第5,177,198号に記述されるとおりに調製する。
【０１２５】
オリゴヌクレオシド：MMI結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシドと共に、例えば交互のMMIおよびP=O、またはP=S結合を有する混合骨格化合物は、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,378,825号、第5,386,023号、第5,489,677号、第5,602,240号、および第5,610,289号に記述されるとおりに調製する。
【０１２６】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,264,562号および第5,264,564号に記述されるとおりに調製される。
【０１２７】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,223,618号に記述されるとおりに調製される。
【０１２８】
実施例3
RNA合成
一般的に、RNA合成化学は、戦略的な中間反応において様々な保護基を選択的に組み入れることに基づく。当業者は、有機合成において保護基を用いることを理解するであろうが、有用なクラスの保護基には、シリルエーテルが含まれる。特に、かさの大きいシリルエーテルは、2'-ヒドロキシル上の酸不安定性のオルトエステル保護基と組み合わせて、5'-ヒドロキシルを保護するために用いられる。次に、この組の保護基を標準的な固相合成技術と共に用いる。他の全ての合成段階の後に、酸不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。その上、合成の際にシリル保護基を最初に用いることによって、望ましければ、2'-ヒドロキシルが望ましくなく脱保護されることなく、除去が確実に容易となる。
【０１２９】
異なるように除去され、異なるように化学的不安定である保護基による2'-ヒドロキシルの保護と組み合わせた5'-ヒドロキシルの連続的な保護に関するこの技法の後、RNAオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１３０】
RNAオリゴヌクレオチドは段階的に合成される。それぞれのヌクレオチドを、固相支持体結合オリゴヌクレオチドに連続的に（3'-から5'方向）加える。第一のオリゴヌクレオシドの鎖の3'末端を、固相支持体に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体であるリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび活性化剤を加えて、第二の塩基を第一のヌクレオシドの5'末端に共役させる。支持体を洗浄して、如何なる未反応の5'-ヒドロキシル基も無水酢酸によってキャッピングして、5'-アセチル部分を生じる。次に、結合を酸化させて、より安定かつ最終的に望ましいP(V)結合を得る。ヌクレオチド付加サイクルの終了時、5'-シリル基をフッ素によって切断する。それぞれの次のヌクレオチドに関してサイクルを繰り返す。
【０１３１】
合成後、ホスフェート上のメチル保護基を、DMF中で1Mジナトリウム-2-カルバモイル-2-シアノエチレン-1,1-ジチオレートトリハイドレート（S2Na2）を利用して30分間切断する。脱保護溶液を、水を用いて固相支持体結合オリゴヌクレオチドから洗浄する。次に、支持体を40％メチルアミン水溶液によって55℃で10分間処置する。これによって、溶液中にRNAオリゴヌクレオチドが放出され、環外アミンが脱保護され、2'-基が改変される。オリゴヌクレオチドは、この段階で陰イオン交換HPLCによって分析することができる。
【０１３２】
2'-オルトエステル基は、除去される最後の保護基である。ダーマコンリサーチインク（Dharmacon Research Inc、ラファイエット、コロラド州）が開発したエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、以下の重要な特性を有する有用なオルトエステル保護基の一例である。これは、ヌクレオシドホスホロアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定である。しかし、オリゴヌクレオチド合成後、オリゴヌクレオチドをメチルアミンによって処理するが、メチルアミンは固相支持体からオリゴヌクレオチドを切断するのみならずオルトエステルからアセチル基を除去する。得られたオルトエステル上の2-エチル-ヒドロキシル置換基は、アセチル化前駆体より電子求引性が低い。その結果、改変オルトエステルは酸触媒加水分解に対してより不安定となる。特に、切断速度は、アセチル基の除去後は約10倍速くなる。したがって、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合させるために十分な安定性を保持するが、その後改変されると、最終的なRNAオリゴヌクレオチド産物と適合性の比較的軽度の水性条件で脱保護を可能にする。
【０１３３】
さらに、RNA合成法は当技術分野で周知である
0004753863.tif 000023
【０１３４】
本発明のRNAアンチセンス化合物（RNAオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載の方法によって合成する、またはダーマコンリサーチインク（ラファイエット、コロラド州）から購入することができる。合成後、次に、相補的RNAアンチセンス化合物を当技術分野で既知の方法によってアニールして、二本鎖（二本鎖；duplex）アンチセンス化合物を形成することができる。例えば、二本鎖は、RNAオリゴヌクレオチドの相補的な鎖（50μM RNAオリゴヌクレオチド溶液）のそれぞれの30μlと、5×アニーリング緩衝液（100mM酢酸カリウム、30mM HEPES-KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウム）15μlと混合した後、90℃で1分間加熱した後37℃で1時間加熱することによって形成することができる。得られた二本鎖アンチセンス化合物は、標的核酸の役割を調べるために、キット、アッセイ、スクリーニング、および他の方法において用いることができる。
【０１３５】
実施例4
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプとなりうる。これらには、結合したヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合したヌクレオシドの5'および3'「ウィング」セグメントのあいだに存在する第一のタイプと、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに存在する第二の「開放末端」型が含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当技術分野において「ギャップマー」またはギャップドオリゴヌクレオチドとしても知られる。第二のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当技術分野において「ヘミマー」または「ウィングマー」としても知られる。
【０１３６】
[2'-O-Me]-[2'-デオキシ]-[2'-O-Me]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ自動DNA分子シンセサイザーモデル394を用いて上記のように合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーおよびDNA部分に関して2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホロアミダイト、ならびに5'および3'ウィングに関して5'ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホロアミダイトを用いて合成する。5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホロアミダイトに関して反応時間を増加させたカップリング段階を組み入れることによって、標準的な合成サイクルを改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断して、濃アンモニア（NH4OH）において55℃で12〜16時間脱保護する。次に、脱保護されたオリゴを適当な方法（沈殿、カラムクロマトグラフィー、真空での容積減少）によって回収して、キャピラリー電気泳動および質量分析によって収量および純度に関して分光光度法によって分析する。
【０１３７】
[2'-O-(2-メトキシエチル)]-[2'-デオキシ]-[2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
[2'-O-(2-メトキシエチル)]-[2'-デオキシ]-[2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関して先に記述した技法の通りに調製して、2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを2'-O-メチルアミダイトの代わりに置換した。
【０１３８】
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]-[2'-デオキシホスホロチオエート]-[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチド
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]-[2'-デオキシホスホロチオエート]-[2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記の技法の通りに調製するが、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを用いて、ヨウ素による酸化によってキメラ構造のウイング部分内にホスホジエステルインターヌクレオチド結合を生成し、そして3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド（Beaucage試薬）を利用する硫化によって中心のギャップに関してホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を生成する。
【０１３９】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、および混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,623,065号に従って合成される。
【０１４０】
実施例5
IGF-IR mRNAを標的とする二本鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明に従って、本発明のアンチセンス化合物およびその相補体を含む一連の核酸二本鎖を、IGF-IR mRNAを標的とするように設計することができる。二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオベース配列は、好ましいASO
0004753863.tif 000024
を含む表1に示されるSEQ ID NO：1〜76およびSEQ ID NO：100〜136から選択されるオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を含む。鎖の末端部は、一つまたは複数の天然または改変ヌクレオベースを加えて突出末端を形成することによって改変してもよい。次に、dsRNAのセンス鎖を設計して、アンチセンス鎖の相補体として合成し、いずれかの末端に対する改変または付加を含んでもよい。例えば、一つの態様において、dsRNA二本鎖の双方の鎖は、中心のヌクレオベースに対して相補的であり、それぞれが一つまたは双方の末端に突出末端を有するであろう。
【０１４１】
例えば、配列
0004753863.tif 000025
を有し、デオキシチミジン（dT）の2ヌクレオベース突出末端を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖は、以下の構造を有するであろう：
0004753863.tif 000026
【０１４２】
二本鎖のRNA鎖は、本明細書に開示の方法によって合成する、またはダーマコンリサーチインク（ラファイエット、コロラド州）から購入することができる。合成後、相補鎖をアニールする。一本鎖を少量ずつに分けて、50uMの濃度に希釈する。希釈した後、各鎖30uLをアニーリング緩衝液の5×溶液15uLと混合する。該緩衝液の最終濃度は100mM酢酸カリウム、30mM HEPES-KOH pH7.4、および2mM酢酸マグネシウムである。最終容量は75uLである。この溶液を90℃で1分間インキュベートした後15秒間遠心した。試験管を37℃で1時間放置した後dsRNA二本鎖を実験に用いた。dsRNA二本鎖の最終濃度は20uMである。この溶液は、凍結保存（-20℃）して5回まで凍結融解することができる。
【０１４３】
調製した後、二本鎖アンチセンス化合物をそのIGF-IR遺伝子発現の調節能に関して評価する。
【０１４４】
細胞が80％コンフルエンシーに達した後、それらを本発明の二本鎖アンチセンス化合物によって処理する。96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞に関して、ウェルをOPTI-MEM-1血清減少培地（ギブコBRL（Gibco BRL））200μLによって1回洗浄した後、12μg/mlリポフェクチン（ギブコBRL）および所望の二本鎖アンチセンス化合物を最終濃度200nMで含むOPTI-MEM-1 130μLによって処理した。5時間処理した後、培地を新鮮な培地に交換する。細胞を処置後16時間目に回収してからRNAを単離して、標的の減少をRT-PCRによって測定する。
【０１４５】
実施例6
オリゴヌクレオチドの単離
制御された多孔性ガラス固相支持体から切断して、濃水酸化アンモニウムにおいて55℃で12〜16時間脱ブロッキングした後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを1M NH4OAcと共に>3量のエタノールからの沈殿によって回収する。合成オリゴヌクレオチドを、エレクトロスプレー質量分析（分子量の測定）およびキャピラリーゲル電気泳動によって分析したところ、完全長の材料の少なくとも70％であると判断した。合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は、-16 amu産物（+/-32 +/-48）に対する正確な分子量の比によって決定した。いくつかの試験に関して、オリゴヌクレオチドは、Chiang et al.、J. Biol. Chem. 266：18162〜18171、1991によって記述されるようにHPLCによって精製した。HPLC精製材料から得られた結果は、非HPLC精製材料について得られた結果と類似であった。
【０１４６】
実施例7
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは、96ウェルフォーマットで配列96個を同時に構築することができる自動シンセサイザー上で固相P（III）ホスホロアミダイト化学によって合成した。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、ヨウ素水溶液による酸化によって得られた。ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合は、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド（Beaucage試薬）の無水アセトニトリル溶液を利用する硫化によって生成した。標準的な塩基保護β-シアノエチル-ジイソ-プロピルホスホロアミダイトは、販売元（例えば、PEアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、またはファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から購入した。非標準ヌクレオシドは、標準的なまたは特許申請された方法の通りに合成する。それらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして利用する。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断して、濃NH4OHにおいて上昇した温度（55〜60℃で）12〜16時間脱保護して、放出された産物を真空下で乾燥させた。次に、乾燥産物を滅菌水に再浮遊させて、主プレートを得て、そこから全ての分析および試験プレート試料をロボットピペッターを用いて希釈する。
【０１４８】
実施例8
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレートフォーマット
各ウェルにおけるオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈およびUV吸収分光法によって評価した。個々の産物の完全長の完全性を、96ウェルフォーマット（Beckman P/ACE（商標）MDQ）において、または個々に調製した試料に関して、市販のCE装置（例えば、Beckman P/ACE（商標）5000、ABI 270）においてキャピラリー電気泳動（CE）によって評価した。塩基および骨格の組成は、エレクトロスプレー質量分析を利用した化合物の質量分析によって確認した。全てのアッセイ試験プレートを1チャンネルおよび多チャンネルロボットピペッターを用いて主プレートから希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85％が少なくとも85％完全長であれば許容可能であると判断された。
【０１４９】
実施例9
細胞培養とオリゴヌクレオチド処置
アンチセンス化合物が標的核酸発現に及ぼす作用は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な如何なる細胞タイプにおいても試験することができる。これは、例えばPCRまたはノザンブロット分析を用いて普通に決定することができる。以下の細胞タイプは、説明する目的のために提供されるが、他の細胞タイプも、選択した細胞タイプに標的が発現される限り、普通に用いることができる。これは、当技術分野において普通の方法、例えばノザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、またはRT-PCRによって容易に決定することができる。
【０１５０】
T-24細胞：
ヒトの移行上皮性膀胱癌細胞株T-24は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（マナッサス、バージニア州）から得た。T-24細胞は普通、10％w/v仔ウシ胎児血清（インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）、カールスバッド、カリフォルニア州）、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を添加した完全なMcCoy's 5A基本培地（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）において培養した。細胞は、90％コンフルエンスに達した際にトリプシン処理および希釈によって日常的に継代した。細胞を、RT-PCR分析に用いるために96ウェルプレート（ファルコン-プリマリア（Falcon-Primaria）、#353872）に細胞7000個/ウェルの密度で播種した。
【０１５１】
ノーザンブロッティングまたは他の分析の場合、適用な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて、細胞を100mmまたは他の標準的な組織培養プレートに播種して、同様に処理してもよい。
【０１５２】
A549細胞：
ヒト肺癌細胞株A549は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（マナッサス、バージニア州）から得た。A549細胞は、10％仔ウシ胎児血清（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）、100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を添加したDMEM基本培地（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）において普通に培養した。細胞は、90％コンフルエンスに達した際にトリプシン処理および希釈によって日常的に継代した。
【０１５３】
NHDF細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NHDF）は、クロネティクスコーポレーション（Clonetics Corporation、ウォーカースビル、メリーランド州）から得た。NHDFsは、供給元の推奨どおりに添加した線維芽細胞増殖培地（クロネティクスコーポレーション、ウォーカースビル、メリーランド州）において日常的に維持した。細胞は、供給元の推奨どおりに継代10回まで維持した。
【０１５４】
HEK細胞：
ヒト胚ケラチノサイト（HEK）は、クロネティクスコーポレーション（ウォーカースビル、メリーランド州）から得た。HEKsは、供給元によって推奨されるとおりにケラチノサイト増殖培地（（クロネティクスコーポレーション、ウォーカースビル、メリーランド州）において日常的に維持した。細胞は、供給元の推奨どおりに継代10回まで維持した。
【０１５５】
アンチセンス化合物による処置：
細胞が65〜75％コンフルエンシーに達すると、細胞をオリゴヌクレオチドによって処置した。96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞の場合、ウェルを、OPTI-MEM（商標）-1血清減少培地（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）100μLによって1回洗浄後、3.75μg/mL LIPOFECTIN（商標）（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含むOPTI-MEM（商標）-1 130μLによって処置した。細胞を処置して、データを1試料あたり3個ずつ得る。37℃で4〜7時間処置後、培地を新鮮な培地に交換した。細胞をオリゴヌクレオチド処置の16〜24時間後に回収した。
【０１５６】
用いたオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株によって異なる。特定の細胞株に関して最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を一定範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドによって処置する。
【０１５７】
ヒト細胞の場合、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH-rasを標的とする
0004753863.tif 000027
、またはヒトJun-N-末端キナーゼ-2（JNK2）を標的とする
0004753863.tif 000028
のいずれかから選択される。いずれの対照も、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（2'-O-メトキシエチルを太字で示す）である。マウスまたはラット細胞の場合、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットc-rafの双方を標的とする、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（2'-O-メトキシエチルを太字で示す）である
0004753863.tif 000029
である。c-H-ras（ISIS 13920の場合）、JNK2（ISIS 18078の場合）、またはc-raf（ISIS 15770の場合）mRNAの80％阻害が起こる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株に関するその後の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。80％阻害が得られない場合、c-H-ras、JNK2、またはc-raf mRNAの60％阻害が起こる陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株に関するその後の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。60％阻害が得られない場合、その特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験にとって不適であると思われる。本明細書において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、50nM〜300nMである。
【０１５８】
実施例10
IGF-IR遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
IGF-IR遺伝子発現のアンチセンスによる調節は、当技術分野で既知の多様な方法においてアッセイすることができる。例えば、IGF-IR mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、またはリアルタイムPCR（RT-PCR）によって定量することができる。リアルタイム定量的PCRが現在好ましい。RNA分析は、総細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNAについて行うことができる。本発明のRNA分析の好ましい方法は、本明細書に記述の他の実施例に記述されるように総細胞RNAを用いることである。RNAの単離法は当技術分野で周知である。ノザンブロット分析も同様に当技術分野で日常的である。リアルタイム定量的PCRは、PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州から入手可能な市販のABI Prism（商標）7600、7700、または7900配列検出システムを用いて、製造元の説明書に従って簡便に行うことができる。
【０１５９】
IGF-IRのタンパク質レベルは、免疫沈殿、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、または蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）のような当技術分野で周知の多様な方法で定量することができる。IGF-IRに対する抗体は、MSRS抗体カタログ（アエリーコーポレーション（Aerie Corporation）、バーミンガム、ミシガン州）のような多様な起源から同定および得ることができ、または当技術分野で周知の通常のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体産生法によって調製することができる。
【０１６０】
実施例11
IGF-IR遺伝子発現阻害剤を用いるための表現型アッセイおよびインビボ試験の設計
表現型アッセイ
IGF-IR遺伝子発現阻害剤を本明細書に開示の方法によって同定した後、化合物を、それぞれが特定の疾患状態または病態の治療において有効性を予測する測定可能なエンドポイントを有する一つまたは複数の表現型アッセイにおいてさらに調べる。
【０１６１】
表現型アッセイ、キット、およびそれらを用いるための試薬は、当業者に周知であり、本明細書において健康および疾患におけるIGF-IRの役割および／または関連を調べるために用いられる。いくつかの販売元のいずれかから購入することができる代表的な表現型アッセイには、細胞生存率、細胞障害性、増殖または細胞生存を決定するためのアッセイ（モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州；パーキンエルマー（PerkinElmer）、ボストン、マサチューセッツ州）、酵素アッセイを含むタンパク質に基づくアッセイ（パンベラ（Panvera）、LLC、マディソン、ウィスコンシン州；BDバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、フランクリンレークス、ニュージャージー州；オンコジーンリサーチプロダクツ（Oncogene Research Products）、サンジエゴ、カリフォルニア州）、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化的プロセスおよびアポトーシス（アッセイデザインズインク（Assay Designs Inc.）、アナーバー、ミシガン州）、トリグリセリド蓄積（シグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、セントルイス、ミズーリ州）、血管新生アッセイ、血管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイ、ならびに代謝アッセイ（ケミコンインターナショナルインク（Chemicon International Inc.）、テメキュラ、カリフォルニア州；アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が含まれる。
【０１６２】
一つの非制限的な例において、特定の表現型アッセイにとって適当であると決定された細胞（すなわち、乳癌の研究のために選択されるMCF-7細胞；肥満の研究のための脂肪細胞）を、上記の方法によって決定される至適濃度の対照化合物と共に、インビトロ試験から同定されたIGF-IR遺伝子発現阻害剤によって処置する。処置期間の終了時、処置および無処置細胞を、表現型の転帰およびエンドポイントを決定するためにアッセイに特異的な一つまたは複数の方法によって分析する。
【０１６３】
表現型エンドポイントには、時間または処置用量による細胞形態の変化と共に、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖質、または金属のような細胞成分レベルの変化が含まれる。pH、細胞周期の期、細胞による生物学的指標の取り込みまたは排泄が含まれる細胞状態の測定も同様に、重要なエンドポイントである。
【０１６４】
処置後の細胞の遺伝子型の分析（細胞の一つまたは複数の遺伝子の発現の測定）も同様に、IGF-IR遺伝子発現阻害剤の有効性または効力の指標として用いられる。顕著な特徴を示す遺伝子、または特定の疾患状態、病態、もしくは表現型に関連することが疑われる遺伝子を、処置および無処置細胞の双方において測定する。
【０１６５】
インビボ試験
本明細書において記述されるインビボ試験の個々の被験者は、ヒトを含む温血脊椎動物である。
【０１６６】
臨床試験は、確実に個々の人が不必要にリスクに曝されないように、そして個々の人が試験におけるその役割に関して十分に通知されるように厳重な制御下で行われる。治療を受ける生理学的効果を説明するために、ボランティアにプラセボまたはIGF-IR遺伝子発現阻害剤を無作為に投与する。さらに、医師が治療に偏見を抱くのを防止するために、医師には彼らが投与している投薬がIGF-IR遺伝子発現阻害剤であるかプラセボであるかを通知しない。この無作為化アプローチを用いて、各ボランティアは新しい治療またはプラセボのいずれかを受ける同じ機会を有する。
【０１６７】
ボランティアはIGF-IR遺伝子発現阻害剤またはプラセボのいずれかを8週間にわたって投与され、表記の疾患状態または病態に関連する生物学的パラメータを試験開始時（任意の治療前の基準値測定）、試験終了時（最終治療後）、および試験期間中定期的な間隔で測定する。そのような測定には、処置前レベルと比較して、体液、組織、または臓器におけるIGF-IRをコードする核酸分子レベルまたはIGF-IRタンパク質レベルが含まれる。他の測定には、治療される疾患状態または病態の指標、体重、血圧、疾患または毒性の薬理学的指標の血清力価と共にADME（吸収、分布、代謝、および排泄）測定が含まれる。
【０１６８】
各患者に関する情報の記録には、年齢（歳）、性別、身長（cm）、疾患状態または病態に関する家族の既往（はい／いいえ）、動機付けの採点（何らか／中等度／最大）、ならびに表記の疾患または病態に関するこれまでの治療レジメの数およびタイプが含まれる。
【０１６９】
本試験に参加するボランティアは健康な成人（年齢18〜65歳）であり、男女ほぼ同数が試験に参加している。特定の特徴を有するボランティアが、プラセボおよびIGF-IR遺伝子発現阻害剤治療に関して等しく分布する。一般的に、プラセボを処置したボランティアは、治療にほとんどまたは全く反応しないが、IGF-IR遺伝子発現阻害剤を処置したボランティアは、試験終了時に疾患状態または病態指数に正の傾向を示す。
【０１７０】
実施例12
RNA単離
ポリ（A）＋mRNA単離
ポリ（A）＋mRNAは、Miura et al.（Clin. Chem. 42、1758〜1764、1996）に従って単離した。他のポリ（A）＋mRNA単離法は当技術分野で日常的である。簡単に説明すると、96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞に関して、増殖培地を細胞から除去して、各ウェルを冷PBS 200μLによって洗浄した。溶解緩衝液（10mMトリス-塩酸、pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5％NP-40、20mMバナジル-リボヌクレオシド複合体）60μLを各ウェルに加えて、プレートを軽く攪拌して、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)コーティング96ウェルプレート（AGCTインク、アーバイン、カリフォルニア州）に移した。プレートを室温で60分間インキュベートして、洗浄緩衝液（10mMトリス-HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl）200μLによって3回洗浄した。最後に洗浄した後、ペーパータオルの上でプレートの水分をしみこませて過剰量の洗浄緩衝液を除去し、5分間風乾させた。予め70℃に加温した溶出緩衝液（5mMトリス-HCl、pH7.6）60μLを各ウェルに加えて、プレートを90℃のホットプレートにおいて5分間インキュベートして、溶出液を新しい96ウェルに移した。
【０１７１】
100mmまたは他の標準的なプレートにおいて増殖させた細胞は、全ての溶液の適当量を用いて同様に処置してもよい。
【０１７２】
総RNA単離
総RNAは、製造元の推奨する技法に従って、キアゲンインク（バレンシア、カリフォルニア州）から購入したRNEASY 96（商標）キットおよび緩衝液を用いて単離した。簡単に説明すると、96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞に関して、増殖培地を細胞から除去して、各ウェルを冷PBS 200μLによって洗浄した。緩衝液RLT 150μLを各ウェルに加えて、プレートを20秒間強く攪拌した。70％エタノール150μLを各ウェルに加えて、上下に3回ピペッティングすることによって内容物を混合した。試料を、排液回収トレイを備えて、真空源に結合させたQIAVAC（商標）マニホルドに接続したRNEASY 96（商標）ウェルプレートに移した。1分間真空を適用した。緩衝液RW1 500μLをRNEASY 96（商標）プレートの各ウェルに加えて、15分間インキュベートして、再度真空を1分間適用した。さらに緩衝液RW1 500μLをRNEASY 96（商標）プレートの各ウェルに加えて、2分間真空を適用した。緩衝液RPE 1mLをRNEASY 96（商標）プレートの各ウェルに加えて90秒間真空を適用した。緩衝液RPEによる洗浄を繰り返して、真空をさらに3分間適用した。プレートをQIAVAC（商標）マニホルドから外して、ペーパータオルの上で乾燥させた。プレートを、1.2mL回収試験管を含む回収試験管ラックを備えたQIAVAC（商標）マニホルドに再度取り付けた。次に、RNアーゼ不含水140μLを各ウェルにピペットによって加えることによってRNAを溶出して、1分間インキュベートしてから、真空を3分間適用した。
【０１７３】
ピペッティングおよび溶出段階の繰り返しは、QIAGENバイオロボット9604（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて自動化してもよい。本質的に、培養プレート上での細胞を溶解後、プレートをロボットデッキに移して、そこでピペッティング、DNアーゼ処置、および溶出段階を行う。
【０１７４】
実施例13
IGF-IR mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析
IGF-IR mRNAレベルの定量は、ABI Prism（商標）7600、7700、または7900配列検出システム（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて、製造元の説明書に従ってリアルタイム定量的PCR分析によって行った。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のリアルタイムでの高スループット定量を行うことができる閉鎖管のゲルを用いない蛍光検出系である。PCRの終了後に増幅産物を定量する標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量的PCRの産物はそれが蓄積する際に定量される。これは、フォワードおよびリバースPCRプライマーのあいだで特異的にアニールして、蛍光色素2個を含むオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応に含めることによって行われる。レポーター色素（例えば、PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、オペロンテクノロジーズインク（Operon Technologies Inc.）、アラメダ、カリフォルニア州、またはインテグレーテッドDNAテクノロジーズインク（Integrated DNA Technologies Inc.）、コラルビル、アイオワ州のいずれかから得られるFAMまたはJOE）をプローブの5'末端に結合させて、消光色素（例えば、PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、オペロンテクノロジーズインク、アラメダ、カリフォルニア州、またはインテグレーテッドDNAテクノロジーズインク、コラルビル、アイオワ州のいずれかから得られるTAMRA）をプローブの3'末端に結合させる。プローブと色素が無傷の場合、レポーター色素の放出は3'消光色素が近位に存在すると消光する。増幅の際に、プローブの標的配列へのアニーリングは、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によって切断することができる基質を作製する。PCR増幅サイクルの伸長相において、Taqポリメラーゼによってプローブが切断されると、プローブの残りの部分（したがって、消光部分から）からレポーター色素が放出され、配列特異的蛍光シグナルが生成される。各サイクルにおいて、さらなるレポーター色素分子がそのそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度を、ABI Prism（商標）配列検出系に組み込まれたレーザー光学によって定期的な間隔でモニターする。それぞれのアッセイにおいて、無処置対照試料からのmRNAの連続希釈を含む一連の平行な反応から標準曲線を作製し、これを用いて試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の％阻害を定量する。
【０１７５】
定量的PCR分析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライマー-プローブの組を、GAPDH増幅反応との「多重複合体形成」能に関して評価する。多重複合体形成において、標的遺伝子と内部標準遺伝子GAPDHはいずれも、単一の試料において同時に増幅される。この分析において、無処置細胞から単離されたmRNAを連続希釈する。各希釈液を、GAPDHのみ、標的遺伝子のみ（「単複合体形成」）、または双方（「多重複合体形成」）に対して特異的なプライマー-プローブの組の存在下で増幅する。PCR増幅後、GAPDHおよび標的シグナルの希釈の関数としての標準曲線を、単複合体形成および多重複合体形成試料の双方から作製する。多重複合体形成試料から生成されたGAPDHおよび標的mRNAシグナルの勾配および相関係数がいずれも、単複合体形成試料から生成された対応する値の10％以内に入る場合、その標的に対して特異的なプライマー-プローブの組は多重複合体形成可能であると思われる。PCRの他の方法も同様に当技術分野で既知である。
【０１７６】
PCR試薬はインビトロジェン社（カールスバッド、カリフォルニア州）から得た。RT-PCR反応は、PCRカクテル（2.5×PCR緩衝液マイナスMgCl2、6.6mM MgCl2、375μM各dATP、dCTP、dCTP、およびdGTP、フォワードおよびリバースプライマー各375nM、125nMプローブ、RNアーゼ阻害剤4単位、PLATINUM（登録商標）Taq 1.25単位、MuLV逆転写酵素5単位、および2.5×ROX色素）20μLを、総RNA溶液（20〜200ng）30μLを含む96ウェルプレートに加えることによって行った。RT反応は、48℃で30分間インキュベートすることによって行った。PLATINUM（登録商標）Taqを活性化するために95℃で10分間インキュベートした後、2段階PCRプロトコール40サイクルを行った：95℃で15秒（変性）の後60℃で1.5分（アニーリング／伸長）。
【０１７７】
リアルタイムRT-PCRによって得られた遺伝子標的量を、その発現が一定である遺伝子であるGAPDHの発現レベルを用いて、またはRiboGreen（商標）（モレキュラープローブスインク、ユージーン、オレゴン州）を用いて総RNAを定量することによって標準化する。GAPDH発現は、リアルタイムRT-PCRによって、標的と同時に行い、多重複合体を形成することによって、または別に行うことによって定量する。総RNAはRiboGreen（商標）RNA定量試薬（モレキュラープローブスインク、ユージーン、オレゴン州）を用いて定量する。RiboGreen（商標）によるRNA定量法は、Jones et al.（Analytical Biochemistry 265：368〜374、1998）において教示されている。
【０１７８】
このアッセイにおいて、RiboGreen（商標）作業試薬（10mMトリス-HCl、1mM EDTA、pH7.5において1：350希釈したRiboGreen（商標）試薬）170μLを、精製細胞RNA 30μLを含む96ウェルプレートにピペットで加えた。プレートを、励起波長485nmおよび放出波長530nmのサイトフルオ4000（PE-アプライドバイオシステムズ）において読み取る。
【０１７９】
公表された配列情報（本明細書においてSEQ ID NO：76として組み入れられるGenBankアクセッション番号NM000875（図2Aおよび2B）、またはIGF-IR遺伝子配列の5'非翻訳配列であるM69229（SEQ ID NO：77））を用いて、IGF-IRヌクレオチド配列にハイブリダイズするヒトIGF-IRに対するプローブおよびプライマーを設計した。ヒトIGF-IRに関して、PCRプライマーは以下の通りであった：
フォワードプライマー：
0004753863.tif 000030
リバースプライマー：
0004753863.tif 000031
および
FAMが蛍光色素であり、TAMRAが消光色素であり、PCRプローブは
0004753863.tif 000032
であった。
ヒトGAPDHに関してPCRプライマーは以下の通りであった：
フォワードプライマー：
0004753863.tif 000033
リバースプライマー：
0004753863.tif 000034
およびJOEが蛍光色素であり、TAMRAが消光色素であり、PCRプローブは：
0004753863.tif 000035
であった。
【０１８０】
実施例14
IGF-IR mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処置の18時間後、細胞単層を冷PBSによって2回洗浄して、RNAZOL（商標）（テルテスト「B」インク（TEL-TEST"B" Inc.）、フレンズウッド、テキサス州）1 mlに溶解した。製造元の推奨するプロトコールに従って総RNAを調製した。総RNA 20μgを、MOPS緩衝液系（アムレスコインク（AMRESCO, Inc.）、ソロン、オハイオ州）を用いて、1.1％v/vホルムアルデヒドを含む1.2％w/vアガロースゲルを通しての電気泳動によって分画した。RNAを、ノーザン／サザン転写緩衝液システム（テルテスト「B」インク、フレンズウッド、テキサス州）を用いて一晩毛細管転写によって、ゲルからHYBOND（商標）-N＋ナイロンメンブレン（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に転写した。RNAの転写はUVの可視化によって確認した。STRATALINKER（商標）UVクロスリンカー2400（ストラタジーンインク（Stratagene, Inc.）、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いてメンブレンをUVクロスリンク剤によって固定した後、ストリンジェントな条件に関して製造元の説明書を用いて、QUICKHYB（商標）ハイブリダイゼーション溶液（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いてプロービングした。
【０１８１】
ヒトIGF-IRを検出するために、ヒトIGF-IRのフォワードプライマー
0004753863.tif 000036
およびヒトIGF-IRのリバースプライマー配列
0004753863.tif 000037
を用いて、PCRによってIGF-IR特異的プローブを調製した。ローディングおよび転写効率の変動を標準化するために、メンブレンを剥がして、ヒトグリセルアルデヒド-3-燐酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（クロンテック（Clontech）、パロアルト、カリフォルニア州）に関してプローブした。
【０１８２】
ハイブリダイズしたメンブレンを、PHOSPHORIMAGER（商標）およびIMAGEQUANT（商標）ソフトウェアV3.3（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics）、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて可視化して定量した。データは無処置対照におけるGAPDHレベルに対して標準化した。
【０１８３】
実施例15
ヒトIGF-IR発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、アクセッション番号NM000875（SEQ ID NO：76）およびM69229（SEQ ID NO：77）に記載される公表された配列を用いて、ヒトIGF-IR mRNAの異なる領域、または5'非翻訳領域を標的とする一連のアンチセンス化合物を設計した。化合物を表1に示す。「標的部位」は、それに対して化合物が結合する特定の標的配列上の第一（最も5'側の）のヌクレオチド番号を示す。表1における全ての化合物は、IGF-IRの5'非翻訳領域またはコード領域のいずれかのASOである。化合物を、本明細書における他の実施例に記述されるように（図3および表1を参照されたい）、定量的リアルタイムPCRによってヒトIGF-IR mRNAレベルに及ぼすその作用に関して分析した。データは実験3回からの平均値である。それぞれのデータポイントに関する陽性対照を表1において配列ID番号によって同定する。「N.D.」は、存在する場合、データなしを示す。
【０１８４】
表1に示すように、いくつかのリード化合物は、このアッセイにおいてIGF-IR発現の少なくとも何らかの阻害を示し、したがって好ましい。好ましいASOの例には、ASO
0004753863.tif 000038
が含まれる。これらの好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書において「好ましい標的セグメント」と呼ばれ、したがって、本発明の化合物によるターゲティングにとって好ましい。SEQ ID NO：137〜171は、IGF-IRにおいて同定された好ましい標的セグメントを表す。表1における「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初の（最も5'側の）ヌクレオチド番号を示す。
【０１８５】
これらの「好ましい標的セグメント」は、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションに対して開放され、アクセス可能であることが実験によって判明したことから、当業者は、単なる普通の実験を用いて、これらの好ましい標的セグメントと特異的にハイブリダイズしてその結果IGF-IRの発現を阻害する他の化合物を含む本発明のさらなる態様を認識または確認することができるであろう。
【０１８６】
本発明に従って、アンチセンス化合物には、標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズするアンチセンスオリゴマー化合物、ASO、リボザイム、外部誘導配列（EGS）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および他の短いオリゴマー化合物が含まれる。
【０１８７】
本実施例の目的は、乾癬の皮膚に局所適用後の、完全なホスホロチオエート2'-O-(2-メトキシ)エチルギャップマー（2' MOEギャップマー）またはC5-プロピニル-dU、dC-ホスホロチオエート（C5-プロピン）化学を有するASOの表皮局在を調べるためである。試験は、図1に示すようにエクスビボ乾癬皮膚外植体について行い、共焦点顕微鏡、直接蛍光、および免疫組織化学を用いてASO局在を検出した。これまでの研究において、FITC結合C5-プロピンASOは、乾癬皮膚に対する局所適用後、表皮の基底層に達することが示された（White et al.、Journal of Investigative Dermatology 118：1003〜1007、2002）。本実施例において、2' MOEギャップマーおよびC5プロピンASOはいずれも、5％w/vメチルセルロースまたはクリームのいずれかにおいて調製した場合に、乾癬皮膚生検の表皮に浸透することが判明した。いずれの化学のASOも、ASOの直接蛍光顕微鏡および免疫組織化学検出の双方によって評価したところ、上皮の基底層に蓄積するように思われた。FITC-ASOの局在は、非FITC ASOの局在と明白な差はなかった。
【０１８８】
ASOの局所適用
C5-プロピンASOは、おそらく乾癬（正常な皮膚には蓄積しない）における角質層の障壁機能の障害により、局所適用後ヒト乾癬皮膚の基底ケラチノサイトに蓄積することが示されている（White et al.、2002、上記）。さらに、ホスホロチオエートASOは、クリームに調製すると正常なヒト皮膚の基底ケラチノサイトに蓄積することが示された（Mehta et al.、J. Invest. Dermatol. 115：805〜812、2000）。ホスホロチオエート-ホスホジエステルハイブリッドASOの蒸留水溶液は、角質層を通過して表皮上層のケラチノサイトの細胞質に蓄積するように思われたにもかかわらず、ヒト皮膚への局所適用後基底ケラチノサイトに蓄積しなかった（Wingens et al.、Lab. Invest. 79：1415〜1424、1999）。
【０１８９】
本実施例は、局所適用後のヒト乾癬皮膚における2' MOEギャップマーASOの局在を調べた。
【０１９０】
オリゴヌクレオチド
用いたオリゴヌクレオチドを表4に記載する。
【０１９１】
（表４）局所適用試験において用いた四つのオリゴヌクレオチドの一覧
下線の部分は2' MOE化学を有する。
0004753863.tif 000039
【０１９２】
乾癬皮膚生検のコレクション
乾癬皮膚生検をボランティアから採取した。完全な厚みの8 mmまでの穿刺生検を、皮膚科医が各ボランティアから採取した。生検を採取した領域は、生検の採取前、清拭または消毒しなかった。生検は、ガーゼに直ちに載せて（PBSによって湿らせる）、使用するまで氷中で保存した（〜2時間）。
【０１９３】
採取時、生検における乾癬の重症度を、PASI（乾癬領域重症度指数）スコア（Fredriksson et al.、Dermatologica 157：238〜244、1978）のPRS（パラメータ採点尺度）成分を用いて採点した。簡単に説明すると、紅斑（発赤）、硬化、および落屑（剥落）をそれぞれ、0（なし）〜4（重度）まで採点して0〜12のPRSスコアを得た。
【０１９４】
生存標本の共焦点顕微鏡
FITC-ASOの適用後24時間目に、生検を培養皿から除去してスライドガラスに角質層を下にして載せて、露出した真皮にPBS 1滴を載せて湿らせた。次に生存標本の共焦点顕微鏡を既に記述されたとおりに実施した（White et al.、J. Invest. Dermatol. 112：887〜892、1999；White et al.、2002、上記）。要約すると、FITC-ASOの局所適用を488nmでの励起（アルゴンイオンレーザー）および515nmでの検出によって評価した。用いた機器は、オプティスキャンf900e共焦点系（オプティスキャン（Optiscan Pty）、メルボルン、オーストラリア）に接続したIX70オリンパス倒立顕微鏡（オリンパスオーストラリア（Olympus Australia）、メルボルン、オーストラリア）であった。
【０１９５】
共焦点顕微鏡によって、皮膚の表面に正面を向いた切片が得られ、それぞれの生検に関して、表皮までの深さを増加させながら一連の画像を撮影した。これまでの研究は、この方法を用いて表面下100μmまで蛍光を検出できることを示している。
【０１９６】
ケラチノサイトを含むFITC-ASOの表皮の位置を決定するために、White et al.（1999、上記）の基準を指針として用いた。これらの基準は以下の通りであった：
・細胞の形態
・核の存在および大きさ：
角質細胞無核
顆粒層のケラチノサイトの核＞15μm
基底ケラチノサイト＜10μm
・細胞の深さ（表面より少なくとも50μm下の基底ケラチノサイト）
【０１９７】
組織試料のプロセシング
共焦点顕微鏡後、生検全体を4％パラホルムアルデヒド（4℃）において24時間固定した後、0.5M蔗糖（4℃）において48時間固定した。次に、生検を段階的なエタノール（70％、80％、90％、および2×100％、それぞれ90分）に沈めた後、組織プロセッサー（シャンドンシタデル1000、シャンドンインク（Shandon Inc.）、ピッツバーグ、アメリカ）を用いてリモネンにおいて2×90分およびパラフィンロウ（65℃）において2×90分沈めた。処理後、生検をパラフィン（シャンドンヒストセンター2、シャンドンインク）に抱埋して必要となるまで室温で保存した。
【０１９８】
表皮を横切る厚さ5μmの切片を切断して（ライカRM2035ミクロトーム、ライカインストルメンツ（Leica Instruments）、ウェツラー、ドイツ）、これをシランコーティングスライドガラスに移し、37℃で一晩乾燥させた。切片を、乾癬の組織学的評価、直接蛍光または免疫組織化学のために処理するまで、室温の密封容器において保存した。
【０１９９】
乾癬の組織学的評価
それぞれの乾癬皮膚生検からの各切片（5μm）をリモネンに沈めて2×5分間ロウを除去した後、段階的エタノール（100％、90％、80％、70％、および50％）において連続して5分間洗浄した後、水において5分間洗浄した。次に、切片をハリスのヘマトキシリン（細胞核を青色に染色）およびエオジン（細胞質および他の組織構造をピンクに染色）によって染色してからエタノール（2×15秒）およびリモネン（2×15秒）において洗浄した。次に、切片をDPX封入培地（BDHラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）、プール、イギリス）と共にカバーガラスで覆った。
【０２００】
直接蛍光によるASOの検出
切片のロウを除去して、上記のように洗浄してから2.5％DABCO抗退色剤（シグマ（Sigma）、セントルイス、アメリカ）を含むMOWIOL封入培地（バイオサイエンシズインク（Biosciences Inc.）、ラホヤ、アメリカ）と共にカバーガラスで覆った。自己蛍光を補正するように画像の明度を調節した。自己蛍光は、ビヒクル（5％w/vメチルセルロースまたはクリーム）処置試料から発生した蛍光であると定義した。
【０２０１】
免疫組織化学によるASOの検出（2E1 Ab）
切片のロウを上記のように除去して、アイシスファーマシューティカルズ（Isis Pharmaceuticals）によって本発明者らに提供されたアフィニティ精製2E1-B5抗体（バークレーアンチボディカンパニー（Berkeley Antibody Company）、バークレー、アメリカ）を用いてASOを検出した。2E1-B5抗体は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおけるTGCおよびGCモチーフを認識するマウスIgG1である（Mehta et al.、2000、上記）。
【０２０２】
切片を1％v/v H2O2のメタノール溶液において30分間インキュベートして、内因性のペルオキシダーゼ活性を消失させて、PBSによって洗浄し、DAKO（登録商標）すぐに使用できるプロテイナーゼK（DAKOコーポレーション（DAKO Corporation）、カーペンテリア、アメリカ）において10分間インキュベートした。切片を1％w/v BSA/20μg/mlヒツジIgGのPBS溶液によって20分間ブロッキングしてから2E1一次抗体（1/4000希釈）と共に45分間インキュベートした。切片をPBSによって再度洗浄して、Vectastain（登録商標）エリートマウスABCキット（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）、バーリンゲーム、アメリカ）を用いて一次抗体を検出した。Vectastain（登録商標）エリートマウスABCキットは、二次ビオチニル化抗マウスIgGを用い、これを次にアビジンおよびビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体によって検出する。DABは抗体の局在が茶色の着色によって示されるように基質として用いた。
【０２０３】
画像の獲得
共焦点画像を例外として（この章において「生存標本の共焦点顕微鏡」を参照されたい）、画像は全て、ニコンE600顕微鏡（ニコンコーポレーション、東京、日本）に接続して、MCID M4撮像システム（イメージングリサーチインク（Imaging Research Inc.）、セントキャサリンズ、カナダ）によって制御するソニーDXC-950Pカラーデジタルカメラ（ソニー、東京、日本）を用いて獲得した。蛍光の励起は、ニコンHB-10103AF高圧水銀灯パワーサプライ（ニコンコーポレーション）によって提供して、適当な濾過フィルターを通して見た。
【０２０４】
乾癬皮膚生検の評価
乾癬皮膚を、ボランティアの腹部、太腿、背部、臀部、脛、肘、または股関節から採取した。各人から生検3個までを採取して、各人からの生検を異なる実験群に割付した。
【０２０５】
PRSを用いて決定した乾癬の重症度は、6.8±1.7（平均±SD、n＝42）、範囲3〜9であった。PRSは、実験群によって有意差がなかった（p＝0.9609、クラスカルワリスノンパラメトリックANOVA）。
【０２０６】
組織学試験において、生検の形態にかなりの変動を認めたものの生検は全て乾癬であるように思われた。乾癬の重症度の変動の他に、認められた変動は生検を採取した体の位置が異なることによる可能性がある。肥厚した基底ケラチノサイト層は、全ての生検において認められ、多くの（しかし全てではない）生検において、伸長した乳頭間隆起および角質層における細胞核（錯角化症）が明らかであった。浸潤白血球に類似の細胞をほとんどの生検の真皮に認めた。
【０２０７】
実施例16
ASOの局所適用
乾癬皮膚生検の基底ケラチノサイトにC5-プロピンASOが局在することを証明したWhite et al.（2002、上記）の結果を確認するため、および5％w/vメチルセルロースまたはクリームでの局所適用後の2' MOE ASOの分布を調べるために、以下のFITC結合ASOを適用して乾癬皮膚生検を分離した：
・0.1％w/w R451（C5-プロピン）の5％w/vメチルセルロース製剤；
・0.1％w/w ISIS 251741（2' MOE）の5％w/vメチルセルロース製剤；
・0.1％w/w ISIS 251741（2' MOE）のクリーム製剤。
【０２０８】
直接蛍光顕微鏡は、乾癬皮膚病変の表皮に2' MOEギャップマーASOおよびC5-プロピンASOの双方が存在することを示し、蛍光は基底ケラチノサイトの核に明らかに存在した。蛍光はまた、真皮に存在する浸潤白血球であるように思われる細胞の核にも認められうる。局所適用後の2' MOEギャップマーとC5-プロピンASOによって産生された蛍光のパターンに明らかな差を認めなかった。
【０２０９】
さらに、2' MOEギャップマーASOのクリーム製剤は、5％w/vメチルセルロースにおいて調製した2' MOEギャップマーASOに関して認められた分布と同等の表皮分布を示し、蛍光の表皮局在に差を認めなかった。
【０２１０】
これらの結果は生存標本の共焦点顕微鏡試験によって確認され、基底ケラチノサイトに関する基準（細胞核＜10 μmおよび表面下少なくとも50 μm）を満たす細胞の核にFITC-AONsが局在することが証明された。興味深いことに、ASOは、錯角化角膜細胞の核に存在するように思われる。この細胞は表皮表面に存在するが、顆粒層のケラチノサイトと角質細胞との中間体であるように思われる。場合によっては、これらのケラチノサイトは、その核からASOを排除するように思われる。正常な皮膚において予想されるよりかなり小さい核を有する顆粒層のケラチノサイト、または正常な皮膚において予想されるより表面にかなり近くに存在する基底ケラチノサイトのいずれかを示す、乾癬に一致した特徴が明らかに認められた。
【０２１１】
実施例17
クリームに調製した0.1％FITC-ASOスパイクを含む5％ASOの検出
より高いASO濃度を用いてもよい。したがって、全体で5％ASO製剤において0.1％スパイクとして含まれるFITC-ASOを、直接蛍光顕微鏡および／または共焦点顕微鏡によって検出できるか否かを決定することは有用である。非FITC 2' MOE ISIS13920（4.9％w/w）クリーム製剤と混合した2' MOE FITC-ASO ISIS 251741（0.1％w/w）を、この目的のために乾癬皮膚生検に適用した。
【０２１２】
0.1％FITC-ASOスパイクを含む5％2' MOEによって処理した試料からの直接蛍光および共焦点顕微鏡画像は、基底ケラチノサイトにおいて蛍光を示した。ASOの濃度を増加させても、FITC-ASOによって生じる蛍光の表皮局在は変化しないように思われ、局在は、0.1％FITC-ASO単独の適用後に認められた局在と類似であった。
【０２１３】
実施例18
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の基準値測定
IGF-IR mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、炎症および／または増殖障害を減少させるための有効な新規治療物質であると提唱されている。本実施例の目的は、15merC5-プロピニル-dU,dC-ホスホロチオエートASOであるDT1064（SEQ ID NO：78）に対する完全なホスホロチオエート「5-10-5」2' MOEギャップマー化学を有する好ましい三つのIGF-IR ASOの基準値を測定することである。DT1064における全てのCおよびUはC5プロピニル化を受ける。試験はヒトケラチノサイトトランスフェクション系において行い、IGF-IR mRNAおよびタンパク質レベル、ならびに細胞増殖をエンドポイントとした。これまでの研究において、DT1064は、この系において首尾よくIGF-IR発現を阻害した（Wraight et al.、2000、上記；Fogarty et al.、Antisense Nucleic Acid Drug Development 12：369〜377、2002）。
【０２１４】
結果は、三つのIGF-IR ASOがDT1064と同じ効力でIGF-IR mRNAを減少させることを示している。IGF-IRタンパク質レベルおよび細胞増殖速度も同様にASOによって減少した。
【０２１５】
これらの知見は、IGF-IR mRNAをノックダウンするために2' MOEギャップマー化学を用いることを支持する。本実施例に示された試験におけるその成績に基づき、ASO 175317は治療試験にとって特に有用な一つの2' MOEギャップマーASOである。
【０２１６】
2' MOEギャップマー
三つの「5-10-5」、2' MOEギャップマー、ホスホロチオエートリードは、リアルタイムPCRによって評価したところ、A549細胞（ヒト肺上皮細胞）においてIGF-IR mRNAの濃度依存的な阻害を示した（図3）。三つのリードを、ヒトケラチノサイト皮膚細胞トランスフェクション系における活性に関して評価した。
【０２１７】
2' MOEギャップマーのインビトロ基準値測定
三つのリードASOを以下のエンドポイントによってDT1064に対してインビトロで「基準値測定」を行った：
1．リアルタイムPCRによって評価した総IGF-IR mRNA；
2．イムノブロットによって決定した総細胞IGF-IRタンパク質；
3．アミドブラック色素結合によってアッセイしたHaCaTケラチノサイト細胞増殖速度。
【０２１８】
オリゴヌクレオチド
本試験において用いたオリゴヌクレオチドを表2に示す。
【０２１９】
（表２）インビトロ試験に用いたオリゴヌクレオチド7個の一覧
ASOのヌクレオチド配列は図3に示す。
0004753863.tif 000040
【０２２０】
細胞培養
自発的に不死化したヒトケラチノサイト細胞株であるHaCaT（Boukamp et al.、1988、上記）を本試験に用いた。細胞を、10％w/v仔ウシ胎児血清（FCS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において37℃で5％v/v CO2の大気中で単層培養として維持した。
【０２２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるケラチノサイトのトランスフェクション
HaCaTケラチノサイト（継代回数44〜47回）を96ウェル（リアルタイムPCR）、24ウェル（細胞増殖）、または12ウェル（イムノブロットまたはアポトーシス）プレートのウェルに播種した。85〜95％コンフルエント細胞をリポソーム調製物、サイトフェクチンGSV（GSV；グレンリサーチ（Glen Research）、スターリング、バージニア州、アメリカ）単独によって、またはアンチセンスもしくは対照オリゴヌクレオチドと複合体を形成して処置した。無処置細胞も同様に試験した（無処置対照）。アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドはそれぞれ、無血清DMEMにおいて20倍に希釈して望ましい最終濃度を得て、GSV（40μg/ml）の等量と混合した。脂質／オリゴヌクレオチド混合物を室温で10分間複合体を形成させた後、10％w/v FCSを含むDMEMによって10倍希釈した。細胞に、最終濃度6.25、25、100、または400nMオリゴヌクレオチドおよび2μg/ml GSVをトランスフェクトさせた。トランスフェクションは1試料あたりウェル2個ずつ行い、無処置およびGSV処置細胞はウェル4個ずつ行った。
【０２２２】
IGF-IR mRNAレベル
総RNAをRNEASY（登録商標）ミニキット（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて抽出し、0.5〜1μgをGeneAmp（登録商標）RNA PCRキット（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて、製造元の説明書に従って逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、GSV単独によって処置した細胞と比較して試料中のIGF-I受容体mRNAの量を決定した。プライマーおよびTaqMan（登録商標）蛍光プローブを含む、ヒトIGF-I受容体（アプライドバイオシステムズ、製品番号4319442F）および18S（製品番号4319413E）に関する予め展開させた試薬を複合PCR反応において用いて、各試料における双方の産物を同時に増幅した。ABI Prism（商標）7700配列検出器（アプライドバイオシステムズ）を分析に用いた。次に、IGF-IR mRNAレベルを18Sに対して標準化した。二つのトランスフェクションプロトコールを用いた、すなわち細胞を、（1）RNA抽出の18時間前に1回トランスフェクトした、または（2）RNA抽出の24時間および48時間前に計2回トランスフェクトした。
【０２２３】
IGF-IRタンパク質レベル
24時間毎に3日間オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした後、細胞単層をPBSによって洗浄し、50 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、10％v/vグリセロール、1％v/vトリトンX-100、100ug/mlアプロチニンを含む緩衝液において溶解した。溶解物の総蛋白質濃度を、タンパク質標準物質としてBSAを用いるBCAタンパク質アッセイキット（ピアス（Pierce）；ロックフォード、イリノイ州、アメリカ）によってアッセイした。各溶解物25または30 μgをSDS-PAGE（7％w/vアクリルアミド）によって分離した後、イモビロン-Pメンブレン（ミリポア（Millipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）にブロッティングした。非特異的結合部位を5％w/vスキムミルク粉末によってブロックした後、フィルターをIGF-IRタンパク質のβ-サブユニットを認識するウサギポリクローナルIgG（C-20；サンタクルズバイオテクノロジーインク（Santa Cruz Biotechnology Inc.）、サンタクルズ、カリフォルニア州、アメリカ）によってプロービングした。IGF-IR特異的シグナルをECFウェスタンブロッティングキット（アマシャム、バッキンガムシャー、イングランド、イギリス）を用いて展開し、化学蛍光および燐画像走査による検出の後にImageQuantソフトウェア（モレキュラーダイナミクス、サニーベール、カリフォルニア州、アメリカ）による定量を行った。フィルター間変動は、GSV単独で処置した細胞の平均シグナルに対してシグナル強度を標準化することによって制御した。
【０２２４】
細胞増殖アッセイ
細胞を、24ウェルプレートにおいて40％コンフルエンスまで増殖させて、24時間毎に3日間トランスフェクトした。アミドブラックの細胞タンパク質（分光光度法によって定量する）に対する結合が細胞数に相関する、アミドブラック結合プロトコール（Schultz et al.、J. Immunol. Methods 167：1〜13、1994）を用いて、細胞数を0、24、48、および72時間目に決定した。簡単に説明すると、細胞単層を1％v/vグルタルアルデヒドのPBS溶液によって固定した後、0.1％w/vアミドブラックの酢酸ナトリウム溶液pH 3.5によって30分間染色した。酸性のH2Oにおいて1回洗浄後、タンパク質結合色素をNaOH（50 mM）によって溶出して、溶出液の吸光度を620 nmでモニターした。データは0時間でのGSV-処置細胞に関して決定したシグナルに対して表記する。
【０２２５】
IGF-IR mRNA
図4は、C5-プロピンまたは2' MOEギャップマーによって処置したHaCaTケラチノサイトに関するIGF-IRリアルタイムPCRデータを示す。結果は、細胞を1回（図4A）または2回（図4B）トランスフェクトしたか否かによらず、類似であった。IGF-IR mRNAレベルはDT1064をトランスフェクトした細胞ではより低く、RNアーゼ保護アッセイを用いて先に報告されたレベルと一致した[Fogarty et al.、2002、上記]。三つのリードASOはまた全て、IGF-IR mRNAのノックダウンを引き起こした。さらに、IGF-IR mRNAのノックダウンは、三つのASOリードおよびDT1064に関して類似であった。例えば、図4Aにおいて、100nM ASOでは、mRNAの減少の平均値は、ASO 175314、ASO 175317、ASO 175323、およびDT1064に関してそれぞれ68％、77％、75％、および78％であった。
【０２２６】
IGF-IRタンパク質
図5Aは、C5プロピンまたは2' MOEギャップマーをトランスフェクトしたHaCaT細胞の代表的なIGF-I受容体ウェスタンイムノブロットを示す。IGF-IRタンパク質（β鎖）は、分子量110kDの単一のバンドとして現れる。
【０２２７】
三つの異なる実験からのバンドの強度（GSV単独によって処置した細胞と比較して表記）を合わせて図5Bに示す。データは、DT1064が、既に示されたようにIGF-IRタンパク質のレベルを強く抑制したことを示す（Fogarty et al.、2002、上記）。GSV単独によって処置した細胞と比較して、三つのリードASOは全て、25 nMおよび100nMでIGF-IRタンパク質を有意に減少させた（P＜0.01）。ISIS 175317およびISIS 175323は、400nM濃度でIGF-IRタンパク質をノックダウンしたが、ISIS 175314はノックダウンしなかった（P＜0.01）。ISIS 175317またはISIS 175323では最低濃度6.25nMでIGF-IRタンパク質の有意なノックダウンを示さなかった。
【０２２８】
GSV対照と比較して、HaCaT細胞のDT1064によるトランスフェクションにより、細胞を100 nM濃度で処置した場合に75％の見かけの最大減少を認めたが、ISIS 175317によるIGF-IRタンパク質レベルは約60％であった。ASOのそれぞれに関連したIGF-IRタンパク質のノックダウンは、その適当な対照の百分率として表記する。このことは、ASOが標的タンパク質をノックダウンする能力がDT1064の能力と同等であることを示している（表3を参照されたい）。
【０２２９】
（表３）同じ濃度の同じ化学の対照オリゴヌクレオチドの百分率として表記したASOのIGF-IRタンパク質ノックダウン
0004753863.tif 000041
*P＜0.5、**P＜0.01、***P＜0.001、同じ化学および用量のオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHaCaT細胞におけるIGF-IRタンパク質に対して；テュキー検定。
【０２３０】
細胞増殖
IGF-IR特異的ASOおよび対照オリゴヌクレオチドのHaCaT増殖に及ぼす効果を図6に示す。無処置細胞の場合、ケラチノサイト細胞数は、3日間のあいだに4倍より多く増加した。GSV-処置細胞も同様に数が増加したが、無処置細胞と同程度ではなく（72時間で無処置細胞の64％）、増殖速度に対して脂質が何らかの作用を有することを示唆した。無処置およびGSV処置細胞と比較して、オリゴヌクレオチドを処置した細胞は全て3日間にわたってより低い細胞増殖速度を示し、DT1064処置細胞では、全ての時点およびオリゴヌクレオチドの全ての濃度で細胞増殖速度が最も低かった。調べたASOの中で、ISIS 175317に関して最低の細胞増殖速度に関連した傾向を認め、これは濃度400 nMでは最も顕著であった。
【０２３１】
三つのIGF-ORリードASOは、MCRIでHaCaTケラチノサイトトランスフェクション系において調べられている。主な知見は以下の通りである：
・  三つのASOリードは全て、GSV対照および2' MOEギャップマーランダムオリゴヌクレオチドと比較してIGF-IR mRNAレベルを減少させた。DT1064と比較して、ASOリードは、IGF-IR mRNAに類似の減少を示した。
・  三つのASOリードは全て、GSV対照および2' MOEランダムオリゴヌクレオチドと比較してIGF-IRタンパク質を有意に減少させた。ASOリードはIGF-IRタンパク質レベルを減少させた。しかし、対照オリゴヌクレオチドと比較したノックダウンの百分率として表記した場合、ASOリードの作用はDT1064の作用と類似であった。
・  三つのASOリードは全て、GSV対照と比較して細胞増殖速度を減少させた。
【０２３２】
乾癬皮膚生検のエクスビボ維持
生検はこれまでに記述されているように（Russo et al.、Endocrinology 135：1437〜1446、1994；White et al.、2002、上記）24時間維持した。簡単に説明すると、皮下脂肪を生検から切除して、それらを三角形のステンレススチールメッシュの中央に形成されたBACTO（商標）アガープラグ（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、フランクリンレークス、アメリカ）の上に真皮を下にして置いた。スチールメッシュは、アガープラグが中心ウェル上に懸垂するように60 mm FALCON（登録商標）中心ウェル組織培養皿（ベクトン・ディッキンソン）の中心ウェルに適合するように設計された。中心ウェルに、アガープラグのレベルまでダルベッコ改変イーグル培地（10％w/v仔ウシ胎児血清、50IU/mlペニシリン、50ug/mlストレプトマイシンを含む）を満たして、湿度を維持するために外側のウェルにPBSを満たした。生検を5％v/v CO2大気中で37℃でインキュベートした。図1は、組織装置の配置を示す。
【０２３３】
実施例19
ASOを検出するための直接蛍光顕微鏡および免疫組織化学の比較
2' MOE FITC-ASO ISIS 251741を、5％w/vメチルセルロースにおいて0.1％w/wで調製して、乾癬皮膚生検に局所適用した。直接蛍光および2E1抗体による免疫組織化学はいずれもISIS 251741を検出することができる。この特徴によって、二つの検出技術によって決定した場合、隣接する切片を用いてASOの局在を直接比較することが可能であった。
【０２３４】
いずれの検出法も、顕著に類似のASO分布を示す。いずれの方法も基底ケラチノサイトにおいてASOの蓄積を示し、顆粒層のほとんどのケラチノサイトの核からASOは排除され、真皮に存在する浸潤白血球であるように思われる細胞の核にASOが存在することを示している。角質層におけるASOの蓄積は双方の検出法を用いて明らかである。
【０２３５】
これらの結果は、直接蛍光および免疫組織化学がいずれも、皮膚におけるASOの検出にとって実行可能な方法であることを示しているが、いずれの方法もその長所と短所とを有する。皮膚切片をプロテイナーゼK（免疫組織化学の前に必要である）によって消化すると、しばしば組織形態の分解が起こる。ASOの免疫組織化学検出はまた、特定の化学（ホスホロチオエート）およびヌクレオチド配列（TGCまたはGCモチーフ）のASOに限定されるが、如何なるASOもFITCに結合させることができる。さらに、ASOの免疫組織化学検出は、直接蛍光によるASOの検出より変動が大きいように思われる。しかし、免疫組織化学染色切片は、蛍光切片より長期間、保存および参照することができるが、時間と共に退色する。さらに、ASOの物理化学的特性に及ぼすFITC結合の影響に関するデータが欠落している。
【０２３６】
実施例20
局所適用後のASOの表皮局在に及ぼすFITC結合の影響
ASOに結合させたFITCタグが局所適用後のASOの表皮局在を変化させるか否かを調べるために、非FITC-ASO 13920（免疫組織化学では検出できるが直接蛍光では検出できない）およびFITC-ASO ISIS 147979（直接蛍光によって検出できるが、免疫組織化学では検出できない）を含むASO混合物によって処置した。この混合物を処置した組織からの連続切片を比較すると、二つのASOの局在に明らかな差を示さなかった。このデータは、乾癬皮膚生検において、ASO上のFITCタグが表皮の局在を変化させないことを示している。
【０２３７】
FITC-ASOがISIS 13920の表皮局在に影響を及ぼす可能性に関して制御するために、生検を0.1％w/v ISIS 13920単独によって処置した。認められうるように、ISIS 13920の免疫組織化学検出は、ISIS 147979と混合したASO 13920について認められる場合と明らかに差がないASO分布パターンを示している。
【０２３８】
乾癬皮膚病変の表皮における局所適用した2' MOE ASOの局在を調べて、C5-プロピンASOと比較した。主な知見は以下の通りである：
・  5％w/vメチルセルロースまたはクリーム製剤として局所適用した2' MOEギャップマーASOは、乾癬皮膚病変の角質層を通過することができた。ASOは表皮における基底ケラチノサイト、および真皮の浸潤白血球の核に存在した。
・  局所適用後の表皮局在は、2' MOEギャップマーとC5-プロピンASOとのあいだで差がないように思われる。
・  局所適用後、2' MOEギャップマーASOは、直接蛍光顕微鏡（FITC結合ASOのみ）と2E1 Abによる免疫組織化学の双方によって基底ケラチノサイトの核において検出することができる。
・  ASOにFITCを結合させても、局所適用後の基底ケラチノサイトにASOが達する能力またはその表皮局在は変化しないように思われる。
【０２３９】
実施例21
医薬品製剤
凍結乾燥ASOを滅菌蒸留水に再懸濁して、ASOの濃度を260nmでのその吸光度によって決定した後、5％w/vメチルセルロースゲルまたはクリーム（アイシスファーマシューティカルズ（Isis Pharmaceuticals））のいずれかにおいて調製した。クリームは以下を含んだ：
・  ミリスチン酸イソプロピル（10％w/w）
・  モノステアリン酸グリセリル（10％w/w）
・  ステアリン酸ポリオキシル40（15％w/w）
・  ヒドロキシプロピルメチルセルロース（0.5％w/w）
・  燐酸二水素ナトリウム一水化物（0.3％w/w）
・  燐酸水素ナトリウム七水化物（0.9％w/w）
・  フェノキシエタノール（2.5％w/w）
・  メチルパラベン（0.5％w/w）
・  プロピルパラベン（0.5％w/w）
・  精製水（59.8％w/w）
【０２４０】
5％w/vメチルセルロース製剤の場合、10％w/vメチルセルロース（PBS溶液）を、所望の最終濃度の2倍のASOを含むPBSによって2倍希釈した。
【０２４１】
クリーム製剤の場合、ASOを乾燥させて（DNAミニ真空乾燥器、メドスカンパニー（Medos company）、メルボルン、オーストラリア）、適当量のクリームに溶解して所望の最終濃度を得た。
【０２４２】
実施例22
薬剤の適用
生検を37℃に移した30分後、ASOまたはビヒクル（30 mg）を計り取って、小さいスパテラでこれを生検の直径約4 mmの中心領域に直接適用した。生検の辺縁部周辺の薄いリングは、試料の露出した辺縁部にASOを適用しないように、ASOまたはビヒクルに接触しないように維持した。このように注意したにもかかわらず、直接蛍光顕微鏡によって評価したところ、生検の約20％において、ASOは生検の辺縁に接触しているように思われた。
【０２４３】
実施例23
実験群
本実施例の目的に従って、ASO製剤を、異なる人からの少なくとも四つの生検に適用した。用いたASO製剤および対照は以下の通りであった：
・0.1％w/w R451の5％メチルセルロース製剤
・0.1％w/w ISIS 251741の5％w/vメチルセルロース製剤
・0.1％w/w ISIS 251741のクリーム製剤
・4.9％w/w ASO 13920と混合した0.1％w/w ISIS 251741のクリーム製剤
・0.1％w/w ISIS 13920の5％w/vメチルセルロース製剤
・0.1％w/w ASO 13920と混合した0.1％w/w ISIS 147979の5％v/vメチルセルロース製剤
・0.1％w/w ISIS 147979の5％w/vメチルセルロース製剤
・5％w/vメチルセルロース単独
・クリーム単独
【０２４４】
実施例24
ISIS 175317およびDT1064の基準値測定
本実施例は、HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IR ASO（ISIS 175317）およびDT1064に対する一次スクリーニングにおいて同定されたヒトIGF-IRの基準値測定を示す。
【０２４５】
IGF-IR mRNAレベルは、HaCaTケラチノサイトをIGF-IR ASOおよび対照オリゴヌクレオチドによって一晩トランスフェクトした後、リアルタイムPCRによって測定した。結果は、四つの新規リードと共にISIS 175317およびDT1064が、IGF-IR mRNAレベルを濃度依存的および配列特異的に強力に阻害したことを示している。トランスフェクション試薬単独で処置したHaCaT細胞と比較して、最近同定された四つのIGF-IR ASOはいずれもISIS 175317ほど大きい強度または効力でIGF-IR mRNAレベルを抑制しなかった。
【０２４６】
オリゴヌクレオチド
（表５）インビトロ試験に用いたオリゴヌクレオチドの一覧
0004753863.tif 000042
【０２４７】
各オリゴヌクレオチドの濃度は使用前に260 nmでのUV吸光度によって確認した。
【０２４８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるケラチノサイトのトランスフェクション
HaCaTケラチノサイトを、10％v/v仔ウシ胎児血清（FCS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において5％v/v CO2／95％v/v O2の大気中で単層培養として維持した。
【０２４９】
HaCaTケラチノサイト[継代回数62回および63回（図8）、ならびに45回（図10）]を96ウェルプレートのウェルに播種した。85〜95％コンフルエント細胞をリポソーム調製物、サイトフェクチンGSV単独によって、またはアンチセンスもしくは対照オリゴヌクレオチドと複合体を形成して20時間処置した。無処置細胞も同様に調べた（無処置対照）。無血清DMEMにおけるそれぞれのアンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（最終濃度の20倍）を、等量のGSV（最終濃度の20倍；40 μg/ml）と混合した。脂質／オリゴヌクレオチド混合物を室温で10〜15分間複合体を形成させた後、10％v/v FCSを含むDMEMによって10倍希釈した。細胞にオリゴヌクレオチド（最終濃度範囲、0.4〜200 nM）および2 μg/ml GSVをトランスフェクトした。トランスフェクションは、1試料あたり2ウェルずつ行い、無処置およびGSV-処置細胞はそれぞれ、4ウェルおよび6ウェルずつ行った。
【０２５０】
IGF-I受容体mRNAレベル
RNeasy（登録商標）ミニキット（キアゲンインク（Qiagen Inc.）、バレンシア、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて総RNAを抽出し、約0.1〜0.2 μgをGeneAmp（登録商標）RNA PCRキット（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて製造元の説明書に従って逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、サイトフェクチンGSV単独を処置した細胞と比較して試料中のIGF-I受容体mRNAの量を決定した。プライマーおよびTaqMan（登録商標）蛍光プローブを含む、ヒトIGF-I受容体（アプライドバイオシステムズ製品番号4319442F）および18SリボソームRNA（製品番号4319413E）に関する予め展開した試薬を、多重PCR反応において用いて、それぞれの試料における双方の産物を同時に増幅した。ABI Prism（商標）7700配列検出器（アプライドバイオシステムズ）を分析のために用いた。次に、IGF-I受容体mRNAレベルを、18SリボソームRNAに対して標準化した。
【０２５１】
生物学的作用
IGF-IR mRNAレベルに及ぼすアンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドの効果を最初に、6、13、25、50、100、および200 nMの濃度で調べた。これらの濃度は、HaCaTケラチノサイトにおいて2' MOEギャップマーを用いたこれまでのインビトロ基準値測定実験とのデータの比較が可能となる範囲を含むことから選択した。
【０２５２】
図8は、HaCaTケラチノサイトを2' MOEギャップマー
0004753863.tif 000043
またはC5-プロピンオリゴヌクレオチド（DT1064または6416）をトランスフェクトした二つの実験のIGF-I受容体mRNAレベルを示す。GSV処置細胞と比較して、2' MOEギャップマーASOは5個全てがIGF-IR mRNAレベルを抑制した（図9）。最大の標的ノックダウンは、それぞれの2' MOE ASOに関して類似であった（範囲71〜77％）。表6は、IGF-IR ASOリードの最大の有効性を示す。
【０２５３】
対照的に、二つの2' MOEギャップマー対照オリゴヌクレオチド（ISIS 129691およびISIS 306064）のIGF-IR mRNAレベルは、GSV処置細胞のレベルと類似であり、IGF-IR mRNAレベルに及ぼす2' MOEギャップマーASOの影響が配列特異的であることを示した（図8）。IGF-IR抑制に及ぼすDT1064の影響は100 nMで77％で最大であった。しかし、HaCaT細胞にC5-プロピンミスマッチ対照オリゴヌクレオチド（6416）をトランスフェクトしても、同じ濃度でIGF-IR mRNAレベルを46％まで抑制した。このことはこれまでのデータと一致する。
【０２５４】
IGF-IR mRNAレベルの最大またはほぼ最大の抑制は、濃度範囲25〜200 nMのASOに関して認められたことから、2' MOE ASO 5個の有効性を区別することは困難であった。したがって、より低い濃度でその効果を調べることを決定した。
【０２５５】
（表６）ISIS  IGF-IR  ASOリードの最大効力
0004753863.tif 000044
図2に報告されている、最大効力IGF-IR mRNAレベル（サイトフェクチンGSV処理細胞の％）から算出。
【０２５６】
図10は、HaCaT細胞を0.4、1.6、3、6、25、または100 nMのオリゴヌクレオチドによって処置した1回の実験からのIGF-IR mRNAレベルを示す。より高い濃度で行った先の実験では、2' MOE ASOは5個全てがIGF-IR mRNAレベルを特異的に抑制し、類似の効力で抑制した。IGF-IR mRNAレベルの最大阻害はISIS 175317に関して87％であり、最近同定された2' MOEギャップマーASO（GSVの79〜85％の範囲）の阻害と類似であった。ASO治療に対する反応は、この範囲において濃度依存的であった。HaCaTケラチノサイトを25 nM DT1064によって処置すると、IGF-IR mRNAレベルを81％抑制し、2' MOEギャップマーASOと類似であった。
【０２５７】
図11は、IGF-IR標的化2' MOE ASOに関する濃度反応曲線を示す（図10と同じデータ）。ISIS 323767をおそらく例外として、これらのデータはISIS 175317および2' MOEギャップマーが類似の強度であることを示している。これは、濃度反応曲線から計算し、表7に示されるEC50に反映される。DT1064のEC50は3.2 nM（C.I. 2.1〜4.7）であった。表7に示したEC50値は、1回の実験から計算し、単なる推定値として示されることに注目することは重要である。ASOに関するEC50に関してより正確な推定値を得るためには、さらなる濃度反応曲線が必要であろう。
【０２５８】
（表７）HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IR mRNAレベルの2' MORギャップマーASO抑制に関するEC50の平均値（95％信頼区間）
0004753863.tif 000045
【０２５９】
本明細書において報告した濃度反応実験を、より高い濃度範囲で2回行ったところ、最大効率に差を示さなかった（表6）。濃度反応実験はより低い濃度範囲で1回行った。調べた全ての濃度（0.4〜200 nM）にわたって、本実施例において用いた四つのリードはいずれも、HaCaTケラチノサイトにおいてISIS 175317より大きいIGF-IR mRNAノックダウンを示さないように思われた（図9および11）。濃度反応曲線を調べると、EC50によって評価した効力はISIS 175317と四つのリードのあいだで類似であることが示された（図11）。
【０２６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本実施例において用いたIGF-IR ASOの詳細を表5に提供する。下線で示したヌクレオチドは2' MOE改変である。シトシン塩基は全てメチル化されている。
【０２６１】
（表５）IGF-IR ASO
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【０２６２】
ISIS 175317（SEQ ID NO：125）は、アイシス・ファーマシューティカルズ、カリフォルニア州、アメリカによって研究等級の品質に製造された。
【０２６３】
乾癬皮膚生検のコレクション
乾癬皮膚生検を倫理的な条件（王立こども病院ヒト研究倫理委員会のプロトコール22023A、メルボルン、オーストラリア）でボランティア11人から採取した。完全な厚みの8 mm穿孔生検3個を各被験者の同じ病変から皮膚科医が採取した。生検を採取した領域は、生検採取の前に清拭または消毒しなかった。生検は直ちにガーゼ（PBSによって湿らせた）に載せて、使用するまで氷中で保存した（2時間まで）。採取時、生検における乾癬の重症度を、PASI（乾癬領域重症度指数）スコア（Fredriksson et al.、1978、上記）のPRS（パラメータ採点尺度）成分を用いて採点した。簡単に説明すると、紅斑（発咳）、硬化（腫脹）、および落屑（剥落）をそれぞれ、0（なし）から4（重度）まで採点して0〜12のPRSスコアを得た。
【０２６４】
乾癬皮膚生検のエクスビボ維持
生検は既に記述されているように24時間維持した（Russo et al.、1994、上記；White et al.、2002、上記）。簡単に説明すると、皮下脂肪を生検から切除して、それらを三角形のステンレススチールメッシュの中央に形成されたBACTO（商標）アガープラグ（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、フランクリンレークス、アメリカ）の上に真皮を下にして置いた。スチールメッシュは、アガープラグが中心ウェル上に懸垂するように60mm FALCON（登録商標）中心ウェル組織培養皿（ベクトン・ディッキンソン）の中心ウェルに適合するように設計された。中心ウェルに、アガープラグのレベルまでダルベッコ改変イーグル培地（10％v/v仔ウシ胎児血清、50IU/mlペニシリン、50ug/mlストレプトマイシンを含む）を満たして、湿度を維持するために外側のウェルにPBSを満たした。生検を5％v/v CO2大気中で37℃でインキュベートした。組織装置の配置を図1に示す。
【０２６５】
製剤
凍結乾燥ISIS 175317（SEQ ID NO：125）を滅菌蒸留水に再浮遊させて溶液の濃度を260 nmでの吸光度によって決定した。クリーム製剤の場合、ASOを乾燥させた後（DNAミニ真空乾燥器、メドスカンパニー、メルボルン、オーストラリア）、適当量のクリーム（アイシス・ファーマシューティカルズ、アメリカ）に溶解して最終濃度10％w/wを得た。クリームは以下を含んだ：
・  ミリスチン酸イソプロピル（10％w/w）
・  フェノキシエタノール（2.5％w/w）
・  モノステアリン酸グリセリル（10％w/w）
・  メチルパラベン（0.5％w/w）
・  ステアリン酸ポリオキシル40（15％w/w）
・  プロピルパラベン（0.5％w/w）
・  ヒドロキシプロピルメチルセルロース（0.5％w/w）
・  精製水（59.8％w/w）
・  燐酸二水素ナトリウム一水化物（0.3％w/w）
・  燐酸水素ナトリウム七水化物（0.9％w/w）
【０２６６】
薬物の適用
生検を37℃に移した30分後、予め重量を測定した薬物またはビヒクル30mgを、小さいスパテラで各生検の直径約4mmの中心領域に直接適用した。試料の露出した辺縁部にクリームが触れないように、生検の辺縁部周辺の薄いリングをISIS 175317（SEQ ID NO：125）またはビヒクルに接触しないように維持した。このようにして適用したFITC ASOを用いた本研究所での先の実験では、生検の約20％において、ASOが生検の辺縁に接触していることが示された。
【０２６７】
実験群
各ボランティアから生検3個を採取した。生検の一つをビヒクル（アイシスクリーム）によって処置し、他の二つを10％ISIS 175317（SEQ ID NO：125）のクリーム製剤によって処置した。この処置療法によって、データの対応のある比較（二つのISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検に対応させたビヒクル処置生検）が可能となり、IGF-IR mRNAレベルにおける被験者間の変動によって引き起こされる可能性がある交絡効果を制御することが可能となる。各患者から二つの生検をISIS 175317（SEQ ID NO：125）によって処置すると、如何なる薬物効果も検出される可能性が増加した。
【０２６８】
真皮から表皮の分離
治療期間終了時（24時間）、組織試料を0.5 M EDTA（pH 7.4）において60℃で90秒間インキュベートして、表皮-真皮接合部を破壊して、鈍器による解剖により表皮と真皮とを分離した（Dusserre et al.、1992、上記）。分離した表皮と真皮を液体窒素において瞬間凍結して、RNAを抽出するまで-70℃で保存した。
【０２６９】
リアルタイムPCRによるIGF-IR mRNAレベルの測定
組織を、液体窒素において冷却しておいたステンレススチール製の乳鉢と乳棒において機械的に粉砕した。総RNAをRNeasy（登録商標）ミニキット（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて抽出した。総RNA（100〜700 ng）をGeneAmp RNA PCRキット（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて、製造元の説明書に従って逆転写した。開始RNAの量を、各組の生検に関して可能な限り厳密にマッチさせて、試料は全て同じ反応において逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、18S RNAに対する生検中のIGF-IR mRNA量を決定した。プライマーおよびTaqMan（登録商標）蛍光プローブを含む、ヒトIGF-IR（アプライドバイオシステムズ、製品番号4319442F）および18S（製品番号4319413E）に関する予め展開させた試薬を複合PCR反応において用いて、各試料における双方の産物を同時に増幅した。各試料を2個ずつアッセイした。ABI Prism 7700配列検出器（アプライドバイオシステムズ）を分析に用いた。IGF-IR mRNAレベルを18Sに対して標準化した。
【０２７０】
統計分析
統計分析に関して、各個体からの生検を組にした。各ビヒクル処置生検を、二つのISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検の平均値に対して対応させた。ISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置およびビヒクル処置生検におけるIGF-IR mRNAレベルを比較するために、パラメトリック対応t-検定を用いた。この試験は、基礎集団がガウス分布を有することを仮定する。これらのデータは、改変コルモゴロフ-スミルノフ試験（Dallal et al.、1986、上記）によって評価した場合に、サンプリングがガウス分布を有する集団からのものである場合、その期待値と有意差を示さなかった（P＞0.1）。さらに、ビヒクルとISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検のあいだのIGF-IR mRNAレベルの差のドットプロットは、ガウス分布集団からのものであるように思われた。他の全ての比較に関して、ノンパラメトリックウィルコクソンのマッチさせた対応のある検定を用いた。この試験は、基礎となる集団分布に関して仮定を行わない。統計分析は、ウィンドウズ用グラフパッドプリズムバージョン3.00（グラフパッドソフトウェア（GraphPad Software）、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて行った。データは全て平均値±1標準偏差として表記する。
【０２７１】
リアルタイムPCRによるIGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体（IR）、カスパーゼ3＆Bax mRNAレベルの測定
組織を、液体窒素において冷却しておいたステンレススチール製の乳鉢と乳棒において機械的に粉砕した。総RNAをRNeasy（登録商標）ミニキット（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて抽出した。総RNA（100〜700 ng）をGeneAmp（登録商標） RNA PCRキット（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて、製造元の説明書に従って逆転写した。開始RNAの量を、各組の生検に関して可能な限り厳密にマッチさせて、試料は全て同じ反応において逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、生検におけるIGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体（IR）、カスパーゼ3＆Bax mRNAの量を18S RNAと比較して決定した。上記の遺伝子に対する予め展開させた試薬（アプライドバイオシステムズ、製品番号#4319442F（IGF-IR）、#433764F（GAPDH）、#4333768F（HPRT）、#4318283F（Bax）およびアプライドバイオシステムズ「アッセイオンデマンド」アッセイID # Hs00263337_ml（カスパーゼ3）および# Hs00169631_ml（インスリン受容体））をそれぞれ多重PCR反応において、18Sに関する予め展開させた試薬（アプライドバイオシステムズ、製品番号4319413E）と共に個々に用いた。これらの予め展開させた試薬はプライマーおよびTaqMan（登録商標）、蛍光プローブを含み、多重PCR反応において用いる場合、各試料における標的遺伝子（IGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体（IR）、カスパーゼ3、またはBax）および18Sを同時に増幅した。各試料を1試料あたり2個ずつアッセイした。ABI Prism（商標）7700配列検出器（アプライドバイオシステムズ）を分析に用いた。IGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体（IR）、カスパーゼ3、およびBax mRNAレベルを18Sに対して標準化した。
【０２７２】
統計分析
統計分析に関して、各個体からの生検を組にした。各ビヒクル処置生検を、二つのISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検の平均値に対して対応させた。
【０２７３】
ISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置およびビヒクル処置生検における対象mRNAレベルを比較するために、パラメトリック対応のあるt-検定を用いた。この試験は、基礎集団がガウス分布を有することを仮定する。これらのデータは、改変コルモゴロフ-スミルノフ試験（Dallal et al.、1986、上記）によって評価した場合に、サンプリングがガウス分布を有する集団からのものである場合、その期待値と有意差を示さなかった（P＞0.1）。さらに、ビヒクルとISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検のあいだの対象mRNAレベルの遺伝子における差のドットプロットは、ガウス分布集団からのものであるように思われた。
【０２７４】
統計分析は、ウィンドウズ用グラフパッドプリズムバージョン3.00（グラフパッドソフトウェア、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて行った。データは全て平均値±1標準偏差として表記する。
【０２７５】
結果を図12〜14に示し、これらはISIS 175317（SEQ ID NO：125）ASOのクリーム製剤が正常な表皮、真皮、および乾癬表皮においてIGF-IRおよびRNAを減少させるために有効であることを明らかに示している。図14における結果はIGF-IRに関するこのASOの特異性を明らかに示す。
【０２７６】
当業者は、本明細書に記述の本発明が特に記述される内容以外の変更および改変を受けることを認識するであろう。本発明にはそのような変更および改変が全て含まれると理解される。本発明にはまた、本明細書において個々にまたは集団的に言及または示された段階、特徴、組成物、および化合物の全て、ならびに上記の段階または特徴の任意の二つ以上の任意の全ての組み合わせが含まれる。
【０２７７】
引用文献
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0004753863.tif 000048
0004753863.tif 000049
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
（図１）エクスビボで維持された皮膚生検の図示である。
（図２）（A）ISIS 175314（SEQ ID NO:122）、ISIS 175317（SEQ ID NO:125）およびISIS 175323（SEQ ID NO:131）の標的の局在を示す、IGF-IR遺伝子の5'非翻訳領域のヌクレオチド配列（M69229；SEQ ID NO：76）、
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（B）IGF-IRのヌクレオチド配列ならびに3'および5'非翻訳領域を含む対応するアミノ酸配列（NM000）を示す。
（図３）（A）陰性対照ISIS 13650、ISIS 18078、およびISIS 29848と比較してA549細胞におけるIGF-IR mRNAに及ぼすリードIGF-IR ASO ISIS 175292〜175328の効果を示すグラフである。（B）A459細胞のIGF-IR mRNAに及ぼすリードIGF-IR ASO ISIS 175314、ISIS 175317、およびISIS 175323の効果。（A）および（B）に関して、A459細胞を、アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドと複合体を形成したリポフェクチンに脂質：オリゴヌクレオチド2：1の比でトランスフェクトさせた。自動プロセス（例えば、キアゲンインク（Qiagen Inc.）、バレンシア、カリフォルニア州）で総細胞RNAを16〜20時間後に単離した。ヒストグラムは、1回の実験からの1試料あたり3個ずつの測定を表し、IGF-IR mRNAレベルの平均値を無処置対照±SDにおけるレベルの％として示す。（C）ASO化合物のヌクレオチド配列、対照オリゴヌクレオチド、およびプライマー／プローブオリゴヌクレオチド。
（図４）HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IR mRNAレベルに及ぼすDT1064（SEQ ID NO：43）およびリードIGF-IR ASO（ISIS 175314（SEQ ID NO：27）、ISIS 175317（SEQ ID NO：30）、およびISIS 175323（SEQ ID NO：36））の効果を示すグラフである。85〜90％コンフルエントHaCaT細胞を、アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチド（6.25、25、100、または400nM）の存在下または非存在下でGSV（2μg/ml）によって処置した。細胞を1回（回収前18時間；A）または2回（回収前24および48時間；B）トランスフェクトした。総RNAを回収して逆転写してから、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-IR mRNAを18Sに対して標準化してGSV-処置対照細胞におけるレベルの％として表記した。結果は、異なる2回の実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SEMを表す。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみを処置した細胞。
（図５）HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IRタンパク質に及ぼすDT1064（SEQ ID NO：43）およびリードIGF-IR ASO（ISIS 175314（SEQ ID NO：27））、ISIS 175317（SEQ ID NO：30）、およびISIS 175323（SEQ ID NO：36））の効果を示す写真およびグラフである。85〜90％コンフルエントHaCaT細胞を24時間毎に3日間トランスフェクトした。細胞溶解物を回収して、各試料から等量のタンパク質（25または30μg）を7％w/v SDS-PAGEによって分離した。タンパク質をPVDFメンブレンにブロッティングして、IGF-IRβサブユニットを認識する抗ウサギIgGによってプロービングした。（A）IGF-IRシグナルの強度を示す代表的なイムノブロット（ウェスタン3）。試料をゲル4個において泳動した；各ゲルからのGSV処置および無処置を同じゲルにおいて泳動した試料と共に示す。（B）GSV-処置対照におけるレベルの％として表記したIGF-IRタンパク質バンド強度の定量。ヒストグラムは、処置を1試料あたり2個ずつ評価した異なる3回の実験からのデータの平均値±SEMを示す。一元配置ANOVAを行った後、ダネット検定による対応のある比較を行った：GSV処置細胞に対して*P<0.05、△P<0.001。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみを処置した細胞。
（図６）HaCaTケラチノサイトにおける細胞増殖速度に及ぼすDT1064およびリードIGF-IR ASOの効果を示すグラフである。サブコンフルエントHaCaT細胞に、GSV単独（2μg/ml）、またはアンチセンスもしくは対照オリゴヌクレオチド（6.25、25、100、または400nM）と複合体を形成したGSV（2μg/ml）を24時間毎に3日間トランスフェクトした。第一のトランスフェクション時、およびその後24時間間隔で、アミドブラックアッセイを用いて細胞数を推定した。データを、細胞数を1試料あたり2個ずつ測定した異なる二つの実験の平均値±SEMとして表記する。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみを処置した細胞。
（図７）ISIS 175314、ISIS 175317、およびISIS 175323の標的の局在を示すIGF-IR遺伝子の5'非翻訳領域のデオキシリボヌクレオチド配列（M69229；SEQ ID NO：76）を表す。
（図８）HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-I受容体mRNAレベルに及ぼすISIS 175317、IGF-IRリードASO、およびDT1064の効果を示すグラフである。85％コンフルエントHaCaT細胞（継代62〜63回）を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（6、13、25、50、100、または200nM）の存在下または非存在下でGSV（2μg/ml）によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞におけるIGF-IR mRNAレベルの百分率として表記した。結果は、異なる二つの実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD（n＝4）を表す。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみによって処置した細胞。
（図９）HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-I受容体mRNAレベルに及ぼすISIS 175317、他のIGF-IRリードASO、およびDT1064の効果を示すグラフである。85％コンフルエントHaCaT細胞（継代62〜63回）を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（6、13、25、50、100、または200nM）の存在下または非存在下でGSV（2μg/ml）によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞におけるIGF-IR mRNAレベルの百分率として表記した。結果は、異なる二つの実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD（n＝4）を表す。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみによって処置した細胞。この実験において、リードIGF-IR ASOはISIS 175317、リードIGF-IR ASOはISIS 323737、ISIS 323744、ISIS 323762、ISIS 323767であった。
（図１０）HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-I受容体mRNAレベルに及ぼすISIS 175317、最近同定された四つのIGF-IRリードASO、およびDT1064の効果を示すグラフである。85％コンフルエントHaCaT細胞（継代45回）を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（0.3、1.6、3、6、25、または100nM）の存在下または非存在下でGSV（2μg/ml）によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞におけるIGF-IR mRNAレベルの百分率として表記した。結果は、1回の実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD（n＝2）を表す。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみによって処置した細胞。この実験において、リードIGF-IR ASOはISIS 175317であった。リードIGF-IR ASOはISIS 323737、ISIS 323744、ISIS 323762、ISIS 323767であった。対照2' MOEギャップマーはISIS 129691（ランダム）、ISIS 306064（ミスマッチ8個）であった。C-5プロピンIGF-IR ASOはDT1064であった。対照C-5プロピンは6416（ミスマッチ15個）であった。
（図１１）HaCaTケラチノサイトにおける相対的IGF-IR mRNAレベルに及ぼす最近同定された四つのASOおよびISIS 175317の効果に関する濃度-反応曲線を示すグラフである。85％コンフルエントHaCaT細胞（継代45回）を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド（0.4、1.6、3、6、25、または100nM）の存在下または非存在下でGSV（2μg/ml）によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞の百分率として表記した。結果は、1回の実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD（n＝2）を表す。UT＝無処置細胞、GSV＝GSVのみによって処置した細胞。この実験において、リードIGF-IR ASOはISIS 175317であった。リードIGF-IR ASOはISIS 323737、ISIS 323744、ISIS 323762、ISIS 323767であった。
（図１２）ISIS 175317（SEQ ID NO：125）の局所適用後の乾癬皮膚生検におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を示すグラフである。バーは、ビヒクル処置およびISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検の表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を表す。データは、ビヒクル処置試料の表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値と比較して表記し、エラーバーは1標準偏差である。局所適用したISIS 175317（SEQ ID NO：125）（10％ISISクリーム製剤）は、外植体に局所適用後24時間で表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルを有意に減少させた。全ての場合においてn＝11であった。（*＝p<0.05、***＝p<0.001）。
（図１３）ISIS 175317（SEQ ID NO：125）の局所適用後の乾癬皮膚生検におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を示すグラフである。バーは、ビヒクル処置およびISIS 175317（SEQ ID NO：125）処置生検の乾癬表皮および正常表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を表す。データは、ビヒクル処置試料の表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値と比較して表記し、エラーバーは1標準偏差である。局所適用したISIS 175317（SEQ ID NO：125）（10％ISISクリーム製剤）は、外植体に局所適用後24時間で表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルを有意に減少させた。全ての場合においてn＝11。（*＝p<0.05、***＝p<0.001）。
（図１４）表皮組織にISIS 175317を局所適用後の乾癬皮膚生検におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を示すグラフであり、ISIS 175317はIGF-IRに対して特異性を示すが、GAPDH、HPRT、インスリン受容体、Casp3、およびBaxに対して特異性を示さない。バーは、ビヒクル処置およびISIS 175317処置生検の表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を表す。データはビヒクル処置試料の表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値と比較して表記し、エラーバーは、1標準偏差である。局所適用したISIS 175317（10％ISISクリーム製剤）は、外植体に局所適用後24時間で表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルを有意に減少させた。全ての場合においてn＝11。（*＝p<0.05、***＝p<0.001）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｂ−４】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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