(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓幹細胞および肝実質細胞を含む１０個より少ない細胞の単離された肝臓細胞クラスターであって、ここで、該肝実質細胞および該幹細胞がデスモソーム接合により接合し、そして、ここで、該幹細胞がＯＣ２を発現しない、肝臓細胞クラスター。
【請求項２】
前記肝臓細胞クラスターが２つの細胞を含むクラスターである、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項３】
前記クラスターが５個未満の細胞を含む、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項４】
前記幹細胞がＯＶ６を発現する、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項５】
前記幹細胞が胆管細胞マーカーを発現する、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項６】
前記胆管細胞マーカーがサイトケラチンである、請求項５に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項７】
前記サイトケラチンがサイトケラチン１９である、請求項６に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項８】
前記幹細胞がデスモプラキンを発現する、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項９】
前記幹細胞が、ラミニン、デスモプラキンＩ、細胞間接着分子（ＣＣＡＭ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γＧＴ）、活性化後超後期（ＶＬＡ）−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−５およびＶＬＡ−６からなる群より選択される抗原を発現することでさらに特徴付けられる、請求項５に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１０】
前記クラスターが成体肝組織由来である、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１１】
前記クラスターが胎児の肝臓または小児の肝臓に由来する、請求項１に記載のクラスター。
【請求項１２】
前記クラスターがヒト組織由来である、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１３】
前記クラスターがげっ歯類組織由来である、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１４】
前記幹細胞が成熟機能性肝実質細胞または胆管細胞に分化する、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１５】
前記幹細胞が治療用タンパク質をコードする異種ＤＮＡを含む、請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１６】
前記治療用タンパク質が、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、グルタミンシンテターゼ、グリコーゲンシンテターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンテターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェリチン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルブミン、トランスフェリン、補体成分Ｃ３、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ：Ｃ因子、第ＩＸ因子、および、α１−抗トリプシンからなる群より選択される、請求項１５に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項１７】
初代肝臓幹細胞であって該幹細胞が：
（ａ）正常肝臓組織から得られ、そして
（ｂ）肝実質細胞および該幹細胞を含む１０個より少ない細胞の単離された肝臓細胞クラスターに由来する、幹細胞であって、ここで、該肝実質細胞および該幹細胞がデスモソーム接合により接合し、そして、ここで、該幹細胞がＯＣ２を発現しない、初代肝臓幹細胞。
【請求項１８】
前記肝臓細胞クラスターが２つの細胞を含むクラスターである、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項１９】
前記クラスターが５個未満の細胞を含む、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２０】
前記幹細胞がＯＶ６を発現する、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２１】
前記幹細胞が胆管細胞マーカーを発現する、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２２】
前記胆管細胞マーカーがサイトケラチンである、請求項２１に記載の幹細胞。
【請求項２３】
前記サイトケラチンがサイトケラチン１９である、請求項２２に記載の幹細胞。
【請求項２４】
前記幹細胞がデスモプラキンを発現する、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２５】
前記幹細胞が、ラミニン、デスモプラキンＩ、ＣＣＡＭ、ＣＥＡ、ジペプチジルペプチダーゼ−４、γＧＴ、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−５およびＶＬＡ−６からなる群より選択される抗原を発現することでさらに特徴付けられる、請求項２１に記載の幹細胞。
【請求項２６】
前記幹細胞が成体肝組織由来である、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２７】
前記幹細胞が胎児の肝臓または小児の肝臓に由来する、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２８】
前記幹細胞がヒト組織由来である、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項２９】
前記幹細胞がげっ歯類組織由来である、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項３０】
前記幹細胞が成熟機能性肝実質細胞または胆管細胞に分化する、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項３１】
前記幹細胞が治療用タンパク質をコードする異種ＤＮＡを含む、請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項３２】
前記治療用タンパク質が、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、グルタミンシンテターゼ、グリコーゲンシンテターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンテターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェリチン、ＬＤＬレセプター、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルブミン、トランスフェリン、補体成分Ｃ３、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ：Ｃ因子、第ＩＸ因子、および、α１−抗トリプシンからなる群より選択される、請求項３１に記載の幹細胞。
【請求項３３】
単離された肝臓幹細胞を産生する方法であって、以下：
（ａ）正常肝臓組織サンプルから肝臓細胞クラスターを単離する工程であって、該クラスターは、肝実質細胞と会合する幹細胞を含み、ここで、該肝実質細胞および該幹細胞がデスモソーム接合により接合している、工程；
（ｂ）該肝実質細胞から該幹細胞を解離する工程；および
（ｃ）該クラスターから該肝実質細胞を除去し、肝臓幹細胞のサンプルを得る工程であって、ここで、該幹細胞がＯＣ２を発現しない、工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
胆管樹と会合した門脈周囲の肝実質細胞を富化する工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記肝臓細胞クラスターが２つの細胞を含むクラスターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝臓細胞クラスターが成体肝臓のヘーリング管に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
デスモプラキンの発現について選択する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
ＯＶ６の発現について選択する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ラミニン、デスモプラキンＩ、ＣＣＡＭ、ＣＥＡ、ジペプチジルペプチダーゼ−４、γＧＴ、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−５およびＶＬＡ−６からなる群より選択される抗原を発現する細胞について選択する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３３に記載の方法により単離された、肝臓幹細胞。
【請求項４１】
請求項１に記載の肝臓細胞クラスターを含む体外肝臓補助デバイス。
【請求項４２】
請求項１７に記載の肝臓幹細胞を含む、体外肝臓補助デバイス。
【請求項４３】
哺乳動物への肝臓移植のための請求項１に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項４４】
哺乳動物への肝臓移植のための請求項１７に記載の幹細胞。
【請求項４５】
哺乳動物における遺伝性または後天性の遺伝性疾患または代謝性疾患を処置するための、該哺乳動物への移植に適した、請求項１５に記載の肝臓細胞クラスター。
【請求項４６】
哺乳動物における遺伝性または後天性の遺伝性疾患または代謝性疾患を処置するための、該哺乳動物への移植に適した、請求項３１に記載の幹細胞。
【発明の詳細な説明】
（発明の背景）
本発明は、肝臓疾患の細胞媒介性処置に関連する。
【０００１】
重篤な、不可逆性の肝臓疾患（他の医薬処置および外科処置が無効であった）を被る患者は、しばしば、肝臓移植の候補である。小児において、最も通常の兆候は、胆管閉鎖症である。この状態は、胆管の歪曲および肝硬変ならびに遺伝的に伝播された代謝性障害（肝不全および／または肝硬変に導き得る）に誘導する。非アルコール性肝硬変またはアルコール性肝硬変ならびに肝癌を罹患した成人は、移植の候補であり得る。
【０００２】
成体肝臓幹細胞の存在は、依然として論争の主題である。しかし、疾患肝臓をもとに戻すための機能性成熟肝実質細胞へ分化する幹細胞は、特定の肝臓疾患の処置のための全器官移植に代わるアプローチであり得る。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、変性性肝臓疾患または肝機能の遺伝性の不全（例えば、変異タンパク質の産生によってか、または肝不全を生じる、タンパク質発現の誤った調節により特徴付けられる）を処置するために用いられ得る初代肝臓幹細胞を提供する。幹細胞は、多能性であり得る。例えば、この細胞は、肝実質細胞または胆管細胞へ分化し得るか、あるいはそれらは肝実質細胞への分化を予め方向付けられ得る。本発明はまた、肝移植のためだけでなく、遺伝子治療のためにおよび、肝臓補助デバイスの生物学的成分として、幹細胞および細胞ダブレットを単離および利用するための方法を提供する。
【０００４】
従って、本発明は、肝臓幹細胞および肝実質細胞を含有する初代肝臓細胞クラスターまたは単離された初代肝臓幹細胞を含む。「幹細胞」とは、成熟機能性肝実質細胞または胆管細胞へ分化する未分化の細胞を意味する。「条件的（通性の）（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）」肝臓幹細胞（ＦＬＳＣ）は、増殖するために刺激が必要である。例えば、ＦＬＳＣは、発癌物質への曝露のようなストレスまたは損傷に応答して増殖する。幹細胞は完全には分化しておらず、そして分化した肝臓細胞が通常増殖しない条件下（例えば、化学的発癌物質への曝露後）で増殖する能力を保持している。「細胞クラスター」は、少なくとも２つの会合した細胞の群を意味する。好ましくは、このクラスターは、１０細胞未満、より好ましくは、５細胞未満を含む。代表的には、単離された細胞クラスターは、１クラスターあたり２〜５細胞を含む。最も好ましくは、このクラスターは、細胞ダブレット（すなわち、２つの細胞を含むクラスター）または細胞トリプレット（すなわち、３つの細胞を含むクラスター）である。クラスター内では、細胞のうち少なくとも２つがデスモソーム接合により接合している。「正常な」肝臓組織とは、非癌性でかつ病原性微生物により感染されていない組織を意味する。
【０００５】
幹細胞は、他の未分化の肝臓細胞または部分的に分化した肝臓細胞（例えば、卵円細胞（ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ））から、肝実質細胞との会合により、識別され、そして分離可能である。ダブレットの肝実質細胞および幹細胞は、デスモソーム接合により接合している。幹細胞は好ましくは、前卵円細胞であり、そして肝実質細胞との堅固な会合、およびＯＣ２のような卵円細胞マーカーの検出可能な発現の欠失により卵円細胞から識別される。好ましくは、幹細胞はマーカーＯＶ６を発現する。この幹細胞はまた、サイトケラチン（例えば、サイトケラチン１９）のような胆管細胞マーカーを発現し得る。細胞外マトリックスマーカー（例えば、ラミニン）、デスモソーム糖タンパク質（例えば、デスモプラキンＩ（ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎ  Ｉ））、肝細胞接着分子（例えば、細胞間接着分子（ＣＣＡＭ））、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４、卵円細胞上の胆管マーカー（例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γＧＴ））、活性化後超後期（Ｖｅｒｙ  Ｌａｔｅ  Ａｆｔｅｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＶＬＡ）−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−５、またはＶＬＡ−６のような他の細胞表面マーカーもまた発現され得る。
【０００６】
単離された肝臓細胞クラスターおよび単離された幹細胞は、胎児肝臓組織、小児肝臓組織、または成体肝臓組織から入手され得る。好ましくは、この細胞は、胎児組織よりも成体肝臓組織から入手される。この細胞は、成熟機能性肝実質細胞または成熟胆管細胞に分化し得る。好ましくは、幹細胞は、成熟機能性肝実質細胞すなわち、肝臓特異的な分化をした代謝性機能（例えば、アルブミン、ＣＣＡＭ、グルコース−６−ホスファターゼ、α１−抗トリプシンまたはＰ４５０酵素活性の発現）により特徴付けられた肝実質細胞に分化する。
【０００７】
幹細胞は、異種ＤＮＡの導入によって遺伝的に変化され得る。遺伝的に変化された幹細胞は、組換えＤＮＡ技術によってポリペプチドをコードする核酸を導入した細胞である。このＤＮＡは、生物の天然に存在するゲノムにおいて直に隣接する５’コード配列および３’コード配列から離れている。例えば、このＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはそれらのフラグメントであり得る。いくつかの場合では、病理学的状態の根本の欠陥は、代謝タンパク質のようなタンパク質をコードするＤＮＡにおける変異である。好ましくは、異種ＤＮＡによりコードされたポリペプチドは、病理学的状態と関連した変異を欠損する。他の場合において、病理学的状態は、タンパク質の発現における減少と関連する。遺伝学的に改変された幹細胞は、組換えタンパク質の強い発現を指向させるプロモーターの制御下で、このようなタンパク質をコードするＤＮＡを含み得る。このような細胞は、タンパク質の異常に低い発現を受ける個体に移植された場合、高レベルのタンパク質を生成し、治療的恩恵を与える。例えば、幹細胞は、代謝タンパク質（例えば、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、グルタミンシンテターゼ、グリコーゲンシンテターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンテターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェリチン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、Ｐ４５０酵素、またはアルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする異種ＤＮＡを含有する。あるいは、この細胞は、分泌血漿タンパク質（例えば、アルブミン、トランスフェリン、補体成分Ｃ３、α2−マクログロブリン、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ：Ｃ因子、第ＩＸ因子、またはα1−抗トリプシン）をコードするＤＮＡを含み得る。
【０００８】
単細胞または細胞クラスター（例えば、幹細胞または幹細胞−肝実質細胞トリプレットまたはダブレット）に関して使用される用語「単離された」とは、細胞または細胞クラスターが、他の細胞型または細胞物質（細胞または細胞クラスターがこれを伴って肝臓で天然に存在する）を実質的に含まない。幹細胞またはダブレットのサンプルは、それが細胞集団の少なくとも６０％であるとき、「実質的に純粋」である。好ましくは、この調製物は、細胞集団の少なくとも７５％であり、より好ましくは、少なくとも９０％であり、そして最も好ましくは、少なくとも９９％である。純度は、任意の適切な標準的方法（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による）によって測定され得る。
【０００９】
本発明は、肝臓幹細胞のサンプルを得る方法を包含し、この方法は、（ａ）正常肝臓組織から細胞ダブレットを単離すること、（ｂ）肝実質細胞から幹細胞を解離すること、および（ｃ）幹細胞をダブレットから除去し、肝臓幹細胞のサンプルを得ることによる。本方法は、必要に応じて、他の細胞マーカー（例えば、デスモプラキン、ＯＶ６、サイトケラチン１９、ラミニン、またはＣＣＡＭ）の発現について選択することを包含する。好ましくは、本方法は、所望の幹細胞について濃縮するために、卵円細胞マーカーＯＣ２発現を欠損する細胞について選択する、すなわち、ＯＣ２を発現する夾雑する胆管細胞に対して選択する、工程を包含する。
【００１０】
肝臓移植の方法もまた、本発明の範囲内である。肝臓移植の必要のある患者（例えば、変性肝疾患、癌、または代謝性疾患を罹患する患者）は、この患者に、幹細胞または幹細胞−肝実質細胞ダブレットを移植することにより処置される。遺伝性のまたは後天性の遺伝子疾患または代謝性疾患を処置するために、遺伝的に変化された幹細胞（単独で、または肝実質細胞と対合して）が移植される。例えば、この幹細胞は、それぞれ血友病ＡおよびＢ、α1抗トリプシン欠損症、および家族性コレステロール血症のようなヒト疾患を処置することに有用な、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子、第ＩＸ因子、α1−抗トリプシン、または低密度リポタンパク質レセプターをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ得る。遺伝的に変化された幹細胞は、インビボでの組換えタンパク質送達系として有用であり、そして分化細胞に比較して不死化（および、従って、より永い長期生存）が可能であるという利点を有する。すなわち、幹細胞は、分化した子孫を生じ得るが、自己複製のための能力を保持する。
【００１１】
本発明の細胞はまた、灌流デバイスの生物学的成分または機能的に分化した肝実質細胞（これは、次いで、肝臓補助デバイス（ＬＡＤ）またはバイオリアクタのような灌流デバイスの生物学的成分として使用され得る）の供給源として有用である。患者由来体液とこのような肝実質細胞との接触は、引き続いて患者に戻すための体液の解毒を生じる。
【００１２】
他に定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似するか、または等価の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は、本明細書中に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が優先する。さらに、材料、方法、および例は、例示のみであって、限定することを意図していない。  本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【００１３】
（選択的肝臓幹細胞）
肝臓幹細胞の存在は、数十年間論争されてきた。肝実質細胞の複製能を損なう肝臓損傷後、卵円細胞と呼ばれる小さい幹様細胞の異種集団が、肝臓において生じる。卵円細胞は、発癌物質への曝露に応答して増殖する卵形核を有する肝臓の小細胞である。卵円細胞は、正常肝臓組織には存在しないが、ストレス性刺激（例えば、機械的損傷）または発癌物質への曝露後に生じる。肝臓の幹細胞区画の活性化が卵円細胞の集団を生じる。このような卵円細胞は両能性であり、すなわち、それらは、肝実質細胞または胆管細胞に分化し得る（図１）。
【００１４】
幹細胞を単離するほとんどの試みは、推定幹細胞による卵円細胞抗原（例えば、ＯＶ６、ＯＣ２、およびＯＣ３）の発現に基づいている。しかし、これらの抗原は、他の肝臓細胞型（例えば、胆管細胞または中皮細胞）にも存在し得、これらの他の細胞型を有する推定幹細胞の調製物の夾雑を生じる。本発明は、肝臓細胞クラスターの特異的型、すなわち、デスモソーム接合を介して小さな非肝実質細胞型の細胞に接合された肝実質細胞により特徴付けられた型）の単離を必要とすることによって新規な表現型プロフィルを同定し、そして夾雑の問題を解決する。さらなる単離測定は、胆管細胞特異的抗原の発現についての選択を包含する。
【００１５】
卵円細胞は、本明細書中に記載の幹細胞の子孫である。本発明の幹細胞は、多くの細胞マーカーを、他の肝臓細胞と共有しているが、それらは、肝実質細胞との堅固な会合によって、卵円細胞および他の推定幹細胞とは区別される。この識別的な特徴は、（胆管系譜よりむしろ）肝臓系譜の細胞に分化する卵円細胞を、増殖の際に生じる、独特の幹細胞の同定および精製を可能にする。単離された幹細胞（または細胞クラスター）は、遺伝子治療のために、および肝臓補助デバイスの生物学的成分として、損傷した肝臓を再増殖させるために使用され得る。
【００１６】
（肝臓幹細胞および肝臓細胞クラスターの調製）
肝臓組織は、幹細胞−肝実質細胞クラスターの完全性を保持しながら結合組織から細胞を解離するために酵素消化される。インビボでは、幹細胞は、肝臓の独特のニッシェ、すなわち、ヘーリング管に存在し、そしてこのニッシェ由来の幹細胞は、１つ以上の胆管細胞マーカーのそれらの発現によって同定される。以前の細胞単離プロトコルは、単細胞懸濁液を生じたが、一方、本発明の方法は、細胞クラスターの単離を提供する。細胞クラスターにおける関与は、前卵円細胞幹細胞の信頼性のある識別的な特徴を表し、そしてこの細胞型の唯一の公知のマーカーである。肝臓の酵素的解離後、細胞懸濁液は、胆管樹（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒｅｅ）と会合した門脈周囲肝実質細胞について濃縮され、そして細胞懸濁液は、胆管抗原を発現する細胞を含む細胞クラスター（例えば、細胞ダブレット）についての濃縮を受ける。例えば、げっ歯類またはヒト肝実質細胞の懸濁液が、マーカーＣＫ１９を発現する幹細胞またはクラスターについての選択を受ける。
【００１７】
哺乳動物器官ドナーは、肝臓組織を提供するために使用され得、その肝臓組織から幹細胞およびダブレットが単離される。例えば、組織は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ヒヒ、ブタ、またはヒトから得られる。この組織は、死亡ドナー、流産胎児、または生存ドナー（例えば、針生検、小楔状生検、または部分肝切除から）から得られる。いくつかの場合、自己細胞が患者から得られ得、（例えば、異種ＤＮＡを導入するために）インビトロで操作され得、そして患者に戻され得る。より代表的には、細胞は、異種ドナーから得られる。ドナーの肝実質細胞が異種である場合、ドナー−レシピエント組織適合性が決定される。クラスＩおよびクラスＩＩ組織適合性抗原が決定され、そして患者に対して免疫学的に密に適合した個体がドナーとして選択される。全てのドナーは、伝播性ウイルスの存在についてスクリーニングされる（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ／Ｂ型肝炎ウイルス）。適切なドナーは、試験された感染性疾患のないドナーである。
【００１８】
ラット肝臓組織およびヒト肝臓組織（死体から得た）を、幹細胞および細胞クラスターの調製のための組織の供給源として使用した。雄性Ｆｉｓｈｅｒラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。試薬および緩衝液を以下に記載する。
【００１９】
【表１】
0004610083.tif 000002
ＣＭＦ（４７５ｍｌ）を０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ストックの２５ｍｌ、ここで２３．８３ｇ  Ｈｅｐｅｓを９９０ｍｌのｄＨ2Ｏに溶解し、ｐＨを７．０にし、ＱＳを１ｌにし、フィルター滅菌した）と混合することによって、前灌流緩衝液を調製した。使用したこの消化緩衝液を処方して、肝臓組織から細胞を遊離させるが、単一細胞の懸濁物を産生するのでななく、細胞のクラスターの完全性を保存する（約２〜１０細胞のサイズ、最適には２〜３細胞のサイズ）。記載された消化緩衝液に肝臓組織を供することは、単一の細胞懸濁物を産生しないが、単一の細胞および細胞のクラスターの混合物（例えば、ダブレット細胞またはトリプレット細胞、および単一の細胞）を産生する。次いで、そのクラスターを回収し、そして単一の細胞を廃棄する。
【００２０】
消化緩衝液（消化緩衝液Ｉ）は、ＩＶ型コラゲナーゼ（６０単位／ｍｌ）を含む。消化緩衝液Ｉ（１００ｍｌ）は、前灌流緩衝液（２５０ｍｌ）、ＣａＣｌ2、５００ｍＭ  １００×ストック（２．５ｍｌ）、ＳＴＩ（０．０２５ｇ）、およびＩＶ型コラゲナーゼ（６０単位／ｍｌ）を含む。消化緩衝液ＩＩは、消化緩衝液Ｉの５０ｍｌ中の０．０２ｇのＢＳＡ溶液である。細胞懸濁緩衝液は、ＨＢＳＳ（４７５ｍｌ）および０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（２５ｍｌ）を含む。細胞洗浄緩衝液は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（５００ｍｌ）およびＢＳＡ（５ｇ）を含む。ＣＭＦ、ＨＢＳＳ、およびＤＭＥＭ−Ｆ１２を、代表的には、他の試薬の添加前に５分間酸素化する。前灌流緩衝液、懸濁緩衝液、および洗浄緩衝液のｐＨを、７．２〜７．３に調整し、消化緩衝液のｐＨを７．４〜７．５に調整する。すべての緩衝液を、０．２ミクロンフィルターを使用して濾過する。前灌流緩衝液、消化緩衝液、および懸濁緩衝液を３７℃で使用し、一方、洗浄緩衝液を氷冷に保つ。
【００２１】
１１５ｇ〜１７０ｇの間の体重の雄性Ｆｉｓｈｅｒラットを、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。右腎静脈の近傍で下大静脈にカニューレを通し、大動脈を結紮して血行を止め、そして門脈を切断した。前灌流緩衝液を用いて、２０ｍｌ／分の流速で約４〜５分間、肝臓の血液が清澄になるまで肝臓を灌流した。次いで、灌流を、消化緩衝液を用いて、３０ｍｌ／分で、約６〜８分間継続した。その肝臓を切除し、みじん切りにし、そして１００ｍｌの懸濁緩衝液とともにスピナーフラスコ中に入れた。そのフラスコを、攪拌プレート上の３７℃のインキュベーター中に、４０〜５０分間置いた。合わせた懸濁物を、２３０ミクロンスチールメッシュフィルターおよび６０ミクロンナイロンメッシュフィルターを通して連続的に濾過した。フィルター上に残った残査を洗浄し、そして１０ｍｌの消化緩衝液ＩＩとともに２５ｍｌフラスコ中に入れた。そのフラスコを、１６０振盪速度／分に設定した３７℃の振盪ウォーターバス中に置いた。２０分後、その細胞懸濁物を１５ｍｌチューブに移し、そして懸濁物を重力によって沈殿させた。
【００２２】
次いで、上清および残渣（沈殿させた物質）を分離した。上清をデカントし、そして８０×ｇで５分間遠心分離した。新鮮な消化緩衝液を細胞に添加し、そして振盪ウォーターバスに戻した。遠心分離後に残存するペレットを洗浄緩衝液で再懸濁し、そして氷上に保った。細胞が胆管樹（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒｅｅ）に非常に付着しているようである場合、ＣＭＦ中に溶解した１ｍＭ  ＥＧＴＡの溶液を、消化工程の代わりに５分間置換した。
【００２３】
次いで、氷上に保った細胞懸濁物を、６０ミクロンナイロンメッシュフィルターを通して濾過して細胞の大きな凝集物を除去し、そして等量の９０％パーコールおよび１０％  １０×ＤＭＥＭ−Ｆ１２と混合した。次いで、これを３００×ｇで５分間遠心分離する。このペレットを洗浄緩衝液中で再懸濁し、そして１２０×ｇで５分間遠心分離した。次いで、このペレットを、洗浄緩衝液中に再懸濁する。
【００２４】
免疫除去（ｉｍｍｕｎｏｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）工程を最初に実行して、所望でない細胞を除去する。これによって、所望の幹細胞−肝実質細胞クラスターについて富化させる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ラット胆管および中皮細胞について特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ2b）に結合体化させた。このビーズを細胞懸濁物に添加し、そして回転装置上で、４℃で１０分間インキュベートした。次いで、その懸濁物を磁石上に配置して、抗体陽性細胞を除去した；これらの細胞を廃棄した。この工程をさらに３回反復した。抗体陰性細胞を、ＣＣＡＭについて特異的な抗体（例えば、抗ラット細胞−ＣＡＭ  １０５；Ｅｎｄｏｇｅｎ）と結合体化されたＤｙｎａｂｅａｄｓとともにさらにインキュベーションに供し、そして結合した幹細胞を有する抗体陽性細胞（例えば、ダブレットおよびトリプレットのような細胞クラスター）を、培養および振盪培養（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）した。
【００２５】
幹細胞および肝実質細胞を含む単離された細胞クラスターをさらに処理して、単離された幹細胞の集団を達成する。例えば、細胞のサンプルをトリプシン処理して、細胞クラスターを解離させる（すなわち、デスモソーム接合を酵素的に破壊する）。肝実質細胞は、特にトリプシン（または、プロナーゼ）に感受性であるので、この工程は、細胞を分離するだけではなく、肝実質細胞を除去することを補助する。次いで、その細胞調製物を、磁気ビーズまたはＦＡＣＳソーティングと組み合わせて、細胞マーカー（例えば、ＣＫ１９（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＣＣＡＭ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４（Ｅｎｄｏｇｅｎ））について特異的な抗体を用いるさらなる選択に供して、所望の幹細胞について富化する。他のマーカー（例えば、γＧＴ、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−５、またはＶＬＡ−６  ＣＥＡ）に対する抗体もまた使用され得る。
【００２６】
図２および３は、それぞれ、正常ラット肝臓および正常ヒト肝臓由来の単離された幹細胞−肝実質細胞ダブレットを示す。各々の図において、２つの細胞のうちのより小さい方（矢印で示す）が幹細胞である。ダブレットのラット幹細胞はまた、ＯＶ６陽性である；ヒト幹細胞は、ＣＫ１０陽性である（ＣＫ１９に対する抗体が、ラットおよびヒトの両方の幹細胞に結合する）。ダブレットの幹細胞および肝実質細胞は、デスモソーム接合によって結合される（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００２７】
（幹細胞コンパートメントを活性化するためのバイオアッセイ）
単離された幹細胞の同定を確証するために、肝臓発癌物質を使用して幹細胞コンパートメントの増殖をインビボで実行し、そして幹細胞−肝実質細胞クラスターを上記に記載のように単離した。増殖の能力を評価し、そして細胞マーカーの発現を測定した。
【００２８】
幹細胞単離の約４８時間前に、１１５〜１７０ｇの間の体重の雄性Ｆｉｓｈｅｒラットをメトファン（ｍｅｔｈｏｐｈａｎｅ）で麻酔し、そして肝臓発癌物質２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）の１ペレットを動物の腹膜腔中に置いた。あるいは、発癌物質ペレットを、放射性同位元素の投与（細胞増殖を測定するため）の前２週間の間、動物の中に放置し、次に幹細胞の回収のために屠殺した。
【００２９】
ブロモウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞内取り込みを、細胞増殖の尺度として使用した。手術の１時間後、ＢｒｄＵの用量を通常の生理食塩水中に溶解し、腹腔内注射する。さらなる用量を、４時間後および２２時間後に与えた。
【００３０】
ラットを屠殺し、そして肝臓の灌流を、ＢｒｄＵの最後の用量が投与されてから２時間後に開始した。細胞クラスターを、上記に記載したように単離した。幹細胞−肝実質細胞ダブレットについて富化された細胞懸濁物を、ＣＣＡＭを発現するダブレットについての選択にさらに供し、そして細胞マーカーの発現および増殖について分析した。
【００３１】
図５Ａおよび５Ｂは、２つのＯＶ６陽性幹細胞が肝実質細胞に結合している幹細胞−肝実質細胞トリプレットを示す。結合している幹細胞のうちの１つは、ＢｒｄＵで強く標識されており、このことは、活発に増殖している細胞を示す。これらの結果は、デスモソーム接合を介して肝実質細胞に結合しているこの小さな細胞が、肝臓の幹細胞であることを確証する。
【００３２】
（治療的使用）
幹細胞および細胞クラスターは、種々の病理学的状態（変性肝疾患、または変異タンパク質の産生、もしくは変異していない、すなわち正常なタンパク質の異常な調節によって特徴付けられる疾患を含む）を処置するために個体に移植される。後者の疾患のカテゴリーには、家族性高コレステロール血症、α1抗トリプシン欠損、第ＶＩＩＩ因子欠損（血友病Ａ）、および第ＩＸ因子欠損（血友病Ｂ）が挙げられる（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９１を参照のこと）。
【００３３】
家族性高コレステロール血症は、低密度リポタンパク質の取り込みを媒介するレセプターの欠損によって引き起こされる、ヒト患者における常染色体優性障害である（例えば、Ｓｃｒｉｖｅｒら（編）Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１２１５〜１２５０頁を参照のこと）。この疾患は、血清コレステロールのレベルの上昇および冠状動脈疾患の未成熟な発症をもたらす。
【００３４】
α1抗トリプシン欠損は、α1抗トリプシン（これは、破壊性のプロテアーゼに対する低位の呼吸管の主要な防御を提供するプロテアーゼインヒビターである）の血清レベルの減少によって特徴付けられる遺伝性の障害である。α1抗トリプシン欠損についてホモ接合性の子供は、顕著な肝疾患（新生児の肝炎および進行性肝硬変を含む）を発症し、そしてα1抗トリプシン欠損の成体は、無症候性の肝硬変に進行し得る。
【００３５】
血友病Ａおよび血友病Ｂは、それぞれ第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の欠損に起因する、伴性遺伝性血漿凝固障害である。血友病Ａについての以前の処置は、第ＶＩＩＩ因子で富化された血漿産物の投与を含んだ。組換え凝固因子を作製するための遺伝的に変化した幹細胞を用いる罹患した患者の処置は、ウイルスの汚染（例えば、ウイルス性肝炎およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））に対して患者を曝露させる潜在的なリスクを回避させる。
【００３６】
（細胞移植）
幹細胞または細胞ダブレット（その状態で存在するかまたは遺伝的に変化して組換え遺伝子産物を産生するかのいずれか）を、肝臓移植の必要があるかまたは遺伝的に変化された細胞によってコードされたタンパク質の必要がある個体に導入する。変性肝臓疾患の処置のために細胞を使用することに加えて、幹細胞は、癌性肝細胞を殺傷するために化学療法を受けている癌患者に投与され得る。従って、化学療法剤の投与後に、患者の肝臓は、幹細胞によって「再播種」され得る。
【００３７】
その細胞が、異種に由来する場合、併用的な、免疫抑制治療は、代表的には、例えば、免疫抑制剤シクロスポリンまたはＦＫ５０６が投与される。あるいは、その細胞は、液体の交換を可能にする膜中にカプセル化され得るが、細胞／細胞接触は妨害される。微小カプセル化細胞の移植は、当該分野で公知である（例えば、Ｂａｌｌａｄｕｒら、１９９５、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １１７：１８９〜１９４；およびＤｉｘｉｔら、１９９２、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １：２７５〜２７９）。
【００３８】
その細胞は、例えば、門脈を介して肝臓に直接導入され得るか、または身体の全体にわたる他の位置（例えば、脾臓、膵臓）、もしくは腹膜中の微小キャリアビーズに蓄積する。例えば、１０2〜１０3細胞が単回の手順で移植され、そしてさらなる移植が、必要とされる場合、実行される。
【００３９】
幹細胞の分化は、肝臓組織（すなわち、他の肝実質細胞または細胞マトリックス成分）との接触によって誘導される。必要に応じて、分化促進剤が同時投与され得るか、または続いて患者に投与され、幹細胞分化を促進する。
【００４０】
（遺伝的に変化された幹細胞）
遺伝的に変化された幹細胞は、インビボで治療用組換えタンパク質を産生するために有用である。この幹細胞は、ドナー（非ヒトまたはヒト）から単離され、インビトロで組換え遺伝子でトランスフェクトまたは形質転換され、そしてレシピエントに移植される。この遺伝的に変化された幹細胞は、インビボで所望の組換え治療用タンパク質を産生し、そのように処置された患者の臨床的な改善を導く。
【００４１】
従来の遺伝子移入法は、ＤＮＡを細胞に導入するために使用される。取り替える遺伝子（例えば、凝固因子または代謝タンパク質）を導入するために使用される詳細な方法は、本発明には重要ではない。例えば、細胞へのＤＮＡの導入のための物理的方法には、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが挙げられる。リン酸カルシウムを用いる共沈殿のような化学的方法およびリポソームへのＤＮＡの取り込みはまた、哺乳動物細胞にＤＮＡを導入する標準的方法である。ＤＮＡは、標準的なベクター（例えば、マウスレトロウイルスおよび鳥類レトロウイルス由来のベクター）を使用して導入される（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８を参照のこと）。標準的な組換えＤＮＡ法は、当該分野で周知であり（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）、そして遺伝子治療のためのウイルスベクターは開発され、そして臨床的に首尾よく使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，３２３：１９９０）。
【００４２】
（肝臓補助デバイス）
幹細胞、細胞クラスター、およびそれらの子孫は、解毒デバイスの生物学的コンポーネント（例えば、肝臓灌流デバイスまたは肝臓補助デバイス）として有用である。
【００４３】
従来の肝臓補助デバイスは、強固な、プラスチックの外殻および中空の半浸透膜ファイバーを含む。このファイバーは、幹細胞、細胞ダブレット、または幹細胞もしくは細胞クラスター由来の分化した肝実質細胞を播種される。幹細胞の分化は、細胞を既知の分化因子（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ビタミンＡ、酪酸ナトリウム）またはマトリックス成分（例えば、ヘパリンサルフェート）と接触させることによって誘導される。
【００４４】
そのファイバーは、細胞の接着のためまたは未処理で放置するために、コラーゲン、レクチン、ラミニン、またはフィブロネクチンで処理され得る。周知の手順に従う無毒化のために、体液をそのデバイスを通して灌流し、次いで患者に戻す。
【００４５】
他の実施態様は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、肝臓幹細胞の発達を示す模式図である。
【図２】  図２は、正常成体ラット肝臓組織由来の肝臓細胞ダブレットの顕微鏡写真である。幹細胞（矢印にて示す）は、細胞マーカーＯＶ６に特異的な抗体を用いるポジティブ標識化を示す。ダブレットの幹細胞および肝実質細胞は、デスモソーム接合により接合される。
【図３】  図３は、正常成体ヒト肝臓組織由来の肝臓細胞ダブレットの顕微鏡写真である。幹細胞（矢印にて示す）は、細胞マーカーＣＫ１９に特異的な抗体を用いるポジティブ標識化を示す。ダブレットの幹細胞および肝実質細胞は、デスモソーム接合により堅固に接合される。
【図４】  図４Ａおよび４Ｂは、肝実質細胞と幹細胞との間の堅固な会合を示す、ラット肝臓組織由来の幹細胞−肝実質細胞の細胞ダブレットの顕微鏡写真である。細胞ダブレットの２つの細胞は、デスモプラキン（デスモソーム接合の一成分）に特異的な抗体を用いるポジティブ染色によって実証されるような、デスモソーム接合によって接合される。図４Ａおよび４Ｂは、同じ顕微鏡視野での同じ細胞の写真を示す。図４Ａは、ＣＫ１９染色を示し、図４Ｂは、デスモプラキン染色を示す。同時二重標識免疫蛍光分析は、幹細胞（矢印で示す）がＣＫ１９およびデスモプラキンの両方を発現していることを示す。デスモプラキン染色のパターンは、幹細胞から近隣の肝実質細胞（「Ｈ」で示す）まで連続的であり、これは、２つの細胞が同時に単離され、そしてデスモソーム接合によって接合されていたことを示す。
【図５Ａ】  図５Ａおよび５Ｂは、肝実質細胞に付着された２つの幹細胞の顕微鏡写真である。細胞クラスターはラット肝臓組織に由来した。図５Ａおよび５Ｂは、同じ顕微鏡視野における同じ細胞の写真である。図５Ａは、位相差顕微鏡下での視野であり、一方、図５Ｂは、ＢｒｄＵ蛍光を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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