(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムに、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列と、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列とを含むDNAを組み入れたトランスジェニック非ヒトほ乳動物を作製する方法であって、該方法が、
（a）ヒトβセクレターゼをコードするコード配列とコード配列に機能的に結合した調節配列とを含むDNA構築物を細胞または胚に導入する段階、
（b）ヒトAPPロンドン型をコードするコード配列とコード配列に機能的に結合した調節配列とを含むDNA構築物を細胞または胚に導入する段階、
（c）上記の細胞または胚のそれぞれからトランスジェニック非ヒトほ乳動物を作製する段階、および
（d）上記のトランスジェニック非ヒトほ乳動物を交配させる段階
を含む前記方法。
【請求項２】
プリオンプロモーター調節配列がヒトβセクレターゼのコード配列に機能的に結合し、Thy-1プロモーター調節配列がヒトAPPロンドン型のコード配列に機能的に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトβセクレターゼのコード配列が配列番号：８である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトAPPロンドン型のコード配列が配列番号：１である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
そのゲノムに、調節配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、調節配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列とを含むDNAを組み入れた、トランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項６】
ヒトβセクレターゼのコード配列がプリオンプロモーター配列に機能的に結合し、ヒトAPPロンドン型のコード配列がThy-1プロモーター配列に機能的に結合している、請求項５記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項７】
ヒトβセクレターゼのコード配列が配列番号：８である、請求項５または６に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項８】
ヒトAPPロンドン型のコード配列が配列番号：１である、請求項５〜７のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項９】
アルツハイマー病と類似の一つまたはそれ以上の組織病理を示す、請求項５〜８のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項１０】
動物が齧歯類である、請求項５〜９のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項１１】
動物がマウスである、請求項５〜10のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物。
【請求項１２】
同じかまたは別の表現型と交配して得られた、請求項５〜11のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物の子孫であって、そのゲノムに、調節配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、調節配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列とを含むDNAを有している、前記子孫。
【請求項１３】
請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物またはその子孫に由来する細胞株または初代細胞培養物。
【請求項１４】
請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物またはその子孫に由来する臓器型脳切片培養物。
【請求項１５】
アルツハイマー病を含むアミロイドパシーのモデルとしての、請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物、請求項13記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項14記載の臓器型脳切片培養物の使用。
【請求項１６】
試験化合物を請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物に投与する段階、ならびにAPP切断産物の量、神経病理、および行動の変化を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定する段階を含む、脳変性病態の予防または治療において用いられる試験化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
脳変性病態がアルツハイマー病である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
試験化合物を請求項14記載の臓器型脳切片培養物に投与する段階、およびAPP切断産物の量を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定する段階を含む、脳変性病態の予防または治療に用いられる試験化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
脳変性病態がアルツハイマー病である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
試験化合物を請求項13記載の細胞株または初代細胞培養物に投与する段階、およびAPP切断産物の量を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定する段階を含む、脳変性病態の予防または治療に用いられる試験化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
脳変性病態がアルツハイマー病である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物をその治療に曝露する段階と、APP切断産物の量および位置、神経病理、ならびに構造の変化に及ぼす治療の効果を決定する段階とを含む、A-βの過剰発現に関連した脳変性病態を治療する有効性を試験する方法。
【請求項２３】
請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物における、APP切断産物の量、神経病理および行動の変化を含む疾患マーカーを決定する段階を含む、A-βペプチド産生、アミロイドーシス、神経変性およびアルツハイマー病理に及ぼすβセクレターゼ活性のインビボ作用を評価する方法。
【請求項２４】
疾患マーカーが対照動物の疾患マーカーと比較される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
請求項13記載の細胞株または初代細胞培養物と、上記の細胞におけるトランスジーンの過剰発現に関連した作用を試験化合物が阻害するか否かを決定するための手段とを含む、アルツハイマー病を含む脳変性病態の予防または治療において有用な試験化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項２６】
脳変性疾患を予防または治療するのに有用な化合物をスクリーニングするための、請求項５〜12のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒトほ乳動物、請求項13記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項14記載の臓器型脳切片培養物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミロイドパシーを含む疾患、特にアルツハイマー病のモデルとするために有用な新規二重トランスジェニック非ヒト動物に関する。そのようなトランスジェニック動物は、アミロイドパシーの治療のための特異的および一般的治療法を開発するために、ならびに新規抗アミロイド形成化合物を同定するスクリーニング方法において有用性を有すると考えられる。本発明はさらに、そのようなトランスジェニック動物を作製する方法、そのような新規トランスジェニック動物を用いての、アミロイドペプチド産生、アミロイドーシス、神経変性およびアルツハイマー病変に及ぼすβセクレターゼ活性のインビボ作用の評価に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病（AD）は、記憶喪失および認識機能の低下を特徴とする神経変性疾患である（非特許文献１）。ADの発生率は、65歳以上の人において５年ごとにほぼ倍加している。全体として年齢65歳以上の人の約５〜10％が罹患している（非特許文献２）。ADの臨床診断はなおも、除外診断に留まっている。確定診断は、アミロイド-β（A-β）ペプチドの微細繊維を含む細胞外アミロイド斑と、重合化リン酸化τタンパク質とを含む細胞内神経原繊維変化の存在に基づく脳の死後顕微鏡解剖によってのみ提供される（非特許文献３および４）。ほとんどの症例において、ADは発症が遅く、散発性である。早発型家族性ADは、症例の少数派であるが、それらは疾患のメカニズムを理解する上で進行にとって極めて重要であった。三つの遺伝子の変異が、早発型家族性AD（FAD）を引き起こすことが示されている：アミロイド前駆体タンパク質（APP）（非特許文献５、６、７および８）、プレセニリン1（Psen1）（非特許文献９）、およびプレセニリン2（Psen2）（非特許文献１０）。既知のミスセンス変異は、APPのコドン717位に影響を及ぼすのに対し（ポリペプチドにおけるV717*1、V717+GおよびV717+Fを変化させる）、スウェーデン人のADの家系のAPP遺伝子ではコドン670/671位（ポリペプチドにおけるK670+NおよびM671+L、以降スウェーデン型変異と呼ぶ）が変化している（APP770に番号付けられる）。これらの変異は全て、APPのタンパク質溶解プロセシングに影響を及ぼして、よりアミロイド形成性のペプチドを産生する。APPは、少なくとも三つのセクレターゼによって処理されうる：α、β、およびγセクレターゼ。βセクレターゼは、メチオニン671位（APP770番号付け）後でAPPを切断することによって、A-βペプチド産生を開始し、12 kDの保持された膜カルボキシ末端断片が得られる（非特許文献１１）。次に、12 kD断片は、疎水性膜貫通ドメイン内でγセクレターゼ切断を受けて、40、42、または43残基のA-βペプチドを放出する可能性がある（非特許文献１２）。
【０００３】
ADの現在の治療法は、ごく控えめに症状を軽減するに過ぎない。疾患の経過を遅らせて、感受性のある人において疾患を予防または遅らせる疾患改変作用物質が真に必要である。そのような作用物質を開発するためには、中でも疾患の分子的基礎の理解および動物モデルの開発がいずれも進歩することが必要である。
【０００４】
動物モデルにおいて疾患を再現するために用いられる戦略は、主にADの開散性の原因を反映する：加齢、APPおよびPsen FAD変異。
【０００５】
ヒト野生型APP、またはβセクレターゼ切断部位（APPスウェーデン型変異；非特許文献１３）および／またはγセクレターゼ切断部位（APPロンドン型変異体：非特許文献１４）でFAD変異を有するヒト野生型APPのいずれかを過剰発現する多くのトランスジェニックマウス系統が作製されている。これらのトランスジェニックマウス系統は、ヒトPsen1またはPsen2（γセクレターゼ活性）FAD変異体を過剰発現するトランスジェニック系統と交配させている。二重トランスジェニックマウスは、アミロイド量の増加を示すが、疾患の全ての局面を再現しない（総説に関しては、非特許文献１５および１６を参照のこと）。
【０００６】
これまでFADがヒトBACE（βセクレターゼ活性）における変異に関連していないという事実にもかかわらず（非特許文献１７）、BACEはなおもADの病理における魅力的で重要な役割を果たす。実際、BACE欠損マウス（非特許文献１８、１９および２０）は、脳においてA-βペプチドを欠損することが示されており、このことは、APPの切断にとってBACEが絶対的に必要であることを証明している。これらの知見によっても、ADの薬剤標的としてのBACEの妥当性は増大する。
【０００７】
最近、βセクレターゼ部位にFAD変異を有するヒトAPP（APPスウェーデン型）とヒトBACE（βセクレターゼ活性）とを過剰発現するマウスが報告されている（非特許文献２１および２２）。
【０００８】
APPスウェーデン型と共にBACEの過剰発現は、双方のタンパク質がAPPの同じ代謝段階を標的とするという意味において重複している。実際のところ、BACE過剰発現によって、野生型APPとスウェーデン型APPの双方のβセクレターゼ切断の増加が起こるが、アミロイドペプチド分泌の増加は野生型に限って認められ、スウェーデン型APPでは認められず、このことは、APPスウェーデン型変異体の場合には、産生されたC99断片の量を処理するにはγセクレターゼレベルが不適当であることを示唆している（非特許文献２３）。
【０００９】
上記の技術的問題は、γセクレターゼ部位でFAD変異を有するヒトAPPとヒトBACE（βセクレターゼ活性）との関連を含み、それによってアミロイドペプチドのN末端およびC末端にそれぞれ対応するAPPのβセクレターゼとγセクレターゼ部位の双方での切断が増加する新規動物モデルを提供する本発明によって解決される。さらに、APPの膜貫通ドメインにおける変異は、A-βペプチド42に都合がよいようにγセクレターゼ活性を変化させることが示されている（非特許文献２４）。本発明は、このように、A-βの最も病原性型として記述されるアミロイドペプチド種A-β42の産生に有利となるはずである（非特許文献２５）。
【００１０】
【非特許文献１】
マカン（MaKhann, G.）、ドラクマン（Drachman, D.）、フォルスタイン（Folstein, M.）、カッツマン（Katzman, R.）、プライス（Price, D.）、スタドラン（Stadlan, E.M.）、「アルツハイマー病の臨床診断：米国保健社会福祉省アルツハイマー病特別調査団の支援によるNINCDS-ADRDA作業部会報告書（Clinical diagnosis of Alzheimer's disease：report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease）」、「Neurology」、1984年、第34巻、p.939〜944
【非特許文献２】
スコラー（Scorer, C.A.）、「アルツハイマー病の疾患改変治療を開発するための前臨床および臨床での課題（Preclinical and clinical challenges in the development of disease-modifying therapies for Alzheimer's disease）」、「DDT」、2001年、第6巻、p.1207〜1219
【非特許文献３】
グレナー（Glenner, G.G.）、ウォン（Wong, C.W.）、「アルツハイマー病とダウン症候群：独自の脳血管アミロイド微細繊維タンパク質の共有（Alzheimer's disease and Down's syndrome：sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein）」、「Biochem. Biophys. Res. Commun.」、1984年、第22巻、p.1131〜1135
【非特許文献４】
スピランティーニ（Spillantini, M.G.）、ゴーデルト（Goedert, M.）、ジェークス（Jakes, R.）、クルグ（Klug, A.）、「アルツハイマー病におけるアミロイド斑と神経原繊維変化に対するβアミロイドの異なる立体配置状態とその分布（Different configurational states of beta-amyloid and their distributions relative to plaques and tangles in Alzheimer's disease）」、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」、1990年、第87巻、p.3947〜3951
【非特許文献５】
シャルティエ-ハーリン（Chartier-Harlin, M.C.）、クラウフォード（Crawford, F.）、ホールデン（Houlden, H.）、ワレン（Warren, A.）、ヒュージズ（Hughes, D.）、フィダニ（Fidani, L.）、ゴート（Goate, A.）、ロッサー（Rossor, M.）、ロケス（Roques, P.）、ハーディ（Hardy, J.）ら、「早発型アルツハイマー病はβアミロイド前駆体タンパク質遺伝子のコドン717位の変異によって引き起こされる（Early-onset Alzheimer's disease caused by mutations at codon 717 of the beta-amyloid precursor protein gene）」、「Nature」、1991年、第353巻、p.844〜846
【非特許文献６】
ゴート（Goate, A.）、シャルティエ-ハーリン（Chartier-Harlin, M.C.）、ミュラン（Mullan, M.）、ブラウン（Brown, J.）、クラウフォード（Crawford, F.）、フィダニ（Fidani, L.）、ジウフラ（Giuffra, L.）、ヘインズ（Haynes, A.）、アービン（Irving, N.）、ジェームス（James, L.）ら、「家族性アルツハイマー病とアミロイド前駆体タンパク質遺伝子におけるミスセンス変異との分離（Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease）」、「Nature」、1991年、第349巻、p.704〜706
【非特許文献７】
ミュレル（Murrell, J.）、ファーロウ（Farlow, M.）、ゲッティ（Ghetti, B.）、ベンソン（Benson, M.D.）、「遺伝性アルツハイマー病に関連したアミロイド前駆体タンパク質における変異（A Mutation in the amyloid precursor protein associated with hereditary Alzheimer's disease）」、「Science」、1991年、第254巻、p.7〜9
【非特許文献８】
ミュラン（Mullan, M.）、ホールデン（Houlden, H.）、ウィンデルスペクト（Windelspecht, M.）、フィダニ（Fidani, L.）、ロンバルディ（Lombardi, C.）、ディアズ（Diaz, P.）、ロサー（Rossor, M.）、クルック（Crook, R.）、ハーディ（Hardy, J.）、ダフ（Duff, K.）ら、「α1-アンチキモトリプシン遺伝子に近位の第14染色体の長腕上の家族性早発型アルツハイマー病の座（A locus for familial early-onset Alzheimer's disease on the long arm of chromosome 14, proximal to the alpha 1-antichymotrypsin gene）」、「Nat. Genet.」、1992年、第2巻、p.340〜342
【非特許文献９】
シェリントン（Sherrington, R.）、ロガエフ（Rogaev, E.I.）、リャン（Liang, Y.）、ロガエバ（Rogaeva, E.A.）、レベスク（Levesque, G.）、イケダ（Ikeda, M.）、チ（Chi, H.）、リン（Lin, C.）、リ（Li, G.）、ホルマン（Holman, K.）ら、「早発型家族性アルツハイマー病におけるミスセンス変異を有する遺伝子のクローニング（Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease）」、「Nature」、1995年、第375巻、p.754〜760
【非特許文献１０】
レビー-ラハド（Levy-Lahad, E.）、ウィスマン（Wijsman, E.M.）、ネメンス（Nemens, E.）、アンダーソン（Anderson, L.）、ゴッダール（Goddard, K.A.）、ウェーバー（Weber, J.L.）、バード（Bird, T.D.）、シェレンバーグ（Schellenberg, G.D.）、「第一染色体における家族性アルツハイマー病の座（A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1）」、「Science」、1995年、第269巻、p.970〜973
【非特許文献１１】
シトロン（Citron, M.）、テプロウ（Teplow, D.B.）、セルコー（Selkoe, D.J.）、「アミロイドβタンパク質のその前駆体からの産生は配列特異的である（Generation of amyloid beta protein from its precursor is sequence specific）」、「Neuron」、1995年、第14巻、p.661〜670
【非特許文献１２】
スーベルト（Seubert, P.）、ビゴ-ペルフレー（Vigo-Pelfrey, C.）、エスク（Esch, F.）、リー（Lee, M.）、ドベイ（Dovey, H.）、デービス（Davis, D.）、シンハ（Sinha, S.）、シュロスマッハー（Schlossmacher, M.）、ホワレー（Whaley, J.）、スウィンドルハースト（Swindlehurst, C.）、「体液からの可溶性アルツハイマー病βペプチドの単離と定量（Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids）」、「Nature」、1992年、第359巻、p.325〜327
【非特許文献１３】
シャオ（Hsiao, K.）、チャプマン（Chapman, P.）、ニルセン（Nilsen, S.）、エックマン（Eckman, C.）、ハリガヤ（Harigaya, Y.）、ヨウンキン（Younkin, S.）、ヤン（Yang, F.）、コール（Cole, G.）、「トランスジェニックマウスにおける相関的記憶欠損、A-β上昇、およびアミロイド斑（Correlative memory deficits, A beta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice）」、「Science」、1996年、第274巻、p.99〜102
【非特許文献１４】
ゲームス（Games, D.）、アダムス（Adams, D.）、アレッサンドリーニ（Alessandrini, R.）、バーバー（Barbour, R.）、ベルテレット（Berthelette, P.）、ブラックウェル（Blackwell, C.）、カー（Carr, T.）、クレメンス（Clemens, J.）、ドナルドソン（Donaldson, T.）、ギレスピー（Gillespie, F.）、「V717Fβアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおけるアルツハイマー型神経変性（Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F beta-amyloid precursor protein）」、「Nature」、1995年、第373巻、p.523〜527
【非特許文献１５】
ファン・リューベン（Van Leuven, F.）、「アルツハイマー病のモデルとしての単および多重トランスジェニックマウス（Single and multiple transgenic mice as models for Alzheimer's Disease）」、「Progress in Neurobiology」、2000年、第61巻、p.305〜312
【非特許文献１６】
エミリエン（Emilien, G.）、マロテュー（Maloteaux, J.M.）、ベイリューター（Beyreuther, K.）およびマスターズ（Masters, C.L.）、「アルツハイマー病。マウスモデルは、治療機会の道を開く（Alzheimer's Disease. Mouse models pave the way for therapeutic opportunities）」、「Arch. Neurol.」、2001年、第57巻、p.176
【非特許文献１７】
クルッツ（Cruts, M.）、ダーモー（Dermaut, B.）、レイドマーカース（Rademakers, R.）、ロクス（Roks, G.）、ファンデンブローク（Van den Broeck, M.）、ムンテーニュ（Munteanu, G.）、ファンドゥイ（van Duij, C.M.）、ファンブロークホーフェン（Van Broeckhoven, C.）、「アミロイドβセクレターゼ遺伝子（BACE）は、早発型アルツハイマー病において変異していないし、または関連していない（Amyloid beta secretase gene (BACE) is neither mutated in nor associated with early-onset Alzheimer's disease.）」、「Neurosci. Lett.」、2001年、第313巻、p.105〜107
【非特許文献１８】
カイ（Cai, H.）、ワン（Wang, Y.）、マッカーシー（McCarthy, D.）、ウェン（Wen, H.）、ボルチェルト（Borchelt, D.R.）、プライス（Price, D.L.）およびウォン（Wong, P.C.）、「BACE1はニューロンによるA-βペプチドの産生にとって主要なβセクレターゼである（BACE1 is the major beta-secretase for generation of A-beta peptides by neurons）」、「Nat. Neuroscience」、2001年、第4巻、p.233
【非特許文献１９】
ルオ（Luo, Y.）、ボロン（Bolon, B.）、カーン（Kahn, S.）、ベネット（Bennett, B.D.）、バブ-カン（Babu-Khan, S.）、デニス（Denis, P.）、ファン（Fan, W.）、カ（Kha, H.）、ザン（Zhang, J.）、ゴン（Gong, Y.）、マーチン（Martin, L.）、ルイス（Louis, J.C.）、ヤン（Yan, Q.）、リチャーズ（Richards, W.G.）、シトロン（Citron, M.）、ワッサー（Vassar, R.）、「アルツハイマーのβセクレターゼであるBACE1を欠損するマウスは正常な表現型を有し、βアミロイドを産生しない（Mice deficient in BACE1, the Alzheimer's beta-secretase, have normal phenotype and abolished beta-amyloid generation）」、「Nat. Neurosci.」、2001年、第3巻、p.231〜232
【非特許文献２０】
ロバーズ（Roberds, S.L.）、アンダーソン（Anderson, J.）、バジ（Basi, G.）、ビエンコウスキ（Bienkowski, M.J.）、ブランステッター（Branstetter, D.G.）、チェン（Chen, K.S.）、フリードマン（Freedman, S.B.）、フリゴン（Frigon, N.L.）、ゲームス（Games, D.）、フ（Hu, K.）、ジョンソン-ウッド（Johnson-Wood, K.）、カッペンマン（Kappenman, K.E.）、カワベ（Kawabe, T.T.）、コラ（Kola, I.）、クーン（Kuehn, R.）、リー（Lee, M.）、リウ（Liu, W.）、モッター（Motter, R.）、ニコルス（Nichols, N.F.）、パワー（Power, M.）、ロバートソン（Robertson, D.W.）、シェンク（Schenk, D.）、スクー（Schoor, M.）、ショップ（Shopp, G.M.）、シャック（Shuck, M.E.）、シンハ（Sinha, S.）、スベンソン（Svensson, K.A.）、タツノ（Tatsuno, G.）、チントルップ（Tintrup, H.）、ウィスマン（Wijsman, J.）、ライト（Wright, S.）、マッコンログ（McConlogue, L.）、「BACEノックアウトマウスは脳における主要なβセクレターゼ活性を欠損するにもかかわらず健康である：アルツハイマー病の治療に関する意味（BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary beta-secretase activity in brain：implications for Alzheimer's disease therapeutics）」、「Hum. Mol. Genet.」、2001年、第10巻、p.1317〜1324
【非特許文献２１】
キオッコ（Chiocco, M.J.）およびラム（Lamb, B.T.）、「ゲノムに基づくβセクレターゼトランスジェニックマウスの作製と特徴付け（Generation and characterization of genomic-based beta-secretase transgenic mice）」、「Soc. Neurosci. Abstr.」、2001年、第13647号、27
【非特許文献２２】
ボデンドルフ（Bodendorf, U.）、スタークラー-ピエラ（Sturchler-Pierrat, C.）、クリストナハター（Christnacher, A.）、ゾマー（Sommer, B.）、スタウフェンビール（Staufenbiel, M.）およびパガネッティ（Paganetti, P.）、「ヒトBACEに関してトランスジェニックであるマウスは、インビボでβセクレターゼ活性の増加を示す（Mice transgenic for human BACE show increased beta-secretase activity in vivo）」、「Soc. Neurosci. Abstr.」 2001年、第13445号、27
【非特許文献２３】
バッサー（Vassar, R.）、ベネット（Bennett, B.D.）、バブ-カン（Babu-Khan, S.）、カーン（Kahn, S.）、メンディアズ（Mendiaz, E.A.）、デニス（Denis, P.）、テプロウ（Teplow, D.B.）、ロス（Ross, S.）、アマランテ（Amarante, P.）、ロエロフ（Loeloff, R.）、ルオ（Luo, Y.）、フィッシャー（Fisher, S.）、フュラー（Fuller, J.）、エデンソン（Edenson, S.）、ライル（Lile, J.）、ヤロシンスキ（Jarosinski, M.A.）、ビエル（Biere, A.L.）、キュラン（Curran, E.）、バーゲス（Burgess, T.）、ルイス（Louis, J.C.）、コリンズ（Collins, F.）、トレアノール（Treanor, J.）、ロジャース（Rogers, G.）、シトロン（Citron, M.）、「膜貫通アスパルティックプロテアーゼBACEによるアルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質のβセクレターゼ切断（Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE）」、「Science」、1999年10月22日、第286巻、第5440号、p.735〜41
【非特許文献２４】
リヒテンタラー（Lichtenthaler, S.F.）、イダ（Ida, N.）、マルタウプ（Multhaup, G.）、マスターズ（Masters, C.L.）、ベイリューター（Beyreuther K.）、「γセクレターゼ特異性を変化させるAPPの膜貫通ドメインの変異（Mutations in the transmembrane domain of APP altering gamma-secretase specificity）」、「Biochemistry」、1997年12月9日、第36巻、第49号、p.15396〜15403
【非特許文献２５】
バウマイスター（Baumeister, R.）、アイマー（Eimer, S.）、「アミロイド凝集体、プレセニリン、およびアルツハイマー病（Amyloid aggregates, presenilins, and Alzheimer's disease）」、「Angew. Chem. Int. Ed.」、1998年、第37巻、第21号、p.2978〜2982
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、アミロイドパシーを含む神経変性疾患、特にADのモデルとするために、マウス等の新規非ヒト動物モデルを提供することを課題とする。より詳しく述べると、本発明の目的は、調節配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、調節配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列とを含むDNAをゲノムに組み入れるトランスジェニック非ヒト動物を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アミロイドパシー、特にアルツハイマー病を含む疾患をモデルとするため有用な新規二重トランスジェニック非ヒト動物に関する。より詳しくは、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（APP）とβセクレターゼ（BACE）のトランスジェニック操作を含む動物モデルに関する。ヒトBACEおよびヒトAPPロンドン型を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した。そのようなトランスジェニック動物は、アミロイドパシーを治療するための特異的および一般的治療を開発するために、ならびに新規抗アミロイド形成化合物を同定するスクリーニング方法において有用性を有すると思われる。本発明はさらに、そのようなトランスジェニック動物を作製する方法、そのような動物に由来する細胞と共に、アミロイドパシーの治療において有用な化合物をスクリーニングするためのこれらの細胞を含むキット、およびそのような新規トランスジェニック動物を用いて、A-β産生、アミロイドーシス、神経変性およびAD病理に及ぼすβセクレターゼ活性のインビボ作用の評価に向けられている。
【００１３】
本発明に係る方法においては、（１）ゲノムが、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列と、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列とを含むDNAを組み入れており、方法が、
（a）ヒトβセクレターゼをコードするコード配列とコード配列に機能的に結合した調節配列とを含むDNA構築物を細胞または胚に導入する段階、
（b）ヒトAPPロンドン型をコードするコード配列とコード配列に機能的に結合した調節配列とを含むDNA構築物を細胞または胚に導入する段階、
（c）上記の細胞または胚のそれぞれからトランスジェニック動物を作製する段階、および
（d）上記のトランスジェニック動物を交配させる段階
を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係る方法においては、（２）プリオンプロモーター調節配列がヒトβセクレターゼのコード配列に機能的に結合し、Thy-1プロモーター調節配列がヒトAPPロンドン型のコード配列に機能的に結合している上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る方法においては、（３）ヒトβセクレターゼのコード配列が配列番号：８である上記(1)または(2)に記載の方法であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る方法においては、（４）ヒトAPPロンドン型のコード配列が配列番号：１である上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法であることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（５）そのゲノムが、調節配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、調節配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列とを含むDNAを組み入れるトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（６）ヒトβセクレターゼのコード配列がプリオンプロモーター配列に機能的に結合し、ヒトAPPロンドン型のコード配列がThy-1プロモーター配列に機能的に結合している上記(5)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（７）ヒトβセクレターゼのコード配列が配列番号：８である上記(5)または(6)に記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（８）ヒトAPPロンドン型のコード配列が配列番号：１である上記(5)〜(7)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（９）アルツハイマー病と類似の一つまたはそれ以上の組織病理を示す上記(5)〜(8)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（１０）動物が齧歯類である上記(5)〜(9)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（１１）動物がマウスである上記(5)〜(10)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
【００２４】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物の子孫においては、（１２）同じかまたは別の表現型と交配して得られた上記(5)〜(11)のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係る細胞株または初代細胞培養物においては、（１３）上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する細胞株または初代細胞培養物であることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る臓器型脳切片培養物においては、（１４）上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する臓器型脳切片培養物であることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る使用においては、（１５）アルツハイマー病を含むアミロイドパシーのモデルとしての上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(13)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(14)記載の臓器型脳切片培養物の使用であることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る方法においては、（１６）試験化合物を上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する段階、ならびにAPP切断産物の量、神経病理、および行動の変化を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定する段階を含む、脳変性病態の予防または治療において用いられる試験化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る方法においては、（１７）脳変性病態がアルツハイマー病である上記(16)記載の方法であることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係る方法においては、（１８）試験化合物を上記(14)記載の臓器型脳切片培養物に投与する段階、およびAPP切断産物の量を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定する段階を含む、脳変性病態の予防または治療に用いられる試験化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る方法においては、（１９）脳変性病態がアルツハイマー病である上記(18)記載の方法であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係る方法においては、（２０）試験化合物を上記(13)記載の細胞株または初代細胞培養物に投与する段階、およびAPP切断産物の量を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定する段階を含む、脳変性病態の予防または治療に用いられる試験化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る方法においては、（２１）脳変性病態がアルツハイマー病である上記(20)記載の方法であることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係る方法においては、（２２）上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物をその治療に曝露する段階と、APP切断産物の量および位置、神経病理、ならびに構造の変化に及ぼす治療の効果を決定する段階とを含む、A-βの過剰発現に関連した脳変性病態を治療する有効性を試験する方法であることを特徴とする。
【００３５】
本発明に係る方法においては、（２３）上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物における、APP切断産物の量、神経病理および行動の変化を含む疾患マーカーを決定する段階を含む、A-βペプチド産生、アミロイドーシス、神経変性およびアルツハイマー病理に及ぼすβセクレターゼ活性のインビボ作用を評価する方法であることを特徴とする。
【００３６】
本発明に係る方法においては、（２４）疾患マーカーが対照動物の疾患マーカーと比較される上記(23)記載の方法であることを特徴とする。
【００３７】
本発明に係るキットにおいては、（２５）上記(13)記載の細胞株または初代細胞培養物と上記の細胞におけるトランスジーンの過剰発現に関連した作用を試験化合物が阻害するか否かを決定するための手段とを含む、アルツハイマー病を含む脳変性病態の予防または治療において有用な試験化合物をスクリーニングするためのキットであることを特徴とする。
【００３８】
本発明に係る薬学的組成物においては、（２６）上記(16)〜(21)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって同定された試験化合物と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００３９】
本発明に係る薬学的組成物においては、（２７）アルツハイマー病を含む脳変性病態の治療に用いられる上記(16)〜(21)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって同定された試験化合物と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００４０】
本発明に係る方法においては、（２８）上記(16)〜(21)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法と、同定された化合物を改変する段階と、得られた化合物を薬学的に許容される担体と共に製剤化する段階とを含む、薬学的組成物を作製する方法であることを特徴とする。
【００４１】
本発明に係る使用においては、（２９）アルツハイマー病を含む脳変性病態を治療するための上記(16)〜(21)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって同定された試験化合物の使用であることを特徴とする。
【００４２】
本発明に係る使用においては、（３０）アルツハイマー病を含む脳変性病態を治療する薬剤を調製するための上記(16)〜(21)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって同定された試験化合物の使用であることを特徴とする。
【００４３】
本発明に係る使用においては、（３１）脳変性疾患を予防または治療するのに有用な化合物をスクリーニングするための上記(5)〜(12)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物、上記(13)記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または上記(14)記載の臓器型脳切片培養物の使用であることを特徴とする。
【００４４】
本発明に係るトランスジェニック動物、方法、組成物、キット、および使用においては、（３２）実施例を特に参照にして、実質的に本明細書において記述されるようなトランスジェニック動物、方法、組成物、キット、および使用であることを特徴とする。
【００４５】
【発明の実施の形態】
本明細書において用いられるように、「βセクレターゼ」とは、A-βのN末端を作製するアルパルチルプロテアーゼとして定義される。好ましいβセクレターゼは、ヒトBACEおよびBACE-2である。最も好ましくは、配列番号：９に開示されるアミノ酸配列を有するヒトBACEである。配列番号：９のBACEアミノ酸配列は、配列番号：８に開示されるヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。βセクレターゼは、完全長のβセクレターゼまたは活性部位を少なくとも示す切断型βセクレターゼとなりうる。好ましくは、βセクレターゼは完全長のβセクレターゼである。βセクレターゼは、そのような置換が一般的にβセクレターゼ活性を変化させなければアミノ酸置換を含んでもよい。本質的に生物活性を変化させないタンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、当技術分野において既知であり、ニューラスおよびヒル（H. Neurath and R.L. Hill、「タンパク質（The Proteins）」、アカデミック出版、ニューヨーク（1979））によって記述されている。上記のように分類される一般的な６つのクラスのアミノ酸側鎖には以下が含まれる：クラスI（システイン）；クラスII（セリン、トレオニン、プロリン、アラニン、グリシン）；クラスIII（アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸）；クラスIV（ヒスチジン、アルギニン、リジン）；クラスV（イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン）；およびクラスVI（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）。βセクレターゼはさらに、「リンカー」配列によってコードされるいくつかのアミノ酸の配列を含みうる。これらの配列は、βセクレターゼの組み換え型発現のために用いられる発現ベクターからの結果として生じる。本発明のβセクレターゼはまた、シグナル配列であるN末端に結合した特異的配列を含みうる。
【００４６】
APPに関して、中でも最も豊富に存在する３つのイソ型のAPP695、APP751、およびAPP770をコードする多くのcDNA型が同定されている。これらの型は、別のスプライシングによって単一の前駆体RNAから生じる。遺伝子は、エキソン18個を含む175 kb以上に及ぶ（ヨシカイ、ササキ、ドウウラ、フルヤ、サカキ（Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakai Y）、「ヒトアミロイドβタンパク質前駆体遺伝子のゲノム構築（Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene）」、Gene 1990、87(2)：257〜63）。APPは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインを含む。A-βは、疎水性膜貫通ドメインのすぐ外側の28個までのアミノ酸と、この15残基までの膜貫通ドメインによって構成される。このように、A-βは、通常、脳ならびに心臓、腎臓および脾臓のような他の組織において認められるAPPに由来する切断産物である。しかし、A-β沈着は通常、脳に限って多量に認められる。別のより大きい型のAPP（APP751、APP770）は、APP695に一つまたは二つのさらなるドメインを加えて構成される。APP751は、APP695の全てのアミノ酸695個に加えてクニッツ（kunitz）ファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤（KPI）と相同性を有するさらなるアミノ酸56個からなる（タンジ、マクラッチェイ、ランペルティ、ビラ-コマロフ、グセラ、ネーベ（Tanzi RE, McClatchey AI, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL）、「アルツハイマー病に関連したアミロイドタンパク質前駆体mRNAによってコードされるプロテアーゼ阻害剤ドメイン（Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer's disease）」、Nature 1988、331：528〜30；ワイデマン、コニッヒ、ブンケ、フィッシャー、サルバウム、マスターズ、ベイリューター（Weidemann A, Konig G, Bunke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K）、「アルツハイマー病A4アミロイドタンパク質の前駆体の同定、生合成、および局在（Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer's disease A4 amyloid protein）」、Cell 1989年４月７日；57(1)：115〜26；キタグチ、タカハシ、トクシマ、シオジリ、イトウ（Kitaguchi N, Takahashi Y, Tokushima Y, Shiojiri S, Ito H）、「アルツハイマー病アミロイドタンパク質の新規前駆体はプロテアーゼ阻害活性を示す（Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity）」、Nature 1988年２月11日；331（6156）：530〜2；タンジ、セントジョージ-ヒスロップ、ハイネス、ポリンスキー、ニー、フォンシン、ネーベ、マクラッチェイ、コンネアリー、グセラ（Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey AI, Conneally PM, Gusella JF）、「家族性アルツハイマー病における遺伝子欠損はアミロイドβタンパク質遺伝子に厳密に連鎖していない（The genetic defect in familial Alzheimer's disease is not tightly linked to the amyloid beta-protein gene）」、Nature 1987、329（6135）：156〜7）。APP770は、APP751のアミノ酸751個全てと、ニューロン細胞表面抗原OX-2に相同なさらなるアミノ酸19個のドメインとを含む（ワイデマン（Weidemann）ら、1989；キタグチ（Kitaguchi）ら、1988）。特に明記していなければ、本明細書において言及するアミノ酸の位置は、それらがAPP770において出現する位置である。APP695およびAPP751における同等の位置のアミノ酸番号は、場合によってはOX-2およびKPIドメインが存在しないために異なる。慣例的に、APPの全ての��のアミノ酸の位置は、APP770型における同等の位置を参考にしている。特に明記していなければ、本明細書はこの慣例に従う。特に明記していなければ、A-βの全ての型を含む、本明細書において言及されるAPPおよびAPPの断片の全ての型は、本明細書においてヒトAPPアミノ酸配列に基づく。APPは、リーダー配列を除去して、硫酸塩および糖基を付加することによって翻訳後改変される。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「APPロンドン型」（APPLo）は、A-β42ペプチドの産生が特異的に増加するようにアミロイドペプチドの産生に影響を及ぼす天然または人工的な変異のいずれかを一つまたはそれ以上含む先に定義したAPPイソ型として定義される。以下を含む、病理的関連性を有するγセクレターゼ切断部位周辺の天然のAPP変異が好ましい：
−  T714I（クマール-シング、デジョネ、クルツ、クライナート、ワン、メルケン、デストルーパー、ファンデルスチッチェレ、ロフグレン、ファンデルホーフェン、バックホーフェンス、ファンメッチェレン、クロイセル、ファンブロークホーフェン（Kumar-Singh S, De Jonghe C, Cruts M, Kleinert R, Wang R, Mercken M, De Strooper B, Vanderstichele H, Lofgren A, Vanderhoeven I, Backhovens H, Vanmechelen E, Kroisel PM, Van Broeckhoven C）、「γ(42)-セクレターゼ部位変異による非繊維様の散在性アミロイド沈着はアルツハイマー病におけるN切断型A-β(42)の本質的な役割を指摘する（Nonfibrillar diffuse amyloid deposition due to a gamma(42)-secretase site mutation points to an essential role for N-truncated A beta(42) in Alzheimer's disease）」、Hum. Mol. Genet. 2000年11月１日；9(18）：2589〜98）。
−  V715M（アンコリオ、ダンマンチン、バレリ、ワルテル、ブライス、キャンピオン、フレボーグ、チェクラー（Ancolio K, Dunmanchin C, Barelli H, Warter JM, Brice A, Campion D, Frebourg T, Checler F）、「新しいVal715からMetへのβAPP770変異によるβアミロイド前駆体タンパク質（βAPP）成熟の異常な表現型の変化は、おそらく早発型アルツハイマー病の原因である（Unusual phenotypic alteration of beta amyloid precursor protein (beta APP)maturation by a new Vel-715 --> Met betaAPP770 mutation responsible for probable early-onset Alzheimer's disease）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999年３月30日；96(7)：4119〜24）。
−  I716V（エックマン、メータ、クルック、ペレツ-ツール、プリハール、ファイファー、グラフ-ラドフォード、ヒンダー、ヤガー、ゼンク、レフォロ、プラダ、ヨーンキン、ハットン、ハーディ（Eckman CB, Mehta ND, Crook R, Perez-tur J, Prihar G, Pfeiffer E, Graff-Radford N, Hinder P, Yager D, Zenk B, Refolo LM, Prada CM, Younkin SG, Hutton M, Hardy J）、「APP遺伝子における新しい病的変異（I716V）はA-β42(43)の相対的割合を増加させる（A new pathogenic mutation in the APP gene(I716V)increases the relative proportion of A beta 42(43)）」、Hum. Mol. Genet. 1997年11月；6(12)：2087〜9）。
−  V717F（ミュレル、ファーロウ、ゲッティ、ベンソン（Murrell J, Farlow M, Ghetti B, Benson MD）、「遺伝性アルツハイマー病に関連するアミロイド前駆体タンパク質の変異（A mutation in the amyloid precursor protein associated with hereditary Alzheimer's disease）」、Science 1991年10月４日；254(5028)：97〜9）。
−  V717G（シャルティエ-ハーリン、クラウフォード、ホールデン、ワレン、ヒュージズ、フィダニ、ゴート、ロッサー、ロケス、ハーディ（Chartier-Harlin MC, Crawford F, Houlden H, Warren A, Hughes D, Fidani L, Goate A, Rossor M, Roques P, Hardy J）ら、「βアミロイド前駆体タンパク質遺伝子のコドン717位での変異によって引き起こされた早発型アルツハイマー病（Early-onset Alzheimer's disease caused by mutations at codon 717 of the beta-amyloid precursor protein gene）」、Nature 10月31日；353(6347)：844〜6）。
−  V717I（ゴート、シャルティエ-ハーリン、ミュラン、ブラウン、クラウフォード、フィダニ、ジウフラ、ヘインズ、アービン、ジェームス（Goate A, Chartier-Harlin MC, Mullan M, Brown J, Crawford F, Fidani L, Giuffra L, Haynes A, Irving N, James L）ら、「家族性アルツハイマー病とアミロイド前駆体タンパク質遺伝子におけるミスセンス変異との分離（Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease）」、Nature 1991年２月21日；349(6311)：704〜6）。
−  V717L（ミュレル、ヘイク、ケイド、ファーロウ、ゲッティ（Murrell JR, Haek AM, Quaid KA, Farlow MR, Ghetti B）、「アミロイド前駆体タンパク質遺伝子における新規変異（V717L）によって引き起こされた早発型アルツハイマー病（Early-onset Alzheimer's disease caused by a new mutation(V717L) in the amyloid precursor protein gene）」、Arch. Neurol. 2000年６月；57(6)：885〜7）。
−  L723P（ウォク、リ、ハルップ、ホワイト、エームス、ベイリューター、マスターズ、スコフィールド（Kwok JB, Li QX, Hallupp M, Whyte S, Ames D, Beyreuther K, Masters CL, Schofield PR）、「新規Leu723Proアミロイド前駆体タンパク質変異はアミロイドβ42(43)ペプチドレベルを増加させてアポトーシスを誘導する（Novel Leu723Pro amyloid precursor protein mutation increases amyloid beta42(43) peptide levels and induces apoptosis）」、Ann. Neurol. 2000年２月；47(2)：249〜53）。
【００４８】
人工的変異（A-βドメイン外の膜貫通領域における全ての残基の置換）も同様に好ましく、その例およびγセクレターゼ切断に及ぼすその結果は、リヒテンタラーと共同研究者（リヒテンタラー、ワン、グリム、ウルジョン、マスターズ、ベイリューター（Lichtenthaler SF, Wang R, Grimm H, Uljon SN, Masters CL, Beyreuther K）、「アミロイド前駆体タンパク質の膜貫通ドメインのフェニルアラニン走査変異誘発によって同定されたアルツハイマー病γセクレターゼの切断特異性のメカニズム（Mechanism of the cleavage specificity of Alzheimer's disease gamma-secretase identified by phenylalanine-scanning mutagenesis of the transmembrane domain of the amyloid precursor protein）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999年３月16日；96(6)：3053〜8）によって記載されている。
【００４９】
より好ましくは、天然のV717F変異を含むヒトAPPロンドン型である。最も好ましくは配列番号：１によってコードされるヒトAPPロンドン型（APPLo）である。
【００５０】
脳変性病態は、以下のパラメータの一つまたはいくつかとして定義される：神経細胞の死、神経細胞の減少、異栄養性の軸索突起、シナプス消失、3-ニトロチロシンおよび4-ヒドロキシ-2-ノネナルのような酸化的損傷中間体の増加、炎症マーカーの存在。脳変性病態の例には、アルツハイマー病が含まれる。
【００５１】
アミロイドパシーは、組織におけるアミロイドの蓄積を特徴とする疾患である。アミロイドパシーの例には、アルツハイマー病（AD）、ダウン症候群（DS）、家族性イギリス性痴呆（FBD）、家族性アミロイド性多発性神経炎（FAP）、およびゲルストマン-ストラウスラー症候群（GSS）が含まれる。
【００５２】
より詳しく述べると、本発明は、ヒトAPPロンドン型を内因性のAPPより高レベルで発現し（図10）、内因性のBACE量より高いレベルでヒトBACEを発現する（図6）トランスジェニック非ヒト動物モデルに関する。
【００５３】
その上、本発明は、年をとるにつれてアミロイド斑と血管にアミロイド沈着を発症する、ヒトBACEとヒトAPPロンドン型とを過剰発現する二重トランスジェニック動物モデル（[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス；hBACE/hAPPLo）に関する（図11および12）。
【００５４】
より詳しく述べると、本発明は、コンゴーレッド親和性染色が11ヶ月齢で検出されうる、ヒトBACEとヒトAPPロンドン型とを過剰発現する二重トランスジェニック動物モデルに関する。
【００５５】
細胞外A-β沈着、神経原繊維変化、リン酸化τタンパク質、炎症反応（星状細胞増加症、小神経膠細胞症）、異栄養樹状突起成分、シナプス密度の喪失、およびADと類似の限局的特異性を有する骨格の変化が含まれる、ADの組織病理に類似の組織病理を一つまたはそれ以上示すトランスジェニック動物を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００５６】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳類である。より好ましくは、動物は齧歯類である。最も好ましくは動物はマウスである。
【００５７】
本発明はまた、同じかまたは別の表現型と交配させることによって得られたトランスジェニック非ヒト動物の子孫にも関する。
【００５８】
本発明はさらに、トランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する臓器型脳切片培養物と同様に細胞株または初代細胞培養物を提供する。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、トランスジェニック非ヒト動物、細胞株または臓器型脳切片培養物をアミロイドパシーのモデル、特にADのモデルとして用いることである。
【００６０】
より詳しく述べると、トランスジェニック非ヒト動物、またはそれに由来する動物細胞を用いて、ADの病理経過を調べて、APP切断産物の量、神経病理、および行動の変化に及ぼすその作用を調べることによってADの病理経過を予防または変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
【００６１】
本発明はさらに、ゲノムが、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列とを含むDNAを組み入れているトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法を提供する。
【００６２】
トランスジェニックマウスは、レダー（Leder）らに交付された米国特許第4,736,866号に記述され、およびホーガン（Hogan）ら、「マウス胚の操作：実験マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual）」、第二版、89〜204頁、プレインビュー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー研究所、アメリカ（1995）によって提供されるマイクロインジェクションの技術を用いて当技術分野において一般的に作製される。
【００６３】
トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスを作製するさらなる方法は、生殖細胞、胚細胞、幹細胞、または卵もしくはそれに由来する細胞にターゲティングベクターを導入することを含む。
【００６４】
これらの試験に関して、構築物は、マイクロインジェクションのような標準的な技法を用いて動物の胚または胚性幹細胞に導入される。細胞培養物に基づくモデルも同様に、２つの方法によって調製することができる。細胞培養物は、トランスジェニック動物から単離するか、または標準的な細胞トランスフェクション技術によって同じ構築物を用いて確立された細胞培養物から調製することができる。
【００６５】
より詳しく述べると、ゲノムが、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、調節プロモーター配列に機能的に結合したヒトβセクレターゼをコードするコード配列とを含むDNAを組み入れている二重トランスジェニック非ヒト動物を作成する方法は、以下を含む：
（a）ヒトβセクレターゼをコードするコード配列と、コード配列に機能的に結合している調節配列とを含むDNA構築物を細胞または胚に導入する段階、
（b）ヒトAPPロンドン型をコードするコード配列と、コード配列に機能的に結合している調節配列とを含むDNA構築物を細胞または胚に導入する段階、
（c）上記の細胞または胚のそれぞれからトランスジェニック動物を作製する段階、および
（d）上記のトランスジェニック動物を交配させる段階。
【００６６】
本発明に従って、二重トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法はまた、先に述べた異なる２つのDNA構築物を単一の細胞または胚に同時注入して（同じベクター構築物に結合して、または異なる２つのベクターによって互いに無関係に）、二重トランスジェニック動物を作製することを含んでいてもよい。
【００６７】
本発明の方法において用いられるベクター構築物の一つは、ヒトβセクレターゼをコードするコード配列と、コード配列に機能的に結合した調節配列とを含む。選択的に、ヒトβセクレターゼのコード配列は、ヒトβセクレターゼ遺伝子のイントロン配列によって中断されている。本発明の方法において用いられる他のベクター構築物は、調節プロモーター配列に機能的に結合したロンドン型変異を含むヒトAPPをコードするコード配列を含む。選択的に、ヒトAPPロンドン型のコード配列は、ヒトAPP遺伝子のイントロン配列によって中断されている。好ましくは、調節配列は脳組織におけるトランスジーンの発現を指示する。好ましくは、ヒトβセクレターゼのコード配列に機能的に結合した調節配列はプリオンプロモーター配列である。最も好ましくは、プリオンプロモーター配列はマウスプリオンプロモーター配列である。好ましくは、ロンドン型変異を含むヒトAPPのコード配列に機能的に結合した調節配列は、Thy-1プロモーター配列である。最も好ましくは、Thy-1プロモーター配列はマウスThy-1.2プロモーター配列である。
【００６８】
しかし、以下の基準に関して選択される他のプロモーターを用いてもよい：
−  高レベル発現
トランスジーンの高い発現を誘導することが知られているプロモーターの例：βアクチンプロモーター、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーター、メタロチオネインIプロモーター、伸張因子1-αプロモーター、プリオンタンパク質プロモーター、Thy-1プロモーター、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター。
−  脳特異的発現
脳に存在する細胞において特異的発現を誘導することが知られているプロモーターの例：メタロチオネインIIIプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター、ナトリウムチャンネルプロモーター、ニューロフィラメントM（NF-M）プロモーター、ニューロフィラメントL（NF-L）プロモーター、ニューロフィラメントH（NF-H）プロモーター、グリア筋原繊維酸性タンパク質（GFAP）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）プロモーター、プロテオリピッドタンパク質（Plp）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター、アルドラーゼCプロモーター、シナプシンIプロモーター、ロンボチンIプロモーター、ドーパミンβヒドロキシラーゼ（DBH）プロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）、プルキンエ細胞（Pcp2）プロモーター。
【００６９】
用いる構築物はまたエンハンサー配列を用いてもよい。以下から選択されるエンハンサーを用いてもよい：免疫グロブリンκ3'エンハンサー、λエンハンサー、IgH 3'エンハンサー、T細胞受容体αエンハンサー、αHS-26エンハンサー、αHS-40エンハンサー、SV40エンハンサーおよびラットインスリンII遺伝子エンハンサー。
【００７０】
以下のようなその他の要素をベクター構築物に含めてもよい：
−  プロモーターとコード配列またはコード配列の3'との間に置かれるイントロン配列。その役割は転写物の安定性を増加させることである。
−  プロモーターが由来する座とは異なる座に由来しうるポリAシグナル。一般的に用いられるポリAシグナルの例は、huGH、SV40である。
−  [プロモーター-コード配列]構築物の5'および／または3'に置かれる特異的DNA配列。それらの配列の役割は、染色質のオープンコンフォメーションにとって都合がよく、このように転写の確率を増加させる。そのような配列の例は：βグロビン座において同定された優性制御領域（DCR）（タルボット、コリス、アントニオウ、ビダル、グロスフェルド、グリーブス（Talbot D, Collis P, Antoniou M, Vidal M, Grosveld F, Greaves DR）、「組み込み部位非依存的遺伝子発現を付与するヒトβグロビン座からの優性制御領域（A dominant control region from the human beta-globin locus conferring integration site-independent gene expression）」、Nature 1989年３月23日；338(6213)：352〜5）；ライソザイム座において同定されたマトリクス結合領域（MAR）（フィ-バン、フォンクリース、オステルタグ、ストラトリング（Phi-Van L, von Kries JP, Ostertag W, Stratling WH）、「ニワトリのライソザイム5'マトリクス結合領域は、異種細胞における異種プロモーターからの転写を増加させ、トランスフェクトした遺伝子の発現に及ぼす位置の効果を減少させる（The chiken lysozyme 5' matrix attachment region increases transcription from a heterologous promotor in heterologous cells and dampens position effects on the expression of transfected genes）」、Mol. Cell. Biol. 1990年５月；10(5)：2302〜7；マクナイト、シャメイ、サンカラン、ウォール、ヘニヒハウゼン（McKnight RA, Shamay A, Sankaran L, Wall RJ, Hennighausen L）、「マトリクス結合領域はトランスジェニックマウスにおいて組織特異的遺伝子の位置非依存的調節を付与しうる（Matrix-attachment regions can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992年８月１日；89(15)：6943〜7）；メタロチオネイン座において同定されたDNA過敏性部位（DHSS）（パルミター、サンドグレン、コーラー、ブリンスター（Palmiter RD, Sandgren EP, Koeller DM, Brinster RL）、「マウスメタロチオネイン座からの遠位調節要素は、トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現を刺激する（Distal regulatory elements from the mouse metallothionein locus stimulate gene expression in transgenic mice）」、Mol. Cell. Biol. 1993年９月；13(9)：5266〜75）、ケラチン18座において同定されたAlu配列（トレイ、セセナ、レイノルズ、オシマ（Thorey IS, Cecena G, Reynolds W, Oshima RG）、「トランスジェニックマウスにおけるケラチン18遺伝子の転写孤立におけるAlu配列の関与（Alu sequence involvement in transcriptional insulation of the keratin 18 gene in transgenic mice）」、Mol. Cell. Biol. 1993年11月；13(11)：6742〜51）である。
【００７１】
トランスジーンの組み込みは、２または３週齢のマウスの尾の生検から単離したDNAを用いて5'および3'領域のゲノムサザンブロットおよびPCR分析を含む様々な方法によって検出することができる。
【００７２】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）またはノザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーションによるmRNAの定量を含むRNAレベルでの方法と共に、組織化学、イムノブロット分析およびインビトロ結合試験を含むタンパク質レベルでの方法を含む、トランスジーンの発現を検出するために用いてもよい多くの分析技法が存在することは当業者に明らかであろう。その上、トランスジーンの発現レベルの定量は、当業者に一般的であるELISA技術によって決定することができる。
【００７３】
定量的測定は、多くの標準的なアッセイ法を用いて行うことができる。例えば、転写物のレベルは、RT-PCRならびにRNアーゼ保護、ノザンブロット分析、およびRNAドットブロット分析を含むハイブリダイゼーション法を用いて測定することができる。APPおよびA-βレベルは、ELISA、ウェスタンブロット分析、および免疫組織化学によって染色した組織切片の比較によってアッセイすることができる。免疫組織化学染色と共に免疫電子顕微鏡も同様に、APPおよびA-βの特定の組織および細胞タイプへの局在を調べるために用いることができる。そのようなアッセイ法の特定の例を下記に提供する。
【００７４】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、ヌクレオチド塩基A、T、CおよびGからなるDNA、または塩基A、U（Tの代わり）、C、およびGからなるRNAであってもよい一本鎖または二本鎖分子を意味する。ポリヌクレオチドは、コード鎖またはその相補体を表してもよい。ポリヌクレオチド分子は、その配列が天然に存在する配列と同一であってもよく、または天然に存在する配列において認められるものと同じアミノ酸をコードする代わりのコドンを含んでいてもよい（レビン（Lewin）、「遺伝子V（Genes V）」、オックスフォード大学出版、第７章、1994、171〜174を参照のこと）。さらに、ポリヌクレオチド分子は、記述のようなアミノ酸の保存的置換を表すコドンを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはゲノムDNAまたはcDNAを表していてもよい。
【００７５】
トランスジェニック動物は、免疫組織化学、電子顕微鏡、磁気共鳴画像（MRI）を含む当技術分野で既知の方法、ならびに神経および認識機能を扱う行動試験によって神経病理を研究することによってさらに特徴を調べてもよい。行動試験の例は：握力、ワイヤ運動性、泳力試験、回転棒、歩行活動、モリス水中迷路、Y-字迷路、明暗嗜好性、受動的および能動的回避試験である。
【００７６】
さらに、方法が、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に化合物を投与すること、ならびにAPP切断産物の量、神経病理、および行動の変化を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を調べることを含む、脳変性病態の治療において用いられる試験化合物をスクリーニングする方法が本発明によって提供される。また、スクリーニング方法には、トランスジェニック動物に由来する臓器型脳切片培養物または細胞に試験化合物を投与することと、APP切断産物の量を含む疾患マーカーに試験化合物が及ぼす作用を決定することとが含まれ、トランスジェニック動物に由来する臓器型脳切片培養物または細胞を用いることができる。
【００７７】
上記の方法はまた、脳変性病態を予防するために用いる試験化合物をスクリーニングするために用いることができ、したがって、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に化合物を投与すること、ならびにAPP切断産物の量、神経病理、および行動の変化を含む疾患マーカーに化合物が及ぼす作用を決定することを含む、脳変性病態を予防するために用いられる試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００７８】
別の態様において、動物に化合物を投与すること、および疾患マーカーに及ぼす化合物の作用を決定することを含む、ADマーカーに及ぼす作用に関して化合物を調べる方法を提供する。
【００７９】
APP型は、化合物がアルツハイマー病に影響を及ぼすか否かを評価するためのアッセイ法にとって好ましいマーカーである。APPおよびAPP転写物の絶対レベル、異なるAPP型およびその切断産物の相対レベル、ならびにAPP発現またはプロセシングの位置は、可能性がある治療化合物による治療の効果を測定するために用いることができる、アルツハイマー病に関連する全てのマーカーである。APP切断産物の量およびアミロイド斑および軸索突起組織への局在は、これらのアッセイ法の特に好ましい標的である。
【００８０】
さらに別の態様において、トランスジェニック動物をその治療に曝露すること、ならびにAPP切断産物の量および局在、神経病理および行動の変化に及ぼす治療の影響を調べることを含む、A-βの過剰発現に関連した脳変性病態を治療するための有効性を調べる方法を提供する。
【００８１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、A-βペプチドを測定すること、脳切片の免疫組織化学および電子顕微鏡、ならびに行動試験を行うことを含む、A-βペプチド産生、アミロイドーシス、神経変性およびAD病態に及ぼすβセクレターゼ活性のインビボ作用を評価する方法も同様に提供する。さらなる態様において、疾患マーカーを対照動物と比較する。対照動物は、そのゲノムにβセクレターゼに関するトランスジーンを含まない動物、および／またはそのゲノムに如何なるトランスジーンも含まない動物であってもよい。
【００８２】
その上、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に由来する細胞株または初代細胞培養物と、上記の細胞におけるトランスジーンの過剰発現に関連した作用を化合物が阻害するか否かを決定する手段とを含む、ADを含む脳変性病態の治療において有用な化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。キットはまた、ADを含む脳変性病態の予防において有用な化合物をスクリーニングするために用いてもよい。
【００８３】
本明細書において用いられるように、「試験化合物」とは、本明細書に記載のトランスジェニック動物と共にそれに由来する臓器型脳切片培養物または細胞を用いて、脳変性病態、例えばADを予防、阻害、または逆転させるか否かをスクリーニングすべき如何なる化合物も意味すると解釈される。同様に、ADの予防、阻害、または逆転において活性な「試験化合物」は、その後A-β産生を含む脳変性病態を治療するため、好ましくはADを治療するための薬学的組成物において用いることができると理解される。
【００８４】
本発明の方法に従って試験および同定することができる化合物は、発現ライブラリ、例えばcDNA発現ライブラリ、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、有機低分子、ホルモン、ペプチド模倣体、PNA等であってもよい（ミルナー（Milner J）、「DNA損傷、p53と抗癌療法（DNA damage, p53 and anticancer therapies）」、Nat. Med. 1995、1：879〜880；ハップ（Hupp TR）、「低分子ペプチドはp53の潜在的配列特異的DNA結合機能を活性化する（Small pepties activate the latent sequence-specific DNA binding function of p53）」、Cell 1995、83：237〜245；ギブス、オリフ（Gibbs JB, Oliff A）、「分子腫瘍学における薬学研究（Pharmaceutical research in molecular oncology）」、Cell 1994年10月21日；79(2)：193〜8）。
【００８５】
上記の方法によって単離された化合物はまた、類似体化合物を開発するためのリード化合物として役立てることができる。類似体化合物の同定は、自己無撞着場（SCF）分析、立体配置相互作用（CI）分析、および通常モードの動態分析のような技術を用いることによって行うことができる。これらの技術を実行するためのコンピュータープログラム；例えば、レイン（Rein）、「受容体-リガンド相互作用のコンピューターを用いたモデリング（Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions）」、（アランリス、ニューヨーク、1989）が利用できる。化学誘導体および類似体を調製する方法は、当業者に周知であり、例えば、ベイルスタイン（Beilstein）の「有機化学ハンドブック（Handobook of Organic Chemistry）」、スプリンガー版、ニューヨークインク（175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010アメリカ）および「有機合成（Organic Synthesis）」、ウィリー、ニューヨーク、アメリカに記載されている。さらに、上記の誘導体および類似体は当技術分野で既知の方法に従ってその作用を調べることができる；同様に上記を参照のこと。さらに、ペプチド模倣体および／または適当な誘導体および類似体のコンピューターを用いた設計は、例えば上記の方法に従って使用することができる。医薬品開発におけるリード作製のための方法も同様に、タンパク質、ならびに質量分析（チェン（Cheng）ら、J. Am. Chem. Soc. 1995、117：8859〜60）およびいくつかの核磁気共鳴（NMR）法（フェゾ（Fejzo）ら、Chem. Biol. 1999、6：755〜69；リン（Lin）ら、J. Org. Chem. 1997、62：8930〜8931）のような検出方法を用いることが含まれる。
【００８６】
さらなる態様において、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって同定された試験化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００８７】
本発明はさらに、ADを含む脳変性病態の治療のために用いられる本発明のスクリーニング法によって同定された試験化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００８８】
従って、本発明はまた、（i）脳変性病態の治療において有用であると同定された試験化合物またはその類似体もしくは誘導体を、治療的に有効量の薬剤を被験者に提供するために十分な量で合成する段階；および／または（ii）脳変性病態の治療において有用であると同定された試験化合物またはその類似体もしくは誘導体を薬学的に許容される担体と合わせる段階を含む、医薬品を産生する方法にも関する。
【００８９】
さらに、本発明は、本発明のスクリーニング法と、同定された化合物を改変する段階と、得られた化合物を薬学的に許容される担体と共に製剤化する段階とを含む、薬学的組成物を調製する方法に関する。
【００９０】
「薬学的に許容される」という句は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に釣り合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織に接触して用いるのに適している化合物、材料、組成物、および／または投与剤形を言及するために用いられる。
【００９１】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される塩」とは、その酸または塩基性の塩を作製することによって親化合物が改変されている、開示の化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容される塩の例には、アミンのような塩基性残基の無機または有機酸の塩；カルボン酸のような酸性残基のアルカリまたは有機塩等が含まれるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機または有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性の塩または四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等のような無機酸に由来する塩；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルフアニリン酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸等のような有機酸から調製した塩が含まれる。
【００９２】
本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学法によって、塩基または酸部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基型を、水または有機溶媒中、またはその両者の混合物中、適当な塩基または酸の化学量論的量に反応させることによって調製することができる；一般的にエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性溶媒が好ましい。適する塩のリストは、その開示が参照として本明細書に組み入れられている、「レミントンの製薬化学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第17版、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州、1985年、1419頁に認められる。
【００９３】
本発明はさらに、ADを含む脳変性病態を治療するために本発明のスクリーニング法によって同定された試験化合物を用いることを提供する。
【００９４】
その上、ADを含む脳変性病態を治療する薬剤を調製するために本発明のスクリーニング法によって同定された試験化合物を用いることを提供する。
【００９５】
さらなる態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物、それに由来する細胞株もしくは初代細胞培養物、または臓器型脳切片培養物を、脳変性疾患を予防または治療するのに有用な化合物をスクリーニングするために用いることを提供する。
【００９６】
一般的に本発明を記述してきたが、本明細書において説明する目的で含められ、かつ特に明記していない限り制限することを目的としない特定の実施例を、図面と共に参照することによって本発明はよりよく理解されると思われる。
【００９７】
【実施例】
実施例で言及する市販の試薬は、特に明記していない限り、製造元の説明書に従って使用した。
【００９８】
実施例１：APPV717Fトランスジェニックマウス
トランスジェニックマウス系統は、マウスThy1プロモーターの制御下でロンドン型変異（V717F）を有するヒトAPPを発現する（マルハーベ、リチャーズ、ブルースマン、マーチン、ブルーエル、トーマス、フィッシャー、ディーナーおよびヒューバー（Malherbe P, Richards JG, Bluethmann H, Martin JR, Bleuel Z, Thomas B, Fischer C, Diener C and Huber G）、「thy-1遺伝子プロモーターのニューロン特異的エレメントによって促進されるヒト変異体アミロイド前駆体タンパク質の三つのイソ型を過剰発現するトランスジェニックマウス（Transgenic mice overexpressing three isoforms of human mutant amyloid precursor protein driven by the neuron-specific elements of the thy-1 gene promoter）」、Soc. Neurosci. 1997、抄録23、1636）。これらのマウス系統をAD124と命名した。
【００９９】
A．ヒトAPPロンドン型ベクター構築物の作製
ロンドン型家族性AD変異（FAD、V717F置換）を、既に記述されている部位特異的変異誘発（マルハーベ、リチャーズ、マーチン、ブルースマン、マジオ、ヒューバー（Malherbe P, Richards JG, Martin JR, Bluethmann H, Maggio J, Huber G）、「家族性アルツハイマー病ミスセンス変異の低レベルを発現するトランスジェニックマウスにはβアミロイドーシスが存在しない（Lack of beta-amyloidosis in transgenic mice expressing low levels of familial Alzheimer's disease missense mutations）」、Neurobiol. Aging 1996、17：205〜14）によってヒトβAPP695 cDNAに導入した。部位特異的変異誘発（SDM）によって、BamHI部位をヒトβAPP695 FAD（V717F）cDNAのエキソン６（ヌクレオチド807〜810位）の起点、ならびにエキソン６、７、８、９およびその隣接領域を含む3.0 kbpのミニhAPP遺伝子断片に導入した（ヤマダ、ゴトウ、サカキ（Yamada T, Goto I, Sakaki Y）、「ミニ遺伝子系におけるアルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質遺伝子のニューロン特異的スプライシング（Neuron-specific splicing of the Alzheimer amyloid precursor protein gene in a mini-gene system）」、Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993、195：442〜8）。βAPP695 FAD cDNAの477 bp BamHI（SDM）-Xho1断片を、ミニ-hAPP遺伝子からの2.83 kbp BamHI（SDM）-XhoI断片に置換すると、4.74 kbpのhβAPP-FAD（V717F）ミニ遺伝子（配列番号：１）が得られた。MThy-1.2-hβAPP-FADミニ遺伝子構築物は、4.74 kbp hβAPP-FAD（V717F）ミニ遺伝子断片を、マウスThy-1.2糖タンパク質遺伝子とプロモーター（アクセッション番号：第M12379号）とを含む発現ベクターのXhoI部位に挿入することによって作製した。この発現ベクターは、エキソン２およびエキソン４に存在する1.5 kbp BanI-XhoI断片がXhoIクローニング部位に置換されているマウスThy-1.2遺伝子を含む6.8 kbp NotI断片を有する（ビダル、モリス、グロスフェルト、スパノポーロウ（Vidal M, Morris R, Grosveld F, Spanopoulou E）、「Thy-1遺伝子の組織特異的制御エレメント（Tissue-specific control elements of the Thy-1 gene）」、EMBO J. 1990、9：833〜40）。MThy-1.2-hβAPP-FADミニ遺伝子ベクターをNotIによって消化したところ、11.5 kbp MThy-1.2-hβAPP-FADミニ遺伝子断片を放出した（AD124と呼ぶ）（図1）。
【０１００】
B．AD124トランスジェニックマウスの確立
直線状のAD124断片をB6D2F1接合子の雄性前核にマイクロインジェクションした（ホーガン、コンスタンチーニ、レーシー（Hogan B, Constantini F, Lacy E）「マウス胚の操作：実験マニュアル（Manipulating the mouse embryo：a laboratory manual）」、第二版、89〜204頁、プレーンビュー、ニューヨーク州；コールドスプリングハーバー研究所）。マイクロインジェクション後、接合子を仮親のB6CBAF1雌性動物の卵管に再度着床させた。トランスジーンの組み込みは、２〜３週齢のマウスの尾生検から単離したDNAを用いて、5'および3'領域のゲノムサザンブロットならびにPCR分析の双方によって検出された。5'領域PCR検出に関して、以下のプライマー（MThy-1.2センス：配列番号：２、hβAPPアンチセンス：配列番号：３、1100 bp PCR断片を産生する）を用い、3'領域PCR検出に関しては以下のプライマー（hβAPPセンス：配列番号：４、MThy-1.2アンチセンス：配列番号：５、932 bp PCR断片を産生する）を用いた。PCRは95℃（２分）で１サイクル、次に92℃（１分）、56℃（１分）、72℃（１分）を35サイクル行った。最終サイクルでは、10分間の伸張を行った。AD124構築物を数回マイクロインジェクションした結果、陽性トランスジェニック創始マウス13例が得られた（系統３、15、27、42、54、64、67、68、82、83、85、90および97）。トランスジーン創始動物を野生型C57BL/6マウスと交配させて、ヘテロ接合の子孫を確立した。
【０１０１】
C．トランスジェニック動物の特徴付け
１．インサイチューハイブリダイゼーションと組織化学
ハロタン麻酔したマウスを断頭して、脳を摘出し、ドライアイス中で直ちに凍結した後使用するまで−80℃で保存した。脳の傍矢状凍結切片（12 μm）を、予め２％ 3-アミノプロピル-トリエトキシシランのアセトン溶液によってコーティングしたスライドガラスに載せて、４％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩液（PBS）、pH 7.4）において20分間固定した後、PBSによる５分の洗浄段階を３回行った。OX-2（hβAPP770）（配列番号：６）およびKPI（hβAPP751+770）（配列番号：７）ドメイン（それぞれ、ヒトβAPP770のアミノ酸344〜363位およびアミノ酸324〜343位に対応する）に対して特異的な60量体アンチセンスポリヌクレオチドプローブを用いて、トランスジェニックマウスにおけるmRNAレベルを同月齢の野生型対照マウスと比較した。ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼおよび35S-dATP（NEN）を用いてオリゴマーを3'末端で標識し、ハイブリダイゼーション組織化学の技法を、本質的に既に記述されているとおり行った（ルケ、マルハーベ、リチャーズ（Luque JM, Malherbe P, Richards JG）、「NMDA受容体サブユニットmRNAのラット青斑核における局在（Localization of NMDA receptor subunit mRNAs in the rat locus coeruleus）」、Brain Res. Mol. Brain Res. 1995、2：224〜32）。簡単に説明すると、組織切片を１時間室温にしてからハイブリダイゼーションを行った。インキュベーション緩衝液（50 μl）には以下が含まれた：４×SSC（標準的なクエン酸生理食塩液）、20％硫酸デキストラン、0.25 μg/μl tRNA、0.25 μg/μlポリA、0.25 μg/μlニシン精子DNA、50％脱イオンホルムアミド、0.1 Mジチオスレイトール、0.5×デンハート溶液および35S-標識プローブ（３×105 d.p.m）。Fujifilm（登録商標）の小片で覆った切片を湿潤チャンバーにおいて43℃で一晩インキュベートした。小片を除いた後、切片を、１×SSCおよび0.5×SSCを含む溶液中でそれぞれ、58℃で15分および15分を２回洗浄した。さらなる洗浄は0.5×SSCで室温で15分行った。二回蒸留した水に浸した後、切片をエタノール中で脱水した。ハイブリダイゼーションシグナルは、まず標識切片をBAS-IP SR 2025万能造影プレートに露出してこれをフジフィルムBAS5000高解像度リン造影装置（Phosphorimager）において走査して、最後にMCID M2画像分析システムにおいて測定した（イメージングリサーチ社、セントカテリーヌ、オンタリオ州、カナダ）。ハイブリダイゼーションシグナルは、１mm2当たりの光刺激発光（PSL）として表記した（図2および3）。
【０１０２】
２．125I-βアミロイドによるインビトロ結合試験
野生型およびトランスジェニックマウスからの組織を、それらを固定していないことを除き、ハイブリダイゼーション組織化学の場合と同様に調製した。切片を0.1 nM 125I-βアミロイドペプチド（アマシャム社）と共にインビトロで20℃にて２時間インキュベートした後、洗浄して乾燥させ、トリチウム感受性造影プレート（BAS-TR2025）またはX線フィルムに４〜14日間感光させた。
【０１０３】
３．イムノブロット分析
マウスを断頭によって屠殺して、脳を摘出し、ドライアイス中で凍結し、使用するまで−70℃で保存した。脳の領域の分析に関して、同腹子３例からの組織をプールした。組織を既に記述されているように（マルハーベ（Malherbe）ら、1996）ホモジナイズした。抽出したタンパク質（50 μg/スロット）を10％トリス-トリシンゲル上で分離して、ニトロセルロースに転写し、22C11mAbの200倍希釈液（ベーリンガー-マンハイム社）または0.8 μg/mlのウサギ抗KPI（レフラー、ヒューバー（Loffler J, Huber G）、「様々なラット脳領域と脳発達時期におけるβアミロイド前駆体タンパク質イソ型（Beta-amyloid precursor protein isoforms in various rat brain regions and during brain development）」、J. Neurochem. 1992年10月；59(4)：1316〜24）のいずれかをプローブとして調べた（図4）。
【０１０４】
D．AD124トランスジェニックマウスの概要
トランスジェニックマウス系統AD124（βAPPミニ遺伝子）において、大きい不均衡な遺伝子スプライシングの結果、βAPP695と比較して実質的に高レベルのβAPPKPIが得られることが認められた。系統AD124/82、AD124/68、およびAD124/64に関して、OX-2ドメインに特異的なプローブを用いた35S-ハイブリダイゼーションシグナルを、AD124/15および野生型対照４例と比較した。この分析の結果は、系統82、68、および64に関して、トランスジェニックマウスでは全脳、皮質および海馬CA-1のそれぞれ平均で５〜９倍、８〜13倍、および14〜23倍増加したことを示している。これらの値は系統15について得られた比較では全脳、皮質、および海馬CA-1に関してそれぞれ、2.5倍、3.5倍、および４倍の増加であったことと鋭い対比をなす。hβAPP-FAD（V717F）のイソ型を高レベルで（インサイチューハイブリダイゼーションおよびイムノブロット分析によって検出）発現したヘテロ接合マウス系統AD124/64およびAD124/68を、異種交配させて、ホモ接合トランスジェニックマウスを作製した。
【０１０５】
実施例２：BACEトランスジェニックマウス
トランスジェニックマウスは、ヒトBACEタンパク質をマウスプリオンプロモーターの制御下で発現する。これらのマウス系統をPrp-Aspと命名した。
【０１０６】
A．ヒトBACEベクター構築物の作製
配列番号：９のタンパク質配列をコードして、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）プラス隣接制限部位を含むBACE1 cDNA（配列番号：８）を、プリオンORFが適切な独自のクローニング部位に置換されているマウスプリオンミニ遺伝子ベクターに挿入した。当初のミニ遺伝子構築物pPrPHgはフィッシャーら（フィッシャー、ルリッケ、レーバー、セイラー、モサー、オエシュ、ブランナー、アグッジ、ワイスマン（Fischer M, Rulicke T, Raeber A, Sailer A, Moser M, Oesch B, Brandner S, Aguzzi A, Weissman C）、「アミノ近位欠失を有するプリオンタンパク質（PrP）はPrPノックアウトマウスのスクレイピーに対する感受性を回復する（Prion protein (PrP) with amino-proximal deletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie）」、EMBO J. 1996、15：1255〜64）によって記述されている。簡単に説明すると、上流のKpnI部位と下流のNarI部位の間のマウスプリオンORFを除去して、SceI制限部位に置換した。BACE1含有断片を、平滑末端ライゲーションによって挿入して、プリオンプロモーターに対するその方向をシークエンシングによって確認した。
【０１０７】
B．BACEトランスジェニックマウスの作製
得られた融合遺伝子（図5）は、ベクター配列を含まず、精製して、標準的なプロトコールを用いて交雑種C57Bl/6×DBA/2 F2マウスの１細胞期胚にマイクロインジェクションした。尾DNAのPCR分析によってトランスジェニック創始動物（F0）10例を、トランスジーンを有すると同定して、その後野生型C57Bl/6マウスと交配させてトランスジェニック系統を確立した。簡単に説明すると、レアードら（レアード、ジデルフェルド、リンダース、ルドニッキ、ヤニッシュおよびバーンズ（Laird PW, Zijderveld A, Linders K, Rudnicki MA, Jaenisch R, and Berns A）、「単純な哺乳類DNA単離技法（Simplified mammalian DNA isolation procedure）」、Nucleic acids Res. 1991、19：4293）によって記述されるプロトコールに従ってゲノムDNAを抽出した。PCRは、プリオンセンス（配列番号：10）およびBACEアンチセンス（配列番号：11）プライマーを用いて、95℃で30秒、59℃で１分、72℃で１分を30サイクルの後に72℃で５分の反応を行った。創始動物10例中８例が生殖系列にトランスジーンを組み入れて、トランスジェニック８系統を確立することができた。
【０１０８】
トランスジェニック系統の特徴をDNAレベル（サザンブロット）、RNAレベル（ノザンブロットおよびRT-PCR）、ならびにタンパク質レベル（ウェスタンブロット）で調べるために、F1世代からの陽性マウスを屠殺した。
【０１０９】
C．BACEトランスジェニックマウスの特徴付け
１．サザンブロット分析
非トランスジェニック同腹子から単離したゲノムDNAと混合した既知量のトランスジーン断片を参照として用いて、トランスジーンのコピー数を決定した。ゲノムXbaI制限断片10 μlを、ゲル電気泳動によって分画して、ナイロンメンブレンにブロッティングした（ロシュモレキュラーバイオサイエンシズ社）。1.1 kb DNAプローブ（トランスジーンのXmnI消化断片）を、簡易DNA標識キット（ファルマシアバイオテック社）を用いてランダムプライマー法によって[33P]dCTPによって標識した。ハイブリダイゼーションは、６×標準クエン酸生理食塩液、10％硫酸デキストラン、0.5％SDS中で65℃で一晩行った。ブロットを２×標準クエン酸生理食塩液（＋0.1％SDS）において65℃で20分間洗浄した後、0.2×標準クエン酸生理食塩液（＋0.1％SDS）において65℃で２回目の洗浄を行った。ブロットは、リン造影装置によって撮像して、イメージクアントソフトウェアを用いて定量した。
【０１１０】
２．RT-PCR（Taqman）によるmRNA定量
市販のFastaRNA BIO101キットを用いて、製造元の推奨に従って、脳から総RNAを単離した。RNAの完全性を確認するために、再浮遊させたRNAペレット10 μlをRNAローディング緩衝液と混合して、変性1.2％ホルムアミド／アガロースゲル上で電気泳動によって分離した。エチジウムブロマイド染色RNA断片をUV透視によって可視化した。抽出したRNAは使用するまで−80℃で保存した。
【０１１１】
RNAはSuperscript（商標）プレアンプリフィケーションシステム（Preamplification System）（ライフテクノロジー社）を用いて逆転写した。それぞれのマウス脳に関して、総RNA 20 μgをオリゴ（dT）18-20プライマー（100 pmol/μl）２μlおよびddH2O DEPCと共に全量22 μlにおいて混合して、70℃で10分間加熱した。次に、混合物を氷中に入れて、５×逆転写酵素緩衝液（250 mMトリス塩酸、pH 8.4、375 mM KCl、15 mM MgCl2）８μl、dNTP混合液（10 mM）２μl、0.1 Mジチオスレイトール４μl、およびスーパースクリプトII RTモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（200 U/μl）４μlと共に42℃で60分間インキュベートした。反応混合物を95℃でさらに５分間インキュベートして、氷冷ddH2Oによって最終容量を100 μlに希釈した。cDNAは使用するまで−20℃で保存した。
【０１１２】
SyBrグリーン検出によるリアルタイムPCRはオリゴヌクレオチドプローブを必要としないため、これを用いてヒトBACE mRNAを定量した。さらに、鎖伸張の際に二本鎖DNAと結合すると、SyBrグリーンの蛍光は大きく増強されるため、この方法は他のアプローチより感度がよくなる。最初に、調製したcDNA（２μl）に、5'および3'ヒトBACEプライマー対の存在下でディファレンシャルポリメラーゼ連鎖反応を行った。マウスGAPDHを内部対照として用いて（ロイテネガー、ミスリン、シグリスト、エーレングルバー、ホフマン-レーマンおよびルッツ（Leutenegger CM, Mislin CN, Sigrist B, Ehrengruber MU, Hofman-Lehmann R and Lutz H）、「ネコサイトカインmRNAを測定するための定量的リアルタイムPCR（Quantitative real-time PCR for the measurement of feline cytokine mRNA）」、Vet Immunol Immunopathol. 1999；71：291〜305）、反応に加えたcDNAの量を標準化した。プライマーエクスプレスソフトウェアを用いて以下の特異的プライマー対を設計した。ヒトBACEに関してはセンスプライマー（配列番号：12）およびアンチセンスプライマー（配列番号：13）を設計し、muGAPDHに関してはセンスプライマー（配列番号：14）およびアンチセンスプライマー（配列番号：15）を設計した。定量的PCR反応に関して以下の成分：10×SyBrグリーン緩衝液2.5 μl、MgCl2（25 mM）３μl、dUTP（12.5 m）を含むdNTPミクス２μl、アンプリタックゴールド（Amplitaq Gold）DNAポリメラーゼ（５U/μl）0.125 μl、増幅されたDNAのキャリーオーバーを防止するためのアンプイレーズUNG（Amp Erase UNG）（１U/μl）0.125 μl、センスプライマー（50 nM）0.1 μl、アンチセンスプライマー（50 nM）0.1 μl、ddH2O 15.25 μl、および鋳型cDNA２μl（20 ng）を総反応容量25 μlにおいて用いた。定量的PCRは、パーキンエルマー7700配列検出器を用いて光学96穴プレート（PEアプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州）において行った。以下の段階からなるPCR反応を行った：a）DNAのキャリーオーバーを防止するために50℃で２分；2）アンプリタックゴールドポリメラーゼを活性化するために95℃で10分；3）95で15秒、60℃で15秒、および72℃で45秒からなるサイクルを50サイクル。増幅されたDNA断片の蛍光による定量的検出の他に、DNAをローディング緩衝液と混合して３％アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、DNA断片をエチジウムブロマイド染色した。
【０１１３】
３．ノザンブロットによるmRNAの定量
総RNA（mRNA単離キット；ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社）50 μgから精製したmRNAを0.7％ホルムアルデヒド-アガロースゲル上で分離した。次に、RNAをハイボンド+メンブレン（アマシャムファルマシアバイオテック社）にブロッティングして、ヒトBACEオープンリーディングフレームのヌクレオチド30位（プローブ659、配列番号：16）、ヌクレオチド570位（プローブ660、配列番号：17）、ヌクレオチド1186位（プローブ661、配列番号：18）で始まるヒトBACEトランスジーンのRNAに対して特異的な60 bpの一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの混合物とハイブリダイズさせた。プローブは、標準的な技法に従って、37℃で60分間のα-[32P]dATP（6000 Ci/mmol；アマシャムファルマシアバイオテック社）dATPとのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応によって3'末端標識されていた。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションは、ラピッドハイブリダイゼーション緩衝液（Rapid Hybridization Buffer）（アマシャムファルマシアバイオテック社）において65℃で2.5時間行った。ブロットを２×SSPE（0.1％SDS）において室温で10分間洗浄した後、65℃で15分間２回目の洗浄を行い、さらに１×SSPE（0.1％SDS）において65℃で10分間の洗浄を２回行った。メンブレンは定量するためにリン造影装置で一晩感光させた。ハイブリダイズしたプローブを、H20/0.1％SDS中で沸騰させることによってブロットから剥がした。同じプロトコールの後、ブロットをマウスβアクチン（配列番号：19）のRNAに対して特異的な[32P]標識一本鎖オリゴヌクレオチドプローブに60℃で90分間ハイブリダイズさせた。洗浄段階の後、メンブレンをリン造影装置上で一晩感光させた。
【０１１５】
４．ウェスタンブロットによるタンパク質の定量
マウスを断頭によって殺し、脳を摘出して、矢状平面で半分にしてからドライアイス中で凍結した。凍結した脳を使用するまで−70℃で保存した。半分の脳を、0.1％トライトンX-100および１％阻害剤カクテルIII（ピアス社）を含むpH 7.3の50 mMヘペス緩衝液１ml中でホモジナイズした。各試料５μlに含まれるタンパク質は、４〜20％ノベックス（インビトロジェン社）ゲルを用いるドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した。タンパク質をハイボンドECLメンブレン（アマシャム社）に転写して、メンブレンを、20％新生児ウシ血清（NBS）を含むPBS 0.05％ツイーン20（V/V）において一晩インキュベートしてブロックし、PBS 0.05％ツイーン10、５％NBS中で100倍希釈した、BACEに対して特異的なmAb BSC-1（グリュニンガー-ライチ、シュラッター、キュング、ネルベック、デベリ（Gruninger-Leitch F, Schlatter D, Kung E, Nelbock P, Dobeli H）、「BACEの基質および阻害剤プロフィールと他の哺乳類アスパラギンプロテアーゼとの比較（Substrate and Inhibitor Profile of BACE(beta-Secretase) and Comparison with Other Mammalian Aspartic Proteases）」、J. Biol. Chem. 2002、277：4687〜4693）と共に室温で１時間インキュベートした。一次抗体の検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗IgG抗体（アマシャム社）によって検出した後、製造元の説明書に従って、増強化学発光検出システム（アマシャム社）によって検出した。
【０１１６】
それぞれのトランスジェニック系統に関して、BACEレベルをマウス２匹において分析して、非トランスジェニック同腹子において測定した内因性のBACEレベルと比較した。発現が最も高い系統である系統13および24は、内因性のマウスBACEの量の５〜10倍に対応するレベルでヒトBACEを発現すると推定された。低発現トランスジェニック系統として定義された系統10は、内因性BACEレベルの約２倍のレベルでヒトBACEを発現した（図6Aおよび6B）。
【０１１７】
D．Prp-Asp2トランスジェニックマウスの概要
ヒトβセクレターゼを発現するマウス系統を、トランスジーンコピー数を決定するためにDNAレベルで（サザンブロット）；トランスジーンmRNAの定量のためにRNAレベルで（ノザンブロット、RT-PCR）；およびBACEトランスジェニックタンパク質を定量するために（ウェスタンブロット；図6B）分析した。図6Aに示すように、DNAレベルのトランスジーンコピー数、BACE mRNA転写物レベル、およびBACEタンパク質レベルに良好な相関を認めた。トランスジーンを１コピーのみ組み入れたトランスジェニック系統は、BACE転写物を、アクチン転写物レベルの10〜30％の範囲で有し、BACEタンパク質レベルは、非トランスジェニックマウスと比較すると、同等であるか、またはごくわずかに増加していた；高発現トランスジェニック系統は、トランスジーン５〜20コピーを組み入れており、アクチン転写物のレベルと同等または倍加したBACE転写物レベルを有する。この分析の後、系統13および24を、C57Bl/6バックグラウンドにおいて交配するための高BACE発現系統として選択し、系統10を低BACE発現系統として選択した。
【０１１８】
実施例３：BACEおよびAPPロンドン型二重トランスジェニックマウス
A．ヒトAPPV717Fを過剰発現するAD124トランスジェニックマウスとヒトBACEを過剰発現するPrp-Aspトランスジェニックマウスとの交雑
標準的な交雑プロトコール（雄性／雌性比、１：１、または１：２）の後、APPV717F高発現トランスジェニック系統AD124/68をBACE高発現トランスジェニック系統Prp-Asp13またはPrp-Asp24と交配させた。最初のタイプの交配には、ホモ接合APPV717Fマウスとヘテロ接合Prp-Aspトランスジェニックマウスが含まれ、これによって両遺伝子の同腹子（APPV717+/-およびBACE+/-）と単トランスジェニック同腹子（APPV717+/-）が得られた。第二のタイプの交配には、ヘテロ接合APPV717Fトランスジェニックマウスとヘテロ接合Prp-Aspトランスジェニックマウスが含まれ、これによって非トランスジェニック同腹子（APPV717-/-およびBACE-/-）、両遺伝子同腹子（APPV717+/-およびBACE+/-）、単トランスジェニック同腹子（APPV717+/-）、および単トランスジェニック同腹子（BACE+/-）が得られた。マウスの遺伝子型は、尾DNAのPCRを用いて確認した。
【０１１９】
B．二重トランスジェニックマウスの特徴付け
１．小脳の臓器型切片培養物
脳切片の調製は、メツガーら（メツガー、カファマー（Metzger F, Kapfhammer JP）、「タンパク質キナーゼC活性は小脳切片培養物においてラットプルキンエ細胞の樹状突起分化を調節する（Protein kinase C activity modulates dendric differentiation of rat Purkinje cells in cerebeller slice cultures）」、Eur J Neurosci. 2000 12：1993〜2005）。まもなく、生後８〜10日齢のマウスを断頭して、脳を無菌的に摘出した。小脳を氷冷培地（MEMに２mMグルタマックスI（glutamax I）、ライフテクノロジーズ社）において解剖して、髄膜を注意深く除去した。マキルウェイン組織カッター（バコフェル、ドイツ）を用いて0.4 mmの矢状切片を作製し、細いピンセットで分離して、湿らせた透明なメンブレン（ミリセル-CM（Millicell-CM）、ミリポア社）に移した。切片３枚を、２％（v/v）B27添加剤を加えたニューロベーザルA（Neurobasal A）培地（全て、ライフテクノロジーズ社）0.7 mlの上で１枚のフィルター（直径30 mm）上で培養した。切片は５％CO2大気中で37℃で８日間培養した。培養培地は１、３、６および８日目（DIV）に交換して、sAPPα、sAPPβ、およびA-β40に関して分析した。
【０１２０】
野生型、APPロンドン型単トランスジェニックおよび[APPロンドン型×BACE]二重トランスジェニックマウスからの小脳切片の培養上清におけるA-β40の産生をモニターした（図7）。APPロンドン型単トランスジェニックマウスおよび[APPロンドン型×BACE]二重トランスジェニックマウスに関して培養３日後に、A-β40ペプチドの増加が明らかに認められる。APPロンドン型単トランスジェニックマウスは、A-β40値約0.7 ng/ml/日を示すのに対し、全ての二重トランスジェニックマウスは１ng/ml/日以上のレベルを示す。それらの結果の確認と、sAPPαおよびsAPPβ断片の評価まで行う分析とは、APPロンドン型単トランスジェニックマウスおよび[APPロンドン型×BACE]二重トランスジェニックマウス（ホモ接合の父親のAPPロンドン型とヘテロ接合の母親のBACEとの交配の結果）を含む一同腹子に由来する脳切片からの上清について行われた（図8）。二重[APPロンドン型×BACE」トランスジェニックマウスは、APPロンドン型同腹子と比較するとsAPPβレベルの増加を示す。sAPPα断片レベルは、[APPロンドン型×BACE]二重トランスジェニックマウス脳切片では検出限界以下であった。比較すると、APPロンドン型単トランスジェニックマウスの１日培養後では15〜20 ng/ml/日のレベルが測定された。これらの結果は、APPロンドン型単トランスジェニックマウスにおけるβセクレターゼの過剰発現が、sAPPα断片が検出されないこととsAPPβが増加することによって示されるように、βでのAPPV717Fの選択的切断を誘導することを示している。γセクレターゼの基質である12 kDa断片が同時に増加することによって、病原性A-βペプチドレベルが増加する。
【０１２１】
２．ELISAにおける定量のためのマウス脳からのアミロイド断片の抽出
マウスを屠殺して脳を摘出した。脳半球１つをファストプレップ（Fast Prep）ホモジナイゼーションチューブ（Qビオジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてDEA緩衝液（２％ジエタノラミン、50 mM NaCl）１ml中でホモジナイズした。可溶性のアミロイドを含む上清を遠心後回収して、既に記述したように１Mトリス塩酸によってpH ８に中和した（サベージ、トルスコ、ハウランド、ピンスカー、ミストレッタ、レオーメ、グリーンバーグ、サイマン、スコット（Savage MJ, Trusko SP, Howland DS, Pinsker LR, Mistretta S, Reaume AG, Greenberg BD, Siman R, Scott RW）、「マウス脳におけるアミロイドβタンパク質の代謝回転とホルボルエステルによるそのレベルの急激な減少（Turnover of amyloid beta-protein in mouse brain and acute reduction of its level by phorbol ester）」、J. Neurosci. 1998、18：1743〜5）。不溶性のアミロイドを抽出するために、ペレットを９M尿素0.5 mlに再浮遊させて、回転させながら４℃で一晩インキュベートし、遠心後上清を回収した。双方の種類の上清（DEAまたは尿素抽出の後で回収）をELISAにおいて調べた。
【０１２２】
３．アミロイド断片を検出するためのELISAにおいて用いられる抗体
6E10および4G8モノクローナル抗体（mAbs）は市販されている（セネテック社、メリーランドハイツ、ミズーリ州）。BAP-1抗体は、可溶性APPαに存在するが可溶性APPβには存在しないエピトープA-β4-7に対して特異的である。モノクローナル抗体BAP17およびBAP24は、アミロイドペプチドA-β40に対して特異的であるが、モノクローナル抗体BAP15は、アミロイドペプチドA-β42に対して特異的である（ブロックハウス、グルンバーグ、ローリヒ、ローチャー、ウィッテンブルグ、バウマイスター、ヤコブセン、ハース（Brockhaus M, Grunberg J, Rohrig S, Loetscher H, Wittenburg N, Baumeister R, Jacobsen H, Haass C）、「カスパーゼ媒介切断はアミロイド形成におけるプレセニリンの活性およびNOTCHシグナル伝達にとって必要ではない（Caspase-mediated cleavage is not required for the activity of presenilins in amyloidgenesis and NOTCH signaling）」、Neuroreport 1988、9：1481〜6）。モノクローナル抗体ABS-1は、可溶性組み換え型ヒトAPPαによって免疫してこれに対してスクリーニングすることによって作製した。検出抗体rbVKMは、ウサギ（ニュージーランド系統）を、N-ヒドロキシスクシニミジルマレイニミドプロピオネート（ピアス社）によって予め活性化したキーホールリンペットヘモシアニン（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）にカップリングさせたペプチドCISEVKMによって免疫することによって作製した。ペプチド結合体をフロイントの完全アジュバント（ディフコ社）において乳化して４カ所に皮下注射した。注射は、フロイントの不完全アジュバント（ディフコ社）を用いて４週間間隔で３回繰り返した。高力価のウサギ血清を得た。これを、製造元の説明書に従ってペプチドCISEVKMをカップリングしておいたスルフォリンクゲル（ピアス社）上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。組み換え型sAPPαはsAPPβのアッセイにおいて反応性がなかったことから、APPに対するβセクレターゼの作用によって産生されたC末端ネオエピトープに対して特異的であると見なされた。
【０１２３】
適当であれば、アフィニティ精製抗体を、過ヨウ素酸塩活性化を用いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社）に結合させた（ナカネ（Nakane PK）、「ペルオキシダーゼ標識抗体法の最近の進歩（Recent progress in the peroxidase-labeled antibody method）」、Ann N Y Acad. Sci. 1975、254：203〜11）。
【０１２４】
脳抽出物においてアミロイドペプチドを検出するために用いられる抗体の組み合わせは、捕獲のためのビオチン化6E10またはビオチン化4G8モノクローナル抗体、ならびにA-β40およびA-β42をそれぞれ検出するためのHRP-BAP24、またはHRP-BAP15モノクローナル抗体である（ブロックハウス（Brockhaus）ら、1998）。可溶性APPα断片およびAPPβ断片は、捕獲のためにビオチン化ABSモノクローナル抗体を、および検出のためにそれぞれHRP-BAP1モノクローナル抗体またはHRP-rbVKMを用いて検出した。
【０１２５】
４．ELISA
ELISAは、これまでに記載されている通りに実施した（ブロックハウス（Brockhaus）ら、1998）。簡単に説明すると、マイクロタイタープレート（ヌンクマキシソルブ、ライフテクノロジーズ社）をまず、５μg/mlストレプトアビジン（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社）の100 mM重炭酸緩衝液溶液によってコーティングした後、捕獲ビオチン化mAbと共にインキュベートした。プレートをトリス緩衝生理食塩液0.05％ツイーン20（TBS-T）によって十分に洗浄した後、上清の５倍連続希釈液を加えて、インキュベーション緩衝液（50 mMトリス、140 mM NaCl、５mM EDTA、0.05％NP40、0.25％ゼラチン、１％BSA）において４℃で24時間インキュベートした。最小希釈液は、培養上清に関して１倍、DEA/トリス上清に関して４倍、尿素上清に関して20倍であった。アミロイド断片の検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）カップリングモノクローナル抗体を用いて行った。過剰量のHRP-mAbは、TBS-T緩衝液を用いる３回の洗浄段階によって除去した。テトラメチルベンジジン（TMB）基質をプレートに５〜10分間加えて、2.5 N硫酸を加えて反応を停止させた後、450 nmでの吸光度を読みとった。精製A-β断片または可溶性APP断片をアッセイの較正のために用いた。
【０１２６】
ホモ接合APPロンドン型マウス（系統AD124/68H）をELISAにおいて調べたところ、主にA-β42ペプチドの有意な増加を10ヶ月齢で約0.1 ng/mg脳の値を検出し、16ヶ月齢では２〜12 ng/mg脳のレベルに達した。ホモ接合APPロンドン型脳から抽出可能なA-β40ペプチドレベルは、0.5〜2.5 ng/mg脳の値よりかなり低かった。
【０１２７】
[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスの分析は、トランスジーンに関してヘテロ接合である単APPロンドン型対照同腹子ではA-βペプチドの有意な増加を認めない６〜７および10ヶ月齢で行った（図9）。それぞれの時点において、雄性３例および雌性３例を分析して、中央値をプロットした。
【０１２８】
A-β40およびA-β42ペプチドの有意に増加したレベル（図9）が、[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスにおいて測定された。A-β42ペプチドレベルは、A-β40ペプチドレベルより約10倍高かった。類似の結果は、APPロンドン型×BACE系統13またはAPPロンドン型×BACE系統24の二重トランスジェニック系統についても認められ、トランスジーンの組み入れ部位による影響は除外された。このように、病原性アミロイドペプチド沈着の増加は、βセクレターゼの発現によって誘導される。[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスの脳における可溶性APPα断片および可溶性APPβ断片のレベルも同様に測定した（図9）。単APPロンドン型対照同腹子と比較すると、[BACE×APPロンドン型]マウス脳では、sAPPα断片のより低いレベルとsAPPβ断片のより高いレベルが測定された。可溶性断片のレベルは、トランスジェニック系統にかかわらず如何なる有意な時間依存的変化も示さなかった。結論すると、APPロンドン型過剰発現マウスにおいてβセクレターゼが同時発現されると、より低いレベルのsAPPα断片を誘導し、sAPPβ断片レベルを増加させ、病原性アミロイドペプチドA-β40およびA-β42の沈着を増加させた。
【０１２９】
５．ウェスタンブロットによる単および二重トランスジェニックマウスにおけるβセクレターゼレベルの比較
実施例２、段落C4に記述した方法と同じ方法論を用いて、βセクレターゼレベルを二重および単トランスジェニックマウスにおいて比較した。その目的に関して、[BACE系統13×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス、APPロンドン型単トランスジェニックマウス（ヒトBACEの陰性対照）、およびBACE系統13単トランスジェニックマウスからのマウス３匹（雄性２匹および雌性１匹）を３ヶ月齢で屠殺した。[BACE系統13×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスにおいて検出されたβセクレターゼレベルと親のBACE 13系統において検出されたレベルに有意差を認めなかった（図13）。これらの結果は、ヒトBACEのトランスジェニック過剰発現がAPPロンドン型の過剰発現によって損なわれないことを示している。
【０１３０】
６．二重トランスジェニックマウス脳におけるトランスジーンの発現とプロセシングのウェスタンブロット分析
トランスジェニックまたは非トランスジェニック同腹子対照マウスからの脳組織を氷中で、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートTM、ベーリンガーマンハイム社、ドイツ）を含む0.32 Mショ糖溶液において、ファストプレップホモジナイゼーションチューブ（Qバイオジーン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてホモジナイズした。上清中のタンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイ法（ピアス社、アメリカ）を用いて測定した。APPおよびA-β検出に関して、タンパク質抽出物25 μgをノベックスヌページローディング緩衝液（インビトロジェン社）において95℃で10分間変性させた。タンパク質を、10％ノベックスヌページ（Novex NuPage）（インビトロジェン社）ゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した。タンパク質をニトロセルロースフィルター（アマシャム社）に転写した後、フィルターをPBSにおいて５分間加熱して、感受性を増加させ、５％（w/V）脱脂粉乳のPBST（PBS、0.05％（V/V）ツイーン20）溶液によってブロックして、濃度0.1 μg/mlの抗体WO-2と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗IgG抗体（アマシャム社）の後に、製造元の説明書に従って増強化学発光検出システム（アマシャム社）を行うことによって検出した。
【０１３１】
８および10ヶ月齢のホモ接合APPロンドン型マウスおよび二重トランスジェニックAPPロンドン型×BACEマウスの脳ホモジネートを、モノクローナル抗体WO-2を用いてAPPおよびA-β発現に関してウェスタンブロットによって分析した（図10）。この抗体は、非トランスジェニックマウスに対応するレーンにはシグナルが検出されないことから、APPおよびA-βを容易に検出して、内因性のマウスAPPとは交叉反応しない（図10、レーン９および12）。総タンパク質の同じ量を各レーンにローディングした。120 kDでの完全長のAPPバンドの強度はホモ接合APPロンドン型マウスでは高く、トランスジーンのさらなるコピーを反映した。APPとβセクレターゼとを発現する二重トランスジェニックマウスでは、APPの12 kDβセクレターゼ断片が、トランスジェニックβセクレターゼの発現のために強く増加している。
【０１３２】
120 kDでの完全長のAPPバンドおよび12 kD断片の強度は、異なる月齢でのマウスにおいて一定である。しかし、二重トランスジェニックマウスでは、８ヶ月齢から始まるA-βの強い蓄積を認める。このA-βの増加は、トランスジェニックマウスの脳におけるアミロイド斑の開始と良く相関しており、ウェスタンブロットによって検出したA-βの増加がアミロイド斑において蓄積されたA-βに類似することを示唆している。単トランスジェニックAPPロンドン型マウスでは、10ヶ月齢でA-βの蓄積を検出できない。明らかに、BACEと変異APPとの同時発現により、A-βの蓄積が強く加速される。
【０１３３】
７．組織化学および免疫細胞化学
Fluothane（登録商標）麻酔マウスを22℃で４％ホルムアルデヒドのPBS溶液の経心還流によって固定した後、脳を摘出して、矢状平面で半分にして、同じ固定液に24時間浸した。脳の半分を30％ショ糖において一晩凍結保護してからドライアイス中で凍結して、残りの半分を脱水してパラフィンワックスに包埋した。凍結切片またはパラフィン切片は10 μmに切断した。
【０１３４】
微細繊維状のA-β沈着は、Accustain（登録商標）アミロイド染色、コンゴーレッド（シグマディアグノスティック社、HT60）によって検出した。以下の抗体を用いて、Vectastain（登録商標）ABCキットエリート（Elite）およびペルオキシダーゼ（ImmunoPure（登録商標）、金属強化DAB基質、ピアス社34065）によって抗原性部位を検出した：BAP-2（Aβ1-40に対して作製したモノクローナルマウスIgG1抗体；アミノ酸４〜７個を認識する、ブロックハウス（Brockhaus）博士）；CD45（活性化小神経膠細胞；クローンIBL-3/16、セロテックMCA 1388）；GFAP（活性化星状細胞；クローンG-A-5、バイオメーカー、6077）；アポE（アポリポタンパク質E；ケミコンAB 947）；AT-8（PHF-τクローンAT-8、エンドテルBR-03）；BSC-1（BACE；グリュニンガー-ライチ（Gruninger-Leitch F）ら、J. Biol. Chem. 2002、277：4687〜4693）。対照に関して、ペプチドブロック、またはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の関連するイソ型をそれぞれ用いた。染色した切片のデジタル撮像および処理に関して、プログレス（ProgRes）3012高解像度スキャナカメラ（コントロン、ツァイス社）およびアドビフォトショップソフトウェアをそれぞれ用いた。
【０１３５】
プラーク構造におけるアミロイド沈着は、11ヶ月齢の[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス（図11）において明らかに検出された。いくつかのプラークはコンゴーレッド親和性であった。強いコンゴーレッド親和性染色も同様に、血管アミロイド沈着上に認められた。[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスとAPPロンドン型単トランスジェニックマウスとの間にアミロイド沈着の脳分布に有意差を認めなかったが、BAP-2 mAbを用いた免疫染色は、単トランスジェニックマウスと比較して[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスからのアミロイド沈着により強い染色パターンを示し、このことはアミロイド斑の構造または組成に何らかの差があることを示唆している。βセクレターゼは、BSC-1 mAbによる正の免疫染色によって示されるように、おそらくアミロイド沈着に最も関連して検出された（図12）。[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスにおいて検出されたアミロイド沈着はまた、炎症マーカー、GFAPおよびCD45の存在を伴った（図12）。
【０１３６】
８．免疫電子顕微鏡
凍結固定、凍結置換および低温包埋
還流固定脳組織を、固定液に浸しながら、ビブラトームを用いて厚さ約100 μmの切片に切断して、漸増濃度のグリセロール（10〜20〜30％ v/v）の10 mMリン酸緩衝液溶液、pH 7.4に１濃度あたり0.5時間浸して凍結保護した。ビブラトーム切片をピンセットで注意深く取り出して、液体窒素によって冷却した液体エタンに沈めた。凍結組織切片を液体窒素中で保存してから、自動凍結置換装置（AFS、ライチェルト、オーストリア）の予め冷却したチャンバー（−90℃）に移した。組織を、0.5％（w/v）酢酸ウラニルを含む無水メタノール中で−90℃で一晩浸した。温度を、6.7℃／時間の割合で−45℃に上昇させた。試料を無水メタノールで各30分間３回洗浄して、残っている水および過剰量の酢酸ウラニルを除去してからロウイクリル（Lowicryl）HM20樹脂（ケミシュベルケロウィ；ワルドクライブルク、ドイツ）を浸透させた。樹脂の浸透は、HM20とメタノール１：１および２：１においてそれぞれ２時間ずつ、ならびに純粋なHM20で２時間、16時間、および２時間行った。試料をライチェルトAFS装置のフロースルーシステムにおいて処理して、間接的UV照射（360 nm）によって−45℃で24時間重合化させた後、UV照射を室温で１日行って、完全な樹脂重合化を達成させた。
【０１３７】
樹脂薄切片の免疫標識
ダイヤモンドナイフ（ダイアトーム）を用いてライチェルトウルトラカットS上で超薄切片を調製して、ホルムバール／炭素コーティングを施した200メッシュのニッケルグリッドに回収した。切片は0.05 mol/LグリシンのPBS溶液上に15分間浮遊させて、遊離のアルデヒド基を不活化した後2.5％（w/v）雌鶏の卵白アルブミン（フルカ社）上で2.5％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA、分画V、ベーリンガー社）のPBS溶液上に15分浮遊させ、非特異的結合部位をブロックした。切片は10 μg/ml mAb BAP-2の２％BSA/PBS溶液と共に１時間インキュベートした。BSA/PBSにおいて６回洗浄した後、切片を二次ヤギ抗マウスIgG（アマシャム社、アーリントンハイツ、イリノイ州）と共にインキュベートして、0.1％ツイーン20のPBS溶液による10 nmの金の２％BSA20倍希釈液に１時間結合させて、BSA/PBSにおいて洗浄した。対照として、正常マウス血清によって処置した切片を用いた、これによって無視できるバックグラウンドは面積10 μm2あたり金粒子10個またはそれ以下となった。切片は２％パラグルタルアルデヒドのPBS溶液において５分間後固定し、洗浄して、４％酢酸ウラニル水溶液によって10分間染色した後、クエン酸鉛によって90秒染色した。電子顕微鏡写真は100 kVでJEOL 1210によって撮影した。
【０１３８】
A-βの超構造局在
免疫電子顕微鏡は、18ヶ月齢動物の低温包埋マウス脳組織について行った。方法は、超構造の優れた保存の長所と効率的な免疫細胞化学染色の抗原性とを組み合わせる。A-βペプチド（BAP-2）のN末端部分に対するモノクローナル抗体を用いる免疫金標識によって、動脈および再動脈の内膜内に微細繊維様A-βが存在することが判明した。微細繊維様A-βの束は時に、基底膜の中に侵入して血液脳関門の完全性を妨害する可能性がある（図14）。微細繊維様A-βは、平滑筋細胞の層においてかなりの密度で認め、これはヒトにおける脳アミロイド血管障害（CAA）と類似のように微細繊維凝集体をますます蓄積するように思われる。用いたマウスモデルでは、CAAの頻度が月齢に応じて軽度から中等度であると考えられる。A-β沈着を増加させるこのプロセスは、最終的にヒトCAAにおいて認められるように血管の破裂に至る可能性がある。
【０１３９】
コンゴーレッド染色によって検出することができる濃い芯のあるプラークが検出されることは少ないが、コンゴーレッドによって染色されないものの免疫組織化学によって検出可能である散在性のA-β沈着はより頻繁である。散在性のプラーク内のA-β超構造を、18ヶ月齢の動物の前頭皮質においてA-βに対する免疫金標識によって分析した（図16）。免疫反応性は軸索突起および樹状突起の細胞膜に隣接する電子密度の高い材料の不連続な小片上に認められた。顕著なことに、血管内膜において認められたような明らかな微細繊維状の超構造は検出されなかった。これは、この型のA-βが、十分に特徴が調べられた成熟A-β微細繊維に対して中間の前駆体である初期凝集塊に類似することを示す可能性がある。有意な神経変性より先に起こる初期A-β凝集の指標は、A-β媒介神経毒性のメカニズム（複数）、およびADを治療するための治療の特徴を調べるために特に重要である。
【０１４０】
９．行動試験
APPロンドン型を発現するマウスおよび[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス（12ヶ月齢）の行動データを、月齢をマッチさせた野生型マウスと比較した。マウスの体重を毎週測定して、全身の外観をチェックした。全てのマウスを個別ケージに収容した。さらに、体温、外皮の外観、分泌兆候、姿勢も同様に記した。
【０１４１】
神経学試験
ワイヤ運動性：マウスの前肢を高架式針金の棹に置いて落ちるまでの潜時を記録した。カットオフ時間は60秒であり、３回試行の最もよいスコアを記録した。
【０１４２】
握力：マウスに歪みゲージを引っ張らせ、放出点を記録する。５回試行の最もよいスコアを記録する。
【０１４３】
回転棒：マウスを一定速度の回転棒の上に置いて、落ちるまでの潜時を記録した。カットオフ時間は120秒であり、３回試行の最もよいスコアを用いた。16 回転/分、32 回転/分の２つの速度を用いた。
【０１４４】
遺伝子型の間に体重の差を認めなかったが、雌性マウスは雄性マウスと比較して体重が少なかったが、これは典型的である（すなわち、雄性マウスは通常雌性マウスより重い）。野生型対照と比較すると、雌性hAPPLoマウスと雄性hBACE/hAPPLoマウスにおいて握力の有意な減少を小さいながらも認めた。水平にした針金の成績は、hAPPLoを発現する雄性マウスおよびhBACE/hAPPLoを発現する雌雄マウスでは減少した。雄性hAPPLoマウスは野生型対照と比較して回転棒（32 回転）に乗っている時間が有意に少なかった。全体として主要な運動能力障害（すなわち、運動失調）は如何なる遺伝子型においても検出されなかった（表１）。
【０１４５】
歩行活動：マウスを、床におがくずを敷いたPlexiglas（登録商標）ボックス（20 cm×20 cm×27 cm）からなる新規試験チャンバーに１時間入れた。動物の運動を電子モニタリングシステムを用いて記録した（オムニテックエレクトロニクスインク、コロンブス、オハイオ州、アメリカ）。動物の運動によって、試験チャンバー周囲に配置した垂直および水平に存在する赤外線源からの光線の列の妨害が起こる。移動した全距離（cm）およびリアリング（後ろ足で立つ）の回数を測定した。
【０１４６】
hBACE/hAPPLoを発現する雄性および雌性マウスはいずれも、この期間の総歩行数の有意な増加によって示されるように１時間の試験期間中の歩行活動が増加した。これと一致して、歩行時間はまた、雄性および雌性hBACE/hAPPLoマウスにおいて有意に上昇し、有意ではないが、リアリング回数の総数に類似の傾向を認めた。このように、hBACE/hAPPLoを発現する雄性および雌性マウスはいずれも野生型対照と比較して活動過多であった（図17）。
【０１４７】
Y字迷路
マウスを、黒いパーペックス（perpex）からなるY字迷路（それぞれのアームは長さが53 cm、幅が15 cm、そして高さが30 cm）に置いた。迷路の上部にカメラを設置して、動物を隣接する部屋のモニターによって観察した。アームの部分に入った回数とその入った道筋を記録して交互移動の測定値を計算した。
【０１４８】
雄性マウスでは遺伝子型の影響を認めなかった。しかし、雌性hBACE/hAPPLoマウスは野生型対照と比較して交互移動度（％）の減少から測定すると、作動記憶に関するこの作業に欠陥を示した（図18）。特に、性別または遺伝子型には位置の偏りに百分率の差はなかった。興味深いことに、有意ではなかったが、雄性および雌性hBACE/hAPPLoマウスはアーム部分に入る回数が増加する傾向を示し、このことはこれらのマウスが、先に歩行活動試験において示されたように、野生型対照より活動的であることと一致する（図17を参照のこと）。このように、hBACE/hAPPLoを発現する雌性マウスは、作動記憶に関するこの作業が障害されたが雄性マウスは障害されなかった。
【０１４９】
モリス水中迷路
水中迷路は、ラテックス溶液（E-308；インデュケム、ボレツビル、スイス）を加えて不透明になった水を満たした灰色の円形タンク（直径１m）からなった。プールの温度は21＋１℃に維持した。隠れた足場の作業に関して、逃避用足場（直径８cm）を、プールを４つにわけた一つの中央の水面より１cm下に位置させた。手がかりを与える訓練作業において、沈められた足場の中央に小さい黒い旗を置くことによって足場の位置を知らせた。水中迷路周囲の壁は、目に見える手がかりとして役立つポスターおよび旗が貼られており、訓練と試験の全ての段階中は目に見えるようになっている。プール内でのマウスの運動を追跡して、コンピューターに基づくビデオ追跡システム（HVSイメージ、ハンプトン、イギリス）によって分析した。
【０１５０】
手がかりを与える訓練に関しては、マウスを４つの開始点（NE、SE、SW、NW）の一つの端部からプールに入れ、マウスに旗をつけた足場の位置を探させたが、その位置は試行にかけて変化する。各マウスは、全体で12回の試行を行った（１ブロックあたり試行３回、１日２ブロック、２日間）。試行間隔は、平均で10分間であり、最長試行時間は60秒であった。マウスが60秒以内に足場を見つけることができなかった場合には、マウスをその位置まで実験者が誘導した。マウスは全て、自分のケージから出して戻されるまで10秒間足場上に留まらせた。手がかりを与える訓練作業の後に位置特定作業を行い、この場合マウスに、その位置が訓練を通して固定されたままである沈められた隠れた足場を探させた。足場の位置は、群の間で均衡であった。各マウスに、４日間で訓練試行８ブロック（１ブロックあたり試行３回、訓練試験と同じタイミング）を行い、この場合マウスをプールの４つの開始位置の一つに置いて、隠れた足場を探させた。空間的学習の評価は、ブロック４の30分間後と最終試行の24時間後に行った探査試行において実施した。それぞれの探査試行においては、足場をプールから除去して、各マウスが泳いだ経路を60秒間の間に記録した。
【０１５１】
訓練習得において、性別と遺伝子型との、または性別と遺伝子型と試行との相互作用はなく、このことは逃避足場を見つけるための視力および動機は遺伝子型の間で同等であることを示した。
【０１５２】
隠れた足場の位置を探すようにマウスを訓練する位置特定習得において、隠れた足場までの経路の距離は、hAPPLoおよびhBACE/hAPPLoの双方を発現する雄性および雌性マウスにおいて増加し、このことは、これらのマウスが野生型対照より作業の習得が遅いことを示している（図19）。注目すべきは、隠れた足場を見つけるまでの潜時も同様に、雄性および雌性hAPPLoマウスではいずれも有意に大きく、このことはこれらのマウスにおける習得レベルの減少と一致している。しかし、雄性（雌性ではない）hAPPLoマウスは、野生型対照と比較して水泳速度の減少を示し、これは逃避潜時の増加の一因となりうる。
【０１５３】
訓練期間の中間点で行った最初の探査試験において、雄性および雌性野生型マウスはいずれも隠れた足場の位置を学習し、マウスは訓練の間に、他の３つの４分の１区画に留まった時間と比較して足場が存在する４分の１区画を有意により長く探していた（図20）。逆に、hAPPLoおよびhBACE/hAPPLoの双方を発現する雄性および雌性マウスは、４つ全ての４分の１区画を探す時間が同等であり、彼らが隠れた足場の位置を学習していなかったことを示している。訓練期間の最後に行った第二の探査試験において、雄性および雌性野生型マウスは訓練の間に足場が存在した４分の１区画を探す時間が有意に長く、彼らが隠れた足場の位置を学習していたことを示している。hAPPLoを発現する雄性マウスは、４つの４分の１区画を探すために同等の時間を費やしており、彼らが隠れた足場の位置を学習していなかったことを示しているが、対照的にhAPPLo雌性マウスは足場の位置を学習していた。雄性および雌性マウスはいずれも、訓練の際に足場を含む４分の１区画に留まる時間がより長い傾向を示したが、これは全ての場合において有意ではなく、これらのマウスが、野生型対照と同じ精度で作業を学習していなかったことを示している。
【０１５４】
能動的回避
マウスを、その中で区画間を自由に移動できる２区画のチャンバー（サンジエゴインストルメンツ、アメリカ）に入れた。それぞれの試行は、マウスが現在存在する側に10秒間の光（CS）を照射して開始し、これを最大で20秒間の足のショック（0.2 mA）の合図として用いた。（NB、マウスは１秒以内に他の（ショックを受けない）区画に移動するか、またはショックを回避することを学習したためにこのショック期間を受けない）。この後に、マウスがチャンバーを自由に探査することができる多様なタイムアウト期間（平均20秒、範囲15〜25秒）（光なし）を行った。タイムアウトの後、次の試行が始まる。ショックはCS期間の間に次の区画に折り返すか、またはショック提示の際にいつでも逃避することによって回避することができる。毎日10回の試験セッションを行い、各セッションは20試行からなった。従属測定は回避率（％）である。
【０１５５】
試験期間全体を通して、hAPPLoを発現する雄性および雌性マウスはいずれも野生型対照と比較して足のショックを回避する学習が遅く（それぞれ、p＝0.003および0.04）、一方、hBACE/hAPPLoを発現する雄性マウスはより速く学習したが雌性マウスはそうではなかった（雄性に関してp＝0.02、繰り返し測定を行う二要因配置ANOVAの後にニューマン・クールズの方法）（図21）。
【０１５６】
雄性マウスにおける如何なる行動も誘発するために必要なショックに差はなく、このことは、ショックの認識が遺伝子型によって差がないことを示している。特に、雄性野生型およびhAPPLoを発現する雄性マウスの間では歩行活動に差を認めなかった（図17）。このように、能動回避実験の結果は、hAPPLoを発現する雄性マウスにおける真の学習欠陥を表している。しかし、ショックの認識は雄性野生型およびhBACE/hAPPLoを発現する雄性マウスの間で差はなかったが、歩行活動はトランスジェニックマウスにおいて上昇していた（図17）。したがって、能動的回避の学習における見かけの改善（図21）は、部分的にこれらの動物の活動過多による可能性がある。同様に、雌性hAPPLoマウスは、野生型対照と比較してそのショック閾値が異ならず、歩行活動の増加も示さず（図17）、能動回避の欠陥は真の学習欠陥を表す。しかし、hBACE/hAPPLoを発現する雌性マウスは、野生型対照と比較してジャンプ反応の増加を示したが、これはショック認識の上昇を示唆する可能性があり、さらにこれらのマウスはまた、野生型対照と比較して活動過多であった。これらの要因はいずれも、能動的回避学習において認められたわずかな（しかし有意ではない）増加を説明することができる。このように、hAPPLoを発現する雄性および雌性マウスは、能動的回避学習が損なわれていたが、hBACE/hAPPLoを発現するマウスでは損なわれていなかった。
【０１５７】
C．[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスの概要
ヒトAPPロンドン型に関してトランスジェニックであるマウスにおけるヒトBACEの過剰発現は以下を誘導することが示された：
−  sAPPα断片の減少に関連したsAPPβ断片の増加に向けてのAPP代謝の変化。これらの結果は、８〜10日齢のマウスから得られた小脳の臓器型切片培養物において初めて証明された；次に、成体マウスからの脳抽出物において証明された。用いた方法は、ELISAおよびウェスタンブロットであった。
−  アミロイドペプチドの増加。この作用は、ELISA、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学を用いて成体マウスの臓器型切片培養物および脳抽出物において証明された。
−  ELISAおよびWBによって証明されたアミロイドペプチド（不溶性A-βペプチド）の沈着の増加によって、加齢二重トランスジェニックマウスの脳において示された病態の増加、組織化学および免疫組織化学によって示されたアミロイド斑の存在および炎症マーカーの検出。
【０１５８】
記述の結果は、類似の結果が二つの親BACE系統、すなわち系統13および系統24を用いて得られていることからhuBACEの発現に帰因することができる。これによって、トランスジーン組み込み部位について考えうる関与は除外される。
【０１５９】
【表１】
野生型ならびにhAPPLoおよびhBACE/hAPPLoを発現するマウスの神経学評価
データは平均値±標準誤差（独立t検定）、括弧内に四分位数間範囲を示す中央値として表記する（マン・ホイットニーU検定）。*p＜0.05、**p＜0.01。
0004824902.tif 000002
【０１６０】
【表２】
hAPPLoおよびhBACE/hAPPLoを発現するマウスならびに野生型対照におけるショック閾値試験
データは括弧内に四分位数間範囲を示す中央値として表記する（クラスカル・ウォリスの後に、適当であれば野生型マウスを対照群として用いてマン・ホイトニーU検定を行う）。**p＜0.01。
0004824902.tif 000003
【０１６１】
【発明の効果】
本発明により、アミロイドパシーを含む神経変性疾患、特にADのモデルとするための、マウス等の新規非ヒト動物モデルが提供された。
【配列表】
0004824902.tif 000004
0004824902.tif 000005
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0004824902.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はトランスジェニックマウスを作製するために用いるAD124（11.5 kbp）構築物を示す略図である。
【図２】  図２はOX-2ドメイン（ヒトβAPP770のアミノ酸344〜363位に対応する）（配列番号：６）に対して特異的な60量体オリゴヌクレオチドプローブを用いたAD124トランスジェニックおよび野生型対照マウスにおけるヒトβAPP770の局所脳分布を示す図である。トランスジーン発現が高レベルである領域は白い色であり、レベルが低い領域は灰色から黒色である。系統64および68では、対照と比較して大脳皮質および海馬形成において発現レベルが高いこと、ならびに系統15ではかなり低いレベルであることに注目されたい。
【図３】  図３はAD124トランスジェニックマウスにおけるβAPP770 mRNA発現レベルを示す図である。AD124ヘテロ接合マウスの異なる系統の脳対野生型対照におけるヒトβAPP770の相対的ハイブリダイゼーションシグナルの定量を示す。
【図４】  図４はイムノブロットの結果を示す図である。２ヶ月齢のヘテロ接合マウスからの総脳タンパク質をβAPPイソ型（22C11）を識別しない抗体と、クニッツ（kunitz）阻害剤含有βAPPイソ型（抗KPI）に対して特異的な別の抗体によってイムノブロットした。
【図５】  図５はPrp-Asp構築物を示す略図である。Eはエキソンを意味する。
【図６】  図６のパネルＡはサザンブロット（SB）、ノザンブロット（NB）、カイネティックPCR（RT-PCR）およびウェスタンブロット（WB）分析における異なるBACE系統について得られた結果を示す比較表である。SBの場合、系統あたりマウス３〜４匹を分析して、平均値の推定値を示す。RT-PCR、NBおよびWBの場合、分析したマウス２匹の個々の値を示す。RT-PCRの標準化結果に関して、値がより低ければ、mRNAレベルはより高くなることに注意されたい。図６のパネルＢはBACEトランスジェニック系統のmAb BSC-1によるウェスタンブロット分析の結果を示す図である。１は系統10、２は系統13、３および４は系統15、５および６は系統17、７は系統24、８は系統38、９は陰性系統である。
【図７】  図７は10日齢のマウスから得られた小脳の臓器型切片培養上清におけるアミロイド断片のレベルを示す図である。[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス、APPロンドン型単トランスジェニックマウス、および野生型マウスからの脳切片の消費培養培地におけるA-β40産生を示す。動物３および４は、非トランスジェニック対照プレップ16、動物６はAPPロンドン型単トランスジェニックマウス、ならびに動物４、５および７は[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスである。
【図８】  図８は10日齢のマウスから得られた小脳の臓器型切片培養上清におけるアミロイド断片のレベルを示す図である。[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス[#52]およびAPPロンドン型単トランスジェニックマウス[#49、#50、#51、#53]を含む一同腹子からの脳切片の消費培養培地において測定したA-β40、sAPPαおよびsAPPβレベルを示す。
【図９】  図９はトランスジーンがヘテロ接合である単APPロンドン型対照同腹子にはA-βペプチドの有意な増加が認められない６〜７および10ヶ月齢での、[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックおよびAPPロンドン型単トランスジェニックマウスからの脳抽出物におけるELISAによって測定したアミロイドレベルを示す図である。それぞれの時点で、雄性マウス３匹および雌性マウス３匹を分析して中央値をプロットした。
【図１０】  図１０は二重トランスジェニックマウスにおけるA-βの蓄積を示す図である。ヒト特異的抗A-β抗体WO-2を用いた、様々な月齢での単および二重トランスジェニックマウスの脳ホモジネートにおけるAPP、APPの12 kDβ切断断片、およびA-βの分析結果を示す。
【図１１】  図１１は11ヶ月齢[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスの皮質におけるアミロイド斑（BAP-2モノクローナル抗体（mAb）免疫反応性によって検出）を示す図である。APPロンドン型に関してホモ接合である16ヶ月齢の単トランスジェニックマウスを比較のために示す。
【図１２】  図１２は16ヶ月齢[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスの皮質におけるアミロイド斑（BAP-2 mAb免疫反応性）の炎症マーカーおよびBACE（BSC-1免疫反応性）の炎症マーカー、すなわちGFAP-免疫反応性星状細胞およびCD45-免疫反応性活性化星状膠細胞を検出した図である。
【図１３】  図１３はBSC-1 mAbによるBACE検出を示す図である。マウス３匹（雄性２匹および雌性１匹）を、[BACE系統13×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウスから、APPロンドン型単トランスジェニックマウス（ヒトBACEの陰性対照）から、およびBACE系統13単トランスジェニックマウスから得、３ヶ月齢で屠殺した。試料１、２および３は[BACE×APPロンドン型]二重トランスジェニックマウス、試料４、５、および６はAPPロンドン型トランスジェニックマウス、試料７、８、および９はBACEトランスジェニックマウスである。
【図１４】  図１４は10 nm金コロイドに結合させたGAM二次抗体によって可視化した抗A-βモノクローナル抗体（BAP-2）を用いた凍結固定後の切片上免疫金標識を示す図である。標識は、平滑筋細胞内の微細繊維沈着物および内皮細胞層（矢印）に向かう基底膜に侵入する微細繊維束において認められる。
【図１５】  図１５は10 nm金コロイドに結合したGAM二次抗体によって可視化した抗A-βモノクローナル抗体（BAP-2）を用いた凍結固定後の切片上免疫金標識を示す図である。標識は、平滑筋細胞の残遺物内に蓄積されたA-β微細繊維の広い部分において検出される。
【図１６】  図１６は10 nm金コロイドに結合させたGAM二次抗体によって可視化した抗A-βモノクローナル抗体（BAP-2）を用いた凍結固定後の切片上免疫金標識を示す図である。電子顕微鏡写真のパネルは、18ヶ月齢のBACE×APPロンドン型トランスジェニックマウス脳の前頭皮質の散在性アミロイド斑内の領域からの異なる三つの例を示す。標識したA-βは、軸索突起と樹状突起（矢印）の細胞質膜近傍の小片上に認められる。標識材料は、非繊維様に見える無定形超構造を有することに注目されたい。
【図１７】  図１７はhAPPLoおよびhBACE/hAPPLoを発現するマウスならびに野生型対照マウスの、歩行数によって測定した歩行活動を示す図である。データは、平均値±標準誤差（二要因配置ANOVA（性別と遺伝子型））として表記し、適当であればこの後に雄性および雌性の双方に関して一要因配置ANOVA（遺伝子型）ならびにニューマン・クールズの方法を行った。* p＜0.05、***p＜0.001。
【図１８】  図１８は野生型マウスならびにhAPPLoおよびBACE/hAPPLoを発現するマウスにおけるY字迷路における自発的交互移動を用いた作動記憶の評価を示す図である。データは、平均値±標準誤差として表記する（適当であれば、この後に二要因配置ANOVA（性別と遺伝子型）を行う）。
【図１９】  図１９は野生型ならびにhAPPLoおよびhBACE/hAPPLoを発現するマウスにおけるモリス水中迷路における修得学習を示す図である。データは平均値±標準誤差として表記する（繰り返し測定（試行）を行う二要因配置ANOVA（性別と遺伝子型）の後に、雄性および雌性動物の双方について一要因配置ANOVA（遺伝子型）およびニューマン・クールズの方法を行った）。*p＜0.05。
【図２０】  図２０は図３の矢印によって示すように、修得訓練の中間で（パネルA）および訓練終了時（パネルB）に、マウスが足場の位置をどれほど十分に学習しているかを評価するために、隠れた足場がプールから除去された60秒の間、それぞれの４分の１区画に留まった時間を測定する探査テストの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差として表記する（各群について繰り返し測定（４分の１区画）を行う一要因配置ANOVAを行い、適当であればその後にニューマン・クールズの方法を行った）。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。
【図２１】  図２１は条件刺激（CS、光）の提示後非条件刺激（US、足に0.2 mAのショックを与える）を能動的に回避するマウスの修得学習を示す図である。データは、平均値±標準誤差として表記する（各群について繰り返し測定（足場）を行う一要因配置ANOVAを行い、適当であればその後にニューマン・クールズの方法を行った）。*p＜0.05、**p＜0.01。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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