(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列と一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離装置において、
キャピラリー型の密閉流路の両端の各端部に、正電極、および負電極を、それぞれ、緩衝液に浸漬して設けてなり、
前記密閉流路中に、前記第１のサンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質に、特定の塩基配列を有するマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを緩衝液中に添加してなるコンジュゲートＤＮＡ溶液を、充填し、かつ、
前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブ、及び前記マーカーＤＮＡの塩基配列に対して相補的な配列を有する第２のプローブを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡとを結合させた第１のＤＮＡ複合体、および、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３のプローブ、及び前記第２のプローブの塩基配列と少なくとも一つの塩基配列が異なる塩基配列を有する第４のプローブを有する第２のリガンドＤＮＡと、前記第２のサンプルＤＮＡとを結合させた第２のＤＮＡ複合体、を含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極の各々に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記第１のＤＮＡ複合体、及び前記第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離する、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項２】
サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列とその一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離装置において、
キャピラリー型の密閉流路の両端の各端部に、正電極、および負電極を、それぞれ、緩衝液に浸漬して設けてなり、
前記密閉流路中に、第１サンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲート溶液を、充填し、かつ、
前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブと、前記マーカーＤＮＡの塩基配列に対して相補的な配列を有する第２のプローブとを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡとが結合した第１のＤＮＡ複合体、および、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３のプローブを有する第３のリガンドＤＮＡと、前記第２のサンプルＤＮＡとを結合させた第３のＤＮＡ複合体と、を含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記第１のＤＮＡ複合体、及び前記第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離する、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ分離装置において、
電気泳動によって前記密閉流路中を移動する、前記第１のサンプルＤＮＡ、あるいは第２のサンプルＤＮＡの、少なくとも一つを検知する検出部を、さらに備え、
前記密閉流路中に、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填し、かつ、前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第２のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、前記検出部で、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第２のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを検知する、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡ分離装置において、
電気泳動によって前記密閉流路中を移動する、前記第１のサンプルＤＮＡ、あるいは第２のサンプルＤＮＡの、少なくとも一つを検知する検出部を、さらに備え、
前記密閉流路中に、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填し、かつ、前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第３のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、
前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、前記検出部で、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第３のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを検知する、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載のＤＮＡ分離装置において、
前記第１のサンプルＤＮＡ、もしくは前記第２のサンプルＤＮＡは、蛍光色素が付加されている、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ分離装置において、
前記第１プローブと、前記第３プローブが、１０塩基以上である、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ分離装置において、
前記第２プローブ、もしくは前記第４プローブが、６塩基以上である、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ分離装置において、
前記緩衝液が、ＴＢ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、もしくはＳＳＣ緩衝液のいずれかである、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項９】
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ分離装置において、
前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作られたリニアポリマーである、
ことを特徴とするＤＮＡ分離装置。
【請求項１０】
サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列とはその一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離方法において、
前記密閉流路中に、第１のサンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲートＤＮＡ溶液を充填させる充填ステップと、
前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブと、前記第１、及び第２の塩基配列とは異なる塩基配列を有する第２のプローブとを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３プローブと、前記第２のプローブと少なくとも一つの塩基配列を異にする塩基配列を有する第４プローブとを有する第２のリガンドＤＮＡと、前記サンプル溶液とを混合して、ハイブリダイズさせ、前記第１のサンプルＤＮＡと、前記第１のリガンドＤＮＡとを結合させた第１のＤＮＡ複合体と、前記第２のサンプルＤＮＡと、前記第２のリガンドＤＮＡとを結合させた第２のＤＮＡ複合体とを含むプレサンプル溶液を作製するプレサンプル溶液作製ステップと、
前記充填ステップで、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填してなる密閉流路内に、前記プレサンプル溶液作製ステップで作製したプレサンプル溶液を注入する注入ステップと、
前記密閉流路の両端にある正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記第１のＤＮＡ複合体、及び第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離する分離ステップと、を含む、
ことを特徴とするＤＮＡ分離方法。
【請求項１１】
サンプル溶液に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列とはその一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離方法において、
前記密閉流路中に、第１のサンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲートＤＮＡ溶液を、充填させる充填ステップと、
前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブと、前記第１、及び第２の塩基配列とは異なる塩基配列の第２のプローブとを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３プローブを有する第３のリガンドＤＮＡと、前記サンプル溶液とを混合して、ハイブリダイズさせ、前記第１のサンプルＤＮＡと、前記第１のリガンドＤＮＡとを結合させた第１のＤＮＡ複合体と、前記第２のサンプルＤＮＡと前記第３のリガンドＤＮＡとを結合させた第３のＤＮＡ複合体とを含むプレサンプル溶液を作製するプレサンプル溶液作製ステップと、
前記充填ステップで、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填してなる密閉流路中に、前記プレサンプル溶液作製ステップで作製したプレサンプル溶液を注入する注入ステップと、
前記密閉流路の両端にある正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記第１のＤＮＡ複合体、及び第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離する分離ステップと、を含む、
ことを特徴とするＤＮＡ分離方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のＤＮＡ分離方法において、
前記プレサンプル溶液作製ステップは、前記第１のリガンドＤＮＡと、前記第２のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡもしくは前記第２のサンプルＤＮＡの少なくとも一つを有するサンプル溶液とを混合してハイブリダイズさせ、前記第１のＤＮＡ複合体もしくは前記第２のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを有するプレサンプル溶液を作製するものであり、
前記注入ステップは、前記プレサンプル溶液を前記コンジュゲートＤＮＡ溶液が充填された密閉流路中に注入するものであり、
前記正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第２のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを検知する検知ステップを、含む、
ことを特徴とするＤＮＡ分離方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＤＮＡ分離方法において、
前記プレサンプル溶液作製ステップは、前記第１のリガンドＤＮＡと、前記第３のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡもしくは前記第２のサンプルＤＮＡの少なくとも一つを有するサンプル溶液とを混合してハイブリダイズさせ、前記第１のＤＮＡ複合体もしくは前記第３のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを有するプレサンプル溶液を作製するものであり、
前記注入ステップは、前記プレサンプル溶液を前記コンジュゲートＤＮＡ溶液が充填された密閉流路中に注入するものであり、
前記正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第３のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを検知する検知ステップを、含む、
ことを特徴とするＤＮＡ分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出するＤＮＡ分離装置、ＤＮＡ分離方法、及びリガンドＤＮＡに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
本出願人は、前述したＳＮＰｓのような一部の塩基配列が異なるＤＮＡを調べる方法として、コンジュゲートＤＮＡを利用して、サンプルＤＮＡを分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（特許文献１参照）。
【０００５】
以下、図６〜８を用いて従来方法について説明する。図６は、一般的なキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図であり、図７は、キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー管内の状態図であり、図８は、従来におけるサンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡとの関係を示す図である。
【０００６】
図６に示すように、キャピラリー電気泳動装置１００は、正電極１３３を配置した第１容器１３１と負電極１３４を配置した第２容器１３２との間を、緩衝液１１を含むコンジュゲートＤＮＡを充たしたキャピラリー管１３０で連絡している。そして、緩衝液１１を含むコンジュゲートＤＮＡを充たしたキャピラリー管１３０に、図７に示すようにサンプルＤＮＡ２００を注入する。前記コンジュゲートＤＮＡ２１０は、図８に示すように、電気泳動時にほとんど泳動しないリニアポリマーなどの電気非泳動物質２１１に、前記サンプルＤＮＡ２００に含まれる目的ＤＮＡの一部の塩基配列と相補的な塩基配列をもつマーカーＤＮＡ２１２を直接結合させてなるものであり、前記サンプルＤＮＡ２００は、前記コンジュゲートＤＮＡ２１０に対して相補的な塩基配列を持つ目的ＤＮＡをその塩基配列の一部に含む第１サンプルＤＮＡ２０１と、コンジュゲートＤＮＡに対して一部の塩基配列が相補的でない第２サンプルＤＮＡ２０２とが混合されたものである。
【０００７】
そしてこの後、両電極１３３，１３４間に可変電源部１３５により電圧を印加して、キャピラリー管１３０内のサンプルＤＮＡ２００を電気泳動させ、該サンプルＤＮＡ２００中の第１サンプルＤＮＡ２０１と第２サンプルＤＮＡ２０２それぞれの、前記コンジュゲートＤＮＡ２１０に対する親和性の差によって、該サンプルＤＮＡ２００を分離する。
【０００８】
次に、図８を用いて、コンジュゲートＤＮＡ２１０をキャピラリー管１３０内で擬似的に固定する方法についてより詳細に説明する。
ＤＮＡには、二重鎖を形成するものと一重鎖を形成するものとが存在する。そしてＤＮＡのもつ、アデニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）の４つの塩基は、ＡとＴ、ＧとＣが結合し易くなっており、ＤＮＡが二重鎖を形成する場合、Ａ−Ｔ，Ｇ−Ｃで対をなしている。従って、二重鎖を形成する一方のＤＮＡが５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’と配列されている場合、他方のＤＮＡは５’−ＡＣＧＣＧＡＴ−３’という塩基配列をもつ。
【０００９】
従来のキャピラリー電気泳動装置に用いる、コンジュゲートＤＮＡは、サンプルＤＮＡを分離するために、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用している。すなわち、図８に示すように、該コンジュゲートＤＮＡ２１０のマーカーＤＮＡ２１２部分に、サンプルＤＮＡ２００中の検出対象である目的ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えておく。
【００１０】
例えば、サンプルＤＮＡ２００中の目的ＤＮＡである第１サンプルＤＮＡ２０１がミュータントＤＮＡであるとし、該ミュータントＤＮＡのＤＮＡ配列が５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’を含み、前記サンプルＤＮＡ２００に含まれる第２サンプルＤＮＡであるワイルドＤＮＡのＤＮＡ配列が５’−ＡＴＣＡＣＧＴ−３’を含む場合、下線で示した部分でミュータントＤＮＡ２０１とワイルドＤＮＡ２０２の塩基が異なっている。このとき、コンジュゲートＤＮＡ２１０のマーカーＤＮＡ２１２の配列を５’−ＡＣＧＣＧＡＴ−３’とすると、ワイルドＤＮＡ２０２は下線部においてコンジュゲートＤＮＡ２１０のマーカーＤＮＡ２１２と相補的ではなくなる。これにより、コンジュゲートＤＮＡ２１０と結合したサンプルＤＮＡ２００のうち、ミュータントＤＮＡ２０１の方がワイルドＤＮＡ２０２より全体の結合力が大きくなり、電気泳動時にミュータントＤＮＡ２０１の方がワイルドＤＮＡ２０２より遅延して泳動される。
【００１１】
ところで、前記サンプルＤＮＡ２００は、血液などから細胞を破砕してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅して作製する。このとき、増幅する部分の塩基数及び塩基配列パターンに応じて、コンジュゲートＤＮＡ２１０の塩基数が決定されるが、ＰＣＲなどで増幅する目的のＤＮＡの塩基数は、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡ中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数の５０個程度である。
【００１２】
そして、前記コンジュゲートＤＮＡ２１０は、電気非泳動物質２１１が例えばアクリルアミドで作られたリニアポリマーの場合、前記サンプルＤＮＡ２００の目的のＤＮＡ配列と相補的配列をもつマーカーＤＮＡ２１２の５’末端をビニル化して、アクリルアミドモノマーに所定の比率で混入し、さらに重合開始剤である過硫酸アンモニウムと重合剤であるテトラ・メチル・エチレン・ジアミンとを混ぜて、２時間振動させて作製する。
【００１３】
前述のようにして作製されたコンジュゲートＤＮＡ２１０を、従来のキャピラリー電気泳動装置１００のキャピラリー管１３０に充填し、該コンジュゲートＤＮＡ２１０中にサンプルＤＮＡ２００を注入して電気泳動により第２容器１３２から第１容器１３１へ移動させると、コンジュゲートＤＮＡ２１０とサンプルＤＮＡ２００との相互作用が、キャピラリー管１３０の壁面近傍に限らず該キャピラリー管１３０内で作用し、該相互作用によりコンジュゲートＤＮＡ２１０と結合した、サンプルＤＮＡ２００中のワイルドＤＮＡ２０２とミュータントＤＮＡ２０１それぞれの移動速度差から、前記サンプルＤＮＡ２００を前記ワイルドＤＮＡ２０２と前記ミュータントＤＮＡ２０１とに分離することができ、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することができる。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上説明したように、従来のコンジュゲートＤＮＡ２１０は、サンプルＤＮＡ２００中の検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列をもつマーカーＤＮＡ２１２の末端と、電気非泳動物質２１１とを結合させてなる構成をもつため、目的ＤＮＡと同じ数のコンジュゲートＤＮＡが必要になり、検出対象が変わる毎に、コンジュゲートＤＮＡを最初から作製しなおさなければならず、測定結果を得るまでに膨大な時間がかかるという課題があった。
【００１５】
さらに、従来のコンジュゲートＤＮＡ２１０は、サンプルＤＮＡ２００との相補的な水素結合による結合力によって、分離性能が決定づけられるため、前記コンジュゲートＤＮＡ２１０のマーカーＤＮＡ２１２の塩基配列の長さ、あるいは配列パターンによって、該マーカーＤＮＡ２１２とサンプルＤＮＡ２００との結合力が異なり、サンプルＤＮＡ２００を適切に分離させるためのさまざまな条件を、サンプルＤＮＡ２００中の目的ＤＮＡの塩基配列が変わる毎に探索する必要があるという課題もある。
【００１６】
具体的に述べると、前述したようにＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）で対となるが、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の場合は２個の水素結合で結合され、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の場合は３個の水素結合で結合されている。従って、マーカーＤＮＡ２１２の塩基配列の長さが同じであっても、サンプルＤＮＡ２００と前記マーカーＤＮＡ２１２との結合力は、サンプルＤＮＡ２００の配列パターンによって異なってくる。例えば、相補的な結合部分であるマーカーＤＮＡ２１２の塩基配列が６個の場合、水素結合が最低１２個（すべてＡ−Ｔの場合）から最高１８個（すべてＣ−Ｇの場合）まで存在することとなり、相補的な結合部分の塩基配列の長さが同じであっても、その結合力はかなり異なる。
【００１７】
しかし、サンプルＤＮＡ２００の電気泳動による分離を行なう場合に、コンジュゲートＤＮＡ２１０を調製した後、装置１００側で制御できる項目は、電気泳動時の電圧と、測定温度のみであり、このような装置１００側での制御だけでは、サンプルＤＮＡ２００とコンジュゲートＤＮＡ２１０のマーカーＤＮＡ２１２との結合力をコントロールするには限界がある。これを解消するために、従来では、サンプルＤＮＡ２００に含まれる検出対象の目的ＤＮＡの塩基配列に応じて、コンジュゲートＤＮＡ２１０を作製することで、サンプルＤＮＡ２００に含まれる目的ＤＮＡと、該目的ＤＮＡと相補的な配列をもつマーカーＤＮＡ２１２との結合力を適当なものにしていた。
【００１８】
その方法としては、例えば、コンジュゲートＤＮＡ２１０のサンプルＤＮＡとの相補的な結合部分であるマーカーＤＮＡ２１２の長さを、長くしたり短くしたりすることで対応するものが挙げられる。
【００１９】
しかし、前述した方法では、サンプルＤＮＡ２００とマーカーＤＮＡ２１２との結合力を細かく制御することはできない問題があった。
【００２０】
この問題を解決するために、従来においては、サンプルＤＮＡ２００とコンジュゲートＤＮＡ２１０との結合力の細かい制御を、サンプルＤＮＡ２００毎に、コンジュゲートＤＮＡ２１０に含有される結合制御剤の量や、電気非泳動物質２１１の粘度、あるいはサンプルＤＮＡ２００の量、コンジュゲートＤＮＡ２１０の量を制御してコントロールしていた。
【００２１】
前記結合制御剤の量が多いほど、電気非泳動物質２１１の粘度が高いほど、コンジュゲートＤＮＡ２１０の量が多いほど、さらには電気泳動時の電圧が低いほど、測定温度が低いほど、前記サンプルＤＮＡ２００の電気泳動速度が遅くなるため、前記密閉流路中における、サンプルＤＮＡ２００とコンジュゲートＤＮＡ２１０との結合力が増加する。
【００２２】
しかしながら、以上に示したように、サンプルＤＮＡ２００毎に、コンジュゲートＤＮＡに含有させる、結合制御剤の量、電気非泳動物質２１１の粘度、サンプルＤＮＡ２００の量、及びコンジュゲートＤＮＡ２１０の量を複雑に組み合わせた様々なパターンを推測し、最適な電気泳動条件を実験して探索するには、多大な労力と時間がかかる。
【００２３】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、前記サンプルＤＮＡを電気泳動により分離する際に、該サンプルＤＮＡ中の検出対象であるＤＮＡ配列毎に、コンジュゲートＤＮＡに含有させる結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、サンプルＤＮＡの量及びコンジュゲートＤＮＡの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索しなくても、前記サンプルＤＮＡを適切、且つ短時間で分離することができ、しかも多種類の被検出サンプルＤＮＡにも対応できるＤＮＡ分離装置、及びＤＮＡ分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
前記課題を解決するために、本発明のＤＮＡ分離装置は、サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列と一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離装置において、キャピラリー型の密閉流路の両端の各端部に、正電極、および負電極を、それぞれ、緩衝液に浸漬して設けてなり、前記密閉流路中に、前記第１のサンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質に、特定の塩基配列を有するマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを緩衝液中に添加してなるコンジュゲートＤＮＡ溶液を、充填し、かつ、前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブ、及び前記マーカーＤＮＡの塩基配列に対して相補的な配列を有する第２のプローブを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡとを結合させた第１のＤＮＡ複合体、および、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３のプローブ、及び前記第２のプローブの塩基配列と少なくとも一つの塩基配列が異なる塩基配列を有する第４のプローブを有する第２のリガンドＤＮＡと、前記第２のサンプルＤＮＡとを結合させた第２のＤＮＡ複合体、を含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、前記正電極、および負電極の各々に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記第１のＤＮＡ複合体、及び前記第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離するものである。
【００２５】
これにより、前記サンプルＤＮＡ中の検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わるたびに、コンジュゲートＤＮＡの塩基配列を変えなくとも、また、最適な長さや結合強度を持ったコンジュゲートＤＮＡの電気泳動条件を探索しなくても、該サンプルＤＮＡに結合させるリガンドＤＮＡの塩基配列を変化させることで、前記第１，第２のＤＮＡ複合体を分離することができるため、ＳＮＰｓのありなしを短時間で、且つ正確に判別可能なＤＮＡ分離装置を提供することができる。
【００２６】
また、本発明のＤＮＡ分離装置は、サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列とその一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離装置において、キャピラリー型の密閉流路の両端の各端部に、正電極、および負電極を、それぞれ、緩衝液に浸漬して設けてなり、前記密閉流路中に、第１サンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲート溶液を、充填し、かつ、前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブと、前記マーカーＤＮＡの塩基配列に対して相補的な配列を有する第２のプローブとを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡとが結合した第１のＤＮＡ複合体、および、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３のプローブを有する第３のリガンドＤＮＡと、前記第２のサンプルＤＮＡとを結合させた第３のＤＮＡ複合体と、を含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記第１のＤＮＡ複合体、及び前記第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離するものである。
【００２７】
これにより、前記サンプルＤＮＡ中の検出対象である目的ＤＮＡの塩基配列が変わるたびに、コンジュゲートＤＮＡの塩基配列を変えなくとも、また、最適な長さや結合強度を持ったコンジュゲートＤＮＡの電気泳動条件を探索しなくても、該サンプルＤＮＡに結合させるリガンドＤＮＡの塩基配列を変化させることで、前記第１，第３のＤＮＡ複合体を分離することができるため、ＳＮＰｓのありなしを短時間で、且つ正確に判別可能なＤＮＡ分離装置を提供することができる。
【００２８】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、電気泳動によって前記密閉流路中を移動する、前記第１のサンプルＤＮＡ、あるいは第２のサンプルＤＮＡの、少なくとも一つを検知する検出部を、さらに備え、前記密閉流路中に、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填し、かつ、前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第２のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、前記検出部で、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第２のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを検知するものである。
【００２９】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、電気泳動によって前記密閉流路中を移動する、前記第１のサンプルＤＮＡ、あるいは第２のサンプルＤＮＡの、少なくとも一つを検知する検出部を、さらに備え、前記密閉流路中に、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填し、かつ、前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第３のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを含むプレサンプル溶液を、前記密閉流路内に注入してなり、前記正電極、および負電極に電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、前記検出部で、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第３のＤＮＡ複合体の、少なくとも一つを検知するものである。
【００３０】
これにより、サンプル溶液中に含まれる第１のサンプルＤＮＡ、あるいは第２のサンプルＤＮＡの検出を行うことができる。
【００３１】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、前記第１のサンプルＤＮＡ、もしくは前記第２のサンプルＤＮＡは、蛍光色素が付加されているものである。
【００３２】
これにより、蛍光色素を検出すれば、密閉流路中にある溶液中に含まれる様々なＤＮＡのうち、第１のサンプルＤＮＡ、もしくは前記第２のサンプルＤＮＡのみを検出することができる。
【００３３】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、前記第１プローブと、前記第３プローブが、１０塩基以上であるものである。
【００３４】
これにより、サンプルＤＮＡをリガンドＤＮＡに強固に結合させてＤＮＡ複合体を形成させることができる。
【００３５】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、前記第２プローブ、もしくは前記第４プローブが、６塩基以上であるものである。
【００３６】
これにより、ＤＮＡ複合体とコンジュゲートＤＮＡとを適度に結合させて、ＤＮＡ複合体の電気泳動速度を適度に遅延させることができる。
【００３７】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、前記緩衝液が、ＴＢ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、もしくはＳＳＣ緩衝液のいずれかであるものである。
【００３８】
さらに、本発明のＤＮＡ分離装置は、前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはポリエチレングリコールのいずれかで作られたリニアポリマーであるものである。
【００３９】
また、本発明のＤＮＡ分離方法は、サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列とはその一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離方法において、前記密閉流路中に、第１のサンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲートＤＮＡ溶液を充填させる充填ステップと、前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブと、前記第１、及び第２の塩基配列とは異なる塩基配列を有する第２のプローブとを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３プローブと、前記第２のプローブと少なくとも一つの塩基配列を異にする塩基配列を有する第４プローブとを有する第２のリガンドＤＮＡと、前記サンプル溶液とを混合して、ハイブリダイズさせ、前記第１のサンプルＤＮＡと、前記第１のリガンドＤＮＡとを結合させた第１のＤＮＡ複合体と、前記第２のサンプルＤＮＡと、前記第２のリガンドＤＮＡとを結合させた第２のＤＮＡ複合体とを含むプレサンプル溶液を作製するプレサンプル溶液作製ステップと、前記充填ステップで、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填してなる密閉流路内に、前記プレサンプル溶液作製ステップで作製したプレサンプル溶液を注入する注入ステップと、前記密閉流路の両端にある正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記第１のＤＮＡ複合体、及び第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離する分離ステップと、を含むものである。
【００４０】
これにより、前記第１，第２のサンプルＤＮＡと、該各サンプルＤＮＡに相補的な塩基配列をその一部に有する第１，第２のリガンドＤＮＡとを結合してなる第１，第２のＤＮＡ複合体と、密閉流路中に充填されたコンジュゲートＤＮＡとの結合強度の違いにより、前記第１，第２のＤＮＡ複合体を分離でき、この結果、ＳＮＰｓのありなしを、短時間で、且つ正確に判別することができる。
【００４１】
また、本発明のＤＮＡ分離方法は、サンプル溶液に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列とはその一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、電気泳動によって分離するＤＮＡ分離方法において、前記密閉流路中に、第１のサンプルＤＮＡ、及び第２のサンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質にマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡを、緩衝液中に添加してなるコンジュゲートＤＮＡ溶液を、充填させる充填ステップと、前記第１の塩基配列に対して相補的な配列を有する第１のプローブと、前記第１、及び第２の塩基配列とは異なる塩基配列の第２のプローブとを有する第１のリガンドＤＮＡと、前記第２の塩基配列に対して相補的な配列を有する第３プローブを有する第３のリガンドＤＮＡと、前記サンプル溶液とを混合して、ハイブリダイズさせ、前記第１のサンプルＤＮＡと、前記第１のリガンドＤＮＡとを結合させた第１のＤＮＡ複合体と、前記第２のサンプルＤＮＡと前記第３のリガンドＤＮＡとを結合させた第３のＤＮＡ複合体とを含むプレサンプル溶液を作製するプレサンプル溶液作製ステップと、前記充填ステップで、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液を充填してなる密閉流路中に、前記プレサンプル溶液作製ステップで作製したプレサンプル溶液を注入する注入ステップと、前記密閉流路の両端にある正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記第１のＤＮＡ複合体、及び第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させて、該両者を分離する分離ステップと、を含むものである。
【００４２】
これにより、前記第１，第２のサンプルＤＮＡは、それぞれ相補的な配列を持つ第１，第３のリガンドＤＮＡと特異的に結合してＤＮＡ複合体を形成し、該形成された第１，第３のＤＮＡ複合体と、密閉流路中に充填されたコンジュゲートＤＮＡとの結合強度の違いにより、前記第１，第３のＤＮＡ複合体を分離でき、この結果、ＳＮＰｓのありなしを、短時間で、且つ正確に判別することができる。
【００４３】
さらに、本発明のＤＮＡ分離方法は、前記プレサンプル溶液作製ステップは、前記第１のリガンドＤＮＡと、前記第２のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡもしくは前記第２のサンプルＤＮＡの少なくとも一つを有するサンプル溶液とを混合してハイブリダイズさせ、前記第１のＤＮＡ複合体もしくは前記第２のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを有するプレサンプル溶液を作製するものであり、前記注入ステップは、前記プレサンプル溶液を前記コンジュゲートＤＮＡ溶液が充填された密閉流路中に注入するものであり、前記正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第２のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第２のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを検知する検知ステップを、含むものである。
【００４４】
さらに、本発明のＤＮＡ分離方法は、前記プレサンプル溶液作製ステップは、前記第１のリガンドＤＮＡと、前記第３のリガンドＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡもしくは前記第２のサンプルＤＮＡの少なくとも一つを有するサンプル溶液とを混合してハイブリダイズさせ、前記第１のＤＮＡ複合体もしくは前記第３のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを有するプレサンプル溶液を作製するものであり、前記注入ステップは、前記プレサンプル溶液を前記コンジュゲートＤＮＡ溶液が充填された密閉流路中に注入するものであり、前記正電極、および負電極に所定の電圧を印加し、前記コンジュゲートＤＮＡ溶液中で、前記プレサンプル溶液に含まれる前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは前記第３のＤＮＡ複合体を電気泳動させ、該密閉流路を移動する前記第１のＤＮＡ複合体、もしくは第３のＤＮＡ複合体の少なくとも一つを検知する検知ステップを、含むものである。
【００４５】
これにより、サンプル溶液中に含まれる第１のサンプルＤＮＡ、あるいは第２のサンプルＤＮＡの検出を行うことができる。
【００４６】
また、本発明の第１のリガンドＤＮＡは、サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列と一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、コンジュゲートＤＮＡ中で電気泳動させて分離させる際に、前記第１のサンプルＤＮＡに結合させる第１のリガンドＤＮＡであって、前記第１のサンプルＤＮＡの第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプローブと、前記各サンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質に、特定の塩基配列を有するマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡの、該マーカーＤＮＡと相補的な塩基配列を有する第２のプローブと、を含む合成オリゴからなるものである。
【００４７】
これにより、コンジュゲートＤＮＡの配列を一定にしても、該第１のリガンドＤＮＡ中の、サンプルに結合する領域の配列を変化させれば、多種類のサンプルに対応することが可能になる。
【００４８】
また、本発明の第２のリガンドＤＮＡは、サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列と一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、コンジュゲートＤＮＡ中で電気泳動させて分離させる際に、前記第２のサンプルＤＮＡに結合させる第２のリガンドＤＮＡであって、前記第２のサンプルＤＮＡの第２の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第３のプローブと、前記各サンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する電気非泳動物質に、特定の塩基配列を有するマーカーＤＮＡを結合させたコンジュゲートＤＮＡの、該マーカーＤＮＡと、少なくとも１塩基が相補的でない塩基配列を有する第４のプローブと、を含む合成オリゴからなるものである。
【００４９】
これにより、コンジュゲートＤＮＡの配列を一定にしても、該第２のリガンドＤＮＡ中の、サンプルに結合する領域の配列を変化させれば、多種類のサンプルに対応することが可能となる。
【００５０】
また、本発明の第３のリガンドＤＮＡは、サンプル溶液中に含まれる、第１の塩基配列を含む第１のサンプルＤＮＡと、該第１の塩基配列と一部の塩基配列を異にする第２の塩基配列を含む第２のサンプルＤＮＡとを、コンジュゲートＤＮＡ中で電気泳動させて分離させる際に、前記第２のサンプルＤＮＡに結合させる第３のリガンドＤＮＡであって、前記第２のサンプルＤＮＡの第２の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第３のプローブを含む合成オリゴからなるものである。
【００５１】
これにより、コンジュゲートＤＮＡの配列を一定にしても、該第３のリガンドＤＮＡ中の、サンプルに結合する領域の配列を変化させれば、多種類のサンプルに対応することが可能になる。
【発明の効果】
【００５２】
本発明のＤＮＡ分離装置、及び方法によれば、コンジュゲートＤＮＡと相互作用する対象物をリガンドＤＮＡとしたので、前記コンジュゲートＤＮＡをサンプルＤＮＡが多種類にわたっても、該コンジュゲートＤＮＡの配列を共通の配列にでき、この結果、前記コンジュゲートＤＮＡを短時間で、且つ安定して提供することができる。さらに、前記サンプルＤＮＡの検出対象である目的ＤＮＡの配列が変化する度に、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度、サンプルＤＮＡの量及びコンジュゲートＤＮＡの量などを複雑に組み合わせて最適な電気泳動条件を探索する、ということをしなくても、サンプルＤＮＡの分離を適切に行うことが可能となる。
【００５３】
また、測定時にＤＮＡ分離装置側で制御可能な電圧や測定温度などの条件を、サンプルＤＮＡの種類に関わらず一定にすることができ、当該ＤＮＡ分離装置を作製する上でも、仕様の簡略化を図ることができる。
【００５４】
また、本発明のリガンドＤＮＡによれば、その構成を、サンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡとの両方に結合できる配列としたので、コンジュゲートＤＮＡの配列を一定にしても、多種類のサンプルに対応することが可能となり、この結果、短時間で多種類の被検出サンプルＤＮＡに対応することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、第１サンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡの両方に結合可能な第１リガンドＤＮＡ、及び前記第２サンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡの両方に結合可能な第２リガンドＤＮＡを、それぞれ前記第１，第２サンプルＤＮＡに結合させて第１，第２のＤＮＡ複合体を形成した後、該第１，第２のＤＮＡ複合体を前記コンジュゲートＤＮＡ中で電気泳動させ、両者を分離するものである。
【００５６】
以下、本実施の形態１におけるコンジュゲートＤＮＡ、リガンドＤＮＡの構成について説明する。
図１は、本実施の形態１におけるコンジュゲートＤＮＡ、サンプル溶液に含まれる２つのサンプルＤＮＡ、及び２つのリガンドＤＮＡの相関を示す図である。
まず、本実施の形態１のコンジュゲートＤＮＡ１０は、従来と同様、電気非泳道物質１と、マーカーＤＮＡ２とを結合して作製する。
【００５７】
ここで、前記電気非泳動物質１は、電気泳動時のサンプルＤＮＡの速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する物質で構成されるものであり、本願でいう「サンプルＤＮＡの電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する」とは、例えば内径が７５μm、距離３８ｃｍのキャピラリー管内を電気泳動する場合、前記サンプルＤＮＡが８分で移動するのに対して、前記コンジュゲートＤＮＡは６０分以上で移動するというレベルを意味し、電気泳動時にほとんど泳動しないといえるものである。
【００５８】
前記電気非泳動物質１は、電気泳動時にほとんど泳動しない物質であればよく、例えば、ポリマーやガラス、磁気ビーズなどが例に挙げられる。なお本実施の形態１では、前記電気非泳動物質１が、一般的に使用されるリニアポリマーである、ポリエチレングリコールであるものとして説明する。
そして、前記マーカーＤＮＡ２は、任意の塩基配列を設定する。
【００５９】
そして、前述したコンジュゲートＤＮＡ１０は、前記電気非泳動物質１がポリエチレングリコールの場合、該ポリエチレングリコールの末端をカルボン酸化し、更にそのカルボン酸化された部分とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応させてエステル化し、一方マーカーＤＮＡ２は、その５’末端をアミノ化し、該アミノ化したマーカーＤＮＡ２と、前記エステル化したポリエチレングリコールとをアミド結合させて作製する。
【００６０】
次に、本実施の形態１における、第１，第２リガンドＤＮＡについて説明する。なお、本実施の形態１では、サンプル溶液中に含まれる第１サンプルＤＮＡ５が、検出対象である目的ＤＮＡを含むものとする。
【００６１】
本実施の形態１の第１，第２リガンドＤＮＡは、図１に示すように、１つの合成オリゴの中に、サンプルＤＮＡと結合する第１の領域（第１，第３プローブ）と、コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２と結合する第２の領域（第２，第４プローブ）が配置されてなるものである。このように構成することにより、前記第１，第２リガンドＤＮＡが、第１，第２サンプルＤＮＡと、前記コンジュゲートＤＮＡの両方に結合することができるため、この結果、検出すべきサンプルＤＮＡの塩基配列が変わっても、コンジュゲートＤＮＡのマーカーＤＮＡの塩基配列を変えるのではなく、前記リガンドＤＮＡ中の、前記サンプルＤＮＡに結合する第１の領域の塩基配列を変化させることで、サンプルＤＮＡの変更に対応でき、サンプルＤＮＡが多種類にわたっても、コンジュゲートＤＮＡを一定のものに決定することが可能となる。
【００６２】
具体的に述べると、第１リガンドＤＮＡ３は、第１サンプルＤＮＡ５の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１プローブ３１と、前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第２プローブ３２とからなる合成オリゴであり、第２リガンドＤＮＡ４は、前記第２サンプルＤＮＡ６の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第３プローブ４１と、前記第１リガンドＤＮＡ３中の前記第２プローブ３２の塩基配列と、少なくとも１塩基以上異なる塩基配列を有する第４プローブ４２とからなる合成オリゴである。
【００６３】
例えば、コンジュゲートＤＮＡのマーカーＤＮＡ２が、５‘−ＣＧＡＣＣＡ−３’であり、第１サンプルＤＮＡ５中の検出対象である目的ＤＮＡの配列が、５‘−ＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＴＣ−３’、該第１サンプルＤＮＡの塩基配列とその一部の塩基配列が異なる第２サンプルＤＮＡ６の目的ＤＮＡが、５‘−ＧＧＧＧＴＴＧＧＣＴＴＣ−３’であるとすると、第１リガンドＤＮＡ３は、第１サンプルＤＮＡ５の目的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する第１プローブ３１と、マーカーＤＮＡ２と相補的な塩基配列を有する第２プローブ３２からなる、５‘−ＴＧＧＴＣＧ−ＧＡＡＧＣＣＧＡＣＣＣＣ−３’であり、第２リガンドＤＮＡ４は、第２サンプルＤＮＡ６の一部と相補的な塩基配列を有する第３プローブ４１と、前記第１リガンドＤＮＡ３の第２プローブ３２と異なる塩基配列を有する第４プローブ４２とからなる、５‘−ＴＡＡＣＧＧ−ＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＣ−３’である。
【００６４】
このように、検出対象である第１サンプルＤＮＡ５と結合する前記第１リガンドＤＮＡ３の第２プローブ３２の塩基配列を、コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の塩基配列と相補的なものにし、前記第２リガンドＤＮＡ４の第４プローブ４２の塩基配列の一部を、前記マーカーＤＮＡ２の塩基配列と相補的でないようにすることで、前記第１リガンドＤＮＡ３と前記コンジュゲートＤＮＡ１０との結合強度が、第２リガンドＤＮＡ４とコンジュゲートＤＮＡ１０の結合強度に比べて強くなるため、コンジュゲートＤＮＡ中で第１，第２リガンドＤＮＡ３，４を電気泳動させた際に、該第１リガンドＤＮＡ３と第２リガンドＤＮＡ４の泳動速度に若干差をつけることができ、この泳動速度の差によって、該第１，第２のリガンドＤＮＡ３，４のそれぞれと結合する２つのサンプルＤＮＡを、分離させることができる。
【００６５】
ここで、前記第１リガンドＤＮＡ３と、前記第２リガンドＤＮＡ４のぞれぞれは、必ず第１サンプルＤＮＡ５か、第２サンプルＤＮＡ６のどちらか一方に結合させる必要がある。従って、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４の塩基配列は、その各リガンド内部で、自らの塩基配列同士で、ヘアピンループ構造を作らない配列でなければならない。
【００６６】
しかし、サンプル溶液中の第１サンプルＤＮＡ５、あるいは第２サンプルＤＮＡ６の塩基配列によっては、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４が、その各リガンド内部でヘアピンループ構造を形成する配列になる可能性もある。その場合は、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４中の、コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２と結合する第２の領域、すなわち、前記第１リガンドＤＮＡ３中の第２プローブ３２、及び前記第２リガンドＤＮＡ４中の第４プローブ４２の塩基配列を変えることで、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４が、それぞれの内部でヘアピンループ構造を形成しないようにする。
【００６７】
ただし、このように第１，第２リガンドＤＮＡ３，４中の第２，第４プローブ３２，３４の塩基配列を変えた場合は、前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の配列を、該第２プローブ３２の塩基配列に相補的な配列に変える必要がある。
【００６８】
さらに、前記第１リガンドＤＮＡ３中の第１プローブ３１及び第２リガンドＤＮＡ４中の第３プローブ４１の塩基配列の長さは、１０〜２０塩基がよく、１２塩基程度が望ましい。
【００６９】
これは、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４の、サンプルＤＮＡと結合する第１の領域、すなわち第１プローブ３１または第３プローブ４１、の塩基配列が短すぎると、第１，第２リガンドＤＮＡ３，４のそれぞれが、第１，２サンプルＤＮＡ５，６と結合して第１，第２のＤＮＡ複合体５，６を形成した後に、その結合力が弱くて、分離してしまう可能性があり、また逆に、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４の第１の領域、すなわち第１プローブ３１または第３プローブ４１、の塩基配列が長すぎると、該第１，第２リガンドＤＮＡ３，４のそれぞれが、第１，第２サンプルＤＮＡ５，６の塩基配列の一部の違いを認識できずに、第１リガンドＤＮＡ５が第２サンプルＤＮＡ４と結合してしなうなど、リガンドＤＮＡとサンプルＤＮＡとが非特異的に結合してしまう可能性があるからである。
【００７０】
また、前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の塩基配列の長さは、６〜１２塩基がよく、７塩基程度が望ましい。
これは、前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の塩基配列が短すぎると、前記コンジュゲートＤＮＡ１０とプレサンプル溶液中の前記第１のＤＮＡ複合体５１との結合力が弱すぎて、前記第１のＤＮＡ複合体５１の電気泳動速度を遅らすことができないため、適切にサンプルＤＮＡを分離することができなくなる可能性があり、また逆に、コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の塩基配列が長すぎると、コンジュゲートＤＮＡ１０と、プレサンプル溶液中の第１のＤＮＡ複合体５１との結合力が強すぎて、ＤＮＡ複合体がコンジュゲートＤＮＡ１０に結合したままになる可能性があるからである。
【００７１】
以下、前述した第１，第２リガンドＤＮＡ３，４及びコンジュゲートＤＮＡ１０を用いて、サンプル溶液中に存在する第１，第２サンプルＤＮＡ５，６を分離するＤＮＡ分離装置について説明する。
【００７２】
本実施の形態１では、サンプル溶液中の、検出対象である特定の配列を有する第１サンプルＤＮＡと、該特定の配列の一部が異なる配列を有する第２サンプルＤＮＡとを分離する場合について説明する。なおここでは、前記第１サンプルＤＮＡがＳＮＰｓ（一塩基多型）が有るＤＮＡ、前記第２サンプルＤＮＡがＳＮＰｓが無いＤＮＡであるものとする。
【００７３】
本実施の形態１のサンプルＤＮＡを分離するキャピラリー電気泳動装置としては、図６に示す、一般的なキャピラリー電気泳動装置１００を用いる。
キャピラリー電気泳動装置１００は、サンプルＤＮＡを分離するための密閉流路であるキャピラリー管１３０と、ｐＨを特定の値に調整し、且つ緩衝作用を有し、さらに支持電解質をも有している緩衝液１１を保持する第１，第２の容器１３１，１３２と、前記キャピラリー管１３０の両端に電圧を印加する正電極１３３，負電極１３４と、その両電極１３３，１３４に電圧を印加する可変電源部１３５と、サンプル溶液中の目的ＤＮＡを検出する検出部１５０と、前記可変電源部１３５の電圧印加、あるいは前記検出部１５０を制御する制御部１４０とで構成されるものである。
【００７４】
そして、前記検出部１５０は、キャピラリー管１３０内のサンプル溶液に付加されている蛍光色素への励起光を発生するレーザー１５１と、前記蛍光色素の発光をみるために、光の量を制御するスリット１５２と、該スリット１５２を通過してきた光のうち励起光をカットするフィルター１５３と、該フィルター１５３を通過してきた光を検出するフォトマルチプライヤー１５４と、前記フォトマルチプライヤー１５４で検出された検出信号を電気的に増幅するプリアンプ１５５と、アナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ１５６とを備える。
【００７５】
ここでは、サンプル溶液中に、検出対象である特定の配列を有する第１サンプルＤＮＡと、該特定の配列のうちの一部が異なる配列を有する第２サンプルＤＮＡとを有し、前記第１サンプルＤＮＡがＳＮＰｓ（一塩基多型）が有るＤＮＡ、前記第２サンプルＤＮＡがＳＮＰｓが無いＤＮＡであるものとし、これら２つのサンプルＤＮＡを分離する場合について説明する。
【００７６】
まず、マーカーＤＮＡ２が６塩基からなるコンジュゲートＤＮＡ１０を、ＤＮＡ濃度１００μＭ、トリス−ホウ酸（ＴＢ）バッファ５０ｍＭ、及び塩化マグネシウムを５００μＭになるように調整し、内径１００μｍの全長５０センチメートル（有効長４０センチメートル）のキャピラリー管１３０中に充填する。なお、緩衝液１１は、ＴＢバッファに限るものではなく、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液、トリス−塩化ナトリウム−ＥＤＴＡ（ＳＳＣ）緩衝液などであってもよい。
【００７７】
次に、第１，第２リガンドＤＮＡ３，４を作製する。
このとき、リガンドＤＮＡとしては、上記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４の２種類を常に用意するようにする。これは、前記サンプル溶液として、第１の塩基配列が含まれている第１サンプルＤＮＡ５だけが存在している場合、あるいは第２の塩基配列が含まれている第２サンプルＤＮＡ６だけが存在している場合、もしくはその両方のサンプルＤＮＡ５，６が含まれている場合の３タイプが考えられるため、前記リガンドＤＮＡは、サンプル溶液中にどちらの塩基配列を有したサンプルＤＮＡが存在しても対応できるようにするためである。
【００７８】
そして、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４をサンプル溶液に混入してハイブリダイゼーションを行い、該サンプル溶液中のサンプルＤＮＡと、前記リガンドＤＮＡとが結合したＤＮＡ複合体を含むプレサンプル溶液を作製する。
【００７９】
具体的に述べると、サンプル溶液中に、ＳＮＰｓありの第１サンプルＤＮＡ５と、該第１サンプルＤＮＡ５に相補的な塩基配列を有する第１リガンドＤＮＡ３、及びＳＮＰｓ無しの第２サンプルＤＮＡ６と、該第２サンプルＤＮＡ４に相補的な塩基配列を有する第２リガンドＤＮＡ４を、最終的に濃度５μＭになるように混合して、ハイブリダイゼーションを行い、第１，第２のＤＮＡ複合体５１，６１を含むプレサンプル溶液を作製する。
【００８０】
なお、前記サンプル溶液中に第１サンプルＤＮＡ５のみが存在している場合、前記プレサンプル溶液中には、第１サンプルＤＮＡ５と第１リガンドＤＮＡ３とが結合してなる第１のＤＮＡ複合体５１、及び一本鎖の状態で存在する第２リガンドＤＮＡ４が含まれ、またサンプル溶液中に第２サンプルＤＮＡ６のみが存在している場合は、該プレサンプル溶液中には、第２サンプルＤＮＡ６と第２リガンドＤＮＡ４とが結合してなる第２のＤＮＡ複合体６１、及び、一本鎖の状態で存在する第１リガンドＤＮＡ３が含まれている。
【００８１】
この後、前述のようにして作製された、第１，第２のＤＮＡ複合体５１，６１を含むプレサンプル溶液を、図７に示すように、予め緩衝液１１を含むコンジュゲートＤＮＡ１０が充填されたキャピラリー管１３０の端部に、１ｃｍ注入する。
【００８２】
そして、ＴＢバッファ５０ｍＭ，塩化マグネシウム２５０μＭになるように調整した緩衝液１１を保持する第１，第２の容器１３１，１３２に、前記キャピラリー管１３０の両端部を浸し、更に該容器１３１，１３２内の緩衝液１１に正電極１３３，負電極１３４を浸す。
【００８３】
可変電源部１３５より、前記正電極１３３と負電極１３４間に印加電圧１５ｋＶを印加し、測定温度２５℃で、プレサンプル溶液中の第１、第２のＤＮＡ複合体５１，６１を電気泳動させる。
【００８４】
これにより、前記第１のＤＮＡ複合体５１と第２のＤＮＡ複合体６１とが、キャピラリー管１３０に充填されたコンジュゲートＤＮＡ１０中を移動する。
【００８５】
このＤＮＡ複合体の移動により、前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２と、第１のＤＮＡ複合体５１中の第１リガンドＤＮＡ３１、あるいは前記第２のＤＮＡ複合体６１中の第２リガンド４１とが結合し、その結合強度の差によって、前記第１のＤＮＡ複合体５１と第２のＤＮＡ複合体６１との間に移動差が生じるため、両者の分離が可能となる。
【００８６】
サンプルＤＮＡの分離の検出は、第１サンプルＤＮＡ５または第２サンプルＤＮＡ６に蛍光色素（ここでは、ＦＩＴＣ）を標識しておき、レーザー１５１より４８８ｎｍの励起光を出力して、サンプルＤＮＡに照射し、該標識されたサンプルＤＮＡからの発せられる５２０ｎｍの蛍光を、フォトマルチプライヤー１５４で検出する。
【００８７】
なお、前記検出部１５０において、前記サンプルＤＮＡの分離検出を行う際に、ＤＮＡ自体を検出する方法をとると、本実施の形態１では、前記プレサンプル溶液中に、第１リガンドＤＮＡ３と第２リガンドＤＮＡ４の両方が含まれているため、常に２種類のＤＮＡが分離された波形を検出してしまって、正しい結果を得ることができない。しかし、前述したように、サンプルＤＮＡに蛍光色素を標識しておけば、該蛍光色素から発せられる蛍光を検出することでサンプルＤＮＡのみを検出することができる。
【００８８】
具体的に述べると、スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記レーザーから照射される前記４８８ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、サンプルＤＮＡから発生した５２０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。なお、検出部１５０では、第１サンプルＤＮＡ５または第２サンプルＤＮＡ６に標識された蛍光物質のみを検出するので、余分な第１リガンドＤＮＡ３あるいは第２リガンドＤＮＡ４は検出されない。これにより、該各リガンドＤＮＡ３，４と複合体を形成した第１のＤＮＡ複合体５１または第２のＤＮＡ複合体６１のピークが検出される。
【００８９】
なお、上記説明では、１種類のサンプル溶液を分離して、１種類のＳＮＰｓを検出する場合について説明したが、複数のサンプル溶液を一度に分離し、一度に多種類のＳＮＰｓを検出することも可能である。この場合、サンプルＤＮＡを標識する蛍光色素を変えるか、あるいはサンプルＤＮＡの長さをさまざまな長さにし、その複数のサンプルＤＮＡに応じた複数種のリガンドＤＮＡを用意する。
【００９０】
以下、前述したＤＮＡ分離方法を用いて、第１サンプルＤＮＡと第２サンプルＤＮＡとを分離した結果を示す。
ここでは、第１サンプルＤＮＡの塩基配列は、５’（ＦＩＴＣ）−ＣＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＡ−３’であり、第２サンプルＤＮＡの塩基配列は、５’（ＦＩＴＣ）−ＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＡ−３’であり、コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡの塩基配列は、５’−ＣＡＣＧＧＴ−３’であり、第１リガンドＤＮＡの塩基配列は、５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧ−３’であり、第２リガンドＤＮＡの塩基配列は、５’−ＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＧＡＴＧ−３’とする。なお、前記第２リガンドＤＮＡ４の３’末端は、コンジュゲートＤＮＡ１０中のマーカーＤＮＡ２に対して１塩基以上相補的でなく、且つヘアピンループ構造をとらない配列であれば、別の塩基配列であっても構わない。
【００９１】
図２は、前記サンプル溶液中に、サンプルＤＮＡが２種類含まれている場合のグラフである。このように、サンプル溶液中に２種類のサンプルＤＮＡが含まれている場合は、プレサンプル溶液中では、第１リガンドＤＮＡ３と第２リガンドＤＮＡ４のそれぞれに相補的な第１，第２サンプルＤＮＡ５，６が結合して、２種類のＤＮＡ複合体５１，６１を形成するため、電気泳動の移動度に差が生じた二つのピークが観察される。
【００９２】
もちろん、サンプル溶液中に、前述した２種類のサンプルＤＮＡのうちのいずれか一方のサンプルＤＮＡが含まれていてもよい。その場合は、図３，４に示すように、それぞれ一つピークが観察される。
【００９３】
例えば、図３は、前記サンプル溶液中に、第１リガンドＤＮＡ３に相補的な配列を含む第１サンプルＤＮＡ５が含まれている場合のグラフである。この場合、プレサンプル溶液中には、第１リガンドＤＮＡ３と、第２リガンドＤＮＡ４と、第１サンプルＤＮＡしか含まれていないため、一部の塩基の違いを認識して、特異的に完全に相補的な配列の第１リガンドＤＮＡ３に結合して、第１のＤＮＡ複合体５１のみが形成され、図３に示すように、一本のピークが検出された。この結果、第１リガンドＤＮＡ３の特異性を確認できた。
【００９４】
また、図４は、図３同様に、前記サンプル溶液中に、第２リガンドＤＮＡ４に相補的な配列を含む第２サンプルＤＮＡ６が含まれている場合のグラフである。この場合、プレサンプル溶液中には、第１，第２リガンドＤＮＡ３，４に対して、第２サンプルＤＮＡ６しか含まれていないため、一部の塩基の違いを認識して、特異的に完全に相補的な配列の第２リガンドＤＮＡ４に結合して、第２のＤＮＡ複合体６１のみが形成され、図４に示すように、一本のピークが検出された。この結果、第２リガンドＤＮＡ４の特異性を確認できた。
【００９５】
このように、プレサンプル溶液中に、前記第１，第２リガンドＤＮＡ３，４の両方を含むようにしておけば、サンプル溶液が、前記第１，第２サンプルＤＮＡ５，６の少なくとも１つを有するものであっても、サンプルＤＮＡを検出することができる。
【００９６】
以上のように、本実施の形態１のＤＮＡ分離方法によれば、電気非泳動物質１と、マーカーＤＮＡ２からなるコンジュゲートＤＮＡ１０と、第１サンプルＤＮＡ５に対して相補的な配列である第１プローブ３１と前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２に対して相補的な配列である第２プローブ３２を持つ第１リガンドＤＮＡ３と、第２サンプルＤＮＡ６に対して相補的な配列を持つ第３プローブ４１と前記コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２に対して少なくとも１塩基以上は相補的な配列でない第４プローブ４２からなる第２リガンドＤＮＡ４とを用意し、前記第１サンプルＤＮＡ５と前記第１リガンドＤＮＡ３、第２サンプルＤＮＡ６と第２リガンドＤＮＡ４のぞれぞれをハイブリダイズさせて、第１，第２のＤＮＡ複合体５１，６１を形成したプレサンプル溶液を作製し、該プレサンプル溶液を緩衝液を含むコンジュゲートＤＮＡ１０中に添加して電気泳動させるようにしたので、簡便且つ正確に、サンプルＤＮＡを分離させることができる。
【００９７】
また、リガンドＤＮＡを、サンプルＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブと、コンジュゲートＤＮＡのマーカーＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブとの合成オリゴからなるようにしたので、コンジュゲートＤＮＡ１０のマーカーＤＮＡ２の配列を、サンプルＤＮＡの塩基配列ごとではなく、共通の塩基配列にすることができるため、コンジュゲートＤＮＡを簡単に大量生産で作製することができる。さらにＤＮＡの分離を検出する際に、装置側で毎回条件検討を行う必要がなくなるため、ＤＮＡ分離装置構成も簡略化できる。
【００９８】
なお、本実施の形態１の説明では、第２リガンドＤＮＡ４が、前記第２サンプルＤＮＡ６の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第３プローブ４１と、前記第１リガンドＤＮＡ３中の前記第２プローブ３２の塩基配列と、少なくとも１塩基以上異なる塩基配列を有する第４プローブ４２とからなる合成オリゴであるものとして説明したが、前記第２リガンドＤＮＡ４の代わりに、図５に示すように、コンジュゲートＤＮＡと結合する第４プローブがない、前記第３プローブのみからなる第３リガンドＤＮＡ４’を用いるようにしてもよい。この場合は、図５に示すように、該第３リガンドＤＮＡ４’と前記第２サンプルＤＮＡ６とを結合させて第３のＤＮＡ複合体６１’を形成し、コンジュゲートＤＮＡ中で、前記第１のＤＮＡ複合体５１及び、前記第３のＤＮＡ複合体６１’とを電気泳動させて、これらを分離するようにすれば、同様の効果が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明にかかるＤＮＡ分離装置は、生体物質の状態を電気泳動で調査する際に、簡便且つ用途に応じた材料を提供でき、装置の簡略化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明の実施の形態１における、コンジュゲートＤＮＡ及び、第１，第２リガンドＤＮＡと第１，第２サンプルＤＮＡとからなる第１，第２のＤＮＡ複合体の相関を示す図である。
【図２】本発明のキャピラリー電気泳動装置における、第１サンプルＤＮＡと第２サンプルＤＮＡとの分離波形を示す図である。
【図３】本発明のキャピラリー電気泳動装置における、第１サンプルＤＮＡの波形を示す図である。
【図４】本発明のキャピラリー電気泳動装置における、第２サンプルＤＮＡの波形を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態１における、コンジュゲートＤＮＡ及び、第１，第３リガンドＤＮＡと、第１，第２サンプルＤＮＡとからなる第１，第３のＤＮＡ複合体の相関の別の例を示す図である。
【図６】一般的なキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図である。
【図７】キャピラリー電気泳動装置のキャピラリーを詳細に示す図である。
【図８】従来のコンジュゲートＤＮＡにより、サンプルＤＮＡが分離される状態を示す図である。
【符号の説明】
【０１０１】
１，２１１  電気非泳動物質
２，２１２  マーカーＤＮＡ
３  第１リガンドＤＮＡ
４  第２リガンドＤＮＡ
４’  第３リガンドＤＮＡ
５   第１サンプルＤＮＡ
６  第２サンプルＤＮＡ
１０，２１０  コンジュゲートＤＮＡ
１１  緩衝液
３１  第１プローブ
３２  第２プローブ
４１  第３プローブ
４２  第４プローブ
５１  第１のＤＮＡ複合体
６１  第２のＤＮＡ複合体
６１’  第３のＤＮＡ複合体
１３０  キャピラリー管
１３１  第１の容器
１３２  第２の容器
１３３  正電極
１３４  負電極
１３５  可変電源部
１４０  制御部
１５０  検出部
１５１  レーザー
１５２  スリット
１５３  フィルター
１５４  フォトマルチプライヤー
１５５  プリアンプ
１５６  Ａ／Ｄコンバータ
２００  サンプルＤＮＡ
【図１】
0004824386.tif 000002
【図２】
0004824386.tif 000003
【図３】
0004824386.tif 000004
【図４】
0004824386.tif 000005
【図５】
0004824386.tif 000006
【図６】
0004824386.tif 000007
【図７】
0004824386.tif 000008
【図８】
0004824386.tif 000009
【配列表】
0004824386000001.app