(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４もしくはその縮重変異型のポリヌクレオチド、配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントを含み、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離した核酸。
【請求項２】
下記よりなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項１記載の単離した核酸：
ａ）  配列番号５または配列番号５との少なくとも９０％の配列同一性を有し、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；
ｂ）  配列番号４；
ｃ）  配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；
ｄ）  配列番号４との少なくとも９５％の配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；
ｅ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的な単離したポリヌクレオチド；および
ｆ）  ６５℃、０.１×ＳＳＣ中での洗浄が適用されるストリンジェントな条件下で配列番号４のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、機能的な植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼをコードする単離したポリヌクレオチド。
【請求項３】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列番号４もしくはその縮重変異型のポリヌクレオチド、配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を有し、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントであってレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む組換え核酸構築物。
【請求項４】
前記調節配列が異型調節配列を含む請求項３記載の組換え核酸構築物。
【請求項５】
前記調節配列が植物細胞において機能的である請求項３記載の組換え核酸構築物。
【請求項６】
さらに終止配列を含む請求項３記載の組換え核酸構築物。
【請求項７】
前記調節配列が構成性プロモーターを含む請求項３記載の組換え核酸構築物。
【請求項８】
前記調節配列が誘導性プロモーターを含む請求項３記載の組換え核酸構築物。
【請求項９】
前記調節配列が組織特異的プロモーター、発生調節プロモーター、オルガネラ特異的プロモーターおよび種子特異的プロモーターからなる群から選択される請求項３記載の組換え核酸構築物。
【請求項１０】
請求項３の組換え構築物を含有する宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、酵母および細菌からなる群から選択される請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が植物細胞である請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞がレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドが植物アシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドである請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項３記載の組換え構築物を含む、少なくとも１の請求項１０記載の宿主細胞を含む植物。
【請求項１６】
請求項３記載の組換え構築物を含む、請求項１５記載の植物の子孫。
【請求項１７】
請求項３記載の組換え構築物を含む、請求項１５記載の植物からの種子。
【請求項１８】
請求項３記載の組換え構築物を含む植物。
【請求項１９】
請求項３記載の組換え構築物を含む、請求項１８記載の植物の子孫。
【請求項２０】
請求項３記載の組換え構築物を含む、請求項１８記載の植物からの種子。
【請求項２１】
配列番号５または配列番号５との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する精製ポリペプチド。
【請求項２２】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドの発現を許容する条件下で請求項１０記載の宿主細胞を培養することを含む前記レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを産生する方法。
【請求項２３】
さらに宿主細胞またはその中で宿主細胞が培養される培地からレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを単離することを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする、配列番号４もしくはその縮重変異型のポリヌクレオチドまたは配列番号４との少なくとも９０％の配列同一性を有し、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物で宿主細胞を形質転換し、ついで宿主細胞が組換え構築物を含まない宿主細胞と比較して修飾されたステロール組成を有するように前記宿主細胞がレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞のステロール含量を修飾する方法。
【請求項２５】
前記修飾されたステロール組成がステロールエステルにおける増加である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記調節配列が構成性プロモーターを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記調節配列が誘導性プロモーターである請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記調節配列が組織特異的プロモーターである請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記調節配列が種子特異的プロモーターである請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドがアンチセンス向きで存在する請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾されたステロール組成がステロールエステルにおける減少である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする、配列番号４もしくはその縮重変異型のポリヌクレオチドまたは配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有し、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を含む植物であって、ここに前記組換え構築物の発現が前記組換え構築物を含まない同一植物と比較して前記植物の修飾されたステロール組成を生じさせる植物。
【請求項３３】
前記調節配列が組織特異的プロモーターを含む請求項３２記載の植物。
【請求項３４】
前記調節配列が種子特異的プロモーターを含む請求項３２記載の植物。
【請求項３５】
前記修飾されたステロール組成がステロールエステルにおける増加である請求項３２記載の植物。
【請求項３６】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがアンチセンス向きで存在する請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
請求項３２記載の植物を提供し、ついで前記植物から油を抽出することを含む修飾されたステロール組成を有する油を産生する方法。
【請求項３８】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする、配列番号４もしくはその縮重変異型のポリヌクレオチドまたは配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有し、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を用いて宿主細胞を形質転換させ、ついで宿主細胞が組換え構築物を含まない宿主細胞と比較して変化した油の産生を有するように前記宿主細胞がレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞による油産生を変化させる方法。
【請求項３９】
前記油産生が増加する請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記宿主細胞が植物細胞である請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記調節配列が組織特異的プロモーターである請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
前記調節配列が種子特異的プロモーターである請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする、配列番号４もしくはその縮重変異型のポリヌクレオチドまたは配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有し、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を含む植物であって、ここに前記組換え構築物の発現が前記組換え構築物を含まない同一植物と比較して前記植物による油の変化した産生を生じる植物。
【請求項４４】
前記油産生が増加する請求項４３記載の植物。
【請求項４５】
前記調節配列が組織特異的プロモーターである請求項４３記載の植物。
【請求項４６】
前記調節配列が種子特異的プロモーターである請求項４３記載の植物。
【請求項４７】
請求項４３記載の植物を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、１９９９年８月３０日に提出されていてあらゆる目的のためにその全体が参照してここに組み込まれる米国仮出願第６０／１５２，４９３号に対する優先権を主張する。
【０００２】
背景
技術分野
本発明は、植物アシルトランスフェラーゼ様核酸およびアミノ酸配列および構築物、およびステロール組成および／または含量を変化させることにおけるそれらの使用に関連する方法、ならびに宿主細胞および植物中の油組成および／または含量に関する。
【０００３】
関連技術
植物遺伝子工学技術の開発を通して、現在では新規かつ望ましい特徴を有する植物を提供するために植物種のトランスジェニック品種を作出することが可能である。例えば、現在では病原菌に対する耐性および除草剤に対する耐性のような環境ストレスに耐えられるように遺伝子工学的に植物を設計することができる。また、例えば改良された脂肪酸、カロテノイド、ステロールおよびトコフェロール組成を提供するために植物の栄養特性を改良することも可能である。しかし、そのような特徴を遺伝子工学で設計するために有用なヌクレオチド配列の数は極めて限定されている。
【０００４】
生合成または天然植物源からステロールの組成物を入手または操作するための改良された手段に対する要望がある。ステロール産生を増加させる、または植物中のステロール組成を変化させる能力は、ヒトおよび動物の栄養において使用するための新規のステロール源を提供し得る。
【０００５】
ステロール生合成は、イソプレノイド経路における二リン酸ファルネシル中間体から分岐する。ステロール生合成は哺乳動物および高等植物におけるメバロン酸塩依存性経路を通して発生するが（Goodwin, (1981), Biosynthesis of Isoprenoid Compounds, vol. 1（Porter, J.W. & Spurgeon, S.L., eds）， pp.443-480, John Wiley and Sons, New York）、緑藻においてはステロール生合成はメバロン酸塩非依存性経路を通して発生すると考えられている（Schwenderら,(1997), Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of Plant Lipids，(Williams J.P., Khan M.U.,およびLem N.W.,eds)， pp.180-182, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA）。
【０００６】
ステロールエステルの溶解性の特徴は、これがステロールの貯蔵形であることを示唆している（Changら, (1997), Annu. Rev. Biochem., 66: 613-638）。例えばアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）およびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のようなステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ酵素は、コレステロールエステルの形成を触媒するので、従って細胞内コレステロール貯蔵を制御するための鍵となる。酵母においては、ＬＲＯ１、ヒトＬＣＡＴのホモログおよびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの過剰発現が脂質合成を増加させることが報告されている（Oelkersら, (2000), J. Biol. Chem., 26: 15609-15612; Dahlqvistら,(2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6487-6492）。
【０００７】
様々なアシルトランスフェラーゼタンパク質の特性付けは、植物ステロール合成系のさらなる研究ならびに新規および／または代わりのステロール源の開発のために有用である。植物機序の研究は、植物細胞のステロール組成をさらに増強する、制御する、修飾する、またはさもなければ変化させるための手段を提供することができる。さらにその上、ステロール含量および／または組成におけるそのような変更は、ストレスおよび虫害に対する耐性を得るための手段を提供し得る。特に興味深いのは、遺伝子工学において適用するために有用な可能性があタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列である。
【０００８】
発明の概要
本発明は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチド（以後、ＬＣＡＴともいう）およびアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチド（以後、ＡＣＡＴともいう）に指向される。特に本発明は、そのようなステロール：アシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド、ならびにステロール組成および油産生を変化させるためのそのようなポリヌクレオチドの使用に関する。本発明のポリヌクレオチドは植物起源に由来するものを含む。
【０００９】
しかるに、本発明の１の態様は、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチド、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドのフラグメント、植物アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドまたは植物アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドのフラグメントをコードする単離した核酸配列である。
【００１０】
また別の態様は、実質的に配列番号２、４、６、８、１０−２９、４３−５１、７３または７５からなる単離した核酸配列を提供する。さらに配列番号２、４、６、８、１０−２９、４３−５１、７３または７５からなる単離した核酸配列を提供する。さらにまた別の態様は、配列番号３または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号２；配列番号２との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００１１】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号３または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号２；配列番号２との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１２】
また別の態様は、配列番号５または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号５のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号４；配列番号４との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号４にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号４にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００１３】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号５または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号５のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号４；配列番号４との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号４にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号４にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１４】
また別の態様は、配列番号７または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号７のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号６；配列番号６との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号６にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号６にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００１５】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号７または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号７のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号６；配列番号６との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号６にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号６にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１６】
また別の態様は、配列番号９または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号９のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号８；配列番号８との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号８にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号８にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００１７】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号９または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号９のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号８；配列番号８との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号８にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号８にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１８】
また別の態様は、配列番号７４または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号７４のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号７３；配列番号７３との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号７３にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号７３にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００１９】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号７４または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号７４のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号７３；配列番号７３との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号７３にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号７３にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２０】
また別の態様は、配列番号７６または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号７６のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号７５；配列番号７５との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号７５にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号７５にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００２１】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号７６または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む配列番号７６のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド；配列番号７５；配列番号７５との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号７５にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号７５にハイブリダイズし、かつ、植物レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２２】
また別の態様は、配列番号４２またはその縮重変異型；配列番号４２との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号４２にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号４２にハイブリダイズし、かつ、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離した核酸配列を提供する。
【００２３】
さらにまた別の態様は、実質的に式５’Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）ｎ−（Ｒ３）ｎ−Ｙ３’のポリヌクレオチドからなる単離した核酸配列を提供するが、式中Ｘは水素であり、Ｙは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸であり、ｎは０〜３，０００の整数であり、Ｒ２は配列番号４２またはその縮重変異型；配列番号４２との少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する単離したポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下で配列番号４２にハイブリダイズする少なくとも１０アミノ酸の単離したポリヌクレオチド；上記のいずれかに相補的な単離したポリヌクレオチド；およびストリンジェントな条件下で配列番号４２にハイブリダイズし、かつ、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２４】
さらにまた提供されるのは、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドおよび／またはアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む組換え核酸構築物である。１の具体例において、ステロールアシルトランスフェラーゼは植物ステロールアシルトランスフェラーゼである。また別の具体例において、組換え核酸構築物はさらに終止配列を含む。調節配列は構成性プロモーター、誘導性プロモーター、発生調節プロモーター、組織特異的プロモーター、オルガネラ特異的プロモーター、種子特異的プロモーターまたは上記のいずれかの組み合わせであってよい。また、この組換え核酸構築物を含む植物、かかる植物からの種子および子孫を提供する。さらにまた本発明のまた別の態様を提供するために、この組換え核酸構築物は適切な宿主細胞内に導入することもできる。宿主細胞が植物宿主細胞である場合は、その細胞を使用して植物を作製して本発明のまた別の態様を提供することができる。さらにまた別の態様にはかかる植物からの種子および子孫が含まれる。
【００２５】
さらにまた別の態様は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号７４、配列番号７６または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む先行する配列のいずれかを含む精製したポリペプチドである。
【００２６】
さらにまた別の態様は、配列番号３、５、７、９、７４、７６および少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む先行する配列のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列からの少なくとも１０の連続アミノ酸を含む精製した免疫原性ポリペプチドを提供する。さらにまた、先行する免疫原性ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体も提供する。
【００２７】
１の態様は、前記レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドまたはアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドの発現を許容する条件下で本発明のいずれかの組換え核酸構築物を含有する宿主細胞を培養することを含むレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドまたはアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００２８】
また別の態様は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を用いて宿主細胞を形質転換し、ついで前記宿主細胞が組換え構築物を含有していない宿主細胞と比較して修飾されたステロール組成を有するようにレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞のステロール含量を修飾する方法を提供する。
【００２９】
さらにもう１の態様は、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を用いて宿主細胞を形質転換し、ついで前記宿主細胞が組換え構築物を含有していない宿主細胞と比較して修飾されたステロール組成を有するようにアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞のステロール含量を修飾する方法である。
【００３０】
さらにまた別の態様は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を含む植物であるが、ここに前記組換え構築物の発現は前記組換え構築物を含有しない同一植物と比較して前記植物の修飾されたステロール組成を生じさせる。
【００３１】
また別の態様は、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を含む植物であるが、ここに前記組換え構築物の発現は前記組換え構築物を含有しない同一植物と比較して前記植物の修飾されたステロール組成を生じる。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明の植物または宿主細胞のいずれかから入手される油を提供する。
【００３３】
さらになお別の態様では、本発明の植物または宿主細胞のいずれかを提供し、ついでいずれか既知の方法によって植物から油を抽出することを含む、修飾されたステロール組成を用いて油を産生する方法を提供する。
【００３４】
さらにまた別の態様は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を用いて宿主細胞を形質転換させるステップと、宿主細胞が組換え構築物を含有していない宿主細胞と比較して変化した油産生を有するようにレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する条件下で宿主細胞を培養するステップとを含む、宿主細胞による油産生を変化させる方法を提供する。
【００３５】
さらにもう１の態様は、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を用いて宿主細胞を形質転換し、ついで宿主細胞が組換え構築物を含有していない宿主細胞と比較して変化した油産生を有するようにアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドを発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞による油産生を変化させる方法を提供する。
【００３６】
さらにまた、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を供える植物が提供されるが、ここに前記組換え構築物の発現は前記組換え構築物を含有しない同一植物と比較して前記植物による油産生の変化を生じさせる。
【００３７】
また別の態様では、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含有する組換え構築物を供える植物が提供されるが、ここに前記組換え構築物の発現は前記組換え構築物を含有しない同一植物と比較して前記植物による油産生の変化を生じさせる。
【００３８】
もう１の態様は、本発明のいずれかの油、植物もしくは宿主細胞を含む食物、食物成分もしくは食品；本発明のいずれかの油、植物もしくは宿主細胞を含む栄養剤もしくは栄養補助食品；および適切な希釈剤、担体もしくは賦形剤と一緒に本発明のいずれかの油、植物もしくは宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００３９】
さらにその他の態様は下記の説明および実施例から明白になるであろう。
【００４０】
本発明のこれらやその他の特徴、態様および長所は、下記の説明、添付されたクレームおよび添付の図面を参照するとより明確に理解されるであろう。
【００４１】
詳細な説明
下記の詳細な説明は、本発明を実施する当業者に役立つように提供される。それにしても、当業者であれば本発明の精神または範囲から逸脱することなくここで考察する実施態様を修飾および変形することが可能なので、この詳細な説明が本発明を過度に限定すると解釈すべきではない。
【００４２】
本出願で言及するすべての出版物、特許、特許出願およびその他の参考文献は、各個別の出版物、特許、特許出願およびその他の参考文献があたかも特異的かつ個別に参照して組み込まれると指示されたようにそれらの全体が参照してここに組み込まれる。
【００４３】
本発明は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ、詳細には植物起源からのレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチド（ＬＣＡＴ）をコードする単離した核酸配列およびアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ、詳細には植物起源からのアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチド（ＡＣＡＴ）をコードする単離した核酸配列に関する。本明細書中で用いるレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様には、酵素反応条件下でエステルを形成するためにステロールもしくはグリセリドのアシル化のためのアシルドナーとしてそのようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドと一緒にレシチン（ホスファチジルコリン）を利用する能力を示す、細胞起源から入手可能なタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのような植物起源からのアミノ酸配列をコードするいずれかの核酸配列が含まれる。本明細書中で用いる“アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様”には、酵素反応条件下でエステルを形成するためにステロールもしくはグリセリドのアシル化のためのアシル供与体としてそのようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドと一緒にアシルＣｏＡを利用する能力を示す、細胞起源から入手可能なタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのような植物起源からのアミノ酸配列をコードするいずれかの核酸配列が含まれる。“酵素反応条件”は、酵素が機能するのを許容する何らかの必要な条件（即ち、例えば温度、ｐＨ、阻害物質の欠如のような要素）を環境内において利用できることを意味する。
【００４４】
植物に適用される用語“ステロール”は、例えばプロトステロイドカチオンのようなｔｒａｎｓ−ｓｙｎ−ｔｒａｎｓ−ａｎｔｉ−ｔｒａｎｓ−ａｎｔｉ立体構造に類似の遷移状態プロセシング空間的構造を通しての酸化スクアレンの環化によって形成することができ、さらにＣ−３（ヒドロキシルもしくはケト）で極性基、環系内にａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ａｎｔｉ空間的構造、および側鎖２０Ｒ−立体構造を保持しているるあらゆるキラル四環系イソペンテノイドを意味する（Parkerら, (1992), In Nesら,, Eds., Regulation of Isopentenoid Metabolism, ACS Symposium Series No.497, p.110; American Chemical Society, Washington, D.C.）。
【００４５】
ステロールは、Ｃ−５−Ｃ−６二重結合を、生合成経路において後に導入される特徴であるため、これを含んでいる場合も含んでいない場合もある。ステロールは、Ｃ−１７位でＣ８−Ｃ１０側鎖を含有している。
【００４６】
植物において唯一見出されるステロールに適用される用語“フィトステロール”は、Ｃ−５、および一部の場合にはＣ−２２二重結合を含有するステロールをいう。フィトステロールはさらに、Ｃ−２４位にメチルもしくはエチル置換基を含むＣ−１７側鎖のアルキル化によってさらに特徴付けられる。主要なフィトステロールには、限定されるものではないが、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等が含まれる。Ｃ−２４位のメチルもしくはエチル側鎖が欠けているコレステロールは植物において検出されるが、植物に独特ではなく、したがって“フィトステロール”ではない。
【００４７】
“フィトスタノール”は、Ｃ−５および、存在する場合はＣ−２２二重結合が還元されているフィトステロールの飽和形態であり、シトスタノール、カンペスタノールおよび２２−ジヒドロブラシカスタノールを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
“ステロールエステル”はさらに、Ｃ−３位での水酸基よりむしろ脂肪酸もしくはフェノール酸部分の存在によってさらに特徴付けられる。
【００４９】
“ステロール”なる語には、ステロール、フィトステロール、フィトステロールエステル、フィトスタノール、およびフィトスタノールエステルが含まれる。
【００５０】
“ステロール化合物”なる語には、ステロール、フィトステロール、フィトステロールエステル、フィトスタノール、およびフィトスタノールエステルが含まれる。
【００５１】
“フィトステロール化合物”なる語は、少なくとも１のフィトステロール、少なくとも１のフィトステロールエステル、またはそれらの混合物をいう。
【００５２】
“フィトスタノール化合物”なる語は、少なくとも１のフィトスタノール、少なくとも１のフィトスタノールエステル、またはそれらの混合物をいう。
【００５３】
“グリセリド”なる語には、グリセロールの脂肪酸エステルをいい、モノ−、ジ−およびトリ−アシルグリセロールが含まれる。
【００５４】
本明細書中で用いる“組換え構築物”は、その製造方法またはその構造のいずれかによって定義される。その製造方法に関しては、例えばあるプロセスによって作られた生成物であるが、そのプロセスは典型的には選択もしくは産生のようなヌクレオチド配列におけるヒトの介入を含む、組換え核酸技術を利用している。あるいはまた構造に関しては、自然には隣接していない、または相互に作動可能に連結されている２以上の核酸配列の融合を含む配列であってよい。
【００５５】
本明細書中で用いる“調節配列”とは、例えばプロモーター、オペレーターおよびアテニュエーターのような遺伝子発現を制御することに関連するＤＮＡの配列を意味する。“異型調節配列”は、遺伝子と自然に結合している調節配列とは相違するものである。
【００５６】
本明細書中で用いる“ポリヌクレオチド”および“オリゴヌクレオチド”は相互交換可能に使用されており、リン酸ジエステル結合によって一緒に結合した少なくとも２のヌクレオチドのポリマーを意味し、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかから構成され得る。
【００５７】
本明細書中で用いる“配列”とは、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序またはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序のようなポリマーにおいてモノマーが現れる線形順序を意味する。
【００５８】
本明細書中で用いる“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”とは相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸からなる化合物を意味する。
【００５９】
本明細書中で用いる“相補的”または“相補性”なる語は、二本鎖核酸において水素結合を通して結び付いている塩基、プリンおよびピリミジンの対合をいう。例えば、下記の塩基対は相補的である：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシル。本明細書中で用いる用語は完全および部分相補性を含む。
【００６０】
単離したタンパク質、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明の第１の態様は、単離したＬＣＡＴポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチド配列には、配列表に記載された配列群から選択される推定アミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドおよびそのような配列およびそれらの変異型に密接に関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００６１】
本発明は、配列表に記載されている各コード配列と全長に渡って同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟ポリペプチドもしくはそれのフラグメントに対するコード配列、ならびに例えばリーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−またはプレプロ−タンパク質配列をコードするもののような他のコード配列を含むリーディング・フレーム中の成熟ポリペプチドもしくはそれのフラグメントのコード配列を提供する。ポリヌクレオチドはさらに、例えば転写された非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化させる配列、イントロン、ポリアデニル化配列、ならびにさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列のような非コード５’および３’配列を含むがそれらに限定されない、非コード配列をも含み得る。例えば融合ポリペプチドの精製を容易にするためのマーカー配列を含めることができる。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子と遺伝子発現を制御する天然に関連した配列とを含むポリヌクレオチドも含む。
【００６２】
本発明にはさらに下記の式のポリヌクレオチドが含まれる：
Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ
式中、５’末端ではＸは水素であり、３’末端ではＹは水素もしくは金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの核酸残基であり、ｎは０〜３,０００、好ましくは１〜１,０００の整数であり、Ｒ２は本発明の核酸配列、特に配列表に記載された群から選択される、好ましくは配列番号２、４、６、８、１０−２９、３３、４２−５１、７３および７５の核酸配列である。式中、Ｒ２は、その５’末端残基が左側に存在してＲ１に結合し、かつ、その３’末端残基が右側に存在してＲ３に結合するように方向付けられる。いずれかのＲ基によって示された核酸残基のいずれかのストレッチは、Ｒが１より大きいときには、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいずれか、好ましくはヘテロポリマーとなり得る。
【００６３】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの変異型をコードする本明細書中に記載するポリヌクレオチドの変異型に関する。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変異型は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用できる。好ましい具体例は、ポリペプチド変異型をコードするポリヌクレオチドであるが、ここに本発明のポリペプチド配列の５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０のアミノ酸残基はいずれかの組合せで置換されているか、付加されているか、または欠失している。特に好ましいのは、それがポリヌクレオチドまたはポリペプチドの特性または活性を変化させないようなサイレントである置換、付加および欠失である。
【００６４】
本発明のさらに好ましい具体例は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとそれらの全長にわたって少なくとも５０、６０または７０％同一であるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。より好ましいのは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその全長にわたって少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドである。これに関して、その全長にわたって少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％同一であるものはより特に好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するものは非常に好ましく、少なくとも９８％および９９％の同一性を有するものは特に非常に好ましいが、少なくとも９９％の同一性を有するものは最も非常に好ましい。
【００６５】
好ましい具体例は、配列表に記載されたポリヌクレオチドによってコードされる成熟ポリペプチドと本明細書中で説明する方法によって測定決定して実質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６６】
さらに、本発明は、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、１０％の硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃にての一晩インキュベーション、その後の約６５℃での０.１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション支持体の洗浄である。さらに含まれるのは、０．１×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＰＥ（５０℃で）の洗浄ストリンジェンシー下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。その他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition， Cold Spring Harbor, New York（1989）の特に第１１章に例示されている。
【００６７】
また、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列表に記載されているポリヌクレオチド配列に対する完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを前記ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブを用いてスクリーニングし；ついで前記ポリヌクレオチド配列を単離することによって入手可能なポリヌクレオチド配列から実質的になるポリヌクレオチドを提供する。ライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野でよく知られており、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition， Cold Spring Harbor, New York（1989）の特に第８章、およびAusbelら, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed，Wiley and Sons, 1995の第６章に見出すことができる。そのようなポリヌクレオチドを入手するために有用な核酸配列には、例えば本明細書中に記載するようなプローブおよびプライマー、特に配列番号２、４、６、８、１０−２９、３３、４２−５１、７３および７５が含まれる。これらの配列は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼおよびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする配列についてアラビドプシス（Arabidopsis）、ダイズおよびトウモロコシから入手されるライブラリーをスクリーニングするのに、およびアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼおよびアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする配列についてライブラリーをスクリーニングするのに特に有用である。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中で論じたように、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためおよび配列表、特に配列番号：２、４、６、８、１０−２９、３３、４２−５１、７３および７５に記載されているポリヌクレオチドに対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡｓまたはゲノムクローンを単離するためのＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。そのようなプローブは一般に少なくとも１５塩基を含むであろう。好ましくは、そのようなプローブは少なくとも３０塩基を有しており、少なくとも５０塩基を有することができる。特に好ましいプローブは３０塩基から５０塩基までを有するであろう。
【００６９】
配列表に記載されたポリヌクレオチド配列を含む、またはそれによって含まれる各遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために配列表に提供されたＤＮＡ配列を使用してスクリーニングすることによって単離することができる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを使用して、そのプローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する目的でｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングする。例えば、ＬＣＡＴ  ＥＳＴ配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを調製する。オリゴヌクレオチドは、ＬＣＡＴ遺伝子の５’および３’末端配列を入手するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術におけるプライマーとして使用する。あるいは、低縮重のオリゴヌクレオチドを特定のＬＣＡＴペプチドから調製できる場合は、そのようなプローブはＬＣＡＴ遺伝子配列につき遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために直接に使用することができる。特に、ファージベクター中のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、バックグラウンド・ハイブリダイゼーションが低レベルであるためにそのような方法において有用である。
【００７０】
典型的には、核酸プローブを使用することによって入手可能なＬＣＡＴ配列は標的ＬＣＡＴ配列とプローブとして使用するコード配列との間の６０〜７０％配列同一性を示すであろう。しかし、５０〜６０％という低い配列同一性を有する長々しい配列もまた入手される可能性がある。核酸プローブは、核酸配列の長々しい断片であっても、またはより短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。プローブとしてより長い（約１００ｂｐより長い）核酸フラグメントを使用する場合は、プローブとして使用する配列から２０〜５０％の偏差（即ち、５０〜８０％の配列相同性）を有する標的試料からの配列を入手するために、より低いストリンジェンシーでスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブはＬＣＡＴ酵素をコードする全核酸配列より相当に短くてもよいが、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、およびより好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドとすべきである。長い領域とは対照的により短い領域を使用する場合にはより高度の配列同一性が望ましい。したがって、他の関連ＬＣＡＴ遺伝子を検出および回収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するためには高度に保存されたアミノ酸配列の領域を同定することが望ましい可能性がある。特に高度に保存された配列を同定できる場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためにより短いプローブがしばしば特に有用である（Gouldら, PNAS USA (1989), 86:1934-1938を参照されたい）。
【００７１】
本発明のまた別の態様はＬＣＡＴポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、配列表に記載された単離したポリペプチド、ならびにポリペプチドおよびそのフラグメント、特にＬＣＡＴ活性を示すポリペプチドおよびさらに配列表に記載された一連の配列の群から選択されたポリペプチド配列に対して少なくとも５０％、６０％または７０％同一性、好ましくは少なくとも８０％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、および最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを含み、さらにまたそのようなポリペプチドの部分も含むが、ここにそのようなポリペプチドの部分は好ましくは少なくとも３０アミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。
【００７２】
当該技術分野においてよく理解されている “同一性”とは、２以上のポリペプチド配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間の、それらの配列を比較することによって決定される関係である。当該技術分野において、“同一性”はさらにそのような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列相関性の程度も意味する。“同一性”は、Computational Molecular Biology, Lesk A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin A.M.およびGriffin H.G., eds., Humana Press NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M.およびDevereux J., eds., Stockton Press, New York (1991);およびCarillo H.,およびLipman,D., SIAM J Applied Math, 48: 1073 (1988)に記載されているものを含むがそれらに限定されない知られている方法によって容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、試験する配列間の最大一致を得るように設計されている。さらにその上、同一性を決定する方法は公衆的に入手可能なプログラムに体系化されている。２の配列間の同一性を決定するために使用できるコンピュータープログラムには、GCG (Devereux J.ら, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984);そのうちの3（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＴＢＬＡＳＴＸ）がヌクレオチド配列クエリーのために設計されており、２（ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）がタンパク質配列クエリーのために設計されている５のＢＬＡＳＴプログラム一式（Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birrenら, Genome Analysis, 1: 543-559 (1997))が含まれるが、それらに限定されない。BLAST ＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他の入手源から公然と入手できる（BLAST Manual, Altschul S.ら, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul S.ら, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990))。同一性を決定するためには、よく知られているSmith Watermanアルゴリズムもまた使用できる。
【００７３】
ポリペプチド配列比較のためのパラメーターは、典型的には下記を含んでいる：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
【００７４】
これらのパラメーターと一緒に使用できるプログラムは、Genetics Computer Group, Madison, Wisconsinからの“ギャップ”プログラムとして公然と入手できる。エンドギャップに対するペナルティを含まない上記のパラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００７５】
ポリヌクレオチド配列比較のためのパラメーターは下記を含んでいる：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：一致＝＋１０；不一致＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
【００７６】
これらのパラメーターと一緒に使用できるプログラムは、Genetics Computer Group, Madison, Wisconsinからの“ギャップ”プログラムとして公然と入手できる。上記のパラメーターは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００７７】
本発明はさらに下記の式のポリペプチドを含む：
Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２)−（Ｒ３）ｎ−Ｙ
式中、アミノ末端ではＸは水素であり、カルボキシル末端ではＹは水素もしくは金属であり、Ｒ１およびＲ3はいずれかの核酸残基であり、ｎは０〜1，０００の整数であり、Ｒ２は本発明のアミノ酸配列、特に配列表に記載された群から選択された、および好ましくは配列番号３、５、７、９、７４および７６のアミノ酸配列である。この式では、Ｒ２は、そのアミノ末端残基が左側に存在してＲ１に結合しており、そのカルボキシル末端残基は右側に存在してＲ３に結合するようには方向付けられている。いずれかのＲ基によって示されたアミノ酸残基のいずれかのストレッチは、Ｒが１より大きいときには、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいずれか、好ましくはヘテロポリマーとなり得る。
【００７８】
本発明のポリペプチドには、配列番号２、４、６、８、７３および７５に含まれる配列の群から選択された配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている単離ポリペプチドが含まれる。
【００７９】
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質であるか、または融合タンパク質の一部であってよい。
【００８０】
ポリペプチドのフラグメントおよび変異型もまた本発明の一部であると見なされる。フラグメントは、上記で説明したポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが一部と完全に同一であるアミノ酸配列を有する変異型ポリペプチドである。これらは“独立型”であっても、それのフラグメントが、最も好ましくは単一連続領域としての一部または領域を形成する大きなポリペプチド内に備えられていてもよい。好ましいフラグメントは、類似活性もしくは改良された活性または低下した活性を含むものを含む、本発明のポリペプチドの活性を媒介するフラグメントである生物学的に活性なフラグメントである。同様に含まれているのは、動物、特にヒトおよびポリクローナルもしくはモノクローナルいずれかの抗体において抗原性もしくは免疫原性である、抗原性フラグメントに特異的に結合するそれらのポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントである。ある好ましい具体例では、そのような抗原性もしくは免疫原性フラグメントはここで開示したアミノ酸配列または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を有するそのような配列からの少なくとも１０の連続的アミノ酸を含む。また別の具体例では、そのような抗原性もしくは免疫原性フラグメントはここで開示したアミノ酸配列または少なくとも１の保存的アミノ酸置換を有するそのような配列からの少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０もしくは少なくとも１００の保存的アミノ酸を含む。ポリペプチドおよび担体分子へ接合されたポリペプチドから抗体を産生するための方法は当分野においてよく知られており、例えばAusbelら, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed, Wiley and Sons, 1995の第１１章に見出すことができる。
【００８１】
ポリペプチドの変異型はさらに、類似特徴を有する別の残基による残基の置換である保存的アミノ酸置換が配列表に記載されている配列とは相違しているポリペプチドを含む。当業者は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列における修飾がオリジナルのアミノ酸配列と比較したときに同等または優れた機能的特徴を示す同等の、またはもしかすると改良された第二世代ペプチド等を生じさせることができることを認識している。したがって、本発明はそのような修飾アミノ酸配列を含む。変化には、そのような修飾によって産生するペプチド配列がここで開示される天然発生対応配列と実質的に同一の機能特性を有することを前提に、アミノ酸の挿入、欠失、置換、切断、融合、サブユニット配列のシャッフリング等を含むことができる。
【００８２】
そのような変化を作成する際に考慮に入れることのできる１の要素は、アミノ酸の親水性指数である。タンパク質へ相互的生物学的機能を与えるときのアミノ酸親水性指数の重要性は、KyteおよびDoolittle (J. Mol. Biol., 157:105-132,1982)によって論じられている。アミノ酸の相対親水特性が結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与することは認められている。これは順に、タンパク質と例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等のような分子との相互作用に影響を及ぼす。
【００８３】
その疎水性および電荷特性に基づいて、各アミノ酸には下記のような親水性指数が指定されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩／グルタミン／アスパラギン酸塩／アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００８４】
当該技術分野において知られているように、ペプチドまたはタンパク質中の一定のアミノ酸は類似の親水性指数もしくはスコアを有する他のアミノ酸と置換させることができ、さらに類似の生物学的活性、すなわちいまだ生物学的機能性を維持している得られたペプチドまたはタンパク質を産生することができる。そのような変化の作成においては、±２内の親水性指数を有するアミノ酸を相互に置換させることが好ましい。より好ましい置換は、アミノ酸が±１内の親水性指数を有する場合の置換である。最も好ましい置換は、アミノ酸が±０．５内の親水性指数を有する場合の置換である。
【００８５】
同様のアミノ酸もさらにまた親水性に基づいて置換させることができる。米国特許第4,554,101号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関していることを開示している。下記の親水性値がアミノ酸に指定されている：アルギニン／リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩／グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン／グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン／ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン／イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。したがって、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１のアミノ酸は類似の親水性を有する他のアミノ酸によって置換させることができ、さらに類似の生物学的活性を有する、すなわちいまだ正確な生物学的機能を保持している結果としてのタンパク質を産生することができる。そのような変化の作成においては、±２内の親水性指数を有するアミノ酸を相互に置換させることが好ましく、±１内の親水性指数を有するものがより好ましく、±０．５内の親水性指数を有するものが最も好ましい。
【００８６】
上記で略述したように、本発明のペプチドにおけるアミノ酸置換は、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズ等のようなアミノ酸側鎖置換基の相対類似性に基づく可能性がある。本発明のペプチド中のサイレントな変化を生じさせる保存的アミノ酸変化を生じさせるために様々な上記の特徴を考慮に入れた例示的置換は、自然発生アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。アミノ酸は下記の４群に分類することができる：（１）酸性アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性極性アミノ酸；および（４）中性非極性アミノ酸。これらの様々な群内の代表的アミノ酸は、下記を含むがこれらに限定されない：（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸のような酸性（陰荷電）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジンおよびリシンのような塩基性（陽荷電）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンのような中性極性アミノ酸；および（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンのような中性非極性アミノ酸。ここで、有益とは予想されない変化もまたこれらが機能的配列の産生を生じさせる場合は有用である可能性があることを言及しておかなければならない。
【００８７】
本発明のポリペプチドのフラグメントである変異型は、対応する全長ポリペプチドをペプチド合成によって作成するために使用できる。したがって、これらの変異型は本発明の全長ポリペプチドを作成するための中間体として使用できる。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば本明細書中で詳細に論じるような植物細胞、動物細胞、酵母細胞、細菌、バクテリオファージおよびウイルスのような宿主細胞の形質転換において使用できる。
【００８９】
本発明はさらにまた、成熟タンパク質とさらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチド中のアミノ酸を加えたものであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する（例えば、タンパク質の成熟形が２以上のポリペプチド鎖を有する場合）。そのような配列は、例えば前駆体から成熟形へのタンパク質のプロセシングにおいて重要な役割を果たしたり、タンパク質輸送を許容したり、タンパク質半減期を短縮もしくは延長したり、またはアッセイもしくは産生におけるタンパク質の操作を容易にしたりすることができる。成熟タンパク質からいずれかのさらなるアミノ酸を除去するために細胞酵素を使用できることは予期されている。
【００９０】
１以上のプロ配列へ融合されたポリペプチドの成熟形を有する前駆体タンパク質はポリペプチドの不活性形であってよい。不活性前駆体は一般に、プロ配列が除去されたときに活性化される。プロ配列の一部または全部は、活性化前に除去することができる。そのような前駆体タンパク質は、一般にはいわゆるプロタンパク質と呼ばれる。
【００９１】
発現構築物の調製および使用方法
興味深いのは、宿主細胞における本発明のアシルトランスフェラーゼ配列の転写または転写および翻訳（発現）を指令するための組換えＤＮＡ構築物におけるヌクレオチド配列の使用である。特に興味深いのは、宿主植物細胞における本発明のアシルトランスフェラーゼ配列の転写または転写および翻訳（発現）を指令するための組換えＤＮＡ構築物におけるポリヌクレオチド配列の使用である。
【００９２】
発現構築物は一般に、本発明のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドまたはアシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された宿主細胞において機能的な調節配列と宿主植物細胞において機能的な転写終止領域とを含む。特に興味深いのは、植物宿主細胞において機能的なプロモーター（転写開始領域とも呼ばれる）の使用である。
【００９３】
当業者であれば、構成性、誘導性、組織特異的、オルガネラ特異的、発性調節および環境調節プロモーターを含む、植物細胞において機能的であって、さらに文献に記載されている多数のプロモーターが存在することを認識するであろう。葉緑体および色素体特異的プロモーター、葉緑体もしくは色素体機能的プロモーター、および葉緑体もしくは色素体作動可能プロモーターもまた想定されている。
【００９４】
１セットのプロモーターは、大多数の植物器官において高レベルの発現を生じさせるＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターのような構成性プロモーターである。ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターの強化形もしくは複製形は本発明の実施に有用である（Odellら (1985), Nature 313: 810-812; Rogers, 米国特許第5,378,619号）。その他の有用な構成性プロモーターには、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーターおよびオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーターが含まれるが、それらに限定されない。
【００９５】
有用な誘導性プロモーターには、熱ショックプロモーター（Ou-Leeら, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6815; Ainleyら, (1990), Plant Mol. Biol. 14: 949）、ホウレンソウ亜硝酸塩レダクターゼ遺伝子由来の硝酸塩誘導性プロモーター（Backら, (1991), Plant Mol. Biol. 17: 9）、ホルモン誘導性プロモーター（Yamaguchi-Shinozakiら, (1990), Plant Mol. Biol. 15: 905; Karesら, (1990), Plant Mol. Biol. 15: 905）、およびＲｕＢＰカルボキシラーゼの小サブユニットおよびＬＨＣＰ遺伝子ファミリーに関連している光誘導性プロモーター（Kuhlemeierら, (1989), Plant Cell 1: 471; Feinbaumら, (1991), Mol. Gen. Genet. 226: 449; Weisshaarら, (1991), EMBO J. 10: 1777; LamおよびChua (1990), Science 248: 471; Castresanaら, (1988), EMBO J. 7: 1929; Schulze-Lefertら, (1989), EMBO J. 8:651）が含まれる。
【００９６】
また、例えば葉、幹、根、塊茎、種子、果実等のような植物の特異的組織におけるアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を引き起こさせることが好ましい場合があり、さらに選択するプロモーターは望ましい組織および発生特異性を有しているべきである。有用な組織特異的、発生調節プロモーターの例には、Ｅ４プロモーター（Cordesら, (1989), Plant Cell 1: 1025)、Ｅ８プロモーター(Deikmanら, (1988), EMBO J. 7: 3315)、キーウィフルーツ・アクチニジンプロモーター(Linら, (1993), PNAS 90: 5939)、２Ａ１１プロモーター(Houckら, 米国特許第4,943,674号)、およびトマトｐＺ１３０プロモーター(米国特許第5,175,095号および第5,530,185号);β−コングリシニン７Ｓプロモーター(Doyleら, (1986), J. Biol. Chem. 261: 9228; SlightonおよびBeachy (1987), Planta 172: 356）、および種子特異的プロモーター（Knutzonら, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624; Bustosら, (1991), EMBO J. 10; 1469; LamおよびChua (1991), J. Biol. Chem. 266: 17131; Staytonら, (1991), Aust. J. Plant. Physiol. 18: 507）が含まれる。果実特異的遺伝子調節は、米国特許第5,753,475号において論じられている。その他の有用な種子特異的プロモーターには、ナピン、ファゼオリン、ゼイン、ソイビーントリプシンインヒビター、７Ｓ、ＡＤＲ１２、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、オレオシン、ラスクエレラ（Ｌａｓｑｕｅｒｅｌｌａ）ヒドロキシラーゼ、およびオオムギアルドースレダクターゼプロモーター（Bartels (1995), Plant J. 7: 809-822）、ＥＡ９プロモーター（米国特許第5,420,034号）、およびＢｃｅ４プロモーター（米国特許第5,530,194号）が含まれるが、それらに限定されない。有用な胚特異的プロモーターには、トウモロコシグロブリン１およびオレオシンプロモーターが含まれる。有用な内胚乳特異的プロモーターには、イネグルテリン−１プロモーター、低−ｐＩβアミラーゼ遺伝子（Ａｍｙ３２ｂ）（Rogersら, (1984), J. Biol. Chem. 259: 12234）、高−ｐＩβアミラーゼ遺伝子（Ａｍｙ６４）（Khurseedら, (1988), J. Biol. Chem. 263: 18953）、およびオオムギチオールプロテアーゼ遺伝子（“Ａｌｅｕｒａｉｎ”）（Whittierら, (1987), Nucleic Acids Res. 15: 2515）に対するプロモーターが含まれる。
【００９７】
特に興味深いのは、植物種子組織内で優先的に発現される転写開始領域からの本発明の核酸配列の発現である。そのような種子優先転写開始配列の例には、植物貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列または脂肪種子中の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来する配列が含まれる。そのようなプロモーターの例には、ナピン（Kridlら, Seed Sci. Res. 1: 209: 219 (1991）、ファゼオリン、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、β−コングリシニンのダイズα’サブユニット（ダイズ７ｓ、（Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8560-8564 (1986)）およびオレオシンのような遺伝子からの５’調節領域が含まれる。種子特異的遺伝子調節は、欧州特許第0255378B1号ならびに米国特許第5,420,034号および第5,608,152号の中で考察されている。プロモーターハイブリッドはさらにまた、転写活性を強化するため（Hoffman, 米国特許第5,106,739号）、または望ましい転写活性および組織特異性を結び付けるために構築することができる。
【００９８】
ＬＣＡＴを与えるタンパク質の局在を特定亜細胞区画、例えばミトコンドリア、小胞体、小胞、葉緑体または他の色素体区画へ指向させることが有益な可能性がある。例えば本発明の興味のある遺伝子を発現のために葉緑体のような色素体に標的化する場合は、構築物はさらに該遺伝子を色素体へ指向させるための配列を使用するであろう。そのような配列は、本明細書中では葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）または色素体輸送ペプチド（ＰＴＰ）という。このように、関心のある遺伝子が色素体内に直接的に挿入されない場合では、発現構築物は関心のある遺伝子を該色素体へ指向させるための輸送ペプチドをコードする遺伝子をさらに含有するであろう。葉緑体輸送ペプチドは関心のある遺伝子由来であっても、またはＣＴＰを有する異種配列由来であってもよい。そのような輸送ペプチドは当該技術分野で知られている。例えば、Von Heijneら, (1991), Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clarkら, (1989), J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; della-Cioppaら, (1987), Plant Physiol. 84: 965-968; Romerら, (1993), Biochem. Biophys. Res Commun. 196: 1414-1421; およびShahら, (1986), Science 233: 478-481を参照されたい。
【００９９】
使用目的に依存して、構築物はＬＣＡＴタンパク質全体、ＬＣＡＴタンパク質の一部、ＡＣＡＴタンパク質全体、またはＡＣＡＴタンパク質の一部分をコードする核酸配列を含有することができる。例えば所定のＬＣＡＴもしくはＡＣＡＴタンパク質のアンチセンス阻害を望む場合は、配列全体は必要とされない。さらに、構築物で使用されるＬＣＡＴもしくはＡＣＴＡ配列をプローブとして使用することを意図する場合は、ＬＣＡＴもしくはＡＣＡＴコード配列の特定部分だけ、例えば高度に保存された領域をコードすることが発見されている配列だけ、を含有する構築物を調製することが有益な可能性がある。
【０１００】
当業者であれば、宿主細胞における内生配列の発現を阻害するための様々な方法が存在することを認識しているであろう。そのような方法には、アンチセンス抑制（Smithら, (1988), Nature 334:724-726)、同時抑制 (Napoliら, (1989), Plant Cell 2 :279-289）、リボザイム（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／１０３２８号）、ならびにセンスおよびアンチセンスの組み合わせ（Waterhouseら, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964）が含まれるが、それらに限定されない。宿主細胞における内生配列の抑制方法は、典型的には抑制すべき配列の少なくとも一部分の転写または転写および翻訳を使用する。そのような配列は内生配列のコードならびに非コード領域と相同であってよい。
【０１０１】
同様に、本発明の植物発現構築物において調節転写終止領域を提供することができる。転写終止領域は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列または異なる遺伝子起源に由来する便宜的な転写終止領域、例えば転写開始領域と自然に関連している転写終止領域によって提供することができる。当業者であれば、植物細胞において転写を停止させることができるいずれかの便宜的な転写終止領域を本発明の構築物において使用できることを認識するであろう。
【０１０２】
また、構築物は宿主植物細胞色素体からの直接のＬＣＡＴもしくはＡＣＡＴ配列の発現を指令するために調製することができる。そのような構築物および方法は当該技術分野において知られており、一般に例えばSvabら, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8536およびSvabおよびMaliga, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917ならびに米国特許第5,963,507号に記載されている。
【０１０３】
その中に発現構築物を含有する組換えＤＮＡ構築物が導入されている植物細胞、組織、器官もしくは植物体は、形質転換、トランスフェクト（核酸導入）されているか、またはトランスジェニックであるとみなす。トランスジェニックもしくは形質転換細胞または植物は、さらに細胞もしくは植物の子孫、およびそのようなトランスジェニック植物を異種交配における親として使用し、かつ、ＬＣＡＴ核酸配列の存在から生じる変化した表現型を示す繁殖プログラムから作出される子孫も含む。
【０１０４】
それらの発現を増加または減少させるための関心のあるＤＮＡ配列として植物ＬＣＡＴを有する植物発現もしくは転写構築物は、多種多様な植物、特に食用用途および工業用途のための植物油の製造に含まれる植物と一緒に使用することができる。特に最も好ましいのは温帯脂肪種子農作物である。関心のある植物には、ナタネ（キャノーラおよび高級エルカ酸種）、ヒマワリ、サフラワー、綿、ダイズ、ピーナッツ、ココナツおよび油ヤシおよびトウモロコシが含まれるが、それらに限定されない。組換え構築物を宿主細胞内に導入する方法に依存して、その他のＤＮＡ配列が必要になる場合がある。重要なことに、本発明は双子葉植物および単子葉植物に対しても同様に適用することができ、さらに新規および／または改良形質転換および調節方法に容易に適用できるであろう。
【０１０５】
特に関心のあるのは、修飾された含量の脂質および／またはステロールエステルを有する植物または葉、幹、根、生殖器および種子を含む植物部分を生産するためおよびそのような植物による油産生を変化させるための、植物中の植物ＬＣＡＴおよびＡＣＡＴの使用である。
【０１０６】
本発明において特に関心のあるのは、種子のステロール含量を増加させるためのＬＣＡＴ配列と結合したＡＣＡＴ遺伝子の使用である。したがって、脂肪種子農作物中のＡＣＡＴおよびＬＣＡＴをコードする核酸配列の過剰発現は、本発明における使用を見出して、植物組織中のステロール濃度を増加させおよび／または油産生を増加させ得る。
【０１０７】
遺伝子配列は、特に植物に好ましい配列を提供することが望ましい場合に、完全または部分的に合成できることは予想される。したがって、所望の構造遺伝子の全部または一部分（ＬＣＡＴまたはＡＣＡＴタンパク質をコードする遺伝子の一部分）は選択した宿主によって好まれるコドンを使用することによって合成できる。宿主に好ましいコドンは、例えば所望の宿主種において発現するタンパク質中で最も頻回に使用されるコドンから決定することができる。
【０１０８】
当業者であれば、様々な植物起源から“相同”または“関連”配列をスクリーニングして発見するために抗体調製物、核酸プローブ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）等を調製して使用できることを容易に認識するであろう。相同配列は、配列同一性があるときに発見されるが、これは核酸もしくはアミノ酸の配列情報の比較に基づいて、または既知のＬＣＡＴと候補起源とのハイブリダイゼーション反応を通して決定することができる。Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｌｎ／Ａｓｎのような保存的変化もまた配列相同性を決定する際に考慮に入れることができる。アミノ酸配列は、２の完全成熟タンパク質間の２５％という低い配列同一性によって相同であると見なされる（一般に、Doolittle, R. F., OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986) を参照されたい）。
【０１０９】
したがって、他のＬＣＡＴは本明細書中に提供する特異的配列から入手できる。さらに、修飾アミノ酸配列および例示したＬＣＡＴおよびＡＣＡＴ配列ならびにそのような例示した配列の使用を通して入手される配列からの合成タンパク質モデリングのための開始物質を含む自然および合成配列を入手できることは明白であろう。修飾アミノ酸配列には、そのような配列が部分的に合成されようと、または完全に合成されようと、突然変異させられている、切断されている、増加させられている等の配列が含まれる。タンパク質または配列を入手するために使用した方法とは無関係に、実際の植物調製物から精製されている、または同一である、もしくはそれと同一のタンパク質をコードする配列は同等に天然由来と見なされる。
【０１１０】
免疫学的スクリーニングのために、タンパク質に対する抗体はウサギまたはマウスに精製タンパク質またはその部分を注射することによって調製できるが、抗体を調製するそのような方法は当業者にはよく知られてる。モノクローナルまたはポリクローナルどちらの抗体も生産できるが、典型的には遺伝子単離のためにはポリクローナル抗体がより有用である。関連タンパク質が所望の植物種の粗抽出液中に存在することを決定するためには、コードされているタンパク質への抗体の交差反応によって決定されるウェスタン解析を実施できる。交差反応性が観察された場合は、関連タンパク質をコードする遺伝子が所望の植物種を表わしている発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離される。発現ライブラリーは、Sambrookら, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)に記載されているようなラムダｇｔ１１を含む様々な市販されているベクター中に構築し得る。
【０１１１】
アシルトランスフェラーゼ酵素として同定された核酸配列によってコードされているタンパク質の活性および特異性を確証するためには、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞培養においてイン・ビトロ（in vitro)アッセイを実施する。そのようなバキュロウイルス発現系は当該技術分野において知られており、その全体が参照してここに組み込まれるＬｅｅらに付与された米国特許第5,348,886号に記載されている。
【０１１２】
さらに、様々な発現系を利用してタンパク質活性についてアッセイするためにその他の発現構築物を調製することもできる。そのような発現構築物は酵母または原核生物宿主内に形質転換され、アシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイされる。そのような発現系は当該技術分野において知られており、市販の入手源を通して容易に入手できる。
【０１１３】
そのようなトランスジェニック植物を入手する際の形質転換法は本発明にとって決定的に重要ではなく、現在ではさらに様々な植物形質転換法を利用できる。さらに、農作物を形質転換させるためにより新規の方法が入手可能になるので、それに従ってそれらを直接に適用することができる。例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染に対して自然では感受性の多数の植物種をアグロバクテリウム媒介形質転換のトリパータイトまたはバイナリーベクター法によって首尾よく形質転換させることができる。多くの場合に、特に左縁および右縁、より特別には右縁を有するＴ−ＤＮＡが片側または両側で隣接する構築物を有するのが望ましいであろう。これは特に、構築物が形質転換の様式としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）を使用する場合には有用であるが、Ｔ−ＤＮＡ境界は他の様式の形質転換を用いた場合に用途がある可能性がある。さらに、様々な単子葉植物および双子葉植物種の形質転換を可能にするマイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子弾丸衝撃およびエレクトロポレーションの方法が開発されている。
【０１１４】
通常は、ＤＮＡ構築物と一緒に含まれるのは宿主における発現のために必要な調節領域を有し、形質転換細胞の選択を提供する構造遺伝子であろう。この遺伝子は、例えば抗生物質、重金属、毒素等の細胞毒性物質に対する耐性、栄養要求性宿主へ原栄養体を提供する相補性、ウイルス免疫等を提供することができる。様々な宿主種の数に依存して、発現構築物またはその構成要素が導入され、様々な宿主に対して様々な選択条件が使用される場合に１以上のマーカーが使用される。
【０１１５】
適切な選択マーカーの非限定的例には、ブレオマイシン、ゲンタマイシン、グリフォセート、ヒグロマイシン、カナマイシン、メトトレキセート、フレオマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミドおよびスルホニル尿素への耐性を与える遺伝子が含まれる（Maligaら,  Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, p.39）。マーカーの例には、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１６】
アグロバクテリウムを植物細胞形質転換に使用する場合は、アグロバクテリウム宿主中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉ−もしくはＲｉ−プラスミドを用いた相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入できるベクターを使用できる。組換えのためのＴ−ＤＮＡを含有するＴｉ−もしくはＲｉ−プラスミドは病原性を有していても（根瘤形成を惹起できる）、非病原性であっても（根瘤形成を惹起できない）よいが、後者は形質転換アグロバクテリウム宿主中にｖｉｒ遺伝子が存在する限りにおいて許容される。病原性を有するプラスミドは正常植物細胞および根瘤の混合物を生じさせることができる。
【０１１７】
アグロバクテリウムが宿主植物細胞を形質転換させるための賦形剤として使用される一部の場合には、Ｔ−ＤＮＡ境界領域が隣接する発現または転写構築物は大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム中で複製できる広汎な宿主域ベクター内に挿入されるであろうが、文献には広宿主域ベクターが記載されている。一般に使用されるのはｐＲＫ２またはその誘導体である。例えば、参照してここに組み込まれるDittaら，（Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980) 77: 7347-7351）および欧州特許第0120515号を参照されたい。あるいは、植物細胞内で発現すべき配列を一方は大腸菌中、他方はアグロバクテリウム中のベクターを安定化させる個別複製配列を含有するベクター内に挿入することもできる。例えば、その中で複製のｐＲｉＨＲＩ（Jouaninら, Mol. Gen. Genet. (1985) 201: 370-374）起源が利用され、宿主アグロバクテリウム細胞中の植物発現ベクターの追加の安定性を提供している、McBrideおよびSummerfelt (Plant Mol. Biol. (1990) 14:269-276）を参照されたい。
【０１１８】
発現構築物およびＴ−ＤＮＡと一緒に含むことができるのは、形質転換アグロバクテリウムおよび形質転換植物細胞の選択を可能にする１種以上のマーカーである。例えばクロラムフェニコール、カナマイシン、アミノ配糖体Ｇ４１８、ヒグロマイシン等への耐性のような、植物細胞と一緒に使用するために多数のマーカーが開発されてきた。使用される特定マーカーは本発明にとって不可欠ではないが、特定宿主および構成方法に依存して１種以上のマーカーが好ましい。
【０１１９】
アグロバクテリウムを使用した植物細胞の形質転換のためには、形質転換のために十分な時間に渡って外殖体を形質転換アグロバクテリウムと組み合わせてインキュベートし、細菌を殺滅し、さらに植物細胞を適切な選択培地中で培養することができる。カルスが形成されると、知られている方法に従って適切な植物ホルモンを使用することによって芽の形成を助成し、芽を植物再生のために発根培地に移すことができる。植物はその後結実するまで成長し、種子を使用して反復世代を確立し、植物油を分離するために使用することができる。
【０１２０】
したがって、本発明の別の態様では、宿主細胞のステロールおよび／またはスタノール組成を修飾する方法が開示される。特に興味深いのは、宿主植物細胞のステロールおよび／またはスタノール組成を修飾する方法である。一般に、それらの方法には総ステロール化合物の比率としてのステロールエステル化合物の濃度を増加させることが含まれる。この方法は一般に、宿主細胞中の本発明のポリヌクレオチドの発現を指令するための発現構築物の使用を含む。
【０１２１】
同様に提供されるのは、宿主植物細胞中の総ステロール化合物の％としてのステロールエステル化合物の比率を低下させる方法である。この方法は一般に、宿主細胞中の内生アシルトランスフェラーゼタンパク質の抑制を指令するための発現構築物の使用を含む。
【０１２２】
特に興味深いのは、宿主植物細胞中のステロール化合物のレベルを修飾するための発現構築物の使用である。最も特別には、これらの方法は植物種子から入手される種子油中のステロール化合物のレベルを修飾する用途を見出す。
【０１２３】
さらに興味深いのは宿主細胞中の油産生を変化させるため、および特に油産生を増加させるための本発明の発現構築物の使用である。特に興味深いのは、宿主植物細胞を形質転換させて発現構築物を含有しない同一植物と比較して油産生増加を有する植物全体を再生させるためにこれらの宿主細胞を使用するためのＬＣＡＴおよび／またはＡＣＡＴポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現構築物の使用である。
【０１２４】
修飾ステロール化合物含量を有するトランスジェニック植物から入手された油は極めて様々な適用において用途を見出す。本発明において特に興味深いのは、ヒトの栄養および心臓血管の健康を改善させることに関与する適用における修飾されたレベルのステロール化合物を含有する油の使用である。例えば、フィトスタノールは血清コレステロールを低下させるために有益である（Lingら, (1995) Life Sciences 57: 195-206）。
【０１２５】
コレステロールを低下させる組成物は、本発明の方法を使用して入手される油およびステロールエステル化合物組成物を含む。そのようなコレステロールを低下させる組成物には、油および／または脂肪を含有する食物、食品、加工食品、食品添加剤、食品添加組成物または栄養補助食品が含まれるが、それらに限定されない。非限定的な例には、マーガリン；バター；ショートニング；クッキングオイル；天ぷら油；サラダドレッシングのようなドレッシング；スプレッド；マヨネーズ；およびビタミン／ミネラル栄養補助食品が含まれる。そのような組成物に関連する特許文書には、米国特許第4,588,717号および第5,244,887号、ならびにＰＣＴ国際公開番号WO96/38047号、WO97/42830号、WO98/06405号およびWO98/06714号が含まれる。さらなる非限定的な例には、トッピング；チーズやプロセスチーズのような乳製品；加工肉；パスタ；ソース；シリアル；フローズンデザートや室温保管可能なデザート；ディップ；チップ；焼き菓子；ペストリー；クッキー；スナックバー；糖菓；チョコレート：飲料；非抽出種子；および挽いたり、粗挽きしたり、製粉したり、圧延したり、押出し成形したり、ペレット化したり、脱脂したり、脱水したり、またはさもなければ加工したりされているが、それでもまだ本明細書中で開示した油等を含有する非抽出種子が含まれる。
【０１２６】
コレステロールを低下させる組成物はさらにまた、医薬上許容し得る担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒に本発明の方法を使用して入手されたコレステロールを低下させるのに有効な量の油またはステロール化合物組成物を含む医薬組成物の形態をとることができる。これらの医薬組成物は液体または固体の形状であってよい。液体は溶液または懸濁液であってよい；固体は粉末、顆粒、ピル、錠剤、ゲル、または押出物の形状であってよい。米国特許第5,270,041号はステロール含有医薬組成物に関している。
【０１２７】
したがって、宿主細胞内における本発明のアシルトランスフェラーゼ様配列をコードする核酸配列の発現によって、宿主細胞の脂質含量および／または組成ならびにステロール含量および／または組成を修飾することができる。
【０１２８】
これまで本発明を一般的に説明してきたが、例示することを目的に含まれていて本発明を限定することは意図されていない下記の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【０１２９】
実施例
実施例１：ＲＮＡの単離
相補的（ｃＤＮＡ）ライブラリーの構築に使用するために、アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）の花部および成長中の種子から全ＲＮＡを単離した。手順は、WebbおよびKnapp（D. M. WebbおよびS. J. Knapp, (1990), Plant Molec. Reporter, 8,180-185）のＤＮＡ単離プロトコルの翻案であった。下記の説明は新鮮重量１ｇの組織を使用することを想定している。冷凍種子組織は、液体窒素下で粉砕することによって粉末化した。この粉末を０.２ｇの不溶性ポリビニルポリピロリドンと一緒に１０ｍｌ  ＲＥＣ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９］、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）へ添加し、室温で粉砕した。ホモジネートを１２，０００×ｇで５分間遠心して不溶性物質をペレット化した。得られた上清画分をクロロホルムで抽出し、最上相を回収した。
【０１３０】
その後ＲＮＡを１容積のＲｅｃＰ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ）の添加によって沈殿させ、上記と同様の短時間の遠心によって収集した。ＲＮＡペレットを０．４ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ中に再溶解させた。ＲＮＡペレットを水中に再溶解させ、フェノール／クロロホルムを用いて抽出した。酢酸中の０．３Ｍ混合液を作製するために十分な３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５）を添加し、その後２容積のエタノールを添加してＲＮＡを沈殿させた。エタノールを用いて洗浄した後、この最終ＲＮＡ沈殿物を水中に溶解させ、冷凍保管した。
【０１３１】
また、全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（BRL-Lifetechnologies, Gaithersberg, MD）を使用して製造業者のプロトコルに従って入手することもできる。ＲＮＡ沈殿物は水中に溶解させ、冷凍保管した。
【０１３２】
実施例２  ＬＣＡＴ配列の同定
さらなるバイオアクセレレーター（Bioaccellerator）ハードウエアおよびCompugen Ltd.によって供給されたゲン・ウェブ（GenWeb）ソフトウエアを使用して、シリコーン・グラフィックス・ユニックス（Silicon Graphics Unix）コンピューター上で検索を実施した。このソフトウエアおよびハードウエアは、クエリーとしてプロフィールを使用することによりＤＮＡおよびタンパク質データベースを検索する際にスミス・ウォーターマン（Smith-Waterman)アルゴリズムの使用を許容した。タンパク質データベースをクエリーするために使用したプログラムはprofilesearchであった。これは、クエリーが単一配列ではなくアミノ酸または核酸配列の多重アライメントに基づくプロフィールである場合の検索である。配列データセット、すなわち配列データベースをクエリーするためにプロフィールを使用した。プロフィールは、実質的に標準クエリー検索のために使用される“スコアリングマトリックス”に代わる配列中の各位置をスコア付けするための全関連情報を含んでいた。タンパク質プロフィールを用いてヌクレオチドデータベースをクエリーするために使用したプログラムは、tprofilesearchであった。tprofilesearchはアミノ酸プロフィールクエリーを使用して核酸データベースを検索する。検索の実行中は、データベース中の配列は６のリーディングフレームでアミノ酸配列へ翻訳される。tprofilesearchのための出力ファイルは、最良アライメントが発生したフレームを指令する追加欄を除いて、profilesearchの出力ファイルと同一である。
【０１３３】
クエリーからの１の配列とデータベースに含有されている配列群との間の類似性について検索するためには、スミス・ウォーターマン・アルゴリズム（SmithおよびWaterman (1981), J. Molec. Biol. 147:195-197）を使用した。
【０１３４】
ＢＬＡＳＴを使用してＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースを検索するために、ヒトからのレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼのタンパク質配列（McLean J.ら,(1986), Nucleic Acids Res. 14 (23): 9397-406、配列番号１）を使用した。アラビドプシスからは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ００４５５７（以下、ＬＣＡＴ１という、配列番号２）、ＡＣ００３０２７（以下、ＬＣＡＴ２という、配列番号４）およびＡＬ０２４４８６（以下、ＬＣＡＴ３という、配列番号６）の３の配列が同定された。推定アミノ酸配列は、各々配列番号３、５および７に提供する。
【０１３５】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用したクエリーから生成したプロフィールはハイパーテキスト記述言語（ｈｔｍｌ）ファイルから削除した。ｎｃｂｉ（全米バイオテクノロジー情報センター）でのｐｓｉ−ｂｌａｓｔへのワールドワイドウエブ（ｗｗｗ）／ｈｔｍｌインターフェースは、ｐｓｉ−ｂｌａｓｔの各反復後に戻されるｈｔｍｌファイル内の隠れ領域に最新に作成されたプロフィールマトリックスを格納する。しかし、このマトリックスはｈｔｍｌを通して容易に輸送するためにストリング６２（ｓ６２）フォーマットへコードされている。ストリング６２フォーマットはマトリックスの数値のｈｔｍｌ正当ａｓｃｉｉ文字への単純な転換である。
【０１３６】
コードされているマトリックスの幅（ｘ軸）は２６文字で、共通文字、順序Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚでの各アミノ酸の確率（ＢがＤおよびＮを表わし、さらにＺがＱおよびＥを表わし、さらにＸがいずれかのアミノ酸を表わす場合）、ギャップ作成値、およびギャップ伸長値を含む。
【０１３７】
マトリックスの長さ（ｙ軸）はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって同定された配列の長さに対応する。アミノ酸の順序はＮ末端がマトリックスの一番上で、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて同定された配列の保存アミノ酸配列に対応する。その位置での他のアミノ酸の確率は、各単一文字アミノ酸略号下で、ｘ軸に沿って各アミノ酸について表わされている。
【０１３８】
したがって、各列のプロフィールは最高スコア（コンセンサス）アミノ酸から構成され、つづいて配列マトリックス中のその位置での可能性のある各アミノ酸のスコア、その位置でギャップを開くためのスコア、およびその位置でギャップを継続するためのスコアが続く。
【０１３９】
ストリング６２プロフィールは、引続いての検索で使用するためにプロフィール内に逆変換される。ｘ軸に沿って、ギャップ開放域は１１およびギャップ伸長域は１に設定される。ギャップ作成値およびギャップ伸長値は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムに与えられた設定に基づくと判明する。マトリックスは標準ＧＣＧプロフィール形にエクスポートされる。このフォーマットはＧｅｎＷｅｂによって読み取ることができる。
【０１４０】
ストリング６２フォーマット化ファイルをマトリックスに転換するために使用したアルゴリズムは表１に略述されている。
【０１４１】
【表１】
0004790952.tif 000002
【０１４２】
ＬＣＡＴ１、ＬＣＡＴ２およびＬＣＡＴ３のタンパク質配列ならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプロフィールを使用して追加のＬＣＡＴ配列について公衆および専有データベースを検索した。ＬＣＡＴ１およびＬＣＡＴ３各々と同一であると思われる２種のＥＳＴ配列が同定された。１の追加のアラビドプシス配列であるＬＣＡＴ４（配列番号：８）は専有データベースから同定された。ＬＣＡＴ４の推定タンパク質配列は配列番号９で提供される。アラビドプシス生態型コロンビア（Columbia）およびランツベルク（Landsberg）のライブラリーからはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプロフィールを使用してＬＣＡＴ７（配列番号１０）およびＬＣＡＴ８（配列番号１１）の２種の追加のゲノム配列が同定された。ＬＣＡＴ７配列はコロンビアおよびランツベルク両方のゲノムライブラリーに存在したが、ＬＣＡＴ８配列はコロンビアライブラリーにしか存在しなかった。
【０１４３】
オープンリーディングフレームはアラビドプシス公衆データベース中のＬＣＡＴ７ゲノム配列から予測されたが、この配列はＭＳＨ１２と呼ばれていた（以下、ＬＣＡＴ５、配列番号７３という）。ＬＣＡＴ５の推定タンパク質配列は配列番号７４に提供されている。
【０１４４】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプロフィールおよびＬＣＡＴ配列を使用して、トウモロコシおよびダイズＥＳＴ配列を含有する公衆酵母データベースおよび専有ライブラリーをクエリーした。酵母ゲノムはヒトＬＣＡＴとの明確な類似性を有する唯一の遺伝子ＬＲＯ１（ＬＣＡＴ関連オープンリーディングフレーム、ＹＮＲ００８Ｗ、図１）だけを含有している。ＬＲＯ１のＤＮＡ配列は配列番号７５に提供されており、タンパク質配列は配列番号７６に提供されている。ダイズライブラリーからは７のＥＳＴ配列がＬＣＡＴ配列であると同定された。ダイズからの２種の配列（配列番号１２および１３）はアラビドプシスＬＣＡＴ１配列に最も緊密に関連しているが、単一配列（配列番号１４）がＬＣＡＴ２に最も緊密に関連していると同定され、３の配列はＬＣＡＴ３に緊密に関連しており（配列番号１５−１７）、さらに１の配列が同定された（配列番号１８）。計１１のトウモロコシＥＳＴ配列がアラビドプシスＬＣＡＴ配列に関連していると同定された。２のトウモロコシＥＳＴ配列（配列番号１９および２０）はＬＣＡＴ１に最も緊密に関連しており、２の配列はＬＣＡＴ２に緊密に関連していると同定され（配列番号２１および２２）、４のトウモロコシＥＳＴ配列はＬＣＡＴ３に緊密に関連していると同定され（配列番号２３−２６）、さらなる３のトウモロコシＥＳＴ配列も同定された（配列番号２７−２９）。
【０１４５】
実施例３  ＡＣＡＴ配列の同定
植物ＡＣＡＴは当該技術分野において知られていないので、公衆データベースからの哺乳動物源由来の既知および関連ＡＣＡＴ配列を同定するために検索を実施した。その後これらの配列を使用して植物ＡＣＡＴ様配列を同定するために公衆および専有ＥＳＴデータベースを検索した。
【０１４６】
マウス発現配列タグ（ＥＳＴ）配列（ｄＢＥＳＴ）を含有する公衆データベースをＡＣＡＴ様配列について検索した。この検索で、既知のＡＣＡＴ配列に関連している（約２０％同一）が不一致であった２の配列が同定された。
【０１４７】
他の生物からＡＣＡＴ様配列を同定するために、２のマウスＡＣＡＴ配列を使用してヒトおよびラット組織由来のＥＳＴ配列を含有する公衆および専有データベースを検索した。検索の結果は、ヒトデータベースおよびラットデータベースからマウス配列に緊密に関連する数種の配列を同定した。重複配列（各々、配列番号３２および３３）を同定することによって完全推定ｃＤＮＡ配列を構成するために、ＧＣＧアッセンブリープログラムを使用して、ヒトおよびラットＡＣＡＴ様ＥＳＴ配列を集合させた。
【０１４８】
ヒトＡＣＡＴ様配列のタンパク質配列を、MacVector（Oxford Molecular, Inc.）を使用してヒト（Changら, (1993), J. Biol. Chem. 268: 20747-20755,配列番号３４）、マウス（Uelmenら, (1995), J. Biol. Chem. 270: 26192-26201,  配列番号３５）および酵母（Yuら, (1996), J. Biol. Chem. 271: 24157-24163，  配列番号３６およびYangら,(1996), Science 272: 1353-1356,  配列番号３７）からの既知のＡＣＡＴ配列とアライメントさせた。このアライメントの結果は、この配列が既知の配列と関連しているが、関連配列は既知の配列と約２５％しか類似していないことを証明した。
【０１４９】
ヒトステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ、受入番号Ａ４８０２６）関連配列のタンパク質配列を使用してタンパク質および核酸Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを検索した。単一の植物ホモログが公衆アラビドプシスＥＳＴデータベースにおいて同定された（受入番号Ａ０４２２９８、配列番号３８）。タンパク質配列（配列番号３９）はＥＳＴ配列から翻訳され、さらに哺乳動物および酵母ＡＣＡＴの両方で保存されたペプチド配列を含有していることが発見された（Changら, (1997), Ann. Rev. Biochem., 66: 613-638）。
【０１５０】
アラビドプシスＡＣＡＴ様ＥＳＴに対応する全コード領域を入手するために、ＡＣＡＴ様配列を含有する部分ｃＤＮＡクローンの５’および３’末端を増幅させるために合成オリゴ−ヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーは、アラビドプシスＡＣＡＴ様ＥＳＴ配列に従って設計し、ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）反応において使用した（Frohmanら, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002）。
【０１５１】
アラビドプシスＡＣＡＴ  ＥＳＴ配列からの５’末端を増幅させるためにプライマー（５’−ＴＧＣＡＡＡＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号４０）および５’−ＡＡＧＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＣＡＡＴＡＧＧ−３’（配列番号４１））を設計した。ｃＤＮＡクローンからのフランキング配列の増幅は、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech, CA）を使用して実施した。
【０１５２】
５’−ＲＡＣＥ増幅から引き出された配列を使用して専有アラビドプシスＥＳＴライブラリーを検索した。５’−ＲＡＣＥ配列と同一である配列を含有している単一ＥＳＴ受入番号ＬＩＢ２５−０８８−Ｃ７（配列番号４２）が同定された。さらに、ＬＩＢ２５−０８８−Ｃ７はアラビドプシスＡＣＡＴ様産物について完全推定コード配列を含有することが発見された。
【０１５３】
Ａ０４２２９８の核酸ならびに推定翻訳産物配列を使用して公衆および専有データベースを検索した。ダイズ（配列番号４３−４６）およびトウモロコシ（配列番号４７−５０）両方の専有データベースにおいて４種のＥＳＴ配列が同定され、さらにモルティエレラ・アルピナ（Mortierrella alpina）  ＥＳＴ配列（配列番号５１）から単一ＡＣＡＴ様配列が同定された。
【０１５４】
種々の起源由来のＡＣＡＴ配列間の配列アライメントを配列間の類似性を同定するために比較した。既知のヒトおよびマウスＡＣＡＴ由来のヌクレオチド配列ならびに既知の酵母ＡＣＡＴ由来のヌクレオチド配列をヒトおよびアラビドプシス由来のＡＣＡＴ様ＥＳＴ配列と比較した。
【０１５５】
配列アライメントの解析で配列類似性に基づく幾つかのクラスのＡＣＡＴが判明した。ヌクレオチド配列において８８％類似である既知のヒトおよびマウスＡＣＡＴが１クラスのＡＣＡＴを形成した。別のクラスのＡＣＡＴは既知のヒトおよびマウスのクラスのＡＣＡＴと２０％未満類似である酵母ＡＣＡＴを含んでいた。
【０１５６】
最終クラスのＡＣＡＴは本発明で開示したアラビドプシスおよびヒト配列を含んでいた。このクラスは既知のヒトおよびマウスＡＣＡＴクラスと約２２％類似であり、酵母クラスのＡＣＡＴと約２３％類似である。したがって、本発明で開示したＡＣＡＴ配列は新規クラスのＡＣＡＴ酵素を表わしている。このクラスの部分マウス配列も提供されている。
【０１５７】
実施例４  発現構築物の調製
植物および培養昆虫細胞におけるＬＣＡＴ１、ＬＣＡＴ２、ＬＣＡＴ３、ＬＣＡＴ４、ＬＣＡＴ５および酵母ＬＲＯ１配列の発現を指令するための構築物を調製した。各ＬＣＡＴの全コード領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において下記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して適切なＥＳＴクローンまたはアラビドプシス・ゲノムｃＤＮＡライブラリーから増幅させた。ＬＣＡＴ１コード配列は、プライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＡＴＴＣＧＧ−３’（配列番号５２）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＧ−３’（配列番号５３）を使用してＥＳＴクローンＬｉｂ２５−０８２−Ｑ１−Ｅ１−Ｇ４から増幅させた。ＬＣＡＴ２コード配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号５４）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号５５）を使用してアラビドプシス・ゲノムｃＤＮＡライブラリーから増幅させた。ＬＣＡＴ３コード配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣ−３’（配列番号５６）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣ−３’（配列番号５７）を使用してＥＳＴクローンＬＩＢ２２−００４−Ｑ１−Ｅ１−Ｂ４から増幅させた。ＬＣＡＴ４コード配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣ−３’（配列番号５８）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＡＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号５９）を使用してＥＳＴクローンＬＩＢ２３−００７−Ｑ１−Ｅ１−Ｂ５から増幅させた。ＬＣＡＴ５コード配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＴＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号７７）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号７８）を使用してＬＩＢ２３−０５３−Ｑ１−Ｅ１−Ｅ３から増幅させた。
【０１５８】
酵母ＬＲＯ１コード配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＧＡＡＧ３’（配列番号７９）および５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号８０）を使用してゲノム酵母ＤＮＡから増幅させた。
【０１５９】
アラビドプシスＡＣＡＴ配列（配列番号４２）の全コード領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてオリゴヌクレオチドプライマーの５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＴＧＧＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号６０）および５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＧＧ−３’（配列番号６１）を使用してＥＳＴクローンＬＩＢ２５−０８８−Ｃ７から増幅させた。
【０１６０】
結果として生じる各ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Invitrogen）および標識ｐＣＧＮ９９６４（ＬＣＡＴ１）、ｐＣＧＮ９９８５（ＬＣＡＴ２）、ｐＣＧＮ９９６５（ＬＣＡＴ３）、ｐＣＧＮ９９９５（ＬＣＡＴ４）、ｐＣＧＮ１０９６４（ＬＣＡＴ５）、ｐＣＧＮ１０９６３（ＬＲＯ１）、およびｐＣＧＮ８６２６（ＡＣＡＴ）内にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅によって誤りが導入されなかったことを検証するために二本鎖ＤＮＡ配列を入手した。
【０１６１】
４Ａ．  バキュロウイルス発現構築物
培養昆虫細胞中でアラビドプシスＬＣＡＴおよび酵母ＬＣＡＴ配列の発現を指令する構築物を調製する。ＬＣＡＴタンパク質の全コード領域は、ＮｏｔＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉを用いた消化、さらにゲル電気泳動法およびゲル精製によって各構築物から除去した。ＬＣＡＴコード配列を含有するフラグメントをＮｏｔＩおよびＰｓｔＩ消化バキュロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Gibco-BRL, Gaithersberg, MD）内にクローニングした。結果として生じるバキュロウイルス発現構築物をｐＣＧＮ９９９２（ＬＣＡＴ１）、ｐＣＧＮ９９９３（ＬＣＡＴ２）、ｐＣＧＮ９９９４（ＬＣＡＴ３）、ｐＣＧＮ１０９００（ＬＣＡＴ４）、ｐＣＧＮ１０９６７（ＬＣＡＴ５）、およびｐＣＧＮ１０９６２（ＬＲＯ１）と呼んだ。
【０１６２】
４Ｂ．  植物発現構築物の調製
多重制限部位を含有する大きなＤＮＡフラグメントをクローニングするためにより有用にするために、および植物２成分形質転換ベクター内への多重ナピン融合遺伝子のクローニングを許容するために、ｐＣＧＮ３２２３（これにより参照してその全体がここに組み込まれる、米国特許第５，６３９，７９０号に記載されている）由来のナピンカセットを含有するプラスミドを修飾した。配列５’−ＣＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴ−３’（配列番号６２）の自己アニーリングオリゴヌクレオチドから構成されたアダプターは、構築物ベクターｐＣＧＮ７７６５への制限エンドヌクレアーゼＢｓｓＨＩＩを用いての消化後にクローニングベクターｐＢＣ  ＳＫ＋（Stratagene）内へ連結した。プラスミドｐＣＧＮ３２２３およびｐＣＧＮ７７６５はＮｏｔＩを用いて消化し、一緒に連結した。結果として生じたベクターｐＣＧＮ７７７０はｐＣＧＮ３２２３からのナピン種子特異的発現カセットとともにｐＣＧＮ７７６５骨格を含有していた。
【０１６３】
ｐＣＧＮ７７７０のナピン調節領域を除いて実質的にｐＣＧＮ７７７０と同一の調節要素を含有していたクローニングカセットｐＣＧＮ７７８７は、二重ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーターおよびｔｍｌポリアデニレーションおよび転写終止領域と置換されている。
【０１６４】
植物形質転換のための２成分ベクターｐＣＧＮ１３９は、ｐＣＧＮ１５５８（McBrideおよびSummerfelt, (1990), Plant Molecular Biology 14: 269-276）から構成した。ｐＣＧＮ５１３９においては、ｐＣＧＮ１５５８のポリリンカーはＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８として独創的な制限エンドヌクレアーゼ部位ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳｗａＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを含有するポリリンカーと置換された。Ａｓｐ７１８およびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位はｐＣＧＮ５１３９において保持されている。
【０１６５】
転写開始領域（プロモーター）および転写終止領域を含有する２成分ベクター内へのＤＮＡ配列の迅速なクローニングを許容するために一連のターボ２成分ベクターを構成した。
【０１６６】
プラスミドｐＣＧＮ８６１８は、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号６３）および５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号６４）をＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ７７７０内に連結することによって構築した。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナピン３’領域を含有するフラグメントはＡｓｐ７１８Ｉを用いた消化によってｐＣＧＮ８６１８から切り取った；このフラグメントはＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されてＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にされていたｐＣＧＮ５１３９内へ連結した。ナピンプロモーターがｐＣＧＮ５１３９の平滑末端Ａｓｐ７１８Ｉに最も近く、ナピン３’が平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いように配置されたインサートを含有するプラスミドにインサートの配向およびクローニング接合部の完全性の両方を確証するための配列解析を受けさせた。結果として生じたプラスミドをｐＣＧＮ８６２２と指定した。
【０１６７】
プラスミドｐＣＧＮ８６１９は、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号６５）および５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号６６）をＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ７７７０内に連結することによって構成した。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナピン３’領域を含有するフラグメントはＡｓｐ７１８Ｉを用いた消化によってｐＣＧＮ８６１９から切り取った；このフラグメントはＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されてＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にされていたｐＣＧＮ５１３９内へ連結した。ナピンプロモーターがｐＣＧＮ５１３９の平滑末端Ａｓｐ７１８Ｉに最も近く、ナピン３’が平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いように配置されたインサートを含有するプラスミドがインサートの配向およびクローニング接合部の完全性の両方を確証するために配列解析を受けさせた。結果として生じたプラスミドをｐＣＧＮ８６２３と指定した。
【０１６８】
プラスミドｐＣＧＮ８６２０は、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴ−３’（配列番号６７）および５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号６８）をＳａｌＩ／ＳａｃＩ消化ｐＣＧＮ７７８７内に連結することによって構成した。ｄ３５Ｓプロモーター、ポリリンカーおよびｔｍｌ３’領域を含有するフラグメントは、Ａｓｐ７１８Ｉを用いた完全消化およびＮｏｔＩを用いての部分消化によってｐＣＧＮ８６２０から切り取った。このフラグメントはＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されてＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にされていたｐＣＧＮ５１３９内へ連結した。ｄ３５ＳプロモーターがｐＣＧＮ５１３９の平滑末端Ａｓｐ７１８Ｉに最も近く、ｔｍｌ３’が平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いように配置されたインサートを含有するプラスミドがインサートの配向およびクローニング接合部の完全性の両方を確証するために配列解析を受けさせた。結果として生じたプラスミドをｐＣＧＮ８６２４と指定した。
【０１６９】
プラスミドｐＣＧＮ８６２１は、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号６９）および５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号７０）をＳａｌＩ／ＳａｃＩ消化ｐＣＧＮ７７８７内に連結することによって構成した。ｄ３５Ｓプロモーター、ポリリンカーおよびｔｍｌ３’領域を含有するフラグメントは、Ａｓｐ７１８Ｉを用いた完全消化およびＮｏｔＩを用いての部分消化によってｐＣＧＮ８６２１から切り取った。このフラグメントはＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されてＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いての５’オーバーハングにおける充填によって平滑末端にされていたｐＣＧＮ５１３９内へ連結した。ｄ３５ＳプロモーターがｐＣＧＮ５１３９の平滑末端Ａｓｐ７１８Ｉに最も近く、ｔｍｌ３’が平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いように配置されたインサートを含有するプラスミドがインサートの配向およびクローニング接合部の完全性の両方を確証するために配列解析を受けさせた。結果として生じたプラスミドをｐＣＧＮ８６２５と指定した。
【０１７０】
プラスミド構築物ｐＣＧＮ８６４０は上記で説明したｐＣＧＮ８６２４の変形である。大腸菌およびアグロバクテリウム選択の決定因子である細菌スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴＮ７から単離された９３９ｂｐのＰｓｔＩフラグメント（Flingら, (1985), Nucleic Acids Research 13 (19): 7095-7106）をＰｆｕポリメラーゼを用いて平滑末端にした。平滑末端フラグメントはＳｐｅＩを用いて消化されてＰｆｕポリメラーゼを用いて平滑末端にされていたｐＣＧＮ８６２４内に連結した。ＰｓｔＩフラグメントを含有する領域は、インサートの配向およびクローニング接合部の完全性を確証するためにシークエンシングした。
【０１７１】
スペクチノマイシン耐性マーカーは下記の通りにｐＣＧＮ８６２２およびｐＣＧＮ８６２３内へ導入した。ｐＣＧＮ８６４０からの７．７ＫｂｐのＡｖｒＩＩ−ＳｎａＢＩフラグメントは上記のｐＣＧＮ８６２３またはｐＣＧＮ８６２２からの１０．９ＫｂｐのＡｖｒＩＩ−ＳｎａＢＩへ連結した。結果として生じたプラスミドは各々ｐＣＧＮ８６４１およびｐＣＧＮ８６４３であった。
【０１７２】
プラスミドｐＣＧＮ８６４４はオリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号７１）および５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴ−３’（配列番号７２）をＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ消化ｐＣＧＮ８６４０内へ連結した。
【０１７３】
４Ｃ．  植物ＬＣＡＴ発現構築物の調製
発現構築物ｐＣＧＮ９９６０、ｐＣＧＮ９９６１、ｐＣＧＮ９９６２、およびｐＣＧＮ９９６３各々を作製するために、ＬＣＡＴ１のコード配列をＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ９９６４からｐＣＧＮ８６４０、ｐＣＧＮ８６４１、ｐＣＧＮ８６４３、およびｐＣＧＮ８６４４内へクローニングした。構築物ｐＣＧＮ９９６０は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのセンス配向においてＬＣＡＴ１コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９６１は、ナピンプロモーターからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ１コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９６２は、ナピンプロモーターからのセンス配向においてＬＣＡＴ１コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９６３は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ１コード配列を発現させるために設計した。
【０１７４】
発現構築物ｐＣＧＮ９９８１、ｐＣＧＮ９９８２、ｐＣＧＮ９９８３、およびｐＣＧＮ９９８４各々を作製するために、ＬＣＡＴ２のコード配列をＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ９９６５からｐＣＧＮ８６４０、ｐＣＧＮ８６４１、ｐＣＧＮ８６４３、およびｐＣＧＮ８６４４内へクローニングした。構築物ｐＣＧＮ９９８１は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのセンス配向においてＬＣＡＴ２コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９８２は、ナピンプロモーターからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ２コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９８３は、ナピンプロモーターからのセンス配向においてＬＣＡＴ２コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９８４は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ２コード配列を発現させるために設計した。
【０１７５】
発現構築物ｐＣＧＮ９９６６、ｐＣＧＮ９９６７、ｐＣＧＮ９９６８、およびｐＣＧＮ９９６９各々を作製するために、ＬＣＡＴ３のコード配列をＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ９９６５からｐＣＧＮ８６４０、ｐＣＧＮ８６４１、ｐＣＧＮ８６４３、およびｐＣＧＮ８６４４内へクローニングした。構築物ｐＣＧＮ９９６６は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのセンス配向においてＬＣＡＴ３コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９６７は、ナピンプロモーターからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ３コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９６８は、ナピンプロモーターからのセンス配向においてＬＣＡＴ３コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９６９は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ３コード配列を発現させるために設計した。
【０１７６】
発現構築物ｐＣＧＮ９９９６、ｐＣＧＮ９９９７、ｐＣＧＮ９９９８、およびｐＣＧＮ９９９９各々を作製するために、ＬＣＡＴ４のコード配列をＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ９９９５からｐＣＧＮ８６４０、ｐＣＧＮ８６４１、ｐＣＧＮ８６４３、およびｐＣＧＮ８６４４内へクローニングした。構築物ｐＣＧＮ９９９６は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのセンス配向においてＬＣＡＴ４コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９９７は、ナピンプロモーターからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ４コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９９８は、ナピンプロモーターからのセンス配向においてＬＣＡＴ４コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ９９９９は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのアンチセンス配向においてＬＣＡＴ４コード配列を発現させるために設計した。
【０１７７】
発現構築物ｐＣＧＮ１０９６５およびｐＣＧＮ１０９６６各々を作製するために、ＬＣＡＴ５のコード配列をＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ１０９６４からｐＣＧＮ９９７７およびｐＣＧＮ９９７９内へクローニングした。構築物ｐＣＧＮ１０９６５は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのセンス配向においてＬＣＡＴ５コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ１０９６６は、ナピンプロモーターからのセンス配向においてＬＣＡＴ５コード配列を発現させるために設計した。
【０１７８】
発現構築物ｐＣＧＮ１０９６０およびｐＣＧＮ１０９６１各々を作製するために、ＬＲＯ１のコード配列をＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ１０９６３からｐＣＧＮ９９７７およびｐＣＧＮ９９７９内へクローニングした。構築物ｐＣＧＮ１０９６０は、構成性プロモーターＣａＭＶ３５Ｓからのセンス配向においてＬＲＯ１コード配列を発現させるために設計した。構築物ｐＣＧＮ１０９６１は、ナピンプロモーターからのセンス配向においてＬＲＯ１コード配列を発現させるために設計した。
【０１７９】
４Ｄ．  植物ＡＣＡＴ発現構築物の調製
アラビドプシスＡＣＴＡ様コード領域を含有するフラグメントは、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩを用いての消化によってｐＣＧＮ８６２６から取り除いた。ＡＣＡＴ様配列を含有するフラグメントは、ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＣＧＮ８６２２内へ連結した。結果として生じるプラスミドはｐＣＧＮ８６２７と指定した。ＤＮＡ配列解析はクローニング接合部の完全性を確証した。
【０１８０】
アラビドプシスＡＣＴＡ様コード領域（配列番号４２）を含有するフラグメントは、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩを用いての消化によってｐＣＧＮ８６２６から取り除いた。このフラグメントはＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＣＧＮ８６２３内へ連結した。結果として生じるプラスミドはｐＣＧＮ８６２８と指定した。ＤＮＡ配列解析はクローニング接合部の完全性を確証した。
【０１８１】
アラビドプシスＡＣＴＡ様コード領域を含有するフラグメントは、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩを用いての消化によってｐＣＧＮ８６２６から取り除いた。このフラグメントはＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＣＧＮ８６２４内へ連結した。結果として生じるプラスミドはｐＣＧＮ８６２９と指定した。ＤＮＡ配列解析はクローニング接合部の完全性を確証した。
【０１８２】
アラビドプシスＡＣＴＡ様コード領域を含有するフラグメントは、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩを用いての消化によってｐＣＧＮ８６２６から取り除いた。このフラグメントはＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＣＧＮ８６２５内へ連結した。結果として生じるプラスミドはｐＣＧＮ８６３０と指定した。ＤＮＡ配列解析はクローニング接合部の完全性を確証した。
【０１８３】
内生ＡＣＡＴ様活性の抑制のための追加の発現構築物もまた調製した。構築物ｐＣＧＮ８６６０は、センス配向においてｐＣＧＮ８６２６からのおよそ１ＫｂのアラビドプシスＡＣＡＴ様コード領域、およびナピン転写開始配列の調節制御下でアンチセンス配向における全長アラビドプシスＡＣＡＴ様コード領域をクローニングすることにより構成した。
【０１８４】
植物におけるラットＡＣＡＴ様配列の発現のために、プラスミドｐＣＧＮ９７００、ｐＣＧＮ９７０１、およびｐＣＧＮ９７０２各々を産生させるためにｐＣＧＮ８５９２のＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７ＩフラグメントをＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ消化２成分ｐＣＧＮ８６２１、ｐＣＧＮ８６２２、およびｐＣＧＮ８６２４内にクローニングした。プラスミドｐＣＧＮ９７００はナピンプロモーターの制御下でラットＡＣＡＴ様ｃＤＮＡのセンス転写を発現し、さらにプラスミドｐＣＧＮ９７０２は二重３５Ｓプロモーターの制御下でラットＡＣＡＴ様ｃＤＮＡのセンス転写を発現する。プラスミドｐＣＧＮ９７００、ｐＣＧＮ９７０１、およびｐＣＧＮ９７０２はアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１内に導入した。
【０１８５】
構築物は、ダイズの種子胚およびトウモロコシの内胚乳におけるラットＡＣＡＴ様配列の発現を指令するために調製した。ダイズにおけるラットＡＣＡＴ様ＤＮＡ配列の発現のために、微粒子弾丸衝撃（particle bombardment）によるダイズ内への形質転換のためのベクターｐＣＧＮ８８１７を作製するために、ラットＡＣＡＴ様配列のコード配列を含有するｐＣＧＮ８５９２からの１．５ｋｂのＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉはグリーンビーンズヌクレアーゼを使用して平滑末端にし、ターボ７Ｓ２成分／クローニングベクターｐＣＧＮ８８０９のＳｍａＩ部位内に連結した。ベクターｐＣＧＮ８８１７はβ−コングリシニンのダイズα’サブユニットのプロモーター領域の作動可能に連結されたコンポーネント（７Ｓプロモーター、（Chenら, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8560-8564)）、全ラットＡＣＡＴ様タンパク質に対するＤＮＡ配列コーディング、およびＥ９  ３’と呼ばれるエンドウマメＲｕＢｉｓＣｏ小サブユニットの転写終止領域（Coruzziら, (1984), EMBO J. 3:1671-1679およびMorelliら, (1985), Nature 315: 200-204）を含有していた。この構築物はさらに、ゴマノハグサ・モザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター（米国特許第5,378,619号）およびＥ９の転写終止領域の制御下で発現されたＣＰ４  ＥＰＳＰＳ（米国特許第5,633,435号）を使用してグリホサートへの耐性についてスクリーニングすることによって陽性形質転換植物を選択するための配列を含有していた。
【０１８６】
トウモロコシ内胚乳においてラットＡＣＡＴ様配列を発現させるために、グリーン・ビーンズヌクレアーゼを使用してラットＡＣＡＴ様配列のコード配列を含有するｐＣＧＮ８５９２からの１．５ｋｂのＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉを平滑末端にし、ｐＧｔ１プロモーター（Leisy D. J.ら, Plant Mol. Biol. 14 (1989), 41-50）およびＨＳＰ７０イントロン配列（米国特許第5,593,874号）からの発現のためにコメｐＧｔ１発現カセットｐＣＧＮ８５９２のＢａｍＨＩ部位内へ連結した。このカセットはさらに、ノパリンシンターゼのクローニング部位の下流転写終止領域ｎｏｓ  ３’（Depickerら, J. Molec. Appl. Genet. (1982), 1: 562-573）も含有していた。トウモロコシ内への形質転換のためにベクターｐＣＧ８８１８を作製するためにｐＧｔ１プロモーター、ラットＡＣＡＴ様タンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびｎｏｓ転写終止配列を含有している７．５ｋｂフラグメントをバイナリ−ｐＣＧＮ８８１６内へクローニングした。この構築物は、さらにＣＡＭＶ  ３５Ｓプロモーターおよびｔｍｌ転写終止領域の制御下でＴｎ５細菌からのカナマイシン耐性遺伝子を使用してカナマイシンとの陽性形質転換体の選択のための配列を含有していた。
【０１８７】
実施例５  昆虫細胞培養における発現
培養昆虫細胞におけるＬＣＡＴ  ｃＤＮＡｓを発現させるためにバキュロウイルス発現系を使用した。
【０１８８】
製造業者の使用説明書に従って、ＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Gibco-BRL, Gaithersberg, MD）を使用してバキュロウイルス発現構築物ｐＣＧＮ９９９２、ｐＣＧＮ９９９３、ｐＣＧＮ９９９４、ｐＣＧＮ１０９００、ｐＣＧＮ１０９６２およびｐＣＧＮ１０９６７を形質転換かつ発現させた。
【０１８９】
当分野において知られている方法を使用してアシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイするために形質転換昆虫細胞を使用した（実施例８を参照）。
【０１９０】
実施例６  植物形質転換
表現型を改変させる目的で配列の転写または転写および翻訳を入手するために当該ＤＮＡ配列を植物宿主のゲノム内に挿入するために様々な方法が開発されてきた。トランスジェニック植物は、Radkeら, (Theor. Appl. Genet. (1988), 75: 685-694; Plant Cell Reports (1992), 11: 499-505)によって記載されているようなアグロバクテリウム媒介性形質転換によって入手した。あるいはまた、核形質転換植物を入手するために、例えばKleinら,(Bio/Technology 10: 286-291）によって記載されているような微粒子弾丸衝撃法を使用することもできる。関連方法を使用して他の植物種を同様に形質転換させることもできる。
【０１９１】
植物組織におけるステロールアシルトランスフェラーゼの発現を指令するために、植物形質転換において上記の植物２成分構築物を使用した。バイナリーベクター構築物は、Holstersら, (Mol. Gen. Genet. (1978), 163: 181-187）の方法によってＥＨＡ１０１株のアグロバクテリウム細胞(Hoodら, J. Bacteriol, (1986), 168: 1291-1301)内へ形質転換させた。トランスジェニック・アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）植物は、Valverkensら, (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988), 85: 5536-5540)、Bentら,((1994), Science 265: 1856-1860）およびBechtoldら, ((1993), C. R. Acad. Sci., Life Sciences 316: 1194-1199）によって記載されているようなアグロバクテリウム媒介性形質転換によって入手した。
【０１９２】
実施例７  修飾されたステロール含量／プロフィールについての植物アッセイ７Ａ：  Ｔ２種子のＮＭＲ
ナピンプロモーターの制御下でＬＣＡＴ１〜４を発現する植物からの種子をＮＭＲによって解析した。トランスジェニック植物からのアラビドプシス種子を広口ＭＡＳ  ＮＭＲサンプル管内へ直接入れた。
【０１９３】
炭素観察ＭＡＳ  ナノプローブ（Nanoprobes）（商標）を備えたバリアンＮＭＲインスツルメンツ（Varian NMR Instruments）（Paloalto, CA）社製イノバ（Inova）（商標）ＮＭＲ分光光度計を使用して高分解能スペクトルを１１．７Ｔ（ＩＨ＝５００ＭＨｚ、１３Ｃ＝１２５ｍＨｚ）で測定した。１３Ｃスペクトルは下記の条件を使用して１４時間にわたって周囲温度（約２１−２２℃）でフィールド周波数ロックを行わずに取得した：スペクトル幅＝２９．９９６ｋＨｚ、取得時間＝緩和時間遅延を伴わずに２．１８５秒、ｐ／２パルス（３．８ｍｓ）、１Ｈ  ｇＢ２＝Ｗａｌｔｚでカップリングを含めて２．５ｋＨｚ。データプロセシング条件は典型的であった：デジタル解像度＝０．１１Ｈｚ、初期の３のデータポイントの０．３〜１．５Ｈｚの線広がりおよび時間反転線形予測。化学シフトは、アラビドプシス種子へニートテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を添加し、結果として生じるスペクトルに対して結果として生じる参照パラメーターを使用することによって比較参照した。１３Ｃ解像度は最も狭い種子共鳴について２−３Ｈｚであった。スペクトル解像度はＭＡＳスピニング速度（１．５〜３．５ｋＨｚ）に非依存性であり、データは典型的には１．５ｋＨｚスピニング速度を用いて入手した。スピニング側波帯は主共振の約１％であった。フィトステロール１３Ｃ指定は、トリオレイン、β−シトステロールおよびコレステロールオレアートから構成されたモデルサンプルに基づいていた。トリアシルグリセロール１３Ｃ指定は文献指定、または１３Ｃ  ＮＭＲデータベース（Advanced Chemical Development, Inc., Ver. ３．５０, Tolonto, Canada）から計算されたシフトとの比較で行った。
【０１９４】
３種の解析の結果は図２に表示されており、ナピンプロモーターの制御下でＬＣＡＴ４遺伝子（ｐＣＧＮ９９９８）を発現する植物５に由来する種子中のフィトステロールの約２倍の増加傾向であった。この解析の経過中に、ナピンプロモーターの制御下でＬＣＡＴ２構築物（ｐＣＧＮ９９８３）を発現する植物からの種子の平均油含量がコントロールの油含量より高いことが認められた。これは、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の過剰発現が油含量を増加させることができるという概念を支持する最初のｉｎ  ｐｌａｎｔａ（生育中）の証拠である。
【０１９５】
７Ｂ：Ｔ２種子のＨＰＬＣ／ＭＳ
加速溶媒抽出器（ＡＳＥ）法を使用してナピンプロモーターの制御下でＬＣＡＴ１〜４を発現しているＴ２植物からの種子油を抽出した。種子サンプルは、微細な均質粗挽き粉を達成するために、乳鉢と乳棒を使用してすりつぶした。油はダイオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）加速溶媒抽出器（ＡＳＥ）法を使用して入手した。等量の珪藻土へ清潔なすりつぶし種子を添加した。すりつぶし種子サンプルおよび珪藻土は、均質な構成が達成されるまで完全に混合した。このサンプルをその後装置内に充填し、妥当性が検証されている実験プロトコル下でヘキサンを使用して油抽出を達成した。
【０１９６】
これらの種子サンプルからの油をその後、遊離カンペステロール、スチグマステロールおよびシトステロールならびにそれらの脂肪酸エステルについてＨＰＬＣ／ＭＳを使用してステロールエステル解析のために解析した。約０．１ｇの油を含有するオートサンプラーバイアルへ０．３ｍＬのＣＤＣｌ３を添加した。１００μｌのこの溶液に９００μｌのＣＨＣｌ３を添加した。この希釈サンプル５μｌを引き続いて、陽イオン大気圧イオン化を行いながらＨＰＬＣ／ＭＳ内へ注入した。２本の４．６×５０ｍｍ  Ｃ８  Ｚｏｒｂａｘカラムおよびアセトニトリルおよびアセトニトリル＋４０％  ＣＨＣｌ３を使用する勾配を使用して連続して油中の個々の構成要素を分離した。ステロール濃度は、各ステロールおよびその脂肪酸が同一モル反応を有すると仮定して計算した。これはコレステロールおよびそのエステルを用いた場合であると観察され、さらにカンペステロール、スチグマステロールおよびシトステロールについての場合であると推定された。本試験では、スチグマステロールであると同定されたステロールは実際にこの化合物のイソマー（異性体）であった。
【０１９７】
これらの解析の結果は図３および４に示されており、ナピンプロモーターの制御下でＬＣＡＴ３（ｐＣＧＮ９９６８）を発現する７のＴ２植物中の６に由来する種子において約５０％のステロールエステル増強が生じたことを示している。
【０１９８】
実施例８  ステロールエステル化活性についてのバキュロウイルス昆虫細胞培養
組換えウイルスの収穫をトランスフェクション後５日間実施することを除いて製造業者の取扱説明書に従って、ＢＡＣ−ＴＯＢＡＣバキュロウイルス発現系（Gibco-BRL, Gaithersberg, MD）を使用してバキュロウイルス発現構築物ｐＣＧＮ９９９２、ｐＣＧＮ９９９３、ｐＣＧＮ９９９４およびｐＣＧＮ１０９００（実施例４を参照）を形質転換して発現させた。ウイルス保存液を生成するためにトランスフェクション混合物からの上清を使用し、これを順にアッセイにおいてＳｆ９細胞を感染させるために使用した。
【０１９９】
ここで記載した方法を使用してレシチン：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性について形質転換細胞をアッセイした。昆虫細胞を遠心分離し、結果として生じた細胞ペレットを直ちに使用するか、後に解析するために−７０℃で保存した。細胞を０．１μＭアプロチニン、１μＭロイペプチン、および１００μＭペファブロック（全てBoehringer Mannheim, Germany）を含む培地Ａ（１００ｍＭ  トリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ７．８、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁させ、超音波処理（２×１０秒）によって溶解させた。遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分間、４℃）によって細胞壁およびその他の破片をペレット化した。上清を新規バイアルへ移し、膜を遠心分離（１００，０００×ｇ、Ｔｉ７０．１ローター、４℃、１時間で４６，０００ｒｐｍ）によってペレット化した。全部の膜を培地Ａ中に再懸濁させた。１００ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７）、２８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０３％トリトンＸ−１００，０．１ｍＭシトステロール、２０μＭ  １，２−［１４Ｃ］−パルミトイル−ホスファチジルコリン（２４６，４２０ｄｐｍ／ｎｍｏｌｅ）、および０．０５〜２０ｍｇの膜タンパク質を含有する０．１ｍｌ反応混合液中でレシチン：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。３０℃での１５分後に、低温担体としての１００μｇコレステロールおよびコレステロールエステルを含有する塩化メチレン：メタノール（４：１、ｖ／ｖ）の０．５ｍｌ溶液を添加することにより反応を停止させた。底部有機相の一部分（０．１ｍｌ）を除去し、窒素ガス下で蒸発させた。濃縮抽出液を３０μｌのヘキサン中に再懸濁させ、シリカゲル−Ｇ薄層クロマトグラフィープレート上にスポットした。このプレートをヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（８０：２０：１）中で一番上に転移させ、その後風乾させた。低エネルギーリン−イメージングスクリーンへの曝露によって放射能を測定した。曝露後、スクリーンをリン・イメージャー上で読み取った。
【０２００】
バキュロウイルス膜中のｐＣＧＮ１０９００からのＬＣＡＴ４タンパク質は、ＬＣＡＴ４がシトステロールエステルを作製するためのレシチン（ＰＣ）からのシトステロールへのアシル基の転移を触媒する能力を有することを示しているコレステロールエステルが転移するＴＬＣプレートの領域において放射性スポットを示した。
【０２０１】
実施例９  修飾された脂質含量についての植物アッセイ
スペクトル検量線が作成されて種子油含量について妥当性が検証されたことを前提に、非破壊的方法でアラビドプシス種子の総油含量を測定するためにはＮｉｒ（近赤外線分光法スペクトルスキャニング）を使用できる。種子油スペクトル検量線は、８５アラビドプシス植物種からの種子サンプルを使用して作製した。種子を清浄化し、Ｆｏｓｓ  ＮＩＲモデル６５００（Foss-Nirs Systems, Inc.）を使用してスキャンした。スペクトルデータを入手するために、１サンプル当たり種子全体の約５０〜１００ｍｇは、ミニインサート［ＩＨ−０３３７］から構成される水晶レンズ［ＩＨ−０３０７］を含むミニサンプルリング形カップにパックし、反射モードでスキャンした。種子サンプルはその後、微細な均質粗挽き粉とするために乳棒および乳鉢を用いてすりつぶした。加速溶媒抽出器（ＡＳＥ）を使用してすりつぶし、サンプルを油について測定した。
【０２０２】
全油含量の測定は、ダイオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）加速溶媒抽出器（ＡＳＥ）上で実施した。９×９ｃｍ計量ボート上で約５００ｍｇの清潔なすりつぶし種子を０．１ｍｇの単位まで計量した。０．０１ｇの単位までトップ・ローディングはかりを使用して等量の珪藻土を添加した。すりつぶし種子サンプルおよび珪藻土は均質な構成が達成されるまで完全に混合した。このサンプルをその後装置内に充填し、妥当性が検証されている実験プロトコル下でヘキサンを使用して油抽出を達成した。標準菜種サンプルは、地域参照局（Community Bureau of Reference:BCR）から入手した。ＡＳＥ抽出法は、ＢＣＲ参照標準を使用して検証した。９９％〜１００％の総油回収率を達成した。“現状（ａｓ−ｉｓ）”油含量は、下記の式を使用して０．０１質量％まで計算した：
油含量＝１００％×（バイアル＋抽出油重量―初期バイアル重量）／（サンプル重量）
【０２０３】
スペクトルの校正を実施するためにＡＳＥによって生成した分析データを使用した。NirSystems winisiソフトウエア中の内臓統計パッケージを使用してＮｉｒ校正方程式を作成した。ソフトウエアのスペクトル校正部分は校正および自己妥当性検証が可能である。総油校正率を作成するために総計８５中の５７サンプルを使用した。油検量線の妥当性を検証するために残りのサンプルを使用した。最適化された平滑化、誘導体のサイズ、および数学的処理（修正部分最小二乗）を利用して検量線を作成した。各検量線を作成する際に使用しなかったサンプルはバリデーションセットとして使用した。例えば相関係数（Ｒ）、決定係数（Ｒ２）、予測の標準誤差（ＳＥＰ）、および偏りについて補正された予測の標準誤差（ＳＥＰＣ）のような統計学ツールを使用して検量方程式を評価した。
【０２０４】
ＬＣＡＴ遺伝子を用いて形質転換されていた植物からのＴ２種子を清浄化し、Ｆｏｓｓ  ＮＩＲモデル６５００（Foss-Nirs Systems, Inc.）を使用してスキャンした。スペクトルデータを入手するために、１サンプル当たり種子全体の約５０〜１００ｍｇは、ミニインサート［ＩＨ−０３３７］から構成される水晶レンズ［ＩＨ−０３０７］を含むミニサンプル円形カップにパックし、反射モードでスキャンした。各種子サンプル中の油含有率は上記で詳細に記載した種子油スペクトル検量線を使用して測定した。
【０２０５】
これらの解析の結果は図５および表２に示されており、ＬＣＡＴ２遺伝子を発現するＴ２植物からの種子中における油濃度の重大な増加が見られることを証明している。この油の増加は、ＬＣＡＴ２が３５Ｓ構成性プロモーターまたは種子特異的ナピンプロモーターのどちらかによって駆動された場合に植物中で所見された。これらの結果は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様ポリペプチドをコードする核酸配列の過剰発現が植物中の種子油産生を増加させられることを証明している。
【０２０６】
【表２】
表  ２
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【表３】
表  ２（続  き）
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【０２０７】
本発明の詳細な説明および上記に提示した実施例に照らすと、本発明の幾つかの態様が達成されることを認識できる。
【０２０８】
本発明が、本発明の当業者にその精神および実際的適用を伝えるために図解および実施例によって詳細に記載されていると理解すべきである。本発明の特定の調製物およびプロセスはここに提示した特定実施態様の説明に限定されているのではなく、むしろそれらの説明および実施例は上記のクレームおよびそれらの同等物に関して考えるべきである。上記の一部の実施例および説明は本発明が機能する方法に関する一部の結論を含んでいるが、発明者らはそれらの結論および機能によって縛られるのではなく、それらを可能性のある説明として提示することだけを意図している。
【０２０９】
さらにまた、本発明の上記の特定実施態様は本発明を網羅するまたは限定するものであることは意図しておらず、上記の実施例および詳細な説明に照らして当業者には多くの代替物、修飾物、および変形物が明白であろうと理解しなければならない。したがって、本発明は上記のクレームの精神および範囲に含まれるそのような代替物、修飾物、および変形物全部を含んでいると意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  アラビドプシス推定アミノ酸配列とともに酵母、ヒトおよびラットのレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼタンパク質配列のアライメントを示した図である。
【図１Ｂ】  アラビドプシス推定アミノ酸配列とともに酵母、ヒトおよびラットのレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼタンパク質配列のアライメントを示した図である。
【図１Ｃ】  アラビドプシス推定アミノ酸配列とともに酵母、ヒトおよびラットのレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼタンパク質配列のアライメントを示した図である。
【図２】  ナピンプロモーター（ｐＣＧＮ９９９８）の制御下でＬＣＡＴ４を発現する植物からのＴ２種子上でのＮＭＲステロールエステル分析の結果を示した図である。
【図３】  ナピンプロモーターの制御下で対照系列（ｐＣＧＮ８６４０）およびＬＣＡＴ３（ｐＣＧＮ９９６８）を発現する系列からのＴ２種子から抽出された油上でのＨＰＬＣ／ＭＳステロール分析の結果を示した図である。
【図４】  ナピンプロモーターの制御下で対照系列（ｐＣＧＮ８６４０）、ならびにＬＣＡＴ１（ｐＣＧＮ９９６２）、ＬＣＡＴ２（ｐＣＧＮ９９８３）、ＬＣＡＴ３（ｐＣＧＮ９９６８）およびＬＣＡＴ４（ｐＣＧＮ９９９８）を発現する植物系列からのＴ２種子から抽出された油上でのＨＰＬＣ／ＭＳステロール分析の結果を示した図である。さらに、３５Ｓプロモーター（ｐＣＧＮ９９９６）の制御下でＬＣＡＴ４を発現する３系列からのデータも示されている。
【図５】  ナピンプロモーターの制御下で対照系列（ｐＣＧＮ８６４０）、およびＬＣＡＴ１（ｐＣＧＮ９９６２）、ＬＣＡＴ２（ｐＣＧＮ９９８３）およびＬＣＡＴ３（ｐＣＧＮ９９６８）を発現する植物系列からのＴ２種子の油含量のＮｉｒ分析の結果を示した図である。さらに、３５Ｓプロモーター（ｐＣＧＮ９９８１）の制御下でＬＣＡＴ２を発現する１６系列からのデータも示されている。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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