(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の工程：
ａ)分析されるべき核酸の試料を無作為に断片化することができかつ平滑末端または付着末端を有するDNA断片F1を生じることができる少なくとも１種の制限酵素E1を用いて第一の二本鎖DNA断片F1を作製し、
ｂ)工程ａ)で得られたDNA断片F1の末端に少なくとも１種の第一の二本鎖アダプタを、該アダプタの3'末端と該DNA断片F1の5'末端との接続部で、次工程で使用されるタイプIIS制限酵素E2の認識部位の5'末端の最初の１以上の塩基対からなるが該認識部位の全体ではない配列であって、制限酵素E1の認識部位の3'末端の最初の１以上の塩基対をその3'末端に含有する配列が形成されるようにライゲーションして、DNA断片F'1を得、
ｃ)制限酵素E2の認識部位の3'末端の最初の１以上の塩基対の配列であって、前記5'末端の最初の１以上の塩基対と共に制限酵素E2の認識部位全体を形成できる配列をその5'末端に含有するDNA断片F1と第一の二本鎖アダプタとから形成されるDNA断片F'1を、制限酵素E2を用いて選択的に切断して、短いDNA断片F2のフラクションを得、
ｄ)該短いDNA断片F2のフラクションをいずれの適切な手段により精製すること
からなることを特徴とする分析されるべき核酸の試料からDNA断片を作製する方法。
【請求項２】
以下の工程：
ｅ)工程ｄ)で得られた短いDNA断片F2の第一の二本鎖アダプタに連結していない末端を少なくとも一種の第二の二本鎖アダプタにライゲーションすることにより断片F'2を生成し、
ｆ)第一および第二のアダプタに連結された短いDNA断片F'2を、少なくとも１対の適切なプライマを用いて、工程ｄ)で得られた短いDNA断片F2のフラクションから短いDNA断片F'2の少なくとも１の部分集合を得るように増幅すること
により短いDNA断片F2のフラクションから断片の１以上の部分集合を選択することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ)が：
−  少なくとも一方の制限酵素が付着末端をつくり、ただし、両方の制限酵素が付着末端をつくる場合は互いに異なる付着末端をつくり、かつ
−  一方の制限酵素が、その認識部位の3'末端の最初の１以上の塩基対が工程ｂ)で規定される配列の3'末端に相当する認識部位を有する
２つの異なる制限酵素E1を用いて行なわれることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２つの異なる制限酵素の一方が頻繁に切断する制限酵素であり、他方が希に切断する制限酵素であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
−  頻繁に切断する制限酵素が、その認識部位の3'末端が工程ｂ)で規定される配列の3'末端に相当し、工程ｂ)において第一の二本鎖アダプタに結合する断片F1の少なくとも一方の末端をつくる制限酵素であり、かつ
−  希に切断する制限酵素が、工程ｂ)において第一の二本鎖アダプタとは異なる第三の二本鎖アダプタに結合する断片F1の少なくとも一方の末端をつくる制限酵素である
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ライゲーション工程ｂ)に先立って、1000 bp未満の断片を精製することからなる付加的な工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ)で規定される第一の二本鎖アダプタが、センス鎖の3'末端またはアンチセンス鎖の5'末端に、１〜８塩基の領域１を含み、該領域１が制限酵素E1で生成されるDNA断片F1の粘着末端に相補的であり、該領域１が、工程ａ)で得られた前記DNA断片F1の末端への前記第一の二本鎖アダプタのライゲーションにより工程ｂ)で規定される配列が形成されるように選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ)で規定される第一の二本鎖アダプタが、センス鎖に関して領域１の5'側に、少なくとも６塩基対の領域２を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ)で規定される第一の二本鎖アダプタが領域１と領域２との間に位置する少なくとも１の塩基を含み、該塩基が、制限酵素E1の認識部位中で領域１に相当する相補配列に隣接する塩基とは異なることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ)およびｂ)が同時に行われることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ)で規定される第一の二本鎖アダプタが、アンチセンス鎖の5'末端に共有結合しているリン酸残基を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が工程ａ)〜ｄ)による短い断片の第一の選択からなる場合に、標識されていてもいなくてもよい適切なプライマ対を用いて、工程ｂ)と工程ｃ)との間に断片F'1を増幅し、および／または工程ｃ)と工程ｄ)との間に断片F2を増幅することからなる少なくとも１の付加的な工程を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ)で規定される第一の二本鎖アダプタが、そのセンス鎖の5'末端で、適切な標識、特に核酸ハイブリッドを検出するための標識または機能化された固体支持体に接着し得る標識に連結されていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
第三の二本鎖アダプタのアンチセンス鎖の5'末端が、機能化された固体支持体に接着し得る標識に連結されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｂ)で得られる断片F'1または請求項１２で規定される付加的な工程で得られる断片F'1の増幅産物を、切断工程ｃ)に先立って機能化された支持体と接触させ、そして工程ｄ)の短い断片F2のフラクションが、工程ｂ)で規定される第一の二本鎖アダプタが前記支持体に接着する標識に連結されている場合には該支持体に保持されている断片のフラクションに相当し、第三の二本鎖アダプタが前記支持体に接着する標識に連結されている場合には遊離している断片のフラクションに相当することを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｅ)がいくつかの異なる第二の二本鎖アダプタのライゲーションを含み、各アダプタが、センス鎖の5'末端またはアンチセンス鎖の3'末端に、１〜10塩基の特異的配列を含むことを特徴とする請求項２〜１１および１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
工程ｅ)で規定される第二の二本鎖アダプタが、センス鎖の5'末端に共有結合しているリン酸残基を含むことを特徴とする請求項２〜１１および１３〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
工程ｆ)で規定されるプライマの１つが、その5'末端において適切な標識に結合している請求項２〜１１および１３〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
いずれの適切な手段により、工程ｄ)で得られた短い断片F2、請求項１２で規定される付加的な工程で得られた短い断片F2の増幅産物または工程ｆ)で得られた短い断片F'2からの一本鎖断片を得ることからなる付加的な工程を含むことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
いずれの適切な手段により、工程ｆ)もしくは請求項１２で規定される付加的な工程で得られた増幅産物または請求項１９で規定される付加的な工程で得られた一本鎖断片を精製することからなる付加的な工程を含むことを特徴とする請求項２〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１つに記載の方法により得ることができる、遺伝マーカーを表す短いDNA断片であって、該短いDNA断片はゲノム配列またはcDNA配列の断片からなる特異配列を含む100より少ない塩基または塩基対の配列を有し、該特異配列の5'末端は、タイプIIS制限酵素E2の認識部位の3'末端の最初の１以上の塩基対からなるが該認識部位の全体ではない配列と同一であり、3'末端は、制限酵素E2の切断部位の5'末端側の配列と同一であり、該特異配列の各末端に少なくとも６塩基または６塩基対の非特異的配列を含むことを特徴とする短いDNA断片。
【請求項２２】
一本鎖断片であることを特徴とする請求項２１に記載のDNA断片。
【請求項２３】
その5'末端の１つで適切な標識に連結されていることを特徴とする請求項２１または２２に記載のDNA断片。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１つに記載のDNA断片を含むことを特徴とするDNAチップ。
【請求項２５】
請求項２１〜２３のいずれか１つに記載のDNA断片の遺伝マーカーとしての使用。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか１つに記載の方法の工程ｄ)もしくはｆ)または請求項１２もしくは１９に記載の方法の付加的な工程で規定されるDNA断片の混合物の遺伝マーカーとしての使用。
【請求項２７】
請求項２１〜２３のいずれか１つに記載のDNA断片または請求項２４に記載のDNAチップを用いることを特徴とする核酸のハイブリダイズ方法。
【請求項２８】
請求項２１〜２３のいずれか１つに記載の少なくとも１のDNA断片または請求項２４に記載のDNAチップを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション方法を行うためのキット。
【請求項２９】
前記DNA断片に相補的なオリゴヌクレオチドプローブも含むことを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
請求項７〜９および１１のいずれか１つで規定される少なくとも１つの第一の二本鎖アダプタと、請求項１で規定される制限酵素E2とを含むことを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１つに記載の方法を行うためのキット。
【請求項３１】
請求項２、１６または１７で規定される少なくとも１つの第二の二本鎖アダプタおよび請求項２または１８で規定されるプライマ対も含むことを特徴とする請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の選択的断片化によるDNA断片の作製方法、ならびにゲノムおよびトランスクリプトームの分析のためのその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
異なる種(動物、植物、微生物)またはこれらの種のうちの異なるサブグループもしくは個体のゲノムあるいはトランスクリプトームを分析する技術は、1種以上の制限酵素を用いるDNA (ゲノムまたはcDNA)の断片化、次いでいずれの適切な手段による、得られたDNA断片の分析による1以上の遺伝マーカーまたはフットプリントの検出に基づく。
【０００３】
これらの技術は、生物学の非常に多様な分野、例えば遺伝マッピング、種、変種または個体(動物、植物、微生物)のジェノタイピング、表現型の特徴付け、特に疾患に関係する遺伝子の多型の検出(SNPまたは一塩基多型)、および遺伝子発現のプロフィールの確立において適用される。
【０００４】
しかしながら、特にゲノムの複雑性のために、提案された技術は、DNAチップハイブリダイゼーションタイプの自動化された技術により、ゲノムおよびトランスクリプトームの系統的な高処理量分析を可能にしない。
【０００５】
具体的には：
・制限酵素により生じた断片のサザンブロッティングによる分析を含むRFLP (制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism))技術は、1回の反応において1つだけ、または最大でもいくつかの遺伝子座しか分析できないという限りにおいて解決に乏しい。さらに、得られる断片は、生じる断片の数が多すぎてチップが飽和してしまうので、DNAチップハイブリダイゼーションにより分析できない。
【０００６】
・Keygeneの名で欧州特許出願(EP 0 534 858号)に記載され、DNAチップ分析(Jaccoudら, N.A.R., 2001, 29, 4e25)に適合させたAFLP (増幅断片長多型(Amplified Fragment Length Polymorphism))技術は、制限部位配列の3'、いくつかの塩基(約1〜10)の特異的配列を含むプライマを用いるPCRによる断片のフラクションの選択的増幅により、出発試料の複雑性を約100断片にまで減少させることを可能にする。よって、nの選択的塩基を有するプライマ対は、理論的には、選択的配列に相補的な配列を有するものに対応する断片の1/42nのフラクション、すなわちn=1およびn=2の断片のそれぞれ1/16および1/256しか増幅しないことを可能にする。
【０００７】
・日本のResearch Development Corporationの名での出願EP 0 735 144号、ならびにZheleznayaら, Biochemistry, 1995, 60, 1037〜1043およびSmithら, PCR Methods and Applications, 1992, 2, 21〜27の文献に特に記載されるライゲーション媒介選択的PCR増幅(ligation-mediated selective PCR amplification)技術は、タイプIISおよび任意にタイプIINを用いる切断により得られる制限酵素断片のフラクションの選択的増幅、次いで上記のタイプIISおよび任意にタイプIIN酵素により作製された付着末端に相補的なアダプタの1つとのライゲーションにより、出発試料の複雑性を減少させることを可能にする。
【０００８】
しかし、上記の技術により提案された出発試料の複雑性の低減にもかかわらず、標的のDNAチップタイプの支持体上の得られる標的(数百塩基対のPCR産物)の、すなわち10〜20塩基のプローブとのハイブリダイゼーションは、以下の理由から、しばしば品質(弱いシグナル、偽陰性および偽陽性)に乏しい。
【０００９】
- 標的内の二次構造の存在がプローブのハイブリダイゼーション効率を減少させる。これは標的への近づきやすさの減少と、同じプローブとハイブリダイズさせるべき異なる構造を有する多数の断片が存在するのでハイブリダイゼーション条件を最適化するのが不可能であるということによる；および
【００１０】
- 標的配列と類似性(similarity)を有する「非標的」配列との非特異的ハイブリダイゼーションまたはクロスハイブリダイゼーション反応が偽陽性に導き、これが少量の特異的配列を検出するこの技術の能力およびこれらの配列を区別する能力を、バックグラウンドノイズの増加により減少させる。
【００１１】
The Perkin-Elmer Corporationの名での米国特許第6,258,539号は、DNAチップタイプの支持体上の小さい標的(約30塩基対)のハイブリダイゼーションを推奨する。該標的は、分析されるべきcDNAの代表的な制限断片から、(i) タイプIIS制限酵素の認識部位を含むアダプタと該断片の末端の1つとのライゲーション、および次いで該タイプIIS酵素を用いる該断片の5'末端の切断により作製される。この技術は、ゲノムやトランスクリプトームのような核酸の複雑な集団の分析には適さない。なぜなら、分析されるべき興味のある分子それぞれの代表的な単一の制限断片を得ることが不可能であるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のことから、同時に信頼性があり、再現性があり、感度がよく、特異的であり、迅速でかつ実行が単純である、実際の必要性により見合ったゲノムおよびトランスクリプトームの分析方法を提供する必要性が実際にあることが明らかである。よって、DNAチップタイプの支持体上の多数の試料を同時に分析することを可能にするこのような方法は、上記の適用のために、ゲノムおよびトランスクリプトームの系統的な分析に完全に適するであろう。
【００１３】
これが、本発明者らが、分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短いDNA断片(100塩基または100塩基対未満)の1以上の集合を得ることを有利に可能にする、核酸(ゲノムDNA、mRNAから逆転写されたcDNA)の選択的断片化によりDNA断片を作製する方法を開発した理由である。この方法は、同時に迅速で、効率よく、信頼性があり、再現性があり、感度がよくかつ標的核酸分子(DNA、RNA)に特異的な、DNAチップタイプの小型支持体(miniaturized support)上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを得ることを可能にする。該方法は、ヌクレオチドプローブ、特にDNAチップタイプの小型支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズできる標的DNAの作製(遺伝マーカーまたはフットプリントの検出)、および標的核酸(DNA、RNA)とハイブリダイズできるDNAプローブ、特にDNAチップの作製(遺伝マーカーまたはフットプリントの作製)の両方において有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
よって、本発明の主題は、分析されるべき核酸の試料からDNA断片を作製する方法であり、該方法は、少なくとも以下の工程による該核酸の選択的断片化を含むことを特徴とする(図1)。
【００１５】
I.
a) 分析されるべき核酸の試料を無作為に断片化することができかつ平滑末端または付着末端を有するDNA断片F1を生じることができる少なくとも1種の制限酵素E1を用いて第一の二本鎖DNA断片F1を作製する、
【００１６】
b) 工程a)で得られた前記DNA断片F1の末端を少なくとも1種のアダプタAA'に、該アダプタの相補末端と該断片F1の5'末端との接続部に、以下のような単位：
- 該単位の配列が、制限酵素Ｅ２の切断部位が認識部位の下流に位置する制限酵素E2の認識部位(N塩基対を含む)の最初の(N-x)塩基対(1≦x≦(N-1))であり、かつ
- 前記DNA断片F1の5'に位置する該単位の3'末端がE1制限酵素の制限部位である
を形成するようにライゲーションする(断片F'1の生成)、
c) b)で得られたDNA断片F'1を、その5'末端の近傍で、短い断片F2のフラクションを選択するように制限酵素E2を用いて切断する、
d) 該短い断片F2のフラクションをいずれの適切な手段により精製する
を含む短い断片の第一の選択、および任意に
【００１７】
II. 以下の工程：
e) d)で得られた短い断片F2の遊離末端(アダプタAA'に連結していない)を少なくとも第二の相補アダプタBB'にライゲーションする(断片F'2の生成)、および
f) 前記アダプタ(AA'およびBB')に連結された短い断片F'2を、少なくとも1対の適切なプライマ(少なくとも1つがその5'末端で任意に標識されていてもよい)を用いて、d)で得られた短い断片F2のフラクションから短い断片F'2の少なくとも1の部分集合を得るように増幅する
に従う、工程d)で得られた短い断片F2のフラクションからの断片の1以上の部分集合の第二の選択(図3)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の目的のために、
・DNA断片の用語は、二本鎖DNA断片を意味することを意図する。
・短い断片F2またはF'2の用語は、100塩基対未満のDNA断片を意味することを意図する。
・長い断片F1またはF'1の用語は、数百塩基対のDNA断片を意味することを意図する。
【００１９】
・アダプタの用語は、少なくとも6塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを意味することを意図する。
・DNA断片、アダプタまたは制限酵素による認識もしくは切断の部位に関する5'末端および3'末端の用語は、該DNA断片、該アダプタまたは該制限酵素による認識もしくは切断の部位のプラス鎖のそれぞれ5'末端および3'末端を意味することを意図する。
【００２０】
・DNA断片に関する遊離末端の用語は、アダプタに連結されていない末端を意味することを意図する。
・アダプタの相補末端の用語は、DNA断片の3'または5'末端に結合する該アダプタの末端を意味することを意図する。該アダプタが該DNA断片の5'末端に結合する場合、これは該アダプタの3'末端を含み、逆も同じである。
【００２１】
・断片のフラクションの用語は、工程a)で得られる(長い)断片F1から作製される短い断片F2のフラクション、または短い断片F2から作製される短い断片F'2のフラクションを意味することを意図する。「フラクション」、「組」または「群」の用語は、本明細書において同等であるとみなされ、かついずれの言外の区別なしに用いられる。同じことが「部分集合」および「サブグループ」の用語について言える。
【００２２】
・切断部位の用語は、エンドヌクレアーゼ(制限酵素)の制限部位を意味することを意図する。本明細書において、「切断部位」または「制限部位」の用語は、いずれの言外の区別なしに用いられる。
【００２３】
本発明によるDNA断片の作製方法の工程a)〜d)の組み合わせは、同時に以下のことを有利に可能にする。
【００２４】
- 分析されるべき全ゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な、すなわちオリゴヌクレオチドプローブと同じ長さを有する短い断片F2を得ること(図1)、および
- 分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短い断片F2のフラクションの、アダプタAA'を用いる選択による分析されるべき試料の複雑性の減少(図2)。このような選択により、ハイブリダイゼーションに用いられるDNAチップタイプの支持体の飽和の問題を回避することができる。
【００２５】
本発明によるDNA断片の作製方法の工程a)〜f)の組み合わせは、同時に以下のことを有利に可能にする(図2)。
- 分析されるべき全ゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な、すなわちオリゴヌクレオチドプローブと同じ長さを有する短い断片F'2を得ること(図1および3)。
【００２６】
- 分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短い断片F'2の1以上の部分集合の、アダプタAA'およびBB'を用いる第一、次いで第二の選択による分析されるべき試料の複雑性の減少(図2)。このような選択により、ハイブリダイゼーションに用いられるDNAチップタイプの支持体の飽和の問題を回避することができる。そして、
- 分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な種々の遺伝フットプリントまたはマーカーの最大数を、短い断片F2の組を用いて、種々のアダプタ(B1B1'、B2B2'など)を用いて工程d)で得られる短い断片F2のこの組の部分集合の第二の選択により検出すること(図2および3)。
【００２７】
DNAチップハイブリダイゼーション技術における標的またはプローブとしてのこのような短い断片F2またはF'2の使用は、従来技術のゲノムまたはトランスクリプトームの分析法に比べて、以下の利点を有する。
【００２８】
信頼性および再現性
アダプタのライゲーションおよび制限酵素での切断だけにより選択される短い断片F2のフラクションは、分析されるべき全ゲノムまたはトランスクリプトームを代表する。まず、これらの短い断片は増幅が容易であり、次に、部分的に分解されたDNAに働くことを可能にする。さらに、ハイブリダイゼーションに用いられるDNAチップタイプの支持体の飽和の問題を回避することを可能にする、分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短い断片F2のフラクションの、アダプタAA'を用いる第一の選択による分析されるべき試料の複雑性の低減は、ゲノムまたはトランスクリプトームの分析の信頼性および再現性の増大にも貢献する。
【００２９】
感度および特異性
ハイブリダイゼーションの感度および特異性は、以下のことにより増大する。
- ハイブリダイズされる断片のサイズの減少(従来技術の方法における数百塩基または塩基対の代わりに、100塩基もしくは塩基対未満の標的またはプローブ)。この減少は、クロスハイブリダイゼーション反応および偽陽性を、「非標的配列」の排除により減少させ、かつDNAの二次構造の減少によりハイブリダイゼーションシグナルを増大させる。
【００３０】
- 均一サイズの断片のハイブリダイゼーション条件(温度)の調和。
- DNAの純度(酵素、バッファーおよび残っている長いDNA断片の除去)。
【００３１】
単純性
核酸(標的またはプローブ)の断片化は、実行が単純な工程を含む(酵素消化、ライゲーション)。さらに、DNA(標的またはプローブ)の長さ、構造および組成の最適化は、良好な品質のハイブリダイゼーション(偽陽性なし、わずかなバックグラウンドノイズなど)を得ることを可能にし、よって必要とされるコントロールの数を最小限にすること、ひいてはチップの複雑性を減少させることを可能にする。
【００３２】
迅速性
ハイブリダイゼーション時間はかなり減少され、従来技術の方法の12〜18時間の代わりに、1時間未満(約15〜20分)である。
【００３３】
比較的低コスト
チップの複雑性の低減は、チップのコストの削減を可能にする。
【００３４】
これらの種々の利点により、本発明による核酸の選択的断片化によるDNA断片の作製方法は、特に：
- DNAチップ上の標的核酸(ゲノムDNAまたはmRNAの逆転写により得られるcDNA)の多数の試料の迅速な分析、および
- 特に、ゲノムまたはトランスクリプトームの遺伝マーカーを代表するプローブが固定化されたDNAチップの製作のためのRNAまたはゲノムDNAからの小さくかつ制御されたサイズのプローブの作製
に適する。
【００３５】
本発明の方法によると、工程a)の二本鎖DNA断片F1は、それら自体で知られる通常の技術により得られる。例えば、分析されるべき試料から抽出されるゲノムDNAは、1000 bp未満、ほぼ200〜400 bp程度の断片を得るように分析されるべきDNAの切断の頻度に応じて選択される、平滑または付着末端の断片を生じる1種以上の制限酵素E1を用いて無作為に断片化される。RNA (mRNA、微生物のゲノムRNAなど)は、分析されるべき試料から抽出され、逆転写により二本鎖cDNAに変換され、次いでゲノムDNAに類似の方法で断片化される。哺乳動物のDNAを切断するのに用い得る制限エンドヌクレアーゼE1のうち、限定されないが、EcoR I、BamH I、Pst I、Msp I、XmaC I、Eco 561、Ksp I、Dra I、Ssp I、Sac I、BbvC I、Hind III、Sph I、Xba IおよびApa Iを挙げることができる。
【００３６】
本発明によると、酵素E1は、平滑末端または付着末端のいずれかを生じる。該酵素は付着末端を生じるのが好ましく、単一のアダプタとのライゲーションを許容する利点を有する。
【００３７】
本発明の方法によると、工程b)で規定されるアダプタは、2つの相補鎖(AおよびA')からつくられる少なくとも6 bpのオリゴヌクレオチドである。b)における該アダプタは、それ自体で知られるいずれの適切な手段、特にT4リガーゼのようなDNAリガーゼを用いることにより該DNA断片F1の末端に連結される。
【００３８】
本発明の方法によると、工程a)およびb)は、連続的または同時に行われる。
【００３９】
本発明の方法によると、制限酵素E1の切断部位の3'末端と制限酵素E2の認識部位の5'末端とは、少なくとも1塩基対にわたって重なっており(図2)、このことが制限酵素E2での切断による短い断片F2のフラクションの選択を可能にする。これらの短い断片F2は、工程b)で得られる長い断片F'1のフラクションに由来し、該フラクションは、上記の制限酵素E2の全認識部位(N塩基対)を含む。制限酵素E2のうち、限定されないが、その認識部位の16ヌクレオチド下流で切断するBpm I、Bsg IおよびBpuE I、ならびにその認識部位の11、10、9、20および8ヌクレオチド下流でそれぞれ切断するEci I、BsmF I、Fok I、Mme IおよびMbo IIを挙げることができる。
【００４０】
本発明の方法によると、上記の部位の重なりは、完全である(ミスマッチなし)かまたは該重なりが少なくとも1のミスマッチを含むことができる(例えば、Ksp I部位(制限酵素E1)の第二の位置に位置する塩基対を参照、これはEci I部位(制限酵素E2)の第一の位置の塩基対と相補的でない(図2))。この場合、制限酵素E2の認識部位の配列は、末端が制限酵素E2の上記の認識部位に相補的なアダプタ(上記の例において鎖Aの3'末端に配列"GGC"を含むアダプタ)とのライゲーションにより回復される。
【００４１】
上記のアダプタAA'の3'相補末端と上記のDNA断片F1の5'末端との接続部領域に位置する制限酵素E2の認識部位の第1〜(N-1)の塩基対、および制限酵素E2の上記の認識部位の長さは、工程a)で生じる(長い)断片F1の組から選択することができる短い断片のフラクションを決定する。N bpのE2認識部位とE1およびE2の間のn bpの重なりとについて、選択された断片のフラクションは1/4(N-n)に相当する。この値は、上記の制限酵素E2 (Mme I酵素、図2)による区別なしに、認識されるいずれのプリンまたはピリミジン塩基対について2の倍数で増加する。よって、重なりが大きくなるほど、フラクションに含まれる断片の数が大きくなり(選択または試料の複雑性の減少の係数が低い)、そして逆もいえる(選択または試料の複雑性の減少の係数が高い) (図2)。
【００４２】
本発明の方法によると、工程c)における5'での長い断片F'1の切断は、特異的ヌクレオチドプローブ、特に遺伝マーカーに相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出され得る遺伝マーカーを含み得る分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短いDNA断片を得ることを可能にする。あるいは、上記の断片は、DNAチップタイプの固体支持体に固定化され、かつゲノムまたはトランスクリプトームを分析するための遺伝フットプリントまたはマーカーとして用いられる。
【００４３】
本発明の方法によると、任意に一本鎖であるかおよび／または適切な標識(ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン)に連結していてもよい短い断片F2の精製(工程d)を、それ自体で知られるいずれの適切な手段、例えば排除クロマトグラフィ、濾過、エタノールおよび酢酸アンモニウムまたは酢酸ナトリウムの混合物を用いる沈殿、機能化された支持体への結合(ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニンもしくは抗フルオレセイン抗体に結合した磁性ビーズ、非磁性ポリマーまたは金表面)により行う。
【００４４】
本発明による方法の有利な実施形態によると、工程a)は、
- 少なくとも一方が、他の制限酵素により任意に生じるものとは異なる付着末端を生じ、かつ
- E11A制限部位の3'末端が、工程b)で規定される単位のものである
ような2つの異なるE1制限酵素、E1AおよびE1Cを用いて行なわれる。
【００４５】
この実施形態の有利な形態によると、酵素の一方が頻繁に切断し(cleaves frequently)、かつ他方が希に(rarely)切断する。
【００４６】
好ましくは、頻繁に切断する酵素は酵素E1Aであり、該酵素E1Aは工程b)においてアダプタAA'に結合する断片F1の少なくとも一方の末端を生じる。酵素E1Aは、E1A制限部位の3'末端がE2認識部位の最初の(N-x)塩基対に相当する限りにおいて酵素E2に関係する。酵素E1Cは、酵素E1Aにより生じる末端と同一または異なる断片F1の少なくとも一方の末端を生じ、該末端が、工程b)において、アダプタAA'とは異なる第二のアダプタCC'に結合する。好ましくは、E1C制限部位の3'末端は、上記のアダプタCC'の工程a)で得られる上記のDNA断片の末端の少なくとも一方へのライゲーションにより制限酵素E2の認識部位の最初の(N-x)塩基または塩基対の配列を再構築しないように、工程b)において規定される酵素E2の認識部位の最初の(N-x)塩基対の3'末端とは異なる。
【００４７】
このような酵素の対の使用は、断片A=Cの組の付加的な選択により、特にアダプタCC'の5'末端に連結された標識に対するリガンドで機能化された支持体に結合することにより、分析されるべき試料の複雑性をさらに低減することを可能にする(図7および8)。
【００４８】
DNAを頻繁に切断する酵素の限定しない例としては、4塩基対の制限部位を有するもの、例えばMsp IおよびTaqα Iを挙げることができる。
DNAを希に切断する酵素の限定しない例としては、5または6の塩基対の制限部位を有するもの、例えばPst IおよびEcoR Iを挙げることができる。
【００４９】
本発明による方法の有利な実施形態によると、該方法は、ライゲーション工程b)に先立って、1000 bp未満の断片の精製からなる付加的な工程を含む。該精製は、それ自体で知られるいずれの適切な手段、特に、通常の方法に従うアガロースゲル電気泳動によるa)で得られる消化産物の分離、得られる種々の断片に対応するバンドの視覚化、1000 bp未満の断片に相当するゲルバンドの回収および該二本鎖DNA断片の抽出により行なわれる。
【００５０】
本発明による方法の別の有利な実施形態によると、工程b)で規定されるアダプタAA'は、鎖Aの3'末端および／または鎖A'の5'末端に、約1〜8塩基または塩基対の領域1を含み、該領域1は、酵素E1またはE1Aの切断部位と部分的または完全に同一もしくは相補的であり、工程a)で得られたDNA断片の少なくとも一方の末端への該アダプタAA'のライゲーションにより、制限酵素E2の認識部位の最初の(N-x)塩基または塩基対の配列を再構築するように選択される。該領域1は、酵素1の切断部位の配列との1以上のミスマッチを任意に含み得る。
【００５１】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、上記で規定されるアダプタCC'は、鎖Cの3'末端および／または鎖C'の5'末端に、酵素E1Cの切断部位と部分的または完全に相補的な約1〜8塩基または塩基対の領域1を含む。該領域1は、酵素E1Cの切断部位の配列との1以上のミスマッチを任意に含み得る。アダプタAA'の領域1とは異なるこの領域1は、(i) 酵素E1Cにより生じる末端にのみ結合し、酵素E1Aにより生じる末端には結合せず、かつ(ii) 工程a)で得られたDNA断片の少なくとも一方の末端への該アダプタCC'のライゲーションにより、制限酵素E2の認識部位の最初の(N-x)塩基または塩基対の配列を再構築しないように選択される。
【００５２】
本発明による方法の別の有利な実施形態によると、工程b)で規定されるアダプタAA'または上記で規定されるアダプタCC'は、領域1の上流に、アダプタの延長によりハイブリダイゼーションを向上させ得る少なくとも6塩基対の領域2を含む。この領域2の配列は、それ自体で知られるいずれの適切な手段、特にオリゴヌクレオチドの長さ、構造および組成(GCパーセンテージ、二次構造および／または自己対形成の不在など)を最適化することを可能にする適切な配列を予測するプログラムを用いることにより選択される。好ましくは、該アダプタは、領域1と領域2との間の位置に、制限酵素E1の切断部位中の先行する相補配列に隣接する塩基とは異なる少なくとも1つの塩基を含む。この塩基が、工程b)におけるアダプタのライゲーションの後に上記の制限部位を再構築しないことを可能にし、よって上記の二本鎖DNA断片の末端に連結されたアダプタの切断を回避することを可能にする。
【００５３】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、工程b)で規定されるアダプタAA'および／または上記で規定されるアダプタCC'は、鎖A'および／またはCの5'末端に共有結合しているリン酸残基を含む。このリン酸残基は、T4 DNAリガーゼのような酵素が、該アダプタをホスホジエステル結合により二本鎖DNA断片(F1)の3'-OH末端に連結させることを可能にする。
【００５４】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、工程b)で規定されるアダプタAA'および／または上記で規定されるアダプタCC'は、鎖Aおよび／またはC'の5'末端で、異なる標識に連結される。
【００５５】
この実施形態の有利な形態によると、アダプタCC'の鎖C'の5'末端は、機能化された固体支持体に接着できる標識に連結している。
【００５６】
核酸の接着を可能にする機能化された固体支持体は、当業者に周知である。限定しない例としては、特に、ストレプトアビジン(ビオチン標識核酸分子に結合する)、または抗フルオレセインもしくは抗ジゴキシゲニン抗体(フルオレセインまたはジゴキシゲニンで標識された核酸分子に結合)で機能化された磁性ビーズ、またはポリマーもしくは金表面でつくられ、機能化された非磁性ビーズのような他の機能化された表面を挙げることができる。
【００５７】
この実施形態の別の有利な形態によると、アダプタAA'は、核酸ハイブリッド(DNA-DNAまたはDNA-RNA)を検出するための標識、例えば蛍光体に連結している。
【００５８】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、該方法が上記で規定する工程a)〜d)による短い断片の単一の選択を含む場合に、該方法は、工程b)とc)の間またはc)とd)の間または工程d)の後に、それぞれ、適切なプライマ対、好ましくは上記で規定される標識で標識されたプライマ対を用いる断片F'1またはF2の増幅からなる少なくとも1の付加的な工程b')、c')および／またはd')を含む。
【００５９】
好ましくは、断片F'1は、プライマA、A'およびC'の配列が上記で規定されるアダプタAA'およびCC'の鎖の一方のものであり、プライマAおよび／またはプライマC'が、5'位においてそれぞれ核酸ハイブリッド(DNA-DNAまたはDNA-RNA)を検出するための標識および上記で規定するような機能化された固体支持体に接着できる標識に任意に連結されているプライマ対AA'またはAC'を用いて増幅される。好ましくは、短い断片F2は、3'位において、制限酵素E2により作製されうる断片F2の全ての3'末端に相補的なアダプタの混合物と連結され、次いで該短い断片F2は、核酸ハイブリッド(DNA-DNAまたはDNA-RNA)を検出するための標識に5'位において好ましくは連結されている上記で規定する(センス)プライマAと、上記のアダプタ混合物の鎖の1つの配列の混合物に対応するアンチセンスプライマの混合物とを用いて増幅される。
【００６０】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、工程a)およびb)が、それぞれ2つの異なる制限酵素E1AおよびE1CならびにアダプタAA'またはCC'が機能化された固体支持体に接着し得る標識と連結された2つの異なるアダプタAA'およびCC'を用いて行なわれる場合、工程b)またはb')で得られる断片F'1を、切断工程c)に先立って上記の機能化された支持体と接触させ、そして工程d)の短い断片F2のフラクションが、該支持体上に保持される(支持体に接着する標識に連結されたアダプタAA')かまたは遊離である(支持体に接着する標識に連結されたアダプタCC')かのいずれかの断片のフラクションに対応する。
【００６１】
上記の遊離のフラクションは、当業者に周知のいずれの手段、特に機能化された支持体(ビーズ)の遠心分離または磁化(magnetization)により回収される。
【００６２】
上記の支持体上に保持されるフラクションは、特に水酸化ナトリウムを用いる二本鎖DNAの変性によるか、または適切なプライマ対、特に上記で規定されるセンスプライマAとアンチセンスプライマの混合物とを用いる増幅により任意に回収することができる。
【００６３】
本発明の方法によると、工程d)で得られる上記の短い断片F2は、一方の末端がアダプタAA'からなり、付着末端であることが好ましい他方の末端(遊離末端)が、制限酵素E2での切断により生じた数塩基(10未満)の無作為な配列を含む(図2)。したがって、鎖Bの5'末端または鎖B'の3'末端に、短い断片F'2の部分集合の3'末端に相補的な1〜10塩基の特異的付着末端を含むアダプタ(BB')またはいくつかの異なるアダプタ(B1B1'、B2B2'など)とのライゲーションにより、短い断片F'2の1以上の部分集合の選択が可能である(図3)。断片F'2の上記の部分集合は、独立してまたは同時に、PCRにより、上記で規定されるアダプタの鎖AおよびB'の配列と配列が相補的であるプライマ対を用いて増幅される。
【００６４】
本発明の方法によると、工程e)で規定されるアダプタBB'は、2つの相補鎖(BおよびB')からつくられ、それ自体で知られるいずれの適切な手段、特にオリゴヌクレオチドの長さ、構造および組成(GCパーセンテージ、二次構造および／または自己対形成の不在など)を最適化することを可能にする適切な配列を予測するプログラムを用いて選択される少なくとも6 bpのオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
本発明の方法によると、e)における上記のアダプタは、それ自体で知られるいずれの適切な手段、特にT4リガーゼのようなDNAリガーゼを用いることにより、上記の短い断片F2の末端に連結される。
【００６６】
本発明の方法によると、工程f)における増幅は、特に、センスおよびアンチセンス配列が、それぞれ、上記で規定されるアダプタの鎖Aのものおよび鎖B'のものであるプライマ対を用いてPCRにより行われる。
【００６７】
この実施形態の有利な形態によると、工程e)は、d)で得られる短い断片F2の一方の末端の、いくつかの異なるアダプタ(B1B1'、B2B2'など)へのライゲーション(同時または独立して、好ましくは独立して)を含む。該アダプタの各々は、鎖Bの5'末端または鎖B'の3'末端に、上記の短い断片F2の遊離の3'末端に相補的な1〜10塩基の特異的配列を含む。このような形態は、それぞれが異なる遺伝フットプリントまたはマーカーに相当する断片F'2の部分集合を得ることを有利に可能にする。よって、n塩基の特異的配列を有するアダプタは、4nの異なる遺伝フットプリントの部分集合を得ることを可能にする(図2)。
【００６８】
この実施形態の別の有利な形態によると、上記のアダプタBB' (工程e)は、鎖Bの5'末端に共有結合したリン酸残基を含む。このリン酸残基は、T4 DNAリガーゼのような酵素が、ホスホジエステル結合により短い断片F2の3'-OH末端に該アダプタを連結することを可能にする。
【００６９】
この実施形態のさらに別の有利な形態によると、プライマの1つ(工程f)は、その5'末端で、核酸ハイブリッド(DNA-DNAまたはDNA-RNA)を検出するための適切な標識、例えば蛍光体に連結される。
【００７０】
上記の実施形態のさらに別の有利な形態によると、該実施形態は、工程d)またはd')で得られる短い断片F2から、または工程f)で得られる短い断片F'2から一本鎖断片をいずれの適切な手段により得ることからなる付加的な工程d'')またはg)を含む。好ましくは、工程d)、d')またはf)で得られる短い断片の一方の鎖は、その5'末端で適切な標識、例えば特に、ホスファターゼ、次いで5'-エキソヌクレアーゼの作用を介して相補鎖を除去することを可能にする標識により保護される。
【００７１】
上記の実施形態のさらに別の好ましい形態によると、該実施形態は、工程b')、c')、d')もしくはf)で得られる増幅産物または工程d'')またはg)で得られる一本鎖断片のいずれの適切な手段による精製からなる付加的な工程を含む。
【００７２】
本発明の主題は、上記で規定する方法により得ることができ、遺伝マーカーを表すDNA断片でもあり、該断片は、制限酵素E2の認識部位と切断部位とそれぞれ境界をなすゲノムDNAまたはcDNAの断片からなる少なくとも1の特異的配列を、該特異的配列の5'末端がN塩基対を有する制限酵素E2の認識部位の最後のx塩基対(1≦x≦(N-1))に相当するように含む、100塩基または塩基対未満の配列を有することを特徴とし、ここで該制限酵素E2の切断部位は認識部位の下流に位置し、該マーカーは各末端に少なくとも6塩基または6塩基対の非特異的配列を含む。
【００７３】
上記のDNA断片の有利な実施形態によると、これは一本鎖断片である。
上記のDNA断片の別の有利な実施形態によると、これは、その5'末端の1つで、核酸ハイブリッド(DNA-DNAまたはRNA-DNA)を検出するための適切な標識、例えば蛍光体に連結される。
【００７４】
本発明の主題は、上記のDNA断片を含む適切な支持体、特にDNAチップタイプの小型支持体でもある。その上に核酸を固定化し得る支持体はそれら自体で知られている。限定しない例としては、以下の材料：プラスチック、ナイロン、ガラス、ゲル(アガロース、アクリルアミドなど)およびケイ素からつくられるものを挙げることができる。
【００７５】
上記で規定されるDNA断片の他に、本発明の主題は、工程f)またはg)で得られる短い断片F'2の部分集合に対応するDNA断片の混合物でもある。上記で規定される該断片またはその混合物は、ゲノムおよびトランスクリプトームの分析、特に種、変種または個体(動物、植物、微生物)の検出、遺伝子多型の検出および遺伝子発現プロフィールの確立のための遺伝子マーカーとして有用である。
【００７６】
したがって、本発明の主題は、上記で規定されるDNA断片、または上記で規定される方法の工程f)もしくはg)で得られる短い断片F'2の部分集合に対応するDNA断片の混合物の、遺伝マーカーとしての使用でもある。
【００７７】
本発明の主題は、上記で規定されるDNA断片を用いることを特徴とする核酸のハイブリダイズ方法でもある。
【００７８】
本発明の主題は、上記で規定される少なくとも1のDNA断片(標的またはプローブ)を含むことを特徴とする、ハイブリダイゼーション方法を行うためのキットでもある。好ましくは、上記の断片が標的である場合に、該キットは該DNA断片に相補的な核酸分子、特にオリゴヌクレオチドプローブも含む。
【００７９】
本発明の主題は、上記で規定される酵素E2と組み合わせた上記で規定される少なくとも1のアダプタAA'の、上記で規定されるDNA断片を作製するための使用でもある。
【００８０】
本発明の主題は、上記で規定される少なくとも1のアダプタAA'と酵素E2とを含むことを特徴とする、上記で規定される方法を行うためのキットでもある。好ましくは、該キットは上記で規定される少なくとも1のアダプタBB'とプライマ対とをも含む。
【００８１】
上記の形態の他に、本発明は、以下の記載から明らかになるその他の形態も含むが、以下の記載は本発明による方法、およびDNAチップタイプの小型支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによりゲノムを分析するためのその使用の実施形態の例、ならびに添付の図面に言及する。この図面において：
- 図1は、本発明による方法の工程a)〜d)を図示する。図を単純にするために、アダプタAA'の鎖Aにのみ注釈をつける。
【００８２】
- 図2は、制限酵素E1の切断部位および制限酵素E2の認識部位を例として、短いDNA断片の5' (工程b)および3' (工程e)末端でそれぞれ選択された塩基の数から導き出される、工程d)で選択される短い断片F2のフラクションおよび工程f)で得られるフットプリントの可能性のある部分集合の数を図示する。
【００８３】
- 図3は、本発明による方法の工程e)およびf)を図示する。図を単純にするために、アダプタAA'およびBB'の鎖AおよびBにのみ注釈をつける。
- 図4-1〜4-3は、本発明による方法の工程a)〜f)の第一の例を示す。図4-1：工程aおよびb、図4-2：工程cおよびd、図4-3：工程eおよびf。
【００８４】
- 工程a)：二本鎖DNA断片は、GAATTC部位を認識するEcoR Iでの切断により生じる。
- 工程b)：アダプタAA' (16/20 bp)は、それぞれ5'から3'に：15塩基対(鎖A上に領域2：GGAAGCCTAGCTGGA (配列番号1))と、EcoR I部位に相補的でない1塩基対(鎖A上のC)と、鎖A'の5'末端にはさらにMme I部位の5'末端(A)を含むEcoR I 部位に相補的な4塩基(領域1)と、リン酸残基(5'リン酸-AATT)とを含む。DNAリガーゼは、ホスホジエステル結合によりEcoR I断片の付着末端にアダプタを連結させることができる。
【００８５】
- 工程c)およびd)：アダプタに連結された断片を、アダプタAA'の、5'末端が配列CPuACに相当する断片とのライゲーションによりMme I部位(TCCPuAC)を回復した断片からの短い断片(45/43 bp)を生じるように、Mme I酵素(酵素E2)で切断する。4つの特異的塩基対(CPuAC)の選択は、出発試料に比べて断片の数を128 (4×2×4×4)分の1に減少させることを可能にする。
【００８６】
- 工程d)：工程 c)で得られる短い断片を精製する。
- 工程e)：工程d)で精製された短い断片は、その一方の末端で、鎖B'1の3'末端で該断片の末端に相補的な2つの塩基(TT)を含み、かつ鎖B1の5'末端でリン酸基を含むアダプタB1B1' (14/16 bp)に連結される。2つの特定の塩基(AA)の選択は、出発試料に比べて断片の数を2048 (4×2×4×4×16)分の1に減少させることを可能にし、分析されるべきDNAに特異的な28塩基対を含む59の塩基対の短い断片を得ることを可能にするが、ここで該断片は遺伝フットプリントの16の可能性のある部分集合に対応する。
【００８７】
- 工程f)：工程e)で選択される断片を、アダプタAA'およびB1B'1の鎖AおよびB'1にそれぞれ相補的な配列に対応するセンスおよびアンチセンスプライマを用いて増幅する。
【００８８】
- 図5-1〜5-3は、本発明による方法の工程a)〜f)の第二の例を示す。図5-1：工程aおよびb、図5-2：工程cおよびd、図5-3：工程eおよびf。
- 工程a)：二本鎖DNA断片は、GGATCC部位を認識するBamH Iを用いる切断により生じる。
【００８９】
- 工程b)：アダプタAA' (16/20 bp)は、それぞれ5'から3'に：15塩基対(鎖A上に領域2：GGAAGCCTAGCTGGA (配列番号1))と、BamH I部位に相補的でない1塩基対(鎖A上のC)と、鎖A'の5'末端にはさらにMme I部位の5'末端の2塩基(AG)を含むBamH I 部位に相補的な4塩基(領域1)と、リン酸残基(5'リン酸-GATC)とを含む。DNAリガーゼは、ホスホジエステル結合によりBamH I断片の付着末端にアダプタを連結させることができる。
【００９０】
- 工程c)およびd)：アダプタに連結された断片を、アダプタAA'の、5'末端が配列PuACに相当する断片とのライゲーションによりMme I部位(TCCPuAC)を回復した断片から短い断片(44/42 bp)を生じるように、Mme I酵素(酵素2)で切断する。3つの特異的塩基対(PuAC)の選択は、出発試料に比べて断片の数を32 (2×4×4)分の1に減少させることを可能にする。
【００９１】
- 工程d)：工程 c)で得られる短い断片を精製する。
- 工程e)：工程d)で精製された短い断片は、その一方の末端で、鎖B'1の3'末端で該断片の末端に相補的な2つの塩基(TT)を含み、かつ鎖B1の5'末端でリン酸基を含むアダプタB1B1' (14/16 bp)に連結される。2つの特異的塩基(AA)の選択は、出発試料に比べて断片の数を512 (2×4×4×16)分の1に減少させることを可能にし、分析されるべきDNAに特異的な28塩基対を含む58の塩基対の短い断片を得ることを可能にするが、ここで該断片は遺伝フットプリントの16の可能性のある部分集合に対応する。
【００９２】
- 工程f)：工程e)で選択される断片を、アダプタAA'およびB1B'1の鎖AおよびB'1にそれぞれ相補的な配列に対応するセンスおよびアンチセンスプライマを用いて増幅する。
【００９３】
- 図6-1〜6-3は、本発明による方法の工程a)〜f)の第三の例を示す。図6-1：工程aおよびb、図6-2：工程cおよびd、図6-3：工程eおよびf。
- 工程a)：二本鎖DNA断片は、CCGCGG部位を認識するKsp Iを用いる切断により生じる。
【００９４】
- 工程b)：アダプタAA' (18/16 bp)は、それぞれ5'から3'に：15塩基対(鎖A上に領域2：GGAAGCCTAGCTGGA (配列番号1))と、Eci I部位の5'配列の1塩基対(鎖A上のG)およびKsp I 部位に相補的な2塩基(鎖A上のGC)と、鎖A'の5'末端にリン酸残基とを含む。該アダプタは、Eci I部位の5'末端の3塩基(GGC)を含む。DNAリガーゼは、ホスホジエステル結合によりKsp I断片の付着末端にアダプタを連結させることができる。
【００９５】
- 工程c)およびd)：アダプタに連結された断片を、アダプタAA'の、5'末端が配列Aに相当する断片とのライゲーションによりEci I部位(GGCGGA)を回復した断片からの短い断片を生じるように、Eci I酵素(酵素2)で切断する。特定の塩基対の選択は、出発試料に比べて断片の数を4分の1に減少させることを可能にする。
【００９６】
- 工程d)：工程 c)で得られる短い断片を精製する。
- 工程e)：工程d)で精製された短い断片は、その一方の末端で、鎖B'1の3'末端で該断片の末端に相補的な2つの塩基(TT)を含み、かつ鎖B1の5'末端でリン酸基を含むアダプタB1B1' (14/16 bp)に連結される。2つの特異的塩基(AA)の選択は、出発試料に比べて断片の数を64 (4×16)分の1に減少させることを可能にし、分析されるべきDNAに特異的な28塩基対を含む短い断片を得ることを可能にするが、ここで該断片は遺伝フットプリントの16の可能性のある部分集合に対応する。
【００９７】
- 工程f)：工程e)で選択される断片を、アダプタAA'およびB1B'1の鎖AおよびB'1にそれぞれ相補的な配列に対応するセンスおよびアンチセンスプライマを用いて増幅する。
【００９８】
- 図7は、酵素E1Cでの切断を介してさらなる選択を導入することにより、分析されるべきDNAの複雑性をさらに減少させるように2つの異なる酵素E1 (E1Aは頻繁に切断し、例えばMsp IおよびTaqα I、E1Cは希に切断する、例えばPst I、EcoR I)を用いる本発明の方法の実行の例を図示する。制限部位の配列は、プラス鎖について5'→3'の方向で示される。太字で示す塩基は、切断後に対象の断片上に残る。下線を引いた塩基は、E1AおよびE2酵素の結合により付加される(imposed)ものである。
【００９９】
- 図8は、断片A=Cの第一の組、次いで短い断片F2のフラクションを選択するように、2つの異なる酵素E1を用いる本発明の方法の実施の例を示す(工程c)。
【０１００】
実施例1：本発明の方法による短いDNA断片(標的またはプローブ)の作製
核酸の作製、酵素消化、ライゲーション、PCR増幅およびそのようにして得られた断片の精製は、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA)に記載されるもののような標準的なプロトコルに従う通常の技術を用いて行なった。
【０１０１】
ゲノムDNAを、ウシ血液から、製造業者の使用説明に従ってPAXgene Blood DNAキット(参照761133, QIAGEN)を用いて抽出した。
【０１０２】
以下のアダプタおよびプライマをMWG Biotechにより合成した。
- アダプタAA'
- 鎖A：5'-GGAAGCCTAGCTGGAC-3' (配列番号2)
- 鎖A'：5'-P-AATTCTCCAGCTAGGCTTCC-3' (配列番号3)
【０１０３】
- アダプタBB'
B：5'-P-GGTGAGCACTCATC-3' (配列番号4)
B'：5'-GATGAGTGCTGACCTT-3' (配列番号5)
【０１０４】
- プライマ
プライマ対1：
センス：5'-CCTTCGGATCGACCTG-3' (配列番号6)
アンチセンス：5'-CTACTCACGAGTGGAA-3' (配列番号7)
またはプライマ対2：
センス：5'-GGAAGCCTAGCTGGAC-3' (配列番号2)
アンチセンス：5'-GATGAGTGCTGACCTT-3' (配列番号5)
を区別なく用いることができる。
プライマ対2は、特に、アダプタの配列の一部分を再利用することを可能にする。
【０１０５】
短いDNA断片(F2およびF'2)を、次いで、次の工程に従って作製した。
1) ゲノムDNAのEco RIを用いる消化およびアダプタAA'への断片のライゲーション(工程aおよびb)
精製ゲノムDNA (5μg)とアダプタ(5μg)とを、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM ATPおよび1 mg BSAと、50 IUのEcoR Iおよび2 IUのT4 DNAリガーゼとを含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5 40μl中に37℃で3時間インキュベートした。このようにして得られたアダプタAA'がその末端に連結されたDNA断片を、3M酢酸アンモニウムおよびエタノールの1：4 (V/V)混合物からの沈殿により精製した。
【０１０６】
2) 断片のMme Iを用いる消化および短い断片F2の選択(工程c)およびd))
ペレットを50 mM酢酸カリウム、20 mM Tris-酢酸、10 mM 酢酸マグネシウムおよび1 mM DTTを含むバッファー、pH 7.9 40μlに再懸濁し、5 IUのMme Iの存在下に37℃で1時間インキュベートした。
【０１０７】
3) 短い断片F2のフラクションの精製(工程d)
酵素を、Micropure-EZキット(Millipore)を用いて除去し、続いて塩を濾過(Microcon YM3)により除去し、YM3濾紙上に保持されたDNAを溶出し、短い断片を濾過(Microcon YM 30またはYM 50, Millipore)により精製した。100 bp未満のDNA断片が溶出液に相当し、それより大きい断片は濾紙上に保持される。
【０１０８】
4) 短い断片F2のアダプタBB'へのライゲーション(工程e)
工程d)で得られた短い断片とアダプタBB' (3μg)とを、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM ATPおよび1 mg BSAと、2 IUのT4 DNAリガーゼとを含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5、40μl中に、37℃で3時間インキュベートした。
【０１０９】
5) アダプタBB'に連結された短い断片(F'2)の増幅(工程f)
工程e)で得られた、アダプタBB'に連結された短い断片を、続いて、アダプタAA'およびBB'の鎖AおよびB'に相補的な配列に相当するセンスおよびアンチセンスの対を用いてPCRにより、1 ngのDNA断片、150 ngの各プライマおよび2 IUのAmpliTaq GOLD (登録商標) (Perkin Elmer)を、10 mM KCl、5 mM MgCl2および200μM dNTPsを含む15 mM Tris-HClバッファー、pH 8.0中に含む50μlの反応容量で増幅した。増幅は、サーモサイクラーで、94℃で30秒間の変性工程、続いて60℃で30秒間のハイブリダイゼーション工程および72℃で2分間の伸長工程を含む35サイクルで行なった。PCR増幅断片を、製造業者の使用説明に従ってMinElute PCR Purificationキット(参照LSKG, Qiagen)を用いて精製した。
【０１１０】
酵素、塩および遊離のdNTPsを、Micropure-EZ (Millipore)上、次いでMicrocon YM3 (Millipore)上での濾過により除去し、濾紙上に保持されたPCR増幅産物を溶出した。
【０１１１】
実施例2：オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションのための標的DNAの使用
実施例1で得られた短い二本鎖DNA断片(標的DNAs)を、0.02 Mクエン酸アンモニウムバッファー、pH 5中に3×10-3 IUの5'-エキソヌクレアーゼを含む40μlの反応容積中に、37℃で30分間の消化により一本鎖DNAに変換した。酵素、塩および遊離のdNTPsを、Micropure-EZ (Millipore)上、次いでMicrocon YM3 (Millipore)上での濾過により除去し、濾紙上に保持された一本鎖DNAを溶出した。
【０１１２】
その上にオリゴヌクレオチドプローブ(このうちのいくつかは実施例1で得られた標的DNA断片に相補的である)が固定化されたDNAチップタイプのガラス支持体を、それ自体で知られる技術に従って作製した。次いで、該標的DNAをハイブリダイゼーションバッファー(H7140, Sigma)中に希釈し、10μlを、スライドとカバーガラスとの間でガラス支持体上に沈積させた。次いでハイブリダイゼーションを、サーモサイクラー中の湿気のあるチャンバ内で以下の条件で行った：80℃で3分間、次いで温度を50℃まで0.1℃/sの段階で下げ、最後に温度を50℃で10分間維持する。ハイブリダイゼーション反応を、ガラススライドを氷上におくことにより停止させた。
【０１１３】
プローブに相補性でない過剰の標的DNA断片を、連続洗浄により除去した：2×SSC (Sigma, S6639)で30秒、0.1% SDS (L4522, Sigma)を加えた2×SSCで30秒、0.2×SSCで30秒、+4℃にて。
【０１１４】
次いで、ガラススライドを乾燥させ、スキャナ(Gentaqモデル, Genomic Solution)を用いてハイブリダイゼーションを視覚化した。
【０１１５】
実施例3：2つの異なるE1酵素、E1AおよびE1Cを用いる短いDNAの作製
ゲノムDNAを、実施例1に記載のようにして作製する。
次のアダプタおよびプライマを合成した。
- アダプタAA' (Taqα I部位に相補的)
- 鎖A：5'-GACGATGAGTCCTGAC-3' (配列番号8)
- 鎖A'：5'-P-CGGTCAGGACTCATCGTC-3'(配列番号9)
【０１１６】
- アダプタCC' (EcoR I部位に相補的)
- 鎖C：5'P-AATTGGTACGCAGTCTAC-3' (配列番号10)
- 鎖C'：5'-GTAGACTGCGTACC-3' (配列番号11)
- プライマ
- センスプライマ：5'-Cy3-GACGATGAGTCCTGACCG-3' (配列番号12)
- アンチセンスプライマ：5'-ビオチン-GTAGACTGCGTACCAATT-3' (配列番号13)
【０１１７】
短いDNA断片(F2)を、次の工程に従って作製した。
1) ゲノムDNAのEco RIおよびTaqα Iを用いる消化ならびに断片のアダプタAA'およびCC'へのライゲーション(工程aおよびb)
精製ゲノムDNA (5μg)とそれぞれのアダプタ(5μgのAA'および5μgのCC')を、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM ATPおよび1 mg BSAと、50 IUのEcoR I、50 IUのTaqα Iおよび2 IUのT4 DNAリガーゼを含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5 40μl中に37℃で3時間インキュベートした。
【０１１８】
2) 断片F'1の増幅
5'位でアダプタAA'にかつ3'位でアダプタCC'に連結されたDNA断片F'1を、センスおよびアンチセンスプライマ(配列番号8および11)を用いて、10 mM KClおよび5 mM MgCl2を含むTris-HClバッファー、pH 8中に1μlのライゲーションされた断片、2 IUのポリメラーゼ(AmpliTaq Gold, Perkin-Elmer)、150 ngの各プライマおよび200μMの各dNTPを含む50μlの最終容積の反応混合物中で増幅させた。増幅は、次の条件下で行った：94℃で30秒間の変性工程、続いて60℃で30秒間のハイブリダイゼーション工程および72℃で2分間の伸長工程を含む35サイクル。
【０１１９】
3) 断片F'1 (A=C)の機能化された磁性ビーズへの結合
【０１２０】
ストレプトアビジンで機能化された再懸濁磁性ビーズ(Dynal or Molecular Probes; 500μg)を、ペレットを形成するようにして磁石の近傍におき、上清を除く。ビーズをバッファー(2 M NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA) 50μl中で2回リンスし、次いでバッファー(1 M NaCl、5 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5 mM EDTA) 100μl中に再懸濁する。PCR反応産物(50μl)をビーズの懸濁物に加え、混合物を激しく攪拌し、次いで攪拌しながら周囲温度で30分間インキュベートする。上清を上記のような磁化により除去し、ビーズを0.1% SDSを含む0.1×SSCバッファー100μlでリンスする。
【０１２１】
3) 断片F'1 (A=C)のBseR Iでの消化および短い断片F2の精製(工程cおよびd)
ビーズで形成されたペレットをBseR I酵素反応バッファー40μl中に再懸濁し、5 IUのBseR Iの存在下に37℃で3時間インキュベートした。反応媒体中に放出された短い断片F2を回収する。
【０１２２】
4) 標的DNAハイブリダイゼーション
その上にオリゴヌクレオチドプローブ(このいくつかは得られた標的DNA断片に相補的DNAある)が固定化されたDNAチップタイプのガラス支持体を、それ自体で知られる技術に従って作製した。次いで、該標的DNAを95℃で3分間変性させ、ハイブリダイゼーションバッファー(H7140, Sigma)中に希釈し、10μlを、スライドとカバーガラスとの間でガラス支持体上に沈積させた。次いでハイブリダイゼーションを、湿気のあるチャンバ内で、50℃で2時間行った。ハイブリダイゼーション反応を、ガラススライドを氷上におくことにより停止させた。
【０１２３】
プローブに相補性でない過剰の標的DNA断片を、連続洗浄により除去した：2×SSC (Sigma, S6639)で30秒、0.1% SDS (L4522, Sigma)を加えた2×SSCで30秒、0.2×SSCで30秒、+4℃にて。
【０１２４】
次いで、ガラススライドを乾燥させ、スキャナ(Gentaqモデル, Genomic Solution)を用いてハイブリダイゼーションを視覚化した。
【０１２５】
上記から明らかなように、本発明は、今ここで明確に記載した実行、実施および適用の方法に限定されるものではない。逆に、本発明は、本発明の状況または範囲から逸脱することなく、当業者が想到する全ての変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明による方法の工程a)〜d)を図示する。
【図２】制限酵素E1の切断部位および制限酵素E2の認識部位を例として、短いDNA断片の5' (工程b)および3' (工程e)末端でそれぞれ選択された塩基の数から導き出される、工程d)で選択される短い断片F2のフラクションおよび工程f)で得られるフットプリントの可能性のある部分集合の数を図示する。
【図３】本発明による方法の工程e)およびf)を図示する。
【図４−１】本発明による方法の工程aおよびbの第一の例を示す。
【図４−２】本発明による方法の工程cおよびdの第一の例を示す。
【図４−３】本発明による方法の工程eおよびfの第一の例を示す。
【図５−１】本発明による方法の工程aおよびbの第二の例を示す。
【図５−２】本発明による方法の工程cおよびdの第二の例を示す。
【図５−３】本発明による方法の工程eおよびfの第二の例を示す。
【図６−１】本発明による方法の工程aおよびbの第三の例を示す。
【図６−２】本発明による方法の工程cおよびdの第三の例を示す。
【図６−３】本発明による方法の工程eおよびfの第三の例を示す。
【図７】酵素E1Cでの切断を介してさらなる選択を導入することにより、分析されるべきDNAの複雑性をさらに減少させるように2つの異なる酵素E1を用いる本発明の方法の実行の例を図示する。
【図８】断片A=Cの第一の組、次いで短い断片F2のフラクションを選択するように、2つの異なる酵素E1を用いる本発明の方法の実施の例を示す(工程c)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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