(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５１であるハイブリドーマ、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５３であるハイブリドーマ、または受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５２であるハイブリドーマである、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２】
請求項１に記載のハイブリドーマにより産生される、デクチン−１に対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のハイブリドーマを培養し、その培養物からデクチン−１に対するモノクローナル抗体を採取するステップを含むことを特徴とする、デクチン−１に対するモノクローナル抗体の生産方法。
【請求項４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体とデクチン−１を反応させるステップを含むことを特徴とする、デクチン−１の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を産生する新規なハイブリドーマ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いた略号について説明する。
ＢＧ：(1→3)-β-D-グルカン（(1→3)-β-D-glucan）
ＣＲＤ：糖鎖認識ドメイン（carbohydrate recognition domain）
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーター（fluorescence-activated cell sorter）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）
ＳＰＧ：シゾフィラン（schizophyllan；Schizophyllum communeに由来する、1,6-分枝化ＢＧであり、3重らせん構造を有する）
デクチン−１（dectin-1）は、(1→3)-β-D-グルカン類に対する特異的受容体であり、好中球、マクロファージ、樹状細胞などの白血球の細胞表面に存在している（非特許文献１及び２参照）。【０００３】
従来、デクチン−１に対する抗血清は報告されているが（非特許文献３）、これに対するモノクローナル抗体については報告されていない。
【非特許文献１】ブラウン、Ｇ（Brown, G）ら、２００１年、ネイチャー（Nature）、第４１３巻、ｐ．３６−３７
【非特許文献２】テイラー、Ｐ．Ｒ．（Taylor, P.R.）ら、２００２年、ジャーナル オブ イムノロジー（Journal of Immunology）、第１６９巻、ｐ．３８７６−３８８２
【非特許文献３】アリイズミ、Ｋ．（Ariizumi, K.）ら、２０００年、ザ  ジャーナル オブ  バイオロジカル  ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、第２７５巻、第２６号、ｐ．２０１５７−２０１６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を産生する新規なハイブリドーマ、当該ハイブリドーマにより産生される新規な抗デクチン−１抗体、前記ハイブリドーマを用いた抗デクチン−１抗体の新規な生産方法及び前記抗体を用いたデクチン−１の新規な検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を産生する新規なハイブリドーマ、当該ハイブリドーマにより産生される新規な抗デクチン−１抗体、前記ハイブリドーマを用いた抗デクチン−１抗体の新規な生産方法及び前記抗体を用いたデクチン−１の検出方法を提供するに至り、本発明を完成させた。【０００６】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（４）に関する。
（１）  受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５１であるハイブリドーマ、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５３であるハイブリドーマ、または受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５２であるハイブリドーマである、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（以下、「本発明ハイブリドーマ」という。）。
（２）  （１）に記載のハイブリドーマにより産生される、デクチン−１に対するモノクローナル抗体（以下、（２）を総称して「本発明抗体」という。）。
（３）  （１）に記載のハイブリドーマを培養し、その培養物からデクチン−１に対するモノクローナル抗体を採取するステップを含むことを特徴とする、デクチン−１に対するモノクローナル抗体の生産方法（以下、「本発明生産方法」という。）。
（４）  （２）に記載のモノクローナル抗体とデクチン−１を反応させるステップを含むことを特徴とする、デクチン−１の検出方法（以下、「本発明検出方法」という。）。
【発明の効果】
【０００７】
本発明ハイブリドーマは、デクチン−１に対する抗体を均一、大量、永続的かつ安価に生産できるツールとして利用することができ、極めて有用である。本発明抗体は、デクチン−１に対する新規なモノクローナル抗体であり極めて有用である。また本発明生産方法によれば、本発明抗体を均一かつ大量に生産させることができ、極めて有用である。また本発明検出方法によれば、デクチン−１を簡便、迅速、特異的、高感度、高精度かつ安価に検出することができ、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】４Ｂ２のデクチン−１又はその変異体に対する結合を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明ハイブリドーマ
本発明ハイブリドーマは、デクチン−１またはその部分ペプチドを免疫原としてラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の免疫動物を免疫し、該免疫動物のリンパ節、脾臓、末梢血等から抗体産生細胞を採取し、該抗体産生細胞とマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等のミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを得、デクチン−１に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得ることができる。【００１０】
本発明ハイブリドーマとして、具体的には、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５１であるハイブリドーマ（以下、「本発明ハイブリドーマ１」という。）、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５３であるハイブリドーマ（以下、「本発明ハイブリドーマ２」という。）、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５２（以下、「本発明ハイブリドーマ３」という。）等が挙げられる。【００１１】
本発明ハイブリドーマ１は、マウスミエローマ細胞とラットリンパ球細胞との細胞融合によって得られたものであり、平成１６年１０月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、識別のための表示を「Mouse-Rat hybridoma ４Ｂ２」とする微生物として、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５１として受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５１として受託されたものである。したがって、本発明ハイブリドーマは、同センターから入手することができる。【００１２】
本発明ハイブリドーマ２は、マウスミエローマ細胞とラットリンパ球細胞との細胞融合によって得られたものであり、平成１６年１０月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、識別のための表示を「Mouse-Rat hybridoma ＲＨ１」とする微生物として、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５３として受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５３として受託されたものである。したがって、本発明ハイブリドーマは、同センターから入手することができる。【００１３】
本発明ハイブリドーマ３は、マウスミエローマ細胞とラットリンパ球細胞との細胞融合によって得られたものであり、平成１６年１０月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、識別のための表示を「Mouse-Rat hybridoma ＳＣ３０」とする微生物として、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５２として受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５２として受託されたものである。したがって、本発明ハイブリドーマは、同センターから入手することができる。【００１４】
本発明ハイブリドーマは、抗体産生ハイブリドーマの通常の培養・保存方法等に従って取り扱うことができる。詳細は、後述の「＜３＞本発明生産方法」の項を参照されたい。【００１５】
本発明ハイブリドーマは、本発明抗体を産生することから、本発明抗体の生産等に用いることができる。
＜２＞本発明抗体
本発明抗体は、デクチン−１に特異的に反応するモノクローナル抗体であり、好ましくは本発明ハイブリドーマにより産生される、デクチン−１に対するモノクローナル抗体である。本発明抗体として、具体的には、本発明ハイブリドーマ１により産生される、デクチン−１に対するモノクローナル抗体（以下、「本発明抗体１」という。）、本発明ハイブリドーマ２により産生される、デクチン−１に対するモノクローナル抗体（以下、「本発明抗体２」という。）、本発明ハイブリドーマ３により産生される、デクチン−１に対するモノクローナル抗体（以下、「本発明抗体３」という。）等が挙げられる。【００１６】
本発明ハイブリドーマについては、前記の通りである。【００１７】
本発明抗体１は、デクチン−１に結合する、ラット免疫グロブリンG2a/κ（IgG2a/κ）である。本発明抗体１が結合するデクチン−１は、マウス由来のものであることが好ましい。【００１８】
本発明抗体２は、デクチン−１に結合する、ラット免疫グロブリンG1/κ（IgG1/κ）である。本発明抗体２が結合するデクチン−１は、マウス由来のものであることが好ましい。【００１９】
本発明抗体３は、デクチン−１に結合する、ラット免疫グロブリンG2a/κ（IgG2a/κ）である。本発明抗体３が結合するデクチン−１は、マウス由来のものであることが好ましい。【００２０】
また本発明抗体１および２は、デクチン−１に対するＢＧ（特に、ＳＰＧやザイモサン）の結合を阻害する作用を有する点に特徴がある。このことから、デクチン−１分子における本発明抗体１および２とＢＧ（特に、ＳＰＧやザイモサン）とのエピトープは共通しているといえる。【００２１】
また本発明抗体３は、デクチン−１に対するＢＧ（特に、ＳＰＧやザイモサン）の結合を阻害しない点に特徴がある。このことから、デクチン−１分子における本発明抗体３とＢＧ（特に、ＳＰＧやザイモサン）とのエピトープは共通していないと考えられる。【００２２】
また本発明抗体１のデクチン−１に対する結合には、少なくともマウス由来のデクチン−１における２２１番目のトリプトファンや、その周辺のアミノ酸残基が必須であることにも特徴がある。【００２３】
本発明抗体には、本発明ハイブリドーマにより産生された抗体そのもののみならず、その抗体を公知の方法で標識したものや、その抗体を不溶性の担体等に固着した状態のものなども包含される。【００２４】
本発明抗体の標識に用いることができる物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（125I、131I、3Ｈなど）、蛍光色素（Alexa Fluor（登録商標）488、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リスアミンローダミンＢ(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリスリン(Phycoerythrin；PE)、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸(AMP)、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンIII(ATIII)、多糖類とその結合タンパク質（ヒアルロン酸とヒアルロン酸結合性タンパク質(HABP)など）のいずれか一方の物質等が例示される。【００２５】
抗体をこのような物質で標識する方法は、それぞれの物質に適した公知の方法、例えば酵素で標識する場合にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法など、放射性同位元素で標識する場合にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人（１９８７年）参照）等から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシミドエステル誘導体又はヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）等を用いることができる。【００２６】
本発明ハイブリドーマにより産生された抗体を固着しうる不溶性の担体の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。また、その担体の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、テフロン（登録商標）、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等を例示することができる。【００２７】
このような不溶性の担体に、本発明ハイブリドーマにより産生された抗体を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。【００２８】
また本発明抗体には、本発明ハイブリドーマにより産生された抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して、Ｆａｂを含むフラグメント等としたものも包含される。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')2等が例示される。【００２９】
本発明抗体は、本発明ハイブリドーマを培養し、その培養物からデクチン−１に対するモノクローナル抗体を採取することにより生産することができる。詳細は後述の「＜３＞本発明生産方法」の項を参照されたい。【００３０】
ただし、本発明抗体の生産方法はこれに限定されるものではなく、他の生産方法、例えば本発明抗体をコードする遺伝子の塩基配列情報又は本発明抗体のアミノ酸配列情報をベースにして遺伝子工学的に生産する方法等を採用してもよい。【００３１】
また、本発明抗体は、完全に精製された状態のものであっても、部分精製された状態のものであっても、精製していない状態のものであってもよい。【００３２】
生産された抗体がデクチン−１に結合するか否か、あるいは特異的に結合するか否か等は、デクチン−１や抗原となりうる他の物質（例えば、他の種類のタンパク質）等を用いて、通常の方法によって当業者が容易に決定することができる。【００３３】
また本発明抗体を保存、流通、使用等する場合には、本発明抗体の機能や作用を実質的に害さない限り他の成分を含有させてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有させることもできる。このようなものとして具体的には、リン酸緩衝食塩水(PBS)、アジ化ナトリウム(NaN3)、ウシ血清アルブミン(BSA)等が例示される。【００３４】
本発明抗体は、デクチン−１の検出、測定、アフィニティー精製その他の用途に用いることができる。
＜３＞本発明生産方法
本発明生産方法は、本発明ハイブリドーマを培養し、その培養物からデクチン−１に対するモノクローナル抗体を採取するステップを含むことを特徴とする、デクチン−１に対するモノクローナル抗体の生産方法である。【００３５】
本発明ハイブリドーマについては前記の通りである。【００３６】
本発明ハイブリドーマの具体的な培養方法や培養条件は、当該ハイブリドーマが本発明抗体を産生する限りにおいて特に限定されない。例えば本発明ハイブリドーマは、ハイブリドーマの培養に通常用いられている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０（シグマ社製）など）にウシ胎仔血清などを１０％程度含有させた液体培地中で培養することができる。この場合、微生物汚染を防ぐために、さらにゲンタマイシン等の抗生物質を含有させてもよい。【００３７】
このような液体培地中で本発明ハイブリドーマを培養する際の条件も、当該ハイブリドーマが本発明抗体を産生する限りにおいて特に限定されないが、液体培地中に播種する本発明ハイブリドーマは１〜２ｘ１０５／ml以上であることが好ましい。また、培養の際の温度は３７℃程度が好ましい。また、培養の際の二酸化炭素濃度は５％（v/v）程度が好ましい。【００３８】
また、マウスの腹腔などの生体内で本発明ハイブリドーマを培養することもできる。この場合、本発明ハイブリドーマを保持する生体が生存する条件下で当該生体を飼育すればよい。【００３９】
このようにして本発明ハイブリドーマを培養することにより、本発明ハイブリドーマによってデクチン−１に対するモノクローナル抗体が産生され、その培養物中にデクチン−１に対するモノクローナル抗体が蓄積する。なお本出願書類において「培養物」とは、本発明ハイブリドーマにより産生されたデクチン−１に対するモノクローナル抗体を含有する画分を意味し、培養後のハイブリドーマ、培養後の培地及びその両者の混合物並びに腹水（生体内で本発明ハイブリドーマを培養した場合）等が包含される。なかでも、「培養後の培地」又は「腹水」（生体内で本発明ハイブリドーマを培養した場合）であることが好ましい。すなわち、本発明生産方法においては、本発明ハイブリドーマを培養した後に、その培養上清（培養後の培地）又は腹水を分離するステップをさらに含むことが好ましい。【００４０】
培養物からのデクチン−１に対するモノクローナル抗体の採取の方法も特に限定されない。例えば、液体培地中で本発明ハイブリドーマを培養した場合において、その培養上清（培養後の培地）を使用する場合には、遠心分離やろ過等の方法でその培養上清（培養後の培地）を採取することにより、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を採取することができる。また、生体内で本発明ハイブリドーマを培養した場合には、一般的な方法でその腹水等を採取することにより、デクチン−１に対するモノクローナル抗体を採取することができる。【００４１】
このようにして採取された培養物や腹水等は、そのまま、デクチン−１に対するモノクローナル抗体として使用してもよく、さらに抗体の通常の精製方法によって精製してもよい。【００４２】
抗体の精製方法としては、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿、ポリエチレングリコールや等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体やＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過法、超遠心法等を例示することができる。また、これらの方法を適宜組み合わせても良い。【００４３】
本発明生産方法によって生産された抗体がデクチン−１に結合するか否か、あるいは特異的に結合するか否か等は、デクチン−１や抗原となりうる他の物質（例えば、他の種類のタンパク質）等を用いて、通常の方法によって当業者が容易に決定することができる。
＜４＞本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明抗体とデクチン−１を反応させるステップを含むことを特徴とする、デクチン−１の検出方法である。【００４４】
なお本出願書類において「検出」の用語は、その対象となるものを何らかのかたちで見つけ出すことを意味する。したがって、本出願書類における「検出」の用語は、その検出対象の存否（有無）を見つけ出すことのみならず、その検出の対象を定量的に見つけ出すこと（検出対象を定量的に測定すること）をも含む概念である。
本発明抗体とデクチン−１との反応の方法は、本発明抗体の分子とデクチン−１の分子とが接触し、両者が抗原抗体反応により結合する条件で行われる限りにおいて限定されない。このような条件の一例として、例えば両者を混合して、０℃〜３７℃で１５分間〜２時間インキュベートする条件が例示される。【００４５】
また、デクチン−１と反応させる本発明抗体や、本発明抗体と反応させるデクチン−１は、固相その他のものに固定されている状態であっても良い。したがって、例えば、本発明抗体を用いた免疫沈降法によるデクチン−１の検出、本発明抗体を用いたウエスタンブロッティングによるデクチン−１の検出、本発明抗体を用いたフローサイトメトリーによる細胞表面上のデクチン−１の検出等は、本発明検出方法に包含される。【００４６】
また、検出対象であるデクチン−１は、予め単離・精製等の処理が施されている必要もない。すなわち、検体中にデクチン−１以外の成分等が含有されていても、本発明検出方法によれば、デクチン−１を特異的に検出することができる。【００４７】
デクチン−１の検出は、本発明抗体に結合した標識物質の種類等に応じて、公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば過酸化水素（酵素がペルオキシダーゼの場合））及び発色物質（例えば3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジンや、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって検出することができる。【００４８】
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。【００４９】
また、本発明抗体に結合する抗体（二次抗体）を標識し、これを用いてデクチン−１を検出してもよい。【００５０】
本発明検出方法では、このような標識物質の検出等を介してデクチン−１を検出することができる。デクチン−１の定性的な検出（デクチン−１の存否の検出）を望む場合には、標識物質の検出の有無をそのまま検出結果とすることができる。また、デクチン−１の定量的な検出（デクチン−１の濃度の測定など）を望む場合には、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのままデクチン−１の量の指標とすることができる。また、既知濃度のデクチン−１の標準溶液を用いて予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用いて検体中のデクチン−１の濃度等を求めることもできる。
本発明検出方法は、本発明抗体とデクチン−１を反応させるステップを少なくとも含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。
例えば、本発明抗体とデクチン−１を反応させた後にデクチン−１を検出するステップはもちろん、本発明抗体とデクチン−１との反応前にこれらの一方又は双方を精製するステップや、本発明抗体とデクチン−１を反応させた後、デクチン−１を検出する前に固相等を洗浄するステップ等をさらに含んでいてもよい。
【実施例１】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。【００５２】
（参考例）
まず、本実施例において使用した、マウス由来のデクチン−１（又はその変異体）を発現するHEK293細胞トランスフェクタント及びビオチン化ＳＰＧの調製方法について説明する。【００５３】
（１）マウス由来のデクチン−１（又はその変異体）を発現するHEK293細胞トランスフェクタントの調製
マウス由来のデクチン−１をコードするcDNA（配列番号１；GenBankアクセッション番号AF262985）を保持するプラスミドを、マウスのマクロファージ細胞株RAW264（RIKEN Cell Bankより入手）から調製した全RNAから、逆転写酵素PCRによって増幅した。このデクチン−１のアイソフォームＡのコーディング領域を、哺乳類発現ベクターp3xFLAG CMV-14（Sigma社製）に挿入した。このベクターを直線状にし、これをエレクトロポレーションによってHEK293（Cell Resource Center for Biomedical Research、Tohoku Universityより入手）にトランスフェクトした。その後、Geneticin（Invitorogen社製）を含有する培地を用いて選別することにより、マウス由来のデクチン−１を発現する安定なHEK293細胞トランスフェクタントを得た。【００５４】
マウス由来のデクチン−１の変異体を発現するHEK293細胞トランスフェクタントは、以下の通り製造した。【００５５】
アミノ酸が変異したデクチン−１変異体のプラスミドは、KOD-Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO製）及びDpnIヌクレアーゼ（Roche製）を用い、PCRを介する突然変異誘発（PCR-mediated mutagenesis）によって次の通り構築した。３０塩基からなるフォワードとリバースの変異オリゴヌクレオチドプライマー（Sigma Genosys製）は、その14番目及び／又は15番目のヌクレオチド残基をAlaコードに置換することによってデザインした。野生型のデクチン−１のcDNAが挿入された発現プラスミドベクターを、KOD-Plus DNAポリメラーゼと前記の変異オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって忠実に複製した。これによって得られたPCR混合物中の鋳型プラスミドを、DpnIヌクレアーゼ存在下、37℃で３時間インキュベートすることによって、野生型のデクチン−１のcDNAを消化した。センス及びアンチセンスDNAを混合し、Escherichia coli DH5αコンピテント細胞にトランスフォームした。変異を有するプラスミドのDNA配列は、DNAシーケンサー（ABI PRISM 310）を用いて確認した。【００５６】
その後、この変異を有するcDNAをp3xFLAG CMV-14ベクターに挿入し、これをFuGene6（Roche製）を用いたリポフェクションによってHEK293細胞（105細胞/ウエル）中に形質導入した。【００５７】
（２）ビオチン化ＳＰＧの調製
ＳＰＧは科研製薬株式会社（Kaken Pharmaceutical Co.）より購入した。ビオチン化ＳＰＧの調製は、Biol. Pharm. Bull. 17, 1508-1512(1994)に記載された方法で調製した。【００５８】
（実施例１）ハイブリドーマの確立１
マウス由来のデクチン−１の可溶性ＣＲＤ（sCRD；配列番号２における、アミノ酸番号１１９〜２４４に相当するペプチド部分）を、CHO-dhfr-トランスフェクタント（American Type Culture Collection）の培養上清から取得した。この細胞株は、デクチン−１のＣＲＤとマウスのデヒドロ葉酸還元酵素をコードするcDNAを含む発現ベクターを用いたエレクトロポレーションにより調製した。【００５９】
フロイント（Freund）の完全アジュバント（Difco製）とsCRDとを乳化し、これをF344ラット（日本ＳＬＣ（Japan SLC）より入手）のフットパッド（footpads）に注入した。３回目の免疫を終えた後、リンパ節を切開してリンパ球を採取し、これをP3X63.Ag8.653ミエローマ（Cell Resource Center for Biomedical Research、Tohoku Universityより入手）と融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンの選択条件下で培養した。【００６０】
抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、5μg/mlのsCRDを用いてコーティングしたマイクロプレートを用いて、酵素結合免疫吸着法（ELISA）によって行った。マイクロプレート上に存在するsCRDに対する、5μg/mlのビオチン化ＳＰＧと2,000倍希釈したストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ（Pharmingen製）の結合を阻害する活性を有する培養上清を選択することで、ハイブリドーマの選択を行い、ラット免疫グロブリンG2a/κ（IgG2a/κ）を産生するハイブリドーマクローン４Ｂ２を取得した。このハイブリドーマクローン（Mouse-Rat hybridoma ４Ｂ２）は、平成１６年１０月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにより、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５１として受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５１として受託された。以下、このハイブリドーマクローン及びこれによって産生される抗体を、単に「４Ｂ２」という。【００６１】
（実施例２）４Ｂ２の特性の解析１
可溶性のマウス由来のデクチン−１について非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後４Ｂ２を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、可溶性のマウス由来のデクチン−１が存在する位置にバンドが検出された。このことから、４Ｂ２はマウス由来のデクチン−１に結合することが示された。【００６２】
（実施例３）４Ｂ２の特性の解析２
HEK293細胞（Cell Resource Center for Biomedical Research、Tohoku Universityより入手）上に種々の変異デクチン−１を発現する一過性のトランスフェクタント（3×105細胞）を、４Ｂ２または抗-FLAG BIO-M2抗体（10μg/ml；Sigma社製）存在下、氷上で30分間インキュベートした。細胞を洗浄後、ビオチン化抗ラットIgG抗体（2.5μg/ml）とストレプトアビジン-Alexa 488（5μg/ml；Molecular Probes社製）を添加し、氷上で30分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。結果を図１に示す。図１中のそれぞれのヒストグラムの縦軸は細胞数を、横軸は蛍光の強度を示す。【００６３】
図１中の最上段のグラフは、コントロールのベクターでトランスフェクトしたHEK293細胞を４Ｂ２で染色した結果、野生型のデクチン−１でトランスフェクトしたHEK293細胞をコントロールの抗体で染色した結果、及び、野生型のデクチン−１でトランスフェクトしたHEK293細胞を４Ｂ２で染色した結果をそれぞれ示すヒストグラムである。その結果、前２者の蛍光強度は低かったのに対し、後１者の蛍光強度は高かった。この結果からも、４Ｂ２がマウス由来の野生型のデクチン−１に結合することが示された。【００６４】
また、図１中、「Ｖ２２０Ａ」はデクチン−１分子における２２０番目のバリンをアラニンに変異させたもの、「Ｗ２２１Ａ」は２２１番目のトリプトファンをアラニンに変異させたもの、「Ｉ２２２Ａ」は２２２番目のイソロイシンをアラニンに変異させたもの、「Ｈ２２３Ａ」は２２３番目のヒスチジンをアラニンに変異させたもの、「Ｇ２２４Ａ」は２２４番目のグリシンをアラニンに変異させたものを、それぞれ発現させたHEK293細胞を用いた結果を示す。また、「Ｗ２２１Ａ／Ｉ２２２Ａ」、「Ｉ２２２Ａ／Ｈ２２３Ａ」及び「Ｗ２２１Ａ／Ｈ２２３Ａ」は、デクチン−１分子においてそれぞれこれらの２つの変異を有するものを、それぞれ発現させたHEK293細胞を用いた結果を示す。影を付したヒストグラムが、４Ｂ２で染色した結果を示す。【００６５】
その結果、「Ｗ２２１Ａ」において４Ｂ２による染色が妨げられた。また、「Ｗ２２１Ａ／Ｉ２２２Ａ」、「Ｉ２２２Ａ／Ｈ２２３Ａ」及び「Ｗ２２１Ａ／Ｈ２２３Ａ」においても同様に４Ｂ２による染色が妨げられた。「Ｉ２２２Ａ」や「Ｈ２２３Ａ」においても４Ｂ２による染色が若干妨げられたが、「Ｖ２２０Ａ」や「Ｇ２２４Ａ」では、４Ｂ２による染色の減少は見られなかった。これらの結果から、４Ｂ２のデクチン−１に対する結合には、少なくとも２２１番目のトリプトファンや、その周辺のアミノ酸残基が必須であることが示された。【００６６】
（実施例４）４Ｂ２の特性の解析３
FLAGタグを付加したデクチン−１のトランスフェクタントを、氷上で30分間、1mg/mlのＳＰＧ（科研製薬株式会社（Kaken Pharmaceutical Co.）販売）存在下で予めインキュベートした。その後、これに４Ｂ２の培養上清を添加して、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ビオチン化抗ラットIgGとストレプトアビジン-Alexa 488とを用いて細胞を染色した。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。その結果、ＳＰＧ処理したトランスフェクタントに対する４Ｂ２の結合は、ＳＰＧ処理しなかった場合に比して著しく減少した。これに対し、４Ｂ２に替えて抗FLAG BIO-M2抗体を用いてストレプトアビジン-Alexa 488で染色した場合には、ＳＰＧ処理したトランスフェクタントに対する抗FLAG BIO-M2抗体の結合は減少しなかった。【００６７】
また、FLAGタグを付加したデクチン−１のトランスフェクタントを、氷上で30分間、４Ｂ２存在下で予めインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１μｇ／ml又は５μｇ／mlのビオチン化ＳＰＧと、ストレプトアビジン-Alexa 488とを用いて細胞を染色した。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。その結果、４Ｂ２処理したトランスフェクタントに対するビオチン化ＳＰＧの結合は、４Ｂ２処理しなかった場合に比して著しく減少した。【００６８】
また、デクチン−１を予め４Ｂ２と共にインキュベートしたところ、デクチン−１のザイモサン（zymosan）に対する結合は、４Ｂ２の濃度に依存して阻害された。【００６９】
これらのことから、４Ｂ２とＢＧ（SPGやザイモサン等）のデクチン−１分子におけるエピトープは共通していることが示唆された。【００７０】
（実施例５）ハイブリドーマの確立２
実施例１と同じ操作を行った後、ハイブリドーマの選択を行い、ラット免疫グロブリンG1/κ（IgG1/κ）を産生するハイブリドーマクローンＲＨ１を取得した。このハイブリドーマクローン（Mouse-Rat hybridoma ＲＨ１）は、平成１６年１０月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにより、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５３として受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５３として受託された。以下、このハイブリドーマクローン及びこれによって産生される抗体を、単に「ＲＨ１」という。【００７１】
（実施例６）ＲＨ１の特性の解析１
可溶性のマウス由来のデクチン−１について非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後ＲＨ１を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、可溶性のマウス由来のデクチン−１が存在する位置にバンドが検出された。このことから、ＲＨ１はマウス由来のデクチン−１に結合することが示された。【００７２】
（実施例７）ＲＨ１の特性の解析２
HEK293細胞（Cell Resource Center for Biomedical Research、Tohoku Universityより入手）上にデクチン−１を発現するトランスフェクタント（3×105細胞）を、ＲＨ１または抗-FLAG BIO-M2抗体（10μg/ml；Sigma社製）存在下、氷上で30分間インキュベートした。細胞を洗浄後、ビオチン化抗ラットIgG抗体（2.5μg/ml）とストレプトアビジン-Alexa 488（5μg/ml；Molecular Probes社製）を添加し、氷上で30分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。【００７３】
その結果、抗-FLAG BIO-M2抗体を用いた場合には蛍光強度は低かったのに対し、ＲＨ１を用いた場合には蛍光強度は高かった。この結果からも、ＲＨ１がマウス由来の野生型のデクチン−１に結合することが示された。【００７４】
（実施例８）ＲＨ１の特性の解析３
FLAGタグを付加したデクチン−１のトランスフェクタントを、氷上で30分間、1mg/mlのＳＰＧ（科研製薬株式会社（Kaken Pharmaceutical Co.）販売）存在下で予めインキュベートした。その後、これにＲＨ１の培養上清を添加して、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ビオチン化抗ラットIgGとストレプトアビジン-Alexa 488とを用いて細胞を染色した。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。その結果、ＳＰＧ処理したトランスフェクタントに対するＲＨ１の結合は、ＳＰＧ処理しなかった場合に比して著しく減少した。これに対し、ＲＨ１に替えて抗FLAG BIO-M2抗体を用いてストレプトアビジン-Alexa 488で染色した場合には、ＳＰＧ処理したトランスフェクタントに対する抗FLAG BIO-M2抗体の結合は減少しなかった。【００７５】
また、FLAGタグを付加したデクチン−１のトランスフェクタントを、氷上で30分間、ＲＨ１存在下で予めインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１μｇ／ml又は５μｇ／mlのビオチン化ＳＰＧと、ストレプトアビジン-Alexa 488とを用いて細胞を染色した。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。その結果、ＲＨ１処理したトランスフェクタントに対するビオチン化ＳＰＧの結合は、ＲＨ１処理しなかった場合に比して著しく減少した。【００７６】
また、デクチン−１を予めＲＨ１と共にインキュベートしたところ、デクチン−１のザイモサン（zymosan）に対する結合は、ＲＨ１の濃度に依存して阻害された。【００７７】
これらのことから、ＲＨ１とＢＧ（SPGやザイモサン等）のデクチン−１分子におけるエピトープは共通していることが示唆された。【００７８】
（実施例９）ハイブリドーマの確立３
実施例１と同じ操作を行った後、ハイブリドーマの選択を行い、ラット免疫グロブリンG2a/κ（IgG2a/κ）を産生するハイブリドーマクローンＳＣ３０を取得した。このハイブリドーマクローン（Mouse-Rat hybridoma ＳＣ３０）は、平成１６年１０月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにより、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１５２として受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５２として受託された。以下、このハイブリドーマクローン及びこれによって産生される抗体を、単に「ＳＣ３０」という。【００７９】
（実施例１０）ＳＣ３０の特性の解析１
可溶性のマウス由来のデクチン−１について非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後ＳＣ３０を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、可溶性のマウス由来のデクチン−１が存在する位置にバンドが検出された。このことから、ＳＣ３０はマウス由来のデクチン−１に結合することが示された。【００８０】
（実施例１１）ＳＣ３０の特性の解析２
HEK293細胞（Cell Resource Center for Biomedical Research、Tohoku Universityより入手）上にデクチン−１を発現するトランスフェクタント（3×105細胞）を、ＳＣ３０または抗-FLAG BIO-M2抗体（10μg/ml；Sigma社製）存在下、氷上で30分間インキュベートした。細胞を洗浄後、ビオチン化抗ラットIgG抗体（2.5μg/ml）とストレプトアビジン-Alexa 488（5μg/ml；Molecular Probes社製）を添加し、氷上で30分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。【００８１】
その結果、抗-FLAG BIO-M2抗体を用いた場合には蛍光強度は低かったのに対し、ＳＣ３０を用いた場合には蛍光強度は高かった。この結果からも、ＳＣ３０がマウス由来の野生型のデクチン−１に結合することが示された。【００８２】
（実施例１２）ＳＣ３０の特性の解析３
FLAGタグを付加したデクチン−１のトランスフェクタントを、氷上で30分間、1mg/mlのＳＰＧ（科研製薬株式会社（Kaken Pharmaceutical Co.）販売）存在下で予めインキュベートした。その後、これにＳＣ３０の培養上清を添加して、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ビオチン化抗ラットIgGとストレプトアビジン-Alexa 488とを用いて細胞を染色した。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。その結果、ＳＰＧ処理したトランスフェクタントに対するＳＣ３０の結合は、ＳＰＧ処理しなかった場合に比して減少しなかった。ＳＣ３０に替えて抗FLAG BIO-M2抗体を用いてストレプトアビジン-Alexa 488で染色した場合も同様であった。【００８３】
また、FLAGタグを付加したデクチン−１のトランスフェクタントを、氷上で30分間、ＳＣ３０存在下で予めインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１μｇ／ml又は５μｇ／mlのビオチン化ＳＰＧと、ストレプトアビジン-Alexa 488とを用いて細胞を染色した。この細胞を洗浄し、固定して、FACSで分析した。その結果、ＳＣ３０処理したトランスフェクタントに対するビオチン化ＳＰＧの結合は、ＳＣ３０処理しなかった場合に比して減少しなかった。【００８４】
また、デクチン−１を予めＳＣ３０と共にインキュベートしたところ、デクチン−１のザイモサン（zymosan）に対する結合は、ＳＣ３０の濃度によって影響を受けなかった。【００８５】
これらのことから、ＳＣ３０とＢＧ（SPGやザイモサン等）のデクチン−１分子におけるエピトープは共通していないことが示唆された。【００８６】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。【００８７】
本出願は、2004年11月12日出願の日本特許出願（特願2004-329795）、2004年11月12日の日本特許出願（特願2004-329796）、2004年11月12日の日本特許出願（特願2004-329797）、に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明ハイブリドーマは、デクチン−１に対する抗体の生産ツールとして利用することができる。本発明抗体は、デクチン−１の検出、測定、アフィニティー精製その他の用途に利用することができる。また本発明生産方法は、本発明抗体の生産に利用することができる。また本発明検出方法は、デクチン−１の簡便・迅速な検出に利用することができる。
【図１】
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【配列表】
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