(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的ペプチドを経口投与することにより、該目的ペプチドの機能を生体内で発揮させる経口キャリア手段であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス（NLV:Norwalk virus）外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体を経口投与の有効成分とすること、上記目的ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであって、R7抗原の最小防御エピトープ領域であるLRE1ペプチドであること、を特徴とする上記経口キャリア手段。
【請求項２】
目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号１で示される組換え遺伝子である、請求項１に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
【請求項３】
融合させた遺伝子をジャガイモに導入・発現させた組換え植物体を使用する、請求項１に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
【請求項４】
融合させた遺伝子を導入・発現させた組換え植物体を、更に目的ペプチドを抽出・精製して使用する、請求項１に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
【請求項５】
目的ペプチドを経口投与することにより、該目的ペプチドの機能を生体内で発揮させる経口キャリア手段に使用する組換え植物体であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス（NLV:Norwalk virus）外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体であること、上記目的ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであって、R7抗原の最小防御エピトープ領域であるLRE1ペプチドであること、を特徴とする上記組換え植物体。
【請求項６】
目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号１で示される組換え遺伝子である、請求項５に記載の上記組換え植物体。
【請求項７】
融合させた遺伝子を導入し・発現させた組換え植物体が、ジャガイモである、請求項５に記載の上記組換え植物体。
【請求項８】
植物体に導入・発現させた遺伝子が、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであって、R7抗原の最小防御エピトープ領域であるLRE1ペプチドをコードするLRE1遺伝子及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、配列番号1で示されるCalici-LRE1抗原組換え遺伝子である、請求項５に記載の上記組換え植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的ペプチドを発現した組換え植物体を経口投与することにより、生体の目標部位にそのペプチドを運搬し、ペプチドの機能を発揮させるキャリア手段及び当該組換え植物体に関するものであり、更に詳しくは、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を発現した植物体を、経口投与することにより、目的ペプチドの機能を生体内で発揮させるキャリア手段及び組換え植物体に関するものである。
【０００２】
本発明は、目的ペプチドを発現した組換え植物体を作出し、それを経口摂取することにより、生体内でその機能を発揮させるという新しい技術に関するものであり、例えば、人ならびに動物のワクチンによる疾病予防の技術分野において、植物体の摂取による抗体の産生という新しい技術を創生するものであって、医療、薬学等の技術分野における、今後の発展並びに新しい技術の開発にあたり重要な基礎技術となるものである。本発明は、例えば、住血胞子虫（原虫）であるロイコチトゾーン・カウレリー（Leucocytozoon caulleryi ）の感染に起因することが１９０９年に初めて報告された、鶏の出血性、貧血性の疾病であり、産卵率低下、増体率低下、死亡率の上昇等を誘導するため、養鶏産業において重要疾病の一つとされている、鶏のロイコチトゾーン症を効率的に予防することができる、新しい経口ワクチンキャリアシステムを構築することを可能とするものである。このシステムでは、抗原を発現した遺伝子組換え植物を、飼料とともに経口投与することによって、病原体による抗体を誘導して、感染症を有効に予防することが可能である。本発明は、人又は動物に適用することが可能であり、注射による筋肉投与と比べて、ストレスを与えず、省力的な投与が可能であり、また、抗体を有する植物の大量生産が可能であり、低コストで経口ワクチンを提供することを可能とするものとして有用である。
【背景技術】
【０００３】
本発明のペプチドとしては、広く、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチド等が含まれるが、その中で、例えば、鶏のロイコチトゾーン原虫の免疫原性ペプチドが知られている。鶏のロイコチトゾーン症は、住血胞子虫類であるロイコチトゾーン・カウレリーの感染によって引き起こされる疾病である。本原虫は、吸血昆虫の一種である双翅目Dipteraのヌカカ科Ceratopogonidaeに属するニワトリヌカカCulicoides arakawae（以下ヌカカと略称する）によって生物学的に伝播される。その生活環がほぼ明らかにされ、ロイコチトゾーン・カウレリーは、宿主の鶏の体内でのジゾゴニー（増員生殖）とガメトゴニー（生殖体形成生殖）、伝播者であるヌカカの体内でのスポロゴニー（胞子形成生殖）の３つの発育期を持っている。
【０００４】
本原虫に感染したヌカカの吸血の際に、その唾液と共に鶏の体内に侵入したスポロゾイト（種虫）は、主として、肺、肝、脾、腎等の血管内皮系の細胞に寄生して第１代シゾント（分裂体）を形成する。感染後５〜７日目には、それより第１代メロゾイト（分裂小体）が血液中に放出され、全身に分布する血管内皮系細胞に再び侵入して第２代シゾントとして増殖し、後期には宿主細胞から離れて細胞間隙でさらに発育する。１４日目には、これらのシゾントから第２代メロゾイトが血液中に放出され、次いで、それらは赤血球細胞に侵入して発育し、１８〜１９日目には宿主細胞から遊離して、それぞれマクロガメトサイト（雌性生殖母体）、ミクロガメトサイト（雄性生殖母体）として成熟する。
【０００５】
両ガメトサイトは、ヌカカの吸血時に鶏の血液と共にその中腸内に取り込まれ、マクロガメート（雌性生殖体）とミクロガメート（雄性生殖体）を形成して融合（受精）し、チゴート（融合体）を経てオオキネート（虫葉体）となり、虫腸壁の細胞間隙に侵入し、次いで、その外膜下に移行してオオシスト（胞のう体）に発育する。オオシストの内部には数十個のスポロゾイトが形成され、唾液腺に移動してその発育環を完了する。
【０００６】
本原虫感染による鶏の症状と病変は、主として、第２代シゾントが発育するシゾゴニーの末期と、第２代メロゾイトが赤血球系細胞に寄生してガメトサイトに発育する過程のガメトゴニーの時期に認められる。本症の最も特徴的な各臓器及び組織の出血病変と貧血症状は、第２代シゾントによる血管栓塞に伴う出血とガメトゴニーの原虫の寄生によって赤血球が破壊されるために引き起こされるものと考えられている。
【０００７】
鶏のロイコチトゾーン症についての従来の予防法や、診断法には、次のものが知られている。
（１）ピリメタミンやサルファ剤といった化学薬剤の使用による予防法があり、飼料に化学薬剤を添加することにより、本疾病の発生を抑えることに成功し、大きな効果を上げ、防疫法の最も確実で安価な手段として普及し、その後、薬剤耐性の原虫の出現が明らかとなり、薬の改良と耐性原虫の出現とが繰り返し行われてきたが、飼料安全法の一部が改正され、採卵鶏には薬剤の使用ができなくなった。
（２）本疾病がニワトリヌカカにより媒介されることから、蚊の侵入しにくい鶏舎構造ヘの改築が考えられ、ウィンドレス鶏舎が代表的なものとして提案された他、防虫網や送風装置の設置と殺虫剤の併用が行われた。
（３）スポロゾイトを用いた生ワクチンと虫体由来物質を抗原とする不活化ワクチンの二種類のワクチンが提案された。これらのワクチン製造には、材料として何れもニワトリヌカカと鶏の双方が必要なため、大量、安全且つ安価な製造を困難にしており、生産効率の低い従来法によるワクチン製造では、工業的規模での大量生産には限界があった。
【０００８】
そこで、鶏及びヌカカを用いずロイコチトゾーン症を予防するために、遺伝子工学的手法により作出した組換体により発現させた蛋白質でワクチンを作製し、それによって安価で安定した大量供給が可能な、鶏ロイコチトゾーン免疫原性蛋白質を発現する遺伝子クローン及び鶏ロイコチトゾーン症に対する遺伝子組換えワクチンを提供することが提案された。例えば、免疫原性蛋白質遺伝子クローン、ロイコチトゾーン原虫の第２代シゾントが有している蛋白質をコードしているｍRNAから調製されるｃDNAライブラリーから選別された、免疫原性蛋白質（R7）によるもの（特許文献１参照）、また、ロイコチトゾーン原虫の感染防御に関わる蛋白質をコードする遺伝子を、ロイコチトゾーン原虫の第２代シゾントより、組換え遺伝子技術を用いて制限酵素Dral及びHindIII を用いてDNA断片を切り出し、これを、制限酵素StuI及びHindIII で切り出した発現べクター（pMAL-C）の発現系とライゲーションし、構築したプラスミッド（p２４DH）を持つ大腸菌でワクチンに有効な蛋白質を発現させるもの（特許文献２参照）が提案されたが、ワクチンの製造、投与において、経済性、簡便性が更に求められている。遺伝子工学を利用した、経口キャリア手段を適用することができる免疫原性ないし機能性ペプチドについての提案、及びそれらのペプチドを産生する植物についての提案は見当たらない。
【０００９】
【特許文献１】特開平７−２８４３９２号公報
【特許文献２】特開平７−８９９９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上記の問題を解決するために、消化管での耐分解性を付与し、作用すべき腸管などに到達する前に分解されることがない、機能を有する目的ペプチドを開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を発現した植物体を、経口投与することにより、目的ペプチドを目標部位に運搬することが可能であり、例えば、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであるLRE1をコードするLRE1遺伝子を発現した植物体を作出することによって、上記の問題を解決できることを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を導入・発現させた組換え植物体を、経口投与することによる、目的ペプチドを、人又は動物の目標部位に運搬する機能を有するキャリア手段を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、経口投与しても、消化管での耐分解性を有し、作用すべき目的の場所である腸管等に到着することが可能な、目的ペプチドを産生する組換え植物体を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、免疫原性ペプチド、血圧低下ペプチド等の機能性ペプチドを産生する、組換え植物体を作出することを目的とするものである。
また、本発明は、目的ペプチドを産生した植物体を大量に栽培することを可能にして、目的ペプチドを、大量に、経済的に提供することを目的とするものである。  
また、本発明は、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子を導入・発現した植物体による、経口ワクチンキャリア手段を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、目的ペプチドを、植物体を通して、人又は動物に摂取させることにより、筋肉内注射によるストレスを与えることがない、簡便な、省力化したワクチンの投与を可能とすることを目的とするものである。
更に、本発明は、医療、医薬の技術分野において有用な、植物体による目的ペプチドの産生と、経口投与を可能とする新しい技術の創生を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための、本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）目的ペプチドを経口投与することにより、該目的ペプチドの機能を生体内で発揮させる経口キャリア手段であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス（NLV:Norwalk virus）外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体を経口投与の有効成分とすること、上記目的ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであって、R7抗原の最小防御エピトープ領域であるLRE1ペプチドであること、を特徴とする上記経口キャリア手段。
（２）目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号１で示される組換え遺伝子である、上記（１）に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
（３）融合させた遺伝子をジャガイモに導入・発現させた組換え植物体を使用する、上記（１）に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
（４）融合させた遺伝子を導入・発現させた組換え植物体を、更に目的ペプチドを抽出・精製して使用する、上記（１）に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
（５）目的ペプチドを経口投与することにより、該目的ペプチドの機能を生体内で発揮させる経口キャリア手段に使用する組換え植物体であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス（NLV:Norwalk virus）外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体であること、上記目的ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであって、R7抗原の最小防御エピトープ領域であるLRE1ペプチドであること、を特徴とする上記組換え植物体。
（６）目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号１で示される組換え遺伝子である、上記（５）に記載の上記組換え植物体。
（７）融合させた遺伝子を導入し・発現させた組換え植物体が、ジャガイモである、上記（５）に記載の上記組換え植物体。
（８）植物体に導入・発現させた遺伝子が、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであって、R7抗原の最小防御エピトープ領域であるLRE1ペプチドをコードするLRE1遺伝子及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、配列番号1で示されるCalici-LRE1抗原組換え遺伝子である、上記（５）に記載の上記組換え植物体。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、目的ペプチド、例えば、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を発現した植物体を、人又は動物に経口投与することを特徴とする目的ペプチドを生体の目標部位に運搬する機能を有する経口投与するためのキャリア手段及び組換え植物体に関するものであり、例えば、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子、及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合した、Calici-LRE1抗原発現キャリアシステム遺伝子を発現した植物体を、鶏に、経口投与する経口ワクチンキャリアシステム、及び該システムに使用するジャガイモ等の組換え植物体に関するものである。本発明は、目的ペプチドをコードする遺伝子をノーウォークウイルス外皮蛋白遺伝子と融合させ、当該遺伝子を植物体に導入・発現させる組換え植物体を作出し、この植物体を経口投与して、その有効な機能を発揮させるものである。
【００１４】
本発明の、経口投与キャリア手段は、遺伝子組換え植物体の摂取により実施され、目的ペプチドを、抽出・精製することなく、組換え植物体を経口投与するだけで、所期の目的が達成できるものである。ただし、組換え植物体が産生した、目的ペプチドを、公知の方法により抽出・分離した後、経口投与しても差し支えない。
【００１５】
ノーウォークウイルスは、哺乳類に下痢症状を引き起こすウイルスであり、ウイルス粒子が消化管で消化・分解されることなく、腸管へ到達し、腸管粘膜に作用して病害を引き起こすものである。一方、例えば、ワクチンとして効果を発揮するペプチド類を、経口投与した場合には、そのペプチド類は、通常、このような消化管での分解耐性を有していないので、効果を発揮する前、もしくは、作用すべき腸管等の目標部位に到達する前に分解されてしまう。そこで、目的とする機能性ペプチドを、消化管での分解耐性を有する下痢症に関連するウイルス粒子（遺伝子）と融合させ発現することにより、擬似ウイルス粒子を形成させると、この分解耐性を有するために消化管で分解されることはなく、目標部位（腸管粘膜等）に到達し、その結果、目的ペプチドの機能を誘導することができる。本発明は、哺乳類に下痢症状を引き起こすウイルス粒子（遺伝子）と融合させ発現させたものであることから、哺乳類の経口投与に有効であるばかりか、更に鳥類にも有効である。
【００１６】
本発明の形質転換植物を作出する方法の一例としては、例えば、植物発現用ベクターと、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、Calici-LRE1抗原遺伝子を、ライゲーションした植物発現用遺伝子を、大腸菌に移入して増菌する。次いで、抽出したプラスミドを、アグロバクテリウムに導入し、この形質転換したアグロバクテリウムを植物に感染させることにより、該抗原遺伝子を植物に移入して、形質転換植物とするが、他の目的ペプチドに関しても、同様な操作により形質転換植物体を作出することができる。
【００１７】
次に、本発明について、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドであるLRE1を代表例として詳細に説明するが、本発明が、哺乳類ないし鳥類にも適用することが可能であることは、ノーウォークウイルス外被蛋白質の性質によるところが大きい。
【００１８】
本発明における、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子については、特開平７−２８４３９２号公報（特許文献1）に記載され、LRE1ペプチドは、R7抗原の最小防御エピトープ領域である。また、ノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子については、Complete nucleotide sequence of the chiba virus genome and functional expression of the 3C-like protease in Escherichia coli,Virology.2000 Dec. 20,278(2):490-500.Someya Y.Takeda N,Miyama T.、に記載されている。
【００１９】
これらの両遺伝子を、次のようにして連結し、Calici-LRE1遺伝子を構築した。カリシキャプシト蛋白質欠失遺伝子とロイコチトゾーン原虫のエピトープ遣伝子を融合するため、また当該遺伝子の５’側にSｍaI制限酵素認識部位を、３’側にSacＩ制限酵素認識部位及び植物の小胞体保持シグナルペプチド配列(KDEL配列)を付加するために、以下に示すように設計したブライマーを用いてPCRを行った(表１)。カリシキャプシト蛋白質遺伝子の５’末端にはSｍaI制限酵素認識部位を、３’末端は１０アミノ酸を欠失させ、ロイコチトゾーン原虫のエピトープ配列をコードするように設計したプライマー(calici5sma、LRE1-14a.a.)（表１)と、LATaqTM(TaKaRa)及びこれに添付のGC緩衝液、反応液を用いて行った。熱反応は、９４℃で１分問加熱した後、９４℃で３０秒聞、５５℃で３０秒問、７２℃で２分間を３０サイクル行った後、７２℃で５分間伸長反応した。PCRで増幅されたDNA断片は、１％アガロースゲルで電気泳動し、増幅された約１．６５bｐのバンドを確認後、アガロースゲルより切り出し精製した。
【００２０】
次に、回収したDNA断片を鋳型にし、５’側は上記と同様のプライマーを、３’側はエピトープ配列、KDEL配列、SacI制限酵素認識部位をコードするように設計したプライマー(calici5sma、LRE1−8aaKDELSac)(表１)と、LA  TaqTM(TaKaRa)及びこれに添付のGC緩衝液、反応液を用いて上記の条件でPCRを行った。PCRで増幅されたDNA断片は１％アガロースゲルで電気泳動し、約1.７bpのバンドを確認後、DNA断片の精製を行った。
【００２１】
精製したDNA断片とpUC118ベクター（TaKaRa)を制限酵素(TaKaRa)SｍaI及びSacIで消化した後、ライゲーション反応を行いpUC118べクターへDNA断片を挿入した。このプラスミド全量を用いて大腸菌コンピテントセルJＭ109(TaKaRa)に形質転換操作を行い、アンピシリン(５０μg/ml)を含むLB固形培地に播き３７℃でー晩培養し、形質転換株を得た。この形質転換株よりプラスミトを抽出し、塩基配列の解析に用いた。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
Calici-LRE1遺伝子の配列を、図５及び図６に示す。
【００２４】
上記Calici-LRE1遺伝子は、プロモーターを有するベクター中に挿入される。プロモーターは、植物細胞内で転写を行わせることができる公知のいずれのプロモーターであってもよいが、好ましい例としては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本発明に用いられる組換えベクターは、植物を形質転換することができ、その細胞内で複製し得るものであれば、いずれのベクターをもベースとすることができる。ベクターは、上記プロモーターの他に、細胞内で機能する、複製開始点を有し、また、ターミネーター及び薬剤耐性のような選択マーカーを有することが望ましい。このようなベクターは、市販されており、植物発現用ベクターとして、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを保有するpBE2113を挙げることができる。
【００２６】
本発明で用いられる、組換えベクターは、上記ベースとなるベクターに、Calici-LRE1遺伝子を、定法により、制限酵素を駆使して挿入することにより容易に調整することができる。具体的な調整方法の例は、以下の実施例に記載されているが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明で用いられる植物を、形質転換する方法としては、先ず、上記組換えベクターで、植物に対して強力な感染力を有する、アグロバクテリウムを形質転換し、これを植物に、接種して感染させる方法が好ましくは用いられるが、アグロバクテリウムによる形質転換方法自体は公知であり、例えば、凍結溶融法により行うことができる。
【００２８】
本発明に用いられる、植物としては、免疫原性ペプチドLRE1等の、目的ペプチドを多量に産生するものが好ましく、例えば、ジャガイモが挙げられるが、特に限定されるものではない。また、例えば、ジャガイモを形質転換するにあたっては、その品種等に限定されるものではない。
【００２９】
なお、一般に、DNAにわずかな置換、欠失又は挿入が生じても、その機能に実質的に影響しないことがあることは当業者がよく認識するところである。したがって、配列表又は図５及び６に示す、Calici-LRE1遺伝子配列にわずかな置換、欠失又は挿入が生じたものであっても、この明細書に記載した方法に基いて、植物に形質転換することができ、それによって、本発明のキャリア手段に適用可能であるものであれば、本発明での融合遺伝子に含まれる。
【００３０】
以上説明したように、本発明は、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体を有効成分とする、目的ペプチドの経口投与するためのキャリア手段及び当該植物体に関し、目的ペプチドを発現した組換え植物体を作出し、それを、人ないし動物に経口投与することにより、そのペプチドの機能を発揮させるという新しい技術に関するものであり、例えば、鶏のロイコチトゾーン原虫の感染による疾病を予防するための抗体産生に有用な、形質転換植物及びそれを利用した経口ワクチンキャリアシステムを挙げることができる。該形質転換植物は、該原虫の生活環において、比較的免疫原生が強い、第２代シゾントにおける免疫原性ペプチドを発現するものであり、該植物体を、飼料と共に経口投与することにより、鶏に抗体を産生することができる点に特徴を有する。また、経口ワクチンの欠点である、消化管での分解を克服するために、本発明では、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、Calici-LRE1抗原発現遺伝子を植物に導入して、経口ワクチンとしての有効性を高めている。また、本発明の、免疫原性ペプチドを有する植物体を大規模に栽培することにより、経済的に、大量に、ワクチンを生産することが可能であり、簡便な投与ができ、鶏のロイコチトゾーン症を予防することができる、新しいワクチンとして有用である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、（１）目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を導入・発現させた組換え植物体を、経口投与することによる、目的ペプチドを、人又は動物の目標部位に運搬する機能を有するキャリア手段を提供できる、（２）経口投与しても、消化管での耐分解性を有し、作用すべき目的の場所である腸管等に到着することが可能な、目的ペプチドを産生する組換え植物体を提供することができる、（３）免疫原性ペプチド、血圧低下ペプチド等の目的ペプチドを産生する、組換え植物体を作出することができる、目的ペプチドを産生した植物体を大量に栽培することを可能にして、目的ペプチドを、大量に、経済的に提供することができる、（４）目的ペプチドを、植物体を通して、人又は動物に摂取させることにより、筋肉内注射によるストレスを与えることがない、簡便な、省力化したワクチン等の投与を可能とする、（５）医療、医薬の技術分野において有用な、植物体による目的ペプチドの産生と、経口投与を可能とする新しい技術の創生を可能とする、という格別の効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
次に、本発明を実施例に基いて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではなく、本発明は、例えば、免疫原性ペプチド、血圧降下ペプチド等の機能性を有するペプチド一般に適用でき、また、鶏以外の鳥類ないし哺乳類にも適用可能である。
【実施例１】
【００３３】
（１）ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1、及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子が連結したCalici-LRE1遺伝子導入ジャガイモの作出
【００３４】
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを保有する植物発現用ベクターpBE2113を、Sma Iサイト及びSac Iサイトで消化し、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドであるLRE1をコードするLRE1遺伝子、及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、Calici-LRE1遺伝子（配列番号1）を、同様に、Sma Iサイト、Sac Iサイトで消化した、pBE2113とCalici-LRE1遺伝子をライゲーションして構築した、pBE/Calici-LRE1を、カナマイシン耐性の植物発現用遺伝子として、以後の実験に供した。PBE/Calici-LRE1を大腸菌（HB101）に移入し、増菌後、この形質転換大腸菌より上記プラスミドを抽出した。
【００３５】
上記のようにして得られた、Calici-LRE1遺伝子導入プラスミドpBE/Calici-LRE1を、下記に示す、凍結溶解による直接導入法によって、Agrobacterium tumefaciens LBA 4404（Clontech社製）に導入した。
【００３６】
Agrobacterium tumefaciens LBA 4404を、50mLのLB液体培地中（ 1％ Bacto torypton , 0.5% Yeast extracts , 1% 塩化ナトリウム）で、Ａ600の吸光値が、約1.0になるまで28℃で振とう培養した。氷上で冷却後、4℃で3000gの遠心分離（ Kubota RA-6を用いた）を行い、集菌後、1mLの氷冷した20mMの塩化カルシウム溶液に浮遊させた。これを、0.1mL毎にエッペンドルフチューブに分注した。これに組換えプラスミドpBE/Calici-LRE1を1μg加え、液体窒素中で急速に凍結した。次に、得られた凍結細胞を、37℃で溶解した後、5分間静置した。これに、1ｍLのLB培地を加え、28℃で2〜4時間振とう培養した。約10000gで1分間遠心分離（Kubota KM-15200を用いた）して集菌し、0.1ｍLのLB培地に浮遊させた後、リファンピシン（ 100μg／ｍL ）、カナマイシン（ 25μg／ｍL ）及びストレプトマイシン（ 300μg／ｍL ）を含むLB固形培地に広げた後、2〜3日間、28℃で培養して、pBE/Calici-LRE1が組み込まれた形質転換菌を得た。
【００３７】
ジャガイモへのCalici-LRE1遺伝子の導入は、上記において作出したアグロバクテリウムとチユーパーディスク法によって実施した。ジャガイモへの形質転換操作、即ち、感染実験は、作製したpBE/CaliciLRE1を保有するアグロバクテリウムLBA4404を用いて、チューバーディスク法で感染させた。即ち、ジャガイモの塊茎を1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で15分間殺菌し、滅菌蒸留水で2〜3回洗浄した後、滅菌したコルクポーラーで直径約1cmの円柱状にくり抜き、メスで約2mm幅で切りチューバーディスクとした。導入する遺伝子を保有しているアグロバクテリウムを、LB培地で28℃下で振盪培養後、4℃で8,000rpmの遠心分離(KUBOTA KR-20000T)を行い集菌し、MS液体培地  {3-インドール酢酸50μg/l、ジベレリン酸100μg/l、アブシジン酸100μg/l、ゼアチンリボシド2mg/l を含む(pH5.9)}に懸濁した液に、このディスクを15分間浸した。この後、MS固形培地上で24〜25℃で3日間共存培養を行い、カルスへアグロバクテリウムを感染させた後、アグロバクテリウムを除去するため抗生物質を含むMS液体培地でカルスを洗浄した。洗浄後のカルスは、上記の抗生物質を含むMS固形培地上に置床し、22℃、16時間照明、8時間暗期の条件下で2週間毎に継代培養を行い、再分化系統を作出した。形質転換後、再分化してきた個体を発根培地に移植した。
【００３８】
（２）遺伝子組換えジャガイモにおけるCalici-LRE蛋白質の発現確認
植物発現用遺伝子を導入し得られた再分化系統の葉に、5倍量のPBS-T緩衝液〔135ｍM塩化ナトリウム、1.5ｍMリン酸二水素ナトリウム、2.7ｍMリン酸水素二ナトリウム、0.05％（v／v）Tween20、pH7.2〕を加え試料を調製し、粗汁液とした。本材料は抗ノーウォークウイルス血清を用いたELISA検定に供した。抗Norwalk like virus 血清（ウサギポリクローナル抗体：国立感染症研究所より分与）又は抗Norwalk like virus抗体（マウスモノクローナル抗体）を、0.05M Carbonate-Bicarbonate緩衝液（15mM 炭酸ナトリウム、35mM炭酸水素ナトリウム、2.5mMアジ化ナトリウム）で希釈し、ELISAプレート(Maxisorp; Nunc)に加えた後、37℃で3時間プレートに固相化した。固相化プレートをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した後、調製した組換え植物体の葉及び種子の粗汁液を加え4℃で一晩インキュベートした。このプレートをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した後、抗NLV HRPO conj.を順に加えた。このプレートをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した後、o-phenylenediamineを基質として加え、室温で30分間反応させた。反応は停止液(5% sodium lauryl sulfate)で停止後、493nmの吸光値をマイクロプレートリーダー(Bio Rad model 2550 EIA reader)で測定した。
【００３９】
その結果、供試した幾つかの系統が、非組換え体より明らかに発現量が高いことが確認された（図1）。葉で原虫抗原キャリアシステム蛋白質の発現量が高い個体を7系統選抜した。葉と同様に試料を調製し、塊茎におけるELISA検定を行った。その結果、塊茎においても葉と同様に高い発現量が確認された（図1）。
【００４０】
ELISA検定に用いた再分化系統の葉の粗抽出液を使用し、ウエスタンブロット法による発現確認を行った。即ち、植物の粗汁液をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)試料用緩衝液を加え、沸騰水中で3分間加熱し蛋白質を変性させた。この溶液20μlを8%SDS-ポリアクリルアミドゲルを用い、Laemmliの方法（Laemmli, 1970）に従い電気泳動を行った。泳動後のゲルは蒸留水でリンスした後、ミニプロティアンII(Bio-Rad)を用い、定法に従いECLメンブレン(Amersham)に蛋白質の転写を行った。転写後のメンブレンはエタノールで洗浄後、Block-Aceに一晩浸漬し平衡化させた。
【００４１】
抗Norwalk like virus 血清をTBS緩衝液(20mM Tris-HCl, 0.14M NaCl, pH7.5)で希釈し、平衡化させたメンブレンをこの溶液中で1時間振盪した。振盪後のメンブレンは、TBS-T緩衝液(TBS緩衝液-0.1% (v/v) Tween20)で3回リンス後、TBS-T緩衝液で希釈したHRPO標識の抗体で1時間振盪した。反応後のメンブレンはTBS-T緩衝液で5回洗浄した後、ECL-Plus (Amersham)を用いて化学発光させた。発光の検出はVersaDoc(Bio Rad)を用いて行った。再分化個体の粗抽出液をSDS-PAGEで分画し、これに抗NLV血清を反応させた。その結果、抗NLV血清は、非組換え体とは全く反応せず、原虫抗原キャリアシステム遺伝子を導入した再分化系統のみに反応した（図2）。
【００４２】
（３）Calici-LRE1遺伝子のジャガイモ体内への遺伝子導入の確認
Calici-LRE1遺伝子のジャガイモへの遺伝子導入をゲノミックPCR法により確認した。ジャガイモの葉からの全DNA抽出及びゲノミックPCRにはREDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit (SIGMA)を用いた。作出した再分化系統の葉から抽出した全DNAを鋳型に用い、Calici-LRE1遺伝子の塩基配列を基に2種類のプライマーを設計し｛（CaL553：5'−TTGTACACTCCTCTC−3'：配列2）及び（CaL1423：5'−AGTGGAGTAAGGCAG−3'：配列3）、ゲノミックPCRを行った。即ち、抽出した植物の全DNA（4μl）を鋳型とし、導入遺伝子の塩基配列を基に設計したプライマー（最終濃度0.4μM）及び、REDExtract-N-Amp PCR reaction mix（10μl）を用い、DWで全容量を20μlにしPCRを行った。PCR反応は、94℃で3分間の後、94℃30秒間、55℃で30秒間、72℃で1.5分間を1サイクルとして30サイクルを行い、72℃で10分間伸長反応を行った。この反応にはサーマルサイクラー (MJ RESARCH DNA Engine PTC-200)を使用した。結果、アガロースゲル電気泳動パターンでは、目的の大きさ（約870bp）の位置に再分化系統由来のバンドが得られた。陰性対照として用いた非組換えジャガイモ由来のバンドは同様の位置に確認されなかった（図3）。この結果より、ジャガイモへの原虫抗原キャリアシステム遺伝子の導入が確認された。
【００４３】
（４）Calici-LRE1遺伝子導入ジャガイモの抗原性の確認
Calici-LRE1遺伝子を導入したジャガイモの葉を、乾燥重量とて生重量の約1／12になるまで凍結乾燥（共和真空技術株式会社製RLE-204を用いて48時間工程で実施）した。乾燥した葉を、パウダー状に磨砕後、鶏用配合飼料（船橋農場製）と混合して、経口投与材料とした。
【００４４】
経口投与試験に供試した鶏は、現在野外で広く使われている鶏ロイコチトゾーン病ワクチン〔ワクチン抗原成分として大腸菌で発現させたロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来のR7タンパク質を用いている（特開H07-284392参照）〕を注射後、抗2GS ELISA抗体価が12,800倍を有する3羽を用い、それぞれ、Calici-LRE1抗原発現ジャガイモの凍結乾燥葉経口投与鶏、注射型ワクチン抗原であり大腸菌で発現させたR7抗原（植物材料同様に凍結乾燥し粉末化したもの）経口投与鶏並びに非経口投与鶏を設定した。
【００４５】
Calici-LRE1抗原を発現するジャガイモの凍結乾燥葉は、給餌総量として1日1羽当り60g（このうち、約6.7gが凍結乾燥したCalici-LRE1遺伝子導入ジャガイモの葉とした。1日当りの取り込み抗原量は、抗原価で約1,500単位となり、総投与抗原量は1羽当り約2万単位であった）給餌し、13日間連続で経口投与（自発的に摂食させた）した。Calici-LRE1遺伝子導入ジャガイモの葉を含む給餌が終了した後は、1日1羽当り60gの鶏用配合飼料（船橋農場製）を与えた。
【００４６】
大腸菌で発現させたR7抗原についても、給餌総量として1日1羽当り60ｇとし、本材料中に抗原価として100万単位を含むように、R7抗原粉末を添加し、7日間経口投与、7日間非投与、7日間連続経口投与の間歇投与で実施した（1羽当りの総投与高原量は1,400万単位であった）。なお、通常の鶏用配合飼料のみを1日1羽当り60g、試験開始より投与した対照鶏1羽を設定した。経口投与材料の給餌時より、随時対照鶏を含む全試験鶏の翼下静脈より血液を採取し、遠心分離により血清を得た。これらの血清を用いて、下記に示すELISA法で抗体検査を実施した。
【００４７】
0.05Mの炭酸ナトリウム緩衝液〔1リットル中、炭酸二ナトリウム1.59g、炭酸水素ナトリウム2.93g、（pH9.6）〕で、0.1μg／ｍL濃度に希釈したロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント超音波処理可溶化抗原〔Ito, A. et al., J. Vet. Med. Sci. 64(5):405-411 (2002)〕を、96穴ELISAプレート（IWAKI社製）に分注し、4℃で一晩放置してコーティングした。コーティングしたプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミンが最終濃度3％（w／v）となるようPBS-T緩衝液に加えたブロッキング液をプレートに分注し、37℃で1時間静置して、ブロッキング処理した。ブロッキング処理後、PBS-T緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミンが最終濃度0.3％（w／v）となるようPBS-T緩衝液に加えた抗体希釈用液で、400倍から51,200倍まで2倍階段希釈した血清をプレートに分注し、37℃で1時間静置して、抗体と反応させた。このプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、抗体希釈用液で12,000倍希釈したHRPO標識抗ニワトリIgG（ZYMED社製）をプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。このプレートをPBS-T緩衝液で洗浄後、基質溶液（1L中にリン酸水素二ナトリウム14.6g、クエン酸一水和物10.2g、O-フェニレンジアミン1g、過酸化水素水1ｍLを含む）をプレートに添加して、37℃で15分間、暗所で静置し反応させた。反応は停止液（5N硫酸水溶液）で停止後、A492の吸光度値をマイクロプレートリーダー（Corona MTP-120を用いた）で測定した。
【００４８】
この試験の結果を図4に示す。非経口投与鶏の抗体価は、試験開始後急激に低下し、6週目には抗体価1,600倍にまで低下した。一方、Calici-LRE1抗原を発現するジャガイモの葉を経口投与した鶏では、経口投与中抗体価が一旦低下したが、投与終了後に上昇し、6週目においても抗体価6,400倍を有していた。大腸菌で発現させたR7抗原（特許文献1参照）の経口投与鶏においても、抗体価の下げ止まりが観察されたが、投与終了後徐々に抗体価は低下し、6週目では抗体価3,200倍を呈した。以上の試験成績から、Calici-LRE1抗原を発現するジャガイモ葉の経口投与鶏では、大腸菌発現R7抗原のおよそ1／700量の投与抗原量においても、より高い抗体の再誘導が確認されたことから、本キャリアシステム、即ちノーウォークウイルス外被蛋白質と外来抗原を融合させた経口免疫材料は有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上詳述したように、本発明は、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を導入・発現させた植物体を、経口投与することを特徴とする目的ペプチドを生体の目標部位に運搬するためのキャリア手段に係るものであり、例えば、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1等の免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドを発現した組換え植物体によって、従来技術の諸問題を解決することを可能とするものである。
【００５０】
また、本発明は、目的ペプチドを経口投与しても消化管で耐分解性を示し、作用すべき場所である腸管等に到着することが可能な、機能性ペプチドを産生する組換え植物体を提供するものである。目的ペプチド、例えば、免疫原性ペプチド、血圧低下ペプチド等、を産生する、遺伝子組換え植物体を作出するものであり、この機能性ペプチドを産生する植物体を大量に栽培することにより、目的ペプチドを、大量に、経済的に提供することを可能とし、例えば、ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子を発現した植物体を、鶏に、経口投与することにより、鶏のロイコチトゾーン症を予防するために有効な、経口ワクチンキャリアシステムを提供するものである。上記遺伝子を発現した植物体を、鶏に飼料として与えることにより、筋肉内注射によるストレスを与えることがない、簡便な、省力化したワクチンの投与を可能とするものである。更に、本発明は、医療、医薬の技術分野において有用な、機能性ペプチドの産生と、経口投与を可能として新しい技術の創生を可能とするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ジャガイモにおけるCalici-LRE1蛋白質の発現量を示す。
【図２】形質転換ジャガイモの葉における、ウエスタン検定による、発現の確認を示す。
【図３】再分化ジャガイモにおける、ゲノミックＰＣＲによる、Calici-LRE1遺伝子導入の確認を示す。
【図４】本発明のジャガイモを給餌した鶏の抗体検査結果を示す。
【図５】Calici-LRE1遺伝子配列の前半を示す。
【図６】Calici-LRE1遺伝子配列の後半を示す。
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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