(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んで成るヒトＡｋｔ−３タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２】
ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１もしくは２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１もしくは２に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んで成るヒトＡｋｔ−３タンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる、ヒトＡｋｔ−３タンパク質。
【請求項７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列から成る、請求項６に記載のヒトＡｋｔ−３タンパク質。
【請求項８】
請求項２もしくは３に記載の核酸分子を含んで成る発現ベクター。
【請求項９】
誘導可能なプロモーターを含んで成る、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
レポーター分子をコードする配列を含んで成る、請求項８もしくは９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされた宿主細胞もしくは生物体（ヒトを除く）。
【請求項１２】
請求項５ないし７のいずれかに記載のヒトＡｋｔ−３タンパク質を発現することが可能な導入遺伝子を含んで成るトランスジェニックの細胞、組織もしくは生物体（ヒトを除く）。
【請求項１３】
請求項１１もしくは１２に記載の細胞もしくは生物体（ヒトを除く）から発現されたヒトＡｋｔ−３タンパク質。
【請求項１４】
請求項５ないし７のいずれかに記載のヒトＡｋｔ−３タンパク質の活性に影響する作用物質の同定方法であって、試験化合物およびリン酸供給源の存在下で前記ヒトＡｋｔ−３タンパク質をそのための基質と接触させる工程、ならびに前記基質のいかなるリン酸化についてもモニターする工程を含んで成る前記方法。
【請求項１５】
Ａｋｔ−３タンパク質が、既知の基質をリン酸化することが可能なドメインを有する融合もしくはエピトープ標識されたタンパク質として提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａｋｔ−３タンパク質がＧＳＴおよびヒトＡｋｔ−３の融合分子として提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項５ないし７のいずれかに記載のヒトＡｋｔ−３タンパク質の活性に影響する作用物質の同定方法であって、リン脂質を、試験されるべき作用物質の存在下で請求項５ないし７のいずれかに記載のヒトＡｋｔ−３タンパク質のＰＨドメインと接触させる工程と、および前記リン脂質の前記Ａｋｔ−３タンパク質の前記ＰＨドメインとのいかなる結合もモニターする工程を含んで成る前記方法。
【請求項１８】
リン脂質がホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）放射標識されたリン酸供給源および試験されるべき化合物の存在下で、請求項５ないし７のいずれかに記載のＡｋｔ−３タンパク質をその基質と接触させる工程、
ｂ）反応を停止する工程
ｃ）ホスホセルロース陽イオン交換紙を通して反応混合物を濾過する工程、ならびに
ｄ）前記化合物と接触されていない対照に比較した前記濾紙からのシグナルをモニターする工程
を含んで成る、前記Ａｋｔ−３活性を調節する化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、「Ａｋｔ−３」と命名された新たなヒトセリン／トレオニンキナーゼのクローニングおよび発現、ならびにとりわけＡｋｔ−３タンパク質をコードする核酸分子、タンパク質それ自身および細胞の生存を阻害するのに使用することができる化合物に関する。
【０００２】
多くの癌細胞の特徴的特徴は接着と独立に成長するそれらの能力である。対照的に、形質転換されない内皮細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に接着することを予防される場合に、それらはアポトーシスをうける（フリッシュ（Ｆｒｉｓｃｈ）とフランシス（Ｆｒａｎｃｉｓ）、１９９４；メレディス（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ）ら、１９９３）。正常に接着する細胞がＥＣＭに接着することができない場合にそれらがアポトーシスをうけるきっかけとなる過程は「アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）」と命名され（フリッシュ（Ｆｒｉｓｃｈ）とルオスラーティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）、１９９７）、そして生存因子の除去の細胞に対する効果の一例である。接着分子によるシグナル伝達の変化はアノイキスに対する抵抗性につながる可能性があり（フリッシュ（Ｆｒｉｓｃｈ）とルオスラーティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）、１９９７）、そして、これは、それにより接着と独立して成長する癌細胞がアノイキスを回避することが可能である機構に寄与することができる。
【０００３】
Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）もしくは「ＡおよびＣタンパク質キナーゼに関連する（ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ａ  ａｎｄ  Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）」（ＲＡＣ−ＰＫ）としてもまた知られる）は、生存細胞の調節に関係しているセリン／トレオニンキナーゼである（クヮヤ（Ｋｈｗａｊａ）ら、１９９７；デュデク（Ｄｕｄｅｋ）ら、１９９７；カウフマン・ゼー（Ｋａｕｆｆｍａｎｎ−Ｚｅｈ）ら、１９９７；ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７；ダッタ（Ｄａｔｔａ）ら、１９９７；マルテ（Ｍａｒｔｅ）とダウンワード（Ｄｏｗｎｗａｒｄ）、１９９７）。Ａｋｔは、ＥＣＭからの分離（アノイキス；クヮヤ（Ｋｈｗａｊａ）ら、１９９７）ならびに生存因子の除去（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７；アーメド（Ａｈｍｅｄ）ら、１９９７；デュデク（Ｄｕｄｅｋ）ら、１９９７；カウフマン・ゼー（Ｋａｕｆｆｍａｎ−Ｚｅｈ）ら、１９９７；フィルポット（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ）ら、１９９７；クラウダー（Ｃｒｏｗｄｅｒ）とフリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、１９９８；イヴス（Ｅｖｅｓ）ら、１９９８）もしくは照射（クーリック（Ｋｕｌｉｋ）ら、１９９７）により誘発されるアポトーシスを阻害することが可能である。
【０００４】
Ａｋｔは、脂質結合に関与するＮＨ2−末端のプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメイン、キナーゼドメインおよびＣＯＯＨ末端の「尾（ｔａｉｌ）」を含んで成る。Ａｋｔは、原形質膜への動員、および２種の上流のキナーゼＰＤＫ−１およびＰＤＫ−２によるその後のリン酸化により活性化されると考えられている（コファー（Ｃｏｆｆｅｒ）ら、１９９８；アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、１９９８に概説されている）。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ  ３−キナーゼ）により生成される３−ホスホイノシチドのＡｋｔのＰＨドメインへの結合は、原形質膜への移動を促進し、そしてＴｈｒ308でのＰＤＫ−１によるＡｋｔ−１の（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６；アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９７；スティーヴンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）ら、１９９８）もしくはＴｈｒ309でのＡｋｔ−２の（マイヤー（Ｍｅｉｅｒ）ら、１９９７）リン酸化を助長すると考えられている。完全な活性化は、Ｔｈｒ308のリン酸化に加えてＡｋｔ−１のＳｅｒ473（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６）もしくはＡｋｔ−２のＳｅｒ474（マイヤー（Ｍｅｉｅｒ）ら、１９９７）でのＣＯＯＨ尾のリン酸化を必要とする。Ｓｅｒ473／Ｓｅｒ474のリン酸化の原因である酵素は、元はＰＤＫ−２と名付けられたが、しかし最近はインテグリン連結キナーゼ（ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）ＩＬＫ（デルコメンヌ（Ｄｅｌｃｏｍｍｅｎｎｅ）ら、１９９８）がこの機能の候補として現れている。
【０００５】
Ａｋｔの２種のヒトのアイソフォーム、Ａｋｔ−１およびＡｋｔ−２が今日までに記述されている（コファー（Ｃｏｆｆｅｒ）とウッドゲット（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ）、１９９１；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９１；チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、１９９２）。第三のアイソフォーム（ここでＡｋｔ−３と称される）がラットで記述されている（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５）。このラットＡｋｔ−３は明らかに短縮された尾を所有しそしてそれによりＳｅｒ473を欠くため、その調節はＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２のものと異なるかも知れない。Ａｋｔ−１およびＡｋｔ−２双方は広範に発現されるが、Ａｋｔ−２の発現は肝および骨格筋のようなインスリン応答性の組織で最も顕著である（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９４；アルトメア（Ａｌｔｏｍａｒｅ）ら、１９９５）。Ａｋｔ−１およびＡｋｔ−２は、ラットの脂肪細胞、肝細胞および骨格筋中でインスリンにより活性化される。対照的に、Ａｋｔ−３はこれらの組織中でインスリンにより強く活性化されるようではない（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９８）。インスリンのシグナル伝達における多様なＡｋｔのアイソフォームの役割は、Ａｋｔ−１もしくはＡｋｔ−２の活性を阻害する化合物の有用性を制限するかも知れない。なぜなら、こうした作用物質は糖尿病の患者で観察される症状を誘発するかも知れないからである。われわれは、Ａｋｔ−３の選択的阻害剤を使用することによりこの問題が回避されるかも知れないと仮説を立て、そして、このことはわれわれを促してラットＡｋｔ−３のヒト類似物を同定させた。
【０００６】
本発明者らは、今や、Ａｋｔ−３のヒトのアイソフォームをコードする核酸分子を同定かつ特徴づけした。意義あることに、ヒトＡｋｔ−３は、Ａｋｔ−１／Ａｋｔ−２の活性化に既に関係づけられているがしかしラットＡｋｔ−３タンパク質に存在しないＳｅｒ473／Ｓｅｒ474に類似のアミノ酸残基を含有するＣＯＯＨ末端の尾を所有する。
【０００７】
従って、本発明の第一の局面により、図２に示されるアミノ酸配列を含んで成るヒトＡｋｔ−３またはその機能的同等物、誘導体もしくは生物前駆物質（ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）をコードする核酸分子が提供される。好ましくは、該分子はＤＮＡ分子、そしてなおより好ましくはｃＤＮＡ分子であり、かつ、なおより好ましくは図１に示されるヌクレオチドの配列を含んで成る。本発明の本局面により、高ストリンジェンシー条件下で本発明の分子にハイブリダイズすることが可能な核酸分子もまた提供される。
【０００８】
本明細書で使用されるところのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸が安定である条件を指す。ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは、式：
８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］＋０．４１（ＧおよびＣの％）−６００／ｌ
により近似することができ、
ここで、ｌはヌクレオチドのハイブリッドの長さである。Ｔｍは、配列の相同性の１％の低下ごとにおよそ１〜１．５℃だけ低下する。
【０００９】
「ストリンジェンシー」という用語は、その中で、一本鎖核酸中のプリンもしくはピリミジン塩基が水素結合形成によりそれらの対応する塩基と対をなす場合に一本鎖核酸が相補鎖と結合するハイブリダイゼーション条件を指す。高ストリンジェンシー条件は相同的塩基対形成に好都合である一方、低ストリンジェンシー条件は非相同的塩基対形成に好都合である。
【００１０】
「低ストリンジェンシー」条件は、例えば約３７℃もしくはより低い温度、約５０％未満のホルムアミド濃度、および中程度ないし低塩（ＳＳＣ）濃度；あるいは、約５０℃もしくはより低い温度、および中程度ないし高塩（ＳＳＰＥ）濃度、例えば１Ｍ  ＮａＣｌを含んで成る。
【００１１】
「高ストリンジェンシー」条件は、例えば、約４２℃もしくはより低い温度、約２０％未満のホルムアミド濃度、および低塩（ＳＳＣ）濃度；あるいは、約６５℃もしくはより低い温度、および低塩（ＳＳＰＥ）濃度を含んで成る。例えば、高ストリンジェンシー条件は、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのハイブリダイゼーションを含んで成る（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、１９８９；グリーン  インク（Ｇｒｅｅｎ  Ｉｎｃ．）ニューヨーク、２．１０．３）。
【００１２】
「ＳＳＣ」はハイブリダイゼーションおよび洗浄の溶液を含んで成る。ストック２０×ＳＳＣ溶液は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する。
【００１３】
「ＳＳＰＥ」はハイブリダイゼーションおよび洗浄の溶液を含んで成る。１×ＳＳＰＥ溶液は、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含有する。
【００１４】
本発明の核酸分子にハイブリダイズすることが可能な核酸は、一般に、本発明のヌクレオチド配列に最低８５％、好ましくは最低９０％およびなおより好ましくは最低９５％相同であることができる。
【００１５】
有利には、本発明のＤＮＡ分子を、適する宿主中でコードされるポリペプチドをそれから発現するのに適する発現ベクター中に包含することができる。
【００１６】
本発明は、その範囲内に、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質もしくはポリペプチド、またはその機能的同等物、誘導体もしくは生物前駆物質もまた含んで成る。
【００１７】
本発明の発現ベクターは、前記ＤＮＡフラグメントの発現を達成することが可能であるプロモーター領域のような調節配列に操作可能に連結された本発明の核酸を有するベクターを包含する。「操作可能に連結される」という用語は、記述される成分がそれらの意図された様式でそれらを機能させる関係にある並置を指す。こうしたベクターは、本発明のポリペプチドの発現を提供するため適する宿主細胞に形質転換することができる。従って、さらなる一局面において、本発明は、該ポリペプチドをコードするコーディング配列のベクターによる発現を提供する条件下で上述されたような発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされた宿主細胞を培養すること、および発現されたポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１８】
ベクターは、例えば、複製開始点、場合によっては前記ヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および場合によってはプロモーターの調節物質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）とともに提供されるプラスミド、ウイルスもしくはファージベクターであってよい。ベクターは、例えばアンピシリン耐性のような１種もしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有してよい。
【００１９】
発現に必要とされる調節要素は、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、ならびに転写開始のためにシャイン・ダルガーノ配列および開始コドンＡＵＧを包含することができる。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種もしくは同種のプロモーター、下流のポリアデニル酸化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボソームの分離のための終止コドンを包含することができる。こうしたベクターは商業的に得てよいか、もしくは、記述される配列から当該技術分野で公知の方法により集成してよい。
【００２０】
アンチセンスＲＮＡの製造を提供するために、本発明の核酸分子をアンチセンスの向きで記述されるベクターに挿入してよい。アンチセンスＲＮＡもしくは他のアンチセンス核酸は合成手段により製造してよい。
【００２１】
本発明により定義される核酸は、同一の核酸のみならず、しかしとりわけ保存的アミノ酸置換中の縮重暗号による同義コドン（同一のアミノ酸残基を明記する異なったコドン）をもたらす塩基の置換を包含するいずれかの小さな塩基の変異もまた包含する。「核酸配列」という用語は、塩基の変異に関して与えられるいかなる一本鎖配列に対する相補的配列もまた包含する。
【００２２】
本発明は、本発明の核酸の最低およそ１０個の連続するヌクレオチド、および好ましくは１０から１２０まで、およびなおより好ましくは１０からおよそ５０ヌクレオチドまでの核酸配列もまた有利に提供する。これらの配列は、複製を開始するためのプローブもしくはプライマーなどとして有利に使用してよい。こうした核酸配列は、組換えもしくは合成手段によるように当該技術分野で公知の技術に従って製造してよい。それらは、本発明の核酸の存在を検出するための診断キットなどでもまた使用してよい。これらの試験は、ハイブリダイズする条件下でサンプルとプローブを接触させること、およびプローブとサンプル中のいずれかの核酸との間のいかなる二重鎖もしくは三重鎖の形成の存在についても検出することを一般に含んで成る。
【００２３】
本発明により、これらのプローブは固体支持体に固定してよい。好ましくは、それらは複数のプローブが単一の生物学的サンプルに同時にハイブリダイズすることができるように一列上に存在する。該プローブは列上にスポットすることができるか、もしくは列上でインシトゥに合成することができる（ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１４、１９９６年１２月、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ”を参照されたい）。単一の列は別個の位置で１００、５００もしくはなお１，０００以上の異なるプローブを含有することができる。
【００２４】
有利には、本発明の核酸配列は、例えばＰＣＲクローニング機構を使用するようなこうした組換えもしくは合成手段を使用して製造することができ、その機構は、一般に、およそ１０ないし５０ヌクレオチドからクローン化することが望ましい遺伝子の一領域までであることができる一対のプライマーを作成すること、該プライマーをｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはヒト細胞からのゲノムＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、増幅された領域もしくはフラグメントを単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを必要とする。一般に、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８９）に記述されるような本明細書で定義されるような技術は、当該技術分野で公知である。
【００２５】
本発明の核酸もしくはオリゴヌクレオチドは顕示する標識を運搬してよい。適する標識は、32Ｐもしくは35Ｓのような放射性同位元素、酵素標識またはビオチンのような他のタンパク質標識、あるいは蛍光マーカーを包含する。こうした標識を本発明の核酸もしくはオリゴヌクレオチドに付加してよく、そしてそれ自体既知の技術を使用して検出することができる。
【００２６】
本発明のさらなる一局面は、図２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る、ヒトＡｋｔ−３またはその機能的同等物、誘導体もしくは生物前駆物質を含んで成る。
【００２７】
本発明によりヒトＡｋｔ−３と呼称されるポリペプチドは、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドを包含しかつ保存的アミノ酸変化を有する、前記分子によりコードされる全部の可能なアミノ酸変異体を包含する。本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドに実質的に相同である天然に存在する対立遺伝子変異体を包含するこうした配列の変異体をさらに包含する。この状況において、実質的な相同性は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドと最低９０％のアミノ酸相同性、そしてなおより好ましくは最低９５％のアミノ酸相同性を有する配列とみなされる。
【００２８】
本発明の核酸分子もしくはヒトＡｋｔ−３は、癌などのようなＡｋｔ−３活性を伴う疾患を治療するための医薬としてもしくは医薬の製造において有利に使用することができる。
【００２９】
有利には、本発明の核酸分子もしくはポリペプチドは、そのための製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤と一緒の製薬学的組成物で提供してよい。
【００３０】
本発明は、さらに、アンチセンス技術の使用によるインビボでのＡｋｔ−３の阻害に向けられる。アンチセンス技術は、三重鎖形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより遺伝子発現を制御するのに使用することができ、その方法の双方はＤＮＡもしくはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明のタンパク質をコードする成熟タンパク質配列の５’コーディング部分を使用して、長さが１０から４０塩基対までのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の一領域に相補的であるように設計し（三重鎖――リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃｏｏｎｅｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびデルヴァン（Ｄｅｒｖａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３６０（１９９１）を参照されたい）、それによりＡｋｔ−３の転写および産生を予防する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＡｋｔ−３への翻訳を遮断する（アンチセンス――岡野（Ｏｋａｎｏ，Ｊ．）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  プレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボカレイトン（１９９８））。
【００３１】
あるいは、上述されたオリゴヌクレオチドを、アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡをインビボで発現して上述された様式でＡｋｔ−３の産生を阻害することができるような当該技術分野の手順により細胞に送達することができる。
【００３２】
従って、Ａｋｔ−３に対するアンチセンス構築物は、細胞の生存を阻害しそしてさらなる癌もしくは腫瘍の成長を予防することができる。
【００３３】
本発明のさらなる一局面によれば、本発明のヒトＡｋｔ−３タンパク質を発現することが可能な導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含んで成るトランスジェニックの細胞、組織もしくは生物体もまた提供される。本明細書で使用されるところの「発現が可能な導入遺伝子」という用語は、ヒトＡｋｔ−３または同一の機能および／もしくは活性を有するヒトタンパク質の発現につながる適する核酸配列を意味する。導入遺伝子は、例えば、ヒト細胞から単離されたゲノム核酸、またはゲノム中に組み込まれたもしくは染色体外の状態のＤＮＡを包含する合成核酸を包含してよい。好ましくは、導入遺伝子は、本明細書に記述されるような本発明のタンパク質をコードする核酸配列、もしくは前記核酸の機能的フラグメントを含んで成る。前記核酸の機能的フラグメントは、本発明のタンパク質、あるいは前記タンパク質の機能的同等物、誘導体もしくは優性ネガティブ突然変異体のような非機能的誘導体または生物前駆物質をコードする前記核酸を含んで成る遺伝子のフラグメントを意味すると解釈すべきである。例えば、慣例の技術を使用して、前記核酸によりコードされるタンパク質配列に影響を及ぼさない、もしくは本発明の機能的タンパク質をコードするヌクレオチドの置換もしくは欠失を使用してよいことが当業者に容易に明らかであろう。
【００３４】
前記トランスジェニックの細胞、組織もしくは生物体により発現されたヒトＡｋｔ−３タンパク質、または前記タンパク質の機能的同等物もしくは生物前駆物質もまた本発明の一部を形成する。
【００３５】
ヒトＡｋｔ−３に対する抗体は、有利には、当該技術分野で既知である技術により製造してよい。例えば、マウスのような宿主動物に本発明のヒトＡｋｔ−３もしくはそのエピトープを接種すること、および免疫血清を回収することによりポリクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｒ．）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．）、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６、４９５−４９７により記述されるような既知の技術に従って製造することができる。
【００３６】
本発明の抗体は、本発明のヒトＡｋｔ−３の存在の検出方法でもまた使用することができ、その方法は、抗体をサンプルと反応させること、および前記抗体に結合されたいかなるタンパク質も同定することを含んで成る。前記方法を実施するために、本発明の抗体および前記サンプルと抗体を反応させるための手段を含んで成るキットもまた提供することができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質は、例えばチエン（Ｃｈｉｅｎ）ら（１９９１）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２により最初に提案された２ハイブリッドベクター系を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検討することにより同定することができる。
【００３８】
本技術は、レポーター遺伝子を活性化する転写因子のインビボでの機能の再構成に基づく。より具体的には、該技術は、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含んで成るＤＮＡ構築物を適切な宿主細胞に提供すること、本発明の核酸配列のフラグメントもしくは全部および転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメインもしくは前記活性化ドメインのいずれかの第一の融合をコードする第一のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞中で発現させること、第一の融合に組み込まれていない転写因子のＤＮＡ結合ドメインもしくは活性化ドメインと一緒に、検討されるべき推定の結合タンパク質をコードするライブラリーなどのような最低１種の第二のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主中で発現させること；宿主細胞中のいかなるレポーター遺伝子産物の存在についても検出することにより本発明のタンパク質との検討されるべきタンパク質のいかなる結合も検出すること；場合によっては結合タンパク質をコードする第二のハイブリッドＤＮＡ配列を単離することを含んで成る。
【００３９】
こうした技術の一例は酵母のＧＡＬ４タンパク質を利用する。ＧＡＬ４は酵母中の果糖代謝の転写のアクチベーターであり、そして果糖を代謝する遺伝子の上流のアクチベーターに結合する別個のドメイン、ならびにタンパク質結合ドメインを有する。その１つがＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド残基を含んで成るヌクレオチドベクターを構築することができる。これらの結合ドメイン残基を、例えば本発明の核酸のような既知タンパク質のコーディング配列に融合してよい。他のベクターは、ＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードする残基を含んで成る。これらの残基を、試験タンパク質をコードする残基に融合する。本発明の核酸によりコードされるポリペプチドと試験されるべきタンパク質との間のいかなる相互作用も、ベクターが形質転換されているＧＡＬ−４転写欠損酵母細胞でのレポーター分子の転写活性化につながる。好ましくは、β−ガラクトシダーゼのようなレポーター分子は酵母の果糖代謝遺伝子の転写の回復に際して活性化される。
【００４０】
本発明のさらなる一局面は、生存細胞のヒトＡｋｔ−３媒介性の促進を選択的に阻害する化合物の同定方法を提供し、前記方法は、ｉ）Ａｋｔ−３経路を活性化する発現ベクターで形質転換された細胞を提供すること［この細胞は、前記ベクターで形質転換されておらずかつ生存因子の非存在下で死ぬことができる対照細胞に比較して、前記生存因子の存在もしくは非存在下で生存する］、ｉｉ）前記細胞を、前記生存因子からの前記細胞の取り出し後に試験化合物と接触させること［ここで、前記形質転換された細胞の死が、生存を促進するヒトＡｋｔ−３経路に対する前記化合物の選択的阻害を暗示する］を含んで成る。
【００４１】
あるいは、Ａｋｔ−３の生存促進活性は、ｉ）Ａｋｔ−３経路を活性化する発現ベクターで形質転換されていない対照細胞に加えて、前記ベクターで形質転換された細胞を提供すること、ｉｉ）前記細胞のそれぞれを死亡誘発剤と接触させること［それにより、前記対照細胞の死および前記形質転換された細胞の生存が、活性化されたＡｋｔ−３経路の生存促進活性を暗示する］、ｉｉｉ）その後、前記形質転換された細胞を、前記死亡誘発剤の除去を伴わずに試験化合物と接触させること［ここで、前記細胞の死が、生存を促進するヒトＡｋｔ−３経路に対する前記化合物の選択的阻害を暗示する］により評価することができる。
【００４２】
本発明は、さらなる一局面において、その基質、調節分子もしくは代理物とヒトＡｋｔ−３タンパク質を接触させること、および当該技術分野で公知の標準的リン酸化アッセイもしくは結合アッセイを使用して試験物質との相互作用をモニターすることを含んで成る、前記タンパク質の活性に影響を及ぼす作用物質の同定方法を提供する。
【００４３】
ヒトＡｋｔ−３に対する抗体に加えて、本発明の本局面により同定される化合物は、本発明のヒトＡｋｔ−３タンパク質の発現を伴う疾患を治療するための医薬としてあるいは医薬の製造において有利に利用してよい。
【００４４】
本発明のさらなる一局面は、そのための製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤と一緒に本発明の化合物、アンチセンス分子もしくは抗体のいずれかを含んで成る製薬学的組成物を提供する。
【００４５】
アンチセンス分子、または実際に本発明の核酸もしくはポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストと同定された化合物は、当該技術分野で公知の手順に従って製造してよい製薬学的組成物の形態で使用してよい。好ましい組成物は、例えば生理学的生理的食塩水溶液のような製薬学的に許容できるベヒクルもしくは希釈剤もしくは賦形剤を包含する。他の非毒性の塩、滅菌水などを包含する他の製薬学的に許容できる担体もまた使用してよい。組成物を凍結乾燥しそしてその後の投与のための滅菌水の添加による再構成に先立ち滅菌状態で保存することを可能にする適する緩衝剤もまた存在してよい。治療を必要とする組織中に埋込むことが可能である固体もしくは半固形の生物学的に適合するマトリックスへの本発明のポリペプチドの組込みを実施してよい。
【００４６】
担体は、ｐＨ、浸透圧、粘度、滅菌性、凍結乾燥性、溶解性などのような他の条件を改変するための他の製薬学的に許容できる賦形剤もまた含有することができる。
【００４７】
投与後の持続性もしくは遅延性の放出を可能にする製薬学的に許容できる賦形剤もまた包含してよい。
【００４８】
本発明のポリペプチド、核酸分子もしくは化合物は経口で投与してよい。この態様において、それらは、当業者に公知であるとみられる固体の投薬形態中で被包化しかつ適する担体と組み合わせてよい。
【００４９】
当業者に公知であるとみられるとおり、使用されるべき特定の投与経路に依存して、患者の体表面積もしくは占有されるべき体腔の容積に従って特定の投薬型を計算してよい。しかしながら、実際に投与される組成物の量は、症状の重篤度、投与されるべき組成物、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに選ばれた投与経路のような、治療されるべき障害に関する状況に基づいて実地医により決められるであろう。
【００５０】
本発明は、純粋に例示する以下の実施例および付随する図面への言及でより明瞭に理解することができる。
材料および方法
オリゴヌクレオチド合成およびＤＮＡ配列の決定
全部のプライマーはユーロゲンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ベルギー・セライングから得た。挿入物特異的な配列決定プライマー（１５および１６ｍｅｒ）はＤＮＡ配列の目視により設計した。ＤＮＡは、キアゲンチップ２０（Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ−２０）カラムもしくはキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）スピンカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＧｍｂＨ、ドイツ・デュッセルドルフ）で調製し、そしてスピンカラムから３０μｌのトリス／ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ナトリウム塩））中に回収した。配列決定反応は、ビッグダイ［ＢｉｇＤｙｅ］（商標）ターミネーター循環配列決定即時反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＡＢＩ部門、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して実施し、そしてアプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７７ＤＮＡシークェンサー（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＡＢＩ部門、米国カリフォルニア州フォスターシティ）で分析した。
ヒトＡｋｔ−３の分子クローニング
クエリ配列としてラットＲＡＣ−ＰＫγ配列（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｄ４９８３６）を使用して、ウォッシュＵ  メルク（ＷａｓｈＵ  Ｍｅｒｃｋ）の発現された配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）（ＥＳＴ）データベース（レノン（Ｌｅｎｎｏｎ）ら、１９９６）および占有のライフシーク［ＬｉｆｅＳｅｑ］（商標）ヒトＥＳＴデータベース（インサイト  ファーマシューティカルズ  インク（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）、米国カリフォルニア州パロアルト）でＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０）サーチを実施した。ラットＲＡＣ−ＰＫγと高い類似性をもつ数個のヒトＥＳＴクローンを同定した。海馬のｃＤＮＡライブラリー由来の１個のＥＳＴ配列（インサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）受託番号２５７３４４８）が、推定のメチオニン開始コドン（ＡＴＧ）を包含するコーディング配列の一部および５’非翻訳領域の一部を含有した。開始コドンは、翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列により取り巻かれ、また、同じ読み枠の終止コドンが位置−６ないし−３に存在した。この２３９ｂｐの配列に基づき、ｃＤＮＡ端の３’迅速増幅（３’ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）（３’ＲＡＣＥ）実験のためのオリゴヌクレオチドセンスプライマー、すなわちＡｋｔ−３ｓｐ１＝５’−ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’およびＡｋｔ−３ｓｐ２＝５’ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  Ｃ−３’ を合成した。３’ＲＡＣＥ実験は、一次ＰＣＲのプライマーとしてＡｋｔ−３ｓｐ１／ｒａｃｅ−ａｐ１およびネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲでＡｋｔ−３ｓｐ２／ｒａｃｅ−ａｐ２を使用し、製造元の説明書に従って、ヒト胎児脳もしくはヒト小脳のマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック  ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト）で実施した。生じるＰＣＲフラグメントをクローン化かつ配列決定した。これはＡｋｔ−３のコーディング配列を９１６ｂｐだけ伸長したが、しかし、新規配列は同じ読み枠の終止コドンを包含しなかった。第二回の３’ＲＡＣＥ増幅は、それぞれｒａｃｅ−ａｐ１およびｒａｃｅ−ａｐ２と組み合わせで、第一回で得られた配列に基づくセンスプライマー（Ａｋｔ−３ｓｐ３＝５’ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＧＧ−３’およびＡｋｔ−３ｓｐ４＝５’ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  Ｇ−３’）を使用して、ヒト脳マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡで実施した。得られた配列は、同じ読み枠の終止コドンおよびポリ（Ａ）尾までの３’非翻訳配列を包含した。３’非翻訳領域に基づきアンチセンスプライマーを設計し（Ａｋｔ−３ａｐ４＝５’−ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＡ  ＧＧ−３’およびＡｋｔ−３ａｐ５＝５’ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  ＧＧ−３’）、そして、プライマーとしてＡｋｔ−３ｓｐ１／Ａｋｔ−３ａｐ４（一次ＰＣＲ）およびＡｋｔ−３ｓｐ２／Ａｋｔ−３ａｐ５（ネステッドＰＣＲ）を使用してヒト海馬ｃＤＮＡから完全なＡｋｔ−３コーディング配列を増幅した。生じる１２００ｂｐのＰＣＲフラグメントをその後ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ２．１（元はＴＡクローニングキット、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＢＶ、オランダ・レーク）にクローン化し、そして数クローンの挿入物を完全に配列決定した。確認された配列をもつ１個の挿入物を含有する１クローン（ｈＡｋｔ−３／ｐＣＲ２．１）を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ−３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へのその後のサブクローニングに使用して、構築物ｈＡｋｔ−３／ｐｃＤＮＡ−３を生じた。ＣＯＯＨ末端標識されたＡｋｔ−３タンパク質をコードする構築物を作成するため、Ａｋｔ−３配列のアミノ酸４７９の後にＸｈｏＩ制限部位およびヘマグルチニン（ＨＡ）標識をコードする配列（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を組み込むアンチセンスプライマーを使用して、５５３ｂｐのフラグメントをプラスミドＡｋｔ−３／ｐｃＤＮＡ−３から増幅した。ＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してプラスミドｈＡｋｔ−３／ｐｃＤＮＡ−３にこのフラグメントを再クローン化して、構築物ＨＡ−ｈＡｋｔ−３／ｐｃＤＮＡ−３を生じた。
Ａｋｔ−３の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のための構築物および突然変異体
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でヒトＡｋｔ−３タンパク質を発現させるため、５’および３’端にそれぞれＥｃｏＲＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位を導入するプライマーを使用して、完全なＡｋｔ−３コーディング配列をプラスミドｈＡｋｔ−３／ｐＣＲ２．１から増幅した。このＰＣＲフラグメントをベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、スウェーデン・ウプサラ）中にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して構築物ｈＡＫＴ−３（ＷＴ）／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３を生じ、そして挿入物の配列を配列分析により確認した。
【００５１】
製造元の説明書に従ってクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、この構築物の突然変異体を作成した。位置９２３−９２５のＡＣＡをＧＡＣに突然変異することによりＴ３０５Ｄ突然変異体（構築物ｈＡＫＴ−３（Ｔ３０５Ｄ）／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３）を創製し、生じるタンパク質中でＴｈｒ305のＡｓｐへの突然変異をもたらした。変更を組み込む長いアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲを使用して位置１４０４−１４０５のＴＣをＧＡに変更することにより、Ｓ４７２Ｄ突然変異体（構築物ｈＡＫＴ−３（Ｓ４７２Ｄ）／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３）を創製し、生じるタンパク質中のＳｅｒ472のＡｓｐへの突然変異をもたらした。二重突然変異体もまたｈＡＫＴ−３（Ｓ４７２Ｄ）／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３での部位特異的突然変異誘発により構築し、そしてこれらの突然変異の双方を含有した（構築物ｈＡＫＴ−３（Ｔ３０５Ｄ／Ｓ４７２Ｄ）／ｐＧＥＸ−４Ｔ−３）。全部の生じる構築物の挿入物を完全配列分析により確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのこれらの構築物の発現から生じる融合タンパク質は、ヒトＡｋｔ−３配列のＮＨ2−末端に結合されたＧＳＴ部分を含有する。
Ｃｏｓ−７細胞およびＨＥＫ−２９３細胞中での発現
構築物ＨＡ−ｈＡｋｔ−３／ｐｃＤＮＡ−３での細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、Ａｋｔ−３をＣｏｓ−７中で一過性に発現した。細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１で３０分間刺激し、溶解し、そしてｍＡｂ  １２ＣＡ５を用いてＡｋｔ−３を免疫沈降した。Ａｋｔ−３活性を下述されるとおり評価した。
【００５２】
ＨＥＫ−２９３細胞中での発現のため、既に記述された（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら  １９９６）とおりｐＣＤＮＡ−３  Ａｋｔ−３構築物で細胞をトランスフェクションした。ＩＧＦでの刺激後に細胞を溶解し（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら  １９９６）、そして抗体３Ｆ１０（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））でＨＡ−Ａｋｔを免疫沈降した。Ａｋｔ活性は、記述されるとおり、１μＭのＰＫＩ（ＰＫＡ阻害剤）および１μＭのＧＦ  １０９３０２Ｘ（ＰＫＣ阻害剤）の存在下でペプチド基質（クロスタイド（Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ））のリン酸化を測定することにより、免疫複合体中で評価した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での野生型および突然変異体のＡｋｔ−３の発現およびアッセイ
ｐＧＥＸ発現構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１  ＤＥ３に形質転換し、そして、製造元の説明書（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、スウェーデン・ウプサラ）に従って、野生型および突然変異されたＡｋｔ−３のＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース上で精製した。ビーズから溶出されたタンパク質を−２０℃で５０％グリセロール中に保存した。２５μｌの総体積中に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌヒストンＨ２Ｂ（ｐＨ７．０）を含有しかつ１０μＣｉの［γ−32Ｐ］−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する緩衝液中で、０．８μｇの精製された酵素を（別の方法で示されない限り）室温で３０分間インキュベートすることにより、Ａｋｔ活性を評価した。最初の実験は、反応が最低４５分間、時間とともに直線的であったことを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプル緩衝液２５μｌの添加により反応を停止した。１５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、結果をリン画像形成装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）で定量した。
染色体マッピング研究
本質的に記述された（ヘン（Ｈｅｎｇ）ら、１９９２；ヘン（Ｈｅｎｇ）とツイ（Ｔｓｕｉ）、１９９３）ような蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を使用して、シーＤＮＡ（ＳｅｅＤＮＡ）バイオテック  インク（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）、カナダ・トロントにより染色体マッピング研究を実施した。簡潔には、ヒトリンパ球を、細胞集団中で細胞周期に同時性をもたせる０．１８ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）での処理前に６８〜７２時間、３７℃で培養した。同時性をもたされた細胞を洗浄し、そして３７℃で６時間再培養した。細胞を収穫し、そして低張処理、固定および風乾を包含する標準的手順を使用してスライドガラスを調製した。Ａｋｔ−３のｃＤＮＡプローブ（クローンｈＡｋｔ−３／ｐｃＤＮＡ−３の１．４４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント）をビオチニル化し、そしてＦＩＳＨ検出に使用した。スライドガラスを５５℃で１時間焼き、Ｒｎアーゼで処理し、そして、７０℃で２分間、２×ＮａＣｌ／Ｃｉｔ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸二ナトリウム、ｐＨ７．０）中７０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドで変性させ、次いでエタノール中で脱水した。プローブは、変性された染色体のスライドガラスへの負荷の前に変性させた。一夜のハイブリダイゼーション後にスライドガラスを洗浄し、そしてＦＩＳＨシグナルおよび４’，６−ジアミジオノ−２−フェニルインドールバンド形成パターンを写真フィルム上に別個に記録し、そして、ＦＩＳＨシグナルの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールでバンド形成された染色体との重ね合わせにより、染色体のバンドを伴うＦＩＳＨマッピングデータの割り当てを達成した（ヘン（Ｈｅｎｇ）とツイ（Ｔｓｕｉ）、１９９３）。
ノーザンブロット分析
多様なヒト組織由来のポリ（Ａ）豊富なＲＮＡ２μｇを含有するノーザンブロット（クロンテック  ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト）を、製造元の説明書に従って、３’非翻訳配列の一部に対応するα−32Ｐ−ｄＣＴＰでランダムプライミング標識された（ハイプライム（ＨｉｇｈＰｒｉｍｅ）キット、ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））４５４ｂｐのＮｏｔＩ−ＸｂａＩ  Ａｋｔ−３フラグメント（ヌクレオチド１４０４ないし１８５７）とハイブリダイズさせた。
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析
Ａｋｔ−３からのフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーは、Ａｋｔ−３ｓｐ２＝５’−ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  Ｃ−３’（センスプライマー）およびＡｋｔ−３ａｐ１＝５’−ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣ−３’（アンチセンスプライマー）であり、４２５ｂｐの産物を生じた。陽性対照として、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）のＰＣＲ増幅を、Ｇ３ＰＤＨプライマー、５’−ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＴ−３’（センスプライマー）および５’−ＣＡＴ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ−３’（アンチセンスプライマー）を使用して同一のｃＤＮＡサンプルで実施し、１０００ｂｐのフラグメントを生じた。これらのプライマーを、複数組織ｃＤＮＡパネル（クロンテック  ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））および腫瘍細胞系から調製されたｃＤＮＡでのＰＣＲ増幅に使用した。腫瘍細胞ｃＤＮＡの調製のため、細胞をホモジェナイズし、そして製造元の説明書に従ってＲＮイージーミニ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン）を使用して全ＲＮＡを調製した。製造元の説明書に従い、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）15および５０Ｕのエクスパンド［Ｅｘｐａｎｄ］（商標）逆転写酵素（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ・マンハイム）を使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。その後、１μｌのｃＤＮＡで、Ａｋｔ−３特異的もしくはＧ３ＰＤＨ特異的プライマーを用いるＰＣＲ反応を実施した。イーグルアイ（Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ）ＩＩビデオシステム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、臭化エチジウム染色されたゲルの画像を得、そしてイーグルサイト（ＥａｇｌｅＳｉｇｈｔ）ソフトウェアを使用してＰＣＲのバンドを分析した。
Ａｋｔ−３の活性を調節する作用物質を同定するアッセイ
Ａｋｔ−３の活性を調節する作用物質を同定するため、Ａｋｔ−３活性についてのＳＰＡ（シンチレーション近似アッセイ）およびフィルターアッセイを開発した。
【００５３】
ＳＰＡアッセイは、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０の存在下で２５℃で３時間実施した。各アッセイは、１１１ｎＭ  ＧＳＴ−ＡＫＴ−３（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０中で希釈された）、０．７５μＭのビオチニル化されたヒストンＨ２Ｂ、２ｎＭ［γ−33Ｐ］−ＡＴＰおよび試験中のいずれかの作用物質を含有する１００μｌの反応体積中で実施した。１００μｌの停止混合物（５０μＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００および７．５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン被覆されたＰＶＴ  ＳＰＡビーズ）の添加により反応を終了させた。３０分間ビーズを沈降させた後に、アッセイ混合物をマイクロタイタープレートシンチレーション計数器で計数した。結果を図７に示する。
【００５４】
ＡＫＴ３フィルターアッセイは、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０の存在下で２５℃で３時間実施した。各アッセイは、１１１ｎＭ  ＧＳＴ−ＡＫＴ−３（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０中で希釈された）、２．５μＭのヒストンＨ２Ｂ、２ｎＭ［γ−33Ｐ］−ＡＴＰおよび試験中のいずれかの作用物質を含有する１００μｌの反応体積中で実施した。１００μｌの７５ｍＭ  Ｈ3ＰＯ4の添加により反応を終了させた。９０μｌのアッセイ混合物を、ホスホセルロース陽イオン交換紙を通して濾過した。７５μＭ  Ｈ3ＰＯ4で５回洗浄した後に、濾紙をマイクロタイタープレートシンチレーション計数器で計数した。結果を図８に示する。
結果
ヒトＡｋｔ−３の分子クローニング
クエリ配列としてラットＡｋｔ−３配列を使用するライフシーク［ＬｉｆｅＳｅｑ］（商標）およびＥＭＢＬデータベースの類似性の検索は、数個のヒトＥＳＴ配列を生じさせ、これらはラットＡｋｔ−３のヒト相同物の一部をコードした。データベースのＤＮＡ配列情報を使用して、その後の３’ＲＡＣＥ実験でヒトＡｋｔ−３の完全なｃＤＮＡ配列を推定することが可能であった（図１）。得られたｃＤＮＡ配列は５５７７０Ｄａの計算された分子質量をもつ４７９アミノ酸残基の１個のタンパク質をコードした。ヒトＡｋｔ−３タンパク質の最初の４５１アミノ酸は対応するラット配列（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５）に対する２個のみの差異を含有し（位置１０でＡｓｐ（ラット）からＧｌｙ（ヒト）へ、および位置３９６でＰｒｏ（ラット）からＡｌａ（ヒト）へ）、そして１個のプレクストリン相同性ドメイン、１個のキナーゼドメインおよびＣＯＯＨ末端の「尾」をコードする。予測されたＡｋｔ−３（図２）タンパク質は、Ａｋｔ−１（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９１；８３．６％の同一性；８７．８％の類似性）およびＡｋｔ−２（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、１９９２；７８％の同一性；８４．３％の類似性）との有意の類似性を示す。ＣＯＯＨ末端の「尾」はヒトおよびラットのＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２タンパク質双方で観察されているが、しかし、それは唯一の他の報告されたＡｋｔ−３配列（ラットＡｋｔ−３、小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５；受託番号Ｄ４９８３６）で見かけ上短縮されている。多様な組織由来のヒトｃＤＮＡで実施された３’ＲＡＣＥ実験は、ラットＡｋｔ−３に類似であるとみられるより短い形態のＡｋｔ−３の存在についての証拠を生じなかった（データは示されない）。ヒトＡｋｔ−３の尾は２８アミノ酸残基（ＹＤＥＤＧＭＤＣＭＤＮＥＲＲＰＨＦＰＱＦＳＹＳＡＳＧＲＥ）を含んで成り、これはラット配列中の３アミノ酸残基を置き換える（ＣＰＬ）。ヒトＡｋｔ−３の尾は位置４７２（太字で示される）にセリン残基（Ａｋｔ−１のＳｅｒ473もしくはＡｋｔ−２のＳｅｒ474に対応する）を含有する。Ｓｅｒ473およびＳｅｒ474のリン酸化はそれぞれＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２の活性化に既に関係づけられた（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６；マイヤー（Ｍｅｉｅｒ）ら、１９９７）。（キナーゼドメイン中の）Ｔｈｒ308もまたＡｋｔ−１の活性化に関係づけられており、そしてこの残基はヒトＡｋｔ−３でもまた保存されている（Ｔｈｒ305）。
Ａｋｔ−３活性の特徴づけ
Ａｋｔ−３の酵素活性を特徴づけるため、組換え酵素をＧＳＴ融合タンパク質として発現かつ精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製された産物の分析は、該タンパク質が見かけ上＞９０％純粋であったことを示した。精製された酵素はヒストンＨ２Ｂをリン酸化することが可能であり（図３）、そして組換えＧＳＴ単独を使用してリン酸化は観察されなかった。既に、Ａｋｔ−１の酵素活性はＴｈｒ308およびＳｅｒ473のリン酸化により増大されることが示されており、そして（リン酸化を模倣するための）双方のこれらの残基のＡｓｐへの突然変異はＡｋｔ−１を相乗的に活性化する（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６）。Ａｋｔ−３が同様に調節されるかどうかを検討するため、（Ａｋｔ−１のＴｈｒ308およびＳｅｒ473に対応する）Ｔｈｒ305もしくはＳｅｒ472のいずれか、またはＴｈｒ305およびＳｅｒ472の双方をＡｓｐに突然変異したＧＳＴ融合タンパク質を発現し、そして野生型酵素と比較してアッセイした。Ｔｈｒ305のＡｓｐへの突然変異（「Ｔ３０５Ｄ」）はヒストンＨ２Ｂのリン酸化の初期速度の２．０倍の増大をもたらした一方、Ｓｅｒ472のＡｓｐへの突然変異（「Ｓ４７２Ｄ」）は初期速度を１．４倍のみ増大させた（図３Ａ）。Ｔｈｒ305およびＳｅｒ472双方（「Ｔ３０５Ｄ，Ｓ４７２Ｄ」）をＡｓｐに突然変異した場合、初期リン酸化速度の３．２倍の増大が観察された。
【００５５】
細胞外の刺激が哺乳動物細胞でＡｋｔ−３を活性化することができることを確認するため、ＨＡ標識に融合されたＡｋｔ−３をコードするｃＤＮＡでＣｏｓ−７細胞をトランスフェクションした。ＨＡ免疫沈降物のＡｋｔ−３活性は、ＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）での刺激後に１．５および１．９倍（ｎ＝２）増大した。
【００５６】
細胞外の刺激が哺乳動物細胞でＡｋｔ−３を活性化することができることをさらに確認するため、ＨＡエピトープ標識に融合されたＡｋｔ−３をコードするｃＤＮＡでＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクションした。ＩＧＦでの処理に際して、抗ＨＡ免疫沈降物のＡｋｔ−３活性（図３Ｂ）は、トランスフェクションされない細胞でのもののほぼ６０倍上に増大した（図３Ｃ）。Ｔｈｒ305およびＳｅｒ472をアラニンに突然変異させたＡｋｔ変異体はＩＧＦによる活性化に対し無反応性であった。これに一致して、ＩＧＦで刺激された細胞からのＨＡ免疫沈降物のＳｅｒ472リン特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングは、Ｓｅｒ472がＩＧＦでの刺激後にリン酸化されたことを立証した（図３Ｂ）。加えて、Ａｋｔ−３の活性化はＣＹ２９  ４００２（１００μＭ）での前処理により阻害された（９４％阻害、データは示されない）。
【００５７】
ヒトＡｋｔ−３をさらに特徴づけるため、ある範囲のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ阻害剤のＡｋｔ−３を阻害する能力を検討した。これらは、Ｇｏ  ６９７６、ＧＦ−１０９２０３Ｘ（双方はタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤）；Ｈ−８５、Ｈ−８８、Ｈ−８９およびＫＴ５７２０（タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤）、ＫＮ−６２（Ｃａ2+／カルモジュリン依存性キナーゼ阻害剤）ならびにＰＤ  ９８０５９（ＭＥＫ阻害剤）を包含した。１０μＭの濃度で試験された場合、これらの化合物はＡｋｔ−３のＴ３０５Ｄ，Ｓ４７２Ｄ変異体の活性に対し有意の効果を有しなかった。しかしながら、広範なスペクトルのキナーゼ阻害剤スタウロスポリン（ＩＣ50＝２．０±０．３μＭ）およびＰＫＣ阻害剤Ｒｏ  ３１−８２２０（ＩＣ50＝３．２±１．０μＭ）はＡｋｔ−３のＴ３０５Ｄ，Ｓ４７２Ｄ変異体を阻害した（図４）。
Ａｋｔ−３の染色体位置推定
Ａｋｔ−３の完全なコーディング配列をＦＩＳＨ分析のプローブとして使用した。使用された条件下でのハイブリダイゼーション効率はこのプローブについておよそ７５％であった（１００個のチェックされた分裂像（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｆｉｇｕｒｅ）のなかで、それらの７５個が一対の染色体上にシグナルを示した）。特定の染色体を同定するのにＤＡＰＩバンド形成を使用したため、プローブからのシグナルと第１染色体の長腕との間の割り当てを得た。１０枚の写真からの要約に基づいた図で詳細な位置をさらに決定した（図５Ａ）。使用された条件下でのＦＩＳＨ検出により選び出された付加的な遺伝子座は存在せず、従って、Ａｋｔ−３はヒト第１染色体の領域ｑ４３−ｑ４４に配置されると結論した。マッピングの結果の一例を図５Ｂに提示する。
Ａｋｔ−３のｍＲＮＡの組織分布
多様なヒト組織由来のｍＲＮＡでノーザンブロット分析を実施した。Ａｋｔ−３のｍＲＮＡは、類似の発現パターンを示すおよそ４．５ｋｂおよび７．５ｋｂの２種の転写物として検出された（図６Ａ）。Ａｋｔ−３のｍＲＮＡはある範囲の組織で、最も顕著には脳で発現された。同様に、ラットＡｋｔ−３は脳で最も高度に発現される複数の転写物として検出された（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５）。Ａｋｔ−３の最も弱い発現は２種のインスリン応答性組織、骨格筋および肝で観察された。Ａｋｔ−３は、ＳＷ４８０結腸直腸腺癌、Ａ５４９肺癌腫およびＧ３６１黒色腫を包含する多数の癌細胞系でもまた発現された（データは示されない）。
【００５８】
ノーザンブロット分析を確認するため、多様なヒト組織由来のｃＤＮＡでＡｋｔ−３特異的およびＧ３ＰＤＨ特異的（内的対照）プライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した（図６Ｂ）。Ａｋｔ−３のメッセージは試験されたすべての組織中に存在した。なぜなら、特異的な４２５ｂｐのフラグメントが３０周期のＰＣＲ後にすべてのｃＤＮＡで増幅されたからである。Ａｋｔ−３のｍＲＮＡ発現は胎盤、卵巣および脾で高かった。中程度の発現は脳、心、腎、結腸、前立腺、小腸および精巣でみられた。最も低い発現は肝、肺、膵、骨格筋、末梢血白血球および胸腺においてであった。腫瘍細胞系において（図６Ｃ）のＡｋｔ−３のｍＲＮＡ発現は、ＨＴ−１０８０骨線維肉腫細胞、ＳａＯＳ−２骨肉腫およびＪＵＲＫＡＴ  Ｔ細胞白血病細胞で比較的高かった（３０周期のＰＣＲ後に検出可能なＡｋｔ−３のバンド）。Ｃａｃｏ−２結腸直腸腺癌、Ｔ８４結腸直腸癌腫、ＭＣＦ−７乳房腺癌およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽腫細胞は３５周期のＰＣＲの後にＡｋｔ−３のｍＲＮＡ発現を示す。Ｔ−４７Ｄ乳房管状腺癌腫およびＨｅｐＧ２胚芽腫では、Ａｋｔ−３のｍＲＮＡの発現は非常に低いかもしくは存在しない（３５周期のＰＣＲ後に検出可能なシグナルがない）。
【００５９】
Ａｋｔ−１およびＡｋｔ−２は数種で同定されている。ヒト（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９９１；コファー（Ｃｏｆｆｅｒ）ら  １９９１）、マウス（ベラコサ（Ｂｅｌｌａｃｏｓａ）ら、１９９３）およびウシ（コファー（Ｃｏｆｆｅｒ）とウッドゲット（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ）、１９９１）のＡｋｔ−１のクローンが報告されている一方、Ａｋｔ−２のヒト（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、１９９２）、マウス（アルトメア（Ａｌｔｏｍａｒｅ）ら、１９９５）およびラット（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９４）のクローンが同定されている。しかしながら、Ａｋｔ−３は以前にはラットで同定されたのみである（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５）。本発明者らはＡｋｔ−３のヒトのアイソフォームを同定した。ヒトＡｋｔ−３はヒトＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２に対するかなりの類似性を示すが、ヒトＡｋｔ−３の発見はとりわけ重要である。なぜなら、該ｃＤＮＡ配列はＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２の活性化に関係するリン酸化部位を包含するＣＯＯＨ末端の「尾」をコードする（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６；マイヤー（Ｍｅｉｅｒ）ら、１９９７）からである。この尾は予測されるラットのアミノ酸配列に存在しない。ヒトＡｋｔ−３はＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２と類似の様式でリン酸化により活性化されるようである。しかしながら、その発現プロフィルは、この酵素の主機能がインスリンに対する応答を調節することにないことを示唆する。
【００６０】
同定された配列はＡｋｔ−３のヒト相同物を代表する。この割り当てはラットとヒトのＡｋｔ−３タンパク質配列の間の＞９９％の同一性に基づく。ヒトＡｋｔ−３でみられるＣＯＯＨ末端の尾を除き、ラットとヒトのＡｋｔ−３タンパク質の間に２個のみのアミノ酸の差異（ヒトＡｋｔ−３のＧｌｙ10およびＡｌａ396）が存在する。全部の既に記述されたＡｋｔの配列の整列は、ヒトタンパク質のＧｌｙ10およびＡｌａ396が他の種から同定されたＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２配列のそれぞれＧｌｙおよびＡｌａ残基に対応することを立証する。Ａｋｔ−３のアイソフォームを同定したことのさらなる証拠は、ヒトＡｋｔ−３の残基４７−４９（ＬＰＹ）、１１８−１２２（ＮＣＳＰＴ）および１３９−１４１（ＨＨＫ）により表されるアイソタイプ特異的配列の存在から生じる。各アイソタイプについて、これらの配列は種間で保存されているがしかしアイソタイプ間で異なる。
【００６１】
ヒトＡｋｔ−３のｃＤＮＡ配列は、ＨＮ2末端のプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメイン（ムサッキオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）ら、１９９３）およびＣＯＯＨ末端のキナーゼドメインをコードすると予測された。ヒトとラットのＡｋｔ−３タンパク質配列（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５）の間の著しい差異は、キナーゼドメインの後の７４残基を含んで成るＣＯＯＨ末端の「尾」の存在である。ヒトＡｋｔ−３の最後の２８アミノ酸残基はラットＡｋｔ−３配列に存在しない。数種の異なるヒト組織からのｃＤＮＡを使用してＲＡＣＥ実験を実施したにもかかわらず、類似の短縮をコードしたヒトｃＤＮＡ配列を同定することができなかった。ラットＡｋｔ−３に存在しないヒトＡｋｔ−３の領域は、ヒトＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２の対応する領域に同一である１０残基の伸長（ヒトＡｋｔ−３の残基４６７−４７６）を包含する。このことは、ヒトＡｋｔ−３で観察される尾が真正であることを示唆する。ラットＡｋｔ−３の尾領域で観察される差異の意義は検討されるべきまま留まる。しかしながら、ヒトＡｋｔ−３のＣＯＯＨ末端配列はＳｅｒ472を包含し、これはＡｋｔ−１のＳｅｒ473に対応する。Ｓｅｒ473のリン酸化はＡｋｔ−１の活性の５倍の増大につながることが示されている一方、Ｓｅｒ473およびＴｈｒ308の双方がリン酸化される場合にＡｋｔ−１の活性の２０〜２５倍の増大が観察される（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６）。従って、Ｓｅｒ472がヒトＡｋｔ−３に存在するというわれわれの観察結果は重要である。なぜなら、それは、ヒトＡｋｔ−３が、Ａｋｔ−１およびＡｋｔ−２に類似の様式で潜在的に調節されることを示唆するからである。ラットＡｋｔ−３が異なる様式で調節されるかどうかは解明されるべきまま留まる。
【００６２】
Ａｋｔ−３のキナーゼドメインおよびＰＨドメインはコンセンサスのＰＨドメインおよびキナーゼドメインの配列に対する相同性を示す（ムサッキオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）ら、１９９３；ハンクス（Ｈａｎｋｓ）とハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）１９９５）。ヒトＡｋｔ−３のＰＨドメインはＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２のＰＨドメインにそれぞれ７７％および８６％同一である一方、Ａｋｔ−３のキナーゼドメインはＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２のキナーゼドメインにそれぞれ８８％および８７％同一である。ＰＨドメインの高い保存はＡｋｔに特異的な機能を示しているかも知れない。なぜならＰＨドメインはしばしば高度に互いに異なる（ムサッキオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）ら、１９９３）からである。ＡｋｔのＰＨドメインは、結合するホスホイノシチドは別として、ＡｋｔとＰＫＣの間の相互作用を媒介し（小西（Ｋｏｎｉｓｈｉ）ら、１９９５）ならびに多量体のＡｋｔ複合体の形成を指図する（ダッタ（Ｄａｔｔａ）ら、１９９５）ことが示されている。対照的に、ＰＨドメインとキナーゼドメインの間の領域は、ヒトＡｋｔ−１、Ａｋｔ−２およびＡｋｔ−３配列の間で不十分に保存され、そしてこの領域もまた多量体のＡｋｔ複合体の形成を媒介するために重要である（ダッタ（Ｄａｔｔａ）ら、１９９５）。これは興味深い論点（Ａｋｔ−３のキナーゼドメインに対しＮＨ2末端の配列が、Ａｋｔ−３に独特であるかもしくは複数のＡｋｔのアイソフォームに結合する結合パートナーとの相互作用を媒介するかどうか）を提起する。
【００６３】
予測されたキナーゼドメインが触媒的に活性であったことを確かめるため、Ａｋｔ−３をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した。精製されたタンパク質は外因性の基質をリン酸化することが可能であった一方、ＧＳＴ−Ａｋｔ−３の代わりにＧＳＴを使用して触媒活性は観察されなかった。Ａｋｔ−３が実際にＡｋｔ−１およびＡｋｔ−２に類似した様式で調節されることを確認するため、Ｔｈｒ305およびＳｅｒ473を別個にもしくは連帯してのいずれかでＡｓｐに突然変異させた。この戦略は、Ａｋｔ−１のこれらの残基のリン酸化の効果を誠実に模倣することが既に示されている（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６）。これらの残基のいずれかの突然変異は増大された活性をもたらしたが、その増大はＡｋｔ−１で観察されたものより小さかった（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６）。加えて、Ｔｈｒ305およびＳｅｒ473双方の突然変異によるＡｋｔ−３の相乗的活性化を観察しなかった。対照的に、双方の対応する残基をＡｋｔ−１中でＡｓｐに同時に突然変異した場合は相乗的活性化が観察された（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）ら、１９９６）。Ａｋｔ−１とＡｋｔ−３との間の明白な量的差異はこれら２種のアイソフォームの調節における真の差異を反映することができるか、もしくは、それは使用される異なる発現系のような他の因子によるのかも知れない。本研究ではＡｋｔ−３を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＧＳＴ融合タンパク質として発現した一方、Ａｋｔ−１活性はＣＯＳ細胞中で発現されたＨＡ標識されたタンパク質を使用して研究した。にもかかわらず、われわれの結果は、Ａｋｔ−３がＡｋｔ−１に類似の様式で質的に調節されることを立証する。以前の研究は、Ａｋｔの活性化はＰＩ  ３−キナーゼに依存してＡｋｔのＰＨドメインを結合する３−ホスホイノシチドを生成させ、原形質膜へのＡｋｔの移動を促進し、そして上流のキナーゼによるＡｋｔのリン酸化を助長することもまた示した（アレシ（Ａｌｅｓｓｉ）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、１９９８；コファー（Ｃｏｆｆｅｒ）ら、１９９８に概説されている）。３−ホスホイノシチドの非存在下で測定される場合にＡｋｔ−３のＴ３０５Ｄ／Ｓ４７２Ｄ突然変異体が野生型酵素より活性であるというわれわれの観察結果（図３）は、リン酸化後にＡｋｔ−３がホスホイノシチド結合に（少なくとも部分的に）依存しなくなることを示唆している。
【００６４】
Ａｋｔの触媒ドメインの構造はタンパク質キナーゼＡおよびタンパク質キナーゼＣに緊密に関連している。実際、スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）データベースのＢＬＡＳＴサーチは、（異なるＡｋｔのアイソフォーム以外の）最も緊密に関連したキナーゼが数種のタンパク質キナーゼＣのアイソフォームを包含することを示した。これは、われわれを促してＰＫＡもしくはＰＫＣの現存する阻害剤ならびに他のセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤をＡｋｔ−３の阻害剤として使用することができるのかどうかを検討させた。試験された化合物のうち、スタウロスポリンおよび構造的に関連する化合物Ｒｏ  ３１−８２２０の双方のみがＡｋｔ−３を強力に阻害した。スタウロスポリンは非選択的キナーゼ阻害剤である一方、Ｒｏ  ３１−８２２０はより選択的なＰＫＣ阻害剤である（デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２）。Ｒｏ  ３１−８２２０はＡｋｔ−３よりおよそ１００倍より強力な（ＩＣ50＝１０ｎＭ；デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９２）ＰＫＣの阻害剤であるが、この観察結果は、高濃度のＲｏ  ３１−８８２０を使用する実験がＡｋｔ−３に影響を及ぼすかも知れないことを警告する。２種の他のＰＫＣ阻害剤および３種の他のＰＫＡ阻害剤は、スタウロスポリンおよびＲｏ  ３１−８２２０と対照的に、Ａｋｔ−３を阻害しなかった。これは、Ａｋｔ−３が配列でＰＫＣに緊密に関連するとは言え、Ａｋｔの選択的阻害剤を見出すことが可能であるかも知れないことを示唆する。
【００６５】
Ａｋｔ−３がＩＧＦ−１により活性化されるという観察結果は、Ａｋｔ−３が生存細胞の調節である役割を演じているかも知れないことを示唆する。Ａｋｔ−３は腫瘍細胞でアポトーシスを潜在的に抑制するかも知れない。癌の薬物開発の一標的としてＡｋｔを使用することにおける１つの懸念は、インスリンのシグナル伝達でＡｋｔがある役割を演じていることである（シェパード（Ｓｈｅｐｅｒｄ）ら、１９９８に概説されている）。従って、Ａｋｔの阻害剤は糖尿病の患者で観察される症状を誘発するかも知れない。提案されている一解決策は、Ａｋｔ−２の選択的阻害剤を開発することである（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９８）。これは、Ａｋｔ−１がラットの肝細胞および骨格筋中でインスリンにより強く活性化される一方、Ａｋｔ−２はこれらの組織中でインスリンにより
弱く活性化されるのみであるという観察結果に部分的に基づく。しかしながら、ラットＡｋｔ−３はこれらの組織中でインスリンによりなおより弱く活性化されるようであり（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９８）、また、本研究において、Ａｋｔ−３のｍＲＮＡがヒト肝および骨格筋（インスリン応答性の組織である）で低レベルでのみ発現されることを示した。このことは、Ａｋｔ−３の選択的阻害剤は、Ａｋｔ−２の阻害剤がするよりも、糖尿病の患者でみられるものに類似の症状を引き起こすなおより小さい可能性を有する可能性があることを示唆する。ヒト染色体１ｑ４３−４４へのヒトＡｋｔ−３の位置推定もまた興味深い。なぜなら、血液学的癌の患者はこの領域中の染色体異常を伴い報告されているからである（ミテルマン（Ｍｉｔｅｌｍａｎ）ら、１９９７）。後者の観察結果の意義は論争の余地があるとは言え、血液学的癌の患者では多数の遺伝子座での染色体異常が観察されているため、ここに提示される結果は、Ａｋｔ−３が癌の治療のための新規治療薬の開発の重要な標的であることが判明するかも知れないことを示している。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
【表２】
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【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４】
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【００７０】
【表５】
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【００７１】
【表６】
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【００７２】
【表７】
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【００７３】
配列表
１．配列番号１は、図１に示されるＡｋｔ−３のヌクレオチド配列に対応する。
２．配列番号２は、図１に示されるＡｋｔ−３の核酸配列のヌクレオチド位置１１から１４４７までに対応する。
３．配列番号３は、図１および２に示されるＡｋｔ−３のアミノ酸配列に対応する。
【図面の簡単な説明】
【図１】発明にかかる、ヒトＡｋｔ−３のｃＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列の具体的説明である。Ａｋｔ−３のコーディング配列ならびに５’および３’の非翻訳領域の一部を示し、そして左側の欄に番号付けする。Ａｋｔ−３タンパク質の推定されるアミノ酸配列は対応するＤＮＡ配列の上に示し、そして右側の欄に番号付けする。Ａｋｔ−３の活性化に際してリン酸化されると推定される２個のアミノ酸残基（Ｔｈｒ305およびＳｅｒ472）は太字であり、そして＊で印を付ける。ラット相同物と異なるヒトＡｋｔ−３タンパク質のＣＯＯＨ末端部分に下線を付ける。
【図２】発明にかかる、ヒトＡｋｔ−１、Ａｋｔ−２およびＡｋｔ−３の推定されるアミノ酸配列の整列である。配列はクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ整列プログラム（ＥＭＢＬ、ドイツ・ハイデルベルク）を使用して整列した。全３種のタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基を黒色領域中に包含する。配列の２種のみの間で保存されている残基は灰色に影を付ける。アミノ酸残基は右側の欄に番号付けする。活性化に際してリン酸化されると推定される保存されたＴｈｒおよびＳｅｒ残基を配列の上に＊で印を付ける。
【図３】発明にかかる、Ａｋｔ−３変異体によるヒストンＨ２Ｂのリン酸化の具体的説明である。（Ａ）Ａｋｔ−３をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した。ｈＡｋｔ−３活性を評価するため、指定された時間の間、ＧＳＴ−Ａｋｔ−３およびＧＳＴ−Ａｋｔ−３変異体とともにヒストンＨ２Ｂをインキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にリン酸化の程度を評価した。Ａｋｔ−３の変異体を呼称する。すなわちＷ．Ｔ．、野生型；Ｔ３０５Ｄ、Ａｓｐに突然変異されたＴｈｒ305；Ｓ４７２Ｄ、Ａｓｐに突然変異されたＳｅｒ472；Ｔ３０５Ｄ，Ｓ４７２Ｄ、Ａｓｐに突然変異されたＴｈｒ305およびＳｅｒ472双方。ＧＳＴ−Ａｋｔの代わりにＧＳＴを使用した場合には有意のリン酸化は観察されなかった。結果は平均（±ｓ．ｅ．ｍ．；ｎ＝３ないし６）であり、かつ、４５分後にＴ３０５Ｄ，Ｓ４７２Ｄ  ｈＡｋｔ−３により触媒されたＨ２Ｂのリン酸化の程度に関して表す。挿入、精製されたＧＳＴ（レーン１）、野生型Ａｋｔ−３（レーン２）、Ｔ３０５Ｄ  Ａｋｔ−３（レーン３）、Ｓ４７２Ｄ  Ａｋｔ−３（レーン４）もしくはＴ３０５Ｄ／Ｓ４７２Ｄ  Ａｋｔ−３（レーン５）の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により評価した。（Ｂ）ＨＥＫ−２９３細胞を、ベクター（レーン１および２）またはＡｋｔ−３（レーン３および４）、Ａｋｔ−３Ｔ３０５Ａ（レーン５および６）もしくはＡｋｔ−３  Ｓ４７２Ａ（レーン７および８）のいずれかでトランスフェクションし、そして緩衝液（レーン１、３、５および７）もしくはＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ；レーン２、４、６および８）のいずれかで処理した。Ａｋｔ−３を抗体３Ｆ１０（抗ＨＡ標識）で免疫沈降した。サンプルを、ＨＡ標識についてのブロッティングにより（上図）もしくはリン酸化されたＳｅｒ472を認識するリン特異的抗体で（下図）分析した。（Ｃ）ペプチド基質（クロスタイド（Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ））のリン酸化を測定することにより、上述されたとおり調製されたサンプルからのＨＡ免疫沈降物中のＡｋｔ活性を評価した。結果は、空のベクターでトランスフェクションされた刺激されない細胞に比較した活性の増大として表す（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝７）。
【図４】発明にかかる、スタウロスポリンおよびＲｏ  ３１−８２２０によるＡｋｔ−３の阻害の具体的説明である。示された濃度のスタウロスポリンもしくはＲｏ  ３１−８２２０のいずれかの存在下で、ヒストンＨ２ＢをＡｋｔ−３（Ｔ３０５Ｄ，Ｓ４７２Ｄ変異体）で処理した。３０分後に反応を停止し、そしてＨ２Ｂリン酸化の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にリン画像形成装置で定量した。結果（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）は、溶媒の存在下で観察されたリン酸化（対照、「Ｃ」）に関する（％）として表す。
【図５】発明にかかる、ヒトＡｋｔ−３の染色体の位置推定の具体的説明である。（Ａ）Ａｋｔ−３のＦＩＳＨマッピングの結果の図。各点は、ヒト第１染色体の領域ｑ４３−ｑ４４上で検出された二重のＦＩＳＨシグナルを表す。（Ｂ）Ａｋｔ−３のＦＩＳＨマッピングの例。左図は第１染色体上のＦＩＳＨシグナルを示す。右図は、第１染色体を同定するため４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで染色された同一の分裂像を示す。
【図６】発明にかかる、多様なヒト組織中でのＡｋｔ−３の発現の具体的説明である。（Ａ）Ａｋｔ−３の組織発現のノーザンブロット分析。多様なヒト組織中でのｈＡｋｔ−３のｍＲＮＡの発現を、ヒトポリＡ+  ＲＮＡのブロットを分析するためのｈＡｋｔ−３の３’非翻訳領域に対応するプローブを使用して評価した（「複数組織ノーザン（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｔｈｅｒｎ）」）。レーンの等しい負荷を確認するための対照としてヒトβ−アクチンを使用した（データは示されない）。（Ｂ）および（Ｃ）Ａｋｔ−３の組織発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。指定された数のＰＣＲ周期の間、ヒトＡｋｔ−３もしくはＧ３ＰＤＨ（対照）に特異的なプライマーを使用して、多様なヒト組織（Ｂ）および多様な腫瘍細胞系（Ｃ）からのｃＤＮＡでＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。期待された大きさのバンド（Ａｋｔ−３について４２５ｂｐおよびＧ３ＰＤＨについて１ｋｂ）がゲル上で見える。臭化エチジウム染色された１．２％アガロースゲルからの像を、イーグルサイト（ＥａｇｌｅＳｉｇｈｔ）ソフトウェア（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して明瞭性のため反転させた。２５、３０もしくは３５周期の間実施された類似のＰＣＲ反応からの結果は示されないが、しかし、この図からの結果が増幅の直線範囲にあることを示した。Ｃａｃｏ−２＝結腸直腸腺癌；Ｔ−８４＝結腸直腸癌腫；ＭＣＦ−７＝乳房腺癌；Ｔ−４７Ｄ＝乳房管状腺癌腫；ＨＴ１０８０＝骨線維肉腫；ＳａＯＳ−２＝骨肉腫；ＳＫ−Ｎ−ＭＣ＝神経芽腫；ＨｅｐＧ２＝胚芽腫；ＪＵＲＫＡＴ＝Ｔ細胞白血病。
【図７】発明にかかる、Ａｋｔ−３活性の活性を調節する作用物質を同定するシンチレーション近似アッセイでのシンチレーション計数により得られた結果の具体的説明である。
【図８】発明にかかる、Ａｋｔ−３の活性を調節する作用物質を同定するＡｋｔ−３フィルターアッセイから得られた結果の具体的説明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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