(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成された、直径が１００〜５００μｍの範囲にある気孔から構成される気孔連続体を含み、かつ全体の気孔率が９０〜９９％の範囲にある多孔質リン酸カルシウム化合物シートを用いて、細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
多孔質リン酸カルシウム化合物シートの全体の気孔率が９５〜９９％の範囲にある請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
細胞が肝細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞である請求項１もしくは２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成された、直径が１００〜５００μｍの範囲にある気孔から構成される気孔連続体を含み、かつ全体の気孔率が９０〜９９％の範囲にある多孔質リン酸カルシウム化合物シート。
【請求項５】
全体の気孔率が９５〜９９％の範囲にある請求項４に記載の多孔質リン酸カルシウム化合物シート。
【請求項６】
繊維状リン酸カルシウム化合物が、水酸アパタイトからなることを特徴とする請求項４もしくは５に記載の多孔質リン酸カルシウム化合物シート。
【請求項７】
請求項４乃至６のうちのいずれかの項に記載の多孔質リン酸カルシウム化合物シートからなる骨芽細胞培養用シート。
【請求項８】
繊維状リン酸カルシウム化合物１質量部に対して、粒子径が１００〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料を１００〜２０００質量部の範囲にて含む混合スラリを吸引ろ過により脱水して成形体を得て、次いで、該成形体を加熱して該可燃性球状材料を焼却除去する請求項４に記載の多孔質リン酸カルシウム化合物シートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨芽細胞の培養方法に関し、さらに詳しくは、骨芽細胞の培養基材として有用な多孔質リン酸カルシウム化合物シートに関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨欠損部の修復方法として、従来より、工業的に製造した骨充填材や人工骨などのバイオマテリアルを適用する方法が行われている。しかし、バイオマテリアルは、通常、生体骨とは機械的強度などの特性が異なり、応力集中による疲労や緩みが生じ易い傾向にある。従って、バイオマテリアルを適用する方法では、半永久的な骨欠損部の修復が難しいという問題がある。
【０００３】
このため、近年、組織工学的な骨欠損部の修復方法が注目されている。この方法は、骨芽細胞（造骨細胞ともいう）を生体外で培養して、骨芽細胞に骨組織を形成させ、この骨組織を骨欠損部に移植して、生体内にて骨欠損部の骨組織そのものを再生するものである［吉川の研究報告「骨髄間質細胞による骨軟部組織の再生」生体材料，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１（２００１），２７〜３３頁参照］。
【０００４】
骨芽細胞は、骨髄細胞を分化させた細胞の一種であるから、患者から採取した骨髄細胞を培養して、骨髄細胞を骨芽細胞に分化させることができる。そして、この骨芽細胞を人工的に培養して、骨芽細胞に骨組織を形成させれば、移植後に免疫拒絶が起こりにくい骨組織を得ることができる。従って、骨組織の形成が速やかに進行する骨芽細胞の培養方法が開発されれば望ましい。
【０００５】
骨芽細胞を培養して、骨芽細胞に骨組織を形成させるには、一般に、細胞の足場となる気孔が形成された培養基材（マトリックス）が必要となる。
従来より、人工骨に細胞の足場となる気孔を形成し、生体内にて、気孔内に骨組織を形成させることによって、生体骨と人工骨との接合性を高めることが行われている。従って、従来の人工骨を用いても骨芽細胞を培養することができる。なお、細胞の足場となる気孔の直径は、１００μｍ以上とすることが好ましいことが知られている。
【０００６】
本発明者は、繊維状アパタイト（アパタイトファイバー）のスラリを調製し、これを吸引ろ過により脱水して、繊維状アパタイトを係合させて得たアパタイトシートを用いて骨芽様樹立細胞株を培養したところ、骨芽細胞が良好に増殖する傾向にあることを発見し、この発見を、マテリアルインテグレーション，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．７５（１９９９．７）に発表している。但し、このアパタイトシートには、足場となるような気孔は形成されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
生体外にて骨芽細胞を培養する場合には、足場に培地（培養液）を供給することが必要となる。しかし、これまで知られている従来の人工骨では、気孔に骨組織が形成されるに従って、気孔の開口部が狭くなり、気孔内に培地を供給するのが困難となる傾向にあるという問題がある。
【０００８】
一方、繊維状アパタイトを係合させて得たアパタイトシートは、繊維状アパタイトと繊維状アパタイトとの間に形成される隙間を多数有しているから、一つの開口部（隙間）が塞がっても、シート全体に培地を安定に供給することができる点で有利である。
【０００９】
そこで、本発明者は、さらに研究を進め、繊維状アパタイトを用いて、直径が１００〜５００μｍの範囲にある気孔から構成される気孔連続体を含む多孔質アパタイトシートを作製し、これを用いて骨芽様樹立細胞株を培養したところ、上記の繊維状アパタイトを用いて作製した気孔を有しないアパタイトシートよりも骨芽細胞が良好に増殖する傾向にあることを見い出した。
【００１０】
従って、本発明の目的は、細胞の足場に安定に培地を供給できる培養基材を得て、骨組織の形成が速やかに進行する、すわなち骨芽細胞を効率よく増殖させることができる骨芽細胞の培養方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成された、直径が１００〜５００μｍの範囲にある気孔から構成される気孔連続体を含み、かつ全体の気孔率が９０〜９９％の範囲にある多孔質リン酸カルシウム化合物シートを用いて、細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法にある。
【００１２】
本発明はまた、繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成された、直径が１００〜５００μｍの範囲にある気孔から構成される気孔連続体を含み、かつ全体の気孔率が９０〜９９％の範囲にある多孔質リン酸カルシウム化合物シートにもある。
【００１３】
本発明はさらに、上記多孔質リン酸カルシウム化合物シートからなる骨芽細胞培養用シートにもある。
【００１４】
本発明はさらに、繊維状リン酸カルシウム化合物１質量部に対して、粒子径が１００〜５００μｍの範囲にある可燃性球状材料を１００〜２０００質量部の範囲にて含む混合スラリを吸引ろ過により脱水して成形体を得て、次いで、該成形体を加熱して該可燃性球状材料を焼却除去する上記の多孔質リン酸カルシウム化合物シートの製造方法にもある。
【００１５】
本発明において規定する気孔の直径は、電子顕微鏡による表面観察、および水銀ポロシメータを用いて測定することができる。
【００１６】
また、本発明において規定する気孔率は、シートの総体積に対する全ての気孔の体積の割合であり、直径が１００〜５００μｍの範囲を超える気孔（例えば、繊維状リン酸カルシウム化合物と繊維状リン酸カルシウム化合物との隙間）も含めた値である。この気孔率は、次のようにして求めることができる。
【００１７】
シートの寸法および重量からシートのかさ密度を算出する。次に、このかさ密度をリン酸カルシウム化合物の理論密度で除して相対密度（％）を算出する（下記の式（１）参照）。この相対密度（％）は、シートの総体積に対する全ての繊維状リン酸カルシウム化合物の体積の割合である。そして、最後に、気孔率（％）を、相対密度（％）を１００から減じて算出する（下記の式（２）を参照）。
【００１８】
【数１】
式（１）
相対密度（％）＝かさ密度（ｇ／ｃｍ3）／理論密度（ｇ／ｃｍ3）
【００１９】
【数２】
式（２）
気孔率（％）＝１００−相対密度（％）
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のシートは、繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成されている。すなわち、本発明のシートは、繊維状アパタイトと繊維状アパタイトとの間に形成される隙間を多数有している。この隙間は、細胞を培養する際に、主として細胞の足場に培地を供給するための通路として機能する。
【００２１】
本発明のシートはまた、直径が、通常は１００〜５００μｍの範囲にあり、好ましくは１００〜２５０μｍの範囲にある気孔が複数個、互いに連通して構成される気孔連続体を含んでいる。気孔連続体は、細胞を培養する際に、主として細胞の足場として機能する。気孔連続体は、シート表面に沿った方向に延びるような形で形成されていてもよいが、シート表面から内部に向かう方向（シートの厚み方向）に延びるような形で形成されていることが好ましい。気孔連続体をシート表面から内部に向かう方向に延びるような形に形成することによって、３次元的な細胞の培養が可能となり、細胞を効率よく培養することができる。
【００２２】
本発明のシートはさらに、気孔率が、通常は、９０〜９９％の範囲にあり、９５〜９９％の範囲にあることがより好ましい。
【００２３】
本発明のシートは、例えば、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性球状材料とを含む混合スラリを吸引ろ過により脱水して成形体を得て、次いで、該成形体を加熱して該可燃性球状材料を焼却除去することにより製造することができる。
【００２４】
上記繊維状リン酸カルシウム化合物は、下記の式（３）で定義されるアスペクト比が４０〜２００の範囲にあることが好ましい。
【００２５】
【数３】
式（３）
アスペクト比＝Ｌ／｛（ａ＋ｂ）／２｝
（Ｌは繊維状リン酸カルシウム化合物の長さ、ａは繊維状リン酸カルシウム化合物の厚さ、ｂは繊維状リン酸カルシウム化合物の幅を示す。）
【００２６】
繊維状リン酸カルシウム化合物の長さ（Ｌ）は、通常は、３０〜１５０μｍの範囲にあり、６０〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００２７】
繊維状リン酸カルシウムの材料としては、リン酸三カルシウム［Ｃａ3（ＰＯ4）2］、リン酸水素カルシウム［ＣａＨＰＯ4］、リン酸二水素カルシウム［Ｃａ（ＨＰＯ4）2］、及び水酸アパタイト（ハイドロキシアパタイト）［Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2］の一種、もしくは二種以上の混合物を挙げることができる。なお、水酸アパタイトには、カルシウムの一部が水素原子置換したカルシウム不足水酸アパタイト［Ｃａ10-xＨ2x（ＰＯ4）6（ＯＨ）2］などの非化学組成組成水酸アパタイトも含まれ、水酸アパタイトのリン酸イオン、または水酸化物イオンの一部が炭酸イオンで置換された炭酸含有水酸アパタイトも含まれる。
【００２８】
上記繊維状リン酸カルシウム化合物のうちで好ましいのは繊維状水酸アパタイトであり、特に好ましいは、（１００）、（２００）および（３００）面が発達したａ面配向の繊維状水酸アパタイトである。ａ面配向の繊維状水酸アパタイトは、カルシウム塩およびリン酸塩を含む溶液を尿素の存在下にて加熱することにより製造することができる。
【００２９】
上記可燃性球状材料は、５００〜１５００℃の温度に加熱したときの灰分が１質量％以下となるものであることが好ましい。このような可燃性球状材料の材料の例としては、ポリメタルクリレート、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびカーボンを挙げることができる。これらのうちで好ましいはカーボンである。なお、可燃性球状材料は、真球であることが好ましいが、必ずしも真球である必要はなく、略球形状であればよい。可燃性球状材料の粒子径は、通常は、１００〜５００μｍの範囲にあり、好ましくは１００〜２００μｍの範囲にある。
【００３０】
上記混合物スラリの溶媒には、水あるいは水とアルコールの混合溶液を用いることが好ましい。溶媒として水とアルコールの混合溶液を用いる場合、その比率は容積比で、水：アルコールが、通常は１：９９〜９９：１の範囲にあり、好ましくは２５：７５〜７５：２５の範囲にある。なお、溶媒として用いるアルコールの種類には特に制限はなく、メタノール、エタノールなどの１価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの２価アルコールを用いることができるが、エタノールが好ましい。
【００３１】
上記混合スラリにおいて、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性球状材料との配合割合は、繊維状リン酸カルシウム化合物１質量部に対して、可燃性球状材料が、通常は１００〜２０００質量部の範囲にあり、好ましくは５００〜２０００の範囲にある。
【００３２】
上記混合スラリを吸引ろ過により脱水することによって、繊維状リン酸カルシウム化合物の物理的な係合により形成された成形体を得ることができる。この成形体は、複数個の可燃性球状材料を包含する。
成形体を加熱して、可燃性球状材料を焼却除去することによって、成形体に気孔ならびに気孔連続体が形成される。ここで、気孔は、１個の可燃性球状材料の焼却除去跡であり、気孔連続体は、互いに接触した複数個の可燃性球状材料の焼却除去跡である。形成体の加熱温度は、通常は５００〜１５００℃の範囲にあり、好ましくは１０００〜１５００℃の範囲にある。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
各実施例、及び比較例で得られたシートの物性は、次のようにして測定した。
【００３４】
（１）気孔の直径は、電子顕微鏡による表面観察、および水銀ポロシメーター（（株）島津製作所製、アポタイザ）を用いて測定した。
【００３５】
（２）気孔率は、次のようにして求めた。シートの寸法および重量からシートのかさ密度を算出する。次に、このかさ密度をリン酸カルシウム化合物の理論密度で除して相対密度（％）を算出する（上記の式（１）参照）。そして、最後に、気孔率（％）を、相対密度（％）を１００から減じて算出する（上記の式（２）を参照）。
【００３６】
（３）吸水率（％）は、ＪＩＳ−Ｒ−２２０５に記載の方法に準じて測定し、下記式（４）により算出した。
【００３７】
【数４】
式（４）
吸水率（％）＝（Ｗ2−Ｗ1）／Ｗ1×１／Ｓ×１００
（Ｗ1は、試料を１１０℃で乾燥したときの乾燥試料の質量であり、Ｗ2は、１時間以上、媒液（精製水）に浸漬した試料を、媒液中から取り出して秤量したときの飽水試料の質量であり、そしてＳは、媒液の比重である。）
【００３８】
［実施例１］
（１）繊維状リン酸カルシウム化合物の製造
硝酸カルシウム四水和物、リン酸水素二アンモニウム、尿素及び硝酸を混合し、それぞれの濃度が、硝酸カルシウム四水和物０．１６７モル・ｄｍ-3、リン酸水素二アンモニウム０．１００モル・ｄｍ-3、尿素０．５００モル・ｄｍ-3、及び硝酸０．１０モル・ｄｍ-3の混合水溶液を調整した。
次いで、得られた混合水溶液０．７５ｄｍ3を三つ口フラスコに入れ、シリコンオイルバス中で８０℃で２４時間加熱し、次いで９０℃で７２時間加熱して、リン酸カルシウム化合物を合成した。得られたリン酸カルシウム化合物を精製水で洗浄し、１１０℃で乾燥した。
【００３９】
上記リン酸カルシウム化合物の形態を走査型電子顕微鏡で観察したところ、繊維状であり、そのアスペクト比は３０〜１５０であり、長さは６０〜１００μｍの範囲であった。また、上記リン酸カルシウム化合物は、Ｘ線回折分析及び赤外線吸光（ＩＲ）スペクトルにより炭酸含有水酸アパタイトの単一相であることが確認された。
【００４０】
（２）リン酸カルシウム化合物シートの製造
上記繊維状リン酸カルシウム化合物を、水とエタノールの混合溶液（容積比１：１）に懸濁して、固形分濃度が１質量％のリン酸カルシウム化合物スラリを調製した。このスラリに粒子径約１５０μｍの球状カーボン（ニカビーズ、日本カーボン（株）製）を、繊維状リン酸カルシウム化合物１質量部に対して１０００質量部となる量添加した。
【００４１】
球状カーボンを添加したスラリ（混合スラリ）を、下側開口部にろ紙を備えた塩化ビニル管（直径１６．３ｍｍ）に５ｃｍ3注ぎ、吸引ろ過により脱水した後、１１０℃で乾燥してシート状に形成した。次いで、このシートを水蒸気雰囲気下、１３００℃の温度で５時間焼成して、リン酸カルシウム化合物シート（直径約１５ｍｍ、厚さ：約１０ｍｍ）を得た。
【００４２】
上記リン酸カルシウム化合物シートの形態を走査型電子顕微鏡で観察したところ、直径が約１００〜１５０μｍの範囲の気孔から構成された気孔連続体が確認された。このリン酸カルシウム化合物シートの細孔径分布を図１に示す。図１の結果から求めた気孔のメジアン径（累積細孔体積５０％の細孔直径）は１１２．８μｍであった。また、このリン酸カルシウム化合物シートの気孔率は９７．９±０．１％、吸水率は１３０８±１３％であった。なお、上記リン酸カルシウム化合物シートのリン酸カルシウム化合物は、赤外線（ＩＲ）スペクトルにより、水酸アパタイト（炭酸イオンは焼失した）の単一相であることが確認された。
【００４３】
［実施例２］
実施例１の（２）において、粒子径約１５０μｍの球状カーボンを、繊維状リン酸カルシウム化合物１質量部に対して２０００質量部となる量にて添加した以外は、実施例１と同様の操作を行って、リン酸カルシウム化合物シート（直径約１５ｍｍ、厚さ：約１０ｍｍ）を得た。
上記リン酸カルシウム化合物シートの形態を走査型電子顕微鏡で観察したところ、直径が約１００〜２５０μｍの範囲の気孔から構成された気孔連続体が確認された。このリン酸カルシウム化合物シートの細孔径分布を図２に示す。図２の結果から求めた気孔のメジアン径（累積細孔体積５０％の細孔直径）は２４７．３μｍであった。また、このリン酸カルシウム化合物シートの気孔率は９８．８±０．１％、吸水率は１９９５±５７％であった。なお、上記リン酸カルシウム化合物シートのリン酸カルシウム化合物は、ＩＲスペクトルにより、水酸アパタイト（炭酸イオンは焼失した）の単一相であることが確認された。
【００４４】
［比較例１］
実施例１の（２）において、粒子径約１５０μｍの球状カーボンを、添加しない以外は、実施例１と同様の操作を行って、リン酸カルシウム化合物シート（直径約１５ｍｍ、厚さ：約１０ｍｍ）を得た。
上記リン酸カルシウム化合物シートの形態を走査型電子顕微鏡で観察したところ、直径が約１００μｍを超える気孔は確認されなかった。このリン酸カルシウム化合物シートの細孔径分布を図３に示す。図３の結果から求めた気孔のメジアン径（累積細孔体積５０％の細孔直径）は５．２μｍであった。また、このリン酸カルシウム化合物シートの気孔率は９４．２±０．１％、吸水率は３４３±３７％であった。なお、上記リン酸カルシウム化合物シートのリン酸カルシウム化合物は、ＩＲスペクトルにより、水酸アパタイト（炭酸イオンは焼失した）の単一相であることが確認された。
【００４５】
［実施例３］
（細胞の培養）
上記実施例２、および比較例１で得たリン酸カルシウム化合物シート、及び参考例として、市販の細胞培養用ポリエチレン２４孔プレート（直径１５．５ｍｍ）を培養基材に用いて、下記（１）、（２）に示す細胞の培養評価を行った。
細胞には、新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用い、シート１個に５×１０5個の細胞を播種した。
培地には、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０容量％添加したα−最小必須培地（α−ＭＥＭ（＋））を用いた。また、培地には抗生物質であるカナマイシンとストレプトマイシンとをそれぞれ１０ｎｇ／ｃｍ3となるように添加した。細胞の培養中、培地は一日ごとに交換した。
培養は、３７℃に維持された５％ＣＯ2インキュベータ内にて行った。
【００４６】
（１）初期付着率
細胞を播種してから５時間後のリン酸カルシウム化合物シートに付着している細胞のＤＮＡ量を測定した。そして、下記式（５）により定義される初期付着率Ａ（％）を算出した。その結果を図４に示す。なお、評価は各培養基材について３回ずつ行ない、図４に示した結果はその平均値である。
【００４７】
【数５】
式（５）
初期付着率Ａ（％）＝Ｎ5／Ｎ0×１００
（Ｎ5は、培養基材に付着している細胞のＤＮＡ量（μｇ・ｗｅｌｌ-1）であり、Ｎ0は、培養基材に播種した細胞のＤＮＡ量（μｇ・ｗｅｌｌ-1）である。）
【００４８】
（２）細胞の増殖性
細胞を播種してから１日後、７日後、そして１４日後の培養基材に付着している細胞のＤＮＡ量を測定した。その結果を図５に示す。なお、評価は各培養基材について４回ずつ行ない、図５に示した結果はその平均値である。
【００４９】
図４、及び図５に示した結果から、直径が１００〜２５０μｍの気孔連続体が形成されているリン酸カルシウム化合物シート（実施例２）は、細胞が付着し易く、細胞の増殖性も良好であり、培養基材として有用であることが分かる。
【００５０】
【発明の効果】
繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成された、直径が１００〜５００μｍの範囲にある気孔から構成される気孔連続体を含み、かつ全体の気孔率が９０〜９９％の範囲にある多孔質リン酸カルシウム化合物シートは、細胞の足場となる気孔連続体に培地を安定に供給することができる。従って、上記シートは、肝細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞などの各種細胞の培養に有利に用いることができる。特に、上記シートは、骨芽細胞の培養用シートとして有利に用いることができる。
また、上記の多孔質カルシウムシートを用いる本発明の骨芽細胞の培養方法によれば、骨芽細胞を良好に増殖させることができる。
さらに、本発明の製造方法によれば、上記の多孔質リン酸カルシウム化合物シートを工業的に容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１にて得られたシートの細孔径分布を示す図である。
【図２】実施例２にて得られたシートの細孔径分布を示す図である。
【図３】比較例１にて得られたシートの細孔径分布を示す図である。
【図４】実施例３の細胞の初期付着率の評価結果を示す図である。
【図５】実施例３の細胞の増殖性の評価結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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