(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のＨＩＶ−１核酸の検出に用いるためのオリゴマーの組み合わせであって、以下の；
ｐｏｌ領域に特異的な、少なくとも４つの増幅オリゴマーであって、
配列番号１３および配列番号１５からなる第１の増幅オリゴマーペア；及び
配列番号１０および配列番号１１からなる第２の増幅オリゴマーペア；
を含む前記増幅オリゴマー；並びに
ｐｏｌ領域に特異的な前記増幅オリゴマーを用いて増幅されるｐｏｌ領域中の増幅された配列と特異的に結合する、少なくとも１つの標識された検出プローブ；
を含む、前記組み合わせ。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴマーの組み合わせであって、さらに、ＬＴＲ領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマー及びＬＴＲ領域に特異的な増幅オリゴマーを用いて増幅されたＬＴＲ領域中の増幅された配列に特異的に結合する少なくとも１つの標識された検出プローブから構成される、ＬＴＲ領域配列を増幅し及び検出するためのオリゴマーを含み、ここで；
前記増幅オリゴマーは、
ｉ）配列番号７からなるＬＴＲ特異的配列；又は
ii）配列番号７の５’端に共有結合するプロモーター配列；
からなる第１の増幅オリゴマー、及び
配列番号９からなるＬＴＲ特異的配列からなる第２の増幅オリゴマー
を含む、
前記組み合わせ。
【請求項３】
配列番号７の５’端に共有結合するプロモーター配列からなる第１の増幅オリゴマーが配列番号８からなる、請求項２記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項４】
さらに、３’テール配列がある配列番号１、配列番号２、３’テール配列がある配列番号３、配列番号４、３’テール配列がある配列番号５、配列番号６、３’テール配列がある配列番号１９、配列番号２０、３’テール配列がある配列番号５７及び配列番号４５からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む、請求項１記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項５】
さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０及び配列番号４５からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む、請求項１記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項６】
ｐｏｌ領域中の増幅された配列と結合する標識された検出プローブが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６からなる群から選択される、請求項１記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項７】
ｐｏｌ領域中の増幅された配列と結合する標識された検出プローブが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３からなる群から選択される、請求項６記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項８】
ＬＴＲ領域中の増幅された配列と結合する標識された検出プローブが配列番号１６からなる、請求項２〜７のいずれか１項記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項９】
オリゴマーが、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸連結、少なくとも１つのホスホロチオエート連結、少なくとも１つのメチルホスホネート連結又はそのいずれかの組み合わせを含有する、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーの組み合わせ。
【請求項１０】
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなるオリゴマーをすべて含むキットであって、配列番号１７及び配列番号１８からなるオリゴマーが検出可能な標識で標識された、前記キット。
【請求項１１】
生物学的試料中のＨＩＶ−１核酸を検出する方法であって：
ＨＩＶ−１のＬＴＲ又はｐｏｌ配列中の標的領域に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１つの捕捉オリゴマーと、ＨＩＶ−１  ＲＮＡを包含する生物学的試料とを接触させて、捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１核酸複合体を生成し；
生物学的試料から捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１核酸複合体を分離し；
その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸ポリメラーゼと、少なくとも４つのｐｏｌ特異的増幅オリゴマーであって、
配列番号１３および配列番号１５からなる第１の増幅オリゴマーペア、及び
配列番号１０および配列番号１１からなる第２の増幅オリゴマーペア、
から構成される前記増幅オリゴマー
との組み合わせを用いてｐｏｌ領域中のＨＩＶ−１配列を増幅し；並びに
ｐｏｌ特異的増幅オリゴマーを用いて増幅されたｐｏｌ領域中の増幅された配列に特異的に結合する標識された検出プローブを用いて増幅産物を検出する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法であって、さらに：
ｉ）配列番号７からなるＬＴＲ特異的配列；又は
ii）配列番号７の５’端に共有結合するプロモーター配列；及び
配列番号９からなるＬＴＲ特異的配列からなる第２の増幅オリゴマー
から構成される少なくとも２つのＬＴＲ特異的増幅オリゴマーを用いて、ＬＴＲ領域中のＨＩＶ−１配列を増幅し；
ＬＴＲ特異的増幅オリゴマーを用いて増幅したＬＴＲ領域中の増幅された配列に特異的に結合する標識された検出プローブを用いて、増幅産物を検出する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
増幅する工程が、１つの増幅反応混合物中で、ｐｏｌ領域及びＬＴＲ領域中の配列を増幅する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
接触する工程で、配列番号１、３’テール配列がある配列番号１、配列番号２、３’テール配列がある配列番号３、配列番号４、３’テール配列がある配列番号５、配列番号６、３’テール配列がある配列番号１９、配列番号２０、３’テール配列がある配列番号５７及び配列番号４５からなる群から選択される、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを用いる、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
接触する工程で、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群から選択される、少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを用いる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
増幅する工程で、転写関連増幅法を用いる、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
検出する工程で、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４６、配列番号５０及び配列番号５３からなる群から選択される少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる、請求項１１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
検出する工程で、ＬＴＲ領域中の増幅された配列に結合する、配列番号１６又は配列番号４１からなる、少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる、請求項１２〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
検出する工程で、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる標識された検出プローブの組み合わせを用いる、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項２０】
検出する工程で、「Ｎ」残基がイノシンである配列番号１６からなる標識された検出プローブを用いる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
検出する工程で、少なくとも１つの２’−メトキシ主鎖連結を含有する、少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる、請求項１１〜２０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス核酸の診断的検出に関し、そして具体的には、転写仲介核酸増幅および増幅された配列のプローブ検出を用い、ＨＩＶ−１配列を検出するための組成物およびアッセイに関する。
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）の原因病原体である。感染性ウイルスは、血液および血漿を含む体液中で伝播性であるため、感染した個体において、ウイルスに対する抗体が検出可能になるか、または症状が明らかになる前に、感染した体液を検出することが重要である。そうでなければＨＩＶ−１感染体液（例えば輸血中の全血または血漿）、あるいは血液または血漿由来の製品を受け取る可能性がある患者の保護のため、体液中のウイルスの存在を検出し、こうした方法または製品におけるその使用を防ぐことが特に重要である。ＨＩＶ−１を検出するのに用いる方法および試薬が、感染した個体に存在する可能性がある比較的少数のウイルスコピーを検出することが可能であることもまた、重要である。
【０００３】
ＨＩＶ−１を検出するためのアッセイおよび試薬は、先に、例えば、米国特許第５，００８，１８２号、第５，５９４，１２２号、第５，６８８，６３７号および第５，８４３，６３８号；欧州特許第ＥＰ  １７８  ９７８  Ｂ１号、第ＥＰ  １８１，１５０  Ｂ１号および第ＥＰ  １８５，４４４  Ｂ１号；公開欧州特許出願第ＥＰ  ４０３，３３３号、第ＥＰ  ４６２，６２７号および第ＥＰ  ８０６，４８４号；およびＰＣＴ第ＷＯ  ９９／６１６６６号に開示されている。
【０００４】
本発明は、好ましくは転写仲介核酸増幅（例えば、先に、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に開示されたようなもの）を含むアッセイを用い、生物学的試料中に存在するＨＩＶ−１核酸の増幅のためのプライマーおよび検出のためのプローブとして用いるオリゴヌクレオチド配列を含む。好ましい検出法は、既知の均質検出技術を用い、混合物中で、増幅された核酸に結合している標識化プローブを検出する（例えば、Ａｒｎｏｌｄら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３５：１５８８−１５９４（１９８９）；  Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＬｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に開示されるようなもの）。本発明はまた、好ましくは捕捉された標的の分離に磁気粒子を用いる核酸ハイブリダイゼーション技術（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、米国特許第４，５５４，０８８号および第４，６９５，３９２号）を用い、ＨＩＶ−１標的を捕捉するのに有用な核酸オリゴヌクレオチド配列も含む。
【０００５】
発明の概要
本発明の１つの側面にしたがい、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５７の塩基配列を含んでなるオリゴマーが提供される。1つの態様は、塩基配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８または配列番号４５のものである、オリゴマーを含む。別の態様は、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸連結、少なくとも１つのホスホロチオエート連結、少なくとも１つのメチルホスホネート連結またはそのいずれかの組み合わせを含む主鎖をさらに含んでなる、オリゴマーを含む。別の態様は、塩基配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号４５の配列を含んでなり、そして主鎖が、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含んでなる、オリゴマーを含む。
【０００６】
本発明の別の側面にしたがい、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６の塩基配列からなるオリゴマーがある。１つの態様において、オリゴマーは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１６の塩基配列を有する。別の態様において、オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基、少なくとも１つの２’フルオロ置換ＲＮＡ基、少なくとも１つのペプチド核酸連結、少なくとも１つのホスホロチオエート連結、少なくとも１つのメチルホスホネート連結またはそのいずれかの組み合わせを含む主鎖により、連結される。
【０００７】
本発明の別の側面にしたがい、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６の塩基配列；および該塩基配列に直接または間接的に連結された検出可能標識を含んでなる、標識化オリゴマーが提供される。１つの態様において、検出可能標識は、発光化合物である。別の態様において、塩基配列は、少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含んでなる主鎖により連結される。１つの態様は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列および化学発光化合物である標識を有する標識化オリゴマーである。好ましい態様は、残基７でイノシンを含む配列番号１６の塩基配列および標識としてアクリジニウムエステル化合物を有する標識化オリゴマーである。
【０００８】
本発明の別の側面にしたがい、生物学的試料において、ＨＩＶ−１  ＲＮＡを検出する方法であって：ＨＩＶ−１  ＲＮＡを含む生物学的試料を提供し；ＨＩＶ−１  ＲＮＡのＬＴＲまたはｐｏｌ配列中の標的領域に特異的にハイブリダイズし、こうして捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１  ＲＮＡ複合体を形成する塩基配列を含んでなる、少なくとも１つの捕捉オリゴマーと、該生物学的試料を接触させ；生物学的試料から捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１  ＲＮＡ複合体を分離し；その後、ＬＴＲまたはｐｏｌ配列、あるいはこれらから作成されたｃＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸ポリメラーゼを用いて増幅し、増幅産物を産生し；そして増幅産物に特異的にハイブリダイズする標識された検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程を含んでなる、前記方法が提供される。１つの態様において、接触工程は、固体支持体上に固定された相補的配列に結合するテール配列をさらに含んでなる捕捉オリゴマーを用いる。別の態様において、ＬＴＲまたはｐｏｌ配列中の標的領域に特異的にハイブリダイズする捕捉オリゴマーの塩基配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１９または配列番号５７の配列を含んでなる。別の態様において、捕捉オリゴマーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０または配列番号４５の少なくとも１つの塩基配列を含んでなるか、あるいは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０または配列番号４５のオリゴマーのいずれかの組み合わせである。好ましい態様において、捕捉オリゴマーは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群より選択される塩基配列を有する、少なくとも２つのオリゴマーのいずれかの組み合わせである。１つの態様において、捕捉オリゴマーは、配列番号２０および配列番号６、または配列番号４５および配列番号６の塩基配列を有するオリゴマーの組み合わせである。別の態様において、増幅工程は、ＬＴＲまたはｐｏｌ配列に特異的に結合する少なくとも２つの増幅オリゴマーまたはそれらに相補的な配列を用いる。好ましくは、増幅工程は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される、ＬＴＲ配列を増幅するための少なくとも２つの増幅オリゴマーを用いる。別の態様は、増幅工程において：配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４からなる群より選択される、ｐｏｌ配列を増幅するための少なくとも２つの増幅オリゴマーを用いる。別の態様において、増幅工程は、転写関連増幅法であって、プロモーター配列が二本鎖である際にＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター配列を含んでなる少なくとも１つのプロモーター−プライマーであって、該プロモーター配列が、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３からなる群より選択される、ＬＴＲ特異的配列、または配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される、ｐｏｌ特異的配列の５’端に共有結合する、前記プロモーター−プライマー；および少なくとも１つのプライマーであって、配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される、ＬＴＲ特異的配列、または配列番号１０、配列番号１１および配列番号４２からなる群より選択される、ｐｏｌ特異的配列を含んでなる、前記プライマー、を含む、前記増幅法を含んでなり、但し、少なくとも１つのＬＴＲ特異的プロモーター−プライマーは、ＬＴＲ標的領域を増幅するため、少なくとも１つのＬＴＲ特異的プライマーと組み合わされるか、または少なくとも１つのｐｏｌ特異的プロモーター−プライマーは、ｐｏｌ標的領域を増幅するため、少なくとも１つのｐｏｌ特異的プライマーと組み合わされる。１つの態様において、増幅工程は、転写関連増幅法であって：配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選択される、ＬＴＲ特異的配列、または配列番号１３、配列番号１５、配列番号４３および配列番号４４からなる群より選択される、ｐｏｌ特異的配列を有する、少なくとも１つのプロモーター−プライマー；および配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される、ＬＴＲ特異的配列、または配列番号１０、配列番号１１および配列番号４２からなる群より選択される、ｐｏｌ特異的配列を有する、少なくとも１つのプライマー、を含む、前記増幅法を含んでなり、但し、少なくとも１つのＬＴＲ特異的プロモーター−プライマーは、ＬＴＲ標的領域を増幅するため、少なくとも１つのＬＴＲ特異的プライマーと組み合わされるか、または少なくとも１つのｐｏｌ特異的プロモーター−プライマーは、ｐｏｌ標的領域を増幅するため、少なくとも１つのｐｏｌ特異的プライマーと組み合わされる。好ましくは、増幅工程は、プロモーター−プライマーおよびプライマーの以下のいずれかの組み合わせ：配列番号１３および配列番号１５のプロモーター−プライマーと、配列番号１０および配列番号１１のプライマー；配列番号１３および配列番号１５のプロモーター−プライマーと、配列番号４２および配列番号１１のプライマー；配列番号４３および配列番号１５のプロモーター−プライマーと、配列番号１０および配列番号１１のプライマー；配列番号１３および配列番号４４のプロモーター−プライマーと、配列番号１０および配列番号１１のプライマー；配列番号７、配列番号１３および配列番号１５のプロモーター−プライマーと、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のプライマー；配列番号８のプロモーター−プライマーと、配列番号９のプライマー；配列番号８のプロモーター−プライマーと、配列番号３５のプライマー；配列番号８のプロモーター−プライマーと、配列番号３６のプライマー；配列番号３０のプロモーター−プライマーと、配列番号９のプライマー；配列番号３０のプロモーター−プライマーと、配列番号３６のプライマー；配列番号３２のプロモーター−プライマーと、配列番号９のプライマー；配列番号３４のプロモーター−プライマーと、配列番号３６のプライマー；配列番号１３のプロモーター−プライマーと、配列番号１０のプライマー；または配列番号７のプロモーター−プライマーと、配列番号９のプライマーを用いる。１つの態様において、検出工程は、配列番号１６、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる、ＬＴＲ特異的群、または配列番号１７、配列番号１８、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる、ｐｏｌ特異的群、またはそれらの組み合わせ、より選択される塩基配列を有する、少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる。別の態様において、検出工程は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有する、少なくとも２つの標識された検出プローブの組み合わせを用いる。好ましくは、配列番号１６の標識された検出プローブは、位７にイノシンを有する。１つの態様は、検出工程において、配列番号１６、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなるＬＴＲ特異的群より選択される塩基配列を有する、少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる。別の態様は、検出工程において、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなるｐｏｌ特異的群より選択される塩基配列を有する、少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる。１つの態様において、検出工程は、少なくとも１つの２’−メトキシ主鎖連結を含む、少なくとも１つの標識された検出プローブを用いる。別の態様は、配列番号２、配列番号４および配列番号６の配列を有する捕捉オリゴマーを用いる接触工程；配列番号８、配列番号１３および配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマー、並びに配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の配列を有するプライマーを用いる増幅工程；および配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８の配列を有する標識された検出プローブを用いる検出工程を含む。１つの態様において、接触工程は、標的領域中の異なる配列にハイブリダイズする、少なくとも２つの捕捉オリゴマーを用い；増幅工程は、標的領域内の第一の組の配列にハイブリダイズする、少なくとも２つの異なるプロモーター−プライマー、並びに標的領域内の第二の組の配列にハイブリダイズする、少なくとも２つの異なるプライマーを用い；そして検出工程は、標的領域内の第一の組および第二の組の配列の間に位置する、異なる配列に特異的に結合する、少なくとも２つの標識化プローブを用いる。別の態様において、接触工程は、配列番号４および配列番号６の配列を有する捕捉オリゴマーを用い；増幅工程は、配列番号１３および配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマー、並びに配列番号１０および配列番号１１の配列を有するプライマーを用い；そして検出工程は、配列番号１７および配列番号１８の配列を有する標識化プローブを用いる。好ましい態様において、増幅工程は、標的領域内の第一の組の重複する配列にハイブリダイズする、少なくとも２つのプロモーター−プライマー、標的領域内の第二の組の重複する配列にハイブリダイズする、少なくとも２つのプライマー、またはその組み合わせを用いる。
【０００９】
本発明の別の側面にしたがい、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１８の配列を有する複数のオリゴマーを含んでなり、配列番号１７および配列番号１８の配列を有するオリゴマーが、検出可能標識で標識されている、キットが提供される。１つの態様において、キットは配列番号８、配列番号９および配列番号１６の配列を有するオリゴマーをさらに含み、配列番号１６のオリゴマーが、検出可能標識で標識されている。
【００１０】
付随する図は、本発明のいくつかの態様を例示する。これらの図は明細書の記載と共に、本発明の原理を説明し、そして例示するよう働く。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト由来の生物学的試料中、好ましくは血液、血清または血漿中に存在するＨＩＶ−１核酸を検出する方法を含む。本発明はまた、生物学的試料中に存在するＨＩＶ−１標的配列を特異的に捕捉するのに用いられる核酸捕捉オリゴマー（または捕捉オリゴヌクレオチド）、選択されたＨＩＶ−１核酸配列を特異的に増幅するのに用いられる核酸増幅オリゴマー（またはプライマー）および増幅されたＨＩＶ−１配列を検出するための核酸プローブオリゴマー（プローブまたは標識化プローブ）を含む。
【００１１】
本発明の核酸は、生物学的試料、例えばＨＩＶ−１を含むヒト血液、血清、血漿または他の体液中に存在するＨＩＶ−１核酸を捕捉し、増幅し、そして検出するのに有用である。本発明の方法は、生物学的試料中のＨＩＶ−１核酸を検出するのに有益であり、そしてしたがって、ＨＩＶ−１感染を診断し、そして感染性ウイルスを含む可能性がある血液および血液製品をスクリーニングし、感染した血液または血漿を用いた輸血を通じ、個体を感染させるのを防ぐのに重要である。こうしたスクリーニングはまた、血液由来療法におけるＨＩＶ−１混入を防ぐのにも重要である。
【００１２】
「生物学的試料」により、標的ＨＩＶ−１核酸を含む可能性がある生存しているまたは死亡したヒト由来のいずれかの組織または成分を意味し、例えば、末梢血または骨髄、血漿、血清、子宮頚スワブ試料、リンパ節を含む生検組織、呼吸組織または滲出物、胃腸組織、尿、糞便、精液または他の体液、組織または成分が含まれる。生物学的試料を処理し、物理的または機械的に組織または細胞構造を破壊し、こうして標準的解析法を用い、生物学的試料を調製するのに用いられる酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤およびそれらに匹敵するものを含んでもよい溶液中に、細胞内構成要素を放出させてもよい。
【００１３】
「核酸」により、窒素性複素環塩基、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含んでなり、ヌクレオシドがホスホジエステル結合により共に連結され、ポリヌクレオチドを形成する、多量体化合物を意味する。用語「核酸」は、慣用的なＲＮＡおよびＤＮＡオリゴマー、並びに塩基類似体または置換を含むものを含む。核酸の「主鎖」は、既知の多様な連結で構成される可能性があり、該連結には、１つまたはそれ以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（すなわち、Ｈｙｄｉｇ−Ｈｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ第ＷＯ  ９５／３２３０５号に記載されるような「ペプチド核酸」）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは、例えば、２’メトキシ置換および２’ハロゲン化物置換（例えば２’−Ｆ）などの既知の置換を有する同様の化合物であってもよい。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシン；  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，  Ａｄａｍｓら監修，  第１１版，  １９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジン塩基類の既知の誘導体（例えば、Ｎ4−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類、デアザ−またはアザ−ピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２、６または８位に改変されたまたは置換置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ6−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ4−アルキル−ピリミジン類；  Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ第ＷＯ  ９３／１３１２１号を参照されたい）および、主鎖がポリマーの１つまたはそれ以上の残基に関し、窒素性塩基を含まない、「非塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）であってもよい。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られる慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでもよいし、または慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１つまたはそれ以上の塩基類似体を含む核酸）を含んでもよい。
【００１４】
オリゴマーの主鎖構成要素は、（例えば、標的核酸への捕捉オリゴマーのハイブリダイゼーションにより形成される）ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を与える可能性がある。好ましい主鎖には、ペプチド核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡにおけるような糖−ホスホジエステル型連結、またはその誘導体が含まれる。ペプチド核酸は、ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成するのに好適である。いくつかの態様において、主鎖は、糖−ホスホジエステル型連結で構成され、糖基および／または該基を連結する連結は、ハイブリダイゼーション複合体安定性を亢進させるため、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡに比較し、改変されている。例えば、１つまたはそれ以上の２’−メトキシ置換ＲＮＡ基または２’−フルオロ置換ＲＮＡを有するオリゴマーは、相補的２’ＯＨ  ＲＮＡと安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する。２つの糖基を連結する連結は、全体の電荷または電荷密度に影響を与えることにより、または立体会合に影響を与えることにより（例えば、大きな連結による立体相互作用は、ハイブリダイゼーション複合体安定性を減少させる可能性がある）、ハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与えることが可能である。好ましい態様には、複合体安定性に影響を与える荷電（例えばホスホロチオエート）または中性（例えばメチルホスホネート）基を用いた連結が含まれる。
【００１５】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」により、一般的に１，０００残基未満を有する核酸を意味し、約２から５残基の下限および約５００から９００残基の上限を有する大きさの範囲に属するポリマーが含まれる。好ましくは、本発明のオリゴマーは、約５から約１５残基の下限および約５０から６００残基の上限を有する大きさの範囲に属する。より好ましくは、本発明のオリゴマーは、約１０から約２０残基の下限および約２２から１００残基の上限を有する大きさの範囲に属する。オリゴマーは、天然に存在する供給源から精製してもよいが、好ましくは、多様な公知の酵素的または化学的方法のいずれかを用い、合成する。
【００１６】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」により、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドを意味する。増幅オリゴヌクレオチドの例には、プライマーおよびプロモーター−プライマーが含まれる。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である、少なくとも約１０の連続する塩基、そしてより好ましくは、少なくとも約１２の連続する塩基を含む。連続する塩基は、好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、９５％以上、増幅オリゴヌクレオチドが結合する領域に相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは、約１０から約６０塩基長であり、そして所望により、修飾ヌクレオチドまたは類似体を含んでもよい。
【００１７】
増幅オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーはまた、「プライマー」または「プロモーター−プライマー」とも称される可能性がある。「プライマー」は、テンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能であり、そして既知の重合反応において伸長することが可能な３’端を有する、所望により修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的であってもよく；５’非相補的領域がプロモーター配列を含む場合、該プライマーは、「プロモーター−プライマー」と称することが可能である。当業者は、プライマーとして機能することが可能ないかなるプライマー（すなわち標的配列に特異的にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼ活性により伸長されることが可能な３’端を有する増幅オリゴヌクレオチド）も、５’プロモーター配列を含むよう修飾され、そしてしたがってプロモーター−プライマーとして機能することが可能であることを認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター−プライマーも、プロモーター配列の除去により、またはプロモーター配列を含まない合成により、修飾され、そしてなおプライマーとして機能することが可能である。
【００１８】
「ＬＴＲ特異的配列」により、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ領域中の配列またはその相補体に、標準的なハイブリダイゼーション条件下で、特異的にハイブリダイズする核酸塩基のいかなる配列も意味し；ＬＴＲ特異的配列は、非ＬＴＲ特異的塩基が、その標的配列へのＬＴＲ特異的配列のハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ＬＴＲ配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズしない核酸塩基をさらに含むかまたは該核酸塩基に共有結合していてもよい。同様に、「ｐｏｌ特異的配列」により、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ領域中の配列またはその相補体に、本明細書に記載されるような、標準的なハイブリダイゼーション条件下で、特異的にハイブリダイズする核酸塩基のいかなる配列も意味し；ｐｏｌ特異的配列は、非ｐｏｌ特異的塩基が、その標的配列へのｐｏｌ特異的配列のハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ｐｏｌ配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズしない核酸塩基をさらに含むかまたは該核酸塩基に共有結合していてもよい。
【００１９】
「増幅」により、標的核酸配列あるいはその相補体または断片の多コピーを得るための、いかなる既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法も意味する。「その断片」の増幅は、完全標的領域核酸配列またはその相補体より短い配列を含む増幅核酸の産生を指す。こうした断片は、例えば、標的核酸の内部部分にハイブリダイズし、そして該部分から重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いることにより、標的核酸の一部を増幅することにより、産生することが可能である。既知の増幅法には、例えば、転写仲介増幅、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼのようなレプリカーゼを用いる（例えばＫｒａｍｅｒら、米国特許第４，７８６，６００号；  ＰＣＴ第ＷＯ  ９０／１４４３９号を参照されたい）。ＰＣＲ増幅は、公知であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよび熱反復を用い、多コピーのＤＮＡの２つの相補鎖を合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８７，  Ｖｏｌ．  １５５：３３５−３５０を参照されたい）。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用い、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の多周期を用いることにより、標的およびその相補鎖を増幅する（欧州特許出願第０  ３２０  ３０８号を参照されたい）。ＳＤＡは、プライマーが制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含み、エンドヌクレアーゼが標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の１つの鎖にニックを入れ、続いて、一連のプライマー伸長および鎖置換工程において増幅が起こるであろう方法である（Ｗａｌｋｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６（１９９２）；および米国特許第５，４２２，２５２号を参照されたい）。転写関連増幅は、本発明の好ましい態様である。しかし、当業者には、本明細書に開示される増幅オリゴヌクレオチドが、プライマー伸長を用いる他の増幅法に容易に適用可能であることが明らかであろう。
【００２０】
「転写関連増幅」または「転写仲介増幅」により、ＲＮＡポリメラーゼを用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅のいかなる種類も意味する。転写関連増幅は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用し、そして所望により、１つまたはそれ以上の類似オリゴヌクレオチドを含んでもよい。多様な転写関連増幅が、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；  Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；  Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ第ＷＯ  ９３／２２４６１号；  Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ  ８８／０１３０２号；  Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ  ８８／１０３１５号；  Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；  Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号；  ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ第ＷＯ  ９４／０３４７２号；およびＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ第ＷＯ  ９５／０３４３０号に詳細に開示されるように、当該技術分野に公知である。Ｋａｃｉａｎらの方法が、本発明の好ましい態様に用いられる。
【００２１】
「プローブ」により、核酸、好ましくは増幅核酸の標的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する標準的条件下で特異的にハイブリダイズし、それにより、標的配列または増幅核酸の検出を可能にする核酸オリゴマーを意味する。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列または増幅核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合（すなわち塩基対形成）を用い、プローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする増幅核酸配列または標的領域内の配列（すなわちサブセット）を指す。プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元コンホメーションに貢献する他の配列（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に記載されるようなもの）を含んでなってもよい。「十分に相補的な」配列は、プローブの標的特異的配列に完全に相補的でなくても、標的配列へのプローブオリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。
【００２２】
「十分に相補的」により、一連の相補的塩基間の水素結合により、別の塩基配列にハイブリダイズすることが可能な連続する核酸塩基配列を意味する。相補的塩基配列は、標準的塩基対形成を用い、オリゴマーの塩基配列の各位で相補的であってもよいし、あるいは標準的水素結合を用いて相補的ではない１つまたはそれ以上の残基（非塩基性「ヌクレオチド」を含む）を含むが、全体の相補的塩基配列が、適切なハイブリダイゼーション条件において、別の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能であるものであってもよい。連続する塩基は、オリゴマーが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に、好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、９５％以上相補的である。当業者には、適切なハイブリダイゼーション条件が公知であり、該条件は、塩基組成に基づき予測することが可能であり、または日常的な試験を用いることにより、実験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。
【００２３】
「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉オリゴマー」により、塩基対ハイブリダイゼーションにより、標的配列および固定化オリゴマーに特異的に連結するための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴマーを意味する。捕捉オリゴマーは、好ましくは、２つの結合領域：標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を、通常同一のオリゴマー上に連続して含むが、捕捉オリゴマーは、１つまたはそれ以上のリンカーにより、共に連結される２つの異なるオリゴマー上に存在する、標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を含んでもよい。例えば、固定化プローブ結合領域が第一のオリゴマー上に存在してもよく、標的配列結合領域が第二のオリゴマー上に存在してもよく、そして２つの異なるオリゴマーが、第一および第二のオリゴマーの配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む第三のオリゴマーであるリンカーとの水素結合により、連結される。ときに、捕捉オリゴマーは、「捕捉プローブ」と称される。
【００２４】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」により、固定された支持体に捕捉オリゴマーを直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の非結合成分からの、結合した標的配列の分離を促進する、固体支持体に連結したオリゴマーである。例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよび金属粒子、特に磁気誘引可能粒子を含む、マトリックスおよび溶液中に遊離の粒子などの、いかなる既知の固体支持体を用いてもよい。好ましい支持体は、それにより、一貫した結果を提供し、固定化プローブが直接（例えば共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用を介し）、または間接的に（例えば１つまたはそれ以上のリンカーを介し）連結され、連結または相互作用が核酸ハイブリダイゼーション中、安定である、単分散磁気球体（すなわち大きさが±約５％で均一）である。
【００２５】
「分離」または「精製」により、生物学的試料の１つまたはそれ以上の構成要素が、該試料の１つまたはそれ以上の他の構成要素から除去されることを意味する。試料構成要素には、タンパク質、炭水化物、脂質および標識化プローブなどの成分もまた含む可能性がある、一般的に水性溶液相中の核酸が含まれる。好ましくは、この工程は、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％の他の試料構成要素を、望ましい構成要素から除去する。
【００２６】
「標識」または「検出可能標識」により、検出することが可能であるかまたは検出可能反応を導くことが可能である分子部分または化合物を意味する。標識は、直接または間接的に、核酸プローブに連結される。直接標識は、共有結合または非共有相互作用（例えば水素結合、疎水性およびイオン性相互作用）を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じ、あるいはキレートまたは配位複合体の形成を通じ、起こってもよい。間接的標識は、直接または間接的に標識され、そして検出可能シグナルを増幅することが可能な、架橋部分または「リンカー」、例えば抗体あるいは単数または複数のオリゴヌクレオチドの使用を通じ、起こってもよい。標識は、例えば、放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素または酵素基質、反応性基、発色団、例えば検出可能な色を与える色素または粒子（例えばラテックスまたは金属粒子）、発光化合物（例えば、生物発光剤、燐光剤または化学発光剤標識）および蛍光化合物などの、いかなる既知の検出可能部分であってもよい。
【００２７】
好ましくは、標識化プローブ上の標識は、均質アッセイ系、すなわち混合物中で、結合した標識化プローブが、非結合標識化プローブに比較し、物理的に標識または標識化プローブの非ハイブリダイズ型からハイブリダイズ型を除去することなく、検出可能な変化、例えば安定性または差別的分解を示す系で、検出可能である。「均質検出可能標識」は、その存在が、先に、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；  Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載されるような均質な方式で検出することが可能な標識を指す。均質アッセイで用いるのが好ましい標識には、化学発光化合物（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；  Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．ら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）が含まれる。好ましい化学発光標識はアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）である。合成および核酸に標識を結合させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９），  第１０章；  Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；  Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；  Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；  Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；  Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０  ７４７  ７０６号を参照されたい）。
【００２８】
「本質的にからなる」により、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させないさらなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物または単数または複数の方法工程が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、生物学的試料、例えば全血または血漿において、約１００コピーのＨＩＶ−１のコピー数で、ＨＩＶ−１核酸を検出する能力が含まれる。本発明の基本的なそして新規の特性に実質的な影響を有する、いかなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物または単数または複数の方法工程も、この用語の外に属する。
【００２９】
別に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての科学的および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に用いられる多くの用語の一般的な定義は、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，  １９９４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク）またはＴｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  １９９１，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ニューヨーク州ニューヨーク）に提供される。別に言及されない限り、本明細書に使用されるまたは意図される技術は、一般の当業者の１人に公知の標準的方法論である。実施例は、本発明のいくつかの態様を例示するため、含まれる。
【００３０】
本発明は、ヒト生物学的試料中のＨＩＶ−１核酸を検出するための組成物（核酸捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよびプローブ）および方法を含む。こうした使用に適したオリゴマー配列を設計するため、公共にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能な、サブタイプ、部分的配列、または相補的配列を含む、既知のＨＩＶ−１  ＤＮＡ配列を、公知の分子生物学的技術を用いて、同一のまたは類似の配列の領域をマッチさせることにより、並列し、そして比較した。比較に用いた配列には（データベースの名称を用いると）：ＨＩＶ３ＡＬＴＲｃ、ＨＩＶＡＮＴ７０、ＨＩＶＡＮＴ７０Ｃ、ＨＩＶＢＡＬ１、ＨＩＶＢａＬＴＲｃ、ＨＩＶＢｂＬＴＲｃ、ＨＩＶＢＲＵＣＧ、ＨＩＶＣＡＭ１、ＨＩＶＣＤＣ４１、ＨＩＶＤ３１、ＨＩＶＥａＬＴＲｃ、ＨｌＶ１ＥｂＬＴＲｃ、ＨＩＶＥＬＩ、ＨＩＶＥＬＩＣＧ、ＨＩＶＨＡＮ、ＨＩＶＨＸＢ２、ＨＩＶＨ９ＮＬ４３、ＨＩＶＪ２３３、ＨＩＶＪＲＣＳＦ、ＨＩＶＪＲＦＬ、ＨＩＶＪＨ３１、ＨＩＶＫＥＢＯ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＡＬ、ＨＩＶＭＣＫ１、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶＭＮＣＧ、ＨＩＶＭＶＰ５１８０、ＨＩＶＮＤＫ、ＨＩＶＮＬ４３、ＨＩＶＮＹ５、ＨＩＶＮＹ５ＣＧ、ＨＩＶＯＹＩ、ＨＩＶＲＦ、ＨＩＶＳＣ、ＨＩＶＳＦ１６２、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−ｓｕｂＣ、ＨＩＶＵ４５５、ＨＩＶＴＨ４７５Ａ、ＨＩＶＹＵ２、ＨＩＶＺ２Ｚ６、ＨＩＶ１ＳＧ３Ｘ、ＨＩＶ１Ｕ１２０５５、ＨＩＶ１Ｕ２１１３５、ＨＩＶ１Ｕ２３４８７、ＨＩＶ１Ｕ２６５４６、ＨｌＶｌＵ２６９４２、ＨｌＶｌＵ３４６０３、ＨｌＶｌＵ３４６０４、ＨｌＶｌＵ３９３６２、ＨＩＶ１Ｕ３ＲＡ、ＨＩＶ２ＡＬＴＲｃ、ＨＩＶ２ＢＬＴＲｃ、ＨＩＶ２ＣＬＴＲｃ、ＨＩＶ２１３２、ＨＩＶ３ＢＬＴＲｃ、ＨＩＶ４ＡＬＴＲｃ、ＨＩＶ４ＢＬＴＲｃ、ＨＩＶ４ＣＬＴＲｃ、およびＲＥＨＴＬＶ３が含まれた。設計された捕捉オリゴマーを用いた検出に標的化されたＨＩＶ−１ゲノム領域、プライマーおよびプローブは、図１に図式的に示されるように、ＬＴＲおよびｐｏｌ領域であった。配列比較は、アルゴリズムの使用により容易になるが、当業者は、こうした比較を手で容易に行うことが可能である。比較された配列間に、比較的少ない配列変動を含む配列部分を、捕捉、増幅および増幅配列の検出で用いるのに適した合成オリゴマーを設計する基礎として選択する。オリゴマーを設計する際の他の考慮事項には、当業に公知の方法を用いた、配列の相対ＧＣ含量（約３０％から約５５％の範囲）および配列内の予測される二次構造（例えばヘアピンターン形成分子内ハイブリッド）の相対的非存在が含まれる。
【００３１】
これらの解析に基づき、配列番号１から配列番号４５の捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよびプローブ配列を設計した。一般的に、捕捉オリゴマー配列に関しては、ＨＩＶ−1配列に特異的に結合する配列が、３’テールを含まず（配列番号１、３、５、および１９）、そして３’テールを含み（配列番号２、４、６、および２０）、示される。一般的に、Ｔ７プロモーター配列を含む、Ｔ７プロモータープライマーの配列に関しては、Ｔ７プロモーター配列を含まず（配列番号７、１２、１４、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３）、そして５’  Ｔ７プロモーター配列を含み（配列番号８、１３、１５、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４）、示される。いくつかのＴ７プロモータープライマー配列は、Ｔ７プロモーター配列と共にのみ示される（配列番号４３および配列番号４４）が、当業者は、Ｔ７プロモーター配列を含むまたは含まない、ＨＩＶ−１に特異的なプライマー配列は、いくつかの増幅条件下でプライマーとして有用である可能性があることを認識するであろう。
【００３２】
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドには、テール配列に共有結合する、ＬＴＲ領域またはｐｏｌ領域でＨＩＶ−１配列に特異的に結合する配列（すなわちＨＩＶ−１結合配列）が含まれる。捕捉オリゴマーの塩基配列を連結するいかなる主鎖を用いてもよく、そして好ましい態様において、捕捉オリゴマーは、主鎖内に少なくとも１つのメトキシ連結を含む。好ましくは捕捉オリゴマーの３’端にあるテール配列を用い、相補的塩基配列にハイブリダイズさせ、生物学的試料中の他の構成要素から、ハイブリダイズした標的ＨＩＶ−１核酸を捕捉する手段を提供する。相補的塩基配列にハイブリダイズするいかなる塩基配列を、テール配列に用いてもよく、該配列は、好ましくは、約５から５０ヌクレオチド残基の配列長を有する。好ましいテール配列は、実質的にホモポリマーであり、約１０から約４０のヌクレオチド残基を含む。例えば、テールは、約（Ａ）10から約（Ａ）40残基を含んでなってもよい。好ましくは、捕捉オリゴマーのテールは、約１４から約３０残基を含み、そして配列において、実質的にホモポリマーである。好ましいテール配列には、ＴＴＴ（Ａ）14からＴＴＴ（Ａ）30および（Ａ）14から（Ａ）30の配列が含まれる。
【００３３】
本発明の好ましい方法は実施例に記載され、そして例示される。図２は、ＨＩＶ−１ゲノム（太い水平な実線により示される）の標的領域（すなわち選択された部分）を検出するための１つの系を例示する。この系は、４つのオリゴマー（より短い実線により示される）：標的領域でＨＩＶ−１配列に特異的にハイブリダイズする配列、および生物学的試料中に存在する標的領域を捕捉するため、固体支持体に固定された相補的配列にハイブリダイズするテール（「Ｔ」）を含む１つの捕捉オリゴマー；標的領域でＨＩＶ−１配列に特異的にハイブリダイズする配列、および二重鎖で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの機能するプロモーターとして作用するＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）を含む１つのＴ７プライマー；Ｔ７プライマーを用い、標的領域配列から作成される第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含む１つの非Ｔ７プライマー；および２つのプライマーを用いて増幅されている標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列を含む１つの標識化プローブを含む。
【００３４】
図２に例示される構成要素を用い、生物学的試料中のＨＩＶ−１配列を検出するためのアッセイには、捕捉オリゴマーを用い、標的核酸を捕捉し、好ましくは転写関連増幅反応を用いることにより、少なくとも２つのプライマーを用い、捕捉した標的領域を増幅し、そして増幅核酸に含まれる配列に標識化プローブをハイブリダイズさせ、そして結合した標識化プローブから生じるシグナルを検出することにより、増幅核酸を検出する工程が含まれる。
【００３５】
捕捉工程は、好ましくは、図２に例示される捕捉オリゴマーを用い、ハイブリダイゼーション条件下で、捕捉オリゴマーの１つの部分が標的核酸に特異的にハイブリダイズし、そしてテール部分が、標的領域を試料の他の構成要素から分離することを可能にする、結合対の１つの部分、例えばリガンド（例えばビオチン−アビジン結合対）として作用する。好ましくは、捕捉オリゴマーのテール部分は、固体支持体粒子に結合されることにより、固定されている相補的配列にハイブリダイズする配列である。好ましくは、まず、捕捉オリゴマーおよび標的核酸は、溶液相ハイブリダイゼーション動力学を利用するため、溶液中にある。ハイブリダイゼーションは、相補的固定化配列と捕捉オリゴマーのテール部分のハイブリダイゼーションにより、固定化プローブに結合させることが可能な捕捉オリゴマー：標的核酸複合体を生じる。したがって、標的核酸、捕捉オリゴマーおよび固定化プローブを含む複合体が、ハイブリダイゼーション条件下で形成される。好ましくは、固定化プローブは、テール配列に相補的であり、そして固体支持体に結合している反復配列であり、そしてより好ましくは、ホモポリマー配列（例えばポリ−Ａ、ポリ−Ｔ、ポリ−Ｃまたはポリ−Ｇ）である。例えば、捕捉オリゴマーのテール部分がポリ−Ａ配列を含む場合、固定化プローブは、ポリ−Ｔ配列を含むであろうが、相補的配列のいかなる組み合わせを用いてもよい。捕捉オリゴマーはまた、標的にハイブリダイズする塩基配列および固定化プローブにハイブリダイズするテールの塩基配列の間に位置する１つまたはそれ以上の塩基である、「スペーサー」残基も含んでもよい。例えば、ポリ−ｄＴ固定化プローブにハイブリダイズするＴＴＴ（Ａ）16からなるテール部分は、標的配列にハイブリダイズする塩基配列および固定化プローブにハイブリダイズする（Ａ）16配列を分離するＴＴＴからなるスペーサーを含む。例えばマトリックスおよび溶液中に遊離した粒子（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよび好ましくは、磁気誘引可能粒子）などのいかなる固体支持体を用いてもよい。固体支持体に固定化プローブを結合させる方法は公知である。支持体は、好ましくは、標準的方法（例えば遠心分離、磁気粒子の磁気誘引、およびそれらに匹敵するもの）を用い、溶液から回収することが可能な粒子である。好ましい支持体は、常磁性単分散粒子（すなわち大きさが±約５％で均一）である。
【００３６】
標的核酸：捕捉オリゴマー：固定化プローブ複合体を回収すると、（生物学的試料におけるその濃度に比較し）標的核酸が濃縮され、そして生物学的試料中に存在する可能性がある増幅阻害因子から標的核酸が精製される。捕捉された標的核酸は、１回またはそれ以上、洗浄し、（例えば結合した標的核酸：捕捉オリゴマー：固定化プローブ複合体を含む粒子を、洗浄溶液に再懸濁し、そしてその後、上述のように、洗浄溶液から結合した複合体を含む粒子を回収することにより）標的をさらに精製してもよい。好ましい態様において、捕捉工程は、連続的に、捕捉オリゴマーを標的核酸とハイブリダイズさせ、そしてその後、ハイブリダイゼーション条件を調整し、捕捉オリゴマーのテール部分と、固定化相補的配列とのハイブリダイゼーションを可能にすることにより、行う（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ  ９８／５０５８３号に記載されるように）。捕捉工程、およびそこに含まれるいかなるものでもよい所望による洗浄工程が完了した際、好ましくは捕捉オリゴマーから遊離させることなく、標的核酸を増幅する。
【００３７】
捕捉された標的領域の、２つのプライマーを用いた増幅は、多様な既知の核酸増幅反応を用いて達成してもよいが、好ましくは、転写関連増幅反応を用いる。こうした態様において、多くの核酸鎖が、標的核酸の単一コピーから産生され、したがって、増幅された配列に結合した検出可能プローブを用いることにより、標的の検出が可能になる。転写関連増幅は、別の場所に詳細に記載されてきており（Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号）、そして以下に簡潔に記載される。好ましくは、転写関連増幅は、溶液において、適切な塩および緩衝剤と共に、２種類のプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むため、プロモーター−プライマーと称され、図２に「Ｐ」と明示される）、酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、および基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を用い、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。簡潔には、第一の工程において、プロモーター−プライマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズし、そして逆転写酵素がプロモーター−プライマーの３’端からの伸長により、第一鎖ｃＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡは、公知の技術を用いることにより、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡを分解するため、例えば、二重鎖を変性させるか、または好ましくは逆転写酵素に供給されるＲＮアーゼＨ活性を用いることにより、第二のプライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能になる。その後、第二のプライマーがｃＤＮＡに結合し、そしてＤＮＡの新規鎖が逆転写酵素を用い第二のプライマーの端から合成され、１つの端で機能するプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡが生成される。ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖プロモーター配列に結合し、そして転写は、多数の転写物または「単位複製物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」を生じる。これらの単位複製物は、その後、転写関連増幅過程に用いられ、各々、上述のような複製の新たな周期のテンプレートとして利用され、このように、多量の一本鎖増幅核酸（単一のテンプレートから合成される約１００から約３，０００のＲＮＡ転写物）が生成される。好ましくは、増幅は、実質的に一定の反応条件（例えば単一の温度）を用いる。
【００３８】
プロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドは、二本鎖になると、ＲＮＡポリメラーゼの機能するプロモーターとして働く５’配列プロモーター配列、および標的領域内の配列に特異的にハイブリダイズする３’配列領域を含む。好ましいプロモーター−プライマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列を含み、そしてこうしたプロモーター−プライマーは、「Ｔ７プライマー」と称することが可能である。プロモーター配列を含まない第二のプライマーは、しばしば、Ｔ７プライマーと区別するため、「非Ｔ７プライマー」と称される。
【００３９】
図２に関し、転写仲介増幅中、捕捉された標的核酸は、Ｔ７プライマーとして示される第一のプライマーにハイブリダイズする。逆転写酵素を用い、標的ＲＮＡをテンプレートとして用い、Ｔ７プライマーからｃＤＮＡが合成される。非Ｔ７プライマーとして示される、第二のプライマーは、該ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、そして逆転写酵素がＤＮＡ二重鎖を形成し、こうして二重鎖の機能するＴ７プロモーターを形成する。その後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、機能するＴ７プロモーターを用いることにより、多数のＲＮＡ転写物を生成する。最初のｃＤＮＡ合成工程に続き、これらのハイブリダイゼーションおよび重合工程を反復することにより、さらなるＲＮＡ転写物が産生され、こうして標的領域特異的核酸配列が増幅される。
【００４０】
検出工程は、増幅された核酸（例えば転写仲介増幅から生じるＲＮＡ転写物または単位増幅物）に特異的に結合する、少なくとも１つの標識化プローブを用いる。好ましくは、該プローブは、結合プローブを非結合プローブから精製することなく検出することが可能なシグナルを産生する検出可能標識で標識される（すなわち均質検出系）。より好ましくは、プローブは、先に詳細に記載される（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号および米国特許第５，６５６，７４４号；  Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号）ような、化学発光シグナルが産生され、そして検出される、アクリジニウムエステル化合物で標識される。
【００４１】
図３に例示されるように、転写関連増幅反応は、標的領域に関し、多数のプロモーター−プライマーおよびプライマーを用いてもよい。図３では、標的領域核酸を捕捉するのに、２つの捕捉オリゴマーが用いられる。その後、転写関連増幅中、上述のように、多数のＴ７プライマーおよび非Ｔ７プライマーが用いられる。検出工程中、転写物に特異的に結合する多数の標識化プローブを用い、単位増幅物を検出する。例示の目的のため、図３は、上記の構成要素の各々の２つの異なる型を示すが、各構成要素の２以上が、アッセイ反応に用いられてもよい。
【００４２】
図３は、捕捉工程で用いられる、各々標的領域の異なる配列に特異的にハイブリダイズする、２つの異なる捕捉オリゴマーを例示する。好ましくは、１つの捕捉オリゴマーは、標的領域の５’部分にハイブリダイズし、そして第二の捕捉オリゴマーは、３’部分にハイブリダイズする。捕捉工程中、多数の捕捉オリゴマーを用いる態様において、好ましくは、両捕捉オリゴマーは、上述のように、両捕捉オリゴマーの同一の固定化プローブ種へのハイブリダイゼーションを可能にする、実質的に同一のテール配列を有する。例えば、２つの異なる捕捉オリゴマーのテールは、ポリ−Ｔ配列であってもよく、そして固定化配列はその場合、相補的ポリ−Ａオリゴマーである。
【００４３】
図３では、標的捕捉に続き、好ましくは少なくとも２つのＴ７プライマーおよび少なくとも２つの非Ｔ７プライマーを使用する転写関連増幅法を用い、標的領域の一部を増幅する。転写関連増幅には、２つのプライマー（Ｔ７プロモータープライマーおよび非Ｔ７プライマー）しか必要でないが、各種類の２つまたはそれ以上の異なるプライマーの使用は、いくつかの標的配列の増幅を亢進することが見出されてきている。驚くべきことに、２つのプライマーが重複する標的配列に特異的に結合する場合（図３に例示されるようなもの）であっても、亢進された増幅が観察された。すなわち、重複する標的配列に特異的に結合するプライマーを提供することにより、例えば、標的配列へのハイブリダイゼーションに関し、プライマーが競合する場合に期待される可能性があるような阻害された増幅よりむしろ、標的領域の亢進された増幅が観察された。さらなる予期されぬ利点は、いくつかの標的（例えばＨＩＶ−１  Ｏ群ｐｏｌ）に関し、重複する標的配列に結合する少なくとも２つの増幅オリゴマーの組み合わせが、１つのプライマーおよび１つのプロモーター−プライマーを用いる、図２に例示されるような系を用いて達成されたより、より効率的な標的増幅を可能にしたことであった。
【００４４】
再び、図３では、標的配列の増幅に続き、増幅配列に特異的にハイブリダイズする２つまたはそれ以上の異なる標識化プローブを、アッセイの検出工程で用いる。上に論じられるように、いかなる検出可能標識を用いてもよく、そして異なるプローブに異なる標識を用いてもよい。例えば、１つの標識を放射標識し、別のプローブを蛍光標識し、こうして異なる区別可能なシグナルを提供してもよい。好ましくは、２つまたはそれ以上の標識化プローブを、各々、非結合プローブが物理的分離を必要とすることなく、結合プローブから区別される、均質系におけるシグナル検出を可能にする標識で、標識する。好ましい態様において、２つまたはそれ以上の標識化プローブを発光標識で標識し、そしてより好ましくは、発光標識は、公知の方法を用い、均質検出アッセイで化学発光シグナルとして検出されるＡＥ化合物である。
【００４５】
図２は、各構成要素の１つが用いられる態様を例示し、そして図３は、各構成要素の２つが用いられる態様を例示するが、当業者は、図２および図３に例示されるような特徴を組み合わせた、異なる変動が用いられてもよいことを認識するであろう。例えば、アッセイは、標的領域を捕捉する１つの捕捉オリゴマーを用いてもよく、その後、増幅中２つのプロモーター−プライマーおよび２つの第二のプライマーを用いてもよく、そして最後に、すべての単位複製物に特異的に結合する１つのプローブを用い、増幅された産物を検出してもよい。別の例において、多数の捕捉オリゴマーを用い、標的領域核酸を捕捉し、その後、多数のプロモーター−プライマーであるが、単一の第二のプライマー配列を用いる転写仲介増幅を行い、その後、１つの標識化プローブを用い、検出してもよい。すなわち、少なくとも１つの各構成要素がアッセイに存在する限り、図２に示される基本的アッセイの構成要素の異なる組み合わせを用いてもよい。
【００４６】
ＨＩＶ−１  ＬＴＲおよびｐｏｌ配列の標的領域を検出するための特定の態様の例が、図４Ａおよび４Ｂに例示される。図４Ａに示されるように、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列を検出するため、捕捉オリゴマーは配列番号２の配列を含み、非Ｔ７プライマーは配列番号９の配列を含み、Ｔ７プライマーは配列番号８の配列を含み、そして標識化プローブは配列番号１６の配列を含み、これらの配列の相対的位置は、ＬＴＲ標的領域を示す長い垂直な線の上または下の短い水平線により、例示される。好ましくは、標識化プローブは、配列番号１６と明示される水平線に連結した短い垂直な線により示されるようなＡＥ由来標識を含む。図４Ｂに示されるように、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ配列を検出するため、オリゴマーの各種類の２つがアッセイに含まれ、これらの配列の相対的な位置は、ｐｏｌ標的領域を示す長い垂直な線の上または下の短い水平線により、例示される。すなわち、２つの捕捉オリゴマーが用いられ、第一のものは配列番号４の配列を有し、そして第二のものは配列番号６の配列を有し；２つの非Ｔ７プライマーが用いられ、第一のものは配列番号１０の配列を有し、そして第二のものは配列番号１１の配列を有し；２つのＴ７プライマーが用いられ、第一のものは配列番号１３の配列を有し、そして第二のものは配列番号１５の配列を有し；そして２つの標識化プローブが用いられ、第一のものは配列番号１７の配列を有し、そして第二のものは配列番号１８の配列を有する。好ましくは、標識化プローブは、配列番号１７および配列番号１８と明示される水平線に連結した短い垂直な線により示されるようなＡＥ由来標識を含む。
【００４７】
上述の方法に関し、特定の配列を有する捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび標識化プローブが、ＨＩＶ−１ゲノムのＬＴＲおよびｐｏｌ領域に位置するＨＩＶ−１標的配列を検出するのに有用であると同定されてきている。これらの特定の配列は、単一の連続する配列中に、天然に存在する核酸（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）に存在するような連続する核酸塩基、類似体（例えばイノシン）または合成プリンおよびピリミジン誘導体、例えばＰまたはＫ塩基（Ｌｉｎ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，  １９８９，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：１０３７３−８３；  Ｌｉｎ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，  １９９２，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：５１４９−５２）、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ＬＴＲ標的領域に好ましい捕捉オリゴマーには、回収可能な固相に標的領域配列を連結するための結合パートナー（すなわちリガンド）として働くことが可能ないかなるものでもよい部分に結合する、配列番号１および配列番号１９のＨＩＶ−１結合配列が含まれる。好ましくは、リガンドは、固定化相補的オリゴマーにハイブリダイズする３’テール配列である。テール配列を含む、好ましいＬＴＲ特異的捕捉オリゴマーは、配列番号２、配列番号２０および配列番号４５の配列により示される。ｐｏｌ標的領域に好ましい捕捉オリゴマーには、固定化相補的オリゴマーにハイブリダイズするテール配列に結合する、配列番号３および配列番号５のＨＩＶ−１結合配列が含まれる。テール配列を含む、好ましいｐｏｌ標的領域捕捉オリゴマーには、配列番号４および配列番号６の配列が含まれる。
【００４８】
ＬＴＲ領域の配列を増幅するための好ましい増幅オリゴマー配列には、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８が含まれる。好ましいＴ７プロモータープライマーであるＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列の増幅のためのプライマー配列には、配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４が含まれる。ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列の増幅のための好ましい非Ｔ７プライマー配列には、配列番号９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８が含まれる。転写仲介増幅反応において、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ領域を増幅するためのプライマーの好ましい組み合わせには、配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２または配列番号３４の配列を含む、少なくとも１つのＴ７プロモータープライマー；および配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８の配列を含む、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーが含まれる。
【００４９】
ｐｏｌ領域の配列を増幅するための好ましい増幅オリゴマー配列には、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４が含まれる。好ましいＴ７プロモータープライマーであるＨＩＶ−１  ｐｏｌ配列の増幅のためのプライマー配列には、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４３および配列番号４４が含まれる。ＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的配列の増幅のための好ましい非Ｔ７プライマー配列には、配列番号１０、配列番号１１および配列番号４２が含まれる。転写仲介増幅法において、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的領域を増幅するためのプライマーの好ましい組み合わせには、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４３または配列番号４４の配列を含む、少なくとも１つのＴ７プロモータープライマー；および配列番号１０、配列番号１１または配列番号４２の配列を含む、少なくとも１つの非Ｔ７プライマーが含まれる。
【００５０】
検出可能シグナルを提供する、増幅されたＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列にハイブリダイズするのに好ましいプローブには：配列番号１６、ここで「Ｎ」残基は、いかなる塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ，Ｃ）またはイノシンまたはその類似体（例えば５−ニトロ−インドールまたは２’−メトキシ塩基）であってもよく、そして好ましくはイノシンである；配列番号３９、ここで「Ｎ」残基は、いかなる塩基またはイノシンまたはその類似体であってもよい；配列番号４０、ここで「Ｒ」残基は、ＡまたはＧいずれかであってもよく、そして好ましくはＡである；および配列番号４１の配列が含まれる。１つの態様において、増幅されたＬＴＲ配列を検出するための標識化プローブ配列は、核酸主鎖中に、メトキシ主鎖または少なくとも１つのメトキシ連結を有する。好ましくは、標識化プローブ中の標識は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号；およびＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に実質的に記載されるように、特に１０欄６行から１１欄３行、および実施例８に記載されるように、リンカーを介し、プローブ配列に結合する化学発光ＡＥ化合物（例えば２−メチル−ＡＥ）である。すなわち、好ましい標識位置は、プローブの中央領域でそしてＡ／Ｔ塩基対の近く、プローブの３’または５’末端、あるいは、望ましい標的配列でない既知の配列とのミスマッチ部位またはその近傍である。例えば、配列番号１７の配列を有するプローブを用いると、ＡＥ標識は、好ましくは、３’または５’末端、あるいは残基５から１４または残基１６から１９の隣接する残基間、例えば、残基６および７の間、または残基７および８の間、または残基１０または１１の間の位で結合する。
【００５１】
配列番号１６、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１の配列を有するプローブの個々の態様を、サブタイプＢ、サブタイプＧ（サブタイプＢに比較し、ＬＴＲ中に塩基置換を有する）およびＯ群のＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列への結合に関し、試験した。例えば、配列番号１６を有するプローブが、位７でイノシンを含む場合、サブタイプＢおよびＯ群両方に関するＴmは、本質的に同じ（７２−７３℃）であり、そしてサブタイプＧに関して、より高く（約８０℃）、一方、５−ニトロ−インドールを位７で用いた場合、すべての試験した株に関するＴmは、ほぼ同じであった（７０−７３℃）。配列番号３９の異なる態様を用い、同様の試験を行い、そしてすべての試験から、以下の結論が引き出された：１つの２’−メトキシリボース塩基を、デオキシリボース塩基の代わりに用いると、一般的にＴmが約２℃低下し；標的配列間で異なる残基に相補的な塩基の代わりに、イノシンを用いると、標的へのハイブリダイゼーションが補助され；そして塩基の代わりに５−ニトロ−インドールを用いると、ハイブリダイゼーション動力学が増加する可能性がある。
【００５２】
検出可能シグナルを提供する、増幅されたＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的配列へのハイブリダイゼーションに好ましいプローブは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の配列を含み、そしてより好ましくは、配列番号１７および配列番号１８を含む。１つの態様において、増幅されたＨＩＶ−１  ｐｏｌ配列を検出するための標識化プローブ配列は、メトキシ主鎖を有する。好ましい標識は、実質的に上述のようにプローブ配列に結合した、化学発光ＡＥ標識であり、より好ましくは、２−メチル−ＡＥである。
【００５３】
本発明の一般的な原理は、以下の制限しない実施例を参照することにより、より完全に理解することが可能である。
【００５４】
【実施例】
実施例１
増幅オリゴマー混合物における、配列番号１０または配列番号４２を用いた、ＨＩＶ−１、サブタイプＢ（ＨＩＶ−１、ＩＩＩｂ）ｐｏｌ標的配列の検出
既知の量のＨＩＶ−１サブタイプＢを含むヒト血漿の試料（反応試験管当たり、ＨＩＶ−１  ＩＩＩｂの１００コピー）を、等体積の溶解緩衝液（７９０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２３０  ｍＭ  コハク酸、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、６８０  ｍＭ  水酸化リチウム一水和物）と混合した。ＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的ＲＮＡを捕捉するため、混合物はまた、各約１．７５  ｐｍｏｌの配列番号４および配列番号６のオリゴマー、および常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）に結合した固定化ポリ−ｄＴ14プローブ約１００μｇも含んだ。プローブは、先に記載されるように（Ｌｕｎｄら，  １９８８，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８６１−１０８８０）、カルボジイミド化学反応を用いて、粒子に結合させた。混合物を、５５℃から６０℃に、約１５から３０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却し、ハイブリダイゼーションさせた。その後、磁場を適用し、固定化プローブＨＩＶ−１、捕捉オリゴマーおよびＨＩＶ−１  ＲＮＡを含む複合体と共に磁気粒子を、反応容器上の位置にひきつけた（実質的にＷａｎｇら、米国特許第４，８９５，６５０号に記載されるように）。その後、１  ｍｌの洗浄緩衝液（１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．５  ｍＭ  ＮａＯＨ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチル−パラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピル−パラベン、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）に粒子を再懸濁し、そしてその後、磁気分離工程を反復することにより、１  ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した。その後、洗浄した粒子を、実質的に先に記載されるような方法（Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号）を用いた転写関連増幅用の核酸増幅試薬溶液７５μｌに懸濁した。
【００５５】
簡潔には、結合した複合体を伴う洗浄粒子を、反応混合物（４０  ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ  ７．５、１７．５  ｍＭ  ＫＣｌ、２０  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５％  ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、各１  ｍＭのｄＮＴＰ、各４  ｍＭのｒＮＴＰ）中で、（１）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５、または（２）配列番号４２、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５、いずれかである増幅オリゴヌクレオチド各７．５  ｐｍｏｌと混合し、不活性油の層（２００μｌ）で覆い、蒸発を防ぎ、そして６０℃で１０−１５分間インキュベーションし、そしてその後、４１．５−４２℃で５分間インキュベーションした。酵素（反応当たり逆転写酵素約７５０単位およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ約２０００単位）を添加し、混合し、そして標的ＨＩＶ−１核酸を４１．５−４２℃で２時間増幅した。
【００５６】
増幅されたＨＩＶ−１標的配列を、実質的に先に記載されるように（米国特許第５，６５８，７３７号、２５欄２７−４６行；  Ｎｅｌｓｏｎら，  １９９６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：８４２９−８４３８の８４３２）、化学発光により検出し、そして相対光単位（ＲＬＵ）で表す、ＡＥ標識化プローブ（配列番号１７）を用いて検出した。各アッセイ条件に関し、陰性対照は、すべての同一の試薬からなるが、ＨＩＶ−１を含まない血漿同体積で代用した。各組の増幅オリゴヌクレオチドに関する１１のＨＩＶ−１陽性（「ＨＩＶ−１  ＋」）試料および８つのＨＩＶ−１陰性試料に関するこれらのアッセイの検出されたＲＬＵを表１に示す。
【００５７】
表１
増幅オリゴヌクレオチドの組み合わせに関し、検出されたＲＬＵ
【００５８】
【表１】
0004824236.tif 000002
【００５９】
これらの結果は、ＨＩＶ−１が、本発明の組成物および方法を用いて、生物学的試料中で容易に検出することが可能であることを示す。さらに、増幅オリゴマーの２つの異なる組み合わせは、捕捉されたｐｏｌ標的配列を同様に増幅し、検出可能な増幅産物を生じることが可能であった。次の実施例は、異なるサブタイプ、ＨＩＶ−１サブタイプＣもまた、捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび標識化プローブの同一の組み合わせを用いて、検出することが可能であることを示す。
【００６０】
実施例２
生物学的試料中のＨＩＶ−１、サブタイプＣ、ｐｏｌ標的配列の検出
正常非感染血液血漿の試料を、既知の量のＨＩＶ−１サブタイプＣ  ＲＮＡと混合し、反応当たり、約１００コピーの標的核酸を含む試料を生じた。陰性対照は、アッセイにおいて、同一に処理された、ＨＩＶ−１  ＲＮＡを含まない血漿試料であった。実質的に実施例１に記載されるように、試料を標的捕捉、転写仲介増幅および標識化プローブ検出に供し、そしてこれらのアッセイの結果を表２に示す。
【００６１】
表２
増幅オリゴヌクレオチドに関し、検出されたＲＬＵ
【００６２】
【表２】
0004824236.tif 000003
【００６３】
これらのアッセイで検出されたシグナルは、実施例１のものより幾分低かったが、これらの結果は、該アッセイ条件がまた、生物学的試料中のＨＩＶ−１サブタイプＣ核酸の検出も可能にすることを示す。
【００６４】
次の実施例は、１  ｍｌ当たり、６００および６０コピーの間で生物学的試料中に存在するＨＩＶ−１標的の検出を示す。
実施例３
異なるコピー数のＨＩＶ−１サブタイプＢ（ＨＩＶ−１  ＩＩＩｂ）ｐｏｌ標的配列の検出
本実施例では、既知のコピー数のＨＩＶ−１  ＩＩＩｂ（６００、２００または６０コピー／ｍｌ）を含む血漿試料を、実質的に実施例１に記載されるとおりであるが、異なる組み合わせの増幅オリゴマーを用いる方法を用いてアッセイした。これらのアッセイでは、転写仲介増幅は、（１）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５、または（２）配列番号１０、配列番号１１、配列番号４３および配列番号１５、いずれかを用いて行った。捕捉および増幅工程後、表３に示されるＲＬＵシグナルを検出した。表３は、試験した、異なるコピー数試料の各々のための１０の反応（コピー数＝１  ｍｌ当たり６００、２００または６０）、または陰性対照のための５つの反応（コピー数＝１  ｍｌ当たり０）から得た、平均ＲＬＵおよび標準偏差を示す。
【００６５】
表３
増幅オリゴヌクレオチドに関し、検出された平均ＲＬＵ
【００６６】
【表３】
0004824236.tif 000004
【００６７】
これらのアッセイでは、配列番号１３の配列を有する増幅プロモーター−プライマーを含む捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび検出標識化プローブの組み合わせは、配列番号４３を含む組み合わせより高い検出可能シグナルを提供したが、どちらの組み合わせも、試料１  ｍｌ当たりＨＩＶ−１の少なくとも２００またはそれ以上のコピー数の存在を検出することが可能であった。さらに、配列番号１３のプライマーを含む組み合わせは、一般的に、１  ｍｌ当たり６０コピーのＨＩＶ−１程度の低コピー数を検出することが可能であった。
【００６８】
これらのアッセイはまた、反応当たり５００コピーのＨＩＶ−１  ＩＩＩｂを含む試料に対する別個の試験でも行った。これらのアッセイでは、配列番号１３の配列を有する増幅プロモーター−プライマーを含む捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび検出標識化プローブの組み合わせは、５つの陰性対照の１，６２４±１７４の平均ＲＬＵに比較し、１０の試料の２．０３  Ｘ  １０6±７．０３  Ｘ  １０4の平均ＲＬＵシグナルを提供した。配列番号４３の配列を有する増幅プロモーター−プライマーを含む捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび検出標識化プローブの組み合わせは、４つの陰性対照の１，６９３±１９６の平均ＲＬＵシグナルに比較し、１０の試料の１．３０  Ｘ  １０6±４．５２  Ｘ  １０5の平均ＲＬＵシグナルを提供した。
【００６９】
次の実施例に見られるように、同様のアッセイにおいて、プライマーの他の組み合わせもまた用い、生物学的試料中のＨＩＶ−１を検出した。
実施例４
別のプロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドを用いた、異なるコピー数のＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的配列の検出
さらなる組の実験で、反応当たり２００、１００または２０コピーのＨＩＶ−１  ＩＩＩｂを含む血漿試料を、実施例３に記載される１つの態様と同様の組み合わせの捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび検出標識化プローブを用い、しかし、増幅反応混合物中で、配列番号１５の配列を有するプライマーの代わりに配列番号４４の配列を有するプロモーター−プライマーを用いて、試験した。すなわち、標的捕捉、増幅および検出工程は、実質的に実施例１に記載されるように行ったが、増幅反応に用いられる増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号４４の配列を有するものを含んだ。
【００７０】
これらのアッセイの結果を表４に示し、該表では平均検出ＲＬＵがアッセイ組の各々に関し示される。
表４
試料中の異なる数のＨＩＶ−１標的の検出
【００７１】
【表４】
0004824236.tif 000005
【００７２】
これらの結果は、該アッセイが、生物学的試料中の２０コピーのＨＩＶ−１標的核酸程度の少ないコピー数を検出することが可能であることを示す。
以下の実施例は、ＨＩＶ−１のＬＴＲ標的領域に特異的な捕捉オリゴマー、増幅オリゴヌクレオチドおよび標識化プローブを用いた同様のアッセイを用い、生物学的試料中のＨＩＶ−１標的核酸を検出することもまた可能であることを示す。
【００７３】
実施例５
ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列の検出
本アッセイは、既知のコピー数で、試料中に存在する標的ＨＩＶ−１  ＲＮＡを捕捉し、そしてその後、図１に図解されるように、ＬＴＲ領域に特異的な増幅オリゴマー（配列番号８および配列番号９）を用い、ＨＩＶ−１配列を増幅するため、異なる捕捉オリゴマーを用いた。増幅された配列をその後、ＬＴＲ配列に特異的に結合する標識化プローブ（配列番号４１）を用いて検出した。ＨＩＶ−１標的ＲＮＡは、１，０００、２００または５０コピーのＨＩＶ−１を含む５００μｌのヒト血漿で作成された試験試料中に存在し、そして同一条件下で試験されるＨＩＶ−１  ＲＮＡを含まない陰性血漿試料と比較した。条件の各組に関し、６つの試料を試験した。
【００７４】
用いたプロトコルは、実質的に実施例１に記載されるとおりであり、以下の変化を含んだ。標的捕捉は、配列番号２（ＬＴＲ特異的、２  ｐｍｏｌ／反応）、配列番号２０（ＬＴＲ特異的、２  ｐｍｏｌ／反応）または配列番号４および配列番号６の混合物（共にｐｏｌ特異的、各々１．７５  ｐｍｏｌ／反応）を有する捕捉オリゴマーを用い、そして実質的に実施例１に記載されるような磁気粒子に結合したオリゴ−ｄＴ14オリゴヌクレオチドを用いて行った。試料、捕捉オリゴマーおよび磁気粒子上の固定化プローブの混合物を、６０℃に２０分間加熱し、室温に２０分間冷却し、そしてその後、磁気粒子およびその結合した複合体を分離し、そして２回洗浄した。標的捕捉および洗浄後、実質的に実施例１に記載されるように、増幅を行い、酵素を含まず、そして配列番号８および配列番号９を有する増幅オリゴヌクレオチドを含む増幅試薬７５μｌを用い、これに１００μｌの油を重層し、６５℃で１０分間加熱し、そしてその後、４１．５−４２℃で５分間インキュベーションした。酵素を添加し（２５μｌ）、そして増幅反応を４２℃で１時間インキュベーションした。その後、０．１  ｐｍｏｌ／反応の配列番号４１を有するオリゴマーを含むプローブ試薬１００μｌを添加し、そして混合物を６０℃で１５分間加熱し、その後、３００μｌの選択試薬を添加し、６０℃で１０分間インキュベーションし、室温で冷却し、発光測定装置（例えばＬＥＡＤＥＲ（登録商標）、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）中で相対光単位（「ＲＬＵ」２秒間）を検出した（実質的に米国特許第５，６５８，７３７号、２５欄２７−４６行；およびＮｅｌｓｏｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：８４２９−８４３８（１９９６）８４３２ページに記載されるように）。
【００７５】
これらのアッセイ結果を表５に示し、該表は、各６つの試料の各試験条件に関する平均ＲＬＵ（平均±標準偏差）を報告する。検出されたＲＬＵは、陰性（「Ｎｅｇ．」）対照中の０コピーと比較し、異なる数のＨＩＶ−１標的（１，０００、２００または５０コピー）を含む各群に関し、報告する。
【００７６】
表５
ＬＴＲ増幅および検出
【００７７】
【表５】
0004824236.tif 000006
【００７８】
表５中の結果は、標的核酸が、増幅されるべき領域（ＬＴＲ、２および３列）に特異的なオリゴマーにより、または別の領域（例えばｐｏｌ、４列）に特異的な捕捉オリゴマーにより、捕捉されることが可能であることを示す。該結果はまた、ＬＴＲ領域用の異なる捕捉オリゴマー（配列番号２および配列番号２０）が、ＨＩＶ−１陰性試料に比較し、ＨＩＶ−１含有生物学的試料から陽性シグナルを生じるのに共に有効であったことも示す。
【００７９】
次の実施例は、ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群配列を検出するのに用いた、異なる変形の捕捉オリゴマーを示す。
実施例６
ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群のＬＴＲ領域の検出
本実施例のアッセイは、配列番号２のものと１塩基異なる（位９のＴの代わりにＡ）配列（配列番号４５）を有する、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ領域に特異的な別の捕捉オリゴマーを用いたことを除き、実質的に実施例５に記載されるように行った。異なる血漿試料中のＨＩＶ−１標的核酸は、サブタイプＢ（アッセイ当たり１，０００または１００コピー）またはＯ群（アッセイ当たり１，０００または１００コピーのＭＶＰ５１８０ビリオン）いずれかであった。
【００８０】
試料（アッセイ条件当たり６）を、実質的に実施例５に記載されるように、配列番号２、配列番号４５または配列番号４および配列番号６の混合物の配列を有する捕捉オリゴマーで処理した。増幅は、実質的に実施例６に記載されるように行い、そして増幅された配列に対する、配列番号１６の配列を有するアクリジニウム標識化プローブの結合から生じるシグナルを、実施例５に記載されるように検出した。各アッセイ条件に関する６つの試料の平均ＲＬＵ（平均±標準偏差）を、表６に示す。
【００８１】
表６
サブタイプＢおよびＯ群ウイルスＲＮＡのＬＴＲ  ＨＩＶ−１検出
【００８２】
【表６】
0004824236.tif 000007
【００８３】
これらの結果は、配列番号４５のものなどの修飾捕捉オリゴマーが、Ｏ群ＨＩＶ−１標的配列を含む、捕捉されたＨＩＶ−１標的を増幅し、そして検出するアッセイにおいて、有効であることを示す。さらなるアッセイにおいて、配列番号２および配列番号４５の配列を有するオリゴマーの混合物である捕捉オリゴマー（すなわち、位９がＡまたはＴである合成オリゴマー）もまた、Ｏ群を含むＨＩＶ−１を検出するアッセイにおいて有効であった。本実施例はまた、標的ＨＩＶ−１核酸の捕捉は、１つの領域（例えばｐｏｌ）に特異的な捕捉プローブを用いて行い、そしてその後、別の領域（例えばＬＴＲ）に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを用いて増幅し、そして検出してもよいことも示す。
【００８４】
次の実施例は、異なる組み合わせのプロモーター−プライマーおよび非Ｔ７プライマーを用い、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ標的配列を増幅し、ＨＩＶ−１を含む生物学的試料から検出可能な増幅産物を生じることが可能であることを示す。
【００８５】
実施例７
異なる組み合わせのプライマーを用いた、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ増幅の比較
高力価組織培養標本から精製したＨＩＶ−１  ＲＮＡを、実質的に実施例５に記載されるように、増幅および検出工程を用いるアッセイにおいて、異なる組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドを試験するため、既知のＨＩＶ−１コピー数で、増幅試薬と混合した。該生物学的試料は、反応当たり１０，０００、１，０００、２５０または１００コピーのＨＩＶ−１を含み、そして陰性対照（ＨＩＶ−１  ＲＮＡを含まないヒト血漿）に比較した。これらの試料を、試験する増幅オリゴマーの各対に関し、７つの反復試験で増幅した（アッセイ当たり各プライマー約１．５から２．０  ｐｍｏｌ）。用いたプライマーの組み合わせは：配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８の配列を有する非Ｔ７プライマーと組み合わせた配列番号８の配列を有するＴ７プロモーター−プライマー；および配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８の配列を有する非Ｔ７プライマーと組み合わせた配列番号３０の配列を有するＴ７プロモーター−プライマーであった。これらの１０の組み合わせの各々に関し、１００またはそれ以上のコピー数の標的ＨＩＶ−１を含む生物学的試料は、アッセイにおいて、陽性検出可能シグナルを生じた。すなわち、増幅産物が産生され、そしてその後、標識化ＬＴＲ特異的プローブ（配列番号１６または配列番号４１）を用いて検出され、同一条件下で、１０3  ＲＬＵ（平均）未満を生じる陰性対照に比較し、１０5から１０6  ＲＬＵ（アッセイ条件当たり７試料の平均）のシグナルを生じた。比較のため、ＨＩＶ−１陽性試料はまた、ｐｏｌ特異的増幅オリゴマー（配列番号１０および配列番号１３）の組み合わせを用いて増幅し、これもまた、すべてのＨＩＶ−１陽性試料に関し、１０5から１０6の検出可能平均ＲＬＵシグナルを生じた。
【００８６】
さらなるアッセイでは、配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８の配列を有するプライマーと組み合わせた配列番号８のプロモーター−プライマーを用い、より希釈したＨＩＶ−１標的核酸を増幅した。これらの試験では、ＨＩＶ−１ビリオンＲＮＡは、アッセイ当たり１００、５０、３０または１０コピーで存在した。増幅された配列は、少なくとも３０コピーのＨＩＶ−１ビリオンＲＮＡが試料中に存在する場合、平均１０5から１０6  ＲＬＵで検出された。試料当たり１０コピーのＨＩＶ−１では、増幅されたＬＴＲ配列を示す、検出されたＲＬＵ（平均１０4から１０5）は、陰性対照のもの（平均して１０3  ＲＬＵ未満）より、少なくとも１０倍高かった。
【００８７】
別個のアッセイでは、試料当たり１００、５０、３０または１０コピーで存在するＨＩＶ−１標的核酸を用い、配列番号３２を有するプロモーター−プライマーおよび配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８の配列を有する非Ｔ７プライマーを用い、ＬＴＲ標的配列を増幅した。これらのアッセイでは、すべて４００  ＲＬＵ未満の陰性対照に比較し、配列番号３２を有するプライマーおよび配列番号９、配列番号３５または配列番号３６を有するプライマーの組み合わせは、５０から１００コピーの標的が存在する場合、約１０4から１０5  ＲＬＵ（平均）を生じ、一方、配列番号３２を有するプライマーおよび配列番号３７または配列番号３８を有するプライマーの組み合わせは、５０から１００コピーの標的が存在する場合、約１０3から１０4  ＲＬＵ（平均）を生じた。
【００８８】
試料当たり１００、５０、３０または１０コピーで存在するＨＩＶ−１標的核酸はまた、配列番号３４の配列を有するプロモーター−プライマーおよび上で試験した非Ｔ７プライマー（配列番号９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８）の組み合わせを用いても、増幅した。これらのアッセイにおいて、すべて１０3  ＲＬＵ未満の陰性対照に比較し、配列番号３４を有するプライマーおよび配列番号９または配列番号３６を有するプライマーの組み合わせは、５０から１００コピーの標的が存在する場合、約１０5  ＲＬＵ（平均）を生じ、一方、配列番号３４を有するプライマーおよび配列番号３５、配列番号３７または配列番号３８を有するプライマーの組み合わせは、５０から１００コピーの標的が存在する場合、約１０3から１０4ＲＬＵ（平均）を生じた。
【００８９】
これらの結果およびさらなる試験に基づき、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列を増幅するための増幅オリゴヌクレオチドの好ましい組み合わせには：配列番号８および配列番号３５；配列番号８および配列番号９；配列番号８および配列番号３６；配列番号３０および配列番号９；配列番号３０および配列番号３６；配列番号３２および配列番号９；並びに配列番号３４および配列番号３６が含まれる。
【００９０】
次の実施例は、ｐｏｌ特異的およびＬＴＲ特異的アッセイがどちらも、生物学的試料中で、ＨＩＶ−１  サブタイプＢおよびＯ群核酸を検出することが可能であることを示す。
【００９１】
実施例８
ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群核酸に関するアッセイ
これらの試験では、異なるＨＩＶ−１単離体に関し、ＬＴＲ標的配列を増幅し、そして検出した。既知のコピー数のＨＩＶ−１を含む血漿試料を、サブタイプＢ（アッセイ当たり１００または３０コピーのビリオンＲＮＡ）または２つのＯ群単離体（ＣＡ９およびＭＶＰ５１８０、高力価組織培養から個々に精製され、そしてアッセイ当たり約１，０００、１００または３０コピーに等しい希釈で用いる）を用いて調製した。試料を、実質的に実施例５に示される方法を用い、配列番号２（ＬＴＲ特異的）、および配列番号４および配列番号６（共にｐｏｌ特異的）の配列を有する捕捉オリゴマーを用い、標的捕捉に供した。その後、捕捉された標的を、実質的に実施例５に記載される方法を用い、配列番号８の配列を有するＬＴＲ特異的プロモーター−プライマーおよび配列番号９の配列を有するＬＴＲ特異的プライマーを用い、増幅した。増幅された配列を、上述のように、配列番号１６の配列を有するＡＥ標識化プローブ（０．１  ｐｍｏｌ／反応）を用いて検出した。各組の条件に関し、５つの試料に関して検出された平均ＲＬＵ（平均±標準偏差）を表７に示す。
【００９２】
表７
増幅されそして検出された（ＲＬＵ）サブタイプＢおよびＯ群のＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列
【００９３】
【表７】
0004824236.tif 000008
【００９４】
これらの結果は、該アッセイが、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ特異的プライマーおよびプローブを用いて、サブタイプＢおよびＯ群ＨＩＶ−１両方を検出することが可能であり、そして異なるＯ群株を検出することが可能であることを示す。
【００９５】
同様のアッセイを用い、同一増幅混合物中のＬＴＲおよびｐｏｌ配列両方を検出した。本アッセイでは、同一の標的ＨＩＶ−１核酸を同じ濃度で用い、そして配列番号２を有するＬＴＲ特異的オリゴマー、並びに配列番号４および配列番号６を有する２つのｐｏｌ特異的オリゴマーを含む捕捉オリゴマー混合物を用いて、標的捕捉を行った。上述のような増幅中、配列番号８および配列番号９の配列を有するＬＴＲ特異的プライマー、並びに配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５の配列を有するｐｏｌ特異的プライマーを含む、プライマーの組み合わせを用いた。この多重増幅反応は、同一の増幅試薬中に異なる標的用の多数のプライマーを含み、標的核酸を同時に増幅する。増幅後、増幅された配列を、配列番号１６を有するＬＴＲ特異的ＡＥ標識化プローブ、または配列番号１７を有するｐｏｌ特異的ＡＥ標識化プローブを用い、実施例１に記載されるような標準的プロトコルで、各々０．１  ｐｍｏｌ／μｌを用い、独立に検出した。これらの試験の結果を表８に示し、該表は、各組のアッセイ条件に関し、５つの試料の平均ＲＬＵ（平均±標準偏差）を示す。
【００９６】
表８
多重増幅後のＨＩＶ−１  ＬＴＲおよびｐｏｌ配列の検出
【００９７】
【表８】
0004824236.tif 000009
【００９８】
これらの結果は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲおよびｐｏｌ領域両方に特異的な増幅された配列が、多重増幅中に産生され、そして増幅された配列が、それぞれ、ＬＴＲ特異的またはｐｏｌ特異的プローブを用いて検出されたことを示す。同様の実験において、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８の配列を有する標識化プローブの組み合わせを用い、サブタイプＢおよびＯ群単離体両方の増幅されたＨＩＶ−１配列を検出するのに成功した。別個の実験において、位７にイノシンを持つ配列番号１６を有する標識化プローブを用い、同様の有効な検出が達成された。
【００９９】
増幅される標的領域が、配列番号１７を有する２−メチル−ＡＥ標識化プローブで探査されるサブタイプＢおよびＯ群由来のＨＩＶ−１  ｐｏｌ配列である別個の実験で、同様の結果が得られた。これらの実験では、標的は、標的を含まない陰性対照に比較し、最初に、反応当たり１，０００、１００、５０、２０または１０コピーで存在した。各反応条件に関し、５つの反復アッセイを行った。ＨＩＶ−１サブタイプＢに関しては、検出された平均ＲＬＵは、陰性対照に関する１．９７  Ｘ  １０3の平均ＲＬＵに比較し、標的を含む反応に関し９．２０  Ｘ  １０5から４．４４  Ｘ  １０5の範囲であった。ＨＩＶ−１  Ｏ群に関しては、検出された平均ＲＬＵは、陰性対照に関する２．６０  Ｘ  １０3の平均ＲＬＵに比較し、１，０００から５０コピーの標的を含む反応に関し３．５３  Ｘ  １０5から１．６９  Ｘ  １０4の範囲であり、標的２０または１０コピーを含む試験管に関しては、多様な結果が得られた。
【０１００】
これらの結果はすべて、異なる群のＨＩＶ−１が、本明細書に記載される捕捉プローブ、プライマーおよび検出プローブの組み合わせを用い、標的捕捉および配列の増幅を用いて検出することが可能であることを示す。さらなる組み合わせの使用が、実施例９および１０に記載される。
【０１０１】
実施例９
ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群中のＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的核酸に関するアッセイ
一連の試験で、サブタイプＢおよびＯ群のＨＩＶ−１を、異なるプローブを用い、実質的に先の実施例に記載されるようにアッセイした。試料は、実質的に実施例１に記載されるような方法を用い、配列番号４および配列番号６の配列を有するｐｏｌ特異的捕捉オリゴマーを用い、標的捕捉に供した。その後、捕捉されたＨＩＶ−１標的を、実質的に実施例１に記載される方法を用い、配列番号１３および配列番号１５の配列を有するプロモーター−プライマーの組み合わせ、並びに配列番号１０および配列番号１１の配列を有するプライマーの組み合わせを用い、増幅した。これらの実験は、異なるＨＩＶ−１特異的プローブを用いた検出を比較した。反応は、１０4コピー／ｍｌのＨＩＶ−１サブタイプＢおよび１０6コピー／ｍｌのＯ群を用いて行った。増幅後でそして検出前に、各組のアッセイ用の増幅反応をプールし、そしてその後、表９に示されるように希釈した。限界希釈で、検出されたＲＬＵは、バックグラウンドに等価であった（データ未提示）。表９に報告される各アッセイでは、１０の個々の検出アッセイを行い、そして検出されたＲＬＵの平均の数±標準偏差を示す。
【０１０２】
増幅されたｐｏｌ配列は、先に記載されるように、配列番号１８または配列番号４６の配列を有する２−メチル−ＡＥ標識化プローブ（０．１  ｐｍｏｌ／反応）を用い、残基１０および１１（ロット１）または残基７および８（ロット２）の間で標識された配列番号４６を有するプローブの異なるロットを用い、検出した。
【０１０３】
表９
ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群を検出するためのｐｏｌ特異的プローブの比較
【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
これらの実験の結果は、異なる標識化プローブが、ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群の増幅された標的配列両方を有効に検出することが可能であることを示す。別個の実験において、同様の実験プロトコルを用い、残基６および７、７および８、または１０および１１の間で２−メチル−ＡＥで標識された配列番号４６を有するプローブは、すべて、ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群の増幅された標的配列を検出するのに有効であった。これらの実験は、ＨＩＶ−１の異なる群を検出するため、多様な異なる標識化プローブを、これらの実験において、用いることが可能であることを示す。
【０１０６】
実施例１０
ＨＩＶ−１サブタイプＢおよびＯ群中のＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的核酸に関するアッセイ
実施例９に記載されるのと類似の実験で、サブタイプＢおよびＯ群由来のＨＩＶ−１標的配列を増幅し、そして配列番号５０または配列番号５３の配列を有するプローブを用いて検出し、そして先に試験した配列番号１７のプローブを用いた結果に比較した。これらの実験では、標的ＲＮＡの捕捉は含まれず、そして試料試験管は、４０  ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ塩基（ｐＨ  ７．５）、１７．５  ｍＭ  ＫＣｌ、２０  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５％  ＰＶＰ、各１  ｍＭのｄＮＴＰおよび各４  ｍＭのｒＮＴＰを含む増幅反応混合物中で１０4コピーのＨＩＶ−１サブタイプＢまたはＨＩＶ−１  Ｏ群を含めて（各種類に関し５つの試験管、ＨＩＶ−１  ＲＮＡを含まない陰性対照を伴う）調製した。転写仲介増幅は、インキュベーション温度が６５℃で１０分間であり、およびその後、４２℃で１０分間、その後、酵素添加、その後、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５の配列を有するプライマーを用いた１時間の増幅であることを除き、実施例１に記載されるように行った。増幅後、産物をプールし、異なる増幅試験管間の変動を最小限にし、異なるＨＩＶ−１株に関しては別個のプールを作成した。プールした増幅産物は、希釈なしに用いるか（すなわち試料中約１０4コピーの標的）または表１０に示されるように２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液（実施例１を参照されたい）で連続希釈し、試料中の標的１０3、１０2、１０または１コピーの同等物を提供した。試験管をその後、配列番号５０、配列番号５３または配列番号１７を有するＡＥ標識化プローブとの６０℃で１５分間のハイブリダイゼーションに用いた。選択試薬でハイブリダイゼーション試験管を６０℃で１０分間処理し、非結合プローブを選択的に不活性化した後、化学発光を上述のように検出した。各ハイブリダイゼーション反応の平均ＲＬＵを表１０に示す。
【０１０７】
表１０
異なるプローブを用いた、増幅されたＨＩＶ−１  ｐｏｌ配列に関し検出されたＲＬＵ
【０１０８】
【表１０】
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【０１０９】
実施例９におけるように、そしてこれらの結果との比較により、表１０の結果は、異なるｐｏｌ特異的プローブを用い、異なる群のＨＩＶ−１を検出することが可能であることを示す。これらのおよびさらなる実験で、配列番号５３を有するプローブは、プローブ中の多様な位（例えば残基５および６、または残基６および７、または残基１３および１４の間）で標識した際、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ増幅配列を検出するのに有効であることが示された。同様に、配列番号１７を有するプローブは、多様な位（例えば残基６および７、残基７および８、または残基１０および１１の間）で標識した際、ＨＩＶ−１増幅配列を検出するのに有効であった。したがって、これらの実験結果により例示される、異なるプローブは、増幅されたＨＩＶ−１配列を検出するのに有効である。
【０１１０】
本発明は特定の実施例および好ましい態様に関連して記載されてきているが、本発明はこうした態様に限定されないことが理解されるであろう。その代わり、本発明の範囲は、本明細書中の請求の範囲により判断されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ（垂直の線により部分に分けられる、太い破線により、５’から３’方向に示される）の模式図であり、遺伝子（「ｇａｇ」、「ｐｏｌ」、「ｅｎｖ」）、並びに末端反復配列（「ＬＴＲ」）を含む非翻訳５’および３’領域（それぞれ「Ｒ  Ｕ５」および「Ｕ３  Ｒ」）の相対的な位置を示す；標的領域は、「ＬＴＲ」および「ｐｏｌ」と明示される、二重破線により示される。
【図２】  図２は、ＨＩＶ−１核酸の「標的領域」（太い垂直な線により示される）を検出するための本発明の態様の構成要素の模式図であり、以下の核酸の位置が、標的領域に対比して示され：「捕捉オリゴマー」は、転写仲介増幅前に、標的核酸にハイブリダイズし、そして該核酸を捕捉するのに用いられる核酸を指し、「Ｔ」は、相補的配列を有する固定化オリゴマー（示されていない）にハイブリダイズするのに用いられる３’テール配列を指し；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プライマー」は、転写仲介増幅に用いられる２つの増幅オリゴヌクレオチドを示し、「Ｐ」はＴ７プライマーのプロモーター配列を示し；そして「プローブ」は、増幅核酸を検出するのに用いられる標識化プローブを指す。
【図３】  図３は、２つの捕捉オリゴマー、２つの非Ｔ７プライマー、２つのＴ７プライマーおよび２つの標識化プローブを用い、ＨＩＶ−１核酸標的領域を検出するための、図２に明示されるような、本発明の別の態様の構成要素の模式図である。
【図４】  図４Ａは、一般的に図２に例示されるような、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ標的領域を検出するための好ましい態様の模式図であって、捕捉オリゴマーは配列番号２に示され、非Ｔ７プライマーは配列番号９に示され、Ｔ７プライマーは配列番号８に示され、そして標識化プローブは配列番号１６に示される。
図４Ｂは、一般的に図３に例示されるような、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ標的領域を検出するための好ましい態様の模式図であって、捕捉オリゴマーは配列番号４および配列番号６に示され、非Ｔ７プライマーは配列番号１０および配列番号１１に示され、Ｔ７プライマーは配列番号１３および配列番号１５に示され、そして標識化プローブは配列番号１７および配列番号１８に示される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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