(57)【特許請求の範囲】
【請求項４】
（ａ）電界効果デバイスのゲート部に一本鎖核酸プローブを固定化し、該ゲート部に設けた試料溶液ウェルに、少なくとも１種類の核酸を含む試料溶液を導入して、前記一本鎖核酸プローブとハイブリダイゼーションを行わせるステップと、
（ｂ）洗浄液を前記試料溶液ウェルに導入して、未反応の核酸を前記試料溶液ウェルから除去するステップと、
（ｃ）酵素タックポリメラーゼ（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、及び基質となるｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰのうちの一つを上記試料溶液ウェルに導入し伸長反応を行わせるステップと、
（ｄ）洗浄液を前記試料溶液ウェルに導入して、未反応の酵素、基質を試料溶液ウェルから除去するステップと、
（ｅ）緩衝液を前記試料溶液ウェルに導入して、前記電界効果デバイスのしきい値電圧変化又はフラットバンド電圧変化を測定するステップと
（ｆ）（ｃ）のステップに戻り、酵素タックポリメラーゼ（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、及び上記と異なる基質（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）の一つを上記試料溶液ウェルに導入し第２の伸長反応を行わせ、電界効果デバイスのしきい値電圧変化又はフラットバンド電圧変化を測定するステップと
を有することを特徴とする塩基配列解析方法。
【請求項５】
プリント基板に遺伝子検出用電界効果デバイスをマウントし、ワイヤーで電気的にプリント基板と接続させ、プリント基板にピンを設けて、信号処理回路と接続し、該電界効果デバイスのゲート部に設けた試料溶液ウェルに試料溶液を流路により供給し、試料溶液が信号線となるワイヤーに接触しないようにワイヤー部分を保護キャップで保護したフローセルからなることを特徴とする請求項４の方法に用いる塩基配列解析装置。
【請求項６】
電界効果デバイスに温度センサ及びヒーターを集積化したことを特徴とする請求項５記載の塩基配列解析装置。
【請求項７】
電界効果デバイスは、電界効果トランジスタ又は電界効果キャパシターであることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項８】
温度センサを集積化した電界効果デバイスを用いることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ塩基配列解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子診断、DNA塩基配列解析、あるいは遺伝子多型解析など、バイオテクノロジーの分野、特に遺伝子解析分野の技術に関し、より詳細には、核酸の塩基配列を蛍光色素やラジオアイソトープなどの標識なしで解析することのできる遺伝子検出用電界効果デバイスを用いた核酸の塩基配列解析方法、及びそれを用いた解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの全塩基配列解読が終了し、他の生物のゲノム塩基配列解読が急速に進展する中、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。これらのゲノム塩基配列情報をもとに、生体中における遺伝子の機能を明らかにすることにより、各種疾病の診断、医薬品の開発、農作物の品種改良など広範囲な分野で遺伝子関連技術の開発が飛躍的に進むものと思われる。【０００３】
これらの新規分野発展の基礎となるのが、塩基配列情報に加えて遺伝子の機能情報である。遺伝子の機能解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる技術として、電気泳動やＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイ（以下、両者を総称してＤＮＡマイクロアレイという）、パイロシーケンシングなどが開発されている。電気泳動システムはApplied  Biosystems社やAgilent社から市販され、ＤＮＡマイクロアレイはAffymetrix社やNanogen社などで開発されている。【０００４】
しかし、現状の電気泳動システムやＤＮＡマイクロアレイの多くは蛍光検出を基本原理としているので、試料を蛍光標識でラベルする必要があり、レーザや複雑な光学系が必要となり、システムが大型化し高価である。特に医療の分野では、テーラーメイド医療の実現には一塩基多型（SNP）を高精度にかつ簡便に検出する必要がある。【０００５】
現在開発されている多くのＤＮＡマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションに基づく二本鎖DNAの検出を基本原理としているので、反応の選択性があまり高くなく、精度向上が課題である。また、電気泳動に基づく塩基配列解析は試料の調製が煩雑であり、一般に高電圧・光検出部を要するため装置が大型化する。したがって、小型・簡便性、経済性、高精度などを満足させる技術が求められる。【０００６】
これらの問題を解決する方法として、酸化・還元標識と組み合わせた電流検出方式のＤＮＡマイクロアレイがいくつか報告されている。Clinical Micro Sensors社では分子ワイヤーと称する分子の一端を金属電極上に固定化し、他端に核酸プローブを結合させ、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーションに基づく酸化・還元標識と金属電極の電子の授受を電流変化として検出し、ターゲット遺伝子を検出する方式を開発している（非特許文献１）。【０００７】
また、ＴＵＭ研究所では電気化学的活性のある標識剤としてFerrocenylnaphthalene Diimideを用い、金属電極における酸化・還元電流を計測することにより、ハイブリダイゼーションを検出する方式を開発している(非特許文献２)。東芝では電流検出方式DNAチップを用いて、Ｃ型肝炎の薬効検査システムを開発している（非特許文献３）。この方式では高価なレーザや複雑な光学系を必要としないため、簡単で小型のシステムを構築することができる。しかしながら、金属電極上での酸化・還元反応を検出の基本原理としているため、試料中に酸化物質あるいは還元物質（例えば、アスコルビン酸）が存在すると、酸化又は還元に基づく電流が流れ、遺伝子検出の妨害となり検出精度が劣化する。また、電流計測に伴い、金属電極上で電極反応が進行する。電極反応は不可逆で非平衡反応であるため電極の腐食、ガスの生成などが生じ、固定化した核酸の剥離や電流測定の安定性が損なわれたりするので、特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化する。【０００８】
また、電界効果デバイスを用いDNAのハイブリダイゼーションを検出する試みも報告されている(非特許文献４)。これは、DNA分子が溶液中で負電荷を有していることを利用し、電界効果を利用してハイブリダイゼーションによる電荷変化を検出するものである。しかしながら、基板上に形成されるDNAプローブはもともと負電荷を有しているため、ターゲットDNAのハイブリダイゼーションによる電荷の変化分は小さく、非特異的な吸着との区別ができないなど遺伝子検査のためには高感度化、精度向上が課題であった。また、一塩基多型（Single  Nucleotide  Polymorphism,SNP）のように２つの遺伝子のわずかの違い（一塩基の違い）を検出するには感度、精度（選択性）共に悪く、困難であった。さらに、上記のDNAマイクロアレイなどのようにハイブリダイゼーションのみを基本原理とする方法では、ターゲット遺伝子の塩基配列の解析（DNAシーケンシング）を行うことはできなかった。【０００９】
DNA塩基配列解析を行う方法として電気泳動技術が広く用いられており、電気泳動の泳動路をガラスや高分子の基板に形成して小型化し、短い塩基長の配列解析（ショートシーケンシング）を行うシステムが開発されている（非特許文献５）。しかし、高電圧印加や蛍光検出のための光学系が必要であり、基本原理は従来の電気泳動と変わらず、依然として小型・簡便性、経済性などの課題がある。【００１０】
一方、パイロシーケンシング技術はDNAの伸長反応に伴うパイロフォスフェイトの放出を酵素による化学発光を利用して検出する技術であり、酵素と試薬（dATP,dGTP,dCTP, dTTP）を順次添加して、発光を検出することによりDNAの塩基配列を解析することができる。本方法は、比較的簡便であり、小型化システムに適した技術であるが、化学反応系が複雑であり異なる多数遺伝子の並列解析は困難である（非特許文献６）。【００１１】
また、電界効果を利用したDNA検出用センサがいくつか報告されている。Eagle Research and Development,LLCではシリコン基板に細孔を設け、細孔の内壁の側面に電界効果トランジスタのゲート部を製作した（特許文献１）。細孔の直径が微細であるため細孔の中をDNA分子が通過するとゲート部近傍を通過することになる。DNA分子は負電荷を有しているため、電界効果トランジスタで検出することができる。DNA分子の隣り合う塩基の間隔は0.34nmであるため、この方法では隣り合う塩基を識別して塩基配列を解析することは困難である。また、酵素、基質の添加による伸長反応については記載されていない。【００１２】
一方、日立製作所では細線状のチャネルを有する電界効果トランジスタを利用し、該チャネル上の絶縁膜表面に核酸プローブを固定化し、目的のDNA鎖を細線状チャネルに沿って流したときの、チャネルの導電性変化を測定することにより目的DNAを検出するDNAセンサを開示している（特許文献２）。この場合もDNAの相補的結合に基づく信号を検出する方式であるため、塩基配列を解析することはできない。本公知例についても酵素、基質の添加による伸長反応については記載されていない。【００１３】
【特許文献１】特表2003-533676号公報
【特許文献２】特開平8-278281号公報
【非特許文献１】Nature Biotechnology, vol. 16, (1998)p27, p40,
【非特許文献２】Analytical Chemistry, 72, (2000)1334
【非特許文献３】Intervirology, 43(2000)124-127
【非特許文献４】J. Phys. Chem. B 101, (1997)2980-2985
【非特許文献５】Y. Shi et al, Anal. Chem., 71(1999)  5354-5361
【非特許文献６】Ronagi, M.; Uhlen,M.;Nyren,P.Science, 1998, 281, 363-365
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記従来技術のうちDNAマイクロアレイは、高価で複雑な光学系が必要であったり、電極の劣化、DNAの解離温度の違いなどにより一塩基多型のように２つの遺伝子のわずかの違い（一塩基の違い）を検出するには感度、精度（選択性）共に悪く、困難であったりした。また、電気泳動技術では小型・簡便性、経済性などの課題があり、パイロシーケンシング技術では複数遺伝子の並列解析は困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、電界効果デバイスのゲート部に核酸プローブを固定化し、ターゲットDNAとゲート部でハイブリダイゼーションを行わせ、さらに、酵素であるDNAポリメラーゼを添加し、その基質であるdATP,dGTP,dCTP,dTTPを順次添加してそれぞれ伸長反応を行わせる。基質を添加するごとに電界効果デバイスの電気特性の変化、すなわち、しきい値電圧変化又はフラットバンド電圧変化を測定する。ターゲットDNAの塩基と相補的な塩基を添加したときにはDNAポリメラーゼにより伸長反応が起こり、ポリヌクレオチドが合成されるため核酸プローブを固定化した表面の負電荷が増加する。一方、相補的でない塩基を添加したときには伸長反応は起こらず、電荷の変化は生じない。このように添加する基質と負電荷の増加を検出することによりターゲットDNAの塩基配列を解析することができる。【００１６】
本発明によるDNA塩基配列解析方法は、（ａ）一本鎖核酸プローブをゲート部に有する電界効果デバイスのゲート部の試料溶液ウェルに、少なくとも１種類の核酸を含む試料溶液を導入して、前記一本鎖核酸プローブとハイブリダイゼーションを行わせるステップと、
（ｂ）洗浄液を前記試料溶液ウェルに導入して、未反応の核酸を前記試料溶液ウェルから除去するステップと、
（ｃ）酵素タックポリメラーゼ（Taq polymerase）、及び基質となるdATP,dGTP,dCTP,dTTPのうちの一つを上記試料溶液ウェルに導入し伸長反応を行わせるステップと、
（ｄ）洗浄液を前記試料溶液ウェルに導入して、未反応の酵素、基質を試料溶液ウェルから除去するステップと、
（ｅ）緩衝液を前記試料溶液ウェルに導入して、前記電界効果デバイスの出力値を測定するステップと
（ｆ）（c）のステップに戻り、酵素タックポリメラーゼ（Taq polymerase）、及び上記と異なる基質（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）の一つを上記試料溶液ウェルに導入し第２の伸長反応を行わせ、電界効果デバイスの出力値を測定するステップと
を有することを特徴とする。【００１７】
上記の方法において、原理的にひとつの塩基のAかGかCかTかの種類を決定するのにdATP,dGTP,dCTP,dTTPの４種類の塩基を順次添加する。そして、その隣の塩基の種類を決定するために、またdATP,dGTP,dCTP,dTTPを順番に添加する。したがって、１０塩基のDNAの配列を決定するために最大４０回の基質添加を行う。このように、どのくらいの塩基長のDNAを解析するかによって基質添加のステップを何回繰り返すかが決まる。【００１８】
本発明による遺伝子検出用電界効果デバイス上でハイブリダイゼーション及び伸長反応を高精度に行わせるためには、反応温度を最適値に制御する必要があり、電界効果デバイスに温度センサ及びヒーターを集積化したことを特徴とする。【００１９】
本発明の方法は、プリント基板に遺伝子検出用電界効果デバイスをマウントし、ワイヤーで電気的にプリント基板と接続させ、プリント基板にピンを設けて、信号処理回路と接続し、該電界効果デバイスのゲート部に設けた試料溶液ウェルに試料溶液を流路により供給し、試料溶液が信号線となるワイヤーに接触しないようにワイヤー部分を保護キャップで保護したフローセルを用いて実施することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、電界効果デバイスとハイブリダイゼーション、及びそれに続く伸長反応とを組み合わせることにより、標識を使用しないでDNA塩基配列解析を行うことが可能となった。本発明では、高価なレーザや複雑な光学系を必要とせず、蛍光物質やラジオアイソトープなどの標識なしで、DNA塩基配列を解析することができる。したがって、小型の遺伝子塩基配列解析システムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明では、電界効果デバイス、すなわち電界効果トランジスタ又は電界効果キャパシターのゲート部に核酸プローブを固定化し、ターゲット遺伝子とゲート部でハイブリダイゼーションを行わせ、さらに酵素と基質であるdATP,dGTP,dCTP,dTTPを順次添加してそれぞれ伸長反応を行わせ、その際に生ずる核酸プローブを固定化した表面の負電荷の増加を電界効果を利用して検出する。【００２２】
本発明をより詳細に説述するために、添付の図面に従ってこれを説明する。以下の図において、同じ機能部分には同じ符号を付けて説明する。図１から図６を用いてDNA塩基配列解析の方法を説明する。【００２３】
図１(a)は、本発明による遺伝子検出用電界効果デバイスの一例を説明する断面模式図である。シリコン基板１の中にPウェル２を形成し、該Pウェル２の中にソース及びドレインとなるｎ型領域３を形成する。その上に下層絶縁膜４を形成する。下層絶縁膜４は二酸化シリコン（ＳｉＯ２）を用いることが好ましい。二酸化シリコンは水溶液と接触すると水和化し、絶縁性が劣化するのでシリコン表面の電気的特性を良好に保つため、耐水性の良好な上層絶縁膜５を形成し、二層絶縁膜とすることが好ましい。上層絶縁膜５としては窒化シリコン（ＳｉＮ又はＳｉ３Ｎ４）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料を単独又は組み合わせて用いることができる。    【００２４】
また、核酸の反応温度を正確にモニターするために、Pウェル２の中にｎ型領域９を設け、温度センサとして使用する。Pウェル２及びｎ型領域９にそれぞれ電極を設けpn接合ダイオードを形成し、該pn接合ダイオードの電流―電圧特性の温度特性を利用して温度センサとする。即ち、上記pn接合ダイオードに好ましくは0.6V以上の一定電圧を印加し、電流を測定する。あらかじめ温度変化に対する電流値を測定して検量線を作成しておき、その検量線と電流の測定値とから温度を求める。【００２５】
また、ｎ型領域または金属薄膜を線状にパターン形成することにより、ヒーターを一体化することができる。このｎ型領域または金属薄膜に電流を流すことにより発熱させ、温度を上昇させることができる。上記の温度センサと該ヒーターを組み合わせることにより、電界効果トランジスタが形成された基板の温度を最適値に制御することができ、ハイブリダイゼーション及び伸長反応の高精度化をはかることができる。【００２６】
上記ソース及びドレインとなるｎ型領域３の間がゲート部であり、その拡大図を図１（ｂ）に示す。ゲート部以外の部分の表面には酸化シリコン７さらにはりんガラス（PSG）８を積層して溶液から酸化シリコン７部分を保護している。酸化シリコン７及びりんガラス（PSG）の厚さは通常500から2000nm程度と、ゲート部の絶縁膜（酸化シリコン及び窒化シリコン、100〜200nm）に比べて厚い。図１(ｂ)に示すように、酸化シリコン７及びりんガラス（PSG）８が厚いため、ゲート部を取り囲むように側面が形成されて試料溶液を溜めることができる試料溶液ウェル（井戸）構造となっている。このゲート部に核酸プローブ６を固定化する。この固定化は、図１(b)に示すように、ゲート部分の絶縁膜（以下「ゲート絶縁膜」という）表面に行うことが好ましいが、ゲート部近傍の酸化シリコン７及びりんガラス８の側壁に固定化することも可能である。【００２７】
試料溶液ウェル構造の壁面に固定化された核酸プローブ６にターゲット遺伝子をハイブリダイズさせ、タックDNAポリメラーゼ及び基質を試料溶液ウェルに導入して伸長反応を起こさせると、ゲート絶縁膜表面と平行に、横方向に表面に沿ってDNAが合成される。Pウェル２中の荷電粒子（電子）と静電的相互作用によってしきい値電圧が変化するため、ゲート絶縁膜表面に平行な方向のDNAの合成は、上記DNAと電子との距離が一定であるためその静電的相互作用を常に一定に保つことができる。したがって、塩基長の長い遺伝子の塩基配列を解析することができる。【００２８】
一方、ゲート絶縁膜表面に垂直に固定化した核酸プローブ６は、伸長反応によるDNAの合成とともにゲート絶縁膜表面、したがってPウェル表面の電子との距離が増大する。したがって、静電的相互作用は合成される塩基長が長くなるほど小さくなり、検出可能な塩基長に限界がある。したがって、長い塩基長のターゲット遺伝子の塩基配列を解析する場合、横方向の伸長反応を積極的に利用することが重要である。【００２９】
チオール基で化学修飾した核酸プローブを固定化する場合は、ゲート絶縁膜上又は試料溶液ウェル構造の壁面に金薄膜を形成し、チオール基と金との親和性を利用して核酸プローブを固定化する。また、ビオチンで化学修飾した核酸プローブを固定化する場合には、ゲート絶縁膜表面又は試料溶液ウェル構造の壁面にストレプトアビジンを導入し、ビオチンとストレプトアビジンの親和性を利用して、核酸プローブを固定化する。実際の固定化に際しては、核酸プローブを含む溶液を試料溶液ウェルにのみ滴下又はスポットし、ゲート絶縁膜上又は試料溶液ウェル構造の壁面の官能基と化学反応を行わせて核酸プローブを固定化する。【００３０】
上記遺伝子検出用電界効果デバイスをフローセルの中に設置し、試料溶液ウェルに試料溶液を導入する。遺伝子検出用電界効果デバイスの下流には参照電極が設置されており、必要に応じてゲート電圧を印加する。【００３１】
具体的には、少なくとも２個の電界効果トランジスタを用い、一方を遺伝子検出用電界効果デバイス、他方を参照用電界効果デバイスとして用いて、光や温度の変化、あるいは非特異的吸着によるトランジスタの出力変化を補償する。また、複数の遺伝子を並列解析するためには解析するDNAの種類と同数以上のトランジスタが必要になる。核酸プローブ６はオリゴヌクレオチド又はcDNAの断片を用い、通常３００個以下の塩基から構成されており、オリゴヌクレオチドの場合は８０個以下の塩基長の核酸断片であることが望ましい。【００３２】
核酸プローブを固定化するために、核酸プローブの一端をアミノ基（ＮＨ２基）、チオール基（ＳＨ基）、ビオチンなどで化学修飾する。アミノ基で化学修飾した核酸プローブを用いる場合は、ゲート絶縁膜の表面又は試料溶液ウェル構造の壁面をアミノプロピルエトキシシラン、ポリリジンなどで化学修飾してゲート絶縁膜表面又は試料溶液ウェル構造の壁面にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネート（ＰＤＣ）と反応させてアミノ基で化学修飾した核酸プローブをゲート絶縁膜表面又は試料溶液ウェル構造の壁面に固定化する。【００３３】
試料溶液中に測定すべきターゲット遺伝子を含む多数の遺伝子が存在し、上記遺伝子検出用電界効果デバイスのゲート絶縁膜上又は試料溶液ウェル構造の壁面にターゲット遺伝子と相補的塩基配列を有する核酸プローブが固定化されていると、適切な反応条件のもとでターゲット遺伝子と核酸プローブがハイブリダイズして、ターゲット遺伝子と核酸プローブが二本鎖を形成する。この場合、核酸プローブの塩基配列をターゲット遺伝子の塩基長より短く、塩基配列解析したい部分に隣接してハイブリダイズするように設計しておく。【００３４】
塩基配列解析を行うためにはハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼと基質であるdATP,dGTP,dCTP,dTTPを順次添加して伸長反応を行わせ、各基質との伸長反応のたびごとに電気的特性（しきい値電圧）の変化を測定する。DNAは水溶液中で負の電荷を有するので、ターゲットDNAの塩基配列に相補的であれば伸長反応が起こりポリヌクレオチドが合成される。その結果、ゲート絶縁膜表面又は試料溶液ウェル構造の壁面の負電荷が増加して、その増加分をしきい値電圧の変化として検出できる。どの基質を添加したときにしきい値電圧変化のシグナルが得られたかを照合することにより、ターゲット遺伝子の塩基配列を解析することができる。【００３５】
図２を用いて具体例について以下に説明する。血液凝固遺伝子の一つであるFactor VII遺伝子の一部の塩基配列を用い、以下に示すように核酸プローブの塩基配列を設計した。＜核酸プローブ塩基配列：５’−ＣＧＴＣＣＴＣＴＧＡＡ−３’＞
上記核酸プローブの６‘末端側にはアミノ基を修飾して、ゲート絶縁膜表面に固定化する。本実施例の電界効果トランジスタのゲート絶縁膜には窒化シリコンが用いられており、その表面をγ―アミノプロピルトリエトキシシランで化学修飾して窒化シリコン表面にアミノ基を導入する。核酸プローブのアミノ基と窒化シリコンのアミノ基を例えばグルタルアルデヒドのような２官能性試薬と反応させ、シッフ塩基による結合を形成することにより、核酸プローブを窒化シリコン表面に固定化する。【００３６】
図２に示すように、１１塩基のFactor VII遺伝子核酸プローブ６を電界効果トランジスタのゲート絶縁膜表面に固定化し、あらかじめＰＣＲで増幅した２１塩基のFactor
VII遺伝子１０を含む試料を反応させた。試料は試料溶液として容器中に保持した。【００３７】
試料溶液は、血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、上記Factor VII遺伝子部位を含む２１塩基長の領域を増幅した後、核酸プローブが固定化された遺伝子検出用電界効果トランジスタのゲート部に導入して、４５℃で８時間、ハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイゼーション後、緩衝液により洗浄して未反応の試料をゲート部から除去した。図２（a）はターゲット遺伝子であるFactor  VII遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後の状態を表している。【００３８】
次に、酵素タックDNAポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）、及び基質となるdATP,dGTP,dCTP,dTTPを順番に添加する。まず、遺伝子検出用電界効果トランジスタを緩衝溶液中に設置し、電界効果デバイスに集積化した温度センサとヒーターを用いて温度を７４℃に設定してタックDNAポリメラーゼ及び基質dCTPを上記緩衝溶液中に添加してゲート絶縁膜上で伸長反応を行わせた。【００３９】
図２（ｂ）に示すように、シトシン（C）は核酸プローブの３‘末端と隣接するターゲット遺伝子上の塩基グアニン（G)と相補的であるので、伸長反応が起こり、一塩基だけシトシンが合成される。この伸長反応の後、酵素タックDNAポリメラーゼ及び基質dCTPをゲート上から洗い流し、pH6.86のリン酸緩衝液をゲート絶縁膜上に導入してしきい値電圧の変化を測定した。その結果、伸長反応を行う前のしきい値電圧に比べて4mV増加した。しきい値電圧の正方向のシフトはゲート表面に負電荷が生成されたことを示しており、伸長反応に基づく一塩基の合成をしきい値電圧の変化として検出できたことがわかる。【００４０】
続いて、伸長反応用の緩衝液をゲート絶縁膜上に導入してリン酸緩衝液と置換し、温度を７４℃に設定してタックDNAポリメラーゼ及び基質dATPを添加し、ゲート絶縁膜上で第二の伸長反応を行わせた。図２（ｃ）に示すように、ターゲット遺伝子上の隣接する次の塩基はチミン（T)であり、添加したアデニン（A）はチミン（T)と相補的であるので、伸長反応が起こり、一塩基だけアデニンが合成される。【００４１】
この伸長反応の後、酵素タックDNAポリメラーゼ及び基質dATPをゲート絶縁膜上から洗い流し、pH6.86のリン酸緩衝液をゲート絶縁膜上に導入してしきい値電圧の変化を測定した結果、第二の伸長反応を行う前のしきい値電圧に比べてさらに4mV増加した。したがって、ターゲット遺伝子の塩基配列と相補的な一塩基の添加により伸長反応が起こり、しきい値電圧の変化として信号が得られることになる。【００４２】
さらに、上記の操作を繰り返す。ゲート絶縁膜表面を洗浄し緩衝液を導入して、温度を７４℃に設定し、タックDNAポリメラーゼ及び基質dGTPを添加した。図２（d）に示すように、ターゲット遺伝子上の隣接する次の塩基はグアニン（G)であり、添加したグアニン（G）と相補的ではないので、伸長反応が起こらず、しきい値電圧は変化しない。【００４３】
次に、洗浄後、タックDNAポリメラーゼ及び基質dTTPを添加した。図２（e）に示すように、ターゲット遺伝子上の解析すべき次の塩基はグアニン（G)であり、添加したチミン（T）と相補的ではないので、伸長反応が起こらず、しきい値電圧は変化しない。次に4種類の塩基添加サイクルの最初に戻り、タックDNAポリメラーゼ及び基質dCTPを添加した。【００４４】
図２（f）に示すように、ターゲット遺伝子上の解析すべき次の塩基はグアニン（G)であり、添加したシトシン（C）と相補的であるので、伸長反応が起こり、シトシンが合成される。図２（f）に示すように、この場合、グアニンが4個連続して並んでおり、4個のシトシンが合成されるのでしきい値電圧の変化は大きく、10mV変化した。【００４５】
以上の塩基配列解析過程において、添加した塩基としきい値電圧の変化との関係を求めると図３のようになる。これより、DNAポリメラーゼと基質となるdCTP,dATP,dGTP,dTTPを順次添加し、しきい値電圧の変化のシグナルの有無を測定することにより、ターゲット遺伝子の塩基配列解析を行うことができる。図２（f）に示すように、同じ塩基が連続しているときには、原理的にしきい値電圧のシフトの大きさから塩基の数を推定することができる。【００４６】
本実施例のように電界効果トランジスタと伸長反応を利用するDNA塩基配列解析では、ゲート絶縁膜上への試料導入、ハイブリダイゼーション、伸長反応の各プロセスの進行中、常時電位計測を行い反応の進行をモニタリングすることができる。したがって、反応の完了を電位変化から検出することができ、効率的に塩基配列解析を行うことができる。また、本発明では、伸長反応に伴う塩基の合成を電荷の増加量として検出するため、ターゲット遺伝子に蛍光色素やラジオアイソトープなどの標識をつけずに塩基配列を解析することができる。【００４７】
図４は、本発明の遺伝子検出用電界効果デバイスを用いた測定装置の一例を説明する図である。少なくとも２種類の核酸プローブと２つの遺伝子検出用電界効果デバイスをフローセル１１にマウントし、流路１２に接続する。片方の電界効果デバイスのゲート絶縁膜表面に解析する遺伝子の塩基配列と相補的な配列を有する核酸プローブを固定化し、他方の電界効果デバイスのゲート絶縁膜表面には何も固定化しないで参照用電界効果デバイスとする。そして上記両電界効果デバイスの出力信号の差動測定を行うことにより、伸長反応に基づくしきい値電圧の変化を測定する。差動測定を行うことにより、光や温度変化に基づく出力信号の変化や、非特異的吸着やイオン濃度変化に基づく共通の出力変化を相殺することができ、伸長反応に基づく変化のみを高精度に測定することができる。【００４８】
流路１２には緩衝液１３及び洗浄液１４がバルブ１５を介して接続されており、ポンプ１６を駆動して、緩衝液及び洗浄液をフローセル１１に導入することができる。また、試料及び伸長反応のための酵素タックポリメラーゼ（Taq polymerase）、及び基質となるdATP,dGTP,dCTP,dTTPなどは分注器１７によりバルブ１５中に分注し、フローセル１１に導入して遺伝子検出用電界効果デバイスと反応させることができる。【００４９】
反応後、使用済みの液はポンプ１６により廃液ボトル１８に送られる。また、参照電極１９にはAg-AgCl電極を用い、3MのKCl溶液２０を通過させて上記フローセル１１の下流で流路１２に接続し、液−液接合２１を形成させて、遺伝子検出用電界効果デバイスと電気的に接続する。反応後の遺伝子検出用電界効果デバイスのしきい値電圧出力は、信号処理回路２２により、ノイズ除去、基質添加前後のしきい値電圧の差の計算、上記しきい値電圧の差とノイズの比較、しきい値電圧変化の大きさを利用した塩基数の計算、添加した塩基の種類としきい値電圧変化の大きさから塩基配列の決定などが処理／演算される。【００５０】
図５に、フローセル１１の構造を示す。フローセル１１の中のプリント基板２３に遺伝子検出用電界効果デバイス２４をマウントし、ワイヤー２５で電気的にプリント基板２３と接続させる。プリント基板２３にはピン２６が設けられており、信号処理回路２２と接続されている。試料溶液は流路１２により遺伝子検出用電界効果デバイス２４に導入される。試料溶液が信号線となるワイヤー２５に接触しないようにワイヤー部分を保護キャップ２７で保護する。保護キャップ２７の材料はアクリル、ポリプロピレン、ポリカーボネイトなどが適している。【００５１】
本構成の遺伝子検出用電界効果デバイス測定装置は、フロー方式の測定であるため多数の試料を連続に自動的に処理することができ、高スループットの測定に有効である。上記実施例に示したFactor  VII遺伝子の塩基配列解析を図４に示す測定装置の構成例に基づいて行う場合、次のステップで測定が行われる。
（１）洗浄液１４をフローセル１１中に導入
（２）緩衝液１３をフローセル１１中に導入（洗浄液を置換）
（３）試料をバルブ１５に分注して、フローセル１１に導入
（４）フローセル１１中でハイブリダイゼーション
（５）緩衝液１３をフローセル１１に導入して、未反応の試料を除去
（６）各遺伝子検出用電界効果デバイスのしきい値電圧出力値を測定
（７）電界効果デバイスの温度をタックDNAポリメラーゼの最適温度７４℃に設定
（８）酵素タックDNAポリメラーゼ（Taq polymerase）、及び基質となるdCTP,dATP,dGTP,dTTPのいずれかをフローセル１１に導入し伸長反応
（９）緩衝液１３をフローセル１１に導入して未反応の酵素・基質を除去
（１０）各遺伝子検出用電界効果デバイスのしきい値電圧出力値を測定
（１１）（７）に戻る。基質を変えて順次、伸長反応・しきい値電圧測定を繰り返す
上記測定シーケンスを図６に示す。図中、矢印は出力電位を読み取るタイミングを表す。
（実施例１）【００５２】
本発明の方法により血液凝固因子であるFactor VII遺伝子のR353Q領域の塩基配列を解析した。遺伝子トランジスタのゲート絶縁膜上には９塩基のオリゴヌクレオチドプローブを固定化した。ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーション後、酵素タックDNAポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）、及び基質となるdATP,dGTP,dCTP,dTTPを順番に添加した。各基質を添加した後の遺伝子トランジスタのしきい値電圧を測定した結果を図７に示す。ターゲットDNAの塩基配列と相補的なG,C,A,C,G,Tの塩基を添加したときにしきい値電圧が変化していることが分かる。また、Cが３つ連続して連なった配列ではGの添加で約３倍のしきい値電圧変化が得られていることが分かる。これらよりFactor  VII遺伝子R353Q領域の塩基配列を読み取ることができることが分かる。
（実施例２、３）【００５３】
実施例１と同様にHereditary hemochromatosis遺伝子のC282Y領域（実施例２）及びH63D領域（実施例３）の塩基配列を解析した。結果を図８、図９に示す。この場合も、dATP,dGTP,dCTP,dTTPを順次添加すると、ターゲットDNAの塩基配列に相補的であれば、しきい値電圧の変化が得られ、相補的でなければしきい値電圧は変化しなかった。また、２個連続している場合には１個の場合より大きなしきい値電圧の変化が得られた。このように、本発明の方法によれば、DNAの塩基配列を非標識で解析することができることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、高精度に遺伝子測定が可能で、かつ低価格システムを実現できる遺伝子検出用電界効果デバイス及びその電界効果デバイスを用いたDNA塩基配列解析方法及び解析装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１（ａ）は、本発明の遺伝子検出用電界効果デバイスの一例を説明する断面模式図、図１（ｂ）はそのゲート部の拡大図。
【図２】本発明の遺伝子検出用電界効果デバイスによるDNA塩基配列解析の原理を説明する図。
【図３】本発明による遺伝子検出用電界効果デバイスによるDNA塩基配列解析結果を説明する図。
【図４】本発明の遺伝子検出電界効果デバイスを用いた測定システムの構成例を示す図。
【図５】本発明の遺伝子検出電界効果デバイスを搭載するフローセルの断面模式図。
【図６】本発明の遺伝子検出電界効果デバイスによる測定シーケンスの説明図。
【図７】実施例１の塩基配列解析結果を説明する図。
【図８】実施例２の塩基配列解析結果を説明する図。
【図９】実施例３の塩基配列解析結果を説明する図。
【符号の説明】
【００５６】
１…シリコン基板
２…Pウェル
３…ｎ型領域
４…二酸化シリコン
５…窒化シリコン
６…核酸プローブ
７…二酸化シリコン
８…りんガラス
９…ｎ型領域（温度センサ）
１１…フローセル
１２…流路
１３…緩衝液
１４…洗浄液
１５…バルブ
１６…ポンプ
１７…分注器
１８…廃液ボトル
１９…参照電極
２０…3M KCl溶液
２１…液−液接合
２２…信号処理回路
２３…プリント基板
２４…遺伝子検出用電界効果デバイス
２５…ワイヤー
２６…ピン
２７…保護キャップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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