(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質を含有する溶液に対し少なくとも一回の、凍結及び前記凍結後の融解を含む工程を加えて該溶液中に含まれる中に含まれるリポタンパク質を変性させ、変性リポタンパク質を得、該変性リポタンパク質を凍結乾燥することにより該変性リポタンパク質を安定化することからなる安定化変性リポタンパク質の製造方法。
【請求項２】
該リポタンパク質はヒトリポタンパク質である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
該リポタンパク質はカイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）、ＨＤＬ２及びＨＤＬ３からなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
【請求項４】
安定化剤を添加する工程をさらに含む、請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該安定化剤はシュクロース、ラクトース、トレハロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）からなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
該変性リポタンパク質は血液中の変性リポタンパク質量の測定用の標準物質または変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための実験用試薬として使用される、請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該変性リポタンパク質は、ハイブリドーマセルラインＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７１）により産生されるＤＬＨ３抗体と反応するものである、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該リポタンパク質の変性のための凍結を含む工程は、１〜１０回繰り返し行われる、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該凍結を含む工程中の凍結は、０．０１〜１０℃／分の降温速度で、０〜−１９６℃の温度になるまで降温して凍結し、０〜３６時間、該温度を維持することによって行われる、請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該融解が、０．０１〜１０℃／分の昇温速度で、０〜４２℃の温度になるまで昇温することによって行なわれる、請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項に記載の方法によって製造される安定化変性リポタンパク質。
【請求項１２】
請求の範囲第１１項に記載の安定化変性リポタンパク質を標準物質として使用する変性リポタンパク質の測定方法。
【請求項１３】
該安定化変性リポタンパク質は免疫学的測定法における標準物質として使用される、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
該免疫学的測定法はラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、凝集イムノアッセイ、免疫比濁法及び免疫比朧法から選ばれる、請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
該免疫学的測定法は競合法またはサンドイッチ法である、請求の範囲第１３または１４項に記載の方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１１項に記載の安定化変性リポタンパク質を標準物質として含有する変性リポタンパク質の測定用の試薬キット。
【請求項１７】
検体希釈液、抗体固相化固相、反応用緩衝液、洗浄液、標識化２次抗体、検出用試薬、および標準物質としての請求の範囲第１１項に記載の安定化変性リポタンパク質の全部または一部を構成要素として含む変性リポタンパク質の測定用の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、安定化変性リポタンパク質およびその製造方法に関するものである。詳しく述べると、本発明は、リポタンパク質を変性させた変性リポタンパク質を凍結乾燥することによって得られる長期保存安定性に優れた変性リポタンパク質およびその製造方法に関するものである。
本発明はまた、変性リポタンパク質の製造方法に関するものである。詳しく述べると、本発明は、リポタンパク質を含有する溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えることにより該リポタンパク質を変性することからなる変性リポタンパク質の製造方法、ならびにこのようにして製造された変性リポタンパク質をさらに凍結乾燥することによって得られる長期保存安定性に優れた変性リポタンパク質およびその製造方法に関するものである。
変性リポタンパク質は、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、あるいは腎症、糖尿病性腎症なとの腎動脈系疾患ならびに末梢動脈閉塞症のような末梢動脈系疾患などの各種循環器系疾患との関わりが強く示唆されており、変性リポタンパク質量の測定用の標準物質ならびに変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための各種実験用の試薬は、結果を左右する非常に重要な物質である。したがって、このようにして安定化された変性リポタンパク質は、例えば、変性リポタンパク質を認識する抗体と接触させ、該抗体の試料に対する反応性を測定することによって血液成分中に含まれる変性リポタンパク質を測定する方法において用いられる標準物質や、変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための各種実験用の試薬として有用である。
背景技術
心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、あるいは腎症、糖尿病性腎症などの腎動脈系疾患および末梢動脈閉塞症のような末梢動脈系などの各種循環器系疾患においては、血清中の脂質が重要な役割を担っていることは強く示唆されており、血清脂質低下薬、特にコレステロール低下薬には莫大な保健医療費が支払われている。しかしながら、最近の研究によれば、このような患者群と健常者群の比較を行なった場合、血清脂質の絶対量は両群間でそれほど大きな違いはなく、むしろ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の変性物である酸化ＬＤＬの血清中の存在量が両群間で明確に異なっていることが報告された（例えば、Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４，Ｓｕｐｐｌ．Ｉ：１２８８）。また、変性リポタンパク質の一つである酸化リポタンパク質と粥状硬化病巣の進展との関連性が、スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ）らにより指摘された（例えば、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．，Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｃａｒｅｗ，Ｔ．Ｅ．，Ｋｈｏｏ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．，（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０：９１５）。このため、近年、変性リポタンパク質を用いた様々な測定法の開発がなされ（例えば、特開平８−３０４，３９５号公報や特開平９−２８８，１０６号公報）、変性リポタンパク質の生理的役割を調べるための試験の重要性が増してきている。
しかしながら、これらの実験を行なう上で、測定のための標準物質を得ることが困難であることが事情を複雑にしてきた。即ち、変性リポタンパク質の生理的役割を調べる上では、例えば、血清中の変性リポタンパク質を複数の施設から多数集めて比較する必要があり、このためには個々の試験毎の測定値が変動しないことが必須であるが、これらの試験に必要な期間を通じて、安定で再現性のよい標準物質の存在なくしては、測定間の再現性を確保できない。また、異なる標準物質を用いることによって、測定者間の実験結果を著しく変動させることは、その生理的役割に対する解釈を複雑にし、一定の結論を得ることができない。このように安定に保存可能な標準物質が得られないことが、その生理的な重要性が指摘されながらも、例えば、変性リポタンパク質の存在量の測定による疾病の正確な判断手段としての応用の道が閉ざされていた。
通常、例えば、血清中のタンパク質量の測定にあたっては、いわゆる標準血清のようなものや、目的とする成分を単離した状態で、これらを何らかの方法で安定化し標準物質とすることが用いられている。リポタンパク質についていえば、例えば、リポタンパク質含有血漿または血清を、必要であれば、シュクロース等の非還元性の糖と混合して、水分含量が１〜１０質量％の範囲になるまで凍結乾燥することによって長期保存において安定な標準血漿または標準血清を製造する方法（ＥＰ−Ａ−６１７２８９号公報）、アポリポタンパク質および脂質から得た再構成リポタンパク質をシュクロースやマンニトールなどの安定化剤の存在下で凍結乾燥して安定化させる安定凍結乾燥物の工業的製造方法（ＵＳ−Ａ−５，６５２，３９９号公報）が報告されていた。しかしながら、上記公報では、リポタンパク質を変性させないように安定化する手段としてのリポタンパク質の安定化が図られているのみであり、安定化された変性リポタンパク質およびその製造方法については依然として開示がなされていない。
一方で、従来よく知られた方法により、例えば、超遠心分離法によりリポタンパク質を単離・精製し、これを銅イオン等の金属イオンで酸化させるか、無水酢酸と反応させてアセチル化する、あるいは、マロンジアルデヒド等と反応させるなどの方法で、それぞれ酸化リポタンパク質、アセチル化リポタンパク質およびマロンジアルデヒド化リポタンパク質などの変性リポタンパク質を得る方法が知られている。しかしながら、このような方法で製造した変性リポタンパク質は、未変性のリポタンパク質より不安定であり、そのままの状態では長時間の保存は不可能であった。
このような状況を鑑みて、特開平９−２８８，１０６号公報に、リン脂質を人工的に酸化して得られたリン脂質の酸化物を血漿リポタンパク質に組み込んだ物を標準品として用いて、ヒト酸化リポタンパク質を測定する方法が開示されている。しかしながら、上記方法で開示される標準物質は保存安定性が十分でなく、使用するたび毎に調製する必要があり、操作が煩雑である。
このような諸事情を鑑みると、長期間安定して保存できる変性ポリタンパク質およびその製造方法が強く求められていた。
したがって、本発明は、血液成分中に含まれる変性リポタンパク質量の測定用の標準物質や変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための各種実験用の試薬として使用される、長期保存安定性に優れた（すなわち、保存期間によって測定値の変動が見られない）変性リポタンパク質およびその製造方法を提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を解決するべく鋭意努力した結果、リポタンパク質を含む卵黄、乳汁、全血、血清や血漿、これらから部分分画されたリポタンパク質画分、ならびに超遠心分離法等によって分画精製されたリポタンパク質などのリポタンパク質を銅イオン等の金属イオン等で代表される触媒によって酸化させた酸化リポタンパク質、無水酢酸等によってアセチル化させたアセチル化リポタンパク質あるいはマロンジアルデヒド等でアルデヒド化したマロンジアルデヒド化リポタンパク質等の人工的に変性させた変性リポタンパク質を凍結乾燥することによって、変性リポタンパク質の長期保存安定性を顕著に向上することができ、ゆえに、本発明の目的が解決されることを見い出した。本発明者らはまた、凍結乾燥時にシュクロース、ラクトース、トレハロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を安定化剤として存在させることによって、変性リポタンパク質の長期保存安定性をさらに向上することができ、これにより上記諸問題をより良く解決できることをも見い出した。
本発明者はさらに、上記目的を解決するべく鋭意努力した結果、リポタンパク質を含む溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えて当該溶液中に含まれるリポタンパク質を変性させることにより血液中の変性リポタンパク質量の測定用の標準物質や変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための各種実験用の試薬として使用されうる変性リポタンパク質が得られること、さらにこのようにして得られた変性リポタンパク質を凍結乾燥することによって、変性リポタンパク質の乾燥状態での長期保存安定性及び該乾燥状態の変性リポタンパク質を溶液に溶解した後の保存安定性を顕著に向上することができ、ゆえに、本発明の目的が解決されることを見い出した。本発明者らはまた、ここでも凍結乾燥時にシュクロース、ラクトース、トレハロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等を安定化剤として存在させることによって、変性リポタンパク質の長期保存安定性をさらに向上することができ、これにより上記諸問題をより良く解決できることをも見い出した。
上記知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
すなわち、上記目的は、リポタンパク質を人工的に変性させ、変性リポタンパク質を得、該変性リポタンパク質を凍結乾燥することにより該変性リポタンパク質を安定化することからなる安定化変性リポタンパク質の製造方法によって達成される。
上記目的はまた、リポタンパク質を含む溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えることにより、該溶液中に含まれるリポタンパク質を変性することからなる変性リポタンパク質の製造方法によっても達成される。
上記目的はさらに、リポタンパク質を含む溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えることにより、該溶液中に含まれるリポタンパク質を変性させ、変性リポタンパク質を得、該変性リポタンパク質をさらに凍結乾燥することにより該変性リポタンパク質を安定化することからなる安定化変性リポタンパク質の製造方法によっても達成される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一の態様によると、リポタンパク質を人工的に変性させ、変性リポタンパク質を得、この変性リポタンパク質を凍結乾燥することにより変性リポタンパク質を安定化することからなる安定化変性リポタンパク質の製造方法が提供される。
本明細書において、「変性リポタンパク質」ということばは、酸化リポタンパク質、アセチル化リポタンパク質及びマロンジアルデヒド等の作用によるアルデヒド化リポタンパク質などの化学変化を受けた変性リポタンパク質、ならびに凝集や３次元構造の変化といった構造的変化を受けた変性リポタンパク質双方を意味し、未変性リポタンパク質と比較して荷電の変化、分子量の変化、生体内リセプターへの親和性の変化、ＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７１）により産生される抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４．２６９：１５２７４−１５２７９；及び特開平７−２３８，０９８号公報）を代表とする変性リポタンパク質特異的抗体との結合性の変化などによって確認される場合も含む。この際、上記ＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３により産生される抗体を代表とする変性リポタンパク質特異的抗体との結合性の変化とは、例えば、未変性リポタンパク質と本発明に係る変性リポタンパク質とを抗原として不溶化固相に固相化し、当該抗体を反応させて、固相化抗原に結合した当該抗体量を当該抗体に特性を有する酵素標識化抗体を用いて酵素量として検出する場合における、未変性リポタンパク質抗原から得られるシグナル量と変性したリポタンパク質抗原から得られるシグナル量との相違を示す。
本発明において使用されるリポタンパク質は、いずれの生物由来のものであってもよく、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、及びギニアピッグなどの哺乳類；ニワトリやウズラなどの鳥類；サケやニシンなどの魚類；ならびに細菌や真菌などの微生物に由来するリポタンパク質が挙げられる。さらに、本発明において使用されるリポタンパク質の具体例としては、上記した源由来の、細胞膜、ミトコンドリア膜、ミエリン構造膜や細菌細胞膜等の生体膜などに存在する構造リポタンパク質；血漿、卵黄や乳汁などに存在する可溶性リポタンパク質；ならびに、これらを超遠心分離法によって、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、リポタンパク質Ｘ、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、リポタンパク質ａ［Ｌｐ（ａ）］、ＨＤＬ２及びＨＤＬ３等の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、及び超高密度リポタンパク質（ＶＨＤＬ）に分画されたリポタンパク質画分などが挙げられる。これらのリポタンパク質は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態であってもよい。これらのうち、ヒト由来のリポタンパク質であることが好ましく、ヒト血漿及び血清由来のカイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）、ＨＤＬ２若しくはＨＤＬ３、またはこれらの混合物がより好ましく、最も好ましくはヒト血漿及び血清由来のＬＤＬが使用される。
本発明で代表として使用されるヒトリポタンパク質は、ヒト血清から遠心沈降法や超遠心分離法等の公知の方法を用いて所定の比重を有する画分を得、この画分を透析や脱塩等の既知の方法により精製することによって調製される。例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を調製する方法としては、以下の（１）〜（３）の方法が挙げられる。
（１）正常ヒト血清２０〜３０ｍＬに、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を加え、最終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとする。これに、ＮａＢｒを加え、比重１．０００に合わせる。遠心チューブに分注し、その上にＮａＢｒで、比重１．１５、１．０６３、１．０１９及び１．００６に合わせた緩衝液を順に重層し、これを４℃で２４時間遠心（１２０，０００×ｇ）する。上端から順に分画し、各画分の比重を屈折計で測定し、比重１．０１９〜１．０６３の画分をＬＤＬ画分として採取する。このようにして得られたＬＤＬ分画を、採取後直ちに、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ［１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）］で透析する（特開平７−２３８，０９８号公報、段落番号００４０）；
（２）ヘパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で０．２５ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＤＴＡを加えて、その０．７５ｍＬずつを超遠心分離用試験管（１〜４ｍＬ容）に採り、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含む０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを２５０μＬ重層して１８５，０００×ｇにて１０℃で２．５時間遠心する。上層１５０μＬを捨て、下層７５０μＬを分取して、ＫＢｒ溶液（５０ｗ／ｖ％）１５０μＬを加えて、比重１．０６３とする。超遠心分離用試験管（１〜４ｍＬ容）の底に比重調整した血漿を移して２４４，０００×ｇにて１０℃で１６時間遠心する。上層の橙色バンド（約１００〜１５０μＬ）を注意深く回収し、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに対して４℃、６時間（３リットルを２時間間隔で２回交換）透析する（特開平８−３０４，３９５号公報、段落番号００５０）；または
（３）ＥＤＴＡを抗凝固剤として得たヒト血漿から超遠心分離法にて比重１．０１９〜１．０６３の部分をＬＤＬ画分として回収する。アガロース電気泳動法にて単一の鋭いバンドを得られることによりＬＤＬの純度を確認した後、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に対して十分に透析する（特開平９−２８８，１０６号公報、段落番号００６２）。
また、例えば、リポタンパク質ａ［Ｌｐ（ａ）］を調製する方法の一例としては以下がある：ヘパリン採血で得たヒト血漿に最終濃度で０．２５ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＤＴＡを加え、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含む０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ  ２５０μＬを重層して１０５，０００×ｇにて８℃で２０時間遠心する。上層を捨て、下層に予め乳鉢で粉末化したＫＢｒを加えて、４℃にて泡立てないようにして溶解し、比重を１．１２５に調整し、１０５，０００×ｇにて８℃で２０時間遠心する。上層の橙色バンドを注意深く回収し、バイオゲルＡ−５ｍ（バイオラッド社製）を用いて１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液を展開溶媒として、ゲル濾過する。得られた各フラクションをＬｐ（ａ）測定キット（テルモ株式会社製）により測定し、Ｌｐ（ａ）画分を回収する。この画分をリジンセファロース４Ｂ（ファルマシア製）にかけ、吸着画分を０．２ｍｏｌ／Ｌ  ε−アミノカプロン酸を含む緩衝液により溶出させ、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに対して透析する（特開平８−３０４，３９５公報、段落番号００５２）。
本発明において、リポタンパク質を人工的に変性する方法は、特に制限されるものではなく公知の方法が使用される。例えば、ヒトリポタンパク質を用いた場合の変性方法としては、以下の方法が挙げられる：ヒトリポタンパク質を金属イオンの存在下で酸化する方法；ヒトリポタンパク質をアセチル化する方法；ヒトリポタンパク質をマロンジアルデヒドを用いてアルデヒド化する方法；およびリン脂質を人工的に酸化して得られる化合物（例えば、１−パルミトイル−２−（９−オキソノナノイル）−グルセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−（５−オキソバレロイル）−グルセロ−３−ホスホコリン）を適当な溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解した溶液を、ヒトリポタンパク質に添加する方法が挙げられる。これらのうち、ヒトリポタンパク質を金属イオンの存在下で酸化する方法；ヒトリポタンパク質をアセチル化する方法；及びヒトリポタンパク質をマロンジアルデヒドを用いてアルデヒド化する方法が好ましく使用される。
ここで、上記好ましい３方法について代表対象として以下に詳述する。
第一に、ヒトリポタンパク質を金属イオンの存在下で酸化する実施態様について以下に詳述する。上記実施態様の一例を以下に記載する：上記したようにして調製されたヒトリポタンパク質（画分）をＥＤＴＡを含まない緩衝液［例えば、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）］で透析することなどによりＥＤＴＡを除去し、所定のタンパク質濃度（５０〜２０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬ）に調整した後、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を所定濃度になるように添加し、約３６〜３８℃で、反応させる。
上記実施態様で使用される金属イオンとしては、フッ化銅（ＩＩ）二水和物、臭化銅（ＩＩ）、酸化銅（ＩＩ）、水酸化銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、セレン化銅（Ｉ）、セレン化銅（ＩＩ）、セレン酸銅（ＩＩ）五水和物、ヘキサフルオロケイ酸銅（ＩＩ）四水和物、酢酸銅（ＩＩ）−水和物、テトラアンミン銅（ＩＩ）硫酸塩一水和物、及びビス（エチレンジアミン）銅（ＩＩ）硫酸塩二水和物由来の銅イオン；塩化鉄（ＩＩ）、臭化鉄（ＩＩ）六水和物、硝酸鉄（ＩＩ）六水和物、チオシアン酸鉄（ＩＩ）三水和物、酢酸鉄（ＩＩ）四水和物、シュウ酸鉄（ＩＩＩ）五水和物、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、硫酸カリウム鉄（ＩＩＩ）十二水和物、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）十二水和物、及び硫酸鉄由来の鉄イオン；ヘモグロビン（Ｈｂ）、トランスフェリン（Ｔｆ）及びラクトフェリン（Ｌｆ）の金属イオンならびにこれらの混合物が挙げられ、これらのうち、硫酸銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物由来の銅イオンまたはこれらの混合物が好ましく使用される。なお、これらの金属イオンは、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
また、上記実施態様において、金属イオンの使用量は、ヒトリポタンパク質を十分酸化できる量であれば特に制限されないが、例えば、金属イオンの濃度が、酸化されるヒトリポタンパク質１ｇに対して、１０〜２００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２５〜１００μｍｏｌ／Ｌとなるような量である。
また、上記実施態様において、反応時間が短すぎる場合では、リポタンパク質の変性（酸化）が十分起こらず、一方、反応時間が長すぎる場合には、リポタンパク質自体の過剰な分解が引き起こされ、例えば、アポタンパク質の抗原性などが失われてしまうことから好ましくない。また、反応時間は、残存するＥＤＴＡ量や溶液全体の量などにより変動するので一概には規定できないが、上記実施態様において調製されるリポタンパク質（画分）の場合では、約３６〜３８℃で、１〜２４時間、好ましくは２〜４時間である。
第二に、ヒトリポタンパク質をアセチル化する実施態様について以下に詳述する。上記実施態様の一例を以下に記載する：所定タンパク質濃度（約５００〜２０００μｇ／ｍＬ、好ましくは５００〜１０００μｇ／ｍＬ）の上記したようにして調製されたヒトリポタンパク質（画分）の溶液に飽和酢酸ナトリウムを等容加え、０〜４℃で１〜２時間、攪拌する。次に、無水酢酸を０．２５〜４μＬ（即ち、ヒトリポタンパク質に対して、０．５〜２μＬ／ｍｇ）、好ましくは０．４〜２．４μＬ（即ち、ヒトリポタンパク質に対して、０．８〜１．２μＬ／ｍｇ）加えて、０〜４℃で６０〜１２０分間、攪拌した後、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して２〜８℃で十分（５００〜１０００倍容で２〜３回（２時間以上／回））透析する。
第三に、ヒトリポタンパク質をマロンジアルデヒドを用いてアルデヒド化する実施態様について以下に詳述する。上記実施態様の一例を以下に記載する：０．１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）における、所定タンパク質濃度（約０．２５〜１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ）の上記したようにして調製されたヒトリポタンパク質（画分）溶液に、マロンジアルデヒド溶液（マロンジアルデヒドビスジメチルアセタール１ｍｏｌ／Ｌを０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸存在下に１００℃で５分加熱し加水分解したもの）を０．６２５〜１０μＬ（即ち、ヒトリポタンパク質に対して、２．５〜１０μＬ／ｍｇ）、好ましくは１〜６μＬ（即ち、ヒトリポタンパク質に対して、４〜６μＬ／ｍｇ）加え、３０〜４０℃で２〜４時間、反応させた後、この反応液を０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して２〜８℃で十分（５００〜１０００倍容で２〜３回（２時間以上／回））透析する。
本発明の方法は、このようにして得られた変性リポタンパク質を安定化を目的として凍結乾燥する工程を含むことを必須とする。本明細書において、「凍結乾燥」ということばは、当該分野において使用されるのと同様の意味で使用され、すなわち、試料を凍結させ、凍結状態のままで減圧して、試料から水や昇華性のものを除き、乾燥することを意味する。本発明において、凍結乾燥の条件は、変性リポタンパク質を安定化できる条件であれば特に制限されるものではないが、通常、−８０〜２０℃、好ましくは−８０〜１５℃の温度で、０．６６７〜１３．３３Ｐａ、好ましくは０．６６７〜１．３３３Ｐａの圧力で、１２〜７２時間、好ましくは２４〜７２時間、凍結乾燥する。このような凍結乾燥工程によって、変性リポタンパク質を含む凍結乾燥物中の水分含量は、通常、１０質量％以下、好ましくは１質量％以下である。
本発明において、凍結乾燥工程中に安定化剤を存在させることが好ましい。上記態様において使用される安定化剤としては、当該分野において通常使用される安定化剤が使用されるが、具体的には、シュクロース、ラクトース、トレハロース等の糖類；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のタンパク質などが挙げられる。これらのうち、シュクロース、ラクトース、トレハロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が安定化剤として好ましく使用される。なお、上記された安定化剤は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、この際の安定化剤の使用量は、変性リポタンパク質の安定化が図れる量であれば特に制限されるものではないが、通常、１〜２０質量％、好ましくは２〜５質量％である。
また、本発明において、凍結乾燥工程中に安定化剤を存在させる場合の安定化剤の添加時期は、特に制限されるものではないが、凍結乾燥前に予め安定化剤を添加することが好ましく、特に変性工程と凍結乾燥工程との間に安定化剤を添加することが特に好ましい。さらに、凍結乾燥後、安定化剤を取り除く工程は特に必要なく、変性リポタンパク質の保存安定性を考慮すると、むしろ凍結乾燥状態を保つ間は安定化剤を存在させることが好ましい。
本発明の第二の態様によると、リポタンパク質を含む溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えて当該溶液中に含まれるリポタンパク質を変性させることからなる変性リポタンパク質の製造方法が提供される。また、本発明の第三の態様によると、このようにして得られた変性リポタンパク質をさらに凍結乾燥することにより当該変性リポタンパク質を安定化することからなる安定化変性リポタンパク質の製造方法が提供される。本発明者らは、リポタンパク質を含む溶液に少なくとも一回の凍結を含む工程を加えて当該溶液中に含まれるリポタンパク質を変性させることによって得られる変性リポタンパク質もまた、血液中の変性リポタンパク質量の測定に用いる標準物質や変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための試薬として使用されうること；およびこのようにして得られた変性リポタンパク質をさらに凍結乾燥することによって変性リポタンパク質は乾燥状態での長期保存安定性及び該乾燥状態の変性リポタンパク質を溶液に溶解した後の保存安定性に優れることを発見し、この知見に基づいて上記態様の方法を知得した。
第二または第三の態様に係る方法は、リポタンパク質を含む溶液を凍結する工程を含むことを必須要件とする。第二または第三の態様において、「リポタンパク質」ということばは、上記第一の態様における定義と同様である。リポタンパク質を含む溶液としては、例えば、血清、血漿、ならびにカイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、リポタンパク質Ｘ、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、リポタンパク質ａ［Ｌｐ（ａ）］、ＨＤＬ２及びＨＤＬ３等の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及び超高密度リポタンパク質（ＶＨＤＬ）等のリポタンパク質画分などが挙げられる。これらのうち、血清、血漿、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）、ＨＤＬ２若しくはＨＤＬ３、またはこれらの混合物がリポタンパク質を含む溶液としてより好ましく、最も好ましくは、ヒト血漿、ヒト血清、ならびにヒト血漿及び血清由来のＬＤＬが使用される。
第二の態様の方法は、リポタンパク質を含む溶液に対して凍結を含む工程を施すことを必須とする。本明細書において、「凍結を含む工程」ということばは、当該溶液中に含まれるリポタンパク質内のまたは該リポタンパク質を実質的に取り囲む環境中の水分の一部または全部を凍結する工程を少なくとも一回含む工程を意味し、本発明に係る凍結を含む工程を行なうことによって得られる変性リポタンパク質としては、上記第一の態様において記載した変性リポタンパク質のいずれかが挙げられる。好ましくは、本発明に係る凍結を含む工程を行なうことによって得られた変性リポタンパク質は、酸化リポタンパク質、アルデヒド化リポタンパク質、またはハイブリドーマセルラインＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７１）により産生される抗体（本明細書中では、単に「ＤＬＨ３抗体」とも称する）と反応するリポタンパク質である。なお、上記方法で使用されるハイブリドーマセルラインＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３は、１９９４年２月１７日に、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在する通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１５３として「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３」の表示で寄託され、該寄託は、２０００年５月２６日にブタペスト条約に基づく寄託に切り換えられ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７１として同所に保管されている。
上記態様において、リポタンパク質を含む溶液に対して変性を目的として施される凍結を含む工程の条件は、この溶液中に含まれるリポタンパク質を変性できる条件であれば特に制限されるものではなく、また、凍結を含む工程においては、凍結を行なう際のリポタンパク質を実質的に取り囲む環境によってその凍結の効果は大きく左右されるために一概には限定できないが、例えば、凍結を含む工程中の凍結の条件は、０．０１〜１０℃／分、好ましくは０．０１〜１℃／分の降温速度で、０〜−１９６℃、好ましくは−５〜−８５℃の温度になるまで降温して凍結し、０〜３６時間、好ましくは０〜１６時間、所定の温度を維持するような条件である。また、第二の態様において、リポタンパク質の変性のための凍結を含む工程は、少なくとも一回行なう必要があり、また、繰り返し行なっても特に構わない。繰り返し行なわれる場合の凍結を含む工程数は、１〜１０回、より好ましくは１〜４回であることが好ましい。本発明において、繰り返す工程内容は凍結を含む工程毎に異なってもよく、また、各工程の凍結条件は同一であってもあるいは異なるものであってもよい。この際、凍結乾燥工程数が１０回を超えると、これに見合うリポタンパク質の変性効果が減弱し、経済的でない。
または、上記第二の態様によるリポタンパク質の変性のための凍結を含む工程は、凍結後に融解を含む工程であってもよい。上記第二の態様において凍結を含む工程内に融解を含む場合、その条件は特に制限されるものではないが、融解は、０．０１〜１０℃／分、好ましくは０．１〜１０℃／分の昇温速度で、０〜４２℃、好ましくは０〜３７℃の温度になるまで昇温することによって行なわれる。
または、上記第二の態様によるリポタンパク質の変性のための凍結を含む工程は、該工程内に乾燥を含む工程であってもよい。この際の凍結後の乾燥を含む工程の条件は、特に制限されるものではないが、乾燥は、例えば、−８０〜２０℃、好ましくは−８０〜１５℃の温度で、０．６〜１３Ｐａ、好ましくは０．６〜１．３Ｐａの圧力で、１２〜７２時間、好ましくは２４〜７２時間、乾燥することによって行なわれる。
または、上記第二の態様によるリポタンパク質の変性のための凍結を含む工程は、リポタンパク質を含む溶液を凍結乾燥し、得られた乾燥物を溶媒に溶解した後、当該溶液を再度凍結乾燥することからなる工程であってもよい。この際の凍結乾燥工程は第一の態様における定義と同様である。また、最初の凍結乾燥で得られた乾燥物を溶解する溶媒は、乾燥物を溶解できるものであれば特に制限されないが、例えば、水、脱イオン水及び蒸留水などが挙げられる。
第三の態様の方法は、上記第二の態様の方法によって得られた変性リポタンパク質をさらに凍結乾燥して、該変性リポタンパク質を安定化させることを必須要件とするものである。上記態様による凍結乾燥工程は、安定化剤の添加時期以外については第一の態様における定義と同様である。すなわち、第三の態様において、安定化剤は、第二の態様における凍結を含む工程内容によって異なるが、例えば、変性リポタンパク質を含有する溶液に凍結を含む工程を施す際には、安定化剤は、凍結を含む工程前に予め添加しておいても、または変性を目的とする凍結を含む工程と安定化を目的とする凍結乾燥工程との間に添加してもよい。また、変性リポタンパク質を含有する溶液を凍結する際には、安定化剤は凍結を含む工程前に予め添加されることが好ましい。
本発明の第四の態様によると、上記第一または第三の態様によって製造される安定化変性リポタンパク質が提供される。
このようにして製造された変性リポタンパク質および安定化変性リポタンパク質は長期間保存安定性に優れているので、例えば、変性リポタンパク質を認識する抗体と接触させ、該抗体の試料に対する反応性を測定することによって血液成分中に含まれる変性リポタンパク質を測定する方法において用いられる標準物質や、変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための各種実験用の試薬として有用である。
したがって、本発明の第五の態様によると、上記第一または第三の態様によって製造される安定化変性リポタンパク質を標準物質として使用する変性リポタンパク質の測定方法が提供される。また、本発明の第六の態様によると、上記第一または第三の態様によって製造される安定化変性リポタンパク質を標準物質として含有する変性リポタンパク質の測定用の試薬キットが提供される。
上記第五の態様において、変性リポタンパク質の測定方法は特に制限されるものではなく、公知のものが使用できるが、具体的には、変性リポタンパク質を認識する抗体と接触させて、該抗体の試料に対する反応性を測定することにより血液成分中に含まれる変性リポタンパク質を免疫学的に測定する方法、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ、凝集イムノアッセイ、免疫比濁法及び免疫比朧法などが挙げられる。また、測定様式としては、競合法およびサンドイッチ法などが挙げられる。これらの方法のうち、本発明による安定化変性リポタンパク質は、免疫学的に測定する方法、特にラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ及び発光イムノアッセイにおいて標準物質として好ましく使用される。
また、上記第六の態様において、変性リポタンパク質の測定用の試薬キットは、本発明による安定化変性リポタンパク質を標準物質として含有するものであれば特に制限されるものではなく、本発明による安定化変性リポタンパク質を標準物質として使用する以外は、公知のキットの構成と同様の構成からなる。例えば、本発明による安定化変性リポタンパク質をＥＬＩＳＡ法における標準物質として使用する場合には、本試薬キットは、検体希釈液、抗体固相化固相、反応用緩衝液、洗浄液、標識化２次抗体（好ましくは、酵素標識化２次抗体）、検出用試薬（例えば、発色液）、および標準物質としての本発明に係る安定化変性リポタンパク質の全部または一部を含む構成よりなる。上記態様もまた本発明の概念に含まれるものである。したがって、第七の態様によると、検体希釈液、抗体固相化固相、反応用緩衝液、洗浄液、標識化２次抗体、検出用試薬、および標準物質としての上記第一または第三の態様によって製造される安定化変性リポタンパク質の全部または一部を構成要素として含む変性リポタンパク質の測定用の試薬キットが提供される。
上記第七の態様において、標準物質が試薬キットに含まれない場合であっても、実質的にキットに使用することを前提に存在する場合には、本発明に係る標準物質は試薬キットの構成要素として認知されるべきである。
次に、ＥＬＩＳＡ法による変性リポタンパク質の活性測定法を例にとって、下記実施例を参照しながら、本発明による変性リポタンパク質の製造方法およびその効果についてより詳細に説明するが、本発明の態様が下記実施例に限定されるべきものでないことはいうまでもない。
実施例１
（１）ＬＤＬの調製
ＥＤＴＡを抗凝固剤として得たヒト血漿から超遠心分離法（１０℃で比重１．０１９に調整、１２０，０００×ｇ、２０時間後、上層を回収し、１．０６３に比重調整し、さらに１２０，０００×ｇ、２４時間）にて比重１．０１９〜１．０６３の部分を、ＬＤＬ画分として回収した。この際、ＬＤＬの純度は、アガロース電気泳動法にて単一の鋭いバンドが得られることにより確認した。
次に、このＬＤＬ画分を、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で十分（１６時間または一晩）透析することによって精製した。さらに、このようにして精製されたＬＤＬを、ＬＤＬタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、使用するまで４℃で保存した。なお、本実施例において、タンパク質量は、Ｌｏｗｒｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄを使用した。簡潔にいうと、２（ｗ／ｖ）％炭酸ナトリウム、０．４（ｗ／ｖ）％水酸化ナトリウム、０．１６（ｗ／ｖ）％酒石酸、１（ｗ／ｖ）％ＳＤＳ溶液及び４（ｗ／ｖ）％硫酸銅溶液を１００対１に混合した試薬１．５ｍＬを、それぞれ、サンプル及び標準物質（ＢＳＡ）０．５ｍＬに混合した。室温にて２０分間反応後、フェノール試薬０．１５ｍＬを添加し、直ちに混合した。室温にて４５分間反応後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（２）ＬＤＬの酸化
（１）で調製されたＬＤＬを、５００〜１０００倍容以上のＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回以上（２時間以上／回）透析することによってＥＤＴＡを除去し、ＬＤＬの濃度が２００μｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かした。次に、このＬＤＬ溶液１０ｍＬに、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を終濃度が５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、３７℃で３時間インキュベートすることにより、ＬＤＬを酸化した。さらに、この溶液に、ＥＤＴＡを終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することにより、酸化反応を停止した後、５００〜１０００倍容以上のＥＤＴＡを１ｍｍｏｌ／Ｌ含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回以上（２時間以上／回）透析することにより、ＣｕＳＯ４を除去し、酸化ＬＤＬを調製し、これを４℃で保存した。
なお、本実施例において、酸化ＬＤＬ量の表現は、原料であるＬＤＬのタンパク質量で定義した。
（３）酸化ＬＤＬの凍結乾燥品の調製
（２）で調製された酸化ＬＤＬを、タンパク質濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ（「Ｌタイプ」と称する）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（「Ｈタイプ」と称する）になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した後、さらにＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるようにそれぞれ添加して、よく混和した。次に、この混合液をガラス瓶に１ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、２０℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することによって、水分を気化・除去した後、密栓し、４℃で保存した。なお、この際、凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（４）酸化ＬＤＬの凍結乾燥品を標準品として用いた検量線の作成
ａ．ペルオキシダーゼ標識抗体の作製
精製抗ヒトアポＢ抗体（ヤギ、ケミコン社製）溶液（５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸緩衝液  ｐＨ８．０）１ｍＬに、５０μＬの２−イミノチオラン−ＨＣｌ溶液（６０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸緩衝液  ｐＨ８．０）を加え、３０℃で３０分間反応させた後、反応溶液を、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍ×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）にかけ、溶出された抗体画分を回収した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」と略す。東洋紡社製）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液  ｐＨ７．０）１ｍＬに５０μｌのＥＭＣＳ溶液（同人化学社製、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＭＳＯ溶液）を加え、３０℃で３０分間反応させた後、反応溶液を０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍ×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）にかけ、溶出されたＨＲＰ画分を回収した。このようにして回収された抗体画分及びＨＲＰ画分を混合し、３０℃で３０分間反応させた後、反応溶液を０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ−２００カラム（１ｃｍ×１００ｃｍ）（ファルマシア社製）にかけ、溶出された抗体−ＨＲＰコンジュゲート画分を混合・回収し、これをペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポＢ抗体とした。回収された画分は、直ちに終濃度が１（ｗ／ｖ）％になるようにＢＳＡを添加し、使用するまで−５０℃で保存した。
ｂ．ＤＬＨ３抗体の調製
８週齢以上のオスのＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、０．５ｍＬ／匹のプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を注入し、２週間飼育した。次に、このマウスに、所望のモノクローナル抗体を産生する細胞である、ハイブリドーマセルラインＦＯＨ１ａ／ＤＬＨ３（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４．２６９：１５２７４−１５２７９；及び特開平７−２３８，０９８号公報）を１×１０６／匹、腹腔内接種した。７〜１４日後、マウスの腹腔内に十分腹水が貯溜した時点で、腹腔から１８Ｇの注射針を用いて腹水を回収し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を回収した。この上清に、等量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えた後、この混合液と等量の飽和硫酸アンモニウム液を、十分攪拌しながら、１時間かけて滴下し、さらに１時間攪拌を継続した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を廃棄し、沈殿物を回収した。さらに、この沈殿物を０．５モル／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて溶解し、この溶液を、０．５モル／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（２．５ｃｍ×１００ｃｍ）（ファルマシア社製）にかけ、ＩｇＭ画分を回収し、これをＤＬＨ３抗体とした。なお、ＤＬＨ３抗体の濃度は、光路長１ｃｍの２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた吸光度を１．３で除して、この値を抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）とした。
ｃ．サンドイッチＥＬＩＳＡ分析
（３）で調製された酸化ＬＤＬの凍結乾燥品に精製水１ｍＬを加えて溶解後、所定濃度（０ｎｇ／ｍＬ、３．１２５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、及び２５ｎｇ／ｍＬ）となるように、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。
９６Ｆ  マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに、上記ｂ．で調製されたＤＬＨ３抗体をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを、１μｇ／ウエルとなるように加えて、４℃で１６時間インキュベートした。抗体溶液を捨て、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３５０μＬを加えて室温で２時間インキュベートすることによりブロッキングした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
次に、上記で調製された所定濃度の酸化ＬＤＬ凍結乾燥品を含む希釈液を、それぞれ、１００μＬずつウェルに分注し、室温で２時間インキュベートした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
さらに、各ウェルに、上記ａ．で調製されたペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポＢ抗体を１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈した溶液１００μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートした。次に、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（和光純薬工業社製）３ｍｇ／ｍＬを含む０．０３（ｗ／ｖ）％過酸化水素水１００μＬを加えて３０分間発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬを加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第１図に示す。第１図に示されるように、本発明の酸化ＬＤＬの凍結乾燥品を用いてきれいな検量線が作成できた。
（５）保存安定性の比較
（３）で調製された酸化ＬＤＬの凍結乾燥品［酸化ＬＤＬ標準品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ；及び酸化ＬＤＬ標準品（２）：６．２５ｎｇ（Ｌタイプ）］を、所定期間（０、１、３、４週間）４℃で保存した。また、（２）で調製された酸化ＬＤＬを、タンパク質濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ（「Ｌタイプ」と称する）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（「Ｈタイプ」と称する）になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した後、さらにＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるようにそれぞれ添加して、よく混和した。この混合溶液を凍結乾燥せずにそのまま４℃で冷蔵保存したもの［それぞれ、酸化ＬＤＬ比較品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ／ｍＬ；及び酸化ＬＤＬ比較品（２）：６．２５ｎｇ／ｍＬ（Ｌタイプ）とする］を、所定期間（０、１、３、４週間）４℃で保存した。
所定期間保存した後、酸化ＬＤＬ標準品（１）及び（２）に精製水１ｍＬを加え溶解したものならびに酸化ＬＤＬ比較品（１）及び（２）について、それぞれ、上記（４）ｃ．と同様の操作を行ない、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第２図に示す。
第２図から示されるように、本発明による凍結乾燥された酸化ＬＤＬ標準品（１）及び（２）では、調製直後（０週）に比較して測定値がほとんど変動しないのに対して、冷蔵保存された酸化ＬＤＬ比較品（１）及び（２）では、調製直後（０週）に比較して４週間経過後の測定値が、それぞれ、約５０％及び約４５％低下しており、発明による酸化ＬＤＬ標準品（１）及び（２）に比して保存安定性がかなり劣ることが分かる。
実施例２
（１）ＨＤＬの調製
ＥＤＴＡを抗凝固剤として得たヒト血漿からＬＤＬを除去した後、１．２１に比重調整して超遠心分離法（１０℃で１２０，０００×ｇ、４８時間）にて比重１．０６３〜１．２１の部分を、ＨＤＬ画分として回収した。この際、ＨＤＬの純度は、アガロース電気泳動法にて単一の鋭いバンドが得られることにより確認した。
次に、このＨＤＬ画分を、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して十分（１６時間）透析することによって精製した。さらに、このようにして精製されたＨＤＬを、ＨＤＬタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、使用するまで４℃で保存した。なお、本実施例において、タンパク質量は、実施例１（１）に記載のＬｏｗｒｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄを使用した。
（２）ＨＤＬの酸化
（１）で調製されたＨＤＬを、５００〜１０００倍容以上のＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回以上（２時間以上／回）透析することによってＥＤＴＡを除去し、ＨＤＬの濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かした。次に、このＨＤＬ溶液１０ｍＬに、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、３７℃で１８時間インキュベートすることにより、ＨＤＬを酸化した。さらに、この溶液に、ＥＤＴＡを終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することにより、酸化反応を停止した後、５００〜１０００倍容以上のＥＤＴＡを１ｍｍｏｌ／Ｌ含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回以上（２時間以上／回）透析することにより、ＣｕＳＯ４を除去し、酸化ＨＤＬを調製し、これを４℃で保存した。
なお、本実施例において、酸化ＨＤＬ量の表現は、原料であるＨＤＬのタンパク質量で定義した。
（３）酸化ＨＤＬの凍結乾燥品の調製
（２）で調製された酸化ＨＤＬに、ＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるように、それぞれ添加して、よく混和した後、ガラス瓶に１ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、２０℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することによって、水分を気化・除去させた後、密栓し、４℃で保存した。なお、この際、凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（４）酸化ＨＤＬの凍結乾燥品を標準品として用いた検量線の作成
ａ．濃度調整
（３）で調製された酸化ＨＤＬの凍結乾燥品に精製水１ｍＬを加えて溶解後、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳで所定濃度（０ｎｇ／ｍＬ、３．１２５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び７５ｎｇ／ｍＬ）となるように希釈した。
ｂ．サンドイッチＥＬＩＳＡ分析
９６Ｆ  マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに、炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈された抗ヒトアポＡＩマウスモノクロナール抗体（ケミコン社製）溶液０．１ｍＬ／ウェルを各ウエルに加えて、４℃で１６時間インキュベートした。抗体溶液を捨て、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）３５０μＬを加えて室温で２時間インキュベートすることによりブロッキングした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
次に、上記ａ．で調製された所定濃度の酸化ＨＤＬ凍結乾燥品を含む希釈液を、それぞれ、１００μＬずつウェルに分注し、室温で２時間インキュベートした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
さらに、各ウェルに、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１５０倍に希釈されたＤＬＨ３抗体１００μＬを加えて、室温で１時間インキュベートした。次に、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体（ザイメット社製）１００μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートした。０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン３ｍｇ／ｍＬを含む０．０３（ｗ／ｖ）％過酸化水素水１００μＬを加えて発色させ、３０分間放置した後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬを加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第３図に示す。第３図に示されるように、本発明の酸化ＨＤＬの凍結乾燥品を用いてきれいな検量線が作成できた。
（５）保存安定性の比較
（３）で調製された酸化ＨＤＬの凍結乾燥品［酸化ＨＤＬ標準品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ；及び酸化ＨＤＬ標準品（２）：６．２５ｎｇ（Ｌタイプ）］を、所定期間（０、１、２、３、４週間）４℃で保存した。また、（２）で調製された酸化ＨＤＬを、タンパク質濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ（「Ｌタイプ」と称する）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（「Ｈタイプ」と称する）になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した後、さらにＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるようにそれぞれ添加して、よく混和した。この混合溶液を凍結乾燥せずにそのまま４℃で冷蔵保存したもの［それぞれ、酸化ＨＤＬ比較品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ／ｍＬ；及び酸化ＨＤＬ比較品（２）：６．２５ｎｇ／ｍＬ（Ｌタイプ）とする］を、所定期間（０、１、２、３、４週間）４℃で保存した。
所定期間保存した後、酸化ＨＤＬ標準品（１）及び（２）に精製水１ｍＬを加え溶解したものならびに酸化ＨＤＬ比較品（１）及び（２）について、それぞれ、上記（４）ｂ．と同様の操作を行ない、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第４図に示す。
第４図から示されるように、本発明による凍結乾燥された酸化ＨＤＬ標準品（１）及び（２）では、調製直後（０週）に比較して測定値がほとんど変動しないのに対して、冷蔵保存された酸化ＨＤＬ比較品（１）及び（２）では、調製直後（０週）に比較して測定値が、それぞれ、約４０％及び約３０％低下しており、発明による酸化ＨＤＬ標準品（１）及び（２）に比して保存安定性がかなり劣ることが分かる。
実施例３
（１）Ｌｐ（ａ）の調製
ＥＤＴＡを抗凝固剤として得たヒト血漿から超遠心分離法（１５℃で１２０，０００×ｇ、４８時間）にて比重１．０６０〜１．１２５の部分を回収し、さらにバイオゲルＡ−５ｍ（バイオラッド社製）でゲル濾過し、Ｌｐ（ａ）画分を回収した。この際、Ｌｐ（ａ）の純度は、アガロース電気泳動法にて単一の鋭いバンドを示すことによって確認した。
次に、このＬｐ（ａ）画分を、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して十分（１６時間）透析することによって精製した。さらに、このようにして精製されたＬｐ（ａ）を、Ｌｐ（ａ）タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、使用するまで４℃で保存した。なお、本実施例において、タンパク質量は、実施例１（１）に記載のＬｏｗｒｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄを使用した。
（２）Ｌｐ（ａ）の酸化
（１）で調製されたＬｐ（ａ）を、５００〜１０００倍容以上のＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回以上（２時間以上／回）透析することによってＥＤＴＡを除去し、Ｌｐ（ａ）の濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かした。次に、このＬｐ（ａ）溶液１０ｍＬに、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、３７℃で１８時間インキュベートすることにより、Ｌｐ（ａ）を酸化した。さらに、この溶液に、ＥＤＴＡを終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することにより、酸化反応を停止した後、ＥＤＴＡを１ｍｍｏｌ／Ｌ含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して５００〜１０００倍容で２〜３回（２時間以上／回）透析することにより、ＣｕＳＯ４を除去し、酸化Ｌｐ（ａ）を調製し、これを４℃で保存した。
なお、本実施例において、酸化Ｌｐ（ａ）量の表現は、原料であるＬｐ（ａ）のタンパク質量で定義した。
（３）酸化Ｌｐ（ａ）の凍結乾燥品の調製
（２）で調製された酸化Ｌｐ（ａ）に、ＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるように、それぞれ添加して、よく混和した後、ガラス瓶に１ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、２０℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することによって、水分を気化・除去させた後、密栓し、４℃で保存した。なお、この際、凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（４）酸化Ｌｐ（ａ）の凍結乾燥品を標準品として用いた検量線の作成
ａ．濃度調整
（３）で調製された酸化Ｌｐ（ａ）の凍結乾燥品を、所定濃度（０ｎｇ／ｍＬ、０．１５６２５ｎｇ／ｍＬ、０．３１２５ｎｇ／ｍＬ、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬ）となるように、精製水１ｍＬ中に溶解した。
ｂ．サンドイッチＥＬＩＳＡ分析
９６Ｆ  マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに、抗ヒトＬｐ（ａ）マウスモノクロナール抗体（ケミコン社製）を炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを、１μｇ／ウエルとなるように加えて、４℃で１６時間インキュベートした。抗体溶液を捨て、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）３５０μＬを加えて室温で２時間インキュベートすることによりブロッキングした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
次に、上記ａ．で調製された所定濃度の酸化Ｌｐ（ａ）凍結乾燥品を含む水溶液を、それぞれ、１００μＬずつウェルに分注し、室温で２時間インキュベートした後、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。
さらに、各ウェルに、実施例１（４）ｂ．で調製されたＤＬＨ３抗体を１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈された希釈液１００μＬを加えて、室温で１時間インキュベートした。次に、０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体（ケミコン社製）１００μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートした。０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン３ｍｇ／ｍＬを含む０．０３（ｗ／ｖ）％過酸化水素水１００μＬを加えて３０分間発色させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬを加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第５図に示す。第５図に示されるように、本発明の酸化Ｌｐ（ａ）の凍結乾燥品を用いてきれいな検量線が作成できた。
（５）保存安定性の比較
（３）で調製された酸化Ｌｐ（ａ）の凍結乾燥品［酸化Ｌｐ（ａ）標準品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ；及び酸化Ｌｐ（ａ）標準品（２）：６．２５ｎｇ（Ｌタイプ）］を、所定期間（０、１、２、３、４週間）４℃で保存した。また、（２）で調製された酸化Ｌｐ（ａ）を、タンパク質濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ（「Ｌタイプ」と称する）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（「Ｈタイプ」と称する）になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した後、さらにＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるようにそれぞれ添加して、よく混和した。この混合溶液を凍結乾燥せずにそのまま４℃で冷蔵保存したもの［それぞれ、酸化Ｌｐ（ａ）比較品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ／ｍＬ；及び酸化Ｌｐ（ａ）比較品（２）：６．２５ｎｇ／ｍＬ（Ｌタイプ）とする］を、所定期間（０、１、２、３、４週間）４℃で保存した。
所定期間保存した後、酸化Ｌｐ（ａ）標準品（１）及び（２）に精製水１ｍＬを加え溶解したものならびに酸化Ｌｐ（ａ）比較品（１）及び（２）について、それぞれ、上記（４）ｂ．と同様の操作を行ない、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第６図に示す。
第６図から示されるように、本発明による凍結乾燥された酸化Ｌｐ（ａ）標準品（１）及び（２）では、調製直後（０週）に比較して測定値がほとんど変動しないのに対して、冷蔵保存された酸化Ｌｐ（ａ）比較品（１）及び（２）では、調製直後（０週）に比較して測定値が、４週間経過後では、それぞれ、約５０％及び約４０％低下しており、発明による酸化Ｌｐ（ａ）標準品（１）及び（２）に比して保存安定性がかなり劣ることが分かる。
実施例４
（１）凍結変性ヒト血漿の調製
被検者４人より抗凝固剤としてヘパリンを用いて採血し、常法を用いて血漿を採取し、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法と同様の方法に従って、分析した。
次に、各血漿をガラス瓶に２ｍＬずつ分注し、室温（２５℃）から庫内温度−３０℃のフリーザーに移し、３時間以上経過させた後、室温に戻し、完全に内容物を融解した。この凍結を含む工程を施した各自血漿を、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法と同様の方法に従って、分析した。これらの結果を、第７図に示す。第７図に示されるように、血漿に対して凍結を含む工程を施すことにより、血漿中に含まれるリポタンパク質が有意に変性され、凍結変性リポタンパク質（酸化ＬＤＬ）が生産されていることが確認できる。
（２）凍結変性ヒト血漿の凍結乾燥品の調製
上記（１）の凍結を含む工程を計４回施された各自血漿をそれぞれ等容混合し、この混合液について、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法に従って実施例１（４）に示される検量線から変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）濃度を算出した。
次に、（１）で調製された凍結変性ヒト血漿を、酸化ＬＤＬ濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ（Ｌタイプ）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（Ｈタイプ）になるように、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、終濃度２（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ、終濃度５（ｗ／ｖ）％シュクロース、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、この希釈液をガラス瓶に１ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、５℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することにより、水分を気化・除去させた後、密栓し、使用するまで４℃で保存し、これを凍結変性ヒト血漿の凍結乾燥品とした。なお、この凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（３）凍結変性ヒト血漿の凍結乾燥品の濃度測定
（２）で調製された凍結変性ヒト血漿の凍結乾燥品に精製水１ｍＬを加えて溶解した後、この溶液について、実施例１（４）に記載されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの測定方法に従って、４９２ｎｍの吸光度を測定し、この値から実施例１（４）で作成された検量線を用いて酸化ＬＤＬ濃度を確認したところ、凍結乾燥品中の酸化ＬＤＬ濃度の変化は凍結乾燥工程前後でほとんど認められなかった。
（４）保存安定性の比較
（２）で調製された凍結変性ヒト血漿の凍結乾燥品［凍結変性ヒト血漿標準品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ；及び凍結変性ヒト血漿標準品（２）（Ｌタイプ）：６．２５ｎｇ（Ｌタイプ）］を、所定期間（０、６、１２ヶ月間）４℃で保存した。また、実施例１（３）で調製された酸化ＬＤＬ凍結乾燥品［酸化ＬＤＬ標準品（１）（Ｈタイプ）：１２．５ｎｇ；及び酸化ＬＤＬ標準品（２）（Ｌタイプ）：６．２５ｎｇ］を、所定期間（０、６、１２ヶ月間）４℃で保存した。
所定期間保存した後、凍結変性ヒト血漿標準品（１）及び（２）ならびに酸化ＬＤＬ標準品（１）及び（２）に精製水１ｍＬを加えて溶解し、この溶液を、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法と同様の方法に従って、分析した。その結果を下記第１表に示す。
0004611585.tif 000002
第１表から示されるように、本発明による酸化ＬＤＬ標準品も低濃度［酸化ＬＤＬ標準品（２）］であれば保存安定性に優れているが、凍結によりリポタンパク質の変性を行なった後、さらに凍結乾燥により安定化した本発明による凍結変性ヒト血漿標準品は、濃度が高くなっても［凍結変性ヒト血漿標準品（１）］、本発明の酸化ＬＤＬ標準品に比べて、有意に長期間の保存安定性に優れていることが分かる。
実施例５
（１）凍結変性ヒト血清の調製
被検者４人より採血し、常法を用いて血清を分離して混合した。この血清に、ＢＳＡを終濃度２（ｗ／ｖ）％に、及びシュクロースを終濃度５（ｗ／ｖ）％になるように、それぞれ添加して、よく混和した後、ガラス瓶に２ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、５℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することによって、水分を気化・除去させた後、密栓し、４℃で保存した。なお、この凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（２）凍結変性ヒト血清の凍結乾燥品の調製
（１）で調製された凍結変性ヒト血清を含むガラス瓶に、２ｍＬの精製水を加えて内容物を十分溶解した。この溶解液について、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの測定方法に従って、実施例１（４）で作成された検量線から酸化ＬＤＬ濃度を算出した。
次に、（１）で調製された凍結変性ヒト血清を、酸化ＬＤＬ濃度を６．２５ｎｇ／ｍＬ（Ｌタイプ）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（Ｈタイプ）になるように、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、終濃度２（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ、終濃度５（ｗ／ｖ）％シュクロース、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、この希釈液をガラス瓶に１ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、５℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することにより、水分を気化・除去させた後、密栓し、使用するまで４℃で保存し、これを凍結変性ヒト血清の凍結乾燥品とした。なお、この凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（３）凍結変性ヒト血清の凍結乾燥品の濃度測定
（２）で調製された凍結変性ヒト血清の凍結乾燥品に精製水１ｍＬを加えて溶解した後、この溶液について、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの測定方法に従って、実施例１（４）で作成された検量線から酸化ＬＤＬ濃度を確認したところ、凍結乾燥品中の酸化ＬＤＬ濃度の変化は凍結乾燥工程前後でほとんど認められなかった。
（４）溶解後保存安定性の比較
（２）で調製された凍結変性ヒト血清の凍結乾燥品を、それぞれ、精製水１ｍＬを加えて溶解し、酸化ＬＤＬ濃度がそれぞれ１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの凍結変性ヒト血清標準品（１）（Ｈタイプ）及び（２）（Ｌタイプ）とし、これらを所定期間（０、３、７、１０、１４日間）４℃で保存した。また、実施例１（３）で調製された酸化ＬＤＬの凍結乾燥品もまた上記と同様にして溶解して、酸化ＬＤＬ濃度がそれぞれ１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬである酸化ＬＤＬ標準品（３）（Ｈタイプ）及び（４）とし、同様にして、所定期間（０、３、７、１０、１４日間）、４℃で溶解状態で保存した。
所定期間保存した後、凍結変性ヒト血清標準品（１）及び（２）ならびに酸化ＬＤＬ標準品（３）及び（４）について、それぞれ、実施例１（４）に記載されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの測定方法に従って、分析した。その結果を下記第２表及び第８図に示す。
0004611585.tif 000003
第２表から示されるように、本発明による酸化ＬＤＬ標準品も低濃度［酸化ＬＤＬ標準品（４）］であれば溶解後の保存安定性に優れているものの、凍結によりリポタンパク質の変性を行なった後、さらに凍結乾燥により安定化した本発明による凍結変性ヒト血清標準品は、濃度が高くなっても［凍結変性ヒト血清標準品（１）］、本発明の酸化ＬＤＬ標準品に比べて、有意に溶解後の保存安定性に優れていることが分かる。
実施例６
（１）凍結変性ＬＤＬの調製
実施例１（１）で調製されたＬＤＬを、５００〜１０００倍容以上のＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して３回以上（２時間以上／回）透析することによってＥＤＴＡを除去し、ＬＤＬの濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、終濃度２（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ、終濃度５（ｗ／ｖ）％シュクロース、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、よく混和した。次に、この希釈液をガラス瓶に２ｍＬずつ分注し、室温（２２℃）から庫内温度がそれぞれ−８５℃及び−３０℃のフリーザーに移し、１時間以上経過させた後、室温に戻し、完全に内容物を融解した。上記凍結・融解を含む工程を計１０回繰り返した。また、上記凍結・融解を含む工程間に、内容物の一部を回収した後、このサンプルについて、実施例１（４）に記載されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法に従って、分析した。これらの結果を、第９図に示す。
第９図から示されるように、庫内温度が−３０℃では凍結・融解を含む工程を３回繰り返せばＬＤＬの変性はほぼ飽和状態に達するのに対して、庫内温度が−８５℃では凍結・融解を含む工程を９回位繰り返さないとＬＤＬの変性は飽和状態に達せず、降温温度によって変性ＬＤＬの生産量が異なることが示される。
（２）凍結変性ＬＤＬの凍結乾燥品の調製
（１）において庫内温度が−３０℃での凍結を含む工程を計４回施すことにより調製された凍結変性ＬＤＬを、酸化ＬＤＬ濃度が６．２５ｎｇ／ｍＬ（Ｌタイプ）及び１２．５ｎｇ／ｍＬ（Ｈタイプ）になるように、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、終濃度２（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ、終濃度５（ｗ／ｖ）％シュクロース、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、この希釈液をガラス瓶に１ｍＬずつ分注し、共和真空凍結乾燥装置  ＲＬ−２０１ＢＳ（共和真空技術株式会社製）を用いて、−５０℃で１６時間凍結した後、５℃で、１．３３Ｐａの減圧下で４８時間凍結乾燥することにより、水分を気化・除去させた後、密栓し、使用するまで４℃で保存し、これを凍結変性ＬＤＬの凍結乾燥品とした。なお、この凍結乾燥品中の水分含量は０．８質量％であった。
（３）凍結変性ＬＤＬの凍結乾燥品の濃度測定
（２）で調製された凍結変性ＬＤＬの凍結乾燥品に精製水１ｍＬを加えて溶解した後、この溶液について、実施例１（４）に記載されるＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの測定方法に従って、実施例１（４）で作成された検量線から酸化ＬＤＬ濃度をを確認したところ、凍結乾燥品中の酸化ＬＤＬ濃度の変化は凍結乾燥工程前後でほとんど認められなかった。
（４）溶解後保存安定性の比較
（２）で調製された凍結変性ＬＤＬの凍結乾燥品を、それぞれ、精製水１ｍＬを加えて溶解し、酸化ＬＤＬ濃度がそれぞれ１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの凍結変性ＬＤＬ標準品（１）（Ｈタイプ）及び（２）（Ｌタイプ）とし、これらを所定期間（０、３、７、１０、１４日間）４℃で保存した。また、実施例１（３）で調製された酸化ＬＤＬの凍結乾燥品もまた上記と同様にして溶解して、酸化ＬＤＬ濃度がそれぞれ１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬである酸化ＬＤＬ標準品（３）（Ｈタイプ）及び（４）とし、同様にして、所定期間（０、３、７、１０、１４日間）４℃で溶解状態で保存した。
所定期間保存した後、凍結変性ＬＤＬ標準品（１）及び（２）ならびに酸化ＬＤＬ標準品（３）及び（４）について、それぞれ、実施例１（４）に記載されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による酸化ＬＤＬの測定方法に従って、４９２ｎｍの吸光度を測定し、この値から実施例１（４）で作成された検量線を用いて、各標準品中の酸化ＬＤＬを算出した。その結果を下記第３表及び第１０図に示す。
0004611585.tif 000004
第３表から示されるように、本発明による酸化ＬＤＬ標準品も低濃度［酸化ＬＤＬ標準品（４）］であれば溶解後の保存安定性に優れているものの、凍結によりリポタンパク質の変性を行なった後、さらに凍結乾燥により安定化した本発明による凍結変性ヒト血清標準品は、濃度が高くなっても［凍結変性ＬＤＬ標準品（１）］、本発明の酸化ＬＤＬ標準品に比べて、有意に溶解後の保存安定性に優れていることが分かる。
産業上の利用可能性
上述したように、本発明は、リポタンパク質を人工的に変性させて得られた変性リポタンパク質を凍結乾燥することによって得られる保存安定性に優れた変性リポタンパク質およびそれを製造する方法に関するものである。また、本発明は、変性リポタンパク質を含有する溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えて該溶液中に含まれるリポタンパク質を変性することからなる変性リポタンパク質の製造方法；ならびにこのような方法によって得られた変性リポタンパク質をさらに凍結乾燥することによって得られる保存安定性に優れた変性リポタンパク質およびそれを製造する方法に関するものである。変性リポタンパク質は、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、あるいは腎症、糖尿病性腎症などの腎動脈系疾患ならびに末梢動脈閉塞症のような末梢動脈系疾患などの各種循環器系疾患と強く関係することが示唆されており、血液中の変性リポタンパク質量の測定用の標準物質や変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための試薬はこれらの試験の結果を左右する非常に重要な物質である。
したがって、本発明の方法により、保存安定性に優れた、換言すると常に一定の測定値を示す変性リポタンパク質が製造することが可能になった。上記利点に加えて、変性リポタンパク質を含有する溶液に対し少なくとも一回の凍結を含む工程を加えて変性させた変性リポタンパク質を凍結乾燥することにより得られた安定化リポタンパク質は、保存安定性のみならず溶解後の保存安定性にも優れているため、本発明に係る安定化変性リポタンパク質を実際に使用する形態である溶液の形態にした場合の安定性にも優れているため、変性リポタンパク質の測定にあたって非常に有益である。
このため、本発明による安定化変性リポタンパク質は、例えば、変性リポタンパク質を認識する抗体と接触させ、該抗体の試料に対する反応性を測定することによって血液成分中に含まれる変性リポタンパク質を測定する方法において用いられる標準物質や、変性リポタンパク質の生理的役割や生理活性を調べるための各種実験用の試薬として有用であり、さらに、上記したような諸目的での診断技術の商品化や試薬の開発において非常に重要な影響を与えることは明白である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の実施例１において得られた酸化ＬＤＬ（銅で酸化したＬＤＬを凍結乾燥後、所定の方法で溶解したもの）を試料として作成した検量線を示す図である。
第２図は、本発明の実施例１において得られた酸化ＬＤＬ（銅で酸化したＬＤＬを凍結乾燥したもの）を４℃で保存し、一定間隔で所定の方法で溶解したものを試料として測定した場合と、銅で酸化したＬＤＬを凍結乾燥せずそのまま４℃で保存し、一定間隔で試料として測定した場合との測定値の比較を示す図である。
第３図は、本発明の実施例２において得られた酸化ＨＤＬ（銅で酸化したＨＤＬを凍結乾燥後、所定の方法で溶解したもの）を試料として作成した検量線を示す図である。
第４図は、本発明の実施例２において得られた酸化ＨＤＬ（銅で酸化したＨＤＬを凍結乾燥したもの）を４℃で保存し、一定間隔で所定の方法で溶解したものを試料として測定した場合と、銅で酸化したＨＤＬを凍結乾燥せずそのまま４℃で保存し、一定間隔で試料として測定した場合の測定値との比較を示す図である。
第５図は、本発明の実施例３において得られた酸化リポタンパク質ａ［Ｌｐ（ａ）］（銅で酸化したＬｐ（ａ）を凍結乾燥後、所定の方法で溶融したもの）を試料として作成した検量線を示す図である。
第６図は、本発明の実施例３において得られた酸化Ｌｐ（ａ）（銅で酸化したＬｐ（ａ）を凍結乾燥したもの）を４℃で保存し、一定間隔で所定の方法で溶解したものを試料として測定した場合と、銅で酸化したＬｐ（ａ）を凍結乾燥せずそのまま４℃で保存し、一定間隔で試料として測定した場合との測定値の比較を示す図である。
第７図は、実施例４において、血漿に対して凍結を含む工程を施すことにより、変性リポタンパク質が製造されることを示す図である。
第８図は、実施例５において、実施例５（２）で調製された凍結変性ヒト血清標準品および実施例１（３）で調製された酸化ＬＤＬ標準品に関する、ＥＬＩＳＡ法による、溶解後保存安定性を評価した時の測定値（吸光度）の比較を示す図である。
第９図は、実施例６において、ヒトＬＤＬに凍結を含む工程を施すことにより、変性リポタンパク質が製造されることを示す図である。
第１０図は、実施例６において、実施例６（２）で調製された凍結変性ＬＤＬ標準品および実施例１（３）で調製された酸化ＬＤＬ標準品に関する、ＥＬＩＳＡ法による、溶解後保存安定性を評価した時の測定値（吸光度）の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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