(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであって、野生型酵素と比較して、その基質結合領域の部位特異的突然変異誘発により、脂肪族カルボン酸の末端および／または末端付近の酵素的ヒドロキシル化において改変された基質プロフィールを示し、
少なくとも各場合において、アミノ酸配列位置：８７位および１８８位において１つの機能的突然変異、および、アミノ酸配列位置：２６位、４７位、７２位、７４位、および３５４位の１つにおいて任意に少なくとも１つの機能的変異を含む、配列番号２のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来し、
ここで、上記変異は、
Ｐｈｅ８７のＶａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕによる置換；
Ｌｅｕ１８８のＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐによる置換；
Ａｌａ７４のＶａｌまたはＧｌｙによる置換；
Ａｒｇ４７のＨｉｓ、ＴｙｒまたはＰｈｅによる置換；
Ｖａｌ２６のＳｅｒまたはＴｈｒによる置換；
Ｓｅｒ７２のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＧｌｙによる置換；または
Ｍｅｔ３５４のＳｅｒまたはＴｈｒによる置換、
である、上記モノオキシゲナーゼ。
【請求項２】
下記のアミノ酸置換パターン：
ｂ）Ｆ８７Ａ Ｌ１８８Ｋ：
ｃ）Ｆ８７Ｖ Ｌ１８８Ｋ；
ｄ）Ｆ８７Ａ Ｌ１８８Ｋ Ａ７４Ｇ；
ｅ）Ｆ８７Ｖ Ｌ１８８Ｋ Ａ７４Ｇ；
ｆ）Ｆ８７Ａ Ｌ１８８Ｋ Ａ７４Ｇ Ｒ４７Ｆ；
ｇ）Ｆ８７Ｖ Ｌ１８８Ｋ Ａ７４Ｇ Ｒ４７Ｆ；
ｈ）Ｆ８７Ａ Ｌ１８８Ｋ Ａ７４Ｇ Ｒ４７Ｆ Ｖ２６Ｔ；
ｉ）Ｆ８７Ｖ Ｌ１８８Ｋ Ａ７４Ｇ Ｒ４７Ｆ Ｖ２６Ｔ；
の少なくとも１つを含む、請求項１記載のモノオキシゲナーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のモノオキシゲナーゼをコードする核酸またはその相補的核酸。
【請求項４】
調節核酸配列の遺伝的制御下に、請求項３記載の核酸を含むコード配列を含んでなる発現構築物。
【請求項５】
少なくとも１つの請求項４記載の発現構築物を含んでなるベクター。
【請求項６】
請求項５記載の少なくとも１つのベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項７】
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌から選ばれる、請求項６記載の微生物。
【請求項８】
末端または末端付近でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の酵素的製造方法であって、
ａ１）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する培地の存在下に、請求項６または７記載の組換え微生物を培養するか、又は
ａ２）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する反応媒体を請求項１または２記載の酵素と共にインキュベートし、
ｂ）得られたヒドロキシル化産物を該培地又は媒体から単離する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項９】
ヒドロキシル化されうるカルボン酸がＣ８−Ｃ１２−モノカルボン酸またはその誘導体である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
電子供与体または還元当量の存在下で該反応を行う、請求項８または９記載の製造方法。
【請求項１１】
電子供与体または還元当量がＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびＺｎ／Ｃｏ（ＩＩＩ）セパルクレートから選ばれる、請求項１０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、改変された基質プロフィールを有する修飾されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、それをコードする核酸配列、発現構築物およびベクター、これらのベクターを含む組換え微生物、ならびに末端または末端付近（ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ）でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の微生物学的製造方法に関する。
【０００２】
Ｐ４５０  ＢＭ−３と称されるモノオキシゲナーゼは、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のシトクロムＰ４５０酵素であり、哺乳動物Ｐ４５０酵素に対して顕著な配列相同性を有する（１）。これらの類似性のため、Ｐ４５０  ＢＭ−３は、このクラスのＰ４５０酵素の優れたモデル系を構成する。Ｐ４５０  ＢＭ−３は、主として、長鎖飽和脂肪酸をそれらのω−１、ω−２およびω−３炭素原子においてヒドロキシル化する。長鎖不飽和脂肪酸のアミドまたはアルコール類似体およびエポキシドも変換される（１−３）。飽和脂肪酸に対する触媒活性は鎖長に左右され、最適な鎖長は１４〜１６炭素原子である。該酵素は、１２炭素原子未満の鎖長を有する脂肪酸に対しては触媒活性を示さない（１）。
【０００３】
発明の概要
野生型酵素と比較して改変された基質プロフィールを示すシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供することが、本発明の１つの目的である。特に、飽和脂肪族カルボン酸を別の鎖位置でヒドロキシル化する及び／又は改変された基質特異性を有する新規の突然変異体を提供することが１つの目的であった。特に、中鎖長、特に８〜１２、例えば８〜１０炭素原子の鎖長の脂肪族カルボン酸に対する触媒活性を有し、これらのカルボン酸を末端付近で、特にω−１、ω−２および／またはω−３位でヒドロキシル化する突然変異体を提供することが１つの目的であった。
【０００４】
本発明者らは、基質結合領域の部位特異的突然変異誘発と定方向性進化との組合せにより、野生型と比較して脂肪族カルボン酸の末端および／または末端付近の酵素的ヒドロキシル化における改変された反応パターンまたは基質プロフィールを示す修飾されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを提供することにより、この目的が達成されることを見出した。
【０００５】
詳細な説明
本発明の突然変異体には野生型酵素と比較して「改変された基質プロフィール」が認められる。「改変された基質プロフィール」は、本発明の目的においては、ａ）少なくとも１つのヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸またはヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸誘導体に対する突然変異体の反応性の向上、例えば比活性（反応したカルボン酸のｎｍｏｌ／分／Ｐ４５０酵素のｎｍｏｌとして表される）および／または例えばＫｃａｔ、ＫｍおよびＫｃａｔ／Ｋｍから選ばれる少なくとも１つの速度論的パラメーターの増加、例えば、少なくとも１％、例えば１０〜１０００％、１０〜５００％または１０〜１００％の向上、および／またはｂ）カルボン酸のヒドロキシル化における改変された、特に増加した、位置選択性を意味する。したがって、例えば、少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸またはヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸誘導体における好ましい末端または末端付近（ω−１、ω−２、ω−３、ω−４、特にω−１〜ω−３）のヒドロキシル化位置の移動が生じる。本発明における「改変された基質プロフィール」が認められるヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸またはその誘導体は、８〜３０炭素原子を有する分枝状または好ましくは直鎖状のカルボン酸である。基質プロフィールの本発明の改変は、全長（すなわち、Ｃ８−Ｃ３０）にわたり又は部分的にのみ（例えば、Ｃ８−Ｃ１２−、Ｃ１０−Ｃ１２−、Ｃ１２−Ｃ３０−、Ｃ１２−Ｃ２５−もしくはＣ１２−Ｃ２０カルボン酸またはこれらの部分からの個々のカルボン酸の場合に）現れうる。
【０００６】
本発明においてヒドロキシル化されうるカルボン酸として挙げられうる非限定的な具体例としては、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸およびメリシン酸が挙げられる。適当なカルボン酸誘導体の具体例としては、好ましくは短鎖Ｃ１−Ｃ４−カルボン酸とのＣ１−Ｃ４−アルキルエステル、アミドまたは無水物が挙げられる。
【０００７】
本発明のモノオキシゲナーゼは、好ましくは、酵素クラスＥ．Ｃ．１．１４．−．−からのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特にＰ４５０ファミリーＣＹＰ１０２に由来し、真核生物または原核生物、特に細菌に由来するものである。
【０００８】
突然変異体の特に好ましい一群は、アミノ酸配列領域：２４−２８、４５−５１、７０−７２、７３−８２（ヘリックス５）、８６−８８（ヘリックス６）、１７２−２２４（Ｆ／Ｇループ）および３５２−３５６（βストランド８）の１つにおいて少なくとも１つの機能的突然変異を有する（ただし、該酵素が突然変異Ｆ８７Ａを保持する場合には、これらの領域の２以上が突然変異している）、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来するもの、ならびにこれらの突然変異体の機能的等価物である。
【０００９】
本明細書においては、突然変異はアミノ酸の１文字表記で示されている。突然変異の配列位置を示す番号の前には元のアミノ酸が示されており、該番号の後には修飾アミノ酸が示されている。
【００１０】
本発明の目的における「機能的突然変異」は、前記定義による「改変された反応パターン」または「改変された基質プロフィール」を与える前記配列領域内のアミノ酸の置換を含む。
【００１１】
本発明において特に好ましいのは、少なくとも各場合において、個々に又は組合せて、アミノ酸配列領域８６−８８、１７２−２２４、７３−８２、４５−５１および２４−２８（配列番号２による）における１つの機能的突然変異を含むＰ４５０ＢＭ−３モノオキシゲナーゼ突然変異体（グループ（Ａ））である。
【００１２】
したがって、例えば、Ｐｈｅ８７は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、特にＶａｌまたはＡｌａにより置換されうる。Ｌｅｕ１８８は、アミンまたはアミド側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、または特にＬｙｓ、またはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐなどのアミノ酸により置換されうる。Ａｌａ７４は、脂肪族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばＶａｌおよび特にＧｌｙにより置換されうる。Ａｒｇ４７は、環状側鎖基を有するアミノ酸、例えばＨｉｓ、Ｔｙｒまたは特にＰｈｅにより置換されうる。Ｖａｌ１２６は、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えばＳｅｒまたは特にＴｈｒにより置換されうる。
【００１３】
好ましいグループ（Ａ）突然変異体は、以下のアミノ酸置換パターンの少なくとも１つを示す：
ａ）Ｆ８７Ｖ；
ｂ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ：
ｃ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ；
ｄ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ；
ｅ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ；
ｆ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ；
ｇ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ；
ｈ）Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２６Ｔ；または
ｉ）Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２６Ｔ；
およびそれらの機能的等価物。
【００１４】
適当な突然変異体のもう１つの群であるグループ（Ｂ）は、前記配列領域の１つにおける又は配列領域７０−７２および３５２−３５６の１つにおける単一アミノ酸置換を示す。その２つの最後に挙げた配列領域においては、例えば、Ｓｅｒ７２が、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅおよび特にＧｌｙにより置換されることが可能であり、Ｍｅｔ３５４が、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えばＳｅｒまたは特にＴｈｒにより置換されることが可能である。
【００１５】
特に、グループＢの突然変異体は、以下から選ばれるアミノ酸置換を示す：
ａ）Ｖ２６Ｔ、
ｂ）Ｒ４７Ｆ、
ｃ）Ｓ７２Ｇ、
ｄ）Ａ７４Ｇ、
ｅ）Ｆ８７Ｖ、
ｆ）Ｌ１８８ｚ（ここで、ｚは、Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＳである）、および
ｇ）Ｍ３５４Ｔ；
およびそれらの機能的等価物。
【００１６】
「機能的等価物」は、本発明においては、前記配列位置の少なくとも１つにおいて、特に挙げたもの以外のアミノ酸置換を示すが、特に挙げた突然変異体と同様に、野生型と比較して前記定義による「改変された基質プロフィール」を示す突然変異体を尚も与えるアミノ酸置換を示す突然変異体を意味すると理解されるべきである。機能的等価物は、特に、反応性パターンにおける改変が質的に一致する場合にも存在する。
【００１７】
もちろん、「機能的等価物」は、特に挙げたＰ４５０  ＢＭ３突然変異体と同様に、他の生物由来のＰ４５０酵素を突然変異させることにより得られうるＰ４５０モノオキシゲナーゼ突然変異体をも含む。例えば、相同配列の領域を配列比較により同定することができる。本発明において特に記載している原則に従い、現代の分子モデリング方法は、反応性パターンに影響を及ぼす等価的突然変異が施されるのを可能にする。
【００１８】
「機能的等価物」はまた、１以上の追加的なアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位により得られうる突然変異体を含み、前記の追加的な改変は、それが前記の意味で「改変された基質プロフィール」を有する突然変異体を与える限り、配列のいかなる位置にも存在しうる。
【００１９】
本発明は更に、突然変異モノオキシゲナーゼまたは前記定義による「機能的等価物」をコードする核酸配列に関する。これらの配列は、好ましくは、前記アミノ酸置換パターンに従うコドン交換により、配列番号１から得ることができる。
【００２０】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含む又は特に挙げた配列と比較して特定の起源または宿主生物のコドン使用頻度に従い改変された核酸配列、およびそのような核酸配列の天然に存在する変異体を含む。また、本発明は、遺伝暗号の縮重により（すなわち、対応するアミノ酸配列を改変することなく）または保存的ヌクレオチド置換（すなわち、対応するアミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度を有する別のアミノ酸により置換されること）により得られる核酸配列の誘導体、および「改変された基質プロフィール」を有する本発明のモノオキシゲナーゼをコードする、ヌクレオチドの付加、挿入、逆位または欠失により改変された配列、および対応する相補的配列を含む。
【００２１】
本発明は更に、調節核酸配列の遺伝的制御下で本発明の突然変異体をコードする核酸配列を含む発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターに関する。
【００２２】
好ましくは、本発明の構築物は、コード配列の５’上流のプロモーターおよび３’下流のターミネーター配列を、および必要に応じて、他の通常の調節要素を含み、各場合において、それらは該コード配列に機能的に連結されている。機能的な連結は、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび必要に応じて使用する他の調節要素が、該調節要素のそれぞれが該コード配列の発現に際してその意図される機能を果たしうるように、連続的に配置されていることを意味すると理解されるべきである。機能的に連結されうる配列の具体例としては、ターゲッティング配列、または翻訳エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられる。
【００２３】
人工的調節配列に加えて、天然調節配列が実際の構造遺伝子の上流に尚も存在しうる。また、所望により、この天然調節は遺伝的改変により無効にされることが可能であり、該遺伝子の発現は増強または減弱されうる。しかし、遺伝子構築物は構造的に更に単純でありうる。すなわち、追加的な調節シグナルを構造遺伝子の上流に挿入せず、その調節を行う天然プロモーターを保存する。その代わりに、もはや調節が生じず、遺伝子発現が増強も減弱もされないように、天然調節配列を突然変異させる。核酸配列の１以上のコピーが遺伝子構築物内に存在しうる。
【００２４】
プロモーターの具体例としては、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、ｌ−ＰＲまたはｌ−ＰＬプロモーター（それらは全て、グラム陰性菌において有利に用いられる）；およびグラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨまたは植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチンまたはファゼオリンプロモーターが挙げられる。
【００２５】
原則として、調節配列を有する全ての天然プロモーターを使用することができる。また、合成プロモーターも有利に使用することができる。
【００２６】
前記調節配列は、該核酸配列の指令的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）発現を可能にすると意図される。宿主生物に応じて、これは、例えば、誘導が生じた後に初めて該遺伝子が発現または過剰発現されること、またはそれが直ちに発現および／または過剰発現されることを意味する。
【００２７】
調節配列または因子は、好ましくは、発現に正の効果を及ぼし、このようにして、発現を増加または減少させる。したがって、調節要素の増強は、強力な転写シグナル、例えばプロモーターおよび／または「エンハンサー」を使用することにより転写レベルで有利に生じうる。また、翻訳は、例えば、ｍＲＮＡの安定性を向上させることによっても増強されうる。
【００２８】
発現カセットは、適当なプロモーターを適当なモノオキシゲナーゼヌクレオチド配列とターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルとに融合させることにより得られる。この目的には、例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている通常の組換え及びクローニング技術を用いる。
【００２９】
適当な宿主生物内での発現のためには、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、宿主内での最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的ベクター内に挿入すると有利である。ベクターは当業者によく知られており、例えば、“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に記載されている。ベクターは、プラスミドだけではなく、当業者に公知の他のすべてのベクター、例えばファージ、ウイルス（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルス）、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミドおよび直鎖状または環状ＤＮＡをも意味すると理解されるべきである。これらのベクターは、宿主生物内で自律的に又は染色体内で複製されうる。
【００３０】
本発明のベクターは、例えば本発明の少なくとも１つのベクターで形質転換されて突然変異体の製造に使用されうる組換え微生物の作製を可能にする。本発明の組換え構築物は、適当な宿主系内に有利に導入され発現されうる。対象とする発現系内で前記核酸の発現を引き起こすためには、当業者に公知の通常のクローニングおよびトランスフェクション方法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いることが好ましい。適当な系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７に記載されている。
【００３１】
適当な宿主生物は、原則として、本発明の核酸、それらの対立遺伝子変異体およびそれらの機能的に等価な置換体または誘導体の発現を可能にする全ての生物である。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母または植物もしくは動物細胞を意味すると理解されるべきである。好ましい生物は、細菌、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、真核微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、および動物または植物由来の高等真核細胞、例えばＳｆ９またはＣＨＯ細胞である。
【００３２】
所望により、遺伝子産物の発現はまた、トランスジェニック生物、例えばトランスジェニック動物（例えば、特にマウス、ヒツジ）またはトランスジェニック植物内で引き起こすこともできる。また、トランスジェニック生物は、例えば突然変異または部分的もしくは完全な欠失により対応の内因性遺伝子が除去されたノックアウト動物または植物でもありうる。
【００３３】
うまく形質転換された生物は、同様にベクター内または発現カセット内に含有されるマーカー遺伝子により選択することができる。そのようなマーカー遺伝子の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、および形質転換細胞の着色を引き起こす呈色反応を触媒する酵素の遺伝子が挙げられる。ついでそれらを自動細胞選別により選択することができる。ベクターでうまく形質転換され適当な抗生物質（例えばＧ４１８またはハイグロマイシン）耐性遺伝子を保持する微生物は、抗生物質を含有する適当な液体培地または固形培地により選択することができる。細胞表面上に提示されたマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによる選択に利用することができる。
【００３４】
宿主生物と該生物に適合するベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたはファージ、例えばＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系を伴うプラスミド、ファージλ、μもしくは他のテンペレートファージまたはトランスポゾンおよび／または更に有利な調節配列）との組合せは、発現系を形成する。「発現系」なる語は、例えば、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）と哺乳動物細胞に適したベクター（例えばｐｃＤＮＡ３ｎｅｏベクター）との組合せを意味すると理解されるべきである。
【００３５】
前記のとおり、遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物（例えばマウス、ヒツジ）またはトランスジェニック植物内でも有利に発現されうる。同様に、該核酸由来のＲＮＡで無細胞翻訳系を設計することが可能である。
【００３６】
本発明は更に、モノオキシゲナーゼ産生微生物を培養し、必要に応じてモノオキシゲナーゼの発現を誘導し、モノオキシゲナーゼを培養物から単離する、本発明のモノオキシゲナーゼの製造方法に関する。このようにして、所望により工業的規模においても、本発明のモノオキシゲナーゼを製造することができる。
【００３７】
該微生物は、公知方法により培養し発酵させることができる。例えば細菌は、ＴＢまたはＬＢ培地内で２０〜４０℃の温度および６〜９のｐＨで増殖させることができる。適当な培養条件は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に詳細に記載されている。
【００３８】
モノオキシゲナーゼが培地内に分泌されない場合は、ついで該細胞を溶解し、公知タンパク質単離方法により該ライセートからモノオキシゲナーゼを得る。該細胞は、必要に応じて、高周波超音波により、高圧により（例えばフレンチプレスセル内）、オスモリシス（ｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）により、界面活性剤、溶菌酵素または有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または前記の複数の方法の組合せにより破壊することができる。
【００３９】
モノオキシゲナーゼは、公知のクロマトグラフィー法、例えば分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ−セファロース上でのクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーにより、および他の通常の方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気泳動により精製することができる。適当な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］，Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｎｅｗ  ＹｏｒｋまたはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【００４０】
組換えタンパク質を単離するためには、あるヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを伸長させて、更に簡便な精製の目的で改変されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いることが特に有利である。そのような適当な修飾としては、例えば、アンカーとして作用するタグ、例えばヘキサ−ヒスチジンアンカーとして公知の修飾、または抗体の抗原として認識されうるエピトープが挙げられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されている）。これらのアンカーは、例えば、クロマトグラフィーカラム内に充填されるか又はマイクロタイタープレート上もしくは他の任意の担体上で使用される固相支持体（例えば高分子マトリックス）に該タンパク質を結合させるように機能しうる。
【００４１】
同時に、これらのアンカーは、タンパク質の認識にも利用されうる。タンパク質を認識するためには、更に、通常の標識、例えば蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する酵素標識、または放射能標識を、単独で又は該タンパク質を誘導体化するためのアンカーと組合せて使用することが可能である。
【００４２】
本発明は更に、
ａ１）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する培地の存在下、本発明の組換え微生物を好気的に培養するか又は、
ａ２）少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも１つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する反応媒体を本発明の突然変異体と共に好気的にインキュベートし、
ｂ）得られたヒドロキシル化産物または産物混合物を該培地または媒体から単離することを含んでなる、末端または末端付近（ω−１〜ω−４）でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の酵素的製造のための生化学的製造方法に関する。
【００４３】
カルボン酸は、本発明の方法において、それ自体で又はその誘導体（例えば、特に、Ｃ１−Ｃ４−アルキルエステルまたはカルボキサミド）として使用することができる。
【００４４】
本発明の方法において好ましく使用されるヒドロキシル化されうるカルボン酸は、Ｃ８−Ｃ３０−モノカルボン酸またはその誘導体である。
【００４５】
本発明の方法において特に好ましく使用されるヒドロキシル化されうるカルボン酸は、Ｃ８−Ｃ１２−モノカルボン酸またはその誘導体であり、本発明の方法において特に好ましく使用されるモノオキシゲナーゼは前記グループ（Ａ）の突然変異体である。
【００４６】
本発明のもう１つの方法では、使用するヒドロキシル化されうるカルボン酸がＣ１２−Ｃ３０−モノカルボン酸またはその誘導体であり、モノオキシゲナーゼが単一突然変異体Ｆ８７Ａ、Ｆ８７Ｖ、Ｖ２６Ｔ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４ＧおよびＭ３５４Ｔならびに前記グループ（Ａ）の多重突然変異体ｆ）〜ｉ）から選ばれる突然変異体である。
【００４７】
本発明の酸化反応は、通常は、大気酸素の存在下および電子供与体（または還元当量）、例えば特にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびＺｎ／Ｃｏ（ＩＩＩ）セパルクレートの存在下で行う。Ｚｎ／Ｃｏ（ＩＩＩ）セパルクレートの使用は、例えば、本明細書において明示的に言及するＤＥ−Ａ−１９９  ３５  １１５に記載されている。
【００４８】
本発明のヒドロキシル化を組換え微生物で行う場合には、まず、十分な細胞密度に達するまで、酸素の存在下および複合培地（例えばＴＢまたはＬＢ培地）内で約２０〜４０℃の培養温度および約６〜９のｐＨで、該微生物を培養することが好ましい。必要に応じて外因性基質を加える。より良好に酸化反応を制御するためには、誘導性プロモーター、特に温度誘導性プロモーターを使用することが好ましい。この場合、温度を、要求される誘導温度、例えばＰｒＰ１プロモーターの場合には４２℃まで上昇させ、モノオキシゲナーゼ活性を発現させるために十分な時間（例えば、１〜１０、または５〜６時間）にわたり維持し、ついで温度を約３０〜４０℃まで低下させる。ついで培養を、酸素の存在下、１２時間〜３日間継続する。
【００４９】
一方、純化または濃縮された酵素で本発明の酸化を行う場合には、本発明の酵素突然変異体を、外因性基質（約０．０１〜１０ｍＭ、または０．０５〜５ｍＭ）を含む媒体に溶解し、該反応を、好ましくは酸素の存在下、約１０〜５０℃（例えば３０〜４０℃）の温度および約６〜９のｐＨ（例えば１００〜２００ｍＭリン酸またはトリスバッファーで調節する）で、および還元剤の存在下で行い、その過程中に、該基質含有媒体は更に、酸化される基質に対して約１〜１００倍モル過剰の還元当量を示しうる。必要に応じて、該還元剤は、分割して加えることができる。
【００５０】
必要に応じて、自体公知の方法により、酸素を該反応媒体内に通すことができる。
【００５１】
本発明の方法を、富化または精製された酵素で行う場合には、例えば、以下の反応条件を設定することができる：
基質濃度：０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、
酵素濃度：０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、
反応温度：２０〜４０℃、
ｐＨ：６〜８、
バッファー：０．０５〜０．２Ｍ  リン酸カリウム、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、
電子供与体：好ましくは分割して加える（初期濃度は約０．１〜２ｍｇ／ｍｌ）。
【００５２】
電子供与体を加えることにより該反応を開始する前に、１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度のアセトンを加えプレインキュベート（約２０〜４０℃で１〜５分間）することにより該活性を増加させることが可能である。
【００５３】
当業者はこれらの条件を改変し、問題の反応条件を通常の実験により最適化することが可能である。
【００５４】
改変された酵素特性を有する変異体を得るためのタンパク質工学における２つの異なる方法がある。第１の方法は「論理的設計」法（４）であり、第２の方法は「定方向性進化」法（５−７）である。論理的設計の成功のために極めて重要なのは、酵素メカニズムの詳細な知見および高分解三次元構造モデルである。論理的設計は、非天然基質に対して高い活性を有する酵素突然変異体を与えることが示されているが（４）、該突然変異体の安定性、活性および特異性に対する個々のアミノ酸の点置換の効果は予測できないことが多い。
【００５５】
Ｐ４５０  ＢＭ−３のＸ線構造がタンパク質データベース（８）に登録されている場合であっても、決定的なヒドロキシル化段階の基質とＰ４５０とのコンホメーションは依然として不明である（９−１１）。定方向性進化法に極めて重要なのは、ランダムな突然変異体の大きなライブラリーの迅速なスクリーニングのための効率的な検出方法である。ω−パラ−ニトロフェノキシカルボン酸（ｐＮＣＡ）を使用するＰ４５０  ＢＭ−３突然変異体Ｆ８７Ａに関する光学的試験は有用であることが判明している（１２，１３）。単一突然変異体Ｆ８７Ａは脂肪酸のヒドロキシル化位置をω−１、ω−２およびω−３からω−位に移動させ（１３）、さらに１２−ｐＮＣＡの完全な変換をもたらすが、これに対して、野生型酵素では３３％の変換しか認められない（１２）。しかし、Ｐ４５０  ＢＭ−３のモノオキシゲナーゼドメインは４００以上のアミノ酸を含むため、ランダム突然変異体ライブラリーのスクリーニングは、干し草の山の中から針を捜し出すようなものである。
【００５６】
この探索法の効率を改善するために、改変された反応性を有する突然変異体が得られるよう、特に、中鎖長の脂肪酸に対する特異性を有する突然変異体が得られるよう、論理的設計法を定方向性進化法に従い組合せる。本発明の「論理的進化（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」法は、仮想的ランダムライブラリーを与えるための及び所望の特性に影響を及ぼす可能性が高い残基を同定するためのコンピューター支援タンパク質モデリングに基づく。これらの残基をランダム化することによりサブライブラリーを作製し、陽性突然変異体に関してスクリーニングする。第１工程では、構造モデルから出発して、鎖長特異性に潜在的に重要な残基を決定する。改善された特性を有する突然変異体を得るために、該モデルにより提示された突然変異部位を飽和突然変異原により修飾する。ついで、論理的設計を考慮して、最良の特性を有する個々の突然変異体をお互いに組合せる。この組合せ法の適用は、特に、中鎖長の基質に対するＰ４５０  ＢＭ−３の活性の改善を可能にする。
【００５７】
この方法の適用および種々の起源のＰ４５０酵素に対する配列相同性は、同様に本発明の主題である他の突然変異体を当業者が同様に作製するのを可能にする。
【００５８】
つぎに、以下の実験の記載により及び添付図面を考慮することにより、本発明を例示することとする。
【００５９】
方法１：基質／Ｐ４５０  ＢＭ−３複合体のモデリング
基質／酵素複合体のモデリングは、パルミトレイン酸と複合体形成した結晶学的に決定されたＰ４５０  ＢＭ−３の構造に基づくものであった（９）。この構造はタンパク質データベース（８）に登録されている。記載されている２．９Åの分解能の結晶構造は、非対称単位格子内に４個の分子を含有する。該モデル化複合体の基準として、鎖Ａを選択した。ＳＹＢＹＬ“Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｕｉｌｄｅｒ”（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を用いて、基質分子として８−ｐＮＣＡのモデルを作製した。ＳＹＢＹＬ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｏｏｌを用いて、Ｆ８７Ａ突然変異体を作製した。該基質の炭素原子１−４を、結合したパルミトレイン酸の炭素原子６−９に適合する結合部位内に配置した。脂肪酸鎖のねじれ角は、該立体配置転移（ｔｒａｎｓｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）工程に応じて選択した。Ｐ４５０  ＢＭ−３／ラウレート複合体およびＰ４５０  ＢＭ−３／１２−ブロモラウレート複合体に関するＮＭＲ研究は、該ヒドロキシル化炭素原子（Ｃ１０およびＣ１１）のプロトンが、ＩＩ酸化状態にある（１０，１３）ヘム鉄から約３．０Åの距離に位置していることを示した。この知見の結果として、８−ｐＮＣＡの対応原子Ｃ７およびＣ８を、該ヘム鉄からそれぞれ４Åおよび３．６Åの距離に配置した。パラ−ニトロフェノキシ基は、該結合ポケット内に手動で配置した。また、固定されたバックボーン原子により該複合体のエネルギーを最小にした。
【００６０】
方法２：飽和突然変異誘発
本発明で使用する突然変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用する飽和突然変異誘発により作製した。Ｐ４５０  ＢＭ−３モデリングを介した突然変異のために、基質結合チャンネルの近傍の９個の位置、すなわちＰ２５、Ｖ２６、Ｒ４７、Ｙ５１、Ｓ７２、Ａ７４、Ｆ８７、Ｌ１８８およびＭ３５４を選択した。これらの位置のそれぞれのプライマーを表１に列挙する。
【００６１】
【表１】
0004824887.tif 000002
0004824887.tif 000003
【００６２】
反応条件は、すべての突然変異誘発ＰＣＲ法に関して同一であった。ただし、アニーリング温度は以下のとおりに変化させた：２５、２６、１８８および３５４位には５０℃；４７および５１位には５２℃；ならびに７２、７４および８７位には４６℃。反応は５０μｌの反応容積中で行い、各バッチは、１７．５ｐｍｏｌの各プライマー、２０ｐｍｏｌの鋳型プラスミドＤＮＡ、３ＵのＰｆｕポリメラーゼおよび３．２５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰを含有していた。反応は９５℃、４分で開始し、ついでバッチを以下の加熱サイクルに付した：９５℃、１分；４６〜５２℃、２．５分；７２℃、１７分の２０サイクル。これらの２０サイクルの後、該反応を７２℃で１５分間継続した。部位特異的突然変異誘発をＰＣＲにより行うため、１つのアミノ酸を置換するために個々のコドンを改変した。特定のアミノ酸をランダム化するために、「ｎｎｎ」がその特定のアミノ酸をコードするプライマーを使用した。すべてのＰＣＲ産物溶液を、２０Ｕ  ＤｐｎＩで３７℃で３時間処理して、元の未突然変異鋳型ＤＮＡを消化した。ついで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内への形質転換を行った。
【００６３】
方法３：野生型酵素および突然変異体の発現および精製
Ｐ４５０  ＢＭ−３野生型遺伝子およびその突然変異体を、強力な温度誘導性ＰＲＰＬプロモーターｐＣＹＴＥＸＰ１の制御下、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４，ｌａｃＵ１６９［８０ｌａｃＺ  Ｍ１５］  ｈｓｄＲ１７  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｒｅｌＡ１）内で発現させた。単点突然変異Ｆ８７Ａを先行技術（１２）に従い導入した。該形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。該コロニーを１２〜２４時間培養した後、それらを無菌爪楊枝で拾い上げ、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンと共に２００μｌのＴＢ培地（１２ｇのトリプトファン、２４ｇの酵母エキス、４ｍｌのグリセロール、１リットルまでの（蒸留）Ｈ２Ｏ）を各ウェルが含有する９６ウェルマイクロタイタープレート内に入れた。該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。ついで４０μｌを各ウェルから取り出し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンと共に２ｍｌのＴＢ培地を含有する培養チューブ内に移し、ついで該バッチを３７℃で２時間、ついで４２℃で６時間インキュベートした。該細胞を４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により取り出し、ニワトリアルブミンリゾチーム（１Ｕ／ｍｌ）で処理し、ついで２回、凍結し除氷した。１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により粗細胞抽出物を得た。得られた上清中の該活性を測定した。大量の酵素を得るために、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンと共に３００ｍｌのＴＢ培地を含む２−ｌ振とうフラスコを使用し、３７℃でインキュベートし、２００ｒｐｍで２時間振とうし（ＯＤ５７８ｎｍ＝０．８〜１．０）、ついで４２℃で６時間インキュベートした。該細胞を４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により集め、１５ｍｌの０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁させた。該氷冷懸濁液をＢｒａｎｓｏｎ超音波処理装置Ｗ２５（Ｄｉｅｔｚｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（８０Ｗ、２分間、３サイクル）により破砕した。該懸濁液を３２５７０×ｇで２０分間遠心分離した。酵素活性の測定または酵素精製のために、該粗抽出物を使用した。
【００６４】
酵素精製は、ＢｉｏＰｉｌｏｔクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する以外は（１４）に記載のとおりに行った。全タンパク質および酵素の量を測定することにより、酵素純度を測定した。波長の組合せ４５０ｎｍおよび４９０ｎｍに関する９１ｍＭ−１ｃｍ−１の分子吸光率を用いて、鉄（ＩＩ）形態と鉄（ＩＩ）形態のカルボニル複合体との吸光スペクトルの差から、精製された酵素の濃度を求めた。
【００６５】
方法４：より短い鎖長の基質に対して、より高い活性を有する突然変異体の単離
上記野生型の代わりに、Ｐ４５０  ＢＭ−３突然変異体Ｆ８７Ａを鋳型ＤＮＡとして使用した。問題の位置の突然変異を前記のとおりに作製した。各事例において、各位置における該配列領域をスクリーニングするために約１００個のコロニーを拾い、培養チューブ内で増殖させ、細胞をチューブから取り出し、細胞溶解した。選択した各コロニーからの粗細胞抽出物を活性試験に使用した。１５−ｐＮＣＡより短い鎖長を有する少なくとも１つの基質に対してＦ８７Ａより高い活性を示す全ての突然変異体を配列決定して、その突然変異を同定した。
【００６６】
同じ位置の全ての突然変異体のうち、それぞれ１２−ｐＮＣＡ、１０−ｐＮＣＡまたは８−ｐＮＣＡに対して、最も高い活性を有する突然変異体を、続いて行う他の突然変異との組合せのために選択した。組合せた突然変異を、部位特異的突然変異誘発法により段階的に施した。その組合せ法を図１に示す。基質特異性を測定するために、各組合せ工程から６個のコロニーを単離した。典型的な基質特異性を有するコロニーを選択し、その純粋な酵素に対する基質特異性を測定した。選択したコロニーのプラスミドを、部位特異的突然変異誘発法の次工程で使用した。最終突然変異体内の突然変異をＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ＢｉｇＤｙｅ（商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）により同定した。
【００６７】
方法５：酵素活性アッセイ
ｐＮＣＡ活性アッセイでは、使い捨てセル中のＤＭＳＯ中１０ｍＭ  ｐＮＣＡ溶液８μｌ（最終容積１ｍｌ）を使用した。８５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ８．２）および０．１〜０．４ｎｍｏｌのＰ４５０を問題のｐＮＣＡ／ＤＭＳＯ溶液に加えた後、該サンプルを５分間プレインキュベートし、ついで５０μｌの１ｍＮ  ＮＡＤＰＨ水溶液を加えることにより反応を開始させた。ＫｃａｔおよびＫｍを求めるために、種々のｐＮＣＡ基質について一連の濃度系列を確立した（検出方法の詳細に関しては、（１２）を参照されたい）。
【００６８】
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マイクロタイタープレート中でｐＮＣＡ試験を行った。Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ８．２）中の２５０μｌの全反応容積中、反応バッチは６０ｎｍｏｌの８−ｐＮＣＡ、１５ｎｍｏｌの１０−ｐＮＣＡ、１５ｎｍｏｌの１２−ｐＮＣＡまたは１５ｎｍｏｌの１５−ｐＮＣＡ（各場合において２．５μｌのＤＭＳＯに溶解されている）を含有していた。サンプルを４０μｌのＰ４５０  ＢＭ−３サンプルと共に５分間プレインキュベートした後、３０μｌの１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ溶液を各ウェル内に注入することにより反応を開始させた。ＮＡＤＰＨ溶液を加えた直後に、プレートを、プレートリーダーにおいて４０５ｎｍで測定した。
【００６９】
方法６：本発明の突然変異体を使用するカルボン酸の変換およびその産物の同定
ａ）化学反応
Ｐ４５０  ＢＭ−３またはその突然変異体の存在下で脂肪酸をヒドロキシル化するために、以下のバッチを選択した。
Ｐ４５０  ＢＭ−３突然変異体：２０ｍｇ
反応バッファー：              ２０ｍｌ
（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＫＣｌ  ２５０ｍＭ、ｐＨ７．８）
脂肪酸：                      １０ｍｇ
アセトン：                    ４００μｌ（２％  ｖ／ｖ）
（反応を２倍加速する）。
【００７０】
反応を行う前に、酵素凍結乾燥物を１ｍｌの反応バッファーに溶解し、まず、３６℃で３０分間インキュベートした。２％  ｖ／ｖ  アセトンの添加と同様、インキュベーションによって、活性がそれぞれ６０および７５％増大する。
【００７１】
５分間のインキュベーションの後、５００μｌの既に調製されたＮＡＤＰＨ溶液（１２．５ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この反応の経過を３４０ｎｍでの吸光度測定によりモニターし、ＮＡＤＰＨの消費を観察することができる。理論的には、化学量論的変換には４ｍｌのＮＡＤＰＨ溶液が必要と考えられるが、該反応溶液中の過度に高いＮＡＤＰＨ濃度によって、酵素の不活性化が引き起こされる。このため、補因子を５００μｌずつ加える。
【００７２】
上記反応が終了した後、該溶液を５Ｍ  塩酸でｐＨ２に酸性化した。脂肪酸またはヒドロキシル化脂肪酸はこの間に沈殿し、溶液の曇りが認められるようになる。ついでこの混合物を各事例で１０ｍｌのジクロロメタンで２回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。折り重ねたフィルターで濾過した後、該ジクロロメタンをロータリーエバポレーター上で又は窒素と共に蒸発させることにより除去した。残存した白色固体を２ｍｌのジクロロメタン中に取り、ＧＣ分析で使用した。
【００７３】
ｂ）ガスクロマトグラフィーによる分析
ＦＩＤを備えたＦｉｓｏｎｓガスクロマトグラフ（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｅｇａ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を分析に使用した（Ｏｐｔｉｍａ  ５−カラム、内径２５ｍ×０．２５ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００７４】
分析のために、出発物質および産物をＭＳＨＦＢＡでシリル化した。この間、すべてのヒドロキシル基および酸性基が、それぞれ対応するトリメチルシリルエーテルおよびエステルに変換される。このサンプルは無水であることに注意しなければならない。なぜなら、そうでなければシリル化剤との副反応が生じるからである。１５μｌのＭＳＨＦＢＡを１０μｌの該ヒドロキシ脂肪酸含有ジクロロメタン溶液中にピペッティングし、この混合物を室温で１５分間インキュベートした。２５μｌのジクロロメタンを加えた後、ＧＣ分析を行った。
【００７５】
このために、１μｌの上記シリル化サンプルを上記ガスクロマトグラフ内に注入した。インジェクターおよび検出器の温度は３５０℃であった。以下の温度プログラムを用いた：
0004824887.tif 000004
【００７６】
実施例１：出発突然変異体の選択
Ｐ４５０  ＢＭ−３単一突然変異体Ｆ８７Ａを出発鋳型として使用した。前記のとおり、この突然変異は、飽和Ｃ１２−およびＣ１４−脂肪酸におけるω−１、ω−２およびω−３のヒドロキシル化位置をω−位に変化させる（１３）。１２−ｐＮＣＡおよび１５−ｐＮＣＡの変換に関しては、野生型の場合と比べてω−ヒドロキシル化が有意に増大することも示された（１２）。１２−ｐＮＣＡのω−ヒドロキシル化に関しては、該野生型の場合には３３％の変換であるのに対して、完全な変換が得られた。位置選択性の増加に加えて、１２−ｐＮＣＡおよび１５−ｐＮＣＡに対する活性の増加も認められた（表２で比較されたい）。
【００７７】
【表２】
種々の鎖長を有する種々のｐＮＣＡ誘導体に対する選択されたＰ４５０  ＢＭ−３突然変異体の比活性１
0004824887.tif 000005
【００７８】
Ｆ８７Ａの位置選択性の増加は、構造モデルを参照して理解しうる。嵩高い残基Ｆ８７をアラニンで置換すると、Ｆ８７により並びにＶ７８、Ａ８２、Ｔ２６０、Ｉ２６３およびＡ２６４により形成される、ｐ−ニトロフェノキシ基に対する結合ポケットが拡大する。また、その大きなｐ−ニトロフェノキシ基が該結合ポケットに接近するのが容易になり、Ｆ８７とｐＮＣＡの炭素原子ω−２およびω−１との間の立体相互作用が排除される。これは、ヘム鉄原子に対するω位の、より有利な配向を可能にする。
【００７９】
実施例２：モデリングによる個々の突然変異位置の選択、選択した位置の部位特異的ランダム化突然変異誘発およびスクリーニング
１．突然変異位置の選択
結合Ｃ８−ｐＮＣＡ基質のモデルは、カルボキシレートが該カルボキシレート結合残基Ｒ４７およびＹ５１からそれぞれ９および１１Åの距離に位置することを示している。Ｃ８基質に対する活性を誘導するには、該基質のカルボキシレート基から適当な距離に位置する新たな結合部位を生成させる必要がある。８−ｐＮＣＡの結合を促進するには、追加する残基は該結合部位内に配置すべきである。元のカルボキシレート結合部位を形成する残基Ｒ４７およびＹ５１を選択した。Ｒ４７に関しては、そのグアニジニウム基と該基質のカルボキシレート残基との間でイオン対を形成することが提示されている。Ｙ５１は、基質のカルボキシレート基と水素結合を形成する（９）。パルミトレイン酸／Ｐ４５０  ＢＭ−３複合体においては、Ｒ４７のＣα原子と該脂肪酸カルボキシレート基のＣ原子との間の距離は１２Åである。８−ｐＮＣＡモデルのカルボキシレート基の周囲の半径１２Åの半球内の全ての残基を同定し、脂肪酸のカルボキシレート基の方向に向いている側鎖を有するものだけを該結合ポケット内で選択した。このようにして、Ｐ２５、Ｖ２６、Ｓ７２、Ａ７４、Ｌ１８８およびＭ３５４を選択した。これらは、おそらく、短鎖ｐＮＣＡ化合物に対する新たなカルボキシレート結合部位を形成しうるであろう。選択したこれらの６個の残基は、柔軟なコンホメーションで二次構造要素上に位置する（１１）。
【００８０】
２．突然変異およびスクリーニング
選択した８個の残基のそれぞれの突然変異体を、問題の位置における野生型コドンの部位特異的ランダム化により作製した。１９の可能なアミノ酸種のほとんどが試験されることを保証するために、各位置の１００個のコロニーを単離し、培養し、活性に関して試験した（したがって、各アミノ酸が試験される確率は、トリプトファンおよびメチオニンの場合に７９％の確率になることを除き、９５％を超える）。１５−ｐＮＣＡより短い鎖長を有する少なくとも１つの基質に対してより高い活性値を有する突然変異体を、該突然変異の同定のために選択して配列決定した。
【００８１】
１８８位は比較的に可変性であることが明らかになった。上記１００個のコロニーのほとんどはｐＮＣＡに対する活性を示した。これらから、８−ｐＮＣＡに対するそれらの活性に基づき３７個のコロニーを選択した。野生型を含めて１６の異なるアミノ酸型が検出された。この結果は更に、可能性のある２０のアミノ酸のほとんどが試験されることを保証するためには１００個のコロニーの選択で十分であることを証明した。１５の置換のうち、置換Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、ＡおよびＳは、より短い鎖長の基質に対する触媒活性を有意に増大させた。負に荷電したアミノ酸によるＬの置換によって、１０−ｐＮＣＡ、１２−ｐＮＣＡおよび１５−ｐＮＣＡに対する活性が３〜７倍減少した。
【００８２】
残りの７個の位置を、１８８位と同様にランダム化した。突然変異を検出するためのＤＮＡ配列決定のために、各位置から７〜１９個のコロニーを選択した。これらの遺伝子のほとんどは突然変異していないか、または該遺伝子産物は、より短い鎖長の基質に対する活性の減少を示した（この試験は純粋な酵素で行った）。各場合において、１５−ｐＮＣＡと比較して、より短い鎖長の基質に対して、より高い活性を示したのは、２６、４７、７４および３５４位の突然変異体では僅か１個、７２位の突然変異体では２個、そしてＰ２５およびＹ５１位の突然変異体では０個であった。８−ｐＮＣＡに対して最大活性を有する１８８位および７２位における突然変異体、ならびに２６、４７、７４および３５４位の単一突然変異体を、組合せのために選択した。前記表２に列挙されているこれらの突然変異は、以下の置換を含有する：Ｖ２６Ｔ、Ｒ４７Ｆ、Ｓ７２Ｇ、Ａ７４Ｇ、Ｌ１８８ＫおよびＭ３５４Ｔ。Ｆ８７Ａと比較して、８−ｐＮＣＡに対する比活性は、０．５〜３３．５倍増大した。これらの突然変異のそれぞれを、元の突然変異Ｆ８７Ａと段階的に組合せた。
【００８３】
実施例３：突然変異体の段階的組合せにより作製された多重突然変異体およびそれらのスクリーニング
１．突然変異体Ｌ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ）
単一突然変異体の組合せは個々の効果の累積を必ずしも与えないため、最初の突然変異体の選択は決定的に重要である。最初の突然変異の誤った選択は、最適な多重突然変異をもたらさない進化経路につながりうる。単一突然変異体の大きな出発プールの場合、莫大な組合せ多様性が考えられ、その結果、所望の多重突然変異体が見出されることはありそうもない。
【００８４】
以下の２つの基準が出発物質としての突然変異体Ｌの選択を促進する。すなわち、他の全ての突然変異体と比較した場合の８−ｐＮＣＡに対するその活性の増加（表２）、および、酵素／基質相互作用および該結合部位の特性における変化である。これらの変化を確認するために、ＳＹＢＹＬ法により該突然変異位置の側鎖を置換することにより、選択した突然変異体の構造モデルを作製した。Ｌ１８８は、αヘリックスＦのＣ末端上に位置する。このヘリックスおよび近傍のＧヘリックスは、基質結合により最大のシフトを受ける（９）。このモデルは、ロイシンからリシンへの置換が新たな推定カルボキシレート結合部位の形成を招くことを示している。Ｋ１８８のアミノ基と８−ｐＮＣＡのカルボキシレート残基との間の距離は６Åであり、したがって実験的に値が測定されているパルミトレイン酸のカルボキシレート基とＲ４７のグアニジニウム基（元の結合残基）との距離に匹敵する。Ｒ４７のグアニジニウム基と８−ｐＮＣＡのカルボキシレート基との間の距離は１１．４Åである。したがって、該ヒドロキシル化Ｃ８原子ならびにＫ１８８および該基質のカルボキシレート基の間のイオン対反応はヘム鉄原子への反応し易い距離において起こると提示されうる。
【００８５】
残りの５つの突然変異体を、部位特異的突然変異誘発による突然変異体Ｌと段階的に組合せた（図１で比較されたい）。選択した突然変異体の構造モデルを各突然変異誘発工程について作製した。基質結合に対する作製した突然変異体の効果をこのモデルに関して調べ、これに基づき、該突然変異体およびそれらの組合せの最適化された特性に対する論理的説明を提示した。
【００８６】
２．突然変異体ＬＡ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ）
８−ｐＮＣＡに対する触媒効率は、突然変異Ａ７４Ｇを突然変異体Ｌ内に導入することにより増加した。Ａ７４はα−ヘリックスＢ’のＮ末端に位置する。Ａ７４の側鎖はＫ１８８のアミノ基と立体的に相互作用するため、この相互作用は、Ａ７４をグリシンで置換することにより排除される。したがって、該基質のカルボキシレート基に対する、該側鎖のより有利な配向を可能にする。
【００８７】
３．突然変異体ＬＡＲ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ）
８−ｐＮＣＡに対する触媒効率は、追加的な突然変異Ｒ４７Ｆを導入することにより成功裏のうちに改善された。突然変異Ｒ４７Ｆは、考えられうる２つの効果を有していた。フェニルアラニンは元のカルボキシレートの結合を妨げる。そして、残基Ｆ１１、Ｌ１４、Ｌ１７、Ｐ１８、Ｐ４５およびＡ１９１により形成される結合チャンネルの入り口にある疎水性部分（これは溶媒にさらされる）を拡大する。この疎水性部分は、該基質に対する結合に特に重要である（１１）。
【００８８】
４．突然変異体ＬＡＲＶ（Ｆ８７Ａ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２６Ｔ）
突然変異Ｍ３５４Ｔを突然変異体ＬＡＲに加えると、８−ｐＮＣＡに対するＫｃａｔ値が減少する。したがって、更なる組合せ実験にはＭ３５４Ｔを加えなかった。しかし、突然変異Ｖ２６Ｔを突然変異体ＬＡＲに加えると、得られる突然変異体ＬＡＲＶはＬＡＲより若干高いＫｃａｔ値および若干低いＫｍ値を示す。８−ｐＮＣＡに対する触媒効率は増加した。代わりに突然変異Ｓ７２Ｇを突然変異体ＬＡＲに施すと、８−ｐＮＣＡのＫｃａｔ値は減少した。このため、突然変異体ＬＡＲＶを更なる突然変異のために選択した。
【００８９】
Ｖ２６はαヘリックスＡのＮ末端に位置する。モデルは、Ｔ２６が結合部位の元の残基Ｙ５１の役割を果たしうること、および水素結合の形成により該基質のカルボキシレート基を安定化しうることを示唆している。Ｔ２６のヒドロキシル基とＫ１８８のアミノ基との間の距離は６．９Åである。元の結合部位と比較して、この距離は約２Å長い（Ｙ５１のヒドロキシル基とＲ４７のグアニジニウム基との間の距離は４．８Å）。したがって、Ｋ１８８含有Ｆヘリックスを更なるコンホメーション改変に付し、それにより、８−ｐＮＣＡは、より深い結合領域内位置に保持され、Ｔ２６とＫ１８８との間の距離は減少する。
【００９０】
５．突然変異体ＬＡＲＶＦ（Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ、Ａ７４Ｇ、Ｒ４７Ｆ、Ｖ２６Ｔ）
８７位は該酵素の触媒活性および基質特異性に特に重要である可能性があった（３，１３）。このため、部位特異的ランダム化突然変異誘発により８７位において突然変異体ＬＡＲＶを最適化した。１００個のコロニーのうち、８−ｐＮＣＡに対して３．５＊１０４ｓ−１Ｍ−１の触媒効率を示す１個の突然変異体を得た。そのＤＮＡ配列データは、８７位のアラニンがバリンにより置換されていることを示した。
【００９１】
ヘム鉄への基質の接近にはＲ８７が重要であることが、結晶構造（１１）およびより初期の実験（３，１３）から公知である。この物質の嵩高いパラ−ニトロフェニル基は、フェニルアラニンをアラニンで置換することにより該結合部位のサイズを増加させることを必要にする。Ａ８７をバリンで置換することにより、エーテル酸素とＶ８７側鎖との間の立体的相互作用により、Ｃωとヘム鉄原子との接触が改善される。
【００９２】
これらのデータは、２つの鍵となる工程（Ｆ８７ＡからＬ、およびＬＡＲＶからＬＡＲＶＦ）が８−ｐＮＣＡに対する触媒効率を増加させることを示している。これは、突然変異体ＬＡＲＶＦにおけるその他の突然変異が、８−ｐＮＣＡに対する活性を喪失することなく復元しうるか否かに関する問題を提起した。そこで、突然変異Ｆ８７Ａの代わりに突然変異Ｆ８７Ｖを含有する突然変異体を作製した。これらの突然変異体は以下の名称を有する：
１．）突然変異Ｆ８７Ｖ  Ｌ１８８Ｋを有するＬ７Ｖ、
２．）突然変異Ｆ８７Ｖ  Ｌ１８８Ｋ  Ａ７４Ｇを有するＡＬ７Ｖ、
３．）突然変異Ｆ８７Ｖ  Ｌ１８８Ｋ  Ａ７４Ｇ  Ｒ４７Ｆを有するＡＲＬ７Ｖ。
【００９３】
活性アッセイにおいては以下の結果が得られた。
【００９４】
【表３】
ｐＨ８．０および２５℃で測定された種々の鎖長を有するｐＮＣＡ誘導体に対するＰ４５０  ＢＭ−３突然変異体の速度論的パラメーター
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【００９５】
これらの結果は、突然変異体Ｆ８７ＶおよびＬ７Ｖが基質８−ｐＮＣＡに対しては測定可能な変換を示さないことを示している。この結果は更に、４重突然変異体ＡＲＬ７Ｖが、５重突然変異体ＡＲＶＬＦより一層良好な触媒効率を示すことを示している。
【００９６】
さらに、突然変異体ＡＲＬ７ＶおよびＡＲＶＬＦは、野生型酵素の最も短い天然脂肪酸基質より２炭素原子短いカプリン酸（Ｃ１０）に対して高い活性を示す。さらに、ラウリン酸（Ｃ１２）を基質として使用した場合には、ω−４−モノヒドロキシル化産物が認められ、一方、Ｐ４５０  ＢＭ−３の野生型酵素はω−１、ω−２およびω−３位においてのみ活性である。
【００９７】
実施例４：種々の鎖長を有するカルボン酸および種々の突然変異体に関する好ましいヒドロキシル化位置の決定、および野生型酵素との比較
反応バッチを、前記方法（６）に従い後処理し分析した。
【００９８】
その結果を以下の表４に列挙する。
【表４】
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【００９９】
ラウリン酸のヒドロキシル化において認められるのは、位置選択性の変化が、まず、野生型からＰ４５０  ＢＭ−３  Ｆ８７Ｖへの変化中に生じ、それがω−３ヒドロキシル化を優先的に触媒する（これはＰ４５０  ＢＭ−３  Ｌ７Ｖの場合と同様である）ということである。３重突然変異体への変化中に、その位置選択性が再び変化し、Ｐ４５０  ＢＭ−３  ＡＬ７Ｖ、Ｐ４５０  ＢＭ−３  ＡＲＬ７ＶおよびＰ４５０  ＢＭ−３  ＡＲＶＬＦはヒドロキシル化をω−２位に優先的に導く。
【０１００】
すべてのＧＣ分析は、カプリン酸がＰ４５０  ＢＭ−３  ＡＲＶＬＦおよびＰ４５０  ＢＭ３  ＡＲＬ７Ｖによってのみ変換され、一方、その他の突然変異体においては１％未満の変換しか見出せないことを示している。両方の酵素は実質的に同じ位置選択性を示し、ω−１位が好ましい。
【０１０１】
反応収率を測定するために、基準物質のガスクロマトグラムを記録した。用いた出発物質の基準物質は、溶媒としてジクロロメタンを使用するカプリン酸またはラウリン酸溶液（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）であった。ＦＩＤ検出法により、出発物質および生成物のピーク面積を互いに単純に比較することは可能ではなかった。なぜなら、異なる構造式および実験式を有する分子は、燃焼に際して異なるイオンフラックスを生成するからである。これらのイオンフラックスは、出発物質と生成物との量比に比例しない。そこで、用いた生成物の基準物質は、商業的に入手可能な１０−ヒドロキシカプリン酸または１２−ラウリン酸であった。該基準物質および該生成物の実験式は同一であり、その構造はヒドロキシル基の位置に関して異なるにすぎず、このため、同一量に関してほぼ同一の検出可能なイオンフラックスが推定されうる。
【０１０２】
Ｐ４５０  ＢＭ−３  ＡＲＶＬＦおよびＰ４５０  ＢＭ−３ＡＲＬ７Ｖ触媒でのカプリン酸のヒドロキシル化においては、累積生成物収率はそれぞれ５７％および３８％であった。ラウリン酸のヒドロキシル化においては、収率はＰ４５０  ＢＭ−３  ＡＲＶＬＦ触媒では５１％、他の全ての突然変異体および野生型では３８％〜４０％であった。
【０１０３】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  新規基質８−ｐＮＣＡに対するＰ４５０  ＢＭ−３の段階的最適化。各突然変異体について、８−ｐＮＣＡに対する触媒効率が示される（単位はＳ−１Ｍ−１）。
【図２】  Ｐ４５０  ＢＭ−３−突然変異体ＬＡＲＶＦと基質８−ｐＮＣＡとの複合体のモデル。突然変異のための５つの最良の位置を示し、突然変異体ＬＡＲＶＦを与えるように組合された側鎖が示されている（Ｖ２６Ｔ、Ｒ４７Ｆ、Ａ７４Ｇ、Ｆ８７Ｖ、Ｌ１８８Ｋ）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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