(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳量増大機能を有する配列表の配列番号：１で表わされる塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡと、植物の細胞で複製可能なベクター部分とを有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡと、プロモーターと、構造遺伝子と、植物の細胞で複製可能なベクター部分とを有し、請求項１に記載のＤＮＡが、プロモーター及び構造遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする組換えベクター。
【請求項４】
前記プロモーターが、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである請求項３記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組換えベクターによって形質転換されたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項６】
形質転換植物が植物細胞、植物組織、植物器官又は植物体である請求項５に記載の形質転換植物。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換植物体から得られたことを特徴とする種子。
【請求項８】
請求項３または４に記載の組換えベクターを植物に導入することによって該組換えベクターに含まれる構造遺伝子の発現を該植物内で増強することを特徴とする発現増強方法。
【請求項９】
請求項５に記載の形質転換植物に由来することを特徴とする植物体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の任意の構造遺伝子の発現量を増大させる効果を持つＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで生物を利用した有用物質の生産は、アルコール発酵や二次代謝物質生産に代表されるような微生物や植物培養細胞の高生産能株の選抜、交配・選抜による高生産植物の育種、培養条件の最適化などの方法を駆使することにより効率化されてきた。
【０００３】
１９７０年代に入り遺伝子組換え技術が確立され、外来遺伝子の導入やその高発現システムが導入可能となったことにより、微生物においては異種生物の遺伝子を導入した新規物質生産も併せて実用化されてきた。植物においては、アグロバクテリウム法（Weising, K. et al., Annu. Rev. Genet., 22, 421-477 (1988)）、エレクトロポレーション法（Toriyama, K. et al., Bio/Tec., 6, 1072-1074 (1988)）、パーティクルボンバードメント法（Klein, T. M. et al., Nature, 327, 70-73 (1987)）などの外来遺伝子導入技術が確立され、また、その発現システムの構築により、植物を用いた有用物質生産の試みや植物形質の改変が盛んに行われるようになってきている。例えば、ヒト血清アルブミン（Sijimons, P. C. et al., Bio/Tec., 8, 217-221 (1990)）、モノクローナル抗体（Benvenuto, E. et al., Plant Mol. Biol., 17, 865-874 (1991)）、殺虫タンパク質であるBt toxin（Kota, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1840-1845 (1999)）、生分解性プラスチックの原料であるPHB(V)（Slater, S. et al., Nature Biotechnol., 17, 333-338 (1999)）等が生産できることが報告されている。
【０００４】
植物での遺伝子発現は、他の生物同様に転写・転写後・翻訳・翻訳後の4つの段階を経て行われ、基本的には転写レベルで制御されることが多い。転写は、プロモーターを含む5'上流領域で調節されるが、転写制御にとって重要な領域は、通常さらに上流に位置し、この領域はシスエレメントと呼ばれている。このシスエレメントに特異的タンパク質が結合することにより、種々のプロモーター活性が制御され、器官及び時期特異的な遺伝子発現が行われている。従って、導入有用遺伝子を構成的にもしくは器官及び時期特異的に高いレベルで発現させようとすれば、強力な転写活性を持つプロモーター又はシスエレメントの制御下に目的遺伝子を置くことが適当な方法と考えられ、盛んに研究が行われている。
【０００５】
現在までに、植物細胞において強力な転写活性を持つものとしてよく用いられているものに、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）35Sプロモーター（Benfey, P. et al., Science, 250, 959-966 (1990)）が挙げられる。この他に植物本来のプロモーターを用いた報告も多くある（Foster, et al., Plant Mol. Biol., 41, 45-55 (1999), Nagaya, S. et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000)）。また、転写活性を高めるエンハンサーも開発されている（Hayashi,H. et al., Science, 258, 1350-1353 (1992))。しかしながら、既存のプロモーターの転写活性をさらに高めることには限界がある。また、植物では、サイレンシングやＤＮＡのメチル化などにより核染色体へ導入された遺伝子が安定に発現しない現象が報告されている（Vaucheret, H. et al., Plant J., 16, 651-659 (1998)）。このサイレンシングの原因の一つに転写されたＲＮＡの絶対量が挙げられる。ある種のＲＮＡ量が多すぎるとそのＲＮＡの安定性が極端に悪くなると考えられている。
【０００６】
これらのことから、導入遺伝子産物であるタンパク質もしくはペプチドをより大量に得ようとするには、高転写活性であることに加え、遺伝子の発現を転写後レベルで高め、転写物を有効に利用することが重要と考えられる。最近の知見として、酵母や動物では、転写物の安定性を高めるＳＴＥ配列（Ruiz-Echevarrfa, M. J. et al., Cell, 101, 741-751 (2000)）や翻訳レベルを上昇させる効果を持つタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のΩ配列（Gallie, D. et al., Mol. Gen. Genet., 228, 258-264 (1991), Mitsuhara, I. et al., Plant Cell Physiol., 37, 49-59 (1996)）などが報告されている。しかしながらこれらの例は必ずしも汎用性が高いとは言えず、また転写物の安定性を高める効果のある配列が植物から単離された例はこれまであまり知られていない。本発明者はこれまでに、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコーディング領域の20塩基及び5'-非翻訳領域（5'-UTR）40塩基の領域との両方を含む領域が、下流につないだ遺伝子の発現量を転写後レベルで高めることを見出している（Nagaya, S. et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000)）。しかしながら、5'-UTRのみでそのような効果があるのか、5'-UTR全長ではどのような効果があるか、またアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターと併用した場合にどのような効果が期待されるかについては全く知られていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物細胞における遺伝子の発現過程における翻訳後に得られる蛋白質量を増大させることができる遺伝子の高発現能を有する5'-非翻訳領域配列を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するため、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の全長の5'-UTRを単離し、該配列を用いてタバコ培養細胞を用いて、レポーター遺伝子の一過性発現解析を行った。該配列が双子葉植物及び単子葉植物において翻訳を増大させる機能を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、以下の（１）〜（１１）に記載のとおりである。
（１）  翻訳量増大機能を有する配列表の配列番号：１で表わされる塩基配列からなることを特徴とするDNA。
（２）  配列表の配列番号：１で表わされる塩基配列に対して、該塩基配列の翻訳量増大機能を損なわない範囲内で、その１もしくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなることを特徴とするDNA。
（３）  配列表の配列番号：１の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該塩基配列の翻訳量増大機能を保持することを特徴とするDNA。
（４）  上記１〜３項のいずれか一項に記載のDNAと、植物の細胞で複製可能なベクター部分とを有することを特徴とする組換えベクター。
（５）  上記１〜３項のいずれか一項に記載のDNAが、プロモーター及び構造遺伝子の間に挿入されている請求項４に記載の組換えベクター。
（６）  前記プロモーターが、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである上記５項に記載の組換えベクター。
（７）  上記５または６項に記載の組換えベクターによって形質転換されたことを特徴とする形質転換植物。
（８）  形質転換植物が植物細胞、植物組織、植物器官又は植物体である上記７項に記載の形質転換植物。
（９）  上記８項に記載の形質転換植物体から得られたことを特徴とする種子。
（1０）  上記５または６項の組換えベクターを植物に導入することによって該組換えベクターに含まれる構造遺伝子の発現を該植物内で増強することを特徴とする発現増強方法。
（1１）  上記７項に記載の形質転換植物に由来することを特徴とする植物体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明において遺伝子の高発現能を有するDNAとは、構造遺伝子の発現系に共存した際に、この構造遺伝子にコードされた情報が、転写、翻訳されて蛋白質が形成される際に、この翻訳により形成された蛋白質量を増大させる機能を有するものである。この翻訳量増大機能を有するＤＮＡは、例えば、転写されmRNAになる配列のうち、翻訳開始コドンより上流にありタンパク質には翻訳されない部分の配列でかつ、該配列の下流にコードされているタンパク質の翻訳量を増大させる効果を持つ配列として存在しているもので、この配列を翻訳量増大機能を有するＤＮＡとして利用することができる。
【００１１】
本発明の翻訳量増大機能を有するDNAは、配列番号：１の塩基配列からなるDNAだけではなく、配列番号：１の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列からなり、かつ翻訳量増大機能を有するDNAとして作用する能力を維持した変異DNAを含む。
【００１２】
さらに本発明の翻訳量増大機能を有するDNAは、配列番号：１の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ翻訳量増大機能を有するDNAとして作用する能力を維持した変異DNAを含む。ここでストリンジェントな条件とは、2 × SSC（330 mM NaCl, 30 mMクエン酸）、42℃である。
【００１３】
以下に本発明の実施の形態として、翻訳量増大機能を有するDNAの単離方法、発現ベクターの構築方法並びに形質転換植物の作成方法について説明する。
【００１４】
本発明の翻訳量増大機能を有するDNAは、例えばタバコ培養細胞において高発現している遺伝子から得ることができる。
【００１５】
１．翻訳量増大機能を有するＤＮＡ配列のクローニング
タバコ培養細胞から高発現している遺伝子は例えば以下のようにして単離される。
【００１６】
まず、タバコ細胞を培養し、例えば培養４日目の細胞から全mRNAを調製し、これをもとにしてプラスミドcDNAライブラリーを作製する。一方、培養４日目のタバコ培養細胞から調製されたmRNAに対し、ランダムプライマーを用いてα-32P dCTP等によりラベルされた一本鎖cDNAを合成する。このようなプライマーを用いたcDNAの合成では、転写量の多いmRNAの一本鎖cDNAが合成され易い。
【００１７】
発現の強い遺伝子はそれだけ多くmRNAに転写されていることが予想される。そこで、転写量の多いmRNAに対応している可能性の高い上記一本鎖cDNAをプローブとして、cDNAライブラリーから無作為に選出したクローンについてスクリーニングを行う。このような方法によって、転写量の多いmRNAに対応する可能性の高いクローンを選択することができる。
【００１８】
全mRNAは、例えばLongemannらの植物組織のRNA分離の方法（Longemann,J. et al.(1987) Anal.Biochem 163:16-20）に従って調製することができ、また、オリゴdT-セルロースカラムなどのキットを用いた方法、ポリU-セファロースカラムなどのキットを用いた方法等により濃縮又は精製することができる。
【００１９】
このmRNAを鋳型として逆転写酵素により上述した32PでラベルしたcDNAを合成し、プローブとする。
【００２０】
なお、mRNAの転写量の多い構造遺伝子が判明している場合には、その構造遺伝子に含まれる適当な配列をプローブとしてクローンのスクリーニングを行なうことができる。
【００２１】
スクリーニングの結果得られたクローンを単離し、これらのクローンの部分塩基配列を決定することにより、グループ分けを行う。ここで、タバコは複二倍体であるため、単一コピーの遺伝子がそれほど多く存在するとは考えにくい。そこで、前記のようにしてグループ分けされたクローンについて、発現が強く、かつ、ゲノム中のコピー数が少ないクローンを得る。本発明では、発現が強いクローンを得るには例えばノーザンハイブリダイゼーションを、ゲノム中のコピー数が少ないクローンを得るには例えばサザンハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００２２】
次に、得られたクローンから全長のcDNAをクローニングする。cDNAのクローニングには、例えばRACE(Rapid Amplification of cDNA ends)法が用いられる。RACE法とは、cDNAの5'欠失部位をPCRにより迅速に回収する方法である。なお、RACEは、市販のキット(MarathonTM cDNA Amplification Kit(Clonetech社))を用いることができる。
【００２３】
ところで、翻訳量増大機能を有するDNAはゲノムDNAの非翻訳領域に存在するため、cDNAの塩基配列の解析のみならずゲノムライブラリーをスクリーニングすることが望ましい。そこで、前記のようにして得られたクローンから翻訳量増大機能を有するDNA領域を得るため、タバコゲノムライブラリーについて、前記cDNAをプローブとして用いてスクリーニングを行い、得られたゲノムDNAの塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定は、マキサム−ギルバート法、ジデオキシ法等の公知手法により、あるいはABI PRISMTMダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（PERKIN ELMER）、BcaBESTTM ジデオキシシークエンシングキット(宝酒造社)等を用いた自動塩基配列決定装置により行われる。
【００２４】
なお、変異の導入は、公知の手法により(Ito, W.(1991) Gene 102: 67-70)、あるいは市販のキット（Takara社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット）を用いて行うことができる。
【００２５】
一旦本発明の翻訳量増大機能を有するDNAの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は当該翻訳量増大機能を有するDNAの5'および3'末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、若しくは当該翻訳量増大機能を有するDNAが適当なベクターにクローニングされている場合には、インサートとしてマルチクローニングサイトに挿入されている当該翻訳量増大機能を有するDNAの5'および3'方向外側の、ベクター起源の塩基配列を含むプライマーを用いたPCRによって、あるいは本発明の翻訳量増大機能を有するDNAの塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明の翻訳量増大機能を有するDNAを得ることができる。
【００２６】
なお、mRNAの転写量の多い構造遺伝子が判明している場合には、その構造遺伝子に含まれる適当な配列をプローブとしてクローンの選択を行なうことができる。
【００２７】
２．翻訳量増大機能の確認
得られた翻訳量増大機能を有するDNAが目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてGUS(β−グルクロニダーゼ)遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
【００２８】
３．組換えベクター及び形質転換体の作製
(1) 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の翻訳量増大機能を有するDNAを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明の翻訳量増大機能を有するDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド DNAは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法(Birnboim,H.C. & Doly,J.(1979) Nucleic acid Res 7: 1513)又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして例えばpUC118（宝酒造社製）、pUC119 (宝酒造社製）、pBluescript SK+ (Stratagene 社製）、pGEM-T (Promega 社製)等を用いてもよい。
【００２９】
ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、M13mp19 、M13tv18等が挙げられる。
【００３０】
ベクターに本発明の翻訳量増大機能を有するDNAを挿入するには、まず、精製された翻訳量増大機能を有するDNAを適当な制限酵素で切断または、PCR法などによって制限酵素部位を付加し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３１】
(2)発現用組換えベクターの作製
前記(1) のようにして作製された組換えベクターに、植物で機能する任意のプロモーター及び発現の目的遺伝子を組み込むことにより発現用組換えベクターを作製することができる。
【００３２】
発現の目的となる遺伝子としては、各種の構造遺伝子（この構造遺伝子は、細胞外への分泌のためのシグナル配列を含んでいてもよい）等が利用でき、本発明では特に限定されるものではない。例えば、このような遺伝子としては、異種生物の遺伝子、同種生物の遺伝子、あるいは一部又は全部を化学合成した遺伝子などの任意の遺伝子が挙げられる。また、当該遺伝子は何らかの機能を有するものであり、例えば有用タンパク質をコードするものである。これらの遺伝子が発現することにより、それぞれの遺伝子に対応する有用タンパク質が生産される。なお、発現の目的となる遺伝子は、通常のクローニング手法（例えばJ.Sambrook,etal.,  Molecular cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて調製することができる。
【００３３】
発現の目的となる遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の発現用組換えベクターには、プロモーター、本発明の翻訳量増大機能を有するDNA及び上記目的遺伝子のほか、ターミネーター、薬物耐性遺伝子等を組み込んでも良い。この場合、ターミネーターとしてはNOSなどが挙げられ、エンハンサーとしては、Hayashiらが開発したカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター中のエンハンサー領域を４つタンデムに連結したユニット（Hayashi,H. (1992) Science 258: 1350-1353)などが挙げられ、薬物耐性遺伝子としてはカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３４】
(3)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の発現用組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主とは、植物体全体、種子、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、根茎等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
【００３５】
植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、形質転換は、採取した植物切片に当該ベクターをアグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法で、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入し、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などを分離することにより行われる。こうして得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させることができる。例えばイネではFujimuraら（Fujimuraら（１９９５）、Plant Tissue Culture Lett.、vol.２：ｐ７４−）の方法、トウモロコシでは、Shillitoら（Shillitoら（１９８９）、Bio/Technology、vol.7:p581-）の方法、ジャガイモでは、Visserら（Visserら（１９８９）、Theor.Appl.Genet.、vol.78:p589-）の方法、シロイヌナズナではAkamaらの方法（Akamaら（１９９２）、Plant Cell Rep., vol.12:p7-）が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖媒体（例えば種子、塊茎、切穂等）から得た形質転換植物体は本発明の対象である。
【００３６】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、培養細胞に前記と同様、当該ベクターをエレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法若しくはパーティクルガン法で導入し、以下、前記と同様にして細胞培養、組織培養、器官培養及び植物体を得ることができる。
【００３７】
４．有用物質の生産
前記のようにして得られた発現用組換えベクターを保有する形質転換体を培養又は栽培すれば、目的遺伝子の発現産物を有用物質として生産することができる。ここで、目的遺伝子の発現産物が酵素である場合には、その酵素によって触媒される反応の産物、又は該反応に続く一連の生合成反応経路上の中間体及び／又は最終生産物をも有用物質として生産することができる。さらに、目的遺伝子が、タンパク質リン酸化酵素やG-プロテインなどの情報伝達機構において、生合成等の反応経路全体の機能調節を司る制御遺伝子（マスター遺伝子などとも呼ばれる）である場合には、該制御遺伝子の情報伝達下流に存在する反応経路上の中間体及び／又は最終生産物をも有用物質として生産することができる。
【００３８】
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばMS基本培地(Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol. Plant.15: 473)、LS基本培地(Linsmaier, E. M. & Skoog, F. (1965) Physiol. Plant. 18: 100)、プロトプラスト培養培地(LS培地を改変したもの)等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
【００３９】
上記培地に、細胞、組織又は器官を10~100 g新鮮重/l接種し、必要によりNAA、2,4-D、BA、カイネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地の pHは5~7に調節し、培養は通常20~30℃、好ましくは25℃前後で、また、0.2~1 vvm 通気、50~200 rpm攪拌で1~6週間培養する。
【００４０】
形質転換体が植物体である場合は、圃場やガラスハウスなどで栽培又は水耕培養することができる。培養終了後、培養物より有用物質を採取するには、各物質の通常の精製手段を用いることができる。
【００４１】
すなわち、培養細胞又は培養組織から有用物質を採取するには、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液、あるいは植物の一次及び／又は二次代謝産物を含む溶液を得る。上記粗ポリペプチド溶液からポリペプチドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。
【００４２】
また、上記溶液から植物の一次及び／又は二次代謝産物をさらに精製するには、従来から知られている精製手法を使用することができる。例えば、溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。
【００４３】
植物器官又は植物体から有用物質を採取するには、超音波破砕処理、磨砕処理等を行って上記有用物質の抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同様にして行うことができる。
【００４４】
【実施例】
以下、参考例及び実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４５】
実施例１  タバコ由来アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'-非翻訳領域の一過性発現実験
１．タバコ培養細胞の継代培養
タバコ（Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2; BY2）培養細胞は、300 mlのマイヤーフラスコに改変LS培地を95 ml入れ、7日毎に定常期に達した細胞を2 ml植え継いで、25℃、130rpm、暗所下で培養を行った。
【００４６】
なお、改変LS培地の組成は、概ねBirnboim らのもの（Birnboim, H. C. and Doly, J., Nucleic Acid Res., 7, 1537 (1979)）に従った。組成は表１の通りである。
【００４７】
【表１】
0004627879.tif 000002
【００４８】
２．タバコBY2細胞からのゲノムライブラリーの作成
植継ぎ後4日目のタバコBY2細胞から常法によりゲノムDNAを抽出した。Sau3AIにて部分的に制限酵素処理して約20 kbの断片を得た。このうち75 gを、20 mM Tris-HCl (pH8.0)、5 mM EDTA、1 M NaClを含む38 mlの10〜40%ショ糖密度勾配溶液で分画した。遠心条件は26,000 rpm、24時間、15℃とし、Beckman社のSW28ローターを用いた。分画後、250μlずつ集め、それぞれのフラクションを20μlずつ0.6%アガロースゲル電気泳動した。15~20 kbのフラグメントを含むフラクションをエタノール沈殿し、回収したDNAフラグメントをEMBL3/BamHIベクター（Stratagene社）にライゲーションし、GigapackII packaging（Stratagene社）を用いてパッケージングした。約1×106 pfu/gの規模のゲノムライブラリーを得た。
【００４９】
３．ゲノムライブラリーのスクリーニングによる翻訳量増大機能を有するDNAフラグメントの単離
上記ライブラリーに対し、タバコ培養細胞由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（NtADH, Shinmyo et al., Biotechnol.Bioeng.,58,329-332）をプローブに用いて一次スクリーニングを行なった。得られたポジティブクローンに対し、さらに該遺伝子の5'-領域をプローブとして二次スクリーニングを行ない、該遺伝子の5'-非翻訳領域（5'-UTR）を含む上流域のゲノム断片を得た。パッケージングキット付属のプライマー（要確認）を用い、ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reavtion Kit (PERKIN ELME社) を用いて5'-UTRの塩基配列の決定を行った。得られたDNA配列を配列表の配列番号１に示す。
【００５０】
４．NtADH遺伝子プロモーターを用いた一過性発現実験
まず、タバコ培養細胞由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（NtADH）遺伝子のプロモーターおよび5'-非翻訳領域（5'-UTR）の配列及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基（5'-atgtcaagcactgtcgggcaagt）を含む発現ベクターを用いて、BY2を対象とした一過性発現実験を行い、レポーターであるGUS（β-glucuronidase）の発現量を調べた。
（1）発現ベクターの構築
バイナリーベクターpBI101.2（Bevan, M., Nucleic Acid Res., 12, 8711-8721 (1984)）へNtADH遺伝子のプロモーターおよび5'-UTRが挿入されている発現ベクターNtADHp-GUS（Nagaya, S. et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000)）を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化した。約2.4 kbのNtADH遺伝子のプロモーター、5'-UTR及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基を含むDNA断片を回収し、一過性発現ベクターpBI221（Jefferson, R. A. et al., EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)）（図1-a）のHindIIIおよびBamHI認識部位に連結し、ADH 2.4 kb fusion（図1-b）を構築した。なお、図1において、矢印は予想される転写開始点を示している。"Met"は開始メチオニンを、また、ボックスで囲まれた"TATATAA"および"TATAAAT"は、プロモーターの"TATA"ボックスを表す。
【００５１】
（2）タバコ培養細胞からのプロトプラスト作製
改変LS培地で25℃の暗所下、４日間培養したタバコBY2細胞をファルコンチューブに移して遠心（1000 rpm、5 min、室温、BECKMAN、GS-6KR Centrifuge）し、培地を取り除いた。0.4 Mマンニトール溶液を入れて、遠心（1000 rpm、5 min、室温）し、細胞を洗浄した。プロトプラスト用酵素液 [0.1% (w/v) pectlyase Y23 (キッコーマン)、1% (w/v) cellulase RS (ヤクルト)、0.4 M マンニトール、pH 5.5] を入れて、1.5~2時間、15分毎に軽くピペッティングしながら25℃の振盪培養槽においてゆるやかに細胞をプロトプラスト化した。プロトプラスト化したことを顕微鏡で確認後、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、プロトプラスト用酵素液を取り除いた。0.4 Mマンニトール溶液を入れて、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、細胞を洗浄した。新たに適量の0.4 Mマンニトール溶液を入れて細胞を懸濁し、血球計算盤（エルマ）を用いて細胞数を算出した。細胞は、1×106 個/ml になるように調整した。
【００５２】
（3）エレクトロポレーションに用いるDNAの調製
QIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いて行った。回収したDNAは、滅菌水に溶解し、1μg/μl になるように各々調整した。
【００５３】
（4）エレクトロポレーションによるDNAの導入
1×106 個/ml に調整した細胞懸濁液1.5 ml に、2.5 ml のエレクトロポーレーション溶液 （5 mM MES、70 mM KCl、0.3 M マンニトール、pH 5.8] を加え、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、上清を取り除いた。新たに500μl のエレクトロポーレーション溶液を入れ、細胞を分散させた後、目的の配列（プロモーター領域又は5'-非翻訳領域）を含み、GUS遺伝子をレポーターに持つDNA 溶液10μl（1μg/μl）、導入効率を評価するためのルシフェラーゼ（LUC）遺伝子をレポーターに持つDNA溶液10μl（ 0.1μg/μl ）を各々加え、氷中で15分間静置した。 これを、氷冷した0.4 mm キュベットに移し、エレクトロポーレーター（BIO-RAD、Gene Pulser）により電気パルス（0.2 kv、250μF、400Ω）を与え、DNA導入を行った。DNA導入後の細胞を5 cm シャーレに移し、4.5 ml のプロトプラスト用培地を加え、25℃の暗所下に置いた。プロトプラスト用培地の組成は表２の通りである。
【００５４】
【表２】
0004627879.tif 000003
【００５５】
（5）DNA導入細胞におけるGUS/LUCの相対活性
（i）DNA導入細胞からの粗酵素液の抽出
DNA導入18時間後の細胞をファルコンチューブに移して、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、上清を取り除いた。そこへ、500μl のGUS/LUC溶解緩衝液（2 mM EDTA、5% glycerol、2 mM DTT、100 mM KPO4、pH 7.8）を入れ、エッペンドルフチューブに移した。氷冷しながらエッペンドルフチューブ中でホモジェナイザーを用いて細胞を破砕した後、遠心（15000 rpm、5 min、4℃）し、上清を粗酵素液とした。
(ii) タンパク質の定量
タンパク質の定量は、Bradfordの方法（Bradford, M. M., Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)）に従った。
【００５６】
サンプル（粗酵素液）50μl とタンパク質定量試薬2.5 mlを試験管に入れてよく混合し、2分〜1時間以内に595 nmの吸光度を測定した。サンプルの代わりに既知濃度のBSAを用いて検量線を作製し、これよりサンプルのタンパク質濃度を求めた。タンパク質定量試薬の組成は表３の通りである。
【００５７】
【表３】
0004627879.tif 000004
【００５８】
なお、上記試薬は、使用直前に濾紙（Toyo No.2）で２回濾過した後に用いた。
(iii) GUS活性測定
GUSの比活性測定は、Jeffersonらの方法（Jefferson, R. A., EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)）により行った。
【００５９】
100μlの粗酵素液と1 mMの 4-メチル-ウンベリフェリル--D-グルクロニド（4MUG）を含む200μl のGUS/LUC溶解緩衝液を混合し、37℃で30分間酵素反応を行った。超純水で調製した3 mlの0.2 M Na2CO3を加えて反応を停止させ、蛍光光度計（Excitation wavelength 365 nm、Emission wavelength 455 nm）により、反応生成物4-メチル-ウンベリフェロン（4-MU）の蛍光量を測定した。標準物質4-MU蛍光量から、生成した4-MU濃度を決定して、以下のようにしてGUS比活性（pmol/min/mg protein）を算出した。
【００６０】
【数１】
0004627879.tif 000005
【００６１】
(iv)LUC活性測定
LUC活性は、ピッカジーン発光キット（東洋インキ）を用いて行った。20μlの粗酵素液と発光基質であるルシフェリンを含む発光試薬100μlをすばやく混合し、ルミノメーター（Berthold、Lumat LB9501）により10秒間の発光量を測定した。ルシフェラーゼ標品を用いて検量線を作製し、発光量から粗酵素液1 mg中に含まれる生成したルシフェラーゼタンパク質量を算出して、LUC活性（pmol/ mg protein）とした。
(v)GUS/LUC相対活性
細胞へのDNA導入効率のばらつきにより生じる誤差を考慮し、目的遺伝子のレポーターであるGUSの発現量は、共導入したpBI系ベクターのレポーターであるLUCの発現量を基にGUS/LUCの相対活性として以下のように求めた。
【００６２】
【数２】
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【００６３】
（vi）NtADH遺伝子プロモーターおよび5'-UTRの配列を含む発現ベクターによる一過性発現実験
NtADH遺伝子プロモーター、5'-UTR及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基の配列を含む発現ベクター（ADH 2.4 kb fusion)をタバコ培養細胞プロトプラストにエレクトロポレーション法により導入し、一過性発現実験を各々３回行った。
【００６４】
対照としたpBI221と比較して、ADH 2.4 kb fusionを用いた場合は、約120倍高いGUS活性が得られた（図3）。なお、図3において、横軸の数値の範囲は０〜１０×１０4であり、図中にある数字はpBI221が示す活性に対する相対活性を表す。
５．CaMV35Sプロモーターを用いた一過性発現実験
次に、NtADH遺伝子の5'-UTRがGUSの発現量を著しく高める能力を有するか否かを調べるために、対照実験に用いたpBI221と同じカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター（Benfey, P. et al., Science, 250, 959-966 (1990)）の下流にNtADH遺伝子の5'-UTR及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基を挿入し、一過性発現実験を行った。
【００６５】
（1）発現ベクターの構築
NtADH遺伝子の5'-UTRおよび内部塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドのプライマー5'-TATTTAACTCAGTATTCAGAAACAAC-3'（配列番号2）と5'-CCCGGGGATCCACTTGCCCGA-3'（配列番号3）を用いて、発現ベクターADH 2.4 kb fusion（図1-b）を鋳型として、PCR 法によりNtADH遺伝子の5'-UTRを含むDNA断片を増幅した。この断片をTaKaRa BKL Kit（宝酒造）を用いてpUC118ベクターのHincII認識部位に挿入し、ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（PERKIN ELMER）を用いて塩基配列の決定を行った。塩基配列決定後、制限酵素XbaIおよびBamHIで消化し、約130 bpのNtADH遺伝子の5'-UTRを含むDNA断片を回収した。この断片をpBI221のXbaIおよびBamHI認識部位に連結し、TS221（図1-c）を構築した。
【００６６】
作製した発現ベクターTS221をタバコ培養細胞プロトプラストにエレクトロポーレーション法により導入し、一過性発現実験を各々3回行った。
【００６７】
対照としたpBI221と比較して、タバコ培養細胞由来のNtADH遺伝子の5'-UTR及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基の配列を含む発現ベクター（TS221）を用いた場合は、約50倍高いGUS活性が得られた（図3）。
【００６８】
なお、上記の各操作を必要に応じて以下の一過性発現実験に使用した。
６．NtADH遺伝子の5'-UTRを5'側から欠失させた場合の効果
（1）発現ベクターの構築
NtADH遺伝子の5'-UTRを5'側から欠失させるため、5'-UTRの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドのプライマー5'-AGTTCTTCTCTACATAAAATTTTCC-3'（配列番号4）と5'-CCCGGGGATCCACTTGCCCGA-3'（配列番号3）を用いて、発現ベクターTS221（図1-c）を鋳型として、PCR 法により部分欠失した5'-UTRを含むDNA断片を増幅した。この断片をTaKaRa BKL Kit（宝酒造）を用いてpUC118ベクターのHincII認識部位に挿入し、ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（PERKIN ELMER）を用いて塩基配列の決定を行った。塩基配列決定後、制限酵素XbaIおよびBamHIで消化し、約100 bpのNtADH遺伝子の5'-UTRの一部及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基を含むDNA断片を回収した。この断片をpBI221のXbaIおよびBamHI認識部位に連結し、TS60（図2-a）を構築した。
【００６９】
同様の方法で、プライマー5'-CAGTGAAGGAAATCAAG-3'（配列番号5）と5'-CCCGGGGATCCACTTGCCCGA-3'（配列番号3）を用いて、TS30（図2-b）を構築した。
【００７０】
タバコ培養細胞プロトプラストを用いた一過性発現実験は各々3回行った。
【００７１】
対照としたpBI221と比較して、タバコ培養細胞由来のNtADH遺伝子の5'-UTRを5'末端から順次欠失させた発現ベクターを用いた場合、TS60では約35倍、TS30では約25倍高いGUS活性が得られた（図3）。
【００７２】
7．NtADH遺伝子の翻訳領域を欠失させた場合の効果
先のNtADH遺伝子の5'-UTRの配列を含む発現ベクター（TS221、TS60、TS30）は、いずれもNtADH遺伝子本来の開始コドンから翻訳されるため、目的タンパク質はGUSタンパク質との融合タンパク質として生成される。対照実験に用いたpBI221との相違点の１つは、融合タンパク質として生成されるか否かである。TS221、TS60、TS30で見られた高いGUS活性は、融合タンパク質の比活性や安定性が上昇した結果とも考えられる。
【００７３】
そこで、NtADH遺伝子の5'-UTRを直接、GUS遺伝子に連結させるような非融合型の発現ベクター（TS221 NF）の構築を行った。まず、GUSタンパク質の第３アミノ酸にあたる塩基配列CGTをAGGに置換することにより、新たにStuI認識部位を挿入することを試みた。なお、この塩基置換は、CGT、AGGがともにアルギニンをコードすることからアミノ酸変異を伴わない。GUS遺伝子の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドのプライマー5'-GGTCTAGAATGTTAAGGCCTGTAGAAACCCCAACCCG-3'（配列番号６）と5'-GGTACGTACACTTTTCCCGGCAAT-3'（配列番号７）を用いて、発現ベクターTS221（図1-c）を鋳型として、PCR 法により変異導入したGUS遺伝子を含むDNA断片を増幅した。この断片をTaKaRa BKL Kit（宝酒造）を用いてpUC118ベクターのHincII認識部位に挿入し、ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（PERKIN ELMER）を用いて塩基配列の決定を行った。塩基配列決定後、制限酵素XbaIおよびSnaBIで消化し、約400 bpの変異導入をおこなったGUS遺伝子断片を回収した。この断片をTS221のXbaIおよびSnaBI認識部位に連結し、TS221ΔStuIを構築した。また、NtADH遺伝子の5'-UTRを直接、GUS遺伝子に連結させるため、5'-UTRに基づいて合成したオリゴヌクレオチドのプライマー5'-TATTTAACTCAGTATTCAGAAACAAC-3'（配列番号2）と5'-GGAGGCCTTAACATTTATTTTTCTTGATTTCCT-3'（配列番号８）を用いて、発現ベクターTS221（図1-c）を鋳型とし、PCR 法によってNtADH遺伝子の翻訳領域を欠失した5'-UTRを含むDNA断片を増幅した。上述の方法により塩基配列決定後、制限酵素XbaIおよびStuIで消化し、約100 bpのNtADH遺伝子の5'-UTRの一部を含むDNA断片を回収した。この断片をTS221ΔstuIベクターのXbaIおよびStuI認識部位に連結し、TS221 NF（図2-c）を構築した。
【００７４】
タバコ培養細胞プロトプラストを用いた一過性発現実験は各々3回行った。
対照としたpBI221と比較して、タバコ培養細胞由来のNtADH遺伝子の翻訳領域を欠失させた発現ベクター（TSNF）を用いた場合は、約30倍高いGUS活性が得られた（図3）。この結果は、NtADH遺伝子の翻訳領域よりむしろ5'-UTR がTS221、TS60、TS30で見られた翻訳量増大能に寄与することを示すものである。
【００７５】
実施例２  植物種特異性の検討
１．シロイヌナズナおよびイネ培養細胞からのプロトプラスト作製
（２）シロイヌナズナ培養細胞（T87）の継代培養
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）培養細胞は、300 mlのマイヤーフラスコに改変LS培地を95 ml入れ、14日毎に定常期に達した細胞を5 ml植え継いで、27℃、130rpm、明所下で培養を行った。
【００７６】
なお、改変LS培地の組成は、概ねBirnboim らのもの（Birnboim, H. C. and Doly, J., Nucleic Acid Res., 7, 1537 (1979)）に従った。組成は表１の通りである。
【００７７】
（３）シロイヌナズナ培養細胞からのプロトプラスト作製
改変LS培地で27℃の明所下、5日間培養したシロイヌナズナ培養細胞をファルコンチューブに移して遠心（1000 rpm、5 min、室温、BECKMAN、GS-6KR Centrifuge）し、培地を取り除いた。0.4 Mマンニトール溶液を入れて、遠心（1000 rpm、5 min、室温）し、細胞を洗浄した。プロトプラスト用酵素液 [0.1% (w/v) pectlyase Y23 (キッコーマン)、10% (w/v) cellulase RS (ヤクルト)、0.4 M マンニトール、pH 5.5] を入れて、2〜3時間、室温で振盪させながらゆるやかに細胞をプロトプラスト化した。プロトプラスト化したことを顕微鏡で確認後、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、表層部に浮かんでいる細胞を回収した。そこへ0.4 Mマンニトール溶液を加えて、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し上清を取り除いた。再度、0.4 Mマンニトール溶液を入れて、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し細胞を洗浄した。新たに適量の0.4 Mマンニトール溶液を入れて細胞を懸濁し、40μmのナイロンメッシュに通した。血球計算盤（エルマ）を用いて細胞数を算出した後、細胞を5×106 個/ml になるように調整した。
【００７８】
（１）イネ培養細胞の継代培養
イネ（Oryza sativa）培養細胞は、300 mlのマイヤーフラスコに改変LS培地を95 ml入れ、14日毎に定常期に達した細胞を5 ml植え継いで、27℃、130rpm、明所下で培養を行った。
【００７９】
なお、改変LS培地の組成は、概ねBirnboim らのもの（Birnboim, H. C. and Doly, J., Nucleic Acid Res., 7, 1537 (1979)）に従った。組成は表１の通りである。
【００８０】
（２）イネ培養細胞からのプロトプラスト作製
改変LS培地で27℃の明所下、5日間培養したイネ培養細胞をファルコンチューブに移して遠心（800 rpm、5 min、室温、BECKMAN、GS-6KR Centrifuge）し、培地を取り除いた。0.4 Mマンニトール溶液を入れて、遠心（800 rpm、5 min、室温）し、細胞を洗浄した。プロトプラスト用酵素液 [0.1% (w/v) pectlyase Y23 (キッコーマン)、10% (w/v) cellulase RS (ヤクルト)、0.4 M マンニトール、pH 5.5] を入れて、5〜6時間、室温で振盪させながらゆるやかに細胞をプロトプラスト化した。プロトプラスト化したことを顕微鏡で確認後、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、プロトプラスト用酵素液を取り除いた。そこへ0.5 Mスクロース溶液を加えて懸濁後、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、表層部に浮かんでいる細胞を回収した。そこへ0.4μMマンニトール溶液を加えて、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し上清を取り除いた。再度、0.4 Mマンニトール溶液を入れて、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し細胞を洗浄した。新たに適量の0.4 Mマンニトール溶液を入れて細胞を懸濁し、40μmのナイロンメッシュに通した。血球計算盤（エルマ）を用いて細胞数を算出した後、細胞を1×107 個/ml になるように調整した。
【００８１】
１．エレクトロポレーションによるDNAの導入
（１）シロイヌナズナ培養細胞（T87）へのDNA導入
5×106 個/ml に調整した細胞懸濁液1 ml に、2 ml のエレクトロポーレーション溶液 （5 mM MES、70 mM KCl、0.3 M マンニトール、pH 5.8）を加え、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、上清を取り除いた。新たに500μl のエレクトロポーレーション溶液を入れ、細胞を分散させた後、目的の配列（プロモーター領域又は５'-UTR）を含み、GUS遺伝子をレポーターに持つDNA 溶液10μl（1μg/μl）、導入効率を評価するためのルシフェラーゼ（LUC）遺伝子をレポーターに持つDNA溶液10μl（ 0.1μg/μl ）を各々加え、氷中で15分間静置した。 これを、氷冷した0.4 mm キュベットに移し、エレクトロポーレーター（BIO-RAD、Gene Pulser）により電気パルス（0.3 kv、250μF、400Ω）を与え、DNA導入を行った。DNA導入後の細胞を5 cm シャーレに移し、4.5 ml のプロトプラスト用培地を加え、25℃の暗所下に置いた。プロトプラスト用培地の組成は表２の通りである。
【００８２】
（２）イネ培養細胞へのDNA導入
1×107 個/ml に調整した細胞懸濁液1.5 ml に、2.5 ml のエレクトロポーレーション溶液（5 mM MES、70 mM KCl、0.3 M マンニトール、pH 5.8） を加え、遠心（800 rpm、5 min、4℃）し、上清を取り除いた。新たに500μl のエレクトロポーレーション溶液を入れ、細胞を分散させた後、目的の配列（プロモーター領域又は５'-UTR）を含み、GUS遺伝子をレポーターに持つDNA 溶液10μl（1μg/μl）、導入効率を評価するためのルシフェラーゼ（LUC）遺伝子をレポーターに持つDNA溶液10μl（ 0.1μg/μl ）を各々加え、氷中で15分間静置した。 これを、氷冷した0.4 mm キュベットに移し、エレクトロポーレーター（BIO-RAD、Gene Pulser）により電気パルス（0.2 kv、960μF）を与え、DNA導入を行った。DNA導入後の細胞を5 cm シャーレに移し、4.5 ml のプロトプラスト用培地を加え、25℃の暗所下に置いた。プロトプラスト用培地の組成は表２の通りである。
【００８３】
３.  シロイヌナズナ培養細胞およびイネ培養細胞プロトプラストを用いた一過性発現実験
実験は各々3回行った。対照としたpBI221と比較して、タバコ培養細胞由来のNtADH遺伝子のプロモーター、5'-UTR及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基の配列を含む発現ベクター（ADH 2.4 kb fusion）を用いた場合は、シロイヌナズナ培養細胞では約4倍高くなったが、イネ培養細胞では1/10程度のGUS活性を示した（図4：横軸の数値の範囲は０〜１０×１０4である）。これに対して、pBI221と同じカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターの下流にNtADH遺伝子の5'-UTR及びNtADH遺伝子の開始コドン下流23塩基を挿入した発現ベクター（TS221）を用いた場合では、シロイヌナズナ培養細胞では約40倍、イネ培養細胞においても約5倍高いGUS活性が得られた。このことは、タバコ培養細胞由来のNtADH遺伝子の5'-UTRの配列がGUSの発現量を著しく高める能力を有することを証明するものである。
【００８４】
【発明の効果】
本発明によれば、植物細胞における遺伝子の発現過程における翻訳後に得られる蛋白質量を増大させることができる翻訳量増大機能を有する5'-非翻訳領域配列を提供することができる。
【００８５】
【配列表】
0004627879.tif 000007
0004627879.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）〜ｃ）は一過性発現用ベクターの構築図である。
【図２】ａ）〜ｃ）は一過性発現用ベクターの構築図である。
【図３】本発明の５'-非翻訳領域配列の発現能を示す図である。
【図４】本発明の５'-非翻訳領域配列の発現能を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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