(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ヒト以外の哺乳動物皮膚からコラーゲンを製造する方法:
(a)該皮膚にpHが3〜5である有機酸緩衝液を適用し、付着したウールまたは毛をほぐすのに8〜27時間、該皮膚を20〜40℃の温度でインキュベートする段階；
(b)該皮膚を細かく切るまたは切り刻み、皮膚小片を作製する段階；
(c)該皮膚小片から該コラーゲンを抽出する段階；であって、
段階(a)において、該皮膚を中和・圧縮する段階を含まない。
【請求項２】
動物皮膚がヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、および有袋類からなる群より選択される動物から取り出される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
皮膚に有機酸緩衝液を適用する段階が、動物皮膚の肉面に有機酸緩衝液を適用する段階を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
有機酸緩衝液のpHが3.2〜4.5である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
有機酸緩衝液が、酢酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、および蟻酸からなる群より選択される1つまたは複数の酸の水溶液または懸濁液を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
有機酸緩衝液が40％(w/w)氷酢酸水溶液で構成される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
有機酸緩衝液のpHが4.0〜4.2である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
有機酸緩衝液が、皮膚当たり50〜100mLの割合で適用される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
段階(b)の前に、動物皮膚の毛が取り除かれる、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
段階(b)の前に、動物皮膚に残された肉が機械的に、または手で取り除かれる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
段階(c)が、非変性条件下で動物皮膚の小片と有機酸緩衝液とを懸濁液として混合する段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
有機酸が酢酸、乳酸、および蟻酸からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
有機酸が0.1〜0.05Mの濃度の酢酸である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
皮膚の小片および有機酸が0〜30℃の温度で攪拌しながらインキュベートされる、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
懸濁液が、1つまたは複数の抽出薬剤をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
抽出薬剤が1つまたは複数のプロテアーゼを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼが、ESPERASE(登録商標)、ALCALASE(登録商標)、DURAZYM(登録商標)、およびSAVINASE(登録商標)、MAXATASE(登録商標)、MAXACAL(登録商標)、PROPERASE(登録商標)、MAXAPEM(登録商標)、ならびにペプシンからなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
プロテアーゼがペプシンである、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
分離段階をさらに含む、請求項11〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
分離段階が、可溶性コラーゲンおよび分散コラーゲンが分離される遠心分離および/または濾過を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
分離段階が遠心分離を含み、上清が可溶化コラーゲンを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
分離段階が濾過を含み、濾液が可溶性コラーゲンを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
塩を用いて可溶性コラーゲンを沈殿させる、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
塩が5〜20％w/vの最終濃度まで添加される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
塩が10％の最終濃度まで添加される、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
コラーゲンが凍結乾燥される、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、精製された未変性コラーゲンを製造する方法:
(a)ヒト以外の動物皮膚を準備する段階;
(b)該皮膚とpHが3〜5である有機酸緩衝液とを接触させて、皮膚に存在するグリコサミノグリカンを実質的に消化するために8〜27時間、20〜40℃の温度で、該皮膚をインキュベートし、ペルトを製造する段階;
(c)該ペルトを細かく切り、1つまたは複数のプロテアーゼに暴露して、可溶性コラーゲンおよび分散コラーゲンを含む調製物を製造する段階;
(d)該調製物を遠心分離して、分散コラーゲンから可溶性の未変性コラーゲンを単離する段階;および
(e)塩を用いて該可溶性の未変性コラーゲンを沈殿させて、精製コラーゲンを製造する段階；であって、
段階(b)において、該皮膚を中和・圧縮する段階を含まない。
【請求項２８】
以下の段階を含む、精製された生体適合性コラーゲンを製造する方法:
(a)ヒト以外の動物皮膚を準備する段階;
(b)該皮膚とpHが3〜5である有機酸緩衝液とを接触させて、皮膚に存在するグリコサミノグリカンを実質的に消化するために8〜27時間、20〜40℃の温度で、該皮膚をインキュベートし、ペルトを製造する段階;
(c)該ペルトを細かく切り、1つまたは複数のプロテアーゼに暴露して、可溶性コラーゲンおよび分散コラーゲンを含む調製物を製造する段階;
(d)該調製物を遠心分離して、分散コラーゲンから可溶性の未変性コラーゲンを単離する段階;および
(e)塩を用いて該可溶性の未変性コラーゲンを沈殿させて、生体適合性コラーゲンを製造する段階；であって、
段階(b)において、該皮膚を中和・圧縮する段階を含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、動物皮膚からコラーゲンを製造する方法に関する。特に、本発明は、動物皮膚に有機酸緩衝液を適用することによってコラーゲンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
コラーゲンは、哺乳動物の総タンパク質の約30％を占める物質である(L.C.JunqueiraおよびJ.Carneiro、Basic Histology, 第4版、Lange Medical Publications、Los Altos, Calif.[1983]、89-119頁を参照のこと)。コラーゲンは、皮膚、腱、軟骨、および骨などの結合組織の主要な構造タンパク質であり、独特のアミノ酸組成および構造を有する。重要なことに、コラーゲンのらせん部分の主な部分は哺乳動物種の間でほとんど変わらない。
【０００３】
哺乳動物に由来するコラーゲンは、実際には、数種類の細胞型によって生産されるタンパク質ファミリーの一つである。このタンパク質ファミリーの中で、コラーゲンの型は、その化学組成、異なる形態学的特徴および病理学的特徴、組織内分布、ならびにその機能によって区別することができる。
【０００４】
少なくとも12種類の、遺伝的に異なるコラーゲン型が存在する。最もよく知られているI型は3本のポリペプチド鎖からなる。2本の鎖は同一であり、α1と呼ばれ、3本目はα2と呼ばれる。I型コラーゲンは、軟らかい結合組織(皮膚、腱)および硬い結合組織(骨および象牙質)のコラーゲン両方の大部分をなしている。II型コラーゲンは軟骨の主要なコラーゲンであり、3本のα1鎖で構成されている。III型コラーゲンは3本のα1鎖で構成されており、血管、創傷、およびある特定の腫瘍に見られる。
【０００５】
コラーゲンには多くの特性があり、そのために、コラーゲンは、インプラント、移植片、臓器置換、組織等価物、硝子体置換、形成外科および美容外科、縫合糸、創傷、火傷などに用いられる外科用包帯などの様々な医学的用途に魅力的な物質となっている(例えば、米国特許第5,106,949号、同5,104,660号、同5,081,106号、同5,383,930号、同4,485,095号、同4,485,097号、同4,539,716号、同4,546,500号、同4,409,332号、同4,604,346号、同4,835,102号、同4,837,379号、同3,800,792号、同3,491,760号、同3,113,568号、同3,471,598号、同2,202,566号、および同3,157,524(これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる);J.F.Prudden、Arch.Surg.89:1046-1059[1964];およびE.E.Peacockら、Ann.Surg.、161:238-247[1965]を参照のこと)。例えば、コラーゲンそれ自体は、少なくとも部分的には、コラーゲン構造内に潜在的な抗原決定基が遮蔽されているために、比較的弱い免疫原である。コラーゲンはまた、そのらせん構造のために、タンパク質分解に対する耐性もある。さらに、コラーゲンは細胞接着のための天然物質であり、かつ筋骨格系の、伸張性のある、荷重を支える主要な成分である。従って、医学的ならびに獣医学的な用途における使用に適したコラーゲンの製造に対して、多大な試みが注がれてきた。
【０００６】
コラーゲンは、様々な組織から様々な方法によって多くの形で製造することができる。最も求められているコラーゲンの1つは、低い抗原性および酵素消化に対する耐性を含む多数の独特の特性を有する「未変性」コラーゲンである。超微粒子状の分散した未変性コラーゲンには、化粧品産業、食品産業、および医薬品産業において幅広い実際の用途および潜在的な用途がある。
【０００７】
しかしながら、コラーゲンの相当の利点にもかかわらず、コラーゲンに基づいた材料の商業的な成功は、コラーゲンの独特の特性を利用した少数の特殊な製品に限られてきた。コラーゲンに基づいた市販の医用製品および生物工学製品が不足している主な理由として、純粋なコラーゲンを調製する費用の高さ、単離されたコラーゲンのばらつき、ならびにコラーゲンの取り扱いおよび保管の難しさが挙げられる。
【０００８】
驚くべきことに、出願人は、以前に直面していた問題を克服する、または少なくとも問題のいくつかを緩和すると同時に、高収率の未変性可溶性コラーゲンおよび分散不溶性コラーゲンを安価に製造することが可能な、動物皮膚に対して使用し得る非常に簡単な技法を発見した。特に、出願人は、動物皮膚を適切な有機酸緩衝液で処理することによって、酵素により可溶化される未変性コラーゲンの収率が上がることを発見した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の最も広い局面において、本発明は、コラーゲンを抽出するのに十分な時間、動物皮膚に有機酸緩衝液を適用する段階を含む、動物皮膚からコラーゲンを製造する方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらなる局面は、一般外科、皮膚科、歯科、形成外科および再建外科、神経外科、整形外科、眼科、泌尿器科、血管手術、獣医学、ならびに他の関連分野に有用な医用製品および生物工学製品用のコラーゲンを提供することである。
【００１１】
好ましくは、コラーゲンは、未変性の可溶性コラーゲンおよび微細に分散した未変性コラーゲンである。
【００１２】
本明細書に開示される方法が、任意の動物皮膚からのコラーゲンの抽出に有用であり得ることが当業者に理解されると考えられる。しかしながら、本発明は、動物(偶蹄目、ウサギ目、齧歯目、奇蹄目、食肉目、および有袋目の哺乳動物)から採取された動物皮膚からコラーゲンを抽出するのに特に有用である。より好ましくは、動物皮膚は、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、および有袋類からなる群より選択される動物から取り出される。最も好ましくは、皮膚はヒツジ皮膚である。
【００１３】
有機酸緩衝液は、当技術分野において公知の任意の適切な有機酸を含んでもよい。好ましくは、有機酸緩衝液は、酢酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、および蟻酸からなる群より選択される、1つまたは複数の酸の水溶液または懸濁液である。より好ましくは、有機酸緩衝液は氷酢酸水溶液で構成されており、かつ3〜5のpHを有する。さらにより好ましくは、有機酸緩衝液のpHは3.2〜4.5である。最も好ましくは、有機酸緩衝液のpHは4.0〜4.2である。
【００１４】
有機酸緩衝液が動物皮膚に適用されたら、ウールまたは毛をほぐす、または除去するのに十分な時間、インキュベートする。好ましくは、インキュベーションは20〜40℃の温度で8〜27時間行われる。次いで、動物皮膚は小片に切り刻まれてもよく、または細かく切られてもよい。
【００１５】
次いで、好ましくは、切り刻まれた皮膚または細かく切られた皮膚は、非変性条件下で有機酸緩衝液と混合して懸濁液にされ、攪拌しながら0〜30℃の温度でインキュベートされる。好ましくは、皮膚は、1つまたは複数のプロテアーゼの存在下でもインキュベートされる。好ましくは、プロテアーゼは、ESPERASE(登録商標)、ALCALASE(登録商標)、DURAZYM(登録商標)およびSAVINASE(登録商標)、MAXATASE(登録商標)、MAXACAL(登録商標)、PROPERASE(登録商標)、MAXAPEM(登録商標)、ならびにペプシンからなる群より選択される。最も好ましくは、プロテアーゼはペプシンである。
【００１６】
有機酸緩衝液およびプロテアーゼの懸濁液中で皮膚の小片をインキュベートした後に、懸濁液は遠心分離および/または濾過され、可溶性コラーゲンおよび/または分散コラーゲンが取り出される。
【００１７】
粉末にするために、コラーゲンは乾燥および粉砕してもよい。粉末にするために乾燥および粉砕する代わりに、コラーゲンを有機酸で再分散させ、次いで、この分散液を用いて、Silyerら、米国特許第4,703,108号に開示されるやり方で凍結乾燥することによってコラーゲンマトリックスまたはスポンジを形成することができる。
【００１８】
精製コラーゲンは付加的な化合物を含んでもよいことがさらに意図される。付加的な化合物として、抗菌剤、抗ウイルス剤、成長因子、脱水防止化合物、防腐剤、または生物医学的および/もしくは獣医学的な使用に適した他の化合物が挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】
発明の詳細な説明
本方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の材料および方法に限定されず、これらの材料および方法は異なってもよいことが理解される。本明細書で用いられる用語は特定の態様の単なる説明にすぎず、添付の特許請求の範囲でしか限定されない本発明の範囲の限定を目的としないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「有機酸」についての言及は、当業者に公知の1つまたは複数の有機酸およびその等価物についての言及である。特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明を実施または試験するために、本明細書に記載のものと同様の、または等価な任意の材料および方法を使用することができるが、好ましい材料および方法を今から説明する。
【００２０】
本明細書に記載の全ての刊行物は、刊行物において報告され、本発明と共に用いられる可能性のある方法、プロトコール、および試薬を説明および開示するために引用される。本明細書には、先行発明に基づいて本発明がこのような開示に先行する権利を有さないことを認めるものとして解釈されるものは何もない。
【００２１】
本発明は、動物皮膚からコラーゲンを調製する方法に関する。特に、本発明は、生物医学、獣医学、および他の用途に適したコラーゲンを調製する方法を提供する。
【００２２】
本明細書で使用する「動物」という用語は、開示された方法によってコラーゲンを抽出することができる任意の動物を意味する。例えば、動物は、偶蹄目、ウサギ目、齧歯目、奇蹄目、食肉目、および有袋目の哺乳動物から選択することができる。
【００２３】
偶蹄目は、9つの科:ブタ(イノシシ科)、ペッカリー(ペッカリー科)、カバ(カバ科)、ラクダ(ラクダ科)、マメジカ(マメジカ科)、キリンおよびオカピ(キリン科)、シカ(シカ科)、プロングホーン(プロングホーン科（Antilocapridae）)、ならびにウシ、ヒツジ、ヤギ、およびアンテロープ(ウシ科)、にわたって分布する約150の生物種を含む。ヤギ、ヒツジ、ウシ、およびブタなどのこれらの動物の多くは非常に類似した生物学的特性を有し、かつ高度のゲノム相同性を有する。さらに重要なことに、ヤギとヒツジ、およびウマとロバなどのある特定の動物は交配可能なことがよく知られている。
【００２４】
奇蹄目は、「足指が奇数個の(odd-toed)」または「蹄が奇数個の(odd-hoofed)」哺乳動物であり、サイ（rhinos）、バク、およびウマを含む。ウサギ目は、ラット、マウス、ウサギ、ノウサギ、および他のげっ歯類を含むのに対して、有袋目はカンガルーおよびワラビーを含む。
【００２５】
前記の動物群の全てのメンバーは真皮および表皮の2層から構成される皮膚を有する。表皮は、発生の連続的な段階を示す、いくつかの層からなる。皮膚の最も古い部分は、丈夫な保護性の死細胞からなる使い捨ての外層であり、表面で絶え間なく取り除かれ、下から絶え間なく交換される。細胞が年をとり、成熟するにつれて、最終的には核を消失し、細胞内容物の大部分をケラチンに変える。ケラチンは、皮膚の保護層を作るだけでなく、爪、蹄、毛、および角などの構造も作るタンパク質である。
【００２６】
真皮は表皮の下にあり、関連する筋肉、神経、および血管を有する組合組織の厚い層である。結合組織は大部分がコラーゲンからなる。
【００２７】
本明細書で使用する「コラーゲン」という用語は、堅い3本鎖らせん構造を特徴とする繊維状タンパク質の細胞外ファミリーに関して用いられる。3本のコラーゲンポリペプチド鎖(「α鎖」)は互いにからみついて、このらせん分子を形成する。この用語はまた様々な種類のコラーゲンを含むことが意図されるが、好ましい形態はI型コラーゲンおよびIII型コラーゲンである。「未変性コラーゲン」という用語は、コラーゲンの3本らせん領域が無傷のままであることを意味する。
【００２８】
前記のように、コラーゲンのらせん部分の主な部分は哺乳動物種の間でほとんど変わらない。実際に、多数のコラーゲン型が高度のヌクレオチド配列相同性およびアミノ酸配列相同性を有する。例えば、コラーゲンαI(II型)のヌクレオチド配列相同性は、ヒト、ウマ、およびマウスを比較した場合、少なくとも88％である。ヒトおよびウマはヌクレオチドレベルで93％の配列相同性を有するのに対して、マウスおよびウマは89％の配列相同性を有する。ヒトおよびマウスのヌクレオチド配列相同性は88％である(NCBIアクセッション番号U62528(ウマ)、NM033150(ヒト)、およびNM031163(マウス)http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと)。他の種類のコラーゲンは同様のレベルのアミノ酸相同性を有する。例えば、ブタコラーゲンαI(I型)とヒツジコラーゲンαI(I型)とのヌクレオチド配列相同性は90％である(NCBIアクセッション番号AF29287(ヒツジ)およびAF201723(ブタ)http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと)。
【００２９】
前記の動物の多くについての共通祖先および生物学的特性の程度、類似する形態(すなわち、皮膚構造)、ウシ、ヒツジ、マウス、およびブタなどの多数の種にわたるコラーゲンの高度のアミノ酸配列相同性およびヌクレオチド配列相同性を考慮すれば、当業者は、本明細書に開示される方法が全ての動物に適用できることを理解すると思われる。
【００３０】
コラーゲンを抽出しようとする動物が選択されたら、皮膚が取り出される。当技術分野において公知の動物皮膚を取り出す任意の方法を使用することができる。さらに、皮膚は任意の年齢の動物から取り出すことができる。しかしながら、1つの好ましい態様では、動物は14週齢未満の子ヒツジである。
【００３１】
取り出された皮膚は本発明の方法で直ぐに用いられてもよく、または20℃未満、より好ましくは4℃〜20℃で保存されてもよい。しかしながら、この範囲外の温度での長期保存は、抽出されたコラーゲンの質および量に悪影響を及ぼす可能性のあることが理解されると思われる。
【００３２】
1つの好ましい態様では、1つまたは複数の有機酸に基づく緩衝液が、新鮮な動物皮膚の肉面に適用される。本明細書で使用する「新鮮な」という用語は、使用する1日前以内に、好ましくは使用する12時間前以内に取り出された動物皮膚を意味する。さらにより好ましくは、動物皮膚は、取り出してから8時間以内に用いられる。
【００３３】
有機酸緩衝液は、好ましくは乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ピルビン酸緩衝液、蟻酸緩衝液、またはその組み合わせのいずれかである。しかしながら、当技術分野において公知の他の有機酸緩衝液も使用することができる。
【００３４】
有機酸緩衝液は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、および炭酸ナトリウムを用いて、好ましくはpH3〜5、より好ましくはpH3.2〜4.6に調節される。カリウム塩なども使用することができる。
【００３５】
1つの特に好ましい態様では、緩衝液は、酢酸、乳酸、または蟻酸の1つまたは複数と、アルカリ金属(アンモニウムを含む)またはアルカリ金属塩とが混合した水溶液または懸濁液からなる。無機酸および有機酸の混合物を使用してもよい。
【００３６】
最も好ましい緩衝液は40％(w/w)氷酢酸水溶液で構成され、かつpHは、約20％の無水酢酸ナトリウムまたは必要量の水酸化ナトリウムを添加することによって好ましいpH(4.0〜4.2)に調節される。
【００３７】
有機酸緩衝液の適用は当技術分野において公知の任意の方法によるものでよい。例えば、有機酸緩衝液は、噴霧、塗布、浸漬などによって皮膚に適用することができる。好ましくは、有機酸緩衝液は、皮膚当たり約50〜100mlの割合で塗布することによって適用される。有機酸緩衝液が浸液として用いられる場合、または皮膚が有機酸緩衝液に浸される場合、有機酸緩衝液を水で10倍に希釈してもよい。
【００３８】
適用後、動物皮膚は20〜40℃の温度で8〜27時間インキュベートすることができる。インキュベーションの間の相対湿度は、動物皮膚が完全に乾かないように十分に高いことも好ましい。例えば、60％を超える相対湿度、好ましくは80％を超える相対湿度、さらにより好ましくは90％を超える相対湿度を使用すべきである。
【００３９】
特定のいかなる理論または仮説にも拘束されることは望まないが、出願人は、抽出過程のこの段階で有機酸緩衝液を使用ことによって、ウールおよび毛がほぐれるだけでなく、皮膚に存在するグリコサミノグリカン(GAG)も実質的に消化されると考えている。GAGが除去されるとコラーゲン構造が開き、その結果、後の段階で行われるコラーゲンの酵素的可溶化が容易になる。
【００４０】
本明細書で使用する「実質的な」および「実質的に」という用語は、GAGの除去について言及している場合、有機酸緩衝液を用いた最初のインキュベーション時間の終わりまでに、動物皮膚に通常存在するGAGの量と比較して、全GAGの好ましくは70％を超えるGAG、さらにより好ましくは80％を超えるGAG、さらにより好ましくは90％を超えるGAGが消化されていることを意味する。
【００４１】
インキュベーション後、毛が取り除かれた皮膚(本明細書では「ペルト(pelt)」と呼ぶ)を得るために、ウールまたは毛が機械的に、または手で取り除かれる。毛またはウールに経済的な価値がある場合、乾燥して梱包してもよいし、または単に捨ててもよい。
【００４２】
次いで、ペルトの肉が機械的に、または手で削がれる。残ったウールまたは毛を含むいかなるペルトも取り除かれ、捨てられる。次いで、ペルトは小片に切り刻まれるか、または細かく切られる。産業用の肉ひき機、粉砕機、またはフードプロセッサを含む、ペルトをばらばらにすることができる任意の装置を使用することができる。
【００４３】
次いで、懸濁液を作製するために、ペルト小片は非変性溶液に添加される。非変性溶液は有機酸緩衝液を含み、懸濁液は非変性条件下でインキュベートされる。本明細書で使用する「非変性条件」という用語は、コラーゲンの3本らせん構造が保存されることを意味する。従って、1つの好ましい態様では、使用される有機酸緩衝液は、好ましくは、25℃未満の温度で約pH2である。
【００４４】
1つの好ましい態様では、有機酸緩衝液は、酢酸、乳酸、蟻酸、またはその組み合わせを含む。有機酸緩衝液の濃度は0.01M〜0.5Mでもよく、より好ましくは0.1M〜0.05Mでもよい。好ましい酸は0.1M〜0.05Mの濃度の酢酸である。
【００４５】
ペルト小片と非変性溶液との比率は、それぞれ、10:1〜1000:1でもよい。懸濁液が作製されたら、好ましくは、ゆっくりと攪拌される。攪拌の量は、懸濁液中のペルト小片の大きさによって決まる。しかしながら、好ましくは、攪拌は、ペルト小片を穏やかに動かすのに十分な攪拌である。懸濁液はまた、好ましくは、0〜30℃の温度で少なくとも1時間インキュベートされる。1つの好ましい態様では、インキュベーションは7日間まで続けられる。しかしながら、インキュベーションの長さは、pH、温度、およびペルトの種類によって決まる。
【００４６】
1つの特に好ましい態様では、プロテアーゼが懸濁液に加えられる。非常に多数の適切なプロテアーゼが市販されているか、または当技術分野において公知である。例えば、適切なプロテアーゼは、枯草菌およびリケニホルミス菌(B.licheniformis)の特定の株から得られるサブチリシン(サブチリシンBPNおよびBPN')である。1つの適切なプロテアーゼは、pH8〜12の範囲全体にわたって最大活性を有するバチルス株から得られ、デンマークのNovo Industries A/S(以下「ノボ」)によりESPERASE(登録商標)として開発および販売されている。この酵素および類似酵素の調製物は、ノボに対する英国特許第1,243,784号に記載されている。他の適切なプロテアーゼとして、ALCALASE(登録商標)、DURAZYM(登録商標)、およびSAVINASE(登録商標)(ノボ)、ならびにMAXATASE、MAXACAL(登録商標)、PROPERASE(登録商標)、およびMAXAPEM(登録商標)(タンパク質操作Maxacal)(Gist-Brocades)が挙げられる。プロテアーゼはまた、改変された細菌セリンプロテアーゼ(例えば、1987年4月28日に出願された欧州特許出願第87303761.8号(特に、17頁、24頁、および98頁)に記載のもの、ならびに改変された細菌セリンタンパク分解酵素について言及している1986年10月29日に公開された欧州特許出願第199,404号(Venegas)に記載のもの)を含む。
【００４７】
他の適切なプロテアーゼとして、1991年5月16日に公開された国際公開公報第91/06637号に対応する欧州特許第90915958:4号に記載のアルカリ性セリンプロテアーゼが挙げられる。欧州特許第251446号および国際公開公報第91/06637号に記載のプロテアーゼ、国際公開公報第91/02792号に記載のプロテアーゼBLAPS、ならびに国際公開公報第95/23221号に記載のその変異体も本発明に適している。
【００４８】
必要とされる酵素消化の種類および量に応じて、可溶性コラーゲンの最大収率を得るために使用される条件および必要とされる時間は1日から10日と大きく変化する。酵素重量とペルトの重量の比率は、1:10から1:1000(w/w)と大きく異なってもよい。ペプシンが好ましい酵素であり、酵素重量とペルトの重量の比率は約1:100である。
【００４９】
インキュベーション後、可溶性コラーゲンおよび分散コラーゲンは遠心分離または濾過によって分離することができる。遠心分離を用いると、上清には可溶化コラーゲンが含まれ、沈殿物には分散コラーゲンが含まれる。濾過を用いると、可溶性コラーゲンは濾液に含まれる。
【００５０】
可溶化コラーゲンは、沈殿、濾過などを含む任意の公知の手段によって上清から回収することができる。塩を用いた可溶性コラーゲンの沈殿が好ましい方法である。NaClなどの塩を、5〜20％w/v、好ましくは10％の最終濃度まで上清(濾液)に添加することができる。次いで、懸濁液を遠心分離することができる。沈殿物は保持し、上清は捨てることができる。次いで、沈殿物を0.1Mの希酢酸または乳酸に再溶解してもよい(沈殿物と溶液の比率は約1:100)。次いで、可溶性コラーゲンを塩の添加によって再沈殿させることができる。次いで、沈殿物を希酸に再溶解し、遠心分離してもよい。次いで、上清中のコラーゲン濃度を測定し、必要とされる濃度(1〜10mg/mL)に調整することができる。コラーゲンはこの形で使用することができる。または、溶解したコラーゲンを水に対して透析し、次いで、脱水コラーゲンに変えることができる。
【００５１】
本明細書で使用する「脱水コラーゲン」という用語は、当技術分野において一般に知られている任意の方法を用いて脱水されたコラーゲンを指す。好ましい態様では、脱水コラーゲンは、凍結乾燥(lyophilization)、凍結乾燥(freeze drying)、または乾燥により生成される。
【００５２】
いかなる大きな粒子も除去するために、分散コラーゲンを含む懸濁液を濾過することができる。濾液中のコラーゲン濃度を、必要とされる濃度まで調整し、この形で使用することができる。または、分散コラーゲンを水で洗浄し、次いで、乾燥させることができる。
【００５３】
本明細書で使用する「乾燥した」という用語は、コラーゲンから水を除去するための任意の方法を指す。この用語は、風乾または凍結乾燥を含むが、これに限定されない方法を含むと意図される。
【００５４】
前記から、本発明の方法に従って調製されたコラーゲンの様々な態様が、コラーゲンを必要とする様々な生物医学的用途に適していることは明らかである。本発明のコラーゲンは、複数の状況および多くの用途(コラーゲン縫合糸、コラーゲン軟部組織置換(創傷および火傷の被覆を含む)、動脈血管置換、止血剤、薬物送達マトリックス、眼科療法用の硝子体置換、歯内療法、細胞培養支持体などを含むが、これに限定されない)に使用できることが意図される。本発明の様々な態様は、繊維フィルムまたは膜フィルム、バッグ、スポンジ、縫合糸、および水性懸濁液、ならびに複合材料を含むが、これに限定されない、任意の形で用いられることがさらに意図される。さらに、本発明に従って調製されたコラーゲンは、所望の用途のために、および改善した生理活性応答をもたらすために必要に応じてさらに改変することができる。本発明の方法は、コラーゲンと同様に他の生体分子の調製に適用できることも意図される。
【００５５】
明細書全体を通して、「含む(comprise)」という単語ならびにその単語の変形(例えば、「含む(comprising)」および「含む(comprises)」)は、「を含むが、これに限定されない(including but not limited to)」を意味し、他の添加物、成分、整数、または段階を排除することは意図されない。
【００５６】
ここから、本発明を以下の非限定的な実施例のみを参照することでさらに説明する。しかしながら、以下の実施例は例示にすぎないことが理解されるべきであり、いかようにも、前記の本発明の一般性を制限するとみなしてはならない。例えば、実施例の大半はヒツジ皮膚に関連しているが、本発明は本明細書で開示された他の動物皮膚(例えば、ウシ、ブタ、および有袋類の皮膚を含む)にも適用できることが理解されるべきである。
【００５７】
実施例1  ヒツジ皮膚からのI型およびIII型コラーゲンの抽出
約5cmの長さのウールがついている新鮮なメリノ種羊皮を、地元の屠殺場から屠殺の直後に入手した。皮膚を冷蔵容器に入れて実験室に運んだ。皮膚から肉を機械的に削り取り、次いで、皮膚に約50mLの有機酸緩衝液を噴霧した。使用した緩衝液は、水酸化ナトリウムでpH4.0に調節した40％氷酢酸水溶液であった。
【００５８】
皮膚を、85％相対湿度で35℃で16時間インキュベートした。ウールを手で取り除き、残った毛またはウールを含むいかなる皮膚も取り除くように切り落とした。結果として得られたペルトの重量は約1.2kgであった。
【００５９】
次いで、ペルトを水で洗浄し、産業用フードプロセッサを用いて小片に切り刻んだ。
【００６０】
次いで、切り刻まれたペルトを、0.1M酢酸を含む非変性溶液に入れた。ペルトと使用した非変性溶液との比率は50:1(w/w)であった。次いで、懸濁液にペプシン(1:2000)をペプシン 対 組織比1:100で添加した。次いで、懸濁液を、時々攪拌して5℃で7日間インキュベートした。
【００６１】
インキュベーション後、懸濁液を10,000gで60分間遠心分離した。可溶化コラーゲンを含む上清、および不溶性の分散コラーゲンを含む沈殿物を回収した。
【００６２】
次いで、可溶性コラーゲンを、濃度10％(w/w)までの塩(NaCl)添加によって沈殿させた。次いで、結果として得られた懸濁液を遠心分離し、沈殿物を保持し、上清を捨てた。沈殿物を希酢酸(0.1M)に、沈殿物 対 酢酸比1:100で再溶解した。次いで、結果として得られた溶液を遠心分離した。溶解したコラーゲンを、所望の塩濃度レベルが得られるまで水を数回交換して透析し、次いで、凍結乾燥した。
【００６３】
この方法を用いて、市販のウシコラーゲンに匹敵する純度の30gのペプシン処理（pepsinised）可溶性コラーゲンを得た。生成された可溶性コラーゲンは、95％のI型コラーゲンおよび5％のIII型コラーゲンからなった。ヒドロキシプロリン含有量に基づいて、約270gの分散コラーゲンも生成されたと推定された。
【００６４】
実施例2  子ヒツジ皮膚からのI型およびIII型コラーゲンの抽出
実施例1に示した手順を、「乳飲み」子ヒツジ(すなわち、12〜14週齢未満の子ヒツジ)からの皮膚を用いて行った。この手順によって、存在するコラーゲンの50％を上回る量が酸可溶性コラーゲンとして単離された。I型とIII型の比率は、それぞれ90％ 対 10％であることが分かった。