(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（１）固体表面に核酸分子を固定するステップであって、該固体表面がキャピラリーの内壁である、前記ステップ、
（２）該核酸分子に、その配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーをアニーリングさせるステップ、
（３）ＤＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ｄＮＴＰ（Ｎは、Ａ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣである）、あるいはＲＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ＮＴＰ（Ｎは、Ａ，Ｕ，ＧまたはＣである）、を含む液滴を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの３’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
（４）結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの存在を検出するステップ、
（５）該結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を破壊するステップ、
（６）該色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類を順次変えて上記ステップ（３）から（５）を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと塩基対を形成するｄＮＴＰまたはＮＴＰを順次結合させるステップ、
（７）該結合されたｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（１）固体表面に、測定すべき核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーを固定するステップであって、該固体表面がキャピラリーの内壁である、前記ステップ、
（２）該プライマーに、該核酸分子をアニーリングさせるステップ、
（３）ＤＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ｄＮＴＰ（Ｎは、Ａ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣである）、あるいはＲＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ＮＴＰ（Ｎは、Ａ，Ｕ，ＧまたはＣである）、を含む液滴を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの３’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
（４）結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの存在を検出するステップ、
（５）該結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を破壊するステップ、
（６）該色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類を順次変えて上記ステップ（３）から（５）を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと相補するｄＮＴＰまたはＮＴＰを順次結合させるステップ、
（７）該結合されたｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３】
前記ステップ（４）において、前記色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を光学的に検出することからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（４）において、色素分子をレーザー光線の照射によって励起し、これによって放出された蛍光シグナルを検出することからなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出が共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて行なわれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（５）における色素分子の破壊が、前記ステップ（４）におけるものより強いレーザー光線の照射によって行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記色素が蛍光色素である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記液滴が、前記色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰを含有する水溶液を疎水性液体の内部に含む液滴からなる、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、単一分子検出によって単一核酸分子の塩基配列を決定する方法に関する。
発明の背景
ＤＮＡの塩基配列決定法として日常的に使用されている方法はＳａｎｇｅｒ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３，１９７７）である。この方法はジデオキシ鎖終止法とも称され、ＤＮＡ試料の５’末端にプライマーをアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼと４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸ｄＮＴＰ（ＮはＡ，Ｃ，ＴおよびＧである。）および各２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＮＴＰ（ＮはＡ，Ｃ，ＴまたはＧである。）の存在下に相補鎖合成を行い、ｄｄＮＴＰが取り込まれた位置で伸長反応を停止させ、得られた反応産物をゲル電気泳動にかけてＤＮＡ試料の塩基配列を決定する方法である。このとき形成されるＤＮＡ断片は一般に放射性標識され、これによって断片の位置が識別可能となる。
さらにまた、放射性標識を用いる場合には特別の施設が必要となるため、これに代わる標識として蛍光標識を用い、レーザー光線の照射により蛍光を検出する塩基配列決定法も開発されている（例えば特許第２９０１００４号公報、特公平７−４３３４７号公報など）。
しかしＳａｎｇｅｒ法を利用する場合、配列決定しようとするＤＮＡを予めＭ１３などのベクターに組み込んで大量に複製する必要があること、電気泳動１レーンあたり検出可能な塩基数は最大１０００ｂｐに制限されることなどの問題点がある。このため、ＤＮＡの塩基配列を５’末端から１塩基ずつ直接識別することにより該配列を決定することができ、且つＤＮＡの多数の複製分子を必要とせずに単離された単一ＤＮＡ分子を直接配列決定に使用することができるならば、配列決定の効率が著しく向上すると考えられる。
したがって、本発明の目的は、単一分子検出によって単一核酸分子の塩基配列を決定する方法を提供することである。この方法では、核酸の塩基を一分子ずつ検出することが可能であるとともに、細胞内のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を直接解読できるという利点が提供される。またこれにより、配列決定のスピードが約１〜２桁向上すると共に、一本鎖の核酸分子を多数複製することなしに直接配列決定にかけることができる。
発明の概要
本発明を以下に要約する。
本発明は、その一態様において、単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（１）固体表面に核酸分子を固定するステップ、
（２）該核酸分子に、その配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーをアニーリングさせるステップ、
（３）ＤＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣ）、あるいはＲＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｕ，ＧまたはＣ）、を含む液を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの３’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
（４）結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの存在を検出するステップ、
（５）該結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を破壊するステップ、
（６）該色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類を順次変えて上記ステップ（３）から（５）を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと相補するｄＮＴＰまたはＮＴＰを順次結合させるステップ、
（７）該結合されたｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む方法を提供する。
本発明はまた、別の態様において、単一色素分子検出によって核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（１）固体表面に、測定すべき核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーを固定するステップ、
（２）該プライマーに、該核酸分子をアニーリングさせるステップ、
（３）ＤＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣ）、あるいはＲＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｕ，ＧまたはＣ）、を含む液を該固定された核酸分子に提供して、該プライマーの３’末端にヌクレオチドを反応させ、このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込むステップ、
（４）結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの存在を検出するステップ、
（５）該結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を破壊するステップ、
（６）該色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類を順次変えて上記ステップ（３）から（５）を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと相補するｄＮＴＰまたはＮＴＰを順次結合させるステップ、
（７）該結合されたｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類に基づいて該核酸分子の塩基配列を決定するステップ
を含む方法を提供する。
本発明の一実施態様において、上記ステップ（１）の固体表面はキャピラリーの内壁である。
また本発明の別の実施態様において、上記ステップ（４）の検出は上記色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を光学的に検出することからなる。さらに具体的には、検出は、該色素分子をレーザー光線の照射によって励起し、これによって放出された蛍光シグナルを検出することによって行うことができる。このような検出方法として、例えば共焦点蛍光顕徴鏡システムを用いる方法を挙げることができる。
本発明のさらに別の実施態様において、上記ステップ（５）における色素分子の破壊はステップ（４）におけるものより強いレーザー光線の照射によって行なわれる。
本発明のさらに別の実施態様において、上記色素は蛍光色素である。
本発明のさらに別の実施態様において、上記液は、色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰを含有する水溶液を疎水性液体の内部に含む液滴からなる。
発明の詳細な説明
本発明は、単一分子検出法を用いることによってＤＮＡまたはＲＮＡからなる核酸分子の塩基配列を決定する方法を提供する。ここで単一分子検出法とは、任意の単一分子を任意の分析法で検出する方法を意味する。本発明においては、色素標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ、ここでＮはＡ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣである。）またはヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ、ここでＮはＡ，Ｕ，ＧまたはＣである。）の色素分子は、通常、分光学的装置を用いて光学的に検出することができ、後述の実施例では該検出は共焦点蛍光顕微鏡システムによって行なわれる（図２参照）。
以下においては、図１を参照しながら本発明を説明する。
本発明方法では、その第１ステップにおいて固体表面に核酸分子、または該核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマー、を固定する。
核酸分子は、核酸試料を通常の方法で精製し、例えば、アルカリ処理変性などをして一本鎖分子とした後に、固体表面に固定されうる。
プライマーは核酸分子にアニーリング可能であれば、そのサイズおよび種類は特に制限されない。サイズは、例えば少なくとも１０ヌクレオチド，通常約１５〜３０ヌクレオチドでよい。配列決定されるべき核酸分子の配列の一部が判明している場合には、その配列に基づいてプライマーを作製し使用することができる。あるいはプライマーとして、例えばランダムプライマーやオリゴｄＴプライマーを使用することもできる。
固体表面は核酸分子もしくはプライマーが固定されうるものであればいかなる材質のものでもよく、例えばそのような材質としてガラス、石英、樹脂等を挙げることができる。また固体表面の形状は平面、曲面等のいずれの形状でもよい。固体表面として、例えばキャピラリー（例えばガラス、石英、樹脂製）の内壁を使用することができる。キャピラリーは、キャピラリーの内部に核酸分子もしくはプライマーを固定したあと、その内部に色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰとポリメラーゼ酵素を含む液を自動的に送り込むのに適している。キャピラリーの内径は例えば約１００〜約２５０μｍであり、また長さは通常約１０〜約５０ｍｍで十分であるが、内径および長さはこれらに限定されないものとする。
固体表面は、配列決定すべき核酸分子もしくはプライマーが固定され易いように、また未反応の色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰ分子が付着しないような処理をしておくことが望ましい。固体表面への核酸分子もしくはプライマーの結合は、例えば一般的なＵＶクロスリンク法によって実施可能である。より具体的には、核酸をカルノア液（メタノール／酢酸（３：１ｖ／ｖ））に溶解した溶液を石英製ガラスキャピラリーの内部に入れ、室温で乾燥固化し、次いで２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ  １．７５ｇ、クエン酸ナトリウム０．８８２ｇ／１００ｍｌ）をキャピラリー中に入れＵＶを照射することによって、核酸を固体表面に結合することができる。核酸分子を固体表面に固定するときには、１分子の核酸を固定するのが望ましいが、実際には複数の核酸分子が表面に固定される。実際の測定においては、希釈された核酸分子（約０．１〜１００ｐｍｏｌ／μｌ、好ましくは３０〜７０ｐｍｏｌ／μｌ）を固体表面に固定し、固定された核酸分子１個を視野に入れて配列決定を行う。
第２のステップでは、固体表面上の核酸分子にプライマーをアニーリングさせるか、あるいは、固体表面上のプライマーに核酸分子をアニーリングさせる。
第３のステップでは、ＤＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣ）、あるいはＲＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｕ，ＧまたはＣ）、を含む液を該固定された核酸分子に提供して、上記プライマーの３’末端にヌクレオチドを反応させる。このとき該ポリメラーゼは反応部位と向かい合う塩基と塩基対を組むヌクレオチドを取り込む。
ここで「１種類の」とは、４種類の色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰのうちの特定の１つを意味する。その種類が特定されていることによって、プライマーに実際に結合するｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類が分かる。
図１では、核酸分子を固定したキャピラリーセル中に溶媒を流し、その流れに乗せてＤＮＡポリメラーゼと色素標識塩基ｄＡＴＰを１種類だけ含む液を導入し、すでに標的ＤＮＡに結合しているＤＮＡ配列ＡＴＧの次の塩基の反応を起こさせる。このときＤＮＡポリメラーゼによる塩基の取り込み反応が起こらなければ、未反応の塩基は洗い流されるので、単一分子検出によりＤＮＡ上に色素は検出されない。その時は、別の種類の塩基（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰ）を含む液に対して同様の操作を行う。この操作を、塩基が上記ＤＮＡ配列に取り込まれ、ＤＮＡ上に色素が検出されるまで繰り返す。図では、プライマーの３’側に結合したＡＴＧという配列まで分かった標的のＤＮＡに対して、ｄＴＴＰを含む液を作用させたときに色素を検出すればＡＴＧの次はＴであることが分かる。同じ塩基が連続して並んでいるＤＮＡ試料の場合、複数の塩基がＤＮＡ配列に取り込まれることも考えられるが、このような場合には色素の個数を例えば蛍光強度によって識別することによって何個の連続した塩基が取り込まれたかを検出することができる。
本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ｄＮＴＰ（ここでＮ＝Ａ，ＴもしくはＵ，ＧまたはＣ）、またはＲＮＡポリメラーゼと１種類の色素標識ＮＴＰ（ここでＮ＝Ａ，Ｕ，ＧまたはＣ）、を含有する液は、該色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰを含有する水溶液をミネラルオイル（鉱油）等の疎水性液体の内部に封入した液滴からなってもよい。このような液滴は例えばマイクロインジェクターを使って容易に調製することができる。液滴のサイズは、例えば直径約１０〜２５μｍであり、数百ｆＬの体積に相当する。
キャピラリーセルに流す溶媒としては、色素標識ｄＮＴＰもしくはＮＴＰやポリメラーゼを溶解可能な溶媒（例えばバッファー、例えば６７ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．５），６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含むバッファー）を用いることができる。液滴を使用する場合には、該液滴と非親和性である溶媒が好ましく、例えばＬｉｇｈｔ  ｗｈｉｔｅ  ｏｉｌ（ｄ＝０．８４ｇ／ｍｌ；一般市販名称ミネラルオイル）を使用できる。
ｄＮＴＰまたはＮＴＰを標識するための色素としては、蛍光体または発光体、例えばローダミンまたはフルオレセイン、例えばテトラメチルローダミン（ＴＭＲ、発光波長５７０ｎｍ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ、発光波長５７３ｎｍ）、ローダミン６Ｇ（発光波長５５０ｎｍ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、発光波長５１５ｎｍ）を使用することができる。その他、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラゾン（ＮＢＤ−Ｆ、発光波長５４０ｎｍ）、テキサスレッド（発光波長６０５ｎｍ）なども使用可能である。本発明の方法では、色素は塩基すなわちｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類に関係なく同一であってもよいし、あるいは塩基の種類に応じて異なっていてもよい。操作を簡便化するためには、同一の色素でｄＮＴＰまたはＮＴＰを標識するのが好ましい。ｄＮＴＰまたはＮＴＰに色素を結合する方法としては市販品を使用してもよいし、あるいは文献（例えばＪ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４４（５）：５２５−５２９（１９９６））に記載される方法に従って合成してもよい。
第４のステップでは、結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの存在を検出する。
結合された色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの検出は、図２に示すように、例えば共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて該核酸分子にレーザー光線を照射し、励起された色素分子が出す蛍光シグナルを検出器に導いて光子数を計数することによって蛍光シグナルを検出することにより行なわれる。
図２においては、アルゴンイオンレーザーの励起光（４８８ｎｍ）をダイクロイックミラーで反射させ、対物レンズを通してＤＮＡ試料に焦点を結ぶようにし、この励起光で励起された色素分子が出す蛍光シグナルをバンドパスフィルターを通して共焦点用のピンホール（例えば、直径５０μｍ）に導き、検出器（例えばアバランシェフォトダイオード）に入ってきた光子数をマルチチャンネルカウンターで数え、これによって蛍光シグナルを検出する。バンドパスフィルターを介在させることにより蛍光シグナルを選択的に取り出すことが可能となる。またピンホールを介在させることにより不要な光が除去される。
第５のステップでは、結合した色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの色素分子を破壊する。
本発明によれば、核酸分子上で色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰを反応させ色素分子が検出された後で次の色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰが結合する前に、検出を終えた色素分子を破壊する必要がある。このための手段として、例えばステップ（４）におけるものより強いレーザー光線（例えば約１０ｍＷ）を照射する方法が使用できる。
第６のステップでは、色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類を順次変えて上記ステップ（３）から（５）を繰り返し、該核酸分子のヌクレオチドと塩基対を形成するｄＮＴＰまたはＮＴＰを順次結合させる。
ここで「色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類を順次変えて」とは、４種類の色素標識ｄＮＴＰまたはＮＴＰのうち特定の塩基を核酸分子に送り込み、結合が起こらない場合には別の特定の塩基を送り込み、それでも結合が起こらない場合にはさらに別の特定の塩基を送り込み、というように、結合が起こるまで塩基の種類を変えることを意味する。塩基の結合が起こったか否かをステップ（４）で確認し、結合した塩基の色素分子の破壊をステップ（５）で行う。このステップ（３）から（５）の操作を核酸分子の塩基数（最大）分だけ順次繰り返し行う。
第７のステップでは、結合されたｄＮＴＰまたはＮＴＰの種類に基づいて核酸分子の塩基配列を決定する。
実施例
本発明の方法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されないものとする。
〔実施例１〕
ジー・エルサイエンス（株）（日本）より購入したカプトン被覆石英製ガラスキャピラリー（内径２００μｍ×長さ２０ｍｍ）をバーナーで加熱し、被覆カプトンの一部を燃焼除去し、この部分を顕微鏡の観察窓とした。このキャピラリーをアセトン、１Ｍ  ＫＯＨ、濃Ｈ２ＳＯ４／３０％Ｈ２Ｏ２（１：２ｖ／ｖ）混合液の順に浸して、ガラス表面に付着した油分や有機物を除去、洗浄した。このガラスキャピラリーの内壁に鋳型ＤＮＡをＵＶクロスリンク法で固定した。すなわち、ＤＮＡをカルノア液（メタノール／酢酸（３：１ｖ／ｖ））に溶解した溶液をガラスキャピラリーの内部に入れ、室温で乾燥固化し、次いで２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ  １．７５ｇ、クエン酸ナトリウム０．８８２ｇ／１００ｍｌ）をキャピラリー中に入れＵＶを照射することによって、ＤＮＡを固体表面に結合した。このとき、カルノア液中の鋳型ＤＮＡの濃度は５０ｐｍｏｌ／μｌとしたが、この濃度に調整することにより、単一鋳型ＤＮＡ上の反応を確認できる程度に十分まばらな密度でＤＮＡを固定することができる。
次にこの鋳型ＤＮＡに対してＤＮＡポリメラーゼ反応を行った。反応液は、バッファー液（６７ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．５），６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に鋳型ＤＮＡに相補する配列をもつプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、東洋紡績（株）から購入）、色素標識ヌクレオチドを溶解したものである。この反応液を鋳型ＤＮＡに反応させ、取り込み反応を行った。
反応後、反応液を除去し、上と同じ溶媒をキャピラリー中に流して洗浄を行った。次いで、このガラスキャピラリー内壁を共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて結合色素を観察した。すなわち、レーザー光で色素標識ヌクレオチドの色素分子を励起し、これからの蛍光を観察した。このとき、鋳型ＤＮＡは十分まばらにガラスキャピラリーの内壁表面に固定されているので、単一鋳型ＤＮＡ上の取り込み反応を確認できた。
以下、実験例を詳述する。
使用した試薬類
鋳型ＤＮＡ  Ｎｏ．１（配列番号１）
0004721606.tif 000002
鋳型ＤＮＡ  Ｎｏ．２（配列番号２）
0004721606.tif 000003
プライマーＮｏ．１（配列番号３）
0004721606.tif 000004
プライマーＮｏ．２（配列番号４）
0004721606.tif 000005
色素標識ヌクレオチド
ＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰ（フナコシ（株）から購入；吸収波長５４                                  ４ｎｍ蛍光波長５７０ｎｍ）
ＴＭＲ−ｄＡＴＰ（第一化学薬品（株）から購入；吸収波長５５０ｎｍ蛍光                    波長５７０ｎｍ）
ＴＭＲ−ｄＧＴＰ（第一化学薬品（株）から購入；吸収波長５５０ｎｍ蛍光                    波長５７０ｎｍ）
実験１および結果
鋳型ＤＮＡ  Ｎｏ．１とプライマーＮｏ．１の組み合わせで、ＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰヌクレオチドを反応させた。このＤＮＡの組合せでは、ｄＵＴＰが鋳型ＤＮＡに取り込まれるような配列になっている。実際上記の方法に準じて実験を行った結果、ＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰヌクレオチドが単一鋳型ＤＮＡに取り込まれたことを単一の蛍光分子からの蛍光の存在によって確認した。また参照試験１として、ＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰヌクレオチドが単にガラスキャピラリー内壁に付着しているのではないことを確認する試験を行った。すなわち、内壁に鋳型ＤＮＡを固定していないガラスキャピラリーに上記反応液を反応させ、ＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰヌクレオチドがガラスキャピラリー表面に付着していないことを蛍光が観察されないことにより確認した。さらに参照試験２として、ＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰヌクレオチドの代わりにＴＭＲ−ｄＡＴＰヌクレオチドを用いた試験を行った。この場合、ＴＭＲ−ｄＡＴＰでは単一鋳型ＤＮＡには取り込まれないはずである。実際に、該ヌクレオチドが単一鋳型ＤＮＡに取り込まれていないことを蛍光が観察されないことにより確認した。
実験２および結果
鋳型ＤＮＡ  Ｎｏ．２とプライマーＮｏ．２の組み合わせで上記と同様に実験を行った。このＤＮＡの組合せでは、ｄＡＴＰが鋳型ＤＮＡに取り込まれるような配列になっている。ＴＭＲ−ｄＡＴＰヌクレオチドを反応させた場合と、ＴＭＲ−ｄＧＴＰヌクレオチドを反応させたときを比較した結果、ＴＭＲ−ｄＡＴＰが単一鋳型ＤＮＡに取り込まれたのに対し、ＴＭＲ−ｄＧＴＰは単一鋳型ＤＮＡに取り込まれていないことを確認した。
実験３および結果
実験１において、キャピラリー内壁に単一鋳型ＤＮＡ  Ｎｏ．１とプライマーＮｏ．１の組み合わせでＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲ−ｄＵＴＰを取り込んだ試料に対して１０ｍＷの４８８ｎｍのレーザー光を数秒間照射して色素標識ヌクレオチドの色素分子を破壊した。同様に実験２において、キャピラリー内壁で単一鋳型ＤＮＡ  Ｎｏ．２とプライマーＮｏ．２の組み合わせでＴＭＲ−ｄＡＴＰを取り込んだ試料に対して同様に色素標識ヌクレオチドの色素分子を破壊した。この試料に対して色素標識ヌクレオチドの反応を繰り返し、取り込まれたヌクレオチドの種類を次々に特定すればよい。
産業上の利用可能性
本発明により核酸の塩基配列を一塩基ずつ検出し解読することが可能となった。
配列表フリーテキスト
配列番号１−人工配列の説明：合成鋳型ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成鋳型ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の単一色素分子検出によりＤＮＡの塩基配列を決定する方法を模式的に示したものである。
図２は、共焦点蛍光顕微鏡システムを用いて色素分子由来の蛍光シグナルを検出する仕方を模式的に示したものである。
【図１】
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【図２】
0004721606.tif 000009