(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
この基板の上部に設けた第一の貯留槽と、
前記基板の下部に設けた第二の貯留槽と、
前記第一の貯留槽および前記第二の貯留槽との電位差を検出するためそれぞれに設けられた測定電極とを備え、
前記基板は、
この基板の上面に設けた凹部と、
この凹部の底部から開口し前記基板の下面まで繋がる貫通孔とを有し、
この貫通孔の開口部は、
前記凹部の内部に向けて上方に突出した突出部を備え、
この突出部は、
その先端から湾曲して外方へ下降する前記凹部の内壁と、
前記貫通孔の内壁とで形成され、
前記突出部の先端は、前記基板上面より下方にある細胞電気生理測定デバイス。
【請求項２】
前記突出部の先端は、
上方に丸みを帯びた湾曲面で形成されている請求項１に記載の細胞電気生理測定デバイス。
【請求項３】
前記貫通孔は、
前記基板に対して垂直な円柱構造、
または前記開口部から前記基板の下面に向けて口径が広がるテーパ構造である請求項１または２に記載の細胞電気生理測定デバイス。
【請求項４】
前記基板はシリコンからなり、
この基板表面は絶縁膜で被覆されている請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞電気生理測定デバイス。
【請求項５】
基板の上面から下面に向けてドライエッチングで貫通孔を形成し、
次にこの貫通孔の内壁に保護膜を形成し、
その後前記基板上において、前記貫通孔の外郭に環状のエッチングホールを有するマスクを形成し、
このマスク上方からドライエッチングで凹部を形成する工程からなり、
前記凹部を形成するドライエッチング工程は、
前記凹部の内壁と前記貫通孔の内壁とが繋がるようにドライエッチングし、前記貫通孔の開口部に前記凹部の内部に向けて上方に突出する突出部を形成する細胞電気生理測定デバイスの製造方法。
【請求項６】
前記貫通孔内壁に保護膜を形成する工程において、
前記貫通孔の内壁にはポリマー膜またはＳｉＯ2のいずれかを形成する請求項５に記載の細胞電気生理測定デバイスの製造方法。
【請求項７】
前記凹部を形成するドライエッチング工程において、
エッチングガスにＣＦ4またはＳＦ6またはＸｅＦ2またはＣｌＦ3またはＮＦ3またはこれらの混合ガスのいずれかを用いる請求項５または６に記載の細胞電気生理測定デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤に対する細胞の反応、或いは細胞が発する電気生理現象によって生じる電気化学的変化を測定するために用いられる細胞電気生理測定デバイスと、この細胞電気生理測定デバイスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
図１３に示すように、従来開示されている細胞電気生理測定デバイス１は、基板２と、この基板２の上部に設けた第一の貯留槽３と、基板２の下部に設けた第二の貯留槽４と、第一の貯留槽３および前記第二の貯留槽４にそれぞれ接続された第一の測定電極５および第二の測定電極６とを備えている。そして基板２は、上面に設けた凹部７と、この凹部７から基板２の下面まで繋がる貫通孔８とを有している。
【０００３】
そしてこの細胞電気生理測定デバイス１は、第一の貯留槽３に被験体細胞９を包含する培養液１０ａを注入し、貫通孔８の上方から加圧、あるいは下方から減圧することで培養液１０ａを吸引し、被験体細胞９を凹部７に捕捉することができる。そして例えばこの被験体細胞９の上から薬剤を投与し、第一の貯留槽３の培養液１０ａと第二の貯留槽４の培養液１０ｂとの電位差を第一の測定電極５および第２の測定電極６で測定し、検出装置１１を用いて比較・分析することで被験体細胞９の薬理反応を判断することができる。
【０００４】
なお、この出願の発明に関する先行技術文献情報としては、特許文献１や非特許文献１などが知られている。
【特許文献１】特開２００４−６９３０９号公報
【非特許文献１】Ｔ.Ｌehnertetal, Ｍicro Ｔotal Ａnalysis Ｓystems 2002，pp.28-30（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記従来の構成では、細胞電気生理測定デバイス１の測定精度が低いという問題があった。
【０００６】
これは被験体細胞９と貫通孔８の開口部８ａとの密着性が低く、被験体細胞９を境とした第一の貯留槽３と第二の貯留槽４との間の電気的絶縁性が十分に確保されていない為であった。そしてその結果、測定精度が低下するのであった。
【０００７】
そこで本発明は、上記課題を解決し、細胞電気生理測定デバイス１における測定精度を高めることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的を達成するために本発明は、被験体細胞と密着させる貫通孔の開口部には、凹部の内部に向けて上方に突出した突出部を備え、この突出部は、その先端から湾曲して外方へ下降する凹部の内壁と、貫通孔の内壁とで形成されるものとした。
【発明の効果】
【０００９】
この構成により本発明は、被験体細胞と貫通孔開口部との密着性を高めることができる。
【００１０】
それは、前述の突出部によって被験体細胞と貫通孔開口部との接触面積が増大し、かつこの突出部が被験体細胞へ食い込み、接触抵抗が大きくなるためである。そしてその結果、細胞電気生理測定デバイスの測定精度を向上させることが出来るのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施の形態１）
以下、本実施の形態における細胞電気生理測定デバイスの構成を説明する。
【００１２】
図１の断面図に示すように、本実施の形態の細胞電気生理測定デバイス１２は、基板１３と、この基板１３の上部に設けられた、第一の貯留槽１４を有するウェル１５と、基板１３の下部に設けられた、第二の貯留槽１６を有するプレート１７と、第一の貯留槽１４内に設けられた第一の測定電極１８と、第二の貯留槽１６内であって、基板１３の下面に設けられた第二の測定電極１９と、これらの第一の測定電極１８および第二の測定電極１９により得られた電位を比較検出する検出装置２０とを備えている。
【００１３】
なお、第一の貯留槽１４は培養液２１ａを貯留するためのものであり、第二の貯留槽１６は培養液２１ｂを貯留するためのものである。また第一の測定電極１８と第二の測定電極１９とは、培養液２１ａと培養液２１ｂとの電位差を検出するためのものである。
【００１４】
そして基板１３は、その上面に、被験体細胞２２を捕捉保持する凹部２３と、この凹部２３の底部から基板１３下面までをつなぐ貫通孔２４とを有し、この貫通孔２４の開口部２４ａは、凹部２３の内部に向けて上方に突出した突出部２４ｂを有している。そしてこの突出部２４ｂは、その先端から湾曲して斜め外方へ下降する凹部２３の内壁と、この凹部２３の内壁と連続する貫通孔２４の内壁とで形成されている。本実施の形態では、図２に示すように、貫通孔２４は基板１３に対し垂直な円柱構造に形成し、突出部２４ｂは、その先端が鋭利なものではなく、上方に向かって丸みを帯びた湾曲面で形成されたものとした。また、突出部２４ｂの先端を、基板１３上面より下方に形成し、凹部２３に適切に被験体細胞（図１の２２）を捕捉できるようにしている。
【００１５】
なお、図３の基板１３の斜視図に示すように、本実施の形態における細胞電気生理測定デバイス１２は、基板１３に前述の凹部２３および貫通孔２４を複数個形成している。また、基板１３としては単結晶シリコンを用い、この基板１３の表面にはシリコン酸化物からなる絶縁膜（図１１の３０）を形成している。
【００１６】
さらに、被験体細胞（図１の２２）としては哺乳類細胞を用いた。この場合、代表的な培養液２１ａとしては、Ｋ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液、培養液２１ｂとしてはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液が挙げられる。
【００１７】
次に、本発明の細胞電気生理測定デバイス１２の動作について説明する。
【００１８】
図１に示すように、まず、第一の貯留槽１４を、被験体細胞２２を包含する第一の培養液２１ａで満たし、第一の貯留槽１４側から加圧（あるいは第二の貯留槽１６側から減圧）して第一の培養液２１ａを貫通孔２４の第二の貯留槽１６側へ流動させる。
【００１９】
するとこの第一の培養液２１ａの流動に伴い、被験体細胞２２が凹部２３に捕捉される。この捕捉された被験体細胞２２によって、第一の培養液２１ａと第二の培養液２１ｂとが電気的に分離される。
【００２０】
次に第二の貯留槽１６側から吸引、もしくは薬剤（例えばナイスタチンなど）を投入することで被験体細胞２２の第二の貯留槽１６側の細胞膜に微細小孔を形成する。
【００２１】
その後第一の貯留槽１４側から被験体細胞２２に対して刺激となりうる行為を施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒薬などの化学的刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的刺激が挙げられる。
【００２２】
ここで被験体細胞２２がこれらの刺激に対して反応を示せば被験体細胞２２の細胞膜内に存在するイオンチャネルが活性または拮抗し、このイオンチャネルを介してイオンの移動量が変化するため、この被験体細胞２２を通過した第二の培養液２１ｂの電位に変化が生じることになる。
【００２３】
この電位を第一の測定電極１８と第二の測定電極１９で検出し、検出装置２０で比較・分析することで、薬剤が被験体細胞２２に対して有効性を有するかどうかなどを判断するのである。
【００２４】
このとき、被験体細胞２２が高い密着性を持って貫通孔２４の開口部２４ａおよび凹部２３に接触保持されることで低いバックグラウンドノイズで被験体細胞２２の電気生理現象を測定することが可能となる。
【００２５】
次に、本実施の形態における細胞電気生理測定デバイス１２の製造方法を説明する。
【００２６】
まず図４に示すように、基板１３の上面にフォトリソグラフィーによりレジストマスク２６を形成する。このレジストマスク２６には、所望の貫通孔２４の開口部２４ａと略同形状のマスクホール２７を形成しておく。
【００２７】
次に図５に示すように基板１３をドライエッチングして貫通孔２４を形成する。この時のエッチングガスとしては、エッチングを促進するガス（以下エッチングガスという）とエッチングを抑制するガスと（以下抑制ガスという）とを交互に用いる。
【００２８】
エッチングガスとしてはＳＦ6、ＣＦ4、ＸｅＦ2などがある。また、抑制ガスとしてはＣＨＦ3、Ｃ4Ｆ8などが挙げられる。
【００２９】
これらのエッチングガスにより基板１３を少しエッチングし、その後抑制ガスによりシリコン面に保護膜を形成するステップを繰り返すことで、基板１３の上面に対して垂直方向のみのエッチングが可能となる。
【００３０】
そして図６に示すように、貫通孔２４を形成後、抑制ガスを吹き付け、貫通孔２４側壁にポリマーからなる保護膜２５を形成し、レジストマスク２６を除去する。なお、この保護膜２５を形成するその他の方法として、貫通孔２４を形成し、レジストマスク２６を除去した後に熱酸化法、ＣＶＤ法、スパッタリング法等の成膜方法を用いて酸化物からなる保護膜２５を形成する方法がある。この後者の方法では、後述する凹部２３を形成する工程で利用するレジストマスク（図７の２８）のエッチングホール（図７の２９）に沿って基板１３の上面に成膜された保護膜２５をエッチングする必要がある。この際、エッチングには上面のみのエッチングが可能なドライエッチングが有効となる。
【００３１】
なおこの保護膜２５によって、後の凹部２３形成の際のドライエッチングの影響を受けず、貫通孔２４の形状を保つことができる。
【００３２】
次に図７に示すように、基板１３に貫通孔２４の開口部２４ａの外郭に環状のマスクホール２９を有する新たなレジストマスク２８を形成し、ＳＦ6またはＣＦ4またはＸｅＦ2またはＣｌＦ3またはＮＦ3またはこれらの混合ガスのいずれかを用いたエッチングガスでＳｉのドライエッチングを施す。
【００３３】
すると図８に示すように、環状のマスクホール２９の部分を中心に等方的にエッチングが進み、凹部２３が形成される。
【００３４】
このとき、図９に示すように、貫通孔２４の内壁と凹部２３の内壁とが連結し、突出部２４ｂの先端が基板１３の上面より下方になるまでエッチングを施した後、レジストマスク２８を除去する。この時同時に保護膜２５も除去され、図１０に示すように、貫通孔２４の開口部２４ａには凹部２３内方に向かって上方に突出した突出部２４ｂを形成することが出来る。
【００３５】
さらにその後、図１１に示すように、熱酸化法、ＣＶＤ法、スパッタリング法等の成膜方法を用いることで構造体表面にシリコン酸化物からなる絶縁膜３０を形成する。この絶縁膜３０は、その他シリコン窒化物膜などによって形成してもよい。この絶縁膜３０が成膜されることで突出部２４ｂの先端は丸みを帯びた湾曲面で形成される。
【００３６】
その他突出部２４ｂの先端を上記のような湾曲面で形成するには、ドライエッチングあるいはウェットエッチング加工や、不活性ガスによるアニール処理で鋭利なエッジ部分を丸くする方法がある。
【００３７】
本実施の形態における効果を以下に説明する。
【００３８】
まず、本実施の形態では、細胞電気生理測定デバイス１２の測定精度を高めることが出来る。
【００３９】
これは、図１に示すように、貫通孔２４の開口部２４ａには、凹部２３の内方に向けて上方に突出した突出部２４ｂがあり、この突出部２４ｂは、その先端から湾曲して外方へ下降する凹部２３の内壁と、貫通孔２４の内壁とで形成されていることに由来する。
【００４０】
すなわち、突出部２４ｂは上記構成によってなだらかに湾曲する傾斜面で凹部２３と一体となっていることから、被験体細胞２２は、この凹部２３内壁の湾曲面に沿って、隙間が極力ないよう密着することができ、被験体細胞２２と貫通孔２４の開口部２４ａとの当接面積を増すことができるためである。
【００４１】
さらにこの突出部２４ｂが被験体細胞２２を吸引する方向と逆向きに形成されていることから、吸引の際に接触抵抗が増し、突出部２４ｂが被験体細胞２２に食い込むような形となる。
【００４２】
そしてこのような当接面積の増大と食い込みにより、貫通孔２４開口部と被験体細胞２２との密着性が増し、この結果測定精度を向上させることが出来るのである。
【００４３】
また、本実施の形態では、図２に示すように突出部２４ｂの先端を、上方に向けて丸みを帯びた湾曲面で構成したことから、被験体細胞２２が突出部２４ｂに食い込んだ際も、被験体細胞２２の細胞膜の破損を抑制することができる。
【００４４】
さらに図１１に示すように、凹部２３および貫通孔２４の内壁を含む基板１３表面全体をシリコン酸化物からなる絶縁膜３０で被覆したことにより、微細加工に適したシリコン基板１３を用いつつ、基板１３上面と下面との間の絶縁性を確保することができる。そしてこのシリコン酸化物膜は同時に親水性を有することから、貫通孔２４の開口部２４ａ近傍において被験体細胞２２の密着性をさらに向上させることができる。
【００４５】
また、貫通孔２４内壁も親水性の高いシリコン酸化物膜で被覆することで貫通孔２４内部における流路抵抗が低減され、吸引ポンプなどによる吸引効率が向上し、被験体細胞２２が貫通孔２４の開口部２４ａ近傍および凹部２３に密着し易くなる。
【００４６】
なお、本実施の形態では絶縁膜３０としてシリコン酸化物を用いたが、他の酸化膜、窒化膜など親水性を有する絶縁膜３０を用いれば上記と同様の効果を得られる。
【００４７】
（実施の形態２）
本実施の形態と実施の形態１との違いは、図１２に示すように貫通孔３１の形状を、貫通孔３１の開口部３１ａから基板１３下面に向けて広がったテーパ構造にしたことである。
【００４８】
これにより貫通孔３１の開口部３１ａから基板１３下面に行くにつれて培養液２１ｂの流束密度が徐々に減少するため、安定して培養液２１ｂを吸引することができる。そしてその結果、被験体細胞２２を貫通孔３１の開口部３１ａに的確に吸引することができる。
【００４９】
なお、本実施の形態における貫通孔３１は、この貫通孔３１を形成するドライエッチング工程において、エッチングを促進するガス（エッチングガス）とエッチングを抑制するガス（抑制ガス）の割合を、エッチングが進むに従って（貫通孔３１の下部に行くに従って）、エッチングガスの割合を増やせばよい。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の細胞電気生理測定デバイスは、細胞の薬剤に対する反応、或いは細胞が発する電気生理現象によって生じる電気化学的変化を、高精度で測定するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の細胞電気生理測定デバイスの断面図
【図２】本発明の細胞電気生理測定デバイスの要部拡大模式断面図
【図３】本発明の細胞電気生理測定デバイスの斜視図
【図４】本発明の細胞電気生理測定デバイスの製造工程を示す断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同断面図
【図１２】本発明の細胞電気生理測定デバイスの要部断面図
【図１３】従来の細胞電気生理測定デバイスの断面図
【符号の説明】
【００５２】
１  細胞電気生理測定デバイス
２  基板
３  第一の貯留槽
４  第二の貯留槽
５  第一の測定電極
６  第二の測定電極
７  凹部
８  貫通孔
８ａ  開口部
９  被験体細胞
１０ａ  培養液
１０ｂ  培養液
１１  検出装置
１２  細胞電気生理測定デバイス
１３  基板
１４  第一の貯留槽
１５  ウェル
１６  第二の貯留槽
１７  プレート
１８  第一の測定電極
１９  第二の測定電極
２０  検出装置
２１ａ  第一の培養液
２１ｂ  第二の培養液
２２  被験体細胞
２３  凹部
２４  貫通孔
２４ａ  開口部
２４ｂ  突出部
２５  保護膜
２６  レジストマスク
２７  マスクホール
２８  レジストマスク
２９  マスクホール
３０  絶縁膜
３１  貫通孔
３１ａ  開口部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004742973.tif 000009
【図９】
0004742973.tif 000010
【図１０】
0004742973.tif 000011
【図１１】
0004742973.tif 000012
【図１２】
0004742973.tif 000013
【図１３】
0004742973.tif 000014