(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）エストラジオール、エストロン及びプレグネノロンから選ばれるステロイドホルモンと、（Ｂ）塩酸イリノテカン、ＳＮ−３８、トポテカン及びミトキサントロンから選ばれる癌細胞がＢＣＲＰによる耐性を獲得し得る抗癌剤とを含有する、ＢＣＲＰにより抗癌剤耐性を獲得した癌に対する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗癌剤耐性を獲得した癌に対して有効な抗癌剤及び当該抗癌剤のスクリーニングに有用な細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
塩酸イリノテカン等のカンプトテシン類、ミトキサントロン等の抗癌剤は、抗悪性腫瘍効果が極めて高いことから広く用いられているが、長期連用により抗癌効果が低下する場合のあることが指摘されている。
【０００３】
癌細胞による、これらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては、最近研究されており、ＡＢＣトランスポータの一つであるＢＣＲＰが、これらの抗癌剤耐性獲得に関与していることが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(26), 15665-15670(1998)）。すなわち、抗癌剤が長期連用されると癌細胞内にＢＣＲＰが発現し、当該ＢＣＲＰは抗癌剤を細胞外へ排出することにより抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を有することが判明した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、当該ＢＣＲＰ発現の増大のみにより抗癌剤耐性を獲得するに至った白血病細胞系は見出されておらず、良好な実験系が存在しないことから、抗癌剤耐性を克服するための手段の開発ができなかった。
従って、本発明の目的は、抗癌剤耐性克服剤のスクリーニングに有用な白血病細胞系、及び抗癌剤耐性を獲得した癌に対しても有効な抗癌剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、白血病細胞であるＫ５６２、Ｐ３８８等を用いてＢＣＲＰ遺伝子の導入について検討したところ、外来性ＢＣＲＰ遺伝子を保有し、抗癌剤耐性を獲得した白血病細胞の樹立に成功した。そしてさらに当該白血病細胞を用いて種々の物質についてスクリーニングしたところ、ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物又はそれらのホルモンに拮抗作用を有する化合物が、抗癌剤耐性を獲得した白血病細胞への抗癌剤の取り込みを増大させ、その結果抗癌剤耐性を克服させる効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物又はそれらのホルモンに拮抗作用を有する化合物を有効成分とするＢＣＲＰによる癌細胞の抗癌剤耐性克服剤を提供するものである。
また本発明は、（Ａ）ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物又はそれらのホルモンに拮抗作用を有する化合物、及び（Ｂ）癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤を含有する抗癌剤を提供するものである。
さらにまた本発明は、外来性ＢＣＲＰ遺伝子を有する白血病細胞を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
まず、外来性ＢＣＲＰ遺伝子を有する白血病細胞について説明する。
【０００８】
白血病細胞に導入すべきＢＣＲＰ遺伝子は、DDBJのaccession number AB056867に登録されており、Doyle, L.A., Yang, W., Abruzzo, L. V., Krogmann, T., Gao, Y., Rishi, A.K. and Ross, D. D. Amultidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(26), 15665-15670(1998)などに記載されている。当該ＢＣＲＰ遺伝子としては、ＢＣＲＰを発現し得るものであればよく、例えばレトロウイルスベクターに挿入したプラスミド、ｐＨａＢＣＲＰ、ｐＨａ−ＢＣＲＰ−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ等として用いることができる。より具体的にはＭｙｃエピトープを付したＢＣＲＰをレトロウイルスベクターに挿入したプラスミドが特に好ましい。
【０００９】
白血病細胞としては、もともとＢＣＲＰを発現していないこと、培養が容易であること、ＢＣＲＰによって輸送される抗癌剤に高い感受性を示すことなどから、Ｋ５６２細胞、Ｐ３８８細胞、Ｌ１２１０細胞、ＨＬ−６０細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞等が好ましい。
【００１０】
白血病細胞へのＢＣＲＰ遺伝子の導入手段としては、ＢＣＲＰ遺伝子を導入したレトロウイルス等を用いれば常法に従い容易に行うことができる。
【００１１】
かくして得られたＢＣＲＰ遺伝子を有する白血病細胞は、ＢＣＲＰを発現し、抗癌剤の細胞内への取り込みを低下させることにより、抗癌剤耐性を獲得しており、抗癌剤耐性克服剤のスクリーニング用細胞として有用である。特にレトロウイルスを用いて遺伝子導入されたＢＣＲＰ発現白血病細胞では、親株と比べてＤＭＲ１、ＭＲＰなどの他の抗癌剤耐性遺伝子の変化がないこと、及び取り扱い性が良好であることから、ＢＣＲＰによる抗癌剤耐性克服の研究に優れている。当該細胞は、直接in vitroでスクリーニングに用いてもよいが、マウス等の動物に移植することにより、in vivoのスクリーニングに用いることもできる。
【００１２】
当該細胞を用いて検討した結果、ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物又はそれらのホルモンに拮抗作用を有する化合物を、これらの細胞に添加すると抗癌剤に対する感受性、すなわち抗癌剤による癌細胞増殖抑制効果が回復することが判明した。従って、これらの薬物は癌細胞の抗癌剤耐性克服剤として有用である。
【００１３】
ここでステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、及びそれらのホルモンに拮抗作用を有する化合物としては、女性ホルモン及びその類縁体、女性ホルモン拮抗剤及びその類縁体が好ましい。具体的にはエストロン、エストラジオール、エストラジオールベンゾエート、エストラジオールジプロピオネート、エストラジオールバレレート、エチニルエストラジオール、エストリオール、エストリオールアセテートベンゾエート、エストリオールトリプロピオネート、結合型エストロゲン、メストラノール、ジエチルスチルベストロール、ジエチルスチルベストロールジプロピオネート、ホスフェストロル、リン酸エストラムスチンナトリウム等の卵胞ホルモンとその類縁体；プロゲステロン、プレグネロン、プレグナンジオール、ジドロゲステロン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロンアセテート、クロルマジノンアセテート、アリルエストレノール、ゲストノロンカプロエート等の黄体ホルモンとその類縁体；ノルエチステロン、アリルステロール等のノルテストステロン類；タモキシフェンサイトレート、トレミフェンサイトレート等の女性ホルモン拮抗剤が挙げられる。
【００１４】
また、抗癌剤耐性克服剤の対象となる抗癌剤としては、ＢＣＲＰにより耐性を生じる抗癌剤であれば制限されないが、例えば塩酸イリノテカン、トポテカン等のカンプトテシン類；ミトキサントロン等のアンスラキノン類；７−ヒドロキシスタウロスポリン等のスタウロスポリン類；アドリアマイシン等のアンスラサイクリン類が挙げられる。
【００１５】
また、本発明の抗癌剤耐性克服剤の対象癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に制限されない。
【００１６】
本発明の（Ａ）抗癌剤耐性克服剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治療効果が回復するので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物は新たな抗癌剤として有用である。
【００１７】
本発明の抗癌剤耐性克服剤又は新たな抗癌剤は、これらの成分が従来用いられている製剤をそのまま併用することにより投与してもよいが、これらの成分を含む新たな製剤としてもよい。これらの製剤の形態としては、経口剤、注射剤（筋肉、皮下、静脈を含む）、坐剤、外用剤（パッチ剤、塗布剤）等が挙げられる。
【００１８】
本発明の抗癌剤耐性克服剤の投与量は、投与法、症状等により異なるが、１日あたり１mg〜１０ｇ、特に１００mg〜３ｇが好ましい。また、（Ｂ）癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤の投与量は、通常の薬効量でよく、例えば、１mg〜１ｇ、特に２mg〜３００mgが好ましい。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
（１）ＢＣＲＰ遺伝子
本発明では、ＰＣＲ法を用いてヒト胎盤ｍＲＮＡより単離したヒトＢＣＲＰｃＤＮＡを用いた。このＰＣＲでは、Clontech社のHuman placenta Marathon-ready cDNAを鋳型とし、プライマーとしてヒトＢＣＲＰ  ｃＤＮＡの５’側のプライマー１Ｓ（CCT GAG ATC CTG AGC CTT TGG TT）（配列番号１）および３’側のプライマー５ＡＳ（GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号２）の２本のオリゴヌクレオチドを用いて、Clontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、９４℃で１分の反応を１回行った後、９４℃で３０秒、６８℃で３分の反応を３５回繰り返し、最後に９４℃で３０秒、６８℃で１５分の反応を１回行い、約２１５０ｂｐの増幅されたｃＤＮＡを得た。これをｐＣＲ２．１プラスミドにサブクローニングして、Applied Biosystems社のABI PRISM377 DNAシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。独立な４クローンの塩基配列を決定し、ＰＣＲによる変異と推定される部分は除いて、本遺伝子のコード領域の塩基配列とそれから予想されるアミノ酸配列を推定した。この塩基配列を配列番号３、推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。本発明では、この配列を野生型ＢＣＲＰの配列とする。本発明のＢＣＲＰの配列はDDBJ accession number AB056867として登録されている。
【００２１】
（２）ＢＣＲＰ発現プラスミドの作成
次に、このＢＣＲＰ  ｃＤＮＡにＭｙｃエピトープを付けてレトロウイルスベクターに挿入するために、末端の修飾を目的とした２度目のＰＣＲを行った。Ｍｙｃエピトープタグを付加するためのＰＣＲでは、上記のＰＣＲ反応で得られたヒトＢＣＲＰ  ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｍｙｃエピトープタグを含む５’側のプライマー５Ｍｙｃ−２０４Ｓ（CCC CGC GGC ATG GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG TCT TCC AGT AAT GTC GAA GTT TTT ATC CCA GTG TC）（配列番号５）および３’側のプライマー８ＡＳ（CGC CTC GTG GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ＰＣＲはClontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、９４℃で１分の反応を１回行った後、９４℃で３０秒、６８℃で３分の反応を２０回繰り返し、最後に９４℃で３０秒、６８℃で１５分の反応を１回行い、約２２００ｂｐの増幅されたｃＤＮＡを得た。増幅されたｃＤＮＡをサブクローニングして塩基配列を決定し、ＰＣＲによる変異が起きていないことを確認した。ＨＡエピトープタグを付加するためのＰＣＲでは、上記のＰＣＲ反応で得られたヒトＢＣＲＰ  ｃＤＮＡを鋳型とし、ＨＡエピトープタグを含む５’側のプライマー５ＨＡ−２０４Ｓ（CCC CGC GGC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT ATG TCT TCC AGT AAT GTC GAA GTT TTT ATC CCA GTG TC）（配列番号７）および３’側のプライマー８ＡＳ（CGC CTC GTG GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ＰＣＲはClontech社のAdvantage cDNA ＰＣＲキットを用いて、９４℃で１分の反応を１回行った後、９４℃で３０秒、６８℃で３分の反応を２０回繰り返し、最後に９４℃で３０秒、６８℃で１５分の反応を１回行い、約２２００ｂｐの増幅されたｃＤＮＡを得た。増幅されたｃＤＮＡをサブクローニングして塩基配列を決定し、ＰＣＲによる変異が起きていないことを確認した。
これらのｃＤＮＡの両末端をＳｓｔＩＩとＸｈｏＩの２種の制限酵素で切断後、ＳｓｔＩＩとＸｈｏＩで切断したｐＨａプラスミドベクターとＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。このライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａｌｐｈａに導入し、ｐＨａプラスミドベクターのＳｓｔＩＩサイトとＸｈｏＩサイトの間にＢＣＲＰ  ｃＤＮＡが挿入されたクローンｐＨａＭｙｃＢＣＲＰおよびｐＨａＨＡＢＣＲＰを得た。
【００２２】
（３）ＢＣＲＰレトロウイルスの作成
最初に、マウスのamphotropic retrovirus packaging cell lineであるＰＡ３１７細胞にリン酸カルシウム法を用いてｐＨａＭｙｃＢＣＲＰおよびｐＨａＨＡＢＣＲＰを導入した。遺伝子導入後の細胞を１ng／mLのミトキサントロンで選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞の培養上清を集めて０．４５μmのフィルターで濾過してレトロウイルス液とした。
【００２３】
（４）Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の作成
ＭｙｃＢＣＲＰレトロウイルス液をヒト白血病Ｋ５６２細胞の培養に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を２０ng／mLのＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン：塩酸イリノテカンの活性体）で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰと名付けた。Ｋ５６２およびＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰは７％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞にＢＣＲＰ蛋白が発現していることは、抗ＢＣＲＰ抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した（図１）。Ｋ５６２細胞はヒトの白血病細胞であるが、もともとＢＣＲＰを発現していないこと、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのＢＣＲＰによって輸送される抗癌剤に高い感受性を示すことから、ＢＣＲＰ遺伝子導入細胞の親株として適している。また、Ｋ５６２細胞およびＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞を免疫不全マウスに移植してＢＣＲＰ阻害剤などの動物実験が可能である。
【００２４】
（５）Ｐ３８８／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の作成
ＭｙｃＢＣＲＰレトロウイルス液をマウス白血病Ｐ３８８細胞の培養に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を２０ng／mLのＳＮ−３８で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をＰ３８８／ＭｙｃＢＣＲＰと名付けた。Ｐ３８８およびＰ３８８／ＭｙｃＢＣＲＰは７％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｐ３８８／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞にＢＣＲＰ蛋白が発現していることは、抗ＢＣＲＰ抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した。Ｐ３８８細胞はマウスの白血病細胞であるが、もともとＢＣＲＰを発現していないこと、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのＢＣＲＰによって輸送される抗癌剤に高い感受性を示すことから、ＢＣＲＰ遺伝子導入細胞の親株として適している。また、Ｐ３８８細胞およびＰ３８８／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞はマウスに移植可能であり、ＢＣＲＰ阻害剤などのin vivoの動物実験が可能である。
【００２５】
実施例２（細胞増殖試験）
Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８およびミトキサントロンに対する感受性を細胞増殖阻害試験にて調べた。両細胞を１２穴プレート（イワキ）に１万個／１mL／ウエルでまき、続いてmediumで各濃度に希釈した薬剤をウエルあたり１mL加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間培養した。５日後、９．５mLのセルパック希釈液（東亞医用電子）を入れたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。図２では、各濃度の薬剤添加時における細胞数を薬剤無添加の細胞数で除し、（％of control）で表した。
Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰはＳＮ−３８に約２０倍の耐性を、ミトキサントロンに約１０倍の耐性を示した（図２）。
【００２６】
実施例３（ステロイドホルモンによるＢＣＲＰの耐性克服）
次に、ＢＣＲＰの抗癌剤耐性に対する各種ステロイドホルモンの効果を調べた。Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の両細胞を１２穴プレート（イワキ）に１万個／１mL／ウエルでまき、続いてmediumで各濃度に希釈したステロイドホルモンをウエルあたり０．５mL加え、mediumで各濃度に希釈したＳＮ−３８あるいはミトキサントロンをウエルあたり０．５mL加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間培養した。５日後、９．５mLのセルパック希釈液（東亞医用電子）を入れたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。図３に、３μＭあるいは１０μＭのエストロンによるＢＣＲＰの抗癌剤耐性の克服を示す。エストロンはＢＣＲＰを発現していないＫ５６２細胞の抗癌剤感受性には影響を与えなかったが、Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰの培養にエストロンを加えると、ＳＮ−３８、ミトキサントロンに対する耐性が大幅に減弱した（図３）。エストロンのかわりにエストラジオールを用いて同様の試験を行ったところ、やはりＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰのＳＮ−３８、ミトキサントロンに対する耐性が減弱した（図４）。この耐性克服作用は他のステロイドホルモンであるエストリオール、プロゲステロン、プレグネノロンでも見られた。表１に、これらのステロイドホルモン添加によるＳＮ−３８あるいはミトキサントロンに対する感受性の変化を、細胞増殖を５０％阻害する濃度で表した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
実施例４（ステロイドホルモンによるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込みの増大）
これらステロイドホルモンが抗癌剤の細胞への取り込みに影響を与えるかどうかを調べた。Ｋ５６２、Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞を１００μＭのエストラジオール、エストリオール、エストロン、プロゲステロン、プレグネノロンの存在下あるいは非存在下で２０μＭのトポテカンと３７℃、３０分間加温したのち、細胞外の薬剤を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去した。細胞に取り込まれたトポテカンの蛍光を日本ベクトン社のＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで測定した。その結果を図５に示す。これら５種のステロイドはＫ５６２細胞のトポテカンの細胞内取り込みには影響しなかったが、Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカンの細胞内取り込みを増加させた。また、エストラジオールの誘導体であるエトスラジオール−３−ベンゾエートおよびエストラジオール−１７−アセテートについて同様の実験を行ったところ、これらエストラジオール誘導体もＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカンの細胞内取り込みを増加させた（図６）。
【００２９】
実施例５（抗ホルモン剤によるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込みの増大）
次に、抗ホルモン剤が抗癌剤の細胞への取り込みに影響を与えるかどうかを調べた。Ｋ５６２、Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞を１００μＭのタモキシフェン、ジエチルスチルベステロール、ジエチルスチルベステロールジプロピオネート、トレミフェンの存在下あるいは非存在下で２０μＭのトポテカンと３７℃、３０分間加温したのち、細胞外の薬剤を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去した。細胞に取り込まれたトポテカンの蛍光を日本ベクトン社のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定した。その結果を図７に示す。これら４種の抗ホルモン剤はステロイドと同様にＫ５６２細胞のトポテカンの細胞内取り込みには影響しなかったが、Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカンの細胞内取り込みを増加させた。よって、これら抗ホルモン剤もＢＣＲＰの耐性克服に有効であると考えられる。
【００３０】
以上より、これらのステロイドホルモンおよび抗ホルモン剤は、ＢＣＲＰの発現により低下した抗癌剤の細胞内取り込みを上昇（回復）させることにより、ＢＣＲＰによる抗癌剤耐性を克服することが示された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば耐性発生により充分に薬効の発現できなかった抗癌剤の効果を良好に回復できることから、抗癌剤の投薬量の管理が容易となり、その結果副作用を抑制した癌化学療法が可能となる。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞中にＢＣＲＰ蛋白が発現していることを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図２】Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の抗癌剤耐性獲得の程度を示す図である。
【図３】Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の抗癌剤耐性に対するエストロンの効果を示す図である。
【図４】Ｋ５６２／ＭｃｙＢＣＲＰ細胞の抗癌剤耐性に対するエストラジオールの効果を示す図である。
【図５】各種ステロイドホルモンによるＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカン取り込みの増大効果を示す図である。
【図６】各種ステロイドホルモン類縁体によるＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカン取り込みの増大効果を示す図である。
【図７】各種抗ホルモン剤によるＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカン取り込みの増大効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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