(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：３）のアミノ酸配列を有し、かつ、ＷＴ１野生型ペプチドを認識するＣＴＬを、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導するペプチドを有効成分として含有する油中水型エマルション。
【請求項２】
前記ペプチド０．１〜１００ｍｇを含む単位投与剤型である請求項１記載のエマルション。
【請求項３】
癌ワクチンとして使用される請求項１または２記載のエマルション。
【請求項４】
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：３）のアミノ酸配列を有し、かつ、ＷＴ１野生型ペプチドを認識するＣＴＬを、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導するペプチドを含有する調製物と、乳化剤および油状物質とを混合することを特徴とする、請求項１記載の油中水型エマルションの製造方法。
【請求項５】
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：３）のアミノ酸配列を有し、かつ、ＷＴ１野生型ペプチドを認識するＣＴＬを、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導するペプチドを含む容器、および乳化剤と油状物質とを含む容器を含有する、請求項１記載の油中水型エマルション調製用キット。
【請求項６】
請求項１記載の油中水型エマルションの用時調製に用いられる請求項５記載のキット。
【請求項７】
請求項１記載の油中水型エマルションを含む、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者において癌を治療または予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドを含有する製剤に関する。詳細には、種々の癌に対するワクチンとして使用されるエマルジョン製剤およびそれを調製するためのキットに関する。
【背景技術】  生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡ抗原と称する）とにより形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃・破壊する。
癌抗原タンパク質は、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．１０：２８１，１９９９の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、およびチロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）などのメラノソーム抗原、ならびにメラノーマ以外の癌抗原タンパク質としてＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、およびＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）などの癌マーカーがある。癌抗原ペプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成される約８から１１個のアミノ酸から成るペプチドである（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：７０９，１９９３；Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：７１９，１９９３；Ｃｅｌｌ，８２：１３，１９９５；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４６：１６７，１９９５）。前記のように、この生成された癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）との複合体が細胞表面に提示され、ＣＴＬにより認識される。従って、ＣＴＬによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、ＣＴＬを効率良く誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質から同定することが、非常に重要となる。
ＭＨＣクラスＩ抗原分子には多くのサブタイプが存在し、個々のタイプに結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはＭＨＣ抗原分子のタイプに応じて規則性（結合モチーフ）が存在する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２に対する抗原ペプチドの結合モチーフは、２番目のアミノ酸がロイシン、メチオニンまたはイソロイシン、９番目のアミノ酸がバリン、ロイシンまたはイソロイシンである。またＨＬＡ−Ａ２４に対する抗原ペプチドの結合モチーフは、２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファン、９番目のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。また最近では、前記モチーフを含むＨＬＡ抗原への推定結合配列をデータベース上で検索することも可能である（例えばＢＩＭＡＳソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／））。従って、ＣＴＬを誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質より同定するには、第一に、癌抗原タンパク質のアミノ酸配列より目的のＨＬＡタイプの結合モチーフまたは推定結合配列に一致する約８から１１個のアミノ酸より構成されるペプチド領域を特定する。
しかしながら、結合モチーフや推定結合配列より同定されたペプチドが必ずＣＴＬ誘導活性を有するとは限らない。癌抗原ペプチドは癌抗原タンパク質が細胞内でプロセシングされることにより生成されるため、プロセシングにより生成されないペプチドは抗原ペプチドとはなり得ない。さらに、結合モチーフや推定結合配列を有するペプチドが実際に癌抗原ペプチドとして細胞内で生成されても、多くの癌抗原タンパク質は本来生体に存在する正常な物質であるため、ＣＴＬがこれら癌抗原に対してトレランスとなっている場合がある。以上のことから、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを同定するためには、目的のＨＬＡタイプの結合モチーフ・推定結合配列による予測のみでは不充分であり、イン・ビボでのＣＴＬ誘導活性の評価が重要となる。
Ｗｉｌｍｓ癌の癌抑制遺伝子ＷＴ１（ＷＴ１遺伝子）は、Ｗｉｌｍｓ癌、無紅彩、泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ癌の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離され（Ｎａｔｕｒｅ，３４３：７７４，１９９０）、そのゲノムＤＮＡは約５０ｋｂであり１０のエキソンから成り、そしてそのｃＤＮＡは約３ｋｂである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０）。ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平９−１０４６２７号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特開平９−１０４６２７号公報、特開平１１−３５４８４号公報）、白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１８７３−８０，２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，１９５−２０２，２０００）。癌免疫療法（癌ワクチン）は多くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、多くの癌種で高発現しているＷＴ１における癌抗原ペプチドの同定、および当該癌抗原ペプチドを利用した癌ワクチンの開発は重要である。これに関し、ＷＯ００／０６６０２号公報およびＷＯ００／１８７９５号公報には、ＷＴ１タンパク質の部分から成る幾つかの天然型の癌抗原ペプチドが記載されているが、イン・ビボでの効果は知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、イン・ビボ、特に臨床上有用なＷＴ１由来の癌抗原ペプチドおよび当該癌抗原ペプチドの癌ワクチンとしての投与剤型を提供することにある。
本発明者らは、大阪大学医学部医学倫理委員会の承認を受け、患者のインフォームドコンセントを取得した上で臨床研究を実施したところ、特定の癌抗原ペプチドを特定の投与剤型と組み合わせることにより癌患者の病態の改善に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ（配列番号：２）もしくはＣｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ（配列番号：３）のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその両方のペプチドを有効成分として含有する油中水型エマルション；具体的には、前記ペプチド０．１〜１００ｍｇを含む単位投与剤型である本発明エマルション；好ましくは癌ワクチンとして使用される本発明エマルション；
（２）  配列番号：２もしくは配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその両方、を含有する調製物と乳化剤および油状物質とを混合することを特徴とする、本発明の油中水型エマルションの製造方法；および
（３）  配列番号：２もしくは配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその両方のペプチドを含む容器、および乳化剤と油状物質とを含む容器を含有する、本発明の油中水型エマルション調製用キット；好ましくは用時調製に用いられる本発明キット、に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）投与前後の肺癌患者（女性）における腫瘍マーカー値の推移を示すグラフである。
図２は、ＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）投与前後の肺癌患者（男性）における腫瘍マーカー値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】（１）  有効成分
本発明の油中水型エマルションに有効成分として含まれる配列番号：２または配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、ヒトＷＴ１（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０、ＮＣＢＩデータベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＰ＿０３４４１８、配列番号：１）に由来する。具体的にはヒトＷＴ１の第２３５位から第２４３位の部分ペプチドである配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチド（ＷＯ００／０６６０２）、および当該第２３５位から第２４３位のうち第２３６位のＭｅｔをＴｙｒに改変した配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチド（ＷＯ０２／０７９２５３（国際公開日：２００２年１０月１０日））である。
本発明におけるペプチドが抗原提示細胞に提示され、イン・ビボにてＨＬＡ−Ａ２４抗原拘束性にＣＴＬを誘導するという特性を有することが、本発明者らによる臨床試験により初めて見出された。当該特性は、癌患者にて上昇している腫瘍マーカーの血中濃度を、ペプチド投与後の所定期間に測定すること、またはＨＬＡテトラマー法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２））によりＣＴＬの数を測定すること、により調べることができる。
前記ペプチドは、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ  ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
前記ペプチドは、配列番号：２または３のアミノ酸配列において、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドであってもよい。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられる。アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾しているペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
（２）  油中水型エマルション
本発明において、油中水型エマルションとは、油が分散媒であり水が分散相として構成される、水が細かい滴として油中に分散されている乳剤を意味する。
本発明エマルションの調製には通常、乳化剤と油状物質とが用いられる。乳化剤は有効成分を油中に分散させる限り特に限定されないが、具体的にはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）等が挙げられる。油状物質としては、ドラケオール６ＶＲ、スクワレン、オレイン酸エチル等を用いることができる。
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）７２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）５１などは乳化剤および油状物質を共に適量含有しており、本発明において好適に使用できる。
本発明油中水型エマルションを調製するには、鈴木郁生ら、「医薬品の開発」１５巻、製剤の物理化学的性質、廣川書店、平成元年１０月、２９１−３０６頁などを参考にして行うことができる。例えば、まず、有効成分であるペプチドを蒸留水または生理食塩水に溶解または懸濁し、有効成分を含有する調製物を調製する。次いで、得られた調製物を上記説明した乳化剤および油状物質と混合する。混合はミキサー、ホモジナイザー、超音波攪拌装置などを用いて行うことができる。混合は、医療現場においても行うことができる。
有効成分と乳化剤および油状物質との混合割合は、油中水型エマルションが調製される範囲において当業者なら適宜設定することができる。代表的には、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）５１：有効成分＝５０：５０（ｗ：ｗ）およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）７２０：有効成分＝７０：３０（ｗ：ｗ）である。
本発明の油中水型エマルションは、前記いずれかのペプチドあるいはその両方のペプチドを有効成分として含むことができる。
本発明の油中水型エマルションは、前記ペプチド０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜２０ｍｇを含む単位投与剤型の製剤であることができる。この用量はイン・ビボにてＨＬＡ−Ａ２４抗原拘束性にＣＴＬを誘導するに必要な量であり、１〜１０ｍｇがより好ましい。具体的な用量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により前記範囲内で適宜調整することができる。
本発明の油中水型エマルションは癌ワクチンとして好適に使用される。当該癌ワクチンは癌の治療または予防に有効である。本発明における癌ワクチンの対象となる疾患は、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌である。
このように、本発明は別の態様として、本発明の油中水型エマルションをＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
本発明エマルションの投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられ、ＣＴＬを効率よく誘導する皮内投与や皮下投与が好ましい。投与回数および投与間隔は、治療または予防目的の疾患、患者の個体差により適宜調整することができるが、通常複数回であり、数日ないし数月に１回、本発明の単位投与剤型を投与するのが好ましい。
（３）  キット
本発明は他の態様として、配列番号：２もしくは配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその両方のペプチドを含む容器、および乳化剤と油状物質とを含む容器を含有する、本発明の油中水型エマルション調製用キットに関する。
本発明キットにおける容器とはガラス製またはプラスチック製の封栓可能なバイアル等である。容器に含まれるペプチド、乳化剤および油状物質は前記の通りである。
ペプチドは通常、凍結乾燥品として容器に含まれる。この場合、本発明キットはさらに、適当濃度のペプチド溶液または懸濁液を調製する容量の滅菌水または生理食塩水を含有する容器を含むことができる。あるいはペプチドは水溶液または懸濁液の状態で容器に含まれることもある。
ペプチドを含む容器および乳化剤や油状物質を含む容器には通常、それぞれ１回分の投与量が格納される。例えば、ペプチドは０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜２０ｍｇを１容器に、また乳化剤および油状物質は、用いるペプチドを油中水型エマルションに調製するに必要とされる量を１容器に含有させる。
本発明キットを用いれば、本発明の油中水型エマルションが医療現場にて容易に用時調製することができる。
【実施例】  以下、製剤例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。実施例で示される臨床研究は、大阪大学医学部医学倫理委員会の承認を受け、患者のインフォームドコンセントを取得した上で実施されたものである。
【実施例１】ＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）の肺癌患者に対する効果（１）
転移があるステージＩＶの肺癌患者（女性）にＷＴ１ペプチドワクチンを投与した症例について示す。ＷＴ１タンパク質の第２３５位から２４３位の部分ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に抗原提示され、ペプチド特異的なＣＴＬを誘導することが確認されているＷＴ１野生型ペプチド：Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ（配列番号：２）は、ＭＰＳ社（米国）がＧＭＰグレードで合成したものを使用した。
ＷＴ１野生型ペプチドの溶液を同重量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）５１（ＳＥＰＰＩＣ社）と混合して油中水型エマルションを作製する。８００ｍｇ（約１０１６μｌ）のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）５１に、１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を８００μｌ添加し、ビーカー内で２１Ｇの針をつけた注射筒で溶液を１０回出し入れして混合し、エマルションを調製した。
このようにして得られるエマルション６８０μｌ（ペプチド０．３ｍｇ）を投与直前にそれぞれ調製し、最初の投与日をｄａｙ０とするとｄａｙ０、１４、２８、４２、５６、８５、９９の計７回、上腕に皮内注射した。この患者の腫瘍マーカーＣＥＡの血中濃度は、ペプチド投与の９ヶ月前には約４００ｎｇ／ｍｌであったが、その後急激に増加し、ペプチド投与の２ヶ月前には約２０００ｎｇ／ｍｌになっていた。
ペプチド投与前日からの腫瘍マーカー値の推移を図１に示す。腫瘍マーカーの値は、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）についてはダイナボット社のＩＭｘＣＥＡダイナパックを用いて測定し、ＳＬＸ（シアリルＬｅｘ−ｉ抗原）については住金バイオサイエンス社に委託して測定した。
図１は、ペプチド投与後はＣＥＡの血中濃度増加が抑えられ、投与５回目以降は著しく血中濃度が低下したことを示している。また、ＳＬＸの血中濃度については、ペプチド投与４回目までは増加傾向であったが、それ以降は増加が抑えられ、血中濃度が低下して安定化の状態になったことを示している。
投与したペプチドに対する特異的な免疫反応の指標として遅延型皮内反応（ＤＴＨ）を測定したところ、投与５回目では、投与４８時間後のペプチド投与部位に強い腫脹が認められ、特異的な免疫が成立していることが示唆された。
また、ＥＬＩＳＰＯＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１１０：２９，１９８８）により、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中に投与したペプチドに特異的に反応してＩＦＮ−γを産生するＴ細胞を検出したところ、ペプチド投与後のＰＢＭＣではペプチド投与前のＰＢＭＣと比較して、多量のＩＦＮ−γを産生するＴ細胞が多く認められ、特異的な免疫が成立していることが示唆された。
これらの結果より、ＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）の油中水型エマルションの投与により、腫瘍の進展が抑制されていることが示唆された。
【実施例２】ＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）の肺癌患者に対する効果（２）
転移があるステージＩＶの肺癌患者（男性）にＷＴ１ペプチドワクチンを投与した症例について示す。実施例１と同様にＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）とＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）５１を混合して油中水型エマルションを投与直前にそれぞれ作製し、最初の投与日をｄａｙ０とすると、ｄａｙ０、１４、２８、４２、５６、７１の計６回、上腕に皮内投与した。
ペプチド投与前後の腫瘍マーカー値の推移を図２に示す。腫瘍マーカーの値は、ＣＥＡとＳＬＸについては、実施例１と同様に測定し、ＣＹＦＲＡ（サイトケラチン１９フラグメント）についてはロッシュ社のエクルーシスＣＹＦＲＡを用いて測定した。
図２は、ＳＬＸの血中濃度についてはペプチド投与前は正常値上限の３８Ｕ／ｍｌよりも高い５０Ｕ／ｍｌであったが、ペプチド投与２回目以降は、正常値の範囲にまで減少したことを示している。ＣＹＦＲＡの血中濃度についても、ペプチド投与前は正常値上限の２ｎｇ／ｍｌよりも高値であったが、ペプチド投与３回目以降は、正常値上限値以下になることが示された。また、ＣＥＡの血中濃度については、正常値上限の５ｎｇ／ｍｌ以上ではあるが、ペプチド投与２回目以降はペプチド投与前よりも値が低下していることが示された。
これらの結果より、ＷＴ１野生型ペプチド（配列番号：２）の油中水型エマルションの投与により腫瘍の進展が抑制されていることが示唆された。
【実施例３】ＷＴ１改変ペプチド（配列番号：３）の白血病患者に対する効果
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から転化した低形成性白血病（ＡＭＬ−Ｍ１）の癌患者（男性）にＷＴ１ペプチドワクチンを投与した症例について示す。ＷＴ１改変ペプチド：Ｃｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ（配列番号：３）は、ＭＰＳ社（米国）がＧＭＰグレードで合成したものを使用した。実施例１と同様にＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（登録商標）５１と混合して油中水型エマルションを作製し、患者の上腕に皮内投与した。投与２日前の骨髄中の白血病芽球は５０％であり、投与前日の総白血球数は１５００／μｌであったが、投与２日後には総白血球数が７００／μｌまで減少し、骨髄中の白血病芽球は２７％に減少した。総白血球数が減少したため、造血因子のＧ−ＣＳＦを投与したところ投与７日後には２１５０／μｌまで回復し、骨髄中の白血病芽球は１１％であった。
この結果より、ＷＴ１改変ペプチド（配列番号：３）の油中水型エマルションの投与により、骨髄中の白血病芽細胞の割合が減少し白血病の症状が改善されることが示された。
次に、同じ患者における、ＷＴ１野生型ペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に反応する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数をＨＬＡテトラマー法により測定した。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２テトラマーは、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記載の方法でＷＴ１野生型ペプチドを用いて作製した。フローサイトメーターのＦＡＣＳによりＰＥ標識のＨＬＡ−Ａ＊２４０２テトラマーとＦＩＴＣ標識ＣＤ８抗体との２カラーで染色し、ダブルポジティブの細胞をＷＴ１野生型ペプチドを認識するＣＴＬ、すなわちＷＴ１陽性の癌細胞に反応するＣＴＬとした。ペプチド投与３日前のＣＴＬ頻度は１．１％であったが、投与の２日後には、８．８％にまで増加していた。
この結果より、ＷＴ１ペプチドワクチンの投与によりＷＴ１陽性の癌細胞に反応性ＣＴＬが急激に増加していることが明らかになった。さらに、このＣＴＬが白血病芽細胞を傷害することにより骨髄中の白血病芽細胞の割合が減少した可能性が示唆された。
産業上の利用分野
本発明により、臨床試験においてＣＴＬ誘導活性を有するＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドを有効成分とする油中水型エマルション、それを調製するためのキットが提供される。本発明は、多くの癌患者の病態改善に有効であると考えられる。
【図１】
0004611022.tif 000002
【図２】
0004611022.tif 000003
【配列表】
0004611022000001.xml