(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
杉、檜または松の樹木粉砕物を各１重量部に対して水１０重量部を添加し、これを５〜６時間煮熟したものを濾過して樹脂分および固形物を除去した各熱水抽出物と、オオバコ１重量部に対して水１０重量部を添加し、これを１０時間煮熟したものを濾過して固形物を除去した熱水抽出物とを用い、各熱水抽出物の含有割合が、杉４５％、檜４４％、松０．５％、オオバコ０．５％に調整された水溶性混合抽出物の乾燥物におけるエチルアルコール可溶性成分を有効成分として含有してなる白血病細胞に対する細胞分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、白血病や皮膚癌などの癌細胞に対して分化誘導活性を示し、このような癌細胞の発育や増殖を抑制する制癌剤等として用いられる細胞分化誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、抗癌剤の有効成分の１つとして、植物アルカロイド類が知られており、例えば、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン(商品名 オンコビン oncovin)、ポドフィリン系のものなどが周知である。
【０００３】
これらの植物アルカロイド類を含めた制癌剤の作用機序は、有糸分裂を阻止するなどの細胞分裂阻害、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ合成阻害、代謝拮抗、癌の栄養阻害、酵素作用、ホルモン的効果などであり、腫瘍細胞ばかりでなく、健康な正常細胞にも毒性の作用をするため重篤な副作用が起きる可能性があり、治療効果にも限界を有するものであった。
【０００４】
このような副作用が起きない制癌剤も知られており、その有効成分としては、トコフェロール（ビタミンＥ）が挙げられる（特許文献１参照）。
【０００５】
癌細胞に対するトコフェロール（ビタミンＥ）の作用機序は、正常細胞に毒性を示さずしかもその適切な細胞分化誘導作用によって長期間投与しても安全であり、また造血器腫瘍や固形細胞などの各種癌に対して治療または改善効果がある。
【０００６】
その他に、ホウレンソウなどの緑黄色野菜の水溶性高分子画分からなる成分が、ヒトの癌の予防に効果的であることが、疫学的研究から示唆されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−２５６１８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記した細胞分化誘導作用を示す成分は、ビタミンＥや特定の野菜類からのみ得られるものであって、抽出材料の種類によっては薬効が未確認であり、できるだけ多くの細胞分化誘導成分の発見とその利用性の確立が求められている。
【０００９】
なお、上記した従来の植物由来の成分は、緑黄色野菜という草本類の食用品から得られたものであって、食品ではない樹木から抽出される成分の細胞分化誘導性を調査した知見はなかった。
【００１０】
そこで、この発明の課題は、従来において未利用の植物から抽出される細胞分化誘導成分を含有する細胞分化誘導剤とし、特に白血病細胞や皮膚癌細胞に対して増殖抑制効果のある細胞分化誘導剤とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、この発明においては、杉、松および檜からなる樹木の熱水抽出物と、オオバコの熱水抽出物とを併用混合した水溶性のものでありかつエチルアルコール可溶性のものを有効成分として含有する細胞分化誘導剤としたのである。
【００１２】
また、前記の細胞分化誘導の対象細胞が、白血病細胞や皮膚癌細胞などの癌細胞である細胞分化誘導剤、すなわち白血病細胞分化誘導剤または皮膚癌細胞分化誘導剤としたのである。
【００１３】
上記したように構成されるこの発明の細胞分化誘導剤は、その化学成分やその作用機序が未解明であるが、後述する実験結果からも明らかなように、白血病細胞や皮膚癌細胞などの癌細胞に対して分化誘導作用が顕著なものである。また、この発明の細胞分化誘導剤は、安全性について充分に信頼性の高いものである。
【００１４】
このようにして新規な抽出材料を用いるこの発明の細胞分化誘導剤は、白血病細胞や皮膚癌細胞などの癌細胞に対して有効成分の新しい細胞分化誘導剤になる。
【発明の効果】
【００１５】
この発明の細胞分化誘導剤は、杉、松および檜を含む樹木の熱水抽出物と、オオバコの熱水抽出物とを併用した水溶性混合抽出物におけるエチルアルコール可溶性成分を有効成分として含有する細胞分化誘導剤であるから、各植物に含まれる新規な水溶性かつエチルアルコール可溶性の抽出成分を有効成分とする細胞分化誘導剤になり、特に白血病細胞や皮膚癌細胞に対して増殖抑制効果のある細胞分化誘導剤となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
この発明に用いる樹木粉砕物の熱水抽出物は、杉、松および檜からなる樹木の熱水抽出物であって、通常、前記した所定の樹木を熱水に浸漬し、油脂成分を分離除去し、水溶成分を分取したものである。
【００１７】
この発明に用いる植物の種類の1つである杉（学名：Cryptomeria japonica）は、スギ科、スギ属の常緑高木であり、一属一種である。
【００１８】
同様にこの発明に用いる植物の種類の1つである松は、マツ科を代表するピヌス（Pinus）属に属する種類のいずれであってもよい。例えば、二葉松のアカマツ、クロマツ、五葉松のチョウセンマツ、ハイマツなどが挙げられる。
【００１９】
檜は、ヒノキ科に属する種（Chamaecyparis obtusa）であれば良く、例えば、タイワンヒノキ、サワラ、ベニヒ、北米が主産地であるローソニアナ、ノートカエンシス、ティオデス、その他にチャボヒバなどのヒバ（ヒノキの園芸品種）であってもよい。
【００２０】
これら所定の樹木の抽出原料としての部位は、葉、枝、幹、根、樹皮などいずれの部分であってもよい。
【００２１】
抽出に際しては、これらの樹木の粉砕物や、チップまたはおが屑などの切削物などを用い、すなわち樹木の体積に対して表面積ができるだけ大きくしたものを抽出原料として用いることが好ましい。実際には、樹木の幹部や枝部を木材用破砕機で粉砕したもの、製材時に副生する鉋屑、おが屑、チップなどを用いると、抽出を低コストで行なえるので好ましい。
【００２２】
この発明に用いるオオバコ（Plantago asiatica var.densiuscula）は、本邦に野草として広く分布する植物であり、古くから食用、またはウサギ用餌料、種子は咳止めや利尿作用のある薬草としても知られている植物である。
【００２３】
このようなオオバコについても抽出原料として使用する部位は、葉、茎、根、もしくは植物体全体などのいずれであってもよい。
【００２４】
これら３種の樹木と１種の草本からなる必須の抽出用原料は、それぞれの乾燥物を個別に抽出原料として得た熱水抽出物を１０〜９０体積％の範囲で混ぜ合わせて水溶性混合抽出物を作成するか、または予め前記所定範囲で混ぜ合わせたものから熱水抽出物を製造すればよく、通常、熱水抽出物を等体積ずつ配合するか、または抽出用原料を等体積（樹木類を鉋屑またはおが屑として使用した場合を代表例とする。）ずつ用いて熱水抽出物を製造しこれを混合した水溶性混合抽出物によって好ましい結果を得ている。
【００２５】
また、熱水抽出工程では、樹木類とオオバコはそれぞれ別にして熱水抽出することが便利であり、その場合は、樹木類は水に浸漬して常圧（大気圧）下の沸騰状態で５〜６時間煮沸し、オオバコは、水に浸漬して約１時間以上煮沸して濾過し、それぞれ液状分を分取する。
【００２６】
そして、そのまま静置して浮遊し分離した油脂分を除去し、さらにフィルタを通過させて固形分を除去し、水溶成分を分取する。樹木類とオオバコからの抽出された水溶成分を混和し、混合抽出液が得られる。
【００２７】
これまでの工程から得られる混合抽出液は、植物用栄養液として株式会社フローラから「ＨＢ−１０１」との商品名で市販されており、この場合の樹木粉砕物の熱水抽出物の含有量は、杉４５％（重量％）、檜４４％、松０．５％であり、オオオバコの熱水抽出物は０．５％である。
【００２８】
「ＨＢ−１０１」の安全性については、急性毒性（ラット）の試験結果が、ＬＤ50＝６０ｇ／ｋｇであり、毒性がないこと判明している。また、長期連用毒性についてもこのものは、家畜、家禽、魚類について異常のないことが判明しているものである。
【００２９】
さらに、上記の混合抽出液の水溶成分のうち揮発成分を蒸発させ、得られる有形成分（乾燥物）をエチルアルコールに溶解し、これからエチルアルコールを蒸発させて得られる固形成分を有効成分として細胞分化誘導剤を調整する。
【００３０】
投与剤型としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤などの経口製剤、注射製剤および外用剤が挙げられる。製剤化の際には、通常の製剤担体を用いて常法により製造することができる。
【００３１】
すなわち経口製剤を製造するには、有効成分と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により上記剤形に製剤する。
【００３２】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などがあり、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチル（エチル）セルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどがあり、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン、結晶セルロース、炭酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等があり、錠剤・顆粒剤には糖衣、その他必要に応じてコーティングしてもよい。
【００３３】
また注射用製剤を製造するには、有効成分にpH調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。
【００３４】
外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造すればよく、すなわち基剤原料として、例えば動植物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤などを添加することができる。
【００３５】
また必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
【００３６】
この発明における有効成分の臨床投与量は、症状、重症度、年齢、合併症などによって異なり限定されず、また化合物の種類・投与経路などによっても異なるが、通常成人１日あたり２５ｍｇ〜１１５ｍｇであり、好ましくは５０ｍｇ〜２５０ｍｇであり、さらに好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇであり、これを経口、静脈内または経皮投与する。
【実施例】
【００３７】
［実施例１〜３、比較例１、２］
植物用栄養液（フローラ社製：ＨＢ−１０１）の揮発成分を室温で蒸発させて乾燥させ、得られた有形成分を９５％エチルアルコールに溶解し、この乾燥有形成分のエチルアルコール溶解物濃度を種々の有効成分濃度として、以下の細胞増殖抑制試験により細胞分化誘導剤に調整した場合の薬効（ヒトは白血病細胞に対する増殖抑制性と分化誘導活性）および安全性を調べた。
【００３８】
前記した植物用栄養液（フローラ社製：ＨＢ−１０１）は、杉、檜または松からなる樹木粉砕物を各１重量部に対して水１０重量部を添加し、これを５〜６時間煮熟したものをフィルター濾過して樹脂分および固形物を除去し、またオオバコ１重量部に対して水１０重量部を添加し、これを１０時間煮熟したものをフィルターで濾過して固形物を除去し、各成分を混合して濃縮（Brix25）し、精製水を添加して熱水抽出物の含有量が、杉４５％、檜４４％、松０．５％、オオオバコの熱水抽出物０．５％を含有するように調整し、またｐＨ３．５としたものである。
【００３９】
＜細胞増殖抑制試験＞
１２ｗｅｌｌプレートの下記培地上にＨＬ６０細胞（ヒト白血病細胞）を各１０万個／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように播種し、前記した乾燥有形成分のエチルアルコール溶解物濃度を５０μｇ／ｍｌ（実施例１）、３μｇ／ｍｌ（実施例２）、１μｇ／ｍｌ（実施例３）、０．５μｇ／ｍｌ（比較例１）、０μｇ／ｍｌ（比較例２：無添加区）とし、インキュベータ内３７℃の条件下で３日間の培養を行なった。その間、２４時間毎に顕微鏡を用いて血球計算盤上の細胞数をカウントし、その増減の変動を調べ、計数細胞数を記録し、グラフ化したものを図１に示した。
【００４０】
［使用培地］
ＲＰＭＩ−１６４０  Medium in 10％ FCS
ＲＰＭＩ−１６４０  Medium SIGMA lot.22K2354
ＦＣＳ  ＨＹ Clone in USA
【００４１】
＜細胞分化誘導確認試験＞
（ａ）  使用検体：細胞増殖抑制試験後のＨＬ60細胞（ＨＢ101の乾燥有形成分のエチルアルコール溶解物濃度３μｇ／ｍｌ添加区分cellおよび無添加区細胞）
試験材料：発色試験  Nitro Blue Tetrazolium SIGMA N6876
TPA(12-O-Tetradecanoyl-13-ace)stock solution
（ｂ）  試験方法：
(1) 細胞増殖抑制試験で培養したHL60細胞(ＨＢ101の乾燥有形成分のエチルアルコール溶解物濃度３μｇ／ｍｌ（実施例２）および０μｇ／ｍｌ（比較例２：無添加区）)を１００μl採取し、96wellプレート上に添加した。
(2) ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）in ＴＰＡ（２×10-6M）溶液を同量（100μｌ）採取し、96well各プレート上に添加した。
(3) 両液添加後、本96wellプレートを37℃で40分間培養した。
(4) 培養終了後、顕微鏡下で細胞の呈色状態を観察した。
（ｃ）  評価方法
この試験では、ＨＢ101の添加培養により分化誘導された細胞については無添加区と比較して黒色に強く呈色する。呈色後、ＨＢ101添加区分HL60細胞および無添加区HL60細胞における呈色度合を比較することにより、ＨＢ101添加培養における分化誘導活性を判定した。
（ｄ）  試験結果
上記の試験結果から、比較例２（無添加区）のHL60細胞の細胞分化誘導率は０％であったが、実施例２のHL60細胞の細胞分化誘導率は４．２％であった。
【００４２】
図１に示した細胞増殖抑制試験および細胞分化誘導確認試験の結果からも明らかなように、乾燥有形成分のエチルアルコール溶解物濃度を０．５μｇ／ｍｌとした比較例１または０μｇ／ｍｌの比較例２では、ヒト白血病細胞に対する細胞増殖抑制効果がほとんど認められなかったが、実施例１、２、３で得られた有効成分濃度の場合は、ヒト白血病細胞に対する安定した細胞増殖抑制効果が認められた。また、上述の試験結果（ｄ）からも明らかなように、乾燥有形成分のエチルアルコール溶解物濃度１〜５０μｇ／ｍｌでは細胞分化誘導性が認められた。
【００４３】
＜安全性試験＞
（１）  実施例２の２０００ｍｇ/ｋｇをＣｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ系の雄ラット５匹に１回経口投与し、その毒性を調べた。その結果、死亡例はみられず、一般状態、体重および剖検でも異常は認められなかった。したがって、実施例２の最小致死量は２０００ｍｇ／ｋｇを超えるものと判断された。
【００４４】
（２）  胃ゾンデにて、投与群のラット（ＳＤ系、３匹）に実施例２の５００倍水希釈液を投与し、対照群のラット（ＳＤ系、３匹）には生理食塩水５ｍｇ／ｋｇ投与した。１週間飼育した後に、麻酔後、脱血屠殺した。個々のラット肝臓からtotalＲＮＡを抽出した。そして、毒性に関わる遺伝子１０３１個を選択し、それを検出するプローブを貼り付けたＤＮＡチップ上に、肝臓細胞から抽出したＲＮＡの蛍光標識したものをハイブリダイズさせ、蛍光強度から結合しているＲＮＡ量を遺伝子毎に測定した。
毒素に関わる遺伝子の５倍以上の増減があったものについてみると、cytosolic epoxide hydrolase, stress activated protein kinase alpha II, N-heparan sulfate sulfotranferase, connexin proteinなどの遺伝子において変化がみられたものの、発現が減少傾向にあり、数値的にも変化量が大きくないことから、毒性の影響は見られず、その他の遺伝子の変化量も微量であることから、実施例２の毒性反応は殆どないと考えられた。
【００４５】
（３）  胃ゾンデにて、投与群のラット（ＳＤ系、３匹）に実施例２の５００倍水希釈液を投与し、対照群のラット（ＳＤ系、３匹）には生理食塩水５ｍｇ／ｋｇ投与した。１週間飼育した後に、麻酔後、脱血屠殺した。個々のラットの脱血時に採取した血液を遠心分離（3000rpm 15分間）にて血清を分離回収し、この血清をサンプルとした。
サンプルの血清２μｌをＨ４プロテインチップ上に滴下し、洗浄処理後、EAMEAM０．５μｌにてチップ上に固定化処理を行なった。タンパク質を固定化したＨ４プロテインチップをプロテインチップアナライザーSELDIにセットし、分子量分布の測定を行なった。
この結果、分子量5000から15000には主なピークが５個観察されたが、その全てが対照群と投与群の両方に見られ、その量の違いの明確な傾向も認められなかった。
また、分子量15000から50000においては、主なピークが８個観察されたが、これらもその全てが対照群と投与群の両方に見られるものであり、その量の違いの明確な傾向も見られなかった。
これらのことから、投与群と対照群との間に、血清中の発現タンパク量の違いは認められず、毒性反応は見受けられなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例および比較例の細胞増殖抑制試験の結果を示す図表
【図１】
0004717362.tif 000002