(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸塩誘導（pyruvate-derived）有機生成物の形成方法であり、
ａ）クラブトリー負表現型(crabtree-negative phenotype)を呈示し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持っていない酵母細胞を準備し、
ｂ）前記クラブトリー負表現型酵母細胞を、大気圧の空気で飽和した状態で存在する量に対して、少なくとも２０％の溶解した酸素の量を含む第一の培養条件下で、炭素源を含む第一の培地で培養し、
ｃ）前記クラブトリー負表現型酵母細胞を、溶解した酸素の量が大気圧の空気で飽和した状態で存在する量に対して、２．０％未満である第二の培養条件下で、炭素源を含む第二の培地で培養し、
前記第二の培養条件下で消費される炭素源１グラムあたり０．３グラム以下のバイオマスが生成される方法。
【請求項２】
前記酵母細胞が、クライベラミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）、トリクスポロン（Trichsporon）、およびヤマダジマ（Yamadazyma）からなる群より選択される酵母である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クラブトリー負表現型酵母細胞が、遺伝子組み換えされている請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記クラブトリー負表現型酵母細胞が、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むよう遺伝子組み換えされ、前記ピルビン酸塩誘導生成物が乳酸塩である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ウシ(bovine)乳酸デヒドロゲナーゼ、細菌性乳酸デヒドロゲナーゼおよび真菌性乳酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される遺伝子である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記クラブトリー負表現型を呈示する酵母細胞が、クライベラミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、カンジダ（Candida）およびハンゼヌラ（Hansenula）からなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記クラブトリー負表現型を呈示する酵母細胞が、クライベラミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、カンジダ（Candida）およびハンゼヌラ（Hansenula）からなる群から選択され、
前記第一の培地が、グルコースを含む炭素源を含み、
前記第二の培地が、グルコースを含む炭素源を含み、かつ、前記第二の培養条件が、１．５を超える酸性ｐＨを含む請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
１．技術分野
本発明は、有機生成物を生成する方法及び材料に関する。
２．関連技術
乳酸のような有機生成物には、多くの重要な産業的用途がある。例えば、有機酸は塑性材料またその他の生成物の合成に用いることができる。有機生成物の需要の増加に対処するため、より効率的でコストのかからない生成方法が開発されている。そのような方法の一つとして細菌の使用が挙げられる。具体的には、ある種の細菌は所定の発酵条件下で特定の有機生成物を大量に生成することができる。しかしながら、その有機生成物が増殖媒体中で堆積する際にその細菌が増殖できないため、ファクトリー(factories)としての生きた細菌の使用は制限される。そのような制限に対処するため、生成物の合成の間に様々な生成物精製技術が採用されてきた。加えて、細菌の代替物として微生物の使用も試みられてきた。実際に、耐酸性を持つことで知られるサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)が、乳酸生成目的で遺伝子修飾されてきた。具体的には、エス・セレビシアエ細胞にウシの乳酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡを与えて内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５，およびＰＤＣ６）を分断することによって遺伝子修飾を行った。これらの遺伝子修飾エス・セレビシアエ細胞は幾らかの乳酸を生成したが、細胞の増殖が抑制されたため、細胞増殖と乳酸生成の両方で改善を必要とするという結論に達した。
要約
本発明は全体的に、有機生成物を生成するための方法および材料に関する。具体的には、本発明は酵母細胞、酵母細胞の培養方法、酵母細胞の形成方法、核酸構造物、ならびに様々な有機生成物を生成するための方法と材料を提供するものである。本発明は、特定の微生物（例えば細菌性(bacterial)微生物や真菌性(fungal)微生物）が、所定の培養条件下で増殖し、増殖および生成物を生成するために炭素源を利用し、商業目的の所望の有機生成物を生成することができるような遺伝子操作が可能であるという発見に基づく。たとえば、ここで使用されている酵母細胞は低ｐＨ、高温培養すると増殖し、ある有機生成物を生成することができる。低ｐＨ、高温といった条件下で急速に増殖し有機生成物を効率よく生成する能力を持つことは非常に有意義なことである。特に、中性の環境を維持することは、大規模な生成プロセスにおいては困難で費用がかかる恐れがあるものであるが、微生物が低ｐＨに耐性を持っていれば、ｐＨが中性の環境を維持する必要がなくなる。それに加え、所望の有機生成物を低ｐＨブロスから回収するのに要する方法および材料は、同じ有機生成物をより中性に近いｐＨのブロスから回収するのに必要な方法や材料よりも実際的かつ効率的である。例えば、ある種の有機酸生成物は、ｐＨがその生成物のｐＫａ値より低くなれば溶液から析出が可能であり、回収が相当容易になる。その上、微生物が高温に対し耐性を持っていれば、増殖および生成相中に低温を維持する必要がなくなる。明らかに、大規模な生成プロセスにおいて大容量のブロスのタンク内の温度を下げる必要性が緩和されれば、プロセス全体が一層効率的となりコストが下がる。その上、微生物が低ｐＨと高温のどちらに対しても耐性を持っていれば、大規模な生成プロセスの間、耐性の劣る他の微生物による汚染を防止する上で好都合な方法を提供できる。
【０００２】
ここで重要なのは、商業目的で所望の有機生成物を生成するための能力に関する重要な局面は、所望の有機生成物が生成される特定生産性(specific productivity)であってもよいということである。例えば、ここで記載されている方法および材料を用いて高い特定生産性を提供すると、低ｐＨ、高温といった培養条件に露出された時に微生物が細胞の維持に必要なエネルギーを発生させることが可能である。この必要なエネルギーは呼吸経路を介してのエネルギー発生に依存しているのではなく、実質的に嫌気性条件下での発酵経路を介して発生される。発酵経路を介してエネルギーを得ることは、呼吸経路を必要としない有機生成物を生成する際に特に有効である。なぜなら、提供された炭素源のほとんど全部を、所望の有機生成物を生成する目的で使用することができるからである。
【０００３】
本発明はまた、所定の遺伝子操作微生物によって、炭素源の利用を抑制し、炭素源が主としてバイオマスまたは所望の有機生成物の生成に利用されるようにするという発見に基づく。概して、本発明は二タイプの培養プロセスを含む。一方の培養プロセスは所定の培養条件下での微生物の培養を含んでおり、その培養条件とは、微生物および所望の結果次第でバイオマスの生成を促進する。もう一方のプロセスはそれとは異なる培養条件を含み、その条件もまた、微生物および所望の結果次第で、所望の有機生成物の生成を促進する。明らかに、大規模な生成プロセスの間に炭素源の利用の操作が可能であれば、生産者は代替の方法をとった場合に比べて優れた柔軟性と抑制性を享受できる。
【０００４】
本発明は、加えてある種の微生物の遺伝子操作が可能であるため、全部ではないにせよ炭素源の大部分をバイオマスまたは所望の有機生成物の生成に利用し得るという発見に基づいている。具体的には、本発明は、炭素源の利用をバイオマスや所望の有機生成物の生成からそらす生合成路が不活性化されるように遺伝子修飾されている酵母細胞を提供する。そのような生合成路を不活性化することにより、効率よく増殖し所望の生成物を生成し得る微生物が提供される。
【０００５】
全般に、本発明は、外因性核酸分子を含有する酵母細胞を特徴とするもので、その外因性核酸分子は細胞内部で酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する。その核酸を、細胞のゲノムに導入してもよい。酵素活性によって有機生成物が形成され、実施態様によっては、細胞から分泌(secrete)される。その細胞はさらにクラブトリー負表現型を持ち、その有機生成物を生成する。その細胞は例えば、クライベラミセス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、ハンゼヌラ(Hansenula)、カンジダ(Candida)、トリクスポロン(Trichosporon)、またはヤマダジマ(Yamadazyma)の属由来でもよい。その有機生成物は例えば、発酵生成物、ピルビン酸塩誘導生成物、有機酸、または乳酸塩のようなカルボン酸塩であってもよい。実施態様によっては、そのポリペプチドが乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持っていてもよい。例えば、外因性核酸が細菌性乳酸デヒドロゲナーゼまたはケー・ラクチス(K. lactis)真菌性乳酸デヒドロゲナーゼのような真菌性乳酸デヒドロゲナーゼを暗号化することも可能である。
【０００６】
別の実施態様では、その細胞が４個の外因性核酸分子を含有しており、その４個の外因性核酸分子が各自、別々のポリペプチドを暗号化する。例えば、その４個の外因性核酸分子の内第一の分子は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つ第一のポリペプチドを暗号化することができ、第二の分子はＣｏＡ−転移酵素活性を持つ第二のポリペプチドを暗号化することができる。第三の分子はラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を持つ第三のポリペプチドを暗号化し、第四の分子はアクリリル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つ第四のポリペプチドを暗号化することができる。そのような細胞はカルボン酸塩生成物としてのアクリル酸塩を生成することができる。或いは、４個の外因性核酸分子の内最初の１個は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタノエートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-D-pentanoate aldolase)活性を持つ第一のポリペプチドを暗号化することができ、第二の分子はキシロネート(xylonate)デヒドラターゼ活性を持つ第二のポリペプチドを暗号化することができる。第三の分子はキシロノラクトナーゼ(xylonolactonase)活性を持つ第三のポリペプチドを暗号化し、第四の分子はＤ−キシロースデヒドラターゼ活性を持つ第四のポリペプチドを暗号化することができる。そのような細胞は、有機生成物として、Ｄ−キシロースのような炭水化物を生成することができる。
【０００７】
さらに別の実施態様では、その細胞が６個の外因性核酸分子を含有し、その６個の外因性核酸分子が各自別々のポリペプチドを暗号化する。例えば、その６個の外因性核酸分子の第一の分子は２，５−ジオキソバレレートヘヒドロゲナーゼ(dioxovalerate hehydrogenase)活性を持つ第一のポリペプチドを暗号化することができ、第二の分子は５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカレート(5-dehydro-4-deoxy-D-glucarate)活性を持つ第二のポリペプチドを暗号化することができる。第三の分子はグルカレートデヒドラターゼ活性を持つ第三のポリペプチドを暗号化し、第四の分子はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を持つ第四のポリペプチドを暗号化し、第五の分子はグルクロノラクトンレダクターゼ活性を持つ第五のポリペプチドを暗号化し、第六の分子はＬ−グロノラクトンオキシダーゼ活性を持つ第六のポリペプチドを暗号化することができる。そのような細胞は、有機生成物として、例えばＬ−アスコルビン酸塩のようなビタミンを生成することができる。
【０００８】
その有機生成物は４個以上の炭素原子を含有してもよく、例えばアミノ酸であってもよい。
【０００９】
別の実施態様では、その細胞はリボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースのようなペントース炭素を異化する能力を有する。
【００１０】
別の実施態様では、その細胞は低い(reduced)ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pyruvate decarboxylase)活性および低いアルコールデヒドロゲナーゼ活性を持つ。例えば、その細胞がピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を全く持っていなくてもよい。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低いのは、分断した遺伝子座が原因かもしれない。その場合、その座は普通、ピルビン酸デカルボキシラーゼを暗号化する核酸シーケンスを持つ。或いは、その細胞がリボザイムのようなアンチセンス分子を含有することもあり得る。このような分子は内因性核酸シーケンスに相当し、その場合そのアンチセンス分子がピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を低下させる。またその分子が、キラープラスミドとして機能する追加の外因性核酸分子を含有していてもよい。
【００１１】
別の実施態様では、外因性核酸によって暗号化されたポリペプチドの酵素活性によってＮＡＤＨ−消費法で有機生成物が形成される。
【００１２】
別の実施態様では、その細胞を有機生成物生成目的で最適条件下で培養すると、その細胞は、消費されるグルコース１００グラムにつき約６０グラム以上の有機生成物を生成する。
【００１３】
別の局面では、本発明は酵素細胞のような、外因性核酸分子を含有する細胞を特徴とし、その場合その外因性核酸分子は、細胞によるペントース炭素の異化作用を促進するポリペプチドを暗号化する。そのポリペプチドは、例えば、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、またはキシルロキナーゼ(xylulokinase)であり、そのペントース炭素は、例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびリキソースであってもよい。その細胞はさらにヘキソース炭素を異化することも可能で、必要があれば、ヘキソース炭素とペントース炭素を同時に異化することもできる。そのヘキソース炭素は例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イオドース(iodose)、フルクトース、ガラクトースおよびタロース等であってもよい。
【００１４】
別の局面では、本発明は外因性核酸分子を含有する酵素細胞を特徴とする。その場合、その外因性核酸分子は、細胞の細胞質中でアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する。そのポリペプチドはクエン酸リアーゼ活性を持つポリペプチドであってもよく、またはアセチル−ＣｏＡのミトコンドリア膜への透過を促進するミトコンドリア膜ポリペプチドであってもよい。その細胞が、低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性または低いアルコールデヒドロゲナーゼ活性を持っていてもよい。或いは、その酵素細胞にエタノール生成力がなく、エタノールと酢酸塩を含まない培養条件下での増殖率が、エタノール生成力のない比較用の酵母細胞について観察された増殖率より高いものであってもよい。
【００１５】
さらに別の局面では、本発明は低いミトコンドリア性ポリペプチドを持つ酵母細胞を特徴とし、その場合その細胞がクラブトリー負表現型を持つ。そのような細胞は、例えば、クライベラミセス、ピチア、ハンゼヌラ、カンジダ、トリクスポロン、またはヤマダジマといった属由来であってもよい。その細胞に全く活性がなくてもよい。その細胞が分断座を含有していてもよく、その場合その座は普通、ミトコンドリア性ポリペプチドを暗号化する核酸分子シーケンスを含む。そのミトコンドリア性ポリペプチドがクレーブスサイクル酵素であってもよい。さらに、その細胞がクレブス回路生成物を堆積してもよい。その細胞が外因性核酸分子を含んでいてもよく、その場合その外因性核酸分子は、細胞内部で酵素活性を持つポリペプチドを暗号化し、その酵素活性で有機生成物が生成され、その結果その細胞は有機生成物を生成する。その有機生成物は、例えば、クエン酸塩、α−ケトグルタル酸、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、およびオキサロ酢酸塩であってもよい。そのポリペプチドが、乳酸塩または酢酸塩の異化作用に参与するポリペプチドであってもよい。
【００１６】
別の局面では、本発明は有機生成物の生成方法に関する。その方法では酵母細胞を用い、その細胞は、細胞内部で酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含む。この場合、その酵素活性によってその有機生成物が形成され、それらの細胞がクラブトリー負表現型を持ち、その細胞を培地を用いて培養することで、その有機生成物を生成する。その酵母細胞は例えば、クライベラミセス、ピチア、ハンゼヌラ、カンジダ、トリクスポロン、またはヤマダジマといった属に由来するものであってもよい。その有機生成物は発酵生成物、ピルビン酸塩誘導生成物、炭素原子を４個以上含有する有機生成物、カルボン酸塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミンまたは脂質生成物であってもよい。さらにその有機化合物が、乳酸塩、グリセリン、アクリル酸塩、キシロース、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩(isocitrate)、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、またはオキサロ酢酸塩であってもよい。実施態様によっては、有機生成物をそれらの細胞によって分泌する。この方法によって、低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性または低いアルコールでヒドロナーゼ活性を持つ細胞となる。酵素活性により、ＮＡＤＨ消費法で有機生成物を形成することも可能である。
【００１７】
このような方法で形成された細胞によって、培養工程が有機生成物の生成に最良であれば、消費されるグルコース１００グラムにつき約６０グラム以上の有機生成物を生成することができる。その培地は液状であってもよく、アンチマイシンＡ、シアニド、またはアジドのような細胞呼吸の阻害剤を含んでいてもよい。培養工程においては、好気性増殖条件下で細胞を増殖し、その後前記細胞を細胞呼吸阻害剤と接触させてもよい。
【００１８】
或いは、培養工程中で、嫌気性培養条件下で細胞を培養してもよい。さらに別の実施態様では、培養工程中に、好気性増殖条件下で細胞を増殖させ,その後嫌気性培養条件下で細胞を培養してもよい。また培養工程において、細胞を約３５℃より高い温度で培養してもよい。
【００１９】
一実施態様では、培地の有機ｐＨ値が約３．０未満、および／または無機ｐＨ値が約３．０未満である。別の実施態様では、培地が、リボース、アラビノース、キシロースまたはリキソースといったペントース炭素を含有する。また培地が、ｐＨ値が例えば約２．０〜約６．５のコーンファイバー加水分解物質を含むものであってもよい。
【００２０】
別の局面では、本発明は、有機生成物の生成方法に関し、その方法においては、ａ）細胞のペントース炭素の異化作用を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有する酵素細胞を供給し、その場合その細胞が前記有機生成物を形成するための酵素活性を含有し、ｂ）その細胞を培地で培養することにより有機生成物を生成することを特徴とする。
【００２１】
さらに別の局面では、本発明は有機生成物を生成する方法に関し、その方法においては、ａ）酵素細胞を供給し、その場合、それらの細胞が、細胞の細胞質でアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含み、また細胞が、有機生成物の形成につながる酵素活性を含有するものであり、ｂ）細胞を培地で培養することによって有機生成物を生成することを特徴とする。
【００２２】
別の局面では、本発明は有機生成物の生成方法に関し、その方法においてはａ）ミトコンドリア性酵素の活性が低い酵素細胞を供給し、その場合活性の低さが有機生成物の堆積につながり、ｂ）前記細胞を培地で培養することにより前記有機生成物を生成することを特徴とする。
【００２３】
別の局面では、本発明はクラブトリー負表現型を持つ酵素細胞の培養方法に関し、その方法においては細胞を培地で培養し、その場合、その培地の有機ｐＨ値が約３．０未満および／または無機ｐＨ値が約３．０未満であることを特徴とする。培養工程においては細胞を約３５℃より高い温度で培養してもよい。培地に細胞呼吸の阻害剤が含まれていてもよい。また培地がペントース炭素を含んでいてもよい。別の実施態様では、培地がコーンファイバー加水分解物質を含んでいてもよい。
【００２４】
別の局面では、本発明はクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞を培養する方法に関し、その方法では培地で細胞を培養し、その場合園培地がコーンファイバー加水分解物質を含むことを特徴とする。
【００２５】
別の局面では、本発明はクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞を培養する方法に関し、その方法では培地で細胞を約３５℃より高い温度で培養し、その培地の無機ｐＨ値が約３．０未満であることを特徴とする。
【００２６】
別の局面では、本発明はクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞を培養する方法に関し、その方法では培地で細胞を約３５℃より高い温度で培養し、その培地がペントース炭素を含むことを特徴とする。
【００２７】
別の局面では、本発明はクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞を培養する方法に関し、その方法では培地で細胞を約３５℃より高い温度で培養し、その培地がコーンファイバー加水分解物を含むことを特徴とする。
【００２８】
別の局面では、本発明は組み換えシーケンスおよび選択されたシーケンスを含む核酸構造物に関し、その組み換えシーケンスがクラブトリー負表現型を持つ細胞のゲノムシーケンスに相当し、そのゲノムシーケンスが細胞によって発現される酵素を暗号化し、その選択されたシーケンスが細胞内部の有機生成物の形成につながる酵素を暗号化することを特徴とする。その選択されたシーケンスは、組み換えシーケンスによって各末端でフランキングされる(flank)ように、組み換えシーケンス内部にあってもよい。
【００２９】
別の局面では、本発明は組み換え酵素細胞の形成方法に関し、その方法において、クラブトリー負表現型を持つ酵素細胞を供給し、最終生成物を選択し、いずれの外因性酵素または酵素を細胞に添加して最終生成物を生成するのか識別し、その活性が前記細胞内で低下する外因性酵素または酵素を識別することで前記細胞内での前記最終生成物の生成を可能とし、識別済みの外因性酵素または酵素を供給された酵素細胞に添加し、供給された酵母細胞内で識別済みの外因性酵素または酵素の活性を低下させることでその細胞が培養条件下で最終生成物を生成するようにすることを特徴とする。
【００３０】
別の局面では、本発明はコーンファイバー加水分解物質に関し、その加水分解物質のｐＨ値が約２．０〜約６．５であることを特徴とする。その加水分解物質はグルコース、キシロース、およびアラビノースを含んでいてもよい。加水分解物質は約４０グラム／Ｌのグルコース、約４０グラム／Ｌのキシロース、および約２０グラム／Ｌのアラビノースを含んでいてもよい。或いは、加水分解物質が約３８．７グラム／Ｌのグルコース、約３９．１グラム／Ｌのキシロース、約２０．７グラム／Ｌのアラビノース、および約１．６グラム／Ｌのフルフラールを含んでいてもよい。
【００３１】
別の局面では、本発明は有機生成物の形成方法に関し、その方法においてはａ）微生物を培養条件下で培養するが、その場合にその微生物は低い酵素活性を持ち、その酵素活性はピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性であってもよく、その微生物が、エタノールおよび酢酸塩が添加されていない場合に呈示する増殖率は、相当する微生物が前記低い酵素活性を持たない場合との比較において約３０％以上であり、ｂ）培養条件を変更して有機生成物の生成を促進することを特徴とする。
【００３２】
別の局面では、本発明は有機生成物の形成方法に関し、その方法においてはａ）微生物を、細胞呼吸を促進する培養条件下で培養し、その場合にその微生物は低い酵素活性を持ち、その酵素活性はピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性であってもよく、その微生物がエタノールおよび酢酸塩が添加されていない場合に呈示する増殖率は、相当する微生物が前記低い酵素活性を持たない場合との比較において約３０％以上であり、ｂ）培養条件を変更して細胞呼吸を減少させることで有機生成物の生成を促進することを特徴とする。
【００３３】
特に断りがなければ、ここで使用されている技術用語および化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常解釈されている意味と同一の意味を持つ。ここに記載されている方法および材料と類似または同等のものを本発明を実施または試行する上で使用することも可能であるが、適切な方法および材料は以下に記載されている通りである。ここで言及されている刊行物、特許出願、特許、およびその他の引例を参考のためすべて挿入している。抵触が起こったら、本明細書が、定義も含め、比較の対象となる。それから、これらの材料、方法、および実施例は本発明の限定を意図するものではない。
【００３４】
以下に述べる詳細な説明および請求項より、本発明の他の特徴および利点は明らかであろう。
詳細な説明
本発明は、有機生成物の生成に関する方法および材料を提供するものである。特に本発明は、酵母細胞、酵母細胞の培養方法、酵母細胞の形成方法、核酸構造物、および様々な有機生成物を生成する方法および材料に関する。
【００３５】
ここで提供される酵母細胞を、有機生成物を生成する目的で使用してもよい。そのような有機生成物を、広範囲の用途に使用することも可能である。例えば、ここで記載されている酵母細胞によって生成された有機生成物を、食品、薬品または化粧品の防腐剤または添加物として用いることもできるし、プラスチックおよびその他の製品を作る目的で用いてもよい。
【００３６】
上記本発明の目的のために、有機生成物は炭素原子を含有するどのような化合物であってもよい。例えば、カルボン酸塩（例えば、乳酸塩、アクリル酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、α−ケトグルタル酸、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、オキサロ酢酸塩）、炭水化物（例えばＤ−キシロース）、アルジトール（例えば、キシリトール、アラニトール、リビトール）、アミノ酸（例えば、グリシン、トリプトファン、グルタミン酸塩）、脂質、エステル、ビタミン（例えば、Ｌ−アスコルビン酸塩）、ポリオール（例えば、グリセリン、１，３−プロパンジオール、エリトリトール）、アルデヒド、アルケン、アルキン、およびケトンが有機生成物である。従って、１個の有機生成物が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の炭素原子を含有してもよい。加えて、有機生成物の分子量が約１，０００未満（例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００または１００未満）であってもよい。例えば、Ｄ−キシロース(Ｃ5Ｈ10Ｏ5)は、分子量が１５０の有機生成物である。さらに、有機生成物は発酵生成物であってもよい。ここで用いられている「発酵生成物」という語は、発酵プロセスによって生成される有機化合物を指す。一般に、発酵プロセスとは、炭水化物のような有機化合物からエチルアルコールのような化合物への嫌気性酵素変換を含み、その結果アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態でエネルギーとなる。従って、発酵は、分子の酸素ではなく有機生成物が電子受容体として用いられるという点で細胞呼吸と区別される。発酵生成物の例としては、酢酸塩、エタノール、ブチレート、および乳酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
また、有機生成物がピルビン酸塩誘導生成物であってもよい。ここで用いられている「ピルビン酸塩誘導生成物」という語は、１５以下の酵素工程でピルビン酸塩から合成される化合物を指す。酵素工程は酵素活性を持つポリペプチドによって触媒作用を受ける化学反応または一連の化学反応である。ここで用いられている「酵素活性を持つポリペプチド」という語は、一度または複数回の反応の完了に際して自身が破壊されたり変質することなくほかの物質の化学反応の触媒として作用するポリペプチドを指す。通常、酵素ポリペプチドは１種または複数の物質から１種または複数の生成物を形成する際に触媒として作用する。そのようなポリペプチドはあらゆるタイプの酵素活性を持ち得るが、限定を意図せずにその例を挙げるならば、その酵素活性が関与する酵素は例えば、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸チオキナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、２，５−ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ(dioxovalerate dehydrogenase)、５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカル酸デヒドロゲナーゼ、グルカル酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルクロノラクトンレダクターゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタン酸塩アルドラーゼ(pentanoate aldolase)、キシロネートデヒドロゲナーゼ(xylonate dehydratase)、キシロラクトネーゼ(xylonolactonase)、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＣｏＡ−転移酵素、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ、またはアクリリルＣｏＡ−ヒドラターゼ(acrylyl-CoA hydratase)である。
【００３８】
重要なのは、特定の酵素活性を持つポリペプチドは、天然(naturally-occurring)ポリペプチドまたは非天然(non-naturally-occurring)ポリペプチドであってもよいということである。天然ポリペプチドは、天然で発見されるようなアミノ酸シーケンスを持つポリペプチドであり、野生型および多型ポリペプチドを含む。限定を意図したものではないが、そのような天然ポリペプチドは、哺乳動物、真菌および細菌といったあらゆる種から得られる。非天然ポリペプチドは、天然に発見されないアミノ酸シーケンスを持つポリペプチドである。従って、非天然ポリペプチドが天然ポリペプチドの突然変異(mutated version)または作り変えた(engineered)ポリペプチドであってもよい。例えば、クエン酸シンターゼ活性を持つ非天然ポリペプチドが、少なくとも幾らかのクエン酸シンターゼ活性を保持するクエン酸シンターゼ活性を持つ天然ポリペプチドの突然変異であってもよい。ポリペプチドは例えば、シーケンス転化、欠失(deletion)および／または置換などによって突然変異させてもよい。
【００３９】
有機生成物は、その生成物が１６以上の酵素工程を必要とするピルビン酸塩から合成されるのであればピルビン酸塩誘導生成物ではない。ピルビン酸塩誘導生成物の例として挙げられるのは、クエン酸塩、α−ケトグルタル酸、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、オキサロ酢酸塩、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−キシロネート、Ｄ−キシロネート、Ｄ−キシロノラクトン(xylonolactone)、Ｄ−キシロース、アクリル酸塩、酢酸塩、エタノール、ブチレート、および乳酸塩であるが、これらに限定されるのではない。
【００４０】
本発明の目的において、「自由酸」または「塩」形態をとり得るカルボン酸塩生成物を、塩形態の命名法を用いて表すことにする。例えば、乳酸を乳酸塩と見なす。従ってこの場合、「乳酸塩」という語は乳酸塩と同じく乳酸も含むものとする。
【００４１】
ここで用いられている「核酸(nucleic acid)」という語は、ＲＮＡとＤＮＡの双方に及び、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成（例えば、化学合成した）ＤＮＡを含む。核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の場合、その核酸はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。加えて、核酸は円形でも線状でもよい。
【００４２】
核酸細胞および特定の細胞に関してここで用いられている「外因性」という語は天然に発見される特定の細胞に起因するものではない核酸細胞を指す。従って、全ての非天然核酸細胞は、細胞に一旦導入されると細胞にとって外因性となると考えられる。ここで重要なのは、非天然核酸分子が、その核酸分子が全体として天然に存在しない場合でも、天然に発見される核酸シーケンスまたは核酸シーケンスの断片を含有する可能性があるということである。例えば、発現ベクター内部にゲノムＤＮＡシーケンスを含有する核酸分子は非天然核酸分子と考えられるので、一旦細胞内に導入されると細胞にとって外因性となると考えられる。なぜなら、その核酸分子が全体としては（ゲノムＤＮＡに加えベクターＤＮＡ）天然に存在しないからである。従って、いずれのベクターも、自己複製プラスミド(autonomously replicating plasmid)、または全体としては天然に存在しないウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）が、非天然核酸分子であると考えられる。すなわち、ｃＤＮＡの場合と同様、ＰＣＲまたは制限酵素処理で生成したゲノムＤＮＡ断片も、非天然核酸分子であると考えられる。なぜなら、それらは天然に発見されない別個の分子として存在するからである。また、天然に発見されない配列(arrangement)のプロモーターシーケンスおよびポリペプチド暗号化シーケンス（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有する核酸分子は非天然核酸分子と考えられる。
【００４３】
「内因性」という語は外因性ではないゲノム材料を指す。一般的に、内因性ゲノム材料は有機体、組織または細胞内部で生じ(develop)、組み換え技術によって挿入されたり修飾されることはない。内因性ゲノム材料の範囲には、天然変種(naturally occurring varations)は含まれない。
【００４４】
また重要なことは、天然の核酸分子によっては特定の細胞にとって外因性となり得るということである。例えば、ある個人Ｘの細胞から単離した純粋な染色体は、一旦その染色体が個人Ｙの細胞に導入されると、Ｙの細胞にとって外因性核酸分子となると考えられるであろう。
【００４５】
ここで用いられている「遺伝子修飾」という語句は、そのゲノムが例えばゲノム材料の添加、置換または欠失によって修飾された有機体を指す。ゲノム材料を添加または欠失する方法は周知であり、限定を意図するものではないが例として挙げられるのは、無作為の突然変異形成(random mutagenesis)、挿入や欠失および置換を含む点的突然変異(point mutations)、ノックアウト技術、および、組み換え技術を用いての核酸シーケンスを備えた有機体の形質転換であり、安定性形質転換体と遷移性形質転換体(transient transformant)の両方が含まれる。また酵母細胞が自然に、または遺伝子修飾によって澱粉を異化することもあり、例えば真菌性セルラーゼを添加することにより、遺伝子変換してセルロース化合物を異化することすらあり得る。
１．クラブトリー負表現型を持つ酵母細胞
本発明は、クラブトリー負表現型を持つ様々な遺伝子操作酵母細胞を提供する。そのような組み換え酵母細胞は、有機生成物を生成するのに用いられる。例えば、本発明が提供する酵母細胞はクラブトリー負表現型を持ち、有機生成物の形成につながる酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有する。そのような酵母細胞は、その有機生成物を生成するのであれば本発明の範囲に含まれる。特筆すべきなのは、生成された有機生成物を酵母細胞から分泌することができ、細胞膜を分断して有機生成物を取り出す必要がないということである。通常、本発明の酵母細胞は、培養条件が有機生成物の生成に最良であれば、消費されるグルコース１００グラムにつき約４０グラム以上（例えば、少なくとも約４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５グラム）の収率で有機生成物を生成する。特定の酵母細胞について有機生成物の生成の収率を決定する際には、どのような方法を用いてもよい。例として、キエルズら(Kiers et al.)Yeast, 14(5):459−469 (1998))を参照。また特筆すべきは、暗号化されたポリペプチドの酵素活性によって、ＮＡＤＨを消費する方法で有機生成物が形成されることである。すなわち、その有機生成物の生成には、ＮＡＤＨがエネルギー源として必要かもしれない。「ＮＡＤ」という語は、特定の酸化還元反応において電子および水素の担体として作用する補因子(co-factor)を指し、一方「ＮＡＤＨ」はＮＡＤの還元体を指す。合成の際にＮＡＤＨを必要とする有機生成物の例としては、乳酸塩、エタノール、酢酸塩、およびアクリル酸塩が挙げられるが、これらに限定されるのではない。通常、本発明の範囲内の酵母細胞はグルコースのようなヘキソース炭素を異化する。しかしながら、そのような酵母細胞はまた、ペントース炭素（例えばリボース、アラビノース、キシロースおよびリキソース）を異化する。換言すれば、本発明の範囲内の酵母細胞は、天然の状態で(naturally)ペントース炭素を利用することもできるし、またはペントース炭素を利用するために作り変えることも可能である。例えば、酵母細胞に外因性核酸分子を与えてもよい。この外因性核酸分子はキシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよび／またはキシルロキナーゼを暗号化するので、キシロースが異化されることもあり得る。酵母細胞はまた、天然の澱粉かまたは遺伝子修飾された澱粉を異化することもあり得るし、例えば真菌性セルラーゼのようなものを添加することで、遺伝子修飾されてセルロース化合物を異化することすらあり得る。
【００４６】
クラブトリー負表現型を持つ酵母細胞はクラブトリー効果を呈示しない酵母細胞である。「クラブトリー負(crabtree-negative)」という語は、天然の有機体および遺伝子修飾された有機体の両方を指す。簡単に言えば、クラブトリー効果とは、高濃度（例えばグルコース／Ｌが５０グラム）のグルコースが存在するために、好気性条件下で培養した時に微生物による酸素の消費を阻害することと定義される。換言すれば、クラブトリー正表現型を持つ酵母細胞は、グルコースの存在により利用可能な酸素量とは無関係に発酵を継続するが、一方でクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞は、グルコースを介した酸素消費の阻害が呈示されない。通常クラブトリー負表現型を持つ酵素細胞の例として挙げられるのは、クライベラミセス、ピチア、ハンゼヌラ、カンジダ、トリクスポロン、およびヤマダジマであるがこれらに限定されるのではない。
【００４７】
ここに記載されているように、本発明は、幅広い種類の有機生成物を生成することのできる多くの異なるタイプの組み換え酵母細胞を提供している。例えば、酵母細胞が、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化しそれによって乳酸塩を生成できるような外因性核酸分子を含有していてもよい。そのようなポリペプチドの例としては、これに限定されるものではないが、ウシ乳酸デヒドロゲナーゼ、細菌性乳酸デヒドロゲナーゼおよび真菌性乳酸デヒドロゲナーゼ（例えばケー・ラクチス、またはケー・サーモトレランス真菌性乳酸デヒドロゲナーゼ）が挙げられる。この場合も、乳酸デヒドロゲナーゼ活性のような酵素活性を持つポリペプチドが天然のものであっても非天然のものであってもよい。
【００４８】
重要なのは、ここで記載されている酵母細胞が特定の外因性核酸分子の単一の複製または複数の複製（例えば約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００または１５０）を含有してもよいということである。例えば、一酵母細胞が外因性核酸分子Ｘの複製を約５０個含有していてもよい。また重要なことは、ここに記載されている酵母細胞が２個以上の特定の外因性核酸分子を含有していてもよいということである。例えば、ある酵母細胞が外因性核酸分子Ｘの複製を約５０個と、同様に外因性核酸分子Ｙの複製を約７５個含有していてもよい。このような場合、異なる核酸分子が各自、固有の酵素活性を持つポリペプチドを暗号化するのでもよい。例えばある酵母細胞が４個の異なる外因性核酸分子を含有しそれによってアクリル酸塩を生成するのでもよい。この例では、そのような酵母細胞が持ち得る第一の外因性核酸分子は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第二の分子はＣｏＡ−転移酵素活性を持つポリペプチドを暗号化し、第三の分子はラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第四の分子はアクリリル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する。別の例では、ある酵母細胞が４個の異なる外因性核酸分子を含有し、それによってＤ−キシロースを生成することができる。具体的には、そのような酵母細胞が含有し得る第一の外因性核酸分子は、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ―ペンタノエートアルドラーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第二の分子はキシロネートデヒドラターゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第三の分子はキシロノラクトナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第四の分子はＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する。さらに別の例では、ある酵母細胞が６個の異なる外因性核酸分子を含有し、それによってビタミン、Ｌ−アスコルビン酸塩が生成される。具体的には、そのような酵母細胞の持ち得る６個の外因性核酸分子の第一の分子は２，５−ジオキソバレレートヘヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第二の分子は５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカレートデヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第三の分子はグルカレートデヒドラターゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第四の分子はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第五の分子はグルクロノラクトンレダクターゼ活性を持つポリペプチドを暗号化し、第六の分子はＬ−グロノラクトンオキシダーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する。
【００４９】
重要なのは、酵素ポリペプチドを使用して所望の有機生成物を光学的に純粋（例えば、約９０、９５、９９％の純度）にすることができるという点である。例えば、（Ｌ）−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを用いて（Ｌ）−乳酸塩を生成してもよい。
【００５０】
本発明の範囲内の酵母細胞はまた、低いピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性のような低い酵素活性を持っていてもよい。ここで、細胞および特定の酵素活性について用いられている「低い(reduced)」という語は、比較の対象としての同種の酵母細胞で計測したレベルよりも低いレベルの酵素活性を指す。従って、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を欠く酵母細胞は、低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持つと考えられる。なぜなら、全部とはいえなくてもかなりの酵母細胞が少なくとも幾らかのピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持つからである。そのように酵素活性が低くなる原因は、低い酵素濃度、低い酵素比活性、またはそれらが組み合わさった結果であるとも考えられる。低い酵素活性を持つ酵母細胞を形成する目的で、多くの異なる方法を用いることができる。例えば、一般的な突然変異生成またはノックアウト技術を用いて酵母細胞を処理することによって酵母細胞が分断された酵素暗号化座(disrupted enzyme-encoding locus)を持つようにしてもよい。例として、('Methods in Yeast Genetics'１９９７年度版）、アダムズ(Adams)、ゴツリング(Gottschling)、カイザー(Kaiser)、スターンズ(Sterns)、コールドスプリングハーバープレス(Cold Spring Harbor Press)（１９９８）を挙げる。或いは、アンチセンス技術を用いて酵素活性を低下させてもよい。例えば、酵母細胞を処理することによって、酵素の形成を防止するアンチセンス分子を暗号化するｃＤＮＡを含有させてもよい。ここで用いられている「アンチセンス分子」という語には、内因性ポリペプチドの暗号鎖に相当するシーケンスを含有する核酸分子までもが含まれる。アンチセンス分子もフランキングシーケンス（例えば調節シーケンス）を持つ可能性がある。従って、アンチセンス分子がリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。リボザイムは、その分子がＲＮＡを開裂させるとすれば、限定を意図するものではないが、ヘアピン型、ハンマーヘッド型、またはアックスヘッドといった一般的な構造をとり得る。
【００５１】
低い酵素活性を持つ酵母細胞は、何らかの方法で識別可能である。例えば、低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持つ酵素細胞は、通常の方法を用いて容易に識別できる。例として、アルブリック(Ulbrich)'Methods in Enzymology' １８:１０９〜１１５(１９７０)を参照。
２．クラブトリー正表現型またはクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞
本発明はまた、クラブトリー負表現型を持つ必要のない遺伝子操作された様々な酵母細胞を提供する。換言すれば、そのような細胞はクラブトリー正表現型であってもクラブトリー負表現型であってもよい。そのような組み換え酵母細胞を、有機生成物の生成に用いることができる。例えば、本発明は、細胞によるペントース炭素（例えばリボース、アラビノース、キシロースおよびリキソース）の異化を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有する酵母細胞を提供する。具体的には、酵母細胞がキシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、および／またはキシルロキナーゼを暗号化する外因性核酸分子を持ち、それによってキシロースをより効率的に異化させることが可能になる。その上、ペントース炭素を異化させることのできるその酵母細胞はまた、ヘキソース炭素（例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イオドース、ガラクトースおよびタロース）を、順次または同時に異化させることもできる。例えば、酵母細胞を処理してキシロースおよびグルコースが同時に異化されるようにしてもよいということである。特筆すべきは、高いペントース炭素異化能力を持つ酵母細胞を用いて、ペントース炭素源から有機生成物を生成できる酵母細胞を処理してもよい。この特徴は特に有利である。なぜなら、キシロースのようなペントース炭素源は通常グルコースのようなヘキソース炭素源より安価だからである。異化が可能なその他の炭素源としては、メリビオース、サッカロース、フルクトース、ラフィノース、スタキオース、澱粉(例えば、コーンスターチおよび小麦澱粉)、および加水分解物質（例えば、コーンファイバー加水分解物質およびその他のセルロース性加水分解物質）が挙げられるが、これらに限定されるのではない。
【００５２】
加えて、本発明は外因性核酸分子を含有する酵母細胞を提供し、その外因性核酸分子は細胞の細胞質でのアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する。例えば、酵母細胞が、クエン酸リアーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を持っていてもよい。或いは、酵母細胞が、ミトコンドリア膜へのアセチル−ＣｏＡの浸透を促進するミトコンドリア膜ポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を持っていてもよい。特筆すべきは、エタノール生成能力のない多くの酵母細胞は、エタノールと酢酸塩が存在しなければ増殖できないことである。通常、ピルビン酸デカルボキシラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼの活性のいずれかが何らかの理由で不足していれば、酵母細胞はエタノール生成能力を欠く。例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性に欠けるクラブトリー正表現型（例えばサッカロミセス）は、エタノールと酢酸塩がなければ増殖率が悪化する。従って、エタノールの生成を減少させてピルビン酸塩が他の有機生成物に利用されるよう再度仕向ける(redirect)方法でそのようなクラブトリー正表現型酵母の操作を行うと、特にエタノールおよび酢酸塩がない時に増殖率が悪化する。これは、グルコースが存在するとクラブトリー正表現型酵母が細胞呼吸を制限するからである。ここに記載されているように、細胞質の酢酸塩濃度およびアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性に頼らない方法で細胞質のアセチル−ＣｏＡの堆積を促進できる酵母細胞は、エタノールを生成することが不可能な時でもエタノールおよび酢酸塩無しで増殖可能である。特筆すべきは、エタノール生成能力を欠きながらも、エタノールおよび酢酸塩が存在しないところで増殖する能力を持つ酵母細胞は、ピルビル酸塩を、エタノール以外の有機生成物を生成目的で利用できるように再度仕向けることが可能ということである。
【００５３】
いずれのタイプの酵母でも、細胞の細胞質でのアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有し得る。例えば、クラブトリー正表現型またはクラブトリー負表現型を持つ酵母細胞が、細胞の細胞質でアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有していてもよい。通常、そのような酵母細胞は以下の方法で識別可能である。すなわち（１）外因性核酸分子を含有する細胞を操作して、ピルビン酸デカルボキシラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを持たないようにする、（２）細胞を、微量(titrating amounts)の呼吸阻害剤（例えば、アンチマイシンＡ、シアナイド、またはアジド化物）の存在下で培養しながらその細胞の増殖特性を判断し、（３）それらの増殖特性を、同じ外因性核酸分子を含まずまたピルビン酸デカルボキシラーゼやアルコールデヒドロゲナーゼを持たないよう同様に操作された比較対照用の酵母細胞の観察結果と比較する。比較の結果、外因性核酸分子が存在する故により好ましい増殖特性を持つと判断された酵母細胞は、細胞の細胞質でアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有すると考えられる。
【００５４】
細胞の細胞質でアセチル−ＣｏＡの堆積を促進するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有する酵母細胞はまた、低いピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性といった低い酵素活性を持ち得る。例えば、ある酵母細胞に、エタノールを生成する能力が欠けていてもよい。通常、そのような酵母細胞はエタノールおよび酢酸塩を欠く培養条件下では、外因性核酸分子を含有しないものの類似の条件下（すなわち、エタノールおよび酢酸塩を欠く条件）で培養された比較対照用の酵母細胞（すなわち、エタノール生成能力を各酵母細胞）よりも高い増殖率（例えば約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００％またはそれ以上）を示す。
【００５５】
本発明はまた、ポリペプチドの活性が低い酵母細胞を提供する。そのような酵母細胞は、クラブトリー正表現型またはクラブトリー負表現型を持っていてもよい。例えば、本発明の範囲内の酵母細胞は、プラズマ膜ポリペプチド（例えば、プラズマ膜輸送体）、細胞質のポリペプチド（例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ）、および／またはミトコンドリアポリペプチド（例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼ）の活性が低くてもよい。「プラズマ膜輸送体」という語は、有機生成物がプラズマ膜を通過して移動し易くなるようにするポリペプチドを指す。そのようなポリペプチドの例としては、エス・セレビシアエ(S. cerevisiae)中のＪＥＮ１（ジェンバンク(Genbank)登録番号Ｕ２４１５５）のようなカルボン酸輸送体が挙げられるが、これに限定されるわけではない。「ミトコンドリアポリペプチド」という語は、ミトコンドリア内部で機能するポリペプチドを指し、その例としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸塩またはアセチル−ＣｏＡの異化に参与するポリペプチド（例えばチトクロムｂ２ポリペプチド）、およびクレブズ回路酵素が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。クレブズ回路酵素はアコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸チオキナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびクエン酸シンターゼを含む。ここに記載したように、低い酵素活性を持つ酵母細胞には、特定の酵素活性を全く持たない酵母細胞も含まれる。重要なのは、酵母細胞およびポリペプチド活性に関してここで用いられている「低い(reduced)」という語が、類似の条件下で同種の比較対照用酵母細胞で測定した活性のレベルより低いレベルを指すことである。従って、特定の輸送体活性を持たない酵母細胞は、比較対照用の細胞が少なくとも幾らかの輸送体活性を持つのであれば、低い輸送体活性を持つと考えられる。そのような低いポリペプチド活性は、低いポリペプチド濃度、低いポリペプチド比活性、あるいはそれらが組み合わさった結果ということも有り得る。低いポリペプチド活性を持つ酵母細胞を形成する際に、様々な方法のいずれを用いてもよい。例えば、ミトコンドリアポリペプチドを暗号化する核酸シーケンスを持つ座を、一般的な突然変異生成またはノックアウト技術等により不活性にしてもよい。
【００５６】
低いミトコンドリア酵素活性を持つ酵母細胞は、クレブス回路生成物(例えば、クエン酸塩、イソクエン酸塩、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、およびオキサロ酢酸塩)を堆積することができる。例えば、低いフマラーゼ活性を持つ酵母細胞は、フマル酸塩を堆積することができる。加えて、その酵母細胞は、有機生成物の形成につながる酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有し得るので、それによってその細胞は有機生成物を生成する。
【００５７】
重要なのは、幾つかのクレブス回路生成物（例えばα−ケトグルタル酸およびスクシニル−ＣｏＡ）がミトコンドリア膜を透過できないということである。従って、特定のクレブス回路酵素の活性を低下させると、結果的にミトコンドリア内腔のある種のクレブス回路生成物が堆積する。このような場合、クレブス回路の活性が低い酵母細胞を、１個または複数の異なる外因性核酸分子を含有するよう処理してもよく、それらの分子はそれぞれ異なる酵素活性を持つポリペプチドを暗号化し、その結果望ましいクレブス回路生成物が細胞質内部に堆積する。例えば、ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させると、結果的にα−ケトグルタル酸が堆積し、また順次、イソクエン酸塩も堆積する。α−ケトグルタル酸はミトコンドリア膜を透過できないが、一方、イソクエン酸塩はミトコンドリア膜を透過できる。従って、イソクエン酸塩は細胞の細胞質内部で堆積可能である。しかしながら、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を同様に含有する酵母細胞を含有し、また細胞質内部で機能的ポリペプチド(functional polypeptide)を発現させる酵母細胞は、細胞質α−ケトグルタル酸を生成可能である。従って、特定のクレブス回路酵素の活性を低下させる一方で、その細胞質内部で機能を持つようにその（または別の）クレブス回路酵素を暗号化する外因性核酸分子を供給していると、細胞質内部で様々なクレブス回路生成物（またはクレブス回路生成物に由来する生成物）を生成することが可能である。
【００５８】
さらに、本発明は、炭素源がバイオマスや所望の有機生成物の生成に利用できないようにする酵素の活性が低い酵母細胞を提供する。例えば、培地内の炭素源がバイオマスまたは所望の有機生成物の生成に主として利用されるようにグリセリンまたはアセトイン経路内の酵素を分断する。グリセリン経路酵素の例として挙げられるのは、ジヒドロキシアセトンリン酸還元酵素であるがこれに限定されない。アセトイン経路酵素の例として挙げられるのは、α−アセト乳酸シンターゼおよびα−アセト乳酸デカルボキシラーゼであるがこれらに限定されない。この場合も、酵素の活性を低下させるためにどのような方法をとってもよい。
【００５９】
その上、ここで提供されている酵母細胞のいずれかが、キラープラスミドとして機能する外因性核酸分子を含有していてもよい。ここで用いられている「キラープラスミド」という語は、他の種の酵母を殺す能力を備えた酵母の一種を供給する核酸分子を指す。例えば、キラープラスミドを含有する属のクライベラミセスに由来する酵母細胞は、属サッカロミセス由来の酵母の増殖を防止することができる。従って、キラープラスミドを持つ酵母細胞を、大規模な生成プロセス中に起こる汚染の問題を防止する目的で用いることができる。加えて、どのようなタイプのキラープラスミドを酵母細胞に与えてもよい。例えば、ケー・ラクチスから単離したキラープラスミドをケー・マルシアヌス酵母細胞に与えてもよい。キラープラスミドを含有する酵母細胞は、一般的な方法を用いて容易に識別可能である。例として、ガンジェら(Gunge et al., J. Bacteriol. 145(1):382390 (1981))、ガンジェおよびキタダ(Gunge and Kitada, Eur. J. Epidemiol.,4:409414 (1988))、およびウェソロスキ−ローベルら(Wesolowski-Louvel et al., Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, p. 138-201 (1996))参照。
【００６０】
同様に、ここで提供した酵母細胞のいずれも、ＡＴＰアーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有してもよい。そのポリペプチドは、酵母細胞が低ｐＨ環境により高い耐性を持つよう形質転換されている。例えば、ある酵母細胞に、細胞外プロトン濃度が高い時に効率よく低細胞質プロトン濃度を維持するＡＴＰアーゼを与えてもよい。そのようなポリペプチドは、モルソメら(Morsomme et al. (EMBO J. 15:5513-5526 (1996))に記載されているように処理してもよい。
【００６１】
重要なのは、ここで記載されている組み換え酵母細胞のいずれも、記載されている遺伝子操作の如何なる組み合わせも含有し得ることである。例えば、クラブトリー正表現型を持つ酵母細胞は、有機生成物の生成につながる酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子同様に、クエン酸リアーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を含有してもよい。
３．適切な有機体
様々な有機体が本発明における使用に適している。エス・セレビシアエおよびエス・ウバルム(S. uvarum)を含むサッカロミセス種、ケー・サーモトレランス、ケー・ラクチス、およびケー・アルシアヌスを含むクライベラミセス、ピチア、エイチ・ポリモルファ(H. polymorpha)を含むハンヌセラ、カンジダ、トリコスポロン、ワイ・スチピチス(Y. stipitis)を含むヤマダジマ、またはトルラスポラ・プレトリエンシス(Torulaspora pretoriensis)といった、クラブトリー負表現型およびクラブトリー正表現型微生物に加え、幅広い範囲の微生物種由来の有機体が、乳酸生成用の宿主として有用である。例えば、天然の乳酸生成者(producer)であるリゾプス・オリーゼ(Rhizopus oryzae)のような有機体wo、耐酸性、収率向上、および任意の純度の乳酸を得るといった目的で遺伝子修飾してもよい。アスペルギルス種(Aspergillus spp.)も、クエン酸のような有機酸類を生成することと、低ｐＨへの耐性を持つことで知られる。乳酸を生成する目的でアスペルギルス種を遺伝子修飾する方法も有効である。その上、リゾプスおよびアスペルギルス種のような真菌は酵素を生成し、それによって澱粉およびその他の炭水化物重合体を減成(degrade)して炭素源として使用される単量体炭水化物とすることができる。
【００６２】
大腸菌(Escherichia coli)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、およびかん菌属(Bacillus spp.)といった原核生物(Prokaryotes)は、乳酸生成目的で既に遺伝子修飾が行われており、またそれが可能である。バチルス-コアグランス(Bacillus coagulans)として識別されてきた微生物もまた、低ｐＨ乳酸生成を改善する目的でさらなる遺伝子修飾も可能な天然の乳酸生成者である。
【００６３】
加えて、アルキア(Archea)科由来の極オフィレ(extremeophile)有機体は、極低ｐＨおよび高温に耐えることができる。この科から選択された種の遺伝子修飾によって乳酸生成菌株の提供も可能かもしれない。
４．遺伝学的局面
酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する核酸分子は、あらゆる方法を用いて識別および形成が可能である。例えば、遺伝子暗号に基づいて核酸シーケンスをアミノ酸シーケンスに翻訳する標準的な核酸配列技術およびソフトウェアプログラムを用いて、特定の核酸が公知の酵素ポリペプチドを備えた何らかのシーケンスホモロジーを持つか否かを判断することができる。メガライン（登録商標）(MEGALIGNR,DNASTAR, Madison, WI, 1997)のような配列アラインメントソフトウェアを用いて、様々なシーケンスを比較することができる。加えて、公知の酵素ポリペプチドを暗号化する核酸分子を、一般的な分子クローニング技術（例えば部位指向性突然変異生成）を用いて突然変異させることができる。限定を意図したものではないが、可能な突然変異として挙げられるのは、欠失、挿入、および塩基置換(base substitutions)で、欠失、挿入および塩基置換を組み合わせてもよい。さらに、核酸およびアミノ酸データベース（例えばジェンバンク（登録商標）(GenBankR)）を用いて、酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する核酸シーケンスを識別することもできる。簡単に言えば、酵素活性を持つポリペプチドに対するなんらかのホモロジーを持つアミノ酸シーケンス、または酵素活性を持つポリペプチドを暗号化するシーケンスに対する何らかのホモロジーを持つ核酸シーケンスを、ジェンバンク（登録商標）のサーチを行うクエリーとして用いることができる。識別されたポリペプチドはその後、酵素活性を呈示するかどうか判断する目的で分析することもできる。
【００６４】
酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する核酸分子を、ＰＣＲのような一般的な分子クローニングまたは化学核酸合成処理方法および技術を用いて識別および形成することも可能である。ＰＣＲは、標的となる核酸を、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている方法と類似の方法で増幅することと、その後にその中で記載されているプロセスの修飾を指す。一般に、対象領域の末端またはその周辺(beyond)からのシーケンス情報を用いて、増幅されるポテンシャルテンプレートの対生菌株(opposite strands)にシーケンスが一致するかまたは類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを用いて、核酸シーケンスをＲＮＡまたはＤＮＡから増幅してもよい。例えば、核酸シーケンスを、ＰＣＲ増幅によって、総細胞ＲＮＡ(total cellular RNA)、総ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡから、さらにはバクテリオファージシーケンス、プラスミドシーケンス、ウイルスシーケンス等から単離することができる。ＲＮＡをテンプレート源として用いる時、優勢な(complimentary)ＤＮＡ菌株を合成する目的で逆転写酵素を用いてもよい。
【００６５】
さらに、酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する核酸分子を識別および形成するために核酸ハイブリッド形成技術を用いてもよい。簡単に言えば、公知の酵素ポリペプチドまたはその断片を暗号化する核酸分子を、中〜高度の厳密さの条件下でのハイブリッド形成によって類似の核酸分子を識別するプローブとして用いることができる。そのような類似の核酸分子をその後単離、配列および分析することにより、暗号化されたポリペプチドが酵素活性を持つかどうか判断することもできる。
【００６６】
ハイブリッド形成は、ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスをそれぞれ識別するサザン分析またはノーザン分析によって行うことも可能であり、プローブのために異種交配を行う。そのプローブは、32Ｐのような放射性同位体、酵素、ジゴキシゲニンを用いて、またはビオチニレーション(biotinylation)によって標識されてもよい。分析用のＤＮＡまたはＲＮＡは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル表面で電気泳動分離され、ニトロセルロース、ナイロン、またはその他の適当な膜に移植され、当業者に周知の標準的な技術を用いてプローブで異種交配される。そのような技術は例えば、サムブルックら(Sambrook et al. sections 7.39-7.52 of Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY.)に記載されている。通常、プローブの長さは約２０ヌクレオチド以上である。例えば、哺乳類のクエン酸リアーゼ活性を暗号化する２０ヌクレオチドに相当するプローブを、クエン酸リアーゼ活性を持つ真菌性ポリペプチドを暗号化する核酸分子の識別に用いてもよい。加えて、２０ヌクレオチドより長いまたは短いプローブを用いてもよい。
【００６７】
外因性核酸分子を細胞に導入するのにあらゆる方法が用いられる。実際に、酵母細胞に核酸を導入する多くの方法が当業者間で知られている。例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合(conjugation)およびプロトプラスト融合法が、核酸を酵母細胞に導入する一般的な方法である。例として、イトウら(Ito et al. J. Bacterol. 153:163-168 (1983); Durrens et al., Curr. Genet. 18:7-12 (1990); and Becker and Guarente, Methods in Enzymology 194:182-187 (1991)）を参照。
【００６８】
重要なのは、本発明の酵母細胞内部に含有される外因性核酸分子を、あらゆる形態で細胞内で維持できるということである。例えば、外因性核酸分子を細胞のゲノムに組み込むか、エピゾームの状態で維持することができる。換言すれば、本発明の細胞は、安定性形質転換体でもよくまた遷移性形質転換体であってもよい。加えて、ここに記載されている酵母細胞は、上記のような特定の外因性核酸分子の、単一または複数の複製（例えば約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００または１５０個）を含有していてもよい。
【００６９】
外因性核酸分子からアミノ酸シーケンスを発現させる方法は、当業者間でよく知られている。限定を意図したものではないが、そのような方法の一例として挙げられるのは、調節要素(regulatory elements)ポリペプチドを暗号化する核酸シーケンスの発現を促進できるように核酸を構成するということである。通常、調節要素は、転写のレベルで他のＤＮＡシーケンスの発現を調節するＤＮＡシーケンスである。従って、調節要素は、プロモーター、エンハンサーおよびその他を含むが、これらに限定されるのではない。その上、酵母の外因性核酸分子からポリペプチドを発現させる方法は当業者間でよく知られている。例えば、クライベラミセス内部で外因性ポリペプチドを発現できる核酸構造物がよく知られている。例として、米国特許第４，８５９，５９６号および第４，９４３，５２９号を参照。
【００７０】
ここに記載されているように、本発明の範囲内の酵母細胞は外因性核酸分子を含有している。その分子は例えば、有機生成物の形成につながる酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する。外因性核酸を含有する細胞を識別する方法は、当業者間でよく知られている。そのような方法の例として挙げられるのは、ＰＣＲおよび、ノーザン分析およびサザン分析のようなハイブリッド形成技術であるが、これらに限定されるのではない。場合によっては、免疫組織化学および生化学的な技術を用いて、特定の核酸分子によって暗号化された酵素ポリペプチドの発現を検出することで、ある細胞がその特定の核酸を含有しているかどうかを判断することもできる。例えば、ある暗号化された酵素に関して特異性を持つ抗体を用いて、ある特定の酵母細胞がその暗号化された酵素を含有するかどうかを判断することができる。さらに、生化学的な技術を用いて、ある酵素ポリペプチドの発現の結果として生成された有機生成物を検出することによって、ある細胞がその酵素ポリペプチドを暗号化する特定の核酸分子を含有するかどうかを判断することができる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子を、通常はそのようなポリペプチドを発現しない酵母細胞に導入した後に乳酸塩が検出されれば、酵母細胞が導入された外因性核酸分子を含有するのみならず、その導入された外因性核酸分子からの暗号化された酵素ポリペプチドを発現するということがわかる。具体的な酵素活性または特定の有機生成物の存在を検出する方法は、当業者によく知られている。例えば、乳酸塩の存在は、別記の方法で判断できる。例として、ウィッテら(Witte et al. J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989))参照。
【００７１】
本発明はまた、組み換えシーケンスおよび選択されたシーケンスを含有する核酸構造物を提供する。ここで用いられている「組み換えシーケンス」という語は、細胞内に発見されるゲノムシーケンスに相当する核酸シーケンスを指す。ここで記載されている組み換えシーケンスを、ノックアウト有機体の発生(generation)の間に、組み換え事象を指示する(direct)目的で用いてもよい。換言すれば、組み換えシーケンスを、特定のシーケンスを暗号化する核酸シーケンスを含有する座を特に限定して分断することもできる。ここで用いられている「選択されたシーケンス」という語にはあらゆる核酸シーケンスが含まれる。通常、ある選択されたシーケンスは、細胞内の有機生成物の形成につながる酵素活性を持つポリペプチドを暗号化する。従って、本発明の核酸構造物を用いて、一工程で内因性酵素活性をノックアウトし、外因性酵素活性を添加することもできる。ほとんどの場合、選択されたシーケンスは組み換えシーケンス内部にあるので、その選択されたシーケンスは組み換えシーケンスによって各末端部でフランキングされる。
５．有機生成物の生成および培養方法
本発明は、酵母細胞およびその他ここで提供されている細菌性細胞のいずれかを用いて有機生成物を生成する方法を提供する。そのような方法の一例では、酵母細胞を供給しその供給された酵母細胞を培地で培養することによって、有機生成物（例えば、グリセリン、アクリル酸塩、キシロース、アスコルビン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、およびオキサロ酢酸塩）が生成される。一般的に、培地および／または培養条件は、２種のカテゴリーのいずれかに分類される。すなわち、細胞呼吸および／またはバイオマス生成を促進するカテゴリーと、細胞呼吸を減少させるカテゴリーである。通常、細胞呼吸を促進する培地および／または培養条件は、急速な増殖が要求される状況、またはその生成物が細胞呼吸無しでは生成不可能な状況で用いられる。そのような有機生成物がクレブス回路生成物を含んでいてもよいが、必ずしもそれに限定されない。一方、細胞呼吸を減少させる培地および／または培養条件は、急速な増殖が不要もしくは望ましくない、またはその生成物が細胞呼吸無しでも生成可能な状況で用いられる。そのような生成物には乳酸塩、アクリル酸塩およびキシロースが含まれるがこれらには限定されない。ここでのように、「細胞呼吸を促進する」または「バイオマス生成を促進する」といった語句を培養条件について用いた場合、それは、主として培地内の炭素源が酸化呼吸(oxidative respiration)により、または有機体を生成するために新陳代謝されるように、その細胞培養条件が維持されていることを意味する。ここで用いられている「バイオマス」という語は、その有機体の乾燥重量を指す。ここでの「有機体を生成するために主として新陳代謝される」という語句は、（炭水化物の形態で）消費される炭素源１グラムあたり約０．３グラム以上のバイオマス（例えば、約０．４、０．４５、０．５、または０．６グラム以上のバイオマス）を意味する。一般的に、炭素源１グラムあたり約０．３グラム〜約０．６グラムのバイオマスが生成される。ある培養におけるバイオマスの量（乾燥細胞重量）を判断する方法は公知であり、その例として挙げられるのは、ポスツマら(Postma et al. "Enzymic analysis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Mocrobiol., 53, 468-477 (1989))、およびキエルズら(Kiers  et al., "Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359," Yeast, 14, 459-469 (1998))である。炭素源の消費量を判断する方法は公知であり、例えばＨＰＬＣ方法学が挙げられる。
【００７２】
特筆すべきは、炭素源利用の効率が炭素源および有機体によって変わり得るということである。従って、炭水化物以外の炭素源を含む複合増殖媒体(complex growth media)を用いてもよいが、炭素源１グラムに対し生成されるバイオマスの量は、消費された炭水化物炭素源１グラムに対するバイオマスの量のみを指す。
【００７３】
通常、細胞呼吸の阻害剤（例えば、アンチマイシンＡ、シアニド、およびアジド）を含有する培地は細胞呼吸を減少させ、一方そのような阻害剤がなければ細胞呼吸が促進されるであろう。同様に、嫌気性培養条件は細胞呼吸を減少させるが、好気性条件下は細胞呼吸を促進するであろう。好気性条件とは、酸素が導入されるか自然に発生し、呼吸経路用の基剤の役割を果たす条件のことである。一般的に、「好気性」という語は、培地が空気流０．１ＶＶＭ（空気量／液体量／分）以上（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、または２．０ＶＶＭより大きい）に維持される培地条件を指す。空気以外の気体を用いる場合は、見かけの(nominal)ＶＶＭをその基質の酸素含有量に基づいて空気と同等になるよう調整する。或いは、「好気性」を、大気圧の空気で飽和した状態で存在する量に対し、溶解した酸素の量が２％以上（例えば５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５または８０％以上）である培地として定義してもよい。
【００７４】
嫌気性条件は、酸素が故意にまたは自然に、その呼吸経路でほとんど利用できないようにされている条件のことであり、結果的に例えばエタノールのような還元生成物が生成される。一般的に、培地に溶解している酸素（ＤＯ）の量が約２．０％未満（例えば、約１．５、１．０、もしくは０．５％未満または約０％）であれば、嫌気性条件と考えられる。同様に、ＶＶＭ（空気量／液体量／分）が約０．１未満（例えば、約０．０５未満または約０）であれば、嫌気性条件であると考えられる。通常、ＶＶＭに関してここで用いられている「空気」という語は、大気中に存在するような空気を指す。それ以外に細胞呼吸に影響を及ぼし得る培養条件としては、ｐＨ、温度、および特定の炭素源(グルコース等)が挙げられるが、これらに限定されるのではない。重要なのは、一つの種の酵母内部で細胞呼吸を促進する幾つかの培地および／または培養条件は、別の種内部の細胞呼吸を減少させる可能性があるということである。例えば、培地内部にグルコースが存在すると、クラブトリー正表現型を持つ酵母細胞の細胞呼吸が減少するが、クラブトリー負表現型を持つ酵母細胞の細胞呼吸にはほとんど、または全く影響がない。
【００７５】
商業的生成中に培養条件を直接的に操作することは、ここに記載されているような所望の有機生成物の最適なレベルに到達する上で重要な工程であるといえる。通常、本発明の範囲内の酵母細胞は細胞呼吸を促進し有意の細胞密度を生成する培養条件下で増殖される。例えば、酵母細胞を培養容器に設置し、大量のグルコースと酸素を与えればよい。通常、細胞呼吸が促進される条件下では、ここで供給された微生物が倍増する時間は約１０時間未満（例えば、約８、５、または３時間未満）である。一旦細胞が有意の密度に達すると、細胞呼吸を減少させるようにその培養条件の切り替えを行うことによって、細胞呼吸を必要としない有機生成物が生成される。例えば、酵母細胞を培養容器に移して大量のグルコースを与えるが酸素は与えないようにしてもよい。この場合、培養条件を直接的に操作し好気性条件から嫌気性条件に切り替えることにより、所望の有機生成物を最適レベルで生成することができる。或いは、場合によっては、細胞呼吸を促進する条件下でそのような細胞を単独で培養することにより、細胞呼吸を必要とする有機生成物を生成してもよい。特筆すべきは、生成容器内の細胞マスが、約２ｇ／Ｌを超える（例えば約４、６、または８ｇ／Ｌを超える）ことである。
【００７６】
培養の間、温度を約３５℃より高く（例えば、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃より高く）してもよい。加えて、培地が液体であってもよい。その培地は通常、炭素源を含有する。一般的に、炭素源は粗材料を含有する炭水化物を含む。通常、養分培地(nutrient media)はまた、窒素源も含有する。その窒素源が有機および無機の窒素化合物の組み合わせを含むのが好ましい。
【００７７】
一実施態様においては、大型の発酵容器に、バイオマス生成および所望の生成物の生成に十分なように、必要とされる全栄養素と全炭水化物を含む培地を満たすのが望ましいといえよう。その容器を、例えば好気性条件にすることによって当初はバイオマス生成が促進され、次に所望の生成物を生成するために嫌気性条件に切り替えるといった条件下で操作してもよい。
【００７８】
また別の実施態様では、バイオマス生成用として小型の容器を使用し、高レベルの栄養素と十分な炭水化物を用いて、例えば約１００ｇ／ｌのバイオマスを生成する。この容器の内容物をその後、栄養素が少な目の第二の培地を含有するより大きめの容器に移してもよい。そのような培地は例えば、水中に炭素源としてのグルコースまたはその他の炭水化物炭素源のみを含有する。この容器を嫌気性条件下で操作して、所望の有機生成物を生成してもよい。低い栄養素レベルと嫌気性条件のため、バイオマス増殖は減少する。
【００７９】
好ましい実施態様では、所望の生成物の回収を簡略化するために、養分媒体を必要な材料のためだけに保持する。好気性増殖を利用すると、嫌気性条件下での増殖が必要とされる場合に比べ、単純な媒体を使用することが可能になる。ここで記載されている酵母の多くが、好気性条件下で、糖類、無機窒素源、微量金属およびいくらかのビタミン類のみで構成される媒体表面で増殖可能である。
【００８０】
発酵またはその他のプロセスの結果として生じた培地に有機生成物を添加するまでは、その培地のｐＨは一般的には約５．０〜７．０である。しかしながら、有機酸等の有機生成物が微生物によってその培地に分泌されると、培地のｐＨは低下し易い。ここで用いられている「有機ｐＨ」という語は、乳酸等のカルボン酸塩類のような、その培地に存在する有機化合物に起因する培地のｐＨを指す。ここで用いられている「無機ｐＨ」という語は、ＨＣｌやＨ2ＳＯ4といった無機化合物に起因するｐＨを指す。その培地の有機ｐＨ値が約３．０未満（例えば、約２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、または１．５未満）、または無機ｐＨ値が約３．０未満（例えば、約２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、または１．５未満）であればよい。培養処理中はあらゆる炭素源を用いることができる。例えば、ペントース炭素（例えばリボース、アラビノース、キシロースおよびリキソース）を含有する培地を用いてもよい。加えてコーンファイバー加水分解物質を含有する培地も用いられる。コーンファイバー加水分解物質のｐＨ値が２．０〜６．５であってもよい。通常、コーンファイバー加水分解物質はグルコース、キシロースおよびアラビノースを含有する。例えば、コーンファイバー加水分解物質がグルコースを約４０グラム／Ｌ、キシロースを約４０グラム／Ｌ、およびアラビノースを約２０グラム／Ｌ含有していてもよい。
【００８１】
大規模な生成プロセスでは、以下に示す方法を用いてもよい。ヘキソースおよび／またはペントース炭素等を含む適当な培地を備えた大型タンク（例えば、５０−、１００−、２００−ガロンまたはそれ以上のタンク）に特定の微生物を植え付ける。植え付けの後、炭素源がバイオマスの生成に主に利用されるように、培養条件を操作してもよい。例えば、培地を操作して、ｐＨ値が約７．０、温度が約３５℃、そしてタンク全体が好気性環境となる程度の量の酸素を溶解させてもよい。特筆すべきは、このバイオマス生成相の間に所望の有機生成物の生成が可能ということである。一旦十分なバイオマスに到達すれば、その微生物を含有するブロスを第二のタンクに移してもよい。この第二のタンクはどのようなサイズでもよい。例えば、第二のタンクが最初のタンクに比べ、大きくても、小さくても、または同サイズでもよい。通常、第二のタンクは、第一のタンクからのブロスに追加の培地を添加できるように、第一のタンクより大きくなっている。加えて、この第二のタンク内の培地は第一のタンクで使用されている培地と同じでも、異なっていてもよい。例えば、第一のタンクがキシロースとアラビノースを含有するのであれば、第二のタンクがグルコース入りの培地を備えていてもよい。
【００８２】
微生物を移した後、炭素源が主として有機生成物の生成に用いられるよう、第二のタンク内の培養条件を操作してもよい。ここで、「有機生成物」としてはまずピルビン酸塩誘導生成物および二酸化炭素（ＣＯ2）が含まれるが、バイオマス（すなわち細胞乾燥重量）は含まれない。ここで、培養条件に関して用いられている「選択された有機生成物を主として生成する」または「選択されたピルビン酸塩誘導生成物」という語句は、その炭素源が培地内で、通常は発酵プロセスによって（必ずしもというのではないが）新陳代謝されることを意味し、消費される炭素源１グラムあたり０．５グラム以上の有機生成物（例えば０．６、０．７５、または０．８グラム以上の有機生成物）が形成される。生成された有機生成物および／または消費された炭素源の量を判断する方法は公知であり、その一例としてＨＰＬＣが挙げられる。
【００８３】
先に記載したように、炭素源利用効率は基質および有機体によって変化し得る。従って、炭水化物以外の炭素源（アミノ酸等）を含む複合増殖培地を用いることも可能であるが、１グラムの炭素源に対して生成される有機生成物またはピルビル酸塩誘導生成物の量は、消費される炭水化物炭素源１グラムに対して生成される有機生成物またはピルビル酸塩誘導生成物の量のみを指す。好ましくは、この段階では、炭素源１グラムあたり０．３グラム以下のバイオマス（例えば、０．２、０．１、または０．０５グラム以下のバイオマス）が生成される。
【００８４】
例えば、酸素分を溶解させてタンク全体を嫌気性環境とするか、または細胞呼吸の阻害剤を添加して培地を操作してもよい。加えて、培地を操作することで、特定のｐＨ値（例えば、酸性、中性、または塩基性ｐＨ値）を維持してもよい。或いは、特定のｐＨ値を維持することなく、培養のｐＨを定期的に調整してもよい。通常、有機酸を生成する際には、培地のｐＨ値は約１．５を超えるように（例えば、約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５または７．０を超える）に維持される。さらに、微生物がその供給された炭素源を異化する際に、タンク内部の温度は上昇する。従って、培地を操作することにより、特定の温度を維持してもよい。或いは、特定の温度を維持することなく、培地の温度を定期的に調整してもよい。通常、熱に敏感な微生物を用いる時には温度を約３５℃未満（例えば、約３４、３３、３２、３１、または３０℃未満）に維持し、一方、熱に反応しない微生物を用いる時には温度を約４５℃未満（例えば、約４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、または３５℃未満）に維持する。特筆すべきは、この有機生成物生成相の間にバイオマスの生成が可能であるということである。加えて、第二のタンク内部の培養条件を生成物の生成を促進する条件からバイオマス生成を促進する条件へ、またはその逆の切替を、１回または複数回行える。例えば、第二のタンク内部の培養条件を、短期間断続的に酸素を溶解させつつほとんどの時間を嫌気性条件とすることで、好気性条件を定期的に存在させることもできる。
【００８５】
別の方法では、例えば末端電子受容体を添加することによってその嫌気性条件を変更し、培養された微生物の新陳代謝エネルギーを増加させてもよい。ここで用いられている「新陳代謝エネルギー」という語は、エネルギー源（炭素源等）から有機体によって誘導されるエネルギー（ＡＴＰ換算）を指す。条件によっては、炭素源の新陳代謝によって有機体から得られる新陳代謝エネルギーが、それとは異なる条件下で同じ炭素源から得られるエネルギー量よりも大きい。
【００８６】
生細胞は生き延びて増殖するために、で高度に規則配列(order)されておりまたその内部で規則配列を作成しなければならない。有機体内部の規則配列を維持するために、有機体内では何千もの異なる化学反応が同時にまたひっきりなしに起こっている。例えば、細胞は、ＤＮＡやＲＮＡそれにタンパク質を重合する反応のような生合成反応や新陳代謝生成物の形成にエネルギーを必要とする。細胞はまた、基質を細胞に導入し、細胞内部の新陳代謝を保ち、適度な膨圧と内部のｐＨをを維持するための、また運動のためのエネルギーを必要とする。
【００８７】
エネルギーは作り出すことも壊すこともできないので、細胞はその規則配列を維持するために環境からのエネルギー入力を必要とする。エネルギーは一般的に、電磁放射または化学エネルギーの形態で環境より供給される。環境から得られるエネルギーは、２種類の一般的な生化学メカニズム、すなわち基質レベルの燐酸化および電子伝達のいずれか一方によってその細胞に利用される。
【００８８】
一般的に、嫌気性条件下では、ＡＴＰ（エネルギーの「細胞輸送(cellular currency)」）が基質レベルの燐酸化によって生成される。基質レベルの燐酸化では、エネルギーは化学結合から放出され、主にＡＴＰの形態で保存される。
【００８９】
基質レベル形成の一例が、以下に示すようなグルコースからグリコリシスを介してのピルビン酸塩への転換である。
【００９０】
グルコース＝２ピルビン酸塩＋２ＡＴＰ＋２Ｈ2
ピルビン酸塩がその後、乳酸に転換されることもあり得る。
【００９１】
ピルビン酸塩＋２Ｈ2＝乳酸塩
上記基質変換によって生成された正味エネルギーは、２ＡＴＰに等しい。
【００９２】
ピルビン酸塩をさらに加工処理してトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルとし、さらにエネルギーおよび水素原子を発生させてもよい。
【００９３】
ピルビン酸塩＋３Ｈ2Ｏ＝３ＣＯ2＋ＡＴＰ＋５Ｈ2
グルコース呼吸のためのネット反応(net reaction)を以下に示す。
【００９４】
グルコース＋６Ｈ2Ｏ＝６ＣＯ2＋４ＡＴＰ＋１２Ｈ2
従って、基質レベル燐酸化によって、グルコースのＣＯ2への完全呼吸が、４ＡＴＰおよび２４水素原子と同等の正味エネルギーを供給するであろう。
【００９５】
「電子伝達」では、「電子伝達鎖」の要素を構成する化合物の酸化還元ポテンシャルが平衡を保っているので、各要素を前述の要素の還元形態によって還元することができる。従って、還元力が電子として、担体分子の鎖を通って酸素（Ｏ2）、硝酸塩（ＮＯ3-）、およびフマル酸塩といった末端電子受容体まで流れることができる。酸素、硝酸塩、およびフマル酸塩といった末端電子受容体を培地に添加することで、高い新陳代謝エネルギー（例えば、消費分と同等の炭素源を生成するための高いＡＴＰ生成）を備えた微生物を供給することができる。酸素は最も好ましい末端電子受容体である。
【００９６】
例えば、酸素を末端電子受容体として使用するのであれば、水素をその電子伝達鎖を介して加工処理し、細胞に対し、水素原子１個あたり１．５ＡＴＰおよび酸素原子１個あたり３ＡＴＰを追加的に供給することが可能である。一般的に、新陳代謝エネルギーの量は、グルコース消費量に対する酸素消費量の比を計測することによって判断可能である。表１に、ＴＣＡサイクル（および、結果的に呼吸）に対するピルビン酸塩の損失が原因で減少する収率の関数として、生成中に酸素を添加した場合の、エネルギー収率の最大および最小向上期待値（グルコースのモル毎のＡＴＰのモル）を示す。最大向上％を、Ｐ／Ｏ比が３と仮定して算出し、一方最小向上％を、Ｐ／Ｏ比が０．５であると仮定して算出した。表２は、消費されるグルコース１モルあたり消費される酸素の最大量の推定値を示す。酸素を添加することによって、炭素を切り離して(sequester)生合成する最低限度の増殖を促進することができるので、少量の炭素が残りそれを呼吸（従って酸素利用）に用いることが可能である。
【００９７】
【表１】
0004637372.tif 000002
【００９８】
【表２】
0004637372.tif 000003
【００９９】
従って、細胞培養中の微生物の新陳代謝エネルギーを向上させるために、末端電子受容体として酸素をその細胞培養に添加してもよい。グルコースから乳酸を得る際の最大モル収率はグルコース１モルに対し乳酸塩２モルでありグルコースからＡＴＰを得るモル収率はグルコース１モルに対しＡＴＰ２モルであるが、末端電子受容体として酸素を添加すると、ピルビン酸塩の一部がクエン酸（ＴＣＡ）サイクルに向けられ、そこでＣＯ2およびエネルギーに転換される。従って、末端電子受容体を供給すると微生物の「新陳代謝エネルギーが増加する」。
【０１００】
ピルビン酸塩をＴＣＡに転向すると、生成される他のピルビン酸塩誘導生成物（乳酸等）の量が減少する傾向がある。例えば、収率が１０％減少すると結果的に微生物の新陳代謝エネルギーの発生が２．６倍になり、収率が２０％減少すると微生物の新陳代謝エネルギーの発生が４．２倍になり、さらに収率が５０％減少すると微生物の新陳代謝エネルギーの発生が９倍になることもあり得る。
【０１０１】
プロセスの後半の段階で、乳酸のような新陳代謝性の生成物が高レベルで存在している場合、細胞は機能を維持するためにより多くの新陳代謝エネルギーを必要とするであろうことが予測される。
【０１０２】
従って、嫌気性培地内の微生物を、溶解した酸素に短時間断続的に露出することが望ましいとも考えられる。「溶解酸素に短時間(brief pulse of dissolved oxygen)」露出した結果、その培地が濃度０．５パーセント以下、好ましくは約０．１〜０，５パーセントの溶解酸素を持つようになるのが好ましい。交替で、嫌気性発酵中の微生物の増殖率または細胞維持を、硝酸塩またはフマル酸塩のような別の末端電子受容体を添加することで向上させることも可能である。酸素を、所望のレベルでの生産性を維持しつつ微生物の新陳代謝エネルギーを増加させるのにちょうど十分なレベルで添加する。収率損失が過度にならないよう注意しなければならない。この技術は、残留糖類の消費を助けそれによって回収プロセスをさらに簡略化するのにも用いることができる。
６．有機生成物精製方法
生成後に、所望の生成物を単離するの目的でどのような方法を用いてもよい。例えば、公知の分離技術を用いてブロスからバイオマスを除去してもよいし、公知の単離処理方法（例えば、抽出、蒸留、およびイオン交換法）を用いて微生物を含まないブロスから有機生成物を得ることも可能である。例として、米国特許第４，２７５，２３４号、米国特許第５，５１０，５２６号、米国特許第５，８３１，１２２号、米国特許第５，６４１，４０６号、および、国際出願ＷＯ９３／００４４０を参照。加えて、所望の有機生成物をその生成中に単離したり、生成物生成相が終了した後でブロスから単離してもよい。重要なのは、第二のタンク内部の培養条件を操作することが可能なので、単離プロセスを向上させられるという点である。例えば、第二のタンク内部のｐＨおよび温度を操作して、所望の有機生成物が溶液から析出するか、またはより単離し易い形態とすることも可能である。具体的には、ブロスのｐＨが有機酸のｐＫａ値より低い時、有機酸のｐＨ値は溶液からの析出が可能なものである。例えば、グルタミン酸生成中の培養条件が、そのｐＨが２．１９、すなわちグルタミン酸のｐＫａ値より低くてもよい。すなわち、ｐＨ、温度、およびブロスの含有量を操作することにより、有機生成物の単離を容易にすることが可能である。加えて、特定の遺伝子操作酵母を選択する、および／または所定の培養条件を操作することによって、そのブロス内の副生物を、所望の有機生成物の回収を妨げないようにすることが可能である。
【０１０３】
ここに記載されている方法および材料があらゆるタイプの培養プロセスでも採用および使用可能であると都合がよく、限定を意図するものではないが、そのような方法には、普通「連続発酵」や「バッチ発酵」プロセスと呼ばれるプロセスが含まれる。加えて、ある生成プロセスの間に使用される微生物を回収して後続の生成プロセスで再使用してもよい。例えば、その微生物を複数回再使用して所望の有機生成物を生成してもよい。さらに、どのような炭素源を用いてもよい。例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イオドース、ガラクトース、タロース、メリビオース、サッカロース、フルクトース、ラフィノース、スタキオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、コーンスターチや小麦澱粉等の澱粉、および、コーンファイバー加水分解物質やその他のセルロース加水分解物質等の加水分解物質が、バイオマスまたは所望の有機生成物を生成するための炭素源として使用可能である。その上、どのような培地を用いてもよい。例えば、標準的な培地（例えば酵母最小培地およびＹＰ培地（酵母エキスが１０ｇ／Ｌ、ペプトンブロスが２０ｇ／Ｌ））、また、コーン浸漬(steep)水またはコーン浸漬流体(liquor)を用いることもできる。
【０１０４】
本発明における重要な利点の一つが、好ましい微生物が、特に好気性条件下で増殖させると、最小培地を利用できるということである。通常、嫌気性生成は養分を追加する必要がないため、様々な分離技術のいずれかを用いて、比較的清浄な発酵ブロスから最終生成物を単離することができる。液液抽出は、発酵ブロスから有機酸を分離する上でよく知られている技術であり、かなりの純度が得られる。本発明によって、より単純で、費用がかからず、エネルギーを節約できるシステムが利用できるとも考えられる。
【０１０５】
一実施態様では、本発明は、トレインタイププロセス(train-type process)において、クラブトリー負表現型を持つ遺伝子修飾酵母を用いる。トレインタイププロセスとは、臨界細胞密度に到達した後で、かつ、所望の有機生成物の特定生産性を激増させることが望ましい場合に、新陳代謝経路での「切替(switch)」を誘発することである。新陳代謝経路切替を誘発する方法としては通常、バイオマスを高ばっ気式容器から実質的に嫌気性の容器に移動させて酸素欠乏を生じさせる。特筆すべきは、増殖相と生成相のいずれでも、一般的な炭水化物（例えばグルコースまたはキシロース）を炭素源として用いることが可能ということである。クラブトリー負表現型を持つ遺伝子修飾酵母細胞の使用が、この実施態様を成功させる上で非常に重要といえよう。加えて、所望の有機生成物の特定生産性も成功する上で非常に重要といえる。ここで用いられている「特定生産性」という語は、生成物の量を反映し、１時間に１グラムのバイオマス（乾燥重量）に対して生成される有機生成物のグラム数として、すなわちｇ／(ｇ＊時間）で表される。通常、乳酸塩およびアクリル酸塩のような有機生成物の特定生産性は、約０．１ｇ／(ｇ＊時間）を超える、例えば約０．２ｇ／(ｇ＊時間）を超えるかまたは約０．５ｇ／(ｇ＊時間）を超える。ここで記載されているような高い特定生産性を提供することにより、細胞の維持に必要なエネルギーを、呼吸経路を介した大量のエネルギーを発生するエアレーションによらずとも、実質的に嫌気性である条件下での発酵生成物路を介して得られるであろう。特筆すべきは、実質的に嫌気性である容器が約０．１ＶＶＭより低い率でばっ気されるということである。生成状態によっては、エアレーションは用いられない。加えて、この実施態様の収率（すなわち、有機生成物のｇ／消費される炭素源のｇ）は、約７０重量％を超え、エタノールや酢酸塩のような炭素源を添加することなく生成される。場合によっては、細胞維持に必要なエネルギーを発生するために必要な特定生産性を達成するために、所望の生成物の生成に必要な酵素の供給に加えて、グルコースからピルビン酸塩への経路を増強することも必要かもしれない。
【０１０６】
別の実施態様では、トレインタイププロセスを、高ばっ気増殖容器のみが滅菌能力を備えるように設計してもよい。嫌気性生成容器は通常、約３５℃より高い温度（例えば、約３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃より高い温度）で作動される。このような温度では、生成物を生成する間にそのｐＨが下がるので、生き延びて遺伝子修飾酵母と競えるような野生型酵母はほとんどない。そのような野生型酵母は特に、細胞維持のためのエネルギーを発生できるよう増強された発酵経路を持たないと思われるからである。加えて、その酵母を、ここで記載されているような「キラープラスミド」を含むように処理してもよく、そうすれば、他の種からの酵母が生き残るのを防止することができる。
【０１０７】
本発明はまた、酵母細胞を培養する様々な方法を提供している。例えば、クラブトリー負表現型を持つ酵母細胞を、有機ｐＨ値が約３．０未満であるかまたはコーンファイバー加水分解物質を含有する培地で培養してもよい。酵母細胞を培養する方法として他に挙げられるのは、限定を意図したものではないが、クラブトリー負表現型を持つ酵母細胞を、無機ｐＨ値が約３．０未満であるかまたはペントース炭素もしくはコーンファイバー加水分解物質を含有する培地で約３５℃より高い温度で培養する方法である。
【０１０８】
さらに、本発明は有機生成物を形成するプロセスを提供する。このプロセスは、培養条件下で微生物を増殖し、培養条件を変更して有機生成物の生成を促進することを含む。このプロセスでは、微生物は低いピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および／またはアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性を持ち、エタノールおよび酢酸塩のない場合に呈示する増殖率が、低いピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性を持たない同等の微生物との比較において、約３０パーセント以上（例えば、約３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００％またはそれ以上）である。通常、細胞呼吸を促進する培養条件は、急速な増殖が要求される状況、または、その有機生成物が細胞呼吸無しでは生成不可能な状況で用いられ、一方、細胞呼吸を減少させる培養条件は、急速な増殖が不要、またはその有機生成物が細胞呼吸無しでも生成可能な状況で用いられる。
【０１０９】
本発明は、以下の実施例でさらに詳細に説明されているが、これらの実施例は請求項に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１０】
実施例
実施例１−組み換えプラスミドｐＨＥＳ／ｐＳＥＨ
０．５マイクログラムのキエンら（Chien et al.）（Proc. Nat'l Acad. Sci., 88(21):9578-9582(1991)）の記載によるプラスミドｐＧＡＤ４２４を、制限酵素ＨｉｎｄIIIと消化させた。消化させた混合物は、ＴＢＥ緩衝液（buffer）を用いて、０．８％のアガロースゲル上でゲル電気泳動により分離された。５．９ｋｂｐの断片は、サムブルックら（Sambrook et al.）（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されているように、その後ゲルから精製された。９２ｂｐの多重制限酵素認識部位を有する合成オリゴマーの相補対が設計された。１番目はｆｗｄ ｈｅｓ ｏｌｉｇｏと表わされ、以下のシーケンスからなる。
5'‐CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATCTACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO:1)
２番目はｃｏｍｐ ｈｅｓ ｏｌｉｇｏと表わされ、以下のシーケンスからなる。5'‐CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO:2)
５００ナノモルの二つの相補オリゴマーを１０分間沸騰させ、徐々に室温にまで冷却させて互いにアニールさせた。二本鎖９２ｂｐＤＮＡをＨｉｎｄIIIと消化させ、５．９ｋｂｐのｐＧＡＤ４２４を消化させＨｉｎｄIIIに連結させた。連結混合物は、サムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されているような電気穿孔法により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（electromax cells, Life Technologies, Rockville, MD）を形質転換させるのに使用された。組み換え大腸菌を、ルリア・ベルターニブロスプレート上で平板培養（plate）し、１００マイクログラム／ｍｌの抗生物質性アンピシリンを用いて、プラスミドを含む細胞を選別した。アンピシリン耐性大腸菌クローンからのプラスミドＤＮＡをふるいにかけ、二つのプラスミドｐＨＥＳとｐＳＥＨを得た（図１および図２）。二つのプラスミドは、アルコールデヒドロゲナーゼ、すなわちベクター上のＡＤＨ１プロモーターの点で、合成オリゴマーの配向が異なる。
【０１１１】
実施例２−ラクトバチルス・ヘルヴェティクスおよびペジオコックス・アシジラクティシからの乳酸デヒドロゲナーゼを暗号化する核酸のＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ゲノムＤＮＡ単離キット（Gentra systems, Minneapolis, MN）を用いて、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス（ＡＴＣＣ１０７９７）およびペジオコックス・アシジラクティシ（ＡＴＣＣ２５７４１）の一晩培養物から単離させた。ＰＣＲプライマーは、エル・ヘルヴェティクス（lh-ldh oligos）およびピー・アシジラクティシ（pa-ldh oligos）ゲノムＤＮＡから乳酸デヒドロゲナーゼ暗号化核酸を単離するように設計された。これらのプライマーは、ジェンバンクデータベースの中の乳酸デヒドロゲナーゼに関して入手可能な遺伝子シーケンスに基づいて設計され、以下のシーケンスからなる。
5' lh-ldh, 5'-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3' (SEQ ID NO:3)、3' lh-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3' (SEQ ID NO:4)、5' pa-ldh, 5'-CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATCAAAAAG-3' (SEQ ID NO:5)および、3' pa-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3' (SEQ ID NO:6)
プライマーは、サイエドソフトウェア（Sci-ed software）（Durham, NC）から入手したプライマーデザイナーソフトを用いて最適化された。１００ナノモルのプライマーと共に、１マイクロモルのゲノムＤＮＡを使用した。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて、サムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されているように、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）核酸をＰＣＲ増幅させた。
【０１１２】
同様の方策を用いて、桿菌属種、例えば巨大菌（Bacillus megaterium）（ATCC 6458）またはリゾプス・オリーゼ（Rhizopus oryzae）（ATCC 76275）、または乳酸を生成する他のいかなる有機体（菌類や細菌などの微生物と哺乳類などの多細胞有機体を含む）、または乳酸を生成する有機体の組織からのゲノムＤＮＡから、Ｌ乳酸デヒドロゲナーゼ暗号化核酸を単離させる。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ゲノムＤＮＡ単離キット（Gentra systems, Minneapolis, MN）を用いて、有機体の増殖培地から単離させる。適正なＰＣＲプライマーは、ゲンバンクから入手可能なこれらの種に対するＬＤＨ遺伝子シーケンスに基づき、乳酸デヒドロゲナーゼ暗号化核酸を単離するように設計される。一般に、１００ナノモルの適正なプライマーと共に、１マイクロモルのゲノムＤＮＡを使用する。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）または他のいかなる適正なＤＮＡポリメラーゼが、例えばサムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されているように、ＰＣＲ技術を用いて各ゲノムＤＮＡから乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）核酸をＰＣＲ増幅させるのに使用される。
【０１１３】
交互に、乳酸デヒドロゲナーゼ暗号化核酸は、以下の方法論のいずれかを用いて、クライベラミセス・サーモトレランス（Kluyveromyces theromotolerans）ＡＴＣＣ５２７０９、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma Reesei）ＡＴＣＣ１３６３１、トルラスポラ・プレトリエンシス（Torulaspora pretoriensis）ＡＴＣＣ３６４２５、または乳酸デヒドロゲナーゼを生成する他のいかなる有機体から単離される。
【０１１４】
１）これらの有機体の一つからのゲノムｃＤＮＡライブラリーは、標準技術（Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）を用いて、ｐＵＣ１９などの標準大腸菌発現ベクターにクローニングされる。大腸菌（ldh pfl）突然変異株ＮＺＮ１１１（Bunch et al., (1997) "The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli, " Microbiology, 143: 187-95）を、このライブラリーと形質転換させて、細胞を嫌気性条件下でカザミノ酸を補充したＭ９培地の中で増殖させる。これらの条件下で増殖する大腸菌はいずれも、乳酸デヒドロゲナーゼを暗号化するか、またはｌｄｈやｐｆｌにおける復帰突然変異体である。陽性（嫌気性増殖条件下で形成されるコロニー）は、（Ｌ）−ＬＤＨと（Ｄ）−ＬＤＨ（Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)）とが区別できる乳酸特定軟寒天培地オーバーレイ（ＬＡＳＳＯ）の比色アッセイを用いて、ＬＤＨ活性のためにふるいにかけられる。Ｌ乳酸デヒドロゲナーゼを発現する疑いのあるクローンからのプラスミドＤＮＡを、その後単離して配列する。
【０１１５】
２）ケー・サーモトレランスＡＴＣＣ５２７０９、ティー・リーセイＡＴＣＣ１３６３１、およびトルラスポラ・プレトリエンシスＡＴＣＣ３６４２５は、いずれも嫌気性条件下で培養されたときにＬ乳酸を生成する真核細胞である（Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)）。従って、この方法によると、これらの株の少なくとも一つは、乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を誘発するために嫌気性条件下増殖される。細胞のないエキスを、その後標準方法を用いて得たら、公知のタンパク質精製法にかけて、乳酸デヒドロゲナーゼ酵素を単離させる。乳酸デヒドロゲナーゼを精製する方法はすでに知られている（Kelly et al., (1978) "Affinity chromatography of bacterial lactate dehydrogenases," Biochem J. 171 (3): 543-7）。タンパク質の精製後、アミノ酸シーケンスを測定するために部分的に切断され配列される。このアミノ酸シーケンスは、遺伝子暗号化乳酸デヒドロゲナーゼをゲノムＤＮＡから単離するため、その後縮退プライマーの設計に使用される。
【０１１６】
ケー・サーモトレランスまたはトリコデルマ・リーセイまたはトルラスポラ・プレトリエンシスから単離されたものなどの真核細胞からなるＬＤＨは、桿菌族または乳酸桿菌族などの細菌源からのＬＤＨに比べると、（転写効率、翻訳効率および／またはタンパク質活性の点において）ケー・マルキアヌスの酵母の中でより良く機能するかもしれない。
【０１１７】
３）ジェンバンクから入手可能な公知の真核細胞からなる乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子シーケンスを用いて、ケー・サーモトレランスＡＴＣＣ５２７０９、ティー・リーセイＡＴＣＣ１３６３１またはトルラスポラ・プレトリエンシスＡＴＣＣ３６４２５のゲノムＤＮＡから乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を単離するように、縮退プライマーを設計する。ＬＤＨ遺伝子シーケンスの中の保存ＮＡＤ＋結合部位およびピルビン酸塩結合部位を用いて、縮退プライマーを設計する。１００ナノモルのプライマーと共に、１マイクロモルのゲノムＤＮＡを使用する。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）または他の適正なＤＮＡポリメラーゼを用いて、例えばサムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されているような公知のＰＣＲ方法により、Ｌ＋乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）核酸の断片を増幅させる。
【０１１８】
実施例３−エル・ヘルヴェティクスおよびピー・アシジラクティシのｐＣＲIIベクターへのクローニング
ＰＣＲ増幅ＬＤＨのＤＮＡ生成物は、インヴィトロゲン（Invitrogen）（Carlsbad, CA）から入手したＴＡクローニングキットを用いて、ｐＣＲIIベクター（図３および図４）に連結させた。連結混合物は、サムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されている方法を用いて、その後大腸菌ＤＨ１０Ｂの形質転換に用いられた。キットと共に供給されたｐＣＲIIベクターは、製造者の指示に従って、ＰＣＲ生成物を迅速にクローニングさせる。エル・ヘルヴェティクスおよびピー・アシジラクティシからのＬＤＨ遺伝子と共にｐＣＲIIベクターを、図４に示す。
【０１１９】
実施例４−ｐＨＥＳベクターにおけるエル・ヘルヴェティクスおよびピー・アシジラクティシＬＤＨ遺伝子を有する組み換えプラスミドｐＬｈ ｌｄｈ−ＨＥＳ／ｐＰａ ｌｄｈ−ＨＥＳ
エル・ヘルヴェティクスおよびピー・アシジラクティシからのＬＤＨ遺伝子を含むｐＣＲIIベクターを、適正な制限エンドヌクレアーゼと消化させた。ｐＨＥＳベクターも同様に、同じ制限エンドヌクレアーゼと消化させた。ｐＣＲIIベクターからのＬＤＨを含む１ｋｂｐインサートを、サムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載されているようなＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、その後６．０ｋｂｐのｐＨＥＳに連結させた。連結混合物は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（electromax cells, Life Technologies, Rockville, MD）を形質転換させるのに使用され、アンピシリン耐性のために組み換えクローンを選択した。組み換えクローンから単離されたＤＮＡは、ｐＬｈ ｌｄｈ−ＨＥＳおよびｐＰａ ｌｄｈ−ＨＥＳベクターを測定するために分析された（図５）。これらのベクターは、酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１）を抑制しながら、ｐＨＥＳベクターの中でエル・ヘルヴェティクスおよびピー・アシジラクティシからＬＤＨを暗号化する遺伝子を含有している。
【０１２０】
実施例５−サッカロミセスＰＤＣ１遺伝子プロモーターを用いた、発現のための桿菌属種、リゾプス・オリーゼ、ケー・サーモトレランス、トリコデルマ・リーセイまたはトルラスポラ・プレトリエンシスＬＤＨ遺伝子のクローニング
リゾプス・オリーゼ、ケー・サーモトレランス、トリコデルマ・リーセイまたはトルラスポラ・プレトリエンシスで発見された乳酸デヒドロゲナーゼプロモーターを、ケー・マルキアヌスの中でクローニングされた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を抑制するために使用することは可能ではあるが、サッカロミセス・セレヴィシアエ（Saccharomyces cerevisiae）からのＰＤＣ１プロモーターを、単離した乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現制御に用いてもよい。サッカロミセス・セレヴィシアエ解糖プロモーターは、クライベラミセス株の中で遺伝子の発現に使用され成功している（Gellissen and Hollenberg, (1997) "Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharonyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis - a review, "Gene, 190(1):87-97）。
【０１２１】
これにより、ジェンバンクで入手可能なサッカロミセス・セレヴィシアエのゲノムシーケンスを用いた適正なオリゴマープライマーを設計することで、サッカロミセス・セレヴィシアエからのＰＤＣ１プロモーターを得た。ＰＤＣ１遺伝子シーケンスおよびＰＤＣ１遺伝子を囲む１Ｋｂ領域は、ＰＣＲ技術により増幅される。結果としての４ＫｂのＤＮＡ断片は、プロモーターと、ＰＤＣ１遺伝子発現を抑制する終了暗号の両方を含んでいる。多重制限酵素部位を、プロモーターと、ＰＤＣ１遺伝子発現を制御する終了暗号の間に含めることで、ＰＤＣ１プロモーターと終了暗号を抑制しながら多様なＬＤＨ遺伝子を挿入することができる。４ｋｂのＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１９を基にしたサッカロミセス・セレヴィシアエまたは大腸菌シャトルベクターのような適正なベクターの中に挿入される。ＬＤＨ遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現がＰＤＣ１プロモーターと終了暗号によって抑制されるように、ＰＤＣ１プロモーターと終了暗号を抑制しながら多重クローニング部位の一つでベクターにその後導入される（図１４）。交互に、サッカロミセス・セレヴィシアエ・グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼまたはホスホ・グリセリン酸塩キナーゼ遺伝子の発現を抑制するようなその他のサッカロミセス解糖プロモーターを、クローニングされたＬＤＨ遺伝子をケー・マルキアヌスで発現させるのに同様に使用してもよい。
【０１２２】
実施例６−ピルビン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を分断する相同ＤＮＡの線形断片の増幅
８２ｂｐのオリゴマープライマー（５'ｋｍＰＤＣ１Ｋｏ）を、ケー・マルキアヌスからのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の５'末端に等しい５１ｂｐと、ｐＨＥＳベクターからのＡＤＨ１プロモーターの５'末端に等しい３０ｂｐを含有するように設計した。５'ＫｍＰＤＣ１Ｋｏのシーケンスは以下のとおりである。
5'-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCA
AACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3' (SEQ ID NO:7)
提出されたジェンバンクのシーケンスから、酵母（ケー・マルキアヌスまたはワイ・スティピティスまたはエイチ・ポリモルファ）からのＰＤＣ遺伝子に対するシーケンスを得た。同様に、逆７９ｂｐオリゴマー（３'ｋｍＰＤＣ１Ｋｏ）を、５４ｂｐがＰＤＣ遺伝子の３'末端に等しく、２２ｂｐがＡＤＨ１終了暗号の３'末端に等しくなるように設計した。３'ＫｍＰＤＣ１Ｋｏのシーケンスは以下のとおりである。
5'-TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCC
CTCTCTACATGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3' (SEQ ID NO:8)
プライマーは、ｐＬｈｌｄｈ−ＨＥＳおよびｐＰａｌｄｈ−ＨＥＳプラスミドからの線形ＤＮＡ断片を、その断片がＡＤＨ１プロモーターと終了暗号と共に全ての乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するように、増幅させる設計とした（図６）。ＰＣＲ増幅生成物もまた、ケー・マルキアヌスＰＤＣ１、ヤマダジマ・スティピティスＰＤＣ１およびＰＤＣ２、並びにハンゼヌラ・ポリモルファＰＤＣ１およびＰＤＣ２のいずれかからのシーケンスと相同であった末端を含有している。増幅反応は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて行われた（New England Biolabs; Beverly, MA）。１００ナノグラムのｐＬｈｌｄｈ−ＨＥＳまたはｐＰａｌｄｈ−ＨＥＳを、５単位のポリメラーゼと１００ナノモルのオリゴマーと共に反応で使った。反応は、サムブルックら（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)）に記載のプロトコルに従って実施された。図６は、説明した相同での最終線形生成物を示す。
【０１２３】
ケー・マルキアヌスのｐｄｃ陰性株を得る尤度を向上させるため、交互構造物を準備した。これらの構造物を準備するために、ケー・マルキアヌス１．７ｋｂｐＰＤＣ１遺伝子を囲む５．５ｋｂｐ断片を、ＰＣＲおよびゲノム歩行技術（Clonetech）を用いて単離した（図６）。５．５ｋｂｐ断片は、その後標準方法を用いて、ｐＣＲIIＴＡクローニングベクター（インヴィトロゲン）にクローニングされた。ＰＤＣ１の１．７ｋｂｐ暗号化領域中央付近ほぼ３７０ｂｐの一部を、ケー・マルキアヌス５．５ｋｂｐ断片から制限消化により（サムブルック）取り出した。取り出された断片は、以下のシーケンスからなる。
CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACTACATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAGTTCGTCTTGCAAAAGTTGTTGACCAAGGTCAAGGATGCTGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTCCAGTTCCTCACGCTCCAAGAGACAACAAGCCAGTTGCTGACTCTACTCCATTGAAGCAAGAATGGGTCTGGACTCAAGTCGGTAAGTTCCTACAAGAAGGTGATGTTGTTCTAACTGAAACCGGTACCTCCGCTTTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCAAGTCTTGTGGGGTTCCATTGGTTTCA (Sequence ID No. 10)
カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを、標準制限技術（サムブルックらを参照のこと）を用いて、ｐＰＩＣ９Ｋベクター（インヴィトロゲン）からその後単離し、上記断片を取り出した５．５ｋｂｐの中の部位にクローニングした。ｐＰＩＣ９Ｋ（インヴィトロゲン）カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを挿入し、挿入した領域のシーケンスが以下のようになるようにした。
GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (Sequence ID No.9)
結果としての構造物は、図６ｃに示すように、ｐｄｃ領域のほぼ５ｋｂｐに囲まれたＧ４１８耐性遺伝子を含んでいる。また、図６ｄに示すようなｐＣＲIIベクターでは、ケー・マルキアヌスＰＤＣ１の２．３ｋｂｐにより囲まれた内部Ｇ４１８遺伝子を含む同様のＤＮＡ構造物が作られた。
【０１２４】
実施例７−内因ＰＤＣ暗号化シーケンスを分断し、ＬＤＨ暗号化シーケンスを同時挿入するための線形ＤＮＡ断片の使用
実施例５に記載のＰＣＲにより生成された線形ＤＮＡ断片を用いて、ケー・マルキアヌス、ヤマダジマ・スティピティス、またはハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換する。形質転換に用いたプロトコルは、ウィソロフスキー−ルーヴルら（Wesolowski-Louvel et al.）（Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, p.138-201 (1996)））に記載されているとおりである。簡単に言えば、５ｍｌの一晩培養物の回転を遅くし、電気穿孔法緩衝液（Ｔｒｉｎ−ＨＣＬ １０ｎＭ、スクロース２７０ｎＭ、ＭｇＣｌ2 １ｎＭ、ｐＨ値７．５）で洗浄する。洗浄した細胞を、その後３０分、３０℃で定温培養緩衝液（酵母エキス５グラム／Ｌ、ペプトンブロス１０グラム／Ｌ、グルコース１０グラム／Ｌ、ＤＴＴ２０ｎＭ、ＨＥＰＥＳ２０ｎＭ、ｐＨ値８．０）で培養する。この時期の終わりに、細胞を再び洗浄し、４００マイクロリットルの定温培養緩衝液の中で再び懸濁させる。これらの細胞に２００ナノグラムのＤＮＡを加え、細胞をビオラドジーンパルサー（Bio-Rad Gene Pulser）を用いて、０．４センチのキュベットで１８００ボルト、１０００アンペア、２５マイクロＦで脈動させる。
【０１２５】
細胞を正規ＹＤＰ（酵母エキス１０グラム／Ｌ、ペプトンブロス２０グラム／Ｌ、グルコース２０グラム／Ｌ、寒天培地１５％）上で平板培養し、コロニーを７２時間にわたり再生させる。コロニーを有するそれぞれのプレートを、新しいＹＰＤプレート上にレプリカ培養し、４８時間保温する。コロニーを、その後６．５％の軟寒天培地（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３００ｍＭ中の寒天培地０．５％、グルタミン酸塩 １８７ｍＭ、ｐＨ値８．３）で上塗りする。上塗りしたプレートに、染色混合物（１％の寒天培地３．２ｍＬ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ １．６ｍｌ、グルタミン酸塩 ７５ｍＭ、ｐＨ値８．３、２ミリグラム／ｍｌフェナジンメトスルフェート０．４ｍｌ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ７単位、Ｌ（＋）仔豚筋肉乳酸デヒドロゲナーゼ７単位）を加える。Ｌ（＋）の高い酵母株は、１０〜１２０分の間に青色ハローを形成する。この方法は、サブデンら（Subden et al.）（Canadian J. Microbiol., 28:883-886 (1982)））が提案し、ウィッテら（Witte et al.）（J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)）が変更した方法に類似している。コロニーを選び出し、コロニーから単離されたＤＮＡは、ＰＣＲ分析で試験し、分断ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を検出するために配列される。
【０１２６】
別の実施態様において、上記実施例６に記載された、図６ｃおよび図６ｄに示したクローンを、二つの制限酵素と消化させて（サムブルックらを参照のこと）、半シーケンス挿入カナマイシン耐性遺伝子の含まれる相同ＰＤＣ領域を含有している断片ＤＮＡを、ほぼ３マイクログラム産出する。ケー・マルキアヌスは、電気穿孔法等の公知技術を用いて、断片と形質転換させてケー・マルキアヌスのｐｄｃを分断する。
【０１２７】
一般に、電気穿孔法は以下の手順で行われる。ａ）容量２０ｍｌのＹＰＡＤ内で一晩（１５時間まで）微生物の培養物を増殖させる；ｂ）培養物から５００ｕｌをマイクロフーゲチューブ（microfuge tube）に移し、＠４Ｋで４分回転させ、上澄みを捨てる；ｃ）ペレットを１ｍｌの冷却ＥＢ（ＥＢ＝電気穿孔法緩衝液：Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ１０ｍＭ、ｐＨ値７．５；スクロース２７０ｍＭ；ＭｇＣｌ2 １ｍＭ）で洗浄する；ｄ）１ｍｌのＩＢ（ＩＢ＝インキュベーション緩衝液：ＹＰＤ；ＤＴＴ２５ｍＭ；Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐｈ値８．０）で再び懸濁させる；ｅ）エッペンドルフサーモミキサー内で、＠８００回転／分、３０℃で３０分シェークする；ｆ）回転を遅くし、ＥＢで一回洗浄し、４００ｕｌのＥＢで再び懸濁させる；ｇ）３マイクログラムの断片ＤＮＡを加え（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍＭの水、ｐＨ値８．５）、氷の上で３０分保温する；ｈ）０．４センチの電気穿孔法キュベットに移す。ビオラドジーンパルサーの設定は、１０００ボルト、１０００アンペア、５０時間周波数である。パルス後の時定数：２０ミリセカンドまで；ｉ）３ｍｌのモートンクロージャーチューブ（Morton Closure tube）に移し、シェークせずに３０℃で１時間保温する。液体ＹＰＡＤ培地４００ｕｌ（ＹＰＡＤ：酵母エキス１０グラム；ペプトン２０グラム；グルコース２０グラム、アデニンヘミスルフェート（Adenine Hemisulphate）１００ミリグラム。容量＝１Ｌ。ｐＨ調整なし）を加え、エッペンドルフサーモミキサー内で、＠８００回転／分、３０℃で１時間シェークする。４００ｕｌの液体ＹＰＡＤを加えて４〜６時間回収する；ｊ）マイクロフーゲチューブ内で＠４Ｋ、４分間回転を遅くして、上澄みを捨て、１Ｍのソルビトール４００ｕｌ内で懸濁させる；ｋ）２００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８選択プレート上で平板培養し、ｌ）３０℃で３〜５日間保温する。
【０１２８】
コロニーを、まず第二のパッチングにより３００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８上へとふるいにかける。ゲノムＤＮＡを、標準ゲノム製剤（サムブルック）によって二次酵母パッチから単離する。これらを、ＰＣＲを介して、１）適正なプライマーおよび条件（サムブルック）を用いてカナマイシン断片の存在と、２）適正なプライマーおよびＰＣＲ条件を用いて分断されたｐｄｃ領域の不在に対して、その後ふるいにかける。選択マーカーに対して陽性でありｐｄｃ分断領域に対して陰性のコロニーは、その後増殖され、ＨＰＬＣによる生理学分析を行った。これらの株からのゲノムＤＮＡは、サザン交雑分析により分析が進められた。
【０１２９】
実施例８−細胞の増殖特性
１．低ｐＨ／高温
ケー・マルキアヌスの一晩培養物を、キールスら（Kiers et al.）（Yeast, 14(5): 459-469 (1998)）に従って、５０ｍｌの酵母最小培地に接種した。炭素源としてグルコース１００グラム／Ｌを使用した。一晩培養物を４０℃で保ち、同じく４０℃に保たれた培地の中に接種した。接種剤の添加により、培地のｐＨ値は５．５から２．５に変化した。実験の最中、ｐＨ値は２．５のままであった。グルコース濃度はＹＳＩメンブレンで測定され、光学密度（ＯＤ）は分光光度計を用いて測定された。
【０１３０】
グルコースは７２時間後に利用されたので、代謝活動が低ｐＨ値で高温の培養条件下でその時期に起こるのが分かった（図７）。その上、４８〜７２時間の時期にバイオマスがわずかに減少したことから、細胞異化のペースが同化のを追い越すのが分かった（図７）。
【０１３１】
２．ペントス炭素源
ケー・マルキアヌスの一晩培養物を、キールスら（Yeast, 14(5): 459-469 (1998)）に従って、酵母最小培地を含む三つの５０ｍｌフラスコの中に接種した。三つのフラスコのそれぞれには、異なる炭素源が含まれていた。第一のは、グルコース１０パーセント、第二のはＤキシロース１０パーセント、第三のはＬアラビノース１０パーセントを含んでいた。これらのフラスコを３０℃で保温し、周期的にＯＤ測定を行った。
【０１３２】
４０時間後、グルコースまたはキシロースで培養した酵母のバイオマス収量は類似していたのに対し、アラビノースで培養した酵母のバイオマス収量は低下していた（図８）。グルコースと、キシロースまたはアラビノースで培養した酵母の増殖を比較した結果、増殖に初期遅れ時間のあることが判明した。アラビノースで培養した酵母は、数時間の遅れ時間を示したのに対し、キシロースで培養した酵母の遅れ時間は、一層顕著であった（図８）。この遅れ時間の存在は、酵母細胞がキシロースおよびアラビノース炭素源に適合するのに時間を要することを示している。おそらく、この時間は、通常発現されないポリペプチドの合成を誘発するのに必要なのであろう。
【０１３３】
３．低ｐＨのコーンファイバー加水分解物質
ケー・マルキアヌスの一晩培養物を、キールスら（Yeast, 14(5): 459-469 (1998)）に従って、酵母最小培地を含むフラスコの中に接種した。それぞれのフラスコには、炭素源としてコーンファイバー加水分解物質３０％が含まれていた。簡単に言えば、コーンファイバー加水分解物質は、コーンファイバーを硫酸１．２％と１４５℃で２５分反応させて作られた。反応の間に、ヘミセルロースは、単量体生成物であるアラビノース、キシロース、およびグルコースに分解された。反応中は高温であるため、アラビノースとキシロースの中にはフルフラールへと劣化したものがあるのに対し、グルコースの中にはヒドロキシメチルフルフラールへと劣化するものがあった。加水分解物質のＨＰＬＣ分析の結果、グルコース３８．７グラム／Ｌ、キシロース３９．１グラム／Ｌ、アラビノース２０．７グラム／Ｌ、およびフルフラール１．６グラム／Ｌであるのが判明した。その上、加水分解物質のｐＨ値は１．５１であった。酵母を培養する前、コーンファイバー加水分解物質のｐＨ値は３．０に調整された。培養実験中、周期的にＯＤ測定を行った。
【０１３４】
酵母細胞は、コーンファイバー加水分解物質と共に培養したときにバイオマスを生成することができた（図９）。
【０１３５】
４．多様なｐＨ値の条件
ケー・マルキアヌスの一晩培養物を、５０ｍｌの酵母ＹＰＤ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトンブロス２０グラム／Ｌ、グルコース２０グラム／Ｌ）を含む四つのフラスコの中に接種した。それぞれのフラスコで異なるｐＨ値は、ＨＣｌを用いて調整された。培養実験中、温度は３０℃に保たれ、周期的にＯＤ測定を行った。各フラスコ内での増殖の観察を行った（図１０）。
【０１３６】
５．多様なｐＨ値の条件／乳酸
ケー・マルキアヌスの一晩培養物を、５０ｍｌの酵母ＹＰＤ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトンブロス２０グラム／Ｌ、グルコース２０グラム／Ｌ）と、乳酸４０グラム／Ｌとを含む四つのフラスコの中に接種した。乳酸を添加した結果、ｐＨ値は２．８になった。従って、三つのフラスコ内のｐＨ値は、ＮａＯＨを用いて指示ｐＨに調整された。培養実験中、温度は３０℃に保たれ、周期的にＯＤ測定を行った。各フラスコ内での増殖の観察を行った（図１１）。
【０１３７】
実施例９−アクリリルＣｏＡの生成可能な組み換え細胞
アクリル酸塩を炭素源として利用することのできない有機体（例えば、大腸菌）は、クロストリジウム・プロピオニカム・ゲノムライブラリーと形質転換させる。シー・プロピオニカム・ゲノムライブラリーは、シー・プロピオニカム・ゲノムの１０ｋｂｐ断片を発現するように、ｐＨＥＳプラスミドを用いて生成される。形質転換された大腸菌は、炭素源としてアクリル酸だけを用いて選択培地上で平板培養される。アクリル酸塩と同化する能力を有する細胞だけが、増殖することになる。アクリル酸塩は通常、その酵素媒介変換によって乳酸塩へと同化する。次に、乳酸塩はピルビン酸塩へと変換されて、クレブス回路を介して細胞によって利用されることができる。
【０１３８】
いったん形質転換された大腸菌を選択したら、ＤＮＡプラスミドはゲノムライブラリーから単離され、挿入された断片は配列される。いったん配列されると、乳酸塩とアクリル酸塩との変換に係わる酵素の暗号化シーケンスを測定するために断片の転写解読枠を走査する（例えば、ラクトイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびＣｏＡトランスフェラーゼ）。
【０１３９】
これらの酵素に対する暗号化シーケンスを含む単離されたクローンは、乳酸デヒドロゲナーゼを含み、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のない実施例６に記載さの酵母細胞へと導入される。導入された核酸を含む組み換え酵母細胞を、Ｇ４１８（３００グラム／Ｌ）を用いて選択する。いったん単離したら、組み換え酵母細胞はグルコース上で好気的に増殖され、その後嫌気性条件に切り換えられる。ブロスをその後回収し、ダナーら（Danner et al.）（Biotechnological production of acrylic acid from biomass, In: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 70-72 (1998)）に記載されているような標準ＨＰＬＣ方法を用いてアクリル酸塩に評価分析される。
【０１４０】
実施例１０−アスコルビン酸塩を生成可能な組み換え細胞
発現ベクターを作り変えて、次のポリペプチド、すなわち、２，５−ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカラート・デヒドラターゼ、グルカラート・デヒドラターゼ、アルデヒドデヒドラターゼ、グルクロノラクトン・レダクターゼ、およびＬグルオノラクトン・オキシダーゼ、が発現されるようにする。これらのポリペプチドを暗号化する核酸シーケンスを、様々な微生物から単離する。いったん作り変えたら、発現ベクターは、電気穿孔法により酵母細胞に形質転換される。いったん形質転換されたら、酵母細胞は、これらがＬ−アスコルビン酸塩を生成するか否かを測定するために分析される。
【０１４１】
実施例１１−Ｄ−キシロースを生成可能な組み換え細胞
発現ベクターを作り変えて、次のポリペプチド、すなわち、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタノエート・アルドラーゼ、ザイロネート・デヒドラターゼ、ザイロノラクトナーゼ、およびＤ−キシロース・デヒドゲナーゼが発現されるようにする。これらのポリペプチドを暗号化する核酸シーケンスを、シュードモナス属種から単離する。いったん作り変えたら、発現ベクターは、電気穿孔法により酵母細胞へと形質転換される。いったん形質転換されたら、酵母細胞は、これらがＤ−キシロースまたはその他のペンタロース炭素化合物を生成するか否かを測定するために分析される。
【０１４２】
実施例１２−クエン酸塩を生成可能な組み換え細胞
エス・セレビシアエ・アコニターゼ（ＡＣＯ１、ジェンバンク登録番号Ｍ３３１３１）核酸シーケンスを基にして、ＰＣＲプライマーを設計する。これらのプライマーは、クライベラミセス、ヤマダジマ、またはハンゼヌラ種からのアコニターゼ暗号化核酸をクローニングするのに使用される。いったん配列されたら、実施例５に記載されているような線形構造物が作られ、酵母細胞内でアコニターゼ暗号化核酸を分断するのに用いられる。選択マーカーとして使用したのは、実施例５に記載されている乳酸塩生成の代わりに、抗生物質Ｇ４１８である。抗生物質Ｇ４１８に耐性をもたらす核酸は、ネオマイシン／カナマイシン遺伝子である。この遺伝子は、ｐＰＩＣ９Ｋベクター（インヴィトロゲン）から得られ、ｐＨＥＳベクターに挿入される。酵母細胞は、上記のようにＡＣＯ１に相同する末端を有するように作り変えられたＰＣＲ生成線形断片と形質転換させる。線形断片は、Ｇ４１８耐性遺伝子を暗号化する設計となっている。アコニターゼ暗号化核酸の位置で線形断片を同化した細胞だけが、抗生物質に対して耐性をもっている。これらの細胞の同化が適正であるかを、ＰＣＲを用いて分析する。この方法によって得られた酵母細胞は、部分的に機能性ＴＣＡ回路を有するため、クエン酸塩を過剰に生産することができる。クエン酸塩は、ミトコンドリアメンブレンを横切り、ブロスの中に輸送される。その上、これらの酵母細胞には、これらが堆積クエン酸塩のオキサル酢酸塩への変換を触媒させることができるように、ＡＴＰクエン酸リアーゼ等の酵素を暗号化する外因性核酸分子が与えられている（実施例１３を参照のこと）。
【０１４３】
実施例１３−クエン酸リアーゼをサイトゾル内で発現可能な組み換え細胞
クラブトリー正酵母細胞を、ＡＴＰクエン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドを暗号化する核酸シーケンスを含むｐＨＥＳプラスミドと形質転換させる。この核酸は、大腸菌、肺炎かん菌（ジェンバンク登録番号Ｘ７９８１７）、またはその他の既刊出典から単離される。いったん形質転換されたら、酵母細胞を、これらが多量の脂質堆積を生成するのに砂糖を利用できるか否かを測定するために分析する。その上、酵素細胞を、これらがホルズワースら（Holdsworth et al.）（J. Gen. Microbiol., 134:2907-2915 (1998)）に記載されているようなＡＴＰクエン酸リアーゼ活性を示すか否かを測定するために分析する。ＡＴＰクエン酸リアーゼ活性を有する酵母細胞は、アルデヒドを、アルデヒド・デヒドロゲナーゼを介してアセタートに分解すること以外の手順によって、好気性条件下でサイトゾル・アセタートを提供することができる。さらに、このような酵母がピルビン酸デカルボキシラーゼまたはアルデヒド・デヒドロゲナーゼ活性に欠けるとき、これらは、クレブス回路を介して生合成のためのアセタートを提供できるはずである。
【０１４４】
実施例１４−乳酸塩を炭素源として利用できない組み換え細胞
エス・セレビシアエＪＥＮ１ポリペプチドに類似したカルボキシ酸輸送体の活性が減少するように、酵母細胞を作り変える。このような酵母細胞は、乳酸塩を輸送する能力が劣っていて、よって乳酸塩の利用効率が低い。酵母細胞内のカルボキシ酸輸送体の活性は、このポリペプチドに対する暗号化シーケンスを含む座を分断させることによって減少する。まず、ＪＥＮ１ポリペプチドの相同体を、ＪＥＮ１（ジェンバンク登録番号Ｕ２４１５５）に対して入手可能なシーケンスに基づいて設計された縮退プライマーを用いて、宿主細胞から単離する。いったん核酸を宿主細胞から単離したら、配列を行う。このポリペプチドに対する暗号化シーケンスの分断は、実施例１１に記載の手順を用いて行われる。線形断片が生成され、ＪＥＮ１シーケンスに対する相同領域ならびに全てのＧ４１８耐性遺伝子を暗号化する。この線形断片がＪＥＮ１ゲノムシーケンスに同化される結果、活性が分断される。カルボキシ酸輸送体活性のない細胞は、それらがカルボキシ酸を輸送する能力がないことにより、従って乳酸塩上で培養されたときに増殖する能力がないことにより識別される。
【０１４５】
さらに、エス・セレビシアエ・チトクロームｂ２ポリペプチドの機能性等価物の活性が低下するように、細胞の変更を行う。チトクロームｂ２ポリペプチドは、エス・セレビシアエ細胞がミトコンドリア内で乳酸塩を新陳代謝させるのを可能にする。まず、縮退プライマーを、サッカロミセス・チトクロームｂ２シーケンス（ジェンバンク登録番号Ｚ４６７２９）から設計する。いったん単離したら、クローンの配列を行う。チトクロームｂ２の酵母宿主相同体の分断は、酵母遺伝学の方法（Eds. Alison et al., Cold Spring Harbor Press (1997)）に記載されている方法を用いて行われる。この組み換え酵母細胞は、乳酸塩を炭素源として利用することができなくなる。
【０１４６】
実施例１５−乳酸塩の大量生産
ＰＤＣ活性の低下したケー・マルキアヌス細胞の多様な変異株を生成し、単離させる。各変異株は、ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを暗号化する外因性核酸分子の異なるコピー数を含むように作り変えられる。ＬＤＨポリペプチドは、多様な異なる源からのものである。このような変異体細胞は、乳酸に対して異なる特定生産性を４０℃で有することができる。
【０１４７】
各変異体を、１．５ＶＶＭの空気流と３０％の溶存酸素量のある好気性条件下で、細胞密度が乾燥量基準で約６０グラム／Ｌになるように容器内で増殖させる。いったん十分な密度になったら、空気流を停止し、容器内の条件を嫌気性条件に切り換える。塩基の添加は行わない。嫌気性相中に最高の特定生産性を有する変異体は、低い特定生産性を有する変異体よりも、乳酸を迅速に生成するだけでなく、低ｐＨ値で高い濃度とも実現することが分かる。生成相中のグルコース上の生成物収量は、９０％を越えることができる。
【０１４８】
一定の変異体を選択し、空気流を完全に切るのではなく、０．１ＶＶＭに減少させる以外は同じ培養方法により培養する。このような条件下では、容器内の最終ｐＨ値を低下させることができ、乳酸塩の濃度は、空気流がない条件の場合よりも高くなることができる。グルコース上の生成物収量は低下するが、約９０％を維持することができる。０．５ＶＶＭの空気流でこの試験を繰り返したら、グルコース上の生成物収量は、８０％未満に減少させることができる。
【０１４９】
実施例１６−一連の一括発酵を用いた乳酸塩の大量生産
ＰＤＣ活性がなく、ＬＤＨ活性のあるケー・マルキアヌスの培養物を、一連の一括発酵で接種材料として使用する。それぞれの発酵は、連続的に大きくなる容器内で行われ、それぞれの容器は、使用直前に滅菌される。その上、それぞれの容器には、１．５ＶＶＭの空気流が与えられ、１０％を越える溶存酸素量を保つように十分攪拌を行う。最終容器の容量は、６，０００Ｌである。容器はまた、遺伝子変更されたケー・マルキアヌス細胞が、野生型酵母やその他の微生物を制して生存するのを高めるために４５℃の温度に保たれる。それぞれの容器には、最適増殖のための標準培養培地が充填されている。
【０１５０】
細胞密度が乾燥量基準で１００グラムの細胞／Ｌとなる最終容器の内容量は、３００，０００Ｌの容量を有する最近蒸気を出した生成容器に移された。オプションとして、前の生成プロセスの濾過で得られた付加の細胞を加える。生成容器内の細胞密度は、乾燥量基準で６グラムの細胞／Ｌである。グルコースを、８０グラム／Ｌのレベルまで加える。容器内の条件は嫌気性であり、４２℃の温度を２５時間保つ。特定生産性は、生産性が低下し始めるプロセスの終了近くまで、乳酸塩０．５グラム／（グラムバイオマス*時間）よりも大きい。いったん生産性が低下し始めると、細胞を取り出して再利用のために保管する。最終乳酸塩濃度は、７５グラム／Ｌで、ｐＨ値は２．８となることができる。バイオマスを取り出した後、溶液を蒸発させて乳酸塩５０％の濃度にまで濃縮する。遊離酸（全乳酸塩の約８６％）が、液体抽出法で有機酸へと抽出され、高温で水へと再度抽出される。乳酸塩を含むラフィネートは、増殖容器内で洗浄されて緩衝液としてリサイクルされるか、例えば硫酸で酸性化され、精製される。
【０１５１】
実施例１７：クラブトリー負（ケー・マルキアヌス）およびクラブトリー正（エス・ウバルム）有機体を、それぞれ好気性および嫌気性の一括発酵器で増殖した。一括培養は、３０℃で実験室の発酵器において１．５Ｌの使用量で行われた。ｐＨ値は、２モル・Ｌ-1の水酸化カリウム（ＫＯＨ）を自動的に加えて、５．０±０．１に保たれた。発酵器には、空気（好気培養物）または窒素ガス（嫌気性培養物）を０．８１・分-1の流量で流し込み、８００回転／分で攪拌を行った。溶存酸素濃度は、酸素電極（Ingold,341003002型）で連続的にモニターされた。好気性培養物では、溶存酸素濃度は６０％より高く保たれた。１０ｍｌの試料を、乾燥重量と代謝濃度の測定のために適正な間隔で抜き出した。嫌気性培養物には、脂肪酸合成に必要な化合物を供給するため、トウィーン８０およびエルゴステロールを加えた。
【０１５２】
指数増殖の間、酵母培養物の乾燥重量およびＯＤ６６０の両方と、上澄みのグルコースおよびエタノール濃度を、適正な間隔で測定した。特定エタノール生産速度（ｑethanol，ｍｍｏｌ・ｇ-1・ｈ-1）は、線形回帰分析を用いて以下の式により計算された。
ｑethanol＝ｄＥ／ｄＣx・μmax
ｄＥ／ｄｔ（培養物内のエタノール濃度の上昇率；ｍｍｏｌ・ｇ-1・ｈ-1）およびｄＣx／ｄｔ（バイオマス濃度の上昇率；ｇ-1・ｈ-1）は、時間μmax（ｈ-1）に対するエタノール濃度とバイオマス濃度のプロットの差異を用いて計算した。グルコース上の最大特定増殖率は、時間に対するＣxのプロットの指数部分から推定された。特定グルコース消費率（ｑglucose，ｍｍｏｌ・ｇ-1・ｈ-1）を計算するために、ｄＥをｄＧと置き換えた（１時間あたりのグルコース消費量）。
【０１５３】
好気性一括培養物では、クライベラミセスとサッカロミセスの株が、グルコース上でそれぞれ０．４ｈ-1と０．２８ｈ-1の最大特定成長率を示した。高いグルコース濃度と、その結果としてのサッカロミセス培養物の高い特定成長率の結果、好気的アルコール発酵率が高くなった（表３、図１）。サッカロミセス株におけるグルコースの特定消費率は、強力なアルコール発酵により、クライベラミセスと比較して２〜３倍高かった。エネルギーの観点から、アルコール発酵は、細胞のＡＴＰ生成方法としては効率が低い。グルコース上のバイオマス収量は、クライベラミセスでは０．３８グラム／グラムであり、サッカロミセス・ウバルムでは０．１４グラム／グラムであった。グルコール上のエタノール収量は、クラブトリー負表現型クライベラミセス株ではゼロであり、クラブトリー正表現型であるサッカロミセス培養物では１．８３ミリモル／ミリモルであった。
表３：２％（重量／容量）のグルコースを含むミネラル培地上のサッカロミセス・ウバルムおよびクライベラミセス・マルキアヌスの一括培養物における指数増殖中の最大特定増殖率、エタノール生成およびグルコース消費の特定率（ｑ、ミリモル［グラム バイオマス］-1ｈ-1）、バイオマス収量（グラム／グラム）、生成物収量（ミリモル／ミリモル）、および炭素回収（％表示、嫌気性培養物に対してのみ計算）
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
嫌気性一括培養物では、両方の株の特定増殖率とバイオマス収量は、好気性条件下で発見されたのに比べて非常に低かった（表３、図１および図２）。クライベラミセスおよびサッカロミセスの株に対しては、バイオマス収量は、それぞれ０．０７と０．０９グラム／グラムであった。両方の株は、アルコール発酵の特定率について、嫌気性条件下で同等に良好である。このことは、ＣＯ2生成データを用いて確認された。
【０１５６】
一般に、この実施例は、バイオマスの好気的生成が、嫌気的よりもずっと迅速であり、好気性条件下でのバイオマスの収量が、クラブトリー負有機体に対して高いことを示している（なぜなら、クラブトリー正有機体では、あるアルコール発酵が起こり、グルコースを使い切ってしまうから）。この実施例は、発酵生成物（この場合、エタノール）が、嫌気性条件下でクラブトリー正負両方の有機体が同じ速度で生成されることも表わしている。従って、好気性増殖段階は、高いバイオマス収量を与え、その次の嫌気性発酵段階は、代謝エネルギーを生成物形成へと振り向ける（増殖を上げるよりも）。全体的に、生成を増殖と分離するプロセスは、プロセスの融通性を高め、プロセス収量の全体にわたる抑制をより良く行うことができる。
【０１５７】
実施例１８：自然にＬ乳酸を作る宿主株の中での乳酸塩生成の改善：ピルビン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を分断する相同ＤＮＡの線形断片の増幅
酵母クライベラミセス・サーモトレランス（ケー・サーモトレランス）は、Ｌ乳酸を自然に生成する酵素である（Kurtzman and Fell, (1998) "The Yeasts, A Taxonomic Study" pp. 240-241; Elsevier Science B.V.; Amsterdam, The Netherlands）。ケー・サーモトレランスには、自然発生の乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子があり、それがＬ乳酸を生成させる。嫌気性条件下で生成させる乳酸の量は、利用されるグルコースのほぼ４％グラム／グラムであるのに対し、グルコースの残余は殆どエタノール（消費されるグルコースの４２．５％グラム／グラム）、グリセロール（消費されるグルコースの３％グラム／グラム）およびアセタート（消費されるグルコースの０．３％グラム／グラム）に変換される。
表４：ケー・サーモトレランスを用いた嫌気性発酵の結果、ＹＰＡＤ培地におけるグルコース１００グラム／ｌを始点とした場合（リッチ培地）
【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
ＰＤＣ１の６００ｂｐ領域を、ケー・マルキアヌスおよびケー・ラクティスからのＰＤＣ１遺伝子シーケンスと比較することにより誘導されたシーケンスから構成したコンセンサスプライマーを用いて、ケー・サートモレランスから単離した。ＰＤＣ１断片は、その後配列され（Sanger）、ＰＣＲおよびゲノム歩行技術（Clonetech）を用いて、ケー・サーモトレランスｐｄｃ１（図６ｃ）を囲む７．５ｋｂｐ断片を単離した。７．５ｋｂｐ断片は、その後ｐＣＲIIＴＡクローニングベクター（インヴィトロゲン）にクローニングされた。ＰＤＣ１の暗号化領域中央付近ほぼ７３０ｂｐの一部を、ケー・サーモトレランス７．５ｋｂｐ断片から取り出した。制限消化（サムブルック）により取り出されたケー・サーモトレランスｐｄｃ１の部分は、以下のシーケンスを含んでいた。
TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGACGAGATCTACGAGGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGTTGAACGCTTCTTACGCTGCCGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCCTGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTGAGTTGTCCGCTTTGAACGGTATCGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCACATTGTCGGTGTCCCATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTTGGGTAACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGACCACTGCTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGATGTATCAGAACCACCTACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCATCTAACTTCGTTGACCAGATGGTCCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAATTGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGGCTGAGGAGGAGGTCATCTCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTCATCTTGGCTGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTGATTGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTCCATTGACGAGAAGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT (Sequence  ID No. XX)
プロモーターを含むカナマイシン耐性暗号化遺伝子は、その後制限消化（サムブルック）によりｐＰＩＣ９Ｋベクター（インヴィトロゲン）から単離され、７３０ｂｐ断片を取り出した７．５ｋｂｐの部位にクローニングされた。ｐＰＩＣ９Ｋ（インヴィトロゲン）からのカナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターのシーケンスは、以下のとおりであった。
GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (Sequence ID No.9)
結果としての構造物は、図６ｆに示すように、ＰＤＣ領域のほぼ６．８ｋｂｐに囲まれたカナマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８）を含んでいる。
【０１６０】
図６ｆに示す構造物は、二つの制限酵素と消化させ（サムブルック）、相同ＰＤＣ領域と半シーケンス挿入カナマイシン耐性遺伝子を含有するほぼ３マイクログラムの断片ＤＮＡを産出する。ケー・サーモトレランスは、電気穿孔法等の公知の形質変換技術を用いて、断片と形質転換させ、ケー・サーモトレランスのＰＤＣを分断する。電気穿孔法は、次のとおりである。ａ）容量２０ｍｌのＹＰＡＤ内で一晩（１５時間まで）微生物の培養物を増殖させる；ｂ）培養物から５００ｕｌをマイクロフーゲチューブに移し、＠４Ｋで４分回転させ、上澄みを捨てる；ｃ）１ｍｌの冷却ＥＢ（ＥＢ＝電気穿孔法緩衝液：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ、ｐＨ値７．５；スクロース２７０ｍＭ；ＭｇＣｌ2 １ｍＭ）で洗浄する；ｄ）１ｍｌのＩＢ（ＩＢ＝インキュベーション緩衝液：ＹＰＤ；ＤＴＴ２５ｍＭ；Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐｈ値８．０）で再び懸濁させる；ｅ）エッペンドルフサーモミキサー内で、＠８００回転／分、３０℃で３０分シェークする；ｆ）回転を遅くし、ＥＢで一回洗浄し、４００ｕｌのＥＢで再び懸濁させる；ｇ）３マイクログラムの断片ＤＮＡを加え（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍＭの水、ｐＨ値８．５）、氷の上で３０分保温する；ｈ）０．４センチの電気穿孔法キュベットに移す。ビオラドジーンパルサーの設定は、１０００ボルト、１０００アンペア、５０時間周波数である。パルス後の時定数：２０ミリセカンドまで；ｉ）３ｍｌのモートンクロージャーチューブに移し、シェークせずに３０℃で１時間保温する。ｊ）液体ＹＰＡＤ培地４００ｕｌ（ＹＰＡＤ：酵母エキス１０グラム；ペプトン２０グラム；グルコース２０グラム、アデニンヘミスルフェート１００ミリグラム。容量＝１Ｌ。ｐＨ調整なし）を加え、エッペンドルフサーモミキサー内で、＠８００回転／分、３０℃で１時間シェークする。ｋ）液体ＹＰＡＤ４００ｕｌを加えて４〜６時間回収する；ｌ）マイクロフーゲチューブ内で＠４Ｋ、４分間回転を遅くして、上澄みを捨て、１Ｍソルビトール４００ｕｌ内で懸濁させ、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８選択プレート上で平板培養し、ｍ）３０℃で３〜５日間保温する。
【０１６１】
コロニーを、まず第二のパッチングにより２００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培養皿へとふるいにかける。ゲノムＤＮＡを、標準ゲノム製剤（サムブルック）によって二次酵母パッチから単離する。単離したゲノムを、ＰＣＲを介して、１）適正なプライマーおよび条件（サムブルック）を用いてカナマイシン断片の存在と、２）適正なプライマーおよびＰＣＲ条件を用いて分断されたＰＤＣ領域の不在に対して、その後ふるいにかける。選択マーカーに対して陽性でＰＤＣ分断領域に対して陰性のコロニーは、さらなる研究のためにその後増殖され、例えば、これらの株からのゲノムＤＮＡは、サザン交雑分析により分析が進められる。
【０１６２】
その他の実施態様
本発明は、詳細な説明と共に記載されているが、前記説明は、付加の請求項の範囲によって規定されている発明の範囲を例証することを目的とし、それを制限するものではないと理解されるべきである。その他の側面、利点および変更は、以下の請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨＥＳプラスミドを示す線図。
【図２】ｐＳＥＨプラスミドを示す線図。
【図３】Ｌｈ−１ｄｈまたはＰａ−１ｄｈを含有するｐＣＲIIプラスミドの発生を示す線図。
【図４】１ｄｈ／ＣＲIIプラスミドを示す線図。
【図５】Ｌｈ−１ｄｈまたはＰａ−１ｄｈを含有するｐＨＥＳプラスミドの発生を示す線図。
【図６Ａ】ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）ノックアウト断片の発生を示す線図。
【図６Ｂ】ケー・マルキシアヌス１．７ｋｂｐＰＤＣ１を囲む５．５ｋｂｐ断片を示す線図。
【図６Ｃ】４００ｂｐの５．５ｋｂｐＰＤＣ相同領域(homologous region)の欠失およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を示す線図。
【図６Ｄ】カナマイシン耐性遺伝子を含有し２．３ｋｂｐのＰＤＣ１を囲む４ｋｂ領域を示す線図。
【図６Ｅ】７．５ｋｂｐケー・サーモトレランスＰＤＣ１および周辺の領域を示す線図。
【図６Ｆ】１．７ｋｂｐのＰＤＣ１遺伝子からの７５０ｂｐの欠失およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を示す線図。
【図７】低ｐＨ(ｐＨ２．５)および高温（４０℃）条件下で培養されたクルベロミセス・マルキシアヌスの、時間（hour）に対する増殖（光学密度；ＯＤ）を示すグラフ。
【図８】グルコース、キシロース、またはアラビノースを用いて３０℃で培養したケー・マルキシアヌスの時間（hour）に対する増殖（ＯＤ）を示すグラフ。
【図９】コーンファイバー加水分解物質を用いて３０℃で培養したケー・マルキシアヌスの時間（hour）に対する増殖（ＯＤ）を示すグラフ。
【図１０】３０℃で培養したケー・マルキシアヌスの時間（hour）に対する増殖（ＯＤ）およびその際のｐＨを示すグラフ。
【図１１】３０℃で培養したケー・マルキシアヌスの所要時間（hour）に対する増殖（ＯＤ）および、４０グラムの酪酸の存在下でのｐＨを示すグラフ。
【図１２】好気性条件下で２％のグルコースを含む無機培地上で培養した時の、エス・ウバルムおよびケー・マルキシアヌスに関する、（Ａ）はバイオマス生成、（Ｂ）はグルコース消費、および（Ｃ）はエタノール生成を示す３種のグラフ。
【図１３】嫌気性条件下で２％のグルコースを含む無機培地上で培養した時の、エス・ウバルムおよびケー・マルキシアヌスに関する、（Ａ）はバイオマス生成、（Ｂ）はグルコース消費、および（Ｃ）はエタノール生成を示す３種のグラフ。
【図１４】ＰＤＣ１プロモータベクターのプラスミド遺伝学的地図。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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