(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにつき隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材。
【請求項２】
上記線状分子がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体又はポリメチルビニルエーテルであり、上記環状分子がα、β又はγ−シクロデキストリンである請求項１記載の組織再生用基材。
【請求項３】
上記加水分解性結合がエステル結合である請求項１又は２記載の組織再生用基材。
【請求項４】
上記架橋結合がウレタン結合、アミド結合、カルバミド結合、エーテル結合、スルフィド結合又はシッフ塩基型結合である請求項３記載の組織再生用基材。
【請求項５】
上記嵩高い置換基が１以上のベンゼン環を有する基又は１以上の第三ブチルを有する基である請求項１〜４のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項６】
上記生体親和性基がアミノ酸、オリゴペプチド、オリゴ糖類又は糖誘導体である請求項１〜５のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項７】
上記線状分子がポリエチレングリコール、上記環状分子がα−シクロデキストリン、上記加水分解性結合がエステル結合、上記嵩高い置換基を有する生体親和性基がベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンである請求項１〜６のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項８】
上記ポリロタキサンヒドロゲルが多孔体である請求項１〜７のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項９】
上記ポリロタキサンヒドロゲルは、使用状況に適した分解速度になるように、上記ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合が定められていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項１０】
上記ポリロタキサンヒドロゲルは、使用状況に適した分解速度又は分解パターンになるように決められた所定平均分子量の架橋用線状分子を介して、環状分子同士、生体親和性基同士又は環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋したことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項１１】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにつき、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子同士を架橋用線状分子を介して架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなり、下記（ａ）の性質を有する組織再生用基材。
（ａ）ポリロタキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間が、ポリロタキサンヒドロゲル中の含水率に依存せず、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサン含有率が減少するのに伴って、又は、環状分子に対する架橋用線状分子のモル比が増加するのに伴って、又は、架橋用線状分子の平均分子量が減少するのに伴って、長くなる。
【請求項１２】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにつき、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子同士を架橋用線状分子を介して架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなり、下記（ｂ）の性質を有する組織再生用基材。
（ｂ）ポリロタキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間をｔ∞、ポリロタキサンヒドロゲルを浸水してからの経過時間をｔ、初期の水膨潤状態でのポリロタキサンヒドロゲル重量をＭ0、時間ｔにおけるポリロタキサンヒドロゲル重量をＭtとし、横軸にｔ／ｔ∞、縦軸にＭt／Ｍ0をとってグラフを描いたときの分解パターンが、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサン含有率に依存せず、架橋用線状分子の分子量に依存して決まる。
【請求項１３】
環状分子がα−シクロデキストリン、線状分子がポリエチレングリコール、加水分解性結合がエステル結合、架橋用線状分子がポリエチレングリコールビスアミンであり、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれるα−シクロデキストリンのＯＨ基同士をポリエチレングリコールビスアミンの両末端のＮＨ2基でウレタン結合により架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなる請求項１１又は１２記載の組織再生用基材。
【請求項１４】
間葉系細胞、肝細胞又は神経細胞の培養に用いられる請求項１〜１３のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の組織再生用基材に細胞が培養されているか又は組み込まれていることを特徴とする移植用材料。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の組織再生用基材に細胞を培養するか組み込むことにより移植用材料を得ることを特徴とする移植用材料の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、整形外科、口腔外科、形成外科などの医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料及びその製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト組織を再形成、再構築させることによって治療を行う組織工学（Tissue Engineering）の分野が急速に発展してきている。このような組織工学では、１９８０年代初期より、整形外科分野等において皮膚、軟骨あるいは神経細胞を分解・非分解性材料中で培養する試みがなされてきた。
【０００３】
組織工学では、組織再生の足場となるマトリクスを生体内に移植し、生体内（in vivo）で細胞を増殖させることで治療を行う方法や、マトリクスを足場とした細胞の培養、増殖を生体外（in vitro）で行った後、培養した細胞（組織）を生体内にマトリクスとともに、あるいは再生組織単独で移植する方法などが知られている。
【０００４】
また、組織再生の足場となるマトリクスに関しても種々の生体由来、合成材料等が知られており、例えば、コラーゲンやポリグリコール酸のマトリクス中では細胞の３次元培養が可能であり、生体内で分解・吸収される特徴を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらのマトリクスの分解産物は炎症反応を誘起する可能性があり、さらに、マトリクスが組織再建の前に分解したり、組織再生後も長い間分解しない等、分解・消失時間の制御が困難であった。
【０００６】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、組織再生が可能であり、組織再建時に必要な力学特性を備え、組織再建後の生体内での分解消失特性を有する組織再生用基材を提供することを目的とする。また、良好に組織を再建でき、組織再建後の生体内での分解消失特性を有する移植用材料を提供すること、また、そのような移植用材料の製法を提供することを別の目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発明の効果】
上記課題を解決するため、本発明は組織再生用基材であって、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにつき隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなることを特徴とする。
【０００８】
本発明のポリロタキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材を用いて例えば軟骨細胞を培養すると、細胞は軟骨細胞様の形態を維持しながら増殖する。また、この組織再生用基材を単体で生体内に移植しても、細胞形態や増殖を阻害する事はない。つまり、組織再生が可能である。
【０００９】
また、本発明で用いられるポリロタキサンヒドロゲルは、組織再建時に必要な力学特性を備えている。これは、ポリロタキサンヒドロゲルが超分子構造つまり線状分子と環状分子のような異分子間の物理的な絡み合い（非共有結合）をしていることにより、高い結晶性を有している為と考えられる。
【００１０】
更に、本発明で用いられるポリロタキサンヒドロゲルは、組織再建後の生体内での分解消失特性を備えている。これは、加水分解性結合を有しているため、生体内でのこの加水分解性結合が加水分解して嵩高い生体親和性基（つまりキャップ）が線状分子の両末端から外れ、この線状分子から環状分子が脱離することにより分解消失すると考えられる。
【００１１】
このように本発明の組織再生用基材によれば、組織再生が可能であり、組織再建時に必要な力学特性を備えると共に、組織再建後の生体内での分解消失特性を有しているため、細胞から組織を再構築するのに適している。
【００１２】
本発明の組織再生用基材において、線状分子や環状分子は生体親和性（生体にほとんど害を与えない性質）を有するものであれば特に限定されないが、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。このように構成する環状分子や線状分子として、生体親和性に優れているものを選ぶことにより、合成されたポリロタキサンヒドロゲルは生体親和性に優れ、組織再生用移植材料として適している。また、平均分子量は２００〜５００００、特に４００〜５０００であることが好ましい。環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せが好ましい。
【００１３】
本発明の組織再生用基材において、加水分解性結合としては、生体内で加水分解する結合であればどのような結合であってもよい。このうち、生体内で速やかに非酵素的に加水分解することを考慮すればエステル結合であることが好ましい。
【００１４】
組織再生用基材がポリロタキサンヒドロゲルの場合、架橋結合はウレタン結合、アミド結合、カルバミド結合、エーテル結合、スルフィド結合又はシッフ塩基型結合が好ましい。また、架橋結合は、環状分子同士を架橋する場合、加水分解性結合よりも水に対して安定であることが好ましい。これは、先に加水分解性結合が分解して線状分子の両末端から嵩高い置換基を有する生体親和性基が外れ、架橋結合された環状分子が一度期に脱離することにより、良好な分解パターンが得られるからである。
【００１５】
本発明の組織再生用基材において、線状分子の両末端の生体親和性基としては、生体に対する親和性が高い基（生体に対して安全性の高い基）であればどのような基であってもよいが、例えばアミノ酸、オリゴペプチド、オリゴ糖類又は糖誘導体であることが好ましい。アミノ酸としては、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミンサン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。また、オリゴペプチドとしては、前出のアミノ酸の複数がペプチド結合して形成されたもの等が挙げられる。また、オリゴ糖類としては、繰り返し単位が１〜５であり、構成多糖としてデキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷんからなるもの等が挙げられる。更に、糖誘導体としては、オリゴ糖類、多糖又は単糖をアセチル化やイソプロピル化等の化学修飾した化合物等が挙げられる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等が好ましい。
【００１６】
本発明の組織再生用基材において、生体親和性基が有する嵩高い置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのような基であってもよいが、例えば１以上のベンゼン環を有する基又は１以上の第三ブチルを有する基が好ましい。１以上のベンゼン環を有する基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基等が挙げられ、また、１以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等が挙げられるが、このうち、ベンジルオキシカルボニル基が好ましい。
【００１７】
本発明の組織再生用基材としては、上記線状分子がポリエチレングリコール、上記環状分子がα−シクロデキストリン、上記加水分解性結合がエステル結合、上記嵩高い置換基を有する生体親和性基がベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンであることが特に好ましい。なお、α−シクロデキストリンをポリエチレングリコールに貫通させる場合、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールの繰り返し単位（エチレンオキシド単位）の比の化学量論数は１：２といわれている。
【００１８】
本発明の組織再生用基材がポリロタキサンヒドロゲルの場合には、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合（ポリロタキサンヒドロゲル骨格に占めるポリロタキサンの重量割合）を変化させることによりポリロタキサンヒドロゲルの分解速度をコントロールできる。これは今回新たに得られた知見であるが、この知見を利用して次のようにポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合を定めるのが好ましい。即ち、組織再生用基材の使用状況に適した分解速度を予め求めておき、その分解速度になるようにポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの割合を定めるのである。この結果、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。
【００１９】
本発明の組織再生用基材がポリロタキサンヒドロゲルであって、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子同士（又は生体親和性基同士、又は環状分子と生体親和性基）を、架橋用線状分子を介して架橋結合で架橋した構造の場合には、その架橋用線状分子の平均分子量を変化させることによりポリロタキサンヒドロゲルの分解速度や分解パターンをコントロールできる。これも今回新たに得られた知見であるが、この知見を利用して次のように架橋用線状分子の平均分子量を定めるのが好ましい。即ち、組織再生用基材の使用状況に適した分解速度や分解パターンを予め求めておき、その分解速度や分解パターンになるように架橋用線状分子の平均分子量を定めるのである。この結果、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。
【００２０】
ここで分解パターンとしては、生体内で徐々に分解していくパターンや、生体内である時間経過するまではほとんど分解せずにその後急激に分解するパターンなどがある。また、架橋用線状分子としては、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体などの生体親和性ポリマーが好ましく、その平均分子量は０〜５００００の範囲で決めることが好ましい。なお、架橋部分の分子量が０の場合には、架橋用線状分子が介在せずに直接結合していることを意味する。また、架橋用線状分子を介して架橋する際、架橋用線状分子の両端で架橋することが好ましい。
【００２１】
本発明の組織再生用基材は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにつき、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子同士を架橋用線状分子を介して架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなり、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の性質を有するものが好ましい。
（ａ）ポリロタキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間が、ポリロタキサンヒドロゲル中の含水率に依存せず、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサン含有率が減少するのに伴って、又は、環状分子に対する架橋用線状分子のモル比が増加するのに伴って、又は、架橋用線状分子の平均分子量が減少するのに伴って長くなる。
（ｂ）ポリロタキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間をｔ∞、経過時間をｔ、初期の水膨潤状態でのポリロタキサンヒドロゲル重量をＭ0、時間ｔにおけるポリロタキサンヒドロゲル重量をＭtとし、横軸にｔ／ｔ∞、縦軸にＭt／Ｍ0をとってグラフを描いたときの分解パターンが、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサン含有率に依存せず、架橋用線状分子の分子量に依存して決まる。
【００２２】
上記（ａ）の性質を有する場合には、組織再生用基材の使用状況に適した分解速度を予め求めておき、その分解速度になるようにポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの割合（含有率）を定めるか、あるいは、環状分子に対する架橋用線状分子のモル比を定めるか、あるいは、架橋用線状分子の平均分子量を定めることにより、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。
【００２３】
一方、上記（ｂ）の性質を有する場合には、組織再生用基材の使用状況に適した分解パターンを予め求めておき、その分解パターンになるように架橋用線状分子の平均分子量を定めることにより、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。なお、実際に生体内で使用するときにある時間経過するまではほとんど分解せずにその後急激に分解するパターンを得ようとすれば、例えば架橋用線状分子の平均分子量を４０００〜１００００とすることが好ましい。
【００２４】
上記（ａ）及び／又は（ｂ）の性質を有する組織再生用基材としては、例えば、環状分子がα−シクロデキストリン、線状分子がポリエチレングリコール、加水分解性結合がエステル結合、架橋用線状分子がポリエチレングリコールビスアミンであり、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれるα−シクロデキストリンのＯＨ基同士をポリエチレングリコールビスアミンの両末端のＮＨ2基でウレタン結合により架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなるものが挙げられる。
【００２５】
本発明の組織再生用基材は、細胞を培養又は組み込み可能な形態であれば特にどのような形態であろうと限定されない。例えばフィルム状にしてその上に細胞を播種したり、ゲル状にしてその上に細胞を播種したり、溶媒に溶かしてその溶液に細胞を播種したり、溶媒に懸濁させてその懸濁液に細胞を播種したりしてもよい。特に、細胞を保持・培養しやすくする点を考慮すれば、ポリロタキサンヒドロゲルの多孔体を用いることが好ましい。このときの孔については細胞を保持できる大きさ・密度であれば特に限定されない。また、細胞と組み合わせず組織再生用基材を単体で生体内に移植する場合にも、組織再生用基材の形態が限定される事はない。好ましくは移植周辺組織からの細胞が増殖するのに好適な環境を与える為、多孔体にする事が望ましい。その際、孔の大きさ、密度は移植周辺組織から細胞が侵入し、血管新生ができるのに適当な大きさ、密度とすればよく、特に限定はされない。また、多孔体の製法としては、周知の方法を適用可能であり、例えば、塩化ナトリウム存在下でゲル化する方法や、含水ヒドロゲルを真空凍結乾燥する方法等が適用可能である。
【００２６】
本発明の組織再生用基材は、その表面が細胞接着促進物質によって被覆されていてもよい。細胞接着促進物質とは、細胞の接着を促進する性質を有するものであれば特に限定されないが、例えばコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。被覆方法は特に制限されず、常法に従って行うことができるが、簡便には多孔体を調製後、細胞接着促進物質に浸漬し、その後再度凍結乾燥する方法が挙げられる。
【００２７】
組織再生用基材は特にどのような細胞の培養又は組み込みに用いてもよいが、例えば、間葉系細胞、肝細胞、神経細胞の培養に用いることが好ましい。ここで、間葉系細胞には、軟骨細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞とこれら全ての前駆細胞が含まれ、本発明の組織再生用基材は軟骨細胞の培養に用いることが特に好ましい。
【００２８】
本発明の組織再生用基材を用いて組織を再生する方法としては、ポリロタキサンゲルを単体で使用する方法、この再生用基材に単に細胞を組み込み使用する方法、またこの再生用基材で細胞を培養して使用する方法が考えられる。
【００２９】
また、細胞を固定化する方法としては、例えば、ポリロタキサンヒドロゲルにあっては高濃度の細胞培養液を添加し、ゲルの膨潤と共に細胞をゲル孔内へ取り込ませることにより固定化する方法、回転培養する方法、細胞を播種したあと細胞に影響を与えない程度に減圧することにより固定化する方法等が挙げられる。
【００３０】
本発明の組織再生用基材に細胞が培養されているか又は細胞が組み込まれた移植用材料を用いれば、組織再生が可能となる。この移植用材料を製造する方法としては、特にどのような製造方法でもよいが、上記組織再生用基材を使用目的に応じて適当な大きさ又は形状に調製した後、この組織再生用基材に細胞を培養するか組み込むことにより移植用材料を得ることが好ましい。例えば、耳の軟骨の再建に用いる場合には、耳の適用部位に適合するよう整形・加工した組織再生用基材に細胞分散液を注入して、一定期間培養して移植用材料としてもよい。この場合、この移植用材料は耳の適用部位に埋め込まれる。逆に、組織再生用基材に細胞を培養または組み込んだ後、この移植用材料を利用時、または出荷時に適応部位に応じた適切な大きさまたは形状に調整してもよい。
【００３１】
ポリロタキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材に例えば軟骨細胞が培養された移植用材料では、培養細胞は軟骨細胞様の形態を維持しながら増殖し、軟骨基質を豊富に産生している。軟骨組織は、軟骨細胞とその細胞が産生する基質によって主に修復されるため、予めこれらが豊富に含有されていることは、その移植用材料が高い組織再生能力を有することを意味している。このように、培養操作を行った場合には、組織修復に必要な細胞を増殖させること、あるいは、細胞の産生物質（基質や成長因子など）を移植用材料中に担持できる点が好ましいが、何らかの理由によって細胞が死滅した場合でも、細胞が産生した基質や成長因子は移植用材料中に残存するため組織再生には有効である。さらに、上記組織再生用基材に例えば軟骨細胞を播種しただけ、すなわち、培養せずに単に組み込んだだけでも、細胞の形態が維持されるために移植直後からこれらの細胞が組織再生に機能し、移植用材料として有効である。
【００３２】
【実施例】
本発明の好適な実施例について以下に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３３】
（１）生分解性ポリロタキサンの合成（図１参照）
（１−１）両末端にアミノ基を有するＰＥＧの合成
分子量３３００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（３３ｇ，１０ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（２０ｇ，２００ｍｍｏｌ）をトルエン（２２０ｍｌ）に溶解させ、この溶液を１５０℃で５時間還流させた。反応終了後、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥して粗生成物を得た。これをジクロロメタンに溶解させ、不溶物を遠心分離により除去し、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込んで、濾別・減圧乾燥後に両末端にカルボキシル基を有するＰＥＧ（化合物Ａ）を白色粉末として得た。
【００３４】
この化合物Ａ（２０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）（１７．１ｇ，１４８．２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンとジクロロメタンの混合溶液（３５０ｍｌ，体積比１：１）に溶解させ、氷冷後ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２３．５ｇ，１１４ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷したまま１時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロウレタンを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジエチルエーテルに注ぎ込んだ。濾別・減圧乾燥後にカルボキシル基が活性化されたＰＥＧ（化合物Ｂ）を白色粉末として得た。
【００３５】
エチレンジアミン（０．４ｍｌ，６ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（７５ｍｌ）に、化合物Ｂ（１０ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（７５ｍｌ）を滴下し、滴下終了後から室温で１時間攪拌した。反応終了後、溶液を過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥後に両末端にアミノ基を有するＰＥＧ（化合物Ｃ）を白色粉末として得た。
【００３６】
（１−２）擬ポリロタキサンの調製
α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）（４８ｇ，４９．２ｍｍｏｌ）の飽和水溶液（３１１ｍｌ）に化合物Ｃ（４ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍｌ）を室温で滴下した。１時間超音波を照射しながら攪拌し、その後室温で２４時間攪拌した。遠心分離により白色の沈殿物を回収し、５０℃で減圧乾燥を行い、白色粉末の擬ポリロタキサンを得た。
【００３７】
なお、ポリロタキサンとは、多数の環状分子（例えばシクロデキストリン）に線状分子（例えばＰＥＧ）が貫通し、その線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたものをいい、擬ポリロタキサンとは、ポリロタキサンの両末端を未だ嵩高い置換基でキャップしていないものをいう。
【００３８】
（１−３）末端キャップ剤の調製
α−ＣＤの脱離を防止する嵩高い置換基としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）を導入するために、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅのカルボキシル基の活性化を行った。
【００３９】
すなわち、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ（１００ｇ，３３４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８００ｍｌ）に溶解させ、氷冷しながらＨＯＳｕ（３８．４２ｇ，３３４ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後にＤＣＣ（７５．７ｇ，３６７ｍｍｏｌ）を溶解させた１，４−ジオキサン溶液（２００ｍｌ）をゆっくり加え、氷冷したまま１時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロウレタンを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥後に粗生成物を得た。室温でできるだけ飽和濃度になるように粗生成物をジクロロメタンに溶解させた後、石油エーテルを適量加え冷蔵し、再結晶を行った。結晶を濾別・減圧乾燥して白色針状結晶のＺ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステル（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ）を得た。
【００４０】
（１−４）生分解性ポリロタキサンの調製
Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（８０ｇ，２００ｍｍｏｌ）をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）（６０ｍｌ）に溶解させ、擬ポリロタキサン（４５ｇ、２ｍｍｏｌ）を加えた。この不均一溶液を室温で攪拌しながら、均一になるように少しずつＤＭＳＯを加えて９６時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、粗生成物を得た。粗生成物をアセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の順で洗浄して不純物（未反応Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ、α−ＣＤ、化合物Ｃなど）を除去し、濾別・減圧乾燥して生分解性ポリロタキサンを白色粉末として得た。合成の確認は、1Ｈ−ＮＭＲにより行った。
【００４１】
（２）ポリロタキサンヒドロゲルの調製（図２参照）
窒素雰囲気下で生分解性ポリロタキサン（１ｇ，２．９１×１０-5ｍｏｌ，［ＯＨ］＝１６．２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に溶解させた後に、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（８．１３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応終了後、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥して白色粉末のＣＤＩ活性化ポリロタキサン（ＣＤＩ−ＰＲ）を得た。
【００４２】
下記表１に示す配合量に従い、ＣＤＩ−ＰＲのＤＭＳＯ溶液と、ＰＥＧのビスアミン（ＰＥＧ−ＢＡ、分子量６００）と、塩化ナトリウムとを加え、攪拌・脱気後テフロンスペーサ（直径１３ｍｍ、深さ２ｍｍ）を用いて３５℃で２４時間ゲル化を行った。得られたゲルは、ＤＭＳＯで洗浄し、続いて水で重量が変化しなくなるまで洗浄し、ポリロタキサンヒドロゲルを得た（ＰＲＨＧ−１〜４）。
【００４３】
これらのポリロタキサンヒドロゲルＰＲＨＧ−１〜４は、隣合うポリロタキサン１分子中に含まれる環状分子（α−シクロデキストリン）同士を、架橋結合（ウレタン結合）によりＰＥＧを介して架橋して三次元網目構造としたものである。また、塩化ナトリウム存在下でゲル化を行ったＰＲＨＧ−１〜３は多孔体であり（電子顕微鏡で確認済み）、塩化ナトリウム不在下でゲル化を行ったＰＲＨＧ−４は非多孔体であった。
【００４４】
【表１】
0004753525.tif 000002
【００４５】
（３）ポリロタキサンヒドロゲルの物性
ポリロタキサンヒドロゲルの含水率、力学強度の指数となる圧縮弾性率及び膨潤時の架橋密度を測定した（表１参照）。なお、これらは非多孔体の測定値であるが、圧縮弾性率については多孔体でも同等ないしは１オーダー低い程度であり、架橋密度については多孔体でも同等である。
【００４６】
含水率は、室温において平衡膨潤状態のポリロタキサンヒドロゲル重量（Ｗwet）、およびそのゲルを５０℃で減圧乾燥した後の乾燥ポリロタキサンヒドロゲル重量（Ｗdry）を測定し、下記数１から算出した。
【００４７】
【数１】
0004753525.tif 000003
【００４８】
圧縮弾性率は、室温で熱応力歪み測定装置を用いて測定し、架橋密度は、圧縮弾性率を用いて下記数２から算出した。なお、測定には、コルクボーラーを用いてプローブとほぼ同じ断面積にくり抜いた平衡膨潤状態のポリロタキサンヒドロゲルを用いた。
【００４９】
【数２】
0004753525.tif 000004
【００５０】
（４）ポリロタキサンヒドロゲルの非酵素的加水分解挙動の解析
（４−１）ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの割合に関する考察
上記（２）において、ＣＤＩ−ＰＲのＤＭＳＯ溶液とＰＥＧ−ＢＡのＤＭＳＯ溶液と塩化ナトリウムを加えてゲル化を行う際、ポリロタキサン重量（ＣＤＩ−ＰＲのＤＭＳＯ溶液から換算）とＰＥＧ−ＢＡ重量との比を７０：３０としたポリロタキサンヒドロゲル（ＰＲＨＧ−５）と、６０：４０としたポリロタキサンヒドロゲル（ＰＲＨＧ−６）を調製した。
【００５１】
平衡膨潤状態のポリロタキサンヒドロゲルＰＲＨＧ−５，ＰＲＨＧ−６を０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ＝８．０）に浸漬し、３７℃で振盪、所定時間毎に水を拭き取りゲルの重量変化を測定した。この重量変化を非酵素的加水分解挙動の評価とした。結果を図３に示す。
【００５２】
ポリロタキサンヒドロゲルの分解パターンは、初期において重量が増加していきその後減少してついにはゼロになるというパターンである。ここで、重量が増加している間は、ポリロタキサンヒドロゲルの架橋点が減少して三次元構造の網目のマスが広がることにより水分を保持しやすくなり含水率が上がったものと考えられるが、ポリロタキサンヒドロゲルの三次元構造は維持されていると考えられる。一方、ポリロタキサンヒドロゲルの三次元構造が維持できなくなるほど架橋点が減少すると、溶解して重量が減少していきゼロに至ると考えられる。したがって、重量変化の測定を開始してから重量がゼロに至るまでの時間が分解速度を表す。
【００５３】
図３によれば、ＰＲＨＧ−６よりもＰＲＨＧ−５の方が分解速度が速いことから、ポリロタキサンヒドロゲルの分解速度はポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合が多いほど速くなるといえる。
【００５４】
また、ポリロタキサンヒドロゲルの分解パターンを考察するために、実験開始前の水膨潤状態時のヒドロゲルの重量Ｍ0、ポリロタキサンヒドロゲルが完全に分解するまでの時間（完全分解時間という）ｔ∞を用いて規格化を行い、ポリロタキサンヒドロゲルを浸水してからの経過時間ｔをｔ∞で割った値ｔ／ｔ∞、時間ｔにおけるゲル重量ＭtをＭ0で割った値Ｍt／Ｍ0を規格化した数値として図４のグラフを作成した。分解パターンを考察する際の視点の一つは、ｔ／ｔ∞の数値がいくつのときにポリロタキサンヒドロゲルの分解が始まったか（Ｍt／Ｍ0がピークに達したか）という点にある。分解開始時のｔ／ｔ∞の数値が小さいということは、分解し始めてから完全に分解するまでに要する時間が長いということであり、逆に分解開始時のｔ／ｔ∞の数値が大きいということは、分解し始めてから完全に分解するまでに要する時間が短いということである。
【００５５】
図４によれば、ＰＲＨＧ−５でもＰＲＨＧ−６でも分解開始時のｔ／ｔ∞の数値はほぼ同じ（約０．５）であることから、ポリロタキサンヒドロゲルの分解パターンはポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの割合に依存しないといえる。
【００５６】
（４−２）まとめ
以上の結果から、ポリロタキサンヒドロゲルの分解速度をコントロールするには、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合を変化させればよいことがわかる。つまり、組織再生用基材としてポリロタキサンヒドロゲルを用いる場合、その組織再生用基材の使用状況に適した分解速度を求め、その分解速度が得られるように、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合を決めればよい。
【００５７】
（５）ポリロタキサンヒドロゲルの非酵素的加水分解挙動の解析−その２
前出のＣＤＩ−ＰＲ（４．２×１０-5ｍｏｌ、Ｎ−アシルカーボネート基：１０．７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍｌ）に溶かし、次いで溶融させた種々のＰＥＧビスアミンを添加した。その合成条件を表２にまとめた。反応混合物をガス抜きし、テフロンスペーサに注入し、３５℃で２４時間維持した。その後、得られた生成物をＤＭＳＯで洗浄し、室温で水に浸し、２日間かけて完全に水和させた。これによりポリロタキサンヒドロゲルを得た。
【００５８】
【表２】
0004753525.tif 000005
【００５９】
加水分解挙動は以下のようにして調べた。即ち、上述のようにして得られたポリロタキサンヒドロゲルの膨潤物を１ｃｍ×１ｃｍのスラブ（厚さ＜１ｍｍ）にカットし、０．０２％のアジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）にこれらのスラブを３７℃にて浸し、振盪機で１３０ｒｐｍで振盪した。ポリロタキサンヒドロゲルの分解は、残ったポリロタキサンヒドロゲルの重量を測定することによって評価した。実験は３回行った。実験結果を図５〜図７にグラフで示した。
【００６０】
図５はＰＥＧビスアミンの分子量を一定にしてポリロタキサンの含有率を種々変化させたポリロタキサンヒドロゲルの分解挙動を表すグラフであり、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれＰＥＧビスアミンの分子量が４０００，２０００，６００である。また、図６はポリロタキサン含有率と完全分解時間との関係を表すグラフである。この図５及び図６から明らかなように、完全分解時間は、ＰＥＧビスアミンの分子量が同じ場合、ポリロタキサンの含有率が減少するのに伴って長くなる。つまり、ポリロタキサンヒドロゲルの分解速度は、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合が多いほど速くなる。
【００６１】
図７はポリロタキサン含有率と含水率との関係を表すグラフである。この図７から明らかなように、ポリロタキサンヒドロゲル中の含水率は、ＰＥＧビスアミンの分子量が同じ場合、ポリロタキサン含有率に関わらず概ね一定である。ここの結果は、含水率は完全分解時間を変化させる要因ではないことを示唆している。
【００６２】
図８はＰＥＧ／α−ＣＤ比と完全分解時間との関係を表すグラフである。ここで、ＰＥＧ／α−ＣＤ比は、ポリロタキサンヒドロゲル中のＰＥＧビスアミンとα−ＣＤとのモル比である。この図８から明らかなように、完全分解時間は、ＰＥＧビスアミンの分子量が同じ場合、ＰＥＧ／α−ＣＤ比が増加するのに伴って長くなる。つまり、ポリロタキサンヒドロゲルの分解速度は、ＰＥＧ／α−ＣＤ比が小さいほど速くなる。表２に示すように、ＰＥＧ／α−ＣＤ比はつねに２以下に調整した。なお、ＰＥＧ／α−ＣＤ比が２を越えると、ポリロタキサンヒドロゲルは生理学的条件あるいは０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液下で分解しないため、ここではＰＥＧ／α−ＣＤ比が２以下のものを取り上げた。
【００６３】
図９は図４と同様、横軸をｔ／ｔ∞、縦軸をＭt／Ｍ0としたときの分解パターンを表すグラフである。図９から明らかなように、この分解パターンはポリロタキサンヒドロゲル中のポリロタキサン含有率に依存せず、ＰＥＧビスアミンの分子量が同じならば同様のプロファイルになる。また、ポリロタキサンヒドロゲルの分解開始点までのタイムラグはＰＥＧビスアミンの分子量が増加するにつれて長くなる。この結果は、絶対的な分解時間と関係なく、ＰＥＧビスアミンの分子量が大きいほど、より分解開始点までのタイムラグが長く、分解開始後は早期に分解されるようなパターンになることを示している。
【００６４】
（６）軟骨細胞の培養
表１に示したポリロタキサンヒドロゲルＰＲＨＧ−１，ＰＲＨＧ−３をオートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間処理して滅菌した。滅菌後のポリロタキサンヒドロゲルを９６穴培養用プレートに入れ、凍結保存してあったウサギ軟骨細胞を１穴あたり２×１０5細胞／１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ内で静置し、細胞を各ポリロタキサンヒドロゲルに固定した（固定時間２時間又は２４時間）。
【００６５】
このように軟骨細胞を固定した各ポリロタキサンヒドロゲルを２４穴培養用プレートに移し、１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含むダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）（以下、単に培地という）を添加し、７日ごとに培地交換し、計６週間培養した。培養後、１０％ホルマリンで固定し、アルシャンブルー（Alcian Blue）（ｐＨ１．０）で染色し、脱色、脱水、透徹したのち封入した。なお、アルシャンブルー染色は、酸性ムコ多糖の染色法の一つで軟骨組織染色法の一種である。
【００６６】
固定時間が２時間の場合、培養開始後から円形細胞がコロニーを形成しながら増殖を開始し、培養期間と共に大型化した。具体的には培養１４日目、２８日目、４２日目で観察を行い、大型化していく様子を確認した（図１０参照）。これらのコロニーは、コロニーの大型化と共に不透明な基質を産生し、顕微鏡下で濁ったような像として観察された。また、４週間培養後には細胞コロニー全体に非常に強固なアルシャンブルー陽性像が観察された。つまり、このポリロタキサンヒドロゲルを用いて軟骨細胞を３次元形状で培養したときに、軟骨細胞は元の形状を維持しながら増殖すると共に基質（酸性ムコ多糖類）も産生することが確認された。したがって、ポリロタキサンヒドロゲル（ＰＲＨＧ−１，３）からなる組織再生用基材に軟骨細胞が３次元形状で培養されたものを移植用材料として用いることができる。また、固定時間が２４時間の場合においても概ね同じ様子が観察された。
【００６７】
また、細胞の伸展あるいはポリロタキサンヒドロゲルの分解に伴って培養プレート中に軟骨細胞のコロニーがこぼれ出て底面に接着してきた。その後、接着したコロニーから、線維芽細胞様形態を持つ細胞がアウトグロースしてきた。これらは軟骨細胞の円形の形態を維持しておらず、アルシャンブルー染色も陰性を示した。この結果は、ポリロタキサンヒドロゲル内で維持した軟骨様細胞コロニーを取り出して単層培養にかけたところ軟骨細胞様形質を失ったことから、脱分化を引き起こしたものと推察される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  生分解性ポリロタキサンの合成手順を表す説明図である。
【図２】  ポリロタキサンヒドロゲルの合成手順を表す説明図である。
【図３】  ポリロタキサンヒドロゲルＰＲＨＧ−５，６の非酵素的加水分解挙動のグラフである。
【図４】  ポリロタキサンヒドロゲルＰＲＨＧ−５，６の分解パターンを考察するためのグラフである。
【図５】  ＰＥＧビスアミンの分子量を一定にしてポリロタキサンの含有率を種々変化させたポリロタキサンヒドロゲルの分解挙動を表すグラフである。
【図６】  ポリロタキサン含有率と完全分解時間との関係を表すグラフである。
【図７】  ポリロタキサン含有率と含水率との関係を表すグラフである。
【図８】  ＰＥＧ／α−ＣＤ比と完全分解時間との関係を表すグラフである。
【図９】  横軸をｔ／ｔ∞、縦軸をＭt／Ｍ0としたときの分解パターンを表すグラフである。
【図１０】  ポリロタキサンヒドロゲルＰＲＨＧ−１，３上でのウサギ軟骨細胞培養の経時変化を表す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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