(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖ３領域が配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＩＶエンベロープタンパク質。
【請求項２】
複数のＨＩＶ−１株に対する交差反応性中和抗血清の産生をインビトロで誘導することが可能な、請求項１に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質。
【請求項５】
少なくとも５２０アミノ酸残基の配列からなり、当該５２０アミノ酸残基の配列は配列番号１のアミノ酸１〜５２０の配列である、請求項１又は２に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質を含む環状ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質を含有するワクチン組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される担体を更に含有する、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
アジュバントを更に含有する、請求項８または９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ヒトにおける使用に適した、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
抗ＨＩＶエンベロープタンパク質抗体を作り出すためのワクチンを製造する方法であって、
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物を使用することを特徴とする方法。
【請求項１３】
抗ＨＩＶエンベロープタンパク質抗体を製造する方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質を使用することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により得ることのできる抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
サンプル中の抗ＨＩＶエンベロープタンパク質抗体を検出する方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質とサンプルとを接触させるステップと、
ＨＩＶエンベロープタンパク質とサンプル中の抗ＨＩＶエンベロープタンパク質抗体との結合を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
宿主細胞を形質転換して、ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現させる方法であって、
請求項１８に記載のベクターを、当該ベクターが宿主細胞を形質転換して、前記核酸によってコードされるＨＩＶエンベロープタンパク質を発現させることが可能な条件下で、宿主細胞に導入するステップを含む方法。
【請求項２０】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／０９５，２６７号（１９９８年８月４日出願）に関し、これはその全体が引用により本明細書中に援用される。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、様々なサブタイプの一次ＨＩＶ単離株を中和するその能力が注目されている中和基準ヒト血清（２）のドナーに由来するＨＩＶ−１エンベロープタンパク質およびペプチドに関する。
【０００３】
（連邦政府への謝辞）
本発明は、一部が下記の連邦政府補助金によって資金援助された研究から派生した。すなわち、ＮＩＨ  ＡＩ３７４３６およびＡＩ４４３３９ならびにＵＳＵＨＳ  Ｒ０８７Ｅ２である。
【０００４】
【従来の技術】
ＨＩＶ感染に対して成功するワクチンまたはＨＩＶ疾患の進行を予防し得るワクチン剤の開発は、１５年を超える期間にわたる公衆衛生の目標であった。ＨＩＶ感染に対する保護的な免疫応答を惹起するために必要とされ得る免疫応答の１つは、ウイルスを中和する抗体を産生させることである。
【０００５】
ＨＩＶ−１中和抗体（ＮＡ）の標的は、エンベロープ糖タンパク質複合体である。この複合体は、それぞれがｇｐ１２０表面糖タンパク質およびｇｐ４１膜貫通糖タンパク質の３コピーまたは４コピーから構成される多量体構造である（Ｌｕｃｉｗ、１９９６）。多数の中和ドメインがこの複合体の３つまたは４つのヘテロダイマー成分のそれぞれに存在する（Ｔｈａｌｉら、１９９２、１９９３；Ｚｗａｒｔら、１９９１；Ｍｏｏｒｅら、１９９３；Ｔｒｋｏｌａら、１９９６；Ｍｕｓｔｅｒら、１９９３；Ｃｏｔｒｏｐｉａら、１９９６；Ｓａｂｒｉら、１９９６）。それらのタンパク質のアミノ酸組成は株ごとに相当変化している。中和ドメインは、非常に変化しやすい領域にそのいくつかが存在し、一方、非常に保存されやすい領域にその他のいくつかが存在する。変化しやすい中和ドメインは、ｇｐ１２０の可変（Ｖ）領域１、２および３におけるドメインを含み、一方、保存されたドメインは、一次レセプターの結合部位、ならびにｇｐ１２０およびｇｐ４１における他のエピトープを含む。アミノ酸配列が変化していることにより、ウイルス株間の中和感受性の特異性において認められる変化が疑問の余地なく説明される。しかし、遺伝子分析に基づいてＨＩＶ−１の抗原性サブタイプを分類することはこれまでできず、そして中和ドメインの外側においてさえ、エンベロープ複合体の様々な領域が抗原性の変化しやすさの一因であると明らかにされている（Ｔｈａｌｉら、１９９４；Ｂａｃｋら、１９９３）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
最近の発見により、ＨＩＶの一次単離株の中和は、モノマー状のｇｐ１２０においてではなく、オリゴマー状の複合体において発現している非Ｖ３領域エピトープに対する抗体によって主に媒介され得るが、実験室で使用されている株は、Ｖ３に対する抗体によってより容易に中和されることが示されている（Ｈｉｏｅら、１９９７；ＶａｎＣｏｔｔら、１９９７）。一次単離株において認識される非Ｖ３エピトープの正体は明らかにされていない。ＨＩＶ−１の多くのサブタイプの一次単離株に対する広い中和活性を有する抗体が感染者の血清に存在することは珍しいことであるが、そのような抗体を有する個体におけるエンベロープタンパク質の性質は、ワクチンにおいて広い免疫原性を有し得るエピトープを明らかにするために注目され得る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、様々なサブタイプの一次ＨＩＶ単離株を中和するその能力が注目される、ヒト血清のドナーからのエンベロープ遺伝子をクローニングし、キャラクタライゼーション（特徴決定）を行った（Ｖｕｊｃｉｃら、１９９５；Ｄ’Ｓｏｕｚａら、１９９１）。
【０００８】
本発明には、哺乳動物に注射されたときに多数のＨＩＶ−１株に対する広い交差反応性の中和抗血清の産生を誘導する単離されたＨＩＶエンベロープタンパク質またはそのフラグメントが含まれる。
【０００９】
本発明にはさらに、配列番号１のアミノ酸残基３１３に対応する位置におけるプロリン、配列番号１のアミノ酸残基３１４に対応する位置におけるメチオニン、および配列番号１のアミノ酸残基３２５に対応する位置におけるグルタミンを含む単離されたＨＩＶエンベロープタンパク質またはそのフラグメントが含まれる。
【００１０】
別の実施の形態において、本発明には、配列番号１のアミノ酸残基１６７に対応する位置におけるアラニンを含む単離されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク質またはそのフラグメントが含まれる。
【００１１】
本発明にはまた、配列番号１のアミノ酸配列を含む単離されたＨＩＶエンベロープタンパク質、ならびにこのエンベロープタンパク質をコードする単離された核酸分子が含まれる。
【００１２】
免疫応答を惹起させる組成物（例えば、ワクチン、免疫原性組成物）、本発明のエンベロープタンパク質およびペプチド、並びに本発明のかかるタンパク質およびペプチドをコードする核酸を含む弱毒化ウイルスワクチン送達ベクターもまた含まれる。このようなタンパク質、ペプチドおよび核酸の１つ以上を、抗体の産生を誘導させるために十分な量で投与することを含む、哺乳動物における抗体の産生方法もまた本発明に含まれる。
【００１３】
本発明にはまた、１つ以上の単離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含む診断試薬、ならびに多数のＨＩＶ−１株に対する広い交差反応性の中和抗血清を検出する方法が含まれる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
一般的説明
ＨＩＶに対する免疫化の目標は、様々なウイルス株に対して広い反応性の中和抗体（ＮＡ）応答を誘導することである。本発明者らは、広い交差反応性の一次ウイルスＮＡが血清に含まれる非進行性ＨＩＶ−１感染のドナーから得られるエンベロープタンパク質を研究してきた。ＤＮＡを、交差反応性の血清が採取される約６ヶ月前から１２ヶ月前に集められたリンパ球から抽出し、ｅｎｖ遺伝子をネスティッドＰＣＲにより合成し、クローニングし、偽ウイルスで発現させて、ＮＡアッセイで表現型を決定した。各時点で得られた２つのクローンは、細胞進入に関してＣＸＣＲ４ではなく、ＣＣＲ５を用いて、同一のＶ３領域のヌクレオチド配列を有し、２つの基準血清に関して類似する反応性を有していた。１つのクローンの全ヌクレオチド配列を分析することにより、このクローンが、予想されるＧＰＧＲＡＦの先端のＶ３配列、正常な予想されるグリコシル化、および完全な読み枠を伴うサブタイプＢであることが明らかにされた。ＣＤ４および様々な補助受容体を発現するＨＯＳ細胞におけるＲ２偽ウイルスの感染性アッセイにより、エンベロープはＣＣＲ５依存性であることが明らかにされた。Ｒ２偽ウイルスを、合衆国内のドナー（サブタイプＢが推定される感染、またはサブタイプＢと知られている感染）、およびＡ、ＣおよびＥのサブタイプのウイルスに感染した個体の血清による中和に関して、様々な系統（クレード）のｅｎｖ遺伝子を発現する他のウイルスと比較した。合衆国内のドナーの血清による、Ｒ２および他のＢクレードのｅｎｖを発現する偽ウイルスの中和は、同様に低度から中程度であったが、Ｒ２はすべてによって独特に中和された。Ｒ２は、ＡからＦのクレードに感染したヒトの血清によって中和されたが、他のＢ、Ｄ、ＥおよびＧのクレードの偽ウイルスはそれほど頻繁に中和されなかった。高感受性のクレードＣの偽ウイルスはそのような血清のすべてによって中和されたが、その力価は２５０倍以上変化していた。これらの結果は、ドナー２においてクレード間の反応性を有するＮＡを誘導するエピトープ（またはエピトープ類）がＲ２エンベロープに発現され得ることを示唆している。
【００１５】
本発明は、広い交差反応性の一次ウイルス中和抗体が血清に含まれる非進行性ＨＩＶ−１感染を有するこのドナーから得られるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に関する。本発明はまた、前記のＨＩＶ−１タンパク質と特定の位置において特定のアミノ酸を共有する単離または精製されたタンパク質およびタンパク質フラグメントに関する。
【００１６】
（具体的な実施の形態）
タンパク質およびペプチド
本発明のタンパク質およびペプチドには、表４のアミノ酸配列（配列番号１）を有する全長のエンベロープタンパク質、表４のｇｐ１２０に対応するアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１〜５２０）を有するｇｐ１２０、表４のｇｐ４１に対応するアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸５２１〜８６６）を有するｇｐ４１、ならびにＶ３ドメインおよび他のドメイン（Ｖ１／Ｖ２、Ｃ３、Ｖ４、Ｃ４およびＶ５など）に対応するポリペプチドおよびペプチドが含まれる。これらのドメインは、配列番号１の下記のアミノ酸残基に対応する。
【００１７】
【表１】
0004637356.tif 000002
【００１８】
任意の１つのドメインを含むポリペプチドおよびペプチドは様々な長さであり得るが、以前にシークエンスされたエンベロープタンパク質とは異なる表４（配列番号１）のアミノ酸残基を含むことができる。例えば、そのＶ３ドメインのすべてまたは一部を含む本発明のペプチドは、ＰＭＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｑ（式中、Ｘ1〜Ｘ10が任意の天然アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｐはプロリンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｑはグルタミンを示す）の配列を含むことができる。非天然アミノ酸には、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）または他のω−アミノ酸（３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、４−アミノ酪酸など）、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；ならびにメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）が含まれる。好ましくは、本発明のペプチドは、表４（配列番号１）のＨＩＶエンベロープタンパク質のＶ３領域に対して、６０％、７０％、８０％が同一であり、より好ましくは９０％が同一である。従って、本発明のＶ３ペプチドは、約１３個の長さのアミノ酸を含むが、１４個、１５個、１７個、２０個、２５個、３０個、３５個、３６個、３９個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上の長さのアミノ酸であってもよい。１つの実施の形態において、長さが１３アミノ酸のＶ３ペプチドは、ＰＭＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＱの配列（表４（配列番号１）のアミノ酸３１３〜３２５）からなる。
【００１９】
本発明の別の実施の形態において、Ｖ１／Ｖ２ドメインのすべてまたは一部を含むポリペプチドおよびペプチドは、表４（配列番号１）のアミノ酸１６７に対応する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列を含む。例えば、Ｖ１／Ｖ２ドメインにまたがる本発明のペプチドは、ＦＮＩＡＴＳＩＧの配列（配列番号１の残基１６４〜１７１）を含むことができ、約８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上の長さのアミノ酸であってもよい。本明細書中で使用される、「に対応する位置に」とは、周囲の残基に関連して、表４（配列番号１）の配列における特定のアミノ酸残基と等価な、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸位置を指す。
【００２０】
本発明のペプチドは、公知のいかなる手法でも調製することができる。便宜的には、本発明のペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６５）（これは引用として本明細書中に援用される）により最初に記載された固相合成手法を使用して、合成することができる。他のペプチド合成手法が、例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｉｌｅｙ、１９７６年）において見出され得る。
【００２１】
（ペプチドまたはタンパク質の核酸および組換え発現）
本発明のタンパク質およびペプチドは、所望のタンパク質またはペプチドの真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞における組換え発現（米国特許第５，６９６，２３８号を参照）を含む任意の利用可能な手段で調製することができる。精製するために本発明のタンパク質またはペプチドを製造する方法には、当業者のレベルに含まれる従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ手法を用いることができる。そのような手法は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻から第４巻（Ｏｘｆｏｒｄ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）；Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８４年）；Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｉｌｅｙ、１９８４年）を参照。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、単離された形態であり得るか、あるいは発現制御エレメントまたはベクター配列に作動的に連結することができる。本発明はさらに、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または核酸を細胞内に導入する当該分野で認識されている任意の他の手段を介してベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００２３】
本明細書中で使用される、「細胞株（系）」は、多数の世代にわたるインビトロでの安定な成長が可能な初代細胞のクローンである。
【００２４】
ＤＮＡの「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたときにインビボで転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖のＤＮＡ配列である。コード配列の領域は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳終了コドンによって決定される。ポリアデニル化シグナルおよび転写停止配列が、通常、コード配列の３’側に位置している。
【００２５】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きな分子との組合せで自然界に見出されない、より大きなＤＮＡ分子内におけるＤＮＡの同定可能なセグメントである。従って、異種の領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、その遺伝子は、通常、起源となった生物のゲノムにおいてその哺乳動物のゲノムＤＮＡと隣接していないＤＮＡが隣接している。異種コード配列のもう一つの例は、コード配列自体が自然界に見出されていない構築物（例えば、ゲノムのコード配列がイントロン、または本来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成された配列を含有するｃＤＮＡ）である。対立遺伝子変異体または天然に存在する変異（突然）事象体は、本明細書中において定義されるＤＮＡの異種領域をもたらさない。
【００２６】
本明細書中で使用される、「ネイクドＤＮＡ」は、ウイルス粒子（特に、レトロウイルス粒子）を含まない（ｆｒｅｅ）核酸分子を意味する。この用語はまた、脂質、リポソーム、細胞外マトリックス活性酵素、サポニン類、レシチン類、エストロゲン化合物およびステロイドホルモン、ヒドロキシル化低級アルキル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および尿素を含む群（これらに限定されない）を含む促進因子剤を含まない核酸分子をも意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される、「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンおよび／またはシトシン）のその一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかにあるポリマー形態、ならびにＲＮＡを指す。この用語は分子の一次構造および二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態には限定されない。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するとき、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（例えば、ｍＲＮＡと相同的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向に配列を示すだけの標準的な習慣に従って本明細書中に記載される。転写制御配列および翻訳制御配列とは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供するＤＮＡの調節配列である。
【００２８】
本明細書中で使用される、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼと細胞内で結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させ得るＤＮＡの調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最少数の塩基またはエレメントを含むように、その３’末端（３’末端を含む）が転写開始部位に接し、上流（５’方向）に伸びている。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物のプロモーターは、多くの場合、しかし常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。
【００２９】
本明細書中で使用される、「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ自己複製ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製可能な任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００３０】
「シグナル配列」はコード配列の前に含まれ得るか、あるいは表３のエンベロープタンパク質に由来する本来の２９アミノ酸のシグナル配列を使用することができる。この配列は、宿主細胞と連絡して、ポリペプチドを細胞表面に導くか、またはポリペプチドを培地に分泌させるシグナルペプチド（ポリペプチドに対するＮ末端）をコードする。このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞によって切断される。種々のシグナル配列が、原核生物および真核生物に特有な様々なタンパク質と一緒になって見出され得る。例えば、α−因子（天然の酵母タンパク質）は酵母から分泌され、従って、そのシグナル配列は、培地中に分泌させるために異種のタンパク質に取り付けることができる（米国特許第４，５４６，０８２号および欧州特許第０１１６２０１号を参照）。さらに、α−因子およびそのアナログは、異種のタンパク質を、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓなどの様々な酵母から分泌させることが見出されている（欧州特許公開８８３１２３０６．９；欧州特許第０３２４２７４号公報、および欧州特許第０３０１６６９号）。哺乳動物細胞における使用例は、第ＶＩＩＩｃ因子の軽鎖を発現させるために使用されるｔＰＡシグナルである。
【００３１】
本明細書中で使用され場合、ＤＮＡ配列は、少なくとも約８５％（好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）のヌクレオチドが、ＤＮＡ配列の規定された長さにわたって一致しているときに「実質的に相同的」である。実質的に相同的な配列は、サザンハイブリダイゼーション実験において、例えば、その特定の系に関して規定されたストリンジェントな条件のもとで同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（上記）を参照。
【００３２】
細胞は、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されたとき、外因性ＤＮＡまたは異種のＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡへの組み込み（共有結合）が行われてもよく、あるいは行われなくてもよい。例えば、原核生物の場合、形質転換ＤＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクターなどのエピソームエレメントに保持され得る。真核生物に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、該形質転換ＤＮＡが染色体の複製を介して娘細胞によって受け継がれる細胞である。この安定性は、細胞株を樹立するか、または形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなるクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって証明される。
【００３３】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコード配列をｍＲＮＡに転写し、その後、そのｍＲＮＡが、該コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、細胞内において転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００３４】
本明細書中に使用される、「ベクター」とは、結合セグメントの複製が生じるように別のＤＮＡセグメントを結合させることができる、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。
【００３５】
ベクターは、さらなる処理のために大量のＤＮＡを調製すること（クローニングベクター）またはＨＩＶタンパク質またはペプチドの発現（発現ベクター）のいずれかのために、ＨＩＶタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡの操作を簡単にするために使用される。ベクターには、プラスミド、ウイルス（ファージを含む）、および組み込まれたＤＮＡフラグメント（すなわち、組換えにより宿主のゲノムに組み込まれるフラグメント）が含まれる。クローニングベクターは発現制御配列を含有する必要はない。しかし、発現ベクター内の制御配列は、転写プロモーター、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を制御する配列などの転写制御配列および翻訳制御配列を含む。発現ベクターは、好ましくは、ＨＩＶ遺伝子の安定な発現を容易にし、および／または形質転換体を同定するための選択遺伝子を含むことができる。しかし、発現を維持するための選択遺伝子は、真核生物の宿主細胞が使用される同時形質転換システムの別のベクターによって提供され得る。
【００３６】
好適なベクターは、目的とする発現宿主と適合し得る種から得られるレプリコン（非組込みベクターにおいて使用される複製起点）および制御配列を一般に含有する。本明細書中で使用される用語「複製可能」なベクターにより、そのようなレプリコンを含有するベクター、ならびに宿主ゲノムへの組込みにより複製可能なベクターが包含されるものとする。形質転換された宿主細胞は、ＨＩＶペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターによって形質転換またはトランスフェクションされた細胞である。発現したＨＩＶタンパク質またはペプチドは、発現ペプチドにおける好適なプロセシングシグナル（例えば、同種または異種のシグナル配列）の制御下のもとで培養上清に分泌され得る。
【００３７】
宿主細胞に対する発現ベクターは、通常、複製起点、ＨＩＶタンパク質またはペプチドのコード配列の上流に位置するプロモーターを、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位および転写停止配列とともに含む。これらの配列のいくつかは特定の宿主における発現には必要とされないことが当業者には理解される。微生物とともに使用される発現ベクターは、宿主により認識される複製起点、宿主において機能するプロモーター、および選択遺伝子を含有することだけが必要である。
【００３８】
広く使用されているプロモーターは、ポリオーマ、ウシ乳頭腫ウイルス、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス、ネズミまたはヒトのいずれか）、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、およびサルウイルスＳＶ４０（ＳＶ４０）から誘導される。他の制御配列（例えば、ターミネーター、ポリＡ、エンハンサーまたは増幅配列）もまた使用することができる。
【００３９】
発現ベクターは、ＨＩＶタンパク質またはペプチドのコード配列が適切な調節配列とともにベクター内に配置されるように構築される。制御配列に対するコード配列の位置および向きは、コード配列が制御配列の「制御」下で転写および翻訳される（すなわち、制御配列においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼによってコード配列が転写される）ようにされる。制御配列は、上記に記載されているクローニングベクターなどのベクター内に挿入される前にコード配列に連結することができる。代わりに、コード配列は、制御配列および適切な制限部位を既に含有する発現ベクターに直接クローニングすることができる。選択された宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、制御配列は、ＨＩＶコード配列に対して異種または同種とすることができ、コード配列は、イントロンを含有するゲノムＤＮＡであり得るか、あるいはｃＤＮＡであり得る。
【００４０】
高等真核生物細胞の培養物を使用して、脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞（昆虫を含む）に由来するとしても、本発明のタンパク質を発現することができ、その増殖方法は知られている。例えば、Ｋｒｕｓｅ＆Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７３年）を参照。
【００４１】
ＨＩＶタンパク質またはペプチドを高等真核生物において発現させるために好適な宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（Ｕｒｌａｕｂ＆Ｃｈａｓｉｎ、１９８０）；マウスＳｅｒｔｏｌｉ細胞（Ｍａｔｈｅｒ、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト頸部ガン細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファロラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腫瘍（ＭＭＴ０６０６５２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ラット肝ガン細胞（Ｂａｕｍａｎｎら、１９８０）およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、１９８２）が含まれる。
【００４２】
哺乳動物組織において発現させたとき、組換えＨＩＶ遺伝子産物は、グリコシル化のために予想されるよりも大きな分子量を有し得ることが理解されている。従って、１６０ｋＤ、１２０ｋＤまたは４１ｋＤから少し異なる分子量を有するＨＩＶのプレタンパク質またはペプチドの部分的または完全にグリコシル化された形態は本発明の範囲に含まれるものとする。
【００４３】
他の好ましい発現ベクターは、真核生物システムで使用されるものである。例示的な真核生物発現システムは、当該技術分野で周知である、ワクシニアウイルスを用いる発現システムである。例えば、Ｍａｃｋｅｔら、（１９８４）；Ｇｌｏｖｅｒ（上記）；および国際特許公開ＷＯ８６／０７５９３を参照。酵母の発現ベクターが公知である。例えば、米国特許第４，４４６，２３５号；同第４，４４３，５３９号；同第４，４３０，４２８号；および欧州特許第１０３４０９号；欧州特許第１００５６１号；欧州特許第９６４９１号を参照。
【００４４】
別の好ましい発現システムは、チャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換するベクターｐＨＳＩである（国際特許公開ＷＯ８７／０２０６２を参照）。哺乳動物の組織は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼなどの選択マーカーをコードするＤＮＡおよびＨＩＶタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを用いて同時に形質転換することができる。野生型のＤＨＦＲ遺伝子を用いる場合、ＤＨＦＲが欠乏している宿主細胞を選択することが好ましく、従って、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを含まないｈｇｔ培地において、成功したトランスフェクションに対するマーカーとしてＤＨＦＲコード配列を使用することができる。この場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が不十分なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。この細胞は、Ｕｒｌａｕｂ＆Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）による記載に従って調製および増殖される。
【００４５】
選択された発現システムおよび宿主に依存して、ＨＩＶタンパク質またはペプチドは、外因性または異種のＤＮＡ構築物（上記に記載されている発現ベクターなど）によって形質転換された宿主細胞を、ＨＩＶタンパク質を発現させる条件のもとで生育させることによって製造される。その後、ＨＩＶタンパク質またはペプチドは宿主細胞から単離され、そして精製される。発現システムがタンパク質またはペプチドを生育培地中に分泌する場合、そのタンパク質は、細胞を含まない培地から直接精製することができる。適切な生育条件および最初の粗生成物回収方法の選択は当業者の熟練度の範囲内である。
【００４６】
本発明のＨＩＶタンパク質またはペプチドのコード配列が一旦調製または単離されると、そのコード配列を任意の好適なベクターにクローニングすることができ、それにより、ＨＩＶコード配列を含有しない細胞を実質的に含まない細胞の組成物で維持することができる。多数のクローニングベクターが当業者に知られている。クローニングに必要な組換えＤＮＡベクター、およびそれにより形質転換され得る宿主細胞の例には、様々なバクテリオファージλベクター（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲＩ（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０（非大腸菌グラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌および枯草菌）、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐ１Ｊ６１（ストレプトマイセス）、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、アクチノファージ、ｆＣ３１（ストレプトマイセス）、ＹＩｐＳ（サッカロマイセス）、ＹＣｐ１９（サッカロマイセス）、およびウシ乳頭腫ウイルス（哺乳動物細胞）が含まれる。一般的には、Ｇｌｏｖｅｒ（上記）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、（上記）；およびＰｅｒｂａｌ（上記）を参照。
【００４７】
（融合タンパク質）
ＨＩＶエンベロープの融合タンパク質およびそのようなタンパク質を作製する方法が以前に報告されている（米国特許第５，８８５，５８０号）。現在、外来遺伝子を発現する細胞を調製することは比較的簡単な技術である。そのような細胞は宿主として作用し、本発明の融合タンパク質に関しては、酵母、真菌、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞を含み得る。これらの宿主細胞の多くに対する発現ベクターが単離および特徴決定されており、そして目的とする外来のＤＮＡ挿入物を有するベクターを従来の組換えＤＮＡ手法によって構築するときの出発材料として使用されている。ＤＮＡが、ＤＮＡ挿入物を発現するために使用される宿主細胞から天然には得られない場合、そのＤＮＡは外来である。外来のＤＮＡ挿入物は、染色体外のプラスミドにおいて、あるいは宿主細胞の染色体に全体または一部が組み込まれた後で発現させることができ、あるいは実際には、２つ以上の分子形態の組合せとして宿主細胞内に存在し得る。所望する外来ＤＮＡの発現に関する宿主細胞および発現ベクターの選択は、主に、宿主細胞の入手しやすさ、および宿主細胞の培養のしやすさ、宿主細胞が発現ベクターの複製を助けるかどうか、ならびに当業者により容易に理解される他の要因に依存している。
【００４８】
目的とする外来のＤＮＡ挿入物には、このようなコーディング能を有する任意の合成された配列を含む融合タンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列、または任意のそのようなクローニングされた配列、またはその組合せが含まれる。例えば、完全な組換えＤＮＡ配列によってコードおよび発現される融合タンパク質は本発明により包含されるが、他の手法で得られる融合タンパク質、ペプチドは除外されない。
【００４９】
融合タンパク質を産生させるための真核生物発現システムの構築に有用なベクターは、プロモーターおよび／またはオペレーターなどの適切な転写活性化ＤＮＡ配列と作動的に連結された融合タンパク質のＤＮＡ配列を含む。他の代表的な特徴には、適切なリボソーム結合部位、停止コドン、エンハンサー、ターミネーターまたはレプリコンエレメントが含まれ得る。これらのさらなる特徴は、制限エンドヌクレアーゼ消化および連結などの従来のつなぎ合わせ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）手法によってベクター内のいずれか１つの適切な部位に挿入することができる。
【００５０】
酵母の発現システムは、組換え真核生物発現システムの好ましい別の形態であり、サッカロマイセス・セレビジアエが、組換えタンパク質を発現させるために選ばれた種として一般に用いられている。サッカロマイセス属の他の種も組換え酵母発現システムとして好適であり、これには、カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）、ロウキシイ（ｒｏｕｘｉｉ）、モンタヌス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、エロンギスポルス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、オビホルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）およびジアスタチクス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）の種が含まれるが、これらに限定されない。サッカロマイセス・セレビジアエおよび類縁の酵母は、酵母において活性な発現システムを構築するときに有用なよく知られているプロモーターを有する。そのようなプロモーターには、ＧＡＰ、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、およびα接合因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
融合タンパク質を発現させるための組換え酵母発現システムの構築に有用な酵母ベクターには、シャトルベクター、コスミドプラスミド、キメラプラスミド、および２ミクロン環状プラスミドから得られる配列を有するベクターが含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質をコードする適切なＤＮＡ配列をこれらのベクターに挿入することによって、原理的には、改変されたベクターが適切な宿主細胞に形質転換または他の手段で挿入される、融合タンパク質に関して有用な組換え酵母発現システムが得られる。組換え哺乳動物発現システムは、本発明のワクチン／免疫原の融合タンパク質を産生する別の手段である。一般に、宿主の哺乳動物細胞は、細胞培養において効率的にクローニングされたいかなる細胞であってもよい。しかし、哺乳動物での発現の選択肢が、器官培養およびトランスジェニック動物が含まれるように拡大され得ることが当業者には明らかである。組換え哺乳動物発現システムを構築するために有用な宿主の哺乳動物細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＧＨ３細胞、ＣＯＳ細胞、ネズミＣ１２７細胞またはマウスＬ細胞が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物の発現システムは、ウイルスベクター、ＳＶ４０、ＢＰＶまたは他のウイルスレプリコンを有し得るプラスミドベクター、あるいは動物細胞のレプリコンを有しないベクターに基づくことができる。哺乳動物の発現ベクターに対する詳しい説明を、Ｇｌｏｖｅｒの専門書、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻から第４巻（Ｏｘｆｏｒｄ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）に見出すことができる。
【００５２】
融合タンパク質は、アデニル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリスチル化などの、有機合成された同じペプチドの場合には有しないさらなる望ましい構造的修飾を保有する。これらの付加された特徴は、組換え発現システムを適切に選ぶことによって、場合により選ぶことができ、あるいは好ましい場合がある。一方、融合タンパク質は、その配列を有機合成の原理および実施によって伸長させることができる。
【００５３】
（ワクチンおよび免疫原性組成物）
ワクチンまたは免疫原性組成物中で使用するとき、本発明のタンパク質またはペプチドは、「サブユニット」ワクチンまたは免疫原として使用できる。このようなワクチンまたは免疫によって、安全性や生産コストの点で、従来のワクチンをしのぐ大きな利点がもたらされる。しかしながら、サブユニットワクチンは、全ウイルスワクチンよりも免疫原性が低いことが多く、その潜在能力をすべて引き出すためには、かなりの免疫賦活機能を持つアジュバントが必要となる可能性がある。
【００５４】
現在、米国においてヒト用途に認可されたアジュバントとして、アルミニウム塩（ミョウバン）が挙げられる。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、インフルエンザを含む幾つかのワクチンに有用となっている。他の有用なアジュバントとして、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）（Ｅｌｌｏｕｚら、１９７４を参照）、ＭＤＰの合成類似体（Ｃｈｅｄｉｄら、１９７８の総説）、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリロキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）、代謝可能オイルと乳化剤を含む組成物が挙げられる。ここでオイルと乳化剤は、ほぼ実質的にすべて直径１ミクロン未満の小滴を含む水中油型エマルションの形で存在する（欧州特許０３９９８４３号を参照）。
【００５５】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物の処方では、有効量のタンパク質またはペプチド抗原を使用する。すなわち、被験者が次にＨＩＶウイルスに暴露するのを防御するために、アジュバントと組み合わせて、被験者に特異的で十分な免疫反応を起こさせる量の抗原が含まれる。免疫原性組成物として使用するとき、処方は、アジュバントと組み合わせて、被験者に診断または治療目的に使用できる特異的な抗体を生成させる量の抗原を含む。
【００５６】
本発明のワクチン組成物は、ＨＩＶ−１感染の予防または治療に有用である。ＨＩＶ−１に罹患する可能性のあるすべての動物をこのように治療するが、本発明はもちろん、ヒトにおける本発明のワクチンの予防および治療用途向けのものである。所望の予防および治療効果をもたらすには、１回以上の投与が必要なことが多いが、正確なプロトコル（投与量と頻度）は標準的な臨床手順によって設定できる。
【００５７】
ワクチン組成物は、ワクチンを動物に導入する任意の従来方法で、特に注射によって投与される。経口投与の場合、ワクチン組成物は、他のタンパク質材料の経口投与に使用されるのに似た形態で投与できる。上で述べたように、予防または治療のいずれかに使用する正確な量および処方は、抗原固有の純度および活性の状況、その他の成分または担体、投与方法などによって変わることがある。
【００５８】
限定的ではない例示によると、投与されるワクチン投与量は、ｇｐ１２０抗原に関しては典型的に、最低約０．１ｍｇ／用量であり、さらに典型的には最低約１ｍｇ／用量であり、最低約１０ｍｇ／用量であることが多い。最大投与量は典型的に、それほど重要ではない。しかし通常、投与量は５００ｍｇ／用量以下であり、２５０ｍｇ／用量以下であることが多い。これらの投与量は、適切な製薬用ビヒクルまたは担体中に、その投与量を運搬する十分な量で懸濁させることができる。一般に担体、アジュバントなどを含む最終容量は、典型的に少なくとも０．１ｍｌであり、さらに典型的には少なくとも約０．２ｍｌとなる。上限は、投与される量の実用性によって決まり、一般に約０．５ｍｌ以下から約１．０ｍｌである。
【００５９】
Ｖ３などのエンベロープタンパク質のドメインに対応する、本発明のペプチドは、同一ドメインの多量体または異なるドメインの多量体を含む化合物または組成物に構築あるいは配合される。例えば、Ｖ３ドメインに相当するペプチドは、システイン残基の酸化によって環状化され、１、２、３、４またはそれ以上の個々のペプチドエピトープを含む多量体を形成してもよい。環状形態は、空気酸化などの標準酸化手順によりジスルフィド結合を生成するために、システイン残基を酸化することによって得られる。
【００６０】
本発明の合成ペプチドも、エンベロープタンパク質内で発生するこれらの部分の幾何構造を模倣するために、環状化できる。環状化は、既存のシステイン残基間のジスルフィド架橋によって促進される。システイン残基は、エンベロープタンパク質に由来するペプチドの部分の側面に位置するペプチド上の位置に含めることもできる。代わりに、エンベロープタンパク質に由来するペプチド部分内のシステイン残基は、除去および／または保守的に置換されて、このような残基が関与するジスルフィド架橋の生成をなくすることがある。環状ペプチドの他の手段も既知である。ペプチドは、アミノ末端とカルボキシ末端で、またはその付近でのような、そのペプチドのアミノ酸残基間のアミド結合などの共有結合によって環状化される（米国特許４，６８３，１３６号）。
【００６１】
別の形式において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、宿主動物内で本発明のＨＩＶタンパク質またはペプチドを発現するワクチンベクターとして調製してもよい。いかなる入手可能なワクチンベクターを使用してもよいが、これらはベネズエラウマ脳炎生ワクチン（米国特許５，６４３，５７６号を参照）、ポリオウイルス（米国特許５，６３９，６４９号）、ポックスウイルス（米国特許５，７７０，２１１号）、ワクシニアウイルス（米国特許４，６０３，１１２および５，７６２，９３８号）を含む。あるいは、本発明のタンパク質またはペプチドをコードするネイキド核酸を直接投与して、抗原を発現させてもよい（米国特許５，７３９，１１８号を参照）。
【００６２】
（診断試薬）
本発明のＨＩＶタンパク質またはペプチド組成物は、抗ＨＩＶ抗体、特に抗−ｇｐ１２０抗体を検出するイムノアッセイで診断試薬として使用される。多くのＨＩＶイムノアッセイ形式が利用できる。したがって、以下の説明は例示のためのみであり、すべてを含むものではない。一般には、米国特許４，７４３，６７８号、４，６６１，４４５号、および４，７５３，８７３号、並びに欧州特許０１６１１５０号および欧州特許０２１６１９１号を参照すること。
【００６３】
イムノアッセイ・プロトコルは、例えば、組成物、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイなどによって変わる。プロトコルはまた、例えば、不均一相で固体担体を使用してもよいし、均一相で溶液中の免疫反応を含んでもよい。ほとんどのアッセイは、標識抗体またはポリペプチドを使用した。標識は例えば、蛍光、化学発光、放射性または染料分子であった。プローブからの信号を増幅するアッセイも既知であり、そのようなアッセイの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識および酵素媒介イムノアッセイである。
【００６４】
抗ＨＩＶ抗体のイムノアッセイは典型的に、生物サンプルなどの試験サンプルの選択と調製、そして抗原−抗体複合体が形成するのを許容する条件下で、本発明のＨＩＶタンパク質またはペプチド組成物とサンプルとのインキュベーションを含む。このような条件は当業者に既知である。不均一形式では、タンパク質またはペプチドを固体担体に結合し、インキュベーション後にポリペプチドからサンプルを分離しやすくする。使用可能な固体担体の例として、膜またはマイクロタイターウェル状のニトロセルロース、シートまたはマイクロタイターウェル状のポリ塩化ビニル、ビーズまたはマイクロタイタープレート状のポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、プロテインＡビーズがある。最も好ましくは、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、ＩｍｍｕｌｏｎRマイクロタイタープレートか、０．２５インチのポリスチレンビーズを不均一形式で使用する。固体担体は通常、試験サンプルから分離後に洗浄する。
【００６５】
他方、均一形式の場合、当該技術分野で公知であるが、生成した抗原−抗体複合体があれば沈殿させる条件下で、試験サンプルを溶液中でＨＩＶタンパク質またはペプチドとインキュベートする。その後、沈殿した複合体を試験サンプルから、例えば遠心分離によって分離する。抗ＨＩＶ抗体を含む生成複合体は、多くの手法で検出される。形式によっては、複合体は標識抗異種Ｉｇで検出可能であり、競合形式を使用する場合は、結合した標識競合抗体量を測定することによって、検出可能である。これらや他の形式は、当該技術分野において周知である。
【００６６】
本発明のこのようなアッセイで有用な診断プローブには、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に対する抗体が含まれる。この抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、当該技術分野において周知の標準的手法を用いて生産される（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｔｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）。これらを使用して、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に特異的に結合させ、続いて、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどによって抗体−タンパク質複合体を検出することによって、該タンパク質を検出できる。これらの抗体を誘発するのに使用されるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、上で述べた変異体のいずれでもよい。抗体も、当該技術分野での標準手法を使用して、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のペプチド配列から生産される（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、上掲）。免疫学的に重要な部分を含む、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のフラグントも作製できる。
【００６７】
以下の実施例は特に、本発明の好ましい実施の形態を明示しており、いかようにも開示の残りを限定していると解釈されるべきではない。他の一般的な構成も当業者には、明らかであろう。米国または他の外国特許を含む、本出願で言及したすべての参考文献は、引用によりそれら全体が本明細書に援用される。
【００６８】
【実施例】
実施例では、以下の方法を使用した。
【００６９】
（参照となる血清ドナーエンベロープ遺伝子のクローニング）
国立衛生研究所（ＮＩＨ）エイズ研究基準試薬プログラム（カタログ番号：１９８３）で入手できる、ＨＩＶ−１中和血清（２）（基準２）のドナーは、ＮＩＨ臨床センターにおける長期集団研究の参加者である（Ｖｕｊｃｉｃら、１９９５）。基準２の調製に使用した血液は、１９８９年の春に採取した。基準２採取の約半年および１年前に得られた、献血による凍結保存された末梢血単核細胞は、ｅｎｖ細胞クローニングのＤＮＡ源として使用した。細胞を、生存率を維持するために、保管しなかった。各献血による約１〜３ｘ１０6個の細胞から、フェノール／クロロホルムを使用してＤＮＡを抽出した（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８）。ＤＮＡを、ｒＴｔｈをＤＮＡポリメラーゼとして使用したことを除いて、以前に報告されたのと同様に、製造者の指示に従って、ネスティドポリメラーゼ連鎖反応でのテンプレートとして使用した（Ｂａｒｎｅｓ、１９９２；Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１）。以前報告されたように、ＤＮＡを発現ベクターｐＳＶ７ｄにクローニングした（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｓｔｕｖｅら、１９８７）。
【００７０】
（他のｅｎｖ遺伝子クローンとウイルスプール）
以下の発現ベクターｐＳＶ３内のＨＩＶ−１ｅｎｖクローンをエイズ研究基準試薬プログラムから入手した。それらは、９３ＭＷ９６５．２６（クレードＣ）、９２ＲＷＯ２０．５（クレードＡ）、９３ＴＨ９６６．８（クレードＥ）、９２ＵＧ９７５．１０（クレードＧ）（Ｇａｏら、１９９４）である。分子ウイルスクローンＮＬ４３、ＡＤ８およびＳＦ１６２からのｅｎｖクローンの生成は、以前に報告されている（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ａｄａｃｈｉら、１９８６；Ｔｈｅｏｄｏｒｅら、１９９６；Ｅｎｇｌｕｎｄら、１９９５）。ポリメラーゼ連鎖反応におけるテンプレートとして分子ウイルスクローンプラスミドを使用し、遺伝子をプラスミドｐＳＶ７ｄ内にクローニングすることによって、Ｚ２Ｚ６菌株のｅｎｖ遺伝子を同様にクローニングした（Ｓｅｔｈら、１９９３）。マルチセンターエイズ集団研究の参加者からの一次単離株ｅｎｖクローン（ここではＰ９およびＰ１０と呼ぶ）の生成も、以前に報告されている（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８）。Ｐ９およびＰ１０−ウイルスプールをＰＨＡ芽細胞の一次培養からの細胞培養液の単一サブ継代によって調製した（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８）。Ｈ９細胞におけるＮＬ４３、およびＰＨＡ芽細胞におけるＮＬ（ＳＦ１６２）やＡＤ８のウイルスプールの調製に分子ウイルスクローンを使用することも、以前に報告されている（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８）。
【００７１】
（細胞の培養）
Ｈ９細胞系をロバート・ギャロから得た（Ｍａｎｎら、１９８９）。Ｍｏｌｔ３細胞系をメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より得た（Ｄａｎｉｅｌら、１９８８）。ＣＤ４およびＨＩＶ−１の各種の補助受容体を発現するＨＯＳ細胞系をＰＭ１細胞系と同様に、ＮＩＨエイズ研究基準試薬プログラムから入手した（Ｄｅｎｇら、１９９６；Ｌａｎｄａｕら、１９９２；Ｌｕｓｓｏら、１９９５）。２９３Ｔ細胞系をロックフェラー研究所の許可を得て、ＡＴＣＣから入手した（Ｌｉｏｕら、１９９４）。Ｈ９、Ｍｏｌｔ３およびＰＭ１細胞培養物を１０％ウシ胎仔血清および抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。ＨＯＳおよび２９３Ｔ細胞を同様の補足物を加えたダルベッコ最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。ただし、ＨＯＳ細胞培養液は、プラスミドの安定性を維持するためにピューロマイシンを補った。冷凍保存したヒト末梢血リンパ球をＰＨＡで刺激し、ウイルス感染に使用した（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｍａｓｃｏｌａら、１９９４）。
【００７２】
（逆転写酵素アッセイ）
逆転写酵素活性は、以前報告されたようにアッセイした（Ｐａｒｋら、１９９８）。
【００７３】
（ウイルス中和アッセイ）
以前報告されたように、Ｍｏｌｔ３細胞を標的細胞として、終点決定のために巨大細胞形成を使用した中和アッセイでウイルスＮＬ４３を使用した（Ｖｕｊｃｉｃら、１９９５）。使用したウイルス量は、ウェル当たり３０〜５０個の巨大細胞が形成されるのに十分であった（Ｖｕｊｃｉｃら、１９９５；Ｌｅｎｎｅｔｔｅ、１９６４）。ウイルスＮＬ（ＳＦ１６２）、ＡＤ８、Ｐ９、Ｐ１０をＩＬ−２の存在下で、ＰＨＡ刺激ヒトリンパ芽球における中和に関して試験を行った（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｍａｓｃｏｌａら、１９９４）。後者のアッセイでは、毎週、細胞懸濁液の１０％を除去し、毎週、培養液の５０％を交換し、逆転写酵素アッセイのために、各ウェルから週２回培養液をサンプリングした。逆転写酵素アッセイは、試験サンプルに対して、最初のサンプリング日から実施した。このとき、中和していない対照ウェルの逆転写酵素活性は、一般にアッセイの１４日目または１７日目で、バックグラウンドの約１０〜２０倍であった。中和の終点は、逆転写酵素の活性が少なくとも５０％に低下した、血清の最高希釈度とみなした。基準中和血清１および２、陰性基準血清はそれぞれ陽性および陰性対照として使用した（ＮＩＨエイズ研究基準試薬プログラム）。
【００７４】
（偽ウイルス構築と偽ウイルスの感染性および中和に関するアッセイ）
偽ウイルスは、以前に報告されたのと同様の方法を用いて構築およびアッセイした（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｄｅｎｇら、１９９６；Ｐａｒｋら、１９９８）。ｐＳＶ７ｄ−ｅｎｖプラスミドＤＮＡおよびｐＮＬ４３．ｌｕｃ＋．Ｅ−Ｒ−を、リン酸カルシウム／Ｈｅｐｅｓ緩衝液手法を用いて、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マジソン）の指示に従い、２４ウェルのプラスチック製組織培養トレーか２５ｃｍ2のフラスコ中の、７０から８０％コンフルエント２９３Ｔ細胞培養物に同時形質移入した（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｄｅｎｇら、１９９６；Ｐａｒｋら、１９９８）。２４時間後、培地を１ｍＭ酪酸ナトリウムを含む培地と交換した（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｐａｒｋら、１９９８）。形質移入の２日後、培養液を回収し、４５μｍ滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、マサチューセッツ州ベッドフォード）で濾過し、２０％ウシ胎仔血清をさらに補って、から−８０℃で保存した。
【００７５】
偽ウイルスの感染性を種々の補助受容体を発現しているＰＭ１またはＨＯＳ−ＣＤ４細胞でアッセイした。形質移入上澄み液を連続的に希釈し、９６ウェルのプレート内の細胞に、ウェル当たり５０μｌずつ播種した。アッセイは、通常的に３重に実施した。培養物を４日間インキュベートし、ＰＭ１細胞を使用した場合は４００ｘｇで１０分間遠心分離を行い、吸引によって培養液を除去した。それら細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）の指示に従って、２５μｌ細胞培養溶解試薬で溶解した。その後、細胞を培養液内に滴定し、懸濁液１０μｌを９６ウェル照度計プレートのウェルに移した。基質１００μｌを自動的に加え、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ照度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いてルミネッセンスを測定した。偽ＰＶ対照をｐＳＶ７ｄ（ｅｎｖインサートなし）およびｐＮＬ４３．Ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−で形質移入された２９３Ｔ細胞培養物から収集した培養液から成る各アッセイで使用し、ＰＶ調製用の培養物と同じ方法で処理した。感染性終点を修正Ｒｅｅｄ  Ｍｕｎｃｈ法によって決定した。ルミネッセンスが偽対照よりも少なくとも１０倍以上大きい場合、各ウェルは陽性と見なし、その終点は、陽性の計算頻度が５０％以上である最高希釈度と見なした（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｐａｒｋら、１９９８；Ｌｅｎｎｅｔｔｅ、１９６４）。最小限に希釈したサンプルによる感染から生じるルミネッセンスは通常、バックグラウンドよりも約１０，０００倍以上大であった。
【００７６】
中和試験をＰＭ１細胞またはＨＯＳ−ＣＤ４細胞を用いて実施した。血清の連続２倍希釈物の２５μｌアリコートを、９６ウェルプレートのウェル中の同体積の希釈ＰＶと混合した。ＰＶ希釈物は、非中和血清の存在下で予想されるルミネッセンスがバックグラウンドの約１００倍となるように選択した。アッセイは３重に実施した。ウイルス血清混合物を４０℃で６０分間インキュベートし、その後、細胞１．５ｘ１０4個を含むＰＭ１細胞懸濁液１５０μｌを加えるか、懸濁液を、ＨＯＳ−ＣＤ４細胞を含むウェルに移した。それから、アッセイは、感染性アッセイと同様に処理した。中和終点を修正Ｒｅｅｄ  Ｍｕｎｃｈ法によって計算した。ここで終点は、非中和対照と比較してルミネッセンスが９０％以上低下した場合、５０％以上の頻度を持つと計算された最高血清希釈度と見なした。ＰＶ滴定を各中和アッセイと平行して、２重に実施した。
【００７７】
（核酸シークエンシング）
ヌクレオチド配列分析は、ジオデオキシサイクルシークエンシング手法とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼを使用し、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）の指示に従って実施した。シークエンシング反応後、Ｃｅｎｔｒｉｆｌｅｘゲル濾過カートリッジ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用してＤＮＡを精製した。シークエンシングゲルを流し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  モデル３７７  ＤＮＡシーケンサーを使用して分析した。シークエンシングを両方の鎖に対して行った。配列比較は、ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐの方法（１９８９）に従って、Ｅｄｉｔｓｅ  ＳＥＱＭＡＮおよびＤＮＡ  ＳｔａｒのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施した。
【００７８】
（実施例１）  異なる時点で分離されたクローンの比較性
２つの時点それぞれからの被験者細胞のサンプルから、偽ウイルスが標的細胞に進入するのを仲介可能なタンパク質をコードしたｅｎｖクローンを回収した。各時点から、このような２つのクローンについて、さらにキャクタライゼーションを行った。表２に示すように、４種類のクローンすべてのエンベロープはＰＭ１細胞の感染を仲介し、基準１および２によって、同等に中和された。各クローンに対応するエンベロープを持つ偽ウイルスも、ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５を発現するＨＯＳ−ＣＤ４細胞に対する感染性について試験を行った。表３に示すように、４種類すべてがＣＣＲ５を発現する細胞のみに感染性であった。各クローンについて３００を超える塩基を割り当てて、Ｖ３領域を含むヌクレオチド配列を分析すると、クローン間の差異は見られなかった（結果は示さず）。これらのアッセイにおける違いが証明されていないことに基づいて、Ｍａｒｃｈサンプルからの単一クローンを以下のアッセイに使用するために選択し、以後これをＲ２と呼ぶ。
【００７９】
【表２】
0004637356.tif 000003
【００８０】
【表３】
0004637356.tif 000004
【００８１】
（実施例２）  クローンＲ２遺伝子型および宿主範囲表現型
ｅｎｖ遺伝子クローンＲ２の完全ヌクレオチド配列を決定すると、２５９８塩基の読取枠があることがわかった（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＦ１２８１２６）。この配列から推定されるアミノ酸配列を表４に示す（配列番号１）。クレードＢコンセンサス配列には２９個あるのに対して、予測されたグリコシル化部位が３０個ある。Ｒ２において、４個のコンセンサスグリコシル化部位が欠けている。これらの部位は、ｇｐ１２０のＶ２、Ｃ２、Ｃ２およびＶ４領域それぞれにおける、残基１４６、２１５、２７０、３６８の部位が含まれる（ヒトレトロウイルスおよびエイズデータベース  クレードＢコンセンサス配列による番号付け）（Ｍｙｅｒｓら、１９９３）。残基２１５および２７０のコンセンサスグリコシル化配列は高度に、および適度に、それぞれ変わりやすい。
【００８２】
実施した遺伝子型分析には、図１に示すように、クレードＡ−Ｇの多数の菌株のヌクレオチドコード配列と比較した、ｇｐ１２０とｇｐ４１のヌクレオチドコード配列の評価が含まれていた（Ｓａｉｔｏｕら、１９８７；Ｍｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ、１９８８）。どちらのコード領域も、非クレードＢ配列よりもクレードＢに密接に関連づけられていた。予測されたｇｐ１２０とｇｐ４１のアミノ酸配列の領域の比較分析も実施した（結果は示さず）。分析した領域には、ｇｐ１２０の定常領域と可変領域、基部ｇｐ４１外部ドメイン（ロイシンジッパー領域を含む）、ロイシンジッパー端から第２システインまで伸びるｇｐ４１の部分、残りのｇｐ４１外部ドメイン、膜貫通領域、細胞質領域が含まれる。Ｒ２は一貫して、他の配列よりもクレードＢ配列に密接に関連づけられた。
【００８３】
（実施例３）Ｒ２、その他のクレードＢウイルスおよび偽ウイルスの、クレードＢ感染した患者の血清による中和に対する比較感受性
図２に示すように、Ｒ２偽ウイルスの中和を、他のクレードＢウイルス類と偽ウイルス類と比較した。実施した５つのウイルス偽ウイルス比較（Ｐ９、Ｐ１０、ＮＬ４３、ＡＤ８とＳＦ１６２Ｖ、ＰＶ）のうち、ｔ検定によっては、対になったウイルスと偽ウイルスの中和には、著しい違いはなかった（統計結果は示さず）。偽ウイルス調製物はそれぞれ、試験を行った７、８、９種類の血清で中和され、幾何平均力価は１：１３．９から１：５６の範囲であったのに対し、Ｒ２−ＰＶは試験を行った１０種類すべての血清によって中和され、幾何平均力価は１：７３．５であった。Ｒ２および他の偽ウイルスに対する各種血清の中和力価は、しばしば４倍以内であったが、Ｒ２−ＰＶの中和は、ｔ検定により、他の４つのＰＶ調製物よりも著しく大きかった。
【００８４】
（実施例４）  Ｒ２と多様なサブタイプ感染からの血清による多様なサブタイプの他のエンベロープを発現する偽ウイルスとの比較中和
サブタイプＡ、ＣおよびＥのＨＩＶ−１菌株に感染した患者の血清と、基準１および２、タイクレードＢ血清を用いる比較中和試験の結果を、表５に示す。表示した実験で、基準２は、相同Ｒ２エンベロープを発現する偽ウイルスを中程度の１：６４という力価で中和した、そしてその他の多くの実験では、この力価の２倍以内で中和した。基準２は、試験した他の７種類の偽ウイルスも、低から中程度の力価で中和した。Ｒ２偽ウイルスは、２４種類の血清のうち、クレードＡ−Ｆそれぞれに感染した患者の血清を含む１７種類で中和された。他の２種類のクレードＢ偽ウイルスは、あまり頻繁に中和されず、クレードＥ血清によっても頻繁に中和されなかった。異なるクレードに感染した患者からの血清による中和頻度は、他の４種類の偽ウイルスのいずれでも著しくはずれなかった。クレードＡ、Ｃ、ＤおよびＧ偽ウイルスは、試験を行った１７種類の血清のうち、それぞれ、８、１７、６、３種類によって中和された。クレードＣ偽ウイルスは一般に、試験を行った他の偽ウイルスよりも、実質的に中和に対する感受性が高かった。クレードＥ偽ウイルスは、５種類のクレードＤ血清のうち５種類、８種類のクレードＥ血清のうち７種類によって中和されたが、他のクレードに感染した患者の血清の内、１種類によってしか中和されなかった。
【００８５】
（実施例５）  Ｒ２菌株のＶ３アミノ酸配列から創製された合成ペプチド
Ｒ２菌株Ｖ３ペプチドを自動ＡＢＩシンセサイザーおよびＦＭＯＣ化学を使用して合成した（Ｚｅｎｇら、１９９７）。これらのペプチド配列は、ＫＳＩＰＭＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＱＩ（配列番号２）およびＣＳＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＰＭＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＱＩＩＧＤＩＲＱＡＨＣ（配列番号３）であった。突然変異Ｒ２（３１３−４ＰＭ／ＨＩ，  ３２５Ｑ／Ｄ）Ｖ３ペプチドを同様に調製した。配列：ＣＴＲＰＳＮＮＴＲＴＳＴＴＩＧＰＧＱＶＦＹＲＴＧＤＩＴＧＮＩＲＫＡＹＣ（配列番号４）である菌株９３ＴＨ９６６．８  Ｖ３ペプチドを同じ方法を用いて合成した。ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ高速液体クロマトグラフにより、Ｃ１８、アセトニトリル−イン−ウォーター勾配クロマトグラフィーを使って精製した。精製ペプチドの配列をＡＢＩ自動シーケンサーで確認した。ペプチドは、凍結乾燥して、４〜８℃で保管した。線状ＭＮ菌株Ｖ３ペプチドの調製は、以前に報告されている（Ｃａｒｒｏｗら、１９９１）。環状ＭＮ菌株３５−ｍｅｒペプチドは、Ｃａｔａｓｔｉら（１９９６）が供給したエイズ研究基準試薬プログラム（カタログ番号１８４１）から入手した。
【００８６】
Ｒ２  Ｖ３  ３５−ｍｅｒは水に不溶性であったが、試験を行った他のすべてのペプチドは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌは水に溶解した。環状ペプチドを得るために、Ｒ２およびＲ２（３１３−４ＰＭ／ＨＩ，  ３２５Ｑ／Ｄ）Ｖ３  ３５−ｍｅｒｓの１０ｍｇ／ｍｌジエチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を室温または３７℃にて水で１：１０の割合で希釈し、水酸化アンモニウムでｐＨを８．５に調整した。これらの溶液をバブリングエアによって１時間以上通気した。通気の後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整した。これらの手順の間に、Ｒ２  Ｖ３  ３５−ｍｅｒの一部が沈殿した。溶液中に残ったＲ２  Ｖ３  ３５−ｍｅｒのおよその量を定量するために、分光光度計を使用して波長４８０ｎｍの可視光で、懸濁液の濁度を決定した。分光光度計は１０％ＤＭＳＯ水溶液で校正し、水中に懸濁した既知量の３５−ｍｅｒペプチドのスラリーを用いて標準曲線を作成した。濁度から概算した沈殿の量を、調製手順開始時に加えたペプチドの量から引いて、溶液中に残っている量を概算した。ｐＨ７．４の１０％ＤＭＳＯ溶液における酸化Ｒ２  ３５−ｍｅｒペプチドの溶解度は、室温で処理したとき、３００〜３５０μｇ／ｍｌ、３７℃で処理したとき、８５０〜９００μｇ／ｍｌであった。ペプチドは使用する前に、０．２２μ孔径フィルターで濾過して滅菌した。
【００８７】
（実施例６）  クローンＲ２偽ウイルスに対する中和抗体活性の、ペプチドによるブロッキング
基準２とクローンＲ２の交差反応の中和における、Ｖ３−抗−Ｖ３相互作用の寄与についての試験を行うために、合成Ｖ３ペプチドの中和ブロッキング効果を調べた。クローンＲ２偽ウイルスに対する基準２の中和活性に対するペプチドのブロッキング効果を図３Ａに示す。示したように、通常、線状１７−ｍｅｒペプチドは、中和に対して阻害効果を持たない。いくつかの実験のうち１つのみにおいて、１７−ｍｅｒペプチドの存在下で、２倍の中和低下が見られた。環状３５−ｍｅｒＲ２  Ｖ３ペプチドの、基準２によるクローンＲ２偽ウイルスの中和に対する濃度依存の阻害効果は、示した実験や他の多くの同様の実験で見られた。最大の効果は、約１５μｇ／ｍｌで見られた。ＨＩＶ−１  ９３ＴＨ９６６．８菌株のＶ３領域に相同性の環状ペプチドを用いると、阻害効果は見られなかった。
【００８８】
Ｒ２およびＭＮ菌株偽ウイルスの中和に対するＲ２とＭＮ菌株Ｖ３ペプチドの比較効果を図３Ｂに示す。示した結果は、さらに２回の追加実験を表す。環状Ｒ２  Ｖ３ペプチドのみが、Ｒ２偽ウイルス中和を一貫してブロックした。線状Ｒ２およびＭＮと環状ＭＮペプチドは、２回の実験におてＲ２中和をブロックせず、３番目の実験では、２倍のみブロックした。これに対して、ＭＮ環状および線状ペプチドは、これらの実験において一貫して、ＭＮ菌株中和を８から１６倍阻害し、Ｒ２ペプチドは、ＭＮ菌株の中和に対して一貫して、２倍の阻害効果を示した。ＭＮ菌株に対するＭＮペプチドのこのような効果は、以前の報告と一致している（Ｃａｒｒｏｗら、１９９１；Ｐａｒｋら、１９９９）。
【００８９】
（実施例７）  ＭＡＣＳ患者の血清によるＲ２偽ウイルスの中和の、環状Ｒ２  Ｖ３ペプチドによる阻害
環状Ｒ２  Ｖ３ペプチドによる、Ｒ２偽ウイルスの非相同血清の中和の阻害を、これらの血清のＲ２との交差反応性に抗−Ｖ３抗体の効果が含まれるかどうかを判定するために評価した。ＭＡＣＳの１０人の患者血清の、環状Ｒ２  Ｖ３ペプチドの存在時と不在時の、Ｒ２偽ウイルスクローンに対する比較中和力価を図４Ａに示す（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８）。これらの血清については以前に報告されており、１次ＨＩＶ−１エンベロープ偽ウイルスを交差反応的に中和することが示されているが、基準２よりも低い程度であった（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。各血清について２回の試験を行った。それら血清のうち７種類が、１つのまたは両方の試験で少なくとも２倍阻害されるようであった。すべての試験の幾何平均阻害効果は、１．９倍であった。図４Ａおよび４Ｂに示した、これらの試験と同時に実施した１２種類の試験の結果は、基準２について示している。幾何平均阻害効果は３．５６であった。
【００９０】
（実施例８）  ＭＡＣＳ患者のエンベロープを発現する偽ウイルスの基準２中和の、環状Ｒ２  Ｖ３ペプチドによる阻害
非相同エンベロープを発現する偽ウイルスの基準２による中和の、環状Ｒ２  Ｖ３ペプチドによる阻害を、抗−Ｖ３抗体が基準２の中和交差反応性に寄与したかどうかを判定するために評価した。これらの実験結果を図４Ｂに示す。各偽ウイルスについて、２，３回試験を行った。そのペプチドは、６種類の各偽ウイルスを使用した１回、２回あるいは３回の実験で、２倍の阻害効果を示すことがわかった。幾何平均阻害効果は１．６倍であった。
【００９１】
（実施例９）  ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現する組換え送達ベクターを用いた免疫感作に続いて、交差反応性中和抗体のマウスでの誘導
Ｒ２エンベロープをコードにするＤＮＡクローンを、免疫感作のためにインビボでエンベロープタンパク質複合体を発現するのに使用できる発現ベクターに導入した。Ｒ２エンベロープクローンを発現する組換え送達ベクターは、ｇｐ１２０とｇｐ４１の両方をコードする全長型か、切断型をマウスに投与した。切断型は、ｇｐ１４０を発現する細胞によって分泌される。これらの構築物の全長型および切断型は、ともにマウスで中和抗体を誘導した。Ｖ３領域を含むｇｐ１４０構築物を投与されたマウスは、少なくとも３種類の異なる菌株を中和する中和抗体を発生した。これらにはＲ２菌株、ＳＦ１６２として知られるマクロファージ向性実験室菌株、実験室に順応されていない１次菌株が含まれる。観測された交差反応性の量は、単一の薬剤として試験されたほとんどの、そして他のすべてのＨＩＶ免疫原によって誘導された交差反応性の量を超えている。
【００９２】
【表４】
0004637356.tif 000005
【００９３】
【表５】
0004637356.tif 000006
【００９４】
【表６】
0004637356.tif 000007
【００９５】
（文献）
Adachi A, Gendelman HE, Keonig S, Folks T, Wiley R, Rabson AおよびMartin MA, Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.  J Virol. (1986) 59: 284-291。
【００９６】
Back NK, Smit L, Schutten M, Nara PL, Tersmette MおよびGoudsmit J, Mutations in human immunodeficiency virus type 1 gp41 affect sensitivity to neutralization by gp120 antibodies.  J Virol. (1993) 67: 6897-6902。
【００９７】
Barnes WM,  The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion.  Gene (1992) 112: 29-35。
【００９８】
Baumann H, Gelehrter TDおよびDoyle D, Dexamethasone regulates the program of secretory glycoprotein synthesis in hepatoma tissue culture cells.  J Cell Biol. (1980) 85: 1-8。
【００９９】
Cariello NF, Swenberg JAおよびSkopek TR, Fidelity of Thermococcus litoralis DNA polymerase (Vent) in PCR determined by denaturing gradient gel electrophoresis.  Nucleic Acids Res. (1991) 19: 4193-4198。
【０１００】
Catasti P, Bradbury EMおよびGupta G. Structure and polymorphism of HIV1 third variable loops.  J Biol Chem. (1996) 271: 8236-8242。
【０１０１】
Carrow EW, Vujcic LK, Glass WL, Seamon KB, Rastogi SC, Hendry RM, Boulos R, Nzila NおよびQuinnan GV.  High prevalence of antibodies to the gp120 V3 region principal neutralizing determinant of HIV1 MN in sera from Africa and the Americas.  AIDS Res Hum Retroviruses (1991) 7: 831-838。
【０１０２】
Chackerian B, Rudensey LMおよびOverbaugh J.  Specific N-linked and O-linked glycosylation modifications in the envelope V1 domain of simian immunodeficiency virus variants that evolve in the host alter recognition by neutralizing antibodies, J Virol (1997) 71: 7719-7727。
【０１０３】
Chedid L, Audibert FおよびJohnson AG, Biological activities of muramyl dipeptide, a synthetic glycopeptide analogous to bacterial immunoregulating agents. Prog Allergy (1978) 25: 633-105。
【０１０４】
Daniel MD, Li Y, Naidu YM, Durda PJ, Schmidt DK, Troup CD, Silva DP, MacKey JJ, Kestler HW, Sehgal PKら、Simian immunodeficiency virus from African green monkeys.  J Virol. (1988) 62: 4123-4128。
【０１０５】
Deng H, Liu R, Ellmeier W, Choe S, Unutmaz D, Burkhart M, Di Marzio P, Marmon S, Suttom RE, Hill CM, Davis CB, Peiper SC, Schall TJ, Littman DRおよびLandau NL, Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV.  Nature (1996) 381: 661-666。
【０１０６】
D'Souza MP, Durda P, Hanson CV, Milman Gおよびcollaborating investigators, Evaluation of monoclonal antibodies to HIV-1 by neutralization and serological assays: an international collaboration.  AIDS (1991) 5: 1061-1070。
【０１０７】
Ellouz F, Adam A, Ciorbaru RおよびLederer E, Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives.  Biochem Biophys Res Commun. (1974) 59: 1317-1325。
【０１０８】
Englund G, Theodore TS, Freed EO, Engleman AおよびMartin MA, Integration is required for productive infection of monocyte-derived macrophages by human immunodeficiency virus type 1.  J Virol. (1995) 69: 3216-3219。
【０１０９】
Fortin JF, Cantin RおよびTremblay MJ,  T cells expressing activated LFA-1 are more susceptible to infection with human immunodeficiency virus type 1 particles bearing host-encoded ICAM.  J Virol. (1998) 72: 2105-2112。
【０１１０】
Gao F, Yue L, Craig S, Thornton CL, Robertson DL, McCutchan FE, Bradac JA, Sharp PMおよびHahn BH, Genetic variation of HIV type 1 in four World Health Organization-sponsored vaccine evaluation sites: generation of functional envelope (glycoprotein 160) clones representative of sequence subtypes A, B, C and E.  WHO Network for HIV Isolation and Characterization.  AIDS Res Hum Retroviruses (1994) 10: 1359-1368。
【０１１１】
Ghiara JB, Stura EA, Stanfield RL, Profy ATおよびWilson IA, Crystal structure of the principal neutralization site of HIV.  Science (1994) 264: 82-85。
【０１１２】
Higgins DGおよびSharp PM, Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.  CABIOS (1989) 5: 151-153。
【０１１３】
Hioe CE, Xu S, Chigurupati P, Burda S, Williams C, Gorny MKおよびZolla-Pazner S, Neutralization of HIV-1 primary isolates by polyclonal and monoclonal human antibodies.  Int Immunol. (1997) 9: 1281-1290。
【０１１４】
Korbert BT, MacInnes K, Smith RFおよびMyers G, Mutational trends in V3 loop protein sequences observed in different genetic lineages of human immunodeficiency virus type 1.  J Virol. (1994) 68: 6730-6744。
【０１１５】
Landau NRおよびLittman DR, Packaging system for rapid production of murine leukemia virus vectors with variable tropism.  J Virol. (1992) 66: 5110-5113。
【０１１６】
Lennette EH.  "General principles underlying laboratory diagnosis of viral and rickettsial infections"  in: Lennette EHおよびSchmidt MJ, Diagnostic Procedures of Viral and Rickettsial Disease (New York, American Public Health Association, 1964) pp. 45-。
【０１１７】
Liou HC, Sha WC, Scott MLおよびBaltimore D, Sequential induction of NF-kappa B/Rel family proteins during B-cell terminal differentiation.  Mol Cell Biol. (1994) 14: 5349-5359。
【０１１８】
Luciw PA. in: Fields BN, Knipe DMおよびHowley PM, Fields Virology, 第3版, (Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996), pp 1881-952。
【０１１９】
Lusso P, Cocchi F, Balotta C, Markham PD, Louie A, Farci P, Pal R, Gallo RCおよびReitz MS, Growth of macrophage-tropic and primary human immunodeficiency virus tupe 1 (HIV-1) isolates in a unique CD4+ T-cell clone (PM1): failure to downregulate CD4 and to interfere with cell-line HIV-1.  J Virol. (1995) 69: 3712-3720。
【０１２０】
Mackett M, Smith GLおよびMoss B, General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes. J Virol. (1984) 49: 857-864。
【０１２１】
Mann DL, O'Brien SJ, Gilbert DA, Reid Y, Popovic M, Read-Connole E, Gallo RCおよびGazdar AF, Origin of the HIV-susceptible human CD4+ cell line H9.  AIDS Res Hum Retroviruses (1989) 5: 253-255。
【０１２２】
Mascola J, Louwagie J. McCutchan FE, Fischer CL, Hegerich PA, Wagner KF, Fowler AK, McNeil JGおよびBurke DS, Two antigenically distinct subtypes of Human Immunodeficiency Virus Type 1: Viral genotype predicts neutralization serotype.  J Infect Dis. (1994) 169: 48-54。
【０１２３】
Mather JP, Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol Reprod. (1980) 23: 243-252。
【０１２４】
Mather JP, Zhuang LZ, Perez-Infante VおよびPhillips DM, Culture of testicular cells in hormone-supplemented serum-free medium.  Ann NY Acad Sci. (1982) 383: 44-68。
【０１２５】
Merrifield RB, Automated synthesis of peptides. Science (1965) 150: 178-185。
【０１２６】
Moore JP, Sattentau QJ, Yoshiyama H, Thali M, Charles M, Sullivan N, Poon S-W, Fung MS, Traincard F, Pinkus M, Robey G, Robinson JE, Ho DDおよびSodroski J, Probing the structure of the V2 domain of human immunodeficiency virus type 1 surface glycoprotein gp120 with a panel of eight monoclonal antibodies: human immune response to the V1 and V2 domains.  J Virol. (1993) 67: 6136-6151。
【０１２７】
Montefiori DC, Pantaleo G, Fink LM, Zhou JT, Zhou JY, Bilska M, Miralles GDおよびFauci AS, Neutralizing and infection-enhancing antibody responses to human immunodeficiency virus type 1 in long-term nonprogressors. J Infect Dis. (1996) 60-67。
【０１２８】
Moore JP, Cao Y, Leu J, Qin L, Korber BおよびHo DD.  Inter- and intraclade neutralization of human immunodeficiency virus type 1: genetic clades do not correspond to neutralization serotypes but partially correspond to gp120 antigenic serotypes.  J Virol. (1996) 70: 427-44。
【０１２９】
Muster T, Stein F, Purtscher M, Trkola A, Klima A, Himmler G, Ruker F およびKatinger H, A conserved neutralization epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1.  J Virol. (1993) 67: 6642-6647。
【０１３０】
Myers EWおよびMiller W, Optimal alignments in linear space.  CABIOS (1988) 4: 11-17。
【０１３１】
Myers G, Berzofsky JA, Korber B, Smith RFおよびPavlakis GN, Human retroviruses and AIDS 1992. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1993。
【０１３２】
Overbaugh JおよびRudensey LM.  Alterations in potential sites for glycosylatioon predominate during evolution of the simian immunodeficiency virus envelope gene in macaques.  J Virol. (1992) 66: 5937-5948。
【０１３３】
Park EJ, Vujcic LJ, Anand R, Theodore TSおよびQuinnan GV, Mutations in both gp120 and gp41 are responsible for the broad neutralization resistance of variant HIV-1 mn to antibodies directed at v3 and non-v3 epitopes, J Virol. (1998) 72: 7099-7107。
【０１３４】
Plantier JC, Le Pogam S, Poisson F, Buzelay L, Lejeune B, Barin F, Extent of antigenic diversity in the V3 region of the surface glycoprotein, gp120, of human immunodeficiency virus type 1 group M and consequences for serotyping.  J Virol. (1998) 72: 677-83。
【０１３５】
Quinnan G, Zhang P, Fu D, Dong MおよびMargolick J, Evolution of neutralizing antibody response against hiv-1 virions and pseudovirions in multicenter aids cohort study participants. AIDS Res Hum Retroviruses (1998) 14: 939-949。
【０１３６】
Sabri F, Chiodi FおよびFenyo EM, Lack of correlation between V3 amino acid sequence and syncytium-inducing capacity of some HIV type 1 isolates.  AIDS Res Hum Retroviruses. (1996) 12: 855-858。
【０１３７】
Saitou NおよびNei M, The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees.  Mol. Biol. Evol (1987) 4: 406-425。
【０１３８】
Schonning K, Jansson B, Olofsson S, Nielsen JOおよびHansen JS.  Resistance to V3-directed neutralization caused by an N-linked oligosaccharide depends on the quaternary structure of the HIV-1 envelope oligomer.  Virol. (1996) 218: 134-140。
【０１３９】
Seth A, Hodge DR, Thompson DM, Robinson L, Panayiotakis A, Watson DK およびPapas TS, ETS family proteins activate transcription from HIV-1 long terminal repeat.  AIDS Res Hum Retroviruses (1993) 9: 1017-1023。
【０１４０】
Stuve LL, Brown-Shimer S, Pachl C, Naharian R, Diaz DおよびBurke RL, Structure and expression of the herpes simplex virus type 2 glycoprotein gB gene.  J Virol. (1987) 61: 326-335。
【０１４１】
Thali M, Charles M, Furman C, Cavacini L, Posner M, Robinson JおよびSodroski J, Resistance to neutralization by broadly reactive antibodies to the human immunodeficiency virus type 1 gp120 glycoprotein conferred by a gp41 amino acid change.  J Virol. (1994) 68: 674-680。
【０１４２】
Thali M, Furman C, Ho DD, Robinson J, Tilley S, Pinter AおよびSodroski J, Discontinuous, conserved neutralization epitopes overlapping the CD4-binding region of human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.  J Virol. (1992) 66: 5635-5641。
【０１４３】
Thali M, Moore JP, Furman C, Charles M, Ho DD, Robinson JおよびSodroski J, Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4.  J Virol. (1993) 67: 3978-3988。
【０１４４】
Theodore TS, Englund G, Buckler-White A, Buckler CE, Martin MAおよびPeden KW, Construction and characterization of a stable full-length macrophage-tropic HIV tupe 1 molecular clone that directs the production of high titers if progeny virions.  AIDS Res Hum Retroviruses (1996) 12: 191-194。
【０１４５】
Trkola A, Purtscher M, Muster T, Ballaun C, Bauchacher A, Sullivan N, Srinivassan K, Sodroski J, Moore JPおよびKatinger H, Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope of human immunodeficiency virus type 1.  J Virol. (1996) 70: 1100-1108。
【０１４６】
Urlaub GおよびChasin LA, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity.  Proc Natl Acad Sci USA (1980) 77: 4216-4220。
【０１４７】
VanCott TC, Mascola JR, Kaminski RW, Kalyanaraman V, Hallberg PL, Burnett PR, Ulrich JT, Rechtman DJおよびBirx DL, Antibodies with specificity to native gp120 and neutralization activity against primary human immunodeficiency virus type 1 isolates elicited by immunization with oligomeric gp160.  J Virol. (1997) 71: 4319-4330。
【０１４８】
Vujcic LKおよびQuinnan GV, Preparation and characterization of human HIV type 1 neutralizing reference sera. (1995) AIDS Res Hum Retroviruses. 11: 783-787。
【０１４９】
Wrin T, Loh TP, Vennari JC, Schuitemaker HおよびNunberg JH, Adaptation to persistent growth in the H9 cell line renders a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1 sensitive to neutralization by vaccine sera.  J Virol. (1995) 69: 39-48。
【０１５０】
Zeng W, Regamey PO, Rose K, Wang YおよびBayer E.  Use of Fmoc-N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)amino acids in peptide synthesis.  J Pept Res. (1997) 49: 273-279。
【０１５１】
Zhang PF, Chen X, Fu DW, Margolick JBおよびQuinnan GV.  Primary virus envelope crossreactivity of the broadening neutralizing antibody response during early chronic human immunodeficiency virus type 1 infection.  J Virol. (1999) 73: 5225-5230。
【０１５２】
Zolla-Pazner SおよびSharpe S. A resting cell assay for improved detection of antibody-mediated neutralization of HIV type 1 primary isolates.  AIDS Res Hum Retroviruses (1995) 11: 1449-1458。
Zwart G, Langedijk H, Van der Hoek L, de Jong JJ, Wolfs TF, Ramautarsing C, Bakker M, De Ronde AおよびGoudsmit J, Immunodominance and antigenic variation of the principal neutralization domain of HIV-1.  Virol. (1991) 181: 481-489。
【図面の簡単な説明】
【図１】  クローンＲ２のｇｐ１２０およびｇｐ４１のヌクレオチドをコードする配列の系統発生的分析を示す図である。配列比較を、プログラムＤＮＡ  ＳｔａｒにおけるＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐのＣｌｕｓｔｉａｌアルゴリズムを使用して行った（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８９；Ｓａｉｔｏｕら、１９８７；Ｍｙｅｒｓら、１９８８）。２つの図の下部のグラフは、系統樹により表されるパーセント類似度の距離を示す。示されている配列のＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号は下記の通りである：ＭＷ９５９、Ｕ０８４５３；ＭＷ９６０、Ｕ０８４５４；Ｄ７４７、Ｘ６５６３８；ＢＲ０２０、Ｕ２７４０１；ＢＲ０２９、Ｕ２７４１３；ＲＵ１３１、Ｕ３０３１２；ＵＧ９７５、Ｕ２７４２６；ＡＤ８、Ｍ６０４７２；ＨＸＢ、Ｋ０３４５５；ＮＤＫ、Ｍ２７３２３；Ｚ２Ｚ６、Ｍ２２６３９；ＵＧ０２１、Ｕ２７３９９；ＣＭ２３５、Ｌ０３６９８；ＴＨ０２２、Ｕ０９１３９；ＴＨ００６、Ｕ０８８１０；ＵＧ２７５、Ｌ２２９５１；ＳＦ１７０３、Ｍ６６５３３；ＲＷ０２０、Ｕ０８７９４；ＲＷ００９、Ｕ０８７９３；Ｕ４５５、Ｍ６２３２０；およびＺ３２１、Ｍ１５８９６。
【図２】  マルチセンターエイズ集団研究（Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ＡＩＤＳ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙ）において１９８５年から１９９０年に集められたボルチモア／ワシントン特別区地区の１０名の男性住民から得られた血清によるクレードＢウイルスおよび偽ウイルスの中和作用を示すグラフである。Ｐ９ウイルスおよびＰ１０ウイルス（Ｐ９−ＶおよびＰ１０−Ｖ）は、２人の血清ドナーから得られた一次単離株である（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８）。中和アッセイを、実施例に記載されているようにＰＭ１細胞で行った。それぞれの点は、個々の血清で得られた結果を表している。四角の棒は、中央の線により示される幾何平均に対する標準偏差を表している。偽ウイルスを使用して得られた結果の上部の数字は、個々の偽ウイルスをＲ２と比較する対になったｔ検定によって帰無仮説を検定することから得られる確率を示す。
【図３】  図３Ａは、合成Ｖ３ペプチドによる偽ウイルスの基準２媒介中和の阻害を示すグラフである。９０％の中和に対する中和終点を以前の記載に従って計算した（Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９９；Ｑｕｉｎｎａｎら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、１９９９；Ｐａｒｋら、１９９８）。示されている結果は三連の測定の平均である。偽ウイルスＲ２クローンの中和に対するＲ２線状１7-mer（白四角）およびＲ２環状体（黒四角）ならびに９３ＴＨ９６６．８環状体（斜線四角）の各Ｖ３ペプチドの用量応答作用である。ペプチド濃度は、３ｘ１０における累乗数が示されている。
図３Ｂは、Ｒ２偽ウイルスおよびＭＮ偽ウイルス（クローンＶ５）の中和に対するペプチドの阻害作用の比較を示すグラフである。すべてのペプチドを１５μｇ／ｍｌで試験した。線状ペプチド（Ｌ）は、それぞれのＶ３ループの先端配列に対応した。環状ペプチド（Ｃ）は、異なる株のそれぞれのＶ３領域全長に対応した。ペプチドの非存在下（無し）での中和もまた示されている。
【図４】  図４Ａは、偽ウイルスの中和に対する環状Ｒ２Ｖ３ペプチドの作用を示すグラフである。中和の阻害倍数を、環状Ｒ２Ｖ３ペプチド（１５μｇ／ｍｌ）の存在下で得られた５０％中和力価と比較するとき、ペプチドの非存在下で得られた５０％中和力価の比として計算した。すべてのアッセイを三連で行った。曲線がこの領域で最も平行的である傾向を有していたので、中和力価を感染阻害曲線の中点で計算した。同様の結果が、９０％中和終点を比較して得られた。ＭＡＣＳドナー（ドナー番号１〜１０）の血清によるＲ２偽ウイルスの中和のペプチド阻害（それぞれ、２回のアッセイ）および基準２によるＲ２偽ウイルスの中和のペプチド阻害。結果は、パネル（Ａ）および（Ｂ）に示されているそれ以外の実験と同じ時間間隔で行われたＭＡＣＳドナーのそれぞれの血清に関する２回の測定、および基準２の１２回のアッセイについて示されている。
図４Ｂは、ＭＡＣＳ患者のエンベロープ（患者番号３、４、６、８、９および１０）を発現する偽ウイルスの基準２による中和のペプチド阻害を示すグラフである。各偽ウイルスの２回または３回の異なるアッセイの結果が示されている。
【図１】
0004637356.tif 000008
【図２】
0004637356.tif 000009
【図３】
0004637356.tif 000010
【図４】
0004637356.tif 000011
【配列表】
0004637356000001.app