(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）から選ばれる遺伝子工学的な手法により、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの活性が、該遺伝子工学的な手法を施す前の細胞よりも低下または欠失した、抗体分子をコードする遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞。
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端３０アミノ酸が欠失したＮ末端欠失体を導入する手法；
（２）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの転写または翻訳を抑制する手法；
（３）ＧＤＰ−フコーストランスポーターの遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法。
【請求項２】
前記遺伝子工学的な手法が前記（３）の遺伝子破壊の手法であり、前記ＧＤＰ−フコーストランスポーターが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である請求項１に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求項１または２に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項４】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
抗体分子が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子が、該抗体分子中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子よりも高いことを特徴とする、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を用いること特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
【請求項１１】
抗体組成物が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失するように、ゲノムが改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫、該動物あるいは植物から抗体組成物を製造する方法、および該抗体組成物を含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域には、２個所のＮ−グリコシド型の糖鎖結合部位が存在しており、血清中のＩｇＧでは、通常、この部位に、シアル酸やバイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレックス型糖鎖が結合している。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトースの付加および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られている［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１３０，１９９７］。
このような糖鎖の構造は、糖鎖を合成する糖転移酵素と糖鎖を分解する糖分解酵素によって規定されていると考えられている。
【０００３】
以下に、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。
糖蛋白質は、小胞体（以下、ＥＲと表記する）内腔で糖鎖の修飾を受ける。Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成過程では、比較的大きな糖鎖が、ＥＲ内腔で伸長しつつあるポリペプチド鎖に転移される。この際、糖鎖はまず、ドリコールリン酸（以下、Ｐ−Ｄｏｌとも表記する）と呼ばれるα−イソプレン単位を２０個程度含む長鎖の脂質担体のリン酸基に順次付加される。すなわち、ドリコールリン酸にＮ−アセチル−グルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が転移されＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなり、続いてもう１個ＧｌｃＮＡｃが転移されＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなる。次いで、マンノース（以下、Ｍａｎとも表記する）が５個転移され（Ｍａｎ）５−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌに、さらに、Ｍａｎが４個、グルコース（以下、Ｇｌｃとも表記する）が３個転移される。このようにして、コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体（Ｇｌｃ）３−（Ｍａｎ）９−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌができる。この１４個の糖からなる糖鎖の前駆体はアスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン配列（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）を持ったポリペプチドへＥＲ内腔でひとかたまりのまま転移される。この際、コアオリゴ糖に結合していたドリコールピロリン酸（Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌ）は遊離するが、ピロホスファターゼの分解を受けて再びドリコールリン酸となり再利用される。糖鎖のトリミングは、糖鎖がポリペプチドに結合すると直ちに開始される。すなわち、３個のＧｌｃと１ないし２個のＭａｎがＥＲ上で除去され、この除去にはα１，２−グルコシダーゼＩ、α１，３−グルコシダーゼＩＩおよびα１，２−マンノシダーゼが関与することが知られている。ＥＲ上でトリミングを受けた糖蛋白質はゴルジ体へ輸送され様々な修飾を受ける。ゴルジ体シス部には、マンノースリン酸を付加するＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびα−マンノシダーゼＩが存在し、Ｍａｎ残基を５個にまで減少させる。ゴルジ体メディア部には、コンプレックス型のＮ−グリコシド結合糖鎖の最初の外側のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）、２個のＭａｎを除去するα−マンノシダーゼＩＩ、外側から２個目のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するα１，６−フコシルトランスフェラーゼが存在する。ゴルジ体トランス部にはガラクトースを付加するガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルノイラミン酸などのシアル酸を付加するシアル酸転移酵素が存在する。このような各種酵素の作用を受けてＮ−グリコシド結合糖鎖が作られることが知られている。
【０００４】
抗体の糖鎖に関しては、ボイド（Ｂｏｙｄ）らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）或いはマウスミエローマ細胞由来のＮＳＯ細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖の抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性とも表記する）、補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性とも表記する）に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでＣＤＣ活性のみが影響を受け、約５０％程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告している［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１３１１（１９９５）］。また、ライフリー（Ｌｉｆｅｌｙ）らは、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞或いはラットミエローマＹ０細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）の糖鎖の分析およびＡＤＣＣ活性を測定した結果、Ｙ０細胞由来のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈが最も高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が重要であることを示唆している［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）、ＷＯ９９／５４３４２］。
【０００５】
さらに、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加修飾によって、抗体のＡＤＣＣ活性が大きく変化することが報告されている（ＷＯ００／６１７３９）。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。
【０００６】
一般的に、医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞などを宿主細胞として用い製造されているが、上述したように、抗体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、宿主細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違いが観察されることから、より高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望まれている。
【０００７】
宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変する一つの方法として、糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用することが試みられている。
糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の前駆体であるコアオリゴ糖形成の最初のステップであるＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌの形成を選択的に阻害するツニカマイシン、グリコシダーゼＩの阻害剤であるカスタノスペルミンやＮ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、グルコシダーゼＩＩの阻害剤であるブロモコンヅリトール、マンノシダーゼＩの阻害剤である１−デオキシノジリマイシンや１，４−ジオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール、マンノシダーゼＩＩの阻害剤であるスワンソニンなどが知られている。糖転移酵素の特異的な阻害剤としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）などに対する基質のデオキシ誘導体が開発されつつある［グライコバイオロジーシリーズ２−糖鎖の細胞における運命（講談社サンエンティフィック）永井克孝・箱守仙一朗・木幡陽編（１９９３）］。また、１−デオキシノジリマイシンはコンプレックス型糖鎖の合成を抑え、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖の割合を増加させることが知られている。実際に、カスタノスペルミン、Ｎ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、スワンソニンあるいはツニカマイシンなどの阻害剤を培地に添加することでハイブリドーマが産生するＩｇＧの糖鎖構造が変化し、抗原結合性やＡＤＣＣ活性などが変化することが報告されている［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ），２６，１１１３（１９８９）］。しかしながら、これら阻害剤の特異性は弱く、また標的とする酵素を十分に阻害することも難しいため、生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは難しい。
【０００８】
また、糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられており、その具体的な例としては、１）ラットのβ−ガラクトシドα
２，６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能であること［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８，１９８９］、２）ヒトのβ−ガラクトシド２−αフコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−）の発現が可能であること［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，１９９１］、３）β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を生産することでＮ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）、ＷＯ９９／５４３４２］が報告されている。ＧｎＴＩＩＩを導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示した。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されているため、抗体医薬の生産には適切ではない。
【０００９】
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されており、その具体的な例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体を生産した報告が挙げることができる［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターやＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現例が報告されているが、医薬への応用に適したエフェクター作用が向上した抗体の発現には成功していない［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。これら変異株は、変異剤処理によりランダムに変異が導入された結果の株として取得されており、医薬品製造に用いる株として適切ではない。
【００１０】
このように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、実際には糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。特に、抗体のエフェクター機能は糖鎖構造により大きな影響を受ける事が明らかになりつつあるが、最適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を産生しうる宿主細胞の取得には至っていない。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、以下に関する。
１．以下の（１）〜（３）から選ばれる遺伝子工学的な手法により、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの活性が、該遺伝子工学的な手法を施す前の細胞よりも低下または欠失した、抗体分子をコードする遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞。
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端３０アミノ酸が欠失したＮ末端欠失体を導入する手法；
（２）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの転写または翻訳を抑制する手法；
（３）ＧＤＰ−フコーストランスポーターの遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法。
２．前記遺伝子工学的な手法が前記（３）の遺伝子破壊の手法であり、前記ＧＤＰ−フコーストランスポーターが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である前項１に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、前項１または２に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
４．抗体分子のクラスがＩｇＧである、前項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
５．抗体分子が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子である、前項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
６．抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子が、該抗体分子中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子よりも高いことを特徴とする、前項５に記載の細胞。
７．糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である前項６に記載の細胞。
８．フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、前項６または７に記載の細胞。
９．前項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を用いること特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
１０．前項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
１１．抗体組成物が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、前項９または１０に記載の方法。
１２．抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、前項１１に記載の方法。
１３．糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である前項１２に記載の方法。
１４．フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、前項１２または１３に記載の方法。
１５．前項９〜１４のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
１６．前項１５に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
１７．医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、前項１６に記載の医薬。
１８．前項１６または１７に記載の医薬を製造するための、前項１５に記載の抗体組成物の使用。
【００２３】
本発明の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が親細胞よりも低下または欠失した細胞（以下、「本発明の宿主細胞」と略記する）としては、親株細胞よりも細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質（以下、「ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質」と略記する）の活性を低下または欠失させた細胞であればいかなる細胞も包含される。
【００２４】
親株細胞とは、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法を施す前の細胞をいう。
ＮＳＯ細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳＯ細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳＯ細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２５】
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
【００２６】
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株なども具体的な例としてあげられる。
【００２７】
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞をあげることができる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２８】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法としては、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法であればいずれの手法でも用いることができるが、遺伝子工学的な手法が望ましい。その具体的な方法としては、
（ａ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法などがあげられる。
【００２９】
また、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選別する方法を用いることにより、本発明のＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞を取得することができる。
【００３０】
レクチンに耐性な細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行ったときにも、生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチン有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌである。親株細胞に変異が導入された場合のレクチンの有効濃度とは、親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
【００３１】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
【００３２】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質もＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に包含される。
【００３３】
本発明のＧＤＰ−フコーストランスポーターとしては、
以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質があげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３４】
さらに、本発明のＧＤＰ−フコーストランスポーターとしては、以下の（ｉ）〜（ｔ）からなる群から選ばれる蛋白質があげられる。
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｌ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｍ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｐ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｑ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｒ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｓ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｔ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
【００３５】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、３、２９または３０で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡなどがあげられる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、３、２９または３０で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００３６】
本発明において、配列番号２、４、３１または３２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号２、４、３１または３２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質などがあげられる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００３７】
また、本発明において、配列番号２、４、３１または３２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質してとは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２、４、３１または３２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質などがあげられる。
【００３８】
本発明の宿主細胞としては、抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、好ましくは、動物細胞があげられる。動物細胞の好ましい具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。
本発明の宿主細胞に抗体分子をコードする遺伝子を導入することにより、あるいは、宿主細胞が抗体分子を生産する能力を有する場合は、そのまま当該宿主細胞を用いることにより抗体組成物を製造することができる。
【００３９】
本発明は、また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下するようにゲノムが改変された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いることを特徴とする抗体組成物を製造する方法に関する。
【００４０】
本発明において、抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有する組成物をいう。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「Ｈ鎖」および「Ｌ鎖」と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域（以下、「Ｖ領域」と表記する）と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半は定常領域（以下、「Ｃ領域」と表記する）と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
【００４１】
Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｅ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
【００４２】
【化１】
0004628679.tif 000002
【００４３】
上記構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式（Ｉ）のコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
【００４４】
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明において、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が欠失または低下した細胞を用いて製造した本発明の抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような本発明の抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を欠失または低下させるような処置が施されていない親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
【００４５】
また、本発明において、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下するようにゲノムが改変された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いて製造した本発明の抗体組成物も、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような本発明の抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫（以下、親個体と称す）が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
【００４６】
ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞または親個体が生産する抗体組成物の該割合よりも高いものがあげられる。具体的には、該割合が親株細胞または親個体よりも２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上高い抗体組成物があげられ、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の全てが糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物が最も好ましい。
【００４７】
本発明の抗体組成物において、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞または親個体が生産する抗体組成物よりも高い場合、本発明の抗体組成物は、親株または親個体が生産する抗体分子からなる抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
【００４８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することによっても決定することができる。
【００４９】
抗体分子とは、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
抗体としてはハイブリドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
【００５０】
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体をいう。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５２】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体酸産生トランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００５３】
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
本発明の宿主細胞は、親株細胞が生産する抗体組成物より、ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を生産することができる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
【００５４】
抗体の断片は、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ  Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のＣｙｓからＣ末端、あるいは２３０番目のＰｒｏからＣ末端までを意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域の一部を有する融合蛋白質とは、抗体のＦｃ領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）を意味する。
【００５５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
【００５６】
（１）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする蛋白質の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
【００５７】
（ａ）アンチセンス法またはリボザイム法による本発明の細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
【００５８】
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするゲノムＤＮＡの例としては、配列番号３４または３５で表される塩基配列からなるＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードするゲノムＤＮＡがあげられる。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
【００５９】
本発明の宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得する。
【００６０】
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
【００６１】
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
【００６２】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【００６３】
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
【００６４】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【００６５】
取得した遺伝子断片がＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のＤＮＡを取得することができる。
【００６６】
また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１、３、２９または３０に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを取得することもできる。
【００６７】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。形質転換体を選択する方法
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座  ３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製），谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、ＧＤＰ−フコースを基質として用いゴルジ体への輸送活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
【００６８】
また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などがあげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の５．に記載の方法があげられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、好ましくはレンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等があげられる。
具体的には、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地に１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の宿主細胞を選択することができる。
【００６９】
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
【００７１】
（ｂ）相同組換え法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
【００７２】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
【００７３】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【００７４】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００７５】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
【００７６】
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ（ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００７７】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした蛋白質、すなわちＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００７８】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００７９】
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした蛋白質、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述の５．に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
【００８０】
（ｄ）ＲＮＡｉ方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００８１】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を得ることができる。
【００８２】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクター、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００８３】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【００８４】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載された「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
【００８５】
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．），２，７０，（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
【００８６】
本発明のＲＮＡｉ法に用いられるＲＮＡとしては、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質などをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。好ましくはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質が、上記記載のＧＤＰ−フコーストランスポーターであるＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。
本発明のＲＮＡｉ法で使用されるＲＮＡとしては、ＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター等のＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡであればいかなるものでもよいが、ＲＮＡの長さとしては、好ましくは１〜３０、より好ましくは５〜２９、さらに好ましくは１０〜２９、最も好ましくは１５〜２９の連続したＲＮＡがあげられる。具体的には、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ、さらに好ましくは、
（ａ）配列番号３３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に対して配列番号３３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡがあげられる。
上述の「配列番号３３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ」としては、配列番号３３で表されるＲＮＡと、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に対する同様のＲＮＡｉ活性を有するものであればいかなるものでもよく、ＲＮＡの長さなどの量的要素は異なっていてもよい。
【００８７】
１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列とは、配列番号３３の両端の塩基が１または数個欠失および／または付加された塩基配列をいう。塩基配列としては、好ましくは１〜３０塩基、より好ましくは５〜２９塩基、さらに好ましくは１０〜２９塩基、最も好ましくは１５〜２９塩基の連続したＲＮＡがあげられる。
また、これらＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡも本発明に包含され、ＲＮＡに対応するＤＮＡとして、具体的には配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡがあげられる。さらに、該ＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをベクターに含む組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体も、本発明に包含され、該２本鎖ＲＮＡを発現させるために用いることができる。
【００８８】
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
【００８９】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００９０】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【００９１】
（２）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質を標的とし、該蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
【００９２】
細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、小胞体およびゴルジ体の膜上においてダイマーを形成して機能していることが知られている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８（２０００）］。また、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させることにより、野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、形成したヘテロダイマーは野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８（２０００）］。従って、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作製し細胞内に導入することで、ドミナントネガティブ体として機能させることが可能である。このような変異体の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
【００９３】
上記方法で得られる、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のＮ末端欠失体、好ましくは、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のＮ末端３０アミノ酸が欠失したＮ末端欠失体があげられる。具体的には、実施例１に記載のＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体があげられる。
【００９４】
本発明の宿主細胞は、上述のように作製した標的蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
【００９５】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
【００９６】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【００９７】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
【００９８】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００９９】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【０１００】
（３）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質についての突然変異を導入する手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子について突然変異を導入し、該蛋白質に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
【０１０１】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子としては、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
具体的には、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
【０１０２】
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術  第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
【０１０３】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を測定する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【０１０４】
（４）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
【０１０５】
２．本発明の、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的として、１．に記載の手法を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞より、公知の方法を用い作製することができる。
具体的な方法について、以下に記す。
【０１０６】
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
【０１０７】
具体例としては、染色体上のＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあげられる。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞でＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【０１０８】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
【０１０９】
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ，Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
【０１１０】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
【０１１１】
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
【０１１２】
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−Ｄｉｌ−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、（Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨ  ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ等があげられる。
【０１１３】
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
【０１１４】
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
【０１１５】
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、１．に記載の手法を施すことで、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した本発明の植物細胞からなるカルスを作製することができる。
【０１１６】
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック植物を作製することができる。
【０１１７】
３．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
【０１１８】
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
【０１１９】
宿主細胞として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができるが、好ましくは動物細胞があげられる。
【０１２０】
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
【０１２１】
本発明の抗体組成物の製造方法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が親株細胞より欠失または低下した細胞をあげることができる。
【０１２２】
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【０１２３】
ｃＤＮＡは、上記１．の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
【０１２４】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
【０１２５】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
【０１２６】
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
【０１２７】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
【０１２８】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
【０１２９】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１３０】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
【０１３１】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
【０１３２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【０１３３】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
【０１３４】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
【０１３５】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
【０１３６】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
【０１３７】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
【０１３８】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
【０１３９】
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【０１４０】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
【０１４１】
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
【０１４２】
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
【０１４３】
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
【０１４４】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１４５】
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１４６】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
【０１４７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【０１４８】
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【０１４９】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【０１５０】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１５２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５３】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５４】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５５】
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
【０１５６】
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【０１５７】
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１５８】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１５９】
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素・遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【０１６０】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
【０１６１】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
【０１６２】
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
【０１６３】
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０１６４】
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
【０１６５】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１６６】
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１６７】
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１６８】
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質などを挙げることができる。
【０１６９】
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物およびＦｃ融合蛋白質の製造方法について記すが、他の抗体組成物を上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
【０１７０】
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１７１】
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
【０１７２】
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
【０１７３】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１  β  ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０１７４】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
【０１７５】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｅｌｅｉｃ  Ａｅｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖およびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１（以下、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレストと略記する）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０１７６】
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することによって見出すことができる。
【０１７７】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１７８】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されて
いるヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０１７９】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製において、該抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、最も重要な点である。抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸を同定する方法としては、Ｘ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等の抗体の立体構造の構築及び解析方法があげられる。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらした。しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されていない。したがって、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項３の（５）に記載のＰＣＲ法により行うことができる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０１８０】
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１８１】
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、１．に記載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンチボディズ、モノクローナルアンチボディズ）等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１  β  ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０１８２】
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有している場合には、前記１．に記載の方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を採取することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
【０１８３】
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
【０１８４】
５．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
【０１８５】
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的には、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【０１８６】
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【０１８７】
６．本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
【０１８８】
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明の抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
【０１８９】
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
【０１９０】
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
【０１９１】
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
【０１９２】
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
【０１９３】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）などがあげられる。
【０１９４】
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）などがあげられる。
【０１９５】
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などがあげられる。
【０１９６】
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１−６８，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体または抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）などがあげられる。
【０１９７】
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
【０１９８】
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１９９】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０２００】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０２０１】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
【０２０２】
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０２０３】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０２０４】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
【０２０５】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
【０２０６】
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０２０７】
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０２０８】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２０９】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【０２１０】
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
【０２１１】
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
【実施例】
【０２１２】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１３】
実施例１．ＧＤＰ−フコーストランスポータードミナントネガティブ体発現細胞の作製と産生抗体の評価
【０２１４】
（１）ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子の単離
ネイチャー・ジェネティクス［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，７３（２００１）］に記載のヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターｍＲＮＡ配列を用いて、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと表記）の全長を増幅する為のプライマーセット［ＧＤＰｆＴ−Ｆｗ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）とＧＤＰｆＴ−Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号６）］を設計し、ＤＮＡを合成した。
【０２１５】
５００μｌ容のマイクロ遠心管（エッペンドルフ社製）中に、２．５μｌのヒト胎児脳由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ−ｃＤＮＡ（クロンテック社製）、５μｌの２０ｍＭデオキシリボヌクレオチド混合液（東洋紡績社製）、
５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（クロンテック社製）、４μｌのＧＤＰｆＴ−Ｆｗ  Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、４μｌのＧＤＰｆＴ−Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社製）、２８．５μｌの滅菌蒸留水（インビトロジェン社製）を添加し、ＰＣＲ液を調製した。反応液を十分に混合後、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｌ重層し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）にて、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６４℃で３分間からなる反応を１サイクルとして、３０回反復させ、最後に７２℃にて３分間反応させた。反応液から５μｌを分取してアガロースゲル電気泳動を行い、全長約１．１ｋｂｐの用いたプライマー特異的なＤＮＡの増幅を確認した。
【０２１６】
次に、５００μｌ容のマイクロ遠心管（エッペンドルフ社製）中に、４μｌのＰＣＲ液、１μｌのＴｏｐｏＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社製）、１μＬのＳａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）を混合し、室温にて１５分間放置した。反応後の液から１μｌを分取して、５０μｌの大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｉａｔａｇｅｎｅ社製）と混合し、氷上にて１５分間放置後、４２℃の温浴にて４５秒間加熱して熱ショックによる大腸菌の形質転換を行った。形質転換後の大腸菌は、ＬＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製）に懸濁後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加したＬＢ寒天培地プレート上に播種した。プレートを３７℃にて一晩培養し、寒天培地上に形質転換株のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で剥ぎ取り、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加した５０ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃、１５０ｒｐｍ（往復振とう）の条件で一晩培養した。得られた培養液を遠心管（ベクトンディッキンソン社製）に分取し、４℃にて８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離を行い、上清を除去し、大腸菌の菌体を取得した。得られた菌体に対し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡはアガロースゲル電気泳動にて純度を確認後、分光光度計（島津製作所社製）を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、濃度を算出した。ＤＮＡシーケンサー３７７Ａ（島津製作所社製）を用いて、１．１ｋｂｐの組換えＤＮＡ配列を解読し、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの全長ＯＲＦであることを確認した。配列決定したヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、該塩基配列に基づくヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのアミノ酸配列を配列番号４に示した。得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＣＲ／ｈＧＤＰｆＴと名付けた。
【０２１７】
（２）ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターＮ末端欠失変異体とその発現ベクターの作製
ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端側から３０残基のアミノ酸を削除したｃＤＮＡ配列を増幅する為のプライマーセット［ＧＤＰｆＴΔ３０−Ｆｗ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７）とＧＤＰｆＴΔ３０−Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号８）］を設計し、ＤＮＡを合成した。なお、ＧＤＰｆＴΔ３０−Ｆｗ  Ｐｒｉｍｅｒには、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターの３１番目のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の５’末端側上流に、動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込む為の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト、翻訳効率化配列であるＫｏｚａｋ配列（ＣＣＧＣＣ）および翻訳開始コドンＡＴＧを接続した形で設計した。
【０２１８】
また、ＧＤＰｆＴΔ３０−Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒには、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターの翻訳終止コドンをコードするＤＮＡ配列の５’末端外側に、動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込む為の制限酵素ＸｂａＩサイトを接続した形で設計した。
【０２１９】
５００μｌ容のマイクロ遠心管（エッペンドルフ社製）中に、本項（１）で作製した１０ｎｇのｐＣＲ／ｈＧＤＰｆＴ、５μｌの２０ｍＭデオキシリボヌクレオチド混合液（東洋紡社製）、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（クロンテック社製）、４μｌのＧＤＰｆＴΔ３０−Ｆｗ  Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、４μｌのＧＤＰｆＴΔ３０−Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、１μｌのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）、２８．５μｌの滅菌蒸留水（インビトロジェン社製）を添加し、ＰＣＲ液を調製した。反応液を十分に混合後、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｌ重層し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）にて、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６４℃で３分間からなる反応を１サイクルとして、３０回反復させ、最後に７２℃にて３分間反応させた。反応液から５μｌを分取してアガロースゲル電気泳動を行い、全長約１ｋｂｐの用いたプライマー特異的なＤＮＡの増幅を確認した。
【０２２０】
次に、ＰＣＲ液をマイクロ遠心管に回収し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを精製し、ＤＮＡ溶液の１／１０容のＭバッファー（宝酒造社製）を添加後、各１０ｕｎｉｔｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ（共に宝酒造社製）を添加して３７℃にて８時間処理した。なお、この制限酵素処理の際、１０μｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）も同様に処理した。
【０２２１】
制限酵素処理したサンプルよりＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを精製し、Ｎ末欠失体のｃＤＮＡ溶液５μＬとｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）溶液１μＬを混合後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を６μＬ添加し、１６℃にて３０分間ライゲーション反応を行った。反応液を２μＬ分取し、５０μｌの大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）と混合し、氷上にて１５分間放置後、４２℃の温浴にて４５秒間加熱して熱ショックによる大腸菌の形質転換を行った。形質転換後の大腸菌は、ＬＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製）に懸濁後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加したＬＢ寒天培地プレート上に播種した。プレートを３７℃にて一晩培養し、寒天培地上に形質転換株のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で剥ぎ取り、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加した５０ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃、１５０ｒｐｍ（往復振とう）の条件で一晩培養した。
【０２２２】
得られた培養液を遠心管（ベクトンディッキンソン社製）に分取し、４℃にて８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離を行い、上清を除去し、大腸菌の菌体を取得した。得られた菌体に対し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡはアガロースゲル電気泳動にて純度を確認後、分光光度計（島津製作所社製）を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、濃度を算出した。ＤＮＡシーケンサー３７７Ａ（島津製作所社製）を用いて、１ｋｂｐの組換えＤＮＡ配列を解読し、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体であることを確認した。得られたプラスミドＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ／ｈＧＤＰｆＴΔ３０と名付けた。
【０２２３】
（３）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へのプラスミドの導入と形質転換体の取得
１０μｇのｐｃＤＮＡ／ｈＧＤＰｆＴΔ３０と１０μｇのＣＣＲ４キメラ抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０（ＷＯ０１／６４７５４に記載）を、１．６×１０６個のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）］へ、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により共導入した。また、対照として、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）と１０μｇのｐＫＡＮＴＥＸ２１６０をＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に同様に共導入した。
【０２２４】
それぞれの細胞懸濁液を１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−Ｈｙｇ（５００）［透析牛胎児血清を１０％、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を５００μｇ／ｍｌで含むＩＭＤＭ培地］に懸濁し、Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）へ播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２週間培養し、ハイグロマイシン耐性形質転換株を得た。次に培地をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−Ｈｙｇ（５００）に５０ｎＭ  ＭＴＸを添加した培地に交換し、２週間培養して５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性株を取得した。更に、引続き、培地をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−Ｈｙｇ（５００）に２００ｎＭ  ＭＴＸを添加した培地に交換し、２週間培養して２００ｎＭ  ＭＴＸ耐性株を取得した。これらの２００ｎＭ  ＭＴＸ耐性株は、本実施例（６）に記載のＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現を確認した。
【０２２５】
ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体を導入した形質転換株をＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）を導入した形質転換株をＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株とそれぞれ称す。なお、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株はＮｅｇａ−１３／ＧＤＰｆＴΔ３０の細胞名で、平成１４年３月１４日付けで独立法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６５として寄託されている。
【０２２６】
（４）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製
作製したＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が産生する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製は、以下のように行った。
【０２２７】
ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株をそれぞれＴ１８２フラスコ（グライナー社製）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にてコンフルエントになるまで増殖させた。細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳバッファー（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、３５ｍｌのＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を添加した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて一週間培養後、培養上清を回収し、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア社製）による精製を添付の説明書に従い行った。精製抗体の蛋白質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）で定量した。得られた精製抗体は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株の生産抗体をＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体と、ＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株の生産抗体をＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体とそれぞれ名付けた。
【０２２８】
（５）精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の解析
本実施例の（４）で得られた、２種類の精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量および精製度を解析した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４、モノクローナル・アンティボディズ）と一致し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０２２９】
（６）ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の評価
本実施例の（４）で得られた２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性は、ＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法に従って以下の方法で測定した。
【０２３０】
抗体ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号１５）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍＬに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液を撹拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬ  ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ
【０２３１】
ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ  ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）を撹拌しながら添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
【０２３２】
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０２３３】
その結果、第１図に示したように、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体とＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体は、ほぼ同等のＣＣＲ４ペプチドに対する抗原結合活性を示した。
【０２３４】
（７）ヒトＣＣＲ４高発現細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価
本実施例の（４）で得られた２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、ヒトＣＣＲ４高発現細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）に対するＡＤＣＣ活性は、以下に記載の方法に従って測定した。
【０２３５】
（ａ）標的細胞溶液の調製
ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトＣＣＲ４を発現しているＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞の１．５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を５．５５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間３０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、培地を用いた懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を１５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０２３６】
（ｂ）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血６０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．６ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
【０２３７】
（ｃ）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（ａ）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（ｂ）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．０００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性（％）は下式（１）により求めた。
【０２３８】
【式１】
0004628679.tif 000003
【０２３９】
その結果、第２図に示したように、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性は、ＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体と比較して有意に高いことが明らかとなった。
【０２４０】
（８）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖構造の解析
本実施例の（４）で得られた２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体について、糖鎖構造の解析を行った。精製したそれぞれの抗体を、ウリトラフリー０．５−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４に溶液を置換した。置換倍率は８０倍以上になるように行なった。置換した抗体は、ＵＶ−１６００（島津製作所製）を用いて濃度を測定した。抗体のアミノ酸配列から下記式（２）［アドバンスズ・イン・プロテインケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１２，３０３（１９６２）］を用いてモル吸光定数を算出し、２８０ｎｍの吸光度１．０を１．３８ｍｇ／ｍｌとして濃度を決定した。
【０２４１】
【式２】
0004628679.tif 000004
【０２４２】
１００μｇの抗体をヒドラクラブＳ−２０４用試験管に入れ、遠心濃縮機にて乾固した。サンプルを乾固させた該試験管をホーネン社製ヒドラクラブを用いてヒドラジン分解を行なった。ヒドラジン分解はホーネン社製ヒドラジン分解試薬を用い、１１０℃、１時間反応させることにより行った［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３（１９８２）］。反応後ヒドラジンを減圧留去させて、反応容器を３０分間放置して室温に戻した。試験管にホーネン社製アセチル化試薬のａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ入れてよく攪拌させ、室温で３０分間反応させた。さらにａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ加えてよく攪拌させ、室温で１時間反応させた。試料を−８０℃のフリーザーで凍結させ、約１７時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料から、ＴａＫａＲａ社製セルロースカートリッジ  グリカンプレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。
【０２４３】
試料糖鎖溶液を遠心濃縮機にて乾固後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］。２−アミノピリジン溶液は２−アミノピリジン１ｇに対しＨＣｌ７６０μｌを加え（１×ＰＡ溶液）、その溶液を逆浸透精製水で１０倍に希釈したものを用いた（１０倍希釈ＰＡ溶液）。シアン化水素化ホウ素ナトリウム溶液は、シアン化水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇに対し１×ＰＡ溶液２０μｌ、逆浸透精製水４３０μｌを加えて調製した。試料に１０倍希釈ＰＡ溶液を６７μｌ入れて１００℃、１５分間反応させ、放冷後にシアン化水素化ホウ素ナトリウム溶液を２μｌ入れて９０℃、１２時間反応させて試料糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。溶離液は１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。試料添加後２０分から３０分の溶出液を回収し、遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製φ６．０ｎｍ×１５０ｎｍ）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った。カラム温度は５５℃、流速は１ｍｌ／ｍｌ、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）でカラムを平衡化し、０．５％１−ブタノールの直線濃度勾配にて８０分間溶出した。各ＰＡ化糖鎖の同定は、分取した各ＰＡ化糖鎖のピークのマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）におけるポストソース分解（Ｐｏｓｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ）分析、ＴａＫａＲａ社製ＰＡ化糖鎖スタンダードとの溶出位置の比較、並びに各種酵素を用いて各ＰＡ化糖鎖を消化後、逆相ＨＰＬＣ分析により行なった。糖鎖含量は、逆相ＨＰＬＣ分析における各ＰＡ化糖鎖のピーク面積より算出した。還元末端がＮ−アセチルグルコサミンでないＰＡ化糖鎖は、不純物由来であるか、ＰＡ化糖鎖調製中の副反応物であるため、ピーク面積の算出から除外した。ＨＰＬＣの分析チャートを第３図に示す。緩衝液Ａとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとして０．５％１−ブタノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を用い、以下のグラジエントで分析した。
【０２４４】
【表１】
0004628679.tif 000005
【０２４５】
なお、第３図で示した（１）〜（８）（図中では丸付き数字で表記）のピークは、以下の構造（１）〜（８）にそれぞれ対応する。
【０２４６】
【化２】
0004628679.tif 000006
【０２４７】
【化３】
0004628679.tif 000007
【０２４８】
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。第３図において、α１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は、（１）〜（８）のうち（１）〜（４）のピークが占める面積、α１，６−フコースが結合した糖鎖群の割合は、（１）〜（８）のうち（５）〜（８）のピークが占める面積から算出した。その結果を第１表に示す。
【０２４９】
【表２】
0004628679.tif 000008
【０２５０】
ピーク面積から計算すると、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体のα１，６−フコースのない糖鎖含量は３５％、α１，６−フコースが結合した複合型糖鎖の割合は６５％であった。ＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体のα１，６−フコースのない糖鎖含量は１０％、α１，６−フコースが結合した複合型糖鎖の割合は９０％であった。
【０２５１】
以上の結果から、導入したＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体はＧＤＰ−フコーストランスポーターのドミナントネガティブ体として働き、産生抗体のα１，６−フコースが結合した複合型糖鎖の割合を低下させることが可能であることが分かった。
【０２５２】
実施例２．チャイニーズハムスター細胞からのＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子の単離
【０２５３】
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全ＲＮＡの抽出
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）］を、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養２日目に１×１０７個を回収後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
【０２４３】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全一本鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製した全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
【０２５４】
得られた各々の全ＲＮＡ３μｌに対しＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲクローニングには該反応液の５０倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−８０℃で保管した。
【０２５５】
（３）ヒト／チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）キメラＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの取得
上記（２）で作製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡに対し、実施例１の（１）に記載したヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター配列に基づいて設計したプライマーセットＧＤＰｆＴ−Ｆｗ  ＰｒｉｍｅｒとＧＤＰｆＴ−Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５および配列番号６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ないプライマー部分がヒトＧＦＴ配列、増幅部分がＣＨＯ配列となるキメラＧＤＰ−フコーストランスポーターを増幅した。ＰＣＲはＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ上記遺伝子特異的プライマーセット］を調製し、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で５分間加熱する条件で行った。ＰＣＲ終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約１１００ｂｐをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた）し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片９μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いた２０μｌの反応系でＴ７ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ５０ｎｇとの連結反応を行ない、該反応液２μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αをコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーから、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｅｈ），７，１５１３（１９７９）］（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いた）に従って、プラスミドＤＮＡを単離した。インサートの有無は、アガロースゲル電気泳動によるサイズ比較により確認し、塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して添付のマニュアルに従い決定した。決定した４つのクローンの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除いた後、本法より決定した挿入ＤＮＡがヒト／ＣＨＯキメラＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードしていることを確認した。
【０２５６】
（４）ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの合成
上記（１）で抽出したＣＨＯ／ＤＧ４４全ＲＮＡからの５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製を、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、添付の説明書に従って行った。ただしＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を逆転写酵素として用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは各々、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
【０２５７】
（５）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターの非翻訳領域塩基配列の決定
上記（３）で決定したヒト／ＣＨＯキメラＧＤＰ−フコーストランスポーター塩基配列をもとにチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ５’−１（配列番号９）およびＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ５’−２（配列番号１０）、チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーター特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ３’−１（配列番号１１）およびＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ３’−２（配列番号１２）を設計した。
【０２５８】
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本実施例（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーター特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。反応終了後、反応液より１μｌをテンプレートとして使用し、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。１回目および２回目のＰＣＲで用いたテンプレート、プライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第２表に示した。２回目のＰＣＲ終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片を精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。
【０２５９】
上記、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥにより取得したＰＣＲ産物の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用してダイレクトシークエンス法により決定した。方法は添付のマニュアルに従った。チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターのＯＲＦに隣接する５’および３’の非翻訳領域の塩基配列について第４図に示す。
【０２６０】
【表３】
0004628679.tif 000009
【０２６１】
（６）チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターの全長ｃＤＮＡのクローニング
まず、本実施例（５）で決定したＧＤＰ−フコーストランスポーターの非翻訳領域の塩基配列に基づいて、チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーター特異的増幅用プライマーセット、ＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＦＷ（配列番号１３）および、ＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＲＶ（配列番号１４）を設計した。次にＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いて、本実施例（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２０μｌの反応液［ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭ上記遺伝子特異的プライマー（ＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＦＷおよびＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＲＶ）］を調製し、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で５秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクル繰り返す条件でＰＣＲを行った。独立した系で４回のＰＣＲを実施後、それぞれの反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約１２５０ｂｐをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いた２０μｌの系でｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５ｎｇとの連結反応を行ない、該反応液２μｌを用いてＤＨ５αを形質転換した。得られた複数のカナマイシン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、約１００ｎｇをＥｃｏＲＩ消化後、アガロースゲル電気泳動に供しインサートの存在を確認した。クローニングしたＰＣＲ増幅断片の塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。本法より配列決定したチャイニーズハムスターのＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡについて配列番号１に示した。さらに、決定した全長ｃＤＮＡ配列中に存在するＯＲＦ（塩基番号１１７番〜１２１４番）より推定されるチャイニーズハムスターのＧＤＰ−フコーストランスポーターアミノ酸配列（３６５アミノ酸）を配列番号２に示した。
【０２６２】
実施例３．ＧＤＰ−フコーストランスポーターを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入細胞の作製と該細胞を用いた抗体組成物の生産
【０２６３】
１．ＧＤＰ−フコーストランスポーターを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築
【０２６４】
（１）ＲＮＡｉの標的とするＣＨＯ由来遺伝子塩基配列の選別
配列番号１６に示した１９塩基をＲＮＡｉの標的配列とした。該配列は実施例２で取得したチャイニーズハムスター由来ＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡ（配列番号１）に示された塩基配列の８０３番目から８２１番目に相当する。該配列を標的としたショートインターフェアリングＲＮＡ（以下、ｓｉＲＮＡと記載する）をｓｉＲＮＡ＿ＧＦＴ＿Ｈと称す。以下にｓｉＲＮＡ＿ＧＦＴ＿Ｈを動物細胞内で発現するプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築方法を記載する。なお、該発現プラスミドの基本構造はＭｉｙａｇｉｓｈｉらの方法［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），２０，５（２００２）］に準じて設計した。
【０２６５】
（２）プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅを構築した（第５図）。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ０７４２５およびＭ１４４８６）より設計したプライマー（配列番号１７および配列番号１８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲはＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（クロンテック社製）を２００ｎｇ含む５０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ
Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号１７および配列番号１８）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
【０２６６】
このＰＣＲ液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を回収した。この増幅断片をＸｂａＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＸｂａＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）をコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換はこの方法を用いた）により形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれるＵ６プロモーター塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンよりＰＣＲに伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅと命名した。
【０２５７】
（３）プラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩの構築
以下の手順でプラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩを構築した（第６図）。配列番号１９および配列番号２０に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｃＩ（宝酒造社製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。各クローンの中からＢａｌＩＩ（宝酒造社製）で切断されるプラスミドを選択し、ｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩと命名した。
【０２６７】
（４）プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅを構築した（第７図）。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０７４２５、Ｍ１４４８６）より設計したプライマー（配列番号２１および配列番号２２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＰ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲはＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（クロンテック社製）を２００ｎｇ含む５０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号２１および配列番号２２）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
【０２６８】
このＰＣＲ液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を回収した。この増幅断片をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＢａｍＨＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれるＵ６プロモーター塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンよりＰＣＲに伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅと命名した。
【０２６９】
（５）プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈを構築した（第８図）。配列番号２３および配列番号２４に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号２３および配列番号２４の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈと命名した。
【０２７０】
（６）プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈを構築した（第９図）。配列番号２５および配列番号２６に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号２５および配列番号２６の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈと命名した。
【０２７１】
（７）プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈを構築した（第１０図）。プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿ＨをＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｌＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＧＦＴ＿Ｈと命名した。
【０２７２】
（８）プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏを構築した（第１１図）。プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿ＨをＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断後、該反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＰＵＲ（クロンテック社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏと命名した。
【０２７３】
（９）直鎖化したプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの作製
プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏを制限酵素ＦｓｐＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖化した。切断後は反応液をアガロース電気泳動に供し、該プラスミドが正確に直鎖化されていることを確認した。
【０２７４】
２．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｓｉＲＮＡ発現プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏを導入した抗体生産株の取得
【０２７５】
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主とした、抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０（ＷＯ０１／６４７５４に記載）の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析牛胎児血清（以下、ｄＦＢＳと表記する；インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）を］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（旭テクノグラス社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の濃度を実施例１．の（６）に記載のＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０２７６】
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（旭テクノグラス社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させた。最終的にＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株を、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）に５００ｎＭ  ＭＴＸを添加した培地に０．５細胞／ウェルの密度で懸濁し、９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に播種することにより、限界希釈法による単細胞分離を実施した。３７℃で２週間培養後、各プレートを顕微鏡で観察し、シングルコロニーの増殖を確認したウェルを拡大培養し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現するクローンである、３２−０５−０９株を得た。
【０２７７】
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産細胞へのｓｉＲＮＡ発現ベクターＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの導入
本実施例第１項で構築したｓｉＲＮＡ発現ベクターを、本実施例第２項の（１）で作製した３２−０５−０９株へ導入した。
【０２７８】
ｓｉＲＮＡ発現ベクターの３２−０５−０９株への導入は、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で培養中の３２−０５−０９株をダルベッコＰＢＳ（Ｋ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０６個／ｍｌとし、細胞懸濁液２００μｌ（１．８×１０６個）を本実施例第１項で調製した線状化プラスミド１０μｇと混和した。細胞−ＤＮＡ混和液をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移した後、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧０．３５ＫＶ、電気容量２５０μＦの条件で導入を行った。
【０２７９】
この細胞懸濁液を３０ｍｌの基本培地（１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および５０μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））に混和し、３枚の組織培養用９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に、１００μＬ／ウエルで分注した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後に培地を吸引除去し、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を１００μＬ／ウエルで分注した。引続き６日間培養後に培地を吸引除去し、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｒｉｎａｌｉｓ  Ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ）（Ｖｅｃｔｏｒ社製）と１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を１００μＬ／ウエルで分注した。引続き１０日間培養することにより生き残った株を取得した。なお、これら生き残った株については、実施例１．の（６）に記載のＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により、培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現を確認した。
【０２８０】
取得した株をトリプシン処理して培養器より剥離させ、組織培養用２４穴プレート（旭テクノグラス社製）へ移植し、１２ｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて５日間培養した。培養後、上記プレート各ウエル中の各株に対し、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、組織培養用フラスコ（旭テクノグラス社製）へ拡大培養を行いった。このようにして取得した、ｓｉＲＮＡ発現ベクターＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏ導入株の一株を３２−０５−０９−Ｈ１２株と名付けた。なお、３２−０５−０９−Ｈ１２株は、３２−０５−０９−Ｈ１２株の細胞名で、平成１５年３月２７日付けで独立法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３４５として寄託されている。
【０２８１】
３．ＧＤＰ−フコーストランスポーターを標的としたｓｉＲＮＡ＿ＧＦＴ＿Ｈ導入株におけるＧＤＰフコーストランスポーターｍＲＮＡ量の測定
本実施例第２項で得た３２−０５−０９−Ｈ１２株を１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した基本培地に３×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種して３日間培養した。トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し１２００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を除去した。ダルベッコＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度１２００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行った後、−８０℃で凍結した。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入していない親株３２−０５−０９株についても同様の操作を行い、凍結細胞を調製した。
【０２８２】
調製した凍結細胞を室温で融解後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し全ＲＮＡを抽出した。方法は添付の説明書に従った。全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、４０μｌの滅菌水に溶解した。
【０２８３】
得られた各々の全ＲＮＡ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０２８４】
次に、配列番号１に示したチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの塩基番号７９９番から１１０８番の領域を増幅するよう設計したプライマーセットｈ＿ＧＦＴ＿ｆｗ４（配列番号２７）およびｈ＿ＧＦＴ＿ｒｖ２（配列番号２８）を用い、１００倍に希釈したｃＤＮＡ溶液を鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、２０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅホットスタートバージョン（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号２７および配列番号２８）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて２分間のサイクルを３２サイクル行なった。ＰＣＲ溶液のうち、７ｕｌを１．７５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを１倍濃度のＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）に３０分間浸漬し染色し、フルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）でＰＣＲで増幅させたＤＮＡ量を測定することで、ＧＤＰ−フコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量を比較した。また、ＧＤＰ−フコーストランスポーターのｍＲＮＡ量を測定した際に鋳型として用いた一本鎖ｃＤＮＡと同量の一本鎖ｃＤＮＡを用い、ＷＯ００／６１７３９記載の競合的ＰＣＲによる転写量の定量方法に従い、β−アクチンｍＲＮＡ発現量についても測定し比較した。
【０２８５】
上記の方法により、３２−０５−０９株および３２−０５−０９−Ｈ１２株で発現するＧＤＰ−フコーストランスポーターとβ−アクチンのｍＲＮＡを比較した結果について第１２図に示した。独立した３回のＰＣＲにおいて、比較した２株の間でβ−アクチンのｍＲＮＡ量に変化はなかったが、３２−０５−０９−Ｈ１２株においてＧＤＰ−フコーストランスポーターｍＲＮＡの発現量が有意に減少していることが示された。
【０２８６】
４．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入株が生産する抗体組成物の取得
取得した３２−０５−０９−Ｈ１２株および３２−０５−０９株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の取得を以下の手順で行った。
【０２８７】
３２−０５−０９−Ｈ１２株を、１２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加した基本培地へ３×１０５個／ｍｌの密度で懸濁後、３０ｍｌを接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種し、１００％コンフルエントになるまで培養した３２−０５−０９株も、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ未添加基本培地を使用した以外は上記と同様に培養した。各株の培地全量を除去して、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を同量入れてから再度除去することで洗浄し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍｌへ交換した。さらに７日間培養後、各細胞懸濁液を回収した。懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて濾過した。
【０２８８】
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍｌを充填し、精製水３．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌを順次通筒した。さらに、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記濾過処理した培養上清３０ｍｌをカラムに通筒した後、０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１．２５ｍｌを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。始めに溶出する０．２５ｍｌの画分を廃棄し、次に得られる溶出画分１ｍｌを回収して２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）０．２ｍｌと混合して中和した。このようにして取得した抗体組成物を含む溶出液に対し、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
【０２８９】
５．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入株が生産する抗体組成物の単糖組成分析
本実施例第４項で精製した抗ＣＣＲ４キメラ化抗体に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７（１９８３）］に従って単糖組成分析を行った。第３表に各抗体の単糖組成比より計算される、全複合型糖鎖に占める、フコースを持たない複合型糖鎖の割合を示した。ｓｉＲＮＡ導入に供した親株３２−０５−０９株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖の割合が８％であったのに対し、ｓｉＲＮＡ導入株３２−０５−０９−Ｈ１２株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖は５６％となり、フコースを有さない糖鎖の割合が有為に上昇していることが示された。
【０２９０】
以上の結果より、ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡの導入により、宿主細胞の生産する抗体における複合型糖鎖のフコース修飾を制御できることが示された。
【０２９１】
【表４】
0004628679.tif 000010

【０２９２】
６．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入株が生産する抗体組成物の生物活性
本実施例第４項で精製した抗ＣＣＲ４キメラ化抗体の生物活性を、実施例１．の（７）に記載のＡＤＣＣ活性の測定方法および実施例１．の（６）に記載の抗原結合活性の測定方法に従って測定した。その結果を第３表に示す。親株３２−０５−０９株の生産する抗体とｓｉＲＮＡ導入株３２−０５−０９−Ｈ１２株が産生する抗体で抗原結合活性に違いは観察されなかったが、ＡＤＣＣ活性はｓｉＲＮＡ導入株３２−０５−０９−Ｈ１２株が産生する抗体の方が大幅に上昇していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２９３】
本発明によれば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失するように、ゲノムが改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫、該動物あるいは植物から抗体組成物を製造する方法、および該抗体組成物を含有する医薬を提供することができる。
【０２９４】
配列表フリーテキスト
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
<120> Cells in which activity of the protein involved in transportation
of GDP-fucose is reduced or lost
<130> P044079
<150> JP 2002-106952
<151> 2002-04-09
<160> 35
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1245
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 1
gaacttcacc caagccatgt gacaattgaa ggctgtaccc ccagacccta acatcttgga    60
gccctgtaga ccagggagtg cttctggccg tggggtgacc tagctcttct accaccatga   120
acagggcccc tctgaagcgg tccaggatcc tgcgcatggc gctgactgga ggctccactg   180
cctctgagga ggcagatgaa gacagcagga acaagccgtt tctgctgcgg gcgctgcaga   240
tcgcgctggt cgtctctctc tactgggtca cctccatctc catggtattc ctcaacaagt   300
acctgctgga cagcccctcc ctgcagctgg atacccctat cttcgtcact ttctaccaat   360
gcctggtgac ctctctgctg tgcaagggcc tcagcactct ggccacctgc tgccctggca   420
ccgttgactt ccccaccctg aacctggacc ttaaggtggc ccgcagcgtg ctgccactgt   480
cggtagtctt cattggcatg ataagtttca ataacctctg cctcaagtac gtaggggtgg   540
ccttctacaa cgtggggcgc tcgctcacca ccgtgttcaa tgtgcttctg tcctacctgc   600
tgctcaaaca gaccacttcc ttctatgccc tgctcacatg tggcatcatc attggtggtt   660
tctggctggg tatagaccaa gagggagctg agggcaccct gtccctcata ggcaccatct   720
tcggggtgct ggccagcctc tgcgtctccc tcaatgccat ctataccaag aaggtgctcc   780
cagcagtgga caacagcatc tggcgcctaa ccttctataa caatgtcaat gcctgtgtgc   840
tcttcttgcc cctgatggtt ctgctgggtg agctccgtgc cctccttgac tttgctcatc   900
tgtacagtgc ccacttctgg ctcatgatga cgctgggtgg cctcttcggc tttgccattg   960
gctatgtgac aggactgcag atcaaattca ccagtcccct gacccacaat gtatcaggca  1020
cagccaaggc ctgtgcgcag acagtgctgg ccgtgctcta ctatgaagag actaagagct  1080
tcctgtggtg gacaagcaac ctgatggtgc tgggtggctc ctcagcctat acctgggtca  1140
ggggctggga gatgcagaag acccaagagg accccagctc caaagagggt gagaagagtg  1200
ctattggggt gtgagcttct tcagggacct gggactgaac ccaag                  1245
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 2
Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu Arg Met Ala Leu
1               5                  10                  15
Thr Gly Gly Ser Thr Ala Ser Glu Glu Ala Asp Glu Asp Ser Arg Asn
20                  25                  30
Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu
35                  40                  45
Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu
50                  55                  60
Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr
65                  70                  75                  80
Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Thr Leu Ala
85                  90                  95
Thr Cys Cys Pro Gly Thr Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn Leu Asp Leu
100                 105                 110
Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met
115                 120                 125
Ile Ser Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr
130                 135                 140
Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly
165                 170                 175
Ile Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ala Glu
180                 185                 190
Gly Thr Leu Ser Leu Ile Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu
195                 200                 205
Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu Pro Ala Val
210                 215                 220
Asp Asn Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys
225                 230                 235                 240
Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Val Leu Leu Gly Glu Leu Arg Ala Leu
245                 250                 255
Leu Asp Phe Ala His Leu Tyr Ser Ala His Phe Trp Leu Met Met Thr
260                 265                 270
Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln
275                 280                 285
Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys
290                 295                 300
Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys
305                 310                 315                 320
Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Ser Ser
325                 330                 335
Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr Gln Glu Asp
340                 345                 350
Pro Ser Ser Lys Glu Gly Glu Lys Ser Ala Ile Gly Val
355                 360                 365
<210> 3
<211> 1095
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgaataggg cccctctgaa gcggtccagg atcctgcaca tggcgctgac cggggcctca    60
gacccctctg cagaggcaga ggccaacggg gagaagccct ttctgctgcg ggcattgcag   120
atcgcgctgg tggtctccct ctactgggtc acctccatct ccatggtgtt ccttaataag   180
tacctgctgg acagcccctc cctgcggctg gacaccccca tcttcgtcac cttctaccag   240
tgcctggtga ccacgctgct gtgcaaaggc ctcagcgctc tggccgcctg ctgccctggt   300
gccgtggact tccccagctt gcgcctggac ctcagggtgg cccgcagcgt cctgcccctg   360
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gccttctaca atgtgggccg ctcactcacc accgtcttca acgtgctgct ctcctacctg   480
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ctcttcctgc ccctgctcct gctgctcggg gagcttcagg ccctgcgtga ctttgcccag   780
ctgggcagtg cccacttctg ggggatgatg acgctgggcg gcctgtttgg ctttgccatc   840
ggctacgtga caggactgca gatcaagttc accagtccgc tgacccacaa tgtgtcgggc   900
acggccaagg cctgtgccca gacagtgctg gccgtgctct actacgagga gaccaagagc   960
ttcctctggt ggacgagcaa catgatggtg ctgggcggct cctccgccta cacctgggtc  1020
aggggctggg agatgaagaa gactccggag gagcccagcc ccaaagacag cgagaagagc  1080
gccatggggg tgtga                                                   1095
<210> 4
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu His Met Ala Leu
1                   5                  10                  15
Thr Gly Ala Ser Asp Pro Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asn Gly Glu Lys
20                  25                  30
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50                  55                  60
Ser Pro Ser Leu Arg Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr Gln
65                  70                  75                  80
Cys Leu Val Thr Thr Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ala
85                  90                  95
Cys Cys Pro Gly Ala Val Asp Phe Pro Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg
100                 105                 110
Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met Ile
115                 120                 125
Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr Asn
130                 135                 140
Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Ile
165                 170                 175
Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Val Asp Gln Glu Gly Ala Glu Gly
180                 185                 190
Thr Leu Ser Trp Leu Gly Thr Val Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu Cys
195                 200                 205
Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Thr Lys Val Leu Pro Ala Val Asp
210                 215                 220
Gly Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys Ile
225                 230                 235                 240
Leu Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg
245                 250                 255
Asp Phe Ala Gln Leu Gly Ser Ala His Phe Trp Gly Met Met Thr Leu
260                 265                 270
Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln Ile
275                 280                 285
Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys Ala
290                 295                 300
Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys Ser
305                 310                 315                 320
Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Met Met Val Leu Gly Gly Ser Ser Ala
325                 330                 335
Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Lys Lys Thr Pro Glu Glu Pro
340                 345                 350
Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Ser Ala Met Gly Val
355                 360             364
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400>5
gcaagcttcc gccatgaata gggcccctct gaagcgg                             37
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 6
gctctagatc acacccccat ggcgctcttc tcgc                                34
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 7
gcaagcttcc gccatggaga agccctttct gctgcgggca ttgcagatcg cgc           53
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 8
gctctagatc acacccccat ggcgctcttc tcgc                                34
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 9
gagatggagg tgacccagta gaga                                           24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 10
gagagagacg accagcgcga tctg                                           24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 11
gccattggct atgtgacagg actg                                           24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 12
gcagatcaaa ttcaccagt cccc                                            24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 13
gaacttcacc caagccatgt gac                                            23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 14
cttgggttca gtcccaggtc                                                20
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys
1               5                  10                  15
Pro Cys
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<220>
<400> 16
gcgcctaacc ttctataac                                                 19
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 17
gctctagaga attcaaggtc gggcaggaag agggcctatt tc                       42
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 18
cgggatcctt cacgtgtttc gtcctttcca caagatatat aaagcc                   46
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 19
cagatctgcg gccgcgagct                                                20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 20
cgcggccgca gatctgagct                                                20
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 21
cgggatccaa ggtcgggcag gaagagggcc tatttcc                             37
<210> 22
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 22
cggaattctt cacgtgtttc gtcctttcca caagatatat aaagcc                   46
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 23
cgcgcctaac cttctataac tttttg                                         26
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 24
gatccaaaaa gttatagaag gttaggcgcg                                     30
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 25
cgttatagaa ggttaggcgc tttttt                                         26
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 26
aattaaaaaa gcgcctaacc ttctataacg                                     30
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 27
tctggcgcct gactttctac aacaa                                          25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 28
accatcatgt tgctcgtcca ccaga                                          25
<210> 29
<211> 2609
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
gagccgaggg tggtgctgca ggtgcacccg agggcaccgc cgagggtgag caccaggtcc    60
ctgcatcagc caggacacca gagcccagtc gggtggacgg acgggcgcct ctgaagcggt   120
ccaggatcct gcgcatggcg ctgactggag tctctgctgt ctccgaggag tcagagagcg   180
ggaacaagcc atttctgctc cgggctctgc agatcgcgct ggtggtctct ctctactggg   240
tcacctccat ttccatggta ttcctcaaca agtacctgct ggacagcccc tccctgcagc   300
tggatacccc catttttgtc accttctacc aatgcctggt gacctcactg ctgtgcaagg   360
gcctcagcac tctggccacc tgctgccccg gcatggtaga cttccccacc ctaaacctgg   420
acctcaaggt ggcccgaagt gtgctgccgc tgtcagtggt ctttatcggc atgataacct   480
tcaataacct ctgcctcaag tacgtagggg tgcccttcta caacgtggga cgctcgctca   540
ccaccgtgtt caacgttctt ctctcctacc tgctgctcaa acagaccact tccttctatg   600
ccctgctcac ctgcggcgtc atcattggtg gtttctggct gggtatagac caagaaggag   660
ctgagggaac cttgtccctg acgggcacca tcttcggggt gctggccagc ctctgcgtct   720
ccctcaatgc catctatacc aagaaggtgc tccctgcagt agaccacagt atctggcgcc   780
taaccttcta taacaatgtc aatgcctgcg tgctcttctt gcccctgatg atagtgctgg   840
gcgagctccg tgccctcctg gccttcactc atctgagcag tgcccacttc tggctcatga   900
tgacgctggg tggcctgttt ggctttgcca tcggctatgt gacaggactg cagatcaaat   960
tcaccagtcc cctgacccat aacgtgtcag gcacggccaa ggcctgtgca cagacagtgc  1020
tggccgtgct ctactacgaa gagattaaga gcttcctgtg gtggacaagc aacctgatgg  1080
tgctgggtgg ctcctccgcc tacacctggg tcaggggctg ggagatgcag aagacccagg  1140
aggaccccag ctccaaagat ggtgagaaga gtgctatcag ggtgtgagct ccttcaggga  1200
gccagggctg agctcgggtg gggcctgccc agcacggaag gcttcccata gagcctactg  1260
ggtatggccc tgagcaataa tgtttacatc cttctcagaa gaccatctaa gaagagccag  1320
gttctttcct gataatgtca gaaagctgcc aaatctcctg cctgccccat cttctagtct  1380
tgggaaagcc ctaccaggag tggcaccctt cctgcctcct cctggggcct gtctacctcc  1440
atatggtctc tggggttggg gccagctgca ctctttgggc actggactga tgaagtgatg  1500
tcttactttc tacacaaggg agatgggttg tgaccctact atagctagtt gaagggagct  1560
gtgtaacccc acatctctgg ggccctgggc aggtagcata atagctaggt gctattaaca  1620
tcaataacac ttcagactac ctttggaggc agttgggagc tgagccgaga gagagagatg  1680
gccattctgc cctcttctgt gtggatgggt atgacagacc aactgtccat ggggtgactg  1740
acacctccac acttcatatt ttcaacttta gaaaaggggg agccacacgt tttacagatt  1800
aagtggagtg atgaatgcct ctacagcccc taaccccact ttccctgcct ggcttctctt  1860
ggcccagaag ggccaccatc ctgttctcca acacctgacc cagctatctg gctatactct  1920
ctttctgtac tcccttcccc ttcccccccc cattagcctc ctccccaaca cctccatctt  1980
caggcaggaa gtggggtcca ctcagcctct gttcccatct gcttggaccc ctgagcctct  2040
catgaaggta ggcttatgtt ctctgaggct ggggccggag gagcgcactg attctcggag  2100
ttatcccatc aggctcctgt cacaaaatag cctaggccgt gtgtctaaga acagtggagg  2160
ttggcttata actgttctgg gggcagcgaa gcccacatca aggtactcat agacccagta  2220
tttctgagga aacccctgtc cacatcctca cttggtaaag gcacagataa tctccctcag  2280
gcctcttgta taggagcact agccctggga gggctccgcc ccatgacctg atcaccccaa  2340
agccttcaac agaaggattc caacatgaat ttggggacag aagcactcag accacgatgc  2400
ccagcaccac accctcctat cctcagggta gctgtcactg tcctagtccc ttctgtttgg  2460
ccttttgtac cctcatttcc ttggcgtcat gtttgatgtc tttgtctctt tcgtgagaag  2520
atggggaaac catgtcagcc tctgcttccg acttcccatg ggttctaatg aagttggtgg  2580
ggcctgatgc cctgagttgt atgtgattt                                    2609
<210> 30
<211> 1053
<212> DNA
<213> Rattus norvegiucus
<400> 30
atggcgctga ctggagcctc tgctgtctct gaggaggcag acagcgagaa caagccattt    60
ctgctacggg ctctgcagat cgcgctggtg gtttctctct actgggtcac ctccatctcc   120
atggtattcc tcaacaagta cctgctggac agcccctccc tgcagctgga tacccccatc   180
ttcgtcacct tctaccaatg cctggtgacc tcactgctgt gcaagggcct cagcactctg   240
gccacctgct gccctggcat ggtagacttc cccaccctaa acctggacct caaggtggcc   300
cgaagtgtgc tgccgctgtc cgtggtcttt atcggcatga taaccttcaa taacctctgc   360
ctcaagtacg tgggggtggc cttctacaac gtgggacgct cgctcactac cgtgttcaat   420
gtgcttctct cctacctgct gcttaaacag accacttcct tttatgccct gctcacctgt   480
gccatcatca ttggtggttt ctggctggga atagatcaag agggagctga gggcaccctg   540
tccctgacgg gcaccatctt cggggtgctg gccagcctct gtgtctcact caatgccatc   600
tacaccaaga aggtgctccc tgccgtagac cacagtatct ggcgcctaac cttctataac   660
aacgtcaacg cctgtgtgct cttcttgccc ctgatggtag tgctgggcga gctccatgct   720
ctcctggcct tcgctcatct gaacagcgcc cacttctggg tcatgatgac gctgggtgga   780
ctcttcggct ttgccattgg ctatgtgaca ggactgcaga tcaaattcac cagtcccctg   840
acccataatg tgtcgggcac agccaaggcc tgtgcacaga cagtgctggc tgtgctctac   900
tatgaagaga ttaagagctt cctgtggtgg acaagcaact tgatggtgct gggtggctcc   960
tctgcctaca cctgggtcag gggctgggag atgcagaaga cccaggagga ccccagctcc  1020
aaagagggtg agaagagtgc tatcggggtg tga                               1053
<210> 31
<211> 360
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 31
Met Ala Leu Thr Gly Val Ser Ala Val Ser Glu Glu Ser Glu Ser Gly
1               5                  10                  15
Asn Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser
20                  25                  30
Leu Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu
35                  40                  45
Leu Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe
50                  55                  60
Tyr Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Thr Cys Cys Pro Gly Met Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn Leu Asp
85                  90                  95
Leu Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly
100                 105                 110
Met Ile Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Pro Phe
115                 120                 125
Tyr Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser
130                 135                 140
Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys
145                 150                 155                 160
Gly Val Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ala
165                 170                 175
Glu Gly Thr Leu Ser Leu Thr Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser
180                 185                 190
Leu Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu Pro Ala
195                 200                 205
Val Asp His Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala
210                 215                 220
Cys Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Ile Val Leu Gly Glu Leu Arg Ala
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Phe Thr His Leu Ser Ser Ala His Phe Trp Leu Met Met
245                 250                 255
Thr Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu
260                 265                 270
Gln Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala
275                 280                 285
Lys Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Ile
290                 295                 300
Lys Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Ser
305                 310                 315                 320
Ser Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr Gln Glu
325                 330                 335
Asp Pro Ser Ser Lys Asp Gly Glu Lys Ser Ala Ile Arg Val
340                 345                 350
<210> 32
<211> 350
<212> PRT
<213> Rattus norvegiucus
<400> 32
Met Ala Leu Thr Gly Ala Ser Ala Val Ser Glu Glu Ala Asp Ser Glu
1               5                  10                  15
Asn Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser
20                  25                  30
Leu Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu
35                  40                  45
Leu Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe
50                  55                  60
Tyr Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Thr Cys Cys Pro Gly Met Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn Leu Asp
85                  90                  95
Leu Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly
100                 105                 110
Met Ile Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe
115                 120                 125
Tyr Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser
130                 135                 140
Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ile Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ala
165                 170                 175
Glu Gly Thr Leu Ser Leu Thr Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser
180                 185                 190
Leu Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu Pro Ala
195                 200                 205
Val Asp His Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala
210                 215                 220
Cys Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Val Val Leu Gly Glu Leu His Ala
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Phe Ala His Leu Asn Ser Ala His Phe Trp Val Met Met
245                 250                 255
Thr Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu
260                 265                 270
Gln Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala
275                 280                 285
Lys Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Ile
290                 295                 300
Lys Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Ser
305                 310                 315                 320
Ser Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr Gln Glu
325                 330                 335
Asp Pro Ser Ser Lys Glu Gly Glu Lys Ser Ala Ile Gly Val
340                 345                 350
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 33
gcgccuaacc uucuauaac                                                 19
<210> 34
<211> 7752
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 34
agcgttgcaa gttcagccga gggtggtgct gcaggtgcac ccgagggcac cgccgagggt       60
gagcaccagg tccctgcatc agccaggaca ccagagccca gtcgggtgga cggacggtac      120
gttctggaag ggaaagggcc ccgggaaggg gatacagcat tgagaagctc agaggctttg      180
gtctgggcat ccagaatgga ctttatctgg aggaggtgac atggcttctc gcctctggaa      240
gtgctgcttg gatctccggg acttcatgtc ctgactaggt ctggaagcgg tgaaaatagg      300
ggtaggaaaa aaggagagga ctgcaacaag gtcttcccga gtggcctgag ctcgagggac      360
gagggaggtg caacggtggg gagccgggcg caagggctgg gcggagggag ggggggggtc      420
tccctaagca gaaaggtggt attccatttt ctgggtagat ggtgaagatg cacctgaccg      480
agtctggtcg atctgaagat atcaggggaa aagatagtgc gggtggaggg gagaatgaca      540
gaaccttcca gaaaatggga gaggctatag cacttgcaaa cccttccctg atctccgggg      600
actcccggaa gaagagggca ggtctgtggg cataggtgca gacttgccgg ggagctcttg      660
acggccgcgg gaagtggcaa cggcctgcga gctggccctt taaggcggct cgtaggcgtg      720
tcaggaaatg cgcgcagggc ccgccctgct cggtaagtgg cccgggaccc gcgtcgctga      780
gccggaactt gaattcggct cgtggcaacc gcagggcctt gctccggtca ggcccctgtc      840
cgtgtccctc gagacgcctt cctgagcctc ggtgatctcc ctgcagcacg ccctcctttc      900
ggctctgcgg gtgcttccgg gggttcccgc agcccatgct tcccacgcgg tccgcgtcca      960
gttatttcct cctccgctcc gtccttcctt cgctctctcg cttcctttct ccctgcgact     1020
cacgtgtccc ctgtcctcaa actggccatg gctgtcaaag cccacatcct tagttaggcc     1080
ccttctccct tccctgggtc ttgtttcgtg acaccacctc cctcccccgc cccgggagcg     1140
agcaagatga ggagcggtgc acctcggcaa atccggaagc agaacttcat ccaagaagga     1200
ggggaccgat aggtcatccc atgtgacagt tgaaggctgc agccacagac cctagctgct     1260
tgaagccctg tagtccaggg actgcttctg gccgtaaggt gacccagctc ttctgccacc     1320
atgaacaggg cgcctctgaa gcggtccagg atcctgcgca tggcgctgac tggagtctct     1380
gctgtctccg aggagtcaga gagcgggaac aagccatttc tgctccgggc tctgcagatc     1440
gcgctggtgg tctctctcta ctgggtcacc tccatttcca tggtattcct caacaagtac     1500
ctgctggaca gcccctccct gcagctggat acccccattt ttgtcacctt ctaccaatgc     1560
ctggtgacct cactgctgtg caagggcctc agcactctgg ccacctgctg ccccggcatg     1620
gtagacttcc ccaccctaaa cctggacctc aaggtggccc gaagtgtgct gccgctgtca     1680
gtggtcttta tcggcatgat aaccttcaat aacctctgcc tcaagtacgt aggggtgccc     1740
ttctacaacg tgggacgctc gctcaccacc gtgttcaacg ttcttctctc ctacctgctg     1800
ctcaaacaga ccacttcctt ctatgccctg ctcacctgcg gcgtcatcat tggtgagtgg     1860
gactgggggc gtggggagca ggaatcgtaa agatcaatac cacattactc attatctgtc     1920
ccaggtcttt tgcaccacca gtcataggga gagacctgta gagaacaaat aacttcctta     1980
ctgtgactca gtaagttagg gatccagcca aggtgaacat aataatgtta ggcagacact     2040
acagcaaagc cagccagaca ctcagatcta gctaagcatt tgagccatgt taatgtaacg     2100
gatccccatt acaaggtata atatagctgc gttttatgga gagaaaccca aggcacagag     2160
aagctaagta gctgggatca cacaggtaat cactgacgta gcagaaattt gcacataagc     2220
agttacctcc ataggttaca ctcttgacca acacaccact gttctcaaga ggtcaagggt     2280
gaactcaggt catcacaatt ggcacaagta cctctaccca ctgagccatt tcagtggtcc     2340
agtcaatatg tgtgtgcttt aagaggcttt aactaccttc tcagatgtga ccataagtaa     2400
ttaattaccg ataggagcgt tgtgctgatc attacacttg tagcatcctc tttattgtac     2460
ccataagctc tctgagtggc ggcatctctg tgaaactgca gctcggagag gctgcgctcc     2520
ttgccacagc cccacaacta agaagcagat agtctgggac gcagtcccca gttggtcata     2580
ctccctggcc tgtgtttcaa gccagtctgc tttgctcctg acccttggga gttagcgcaa     2640
tgaaaaccaa cactatcact acagtctaaa tgtgctttta aatgaaagcc caggaacttt     2700
gaagcatccg gccccttaac ggcagccact atgtcctgat tccgccaaca tcttttcagt     2760
gcccggcagt cacatggagc aagggcctct tggcttggac agcatgtgtt agggaacatg     2820
tttgccactt tgaatgaatt tagtggctgc tgggttacag agaccagggc atctttcccc     2880
tcagagtcct gaatgaacga aaagcaacct tcatttgtac ctgctctgga ttttagttcg     2940
tcttgtttgg cctatttaga tgtccctggt gtctctgagg cccaggctgg gtgctctaga     3000
tgtagggacc aggccaacct gtactgtctt ccctagaaac attgccctgg ttgggcagct     3060
cctggatcca gggttaaggg gtctgggcgg agagaggtca gatagtggca ggatgcctcc     3120
cactgccccc acatacatac cctaagagat ctggtactcc tccttccagc ctacaagcta     3180
ccgtggggtc ccacttcagt ccaccagccc tgccaacgtt agaggggatg ggcctcctag     3240
taggagaact tacatgcagg aaggtacagt ctctggagaa cctgagcccg ggtccccaaa     3300
gggacaagta gctgatagtg aggcagctga gccccatggc ggcctgccca agtggcacgg     3360
gaaagtggag ctctctgctg cccccactac tggccccatc tcttggctct cccctccctt     3420
cctcctgtgg agaaggccca tctctggaaa ggcctcctag acatgcggca ctttgcaaag     3480
cctgtcgggc tcacagcccc tctagggtct aggaccttga gaatgaagaa tggagtcact     3540
tctagactct agtggtaacc accaggaggt acagggtgct ctgactgtgc agggaaaccc     3600
accgtgggct ctgctgagcc aagtgcctgt gaggctggag agtctggtgc ccttgttctg     3660
agatagcatc ttgctatgtt gccctcaagt cccaggcaac tggggctgca ggagcaccac     3720
cttgcctctc tccagcttct tgaagacttg tacctttctc ctagcagtct ctatctgctc     3780
tcactccatc cattgagcag ctattagctt gtggccaagt attttccagg ccctgtactg     3840
agttttaggg tacaagtttg agaaaggaag ggtggggtcc ttgctcctgg tccgtgaatg     3900
atgttgatgg cagaaacgat agttacacta gatgctaagg gctgtgggta tctagaggga     3960
gcagggagca tgtgggataa cctgagcagg cctagctgaa aagtcattgc tggcatgaga     4020
ctgctccagt agtacaggct gggaacacac atttgaatgt ttcctgaaga cagttgggag     4080
ccacaggaaa tatccactgt agaaagatta tttagttgta agacagagta gtagattggt     4140
taacatagta gcaaaaacgt ggccccagtt tttacagatg aagggaattg gaactcagag     4200
aggttaagta acttctccca agcagctcag ctacaaaaat cacagaacag gcaggggcct     4260
gatggctctg atgcctgtgc tggtcccact attccatgtt gctaattcct gcagcagcag     4320
taaacctctg ccttgtggaa atgaggagtc taaataaaga gaccatagca ttgccacaag     4380
caggtttcta ccaactgggg gtggcaagga atgctgtgtt agcagcagga agctgggaag     4440
aggctgagta ctggggggat gaggaaggga tccccaggag aggctgactt tggccttgaa     4500
gaatggtgga gtccctggaa agatgcagat acacagagct ctgtggatat acagagaagt     4560
ggggagctaa gtaggtggct tggggccatc atgtgacaga ggaagtcggg ctagatgcag     4620
gaagcccggt gctgtggcct agggagccat gtaggttctt tgagcagggg gcgggggggg     4680
gggggggtga cccaggagtg actgtaaaca acatcaggcc atgagcagct ctgacctaat     4740
gttctcacca agggagccag aaccaaggct tagagccctg tcccttttta gtgtccaagg     4800
tcactttact ggccctcttc ctttacagct gttggccccc acaggccatc aggcacctat     4860
gctattttat tttatagcct tcattacaat gactacaatt gtaattagag agttgacagg     4920
gtcacatctg tccttatata ttccccctct gctaagttct gcctgggaga atgtggaggg     4980
tattggtgaa atttggggaa gttataaccc ccccacccct gcccccaccc cctgctttgc     5040
tccctttatc tgcagggcat ttctgtgccc actttagccc atatagctcc caaataaatg     5100
acacagaaac ctggtatttt cattaacaaa ctgctggcac tctgctgggc aggttctgag     5160
ctgttctaac cctctaagct gctaatgccc agatagatgc cccaatgctt gccatccgag     5220
tctttctctg gcttgctctg ctccatgtgt gacctcatgg tgaatcctcc tgatttcccc     5280
acatggcctc tccacacttt tccttctccc ctctctctac cagggaccct ctcactggga     5340
cccgatgtcc catctgtact gtcctctccc acccagtcat aggctgattg agtctttatt     5400
aaccaatcag agatgatgga aaaacagttt ttacatagca ctgaggatgg agatgcttga     5460
cccttgagat gcttgcccgt aacctgtact gtatccagat gtctgggccc ccaaatcagc     5520
aggtgaatac acagtacaca ggactgaccc ccaacagagg gggaacacag gttctcactc     5580
tgggctccac gccctcggcc ctttcttagt gcaggggtta gactttgtat gtgttgatga     5640
tgaggtaagg gccatggaac agtcagaacg gtggtgtcag aatcctgtcc ctctccctcc     5700
tgtcctcatc cctccttacc gtgtcactct tctgtctgtt gcaggtggtt tctggctggg     5760
tatagaccaa gaaggagctg agggaacctt gtccctgacg ggcaccatct tcggggtgct     5820
ggccagcctc tgcgtctccc tcaatgccat ctataccaag aaggtgctcc ctgcagtaga     5880
ccacagtatc tggcgcctaa ccttctataa caatgtcaat gcctgcgtgc tcttcttgcc     5940
cctgatgata gtgctgggcg agctccgtgc cctcctggcc ttcactcatc tgagcagtgc     6000
ccacttctgg ctcatgatga cgctgggtgg cctgtttggc tttgccatcg gctatgtgac     6060
aggactgcag atcaaattca ccagtcccct gacccataac gtgtcaggca cggccaaggc     6120
ctgtgcacag acagtgctgg ccgtgctcta ctacgaagag attaagagct tcctgtggtg     6180
gacaagcaac ctgatggtgc tgggtggctc ctccgcctac acctgggtca ggggctggga     6240
gatgcagaag acccaggagg accccagctc caaagatggt gagaagagtg ctatcagggt     6300
gtgagctcct tcagggagcc agggctgagc tcgggtgggg cctgcccagc acggaaggct     6360
tcccatagag cctactgggt atggccctga gcaataatgt ttacatcctt ctcagaagac     6420
catctaagaa gagccaggtt ctttcctgat aatgtcagaa agctgccaaa tctcctgcct     6480
gccccatctt ctagtcttgg gaaagcccta ccaggagtgg cacccttcct gcctcctcct     6540
ggggcctgtc tacctccata tggtctctgg ggttggggcc agctgcactc tttgggcact     6600
ggactgatga agtgatgtct tactttctac acaagggaga tgggttgtga ccctactata     6660
gctagttgaa gggagctgtg taaccccaca tctctggggc cctgggcagg tagcataata     6720
gctaggtgct attaacatca ataacacttc agactacctt tggaggcagt tgggagctga     6780
gccgagagag agagatggcc attctgccct cttctgtgtg gatgggtatg acagaccaac     6840
tgtccatggg gtgactgaca cctccacact tcatattttc aactttagaa aagggggagc     6900
cacacgtttt acagattaag tggagtgatg aatgcctcta cagcccctaa ccccactttc     6960
cctgcctggc ttctcttggc ccagaagggc caccatcctg ttctccaaca cctgacccag     7020
ctatctggct atactctctt tctgtactcc cttccccttc ccccccccat tagcctcctc     7080
cccaacacct ccatcttcag gcaggaagtg gggtccactc agcctctgtt cccatctgct     7140
tggacccctg agcctctcat gaaggtaggc ttatgttctc tgaggctggg gccggaggag     7200
cgcactgatt ctcggagtta tcccatcagg ctcctgtcac aaaatagcct aggccgtgtg     7260
tctaagaaca gtggaggttg gcttataact gttctggggg cagcgaagcc cacatcaagg     7320
tactcataga cccagtattt ctgaggaaac ccctgtccac atcctcactt ggtaaaggca     7380
cagataatct ccctcaggcc tcttgtatag gagcactagc cctgggaggg ctccgcccca     7440
tgacctgatc accccaaagc cttcaacaga aggattccaa catgaatttg gggacagaag     7500
cactcagacc acgatgccca gcaccacacc ctcctatcct cagggtagct gtcactgtcc     7560
tagtcccttc tgtttggcct tttgtaccct catttccttg gcgtcatgtt tgatgtcttt     7620
gtctctttcg tgagaagatg gggaaaccat gtcagcctct gcttccgact tcccatgggt     7680
tctaatgaag ttggtggggc ctgatgccct gagttgtatg tgatttaata aaaaaaaaat     7740
ttttttaaaa ac                                                         7752
<210> 35
<211> 4039
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 35
gaacttcacc caagccatgt gacaattgaa ggctgtaccc ccagacccta acatcttgga        60
gccctgtaga ccagggagtg cttctggccg tggggtgacc tagctcttct accaccatga       120
acagggcccc tctgaagcgg tccaggatcc tgcgcatggc gctgactgga ggctccactg       180
cctctgagga ggcagatgaa gacagcagga acaagccgtt tctgctgcgg gcgctgcaga       240
tcgcgctggt cgtctctctc tactgggtca cctccatctc catggtattc ctcaacaagt       300
acctgctgga cagcccctcc ctgcagctgg atacccctat cttcgtcact ttctaccaat       360
gcctggtgac ctctctgctg tgcaagggcc tcagcactct ggccacctgc tgccctggca       420
ccgttgactt ccccaccctg aacctggacc ttaaggtggc ccgcagcgtg ctgccactgt       480
cggtagtctt cattggcatg ataagtttca ataacctctg cctcaagtac gtaggggtgg       540
ccttctacaa cgtggggcgc tcgctcacca ccgtgttcaa tgtgcttctg tcctacctgc       600
tgctcaaaca gaccacttcc ttctatgccc tgctcacatg tggcatcatc attggtgagt       660
ggggcccggg ggctgtggga gcaggatggg catcgaactg aagccctaaa ggtcaacact       720
gtaggtacct ttacttactg tcccaggtcc cttgcatcag cagttacagg aagagccctg       780
tagaaaacaa ataacttcct tatggtcatt caacaagtta gggacccagc cagggtgaaa       840
ataatgttag cagcaactac agcaaagatg gctctcgcca cttgcatgat taaaatgtgc       900
caggtactca gatcyaagca ttggatccac attaactcaa ctaatcccta ttacaaggta       960
aaatatatcc gaattttaca gagggaaaac caaggcacag agaggctaag tagcttgacc      1020
aggatcacac agctaataat cactgacata gctgggattt aaacataagc agttacctcc      1080
atagatcaca ctatgaccac catgccactg ttccttctca agagttccag gatcctgtct      1140
gtccagttct ctttaaagag gacaacacat ctgacattgc taccttgagg taacatttga      1200
aatagtgggt agacatatgt tttaagtttt attcttrctt tttatgygtg tgtgtttggg      1260
gggccaccac agtgtatggg tggagataag gggacaactt aagaattggt cctttctccc      1320
accacatggg tgctgaggtc tgaactcagg tcatcaggat tggcacaaat ccctttaccc      1380
actgagccat ttcactggtc caatatatgt gtgcttttaa gaggctttaa ctattttccc      1440
agatgtgaat gtcctgctga tcattatccc cttttacccg gaagccctct gggaggtgcc      1500
atccctgtgg tcgtctgcat acaaatgggg aaactgcaac tcagagaaac aaggctactt      1560
gccagggccc cacaagtaag ataggctggg atgccatccc agactggcca cactccctgg      1620
cctgtgcttc aagccagttt actttgttcc tgcccattgg aagttagcat gttgcagtca      1680
aacacaataa ctacaggcca aaagtgcttt taaattaaag tcagatgaac ttttaaacat      1740
ccagagctcc tcaactgcag gagttacaac ctgattctgc aaccatcttt gcagtgcccg      1800
gtagtcatat gtagctagag gctcttggct aggacagcat gtgttaggaa acatctggcc      1860
ctgagatcat tgaattgagt gactgctggg tgacaaagac caaggcatcc gttccctgag      1920
agtcctgggc aagcagcaat gtgaccttca tttgtaccta ctcaggttct ttatctgtcc      1980
tgtttgacct acttagtctc ctctggtgtc tcagaggccc aggctgggta ctctggatgt      2040
caggatcagg ccaatgcgca catctgccct agaaatgtcc ccctggttga gcagctcctg      2100
aatccatcgg taaagggtct ggaccaggga ggagtcagat aaaaagctga cagcactggg      2160
ggactccatg gggaactccc acctgccccc acacatccat cctaagagaa ctggtattcc      2220
ttgtttcctc tttgtcctac aaggcaccct gggatcccac ttcagtctcc cagccttgcc      2280
agggttagag ggcatgagcc tccttgtggg gaatttagat gcaagaaggt acagtcacta      2340
gagaacctga gctcagatcc ccaaagtaac cagtacctga tagtgaggca gctgagaacc      2400
gcagcagcct gcctgagtgg ctgaactctg cggcctccgg aactggcccc aactgttggg      2460
tctcctcttc cttcctcctg tgagggaggg cccatctctg ataagtgctg tggggactct      2520
agagtaggga ggaggaggag caatctaagc aggccttact gagaagtcct tgctggcatg      2580
tggctgcctg aggagtacag actgggaaca cccatttgaa tgagtaaggt ttttcctgaa      2640
ggccatgggg agccacggag gaaaatcatt ttagttacaa gacaaagagt agattggtta      2700
acatgggagc arggacatgg ccccaatttt cattgatgaa ggaaattgga actcrgagag      2760
gttaagtaac ttctcccaaa tagctcagct tcataatcac agaacagtca gagtctagat      2820
ctctctgatg cctgtgatgg tcctgccatt ccatgttgct gatccctgtg gcatcagtaa      2880
gcctctacct tgtgggaatg caggatctaa atgaagagag raagtgctgg ccccatgctg      2940
tggtctggaa agctatgcag gctctttgag cagagagtga cccacaagtg aatagagtcc      3000
tatgagactc aaagcaacat ccacccttaa gcagctctaa ccaaatgctc acactgaggg      3060
agccaaagcc aagttagagt cctgtgcttg cccaaggtca ctttgcctgg ccctcctcct      3120
atagcacccg tgttatctta tagccctcat tacagtgatt acaattataa ttagagaggt      3180
aacagggcca cactgtcctt acacattccc ctgctagatt gtagctggga gagggggaga      3240
tgtaggtggc tgggggagtg ggagggaaga tgcagatttt cattctgggc tctactccct      3300
cagccatttt ttggtgtggg agttagactt tggatatgtt gatgatgagg taagggccac      3360
agaacagtct gaactgtggt atcagaatcc tgtccctctc cctctctcct catccctctt      3420
caccttgtca ctcctctgtc tgctacaggt ggtttctggc tgggtataga ccaagaggga      3480
gctgagggca ccctgtccct cataggcacc atcttcgggg tgctggccag cctctgcgtc      3540
tccctcaatg ccatctatac caagaaggtg ctcccagcag tggacaacag catctggcgc      3600
ctaaccttct ataacaatgt caatgcctgt gtgctcttct tgcccctgat ggttctgctg      3660
ggtgagctcc gtgccctcct tgactttgct catctgtaca gtgcccactt ctggctcatg      3720
atgacgctgg gtggcctctt cggctttgcc attggctatg tgacaggact gcagatcaaa      3780
ttcaccagtc ccctgaccca caatgtatca ggcacagcca aggcctgtgc gcagacagtg      3840
ctggccgtgc tctactatga agagactaag agcttcctgt ggtggacaag caacctgatg      3900
gtgctgggtg gctcctcagc ctatacctgg gtcaggggct gggagatgca gaagacccaa      3960
gaggacccca gctccaaaga gggtgagaag agtgctattg gggtgtgagc ttcttcaggg      4020
acctgggact gaacccaag                                                   4039
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体とＣＣＲ４部分ペプチドとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果を示したものである。グラフの縦軸は、ＣＣＲ４部分ペプチドとの結合活性を波長４９０ｎｍにおける吸光度で示している。横軸は抗ＣＣＲ４キメラ抗体の反応液中の濃度を示している。▲はＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体、■はＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体の抗原結合活性を示す。
第２図は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を抗体濃度を変化させて測定した結果を示したものである。グラフの縦軸に細胞障害活性、横軸に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の反応液中の濃度をそれぞれ示す。▲はＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体、■はＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体の活性をそれぞれ示す。
第３図は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第４図は、チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターの非翻訳部分および隣接する翻訳領域の塩基配列を示した図である。全長ｃＤＮＡ取得のために設計したプライマー部分を下線で示す。翻訳領域の塩基配列下部に塩基配列より推定されるアミノ酸配列を示す。
第５図は、プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅの構築工程を示す図である。
第６図は、プラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩの構築工程を示す図である。
第７図は、プラスミドＵ６＿＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅの構築工程を示す図である。
第８図は、プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築工程を示す図である。
第９図は、プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築工程を示す図である。
第１０図は、プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈの構築工程を示す図である。
第１１図は、プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築工程を示す図である。
第１２図は、ｓｉＲＮＡ発現によるβ−アクチンとＧＤＰ−フコーストランスポーターの発現量の変化を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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