(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0004627881.tif 000034
［式中、Ａは置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｒaは−ＣＯ−ＮＲｓＲｔであり、ここにＲｓおよびＲｔはそれぞれ独立して水素、アルキル、置換アルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロサイクリルまたは置換されていてもよいヘテロサイクリルアルキル基であるか、あるいはＲｓおよびＲｔはそれらが結合している窒素と一緒になってヘテロサイクリル基を形成し；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してハロゲンであり；
Ｒ３は水素、アルカノイル、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、カルボアルコキシアルキル、カルバモイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルである］
で示される化合物またはその塩またはその溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１が５−クロロであり、Ｒ２が６−クロロである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３が水素である請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ＲｓおよびＲｔがそれぞれ独立してＣ１−６アルキル基である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒｓが置換されていてもよいヘテロサイクリルまたはアリールである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒｓが置換されていてもよいピペリジニル基である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒｓが１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル基または２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イルである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒｓが置換されていてもよいヘテロサイクリルアルキル基である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒｓが置換されていてもよいピペラジニル−Ｃ１−６アルキル基である請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
ヘテロサイクリル基に存在していてもよい置換基がヒドロキシフェニルまたはクロロフェニル基から選択される請求項８または９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒｔが水素である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−２−メトキシ−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）ベンズアミド；
２−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）ベンズアミド；
３−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−［３−［４−（３−クロロフェニル）ピペラジニル］プロピル］−ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−［３−［４−（３−ヒドロキシフェニル）ピペラジニル］プロピル］−ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）−ベンズアミド；
４−（５，６−ジクロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチルベンズアミド；および
４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチルベンズアミド；またはそれらの塩、またはそれらの溶媒和物
から選択される化合物。
【請求項１３】
請求項１記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩またはその溶媒和物の製造方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
0004627881.tif 000035
［式中、Ａは式（Ｉ）に関する定義と同じであり、Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’はそれぞれ式（Ｉ）に関して定義されたＲ１、Ｒ２およびＲ３であるか、あるいはまたはその保護形態である］
で示される化合物をアミド化し、ついで、必要ならば下記反応：
（ｉ）式（Ｉ）の化合物を別の式（Ｉ）の化合物に変換すること；
（ｉｉ）保護基を除去すること；
（ｉｉｉ）そのようにして得られた化合物の塩または溶媒和物を得ること
の１つまたはそれ以上を行うことを含む方法。
【請求項１４】
請求項１記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物ならびに医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
活性治療物質として使用される請求項１記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物。
【請求項１６】
骨粗鬆症または関連オステオペニー疾患の治療および／または予防に使用される請求項１記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物。
【請求項１７】
骨粗鬆症および関連オステオペニー疾患の治療および／または予防のごとき、哺乳動物における破骨細胞の過剰活性に関連した疾患を治療および／または予防するための医薬の製造のための、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物の使用。
【請求項１８】
腫瘍、ウイルスによる症状、潰瘍、自己免疫性疾患および移植における治療のための医薬の製造、ならびに高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化、エイズおよびアルツハイマー病、脈管形成性疾患を治療および／または予防するための医薬の製造のための、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物の使用。
【請求項１９】
請求項１記載の化合物であって、該化合物中の各々のヘテロサイクリル基が独立して飽和または不飽和の単環式または縮合環式の複素環基であり、各環は５ないし８個の環の原子を有し、該環の原子はＯ、Ｓ、またはＮから選択される１、２または３個の異種原子を含み、該化合物中の各々の置換基が独立してアルキル、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、アルキルカルボニル、シアノ、ニトロならびにＲｕおよびＲｖがそれぞれ独立して水素、アルキルおよびアルキルカルボニルを示すＮＲｕＲｖ、から選択される３個までの置換基を含むものである、化合物。
【請求項２０】
Ａがアルキル、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、アルキルカルボニル、シアノ、ニトロならびにＲｕおよびＲｖがそれぞれ独立して水素、アルキルおよびアルキルカルボニルを示すＮＲｕＲｖ、から選択される３個までの置換基によって置換されていてもよいフェニルである、請求項１記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒｔが水素またはアルキルを示す、請求項１記載の化合物。
【請求項２２】
アリールがフェニルまたはナフチルである、請求項１記載の化合物。
【請求項２３】
請求項１の化合物であって、該化合物中のＲｓが水素、アルキル、２−（ジアルキルアミノ）エチル、３−（ジアルキルアミノ）プロピル、４−（ジアルキルアミノ）ブチル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロサイクリル、または置換されていてもよいヘテロサイクリルアルキル基であって、該ヘテロサイクリルアルキル基の部分を形成しているヘテロサイクリル基が５ないし８個の環の原子を有し、該環の原子がＯ、Ｓ、もしくはＮから選択される１、２もしくは３個の異種原子を含み、置換されていてもよいアリール基で置換されていてもよい飽和単環式複素環基であるヘテロサイクリルアルキル基を示す、化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ある種の新規化合物、かかる化合物の製造方法、かかる化合物を含む医薬組成物ならびにかかる化合物および組成物の医学における使用に関する。
【０００２】
骨量の低下に関連した疾患は、破骨細胞の過剰活性により引き起こされることが知られている。ある種の化合物、通常にはバフィロマイシンに関連した化合物かかる疾患の治療に有用であることも知られている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９１／０６２９６号には、骨の疾患の治療のためのある種のバフィロマイシンマクロライドが開示されている。
【０００３】
しかしながら、バフィロマイシン誘導体はヒトにおいて破骨細胞に対して選択的でない。それゆえ、これらの化合物の使用は、他の必須ｖ−ＡＴＰａｓｅの全身的なブロックによる許容できない毒性を伴う。実際、現在に至るまで、ヒトの破骨細胞に選択的な治療は知られていない。
【０００４】
破骨細胞の選択阻害のための治療標的の性質が議論の余地のあるものでなので、ヒトにおける骨量の低下に関連した疾患に対するよい治療を探すことは困難である。かくして、Baronら（国際特許出願公開第ＷＯ９３／０１２８０号）は、特別な液胞ＡＴＰａｓｅ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）が破骨細胞中において潜在的に有効な治療標的であると同定されたことを示している。しかしながら、Baronの研究はニワトリにおいて行われたものであり、Hallら（Bone and Mineral 27, 159-166, (1994)）は哺乳動物に関連した研究において、トリの破骨細胞Ｖ−ＡＴＰａｓｅとは対照的に哺乳動物の破骨細胞Ｖ−ＡＴＰａｓｅは他の細胞のｖ−ＡＴＰａｓｅと薬理学的に類似であり、それゆえ、よい治療標的である可能性が低いと結論している。
【０００５】
我々は、ヒトの破骨細胞に選択的で、それらの骨吸収活性を選択的に阻害する一群の化合物を今回見出した。それゆえ、これらの化合物は、骨粗鬆症ならびに関連オステオペニー疾患、パジェット病、副甲状腺機能亢進および関連環のごとき骨量の低下に関連した疾患の治療および／または予防に特に有用であると考えられる。またこれらの化合物は抗腫瘍活性、抗ウイルス活性（例えば、セムリキ森林熱ウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ニューカッスル病、インフルエンサＡおよびＢ、ＨＩＶウイルス）、抗潰瘍活性（例えば、化合物は慢性胃炎およびHelicobacter pyloriにより誘発される消化性潰瘍の治療に有用でありうる）、免疫抑止活性、抗高脂血症活性、抗アテローム性動脈硬化活性を有していると考えられ、エイズおよびアルツハイマー病の治療にも有用であると考えられる。さらなる態様において、これらの化合物は、脈管形成の阻害、すなわちリューマチ性関節炎、糖尿病性レチノパシー、乾癬および固形腫瘍のごとき種々のタイプの病状（脈管形成性疾患）において観察される新たな血管形成の阻害においても有用であると考えられる。
【０００６】
したがって、本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
0004627881.tif 000002
［式中、Ａは置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロサイクリル基であり；
Ｒaは−ＣＯ−ＮＲsＲtであり、ここにＲsおよびＲtはそれぞれ独立して水素、アルキル、置換アルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロサイクリルまたは置換されていてもよいヘテロサイクリルアルキル基であるか、あるいはＲsおよびＲtはそれらが結合している窒素と一緒になってヘテロサイクリル基を形成し；
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシ、置換されていてもよいベンジルオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、アルキル、カルボキシ、カルボアルコキシ、カルバモイル、アルキルカルバモイルであるか、あるいはＲ1およびＲ2は一緒になってメチレンジオキシ、カルボニルジオキシまたはカルボニルジアミノとなり；
Ｒ3は水素、アルカノイル、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、カルボアルコキシアルキル、カルバモイルまたはアルキルスルホニルおよびアリールスルホニルである］
で示される化合物またはその塩またはその溶媒和物を提供する。
【０００７】
Ａにより示されるアリール基の例は、フェニルおよびナフチルを包含する。
Ａにより示されるヘテロサイクリルの例はフリル基を包含する。
適当には、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してハロゲン置換基、例えば、クロロである。
Ｒ1またはＲ2での適当な置換位置は４、５、６または７位であり、好ましくは、５または６位である。
好ましい態様において、Ｒ1はクロロ、特に５−クロロであり、Ｒ2はクロロ、特に６−クロロである。
適当には、Ｒ3は水素である。
ＲsおよびＲtがアルキルまたは置換アルキルである場合、適当なアルキル基はＣ1-6アルキル基であり、例えば、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4およびＣ5アルキル基であり、好ましくは、エチル、プロピルまたはブチルである。
ＲsまたはＲtが置換アルキルである場合、好ましい基は２−（ジアルキルアミノ）エチル、３−（ジアルキルアミノ）プロピル、４−（ジアルキルアミノ）ブチル、３−［４−（３−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル］プロピル、３−［４−（３−ヒドロキシフェニル）ピペラジン−１−イル］プロピル、ヘテロサイクリルメチル、ヘテロサイクリルエチルまたはヘテロサイクリルプロピル基である。
適当には、Ｒsは置換されていてもよいヘテロサイクリルおよびアリールである。
適当には、Ｒsは置換されていてもよいヘテロサイクリルアルキルである。
適当には、Ｒtは水素である。
好ましい態様において、Ｒsは置換されていてもよいピペリジニル基であり、特に、４−ピペリジニル基である。
ピペリジニル環に対する置換基は、アルキル、縮合シクロアルキルおよびヒドロキシアルキル、ポリヒドロキシアルキルを包含する。
ピペリジニル基に対する好ましい置換基はアルキル基である。
ピペリジニル基が置換されている場合、窒素原子に対してα位にある炭素原子の一方または両方に置換基が結合しているのが好ましい。
置換ピペリジニル基の例は１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル基および２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イルである。
Ｒsがヘテロサイクリルアルキルである場合、適当なヘテロサイクリル基は、５ないし８個、好ましくは５または６個の環の原子を有する置換されていてもよい飽和単環式複素環基であり（複素環基は、Ｏ、ＳまたはＮから選択される１、２または３個の異種原子を含む）、例えば、置換されていてもよいピペラジニル基である。ヘテリサイクリル基に対して存在していてもよい適当な置換基は、置換されていてもよいアリール基であり、例えば、ヒドロキシフェニルまたはクロロフェニル基である。
【０００８】
本明細書において部分（ｂ）と称される部分が存在し、これは式（Ｉ）の一部分を形成し、下式：
【化５】
0004627881.tif 000003
で示される。
１の好ましい態様において、部分（ｂ）は式（ｃ）：
【化６】
0004627881.tif 000004
［式中、Ｒaは式（Ｉ）における定義と同じであり、Ｒ4は水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲンまたは基ＮＲuＲvであり、ここにＲuおよびＲvはそれぞれ独立して水素、アルキルまたはアルキルカルボニルである］
で示される部分である。
適当には、Ｒ4はＲaに対してメタ位に存在する。
適当には、Ｒ4は水素またはアルコキシであり、好ましくはアルコキシである。
Ｒ4の例は水素である。Ｒ4の例はメトキシである。
式（Ｉ）の特別な例は実施例番号２、７および８のものである。
【０００９】
本明細書の用語「アルキル」は、１ないし１２個、適当には１ないし６個、好ましくは１ないし４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基を包含し、例えばメチル、エチル、ｎ−およびｉｓｏ−プロピルならびにｎ−、ｉｓｏ−、ｔｅｒｔ−ブチルならびにペンチル基であり、さらにアルコキシまたはアルカノイル基のごとき他の基の一部を形成する場合にはかかるアルキル基も包含する。
本明細書の用語「アリール」はフェニルおよびナフチルを包含し、特にフェニルをいう。
アリール基に対して存在していてもよい適当な置換基は、５個まで、適当には３個までの置換基を包含し、それらはアルキル、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、アルキルカルボニル、シアノ、ニトロ、または基−ＮＲuＲv（ここにＲuおよびＲvはそれぞれ独立して水素、アルキルまたはアルキルカルボニルである）から選択される。
適当なアリールアルキル基は、フェニルエチルおよびベンジル基、特にベンジル基のごときアリール−Ｃ1-3−アルキル基を包含する。
好ましくは、置換アラルキル基はアリール基において置換されている。
本明細書の用語「ヘテロサイクリル」は、飽和または不飽和の単環式または縮合環式の複素環基を包含し、各環は４ないし１１個の環の原子を有し、特に５ないし８個、好ましくは５、６または７個の環の原子を有し、Ｏ、ＳまたはＮから選択される１、２また３個の異種原子を含む。
ヘテロサイクリル基に対して存在していてもよい適当な置換基は、アリール基に関して説明したものを包含する。
本明細書の用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを包含し、適当にはフルオロおよびクロロであり、好ましくはクロロである。
本明細書の用語「アシル」はアルキルカルボニルを包含する。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物の特定の炭素原子はキラル炭素原子であり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物の立体異性体が存在する。本発明は、式（Ｉ）の化合物のすべての立体異性体を包含し、それにはエナンチオマーおよびそれらの混合物、ラセミ体も包含される。慣用的方法により異なる立体生体を互いに分離または分割してもよく、慣用的な立体特異的合成または不斉合成により異性体を得てもよい。
適当な塩は医薬上許容される塩である。
適当な医薬上許容される塩は酸付加塩およびカルボキシ基の塩を包含する。
適当な医薬上許容される酸付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、オルトリン酸または硫酸のごとき無機酸との塩、あるいは例えば、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、サリチル酸、マレイン酸、グリセロリン酸またはアセチルサリチル酸のごとき有機酸との塩を包含する。
カルボキシ基の適当な医薬上許容される塩は、金属塩、例えば、アルミニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩またはカリウム塩またはリチウム塩のごとき）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩またはマグネシウム塩のごとき）、およびアンモニウム塩または置換アンモニウム塩（例えば、トリエチルアミンのごときＣ1-6アルキルアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）−アミンのごときヒドロキシ−Ｃ1-6アルキルアミン、ジシクロヘキシルアミンのごときシクロアルキルアミンとの塩、あるいはプロカイン、１，４−ジベンジルピペリジン、Ｎ−ベンジル−ｂ−フェネチルアミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、またはピリジン、コリジンまたはキノリンのごときピリジンタイプの塩基との塩）を包含する。
式（Ｉ）の化合物の適当な溶媒和物は水和物のごとき医薬上許容される溶媒和物である。
医薬上許容されない式（Ｉ）の化合物の塩および／または溶媒和物は、式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩および／または溶媒和物あるいは式（Ｉ）の化合物自体の製造における中間体として有用でありうるし、かかる形態も本発明のもう１つの態様である。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物またはその塩またはその溶媒和物を、式（ＩＩ）：
【化７】
0004627881.tif 000005
［式中、Ａは式（Ｉ）に関する定義と同じであり、Ｒ1’、Ｒ2’およびＲ3’はそれぞれ式（Ｉ）に関して定義されたＲ1、Ｒ2およびＲ3であるか、あるいはまたはその保護形態である］
で示される化合物をアミド化し、ついで、必要ならば下記反応：
（ｉ）式（Ｉ）の化合物を別の式（Ｉ）の化合物に変換すること；
（ｉｉ）保護基を除去すること；
（ｉｉｉ）そのようにして得られた化合物の塩または溶媒和物を得ること
の１つまたはそれ以上を行うことにより製造してもよい。
【００１２】
適当なアミド化方法は、式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）：
ＨＮＲsＲt      （ＩＩＩ）
［式中、Ｒ2およびＲtは式（Ｉ）に関する定義と同じ］
で示される化合物で処理し、ついで、必要ならば、そのようにして得られた化合物から保護基を除去することを含む。
式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物との間の反応を、適当な慣用的アミド化条件下において、例えば、ジメチルホルムアミドのごとき非プロトン性溶媒中、所望生成物を適当な速度で得られる温度において、都合よくは周囲温度において行ってもよい。好ましくは、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）および／または１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）のごときペプチドカップリング試薬の存在下においてアミド化反応を行う。
【００１３】
式（ＩＶ）：
【化８】
0004627881.tif 000006
［式中、Ａ、Ｒ1’およびＲ2’は式（ＩＩ）に関して定義したのと同じであり、Ｒpは保護カルボキシル基またはカルボキシル基に変換可能な基である］
で示される化合物を環化させ、ついで、必要ならば基Ｒpをカルボキシル基に変換することにより式（ＩＩ）の化合物を得てもよい。
適当には、還元的環化条件において、例えば、鉄粉／酢酸混合物または亜硫酸水素アルカリ金属（例えば、亜硫酸水素ナトリウム）を用いて、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノールまたは水またはそれらの混合物のごとき適当な溶媒中、所望生成物を適当な速度で得られる温度において、例えば昇温して、都合よくは溶媒の還流温度において環化反応を行う。
Ｒpが保護基である場合、適当な保護基は低級アルキル基、例えばメチルまたはエチル基を包含し、それらを慣用的な加水分解法、例えばエタノール性水酸化カリウムを用いる加水分解により除去してもよい。
Ｒpがカルボキシル基に変換可能な基である場合、適当な基はシアノ基を包含する。慣用的な方法を用いてかかる基をカルボキシル基に変換してもよい。例えば、Ｒpがシアノ基である場合には、例えば還流エタノール中水酸化カリウム溶液を用いる塩基加水分解を用いることによりカルボキシル基に変換してもよい。好ましいＲpはシアノ基である。
【００１４】
式（Ｖ）：
【化９】
0004627881.tif 000007
［式中、Ｒ1’およびＲ2’は式（ＩＩ）に関する定義と同じ］
で示される化合物を式（ＶＩ）：
【化１０】
0004627881.tif 000008
［式中、ＡおよびＲpは式（ＩＶ）に関する定義と同じであり、Ｌ1は脱離基またはハロゲン原子のとき原子、例えば塩素原子である］
で示される化合物と反応させることにより式（ＩＶ）の化合物を得る。
式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩ）の化合物との間の反応を、シクロヘキサンのごとき不活性炭化水素溶媒中、所望生成物を適当な速度で得られる温度において、好ましくは昇温して、例えば溶媒の還流温度において、塩基（好ましくは、トリエチルアミンのごとき第３級アミン）の存在下において行ってもよい。
式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩ）の化合物との間の反応は、通常には単離されないがin situにおいて加熱すると所望の式（ＩＶ）の化合物を生じる中間体を経て進行する。別の態様において、中間体が単離され、そのことにより式（ＩＶ）の化合物の別の調製法が提供され、この方法において、式（ＶＩＩ）：
【化１１】
0004627881.tif 000009
［式中、Ａ、Ｒ1’およびＲ2’は式（ＩＩ）に関する定義と同じであり、Ｒpは式（ＩＶ）に関する定義と同じ］
で示される化合物を加熱して上記の式（ＩＶ）の化合物を得る。
式（ＶＩＩ）の化合物の式（ＩＶ）の化合物への変換はJ. Het. Chem. 11, 219-221, (1974)に記載された条件と同様の条件下で、都合よくは、ジオキサンおよび水のごとき極性溶媒混合物中、通常には溶媒混合物の還流温度において行う。
【００１５】
式（Ｖ）の化合物は既知化合物であるか、あるいはMeervein et al., Ann. Chem. 641. 1 (1961)およびOrg. Synth. Collective VII, 34-41により開示されたような既知化合物の製造に用いられるのと同様の方法を用いて製造される。
式（ＩＩＩ）の化合物は既知であるか、あるいはJ. March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition (1985), Wiley Interscienceに記載されたような既知化合物の製造に用いられるのと同様の方法を用いて製造される。
【００１６】
式（Ｉ）で示される１の化合物を式（Ｉ）で示される別の化合物への適切な変換は、Ｒ3がＨである式（Ｉ）の化合物をＲ3がＨ以外、例えば低級アルキルまたはカルボキシアルキルである式（Ｉ）の化合物への変換を包含する。
式（Ｉ）で示される１の化合物を式（Ｉ）で示される別の化合物への変換を、適当な慣用的方法を用いて行ってもよい。例えば、上記変換（ｉ）（Ｒ3がＨであるものをＲ3がＨ以外のものに変換）を、ジメチルホルムアミドのごとき溶媒中で、式（Ｉ）の化合物を強塩基と、例えば水素化ナトリウムと反応させ、ついで、ハロゲン化アルキルまたはアルキルサルフェートを用いてアルキル化、あるいはハロゲン化アシルを用いてアシル化することにより行ってもよい。別法として、アセトンのごとき溶媒中で、式（Ｉ）の化合物を細粉固体塩基、例えば水酸化カリウムと反応させ、ついで、ハロゲン化アルキルでのアルキル化またはハロゲン化アシルでのアシル化を行うことにより、Ｒ3がＨであるものをＲ3がＨ以外のものに変更してもよい。
【００１７】
一般式ＨＮＲsＲtで示されるアミンを、アミン製造の分野で知られた方法、例えば、Houben-Weil, Methoden der Organischen Chemie, Vol. XI/1 (1957) and Vol. E16d/2 (1992), Georg Thieme Verlag, Stuttgartに教示される方法を用いて製造してもよい。
式（Ｉ）の化合物の塩および／または溶媒和物の製造を、適当な慣用的方法を用いて行ってもよい。
必要ならば、例えば、光学活性酸を分割試薬として用いることにより、本発明化合物の異性体混合物を個々の立体異性体およびジアステレオマーに分離してもよい。分割試薬として使用できる適当な工学活性酸は"Topics in Stereochemistry", Vol. 6, Wiley Interscience, 1971, Allinger, N. L. and Eliel, W. L. Eds.に記載されている。
別法として、既知の配置を有する光学的に純粋な物質を用いる立体特異的合成により、本発明化合物のエナンチオマーを得てもよい。
Ｘ線結晶回折法のごとき慣用的方法により化合物の絶対配置を決定してもよい。
【００１８】
上記方法の適当な段階において反応性の基の保護を行ってもよい。適当な保護基は保護すべき特定の基または原子に関して当該分野において慣用的に使用されているものを包含する。慣用的な適当な方法を用いて保護基を調製し、除去してもよく、例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルシリルビス（トリフルオロメタンスルホネート）のごとき適当なシリル化剤での処理によりジオールを包含するＯＨ基をシリル化誘導体として保護してもよい。その後、アルミナ存在下でにおいて、好ましくはピリジン複合体の形態としてフッ化水素で処理するような、あるいはメタノール中で塩化アセチルで処理するような慣用的方法を用いてシリル基を除去してもよい。別法として、ベンジルオキシ基を用いてフェノール性の基を保護してもよく、塩化パラジウム（ＩＩ）または炭素上１０％パラジウムのごとき触媒を用いる触媒水素添加を用いてベンジルオキシ基を除去してもよい。
【００１９】
慣用的な保護基用いてアミノ基を保護してもよく、例えば、アミノ基をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートで処理することによりカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステルを形成させ、ついで、酸性条件下において、例えば水性エタノールまたは塩化メチレン中トリフルオロ酢酸中での塩酸を用いてエステルを加水分解することによりアミノ基を形成させてもよい。塩基性条件下で適当なアミンとハロゲン化ベンジルから調製されるベンジル誘導体としてアミノ基を保護してもよく、ついで、例えば炭素上パラジウム触媒を用いる触媒加水素分解によりベンジル基を除去してもよい。
【００２０】
慣用的な基、例えば、ベンゼンスルホニル、メチルスルホニル、トシル、ホルミル、アセチル（これらすべてはアルカリ性試薬での処理により除去可能）、ベンジル（液体アンモニアまた中ナトリウムまたはトルエン中ＡｌＣｌ3のいずれかで除去可能）、アリル（酸性条件下における塩化ロジウム（ＩＩＩ）での処理により除去可能）、ベンジルカルボニル（触媒水素添加またはアルカリ処理のいずれかにより除去可能）、トリフルオロアセチル（アルカリまたは酸のいすれかでの処理により除去可能）、ｔ−ブチルジメチルシリル（フッ化テトラブチルアンモニウムでの処理により除去可能）、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）（エチレンジアミン存在下においてフッ化テトラブチルアンモニウムで処理することにより除去可能）、メトキシメチル（ＭＯＭ）またはメトキシエチル（ＭＥＭ）基（温和な酸処理により除去可能）を用いてインドールＮＨ基等を保護してもよい。
【００２１】
カルボキシル基をアルキルエステルとして、例えば、メチルエステルとして保護してもよく、慣用的方法を用いて該エステルを調製し除去できる。カルボメトキシをカルボキシルに変換する１の慣用的方法は水酸化リチウム水溶液を用いることである。
脱離基または脱離原子は、反応条件下において出発物質から開裂され、特定部位における反応を促進する基または原子である。かかる基の適当な例は、特記しないかぎり、ハロゲン原子、メシルオキシ、ｐ−ニトロベンゼンスルホニルオキシおよびトシルオキシ基である。
【００２２】
ここで論じる化合物の塩、エステル、アミドおよび溶媒和物は、必要ならば、当該分野において慣用的な方法により製造してもよい。例えば、式（Ｉ）の化合物を適当な酸で処理することにより酸付加塩を得てもよい。
慣用的なエステル化方法によりカルボン酸のエステルを得てもよく、例えば、一般的には酸性条件下において所望カルボン酸を適当なアルカノールで処理することによりアルキルエステルを得てもよい。
【００２３】
慣用的なアミド化法を用いてアミドを調製してもよく、例えば、対応カルボン酸を式ＨＮＲsＲtのアミンで処理することにより式ＣＯＮＲsＲtのアミドを調製してもよい（ＲsおよびＲtは上記定義と同じ）。別法として、Tetrahedron Lett. 48, 4171-4173, (1977)に記載の方法に従って、所望によりトリメチルアルミニウムの存在下において酸のＣ1-6アルキルエステル、例えばメチルエステルを上式ＮＨＲsＲtのアミンで処理して所望アミドを得てもよい。
【００２４】
上記のように、本発明化合物は有用な治療特性を有することが示されている。
それゆえ、本発明は、哺乳動物の破骨細胞の過剰活性に関連した疾患の治療および／または予防方法を提供し、該方法は、有効量かつ無毒な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物を投与することを含む。
よって、さらに本発明はヒトまたは非ヒト哺乳動物における骨粗鬆症および関連オステオペニー疾患の治療方法を提供し、該方法は、治療が必要なヒトまたは非ヒト哺乳動物に有効かつ無毒な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される溶媒和物を投与することを含む。
さらなる態様において、本発明は、活性治療物質として使用される式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物に関する。
詳細には、本発明は、骨粗鬆症または関連オステオペニー疾患の治療および／または予防に使用される式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。
閉経近くまたは閉経後の状態に関連した骨粗鬆症は特に興味深い。パジェット病、骨の新生物に関連した高カルシウム血症ならびに病因により以下のように分類されるすべてのタイプの骨粗鬆症性疾患の治療および予防も包含される：
一次的骨粗鬆症
退縮性
Ｉ型または閉経後のもの
ＩＩ型または老人性
若年性
若い成人における突発性
二次的骨粗鬆症
内分泌異常
甲状腺機能亢進
性的機能低下
卵巣形成不全またはTurner症候群
高アドレナリン症またはCushing症候群
上皮小体機能亢進
骨髄異常
多発性ミエローマおよび関連疾患
全身性肥満細胞症
散在性カルシノーマ
Gaucher病
結合組織異常
骨形成不全
ホモシスチン尿症
Ehlers-Danlos症候群
Marfan症候群
Menke症候群
雑多な原因
不動化または体重減少
Sudeck委縮症
慢性狭窄性肺疾患
慢性アルコール中毒
長期のヘパリン投与
長期の抗痙攣薬服用
さらに、本発明は、腫瘍、特に腎臓癌、メラノーマ、大腸癌、肺癌および白血病、ウイルスによる症状（例えば、セムリキ森林熱ウイルス、Vesicular Stomatitisウイルス、Newcastle病ウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルス、ＨＩＶウイルスによる症状を包含）、潰瘍（例えば、Helicobacter pyloriにより誘導される慢性胃炎および消化性潰瘍）の治療を包含し、本発明化合物は自己免疫性疾患および移植における免疫抑制剤、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化の治療および／または予防のための抗高脂血症薬として使用され、エイズおよびアルツハイマー病の治療に有用である。これらの化合物は脈管形成性疾患、すなわち、リューマチ性関節炎、糖尿病性レチノパシー、乾癬および固形腫瘍のごとき脈管形成に依存する病理学的状態の治療に有用であるとも考えられる。
【００２５】
式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物をそれ自体投与してもよく、あるいは医薬上許容される担体を含む医薬組成物として投与してもよい。
したがって、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物ならびに医薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
活性化合物またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物は、通常には、単位投与形態で投与される。
上記疾患を治療するに有効な量は、活性化合物の有効性、選択した医薬上許容される塩または医薬上許容される溶媒和物の個々の性質、治療すべき疾患の性質および重さならびに哺乳動物の体重のごとき要因に依存する。しかしながら、通常には、単位用量は０．０１ないし５０ｍｇ、例えば、１ないし２５ｍｇの本発明化合物を含有するであろう。単位用量は、通常には、１日１回または１回以上、例えば、１日１、２、３、４、５または６回、より通常には、１日１ないし３または２ないし４回投与され、通常には、１日の全投与量が７０ｋｇの成人に対して約０．０１ないし２５０ｍｇ、より通常には１ないし１００ｍｇ、例えば、５ないし７０ｍｇ、すなわち、約０．０００１ないし３．５ｍｇ／ｋｇ／日、より通常には０．０１ないし１．５ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、０．０５ないし０．７ｍｇ／ｋｇ／日となるようにする。
【００２６】
また本発明は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物における腫瘍、特に腎臓癌、メラノーマ、大腸癌、肺癌および白血病、ウイルスによる症状（例えば、セムリキ森林熱ウイルス、Vesicular Stomatitisウイルス、Newcastle病ウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルス、ＨＩＶウイルスによる症状を包含）、潰瘍（例えば、Helicobacter pyloriにより誘導される慢性胃炎および消化性潰瘍）、自己免疫性疾患および移植における治療方法、ならびに高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化、エイズおよびアルツハイマー病、リューマチ性関節炎のごとき脈管形成性疾患、糖尿病性レチノパシー、乾癬および固形腫瘍の治療および／または予防方法であって、有効かつ無毒な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される溶媒和物を、治療を要するヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
かかる治療において、活性化合物をいずれかの適当な経路により、例えば、経口、非経口または局所経路により投与してもよい。かかる使用には、通常には、化合物を、ヒトまたは獣医用の医薬担体、希釈剤および／または賦形剤と混合された医薬組成物の形態として用られようが、組成物の正確な形態は、もちろん、投与様式に依存するであろう。
【００２７】
混合により組成物を調製し、適当には、経口、非経口または局所投与に適用し、そのようなものとして錠剤、カプセル、経口液体調合物、粉末、顆粒、甘味入り錠剤、香錠、復元可能粉末、注射可能および輸液可能溶液または懸濁液、坐薬ならびに経皮デバイスの形態としてもよい。一般的使用に便利なので、経口投与可能な組成物が好ましく、特に、成形された経口用組成物が好ましい。
経口投与用錠剤およびカプセルは、通常には、単位用量として提供され、結合剤、充填剤、希釈剤、成形剤、滑沢剤、崩壊剤、着色料、香料および湿潤剤のごとき慣用的な賦形剤を含有する。当該分野で良く知られた方法により錠剤をコーティングしてもよい。
使用に適する充填剤は、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の類似の薬剤を包含する。適当な崩壊剤は、でんぷん、ポリビニルピロリドンおよびでんぷんグリコール酸ナトリウムのごときでんぷん誘導体を包含する。適当な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウムを包含する。適当な医薬上許容される湿潤剤はラウリル硫酸ナトリウムを包含する。
混合、充填、成形等の慣用的方法によりこれらの固形経口組成物を調製できる。大量の充填剤を用い、繰り返し混合操作を用いて活性作用剤を組成物全体に分散させてもよい。かかる操作は、もちろん、当該分野において慣用的である。
経口液体調合物は、例えば、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、あるいは使用前に水または他の適当な担体で復元する乾燥製品として提供されてもよい。かかる液体調合物は、懸濁剤（例えば、ソルビトール、糖蜜、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは水素添加食用油）、乳化剤（例えば、レシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアラビアゴム）、非水性担体（食用油を包含、例えばアーモンド油、分別ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールの油性エステル）、保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）、ならびに所望ならば慣用的な香料もしくは着色料のごとき慣用的な添加物を含有していてもよい。
【００２８】
非経口投与には、本発明化合物および滅菌担体を含有する液体単位投与形態を調製する。担体および濃度によっては、化合物を懸濁または溶解することができる。通常には、担体中に化合物を溶解し、適当なバイアルまたはアンプルに充填して密封する前にフィルター滅菌することにより非経口溶液を調製する。有利には、局所麻酔剤、保存料および緩衝化剤のごときアジュバントも担体に溶解する。安定性を向上させるには、バイアルに入れた後、組成物を凍結し、減圧下で水分を除去することができる。
化合物を担体に溶解せずに懸濁し、滅菌担体に懸濁する前に化合物をエチレンオキサイドに曝露すること以外は実質的に同じ方法で非経口懸濁液を調製する。有利には、界面活性剤または湿潤剤を組成物に含ませて活性化合物の均一な分散を容易ならしめる。
【００２９】
局所投与には、組成物は活性化合物を全身投与するための経皮軟膏またはパッチの形態であってもよく、例えば、'Dermatological Formulations' - B.W. Barry (Drugs and the Pharmaceutical Sciences - Dekker) or Harrys Cosmeticology (Leonard Hill Books)のごとき標準的教科書に記載された慣用的方法により調製できる。
【００３０】
また本発明は、骨粗鬆症および関連オステオペニー疾患の治療および／または予防のごとき、哺乳動物における破骨細胞の過剰活性に関連した疾患を治療および／または予防するための医薬の製造のための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物の使用も提供する。
また本発明は、腫瘍、特に腎臓癌、メラノーマ、大腸癌、肺癌および白血病、ウイルスによる症状（例えば、セムリキ森林熱ウイルス、Vesicular Stomatitisウイルス、Newcastle病ウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルス、ＨＩＶウイルスによる症状を包含）、潰瘍（例えば、Helicobacter pyloriにより誘導される慢性胃炎および消化性潰瘍）、自己免疫性疾患および移植の治療のための医薬、ならびに高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化、エイズおよびアルツハイマー病、リューマチ性関節炎のごとき脈管形成性疾患、糖尿病性レチノパシー、乾癬および固形腫瘍の治療および／または予防のための医薬を製造するための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物の使用も提供する。
本発明に従って投与した場合、本発明化合物に関して許容できない毒物学的効果は考えられない。通常の慣習として、関連する医学的処置に使用する手書きまたは印刷された説明書が組成物に添付されるであろう。
以下の記載例、実施例および薬理学的方法は本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【００３１】
実施例および記載例
記載例１：トランス−４，５−ジクロロ−２−ニトロ−β−ジメチルアミノスチレン
【化１２】
0004627881.tif 000010
ＤＭＦ（２５ｍｌ）中の１１．９ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール混合物中の１０．３ｇ（５０ｍｍｏｌ）の４，５−ジクロロ−２−ニトロトルエン（Helv. Chim. Acta 1936, 19, 434-439）の溶液を１００℃で１６時間加熱した。暗色反応混合物を減圧濃縮し、残渣を塩化メチレンで希釈し、２回水洗した。有機溶液をＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮して１２．６ｇ（４８ｍｍｏｌ、収率９５％）の標記化合物を暗赤色粗結晶として得た。
【００３２】
記載例２：４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］安息香酸メチル
【化１３】
0004627881.tif 000011
シクロヘキサン（２０ｍｌ）中のトランス−４，５−ジクロロ−２−ニトロ−β−ジメチルアミノスチレン（３．６５ｇ，１４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．４ｇ，１４ｍｍｏｌ）の撹拌されている溶液に、塩化テレフタル酸メチル（２．８ｇ，１４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を撹拌し、還流下で１６時間加熱した。ついで、十分量の水を添加して、精製した塩を溶解させ、有機相を分離した。水相を酢酸エチルで３回抽出し、有機相を貯留し、水洗し、ついで、減圧濃縮した。ジオキサン（３０ｍｌ）および水（２０ｍｌ）の混合物に残渣を溶解し、還流下で１４時間加熱した。残渣を塩化メチレンに溶解し、髄線し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ついで、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2；ＣＨ2Ｃｌ2）により粗化合物を精製して、２．７ｇの標記化合物（７．３ｍｍｏｌ、収率５２％）を得た。
1Ｈ−ＭＮＲ（ＣＤＣｌ3）δ＝８．３２（ｓ，１Ｈ）；８．１８（ｄ，２Ｈ）；８．０６（ｄ，２Ｈ）；７．４８（ｓ，１Ｈ）；４．７２（ｓ，２Ｈ）；３．９７（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ
【００３３】
記載例３：４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸メチル
【化１４】
0004627881.tif 000012
ＴＨＦ（２０ｍｌ）、エタノール（２０ｍｌ）および水（１５ｍｌ）の混合物中の４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］安息香酸メチルの溶液に、亜硫酸水素ナトリウム（２．９ｇ，７．９ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を還流下で１５分加熱し、ついで、室温で撹拌を１５分継続した。さらに亜硫酸水素ナトリウムを添加し、５分後に混合物を暖め、室温でさらに１５分撹拌し、ついで、減圧蒸発させて有機溶媒を除去した。分離した固体を濾過し、水洗し、乾燥させて０．９ｇの所望化合物を得た（２．８ｍｍｏｌ、収率３８％）。
1Ｈ−ＭＮＲ（ＤＭＳＯｄ6）δ＝１２．０５（ｓ，１Ｈ）；８．０３（ｍ，４Ｈ）；７．８４（ｓ，１Ｈ）；７．６１（ｓ，１Ｈ）；７．０９（ｓ，１Ｈ）；３．８８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ
【００３４】
記載例４：４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸
【化１５】
0004627881.tif 000013
ＥｔＯＨ（１５ｍｌ）および水（１５ｍｌ）の混合物中の４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸メチル（０．８６ｇ，２．７ｍｍｏｌ）およびＫＯＨ（０．３６ｇ，６．４ｍｍｏｌ）の溶液を３時間還流させた。エタノールを濃縮後、溶液を酸性にし、酢酸エチルで抽出した。有機相を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮して０．５８ｇ（１．８ｍｍｏｌ、収率７０％）の酸を得て、さらに精製せずに使用した。
1Ｈ−ＭＮＲ（ＤＭＳＯｄ6）δ＝１２．０３（ｓ，１Ｈ）；８．０２（ｍ，４Ｈ）；７．８３（ｓ，１Ｈ）；７．６１（ｓ，１Ｈ）；７．０７（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【００３５】
記載例５：２−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸モノエチルエステルおよび３−メトキシ−１，４−ベンゼンカルボン酸モノエチルエステル（それぞれＡおよびＢ）
【化１６】
0004627881.tif 000014
ＥｔＯＨ（１２０ｍｌ）中の２−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸ジメチル（５．８ｇ，２６ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（１．７ｇ，２６ｍｍｏｌ）の混合物を１６時間還流させた。溶媒を濃縮し、残渣を水に溶解し、水相をＥｔＯＡｃで２回洗浄した。水溶液をＨＣｌで酸性にし、塩化メチレンで３回抽出した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2；ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ）により残渣を精製して、２−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸モノエチルエステルおよび３−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸モノエチルエステルの５０／５０混合物を得た（３．５ｇ，１７．５ｍｍｏｌ，収率６７％）。
【００３６】
記載例６：塩化２−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸エチルおよび塩化３−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸エチル（それぞれＡおよびＢ）
【化１７】
0004627881.tif 000015
２−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸モノエチルエステルおよび３−メトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸モノエチルエステルの混合物（３．５ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）を、１滴のＤＭＦを含有する塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解した。室温において塩化オキサリル（２．７ｇ，２１ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を２時間継続した。溶媒および過剰の試薬を減圧濃縮し、シクロヘキサンを残渣に添加し、ついで、試薬が最後の痕跡となるまで濃縮した。混合物をさらに精製せずに次の工程に使用した。
【００３７】
記載例７：３−メトキシ−４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］−安息香酸エチルおよび２−メトキシ−４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］−安息香酸エチル（それぞれＡおよびＢ）
【化１８】
0004627881.tif 000016
上記のごとく得た粗酸塩化物の混合物を、室温において、シクロヘキサン（３５ｍｌ）中のトランス−４，５−ジクロロ−２−ニトロ−β−ジメチルアミノスチレン（４．３ｇ，１６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．３ｍｌ，１６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。混合物を還流下で１６時間加熱し、ついで、溶媒を濃縮した。残渣を塩化メチレンに溶解し、水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。
残渣をジオキサン（４０ｍｌ）に溶解し、水（２４ｍｌ）を添加した。混合物を２４時間還流させた。ジオキサンを減圧濃縮し、塩化メチレンを添加し、有機相を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2；ＣＨ2Ｃｌ2）により粗化合物を精製して３．６ｇの標記混合物を得た（８．７ｍｍｏｌ，収率５３％）。
【００３８】
記載例８：２−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−安息香酸エチルおよび３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−安息香酸エチル（それぞれＡおよびＢ）
【化１９】
0004627881.tif 000017
３−メトキシ−４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］−安息香酸エチルおよび２−メトキシ−４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］−安息香酸エチルの混合物（３．６ｇ，８．７ｍｍｏｌ）を酢酸（５０ｍｌ）で処理し、鉄粉（１．５ｇ，２６ｍｍｏｌ）を添加し、４時間還流させた。酢酸を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ水溶液で２回洗浄し、ついで、水洗した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１５０ｇ ＳｉＯ2；ＣＨ2Ｃｌ2）により残渣を精製して１．３ｇ（３．５ｍｍｏｌ、収率４０％）の２−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−安息香酸エチル（Ａ）および３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−安息香酸エチル（Ｂ）を得た。
Ａ  1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ＝８．９６（ｂｒｏａｄｓ，１Ｈ）；７．８６（ｄ，１Ｈ）；７．６９（ｓ，１Ｈ）；７．５３（ｓ，１Ｈ）；７．２４（ｄ，１Ｈ）；７．１６（ｓ，１Ｈ）；６．７９（ｄ，１Ｈ）；４．４０（ｑ，２Ｈ）；３．８１（ｓ，３Ｈ）；１．４１（ｔ，３Ｈ）．
Ｂ  1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ＝９．７７（ｂｒｏａｄｓ，１Ｈ）；７．８５（ｄ，１Ｈ）；７．７３（ｍ，３Ｈ）；７．５３（ｓ，１Ｈ）；６．９１（ｄ，１Ｈ）；４．４１（ｑ，２Ｈ）；４．１０（ｓ，３Ｈ）；１．４３（ｔ，３Ｈ）．
【００３９】
記載例９：３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸
【化２０】
0004627881.tif 000018
３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸エチル（１ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（５０ｍｌ）中のＫＯＨ（０．４ｇ，７ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を４時間還流させた。溶媒を濃縮し、残渣を水に溶解した。水溶液をＨＣｌで酸性にし、ついで、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮して０．８９ｇ（２．６ｍｍｏｌ、収率９９％）の標記化合物を得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．６０（ｂｒｏａｄｓ，１Ｈ）；７．９２（ｄ，１Ｈ）；７．８３（ｓ，１Ｈ）；７．６６（ｍ，３Ｈ）；７．１０（ｓ，１Ｈ）；４．０２（ｓ，３Ｈ）．
【００４０】
記載例１０：塩化２−メトキシ−４−シアノベンゾイル
【化２１】
0004627881.tif 000019
２−メトキシ−４−シアノ安息香酸（Tetrohedron Letters, 1986, 27(49), 5997-6000）（１ｇ，５．６ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）に溶解した。塩化オキサリル（１．５ｍｌ，８．２ｍｍｏｌ）を素早く溶液中に導入し、１滴のＤＭＦを添加した。激しい反応が起こり、気体が多く発生した。溶液を１時間撹拌し、ついで、一晩放置した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して１．１ｇのわずかに灰色がかった白色の固体を得て（５．６ｍｍｏｌ、収率９９％）、さらに精製せずに使用した。
【００４１】
記載例１１：３−メトキシ−４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］−ベンゾニトリル
【化２２】
0004627881.tif 000020
塩化２−メトキシ−４−シアノベンゾイル（１．１ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を、シクロヘキサン（２０ｍｌ）中のトランス−４，５−ジクロロ−２−ニトロ−β−ジメチルアミノスチレン（１．４７ｇ，５．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に少しずつ添加した。ついで、溶液を１６時間還流させた。反応物を冷却し、ロータリーエバポレーターを用いてすべての気化性生成物を除去した。暗色残渣を得て、ついで、これをＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）に溶解し、１０％ Ｎａ2ＣＯ3溶液（２０ｍｌ）で１回洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。暗褐色ないし黒色の粉末（２．４２ｇ）を得て、これを最少量の酢酸エチルに溶解し、この溶液にヘキサンを添加してうす褐色粉末（１．７２ｇ、融点１６７〜１７０℃）を得て、これをさらに精製せずに次工程に使用した。
粗中間体（１．２ｇ）を１，４−ジオキサン（２０ｍｌ）に溶解し、水（１０ｍｌ）を添加した。溶液を４８時間還流させ、熱いうちに濾過し、ついで、氷水浴で冷却した。黄色ないし褐色の結晶をブフナー漏斗上に集め、０．６０ｇ（１．６ｍｍｏｌ、収率３０％）の標記化合物を得た。融点１７１〜１７４℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ＝８．２７（ｓ，１Ｈ）；７．８１（ｄ，１Ｈ）；７．４９（ｓ，１Ｈ）；７．３５（ｄｄ，１Ｈ）；７．２８（ｄ，１Ｈ）；４．６１（ｓ，２Ｈ）；４．００（ｓ，３Ｈ）。
【００４２】
記載例１２：３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ベンゾニトリル
【化２３】
0004627881.tif 000021
３−メトキシ−４−［２−［（４，５−ジクロロ−２−ニトロ）フェニル］−１−オキソ−エチル］−ベンゾニトリル（０．４ｇ，１．０ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（１０ｍｌ）およびＡｃＯＨ（１０ｍｌ）に溶解した。溶液を穏やかに還流させ、鉄粉（０．５ｇ，９ｍｍｏｌ）を１時間かけて少しずつ添加した。溶液を１２時間還流させ、その後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残渣をＴＨＦで数回抽出した。溶媒を除去した後、粗３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ベンゾニトリル（０．３５ｇ，１．０ｍｍｏｌ、収率１００％）を得て、ついで、これをさらに精製せずに次工程に使用した。融点＝２４１〜２４４℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．６０（ｓ  ｂｒ，  １Ｈ）；  ７．９８（ｄ，１Ｈ）；７．８５（ｓ，１Ｈ）；７．６７（ｓ，１Ｈ）；７．６５（ｄ，１Ｈ）；７．５５（ｄｄ，１Ｈ）；７．１４（ｓ，１Ｈ）；４．００（ｓ，３Ｈ）。
【００４３】
記載例１３：３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸
【化２４】
0004627881.tif 000022
３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ベンゾニトリル（０．３５ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を、３０％ ＮａＯＨ（２０ｍｌ）および９５％ ＥｔＯＨ（２０ｍｌ）に添加した。混合物を１２時間還流させ、ついで、室温まで放冷した。ロータリーエバポレーターを用いて約半分の体積まで懸濁液を濃縮し、ついで、ブフナー漏斗で濾過して黄土色ないし黄色の粉末を得た。これを１０％ ＨＣｌ中で２時間撹拌した。ついで、溶液を濾過して０．２５６ｇ（０．７６ｍｍｏｌ、収率６９％）の純粋な標記化合物を得た。融点＞２７０℃。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．６０（ブロード  ｓ，  １Ｈ）；７．９２（ｄ，１Ｈ）；７．８３（ｓ，１Ｈ）；７．６６（ｍ，３Ｈ）；７．１０（ｓ，１Ｈ）；４．０２（ｓ，３Ｈ）。
【００４４】
記載例１４：２−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸
【化２５】
0004627881.tif 000023
トランス−４，５−ジクロロ−２−ニトロ−β−ジメチルアミノスチレンおよび塩化２−（メトキシカルボニル）ベンゾイルから出発し、その後記載例２、３および４の方法を連続的に行って標記化合物をうす褐色固体として得て、これをさらに精製せずに次工程に使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．７１（ｓ，１Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）；７．７６（ｄ，１Ｈ）；７．６５〜７．５２（ｍ，４Ｈ）；６．５４（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ
【００４５】
記載例１５：３−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸
【化２６】
0004627881.tif 000024
トランス−４，５−ジクロロ−２−ニトロ−β−ジメチルアミノスチレンおよび塩化３−（メトキシカルボニル）ベンゾイルから出発し、その後記載例２、３および４の方法を連続的に行って標記化合物をベージュ色固体として得て、これをさらに精製せずに次工程に使用した。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１２．０６（ｓ，１Ｈ）；８．４３（ｓ，１Ｈ）；８．１２（ｄ，１Ｈ）；７．９３（ｄ，１Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）；７．６６〜７．５８（ｍ，２Ｈ）；７．０２（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ
【００４６】
実施例１：４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）ベンズアミド
【化２７】
0004627881.tif 000025
ＤＭＦ（３ｍｌ）中の４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸（０．２５ｇ，０．８２ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ（０．１５６ｇ，０．８２ｍｍｏｌ），ＨＯＡＴ（０．１１ｇ，０．８２ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン（０．２０９ｇ，１．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．２１２ｇ，１．２ｍｍｏｌ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。ついで、混合物を水に注ぎ、ＮａＯＨにより塩基性にし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機溶液を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧濃縮し、ついで、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＮＨ4ＯＨ；９／１／０．１）により残渣を精製して、０．３５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ、収率９３％）の標記化合物を白色結晶として得た。融点３２５℃。
1Ｈ−ＭＮＲ（ＤＭＳＯｄ6）δ＝１１．９８（ｓ，１Ｈ）；８．２６（ｄ，１Ｈ）；７．９５（ｍ，４Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）；７．６（ｓ，１Ｈ）；７．０５（ｓ，１Ｈ）；４．１９（ｍ，１Ｈ）；２．１９（ｓ，３Ｈ）；１．７１（ｍ，２Ｈ）；１．４８（ｍ，２Ｈ）；１．１０（ｓ，６Ｈ）；１．０５（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ
【００４７】
実施例２：４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−３−メトキシ−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）−ベンズアミド
【化２８】
0004627881.tif 000026
ＤＭＦ（２ｍｌ）中の３−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸（０．１５ｇ，０．４５ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ（０．０９４ｇ，０．５ｍｍｏｌ），ＨＯＡＴ（０．０６７ｇ，０．５ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン（０．１５ｇ，０．９ｍｍｏｌ）の混合物を５０℃で１８時間撹拌した。ついで、混合物を大量の水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機溶液を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ−ＮＨ4ＯＨ；９１．５−７．５−１）により残渣を精製し、ついで、ジイソプロピルエーテルから再結晶させて０．１３ｇ（０．２６ｍｍｏｌ、収率５９％）の標記化合物を得た。融点２６０℃。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．５８（ｓ，１Ｈ）；８．２６（ｄ，１Ｈ）；７．８８（ｄ，１Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）；７．６７（ｓ，１Ｈ）；７．５７（ｍ，２Ｈ）；７．０７（ｓ，１Ｈ）；４．２２（ｍ，１Ｈ）；４．０２（ｓ，３Ｈ）；２．２０（ｓ，３Ｈ）；１．７３（ｍ，２Ｈ）；１．４６（ｍ，２Ｈ）；１．１１（ｓ，６Ｈ）；１．０６（ｓ，６Ｈ）
【００４８】
実施例３：４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−２−メトキシ−Ｎ−（１，２，２，６，６−ペンタメチルピペリジン−４−イル）−ベンズアミド
【化２９】
0004627881.tif 000027
対応する２−メトキシ−４−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸から出発して同じ手順によりこの化合物を得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．９８（ｓ，１Ｈ）；７．９１（ｄ，１Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）；７．７７（ｄ，１Ｈ）；７．５６（ｍ，３Ｈ）；７．０８（ｓ，１Ｈ）；４．１９（ｍ，１Ｈ）；４．００（ｓ，３Ｈ）；２．１９（ｓ，３Ｈ）；１．７５（ｍ，２Ｈ）；１．３８（ｍ，２Ｈ）；１．１０（ｓ，６Ｈ）；１．０５（ｓ，６Ｈ）
【００４９】
実施例４：２−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）ベンズアミド
【化３０】
0004627881.tif 000028
ＤＭＦ（２ｍｌ）中の粗２−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸（０．１９ｇ，０．６２ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ（０．１３ｇ，０．６８ｍｍｏｌ）、ＨＯＡＴ（０．０９３ｇ，０．６８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノプロピルアミン（０．１３ｇ，１．３ｍｍｏｌ）の混合物を５０℃で１６時間加熱した。ついで、混合物を水に注ぎ、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＮＨ4ＯＨ；９／１／０．１）により精製して標記化合物を油状物質として得て、これをジイソプロピルエーテル中で粉砕することにより結晶化させ、濾過後に０．０７２ｇ（０．１８ｍｍｏｌ、収率３０％）の標記化合物を白色結晶として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１１．６３（ｓ，１Ｈ）；８．３２（ｔ，１Ｈ）；７．７９（ｓ，１Ｈ）；７．６９（ｄ，１Ｈ）；７．６１（ｓ，１Ｈ）；７．５９〜７．３５（ｍ，３Ｈ）；６．６２（ｓ，１Ｈ）；３．１８（ｍ，２Ｈ）；２．０８（ｔ，２Ｈ）；２．００（ｓ，６Ｈ）；１．４９（ｍ，２Ｈ）。
【００５０】
実施例５：３−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）ベンズアミド
【化３１】
0004627881.tif 000029
３−（５，６−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）安息香酸から出発して、上記手順に従って標記化合物を白色結晶として得た（融点２０４℃）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ＝１２．００（ｓ，１Ｈ）；８．６３（ｔ，１Ｈ）；８．３１（ｓ，１Ｈ）；７．９９（ｄ，１Ｈ）；７．８３（ｓ，１Ｈ）；７．７８（ｄ，１Ｈ）；７．６０（ｓ，１Ｈ）；７．５７（ｔ，１Ｈ）；７．００（ｓ，１Ｈ）；３．２８（ｔ，２Ｈ）；２．２７（ｔ，２Ｈ）；２．１４（ｓ，６Ｈ）；１．６８（ｍ，２Ｈ）。
【００５１】
実施例１の方法に従って下記化合物を調製した。
【表１】
0004627881.tif 000030
【表２】
0004627881.tif 000031
【００５２】
生物学的アッセイ
背景：骨への結合により、電気発生性Ｈ+−アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）が分極して破骨細胞界面に到達する。ポンプにより大量のプロトンが骨吸収微少環境中に輸送されて骨の鉱物質の代謝が起こり、コラゲナーゼが骨のマトリックスを分解するために必要な酸性ｐＨとなる。
破骨細胞のプロトンポンプの液胞での性質は、元々、Blair [H. C. Blair at al., Science, 245, 855 (1989)] and than confirmed by Bekker [P.J. Bekker et al., J. Bone Min. Res., 5, 569 (1990)] and Vaananen [K.K. Vaananen et al., J. Cell. Biol., 111, 1305 (1990)]によって認識されていた。その証拠は、鳥類の破骨細胞のしわのある膜フラグメント（カルシウム飢餓の産卵期間中のニワトリの髄質から得た）を調製することに基いていた。得られた膜小胞はＡＴＰに応答して酸性化し、このことは、酸性コンパートメント中に蓄積する弱塩基であるアクリジンオレンジの蛍光消失を調べることにより容易に評価される。
生化学的パターンによれば、スルフヒドリル試薬であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）および液胞Ｈ+−ＡＴＰａｓｅの選択的阻害剤であるバフィロマイシンＡ１によりプロトン輸送が阻害されるので、破骨細胞のプロトンポンプが液胞様ＡＴＰａｓｅに属することが示された[J.E. Bowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7972 (1988)]。一方、破骨細胞のプロトンポンプは、Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅの阻害剤であるオウアビアン、Ｐ−ＡＴＰａｓｅの阻害剤であるオルトバナジン酸ナトリウム、またはオメプラゾールもしくはＳＣＨ ２８０８０（いずれも胃のＨ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅの阻害剤）によっては阻害されなかった[J.P. Mattson et al., Acta Physiol. Scand., 146, 253 (1992)]。
バフィロマイシンＡ1のごとき液胞ＡＴＰａｓｅの特異的阻害剤は破骨細胞培養物において骨の吸収を阻害しうる[K. Sundquist  et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 168, 309-313 (1990)]。
【００５３】
膜小胞におけるプロトン輸送およびｖ−ＡＴＰａｓｅ活性の阻害
カルシウム飢餓の産卵期間中のニワトリからの粗骨ミクロソームの調製
少なくとも１５日間カルシウム飢餓状態の産卵期間中のニワトリの脛骨および大腿骨から得た髄質から小胞を調製した。簡単に説明すると、骨フラグメントを24 scalpel bladeで掻き取り、４０ｍｌの単離培地（0.2 M スクロース, 50 mM KCl, 10 mM Hepes, 1 mM EGTA, 2 mM ジチオスレイトール, pH 7.4）中に懸濁し、１００μｍの孔サイズのナイロンメッシュで濾過した。全工程を４℃で行った。４０ｍｌの単離培地中の小胞をポッター（２０ストローク）中でホモジナイズした後、最初の遠心分離（最大６５００ｘｇ、２０分）を行ってミトコンドリアおよびリソソームを除去した。上清を最大１０００００ｘｇで１時間遠心分離し、ペレットを１ｍｌの単離培地中に集め、２００μｌずつに分け、即座に液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。Bradfordの方法[M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)]によるBioradの比色キットを用いて蛋白含量を調べた。プロトン輸送アッセイのために、５〜１０μｌの膜を使用した。
【００５４】
破骨細胞膜の精製：上記のごとく調製した１ｍｌの粗ミクロソーム小胞を、単離培地中１５％、３０％および４５％（ｗ／ｗ）のスクロースからなる３．５ｍｌのスクロースステップグラジエントの頂上に乗せ（チューブ１本につき約０．２ｍｌ）、最大２８００００ｇで２時間遠心分離した（SW 41 Tiローター）。遠心分離後、３０〜４５％スクロース界面を集め、単離培地で約２０倍に希釈し、最大１０００００ｇで１時間ペレット化させた（SW 28ローター）。ついで、ペレットを１ｍｌの単離培地に再懸濁し、部分試料に分け、液体窒素中で凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５５】
ウシ腎臓に関する文献に報告されている方法(S. Gluck, J. Biol. Chem., 265, 21957 (1990))に従って、ヒト腎臓皮質からヒト腎臓膜を得て、切除後、即座に凍結した。
【００５６】
ヒト破骨細胞ミクロソーム小胞の調製：破骨細胞腫唐単離された破骨細胞様巨細胞をガラス−テフロンホモジナイザー（１０００ｒｐｍ  ｘ  ２０ストローク）でホモジナイズし、材料を最大６０００ｘｇで２０分遠心分離した。ついで、得られたペレットを最大１０００００ｘｇで６０分遠心分離してミクロソーム画分をペレット化させた。１ｍｌの単離培地（ｐＨ７．４）に再懸濁後、液体窒素で凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５７】
0.2 M スクロース, 50 mM KCl, 10 mM Hepes pH 7.4, 1 mM ATP.Na2, 1 mM CDTA, 5 オM バリノマイシン および 4 オM アクリジンオレンジを含有する１ｍｌのバッファーに５〜２０μｌの膜小胞を添加した後のアクリジンオレンジの蛍光消失の初速度を測定することにより（励起４９０ｎｍ；発光５３０ｎｍ）、膜小胞おけるプロトン輸送を半定量的に評価した。５ｍＭ ＭｇＳＯ4を添加することにより反応を開始させた。結果を、２つの対照に対する平均値のパーセント値として表す。
【００５８】
バフィロマイシンＡ１存在または不存在の９６ウェルプレート中、３７℃で３０分インキュベーションしている間の無機リン酸（Ｐｉ）の遊離を測定することによりバフィロマイシン−感受性ＡＴＰａｓｅ活性の阻害を評価した。反応媒体は1 mM ATP, 10 mM HEPES-Tris pH 8, 50 mM KCl, 5 uM バリノマイシン, 5 uM ニゲリシン, 1 mM CDTA-Tris, 100 uM モリブデン酸アンモニウム, 0.2 M スクロース および 膜 (20 μg 蛋白/ml)を含有していた。ＭｇＳＯ4を添加することにより（８アームのピペットで）反応を開始させ、３０分後に４倍体積のマライトグリーン試薬（Chan [Anal. Biochem. 157, 375 (1986)]に従って調製）を添加することにより（９６アームのピペットで）反応を停止させた。結果を、ｎｍｏｌ（Ｐｉ）  ｘ  ｍｇ蛋白-1  ｘ  分-1として表し、３系の各実験に関して平均値±標準偏差を示す。
【００５９】
薬理学的データ
本明細書記載の化合物は、ニワトリの破骨細胞のバフィロマイシン感受性ＡＴＰａｓｅを５０ｎＭないし２μＭの範囲において、ヒト破骨細胞のバフィロマイシン感受性ＡＴＰａｓｅを３０ｎＭないし５μＭの範囲で阻害しうる。これらの結果の例を下に示す。
【表３】
0004627881.tif 000032
ヒト破骨細胞およびヒト腎臓膜におけるバフィロマイシン感受性ＡＴＰａｓｅの阻害
【表４】
0004627881.tif 000033