(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状培地内に存在する、生細胞及び細胞培養を分析する装置であって、該装置が液状培地及び細胞培養のための少なくとも１つのレセプタクルを有しかつ細胞培養を測定するための単数又は複数の測定装置及び／又はセンサが設けられておりかつ反応チャンバを制限する運動可能な分離部材が設けられている形式のものにおいて、分離部材（７，７ａ）が測定位置ではレセプタクルの底の上に存在する細胞培養の上の近くの測定位置に位置決めされておりかつ反応チャンバ（８，８ａ）を貯蔵チャンバから分離し、該貯蔵チャンバの受容容積は反応チャンバ（８，８ａ）の受容容積よりも数倍大きく、かつ、分離部材（７，７ａ）は細胞培養を覆う底近くの測定位置と、少なくとも貯蔵チャンバ（１４，１４ａ）が反応チャンバ（８，８ａ）と液体結合する底から離れた位置との間で、実質的に垂直な運動により往復運動可能であることを特徴とする、細胞培養の分析を実施する装置。
【請求項２】
少なくとも１つの分離部材がレセプタクルの底の上に存在する単数又は複数の細胞培養（２）に対してそれぞれ細胞培養を覆う液状培地（４）の部分容量を側面に押し退けるために位置決め可能でありかつそこで接近可能であることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
単数又は複数のセンサ（６）がレセプタクル（３ａ）の底部に又は底内に配置されており、互いに分離された培養領域が構造化されて被着された、細胞を付着しない被覆により又は凹所もしくは隆起を有する底の三次元的構造化によりそれらの間に存在する分離領域が形成されておりかつ培養領域内に培地（４）がそれぞれ滴（２５）として存在することを特徴とする請求項１又は２項記載の装置。
【請求項４】
レセプタクルの底が少なくともセンサ（６）を有する少なくとも１つのウェハの少なくとも一部により形成されていることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
液状培地内に存在する、生細胞及び細胞培養を分析する装置であって、該装置が液状培地及び細胞培養のための少なくとも１つのレセプタクルを有しかつ細胞培養を測定するための単数又は複数の測定装置及び／又はセンサが設けられておりかつ反応チャンバを制限する運動可能な分離部材が設けられている形式のものにおいて、レセプタクルとして上に開放した容器（３）が設けられており、該容器内に分離部材（７）が突入し、該分離部材はレセプタクル（３）の全受容スペースを２つの上下に位置するサブチャンバに分割し、底側のサブチャンバがレセプタクル（３）の全受容容積に比較して小さい容積の反応チャンバ（８）をかつ他方のサブチャンバが貯蔵チャンバ（１４）を形成し、その受容容積が反応チャンバの受容容積よりも数倍大きく、少なくとも１つの流動チャンネル（９）が設けられており、該流動チャンネルは一方では反応チャンバ（８）に他方では貯蔵チャンバ（１４）に接続されており、分離部材（７）の内部に単数又は複数の貫通路（１５）が設けられており、該貫通路はレセプタクル（３）の小容積の反応チャンバ（８）及び／又はレセプタクル（３）の貯蔵チャンバ（１４）に開口していることを特徴とする請求項１記載の細胞培養の分析を実施する装置。
【請求項６】
単数又は複数のセンサ（６）及び／又は測定装置が反応チャンバ（８，８ａ）の範囲内に配置されていることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
分離部材（７）がレセプタクル（３）内で底近くの位置と底から離れた位置の間で往復運動可能であることを特徴とする請求項５又は６記載の装置。
【請求項８】
底（５）に面した分離部材（７）の面が、細胞によって消費又は形成された物質を測定するために覆うもしくは制限する少なくとも１つの面であるセンサ表面に相当する面を有することを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
分離部材（７）が上からレセプタクル（３）内に侵入可能である請求項５から８までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１０】
細胞培養（２）からの分離部材（７）の距離、ひいては分離部材（７）の底近くの位置が調節可能である請求項１から９までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１１】
分離部材（７）がスタンプ状に構成されておりかつほぼレセプタクル（３）の横断面に合わせられた横断面を有するヘッド（１０）を有し、該ヘッドはレセプタクル（３）を反応チャンバ（８）と貯蔵チャンバ（１４）に分割し、かつ分離部材ヘッドに対して外側に案内されたシャフト（１１）が引き続き、該シャフトの外横断面はレセプタクルの正味の内部横断面より小さく、かつ、シャフトとレセプタクル（３）の内壁の間の中間スペースが貯蔵チャンバ（１４）を形成することを特徴とする、請求項５から１０までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１２】
分離部材（７）の内部に一方では反応チャンバ（８）にかつ他方では貯蔵チャンバ（１４）に開口する単数又は複数の流動チャンネルが設けられていることを特徴とする請求項５から１１までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
流動チャンネルが分離部材（７）とレセプタクル（３）の内壁の間に設けられた環状ギャップ（９）又は周辺成形部により形成されかつ該単数又は複数の流動チャンネルが高低の調節可能な分離部材（７）の場合には少なくとも分離部材（７）の底近くの位置と底から離れた位置の間の昇降範囲内に設けられていることを特徴とする請求項５から１２までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１４】
分離部材（７）の下側が気泡を外に排出する成形部である凸面状湾曲部を有することを特徴とする請求項１から１３までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
分離部材（７）のための昇降制限部が設けられており、かつそのために底近くの位置で有効な、容器縁部に接触するストッパが分離部材（７）に設けられていることを特徴とする請求項４から１４までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１６】
容器縁部に接触する、分離部材（７）のストッパが容器縁部を把持する蓋（１３）又は円錐部分で容器開口の対応円錐部に嵌合する蓋により形成されていることを特徴とする請求項１５項記載の装置。
【請求項１７】
分離部材（７）が上側に、ピペット、ピペット尖端又はディスペンサーチャンネルとカップリングするための特別の規格化された受容口である受容円錐部を有することを特徴とする請求項１から１６までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１８】
反応チャンバ（８，８ａ）の受容容積に対して貯蔵チャンバ（１４，１４ａ）の数倍大きい受容容積が１０：１〜１００：１であることを特徴とする請求項５から１７までのいずれか１項記載の装置。
【請求項１９】
少なくとも容器（３）又はレセプタクルの底部に単数又は複数のマイクロセンサを有する少なくとも１つのチップが配置されていることを特徴とする請求項１から１８までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２０】
分離部材（７）、反応チャンバ（８）及び／又は貯蔵チャンバ（１４）に面して、センサ（６）及び／又は電極が設けられていることを特徴とする請求項１から１９までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２１】
容器底に対して距離を置いてかつ容器底と底近くの位置に存在する分離部材（７）との間に、微孔質ダイヤフラム（２３）又は同種のフィルタ又は細胞培養（２）のための保護カバリングが設けられていることを特徴とする請求項５から２０までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２２】
分離部材（７）が平滑な、細胞を付着しない、不活性かつ容易に滅菌可能な材料であるポリテトラフルオロエチレンからなることを特徴とする請求項１から２１までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２３】
細胞培養（２）のための支持面が光学的に透明でありかつ支持面に光学測定装置が配属され、該装置は下側に配置されていることを特徴とする請求項１から２２までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２４】
多数のレセプタクル（３）が設けられており、自動ピペッティング装置（１９）の一部として設けられており、このレセプタクル（３）がマルチウェルプレート（２０）により形成されておりかつ自動ピペッティング装置のディスペンサーチャンネルの下端部にそれぞれ分離部材（７）が設けられていることを特徴とする請求項５から２３までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２５】
分離部材（７）がその底部とは反対側に結合のための、自動ピペッティング装置のディスペンサーチャンネル（２２）に差し込むための接続部を有することを特徴とする請求項１から２４までのいずれか１項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、液状培地内に存在する、生細胞及び細胞培養を分析する、特に細胞の代謝活性を検出する装置であって、該装置が液状培地及び細胞培養のための少なくとも１つのレセプタクルを有しかつ細胞培養を測定するための単数又は複数の測定装置及び／又はセンサが設けられておりかつ反応チャンバを制限する運動可能な分離部材が設けられている形式のものに関する。
【０００２】
このような公知の装置の場合には、細胞に一定の時間的順序で新鮮な培地又はこの培地内に溶解した作用物質が供給されるかつ消費された培地は細胞培養範囲から除かれる。例えば適当な流動系（Fliidiksystem）による、培地の頻繁な再生は、十分に一定の生理学的環境（Milieu）を発生する。培地に添加された容易に分解可能な作用物質は、同様に容易に再生することができる。供給された媒体及び細胞培養領域自体は、微生物による汚染及び過度の希釈から保護されねばならない。このことは細胞反応の高感度な測定のために重要な前提条件である。
【０００３】
共通に、あらゆる細胞培養領域は細胞保管／細胞成長のための底面並びに培地を受容するためのトラフを形成する壁である。培地は規則的な時間間隔で再生されなければらない。それというのも、細胞成長の排産物は蓄積され、栄養素は消費されかつ生物活性物質はその活性を時間の経過中に失うからである。
【０００４】
ＥＰ０３９４４０６から、既にセンサと組み合わせた細胞培養の液体ハンドリングのための装置が公知である。この装置は、密閉された、小容積の灌流チャンバ（Perfusionkammer）を有し、該灌流チャンバ内で細胞は培養されかつ該灌流チャンバは同時にセンサを装備している。該灌流チャンバは、供給チャンネル及び排出チャンネルを有する。液体ポンプを始動させると、培地は灌流チャンバを貫流する。周期的に連続するインターバルで、灌流を行う期間と灌流を行わない期間が続く。灌流を行う期間は、培地の再生に役立ち、灌流を行わない期間は測定プロセス、即ち灌流チャンバ内での細胞外の発酵（Ansaerung）の直接的追跡に役立つ。
【０００５】
しかしながら、高い装置費用が存在することが欠点である。それというのも、液体駆動ポンプ、液体流を調節するための弁並びにチューブ案内装置が必要であるからである。さらに欠点であるのは、比較的高い費用をかけて排除されるに過ぎない、灌流チャンバ内での気泡の発生がある程度起こり易いことである。このために、細胞培養の前方に接続しなければならない、培地の部分排気のための装置が必要である。このことは全体として費用を高める。最後に、装置の気泡不含及び気密もしくは液密の取付を達成するために、比較的高い作業費用が必要である。このことは、多数の並行サンプルを試験すべき場合（このことは実地において一般的である）、特に不利に作用する。
【０００６】
本発明の課題は、細胞培養溶液の再生のための比較的簡単な装置を提供すること及び小さい測定容積を提供することである。この場合、幾何学的周囲条件を細胞培養に適合させることができる可能性が与えられるべきである。
【０００７】
前記課題は、本発明により、分離部材が測定位置ではレセプタクルの底の上に存在する細胞培養の上の近くの測定位置に位置決めされておりかつ反応チャンバを貯蔵チャンバから分離し、該貯蔵チャンバの受容容積は反応チャンバの受容容積よりも数倍大きく、かつ、分離部材は細胞培養を覆う底近くの測定位置と、少なくとも貯蔵チャンバが反応チャンバと液体結合する底から離れた位置との間で、実質的に垂直な運動により往復運動可能であるか、又は分離部材は横方向運動により測定位置と、反応チャンバが貯蔵チャンバと液体結合する位置との間で往復運動可能であることにより解決される。
【０００８】
この場合、有利には前記反応チャンバの範囲内に単数及び／又は複数のセンサ及び／又は測定装置が配置されている。
【０００９】
さらに、有利な１実施態様によれば、分離部材が底部近くの位置と底部から離れた位置との間で往復運動可能でありかつ底部近くに位置で反応チャンバを制限する。
【００１０】
底近くの位置で、分離部材は小容積の反応チャンバの境界を形成し、該境界は、細胞に形成されるか又は消費される物質のための拡散制限のために役立つ。
【００１１】
この本発明による手段により、小容積の反応チャンバが実現され、該反応チャンバ内で、代謝に起因する、測定可能な物質的変化が大容積におけるよりも著しく急速に進行する。時間インターバルにおけるｐＨ値又は酸素分圧の変化速度から、例えば細胞代謝の活性に関する情報を得ることができる。
【００１２】
本発明の１実施態様によれば、互いに分離された培養領域が特に構造化されて被着された、細胞を付着しない被覆により、又は凹所もしくは隆起を有する底の三次元的構造化によりそれらの間に存在する分離領域が形成されておりかつ培養領域内に培地が好ましくはそれぞれ滴として存在する。
【００１３】
例えば下側に平面を有するスタンプ状分離部材を用いて、分離部材の下に細胞培養を覆う液体薄膜のみが残り、該薄膜がマイクロ反応容量の細胞培養を有する反応チャンバを形成するようになるまで、滴を上から圧迫しかつ部分容量を側方に押し退けることができる。
【００１４】
分離部材は、底に近い位置では反応チャンバを他の、側方外側に押し退けられた培地の滴容量から分離する。分離部材の昇降運動により、該分離部材は側方に押し退けられた、リザーブとして役立つ容量の培地を反応チャンバ内に存在する容量の培地と混合しかつそれにより反応チャンバ内に存在する培地の再生を達成することができる。
【００１５】
１実施態様では、少なくとも１つの分離部材がレセプタクルの底の上に存在する単数又は複数の細胞培養に対してそれぞれ側面から細胞培養を覆う液状培地の部分容量を圧縮するために位置決め可能でありかつそこで場合により接近可能である。
【００１６】
例えば、センサを有する半導体ウェハの上にこのセンサの範囲内に細胞培養を載せ、次いで分離部材を順次に側面で、それが細胞培養の上に存在するように位置決めすることができる。次いで、この位置で測定を実施することができる。その際、側面でほぼ水平及び場合によりまたほぼ鉛直方向で位置決め可能な複数の分離部材を設けることもできる。
【００１７】
この場合には、センサをウェハの製造後に試験するために、細胞培養を半導体ウェハに載せることができ、又はセンサを有する半導体ウェハは、細胞培養の測定を実施することができるように、実質的に試験装置を形成する。半導体ウェハの、細胞培養が占有する領域は、必要に応じて細胞培地のためのレセプタクル
を形成するための囲みで囲まれていてもよい。
【００１８】
独自の保護が要求される本発明の１実施態様においては、レセプタクルとして上方が開放した容器が設けられており、該容器内に分離部材が突入し、該分離部材はレセプタクルの全受容チャンバを２つの上下に位置するサブチャンバに分割し、底側のサブチャンバがレセプタクルの全受容容積に比較して小さい容積の反応チャンバをかつ他方のサブチャンバが貯蔵チャンバを形成し、少なくとも１つの流動チャンネルが設けられており、該流動チャンネルは一方では反応チャンバに他方では貯蔵チャンバに接続されており、分離部材の内部に単数又は複数の貫通路が設けられており、該貫通路はレセプタクルの小容積の反応チャンバ及び／又はレセプタクルの貯蔵チャンバに開口している。
【００１９】
この場合、有利には、単数又は複数のセンサ及び／又は測定装置が反応チャンバの領域内に配置されている。
【００２０】
この実施例の場合も、小容積の反応チャンバにより、例えば高められた細胞濃度でマイクロセンサ測定を実施することができ、その際高められた細胞濃度は急速な活性変化を生じかつそれに伴い相応する測定の促進をもたらす。
【００２１】
反応チャンバの上に存在しかつ分離部材により分離された貯蔵チャンバは、この実施態様においては比較的大きくてもよいので、消費された培地は、外部から培地を供給する必要が無く、反応チャンバ内で貯蔵チャンバからの培地との対流混合により長時間帯にわたり再生可能である。
【００２２】
反応チャンバ内及び貯蔵チャンバ内に存在する培地の対流混合は、貫流チャンネルを介して一定の液体量の培地を反応室に供給しかつ再び吸出すことにより行うことができる。対流混合は、流動チャンネルを介して行われる。
【００２３】
本発明の１実施態様によれば、分離部材はレセプタクルの内部で底近くの位置と底から離れた位置の間で往復運動可能である。
【００２４】
それにより、反応チャンバ内の細胞培養溶液の再生のために、スタンプ状分離部材を持上げかつ再びその先の位置に下降させる可能性が生じる。この場合には、細胞培養レセプタクルの反応チャンバからの消費された培地と、貯蔵チャンバ内に存在する残りの培地との対流混合は流動チャンネルを介して行われる。それによって、マイクロ反応容量に関する液体量の供給及び吸出しは、上下に向かう分離部材の機械的運動により行われる。細胞培地の完全な交換は、細胞の物質代謝性及び測定溶液の全容量に依存して比較的大きな時間間隔で初めてその時期に達する。
【００２５】
分離部材は、反応チャンバの上方閉鎖部を形成するので、希釈及びまた汚染に対する保護も与えられる。その他に、そこに存在するマイクロ反応容量は貯蔵チャンバ内の著しく大きな容量によってもクッション作用を受け、それにより液表面で生じる希釈は全体としてマイクロ反応容量には影響を及ぼさない。
【００２６】
本発明の有利な１実施態様によれば、細胞培養からの分離部材の間隔、ひいてはレセプタクル内部の分の底近くの位置は調節可能である。レセプタクルの底までのその距離が調節可能な分離部材により、細胞培養の周囲においてその都度の要求に正確に適合したマイクロ反応容量を調整することができる。この際、このマイクロ反応容量は、例えば５０〜５００μｍの狭い液体チャンネルのみが細胞培養の上に残るように調節することができる。それにより、相応して高い細胞濃度を有する必要とされるマイクロ反応容量が製造される。
【００２７】
本発明の有利な１実施態様によれば、分離部材の下側は気泡を外部に向かって導出する成形部、好ましくは凸面状の湾曲を有している。それによって、空気もしくは気泡は逃げることができかつ細胞培養もしくはセンサによる測定を悪影響を及ぼさない。その際、分離部材は細胞培養領域の気密及び液密の密閉を形成しないので、気泡は外部に逃げることができる。それによりまた組立も容易になる。それというのも、そのためにガス不在性に注意する必要がないからである。
【００２８】
多数のレセプタクルが好ましくは自動ピペッティング装置の一部として設けられており、このレセプタクルが特に市販のマルチウェルプレートとして形成されておりかつピペットの下端部又は自動ピペッティング装置のディスペンサーチャンネルにそれぞれ１つの分離部材が設けられていれば、特に有利である。それにより、この分離部材はピペット尖端の特殊形を形成する。
【００２９】
まさに自動ピペッティング装置及び細胞培養容器として相応して多数の例えば９６レセプタクルと関連して、スタンプ状分離部材を有するそれぞれの装置の簡単な構造は有利に影響する。特に、例えばマイクロセンサ測定をこのような標準細胞培養フォーメーションで実施することができ、このことはポンプ駆動される貫流を伴う公知のシステムでは実際に不可能である。
【００３０】
本発明の１実施態様よれば、容器底に対して距離を置いてかつ容器底と底近くの位置に存在する分離部材との間に、微孔質ダイヤフラム又は同種のもの又は細胞培養のための保護カバリングが設けられている。微孔質ダイアフラムフィルタとして構成されていてもよい前記のようなダイアフラム、又は細胞培養の直ぐ上に別の保護装置を組込むことにより、対流混合及び細胞培地の供給及び吸出しの際に生じ得る液体剪断力及び圧出から敏感な細胞培養が守られる。またその際には、さもなければ液体流によってセンサから又は小容積の部分チャンバから容易に洗い流される、非付着性の細胞タイプの測定も実施することができる。
【００３１】
本発明の１実施態様によれば、細胞培養のための支持面は光学的に透明であってよい。その際にはそれにより、細胞の吸収、散乱、蛍光の測定を、場合により着色後に実施することができる。
【００３２】
本発明の付加的実施態様は、別の従属請求項に記載されている。以下に、本発明をその重要な詳細とともに図面によりさらに詳細に説明する。
【００３３】
図１〜７に示された装置は、細胞培養２の調査のために役立つ。そのために、該装置は好ましくはトラフ状のレセプタクル３を有し、該レセプタクル内で底側に液状培地４内の細胞培養２が存在する。レセプタクルの底３には、単数又は複数のセンサ６が存在し、それにより細胞培養２の測定を行うことができる。有利には、特に多数のマイクロセンサを有する半導体チップが設けられており、その際底全体が、図９から良好に認識できるように、センサチップとして構成されていてもよい。該センサチップは、例えばイオン活性、酸素活性、溶解した代謝物の活性、電気インピーダンス、温度等のための種々のセンサ機能を有することができる。
【００３４】
レセプタクル３は、上が開放されかつそこから分離部材７が挿入されており、該分離部材は、図１で認識されるような底近くの位置で、レセプタクルの全受容容積に対して小容積の部分チャンバを反応チャンバ８として制限する。分離部材７はレセプタクルの横断面にほぼ合わされた横断面を有しかつ分離部材とレセプタクルの内壁の間にオーバフロー間隙９が流動チャンネルと形成されている。例えば５ｍｍ又は１０ｍｍの内法の幅のレセプタクル直径の場合には、該オーバフロー間隙９は１ｍｍ未満の内法の幅を有する。
【００３５】
分離部材７は、該実施例においてはプレート状ヘッド１０を有し、該ヘッドに柄条シャフト１１が引き続いている。分離部材の、細胞培養に面した側もしくは分離部材のヘッド１０は、細胞により消費された又は形成された物質を測定するために少なくとも１つの面をカバーもしくは制限しかつ特にセンサ表面にほぼ相当する面を有するような寸法に設計されている。
【００３６】
レセプタクル３の外部で、シャフト１１はレセプタクル縁部１２を把持する蓋１３と結合されており、該蓋は特にレセプタクル３の内部への分離部材７の侵入深さを制限するためのストッパを形成する。蓋１３の支持側は、気密閉鎖が生じるように構成されている。相応する成形部又は通路２６は点線で示されている。レセプタクル縁部１２及び／又は蓋の支持領域に、レセプタクルの内部の分離部材７の底に近い位置を調節することができる調節手段が設けられていてもよい。それに相応して、反応チャンバの大きさは変更可能である。特にそれにより、極めて小さいマイクロ反応容積を生ぜしめることができ、その際細胞培養からヘッド１０の下側までの距離は例えば５０μｍ〜５００μｍにすることができる。ヘッド１０の上に存在するレセプタクル３のサブチャンバは、貯蔵チャンバ１４を形成し、該貯蔵チャンバ１４内で下の小容積の反応チャンバ８におけると同様に液状の培地４が存在する。貯蔵チャンバの受容容積は、反応チャンバ８の受容容積よりも約１００倍の大きさであってよい。
【００３７】
分離部材７の内部に、反応チャンバ８に開口する貫通通路１５が設けられており、その他方の端部は蓋１３の範囲内にピペット１７又は同種のものと結合するための接続部１６を有する。この貫通通路１５を介して、新鮮な培地を供給しかつ消費された培地を吸い出すことができる。
【００３８】
反応チャンバ８に開口する貫通通路１５の他に、また貯蔵チャンバ１４に開口する貫通又は接続通路が設けられていてもよい。
【００３９】
１８で、電極又はセンサが示されており、これは分離部材７を貫通案内されかつ部分チャンバ８で終わっている。例えばこの場合、ｐＨ及びｐＯ２測定のための参照電極を使用することができる。
【００４０】
本発明による装置１は、有利に、図８に略示された自動ピペティング装置１９と組合せて使用される。この場合には、多数のレセプタクル３を有する３つのいわゆるマルチウェルプレート２０が明らかに認識される。標準的には、このようなマルチウェルプレート６，２４は特にまた９６のレセプタクルを細胞培養容器として有する。
【００４１】
多数のディスペンサーチャンネル２２を有するピペットヘッド２１は、ここには詳細には示されていない位置決め装置と結合されており、該位置決め装置によりピペットヘッドを１つの面内で２つの座標方向に移動可能でありかつ付加的でに高さを調節することができる。個々のディスペンサーチャンネル２２はそれらの開放端部でそれぞれ分離部材７に結合され、かつ、分離部材７が１つ以上の列で同時にマルチウェルプレート２０のレセプタクル３内に挿入することができる。
【００４２】
自動ピペッテイング装置を用いて、予め設定可能な時間間隔で液体を個々のレセプタクル３から取出しかつ別の容器に移すかもしくは液体を容器から取出しかつ細胞培養を有するレセプタクル３に添加することができる。それによって、原理的にマイクロ反応容量の周期的再生を小容量の部分チャンバ８、ひいてはセンサ６の周囲並びに生存している細胞培養内で実施することができる。この場合、マイクロ反応容量は密閉された灌流チャンバによってかつ再生は従来の技術におけるような溶液の貫流によっては行われず、後続のプロセスステップと結び付いた分離部材７の形成により達成される。
【００４３】
このためには、図２〜４に作動モードが示されており、この場合には液状細胞培地の混合は細胞培地の周期的放出及び受容により行われる。
【００４４】
別の作動モードは、図５〜７により示されている。ここで、細胞培地の混合は分離部材７の周期的昇降により行われる。
【００４５】
図２〜７には、それぞれ接続部１６と結合されたディスペンサーチャンネル２２は簡明化のために省かれている。これらを介して、培地の供給及び吸い出しが行われる。ピペットヘッド１７もしくはディスペンサーチャンネル２２は図１もしくは８に示されている。
【００４６】
図２〜４による作動モードの場合には、ピペットヘッド２１のディスペンサーチャンネル２２の下端部に存在する分離部材７がレセプタクル３に挿入されかつ細胞培養２に、そのヘッド１０が上側で小容積の反応チャンバ８を制限するまで近付けられ、その際液体容量は例えば数マイクロリットルであってよい。次いで、分離部材７もしくはそのヘッド１０の前記の底に近い位置において、例えば細胞培養２の物質代謝活性のマイクロセンサ測定が行われる。この場合、この測定インターバルにおけるｐＨ値又は酸素分圧の変化速度から細胞代謝の活性に関する情報を得ることができる。
【００４７】
その後、次の時間インターバルにおいて、培地の再生は反応チャンバ８内に存在するマイクロ反応容積の内部において行われる。そのために、貫流チャンネル１５を介して、培地の一定の液体量を反応チャンバ８に供給する、その際培地は反応チャンバ８から矢印Ｐｆ１に基づき貯蔵チャンバ１４を内に押し退けられ、そこで新鮮な培地と使用済みの培地の対流混合が行われる。引き続き、同じ液体量をチャンネル１５から吸い出すので、貯蔵チャンバ１４から矢印Ｐｆ２に基づき培地は反応チャンバ８にオーバフローする。引き続き、次いで貫流が存在しない静止インターバル（図４）において、まず最初の例えばマイクロセンサ測定を行う。この図２〜４により説明した作動モードでは、実質的にマイクロ反応容量だけが周期的に交換されるが、しかしレセプタクル３の貯蔵容量は交換されない。液体量の供給及び吸い出しにより、実際に“ポンピング作用”は反応チャンバ８及び貯蔵チャンバ１４内に存在する液状細胞培地の混合において達成される。
【００４８】
予め設定可能な時間間隔において、液体量を取出し、これを廃棄容器に移しかつ引き続き新鮮な培地を貯蔵チャンバから吸引しかつ細胞培養チャンバを備えたレセプタクル３に充満する。
【００４９】
図５〜７に基づく作動モードにおいては、分離部材７は二重矢印Ｐｆ３に基づき周期的時間インターバルにおいて上下に案内される。分離部材７が下方位置に存在する場合（図５及び７）には、所定のマイクロ容量が反応チャンバ８内部に測定のために存在する。測定インターバル後に、分離部材７は持ち上げられかつこの上方に向かう運動により、初期には反応チャンバ８内に存在し、消費された培地と貯蔵チャンバ１４の残りの培地との対流混合、ひいては細胞培地の均質化が行われる。このプロセスは周期的に繰り返される。細胞培地の完全な交換は、細胞の物質代謝及び測定溶液の容量に依存にして、その都度のｎ回目の周期で行うべきである。この場合、反応チャンバ８内に存在する培地の再生を、スタンプ状部材の機械的運動により及び貯蔵チャンバ１４からの未使用の培地との混合により行う。
【００５０】
両者の操作モードにおいて、反応チャンバ８に比較して大きな貯蔵容積により全体として比較的大量の細胞培地が提供され、これはマイクロ反応容積からの細胞培地との対流混合により比較的長い可能な使用時間が、最終的に培地の交換が行われねばならないまで提供される。
【００５１】
細胞培養溶液からの連続的又は間欠的な貫流を省く本発明による装置により、それと結び付いた問題が回避される。該装置は、簡単な手段で、例えば９６ウェルマルチウェルプレートのような普及している細胞培養フォーマットに適合しかつ細胞培養インキュベータ内の設置に適合するように構成することができる。該装置は、既に述べたように、有利に、細胞培養溶液の非手動の再生を達成するために自動ピペッティング装置と組合せることができる。
【００５２】
図１〜７においてなお、気泡を側方外側に向かって導きかつオーバフロー間隙９に到達させることができるように、分離部材７のヘッド１０の下側が凸面状に湾曲していることを十分に認識することができる。蓋１３はレセプタクル３のシールする接続部を形成しない（このことは図１に点線のチャンネル２６で示されている）ので、培地と周囲の大気との間のガス交換が保証される。レセプタクル３の、この非気密の接続にもかかわらず、細胞培養溶液の希釈からの十分な保護が存在しかつまた微生物汚染の侵入も阻止される。チャンネル２６は、その横断面が適当に小さい寸法に設計されている。
【００５３】
蓋１５を有する分離部材７全体は、好ましくは平滑な、細胞を付着しない、不活性かつ容易に滅菌可能な材料からなる。
【００５４】
さらに、図１〜７において、レセプタクル底に対して間隔を置いてかつ該底と底近くに存在する分離部材７との間に微孔質のダイアフラム２３が細胞培養のための保護カバリングとして設けられている。この微孔質ダイアフラムフィルタにより、対流混合並びに細胞培地の供給及び吸い出しの際に生じうる液体剪断力及び圧力ショックから敏感な細胞培養が保護される。特に付着性の細胞タイプの場合には、該細胞が液体流によって洗い落とされないことが回避される。
【００５５】
図９は、上部と下部を組み合わせる前のマルチウェルプレート２０を示す。ここに示された実施例においては、市販のマイクロタイタープレートのレセプタクル３のために底部が分離されているので、貫通する小管が生じる。次いで、このマイクロタイタープレート上部をサブストレートプレートに載せかつ好ましくは超音波溶接により密にこれと結合させる。サブストレート上のセンサ又はセンサアレイは、マイクロタイタープレートの使用の際には個々の小管もしくは個々のレセプタクルから間隔をおいて配置されている。
【００５６】
レセプタクル３を形成するためにマイクロタイタープレート上部を使用することにより、従来市販のマルチウェルプレートと関連して使用された装置、例えば図８に示された自動ピペッティング装置もしくは自動サンプリング装置、マイクロタイタープレート読取り器及び同種のものを変化せずに使用できるという可能性が生じる。
【００５７】
センサ６は、多数の異なる個々のセンサを有するセンサアレイにより形成されていてもよい。サブストレート上には、制御及び評価装置もしくはそれらの部分が存在してもよい。
【００５８】
半導体ベース上の電子センサの他に、なお別のセンサ、例えば光学ベースのもの、又は厚膜技術ベースのもの又はバイオ技術センサが設けられていてもよくかつ好ましくは先に記載したセンサと組合せて使用することができる。
【００５９】
さらに、半導体基板２４の場合下側に、基板の温度調節を可能にする加熱層を設ける可能性も生じる。そうして、細胞培養においては、温度に関してその正常な生存条件を作り出すことができるので、長い時間帯にわたる調査が可能である。また、連続した加熱層の代わりに部分的な、互いに分離された加熱層区分を設け、例えば必要に応じて一定の領域内で異なった温度を発生させることができる。加熱装置のサーモスタット調節のために、基板の単数又は複数の位置に温度測定センサが設けられていてもよい。このような温度測定センサは、個々のレセプタクルに配属されたセンサの場合直接集積されていてもよい。個々のレセプタクルの領域内の温度センサを、加熱装置のサーモスタット調節のための他に細胞の生物学的活性の検出のために使用することもできる。
【００６０】
図１０及び１１は、上側にセンサ６を支持するプレート状レセプタクル３ａが設けられた本発明による装置の１実施例を示す。単数又は複数のセンサ６の領域内に、液状培地４が滴２５として載せられている。この培地滴はセンサ６上に存在する細胞もしくは細胞培養２を覆う。小容積の反応チャンバ８ａを形成するために図１０において滴２５の上に設置された分離部材７ａは、図１１に示されているように底近くの位置に移動せしめられる。スタンプ状分離部材７ａが下降する際に、滴２５は変形されかつその容量の一部は側面外側に向かって押し退けられる。その際、分離部材７ａのその投影延長部の下に、細胞培養２と、分離部材７ａのほぼ平坦な下面との間に相応して小さい容量を有する薄い液体層が残り、該容量は、滴２５の側面に押し退けられた容量よりも著しく小さくてもよい。
【００６１】
従って一面では、図１〜７に基づく実施例で説明したと同様に、小容積の反応チャンバ８ａが、かつ分離部材投影延長部を越えて側面に押し出された培地容量により貯蔵体１４ａが提供される。培地４が間隙状の反応チャンバ８ａ内で細胞の反応により消費されると、分離部材７ａを幾分か持上げ、それにより側面に押し退けられた滴部分から培地は分離部材７ａの下に入り込みかつ消費された培地と混合することができる。引き続き、再び小容積の反応室８ａが形成されるように分離部材７ａを下降させる。それにより、その後この部分には再生された培地が存在する。それに引き続き測定期間が生じる。この装置は、好ましくは、切断されていない（チップ）ウェハでセンサでの機能試験を実施するために使用することができる。
【００６２】
プレート状レセプタクル３ａは、例えば図９に基づく基板プレート２４と同様に構成されていてもよく、この場合個々のセンサ部分は構造化されて被着された、細胞を付着しない被覆により互いに分離されていてもよい。この場合には、レセプタクルの底はセンサを有するウェハの一部を形成する。
【００６３】
さらに言及すれば、プレート状レセプタクル３ａ（図１０及び１１）もしくはレセプタクル３の底５（図１〜７）は光学的に透明であってよく、それにより細胞培養もしくはこの領域に存在する細胞培養は光学測定装置のために好ましくは下からアクセス可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  レセプタクル、その中に存在する細胞培養並びに液状培地及び該培地内に浸漬された分離部材を有する細胞培養を分析する装置の略示図である。
【図２】  図１に示した装置の異なる操作状況を示す図である。
【図３】  図１に示した装置の異なる操作状況を示す図である。
【図４】  図１に示した装置の異なる操作状況を示す図である。
【図５】  異なる位置に存在する分離部材を有する、図１に示した装置を示す図である。
【図６】  異なる位置に存在する分離部材を有する、図１に示した装置を示す図である。
【図７】  異なる位置に存在する分離部材を有する、図１に示した装置を示す図である。
【図８】  自動ピペッティング装置の略示図である。
【図９】  マイクロセンサアレイを有するマルチタイタープレートの形の多数のレセプタクルを示す図である。
【図１０】  異なる位置に存在する分離部材を有する、レセプタクル底上に存在する培地滴を示す図である。
【図１１】  異なる位置に存在する分離部材を有する、レセプタクル底上に存在する培地滴を示す図である。
【符号の説明】
１、１ａ  細胞培養の分析装置、  ２  細胞培養、  ３、３ａ    レセプタクル、  ４  培地、５  レセプタクルの底、  ６  センサ、  ７、７ａ  分離部材、  ８、８ａ  反応チャンバ（部分チャンバ）、  ９  オーバフロー間隙、  １０  分離部材のプレート状ヘッド、  １１  シャフト、  １２  レセプタクル縁部、  １３  蓋、  ２６  チャンネル、  １４、１４ａ  貯蔵チャンバ、  １５  貫通チャンネル、  １６  接続部、  １７  ピペット、  １８  電極又はセンサ、  １９  自動ピペッティング装置、  ２０  マルチウェルプレート、  ２１  ピペットヘッド、  ２２  ディスペンサーチャンネル、  ２３  微孔質ダイアフラム、  ２４  基板プレート、  ２５  滴
【図１】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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