(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各検査種類の検査で用いられ各検査種類ごとに多数含まれる検出体を、各検査種類間で相互に識別可能となるように各検査種類ごとに標識化した複数検査種類の標識化検出体群と、
各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の磁性粒子群とを含む懸濁液であって、
前記検査種類ごとに多数の前記磁性粒子による前記標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出することによって、複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行して行われるとともに、
前記各検査種類の前記標識化検出体は各検査種類の標識物質とのみ結合することによって標識化され、各検査種類ごとの前記標識物質の全体は、複数の所定の種類が所定の量比含まれたものであって、その種類およびその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なることを特徴とする複数検査多重化用懸濁液。
【請求項２】
各検査種類ごとの標識物質の全体は、各検査種類ごとに前記標識化検出体の略全てに分配され、１個の標識化検出体は１種類の標識物質とのみ結合したものであることを特徴とする請求項１に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項３】
複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体群は、その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群であり、前記結合物質群はその標識化検査対象物群が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項４】
各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想され、相互に異なるように標識化された既知の複数種類の構造体であって、前記結合物質と結合した該既知の前記構造体から前記未知の構造の決定を行うことを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項５】
複数検査種類の検査対象物の存在の有無、またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物を介してのみ互いに結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項６】
遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体は、各々、一本鎖の検査部位が１検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたＤＮＡ断片等の遺伝物質であり、各検査種類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質であることを特徴とする請求項３に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項７】
所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体は、前記タンパク質であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項３または請求項５のいずれかの１項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項８】
複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質について、未知のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中での存在の有無、または存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体群は、各検査種類ごとに多数含まれ、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに該当する塩基配列の合成、増幅を開始する既知の多数の複数検査種類のプライマー群であり、
前記結合物質は、そのプライマー群と対をなす複数検査種類のプライマー群であることを特徴とする請求項５に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項９】
変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記標識化検出体の各構造体は、前記プライマーの３'末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造の異なるものを互いに識別可能に標識化させたものであり、前記結合物質は、前記プライマーの３'末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであり、前記磁性粒子は、前記構造ごとに前記標識化されたプライマーを前記プライマーを介して保持することを特徴とする請求項４に記載の複数検査多重化懸濁液。
【請求項１０】
前記標識化検出体は、複数の検査部位をもつ二本鎖のＤＮＡを、各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、ＰＣＲプライマーに影響を及ぼさない程度に離れているＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列を３'末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数検査種類のプライマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片であることを特徴とする請求項１、請求項３または請求項５のいずれかの１項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
【請求項１１】
各検査種類の検査で用いられ各検査種類ごとに多数含まれる検出体を、各検査種類間で相互に識別可能となるように各検査種類ごとに標識化して複数検査種類の多数の標識化検出体群を生成する生成工程と、少なくとも、各検査種類ごとに多数の生成された複数検査種類の標識化検出体群、および、各検査種類の検査の内容に応じて検査種類ごとに多数の前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の磁性粒子群を、液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、前記検査種類ごとに、前記磁性粒子による標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出する検出工程とを有することによって、複数検査種類の検査を並行して行うとともに、
前記生成工程は、各検査種類ごとに、多数の検出体と、複数の所定の種類が所定の量比含まれた各検査種類の標識物質とを液中に懸濁させて結合させる工程を有し、その種類およびその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なるものであることを特徴とする複数検査多重化方法。
【請求項１２】
前記生成工程において、各検査種類の標識物質の全体は、各検査種類ごとの前記標識化検出体の略全てに分配され、１個の前記標識化検出体は１種類の標識物質とのみ結合する工程を有することを特徴とする請求項１１に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１３】
複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、各々前記検査対象物を標識化したものであり、前記検出工程において、前記結合物質はその検査対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質であることを特徴とする請求項１１または請求項１２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１４】
各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想される既知の複数種類の構造体であって、相互に異なるように標識化されたものであり、前記結合物質と結合した前記既知の構造体から前記未知の構想を決定することを特徴とする請求項１１または請求項１２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１５】
前記検査対象物の存在の有無および存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記検査工程における前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物が存在する場合のみ互いに結合するように選ばれた物質であり、前記処理工程においては、前記検査対象物をも懸濁して処理することを特徴とする請求項１１または請求項１２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１６】
遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、生成工程において、前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が１検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたＤＮＡ断片等の遺伝物質を生成し、各検査種類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質であることを特徴とする請求項１１または請求項１２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１７】
前記生成工程は、複数検査種類の検査部位をもつ二本鎖のＤＮＡと、各検査種類ごとに、一端に結合した標識物質で標識化され、プライマーの３'末端の下流側にある検査部位が突出末端となる切断部位をもつＴｙｐｅII Ｓ制限酵素の認識部位が挿入されたプライマー群と、それと対をなすプライマー群と、を混合してＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する増幅工程と、増幅された前記ＤＮＡ断片をＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによって、前記標識化検出体として、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片を生成する酵素反応工程とを有し、
前記処理工程は、各検査種類毎に、前記標識化検出体の突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合可能な塩基配列をもつ突出末端を有するＤＮＡ断片を有する複数検査種類の磁性粒子群、および前記標識化検出体群を液中に懸濁して混合しライゲーション反応を行うものであることを特徴とする請求項１３に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１８】
前記生成工程は、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中にその塩基配列が存在するか否かの検査の対象となる既知の複数検査種類のＤＮＡ合成を開始するプライマー群と、それと対をなす複数検査種類のプライマー群を各検査種類ごとに多数有する磁性粒子とを、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中に懸濁してＰＣＲ法により増幅する増幅工程を有することを特徴とする請求項１５に記載の複数検査多重化方法。
【請求項１９】
各検査種類における変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記増幅工程は、前記標識化検出体の各構造体として、前記プライマー３'末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造が異なるものを互いに識別可能に標識化させ、前記結合物質は、前記プライマーの３'末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーを多数有する磁性粒子とを、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中に懸濁してＰＣＲ法により増幅することを特徴とする請求項１４に記載の複数検査多重化方法。
【請求項２０】
所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記処理工程における前記標識化検出体は、複数検査種類のタンパク質であって、前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項１１または請求項１２のいずれかの１項に記載の複数検査多重化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法に関する。本発明は、特に、遺伝子、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖等の生体高分子に関する検査、解析、分析が要求される分野、例えば、工学分野、食品、農産、水産加工等の農学分野、薬学分野、衛生、保健、免疫、疾病、遺伝等の医学分野、化学もしくは生物学等の理学分野等、あらゆる分野に関係するものである。
【０００２】
本発明は、特に、遺伝子の変異解析、多型解析、マッピング、塩基配列解析、発現解析等において適した複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
従来、遺伝子プローブ（標識化された特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列）分析を行うために、遺伝子増幅技術（例えばＰＣＲ）を用いて目的の遺伝子配列を増幅し、ハイブリダイゼーション・ライゲーション検出法を用いて、ターゲット配列にハイブリダイズされたプローブの配列が分離され且つ検出されるようにすることにより（例えば、プローブは磁性粒子とアクリジニウムエスエルの組み合わせを含有する）特定の配列が存在するか否かを決定するものがあった（特表平９−５１０８７８号）。
【０００４】
この方法は、詳しくは、ターゲットポリ核酸配列を同定する方法であって、（ａ）２種類のプローブがライゲーションされたときに、それらのプローブが、前記ターゲットポリ核酸の予想配列の一部または全部に相補的であるようにし、該プローブの一方は、そのプローブが反応混合物から容易に分離され得るようにする部分に結合され、さらに、他方のプローブは、ラベルに結合されるようにし、（ｂ）該プローブをターゲットポリ核酸と混合することにより、それらのプローブが該ターゲットポリ核酸にハイブリダイズするようにし、（ｃ）ライゲーション用試薬を添加し、（ｄ）反応混合物を変成することにより、ターゲットポリ核酸からプローブが分離されるようにし、（ｅ）分離を容易にする前記部分を利用して、プローブを分離し、さらに、（ｆ）分離後のプローブを分析して該プローブに前記ラベルが結合されているか否かを決定するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記の遺伝子プローブ分析方法にあっては、分析は、常に１種類の塩基配列の検査に限られるものである。そのために、複数の分析を行うには、上記の方法を、各種類ごとに別途行う必要がある。そのために、各種類ごとに、容器や、反応物質や、試薬の多種類を大量に用意する必要や、各検査毎に容器等を洗浄する必要や、恒温装置等の設備が必要になったり、各種類ごとに処理を順次行う必要があり、処理時間を長く必要とし、また、大きな処理空間や処理設備を必要とすることになるという問題点を有していた。
【０００６】
また、各種類の検査ごとに種々の手間がかかるため、処理が煩雑になり、使用者に大きな手間がかかるという問題点をも有していた。
【０００７】
さらに、各処理ごとに異なる懸濁液や試薬等を種類間でクロスコンタミネーションが生じないように用意する必要があるので、処理の管理に大きな手間がかかることになるという問題点を有していた。
【０００８】
そこで、本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、第１の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、その処理時間のみならず、その作業空間を省き、効率的に処理を行うことができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【０００９】
第２の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、各検査ごとには微小な量であっても、それらをまとめてバルクな量を扱うことによって、より扱いやすく使い勝手の良い複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【００１０】
第３の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、各検査における共通に必要とする試薬等の物品や、温度等の環境等の設備、人手を節約し、検査コストを低下させることができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【００１１】
第４の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、各種類の検査に同一の条件を設定することが可能となり、各種類間で同一条件での検査結果の比較を行うことができ、これによって各種類間の本質的な相違点の発見や、信頼性のある精度の高い検査結果を得ることができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【００１２】
第５の目的は、特に、遺伝物質の塩基配列の決定等のように大量の情報を得る必要があるために、多数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処理に適した複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
以上の課題を解決するために、第１の発明は、各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複数検査種類の標識化検出体群と、各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群とを含む懸濁液であって、前記検査種類ごとに、前記微粒子による前記標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出することによって、複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行して行われる複数検査多重化用懸濁液である。
【００１４】
ここで、「検査種類」とは、並行して行おうとする複数の検査の種類をいう。検査種類は、例えば、検査対象物の種類、同一検査対象物における検査部位の種類によって区別することができる。
【００１５】
また、「標識化検出体」とは、標識化された検出体であり、「検出体」とは、検出に用いられる微小な固体であって、各検査種類ごとに前記懸濁液中に多数含まれる。「標識化」は、例えば標識物質と結合することによって行う。標識物質は、光学物質のみならず、種々の瞬時に定量可能な他の物理量、化学量をもつ物質によって行っても良い。「保持の程度」は、保持量の多少、すなわち検出の際の標識の程度を意味し、標識化が光学的に行われる場合には、例えば光の強度である。「結合物質を有する」態様としては、結合物質が結合し、結合物質が付着し、もしくは固定し、結合物質を吸着し、結合物質を微粒子の表面にコーティングしている場合、または他物質を媒介にして結合物質を有する場合を含む。
【００１６】
本発明によれば、各微粒子ごとに前記結合物質を介して保持された前記標識化検出体による標識化の状態を検出しまた検出できないことによって、その標識によって識別しようとする検査種類を特定し、その検査種類について種々の情報を容易に得ることができる。
【００１７】
第２の発明は、第１の発明において、前記各検査種類の前記標識化検出体は各検査種類の標識物質とのみ結合することによって標識化され、各検査種類ごとの標識物質の全体は、所定の種類が所定の量比含まれたものであって、その種類またはその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なる複数検査多重化用懸濁液である。ここで、「標識物質」には、例えば、蛍光物質等の発光物質、電磁波を発する物質、磁場を発する物質、電荷をもつ物質等がある。
【００１８】
第３の発明は、第２の発明において、各検査種類ごとの標識物質の全体は、各検査種類ごとに前記標識化検出体の略全てに分配され、１個の標識化検出体は１種類の標識物質とのみ結合したものである複数検査多重化用懸濁液である。
【００１９】
第４の発明は、第１の発明ないし第３の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体群は、その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群であり、前記結合物質群はその標識化検査対象物が所定構造を持つ場合のみ結合しうる物質である。「検査対象物」には遺伝物質、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖等の生体高分子等を含む。
【００２０】
第５の発明は、第１の発明ないし第３の発明のいずれかにおいて、各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想され、相互に異なるように標識化されたら既知の複数種類の構造体であって、前記結合物質と結合した該既知の構造体から前記未知の構造の決定を行う複数検査多重化用懸濁液である。
【００２１】
第６の発明は、第１の発明ないし第３の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の存在の有無、またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物を介してのみ互いに結合するように選ばれた物質である。
【００２２】
第７の発明は、第４の発明において、遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体は、各々、一本鎖の検査部位が１検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたＤＮＡ断片等の遺伝物質であり、各検査種類の前記結合物質は、正常なまたは異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質である。
【００２３】
第８の発明は、第４の発明または第６の発明のいずれかにおいて、所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体は、前記タンパク質であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質である。「物質」には、例えば抗体を含む。
【００２４】
第９の発明は、第６の発明において、複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質について、未知のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中での存在の有無、または存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体群は、各検査種類ごとに多数含まれ、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに該当する塩基配列の合成、増幅を開始する既知の多数の複数検査種類のプライマー群であり、前記結合物質は、そのプライマー群と対をなす複数検査種類のプライマー群である。
【００２５】
第１０の発明は、第５の発明において、変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記標識化検出体の各構造体は、前記プライマーの３’末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基若しくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造の異なるものを互いに識別可能に標識化させたものであり、前記結合物質は、前記プライマーの３’末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであり、前記微粒子は、前記構造ごとに前記標識化されたプライマーを前記プライマーを介して保持する複数検査多重化懸濁液である。
【００２６】
ここで、「プライマーの３’末端もしくはその近傍」としたのは、プライマーの３’末端から離れれば離れるほど、その変異部位に相当する位置における塩基または塩基配列がＰＣＲ法による合成、増幅における影響が小さくなり、その塩基または塩基配列の相違に拘わらず合成、増幅されるおそれがあるからである。また、「相当する塩基もしくは塩基配列を有しない」とは、検査対象であるＤＮＡの対応する位置に欠失が存在する場合のプライマーを意味する。
【００２７】
第１１の発明は、第１の発明ないし第１０の発明のいずれかにおいて、前記微粒子は、磁場等により遠隔操作可能となる複数検査多重化用懸濁液である。
【００２８】
第１２の発明は、第１の発明、第４の発明または第６の発明のいずれかにおいて、前記標識化検出体は、複数の検査部位をもつ二本鎖のＤＮＡを、各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、ＰＣＲプライマーに影響を及ぼさない程度に離れているＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列を３’末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数検査種類のプライマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片である。
【００２９】
ここで、「各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、ＰＣＲプライマーに影響を及ぼさない程度に離れている」とは、好ましくは１０塩基以上離れている場合をいう。理想的には、２０〜３０塩基程度離れているのが良い。しかし、現在知られているＴｙｐｅII Ｓ制限酵素では、最大１０〜２０塩基程度である。
【００３０】
第１３の発明は、各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複数検査種類の標識化検出体群を生成する生成工程と、少なくとも、生成された複数検査種類の標識化検出体群、および、各検査種類の検査の内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群を、液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、前記検査種類ごとに、前記微粒子による標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出する検出工程とを有することによって、複数検査種類の検査を並行して行う複数検査多重化方法である。
【００３１】
第１４の発明は、第１３の発明において、前記生成工程は、各検査種類ごとに、多数の検出体と、所定の種類が所定の量比含まれた各検査種類の標識物質とを液中に懸濁させて結合させる工程を有し、前記種類またはその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なる複数検査多重化方法である。
【００３２】
第１５の発明は、第１４の発明において、前記生成工程において、各検査種類の標識物質の全体は、各検査種類ごとの前記標識化検出体の略全てに分配され、１個の前記標識化検出体は１種類の標識物質とのみ結合する工程を有する複数検査多重化方法である。
【００３３】
第１６の発明は、第１３の発明ないし第１５の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、各々前記検査対象物を標識化したものであり、前記検査工程において、前記結合物質はその検査対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質である。
【００３４】
第１７の発明は、第１３の発明ないし第１５の発明のいずれかにおいて、各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想される既知の複数種類の構造体であって、相互に異なるように標識化されたものであり、前記結合物質と結合した前記既知の構造体から前記未知の構造を決定する複数検査多重化方法である。
【００３５】
第１８の発明は、第１３の発明ないし第１５の発明のいずれかにおいて、前記検査対象物の存在の有無および存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記検査工程における前記検出体および結合物質は、前記検査対象物が存在する場合のみ互いに結合するように選ばれた物質であり、前記処理工程においては、前記検査対象物をも懸濁する複数検査多重化方法である。
【００３６】
第１９の発明は、第１３の発明ないし第１５の発明のいずれかにおいて、遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、生成工程において、前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が１検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたＤＮＡ断片等の遺伝物質を生成し、各検査種類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質である複数検査多重化方法である。
【００３７】
第２０の発明は、第１６の発明において、前記生成工程は、複数検査種類の検査部位をもつ二本鎖のＤＮＡと、各検査種類ごとに、一端に結合した標識物質で標識化され、プライマーの３’末端の下流側にある検査部位が突出末端となる切断部位をもつＴｙｐｅII Ｓ制限酵素の認識部位が挿入されたプライマー群と、それと対をなすプライマー群と、を混合してＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する増幅工程と、増幅された前記ＤＮＡ断片をＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによって、前記標識化検出体として、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片を生成する酵素反応工程とを有し、前記処理工程は、各検査種類毎に、前記標識化検出体の突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合可能な塩基配列をもつ突出末端を有するＤＮＡ断片を有する複数検査種類の微粒子群、および前記標識化検出体を液中に懸濁して混合しライゲーション反応を行う複数検査多重化方法である。
【００３８】
第２１の発明は、第１８の発明において、前記生成工程は、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中にその塩基配列が存在するか否かの検査の対象となる既知の複数検査種類のＤＮＡ合成を開始するプライマー群と、それと対をなす複数検査種類のプライマー群を各検査種類ごとに多数有する微粒子とを、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中に懸濁してＰＣＲ法により増幅する増幅工程を有する複数検査多重化方法である。
【００３９】
第２２の発明は、第１７の発明において、各検査種類における変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記増幅工程は、前記標識化検出体の各構造体として、前記プライマー３’末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造が異なるものを互いに識別可能に標識化させ、前記結合物質は、前記プライマーの３’末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーを多数有する微粒子とを、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中に懸濁してＰＣＲ法により増幅する複数検査多重化方法である。
【００４０】
第２３の発明は、第１３の発明ないし第１５の発明のいずれかにおいて、所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記処理工程における前記標識化検出体は、複数検査種類のタンパク質であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質である複数検査多重化方法である。なお、以上の第１３から第２３の発明において、前記微粒子は、例えば、磁性粒子を有し、磁場等により遠隔操作可能となるものが好ましい。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を、図面に基づいて以下に説明する。なお、この実施の形態は特に指定のない限り本発明を制限するものと解してはならない。
【００４２】
図１は、第１の実施の形態に係るその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を示すものである。
図１（ａ）に示すように、本実施の形態では、例えば、一人の患者から抽出した遺伝物質である特定の二本鎖の検体ＤＮＡ１１の複数箇所の検査部位１２、１３にある塩基配列をもつ各検査対象の構造が予想される構造と一致するか否か、すなわち構造の当否の検査を行うものである。
【００４３】
前記「検査種類」とは、ここでは検体ＤＮＡ１１上の位置およびその塩基配列が異なる検査部位１２、１３の種類を意味する。この例では、説明上簡単のため、２種類の前記検査部位１２、１３のみを示し、また、各検査部位１２、１３の塩基数は２塩基の場合のみを示しているが、この種類数およびこの塩基数に限定されるものではない。
【００４４】
図１（ａ）は、さらに、一端が２つの種類の標識物質１４、１５のどちらかのみと結合し、３’末端の上流側に設けられ前記検査部位１２に切断部位をもつように、認識部位と切断部位にある塩基とが１０塩基以上離れたＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列１６を含有するプライマー１７からなるプライマー群１８を有する。
【００４５】
また、このプライマー１７と対をなし、標識化のされていないプライマー２０からなるプライマー群２１を有している。ここで、前記標識物質１４、１５は例えば種類の異なる２種類の蛍光物質である。蛍光物質には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン  イソチオシアネート）、ローダミン、イソチオシアネート、ＩＲＤ４０，Ｃｙ３等の誘起物質またはユウロピウム錯体等の無機物質がある。
【００４６】
前記検査部位１３に対しても、同様にして、標識化がされ、前記ＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列を含有するプライマー１９からなるプライマー群２２を有する。また、このプライマー１９と対をなし、標識化のされていないプライマー２３からなるプライマー群２４を有する。
【００４７】
ここで、前記プライマー群１８では、前記標識物質１４と結合したプライマー１７と、標識物質１５と結合したプライマー１７との量比（各プライマーに標識物質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相当する）とは、２対１である。それに対して、プライマー群２２では、前記標識物質１４と結合したプライマー１９と、標識物質１５と結合したプライマー１９との量比は、１対２である。
【００４８】
次に、図１（ｂ）において、これらの検体ＤＮＡ１１、プライマー群１８およびプライマー群２１、プライマー群２２、およびプライマー群２４を混合し、ＰＣＲを実行する。
【００４９】
すると、図１（ｂ）に示すように、標識化されたプライマー側末端の近傍にＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識部位を有する２種類の二本鎖ＤＮＡ断片群２５、２６が並行して合成される。
【００５０】
次に、図１（ｃ）に示すように、増幅された前記ＤＮＡ断片群２５、２６をＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによって、末端に標識物質を有し、他端に検査部位１２の突出末端６を有する多数のＤＮＡ断片からなるＤＮＡ断片群２７、同様に、他端に検査部位１３の突出末端２８を有する多数のＤＮＡ断片からなるＤＮＡ断片群２９が生成される。このＤＮＡ断片群２７、２９が前記複数検査種類の標識化検出体群に相当する。
以上説明した、図１（ａ），（ｂ），（ｃ）の各工程が、前記生成工程に対応する。
【００５１】
次に、図１（ｄ）に示すように、前記結合物質として、末端に突出末端３０を有するＤＮＡ断片３１を有する微粒子３２を用意する。このＤＮＡ断片３１の突出末端３０は、前記検査部位１２の塩基配列が正常型（検査部位１２が正常であった場合にはGAとする）であった場合には、それと相補的な突出末端を有する（TC）。
【００５２】
これを多数集めたものが前記検査部位１２に対応する微粒子群３６である。同様にして、前記結合物質として、末端に突出末端３３をもつＤＮＡ断片３４を有する微粒子３５を用意する。このＤＮＡ断片３４の突出末端３３は、前記検査部位１３の塩基配列が正常型（検査部位１３が正常であった場合にはACとする)であった場合には、それと相補的な突出末端を有する(GT)。これを多数集めたものが前記検査部位１３に対応する微粒子群３７である。なお、前記微粒子３２、３５には、各々同種のＤＮＡ断片３１、３４のみを有している。
【００５３】
図１（ｃ）で生成された，ＤＮＡ断片群２７、２９と、前記図１（ｄ）において生成された前記微粒子群３６、３７を混合し、ライゲーション反応を行う。これにより、いずれの検査部位１２、１３も正常型である場合には、前記微粒子群３６、３７の各々が有する多数の結合物質であるＤＮＡ断片３１およびＤＮＡ断片３４は、各々標識化検出体である多数のＤＮＡ断片群２７およびＤＮＡ断片群２９と結合する。この図１（ｄ）が前記処理工程に対応する。
【００５４】
その結合は、多数の物質同士でランダムに行われるため、統計的誤差を除き検出体の前記標識物質１４および前記標識物質１５との量比が維持された状態で、結合可能な結合物質と結合する。この誤差は、個数が増加すればするほど小さくなる。
【００５５】
したがって、図１（ｅ）に示すように、各々標識物質１４および標識物質１５は、各検査種類毎に異なる量比、すなわち、Ｆ１：Ｆ２＝２：１，およびＦ１：Ｆ２＝２：１に限りなく近いいずれかの状態で標識化された複合粒子３８および複合粒子３９が得られることになる。
【００５６】
一方、いずれかの検査部位１２、１３が変異型である場合（ｄでの配列と異なる場合）には、それぞれ、各複合粒子３８または複合粒子３９は検出されないことになる。
【００５７】
したがって、１本の反応容器中で上記の反応を行い、フローサイトメータで検出を行うことにより、２種類以上の変異部位を同時に検出することが可能である。このフローサイトメータによる検出が、前記検出工程に相当する。
【００５８】
以上の実施の形態の説明では、検査部位１２のまたは検査部位１３の構造（各々AT,CA)が正常か異常かであるかを調べるのみであった。もし、各検査部位１２、検査部位１３の構造をも特定しようとするのであれば、前記構造体として予想される全検査部位の構造に対応する塩基配列の組み合わせを、前記プライマー群１８の３’末端またはその近傍に含むプライマー群１８を形成し、相互に識別可能とするように標識化したものを各検査部位（１２、１３）ごとに全て互いに異なるように標識化したものを用いることによって行うことができる。
【００５９】
また、以上の説明で用いられた２塩基突出は、例えばFok I等のＴｙｐｅII Ｓ制限酵素による４塩基突出末端など、３塩基以上の突出末端を用いることが可能である。例えば、４塩基突出末端の場合には、異なる配列として認識が可能な場合の数は２５６種類となり、同時に検出可能な変異部位ある変異からなる検出の種類の数を増加させることができる。
【００６０】
続いて、第２の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を、図２に基づいて説明する。
本実施の形態は、食品等に汚染されている複数の微生物種の存在を、その微生物種毎に、１本の反応容器中で反応させることによって検出するものである。
【００６１】
図２（ａ）で、複数の微生物種を含むと予想される含微生物試料４０を用意する。図２（ｂ）において、この含微生物試料４０から、その含微生物試料４０に含有されている様々な未知の各種検体ＤＮＡ（ＤＮＡ(1)、ＤＮＡ(2)、ＤＮＡ(3)等）４１を抽出する。
【００６２】
次に、図２（ｃ）に示すように、前記含微生物試料４０に含有されているか否かの検査の対象となる検査対象物が、例えば、２種類（もちろん、３種類以上の微生物種であっても良い）の微生物種であるとする。この２種類が前記検査種類に相当する。
【００６３】
また、第１の微生物種および第２の微生物種に各々特有となるように、前記２種類の標識物質を結合することによって標識化（コード化）されたプライマー４３、４６を用意する。前記プライマー４３、４６は、例えば、一端が２種類の標識物質（例えば蛍光物質）４２、４４の一方のみと結合したものを多数用意し、各々プライマー群４５とプライマー群４７とする。このプライマー群４５、４７が標識化された複数検査種類の標識化検出体群に相当する。
【００６４】
但し、プライマー群４５では、前記標識物質４２と結合したプライマー４３と、標識物質４４と結合したプライマー４３との量比（各プライマーに標識物質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相当する）は、２対１である。それに対して、プライマー群４７では、前記標識物質４２と結合したプライマー４６と、標識物質４４と結合したプライマー４６との量比は、１対２として互いに異なるように標識化する。この標識化を行うまでの工程である図２（ｃ）は前記生成工程に相当する。
【００６５】
前記結合物質として、前記プライマー４３、４６と対をなすプライマー４８、４９を微粒子５０、５１に各々固定化されたものを用意する。その際、同一の前記微粒子５０または微粒子５１には、同一の配列を有するプライマー４８、またはプライマー４９のみが固定化されるようにした多数の微粒子５０、５１からなる２検査種類の微粒子群５２、５３を用意する。
【００６６】
次に、これらのプライマー群４５、４７および微粒子群５２、５３を懸濁させた懸濁液に、検査対象物として図２（ｂ）で示した抽出されたＤＮＡ試料を混合し、ＰＣＲを行う。すると、前記試料中に、第１の微生物種および第２の微生物種が存在していた場合には、ＰＣＲ法により、前記微粒子５０、５１が有するプライマー４８、４９と標識化されたプライマー４３、４６によって、図２（ｄ）に示すように標識化された二本鎖のＤＮＡ断片が形成される。
【００６７】
多数のプライマー４３、４６と多数のプライマー４８、４９による二本鎖の形成はランダムに行われるため、統計的誤差を除き標識化検出体の前記標識物質４２および前記標識化検出体の前記標識物質４４との量比が維持された状態で二本鎖が形成される。
【００６８】
この誤差は、個数が増加すればするほど小さくなる。したがって、図２（ｄ）に示すように、各々標識物質４２および標識物質４４は、各微生物種毎に異なる量比、すなわち、Ｆ１：Ｆ２＝２：１、およびＦ１：Ｆ２＝２：１に限りなく近いいずれかの状態で標識化された複合粒子５４、５５が得られることになる。したがって、フローサイトメータを用いた分析によって、前記量比を検出することによって、これらの複合粒子５４、５５の存在を確認することができる。
【００６９】
この図２（ｄ）（ｅ）が前記処理工程に相当し、前記フローサイトメータによる分析が前記検出工程に相当する。
【００７０】
一方、いずれかの微生物種が前記試料中に存在しない場合には、それぞれ、各複合粒子５４または複合粒子５５は検出されないことになる。
【００７１】
続いて、第３の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を図３に基づいて説明する。
【００７２】
この実施の形態では、試料中に存在する複数の異なるタンパク質について、それぞれ構造の変異を有するか否かの検査を１個の容器中での反応によって可能とするものである。
【００７３】
図３（ａ）に示すように、ヒト等の組織より、タンパク質（Ｐ１）６０および異なる種類のタンパク質（Ｐ２）６３を含む粗抽出液を用意する。
【００７４】
各タンパク質６０、６３には、後述する微粒子群７７、７９に固定化されるべき所定の固定化部位６１、６４と、変異があるか否かの構造の当否、もしくはそれが存在するか否か、またはどのくらい存在するか否かの存在の程度の検査の対象となる部位である検査部位６２、６５とを有する。
【００７５】
図３（ｂ）に示すように、タンパク質６０、６３の前記検査部位６２、６５が正常型である場合に、その検査部位６２、６５と特異的に結合する標識化された多数の抗体６８、７０からなる抗体群６９、７１を示す。
【００７６】
各抗体群６９では、前記標識物質６６と結合した抗体６８と、標識物質６７と結合した抗体６８との個数の比は、２対１である。それに対して、抗体群７１では、前記標識物質６６と結合した抗体７０と、前記標識物質６７と結合した抗体７０との個数の比は、１対２である。
【００７７】
次に、これらのタンパク質６０、６３を、抗体群６９、７１が懸濁されている懸濁液中に投入して混合し、反応させる。
【００７８】
すると図３（ｃ）に示すように、タンパク質６０によって、前記標識物質６６、６７が２対１となるように標識化されたタンパク質群７２が得られ、タンパク質６３によって、標識物質６６、６７が１対２となるように標識化されたタンパク質群７３が得られる。このタンパク質群７２、７３は前記標識化検出体群に相当する。すなわち、図３（ａ），（ｂ），（ｃ）が前記生成工程に相当する。
【００７９】
一方、図３（ｄ）に示すように、前記結合物質として、前記固定化部位６１、６４と結合可能な多数の抗体７６、７８を多数の微粒子７４、７５に固定化させた微粒子群７７、７９を用意する。但し、同一の粒子には、同一の抗体のみが固定化されるようにする。
【００８０】
次にその微粒子群７７、７９が懸濁する懸濁液中に、前記標識化されたタンパク質群７２、７３を懸濁させて混合する。もし、前記タンパク質６０、６３の検査部位６２、６５が正常型である場合には、図３（ｅ）に示すような、標識化された複合粒子８０、８１が形成される。
【００８１】
多数の抗体６８、７１と、多数のタンパク質６０、６３との結合はランダムに行われるため、統計的誤差を除き検出体の前記標識物質６６および前記検出体の前記標識物質６７との量比が維持された状態で複合粒子８０、８１が形成される。この誤差は、個数が増大すればする程小さくなる。
【００８２】
したがって、図３（ｅ）に示すように、各々標識物質６６および６７は、各タンパク質毎に異なる量比、すなわち、Ｆ１：Ｆ２＝２：１、およびＦ１：Ｆ２＝２：１に限りなく近いいずれかの状態で標識化されることになる。したがって、フローサイトメータを用いた１粒子ごとに、前記量比を検出することによって、これらの複合粒子８０、８１の存在を確認することができる。この図３（ｄ）（ｅ）の工程が前記処理工程に相当し、フローサイトメータによる検出が前記検出工程に相当する。
【００８３】
さらに、第３の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法の他の例として、前記抗体６８、７０に代えて、発癌に関連するタンパク質の変異した検査部位に特異的に結合する抗体６８、７０を選択し、変異の有無によって結合の可否が決定されるようにする。
【００８４】
この例では、そのような抗体群によって結合された各複合粒子８０、８１の蛍光強度を測定することによって、変異された（発癌に関係する）タンパク質の有無、そのタンパク質の種類間の量の相違や比若しくは１タンパク質あたりの変異部位の個数の相違や比を検出することができる。
【００８５】
第４の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を、図４に基づいて説明する。
【００８６】
本実施の形態は、第２の実施の形態として、図２で説明した複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質に、変異が予想される変異部位を有する遺伝物質が含まれている場合にその変異の構造をも特定するためのものである。
【００８７】
図４（ａ）は、説明の簡単のために、検体ＤＮＡ９０に検査部位として１塩基の変異部位９１が存在する場合に、その構造を決定する方法を示す。
【００８８】
前記標識化検出体の各構造体として、プライマー９３の３’末端もしくはその近傍９５、９７であって前記変異部位９１に相当する位置において変異が予想される１塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃを各々有する（図４では説明の簡単のためにＡとＧのみについて図示している）多数のプライマー９３からなる４種類のプライマー群９６、９８を液中に懸濁したものを用いる。
【００８９】
各Ａ，Ｇ（Ｔ，Ｃ）を有する各プライマー群９６、９８に属する各プライマー９３は、１の種類の標識物質９２、９４とのみ結合し、各種類ごとに、前記標識物質９２，９４と結合した各プライマー群９６、９８は、予め定めた量比、例えば、プライマー群９６については、Ｆ１：Ｆ２＝２：１であり、プライマー群９８についてはＦ１：Ｆ２＝１：２である。
【００９０】
なお、結合物質として、前記プライマー９３と対をなすプライマー１００を用いる。この多数のプライマー１００を有する多数の微粒子９９は微粒子群１０１を構成する。
【００９１】
これらのプライマー群９６、９８、前記微粒子群１０１を液中に懸濁させて、ＰＣＲ法により増幅し、前記プライマー群９６、９８のいずれかと結合して微粒子９９に形成された複合体を検出することによって、前記変異部位９１の構造を特定することができる。
【００９２】
図４（ｂ）は、２種類の検体ＤＮＡ(1)１０２，検体ＤＮＡ(2)１１１の各々に変異部位１０３、１１２（説明の簡単上、１塩基の構造をもつとする）がある場合に、その変異部位の構造の当否を決定するものである。
【００９３】
本例では、標識化検出体として、標識化されたプライマー１０５、１０９とを用意する。前記プライマー１０５、１０９は、例えば、一端が２種類の標識物質（例えば蛍光物質）９２、９４の一方のみと結合したものを多数用意し、各々プライマー群１０４と、プライマー群１１０とする。
【００９４】
プライマー群１０４では、前記標識物質９２と結合したプライマー１０５と、標識物質９４と結合したプライマー１０５との個数の比は、１対２であり、標識物質９２と結合したプライマー１０９と、標識物質９４と結合したプライマー１０９との個数の比は２対１として互いに異なるように標識化する。
【００９５】
また、前記結合物質としては、前記プライマー１０５、１０９と各々対をなすプライマー１０６、１１３であり、その３’末端もしくはその近傍１０７、１１７の前記変異部位１０３、１１２に相当する位置において、変異が予想される１塩基Ａ、Ｇを各々もつ多数のプライマー１０６、１１３を有する２種類の微粒子９９からなる微粒子群１０８、１１５を用意する。
【００９６】
この前記プライマー群１０４、１１０、検体ＤＮＡ(1)１０２，ＤＮＡ(2)１１１、微粒子群１０８、１１５を液中に懸濁させてＰＣＲ法で増幅させる。その結果、前記ＤＮＡ(1)またはＤＮＡ(2)の変異部位１０３、１１２が該当する塩基を有する場合のみフローサイトメータで前記量比を持った蛍光が観測され、前記変異部位の構造の当否を決定することができる。
【００９７】
図４（ｃ）は、説明の簡単のために、検体ＤＮＡ１２１に検査部位として１塩基の変異部位１２２が存在する場合に、その構造を決定する方法を示す。
【００９８】
前記標識化検出体の各構造体として、プライマー１１６の３’末端もしくはその近傍１１７、１１９であって、前記変異部位１２２に相当する位置１１７、１１９において変異が予想される変異が予想される塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ（説明の簡単のためＡ，Ｇのみ図示）を各々有する多数のプライマー１１６からなる４種類のプライマー群１１８、１２０を用いる。各プライマー群１１８、１２０に属する各プライマー１１６は、１の種類の標識物質９２、９４とのみ結合し、各種類ごとに、前記標識物質９２、９４と結合した各プライマー群１１８、１２０は、予め定めた量比、例えば、プライマー群１１８については、Ｆ１：Ｆ２＝２：１であり、プライマー群１２０についてはＦ１：Ｆ２＝２：１である。
【００９９】
また、第１の微粒子群の例としては、前記プライマー１１６と対をなし、その３’末端もしくはその近傍の前記変異部位１２２に相当する位置１２４、１２５において、変異が予想される塩基Ａ，Ｇ（Ｔ、Ｃ）を有する多数のプライマー１２３を結合物質として用いる。この多数のプライマー１２３を有する４種類の微粒子９９からなる微粒子群１２６、１２７を用いる。これらのプライマー群１１８、１２０、検体ＤＮＡ１２１，及び微粒子群１２６、１２７を液中に懸濁させてＰＣＲ法により増幅を行うことにより、変異部位１２２の構造に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、その変異部位を有するＤＮＡが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析することができる。
【０１００】
第２の微粒子群の例として、前記プライマー１１６と対をなし、その３’末端もしくはその近傍の前記変異部位１２２に相当する位置１２４、１２５において、変異が予想される塩基Ａ，Ｇ（Ｔ、Ｃ）を有する多数のプライマー１２３を結合物質として用いる。この４種類の多数のプライマー１２３が同一量比となるように有する１種類の微粒子９９からなる微粒子群１２９を用いる。これらのプライマー群１１８、１２０、検体ＤＮＡ１２１，及び微粒子群１２９を液中に懸濁させてＰＣＲ法により増幅を行うことにより、変異部位１２２に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、その変異部位を有するＤＮＡが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析することができる。
【０１０１】
第３の微粒子群の例として、前記プライマー１１６と対をなし、その３’末端から離れた内部にあって前記変異部位１３１に相当する位置１３１において、適当な塩基、例えば、Ａ（Ｇ、Ｔ、Ｃでも可、またはイノシン）を有する１種類の多数のプライマー１３２を結合物質として用いる。この多数のプライマー１３２を有する微粒子９９からなる微粒子群１３０を用いる。この例では、変異部位に相当する位置が３’末端から離れているので、その変異部位に相当する位置にくる塩基または塩基配列はＰＣＲ法による増幅に大きな影響を与えないので、結合物質を共通のものを用いることができる。したがって、第３の微粒子群を用いた場合には第１の微粒子群の場合に比較して検査処理を簡単化することができる。なお、第１の微粒子群および第３の微粒子群を用いることによって、他のＤＮＡが存在した状態での並行検査が可能となる。
【０１０２】
これらのプライマー群１１８、１２０、検体ＤＮＡ１２１，及び微粒子群１３０を液中に懸濁させてＰＣＲ法により増幅を行うことにより、変異部位１２２の構造に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、その変異部位を有するＤＮＡが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析することができる。
【０１０３】
以上の実施の形態は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、説明の便宜上、２検査種類の検査を、２種類の標識化検出体を用いて検査を多並行して行い、２種類の標識物質によって標識化したものについて説明したが、この場合に限られず、３検査種類以上の検査、および３以上の種類の標識物質を用いて検査を行うことができる。
【０１０４】
以上の例では、標識物質が発光物質の場合について説明したが、標識物質は、この例に限られず、磁場、核スピン状態等、種々の瞬時に定量可能な物理量をもつ物質であっても良い。また、発光物質であっても、発光波長および発光強度のみならず、発光偏光度、発光位相、発光寿命等を検出するようにしても良い。
【０１０５】
以上の検査は、ＤＮＡに関する多型、微生物種類の検査、タンパク質の変異に関する場合について行われているが、これらの例に限られることなく、糖やアミノ酸等に関する検査にも用いることができるのはいうまでもない。
【０１０６】
また、抗体以外にも、レクチン、その他のタンパク質、低分子物質など、検査物質に特異的に結合する物質を用いることができる。この場合、糖、脂質、その他の低分子量および高分子量からなる、特異的結合が可能な種々の物質の検査を行うことが可能である。
【０１０７】
また、以上の例では、変異部位は１塩基または２塩基の変異の場合についてのみ説明したが、この例に限られることなく、例えば、３以上の塩基からなる塩基配列をもつ変異の場合、欠失、挿入がある場合についても適用できることはいうまでもない。さらに、変異部位の解析方法は、必ずしも複数検査種類の並行検査を行う場合に限られず、１検査種類の検査のみを行う際にも使用することができる。
【０１０８】
【発明の効果】
第１の発明または第１３の発明によれば、複数検査種類の検査を多重化することによって並行して実行することができる。したがって、処理時間を短縮化し、かつ効率化することができるとともに、処理に必要な作業面積を省略化し、使用する装置はコンパクトなもので済むことになる。
【０１０９】
また、各検査ごとには微小な量であっても、それらをまとめてバルクな量を扱うことによって、より扱いやすく使い勝手が良い。さらに、各検査における共通に必要とする試薬等の物品や、温度等の環境等の設備、人手を節約し、検査コストを低下させることができる。
【０１１０】
さらに、各種類の検査に同一の条件を設定することが可能となり、各種類間で同一条件での検査結果の比較を行うことができる。これによって各種類間の本質的な相違点の発見や、信頼性のある精度の高い検査結果を得ることができる。また、遺伝物質の塩基配列の決定等のように大量の情報を得る必要があるために、多数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処理を効率的に行う場合に適している。
【０１１１】
第２の発明または第１４の発明によれば、所定の種類が所定の量比含まれた標識物質が各検査種類間で識別可能となるように異ならせることによって標識化している。したがって、前述した効果の他に、少数の種類の標識物質を用いて多数の検査種類間（例えば、数百、数千、数万種以上）を識別することができるという効果を奏する。また、各検査種類ごとに多数の関係物質を懸濁させることによって容易にかつ統計誤差内の正確で精密な標識化を実現することができる。
【０１１２】
第３の発明または第１５の発明によれば、前述した効果の他に、各検出体ごとに１種類の種類の標識物質とのみ結合するようにしている。したがって、量比は個々の微粒子に特異的に結合した標識物質の検出強度になるので、単に存在の有無のみならず、存在の程度をも容易に検出することができる。
【０１１３】
第４の発明または第１６の発明は、前述した効果の他に、例えば、ＤＮＡの塩基配列等の構造について、高い信頼性をもって高い精度で決定することができる。
【０１１４】
第５の発明、第１０の発明、第１７の発明または第２２の発明によると、前述した効果の他に、複数検査種類の検査対象物質の未知の構造をも高い精度で決定することができる。
【０１１５】
第６の発明または第１８の発明は、前述した効果の他に、例えば、ある試料中に微生物種が存在するか否かに関する検査に適用しやすい。これによって、大腸菌、Ｏ-157等の有無の検査を容易かつ確実に実行することができる。
【０１１６】
第７の発明または第１９の発明は、前述した効果の他に、標識化検出体として、１種類のＤＮＡ等の構造の当否の検査が行われる１本鎖の検査部位が含まれるように切断したものを用いている。したがって、ＤＮＡの塩基配列にある複数の変異を並行して効率的にかつ正確に特定することができる。
【０１１７】
第８の発明または第２３の発明によると、前述した効果の他に、標識化検出体として、１種類のタンパク質の構造の当否、その存在の有無、その存在の程度の検査が行われるように、検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた抗体群を介して標識物質で標識化したものである。これによって、複数種類のタンパク質の検査部位について、迅速かつ効率的にタンパク質の変異型の検査を並行して行うことができる。
【０１１８】
第９の発明または第２１の発明によれば、前述した効果の他に、複数検査種類の検査対象物である未知のＤＮＡが懸濁するＤＮＡ抽出液中に遺伝物質が存在するか否かの検査を並行して迅速かつ効率的に行うことができる。
【０１１９】
第１１の発明によれば、前述した効果の他に、磁性粒子等の遠隔操作可能となる微粒子を用いることによって、処理を一層効率的かつ容易に行うことができる。
【０１２０】
第１２の発明または第２０の発明によれば、前述した効果の他に、前記検出体として、複数の検査部位をもつ二本鎖のＤＮＡを、各検査部位ごとに認識部位と切断部位とが１０塩基対以上離れたＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列を３’末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数の検査種類のプライマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片である。
本発明によれば、ＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列を用いることによって、検査部位に悪影響を与えることなく、任意の位置で二本鎖のＤＮＡを切断することができるので、多様性または汎用性のある検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【図２】本発明の第２の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【図３】本発明の第３の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【図４】本発明の第４の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【符号の説明】
１１、４１、９０、１０２、１１１、１２１…検体ＤＮＡ
１２、１３…検査部位
１４、１５、４２、４４、６６、６７、９２、９４…標識物質（蛍光物質）
１７、１９、２０、２３、４３、４６、９３、１０５、１０９、１１６…プライマー
１８、２１、２２、２４、…プライマー群
２５、２６、…ＤＮＡ断片群
３１、３４…ＤＮＡ断片（結合物質）
２７、２９…ＤＮＡ断片群（標識化検出体群）
３２、３５、５０、５１、７４、７５…微粒子
３６、３７、５２、５３、７７、７９…微粒子群
３８、３９、５４、５５、８０、８１…複合粒子
４０…含微生物試料
４５、４７、９６、９８、１０４、１１０、１１８、１２０…プライマー群（標識化検出体群または構造体群）
４８、４９、１００、１０６、１１３、１２３、１３２…プライマー（結合物質）
６０、６３…タンパク質
６１、６４…固定化部位
６２、６５…検査部位
６８、７０…抗体
６９、７１…抗体群
７２、７３…タンパク質群（標識化検出体群）
７６、７８…抗体（結合物質）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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