(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液又は分散液状の、又は溶液又は分散液状に処理した食品中のＬ−カルニチン類の測定方法において、１）１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを粉末状で加えて、カルニチン類に蛍光ラベル体を定量的に付加し、２）高速液体クロマトグラフィーで２本のカラムを使用し、バルブを介して当該カラムを並列、直列に組替えて接続して通液することにより、Ｌ−カルニチン・蛍光ラベル体付加物と夾雑物を分離し、３）高感度蛍光検出器により分離したＬ−カルニチン・蛍光ラベル体付加物の蛍光強度を検出することを特徴とする、高感度で精度良くしかも短時間で複数サンプルの定量を可能とする食品中のＬ−カルニチン類の測定法。
【請求項２】
蛍光ラベル体が１−アミノアントラセンであることを特徴とする請求項１の測定法。
【請求項３】
蛍光ラベル体と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドの重量比が１：５以上であることを特徴とする請求項１又は２の測定法。
【請求項４】
ポート(穴)数が５個以上のバルブのバルブ切替により、２本のカラムを並列、直列に組替えて接続することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、食品に含まれている微量Ｌ−カルニチン類を精度良く高感度に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脂肪は生体内で分解され脂肪酸となり、最終的にミトコンドリアマトリックス内に運搬され、β酸化を受けATPを生成し、重要なエネルギー源となる。Ｌ−カルニチンはビタミンＢTといわれ、ミトコンドリア膜を脂肪酸が通過する際の担体の役割を果たしており、脂肪酸代謝に関わりをもっている。Ｌ−カルニチンが欠乏すると脂質代謝に異常をきたすばかりでなく、骨格筋や心筋に障害が現れ虚血性疾患等の疾病に陥ることが知られている。また、脳老化や肥満防止への応用も期待されており生理的に重要な物質であることがわかってきている。このようにＬ−カルニチンは、生理的機能の解析や治療薬としての臨床的応用が研究されており、臨床分野での測定法の報告は多い。
【０００３】
一方、カルニチン必要量の一部が食品を通じて補給されている事実があるにもかかわらず、その定量に関しては放射性同位体を用いた方法(J.Lipid Research、Vol.17、277−281、1976および日本栄養・食糧学会誌、Vol.41、No.5、389−395、1988)を除いて、含まれている量が少ないことから感度的に課題があり、食品中のＬ−カルニチン類が精度良く測定されていないのが現実である(特開平6-105700)。
【０００４】
また、蛍光ラベル物質を利用した高速液体クロマトグラフィー法は知られているが、蛍光ラベル物質を付加する際の条件が、80℃以上の高温であったり、ピリジンの共存が必要であったりするものである。食品を80℃以上に加温することは夾雑物質の分解をも招き、一層高速液体クロマトグラフィーでの分離を困難とし、ピリジンの添加は測定者の健康を考慮すると使用を避けることが望ましい。したがって、現在のところ放射性同位体を使用した測定法を除いて、食品中のＬ−カルニチン類を精度良く測定できる方法は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しょうとする課題】
しかし、上記放射性同位体を用いた方法も、特別な施設や煩雑な操作を要するという課題を有している。したがって、食品中に微量含まれているＬ−カルニチン類を、特別な施設や煩雑な操作を要することなく高感度に精度良く、短時間で測定する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、極めて強い蛍光を発する物質とこれを定量的に付加する物質とによりＬ−カルニチン類を蛍光ラベル化し、次に高速液体クロマトグラフィー法で２本のカラムを併用することで、夾雑物質から短時間で完全に分離し、高感度蛍光検出器により蛍光強度を検出するシステムを開発し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は
（１）溶液又は分散液状の、又は溶液又は分散液状に処理した食品中のＬ−カルニチン類の測定方法において、１）１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを粉末で添加して、カルニチン類に蛍光ラベル体を定量的に付加し、２）高速液体クロマトグラフィーで２本のカラムを使用し、バルブを介して当該カラムを並列、直列に組替えて接続して通液することにより、Ｌ−カルニチン・蛍光ラベル体付加物と夾雑物を分離し、３）高感度蛍光検出器により分離したＬ−カルニチン・蛍光ラベル体付加物の蛍光強度を検出する測定法、
（２）蛍光ラベル体が１−アミノアントラセンである（１）の測定法、
（３）蛍光ラベル体と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドの重量比が１：５以上である（１）又は（２）の測定法。
（４）ポート(穴)数が５個以上のバルブのバルブ切替により、２本のカラムを並列、直列に組替えて接続する（１）〜（３）のいずれか１つの測定法、に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
前処理：本発明の実施の前処理として、「食品の液状化」、「加水分解」および「除たん白」を行うことが望ましい。対象となる食品はＬ−カルニチン類を含むものであり、具体的には乳製品、肉類があげられる。また、食品の形態は固体、半固体、液状の何れでもよく、液状であればそのまま使用することもできるが、固体(予め形状を壊しておく)および半固体状であれば水を加えホモミキサー等で磨砕し使用する。これらのものに水を加え溶液とするか分散させるかし、溶液状の形態とすることが好ましい。また、本発明の測定障害となるたん白質を、限外濾過フィルターを通過させるなどして除いておくことが望ましい。
【０００９】
本発明の目的の一つとして、食品中のＬ−カルニチンとしての総量を測定することがあげられ、この目的においては試料中のＬ−カルニチンエステル体を水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどの無機アルカリで加水分解処理し、Ｌ−カルニチン類を遊離体にしておく必要がある。当然のことながら加水分解処理を行わなければＬ−カルニチン類（各種アシルエステル体）の定性、定量も可能となる。
【００１０】
蛍光ラベル体の付加：本発明の第１の工程である蛍光ラベル体の付加反応は、Ｌ−カルニチンのカルボキシル基に１−アミノアントラセンをアミド結合させ、Ｌ−カルニチン−１−アミノアントラセナミド(以降ＣＡＡと称する)を定量的に得るものである。前処理を終えた本発明の測定試料液を、水で希釈しＬ−カルニチンとして0.01〜1μg/mL、好ましくは0.1〜0.5μg/mLの水溶液とし、この一部を蓋付き試験管にとり、塩酸等の鉱酸を加え酸性とし、１−アミノアントラセン(好ましくは溶液)および１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド粉末を添加し、蓋をし一定時間加温し反応させる。この際の１−アミノアントラセンと１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミドの重量比は１：５以上が好ましく、より好ましくは１：１０以上である。
【００１１】
また、これらの添加量は食品中に含まれるカルボキシル基を有する夾雑物の量により変化させることができる。ラベル化物質として、１−アミノアントラセンの他、５、６−ジメトキシ−２−(４−ヒドラジノカルボニルフェニル)ベンゾチアゾール、２−（４−ヒドラジノカルボニルフェニル）−４、５−ジフェニルイミダゾール等の複数の共役ベンゼン環と一級アミノ基を有するものを使用することが望ましい。
【００１２】
高速液体クロマトグラフィーでの分離：ＣＡＡを含む反応液をそのまま、または、エーテルで未反応の１−アミノアントラセンおよび副反応物を取り除いた後、フィルターを通過させ、次に説明する高速液体クロマトグラフィーに注入する。食品中には図１に例示したように夾雑物のピークが複数存在する。この中からＣＡＡを分離する方法として、カラムを長くする方法または２液グラジュエント法が考えられる。しかし、前者では展開に膨大な時間を要することまた、後者では次の試料の測定までに要する時間が長いことから、複数の試料の測定には適していない。
【００１３】
本発明は、２本のカラムを使用しＣＡＡを含む反応液をカラム（以降、第１カラムと称する）で展開させ、予め調べておいたＣＡＡ画分の保持時間近くでバルブを切替え、これを介して２番目のカラム（以降、第２カラムと称する）と直列に連結し、ＣＡＡ画分を第２カラムへ移す。第１カラムでのＣＡＡ画分の保持時間が完全に過ぎた時点で、再びバルブを切替えて２本のカラムの接続を絶つ。ＣＡＡ画分は第２カラムで更に展開され、ＣＡＡのピークと夾雑物のピークの分離が完了する(図２）。その間に、第１カラムは夾雑物の排除を終え、次の試料の展開に入っており、第２カラムへ次の試料のＣＡＡ画分を移行するというサイクルで測定が進む。したがって、２本のカラムは並行して展開しており、２番目移行の試料の測定時間が著しく短縮化できる利点を有する。
【００１４】
第１カラムの役割はＣＡＡを粗分離することにあり、測定時間を短縮化するには短い方が有利となるが、これに限定されるものではない。カラムはオクタデシルシリル化されたシリカゲルが充填されたものが分離能が高く好ましいが、逆相系の充填剤が充填されたカラムであれば特に限定されない。また、移動相の組成は第２カラムへ影響を及ぼさないものであれば特に限定されない。バルブは、高圧状態（10〜20MPa）に耐えうるものであれば市販品でもよく、レオダイン社製のスイッチングバルブが好適であり、第１カラムから第２カラムへのＣＡＡ画分の移行を行うには、ポート(穴)数５以上を有するものが必須となる（図３）。
【００１５】
蛍光検出器での検出：食品中のＬ−カルニチン類は微量であり、蛍光ラベル体と反応する脂肪酸（脂肪の加水分解から発生）等の夾雑物が多く、高速液体クロマトグラフィーでの分離を良くするには、前処理後の試料液はより希釈されていることが望ましい。したがって、食品中の微小ＣＡＡピーク面積または高さを精度良く検出するには、高感度の蛍光検出器を使用することが好ましい。Ｌ−カルニチン標準品からのＣＡＡピーク面積または高さを基準に、それぞれの試料中のＬ−カルニチン量を算出することにより測定は完了する。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例、参考例に限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】
本発明の液体クロマトグラフィーシステム
図３に示した液体クロマトグラフィーシステムを作成した。３のインジェクターから注入された蛍光ラベル化されたＬ−カルニチン（ＣＡＡ）を含んだ測定試料液は、２のポンプにより送られた１のタンク中の移動相に混和し４のカラムに入り展開される。ＣＡＡ画分の流出直前までは、５のバルブを介して12の廃液タンクへ送り、ＣＡＡ画分で５のバルブを反転し切替え、ＣＡＡ画分は６のカラムに入り、ＣＡＡ画分が過ぎた後は再び５のバルブを反転し切替え12の廃液タンクへ送る。ＣＡＡ画分は４のカラムから６のカラムへ移る（以降、ＣＡＡ画分の移行と称する）。これにより試料溶液中の夾雑物の多くは６のカラムに入ることはなく、測定時間の短縮化、６のカラムでの分離性の向上等の利点を有する。
【００１８】
４のカラムと６のカラムは、ＣＡＡ画分の移行のときのみ５のバルブを介して直列につながり、２のポンプにより移動相が送液される。ＣＡＡ画分の移行までは６のカラムへは、５のバルブを介して９のタンク中の移動相が10のポンプにより送られ、７の蛍光検出器を通り８の廃液タンクへ送られている。ＣＡＡ画分の移行の後も同じ流路で移動相が送られ、６のカラムによりＣＡＡ画分の分離が進みＣＡＡが単離され、７の蛍光検出器でＣＡＡの検出が行われる。ＣＡＡ画分の移行中、10のポンプにより送られた移動相は５のバルブを介して６のカラムへ入ることなく11の廃液タンクへ送られる。このシステムにおいて、牛乳を例にするとＣＡＡの分離の状態は４のカラムでは図１のごとく不完全であるが、６のカラムでは図２のごとく完全に単離されおり、このシステムの有用性がわかる。
【００１９】
また、このシステムはＣＡＡ画分の移行後、４のカラムから夾雑物の排出が終わり次第、次の試料液の注入を行うことができ、６のカラムの展開が終わるのを待つ必要はない。したがって、多数の試料液の連続測定に要する時間を短縮化することができる利点を有している。
【００２０】
【実施例２】
蛍光ラベル体の付加反応
0,0.01,0.05,0.1,0.5,1μg/mLのＬ−カルニチン水溶液のそれぞれ１mLを10mL蓋付き試験管にとり、１Ｎ塩酸40μL、10mg/mLの１−アミノアントラセンアセトン溶液0.2mLおよび１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（以降、ＥＤＣと称する）粉末20mgを加えよく振り混ぜ、25℃の恒温水槽内に20分間置き反応させた。これにエーテル５mLを加えよく振り混ぜ未反応の１−アミノアントラセンをエーテル層に移し、エーテル層をピペットで除去した。残った水層の内、0.8mLをとり後述する高速液体クロマトグラフィーの移動相で10倍希釈し、孔径0.2μmのメンブランフィルターで濾過することにより蛍光ラベル化されたＬ−カルニチン含有の測定試料液を得、実施例１のインジェクターに注入し測定した。
【００２１】
測定条件として、第１カラムは資生堂製CAPCELL PAK C18 UG120（内径4.6mm、長さ150mm）および第２カラムは資生堂製CAPCELL PAK C18 SG250（内径4.6mm、長さ250mm）、カラム温度は30℃、移動相は0.1Ｍ酢酸・酢酸アンモニウム緩衝液（pH3.5）・アセトニトリル混合液（75：25）、移動相の流速は２台のポンプともに1.0mL/min、測定試料液の打ち込み量は20μL、蛍光検出器の励起波長は248nm、測定波長は418nmである。まず第１カラムでのＣＡＡの保持時間を調べ、その保持時間の前後1.5分間をＣＡＡ画分とした。測定結果（図４）は、ＣＡＡのピーク面積とＬ−カルニチンの濃度は相関しており、定量性の良い測定法であることがわかる。
【００２２】
【参考例１】
前処理
本発明の測定法の実施に供する試料液の前処理について例示する。牛乳11ｇをとり、水を加えて50mLとし、蓋付き試験管内にその２mLをとり0.5Ｎ水酸化カリウム水溶液５mLを加えて、56℃の恒温水槽内で30分放置し、Ｌ−カルニチンエステルの加水分解を行いＬ−カルニチン遊離体を得た。恒温水槽から取り出し室温まで冷却し、３Ｎ塩酸を加えpH７に中和した後、25mLのメスフラスコに全量を移し、水を加えてメスアップした。たん白を除く目的で、この液の２mLを分画分子量10,000以下の限外濾過ユニット（ADVANTEC USY-1）に入れ、プラスティック製注射器で加圧し、得られた濾過液を牛乳の試料液とした。
【００２３】
粉乳３ｇをとり、水を加えて50mLとし、良く振り混ぜて分散させた。蓋付き試験管内にその２mLをとり、以下牛乳の場合と同じ操作を行い粉乳の試料液とした。
【００２４】
和牛もも肉１ｇに水を加えて100ｇとし、日本精機製ホモジェナイザーＡＭ−３を用い、10,000rpmで１分間処理し分散状態とした。蓋付き試験管内にその２mLをとり、以下牛乳の場合と同じ操作を行い和牛もも肉の試料液とした。このように固形、半固形、液状等どのような形態の食品においても磨砕等の処理により溶液または分散液状とし、加水分解、除たん白を行えば本発明の試験液とすることができる。
【００２５】
【実施例３】
蛍光ラベル体とＥＤＣの割合およびＥＤＣの添加法
0.5μg/mLのＬ−カルニチン水溶液および牛乳で、蛍光ラベル体に対するＥＤＣの必要量を実施例１、２に示した方法で検討した。牛乳は、参考例１の前処理を行った。図５に最大のピーク面積を１としたピーク面積とＥＤＣ/１−アミノアントラセンの関係を示した。Ｌ−カルニチン水溶液、牛乳ともにＥＤＣを添加していないものでは蛍光ラベル体付加反応は、全く起こらなかった。１−アミノアントラセンに対してＥＤＣが2.5倍量では最大に反応したものの５割以下と不充分であり、５倍量で約８割を超え定量性を有するようになった。10倍量以上でピーク面積がほぼ一定となり反応が平衡に達していた。
【００２６】
ＥＤＣの添加方法について0.5μg/mLのＬ−カルニチン水溶液を試料とし、実施例１の測定システムを用い、実施例２の測定条件で検討した結果を図６に示した。ＥＤＣを一定量添加するには、水溶液とし定量ピペット等で添加することが簡便かつ精密と考えられるが、ＥＤＣは水溶液とした時点から比較的短時間で蛍光ラベル体付加能の低下が始まり、時間が経つに連れて低下の度合いは直線的に大きくなった。参考例１で処理した粉乳を試料液としたものでは、低下の度合いがより大きいものであった（図７）。これに対して、ＥＤＣを粉末で添加したものは、蛍光ラベル体付加能の低下が全くなく、粉末添加は重量を測定しながら実施しなければならない煩雑性はあるものの定量を行うには必須であることがわかる。
【００２７】
【実施例４】
添加回収率
牛乳１Lに塩化Ｌ−カルニチン原末をＬ−カルニチンとして19.4mg(全体の1.94mg％相当)添加したものと元の牛乳を実施例１、２、参考例１の方法により測定した。ＥＤＣは粉末添加で行っている。測定結果(表１)では、塩化Ｌ−カルニチン添加牛乳3.83mg％、無添加牛乳1.95mg％であり、96.9％の高い添加回収率を得た。添加回収率の算出式は(3.83−1.95)/1.94×100＝96.9％である。
【表１】
0004610111.tif 000002
【００２８】
【実施例５】
食品中の総Ｌ−カルニチンの測定
参考例１にしたがって、牛乳、粉乳、和牛もも肉（何れも市販品）の各試料の前処理を行い、実施例１の装置、実施例２の測定法、ＥＤＣ粉末添加により、液体、粉末、半固体の食品中の総Ｌ−カルニチン量を５回ずつ測定した。表２の測定結果から牛乳、粉乳、和牛もも肉ともに５回の測定値の変動係数は１％以下であり、何れの形態の食品においても極めて精度良く測定することができた。
【表２】
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【００２９】
【発明の効果】
従来の方法と比較して、食品のように夾雑物が多いものの中に微量に含まれた成分を、高感度に精度良く測定することができる。また、専用施設を設けることもなく、測定時間も短いことから、一度に多くの試料を測定することもできる。さらに、測定装置の構造が単純であり自動化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  牛乳の第１カラムのクロマトグラムである。
【図２】  牛乳の第２カラムのクロマトグラムである。
【図３】  実施例１での液体クロマトグラフィーシステムの構成図である。
【図４】  蛍光ラベル体の付加反応による定量性(直線性)を示したグラフである。
【図５】  Ｌ−カルニチン水溶液または牛乳を試料としたＥＤＣと１−アミノアントラセン比率の蛍光ラベル体の付加反応への影響を調べたグラフである。
【図６】  Ｌ−カルニチン水溶液を試料としたＥＤＣの粉末添加と水溶液添加での蛍光ラベル体の付加反応への影響を調べたグラフである。
【図７】  粉乳を試料としたＥＤＣの粉末添加と水溶液添加での蛍光ラベル体の付加反応への影響を調べたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0004610111.tif 000009
【図７】
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