(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学ユニットのポリマーの特性の値のデータベースとプロセッサとを含むシステムにおいて用いられる方法であって、前記方法は、既知の分子長を有する化学ユニットのサンプルポリマーの組成を決定するためのものであり、前記方法は、
前記プロセッサが、前記データベースから、前記化学ユニットのサンプルポリマーと同じ長さを有する化学ユニットの候補ポリマーを選択するステップであって、前記サンプルポリマーについて、所定の特性の値が、前記化学ユニットのサンプルポリマーの所定の特性の値に類似している、ステップと、
前記プロセッサが、前記化学ユニットのサンプルポリマーに実験的な制約を適用した後に、前記化学ユニットのサンプルポリマーの特性を測定するステップであって、前記サンプルポリマーの測定された特性は、前記実験的な制約の適用に基づく前記サンプルポリマーの改変を反映したものである、ステップと、
前記プロセッサが、前記化学ユニットの候補ポリマーから、前記測定された特性に対応しない特性を有する化学ユニットのポリマーを排除するステップと
を含み、
前記サンプルポリマーは、ポリサッカリドであり、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記プロセッサが、化学ユニットの候補ポリマーの数が所定の閾値を下回るまで、前記排除するステップを繰り返し実行するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所定の特性は、分子量である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素消化は、外酵素、内酵素、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素改変は、サルフェートである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリサッカリドは、ヘパリン様グリコサミノグリカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定する方法であって、前記方法は、プロセッサと参照データベースとを含む情報処理装置によって用いられ、前記方法は、
前記プロセッサが、化学ユニットのサンプルポリマーの特性を決定するステップであって、前記特性を改変するために実験的な制約が前記化学ユニットのサンプルポリマーに適用される、ステップと、
前記プロセッサが、前記化学ユニットのサンプルポリマーに前記実験的な制約を適用した後に、前記化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するために、前記サンプルポリマーの特性と前記参照データベースから検索された既知のシーケンスを有するポリマーの既知の特性とを比較するステップと
を含み、
前記ポリマーの参照データベースは、前記ポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、前記識別子のそれぞれは、前記特性に対応する値を格納するフィールドを含み、
前記サンプルポリマーは、ポリサッカリドであり、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
前記サンプルポリマーの特性を決定するステップは、前記ポリマーの分子量を決定するための質量分光法の使用を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記質量分光法は、約１ダルトンの精度で分子量を検出するＭＡＬＤＩである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＡＬＤＩ分析が、ＭＡＬＤＩ表面上に被覆されたタンパク質を有するＭＡＬＤＩ表面上で実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルポリマーは、細胞表面から単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルポリマーは、少なくとも２つのフラグメントに分解され、前記サンプルポリマーの特性は、前記フラグメントのサイズであり、前記特性を決定するステップは、強力なイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリサッカリドは、ヘパリン様グリコサミノグリカンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素消化は、外酵素、内酵素、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素改変は、サルフェートである、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
プロセッサと参照データベースとを含む情報処理装置によって用いられる方法であって、前記方法は、化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するためのものであり、前記方法は、
前記プロセッサが、化学ユニットのサンプルポリマーの特性を決定するステップであって、前記特性を改変するために実験的な制約が前記化学ユニットのサンプルポリマーに適用される、ステップと、
前記プロセッサが、前記実験的な制約を適用した後に、前記化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するために、前記サンプルポリマーの特性と前記参照データベースから検索された既知のシーケンスを有するポリマーの既知の特性とを比較するステップと
を含み、
前記ポリマーの参照データベースは、前記ポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、前記識別子のそれぞれは、前記特性に対応する値を格納するフィールドを含み、
前記特性を決定するステップは、約１ダルトンの精度で分子量を検出するＭＡＬＤＩの使用を含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項１７】
プロセッサと参照データベースとを含む情報処理装置によって用いられる方法であって、前記方法は、化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するためのものであり、前記方法は、
前記プロセッサが、化学ユニットのサンプルポリマーの特性を決定するステップであって、前記特性を改変するために実験的な制約が前記化学ユニットのサンプルポリマーに適用される、ステップと、
前記プロセッサが、前記実験的な制約を適用した後に、前記化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するために、前記サンプルポリマーの特性と前記参照データベースから検索された既知のシーケンスを有するポリマーの既知の特性とを比較するステップと
を含み、
前記ポリマーの参照データベースは、前記ポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、前記識別子のそれぞれは、前記特性に対応する値を格納するフィールドを含み、
前記サンプルポリマーは、少なくとも２つのフラグメントに分解され、前記サンプルポリマーの特性は、前記フラグメントのサイズであり、前記特性を決定するステップは、強力なイオン交換クロマトグラフィーを含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
プロセッサと参照データベースとを含む情報処理装置によって用いられる方法であって、前記方法は、化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するためのものであり、前記方法は、
前記プロセッサが、化学ユニットのサンプルポリマーの特性を決定するステップであって、前記特性を改変するために実験的な制約が前記化学ユニットのサンプルポリマーに適用される、ステップと、
前記プロセッサが、前記実験的な制約を適用した後に、前記化学ユニットのサンプルポリマーと同一の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するために、前記サンプルポリマーの特性と前記参照データベースから検索された既知のシーケンスを有するポリマーの既知の特性とを比較するステップと
を含み、
前記ポリマーの参照データベースは、前記ポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、前記識別子のそれぞれは、前記特性に対応する値を格納するフィールドを含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項１９】
検出手段とプロセッサと参照データベースとを含む情報処理装置によって用いられる方法であって、前記方法は、サンプルポリマーの化学ユニットの組成分析を行うためのものであり、前記方法は、
前記分析手段が、実験的な制約を前記サンプルポリマーに適用した後に、前記サンプルポリマーの特性を検出するステップであって、前記実験的な制約は、前記サンプルポリマーを改変する、ステップと、
前記プロセッサが、前記改変されたサンプルポリマーと、前記参照データベースに含まれる、前記ポリマーと同一のサイズを有するポリマーの参照データベースとを比較するステップと
を含み、
前記参照データベースの前記ポリマーは、前記サンプルポリマーと同一の実験的な制約を受けており、
前記比較は、前記サンプルポリマーの組成分析を提供し、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項２０】
前記検出するステップは、キャピラリー電気泳動を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出するステップは、マトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化質量分光法を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリマーに適用される実験的な制約は、前記ポリマーの不完全な酵素消化を含み、前記ステップ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、前記参照データベース内のポリマーの数が所定の閾値を下回るまで反復され、前記組成分析は、前記ポリマーの化学ユニットのシーケンスのアイデンティティを示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記参照データベースは、複数のポリマーの化学ユニットに対応する複数の識別子を含み、前記複数の識別子のそれぞれは、前記対応する化学ユニットの特性に対応する値を格納するフィールドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
情報処理デバイスによって用いられる方法であって、前記情報処理デバイスは、検出手段と、プロセッサと、ポリマーの参照データベースとを含み、前記方法は、化学ユニットのサンプルポリマーと共通の特性を有するポリマーの部分母集団を同定するためのものであり、
前記方法は、
前記検出手段が、前記サンプルポリマーに実験的な制約を適用した後に、前記サンプルポリマーの特性を検出するステップであって、前記実験的な制約は、前記サンプルポリマーを改変する、ステップと、
前記プロセッサが、前記参照データベースに格納された情報を有するポリマーの化学ユニットのポリマーの集団を同定するステップであって、前記同定されたポリマーの集団は、前記サンプルポリマーと同じ分子長を有する、ステップと、
前記プロセッサが、前記改変されたポリマーの前記検出された特性と一致する特性を有するポリマーの前記同定された集団の部分母集団を同定するステップであって、前記部分母集団を同定するステップは、前記同定されたポリマーの集団から、前記改変されたポリマーと対応しない特性を有するポリマーを排除することによって実行される、ステップと
を含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
前記改変されたポリマーと共通の第２の特性を有するポリマーの部分母集団内の第２の部分母集団を用いて、前記集団を同定するステップと、前記部分母集団を同定するステップとを繰り返すステップをさらに含み、
前記サンプルポリマーは、第２の実験的な制約の適用によって、前記ステップの繰り返しの前にさらに改変される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記さらに改変されたポリマーについて、前記部分母集団内のポリマーの数が所定の閾値を下回るまで、前記サンプルポリマーにさらなる実験的な制約を繰り返し適用し、前記集団を同定するステップと、前記部分母集団を同定するステップとを繰り返し実行することをさらに含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記部分母集団内のポリマーの前記所定の閾値は、２つのポリマーであり、前記方法は、前記ポリマーの配列を同定するために実行される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリマーに適用される実験的な制約は、各繰り返しについて異なる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリマーに適用される実験的な制約は、外酵素による消化である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマーに適用される実験的な制約は、内酵素による消化である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリマーの特性は、分子量である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学ユニットのポリマーの集団は、前記サンプルポリマーの分子量を有するあらゆるポリマーの配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学ユニットのポリマーの集団は、前記サンプルポリマーの分子量を有するあらゆるポリマーの配列よりも少ない配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出するステップは、前記ポリマーの分子量を決定するために質量分光法を用いることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記質量分光法は、約１ダルトンの精度で分子量を検出するマトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリマーは、少なくとも２つのフラグメントに分解され、前記ポリマーの特性は、前記フラグメントのサイズであり、前記検出するステップは、強力なイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記集団を同定するステップは、化学ユニットのポリマーの分子量を含む前記参照データベース内に格納されたデータベースから、化学ユニットのポリマーの前記集団を選択するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記データベースは、複数のポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、前記識別子の各々は、対応する化学ユニットの特性に対応する値を格納するフィールドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
情報処理デバイスによって用いられる方法であって、前記情報処理デバイスは、検出手段と、プロセッサと、ポリサッカリドの参照データベースとを含み、前記方法は、ポリマーを配列決定するためのものであり、
前記方法は、
前記検出手段が、前記サンプルポリマーに実験的な制約を適用した後に、前記サンプルポリマーの特性を検出するステップであって、前記実験的な制約は、前記サンプルポリマーを改変する、ステップと、
前記プロセッサが、前記参照データベースに格納された前記ポリサッカリドのポリマーの集団を同定するステップであって、前記同定されたポリサッカリドの集団は、前記サンプルポリマーと同じ分子長を有し、かつ、前記サンプルポリマーの分子量と類似の分子量を有する、ステップと、
前記プロセッサが、前記改変されたポリマーの前記検出された特性と一致する特性を有するポリマーの前記同定された集団の部分母集団を同定するステップであって、前記部分母集団を同定するステップは、前記同定されたポリマーの集団から、前記改変されたポリマーに対応しない特性を有するポリマーを排除することによって実行される、ステップと、
前記部分母集団内のポリマーの数が１つになるまで、前記ポリマーにさらなる実験的な制約を繰り返し適用し、前記さらなる実験的な制約の各々を適用した後に、ポリマーのさらなる部分母集団を同定するステップと
を含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項４０】
前記ポリマーは、ポリサッカリドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリサッカリドは、ヘパリン様グリコサミノグリカンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
情報処理デバイスによって用いられる方法であって、前記情報処理デバイスは、検出手段と、プロセッサと、ポリサッカリドの参照データベースとを含み、前記方法は、サンプルポリサッカリドと共通の特性を有するポリサッカリドの部分母集団を同定するためのものであり、
前記方法は、
前記検出手段が、前記サンプルポリサッカリドに実験的な制約を適用した後に、前記サンプルポリサッカリドの特性を検出するステップであって、前記実験的な制約は、前記サンプルポリサッカリドを改変する、ステップと、
前記プロセッサが、前記参照データベースに格納された情報を有する前記ポリサッカリドの、ポリサッカリドの集団を同定するステップであって、前記同定されたポリサッカリドの集団は、前記サンプルポリサッカリドと同じ分子長を有する、ステップと、
前記プロセッサが、前記改変されたポリサッカリドの前記検出された特性と一致する特性を有するポリサッカリドの前記同定された集団の部分母集団を同定するステップであって、前記部分母集団を同定するステップは、前記同定されたポリサッカリドの集団から、前記改変されたポリサッカリドに対応しない特性を有するポリサッカリドを排除することによって実行される、ステップと
を含み、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項４３】
前記ポリサッカリドは、ヘパリン様グリコサミノグリカンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
情報処理デバイスによって用いられる方法であって、前記情報処理デバイスは、検出手段と、プロセッサと、ポリサッカリドの参照データベースとを含み、前記方法は、ＨＬＧＡＧサンプルの化学ユニットの組成分析の方法であり、
前記方法は、
前記検出手段が、前記ＨＬＧＡＧサンプルに実験的な制約を適用した後に、前記ＨＬＧＡＧサンプルの特性を検出するステップであって、前記実験的な制約は、前記ＨＬＧＡＧサンプルを改変する、ステップと、
前記プロセッサが、前記サンプルＨＬＧＡＧと同じ分子量、電荷、硫酸化パターン、または、鎖長を有するポリサッカリドを同定するために、前記改変されたＨＬＧＡＧサンプルを複数のポリサッカリドの前記参照データベースと比較するステップと
を含み、
前記参照データベースに格納された前記ポリサッカリドはまた、前記サンプルＨＬＧＡＧと同じ実験的な制約に供されており、
前記比較は、前記ＨＬＧＡＧサンプルの組成分析を提供し、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項４５】
前記実験的な制約は、前記ＨＬＧＡＧサンプルの個々の化学的ユニットへの完全な分解である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出するステップは、キャピラリー電気泳動を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出するステップは、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記検出するステップは、質量分光法を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記質量分光法は、マトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＬＧＡＧサンプルは、ヘパリンサンプルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＨＬＧＡＧサンプルは、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）サンプルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記改変されたＨＬＧＡＧサンプルは、前記ＨＬＧＡＧサンプルと同じ分子量を有するポリサッカリドの参照データベースと比較され、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ＨＬＧＡＧサンプルと同じ実験的な制約に供されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＨＬＧＡＧサンプルの特性は、硫酸化パターンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記改変されたＨＬＧＡＧサンプルは、前記ＨＬＧＡＧサンプルと同じ鎖長を有するポリサッカリドの参照データベースと比較され、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ＨＬＧＡＧサンプルと同じ実験的な制約に供されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＨＬＧＡＧサンプルの特性は、硫酸化パターンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記改変されたＨＬＧＡＧサンプルは、前記ＨＬＧＡＧサンプルと同じ硫酸化パターンを有するポリサッカリドの参照データベースと比較され、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ＨＬＧＡＧサンプルと同じ実験的な制約に供されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記特性は、前記ＨＬＧＡＧサンプルの基本的なタイプのビルディングブロックである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記プロセッサが、前記ポリサッカリドの参照データベースから、前記改変されたＨＬＧＡＧサンプルの特性と対応しない特性を有するポリサッカリドを排除するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記参照データベース内のポリサッカリドの数が所定の閾値を下回るまで、前記検出するステップと、前記比較するステップと、前記排除するステップとを繰り返し実行することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
情報処理デバイスによって用いられる方法であって、前記情報処理デバイスは、検出手段と、プロセッサと、ポリサッカリドの参照データベースとを含み、前記方法は、ヘパリンサンプルの化学ユニットの組成分析の方法であり、
前記方法は、
前記検出手段が、前記ヘパリンサンプルに実験的な制約を適用した後に、前記ヘパリンサンプルの特性を検出するステップであって、前記実験的な制約は、前記ヘパリンサンプルを改変する、ステップと、
前記プロセッサが、前記ヘパリンサンプルと同じ分子量、電荷、硫酸化パターン、または、鎖長を有するポリサッカリドを同定するために、前記改変されたヘパリンサンプルを複数のポリサッカリドの前記参照データベースと比較するステップと
を含み、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ヘパリンサンプルと同じ実験的な制約に供されており、
前記比較は、前記ヘパリンサンプルの組成分析を提供し、
前記実験的な制約は、酵素消化、化学消化、化学改変、結合化合物との相互作用、化学剥離、酵素改変からなる群から選択される、方法。
【請求項６１】
前記実験的な制約は、前記ヘパリンサンプルの個々の化学的ユニットへの完全な分解である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記検出するステップは、キャピラリー電気泳動を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記検出するステップは、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出するステップは、質量分光法を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記質量分光法は、マトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記改変されたヘパリンサンプルは、前記ヘパリンサンプルと同じ分子量を有するポリサッカリドの参照データベースと比較され、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ヘパリンサンプルと同じ実験的な制約に供されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記ヘパリンサンプルの特性は、硫酸化パターンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記改変されたヘパリンサンプルは、前記ヘパリンサンプルと同じ鎖長を有するポリサッカリドの参照データベースと比較され、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ヘパリンサンプルと同じ実験的な制約に供されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記ヘパリンサンプルの特性は、硫酸化パターンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記改変されたヘパリンサンプルは、前記ヘパリンサンプルと同じ硫酸化パターンを有するポリサッカリドの参照データベースと比較され、
前記参照データベースの前記ポリサッカリドはまた、前記ヘパリンサンプルと同じ実験的な制約に供されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
前記特性は、前記ヘパリンサンプルの基本的なタイプのビルディングブロックである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロセッサが、前記ポリサッカリドの参照データベースから、前記改変されたヘパリンサンプルの特性と対応しない特性を有するポリサッカリドを排除するステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７３】
前記参照データベース内のポリサッカリドの数が所定の閾値を下回るまで、前記検出するステップと、前記比較するステップと、前記排除するステップとを繰り返し実行することをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景）
種々の表記法が、化学ユニットのクラスをコードするために用いられている。このような方法では、固有のコードが、このクラスにおける各化学ユニットに対して割り当てられる。例えば、アミノ酸をコードするための従来の表記法では、アルファベットの１文字が、各公知のアミノ酸に割り当てられる。化学ユニットのポリマーは、このような表記法を用いて、化学ユニットに対応する１組のコードとして、表現され得る。このような表記法は、コンピューター読み取り可能な形式で、タンパク質のようなポリマーをコードするために用いられている。このような表記法に従うコンピューター読み取り可能な形式で表現されているポリマーは、コンピューターにより処理され得る。
【０００２】
化学ユニットを表現するための従来の表記スキームは、文字（例えば、核酸について、Ａ、Ｔ，Ｇ、およびＣ）として化学ユニットを表現しており、そして配列または文字の組として、化学ユニットのポリマーを表現していた。種々の演算が、このような化学ユニットまたは化学ユニットを含むポリマーのこのような表記表現において実行され得る。例えば、ユーザーは、化学ユニットの問い合わせ配列について、化学ユニットのデータベースを検索し得る。ユーザーは、代表的には、文字の配列の形式で、配列のキャラクタベースの表記表現を提供し、これは、データベース内に保存された化学ユニットの配列のキャラクタベースの表記表現に対して比較される。しかし、キャラクタベース検索アルゴリズムは、代表的には遅い。なぜならば、このようなアルゴリズムは、データベース内に保存された化学ユニットの配列中の個々の文字に対して、問い合わせ配列中の個々の文字を比較することにより検索するからである。従って、このような検索の速度は、問い合わせ配列の長さと相関し、長い問い合わせ配列について特に劣った性能となる。
【０００３】
（要旨）
ポリマーは、ポリマーの特性を同定し、そして参照ポリマーに対してこれらの特性を比較すること（本明細書中で、特性コード命名法（ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌｕｔｕｒｅ）（ＰＥＮ）といわれるプロセス）により特徴付けられ得る。１つの実施形態では、この特性は、二進表記法を用いてコードされ、そして比較は、ポリマーの二進表現を比較することにより達成される。例えば、１つの局面では、サンプルポリマーは、実験的拘束を受けて、ポリマーを修飾し、修飾されたポリマーは、ポリマーの参照データベースと比較されて、サンプルポリマーの特性と同じかまたは類似する特性を有する、ポリマーの集団を同定する。この方法は、参照データベース中のポリマーの集団が１つまで減少し、かつサンプルポリマーの正体がわかるまで繰り返され得る。
【０００４】
１つの局面では、本発明は、化学ユニットのポリマーを表現する表記法に関する。この表記法は、特性コード命名法（ＰＥＮ）といわれる。表記法の１つの実施形態に従って、ポリマーは、ポリマーの特性についての情報を含む識別子を割り当てられる。例えば、１つの実施形態では、ジサッカリドの特性は、それぞれ二進数値を割り当てられ、そしてジサッカリドについての識別子は、ジサッカリドの特性に対して割り当てられた二進数値を含む。１つの実施形態では、この識別子は、１桁の１６進数の数字のような、数として表現され得る。この識別子は、ポリマーデータベースのデータユニット（例えば、レコード、または表エントリ）のように、コンピューター読み取り可能媒体に記録され得る。ポリマー識別子は、多数の方法で用いられ得る。例えば、識別子は、化学ユニットの問い合わせ配列の特性が、化学ユニットのポリマーの特性に一致するか否かを決定するために用いられ得る。このような整合の１つの適用は、目的の特定のポリマー、または規定の特性を有するポリマーについてポリマーデータベースを迅速に検索することである。
【０００５】
１つの局面では、本発明は、化学ユニットのポリマーを表現する、データ構造（これは、コンピューター読み取り可能媒体に実体として組込まれている）に関する。別の局面では、本発明は、このようなデータ構造を生成するためのコンピューター実行法に関する。このデータ構造は、ポリマーの特性に対応する値を記録する１つ以上のフィールドを含み得る識別子を含み得る。少なくとも１つのフィールドが、非キャラクタベースのフィールドであり得る。各フィールドは、二進数値を記録し得る。この識別子は、１桁の１６進数として表現可能である数字のように、数字の識別子であり得る。
【０００６】
ポリマーは、種々のポリマーのいずれかであり得る。例えば、（１）ポリマーはポリサッカリドであり得、そして化学ユニットはサッカリドであり得る；（２）ポリマーは核酸であり得、そして化学ユニットはヌクレオチドであり得る；または（３）ポリマーはポリペプチドであり得、そして化学ユニットはアミノ酸であり得る。
【０００７】
特性は、ポリマー中の化学ユニットの特性であり得る。例えば、この特性は、ポリマー中の化学ユニットの電荷、ポリマー中の化学ユニットの正体、ポリマー中の化学ユニットの確認、またはポリマー中の化学ユニットの置換基の正体を含み得る。この特性は、ポリマー内の個々の化学ユニットのいずれかの特性ではない、ポリマーの特性であり得る。例示的特性はとしては、ポリマーの総電荷、ポリマーの硫酸の総数、ポリマーの色素結合、ポリマーの質量、置換基の組成比、イズロン酸対グルクロン酸の組成比、酵素感受性、硫酸化の程度，電荷、およびキラリティーが挙げられる。
【０００８】
別の局面では、本発明は、化学ユニットの問い合わせ配列の特性が、化学ユニットのポリマーの特性に一致するか否かを決定するためのコンピューター実行方法に関する。この問い合わせ配列は、問い合わせ配列の特性に対応する値を記録するための１ビット以上のフィールドを含み得る識別子を含む、第１のデータ構造（これは、コンピューター読み取り可能媒体に実体として組込まれている）により表現され得る。ポリマーは、ポリマーの特性に対応する値を記録するための１ビット以上のフィールドを含み得る識別子を含む、第２のデータ構造（これは、コンピューター読み取り可能媒体に実体として組込まれている）により表現され得る。この方法は、第１のデータ構造の１ビット以上のフィールドにおいて記録された値に基づき、少なくとも１つのマスクを生成し、少なくとも１つの結果を生成するための少なくとも１つのマスクを用いる第２のデータ構造の１ビット以上のフィールドにおいて記録された値に対して、少なくとも１つの二進演算を実行し、そして問い合わせ配列の特性が少なくとも１つの結果に基づくポリマーの特性と一致するか否かを決定する演算を含み得る。化学ユニットは、例えば、上記の化学ユニットのいずれかであり得る。同様に、この特性は、上記の特性のいずれかであり得る。
【０００９】
１つの実施形態では、生成する演算は、第１のデータ構造の１ビット以上のフィールドにおいて記録される値に等しいビットの配列として、少なくとも１つのマスクを生成する演算を含む。別の実施形態では、生成する演算は、第１のデータ構造の１ビット以上のフィールドにおいて保存された値の連続反復として、少なくとも１つのマスクを生成する演算を含む。
【００１０】
さらなる実施形態では、少なくとも１つのマスクは、複数のマスクを含み、そして少なくとも１つの二進演算を行う演算は、複数の中間結果を生成するための複数のマスクの各々を用いる、第２のデータ構造の１ビット以上のフィールドにおいて記録された値に基づいて論理ＡＮＤ演算を行い、そして少なくとも１つの結果を生成するために少なくとも１つの論理ＯＲ演算を用いる複数の中間結果と組み合わせる演算を含む。１つの実施形態では、決定する演算は、少なくとも１つの結果が非ゼロ値を有する場合、問い合わせ配列の特性が、ポリマーの特性と一致するか否かを決定する演算を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの二進演算は、少なくとも１つの論理ＡＮＤ演算を含む。
【００１１】
別の局面では、本発明は、１つ以上のポリマーを説明する情報を記録するためのデータベース（これは、コンピューター読み取り可能な媒体に実体として組込まれている）に関する。このデータベースは、１つ以上のポリマーに対応する１つ以上のデータユニット（例えば、レコードまたは表エントリ）を含み得る。このデータユニットの各々は、ポリマーの特性に対応する値を記録するための１つ以上のフィールドを含み得る識別子を含み得る。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、ポリマーの化学ユニットに対応するデータ構造（これは、コンピューター読み取り可能な媒体に実体として組込まれている）に関する。このデータ構造は、１つ以上のフィールドを含む識別子を含み得る。各フィールドは、化学ユニットの１つ以上の特性に対応する値を記録するためのものであり得る。少なくとも１つのフィールドは、例えば、二進数値または十進数値のような、非キャラクタベース値を記録し得る。
【００１３】
ポリマーは、ポリマーの特性を同定し、そしてその特性を参照ポリマーに対して比較すること（本明細書中で、特性コード命名法（ＰＥＮ）といわれる処理）により特徴付けられ得る。１つの実施形態では、この特性は、二進表記法を用いてコードされ、そして比較は、ポリマーの二進表現を比較することにより達成される。例えば、１つの局面では、サンプルポリマーは、実験的拘束を受けて、このポリマーを修飾し、修飾されたポリマーは、ポリマーの参照データベースに対して比較されて、サンプルポリマーの特性と同じかまたは類似する特性を有するポリマーの集団を同定する。この方法は、参照データベース中のポリマーの集団が１つまで減少し、かつサンプルポリマーの正体がわかるまで繰り返され得る。
【００１４】
化学ユニットのポリマーの特性のデータベースを含むシステムでは、公知の分子量および長さを有する化学ユニットのサンプルポリマーの組成を決定するための方法が、本発明の１つの局面に従って提供される。
この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）データベースから、化学ユニットのサンプルポリマーと同じ長さを有し、かつ化学ユニットのサンプルポリマーの分子量と類似の分子量を有する化学ユニットの候補ポリマーを選択する工程；
（Ｂ）化学ユニットのサンプルポリマーについて実験を行う工程；
（Ｃ）この実験から生じる化学ユニットのサンプルポリマーの特性を測定する工程；および
（Ｄ）化学ユニットの候補ポリマーから、実験結果に対応しない特性を有する化学ユニットのポリマーを除去する工程。
【００１５】
いくつかの実施形態において、この方法はまた、以下の工程を包含する：
（Ｅ）化学ユニットの候補ポリマーの数が、予め決定された閾値より下になるまで、工程（Ｄ）を繰り返して行う工程。
【００１６】
他の局面において、本発明は、化学ユニットのサンプルポリマーと同じ特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するための方法である。この方法は、化学ユニットのサンプルポリマーの特性を決定する工程、およびこのサンプルポリマーの特性を既知の配列のポリマーの参考データベースおよび既知の特性と比較する工程を包含する。化学ユニットのサンプルポリマーと同じ特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定するためにであり、ここでポリマーの参考データベースは、ポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、識別子の各々は、その特性に対応する値を記憶するフィールドを含む。
【００１７】
１つの実施形態において、サンプルポリマーの特性を決定する工程は、ポリマーの分子量を決定するために質量分析（例えば、マトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）エレクトロンスプレー−ＭＳ、ファーストアトムボンバードメント質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）および衝撃活性化解離質量分析（ＣＡＤ））の使用を含む。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、約１ダルトンの正確さでポリマーの分子量を決定するために使用され得る。
【００１８】
他の実施形態におけるポリマーの特性を同定する工程は、強力なイオン交換クロマトグラフィーによって検出され得るいくつかの長さのユニットの断片へのポリマーのサイズの分解が含み得る。ポリマーのフラグメントは、参考データベースポリマーと比較され得る。
【００１９】
他の局面によると、本発明は、化学ユニットのサンプルポリマーとの共通の特性を有するポリマーの部分集団を同定するための方法である。この方法は、ポリマーを修飾するために、実験的拘束をポリマーに適用する工程、修飾されたポリマーの特性を検出する工程、サンプルポリマーと同じ分子長を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定する工程、およびポリマーの同定された集団の部分集団を同定する工程を包含する。このポリマーは、ポリマーの同定された集団から、修飾されたポリマーに対応しない特性を有するポリマーを除去することによって修飾されたポリマーと同じ特性を有する。これらの工程は、２度修飾されたポリマーに共通な第２の特性を有するポリマーの部分集団内の第２の部分集団を同定するために、修飾されたポリマーで繰り返され得る。次いで、部分集団内のポリマーの数が、予め決定された閾値より下がるまでこれらの工程の各々は繰り返され得る。この方法は、ポリマーの配列を同定するために行われ得る。この場合、部分集団内のポリマーの予め決定された閾値は、２つのポリマーである。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、化学ユニットのサンプルポリマーに共通する特性を有するポリマーの部分集団を同定するための方法である。この方法は、ポリマーを修飾するために、実験的拘束をポリマーに適用する工程、修飾されたポリマーの第１の特性を検出する工程、サンプルポリマーと共通する第２の特性を有する化学ユニットのポリマーの集団を同定する工程、およびポリマーの同定された集団の部分集団を同定する工程を包含する。このポリマーの集団は、ポリマーの同定された集団から、修飾されたポリマに対応しない特性を有するポリマーを除去することによって修飾されたポリマーと同じ第１の特性を有する。
【００２１】
１つの実施形態において、ポリマーに適用された実験的拘束は、各々の反復について異なる。実験的拘束は、任意の操作であり得る。この操作は、ポリマーまたはポリマーのユニットについての構造情報を引き出すことが可能である様式でポリマーを変化する。いくつかの実施形態において、ポリマーに適用された実験的拘束は、任意の１以上の以下の制限であり得る：酵素学的消化（例えば、細胞外酵素、細胞内酵素、制限エンドヌクレアーゼでの消化）；化学消化；化学修飾；結合化合物との相互作用；化学剥離（すなわち、モノサッカリドユニットの除去）；および酵素学的修飾（例えば、ヘパリン硫酸塩スルホトランスフェラーゼを用いた特定部位での硫酸化）。
【００２２】
本発明の方法によって検出されるポリマーの特性は、ポリマーまたはユニットの任意の構造的特性であり得る。例えば、ポリマーの特性は、分子量またはポリマーの長さであり得る。他の実施形態において、特性は、置換基またはユニット組成の比、ポリサッカリドの基礎ビルディングブロックの型、疎水性、酵素学的感受性、親水性、２次構造および高次構造（すなわち、へリックスの部位）、置換基の空間的な配置、修飾の別のセットに対する修飾の１つのセットの比（すなわち、Ｎ−硫酸化に対する２−Ｏ硫酸化の相対量またはグルクロン酸に対するイズロン酸の比）、およびタンパク質に対する結合部位であり得る。
【００２３】
修飾されたポリマーの特性は、特性および分析されるポリマーに依存する可能な任意の様式で検出され得る。１つの実施形態において、検出工程は、質量分析（例えば、マトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）エレクトロンスプレーＭＳ、ファーストアトムボンバードメント質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）および衝撃活性化解離質量分析（ＣＡＤ））を含む。あるいは、例えば、ポリマーが、いくつかのユニットの各々から構成されるいくつかのより小さなフラグメントに消化されている場合、検出工程は、強力なイオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００２４】
この方法は、同じ長さのポリマーまたは少なくとも１つの共通の特性を有するポリマーの集団と、サンプルポリマーとの比較に基づく。いくつかの実施形態において、化学ユニットのポリマーの集団は、サンプルポリマーの分子量を有するあらゆるポリマー配列を誘導する。他の実施形態において、化学ユニットのポリマーの集団は、サンプルポリマーの分子量を有するあらゆるポリマー配列より少ない配列を含む。いくつかの実施形態によると、同定工程は、化学ユニットのポリマーの集団を、化学ユニットのポリマーの分子量を含むデータベースから選択する工程を包含する。好ましくは、このデータベースは、複数のポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、認識子の各々は、対応する化学ユニットの特性に対応する値を記憶するフィールドを含む。
【００２５】
本発明の別の局面によると、サンプルポリマーの組成分析方法が提供される。この方法は、サンプルポリマーを修飾するために実験的拘束を、サンプルポリマーに適用する工程、修飾されたサンプルポリマーの特性を検出する工程、および修飾されたサンプルポリマーを、ポリマーとして同一のサイズのポリマーの参高データベースに比較する工程を包含し、ここで参考データベースのポリマーはまた、サンプルポリマーと同じ実験的拘束に供されおり、ここでこの比較は、同じサンプルポリマーの組成分析を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、組成分析は、ポリマー内のユニットの数および型が明らかにする。他の実施形態において、組成分析は、ポリマーの化学ユニットの配列の同定を明らかにする。
【００２７】
ポリマーの特性について上記の本発明の局面への類似性は、可能な任意の様式で検出され得、そして特定の特性および分析されるポリマーに依存する。１つの実施形態において、検出工程は、質量分析（例えば、マトリクスアシスティドレーザーデソープションイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）エレクトロンスプレーＭＳ、ファーストアトムボンバードメント質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）および衝撃活性化解離質量分析（ＣＡＤ））を含む。好ましくは、ポリマーに適用された実験的拘束は、酵素学的反応または化学反応であり、それらは、ポリマーの不完全な酵素学的消化を含む。ここでこの方法の工程は、参考データベース内のポリマーの数が、予め決定された閾値より下がるまで繰り返される。あるいは、検出工程は、キャピラリー電気泳動を含み、特に実験的拘束がポリマーに適用される場合、個々の化学ユニットへのポリマーの完全分解を含む。
【００２８】
１つの実施形態において、参考データベースは、複数のポリマーの化学ユニットに対応する識別子を含み、その識別子の各々は、対応する化学ユニットの特性に対応する値を記憶するフィールドを含む。
【００２９】
本発明のさらに別の局面によると、ポリマーを配列決定する方法が提供される。この方法は、ポリマーを修飾するために、ポリマーに、実験的拘束を適用する工程、修飾されたポリマーの特性を検出する工程、サンプルポリマーと同じ分子長を有し、かつサンプルポリマーの分子量と類似の分子量を有するポリマーの集団を同定する工程、ポリマー（ポリマーの同定された集団から、修飾されたポリマーに対応しない特性を有するポリマーを除去することによって修飾されたポリマーと同じ特性を有する）の同定された集団の部分集団を同定する工程、および部分集団内のポリマーの数が１つであり、かつポリマーの配列が同定され得るまで、以下の工程を繰り返す工程を包含する；実験的拘束を適用する工程、特性を検出する工程および部分集団を同定する工程（さらなる実験的拘束を、ポリマーに適用し、そしてポリマーの部分集団を同定することによって）。
【００３０】
別の局面において、本発明は、ポリサッカリド−タンパク質被覆化ＭＡＬＤＩ表面を生成するための、タンパク質被覆化ＭＡＬＤＩ表面と、サンプルを含むポリサッカリドとの接触、ポリサッカリド−タンパク質被覆化ＭＡＬＤＩ表面から未結合のポリサッカリドを取り除く工程、およびＭＡＬＤＩ質量分析を実施してＭＡＬＤＩ表面上に被覆されたタンパク質と特異的に相互作用するポリサッカリドを同定する工程により、ポリサッカリド−タンパク質相互作用を同定するための方法に関する。
【００３１】
１つの実施形態において、ＭＡＬＤＩマトリクスを、ポリサッカリド−タンパク質被覆化ＭＡＬＤＩ表面に加える。他の実施形態において、ＭＡＬＤＩ質量分析を実施する前、ポリサッカリド−タンパク質被覆化ＭＡＬＤＩ表面上に結合されたポリサッカリドに実験的拘束が加えられ得る。いくつかの実施形態において、このポリマーに加えられた実験的拘束は、細胞外酵素での消化または細胞内酵素での消化である。他の実施形態において、このポリマーに加えられた実験的拘束は、制限エンドヌクレアーゼ消化；化学消化；化学的修飾；および酵素的修飾からなる群より選択される。
【００３２】
（詳細な説明）
本発明は、いくつかの局面において、ポリマーの構造的特性（例えば、荷電、このポリマーのユニットの性質および数、このユニット上の化学的置換基の性質および数、ならびにポリマーの立体特異性）を同定するためポリマーを特徴付けるための方法に関する。ポリマーの構造的特性は、ポリマーの機能に関して有用な情報を提供し得る。例えば、ポリマーの特性は、ポリマーのユニットの配列全体を明らかにし得る。これはポリマーを同定するのに有用である。同様に、ポリマーの配列が以前に既知でない場合、このポリマーの構造的特性は、既知の機能を有する既知のポリマーに対してこのポリマーを比較するのに有用である。このポリマーの特性はまた、ポリマーが正味の荷電を有するか、または荷電された領域を有することを明らかにし得る。この情報は、このポリマーが相互作用し得る化合物を同定するか、またはポリマーの領域が結合相互作用に関与し得るか、または特定の機能を有することを予測することに有用である。
【００３３】
ポリマーを同定するため、そして特には、ポリマーのユニットの配列を同定するための多くの方法が、先行技術において記載されている。一旦、ポリマーの配列が、同定されれば、配列情報は、データベース中でソートされ、そしてこのポリマーを他の配列決定されたポリマーと比較するために用いられ得る。ＧＥＮＢＡＮＫのようなデータベースは、核酸の配列（世界中の検索者により同定された）に関する情報の記録および検索を可能にする。これらのデータベースは、代表的に、特有のコードをクラス中の各化学ユニットに割当てることにより化学ユニットのクラスをコードする、表記法を用いて情報を記録する。例えば、アミノ酸をコードするための従来の表記法は、アルファベットの１文字をそれぞれの公知のアミノ酸に割当てる。このようなデータベースは、化学ユニットに対応する１セットのコードを用いてポリマーの化学ユニットを示す。このようなデータベースの検索は、代表的に、キャラクターベースの比較アルゴリズムを用いて実行されている。
【００３４】
ポリマーの構造的特性を同定するための新しい方法（バイオインフォマティクスを利用し得、そして１文字をポリマーの各ユニットに割当てる先行技術の方法とは異なる）が開発されてきている。これらの方法は、ＰＥＮ（特性コード化命名法：ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）と呼ばれる。１つの局面において、本発明は、ポリマーのユニットではなく、ポリマーの特性の同定および特徴付け、ならびにそれらの特性を分類し、かつポリマーに関する情報処理を容易にする、数的識別子の使用に基く。
【００３５】
ポリマーの特異性を同定する、そしてポリマーの特異性に関する情報を操作する能力により、ポリマーを特徴付ける先行技術の方法およびバイオインフォマティクスを上回る多くの利点が提供される。例えば、本発明の方法を用いて、構造的情報を同定し、そして複合ポリマー（例えば、先行技術の方法を用いて分析することが以前には非常に困難であったポリサッカリド）を分析し得る。
【００３６】
ポリサッカリド構築ブロックの異質性および高い程度の可変性により、先行技術がそれらの複合分子を順序付ける試みは妨げられてきた。生体高分子を単離し、そして特徴付けるための、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および質量分析（ＭＳ）のような非常に鋭敏な技術の出現で、特定の配列を含むポリサッカリドフラグメントを単離および精製するにおいて、大きな進歩がなされた。しかし情報を同定しかつ順序付けるには、過度の実験的操作がなお必要である。さらに、これらのアプローチのほとんどにおいて、ポリサッカリドの配列決定を可能にする実験的操作を設計するためには、配列に間する多くの情報が、必要である。先行技術の方法は、配列情報を同定するための簡易でかつ迅速な方法を提供する。多くの他の利点が、以下に記載する好ましい実施形態の記載から明白である。
【００３７】
本発明は、本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明の観点から、添付の図面と組み合わせて、良好に理解される。
【００３８】
図１は、ポリマー情報をソートし、そして操作するためのコンピューターシステム１００の例を示す。コンピューターシステム１００は、複数のポリマーに対応する情報をソートする複数の記録１０４ａ−ｎを含むポリマーデータベース１０２を備える。記録１０４ａ−ｎのそれぞれは、対応するポリマーの特性、対応するポリマーの構成化学ユニットの特性、またはその両方についての情報を記憶し得る。情報がポリマーデータベース１０２に記憶されるポリマーは、任意の種類のポリマーであり得る。例えば、このポリマーとしては、ポリサッカリド、核酸またはポリペプチドが挙げられ得る。
【００３９】
本明細書において用いられる「ポリマー」は、結合により一緒に固定される直線骨格および／または分枝骨格の化学ユニットを有する化合物である。全てではないがいくつかの場合、ポリマーの骨格は、分枝され得る。用語「骨格」は、ポリマー化学の分野におけるその通常の意味である。このポリマーは、骨格組成物中で異種であり得、それにより、一緒に結合するポリマーユニットの任意の可能性のある組み合わせ（例えば、ペプチド−核酸）を含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは、骨格組成物において同種であり、そして、例えば、核酸、ポリペプチド、ポリサッカリド、炭水化物、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリアミド、ポリアセテート、ポリアミド、ポリエステル、またはポリチオエステルである。「ポリサッカリド」は、結合した糖類または糖ユニットから構成される生体高分子である。本明細書において用いる場合「核酸」は、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）またはリボース核酸（ＲＮＡ））から構成される生体高分子である。本明細書において用いられる場合、ポリペプチドとは、連結されたアミノ酸から構成される生体高分子である。
【００４０】
ポリマーの連結ユニットに関して使用される場合、「連結された」または「連結」は、２つの要素が生理化学的手段によって互いに結合されることを意味する。当業者に公知の任意の連結（共有または非共有）が含まれる。このような連結は、当業者に周知である。天然の連結（特定のポリマーの化学ユニットを接続する、天然に通常見出される連結）が、最も通常である。天然の連結には、例えば、アミド、エステルおよびチオエステルの連結が挙げられる。しかし、本発明の方法によって分析されるポリマーの化学ユニットは、合成または修飾の連結によって連結され得る。ユニットが共有結合によって連結されるポリマーは、最も通常であるが、水素結合なども含む。
【００４１】
ポリマーは、複数の化学ユニットから作製される。本明細書で使用される場合、「化学ユニット」は、ポリマーを形成するために、他の構築ブロックまたはモノマーに直接的または間接的に連結され得る構築ブロックまたはモノマーである。ポリマーは、好ましくは、少なくとも２つの異なる連結ユニットのポリマーである。ユニットの特定の種類は、ポリマーの種類に依存する。例えば、ＤＮＡは、プリンおよびピリミジンのユニットから構成されるリン酸デオキシリボース骨格から構成される生体高分子であり、プリンおよびピリミジンとしては、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然および非天然の核酸塩基（置換および非置換芳香族部分）が挙げられる。ＲＮＡは、プリンおよびピリミジンのユニットから構成されるリン酸リボース骨格から構成される生体高分子であり、プリンおよびピリミジンとしては、例えば、ＤＮＡについて記載されるものが挙げられるが、ここで、ウラシルが、チミジンの代わりに使用される。ＤＮＡユニットは、５’または３’のヒドロキシル基によってポリマーの他のユニットと連結され得、それによって、エステル連結を形成する。ＲＮＡユニットは、５’、３’または２’のヒドロキシル基によってポリマーの他のユニットと連結され得、それによって、エステル連結を形成する。あるいは、末端５’，３’または２’のアミノ基を有するＤＮＡまたはＲＮＡユニットは、アミノ基によってポリマーの他のユニットに連結され得、それによってアミド連結を形成する。
【００４２】
核酸が文字の配列によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドが、左から右に、５’→３’の順序であり、他に記さない限り、「Ａ」がアデノシンを示し、「Ｃ」がシチジンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、そして「Ｕ」がウラシルを示すことが理解される。
【００４３】
ポリペプチドの化学ユニットは、２０の天然のアミノ酸ならびに改変されたアミノ酸を含む、アミノ酸である。アミノ酸は、アミドまたは遊離酸として存在し得、ａ−アミノ基を介してポリマーの骨格の他のユニットに連結され、それによって、ポリマーへのアミド連結を形成する。
【００４４】
ポリサッカリドは、互いに連結されるモノサッカリドから構成されるポリマーである。多くのポリサッカリドにおいて、ポリサッカリドの基本の構築ブロックは、実際に、繰り返しであり得るかまたは非繰り返しであり得るジサッカリドである。従って、ポリサッカリドに関して使用される場合、ユニットは、ポリサッカリドの基本的な構築ブロックを示し、モノマーの構築ブロック（モノサッカリド）またはダイマー構築ブロック（ジサッカリド）を含み得る。
【００４５】
「複数の化学ユニット」は、互いに連結された少なくとも２つのユニットである。
【００４６】
ポリマーは、天然に存在するネイティブまたは天然ポリマーであり得るか、または天然に存在しない非天然ポリマーであり得る。ポリマーは、典型的に、天然に存在するポリマーの少なくとも一部分を含む。ポリマーは、単離され得るかまたは新規に合成され得る。例えば、ポリマーは、天然の供給源から単離され得る（例えば、切断およびゲル分離により精製され得る）か、または合成され得る（例えば、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅される；（ｉｉ）例えば、化学合成によって合成される；（ｉｉｉ）クローニングによって組換え産生される、など）。
【００４７】
図２Ａは、ポリマーデータベース１０２のデータユニット２００（すなわち、データユニット１０４ａ〜ｎの１つ）のフォーマットの例を示す。図２Ａに示されるように、データユニット２００は、データユニット２００に対応するポリマーを同定するポリマー識別子（ＩＤ）２０２を含み得る。ポリマーＩＤ２０２は、図２Ｂに関して以下にさらに記載される。データユニット２００はまた、データユニット２００に対応するポリマーを構成する化学ユニットに対応する１つ以上の化学ユニット識別子（ＩＤ）２０４ａ〜ｎを含み得る。化学ユニットＩＤ２０４ａ〜ｎは、図２Ｃに関して以下にさらに詳細に記載される。図２Ａに示されるデータユニット２００のフォーマットは、ポリマーデータベース１０２のポリマーを表わすために使用され得るフォーマットの例にすぎない。ポリマーは、他の方法でポリマーデータベースにおいて表され得る。例えば、データユニット２００は、ポリマーＩＤ２０２のみを含み得るか、または１つ以上の化学ユニットＩＤ２０４ａ〜ｎを含むのみであり得る。
【００４８】
図２Ｂは、ポリマーＩＤ２０２の例を示す。ポリマーＩＤ２０２は、データユニット２００に対応するポリマーの性質についての情報を記憶するために、１つ以上のフィールド２０２ａ〜ｎを含み得る。同様に、図２Ｃは、化学ユニット２０４ａの例を示す。化学ユニットＩＤ２０４ａは、化学ユニットＩＤ２０４ａに対応する化学ユニットのペプチドについての情報を記憶するために、１つ以上のフィールド２０６ａ〜ｍを含み得る。以下の記載は化学ユニットＩＤ２０４ａのフィールド２０６ａ〜ｍを示すが、このような記載は、ポリマーＩＤ２０２ａのフィールド２０２ａ〜ｎ（および化学ユニットＩＤ２０４ｂ〜ｎのフィールド）に等しく適用可能である。
【００４９】
化学ユニット２０４ａのフィールド２０６ａ〜ｍは、コンピュータ読み取り可能な媒体に記憶され得る任意の種類の値（例えば、二進法値、十六進法値、整数十進法（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｄｅｃｉｍａｌ  ｖａｌｕｅ）値、または浮動小数点値）を記憶し得る。
【００５０】
各フィールド２０６ａ〜ｍは、対応する化学ユニットの任意の性質についての情報を記憶し得る。従って、本発明は、ポリマーの性質を同定するために有用である。本明細書で使用される場合、「性質」は、ポリマーの特徴（例えば、構造的特徴）であり、これは、ポリマーについての情報（例えば、構造情報）を提供する。用語性質がポリサッカリドを除いて任意のポリマーに関して使用される場合、性質は、ポリマーのユニットまたはポリマー自身の同一性以外の情報を提供する。ポリマーのいくつかの性質の編集は、化学ユニットまたはポリマー全体さえも同定するための十分な情報を提供し得るが、ポリマー自身の性質は、化学ユニットまたはポリマーの化学的基礎を含まない。
【００５１】
用語性質がポリサッカリドの性質を規定するためにポリサッカリドに関して使用される場合、ポリサッカリドの複雑さに起因して、性質がポリサッカリドのモノマーの構築ブロックの種類を同定し得ることを除いて、上記のように同じ意味を有する。ポリサッカリドの化学ユニットは、他のポリマー（例えば、核酸およびポリペプチド）の化学ユニットよりずっと複雑である。ポリサッカリドユニットは、その基礎的な化学構造に加えて、他の化学ユニットよりも可変性を有し得る。例えば、ポリサッカリドは、化学ユニット上のいくつかの部位においてアセチル化され得るかまたは硫酸化され得、あるいは、荷電していても荷電していなくてもよい。従って、ポリサッカリドの１つの性質は、ポリサッカリドの一つ以上の基礎的な構築ブロックの同一性であり得る。
【００５２】
しかし、基礎的な構築ブロックのみは、糖類またはジサッカリドの置換基の性質および電荷についての情報を提供しないかもしれない。例えば、ウロン酸の構築ブロックは、イズロン酸またはグルクロン酸であり得る。これらの構築ブロックのそれぞれは、化学ユニットの構造に対して複雑性を追加するさらなる置換基を有し得る。しかし、単一の性質は、ポリサッカリドの完全な構築ブロックを同定することに加えて、このようなさらなる置換基の電荷を同定しないかもしれない。しかし、この情報は、いくつかの性質から組み立てられ得る。従って、本明細書中に使用されるポリマーの性質は、アミノ酸またはヌクレオチドを含まないが、ポリサッカリドの糖類またはジサッカリドの構築ブロックを含む。
【００５３】
ポリマーについての情報を提供する性質の種類は、分析されるポリマーの種類に依存し得る。例えば、ポリマーがポリサッカリドである場合、電荷、分子量、硫酸化またはアセチル化の性質および程度ならびにポリサッカリドの種類のような性質は、ポリマーについての情報を提供し得る。性質には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：電荷、キラリティー、置換基の性質、置換基の量、分子量、分子の長さ、置換基またはユニットの組成比、ポリサッカリドの基礎的な構築ブロックの種類、疎水性、酵素感受性、親水性、二次構造およびコンフォメーション（すなわち、らせんの位置）、置換基の空間的分布、一セットの改変体の別のセットの改変体に対する比（すなわち、Ｎ−硫酸化に対する２−Ｏ硫酸化の相対量またはイズロン酸のグルクロン酸に対する比）、およびタンパク質の結合部位。他の性質は、当業者によって同定され得る。本明細書中で使用される場合、置換基は、ユニットを置換する原子または原子の群であるが、ユニット自身ではない。
【００５４】
ポリマーの性質は、当該分野で公知の任意の手段によって同定され得る。性質を同定するために使用される手順は、性質の種類に依存し得る。例えば、分子量は、質量分光法を含むいくつかの方法によって決定され得る。ポリマーの分子量を決定するための質量分光法の使用は、当該分野で周知である。質量分光法は、生成されるフラグメントの質量を報告する際のその正確性（±１ダルトン）が理由で、そしてまたｐＭサンプル濃度のみが必要とされるので、ポリマーを特徴付けるのに強力なツールとして使用されている。例えば、マトリクスアシスティドレーザーデリープションイオン化質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．ら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，ｖ．９５，４１７６−４１８１頁（１９９８）；Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．ら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，ｖ．９５，１２２３２−１２２３７頁（１９９８）；およびＥｒｎｓｔ，Ｓ．ら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，ｖ．９５，４１８２−４１８７頁（１９９８）のような刊行物（それぞれが、本明細書によって参考として援用される）においてポリサッカリドフラグメントの分子量を同定するために記載されている。当該分野で公知の他の種類の質量分光法（例えば、電子スプレーＭＳ、高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）、および衝突活性化解離質量分光法（ＣＡＤ））もまた、ポリマーまたはポリマーフラグメントの分子量を同定するために使用され得る。
【００５５】
質量分光法データは、ポリマーが、酵素または化合物を用いて分解を受けた後に、ポリマーフラグメントサイズについての情報を確認するために価値のあるツールであり得る。ポリマーの分子量が同定された後に、これは、他の公知のポリマーの分子量と比較され得る。質量分光法データから得られた質量が、１ダルトン（１Ｄ）について正確であるので、酵素消化によって得られた１つ以上のポリマーのフラグメントのサイズが、正確に決定され、多くの置換基（すなわち、存在する硫酸基および酢酸基）が決定され得る。分子量を比較するための一つの技術は、質量ライン（ｍａｓｓ  ｌｉｎｅ）を生成し、未知のポリマーの分子量を同じ分子量を有するポリマーの下位集団を決定するための質量ライン比較することである。本明細書中で使用される場合、「質量ライン」は、好ましくは、グラフまたはチャートの形態の情報データベースであり、これは、ポリマーの分子量に基づく独特の配列を有するポリマーのそれぞれ可能な種類についての情報を記憶する。従って、質量ラインは、特定の分子量を有する多くのポリマーを記載し得る。２つのユニットの核酸（すなわち、２つの化学ユニットを有する核酸）は、２つのヌクレオチドに対応する分子量で１６（４ユニット2）の可能なポリマーを有する。２つのユニットのポリサッカリド（すなわちジサッカリド）は、２つの糖類に対応する分子量において３２の可能なポリマーを有する。従って、質量ラインは、特定の質量を特定の長さの所与のフラグメント（全ての可能なジサッカリド、四糖類、六糖類、八糖類、十六糖類まで）を独特に割り当て、結果を作表する（例は、図８に示される）ことによって生成され得る。
【００５６】
以下の表１は、ポリサッカリドについての値の計算されたセットの例を示す。表１から、多数の重合体の化学ユニットは、長さｎ＋１のフラグメントと長さｎのフラグメントとの間の質量の最小の差から決定され得る。例えば、この繰り返しが、ジサッカリドユニットである場合、長さｎのフラグメントは、２ｎモノサッカリドユニットを有する。例えば、ｎ＝１は、ジサッカリドの長さに対応し、そしてｎ＝２は、四糖類の長さに対応し得るなど。
【００５７】
【表１】
0004824170.tif 000002
質量分析データが、フラグメントの質量は、１Ｄ精度を示すので、長さは、質量ライン（ｍａｓｓ  ｌｉｎｅ）における質量を調査することによってフラグメントに対して独自に割り当てられる。さらに、それは、ジサッカリドよりも長い特定の長さのフラグメントにおいて質量ラインから決定され得、最小の４．０２Ｄの質量の差があり、これは、２つのアセテート基（８４，０８Ｄ）が、サルフェート基（８０．０６Ｄ）に置換したことを示している。従って、重合体フラグメントの多数のサルフェートおよびアセテートは、質量分析データからの質量から決定され得、そしてこのような数は、重合体フラグメントに割り当てられ得る。
【００５８】
分子量に加えて、その他の特徴は、当該分野で公知の方法を用いて決定され得る。置換基ユニットまたは化学ユニットの組成比（全置換基ユニットまたは化学ユニットの量および型）は、当該分野で公知の方法論（例えば、キャピラリー電気泳動）を用いて決定され得る。重合体は、この重合体の化学ユニットの各々を分離するための酵素的分解または化学的分解のような実験的な制約を受け得る。次いでこれらのユニットは、キャピラリー電気泳動を用いて分離され、この重合体に存在する、置換基ユニットまたは化学ユニットの量および型を決定し得る。さらに、多数の置換基ユニットまたは化学ユニットは、重合体の分子量に基づいて計算機を用いて決定され得る。
【００５９】
キャピラリーゲル電気泳動の方法において、反応サンプルは、直径の短い、ゲル濾過キャピラリーによって分析され得る。キャピラリーの短い直径（５０μｍ）は、電気泳動中に生じる熱の効果的な損失を可能にする。従って、高領域強度（ｈｉｇｈ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）は、過剰なジュール熱（４００Ｖ／ｍ）を伴なわないで、、反応実施あたり約２０分の分離時間を下げて使用され得、そのために、従来のゲル電気泳動での分解能を上昇する。さらに、多くのキャピラリーは、平行して分析され得、生成される重合体情報の増幅を可能にする。
【００６０】
特徴を同定するために有用であることに加えて、組成分析をまた使用して、不純物の存在および組成ならびにこの重合体の主な特徴を決定し得る。このような決定は、不純物がこの重合体のような同一の組成を含まない場合、達成され得る。不純物が存在するか否かを決定するために、電気泳動図において現れる各々のピークの面積を、正確に１つにまとめる工程およびこのピークを主なピークの最も小さいものに対して正規化する工程を包含し得る。この正規化したピークの和は、１に等しいかまたは１に近くなければならない。そうでない場合、次いで、１以上の不純物が存在する。この不純物の少なくとも１つのジサッカリドユニットが、未知のいずれかのジサッカリドユニットとは違う場合、不純物でも未知のサンプルにおいて検出され得る。
【００６１】
不純物が存在する場合、その成分の組成の１つ以上の状態が、キャピラリー電気泳動を用いて決定され得る。全ての公知のジサッカリドユニットは、上記のキャピラリー電気泳動法によってベースライン分離され得、そして移動時間が代表的には、電気泳動を用いて決定され（すなわち、電気浸透フローに対向するように）、そして再現可能であるので、種々の糖類ユニットの重合体フラグメントに対する確実な割り当てが達成され得る。その結果、主なピークの組成およびわずかな汚染物質の組成の両方は、重合体フラグメントに対して割り当てられる。溶液の主な成分およびわずかな成分の両方の組成は、下記のように割り当てられ得る。
【００６２】
組成のこのような割り当ての一例は、溶液中に９：１の比で存在する主なＡＴ−ＩＩＩ結合ＨＬＧＡＧ十糖類（＋ＤＤＤ４−７）およびそのわずかな汚染物（＋Ｄ５Ｄ４−７）の組成を決定することを含む。ヘパリナーゼを用いるこの９：１混合物の完全な分解は、４つのピークを生じる：３つは主な十糖類（ｖｉｚ、Ｄ、４、および−７）の代表であり、これらは、この汚染物においても存在し、そして１つのピーク（５）は、汚染物質にのみ存在する。換言すれば、Ｄ、４、および−７の各々のピークの面積は、主な十糖類からの寄与およびこの汚染物からの寄与の付加的な組み合わせを示すが、これに対して、５のピークは、汚染物のみを示す。
【００６３】
この汚染物および主な成分の組成を割り当てるために、５ピークの面積は、開始点として用いられ得る。この面積は、汚染物の１つのジサッカリドユニットのピークの面積を示す。４と−７の全面積からこの面積を減算して、そしてＤの面積からこの面積を２回減算すると、４：−７：Ｄの比が１：１：３になる。このような比は、主な成分の組成を確認し、そして不純物の組成が、２つのＤ、１つの４、１つの−７、および１つの５を示す。
【００６４】
特徴のその他の型を同定する方法は、当業者に容易に同定可能であり得、そして特徴の型および重合体の型に依存し得る。例えば、疎水性は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて決定され得る。酵素感受性は、この重合体を酵素に曝し、かつこのような曝露の後に存在する多数のフラグメントを決定することによって同定され得る。このキラリティーは、円偏光二色性を用いて決定され得る。タンパク質結合部位は、質量分析法、等温熱量測定およびＮＭＲによって決定され得る。酵素的改変（分解ではない）は、酵素分解のような同様の様式において決定され得る。すなわち、基質を酵素に曝露し、かつＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いることによって基質が改変されているか否かを決定する。例えば、スルホトランスフェラーゼは、サルフェート基を、汚染物を有するＨＳ鎖に転移し、８０Ｄａに増加する。構造は、モデリングおよび核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定され得る。硫酸化の相対的な量は、組成分析によって決定され得るか、またはラマン分光法によっておおまかに決定され得る。
【００６５】
いくつかの局面において、本発明は、重合体についての生成情報、調査情報、操作情報のために有用である。この局面において、重合体の全基本骨格は、独特な数値識別子を割り当てられる。この識別子を用いて、全基本骨格をクラス分けし得る。例えば、ポリサッカリドが分析される場合、各々の数値識別子が、ポリサッカリドの全基本骨格を示し、これは、ポリサッカリドの基礎的な基本骨格およびその置換基、電荷などの全てによって定義される正確な化学構造を含む。基礎的な基本骨格とは、重合体ユニットの基礎的構造（例えば、ポリサッカリドの基礎的な環状構造（例えば、イズロン酸またはグルクロン酸））をいうが、置換基、電荷などは含まない。この情報は、重合体の「特徴」に関する上記の同一の様式において生成および処理される。
【００６６】
現在、糖類のフラグメントは、ヘパリナーゼ分解の際に生成されるΔ4,5二重結合が吸収する、波長２３２ｎｍでモニタすることによってキャピラリー電気泳動において検出される。しかし、他の検出方法は可能である。まず、ヘパリンフラグメントの亜硝酸分解、続いて、3Ｈ水素化ホウ素ナトリウムで還元して、3Ｈ放射能タグを有する分解されたフラグメントを生じる。これは、引き続くキャピラリー電気泳動（放射能を計数する）、またはマススペクトル（質量の増加によって）の両方のタグであり得ることを示す。放射能を使用する別の方法は、Ｓ35でヘパリンフラグメントを標識することである。3Ｈ標識フラグメント、Ｓ35標識フラグメントの可能性のある検出の型の類似性は、放射能検出（ＣＥ）または質量の差の測定（ＭＳ）について有用である。
【００６７】
特にＳ35の場合、この検出は有力である。この場合、ヒトスルホトランスフェラーゼを使用して、特異的に特定の残基に標識し得る。これは、さらなる構造の情報を与える。
【００６８】
ヘパリナーゼ誘導フラグメントととは違い、亜硝酸分解したフラグメントは、ＵＶ吸収発色団を有しない。本発明者らが示しているように、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、それらを誘導する方法に関係なく、ヘパリンフラグメントの質量を記録する。ＣＥに関して、２つの方法を使用して、適切な発色団を欠失するフラグメントをモニタし得る。第１は、フラグメントの間接的な検出である。本発明者らは、本発明者らのＣＥ方法論を用いて適切な背景吸収体（例えば、１，５−ナフタレンジスルホニル酸）を用いてヘパリンフラグメントを検出し得る。検出の第２の方法は、糖類による金属イオンのキレート化に関与する。この糖類−金属錯体は、不飽和の二重結合をモニタするのと同様にＵＶ−Ｖｉｓを用いて検出され得る。
【００６９】
他の群は、特異的なＨＬＧＡＧ配列に対して抗体を惹起する過程を始める。本発明者らは、以前に、タンパク質（例えば、アンギオゲニン、ＦＧＦ）が、合成ペプチド、塩基性ペプチドの代わりに錯化剤として使用され得ることを示した。拡大解釈すれば、抗体は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のための錯化剤として使用され得る。これは、本発明者らが、単に、所定の抗体が、未知のサンプルとともに所定の配列特異性錯体を有するか否かをＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて観察することによって特異的な配列がこの未知のサンプルにおいて存在するか否かを決定することが可能である。
【００７０】
最終点は質量タグを使用することであり、本発明者らは、非還元末端からグリコサミノグリカンの還元末端を識別し得る。これらタグの全ては、アノマーＯＨ（ポリマーの還元末端に存在する）を用いた選択的化学を含み、従って、標識は鎖の還元末端で生じる。１つの一般的なタグは、蛍光性である２−アミノ安息香酸である。一般的に、タグは以下の型の化学を含む：（１）アノマー位を用いたアミンの反応でイミンを形成（すなわち、２−アミノ安息香酸）、ヒドラジン反応でヒドラゾンを形成、およびアノマーＯＨを用いたセミカルバゾンの反応でセミカルバジドを形成。通常使用される（２−アミノ安息香酸以外の）タグとしては、以下の化合物が挙げられる：
１．セミカルバジド
２．ジラールＰ試薬
３．ジラールＴ試薬
４．ｐ−アミノ安息香酸エチルエステル（ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）
５．ビオチン−ｘ−ヒドラジド
６．２−アミノベンズアミド
７．２−アミノピリジン
８．アントラニル酸
９．５−［（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ］−フルオレセイン
１０．８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸
１１．２−アミノアクリドン
図２Ｄは、化学ユニットＩＤ２０４ａの例を示す。化学ユニットＩＤ２０４ａは、ポリマー集団に関する情報を記憶するための１つ以上の領域２１２ａ〜ｅを含む。本発明は、全てのポリマーを含むが、本発明の使用は、ポリサッカリドの複雑な性質が理由で、ポリサッカリドに関してより詳細に記載される。しかし、本発明は、ポリサッカリドに限定されない。ヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）フラグメントの不均一性およびそれらの糖類構築物における高度な可変性は、これらの複合体分子を配列決定しようという試みにさらされる。ヘパリンおよびヘパラン硫酸を含むヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）は、へキソセアミン（ｈｅｘｏｓｅａｍｉｎｅ）およびα／β１−４グリコシド結合によって結合されるグルクロン酸／イズロン酸を含むジサッカリド反復ユニットで構成される複合ポリサッカリド分子である。これらの定義されたユニットは、へキソセアミンのＮ、３−Ｏおよび６−Ｏ位における硫酸化、ウロン酸の２−Ｏ硫酸化、ならびにグルクロン酸をイズロン酸に変換するＣ５エピマー化によって改変され得る。ＨＬＧＡＧのジサッカリドユニットは、以下：
（α１→４）Ｉ／Ｇ2OX（α／β１→４）Ｈ3OX,NY60X（α１→４）、
として表され得、ここで、Ｘは、硫酸化された（−ＳＯ3Ｈ）または硫酸化されていない（−Ｈ）であり得、そしてＹは、硫酸化された（−ＳＯ3Ｈ）またはアセチル化された（−ＣＯＣＨ3）であり得るか、稀な場合、硫酸化もアセチル化されていない。
【００７１】
領域２１２ａ〜ｅは、任意の種類の値、例えば、単一ビット値、単一ディジット１６進値、または１０進値などで記憶され得る。１つの実施形態において、化学ユニットＩＤ２０４ａは、以下の各領域を含む：（１）ポリマーがイズロン酸またはグルクロン酸を含むか否かを示す値を記憶するための領域２１２ａ（Ｉ／Ｇ）；（２）イズロン酸またはグルクロン酸の２Ｘ位が硫酸化されているかまたは硫酸化されていないかを示す値を記憶するための領域２１２ｂ；（３）へキソセアミンが硫酸化されているかまたは硫酸化されていないかを示す値を記憶するための領域２１２ｃ；（４）ヘキソセアミンの３Ｘ位が硫酸化されているかまたは硫酸化されていないかを示す領域２１２ｄ；および（５）ヘキソセアミンのＮＸ位が硫酸化されているかまたはアセチル化されているかを示す領域２１２ｅ。必要に応じて、各領域２１２ａ〜ｅは、単一ビットとして表され得る。
【００７２】
表２は、複数の入力を有するデータ構造の例を示し、ここで、各入力は、図２Ｄに従ってコードされたＨＬＧＡＧを示す。各領域２１２ａ〜ｅのビット値は、任意の公知の様式で設定され得る。例えば、領域２１２ａ（Ｉ／Ｇ）に関して、１の値は、イズロン酸を示し得、０の値は、グルクロン酸を示し得、またその逆もまた同様である。
【００７３】
【表２】
0004824170.tif 000003
0004824170.tif 000004
表２
ビット領域を用いたＨＬＧＡＧの表示は、多くの有意な点を有し得る。ＨＬＧＡＧのプロパティは２つの可能な状態のうちの１つを有し得るので、２進ビットは、理想的にＨＬＧＡＧプロパティを表す情報の記憶に適している。ビット領域は、そのような情報をコンピューターで読み取り可能な媒体（例えば、コンピューターメモリーまたは記憶デバイス）に記憶することに使用され得、例えば、複数ビット（複数領域を示す）を単一バイトまたはバイトの連続にパックすることによる。さらに、ビット領域は、デジタルコンピュータープロセッサーによって迅速かつ効果的に記憶され、そして操作され得る。これは、代表的には、ビットを用いて情報を記憶し、そして代表的には、ビット上で迅速に操作を実行し得る（例えば、シフト、ＡＮＤ、ＯＲ）。例えば、以下により詳細に記載するように、ビット領域として各々記憶された複数のプロパティは、代表的な特徴ベースの検索方法を用いて実施される検索よりも、より迅速に検索され得る。
【００７４】
さらに、ＨＬＧＡＧのプロパティを示すためにビット領域を用いて、利用者が、さらなるプロパティを示すようにさらにビットを加えることによって、化学ユニットＩＤ２０４ａにさらなるプロパティ（例えば、４−Ｏの硫酸化対非硫酸化）をより容易に組込むことを可能にする。
【００７５】
１つの実施形態において、４つの領域２１２ｂ〜ｅ（これらの各々は、単一ビット値を記憶し得る）は、単一１６進（ベース１６）数として表され得、ここで、各領域２１２ａ〜ｅは、１６進数の１つのビットを表す。ジサッカリドユニットを示すために１６進数を用いることは、表示および加工の両方において好都合である。なぜなら、１６進ディジットは、従来のコンピューターによって使用される表示の一般的な形態だからである。
【００７６】
必要に応じて、記録２１０の５つの領域２１２ａ〜ｅは、符号付１６進ディジットとして表され得、ここで、領域２１２ｂ〜２１２ｅは、上記のように集団的に単一ディジット１６進数をコードし、そしてＩ／Ｇ領域は、符号ビットとして使用される。そのような符号付けされた表示において、１６進数０〜Ｆは、イズロン酸を含む化学ユニットをコードするために使用され得、そして１６進数−０〜−Ｆは、グルクロン酸を含むユニットをコードするために使用され得る。しかし、化学ユニットＩＤ２０４ａは、他の形態の表示、例えば、二の補数（ｔｗｏｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）表示を用いることによってコードされ得る。
【００７７】
化学ユニットＩＤ２０４ａの領域２１２ａ−ｅは、任意の順番で配置され得る。例えば、グレイコードシステムは、ＨＬＣＡＧをコードするために使用され得る。グレイコード番号付けスキームにおいて、各々の連続した値は、単一ビット位置のみにおいて、前の値とは異なる。例えば、ＨＬＧＡＧの場合、ＨＬＧＡＧを表す値は、任意の２つの隣りの値がたった１つの特性の値で異なるように配置され得る。ＨＬＧＡＧをコードするために使用されるグレイコードシステムの例は、表３に示される。
【００７８】
【表３】
0004824170.tif 000005
0004824170.tif 000006
表３は、隣りの表の項目が単一の特性の値でのみ互いに異なるように、グレイコードスキームの使用が二糖結合ブロックを配置することを示す。ＨＬＧＡＧをコードするためにグレイコードを使用する１つの利点は、ＨＬＧＡＧフラグメントの生合成が基本的な構築ブロックＧ−ＨHNacから始まる改変の特異的な配列に従い得る。
【００７９】
表３において、８、４、２、および１のビット量は、１６進数の数的当量を計算するために使用され、最も重要なビット（Ｉ／Ｇ）はサインビット（ｓｉｇｎ  ｂｉｔ）として使用される。例えば、１６進法コードＡ（０１０１０  ２進法）は、８＊１＋４＊０＋２＊１＋１＊０＝１０に等しい。
【００８０】
別の実施形態において、領域２１２ａ−ｅの各々の重量は変更され得、それによって代替の重量システムを実施する。例えば、ビット領域２１２ａ−ｅは、表４に示されるように、それぞれ、１６、８、４、−２、および−１の重量を有し得る。
【００８１】
【表４】
0004824170.tif 000007
0004824170.tif 000008
ビットの重量の改変は、二糖ユニットを記録するために使用され得る。例えば、配列のデータベースが作成され得、異なる二糖ユニットがデータベースに存在する配列のそれらの相対含量に基づいて記録され得る。天然に存在するＨＬＧＡＧにおいて稀に起こる、幾つかのユニット（例えば、Ｉ−ＨNAc,3S6S）は、ビットが表４に示される様式で計量されるスキームに基づく低スコアを受容し得る。
【００８２】
必要に応じて、硫酸化およびアセチル化の位置は、表２に示されるＩ／Ｇ、２Ｘ、６Ｘ、３Ｘ、ＮＸに配置され得る。しかし、これらの位置は、異なって配置され得、異なる二糖ユニットを表す同じ組のコードを生じる。例えば、表５は、それらの位置がＩ／Ｇ、２Ｘ、ＮＸ、３Ｘ、６Ｘとして配置される配置を示す。
【００８３】
【表５】
0004824170.tif 000009
0004824170.tif 000010
いくつかのＨＬＧＡＧ配列における二糖ユニットは、Ｎ−硫酸化もＮ−アセチル化もされていないことが観察される。このような二糖ユニットは、多くの任意の方法において、化学ユニットＩＤ  ２０４ａを使用して表され得る。
【００８４】
化学ユニットの性質がビットフィールドで表される場合、Ｎ位に遊離アミンを含む二糖ユニットは、例えば、さらなるビットフィールドの追加によって表され得る。例えば、図２Ｄを参照すると、追加フィールドＮＹは、化学ユニットＩＤ  ２０４ａにおいて使用され得る。例えば、ゼロの値を有するＮＹフィールドは、遊離アミンに対応し得、そして１の値を有するＮＹフィールドは、Ｎ−アセチル化に対応し得、また逆も同様である。さらに、ＮＸフィールド２１２ｅにおける１の値は、Ｎ−硫酸化に対応し得る。
【００８５】
必要に応じて、Ｎ位に遊離アミンを含む二糖ユニットは、トライステートフィールドを使用して表され得る。例えば、化学ユニットＩＤ  ２０４ａにおけるフィールド２１２ｅ（ＮＸ）は、３つの許容された値を有するトライステートフィールドであり得る。例えば、ゼロの値は、遊離アミンに対応し得、そして１の値はＮ−アセチル化に対応し得、そして２の値はＮ−硫酸化に対応し得る。同様に、フィールド２１２ａ〜ｅの任意の値は、２より大きな基数を有する記数法を使用して表され得る。例えば、フィールド２１２ｅ（ＮＸ）の値が、３の基数を有する１桁の数によって表される場合、フィールド２１２ｅは、３つの許容される値を保管し得る。
【００８６】
図１を参照すると、ユーザーは、特定の情報を検索するために、ポリマーデータベース１０２上での照会を行い得る。例えば、ユーザーは、特定のポリマー、特定の化学ユニット、あるいは特定の性質を有するポリマーまたは化学ユニットについて、ポリマーデータベース１０２を検索し得る。ユーザーは、検索する性質を示すユーザーインプット１０６を、照会ユーザーインターフェース１０８に提供し得る。このユーザーインプット１０６は、例えば、標準文字表記法を使用して、例えば、１つ以上の化学ユニット、化学ユニットのポリマーまたは１つ以上の検索する性質を示し得る。照会ユーザーインターフェース１０８は、例えば、キーボードまたはマウスのような入力装置を使用して、性質のリストからユーザーが選択することを可能にするグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を提供し得る。
【００８７】
照会ユーザーインターフェース１０８は、ユーザーインプット１０６に基づく検索照会１１０を作製し得る。サーチエンジン１１２は、検索照会１１０を受け、そして検索照会に基づいてマスク１１４を作製し得る。マスク１１４の型式の例、およびマスク１１４によって特定された性質がポリマーデータベース１０２におけるポリマーの性質に一致するか否かを決定する技術の例は、図３と関連して以下でより詳細に説明される。
【００８８】
このサーチエンジン１１２は、マスク１１４によって特定された性質がポリマーデータベース１０２に保管されたポリマーの性質と一致するか否かを決定し得る。引き続いて、このサーチエンジン１１２は、ポリマーデータベース１０２が、マスク１１４によって特定された性質を有するポリマーを含むか否かを示す検索に基づいて、検索結果１１６を作製し得る。この検索結果１１６はまた、ポリマーデータベース１０２における、マスク１１４によって特定された性質を有するポリマーを示し得る。例えば、ユーザーインプット１０６が化学ユニットの性質を特定した場合、検索結果１１６は、ポリマーデータベース１０２におけるどのポリマーが特定の化学ユニットを含むかを示し得る。あるいは、ユーザーインプット１０６が特定の化学ユニットの性質を特定した場合、検索結果１１６は、ポリマーデータベース１０２中の特定された化学ユニットの性質を有する化学ユニットを含むポリマーを示し得る。同様に、ユーザーインプット１０６が特定のポリマー特性を特定した場合、検索結果１１６は、ポリマーデータベース１０２中のどのポリマーが特定されたポリマー性質を有するかを示し得る。
【００８９】
図３は、検索結果１１６を作製するためにサーチエンジン１１２によって使用され得るプロセス３００の例を図示するフローチャートである。行動３０２において、サーチエンジン１１２は、照会ユーザーインターフェース１０８から検索照会１１０を受け得る。次に、行動３０４において、サーチエンジン１１２は、検索照会１１０に基づいて作製されるマスク１１４を作製し得る。行動３０６に続いて、サーチエンジン１１２は、マスク１１４の適用によって、ポリマーデータベース１０２における記録１０４ａ〜ｎの１つ以上において、２進法操作を行い得る。次に、行動３０８において、サーチエンジン１１２は、工程３０６で行われる２進法操作の結果に基づいて、検索結果１１６を作製し得る。
【００９０】
ここで、プロセス３００は、実施形態に関してより詳細に記載され、この実施形態において、化学ユニット２０４ａのフィールド２０６ａ〜ｍは２進法フィールドである。行動３０２において、受けられた検索照会１１０は、特定の化学ユニット（例えば、化学ユニットＩ2S−ＨNS）についてポリマーデータベース１０２を検索するために示し得る。例えば、表１に示されるコードスキームが、ポリマーデータベースにおける化学ユニットをコードするために使用される場合、化学ユニットＩ2S−ＨNSは、０１００１の２進数値で表され得る。この化学ユニットについてのマスク１１４を作製するために（ステップ３０４）、サーチエンジン１１２は、マスク１１４の値として、この化学ユニットの２進数値（すなわち、０１００１）を使用し得る。結果として、マスク１１４のビットの値は、化学ユニットＩ2S−ＨNSの性質を特定し得る。例えば、最も左のビット位におけるゼロの値は、イズロン性（Ｉｄｕｒｏｎｉｃ）を示し得、そして次のビット位における１の値は、２Ｘ位が硫酸化されていることを示し得る。
【００９１】
このサーチエンジン１１２は、ポリマーデータベース１０２中のポリマーが、化学ユニットＩ2S−ＨNSを含むか否かを決定するために、このマスク１１４を使用し得る。この決定を行うために、このサーチエンジン１１２は、マスク１１４を使用してポリマーデータベース１０２のデータユニット１０４ａ〜ｎの二進法操作を行い得る（ステップ３０６）。例えば、このサーチエンジン１１２は、マスク１１４を使用して、ポリマーデータベース１０２中の各ポリマーの各化学ユニットについて論理的ＡＮＤ操作を行い得る。特定の化学ユニットについての論理的ＡＮＤ操作の結果がマスク１１４の値と等しい場合、この化学ユニットは、検索照会１１０を満たし、そして、行動３０８において、このサーチエンジン１１２は検索結果１１６において成功した一致を示し得る。このサーチエンジン１１２は、検索結果１１６において一致した化学ユニットを含むポリマーのポリマー識別子のようなさらなる情報を作製し得る。
【００９２】
行動３０２における検索照会の受信に応答して、行動３０４において、このサーチエンジン１１２はまた、特定のポリマーまたは化学ユニットの１つ以上の性質を示すマスク１１４を作製し得る。このような検索照会についてのマスク１１４を作製するために、このサーチエンジン１１２は、この検索照会によって特定された値に対する検索照会によって特定された性質に従って、マスク中の各ビット位を設定し得る。例えば、その２Ｘ位および６Ｘ位の両方が硫酸化された全ての化学ユニットについての検索を示す検索照会１１０を考慮する。この検索照会に対応するマスクを作製するために、このサーチエンジン１１２は、２Ｘおよび６Ｘ位に対応するマスクのビット位に、硫酸化されたものに対応する値を設定し得る。上記の表１に示されるコードスキームを使用して、例えば、２Ｘおよび６Ｘ位は、それぞれ３および２のビット位を有し（ビット位ゼロで始まる最も右の位置から数える）、この検索照会に対応するマスクは０１１００である。１の値を有するこのマスクの２つのビットは、２Ｘおよび６Ｘ位に対応し、表１におけるビット位に対応する。
【００９３】
ポリマーデータベース１０２中の特定の化学ユニットの１つ以上の性質が、マスク１１４によって特定された１つ以上の性質に一致するか否かを決定するために、このサーチエンジン１１２は、マスク１１４を使用してポリマーデータベース１０２中の化学ユニットの化学ユニット識別子について、論理的ＡＮＤ操作を行い得る。この化学ユニットについての検索結果を作製するために（すなわち、行動３０８）、このサーチエンジン１１２は、論理的ＡＮＤ操作の結果をマスク１１４と比較し得る。検索照会によって特定された性質に対応する論理的ＡＮＤ操作のビット位の値が、マスク１１４の同じビット位の値と等しい場合、この化学ユニットは、この検索照会１１０によって特定された性質を有し、そしてこのサーチエンジン１１２は、検索結果１１６において成功した一致を示す。
【００９４】
例えば，上記の検索照会１１０を考慮し、これはその２Ｘ位および６Ｘ位の両方が硫酸化された全ての化学ユニットについての検索を示す。表１のコードスキームを使用して、２Ｘおよび６Ｘ位に対応するビット位は、３および２のビット位である。従って、マスク１１４を使用して化学ユニットの化学ユニット識別子についての論理的ＡＮＤ操作を行った後、このサーチエンジン１１２は、論理的ＡＮＤ操作の結果のビット位３および２を、マスクのビット位３および２と比較する。両方のビット位における値が等しい場合、この化学ユニットは、マスク１１４によって特定された性質を有する。
【００９５】
マスク１１４の作製およびマスク１１４を用いる検索についての上記の技術はまた、化学ユニットの配列またはポリマー全体に関する検索を行うために使用され得る。例えば、検索照会１１０が化学ユニットの配列を示す場合、このサーチエンジン１１２は、マスク１１４を、化学ユニットの特定された配列の２進数コード化の連続に対応するビットの配列で満たし得る。次いで、このサーチエンジン１１２は、マスク１１４を使用してポリマーデータベース１０２中のポリマー識別子について２進法ＡＮＤ操作を行い、そして上記のような検索結果１１６を作製し得る。
【００９６】
マスク１１４の作製およびマスク１１４を用いる検索について上記に記載される技術は、単に例として提供される。マスク１１４を用いて作製および検索するための他の技術もまた、使用され得る。このサーチエンジン１１２はまた、各検索照会１１０について、１より多くのマスクを使用し得、そしてこのサーチエンジン１１２は、計算効率を改善するために、並行して複数の２進法操作を行い得る。さらに、論理的ＡＮＤ以外の２進法操作は、ポリマーデータベース１０２中のポリマーの性質が、マスク１１４によって特定された性質に一致するか否かを決定するために使用され得る。他の２進法操作としては、例えば、論理的ＯＲおよび論理的ＸＯＲ（排他的ＯＲ）が挙げられる。このような２進法操作は、単独または互いの組合わせで使用され得る。
【００９７】
上記の技術を使用して、このポリマーデータベース１０２は、特定の化学ユニットについて迅速に検索され得る。プロセス３００の１つの利点は、２進数値を使用して化学ユニットの性質をコードする化学ユニットコードスキームと組合わせて使用される場合、化学ユニット識別子（例えば、化学ユニット識別子２０４ａ）が、単一の２進法操作（例えば、２進法ＡＮＤ操作）を使用して、検索照会（マスクの形態で）と比較され得ることである。上記のように、化学ユニットの配列をコードするために文字ベースの記数法システムを使用する従来の記数法システム（例えば、文字の配列としてＤＮＡ配列をコードするシステム）は、代表的には、化学ユニットの超配列（ｓｕｐｅｒ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（文字の第２配列によって表される）内の化学ユニットのサブ配列（文字の第１配列によって表される）について検索し、そして文字ベースの比較を使用する。このような比較は、代表的に遅い。なぜならこれは、一致が見出されるまで、文字の第１配列（サブ配列に対応する）における各文字を第２配列における文字と連続して比較するためである。結果的に、検索の速度は、サブ配列の長さに関連する（すなわち、長い配列であれば検索は遅くなる）。
【００９８】
対照的に、検索二進演算についての上記技術の速度は、検索照会の基礎である部分配列の長さに対して一定であり得る。検索エンジン１１２は、問い合わせ配列の長さに関わらず、単一の二進演算（例えば、論理ＡＮＤ演算）を使用して、化学ユニットの問い合わせ配列について検索し得るので、検索は、問い合わせ配列の長さに速度が相関する従来の特徴ベースの方法よりも、迅速に実行され得る。さらに、検索エンジン１１２によって使用される二進演算は、より迅速に実行され得る。なぜなら、従来のコンピュータープロセッサーは、バイナリデータにおいて二進演算を実行するように設計されているからである。
【００９９】
二進演算を使用して検索するための上記技術のさらなる利点は、ポリマーの記数表示中にポリマーの１以上の特性を符号化することによって、検索エンジン１１２が、迅速かつ直接的に、ポリマーの特定の特性についてポリマーデータベース１０２を検索することを可能にするという点である。ポリマーの特性は、そのポリマーの記数表示中に符号化されるので、検索エンジン１２２は、そのポリマーの記数表示中に特定の特性が符号化されているか否かを決定することによって、そのポリマーが特定の特性を有するか否かを決定し得る。例えば、上記のように、検索エンジン１１２は、マスク１１４を使用してポリマーの記数表示において論理ＡＮＤ演算を実行することによって、そのポリマーが特定の特性を有するか否かを決定し得る。この演算は、従来のコンピュータープロセッサーよりも迅速に実行され得、そしてポリマーの特性に関するさらなる情報を参照しなくとも、そのポリマーの記数表示およびマスクのみを使用して実行され得る。
【０１００】
二進演算を使用して特性を表示するために本明細書中で記載される技術のいくつかの局面は、ポリサッカリドに関する情報を生成し、検索し、そして操作するために有用であり得る。従って、ポリマーの完全な基礎ユニットが、固有の数字識別子（これは、完全な基礎ユニットを分類するために使用され得る）を割り当てられ得る。例えば、各数字識別子は、ポリサッカリドの基本基礎ユニット、およびそのすべての置換基、電荷などによって規定されるような正確な化学構造を含む、ポリサッカリドの完全な基礎ユニットを表記し得る。基本基礎ユニットは、基本環構造（例えば、イズロン酸またはグルクロン酸）をいうが、これは、置換基、電荷などを含まない。このような基礎ユニット情報は、ポリマーの「特性」に関して上記されたのと同じまたは類似の様式で生成および処理され得る。
【０１０１】
コンピュータープログラムとして図１のシステム１００を実行し得るコンピューターシステムは代表的に、利用者に情報を表示する出力デバイスおよび利用者からの入力を受容する入力デバイスの両方に接続された本体を備え得る。本体は、一般的に、相互接続機構を介して記憶装置システムに接続されたプロセッサーを備える。入力デバイスおよび出力デバイスはまた、相互接続機構を介して、プロセッサーおよび記憶装置システムに接続され得る。
【０１０２】
１以上の出力デバイスが、コンピューターシステムに接続され得る。例示的な出力デバイスとしては、陰極線管（ＣＲＴ）ディスプレイ、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、プリンター、通信デバイス（例えば、モデム）、および音声出力が挙げられる。１以上の入力デバイスもまた、コンピューターシステムに接続され得る。例示的な入力デバイスとしては、キーボード、キーパッド、トラックボール、マウス、ペンおよびタブレット、通信デバイス、およびデータ入力デバイス（例えば、センサー）が挙げられる。本明細書中に開示される主題は、コンピューターシステムと組合せて使用される特定の入力または出力デバイスに限定されず、しかも本明細書中に記載されるものにも限定されない。
【０１０３】
コンピューターシステムは、コンピュータープログラミング言語（例えば、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、または他の言語（例えば、スクリプト言語またはアセンブリ言語））を使用してプログラム可能な、汎用性コンピューターシステムであり得る。コンピューターシステムはまた、特殊にプログラムされた特殊目的のハードウェア（例えば、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ（ＡＳＩＣ）のような）を備え得る。汎用性コンピューターシステムにおいて、プロセッサーは、代表的に市販のプロセッサーであり、この例が、シリーズ×８６、Ｃｅｌｅｒｏｎ、およびＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサー（Ｉｎｔｅｌから入手可能）、ならびにＡＭＤおよびＣｙｒｉｘからの類似のデバイス、６８０×０シリーズマイクロプロセッサー（Ｍｏｔｏｒｏｌａから入手可能）、ＰｏｗｅｒＰＣマイクロプロセッサー（ＩＢＭから）、Ａｌｐｈａシリーズプロセッサー（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。多くの他のプロセッサーが利用可能である。このようなマイクロプロセッサーは、オペレーティングシステム（この例が、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ、Ｌｉｎｕｘ、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＤＯＳ、ＶＭＳ、およびＯＳ８である）と呼ばれるプログラムを実行し、これは、他のコンピュータープログラムの実行を制御し、そしてスケジューリング、デバッグ、入力／出力制御、計算、コンパイル、記憶割り当て、データ管理および記憶管理、ならびに通信制御、ならびに関連のサービスを提供する。プロセッサーおよびオペレーティングシステムは、ハイレベルプログラミング言語でアプリケーションプログラムが書き込まれ得るコンピュータープラットフォームを規定する。
【０１０４】
記憶装置システムは、代表的に、コンピューター読み取り可能および書き込み可能な不揮発性記録媒体（この例が、磁気ディスク、フラッシュメモリーおよびテープである）を備える。ディスクは、取り外し可能（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク）であり得るか、または永続的（ハードドライブとして公知）であり得る。ディスクは、多くのトラックを有し、ここでシグナルは、代表的にバイナリー形態（すなわち、０および１の数列として解釈される形態）で保存される。このようなシグナルは、マイクロプロセッサーによって実行されるべきアプリケーションプログラム、またはこのアプリケーションプログラムによって処理されるディスクに保存された情報を規定し得る。代表的に、実行中、プロセッサーは、不揮発性記録媒体から集積回路記憶装置エレメント（これは代表的に、揮発性のランダムアクセス記憶装置（例えば、動的ランダムアクセス記憶装置（ＤＲＡＭ）または静的記憶装置（ＳＲＡＭ））である）に、データを読み取らせる。集積回路記憶装置エレメントは、代表的に、ディスクによって実行されるよりも、プロセスによる情報へのより迅速なアクセスを可能にする。プロセッサーは、一般的に、集積回路記憶装置においてデータを操作し、次いで、処理が完了した後に、データをディスクにコピーする。ディスクと集積回路記憶装置エレメントとの間でのデータの移動の管理について、種々の機構が公知であり、そして本明細書中に開示される主題は、このような機構に限定されない。さらに、本明細書中に開示された主題は、特定の記憶装置システムに限定されない。
【０１０５】
本明細書中に開示される主題は、特定のコンピュータープラットフォーム、特定のプロセッサー、または特定のハイレベルプログラミング言語に限定されない。さらに、コンピューターシステムは、マルチプロセッサーコンピューターシステムであり得るか、またはコンピューターネットワークにおいて接続されたマルチプルコンピューターを含み得る。図１の各モジュール（例えば、１１０、１２０）が、コンピュータープログラムの別個のモジュールであってもよく、または別個のコンピュータープログラムであってもよいことが理解されるべきである。このようなモジュールは、別個のコンピューターにおいて操作可能であり得る。データ（例えば、１０４、１０６、１１０、１１４、および１１６）は、記憶装置システムに保存され得るか、またはコンピューターシステム間で伝送され得る。本明細書中に開示される主題は、ソフトウェアもしくはハードウェアもしくはファームウェア、またはそれらの任意の組合せを使用する、いかなる特定のインプリメンテーションにも限定されない。個々にかまたは組合せてかのいずれかで、システムの種々のエレメントは、コンピュータープロセッサーによる実行について機械で読み取り可能な保存デバイスにおいて明確に具現化されるコンピュータープログラム製品としてインプリメンテーションされ得る。種々の処理工程が、入力を操作し、そして出力を生じることによって機能を実行するように、コンピューター読み取り可能な媒体において明確に具現化されるプログラムを実行するコンピュータープロセッサーによって、実行され得る。このようなシステムをインプリメンテーションするために適切なコンピュータープログラミング言語としては、手続型プログラミング言語、オブジェクト指向型プログラミング言語、およびこの２つの組合せが挙げられる。
【０１０６】
図４を参照して、ポリマーを配列決定するためのシステム４００が示される。システム４００は、ポリマーデータベース４０２を含み、このポリマーデータベース４０２は、複数のポリマーに対応する情報を保存する複数の記録を含む。各記録は、対応するポリマーの特性に関する情報、対応するポリマーの構成要素化学ユニットの特性、または両方に関する情報を保存し得る。ポリマーデータベース４０２に情報が保存されるポリマーは、任意の種類のポリマーであり得る。例えば、ポリマーは、ポリサッカリド、核酸、またはポリペプチドを含み得る。１つの実施形態では、ポリマーデータベース４０２中の各記録は、ポリマー識別子（ＩＤ）（これは、記録に対応するポリマーを識別する）を含む。記録はまた、記録に対応するポリマーの構成要素である化学ユニットに対応する化学ユニット識別子（ＩＤ）を含む。ポリマーは、他の様式において、ポリマーデータベース中に提示され得る。例えば、ポリマーデータベース４０２における記録は、ポリマーＩＤのみを含み得るか、または化学ユニットＩＤのみを含み得る。
【０１０７】
ポリマーデータベース４０２は、本明細書中に記載されるようなポリマーに関する情報を保存し得る任意の種類の保存媒体であり得る。例えば、ポリマーデータベース４０２は、フラットファイル、リレーショナルデータベース、データベース中のテーブル、コンピューター読み取り可能な揮発性または不揮発性の記憶装置におけるオブジェクトもしくは構造、またはコンピュータープログラムにアクセス可能な任意のデータ（例えば、コンピューター読み取り可能な保存媒体におけるアプリケーションプログラムファイルのリソースフォーク中に保存されたデータ）であり得る。
【０１０８】
１つの実施形態では、ポリマーＩＤは、ポリマーＩＤを含む記録に対応するポリマーの特性に関する情報を保存するための複数のフィールドを含む。同様に、１つの実施形態では、化学ユニットＩＤは、化学ユニットＩＤに対応する化学ユニットの特性に関する情報を保存するための複数のフィールドを含む。以下の説明は、化学ユニットＩＤのフィールドを言及するが、このような説明は、ポリマーＩＤのフィールドにも同様に適用可能である。
【０１０９】
化学ユニットＩＤのフィールドは、コンピューター読み取り可能な媒体に保存され得る任意の種類の値（例えば、二進値、十六進値、整数型十進値（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｄｅｃｉｍａｌ  ｖａｌｕｅ）、または浮動小数点値）を保存し得る。このフィールドは、対応する化学ユニットの任意の特性に関する情報を保存し得る。
【０１１０】
組成アナライザ４０８は、入力としてサンプルポリマー４０６を受信し、そして出力としてポリマー組成データ４１０を生成し、このデータは、このサンプルポリマーの組成を説明する。本明細書中で使用される場合に、組成アナライザとは、上に記載されるもののような実験的拘束により改変されるポリマーの特性を同定するために使用され得る、任意の種類の設備または実験手順である。これらとしては、例えば、キャピラリー電気泳動、質量分析、およびクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー組成データ４１０は、サンプルポリマー４０６中の化学ユニットの特性、およびサンプルポリマー４０６中の化学ユニットの数のような、サンプルポリマー４０６についての情報を含む。シーケンサー４１２は、質量ライン４１４およびポリマーデータベース４０２に含まれる情報を使用してサンプルポリマー４０６を配列決定するプロセスにおいて、サンプルポリマー４０６に適合し得る、ポリマーの副集団の候補リスト４１６を生成する。候補リストはまた、本明細書中において、ポリマーの「集団」とも呼ばれる。配列決定プロセスの終わりに、候補リスト４１６は、サンプルポリマー４０６に対応する０以上のポリマーを含む。ポリマーの副集団は、サンプルポリマーと共通の少なくとも２つの特性を有するポリマーのセットとして、規定される。ポリマーの副集団を、サンプルポリマー４０６と比較する情報セットを有するために同定することは、有用である。
【０１１１】
例えば、配列ＤＤ７ＤＡＤ−７を考える。これは、２０のスルフェート基を含むＨＬＧＡＧのテトラデカサッカリド（１４マー）である。組成アナライザ４０８は、例えば、ＤＤ７ＤＡＤ−７の組成分析を、この配列をそのジサッカリドの構成ブロックに分解し、そして各ユニットの相対的なアバンダンスをキャピラリー電気泳動を使用して分析し、ポリマー組成データ４１０を生成することにより、実施し得る。この場合のポリマー組成データ４１０は、±Ｄに対応する主要なピーク、この主要なピークの約１／２の大きさの、±７に対応するピーク、およびこの主要なピークの約１／４の大きさの、±Ａに対応する別のピークを示す。±の符号は、ヘパリナーゼによる分解が、ウロン酸環のＣ４原子とＣ５原子との間に二重結合を形成し、これによってイズロン酸対グルクロン酸の情報の損失をもたらすことに起因して、使用されることに注目のこと。ポリマー組成データ４１０から、４つの±Ｄ、２つの±７、および１つの±Ａがこの配列に存在することが、推論され得る。
【０１１２】
図５を参照すると、サンプルポリマー４０６を配列決定するためにシーケンサー４１２により実行され得るプロセス５００が示される。シーケンサー４１２は、ポリマー組成データ４１０を組成アナライザ４０８から受信する。シーケンサー４１２は、ポリマー組成データ４１０およびポリマーデータベース４０２に含まれる情報を使用して、全ての可能なポリマーの最初の候補リスト４１６を生成する：（１）サンプルポリマー４０６と同じ長さを有するポリマーおよび（２）サンプルポリマー４０６と同じ成分の化学ユニットを有するポリマー（ステップ５０４）。
【０１１３】
例えば、上記配列ＤＤ７ＤＡＤ−７を考える。ポリマー組成データ４１０は、この配列が４つの±Ｄ、２つの±７、および１つの±Ａを含むことを示し、そしてサンプルポリマー４０６の長さが７であることを示す。この場合には、工程５０４（候補リスト４１６の生成）は、サンプルポリマー４０６と同じ長さを有し、そして４つの±Ｄ、２つの±７、および１つの±Ａを有する全ての可能な配列を生成する工程を包含する。１つの実施形態において、シーケンサー４１２は、暴力的な（ｂｒｕｔｅ  ｆｏｒｃｅ）方法を使用して、これらの特徴を有する全ての配列を、標準的なコンビナトリアル方法を使用して、４つの±Ｄ、２つの±７、および１つの±Ａを有する長さ７の全ての配列を生成することにより、生成する。
【０１１４】
次いで、シーケンサー４１２は、質量ライン４１４からのデータを使用して、リスト中の配列の数が所定の閾値（例えば、１）に達するまで、工程５０４において生成されたリストから、次第に配列を排除する。このような排除を実施するために、１つの実施形態においては、シーケンサー４１２は、候補リスト４１６におけるポリマーの各々の所定の特性の値を計算する（ステップ５０６）。所定の特性とは、例えば、ポリマーの質量であり得る。ポリマーの質量を計算するための例示的な方法は、以下にさらに詳細に記載する。シーケンサー４１２は、候補リスト４１６中のポリマーの所定の特性の計算値を、サンプルポリマー４０６の所定の特性の値と比較する（ステップ５０８）。シーケンサー４１２は、所定の特性の値が、所定の範囲内のサンプルポリマー４０６の所定の特性の値と合致しない候補ポリマーを、候補リスト４１６から排除する（ステップ５０８）。例えば、所定の特性が分子量である場合には、所定の範囲は±１．５Ｄであり得る。
【０１１５】
シーケンサー４１２は、実験的拘束をサンプルポリマー４０６に適用して、サンプルポリマー４０６を改変する（ステップ５１０）。「実験的拘束」とは、本明細書中において使用される場合に、検出され得るポリマーの改変をもたらす、ポリマーにおいて実施される生物学的プロセスである。実験的拘束としては、例えば、外酵素、内酵素、制限エンドヌクレアーゼによる、酵素的消化；化学的消化；化学的修飾；結合している化合物との相互作用；化学剥離（すなわち、モノサッカリドユニットの除去）；および酵素的改変（例えば、ヘパリンスルフェートスルホトランスフェラーゼによる特定の位置での硫酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
シーケンサー４１２は、改変されたサンプルポリマー４０６の特性を測定する（ステップ５１２）。シーケンサー４１２は、候補リスト４１６から、実験結果４２２の特性値と合致しない特性値を有する候補ポリマーを、排除する（ステップ５１４）。
【０１１７】
候補リスト４１６の大きさが所定の閾値（例えば、１）より小さい場合には（ステップ５１６）、シーケンサー４１２が完了する（ステップ５１８）。この時点での候補リスト４１６の内容は、配列決定プロセスの結果を表す。候補リスト４１６は、ポリマーデータベース４０２の内容および所定の閾値の値に依存して、０以上のポリマーを含み得る。候補リスト４１６の大きさが所定の閾値以上である場合には（ステップ５１６）、候補リスト４１６の大きさが所定の閾値より低くなるまで、工程５１０〜５１６が繰り返される。シーケンサー４１２が完了する場合には（ステップ５１８）、シーケンサー４１２は、例えば、候補リスト４１６を、コンピュータモニタのような出力デバイス上で、ユーザに表示し得る。
【０１１８】
図６を参照すると、別の実施形態においては、シーケンサー４１２は、遺伝アルゴリズムプロセス６００を使用して、最初の候補リスト４１６を生成し、そしてサンプルポリマー４０６の配列を同定する最後の候補ポリマーに達するために、候補リスト４１６を改変する。シーケンサー４１２は、ポリマー組成データ４１０により示される組成を有し、そしてサンプルポリマー４０６と同じ長さを有する、ランダムな配列の集団を生成する（ステップ６０２）。シーケンサー４１２は、酵素ＥＮＺの酵素的分解に基づくスコア機能を使用して、候補リスト４１６中のポリマーの当てはめ（スコア）を評価する（ステップ６０４）。遺伝アルゴリズムプロセス６００は、この当てはめ値を使用して、候補リスト４１６中の配列のいずれが次の世代に生き残り得るか、および候補リスト４１６中の配列のいずれが交差および当てはめにより等しいかまたはより高い変異の他の配列を産生する最も高い機会を有するかを、推定する。次いで、シーケンサー４１２は、次の世代に当てはまる、候補リスト４１６中の配列をために選択する、交差および変異の操作を実行する（ステップ６０６）。少なくとも所定の数（例えば、３）の、候補リスト４１６の世代が、正しい配列のコピーを最大の当てはめで含む場合には（ステップ６０８）、シーケンサー４１２は配列決定を完了する。そうでなければ、シーケンサー４１２は、工程６０８の条件が満足されるまで、工程６０４〜６０６を繰り返す。交差および変異の操作が、遺伝アルゴリズムにより使用されて、検索スペースの異なる領域をランダムにサンプリングする。
【０１１９】
１つの実施形態において、工程５１０および５１２は、自動化される（例えば、コンピュータにより実行される）。例えば、最初の候補リスト４１６が生成された後に（ステップ５０８）、シーケンサー４１２は、候補リスト４１６をカテゴリー（カテゴリーは、好ましくは特性に基づく）（例えば、ｈｅｐＩ切断可能、ｈｅｐＩＩＩ切断可能、および亜硝酸切断可能（この特性は、酵素感受性である））に分割し得る。次いで、シーケンサー４１２は、このカテゴリーの各々に存在する配列の対応する分解または改変をシミュレートし得、そして独特の質量のフラグメントを与える配列を検索し得る。分解または改変の際に独特の質量のフラグメントを与え得る配列の集団に基づいて、シーケンサー４１２は、特定の酵素または化学物質を、候補ポリマーを候補リスト４１６から排除するための実験的拘束として、選択する（ステップｘ）。この実施例においては、ｈｅｐＩ、ｈｅｐＩＩＩ、および亜硝酸のみを使用するが、酵素のような他の実験的拘束（外酵素および他のＨＬＧＡＧ分解化学物質が挙げられる）を使用し得る。
【０１２０】
別の実施形態において、シーケンサー４１２は、化学的特性を使用して、実験的拘束の選択をガイドする。例えば、既知のポリマーの化学ユニット（Ｉ2S、Ｇ、ＨNS、およびＨNacを含む）の標準化された頻度が、計算され得る。例えば、Ｉ2Sを含む化学ユニットの標準化された頻度ｆ（Ｉ2S）は、ｆ（Ｉ2S）＝（Ｉ2Sを含むジサッカリドユニットの数）／（ジサッカリドユニットの数）として計算され得る。この様式で既知の配列について計算された、標準化された頻度の例示的なセットを、以下の表６に示す。
【０１２１】
【表６】
0004824170.tif 000011
「収斂のために使用される拘束」の列は、対応する既知の配列の収斂を達成することが実験的に示された拘束を示す。一旦、組成分析がサンプル（未知）ポリマーに対して実施されると、このサンプル配列におけるＩ2S、Ｇ、ＨNS、およびＨNAcの相対頻度が、上記表を使用して、既知の配列の相対頻度と比較され得る。サンプルポリマーに適用するための実験的拘束のセットを選択するために、サンプルポリマーの相対頻度を、上記表の既知の配列の相対頻度と比較し得る。次いで、サンプルポリマーの相対頻度と類似の相対頻度を有する既知の配列が選択され得、次いでこの選択された配列を用いて同定される実験的拘束（表に示すような）が、サンプルポリマーに適用され得る。
【０１２２】
例えば、表６は、ｆ（Ｇ）およびｆ（ＨNAc）の存在が、ｈｅｐＩＩＩおよび亜硝酸を使用する決定において重要な因子であることを実証する。なぜなら、亜硝酸は、ＨNSの後ろで切り取り（ｃｌｉｐ）、そしてｈｅｐＩＩＩはＧを含む二糖ユニットの後ろで切り取るからである。二糖ユニットＩ2S−ＨNS,6Ｓは、ＨＬＧＡＧ鎖のヘパリン様領域（すなわち、非常に硫酸化した領域）において主なユニットである。それゆえ、配列がさらにヘパリン様であるならば、ｈｅｐＩは、デフォルト酵素として選択され得、そしてＧおよびＨNAcを含む化学ユニットに存在する情報の中身は、ｈｅｐＩ以外の酵素および化学物質を選択するために重要となる。同様に、ＨＬＧＡＧ鎖上の低硫酸化領域については、ｈｅｐＩＩＩはデフォルト酵素であり得、そしてｆ（Ｉ2S）およびｆ（ＨNS）はｈｅｐＩおよび亜硝酸を選択するために重要になる。同様に、鎖に沿ったスルフェートまたはアセテートの位置分布もまた算出し得、そして収束のためにスルホトランスフェラーゼまたはスルファターぜ（ｓｕｌｆａｔｅａｓｅ）を用いる基準を作成し得る。
【０１２３】
ポリマーデータベース４０２は、ポリマーのある位置での硫酸化がポリマーの質量に対して８０．０６Ｄを与えること、およびアセテートについてのスルフェートによる置換がポリマーの質量に対してさらに３８．０２Ｄを与えることを示す情報を含み得る。それゆえ、ポリマーデータベース４０２における任意のポリマーの質量Ｍは、以下の式を用いて算出され得る：
Ｍ＝３７９．３３＋［０  ８０．０６  ８０．０６  ８０．０６  ３８．０２］*Ｃ、
ここでＣはポリマーの二進表示を含むベクトルであり、そして*はベクトル乗法演算子（ｖｅｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ）である。例えば、０１１０１の二進表示を有する二糖ユニットＩ2S−ＨNS,6Sの質量は、３７９．３３＋［０  ８０．０６  ８０．０６  ８０．０６  ３８．０２］*［０１１０１］＝３７９．３３＋０＋８０．０６*１＋８０．０６*１＋８０．０６*０＋３８．０２*１＝５７７．４７Ｄに等しい。
【０１２４】
ＨＬＧＡＧフラグメントは、酵素（例えば、ヘパリンリアーゼ酵素）または亜硝酸を用いて分解され得、そしてこれらはまた、硫酸基を先に述べた位置へと転移するかまたは硫酸基をその位置から除去する異なる酵素を用いて改変され得る。修飾酵素は、外溶解性（ｅｘｏｌｙｔｉｃ）でかつ非プロセシング性（ｎｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）であり、このことは、これらが非還元末端に対して１回だけ作用するに過ぎず、そしてその鎖の逐次修飾を伴わずにヘパリン鎖から離れることを意味する。二糖ユニットにおける修飾可能な位置の各々について、修飾酵素が存在する。硫酸基を付加する酵素はスルホトランスフェラーゼと呼ばれ、そして硫酸基を除去する酵素はスルファターゼと呼ばれる。修飾酵素としては、２−Ｏスルファターゼ／スルホトランスフェラーゼ、３−Ｏスルファターゼ／スルホトランスフェラーゼ、６−Ｏスルファターゼ／スルホトランスフェラーゼおよびＮ−デアセチラーゼ−Ｎ−スルホトランスフェラーゼが挙げられる。これらの酵素の機能は、それらの名称から明らかである。例えば、２−Ｏスルホトランスフェラーゼは、硫酸基をイズロン酸の２−Ｏ位置へと転移させ（２−Ｏ硫酸化グルクロン酸はＨＬＧＡＧ鎖中で稀な存在である）、そして２−Ｏスルファターゼは硫酸基をイズロン酸の２−Ｏ位置から除去する。
【０１２５】
ＨＬＧＡＧ分解酵素としては、へパリナーゼ−Ｉ、へパリナーゼ−ＩＩ、へパリナーゼ−ＩＩＩ、Ｄ−グルクロニダーゼおよびＬ−イズロニダーゼが挙げられる。へパリナーゼは、ウロン酸の前のグリコシド結合を切断する。へパリナーゼＩは、２−Ｏ硫酸化イズロン酸の前のグリコシド結合を切り取る。へパリナーゼ−ＩＩＩは、非硫酸化グルクロン酸の前のグリコシド結合を切断する。へパリナーゼ−ＩＩは、Ｈｅｐ−Ｉ切断可能部位およびＨｅｐ−ＩＩＩ切断可能部位の両方で切断する。へパリナーゼによる切断の後に、その前で切断が生じるウロン酸は、グルクロン酸に対するイズロン酸の情報を失う。なぜなら、ウロン酸のＣ４原子とＣ５原子との間に二重結合が作製されるからである。
【０１２６】
グルクロニダーゼおよびイズロニダーゼは、それらの名称が示唆するように、グリコシド結合をそれぞれ、グルクロン酸およびイズロン酸の後ろで切断する。亜硝酸は、Ｎ硫酸化ヘキソースアミンの後ろのグリコシド結合でランダムに切り取り、そして６員のヘキソースアミン環を５員の無水マンニトール環へと変換する。
【０１２７】
酵素についての上記の規則は、二進算術を用いて上記のようにコンピューター中に容易にコードされて、その結果、配列に対する酵素の活性が、単純な二進演算子を用いて実施されて、酵素活性から形成されるフラグメントを生じ得る。
【０１２８】
これらの技術を用いて、ポリサッカリド配列のデータベースを構築し得る。いくつかの局面では、本発明は、これらの分子の生物学的機能について極めて重要であるポリサッカリド−タンパク質相互作用の性質について有益な情報を得るための、ポリサッカリド配列のデータベース、ならびにモチーフ検索および配列アラインメントアルゴリズムである。ポリサッカリド配列のデータベースにおける配列情報をまた用いて、これらの分子の配列構造の関係について有益な洞察を提供し得る。
【０１２９】
配列決定ポリマーについての本発明の方法の使用に加えて、この方法は、ポリマーに関連した構造特性を同定することが望ましい、任意の目的のために用いられ得る。例えば、本発明の方法を、低分子量ヘパリンの分析に用い得る。ＬＭＷＨの制限された消化ならびにＣＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析によって、本発明者らは、ＬＭＷＨの種々の調製物の「消化スペクトル」を入手し得、従って、組成およびそのバリエーションについての情報を導き得る。このような情報は、ＬＭＷＨ調製物の品質の制御に関して有用である。
【０１３０】
この方法はまた、基本的な生物学的プロセスにおけるＨＬＧＡＧの役割を理解するために有用である。既にＭＳは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの発生における時間の関数として種々のタンパク質の存在について調べるために用いられている。類似の様式で、ＨＬＧＡＧ発現は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの発生において関数として位置および時間の両方が存在し得る。同様に、この方法は、ヒト疾患についての診断ツールとして用いられ得る。ムコ多糖症（ＭＰＳ）と呼ばれる一群のヒト疾患が存在する。これらの疾患についての分子的基礎は、大部分、ＨＬＧＡＧについての分解経路に存在する。例えば、Ｉ型ムコ多糖は、イズロニダーゼにおける欠損を含み、イズロニダーゼは、非硫酸化イズロン酸残基をＨＬＧＡＧ鎖から切り取る。同様に、ＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ  ＩＩ）を患うヒトは、イズロン酸−２−スルファターゼを欠く。これらの障害の各々では、細胞表面ＨＬＧＡＧの組成および順序において著しい変化が生じる。本発明者らの方法論は、これらの障害についての診断として用いられて、患者がどのＭＰＳ症候群を患っているかを同定し得る。
【０１３１】
さらに、本発明の方法は、タンパク質結合ＨＬＧＡＧ配列をマッピングするために有用である。ＤＮＡをフィンガープリントすることと同様に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ配列決定アプローチを用いて、選択されたタンパク質に結合するＨＬＧＡＧ配列を特異的にマッピングし得る。これは、ＨＬＧＡＧ鎖を標的タンパク質の存在下ならびにこの特定のタンパク質の非存在下で配列決定することによって達成される。このようにして、消化から保護された配列は、標的タンパク質に対して高い親和性で結合する配列を示す。
【０１３２】
本発明の方法を用いて、分枝ポリマーまたは非分枝ポリマーを分析し得る。分枝ポリマーの分析は、非分枝ポリマーの分析よりも困難である。なぜなら、分枝炭水化物は、「情報稠密」分子であるからである。分枝ポリサッカリドとしては、いくつかの異なる方法で合わされ得る、それゆえ、多くの配列をコードし得る、わずかな構築ブロックが挙げられる。例えば、三糖は理論的に、６００万を超える異なる配列を生じ得る。分枝ポリサッカリドを分析するための方法は特に、コンピュータ操作が実行可能である効率的な命名法の作成によって進歩する。従って、コンピュータ操作が実行可能である分枝糖についての効率的な命名法が本発明に従って開発された。これらのポリサッカリドの配列情報をコードし得る２つの型の数値スキームが、広範に用いられるグラフ（画）表示および以下に議論した提唱された数値スキームを架橋するために開発された。
【０１３３】
ａ．バイトに基づく（二進スキーム）表記スキーム：第１の表記スキームは、二進数値システムに基づく。ツリートラバースアルゴリズム（ｔｒｅｅ−ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）に関連した二進表示を用いて、分枝ポリサッカリドの全ての可能な組み合わせを表示する。この節（ｎｏｄｅ）（分岐点）は、ツリートラバースアルゴリズム（図７Ａ）を通してコンピュータ検索することが容易に実行可能である。図７Ａは、分岐糖についての表示スキームを示す。各モノサッカリドユニットは、３において節（Ｎ）として表示され得る。構築ブロックは、（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかであり得ると規定され得、ここで、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４は、個々のモノサッカリドである。これらの組み合わせの各々は、情報の構築ブロックを表すように数字的にコードされ得る。グリコシル化パターンをこのようにして規定して、この課題を解決するために適用され得る計算機科学においていくつかの、ツリートラバースおよび検索アルゴリズムが存在する。
【０１３４】
この表記スキームのより単純なバージョンを図７Ｂに示す。この単純化されたバージョンは、異常な構造を含む、他の全ての可能な改変を含むように拡大され得る。例えば、脊椎動物におけるＮ結合型グリコシル化は、コア領域（トリ−マンノシルキトビオース部分）およびコアからの４までの分枝鎖を含む。分枝鎖に加えて、表記法スキームはまた、他の修飾（例えば、コアに対するフコースの付加、または分枝鎖におけるＧｌｃＮａｃもしくは分枝鎖におけるシアル酸のフコシル化）を含む。従って、Ｎ結合型ポリサッカリドのスーパーファミリーは、３つのモジュラーユニットによって広範に表され得る：ａ）コア領域：通常の、フコシル化および／またはＧｌｃＮａｃでの二分、ｂ）分枝数：各々がＧｌｃＮａｃ、ＧａｌおよびＮｅｕを有する４までの分枝鎖、ならびにｃ）分枝糖の改変。これらのモジュラーユニットは、系統的に合わされて、ポリサッカリドの可能な全ての組み合わせを作製し得る。分枝および分枝内の配列の表示は、ｎ−ビットの二進法コード（０および１）で行われ得、ここで、ｎは、分枝におけるモノサッカリドの数である。図７Ｃは、分枝に関する情報全体を含む二進法コードを示す。４までの分枝が可能であるので、各鎖は、３ビットの二進法コードによって表され得、合計１２の二進法ビットを与える。第１のビットは、マンノースに隣接したＧｌｃＮａｃ残基の存在（二進法で１）または非存在（二進法で０）を示す。第２および第３のビットは同様に、分枝におけるＧａｌ残基およびＮｅｕ残基の存在または非存在を示す。それゆえ、ＧｌｃＮａｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕを含む完全な鎖は、二進法で（１１１）として表される。１１１は、十進法での７に等しい。次いで、分枝のうちの４つが、４ビットの十進法コードによって、十進法のコードのうちの第１のビット第１鎖についてであり、そして第２のビットは第２鎖についてであるなどとあらわされ得る（右）。
【０１３５】
この単純な二進法コードは、コアに対する結合（α対βおよび１−６または１−３など）に関する情報を含まない。しかし、この型の表記スキームは、分枝の修飾についてさらなるビットを含むように容易に拡大され得る。例えば、分枝におけるＧｌｃＮａｃに対する２〜６の分枝したノイラミン酸の存在は、二進法のビットによってコードされ得る。
【０１３６】
（ｂ．素数進法方式（Ｐｒｉｍｅ  Ｄｅｃｉｍａｌ  Ｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｓｃｈｅｍｅ）：）  上記の２進法に類似する、素数方式の使用を含む、第２のコンピューター化に適した数値化システムを開発した。素数代数学は、符号化、暗号化および計算機データ操作の領域において広範に使用されている。この方式は、小さい数について、唯一定義され得る、素数の約数集合が存在するという定理に基づく。この様式において、組成物情報が、迅速かつ正確に分析され得る。
【０１３７】
この方式を、以下の例によって例示する。素数２、３、５、７、１１、１３、１７、１９および２３を、ポリサッカリドの９つの共通の基本ユニット（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）に設定する。次いで、ポリサッカリド鎖の組成物を、各基本ユニットを表す素数の、積として表し得る。例えば、ＧｌｃＮａｃを、数３に、そしてマンノースを、数２と設定する。この方式で、コアを、２×２×２×３×３＝７２（３つのマンノースおよび２つのＧｌｃＮａｃ）として表す。従って、この記数法は、７２が、３つの２と２つの３の組み合わせとしてのみ表され得るという、数学的原理に基づく。従って、これらの素数の約数は固有であり、そしてこの組成物情報をコードし得る。これは、非常に大きい数になる場合に問題となるが、本発明者らがこの分析において扱う数の大きさについては、問題とはならない。この数から、ポリサッカリド鎖の質量が決定され得る。
【０１３８】
この記数方式のコンピューター化アプローチの能力を使用して、ポリサッカリド配列の全ての可能な組み合わせの完全なリストを系統的に開発し得る。例えば、大きさｍnの可能な配列の制限されない組み合わせのリストが使用され得、ここで、ｍは、基本ユニットの数であり、ｎは、鎖における位置の数である。図７Ｃにおいて、理論的に可能な、２５６個の異なるサッカリドの組み合わせを示す（各分枝についての４つの組み合わせかつ４つの分枝＝４4）。
【０１３９】
この２５６個の異なるポリサッカリド構造の質量線をプロットし得る。次いで、生合成経路の法則を使用して、ポリサッカリドをさらに分析し得る。この例において（図７Ｂに示される）、この生合成経路の第１工程が、１−３連結された鎖でのＧｌｃＮａｃの付加（分枝１）であることが認識される。従って、分枝１は、任意の他の分枝が存在するために、存在しているはずである。この法則に基づいて、この２５６個の可能な組み合わせは、分枝１が０でない場合およびその場合でのみ、分枝２、３および４が存在することを結論付けるための階乗アプローチを使用して減少され得る。類似の制限が、集団の基本リストの生成前に記数レベルで組み込まれ得る。この記数方式を設定して、実験データを生成し得（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＣＥ、あるいはクロマトグラフィー）、そしてこのデータを満足しない配列が排除され得る。従って、繰返し手順が、解への迅速な収束を可能にする。
【０１４０】
分枝パターンを同定するために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＣＥ（または、他の技術）の組み合わせを、実施例に示されるように使用し得る。分枝ポリサッカリドの垂下アームの除去は、細胞外酵素および細胞内酵素をうまく使用することによって達成され得る。全てのアンテナ型の基が除去され、マンノースコアから伸びるＧｌｃＮＡｃ部分のみを保持し、そして「拡張」コアを形成する。この方法において、分枝についての情報は保持されるが、グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の分離および同定はより単純になる。ほとんどのポリサッカリド構造について、拡張コアを形成するために使用され得る１つの方法論は、以下である。シアリダーゼおよびフコシダーゼの添加により、アームからキャップ基および分枝基を除去する。次いで、エンド−β−ガラクトシダーゼの適用によって、アームを切断し、この拡張コアを生じる。より通常ではない構造について、他のエキソグリコシダーゼ（例えば、キシラーゼおよびグルコシダーゼ）が利用可能である。分解酵素の反応混液の添加によって、任意のポリサッカリドモチーフが、その対応する「拡張」コアに還元され得る。「拡張」コア構造の同定は、質量スペクトル分析によって成される。垂下アームの数に依存して、拡張コアモチーフに関連する、固有の質量サインが存在する（図７Ｄ）。図７Ｄは、この酵素反応混液によるグリカン構造の完全な消化に際して発生される、「拡張」コアモチーフの質量線を示す。コアＧｌｃＮＡｃ部分にα１→α６連結されたフコースを有するおよび有さない両方の、一アンテナ型構造、二アンテナ型構造、三アンテナ型構造および四アンテナ型構造の予測される質量が示される（左から右）。全ての「拡張」コア構造は、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって容易に解明される、固有の質量サインを有する（左から右）。存在する種々のグリカンコアの定量化は、キャピラリー電気泳動によって達成され得、キャピラリー電気泳動は、ポリサッカリド構造を定量化するための高速かつ高感度の手段であることが証明されている［Ｋａｋｅｈｉ，Ｋ．およびＳ．Ｈｏｎｄａ，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，１９９６．７２０（１−２）：３７７−９３頁］。
【０１４１】
（実施例）
（実施例１：ジサッカリド、テトラサッカリドおよびヘキササッカリドについてのフラグメント数  対  フラグメント質量の同定）
全ての可能なジサッカリド、テトラサッカリドおよびヘキササッカリドのフラグメントの質量を計算し、そして図８に示される質量線に示した。Ｘ軸は、ジサッカリド、テトラサッカリドおよびヘキササッカリドの異なる可能な質量を示し、そしてＹ軸は、特定の質量を有するフラグメントの数を示す。テトラサッカリドとヘキササッカリドとの間にかなりの重複が存在するが、それらの質量の最小差は、１３．０３Ｄである。全てのバーを明確に示すために、Ｙ軸が中断され１７と４０との間の値が除かれていることに留意する。
【０１４２】
（実施例２：ＨＬＧＡＧのオクタサッカリドの配列決定）
ｈｅｐＩ、ｈｅｐＩＩ、ｈｅｐＩＩＩ、亜硝酸および細胞外酵素（例えば、２−スルファターゼ）、ならびに実験制限としてα−イズロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ｎ−デアセチラーゼ、および上記のコンピューターアルゴリズムを使用して、ＨＬＧＡＧのオクタサッカリド（Ｏ２）配列、２つのデカサッカリド（ＦＧＦ結合およびＡＴＩＩＩ結合）配列およびヘキササッカリド配列を、配列決定した。
【０１４３】
（１．Ｏ２の組成分析）
Ｏ２の組成分析を、ヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩでの３０μＭサンプルの完全な消化、およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による分析によって行った。手短に言うと、１０μＬのポリサッカリドに対して、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）中の２００ｎＭのヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩを添加した。この反応を、３０℃で一晩進行させた。ＣＥ分析のために、このサンプルを、２５μＬに増加させた。ナフタレントリスルホン酸（２μＭ）を内部標準として泳動した。ΔＵ2S−ＨNS,6SおよびΔＵ−ＨNS,6Sの割当てを、それらと同時に泳動した既知の標準に基づいて行った。内部標準は、４分と６分との間で移動し、三硫酸化ジサッカリドΔＵ2S−ＨNS,6Sは、６分と８分との間で移動し、そして二硫酸化ジサッカリドΔＵ−ＨNS,6Sは、８分と１０分との間で移動した。ピークの積分は、２つのサッカリドの相対量が、３：１であることを示した。
【０１４４】
Ｏ２オクタサッカリドについてのＣＥデータは、通常生じる三硫酸化ジサッカリド（ΔＵ2S−ＨNS,6S）に対応する大きいピーク、および二硫酸化ジサッカリド（ΔＵ−ＨNS,6S）に対応する小さいピークが存在することを実証した。ＣＥデータから得られたこれらのジサッカリド単位の相対量は、３つのＤ（±）および１つの５（±）が存在することを示す。これらのジサッカリド単位を有する配列の可能な組み合わせの数は、３２である。これらの可能な組み合わせを、以下の表７に示す。
【０１４５】
【化１】
0004824170.tif 000012
（２．ヘパリナーゼＩでのＯ２の消化）
Ｏ２の消化は、短い手順および完全な消化の両方を使用して完了した。「短い」消化は、１００ｎＭのヘパリナーゼＩおよび１０分の消化時間を使用することと定義した。「完全な（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ）」消化は、２００ｎＭの酵素での一晩消化として定義した。全ての消化を室温で行った。Ｏ２の場合、両方の消化条件が、同じ結果を生じる。ヘパリナーゼＩでの短い消化は、ｍ／ｚ５３００．１（１０７４．６）の五硫化テトラサッカリド（アセチル基なし）および三硫化ジサッカリドに対応するｍ／ｚ４８０２．６（５７７．１）のジサッカリドを生じた。このプロフィールは、Ｏ２の完全な消化について変化しなかった。
【０１４６】
へパリナーゼＩを用いた処理において、Ｏ２をはさみ、ｍ／ｚ４８０２．６および５，３００．１を有するフラグメントを形成する。これらのフラグメントの質量から、４８０２．６のｍ／ｚが、三硫酸化されたジサッカリドに対応し、そして５３００．１のｍ／ｚは、五硫酸化された四糖類に対応することを独自に決定することが可能であった。この配列のジサッカリド組成物は既知であるので、形成され得る三硫酸化されたジサッカリドのみ±Ｄであり、そして形成され得る可能な五硫酸化された四糖類は、±５Ｄ、±５−Ｄ、±Ｄ５および±Ｄ−５である。フラグメントの同定後、次の工程は、それらを配列して、正しい配列を与える。これは、手動で扱われるべき扱いにくい仕事なので、コンピューターシュミレーションを使用して、実験データと合わなかったマスターリストから、配列を漸次排除した。へパリナーゼＩがＩ2Sの前（ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  Ｉ2S）を切断する規則を使用して、へパリナーゼ消化をコンピューターでシュミレートして、マスターリストにおける全ての３２の配列に対するフラグメントを生成した。各配列に対して形成されるフラグメントのリストから、コンピューターを使用して、質量分析法データから観察されるジサッカリドおよび三糖類に対応するフラグメントを探索した。ｈｅｐ  Ｉの質量分析法に合うフラグメントを与えた配列を、図８Ａにおいて示す。全ての配列が、これらのフラグメントを生成するために使用されるｈｅｐＩ消化についての公知の規則と一致する３Ｄを有することが、図８Ａから観察され得る。２つの配列が、すなわち、還元末端の＋／−５（Ｉ−ＨNAc,6SまたはＧ−ＨNS,6S）を有し、そして非還元末端から第二の位置に＋／−５を有する同じ生成物プロフィールを与えることもまた観察し得る。第二の実験的拘束を解決するために、ｈｅｐＩＩＩを用いた消化を使用した。
【０１４７】
表７は、ｈｅｐＩの生成物プロフィールおよび八糖類Ｏ２のｈｅｐＩＩＩ消化を満足する配列のリストを提供する。（ａ）は、質量分析計データから観察されるようなジサッカリドフラグメントおよび四糖類フラグメントを与える配列を示す。フラグメントの質量とともに以下に列挙されるフラグメントは、ｈｅｐＩ消化のコンピューターシュミレーションにより生成されたものである。（ｂ）は、ｈｅｐＩＩＩ消化後の質量分析データにおいて観察される六糖類フラグメントを与える（ａ）において配列決定する。それらの質量を伴ったフラグメントを、ｈｅｐＩＩＩ消化のコンピューターシュミレーションにより生成した。
【０１４８】
（３．へパリナーゼＩＩＩを用いたＯ２の消化）
へパリナーゼＩＩＩを用いたＯ２の消化は、ｍ／ｚ５９５８．７（１７３１．９）の硫酸化されていない六糖類および観察されなかった二硫酸化されたジサッカリド（硫酸を保存するため）を産生した。短い消化および完全な消化の両方が、同じプロフィールを産生した。
【０１４９】
Ｏ２のヘパリナーゼＩＩＩ処理が、９個の硫酸基を有する六糖類として独自に同定されたｍ／ｚ５９５８．７の主要なフラグメントを生じた。ｈｅｐＩＩＩ消化の生成物プロフィールを満足する配列のみが、表７において示される±ＤＤＤ−５であった。表７は、還元末端においてａ−５（Ｇ−HNAc,6S）が存在し得ることを示す。これは、ｈｅｐＩＩＩ消化のために使用されるルールと一致した（すなわち、１つのＧの前のｈｅｐＩＩＩクリップ）。表に示された質量は、整数である。必要とされるフラグメントを探索するために使用される質量は、小数点以下に対して正確であった。
【０１５０】
従って、実験データに合わない配列を削除することにより、全ての可能な配列のリストから始まる最後の配列に集中する能力を示すことが可能であった。開始点が、配列の組成を与えられた全ての可能な配列のリストであったことから、任意の配列が分析の間に失われることは可能ではなかった。
【０１５１】
（実施例３：塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）結合糖類）
塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）結合糖類のＭＡＬＤＩ−ＭＳが実施され、ＦＧＦ−２との複合体として糖類の質量および大きさを決定した（Ｇ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、ＰＮＡＳ．９６，１８９２，（１９９９））。ＦＧＦ−２の二量体が、３７，００９のｍ／ｚを有する種類を産生する糖類（Ｓ）に結合した。ＦＧＦ−２の分子量のサブトラクションにより、糖類の分子量が、１４個の硫酸を有する十糖類および還元末端のアンヒドロマンニトールに対応して、２８０８であることを決定した。
【０１５２】
（１．組成分析）
組成分析およびＦＧＦ−２結合モノサッカリドのＣＥを、上記のように完成した。このサンプルの組成分析は、比率３：１で、±Ｄ（ΔＵ2SＨNS,6S）および±Ｄ’（ΔＵ2SＭａｎ6S）に対応する２つのピークを生じた。この二モノサッカリドは、ヘパリンの亜硝酸分解に由来するので、非還元末端におけるウロン酸と、ＣＥ（２３２ｎｍ）より観察しなかった。従って、非還元末端残基を、細胞外酵素を用いた配列決定により、＋Ｄ（Ｉ2SＨNS,6S）として同定した。この組成物についての可能な配列の数は、表８（ｉ）の１６である。１６の配列のうち、十糖類のヘパリンＩ消化において観察されるフラグメントを生じ得る配列は、表８（ｉｉ）において示される。
【０１５３】
【化２】
0004824170.tif 000013
（２．へパリナーゼＩおよびへパリナーゼＩＩＩを用いた消化）
内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ウロン酸＋Ｄ対−Ｄの異性体状態を分解するため、へパリナーゼＩおよびへパリナーゼＩＩＩを用いた糖類の完全な消化を実施した。糖類のへパリナーゼＩの完全な消化は、三硫酸化されたジサッカリド（±Ｄ）およびそのアンヒドロマンニトール誘導体に対応する二種類のみを生じるが、へパリナーゼＩＩＩは、全くジサッカリドを切断しなかった。
【０１５４】
ジサッカリドのへパリナーゼＩ消化は、還元末端にアンヒドロマンニトールを有する五硫酸化された四糖類（ｍ／ｚ５２８６．３）およびｍ／ｚ４８０４．６の三硫酸化されたジサッカリドを生じた。表８は、ＦＧＦ結合十糖類配列の集合を示す。従って、ｈｅｐＩを用いた処理において、ＦＧＦ−２結合糖類の質量分析生成物プロフィールを満足する配列のリストを提供する。表８のセクション（ｉ）は、組成分析に由来する１６配列のマスターリストおよび非還元末端の細胞外酵素配列決定を示す。非還元末端のジサッカリドユニットが、細胞外酵素を用いて、＋Ｄであることが指定され、そして還元末端のアンヒドロマンニトール基が、‘として示される。へパリナーゼＩを用いた十糖類の消化から生じるフラグメントの質量は、（ｉｉ）において示される。また、へパリナーゼＩ消化データを満足する（ｉ）からの配列も示される。表８のセクション（ｉｉｉ）は、へパリナーゼＩを用いた完全な消化からのデータを満足する（ｉｉ）からの十糖類の配列を示す。表１４のセクションｉｉｉにおいて示される最終的な配列ＤＤＤＤＤ’に集中するよう本発明者らを導く十糖類において、全ての位置でｈｅｐＩ切断可能部位が存在する場合のみ、この生成物プロフィールを得られ得る。上記をひとまとめにして考えると、ＦＧＦ−２結合十糖類配列の配列が、ＤＤＤＤＤ’［（Ｉ2SＨNS,6S）4Ｉ2SＭａｎ6S］であることを確認する。
【０１５５】
（実施例４：ＡＴ−ＩＩＩ結合ジサッカリドの配列決定）
ＡＴ−ＩＩＩ結合ジサッカリドを、複合体配列の決定の例として使用した。
【０１５６】
（１．組成分析）
組成分析およびＣＥを、上記のように完成した。ＡＴ−ＩＩＩ結合糖類の組成分析が、それぞれ３：１：１の相対比で、ΔＵ2SＨNS,6S（±Ｄ）、ΔＵＨNAc,6S（±４）およびΔＵＨNS,3S,6S（±７）に対応した３つの構築物（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）の存在を示した。この組成物を用いて形成され得る最も短いポリサッカリドが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳデータと一致して、十糖類に対応する。上記のジサッカリド構築物と、この十三硫酸化され、１つアセチル化された十糖類配列の可能な組み合わせの総数は、表９の３２０である。
【０１５７】
【化３】
0004824170.tif 000014
（２．ヘパリナーゼＩを用いる消化）
ヘパリナーゼＩを用いるこのデカサッカリドの消化は、４つのフラグメントを生じた。主要なフラグメントには、１０硫酸化１アセチル化オクタサッカリド（ｍ／ｚ  ６４１９．７）、７硫酸化１アセチル化ヘキササッカリド（ｍ／ｚ  ５８４２．１）、６硫酸化テトラサッカリド（ｍ／ｚ  ５３８３．１）、および３硫酸化ジサッカリド（ｍ／ｚ  ４８０５．３）が含まれる。夾雑物（*）である５硫酸化テトラサッカリドもまた、存在する。ＡＴ−ＩＩＩ結合デカサッカリドは、ＮＭＲスペクトル分析に基づいてＤ４−７ＤＤであると報告されている（Ｙ．Ｔｏｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１．３２０４０（１９９６））。このような配列は、還元末端においてタグ化されたＤまたはＤＤ残基の出現を示すはずである。しかし、本発明者らは、デカサッカリド配列の解明において使用したすべての異なる実験が、互いに、４〜７タグ化生成物の出現において一致し、そしてそれはＤ（またはＤＤ）生成物ではないことを見出した。驚くべきことに、このサッカリドは、提案されるような、インタクトなＡＴ−ＩＩＩ結合部位を含んでいなかった。従って、提案される配列の確認は、完全グリカン配列決定（ＩＧＳ）方法論の使用を通して探求された。ＩＧＳの結果は、本発明者らの分析と一致した。マイナーな夾雑物のサッカリドもまた見出された。３２０の可能性のある配列のうち、５２の配列のみがヘパリナーゼＩ消化データである表１５（ｉ）を満たした。ヘパリナーゼＩを用いるデカサッカリドの消耗的な消化の質量スペクトルは、３硫酸化ジサッカリドおよび８硫酸化ヘキササッカリドに対応するｍ／ｚ値を示し、それによって５２配列のリストを２８配列（表９（ｉｉ））にまでさらに減らした。
【０１５８】
（３．ヘパリナーゼＩＩを用いる消化）
配列にさらに収束するために、サッカリドの還元末端で「分子量タグ（ｍａｓｓ−ｔａｇ）」を使用した（「ｔ」として示される５６．１のΔｍ／ｚ）。これは、還元末端の近くおよび還元末端におけるサッカリドの同定を可能にする。分子量タグ標識の代表的な収率は、ＣＥによって決定されるように、８０〜９０％の間で変動する。セミカルバジドタグ化されたデカサッカリドのヘパリナーゼＩＩを用いる処理は、以下の生成物を生じた：ｍ／ｚ  ５９５８．４（９硫酸化ヘキササッカリド）、ｍ／ｚ  ５８９７．７（タグ化された、７硫酸化、１アセチル化ヘキササッカリド）、ｍ／ｚ  ５３８０．１（６硫酸化テトラサッカリド）、ｍ／ｚ  ５３２０．９（タグ化された４硫酸化テトラサッカリド）、ｍ／ｚ  ５２６４．６（４硫酸化テトラサッカリド）、およびｍ／ｚ  ４８０５．０（３硫酸化ジサッカリド）。５３２０．９および５８９７．７のｍ／ｚ値は、タグ化された４硫酸化テトラサッカリドおよびタグ化された７硫酸化ヘキササッカリドに一致し、これらの両方は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含む。この結果は、＋／−４（Ｉ／ＧＨNAc,6S）が還元末端に存在するか、または還元末端からの１単位に存在し、それによって可能性のある配列の数を２８から６に制限すること（表９（ｉｉｉ））を示す。
【０１５９】
（４．亜硝酸を用いる消化）
タグ化されたデカサッカリドならびにタグ化されていないデカサッカリドの部分的な亜硝酸消化は、さらなる制限を提供しなかったが、ヘパリナーゼＩＩデータを確証した。しかし、消耗的な亜硝酸消化は、切断されていない生成物として還元末端テトラサッカリド（タグを有するものおよびタグを有さないもの）のみを与えた。デカサッカリドの消耗的な亜硝酸処理は、本質的に、４硫酸化１アセチル化アンヒドロマンニトールテトラサッカリド種を与える（タグ化されたものｍ／ｚ  ５２４１．５およびタグ化されていないものｍ／ｚ  ５１８６．５）。これは、＋／−４（Ｉ／ＧＨNAc,6S）が還元末端からの１単位離れて存在することを確証した。外酵素の連続使用は、ウロン酸の異性体状態を＋４と決定し、そして還元末端ジサッカリドが、鍵となるＡＴ−ＩＩＩ結合モチーフである４〜７に一致して−７であることを決定した。このテトラサッカリドのイズロニダーゼ（そして、グルクロニダーゼではない）を用いる処理は、イズロネート残基の除去に一致するｍ／ｚ  ５００７．８の種を生じた。外酵素を用いるさらなる処理は、以下の順番（グルコサミン６−Ｏスルファターゼ、ヘキソサミダーゼ、およびグルクロニダーゼ）でのみ、トリサッカリドの完全消化を生じた。表９は、３２０の可能性のある配列から５２、２８、６、最終配列までのＡ−ＩＩＩ結合デカサッカリド配列の収束を示す。従って、ＡＴ−ＩＩＩ結合デカサッカリドの配列は、±ＤＤＤ４−７（ΔＵ2SＨNS,6SＩ2SＨNS,6SＩ2SＨNS,6SＩＨNAc,6SＧＨNS,3S,6S）と推定された。
【０１６０】
（実施例５：ＨＬＧＡＧのヘキササッカリド１の配列決定）
１０ｐＭ  Ｈ１を、限定的な分解が生じるように、２０ｍＭ  ＨＣｌ中で、室温で２０分間、２ｍＭ  亜硝酸で処理した。２０分後、飽和したマトリクス溶液中の２倍モル過剰の（ａｒｇ−ａｒｇ）19ａｒｇを添加した。１ｐｍｏｌのサッカリドをスポットし、質量スペクトル研究のために使用した。すべてのサッカリドを、（ａｒｇ−ａｒｇ）19ａｒｇとの非共有結合性複合体として検出した。開始のヘキササッカリドを、テトラサッカリドおよびジサッカリドと同様に観察した。複合体化していないペプチドもまた、観察した。この後、２つのｍ／ｚ値を報告する。第１のものは、サッカリド＋ペプチドに対応する、観察されたｍ／ｚ値である。第２の括弧内の数字は、ペプチドの分子量を減算することによって得られたサッカリド単独のｍ／ｚである。
【０１６１】
２０分後、Ｈ１の亜硝酸処理は、ｍ／ｚ  ５８８２．５（１６５５．８）の開始物質を生じ、これは、８硫酸化を有するヘキササッカリドに対応し、そして還元末端のアンヒドロマンニトール、ｍ／ｚ  ５３０４．１（１０７７．３）は、還元末端にアンヒドロマンニトールを有するテトラサッカリドに対応し、そしてｍ／ｚ  ４７２６．２（４９９．４）は、還元末端にアンヒドロマンニトールを有する２硫酸化ジサッカリドに対応する。
【０１６２】
次いで、このサンプルを外酵素分析に供した。３つの外酵素−イズロネート  ２−Ｏスルファターゼ、イズロニダーゼ、およびグルコサミン６−Ｏスルファターゼを添加した。亜硝酸サンプルを、１／５容量の２００ｍＭ  酢酸ナトリウム  １ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ｐＨ  ６．０の添加を介して中和し、その後、酵素を添加した。グルコサミン６−Ｏスルファターゼを、最初の２つの酵素を用いる消化が完了した後に添加した。最終酵素濃度は、２０〜４０ミリユニット／ｍＬの範囲であり、消化は、３７℃で最低２時間行った。
【０１６３】
イズロネート２−Ｏスルファターゼおよびイズロニダーゼとのインキュベーションに際して、ヘキササッカリドおよびテトラサッカリドのピークは、質量において減少した。ジサッカリドは、酵素とのインキュベーション後にはもはや検出可能ではなかった。ヘキササッカリドは、硫酸およびイズロネートの損失に対応する、ｍ／ｚ  ５６２７．３（１３９８．８）の新規な種を与えた。テトラサッカリドはｍ／ｚ  ５０４９．３（８２０．８）の種を生じ、これは再び、２−Ｏ位での硫酸の損失およびイズロネートの損失に対応する。これらのデータは、すべてのジサッカリドのビルディングブロックが、Ｉ２Ｓを含むことを示した。
【０１６４】
グルコサミン６−Ｏスルファターゼの添加および３７℃での一晩のインキュベーションは、２つの新規な種の産生を生じた。１つは、グルコサミンの６位の硫酸の損失から生じるｍ／ｚ  ５５４６．８（１３１８．３）の種であり、そして他方は、ｍ／ｚ  ５２２４．７（９９６．２）の種であり、再度テトラサッカリド６−Ｏ硫酸に対応する。これらのデータは、還元末端以外ではアンヒドロマンニトールはジサッカリドユニットを含み、他のユニットはＨＮＳを含むことを示す。このデータは、配列がＤＤＤ’であることを示した。このことは、他の配列がヘパリナーゼによる分解によって誘導されたこととは違って、この配列が、もともと亜硝酸分解から誘導されたことを示す。
【０１６５】
（実施例６：他の複合体ポリサッカリドの配列決定）
配列決定アプローチは、適切な実験的な制限を開発することによって他の複雑なポリサッカリドに容易に拡張され得る。例えば、ジサッカリド反復単位からなるデルマタン／コンドロイチンムコポリサッカリド（ＤＣＭＰ）は、ヘキサデシマルコードシステムおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳに従う。ＨＬＧＡＧについて観察されたものと同様に、ＤＣＭＰ中の所定の質量に対する長さおよび組成に関連する独特なサインが存在する。例えば、任意のジサッカリドと任意のテトラサッカリドとの間の最小差は、１３９．２Ｄａであり、従って、長さ、硫酸および酢酸の数は、所定のＤＣＭポリサッカリドについて、オクタデカサッカリドまで容易に割り当てられ得る。同様に、ポリシアリン酸の場合、大部分５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮ）または５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮ）のホモポリマーとして存在し、ヘキサデシマルコードシステムは、ＮＡＮ／ＮＧＮに容易に拡張され、官能基のバリエーションをコードし得、そしてＰＳＡについての配列決定アプローチを可能にする。
【０１６６】
（１．複合体ムコポリサッカリドのデルマタン／コンドロイチンファミリー）
ＤＣＭＰは、骨および軟骨のような密集した結合組織において見出される。デルマタン／コンドロイチンムコポリサッカリド（ＤＣＭＰ）の基本反復単位は、（β１→４）Ｕ2X−（α／β  １→３）ＧａｌNAc,4X,6X-として提示され得、ここでＵはウロン酸であり、ＧａｌNAcは、Ｎ−アセチル化グルコサミンである。ウロン酸は、グルクロン酸（Ｇ）またはイズロン酸（Ｉ）でありかつ２−Ｏ位で硫酸化され得、そしてガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、４−Ｏ位または６−Ｏ位で硫酸化され得、それによって１６の可能な組み合わせおよびＤＣＭＰについてのビルディングブロックを生じる。ＨＬＧＡＧを分解するヘパリナーゼと同様に、別個のコントロイチナーゼおよびＤＣＭＰの特異的グリコシド性の連結を切断するための他の化学的方法が存在し、そして実験的な制限として機能する。さらに、ＤＣＭＰは、酸性ポリサッカリドであるので、ＨＬＧＡＧについてのＭＡＬＤＩ−ＭＳ技術および方法は、容易にＤＣＭＰに拡張され得る。
【０１６７】
ＤＣＭＰについてのＰＥＮスキームおよび質量同定関連性：表１０に示すものは、デルマタン／コンドロイチンファミリーの分子の１６の可能性のあるビルディングブロックの特性コード命名法（ＰＥＮ）である。この配列決定アプローチは、重要な質量同定関連性ならびにジサッカリドからドデカサッカリドまでのすべての可能なＤＣＭＰのマスターリストの確立を可能にする。これらは、表８に示されるように、質量の線としてプロットされる。ＨＬＧＡＧについて観察されたように、所定の質量についての長さおよび組成に関連する独特のサインが存在する。上記のように、任意のジサッカリドおよび任意のテトラサッカリドの間の最小の差は、ＨＬＧＡＧについて１０１ダルトンであることが見出された。興味深いことに、ＤＣＭＰの場合において、任意のジサッカリドおよび任意のテトラサッカリドの間の最小の差は１３９．２Ｄａである。従って、長さ、硫酸および酢酸の数は、所定のＤＣＭポリサッカリドについて、オクタデカサッカリドにまで、容易に割り当てられ得る。
【０１６８】
【表７】
0004824170.tif 000015
表１０は、ＤＣＭＰをコードするために使用された特性コード化数値スキームを示す。第１欄は、ウロン酸の異性体状態をコードする（０は、イズロン酸に対応し、そして１は、グルクロン酸に対応する）。第２欄は、ウロン酸の２−Ｏ位置での置換をコードする（０−硫酸化されていない、１−硫酸化されている）。欄３および４は、ガラクトサミンの４および６位置での置換をコードする。欄５は、ジサッカリド単位についての数値コードを示し、欄６は、ジサッカリド単位を示し、そして欄７は、ジサッカリド単位について計算した理論質量を示す。
【０１６９】
実験的制約としてのツール：ＨＬＧＡＧを分解するヘパリナーゼと類似して、ＤＣＭＰのコンドロニチン様領域およびデルマタン様領域を分解するコンドロイチナーゼが存在する。コンドロイチナーゼＢ、Ｃ、ＡＣ、およびＡＢＣは、いくつかの重複を有する個別の特異性を有する。ほとんどの部分において、コンドロイチナーゼは、ＤＣＭＰに見出される連結のほとんどの領域をカバーする。異なる供給源から単離され、そしてクローニングされたいくつかのコンドロイチナーゼが存在する。この酵素に加えて、ＤＣＭＰを調査するために使用され得る十分に確立されたいくつかの化学的方法が存在する。これらには、亜硝酸処理が含まれる。従って、ＤＣＭＰ配列決定を可能にするために、「実験的制限」として機能する適切なツール（酵素的および化学的）が存在する。以下に、本発明者らは、ＤＣＭＰを配列決定することを示すために、２つのＤＣＭＰ配列を使用する。
【０１７０】
（Ａ．セルピンＨＣＦ−２結合ＤＣＭＰヘキササッカリド）：
スペリンＨＣＦ−２に結合する最小サイズのＤＣＭＰを単離し、そしてその組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー、ペーパー電気泳動、およびペーパークロマトグラフィーを含む巧妙な方法を使用して決定した。ＰＥＮよおびＭＳの統合を介するこの配列決定戦略は、６個のスルフェートおよび３個のアセテートを有するヘキササッカリドであるこのセルピンＨＣＦ−２結合サッカリドの同一性を確立した。硫酸化の高い程度はデルマタン様サッカリドにねらいを付けた。このサッカリドは、部分的な脱Ｎ−アセチル化および亜硝酸化処理を使用して、誘導されたので、それは、還元末端に５員のアンヒドロタリトール環を含む。このサッカリドの比較分析が、コンドロイチナーゼを使用した分解によって得られ得る。比較は、ΔＵ2SＧａｌNAc,4S（±５）およびΔＵ2SａＴａｌ4S（ａＴａｌ−アンヒドロタリトール−±５）の、２：１の比での存在を示す。このことは、表１１ａに示される８個の可能な配列を有するマスターリストの作成を可能にした。へキササッカリドの２−スルファターゼおよびイズロニダーゼ処理は、スルフェートおよびイズロネートの損失に対応するマススペクトルのシフトを生じ、それによって、非還元末端にＩ2Sを固定した（表１１ｂ）。さらなる集結のために、コンドロイチナーゼＢ（これは、デルマタン様領域においてイズロネート残基に対して作用する）を使用し、そしてマススペクトルにおいて、２−硫酸化ジサッカリドに対応する単一ピークを観測した。このことは、本発明者らを、配列＋５５５’（Ｉ2S−ＧａｌNAc,4S−Ｉ2S−ＧａｌNAc,4S−Ｉ2S−ａＴａｌ4S）に集結させた。
【０１７１】
【表８】
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（Ｂ．仮説：）
本実施例において、先の実施例よりのより複雑な「仮説的ＤＣＭＰ多糖類」を使用する。ＭＳは、８個のスルフェートおよび４個のアセテートを有するオクタサッカリドであると解釈される結果を得、そして比較分析が、ΔＵ2SＧａｌNAc,4S（±５）、ΔＵＧａｌNAc,6S（±２）およびΔＵ2SＧａｌNAc,4S,6S（±７）に対応する３つの種が、２：１：１の相対量であると指摘することを仮定する。このことは、当業者が、マスターリストを作成することを可能に、９６の可能な配列を指摘する（表１２ａ）。コンドロイチナーゼＡＣでのサッカリドサンプルの消化は、２つの四硫酸化サッカリド単位に対応する質量の２つの産物を生じ、それによって、マスターリストを４つの可能な配列に減少させる（表１２ｂ）。ヒドラゾン分解および亜硝酸処理を使用する完全な脱アミン化は、３つのピークを生じ、このうちの２つは、二硫酸化ジサッカリドに対応し、そして３番目は、三硫酸化ジサッカリドに対応する。分解産物の、２−スルファターゼおよびイズロニダーゼ（およびグリクロニダーゼは用いない）を用いる処理は、スルフェートよおびイズロネート残基の損失に対応するピークを与えるべきである。このことは、５および７の異性体状態の同定を可能にし、従って、マスターリストを１つの配列±５５−２７（ΔＵ2S−ＧａｌNAc,4S−Ｉ2S−ＧａｌNAc,4S−Ｇ−ＧａｌNAc,6S−Ｉ2S−ＧａｌNAc,4S,6S）に集結させる。
【０１７２】
【表９】
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ＨＬＧＡＧに対して発展されたものに類似して、個別のまたはさらなる「集結戦略または実験的制限」を使用して、ＤＣＭＰについての「固有」の解答に達し得ることを反復することは重要である。
【０１７３】
（ポリシアル酸）
ポリシアル酸は、直鎖の複雑な多糖類であり、哺乳動物の中性細胞接着分子の高度に調節された翻訳後改変として見出されている。これらは、ほとんど、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮ）または５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮ）のホモポリマーとして存在する。ＮＡＮおよびＮＧＮのモノマー単位は、α２−８グリコシド連結によって連結され、そして４−Ｏ、７−Ｏおよび９−Ｏ位置で改変されている。主要な改変は、アセチル化である。さらに、硫酸化およびラクトン化を含むよりまれな改変が、９−Ｏ位置で起こる。ノイラミン酸の脱アミン化形態（すなわち、５−デアミノ−３，５−ジデオキシノイラミン酸（ＫＤＮ））がまた、発見されている。ＰＥＮ−ＭＳ配列決定アプローチは、ポリシアル酸に拡張され、そしてＮＡＮおよびＮＧＮユニットを使用して、本発明者らは、これがどうように達成されるかを例示する。
【０１７４】
ＰＳＡに対するＰＥＮスキームおよび質量−同一性の関係：ＰＳＡは、２つの異なるモノマー繰返しから構成され、各単位の改変においてバリエーションを有する。ＰＥＮの多様性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）は、ＨＬＧＡＧおよびＤＣＭＰについてのダイマー繰返しからのＰＳＡについてのモノマー繰返し単位に対する容易な適合を可能にする。ＰＳＡに対するＰＥＮスキームは、表１３に示される。この配列決定アプローチは、重要な質量−同一性関係ならびにＮＡＮおよびＮＧＮについてのモノマー単位の全ての組み合わせのマスターリストを確立する。ＮＡＮＡおよびＮＧＮのポリマーユニットについての質量ラインは、図９Ａおよび図９Ｂに示される。ＮＡＮおよびＮＧＮの両方の高次のオリゴマーに対して観測される質量におけるかなりの重複が存在することに注意する（図９Ａおよび図９Ｂ）。ｎマーとｎ＋１マーとの間の質量における最小の差異は、ＮＡＮに対して３．０１Ｄａ、そしてＮＧＮに対して１３Ｄａで安定化し（テトラサッカリド、ペンタサッカリド、およびヘキササッカリドになるにつれて）、それによって、ＭＳを使用するこれらのフラグメントの検出について安全な限度を提供する。
【０１７５】
（表１３）
【０１７６】
【表１０】
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ＰＳＡについての特性符号化数値スキーム（Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｓｃｈｅｍｅ）を表１３に示す。。第１列は、モノマーユニットがＮＡＮまたはＮＧＮであるか否かについてを符号化する。第２、３、および４列は、それぞれ、９位、７位および４位における変動を符号化する。ここで、１はアセチル化に対応し、０は非アセチル化に対応する。第５列はＰＳＡについての数値符号を示す。０〜−７を８−Ｆの代わりに使用した。アセチル化の変動性を符号化する数字およびサインの割り当ては、ＮＡＮ／ＮＧＮである場合を示す。第６列は、第５列の符号により表されたモノサッカリドを列挙する。第７列は、第６列に示されるモノマーユニットについて計算された理論的質量を列挙する。
【０１７７】
ＰＳＡにおける置換された／置換されていないＮＡＮ含有モノマーユニットの組合わせについての質量線を図９Ａに示す。Ｘ軸は、モノサッカリドからヘキササッカリドについての計算された質量を示す。所定の質量のために存在する特定の長さおよび組成のフラグメントの数をＹ軸に示す。１５０〜１９０の値を、他のピークの明瞭性を改善するために省略した。任意のモノサッカリドと任意のジサッカリドとの間の最小差は、１６５．２Ｄａであり、任意のジサッカリドと任意のトリサッカリドとの間の最小差は、３９．０３Ｄａであり、任意のトリサッカリドと任意のテトラサッカリドとの間の最小差は、３９．０３Ｄａであり、そして全ての高次サッカリドについては３．０１Ｄａである。
【０１７８】
ＰＳＡにおける置換された／置換されていないＮＧＮモノマーユニットの組合わせについての質量線を図９Ｂに示す。Ｘ軸は、モノサッカリドからヘキササッカリドについての計算された質量を示す。所定の質量のために存在する特定の長さおよび組成のフラグメントの数をＹ軸に示す。１５０〜１９０の値を、他のピークの明瞭性を改善するために省略した。任意のモノサッカリドと任意のジサッカリドとの間の最小差は、１８１．２Ｄａであり、任意のジサッカリドと任意のトリサッカリドとの間の最小差は、５５．０３Ｄａであり、そして全ての高次サッカリドについては１３Ｄａである。
【０１７９】
実験的制約としてのツール：ＰＳＡを研究するために利用可能ないくつかのツールおよび検出方法が存在する。ＰＳＡの構成ブロックの特性に基づいて、このクラスの直鎖状ポリサッカリドは、ＭＳで分析できる。ＰＳＡポリマーを精製し、そしてＨＰＬＣ、ＣＥおよび質量分析を用いて組成を得る方法は、ごく最近確立された。種々の供給源に由来する酵素ツールを使用して、広範にＰＳＡが研究されている。特に、ＰＳＡポリマーを非還元末端から順番に切断する細菌エキソシアリダーゼ（ｅｘｏｓａｌｉｄａｓｅ）およびバクテリオファージ由来のエンドノイラミニダーゼ（これは、ＮＡＮおよびＮＧＮ両方を含有するＰＳＡの直鎖状ポリサッカリドのエンド分解で切断する）。これらの酵素に加えて、ヒドラジン分解（ｈｙｄｒｏｚｏｎｏｌｙｓｉｓ）に続いて亜硝酸処理、および過ヨウ素酸酸化に続いて水素化ホウ素ナトリウム処理のような化学的方法を、ＰＳＡポリサッカリドをより小さなポリサッカリドへ分解するためのツールとして使用し得る。
【０１８０】
（実施例７：酵素反応の改変を生じる実験条件のバリエーションおよび本発明の方法に対するその効果）
ヘパリナーゼの二次的特性を、特に徹底的な分解条件下で観察した。ヘパリナーゼの酵素学へと継続している調査の部分として、異なる条件下で、規定された基質を用いたヘパリナーゼＩおよびＩＩＩによるＩおよびＧを含む部位の切断の相対的割合を測定した。例えば、ヘパリナーゼＩＩＩは、ＩおよびＧを含む結合で両方を切断するが、Ｉ2Sは切断しない［Ｈ．Ｅ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８）］。しかし、この研究で用いた反応条件下で、劇的な（８〜１０倍）切断割合の差異が存在し、Ｉを含む結合は、Ｇを含む結合よりゆっくりと切断される（図１０Ａ）。図１０Ａは、Ｇ結合（黒丸）、Ｉ結合（白丸）、またはＩ2S結合（菱形）のいずれかを含むテトラサッカリドの組換えヘパリナーゼＩＩＩによる切断を示す。各反応の次に、キャピラリー電気泳動を行った。これらの基質を用いると、ヘパリナーゼＩＩＩは、Ｉ2S含有グリコシド結合を切断せず、そしてＩ含有結合よりおよそ１０倍速くＧ含有結合を切断する。消化の「短時間」条件下では、Ｇ含有サッカリドのみが適切な程度まで切断されることが予測される。［ＨＬＧＡＧオリゴサッカリドの酵素的消化の条件を上記に示し、簡潔には、消化を「短時間」または「徹底的」のいずれかとして示した］。短時間消化は、５０ｎＭ酵素を用いて１０分間で完了した。徹底的な消化は、２００ｎＭ  酵素を用いて４時間または一晩のいずれかで完了した。部分的な亜硝酸切断は、発表された手順の改変法を用いて完了した。簡潔には、亜硝酸の濃度が２ｍＭおよび塩酸が２０ｍＭであるように、サッカリドの水溶液に塩酸中の亜硝酸ナトリウムの２×溶液を添加した。反応を室温で進行させ、１μＬの２００ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（ｐＨ６．０）を添加することにより種々の時点で、アリコートをクエンチした。徹底的な亜硝酸切断は、塩酸中の４ｍＭ  亜硝酸とサッカリドを室温で一晩反応させることにより完了させた。両方の場合において、亜硝酸切断の産物は、さらなる精製（ｃｌｅａｎｕｐ）の必要も、無水マンノース残基を無水マンニトールに還元する必要もなく、ＭＡＬＤＩにより直接サンプリングし得ることを見出した。ＨＬＧＡＧ分解エキソ酵素のパネル全体を、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，ＭＡ）から購入し、そして製造業者により示唆されるように使用した。例えば、ヘキササッカリドΔＵＨNH,6SＧＨNSＩＨNAc（最小限に硫酸化された領域でＩおよびＧ両方を含有する）を用いると、表１４に示されるように「短時間」消化条件下で、Ｇにおいてのみ切断が生じる。
（表１４）
【０１８１】
【表１１】
0004824170.tif 000019
ヘパリナーゼＩＩを、ヘキササッカリドＵＨNH,6SＧＨNSＩＨNAcとともにインキュベートし、そしてＩにおいてではなくＧにおける切断のみ観察した。さらに、本発明者らは、硫酸化の程度が、オリゴサッカリドのヘパリナーゼＩＩＩ分解の速度論に影響を及ぼさないことを見出した［Ｓ．Ｅｒｎｓｔら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７（１９９５）；Ｓ．Ｙａｍａｄａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４，６９（１９９４）；Ｕ．Ｒ．Ｄｅｓａｉ，Ｈ．Ｍ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２．８１４０（１９９３）；Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，２６１１（１９９０）］。ヘパリナーゼＩの場合において、この酵素は、ＩまたはＧを含有するグリコシド結合のいずれも、本発明者らの実験手順の状況では切断しないのに対して、Ｉ2S含有ポリサッカリドを容易に切断する（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、ヘパリナーゼＩＩＩの代わりにヘパリナーゼＩを使用したことを除いて、（Ａ）において完了したものと同じ研究を示す。ヘパリナーゼＩを用いると、Ｉ2S含有結合でのみ切断が生じるが、Ｉの前でもＧの前でも生じない。Ｇ2S含有結合を切断するヘパリナーゼＩの報告は、わずか１つしかない［Ｓ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．Ｔｓｕｄａ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，８６９６（１９９５）］。このヘパリナーゼＩを、２つのテトラサッカリド基質を用いて試験し、そしてここで示される「短時間」のヘパリナーゼＩ消化とは速度論的に非常に異なる条件下で実験を行った。
【０１８２】
多くの因子が厳格に制限されており、そして先行技術研究およびヘパリナーゼ基質特異性実験の解釈を複雑にしている。第１に、均一な基質調製が困難であるだけでなく、基質および産物を分析することもまた非常に難しい。分析は主に、既知の標準物質を用いたサッカリドの同時移動に依存し、そして他者および本発明者らが観察した場合、異なる硫酸化パターンを有するオリゴサッカリドが同時に移動し、このことは、独特の割り当てを複雑にする。さらに、ヘパリナーゼについての基質特異性を割り当てるために以前の研究において使用したいくつかのオリゴサッカリドは、均一ではなく、分析に複雑なった。本発明のＭＡＬＤＩ−ＭＳ手順の開発は、迅速かつ正確なサッカリドの決定を可能にした。第２の問題は、ネイティブな宿主からの純粋な野生型ヘパリナーゼの調製である。野生型ヘパリナーゼを、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍから単離し、そしてこの生物は、いくつかの複合型ポリサッカリド分解酵素を生成し、そしてしばしば、これらは互いに同時精製する。例えば、ヘパリナーゼＩＩＩの速度論を試験する場合、本発明者らは、ヘパリナーゼＩＩＩの市販の供給源がおそらく切断可能でないΔＵ2SＨNS,6SＩ2SＨNS,6Sを分解できることを見出した。さらに、この産物のＭＳおよびＣＥ分析は、スルファターゼ夾雑を示唆する特異的２−Ｏ脱硫酸化を示した。本発明者らの研究室で産生および精製した（他のヘパリン分解酵素との夾雑はない）組換えヘパリナーゼＩＩＩは、予測されるように、ΔＵ2SＨNS,6SＩ2SＨNS,6Sを切断しない。従って、異なる酵素調製物および消化条件における差異、ならびに基質サイズおよび組成における差異、ならびにそいばしば夾雑物質は、同時溶出に基づいた割り当てを一緒に考えると、データの比較が非常に困難になるだけでなく、矛盾した知見もまた導く。
【０１８３】
ヘパリナーゼ基質特異性の結果に拘わらず、ウロン酸のアイソマー状態を抽出するために使用され得る他の方法がある［ＩまたはＧまたはＩ2SまたはＧ2S］。各ジサッカリドユニットのウロン酸成分を、徹底的な亜硝酸処理の後に組成分析を完了することにより、明白に確認し得る。この方法により、所定のオリゴサッカリドの組成分析を行い得、そしてＧ2S、Ｉ2S、ＩおよびＧを含有する構成ブロックの存在を評価し得る。この情報を用いると、ヘパリナーゼの賢明な適用により（それらの正確な基質特異性に拘わらず）単一の配列に対する迅速な集中が完了され得る。なぜなら、切断により、切断部位のいずれかの側に対して質量情報が与えられるからである。従って、オクタサッカリド（実施例１）の場合、徹底的な亜硝酸の適用は、１×ΔＵＭａｎ6S、２×Ｉ2SＭａｎ6Sおよび１×ＧＭａｎ6Sを生じる。次いで、タグ化の後の任意の条件下（促進または非促進）でのこのオクタサッカリドのヘパリナーゼＩＩＩでの消化は、ヘキササッカリドｍ／ｚ５９５８．７およびジサッカリドの形成を生じ、迅速に配列を固定する。オクタサッカリドの単一の配列に集中するためにヘパリナーゼＩを用いて、事象の類似のシーケンスが使用され得る。配列分析のためのいずれか１つの特定のシステムの使用に対する補足説明はあるが、このシステムが化学的分解または酵素的分析であるか否かに拘わらず、ここで示される配列決定ストラテジーは、任意の単一の技術に決定的に依存する。
【０１８４】
本発明の配列決定ストラテジーの主な強みの１つは、本発明者らのアプローチの柔軟性およびＭＡＬＤＩとコーディングスキームの統合であり、これらは異なる実験的制約にその能力が適合することを可能にする［例えば、最近クローン化された哺乳動物へパラナ−ゼは、可能な別の実験的制約である。Ｍ．Ｄ．Ｈｕｌｌｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５、７９３（１９９９）；Ｉ．Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５、８０３（１９９９）］。述べられたように、実験的制約のさらなるセットまたは異なるセットを、特有の溶液を得るために使用しれるだけでなく、実験的制約の所定のセットからその溶液を確証または確認するためにも使用し得る。
【０１８５】
（実施例８：タンパク質−ポリサッカリド相互作用を同定するための方法、およびスクリーニングのための改良法）
特定のタンパク質に結合するＨＬＧＡＧ配列を同定するために、最も一般的方法論は、特定のＨＬＧＡＧサブセット（すなわち、ブタ腸粘膜ヘパリン）を使用するオリゴサッカリドのアフィニティー分画を含む。酵素的または化学的に誘導された特定の長さのヘパリンオリゴサッカリドを、固定したタンパク質のカラムに通す。洗浄後、結合画分を、そのポリサッカリド上のサルフェートとそのタンパク質上の塩基性残基との間の相互作用（結合に重要な相互作用）を破壊するために高塩を使用して溶出する。次に、溶出したオリゴサッカリドを、代表的にはＮＭＲによって特徴付ける。この様式で、多数のタンパク質（アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）およびエンドスタチンを含む）に結合する配列を同定している。
【０１８６】
厳密かつ十分に試験する間に、このアプローチは、多数の制限に苦しむ。第１に、カラムクロマトグラフィーが、成功する分析のためには大量（ミリグラム量）の材料を必要とする。ＨＬＧＡＧのファミリー全体のうちで、ヘパリンのみが、これらの量で入手可能である。しかし、ヘパリンは、その高いサルフェート含量に起因して、限定数の配列を含み、選択手順を偏らせる。従って、高い親和性で実際に結合し得る通常でない配列についてサンプリングするかまたは選択する機会が存在しない。インビボでのＨＬＧＡＧ結合タンパク質は、ヘパリン様配列（すなわち、高い程度に硫酸化している配列）が常に優勢であるわけではない細胞表面のプロテオグリカンのより構造的に多様なヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖をサンプリングしそしてそれに結合する。ヘパリンは、構造的にＨＳに関連しているが、マスト細胞中にのみインビボで存在する。これらの理由から、ヘパリンは、常に細胞表面ＨＳの適切なアナログであるわけではなく、そして実際、アフィニティー分画実験におけるヘパリンの排他的使用は、現場において混乱を生じている。１つの例は、この点を示す。ＦＧＦ−２は、重要な２−Ｏ硫酸化イズロネート残基を含む、ヘパラン硫酸配列の特定のサブセットに結合する。カラムクロマトグラフィーは、ＦＧＦ−２の高親和性結合物質を分離しており、その配列は、優勢なトリ硫酸化ジサッカリド［Ｉ2SＨNS,6S］n（ｎ＝３〜６）を含むオリゴサッカリドとして同定されている。しかし、ＦＧＦ−２の結晶構造（ＨＬＧＡＧオリゴサッカリドとのＦＧＦの共結晶を含む）の厳密な試験は、ＦＧＦ−２上のサルフェートと塩基性残基との間の３つの接触のみが高親和性結合に重要であることを示す。
【０１８７】
本発明の質量分析アプローチを使用して、本発明者らは、ポリサッカリドタンパク質相互作用を同定するための改良様式を開発した。このアプローチの利点は、これが非常に感度がよく、ピコモルの材料しか必要としないことであり、この材料はインビボで供給源から単離され得る。下記のように、このアプローチは、ピコモルの材料を使用して、タンパク質に結合するオリゴサッカリドの同定および配列決定に使用され得る。概念の証明として、本発明者らは本明細書中で、この新規な方法論が、３つのタンパク質（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＡＴＩＩ）について確立されたカラムアフィニティー分画法と機能的に等価であることを、ヘパリンオリゴサッカリドをモデル系として使用して、示す。さらに、本発明者らは本明細書中で、この系が、細胞表面から単離されたヘパラン硫酸が結合タンパク質を単離するために使用され得るように拡張され得ることを示し、このことは、偏りのない生物学に関連のあるＨＬＧＡＧが、結合配列を同定するために使用され得ることを初めて示す。
【０１８８】
（方法）
（タンパク質の調製および固定）  ＡＴＩＩＩを、過剰な粘膜ヘパリンとともに一晩インキュベートし、次いで、ＥＺ−ｌｉｎｋ  ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ  ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）でビオチン化した。Ｃａｎｏｎ  ＮＰ  Ｔｙｐｅ  Ｅ透明フィルムをＭＡＬＤＩサンプルプレートにテープで止め、そしてタンパク質固定表面として使用した。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２を、そのフィルム上に１μｌの水溶液をスポットすることおよび風乾することによって、固定した。ＡＴＩＩＩを、まずこのフィルム表面上に４μｇのニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）を乾燥し、次いでこのニュートラビジンスポットにビオチン化ＡＴＩＩＩを添加することによって、固定した。ヘパリンを、１Ｍ  ＮａＣｌで１０回、および水で１０回洗浄することによって、除去した。
【０１８９】
（サッカリドの結合、選択および分析）  サッカリドは、ヘパリナーゼＩによるブタ粘膜ヘパリンの部分消化に由来した。そのヘキササッカリド画分を、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ−６におけるサイズ排除クロマトグラフィーにより得、そして凍結乾燥して乾燥させた。少なくとも５分間そのタンパク質スポット上に水溶液１μｌをスポットすることによって、固定したタンパク質にサッカリドを結合させた。未結合サッカリドを、水で１５回洗浄することにより除去した。選択実験のために、そのスポットを種々のＮａＣｌ濃度で１０回洗浄し、続いて水で１０回洗浄した。２ｐｍｏｌ／μｌ（ＲＧ）19Ｒを含む５０％アセトニトリル中のカフェー酸マトリクスをこのスポットに添加し、その後、ＭＡＬＤＩ分析した。サッカリドすべてを、本明細書中に記載されるＭＡＬＤＩパラメーターを使用して、（ＲＧ）19Ｒとの非共有複合体として検出した。
【０１９０】
（ヘパリナーゼＩまたはＩＩＩによるサッカリド消化）  ＦＧＦ−２結合について選択したサッカリドを、選択が完了した後に水中の酵素８μｇをスポットすることによって、ヘパリナーゼＩまたはＩＩＩで消化した。このスポットを、必要な場合には水を添加することによって、所望の消化時間の間湿らせたままにした。２ｐｍｏｌ／μｌ（ＲＧ）19Ｒを含むカフェー酸マトリクスを、ＭＡＬＤＩ分析のためにこのスポットに添加した。
【０１９１】
（ＳＭＣヘパラン硫酸からのＦＧＦ結合物質の単離、精製、および選択）  ウシ大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣＳ）を、コンフルエントになるまで増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで２００ｎＭヘパリナーゼＩＩＩを１時間添加した。上清を１０分間５０℃まで加熱して、ヘパリナーゼＩＩＩを不活化し、そして濾過した。ポリヌクレオチドの混入を除去するために、サンプルを室温で一晩ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅで処理した。ヘパラン硫酸を、ＤＥＡＥフィルターに結合させ、未結合物質を洗浄して除き、そして１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を使用して溶出することによって単離した。次いでこの物質を濃縮し、そして３，０００  ＭＷＣＯ膜を使用して緩衝液を水に交換した。保持物を凍結乾燥し、そして水で再構成した。１００ｎＭヘパリナーゼＩＩを添加し、そして添加の５分、１０分、２０分、および３０分後に、アリコートを採取した。１μＬをＦＧＦ上にスポットした。乾燥後、サンプルを洗浄し、マトリクス中の２ｐｍｏｌ／μｌ（ＲＧ）19Ｒを添加し、そしてサンプルを上記に概説したように分析した。
【０１９２】
（結果）
（ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−１へのサッカリドの結合）  実行可能なＭＡＬＤＩ選択手順の開発に向けての第１の工程として、その原型メンバー（すなわち、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２）を使用するＦＧＦ系を選択した。最初の実験は、高い親和性でＦＧＦに結合することが既知である、精製ポリサッカリド（表２１のＨｅｘａ  １）の使用を含んだ。ＦＧＦ−２を用いて、本発明者らは、Ｈｅｘａ  １がＦＧＦ−２に結合すること、および０．５Ｍ  ＮａＣｌでの塩洗浄によってさえ検出されたことを見出した。これは、ＦＧＦ−２についてのＨｅｘａ  １の既知の親和性と一致する。さらに、Ｈｅｘａ  １およびＨｅｘａ  ２（低親和性結合物質）の等モル混合物をＦＧＦ−２に適用し、そして０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄して非特異的結合を除去した場合、Ｈｅｘａ  １のみ観察された。まとめると、これらの結果は、この実験条件下では、固定されたＦＧＦ−２が溶液中のＦＧＦと同じ結合特異性を保持するという事実を示す。さらに、ＦＧＦの熱変性によりサッカリド結合物質が検出されず、これは、この結合特異性が完全であることを示す。
【０１９３】
【表１２】
0004824170.tif 000020
ヘパリンの酵素的脱重合に由来するヘキササッカリド混合物のＦＧＦアフィニティー分画を使用して、ＦＧＦ結合物質について濃縮した。本発明者らの方法論を使用してより複雑な混合物から特定の結合物質を選択し得るか否かを決定するために、ブタ腸粘膜ヘパリンの不完全ヘパリナーゼＩ消化に由来するヘキササッカリド画分を、固定したＦＧＦ上にスポットした。少なくとも５つの独特の構造物を、未分画のヘキササッカリド混合物中で検出した。塩洗浄の際に、２つの構造（８硫酸化ヘキササッカリドおよび９硫酸化ヘキササッカリド）のみが、残った。重要なことには、同じ結果は、あるいはこのスポットを特定の結合物質について濃縮しそして低親和性結合物質と競合することによって、達成し得る。ＦＧＦ−１（これは、ＦＧＦ−２と類似の結合特性を有することが示されている）はまた、オクタ硫酸化ヘキササッカリドおよびノナ硫酸化ヘキササッカリドについて混合物から選択し得る。
【０１９４】
（ＭＡＬＤＩ表面上のサッカリドの配列決定）  本発明の非常に感度のよい配列決定法を使用して、本発明者らが標的に対するＦＧＦ高親和性結合物質の構造情報を誘導し得るか否かを試験した。このオクタ硫酸化サッカリドおよびノナ硫酸化ヘキササッカリドを、酵素的および化学的脱重合に供した。サッカリド選択の後、このサッカリドサンプルをヘパリナーゼＩにより脱重合化して、配列情報を得た。このノナ硫酸化ヘキササッカリドを、単一のトリ硫酸化ジサッカリドに還元した。このことは、このサッカリドが、［Ｉ2SＨNS,6S］の反復であることを示す。オクタ硫酸化ヘキササッカリドの消化は、トリ硫酸化ジサッカリドおよびペンタ硫酸化テトラサッカリドを生じた。このテトラサッカリドが非硫酸化ウロン酸を含むことを、ヘパリナーゼＩＩＩ切断により確認した。これは、このテトラサッカリドの消失をもたらした。本発明者らの配列決定割り当ての確認を、オクタ硫酸化ヘキササッカリドおよびノナ硫酸化ヘキササッカリドを単離し、そして本明細書中に記載の方法を使用して配列決定することにより行った。従って、このノナ硫酸化ヘキササッカリドの配列は、±ＤＤＤ（ΔＵ2SＨN5,6SＩ2SＨNS,6SＩNS,6S）であり、そしてオクタ硫酸化ヘキササッカリドの配列は、±ＤＤ−５である。
【０１９５】
（アンチトロンビンＩＩＩへのサッカリドの結合）  ＡＴＩＩＩは、ひどくグリコシル化されている。従って、本発明者らは、ＡＴＩＩＩがＭＡＬＤＩプレートに十分には結合しないと予測した。代替的ストラテジーとして、アビジンをこのプレートに固定し、そしてビオチン化ＡＴ−ＩＩＩをこのアビジンに結合させた。このＡＴＩＩＩビオチン化反応を、ＨＬＧＡＧオリゴサッカリドについてのこのタンパク質の結合部位を保護するために、ヘパリンの存在下で実行した。この複合ヘパリンを洗浄して除いた後、ペンタ１（インタクトなＡＴＩＩＩペンタサッカリド結合配列を含む）を使用して、このタンパク質がこの表面上に固定されそしてサッカリドに結合し得ることを確認した。ＡＴＩＩＩへのペンタ１の結合が、０．５Ｍ  ＮａＣｌの洗浄まで観察された。これは、ペンタ１がＡＴＩＩＩへの強力な結合物質であることと一致する。
【０１９６】
さらに、この結合は特異的でもある。固定されたＡＴＩＩＩにヘキサ１、ヘキサ２、およびペンタ１の溶液を導入し、続いて０．２Ｍ塩洗浄して非特異的結合物質を除去すると、ペンタ１についてのシグナルのみ生じた。興味深いことに、部分的にインタクトなＡＴＩＩＩ結合部位を含むヘキサ２からのシグナルは存在しなかった。このことは、本発明者らの選択条件下では、完全結合部位を有する配列のみ選択されることを示唆する。
【０１９７】
（ＳＭＣ  ＨＳにおけるＦＧＦ−２バインダーの選択）ＳＭＣの細胞表面におけるヘパラン硫酸は、ＦＧＦ結合についての高い親和性部位を含むことが公知である。本出願人らの高度に硫酸化されたヘパリンを用いる初期の研究を拡張しようという活動において、ＳＭＣの細胞表面におけるヘパラン硫酸化プロテオグリカンの高親和性ＦＧＦバインダーを同定するための探求を行った。この目的のために、ＳＭＣをヘパリナーゼＩまたはへパリナーゼＩＩＩのいずれかで処理し、そしてＨＬＧＡＧを単離および精製した。これらの酵素の公知の基質特異性と一致して、放出されたフラグメントの組成は異なる。次いでフラグメントをヘパリナーゼＩＩで処理してサイズを減少させた。特定の時点で、消化物をＦＧＦ−２上にスポットし、そして選択プロセスを上記に要約したように完了した。本出願人らのヘパリンを用いた発見に一致して、単一の六糖をＦＧＦ−２の高親和性バインダー（すなわち、配列±ＤＤＤを有する九硫酸化六糖）であると同定した。
【０１９８】
上記の方法論は、タンパク質に対する糖バインダーの選択のための代替のプロトコルを記載する。この方法論は、２つの十分に確立された系（ＦＧＦおよびＡＴＩＩＩ）に結合するヘパリンから誘導されるオリゴ糖の同定に対して適用された。示されるように、この手順は、親和性分画のより確立された方法論と同一の結果を与えた。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２については、高親和性バインダーが、同様の糖のプールから選択され得る。さらに、ＡＴＩＩＩは、部分的結合部位のみを含むバインダーよりも高い親和性のバインダーについて選択され得る。
【０１９９】
この方法論は、従来技術のストラテジーよりも多数の重要な利点を有する。第１に、標的上に直接結合された糖から配列情報を導くことが可能である。第２に、そしてより詳細には、ＦＧＦおよびＡＴＩＩＩの両方を用いる分析は、タンパク質および糖の両方についてわずか数ピコモルの材料しか必要としない。このような進歩により、マスト細胞由来の高度に硫酸化されたヘパリンよりも、基質として細胞表面から単離されたより生物学的に関連性のあるＨＳを使用することが可能になる。最後に、実施例は、化学的複合体および情報稠密ＨＬＧＡＧについてのこの技術を実証したが、この技術は他の多糖類−タンパク質相互作用の同定に対して広く適用可能である。
【０２００】
（実施例９：分岐を同定するための方法および分岐した多糖類の配列決定のための方法）
グリコシル化パターンが、細胞の表現型により高度に影響されるという証拠が多く存在する。病気の始まりに関して、グリカン構造における変化、特に分岐の程度における変化が存在するということが注目された。例えば、正常プリオンタンパク質に対する病原体において、二等分（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃ残基を有するグリカンのレベルが減少し、そして三触角状（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造および四触角状構造のレベル増加する。酵素的分解および化学的分解の賢明な適用により、分岐鎖の同一性もまた、同定され得る。
【０２０１】
（複合グリカン構造のＭＳ分析）図１１に示されるように、複合Ｎ−グリカン構造から生じた拡張コア構造を、酵素的に生成し、そして同定した。二触角状構造および三触角状構造の混合物の酵素的処理から誘導した拡張コア構造に対して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を行った。各糖の１ｐｍｏｌを、Ａ．ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のβ−ガラクトシダーゼを含む酵素カクテルを用いる消化に供した。１４６２．４の質量サインは、これらの構造のうちの１つがコアフコース部分を有する二触角状であり、一方１６６５．８の質量サインが、またコアフコースを有する三触角状構造であることを示す。
【０２０２】
【数１】
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（ＰＳＡのＮ−連結多糖のＭＡＬＤＩ−ＭＳ配列決定）次に、正常前立腺組織由来のＰＳＡのグリカン構造の高速配列決定を行った（図１２）。図１２は、ＰＳＡ多糖構造のＭＡＬＤＩ−ＭＳミクロ配列決定から生じるデータである。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを５００ｆｍｏｌの糖で実行した。分析を添加物として３００ｍＭのスペルミンを含む２，５−ジヒドロキシ安息香酸の飽和水溶液を用いて実行した。分析物をネガティブモードで加速電圧２２ｋＶで検出した。１μＬのマトリクスを０．５μＬの水性サンプルに添加し、そしてターゲット上で乾燥させた。（Ａ）インタクトな多糖構造のＭＳ。アステリスクでマークされたピークは不純物であり、そして分析物のピークは、Ｍ−Ｈ（ｍ／ｚ  ２３６９．５）および一ナトリウム付加物（Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ、ｍ／ｚ  ２３９２．６）の両方として検出される。（Ｂ）Ａ．ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼを用いる［Ａ］の処理。製造業者の使用説明書に従って、１０ｐｍｏｌの糖を酵素と共に一晩３７℃で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中でインキュベートした。２つの新しい糖が見られ、１つ目は、１つのシアル酸部分の損失に対応するｍ／ｚ  ２０７８に見られ、そして２つ目は、非還元末端からの２つのシアル酸の損失に対応する１７８６．９に見られた。（Ｃ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のガラクトシダーゼを用いる［Ｂ］の消化。消化手順を本質的に上記のように遂行した。ｍ／ｚ１４６２．８のシグナル生成物は、２つのガラクトース残基が酵素での［Ｂ］の処理の際に除去されたことを示した。（Ｄ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチルヘキソースアミニダーゼを用いる［Ｃ］の消化。１つの生成物を、［Ｃ］からの２つのＮ−アセチルヘキソースアミン単位の損失に対応するＭ−Ｈ（ｍ／ｚ  １０５６．３）およびＭ＋Ｎａ−２Ｈ、ｍ／ｚ  １０７８．１）の両方として観測した。概略構造および理論分子質量とともに分析スキームの表を図１２の中央に示す。親多糖およびこの分析において見られた酵素的に誘導した生成物を示す。
【０２０３】
【数２】
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ＮＭＲによるインタクトな多糖の研究（この研究には大量のＰＳＡが必要である）は、グリカンの配列情報を与えた。［Ｂｅｌａｎｇｅｒ，Ａ．，ｖａｎ  Ｈａｌｂｅｅｋ，Ｈ．，Ｇｒａｖｅｓ，Ｈ．Ｃ．Ｂ．，Ｇｒａｎｄｂｏｉｓ，Ｋ．，Ｓｔａｍｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｏｐｐｅ，Ｉ．，およびＬａｂｒｉｅ，Ｆ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，１９９５．２７：１８７−１９７頁］。他のＮ−連結糖タンパク質と同様に、上述のように、ＰＳＡは、二触角状分岐モチーフを含む。ＰＳＡの各マンノースアームからの拡張はトリ糖単位である。インタクトな多糖について２３７０Ｄａの予想分子質量が、これらの改変と共に示された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびエキソグリコシダーゼアレイを使用して、本出願人らは、ＰＳＡ上のＮ−連結多糖について推定構造を配列決定した（図１２）。インタクトな多糖の分析は、２３７０Ｄａの分子質量を与え（図１２Ａ）、これはその構造に基づく推定された分子質量と同一である。実際、これらから誘導された全ての構造および酵素産物について、１ダルトン未満の質量精度が実現される。
【０２０４】
初期の研究において、本出願人らは、添加物としてのスペルミンと共に２，５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリクスとして用いて、最大の感度が得られるということを見出した［Ｍｅｃｈｒｅｆ，ＹおよびＭ．Ｖ．Ｎｏｖｏｔｎｙ、酸性糖結合体のマトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析は、コマトリクスとしてのスペルミンの使用により促進される。Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１９９８．９（１２）：１２９３−３０２頁］。この場合、オリゴ糖を、陰イオンとして検出した。上記に要約したように、これらの条件は最大の感度を与え（約５００ｆｍｏｌまたは約１．５ｎｇの検出限界）、そしてまた均一なシグナルを与え、検出可能な付加物はない。ネガティブモード検出は、シアル酸含有ペンダントアームの分析に敏感であるが、異なるマトリクス条件を用いるポジティブモードでも検出が行われ得ることに留意する。多糖のシアリダーゼを用いる処理（２Ｎｅｕα→６，８結合の特異的切断）は、２つのシアル酸残基の切断に一致する６１８Ｄａの質量減少を生じた（図１２Ｂ）。この糖のβ−ガラクトシダーゼを用いる処理は、さらに３６０Ｄａの質量の減少を生じ、シアル酸の近傍に位置する２つのガラクトース残基の存在を確認した（図１２Ｃ）。重要なことには、図１２Ｂのアシアロ（ａｓｉｌａｏ）構造を、β−ガラクトシダーゼに加えて別の酵素で処理する場合、質量の減少は観察されず、これらのユニットの正体がβ−連結ガラクトース残基であることを確認する。エキソグリコシダーゼの系統的適用により、本出願人らは、ＰＳＡの推定グリカン構造の全体の配列を「通読（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）」し得る。さらに、構造を「通読」し得るだけでなく、この方法論によりマイクログラム未満の量の材料を用いた分析を遂行し得る。また、配列を「読む（ｒｅａｄｉｎｇ）」すべての工程において、質量を決定したので、酵素特異性およびＮ−グリカン構造の本出願人らの推定が正しいことを保証するための内部コントロールを得た。
【０２０５】
（ＰＳＡ多糖の直接配列決定）ＰＳＡの糖部分の構造についての情報は、糖の単離および配列決定によって（例えば、上記の方法論を使用することによって）のみ得られ得るが、タンパク質から除去することなしに糖構造についての情報を得ることができる。図１３は、ＰＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の糖の配列決定の結果を示す。図１３は、ＰＳＡの糖鎖からの直接的酵素分解の結果を示す。５０ｐｍｏｌのＰＳＡ（約１．４μｇ）を、８０℃で２０分間の熱処理により変性させた。次いで、このサンプルを連続的に細胞外酵素（Ｂ〜Ｄ）で処理した。一晩３７℃でのインキュベーションの後、１ｐｍｏｌの消化されたＰＳＡを質量分析で調べた。簡単に述べると、水性サンプルを３０％アセトニトリル中でシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）と混合し、乾燥させ、次いでＭＡＬＤＩ  ＴＯＦにより調べた。全てのスペクトルを、分子質量決定の精度を確実にするために、ミオグロビン、オボアルブミン、およびＢＳＡの混合物を用いて外部較正した。（Ａ）細胞外酵素の添加前のＰＳＡ。２８，４７８の測定された質量は、２８，４７０の報告された値とよく一致する。（Ｂ）（Ａ）のシアルダーゼでの処理は、１つのシアル酸残基の損失と一致する、２８７Ｄａの質量減少を生じた。（Ｃ）ガラクトシダーゼを用いる（Ｂ）の処理。さらなる３２１Ｄａの減少は、２つのガラクトース部分の損失を示す。（Ｄ）ヘキソースアミニダーゼを用いる（Ｃ）の消化の際に、３９３Ｄａの減少が、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基の損失を示した。
【０２０６】
このタンパク質は、２８，４７８．３の測定された質量を有する（図１３Ａ）。インタクトなタンパク質のシアリダーゼでの処理は、１つのシアル酸残基の損失と一致する２８７Ｄａの減少を生じた（図１３Ｂ）。ガラクトシダーゼを用いるさらなる処理は、２つのガラクトース残基の損失と一致する３２１の質量の減少を生じた（図１３Ｃ）。最後に、Ｎ−アセチルヘキソースアミニダーゼを用いる処理は、２つのＧｌｃＮＡｃ部分の切断を生じた（図１３Ｄ）。
【０２０７】
（ＥｎｄｏＦ２処理によるＰＳＡのグリコタイピング（ｇｌｙｃｏｔｙｐｉｎｇ））ＥｎｄｏＦ２は、二触角状構造のみを切断するエンドグリカナーゼである。三触角状および四触角状構造が、この酵素には基質として作用しない（図１４）。このように、グリカン構造のＥｎｄｏＦ２処理は、タンパク質に結合していてもまたは単離後のいずれでも、分岐しているか否かを同定するために使用した。グリコシル化パターンにおける異常型変化が、通常分岐の増大を生じるという事実を考慮すると、このことは特に重要である。さらに、ＥｎｄｏＦ２は、目的のタンパク質になお結合しているグリカン構造を切断するために使用した。実際、ＰＳＡのＥｎｄｏＦ２での処理は、二触角状複合型グリカン構造の損失に一致する質量シフトを生じた。図１４は、二触角状および三触角状糖のエンドグリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎｓｅ）Ｆ２による処理の結果を示した。（Ａ）二触角状糖の処理は、ＧｌｃＮＡｃ残基間の切断を示す３４８．６の質量減少を生じた。（Ｂ）同じ置換基を有する三触角状糖の処理は、全く切断を生じず、ＥｎｄｏＦ２が主に二触角状構造を切断するということを示した。（Ｃ）熱変性ＰＳＡのＥｎｄｏＦ２処理。ＰＳＡの分子質量における１７０９．７Ｄａの質量減少があり（１１Ｃと１１Ａとを比較）、ＰＳＡの正常グリカン構造が二触角状であることを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ポリマー情報をソートしそして操作するためのコンピューターシステムの例を示すブロックダイアグラムである。
【図２】  図２Ａは、ポリマーおよびその構成化学ユニットについての情報をソートするための記録の例を示すダイアグラムである。
図２Ｂは、ポリマーについての情報をソートするための記録の例を示すダイアグラムである。
図２Ｃは、ポリマーの構成化学ユニットについての情報をソートするための記録の例を示すダイアグラムである。
【図３】  図３は、化学ユニットの第１のポリマーの特性が、第２の化学ユニットの特性に適合するか否かを決定するための方法の例を示すフローチャートである。
【図４】  図４は、ポリマーを配列決定するためのシステムのデータフローダイアグラムである。
【図５】  図５は、ポリマーを配列決定するためのプロセスのフローチャートである。
【図６】  図６は、遺伝アルゴリズムを用いて、ポリマーを配列決定するためのプロセスのフローチャートである。
【図７】  図７は、分枝した鎖の分析のための表記スキームを示す一連のダイアグラムである。
【図８】  図８は、質量線図である。
【図９】  図９は、ＮＡＮを有するポリシアル酸（Ａ）およびＮＧＮを有するポリシアル酸（Ｂ）についての質量線図である。
【図１０】  図１０は、Ｇ（黒丸）、Ｉ（白丸）またはＩ2S（黒菱形）のいずれかの結合のＨｅｐＩＩＩによる切断を示すグラフ（Ａ）、およびＡと同じ研究を示すが、切断をＨｅｐＩで行ったグラフ（Ｂ）である。
【図１１】  図１１は、２触角性構造および３触覚性構造の混合の酵素処理から誘導される伸張したコア構造のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を示すグラフである。
【図１２】  図１２は、ＰＳＡポリサッカリドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を示すグラフである。（Ａ）：インタクトなポリサッカリド構造。（Ｂ）：Ａ．ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼでの［Ａ］の処理。（Ｃ）：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のガラクトシダーゼでの［Ｂ］の消化。（Ｄ）：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチルヘキサミニダーゼでの［Ｃ］の消化。（Ｅ）：模式的構造および理論的分子量での分析スキームの表。［白丸］＝マンノース；［黒星印］＝フコース；［黒四角］＝Ｎ−アセチルグルコサミン；［白四角］＝ガラクトース；および［白三角］＝Ｎ−アセチルノイラミン酸。アスタリスクで印されるピークは不純物である。そして分析物ピークは、Ｍ−Ｈ（ｍ／ｚ  ２３６９．５）として、および一ナトリウム化付加物（Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ，ｍ／ｚ  ２３９２．６）として両方で検出される。
【図１３】  図１３は、ＰＳＡの糖鎖直接解離の酵素的分解の結果を示すグラフである。（Ａ）：外部酵素の添加の前のＰＳＡ。（Ｂ）：２８７Ｄａの質量低下（１つのシアリル酸残基の欠失と一致）を生じるシアリダーゼでの（Ａ）の処理。（Ｃ）：ガラクトシダーゼでの（Ｂ）の処理。（Ｄ）：ヘキサミニダーゼでの（Ｃ）の消化の際、３９３Ｄａの低下は、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基の欠失を示す。
【図１４】  図１４は、エンドグリカンＦ２を用いた、２触覚性および３触覚性の糖類の処理の結果を示すグラフである。（Ａ）：２触角性糖類の処理は、３４８．６の質量減少を生じ、このことは、ＧｌａＮＡｃ残基間の切断を示す。（Ｂ）：同じ置換基での３触覚性糖類の処理は、切断を生じず、このことは、ＥｎｄｏＦ２が主に２触覚性構造を切断することを示す。（Ｃ）：熱変性ＰＳＡのＥｎｄｏＦ２処理。ＰＳＡの分子量中に１７０９．７Ｄａの質量低下が存在し（Ｂ４ＣおよびＢ３ａを比較する）、このことは、ＰＳＡの正常グリカン構造が２触覚性であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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