(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非プロトン性溶媒中で、コンドロイチン硫酸を、有機アミン鉱酸塩の共存下、三酸化硫黄錯体で多硫酸化して、次の物理化学的性質
ａ）硫酸基含量：２５．８〜３７．３％
ｂ）極限粘度：０．０９〜０．１８
を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を製造する方法であって、
前記非プロトン性溶媒が、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択されること、
前記有機アミン鉱酸塩が、ピリジン、トリメチルアミンおよびトリエチルアミンの塩酸塩または硫酸塩からなる群から選択されること、
前記三酸化硫黄錯体が、三酸化硫黄のピリジン錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド錯体およびトリメチルアミン錯体からなる群から選択されること
を特徴とする多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項２】
前記コンドロイチン硫酸が、サケ、サメ、エイ、ブタおよびウシからなる群から選択される基原に由来することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記コンドロイチン硫酸が、サケ、サメ、ブタからなる群から選択される基原に由来することを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記非プロトン性溶媒が、ピリジンまたはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記有機アミン鉱酸塩が、ピリジン塩酸塩またはピリジン硫酸塩から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記三酸化硫黄錯体が、三酸化硫黄のピリジン錯体またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド錯体から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記非プロトン性溶媒がピリジンであり、前記有機アミン鉱酸塩がピリジン塩酸塩であり、前記三酸化硫黄錯体が三酸化硫黄ピリジン錯体であって、
ピリジン中にクロロスルホン酸を添加することによって、ピリジン塩酸塩と三酸化硫黄ピリジン錯体を生成する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記非プロトン性溶媒が含水ピリジンであることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコンドロイチン硫酸の分子量を制御しながら硫酸化して、一定の分子量および硫酸基含量を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多硫酸化コンドロイチン硫酸は、血液凝固抑制作用、末梢血液循環促進作用、繊維芽細胞増殖抑制作用、皮膚保湿作用等に優れており、医薬品または化粧品として用いられている。
【０００３】
多硫酸化コンドロイチン硫酸の原料となるコンドロイチン硫酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸の繰り返し単位を構成とする酸性多糖であり、動物組織中に存在する。しかし、硫酸基の結合位置により、コンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン−４硫酸）とコンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン−６硫酸）に分類され、この比率は動物種によって異なる。近年、サメ、サケ等の魚類から抽出されたコンドロイチン硫酸が工業レベルで供給されるようになった。ところが、コンドロイチン硫酸Ａとコンドロイチン硫酸Ｃの比率は基原動物に依存し、またコンドロイチン硫酸の分子量は基原動物や抽出、精製方法に依存している。そのため、基原および製造会社によって、コンドロイチン硫酸は幅広い物理化学的性質を示す。
このようにコンドロイチン硫酸の物理化学的性質が広くとも、一定の分子量及び硫酸基含量を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を製造する方法が望まれている。
【０００４】
コンドロイチン硫酸を多硫酸化する方法としては、コンドロイチン硫酸Ｃを濃硫酸中低温で硫酸化する方法（特許文献１）が開示されている。この方法は硫酸化と低分子化が同時に一段階反応で行われる点で優れている。しかし、この方法では硫酸化と低分子化を独立して制御することは困難であるため、品質制御をすることは困難である。また、反応温度を低温に制御しなければならないことや大量のエーテル系溶媒が必要なため工業的には不利である。
【０００５】
また、コンドロイチン硫酸のトリブチルアミン塩を用いて分子内の水酸基全てを硫酸化する方法（特許文献２）、コンドロイチン硫酸の有機アミン塩を三酸化硫黄の錯体あるいは硫酸−カルボジイミド混合物で多硫酸化する方法（特許文献３、４）が開示されている。しかし、いずれの方法でもコンドロイチン硫酸の低分子化は進まないため、望みの分子量の多硫酸化コンドロイチン硫酸を得るには、所定の分子量のコンドロイチン硫酸を用いなければならない。さらに原料であるコンドロイチン硫酸は通常ナトリウム塩の形態で入手することができるが、ナトリウム塩は有機溶媒に難溶であり、反応が不均一になりやすい。そのため、有機溶媒に溶けやすい有機アミン塩に変換してから、多硫酸化している。ナトリウム塩を有機アミン塩に変換する方法はイオン交換樹脂を用いることで可能であるが、工業生産には不利である。それに加えて、反応が進行すると生成物（多硫酸化物）の粘度が上昇し攪拌が困難になる。そうすると工業生産スケールでは攪拌機に過大な負荷がかかり、その結果攪拌機のモーターから出火する危険性がある。
【０００６】
さらに、コンドロイチン硫酸を硫酸とクロロスルホン酸の混合物を用いて硫酸化する方法（特許文献５）が開示されているが、この方法では硫酸化と低分子化が同時に進むことから、硫酸化と低分子化を独立して制御することは困難である。またこの方法ではコンドロイチン硫酸では不安定で、低分子化が進みすぎると明記されている。
【０００７】
他方、低分子化したオリゴ糖を三酸化硫黄の錯体で反応させて多硫酸化する方法（特許文献６）があるが、この方法は予め原料を低分子化させる必要がある上に、この反応で分子量や硫酸基含量を制御できる記載はない。
【特許文献１】特公昭４７−３０１６７号公報
【特許文献２】特開平１１−１６６００１号公報
【特許文献３】特開昭６２−２７４０２号公報
【特許文献４】米国特許第６３８８０６０号明細書
【特許文献５】特開昭５９−１３３２０１号公報
【特許文献６】国際特許公開第０３／０２０７３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の硫酸化方法では、あらかじめ有機アミン塩に変更したり、分子量と硫酸化を制御することが困難であり、一定の分子量および硫酸基含量を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を合成することは困難であった。
【０００９】
したがって、本発明の目的はコンドロイチン硫酸ナトリウムの分子量や基原が異なっていても一定の分子量および硫酸基含量を有する多硫酸コンドロイチン硫酸の製造方法を提供することである。
【００１０】
また、市販しているコンドロイチン硫酸はナトリウム塩であるが、有機溶媒に溶解しやすい塩に塩交換することなく、ナトリウム塩のまま多硫酸化反応に用いることができる製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、魚類由来のコンドロイチン硫酸から一定の分子量および硫酸基含量の多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造法を見出し、また、コンドロイチン硫酸の塩交換することなく多硫酸化する製造方法を見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）  魚類由来コンドロイチン硫酸からａ）硫酸基含量：２５．８〜３７．３％、ｂ）極限粘度：０．０９〜０．１８の物理化学的性質を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を製造する方法；
（２）  魚類由来コンドロイチン硫酸がサケ、サメ、エイから得られたコンドロイチン硫酸である（１）記載の方法；
（３）  魚類由来コンドロイチン硫酸がコイ、スズキ、マダイ、エツから得られたコンドロイチン硫酸である（１）記載の方法；
（４）  コンドロイチン硫酸を有機アミン鉱酸塩の共存下、三酸化硫黄で多硫酸化して、ａ）硫酸基含量：２５．８〜３７．３％、ｂ）極限粘度：０．０９〜０．１８の物理化学的性質を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を製造する方法；
（５）  有機アミン鉱酸塩を１種類又は２種類用いて多硫酸化する（４）記載の方法；
（６）  三酸化硫黄が三酸化硫黄の錯体である（４）または（５）のいずれかに記載の方法；
（７）  非プロトン性溶媒を用いて多硫酸化する（４）ないし（６）のいずれか１に記載の方法；
（８）  コンドロイチン硫酸は魚類由来のコンドロイチン硫酸である（４）ないし（７）のいずれか１に記載の方法；
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
魚類由来のコンドロイチン硫酸から、工業的に簡便かつ安全な方法で一定の品質を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を製造することができる。
また、市販されているコンドロイチン硫酸に何ら手を加えることなく、工業的に簡便かつ安全な方法で一定の品質を有する多硫酸化コンドロイチン硫酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の多硫酸化コンドロイチン硫酸はコンドロイチン硫酸の塩を、有機アミン鉱酸塩の共存下、非プロトン性溶媒中で、０℃から用いる反応溶媒の沸点までの温度下で、コンドロイチン硫酸の構成ユニットの水酸基に対して、１：１ないし１：１０の三酸化硫黄を反応させることにより製造することができる。
【００１５】
出発原料となるコンドロイチン硫酸の基原は特に問わないが、魚類またはほ乳類が好ましい。ほ乳類としては、クジラ、ウシ、ブタなどが好ましい。また、例えば特開２００１−１３９６０２号公報で開示された技術によって得られる魚類のうろこから得られるコンドロイチン硫酸を用いることもできる。特に、コイ、スズキ、マダイ、エツなどのうろこから得られたコンドロイチン硫酸が好ましい。
またコンドロイチン硫酸は市販されている形態であれば、塩の種類は限定されないが、無機塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。 コンドロイチン硫酸については、ナカライテスク株式会社、マルハ株式会社、生化学工業株式会社、東京化成工業株式会社、日本バイオコン株式会社、株式会社日本バリアフリー、和光純薬株式会社、American Laboratories, Inc.、Bioiberica、Kraeber GmbH & Co.、Oxford Glyco Sciences、Qingdao Kangyuan Pharmaceutical Co., Ltd.、Sichuan Biosyn Pharmaceutical Co., Ltd.等から入手することができる。
【００１６】
溶媒は非プロトン性溶媒であれば特に限定されないが、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい。また、これらの溶媒は回収して再利用することが可能であり、０．１〜１０％程度の水分を含んでいても良い。反応温度は、０℃から用いる反応溶媒の沸点までで行えるが、好ましくは６０〜１００℃である。反応時間は原料の分子量により異なるが、３０分以上、好ましくは３０分から１２時間、より好ましくは３０分から５時間である。
【００１７】
コンドロイチン硫酸の構成ユニットの水酸基と三酸化硫黄のモル比は１：１ないし１：１０が好ましく、特に１：３ないし１：８が好ましい。三酸化硫黄は通常市販されている形態のものであれば、特に限定されないが、好ましくはピリジン、トリメチルアミン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサンの錯体、さらに好ましくは、ピリジン、ＤＭＦの錯体の形で用いてもよい。これらの錯体は公知の方法で、クロロスルホン酸と３級アミンを反応させて作ることもでき、単離精製することなく反応に用いてもよい。
【００１８】
有機アミン鉱酸塩として、好ましくはアンモニアまたは１級、２級、３級の低級アルキルアミンの塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩であり、特に好ましくは塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、エチルアミン塩酸塩、エチルアミン硫酸塩、ジエチルアミン塩酸塩、ジエチルアミン硫酸塩、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルアミン硫酸塩、ピリジン塩酸塩、ピリジン硫酸塩であり、さらに好ましくは、ピリジン塩酸塩、ピリジン硫酸塩である。
また、有機アミン鉱酸塩は複数種類用いることができるが、好ましくは１種類または２種類である。
【００１９】
上記方法により、本発明の多硫酸化コンドロイチン硫酸が生成する。単離精製する方法は一般的に知られている方法、例えば透析や限外濾過、樹脂処理による脱塩、有機溶媒を添加して析出させる方法、凍結乾燥や噴霧乾燥による回収方法を使用することができる。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２１】
［実施例１］
三酸化硫黄ピリジン錯体13g、ピリジン塩酸塩12gにピリジン10mLを加えて加熱した。ピリジン80mL  に懸濁させたサメ由来コンドロイチン硫酸ナトリウム（マルハ株式会社製）10gを加えて加熱した。反応後３時間に反応液の一部をメタノールに注いだ。溶媒を除去した後、粗生成物に水を加えて溶解させ、30%水酸化ナトリウム溶液でpH10以上に調整した後、透析を行った。粗生成物の水溶液に食塩を加えた後、メタノール中に滴下した。析出物をろ取し、多硫酸化物を得た。
反応後5時間においても同様の後処理を実施し、多硫酸化物を得た。
【００２２】
実施例２〜７は下記の条件で実施例１と同様（反応時間は１，３または５時間）にして行った。
【表１】
0004636818.tif 000002
【００２３】
［比較例］
三酸化硫黄ピリジン錯体13gにピリジン10mLを加えて加熱した。ピリジン80mLに懸濁させたサメ由来コンドロイチン硫酸ナトリウム10gを加えてさらに加熱した。反応後30分で凝固し、攪拌が不可能となったが、その状態で1時間まで反応を継続した。反応物を取り出し、メタノール中に加えた。以下、実施例１の後処理と同様の処理を行い、多硫酸化物を得た。
【００２４】
［試験例１］  硫酸基含量
多硫酸化物を1M塩酸溶液で2時間加水分解した後、 HPLCで測定した。標準溶液として硫酸カリウムを用いた。
使用カラム：TSKgel IC-ANION PW（東ソー）
移動相：ホウ酸緩衝液
流速：1.0mL/min
注入容量 50μL
カラム温度：40℃
検出器：電気伝導度検出器（Waters）
ホウ酸緩衝液の調製
グルコン酸カリウム 300mg、ホウ酸 360mg、四ホウ酸ナトリウム十水和物 500mg、グリセリン 5.00g、1-ブタノール 30 mL及びアセトニトリル 120mLを水に溶かし 1000mL とする。（pH 8.5）
【００２５】
［試験例２］  極限粘度
日本薬局方外医薬品規格２００２（日本公定書協会編集）のヘパリン類似物質の項の記載方法に従い、ウベローデ型粘度計を用いて測定した。
【００２６】
【表２】
0004636818.tif 000003
【００２７】
［試験例３］
電気泳動は文献（タンパク質  核酸  酵素,Vol.18, No.9,843-857(1973)）を参考に行い、0.1Mピリジン−0.47Mギ酸緩衝液を電極液として用いた。
実施例３及び比較例の反応１時間後の反応物の電気泳動の結果を図１に示した。実施例３では一本のバンドのみが確認され均一であるが、比較例は複数のバンドが確認され不均一である。
【００２８】
［実施例８］
含水（1.5%）ピリジン 260mL中に、クロロスルホン酸 70mL を滴下した。サメ由来コンドロイチン硫酸ナトリウム 100g と含水（1.5%）ピリジン700mLの懸濁液を加え、３時間加熱した。 
反応液をメタノール中に注いだ後、溶媒を除去し、残査に食塩水を加えて溶解させた。ここに30%水酸化ナトリウム溶液を加えてpH 11.5に調整し、メタノール中に注いだ。析出した固体をろ取した後に、水に溶解させ、1M塩酸試薬を加えてpHを7.0として、限外ろ過した。残留溶液に塩化ナトリウムを加えた後、メタノール中に注いだ。析出した固体をろ取して、多硫酸化物を得た。
【００２９】
実施例９及び１０は実施例８と同様にして行った。
【表３】
0004636818.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例３および比較例の反応１時間後の生成物の電気泳動の結果を示すパターン。
【図１】
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