(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスおよび／またはプリオン汚染されている開始溶液を、遠心管の底に層状化された高モル濃度でかつ尿素溶液の密度が開始溶液に比べ高密度である尿素溶液層の上にのせ、超遠心を分離手順として使用し、該遠心管の底に層状化された高モル濃度でかつ尿素溶液の密度が開始溶液に比べ高密度である尿素溶液をウイルスおよび／またはプリオンの不活性化成分として使用することを特徴とする、開始溶液を汚染している、ウイルスおよび／またはプリオンの分離および不活性化のための工程。
【請求項２】
高モル濃度尿素が、６Ｍ〜１０Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の工程。
【請求項３】
開始溶液と高モル濃度尿素溶液の間に介入した液体相も遠心管内に存在する、請求項１から２のいずれかに記載の工程。
【請求項４】
前記介入液体相が、１つ以上のサッカライド性質の基質を含む溶液である、請求項３に記載の工程。
【請求項５】
前記介入相が、６．５〜８の範囲のｐＨ、１．０〜１．３２ｇ／ｍｌの範囲の密度でのスクロースを含む溶液である、請求項３から４のいずれかに記載の工程。
【請求項６】
前記開始溶液が、生物学的物質、中間体または精製工程の最終産物、または合成溶液である、請求項１から５のいずれかに記載の工程。
【請求項７】
前記開始溶液が、１つ以上の、工業的に利益のある基質を含む、請求項１から６のいずれかに記載の工程。
【請求項８】
前記開始溶液が、閉経後尿またはそのものの中間体または最終精製産物であり、前記工業的に利益のある基質が、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）である、請求項１から７のいずれかに記載の工程。
【請求項９】
前記開始溶液を汚染している、ウイルスおよび／またはプリオンが、レトロウイルス、エンベロープまたは非エンベロープＲＮＡウイルス、エンベロープまたは非エンベロープＤＮＡウイルス、および感染性プリオンタンパク質の群に含まれる、請求項１から８のいずれかに記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的物質の汚染除去に関する。本発明は、ウイルスおよび／またはプリオン汚染除去のための新規工程を記載しており、分離および不活性化の原理に基づいている。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスまたはプリオン汚染が、生物学的物質の消毒に関する主要な問題を表していることは周知である。この問題は、とりわけ、ただしそれだけではないが、血液、尿または培養培地からの標的物質の精製に関する、下流の工業的工程で発生する。事実、標的分子が、化学的および非化学的処置に対して感受性が高い、一般的に、標的分子それ自身に傷害を与えることなしに、または少なくとも、工程の最終収率を非常に低いレベルまで減少させることなしに、厳しい条件の消毒手順を使用することは難しい。とりわけ、小さな非エンベロープ（ｎｏｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスおよび感染性プリオンタンパク質に関して、解決するのが非常に難しい問題が存在することが周知である。ウイルス汚染の場合、精製工程の安全性に寄与しうる、いくつかの手順が使用可能である。これらの手順は、不活性化または分離工程で、一般的に異なる。ウイルス不活性化工程の例は、熱処置（たとえば、低温殺菌、凍結乾燥／乾燥加熱）、界面活性剤として働く溶媒の使用、および高または低ｐＨ処置である。ウイルス分離工程の例は、沈殿工程（たとえば、エタノール、ポリエチレングリコール中）、クロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、逆相）およびナノ濾過である。
【０００３】
精製手順の消毒効果を証明するために、適切な評価研究を実施する必要がある。そのような研究には、手順の開始時点での、公知の量の感染性剤の物質への添加（「スパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）」）、および手順の終了時点での同一の薬剤の残余量の検出が含まれる。添加した（スパイクした）感染性薬剤量は、ログに基づき測定し、手順の精製効率を、病原体に関するＬｏｇ減少数で表記する。理想的には、規制の目的で、精製手順は、少なくとも１２〜１５Ｌｏｇの総ウイルス消毒効果を示すべきである。前記効果（総Ｌｏｇ減少）は、異なる原理にしたがう、少なくとも３つの異なる精製段階に基づくべきである。しかしながら、いくつかの精製工程では、上記手順が、工業規模での適用に制限があったり、標的分子に対して過酷であるので、そのような結果を得ることが難しい。
【０００４】
プリオン汚染を除去するのはさらに難しく、ほとんど報告されておらず、最近主要生物安全性の考慮を提起した。事実、その化学的性質および小さなサイズのために、プリオンは、ウイルスに効果を持つ、多くの種類の分離工程を避け、その不活性化を達成するのも非常に難しい。本質的なプリオン不活性化を誘導することが知られている工程には、高アルカリ溶液への暴露と、尿素誘導変性がある。しかしながら、そのような手順はしばしば、標的分子に対して有害であることが明らかになり、したがって、工業的な使用には適さない。
【０００５】
したがって、工業的に簡単に使用可能である工程に対する、明らかな要求が存在する。前記工程は、有用な標的分子の活性を維持したまま、ウイルスおよび／またはプリオンを含む溶液を、効果的に消毒可能であるべきである。  
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ここで、遠心管中の試験物質（開始溶液）の超遠心に基づく、ウイルスおよびプリオン汚染物の分離および不活性化のための新規方法を発見した。高モル濃度でかつ尿素溶液の密度が開始溶液に比べ高密度である尿素溶液を、遠心管の底に層状にし、この層の上に試験物質をのせる。好ましい実施様態において、ポリサッカライドを含む第三の溶液を、前記２つの溶液の間の界面に、クッションとして層化した。ｇ（重力加速度）値および時間での超遠心の後に、汚染粒子が管の底、尿素相内に沈殿し、不活性化が起こる。ついで汚染物のない試験物質が、上清として、選択的に取り除かれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、開始溶液を汚染している、プリオンおよび／またはウイルスを分離および不活性化するための工程である。本工程は、分離手順としての超遠心の使用と、不活性化成分として、遠心管の底に層状化した、高モル濃度でかつ尿素溶液の密度が開始溶液に比べ高密度である尿素の使用によって特徴づけられる。
【０００８】
語句「分離（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）」は、開始生物学的物質（たとえば溶液）の、前記開始物質中にともに混合された２つの成分が、選択的に分離される（本発明者らの場合、一方が標的タンパク質であり、他方が、ウイルス／プリオンである）、２つのサブフラクション内への、分離を意味する。
【０００９】
語句「不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、ウイルスおよびプリオンの感染能力の減少または削減を意味する。概略としては、手順には、底層として高モル濃度でかつ尿素溶液の密度が開始溶液に比べ高密度である尿素溶液、最上層として開始溶液を含む、層からなる液体系の遠心管中での調製が含まれる。遠心において、汚染剤は開始溶液中から出て、下方の尿素相中に沈殿し、そこで不活性化が起こる。本方法によって消毒された、開始溶液が分離され、必要に応じて使用可能である。
【００１０】
本工程の独特の特徴は、ウイルスおよび／またはプリオン汚染物の分離および不活性化両方を同時に達成することが可能であることである。事実、一般的に使用される精製段階では、分離または不活性化いずれかが達成されるが、両方の結果を得ることは不可能である。分離のみでは、非常に少量の汚染薬剤が疾患を引き起こしうるので、完全な消毒が保証することはできない。一般的に完了せず、有害でありうる汚染薬剤の免疫原性エピトープの持続のために、不活性化だけでは不十分である。本明細書で提案した新規方法では、簡単に適用可能な手順によって、分離および不活性化両方が提供される。しかしながら、同時分離および不活性化は、もっとも成功する計画のみを示しており、本発明はまた、分離のみ可能である物質／汚染物の場合にも有用である。
【００１１】
他の重要な態様は、開始溶液中におそらく含まれる工業的対象（本明細書では、「標的分子（ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」と表記する）と、変性力を持つ尿素溶液間での分子間の接触が最少であるか、または接触がないことである。この特徴により、開始溶液中に存在する標的分子の活性に障害を与えることなしに、汚染薬剤に対して、厳密な処理を実施することが可能である。
【００１２】
消毒を実施する開始溶液は、限定的ではないが、典型的には、血液、血清、尿または他の生理学的流体のような、ヒト起源の生物学的流体である。この溶液には、消毒過程の間に保存されなければならない標的分子が含まれる。標的分子は、薬理学的に活性な基質、たとえば、タンパク質（酵素類、サイトカイン類、ホルモン類）でありうる。標的ホルモンの例は、大量に、閉経後尿中に含まれるＦＳＨである。本手順は、尿から、および下流精製産物から、ドナーより由来するウイルス／プリオンを除去し、純粋な汚染されていない状態で、ＦＳＨまたは他の標的分子を回収するために使用可能である。
【００１３】
この工程は、医学的適用または天然の産物の精製に限定はされない。開始溶液は、いくつかの基質の工業的精製工程の中間体または最終産物、または化学合成または発酵工程の手順からの排出物などでも相当しうる。さらに、本手順は、本来液体の形態での試料の消毒には限定されず、液体中、とりわけ水性担体中に適切に可溶化可能である限り、任意の固体物質の処置が含まれる。得られた溶液を、本明細書で記載した手順にて、開始溶液として使用する。固体物質は、続いて、本技術分野でよく公知の技術による溶媒の除去によって、消毒された溶液から回収しうる。一般的に、ウイルスまたはプリオン負荷を含む溶液試料が、本発明の方法によって効果的に消毒される。
【００１４】
高モル濃度尿素溶液は、事実上４Ｍ〜１２Ｍ、好ましくは６Ｍ〜１０Ｍ、より好ましくは８Mの範囲の尿素濃度を含む溶液である。前記溶液は、ウイルスおよびプリオンに対して、高い不活性化力を持つことが特徴である。同時に、その高いモル数により、これらの溶液は、開始溶液に比べて高密度であり、より重い液体相を形成し、開始溶液とは分離し、試験チューブの底に層化可能である。本発明はまた、前記尿素溶液のものと同等の密度値および不活性化力を提供可能である、尿素以外の消毒基質の使用にも言及している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
好ましい実施様態において、本工程には、開始溶液と尿素溶液の間の中間密度を持つ、これら２つの溶液の間の中間液体層として位置する、第三の溶液（「緩和液（ｃｕｓｈｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」）の使用が含まれる。中間の密度を持つ前記緩和液には、サッカライド、塩、生理学的溶液成分、緩衝液などの不活性物質が含まれ、好ましくは、中性または生理学的ｐＨを特徴とする。本質的に、中間溶液中の溶質の役割は、密度を制御することであり、これによって、中間密度値が提供される。緩和液の有用な参照密度値には、限定はしないが、１．０〜１．３２ｇ／ｍｌの範囲が含まれる。語句「不活性（ｉｎｅｒｔ）」は、開始溶液と適合可能な溶質、すなわち、そのような溶液中に存在する有用な基質上で、望まない効果（変性、不活性化、沈殿など）がおこらないものを意味する。前記不活性サッカライド溶質は、モノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライドでありうる。とりわけ好ましい溶質は、たとえば、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の溶液として、１．０〜１．３２ｇ／ｍｌの範囲の密度で使用可能なサッカロースである。前記溶液は、開始溶液中に含まれるタンパク質にて、望まない効果を示さず、粒子沈殿を防止しない。さらに、サッカロースは、容易に水に溶ける利点がある。最終的に、安価で簡単に入手でき、したがって、大規模な工程で好適である。１０％  ｗ／ｖサッカロース濃度を実施例で使用したが、しかし、他のサッカロース濃度も、異なる試験物質に関して使用可能である。
【００１６】
緩和液の存在下、遠心を受ける液体系は、底にある尿素溶液、中間層としての緩和液、および最上層としての開始溶液の、三層からなる。遠心後、開始溶液を含んでいる上層が、中間層（「上試料（ｕｐｐｅｒ  ｓａｍｐｌｅ）」の一部分とともに除去され、中間層が、「下試料（ｌｏｗｅｒ  ｓａｍｐｌｅ）」からの尿素層とともに中間層として残る。本工程の好ましい実施様態において、下試料は、サッカロース層の三分の一と尿素層からなり、反対に上試料は、開始溶液と、サッカロース層の上三分の一からなる。
【００１７】
緩和液の使用によって、いくつかの利点が提供される。開始溶液と尿素層の間にバリアを形成することで、緩和液は、（高い変性活性を持つ）尿素溶液との境界に存在する標的分子の部分的不活性化のリスクを減少させる。工程の最後で、緩和液は、還流、またはチューブの底に形成される沈殿物の流動によって引き起こされる可能性の新たな汚染のリスクをへらす。最後に、工程の最後に、緩和液は、吸引による開始溶液の、簡単で定量的な回収の可能性を提供し、これによって、尿素層の部分の回収が防がれる。開始溶液と一緒の、中間層の部分の吸引によって、毒性学的問題は引き起こされず、溶液の有用な成分の不活性化は導かれず、処理時間の間に、存在するサッカロース層中で拡散しうる標的分子の画分の回収が可能になる。
【００１８】
一般的な超遠心が本工程で使用される。特別な、超遠心機器または遠心管の特徴は要求されない。遠心条件は、一般的には、０．５〜１０時間、好ましくは１〜６時間の長さで、２〜８℃の温度範囲での、５０．０００〜５００．０００ｇ（重力加速度）の範囲である。液体系の最終容量と比較して、開始溶液は、好ましくは、およそ７０％ｖ／ｖからなり、尿素溶液は、およそ１５％ｖ／ｖからなり、緩和液は、１５％ｖ／ｖからなる。
【００１９】
本明細書で請求している工程は、実験室から、工業スケールまで、任意のスケールでの超遠心が含まれる。本発明にしたがった工程はまた、異なる構造によって特徴づけることができるが、機能的には、超遠心および遠心管と等しい、器具の使用を含む。
【００２０】
本明細書で記載した工程は、任意のウイルスおよびプリオンの分離および不活性化に広く適用可能である。本発明にしたがって、分離／不活性化可能であるウイルスには、限定はしないが、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、レトロウイルスなどが含まれる。レトロウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、エンベロープＲＮＡウイルスの例は、ウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、非エンベロープＤＮＡウイルスの例は、マウス極小ウイルス（ＭＶＭ）であり、非エンベロープＲＮＡウイルスの例は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）である。プリオンの例は、ハムスタースクレピータンパク質（ＰｒＰＳｃ）２３６Ｋである。
【００２１】
本発明は、限定することなしに、以下の実施例によって本明細書にて例示される。
【００２２】
(実施例)
材料と方法
１．  開始溶液の選択
開始溶液は、潜在的なウイルスまたはプリオン汚染を含む生物学的試料からの、精製工程の最終産物の代表として選択した。さらに、開始溶液は、好適な量の標的分子を含むべきである。
【００２３】
したがって、本発明者らは、ヒト卵胞に多く濃縮される、閉経後尿からの精製工程の最終産物−刺激ホルモン（ＦＳＨ）を選択した。事実、ＦＳＨは、複合ヘテロ二量性糖タンパク質であり、その構造および機能は、厳しい下流処置によって簡単に傷害をうけ、したがって、もっとも代表的な例として選択した。
【００２４】
より特には、本発明者らは、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、ラットでのｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的アッセイによって測定した、ｍｇタンパク質あたり、６５７８ＩＵの予想ＦＳＨ活性、およびＥＩＡによって測定した、ｍｇタンパク質あたり、５８９３ＩＵの予想ＦＳＨ活性を含む、閉経後尿からの精製バッチを使用した。ラットにおける生物学的アッセイは、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）にて記載されたように実施した。
【００２５】
本手順の消毒効率を試験するために、「スパイキング」として公知の工程で、本試験のために適切に選択した、感染性薬剤の公知量を、本物質に加えた。
２．  緩和液の調製
本発明者らは、以下の実施例で、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中のサッカロースの溶液を、緩和液として使用した。サッカロース溶液は、１０％ｗ／ｖであった。
３．  素溶液の調製
本発明者らは、８Ｍ尿素溶液を調製し、使用した。
４．  遠心管の調製
公知の量の感染性薬剤を加えた（スパイキング）７．０ｍｌの開始溶液を、１２．０ｍｌの用量のある遠心管に入れた。ついで、緩和液（１．５ｍｌ）を、蠕動ポンプに連結したガラスキャピラリーを用いて、管の底に置き、上記溶液中で完全に沈殿させた。最後に、１．５ｍｌの８Ｍ  尿素溶液を、同様の手順にて、管の底にしいた。
５．  遠心条件
以下の実施例において、本発明者らは、４℃にて４時間、２５０．０００×ｇの固定加速度を使用した。試験したすべての感染性粒子が、この加速度／時間で完全に沈殿することが予想される。したがって、これらの条件を使用して、遠心の間およびその回収の間の、相の安定性を試験した。必要ならば、残った相を、すべての実験の最後まで分離したままにした。
【００２６】
本発明者らは、１２．０ｍｌポリエチレン管を備える、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＴＨ６４１スウィングバケットローターを用いた。
６．  試験試料の不活性化および回収の工程
サイクルの最後に、本発明者らは、試験試料を含む相に相当する上層７．５ｍｌ、および０．５ｍｌのサッカロース相（上試料）を吸引することで回収した。沈殿物を、残っている２．５ｍｌ中で、２．０ｍｌプラスチックピペットで、ピペッティングを繰り返して再懸濁させ、分離して回収した（下試料）。
【００２７】
細胞感染アッセイに関して、高モル尿素が胞毒性であるので、下試料をさらに以下のように試験した。２．５ｍｌ試料を、組織培養培地にて、１：１０に希釈して、最終容量２５ｍｌとした。ついで、２０分間、５００．０００×ｇにて超遠心した。最後に、沈殿物を、２．５ｍｌの組織培養培地に再懸濁した。
７．  工程前後の標的分子の活性の査定
上記条件下での遠心後、標的分子の保存を確認するために、ＦＳＨ対照試料を含む、非スパイク管（すなわち、ＦＳＨ試験を不可能にするか、信頼できなくした、可能性のある感染性剤を添加しないもの）を、スパイク管に関して記載したように調製した。遠心後、非スパイク試験チューブからの上および下試料を、ラットでのｉｎ  ｖｉｖｏ試験によって、およびＥＩＡによって、ＦＳＨ活性に関して試験した。ＦＳＨ活性が、下試料では検出不可能なままである一方で、上試料中で変化しなかったことが発見された（それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験およびＥＩＡにて、９７％および１０４％）。
８．８  試験ウイルスおよびプリオンの選択
以下のウイルスを選択し、試験した。
【００２８】
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）をレトロウイルスの例として選択した。
【００２９】
ウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ヒトＣ型肝炎ウイルスに関するモデルウイルスを、エンベロープＲＮＡウイルスの例として選択した。
【００３０】
マウス極小ウイルス（ＭＶＭ）、パルボウイルスＢ１９に関するモデルウイルスを、非エンベロープＲＮＡウイルスの例として選択した。
【００３１】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を、非エンベロープＲＮＡウイルスの例として選択した。
【００３２】
さらに、ハムスタースクレピータンパク質（ＰｒＰＳｃ）２３６Ｋを、病原性プリオンタンパク質の例示として選択した。
【実施例１】
【００３３】
ＨＩＶ−１の分離／不活性化
本発明者らは、ＭＴ４細胞における定量的アッセイによって決定したように、２．６３＊１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（組織培養感染用量５０％／ミリリットル）のタイターで、ＨＩＶ−１ストック、Ｌａｉ株を使用した。０．４ｍｌのウイルスストックの分液を、１９．６ｍｌのＦＳＨ溶液に加え、総容量２０ｍＬにし、５．２６＊１０６の理論的感染タイターを達成した。スパイク溶液の効果的なウイルス力価を、ＭＴ４細胞上での定量的アッセイによって測定し、４．６７＊１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるとわかった。
【００３４】
７．０ｍｌのスパイク溶液の分液を遠心管に入れ、先に記載したように、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１０％ｗ／ｖサッカロース、１．５ｍｌ、および１．５ｍｌの８Ｍ尿素をしいた（試験チューブ）。
【００３５】
第二管を同様の方法で調製し、非遠心対照として使用した（対照チューブ）。
【００３６】
試験チューブを、４℃にて４時間、２５０．０００×ｇで遠心し、ついで上および下試料を回収し、先に記載した条件および手順にしたがって試験した。
【００３７】
同様に、対照チューブから上および下試料を回収した。
【００３８】
試験および対照チューブ両方から回収した、上および下試料を、ウイルス感染性に関してアッセイした。
【００３９】
ＭＴ４細胞における定量的アッセイの結果：遠心後、試験チューブ中で見られたウィルス力価は、上および下試料両方で、検出限界以下であり、このことは、下試料において、完全な分離および不活性化が達成されたことを示している。分離および不活性化に関する得られたＬｏｇ減少は、それぞれ、４．９８Ｌｏｇおよび５．４６Ｌｏｇであった。
【００４０】
対照チューブは、上試料中で全ウイルス活性を維持し、一方、下試料では、わずかな感染性しか検出されず、これはおそらく、４時間のインキュベーション期間中の、サッカロース相中のウイルスの最小分散による。
【００４１】
表１は、実施例１で得られた結果の要約を示している。
【００４２】
【表１】
0004610409.tif 000002
【実施例２】
【００４３】
ＢＶＤＶの分離／不活性化
本発明者らは、ＭＢＤＫ細胞におけるアガロースプラークアッセイによって決定したように、１．５３＊１０７  プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのタイターで、ＨＩＶ−１ストック、ＮＡＤＬ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）を使用した。０．２ｍｌのウイルスストックの分液を、１９．８ｍｌのＦＳＨ溶液に加え、総容量２０ｍＬにし、１．５３＊１０５の理論的感染タイターを達成した。スパイク溶液の効果的なウイルス力価を、ＭＢＤＫ細胞上でのアガロースプラークアッセイによって測定し、２．３＊１０５ＰＦＵ／ｍｌであるとわかった。
【００４４】
７．０ｍｌのスパイク溶液の分液を遠心管に入れ、先に記載したように、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１０％ｗ／ｖサッカロース、１．５ｍｌ、および１．５ｍｌの８Ｍ尿素をしいた（試験チューブ）。
【００４５】
第二管を同様の方法で調製し、非遠心対照として使用した（対照チューブ）。試験チューブを、４℃にて４時間、２５０．０００×ｇで遠心し、ついで上および下試料を回収し、先に記載した条件および手順にしたがって試験した。
【００４６】
同様に、対照チューブから上および下試料を回収した。
【００４７】
試験および対照チューブ両方から回収した、上および下試料を、ウイルス感染性に関してアッセイした。
【００４８】
ＭＢＤＫ細胞における定量的アッセイの結果：遠心後、試験チューブの上試料中で見られたウイルス力価は、検出限界以下であり、このことは、下試料において、完全な分離および不活性化が達成されたことを示している。試験チューブの下試料中で回収された総感染性は、適用した量よりもあきらかに下であり、このことは、有意な不活性化が起こったことを示している。分離および不活性化に関する得られたＬｏｇ減少は、それぞれ、５．０８Ｌｏｇおよび３．１８Ｌｏｇであると計算された。
【００４９】
対照チューブは、上試料中で全ウイルス活性を維持し、一方、下試料では、わずかな感染性しか検出されず、これはおそらく、４時間のインキュベーション期間中の、サッカロース相中のウイルスの最小分散による。
【００５０】
表２は、実施例２で得られた結果の要約を示している。
【００５１】
【表２】
0004610409.tif 000003
【実施例３】
【００５２】
ＭＶＭの分離／不活性化
本発明者らは、Ａ９細胞におけるアガロースプラークアッセイによって決定したように、３．２７＊１０９  プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのタイターで、ＭＶＭストック、プロトタイプ株を使用した。１９．８ｍｌのＦＳＨ溶液分液を、０．２ｍｌのウイルスストックでスパイクし、総容量２０ｍＬにし、３．２７＊１０７の理論的感染タイターを達成した。スパイク溶液の効果的なウイルス力価を、Ａ９細胞上でのアガロースプラークアッセイによって測定し、５．７５＊１０７ＰＦＵ／ｍｌであるとわかった。
【００５３】
７．０ｍｌのスパイク溶液の分液を遠心管に入れ、先に記載したように、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１０％ｗ／ｖサッカロース、１．５ｍｌ、および１．５ｍｌの８Ｍ尿素をしいた（試験チューブ）。
【００５４】
第二管を同様の方法で調製し、非遠心対照として使用した（対照チューブ）。試験チューブを、４℃にて４時間、２５０．０００×ｇで遠心し、ついで上および下試料を回収し、先に記載した条件および手順にしたがって試験した。
【００５５】
同様に、対照チューブから上および下試料を回収した。
【００５６】
試験および対照チューブ両方から回収した、上および下試料を、ウイルス感染性に関してアッセイした。
【００５７】
Ａ９細胞における定量的アッセイの結果：遠心後、試験チューブの上試料中で見られたウイルス力価は、検出限界以下であり、このことは、下試料において、完全な分離および不活性化が達成されたことを示している。試験チューブの下試料中で回収された総感染性は、適用した量よりもあきらかに下であり、このことは、有意な不活性化が起こったことを示している。分離および不活性化に関する得られたＬｏｇ減少は、それぞれ、７．０５Ｌｏｇおよび６．０２Ｌｏｇであると計算された。
【００５８】
対照チューブは、上試料中で全ウイルス活性を維持し、一方、下試料では、わずかな感染性しか検出されず、これはおそらく、４時間のインキュベーション期間中の、サッカロース相中のウイルスの最小分散による。
【００５９】
表３は、実施例３で得られた結果の要約を示している。
【００６０】
【表３】
0004610409.tif 000004
【実施例４】
【００６１】
ＨＡＶの分離／不活性化
本発明者らは、Ｆｒｈｋ−４細胞におけるアガロースプラークアッセイによって決定したように、２．７＊１０９  プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのタイターで、ＨＡＶストック、ＨＭ株を使用した。
【００６２】
１９．８ｍｌのＦＳＨ溶液分液を、０．２ｍｌのウイルスストックでスパイクし、総容量２０ｍＬにし、２．７０＊１０７の理論的感染タイターを達成した。
【００６３】
スパイク溶液の効果的なウイルス力価を、Ｆｒｈｋ−４細胞上でのアガロースプラークアッセイによって測定し、３．８２＊１０７ＰＦＵ／ｍｌであるとわかった。
【００６４】
７．０ｍｌのスパイク溶液の分液を遠心管に入れ、先に記載したように、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１０％ｗ／ｖサッカロース、１．５ｍｌ、および１．５ｍｌの８Ｍ尿素をしいた（試験チューブ）。
【００６５】
第二管を同様の方法で調製し、非遠心対照として使用した（対照チューブ）。試験チューブを、４℃にて４時間、２５０．０００×ｇで遠心し、ついで上および下試料を回収し、先に記載した条件および手順にしたがって試験した。
【００６６】
同様に、対照チューブから上および下試料を回収した。
【００６７】
試験および対照チューブ両方から回収した、上および下試料を、ウイルス感染性に関してアッセイした。
【００６８】
Ｆｒｈｋ−４細胞における定量的アッセイの結果：遠心後、試験チューブの上試料中で見られたウイルス力価は、検出限界以下であり、このことは、下試料において、完全な分離および不活性化が達成されたことを示している。不活性化の程度は、先の実施例よりも明らかに低いけれども、試験チューブの下試料中で回収された総感染性が、不活性化が起こったことを示唆している。分離および不活性化に関する得られたＬｏｇ減少は、それぞれ、６．８８Ｌｏｇおよび１．４９Ｌｏｇであると計算された。
【００６９】
対照チューブは、上試料中で全ウイルス活性を維持し、一方、下試料では、わずかな感染性しか検出されず、これはおそらく、４時間のインキュベーション期間中の、サッカロース相中のウイルスの最小分散による。
【００７０】
表４は、実施例４で得られた結果の要約を示している。
【００７１】
【表４】
0004610409.tif 000005
【実施例５】
【００７２】
ＰｒＰＳｃの分離／不活性化
ハムスター適合薬剤２３６Ｋを感染させたハムスターからの脳を用いて、１０％スクレピー脳ホモジネート（ＳＢＨ）を調製し、Ｌｅｅ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｏｓ  ２０００；８４：７７−８９）によって記載されたように処置した。２０ｍｌの試験溶液を、ＳＢＨにて、１％でスパイクした。
【００７３】
参照希釈系列を、０．５ｌｏｇの増加にて、ＢＳＡ中のスパイク溶液を希釈することによって調製した。
【００７４】
７．０ｍｌのスパイク溶液の分液を遠心管に入れ、先に記載したように、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１０％ｗ／ｖサッカロース、１．５ｍｌ、および１．５ｍｌの８Ｍ尿素をしいた（試験チューブ）。
【００７５】
第二管を同様の方法で調製し、非遠心対照として使用した（対照チューブ）。
【００７６】
試験チューブを、４℃にて４時間、２５０．０００×ｇで遠心し、ついで上および下試料を回収し、先に記載した条件および手順にしたがって試験した。
【００７７】
同様に、対照チューブから上および下試料を回収した。
【００７８】
試験および対照チューブ両方から回収した、上および下試料を、ＰｒＰＳｃの存在に関して、Ｌｅｅ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｏｓ  ２０００；８４：７７−８９）にしたがって、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）によってアッセイした。
【００７９】
ウイルス感染性に関してアッセイした。
【００８０】
ウエスタンブロッティングアッセイの結果：参照希釈ＷＢアッセイによって、０〜４．５ｌｏｇの希釈範囲での、可視ＰｒＰバンドが産出された。
【００８１】
試験チューブの上および下試料両方が、試験したどの希釈でもＷＢにて陰性であった。対照チューブの上試料が、試験した全希釈範囲でも、ＷＢによって陽性であった。対照チューブの下試料は、１．０Ｌｏｇの希釈まで、ＷＢにて陽性であることがわかり、これはおそらく、４時間のインキュベーション時間の間、サッカロース相中のＰｒＰＳｃの分散による。
【００８２】
簡単に記すと、完全な分離が、本方法の検出限界に対して観察され、感染負荷の４．５Ｌｏｇの減少に相当している。同様に、ＷＢ反応性が、試験チューブの下試料でさえも検出されなかったので、検出限界までの完全な不活性化が起こり、これはまた、感染負荷の４．５ｌｏｇ減少に相当する。