(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが光硬化した親水性樹脂中に均質分散保持された微小構造物を少なくとも一部に配置した流路を備えた、免疫分析マイクロチップ。
【請求項２】
前記微小構造物が、前記微細ビーズが懸濁した親水性光硬化性樹脂溶液に対する露光処理により任意の形にパターニングされたものであることを特徴とする、請求項１記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項３】
前記微小構造物が、親水性光硬化性樹脂溶液に対する露光処理によりパターニングされた微小構造の周囲に、さらに導入された一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性樹脂溶液に対する露光処理によりパターニングされたものであることを特徴とする、請求項１記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項４】
前記流路は、一次抗体が表面に固相化された色調の異なる微細なビーズが分散保持された微小構造物が、流路方向に沿って順に配置されたものであることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項５】
前記流路は、基板上に形成された溝と、開口部を少なくとも含むカバープレートによって形成されたものであることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項６】
前記流路は、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下で、かつ毛細管現象により導入された液体を流路方向に流下可能な流路断面積の領域を少なくとも一部に含むものであることを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項７】
前記流路は、開口部を少なくとも含む毛細管の内面によって区画された空間であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項８】
前記流路は、直径が５０μm以上１０００μm以下の円柱状又は一辺が５０μm以上１０００μm以下の角柱状であり、開口部を少なくとも含む毛細管内面によって区画された空間であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項記載の免疫分析マイクロチップ。
【請求項９】
前記請求項１〜８の何れか１項記載の免疫分析マイクロチップと、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液、洗浄液、及び基質を含む試薬溶液が、該マイクロチップの流路に導入可能に同梱された、免疫分析用キット。
【請求項１０】
流路を少なくとも１つ含む基板を準備する工程、
一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性樹脂溶液を導入し、毛細管現象により前記流路内に該親水性光硬化性樹脂溶液を充填する工程、
前記流路内に充填された前記親水性光硬化性樹脂溶液の少なくとも一部に対して、任意のパターンのフォトマスクを用いて露光を行う工程、
露光により硬化した領域を残し他の領域における未硬化の前記親水性光硬化性樹脂溶液を前記流路から除去し、さらにブロッキング溶液を流路に導入する工程、
少なくとも被検出物質である抗原と、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液を前記流路内に順に又は同時に導入する工程、
洗浄後、基質を含む試薬溶液を前記流路内に導入する工程、
所定時間後に該二次抗体又は該抗原と該基質との反応生成物質の存在を検出する工程
とを少なくとも含む、微小構造物が配設された流路を含む検査チップを用いた免疫分析方法。
【請求項１１】
前記流路は、開口部を含み、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記流路は、基板上に形成された、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下の上部開放の溝であり、少なくとも開口部を含むカバープレートにより覆われることによって形成されるものであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記流路は、開口部を含み、５０μm以上１０００μm以下の円柱状又は一辺が５０μm以上１０００μm以下の角柱状の細管の内面によって区画された空間であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫分析マイクロチップ及びそのマイクロチップを用いた免疫分析方法に関する。詳しくは、微細ビーズが均質に分散保持された親水性光硬化性樹脂溶液に露光処理を施すことにより、免疫分析用微小構造を微小流路中に形成した免疫分析マイクロチップ又は免疫分析キット、さらにはそのマイクロチップを用いた免疫分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板上に形成されたマイクロチャネル中に、抗体を表面に固定したビーズ体を導入し、該導入されたビーズ体をせき止め部によりせき止め、免疫分析用カラムとして用い、せき止め部を越えて流れる酵素反応生成物を熱レンズ顕微鏡等の分析ユニットにより分析する酵素免疫分析チップと酵素免疫分析方法が記載されている。（特許文献１参照のこと。）【０００３】
これにより、従来のマイクロタイタープレートを用いての免疫分析法に比べ、検体量を大幅に低減でき、取り扱いが簡便で検出に要する時間も短縮できるようになった。【０００４】
一方、親水性硬化性樹脂、光重合開始剤、及びアルカリ金属または多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類を含んでなる液状組成物を、アルカリ金属または多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化し、活性光線を照射して硬化せしめてなる微生物の付着に適した表面を有する微生物菌体固定化用粒状担体が知られている。（特許文献２参照のこと。）【０００５】
また、マイクロチャネル内の細胞を含む溶液中に光架橋レジン滴を分散し、顕微鏡を用いて所望の細胞を選択し、その周囲にレーザ光を照射することによって、周囲の光架橋レジンを局所的に光重合し、該選ばれた細胞のみをマイクロチップ中に固定化する、単一細胞レベル実験用の局所的光重合を適用したマイクロチップ内単一細胞固定化技術が知られ、さらに照射時間と硬化レジンの径の関係についても知見が得られている。（非特許文献１参照のこと。）
【特許文献１】国際公開第２００３／０６２８２３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／１９９７８号パンフレット
【非特許文献１】Maruyama,H.,外３名,"Immobilisation of individual cells by local photo-polymerisation on a chip","The Analyst"，The Royal Society of Chemistry, 2005年1月31日，(2005),130,p.304-310
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１のようにマイクロチャネルを用いることで、検体量を大幅に低減できるようになったものの、その反面、検体量が小さくなったが故に反応生成物量も極端に少なくなり、その分析には熱レンズ顕微鏡といった特殊な分析機器を必要とするようになり、適用できる環境には自ずと限界があった。【０００７】
かかる技術的課題を解決する一つの方向性としては、反応効率を向上させて、少ない検体量であっても十分な量の反応生成物を生成させることであるが、反応効率を向上させるためには、反応面積を大きくすることが要請され、ビーズ径を更に小さくする必要がある。【０００８】
ところが、さらにビーズ径を小さくした場合、ビーズ自体の取り扱い（例えば、堰部までビーズを導入しカラムを形成すること）が一層困難になることはもちろんのこと、かかる小径のビーズが多数詰まったマイクロチャネル中に、検体等の液体を流すことは、ビーズ間の隙間長からみて明らかなように、流路抵抗は非常に大きく、処理液を流下させることができなくなると予想された。【０００９】
一方、特許文献２や非特許文献１のように、微生物や細胞を個別にビーズ状の親水性光硬化性樹脂中に固定化する技術は知られているものの、抗体が固定された微細ビーズを、マイクロチャネル内部に低流路抵抗を維持した状態で反応相としてカラム化することについては、何ら教示するところがない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、発明者らは、流路抵抗を実用的な範囲に抑えつつ、微小ビーズのカラムを構築する手法について模索した結果、マイクロチャネルの断面を流路部とビーズを均質分散保持したカラム部に区分することにより、流路抵抗を抑える手法に思い至った。【００１１】
しかしながら、ビーズを均一分散保持したカラム部の親水性が低い場合には、検体等の液体を流下することはできても、カラムとしての機能はほとんど失われてしまうので、カラム部と流路部との間で液の浸透・拡散が可能な程度の高い親水性を保った状態の三次元構造物を構築する手法が要請された。【００１２】
しかも、免疫分析用のマイクロチャネルにおける問題は、抗体等の変性を避ける観点からビーズ等の導入後高温処理等ができないため、流路形成時に所望のカラム等を作り込んでおくことが難しく、その一方で、マイクロチャネルを形成した後に、該マイクロチャネル内にビーズを均質分散保持したカラム等の三次元構造物を事後的に製作することも相当難しい。【００１３】
発明者らは、マイクロチャネルを形成した後に三次元構造物を構築するために、まず、代表的な三次元塑造技術である光硬化性樹脂に対する露光処理によるリソグラフィー技術を応用することについて検討した。しかし通常の光硬化性樹脂溶液を用いただけでは、所望の三次元構造物をマイクロチャネル内に構築することはできても、本来のビーズカラムとしての機能を発揮しないことが判明した。【００１４】
そこで、発明者らは、流路部とビーズカラム部間で十分な物質移動を可能にするために、三次元構造外形を維持できる範囲で緩くビーズを保持できる硬化処理について、光硬化性樹脂溶液の希釈割合と露光条件並びに三次元構造について模索した。【００１５】
その結果、３０％を越えて希釈された、一次抗体を固相化したビーズを懸濁した光硬化性樹脂溶液にあっても、遠心分離処理等を経ても崩れることのない、外径４０μｍ程度、高さ１００μｍ程度の円柱構造を形成できることを確認した。そして、マイクロチャネル内には、各カラム間の流路が確保されたため、三次元構造物の作り込みによる流路抵抗の増大は軽微で、ほとんど操作に支障とはならないことを確認した。【００１６】
本発明（１）は、一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが光硬化した親水性樹脂中に均質分散保持された微小構造物を少なくとも一部に配置した流路を備えた、免疫分析マイクロチップである。
本発明（２）は、前記微小構造物が、前記微細ビーズが懸濁した親水性光硬化性樹脂溶液に対する露光処理によりパターニングされたものであることを特徴とする、本発明（１）の免疫分析マイクロチップである。
本発明（３）は、前記微小構造物が、親水性光硬化性樹脂溶液に対する露光処理によりパターニングされた微小構造の周囲に、さらに導入された一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性樹脂溶液に対する露光処理によりパターニングされたものであることを特徴とする、本発明（１）の免疫分析マイクロチップである。
本発明（４）は、前記流路は、色調の異なる微細ビーズが分散保持された微小構造物が、流路方向に沿って順に配置されたものであることを特徴とする、本発明（１）〜本発明（３）の何れか１発明の免疫分析マイクロチップである。
本発明（５）は、前記流路は、基板上に形成された溝と、開口部を少なくとも含むカバープレートによって形成されたものであることを特徴とする、本発明（１）〜本発明（４）の何れか１発明の免疫分析マイクロチップである。
本発明（６）は、前記流路は、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下で、かつ毛細管現象により導入された液体を流路方向に流下可能な流路断面積の領域を少なくとも一部に含むものであることを特徴とする、本発明（１）〜本発明（５）の何れか１発明の免疫分析マイクロチップである。
本発明（７）は、前記流路は、開口部を少なくとも含む毛細管の内面によって区画された空間であることを特徴とする、本発明（１）〜本発明（４）の何れか１発明の免疫分析マイクロチップである。
本発明（８）は、前記流路は、直径が５０μm以上１０００μm以下の円柱状又は一辺が５０μm以上１０００μm以下の角柱状であり、開口部を少なくとも含む毛細管の内面によって区画された空間であることを特徴とする、本発明（１）〜本発明（４）の何れか１発明の免疫分析マイクロチップである。
本発明（９）は、本発明（１）〜（８）の何れか１発明の免疫分析マイクロチップと、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液、洗浄液、及び基質を含む試薬溶液が、該マイクロチップの流路に導入可能に同梱された、免疫分析用キットである。
本発明（１０）は、流路を少なくとも１つ含む基板を準備する工程、
一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性樹脂溶液を導入し、毛細管現象により前記流路内に該親水性光硬化性樹脂溶液を充填する工程、
前記流路内に充填された前記親水性光硬化性樹脂溶液の少なくとも一部に対して、任意のパターンのフォトマスクを用いて露光を行う工程、
露光により硬化した領域を残し他の領域における未硬化の前記親水性光硬化性樹脂溶液を前記流路から除去し、さらにブロッキング溶液を流路に導入する工程、
少なくとも被検出物質である抗原と、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液を前記流路内に順に又は同時に導入する工程、
洗浄後、基質を含む試薬溶液を前記流路内に導入する工程、
所定時間後に該二次抗体又は該抗原と該基質との反応生成物質の存在を検出する工程
とを少なくとも含む、微小構造物が配設された流路を含む検査チップを用いた免疫分析方法である。
本発明（１１）は、前記流路は、開口部を含み、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、本発明（１０）の方法である。
本発明（１２）は、前記流路は、基板上に形成された、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下の上部開放の溝であり、少なくとも開口部を含むカバープレートにより覆われることによって形成されるものであることを特徴とする、本発明（１０）の方法である。
本発明（１３）は、前記流路は、開口部を含み、５０μm以上１０００μm以下の円柱状又は一辺が５０μm以上１０００μm以下の角柱状の毛細管の内面によって区画された空間であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、本発明（１０）の方法である。【００１７】
ここで、本発明における親水性光硬化性樹脂溶液とは、１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂（ａ）、光重合開始剤（ｂ）を含んでなる水性液状組成物のことをいう。【００１８】
詳細には、上記親水性光硬化性樹脂（ａ）は、一般に、３００〜３００００、好ましくは５００〜２００００の範囲内の数平均分子量を有し、水性媒体中に均一に分散するに充分なイオン性又は非イオン性の親水性基、例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、エーテル結合等を含み、かつ波長が約２５０〜約６００ｎｍの範囲内の活性光線を照射したとき、硬化して水に不溶性の樹脂に変わるものが好適に使用される。そのような光硬化性樹脂としては、包括固定化用の固定化担体として既に知られているものを用いることができる（例えば、特公昭５５−４０号公報、特公昭５５−２０６７６号公報、特公昭６２−１９８３７号公報等参照）。【００１９】
代表的なものとしては以下に記載するものを挙げることができる。
（ｉ）ポリアルキレングリコールの両末端に光重合可能なエチレン性不飽和基を有する化合物：例えば、
・分子量４００〜６０００のポリエチレングリコール１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸２モルでエステル化したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、
・分子量２００〜４０００のポリプロピレングリコール１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸２モルでエステル化したポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、
・分子量４００〜６０００のポリエチレングリコール１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物２モルでウレタン化し、次いで（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の不飽和モノヒドロキシエチル化合物２モルを付加した不飽和ポリエチレングリコールウレタン化物、
・分子量２００〜４０００のポリプロピレングリコール１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物２モルでウレタン化し、次いで（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の不飽和モノヒドロキシ化合物２モルを付加した不飽和ポリプロピレングリコールウレタン化物、など。
（ii）高酸価不飽和ポリエステル樹脂：不飽和多価カルボン酸を含む多価カルボン酸成分と多価アルコールとのエステル化により得られる酸価が４０〜２００の不飽和ポリエステルの塩類など。
（iii）高酸価不飽和エポキシ樹脂：エポキシ樹脂と（メタ）アクリル酸などの不飽和カルボキシル化合物との付加反応物に残存するヒドロキシル基に酸無水物を付加して得られる酸価４０〜２００の不飽和エポキシ樹脂など。
（iv）アニオン性不飽和アクリル樹脂：（メタ）アクリル酸及び（メタ）アクリル酸エステルから選ばれる少なくとも２種の（メタ）アクリル系モノマーを共重合させて得られるカルボキシル基、リン酸基及び／又はスルホン酸基を含有する共重合体に光重合可能なエチレン性不飽和基を導入した樹脂など。
（ｖ）不飽和ポリアミド：トリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネートなどのジイソシアネートとアクリル酸２−ヒドロキシエチルなどのエチレン性不飽和ヒドロキシ化合物との付加物をゼラチンなどの水溶性ポリアミドに付加反応させた不飽和ポリアミドなど。
(vi)  不飽和ポリビニルアルコール樹脂：平均重合度300−5000、平均ケン化度が７０％以上のポリビニルアルコール樹脂とN-ヒドロキシアルキル（メタ）アクリルアミドとの縮合により重合性不飽和基が導入された樹脂。N-ヒドロキシアルキル（メタ）アクリルアミドとしては例えば、N-メチロールアクリルアミド、N-メチロールメタクリルアミド、N,N-ジメチロールアクリルアミド、N,N-ジメチロールメタクリルアミド、N-ヒドロキシエチルアクリルアミド、N-ヒドロキシエチルメタクリルアミドなどが挙げられる。
以上に例示した如き光硬化性樹脂はそれぞれ単独で使用することができ、或いは２種もしくはそれ以上組み合わせて使用してもよい。【００２０】
これらの光硬化性樹脂のうち、本発明において特に有利に使用しうるものは、前記（ｉ）のポリアルキレングリコールの両末端に光重合可能なエチレン性不飽和基を有する化合物などであり、代表的なものとしては、関西ペイント株式会社からＥＮＴ−１０００、ＥＮＴ−２０００、ＥＮＴ−３４００、ＥＮＴＧ−１０００、ＥＮＴＧ−２０００、ＥＮＴＧ−３８００、ＥＮＴＰ−２０００、ＥＮＴＰ−４０００、ＥＮＴＶ−５００等の商品名で販売されているものを挙げることができる。【００２１】
光重合開始剤（ｂ）は、光照射により分解してラジカルを生成し、このものが重合開始種となって重合性不飽和基を有する樹脂間に橋かけ反応をおこさせるものであり、例えば、ベンゾインなどのα−カルボニル類；ベンゾインエチルエーテルなどのアシロインエーテル類：ナフトールなどの多環芳香族化合物類；メチルベンゾインなどのα−置換アシロイン類；２−シアノ−２−ブチルアゾホルムアミドなどのアゾアミド化合物類などを挙げることができる。【００２２】
上記（ａ）及び（ｂ）の各成分の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種類等に応じて広範にわたって変えることができるが、一般には、（ａ）成分の親水性光硬化性樹脂１００質量部に対し、光重合開始剤（ｂ）は０.１〜５質量部、好ましくは０．３〜３質量部の割合で使用するのが適当である。【００２３】
なお、一次抗体を固相化するビーズには、ポリスチレン、ガラス、ラテックス、アガロースなどを用いることが可能である。また、磁性、色素含有、蛍光色素含有ビーズや表面がカルボキシル基、アミノ基、エポキシ基などが表面処理されたビーズを用いることが可能である。粒径は０．１μｍから５０μｍ程度のものを用いることができる。【００２４】
なお、標識方法にはペルオキシダーゼの他に、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼなどの酵素を用いることができる。さらに、その発色基質を選択することにより、蛍光、化学発光、有色などの発色を得ることができる。また、標識方法として金コロイドや量子ドットなどのナノ材料などを用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の微小構造物の製作に用いたフォトマスクの一例（拡大写真）を示す図
【図２】本発明のマイクロチャネル内部における微小構造物の配置の一例を示す図
【図３】本発明の一次抗体が固相化されたビーズが親水性光硬化性樹脂に均質分散保持された微小構造物（拡大写真）の一例を示す図
【図４】本発明のビーズ色の異なる微小構造物を流路方向に配置したマイクロチャネルの一例を示す図
【図５】本発明のマイクロチップにおける発色状態の一例を示す図
【図６】本発明のマイクロチップのレイアウトの一例を示す模式図
【図７】本発明の流路を複数配置したマイクロチップの一例を示す模式図
【図８】本発明の実施例１にかかる心疾患マーカーBNPについての濃度検量線の一例を示す図
【図９】本発明の実施例２にかかるプリオンタンパク質rPrPについての濃度検量線の一例を示す図
【図１０】本発明の実施例３にかかるキャピラリーチューブ内に三次元微小構造物を配置したマイクロチップの一例を示す模式図
【図１１】本発明の実施例３にかかるマイクロチップの顕微鏡写真
【符号の説明】
【００２６】
Ｃ    光硬化性樹脂が光硬化して形成された微小構造物
Ｂ    一次抗体が表面に固相化されたビーズ粒子
ＦＰ  流路部
１    チップ本体
２    メイン流路
３    サブ流路
４    サブ流路
５    カラム領域
６    洗浄液用リザーバータンク
７    二次抗体溶液用リザーバータンク
８    廃液用タンク
９    ダイヤフラム
１０  ダイヤフラム
１１  試料導入口
１２  試料等導入口
１３  試料等排出口
１４  検出窓
１５  キャピラリーチューブ
１６  開放端部
１７  三次元構造物
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
<光硬化性樹脂溶液の調製>
光硬化性樹脂原液（関西ペイント製商品名：ＥＮＴ−２０００）：１００μＬに、水１００μＬと開始剤ベンゾインエチルエーテル２μＬを混合して、本発明に用いる光硬化性樹脂溶液とした。ここで、水による希釈は、該溶液をマイクロチャネル中に導入時の粘性を低減しつつ、光硬化後ゲルの親水性を向上させるためのものである。希釈割合は、０．１〜１０００％の範囲であれば、適用可能である。【００２８】
<フォトマスク>
三次元構造物を作製する際の光硬化性樹脂溶液に対する露光処理には、図１に例示されるフォトマスクを用いた。このフォトマスクは、露光波長光が透過しうる材質で構成されるフィルムであって、露光しない部分に対応した遮光パターンが印刷されたものを用いた。図１のフォトマスクは、直径４００μｍの円形パターンがピッチ６００μｍで最密配置されたものである。【００２９】
<マイクロチップ用基板>
本発明のマイクロチップ用基板には、ガラス製基板を用いた。基板コストを最小限に抑えるため、流路幅１０００μｍ、流路深さ１００μｍの直線上の上部開放溝を有する基板に、導入口と排出口が穿作されたカバープレートを加熱圧着することにより、作製した。流路幅、流路深さを小さくすることは、三次元構造物を事後的に作り込む際、目詰まり等の支障となる恐れがあるとともに反応生成物による発色の視認性を改善するために、幅１００μｍ以上５０００μｍ以下で深さが５０μｍ以上２００μｍ以下であることが望ましく、毛細管現象により液体を導入できる範囲のものに制限される。【００３０】
以上の部材を準備した上で、以下の手順により、前記マイクロチップのマイクロチャネル内部に、光硬化性樹脂の三次元構造物を作製する予備実験を行い、諸条件を把握した。【００３１】
(i)希釈済みの光硬化性樹脂溶液をマイクロチップにピペッタを用いて導入し、毛細管現象によってマイクロチャネル内を流下させ、全体に行き亘らせた。次に、(ii)蛍光顕微鏡のステージにフォトマスクをおき、その上に予め準備しておいたマイクロチップをフォトマスクとマイクロチャネルとを位置合わせして設置し、対物レンズ及び絞りにより照射範囲を選択し、ＮＤフィルターにより照射強度を制御して照射した。【００３２】
具体的な推奨される条件としては、対物レンズ１０倍、絞りなし、ＮＤフィルターなしの場合にあっては、照射時間は３秒であり、光の強度は波長３６４ｎｍで１３ｍＷ／ｃｍ2である。その結果を図２に示す。なお、図中Ｃは、円柱状の微小構造物を上方から観察したものであって、平均直径はおよそ４２０μｍ程度であると見積もられた。【００３３】
そこで、上述の予備実験の条件を参考に、一次抗体が結合しているビーズが懸濁された親水性光硬化性樹脂溶液について、同様の三次元構造物（円柱状のビーズが均質に均一分散保持されたカラム）の作製を試みた。【００３４】
具体的には、(0)同様に、ＥＮＴ−２０００を１００μＬ、水を１００μＬ、開始剤ベンゾインエチルエーテル１μＬを混合し、光硬化性樹脂溶液を準備した。そして、予め用意しておいた一次抗体を固相化したビーズ溶液から１００μＬを取り分け、遠心分離処理にてその上清を廃棄して残ったビーズ溶液に光硬化性樹脂溶液１００μＬを導入し混合した。【００３５】
次に、(i)こうして作製されたビーズが懸濁した光硬化性樹脂溶液１００μＬを、予め用意しておいたマイクロチップのマイクロチャネルに、導入口からピペットで導入し、マイクロチャネルの毛細管現象によりマイクロチャネル内において該溶液を流下させ、全体に行き亘らせた。【００３６】
そして、(ii) 蛍光顕微鏡のステージにフォトマスクをおき、その上に予め準備しておいたマイクロチップをフォトマスクとマイクロチャネルとを位置合わせして設置し、対物レンズ及び絞りにより照射範囲を選択し、ＮＤフィルターにより照射強度を制御して照射した。【００３７】
次に、露光により硬化した領域を残して、未硬化の光硬化性樹脂溶液をマイクロチャネルから洗浄・排出した。こうして、図３に示すとおり、ビーズが略均一に分散保持された光硬化性樹脂の円柱状構造物（円柱の平均直径は４２０μｍと見積もられた）がマイクロチャネル中に作製することができた。また円柱構造物内部にほの暗く見える粒子（図中Ｂ）が硬化したレジン中に分散保持されたビーズの陰影である。なお、図３のビーズが均質分散保持されたカラム周囲の灰色で示した領域（図中ＦＰ）は、酵素反応によって発色基質が発色し、カラム周辺が薄い青色を呈した。【００３８】
このマイクロチャネルにシリンジポンプにより水を導入したが、この円柱構造物は崩れることはなかった。さらに、遠心分離機によりマイクロチップ内に導入された水溶液を排出してみたが、これによっても円柱状の立体構造物は崩れなかった。以上のことから、こうして作製された三次元構造物は、通常想定されるマイクロチップに対する操作に対して、十分な物理的強度があることが確認できた。したがって、溶液のマイクロチャネル内の導入には毛細管現象が利用でき、排出には遠心分離機等を適用して迅速に処理できることが判明した。【００３９】
さらに、導入するビーズ種（表面に固相化された抗体種）を変更しつつ露光処理を繰り返すことによって、１本のマイクロチャネル内に、複数種の検体について同時に検出可能なアッセイを構築したものを、図４に示す。ここでは、検出操作の際の視認性を考慮して、抗体種に対応させてカラム毎に導入するビーズの色も変更した（図中、濃淡はカラムの色の違いを示す）。さらに、色ビーズと白又は透明ビーズの混合比を変えることによって、カラム色に濃淡や、マイクロチャネル方向にカラーグラデーションをつけることも可能である。【００４０】
一方、ビーズ色の選択による着色カラムを配置する技術を応用すれば、目視での検出感度を向上させることもできる。目視での発色検知は、個人差も手伝って、かなり高濃度の試料でなければ適用することが難しく、プライベートユースへの適用は制限されているのが実情である。例えば、一般人の青色発色に対する判別能力は、深さ１００μｍのとき、熱レンズ顕微鏡出力値に換算して１０００μＶ前後であると考えられる。【００４１】
しかしながら、この程度の発色強度の試料に対しては、発色検知に熟練を要するばかりか、プライベートでの検査ニーズの高い検体種の多くは１０００μＶ未満に相当する濃度の検体であることが多いため、目視感度を増感できなければ、実用性が損なわれることも懸念される。【００４２】
そこで、本発明者らは、補色による視認性の違いに着目して、例えば、色相環において反対側に位置する色（SAT Blueの青色に対する橙色）のビーズカラム群を中央にして、その前後に色相環で９０度に位置する黄緑色と紫色にビーズカラム群を、そして、さらにその周りに青色のビーズカラム群を配置する、５群のカラム群からなるマイクロチャネル構成を考案した。【００４３】
これにより、青色発色が微かな、稀薄な検体濃度の試料（例えば、熱レンズ顕微鏡出力値に換算して１０００μＶを僅かに下回るような試料）にあっても、少なくとも中央の橙色のカラム群における発色を容易に識別可能になった。場合によっては、目視による観察を容易にするため、マイクロチャネルのカラムが配置された領域に対応するカバープレートに所要の曲率の凸部を設け、拡大視できるように構成しても良い。【００４４】
一方、本発明の免疫分析チップは、従来のタイタープレート法による分析時間（心疾患マーカーBNPの場合に４−５時間）を、おおよそ２０分と大幅に短縮することに成功したものの、いわゆる上述の特許文献１に例示されるマイクロチップELISA法の分析時間約１５分に対し、同等と考えられるが、本発明者らは、カラムデザインにさらに工夫を加えた。【００４５】
すなわち、本発明の図３に示す免疫分析マイクロチップは、各カラムの全体に亘って均質にビーズが分散保持された構成であることから、検体がカラム全体に含浸した後に発色剤が導入され、それがカラム全体に含浸し、さらにその発色した反応生成物がカラムから浸み出し、カラム周囲の流路部に一様に拡散するまでの時間を不可避的に要するシステムであり、その分時間がかかる。【００４６】
そこで、本発明者らは、まず含浸する時間を短縮するために、ビーズの分布を円柱状の三次元構造物の周囲に限定することとした。すなわち、支柱となる親水性光硬化性樹脂層を先に形成し、その後で一次抗体が表面に固相化されたビーズが懸濁する親水性光硬化性樹脂溶液を導入して、先の支柱と同軸に位置決めした露光処理を施し、円筒状のカラムを作製することにより、含浸時間を短縮することに成功した。【００４７】
この場合、ビーズ量が減少することに伴い、反応生成物量も稀薄化することから、カラム周辺の流路への反応生成物の浸出過程を省き、カラム毎にドーナツ状に分布するビーズ表面を直接熱レンズ顕微鏡等で局所分析することが望ましい。これにより、さらに分析時間を短縮でき、トータルで５〜１０分程度の分析時間の短縮が可能になる。【００４８】
次に、本発明にかかる免疫分析マイクロチップのレイアウトの一例を図６に模式的に示す。チップ本体（１）はガラス基板とカバープレートからなり、ガラス基板上にメイン流路（２）、サブ流路（３，４）に相当する溝が形成されているとともに、洗浄液用リザーバータンク（６）と二次抗体溶液用リザーバータンク（７）に相当する凹部が形成されている。【００４９】
またメイン流路（２）には、光硬化性樹脂内にビーズが均質保持された微小構造物である柱状のカラムが溝の深さ方向に林立するカラム領域（５）が複数箇所配置されている。但し、流路壁とカラムの間には隙間があり、液体の流下を妨げないように形成されている。カラム領域（５）毎に、色及び／又は固相化されている一次抗体が異なるビーズが均質保持されている柱状のカラムとすることにより、領域毎に異なる検体について及び／又は異なる視認性で一度に分析することが可能になる。【００５０】
さらにメイン流路（２）の一端は、カバープレートに形成された試料導入口（１１）とそれに対応する凹部に連通するとともに、他端は廃液用タンク（８）に連通している。該試料導入口（１１）に対応する凹部には、２つのサブ流路（３，４）が連通する。これらのサブ流路（３，４）は、他端側でそれぞれ洗浄液用リザーバータンク（６）と二次抗体溶液用リザーバータンク（７）に連通する。【００５１】
検体を含む試料を試料導入口（１１）にマイクロシリンジ又はピペットを用いて導入する。メイン流路（２）はサブ流路（３，４）よりかなり太いことから、導入された試料はサブ流路（３，４）に侵入することなく、毛細管現象によってメイン流路（２）内に流入する。試料のメイン流路（２）内への導入完了後、試料注入口（１１）を栓等により閉鎖する。【００５２】
洗浄液用タンク（６）と二次抗体溶液用タンク（７）に対応するカバープレート領域には、気密性の弾性体からなるダイヤフラム（９，１０）が配置され、洗浄液や二次抗体を含む二次抗体溶液をメイン流路（２）に導入したいときには、対応するダイヤフラム（９，１０）を押下しリザーバータンクタンク（６，７）内の液体を流下させる。前述のとおり、試料導入口（１１）が密栓されていることから、ダイヤフラム（９，１０）の押下を加減することで、洗浄液や二次抗体溶液のメイン流路（２）内の位置を制御できる。【００５３】
一方、カバープレートは、少なくともカラム領域（５）に対応する部分が透明に構成されていることから、該領域における導入された溶液の発色等を外部から観察できる。なお、図６の態様では、リザーバータンクやドレインタンクを予めチップ内に作り込んだ検査キットの提供のために、１つのチップに対しメイン流路（２）を１つ設けたものについて説明を行ったが、試薬や洗浄液の導入排出を検体の導入排出と同様にピペット等を用いて手動で行うことを想定するチップに関しては、図７のように１つのチップ本体（１）に対し、試料等導入口（１２）と試料等排出口（１３）を別々に設けた、カラム領域（５）を含むメイン流路（２）を複数本配置することもでき、複数種の免疫分析を同時平行的に実施可能となり好適である。図７のようにカラム領域（５）を、カバーガラスからなる検出窓（１４）部に集中配置することにより、図５等の例示される配置に比べ、チップの外形サイズを小さく抑えることが可能になり、顕微鏡等の検出系に対する位置合わせ操作性等が向上し、より好適である。【００５４】
なお、本発明にかかる免疫分析マイクロチップは、各カラム周辺の流路部体積を操作に支障とならない範囲で小さく設定したことから、基質の酸化還元反応を停止する試薬を導入せずとも、二次抗体溶液導入から１０分程度で、基質と反応生成物の移動律速により発色が所定の水準に落ち着くので、分析の時間依存性から開放され、分析者の手際等に分析結果が大きく影響されなくなった。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
本マイクロチップを心疾患マーカー：ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドBNPの検出に適用した例を以下に示す。ビーズに固相化する一次抗体、抗原、酵素標識二次抗体としては、塩野義製薬から提供された、BC203、BNP、Fab’-HRPをそれぞれ用いた。【００５６】
操作手順としては、一次抗体の結合したビーズと光硬化性樹脂溶液（ＥＮＴＧ−２０００を１００μL、水を１００μL、開始剤ベンゾインエチルエーテル１μL）を混合して作製した混合溶液を、毛細管現象によりマイクロチャネル内に導入し、フォトマスクを用いて、NDフィルターなし、対物レンズ４倍で、照射時間４秒の露光を行った。【００５７】
未硬化の光硬化性樹脂溶液をマイクロチャネルから除去した上で、ビーズ等にタンパク質が非特異的に結合するのを防止するために、１％−ウシ血清アルブミンBSAとリン酸緩衝生理食塩水PBSのブロッキング液２μＬによりマイクロチャネル内部のビーズカラムを処理した。このブロッキング処理に要する時間は約６０分である。【００５８】
次に、前記抗原（検体に相当する。）と二次抗体溶液２μＬをマイクロチャネル内に導入した。ビーズ上に固相化された一次抗体との反応する時間を考慮して、その状態で１０分間保持した。その後、０．０１％のポリオキシモノラウレートTween20とPBSの混合溶液１０μＬにより、マイクロチャネル内の洗浄を行った。【００５９】
その後、SAT Blue酸化還元系発色試薬２μＬを導入し、ビーズ上に固相化された一次抗体−抗原−酵素標識二次抗体の検出系と接触させ、酵素標識にかかる酸化還元反応を通じて青色に発色させた。その結果を図５に示す。図５中、マイクロチャネルにそって、縞状の陰影に表示された部分、ビーズカラムが配置された領域であって、流路幅全体に亘って青色を呈している。【００６０】
円柱状の構造物からその周囲の流路部に浸出し、青色を呈した流路部における酵素と反応した試薬を、熱レンズ顕微鏡を用いて検出した。以上の処理を、導入する抗原の濃度を０．１〜１０００ｐｇ／ｍＬの範囲で変更して繰り返し、縦軸に熱レンズ顕微鏡の出力信号強度をとって検量線形式でまとめたものを図８に示す。【００６１】
その結果、再現性は高く、その検出限界は、１０ｐｇ／ｍＬ程度であると見積もられた。心不全診断において、カットオフレベルを１００ｐｇ／ｍＬに設定しており、本実施例の検出限界は、十分実用に耐えるものと評価された。【００６２】
（実施例２）
一方、本発明をプリオンタンパク質の検出に適用した例を以下に示す。
検出系として、一次抗体にT2、抗原にrPrP、酵素標識二次抗体にT17を用いた点を除き、その他の条件は、上述の実施例１と同じとした。【００６３】
その結果を、図９に示す。検出限界は一回の測定あたり４ｐｇ程度であると見積もられた。検出限界が６０ｐｇであると言われるELISA法と同等であるものの、検出時間は、ELISA法ではおよそ４−５時間であるのに対し、本発明では２０分程度で済むことから、実用上も十分な利点を備えていると評価された。【００６４】
（実施例３）
また、通常のリソグラフィー手法を用いて基板上に形成された流路に代えて、既存又は製作したキャピラリーチューブ（毛細管現象による液体の導入が可能な細管）を利用して、該チューブ内の既存の管内空間を流路として、本発明の微小構造物を作り込み、免疫分析マイクロチップとすることについても試みた。【００６５】
キャピラリーチューブの断面は、円形、角形の何れであっても利用することができ、断面が円形の場合、直径は５０〜１０００μmの範囲のものを利用でき、一方、断面が角形の場合、一辺が５０〜１０００μmの範囲のものを利用できる。また、その材質に特に制限はなく、ガラス製でもプラスチック製でも利用できる。【００６６】
但し、キャピラリーチューブを本発明にかかる微小構造物を作り込むための流路として利用するためには、微小構造物をパターニングする必要があることから、露光に必要とされる程度の露光光波長に対する透明度を持った材質であることを要する。また、微小構造物のパターニング精度の観点から、極端に複雑な断面形状を有するキャピラリーチューブの使用は避けるべきである。【００６７】
ここで、円筒状のキャピラリーチューブを利用した場合における微小構造物の配置の一例を、図１０に模式的に示す。図１０の（ａ）は、キャピラリーチューブを一方の開放端側から見た側面図であり、図１０の（ｂ）は、キャピラリーチューブをチューブ内に成形されら微小構造物の露光軸方向から見た正面図であり、図１０の（ｃ）は、キャピラリーチューブの斜視図である。【００６８】
なお、内径が６３０μｍ（外径が９００μｍ）、軸線長さが３２ｍｍ、管内容量が１０μＬである、両側に開放端部（１６）を有するキャピラリーチューブ（１５）を用いた。但し、図１０はあくまで模式的に示したものであって、寸法比等を厳密に反映したものではない。【００６９】
具体的には、一次抗体として、マウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体（ベックマンコールター製）、抗原として、ヒトIgE（ヤマサ製）、酵素標識二次抗体として、HRP−抗ヒトIgE抗体（Goat-Poly)（KPL製）を採用して、次の操作手順にしたがって、キャピラリーチューブ内に本発明にかかる微小構造物を製造した。【００７０】
一次抗体の固定したビーズが光硬化性樹脂液に混合懸濁された液体に、キャピラリーチューブの一端を浸漬し、キャピラリーチューブの毛細管現象を利用して、該光硬化性樹脂液を管内に導入した後、チューブの外側、微小構造物を配置したい箇所に合わせてフォトマスクを配置し、フィルターなし、対物レンズ倍率が４倍の光学系を用いて、照射光量を５５ｍＷ／ｃｍ2に制御された光を３秒間照射し、所定領域の光硬化性樹脂を硬化させ、フォトマスクの陰となった領域の未硬化光硬化性樹脂液を排出除去ずる。【００７１】
露光された領域には、光硬化した樹脂が微小構造物（１７）としてキャピラリーチューブ（１５）内の流路を横切る形で残置する。その様子を示す顕微鏡写真が図１１である。図１１のとおり、フォトマスクのパターンに沿った断面形状の三次元構造物（１７）がキャピラリーチューブ（１５）内に残置される。但し、露光用光源の照射光量や露光時間を制御することにより、光硬化性樹脂が硬化する深さは変化するので、キャピラリーチューブの形状による屈折効果とも相まって、フォトマスクのパターンに通りの円柱や角柱がキャピラリーチューブの反対側側面まで到達するとは限らず、泡がチューブ内面に張り付いたような形状の三次元構造物（図１０左側の白色を呈する領域）とすることもできる。このような三次元構造体形状を選択した場合、流路抵抗が小さくなり、試薬や検体等の液体の導入・排出が容易になるという利点がある。【００７２】
この三次元構造物を含むキャピラリーチューブに対して、１％−ウシ血清アルブミンBSAとリン酸緩衝生理食塩水PBSのブロッキング液１０μＬを導入し６０分間保持することによりブロッキング処理を施した後、前記抗原（ヒトIgE（ヤマサ製））と二次抗体溶液（HRP−抗ヒトIgE抗体（Goat-Poly)（KPL製））１０μＬを同様に毛細管現象を利用して導入して１０分間保持し、さらに０．０１％のポリオキシモノラウレートTween20とＰＢＳの混合溶液１０μＬで洗浄を行い、SAT blue酸化還元系発色試薬１０μＬを導入し１０分間保持したところ、青色の発色が目視により確認できた。【００７３】
（実施例４）
実施例３と同じ一次抗体が固定した橙色のビーズと白色のビーズを別々に用意し、実施例３と同様な手法で、それぞれ別々のキャピラリーチューブ内に三次元構造物を作製した。これらのキャピラリーチューブに対して、１％−ウシ血清アルブミンBSAとリン酸緩衝生理食塩水PBSのブロッキング液１０μＬを導入し６０分間保持することによりブロッキング処理を施した後、前記抗原（ヒトIgE（ヤマサ製））と二次抗体溶液（HRP−抗ヒトIgE抗体（Goat-Poly)（KPL製））１０μＬを同様に毛細管現象を利用して導入して１０分間保持し、さらに０．０１％のポリオキシモノラウレートTween20とＰＢＳの混合溶液１０μＬで洗浄を行い、SAT blue酸化還元系発色試薬１０μＬを導入し１０分間保持した。【００７４】
その結果、白色ビーズを導入したキャピラリーチューブにおける発色強度と橙色ビーズを導入したキャピラリーチューブにおける発色強度は、物理量としては同じであるにも拘わらず、白色ビーズを導入したキャピラリーチューブにおける発色に比べ、橙色ビーズを導入したキャピラリーチューブにおける発色の方が、ビーズと試薬の色のコントラストが鮮明であるためか、視認性に優れていることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、基板上の汎用のマイクロチャネル（乃至汎用のキャピラリーチューブ）に対し事後的にビーズカラムの三次元構造物を作り込むことによって、少量の検体であっても、迅速簡便に且つ高感度に検出可能な免疫分析マイクロチップ乃至免疫分析用チップ、又はそのマイクロチップを用いた免疫分析方法を提供するものである。【００７６】
また、本発明は、カラムにおける反応生成物を熱レンズ顕微鏡等の分析機器を用いて分析することにより、極微量の試料に対しても定量分析が可能であるとともに、ビーズの着色による視認性の向上により、複数種の検体を同時に検知可能であるばかりでなく、極低濃度の場合を除く低濃度域の検体については、特別な分析機器を用いることなく目視での検出をも可能とした、可搬性に優れた免疫分析マイクロチップ乃至免疫分析用チップを提供するものである。また、実用的な観点から敬遠されてきたラジオアイソトープ、毒性物質、感染性が懸念されている物質に対して、被爆の可能性を低く抑えることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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