(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープペプチド。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、Ｂ細胞エピトープペプチド。
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる、Ｂ細胞エピトープペプチド。
【請求項４】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープペプチド。
【請求項５】
合成ペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＢ細胞エピトープペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の化学的に修飾されたペプチド。
【請求項７】
自己免疫疾患および／または炎症性疾患に対する免疫を付与できる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＢ細胞エピトープペプチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＢ細胞エピトープペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号５で示される核酸配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項８に記載の核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
有効成分として請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＢ細胞エピトープペプチドの有効予防免疫接種量を含み、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、添加剤またはアジュバントをさらに含む、ワクチン。
【請求項１４】
有効成分として請求項９および１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ、または請求項１１および１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含み、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、添加剤またはアジュバントをさらに含む、ワクチン。
【請求項１５】
自己免疫疾患または炎症性疾患に対する免疫を付与するための、請求項１３または１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
関節炎に対する免疫を付与するための、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープペプチドに対して向けられた抗体。
【請求項１８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープペプチドに対して向けられた抗体。
【請求項１９】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープペプチドに対して向けられた抗体。
【請求項２０】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープペプチドに対して向けられた抗体。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の抗体の医薬上有効な量を含む、自己免疫疾患または炎症性疾患に対する受動免疫化のための組成物。
【請求項２２】
自己免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療のための、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
関節炎に対する個体の感受性／疾病素因を予測する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドを用いる免疫アッセイ法により、その個体由来の血清サンプルを、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドに対して向けられた抗体の存在に関して試験することによる、方法。
【請求項２４】
免疫アッセイ法がＥＬＩＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の領域に相同な種々のペプチド、かかるペプチドをコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、本発明のペプチドに対して向けられた抗体に関する。本発明はまた、本発明のペプチド、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ構築物を含む有効なワクチン、および本発明の抗体を含む受動免役化組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
発明の背景
本願を通じ、種々の刊行物は括弧内のアラビア数字によって引用されている。これらの刊行物は引用することにより本明細書の一部とされ、本記載の一部を構成する。
【０００３】
アジュバント関節炎（ＡＡ）は自己免疫関節炎の実験モデルであり、同系交配ルイスまたはウィスター系などのラットの感受性系統において完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の加熱殺菌結核菌（ＭＴ）での予防接種で誘導され得る［１−３］。ラットの耐性系統（例えば、ブラウン−ノーウェイ；フィッシャー［５，６］）ではこの疾病は誘導できず、ルイスラットは関節炎から回復後、この疾病の再誘導に対して耐性を発達させる。
【０００４】
本発明者らはこれまでに耐性系統由来免疫グロブリンの静脈注射によってＡＡに対する耐性がラットの感受性系統に伝達され、また耐性は６５ｋＤのＭＴ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６５）に対する抗体の存在に関連していると示している［４］。
【０００５】
熱ショックタンパク質は高度に保存されたタンパク質のファミリーである。マイコバクテリアＨＳＰ６５と哺乳類ＨＳＰ６０の間では〜５０％のアミノ酸が同一である［２１］。実験動物［７、８］ならびにヒト［９−１１］双方において自己免疫関節炎の病原性におけるＭＴの６５ｋＤの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６５）の役割がここ数年包括的に研究されている。例えばBarker et al. ［３２］によりＨＳＰ６５およびプリスタンを与えたマウスにおける関節炎性免疫応答の抑制が記載されている。応答を誘発するのに用いた抗原は全長ＨＳＰ６５であり、このタンパク質に由来する特定のサブドメインまたはペプチドの作用を研究する試みは全くなされなかった。
【０００６】
ＡＡはＭＴ  ＨＳＰ６５の残基１８０−１８８に反応性のＴ細胞クローンによって受動的に伝達され、慢性間接リューマチ（ＲＡ）を患う患者では、ＨＳＰ６５に対するＴ細胞応答と初期段階の関節炎症との間に関連が認められている［７、１２−１４］。逆説的に、マイコバクテリアＨＳＰ６５での予備免役化によりＭＴによる疾病の誘導に対する耐性がもたらされ、この保護作用はＨＳＰ６５に特異的なＴ細胞によって媒介されると考えられている［７、１５−１６］。同様に、関節炎ラットは自己ＨＳＰに対して、およびＭＴ  ＨＳＰのペプチド１８０−１８８に対して活発なＴ細胞応答を生じるが、関節炎感受性ラットに注射した場合にはこれらのうちどちらも関節炎性ではない［１５、１７］。これらの結果およびその他の点からＨＳＰは疾病に関連するエピトープと別の耐性を付与するエピトープとを含み得るということが示唆される［５、１９、２０］。病原性免役応答ならびに保護作用の双方が抗ＨＳＰ  Ｔ細胞に起因していた。以下の実施例は関節炎感受性および耐性ラットの抗ＨＳＰ抗体の鋭敏なエピトープ特異性を例示する。
【０００７】
さらに、本発明者らは未処置のルイスラットはマイコバクテリアＨＳＰ６５のあるエピトープに対する抗体を欠いており、これは若いＢＮおよび老齢の未処置のルイスラットでは天然に認められ、また疾病から回復した後のルイスラットによって獲得されるということを見出している。全ＭＴ  ＨＳＰ６５ｋＤ分子の一次および三次構造の解析により、これらの「保護」エピトープは分子の外表面に認められた非保存性アミノ酸配列を含む、可能性あるＢ細胞エピトープであると示された。
【０００８】
疾病の誘導に先立つ「保護」エピトープの１種でのルイスラットの予備免役化は全分子に対する抗体ならびに疾病誘導に対する耐性を誘導した。このペプチドはそれに対して関節炎耐性ラットでは抗体が認められたが、関節炎感受性未処置ルイスラットでは認められなかった自己ＨＳＰ６０エピトープにも相当する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は実質的に配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドならびにその生物学上機能的な相同体および誘導体に関する。
【００１０】
より詳しくは、本発明は実質的に配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドならびにその生物学上機能的な相同体および誘導体、ならびに実質的に配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドならびにその生物学上機能的な相同体および誘導体に関する。
【００１１】
さらに、本発明は実質的に配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドならびにその生物学上機能的な相同体および誘導体に関する。
【００１２】
本発明のペプチドは合成ペプチドおよび化学的に修飾されたペプチドであり得る。
【００１３】
本発明のペプチドは自己免疫疾患および／または炎症性疾患に対する免役を付与できる。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は本発明のペプチドをコードする核酸配列および同一物を含むＤＮＡ構築物に関する。
【００１５】
なおさらなる態様では、本発明は有効成分として少なくとも１種の本発明のペプチドの有効予防免疫接種量または本発明の核酸を含むワクチンに関する。本発明のワクチンは自己免疫疾患または炎症性疾患に対する免疫の付与に特に有用である。
【００１６】
なおさらには、本発明は本発明のペプチドに対して向けられた抗体およびそれらを含む組成物に関する。本発明の組成物は自己免疫疾患または炎症性疾患に対する受動予防接種に特に有用である。
【００１７】
発明の具体的な説明
本発明は実質的に配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドならびにその生物学上機能的な相同体および誘導体に関する。
【００１８】
好ましくは、本発明の第１の具体的態様のペプチドは実質的に配列番号２で示されるアミノ酸配列または実質的に配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
本発明はさらに、実質的に配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドならびにその生物学上機能的な相同体および誘導体に関する。
【００２０】
また、本発明は本発明のペプチドをコードする核酸配列にも関する。
【００２１】
より詳しくは、本発明は実質的に配列番号５で示される核酸配列を含むＤＮＡ配列ならびにその生物学上機能的な誘導体に関する。この核酸配列は実質的に配列番号４で示される配列を有するペプチドコードする。
【００２２】
アミノ酸および核酸配列は表１に示されている。
【表１】
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【００２３】
「生物学上機能的な相同体および誘導体」とは、ペプチドまたは核酸配列によってコードされるペプチドの自己免疫疾患に対する生物学的活性を変更しない、本発明のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の、または核酸配列における核酸の、欠失、置換および／または挿入をはじめとするいずれかの変異体を意味する。従って、この用語は同様の構造を有するペプチド、保護抗体によって認識されるペプチドもしくはそれらの誘導体、および／または免役化の際に保護抗体を誘導し得るペプチドまたはそれらの誘導体を意味するととられるべきである。
【００２４】
本発明はさらに、本発明の核酸配列を含むＤＮＡ構築物またはその機能的な相同体および誘導体に関する。本発明の構築物は本発明の核酸配列に機能し得る形で連結されたプロモーター、調節および制御エレメント、翻訳、発現およびその他のシグナルなどのさらなるエレメントをさらに含み得る。
【００２５】
本発明はまた、有効成分として少なくとも１種の本発明のペプチドの有効予防接種量を含むワクチンに関する。本発明のワクチンは炎症性疾患および自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチまたはアジュバント関節炎に対する免役を付与するよう特に意図される。
【００２６】
「有効予防免疫接種量」とは炎症性疾患および自己免疫疾患に対する免疫系を直接的または間接的に刺激し、免疫を付与するのに十分な量を意味する。かかる有効量は疾病の重篤度、患者の年齢、性別、体重、ならびに患者の全身状態および主治医の知るその他の考慮すべき事がらによって決定される。注射あたりの好ましい用量は０．０２〜２ｍｇ／Ｋｇ体重であり得る。
【００２７】
あるいは、本発明のワクチンは有効成分として少なくとも１種の本発明の核酸配列を含んでもよい。
【００２８】
本発明のワクチンは所望により医薬上許容される担体、希釈剤、添加剤、賦形剤およびアジュバントをさらに含んでもよい。「医薬上許容される担体、希釈剤、添加剤、賦形剤およびアジュバント」とは、有効成分の有効な送達を補助し得る不活性で、無毒な物質のいずれをも意味する。
【００２９】
本発明に関して用いられる「抗体」とは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を指す。ポリクローナル抗体はウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジまたは同様の哺乳類で作製すればよい。ペプチドに対するポリクローナル抗体の作製は前記のCurrent Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. Chapter 9に記載されている。
【００３０】
モノクローナル抗体は免役化した動物、特にラットまたはマウスの脾臓またはリンパ節から採取したＢ細胞から、ハイブリッド細胞の増殖に好都合な条件下で不死化したＢ細胞と融合することによって作製すればよい。ネズミＢ細胞の融合には、細胞系統Ａｇ−８が好ましい。
【００３１】
モノクローナル抗体を作製する技術は前記のCurrent Protocols in ImmunologyのChapter 2などの多数の論文およびテキストに記載されている。そのChapter 9では実験動物のペプチドでの免役化を記載している。これらの動物の脾臓またはリンパ節細胞は、そのChapter 2に記載されるようなモノクローナル抗体の作製のために、タンパク質で免役化した動物の脾臓またはリンパ節細胞と同様の方法で用いてよい。
【００３２】
「抗体」とは、完全な分子ならびに例えば、抗原に結合できるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などのそのフラグメントの双方ともを含めて意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全抗体からＦｃフラグメントを欠いており、循環からより迅速に除去され、完全抗体よりも非特異的組織結合が少ない場合がある。
【００３３】
抗体は、分子と特異的に反応することができ、その結果分子が抗体に結合する場合に、分子「に対して向けられ」ているといわれる。「エピトープ」とは、その抗体によって認識され、抗体によって結合され得るいずれかの分子のその部分を指すものとされる。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特異的な三次構造特性ならびに特異的な荷電特性を有する。
【００３４】
「抗原」は抗体によって結合され得る分子または分子の部分であり、これはさらに動物がその抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するのを誘導できる。抗原は１個以上のエピトープを有し得る。前記で記載された特異的反応とは、抗原は極めて選択的にその対応する抗体と反応し、その他の抗原によって誘起され得る多数のその他の抗体とは反応しないということを示すよう意図されている。
【００３５】
本発明の抗体は受動免役化に用いるための組成物の形態で提供してよい。かかる組成物は一般に注射によって投与されるが、本発明がこの経路のみに限定されるものではない。しかしながら、一般に、本発明の組成物は筋肉内または皮下注射によって投与される。場合によっては、静脈または腹膜内経路を用いて本発明の組成物を投与してもよい。
【００３６】
本発明の組成物は、有効成分（すなわち、抗体）に加え、緩衝剤、そのモル浸透圧濃度を調節する薬剤、および所望により当技術分野で公知の担体などの１種以上のさらなる添加剤を含んでもよい。
【００３７】
好ましい緩衝剤にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）があり、この溶液はモル浸透圧濃度に関しても調節されている。
【００３８】
好ましい組成物は担体を含まないものである。かかる製剤が筋肉内および静脈注射をはじめとする注射による投与に用いるのに好ましい。
【００３９】
医薬および免役化組成物の製造は当技術分野では十分に公知であり、多数の論文およびテキストに記載されている、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, Gennaro A. R. ed, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990参照。
【００４０】
ＮＯＤマウスにおける自己免疫糖尿病の発現はＨＳＰ６０のｐ２７７ペプチドに対するＴ細胞応答の存在によって特徴づけられことが示されている。ｐ２７７ペプチドを治療用ワクチンとして用いてＮＯＤ糖尿病の進行をとめることができるということもさらに示されている［２８］。ｐ２７７ペプチドはストレプトゾトシン毒によって誘導された自己免疫糖尿病の進行もとめることが示されている［２９］。同様に、本発明のワクチンを用いても自己免疫疾患を抑制できる。
【００４１】
さらに、本発明のワクチンを用いて、多数の自己免疫疾患を特徴づける自己免疫疾患の再発を防ぐこともできる。従って、再発の防止はこれらの疾患に対する治療アプローチの一部である。前記のペプチドｐ２７７は生涯の初期に抗ｐ２７７免役をとめることによってＮＯＤマウス糖尿病を防ぐと示されている。かなり進行した後でさえ自己免疫プロセスをとめると後に示された［２８］。
【００４２】
もう１つの可能性はＨＳＰ分子に対する抗体はＨＳＰの生得的免疫系に対する炎症誘発性作用を阻害することによって炎症を抑制するということである。マイコバクテリアＨＳＰ６５はヒト単球細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を誘導すると示されており［１８］、また哺乳類ＨＳＰ６０はＩＦＮ−γとともに佐薬として作用しＩＬ−１２およびＩＬ−１５のような炎症誘発性サイトカインを促進すると示されている［３１］。抗マイコバクテリア／抗自己ＨＳＰ抗体の誘導はその炎症誘発作用を抑制し得る。
【００４３】
感染性疾病（すなわち、ウイルス肝炎）の予防および治療には特定の免役グロブリン（抗体）が通常用いられる。これは受動予防接種と呼ばれいてる。免役グロブリンを用いてＩＴＰ（免役血小板減少性紫斑病）、重症筋無力症（ＭＧ）、およびその他の自己免疫疾患のような自己免疫疾患の再発を抑制または防止することもできる［３０］。
【００４４】
従って、なおさらなる態様では、本発明は少なくとも１種の本発明のペプチドまたは抗体の産生を誘導し得るその機能的な相同体および誘導体に対して向けられた抗体に関する。
【００４５】
本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
【００４６】
なおさらなる態様では、本発明は少なくとも１種の本発明の抗体を含み、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、添加剤、賦形剤およびアジュバントをさらに含み得る、受動免役化のための組成物に関する。本発明の組成物は特に自己免疫疾患または炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチに対する受動予防接種または免役化および治療のために意図される。
【００４７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、それらは単に例示的なものであって、本発明を何ら限定するものではない。本教示に鑑みて本発明の多数の改変および変法が可能である。従って、本発明は、特に記載されることなく添付の請求の範囲の範囲内で実施され得るということが理解されよう。
【００４８】
以下の実施例は種々のラットの抗ＭＴ  ＨＳＰ抗体反応と関節炎の誘導に対する感受性とのその相関を示す。細菌ＨＳＰ分子では限定された数のエピトープのみがラット抗体によって認識される。この抗体量は耐性および感受性系統間で異なる。耐性系統は分子の外表面に認められたペプチドならびに全分子に応答することが認められた。他方、未処置のルイスラット由来の抗体は分子の外表面にあまり露出していない少数のペプチドとしか反応せず、完全ＨＳＰとは反応しなかった。いくつかのエピトープ、ならびに全ＭＴ−ＨＳＰに対する抗体の存在が関節炎の誘導に対する耐性と関連があり、従って、それらは「保護」エピトープと名づけられた。
【００４９】
これまでに、細菌ＨＳＰに対するＴ細胞応答は決定基伝播を示すと報告されている。以下の実施例で示される本データは同様の明確なＢ細胞決定基伝播が存在し、この伝播はまた自発的に、すなわち、意図的な予防接種がなくとも起こり得ると示している。Ｂ細胞エピトープは示されるように、Ｔ細胞エピトープとは異なる。この知見は本発明にとり特に重要である。
【００５０】
若い未処置のルイスラットは２種の細菌エピトープ、ペプチド４０および６３しか認識しなかった。４ヶ月齢のルイスラットはさらにペプチド６、３６および４５を認識し、９ヶ月齢のルイスラットはその他の記載したペプチドの総てに加え、ペプチド７および３１を認識した。これらのペプチドの認識はまた全細菌ＨＳＰ分子の認識と関連している。
【００５１】
若いＢＮラットのＢ細胞エピトープ量は老齢のルイスラットのものと同様であり、もう１種だけさらなるペプチド、ペプチド５９を含む。ＣＦＡで免役化されたルイスラットは前記のペプチド総て、ならびに２種のさらなるペプチド、すなわち２１および８４を認識した。
【００５２】
老齢のルイスラットおよび未処置の若いＢＮラットにおいて認められた総ての抗ＨＳＰペプチド抗体は天然抗体と呼ばれているが、それらはこれらのラットを環境病原体に曝すことに対する応答として誘発され（「天然」抗体は実際常にそうであり得る）、またこれらの病原体に対する応答におけるエピトープ伝播はＢＮラットではルイスラットよりもより迅速に、早期に、かつより強力に起こる可能性がある。ルイスラットはＢＮラットの天然応答を模倣するにはＣＦＡで免役化されなくてはならない。未処置のＢＮラット抗体量の、免役化ルイスラットのものとの類似性がこの可能性を支持する。
【００５３】
Ｂ細胞エピトープの性質および特定のエピトープと全分子の認識の間の相関は以下に示される分子の一次および三次構造解析からより理解することができる。
【００５４】
抗ＨＳＰ保護抗体が「保護」ペプチドでの免役化によって誘導され得るかどうか確かめるために、ルイスラットをフロイントのアジュバントを含まない種々のペプチドで免役化した。３種のペプチド、細菌ペプチド６および７、ならびに哺乳類ペプチド５での免役化により細菌ペプチド６に対する抗体の産生ならびに抗ＨＳＰ応答が生じ、このことは「外部の」ペプチドに対する抗体が全分子の認識をもたらすということを示す。これらの抗体の誘導はまた疾病耐性ももたらした。
【００５５】
天然ならびに誘導性抗ＨＳＰ抗体によって誘導される疾病耐性の機構は依然明らかとなっていないが、ＭＴ  ＨＳＰに対する抗体がペプチドに対する病原性Ｔ細胞の誘導の初期段階を抗原処理または病原性エピトープのＴ細胞認識に介入することによって阻害する可能性がある。あるいは、それらは自己ＨＳＰ交差反応性標的抗原に結合することによって病原性応答のエフェクター段階を阻止し得る。
【００５６】
細菌ＨＳＰ６５ｋＤに対するＡＡ感受性ルイスおよびＡＡ耐性ＷＫＡウィスターラットのＴ細胞応答は詳細に研究されている。初期免役化後段階ではルイスＴ細胞は分子のＮ末端ならびにカルボキシ末端に認められたいくつかの決定基に応答したが、後にはカルボキシ末端エピトープへの変更が生じたと示されている。ウィスターラットの初期Ｔ細胞応答はルイスラットの後期応答のものと類似していた。分子の３Ｄ構造はカルボキシおよびＮ末端部位が分子の異なる位置にあるとは示さないので、Ｂ細胞エピトープが分子のカルボキシまたはＮ末端のいずれかに関していずれの選択もなしに、分子に沿って総て認められたことは驚くべきことではない。
【００５７】
公開された優性Ｔ細胞エピトープと本Ｂ細胞エピトープ間の比較は共通エピトープを示さなかった。それとは逆に、未処置のルイスラットにおいて６、７または３１のような特定のエピトープに対する天然抗体がないことは、これらのエピトープに対する初期Ｔ細胞応答と関連しているが、４０および６３のようなエピトープに対する抗体の存在は初期Ｔ細胞応答がないことと関連している。これらの相関に基づいて、特定のエピトープに対する天然抗体の存在がそれらに対するＴ細胞応答を実際に阻害し得るが、一方で抗体がないことによりＴ細胞がこれらのエピトープに応答するのが可能となるということが示唆され得る。例えば、細菌ペプチド３１に対する天然抗体を持たないＡＡ感受性ルイスラットはこのペプチドに対するＴ細胞応答を生じ、さらに、これらの病原性Ｔ細胞は関節炎を誘導し得る。
【００５８】
これまでに記載されたように、疾病耐性と抗ＨＳＰ抗体の存在の間には明確な相関があった。若い未処置のルイスラットはＨＳＰ分子に対する検出可能な抗体を有さなかったが、９ヶ月齢のルイスラットはこれらの抗体を相当な力価で発達させていた。抗ＨＳＰ応答の発達に平行して、老齢のラットは関節炎の誘導に対しても耐性となった。若いルイスラットはＣＦＡでの免役化の後に抗体と疾病耐性の双方を獲得し、また天然に耐性のＢＮラットは免役化の必要なく自然発生的に抗ＨＳＰ抗体を有していた。従って、これらの抗体は免役化の直後に細菌ＨＳＰに結合し、免疫系の細胞腕に接近できるようになるのを妨げるという可能性がある。
【００５９】
これまでに記載したように、Ｂ細胞によって細菌ＨＳＰから「選択される」エピトープは、自己ＨＳＰと相対的にあまり相同でないエピトープであり、これは最もおそらくは自己抗原に対する寛容の結果としてである。
抗自己（ラット）ＨＳＰ抗体量の分析は自己ＨＳＰ分子の中にラット免役グロブリンによって認識される限定された数のエピトープが存在するということを実際に示した。未処置の若いルイスラットはいずれの自己ペプチドにも応答せず、全自己ＨＳＰ６０分子に対しても応答しなかった。８〜１０種の細菌ＨＳＰエピトープと反応したＢＮおよびＡＡ後ルイスラットは自己ＨＳＰでは２種のエピトープ、ペプチドＭ５およびＭ３０に対して、ならびに全自己ＨＳＰ分子に対してしか反応しなかった。
【００６０】
ＡＡを患うラットの炎症性滑液では哺乳類（または自己）ＨＳＰの発現はアップレギュレートされ［２２］、またＴ細胞レベルでマイコバクテリアＨＳＰ６５ｋＤと内因性自己ＨＳＰ６０ｋＤとの間に交差反応性免役認識が認められた［２３−２５］。
【００６１】
抗自己抗体が耐性ラットにおいてのみ認められたので、自己ＨＳＰと交差反応する抗体はそれを病原性Ｔ細胞から隠し、従って保護抗体として作用し得るという可能性がある。
【００６２】
興味深くは２種の自己保護エピトープのうちの１種は自己ペプチド５であり、それは細菌保護ペプチド６に対する相同ラットエピトープであるということに注目される。さらに、細菌ペプチド６および７での、ならびに哺乳類ペプチド５での免役化は抗細菌ＨＳＰ６および抗細菌ＨＳＰ抗体の産生ならびに疾病誘導に対する保護をもたらした。これらの３種のペプチドの一次構造を観察することによって、それらは共通モチーフ（Ｖ−Ｋ−ＷＧ−Ｐ）を発現し、これがこれらのペプチドの保護モチーフであろうという結論が得られる（図５）。
【００６３】
従って、細菌ＨＳＰに対する体液性免役応答は限定された数の可能性あるＢ細胞エピトープに向けられ得る。これらのエピトープはベンドおよびスペーサーとして働くアミノ酸の間に位置するペプチド範囲であり、分子の非保存部分に認められる。分子の表面に露出しているＢ細胞エピトープの認識が全分子への結合をもたらし、これが関節炎の誘導に対する耐性と関連している。
【００６４】
この耐性はラットのいくつかの系統では天然に生じるが、その他のものでは年齢とともにか、またはＨＳＰでの免役化の際に獲得され得る。いくつかの「保護性」エピトープでの免役化は疾病耐性ならびに耐性系統に存在する血清学的プロフィールの双方をもたらし得る。
【００６５】
本発明はまた自己免疫関節炎を発現する感受性／疾病素因を予測する方法を提供し得る。ラット系では、未処置の若いルイスラットはＨＳＰのペプチド６に対する抗体を持たず、ＨＳＰに対する曝露後に、またはＨＳＰによる免役化後に関節炎の発現に対して感受性があるということが示されている。同様にして、ＨＳＰ特異的ペプチドに対する抗体のサブグループを欠く健常な個体も関節炎の発症に対して感受性がある場合がある。本発明はまた関節炎に対する感受性／疾病素因を評価し、決定するためのアッセイも提供する。このアッセイはＥＬＩＳＡによって実施され、そこではペプチドは固相に結合させ、血清サンプルを加え、次いで抗ヒトＩｇ類を加える。その他の公知の免疫学的分析技術を用いることもできる。
【００６６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これは単に例示的なものであって、本発明を限定するものではない。
【００６７】
実施例
材料
動物：雌の同系交配ルイスラット、６週齢または９ヶ月齢はHarlan Lab. Israel.から入手した。雌のブラウン−ノーウェイ（ＢＮ）ラット、６週齢はHarlan Sprague-Dawley, USAから入手した。
【００６８】
抗原および抗体：結核菌の組換えＨＳＰ６５はDr. M. Simgh(The WHO Recombinant Protein Bank, Germany)から提供された。組換え哺乳類ＨＳＰ６０はStressGen biothec. Corp. (Victoria, BC, Canada)から購入した。ＭＴ  ＨＳＰ６５の合成ペプチドはDr. L.  Adorini (The Roche Milano Ricerche, Milano, Italy)から提供された。哺乳類ＨＳＰ６０の合成ペプチドはDr. I. Cohen (The Weirmann  Institute, Rehovor, Israel)から提供された。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ラットＩｇＧはJackson ImmunoResearch Lab. Inc. (Avonsdale, PA）から購入した。
【００６９】
方法
アジュバント関節炎の誘導および臨床評価：ルイスラットに完全フロイントアジュバント(Difco)中の１ｍｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ(Difco, Detroit, MT)を尾の基部に皮下注射した。関節炎の重篤度（関節炎指数）は以下のように盲目的に評価した：０−関節炎なし；１−関節の赤み；２−関節の赤みおよび腫れ。各々の足のの足首および足根−中足骨関節に評点をつけた。１６という最大スコアが得られるが、８より大きいスコアは重篤な疾病を示す。
【００７０】
ドットブロットアッセイ：抗原をＰＢＳに溶解し、１μｇのサンプルをニトロセルロースペーパーに吸着させた。このペーパーを風乾し、ＰＢＳ中のＢＳＡ１％とともに２０分間インキュベートして非特異的結合をブロックした。次いで、サンプルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％中で洗浄し、ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１００希釈したラット血清とともに室温にて９０分間インキュベートした。サンプルを洗浄し、ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００希釈したアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ラット抗体とともに室温にて９０分間インキュベートした。再洗浄後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ(Sigma-Fast, Sigma)の混合物を細胞に１５分間添加することによって呈色反応が現れた。水道水を添加することによって反応を停止させた。
【００７１】
ＥＬＩＳＡ：平底９６ウェルプレート(Corning)を炭酸塩バッファーｐＨ９．８中の哺乳類ＨＳＰ６０、またはマイコバクテリアＨＳＰ６５（１０μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コートした。
【００７２】
多量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄した後、プレートを１％ＢＳＡ(Sigma)を含有するブロッキングバッファーとともに室温にて６０分間インキュベートした。
【００７３】
Kasprayk et al,［２６］に従って、ＨＳＰペプチドをグルタルアルデヒドで予め処理したプレートに接着させた。つまり、プレートを１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の５％ｗ／ｖグルタルアルデヒドで室温にて１時間コートした。プレートをＰＢＳで完全に洗浄し、各ウェルにペプチド（１μｇ／１００μｌ）を加え、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを振って乾燥させ、ＰＢＳ中のＢＳＡ１％でブロックした。
【００７４】
ＨＳＰまたはペプチドのいずれかでコートしたプレートを再び洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０１％で１：１００希釈したラット血清とともに室温にて９０分間インキュベートした。再洗浄後、プレートをアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ラットＩｇＧまたはＩｇＭとともに室温にて６０分間インキュベートした。抗体の存在は基質ＰＮＰ(NP100, Chemicon, Temecula, CA)をプレートに添加することによって示された。光学濃度は４０５ｎｍにて光度計で測定した。
【００７５】
アミノ酸比較：「パイルアップ」および「プリティー」プログラム(ＧＣＧ−ウィスコンシンパッケージ、ｖ９．０）を用いて３種のＨＳＰ６０（結核菌、ラットおよびヒト）のアミノ酸配列を比較した。
【００７６】
構造解析：ＲａｓＭｏｌ  ｖ．２．６プログラムおよび大腸菌(E.coli)複合体ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳの３Ｄ構造（ｐｄｂ  ＩＤ：１ＡＯＮ参照）を用いてエピトープの位置を解析した。
【００７７】
ＭＴ  ＨＳＰ６５ｋＤの結晶構造はいまだ完全には知られていないので、解析された大腸菌由来のＧｒｏＥＬの結晶構造（ｐｄｂ  ＩＤ：１ＧＲＬ）を基にしたＭＴ  ＨＳＰ６５ｋＤの三次構造の三次元モデルを鋳型として用いた。このモデルは比較タンパク質モデリングのためにプログラムによって構築した。
【００７８】
マイコバクテリウムおよび哺乳類ＨＳＰペプチドによるＡＡの調節：ペプチド由来のＨＳＰ６５をそれらのルイスラットにおけるＡＡの出現または重篤度を調節する能力に関して試験した。ラットをＰＢＳ中の１００μｇの各ペプチドで、ＭＴによるＡＡの誘導の３週間（３Ｗ）、２Ｗおよび１Ｗ前に免役化した。対照ラットはＰＢＳを受けた。ＭＴの注射前に、およびＭＴ注射３０日後に存在する抗体を調べるためにラットから採血した。
【００７９】
ＤＮＡワクチン製造：表１に示されるオリゴペプチド結核菌ＨＳＰ６５ｋＤ番号６をコードする配列番号５を含む合成オリゴＤＮＡを、市販の哺乳類発現ベクター、図６に示される制限マップを有するｐＴＡＲＧＥＴ(Programa, Madeson, WI, USA)にクローニングした。クローニングは製造業者の使用説明書に従って実施した。
【００８０】
次いで、プラスミド構築物を大腸菌ＪＭ１０８系統にトランスフェクトし、ＤＮＡ精製系Ｗｉｒａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉｐｒｅｐｓキット(Programe, Madison, WI, USA)を用いるさらなるプラスミド精製のために大量に拡大した。
【００８１】
動物予防接種：ルイスラットを予防接種の２日前にブピワクチン(Astra)で予め処理し、次いで疾病誘導した。次いで、ラットに１００μｇのＤＮＡ構築物を前脛骨筋に、注射の間に１週間の間隔をおいて２回注射した。
【００８２】
結果
ラットＩｇと全マイコバクテリウムＨＳＰ６５およびそのペプチドとの相互作用
本発明者らによって行われたこれまでの実験によりＡＡ耐性未処置ラット（すなわち、ＢＮまたはフィッシャー）ならびにＡＡから回復したルイスラット（ＡＡ後ルイスラット）由来のＩｇ類は未処置のルイスラットにおいてＡＡの誘導を抑制することができ、ドットブロットアッセイでは細菌ＨＳＰ６５に結合するということが示された。この結合に関してより定量的な評価を得るために、これらのラット由来のＩｇ類とルイスラットにおいてＡＡに関連していると知られているマイコバクテリアＨＳＰ６５の全分子との相互作用をドットブロットおよびＥＬＩＳＡによって調べた。
【００８３】
６〜８週齢ＢＮラットおよびＡＡ後ルイスラット由来のＩｇ類はＨＳＰと強く反応するが、未処置のルイスラット由来のＩｇを試験した場合には反応は全く認められないということが分かった。興味深いことに、９ヶ月齢の未処置のルイスラット由来のＩｇ類もＨＳＰと反応するということが分かった。
【００８４】
抗細菌ＨＳＰ抗体によって認識されるエピトープを規定するために、本発明者らはドットブロットによって未処置の若いＢＮラットおよびＡＡ後ルイスラット由来のＩｇ類のマイコバクテリア６５ｋＤ  ＨＳＰの９０種の１６量合成ペプチドとの相互作用を調べた。未処置の若いルイスラット由来のＩｇ類を対照として用いた。
【００８５】
試験した９０種のペプチドのうち１０種のペプチのみ（表２）が試験した免役グロブリンと反応した。総てのラット免役グロブリンが２種のペプチド：４０（残基２３５−２６０）および６３（残基３７３−３８８）と反応した。これらのラットが老齢の場合には、それらはさらなるペプチドに対する抗体を獲得しており、老齢のルイスラットのものと同様のプロフィールが若い未処置のＢＮラットにおいて認められ、またＣＦＡで免役化されたルイスラットはペプチド２１（残基１２１−１３６）および８４（残基４９５−５１４）とも反応した。未処置のルイスラットはＨＳＰ６５ｋＤの全分子を認識しないが、そのＩＧ類はＡＡに対する感受性にいずれかの影響を及ぼさことなくこの分子の特定のペプチドと相互作用し得るということが注目される。
【表２】
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【００８６】
ラットＩｇ類の哺乳類ＨＳＰ６０およびそのペプチドとの結合
これまでの研究から特定の細菌ＨＳＰペプチドは疾病抑制調節能を有する自己ＨＳＰ応答Ｔ細胞を誘発し得るということが示されている。これらのラットの抗自己ＨＳＰ抗体量を分析するために、未処置およびＡＡ後ルイスラット由来ならびに未処置のＢＮラット由来のＩｇ類の全哺乳類ＨＳＰ６０に対する反応性をＥＬＩＳＡによって調べた。
【００８７】
表３に示された結果は未処置および４ヶ月齢のルイスラットは抗自己ＨＳＰ６０抗体を保持しないが、９ヶ月齢のルイスラット、若いＢＮラットおよびＡＡ後ルイスラットは自己ＨＳＰに対する相当な結合があったということを示している（表３）。未処置のルイスラットには極めて低い濃度の抗体しか保持していないものもあった。
【表３】
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【００８８】
ドットブロットによって未処置のルイスおよびＢＮラットおよびＡＡ後ルイスラット由来の免役グロブリンを哺乳類ＨＳＰ６０の３８種の合成２０量ペプチドに対する結合に関して調べた。未処置のルイスラット由来はそうではないが、ＢＮおよびＡＡ後ルイスラット由来のＩｇ類は２種のペプチドのみ（ペプチド５（残基６１−８０）およびペプチド３０（残基４３６−４５５））と反応したということが分かった。この結合ならびに４および９ヶ月齢のルイスラット由来の免役グロブリンの結合の定量分析によりドットブロットでの知見が確認された（表３）。
【００８９】
アミノ酸比較
ＨＳＰ６０ファミリーは高度に保存されている。ＭＴ−ＨＳＰ６５およびその哺乳類相同体（ラットまたはヒト）は４８％の同一性を示す。図１では、ＭＴ−ＨＳＰ６５、ラットおよびヒト由来のＨＳＰ６０の３種のアミノ酸配列が比較されている。これらの３種のタンパク質の共通配列も示されている。この研究に関連すると分かったエピトープは太字と下線で示されている。
【００９０】
三次元構造解析
三次構造はＢ細胞エピトープ認識にとって重要な役割を果たしている。第１のアプローチでは、ペプチドの一次構造をスクリーニングすることによって可能性あるＢ細胞エピトープをどこに見出すべきか予測できる単純なコンピュータープログラムを提供した。アルゴリズムはWarren et al.［２７］によるＢ細胞の可能性あるエピトープの位置を定めるためのミエリン塩基性タンパク質に関するこれまでの解析に基づいている。これらの解析によれば、２種のアミノ酸が規定できる。
【００９１】
「分子スペーサー」：これらは隣接する長鎖アミノ酸の分子ギャップを提供するであろう短鎖残基（１個以下の炭素の側鎖）である。この規定に合うこれらのアミノ酸はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）である。
【００９２】
「分子ベンド」：二次構造の破壊を引き起こし得るプロリン（Ｐ）残基。
これらの可能性あるエピトープのために９個の残基という最小長をとった。以下のこれらの法則、分子スペーサーおよび／または分子ベンドの間に位置する６連の連続する長鎖残基（２個以上の炭素の側鎖）が認められた（表４）。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
ペプチドをコンピュータープログラムでスクリーニングし、分子スペーサーおよび／または分子ベンドの間に位置する連続する長鎖残基（２個以上の炭素の側鎖）が示されている（最初の６ペプチド）。それらの下の２つのペプチドは多くとも１個の分子スペーサー（グリシン）を含む連続鎖である。
【００９５】
これらの法則によって同定された６つの連続物のうちの５つが実験でＢ細胞抗体によって認識されると認められたアミノ酸配列と一致している（表１）。従って、さらなるエピトープを見出すためには、プログラムをわずかに変化させて実施する、すなわち、多くとも１個の分子スペーサー（Ｇ、ＳまたはＡ）を含むエピトープを捜す。最小長は１２残基とし（これまでの９ではなく）、バックグラウンドを低下させた（すなわち、３個の残基のペナルティをとりギャップを代償した）。２つの新規配列を同定し、これらはも実験でＢ細胞抗体によって認識されると認められた（３１、４５；表１参照）。これらの２つの場合には分子スペーサーはグリシンであった。
【００９６】
ＭＴ  ＨＳＰ６５ｋＤの三次構造の意味をさらに理解し、これらの種々のアミノ酸配列を全分子に位置付けるために、大腸菌ＧｒｏＥＬの結晶構造を基にしたＭＴ  ＨＳＰ６５ｋＤの三次構造のモデル（図３）を用いた。
【００９７】
構造解析によりタンパク質の表面に位置する実験で認識されたエピトープは抗体結合に対して可能性ある部位を提供し得るということが確認された。ペプチド６、７、２１、３１、５９は最大限に露出されていると分かり、他方、ペプチド３６、４０、４５、６３および８４は部分的に露出している。
【００９８】
実験で認識されなかった１つの可能性あるエピトープ（残基３１８−３３１）は分子中に「埋め込まれて」いると思われた。
【００９９】
ＭＴ  ＨＳＰ６５ｋＤと哺乳類ＨＳＰ６０ｋＤの間には著しい相同性があるが、抗ＭＴ  ＨＳＰ６５抗体によって認識されると認められたペプチドのほとんどは哺乳類ＨＳＰと高い残基相同性を示さなかった。このことは、それら自身のＨＳＰ６０に対する自己免疫自己抗体応答を生じることからラットを守る、自己に対する寛容のためであり得る。２種のペプチド、６および４５は、自己ＨＳＰに対して高い相同性を示す部位を有していたのでこの法則に従わないと思われた。
【０１００】
これらの知見は以下のように両ペプチドについて解釈できる。
【０１０１】
ペプチド６（残基３１−４６）に関して：抗体はこのペプチドの多形部分と重複するペプチド７（残基３７−５２）に結合するが、哺乳類ＨＳＰと相同な領域に相当するペプチド５（残基２５−４０）とは結合しないと分かった。従って、これらの抗体はペプチド６（残基４０−４６）の多形（非自己）領域に対して向けられていると思われた。また、このペプチドの「保護」能に関する仮説を提供することもでき、哺乳類ＨＳＰ６０配列に対する部分的相同性がこの保護作用を担い得る。
【０１０２】
ペプチド４５（残基２６５−２８０）に関して：このペプチドは１つの多形（残基２６５−２７１）および２番目の高度に保存された（残基２７１−２８０）２つの連続する領域に分割され得る。三次構造の解析により多形領域が露出された領域であり、他方、保存領域は全分子中に「埋まって」いるようであると示されている（示されていない）。従って、ペプチド４５に結合する抗体は主に露出された多形領域に対して向けられている可能性がある。
【０１０３】
これらのエピトープには二次構造および疎水性／極性領域の配分に関する特徴は全く認められなかった（実験的にもコンピューターによる認識でも）。高度に極性である（１６個のうちの１３個の残基）ペプチド５９を除き、一般には、実験によって認識されたエピトープは疎水性である（１６個のうちの９〜１２個の疎水性残基）傾向がある。
【０１０４】
図に関しては、図２は大腸菌ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の三次構造での細菌ペプチド６、７および３１の位置を示しており、図３は記載したように、空間充填および二次構造表示に関してＧｒｏＥＬ大腸菌の構造を基にしたＭＴ  ＨＳＰ６５のモデルでの同一のペプチドを示している。
【０１０５】
ＡＡに対するペプチドの免役化力の解析
保護性免疫グロブリンによって認識される細菌または哺乳類ＨＳＰペプチドでの有効な免役化がＡＡに対する保護を誘導できるかどうかを調べるために、ルイスラットを耐性ルイスラット由来の抗体と結合したマイコバクテリアのペプチド６、７、２１、３１、３６、４５、８４（「保護」ペプチド）で、いくつかの非反応性マイコバクテリアＨＳＰ６５ペプチド：ペプチド２６（残基１５１−１６６）、２８（残基１６３−１７８）またはペプチド７０（残基４１５−４３０）で、および哺乳類ペプチド５で免役化した。
【０１０６】
ラットにＭＴでのＡＡの誘導の前に、注射の間の間隔を１週間おいて３回腹膜内（ＩＰ）注射した。
【０１０７】
図４は細菌ペプチド６および７ならびに哺乳類ペプチド５でのラットの予備免役化は疾病重篤度の有意な抑制をもたらしたと示している。
【０１０８】
これらの「保護」ペプチドでの免役化はまた、ペプチド６に対する、ならびに全ＭＴ  ＨＳＰ６５に対する抗体の産生ももたらした（表５）。
【表５】
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【０１０９】
文献：
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ３種のＨＳＰ６０配列のアミノ酸比較。
結核菌、ラットＨＳＰ６０およびヒトＨＳＰ６０（それぞれ配列番号６、７および８に相当する配列Ｐ０６８０６、Ｐ１９２２７およびＰ１０８０９）をＧＣＧ−ウィスコンシンパッケージｖ９．０のパイルアッププログラムを用いて比較した。保存領域が示されている（共通）。太字、下線を引いた残基は好ましいペプチドを表す。
【図２】  大腸菌ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の三次構造。
ＧｒｏＥＳ七量環がダークグレーで示されている。２個のＧｒｏＥＬ七量環はライトグレーで示されている。ペプチド６−７（アミノ酸３１−５２）および３１（アミノ酸１８１−１９７）も示されている。
【図３ａ】  ＨＳＰ６５単量体におけるペプチド６、７および３１の位置。
ＨＳＰ６５単量体におけるペプチド６、７および３１の位置が二次構造配置で示されている。
【図３ｂ】  ＨＳＰ６５単量体におけるペプチド６、７および３１の位置。
ＨＳＰ６５単量体におけるペプチド６、７および３１の位置が空間充填様式で示されている。
【図４】  ＨＳＰペプチドでの予防接種。
ＨＳＰペプチド６、７およびＲ５でのＡＡに対する予防接種が示されている。ＰＢＳを対照として用いた。
【図５】  ペプチド６、７およびＲ５内の保護モチーフ。
ペプチド６、７およびＲ５内の共通モチーフ、Ｖ--Ｅ--ＷＧ−Ｐが示されている。
【図６】  ｐＴＡＲＧＥＴの制限マップ。
プラスミドｐＴＡＲＧＥＴの制限マップが示されている。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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