(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミンの多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液を、ｐＨ９．０に調整し、５時間放置してヒト血清アルブミン多量体の一部を単量体化させた後、塩濃度５０〜７５ｍＭのアルカリ金属塩化物を含みかつｐＨが６〜７の緩衝液で平衡化した陰イオン交換体と接触させることを特徴とするヒト血清アルブミン多量体の除去方法。
【請求項２】
前記アルカリ金属塩化物が、塩化ナトリウムあるいは塩化カリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
陰イオン交換体が強陰イオン交換体である請求項１または２に項記載の方法。
【請求項４】
ヒト血清アルブミンの多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液を、塩化ナトリウム５０〜７５ｍＭを含むｐＨ６〜７のリン酸ナトリウム緩衝液で溶媒置換した後、同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換体と接触させ、多量体を吸着、除去することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
ヒト血清アルブミンの多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液を、塩化ナトリウム５０〜７５ｍＭを含むｐＨ６〜７のリン酸ナトリウム緩衝液で溶媒置換した後、同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて多量体を強陰イオン交換体に吸着させ、多量体を実質的に含有しない素通り画分を回収することを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト血清アルブミンの多量体を除去する方法に関する。より詳細には、ヒト血清アルブミンの多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液を、特定条件下で陰イオン交換体と接触させることによって、該多量体を除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）は、血漿中の主要な蛋白成分で、585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダルトンの分子量を有する(Minghetti, P. P. et al.(1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。ＨＳＡは、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカルシウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリアーとしての役割を果たすことが知られている。純化したＨＳＡは、例えば、外科手術、出血性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アルブミン血症の治療に使用される。
【０００３】
従来、ＨＳＡは、ヒト血漿からコーンの低温エタノール分画法あるいは該方法に準じた方法により、ＨＳＡ画分（ＨＳＡは画分Vに分画される）を得た後、更に、種々の精製方法を駆使して製造されている。また近年、原料をヒト血漿に依存しない方法として、遺伝子組換え技術を応用して酵母や大腸菌、枯草菌にヒト血清アルブミンを生産させる技術が開発されている。酵母については、(1) Production of Recombinant Human Serum Albumin from Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry 11, 273-287(1989)、(2) Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken. Okabayashi et.al, J. Biochemistry, 110, 103-110 (1991)、(3) Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1072(1991)、大腸菌については(4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular human serum albumin; Lawn, R. M., European Patent Appl. 73,646 (1983)、(5) Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et. al. Biotechnique 5, 1309-1314 (1987)、枯草菌については(6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis; Saunders, C. W. et. al, J. Bacteriol. 169, 2917-2925 (1987)参照。
【０００４】
ヒト血清アルブミンの精製方法としては、一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、ヒト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わせにより行われている。
【０００５】
ヒト血清アルブミンの工業的生産においては、ヒトの体内環境と異なる諸条件で処理する必要があり、そのためにヒト血清アルブミンの多量体が生成する。ヒト血清アルブミンの臨床応用でこれらの多量体が人体に悪影響を及ぼすという報告はまだされていないが、これらの多量体による新たな抗原性の発現等の懸念がある。このような医薬品としての安全性の観点より、「ヒト血清アルブミン」の医薬品としての規格試験において多量体の混入限度が規定されており、製剤中の多量体の含量を充分低下させることは製造上の非常に重要な課題となっている。
このヒト血清アルブミンの多量体は、単量体が２分子或いはそれ以上結合して形成されるものであり、等電点や化学的性状が単量体と非常に似通っており、通常生産で行われる精製方法では分離が困難である。そのため、従来技術ではゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点分画処理、硫安分画処理、エタノール分画処理など数種類の精製方法を組み合わせて除去されてきた（特表平11-509525(国際公開WO96/37515、特許第2926722号(平成11年5月14日登録)。
精製方法を複数組み合わせると、回収率は各工程の乗算となり、生産性の低下を招く場合が多い。工業的観点から、なるべく精製工程を少なくして多量体を効率的に除去し、かつ、単量体は高収率で回収できる方法の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ヒト血清アルブミンの製造工程において生成するヒト血清アルブミンの多量体を一段の工程のみを施すことにより効率的に除去する方法を提供することにある。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト血清アルブミンの多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液を、塩濃度10〜150 mM、ｐＨ５〜9.5の緩衝液で平衡化した陰イオン交換体と接触させることを特徴とするヒト血清アルブミン多量体の除去方法を提供するものである。本発明はまた、該方法を含む製造工程により製造されたヒト血清アルブミン多量体の含有量が低減された高純度のヒト血清アルブミンを包含する。以下、本発明について詳述する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒト血清アルブミン多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液を適当な塩濃度の緩衝液組成に調製した後、該ヒト血清アルブミン溶液を、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換体と接触させ、前記多量体を陰イオン交換体に吸着させることにより除去し、高純度のヒト血清アルブミンを回収することを特徴とするものである。この方法を実施することによって、ヒト血清アルブミン多量体を実質的に含有しない高純度のヒト血清アルブミンを効率的に得ることができる。
【００１０】
前記の陰イオン交換体に供されるヒト血清アルブミンとしては、遺伝子組換え技術によって得られた組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡと称することもある）又はＨＳＡが使用される。
血漿からＨＳＡを製造する際、各製造工程で多量体を生じることが予測されるが、いずれの工程で生じた多量体含有水溶液も使用可能である。例えば、低温アルコール分画の画分Ｖの水溶液、画分Ｖを更なる精製工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際に生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられる。
ｒＨＳＡ製造の際に生じた各製造工程の多量体含有水溶液も同様に使用することができる。例えば、ｒＨＳＡ産生宿主の培養物、該培養物を更なる製造工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際に生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられる。ここで、培養物とは、上記宿主を培養した培養液及び宿主を通常使用される方法で破砕した宿主破砕液を含むものとする。
【００１１】
ｒＨＳＡを生産する宿主には特に制限はなく、酵母、大腸菌、枯草菌及び動物細胞などが挙げられる。好ましくは、酵母、例えば、サッカロミセス属、ピキア属が使用されるが、更に好ましくは、サッカロミセスセレビシエＡＨ22株又はその変異株が用いられる。
【００１２】
本発明の方法は、血漿又は組換え宿主由来の夾雑物を含むヒト血清アルブミン溶液を、限外濾過、加熱処理、イオン交換クロマト、吸着クロマト、ゲル濾過及び塩析などの処理工程を経てある程度精製が進んだ段階（ＨＳＡ又はｒＨＳＡの純度約85％以上）で使用することが望ましい。
【００１３】
前記のアルブミン溶液を調製するために用いる緩衝液の種類は、特に限定されないが、通常の陰イオン交換クロマトグラフィーに使用されるリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが好ましい。緩衝液中の緩衝成分の濃度は、一般に、陰イオン交換クロマトグラフィーが行われる条件に設定される。すなわち、好ましくは５〜２００ｍＭ、さらに好ましくは１０〜１００ｍＭが使用される。
【００１４】
緩衝液のｐＨは、該緩衝液中に塩を含まない条件下において、ヒト血清アルブミンの多量体が陰イオン交換体に吸着する範囲に設定すれば良い。すなわち、ｐＨ5〜9.5の範囲、好ましくは、ｐＨ5.5〜7.5の範囲、更に好ましくは、ｐＨ６〜７の範囲で使用される。
【００１５】
緩衝液に添加される塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等のアルカリ金属塩化物等が使用可能であるが、好ましくは、塩化ナトリウムが用いられる。該塩の濃度は、多量体は吸着するが単量体は吸着しない濃度範囲が好ましく、使用される緩衝液の種類、濃度及びｐＨの組み合わせによって、適宜に調整され、10〜150 ｍＭの範囲で使用することができ、好ましくは、25〜100 mM、更に好ましくは、50〜75 mMの範囲である。
【００１６】
塩濃度10〜150 mM、ｐＨ５〜9.5の緩衝液に溶解したヒト血清アルブミンの多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液は、任意の溶液に溶解したヒト血清アルブミン溶液を、塩濃度10〜150 mM、ｐＨ５〜9.5の緩衝液に対して透析して置換する方法、ゲル濾過法、一旦ヒト血清アルブミン溶液を濃縮した後に前記緩衝液で希釈することを繰り返すことにより置換する方法等を用いることができる。
【００１７】
ヒト血清アルブミン溶液中のヒト血清アルブミン濃度は、該アルブミンが溶解する濃度の範囲であれば特に限定されないが、好ましくは１〜３０％、さらに好ましくは５〜２５％である。
【００１８】
陰イオン交換体のベース担体は特に限定されないが、ヒト血清アルブミンを非特異的に吸着しない担体を選択することが好ましい。また、陰イオン交換基は、強陰イオン交換基及び弱陰イオン交換基のいずれも使用可能であるが、好ましくは、強陰イオン交換基が使用される。斯かる強陰イオン交換基を有する強陰イオン交換体としては、Ｑ−セファロースＦＦ(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)、セルファインＱ(ミリポア社製)などが挙げられるが、特に限定されない。
【００１９】
陰イオン交換体を用いてアルブミン多量体を除去する方法としては、アルブミン多量体を含有するアルブミン溶液をカラムクロマトグラフィーにかけ、アルブミン多量体を選択的に陰イオン交換体に吸着させ、多量体を含まない素通り画分を回収する方法、バッチ式により該アルブミン溶液を陰イオン交換体と接触させ、多量体を選択的に陰イオン交換体に吸着させた後、該溶液の自然放置若しくは遠心により陰イオン交換体を分離し、得られる上清を回収する方法が挙げられるが、いずれの方法でも良い。例えば、カラムクロマトグラフィーを行う場合、カラムサイズ、流速などのクロマトグラフィーの条件は、試料の濃度、容量によって適宜調整される。例えば、１０％ヒト血清アルブミン１０Lに対し、陰イオン交換体容積２５L、カラムサイズ（７００cm2 x ３５cm）、流速１２００ml/分が設定される。
【００２０】
ヒト血清アルブミンの多量体が除去された程度については、回収液の一部をゲル濾過高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)分析することによって調べることができる。例えば、ＴＳＫgel  Ｇ３００ＳＷ（東ソー社製）のカラムを用い、0.1ＭＫＨ2ＰＯ4／0.3ＭＮａＣｌ緩衝液で溶離し、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行われる。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒト血清アルブミンの多量体が混在するヒト血清アルブミン含有溶液を、所定の緩衝液組成に調製し、これを同緩衝液で平衡化した陰イオン交換体と接触させることによって、該多量体を効果的に除去し、かつ単量体を高収率で回収することができる。
【００２２】
また、本発明の方法により、ヒトに投与された場合ショックやアレルギーなどの副作用の原因となるかもしれないヒト血清アルブミンの多量体を実質的に含まない高純度のヒト血清アルブミンが提供される。
【００２３】
【実施例】
調製例：多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液の調製
特表平１１−５０９５２５に述べられている方法に従って、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によりｒＨＳＡを生産させた。このｒＨＳＡを含む培養液を精製水で約２倍容量になるように希釈後、酢酸水溶液を用いてｐＨ4.5に調整した。50 mM塩化ナトリウムを含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化したストリームラインＳＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）(径60cm×16cm)に適用した。次に、カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄し、次に、300 mM塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)を送液してｒＨＳＡ含有画分を得た。当該ストリームラインＳＰカラム溶出ＨＳＡ画分をホウ酸塩にてｐＨ9.0に調整し、5時間放置してヒト血清アルブミン多量体の一部を単量体化した。
【００２４】
実施例１：透析に続く強陰イオン交換クロマトグラフィー
調製例の方法によって調製したヒト血清アルブミン多量体を6.1％（ゲル濾過ＨＰＬＣ分析での定量値）含むヒト血清アルブミン溶液を、５０ｍＭ、７５ｍＭ、又は１００ｍＭの塩化ナトリウムをそれぞれ含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.5）中で、室温で８時間透析した後、該ヒト血清アルブミン溶液を予め同じ緩衝液で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（径2.5cm×10cm)にかけ、同緩衝液（500ml、溶出速度12ml／分）を送液し、素通りした画分をすべて回収した。
【００２５】
実験例１：ゲル濾過ＨＰＬＣ分析
実施例１の素通り画分０．０２ｍｌを、0.3ＭＮａＣｌを含む0.1ＭＫＨ2ＰＯ4緩衝液で平衡化したＴＳＫgel  Ｇ３００ＳＷ（東ソー社製）カラム（径０．７５ｃｍｘ３０ｃｍ）にかけ、検出波長２８０ｎｍでゲル濾過ＨＰＬＣ分析を実施した。図1及び表1は実施例１の分析結果を示す。
【００２６】
【表１】
0004798832.tif 000002
【００２７】
表１は、ヒト血清アルブミン溶液を塩化ナトリウムの濃度50〜75 mMを含むリン酸緩衝液で透析した後、該溶液を同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換体カラムを通過させることにより、強陰イオン交換体に多量体を選択的に吸着させ、多量体濃度が低減したヒト血清アルブミンが、高い回収率で得られることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】７５ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後の試料（処理前）及び透析後の試料を同緩衝液で平衡化した強陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、素通りした画分（処理後）を、ゲル濾過ＨＰＬＣで分析した時の結果を示す図面である。
【図１】
0004798832.tif 000003