(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
干渉用ＲＮＡを使用する際におけるインターフェロン応答（但し、ヒトを除く）を低減する方法であって、
標的遺伝子のプロモーター領域若しくは転写調節領域または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡと、
前記標的遺伝子の前記配列に相同なセンスＲＮＡと
を含む一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡからなる二重鎖干渉用ＲＮＡであって、
前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上であり、
二重鎖を形成している領域内のセンスＲＮＡにおいて、二重鎖を形成できる程度の塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジ、又は１個以上の塩基の置換を含む二重鎖干渉用ＲＮＡを使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記二重鎖形成部分の長さが、５０〜３００塩基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二重鎖形成部分の長さが、５０〜１００塩基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
二重鎖を形成している領域内のセンスＲＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
センスＲＮＡにおける塩基の置換がシトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）への置換、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換、またはアデニン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への置換である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
塩基の置換がデアミネーションによって導入される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記バルジ又は前記置換が、前記二重鎖の末端から２０〜２３番目の塩基の位置以外に含まれている請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記二重鎖の末端から１〜１９番目の塩基の間に最初のバルジが含まれ、前記バルジの位置から数えて１〜２５番目の塩基ごとに次のバルジが含まれている請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バルジがセンスＲＮＡに含まれる請求項１、７又は８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡの間にループをさらに含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
干渉用ＲＮＡを使用する際におけるインターフェロン応答を低減するためのベクターであって、
標的遺伝子のプロモーター領域若しくは転写調節領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、
前記標的遺伝子の前記配列に相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、
前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターと
を含んでなるベクターであって、
前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡからなる二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上であり、
二重鎖を形成している領域内のセンスＲＮＡにおいて二重鎖を形成できる程度の塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジ、又は１個以上の塩基の置換を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
前記二重鎖形成部分の長さが、５０〜３００塩基であることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記二重鎖形成部分の長さが、５０〜１００塩基であることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
二重鎖を形成しているＲＮＡをコードするＤＮＡの領域内のセンスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
【請求項１５】
センスコードＤＮＡにおける塩基の置換がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換またはアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
塩基の置換がデアミネーションによって導入される請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記バルジ又は前記置換が、前記二重鎖の末端から２０〜２３番目の塩基の位置以外に含まれている請求項１１に記載のベクター。
【請求項１８】
前記二重鎖の末端から１〜１９番目の塩基の間に最初のバルジが含まれ、前記バルジの位置から数えて１〜２５番目の塩基ごとに次のバルジが含まれている請求項１１に記載のベクター。
【請求項１９】
前記バルジがセンスＲＮＡに含まれる請求項１１、１７又は１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡの間にループをさらに含む請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
前記プロモーターが、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターである請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２２】
前記ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターが、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、７ＳＬプロモーターおよび５ＳｒＲＮＡプロモーターからなる群から選択される請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
干渉用ＲＮＡを使用する際におけるインターフェロン応答を低減するための発現システムであって、
標的遺伝子のプロモーター領域若しくは転写調節領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、
前記標的遺伝子の前記配列に相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターと
を含んでなり、
前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡからなる二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上であり、
二重鎖を形成している領域内のセンスＲＮＡにおいて二重鎖を形成できる程度の塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジ、又は１個以上の塩基の置換を含むことを特徴とする発現システム。
【請求項２４】
前記二重鎖形成部分の長さが、５０〜３００塩基であることを特徴とする請求項２３に記載の発現システム。
【請求項２５】
前記二重鎖形成部分の長さが、５０〜１００塩基であることを特徴とする請求項２４に記載の発現システム。
【請求項２６】
二重鎖を形成しているＲＮＡをコードするＤＮＡの領域内のセンスコードＲＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されていることを特徴とする請求項２３に記載の発現システム。
【請求項２７】
センスコードＤＮＡにおける塩基の置換がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換である請求項２６に記載の発現システム。
【請求項２８】
塩基の置換がデアミネーションによって導入される請求項２７に記載の発現システム。
【請求項２９】
前記バルジ又は前記置換が、前記二重鎖の末端から２０〜２３番目の塩基の位置以外に含まれている請求項２３に記載の発現システム。
【請求項３０】
前記二重鎖の末端から１〜１９番目の塩基の間に最初のバルジが含まれ、前記バルジの位置から数えて１〜２５番目の塩基ごとに次のバルジが含まれている請求項２３に記載の発現システム。
【請求項３１】
前記バルジがセンスＲＮＡに含まれる請求項２３、２９又は３０のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項３２】
前記第一及び第二のプロモーターが、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターである請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項３３】
前記ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターが、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、７ＳＬプロモーターおよび５ＳｒＲＮＡプロモーターからなる群から選択される請求項３２に記載の発現システム。
【請求項３４】
請求項１１〜２２のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の発現システムを保持した細胞。
【請求項３５】
植物細胞である請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
動物細胞である請求項３４に記載の細胞。
【請求項３７】
哺乳動物細胞である請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
請求項１１〜２２のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の発現システムを含む遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項３９】
医薬組成物である請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
標的遺伝子の発現が抑制された哺乳動物細胞を生産する方法であって、
請求項１１〜２２のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の発現システムを細胞に導入する工程と、
前記ベクター又は前記発現システムが導入された細胞を選択する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長い干渉用二重鎖ＲＮＡおよび長い干渉用二重鎖ＲＮＡを発現するためのベクターおよび長い干渉用二重鎖ＲＮＡを用いたノックダウン細胞の生産方法等に関する。より具体的には、二重鎖の部分が、５０塩基以上の干渉用二重鎖ＲＮＡ、それらの干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクター、ベクターを含む干渉用二重鎖ＲＮＡ発現システム、およびこれらを保有する細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（RNA interference、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列からなるセンスＲＮＡとこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる二重鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用として注目を集めている。このようなＲＮＡｉは、当初、線虫において発見されたが（非特許文献１）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。これらの生物では、外来のｄｓＲＮＡを導入することにより、標的遺伝子の発現が抑制されることが実際に確認されており、ノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【０００３】
哺乳動物細胞では、他の生物と同様にｄｓＲＮＡを細胞外から導入することによりＲＮＡｉの誘導が試みられている。しかし、導入されたｄｓＲＮＡによりウイルス感染などに対する宿主細胞の防御機構が作動することにより、タンパク質合成が阻害され、ＲＮＡｉを観察することができなかった。
【０００４】
最近、Tuschlらにより、他の生物で用いられているような長いｄｓＲＮＡに代えて、２もしく３ヌクレオチドの一本鎖の３’末端の突出（オーバーハング）を有する全長２１もしくは２２ヌクレオチド（オーバーハングを含めて数える）の短鎖の干渉用ＲＮＡ二重鎖（short interfering ＲＮＡ、以下、「ｓｉＲＮＡ」と略称する）を哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞でもＲＮＡｉを誘導し得ることが報告された（非特許文献６、非特許文献７）。
このようにｓｉＲＮＡがリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドを越える遺伝子の機能解析や発現制御のための強力なツールとして使用できることがわかり、その改良が日夜続けられている。特に、遺伝子の一次配列がヒトを含む多くの生物種でほぼ決定された現在、生体における遺伝子機能を網羅的かつ高効率に解析するための最も有力なツールとしてｓｉＲＮＡの利用が注目されている。
【０００５】
【非特許文献１】Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference bydouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)
【非特許文献２】Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363(1999)
【非特許文献３】Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)
【非特許文献４】Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J.Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet.2, 110-1119 (2001)
【非特許文献５】Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence.Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)
【非特許文献６】Elbashir, S. M et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001)
【非特許文献７】Caplen, N. J. et al. Specific inhibition of gene expression by smalldouble-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc Natl Acad SciU S A 98, 9742-9747 (2001)
【非特許文献８】Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of anantisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNApromoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)
【非特許文献９】Zanta M.A. et al., Gene delivery: a single nuclear localizationsignal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl AcadSci U S A. 1999 Jan 5;96(1):91-6)
【非特許文献１０】Liu F, Huang L. Improving plasmid DNA-mediated liver gene transferby prolonging its retention in the hepatic vasculature. J. Gene Med. 2001Nov-Dec;3(6):569-76
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＮＡｉを利用してｍＲＮＡレベルで任意の遺伝子の発現を抑制することによって、その遺伝子の機能を解析することができ、また、医療分野への応用として、前述のような方法により疾患原因遺伝子の解明のほか、ＲＮＡウイルスの増殖抑制、疾患関連遺伝子の発現抑制を行なうことのできる可能性がある。
【０００７】
ＲＮＡの化学合成には、ＤＮＡ合成に比べ、塩基数が長いほど格段に費用がかかること等から、哺乳動物細胞では、Tuschlらが行なった二重鎖ＲＮＡ部分の塩基数が１９〜２１（２塩基のオーバーハングをアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡの３’側に２塩基含むため、オーバーハングを含めて数えると塩基数２１〜２３)のｓｉＲＮＡを用いている。しかし、これらの塩基数だと、標的とする配列により遺伝子発現の抑制効果が異なる。すなわち、発現を抑制させたい標的遺伝子のうちの、どの部位をアンチセンスＲＮＡと相補的な部位にするかにより発現抑制効果は異なり、標的とする部位によっては遺伝子発現を効果的に抑制できるが、部位によってはほとんど抑制されない場合もある。このため、実際の適用には、効果的な標的とする部位を予め検討する必要がある。
【０００８】
一方、長い塩基数（３０ｂｐ以上）のＲＮＡを用いた場合には、哺乳動物細胞においてはＲＮＡｉが生じにくいとされていた。この原因の一つとしては、インターフェロン応答と呼ばれる二つの経路が活性化されるためと考えられている。インターフェロン応答は、３０ｂｐ以上の長いｄｓＲＮＡを細胞外から導入したとき、細胞はウイルス感染を受けた際と同様にインターフェロンを産生し、遺伝子全体の翻訳が阻害される現象をいう。インターフェロンにより、ｄｓＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）をコードする遺伝子の転写が高まり、ＰＫＲの自己リン酸化とキナーゼ活性が促進される。活性化されたＰＫＲは、ｅＩＦ−２αをリン酸化し、これにより遺伝子全体の翻訳が阻害される。このようなインターフェロン応答により、長いｄｓＲＮＡを導入した哺乳動物細胞では、ＲＮＡ干渉効果の特異性が下がり、またアポトーシスも誘導されるため、細胞毒性が上がるという問題があった。
【０００９】
そこで、ＲＮＡｉを遺伝子機能解析および遺伝子治療に適用するにあたり、標的とする部位によらず、効果的に遺伝子発現が抑制されるが、細胞毒性が低いｓｉＲＮＡの開発が望まれる。そこで、本発明は、そのような干渉用二重鎖ＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを発現するためのベクターおよび機能遺伝子ノックダウン細胞の生産方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、標的特異性が充分高い長い塩基数を有するが、インターフェロン応答が生じにくいｄｓＲＮＡを開発した。すなわち、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いて、二重鎖の部分が５０塩基以上の長いｄｓＲＮＡを細胞内で生成することにより、インターフェロン応答が低減されたＲＮＡｉを誘導できることを見出した。さらに、二重鎖部分が５０塩基以上のｄｓＲＮＡにバルジや変異を導入することにより、バルジや変異を導入していないものと比べてＲＮＡｉ活性は高まり、インターフェロン応答が顕著に低減されることがわかった。
【００１１】
さらに、本願発明者らは、二重鎖の部分が５０塩基以上の長いｄｓＲＮＡが、転写後レベルだけではなく、転写レベルにおいてＲＮＡｉを誘導することを見いだした。具体的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのみならず、標的遺伝子の周辺部分（例えばプロモーター部分や転写調節領域など）に対するｄｓＲＮＡが、ＤＮＡメチレーションを誘導して、転写を阻害することがわかった。
【００１２】
すなわち、本発明は、標的遺伝子の周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記アンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記配列に相同なセンスＲＮＡとを含む二重鎖干渉用ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上、例えば５０〜３００塩基、好ましくは１００塩基であることを特徴とする二重鎖干渉用ＲＮＡを提供する。
標的遺伝子の周辺領域の配列としては、例えば、プロモーター部分や転写調節領域が例示できる。転写調節領域としては、エンハンサー、リプレッサーを含む転写調節領域およびその近傍領域が例示できる。
【００１３】
このような干渉用二重鎖ＲＮＡは、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されていてもよく、好ましくは、センスＲＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されている。センスＲＮＡにおいて１個以上の塩基が置換されている場合には、シトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）への置換、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換、またはアデニン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への置換が好ましい。このような塩基の置換は、デアミネーションによって導入することができる。
【００１４】
本願の干渉用二重鎖ＲＮＡは、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡにおいて塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジを含んでいてもよい。バルジの位置は、例えば、二重鎖の末端から２０〜２３番目の塩基の位置以外に含まれているのが望ましく、あるいは、二重鎖の末端から１〜１９番目の塩基の間に最初のバルジが含まれ、前記バルジの位置から数えて１〜２５番目の塩基ごとに次のバルジが含まれているものが望ましい。このようなバルジは、センスＲＮＡに導入するのが好ましい。
本願の干渉用二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡの間にループをさらに含むものであってもよい。
【００１５】
また、本発明は、二重鎖干渉用ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターであって、  標的遺伝子のプロモーターを含む周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記配列に相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなるベクターであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上、例えば５０〜３００塩基、好ましくは５０〜１００塩基であることを特徴とするベクターを提供する。標的遺伝子の周辺領域の配列としては、例えば、プロモーター部分や転写調節領域が例示できる。
【００１６】
本願のベクターは、二重鎖を形成しているＲＮＡをコードするＤＮＡの領域内のアンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されていてもよく、好ましくは、センスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されている。センスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が置換されている場合には、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、またはアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換が好ましい。このような塩基の置換は、デアミネーションによって導入することができる。
【００１７】
本願のベクターは、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡにおいて塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジを含む干渉用二重鎖ＲＮＡを生じるものでもよい。バルジの位置は、例えば、二重鎖の末端から２０〜２３番目の塩基の位置以外に含まれているのが望ましく、あるいは、二重鎖の末端から１〜１９番目の塩基の間に最初のバルジが含まれ、前記バルジの位置から数えて１〜２５番目の塩基ごとに次のバルジが含まれているものが望ましい。このようなバルジは、センスＲＮＡに導入するのが好ましい。
本願のベクターは、アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡの間にループをさらに含む干渉用二重鎖ＲＮＡを生じてもよい。
本願のベクターに含まれるプロモーターには、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いることができ、例えば、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、７ＳＬプロモーターおよび５ＳｒＲＮＡプロモーターからなる群から選択されるｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いることができる。
【００１８】
さらに本願は、二重鎖干渉用ＲＮＡを細胞内で発現させるための発現システムであって、標的遺伝子のプロモーターを含む周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記アンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記配列に相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上、例えば５０〜３００塩基、好ましくは５０〜１００塩基であることを特徴とする発現システムを提供する。標的遺伝子の周辺領域の配列としては、例えば、プロモーター部分や転写調節領域が例示できる。
【００１９】
本願の発現システムは、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されている干渉用二重鎖ＲＮＡを生じてもよい。
本願の発現システムは、二重鎖を形成しているＲＮＡをコードするＤＮＡの領域内のアンチセンスコードＤＮＡまたはセンスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されていてもよく、好ましくは、センスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が他の塩基により置換されている。センスコードＤＮＡにおいて１個以上の塩基が置換されている場合には、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換またはアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換が好ましい。このような塩基の置換は、デアミネーションによって導入することができる。
【００２０】
本願の発現システムは、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡにおいて塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジを含む干渉用二重鎖ＲＮＡを生じるものでもよい。バルジの位置は、例えば、二重鎖の末端から２０〜２３番目の塩基の位置以外に含まれているのが望ましく、あるいは、二重鎖の末端から１〜１９番目の塩基の間に最初のバルジが含まれ、前記バルジの位置から数えて１〜２５番目の塩基ごとに次のバルジが含まれているものが望ましい。このようなバルジは、センスＲＮＡに導入するのが好ましい。
本願の発現システムに含まれる第一及び第二のプロモーターには、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いることができ、例えば、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、７ＳＬプロモーターおよび５ＳｒＲＮＡプロモーターからなる群から選択されるｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いることができる。
【００２１】
さらに、本発明は、上記ベクターまたは上記発現システムを保持した細胞を提供する。そのような細胞としては、植物細胞及び動物細胞が好ましい。
また、本発明は上記ベクターまたは上記発現システムを含む組成物を提供する。このような組成物としては、医薬組成物が好ましい。
さらに本発明は、上記ベクターまたは上記発現システムを細胞に導入する工程と、前記ベクター又は前記発現システムが導入された細胞を選択する工程とを含む標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法を提供する。
【００２２】
さらに本発明は、標的遺伝子の周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記領域に相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとにより形成される二重鎖部分の長さが、５０塩基以上である干渉用二重鎖ＲＮＡを発現する一以上のベクターを細胞に導入する工程を含む標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
上記の通り、本発明の長いｄｓＲＮＡを用いることにより、予めどの部位をアンチセンスＲＮＡと相補的な配列にするかを検討することなく、かつ低い細胞毒性でＲＮＡｉをもたらすことができる。
また、本発明のベクターまたは発現システムは、化学合成によらずｓｉＲＮＡを細胞内で合成できるため、より短いｓｉＲＮＡを用いたときのように予め発現抑制効果の高い部位を特定することなく、かつ低毒性なｓｉＲＮＡを、安価に作成することができる。このような本発明のベクターまたは発現システムを用いて、標的遺伝子の機能解析や、ウイルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などによる遺伝子治療を行なうことができる。さらには、本発明のベクターまたはシステムを用いて、標的遺伝子の機能解析のための研究材料となるノックダウン細胞、ノックダウン動物または植物を作成することができる。植物細胞に本発明のｓｉＲＮＡを導入した場合には、機能解析のみならず、品種改良に用いることができる。特に、植物細胞についてはこれまで変異を入れて発現抑制が観察された例は、今まで無かったため、植物細胞のより効率的な発現抑制手法として有力な手段となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の第一の側面は、標的とする配列が限定されることなく、かつ細胞毒性の低い、干渉用二重鎖ＲＮＡに関する。この干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子の周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記アンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記配列に相同なセンスＲＮＡとを含む二重鎖干渉用ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上、例えば５０〜３００塩基、好ましくは５０〜１００塩基であることを特徴とする。標的遺伝子の前記周辺領域としては、プロモーター領域や転写調節領域が例示できる。
【００２５】
さらに、この干渉用二重鎖ＲＮＡは、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡにおいて、１個以上の塩基が他の塩基により置換され、標的配列の塩基とミスマッチとなる塩基を含んでいても良い。この置換は、アンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡのいずれか、又はアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡの両方に導入されていてもよいが、センスＲＮＡに置換が導入されているものが好ましい。また、センスＲＮＡに置換が導入されている場合、シトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）への置換、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換、またはアデニン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への置換が特に好ましい。この塩基置換は、デアミネーションにより導入できる。
また、本発明の干渉用二重鎖ＲＮＡは、二重鎖中に１つ以上のバルジを含んでいても良い。ここでバルジとは、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとにより形成された二重鎖ＲＮＡ中で、対応する１個以上の塩基が一方の鎖にないものをいう。バルジは、二重鎖を形成しているＲＮＡのうちの１本のＲＮＡ鎖から１個以上の塩基を欠失する、または１個以上の塩基を挿入することにより形成することができる。バルジは、二重鎖を形成するアンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡのどちらか一方または両方のＲＮＡに形成することができる。好ましくは、センスＲＮＡにバルジを形成する。
本発明のバルジを含む干渉用二重鎖ＲＮＡは、細胞内でプロセッシングを受けて、ｓｉＲＮＡ様の構造をとるとともに, 一本鎖のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）様の構造になるものと推定される。
【００２６】
バルジの位置は、ｓｉＲＮＡ生成時の切断個所と推定されている二重鎖部分の末端から２０から２３番目の塩基付近を避けて数箇所導入するのが望ましい。例えば、最初のバルジをｄｓＲＮＡの二重鎖部分の末端から数えて、１〜１９塩基目の間に導入し、次のバルジを１〜２５塩基ごとに導入することにより、バルジを導入していないものと同程度またはそれ以上の高い発現抑制効果を保ったままで、細胞毒性効果を低下させることができる。
【００２７】
また、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとの間に、ループ（リンカー）を含んでいてもよい。このループは、アンチセンスＲＮＡの３’末端とセンスＲＮＡの５’末端の間に含めることもでき、または、センスＲＮＡの３’末端とアンチセンスセンスＲＮＡの５’末端の間に含めることもできる。ループの配列は、ｄｓＲＮＡ形成を阻害しない限り、任意の配列でよく、ループの塩基数についても特に限定されない。例えば、４〜２０塩基程度のループや、数百塩基の長さのループであってもｄｓＲＮＡ形成を阻害しない限り使用することができる。
【００２８】
さらに、本願の干渉用二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとの間で形成される二重鎖の部分だけではなく、アンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡの３’側に、１〜４個の塩基、好ましくは２〜３個の塩基からなるオーバーハングを有しても良い。オーバーハングは、二重鎖を形成しない一本鎖の突出部分である。このオーバーハングは、標的遺伝子との特異性が低いため、標的遺伝子の配列と相補的な配列あるいは同じ（相同な）配列である必要は必ずしもない。また、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を保持し得る範囲で、例えば一端の突出部分に低分子ＲＮＡを備えてもよい。このような低分子ＲＮＡとしては、例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子、また人工的なＲＮＡ分子が挙げられる。
【００２９】
本発明の別の側面として、標的とする配列が限定されることなく、かつ細胞毒性の低い、干渉用二重鎖ＲＮＡを発現させるためのベクターが提供される。このベクターは、標的遺伝子のプロモーターを含む周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記配列に相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなるベクターであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上、例えば５０〜３００塩基、好ましくは５０〜１００塩基である。
【００３０】
このベクターは、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡをそれぞれ別個のプロモーターの制御下で発現させてもよく、その結果、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡは、別個のＲＮＡ鎖として形成され、その後相補的塩基対間で二重鎖を形成する。
一方、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを同一のプロモーターの制御下で発現させてもよく、その結果、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとが同一のＲＮＡ鎖として形成される。この場合、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとの間にループ（リンカー）が含まれるように、ベクター中にループ配列を含めることができる。ループは、上述の通り、アンチセンスＲＮＡの３’末端とセンスＲＮＡの５’末端の間に含めることもでき、または、センスＲＮＡの３’末端とアンチセンスセンスＲＮＡの５’末端の間に含めることもできる。
【００３１】
本発明のさらに別の側面として、標的とする配列が限定されることなく、かつ細胞毒性の低い、干渉用二重鎖ＲＮＡを発現させるための発現システムが提供される。この発現システムは、二重鎖干渉用ＲＮＡを細胞内で発現させるための発現システムであって、標的遺伝子のプロモーターを含む周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記アンチセンスＲＮＡに細胞内でハイブリダイズする前記配列に相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記二重鎖形成部分の長さが、５０塩基以上、例えば５０〜３００塩基、好ましくは５０〜１００塩基である。
【００３２】
本願のベクターまたは発現システムから生じる干渉用二重鎖ＲＮＡは、上記に説明したように、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡにおいて、１個以上の塩基が他の塩基により置換され、標的配列の塩基とミスマッチとなる塩基を含んでいても良い。また、本願のベクターまたは発現システムから生じる干渉用二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとにより形成される二重鎖部分に塩基の挿入あるいは欠失による１つ以上のバルジを含んでいても良い。これらの置換及びバルジは、上述したとおりの構成をとることができる。
【００３３】
本発明のベクター及び発現システムにおいて使用されるプロモーターとしては、５０塩基対以上の塩基配列の転写を制御できる限り、特に限定されない。５０塩基以上の塩基配列の転写を制御できるプロモーターとして、例えばｐｏｌＩＩ系プロモーター又はｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを挙げることができる。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５ＳｒＲＮＡプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、７ＳＬプロモーター、７ＳＫプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーターなどが挙げられる。このうち、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターが好ましい。ｐｏｌＩＩ系プロモーターとしては、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが挙げられる。
【００３４】
「ｄｓＲＮＡ」は、哺乳動物細胞内で毒性を示さない範囲の二重鎖ＲＮＡを意味する。本願においては、二重鎖部分が５０塩基以上のｄｓＲＮＡであっても、従来のようにｄｓＲＮＡを細胞外から導入するのではなく、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターなどにより細胞内においてｄｓＲＮＡを発現させれば、細胞毒性が低下することが確認された。望ましいｄｓＲＮＡの長さは、アンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡとの間で形成される二重鎖部分の長さが、５０塩基以上であり、好ましくは、５０塩基以上３００塩基以下、より好ましくは５０塩基以上１００塩基以下である。しかし、二重鎖部分の長さが３０１塩基以上のものであっても、インターフェロン応答のような細胞毒性を示さず、ＲＮＡ干渉効果が得られる限り、本発明の範囲から除外することを意図するものではない。
【００３５】
本発明において、「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子のプロモーターなどの周辺領域の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域の配列と相補する配列からなるＲＮＡである。このアンチセンスＲＮＡが標的遺伝子のｍＲＮＡと結合して、転写後レベルのＲＮＡｉを引き起こしたり、標的配列の周辺領域の配列にＤＮＡメチレーションを誘導することにより転写レベルのＲＮＡｉを引き起こすものと考えられている。アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の周辺領域の特定の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおける特定の領域と完全に相補的な塩基配列を有する必要はなく、センスＲＮＡとともに二重鎖ＲＮＡを形成できる限り、塩基配列の一部に不対合部分が含まれていてもよい。
【００３６】
また、「センスＲＮＡ」は、上記アンチセンスＲＮＡと相補する配列、すなわち、標的遺伝子の周辺領域の特定の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおける特定の領域と相同な（同じ）塩基配列を備え、相補的なアンチセンスＲＮＡとアニーリングしてｓｉＲＮＡを生成するＲＮＡである。センスＲＮＡは、前記標的遺伝子の周辺領域の特定の配列または標的遺伝子のｍＲＮＡにおける特定の領域と完全に相同な（同じ）塩基配列を有する必要はなく、アンチセンスＲＮＡとともに二重鎖ＲＮＡを形成できる限り、塩基配列の一部にバルジや置換のような不対合部分が含まれていてもよい。これらアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとは、従来では、ＲＮＡ合成機により化学合成されることが多いが、本発明では、化学合成のみならず、ベクター中のアンチセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（アンチセンスコードＤＮＡ）、センスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（センスコードＤＮＡ）より細胞内で発現される。
【００３７】
「標的遺伝子」は、その遺伝子の発現がｓｉＲＮＡにより抑制される遺伝子であり、任意に選択することができる。この標的遺伝子は、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを好適に選択することができる。また、がん遺伝子のような疾患関連遺伝子やウイルスタンパク質をコードする遺伝子を標的遺伝子にすることによって、遺伝子治療のための医薬組成物としても使用することが可能である。標的遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列の一部、すなわちｓｉＲＮＡの一方の鎖（アンチセンスＲＮＡ鎖）と結合し得る長さである少なくとも１５塩基以上が判明しているものであれば、ゲノム配列まで判明していない遺伝子であっても選択することができる。したがって、ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）などのｍＲＮＡの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子なども「標的遺伝子」として選択することができる。
【００３８】
本発明のベクターとしては、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡの５’上流にプロモーターをそれぞれ備えたタンデムタイプの干渉用二重鎖ＲＮＡ発現ベクターや、アンチセンスＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを同一ＤＮＡ鎖上に逆向きに配置し、これらＤＮＡ間にリンカーを挟んで連結させたユニットを一つのプロモーターの下流に接続させたステムループタイプの干渉用二重鎖ＲＮＡベクターが挙げられる。
【００３９】
タンデムタイプの干渉用二重鎖ＲＮＡ発現ベクターでは、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをそれぞれ別々のＲＮＡ鎖として発現させた後に、アニーリングさせ、二重鎖ＲＮＡとすることができる。ステムループタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターから生じるｓｉＲＮＡは、リンカー部分をループとし、その両側のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが対合（ステム構造）となったステムループ型構造を有する。そして、細胞内の酵素によりプロセッシングを受けてループ部分が切断され、ｓｉＲＮＡを生成させることができる。なお、この場合のステム部分の長さ、リンカー（ループ）の長さ、種類などは上述した通りの構成とすることができる。
【００４０】
本発明の発現システムでは、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを別個のベクターに保持させる。この場合には、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡのそれぞれの５’上流にプロモーターを含む。この場合には、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをそれぞれ別々のＲＮＡ鎖として発現させた後に、アニーリングさせ、二重鎖ＲＮＡとすることができる。
【００４１】
センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ｔ（チミン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。
【００４２】
また、いずれの場合にも、５’末端にプロモーターからの転写を促進し得る配列を備えてもよい。具体的にはタンデム型の場合には、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの５’末端それぞれに、また、ステムループ型の場合には上記ユニットの５’末端に、プロモーターからの転写を促進し得る配列を備えることにより、干渉用二重鎖ＲＮＡの生成を効率化してもよい。なお、こうした配列からの転写物は、干渉用二重鎖ＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制に支障がない場合には、干渉用二重鎖ＲＮＡに付加された状態で用いてもよいが、発現抑制に影響を与える場合には、リボザイムのようなトリミング手段を用いてトリミングを行うことが好ましい。
【００４３】
また、本願発明は、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとから形成される二重鎖部分の長さが、５０塩基以上、好ましくは５０〜３００塩基、より好ましくは５０〜１００塩基である干渉用二重鎖ＲＮＡを発現させるためのベクターを保持する細胞、当該細胞を有する生物個体、当該ベクターを細胞に導入して、標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法をも意図している。本発明の干渉用二重鎖ＲＮＡ発現用ベクター又はシステムを保持する細胞の生成方法、当該細胞を有する生物個体の生成方法については、当業者は当該技術分野の通常の知識に基づき、適宜実施することが可能である。本発明を下記の実施例に基づき説明するが、実施例に述べる特定の方法に限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４４】
［実施例１：Ｕ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ］
図１に示すようなＵ６プロモーターの制御下で、長いｄｓＲＮＡを発現するベクターを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を確認した。
４８穴プレートに、１穴あたり２．５×１０４個のＨｅＬａ  Ｓ３細胞を播き、２４時間後に１２００ｎｇのプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ルシフェラーゼ活性を測定した。左から数えて、レーン１〜３はネガティブコントロール、レーン４は変異を導入した５０ｂｐのｄｓＲＮＡ発現ベクター、レーン５は完全相補の５０ｂｐ
ｄｓＲＮＡ発現ベクター、レーン６は変異を導入した１００ｂｐのｄｓＲＮＡ発現ベクター、レーン７は完全相補の１００ｂｐのｄｓＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクションしたものである。
【００４５】
ネガティブコントロールとして用いたベクターであるｃ１−ｐＵ６ｉｃ、ｃ２−ｐＵ６ｉｃ５０ＡＳ、ｃ３−ｐＵ６ｉｃ１００ＡＳは、ｄｓＲＮＡを発現しないＵ６プロモーターを含んだベクターであり、生じるＲＮＡ配列は、ＧＵＧＡＧＣＡＧＧＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＵＧＣＣＡＡＣＵＵＵＵ（配列番号１）である。変異を導入した５０ｂｐのｄｓＲＮＡ発現ベクターであるｐＵ６ｉ５０Ｓから生じるＲＮＡ配列は、ＧＣＣＵＵＵＡＧＧＡＵＵＡＵＡＡＧＧＵＵＣＡＡＡＧＵＧＵＧＣＵＧＵＵＧＧＵＧＵＣＡＡＣＵＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＵＵＵ（配列番号２）であり、完全相補の５０ｂｐｄｓＲＮＡ発現ベクターであるｐＵ６ｉ５０ｍ−１から生じるＲＮＡ配列は、ＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡＵＵＣＡＡＡＧＵＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＵＵＵ（配列番号３）、変異を導入した１００ｂｐのｄｓＲＮＡ発現ベクターであるｐＵ６ｉ１００Ｓ１から生じるＲＮＡ配列は、ＧＡＵＵＵＣＧＧＧＵＵＧＵＣＵＵＧＡＵＧＵＡＵＧＧＧＵＵＵＧＧＡＧＡＧＧＡＧＵＵＧＵＵＵＣＵＧＧＧＧＡＧＵＣＵＵＵＡＧＧＡＵＵＡＵＡＡＧＧＵＵＣＡＡＡＧＵＧＵＧＣＵＧＵＵＧＧＵＧＵＣＡＡＣＵＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＵＣＵＵＣＵＵＣＡＡＡＵＣＵＡＵＡＣＡＵＵＡＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＡＡＡＵＣＵＵＵＵ（配列番号４）、完全相補の１００ｂｐのｄｓＲＮＡ発現ベクターであるｐＵ６ｉ１００ｍから生じるＲＮＡ配列は、ＧＡＵＵＵＣＧＡＧＵＣＧＵＣＵＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＡＵＵＵＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＵＧＵＵＵＣＵＧＡＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡＵＵＣＡＡＡＧＵＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＵＣＵＵＣＵＵＣＡＡＡＵＣＵＡＵＡＣＡＵＵＡＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＡＡＡＵＣＵＵＵＵ（配列番号５）である。
【００４６】
結果を図２に示す。Ｕ６プロモーターの下で転写された長いｄｓＲＮＡ（二重鎖部分が５０ｂｐ、１００ｂｐ）は、ＨｅＬａ細胞のルシフェラーゼの発現を抑制し、さらに、ｄｓＲＮＡ部分に変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を導入したものは、完全に標的配列と相補しているｄｓＲＮＡと比べてＲＮＡｉ活性が上昇していることが明らかになった。
【００４７】
［実施例２：Ｕ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡよるＨｅＬａ  Ｓ３細胞におけるインターフェロン応答］
Ｕ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を誘導するか否かを調べるために、ＰＫＲのリン酸化及びｅｌＦ２αのリン酸化をウエスタンブロットにより調べた。
１２穴プレートに、１穴あたり２．１×１０５個のＨｅＬａ  Ｓ３細胞を播き、２４時間後にプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、ウエスタンブロットによりタンパク質を検出した。
【００４８】
ＰＫＲ抗体は、ＰＫＲ（Ｋ−１７）：ｓｃ−７０７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ｅＩＦ２抗体はｅＩＦ２・ （ＦＬ−３１５）：ｓｃ−１１３８６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 Ｉｎｃ、リン酸化ＰＫＲ抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＲ（Ｔｈｒ４５１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、リン酸化ｅＩＦ２α抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ2α（Ｓｅｒ５１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いた。
結果を図３に示す。ｍｏｃｋはトランスフェクション試薬のみで処理したもの、ＩＦＮは１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンα（Ｉ−２３９６、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，
Ｈｕｍａｎ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）をトランスフェクション試薬とともに加えたもの、コントロールはｄｓＲＮＡを発現しないＵ６プロモーターを含んだベクターをトランスフェクションしたものであり、生じるＲＮＡ配列は、配列番号１のとおりである。
【００４９】
２１−ｍｕｔは変異を導入した二重鎖部分が２１ｂｐのｄｓＲＮＡ（配列番号６：ＧＵＧＣＧＵＵＧＵＵＧＧＵＧＵＵＡＡＵＣＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＵ）、５０−ｍｕｔは変異を導入した５０ｂｐのｄｓＲＮＡ（配列番号２）、５０−ｍａｔｃｈは標的配列と完全に相補する二重鎖部分５０ｂｐのｄｓＲＮＡ（配列番号３）、１００−ｍｕｔは変異を導入した二重鎖部分が１００ｂｐのｄｓＲＮＡ（配列番号４）、１００−ｍａｔｃｈは標的配列と完全に相補する二重鎖部分が１００ｂｐのｄｓＲＮＡ（配列番号５）を、それぞれをＵ６プロモーターによって発現するベクターをトランスフェクションしたものである。
【００５０】
Ｕ６プロモーターにより細胞内で転写された長いｄｓＲＮＡは、二重鎖部分に変異を含むものも、標的配列に完全に相補するものも、どちらもＰＫＲ及びｅｌＦ２αのリン酸化が抑えられていることが示され、インターフェロン応答を誘導しないことがわかった。二重鎖部分に変異を含む二重鎖部分が５０ｂｐおよび１００ｂｐの長いｄｓＲＮＡは、ＰＫＲ及びｅｌＦ２αのリン酸化が特に効果的に抑えられていることが示された。
【００５１】
［実施例３：ｔＲＮＡプロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡによるＨｅＬａ  Ｓ３細胞におけるインターフェロン応答］
ｔＲＮＡプロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を誘導するか否かを調べるために、ＰＫＲのリン酸化及びｅｌＦ２αのリン酸化をウエスタンブロットにより調べた。
１２穴プレートに、１穴あたり２．１×１０５個のＨｅＬａ  Ｓ３細胞を播き、２４時間後にプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、ウエスタンブロットによりタンパク質を検出した。ＰＫＲ抗体はＰＫＲ（Ｋ−１７）： ｓｃ−７０７，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、ｅＩＦ２α抗体はｅＩＦ２α （ＦＬ−３１５）：ｓｃ−１１３８６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ、リン酸化ＰＫＲ抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＲ （Ｔｈｒ４５１） Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、リン酸化ｅＩＦ２α抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５１） Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いた。
【００５２】
結果を図４に示す。ｍｏｃｋはトランスフェクション試薬のみ、ＩＦＮは１０００ Ｕ／ｍｌのインターフェロンα（Ｉ−２３９６，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，Ｈｕｍａｎ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，）をトランスフェクション試薬とともに加えたもの、コントロールはｄｓＲＮＡを発現しないｔＲＮＡプロモーターを含んだベクターであり、生じるＲＮＡは、ＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵＵＣＣＧＵＡＧＵＧＵＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＣＧＣＣＵＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＧＵＣＣＣＣＧＧＵＵＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＵＧＡＧＣＡＧＧＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＵＧＣＣＡＡＣＵＵＵＵである（配列番号７）。
５０−ｍａｔｃｈは標的と完全に相補する二重鎖部分が５０ｂｐのｄｓＲＮＡ（配列番号８：ＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵＵＣＣＧＵＡＧＵＧＵＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＣＧＣＣＵＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＧＵＣＣＣＣＧＧＵＵＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡＵＵＣＡＡＡＧＵＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＵＵＵ）、１００−ｍｕｔは変異を導入した二重鎖部分が１００ｂｐのｄｓＲＮＡ（ＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵＵＣＣＧＵＡＧＵＧＵＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＣＧＣＣＵＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＧＵＣＣＣＣＧＧＵＵＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＡＵＵＵＣＧＧＧＵＵＧＵＣＵＵＧＡＵＧＵＡＵＧＧＧＵＵＵＧＧＡＧＡＧＧＡＧＵＵＧＵＵＵＣＵＧＧＧＧＡＧＵＣＵＵＵＡＧＧＡＵＵＡＵＡＡＧＧＵＵＣＡＡＡＧＵＧＵＧＣＵＧＵＵＧＧＵＧＵＣＡＡＣＵＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＵＣＵＵＣＵＵＣＡＡＡＵＣＵＡＵＡＣＡＵＵＡＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＡＡＡＵＣＵＵＵＵ：配列番号９）、１００−ｍａｔｃｈは標的と完全に相補する二重鎖部分が１００ｂｐのｄｓＲＮＡ（ＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵＵＣＣＧＵＡＧＵＧＵＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＣＧＣＣＵＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＧＵＣＣＣＣＧＧＵＵＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＡＵＵＵＣＧＡＧＵＣＧＵＣＵＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＡＵＵＵＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＵＧＵＵＵＣＵＧＡＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡＵＵＣＡＡＡＧＵＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＵＣＵＵＣＵＵＣＡＡＡＵＣＵＡＵＡＣＡＵＵＡＡＧＡＣＧＡＣＵＣＧＡＡＡＵＣＵＵＵＵ：配列番号１０）を、それぞれｔＲＮＡプロモーターによって発現するベクターをトランスフェクションしたものである。
【００５３】
ｔＲＮＡプロモーターにより細胞内で転写された長いｄｓＲＮＡは、二重鎖部分に変異を含むものも、標的配列に完全に相補するものも、どちらもＰＫＲ及びｅｌＦ２αのリン酸化が抑えられていることが示され、インターフェロン応答を誘導しないことがわかった。特に、二重鎖部分に変異を含む二重鎖部分が１００ｂｐの長いｄｓＲＮＡは、特に効果的にＰＫＲの誘導およびＰＫＲのリン酸化が抑制されていることが示された。
【００５４】
［実施例４：バルジ構造を有するＵ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ］
バルジの位置による発現抑制効果について検討した。図１に示すようなＵ６プロモーターの制御下で、バルジ構造を含む、長いｄｓＲＮＡを発現するベクターを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を確認した。
４８穴プレートに、１穴あたり２．５×１０４個のＨｅＬａ  Ｓ３細胞を播き、２４時間後に１２００ｎｇのプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により，ルシフェラーゼ活性を測定した。プラスミドは、図４の左に示される、バルジを含まないｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（５０Ｓ）と、３種のバルジ構造を含むｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（５０ＳＶ１、５０ＳＶ２、５０ＳＶ）のいずれかを含むものを用いた。５０ＳＶ１は、ｓｉＲＮＡ生成に邪魔にならないと推定される位置である、５’末端から１０、あるいは３０番目の塩基付近にバルジを入れたものであり（ＧＣＣＵＵＵＡＧＧＡＵＵＡＵＵＡＡＧＧＵＵＣＡＡＡＧＵＧＵＵＧＣＵＧＵＵＧＧＵＧＵＣＡＡＵＣＵＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＵＵＵ：配列番号１１）、５０ＳＶ２は、ＳＶ２では、ｓｉＲＮＡ生成時の切断個所と推定されている５’末端から２１から２３番目塩基付近にバルジを入れたもの（ＧＣＣＵＵＵＡＵＧＧＡＵＵＡＵＡＡＧＧＵＵＣＵＡＡＡＧＵＧＵＧＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧＵＣＡＡＵＣＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＵＵＵ：配列番号１２）、５０ＳＶは、ｓｉＲＮＡ生成時の切断個所と推定されている５’末端から２１から２３番目塩基付近および１５番目の塩基前後にバルジを入れたもの（ＧＣＣＵＵＵＡＵＧＧＡＵＵＡＵＵＡＡＧＧＵＵＣＵＡＡＡＧＵＧＵＵＧＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧＵＣＡＡＵＣＵＣＵＡＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＣＵＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＣＵＵＵＵ：配列番号１３）である。
【００５５】
結果を図４の右に示す。この結果から、５０ＳＶ１のように、バルジをｓｉＲＮＡ生成時の切断個所と推定されている二重鎖部分の５’末端から２１から２３番目塩基付近を避けて数箇所導入する、例えば、最初のバルジをｄｓＲＮＡの二重鎖部分の５’末端から数えて、１〜２０塩基目の間に導入し、次のバルジを１〜２５塩基ごとに導入することにより、バルジを導入していないものと同程度の高い発現抑制効果を保ったままで、細胞毒性効果を低下させることができることがわかった。
【００５６】
［実施例５：５０ｂｐのｍｈＲＮＡベクターを用いたＣ型肝炎ウイルスの抑制（１）］
Ｓｅｅｇｅｒ株、Ｗａｋｉｔａ株Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の一部の配列をルシフェラーゼ遺伝子に融合した遺伝子を持つプラスミドであるｐＳｅｅｇｅｒ−ｌｕｃ及びｐＷａｋｉｔａ−ｌｕｃを構築した。２９３Ｔ細胞に５０ｎｇのｐＳｅｅｇｅｒ−ｌｕｃあるいはｐＷａｋｉｔａ−ｌｕｃと、２００ｎｇのｓｉＲＮＡ発現ベクターと、３０ｎｇのｐＲＬ−ＲＳＶとをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションし、２４時間後にＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性を測定した。ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、Ｕ６プロモーターの下流に、５１ｂｐのｓｉＲＮＡを発現するもの、（Ｕ６−５１）と、２１ｂｐのｓｉＲＮＡを発現するもの（Ｕ６−２１）のいずれかを用いた。なお、ネガティブコントロールとして、ｓｉＲＮＡ発現ベクターの代わりにＵ６ベクターのみ（Ｍｏｃｋ）のものをトランスフェクションした。Ｕ６プロモーターによって転写されるＤＮＡ配列は以下の通りである。
【００５７】
２１ｂｐ−Ａ；５’−ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＴＴＴ−３’（配列番号１４）
【００５８】
２１ｂｐ−Ｂ；５’−ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴ−３’（配列番号１５）
【００５９】
５０ｂｐ；５’−ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＡＴＣ  ＴＣＧ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＴＴＴ−３’（配列番号１６）
【００６０】
結果を図６の左側のグラフに示す。変異を持つＷａｋｉｔａ株由来の配列に対して、Ｓｅｅｇｅｒ株由来の配列に対する２１ｂｐのｓｉＲＮＡベクター（２１ｂｂ−Ａ及び２１ｂｐ−Ｂ）は、発現抑制効果が見られなかったが、Ｓｅｅｇｅｒ株由来の配列に対する５０ｂｐのｓｉＲＮＡベクター（５１ｂｐ）は高い効果を示した。
【００６１】
［実施例６：５０ｂｐのｍｈＲＮＡベクターを用いたＣ型肝炎ウイルスの抑制（２）］
ルシフェラーゼ遺伝子を持つＨＣＶに感染したＨｕＨ−７細胞を樹立した。５×１０３
個のＨＣＶ感染ＨｕＨ−７細胞を９６穴プレートに播いた。翌日、２０ｂｐ、５０ｂｐヘアピンＲＮＡ発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクションし、５８時間及び８８時間後にＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ネガティブコントロールとして、Ｕ６ベクターのみ（Ｍｏｃｋ）、ｐ５３に対する５０ｂｐヘアピンＲＮＡベクター（ｐ５３−５０ｂｐ）を用いた。
Ｕ６プロモーターによって転写されるDNA配列は以下の通りである。
【００６２】
ＨＣＶ−２０ｂｐ；５’−ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＴＴ−３’（配列番号１７）
【００６３】
ｐ５３−５０ｂｐ；５’−ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＴＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＴＴ−３’（配列番号１８）
【００６４】
ＨＣＶ−５０ｂｐ；５’−ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴ−３’（配列番号１９）
【００６５】
結果を図６の右側のグラフに示す。５０ｂｐのｓｉＲＮＡベクター（ＨＣＶ−５０ｂｐ）は、２０ｂｐのｓｉＲＮＡベクター（ＨＣＶ−２０ｂｐ）と比べて、より迅速に、かつより効果的にＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制することが示された。
【００６６】
［実施例７：ＥカドヘリンのｍＲＮＡ発現におけるＥカドヘリンプロモーターを標的としたＥカドヘリンのｓｉＲＮＡの効果］
Ｅカドヘリン遺伝子の周辺領域として、Ｅカドヘリン遺伝子のプロモーター領域を標的としたｓｉＲＮＡによる、Ｅカドヘリン遺伝子の発現抑制を調べた。用いたｓｉＲＮＡは、プロモーター領域中の１０箇所に対する（図７の上部において、Ｓｉｔｅ１〜１０で示す）。Ｓｉｔｅ１〜１０のいずれかのｓｉＲＮＡをＭＣＦ−７細胞にトランスフェクションするか、またはＳｉｔｅ１〜１０の１０種類のｓｉＲＮＡ全てをＭＣＦ−７細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。トランスフェクション後、総ＲＮＡをノーザンブロッティングにより検出し、アクチンのｍＲＮＡ量によって標準化した。
結果を図７のグラフに示す。プロモーター領域に対するＳｉｔｅ１〜１０のいずれをトランスフェクションした場合でも、コントロールと比較してＥ−カドヘリンの発現抑制が観察された。また、Ｓｉｔｅ１〜１０の１０種類のｓｉＲＮＡ全てをトランスフェクションした場合には、相乗的な発現抑制が観察された。その後の実験により、この発現抑制は、標的となったプロモーター配列がメチル化されて、その結果、プロモーターからの転写が抑制されることによることがわかった（データは示さない）。また、この場合においても、二重鎖部分が従来のｓｉＲＮＡよりも長いｓｉＲＮＡを用いることにより、効率の良い転写抑制が起こることが示された。
【００６７】
［実施例８：デアミネーションによるＤＮＡ配列のＣからＴへの置換］
ＤＮＡのセンス鎖に変異を導入する方法として、デアミネーションを検討し、その効率を確認した。
デアミネーション処理をするＤＮＡとして、ＥＧＦＰ遺伝子を用いた。ＤＮＡ一本鎖化の処理は、ｓｔｒａｎｄａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて付属のプロトコールに従って行った。一回の反応で得られた産物をそのまますべてデアミネーション処理に用いた。デアミネーション処理は、ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＣｐＧｅｎｏｍｅＴＭ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにを用いて付属のプロトコールに従って行なった。デアミネーション処理後、ＰＣＲにより産物を増幅した。デアミネーションの確認は、ＰＣＲで増幅されたデアミネーション処理の産物をＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＰＲＯＭＥＧＡ社のｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）し、各１０クローンずつ塩基配列を確認した。
結果を図８に示す。デアミネーション処理前にはＣであった塩基は全てＴに置換されていた。すなわち、デアミネーションにより、非常に高効率でＣをＴに置換できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】Ｕ６プロモーターの制御下で、長いｄｓＲＮＡを発現するベクターと、そのベクターから生じるｄｓＲＮＡを示した図である。
【図２】Ｕ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡによる発現抑制を比較したグラフである。
【図３】Ｕ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡよるＨｅＬａ  Ｓ３細胞におけるインターフェロン応答を比較したウエスタンブロットの結果である。
【図４】ｔＲＮＡプロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡよるＨｅＬａ  Ｓ３細胞におけるインターフェロン応答を比較したウエスタンブロットの結果である。
【図５】各種のバルジ構造を有するＵ６プロモーターにより発現される長いｄｓＲＮＡによる発現抑制を比較したグラフである。
【図６】Ｃ型肝炎ウイルスの抑制における、２１ｂｐまたは２０ｂｐのｓｉＲＮＡと５０ｂｐのｓｉＲＮＡとの比較を示すグラフである。
【図７】ＥカドヘリンのｍＲＮＡ発現におけるＥカドヘリンプロモーターを標的としたＥカドヘリンのｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図８】デアミネーション法によるＤＮＡ配列のＣからＴへの置換の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004753130.tif 000008
【図８】
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【配列表】
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