(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を含む、精製された且つ単離されたペプチド，ｐＥ２。
【請求項２】
請求項１に定義された、前記ペプチドに融合した非相同のアミノ酸配列を含む組み換え融合タンパク質。
【請求項３】
前記非相同のアミノ酸配列は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードすることを特徴とする、請求項２に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項４】
化学的な合成又は組み換えＤＮＡの発現のいずれかによって、請求項１に定義された、前記ｐＥ２ペプチドを発生させる方法。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＤＮＡ配列を含む、精製された且つ単離された核酸分子，Ｅ２。
【請求項６】
請求項１に定義された、前記ｐＥ２ペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を含む、精製された且つ単離された核酸分子。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載の、配列を含む、精製された且つ単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の前記核酸分子を含有するベクターにおいて、
前記ベクターは、適切な宿主細胞又は微生物への導入の際に前記核酸分子を発現させることが可能なものであることを特徴とする、ベクター。
【請求項９】
前記ベクターは、プラスミドであることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記宿主細胞は、真核細胞であることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
前記宿主細胞は、Ｅ．Ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項８乃至１１のうちいずれか一項に定義された前記ベクターで形質転換された宿主細胞又は微生物。
【請求項１３】
請求項１乃至３のうちいずれか一項に定義された、前記ペプチド又はタンパク質を発生させる方法であって、
適切な宿主細胞又は微生物において発現させられることが可能なものであるようにベクター構築物へと前記ペプチド又はタンパク質をエンコードする核酸分子を挿入すること、前記ベクター構築物で宿主細胞又は微生物を形質転換すること、前記形質転換された宿主細胞又は微生物を培養すること、及び結果として生じるペプチド又はタンパク質の生産物を単離すると共に精製することを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に定義された、前記ｐＥ２ペプチドに対する精製された抗体を生産するための方法であって、
非ヒト哺乳類の宿主へと、免疫学的に有効な量の前記ｐＥ２ペプチドを注入すること、及び、前記生産された抗体を単離すると共に精製することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１に定義された、前記ｐＥ２ペプチドのホモダイマーに対して特異的に反応性のものである、精製された抗体又は抗体のフラグメント。
【請求項１６】
請求項１乃至３のうちいずれか一項に定義された、前記ｐＥ２ペプチド又はタンパク質、及び薬理学的に受容可能な担体を含む、肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）からの感染に対して個体を免疫化するためのワクチン組成物。
【請求項１７】
肝炎Ｅウィルスからの感染に対して個体を免疫化するための医薬の調製のための請求項１６に定義されたワクチン組成物の使用。
【請求項１８】
生物学的なテストサンプルにおけるＨＥＶ抗体の存在又は不在を決定するための方法であって、
−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によって表されたアミノ酸配列を含む、精製された且つ単離されたペプチド，ｐＥ２を提供すること；
−前記ｐＥ２ペプチドと、ＨＥＶ抗体を含有することが疑われた前記生物学的なテストサンプルを接触させること；
−免疫学的な（抗体−抗原）複合体の形成を可能にするために十分な条件下で前記結果として生じる混合物をインキュベートすること；及び
−そのような免疫学的な複合体の存在について前記混合物を検査すること、それによって前記複合体の形成が、前記テストサンプルにおけるＨＥＶ抗体の存在を示唆すること
：を含む、方法。
【請求項１９】
前記生物学的なテストサンプルは、ヒトの血液、血清又は血漿であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫学的な複合体の存在は、反応が起こることを許容する条件下で指示試薬を伴ったインキュベーションを後に続けることによって決定されることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記指示試薬は、着色された生産物を形成するために基質と反応する酵素に付けられた哺乳類の抗ヒト免疫グロブリンであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）に対する抗体の検出のための診断のテストキットであって、
−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を含む、精製された且つ単離されたペプチド，ｐＥ２；及び
−前記ｐＥ２ペプチドを含有する免疫学的な（抗原−抗体）複合体を検出することが可能な指示試薬
：を含む、診断のテストキット。
【請求項２３】
−対照標準；及び
−検体の希釈剤及び／又は洗浄緩衝剤
：をさらに含む、請求項２２に記載の診断のテストキット。
【請求項２４】
前記ペプチド，ｐＥ２は、固体の支持体に不動にさせられることを特徴とする、請求項２２又は２３に記載の診断のテストキット。
【請求項２５】
前記固体の支持体は、滴定マイクロプレートのウェルであることを特徴とする、請求項２４に記載の診断のテストキット。
【請求項２６】
生物学的なテストサンプルにおいて、肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）のウィルス粒子を検出するための方法であって、
−請求項１５に定義された、前記精製された抗ｐＥ２抗体を提供すること；
−前記抗Ｅ２抗体及びＨＥＶウィルス粒子を含有する複合体の形成を可能にする条件下で前記生物学的なテストサンプルと前記抗ｐＥ２抗体を接触させると共にインキュベーションすること；並びに
−そのような複合体の存在について前記混合物を検査すること、それによって前記複合体の形成が、前記テストサンプルにおけるＨＥＶウィルス粒子の存在を示唆すること
：を含む、方法。
【請求項２７】
前記抗ｐＥ２抗体によって捕獲された前記ＨＥＶウィルス粒子の存在は、ウィルスのＲＮＡを抽出すること及びそれに逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を適用することによって決定されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５に定義された、前記精製された抗ｐＥ２抗体を含む生物学的なテストサンプルにおける肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）分析物を検出するための診断の試薬。
【請求項２９】
生物学的なテストサンプルにおける肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）分析物の検出のための診断の試薬としての、請求項１５に定義された、精製された抗ｐＥ２抗体の使用。
【請求項３０】
請求項２８に定義された診断の試薬を含む、生物学的なテストサンプルにおける肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）分析物を検出するための診断のテストキット。
【請求項３１】
前記精製された抗ｐＥ２抗体は、固体の支持体に不動にさせられることを特徴とする、請求項３０に記載の診断のテストキット。
【請求項３２】
生物学的なテストサンプルにおける、肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）抗体の存在又は不在を決定するための診断の試薬において、
前記診断の試薬は、請求項１に定義された、前記ｐＥ２ペプチドと共通して、前記ｐＥ２ペプチドに対して生じさせられた抗体によって認識されることが可能な一つの又はより多くの抗原決定基を有するタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含むことを特徴とする、診断の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、肝炎Ｅ型ウィルス（ＨＥＶ）の中国菌種のゲノムからクローンを合成された免疫反応性の高いウイルスのペプチド、ｐＥ２及びヒトにおけるＨＥＶの防御のためのワクチン構成物の使用と同様に、ＨＥＶの検出および診断用の信頼できる診断の方法の開発での利用に関する。
【０００２】
発明の背景
肝炎Ｅ型ウィルス（ＨＥＶ）は、腸内的に感染された肝炎（Ｂａｌａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）の原因として１９８３年に最初に発見された。ウィルスゲノムの完全長は、１９９１年に最初にクローンされて、シークエンスの解析がなされ、一本鎖のポジティブセンスの包含されていないＲＮＡであると判明した（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。形態論であるが、カリチウィルス科（Ｂｒａｄｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｐａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）のメンバーに似て、それははっきりしたゲノムの構成（Ｂｅｒｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）を持っている。シークエンス分析に基づくと、７．２Ｋｂのウィルスゲノムが三つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことが予測される（図１）（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。非構造的なウィルス性タンパク質は、ウィルスゲノムの５´末端に位置するＯＲＦ１によるポリタンパク質としてエンコードされている。ＯＲＦ２は、ゲノムの３´末端に位置しており、主な構造的タンパク質をエンコードしている。ＯＲＦ３の５´末端は、ＯＲＦ１の３´末端を伴って重複する１塩基を有し、３´末端はＯＲＦ２の５´末端を伴い重複する３３９塩基を有する。ＯＲＦ３は、その機能は未だ解明されていない別の構造的タンパク質のためにコードすると信じられている。線形の抗原エピトープは、エピトープマッピング及び組み合わせペプチド研究によってＯＲＦ２及びＯＲＦ３に位置している（Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。
【０００３】
最近の研究は、ＯＲＦ２領域の主要なＨＥＶ構造タンパク質のアミノ及びカルボキシ末端から派生する切り詰められた組み合わせペプチドが、粒子状のウィルス内でセルフアセンブルできることが示している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。大きさがより小さければ、かかるウィルス状の粒子は、感染ウィルスのカプシドタンパク質に構造的に及び抗原的に同様である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。かかる発見に基づくと、粒子状のウィルスへの組み合わせペプチドのアセンブリは、感染性ウィルス粒子の大きなカプシドへの完全長ＨＥＶ構造的タンパク質のアセンブリとして同様な要求を有するかもしれない。特に、かかる発見は、構造タンパク質のみをエンコードするＯＲＦ２がウィルスカプシドへのセルフアセンブルに十分であろうことを示唆している。さらに、カプシドタンパク質自身の形態において含まれる相互作用は、アミノ酸残基１１２内皮細胞い障害６０８からの完全長ＯＲＦ２タンパク質のドメイン内で起こることが現れるであろう（Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。高いイソエレクトリックポイント１２．３５で、主要な構造的タンパク質のアミノ末端ドメインで位置する１１１アミノ酸シークエンスは、ウィルスゲノムのパッケージングを含んでいると信じられている（Ｂｒｉｔｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｉｎｚ，  １９９０）。しかしながら、かかるドメインは、ウィルスカプシド自身のアセンブリに直接的に明白に参加しない。主要な構造的タンパク質のカルボキシ末端ドメインはまた、ウィルスカプシドのアセンブリに直接的に参加しない。しかしながら、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）は、かかるドメインの適切なタンパク質分解を生ずる分解がウィルス状の粒子のアセンブリに必要であることを示している。
【０００４】
肝炎Ｅは、基本的に発展途上国で流行病及び散発的な形式で発生する。肝炎Ｅの数多の大きな発生は、下水に汚染された飲料水によって１９５０から１９８０年代にかけて発生した（Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ，  １９５７；  Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０；  Ｍｙｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  Ｂｅｌａｂｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  ｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。伝染は通常自己制限している。しかし、伝染が妊娠中に存在する場合、重大な複雑に関する報告がある（Ｔｓｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｄｉｌａｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｈｕｓｓａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ウィルス感染に対する格闘で使用された重要な予防の１つの戦略は、公衆衛生安全性および環境保護を保証する環境上の検体でのＨＥＶのモニタリングおよび検出である。しかしながら、ウィルス粒子を集める及び濃縮するために現在利用される従来の方法は、ＨＥＶの潜在的な源の調査及び発見を限定する、いくつかの周知の損失を持っている。現在、最も一般的な活用されている方法の二つは、吸着と遠心分離である。
【０００５】
吸着方法において、ウィルスは微孔フィルターへの吸着によって最初にテストサンプルから遠心分離され、次いで、大量の溶出液によって溶出される。しかしながら、この技術は、さらに有機物の酸及びタンパク質（それらはウイルスの検出に邪魔をしてもよい）のような様々な他の溶質を有効に濃縮する。特に、多くの自然発生の無機酸及び有機的な溶質が標的ゲノムの増幅において有用な核酸ポリメラーゼを阻害する（例えば、逆転写酵素及びＴａｑポリメラーゼ）（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；１９９３）。それらを増幅することができ、したがって、曖昧な結果の一因となる前に、テスト・サンプルの中にあるヌクレアーゼ及びプロテアーゼの可能性は、ウイルス・ゲノムを退化させるかもしれない。加えて、他の溶質が結局これらのポリメラーゼを破損することができる毒性の結果を示しているかもしれない一方、様々なタンパク質、炭水化物及び他の有機化合物は、核酸ポリメラーゼの適切な機能に必要なマグネシウム・イオンおよびヌクレオチドを拘束するかもしれない（Ｄｅｍｅｋｅ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，  １９９２；  Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｋｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。
【０００６】
遠心分離方法において、テストサンプルは均一化され、次いで繰り返して遠心分離される。処理の期間、ポリエチレングルコース（ＰＥＧ）が上清に添加され、次いで再度遠心分離される。最終的なペレットをバッファーにて再度懸濁される。しかしながら、最終濃縮物はまだ、細胞培養、逆転写反応、及びポリメラーゼチェーンリアクションなどの続く診断方法に影響を与える毒性物質を含有している（Ｂｅｒｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。結果として、ゲル濾過若しくはセファッデクスカラムによって解毒化作用を受けたテストサンプルから派生する濃縮物が必要である。
【０００７】
ウィルス感染との格闘に使用する別の重要な戦略は、公衆衛生安全性及び保護を保証するＨＥＶに対する免疫処置用のワクチンの利用である。しかしながら、培養細胞中のウイルスを繁殖させる際の困難さのために、実際の減じられたウィルス粒子あるいは殺されたウィルス粒子を使用して、ワクチンＨＥＶ伝染病を開発することは従来可能ではなかった。代替となる解決法として、特に、ウィルスゲノムの構造的な遺伝子から派生する、数多の組換えＨＥＶペプチドは、ＨＥＶの収縮からの保護の提供においてより有望である（Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４ａ；  Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。弱毒化ウィルスと比較して、ワクチンの形態での組換えペプチドの使用の利点は、ペプチドがより効率的に合成でき、利便的に精製できることである。さらに、結果となるワクチンがどのような生きた不活ウィルス粒子を含むことなく、そこで感染の危険性の可能性が避けられる。
【０００８】
上記の見解において、以前に記述された損失を回避するだろうだけでなく生物学と環境上の検体のＨＥＶを発見するためにより敏感な分析的なテストを提供するＨＥＶを決定し、及びおよび分析する信頼できる方法の必要性が残る。本発明によると、ＨＥＶによる現在及び過去に伝染された患者からの血清で反応性が高いことが分かっている、肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）ゲノムのＯＲＦ２のカルボキシ末端領域から派生する高い免疫反応性の組換えウィルスペプチド、ｐＥ２を採用する診断方法が提供される。さらに、そのアミノ酸シークエンスの一部が他のＨＥＶ分離株の中に高度に保存されるので、ｐＥ２ペプチドは、抗原的に肝炎Ｅウイルスと関係がある。ここでさらに記載され、例証されるように、ｐＥ２ペプチドの抗原的特性は、ＨＥＶ感染の免疫的処置及び予防におけるワクチンとして良好な候補である。したがって、ＨＥＶ感染の検出に活用する診断方法及び斬新なｐＥ２ペプチドが利用される肝炎Ｅウイルス伝染を防ぐのに有効なワクチン構成がここに提供される。
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、ホモダイマーを成形するｐＥ２モノマーの単に露出された続く二量化である、整合の抗原決定基群の存在により肝炎Ｅウイルスで汚染された個体からの血清で免疫反応性が高い、肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）ペプチドを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、臨床生物学のテスト・サンプル中の免疫グロブリンＭおよびＩｇＧ抗体の検出によるＨＥＶの決定する現在と過去の伝染用の方法であり、それはＨＥＶ抗体に結合するその高い特異性及び感度により免疫試薬としてｐＥ２ダイマーを組込んでいる、改善されてより信頼性のある診断方法の提供である。
【００１１】
本発明のまた別の目的は、テスト・サンプル中のＨＥＶ粒子を有効に捕らえて、分離し、濃縮することができ、従来の方法の使用と提携して欠点を回避する、ｐＥ２ダイマーに対して特に上げられる抗体の使用して、公衆衛生及び環境上の研究中のＨＥＶをモニターし、及び検出検知するための、改善されてより信頼性のある診断方法の提供である。
【００１２】
本発明のまだ別の目的は、ＨＥＶ感染の免疫処置及び予防のための、ｐＥ２ダイマーからなるワクチン構成物及びその使用の提供である。
【００１３】
表１に示されているように、ヌクレオチド配列相同性のパーセンテージは異なるＨＥＶ分離株の中に７７％乃至１００％と異なるかもしれないが、アミノ酸配列の相同性の高い率によって示されるように、これらの変更は自然界において一般に保守的である。ＨＥＶの異なる分離株の中に明らかにされるようなＨＥＶゲノム内の保存は、（１）ｐＥ２ペプチドは、ＨＥＶの構造的タンパク質の重要な機能的ドメインであるかもしれない、（２）ｐＥ２ペプチドを組込む診断のテストは、異なる分離株のＨＥＶの検出において有利だろう、（３）ｐＥ２ペプチドから調製されるワクチンは、異なるＨＥＶ分離株からの保護を産出するだろう、ことを意味する。
【００１４】
【表１】
0004641695.tif 000002
本発明によると、肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）ゲノムのＯＲＦ２のカルボキシ末端領域から派生し、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ：２によって識別されるアミノ酸配列からなる、免疫反応性の高いウィルスペプチド、ｐＥ２が提供される。ｐＥ２ペプチドの特別な特質は、当然ホモダイマーを成形するためにペプチドのモノマー間の共有結合でない相互作用の結果露出されるだけの、整合の抗原決定基群を所有する。さらに、高い免疫反応性の構造ｐＥ２ペプチドのクローニング及び発現は、精製及び特性付けと同様に、ここに記載される。
【００１５】
本発明のＨＥＶペプチドのｐＥ２は、直接的にウィルスカプシドのアセンブリに参加する事前に記載されたＨＥＶの主要な構造的タンパク質のドメインから派生される。ｐＥ２ペプチドのＯＲＦ２ヌクレオチド配列のカルボキシドメインからの翻訳は、完全長タンパク質のカルボキシドメインに対応する長さの２６７アミノ酸残基になると予測される。同様なペプチドマッピング研究（ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）に基づくと、ペプチドは、アミノ及びカルボキシ末端の両者において、線形エピトープを含むことがまた、予測される。しかしながら、クローンされたシークエンスにおけるフレームシフト突然変異は、２１３のアミノ酸残基だけのより小さなペプチドの代わりに与えるオリジナルのｃＤＮＡ配列から上流に位置した新しい終止コドンで翻訳を時期尚早に終了させた（図２）。
【００１６】
効果的に除去されたカルボキシドメインを有するカルボキシ末端にて切断されて示されているｐＥ２ペプチドの特性付けは、ウィルス状の粒子のセルフアセンブリを阻害する。結果として、ｐＥ２ペプチドは、二量化によるモノマーとしてお互いに相互作用し、ホモダイマーとして自然発生する。さらに、ｐＥ２ペプチドは、、ＨＥＶの反応的な人間の血清によって、ホモダイマーがＨＥＶカプシドタンパク質のある構造の特徴を模倣することを提案する、その二量体の形式で強く認識される。したがって、他の調査者によって報告された、他の細菌で表現されたＨＥＶペプチドとそれを識別する役目をするｐＥ２ペプチドの二量化によって引き起こされた整合の抗原決定基群である（Ｙａｒｂｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｐｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。以前に報告されたＨＥＶペプチドの抗原活性が、第１にそれぞれの主要な構造内に含まれていた線形のエピトープの存在に起因していた一方、本発明のｐＥ２ペプチドの抗原活性は、大部分はホモダイマーの４次構造と関係がある。このようにして、他の同様の整合の抗原決定基群ではないことが、以前にペプチドマッピングによって記述されたか若しくは予言された理由により、ｐＥ２ペプチドの抗原領域は、ＯＲＦ２のアミノ末端基領域内に確定された、事前に識別された線形のエピトープとは明確に異なる。
【００１７】
ここに実証され、記載されるように、抗原活性の二つの異なるタイプが、新規なｐＥ２ペプチドによって表現される。抗原活性の第一のタイプは、現在まで記述された、他の細菌で表現されたＨＥＶの抗原ペプチドに関連した同様の型の活性であるｐＥ２ペプチドのモノマーの形式に関係している（Ｙａｒｂｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｐｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｌｉｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。活性は、水溶液中のそれぞれのペプチドによって仮定された様々な形状に対応する二次及び三次構造によって影響を受けるかもしれないが、この種の抗原活性は、主にそれぞれのペプチドの一次構造に位置した線形のエピトープに起因する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。しかしながら、ｐＥ２ペプチドによって示された、第二及びより顕著な抗原活性は、ペプチドの二量体の形式に関係している、そしてそれはより高度にそのモノマーの形式より免疫反応性であると発見された。実験の研究は、ｐＥ２モノマーに対して反応的な抗体のためによりもはるかに高いレベルに、ＨＥＶの反応的なヒトの血清の中にあるｐＥ２二量体に対して反応的な抗体のレベルが頻繁に観察されたことを示す。この新型の抗原活性（それは従来記述されていない）は、大部分は、ｐＥ２ホモダイマーに固有の新しい整合の抗原決定基群に起因する。さらに、抗原活性は二量体の解離で改廃され、また、一旦モノマーがダイマーを成形するために再び連合したならば、活性が再構成される。この行動は、整合の抗原決定基群に関連した抗原活性は、ホモダイマーを成形するためにｐＥ２モノマー間の共有結合でない相互作用によって引き起こされたｐＥ２ペプチドの二量体の形式（すなわち四次元構造）と関係があることを例証する。
【００１８】
Ｅ２ＤＮＡ配列
本発明の一つの態様によると、整合のペプチドｐＥ２をエンコードし、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：１として識別されるｃＤＮＡ配列からなり、任意の相同な配列若しくはそのフラグメントである、精製された核酸分子、Ｅ２が提供される。
【００１９】
核酸配列、Ｅ２は、ＨＥＶの中国菌種Ｄ１１０９２の肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）ゲノムのＯＲＦ２領域のカルボキシ末端から、元来抽出される（図２）。長さで８１１の塩基対を含み、位置７１２７乃至７１２９にある停止コードンを位置６３２６乃至７１３６にかける、オリジナルのクローンの配列は、ＰＣＲ増幅誤差により位置６９５７で不注意に推測上単一の塩基対欠失を含んでいる（図２）。生じるフレームシフト突然変異は、ヌクレオチド配列の翻訳に新しい停止コードンで時期尚早に終了させた（位置６９６６から６９６８）。核酸シーケンスの後の翻訳は６４２の塩基対を含んで、そこからコード化された斬新なｐＥ２ペプチドおよび斬新なＥ２ヌクレオチド配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の生成および発見に結びついた。したがって、図２に言及すると、斬新なＥ２ヌクレオチド配列スパン位置６３２６乃至６９６８であって、そこで位置６９６８が除去され、及び単一の塩基対欠損が、位置６９５７で存在する後新しい停止コドンに下流に配列のフラグメントが位置する。
【００２０】
遺伝子コードの退化により、１つ以上のコドンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（例えば、ｐＥ２）によって表わされる配列の所定のアミノ酸残基のためにコード化するかもしれないし、それによって、生成されるかもしれないし、さらにｐＥ２ペプチドをコード化するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（例えば、Ｅ２）に加えて種々様々の核酸シーケンスに帰着する。したがって、発明は、全ての、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のための補足的な核酸シーケンスを含む可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択により生成することができたヌクレオチド配列の可能な変化を熟考する。これらの組み合わせは、ｐＥ２ペプチドの核酸配列に適用されるような標準の三つ組遺伝子コードに従って作られ、また、そのような変化はすべて特に示されることと見なされることになっている。
【００２１】
さらに、ｐＥ２ペプチド派生物の多様性若しくは抗原等価物は例えば様々な代用、挿入、欠失若しくは拡張、を含んで、合成されるかもしれない、その最終結果は、ｐＥ２ペプチドの免疫化学の反応性を変更しない。したがって、ｐＥ２ペプチドの免疫学的に活発な派生物のためにコード化する核酸配列も、本発明の一部であることとして熟考される。かかる派生物を合成する方法は、当業者によって容易に遂行されるかもしれない（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ＥＤ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ，  １９８９）。本発明と一致して、ｐＥ２ペプチド（すなわち抗原の等価物）のアミノ酸配列をコード化するどんな核酸シーケンスはｐＥ２を表現する組換分子を生成するために使用することができる。
【００２２】
ｐＥ２アミノ酸配列
本発明の別の態様によると、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２若しくは相同配列、フラグメント若しくは上記の類似体によって表わされるアミノ酸配列を含む、整合のＨＥＶペプチド抗原、ｐＥ２が提供される。
【００２３】
完全にそのアミノ酸配列内にポリペプチドの三長さ構造を決定するための情報が伝えられることは相当に確証される。さらに、特定の整合のエピトープを確定するアミノ酸を含む配列部分は、広く、分子の長さに沿った介在配列で分散することができる。ポリペプチドの予言された三次（四次）構造に基づいて、整合のエピトープの三次元の座標は、ポリペプチドの一次構造の三次元の折畳によりそれらの正確な形状へ結局もたらされる。したがって、アミノ酸配列が、エピトープの整合の構造及び免疫化学の反応を実質上変更しないポリペプチドの構造の構成のより高いレベルに基づいたある程度の修正に従うことが期待される。したがって、様々なエピトープを確定する残基のポリペプチドを位置した群間のセグメントは、重要ではなく、これらの介在配列内の残基の拡張、欠失、挿入あるいは代用に続くエピトープの表現を変更しないかもしれない。
【００２４】
さらに、特別のエピトープを確定する配列内に含まれていたアミノ酸残基の化学的性質によって、同様の官能基がある残基を備えた代用は、エピトープの免疫化学の反応を変更しないかもしれない。この点では、それが抗ｐＥ２抗体によって認識可能なままであるように、ｐＥ２ペプチドの免疫化学の反応が保存されている限り、他のアミノ酸残基によってアミノ酸配列中の様々なアミノ酸残基が派生物を生成するために削除されるかもしれないし、挿入されるかもしれないし、代用されるかもしれないことが期待される。もちろん、これは、合併した特別の変更には異なる分離株のＨＥＶの中の緊張させる負荷変化に対処する際にのようにその使用での長所があると規定している（表１）。さらに、発明の範囲内で熟考されるアミノ酸置換は代用品残基の化学性質が、オリジナルのアミノ酸の化学性質に類似している。アミノ酸は、一般的に、Ｇｌｙ／Ａｌａ；  Ａｓｐ／Ｇｌｕ；  Ａｓｎ／Ｇｌｕ；  Ｖａｌ／ｌｌｅ／Ｌｅｕ；  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；  Ｌｙｓ／Ａｒｇ；及びＰｈｅ／Ｔｙｒのような組み合わせを含んでいる官能基に基づいて、同様の化学特性を有していると考えられる。ｐＥ２ペプチドのこれらの派生物は、したがって、もしＨＥＶ抗体へのそれらの免疫化学の反応が保存されていることがＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２によって確定されたアミノ酸配列順序の拡張、代用、挿入および欠失を含むかもしれない。ｐＥ２ペプチドに対して起こされた同じ抗体によって認識することができる場合、本発明の範囲内に２つのペプチドが等価な免疫化学の反応を持っていると言われている。
【００２５】
ｐＥ２ペプチド合成
本発明のｐＥ２ペプチドは、化学の合成方法及び組換ＤＮＡ技術を含む興味のある整合のエピトープを提供する既知の方法によって合成できる。ｐＥ２ペプチドを調製する好ましい方法は、ペプチドの隔離及び精製が後続する宿主細胞中の組換えＤＮＡ発現による。本発明と一致して、ペプチドのフラグメント、融合タンパク質若しくは機能的な等価物である、ｐＥ２ペプチドをエンコードする核酸配列は、適切な宿主細胞でｐＥ２の発現を直接行なう組換えＤＮＡ分子に使用されるであろう。ｐＥ２ペプチドの免疫反応を発現するために、ｐＥ２ペプチドをエンコードする核酸配列（例えば、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：１）若しくは上記の機能的な等価物は、転写に必要な要素及び挿入されたコード配列の翻訳を含む適切な発現ベクターに挿入される。選択された宿主細胞に依存して、発現ベクターは通常、ＤＮＡ配列の発現に影響する、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳の開始及び停止部位、及び転写停止部位を含有するＤＮＡの制御を含むであろう。
【００２６】
したがって、本発明の別の態様によると、ＨＥＶゲノムからのｃＤＮＡ配列の分離、適切な宿主細胞内で発現可能な発現ベクターへのｃＤＮＡ配列の挿入、発現ベクターを伴う宿主細胞への形質転換、形質転換された宿主細胞の培養、及びｐＥ２ペプチドの分離と精製からなる本発明のｐＥ２ペプチドを調製する方法が提供される。
【００２７】
当業者に既知である方法は、ｐＥ２をコード化している配列及び適切な転写及び翻訳制御を含んでいる発現ベクターの合成に使用できる。上述のように得られた所望のｃＤＮＡ配列は、既知の標準的な技術を用いて、発現ベクターに挿入される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）。発現ベクターは、通常は、制限酵素で切断され、ｃＤＮＡ配列は平滑末端若しくはスタッガー末端ライゲーションを用いて挿入される。切断は、通常、発現ベクターの便利な位置における制限部位でなされ、一旦挿入されると、ｃＤＮＡ配列は、発現に影響するｃＤＮＡの機能的要素の制御を受ける。宿主細胞の形質転換及び培養並びに要求されるようなペプチドの分離はまた、標準的な技術を用いて実行される。
【００２８】
細胞系において、発現されるペプチド若しくはタンパク質のために意図される使用に依存して多くの発現ベクターが選択されるかもしれない。例えば、大量のペプチド若しくはタンパク質が、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を導く抗体やベクターの合成に必要とされる場合は所望でありえる。本発明に関連する別の態様によると、ｐＥ２ペプチドをコード化するＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：１によって識別される、核酸配列Ｅ２を含んで、核酸配列Ｅ２の発現が可能な発現ベクターが提供される。発現ベクターは、細胞系の発現において適切であり、しかし多機能のＥ．ｃｏｌｉクローニング及びに制限されていないが、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ、及び発現ベクターｐＧＥＸ（プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン州）を含んでいる。この特異的なベクターにおいて、ｐＥ２をコード化する配列は５´末端で、３´末端でのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のためのへテロな配列を伴うフレームにおけるベクターにライゲートされ、結果となるハイブリッドのポリヌクレオチド配列は、融合タンパク質として表現される。一般的には、かかる融合タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着に続いて、フリーのグルタチオンの存在下における溶出によって容易に溶解された細胞から精製できる。かかるシステムで合成されるタンパク質は、切断部位を含むように設計され、トロンビンのような適切なプロテアーゼを加えることにより、関心のあるクローンされたペプチドはＧＳＴ部位から放出される。
【００２９】
したがって、本発明の好ましい実施態様によると、融合タンパク質、ＧＥ２を発現し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ポリペプチドに融合するＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２として識別されるＨＥＶペプチドからなるプラスミドが提供される。ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：１によって表現されるＥ２核酸配列は、Ｅ２核酸配列のオープンリーディングフレームが、ＧＳＴオープンリーディングフレームのフレーム内にある、ｐＧＥＸ２０発現ベクターに挿入される。本発明のプラスミドは、８１１塩基対の配列を停止コドンを７１２７乃至７１２９に位置する６３２６乃至７１３６に含んでなる。しかしながら、ＰＣＲ増幅のエラーによって起こる、フレームシフト突然変異である６９５７部位の単一塩基対の欠損は、核酸配列の翻訳を新しい停止コドン（６９６６乃至６９６８）で早々に停止し、結果として、新規なｐＥ２ペプチドの産出となる。したがって、新規なＥ２配列は、６９５７部位の単一塩基対の欠損を伴う６３２６乃至６９６８部位まで拡張し、フラグメントは、部位６９６８除去後の新しい停止コドンの下流に位置する（図２）。新規なｐＥ２ペプチドをエンコードする、クローンされたＥ２配列は６４２塩基対を有し、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：１として識別される。
【００３０】
ＧＥ２タンパク質
完全なＧＳＴポリペプチドに融合された完全なｐＥ２ペプチドを含む分離された融合タンパク質ＧＥ２は、約９２ｋＤである。しかしながら、本発明のＧＥ２融合タンパク質は、免疫原であり、したがって９２ｋＤよりも小さいと予測される、ｐＥ２ペプチドの小部分を含むことができる。ここに記載の融合タンパク質ＧＥ２は、ｐＥ２アミノ酸配列及びＧＳＴ若しくはヘテロなタンパク質配列間に位置する切断部位を含んで合成され、トロンビンを用いるグルタチオンセファロース４Ｂカラムに結合して、ｐＥ２ペプチドはヘテロな部位から切断され、精製される。さらに、精製及び特性付けの目的に加えて、ＧＥ２ポリペプチドはまた、適切な宿主細胞でのｐＥ２ペプチドの発現を導き、確認するため及びｐＥ２ペプチドのエピトープに特異的なポリモノクローナル抗血清若しくはモノクローナル抗体の発達のために利用性がある。代わって、分離されたＧＥ２ポリペプチドを伴う哺乳類の免疫反応によって産出されたポリモノクローナル抗血清若しくはモノクローナル抗体は、ここに記載されるように、生物学的テストサンプルでのＨＥＶ粒子の存在をアッセイするために、有用である。
【００３１】
診断試薬としてのｐＥ２
ここに提供される整合のｐＥ２ペプチドは、診断アッセイにおいてＨＥＶ抗体の存在における生物学的テスト・サンプルをスクリーニングするために使用される免疫試薬として使用されるかもしれない、したがって、ＨＥＶ伝染の検出および診断での従業者か臨床医を援助する。したがって、本発明は、ｐＥ２ペプチドを用いて生物学的テストサンプルでの抗ＨＥＶ抗体を検出する免疫化学的な方法を提供する。本質的に、抗ＨＥＶ抗体を検出するための捕獲抗原としてｐＥ２を活用するように設計される任意の免疫アッセイ形態が採用される。免疫アッセイを実行する方法は当業者にとって既知であり、本発明は、任意の特定の免疫アッセイに制限するようには意図されていない。相同性及びヘテロな両者の免疫アッセイが使用される。
【００３２】
一般的に、生物学的テストサンプルは、ＨＥＶ抗体が接触されて、反応が起こるような状況下及び時間においてｐＥ２ペプチドが培養されていることを含むと疑われる。好ましくは、ｐＥ２ペプチドは適切な固体支持に付されている。ＨＥＶ抗体がテストサンプルに存在する場合、ｐＥ２ペプチドを伴って免疫学的複合体（抗原―抗体複合体）を形成し、固体支持に付されるであろう。意見として、ある実例において、固体支持体は、非結合物質を除去するためにバッファー溶液で洗浄され、アッセイの感度を改善するために援助するであろう。洗浄後、免疫学的複合体は指示試薬と反応し、第二の複合体が形成される時間及び状況における培養が可能となる。免疫学的複合体は、アッセイの形態に依存する、多くの既知の技術によって検出される。例えば、標識若しくはシグナルを産出する物質（例えば、酵素）を伴う抗−哺乳類免疫グロブリン複合体の接合体が、指示試薬として一般的に使用される。免疫学的複合体の存在は、テストサンプルにおけるＨＥＶに対する抗体の存在を確認し、シグナル産出の測定によって決定される。多くの指示試薬を伴うように、抗体の存在量は、通常は、シグナルの産出に比例する。テストサンプル中の免疫複合体の存在は、可視で検出されるか、若しくは、自動化走査及び解析装置を用いて機械的に検出される。
【００３３】
適切な固形支持体は、実行する免疫アッセイ形態の種類に依存するが、しかしながら、選択された支持体の種類は適切な強度を有し、免疫学的複合体の免疫反応性を干渉しないか、シグナル産出物質からの検出可能なシグナルの合成を干渉しない。固形支持体の実施例は、反応トレイのマイクロウェルの壁、テストチューブ、シート、プレート、スライド、ビーズ（例えば、ポリスチレン若しくはガラス）、ニトロセルロースストリップ、メンブラン、ラテックス粒子、ガラスのチップ、プラスチック及びその他のような微細粒子を含んでいる。
【００３４】
免疫学的複合体の形態を検出するための手段として使用される標識若しくはシグナル産出物質は、沈澱物の可視検出、若しくは色の変化、顕微鏡による可視検出、若しくは分光光度計、放射線測定若しくはその他同様による自動化検出を可能にする。シグナル産出物質の実施例は、コロイド状の金、蛍光物質、発光物質、クロマゲン、放射活性要素、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシターゼ、及びベータ−ガラクトシダーゼ）及び増幅物質（例えば、ビオチン、抗−ビオチン及びアビジン）を含んでいる。
【００３５】
したがって、本発明の別の態様によると、下記の段階からなる生物学的テストサンプルに存在するＨＥＶ抗体の診断及び検出のための方法が提供される：
−ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２若しくは相同性配列、フラグメント、または上記に列記のアナログによって確定されるアミノ酸配列からなるｐＥ２ペプチドの提供であって、ｐＥ２ペプチドは好ましくは、固形支持体上に固定されることを特徴とする；
−ｐＥ２ペプチド及び抗ＨＥＶ抗体間の免疫学的（抗原−抗体）複合体の形態を可能にする状況下の生物学的テストサンプルを伴うｐＥ２ペプチドの接触及び培養；
−結果となる混合物からの非結合物質の可能な除去；
−指示試薬を伴う結果となる混合物の培養；及び
−免疫学的複合体の存在のための混合物の検査であって、免疫学的複合体の形態がテストサンプルでの肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）に対する抗体の存在を示す。
【００３６】
抗−ｐＥ２抗体の産出
ｐＥ２ペプチドによって表示される高い免疫化学反応により、ｐＥ２ペプチドに対する特異的な反応性の抗体が、当業者によって周知の技術によって産出できることがここに記載の方法及び実施例によってさらに実証された。本発明のｐＥ２ペプチドの整合の抗原決定基群が、ＨＥＶカプシド・タンパク質の同様の構造の特徴を模倣するので、ｐＥ２ペプチドは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方の生産に役立つ。さらに、ｐＥ２ペプチドに対して検出されたかかる抗体、若しくは抗体のフラグメントは、分離によるＨＥＶ感染を決定するための価値のある及びウィルス粒子及び／若しくは抗原のスクリーニングのための免疫試薬として診断テストの発展において特に有用である。このようにして、抗−ｐＥ２抗体は、生物学的サンプルでのＨＥＶ抗原の存在を検出するための従来の免疫アッセイ形態及びＨＥＶウィルス粒子の小サンプルが分離及び濃縮できる免疫捕獲形態を含有する多くの臨床診断手順において使用できる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００３７】
本発明のｐＥ２ペプチドに対するポリクローナル抗体が所望であれば、選択された非ヒトの哺乳類宿主（例えば、マウス、ラット、羊、ウサギ、ヤギ等）は、キャリアーと任意に接合されて、ペプチドを伴って免疫反応を促進するために注入され、このようにして抗体の生産は引き続き回復されて、精製される。本発明の好ましい実施態様によると、哺乳類の宿主は、上記に記載のＨＥＶ整合エピ糖尿病―プ産出するようなＧＥ２ポリペプチドによって免疫反応される。ＧＥ２ポリペプチドは、注入可能な形態で投与され、ＧＥ２ポリペプチドは、生理学的に受理可能な希釈で混合される。フロインドの完全若しくは不完全アジュバントのようなアジュバントが、形態に含まれるかもしれない。かかる形態は、適切な時間をかけて、宿主に注入され、ＨＥＶウィルス抗体のためのアッセイのために適切な間隔で血清サンプルは取られる。適切なレベルの反応が獲得される場合、宿主は出血する。次いで、例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって、抗体が標準的な手順を用いて血液血清から回復されて、精製される。
【００３８】
本発明のポリクローナル抗体が好ましいが、ポリクローナルシステムとして機能する様々なモノクローナル抗体を含むシステムがまた、本発明の範囲内である。ＨＥＶ整合エピトープに対して導かれるモノクローナル抗体はまた、当業者によって、本発明のＧＥ２ポリペプチドを用いて容易に合成できる。ハイブリドーマとして一般に名高い永久の抗体産生細胞ラインを使用して、モノクローナル抗体を生産するための一般的な方法論は有名である。ハイブリドーマは、抗−ｐＥ２抗体及びハイブリッド細胞に長期的な組織培養安定を与える、不朽にする細胞を合成する細胞の融合によって合成できる。ハイブリッド細胞株の形態において、第一の融合相手である、抗体合成細胞は、ＧＥ２ポリペプチドで接種される、例えば、マウス若しくはラットのような非−ヒト哺乳類宿主の脾臓細胞でありえる。ホストが抗体反応をマウントするための十分な時間が経過した後、抗体合成細胞は除去される。マウスまたはネズミの髄腫細胞株のような不朽にする細胞株の細胞は、ハイブリドーマ（それは所望のモノクローナル抗体を分泌する）のような細胞株を識別するためにスクリーニングされた抗体産生細胞及び生じる融合で融合される。不朽にする細胞を伴う抗体合成細胞の融合は、標準的な手法によって達成される（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ２５６，  ４９５−４９７；  Ｋｅｎｎｅｔ，  Ｒ．，  （１９８０）  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  Ｐｐ．  ３６５−３６７，  Ｐｉｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ））。融合された細胞株は培養されて、モノクローナル抗体がスクリーニングされて、ポリクローナル抗体を回復するための同様な方法での培養培地からの抗−ｐＥ２抗体の合成のために精製される。
【００３９】
したがって、本発明のさらなる態様によると、ＨＥＶ抗原に対する精製された抗体を産出するための方法が提供され、ここにおいて、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２若しくは相同な配列、フラグメント又は上記に列記のアナログによって表現されるアミノ酸配列を有する整合ＨＥＶペプチドｐＥ２の効果的な量が非−ヒト哺乳類ホストに注入され、合成された抗体が収集される。本発明の好ましい実施態様において、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２によって表現されるアミノ酸配列を含む組換え融合タンパク質、ＧＥ２が、所望の抗体を産出するために、非−ヒト哺乳類ホストに注入される。
【００４０】
捕獲試薬としての抗−ｐＥ２抗体の活用
本発明のｐＥ２ペプチドを使用して起こされ若しくは発達されたモノクローナル若しくはポリクローナル抗体は、生物学的テストサンプルでのＨＥＶカプシドタンパク質若しくはウィルス粒子の存在を検出する捕獲試薬として免疫アッセイに使用される。本質的に、捕獲試薬として抗−ｐＥ２抗体を活用するために設計された免疫アッセイ形態が、採用される。免疫アッセイを実行するための方法は、当業者において既知であり、本発明は、任意の特異的な免疫アッセイに対して限定するようには意図されていない。
【００４１】
一般的に、本発明のｐＥ２ペプチドの整合の抗原決定基群が、ＨＥＶカプシドタンパク質の同様の構造の特徴を模倣するので、抗−ｐＥ２抗体は、ウィルスＲＮＡの抽出及び逆転写酵素チェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって引き続いて検出できる、ＨＥＶウィルス粒子を分離し、濃縮する免疫捕獲方法に採用されるかもしれない。本発明の好ましい実施態様によると、免疫捕獲方法がＨＥＶウィルス粒子を分離し、濃縮する目的のために提供され、ここにおいて、ポリスチレンパドル若しくは別の適切な固形の吸着物質が、ｐＥ２ペプチドに対して起こされた抗血清で覆われる。かかる方法は、ウィルスＲＮＡの抽出及び好ましくは、入れ子ポリメラーゼチェーン反応である、ＲＴ−ＰＣＲの適用によって決定されるテストサンプルでのウィルスの少量を検出するために効率が高い。
【００４２】
適切な固形支持体若しくは吸着物質は、実行される免疫形態の種類に依存するだろうが、しかしながら、選択された支持体の種類が適切な強度を有し、免疫学的複合体の免疫活性を干渉しないことが望ましい。固形支持体の実施例は、反応トレイのマイクロウェルの壁、テストチューブ、シート、プレート、スライド、ビーズ（例えば、ポリスチレン若しくはガラス）、ニトロセルロースストリップ、メンブラン、ラテックス粒子、ガラスのチップ、プラスチック及びその他のような微細粒子を含んでいる。
【００４３】
したがって、本発明の別の態様によると、下記の段階からなる生物学的テストサンプルに存在するＨＥＶウィルス粒子（例えば、分析物）の検出のための方法が提供される：
−ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２若しくは相同性配列、フラグメント、または上記に列記のアナログによって確定されるアミノ酸配列を有するｐＥ２ペプチドに対して起こされた精製された抗体の提供であって、抗−ｐＥ２抗体は好ましくは、固形支持体上に固定されることを特徴とする；
−抗−ｐＥ２抗体及びテストサンプルに存在するであろう任意のＨＥＶ分析物間の複合体の形態を可能にする状況下の生物学的テストサンプルを伴う抗−ｐＥ２抗体の接触及び培養；
−結果となる混合物からの非結合物質の可能な除去；及び
−ＨＥＶ分析物の存在のための混合物の検査。
【００４４】
診断テストキット
ここに記載されている新規なＨＥＶペプチド、ｐＥ２若しくは抗−ｐＥ２抗体は、一般的には、ＨＥＶ感染の検出及び診断に使用する診断テストキットの形体に包含されている。通常、キットは、分離された容器内に、免疫試薬としてのｐＥ２ペプチド若しくは抗−ｐＥ２抗体が含まれている。さらに、採用される免疫試薬及び検出されるＨＥＶ分析物の種類に依存して、キットは追加的に、ポジティブ及びネガティブコントロールサンプル、ラベルが直接シグナルを産出しない場合には、標識された抗ヒト抗体及びシグナル産出試薬（例えば、酵素標識の場合の酵素基質）のような指示試薬が含まれているであろう。ここで記載されているように、用語としての“分離された容器”は、診断テストキットに提供される他の物質と同様に、本発明のｐＥ２ペプチド若しくは抗−ｐＥ２抗体を限定的に固定して保持できる任意の物質を意味する。アッセイを実行する手引きは、通常、キット内に含有されている。かかる手引きは、一般的に、免疫試薬の濃度若しくは少なくとも一つのアッセイ方法のパラメーター、例えば、混合されている免疫試薬の相対量及びサンプル、免疫試薬／サンプル混合の時間、温度、バッファー状態、等を記載している。
【００４５】
所望であれば、本発明のｐＥ２ペプチド若しくは抗−ｐＥ２抗体は、一般的には、受動的な吸着若しくは当業者において周知である多くの技術の共有結合を介して固形の支持物質に固定される。本発明のｐＥ２ペプチド若しくは抗−ｐＥ２抗体固定するための固形の支持体の有用性は当業者において周知である。適切な支持は、実行される免疫アッセイ形体の種類に依存するが、しかしながら、選択された支持体の種類は適切な強度を有し、免疫学的複合体の免疫反応性を干渉しないか、シグナル産出物質からの検出可能なシグナルの合成を干渉しないことが望ましい。固形支持体の実施例は、反応トレイのマイクロウェルの壁、テストチューブ、シート、プレート、スライド、ビーズ（例えば、ポリスチレン若しくはガラス）、ニトロセルロースストリップ、メンブラン、ラテックス粒子、ガラスのチップ、プラスチック及びその他のような微細粒子を含んでいる。
【００４６】
指示試薬は、本発明の免疫試薬による免疫学的複合体の形態の指示が可能な標識若しくはシグナル産出物質及び捕獲されたＨＥＶ分析物を含むべきである。診断用テストキットの指示試薬は、例えば、凍結乾燥された形体の液体の分散として、若しくは実質的には乾燥パウダーとして、溶液にて提供可能である。指示試薬がシグナル産出物質としての酵素を活用する場合、酵素の基質もまた、診断用テストキットの分離された容器に提供できる。抗原−抗体結合による免疫学的複合体の形態を検出するための手段として使用される標識若しくはシグナル産出物質は、沈澱物の可視検出、若しくは色の変化、顕微鏡による可視検出、若しくは分光光度計、放射線測定若しくはその他同様による自動化検出を可能にする。シグナル産出物質の実施例は、コロイド状の金、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、及びローダミン）、発光物質、クロマゲン、放射活性要素、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシターゼ、及びベータ−ガラクトシダーゼ）及び増幅物質（例えば、ビオチン、抗−ビオチン及びアビジン）を含んでいる。
【００４７】
ＨＥＶ抗体を検出するためのキットの実施例として、本発明のｐＥ２の所定量は、入ってくるＨＥＶ抗体と免疫学的に結合することができるように、反応トレイのマイクロウェルに固定されている。指示試薬は、テストサンプルに存在するであろう任意のＨＥＶ抗体を認識して結合する、標識された哺乳類抗−ヒト抗体でありえる。標識された哺乳類抗−ヒト抗体は、シグナル産出物質としての酵素として活用が可能であり、酵素が直接シグナルを産出しない場合は、酵素の基質が追加的に提供される。
【００４８】
ワクチン
今日、文化的にワクチンの拡大が成功しないため、弱毒化されたワクチンの合成はまだ可能ではない。現在発展している候補となるワクチンは、真核生物で発現される主要な構造的タンパク質の組換えペプチドである（Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３ａ；  Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４ａ）。弱毒化されたワクチンと比較して、ワクチンの形態の組換えペプチドを使用する利点は、ペプチドがより効率的に合成され、簡単に精製されることである。さらに、結果となるワクチンが任意の生きた完全なウィルス粒子を含む可能性はなく、したがって感染の危険性を避けられる。
【００４９】
ｐＥ２ペプチドは、そのモノマーの形式よりそのダイマーの形式でより免疫原であることが分かった。ｐＥ２ペプチドに対して起こされた抗血清の実験研究において、ダイマーに対する抗体活性のレベルが、モノマーの形式に対する活性よりも実質的に高い。さらに、ＨＥＶ抗体の特異性の広いスペクトルを表現するＨＥＶ活性ヒト血清とは違って、ｐＥ２抗血清は、ＨＥＶ抗体の特異性の制限されたスペクトルを有する。特に、しかしながら、ｐＥ２抗血清は、ウィルスの十分な免疫捕獲を効果的にする能力によって証明されるようなＨＥＶ粒子の認識及び結合が可能である。したがって、抗原関係がｐＥ２ペプチドのダイマーの形式とウイルスの間で確立された、ｐＥ２ダイマーがＨＥＶカプシド・タンパク質に形態学的に抗原的にに関連づけられて、それを作るウイルス・カプシドのある構造の特徴を模倣するということである。したがって、肝炎Ｅウィルスカプシド及びｐＥ２ペプチドがある共通の抗原決定基群をシェアして、より詳細には、新しい整合の抗原決定基群は、ｐＥ２ペプチドのダイマーの形式と関連することが、確立が高い。この主張は、ペプチドのダイマーの形式がＨＥＶの反応的なヒトの血清によって強く一般に認識されたという発見と一致している。
【００５０】
ｐＥ２ホモダイマーがＨＥＶカプシドタンパク質と構造上及び抗原的に関係のあるように見えるという事実の概観では、これが、ＨＥＶ伝染に対するワクチンに対する潜在的な候補としてアピールする、細菌で表現されたペプチドを作る。さらに、異なるＨＥＶ分離株（表１）のＨＥＶゲノム内の保存は、ｐＥ２ペプチドが中国の分離株に由来している一方さらに、それがメキシコおよび米国から最近分離された最も遺伝学的に分岐する菌株を含む他のＨＥＶ型からの保護を産出するだろうとさらに示唆する。
【００５１】
したがって、本発明のさらなる別の実施態様によると、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ：２若しくは相同性配列、フラグメント、または上記に列記のアナログ、及び免疫処置に続く肝炎Ｅウイルスを備えた抗原投与から哺乳動物を保護する、薬学的に受容可能なキャリアによって識別され、ｐＥ２ペプチドからなるワクチン構成物が提供される。
【００５２】
さらに、肝炎Ｅウィルスに対する感染に抵抗する個々の免疫処理のためのワクチンの使用が提供され、ここでワクチンは、薬学的に受容可能なキャリアーとの組み合わせにおいて、ｐＥ２ペプチドの免疫学的な有効量からなる。薬学的に受容可能なキャリアーは、当業者にとって既知である（Ａｍｏｎ，  Ｒ．  （Ｅｄ．）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉ：  ８３−９２，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌ．，  １９８７）。キャリアーは、ペプチドを患者に導入するための入れ物（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）の使用において適切な液体状の媒体を含んでいるが、しかし薬剤を受け取る個体に有害な抗体の生産を引き起こしてはならない。かかる液体媒体の実例は、食塩水である。さらに、ワクチンの形態はまた、免疫反応を刺激するためのアジュバントを含んでおり、そこにおいて、ワクチンの効果を増幅する。
【００５３】
“免疫学的に効果的な量”は、上記に定義されたように、処理のために有効である被験者への、一回量中の、あるいは一連の一部としてのその量の投与を意味する。かかる量は、処置される被験者、処置される被験体種（例えば、非−ヒト哺乳類、霊長類等）の健康状態、抗体を合成するための被験者の免疫システムの可能性、望まれる保護の程度、ワクチンの形態、感染しているＨＥＶの菌株、及び他の重要要素に依存する。量は、比較的型通りの試みを経て決定することができる広範囲に落ちるだろうことが予期される。
【００５４】
本発明のワクチンは、経口及び非経口（例えば、静脈内、皮下、若しくは筋肉内）注入を含むワクチンの投与のための任意の簡素な方法によって投与される。処置は、ワクチンの単一の投与若しくは一定期間における複数の投与から構成される。
【００５５】
上記、及び発明を特徴づける斬新さの他の利点及び特徴は、ここに付加され、一部分をこれについて形成した請求項での特殊性で指摘される。本発明をより理解するにあたり、本発明の利点、及び本発明の使用による目的、参照は添付の図面及び記述的な問題（発明の好ましい実施例がその中で例証され記述される）になされるかもしれない。
【００５６】
任意の方法及び同様の物質若しくは等価である任意の方法及び物質もここに記述したが、本発明の実行若しくは試験において使用することができ、好ましい方法及び物質がここで今、記述される。
【００５７】
次の記載では、発明が、本発明の好ましい実施例を例証する、添付の図の援助によって詳細に説明されるだろう。
【００５８】
本発明の詳細な記載
もし他の方法で確定されなかったならば、ここに使用される技術的及び科学的な用語はすべて、この発明が属する技術における通常の当技術のうちの１つによって一般に理解されるのと同じ意味を持っている。一般的に、命名法はここに使用した。また、細胞培養、分子遺伝学、および下に記述された核酸化学における研究室での手順は、既知であり、当技術において採用される。標準的な技術が、組換え核酸方法、細胞培養、及び形質転換に使用される。一般的に、酵素反応及び精製段階は、製造者の手引きにしたがって実行される。技術及び手順は、一般的には、当業の従来の方法及び様々な一般的な参照（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ，  １９８９）にしたがって実行される。開示の全体にわたって使用される、次の用語が、もし他の方法で示されなかったならば、次の意味を持っていると理解される：
生物学的テストサンプルは、関心ある分析物の供給源である、個々の体の構成物を意味する。テストサンプルの実施例は、限定されないが、ヒト及び動物の体液、例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、白血球、腸管の分泌物、小水、及びリンパ液である。
【００５９】
Ｅ２は、図２に例証された中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  Ｎｏ．Ｄ１１０９２）のゲノムの６３２６乃至６９６８位置に拡張しているクローンｃＤＮＡフラグメントで、６９５７部位（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に単一塩基対の欠損を含んでいる。
【００６０】
ｐＥ２は、Ｅ２（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２）によってエンコードされたペプチドである。
【００６１】
Ｅ３は、図３に例証された中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  Ｎｏ．Ｄ１１０９２）のゲノムの５３６４乃至５４７７位置に対応するクローンｃＤＮＡフラグメントである。
【００６２】
ｐＥ３は、図４にて例証されるＥ３によってエンコードされたペプチドである。
【００６３】
ＧＥ２は、融合タンパク質であり、ｐＥ２のアミノ末端がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのカルボキシ末端と結合している。
【００６４】
ＧＥ３は、融合タンパク質であり、ｐＥ３のアミノ末端がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのカルボキシ末端と結合している。
【００６５】
肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）は、カルシウィルス（）の仲間と同様な形態の一本鎖ポジティブＲＮＡウィルスである。それは、肝炎の散発的な症例か固有の発生を引き起こすことができ、肝炎Ａウィルス（ＨＡＶ）、肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ）及び肝炎Ｄウィルス（ＨＤＶ）とは血清学的見地から異なる。
【００６６】
ホモダイマーは、二つの同一のモノマーの結合により形成された分子である。
【００６７】
相同配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１若しくは２のそれぞれにより識別される、Ｅ２核酸配列若しくはｐＥ２アミノ酸配列と同一な配列を少なくとも８０％、より好ましくは９０％を有する核酸若しくはアミノ酸配列である。
【００６８】
Ｉ  ＨＥＶゲノム配列
ＨＥＶゲノム配列は、図２Ａ乃至２Ｄ及び図３にそれぞれのＯＲＦ２及びＯＲＦ３と対応して例証されている。同様に、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３領域のそれぞれから派生する遺伝子の生成物と対応して図４及び５にペプチド配列が示されている。したがって、ゲノム配列は、下記にリスト化して示される：
ＳＥＱＩＤＮＯ：１は、ＯＲＦ２から派生したクローンＤＮＡフラグメントＥ２の核酸配列である。
【００６９】
ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、ペプチドｐＥ２のアミノ酸配列である。
【００７０】
ＳＥＱＩＤＮＯ：３は、ＯＲＦ２Ｒｂ（表９を参照）プライマー下流の核酸配列である。
【００７１】
ＩＩ  ＨＥＶペプチドｐＥ２及びｐＥ３
ＨＥＶゲノムからのｐＥ２及びｐＥ３の発現
ＨＥＶの中国菌株Ｄ１１０９２のゲノム内に位置するＯＲＦ３配列の３´末端からの１１４領域及びＯＲＦ２配列の３´末端からの８１１が、逆転写ポリメラーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、複製されて、増幅された。続いて、かかる配列は、ｐＧＥＸベクターのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩクローニング部位でライゲートされた。複製されたウィルスの遺伝子は、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（図６のレーン２及び３）を伴うプラスミドの消化によって回復され、シークエンス解析された。解析は、ウィルスゲノム内の５３６４乃至５４７７位置の１１４ｂｐに位置した。３．９ｋＤの分子量の３７のアミノ酸のｐＥ３であると予測された。８１１ｂｐの配列が、６３２６乃至７１３６に位置するが、しかしながら、解析はまた、ＰＣＲ増幅のエラーによると思われる、６９５７部位（図２Ｄ）の単一の塩基対欠損を明らかにした。結果となるフレームシフトは、核酸配列の翻訳が６９６８部位の新しい停止コドンで早々に停止し、このようにして、当初予期していたような２６７アミノ酸残基に代わって、期待していたよりも小さい、２３ｋＤの分子量である２１３アミノ酸残基の長さのｐＥ２が得られる。ｐＥ２のカルボキシ末端の３つのアミノ酸残基は、非−ＨＥＶ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）であるフレームシフトによって合成された。
【００７２】
核酸配列は、ＨＥＶの中国菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  Ｎｏ．  Ｄ１１０９２）のＯＲＦ２及びＯＲＦ３領域にそれぞれ対応して図２Ａ乃至２Ｄ及び３にて示されている。
【００７３】
アミノ酸配列は、ＨＥＶの中国菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  Ｎｏ．  Ｄ１１０９２）のＯＲＦ２及びＯＲＦ３領域のそれぞれから派生したｐＥ２及びｐＥ３ペプチドに対応して図４及び５に示されている。
【００７４】
ＨＥＶ  ＯＲＦ２及びＯＲＦ３特異的タンパク質の特性
ＨＥＶゲノムの両ＯＲＦ２及びＯＲＦ３から複製された配列は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ペプチド、ＧＥ２及びＧＥ３のそれぞれに発現される。発現システムは、ウィルスペプチドの高い産出率を与え、グルタチオンセファロース−４Ｂシステムを用いた場合に効果的な精製を可能にする。かかる方法は、約２ｍｇの精製されたＧＥ２及び１リットルの細菌培養から７ｍｇのＧＥ３を産出する。あるいは、セファロース−４ＢへのＧＥ２の結合は、ＧＳＴのカルボキシ末端で融合タンパク質を切断し、ウィルスペプチドｐＥ２を放出する、トロンンビンを用いて溶出される。かかる方法は、１リットルの細菌培養から約１ｍｇの精製されたｐＥ２ペプチドを産出する。
【００７５】
ＧＥ２及びｐＥ２の精製された調製は、ＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング（図７）によって特徴付けられる。精製されたｐＥ２融合タンパク質、ＧＥ２（レーン１及び２）、ｐＥ２ペプチド（レーン３及び４）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（レーン５）は、（Ａ）ＳＤＳＰＡＧＥ及びＧＳＴ特異的抗血清及び（Ｃ）プールされたヒトＨＥＶ活性ヒト血清を用いて（Ｂ）ウェスタンブロッティングによって解析される。加えて、ＧＥ２及びｐＥ２ペプチドのサンプルは、続くＳＤＳＰＡＧＥ（Ａ）及びウェスタンブロッティング（Ｂ及びＣ）による解析（レーン２及び４）のために、１００℃で３分間加熱される。精製されたＧＥ２は９２ｋＤの分子量のダイマー状形態の主用なバンドに分解され（図７Ａ、レーン１）、しかし、サンプルが１００℃の三分間の熱処理後に、４９ｋＤに分離された（図７Ａ、レーン２）。ＧＥ２の両ダイマー状及びモノマー状形態は、対応するウェスタンブロッティングでの抗ＧＳＴ血清によって認識される（図７Ｂ、レーン１及び２）。かかる調製でのマイナーな生成物の一つである、４９ｋＤのＧＥ２モノマーは、抗ＧＳＴとだけ反応して、ヒトＨＥＶ活性血清とは反応しない（図７Ｃ、レーン２）ことは注意すべきである。したがって、ＧＥ２が１００℃で３分間加熱された場合、４９ｋＤのモノマーは主要なバンドになるが、しかし、そのヒトＨＥＶ血清に対する抗原性は著しく縮減された（図７Ｃ、レーン２）。トロンビンを伴う融合タンパク質結合の消化により精製されたｐＥ２ペプチドは、４２ｋＤのダイマーを自然に形成し、１００℃で３分間の過熱後に２３ｋＤのモノマーに分離する（図７Ａ、レーン３及び４のそれぞれ）。ｐＥ２のダイマー若しくはモノマー形態の何れも、抗ＧＳＴ血清にて認識されない（図７Ｂ、レーン３及び４）。さらに、ｐＥ２のダイマー形態のみが、ヒトＨＥＶ血清と反応した（図７Ｃ，レーン１及び３）。
【００７６】
ＯＲＦ３から発現された精製されたＧＳＴ融合タンパク質（ＧＥ３）はまた、ＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって特徴付けられた（図８）。ＧＥ３タンパク質は、予期された３０ｋＤの分子量のバンドとして泳動したモノマーとして発生した。ウェスタンブロッティングは、ＧＥ３が抗ＧＳＴ抗血清及びプールされたＨＥＶヒト血清の両者と反応性があることを示した。しかしながら、ｐＥ２及びＧＥ２と対照的に、ＧＥ３の反応性は、ＧＥ３の抗原性活性が熱によって影響されないため、モノマー形態とのみ関連している。したがって、完全長のタンパク質に特異的なＯＲＦ３のカルボキシ末端への従来のペプチドマッピング研究によって位置したエピトープに、かかる活性が少なくとも部分的に起因することはありそうである。
【００７７】
ＩＩＩ  ｐＥ２及びｐＥ２の抗原活性
ｐＥ２ペプチドはホモダイマーとして自然に発生する
従来からの研究は、ＨＥＶ活性ヒト血清によって認識されるＨＥＶゲノムのＯＲＦ２によりエンコードされたＨＥＶの構造的タンパク質の組み合わせペプチドを記載している（Ｙａｒｂｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｌｉｅｔ  ａｌ，  １９９４）。構造タンパク質の長さを測る短いペプチドのオーバーラップを用いるペプチドマッピングの技術によって、かかる抗原性ペプチドの反応は、ポリペプチドの長さに沿った異なる領域へ位置する抗体結合部位の数及び性質に起因した。線形エピトープに言及すると、かかる抗体結合部位は、アミノ酸配列によって決定されるようなタンパク質の１次構造に関連している。２次及び３次構造によって決定される溶液内の組換えペプチドによる仮定された形状は、抗体に対するエピトープの接近性に影響し、したがって、抗原性活性を縮減する。
【００７８】
本発明の組換えｐＥ２ペプチドは、ＨＥＶ反応性ヒト血清により認識できる抗原性活性の二つの種類を表現する。抗原活性の一つの種類は、ｐＥ２ペプチドの１次構造に関連して、一方で活性の第二種類はダイマー形態におけるペプチドの４次構造に関連している。第一抗原性活性は、ｐＥ２ペプチドのアミノ酸配列内に含まれる線形エピトープに起因しており、ウェスタンブロッティング及び下記の記載によって識別されるように、モノマー形態と関連している。しかしながら、抗原性活性の第二種類は、自然状態において厳密に整合であり、ｐＥ２ペプチドのモノマーがホモダイマーを形成するためにお互いに関連する場合のみの結果である。したがって、他のＨＥＶ組換えペプチドとは区別されるｐＥ２ペプチドの著しい特質は、自然状態で主に生理学的条件の下のホモダイマー（例えば、大きいオリゴマー）を成形し、かかるペプチドの抗原性活性は、そのダイマーの形式によって単独で達成されたｐＥ２ペプチドの４次構造から推測上発生する整合の抗原決定基群に起因する。さらに、抗原活性はダイマーの解離で改廃されるが、モノマーの形式からのダイマーの再構成で活性を回復することができる。したがって、抗原活性のこの種類は、ＨＥＶゲノムのＯＲＦ２領域から派生した組換えペプチドにおいて、報告されるその種類の第一番目である。
【００７９】
図７は、プールされたヒトＨＥＶ活性血清のｐＥ２及び精製されたｐＥ２のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（例えば、ＧＥ２）のダイマー形態に対する強い反応性を示している。精製されたＧＥ２（レーン１及び２）及び精製されたｐＥ２（レーン３及び４）は、ここに記載のように合成されて、ＧＳＴに対して起こされた抗血清及び（Ｃ）プールされたＨＥＶ活性ヒト血清を用いる（Ａ）ＳＤＳＰＡＧＥ及び（Ｂ）ウェスタンブロッティングによって解析された。レーン２及び４にて使用しているサンプルは、解析の直前に１００℃で３分間加熱された。ＧＳＴの精製サンプル及び分子量マーカーの混合物は、レーン５及び６にそれぞれロードされた。非加熱サンプル（７Ａ、レーン１及び３）において、融合タンパク質ＧＥ２は、約９２ｋＤの分子量のダイマーとして泳動（７Ａ、レーン１）し、ｐＥ２は、約４２ｋＤの分子量のダイマーとして泳動した（７Ａ、レーン３）。しかしながら、図７Ａのレーン２及び４に例証されているように、加熱は、４９ｋＤａのモノマー状ＧＥ２融合タンパク質及び２３ｋＤａのモノマー状ｐＥ２ペプチドのそれぞれに分離するように両タンパク質のダイマー形態を引き起こす。ダイマー若しくはモノマー形態の何れかの融合たんぱく質ＧＥ２は、予期されたように（７Ｂ、レーン５）、ＧＳＴと同様に、ＧＳＴ（７Ｂ、レーン１及び２）に対して起こされた抗血清によって認識されることが下記のウェスタンブロッティングによって明らかにされた。ＨＥＶ活性ヒト血清は、ＧＥ２融合タンパク質（７Ｃ，レーン１）及びｐＥ２ペプチド（７Ｃ，レーン３）のダイマー状の形態を強く認識した。１００℃で３分間のサンプルの加熱は、ＧＥ２融合タンパク質及びｐＥ２ペプチドの両者のダイマー状の形態を対応するモノマー状の形態に分離する結果となった。しかしながら、かかる分離は、ＧＥ２タンパク質及びｐＥ２ペプチド（７Ｃ、レーン２及び４のそれぞれ）のモノマー状の形態を認識し及び結合するＨＥＶ活性ヒト血清の不可能によって示されているように、抗原性活性の付随する欠損と関連している。
【００８０】
ｐＥ２モノマーの抗原性は評価され、ウェスタンブロッティング（図９）によるｐＥ２ダイマーの抗原性と比較された。精製されたｐＥ２ペプチドの非加熱及び加熱サンプルの等量が混合された。混合物は、連続的に４倍に希釈され、レーン１乃至６にロードされた。電気泳動後、ｐＥ２の両形態の抗原性は、図７の２００倍希釈で使用されたプールされたＨＥＶ活性ヒト血清にて決定された。図９は、プールされたヒト血清がポジティブ反応を与えるｐＥ２モノマーの最低量は１３６０ｎｇで、同じ状態でテストした場合のｐＥ２ダイマーで決定された最低量の８６ｎｇよりも１６倍高いことを示している。さらに、ｐＥ２ダイマーに対して反応の強度は、ｐＥ２モノマーに対する反応の強度よりも約５倍高いと予測された。したがって、組み合わされた結果は、ｐＥ２ダイマーと関連する抗原性活性はモノマーよりも明らかに大きく、ｐＥ２ダイマーの全体の活性は、ｐＥ２モノマーの全体の活性よりも約８０倍大きいことを実証する。ｐＥ２モノマーの抗原活性は、ｐＥ２アミノ酸配列の１次構造内に含まれる数多の線形エピトープに起因している。
【００８１】
加えて、市販のＨＥＶ  ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ．，  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）における１８の個々のヒト血清のポジティブが、モノマーの形態へｐＥ２ダイマーを分離するために、ｐＥ２ペプチドのダイマー形態を保存するのに未処理にしておかれたか、若しくは１００℃で３分間加熱されて、事前に解析する精製されたｐＥ２のサンプルの等量の混合物（反応につきｐＥ２の各形態が１３６０ｇ）に対してウェスタンブロッティング（図１０）によって５０倍希釈でテストされた。図１０に示されている結果によると、１８血清のうちの８血清のみがｐＥ２ダイマー及びモノマーの両者に対して活性である一方、残りの１０の血清はｐＥ２ダイマーに対してのみ活性であった。モノマー形態と比較されたｐＥ２ダイマーに対する抗体反応性のより高い普及は、ダイマーがモノマーより抗原性的に反応的であるという一層の徴候である。
【００８２】
図１１は、ｐＥ２ダイマーに固有の抗原性活性の第二種類が、ダイマーの４次構造、若しくはオリゴマー、ｐＥ２ペプチドの形態に関連していることを示している。整合の抗原決定基群と呼ばれて、ｐＥ２以外に再結合のペプチドに関連したこの種の抗原反応性（それは、ＨＥＶゲノムのＯＲＦ２領域に由来する）は、従来未知である。ＳＤＳＰＡＧＥ（Ａ）及びウェスタンブロッティング解析（Ｂ）に先立ち、精製されたｐＥ２の分離サンプルは４つの異なる温度：４℃（レーン１）；２０℃（レーン２）；３７℃（レーン３）；及び４５℃（レーン４）で１時間８Ｍで処理された。さらに、４５℃で処理されたサンプルの一部分は、ＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング解析に先立ち、尿素を除去するため（レーン５）に、続いてオーバーナイトで透析された。ウェスタンブロッティングは、２５０倍希釈されたプールされたＨＥＶ活性ヒト血清を用いて実行された。ＳＤＳＰＡＧＥによって得られた結果（図１１Ａ）は、ｐＥ２の完全な解離が４５℃で完全に達成されるまで、ｐＥ２ダイマーがそのモノマー形態へ分離した範囲は加熱過程の間に温度の増加につれて増加したことを示している（レーン４）。これらの結果と一致して、ウェスタンブロッティング解析（図１１Ｂ）は、ｐＥ２ダイマーが存在している（例えば、レーン１乃至３及びレーン５）サンプルにおいてのみ、ＨＥＶ活性血清が反応性の任意の度合いを表すこと例証している。あるいは、ＨＥＶ活性ヒト血清は、ｐＥ２ペプチドのモノマーの形式だけを含んでいる、加熱したサンプルの方へ向かう反応が少しもないことを示している。
【００８３】
かかる結果は、生理学的状況において、ｐＥ２モノマーは自然状態でホモダイマーを形成するためにお互いに関連して、ＨＥＶ活性ヒト血清によって認識される整合抗原性決定は、ｐＥ２のモノマー形態に対する抗体が検出できないために、かかるダイマー状の相互作用の発生によることを提案する。したがって、ｐＥ２ダイマーの４次構造により決定された抗原性活性のかかる第二種類は、ｐＥ２ペプチドがダイマー形態である場合に、自然状態において厳密に整合に見えて、単に機能的である。結果として、ｐＥ２ペプチドのダイマー形態の分離は、整合抗原性活性の損失と関連して示されてた（例えば、図１１Ｂ、レーン４）。しかしながら、整合抗原性活性は、ＰＢＳに対する尿素で扱われたサンプルのオーバーナイトの透析に続くダイマーを成形するためにｐＥ２モノマーの再会合において回復することができるかもしれない（図１１Ｂ、レーン５）。
【００８４】
ＨＥＶ感染におけるｐＥ２重要な整合の抗原決定基群
上記に示して記載したように、ＨＥＶ活性ヒト血清によって認識可能な二つの種類のｐＥ２抗原性活性のダイマー形態の整合の抗原決定基群は、モノマー形態の線形エピトープよりも自然状態のＨＥＶ感染において重要な役割を表す。これは、ウェスタンブロッティング解析（図１０）の結果が、全体の内の１８ＨＥＶ活性ヒト血清において、すべての１８の血清がｐＥ２ペプチドのダイマー形態に対して活性であり、一方で、血清の内の８血清がｐＥ２ペプチドのモノマー形態に対して追加的に活性であることを示す場合に結論とされる。さらに、図９に示された結果に基づくと、ｐＥ２の整合の抗原決定基群の全体の活性は、モノマー内に含まれる線形エピトープの活性よりも約８０倍高いことが予測される。
【００８５】
自然状態のＨＥＶ感染におけるｐＥ２の整合の抗原決定基群の役割は、２１の健康なドナーの血液からの血清及び肝炎の発症後の異なる時間で採取された非Ａ，Ｂ及びＣ急性肝炎を有する９６人の患者からの血清テストによってさらに評価された（表２）。試験に使用された血清は、香港に存在するプリンスマーガレット病院に登録されている、現在若しくは過去において非Ａ，Ｂ及びＣ急性肝炎の患者から得られた。結果は、ｐＥ２に特異的なＩｇＧ抗体は、健康なドナーよりも非Ａ，Ｂ及びＣ急性肝炎の患者において著しく存在していることを示している。違いは、ＨＥＶが非Ａ，Ｂ及びＣ肝炎の共通の原因であることを示すエピデミオロジカル（ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ）な研究と一致している。ＩｇＧ抗体の検出は、数名のかかる患者は現在感染しており、他の患者は過去においてウィルスによって感染していたことを提示している。健康なドナーの約１０％は、過去においてウィルスに感染しており、これは、かかる血液サンプルが得られたコミュニティーの中のＨＥＶ伝染のレベルに合意している。
【００８６】
【表２】
0004641695.tif 000003
ＩＶ  ｐＥ２及びＧＥ３のＨＥＶ特異性の決定
ｐＥ２ダイマー及びｐＥ３の抗遺伝活性がＨＥＶ特異的であると確認するために、急性若しくは非Ａ，Ｂ及びＣ急性肝炎の患者から得られた９６血清検体のうち、７４を市販のＨＥＶ特異的ＥＬＩＳＡによってさらに試験された（表３）。市販のテストとｐＥ２若しくはＧＥ３テスト間の高い一致率は、ｐＥ２及びｐＥ３のＨＥＶ抗原性特異性を実証している。
【００８７】
【表３】
0004641695.tif 000004
Ｖ  ＩｇＧ及びＩｇＭ抗ＨＥＶを検出するためのＥＬＩＳＡの確立
二つの分離したＥＬＩＳＡは、ｐＥ２若しくはグルタチオンＳ−トランステップフェラーゼ融合タンパク質ＧＥ３の何れかの精製された調製を伴う分離されたマイクロプレートのコーティングによって導かれた。かかるＨＥＶペプチドの生成及び精製は、すでに記載済みである。かかる調製の純度は、４２ｋＤｐＥ２ダイマー及びそれぞれの調製における総タンパク質の８９％及び９５％を構成するような、３０．４ｋＤＧＥ３融合タンパク質の相対強度によって決定される（図１２、左のレーン）。ウェスタンブロッティングは、かかるペプチドはＨＥＶポジティブなヒト血清（図１２、固形及びハッチドな円）の反応によって示されるようなかかる調製における主要な抗原であるが、しかしコントロールのネガティブなヒト血清（図１２、開いている円）によって示されるような抗原ではないことを示している。精製されたＨＥＶペプチド調製で生産されたアッセイによるこれらの血清の滴定は、ウェスタンブロッティングにより決定されるような対応するペプチドに対するこれらの血清の反応性と関連した、典型的な結果を産出した。
【００８８】
追加試験において、ＨＥＶＩｇＧ抗体のレベルは、ｐＥ２及びＧＥ３に特異的なアッセイを用いて９０の健康なドナー及び現在及び過去において非Ａ，Ｂ及びＣ急性肝炎に感染した９６名の患者から得られた血清検体で決定された。個々の患者血清の抗体レベルは、一般に、以前にウェスタンブロッティングにより決定されるような対応するウイルスのペプチドに対するそれらの反応性と関連した（図１３）。ウェスタンブロッティングにより決定された活性血清（図１３、固形棒）において得られたＯＤ値は、弱い活性（図１３、ハッチド棒）若しくは非活性（図１３、開いている棒）よりも高い。
【００８９】
ウェスタンブロッティングによって証拠づけられた非活性の血清の平均ＯＤ値より高い５ＳＤにおける遮断値をセットすることにより、ｐＥ２活性の８５．７％若しくは弱い活性血清は、ｐＥ２特異的アッセイによってポジティブな結果が得られ、ＧＥ３活性血清の６６．６％は、ＧＥ３特異的アッセイによってポジティブな結果が得られた。ウェスタンブロッティングとｐＥ２及びＧＥ３特異的アッセイ間の全体の一致は、それぞれ９１．７％及び８８．５％であった。ウェスタンブロッティングの結果に基づくと、両者のＥＬＩＳＡテストは１００％の特性を有し、かかるアッセイ及びウェスタンブロッティングによって得られた異なる結果は、弱い反応的な血清に制限された。ｐＥ２アッセイは４２ｋＤｐＥ２ダイマーに特異的であり、ＧＥ３アッセイは３０．４ｋＤｐＥ３ペプチドに特異的であることがこの結果で確認された。ＥＬＩＳＡによって決定されるようなＩｇＧｐＥ２抗体の漿普及（ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、ＨＥＶ患者で５０％で、ドナーで５．５％で、ＩｇＧ  ＧＥ３の漿普及は、ＨＥＶ患者で２２．９％で、ドナーの１．１５％であった。テスト被験者の何れのグループのｐＥ２特異的抗体の漿普及は、ＧＥ３特異的抗体の漿普及よりも高かった。これは、ｐＥ２が２つの抗原の優先種で、これらの抗体の何れかのより高い存在が急性肝炎に関係していた、と示唆した。
【００９０】
ＨＥＶカプシドタンパク質の明瞭な抗原領域への抗体の反応
さらなる比較において、９６血清のうちの７４血清のＩｇＧ抗体が、市販のテストキット（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ．，  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によってさらにテストされた。市販のテストキットは、ＨＥＶのブメセ（Ｂｕｍｅｓｅ）及びメキシコ菌株（ｙａｒｂｏｕｇｈ  ｅｔａｌ．，  １９９１）のそれぞれのＯＲＦ２及びＯＲＦ３の３´末端からエンコードされた４２アミノ酸ペプチド及び３３アミノ酸ペプチドを含有する混合物から構成された。市販のテストで使用されたＯＲＦ３の３３アミノ酸ペプチドは、なぜならば、すでに記載したように、ｐＥ３は、ＯＲＦ３の３´末端から発現された３８アミノ酸ペプチドであるために、ｐＥ３（例えば、ＧＥ３）の一部分内であることが分かった。したがって、市販テストでのＯＲＦ３特異的ペプチドの抗原性特異性は、ＧＥ３の抗原性特異性に近接して関連するであろうことが予期される。一方で、市販テストに使用されたＯＲＦ２特異的ペプチドは、２１３アミノ酸ｐＥ２ペプチドのカルボキシ末端からのさらなる下流に位置している。したがって、キット内に含まれているＯＲＦ２ペプチドによって部分的に決定された市販テストキットの抗原性特異性は、本発明のｐＥ２ペプチドとは異なることが予期される。ＯＲＦ２領域から派生した過去に報告されたＨＥＶペプチドとは異なって、ｐＥ２の抗原性活性は独特であり、主として、ｐＥ２モノマーがホモダイマーを成形するために互いに関連させる場合、露出されるだけの整合の抗原決定基群に起因する。
【００９１】
ウェスタンブロッティングによって証明されたように、３０の血清はｐＥ２ＩｇＧ及びＧＥ３ＩｇＧの両者において活性があるように過去にテスト（ｐＥ２＋／ＧＥ３＋、図１５Ａ及び１５Ｄ）され、１４の血清はｐＥ２ＩｇＧのみに活性（ｐＥ２＋／ＧＥ３−、図１５Ｂ及び１５Ｅ）で、３０の血清は、何れのペプチドに対しても活性がない（ｐＥ２−／ＧＥ３−、図１５Ｃ及び１５Ｆ）。結果として、ｐＥ２及びＧＥ３の活性血清における市販のアッセイによって決定された抗体のレベルは、ＧＥ３抗体のレベルに応じて同等に変化する（図１５Ａ）が、しかし、ｐＥ２特異的抗体のレベルと独立している（図１５Ｄ）。１１のかかる血清はＧＥ３にとって弱い活性で、ＧＥ３特異的ＥＬＩＳＡの遮断値を下回る低いＯＤ値を与える（図１５Ａ）。ｐＥ２に対してのみ活性である１４血清のうちの１０の血清は、対応する抗体の異なるレベルを含んでいることが分かった。１４血清のうちの７の血清は、市販のアッセイによって活性である（図１５Ｅ）。しかしながら、それらのすべては、ＧＥ３特異的ＥＬＩＳＡによってネガティブな結果が与えられた（図１５Ｂ）。残りの血清は、何れのペプチドに対しても非活性である。それらのすべては、ｐＥ２及びＧＥ３特異的ＥＬＩＳＡの両者によってネガティブな結果が与えられ、しかし１つ以外のすべては市販のアッセイによってネガティブな結果が与えられた。
【００９２】
３つのアッセイによって検出されたＨＥＶ抗体のスペクトルが、表４に概要されている。それらの明瞭な抗原性特異性にも関わらず、３３の血清は、ｐＥ２特異的アッセイ及び市販のアッセイによってポジティブであり、３３の血清は両者のアッセイによってネガティブであり、二つのアッセイ間の全体の一致は８７．８％が与えられた。同様にして、ＧＥ３特異的アッセイと市販のアッセイ間の全体の一致は７４．３％であった。３つのアッセイを組み合わせた全体の一致は、６６．２％であった。市販のアッセイ（４７％）によってＨＥＶ抗体の検出頻度は、ｐＥ２特異的アッセイよりもわずかに低く（５０％）、ＧＥ３特異的アッセイよりも高かった（２９％）。個々の血清によって表現された抗体のスペクトルに基づくと、４０血清のうちの１５血清において市販のアッセイによって検出された抗体は、ＧＥ３特異的アッセイによるテストの場合に血清が非活性であるため、この分析を生産するために使用される、ＯＲＦ２に特異的なペプチドに特異性であるものに起因することができる。残りの２３の血清は市販のアッセイ及びＧＥ３特異的アッセイの両者によってポジティブな結果が与えられるが、しかしながら、これらの血清がさらに市販のアッセイを生産するために使用される、ＯＲＦ２に特異的なペプチドに対する抗体を含んでいる場合、上記の結果は確認されなかった。
【００９３】
【表４】
0004641695.tif 000005
ＶＩ  現在及び過去のＨＥＶ感染における抗体反応
ＨＥＶ患者及び健康なドナーからの血清のｐＥ２及びＧＥ３特異的ＩｇＭ抗体のレベルもまた、決定された。予備的研究において、抗ヒトＩｇＧの存在及び不在において得られた結果が本質的に同一であるように、アッセイは、ＩｇＧ抗体の存在によって影響されないことが示された。後の決定は、したがって抗ヒトＩｇＧがない状態で行われた。また、遮断値は９０人のドナーからの血清の平均ＯＤ値を上回る３ＳＤでセットされた。図１４は、肝炎Ｅの発症の時間を伴う患者からの血清内のｐＥ２及びＧＥ３抗体の発生を比較している。ｐＥ２及びＧＥ３特異的ＩｇＭ抗体及びＧＥ３特異的ＩｇＧ抗体は、主に肝炎Ｅの発症後の早い期間に得られたサンプルの血清に存在する一方で、ｐＥ２特異的ＩｇＧ抗体の発生は疾病の発症とは関連していない。
【００９４】
図１４のようなｐＥ２及びＧＥ３特異的アッセイによって決定されるＨＥＶ抗体レベルに基づくと、テストされた個人の血清検体は９つの明らかなＨＥＶの血清学的なプロファイルを表現する。５３名の患者の血清のすべてが、かかる抗体（表５）の一つ以上において様々な活性があることが判明した。１８の血清は、現在の感染と一致する５つの血清学的プロファイルを表現した（表５、プロファイル１乃至５）。それらは、ｐＥ２ＩｇＭのみに活性である３つの血清（表５、プロファイル１）、ｐＥ２及びＧＥ３特異的ＩｇＧ抗体に追加的に活性である１１の血清（表５、プロファイル２）、及びｐＥ２ＩｇＭ３、ｐＥ２及びＧＥ３特異的ＩｇＧ抗体に活性で、またＧＥ３特異的ＩｇＭ抗体に活性である３つの血清（表５、プロファイル４）を含んでいる。他の血清は、ｐＥ２特異的ＩｇＭに活性で、また様々な他の抗体である。かかるサンプルの１６サンプルは、肝炎Ｅの発症後から３０日以内に採取されたことは注意すべきことである。他の２名の患者の血清は、発症後６０日以上で採取された。ドナーからのそれら及び他の血清は、、推測上肝炎Ｅの過去の出来事と無関係な無症候性のＨＥＶ伝染に依存した。別の３５名の患者の血清は、ＩｇＧ抗体にポジティブで、ＩｇＭ抗体にポジティブでない過去のＨＥＶ感染と一致する、血清学的なプロファイルを表現した（表５、プロファイル６乃至８）。かかる血清の２７の血清は、ｐＥ２特異的ＩｇＧと活性があり（表５、プロファイル６）、及び７つの血清はＧＥ３特異的ＩｇＧに活性があり（表５、プロファイル７）が、しかし何れの血清もＩｇＭ抗体には活性がなかった（表５、プロファイル６乃至８）。一つのプロファイルは、上記の何れかの抗体とも活性がない血清を示している（表５、プロファイル９）。しかしながら、かかる血清学的プロファイルの発生は肝炎Ｅの発症時間とは関係していない。現在の感染プロファイルを示している殆どの検体は、肝炎Ｅの発症から２７日以内に採取され（平均は１３日）、他の検体は括弧内に表示された日にちにおいて採取された。過去の感染のプロファイルは、疾病の発症とは関係しておらず、かかる検体は、非活性血清のように疾病の発症後の同じ率においてまとめられた（平均は５０及び４０日）。
【００９５】
【表５】
0004641695.tif 000006
低い結合活性ＩｇＧ抗ｐＥ２抗体の決定のためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ方法の更なる適用は、ｐＥ２ダイマーを用いて血清での低い結合活性ＩｇＧ抗体の決定のためである。これは、４Ｍ尿素の存在及び不在での血清検体の滴定により達成される。低い結合活性ＩｇＧ抗体の存在は、尿素処理が明らかな抗体レベルを４倍以上著しく縮減する場合に示唆される。表６は、低い結合活性抗体が、肝炎Ｅの発症後２週間以内に採取した患者の血清で占有的に検出され、次いでかかる抗体は徐々に結合活性なＩｇＧ抗体と取り替えられるたことを示している。このようにして、低い結合活性ＩｇＧ抗体の一時的な発生は、急性の肝炎Ｅの診断に潜在的に役立つようにする。
【００９６】
【表６】
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ＶＩＩ  ＨＥＶＲＮＡを検出するための免疫捕獲ＲＴ−ＰＣＲの確立
ヒト血清の上記に記載の反応性は、もしｐＥ２ダイマーがＨＥＶカプシドの模倣のある構造的な特質である場合に説明される。この可能性をテストするために、ｐＥ２に対して起こされた抗血清がＨＥＶ粒子の免疫捕獲に影響することを決定する実験が実行された。
【００９７】
ＲＴ−ＰＣＲプライマーの特異性
この研究において、二つのプライマーである、Ａ５Ｒ／Ａ３Ｆ及びＢ５Ｒ／Ｂ３Ｆ（表９）がＲＴ−ＰＣＲのために選択された。かかるプライマーの特異性は、ＨＥＶ，ＨＡＶ，腸内ウィルス及びカリシウィルスを分離して含んでいる検体で直接ＲＴ−ＰＣＲを行なって評価された。図１６は、ＨＥＶを含んでいる検体のみがＲＴ−ＰＣＲ増幅に続く２０３ｂｐＨＥＶ配列の予期される大きさの特異的なバンドを表した。
【００９８】
ＨＥＶのｐＥ２ダイマーの模倣な構造的特質
ｐＥ２だいまーとＨＥＶウィルス粒子間の抗原的関係は、ｐＥ２ペプチドに対して起こされた抗血清でコーティングされたポリスチレンパドルを用いた免疫捕獲実験によって研究された。使用された抗血清は、ｐＥ２ダイマーに対して優先的に活性がある、１００μｇの精製されたｐＥ２の４回の投与で免疫処理されたサルから得られた。抗血清は、ｐＥ２モノマーに対して弱い活性で、他のＨＥＶ抗原に対しては活性がない。抗血清によってコーティングされたパドルは、ＨＥＶ粒子の特異的な免疫捕獲に影響することが判明し、拘束されたウイルスは続いて、下記に記載の“原料及び方法”の副題の章で記載されているような逆転写ポリメラーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。パドルは、カルシウィルス（レーン４及びレーン５）及び腸内ウィルス（レーン６）との反応を同様に許容するが、しかし、ＨＡＶの捕獲の影響には失敗した（図１６）。
【００９９】
かかる結果は、ｐＥ２ダイマーが、ダイマーに対して優先的に活性である抗血清を可能にし、したがってＨＥＶ粒子の免疫捕獲に十分に影響し特異的である、ＨＥＶ粒子のある構造的特質を模倣しているという主張をさらに支持している。離床、食品及び環境的なサンプルでのＨＥＶの検出のために免疫捕獲アッセイを開発するためのかかる発見の適用が、下記に議論されている。
【０１００】
免疫捕獲ＲＴ−ＰＣＲ
ウサギのｐＥ２に対して起こされた抗血清は、免疫捕獲ＨＥＶに対する可能性をテストされた。抗血清及び事前に免疫処理された血清で分離してコーティングされたポリスチレンのパドルは、ウィルスの捕獲のために使用された。捕獲された粒子にてＲＴ−ＰＣＲが実行された。抗血清が、保存しているウィルスの５５までの希釈のＨＥＶ粒子を捕獲する（図１７Ａ）一方で、事前に免疫処理された血清は、希釈していない保存している溶液でのウィルスの捕獲において失敗した（図１７Ｂ）。
【０１０１】
ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲに対する市販のウィルスＲＮＡ検出キットの比較
上記に記載の免疫捕獲ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲ）方法は、ＨＥＶ特異的タンパク質ｐＥ２の発現から派生した抗血清の安定した供給源の可能性のため、公衆衛生及び環境モニタリングにおけるＨＥＶの検出のために日常的に使用できる。
【０１０２】
下記に記載の方法において、ＨＥＶ粒子の免疫捕獲は、分子生物学者にとって親しまれて使用されている市販のキット（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ，  ＱＩＡＧＥＮ）によるＨＥＶのＲＮＡの抽出によって続かれる。市販のキットを用いたＲＮＡ抽出の効率が干渉なしで１００％だと仮定すると、市販のキットがサンプルの体積よりも３２回分提供できるので、理論的には、ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲは、直接のＲＴ−ＰＣＲよりも感度が３２倍高くなるであろう。この研究において、植え付けられたウィルスは、連続した５倍希釈されるので、予期される結果は、ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲはＲＴ−ＰＣＲよりも２５倍感度が高くなる。
【０１０３】
かかる研究において、ＨＥＶが植え付けられた検体の３つのタイプは、淡水、人間の糞検体の上澄み液、及び均質化された甲殻類検体の上澄み液を含んで調製された。水のサンプル、甲殻類（例えば、カキ）のサンプル、及び糞便のサンプルは、等量のＨＥＶでスパイク（ｓｐｉｋｅｄ）された。スパイクされたサンプルは、連続的に５倍希釈され、希釈されたサンプルの分割は、市販（従来）の方法及び免疫捕獲方法によってＨＥＶの存在をテストされた。かかる検体からのＨＥＶ捕獲の比較的な効率は試験されて、結果は表７に提供された。かかる結果によると、免疫捕獲方法は、ＨＥＶの検出において従来のＲＴ−ＰＣＲ方法よりも感度が水のサンプルにおいて２５倍、糞のサンプルにおいて１２５倍、甲殻類のサンプルにおいて１２５倍高いことが実証している。したがって、結果は、ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲは、市販のウィルスＲＮＡキットよりも感度が少なくとも２５倍高いことが示された。水のサンプルにおいて観察された増大した感度の理由は、従来のＲＴ−ＰＣＲ方法によってテストされたサンプル体積よりも３２倍多い体積によって免疫捕獲方法でテストしたためである。さらに、結果は、続くｃＤＮＡ合成のためのＲＮＡの抽出を阻害する、糞及び甲殻類の上澄み液において未知の要因が存在することを示唆している。したがって、水のサンプルが検出を阻害する物質を含んでいないと思われるため、この理由が、水のサンプルが甲殻類や糞のサンプルの上澄み液よりも著しく高い結果となっている。しかしながら、糞及び甲殻類のサンプルで観察された干渉物は、従来のＲＴ−ＰＣＲにＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲを用いることで最小限に縮減される。従来のＲＴ−ＰＣＲに２５倍高いＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲの感度が上昇した方法は、免疫捕獲方法による阻害物質の除去に起因する。
【０１０４】
【表７】
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結果として、市販のＲＴ−ＰＣＲ方法及びＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲ方法の両者は、水のサンプルよりも糞及び甲殻類のサンプルにおいてより低い感度を有する。しかしながら、この減少は、ウィルスの衰退を加速することが可能な糞及び甲殻類のサンプルにおける数多の未知の要因によって引き起こされる。一方で、ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲの結果は、直接のＲＴ−ＰＣＲを用いるよりも１２５倍より感度が高く、これは、免疫捕獲方法が、糞及び甲殻類サンプル内の未知のものからの干渉を克服したことを意味し、Ｉｃ−ＲＴ−ＰＣＲが臨床及び環境的モニターにおいて実用することを例証する。
【０１０５】
ＶＩＩ  ＨＥＶタンパク質でのｐＥ２の役割
非Ａ，Ｂ及びＣ肝炎患者の研究の過去の結果は、組換えペプチドｐＥ２のダイマー形態は、ペプチドのモノマー形態の二量化によって産出される、整合の抗原決定基群の暴露によって自然のＨＥＶ感染において重要な役割をしていると推測されることが示唆された。
【０１０６】
非Ａ乃至Ｃ急性肝炎患者の研究ですでに示されているように、ｐＥ２のダイマー形態は、自然のＨＥＶ感染においてより顕著な役割であることが仮定として分かっている。一般的に、ｐＥ２特異的ＩｇＭ抗体は、急性ＨＥＶ感染の期間に合成される。対応するＩｇＧ抗体がまた合成され、結合活性を増加させることを伴う、延長された期間の間固執した。さらに、それらは、以前にウイルスに感染された個体からの回復期の血清及び血清の中にある最も普及しているＨＥＶ抗体だった。それらの結果は、ｐＥ２がＨＥＶに対する保護を与えることを示唆し、さらにマカクサルの実験感染での保護研究によって支持される。さらに、結果は、保護的影響は、主に、線形エピトープの表現に反対するようにｐＥ２ペプチドの二量化によって表現される整合の抗原決定基群に起因し、ワクチン開発のための合理的な基礎を提供することが示唆される。
【０１０７】
マカクサルのモデルを用いる実験感染での保護研究は、ｐＥ２ペプチドの精製された調製を用いる免疫処理がＨＥＶ抗原投与に対する動物の保護を与え、したがって主要なワクチンの候補となることを示している。伝染性の服用量は、ゲノムの服用量に接近することが分かった。また、実験的な伝染に関連した病理学は、人間における自然感染に関連した病理学に匹敵した（Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４ｂ）。細菌的に表現されたペプチドがＨＥＶに対する保護を与えるかどうかを明らかに示すことを得るために、本試験で使用された動物は、ＨＥＶウィルスの相同的な菌株と同等な少なくとも１０５のゲノムを含む比較的大量の投与で抗原投与された。糞の中のウイルス排出物、及びコントロール動物で見られたビラエミラ（ｖｉｒａｅｍｉａ）は、免疫になった動物の中で本質的に廃棄された。それらの動物のうちの何れも、抗原投与以前にすでに存在する抗ｐＥ２抗体から分離する追加的なＨＥＶ抗体を発展しなかった。事前の抗原投与の血清中に存在する抗ｐＥ２抗体がｐＥ２のモノマー形態よりもｐＥ２のダイマー形態を特異的に認識することにより優勢であるため、保護的影響が、ウィルスペプチドの二量化から起こされる整合抗原決定基群に大いに起因すると結論された。この確信と一致して、ｐＥ２ペプチドの研究及び特徴付けは、おそらくＨＥＶ（それはＨＥＶカプシドを形成するために相互に作用する）の主な構造タンパク質中の領域を包含することを示唆している。したがって、ウィルスカプシドは、ｐＥ２二量化により産出されるウィルスカプシドと比較して、同一若しくは同様な整合抗原決定基群から産出される。結果として、ｐＥ２ダイマーに特異的な抗体は、自然のＨＥＶ感染の反応において優勢な抗体である。
【０１０８】
２１０のアミノ酸のＨＥＶペプチドのｐＥ２に特異的なヌクレオチド配列は、報告されたヌクレオチド配列と比較された、プロトタイプのＨＥＶ菌株の対応する領域のアミノ酸配列を予測する。２１０のアミノ酸のペプチドは、ＨＥＶゲノム（表１）のＯＲＦ２の保存性の高い領域でエンコードされている。免疫処理のために使用されたウィルスペプチドの純度は、ＳＤＳＰＡＧＥ（図７Ａ、レーン３）及び上記ペプチドの抗原性、ヒトＨＥＶ活性（図７Ｃ、レーン３）を用いた免疫ブロッティングによって評価された。タンパク質の９０％以上を構成するＰＥ２は、免疫処理のために使用されて精製された調製に存在する。ダイマー状の形態は、ＨＥＶ活性ヒト血清（図７Ｃ、レーン３）によって特異的に認識されるが、しかし２３ｋＤのモノマー状の形態（図７Ｃ、レーン４）では認識されない。かかる結果は、ヒトの血清に存在している抗ＨＥＶ抗体は、ウィルスペプチドの二量化から起こされる整合の抗原決定基群に対して主に導かれることを示唆している。
【０１０９】
免疫化
３匹のテストサル（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）が、精製されたｐＥ２ダイマーの１００μｇの調製の投与を４週間ごとに筋肉内投与されて免疫処理された。他の３匹のサル（Ｍ５、Ｍ７、Ｍ８）は、コントロールとして、プラシーボを与えられた。動物は、４回の免疫処理投与後２週間採血され、血清は精製されたｐＥ２、ＧＥ３に対するウェスタンブロッティング及び市販のＥＬＩＳＡテストによってテストされた。続いて、動物は最終の免疫処理投与に続く２週間にＨＥＶの相同性菌株と等価の１０５ゲノムで抗原投与された。
【０１１０】
免疫処理に反応する抗体は、精製されたｐＥ２ペプチドで合成されたＥＬＩＳＡを用いてモニターされた（図１８）。結果は、免疫処理は、すべての３匹の動物（Ｍ１乃至Ｍ３）のウィルスペプチドに対する活発な抗体反応を誘発したことを示している。抗体は、第一免疫処理後の一週で最初に検出され、三回目の投与を受けた後の約一週で最高レベルに到達した。コントロール動物は、検出可能なｐＥ２特異的抗体を示していない。すべての３匹の動物に見られた活発な反応は、ｐＥ２が強い抗原性であることを示している。
【０１１１】
ウィルスの抗原投与の直前に採取されたＨＥＶ特異的血清は、在来（例えば、ｐＥ２ダイマー）と同じサンプル、熱変性されて精製されたｐＥ２（例えば、ｐＥ２モノマー）（図１９Ａ、レーン１乃至４）、精製されたＧＥ３融合タンパク質（図１９Ｂ）に対するウェスタンブロッティング及びＨＥＶ（図１９Ｃ）を検出するための市販のＥＬＩＳＡアッセイによって解析された。後者のアッセイは、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３特異的なタンパク質のカルボキシ末端領域のアミノ酸配列に対応する二つの合成ＨＥＶペプチドの混合物によって生成されたＥＬＩＳＡである。製造者のインストラクションによると、アッセイは二つのＨＥＶペプチドを活用し、一つはｐＥ３（例えば、ＧＥ３）と同様で、もう一つはｐＥ２と重ならないが、隣接して位置している、ＨＥＶの主な構造的タンパク質のカルボキシ末端領域に対応する。
【０１１２】
図１９Ａは、連続的に４倍まで希釈された血清の分割量を用いてウェスタンブロッティングによってｐＥ２ダイマー及びモノマーに対する抗体レベルの決定を示す。Ｍ１からの血清は、４０００倍の希釈（レーン１）と２５６０００倍の希釈（レーン４）間でテストされ、Ｍ２からの血清は、１００倍希釈（レーン１）と６４００倍希釈（レーン４）間でテストされ、Ｍ３からの血清は、２５０倍希釈（レーン１）と１６０００倍希釈（レーン４）間でテストされた。ブロットは、精製されたｐＥ２ペプチドのダイマー状及びモノマー状形態の等価な調製で生成された。何れかの形態に対する抗体のレベルは、ペプチドのそれぞれの形態に対する活性である、血清の最大希釈（希釈の上限）として定義された。結果は、Ｍ１から採取された血清におけるダイマーに対する抗体のレベルは、制限希釈が４０００倍である、モノマーに対する抗体レベルよりも１６倍高い、６４０００倍希釈であることを示している。Ｍ２及びＭ３から採取された血清でのダイマーに対する抗体のレベルは、それぞれ１６００倍希釈及び４０００倍希釈で、同一の血清でのモノマーに対する対応する抗体のレベルよりも、それぞれ１６倍及び４倍以上高い。免疫処理以前にそれらの動物から採取された血清の何れも、１００倍希釈の血清（図１９Ａ、レーン５）において検出可能な活性を示さなかった。
【０１１３】
図１９Ｂは、１００倍希釈において、血清の何れも精製されたＧＥ３に対して活性がないことを示している。同一の血清は、主要なＨＥＶ構造タンパク質のカルボキシ末端に対応する合成ペプチド及びＨＥＶゲノムのＯＲＦ３により特異的なタンパク質で製造された、市販のＥＬＩＳＡによって同一の希釈率でテストされた。図１９Ｃは、血清の何れもかかるＨＥＶペプチドに対して検出可能な抗体を含んでいないことを示している。コントロール動物からの血清はまた、上記に記載の方法によって同様にテストされ、血清の何れも、同様の上記の何れの方法による検出可能なＨＥＶ抗体を示さなかった。
【０１１４】
したがって、それらの結果は、ｐＥ２ペプチドは高い抗原性を有し、例えば、マウス、ラット、羊若しくはウサギのような他の哺乳類のホストにおける免疫反応を活性化することができるように、サルにおける活発な抗体反応の誘発が可能であることを示している。免疫処理に反応して生成された抗体は、ｐＥ２ダイマーに対して優先的に活性である。上限希釈によって決定されている、それらの抗体のレベルは、モノマーに対する抗体の対応するレベルよりも４乃至１６倍高い。これは、ｐＥ２がモノマー形態よりも高いレベルの抗体生成を引き起こすために、ｐＥ２ダイマーが優性な抗原であることを示している。さらに、精製されたｐＥ２を用いる免疫処理は、他の市販の可能な方法による検出可能な他のＨＥＶ抗体の生成を誘発しない。したがって、精製されたｐＥ２に対して起こされたこのような抗血清は、ｐＥ２に対して特異的であり、より詳細には、ペプチドのダイマー形態に対して特異的であることが、これらの結果から結論とされる。さらに、モノマーにおける上限希釈を越えて希釈された抗血清は、モノマーに対してではなく、ダイマーに対してのみ活性を与えられた。免疫学の通常の実行と一致して、ここに記述のように適切な希釈によるダイマーにおいて“単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）”を与えられた抗血清は、抗血清に含まれているモノマー及び線形のエピトープからのダイマーによって表現されたダイマー、及び整合の抗原決定基群を識別するために使用することができる。
【０１１５】
ＨＥＶ抗原投与
３匹のテスト動物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）及び３匹のコントロール動物（Ｍ５、Ｍ７、Ｍ８）が、ＨＥＶの相同な菌株の腹膜内注射による免疫処理に続き２週間抗原投与された。抗原投与するウィルスは、１９８６年に中華人民共和国での発生（表１、菌株Ｄ１１０９２）から元来抽出されて、ウィルスの注入量は、１回の投与が１０５ＨＥＶゲノム等価であるようにＰＣＲによって測定された（図２０）。注入された抗原投与するウィルスの霊長類の感染投与は、決定されなかった。他の調査による最近の研究は、ＨＥＶの霊長類の感染性滴定は、ゲノムの滴定と同一の度合いであることが示された。
【０１１６】
実験的な感染が続き、動物の肝炎Ｅウィルスの発達を毎日観察された。ウィルスの排出物が、感染の前と後の２日置きに採取された糞のサンプルにてモニターされた。末梢血サンプルは、血漿及び末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）でのウィルス負荷の決定をするために、１週間に２回採取された。血清の検体は、ＡＬＴレベルの決定をするために採取された。動物の両グループは、正常なＡＬＴレベルを有し、肝炎Ｅの兆候の発展は観察されなかった。これは、ウィルスが霊長類での過去の系によって弱毒化されたものと推測される（Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。それにもかかわらず、表８は、一つのコントロールサンプルのＭ５が、感染後５日目と１７日目間から採取されたすべての糞のサンプルからウィルスの排出物を確認したことを示している。ウィルスの排泄物は、他のコントロール動物のＭ７及びＭ８にて７日目から１７日目までの１０日間持続した。ＨＥＶゲノムはまた、感染後の９日目のＭ７及び１３日目のＭ８から採取したＰＢＭＣ検体にて検出された。ＨＥＶゲノムは、それらの動物から採取された何れの血漿サンプルからも検出されなかった。ｐＥ２ペプチドで免疫処理された二つのテスト動物のＭ１及びＭ２でのウィルスの排出物は完全に除去され、それは３番目のテスト動物のＭ３での１日のウィルス排出物を縮減し、ウィルスのゲノムは、それらの動物から採取された何れの血漿若しくはＰＢＬサンプルでは検出されなかった。
【０１１７】
【表８】
0004641695.tif 000009
ウィルス抗原投与後のＨＥＶセロコンバージョン（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
ウィルス抗原投与前及び後の４週間までに採取された血清サンプルに存在するＨＥＶ抗体のスペクトルは、図１９に記載の実験的な方法及び状況にしたがって解析された。図２１は、ウィルス抗原投与の前にすべてのコントロール動物（Ｍ５、Ｍ７、Ｍ８）から採取された血清が、初期のすべての３つのＨＥＶ抗体アッセイによってネガティブが与えられた。ＨＥＶセロコンバージョンは、一つのコントロール動物のＭ５において、感染に続いて７日で発生した。これは、この日に採取された血清のｐＥ２ホモダイマー特異的抗体の検出及びすべての続く出来事によって立証された（図２１）。すべての血清サンプルはまた、市販のＥＬＩＳＡテストによるＨＥＶ抗体のための可能なテスト結果を与え、７日目及び１４日目に採取された一連のサンプルは、同様に精製されたＧＥ３に対して活性であった。感染に対する抗体反応の幅広い特異性のスペクトルは、初期に記載したｐＥ２ペプチドでの免疫処理に対する抗体反応の制限された特異的なスペクトルとは対照的である（図２１）。感染後の１４日目及び２１日目の別のコントロール動物Ｍ７から採取した血清検体は、ｐＥ２ダイマーに対して若干活性で、市販のアッセイによってポジティブな結果が得られ、検体の何れもＯＲＦ３特異的ペプチドＧＥ３に対して活性ではない。残りのコントロール動物のＭ８は、感染に対する検出可能な抗体反応を上昇しなかった。対照的に、ｐＥ２抗体を除外すると、免疫処理された動物は、感染後に他の抗体を得られなかった（図２１）。
【０１１８】
免疫処理された動物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）から採取された血清は、ウィルス抗原投与以前の日にちにおいてｐＥ２ダイマーに対してすでに活性であり、抗体は、ウィルス兆銭後の７、１４及び２８日後のそれらの動物から採取された続くサンプルに持続していた。しかしながら、コントロール動物とは対照的に、免疫処理された動物の何れもがウィルス抗原投与後に追加的なＨＥＶ抗体を得られなかった。
【０１１９】
考察
過去の研究では、アカゲザルがＨＥＶにおける適切な動物モデルであった。伝染性の投与量は、ゲノムの投与量にほぼ同等なことが分かった（Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４ｂ）。また、実験の伝染に関連した病理学は、人間の自然感染に関連した病理学に匹敵する（Ｔｓａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３ｂ）。細菌的に発現されたペプチドがＨＥＶに対する保護を供給するかどうかの明らかな示唆を得るために、当研究において使用された動物は、ＨＥＶウィルスの相同的な菌株と等価の少なくとも１０５のゲノムを含んでいる比較的大きな投与量で抗原投与された。我々は、すべての三つのコントロール動物によって少なくとも１０日間排泄物のサンプル中の延長されたウイルス排出物に伝染が起因していることを示した。また、２匹の動物における一時的なビラエミアは、ＰＢＭＣ検体でのウイルス・ゲノムの検出によって証拠づけた。さらに、感染は、２匹の動物でのＨＥＶセロコンバージョンによって伴われた。抗原投与するウィルスは霊長類における過去の感染系によって弱毒化されているためと仮定されるが、しかしながら、すべてのコントロール動物は通常のＡＬＴレベルで健康を維持している。
【０１２０】
精製されたｐＥ２での免疫処理は、モノマー及びダイマー形態の両者におけるペプチドに対する活発な抗体反応を誘発することが分かった。ダイマーの活性な抗対のレベルは、モノマーに特異的な抗体の対応するレベルよりも実質的に高い。それらの抗体とは関係なく、血清は他のＨＥＶ活性を表現しない。ｐＥ２活性抗体は、免疫処理された動物での実験的な感染を防ぐために明白に提供された。排泄物でのウィルスの排出物は、二つの免疫処理された動物で廃棄され、第三の動物では、コントロール動物では１日で観察された、排出物の持続期間は１０日以上から縮減されたことが示された。免疫処理された動物の何れもＰＢＭＣ若しくは血漿検体にて検出可能なウィルス負荷が隠されて、ｐＥ２特異的抗体とは関係なく、それらの動物の何れもウィルス抗原投与後に追加的なＨＥＶ抗体を得られなかった。
【０１２１】
組換えて発現されたｐＥ２ペプチドがＨＥＶの相同的な菌株を伴う霊長類の実験的な感染を防ぎ、その防御がｐＥ２ペプチドのダイマー形態に対する抗体に大いに起因することが結果から示された。ｐＥ２は、メキシコ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）及び米国（Ｓｃｈｌａｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）から最も遺伝的に分岐した分離株を含む異なるＨＥＶ分離株において保存性が高いため、ｐＥ２ペプチドがＨＥＶの他の菌株による感染に対して同様に防御するであろう。
【０１２２】
次の実施例は、創造性のある概念の実例の目的のために供給され、追加された請求項によって確定されるような発明の範囲を限定するようには意図されない。
【０１２３】
実施例
ウィルス菌株−ＤＤＢＪ  承認番号  Ｎｏ．Ｄ１１０９２の中国ＨＥＶ菌株は、Ｈ．Ｚｈｕａｎｇ教授、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｐ．Ｒ．  Ｃｈｉｎａ  （Ａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）からの寛大な提供による。Ｚｈｕａｎｇ（Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）により記載された方法にしたがって実験的に感染されたマカクサルの胆汁が採取され、糞検体が肝炎Ｅ患者から採取された。
【０１２４】
血清−ここに記載されて使用された９６の血清は、現在若しくは過去において非Ａ、Ｂ、及びＣ急性肝炎の香港のプリンスマーガレット病院に登録されている患者から採取された。検体は、入院中若しくは病院から解放された後の異なる期間において、患者から集められた。
【０１２５】
実施例１−ＨＥＶカプシド遺伝子のクローニング
ＨＥＶ  ＲＮＡの抽出
ウィルスのＲＮＡは、製造者の手引書に従い、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＧｂｍＨ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実験的にＨＥＶ感染したマカクサル（Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）の胆汁から抽出された。精製されたＲＮＡは、２倍量のイソプロパノール（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）及び１／１０量の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ６．４）（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）で混合され、１時間マイナス２０℃で放置された。その後、混合物は１５０００ｐｒｍで１５分間遠心分離された。ペレットは、７０％エタノール（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）で一度洗浄され、次いで逆転写バッファーにて再懸濁された。
【０１２６】
標的配列のＲＴ−ＰＣＲ
逆転写において、ＲＮＡのペレットは２０μｌのＲＴマスターミックス（４μｌの５ｘＲＴバッファー（ベーリンガーマンハイム）；１．６μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ；０．２μｌの鳥類の骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）（ベーリンガーマンハイム）；０．６２５μｌのＲＮＡｓｉｎ（ベーリンガーマンハイム）；１μｌのリバースプライマーＥ５Ｒ又はＥＲ３（１５０μｇ／μｌ）；１２．６μｌのＲＮＡｓｅフリーの水）に添加され、４２℃で１時間インキュベートされた。
【０１２７】
使用されたプライマーは、表９にリスト化してある。Ｅ５Ｒ及びＥＲ３は、ウィルスのｃＤＮＡフラグメントを構成するために設計された。ＯＲＦ２及びＯＲＦ３の３´末端領域に対応するｃＤＮＡ配列が、それぞれのプライマーのペアＯＲＦ２Ｆ／ＯＲＦ２Ｒｂ及びＯＲＦ３Ｆ／ＯＲＦ３Ｒを用いて増幅された。上記のプライマーは、増幅されたｃＤＮＡフラグメントのクローニングを容易にするために、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を含むように修正された。すべてのプライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡによって合成された。
【０１２８】
６９５７の位置に単一の塩基対の欠損を含有している６３２６乃至７１３６位置までにわたっている、オリジナルのｃＤＮＡは、ＯＲＦ２Ｆ／ＯＲＦ２Ｒａのプライマーのペアを用いてＯＲＦ２領域からクローニングされた。しかしながら、新規なＥ２ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、ＯＲＦ２Ｆの同一の上流のプライマーを用い、同じ領域からクローニングされ、新規な下流のプライマーであるＯＲＦ２Ｒｂは、配列位置６９３２乃至６９５６に位置してクローニングされた。新規なクローニングされた配列は、ｐＥ２ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と同一な配列をエンコードしたが、新しい停止コドンの下流に位置する配列だけが除去された。
【０１２９】
【表９】
0004641695.tif 000010
標的配列ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、５μｌのｃＤＮＡを４５μｌのＰＣＲマスターミックス（５μｌの１０ｘＴａｑバッファー（ベーリンガーマンハイム）；４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物；１．０μｌの各プライマー（１５０ｎｇ／μｌ）；１μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）（ベーリンガーマンハイム））及び３３μｌの超純水に添加することによって実行された。ＰＣＲの混合物は、５０μｌのミネラルオイルによって覆われた。温度サイクルの条件は、変性が９４℃で４０秒、アニーリングが５７℃で４０秒、伸長が７２℃で１分間である。結果となるＰＣＲ生成物は、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３のそれぞれから設計されたＥ２及びＥ３である。
【０１３０】
ｐＧＥＸプラスミドへのクローニング
ＰＣＲ産物はフェノール−クロロフォルムで抽出され、次いでエタノールで沈澱された。ＰＣＲ産物Ｅ２とＥ３及びベクターｐＧＥＸ２０は、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（ベーリンガーマンハイム）を用いて切断された。ベクターｐＧＥＸ２０は、香港大学の微生物学部のＤｒ．Ｃａｏ  Ｌｉａｎｇからの提供である。ベクターｐＧＥＸ２０は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ及びＣｌａＩの制限部位の認識配列を含有する複数のクローニング部位５´―ＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＧ―３´を伴うｐＧＥＸ発現ベクター（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）の派生物である。切断されたフラグメントは、アガロースゲルにて分離され、電気分解したゲルからバンドを切り出して回収し、次いでエタノールによって沈澱された。次ぎに、Ｅ２及びＥ３は、Ｔ４ライゲース（ベーリンガーマンハイム）を用いてｐＧＥＸ２０にライゲートされた。組換えプラスミドｐＧＥＸ２０−Ｅ２及びｐＧＥＸ２０−Ｅ３は、ｇｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ（バイオ−ラッド）によってＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに電気的な形質転換によって形質転換され、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を伴うＬＢ寒天平板（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に植え付けられた。形質転換した２０のコロニーをプラスミド調製のために採取した。ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの切断が続いて行なわれ、予期される挿入の大きさの組み替え体が選択された（図６）。本研究にて使用されたすべてのプラスミドは、ＱＩＡｇｅｎ  ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ，  Ｈｉｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製された。
【０１３１】
シークエンシング
ＤＮＡシークエンスは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用いて実行された。結果は、８１１ｂｐのＥ２配列が６３２６乃至７１３６部位に位置し、おそらくＰＣＲ増幅のエラーによると仮定される、６９５７位置における単一の塩基対の欠損が明らかになって示された。結果となるフレームシフトは、当初に期待したような２６７のアミノ酸の代わりに、２３ｋＤの分子量を備えた２１３のアミノ酸の期待したより小さなペプチドを与える位置６９６８で新しい停止コドンで翻訳を時期尚早に終了を引き起こすことを予期された。Ｅ２の位置及び相対するフラグメントは、図１に示されている。
【０１３２】
実施例２−ＨＥＶペプチドの生成及び精製
ＧＳＴ融合タンパク質の発現
組み合わせプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１に形質転換された。単一のコロニーが採取されて、２ｘＹＡＴ培地（トリプトン  １６ｇ／ｌ；イースト抽出物  １０ｇ／ｌ；塩化ナトリウム  ５ｇ／ｌ；アンピシリン  １００μｇ／ｌ）で培養された。オーバーナイトの培養（４ｍｌ）は４００ｍｌの２ｘＹＡＴ培地に植え付けられ、２８℃にてＯＤ６００が０．５以上になるまでインキュベートされた。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（ファルマシアバイオテク、米国）（４００μｌの１００ｍＭ溶液）が添加され、培養は５乃至６時間かけて成長された。細胞は、ベックマンＪ２−ＭＣのローターＪＡ−１４にて７０００ｒｐｍで１０分間遠心回転されてペレットにされた。
【０１３３】
精製
ペレットは、リン酸食塩水バッファー（ＰＢＳ：０．８％塩酸；０．０２％塩化カリウム；０．１４４％Ｎａ２ＨＰＯ４；０．０２４％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）で一度洗浄され、２０ｍｌのＰＢＳで再懸濁され、ＳＯＮＩＰＲＥＰ  １５０  （ＭＳＥ）（３０秒間可動；３０秒間停止；３５回；１８乃至２２パワー）にて超音波処理された。超音波処理後、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（シグマ、米国）が、１％の終濃度になるように添加され、混合物は３０分間穏やかに攪拌された。細菌の溶菌液は４℃で遠心分離されて、上澄み液が集められた。融合タンパク質のバッチ精製が、グルタチオンセファロース−４Ｂ（ファルマシアバイオテク、米国）を用いた“ＧＳＴ融合タンパク質システムマニュアル”にしたがって実行された。結合融合タンパク質は、溶出バッファー（５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ８．０の１０ｍＭの還元されたグルタチオン）にて２回溶出され、それぞれのＯＲＦ２及びＯＲＦ３のｃＤＮＡフラグメントに対応するＧＥ２及びＧＥ３として回収される。
【０１３４】
バルクマトリックスに結合の融合タンパク質のトロンビン切断
トロンビン（ファルマシアバイオテク、米国）（５μｌの１Ｕ／μｌ溶液）及び９５μｌのＰＢＳが１００μｌのベッド体積のＧＥ２が結合しているグルタチオンセファロース−４Ｂに添加され、２２℃で１６時間インキュベートされた。上澄み液が遠心分離によって集められ、マトリックスの第二洗浄の上澄み液を伴ってプールされた。このトロンビンが切断されたタンパク質は、計画的なｐＥ２であった。
【０１３５】
実施例３−ＨＥＶペプチドの識別
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の解析
標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）にしたがって、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルがセットされた。ペプチドの検体（４μｇ）がゲルにロードされて、Ｍｉｎｉｇｅｌ  Ｔｗｉｎ  Ｇ４２（バイオメトラ、ドイツ国）を用いて１００ボルトで３時間電気泳動された。ゲルは、４５ｍｌメタノール、４５ｍｌ水及び１０ｍｌ氷酢酸の混合物のクマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色された。
【０１３６】
ウェスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲル内のタンパク質は、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＩ  Ｃｅｌｌ（バイオラッド）を用いて１００ボルトで１時間の条件で０．４５μｍのニトロセルロースメンブラン（バイオラッド、米国）に転写された。ブロットされたものを５％のスキムミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ，  Ｎｅｓｔｌｅ）で１ｘＰＢＳで４℃にてオーバーナイト浸透した後、メンブランは、肝炎Ｅ患者から集められてプールされた血清（５００倍希釈）若しくはギニアピッグから採取された抗ＧＳＴ血清（１０００倍希釈）と室温で１．５時間反応された。ＰＢＳでの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で毎回５分間の洗浄を３回繰り返し洗浄した後、メンブランはプロテイン−Ａ（バイオラッド、米国）が結合しているホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と室温にてさらに１．５時間反応させた。再度３回洗浄した後、ポジティブバンドが、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  ＺＹＭＥＤ，  ＵＳＡ）によってメンブランを室温にて５乃至１０分間のインキュベーションによって現像される。発色反応は、メンブランを水に浸けることによって停止される。血清及び上記に記載の結合物は、ブロッキングバッファー（１ｘＰＢＳ内の５％のスキムミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、ネスレ））にて希釈された。
【０１３７】
実施例４−抗ＨＥＶＩｇＧ及びＩｇＭを検出するＥＬＩＳＡの確立
血清の供給源
香港のプリンセスマーガレット病院で集められた非Ａ、Ｂ及びＣ肝炎の９６名の患者からの血清が研究された。それらの血清のうち、９６のうちの７４サンプルは、市販のＨＥＶキット（Ｇｅｎｅｌａｂｓ，  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によってさらにテストされた。９０名の健康なドナーからの血清は、クィーンメリー病院にて採取された。
【０１３８】
ＨＥＶペプチド抗原を用いるＥＬＩＳＡ
何れかのｐＥ２若しくはｐＥ３に特異的なアッセイが、０．０６３μｇ／ｍｌの精製されたｐＥ２ペプチド（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５の６．３ｎｇ／１００μｌ）若しくは０．２３μｇ／ｍｌのＧＥ３（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５の２３ｎｇ／１００μｌ）を伴うポリスチレンのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク王国）を各ウェルへのコーティングによって合成された。使用されるペプチドの濃度は、適切になるように事前に決定される。４℃でのオーバーナイトのインキューベーション後に、ウェルは３５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ内の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））で洗浄され、次いで２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ、米国）をＰＢＳで２４時間４℃にでブロックされる。プレートは、洗浄バッファーで再度２回洗浄された。ＨＥＶ抗体のレベルは、０．１ｍｌの血清検体を１００希釈で同一に複製されたウェルに添加することによって決定された（希釈液：１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中の０．２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）。３７℃で３０分間のインキューベーション後、ウェルはＰＢＳ内の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄された。ＩｇＭ抗体は、２５０００倍に希釈されたホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）が結合したヒト抗体ＩｇＭ特異的な抗血清（ＢＩＯＳＯＵＣ）及び１６０００倍に希釈されたＨＲＰが結合されたプロテインＡを伴うＩｇＧ抗体（バイオラッド）（希釈液：１％ＢＳＡ、０．２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ、ＰＢＳ中の１０％スクロース）によって決定された。３７℃で３０分間のインキューベーション後、ウェルは５回洗浄されて、１００μｌのＴＭＢ基質（３、３´、５、５´−テトラメチルベンジジン）（Ｄｉｅｓｓｅ，イタリア）を添加された。３７℃で１５分間のインキュベーション後、０．３ＭＨ２ＳＯ４によって反応は停止された。プレートは、Ａｎｔｈｏｓ２００１マイクロプレートリーダー（ＡＮＴＨＯＳ  ＬＡＢ）によって４５０ｎｍで読まれた。分離したテストの実行で獲得された結果を比較するために、各実行されたテスト血清から獲得されたＯＤ値は、同時に得られた標準血清に対して標準化される。抗ｐＥ２ＩｇＧ遮断値は、ウェスタンブロッティングにより事前にテストされた非活性血清の平均ＯＤ値を上回って３ＳＤにセットされた。抗ｐＥ２ＩｇＧ遮断値は、健康な血液のドナーの血清の平均ＯＤ値を上回って３ＳＤにセットされた。
【０１３９】
ｐＥ２ＩｇＧ結合活性テスト
血清は連続的に希釈され、複製されたウェルのｐＥ２でコーティングされたマイクロプレートによって反応された。３７℃で３０分間のインキューベーション後、ウェルは洗浄され、次いでＰＢＳ（コントロール）若しくは４Ｍ尿素を含有するＰＢＳにて室温で１０分間処理された。プレートが洗浄され、次いで先のようにＨＰＲ−プロテインＡで反応された。
【０１４０】
実施例５−ウェスタンブロッティングによるＩｇＧ抗ｐＥ２の検出
血清の供給源
実施例４で使用されたすべての血清を、ウェスタンブロッティング技術を用いて再テストされた。
【０１４１】
ウェスタンブロッティング
３４μｇの精製されたｐＥ２が、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの７０ｍｍ幅の単一レーンにロードされ、１００ボルトで３時間電気泳動された。電気泳動後、ペプチドは０．４５μｍの１００％のニトロセルロースメンブラン（バイオラッド）にＭＩＮＩ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＩ  Ｃｅｌｌ（バイオラッド）を用いて１００ボルトで１時間転写された。ブロッキングバッファーを４℃でオーバーナイトで攪拌した後、メンブランは２ｍｍのストリップに切断された。ストリップは、２５０倍に希釈された各血清にそれぞれ１．５時間インキュベートされた。それらは洗浄バッファーで５分間の洗浄され、ついで３００００倍に希釈されたアルカリフォスファターゼが結合されたヤギ抗ヒト抗体（シグマ、米国）で室温で１．５時間インキュベートされた。３回の洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ混合液（Ｇｉｂｉｃｏ  ＢＲＬ、米国）が発色反応のために添加され、反応はストリップを水に浸けることによって停止した。結果は、殆どの抗体が、ｐＥ２のモノマー形状ではなく、ダイマー形状の結合に起因するＥＬＩＳＡによって決定されたことが、確認された。
【０１４２】
実施例６−免疫捕獲ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲ）
特異的なウサギポリクローナル抗体の生成
ＨＥＶに対する抗体の生成のために使用される抗原は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合たんぱく質、ＧＥ２のように開発されたｐＥ２ペプチドである。体重が２．５乃至３．０ｋｇのメスの白うさぎが、１００μｇの抗原によって免疫処理された。第一投与は、完全なフロイントアジュバントと等量を含んでいる。不完全はフロイントアジュバントは、１０乃至１４日のインターバルスケジュールでの続く投与にて使用された。ウサギ抗体の１００００倍に希釈されたＥＬＩＳＡによろ検出可能なレベルまで特異的な抗体が上昇した場合、ウサギは、ＰＢＳ中の１００μｇの抗原を静脈に追加投与された。追加投与後の４日目に、血液は心臓に穴をあけて採取された。特異的な抗体は、ウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡによって評価された。
【０１４３】
糞便の懸濁の調製
１３人の急性肝炎Ｅ患者の糞便が、Ｆｉｒｓｔ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｇｕａｎｇｚｈｏｕにて採取された。３匹の実験的に感染されたサルの糞便は、ＨＥＶを植え付けた後の０乃至３０日にて採取された。
【０１４４】
糞便検体（５ｇ）は、２０ｍｌの１ｘＰＢＳで混合され、４℃で１時間インキュベートされた。混合物は１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離されて、上澄み液は免疫捕獲のために回収された。
【０１４５】
甲殻類の均一化された懸濁液の調製
６４の甲殻類検体は、香港周辺の市場から収集され、１７の検体は、環境保護局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）から収集された。
【０１４６】
甲殻類の肉の２０ｇは、穏やかに混和されて、均一化された物は１００ｍｌの０．２Ｍグリシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）及びＣａｔ−Ｆｌｏｃ（１％ｗ／ｖ）の２ｍｌの保存溶液で混合された。結果となる混合は、攪拌され、４℃で１０分間インキュベートされた。混合液は、ついで５分間１０００ｒｐｍにて遠心分離された。上澄み液は、免疫捕獲のために収集された。
【０１４７】
ＨＥＶ粒子の種付け
ＨＥＶ粒子を含む胆汁は、Ｚｈｕａｎｇ  Ｈｕｉ教授（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって親切にも提供された確認された実験的に感染されたマカクサルから収集された。胆汁は、ＰＢＳで１％のＢＳＡ２００倍に希釈され、これを保存液と呼ぶ。保存溶液は、５０乃至５６まで５倍連続して希釈され、これを反応溶液と呼ぶ。反応溶液の１０μｌの各分注量は、ＩＣ−ＲＴ−ＰＣＲ及び直接的なＲＴ−ＰＣＲの比較のために、ＨＥＶの植付け検体を合成するために、５ｍｌの何れかの水、糞便の上澄み液、若しくは甲殻類の上澄み液と混合された。
【０１４８】
免疫捕獲
５０ｍＭ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で２００倍に希釈された抗血清は、コーティング溶液として使用された。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ｐａｄｄｌｅ（Ｎｕｎｃ、デンマーク王国）は、１ｍｌのコーティング溶液によってチューブ内で３７℃で４時間インキューベーションされた。抗血清は除去され、パドルを３７℃で１時間インキュベートすることによって、ＰＢＳ中の１ｍｌの２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で置きかえられた。次いで、パドルはＰＢＳの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で洗浄され、免疫捕獲のために試験管に移された。甲殻類の上澄み液若しくは２０％の糞便の上澄み液（４．５ｍｌ）が試験管に添加され、試験管は４℃でオーバーナイとで穏やかに攪拌された。次いで、免疫パドルと呼ばれるパドルは、ＰＢＳの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で３回洗浄され、ＨＥＶのＲＮＡの検出のためのＲＮＡ抽出及び入れ子ＲＴ−ＰＣＲのために、マイクロ遠心試験管に移された。
【０１４９】
ウィルスＲＮＡの抽出
ＲＮＡｓｅフリー水（１４０μｌ）及びＡＶＬバッファー（５６０μｌ）が、免疫パドルを含む試験管に添加された。次いで、ウィルスのＲＮＡは、“ＱＩＡｇｅｎ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”の手引きにしたがって抽出された。その後、１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．６）及び１体積量のイソポロパノ−ルが、精製されたＲＮＡに添加された。混合物は攪拌され、マイナス２０℃で１時間放置され、次いで１４０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離された。ペレットは、事前に冷却した７０％エタノールで一度洗浄された。遠心分離後、エタノールは注意深く除去され、特定のｃＤＮＡに逆転写する前に、ペレットは室温で１５分間風乾された。
【０１５０】
逆転写（ＲＴ）及び入れ子ＰＣＲ
ＲＴ及びＰＣＲに使用されたプライマーは、表９にリスト化されている。外側のプライマーのペアは、ＡＲ５及びＡ３Ｒで、内側のプライマーはＢ５Ｆ及びＢ３Ｒである。
【０１５１】
ＲＴ−ＰＣＲ：各ＲＮＡペレットは、２０μｌのマスターミックス（４μｌの５ｘＲＴバッファー（ベーリンガーマンハイム）、１．６μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ，０．２μｌの２５Ｕ／μｌの鳥類の骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）（ベーリンガーマンハイム）、０．６２５μｌの４０Ｕ／μｌのＲＮＡｓｉｎ（ベーリンガーマンハイム）、１μｌの１５０ｎｇ／μｌのリバースプライマー（Ａ３）及び１２．６μｌのＲＮＡｓｅフリーの水）と混合された。４２℃で１時間のインキューベーション後、ｃＤＮＡ（５μｌ）が、４５μｌのＰＣＲマスターミックス（５μｌの１０ｘＴａｑバッファー（ベーリンガーマンハイム）、４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１．０μｌのフォワード及びリバースプライマー（１５０ｎｇ／μｌ）（Ａ３及びＡ５）、１μｌの１Ｕ／μｌ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）及び３３μｌの超純粋水）に添加された。ＰＣＲ混合液は、５０μｌのミネラルオイルによって覆われた。増幅は、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）によって、下記の条件で実行された：９４℃で４０秒間の変性；５７℃で４０秒間のアニーリング；７２℃で１分２０秒間の伸長反応。処理は、７２℃の最終の自動伸長に続き、全体で３５サイクル行なわれた。
【０１５２】
入れ子ＰＣＲ及びアンプリコン検出：２μｌの第一のＰＣＲ産物が、プライマーＢ３及びＢ５のみが含まれていない第一のＰＣＲと同一の状態の４８μｌのＰＣＲマスターミックスに添加された。５μｌのＰＣＲ産物及び５０ｂｐのＤＮＡラダー（ＧｉｂｃｏＧＲＬ）は、２％アガロースゲルにＴＢＥバッファーでロードされ、１００ボルトで３０分間電気泳動された。ゲルは、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで１５分間染色され、次いで、ＵＶ光にて可視化された。
【０１５３】
実施例７−ＨＥＶほごにおけるｐＥ２の役割
動物
野性型サルのアカゲザルマカクは、１ヵ月間隔離されて、ＡＬＴ及びＨＥＶ抗体のテストのために採血された。６０以上のＡＬＴ／ＡＳＴ若しくはＩｇＧ抗ＨＥＶポジティブのサルは、試験から除外された。サルは、３つのグループ、１つのテストグループ、及び１つのコントロールグループに分けられた。各グループは、３匹の動物から構成された。
【０１５４】
免疫処理
テストグループは、１００μｇの精製されたｐＥ２を各々含有する筋肉内投与を４週間にわたって免疫処理された。第一の投与は、等量のフロイントアジュバントを含有する。不完全なフロイントアジュバントは、続く投与に使用された。精子の検体は、ＨＥＶ抗体の決定のために毎週採取された。特異的な抗体が十分なレベルまで誘発される場合、動物はＩ／Ｖ追加免疫が与えられた。動物の両グループは、ＨＥＶの相同性菌株の１０５ゲノムと等価の投与の静脈内注射によって最後に免疫処理されてから、二週間抗原投与された。糞便の検体は２日置きに採取され、末梢血液サンプルは感染後５週間にわたって毎週採血された。血漿及び末梢単球血液細胞（ＰＭＢＣ）は、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃａｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心分離（Ｋｎｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）によって分離された。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、自動解析機（Ｍｏｄｅｌ７１７０、日立製作所、日本国）によって新鮮に回収された血清サンプルで決定された。血漿サンプルは、ＨＥＶ抗体及びＨＥＶゲノムを決定するために保存された。
【０１５５】
ＨＥＶペプチドの抗原投与
動物の両グループは、ＨＥＶの相同性菌株の１０５ゲノムと等価の投与の静脈注射によって最後に免疫処理されてから、二週間抗原投与された。
【０１５６】
霊長類のモニタリング
糞便の検体は、２日置きに採取され、末梢血液サンプルは感染後５週間続けて毎週採取された。血漿及び末梢単球血液細胞（ＰＭＢＣ）は、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃａｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心分離（Ｋｎｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）によって分離された。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、自動解析機（Ｍｏｄｅｌ７１７０、日立製作所、日本国）によって新鮮に回収された血清サンプルで決定された。血漿サンプルは、ＨＥＶ抗体及びＨＥＶゲノムを決定するために保存された。
【０１５７】
ＨＥＶ抗体のレベルは、Ｂｉｊｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって製造された市販のＨＥＶ  ＥＬＩＳＡキットによって決定されまた、精製されたｐＥ２ペプチドでコーティングされたマイクロタイタープレートによって生成されたアッセイによって決定された。精製されたウィルスペプチドに対する抗体は、約０．５μｇのｐＥ２若しくは１００μｇのＧＥ３を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの７０ｍｍ幅スラブにロードする、ウェスタンブロッティングによって決定された。電気泳動後、ウィルスペプチドは電気泳動的にニトロセルロースメンブランに転移してブロットされた。かかるメンブランは、５％のスキムミルクを用いて４℃でオーバーナイト攪拌され、使用するために２ｍｍのストリップに切断された。ホースラディッシュぺルオキシターゼ結合のプロテインＡ（バイオラッド、米国）は、第二抗体として２０００倍希釈で使用された。
【０１５８】
ＰＭＢＣのウィルスＲＮＡ及び血漿は、製造者の手引きにしたがって、ＱＩＡｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉ−ｋｉｔ及びＱＩＡｇｅｎ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ国）を用いて抽出された。精製されたウィルスＲＮＡは、逆転写され、次いで入れ子ＰＣＲで増幅された。逆転写に使用されるプライマーは、Ａ３Ｒである。外側のプライマーのペアはＡ５Ｆ及びＡ３Ｒで、内側のプライマーのペアはＢ５Ｆ及びＢ３Ｒ（表９）である。
【０１５９】
免疫捕獲方法は、糞便検体におけるＨＥＶの検出のために使用される。ポリスチレンオアドル（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ｐａｄｄｌｅ，  Ｎｕｎｃ，  デンマーク王国）は、１ｍｌの１００倍希釈した高度免疫ウサギ抗ｐＥ２血清で３７℃で４時間コーティングされた。コーティングされたパドルは、１ｍｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン）で３７℃、１時間処理することによってブロックされた。ＰＢＳ溶解の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄後に、パドルは４．５ｍｌの２０％の糞便の懸濁を含有する試験管に移された。試験管は、穏やかに４℃でオーバーナイトで攪拌された。次いで、パドルはＰＢＳ溶解の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄され、ＱＩＡｇｅｎ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国）を用いるＲＮＡの抽出のためにきれいな試験管に配置された。精製されたウィルスＲＮＡは、すでに記載のように、逆転写され、増幅された。
【０１６０】
産業適用可能性
肝炎Ｅウィルス（ＨＥＶ）の中国菌株のゲノムからクローンされた免疫活性が高いウィルスペプチドｐＥ２は、ヒトにおけるＨＥＶを防御するためのワクチンの構成及びワクチンの方法の発展と同様に、ＨＥＶの検出のための信頼の置ける診断方法及び診断アッセイの発展において占有的に使用される。
【０１６１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＥＶゲノム内のオープンリーディングフレームＯＲＦ１、ＯＲＦ２、及びＯＲＦ３のゲノム構造及びｐＥ２及びｐＥ３ペプチドのためのコード領域のおよその位置を例証する。
【図２Ａ】  中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  ＮＯ．Ｄ１１０９２）のＯＲＦ２のヌクレオチド配列及び上記配列から派生するＥ２フラグメントを提供し、単一の塩基対欠損がボックスによって示されている。
【図２Ｂ】  中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  ＮＯ．Ｄ１１０９２）のＯＲＦ２のヌクレオチド配列及び上記配列から派生するＥ２フラグメントを提供し、単一の塩基対欠損がボックスによって示されている。
【図２Ｃ】  中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  ＮＯ．Ｄ１１０９２）のＯＲＦ２のヌクレオチド配列及び上記配列から派生するＥ２フラグメントを提供し、単一の塩基対欠損がボックスによって示されている。
【図２Ｄ】  中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  ＮＯ．Ｄ１１０９２）のＯＲＦ２のヌクレオチド配列及び上記配列から派生するＥ２フラグメントを提供し、単一の塩基対欠損がボックスによって示されている。
【図３】  中国ＨＥＶ菌株（ＤＤＢＪ  承認番号  ＮＯ．Ｄ１１０９２）のＯＲＦ３のヌクレオチド配列及び上記配列から派生するＥ３フラグメントを提供する。
【図４】  Ｅ２によってエンコードされているｐＥ２ペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【図５】  Ｅ３によってエンコードされているｐＥ３ペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【図６】  ＨＥＶ遺伝子配列を運ぶ組換えプラスミドの特質を示している。ＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２の８１０ｂｐ配列を含む８２１挿入（レーン２）及びＯＲＦ３の１１４ｂｐ配列を含む１２４挿入（レーン２）が、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによって組換えｐＧＥＸ２０プラスミドを切断することにより獲得された。かかる生成物の分子量は、マーカーと比較された（レーン１）。
【図７】  ＯＲＦ２から発現された精製されたＨＥＶ組換えペプチドの特性を示す。精製されたｐＥ２融合タンパク質、ＧＥ２（レーン１及び２）、ｐＥ２ペプチド（レーン３及び４）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（レーン５）が、ＧＳＴ−特異的抗血清及び（Ｃ）プールされたヒトＨＥＶ活性ヒト血清を使用して（Ａ）ＳＤＳＰＡＧＥ及び（Ｂ）ウェスタンブロッティングによって解析された。加えて、ＧＥ２及びｐＥ２ペプチドのサンプルは、ＳＤＳＰＡＧＥ（Ａ）及びウェスタンブロッティング（Ｂ及びＣ）による後の解析（レーン２及び４）のために、１００℃で３分間加熱された。かかる生成物の分子量は、マーカーと比較される（レーン６）。
【図８】  ＨＥＶゲノムのＯＲＦ３から発現されたＧＳＴ融合ペプチド、ＧＥ３の特質を示している。ＧＥ３ペプチド（レーン１）、１００℃で３分間加熱されたＧＥ３ペプチド（レーン２）及びＧＳＴ（レーン３）は、ＧＳＴ−特異的抗血清及び（Ｃ）プールされたヒトＨＥＶ活性ヒト血清を使用して（Ａ）ＳＤＳＰＡＧＥ及び（Ｂ）ウェスタンブロッティングによって解析された。かかる生成物の分子量は、マーカーと比較される（レーン４）。
【図９】  ｐＥ２モノマーの抗原活性よりも約８０倍強いｐＥ２ダイマーの抗原活性を示している。図１０において示されるような精製されたｐＥ２の加熱及び非加熱の等価のサンプルを１．３乃至１３６０ナノグラム量を計り、２００倍に希釈したプールされたＨＥＶ活性ヒト血清を使用してウェスタンブロッティングされた。プールされた血清によって検出されたｐＥ２の最低量は、１３６０ｎｇで、これは同一状況下で８６ｎｇを検出したｐＥ２ダイマーの最低量よりも約１６倍高い。制限している濃度でのダイマーに対する活性は、モノマーの制限している濃度に対して観察された反応よりも少なくとも５倍ほど強度が高いと予測された。したがって、ｐＥ２ダイマーの抗原活性は、ｐＥ２モノマーの抗原活性よりも約８０倍強いと予測された。
【図１０】  ダイマー及びモノマー形状の組み合わせｐＥ２ペプチドの異なる抗原性を示している。精製されたｐＥ２の１３００ｎｇを含む等価のサンプルが、ペプチドのダイマー形状をペプチドのモノマー形状に分離するために、１００℃で３分間加熱された。加熱されたサンプルは、加熱されていない精製されたｐＥ２サンプルと等しい割合で混合された。ペプチドの２３ｋＤモノマー形体及び４２ｋＤダイマー形体は、ＳＤＳＰＡＧＥによって分離され、メンブラン上にブロットされた。メンブランは、ウェスタンブロット解析のためにストリップ状に切断された。５０倍に希釈された８の血清の試験は、ｐＥ２モノマー及びｐＥ２ダイマーの両者に対して活性であった一方で、別の１０の血清はｐＥ２ダイマーに対してのみ活性であった。
【図１１】  ８Ｍ尿素で１時間かけて４℃（レーン１）、２０℃（レーン２）、３７℃（レーン３）及び４５℃（レーン４）加熱された精製されたｐＥ２ペプチドの処置を示している。８Ｍ尿素で１時間かけて４５℃加熱された処理した精製されたｐＥ２ペプチドと等価のサンプルはまた、１ｘＰＢＳでオーバーナイトで透析された（レーン５）。５つのサンプルは、プールされたヒトＨＥＶ活性ヒト血清を使用して（Ａ）ＳＤＳＰＡＧＥ及び（Ｂ）ウェスタンブロッティングをされた。
【図１２】  ＥＬＩＳＡによって決定されるように、精製されたｐＥ２若しくはＧＥ３と反応されたヒトの３種類の血清に存在するＩｇＧ抗体のレベルを比較している。かかる血清に含まれているＩｇＧ抗体のレベルは、精製されたｐＥ２若しくはＧＥ３の調製の所定の最適な濃度によってコーティングされたマイクロプレートを用いる滴下によって決定された。ペプチドの調製は、ＳＤＳＰＡＧＥ（左のレーン）によって解析され、１００倍に希釈された血清を使用してウェスタンブロッティングによって試験された。ヒトの血清は、対応する組換えペプチドに対して、強い活性（個体の円）、弱い活性（ハッチドサークル）、若しくは非活性（開かれた円）の何れかである。抗体のレベルは、０．３７の遮断ＯＤ値を越える、ＯＤ値を与える、血清希釈の逆数として定義される。
【図１３】  精製されたｐＥ２若しくはＧＥ３に対して強い活性（個体の棒）、弱い活性（ハッチド棒）、若しくは非活性（開かれた棒）である、ＥＬＩＳＡによって決定されるような非Ａ，Ｂ，及びＣ肝炎を有する９６名の患者から得られる血清に含まれるＩｇＧ抗体の分配レベルを示している。各血清検体は、ウェスタンブロッティングによって１００倍の血清の希釈で試験され、精製されたｐＥ２でコーティングされたマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡによって解析された。抗体のレベルは、ＯＤ値によって確認され、ペプチドに対する血清の活性は、反応の強度によって評価された。
【図１４】  疾病の発症に続くＨＥＶ抗体の時間分配を例証している。非Ａ，Ｂ，及びＣ肝炎を有する９６名の患者から得られる血清に含まれるｐＥ２特異的（Ａ）ＩｇＧ抗体及び（Ｂ）ＩｇＭ並びにｐＥ３特異的（Ｃ）ＩｇＧ及び（Ｄ）ＩｇＭ抗体が、それぞれのＨＥＶペプチドで合成されるＥＬＩＳＡによって決定された。結果は、かかる血清が取られた場合に疾病発症後の時間の長さと比較された。遮断ＯＤ値（点線）は、ｐＥ２ＩｇＧで０．５２、ｐＥ２ＩｇＭで０．５７、ＧＥ３ＩｇＧで１．０５及びＧＥ３ＩｇＭで０．７４であった。
【図１５】  個別のＨＥＶ特異性の三つのＥＬＩＳＡによる抗体の決定を例証している。非Ａ，Ｂ，及びＣ肝炎を有する９６名の患者のうちの７４名の肝炎患者から得られる血清に含まれるＨＥＶ特異的抗体は、市販されているアッセイ（ＧｅｎｅＬａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ．，  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によってさらに試験された。結果は、ＧＥ３に特異的（Ａ、Ｂ及びＣ）若しくはｐＥ２に特異的（Ｄ、Ｅ及びＦ）なアッセイによって得られた結果と比較された。事前に実行されたウェスタンブロッティングは、３２の血清がｐＥ２及びＧＥ３（Ａ及びＤ）に対して活性であり、１４の血清がｐＥ２のみに対して活性であり（Ｂ及びＥ）、４０の血清はかかるペプチドの何れに対しても非活性（Ｃ及びＦ）であることを示した。遮断ＯＤ値（点線）は、市販のアッセイに対して０．６であり、ｐＥ２特異的ＩｇＧで０．５２、及びＧＥ３特異的ＩｇＧで１．０５であった。
【図１６】  精製されたｐＥ２に対して起こされた抗血清でコーティングされたポリスチレンパドルによるＨＥＶの特異的な免疫捕獲を示している。図１９で記載される動物Ｍ１から取得された抗血清は、１００倍に希釈され、ポリスチレンパドルをコーティングするために使用される。パドルは、別々に、ＨＥＶ（レーン２）、ＨＡＶ（レーン３）、カリシウィルス（レーン４及び５）、若しくは腸内ウィルス（レーン６）を含む溶液にオーバーナイトで浸透された。パドルは、溶液から除去され、バッファー溶液を４回変えて、洗浄された。パドルに結合したＲＮＡは抽出されて、逆転写及びｃＤＮＡは、対応するウィルスのプライマーを用いて、ＰＣＲ複製された。かかる生成物の分子量は、マーカーと比較される（レーン１）。
【図１７】  図１８にて記載されている動物Ｍ１から取得された（Ａ）ｐＥ２特異的抗血清若しくは（Ｂ）事前免疫血清の何れかでコーティングされたポリスチレンパドルを用いてＨＥＶの免疫捕獲を例証し、ＨＥＶを含んでいる連続的に希釈された胆汁の４．５ｍｌサンプルで反応された。洗浄後、パドルに結合していたＨＥＶ粒子は、ＲＴ−ＰＣＲにより検出された。かかる生成物の分子量は、マーカーと比較される（左のレーン）。
【図１８】  精製されたｐＥ２で免疫処理に反応するマカクサルによるｐＥ２抗体の合成を示している。３匹のサル（Ｍ１，Ｍ２及びＭ３）は、１００ｕｇの精製されたｐＥ２を４週間注入されて各々免疫処理された。３匹のコントロールサル（Ｍ５，Ｍ７及びＭ８）には、プラシーボが与えられた。免疫処理が終了した２週間後に、動物の両グループは、ＨＥＶの１０５ゲノムと等価な投与を静脈注射によって感染され、動物はさらに７週間観察された。血清サンプルは、週ごとに採取され、ＥＬＩＳＡテストを用いる抗−ｐＥ２抗体の存在のために解析された。
【図１９】  精製されたｐＥ２ペプチドの調製での免疫処理に続くＨＥＶの抗原投与の前にマカクサルから採取された血清に存在するＨＥＶ抗体のスペクトルを例証する。３匹の大人のサル（Ｍ１，Ｍ２及びＭ３）は、１００ｕｇの精製されたｐＥ２を含む調製によって週間隔で４回注入された。最終注入から２週間後に取得された血清は、連続的に４段階に希釈され、精製されたｐＥ２のモノマー（１００℃にて三分間加熱）及びダイマー（未処理）の形体の混合物に等しいものに対するウェスタンブロッティングによって試験された。Ｍ１からの免疫血清は、４倍に連続的に希釈された４０００倍乃至２５６０００倍（レーン１乃至４）で試験され、Ｍ２からのサンプルは、１００倍から６４００倍に希釈されて試験され、Ｍ３からのサンプルは、２５０乃至１６０００倍に希釈されて試験された。事前に免疫処理された血清は、ネガティブコントロールとして、１００倍に希釈されて試験された（レーン５）（Ａ）。かかる動物からの事前免疫処理及び免疫処理血清、及びポジティブコントロール血清Ｐは、ＧＥ３（Ｂ）、ｐＥ３ペプチドを含む３０ｋＤＧＳＴ融合タンパク質に対してウェスタンブロッティングにより、１００倍希釈で試験され、及びに市販のアッセイ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｂｅｉｊｉｎｇ）を用いてＥＬＩＳＡ（Ｃ）によって試験された。製造者によって推奨されるＥＬＩＳＡの遮断ＯＤ値は、点線によって示されている。
【図２０】  抗原投与する肝炎Ｅウィルスのゲノム投与を例証している。動物は、ストックされたＨＥＶの１００倍希釈の１ｍｌで接種された。接種するウィルスのゲノム投与は、“原料及び方法”という副題でここより下記に記載のようにウィルス調製の連続的に希釈されたアリコートでＲＴ−ＰＣＲにて決定された。
【図２１】  ＨＥＶ抗原投与に反応する抗体を例証している。血漿サンプルは、免疫処理された（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）及び非免疫処理のコントロール動物（Ｍ５、Ｍ７、Ｍ８）から、ＨＥＶ抗原投与に続く示された時間の前に直ちに採取された。ポジティブＰ、及びネガティブＮ、コントロールヒト血清サンプルと同様に、血清サンプルは、精製されたｐＥ２及びＧＥ３に対してウェスタンブロッティングによって試験され、市販のアッセイ（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ．，  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を用いてＥＬＩＳＡによって試験された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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