(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内の液中に配置された被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを該容器の底部から測定する際に用いられるマスキング部材であって、
液体透過性を有する一方、前記被測定対象を挟んで前記容器の底部と反対側に位置する液から該容器の底部への背景光を遮光する遮光性を有する遮光部と、そして、
前記遮光部を支持した状態で、前記被測定対象を挟んで前記容器の底部と反対側に該遮光部を位置決めする外枠部とを備えたマスキング部材。
【請求項２】
それぞれに被測定対象を含む液が収容された複数のウェルを備えるマイクロプレートに適用され、該ウェルそれぞれに収納された被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを該ウェルの底部からそれぞれ測定する際に用いられるマスキング部材であって、
前記ウェルそれぞれに対応して用意され、それぞれが液体透過性を有する一方、前記対応するウェル内に収納された被測定対象を挟んで該対応するウェルの底部と反対側に位置する液から該ウェルの底部への背景光を遮光する遮光性を有する複数の遮光部と、そして、
前記マイクロプレートの上面を覆うシート状部と、前記ウェルそれぞれに対応して用意され、それぞれが対応する遮光部を支持した状態で、前記対応するウェル内に収納された被測定対象を挟んで該対応するウェルの底部と反対側に該遮光部を位置決めする複数の外枠部とで構成された支持構造とを備えたマスキング部材。
【請求項３】
被測定対象を容器内に入れる第１ステップと、
前記容器内に蛍光色素、試験化合物及び発光試薬の少なくともいずれかを含む液を加える第２ステップと、
前記被測定対象を挟んで前記容器の底部とは反対側に位置する液から該容器の底部への背景光を遮光するステップであって、遮光性及び液体透過性を有する遮光部を備えたマスキング部材を用意し、容器の底部とともに前記被測定対象を該遮光部で挟むように該容器に対して該マスキング部材を配置する第３ステップと、そして、
前記被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを前記容器の底部から測定する第４ステップとを備えたことを特徴とする光測定方法。
【請求項４】
被測定対象を容器内に入れる第１ステップと、
遮光性及び液体透過性を有する遮光部を備えたマスキング部材を用意し、容器の底部とともに前記被測定対象を該遮光部で挟むように該容器に対して該マスキング部材を配置する第２ステップと、
前記容器内に蛍光色素、試験化合物及び発光試薬の少なくともいずれかを含む液を加える第３ステップと、そして、
前記被測定対象を挟んで前記容器の底部とは反対側に位置する液から該容器の底部への背景光を前記マスキング部材により遮光しつつ、前記被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを前記容器の底部から測定する第４ステップとを備えた光測定方法。
【請求項５】
容器内の液中に配置された被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを該容器の底部から測定するための光測定用キットであって、
前記液とともに前記被測定対象を収容するための容器と、そして、
それぞれが請求項１記載のマスキング部材と同様の構造を有する、１又はそれ以上のマスキング部材を備えた光測定用キット。
【請求項６】
それぞれが被測定対象を収納する１又はそれ以上のウェルを有するマイクロプレートと、そして、
それぞれが請求項１記載のマスキング部材と同様の構造を有する、１又はそれ以上のマスキング部材を備えた光測定用キット。
【請求項７】
それぞれが被測定対象を収納する複数のウェルを有するマイクロプレートと、そして、
請求項２記載のマスキング部材とを備えた光測定用キット。
【請求項８】
液とともに被測定対象を内部に収容し、底部から被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを測定するための光測定用容器であって、
前記容器内壁に、液体透過性を有する一方、前記被測定対象を挟んで前記容器の底部と反対側に位置する液から該容器の底部への背景光を遮光する遮光性を有するマスキング部材の位置決めをするための位置決め手段が設けられた光測定用容器。
【請求項９】
それぞれに被測定対象を含む液が収容された複数のウェルを備え、該ウェルそれぞれに収納された被測定対象由来の蛍光及び発光のいずれかを該ウェルの底部からそれぞれ測定する際に用いられる光測定用容器であって、
前記ウェル内壁それぞれに、液体透過性を有する一方、前記対応するウェル内に収納された被測定対象を挟んで該対応するウェルの底部と反対側に位置する液から該ウェルの底部への背景光を遮光するマスキング部材の位置決めをするための位置決め手段が設けられた光測定用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、マスキング部材、光測定方法、光測定用キット及び光測定用容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、創薬における化合物ライブラリーのスクリーニングなど種々の目的のため、蛍光や発行の測定が用いられる。このような測定では、まずシャーレ、バイエル瓶等の透明容器の底部に、培養された細胞等の被測定対象が配置される。そして、蛍光測定を例にすると、色素を含むバッファー（緩衝液、外液）を追加注入する。このままでは、細胞等に吸収されなかった蛍光色素の蛍光が背景光となり、被測定対象からの蛍光を識別して測定することが困難となるため、このような過剰の蛍光色素を含むバッファーを吸引除去し、蛍光色素を含まないバッファーを追加することを繰り返す洗浄（バッファー置換、ウォッシュアウト）が行われる。その後、スクリーニングを行いたい試験化合物が投入され、容器の透光性部材からなる底部から被測定対象への励起光の照射ならびに被測定対象由来の蛍光の測定を行うことにより、スクリーニングが行われる。【０００３】
なお、上述の蛍光測定では、スクリーニングを行いたい試験化合物には自ら蛍光を発するもの（自家蛍光化合物）が存在する。自家蛍光化合物は、これら化合物の７〜８割に達するとの予測がある。ここで、自家蛍光化合物を被測定対象に供して試験する場合、計測される蛍光値が、細胞等の蛍光色素を取り込んだ被測定対象に由来するものなのか、バッファー中の自家蛍光化合物に由来するもの（アーチファクト）なのか判断することが困難である。その結果、擬陽性が増大するという問題が生じている。このような場合には、自家蛍光を有する試験化合物を被測定対象に供した後に、この化合物を含まないバッファーで洗浄する工程が必要になるが、このような洗浄は時間がかかり、特に、高スループットな化合物のスクリーニングにおいては、検出精度低下、さらにはスループット低下の原因となる。また、洗浄工程の追加により、試験化合物による被測定対象への影響をリアルタイムに計測できないばかりでなく、被測定対象の容器の底からの剥離を招来する可能性もある。【０００４】
バッファー中の過剰な蛍光物質による背景蛍光（非特異的蛍光）に関する障害を解決するため、例えば、第１の蛍光測定方法として、黒色色素あるいは様々な種類の色素をバッファー中に混ぜて、過剰な蛍光色素に起因した影響を洗浄工程を伴うことなく低減する方法が実用化されている（例えば、特許文献１の図２参照）。また、第２の蛍光測定方法として、ポリマーラテックスビーズ、無機粒子等が添加されたバッファーを、被測定対象上に積層することで、被測定対象とバッファーとの間に光学的な分離層を形成し、この分離層より上のバッファー由来の背景蛍光を遮光する方法も提案されている（例えば、特許文献１の図６参照）。
【特許文献１】日本特許第３４５２０６８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明者は、蛍光又は発光を測定する従来の光測定方法について検討した結果、以下のような課題を発見した。すなわち、黒色色素等をバッファー中に混ぜる第１の蛍光測定方法では、この黒色色素等自体が、被測定対象である細胞の機能に影響を及ぼし、各種反応の阻害を引き起こすケースがあり、全ての測定系に対応できない。また、あるケースにおいては、色素への試験化合物の吸着に起因して、試験化合物が被測定対象に及ぼす影響を正確に測定できない。さらに、色素での消光の場合、波長ごとに吸収帯域が異なるため、蛍光色素の種類や測定系により最適な色素の選択が必要となる。【０００６】
一方、ポリマーラテックスビーズ等が添加されたバッファーを、被測定対象上に積層することで被測定対象とバッファーとの間に光学的な分離層を形成する第２の蛍光測定方法では、ポリマーラテックスビーズ等の粒子が被測定対象である細胞に直接接触することにより、細胞への悪影響が生じる可能性がある（物理的接触による影響）。また、ポリマーラテックスビーズ等により分離層が形成された後に、さらに試薬やスクリーニングを行いたい試験化合物が分注されると、ピペットの吐出圧等によって分離層にクレーターが生じ、分離層の厚さが一様でなくなる。その場合、分離層に層の薄い箇所と厚い箇所が生じ、その結果、細胞等に由来する蛍光の高分解能な検出ができなくなるという可能性もある。【０００７】
この発明は上述のような課題を解決するためになされたものであり、バッファー中の蛍光色素、試験化合物等に由来の蛍光又は発光に起因した影響を、被測定対象由来の蛍光又は発光の測定に与えることなく確実に除去し、さらにバッファー中の蛍光色素や試験化合物等の洗浄を不要とする、光測定用のマスキング部材、光測定方法、光測定用キット及び光測定用容器を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明に係るマスキング部材は、容器内の液中に配置された被測定対象由来の蛍光又は発光を容器の底部から測定する際に用いられる測定用部材であって、遮光部と外枠部とを備える。遮光部は、液体透過性を有する一方、被測定対象を挟んで容器の底部と反対側に位置する液から該容器の底部への背景光を遮光する遮光性を有する。外枠部は、遮光部を支持した状態で、被測定対象を挟んで容器の底部と反対側に該遮光部を位置決めする。【０００９】
上述の構成によれば、当該マスキング部材は、蛍光測定の場合には、容器内に収納された液のうち被測定対象より上方に位置する蛍光色素や試験化合物等を含む液に対して、容器底部を介して照射される励起光を遮蔽するため、被測定対象より上方の物質が励起されない。よって、背景光の発生を抑制できるので、被測定対象に特異的な蛍光の検出精度が向上する。励起光の一部がマスキング部材を通過して、被測定対象より上方に位置する過剰な蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、これらを含む液から容器底部への背景光を遮光できるため、被測定対象由来の蛍光と背景光との分離が可能になる。また、発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮蔽するため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になる。一方、当該マスキング部材は、液体を透過させ、液中の蛍光色素、試験化合物、発光試薬等を被測定対象と反応させることができる。すなわち、外枠部により液体透過性を有する遮光部は、容器内の液に浸った状態で被測定対象の上方に配置される。【００１０】
これにより、蛍光測定において、当該マスキング部材自体は細胞等の被測定対象に接触することなく、被測定対象以外の蛍光色素や試験化合物由来の蛍光を確実に遮光できるため、細胞等の被測定対象に悪影響を与えることなく、バッファー中の蛍光色素由来の蛍光や試験化合物の自家蛍光の影響が排除された高感度蛍光測定が可能となる。この場合、蛍光色素の種類（蛍光波長）や測定系を選ばず、どのような測定にも対応可能である。また、当該マスキング部材における遮光部が容器内に挿入された後に試薬が分注される場合であっても、遮光部自体は液体透過性を有するため、試薬は遮光部を透過して被測定対象に到達する。したがって、遮光部材自体の遮光性は均一に保たれ、被測定対象由来の蛍光の高分解能検出が可能になる。また、発光測定においては、蛍光測定と同様に、当該マスキング部材自体は被測定対象に接触することなく、被測定対象に関連しない余剰の発光試薬等に由来する発光を確実に遮光できるため、被測定対象に悪影響を与えることなく、バッファー中の発光試薬からの発光の影響が排除された高感度発光測定が可能になる。この場合、発光試薬の種類や測定系を選ばず、どのような測定にも対応可能である。【００１１】
また、蛍光色素、試験化合物又は発光試薬などを含む液が加えられる前又は加えられた後に、被測定対象が配置された容器内にマスキング部材の遮光部が挿入されるだけで、液中の過剰な蛍光色素、試験化合物又は発光試薬からの蛍光又は発光も遮光することができるため、液に含まれる蛍光色素、試験化合物又は発光試薬の洗浄が不要となり、蛍光又は発光測定におけるスループットの向上が図れる。【００１２】
この発明に係るマスキング部材は、それぞれに被測定対象を含む液が収容された複数のウェルを備えるマイクロプレートにも適用可能のである。この場合、当該マスキング部材は、ウェルそれぞれに対応して用意された複数の遮光部と、これら遮光部をそれぞれ対応するウェル内の所定位置に支持するための支持構造とを備える。遮光部のそれぞれは、液体透過性を有する一方、対応するウェル内に収納された被測定対象を挟んで該対応するウェルの底部と反対側に位置する液から該ウェルの底部への背景光を遮光する遮光性を有する。支持構造は、マイクロプレートの上面を覆うシート状部と、ウェルそれぞれに対応して用意された複数の外枠部とから構成されている。なお、支持構造における外枠部それぞれは、対応する遮光部を支持した状態で、対応するウェル内に収納された被測定対象を挟んで該対応するウェルの底部と反対側に該遮光部を位置決めする。【００１３】
上述の構成によれば、マイクロプレートにおける複数のウェル内に被測定対象が入れられ、同時に多数の蛍光又は発光測定が行われる場合においても、一括して各ウェルの遮光が可能であり、蛍光又は発光測定のスループットをさらに向上させることができる。【００１４】
この発明に係る光測定方法は、被測定対象を容器内に入れる第１ステップと、容器内に蛍光色素、試験化合物又は発光試薬を含む液を加える第２ステップと、上述のような構造を有するマスキング部材を容器に対して対置することで、被測定対象を挟んで容器の底部とは反対側に位置する液から該容器の底部への背景光を遮光する第３ステップと、被測定対象由来の蛍光又は発光を容器の底部から測定する第４ステップとを備える。このとき、第３ステップは、遮光性及び液体透過性を有する遮光部を備えたマスキング部材を用意し、容器の底部とともに被測定対象を該遮光部で挟むように該容器に対して該マスキング部材を配置する。一方、この発明に係る光測定方法は、被測定対象を容器内に入れる第１ステップと、上述のような構造を有するマスキング部材を容器に対して配置する第３ステップと、容器内に蛍光色素、試験化合物又は発光試薬を含む液を加える第３ステップと、被測定対象由来の蛍光又は発光を前記容器の底部から測定する第４ステップとを備えてもよい。この場合、第２ステップにおいて、容器に対してマスキング部材が配置されたとき、該容器内には遮光部が所定位置に位置決めされる。また、第４ステップにおける蛍光又は発光の測定は、被測定対象を挟んで容器の底部とは反対側に位置する液から該容器の底部への背景光をマスキング部材により遮光しつつ行われることになる。【００１５】
上述の構成によれば、蛍光測定の場合には、マスキング部材は、容器内に収納された液のうち被測定対象より上方に位置する蛍光色素や試験化合物等を含む液に対して、容器底部を介して照射される励起光を遮蔽するため、被測定対象より上方の物質は励起されない。よって、背景光の発生を抑制できるので、被測定対象に特異的な蛍光の検出精度が向上する。励起光の一部がマスキング部材を通過して、被測定対象より上方に位置する過剰な蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、マスキング部材により被測定対象の上方に位置する液から容器底部への背景光が遮光され、被測定対象由来の蛍光と該背景光との分離が可能になる。また、発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮光するため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になる。また、液中の蛍光色素等の成分は、マスキング部材における遮光部を透過することができるので被測定対象と反応し得る。【００１６】
これにより、被測定対象に悪影響を与えることなく、容器内の液中における蛍光色素由来の蛍光や試験化合物の自家蛍光の影響が排除された高感度蛍光測定が可能になる。また、発光測定の場合においても、蛍光測定と同様に、液中の発光試薬等からの発光の影響が排除された高感度発光測定が可能になる。また、蛍光色素、試験化合物又は発光試薬の種類等にかかわらず種々の測定に対応可能である。さらに、マスキング部材配置後に試薬が分注される場合でも、遮光の均一性は保たれる。そして、蛍光色素、試験化合物又は発光試薬が加えられる前あるいは加えられた後に、マスキング部材における遮光部が容器内に挿入されるだけで液中の過剰な蛍光色素由来の蛍光、試験化合物の自家発光又は発光試薬由来の発光が遮光されるので、容器内に収納された液中に含まれる蛍光色素、試験化合物又は発光試薬の洗浄が不要となり、蛍光又は発光測定のスループットの向上が図れる。【００１７】
この発明に係る光測定用キットは、容器内の液中に配置された被測定対象由来の蛍光又は発光を該容器の底部から測定するため、液とともに被測定対象を収容するための容器と、それぞれが上述のような遮光部と外枠部とを備えた構造を有する、１又はそれ以上のマスキング部材を備える。また、この発明に係る光測定用キットは、容器として、それぞれが被測定対象を収納する１又はそれ以上のウェルを有するマイクロプレートを備えてもよく、この場合、当該光測定用キットは、上述のようにそれぞれが遮光部と外枠部を備えた構造を有する、１又はそれ以上のマスキング部材を備える。さらに、この発明に係る光測定用キットにおいて、容器として、それぞれが被測定対象を収納する複数のウェルを有するマイクロプレートを備える場合、該マイクロプレートに適用されるマスキング部材は、上述のように複数の遮光部とこれら遮光部を支持する支持構造とを備えた構造を有する、マスキング部材を備えてもよい。この場合、マスキング部材における支持構造は、マイクロプレートの上面を覆うシート状部と、ウェルそれぞれに対応して用意された複数の外枠部とから構成され、シート状部とこれら外枠部は、遮光部それぞれをマイクロプレートの対応するウェル内の所定位置に配置する位置決め手段として機能する。【００１８】
上述の構成によれば、マスキング部材は、容器内あるいは容器として用意されるマイクロプレートの各ウェルにおいて、蛍光測定の場合には、容器内に収納された液のうち被測定対象より上方に位置する蛍光色素や試験化合物等を含む液に対して、容器底部を介して照射される励起光を遮蔽するため、被測定対象より上方の物質が励起されない。よって、背景光の発生を抑制できるので、被測定対象に特異的な蛍光の検出精度が向上する。励起光の一部がマスキング部材を通過して、被測定対象より上方に位置する過剰な傾向色素や試験化合物を励起した場合であっても、マスキング部材により被測定対象の上方に位置する蛍光色素等を含む液から容器底部への背景光を遮光するので、被測定対象由来の蛍光と背景光との分離が可能になる。また、発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮光するため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になる。一方、マスキング部材における遮光部は、液体を透過させ、液中の蛍光色素や種々の化合物等を被測定対象と反応させることができる。【００１９】
これにより、当該光測定用キットが利用されるだけで、被測定対象に影響を与えることなく高感度蛍光測定又は高感度発光測定が手軽に実施可能になる。適用される蛍光色素及び測定装置等は種々の物を選択することができ、試薬の分注時にも高精度蛍光測定又は高感度発光測定が可能にある。また、容器内に収納される液の蛍光色素や種々の試薬の洗浄も不要であり、高スループットの蛍光又は発光測定が可能になる。【００２０】
なお、当該光測定用キットにおいて、マイクロプレートに適用されるマスキング部材が、複数の遮光部とこれら遮光部を支持する支持構造とを備えた構造を有する、マスキング部材を備える場合、マイクロプレートの複数のウェル内には種々の被測定対象が収容可能であり、ウェルの内の一部あるいは全部にマスキング部材の対応する遮光部それぞれが挿入されることにより、一括で当該ウェル内からの背景光を遮光することができ、種々の蛍光又は発光測定が効率良く行え得る。【００２１】
また、この発明に係る光測定用容器は、液とともに被測定対象が内部に収容され、その底部から被測定対象の蛍光又は発光を測定するために利用される。この光測定用容器は、被測定対象の上方に位置する液から容器の底部への背景光を遮光するための遮光性及び液体透過性を有するマスキング部材とともに使用される。特に、当該光測定用容器は、その内壁にマスキング部材の位置決めをするための位置決め手段が設けられている。【００２２】
この構成によれば、マスキング部材は、位置決め手段により、被測定対象の上方の所定位置に配置される。配置されたマスキング部材は、蛍光測定の場合には、容器内に収納された液のうち被測定対象より上方に位置する蛍光色素や試験化合物等を含む液に対して、容器底部を介して照射される励起光を遮蔽するので、被測定対象より上方の物質が励起されない。よって、背景光の発生を抑制できるので、被測定対象に特異的な蛍光の検出精度が向上する。励起光の一部がマスキング部材を通過して、被測定対象より上方に位置する過剰な蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、マスキング部材により被測定対象の上方に位置する蛍光色素等を含む液から容器底部への背景光を遮光し、これにより被測定対象からの蛍光と背景光との分離が可能になる。この光測定用容器にマスキング部材が取り付けられることにより、容器内の所定位置に配置されたマスキング部材が被測定対象の上方に位置する液への励起光の遮蔽、さらには上方からの背景光を遮光するので、被測定対象に影響を与えることなく高感度蛍光測定が可能になる。また、発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮光できるため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になり、被測定対象に影響を与えることなく高感度発光測定が可能になる。適用される蛍光色素及び測定装置等は種々の物を選択することができ、試薬の分注時にも高精度蛍光測定又は高感度発光測定が可能になる。また、容器内に収納される液に含まれる蛍光色素等の洗浄も不要であり、高スループットの蛍光又は発光測定が可能になる。さらに、マスキング部材自体に容器内での位置決めをする手段が特に設けられていなくても、被測定対象に接触せずに十分な遮光ができる位置に遮光部を配置することができる。【００２３】
この発明に係る光測定用容器は、それぞれに被測定対象を含む液が収容された複数のウェルを備えたマイクロプレートであってもよい。この場合も、ウェル内壁それぞれに、マスキング部材の位置決めをするための位置決め手段が設けられている。【００２４】
上述のようなマイクロプレート型の光測定用容器であれば、複数のウェルそれぞれに種々の被測定対象を入れて、同時に複数種類の蛍光又は発光測定が可能となる。各ウェル内壁にはそれぞれマスキング部材の位置決め手段が設けられているため、それぞれ対応するマスキング部材が挿入されることによりウェルそれぞれに収納された液からの背景光の遮光が可能になる。これにより、液中における過剰な蛍光色素からの蛍光、試験化合物の自家蛍光又は発光試薬からの発光の影響が排除された高感度蛍光測定又は高感度発光測定が可能になる。【００２５】
なお、この発明に係る各実施例は、以下の詳細な説明及び添付図面によりさらに十分に理解可能となる。これら実施例は単に例示のために示されるものであって、この発明を限定するものと考えるべきではない。【００２６】
また、この発明のさらなる応用範囲は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明及び特定の事例はこの発明の好適な実施例を示すものではあるが、例示のためにのみ示されているものであって、この発明の思想及び範囲における様々な変形及び改良はこの詳細な説明から当業者には自明であることは明らかである。
【発明の効果】
【００２７】
この発明に係るマスキング部材、光測定方法、光測定用キット及び光測定用容器によれば、細胞等の被測定対象に悪影響を与えることなく、被測定対象とともに容器内に収納されたバッファー中における過剰な蛍光色素からの蛍光、試験化合物の自家蛍光又は発光試薬からの発光の影響が排除された高感度蛍光測定又は高感度発光測定が可能になる。また、蛍光色素の種類（蛍光波長）や測定系を選ばず、どのような測定にも対応可能である。また、容器にマスキング部材が取り付けられた後に試薬が分注される場合であっても、マスキング部材における遮光部の遮光性は均一に保たれ、被測定対象由来の蛍光又は発光の高分解能検出が可能である。さらに、種々の試薬が添加された後の洗浄工程が不要となり、蛍光又は発光測定におけるスループットが向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】は、この発明に係るマスキング部材の第１実施例の構造を示す図である。
【図２】は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材における遮光部の第１具体例の構造を示す図である。
【図３】は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材における遮光部の第２具体例の構造を示す図である。
【図４】は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材における遮光部の第３具体例の構造を示す図である。
【図５】は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材の使用状態を説明するための縦断面図である。
【図６】は、この発明に係るマスキング部材の第２実施例の概略構造及び使用状態を説明するための図である。
【図７】は、この発明に係る光測定方法の第１実施例を説明するための図である。
【図８】は、この発明に係る光測定方法の第２実施例を説明するための図である。
【図９】は、この発明に係る光測定用キットの第１〜第３実施例の概略構造を示す縦断面図である。
【図１０】は、第３実施例に係る光測定用キットとして蛍光測定用キットの使用方法を説明するための図である。
【図１１】は、この発明に係る光測定用容器の第１実施例の概略構造及び使用状態を説明するための図である。
【図１２】は、この発明に係る光測定用容器の第２実施例の概略構造及び使用状態を説明するための図である。
【符号の説明】
【００２９】
１ａ、１ｂ、１ｃ…遮光部、２、２’…メッシュ、３、３’…メッシュ穴、４…斜め穴、１０、２０…外枠部、１１…リム状部、２１…シート状部、１００、１００’、２００…マスキング部材、４００…容器、５００…マイクロプレート、５５０、７５０…ウェル、６００、７００…光測定用容器、６３０、７３０…位置決め手段、８００、８１０、８２０…光測定用キット、Ｂ…蛍光色素、試験化合物又は発光試薬を含む液（バッファー）、Ｓ…被測定対象、ＳＳ…サンプル溶液、ｌ…バッファーからの背景光、Ｌ…被測定対象からの蛍光。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、この発明に係るマスキング部材、光測定方法、光測定用キット、及び光測定装置の各実施例を、蛍光測定を例として図１〜図１２を用いて詳細に説明する。なお、図面の説明において同一部位、同一部材には同一符号を付して重複する説明を省略する。【００３１】
（マスキング部材の第１実施例）
図１は、この発明に係るマスキング部材の第１実施例の構造を示す図であり、領域（ａ）は、この第１実施例に係るマスキング部材の斜視図であり、領域（ｂ）はその縦断面図である。【００３２】
図１に示されたように、第１実施例に係るマスキング部材１００は、遮光部１と、遮光部１を支持した状態で遮光部１を容器内に位置決めする外枠部１０を備える。外枠部１０は、図１中の領域（ａ）に示されたように、容器内壁に嵌合するような円筒形状を有する。外枠部１０は、リム状部１１を有し、使用時には容器上部に係合して遮光部１を容器内の所定の深さに設置させるよう機能する。外枠部１０は、蛍光測定時にタンパク質や試薬等の非特異的吸着を抑制する観点から、疎水性・非吸収性を有するのが好ましく、材質としてはポリスチレンやポリプロピレン、ポリエチレンが好ましい。また、マスキング部材１００の色は透光性のものでなければ特に制限されず、遮光及び消光をするため、一般的に黒色であるのが好ましい。あるいは、遮光部１を反射部とし、非特異的な蛍光又は発光を反射する色が選択されても構わない。【００３３】
図１に示されたように、外枠部１０に支持される遮光部１は膜形状を有する。この遮光部１は、遮光性及び液体透過性を有する。図２〜図４は、遮光部の具体的な構造を示す図である。【００３４】
図２は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材における遮光部の第１具体例の構造を示す図であり、領域（ａ）は、単層メッシュ構造の遮光部を含むマスキング部材を示す斜視図であり、領域（ｂ）は、該マスキング部材の縦断面図、そして、領域（ｃ）は、第１具体例に係る遮光部の拡大図である。【００３５】
図２に示された第１具体例では、マスキング部材１００は単層メッシュ構造の遮光部１ａを備える。図２中の領域（ａ）及び（ｂ）に示されたように、遮光部１ａはメッシュ状の網目構造を有する。また、図２中の領域（ｃ）に示されたように、遮光部１ａを構成するメッシュ２は、複数の微小なメッシュ穴３を有し、蛍光色素や試験化合物等の分注時にはそれらはメッシュ穴３を通って被測定対象へ透過していく。一方、メッシュ穴３は微小なため、遮光部１ａに入射した光の大部分は透過しない（遮光）。【００３６】
図３は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材における遮光部の第２具体例の構造を示す図であり、領域（ａ）は、２層メッシュ構造の遮光部を含むマスキング部材を示す斜視図であり、領域（ｂ）は、該マスキング部材の縦断面図であり、領域（ｃ）は、第２具体例に係る遮光部の拡大図である。【００３７】
図３に示された第２具体例では、マスキング部材１００は２層メッシュ構造の遮光部１ｂを備える。図３中の領域（ａ）に示されたように、遮光部１ｂは単層メッシュを２枚重ねた構造を有する。図３中の領域（ｂ）に示されたように、この２層メッシュ構造は、２層のメッシュの網目が互い違いになるように配置されている。そして、図３中の領域（ｃ）にさらに詳細に示されたように、遮光部１ｂは、メッシュ２、２’のメッシュ穴３、３’がそれぞれ互い違いに重なり、遮光部１ｂに入射した直射光はほとんど透過できない。したがって、この第２具体例に係る遮光部１ｂは、図２の第１具体例のような単層メッシュ構造と比較しても、より高い遮光性を有する。一方、バッファー等の液体は２層のメッシュ２、２’におけるそれぞれのメッシュ穴３、３’を透過可能である。【００３８】
図４は、図１に示された第１実施例に係るマスキング部材における遮光部の第３具体例の構造を示す図であり、領域（ａ）は、斜筒構造の遮光部を含むマスキング部材を示す斜視図であり、領域（ｂ）は、該マスキング部材の縦断面図であり、領域（ｃ）は、第３具体例に係る遮光部の拡大図である。【００３９】
図４に示された第３具体例では、マスキング部材１００は斜筒構造の遮光部１ｃを備える。図４中の領域（ａ）に示されたように、遮光部１ｃにはその表裏を貫通する穴が複数設けられている。しかしながら、図４中の領域（ｂ）及び（ｃ）に示されたように、この穴は遮光部１ｃに垂直に設けられておらず、斜めに角度を付けて設けられた斜め穴４である。このため、遮光部１ｃに入射した光はほとんど透過することができず、遮光される。一方、バッファー等の液体は遮光部１ｃの斜め穴４を透過可能である。【００４０】
以上のような構造を有する遮光部は、外枠部と同様に疎水性・非吸収性を有するのが好ましい。具体的な材質としては、マスキング部材挿入後に薬剤を分注する用途においては、親水性の高いナイロン、セルロース、木綿、ウールなどを用いるか、プラズマ処理、化学処理、光触媒反応などによる親水化処理を施した樹脂、ガラス、シリコン部材などを用いることが好ましい。また、タンパク質等の非特異吸着を避ける場合には、疎水性素材として、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーカーボネイト等を用いることが好ましい。【００４１】
次に、図５を参照して、第１実施例に係るマスキング部材の機能について説明する。図５は、第１実施例に係るマスキング部材の使用状態を説明するための縦断面図である。図５に示されたように、底部が透明な容器４００の底部には、培養された細胞やコーティングされた抗体等の被測定対象Ｓが配置される。容器４００には、蛍光色素を含む液（バッファー）Ｂが入れられ、蛍光色素を取り込んだ被測定対象Ｓ（例えば蛍光標識細胞）は所定の蛍光を発する。また、バッファーＢ中には、スクリーニングを行いたい試験化合物（試薬）も投入される。容器４００には、この第１実施例に係るマスキング部材１００が挿入されている。マスキング部材１００の外枠部１０のリム状部１１は、容器４００の上端に係合し、遮光部１を容器４００内の所定の位置に位置決めする。遮光部１は、被測定対象Ｓに物理的な影響を与えない観点から、被測定対象Ｓに接触しない高さに位置決めされるのが好ましい。【００４２】
この状態では、励起光は容器４００の透明な底面から照射され、被測定対象Ｓからの蛍光Ｌは、容器４００の底部から蛍光測定される。この場合、容器４００の底面から照射された励起光は、遮光部１により遮光されるので、遮光部１より上方に位置するバッファーには到達せず、遮光部１より下方に位置する被測定対象Ｓに選択的に照射される。一方、励起光の一部が遮光部１を通過してバッファーＢ中に存在する過剰な蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、それら由来の蛍光によるバッファーＢからの背景光ｌ（非特異的な蛍光）は、遮光部１により遮光される。そのため、容器４００の底部からの蛍光測定において、バッファーからの背景光ｌに邪魔されることなく、被測定対象からの特異的な蛍光Ｌを測定することができ、擬陽性の少ない高精度蛍光測定が可能になる。【００４３】
さらにこの場合、バッファーＢ中の被測定対象Ｓに吸収されなかった過剰な蛍光色素や試験化合物からの蛍光も遮光部１により遮光されるため、従来、必要であったバッファーの置換工程（洗浄工程）は不要となる。その結果、洗浄の手間を省き、上述のような洗浄工程により被測定対象が容器底部から剥離する問題も生じないため、蛍光測定のスループットが向上する。また、このマスキング部材１００を付けたままの状態でも試薬等の分注も可能であり、分注された試薬は、液体透過性を有する遮光部１を介して、被測定対象Ｓに到達する。このとき、試薬と被測定対象Ｓとが所定の反応を起こし、その結果をリアルタイムで蛍光観察することも可能になる。【００４４】
この図５に示された使用例では、被測定対象Ｓは容器４００の底部に固定されているが、この発明に係るマスキング部材は、バッファーＢ中に浮遊する細胞等の蛍光測定をする際にも適用可能である。この場合、例えば、遮光部１のメッシュ穴のサイズをより微小にし、浮遊細胞を遮光部１より下に留めるようにするのが好ましい。【００４５】
また、この使用例では、被測定対象Ｓに蛍光色素を取り込ませて、蛍光標識することとしているが、被測定対象Ｓが蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の場合には、必ずしも蛍光色素で細胞を標識する必要は無い。この場合であっても、自家蛍光を有する試験化合物に由来する背景光を遮光できるので、擬陽性の少ない高精度蛍光測定が可能となる。さらに、洗浄工程も不要となるので、蛍光測定のスループットが向上する。【００４６】
なお、この使用例では、蛍光標識された被測定対象Ｓを用いているが、例えばルシフェラーゼのような発光酵素の遺伝子を発現する細胞を被測定対象として発光測定を行ってもよい。発光測定では、蛍光色素を励起する励起光の照射は不要である。発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮光できるため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になり、被測定対象に影響を与えることなく高精度かつ高スループットな発光測定が可能となる。【００４７】
（マスキング部材の第２実施例）
図６は、この発明に係るマスキング部材の第２実施例の概略構造及び使用状態を説明するための図であり、領域（ａ）は、第２実施例に係るマスキング部材の全体斜視図であり、領域（ｂ）は、該マスキング部材の拡大図であり、領域（ｃ）は、遮光部周辺の拡大図であり、領域（ｄ）は、当該マスキング部材の使用状態を示す縦断面図である。【００４８】
この第２実施例に係るマスキング部材は、複数のウェルを備えるマイクロプレートに使用される点で、第１実施例に係るマスキング部材（図１）と異なる。【００４９】
図６に示されたように、第２実施例に係るマスキング部材２００は、被測定対象を収容する複数のウェルを備えるマイクロプレートに使用され、該マスキング部材２００は、マイクロプレートの複数のウェルに対応した複数の遮光部１と、これら遮光部１それぞれを支持する支持構造とを備える。支持構造は、小円筒形状の複数の外枠部２０と、マイクロプレートの上面を覆う一体構造のシート状部２１を有し、マイクロプレートの上面形状と嵌合して、マイクロプレートの各ウェル内に各遮光部１をそれぞれ位置決めする。【００５０】
図６中の領域（ｂ）及び（ｃ）に示されたように、個々の遮光部１と、それを支持する小円筒形状の外枠部２０は、上述の第１実施例に係るマスキング部材と同様の構造と材質が適用され得る。なお、全ウェル同時測定する系で使用するため、全ウェルの遮光・消光条件を統一するために、各遮光部１の構造と各ウェル中での位置関係を均一にしておくのが好ましい。【００５１】
この第２実施例に係るマスキング部材の使用状態において、図６中の領域（ｄ）に示されたように、マイクロプレート５００に設けられたウェル５５０の透明な底部には、培養された細胞等の被測定対象Ｓが配置される。各ウェル５５０内には、蛍光色素を含む液（バッファー）Ｂが投入され、各ウェル中の、蛍光色素を取り込んだ被測定対象Ｓは所定の蛍光を発する。バッファーＢ中には、各ウェルにスクリーニングを行いたい試験化合物（試薬）も投入される。マイクロプレート５００にはこの第２実施例に係るマスキング部材２００が、各遮光部１とそれを支持する小円筒状の外枠部２０が各ウェル５５０と嵌合するように挿入される。一体構造のシート状部２１がマイクロプレート５００の上部を覆うようにして嵌合することにより、遮光部１はウェル５５０内の所定の位置に位置決めされる。【００５２】
第２実施例に係るマスキング部材２００において、上述の第１実施例と同様に、各ウェル中の被測定対象Ｓからの蛍光Ｌは、ウェル５５０の透明な底部から蛍光測定される。この場合、ウェル５５０の底面から照射された励起光は、遮光部１により遮光されるので、遮光部１より上方に位置するバッファーには到達せず、遮光部１より下方に位置する被測定対象Ｓに選択的に照射される。一方、励起光の一部が遮光部１を通過してバッファーＢ中に存在する過剰な蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、遮光部１より上部のバッファーＢからの背景光ｌは、遮光部１により遮光される。そのため、各ウェル５５０の底部からの蛍光測定において、バッファーからの背景光ｌに邪魔されることなく、高精度蛍光測定が可能になる。【００５３】
この第２実施例においても、バッファーＢ中の過剰な蛍光色素からの蛍光は、遮光部１により遮光されるため、バッファーの置換工程は不要であり、蛍光測定のスループットが向上し得る。マスキング部材２００を付けたままの状態で、各ウェル５５０中にそれぞれ所望の試薬等が分注される場合であっても、分注された試薬は、液体透過性を有する遮光部ｌを介して、被測定対象Ｓに到達する。そして、試薬と被測定対象Ｓが所定の反応を起こし、その結果を各ウェル５５０の底部から蛍光観察することができる。これにより全ウェル同時に種々の蛍光測定を行なうことが可能になる。【００５４】
なお、この実施例においても、第１実施例と同様に、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞を被測定対象として蛍光測定する場合には、蛍光色素で細胞を標識する工程を除いてもよい。また、第１実施例と同様に、例えばルシフェラーゼのような発光酵素の遺伝子を発現する細胞を被測定対象として発光測定を行えば、同様の効果が奏される。【００５５】
（光測定方法の第１実施例）
次に、上述の第２実施例に係るマスキング部材２００を使用した場合を例にとり、この発明に係る光測定方法の第１実施例を具体的に説明する。【００５６】
図７は、第２実施例に係るマスキング部材を用いた、この発明に係る光測定方法の第１実施例を説明するための図である。この第１実施例に係る光測定方法では、まず図７中の領域（ａ）に示されたように、第１ステップとして、マイクロプレート５００のような容器の各ウェル５５０の透明な底部に、培養された細胞又はコーティングされた抗体等が被測定対象Ｓとして入れられる。次に、図７中の領域（ｂ）に示されたように、第２ステップとして、各ウェル５５０内に、蛍光色素を含んだ液（バッファー）Ｂを供して培養細胞に蛍光色素を取り込ませるが。そして、図７中の領域（ｃ）に示されたように、第３ステップとして、蛍光色素を含んだバッファーＢを除去することなく（洗浄を行うことなく）、上述のような遮光性及び液体透過性を有する遮光部を含むマスキング部材２００がマイクロプレート５００に挿入・嵌合されることにより、該遮光部が被測定対象Ｓの上方に配置される。これにより、ウェル５５０内に存在する被測定対象Ｓ以外からの蛍光が遮光される。【００５７】
このようにマスキング部材２００により、バッファーＢ中の過剰な蛍光色素からの蛍光を遮光するため、手間がかかるバッファー中の過剰な蛍光色素を除去するための洗浄工程を行う必要がない。また。洗浄によりウェル５５０底部から細胞等の被測定対象が剥離するような問題も生じない。そのため、高スループットの蛍光測定が可能になる。【００５８】
その後、図７中の領域（ｄ）に示されたように、第４ステップとして、バッファーＢからの背景光ｌが遮光部１により遮光された状態で、被測定対象Ｓからの蛍光Ｌが各ウェル５５０の底部から観察される。なお、スクリーニングを行いたい化合物や試薬等は、マスキング部材２００を挿入する前に被測定対象Ｓに供給され得るが、マスキング部材２００が挿入された後であっても、液体透過性を有する遮光部１を介して被測定対象Ｓに供給され得る。この第１実施例に係る蛍光測定方法においては、バッファーＢからの背景光ｌが効果的に遮光されるため、高精度蛍光測定が可能になる。【００５９】
また、この実施例では、被測定対象Ｓに蛍光色素を取り込ませて、蛍光標識することとしているが、被測定対象Ｓが蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の場合には、蛍光色素での細胞の標識は不要である。この場合であっても、自家蛍光を有する試験化合物に由来する背景光を遮光できるので、擬陽性の少ない高精度蛍光測定が可能となる。さらに、洗浄工程も不要となるので、蛍光測定のスループットが向上する。【００６０】
また、この実施例では、蛍光標識された被測定対象Ｓを用いているが、例えばルシフェラーゼのような発光酵素の遺伝子を発現する細胞を被測定対象とする場合には、蛍光色素での細胞の標識は不要である。この場合であっても、自家蛍光を有する試験化合物に由来する背景光を遮光できるので、高精度かつ高スループットな発光測定が可能となる。【００６１】
（光測定方法の第２実施例）
図８は、第２実施例に係るマスキング部材を用いた、この発明に係る光測定方法の第２実施例を説明するための図である。この第２実施例に係る光測定方法では、図８中の領域（ａ）に示されたように、第１ステップとして、第１実施例と同様に被測定対象Ｓがマイクロプレート５００の各ウェル５５０に入れられる。しかしながら、この第２実施例では、図８中の領域（ｂ）に示されたように、第２ステップとして、先にマスキング部材２００がマイクロプレート５００に挿入・嵌合され、被測定対象Ｓの上方に配置される。そして、図８中の領域（ｃ）に示されたように、第３ステップとして、各ウェル５５０中に蛍光色素を含む液（バッファー）Ｂを供して、被測定対象に蛍光色素を取り込ませる。その後、図８中の領域（ｄ）に示されたように、第４ステップとして、蛍光色素を含んだバッファーＢを除去することなく（洗浄を行うことなく）、バッファーＢからの背景光ｌが遮光部１により遮光された状態で、被測定対象Ｓからの蛍光Ｌが各ウェル５５０の底部から観察される。スクリーニングを行いたい試薬等は、図７に示された第１実施例に係る蛍光測定方法と同様に適宜被測定対象Ｓに供給され得る。【００６２】
このように、被測定対象に蛍光色素を供給する前にマスキング部材を挿入する方法（第２実施例に係る光測定方法）でも、バッファー中の過剰な蛍光色素を除去するための洗浄工程を行うことなく、バッファー中の背景蛍光を遮光して、高精度、高スループットの蛍光測定が可能になる。【００６３】
なお、この実施例においても、第１実施例と同様に、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞を被測定対象として蛍光測定する場合には、蛍光色素で細胞を標識する工程を除いてもよい。また、第１実施例と同様に、例えばルシフェラーゼのような発光酵素の遺伝子を発現する細胞を被測定対象として発光測定を行えば、同様の効果が奏される。【００６４】
（光測定用キットの第１〜第３実施例）
図９は、この発明に係る光測定用キットの第１〜第３実施例の概略構造を示す縦断面図であり、領域（ａ）は、第１実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キットを示し、領域（ｂ）は、第２実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キットを示し、領域（ｃ）は、第３実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キットを示す。これら第１〜第３実施例に係る光測定用キットにおいて、被測定対象は予め容器内に収容されており、この容器と遮光を行うためのマスキング部材が１セットとなり、手軽に高精度蛍光測定が行えるようになっている。【００６５】
図９中の領域（ａ）に示されたように、第１実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キット８００は、被測定対象Ｓとして予め底部に抗体がコーティング済みのシャーレ又はバイエル瓶型の容器４００と、容器４００内に存在する被測定対象Ｓ以外の物からの光を遮光するために容器４００内に挿入されるマスキング部材１００を１セットとして備える。マスキング部材１００は、上述の第１実施例に係るマスキング部材と同様に、遮光部１と、その遮光部１を支持して容器４００内に位置決めする外枠部１０を有する。遮光部１は遮光性及び液体透過性を有し、図２〜４に示すような構造を有する。外枠部１０は、容器４００上部に係合して容器４００内に遮光部１を位置決めするリム状部１１を有する。これらは、蛍光色素で標識されたリガンド（抗体や細胞からの産出物質など）を含むバッファーが、容器４００にマスキング部材１００を付けたままの状態で投入されることにより、簡単に蛍光測定を可能にする（図５に示されたような状態での蛍光測定を可能にする）。【００６６】
図９中の領域（ｂ）に示されたように、第２実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キット８１０は、容器として予め被測定対象Ｓ（抗体）がコーティング済みの複数のウェル５５０を有するマイクロプレート５００と、１以上のマスキング部材１００とを１セットとして備えた点が、第１実施例（図９中の領域（ａ））と異なる。マイクロプレート５００の各ウェル５５０には、同種あるいは異種の抗体等からなる被測定対象Ｓが予め入れられており、種々の測定・検査が行えるようになっている。個々のマスキング部材１００の外枠部１０は、遮光部１をマイクロプレート５００のウェル５５０内に位置決めするためのリム状部１１を含む。これらのマスキング部材１００は、ウェル５５０の一部又は全部にそれぞれ挿入され、蛍光色素で標識されたリガンド（抗体や細胞からの産出物質など）を含むバッファーをそのウェル５５０内に投入することにより、各ウェル５５０で簡単に種々の蛍光測定が行える。【００６７】
図９中の領域（ｃ）に示されたように、第３実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キット８２０は、容器として第２実施例（図９中の領域（ｂ））のようなマイクロプレート５００を備えるが、マスキング部材として、図６に示されたような一体構成された１つのマスキング部材２００を備えた点で、第２実施例（中９中の領域（ｂ））と異なる。このマスキング部材２００は、マイクロプレート５００の複数のウェル５５０に対応した複数の遮光部１を有する。このマスキング部材２００のシート状部２１は、図６に示されたように、マイクロプレート５００の上面を覆うシート状であり、各ウェル５５０内に各遮光部１を位置決めするよう機能する。この第３実施例では、例えば、各ウェル５５０内に種々の抗体等の被測定対象Ｓをコーティングしておき、マスキング部材２００を挿入・嵌合させたままで、蛍光色素で標識されたリガンド（抗体や細胞からの産出物質など）を含むバッファーが、適宜、各ウェル５５０中に投入される。これにより、短時間で簡単に種々のスクリーニングが行える。この第３実施例では、マスキング部材２００の挿入・嵌合は全てのウェル５５０に対して一括して一度に行うことができ、作業の省力化を図ることができる。【００６８】
なお、上記第１〜第３実施例では、リガンドを蛍光標識する例を示しているが、これに限定されず、例えばリガンドと特異的に結合する、蛍光標識された第２抗体を使用してもよい。この場合には、抗体Ｓが固定化されたウェル５５０内に抗原や細胞からの産出物質などを含むサンプルを加えた後に、蛍光標識された第２抗体が、洗浄工程を伴うことなく加えられる。このように、この発明に係る光測定用キット（蛍光測定用キット）によれば、種々の蛍光イムノアッセイにおいて、サンプル吸着面以外からのバックグラウンド蛍光を除去し、より検出感度を高めることが可能となる。【００６９】
また、上記第１〜第３実施例では、リガンドを蛍光標識する例を示しているが、蛍光標識に替えて、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの発光酵素で標識してもよい。この場合には、ルミノールや過酸化水素やルシフェラーゼなどの発光酵素の基質（発光試薬）が、洗浄工程を伴うことなく加えられる。このように、この発明に係る光測定用キット（特に、発光測定用キット）によれば、種々の化学・生物発光イムノアッセイにおいて、サンプル吸着面以外からのバックグラウンド発光を除去し、より検出感度を高めることが可能となる。【００７０】
次に、上述の第３実施例に係る光測定用キットとしての蛍光測定用キットを使用した蛍光測定を例にとり、この発明に係る光測定用キットの使用方法を具体的に説明する。【００７１】
図１０は、上述の第３実施例に係る蛍光測定用キット（図９中の領域（ｃ））の使用方法の一例を説明するための図である。蛍光測定用キット８２０では、図１０中の領域（ａ）に示されたように、被測定対象Ｓとして抗体がマイクロプレート５００の各ウェル５５０の底部にコーティングされている。これに対し、図１０中の領域（ｂ）に示されたように、抗体Ｓのリガンド（細胞が産出した物質や抗原等）が含まれるサンプル溶液ＳＳが各ウェル５５０内に規定量入れられ、抗体Ｓとリガンドとの間で抗原抗体反応が起こる。そして、図１０中の領域（ｃ）に示されたように、リガンドと特異的に結合する、蛍光標識された第２の抗体を含むバッファーＢが、リガンドを除去するための洗浄工程を伴うことなくウェル５５０に加えられ、リガンドと第２の抗体との間で抗原抗体反応が起こる。最後に、図１０中の領域（ｄ）に示されたように、マスキング部材２００を全てのウェル５５０に落とし込んで嵌合させ、バッファーＢ中の過剰な蛍光標識された第２の抗体を除去するための洗浄工程を行うことなくウェル５５０の底面から蛍光測定が行われる。以上のように、１つの蛍光測定用キットだけで、種々の蛍光測定が簡単に行うことができる。また、この発明に係る光測定用キットは、細胞を用いた蛍光アッセイの他、蛍光イノムアッセイのツールとしても利用可能である。【００７２】
なお、この発明に係る光測定用キットは、図１０に示された例のようにマスキング部材を着脱することなく、マイクロプレートにマスキング部材を嵌合・装着したまま、蛍光色素を含むバッファーや試薬を各ウェルに投入し、バッファーの蛍光色素の洗浄を行わずウェル底面から蛍光測定することによっても、種々の蛍光測定を可能にする。【００７３】
なお、上記使用例では、第２の抗体を蛍光標識する例を示しているが、これに限定されず、例えばリガンドを蛍光標識してもよい。この場合には、第２の抗体を加える工程は不要となる。この発明に係る光測定用キットとして蛍光測定用キットを使用した蛍光測定によれば、種々の蛍光イムノアッセイにおいて、サンプル吸着面以外からのバックグラウンド蛍光を除去し、より検出感度を高めることが可能となる。【００７４】
また、上記使用例では、第２の抗体を蛍光標識する例を示しているが、蛍光標識に替えて、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの発光酵素で標識してもよい。この場合には、ルミノールや過酸化水素やルシフェラーゼなどの発光酵素の基質（発光試薬）が、洗浄工程を伴うことなく加えられる。このように、この発明に係る光測定用キットとして発光測定用キットを使用した発光測定によれば、種々の化学・生物発光イムノアッセイにおいて、サンプル吸着面以外からのバックグラウンド発光を除去し、より検出感度を高めることが可能となる。【００７５】
（光測定用容器の第１実施例）
図１１は、この発明に係る光測定用容器の第１実施例の構造を示す図であり、領域（ａ）は、第１実施例に係る光測定用容器を示す斜視図であり、領域（ｂ）は、第１実施例に係る光測定用容器の縦断面図であり、領域（ｃ）は、第１実施例に係る光測定用容器の使用状態を示す縦断面図である。上述のマスキング部材の第１及び第２実施例、上述の光測定用キットの第１〜第３実施例では、マスキング部材を位置決めする手段がマスキング部材側に設けられていたのに対し、この発明に係る光測定用容器では、被測定対象を収容する当該容器の側に位置決め手段が設けられている。【００７６】
この第１実施例に係る光測定用容器は、容器内に存在する被測定対象以外の物からの光を遮光するための遮光性及び液体透過性を有するマスキング部材を、容器内に挿入されて使用される。図１１中の領域（ａ）及び（ｂ）に示されたように、この光測定用容器６００の内壁には、マスキング部材を位置決めするための位置決め手段６３０が設けられている。このように、容器内壁に段差を設けることによりマスキング部材の位置決めをするようにされているが、位置決め手段としてはこれに限定されるものではなく、他の態様より容器内壁に凹凸部を設けて位置決めをしたり、バネ、ネジ、磁力等を利用した止め具等により位置決めするようにされていても良い。【００７７】
図１１中の領域（ｃ）に示されたように、蛍光測定時には、位置決め手段６３０に、遮光性及び液体透過性を有するマスキング部材１００’が載置され、光測定用容器６００内の所定の位置に位置決めされる。これにより、第１実施例に係るマスキング部材を用いた場合と同様に、光測定用容器６３０の底面から照射された励起光は、遮光部１００’により遮光されるので、遮光部１より上方に位置するバッファーには到達せず、遮光部１００’より下方に位置する被測定対象Ｓに選択的に照射される。一方、励起光の一部が遮光部１００’を通過してバッファーＢ中に存在する蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、バッファーＢからの背景光ｌは遮光部１００’により遮光され、被測定対象Ｓからの蛍光Ｌを測定することができる。この第１実施例に係る測定用容器では位置決め手段６３０が、光測定用容器側に設けられているため、図１に示されたマスキング部材のように、マスキング部材側に位置決め手段は必要ない。そのため、例えば遮光性及び液体透過性を有するメッシュ構造の膜材等をそのままマスキング部材として使用することができる。【００７８】
なお、この第１実施例では、蛍光標識された被測定対象Ｓを用いているが、例えばルシフェラーゼのような発光酵素の遺伝子を発現する細胞を被測定対象として発光測定を行ってもよい。発光測定では、蛍光色素を励起する励起光の照射は不要である。発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮光できるため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になり、被測定対象に影響を与えることなく高精度かつ高スループットな発光測定が可能となる。【００７９】
この第１実施例に係る光測定用容器は、細胞を用いた蛍光アッセイ以外に、種々の発光アッセイや、蛍光イムノアッセイ、化学・生物発光アッセイのツールとしても利用可能である。【００８０】
（光測定用容器の第２実施例）
図１２は、この発明に係る光測定用容器の第２実施例の構造を説明するための図であり、領域（ａ）は、この第２実施例に係る光測定用容器の全体斜視図であり、領域（ｂ）は、第２実施例に係る光測定用容器の拡大図であり、領域（ｃ）は、ウェル周辺の拡大図であり、領域（ｄ）は、第２実施例に係る光測定用容器の使用状態を示す縦断面図である。この第２実施例に係る光測定用容器では、被測定対象を収容するための複数のウェルを備えたマイクロプレート型である点が、第１実施例に係る光測定用容器（図１１）と異なる。【００８１】
図１２中の領域（ａ）に示されたように、この第２実施例に係る光測定用容器７００は、通常のマイクロプレートと同様に被測定対象を収容するための複数のウェル７５０を備える。しかしながら、図１２中の領域（ｂ）に示された拡大図及び領域（ｃ）に示されたウェル７５０周辺の拡大図からも分るように、光測定用容器７００は、各ウェル７５０内壁にマスキング部材を位置決めする位置決め手段７３０がそれぞれ設けられている。【００８２】
図１２中の領域（ｄ）に示されたように、蛍光測定時には、各ウェル７５０内壁の位置決め手段７３０に、遮光性及び液体透過性を有するマスキング部材１００’が載置され、各ウェル７５０内の所定の位置に位置決めされる。これにより、第２実施例に係るマスキング部材（図６）を用いた場合と同様に、ウェル７５０の底面から照射された励起光は、遮光部１００’により遮光されるので、遮光部１００’より上方に位置するバッファーには到達せず、遮光部１００’より下方に位置する被測定対象Ｓに選択的に照射される。一方、励起光の一部が遮光部１００’を通過してバッファーＢ中に存在する蛍光色素や試験化合物を励起した場合であっても、バッファーＢからの背景光ｌが遮光部１００’により遮光され、被測定対象Ｓの蛍光Ｌのみの測定が可能になる。この第２実施例に係る光測定用容器においても、位置決め手段は容器側に設けられているため、マスキング部材側に図６に示されたような位置決め手段は必要なく、遮光性及び液体透過性を有するメッシュ構造の膜材等をそのままマスキング部材として各ウェルに挿入して用いることができる。【００８３】
なお、この使用例では、蛍光標識された被測定対象Ｓを用いているが、例えばルシフェラーゼのような発光酵素の遺伝子を発現する細胞を被測定対象として発光測定を行ってもよい。発光測定では、蛍光色素を励起する励起光の照射は不要である。発光測定の場合には、マスキング部材は、被測定対象より上方に位置する発光試薬等を含む液から容器底部への背景光を遮光できるため、被測定対象由来の発光と背景光との分離が可能になり、被測定対象に影響を与えることなく高精度かつ高スループットな発光測定が可能となる。【００８４】
この第２実施例に係る光測定用容器は、細胞を用いた蛍光アッセイ以外に、種々の発光アッセイや、蛍光イムノアッセイ、化学・生物発光アッセイのツールとしても利用可能である。【００８５】
発明者は、この発明に係るマスキング部材の効果について検証するため、図６に示されたマスキング部材を用いて以下のような蛍光測定を行った。【００８６】
各ウェルの底面にＣＨＯ細胞を接着したマイクロプレートが２枚用意された。これらマイクロプレートのＣＨＯ細胞には、蛍光色素（Ｆｌｕｏ３）を含むバッファーが供給され、蛍光色素をＣＨＯ細胞に取り込ませた。この際、蛍光色素を含むバッファーの除去は行われず、蛍光色素の洗浄は行われなかった。さらに、両マイクロプレートの各ウェル内に、試験化合物の代替物として１μＭのＦＩＴＣが加えられた。【００８７】
次に、これらマイクロプレートに対応した図６に示されたようなマスキング部材が用意された。それぞれの遮光部の構造は図２に示されたような単層メッシュ構造である（ナイロン繊維製）。そして、このマスキング部材が挿入されたマイクロプレートと、マスキング部材が挿入されないマイクロプレートについて、ウェルの底面から蛍光測定が行われた。【００８８】
その結果、マスキング部材が挿入されたマイクロプレートでは、細胞由来の蛍光の検出が可能であった。一方、マスキング部材が挿入されていないマイクロプレートでは、１μＭのＦＩＴＣは非常に高い蛍光量のため、蛍光測定に用いたカメラレンジがすぐに飽和してしまい、細胞由来の蛍光の検出ができなかった。【００８９】
なお、この発明に係るマスキング部材、光測定方法、光測定用キット及び光測定用容器は、上述の実施例に限定されるものではなく、本発明を様々に変形しうることは明らかである。そのような変形は、本発明の思想及び範囲から逸脱するものとは認めることはできず、すべての当業者にとって自明である改良は、以下の請求の範囲に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
この発明に係るマスキング部材、光測定方法、光測定用キット及び光測定用容器は、創薬における化合物ライブラリーのスクリーニングなどで実施される蛍光測定に適用可能である。
【図１】
0004627529.tif 000002
【図２】
0004627529.tif 000003
【図３】
0004627529.tif 000004
【図４】
0004627529.tif 000005
【図５】
0004627529.tif 000006
【図６】
0004627529.tif 000007
【図７】
0004627529.tif 000008
【図８】
0004627529.tif 000009
【図９】
0004627529.tif 000010
【図１０】
0004627529.tif 000011
【図１１】
0004627529.tif 000012
【図１２】
0004627529.tif 000013