(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料の大腸癌の癌化を検定する方法であって、
（ａ）以下の：
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸；
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミンをその受容体基質へβ-１，３-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸
；又は
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも１５個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸；
の少なくとも１に記載の核酸を使用して、生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し；そして
（ｂ）該生物試料中の該核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること；
を含む方法。
【請求項２】
生物試料の大腸癌の癌化を検定する請求項１記載の方法であって、
（ａ）以下の：
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸；
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミンをその受容体基質へβ-１，３-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸；又は
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも１５個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸；
の少なくとも１に記載の核酸を標識してプローブとして使用し、これを生物試料にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここでハイブリダイズした核酸の標識からのシグナルに基づき該生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し；そして
（ｂ）該生物試料中の核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること；
を含む方法。
【請求項３】
生物試料の大腸癌の癌化を検定する請求項１記載の方法であって、
（ａ）配列番号１に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも１５個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸を標識してプライマーとして使用して、生物試料について核酸増幅を行い、且つ該核酸増幅産物の量を測定し；そして
（ｂ）の該核酸増幅産物の量が、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること；
を含む方法。
【請求項４】
大腸癌の癌治療に関する処置の有効性を、以下の：
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸；
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミンをその受容体基質へβ-１，３-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸；又は
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも１５個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸；
の少なくとも１に記載の核酸を使用して検査する方法であって、癌治療のための処置がなされた生物試料中の前記核酸の転写レベルを、上記核酸を使用して測定し、該測定値を、該処置前又は未処置のそれと比較することにより、該生物試料への該処置が有効であるか否かを判断することを含む方法。
【請求項５】
既に癌化している生物試料を使用し、癌治療のための処置がなされた該生物試料中の前記核酸の転写レベルが、該処置前又は未処置のそれを有意に下回る場合に、該生物試料への該処置が有効であると判断することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
生物試料が、非ヒトモデル動物のｉｎ  ｖｉｖｏ生物試料である、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
生物試料が大腸又は末梢血由来の試料である、請求項１〜６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３記載の大腸癌の癌化検定の方法で用いる、以下の：
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸；
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミンをその受容体基質へβ-１，３-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも１５個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸；
の少なくとも１を含む、組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物を含む、大腸癌のための癌マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な核酸、癌化検定用の該核酸、及び生物試料中の該核酸の発現量が異なることに基づく該生物試料の癌化を検定する方法、並びに新規な糖転移酵素及びこれをコードする核酸等に関する。
【背景技術】  近年、生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。例えば、血液型を決定する因子は糖タンパク質であり、また神経系の働きに関与しているのは糖脂質である。従って、糖鎖を合成する働きのある酵素は、様々な糖鎖がもたらす生理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
糖の中でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）やＤ−ガラクトース残基（Ｇａｌ）等はグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、スフィンゴ糖脂質、ムチン型糖鎖、アスパラギン結合型糖鎖（Ｎ結合型糖鎖）など様々な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
例えば、ＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＮ−アセチルグルコサミン酵素は、表１に示す通り、少なくとも２０種類知られており、各々、受容体基質特異性が異なる（文献１〜１８）。
他方、糖鎖合成は癌化において非常に良く変化することが知られており、癌の転移や悪性度と相関することが知られている（文献３０〜３２）。また、各種組織における発現プロファイル等の解析など、今日盛んなそれらの網羅的研究は、癌化メカニズムの解明にも向けられており、癌化のメカニズムが特定遺伝子の発現量と関与し得ることはたびたび議論されてきた。癌診断検査法として、血中癌マーカー等の検査、その他の癌化に関与する遺伝子産物等の同定などが既に行われていることは周知のとおりである。癌マーカーの中には、糖鎖に対する抗体も多く含まれる。とりわけ、癌遺伝子産物に対する免疫学的検定は、感度が高いという利点からたびたび採用されてきた。
0004608694.tif 000002
0004608694.tif 000003
文献
文献３０：Ｋｏｂａｔａ  Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５，２０９（２），４８３−５０１，１９９２
文献３１：Ｓａｎｔｅｒ  Ｕ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｓｅｐ，４４（９），３７３０−５，１９８４
文献３２：Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｎ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４５５（２−３），２８７−３００，１９９９
上述のように癌化に何らかの関与を持つ遺伝子産物の同定により、癌診断上有用な癌マーカーが提供されると期待されている。なかでも、癌化検定に際して転写産物中に見出される核酸を指標とすることができれば、その最終産物、例えばタンパク質の機能解明を待つまでもなく、特定遺伝子の転写産物の同定のみで十分に癌化検定に有用な指標を提供できる。特に核酸の同定は、ＤＮＡマイクロアレイ上で行うこともできるし、微量でもそれをＰＣＲで増幅して定量することも可能であるから、免疫学的検定法にはない利点も有する。
他方、生体内での糖鎖の働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要がある。そのために新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することについての要請も高まっている。
【発明の開示】
上記課題に鑑み、本発明の目的は、癌化に伴ってその転写レベルが有意に変化する癌マーカー核酸、これを標的とした癌化検定用の核酸、及び該核酸を用いた癌化の検定方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、上記癌化の指標として注目される特定遺伝子の解析に伴い、ヒトの新規な糖転移酵素タンパク質をコードする核酸、及び該新規な糖転移酵素タンパク質を提供することにある。本発明の糖転移酵素タンパク質は、特に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを受容体基質へβ１，３結合で転移する活性を有するβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質である。
本発明のまた別の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換体、さらに、当該形質転換体を生育させて、当該タンパク質を単離する方法を提供することにもある。
【図面の簡単な説明】  図１は、様々なヒト組織におけるＧ９転写産物の定量的リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示す。Ｇ９及びＧＡＰＤＨ（グルセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）についての検量線は各々のプラスミドＤＮＡの段階的希釈により得られた。Ｇ９転写産物の発現レベルは、同じｃＤＮＡにおいて測定されたＧＡＰＤＨに調整した。データは３回の実験から得たもので平均値±Ｓ．Ｄ．として示した。
図２は、Ｇ９ポリペプチドの活性について反応液の緩衝剤とｐＨ依存性及び金属イオン依存性を示す。図２ＡにおいてｐＨの活性への効果がカコジル酸塩（黒角）及びＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジシ−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）緩衝剤（黒円）でアッセイされた。図２Ｂにおいて２価陽イオンの効果が様々な濃度のＭｎＣｌ２（黒円）、ＣａＣｌ２（黒角）、ＭｇＣｌ２（黒三角）、ＺｎＣｌ２（白円）、ＮｉＳＯ４（白角）、及びＣｄＳＯ４（白三角）でアッセイされた。
図３は、２−アミノピリジン化オリゴ糖（Ｎ−グリカン）を受容体基質として用いた場合の活性測定の結果を示す。ＮＤは非検出を示す。
図４は、α１−酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、オボアルブミン、及びオボムコイドを受容体基質として用いた場合の活性測定を示す電気泳動写真である。酵素と基質の反応混合物は、グリコペプチダーゼＦで処置しないか（−）又は処置し（＋）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた。ゲルはＣＢＢ（クマシ−ブリリアントブルー）で染色するか（上の写真）又はオートラジオグラフィーにかけた（下の写真）。
発明の詳細な説明
本発明者等は、目的とする酵素と類似した作用を有する酵素遺伝子の塩基配列を基に、配列相同性が高いと思われる目的とする核酸の単離と精製を試みた。具体的には、まず、公知の糖転移酵素であるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の配列をクエリーとしてＢＬＡＳＴ検索を行い、その結果、相同性を有する配列としてゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＣ０１１４６２）を見出した。
さらに、ＰＣＲでタンパク質をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列（配列番号１）及び推測アミノ酸配列（配列番号２）を決定した。配列番号１の塩基配列を有する遺伝子をＧ９遺伝子、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をＧ９タンパク質と命名した。これにより、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを発見し、さらに、癌化した組織において、前記核酸の発現の有無又はその発現量が健常組織と異なることを見出し、本発明を完成した。本発明者らは、さらに、本発明で得られた核酸を遺伝子工学的に発現し、組換えタンパク質を産生させた。本願発明のタンパク質の活性を確認したところ、供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを受容体基質へβ１，３結合で転移する活性を有するβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質であることが明らかになった。
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも１５個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる。
本発明の核酸は、典型的にはプローブまたはプライマーである。また本発明の核酸は、癌マーカでもあり得る。
本発明はまた、生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）前記何れかに記載の核酸を使用して、生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し；そして
（ｂ）該生物試料中の該核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること
を含む方法に関する。
本発明による検定方法の好ましい態様によれば、その生物試料の癌化を検定する方法は、
（ａ）前記何れかに記載の核酸を標識されたプローブとして使用し、これを生物試料にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここでハイブリダイズした核酸の標識からのシグナルに基づき該生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し；そして
（ｂ）該生物試料中の核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること
を含む。
本発明による検定方法の好ましい他の態様によれば、その生物試料の癌化を検定する方法は、
（ａ）標識された前記プライマーを使用して、生物試料について核酸増幅を行い、且つ該核酸増幅産物の量を測定し；そして
（ｂ）の該核酸増幅産物の量が、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること
を含む。
さらに、本発明による検定方法の別の態様によれば、本発明の核酸を使用して、癌治療に関する処置の効果を検査することもできる。
本発明により癌治療に関する処置の有効性を検査する方法は、癌治療に関する処置の有効性を検査する方法であって、癌治療のための処置がなされた生物試料中の前記核酸の転写レベルを、本発明によるいずれかの核酸を使用して測定し、該測定値を、該処置前又は未処置のそれと比較することにより、該生物試料への該処置が有効であるか否かを判断することを含む方法である。
本発明による上記処置の有効性を検査する方法の好ましい態様には、既に癌化している前記生物試料を使用し、癌治療のための処置がなされた該生物試料中の前記核酸の転写レベルが、該処置前又は未処置のそれを有意に下回る場合に、該生物試料への該処置が有効であると判断することを含む方法が含まれる。
なお、上記処置の有効性を検査する方法を適用し得る生物試料には、非ヒトモデル動物のｉｎ  ｖｉｖｏ生物試料のほか、組織、細胞等（ヒトを含む）由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物試料が含まれる。また、本発明による上記各方法を適用し得る生物試料は、典型的には大腸又は末梢血由来の試料である。
本発明の他の側面において、配列番号１の塩基配列は、既知の遺伝子であるヒトのβ１，３ＧｌｃＮＡｃ転移酵素２及びβ１，３Ｇａｌ転移酵素６と３１％の相同性があり、保存されているモチーフはβ１，３Ｇａｌ転移酵素に近い。また、マウスのβ１，３ＧｌｃＮＡｃ転移酵素１とは６０％の相同性がある。さらに、配列番号２の推測アミノ酸配列は、そのＮ末端に糖転移酵素の特徴である疎水膜貫通領域を有する。
上記の観点から、配列番号１の核酸配列は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移させて、β１，３結合で糖鎖を合成するヒトの新規な糖転移酵素をコードしていると推測され、そして、実際に生物活性を有する酵素タンパク質が単離・精製され、特定の活性が確認された（実施例４及び５）。
また配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、新規な糖転移酵素の活性を有するので、この新規なタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする核酸を提供することは、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのに貢献するであろう。
すなわち、本発明は、糖供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を糖受容体基質にβ１，３結合で転移する糖転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸にも関する。典型的な糖供与体基質は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであり、少なくともＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ糖鎖残基を受容体基質とする。
したがって本発明は、供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを受容体基質へβ１，３結合で転移する活性を有するβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質にも関する（「β」は糖環１位のグリコシド結合のアノマーのうち、シスのものを示す）。
また本発明の糖転移酵素タンパク質には、下記の性質（ａ）−（ｃ）：
（ａ）受容体基質の特異性
少なくともＢｚ−β−ラクトシド及び／又はＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ基に対し、有意な転移活性を有する
（「Ｂｚ」はベンジル基を示し、「Ｇａｌ」はガラクトース残基を示し、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を示し、「β」は糖環１位のグリコシド結合のアノマーのうち、シスのものを示す）；
（ｂ）反応ｐＨ
中性又はその付近での活性が高い；又は、
（ｃ）二価イオンの要求性
前記活性は、少なくともＭｎ２＋又はＣｏ２＋の存在下で増強される；
の少なくとも一つを有するものが含まれる。
特に、本発明の糖転移酵素タンパク質には、４つのＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ基を有するＮ結合型糖鎖を持つ受容体基質に有意な活性を有するものが含まれる。
また、本発明の糖転移酵素タンパク質の態様には、下記（Ａ）〜（Ｃ）の何れか１つの配列を有するものが含まれる：
（Ａ）配列番号２、配列番号１６又は配列番号１７の何れか１つのアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２、配列番号１６又は配列番号１７の何れか１つのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列；又は
（Ｃ）配列番号２、配列番号１６又は配列番号１７の何れか１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列。
さらに他の側面において本発明は、上記いずれかの態様のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸にも関する。
本発明の糖転移酵素タンパク質をコードする核酸の態様には、配列番号１に記載の塩基配列全長、その中の塩基番号７６〜１１９４の塩基配列、その中の塩基番号９７〜１１９４の塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を含むものが含まれる。そのような核酸はＤＮＡであり得る。
更なる他の側面において本発明は、上記のように糖転移酵素タンパク質をコードする核酸を含むベクター、及び該ベクターを含む形質転換体にも関する。さらに本発明は、β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質の製造方法であって、前記形質転換体を生育させ、前記糖転移酵素タンパク質を発現させ、該形質転換体から該糖転移酵素タンパク質を回収することを含む製造方法にも関する。
更なる他の側面において本発明は、上記いずれかの態様のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質を認識する抗体を提供することもできる。
また、本発明の核酸が新規糖転移酵素タンパク質をコードするとの知見は、癌組織における該糖転移酵素タンパク質の発現量が健常組織よりを上回っていることを示唆する。よって、生物試料中に発現している本発明のタンパク質を検出又は定量し、対照の健常生物試料中のそれと比較することにより、該生物試料の癌化を検定することも可能であろう。
したがって本発明は、生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の本発明の新規糖転移酵素タンパク質を検出又は定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質のそれを有意に上回る場合には癌化していると判断する工程を含む方法にも関する。
ここで新規糖転移酵素タンパク質を検出するためには、糖転移酵素タンパク質を特異的に認識する抗体を使用することが例示される。
発明を実施するための好ましい形態
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）癌化に関与する本発明の核酸
本発明者らは、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸が発現していない健常組織、例えばヒト大腸組織では、その癌化により該核酸の発現が確認されること、及び、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸が一般に発現している健常組織、例えば大腸癌患者の末梢血では該核酸の発現量が健常人と比較して有意に増大することを発見した。
したがって、配列番号１の塩基配列又はその相補的配列からなる核酸は、生物試料中の転写産物に対する検査において有用な癌マーカーとして着目される。本発明によれば、この癌マーカー核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし得る核酸が提供される。
本発明によるプライマー又はプローブは、典型的には、配列番号１の塩基配列を有する核酸に由来する天然のＤＮＡフラグメント、配列番号１の塩基配列を有するように合成されたＤＮＡフラグメント、又はそれらの相補鎖である。
特に該癌マーカー核酸は、ＢＬＡＳＴ検索を介して突き止めたもので、それは構造遺伝子をコードするｍＲＮＡとして転写されている。通常、そのＯＲＦ全長またはその部分が試料中に存在し得る。この見地から、該核酸を標的とするプライマー又はプローブとして、配列番号１の塩基配列のＯＲＦ全域から、所望の標的配列を選択することができる。本発明のプライマー又はプローブは、配列番号１の塩基配列中の部分配列であることもできる。
上記のようなプライマー又はプローブを用いて、後述のように生物試料中の該標的核酸を検出し及び／又は定量することができる。また、ゲノム配列等も標的となりうるので、本発明の核酸を、医学研究用又は遺伝子治療用のアンチセンスプライマーとして提供されることもできる。
本発明のプローブ
本発明の核酸をプローブとして使用する場合、その核酸は、配列番号１の塩基配列から選ばれる１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上のオリゴヌクレオチド若しくはその相補鎖であるか、或いは、最長でそのＯＲＦ領域（塩基番号１−１１９１）の全長、即ち、１１９１塩基のｃＤＮＡ若しくはその相補鎖である。
特に本発明のプローブは医学研究用の試薬又は診断薬として広く有用である。一般に核酸はあまり分子量が大きいと取り扱いが困難となり、この見地からは、プローブの好ましい塩基長として、５０〜５００塩基、より好ましくは６０〜３００塩基も例示される。
なお、採用される塩基長及びハイブリダイズ条件等に依存するが、比較的短鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列と１又は数個の塩基、特に１又は２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。また、比較的長鎖のｃＤＮＡプローブは、配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列と５０％以下、好ましくは２０％以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。
また、本発明の核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合、その塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、その塩基長及び採用されるハイブリダイズ条件に依存するが、配列番号１に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と１又は数個の塩基、特に１又は２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、１５塩基長もあれば、ストリンジェントな条件下で該標的核酸に対して特異的にハイブリダイズし得ることを理解されるべきである。当業者は、オリゴヌクレオチドプローブ設計に関する公知の各種ストラテジーに従い、配列番号１の塩基配列から適切な少なくとも１５塩基の部分配列を選択することができる。また、配列番号２のアミノ酸配列情報は、プローブとして適切と思われるユニークな配列を選定するのに役立つであろう。
ここでストリンジェントな条件下とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
上記のように、当業者であれば、当該技術分野において公知の各種プローブ設計法及びハイブリダイゼーション条件に関する技術常識、並びに通常用いられる実験手段を通じて得られるであろう経験則を基に、選択されたプローブに適切な中程度又は高程度にストリンジェントな条件を容易に見つけ出し、実施することができる。
また、本発明のプローブには、標的配列とハイブリダイズした該プローブを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。本発明による標識プローブの一例は、配列番号６の塩基配列（配列番号１中の塩基番号４８５−５０２の相補鎖に相当する）からなるオリゴヌクレオチドである。この標識プローブは、標的核酸のＰＣＲ産物を確認又は定量するために使用し得る。また、本発明の標識プローブは、診断用ＤＮＡプローブキット等に組み込まれてもよいし、ＤＮＡマイクロアレイ等のチップ上に固定されてもよい。
本発明のプライマー
本発明の核酸をプライマーとして使用する場合、その核酸は、オリゴヌクレオチドである。具体的には、配列番号１の塩基配列のＯＲＦ領域から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２１塩基以上であり、５０塩基以下であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−７０％であること；
選択された２つの領域と同じ塩基配列若しくはそれら領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造してもよいし、その塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造してもよい。本発明のプライマーは、配列番号１のＯＲＦ領域中の部分配列と完全に相補的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
本発明による一対のプライマーの例は、配列番号４に記載の塩基配列（配列番号１中の塩基番号４５０−４６９の相補鎖に相当する）からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号５に記載の塩基配列（配列番号１中の塩基番号５３１−５４９の相補鎖に相当する）からなるオリゴヌクレオチドである。
ＰＣＲにより増幅させた標的核酸を定量するには、使用された一対のプライマーの間に位置する塩基配列から選択されるプローブを使用できる。ＰＣＲ産物を検出するための標識プローブの例は、配列番号６に記載の塩基配列（配列番号１中の塩基番号４８５−５０２の相補鎖に相当する）からなるオリゴヌクレオチドである。
（２）本発明による癌化の検査方法
本発明の癌化検査方法により、生物試料の転写産物中の標的核酸の転写レベルを測定することができる。その測定の結果は、対照の健常生物試料についての結果と比較される。それら結果の間に有意な差違がある場合に、該生物試料は癌化した組織であると判断することができる。
また、この検定法において、対照とされる健常組織についての検出結果は、健常生物試料に関する既知データを基に予め一般化された閾値を、対照の検出結果として利用しても差し支えない。例えば、末梢血の検査のように同一患者から健常組織を得られない場合は、健常者から測定された平均値との比較が行われる。
ここで癌化していると判断されるべき有意な差違とは、例えばヒト大腸癌患者からの末梢血におけるように健常組織で該標的核酸が発現しているなら、被検組織中の該標的核酸の実質的な存在（即ち、有意な濃度）が確認されること、或いは、例えば大腸癌組織におけるように健常組織で一般に発現しているなら、被検組織中の該核酸濃度が健常組織のそれを有意に上回っていること、好ましくは被検組織の健常組織に対するその濃度比で１．５倍以上、より好ましくは２倍以上であることをいう。
本発明による癌化検査方法には、典型的にはハイブリダイゼーション検定法及びＰＣＲ法が含まれる。
ハイブリダイゼーション検定法
本発明で使用し得るハイブリダイゼーション検定法には、例えば、生物試料から抽出された転写産物に対するサザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、又はコロニーハイブリダイゼーション法等のような当業者に周知である各種ハイブリダイゼーション検定法が含まれる。
また、標的核酸の転写量や健常組織との差違に依存するが、当該標的核酸の定量又は検出レベルの増幅が必要とされる場合、ドットブロット若しくはコロニーハイブリダイゼーション等の定量的ハイブリダイゼーション検定法、或いはそれに免疫学的検定法を組み合わせた公知の検査法を使用してもよい。
典型的なハイブリダイゼーション検定法によれば、生物試料から抽出された検核酸またはその増幅物が固相化され、標識プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識が測定される。
生物試料からの転写産物の抽出及び精製には、当業者に知られているあらゆる方法を適用し得る。生物試料から精製されてハイブリダイゼーション検定法に供されるものは、典型的には、生物試料の転写産物総体からのｃＤＮＡである。但し、当該標的核酸の実質的な検出のみをもって癌化とみなせる場合、すなわち健常組織では標的核酸が発現していないと見られる場合の被検組織については、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような、転写産物の精製等が不要な検査法を使用することが臨床検査上は実用的であろう。
核酸増幅による検査法
本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする本発明の核酸又は調製すべきその一部領域の、両端に位置する塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いて核酸増幅反応（ＰＣＲ）などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５）］、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１）］及び転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０）］およびＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
転写産物中の標的核酸は、例えば、本発明の標的核酸から選ばれる一対のプライマーを使用したＰＣＲ法を用いて検出することができる。一般に、ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、当該技術分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。
本発明のプライマー対を用い、そして上記被検核酸を鋳型として用い、ＰＣＲによる核酸増幅法を行うと、存在する被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物の存在を確認するとにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができるし、増幅産物を定量することにより被検核酸の転写レベル、すなわち濃度を知ることもできる。ＰＣＲの所定サイクル数の繰り返しにより被検核酸は所望の濃度まで増幅されるであろう。また、健常組織中の該核酸も同様にして測定される得る。また、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用するとよい。
被検核酸は、被検組織又は細胞などの生物試料から抽出された転写産物としてのｍＲＮＡ総体でも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ総体でもよい。被検核酸であるｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用してもよい。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
ＰＣＲ法で得られた増幅産物の検出又は定量は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブ、例えば、配列番号６に記載の標識プローブをハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。
また、被検組織と健常組織との間でそれら標的核酸の「濃度」を比較する場合、定量的ＰＣＲ法を使用することが好ましく、それにはキネティックス分析のためのＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法が含まれる。先だって精製される標的核酸はｍＲＮＡであるから、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は特に好適である。但し、本検定法における核酸の定量は、定量的ＰＣＲ法に限定されるものではなく、ＰＣＲ産物に対して、上述のプローブを用いたノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイのような公知の他のＤＮＡ定量法を適用し得る。
また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、検体中の標的核酸の量を定量することも可能である。特に定量的ＲＴ−ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて標的核酸を半定量することも可能である。
癌治療効果に関する検定方法
上記本発明による癌化検定法は、癌治療効果を検査する方法として使用することもできる。検査対象は、その癌治癒効果を検査すべき処置の効果であり、癌化した細胞や組織又は発癌実験モデル動物から得られる腫瘍組織等への処置の効果である。そのような処置には、抗癌剤の投与のほか、放射線治療等のあらゆる処方が含まれる。癌化した生物試料へ又は実験モデル動物の病巣へ処置が行われる。
本発明による癌治療効果の検定法によれば、目的の処置がなされた生物試料中の前記標的核酸の転写レベルが、処置前又は未処置の場合と比較される。また、処置後に転写レベルを追跡してもよい。当該処置に起因して、転写レベルが有意に下がるか、又は仕込まれた上昇が有意に抑制されるなら、該処置はその癌の治療に有効であると評価できる。
この種の検査には、癌化した組織に抗癌剤の候補物質を与えてそれが効くか否か、特に実験モデル動物中の病変組織等にそれが効くか否か、癌患者にとって新たな候補抗癌剤が有効であるか否か等の判断が含まれる。また逆に、発癌するように仕組まれた実験モデル動物において発癌が抑制されるか否か、つまり転写レベルの予期される上昇が有意に抑制されたか否かも評価の対象となる。
本明細書において、核酸の「転写レベル」又は「転写量」というときは、一定量の生物試料中の転写産物に由来する当該核酸の存在量を示す。また、核酸は定量のために増幅され又は標識のシグナルレベルを増幅され得るのであるから、測定された核酸の量は、増幅された量又は増幅されたシグナルレベルとしても記述され得る。
本明細書において、「被検核酸」又は「標的核酸」というときは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかを問わず、ｍＲＮＡやｓｉＲＮＡはもちろんのこと、ｍＲＮＡを鋳型にして得られるあらゆるタイプの核酸が含まれる。
本明細書において、「生物試料」というときは、器官、組織及び細胞、並びに実験動物由来の器官、組織及び細胞等を示すが、好ましくは組織であり、具体的には、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸、末梢血が例示される。好ましくは大腸、直腸、結腸及び末梢血であり、より好ましくは大腸及び末梢血である。また、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。また、本発明の核酸の用途には遺伝子治療も含まれる。
本発明の検定方法は、上記の通り、生物試料の癌化を検定するものであり、ここで「癌化の検定」という用語には、生物試料が発癌しているか否かについての検定のほか、悪性度が高いか否かについての検定も含まれ、医療における癌の診断、治療等に応用することができる。本明細書において使用される用語「癌」には、典型的には、悪性腫瘍全般をいい、該悪性腫瘍による疾病状態を含む。本発明検定方法は、限定されるわけではないが、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、及び結腸癌、末梢血、好ましくは大腸癌、直腸癌、及び結腸癌であり、より好ましくは大腸癌の検定に適している。
（２）新規糖転移酵素をコードする本発明の核酸
本発明はまた、上述の核酸の発見に基づき、新規糖転移酵素タンパク質の全長または断片をコードする核酸を提供する。
本発明の新規糖転移酵素をコードする核酸は、配列番号１に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸、好ましくは配列番号１中の塩基番号７６〜１１９４の塩基配列からなる核酸である。配列番号１の核酸には、配列番号２のアミノ酸配列をコードするものが含まれ、また配列番号１中の塩基番号７６〜１１９４の核酸には、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列をコードする核酸が含まれる。また、コドンの縮重によりそれらと同一のアミノ酸配列をコードする核酸も本発明に含まれる。これら核酸は、例えば癌化検定法への利用に適した核酸であることは既に述べた通りである。
本発明の新規糖転移酵素をコードする核酸は、一本鎖及び二本鎖型両方のＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学結合したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。但し、ベクターや形質転換体の調製時に安定であるとの観点から、ＤＮＡであることが好ましい。
本発明の核酸は、例えば以下の方法により調製することが可能である。
先ず公知の糖転移酵素であるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素のホモログタンパク質をコードする可能性のある候補遺伝子を検索し、そのアミノ酸（ポリペプチド）配列を決定する。すなわち、遺伝子データベースからＢＬＡＳＴ等のプログラムを利用してβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子と相同性のある遺伝子を検索すれば、そのホモログタンパク質をコードするものと考えられるヒトゲノムＤＮＡ配列（ＡＣ０１１４６２：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＣ−４３５Ｍ１０）およびＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ，ＡＷ４４４７１３）配列などが見出される。
上記のようにして見出された核酸の相補配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてｃＤＮＡライブラリーなどから常法に従って核酸増幅反応を行うことで、本発明の核酸を調製することができる。例えば、ＰＣＲ産物として約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離することができる。
また、推定アミノ酸配列（配列番号２）によれば、Ｎ末端に膜貫通領域を有することが予測されるので、この膜貫通領域を有しないポリペプチドをコードする塩基配列の領域を調製するとにより、可溶化形態のポリペプチドをコードする本発明の核酸も得ることができる。実際に発明者の実験により、そのアミノ酸配列のＮ末側から２６ないし３３番目までを除去して、目的の酵素活性を有するポリペプチドを作製できたことから、配列番号１中の塩基番号７６〜１１９４又は塩基番号９７〜１１９４の塩基配列からなる核酸は、酵素タンパク質の活性ドメイン領域をコードする領域を含むと考えられる。
また、上記ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号１に記載の塩基配列に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％以上、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらになお好ましくは少なくとも％以上、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の核酸は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸であり、配列番号１に記載の塩基配列だけでなく、同様の活性、機能、特性等を有するタンパク質（又はその部分）をコードする核酸であれば、本発明の範囲に含まれる。本発明のタンパク質の活性、特性等については、後述の「（５）本発明のＧ９酵素タンパク質」に詳述してある。本発明の核酸は、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸、β１，３ＧｌｃＮＡｃ転移酵素２遺伝子と最も高い同一性を有し、両者の同一性は全長で３１％、活性ドメイン（本発明の配列番号１７に相当）で５１％である。よって、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも５５％同一であり、同様の性質を有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸は本発明の範囲に含まれる。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９７９に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
（３）本発明のベクター及び形質転換体
本発明によれば、単離した上記核酸を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに該核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＴＢ１、ＬＥ３９２、又はＸＬ−ＬＥ３９２又はＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、本発明の酵素を発現させたい宿主細胞に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明による発現ベクターは、上記核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに該核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いることもできる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＲクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
本発明の上記発現ベクターを宿主細胞に組み込めば、形質転換体を得ることができる。上記宿主細胞は、真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であってもよい。本発明の形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、本発明の核酸はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。ほ乳類細胞としては、具体的には、マウス由来、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
（４）本発明による酵素タンパク質の単離・精製
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明に係る酵素タンパク質は、例えば、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、ＮａＣｌ、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明に係るタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
本発明に係るタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明に係るタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明によるタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、そのタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明に係るタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
本発明に係る酵素タンパク質を、糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、所定の糖残基が転移される。従って、本発明に係る酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明による酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。またこの酵素が合成する糖鎖構造は癌細胞で増加していると考えられ、この糖鎖に対する抗体は癌マーカーとして使用可能であると考えられる。糖鎖に対する抗体ではＣＡ１９−９などが癌マーカーとして有用であることが周知である。同様に腫瘍抗原となりうる糖鎖構造をＧ９を使用して合成することができる。
本発明の発現ベクターは、上記のような酵素の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に、酵素活性を有するポリペプチドと標識ペプチドとの融合タンパク質の形態で発現するように構築した本発明による発現ベクターを用いて遺伝子工学的に当該酵素を調製すれば、単離・精製は容易であろう。
上記識別ペプチドの例としては、本発明に係る酵素を遺伝子組み換えによって調製する際に、該識別ペプチドと酵素活性を有するポリペプチドとが結合した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体の生育物から本発明に係る酵素の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような識別ペプチドとしては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６乃至１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明に係る酵素の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号６）との融合タンパク質として本発明に係る酵素を得るのが、取扱面で極めて優れているため好ましい。上記ＦＬＡＧペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２（これを参照することにより本願明細書の開示に組み込む）に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１エハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ  ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として本発明に係る酵素を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（シグマ社製）ある。また、昆虫細胞で発現可能なベクターとしては、ｐＦＢＩＦ（ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）にＦＬＡＧペプチドをコードする領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照）等が例示されるが、当業者であれば、当該酵素の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
（５）本発明のＧ９酵素タンパク質
上述のように遺伝子工学的手法に基づき、本発明の配列番号１のＧ９核酸を用いて持定の酵素活性を有するポリペプチドを単離及び精製することができる。
第１に、上記の観点から、本発明のタンパク質の典型的な態様は、配列番号１の核酸配列から推定される配列番号２のアミノ酸配列を有するＧ９酵素タンパク質である。この酵素タンパク質は、具体的には下記の活性を有する。
触媒反応
その供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をその受容体基質へβ１，３グリコシド結合で転移させ、糖鎖を合成することができる。
供与体基質特異性：
前記Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質には、この糖残基を有する糖ヌクレオチド、例えば、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）アデノシン二リン酸−Ｎ−グルコサミン（ＡＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、及びシチジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）等が含まれる。典型的な供与体基質は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃである。
受容体基質特異性（表５参照）：
典型的な受容体基質としては、ｐＮｐ−α−Ｇｌｃ、ｐＮｐ−β−Ｇｌｃ、ｐＮｐ−α−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮｐ−β−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮｐ−α−Ｇａｌ、ｏＮｐ−β−Ｇａｌ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ、ｐＮｐ−α−Ｘｙｌ、ｏＮｐ−β−Ｘｙｌ、ｐＮｐ−α−Ｆｕｃ、Ｂｚ−α−Ｍａｎ、Ｂｚ−α−ＭａｎＮＡｃ、Ｂｚ−β−ラクトシド、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ＢＺ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−ｐＮｐのうち、Ｂｚ−β−ラクトシド及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−ｐＮｐに対して有意な活性を示し、特にＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−ｐＮｐに対して強い活性を示す。
なお本明細書において、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を示し、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＭａｎＮａｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン残基を示し、「Ｇｌｃ」はグルコサミン残基、「Ｍａｎ」はマンノース残基、「Ｇａｌ」はガラクトース残基、「Ｂｚ」はベンジル基を示し、「ｐＮｐ」はパラニトロフェニル基を示し、「ｏＮｐ」はオルトニトロフェニル基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。また「α」及び「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す）。
したがって、本発明のＧ９酵素タンパク質は、例えば次式の反応を触媒する。
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−Ｒ  →
ＵＤＰ＋ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−Ｒ
（Ｒは、当該ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、又は多糖等である）
また本発明のＧ９酵素タンパク質は、オリゴ糖（例えば２アミノピリジン化オリゴ糖）或いはオリゴ糖残基を有する糖タンパク質に対し、前記転移活性を示す。特にＮ結合型糖鎖の非還元末端に前記オリゴ糖鎖残基を４本鎖で有する基質に対し有意に強い活性或いは選択的に有意な活性を示す（図３及び図４参照）。
至適緩衝液及び至適ｐＨ（図２Ａ参照）：
カコジル酸ナトリウム緩衝液とＨＥＰＥＳ緩衝液のいずれにおいても上記触媒作用を有する。概して中性又はその付近での活性が高い。各緩衝液での活性のｐＨ依存性については、カコジル酸ナトリウム緩衝液ではｐＨ６．４〜７．２の中性域でｐＨが大きくなるに伴って活性が上昇し、ＨＥＰＥＳ緩衝液ではｐＨ７．０付近で最大の活性を示す。
二価イオンの要求性（図２Ｂ参照）：
ヒトＧ９タンパク質の活性は、二価の金属イオンのうち、少なくともＭｎイオン又はＣｏイオンの存在下で有意に増強され、特にＭｎイオンでは顕著に増強される。これらの増強活性は、イオンの低濃度域で急速に上昇し、それ以降は漸次低下する。また、ＣｄイオンやＮｉイオンでは低濃度域で僅かな増強効果があるが、ＭｇイオンやＺｎイオンでは増強効果が実質的に見られない。また通常、糖転移酵素のうち二価イオンを要求するものの多くは、Ｍｎイオンの存在下で反応が増強される。
上述のように本発明のＧ９酵素タンパク質は、上記所定の酵素反応条件下でＧｌｃＮＡｃ残基を特定の糖鎖にβ１，３グリコシド結合で転移させることができるので、糖タンパク質などの糖鎖合成ないし修飾反応に有用である。
第２に、本明細書において、上記酵素タンパク質の１次構造を代表する配列番号２に記載のアミノ酸配列が開示されたことで、これらアミノ酸配列に基づき当該技術分野の周知の遺伝子工学的手法により産生され得るあらゆるタンパク質（以下、「変異タンパク質」ないし「修飾タンパク質」とも記述する）が提供される。すなわち、本発明の酵素タンパク質は、当該技術分野の技術常識によれば、配列番号２の推定アミノ酸配列からなるタンパク質のみに限定されず、下記で説示されるように、例えば、アミノ酸配列Ｎ末端側等が部分的に欠失した不完全長のポリペプチドからなるタンパク質、或いはそれらアミノ酸配列に相同なタンパク質であって、当該タンパク質の生来的な特性を有するタンパク質をも含まれると意図される。
先ず、本発明のヒトＧ９酵素タンパク質は、後述の実施例で得られたように、好ましくは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列（配列番号２中のアミノ酸番号２６からＣ末端までのアミノ酸配列）、より好ましくは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列（配列番号２中のアミノ酸番号３３からＣ末端までのアミノ酸配列）であり得る。
また、一般に酵素のような生理活性を有するタンパク質においては、上記アミノ酸配列のうち、１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持され得ることは周知である。また、天然産のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１個〜複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することも知られている。この観点から、本発明のタンパク質には、配列番号２、１６又１７に示される各アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、上記所定の酵素反応条件下でＧｌｃＮＡｃ残基をＧａｌ残基にβ１，３グリコシド結合で転移する活性を有する変異タンパク質も含まれる。さらに、前記修飾タンパク質としては、配列番号２に示される各アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
上記において「複数個」とは、好ましくは１〜２００個、より好ましくは１〜１００個、さらにより好ましくは１〜５０個、最も好ましくは１〜２０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保持される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個である。
また、本発明の修飾タンパク質には、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換で得られる修飾タンパク質が含まれる。すなわち、一般に同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入して所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、そのようにして得られた修飾タンパク質は元来のタンパク質と同様の性質を有することが多い。この観点から、そのようにアミノ酸置換された修飾タンパク質も本発明に含まれる。
また、本発明の修飾タンパク質は、上述した通りのアミノ酸配列を有し且つ目的酵素に生来的な酵素活性を有するものであれば、当該ポリペプチドに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。
また、本発明の相同タンパク質の範囲を特定するに当たり、本発明のアミノ酸配列についてＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）による同一性検索を行うと、そのアミノ酸配列は、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２タンパク質と最も高い同一性を有し、両者の同一性は全長で３７％、活性ドメイン（配列番号１７に相当）で３９％であることが分かる。この観点から、本発明の相同タンパク質として好適なアミノ酸配列は、概して、配列番号２、１６又は１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性、より好ましくは少なくとも５０％の同一性、特に好ましくは少なくとも６０％の同一性を有するとよい。これら同様の性質を有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質は本発明の範囲に含まれる。
なお、前記ＧＥＮＥＴＹＸは、核酸解析、タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフトウェアであって、通常のホモロジー解析やマルチアラインメント解析の他、シグナルペプチド予測やプロモーター部位予測、二次構造予測が可能である。また、本明細書で用いたホモロジー解析プログラムは、高速・高感度な方法として多用されているＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４３５−１４４１（１９８５））を採用している。
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５．３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２４４４−２４４８（１９８８））に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた使用可能である。
第３に、本発明の単離されたタンパク質は、後述のように、これを免疫原として動物に投与することによって該タンパク質に対する抗体を作製することができる。そのような抗体を用いて免疫測定法により当該酵素を測定、定量することができる。従って、本発明は、そのような免疫原の作製にも有用である。この観点からは、本発明のタンパク質には、抗体形成を引き出すための抗原決定基又はエピトープを含む、該タンパク質のポリペプチド断片、変異体、融合タンパク質なども含まれる。
（６）本発明に係るタンパク質を認識する抗体
本明細書において、本発明の核酸によりコードされる糖転移酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該糖転移酵素タンパク質に特異的に結合する。したがって、上述のような、配列番号２、１６又は１７のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
したがって、本発明の１つの側面は、本発明の核酸によりコードされる糖転移酵素タンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明に係る糖転移酵素タンパク質のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、産生することが可能である。
前記糖転移酵素タンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０を参照されたい。
本発明の糖転移酵素タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を該糖転移酵素タンパク質で免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
本発明に係るモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
本発明に係る抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで、前記糖転移酵素タンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への前記糖転移酵素タンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明に係る酵素から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
こうした抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用するか、又はｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明の糖転移酵素タンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、ほ乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
（７）マウスＧ９の発見、及び遺伝子操作動物の作製
上記ヒトＧ９の発見に伴い、本発明者は、遺伝子データベースからＢＬＡＳＴ検索等を用いて検索した結果、ヒトＧ９のマウスオーソログの存在を突き止めた（配列番号１８〜２０）。
マウスＧ９核酸は、全長で１８４５塩基長の配列（配列番号１８）中に１１７０塩基長のＯＲＦ（配列番号１９）として見出された。このＯＲＦには３８９個のアミノ酸残基からなるマウスのβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）がコードされていると推定される。本願明細書においてヒトＧ９に関してなされたあらゆる検討及び考察は、マウスＧ９についても同様に適用され得る。
本発明は、上記マウスＧ９の発見に基づき、受精卵やＥＳ細胞を用いた各種遺伝子変換技術に基づく動物個体レベルでのＧ９の発現・機能解析の手段、典型的にはＧ９遺伝子を導入したトランスジェニック動物、及びマウスＧ９を欠損させたノックアウトマウスをも提供する。
例えば、ノックアウトマウスの作製は、当該技術分野における常法に従って行うことができる（ジーンターゲティングの最新技術  八木健編集  羊土社：ジーンターゲティング  野田哲生監訳  メディカル・サイエンス・インターナショナル社等を参照すればよい）。すなわち、当業者であれば、本願において開示されたマウスＧ９核酸配列情報を利用し、公知のジーンターゲティング法に従ってｍＧ９の相同組換えＥＳ細胞を取得することができ、これを用いてＧ９ノックアウトマウスを作製することができる（実施例６参照）。
また、最近ではｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ法により遺伝子発現を抑制する方法が開発されており（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０−５５３（２００２））、このような公知の方法に従いＧ９ノックアウトマウスを作製することもできる。
Ｇ９ノックアウトマウスを提供することは、特定の生命現象へのＧ９遺伝子の関与、すなわち、当該遺伝子の重複性に関する情報のほか、当該遺伝子欠損と個体レベルでの表現型（運動、知能、感覚機能に関するあらゆるタイプの異常が含まれる）との関係、さらには発生、成長、老化といった個体のライフサイクルにおける当該遺伝子の機能の解明に役立つであろう。より詳細には、上記の方法により得られるノックアウトマウスを用いてＧ９およびｍＧ９が合成する糖鎖のキャリアの検出および生理的機能、疾患との関連等について検討することができる。例えば、ノックアウトマウスより摘出した各組織より糖蛋白質および糖脂質を抽出し、プロテオミックス等の技法（例えば二次元電気泳動、二次元薄層クロマトグラフィ、質量分析等）により野生型マウスと比較することで、合成された糖鎖のキャリアを同定できる。また、ノックアウトマウスと野生型マウスの表現系（例えば、胎児形成、発育過程、自発行動等）を比較することにより生理的機能や疾患との関連を推定することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】実施例１  本発明ＤＮＡのクローニング
遺伝子データベースから、Ｂｌａｓｔ〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）〕、ＦＡＳＴＡ法、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ法、ＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ法〔Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製〕等のプログラムを利用して、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子と相同性のある遺伝子または本酵素とアミノ酸レベルで相同性を有するタンパク質をコードする可能性のある遺伝子を検索した結果、ヒトゲノムＤＮＡ配列（ＡＣ０１１４６２：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＣ−４３５Ｍ１０）およびＥＳＴ（ＡＷ４４４７１３）配列などを見出した。この配列がコードするポリペプチドは、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素のホモログタンパク質と考えられ、これをＧ９と命名した。
以下では、特に断らない限り、遺伝子操作的手法としてモレキュラー・クローニング第２版に記載されている公知の方法を用いた。
大腸癌細胞株ｃｏｌｏ２０５よりＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で抽出し、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いたｏｌｉｇｏ（ｄＴ）法によりｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型とし、５’プライマー（配列番号３）および３’プライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は９４℃  ３０秒、６５℃  １分、７２℃  １分を２５サイクルとした。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片は制限酵素サイトとしてＯＲＦの開始コドンの５’側にＨｉｎｄＩＩＩをストップコドンの３’側にＥｃｏＲＩを有する。
このＤＮＡ断片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲＳＫＩＩ（−）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を各々制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより処理した後、反応液を混合しライゲーション反応を行うことでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲＳＫＩＩ（−）にＧ９のそのＯＲＦを導入した。反応液をエタノール沈殿法により精製した後、コンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）と混合し、ヒートショック法（４２℃、３０秒）を行い、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播いた。翌日白い単独コロニーを更に培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。
回収されたプラスミドＤＮＡに目的の核酸配列が含まれていることを確認し、塩基配列を決定した（配列番号１）。その塩基配列中の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は１１９４ｂｐであり、また予測アミノ酸配列にして３９７アミノ酸（配列番号２）からなる。そのＮ末端に糖転移酵素の特徴である疎水アミノ酸領域を有する。該核酸配列および該アミノ酸配列からなるものをＧ９と命名した。
Ｇ９が組み込まれる上記ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲＩＩ  ＳＫ（−）は、クローニング操作やシーケンシング操作をより簡便に行うために開発された多機能ベクターであり、従来のｐＵＣやＭ１３ベクターの機能以外に、様々な改良がなされている。ｐＵＣベクターと同様に、ＬａｃＺ遺伝子中にマルチクローニングサイトがあるため、インサートが入ったプラスミドを、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’やＪＭ１０９などのｌａｃＺΔＭ１５の遺伝子型を持つ大腸菌を形質転換すれば、ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌ添加プレートで白色コロニーを形成し、インサートの有無を簡単に判定できる。また、マルチクローニングサイトは、２１個の制限酵素サイトからなるポリリンカーを有するため、Ｅｘｏ／Ｍｕｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍによりデリーション変異体を作製する場合、使用する制限酵素の選択の幅が広くなっている。組み込まれたＧ９遺伝子は、ＬａｃＺオペレーター／プロモーターによって、ｌａｃＩｑ変異を持つ大腸菌内で発現を調節でき、ＩＰＴＧを培地に添加することによって、目的タンパク質を大腸菌に産生させることができる。さらに、そのマルチクローニングサイトの両側には、Ｔ３およびＴ７のプロモーターがあるので、これらのプロモーターによるＲＮＡプローブの作製も可能である。それら両プロモーター配列の両端にはＢｓｓＨＩＩサイトがあり、これを利用して挿入ＤＮＡをプロモーター配列ごと切り出すことができる。両プロモーターのプローブを利用してジーンマッピングを行うことも可能である。このようなベクターには、ｆ１ファージの複製開始領域が含まれており、ＶＣＳＭ１３やＲ４０８ヘルパーファージの感染により、一本鎖ＤＮＡを産生させ、シーケンスやＳｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓに使用できる。ヘルパーファージの感染によりアンチセンス側の鎖がレスキューされる。
実施例２  ヒト大腸癌組織における本発明ＤＮＡの発現量
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いて同一患者の正常及び大腸癌組織でＧ９遺伝子の発現量を比較した。
定量的リアルタイムＰＣＲ法とはＰＣＲにおいてセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーに加え、蛍光標識されたプローブを組合わせる方法である。ＰＣＲにより増幅する際、プローブの蛍光標識が外れて蛍光を示す。蛍光強度が遺伝子の増幅に相関して増幅するためこれを指標として定量を行う。
ヒト大腸癌組織と同一患者の正常及び大腸癌組織のＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で抽出し、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いた。ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）法によりｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型として用いて５’プライマー（配列番号５）、３’プライマー（配列番号６）及びＴａｑＭａｎプローブ（配列番号７）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）により定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、５０℃  ２分、９５℃  １０分で反応させた後、９５℃  １５秒、６０℃  １分を５０回繰り返した。得られた測定値は、個体間のばらつきを補正するため内標準遺伝子としてアプライドバイオシステムズジャパン社製のキットを用いて定量したβ−ａｃｔｉｎにより除し、ヒト大腸癌組織の測定値と、同一患者の正常及び大腸癌組織の測定値との間で比較を行った。
その結果、癌化していない組織において本発明ＤＮＡの転写産物は存在しないか測定限界以下であり、癌化した組織においては本発明ＤＮＡの転写産物が有意に存在していることが明らかとなった（表３参照）。
0004608694.tif 000004
ヒト末梢血における本発明ＤＮＡの発現量
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いて、健常者と大腸癌患者とで末梢血におけるＧ９遺伝子の発現量を比較した。
健康なボランティアおよび大腸癌患者よりＰＡＸｇｅｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ｔｕｂｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ社製）に採血した。ｔｕｂｅ内の試薬と転倒混和し、２４時間室温において反応させた後、ＲＮＡをＰＡＸｇｅｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ社製）で抽出した。Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用い、添付のｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒｓにてｃＤＮＡを合成した。このＤＮＡを鋳型として用いて、５’プライマー（配列番号４）、３’プライマー（配列番号５）及びＴａｑＭａｎプローブ（配列番号６）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）により定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、５０℃  ２分、９５℃  １０分で反応させた後、９５℃  １５秒、６０℃  １分を５０回繰り返した。得られた測定は、個体間のばらつきを補正するため内標準遺伝子としてアプライドバイオシステムズジャパン社製のキットを用いて定量したβ−ａｃｔｉｎにより除し、健常者と大腸癌患者との間で比較を行った。
その結果、健常者に比較して大腸癌患者の末梢血における本発明ＤＮＡの転写レベルは有意に上回っていることが明らかとなった。大腸癌患者のうち、健常者の平均測定値＋（標準偏差×２）を超えるものを陽性と判断する場合、大腸癌患者の陽性率は６７％であった（表４参照）。
0004608694.tif 000005
各種のヒト正常組織における本発明ＤＮＡの発現量
上記と同様にして、定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いてヒト正常組織由来の本発明ＤＮＡの発現量（ｃＤＮＡ）を比較した。これらの組織のＲＮＡはクロンテック社などにより市販されている。ｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を使用した。ただし、内部標準の検量線の作成においてはＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子を含むｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＤＮＡを用いた。Ｇ９の検量線の作成においてはクローニングしたＧ９核酸のＯＲＦを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＳＫＩＩ（−）ベクターＤＮＡを使用した。
その結果、ほとんどのヒト正常組織において本発明ＤＮＡの発現が認められる。なかでも骨髄、脾臓、小腸で比較的発現が高いが、大腸や前立腺で発現が非常に弱いか或いは実質的に発現していないことが明らかとなった（図１参照）。
実施例３  単離されたＧ９全長の発現
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＳＫｌｌ（−）にＧ９を組込んだプラスミドＤＮＡおよびｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）を各々制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにより処理した後、反応液を混合しライゲーション反応を行うことでｐｃＤＮＡ３．１（＋）にＧ９のＯＲＦを導入した。反応液をエタノール沈澱法により精製した後、配列を確認しｐｃＤＮＡ３．１（＋）にＧ９が導入されたことを確認し、これをｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｇ９とした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｇ９をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）と混合し、ヒートショック法（４２℃、４５秒）を行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。翌日単独コロニーを更に培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡに目的の核酸配列が含まれていることを確認し、塩基配列を決定した。
ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）は、広範囲な哺乳類細胞の発現用ベクターである。ｆｏｒｗａｒｄ転写用ベクターであり、発現レベルを上げるため従来のｐｃＤＮＡ３．１を改良してマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）配列からＲＮＡの二次構造を形成する可能性のある配列を除去している。ＣＭＶのエンハンサー／プロモーターがあり高いレベルでの発現が可能である。ポリアデニル化シグナルと転写終結配列によりＲＮＡが安定化される。ＳＶ４０オリジンがあるため、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原を発現している細胞で複製が可能である。大腸菌での選択用にアンピシリン抵抗性遺伝子が導入されている。また、哺乳類細胞において安定株を作製するための選択用としてネオマイシン抵抗性遺伝子が導入されている。
ヒト大腸癌由来細胞株であるＨＣＴ１５細胞を用いてＧ９発現安定株を作製するため、以下の操作を行った。ＨＣＴ１５細胞２×１０６個を抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌにて懸濁し、１０ｃｍディッシュに播き、１６時間３７℃にてＣＯ２インキュベーターで培養した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｇ９のプラスミドＤＮＡ２０ｎｇ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）３０μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）１．５ｍｌと各々混和し、室温にて５分間インキュベーションした。更に２つの液を綬やかに混和し、室温にて２０分間インキュベーションした。この混合液をディッシュに滴下し、４８時間３７℃にてＣＯ２インキュベータにて培養した。定法により細胞を継代した。このとき培地はＲＰＭＩ−１６４０（インビトロジェン社製）を用い、ウシ胎児血清および抗生物質としてペニシリン（インビトロジェン社製）、ストレプトマイシン（インビトロジェン社製）およびジェネチシン（ネオマイシン、インビトロジェン社製）を添加した。ジェネチシンを添加することによりｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｇ９が導入されていない細胞は死滅していくので、培養を続けることでｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｇ９が導入された細胞のみが生存することになる。これをＧ９発現安定株とした。
哺乳類細胞株におけるＧ９組換えタンパク質の発現
Ｇ９の組換えタンパク質を得るためにヒト腎臓由来細胞株２９３Ｔで発現させた。機能を確認するには、少なくともβ１，３ＧｌｃＮＡｃ転移酵素およびβ１，３Ｇａｌ転移酵素と比較的相同性が保たれている配列番号２中の１０５番アミノ酸からＣ末端までの活性領域を発現させれば十分であると考えられるが、ここではＧ９の２４番アミノ酸及び３３番アミノ酸からＣ末端までの２種類の予測活性領域を発現させることとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ  ＳＫｌｌ（−）にＧ９を組込んだプラスミドＤＮＡを鋳型とし、５’プライマー（配列番号８及び配列番号９）と３’プライマー（配列番号１０）を用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は９４℃  ３０秒、６５℃  １分、７２℃  １分を２５サイクルとした。そして、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。このＰＣＲ産物は制限酵素サイトとして５’側にＨｉｎｄＩＩＩ、３’側にＥｃｏＲＩを有していた。このＤＮＡ断片とｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３を各々制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにて処理した後、反応液を混合し、ライゲーション反応を行うことでｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３に導入した。反応液をエタノール沈殿法により精製した後、コンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）と混合し、ヒートショック法（４２℃、４５秒）を行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。
翌日得られたコロニーを、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認した。さらに確実を期すためシーケンシングによりＤＮＡ配列の確認をした後、ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３）を抽出・精製した。
ヒト腎臓細胞由来細胞株２９３Ｔ細胞２×１０６個を抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清入りのＤＭＥＭ培地１０ｍｌにて懸濁し、１０ｃｍディッシュに播き、１６時間３７℃にてＣＯ２インキュベーターにて培養した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｇ９の２０ｎｇ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）３０μｌを。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）１．５ｍｌと各々混和し、室温にて５分間インキュベーションした。更に２つの液を緩やかに混和し、室温にて２０分間インキュベーションした。この混合液をディッシュに滴下し、４８時間３７℃にてＣＯ２インキュベータにて培養した。
培養上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍｌ）、ＣａＣｌ２（２ｍｌ）、抗ＦＬＡＧ  Ｍ１アフィニティーゲル（シグマ社製）（１００μｌ）を混合し、４℃で一夜撹拌した。翌日遠心して（３０００ｒｐｍ  ５分、４℃）ペレットを回収し、２ｍｌのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ５分、４℃）し、ペレットを２００μｌの１ｍｌＣａＣｌ２・ＴＢＳに浮遊させ活性測定のサンプル（Ｇ９酵素液）とした。この一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（シグマ社製）を用いてウェスタンブロッティングを行い、目的とするＧ９タンパク質の発現を確認した。その結果、約４５ｋＤａの位置にバンドが検出、発現が確認された。
昆虫細胞株におけるＧ９組換えタンパク質の発現
Ｇ９の組換えタンパク質を得るためにＧ９を昆虫細胞内で発現させた。機能を確認するには、少なくともβ１，３ＧｌｃＮＡｃ転移酵素およびβ１，３Ｇａｌ転移酵素と比較的相同性が保たれている配列番号２中の１０５番アミノ酸からＣ末端までの活性領域を発現させれば十分であると考えられるが、ここではＧ９の３６番アミノ酸からＣ末端までの予測活性領域を発現させることとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ  ＳＫｌｌ（−）にＧ９を組込んだプラスミドＤＮＡを鋳型とし、５’プライマー（配列番号１１）と３’プライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は９４℃  ３０秒、６５℃  １分、７２℃  １分を２５サイクルとした。そして、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。このようにして単離したＰＣＲ産物をＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１（商標）（インビトジェン社製）へ組み込んで「エントリークローン」を作成した。
反応は上記ＰＣＲ産物２μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１  １μｌ（１５０ｎｇ）、ＢＰ反応緩衝液２μｌ、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」とも略記する）３μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ２μｌを２５℃で１時間インキュベーションして行った。その後、プロテイナーゼＫ（科研製薬株式会社製）を１μｌ加えて３７℃、１０分間インキュベートして反応を終了させた。その反応混合液１１μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシンを含むＬＢプレートに播いた。翌日コロニーを回収し、ＰＣＲ法で目的ＤＮＡが導入されていること及びその塩基配列を確認し、挿入されたベクター（ｐＤＯＮＲ−Ｇ９）を常法に従って抽出、精製した。このベクターに挿入されたＤＮＡの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列を含むことが確認された。
発現クローンの調製
上記エントリークローンは、挿入部位の両端にλファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（λファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデスティネーションベクター（ａｔｔＲを有する）とを混合することで、挿入部位がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作成された。
１μｌのエントリークローン（ｐＤＯＮＲ−Ｇ９）、０．５μｌのデスティネーションベクター（ｐＦＢＩＦ（７５ｎｇ））、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼミックス（λファージの組換え酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓを混合した溶液）２μｌを２５℃で１時間インキュベートし、プロテイナーゼＫ（科研製薬株式会社製）を１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートして反応を停止させた（この組換反応でｐＦＢＩＦ−Ｇ９が生成される）。ｐＦＢＩＦはｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロジェン社製）にＩｇκシグナル配列と精製用のＦＬＡＧペプチドとを常法に従って挿入した。さらに、ｐＦＢＩＦにＧａｔｅｗａｙ配列（ａｔｔＲ）を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて変換カセットを挿入した。この変換カセットは、発現ベクターをデスティネーションベクターに改変するためのカセットであり、ａｔｔＲ組換え部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、及び大腸菌ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅを阻害するタンパク質をコードするｃｃｄＢ遺伝子を有する。また、Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、ＦＬＡＧタグは精製を容易とするために挿入された。
ｐＦＢＩＦ−Ｇ９が含まれる反応混液（１１μｌ）とコンピテントセルである大腸菌ＤＨ５α  １００μｌとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、アンピシリンをで含むＬＢ培地に組換ＤＨ５αを蒔いて培養した。２４時間培養後、コロニーを回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミド（ｐＦＢＩＦ−Ｇ９）を抽出精製した。ＰＣＲ法で目的ＤＮＡが挿入されていることを確認した。
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）によるバクミドの調製
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−Ｇ９とバクミドとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なバクミドにＧ９の配列を挿入した。このシステムは、Ｔｎ７の組換部位を利用し、バクミドを含む大腸菌（大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（商標））に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃ（即ち、ｐＦＢＩＦ−Ｇ９）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生させる組換えタンパク質によって目的とする遺伝子（Ｇ９）がバクミドに取り込まれるシステムである。またバクミドにはＬａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的なコロニーの色（青（挿入なし）−白（挿入あり））による選択が可能である。
すなわち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−Ｇ９）５０μｌとコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ）５０μｌとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、５−ブロモインドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）、及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地に蒔き、２４時間後にバクミドに目的ＤＮＡが挿入された白い独立したコロニーを回収し、更に培養を行った後、常法に従ってバクミドを回収した。
バクミドの昆虫細胞への導入
回収したバクミドに目的ＤＮＡが挿入されていることを常法に従って確認し、バクミドを昆虫細胞（Ｓｆ２１：インビトロジェン社製）に導入した。すなわち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５個／２ｍｌに抗生物質を含むＳｆ９００ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）を添加し、２７℃で１時間細胞を接着させた。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液（Ａ溶液（１００μｌのＳｆ−９００ＳＦＭに上記バクミド５μｌを添加した混合物）とＢ溶液（１００μｌのＳｆ−９００ＳＦＭに６μｌのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加した混合物）とを丁寧に混合して３０分間程度室温でインキュベートして得た溶液）にＳｆ９００ＩＩ（インビトロジェン社製）８００μｌを添加した培養液を添加して２７℃で５時間インキュベーションした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むＳｆ９００ＳＦＭ培地２ｍｌを添加し、２７℃で７２時間インキュベートした。培養後ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収して１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「一次ウイルス液」とする）。
更にＴ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液８００μｌを添加し、２７℃で４８時間培養する。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「二次ウイルス液」とする）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液１０００μｌを添加し、２７℃で８４時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「三次ウイルス液」とする）。
さらに、Ｓｆ２１細胞を６×１０５個／ｍｌの濃度で含むＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を１００ｍｌ用スピナーフラスコに１００μｌ添加し、三次ウイルス液１ｍｌを添加し、２７℃で９６時間培養した。培養後、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「四次ウイルス液」とする）。
四次ウイルス液１０ｍｌに対し、ＮａＮ３、ＮａＣｌ及びＣａＣｌ２を加えた。終濃度はＮａＮ３を０．０５％、ＮａＣｌを１５０ｍＭ、ＣａＣｌ２を２ｍＭとする。抗ＦＬＡＧ  Ｍ１抗体アフィニティーゲル（シグマ社製）を５０μｌ添加し、４℃で１６時間緩やかに転倒混和した。遠心分離（１，０００×ｇ、３分、４℃）して上清を除去した後、１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＴＢＳ（トリス−塩酸緩衝液：ｐＨ７．４）で２回洗浄した。そして洗浄後のアフィニティーゲルを１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌに懸濁して、この懸濁液を活性測定用のＧ９酵素液とした。
実施例４  哺乳動物細胞発現系によるＧ９酵素タンパク質の作製
（１）分泌型Ｇ９ポリペプチド組換え体の作製
上記の実施例で示したように、ポリペプチドのＮ末側を欠損させて構築されたＧ９ポリペプチドは、昆虫細胞等内でタンパク質として発現可能であることが確認された。同様にしてＮ末側を欠損させ、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ９ポリペプチドとして構築されたタンパク質は、哺乳類細胞発現系により活性を有する酵素タンパクとして単離、精製することもできる。
Ｇ９核酸のＯＲＦのうち、酵素タンパク質の触媒領域と考えられる部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ  ＳＫＩＩ（−）にＧ９を組込んだプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３又は１４のいずれかの核酸配列を有する５’プライマーと、配列番号１５の核酸配列を有する３’プライマーを用いてＰＣＲ反応により得ることができた。ＰＣＲ法はＰｆｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）を用いて計５０μｌ反応液中、鋳型５ｎｇの存在下で、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分を２５サイクルとした。そしてＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。
配列番号１３の５’プライマーと配列番号１５の３’プライマーを用いたＰＣＲ反応により、配列番号１の塩基番号７６〜１１９４の核酸配列を有する組換えＤＮＡ断片が得られた。これは、配列番号２中のアミノ酸番号２６〜３９７をコードするもの、すなわち配列番号１６のアミノ酸配列をコードするものに相当する。
また、配列番号１４の５’プライマーと配列番号１５の３’プライマーを用いたＰＣＲ反応により、前記のＤＮＡ断片よりも少し短い配列の組換えＤＮＡ断片が得られた。これは、配列番号１の塩基番号９７〜１１９４であり、配列番号２中のアミノ酸番号３３〜３９７、すなわち配列番号１７のアミノ酸配列をコードするものに相当する。これら組換えＤＮＡ断片から発現したポリペプチドは、いずれも酵素活性を有していることを確認したが、以下の実験では、配列番号１３と配列番号１５のプライマーを組み合わせて得られる長い方のＤＮＡ断片を使用した。
上記のようなＧ９ポリペプチドの開始メチオニンが除去された領域にプレプロトリプシンのシグナル配列及びＦＬＡＧペプチド（Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）を付加することによりＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ９ポリペプチドの分泌発現を試みることができる。すなわち、上記プライマーにて増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＥｃｏＲ  Ｉにて消化した後にＤＮＡ精製、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ベクターのクローニング部位のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＥｃｏＲ  Ｉ間に挿入しライゲーション反応を行うことで、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｇ９を造成した。反応液をエタノール沈殿法により精製した後、コンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）と混合し、ヒートショック法（４２℃、４５秒）を行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。翌日得られたコロニーは直接ＰＣＲにより目的ＤＮＡが含まれていることが確認された。さらに確実を期すためシーケンシングによりプラスミドＤＮＡの配列の確認をした後、ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｇ９）を抽出・精製した。得られた組換えＤＮＡは、後述のように酵素タンパク質として発現させて精製することができ、その活性を確認できる。ここでコンピューター予測や、予備実験等により、おそらく触媒領域は膜貫通型でも分泌型でも同じエクソン（配列）であることが分かっており、またＮ末側は、膜貫通領域などで、とりあえずの活性の確認には必要ない領域であるため、上記のような配列部分を使用した。
前述のように作製したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｇ９プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして培養上清中にＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ９ポリペプチドを発現・分泌させた。トランスフェクトの方法はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて付属説明書に則って行った。具体的にはヒト腎臓細胞由来細胞株２９３Ｔ細胞２×１０６個を抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清入りのＤＭＥＭ培地１０ｍｌにて懸濁し、１０ｃｍディッシュに播き、１６時間３７℃にてＣＯ２インキュベータにて培養した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｇ９の２０ｎｇ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）３０μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）１．５ｍｌと各々混和し、室温にて５分間インキュベーションした。更に二つの液を緩やかに混和し、室温にて２０分間インキュベーションした。この混合液をディッシュに滴下し、４８時間３７℃にてＣＯ２インキュベータにて培養した。
なお、配列番号１６に記載の３７２個のアミノ酸残基は、上記のようにして得られたＧ９ポリペプチド部分のアミノ酸配列のうち、ＦＬＡＧ等含まない部分である。他方、同様にして得られるが少し短い配列番号１７のポリペプチド部分は、配列番号１６の配列に含まれるもので、公知のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素タンパク質との相同性などから見ても活性ドメインと考えられる領域を含む２８２個のアミノ酸残基からなる領域であり、少なくともこの領域を含むものは目的の酵素活性を示すと考えられる
（２）培養液中に分泌されたＧ９ポリペプチドの精製
上記のＧ９ポリペプチド組換え体は、ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されることになるため、抗ＦＬＡＧ  Ｍ１抗体アフィニティーゲル（シグマ社製）を用いて、容易に精製が可能である。精製された酵素タンパク質は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ１アフィニティーゲルから遊離させてもよいが、ゲルに吸着したままの酵素を使用してもよい。本実施例では、ゲルに吸着したままの酵素を用いて実験した。
上記で取得した培養上清１５ｍｌにＮａＮ３、ＮａＣｌ及びＣａＣｌ２を、それぞれ最終濃度０．１％、１５０ｍｍｏｌ／ｌおよび２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加した後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ１  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ；コスモ・バイオ社製）を１００μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
翌日遠心して（３０００ｒｐｍ５分、４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ  ５分、４℃）し、ペレットを２００μｌの１ｍＭ  ＣａＣｌ２・ＴＢＳに浮遊させ活性測定のサンプル（Ｇ９酵素液）とした。この一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（シグマ社製）を用いてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするＧ９タンパク質の発現を確認した。その結果約４５ｋＤａの位置にバンドが検出、発現が確認された。
洗浄後、該ゲルに５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で３０分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。ゲルに再度５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で１０分間処理した後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計３回溶出操作を行い、得られた溶出液には、最終濃度が４ｍｍｏｌ／ｌになるように１ｍｏｌ／ｌＣａＣｌ２を添加した。この溶出液を酵素源として使用した。
実施例５  Ｇ９酵素タンパク質の酵素活性の解析（糖脂質や合成単糖類などを基質として用いた活性測定）
配列番号２記載のアミノ酸配列を基に、他の公知の糖転移酵素と対比した結果、活性部位と考えられるＣ−末端領域の配列の保存性などから、Ｇ９は転移酵素類に分類されることが示唆された。そこで、例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＧｌｃＮＡｃ供与体基質として用いて、上記実施例４で得られたＧ９ポリペプチドを含む酵素液の酵素活性を確認することができる。
本実施例では、下記の参考文献［１］−［３］に記載の方法とほぼ同様の方法に従ってＧ９酵素の活性の測定した。
［１］Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｎ，Ｎａｔｓｕｍｅ  Ａ，Ｔｏｇａｙａｃｈｉ  Ａ，Ｅｎｄｏ  Ｔ，Ａｋａｓｈｉｍａ  Ｔ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｉｍａｉ  Ｎ，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｓ，Ｓｅｋｉｎｅ  Ｓ，Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  Ｈ，Ｓａｓａｋｉ  Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｔａ  １，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  １，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｆｅｂ  ２；２７６（５）：３４９８−５０７．：
［２］Ｔｏｇａｙａｃｈｉ  Ａ，Ａｋａｓｈｉｍａ  Ｔ，Ｏｏｋｕｂｏ  Ｒ，Ｋｕｄｏ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｓ，Ｉｗａｓａｋｉ  Ｈ，Ｎａｔｓｕｍｅ  Ａ，Ｍｉｏ  Ｈ，Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  Ｊ，Ｉｒｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｓａｓａｋｉ  Ｋ，Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  Ｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ  ｂｅｔａ  １，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｂｅｔａ  ３Ｇｎ−Ｔ５），ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＮＫ−１  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｊｕｎ  ２２；２７６（２５）：２２０３２−４０．：
［３］Ｉｗａｉ  Ｔ，Ｉｎａｂａ  Ｎ，Ｎａｕｎｄｏｒｆ  Ａ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｇｏｔｏｈ  Ｍ，Ｉｗａｓａｋｉ  Ｈ，Ｋｕｄｏ  Ｔ，Ｔｏｇａｙａｃｈｉ  Ａ，Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｙ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｈ，Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  Ｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  β  １，３−Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（β  ３Ｇｎ−Ｔ６），ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ３  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｊｕｎ  ２２；２７６（２５）：２２０３２−４０。
（１）基質特異性の検討
上記実施例で得られたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ９ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を、単糖・オリゴ糖・糖脂質・糖タンパク質を基質として既知の方法（前述の参考文献、及びＦＥＢＳ，４６２，２８９（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）など）に従って測定した。
受容体基質として、ｐＮｐ−α−Ｇｌｃ、ｐＮｐ−β−Ｇｌｃ、ｐＮｐ−α−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮｐ−β−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮｐ−α−Ｇａｌ、ｏＮｐ−β−Ｇａｌ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃ、ｐＮｐ−α−Ｘｙｌ、ｏＮｐ−β−Ｘｙｌ、ｐＮｐ−α−Ｆｕｃ、Ｂｚ−α−Ｍａｎ、Ｂｚ−α−ＭａｎＮＡｃ、ｃｏｒｅ１−α−ｐＮｐ、ｃｏｒｅ３−α−ｐＮｐ、Ｂｚ−β−ラクトシド、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−ｐＮｐを使用した（表５参照）。これら基質はシグマ社あるいはトロントリサーチケミカルズ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅａｌｓ）社などより購入することができる。
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（表５においてＮＤは検出なし。受容体基質のａはカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社、ｂはシグマ社、ｃはトロントリサーチケミカルズ社から購入した）
供与体基質に放射能ラベルされた基質を用いる場合の基本的な反応液は、１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４，１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４，０．７５ｍＭ  ＡＴＰ、５０μＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社製），４．５μＭ（５０ｎＣｉ）［１４Ｃ］ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（アマシャムバイオサイエンス社製）、１０μＭ基質（上記の受容体基質）、及び適量（５〜１０μｌ）の精製酵素タンパク質（実施例４で得られた酵素源）で計２０μｌである。酵素反応は３７℃で数時間から１６時間まで行った（通常１６時間）。
反応終了後、０．１Ｍ  ＫＣｌを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＫＣｌで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）に該上清を通し、上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。１ｍｌのＨＰＬＣ用純水にて２回カートリッジを洗浄後、１ｍｌのメタノールで吸着した基質および生成物を溶出した。液体シンチレーター（ＡＣＳＩＩ、アマシャムバイオサイエンス社製）に混和した後、シンチレーションカウンターにて生成物の放射線の量を測定した。
その結果、Ｇ９ポリペプチドは、テストされた上記受容体基質のうちＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα−ｐＮｐに最も転移活性を示し、Ｂｚ−β−ラクトシドに対しても多少転移する活性を示した（表５参照）。
（２）酵素反応条件の検討
反応液及び反応時間は上記と同様としたが、１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４の代わりにＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７５〜７．４）及びカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．４〜７．２）のバッファー条件を検討した（図２Ａ）。
図２Ａに示される通り、Ｇ９ポリペプチドは、カコジル酸ナトリウムとＨＥＰＥＳのいずれを使用しても活性を示した。概して中性又はその付近での活性が高く、カコジル酸ナトリウムではｐＨ６．４〜７．２の中性域でｐＨが大きくなるに伴って活性が上昇し、ＨＥＰＥＳではｐＨ７．０付近で最大の活性を示した。
また、糖転移酵素は金属イオンを要求するものがあるので、Ｇ９酵素の金属イオン要求性について検討を行った。反応液及び反応時間は上記と同様とし、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の代わりにＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣｄＣｌ２を使用した。各金属イオンの濃度は２．５、１０、４０ｍＭとしそれぞれの酵素反応を行った（図２Ｂ）。
図２Ｂに示される通り、Ｇ９ポリペプチドの活性は、二価の金属イオンのうち、少なくともＭｎイオン又はＣｏイオンの存在下で有意に増強され、特にＭｎイオンでは顕著に増強される。これらの増強活性は、イオンの低濃度域で急速に上昇し、それ以降は漸次低下する。また、ＣｄイオンやＮｉイオンでは低濃度域で僅かな増強効果があるが、ＭｇイオンやＺｎイオンでは増強効果が実質的に見られなかった。
また上記の結果から、上記（１）で用いた基本的な反応条件で最も活性が強く出ることが確認された。以下の実験でも同条件を用いて反応を行った。
（３）２−アミノピリジン化オリゴ糖（Ｎ−グリカン）を受容体基質として用いた場合の活性測定
基質としては、市販のＰＡ化オリゴ糖を使用した。オリゴ糖の２−ピリジルアミノ化は、常法（Ｈａｓｅ，Ｓ．Ｉｂｕｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｋｅｎａｋａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，１９７−２０３（１９８４））に従って行うことができ、ＰＡ化オリゴ糖は宝酒造、あるいは生化学工業株式会社から購入した。具体的な試験方法は下記の通りである。
１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４，５０ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４、４０ｐｍｏｌ受容体基質（ＰＡ化オリゴ糖）、及び適量（２００ｎｇ）の精製酵素タンパク質を含む計２０μｌの反応液中で３７℃、１６時間反応後、生産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；詳細は後述する）により検出した。前記精製酵素タンパク質としては、実施例４において抗ＦＬＡＧ  Ｍ１抗体アフィニティーゲルで精製された酵素を使用した。
反応が終了したアッセイ溶液を１００℃で５分間処理後、ＨＰＬＣ用純水８０μｌを加え、１０，０００×ｇで５分間遠心して上清を取得した。次いで、該上清をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通した後、その一部（４０μｌ）をＨＰＬＣに供する。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラムの使用法は付属の説明書に従って行った。
ＨＰＬＣは、カラムとしてＰＡＬＰＡＫ  Ｔｙｐｅ  Ｒカラム（タカラ社製）、溶出液として溶出液Ａ：１００ｍＭ  酢酸／トリエチルアミン（ｐＨ４．０）、溶出液Ｂ：１００ｍＭ  酢酸／トリエチルアミン（ｐＨ４．０）／０．５％  １−ブタノールを用いて５〜５５％溶出液Ｂグラジェント（０〜６０分）、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で行った。生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターＲＦ−１０ＡＸＬ（島津製作所社製）を用いて行った（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）。
この結果、Ｇ９ポリペプチドは、４本鎖のＮ−グリカン（ＰＡ−００４、ＰＡ−０１１：ＴＡＫＡＲＡのＰＡ化基質番号）に有意な活性を示した（図３参照）。これに対し、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２（β３ＧｎＴ２）は糖鎖の本数に関係なくＰＡ−００１〜００１１のタイプのＮ−グリカンに活性を示す。このことから、本実施例のＧ９ポリペプチドは、４本鎖のＮ−グリカンに有意な活性を示すが、１〜３本鎖のＮ−グリカンには有意な活性を示さないという選択的活性を有することも示唆される。なお、図３の結果においてＧ９ポリペプチドの活性をβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２のそれと比較すると比較的弱く見えるが、これはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２が非常に酵素活性の強いホモログ酵素であるからである。
（４）糖タンパク質を受容体基質として用いた場合の活性測定
糖タンパク質を基質にした酵素反応を行った。反応液は、１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４，１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４，０．７５ｍＭ  ＡＴＰ、５０μＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社製）、４．５μＭ（５０ｎＣｉ）［１４Ｃ］ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（アマシャムバイオサイエンス社製）、４０μｇ受容体基質、及び適量（５〜１０μｌ）の精製酵素タンパク質で計２０μｌとした。前記受容体基質としてはα１−酸性糖タンパク質（オロソムコイド；シグマ社製）、オボアルブミン（シグマ社製）、又はオボムコイド（シグマ社製）などを用いた。前記精製酵素タンパク質としては、実施例４において抗ＦＬＡＧ  Ｍ１抗体アフィニティーゲルで精製された酵素を使用した。
反応は３７℃で数時間から１６時間行った。反応物の一部をグリコペプチダーゼＦ（ＧＰＦ、タラカ社製）による酵素消化を説明書に従って行い、酵素消化前のサンプルと酵素消化後のサンプルをともに１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した（図４）。
その結果、Ｇ９ポリペプチドは、いずれの糖タンパク質（オボアルブミンは比較的弱い）に対してもＧｌｃＮＡｃ転移活性を示し、またＧＰＦ消化によってバンドが消失することから、これらの転移反応が各糖タンパク質のＮ−グリカン糖鎖に行われていることが確認された。
実施例６  Ｇ９ノックアウトマウスの作製
ｍＧ９遺伝子は少なくともＯＲＦはシングルエクソンであると考えられる。ノックアウトしたいｍＧ９の活性化ドメインと思われる領域、例えば、配列番号１の塩基番号９７〜１１９４の塩基配列を含む約１０ｋｂ断片を中心とした染色体断片（約１０ｋｂ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）に挿入したターゲティングベクター（ｐＢＳＫ−ｍＧ９−ＫＯｎｅｏ）を作製する。ｐＢＳＫ−ｍＧ９−ＫＯｎｅｏには薬物耐性遺伝子としてｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）をｍＧ９の予測されるＧｌｃＮＡｃ転移活性領域が欠失し、この部分がｎｅｏで置換される。こうして得られたｐＢＳＫ−ｍＧ９−ＫＯｎｅｏを制限酵素であるＮｏｔＩにて直鎖状とした後、８０μｇをＥＳ細胞（Ｅ１４／１２９Ｓｖマウス由来）にトランスフェクション（エレクトロポレーション等）し、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択する。Ｇ４１８耐性コロニーを２４ウェルプレートに移し、培養を行う。細胞の一部を凍結保存した後、残りのＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより組み換えが起こっているクローンを１２０コロニー程度選択する。さらに、ＰＣＲとサザンブロッティング等により組み換えが予定通り起こっているかの確認を行い、最終的に組み換え体を１０クローン程度選択する。選択したうちの２クローンのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞内に注入する。ＥＳ細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させる。その後、ジャームトランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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