(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤糠または脱脂糠をヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素を含む酵素系で処理し、次いで酵母で醗酵することを特徴とする機能性素材の製造方法であって、該素材がＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、及びアラビノキシランを合計で５％以上含むものである製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られる機能性素材。
【請求項３】
請求項２記載の機能性素材を含む機能性食品、医薬組成物または化粧組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醸造副産物からの機能性素材の製造方法およびそれにより得られる機能性素材に関するものであり、詳細には、糠もしくは脱脂糠または玄米をヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素で処理し、次いで、酵母で処理することを特徴とする機能性素材の製造方法ならびにそれにより得られる機能性素材に関する。さらに本発明は、該機能性素材を含有する機能性食品、医薬組成物および化粧組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ビールや清酒の醸造副産物は、その大部分が産業廃棄物として処理されているのが現状である。例えば、清酒醸造副産物の赤糠は、栄養成分が豊富に含まれているにも拘らず、せいぜい飼料として利用されている程度であり、これまで有効活用の技術開発が行われていなかった。赤糠には特にＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、各種オリゴ糖（例えば、アラビノキシラン）などの有用成分が多く含まれている。これらの成分は、特にダイエットや健康増進のごとき種々の好ましい作用を有するといわれている。従来より、これらの成分を分離、精製あるいは濃縮する方法が多く提案されてきた（特許文献１〜８等参照）。
【０００３】
例えば、特許文献１はＬ−アラビノースの精製方法、特許文献２はＬ−アラビノースの分離方法に関するもので、いずれもキシロースを資化する微生物を作用させることを特徴とする方法である。特許文献３はＬ−アラビノースまたはＬ−アラビノース含有酵素処理物の製造方法およびＬ−アラビノースの製造方法に関するものであり、特許文献４はＬ−アラビノースの製造方法ならびにＬ−アラビノース含有酵素処理物およびその製造方法に関するものであるが、いずれもアラビノ多糖類を酵素処理するＬ−アラビノースの製造方法でＤ−キシロースには触れていない。特許文献５は、穀類外皮から水溶性糖類を製造する方法に関するものであり、アラビノ多糖類からＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、そのオリゴ糖を酸処理により製造する方法に関するものである。特許文献６は水溶性アラビノキシランの調製法に関するものであり、特許文献７は免疫力増強物質およびその製造方法に関するものであり、特許文献８はアラビノ多糖類からの水溶性アラビノキシランの製造法およびその機能性に関するものである。
【０００４】
しかしながら、いずれの先行技術も、本発明のような醸造副産物、例えば糠（赤糠、脱脂糠など）、あるいは玄米を原料として、酵素処理および酵母処理の２段階プロセスを用いる、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、およびアラビノキシラン等のオリゴ糖成分を豊富に含有する機能性素材の効率的な製造技術に関するものではなく、また、これらを示唆するものでもない。
【特許文献１】特開２００２−２６２８９９号公報
【特許文献２】特開２００２−２０９５９７号公報
【特許文献３】特開２００２−９５４９１号公報
【特許文献４】特開２００１−２８６２９４号公報
【特許文献５】特開平１１−１１３６００号公報
【特許文献６】特許第３０７９１１５号
【特許文献７】特許第３３４７１６３号
【特許文献８】特開平９−２３８９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のごとく、大量に発生するが用途が無いかあるいはほとんど見出されていない醸造副産物を原料とし、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、各種オリゴ糖を豊富に含み、健康にとり好ましい機能を有し、かつ安全性が高く、香りも良い機能性素材を得ることが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、糠もしくは脱脂糠または玄米をヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素を必須として含む酵素で処理し、次いで、酵母で処理することにより、肝機能改善機能、抗アレルギー機能、抗酸化機能、消化吸収抑制機能、血糖値上昇抑制機能などを有する機能性素材が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、肝機能改善機能、抗アレルギー機能、抗酸化機能、消化吸収抑制機能、血糖値上昇抑制機能などを有し、かつ安全性の高い機能性素材ならびにそれを含有する機能性食品、医薬組成物ならびに化粧組成物が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）糠または玄米をヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素を含む酵素系で処理し、次いで、酵母で処理することを特徴とする機能性素材の製造方法；
（２）糠が赤糠である（１）記載の方法；
（３）（１）または（２）記載の方法により得られる機能性素材；
（４）（３）記載の機能性素材を含む機能性食品、医薬組成物または化粧組成物；ならびに
（５）肝機能改善、抗アレルギー、抗酸化、消化吸収抑制、および血糖値上昇抑制からなる群より選択される機能／効能を有するものである（３）記載の機能性素材、（４）記載の機能性食品または医薬組成物
を提供するものである。
【０００９】
上述のごとく、本発明は、糠もしくは脱脂糠または玄米をヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素を含む酵素系で処理し、次いで、酵母で処理することを特徴とする機能性素材の製造方法ならびにその方法により得られる機能性素材に関するものである。得られる機能性素材はＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、各種オリゴ糖を豊富に含むものである。したがって、本発明の機能性素材の原料はアラビノキシラン含量が高いものが好ましく、例えば、糠（赤糠もしくは脱脂糠など）または玄米が挙げられる。脱脂糠は赤糠を脱脂したものである。本発明に使用される得に好ましい原料は赤糠または脱脂糠である。
【００１０】
本発明の方法によれば、原料をヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素を含む酵素系で処理する。本明細書において、この処理工程を「酵素処理」または「酵素処理工程」ともいう。この工程は多糖類の分解ならびにデンプン質からのグルコースの遊離を目的としたものである
【００１１】
「ヘミセルラーゼ系酵素」とは、ヘミセルロース分解活性を有する酵素であればいずれの酵素であってもよく、精製されていても、あるいは精製されていなくてもよい。またその起源はいずれのものであってもよい。「ヘミセルラーゼ系酵素」として、例えば、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社製）、ヘミセルラーゼＭ（エイチビィアイ株式会社製）等の市販酵素剤を利用することもできる。
【００１２】
「液化酵素」とはデンプン質を液化させる活性を有する酵素であればいずれの酵素であってもよく、精製されていても、あるいは精製されていなくてもよい。またその起源はいずれのものであってもよい。「液化酵素」として、例えば、コクゲンＬ（大和化成株式会社製）、オリエンターゼＡＯ４０（エイチビィアイ株式会社製）等の市販酵素剤を利用することもできる。
【００１３】
「糖化酵素」とはデンプン質を糖化させる活性を有する酵素であればいずれの酵素であってもよく、精製されていても、あるいは精製されていなくてもよい。またその起源はいずれのものであってもよい。「糖化酵素」として、例えば、グルク１００Ｓ（天野エンザイム株式会社製）、グルターゼＡＤ、グルターゼＳ（いずれもエイチビィアイ株式会社製）等の市販酵素剤を利用することもできる。
【００１４】
「ヘミセルラーゼ系酵素ならびに液化酵素および糖化酵素を含む酵素系」とは、上記の「ヘミセルラーゼ系酵素」、「液化酵素」および「糖化酵素」を必須とし、その他の酵素を含んでいてもよい酵素混合物をいう。その他の酵素としては、原料の分解を促進、あるいは原料中の脂質や蛋白を分解する作用を有するものであってもよい。また、原料からのグルコース遊離を促進するもの、製造された機能性素材に好ましい風味を与えるものであってもよい。その他の酵素としては、例えば、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、アラバナーゼ、リパーゼ、プロテア−ゼ等が挙げられる。目的に合わせてこれらの酵素を単独あるいは複数種混合して用いることができる。これらの酵素は精製されていても、あるいは精製されていなくてもよい。またそれらの起源はいずれのものであってもよい。これらの酵素として、例えば、ペクチナーゼＸＰ−５３４（ナガセケムテックス株式会社製）、ペクチナーゼＧ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製）、セルロシンＧＭ５（マンナナーゼ）（エイチビィアイ株式会社製）、リパーゼＡ−１０ＦＧ（ナガセケムテックス株式会社製）、リパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ（天野エンザイム株式会社製）、スミチームＰＨＹ（フィターゼ）（新日本化学株式会社製）、セルロシンＴＰ２５（キシラナーゼ）（エイチビィアイ株式会社製）等の市販酵素剤を利用してもよい。
【００１５】
酵素処理工程における処理条件（例えば、原料に対する酵素量、反応温度、ｐＨ、反応時間等）は目的に応じて適宜選択することができる。原料に対する酵素の割合（重量比）の例は、ヘミセルラーゼ酵素１／２０ないし１／５０、液化酵素１／５０、糖化酵素１／１００、リパーゼ、フィターゼ１／５００である。酵素量が少なすぎると反応が不十分であり、あるいは反応に長時間を要することとなり、酵素量が多すぎると経済的に好ましくない。反応温度は使用酵素の至適温度を考慮して決定すべきであり、例えば、１５〜６０℃が一般的であろう。反応ｐＨも使用酵素の至適ｐＨを考慮して決定すべきであり、一般的には３ないし１０の範囲であろう。実施例に示すごとく、ｐＨ調整用バッファーを使用しなくてもよい。反応時間も適宜決定されうるが、あまり短いと反応が不十分であり、あまり長いと雑菌の混入等の問題が生じるので好ましくない。
【００１６】
酵素処理工程により得られた酵素処理物を酵母で処理する。本明細書において、この処理工程を「発酵」、「酵母処理」、「発酵工程」または「酵母処理工程」ともいう。この酵母工程の特徴は、ペントース（Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロースなど）非発酵（資化）性でグルコース、フルクトース発酵（資化）性である清酒酵母でペントースを濃縮し、製造するアルコールで微生物汚染を防止することと、酵母を増殖させて酵母菌体を多く得ることである。酵母菌体については、特にその細胞壁成分由来の食物繊維が豊富な機能を有することが見出されており、また酵母菌体自体にも種々の栄養素が含まれ、胃腸にも良いとされている。さらに酵母により発酵させることで好ましい発酵香も生じる。
【００１７】
酵母処理工程における反応条件（反応温度、ｐＨ、時間、ならびに使用酵母、通気条件等）も適宜決定されうるが、使用酵母のグルコース消費ならびに増殖などの特性に適した条件とすべきである。使用酵母としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンジダ属、クルイベロミセス属などが挙げられるが、機能性食品や医薬組成物への用途を考慮すると、サッカロミセス属酵母が好ましく、特に清酒酵母、ビール酵母が好ましい。酵母接種量も適宜選択できるが、一般的には１０７ないし１０８個／ｍｌのオーダーであろう。通気は必要に応じて行うことができる。
【００１８】
上で説明した本発明の製造方法により得られる機能性素材は、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースならびにアラビノキシランなどのオリゴ糖を多く含み、酵母菌体も多く含むものであり、以下に詳述するような豊富な機能を有するものである。本発明の機能性素材は上記方法で得られた酵母処理物をそのまま使用してもよく、あるいはこれをさらに処理加工して用いてもよい。例えば、さらに濃縮または希釈してもよく、凍結乾燥、加熱乾燥等の乾燥処理に付して使用してもよく、あるいはさらに固形分を水などで抽出して用いてもよい。その形態は特に限定されず、例えば、溶液、懸濁液、半固体（例えば、ペースト状）、固体（例えば、粉末、顆粒）等であってもよい。実施例で説明するように、本発明の機能性素材は、健康によいとされる諸活性／諸機能を示し、典型的には、肝機能改善機能、抗アレルギー機能、抗酸化機能、消化吸収抑制機能および血糖値上昇抑制機能などの種々の生理活性／機能および薬理学的活性／機能を示す。また本発明の機能性素材の安全性は高く、食品や医薬品への用途が考えられる。ここで、「機能性食品（素材）」とは、「食品（素材）が本来持っている栄養機能（第一次機能）、味・香りなどの感覚機能（第二次機能）に加えて、生体防御や疾病の防止・回復、体調リズムの調整、老化抑制などの生体調節機能（第三次機能）があることに注目し、これらの生体調節を科学的に解明し、機能を発揮できるように設計・加工された食品（素材）」を意味する。
【００１９】
本発明により得られる機能性素材を種々の用途に用いることができる。また本発明の機能性素材は香りが良いものである。１の用途としては本発明の機能性素材を食品中に用いて種々の機能性食品あるいは健康食品を得ることができる。例えば、そのまま、あるいはペレット、粉末、顆粒などの形態として使用してもよく、食品添加物、調味料、ふりかけとして使用してもよい。また、本発明の機能性素材を食材中に含有せしめて使用してもよい。
【００２０】
さらなる用途としては本発明の機能性素材を医薬組成物中に用いることができる。一般的には、かかる医薬組成物は本発明の機能性素材のほかに医薬用担体または賦形剤を含むであろう。その形態も特に限定されず、例えば、固体（錠剤、粉末、顆粒等）、半固体（パスタ等）、液体（溶液、懸濁液、エマルジョン等）、あるいはカプセルに封入されたものであってもよい。これらの剤形のための担体または賦形剤も当業者によく知られており、適宜選択されうる。
【００２１】
もう１つの用途としては本発明の機能性素材を化粧組成物中に用いることができる。本発明の機能性素材はフェルラ酸を豊富に含み、グルコースをほとんど含有しないか含有しないので、グルコースによる皮膚へのべたつきがなく、フェルラ酸による活性酸素消去効果および皮膚細胞の成長促進効果があり、化粧品素材としての用途がある。したがって、本発明は、本発明の機能性素材を含む化粧組成物に関するものである。本発明の化粧組成物は、本発明の機能性素材のほかに化粧品に常用される担体、例えば、水、グリセリン、アルコール類、油脂などを含有するものであり、さらに香料、着色料、防腐剤などを適宜添加してもよい。本発明の機能性素材を含む化粧組成物の形状は特に限定されず、例えばローション、乳液、クリーム、軟膏などの形状とすることができる。
【００２２】
これらの機能性食品や医薬組成物は、本発明の機能性素材が有する機能／効能を有するものであるが、それらの典型的な機能／効能としては、例えば、肝機能改善、抗アレルギー、抗酸化、消化吸収抑制および血糖値上昇抑制が挙げられる。
【００２３】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２４】
酵素処理に使用する酵素のスクリーニングその１
小麦由来のアラビノキシラン（Megazyme社製）2gを50mMリン酸緩衝液（pH5.0）10mlに溶かし、食品用市販酵素剤であるヘミセルラーゼ剤、ペクチナーゼ剤、キシラナーゼ剤、セルラーゼ剤、フィターゼ、リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、アラバナーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどの市販酵素剤をそれぞれ100mgを加え、50℃で18時間反応後のL-アラビノース（以下「アラビノース」ともいう）、D-キシロース（以下「キシロース」ともいう）、アラビノキシランのオリゴ糖が遊離してくる酵素剤をそれぞれスクリーニングした。アラビノース、キシロース、アラビノキシランのオリゴ糖の定性分析は薄層クロマトグラフィー（TLC プラスティックシート  Sirica gel 60 F254 (メルク社製)、展開溶媒  酢酸エチル：ピリジン：水＝12：5：4で展開し、濃硫酸で発色した）、定量分析は液体クロマトグラフィー（HPLCシステム（ギルソン社製）、カラム  Asahipak NH2P-50 4E（昭和電工社製）、SEDEX-55 蒸発光散乱検出計（SEDERE社製）で行った。
【００２５】
その結果、アラビノースが多く遊離する酵素剤はスミチームARS、スミチームPX（新日本化学工業株式会社製）、ヘミセルラーゼ「アマノ」90、セルラーゼA「アマノ」3（天野エンザイム株式会社製）、セルロシンHC100（エイチビィアイ株式会社製）などであり、キシロースが多く遊離する酵素剤はペクチナーゼG「アマノ」、ヘミセルラーゼ「アマノ」90（天野エンザイム株式会社製）、セルロシンTP25、セルロシンGM5、セルロシンT2（エイチビィアイ株式会社製）、スミチームACH（新日本化学工業株式会社製）、アラビノキシランのオリゴ糖が多く遊離する酵素剤はペクチナーゼXP-534（ナガセケムテックス株式会社製）、VERON191（レーム・エンザイム社製）などであることが分かった。
次に赤糠、脱脂糠（築野食品工業株式会社製）を用いて同じ反応条件で各種酵素剤を組合せてアラビノース、キシロースの単糖が多い条件、アラビノキシランのオリゴ糖が多い条件を検討した結果、赤糠ではペクチナーゼXP-534とセルロシンGM5を組合わせると単糖が、脱脂糠ではスミチームARSとセルロシンGM5を組合わせると単糖とオリゴ糖が効率よく遊離してくることが分かった。
【００２６】
また赤糠酵素反応時にリパーゼ剤、フィターゼ剤を同時に酵素処理し、苦味が出なく風味が良くなる酵素剤として、リリパーゼA-10FG（ナガセケムテックス株式会社製）、スミチームPHY（新日本化学工業株式会社製）を選択した。更に赤糠、脱脂糠のデンプン質をグルコースまで効率よく分解する酵素剤として、液化型アミラーゼ剤のコクゲンL（大和化成株式会社製）と糖化型アミラーゼ剤のグルク100S（天野エンザイム株式会社製）を組合わせると良いことが分かった。
【実施例２】
【００２７】
機能性素材の調製その１
上記予備試験の酵素処理条件の結果を受けて、以下の条件で赤糠と脱脂糠の酵素処理を行った。なお、本実施例により赤糠から得られた機能性素材の粉末乾燥品を「赤糠発酵物１」といい、脱脂糠から得られた機能性素材の粉末乾燥品を「脱脂糠発酵物１」という。
【００２８】
赤糠10kgと水50LとペクチナーゼXP-534を500g、リリパーゼA-10FGを20g加え、pH7、50℃で18時間、更にセルロシンGM5を500g、スミチームPHYを20g、コクゲンLを200g、グルク100Sを100g加え、pH4.5、55℃で18時間酵素処理を行った。脱脂糠10kgと水50LとスミチームARSを500g加え、pH3.5、55℃で18時間、更にセルロシンGM5を500g、コクゲンLを200g、グルク100Sを100g加え、pH4.5、55℃で18時間酵素処理を行った。なお各pH調整は食品添加用の乳酸、乳酸ナトリウムで行った。酵素処理後のグルコース、フルクトース含量を測定した（表1中発酵前の欄）。
【００２９】
赤糠及び脱脂糠酵素処理液に清酒酵母である泡無し酵母B29を1×108個植菌し、発酵後の酵母数を更に増加させ（清酒酵母の各種機能性増強）、生成するアルコールで雑菌の繁殖を抑えるためにグルコースを各5kg加えて、25℃で5日間撹拌培養を行った。発酵後の酵母数（cells/ml）、アルコール濃度（Alc;%）、グルコース量（Glu;%）、フルクトース量（Fru;%）と滴定酸度（TA;ml）、滴定アミノ酸度（AA;ml）を測定し、発酵前後での分析値の比較を表1に示す。
【００３０】
【表１】
0004790996.tif 000002
【００３１】
表1より赤糠発酵液、脱脂糠発酵液共に酵母数が増加し、グルコース、フルクトースが清酒酵母によりほとんど資化されて無くなり、アルコールに変換され、更に分析値には出してないが、アラビノース、キシロースは酵母発酵前後により全く変化が無く、糖質のデンプン質が減少し、アラビノース、キシロースが濃縮され、酵母数が増加し、生成したアルコールにより微生物汚染が防止できる目的が達成された素材が開発できた。滴定酸度は赤糠発酵液よりも脱脂糠発酵液の方が高くなりやや酸っぱい素材となったが、両者共に香りは発酵後の良いものであった。
【００３２】
粉末乾燥は各発酵液を2倍に加熱濃縮（100℃、5時間）し、スプレードライヤーSD-1000（東京理化器械株式会社製）で行い、赤糠発酵物１を7.48kgと脱脂糠発酵物１を8.25kg得た。乾燥物の一般成分値を表2に示す。
【００３３】
【表２】
0004790996.tif 000003
【００３４】
表2より食品成分表の米糠の成分と比較すると発酵物はいずれも酵母数が多くなり、酵母細胞壁成分と酵母細胞質成分由来の食物繊維とタンパク質の含量が多くなった。また両者共にデンプン質が分解されていることにより糖質の含量が少なくなった。赤糠発酵物１ではリパーゼ剤の処理により脂質の分解は一部となった。
【００３５】
また各発酵物の遊離のアラビノース、キシロース含量と不溶性残渣中に残存するアラビノース、キシロースの多糖類の含量は、72％硫酸、室温で1時間撹拌、その後4％硫酸、121℃オートクレーブで1時間加水分解を行った後、アラビノース、キシロース含量を測定した結果をそれぞれ表3に示す。
【００３６】
【表３】
0004790996.tif 000004
【００３７】
表3より赤糠発酵物１の可溶性（遊離／遊離＋残渣）アラビノース、キシロースの割合はそれぞれ12％、4％となり、脱脂糠発酵物１の可溶性アラビノース、キシロースの割合はそれぞれ１3％、3％となった。赤糠発酵物１、脱脂糠発酵物１共に可溶性アラビノキシランのオリゴ糖も薄層クロマトグラム、液体クロマトグラムで酵素処理後、酵母発酵で資化されないオリゴ糖が存在していることがわかったが定量することはできなかった（標準物質が無いため）。
【実施例３】
【００３８】
酵素処理に使用する酵素のスクリーニングその２
平成15年産日本晴の玄米2gと50mMリン酸緩衝液10mlに、食品用市販酵素剤であるヘミセルラーゼ剤、ペクチナーゼ剤、キシラナーゼ剤、セルラーゼ剤、フィターゼ、リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、アラバナーゼなどの市販酵素剤をそれぞれ100mgを加え、各種酵素剤の至適pHと至適温度で18時間反応後、反応前後の濁度（HACH社製、2100N Turbidimeter）、グルコース量、直接還元糖量を測定した。その結果、スミチームARS、スミチームPX、スミチームACH（新日本化学工業株式会社製）、ペクチナーゼG「アマノ」、ヘミセルラーゼ「アマノ」90（天野エンザイム株式会社製）、ペクチナーゼXP-534（ナガセケムテックス株式会社製）、セルロシンTP-25、セルロシンGM5（エイチビィアイ株式会社製）、VERON191（レーム・エンザイム社製）などの酵素剤が濁度、グルコース量、直接還元糖の上昇率が高いことが分かった。中でもセルロシンTP-25の濁度の上昇率が高く、玄米の最外部に作用する働きが強い酵素剤である結果となった。
【００３９】
次に赤糠、脱脂糠各10gと50mMリン酸緩衝液50mlに、スミチームARS、スミチームPX、スミチームACH、ペクチナーゼG「アマノ」、ヘミセルラーゼ「アマノ」90、ペクチナーゼXP-534、セルロシンTP-25、セルロシンGM5、VERON191の各種酵素剤500mgを加え、各種酵素剤の至適pHと至適温度で18時間反応後、清酒酵母B29を5×107個植菌し、グルコースを5g加えて25℃で4日間発酵を行い、遊離するアラビノース、キシロース含量と滴定酸度を測定した。その結果、ペクチナーゼG「アマノ」とヘミセルラーゼ「アマノ」90が単独で多くのアラビノース、キシロースを遊離し、発酵液の滴定酸度を低くできることが分かった。
【００４０】
更に赤糠、脱脂糠各10gと50mMリン酸緩衝液50mlに、セルロシンTP-25、ペクチナーゼG「アマノ」、ヘミセルラーゼ「アマノ」90の3種類の酵素剤500mgを組合せの順番を変化させて加え、各酵素剤の至適pH、至適温度で各18時間反応後、清酒酵母B29を5×107個植菌し、グルコースを5g加えて25℃で4日間発酵を行い、遊離するアラビノース、キシロース含量と滴定酸度を測定した。その結果、赤糠、脱脂糠発酵液共に先にセルロシンTP-25で反応し、次にペクチナーゼG「アマノ」とヘミセルラーゼ「アマノ」90を同時に反応させることにより、多くのアラビノース、キシロースを遊離し、発酵液の滴定酸度を低くできることが分かった。
【００４１】
また赤糠、脱脂糠各10gと50mMリン酸緩衝液50mlに、セルロシンTP-25、ペクチナーゼG「アマノ」、ヘミセルラーゼ「アマノ」90の3種類の酵素剤をそれぞれ100、200、500mgとコクゲンLを200mgとグルク100Sを100mg加え、赤糠では更にリパーゼAY「アマノ」30G（天野エンザイム株式会社製）またはリリパーゼA-10FGをそれぞれ20mgとスミチームPHYを20mg加え、各酵素剤の至適pH、至適温度で各18時間または42時間反応後、清酒酵母B29を5×107個植菌し、グルコースを5g加えて25℃で4日間発酵を行い、遊離するアラビノース、キシロース含量と滴定酸度を測定した。その結果、赤糠ではセルロシンTP-25を200〜500mgとコクゲンLを200mgとグルク100Sを100mgでpH5、60℃で18時間反応後、ペクチナーゼG「アマノ」とヘミセルラーゼ「アマノ」90を200〜500mgとスミチームPHYを20mgでpH4.5、50℃で18〜42時間反応後、リパーゼAY「アマノ」30Gを20mgでpH7、50℃で18時間反応し、酵母で発酵後のアラビノース、キシロースが多く遊離する条件であることが分かった。一方、脱脂糠ではセルロシンTP-25を100〜200mgとコクゲンLを200mgとグルク100Sを100mgでpH5、60℃で18時間反応後、ペクチナーゼG「アマノ」とヘミセルラーゼ「アマノ」90を100〜200mgでpH4.5、50℃で18〜42時間反応し、酵母で発酵後のアラビノース、キシロースが多く遊離する条件であることが分かった。また赤糠発酵液と脱脂糠発酵液の遊離するアラビノース、キシロース、滴定酸度も同程度であった。
【実施例４】
【００４２】
機能性素材の調製その２
上記予備試験の酵素処理、発酵条件の結果を受けて、以下の条件で赤糠と脱脂糠の酵素処理、発酵を行った。なお、本実施例により赤糠から得られた機能性素材の凍結乾燥品を「赤糠発酵物２」という。
【００４３】
赤糠2kgと水10LとセルロシンTP-25を40gまたは100gとコクゲンLを40gとグルク100Sを20gでpH5、60℃で18時間反応後、ペクチナーゼG「アマノ」とヘミセルラーゼ「アマノ」90を40gまたは100gとスミチームPHYを4gでpH4.5、50℃で42時間（酵素剤の量が少ない区分）または18時間（酵素剤の量が多い区分）反応後、リパーゼAY「アマノ」30Gを4gでpH7、50℃で18時間反応させた。脱脂糠2kgと水10LとセルロシンTP-25を40gとコクゲンLを40gとグルク100Sを20gでpH5、60℃で18時間反応後、ペクチナーゼG「アマノ」とヘミセルラーゼ「アマノ」90を40gでpH4.5、50℃で42時間反応させた。なおpH調整は食品添加用の塩酸、水酸化ナトリウムで行った。赤糠酵素処理液2区分と脱脂糠酵素処理液1区分に清酒酵母B29を5×107個植菌し、グルコースを1kg加えて25℃で4日間撹拌発酵を行い、遊離するアラビノース、キシロース、グルコース含量と酵母数とアルコール濃度と滴定酸度と滴定アミノ酸度を測定した（表4）。その結果、赤糠発酵液２区分と脱脂糠発酵液１区分の分析値はほぼ同程度であった。そこで赤糠の酵素剤の量が少ない区分の発酵物を加熱処理することなくそのまま真空凍結乾燥機TF10-80TPA（株式会社宝製作所製）で乾燥を行い、赤糠発酵物２ 1.66kgを得た。この赤糠発酵物２と素材の上記赤糠発酵物１との各種成分比較を表4に示す。
【００４４】
【表４】
0004790996.tif 000005
【００４５】
表4より赤糠発酵物２は、赤糠の可溶性（遊離／遊離＋残渣）アラビノース、キシロースの割合はそれぞれ35％、23％となった。また赤糠発酵物１と比べ遊離アラビノースで3倍、遊離キシロースで6倍それぞれが多い素材が開発できた。この赤糠発酵物２の可溶性アラビノキシランのオリゴ糖も液体クロマトグラムで酵素処理後、酵母発酵で資化されないオリゴ糖が存在しているが定量することはできなかった。その他今回の赤糠発酵液（赤糠発酵物２を凍結乾燥する前）の酵母数は前回と同程度であるが、アルコールの生成がやや高くなり、グルコースは全くなくなっていた。滴定酸度は前回の4割程度と低くすることができ、酸っぱさが際立たない、発酵香の良い、嗜好性の優れた素材となった。
【実施例５】
【００４６】
in vitro試験
（ａ）二糖類分解酵素抑制試験
得られた赤糠発酵物、脱脂糠発酵物の消化吸収抑制効果を評価するため、次に調製方法を示す小腸粗酵素を用いてマルターゼ活性阻害率、スクラーゼ活性阻害率を測定した。
Rat intestinal acetone powder（シグマ社製）に10倍容のマレイン酸緩衝液（pH6.0）を加え、5000rpm、30分間の遠心分離後、得た上清を小腸粗酵素とした。また、粉末試料に3.33倍容のマレイン酸緩衝液（pH6.0）を加え14000rpm、20分間の遠心分離後、得た上清を70℃湯浴中で残留酵素を失活させたものを評価した。
【００４７】
マルターゼ活性阻害率は終濃度1％マルターゼ溶液に小腸粗酵素と抽出物を混合し、スクラーゼ活性阻害率は終濃度1％スクロース溶液に小腸粗酵素と抽出物を混合し、それぞれ37℃で1時間反応させ、反応後の溶液中のグルコース生成量をグルコースcIIテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定した。また、阻害率は抽出物を混合しないBlankの値を基準に以下の計算式より導き出した。その結果を表5に示す。
活性阻害率（％）＝100−B／A×100
A：Blankのグルコース生成量、B：抽出物のグルコース生成量
【００４８】
【表５】
0004790996.tif 000006
【００４９】
表5より赤糠発酵物（１、２共に）、脱脂糠発酵物１はいずれもスクラーゼ活性抑制、マルターゼ活性抑制効果が認められた。これらの発酵物においてグルコースを低減し、アラビノース、キシロース、アラビノキシランのオリゴ糖を濃縮している結果と考えられる。原料の赤糠、脱脂糠には共存する糖類の影響で両活性を上昇する傾向が認められた。
【００５０】
（ｂ）DPPHラジカル消去能試験
赤糠発酵物、脱脂糠発酵物の抗酸化能を評価するため、粉末試料に20倍容の50％EtOHを加え、室温で3時間抽出し、3000rpm、5分間の遠心分離後、得た上清をDPPHラジカル消去能試験により行った。
【００５１】
2M  酢酸緩衝液（pH5.5）25μL、99.5％ EtOH 475μL、抽出物 500μL、1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）125μLを混合し、DPPH添加30分後のOD517nmを測定した。ラジカル消去能を算出するために検体の代わりに水を混合したものも測定した。
以下のラジカル消去能計算式からラジカル消去能を算出した。
ラジカル消去能(％)＝100−（OD517B/OD517A）ｘ100
OD517A：水（対照）、OD517B：検体
また、高いDPPHラジカル消去能をもつことが知られているグルタチオンを標準に用い、発酵物、対照のラジカル消去能をグルタチオン量に換算した。その結果を表6に示す。
【００５２】
【表６】
0004790996.tif 000007
【００５３】
表6より赤糠発酵物（１、２共に）、脱脂糠発酵物１はいずれもDPPHラジカル消去能、すなわち抗酸化能が認められた。原料の赤糠、脱脂糠共に抗酸化能があるが、発酵させることによりその活性を高める効果があることが分かった。
【実施例６】
【００５４】
安全性試験
（ａ）急性経口毒性スクリーニング試験
赤糠発酵物１、脱脂糠発酵物１のラットに対する急性経口毒性を検討するため、雌3匹（6週齢）のSlc：Wistar系（SPF）動物を用いて試験を実施した。用量は2000mg/kgの1用量とした。赤糠発酵物１、脱脂糠発酵物１を2000mg精秤後、注射用蒸留水を加え10mLに定容した懸濁液を投与前16時間絶食した動物に胃ゾンデを用いて単回投与した。投与後の観察期間は7日間とし、動物の生死、一般状態および体重推移について観察するとともに、観察終了時に病理解剖検査を行った（表7）。
【００５５】
（ｂ）復帰突然変異スクリーニング試験
赤糠発酵物１、脱脂糠発酵物１の遺伝子突然変異誘発性を検討するため、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）TA100およびTA98株を用いた復帰突然変異スクリーニング試験を行った。
【００５６】
被験物質の調製は、適切な溶媒に溶解あるいは懸濁させ調製原液を調製し、必要に応じ、ろ過除菌を行った。また、試験用量は、39.1、78.1、156、313、625、1250、2500および5000μg/プレートの8用量（公比2）を使用した。被験物質の生育阻害作用を確認するため、プレート上の試験菌株の生育状態について実態顕微鏡で観察し、さらに被験物質の析出状態を肉眼で観察した。次いで、復帰突然変異により生じたコロニー数を計測し、復帰突然変異コロニー数が陰性対照の2倍以上に増加し、かつその増加に用量依存性が認められた場合に陽性と判断する事とした（表7）。
【００５７】
（ｃ）残留農薬多成分一斉分析
常法に従い、赤糠発酵物１の抽出、濃縮、カラム精製等の前処理を行った後、GC-MS測定により77種の残留農薬のスクリーニング分析を行った（表7）。
【００５８】
（ｄ）重金属分析
赤糠発酵物１中の重金属を以下の方法で測定した。
ヒ素、鉛、カドミウムを原子吸光光度法、総水銀を還元気化原子吸光光度法、総クロムをジフェニルカルバジド吸光光度法、シアンをピリジンピラゾロン吸光光度法により測定した（表7）。
【００５９】
【表７】
0004790996.tif 000008
【００６０】
表7より赤糠発酵物１、脱脂糠発酵物１共に急性経口毒性スクリーニング試験、復帰突然変異スクリーニング試験共に陰性の結果であった。赤糠発酵物は残留農薬77成分一斉分析の結果、77成分は定量限界以下であった。砒素、鉛、水銀、カドミウム、シアン、クロムの重金属分析の結果は問題になる含量ではなかった。すなわち、赤糠発酵物１、脱脂糠発酵物１は共に食品素材としての安全性に問題がないことが分かった。赤糠発酵物２についても同様の結果を得た。従って、本発明の機能性素材の安全性が確認された。
【実施例７】
【００６１】
血糖値上昇抑制効果確認試験
4週齢Sprague-Dawley系雄性ラット（Jc1;SD、日本クレア株式会社製）を用い、室温23±1℃、湿度55±7％、明暗周期12時間（明期8〜20時）、MF固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社製）および水は自由に与え、4週間予備飼育後（8週齢、264.6±5.1g）実験に供した。胃および門脈にカテーテルを留置した無麻酔・無拘束下のラットを5匹ずつ2群に分け、更に24時間飼育、次に16時間絶食後、15％スクロース溶液を11.25ml/kgラット/時間の速度で2時間投与し門脈血中グルコース濃度が一定になることを確認した。赤糠発酵物2と対照の赤糠をそれぞれ3倍量の水で30分間抽出し、14000rpm、20分間の遠心分離後、250メッシュでろ過し、更にNo.5Aのろ紙でろ過したろ液を濃縮後の試料をそれぞれ胃内に投与し（赤糠発酵物抽出液；0.36g/kgアラビノース＋キシロース相当量、赤糠；同様な操作の対照）、その後10分おきに3時間まで門脈カテーテルより門脈血0.05mlを採取して、血漿中のグルコース濃度を測定した（図1；赤糠発酵物抽出液投与ラット、図2；対照赤糠投与ラット）。
【００６２】
図1、2より、赤糠発酵物抽出液では門脈血のグルコース濃度は、投与前に比べ投与後20分で有意な低下が認められた（図１中アステリスクで示す）。対照の赤糠では門脈血のグルコース濃度は有意な低下が認められず、投与後10分、100分で有意な上昇が認められた。アラビノースとキシロースの合計濃度で0.36g/kgラットではラット小腸のα−グルコシダーゼ阻害作用があることが分かった。従って本発明の赤糠発酵物は糖尿病食後過血糖を抑制することができる素材であることが分かった。
【実施例８】
【００６３】
肝機能改善効果確認試験
6週齢SD系雄性ラット（日本クレア株式会社製）を1週間予備飼育後、表8の配合の飼料で、飼料と水は自由摂取させ、室温23±2℃、湿度60±10％、12時間の明暗サイクルの環境下で20日間の飼育実験を行った。
【００６４】
【表８】
0004790996.tif 000009
【００６５】
飼育21日目に肝臓と盲腸重量、尾静脈血清については総コレステロールと中性脂肪（TG）を、腹部大動脈血漿についてはGOT（グルタミックオキザロアセティクトランスアミナーゼ活性）、GPT（グルタミックピルビックトランスアミナーゼ活性）、グルコース、HDL−コレステロール（HDLcho）を測定した（表9）。
【００６６】
【表９】
0004790996.tif 000010
【００６７】
表9より、赤糠発酵物１（C群）と脱脂糠発酵物１（D群）はセルロース（A群）と比較して血漿中のGOT、GPTの酵素活性が有意に低下しており、共に肝機能改善効果が認められた。赤糠発酵物１はHDL−コレステロールをやや増加させる傾向があり、体重あたりの盲腸重量も有意に増加しており、何らかの食物繊維的効果があると考えられる。
【実施例９】
【００６８】
アレルギー低減効果確認試験
4週齢のアレルギー発症Brown Norway ssn slcラット（日本エルエスシー株式会社製）の8匹を1群として4群を用い、MF固形飼料と水は自由摂取させ、毎日各飼料（水、赤糠、赤糠発酵物、脱脂糠発酵物の4群）を60mgとなるように胃ゾンデで投与し、室温23±2℃、湿度60±10％、12時間の明暗サイクルの環境下で6週間（4週齢〜10週齢）の飼育実験を行った。1週間毎の血漿IgA、IgEと糞中のsIgAと10週齢時の脾臓、肝臓重量を測定した。その結果、体重は各投与群とも順調に増加した。また脾臓、肝臓重量、糞中sIgAにも各投与群に差は認められなかった。各投与群の血漿中のIgAの変化を図3、図4に、IgEの変化を図5に示す。
【００６９】
図3より、赤糠発酵物１投与群は3週間目以降血漿IgA値が上昇し、特に5週間目では顕著に上昇したことがわかる。その他の投与群では差は認められなかった。また図4より、赤糠発酵物１投与群では投与3週間目以降有意に血漿IgA値が増加し、体液性免疫機構が活性化されたことがわかる。さらに図5より、赤糠発酵物2で10週齢で血漿中のIgEの低下が有意に認められ、免疫機構が活性化された。従って赤糠発酵物2には免疫賦活機能があることがわかった。従って本発明の赤糠発酵物にはアレルギー発症ラットにおいてアレルギー低減効果があることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、健康に好ましい種々の機能を有し、安全性の高い機能性素材を提供するものであり、食品や医薬、あるいは化粧品の分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】赤糠発酵物抽出液投与群における血漿中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。＊は５％の危険率で有意であることを示す。
【図２】対照赤糠投与群における血漿中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。
【図３】図３は水投与群、赤糠投与群、赤糠発酵物１投与群、脱脂糠発酵物１投与群の４群における血中ＩｇＡの経時変化を示す図である。
【図４】図４は赤糠発酵物１投与群のＩｇＡ変化を示す図である。＊は５％の危険率で有意であることを示す。
【図５】図５は赤糠発酵物２投与群の血漿中のＩｇＥ変化を示す図である。＊は５％の危険率で、＊＊は１％の危険率で有意であることを示す。
【図１】
0004790996.tif 000011
【図２】
0004790996.tif 000012
【図３】
0004790996.tif 000013
【図４】
0004790996.tif 000014
【図５】
0004790996.tif 000015