(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）タンパク質及び配列番号６で表されるアミノ酸残基配列からなるサイトカインＣＣＬ２１を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む、癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに適切なＤＮＡワクチン。
【請求項２】
前記サービビンタンパク質が、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、（ｂ）配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、（ｃ）配列番号２３のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、（ｄ）配列番号２４のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及び（ｅ）ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
前記サービビンタンパク質が、配列番号２のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
前記サービビンタンパク質が、配列番号２３のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンスプライスバリアントである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
前記サービビンタンパク質が、配列番号２４のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンスプライスバリアントである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
前記サービビンタンパク質が、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
前記サービビンタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
前記サービビンタンパク質が、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
前記ＤＮＡ構築体が、プラスミドベクターに作用可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ構築体が、弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１１】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ  チフィムリウム、サルモネラ  チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、ＢＣＧ、エシェリキア  コリ、ビブリオ  コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項１０に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１２】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ  チフィムリウムである、請求項１０に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１３】
前記弱毒サルモネラ  チフィムリウムがサルモネラ  チフィムリウムのＡｒｏＡ−系統である、請求項１２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１４】
前記弱毒サルモネラ  チフィムリウムがサルモネラ  チフィムリウムのＡｒｏＡ−，ｄａｍ−系統である、請求項１２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１５】
前記サービビンタンパク質を作用可能にコードする前記ＤＮＡ構築体が、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ構築体が弱毒サルモネラ  チフィムリウムベクターに作用可能に組み込まれている、請求項１５に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１７】
前記ＣＣＬ２１を作用可能にコードする前記ＤＮＡ構築体が、配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ構築体が弱毒サルモネラ  チフィムリウムベクターに作用可能に組み込まれている、請求項１７に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１９】
サービビンタンパク質及び配列番号６で表されるアミノ酸残基配列からなるサイトカインＣＣＬ２１を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む、哺乳動物における腫瘍成長を阻害するための医薬を製造するためのＤＮＡ構築体の使用。
【請求項２０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ構築体が弱毒細菌ベクターに作用可能に組み込まれている、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記弱毒細菌ベクターが、弱毒サルモネラ  チフィムリウム、サルモネラ  チフィ、シゲラ種、バチルス種、ラクトバチルス種、ＢＣＧ、エシェリキア  コリ、ビブリオ  コレレ、カンピロバクター種及びリステリア種からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記弱毒細菌ベクターが弱毒サルモネラ  チフィムリウムである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記弱毒サルモネラ  チフィムリウムが、サルモネラ  チフィムリウムのＡｒｏＡ−系統である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記弱毒サルモネラ  チフィムリウムがサルモネラ  チフィムリウムのＡｒｏＡ−，ｄａｍ−系統である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
密封された無菌容器に梱包された請求項１に記載のワクチンを含み、前記容器が該容器に貼付されたラベルを有し、前記ラベルが前記ワクチンを識別し、前記ワクチンを患者に投与する個人に有用な情報を提供する印刷物を有する、製品。
【請求項２７】
サービビンタンパク質及び配列番号６で表されるアミノ酸残基配列からなるサイトカインＣＣＬ２１を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含む単離されたプラスミドベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載されたベクターが形質移入された形質転換宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効な適切な分子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチンに関する。特に、本発明は、癌関連アポトーシスファミリータンパク質阻害剤（ＩＡＰ）及び免疫活性遺伝子産物をコードするＤＮＡワクチンに関する。本発明は、腫瘍成長を阻害するＤＮＡワクチンを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、病原体が増殖し病理作用を生じる前に病原体を破壊するために生物の免疫系を刺激する予防薬を極めて限定的に投与することによって、いくつかの疾患に対して長期的保護作用をもたらすのに利用されてきた。ワクチン及びワクチン接種の様々な手法は、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒ．  Ｇｌｉｃｋ及びＪａｃｋ  Ｊ．  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２５３〜２７６（１９９８）に記載されている。
【０００３】
ワクチン接種は、体自体の免疫系を誘導して、感染病原体が病理学的応答を引き起こす前に感染病原体を探し出して破壊する手段である。
【０００４】
一般に、ワクチンは、生の、ただし弱毒された病原体（ウイルス又は細菌）か、病原体の死菌ワクチンである。生きた細菌又はウイルスからなるワクチンは、非病原性でなければならない。一般に、細菌培養物又はウイルス培養物は、物理的又は化学的処理によって弱毒化される（弱められる）。この病原体は非病原性ではあるが、ワクチンによる治療を受けた被検者において依然として免疫応答を誘導することができる。
【０００５】
免疫応答は、特定の巨大分子又は病原体であり得る抗原によって誘導される。これらの抗原は、一般に、タンパク質、多糖、脂質又は糖脂質であり、Ｂ細胞及びＴ細胞として知られるリンパ球によって「異質」と認識される。両方のタイプのリンパ球が抗原に曝されると、急速な細胞分裂及び分化応答を誘導し、暴露されたリンパ球のクローンが形成される。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、形質細胞は、抗体（Ａｂ）と呼ばれるタンパク質を産生する。抗体は、病原体上に提示される抗原に選択的に結合し、病原体を無力化又は不活化する（液性免疫）。Ｂ細胞応答は、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の補助を必要とすることもある。
【０００６】
抗原暴露に応答して形成される専門のＴ細胞クローンは、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）であり、これは、抗原を提示する病原体及び組織に結合し、それらを除去することができる（細胞媒介性又は細胞性免疫）。樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、病原体又は他の異質細胞をエンドサイトーシスによって包囲する場合もある。次いで、ＡＰＣは、細胞からの抗原を加工し、これらの抗原を組織適合性分子：ペプチド複合体の形でＣＴＬ上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示し、それによって免疫応答を刺激する。
【０００７】
特異抗体の形成によって特徴付けられる液性免疫は、一般に、急性の細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も有効であるのに対して、細胞媒介性免疫は、ウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も有効である。細胞性免疫は、癌を防御することでも知られ、臓器移植拒絶の原因である。
【０００８】
以前の感染に由来する抗原に対する抗体は、血液中で極めて長期間検出可能であり、したがって以前に病原体に暴露されたかどうかを判定する手段となる。同じ病原体に再び暴露されると、免疫系は、病原体が増殖し病原性応答を生じる前に病原体を除去することによって再感染を有効に防止する。
【０００９】
ある病原によって誘発される同じ免疫応答が、病原として同じ抗原を提示する非病原体によっても生成されることがある。このようにして、被検者は、以前に感染を撃退していなくても、病原体に対するその後の暴露に対して防御され得る。
【００１０】
しかし、ワクチン形成に必要なすべての病原体が容易に培養され、不活化されるわけではない。現代の組換えＤＮＡ技術によって、この制約を克服しようと努力する新しいワクチンの設計が可能になった。病原性遺伝子を欠く病原体を造り出すことができ、したがって生きた非病原性生物をワクチンとして使用することができる。Ｅ  コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの比較的非病原性の生物を操作して病原性キャリアの細胞表面抗原を提示するようにすることもできる。かかる形質転換キャリアをワクチン接種された被検者の免疫系は、「だまされて」病原体に対する抗体を形成する。病原体の抗原性タンパク質は、非病原性種において操作して発現させることが可能であり、その抗原性タンパク質を単離し、精製して「サブユニットワクチン」を製造することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全であり、化学的に明確に定義されている利点を有するが、その製造に法外な費用のかかることがある。
【００１１】
新しいワクチン化手法が近年出現し、広く遺伝子免疫法と呼ばれている。この手法においては、病原体の抗原をコードする遺伝子は、免疫される被検者の細胞中に作用可能に挿入される。処理された細胞、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、形質転換され、病原体の抗原タンパク質を産生する。次いで、これらのインビボで産生された抗原は、宿主において所望の免疫応答を引き起こす。かかる遺伝子ワクチンに利用される遺伝物質は、ＤＮＡ構築体でもＲＮＡ構築体でもよい。抗原をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子の挿入、複製又は発現を促進する他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入されることが多い。
【００１２】
抗原遺伝子をコードするＤＮＡワクチンは、様々な送達システムによって被検者の宿主細胞に導入することができる。これらの送達システムとしては、原核生物、ウイルス送達システムなどが挙げられる。例えば、ひとつの手法は、新しい遺伝物質を組み込むワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを利用して、宿主細胞を接種するものである。或いは、遺伝物質は、プラスミドベクターに組み込むことができ、又は「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち、単なる精製ＤＮＡとして宿主細胞に直接送達させることができる。また、ＤＮＡは、サルモネラ  チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの弱毒細菌に安定に形質移入することができる。形質転換されたサルモネラを患者に経口接種すると、細菌は、腸のパイエル板（すなわち、二次リンパ組織）に輸送され、次いで免疫応答を刺激する。
【００１３】
ＤＮＡワクチンは、遺伝病、癌などの在来の病原体に起因しない病態に対して免疫化する機会を提供するものである。一般に、遺伝子癌ワクチンは、抗原をコードする遺伝子をＡＰＣに導入する。そのように形質転換されたＡＰＣは、特定のタイプの腫瘍細胞に対する抗原を産生する。したがって、いくつかの癌タイプに対して有効な総合ワクチンは、免疫化しようとする癌細胞の各タイプに対する個々のワクチンを多数含むことができる。
【００１４】
アポトーシスタンパク質阻害剤（すなわち、ＩＡＰファミリータンパク質）は、多数の異なる腫瘍細胞において発現される自然抗原の１クラスである。名前が示唆するように、これらのタンパク質は、その自然の形で、アポトーシス（すなわち、プログラム細胞死）を阻害し、エトポシドなどのアポトーシスを誘導する化学療法剤に対する癌細胞の耐性をもたらし得る。ＩＡＰファミリータンパク質の例としては、Ｘ染色体関連ＩＡＰ（ＸＩＡＰ）、ＮＡＩＰ、（ＢＩＲＣ２としても知られる）ｃＩＡＰ１、（ＢＩＲＣ３としても知られる）ｃＩＡＰ２、（ＢＩＲＣ６としても知られる）ブルス（ｂｒｕｃｅ）、（ＢＩＲＣ５としても知られる）サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及び（ＢＩＲＣ７、ＫＩＡＰ及びＭＬ−ＩＡＰとしても知られる）リビン（ｌｉｖｉｎ）が挙げられる。哺乳動物のＩＡＰタンパク質ファミリーとしては、３種類のＢＩＲドメインを有するタンパク質（例えば、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２及びＮＡＩＰ）、単一ＢＩＲドメインを有するタンパク質（例えば、サービビン及びリビン）などが挙げられる。
【００１５】
Ｔａｍｍ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９８；５８（２３）：５３１５〜２０は、６０種類のヒト腫瘍細胞系におけるヒトサービビンの発現について報告している。Ｔａｍｍ等は、サービビンとＸＩＡＰの両方が、Ｂａｘ、Ｆａｓ（ＣＤ９５）などのアポトーシス誘発剤で腫瘍細胞を処理することによって誘発されるプログラム細胞死（アポトーシス）を阻害するのに有効であることも報告した。報告によれば、サービビン及び他のＩＡＰファミリータンパク質は、効果細胞死プロテアーゼ、例えば、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７に結合することによってアポトーシスを阻害する。ＩＡＰファミリータンパク質の突然変異によって、野生型ＩＡＰファミリータンパク質の活性よりもアポトーシス阻害活性が低下する可能性があり、さらにはアポトーシス誘発活性がもたらされる可能性がある。ＩＡＰファミリータンパク質の抗アポトーシス活性は、ＢＩＲドメインと関連があると考えられる。
【００１６】
報告によれば、サービビンは、肺癌、前立腺癌、乳癌及びすい臓癌を含めて、最も一般的なヒト癌細胞中に存在する。サービビンは、高度の非ホジキンリンパ腫においても認められるが、低度の非ホジキンリンパ腫では認められない。報告によれば、サービビンは、胎児の発育中の正常細胞中に存在するが、他のほとんどのＩＡＰファミリータンパク質とは異なり、正常な成人組織中では実質的に検出不可能である。Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ等  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １９９７；３（８）：９１７〜２１を参照されたい。
【００１７】
リビンは、一部の成体組織及び胚組織において検出される。リビン発現レベルは、黒色腫、結腸癌細胞、膀胱癌細胞及び肺癌細胞において増加することが報告された。リビンの２種類のスプライスバリアントが報告され、その両方が単一のＢＩＲドメインを含む。完全長アルファ変異体は２９８アミノ酸残基を有するのに対して、ベータ変異体は２８０アミノ酸残基を有する。
【００１８】
ＩＡＰファミリータンパク質は、ヒトに加えて、マウスなどの哺乳動物、ゼノプス種（アフリカツメガエル）などの両生類、ショウジョウバエ種などの昆虫及びバキュロウイルスを含めたいくつかの種においても確認された。
【００１９】
サービビンは癌細胞において広範かつ極めて選択的に発現することから、癌の有用な診断マーカー候補となっている。例えば、Ｒｏｈａｙｅｍ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００；６０：１８１５〜１７の報告によれば、ヒト肺及び結腸直腸癌患者においてサービビンに対する自己抗体が確認された。
【００２０】
サービビンは、癌治療の標的としても認識されている。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７に対するサービビンの阻害効果は、様々なアポトーシス刺激化学療法に対する癌細胞の抵抗性と関係がある。サービビン発現を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腺癌細胞系におけるサービビンの発現を減少させ、化学療法剤エトポシドに対する癌細胞の感受性を増加させることが報告されている。Ｏｌｉｅ等  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００；６０：２８０５〜９及びＭｅｓｒｉ等  Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓ．、２００１；１０８：９８１〜９９０を参照されたい。
【００２１】
サイトカインは、細胞増殖、細胞分化、免疫応答の調節、血球新生、炎症反応などの他の細胞の挙動に影響を及ぼすことができる、細胞によって産生されるタンパク質及びポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、ヘマトポイエチン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及び様々な未配属の分子を含めて、いくつかのファミリーに分類される。一般には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００、並びにＣ．Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ、Ｐ．  Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｍ．  Ｗａｌｐｏｒｔ及びＭ．  Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００１（以後、Ｊａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓ）を参照されたい。サイトカインの簡潔な分類は、Ｊａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩＩ、６７７〜６７９ページにあり、その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。
【００２２】
ヘマトポイエチンとしては、例えば、エリスロポイエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｔ細胞によって産生され、Ｔ細胞増殖に関与する１３３アミノ酸タンパク質）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５（腸管上皮、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激する１１４アミノ酸ＩＬ−２様タンパク質）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられる。
【００２３】
インターフェロンとしては、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ（Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって産生され、マクロファージ活性化、ＭＨＣ分子及び抗原プロセシング成分の発現増加、ＩＧクラススイッチ、及びＴＨ２の抑制に関与する１４３アミノ酸ホモ二量体タンパク質）が挙げられる。
【００２４】
免疫グロブリンとしては、例えば、その両方がＴ細胞応答を同時刺激するＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）が挙げられる。
【００２５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーとしては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンフォトキシン）、リンフォトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ｔｒａｉｌ及びＯＰＧリガンドが挙げられる。
【００２６】
特定のファミリーに割り当てられない様々なサイトカインとしては、例えば、腫瘍成長因子−β（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１  ＲＡ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ナチュラルキラー細胞刺激因子；１９７アミノ酸鎖と３０６アミノ酸鎖を含み、ＮＫ細胞活性化及びＴＨ１様細胞へのＴ細胞分化の誘導に関与するヘテロ二量体）、マクロファージ抑制因子（ＭＩＦ）、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（上皮、内皮及び繊維芽細胞におけるサイトカイン産生を誘導するサイトカイン産生誘導因子）及びＩＬ−１８が挙げられる。
【００２７】
ケモカインは、比較的小さな化学誘引タンパク質及びポリペプチドであり、白血球遊走など様々な細胞（例えば、食細胞及びリンパ球）の遊走及び活性化を刺激するサイトカインファミリーである。ケモカインは、炎症及び他の免疫応答においてある役割を果たす。ケモカインは、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ３Ｃケモカインを含めて、いくつかのファミリーに分類される。これらの名称は、分子中のシステイン残基の数及び空間的配置を基準とし、Ｃケモカインは１個のシステインを含み、ＣＣケモカインは２個の隣接システインを含み、ＣＸＣは単一のアミノ酸残基によって分離された２個のシステインを含み、ＣＸ３Ｃケモカインは３個のアミノ酸残基によって分離された２個のシステインを含む。ケモカインは、細胞表面にあるいくつかのケモカイン受容体と相互作用する。その関連する開示を参照により本明細書に組み込むＪａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＶ、６８０ページを参照されたい。
【００２８】
また、ケモカインは、免疫調節活性を有することができ、癌に対する免疫応答と関係がある。例えば、ヒト二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）（現在一般にＣＣＬ２１と称される）のマウスアナログであるネズミ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣは、Ｃ−２６結腸癌腫瘍細胞系において抗腫瘍応答を誘導することが報告されている。Ｖｉｃａｒｉ等  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；１６５（４）：１９９２〜２０００を参照されたい。ヒトＣＣＬ２１及びそのネズミ対応物６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣは、ＣＣケモカインに分類され、ＣＣＲ７ケモカイン受容体と相互作用する。ネズミ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）は、Ｖｉｃａｒｉ等によって、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体リガンドであることも報告されている。ヒトＣＣＬ２１、ネズミｍｕＣＣＬ２１及び様々な他のケモカインは、樹状細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの様々な免疫系細胞の調節に関係する。
【００２９】
Ｍｉｇ及びＩＰ−１０は、活性化Ｔ細胞に付随するＣＸＣＲ３受容体と相互作用するＣＸＣケモカインである。リンホタクチンはＣケモカインであり、Ｔ細胞及びＮＫ細胞に付随するＸＣＲ１受容体と相互作用する。フラクタルカインはＣＸ３Ｃケモカインであり、Ｔ細胞、単球及び好中球に付随するＣＸ３ＣＲ１受容体と相互作用する。
【００３０】
ＮＫ細胞は、ウイルスに感染された細胞を認識し破壊する大きな顆粒リンパ球である。ＮＫ細胞は、免疫調節性ポリペプチドリガンドとＮＫ細胞表面受容体の相互作用によって調節することができる。例えば、ＮＫ細胞活性を調節することができるＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドとしては、ｍｕＣＣＬ２１などのケモカイン、ＭＨＣクラスＩ鎖関連抗原、ＵＬ１６結合タンパク質などのストレス誘導性ポリペプチドリガンドが挙げられる。ネズミＨ６０副組織適合抗原ペプチドも、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することが報告されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；１９９（１）：８〜１４；Ｃｈｏｉ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２、１７（５）：５９３〜６０３及びＦａｒａｇ等、Ｂｌｏｏｄ、２００２；１００（６）：１９３５〜１９４７を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明は、単一ベクター中で癌関連ＩＡＰファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物をコードするＤＮＡワクチンを提供することによって、癌細胞に対する全身免疫応答を刺激することができるワクチンに対する継続的な要望を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効なＤＮＡワクチンは、癌関連ＩＡＰファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含む。ＤＮＡ構築体は、弱毒細菌（例えば、弱毒サルモネラ  チフィムリウムベクター）などのベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。ＤＮＡワクチンは、少なくとも１種類の癌関連ＩＡＰファミリータンパク質をコードするポリヌクレオチドと、免疫活性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。ＤＮＡ構築体は、サービビンタンパク質（例えば、ヒトサービビン、ネズミサービビンなど）など成体組織には実質的に存在しないが癌組織では増加する癌関連ＩＡＰファミリータンパク質又はリビンタンパク質をコードすることが好ましい。ＤＮＡ構築体によってコードされる免疫反応性遺伝子産物は、サイトカイン、ナチュラルキラー細胞表面受容体リガンド又は類似の免疫反応性分子であることが好ましい。
【００３３】
一実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、好ましくは、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、（ｂ）配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、（ｃ）配列番号２３のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、（ｄ）配列番号２４のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及び（ｅ）ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片からなる群から選択されるサービビンタンパク質を作用可能にコードするＤＮＡを含む。
【００３４】
さらに別の実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、好ましくは、（ａ）配列番号２７のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、（ｃ）配列番号２７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、（ｄ）配列番号２９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及び（ｅ）ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片からなる群から選択されるリビンタンパク質を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含む。
【００３５】
好ましいサイトカインとしては、ヒトＣＣＬ２１、ネズミＣＣＬ２１、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＩＰ−１０などのケモカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１５などのヘマトポイエチン；ＩＦＮ−γなどのインターフェロン；ＩＬ−１２、ＩＬ−１７などのＴ細胞及びＮＫ細胞遊走又は増殖に関連する他のサイトカインなどが挙げられる。
【００３６】
好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドは、ＮＫＧ２Ｄ細胞表面受容体に結合するヒトＭＩＣＡ、ヒトＭＩＣＢ、ヒトＵＬＢＰ１、ヒトＵＬＢＰ２、ヒトＵＬＢＰ３などのストレス誘導性タンパク質である。特に好ましいＮＫＧ２ＤリガンドはＭＩＣＡ及びＭＩＣＢである。
【００３７】
ミョウバン、水中油型乳剤、防腐剤などの従来のアジュバントもワクチンに入れることができる。本発明のＤＮＡワクチンは、腫瘍細胞アポトーシスの刺激を含めて、腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激し、腫瘍成長及び転移を阻害する。
【００３８】
本発明の方法側面においては、ワクチン接種患者における腫瘍成長を長期間阻害するためにＤＮＡワクチンを利用する。ＩＡＰファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするポリヌクレオチド構築体を薬剤として許容されるキャリア中に含むＤＮＡワクチンは、腫瘍成長を阻害する必要がある患者に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で（好ましくは、経口）投与される。
【００３９】
本発明のワクチンは、様々なタイプの癌を治療するのに有用である。例えば、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫などの患者は、本発明のワクチンによる免疫化による利点を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
腫瘍細胞に対して免疫応答を誘導するのに有効なＤＮＡワクチンは、ＩＡＰファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「ＤＮＡ構築体」という用語は、標的細胞において転写され得る合成ＤＮＡ構造体を意味する。この構築体は、精製ＤＮＡ、プラスミドベクターに組み込まれたＤＮＡ、ＤＮＡを宿主細胞に導入するのに適切な任意の他のベクターに組み込まれたＤＮＡなどの線状核酸を含むことができる。ＤＮＡは、好ましくは、ウイルス又は細菌ベクター、より好ましくは、非病原性である弱毒ウイルス又は細菌ベクター、最も好ましくは、弱毒細菌ベクターに組み込まれる。
【００４１】
本明細書において使用される「免疫」という用語は、毒性病原体又は腫瘍抗原に対する長期の免疫保護作用を指す。「免疫化」という用語は、非病原性源に由来する病原体の抗原に予防的に曝し、その被検者において病原体に対する免疫が獲得されることを指す。
【００４２】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合するグリコシル化タンパク質である分子、免疫グロブリンを指す。
【００４３】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫適格性動物に導入されたときに、特異抗体、すなわちその抗原に結合することができる抗体の産生を刺激する実体を意味する。本明細書において使用される「免疫原」という用語は、単独で抗体産生を刺激することができるが、キャリアと結びついた場合でも抗体産生を刺激することができる実体を意味する。
【００４４】
本明細書において使用される「保存的置換」という用語は、１個のアミノ酸残基が別の生物学的に類似した残基で置換されることを意味する。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの１個の疎水性残基と別のものとの置換、又はアルギニンなどの１個の親水性残基とリジンの置換及びその逆、グルタミン酸とアスパラギン酸の置換及びその逆、グルタミンとアスパラギンの置換及びその逆などが挙げられる。
【００４５】
ペプチド配列に関して本明細書において使用される、文法的に様々な形の「実質的に対応する」という用語は、アミノ末端とカルボキシ末端の一方又は両方において最高３個のアミノ酸残基が追加又は削除され、ポリペプチド配列に沿って保存的置換のみを含む記載のペプチド配列を意味する。
【００４６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫活性遺伝子産物」という用語及びその文法的に変化した用語は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞と相互作用し、それらの活性を調整するタンパク質及びポリペプチドなどの免疫調節活性を有するタンパク質及びポリペプチドを含む。
【００４７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「ＩＡＰファミリータンパク質」という用語は、腫瘍細胞において発現され、その自然の形でアポトーシスを阻害する自然抗原クラスのすべてを含む。ＩＡＰファミリータンパク質としては、例えば、ヒトサービビン、ヒトＸ染色体連鎖ＩＡＰ（ＸＩＡＰ）、ネズミＴＩＡＰ（サービビンのネズミアナログ）、ヒトリビン、ヒトｃ−ＩＡＰ−１、ヒトｃ−ＩＡＰ−２、ヒトＮＡＩＰ、少なくとも１個のバキュロウイルスアポトーシス反復阻害剤（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｐｅａｔ）（ＢＩＲ）ドメインを含む任意の他のタンパク質又はそのホモログが挙げられる。ＢＩＲドメインは、すべての野生型ＩＡＰファミリータンパク質中に存在する。ＢＩＲドメインは、４つの比較的短いアルファらせん及び３本鎖逆平行ベータシート構造領域を含む。このドメインは、ＩＡＰファミリータンパク質の全体にわたって保存されている３個のシステイン残基と１個のヒスチジン残基によってＺｎに結合する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「ＩＡＰファミリータンパク質」という用語は、スプライスバリアント、置換変異体などの野生型ＩＡＰタンパク質の変異体、並びに主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識される断片及びその免疫原性ホモログ（すなわち、サービビンタンパク質エピトープ）も含む。
【００４８】
ＩＡＰファミリータンパク質に関連して、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「癌関連」という用語は、正常な非癌性細胞よりも癌細胞において高いレベルで発現されるＩＡＰファミリータンパク質を意味する。癌関連ＩＡＰファミリータンパク質の例としては、ヒトサービビン及びヒトリビンが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「サービビンタンパク質」という用語は、完全長ヒトサービビン分子（配列番号２）、その完全長ネズミアナログ（すなわち、本明細書に記載するＴＩＡＰ）、スプライスバリアント、置換変異体などのヒトサービビン又はネズミサービビンの変異体、並びに主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるヒトサービビンの断片（例えば、エピトープ）及びヒトサービビンの免疫原性ホモログを含む。ヒトサービビンの公知の置換変異体としては、配列番号２のアミノ酸残基配列中に置換Ｔ３４Ａを有するタンパク質、配列番号２のアミノ酸残基配列中に置換Ｄ５３Ａを有するタンパク質、配列番号２のアミノ酸残基配列中に置換Ｃ８４Ａを有するタンパク質などが挙げられる（Ｓｏｎｇ等、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ、２００４；１５（３）：１２８７〜１２９６、Ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２９，２００３）。これらの公知の変異体の各々は、抗アポトーシス活性を有する野生型サービビンとは対照的にアポトーシス活性を有する。
【００５０】
好ましい実施態様においては、本発明のＤＮＡワクチンは、配列番号２のアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビン、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトサービビンの免疫原性ホモログ、配列番号２３のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、配列番号２４のアミノ酸残基配列を有するヒトサービビンのスプライスバリアント、及びＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるサービビンタンパク質の断片などのサービビンタンパク質を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含む。
【００５１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「リビンタンパク質」という用語は、完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアント（配列番号２７）、ヒトリビンのベータスプライスバリアント（配列番号２９）、ヒトリビンアルファ及びベータスプライスバリアントの置換変異体、並びにＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるその断片及び免疫原性ホモログを含む。
【００５２】
別の好ましい実施態様においては、本発明のＤＮＡワクチンは、配列番号２７のアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンアルファスプライスバリアント、配列番号２９のアミノ酸残基配列を有するヒトリビンベータスプライスバリアント、配列番号２７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する完全長野生型ヒトリビンの免疫原性ホモログ、配列番号２９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基配列を有する野生型ヒトリビンベータスプライスバリアントの免疫原性ホモログ、及びＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるリビンタンパク質の断片などのリビンタンパク質を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含む。
【００５３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「免疫原性ホモログ」という用語及びその文法的に変化した用語は、サービビン、リビンなどの癌関連ＩＡＰファミリータンパク質に関して使用されるときには、野生型癌関連ＩＡＰファミリータンパク質に対して高度の相同性を有するタンパク質であって、ＭＨＣクラスＩ分子に結合することができ、対応する野生型ＩＡＰファミリータンパク質に対して活性である細胞障害性Ｔ細胞によって認識され得るタンパク質を意味する。免疫原性ホモログは、好ましくは、野生型癌関連ＩＡＰファミリータンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一であるアミノ酸残基配列を有する。
【００５４】
理論に拘泥するわけではないが、ヒト患者などの患者への本発明のワクチンの接種によって、抗原提示細胞などの免疫細胞表面で癌関連ＩＡＰファミリータンパク質に由来する抗原が選択的に提示され、さらにこれらの細胞において免疫活性遺伝子産物が選択的に発現されると考えられる。抗原提示細胞の細胞表面でサービビンタンパク質、リビンタンパク質などの癌関連ＩＡＰファミリータンパク質の提示が増加し、さらにサイトカイン、ＮＫ細胞表面受容体に対するリガンドなどの免疫活性遺伝子産物が発現することによって、サービビンタンパク質、リビンタンパク質などの癌関連ＩＡＰファミリータンパク質を発現する癌細胞に対する免疫応答が増強される。成人においては、サービビンはほぼすべて癌細胞において発現される。同様に、リビン発現は、報告によれば、一部の癌細胞系、特にメラノーマ細胞系において増加する。
【００５５】
好ましい実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、サービビンタンパク質及びサイトカインを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。サービビンタンパク質は、ヒトサービビン、ネズミサービビン又はそのエピトープであることが好ましい。サイトカインは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞活性を調整することが好ましい。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロンが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−１２などのＮＫ細胞活性化サイトカイン及びＩＬ−１７などのサイトカイン産生刺激因子が挙げられる。
【００５６】
別の好ましい実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、リビンタンパク質及びサイトカインを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。リビンタンパク質は、野生型ヒトリビン又はそのエピトープであることが好ましい。サイトカインは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞活性を調整することが好ましい。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、ヘマトポイエチン、インターフェロンが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−１２などのＮＫ細胞活性化サイトカイン及びＩＬ−１７などのサイトカイン産生刺激因子が挙げられる。
【００５７】
好ましいケモカインとしては、ＣＣケモカイン、特にＣＣＬ２１（ＳＬＣ）などのＣＣＲ７ケモカイン受容体リガンドであるＣＣケモカイン；リンホタクチンなどのＣＲ１受容体リガンドであるＣケモカイン；フラクタルカインなどのＣＸ３ＣＲ１受容体リガンドであるＣＸ３Ｃケモカイン；ＣＸＣケモカイン、特にＩＰ−１０などのＣＸＣＲ３受容体リガンドであるＣＸＣケモカインが挙げられる。ケモカインは、ヒトＣＣＬ２１又はそのネズミアナログ（ネズミＣＣＬ２１）であることが最も好ましい。
【００５８】
好ましいヘマトポイエチンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５などのＴ細胞増殖因子が挙げられる。好ましいインターフェロンとしては、ＩＦＮ−γなどのＴ細胞及びＮＫ細胞によって産生されるインターフェロンなどが挙げられる。他の好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−１２などのＮＫ細胞活性化サイトカイン、ＩＬ−１７などを含めて、上皮、内皮及び線維芽細胞などの細胞においてサイトカイン産生を誘導するサイトカインなどが挙げられる。
【００５９】
別の好ましい実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、サービビンタンパク質及びナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。サービビンタンパク質は、ヒトサービビン、ネズミサービビン又はヒトサービビンのエピトープであることが好ましい。ナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドは、ＮＫＧ２Ｄ細胞表面受容体リガンドであることが好ましい。ＮＫＧ２Ｄ細胞表面受容体リガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢなどのＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）抗原、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３などのＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）などであることが好ましい。ネズミＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、例えば、Ｒａｅｌ及び副組織適合抗原ペプチドＨ６０が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄ細胞表面受容体リガンドはＭＩＣＡ又はＭＩＣＢであることが最も好ましい。
【００６０】
さらに別の好ましい実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、リビンタンパク質及びＮＫ細胞受容体リガンドを作用可能にコードするポリヌクレオチド配列を含む。リビンタンパク質は、野生型ヒトリビン、ヒトリビンのエピトープ又はリビン変異体とすることができる。
【００６１】
癌関連ＩＡＰファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードする本発明のＤＮＡ構築体は、遺伝子発現に必要な当分野で周知の調節性要素に作用可能に結合されていることも好ましい。
【００６２】
ＤＮＡ構築体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能なＢＵＤＣＥ４．１発現ベクターなどの発現ベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。他の適切な発現ベクターは、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡから市販されている。ＤＮＡ構築体は、発現ベクターに組み込まれると、宿主細胞に発現ベクターを形質移入することによって、生きた弱毒細菌ベクターなどの宿主ベクターに導入することができ、本発明のワクチンが提供される。
【００６３】
ＤＮＡ構築体は、好ましくは、ヌクレオチドの発現に必要な調節性要素を含む。かかる要素としては、例えば、プロモーター、開始コドン、終止コドン及びポリアデニレーションシグナルが挙げられる。また、エンハンサーは、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現に必要なことが多い。当分野で知られているように、これらの要素は、好ましくは、所望のタンパク質をコードする配列に作用可能に結合されている。それらが投与される種に適合する調節性要素が好ましくは選択される。
【００６４】
開始コドン及び終止コドンは、好ましくは、サービビンタンパク質及び免疫調節性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として本発明の遺伝子ワクチンに含まれる。開始コドン及び終止コドンは、サービビンタンパク質及び免疫調節性ポリペプチドのコード配列とインフレームになければならないのは言うまでもない。
【００６５】
本発明のワクチンに含まれるプロモーター及びポリアデニレーションシグナルは、好ましくは、免疫される被検者の細胞内で機能するように選択される。
【００６６】
本発明のワクチン、特にヒト用遺伝子ワクチンの製造に有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ即時型プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に由来するプロモーター、及びヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーターが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６７】
本発明のワクチン、特にヒト用遺伝子ワクチンの製造に有用なポリアデニレーションシグナルとしては、ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル、ＬＴＲポリアデニレーションシグナルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６８】
ＤＮＡ発現に必要な調節性要素に加えて、他の要素もＤＮＡ分子中に入れることができる。かかる追加の要素としてはエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン並びにＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のエンハンサーなどのウイルスエンハンサーとすることができる。
【００６９】
制御配列及びコドンは一般に種に依存する。タンパク質産生を最大にするために、制御配列及びコドンは、免疫される種に有効なように選択される。当業者は、所与の対象種において機能するＤＮＡ構築体を容易に製造することができる。
【００７０】
本ワクチンのＤＮＡ構築体は、その該当する開示を参照により援用するＲｅｓｔｉｆｏ等  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００；７：８９〜９２に定義された「裸の」ＤＮＡとすることができる。ＤＮＡは、ベクターに作用可能に組み込まれていることが好ましい。有用な送達ベクターとしては、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）又はリポソーム、ウイルス、細菌などの生きた遺伝子改変弱毒ベクターなどが挙げられる。
【００７１】
生きた適切な弱毒細菌ベクターの例としては、サルモネラ  チフィムリウム、サルモネラ  チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、バチルス  カルメット  ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ  コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、又は当分野で既知の任意の他の適切な細菌ベクターが挙げられる。ベクターは、生きた弱毒サルモネラ  チフィムリウムベクターであることが好ましい。好ましい生きた弱毒サルモネラ  チフィムリウムとしては、ＳＬ７２０７などのＡｒｏＡ−系統、又はＲＥ８８などの二重弱毒（ｄｏｕｂｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ＡｒｏＡ−，ｄａｍ−系統が挙げられる。二重弱毒ＡｒｏＡ−，ｄａｍ−サルモネラ  チフィムリウムは特に好ましいベクターである。
【００７２】
生きた細菌ベクターを外来性ＤＮＡ構築体で形質転換する方法は、当分野では十分に述べられている。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＤａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ）を参照されたい。
【００７３】
好ましいウイルスベクターとしては、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスが挙げられる。ウイルスベクターを外来性ＤＮＡ構築体で形質転換する方法も当分野では十分に述べられている。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌを参照されたい。
【００７４】
有用なリポソームベクターは、親油性材料と内部水性部分で形成された膜部を有する単層又は多層の小胞である。水性部分は、本発明では、標的細胞に送達されるポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。リポソーム形成材料は、第４級アンモニウムなどの陽イオン性基、及び約６個から約３０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アリル基などの１個以上の親油性基を有することが一般に好ましい。適切な材料の一群は、欧州特許第０１８７７０２号に記載されており、Ｗｏｌｆｆ等の米国特許第６，２２８，８４４号でさらに考察されている。これらの該当する開示を参照により援用する。多数の他の適切なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物が文献に記載されている。例えば、Ｌ．  Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８；２７：３９１７〜３９２５及びＨ．  Ｅｉｂｌ等、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７９；１０：２６１〜２７１を参照されたい。或いは、ポリ乳酸−コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアを利用することができる。核酸構築体は、当分野で知られているとおり、内部に封入されており、又は組織に核酸を送達するリポソーム若しくはミクロスフェアと複合化されている。
【００７５】
他の有用なベクターとしては、Ｗａｎｇ等、Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．、２００４；３（３）：１９０〜６．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｆｅｂ．１５に記載の生分解性ポリ（オルトエステル）材料を含む重合体ミクロスフェアが挙げられる。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。
【００７６】
本発明の方法側面は、癌関連ＩＡＰファミリータンパク質及び免疫反応性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡワクチンをヒトなどの哺乳動物の組織に投与することを含む。一部の好ましい実施態様においては、ＤＮＡワクチンは、経口、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内又は局所に投与される。ＤＮＡワクチンは、経口投与されることが好ましい。
【００７７】
好ましい方法においては、本発明のＤＮＡワクチンは、ワクチンによる治療を受けた患者において腫瘍成長を長期的に阻害するために利用することができる。ＤＮＡワクチンは、サービビンタンパク質などの癌関連ＩＡＰファミリータンパク質、サイトカイン、ＮＫ細胞表面受容体リガンドなどの免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡポリヌクレオチド構築体、及び薬剤として許容されるその担体を含む。ワクチンは、腫瘍成長を阻害する必要がある哺乳動物に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。
【００７８】
本発明のワクチンによる治療を受ける哺乳動物はヒトであることが好ましい。肺癌又は結腸癌、乳房腫瘍、前立腺腫瘍などの癌患者は、本発明のワクチンによる免疫化の利点を得ることができる。
【００７９】
本発明のワクチンは、好ましくは、水、食塩水、デキストロース、グリセリンなど、並びにそれらの組み合わせなどの薬剤として許容される担体又は賦形剤とともに処方される。ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、アジュバントなどの補助物質を含むこともできる。
【００８０】
本発明のワクチンは、好ましくは、薬剤として許容される担体の溶液又は懸濁液としてヒトなどの哺乳動物に、約１から約１０マイクログラム／ミリリットルのＤＮＡ濃度で経口投与される。適切な投与量は、ワクチン接種される被検者によって決まり、ワクチンを投与する又は投与を要求する開業医の判断にある程度依存する。
【００８１】
本発明のワクチンは、アンプル、ビン、バイアルなどの適切に滅菌された容器に複数回投与又は単位剤形として入れられる。容器は、好ましくは、ワクチン調製物を充填した後で機密密封される。ワクチンは、ワクチンを識別するラベルが貼られた容器に入れられ、適切な法の下にワクチンが承認されたことを示す米国食品医薬品局などの政府機関によって規定された形式の表示、投与情報などを有することが好ましい。ラベルは、好ましくは、ワクチンを患者に投与する医療関係者に有用なワクチンについての情報を含む。包装は、好ましくは、ワクチン投与に関する印刷された情報資料、説明書、指示書及びあらゆる必要な所定の警告を含む。
【００８２】
ヒトサービビンＤＮＡ配列及びその対応するタンパク質配列は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫ、ＤＮＡ受託番号ＢＣ０３４１４８のＥＭＢＬデータベースにＳｔｒａｕｓｂｅｒｇによって報告された。その開示を参照により本明細書に組み込む。ネズミＴＩＡＰのＤＮＡ配列及び対応するタンパク質配列は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９９９；９６：１４５７〜６２；ＤＮＡ受託番号ＡＢ０１３８９によって報告された。その開示を参照により本明細書に組み込む。
【００８３】
ヒトサービビンをコードする核酸配列を図１（配列番号１）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号２）を図２に示す。ネズミサービビン（すなわち、ＴＩＡＰ）をコードする核酸配列を図３（配列番号３）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号４）を図４に示す。
【００８４】
ヒトサービビンとそのネズミ対応物ＴＩＡＰのタンパク質相同性を図５に示す。図５に示すように、ヒトサービビン（配列番号２）とネズミＴＩＡＰ（配列番号４）には約８３％の同一アミノ酸残基配列がある。
【００８５】
Ｍａｈｏｔｋａ等は、サービビン−ΔＥｘ３及びサービビン−２Ｂと称するヒトサービビンの２種類のスプライスバリアントを特定した。これらも本発明に使用するのに適切である。Ｍａｈｏｔｋａ等  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９９；５９：６０９７〜６１０２。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。サービビン−２Ｂ（配列番号２３）及びサービビン−ΔＥｘ３（配列番号２４）のアミノ酸残基配列を図３７に示す。Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ等は、サービビン−２Ｂに対して細胞障害性リンパ球応答を誘導するサービビン−２Ｂ８０−８８と称される、アミノ酸残基配列ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ（配列番号２５）を有するサービビン−２Ｂ由来の強力なＴ細胞エピトープを特定した。Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ等  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００２；８：１７３１〜３９。その関連する開示を参照により本明細書に組み込む。このエピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合することができ、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるサービビンの断片であり、本発明のワクチンのＩＡＰファミリータンパク質成分として使用するのに適切である。
【００８６】
ヒトサービビンの別のスプライスバリアントは、Ｂａｄｒａｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４；３１４（３）：９０２〜９０７によって記述されたサービビン−３Ｂ変異体である。サービビン−３Ｂ及びその対応するアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫ、ＤＮＡ受託番号ＡＢ  １５４４１６のＥＭＢＬデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【００８７】
（アルファ変異体として知られる）完全長ヒトリビンは、単一ＢＩＲドメインを有し、２９８アミノ酸残基からなるＩＡＰファミリータンパク質である。ヒトリビンアルファ変異体のＤＮＡ配列及び対応するタンパク質配列は、Ｃｌａｒｋ等によってＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫ、ＤＮＡ受託番号ＮＭ  １３９３１７のＥＭＢＬデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトリビンのベータ変異体のＤＮＡ配列及び対応するタンパク質配列は、受託番号ＮＭ  ０２２１６１としてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【００８８】
完全長ヒトリビン（アルファ変異体）をコードする核酸配列を図３９（配列番号２６）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号２７）を図４０に示す。ヒトリビンのベータ変異体をコードする核酸配列を図４１（配列番号２８）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号２９）を図４２に示す。ヒトリビンのベータ変異体は、完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアント（配列番号２７）のアミノ酸残基２１６から２３３までを欠いている。ベータ変異体は、他のすべての点でヒトリビンのアルファ変異体と同一である。ヒトリビンのアルファとベータ変異体の両方のＢＩＲドメインは、配列番号２７及び配列番号２９のアミノ酸残基Ｒ９０からアミノ酸残基Ｌ１５５の領域にある）。
【００８９】
好ましい実施態様においては、本発明のワクチンは、ヒトサービビン、ＴＩＡＰ（ネズミサービビン）、その免疫原性ホモログなどの１種類以上のサービビンタンパク質をコードするＤＮＡ構築体を含む。免疫原性ホモログは、好ましくは、ヒトサービビンと少なくとも約８０％のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、配列番号２と少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸残基配列が同一である。或いは、ワクチンはヒトサービビンタンパク質の１種類以上のＴ細胞エピトープをコードするＤＮＡ構築体を含むことができる。
【００９０】
別の好ましい実施態様においては、本発明のワクチンは、ヒトリビンアルファ及びベータスプライスバリアント（それぞれ配列番号２７及び２９）、その免疫原性ホモログなどの１種類以上のリビンタンパク質をコードするＤＮＡ構築体を含む。免疫原性ホモログは、好ましくは、ヒトリビンのアルファ又はベータスプライスバリアントと少なくとも約８０％のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、配列番号２７又は配列番号２９と少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸残基配列が同一である。或いは、ワクチンはヒトリビンタンパク質の１種類以上のＴ細胞エピトープをコードするＤＮＡ構築体を含むことができる。
【００９１】
遺伝コード固有の縮重のために、ヒトサービビン、ネズミサービビン、ヒトリビンスプライスバリアントなどの生来の（すなわち、天然）癌関連ＩＡＰファミリータンパク質と実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を本発明のワクチンに使用することができる。かかるＤＮＡ配列としては、生来のサービビン又はリビン  ＤＮＡ配列とハイブリッド形成可能なＤＮＡ配列、対立遺伝子変異体などが挙げられる。機能的に等価なホモログのＤＮＡは、前記未変性サービビン又はリビンタンパク質をコードするＤＮＡと少なくとも約７０％のヌクレオチド配列が同一であり、より好ましくは少なくとも約８０％のヌクレオチド配列が同一であることが好ましい。
【００９２】
本ワクチンのＤＮＡ構築体によってコードされる免疫活性遺伝子産物は、好ましくは、サイトカイン又はナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドである。特に好ましいサイトカインはＣＣケモカインである。特に有用なＣＣケモカインは、ＣＣＲ７ケモカイン受容体のリガンドである。選択的ＣＣＲ７リガンドとしては、（ｅｘｏｄｕｓ−３、ＥＬＣ、ＭＩＰ−３β及びＣＫβ１１としても知られる）ＣＣＬ１９、（ｅｘｏｄｕｓ−２、ＳＬＣ、６Ｃｋｉｎｅ、ＴＣＡ４及びＣＫβ９としても知られる）ＣＣＬ２１などが挙げられる。特に好ましいケモカインは、ヒトＣＣＬ２１及びそのネズミ対応物６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）、及びそれに実質的に対応するケモカインである。
【００９３】
ヒトＳＬＣのＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫ、ＤＮＡ受託番号ＡＢ００２４０９のＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ  ＤＮＡ及びタンパク質配列のネズミＣＣＬ２１ａ変異体は、Ｈｒｏｍａｓ等  Ｊ  ＩｍｍｕｎｏＬ  １９９７；１５９（６）：２５５４〜２５５８、ＤＮＡ受託番号ＮＭ０１１３３５によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ  ＤＮＡ及びタンパク質配列のネズミＣＣＬ２１ｂ変異体は、Ｈｅｄｒｉｃｋ等、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；１５９（４）：１５８９〜１５９３、ＤＮＡ受託番号ＮＭ０１１１２４によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベース報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。
【００９４】
ヒトＣＣＬ２１（ＳＬＣ）をコードする核酸配列を図６（配列番号５）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号６）を図７に示す。ネズミＣＣＬ２１（ＣＣＬ２１ｂ変異体）をコードする核酸配列を図８（配列番号７）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号８）を図９に示す。
【００９５】
ヒトＣＣＬ２１（ＳＬＣ）とそのネズミ対応物（ネズミ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ、ＣＣＬ２１ｂ）のタンパク質相同性を図１０に示す。図１０に示すように、ヒトＣＣＬ２１（配列番号６）とネズミＣＣＬ２１（配列番号８）には約７３％の同一アミノ酸残基配列がある。
【００９６】
ネズミＳＬＣのＣＣＬ２１ａ変異体をコードする核酸配列を図２５（配列番号１１）に示す。その対応するアミノ配列（配列番号１２）を図２６に示す。
【００９７】
ナチュラルキラー細胞表面受容体の好ましいリガンドは、ネズミＮＫＧ２Ｄ表面受容体リガンドである。ＮＫＧ２Ｄ表面受容体の好ましいリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３などである。最も好ましくは、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ。ＮＫＧ２Ｄ表面受容体の他の公知のリガンドとしては、ネズミＲｅａ−１β、ネズミ副組織適合抗原ペプチドＨ６０などが挙げられる。
【００９８】
ネズミＨ６０副組織適合抗原ペプチドＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｍａｌａｒｋａｎｎａｎ等、Ｊ．  Ｉｍｍｕｒａｏｌ．  １９９８；１６１（７）：３５０１〜３５０９、ＤＮＡ受託番号ＡＦ０８４６４３によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ネズミＨ６０副組織適合抗原ペプチドをコードする部分核酸配列を図１１（配列番号９）に示す。その対応する部分アミノ酸残基配列（配列番号１０）を図１２に示す。
【００９９】
ヒトＭＩＣＡのＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｚｗｉｒｎｅｒ等、ＤＮＡ受託番号ＡＹ２０４５４７によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトＭＩＣＡをコードする核酸配列を図２７（配列番号１３）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１４）を図２８に示す。
【０１００】
ヒトＭＩＣＢのＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｂａｈｒａｍ等  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９６；４５（２）：１６１〜１６２、ＤＮＡ受託番号Ｕ６５４１６によってＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトＭＩＣＢをコードする核酸配列を図２９（配列番号１５）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１６）を図３０に示す。ＭＩＣＢの対立遺伝子変異体は、参照により本明細書に組み込むＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ  ００５９２２に記載されている。図３８は、受託番号ＮＰ  ００５９２２のＧＥＮＢＡＮＫ登録の複製である。
【０１０１】
ヒトＵＬＢＰＩのＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｃｏｓｍａｎ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００１；１４（２）：１２３〜１３３、ＤＮＡ受託番号ＡＦ３０４３７７によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトＵＬＢＰ１をコードする核酸配列を図３１（配列番号１７）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号１８）を図３２に示す。
【０１０２】
ヒトＵＬＢＰ２のＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｃｏｓｍａｎ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００１；１４（２）：１２３〜１３３、ＤＮＡ受託番号ＡＦ３０４３７８によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトＵＬＢＰ２をコードする核酸配列を図３３（配列番号１９）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号２０）を図３４に示す。
【０１０３】
ヒトＵＬＢＰ３のＤＮＡ及びタンパク質配列は、Ｃｏｓｍａｎ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００１；１４（２）：１２３〜１３３、ＤＮＡ受託番号ＡＦ３０４３７９によって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ、ＵＫのＥＭＢＬデータベースに報告されている。その開示を参照により本明細書に組み込む。ヒトＵＬＢＰ３をコードする核酸配列を図３５（配列番号２１）に示す。その対応するアミノ酸残基配列（配列番号２２）を図３６に示す。
【０１０４】
特に好ましいナチュラルキラー細胞表面受容体リガンドとしては、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３などのＮＫＧ２Ｄ受容体リガンド及びその機能等価物が挙げられる。機能等価物は、好ましくは、前記免疫調節性ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸残基配列が同一であり、より好ましくは、少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列が同一であり、最も好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸残基配列が同一である。
【０１０５】
遺伝コード固有の縮重のために、ヒトＣＣＬ２１、ネズミＣＣＬ２１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、それに実質的に対応する類似の材料など有用な生来の免疫活性遺伝子産物と実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を本発明のワクチンに使用することができる。かかるＤＮＡ配列としては、免疫調節性ポリペプチドＤＮＡ配列とハイブリッド形成可能なＤＮＡ配列、対立遺伝子変異体などが挙げられる。機能的に等価なホモログのＤＮＡは、前記生来の免疫調節性ポリペプチドをコードするＤＮＡと少なくとも約７０％のヌクレオチド配列が同一であることが好ましい。
【０１０６】
本発明によって使用することができる改変ＤＮＡ配列は、野生型癌関連ＬＡＰファミリータンパク質をコードする生来のポリヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含み、野生型タンパク質又はその免疫原性ホモログをコードする配列が得られる。本発明によって使用することができる改変ＤＮＡ配列は、野生型免疫原性遺伝子産物をコードする生来のポリヌクレオチド配列中の異なるヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換も含み、野生型免疫活性遺伝子産物又はその機能等価物をコードする配列が得られる。機能的に等価な免疫活性遺伝子産物は、サイレントな変化をもたらす野生型サイトカイン又はＮＫ細胞表面受容体リガンド内のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含むことができ、それによって機能的に等価な分子が産生される。かかるアミノ酸置換（例えば、保存的置換）は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似度に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、類似した親水性値を有する非帯電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
【０１０７】
本明細書において使用される、サイトカイン、ＮＫ細胞表面受容体リガンドなどの機能的に等価な免疫活性遺伝子産物とは、その対応物の天然の免疫活性遺伝子産物と実質的に同じ免疫調節活性を有するポリペプチドを意味する。
【０１０８】
本発明のワクチンに有用なＩＡＰファミリータンパク質及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を改変する変更を含めて、ただしこれらだけに限定されない様々な目的のためにコード配列を変更するように操作することができる。例えば、当分野で周知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発によって突然変異を導入して、新しい制限酵素切断部位を挿入し、グリコシル化パターン、リン酸化などを変更することができる。
【０１０９】
本発明の別の態様は、癌の免疫になるように哺乳動物にワクチン接種する方法である。この方法は、本明細書に記載するように、本発明のワクチンを哺乳動物に癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することを含む。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【０１１０】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載するアポトーシスファミリータンパク質阻害剤及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含むベクターが形質移入された形質転換宿主細胞も包含する。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
【０１１１】
本発明は、アポトーシスファミリータンパク質阻害剤及び免疫活性遺伝子産物を作用可能にコードするＤＮＡ構築体を含む単離プラスミドベクターも提供する。このベクターは、本発明のワクチンを調製するために弱毒細菌細胞などの宿主細胞に形質移入するのに有用である。
【０１１２】
以下の例は、本発明の特徴及び実施態様をさらに説明するために提供するものであって、限定するものではない。
材料、方法及び実施例
材料。Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊ及びＢａｌｂ／ｃマウスをＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ育種施設から得た。ＴＩＡＰ（サービビンのネズミ型）をコードするＤＮＡをＰＣＲによってＭＣ３ＰｃＤＮＡからクローン化した。ネズミ６Ｃｋｉｎｅ（ネズミＣＣＬ２１）をコードするＤＮＡをひ臓細胞からクローン化した。Ｈ６０副組織適合抗原ペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのネズミ型）をコードするＤＮＡは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｌｅｙ）のＤｒ．  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｒａｎｌｅｔの厚意によって提供された。ネズミＣＣＬ２１（ｍｕＣＣＬ２１、６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣとしても知られる）及びネズミサービビン（ｍｕサービビン、ＴＩＡＰとしても知られる）をコードするワクチン用ＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手したｐＢｕｄＣＥ４．１真核発現ベクターに、ＭｕＣＣＬ２１に対しては制限酵素切断部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ、ｍｕサービビンの両末端に対してはＸｈｏＩを使用してクローン化した。Ｈ６０及びＴＩＡＰをコードするワクチン用ＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手したｐＢｕｄＣＥ４．１真核発現ベクターに、Ｈ６０に対しては制限酵素切断部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ、ｍｕサービビンに対しては制限酵素切断部位ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを使用してクローン化した。サルモネラ  チフィムリウムのＡｒｏＡ−弱毒系統（ＳＬ２７０７）及びサルモネラ  チフィムリウムの二重弱毒ＡｒｏＡ−，ｄａｍ−系統（ＲＥ８８）をＲｅｍｅｄｙｎｅ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡから得た。抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡから得られた。フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから得た。ＦＩＴＣ標識及びＰＥ標識抗体は、製造者の推奨プロトコルに従って調製された。
パートＡ．  形質転換ＡｒｏＡ−弱毒サルモネラ  チフィムリウムからのワクチン
【実施例１】
【０１１３】
ｍｕサービビン及びｍｕＣＣＬ２１をコードするＤＮＡワクチンの調製
ｍｕサービビン及びｍｕＣＣＬ２１  ＤＮＡ（ｐＤＮＡ約１〜１０μｇ）を含むｐＢｕｄＣＥ４．１ベクターを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｕｌｓｅｒを用いて２．５ｋＶ、２５μＦ及び２００オームで製造者の推奨手順に従って、新しく調製された弱毒サルモネラ  チフィムリウム（ＳＬ２７０７）に電気穿孔して入れた。このベクターを含むサルモネラを、ゼオシンを含むプレート上で選択した。コロニーを翌日に選択し、ゼオシンが添加されたＬＢブロス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）中で終夜培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、洗浄された細菌をＰＢＳ培養液に約１ｘ１０９組換えサルモネラ／ミリリットルＰＢＳの濃度で懸濁して、後で使用するワクチン溶液を生成した。
【０１１４】
ベクターのみで形質転換されたサルモネラからなる対照ワクチン、ｍｕサービビンＤＮＡのみを組み込んだベクター、及びｍｕＣＣＬ２１  ＤＮＡのみを組み込んだベクターも同じ手順に従って調製した。図１３は発現構築体の略図である。
【０１１５】
ワクチンを使用するまで密封アンプルに保存した。プラスミドＤＮＡは、サルモネラを形質転換するまで約−８０℃で保存された。
【実施例２】
【０１１６】
実施例１のＤＮＡワクチンのマウスへの接種
Ｂａｌｂ／ｃマウス（約８匹のマウス／投与群）に実施例１のＤＮＡワクチン（約１００μｌのＰＢＳ中に約１ｘ１０８個の組換えサルモネラ）を経口胃管栄養法によって２週間間隔で３回接種した。
【実施例３】
【０１１７】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
最後のワクチン接種から約１週間後に、実施例２のＢａｌｂ／ｃマウス（約８匹のマウス／投与群）に約１ｘ１０５個のＤ１２１ルイス肺癌細胞を（皮下）投与した。約２週間成長させて肺に自然に播種させた後に皮下ルイス肺腫瘍を外科的に除去した。皮下腫瘍成長を二次元で一日おきに測定し、各腫瘍の腫瘍体積を次式によって計算した。
【０１１８】
体積＝（幅２）（長さ÷２）
肺へのＤ１２１の自然転移量を、皮下原発腫瘍の除去後約２４から約２８日評価した。マウスを屠殺し、解剖し、腫瘍によって覆われた肺表面の割合によって肺の腫瘍量を評価し、腫瘍がないのを「０」、約２０％未満の腫瘍被覆を「１」、約２０から約３０％の腫瘍被覆を「２」、約５０％を超える腫瘍被覆を「３」とした。
【０１１９】
実施例１のワクチンを接種されたマウスの腫瘍量スコアを表１に示す。図１４に、実施例１のワクチンを接種されたマウスから得られた肺の写真を示す。腫瘍体積を表１及び図１４に示す。図１４において、棒Ａは、本発明のｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチンを接種されたマウスの平均肺腫瘍体積（立法ミリメータ）であり、棒Ｂは、ｍｕサービビンＤＮＡのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Ｃは、ｍｕＣＣＬ２１  ＤＮＡのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Ｄは、空のベクターのみを組み込まれたワクチンを接種されたマウスの平均腫瘍体積であり、棒Ｅは、ＰＢＳ緩衝剤を接種されたマウスの平均腫瘍体積である。図１４は、図１４のそれぞれの棒の各々の下に示された各投与群から切除された代表的な肺の写真も含む。
【０１２０】
【表１】
0004616827.tif 000002
【０１２１】
表１及び図１４（図Ａ及びＢ）の結果によれば、ＩＡＰファミリータンパク質（すなわち、ｍｕサービビン）及び免疫活性遺伝子産物（すなわち、ｍｕＣＣＬ２１）をコードするＤＮＡ構築体を含むＤＮＡワクチンは、肺腫瘍転移に対してマウスを有効に免疫することができ、肺腫瘍の成長を阻害した。
【実施例４】
【０１２２】
本発明の本発明のＤＮＡワクチンによって誘導されるＤ１２１肺癌細胞に対するＴ細胞媒介細胞障害性
実施例２に記載したように、Ｃ５／７ＢＬ／６Ｊマウス（約８匹のマウス／投与群）に実施例１のＤＮＡワクチンを接種した。脾細胞をワクチン接種から約４日後に単離し、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｔ  ３．１１．４，  Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９４）に記載されたように、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによってその溶菌活性を分析した。Ｄ１２１細胞を脾細胞の標的細胞として使用した。
【０１２３】
図１５は、本発明のＤＮＡワクチンによって誘導されるＤ１２１肺癌細胞に対するＴ細胞媒介細胞障害性を示すグラフである。白抜きの円で示されるデータポイントは、細胞がＨ−２Ｋｂ／Ｈ−２Ｄｂ  ＭＨＣクラスＩ抗原に対する抗体（クローンＳＦ１−１．１；３４−２−１２  ＩｇＧ２ａ，κ）５０μｇ／ｍｌで処理される阻害アッセイのデータであり、黒塗りの四角は阻害抗体の非存在下におけるデータである。腫瘍細胞の溶解百分率（Ｙ軸）は、各ワクチン接種群に対して効果細胞と標的細胞（Ｅ／Ｔ）の３つの異なる比（すなわち、第１のデータポイントは１００：１のＥ／Ｔであり、第２のデータポイントは５０：１であり、第３のデータポイントは２５：１である）に対してプロットされている。その結果、（ＳＬＣ／ＴＩＡＰと標識された）本発明のｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチンは、１００：１  Ｅ／Ｔ比において、ＰＢＳ、空のベクター及びｍｕＣＣＬ２１  ＤＮＡを含む各対照ワクチンと比較してほぼ５倍、ｍｕサービビンＤＮＡのみを含む対照ワクチンの約２倍の溶解を誘導した。
【実施例５】
【０１２４】
ワクチン接種マウスから得られた脾細胞におけるＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ２８活性化マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の増加
実施例２に記載したように、Ｃ５／７ＢＬ／６Ｊマウス（約４匹のマウス／投与群）に実施例１のＤＮＡワクチンを接種した。脾細胞を最後のワクチン接種から約１週間後に免疫マウス及び対照マウスから単離した。次いで、細胞をＦＩＴＣ複合ＣＤ８＋抗体、並びにＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ２８のＰＥ複合抗体で染色した。細胞懸濁液を、２色フローサイトメトリーＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣスキャンを用いて評価して、各脾細胞についてＣＤ２５、ＣＤ２８及びＣＤ６９に陽性なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を求めた。結果を図１６に示す。各ＦＡＣＳプロットの上部右手四半分の数値は、場合によってはＣＤ８＋抗原とＣＤ２５、ＣＤ２８又はＣＤ６９の両方を提示する細胞の割合である。数値結果を表２に示す。これらの結果は、本発明のワクチンによるＴ細胞マーカー発現の増加を示しており、Ｔ細胞活性化が増大したことを示している。
【０１２５】
【表２】
0004616827.tif 000003
【０１２６】
表２及び図１６のデータは、ｍｕサービビン及びｍｕＣＣＬ２１をコードするＤＮＡ構築体を含む実施例１の本発明のワクチンが、Ｔ細胞活性化分子の発現を増加させることを示している。
【実施例６】
【０１２７】
ワクチン接種マウスにおける樹状細胞上での同時刺激分子の発現増加
実施例２に記載したように、Ｃ５／７ＢＬ／６Ｊマウス（約４匹のマウス／投与群）に実施例１のＤＮＡワクチンを接種した。脾細胞を最後のワクチン接種から約１週間後に免疫マウス及び対照マウスから単離した。次いで、細胞を、同時刺激分子Ｂ７（ＣＤ８０）、ＩＣＡＭ−１及びＤＥＣ２０５のＰＥ複合抗体と組み合わせたＦＩＴＣ複合ＣＤ１１ｃ抗体で染色した。細胞懸濁液を２色フローサイトメトリーＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣスキャンを用いて評価した。図１７は、細胞の平均蛍光値を示すグラフであり、対照ワクチンと比較して、本発明のｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞のＩＣＡＭ−１（上）、ＣＤ８０（中間）及びＤＥＣ２０５（下）の発現が増加していることを示している。
【実施例７】
【０１２８】
細胞内サイトカイン放出の誘導
実施例２と同様に免疫されたマウス（８匹のマウス／群）に実施例３と同様にＤ１２１肺癌細胞を投与した。腫瘍細胞投与から約１週間後に各マウスから脾細胞を採取した。脾細胞をＦＩＴＣ−抗ＣＤ３抗体で染色し、次いで固定し、透過化処理し、引き続いてＰＥ複合抗ＩＦＮ−γ抗体で染色した。２色染色された細胞をＦＡＣＳフローサイトメトリーによって分析した。結果を図１８に示す。細胞をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡの細胞内染色スターターキットによって固定した。
【０１２９】
図１８にプロットされた結果によれば、サイトカインＩＦＮ−γを放出する細胞の割合は、ＰＢＳ対照ワクチンを投与されたマウスの場合のわずか０．４１％、空のベクター対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約０．３８％、ＳＬＣ対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約０．９６％、及びｍｕサービビン対照ワクチンを投与されたマウスの場合の約１．５３％と比較して、本発明のワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞では約３．１７％に増加した。
【実施例８】
【０１３０】
ワクチン接種マウスにおける肺癌細胞のアポトーシスの増加
実施例２と同様に免疫されたマウス（８匹のマウス／群）に実施例３と同様にＤ１２１肺癌細胞を投与した。腫瘍細胞投与から約１週間後に各マウスから脾細胞を採取した。脾細胞をＤ１２１腫瘍細胞とともに温度約３７℃で約３時間インキュベートした。次いで、腫瘍細胞を単離し、ＦＡＣＳによって分析した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣを使用して、集団内の活発にアポトーシスを起こす細胞の割合を定量した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能なＡｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって、生育不能な細胞から生細胞を区別した。
【０１３１】
図１９は、約３時間（上のプロットセット）及び約２４時間（下のプロットセット）後に評価されたＦＡＣＳ分析結果のグラフである。各プロットの下右四半分の数値は、各投与群においてアポトーシスを起こす細胞の割合である。３時間後、無処置の（すなわち、脾細胞に曝されていない）Ｄ１２１細胞の約５．３９％がアポトーシスを起こした。ＰＢＳ緩衝剤のみを含有する対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたＤ１２１細胞の約２．２８％がアポトーシスを起こした。空のベクターＤＮＡを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたＤ１２１細胞のわずか約５．１９％しかアポトーシスを起こさなかった。同様に、ｍｕＣＣＬ２１  ＤＮＡのみを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときにはＤ１２１細胞の約５．１５％がアポトーシスを起こしたのに対して、ｍｕサービビンＤＮＡのみを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときにはＤ１２１細胞の約１１．４６％がアポトーシスを起こした。驚くべきことに、３時間後、ｍｕＣＣＬ２１とｍｕサービビンＤＮＡの両方を含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときには、Ｄ１２１細胞の約１８．４４％がアポトーシスを起こした。
【０１３２】
同様に、２４時間後、（アポトーシス細胞を排除する）ゲート付きＦＡＣＳ分析においては、無処置の（すなわち、脾細胞に曝されていない）Ｄ１２１細胞のいずれもアポトーシスを起こさなかった。ＰＢＳ緩衝剤のみを含有する対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたＤ１２１細胞の約８．４６％がアポトーシスを起こした。空のベクターＤＮＡを含む対照ワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたＤ１２１細胞のわずか約４．７８％しかアポトーシスを起こさなかった。驚くべきことに、２４時間後、ｍｕＣＣＬ２１とｍｕサービビンＤＮＡの両方を含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞とともにインキュベートされたときには、Ｄ１２１細胞の約５９．２％がアポトーシスを起こした。
【実施例９】
【０１３３】
ＴＩＡＰ及びネズミＨ６０副組織適合抗原ペプチドをコードするＤＮＡワクチンの調製
ＴＩＡＰ及びネズミＨ６０副組織適合抗原ＤＮＡ（ｐＤＮＡ約１μｇ）を含有するｐＢｕｄＣＥ４．１ベクターを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｕｌｓｅｒを利用して２．０ｋＶ、２５μＦ及び１００オームで製造者の推奨手順に従って、新しく調製された弱毒サルモネラ  チフィムリウム（ＳＬ２７０７）に電気穿孔して入れた。図２０は、Ｈ６０の発現ベクター、及びベクターに組み込まれたｍｕサービビンの略図である。
【０１３４】
このベクターを含むサルモネラを、ゼオシンを含むプレート上で選択した。翌日、コロニーを選択し、ゼオシンが添加されたＬＢブロス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）中で終夜培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、洗浄された細菌をＰＢＳ培養液に約５ｘ１０９組換えサルモネラ／ミリリットルＰＢＳの濃度で懸濁して、後で使用するワクチン溶液を生成した。
【０１３５】
ベクターのみで形質転換されたサルモネラからなる対照ワクチン、ｍｕサービビンＤＮＡのみを組み込んだベクター、及びＨ６０副組織適合性抗原（Ｈ６０）ＤＮＡのみを組み込んだベクターも同じ手順に従って調製した。
【０１３６】
ワクチンを使用するまで密封アンプルに保存した。プラスミドＤＮＡは、サルモネラを形質転換するまで約−２０℃で保存された。
【実施例１０】
【０１３７】
実施例９のＤＮＡワクチンのマウスへの接種
Ｂａｌｂ／ｃマウス（約８匹のマウス／投与群）に実施例９のＤＮＡワクチン（約１００μｌのＰＢＳ中に約５ｘ１０８個の組換えサルモネラ）を経口胃管栄養法によって２週間間隔で３回接種した。
【実施例１１】
【０１３８】
実施例１０のＤＮＡワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の細胞障害性アッセイ
脾細胞を実施例１０のワクチン接種マウスから単離し、照射を受けたＣＴ−２６細胞で刺激した。５日後、脾細胞を収集し、ＣＴ−２６細胞及びＹａｃ−１細胞（ＮＫ感受性Ｔ細胞）を標的に細胞障害性アッセイを実施した。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｔ  ３．１１．４、Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９４）に記載されたように、４時間５１Ｃｒ放出アッセイによって、細胞特異的溶解度をＥ／Ｔ比２５：１、５０：１及び１００：１において求めた。結果を図２１に図示する。
【０１３９】
その結果、ｍｕサービビン及びＨ６０  ＤＮＡを含む本発明のワクチンを接種されたマウスから得られた脾細胞は、ＣＴ−２６結腸直腸癌細胞の溶解が、１００：１のＥ／Ｔ比において、空のベクター、Ｈ６０及びｍｕサービビン対照ワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の２倍以上増加した。すべてのＥ／Ｔ比においてすべてのワクチンでＹａｃ−１の溶解は極めて少なく、観察された死滅はＴ細胞によって媒介された可能性が高いことが示された。
【実施例１２】
【０１４０】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
第３のワクチン接種から約２週間後に、実施例１０のＢａｌｂ／ｃマウス（約８匹のマウス／投与群）に、約１ｘ１０５個のネズミＣＴ−２６結腸直腸癌細胞を（静脈内；ｉ．ｖ．）投与した。
【０１４１】
肺へのＣＴ−２６細胞の自然転移量を、ＣＴ−２６細胞をｉ．ｖ．投与してから約２５日後に評価した。マウスを屠殺し、解剖し、各群の肺の平均重量を記録することによって肺の腫瘍量を評価した。正常肺重量は約０．２グラムである。図２２に、ワクチン接種されたＣＴ−２６投与マウスから取り出された典型的な肺（上）を示す。図２２は、各投与群の平均肺重量のグラフ（下）も含む。本発明のＨ６０／ｍｕサービビンワクチンを接種されたマウスでは、対照ワクチンと比較して、劇的な腫瘍量減少が認められた。
【０１４２】
図２３は、各投与群において２６日後に生存していたマウスの割合を示すグラフである。本発明のＨ６０／ｍｕサービビンワクチンを接種されたマウスでは、対照ワクチンと比較して、生存のかなりの増加が認められた。
【実施例１３】
【０１４３】
２９３Ｔ細胞におけるＨ６０及びｍｕサービビンの発現の評価
図２４ＡにＨ６０の発現を示す。２９３Ｔ細胞に、空のベクター（Ｖ）又はｐＨ６０（Ｈ）を２４時間形質移入し、収集し、ＮＫＧ２Ｄ四量体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。形質移入効率は、ｐＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）形質移入によって評価して約４５％であった。図２４Ａにｍｕサービビンの発現を示す。２９３Ｔ細胞に、空のベクター又はｐｍｕサービビンを２４時間形質移入し、収集し、溶解し、ウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロットによれば、ｍｕサービビンは、形質移入細胞では検出可能であるが、未変性細胞では検出不可能である。
パートＢ．  形質転換されたＡｒｏＡ−，ｄａｍ−二重弱毒サルモネラ  チフィムリウムからのワクチン
【実施例１４】
【０１４４】
ｍｕサービビン及びｍｕＣＣＬ２１をコードするＤＮＡワクチンの調製
ネズミサービビン（ｍｕサービビン）及びネズミＣＣＬ２１（ｍｕＣＣＬ２１）の完全長コード領域を、それぞれＤ１２１マウスルイス肺癌細胞及び活性化マウス脾細胞から抽出された全ＲＮＡ  １μｇを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅した。全ＲＮＡはＲＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて抽出され、ＲＴ−ＰＣＲはｐｌａｔｉｎｕｍ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて製造者の指示に従って実施された。いくつかの構築体が、哺乳動物発現ベクターにおいて、単一プラスミドから２種類の遺伝子が独立に発現するようになされたＰＣＲ産物を用いてｐＢｕｄＣＥ４．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づいて作製された。第１の構築体である完全長ネズミサービビン及びネズミＣＣＬ２１を含むｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１は、制限酵素切断部位ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩの間のマルチクローニング部位Ａに挿入された。ケモカインｍｕＣＣＬ２１は、制限酵素切断部位ＸｈｏＩとＮｏｔＩの間のマルチクローニング部位Ｂに遺伝子を挿入することによってそれぞれ産生された。ＤＮＡワクチン接種に使用されるもう一方のベクターは、ｍｕＣＣＬ２１又はｍｕサービビンのどちらかが存在しないのではなく、第１の構築に基づいた。空のベクターが対照として作製された。
【０１４５】
ｍｕサービビン及びｍｕＣＣＬ２１のタンパク質発現は、プラスミドをＣＯＳ−７細胞へ形質移入した後に、それぞれ抗サービビン及び抗ＣＣＬ２１抗体を用いた細胞可溶化物のウエスタンブロット法によって示された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのパイエル板におけるＥＧＦＰ活性の発現が、ｐＥＧＦＰで形質転換された１０８個のサルモネラ  チフィムリウム（ＡｒｏＡ−，ｄａｍ−系統ＲＥ８８）を経口投与した後のマウスにおいて検出された。マウスを８、１６及び３６時間で屠殺し、新しい小腸試料を取り出し、ＰＢＳで十分洗浄した後に分析した。ＥＧＦＰの蛍光発現が共焦点顕微鏡法によって検出された。
【０１４６】
弱毒細菌によって宿主中で引き起こされ得る毒性を、二重弱毒ＡｒｏＡ−，ｄａｍ−系統ＲＥ８８を単一弱毒ＡｒｏＡ−系統ＳＬ２７０７と比較することによって評価した。ＲＥ８８系統を使用すると、全１６匹のマウスが明らかな毒性副作用を起こさずに生存したのに対して、ＳＬ２７０７系統で免疫された１６匹のマウスのうち２匹が毒性及び感染によって死亡した。したがって、細菌毒性を制御するＲＥ８８系統のｄａｍ−突然変異によって、この系統がＤＮＡワクチンキャリアとして特に有用になったことが明らかである。
【実施例１５】
【０１４７】
実施例１４のワクチンを用いたマウスの経口ワクチン接種及び腫瘍暴露
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを５つの群に分け、すなわち、空のベクターｐＢＵｄ；ｐＢｕｄ−ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１、ｐＢｕｄ−ｍｕサービビン又はｐＢｕｄ−ｍｕＣＣＬ２１の個々の発現ベクター、並びにＰＢＳ投与群、いずれかを含む約１ｘ１０８個の二重弱毒Ｓ．チフィムリウム（ＲＥ８８）を含有するＰＢＳ約１００μｌを用いた胃管栄養法によって２週間間隔で３回免疫した。予防処置をした全マウスに、約１ｘ１０５個のＤ１２１ネズミルイス肺癌細胞を、最後の免疫化から約１週間後にｉ．ｖ．注射して投与した。治療設定においては、マウスに約１ｘ１０５個のＤ１２１ネズミルイス肺癌をまずｉ．ｖ．注射し、１週間後に、形質転換されたＳ．チフィムリウムを用いて３種類のワクチン接種を行った。マウスを毎日検査し、屠殺し、予防設定では腫瘍細胞投与から約２８日後に、又は治療モデルにおいては最初の腫瘍細胞接種から６３日後に肺転移を調べた。
【０１４８】
ワクチンによる予防処置の場合のＰＢＳ、空のベクター、ＣＣＬ２１、サービビン又はＣＣＬ２１／サービビンワクチンそれぞれによる免疫化後の腫瘍転移スコアを表３に示す。表３の結果は、融合転移病巣で覆われた％肺表面で表される転移スコア、すなわち、０＝なし；１＝５％未満；２＝５から５０％；及び３＝＞５０％として示されている。ＣＣＬ２１／サービビンワクチンによる治療を受けたマウス群と全対照群の転移スコアの差は統計的に有意（Ｐ＝＜０．００１）であった。この治療モデルにおいても腫瘍成長の阻害が認められた。
【０１４９】
【表３】
0004616827.tif 000004
【０１５０】
この予防設定においては、本発明者らは、２週間間隔で３回ワクチンを接種され、次いで１週間後に腫瘍細胞のｉ．ｖ．注射によって暴露されたマウスにおいて、Ｄ１２１ネズミルイス肺癌の播種性の肺転移が明確に抑制されることを認めた。実際、８匹のマウスのうち６匹ですべての肺腫瘍転移が完全に阻止され、残りのマウスでは腫瘍転移が著しく抑制された（表３参照）。これに対して、ｍｕＣＣＬ２１を欠くサービビン系ＤＮＡワクチンは、８匹のマウスのうちわずか１匹においてしか完全な転移抑制を誘導せず、２匹は５％未満の転移性腫瘍成長を示し、残りのマウスはすべて広範な転移性腫瘍成長を示した。ＰＢＳ又は空のベクターの対照ワクチン接種のみによる治療を受けた別のマウスは、腫瘍保護作用をまったく示さず、腫瘍細胞投与後４週間以内に広範な転移のために死亡した。分泌性ｍｕＣＣＬ２１プラスミドのみを含む二重弱毒サルモネラによる免疫化は、腫瘍転移を劇的には抑制しなかったが、それでも対照と比較すると転移が統計的に有意に遅延された。
【０１５１】
重要なことに、ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１系ＤＮＡワクチンは、治療設定においてはすべての実験動物においてすでに十分定着した肺転移の成長を顕著に抑制するのにも有効であった。これに対して、ｍｕサービビン若しくはｍｕＣＣＬ２１系ワクチン自体、又は空のベクター及びＰＢＳ対照を投与されたマウスは、この実験設定においてＤ１２１非小細胞肺癌の大きな播種性肺転移が明らかになった。治療モデルからの様々な実験群の肺重量を表４に示す。正常肺重量は約０．３ｇであった。
【０１５２】
【表４】
0004616827.tif 000005
【実施例１６】
【０１５３】
実施例１５のワクチン接種マウスにおける抗血管形成効果の測定
最後のワクチン接種から２週間後に、ネズミＦＧＦ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）約４００ｎｇ／ｍｌ及び１０００Ｇｙで照射されたＤ１２１腫瘍細胞（１ｘ１０４／ｍｌ）を含むｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）約５００ｍｌをマウスの胸骨領域に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。２匹の対照マウス以外すべてのマウスにおいて、６日後に内皮組織を０．１ｍｇ／ｍｌ蛍光性Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｌｅｃｔｉｎ  Ｉ、Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ．）２００ｍｌを外側尾静脈に注射して染色し、約３０分後、マウスを屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを切除し、巨視的に評価した。次いで、レクチン−ＦＩＴＣを各プラグ１００ｍｌからＲＩＰＡ溶解５００ｍｌで抽出し、蛍光定量法によって４９０ｎｍで定量した。各例においては、注射されなかった２匹の対照マウスで認められたバックグラウンド蛍光が減算された。
【０１５４】
ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１系ワクチンは、腫瘍脈管構造における血管形成を明確に抑制した。Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイ、及びＦＩＴＣ複合レクチンによるマウス内皮のインビボ染色後に測定された相対蛍光による定量によって示されるとおり、腫瘍新血管新生のかなりの減少が観察された。ＦＩＴＣ複合レクチンのｓ．ｃ．注射から６日後に取り出された代表的なＭａｔｒｉｇｅｌプラグを検査すると、腫瘍血管新生における巨視的に明白な差が、ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１２ワクチンで処置された群とマウス対照群の間で認められた。本発明のワクチンを接種されたマウスは、腫瘍血管新生が対照群よりもかなり少なかった。
【実施例１７】
【０１５５】
細胞障害性アッセイ
脾細胞が、腫瘍細胞投与から５日後にワクチン接種マウスから首尾よく単離された。細胞障害性は、Ｄ１２１腫瘍細胞又はサービビンを過剰発現するネズミ内皮細胞のどちらかの標的に対する標準５１Ｃｒ放出アッセイによって評価された。細胞障害性の特異的ＭＨＣクラスＩ拘束を明らかにするために、抗マウスＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｋｂ／Ｄｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１０μｇ／ｍｌを用いて阻害評価を実施した。
【０１５６】
５１Ｃｒ放出アッセイは、ワクチン接種及びその後のＤ１２１ルイス肺癌細胞投与後にマウスから得られた特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって誘導された顕著な細胞障害性を示した。ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１又はｍｕサービビンワクチン自体で免疫されたマウスの脾細胞から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｄ１２１腫瘍細胞のそれぞれ５０％及び３０％を有効に溶解した。これに対して、対照マウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞の注目すべき死滅を惹起せず、バックグラウンドの細胞障害活性を示すに過ぎなかった。特徴的なことに、抗Ｈ２Ｋｂ／Ｈ２Ｄｂ抗体を添加すると細胞障害性は完全に消失したので、観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞障害性は、ＭＨＣクラス１抗原拘束性であった。
【実施例１８】
【０１５７】
フローサイトメトリー分析及びサイトカイン放出アッセイ
Ｔ細胞の活性化マーカー、並びにＣＤ１１ｃ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原陽性ＤＣ上の同時刺激分子の発現を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳｃａｎを用いた２色又は３色フローサイトメトリー分析によって測定した。Ｔ細胞活性化は、首尾よくワクチン接種されたマウスから新たに単離された脾細胞をＰＥ複合抗ＣＤ２５、ＣＤ２８又はＣＤ６９抗体と組み合わせたＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３ｅ抗体で染色することによって判定された。ＡＰＣ上の同時刺激分子の活性化は、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体及びビオチン化抗ＩＡｂ抗体、続いてストレプトアビジン−アロフィコシアニン、及びＰＥ複合抗ＩＣＡＭ−１、ＣＤ８０又はＤＥＣ２０５抗体と組み合わせて測定された。すべての細胞数測定流通実験は、死細胞を除外するために０．１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムの存在下で実施された。これらのアッセイのすべての試薬は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から得られた。
【０１５８】
フローサイトメトリーは、細胞内サイトカインの検出に使用された。このために、脾細胞は、Ｄ１２１腫瘍細胞投与から約２週間後にＢ５７ＢＬ／６Ｊマウスから収集され、照射された前記Ｄ１２１細胞とともに完全Ｔ細胞培地中で約２４時間培養された。プレインキュベートされた細胞は、非特異的染色を阻止するために精製２．４Ｇ２抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）約１ｍｇとともに懸濁された。細胞は洗浄され、次いで、ＦＩＴＣ複合抗ＣＤ３＋抗体０．５ｍｇで染色された。細胞は、２回洗浄後、固定され、フローサイトメトリー分析のために、抗ＩＬ２又は抗ＩＦＮ−ｇ抗体と複合された１ｍｇ／ｍｌ  ＰＥで染色された。すべての抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ．）から得られた。
【０１５９】
ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチン自体のみが、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＣＤ６９  Ｔ細胞活性化マーカーの発現を顕著に増加させるのに最も有効であった。ＤＣ上のＢ７同時刺激分子とＣＤ２８の相互作用は、ナイーブＴ細胞と抗原提示ＤＣの重要な複数の相互作用を実現するのに必須であることが知られているので、ＣＤ２８の増加は特に重要である。これに対して、ｍｕサービビン又はｍｕＣＣＬ２１自体のみをコードするＤＮＡワクチンは、Ｔ細胞活性化マーカーの発現をわずか１倍増加させただけであった。ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチンによるＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞の活性化は、細胞内炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−ｇ及びＩＬ−２の明確な増加によっても示された。これに対して、ＰＢＳ及び空のベクター対照、並びにｍｕサービビン又はｍｕＣＣＬ２１のみをコードするＤＮＡワクチンは、これらのサイトカインを誘導するのに有効性がかなり低いことが判明した。
【０１６０】
Ｔ細胞受容体との最適な連結を得るために、Ｔ細胞の活性化が、ＤＣ上で発現されるこれらの同時刺激分子との強い細胞−細胞相互作用に決定的に依存することはよく知られているので、ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１系ＤＮＡワクチンによって得られるＤＣ上のＩＣＡＭ−１、ＣＤ８０及びＤＥＣ２０５の発現増大は特に重要である。今回も、ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１をコードする真核生物プラスミドを含む二重弱毒サルモネラ  チフィムリウムによる免疫化によって、これらの活性化マーカーが最も有効に増加し、対照のそれの最高２から３倍になった。
【実施例１９】
【０１６１】
腫瘍細胞アポトーシスの分析
ワクチン接種によって誘導されるＤ１２１腫瘍細胞のアポトーシスは、それぞれワクチン接種から約３時間及び約２４時間後に測定された。対照と実験動物の両方に、３回の免疫化の最後から１週間後に約１ｘ１０５個のＤ１２１細胞をｉ．ｖ．投与した。腫瘍細胞投与から１週間後に各個々のマウスから脾細胞を収集し、その後、約２．５ｘ１０７個の脾細胞を約５ｘ１０５個のＤ１２１細胞と６ウェルプレート中で４時間同時培養した。ＡＮＮＥＸＩＮ（登録商標）Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してアポトーシスの初期段階を確認した。後期段階の腫瘍細胞アポトーシスを確認するために、約５ｘ１０５個のＤ１２１細胞と約２．５ｘ１０７個の脾細胞を約２４時間同時培養し、次いで、アポトーシスをＦＡＣＳによって、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴ（商標）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈｒａｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたＴＵＮＥＬアッセイによって製造者の指示に従って分析した。
【０１６２】
アポトーシスは早くも３時間には観察され、２４時間後にはさらにかなりの増加がＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ又はＴＵＮＥＬアッセイによって得られるデータのフローサイトメトリー分析によって示された。すなわち、かかるマウスから収集された脾細胞を腫瘍細胞と同時インキュベートした後の初期アポトーシスは、ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチンで免疫されたマウス群が対照よりも最高３から４倍高かった。ｍｕサービビンのみをコードするワクチンは、アポトーシスをある程度惹起したが、対照よりもわずか１倍高いだけであった。しかし、ｍｕサービビン／ｍｕＣＣＬ２１ワクチンで免疫されたマウスにおいてのみ２４時間でアポトーシスの劇的な８５％の増加が認められ、ＣＴＬによって誘導された強い腫瘍細胞免疫がこの現象を引き起こしたことが示唆される。
【実施例２０】
【０１６３】
ｍｕサービビン及びＨ６０をコードするＤＮＡワクチンの調製
完全長ネズミＮＫＧ２Ｄリガンド−Ｈ６０を含むプラスミドは、Ｄｒ．Ａ．  Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ及びＤｒ．Ｄ．  Ｈ．  Ｒａｕｌｅｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）の厚意によるものであった。発現ベクターは、上述したｐＢｕｄＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）骨格上で構築された。
【０１６４】
二重弱毒Ｓ．チフィムリウム（ＡｒｏＡ−，ｄａｍ−）は、上述したエレクトロポレーションによってＤＮＡワクチンプラスミドで形質転換された。手短に述べると、中間成長期（ｍｉｄｌｏｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）の新しく調製された細菌（約１ｘ１０８）をプラスミドＤＮＡ（１から２μｇ）と氷上で０．１ｃｍキュベット中で混合し、約２．０ＫＶ、２５μＦ及び１００Ωで電気穿孔した。ＤＮＡワクチンベクターを含む耐性コロニーを培養し、コード配列を確認した後に−８０℃で保存した。
【実施例２１】
【０１６５】
実施例２０のワクチンを用いたマウスの経口ワクチン接種及び腫瘍暴露
ＢＡＬＢ／ｃ  Ａ２Ｋｂマウス群（ｎ＝４から１２）を、発現ベクターを含む約５ｘ１０８個の二重弱毒Ｓ．チフィムリウムを含有するＰＢＳ  １００μｌを用いた胃管栄養法によって２週間間隔で２回免疫した。予防モデルにおいては、ＢＡＬＢ／ｃマウスに約１ｘ１０５個のＣＴ−２６細胞を最後のワクチン接種から２週間後にｉ．ｖ．投与し、治療設定においては、第１のワクチン接種の５日前に投与した。腫瘍投与後２５日又は２８日後にマウスを屠殺し、それぞれ肺転移又は腫瘍重量を測定し、対照のそれらと比較した。実験群と対照の鑑別所見の統計的有意性をスチューデントのｔ検定によって判定した。所見は、両側のＰ値が＜０．０５であった場合に有意とみなされた。
【０１６６】
Ｈ６０及びｍｕサービビンの発現は、２９３Ｔ細胞を形質移入し、フローサイトメトリー又はウエスタンブロット分析によって調べることによって確認された。Ｈ６０の発現は、ＮＫＧ２Ｄ四量体の陽性染色によって確認された。サービビンを形質移入された細胞は、約１６．５ＫＤａの予想分子量における単一バンドによって陽性と判定された。ＣＴ−２６によって発現されるＮＫＧ２Ｄリガンドレベルは、正の対照のＹａｋ−１細胞と比較して比較的低い。ＮＫＧ２Ｄリガンド発現が低レベルである腫瘍細胞は、腫瘍阻止を誘導できないことが以前に報告されている。予防設定においては、腫瘍投与から２５日後にマウスを屠殺した後に、肺重量及び（上述した）転移スコアを評価した。結果を表５及び表６に示す。このデータによれば、Ｈ６０及びｍｕサービビンワクチンは、個々にマウスをある程度保護したが、Ｈ６０とｍｕサービビンの組み合わせ（ｍｕサービビン／Ｈ６０ワクチン）は、転移スコアのかなりの低下及び肺における腫瘍量の減少によって示されるように腫瘍投与に対する保護作用を大きく増大させた。これらの所見は、ＰＢＳ、ｐＢｕｄ、ｐＨ６０及びｐｍｕサービビン対照群と比較して統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＜０．０００１、０．００２、０．０１及び０．００５）。
【０１６７】
治療設定においては、すなわち、定着した結腸癌転移に対しては、２８日に屠殺した後に肺腫瘍量を評価した。重要なことには、Ｈ６０／ｍｕサービビンワクチンで処置された１２匹のマウスのうち８匹が生存し、より重要なことには、これらの生存マウスのうち２匹は完全に転移がなく、他の２匹は融合腫瘍転移によって覆われた肺表面は５％未満であった。これに対して、空のｐＢｕｄベクターで処置された対照群においてはわずか２匹のマウスしか生存せず、全生存マウスの肺表面の５０％以上が融合腫瘍転移で覆われた。ｍｕサービビンワクチンのみの接種は、治療モデルにおいて有意な保護作用が得られず、Ｈ６０ワクチンのみの処置は、十分とはいえない治療効果しか示さなかった。後者は、生存率がわずかに改善され、生存マウスのうちの１匹は融合腫瘍転移によって覆われた肺表面がわずか＜５％であったことによって示唆された。
【０１６８】
【表５】
0004616827.tif 000006
【０１６９】
【表６】
0004616827.tif 000007
【実施例２２】
【０１７０】
細胞障害性アッセイ
上述した標準５１Ｃｒ放出アッセイによって細胞障害性を測定した。手短に述べると、脾細胞を最後の免疫化から２週間後に収集し、照射を受けた（１，０００Ｇｙ）ＣＴ−２６細胞によって３７℃で５日間、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−ＭＥ及び２０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２が補充されたＲＰＭＩ  １６４０（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）中において、インビトロで刺激した。脾細胞を収集し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ細胞分離培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて分離した。標的細胞を約１．５時間、室温で５１Ｃｒで標識し、効果細胞とともに様々な効果細胞／標的細胞比で約３７℃で約４時間インキュベートした。特異的標的細胞溶解割合を式［（Ｅ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ）］ｘ１００によって計算した。ここで、Ｅは平均実験放出であり、Ｓは平均自然放出であり、Ｔは平均全放出である。
【０１７１】
ＮＫ活性は、Ｈ６０ワクチンで免疫されたマウスにおいてかなり増大することが判明し、さらに大きなＮＫ死滅がｍｕサービビン／Ｈ６０ワクチンで免疫されたマウスにおいて認められた。ｍｕサービビン／Ｈ６０ワクチンで免疫されたマウスから得られた脾細胞は、ＣＴ−２６標的細胞に対して最も高い細胞障害性を示した。これに対して、ｐＢｕｄで免疫された対照から単離されたかかる脾細胞は最小の細胞障害性死滅を示し、Ｈ６０ワクチン又はｍｕサービビンワクチン接種マウスからの脾細胞自体はいくらか高い細胞障害性死滅を示した。細胞培養５日後、ＮＫ細胞は、Ｙａｃ−１  ＮＫ標的細胞が使用されたときと有意差が見られず、この細胞障害性アッセイにおいて主要な役割を果たしていないと考えられ、検出された細胞障害性は主にＣＴＬによって媒介されたことが示唆された。
【０１７２】
本発明の新規な特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施態様の多数の変更及び改変を実施することができる。本明細書に記載される具体的な実施態様は限定的なものではなく、又は限定的なものと考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】ヒトサービビンをコードする核酸配列、配列番号１を示す図である。
【図２】ヒトサービビンのアミノ酸残基配列、配列番号２を示す図である。
【図３】ネズミＴＩＡＰをコードする核酸配列、配列番号３を示す図である。
【図４】ネズミＴＩＡＰのアミノ酸残基配列、配列番号４を示す図である。
【図５】ヒトサービビンとネズミＴＩＡＰのタンパク質相同性を示す図である。
【図６】ヒトＳＬＣ（ＣＣＬ２１）をコードする核酸配列、配列番号５を示す図である。
【図７】ヒトＳＬＣ（ＣＣＬ２１）のアミノ酸残基配列、配列番号６を示す図である。
【図８】ネズミ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）をコードする核酸配列、配列番号７を示す図である。
【図９】ネズミ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）のアミノ酸残基配列、配列番号８を示す図である。
【図１０】ヒトＳＬＣ（ＣＣＬ２１）とネズミ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）のタンパク質相同性を示す図である。
【図１１】ネズミ副組織適合抗原ペプチドＨ６０をコードする部分核酸配列、配列番号９を示す図である。
【図１２】副組織適合抗原ペプチドＨ６０の部分アミノ酸残基配列、配列番号１０を示す図である。
【図１３】ｐＢｕｄＣＥ４．１ベクター中でサービビンタンパク質（ＴＩＡＰとしても知られるネズミサービビン）及び免疫調節性ケモカイン（ＳＬＣとしても知られるＣＣＬ２１）をコードするＤＮＡ構築体を示す略図である。
【図１４】図１４Ａは、対照緩衝剤（Ｅ）、空のベクターを含む対照ワクチン（Ｄ）、ケモカインを含むＤＮＡワクチン（Ｃ）、サービビンタンパク質を含むワクチン（Ｂ）及び本発明のワクチン（Ａ）による治療を受けたマウスにおけるルイス肺癌の肺転移の平均腫瘍体積を示すグラフである。図１４Ｂは、図１４Ａに示されたワクチン接種マウスから切除された典型的な肺腫瘍転移の写真である。
【図１５】図１４Ａに示されたＤＮＡワクチンによって誘導されるＤ１２１肺癌細胞に対するＴ細胞媒介細胞障害性を示すグラフである。溶解百分率（Ｙ軸）は、各ワクチン接種に対して効果細胞と標的細胞（Ｅ／Ｔ）の３つの異なる比（すなわち、１００：１、第１のデータポイント；５０：１、第２のデータポイント；及び２５：１、第３のデータポイント）に対してプロットされている。
【図１６】フローサイトメトリー分析によって測定された、本発明のワクチンを接種されたマウスにおけるＴ細胞活性化分子の発現増加を示すグラフである。
【図１７】本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後の樹状細胞による同時刺激分子の発現促進を示すグラフである。
【図１８】フローサイトメトリー分析によって測定された、本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後の細胞内サイトカイン放出の誘導を示すグラフである。
【図１９】本発明のワクチン及び様々な対照ワクチンをマウスに接種した後のＤ１２１肺腫瘍細胞におけるアポトーシスの増加を示すＦＡＣＳプロットである。（Ａ）ワクチン接種後３時間及び（Ｂ）ワクチン接種後２４時間。
【図２０】ＴＩＡＰ及び副組織適合抗原ペプチドＨ６０を組み込んだ発現構築体を示す略図である。
【図２１】本発明のワクチンを接種されたマウスから単離された脾細胞の細胞障害性アッセイデータを示すグラフである。
【図２２】実施例１０に記載のワクチン接種マウスから切除された肺の写真（上）及び投与群のマウスの平均肺重量の棒グラフ（下）である。
【図２３】ワクチン接種され、ＣＴ−２６腫瘍細胞を投与されたマウスの生存割合を示すグラフである。
【図２４】Ｈ６０ペプチド（Ａ）及びｍｕサービビン（Ｂ）の発現を示す図である。
【図２５】６ＣＫｉｎｅ／ＳＬＣのＣＣＬ２１ｂ変異体をコードする核酸配列、配列番号１１を示す図である。
【図２６】６ＣＫｉｎｅ／ＳＬＣのＣＣＬ２１ｂ変異体のアミノ酸残基配列、配列番号１２を示す図である。
【図２７】ヒトＭＩＣＡをコードする核酸配列、配列番号１３を示す図である。
【図２８】ヒトＭＩＣＡのアミノ酸残基配列、配列番号１４を示す図である。
【図２９】ヒトＭＩＣＢをコードする核酸配列、配列番号１５を示す図である。
【図２９−Ａ】ヒトＭＩＣＢをコードする核酸配列、配列番号１５を示す図である。
【図３０】ヒトＭＩＣＢのアミノ酸残基配列、配列番号１６を示す図である。
【図３１】ヒトＵＬＢＰ１をコードする核酸配列、配列番号１７を示す図である。
【図３２】ヒトＵＬＢＰ１のアミノ酸残基配列、配列番号１８を示す図である。
【図３３】ヒトＵＬＢＰ２をコードする核酸配列、配列番号１９を示す図である。
【図３４】ヒトＵＬＢＰ２のアミノ酸残基配列、配列番号２０を示す図である。
【図３５】ヒトＵＬＢＰ３をコードする核酸配列、配列番号２１を示す図である。
【図３６】ヒトＵＬＢＰ３のアミノ酸残基配列、配列番号２２を示す図である。
【図３７】ヒトサービビンスプライスバリアントサービビン−２Ｂ（配列番号２３）及びスプライスバリアントサービビン−ΔＥｘ３（配列番号２４）のアミノ酸残基配列を示す図である。
【図３８】ＭＩＣＢの対立遺伝子変異体を記載した受託番号ＮＰ  ００５９２２のＧＥＮＢＡＮＫ記録の複製である。
【図３８−Ａ】ＭＩＣＢの対立遺伝子変異体を記載した受託番号ＮＰ  ００５９２２のＧＥＮＢＡＮＫ記録の複製である。
【図３８−Ｂ】ＭＩＣＢの対立遺伝子変異体を記載した受託番号ＮＰ  ００５９２２のＧＥＮＢＡＮＫ記録の複製である。
【図３９】完全長ヒトリビンアルファスプライスバリアントをコードする核酸配列、配列番号２６を示す図である。
【図４０】ヒトリビンアルファスプライスバリアントのアミノ酸残基配列、配列番号２７を示す図である。
【図４１】ヒトリビンベータスプライスバリアントをコードする核酸配列、配列番号２８を示す図である。
【図４２】ヒトリビンベータスプライスバリアントのアミノ酸残基配列、配列番号２９を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図２９−Ａ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３８−Ａ】
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【図３８−Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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