(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に由来する配列を含むことを特徴とするＤＮＡを調製する方法であって、当該配列はコロナウイルスの天然の配列に対して少なくとも８５％の相同性を有し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードして、ここで、前記ＤＮＡのフラグメントがウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得るＤＮＡであって、当該方法は下記ステップ：コロナウイルス妨害欠損ゲノムが細菌の人工染色体（ＢＡＣ）ベクター中でプロモーターの発現下にクローン化され、そして欠損ゲノム内で欠失した配列が再挿入されるステップを含む、方法。
【請求項２】
クローン化される、細菌に対して毒性のウイルスゲノム中の配列が、前記ＤＮＡ中への再挿入の前に同定される、請求項１に記載のＤＮＡの調製方法。
【請求項３】
前記ウイルスゲノム中の毒性配列が、ゲノムが完成する前に再挿入される最後の配列である、請求項１または２に記載のＤＮＡの調製方法。
【請求項４】
転写調節配列の下にクローン化された、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の完全長のコピーを含む感染性クローンが得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡの調製方法であって、当該方法はコロナウイルスのｇＲＮＡからの完全長ｃＤＮＡを構築することと、当該完全長ｃＤＮＡに転写調節因子を結合する（joining）ことを含む、方法。
【請求項５】
コロナウイルスｇＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの構築が、以下のステップ：
（ｉ）前記コロナウイルスに由来する妨害欠損ゲノムが、ＢＡＣ中で発現プロモーターの下でクローン化するステップ、
（ｉｉ）前記妨害欠損ゲノムの欠失を感染性のｇＲＮＡについて欠失した配列を再生することによって完成するステップ、
（ｉｉｉ）細菌に対して毒性のコロナウイルスの前記配列をクローン化される前に同定し、該毒性配列を除去し、前記毒性配列を、コロナウイルスのｇＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンを得るために、真核細胞に形質転換する直前に挿入するステップ
を含む、請求項４に記載のＤＮＡの調製方法。
【請求項６】
転写調節配列の下にクローン化された、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の完全長のコピーを含む、感染性クローンであって、該感染性ｃＤＮＡが細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化され、当該ＢＡＣは登録番号ＣＥＣＴ  ５２６５のもとで、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅに寄託された大腸菌の細菌の人工染色体（ＢＡＣ）である、感染性クローン。
【請求項７】
前記コロナウイルスが、ブタの感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）の単離物である請求項６に記載の感染性クローン。
【請求項８】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の発現の最初期（ＩＥ）プロモーターである請求項６または７に記載の感染性クローン。
【請求項９】
前記完全長ｃＤＮＡが、ポリ（Ａ）テイル、肝炎ウイルスデルタ（ＨＤＶ）のリボザイム、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結およびポリアデニル化配列によって３’末端で隣接される、請求項６〜８の一項に記載の感染性クローン。
【請求項１０】
登録番号ＣＥＣＴ  ５２６５のもとで、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅに寄託された大腸菌。
【請求項１１】
異種核酸が発現されることを可能にする条件下で、感染性クローン中に挿入された当該異種核酸を含むように改変された、請求項６の感染性クローンを含む、組換えウイルスベクター。
【請求項１２】
前記異種核酸が、目的の遺伝子産物をコードする遺伝子および遺伝子フラグメントから選択される、請求項１１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１１に記載の少なくとも１つの組換えウイルスベクター（ここで、いずれのウイルスベクターも感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原、または前記感染性の病原体に対する防御を提供する抗体を発現する）と、
（ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤を任意的に伴って含む、
感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御するためのワクチン。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、全身性の免疫応答および／または呼吸器、腸粘膜、または他の組織中で増殖する異なる感染性の病原体に対する粘膜における免疫応答を誘導し得る少なくとも１つの抗原を発現する、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ワクチンが１つ以上の感染性の病原体によって引き起こされる感染に対する防御のための多価ワクチンである、請求項１３または１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
混合及び結合接種のための独立の組換えウイルスベクターを含み、前記組換えウイルスベクターがそれぞれ少なくとも一つの異なる抗原または異なる抗体を発現する、請求項１５に記載の多価ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する方法、この方法によって得ることのできる核酸、およびワクチンとしておよび遺伝子治療のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組換えＤＮＡ技術の進歩によって、生物間での遺伝子導入の開発における進歩が導かれてきた。現時点において、多数の努力が、遺伝子導入技術の使用を通じた経済的および商業的な目的の、化学品、医薬品、および生物学的な産物の、産生のために行われている。
【０００３】
原核生物細胞および真核生物細胞の両方の遺伝子操作における重要な因子の１つが、ベクターおよび宿主ベクターシステムの開発である。一般的には、ベクターは、宿主細胞中で複製または発現し得る核酸分子である。ベクター−宿主システムが、ベクターを保有している宿主細胞として定義され得、そしてこれによってこれが含有している遺伝子情報が複製されそして発現されることを可能にする。
【０００４】
ベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡゲノムの両方を用いて種々のウイルスから開発されている。宿主細胞の核内で複製するＤＮＡウイルスに由来するウイルスベクターは、上記の細胞のゲノム中に組み込まれ得る欠点を有し、それによってこれらは、一般的には非常に安全ではない。対照的に、宿主細胞の細胞質中で複製するＲＮＡウイルスに由来するウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスに基づくベクターよりも安全である。なぜなら、複製が核の外側でＲＮＡを通じて生じるからである。従って、これらのベクターは、宿主細胞のゲノム中にはほとんど組み込まれないようである。
【０００５】
ｃＤＮＡクローンが、例えば、以下のような、正の極性を有する一本鎖のＲＮＡウイルスから得られている：［ｓｓＲＮＡ（＋）］ピコルナウイルス（Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ  ＆  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８１）；ブロモウイルス（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、１９８４）；アルファウイルス（シンドビスウイルスを含む属）；セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｒｉｃｅら、１９８７；ＬｉｌｋｅｓｔｏｅｍおよびＧａｒｏｆｆ、１９９１；Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６；ＳｍｅｒｄｏｕおよびＬｉｌｋｅｓｔｏｍ、１９９９）；フラビウイルスおよびペスチウイルス（ＲｉｃｅおよびＳｔｒａｕｓｓ、１９８１；Ｌａｉら、１９９１；Ｒｉｃｅら、１９８９）；ならびにＡｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルス（Ｇｅｉｇｅｎｍｕｌｌｅｒら、１９９７）。同様に、異種遺伝子の発現のためのベクターが、例えば、以下のようなｓｓＲＮＡ（＋）ウイルスのゲノムのＤＮＡ相補鎖のクローンから開発されている：アルファウイルス（シンドビスウイルスを含む属）；セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６；Ｌｉｌｋｅｓｔｏｅｍ、１９９４；Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７）。しかし、ＲＮＡウイルスから開始して組換えウイルスを調製するための全ての方法がなお、ウイルスのほとんどが細菌について毒性である配列を含むという事実によって、面倒である。従って、ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを調製し、そして細菌中にｃＤＮＡをサブクローニングすることは、細菌宿主中のＤＮＡ配列の欠失または再配置をしばしば導く。この目的のためには、ほとんどの一般的に使用されるサブクローニングおよび発現ベクターは、組換えＲＮＡウイルスに由来する大きなＤＮＡ切片の調製のためには使用され得ない。しかし、より長い外来ＤＮＡ配列を保有し得るベクターを得ることが、医薬品（特に、ワクチン）の開発の多数の局面について必要とされる。
【０００６】
コロナウイルスは、約２５から３１キロベース（ｋｂ）の間の長さを含む、ＲＮＡウイルスについての、最も大きな公知のゲノムを示すｓｓＲＮＡ（＋）ウイルスである（Ｓｉｄｄｅｌｌ、１９９５；Ｌａｉ  ＆  Ｃａｖａｎａｇｈ、１９９７；Ｅｎｊｕａｎｅｓら、１９９８）。コロナウイルスによる感染の間に、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は複製し、そして正および負の極性のサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のセットが合成される（Ｓｅｔｈｎａら、１９８９；ＳａｗｉｃｋｉおよびＳａｗｉｃｋｉ、１９９０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｓｔ  ＆Ｓｐａａｎ，１９９５）。ｓｇＲＮＡの合成は、感染した細胞の細胞質中で生じるＲＮＡ依存性のプロセスであるが、その正確な機構はなお正確にはわかっていない。
【０００７】
いくつかのコロナウイルス（例えば、マウスの肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、感染性の気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）（Ｃｈａｎｇら、１９９４）、およびブタ胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）（スペイン特許出願番号第Ｐ６００６２０号；Ｍｅｎｄｅｚら、１９９６；Ｉｚｅｔａら、１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）の欠損妨害（ＤＩ）ゲノム（それらの複製および転写のために相補的なウイルスの存在を必要とする欠失変異体）が、記載されている。しかし、コロナウイルスの完全なゲノムをコードするｃＤＮＡクローンの構築が、コロナウイルスのゲノムの大きな大きさおよびその中の毒性の配列に起因して、可能にはなっていない。
【０００８】
まとめると、宿主細胞中で異種核酸を複製しそして発現するための多数のウイルスベクターが開発されているが、異種遺伝子の発現のための公知のベクターの大部分は、ＲＮＡウイルスのサブクローニングには十分には適さない。さらに、そのように得られたウイルスベクターには、種特異性の欠失、標的器官または組織の限定、ならびにクローニングについてのそれらの限定された能力に起因する欠点が存在する。これは、基本的な研究および応用研究の両方での使用の可能性を制限する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、上記の問題を克服し得る異種遺伝子の発現のための新しいベクターを開発するための方法が、必要とされている。詳細には、高いレベルの安全性およびクローニング能力を有している異種遺伝子の発現のための大きなベクターを有することが、有利である。これは、それらの種特異性および向性が制御され得るように、設計され得る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上記の問題点が、複数の工程を包含するＤＮＡの調製方法によって解決される。ここでは、
（ａ）ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の完全長のコピーを含有しているＤＮＡ；または
（ｂ）ＲＮＡウイルスのｇＲＮＡの１つまたはいくつかのフラグメントを含有しているＤＮＡであって、ここで、フラグメントは、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有しているＤＮＡ；
が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、ウイルスのｇＲＮＡに由来する大きなＤＮＡ配列をサブクローン化しそして発現するための先行技術の方法によって生じる問題が、クローニングベクターとしてＢＡＣを使用することによって克服され得ることを見出した。ＢＡＣの使用は、これらのベクターが１個の細胞あたり１つまたは２つのコピー数で細菌中に存在するという特定の利点を有する。これは、毒性およびプラスミド間での組換えの可能性を相当制限する。
【００１２】
本発明はさらに、複数の工程を包含する、ウイルスのＲＮＡまたはウイルス粒子を調製する方法を提供する。ここでは、ＤＮＡは、上記の方法の１つに従って調製され、ＤＮＡが発現され、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子が単離される。さらに、ＤＮＡを調製するために上記の方法の工程を含有している、医薬品（特に、ワクチン）を調製する方法が、開示される。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、コロナウイルスの天然の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有し、そしてＲＮＡ依存性ポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に由来する配列を含有しているＤＮＡが、提供される。ここでは、上記のＤＮＡのフラグメントは、ＲＮＡに転写され得、そしてこのＲＮＡは、ウイルス粒子に組み立てられ得る。本発明はまた、それぞれのＤＮＡを調製する方法を含む。
【００１４】
本発明はさらに、ベクター（より詳細には、それぞれの核酸を含有している細菌の人工染色体（ＢＡＣ））を提供する。さらなる実施態様に従うと、本発明は、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを含有している、宿主に対して、そして感染性の、弱毒化されたか、または不活化されたウイルスに関する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の核酸、ベクター、宿主細胞、またはウイルス粒子を含有している、一価または多価のワクチンのような、医薬調製物を提供する。
【００１６】
最後に、本発明は、複数の工程を含有している、ウイルス粒子またはウイルスＲＮＡを産生するための方法を提供する。ここでは、本発明のＤＮＡが転写され、そしてウイルス粒子またはウイルスが回収され、そしてこの方法によってウイルスＲＮＡを得ることができる。
なお、ここに、まとめとして、本発明の好ましい実施の形態を示す。
（形態１）
コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に由来する配列を含むことを特徴とするＤＮＡを調製する方法であって、当該配列はコロナウイルスの天然の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードして、ここで、前記ＤＮＡのフラグメントがＲＮＡに転写されウイルス粒子に組み立てられ得、当該方法は下記ステップ：コロナウイルス妨害欠損ゲノムが細菌の人工染色体（ＢＡＣ）ベクター中でプロモーターの発現下にクローン化され、そして欠損ゲノム内で欠失した配列が再挿入されるステップを含む、方法。
（形態２）
クローン化される、細菌に対して毒性のウイルスゲノム中の配列が、前記ＤＮＡ中への再挿入の前に同定される、形態１に記載のＤＮＡの調製方法。
（形態３）
前記ウイルスゲノム中の毒性配列が、ゲノムが完成する前に再挿入される最後の配列である、形態１または２に記載のＤＮＡの調製方法。
（形態４）
転写調節配列の下にクローン化された、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の完全長のコピーを含む感染性クローンが得られる、形態１〜３のいずれか一に記載のＤＮＡの調製方法であって、当該方法はコロナウイルスのｇＲＮＡからの完全長ｃＤＮＡを構築することと、当該完全長ｃＤＮＡに転写調節因子を結合する（joining）ことを含む、方法。
（形態５）
コロナウイルスｇＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの構築が、以下のステップ：
（ｉ）前記コロナウイルスに由来する妨害欠損ゲノムが、ＢＡＣ中で発現プロモーターの下でクローン化するステップ、
（ｉｉ）前記妨害欠損ゲノムの欠失を感染性のｇＲＮＡについて欠失した配列を再生することによって完成するステップ、
（ｉｉｉ）細菌に対して毒性のコロナウイルスの前記配列をクローン化される前に同定し、該毒性配列を除去し、前記毒性配列を、コロナウイルスのｇＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンを得るために、真核細胞に形質転換する直前に挿入するステップ
を含む、形態４に記載のＤＮＡの調製方法。
（形態６）
転写調節配列の下にクローン化された、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の完全長のコピーを含む、感染性クローンであって、該感染性ｃＤＮＡが細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される、感染性クローン。
（形態７）
前記コロナウイルスが、ブタの感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）の単離物である形態６に記載の感染性クローン。
（形態８）
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の発現の最初期（ＩＥ）プロモーターである形態６または７に記載の感染性クローン。
（形態９）
前記完全長ｃＤＮＡが、ポリ（Ａ）テイル、肝炎ウイルスデルタ（ＨＤＶ）のリボザイム、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結およびポリアデニル化配列によって３’末端で隣接される、形態６〜８の一に記載の感染性クローン。
（形態１０）
前記感染性ｃＤＮＡが登録番号ＣＥＣＴ  ５２６５のもとで、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅに寄託された大腸菌の細菌の人工染色体（ＢＡＣ）から得られる、形態６〜９の一に記載の感染性クローン。
（形態１１）
登録番号ＣＥＣＴ  ５２６５のもとで、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅに寄託された大腸菌。
（形態１２）
異種核酸が発現されることを可能にする条件下で、感染性クローン中に挿入された当該異種核酸を含むように改変された、形態６の感染性クローンを含む、組換えウイルスベクター。
（形態１３）
前記異種核酸が、目的の遺伝子産物をコードする遺伝子および遺伝子フラグメントから選択される、形態１２に記載の組換えウイルスベクター。
（形態１４）
（ｉ）形態１２に記載の少なくとも１つの組換えウイルスベクター（ここで、いずれのウイルスベクターも感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原、または前記感染性の病原体に対する防御を提供する抗体を発現する）と、
（ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤を任意的に伴って含む、
感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御するためのワクチン。
（形態１５）
前記ウイルスベクターが、全身性の免疫応答および／または呼吸器、腸粘膜、または他の組織中で増殖する異なる感染性の病原体に対する粘膜における免疫応答を誘導し得る少なくとも１つの抗原を発現する、形態１４に記載のワクチン。
（形態１６）
前記ワクチンが１つ以上の感染性の病原体によって引き起こされる感染に対する防御のための多価ワクチンである、形態１４または１５に記載のワクチン。
（形態１７）
混合及び結合接種のための独立の組換えウイルスベクターを含み、前記組換えウイルスベクターがそれぞれ少なくとも一つの異なる抗原または異なる抗体を発現する、形態１６に記載の多価ワクチン。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、ＤＮＡの調製方法が提供される。この方法は、複数の工程を包含する。ここでは、
（ａ）ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の全長のコピーを含有しているＤＮＡ；または
（ｂ）ＲＮＡウイルスのｇＲＮＡの１つまたはいくつかのフラグメントを含有しているＤＮＡであって、ここで、フラグメントは、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有しているＤＮＡ；
が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される。
【００１８】
本出願によれば、「細菌の人工染色体」はＦ因子の配列を含むＤＮＡ配列である。この配列を含有しているプラスミド（いわゆる、Ｆプラスミド）は、少ないコピー数（１個の細胞あたり１個または２個のコピー）で、３００ｋｂより長い異種配列を安定に維持し得る。それぞれのＢＡＣが、当該分野で公知である（Ｓｈｉｚｕｙａら、１９９２）。
【００１９】
本発明によると、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡは、ＲＮＡウイルスの天然の配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは７５％、そしてより好ましくは、８５％または９５％の相同性を有する。配列相同性は、好ましくは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能であるＣｌｕｓｔａｌコンピュータープログラムを使用して決定される。
【００２０】
本発明の方法によると、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡはさらに、１つのウイルスの構造または非構造タンパク質を除いて、いくつかまたは全てをコードする配列を含み得る。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様においては、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡはさらに、１つまたはいくつかの異種遺伝子をコードする配列を含む。本出願によると、遺伝子は、それがＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよび構造または非構造タンパク質をコードする遺伝子についての供給源として使用されるウイルスに由来しない場合には、「異種遺伝子」として特徴付けられる。従って、「異種遺伝子」はまた、１つのタイプのウイルスに由来する遺伝子をいい、そして別のタイプのウイルスに由来する配列を含有しているベクター中で発現される。目的とするいかなる異種遺伝子も本発明の核酸に挿入することができる。哺乳動物の免疫システムによって感染性病原体からの抗原として認識される、１つまたはいくつかのペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の挿入が、特に好ましい。あるいは、本発明の方法は、感染性の病原体または感染性の病原体に対する防御を提供する抗体の複製を妨害する、少なくとも１つの分子をコードする異種遺伝子を使用して、行われ得る。異種配列は、免疫モジュレーター、サイトカイン、免疫エンハンサー、および／または抗炎症性化合物をコードする特定の配列であり得る。
【００２２】
本発明の方法は、任意の大きさを有するＤＮＡを使用して、ＢＡＣ中へのクローニングが行われ得る。しかし、大きな配列を使用する場合には、ウイルスからサブクローニングされたＤＮＡを調製するための公知の方法を上回る特異的な利点が得られる。従って、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡは、少なくとも５ｋｂの長さを含み、ここでは、少なくとも１５、２５、または３０ｋｂの大きさを有するＤＮＡが、特に好ましい。
【００２３】
本発明の特定の好ましい実施態様によれば、ＢＡＣがＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡの転写を制御する配列を含む、方法が提供される。これによって、ウイルスＲＮＡの転写を可能にし、そして従って、ウイルスの発現を可能にする。当該分野で公知の転写を制御する任意の配列が、この目的のために使用される。これには、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムに由来する遺伝子の発現を駆動する配列が含まれる。サイトメガロウイルスの最初期（ＩＥ）プロモーターが好ましい。
【００２４】
ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡもまた、ポリ（Ａ）テイルによって３’末端に隣接される。核酸は、終結配列および／またはウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化配列を含み得る。さらにまたはあるいは、核酸が、リボザイム（例えば、δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム）をコードする配列を含み得る。
【００２５】
さらなる利点は、ウイルスの少なくとも１つが、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって改変されている場合に、達成され得る。例えば、ウイルスの向性を制御する遺伝子が、変更された向性を有するウイルスを得るために改変され得る。あるいは、ウイルスの向性を制御する遺伝子が、別のウイルスのそれぞれの遺伝子で置換されている。改変は、好ましくは、ウイルスのＳ、Ｍ、および／またはＮ遺伝子中で行われる。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様においては、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡが、ウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得る方法が、提供される。ウイルス粒子は、感染性の、弱毒化された、複製欠損、または不活化されたウイルスであり得る。
【００２７】
任意のＲＮＡウイルスが、本発明の方法において使用され得る。ウイルスは、例えば、ピコルナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、トロウイルス、アルテリウイルス、カルシウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス、オルトミクソウルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、またはレオウイルスであり得る。正方向の鎖のゲノムを自然に有するウイルスの使用が好ましい。
【００２８】
さらに、本発明は、以下の工程を包含する、ウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子の調製方法を提供する。ここでは、ＤＮＡは、上記の方法の１つに従って調製される。ＤＮＡは、適切な宿主細胞中で発現され、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子が、宿主細胞から単離される。当該分野で公知の細胞培養物からウイルスを単離するための任意の方法が、使用され得る。あるいは、ウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子を調製する方法が、開示されている。ここでは、本発明のＤＮＡは、化学物質、生物学的試薬および／または細胞抽出物を使用して転写または翻訳され、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子が続いて、単離される。特定の実施態様については、ウイルスは、実質的に不活化されるか、または死滅させられ得る。
【００２９】
本発明はまた、複数の工程を包含している医学組成物を調製するための方法を提供する。ここでは、ＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡ、またはウイルス粒子が、上記の方法の１つに従って調製され、そして薬学的に受容可能なアジュバントおよび／またはキャリアと混合される。多数のアジュバントおよびキャリアおよび希釈剤が先行技術において公知であり、そして本発明に従って使用されえる。医薬品は、好ましくは、感染性の疾患に対してヒトまたは動物を防御するためのワクチンである。医薬品は、また、遺伝子治療のために使用され得る。
【００３０】
本発明はさらに、コロナウイルスの天然の配列に対して、少なくとも６０％の相同性を有し、そしてＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする。ここでは、上記のＤＮＡは、ウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得る。
【００３１】
本発明によれば、用語「コロナウイルスに由来する配列」は、少なくとも６０％、好ましくは７５％、そしてより好ましくは８５％または９５％の相同性を、コロナウイルスの天然の配列に対して有する核酸をいうように使用される。配列相同性は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能であるＣｌｕｓｔａｌコンピューターを使用して決定され得る。
【００３２】
用語「コロナウイルス」は、直鎖の、正方向のセンスの、２５から３３ｋｂのｓｓＲＮＡの単一の分子を有するウイルスのグループをいう。これらのウイルスは、通常は、７個から１０個の構造遺伝子（すなわち、ウイルス構造を決定するタンパク質をコードする遺伝子）を含む。これらの遺伝子は、代表的には、５’−レプリカーゼ−（ヘマグルチニン−エステラーゼ）−スパイクエンベロープ−膜−核タンパク質―３’の順に、ウイルスゲノム中に並べられる。さらに、ウイルスゲノムは、多数の非構造遺伝子を含み得、これらは、共通の３’末端を有するｍＲＮＡのネストされたセットをコードし、そしてほとんどが必須ではない。
【００３３】
用語「ウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得る」は、ＤＮＡ配列を特徴付けるために使用される。これは、適切な宿主細胞中に導入され、ＲＮＡに転写され、そしてウイルス粒子を作成する。ウイルス粒子は、好ましくは、感染性のウイルスであるが、上記のＲＮＡを含有している、不活化され得るか、弱毒化され得るか、または複製欠損ウイルスであり得る。好ましくは、ウイルス粒子の発現のために必要な情報の全てが、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる。
【００３４】
本発明の核酸はさらに、目的の１つまたはいくつかの異種遺伝子をコードする配列を含み得る。本発明に従うと、遺伝子は、それがコロナウイルスに由来しない場合には、「異種遺伝子」として特徴付けられる。これらは、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼ、および構造または非構造タンパク質をコードする遺伝子の供給源として使用された。従って、「異種遺伝子」はまた、コロナウイルスの１つのタイプに由来し、そして別のタイプのコロナウイルスに由来する配列を含有しているベクター中で発現される遺伝子をいう。目的の任意の異種遺伝子が、本発明の核酸中に挿入され得る。哺乳動物の免疫システムによって感染性の病原体に由来する抗原として認識されるペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の挿入が、本質的に好ましい。従って、異種遺伝子は、感染性の病原体（感染性の病原体の複製を妨害する少なくとも１つの分子、または感染性の病原体に対する防御を提供する抗体）に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原をコードする。あるいは、またはさらに、異種遺伝子は、免疫モジュレーター、サイトカイン、免疫エンハンサー、および／または抗炎症性化合物をコードし得る。
【００３５】
ＲＮＡに転写される本発明のＤＮＡのフラグメントは、好ましくは、少なくとも２５ｋｂの大きさを有する。少なくとも３０ｋｂの大きさを有するフラグメントが、特に好ましい。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＤＮＡはさらに、コロナウイルスの構造または非構造タンパク質の１つを除くいくつかまたは全てをコードするコロナウイルスに由来する配列を含む。あるいは、本発明のＤＮＡは、さらにコロナウイルスの構造または非構造タンパク質の全てをコードする配列を含む。
【００３７】
さらなる実施態様によれば、本発明の核酸は、コロナウイルスのｇＲＮＡに由来する配列の転写を制御する配列を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムに由来する遺伝子の発現を駆動する配列を含む、当該分野で公知の転写を制御する任意の配列は、この目的のために使用され得る。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期（ＩＥ）プロモーターの使用が、好ましい。
【００３８】
本発明の核酸はまた、ポリ（Ａ）テイルによって３’末端で隣接され得る。核酸はまた、ウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結および／またはポリアデニル化配列を含む。さらに、またはあるいは、核酸は、リボザイム（例えば、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム）をコードする配列を含み得る。
【００３９】
本発明の核酸は、任意のコロナウイルスに由来する（例えば、ブタの伝染性の胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、マウスの肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、感染性の気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、ネココロナウイルス（ＦｃｏＶ）、またはヒトコロナウイルスに由来する）配列を含み得る。好ましい実施態様によれば、核酸は、感染性の胃腸炎ウイルスに由来する。
【００４０】
本発明のさらなる実施態様によれば、本発明のＤＮＡは、プラスミドの一部、好ましくは、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）の一部である。
【００４１】
本発明はさらに、それぞれの核酸またはワクチンを含有している宿主細胞を提供する。宿主細胞は、真核生物または原核生物であり得る。あるいは、本発明は、本発明の核酸を含有しているウイルス粒子を提供する。それぞれのウイルス粒子は、例えば、本発明の核酸を用いてトランスフェクトされたかまたは感染させられた細胞培養物から単離され得る。
【００４２】
さらなる実施態様に従うと、本発明は、複数の工程を包含している、ウイルス粒子またはウイルスＲＮＡを産生するための方法を提供する。ここでは、本発明のＤＮＡは、宿主細胞中に導入され、ＤＮＡを含有している宿主細胞が、その発現を可能にする条件下で培養され、そしてウイルス粒子またはウイルスのＲＮＡが回収される。さらに、ウイルス粒子またはウイルスのＲＮＡを産生するための方法が、提供される。ここでは、本発明のＤＮＡがインビトロで化学物質、生物学的な試薬、および／または細胞抽出物と、ＤＮＡの発現を可能にする条件下で混合され、そしてウイルス粒子またはウイルスのＲＮＡが回収される。本発明はまた、上記の方法のいずれかによって得ることができる、ウイルス粒子およびウイルスのＲＮＡを含む。異種遺伝子を含有しているＲＮＡおよびウイルス粒子が好ましい。そのように得られたウイルスは、感染性の、弱毒化された、複製欠損、または不活化されたウイルスの形態を有し得る。
【００４３】
ウイルスは、改変された遺伝子（例えば、改変されたＳ、Ｎ、またはＭ遺伝子）を含み得る。本発明の特異的な実施態様においては、Ｓ、Ｎ、またはＭ遺伝子の改変は、弱毒化されたウイルスまたは変更された向性を有するウイルスを生じる。
【００４４】
さらなる実施態様によれば、本発明は、本発明の核酸、宿主細胞、またはウイルスを含有している、医学調製物を提供する。好ましい実施態様に従うと、医薬調製物は、感染性の病原体によって引き起こされる疾患に対して動物を防御し得るワクチンである。ワクチンは、例えば、感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原、または感染性の病原体に対する防御を提供する抗体、または上記の感染性の病原体に対する防御を提供する抗体の配列を含み得る。ワクチンは、感染性の病原体の複製を妨害する１つ上の分子を発現するＤＮＡを含み得る。あるいは、ワクチンは、全身性の免疫応答および／または呼吸器、腸粘膜、または他の組織中で増殖する種々の感染性の病原体に対して粘膜における免疫応答を誘導し得る少なくとも１つの抗原を発現するベクターを含み得る。ワクチンはまた、１つ以上の感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御し得る多価ワクチンであり得る。これは、本発明の１つ以上の核酸を含み、そしてそれぞれが、上記の感染性の病原体、または感染性の病原体のそれぞれの１つに対する防御を提供する抗体、または任意の感染性の病原体の複製を妨害する他の分子に対して、免疫応答を誘導し得る抗原を発現する。
【００４５】
本発明のワクチンは、さらに、当該分野で公知の、任意の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含み得る。
【００４６】
本発明はさらに、複数の工程を包含する、本発明のＤＮＡを調製するための方法を提供する。ここでは、コロナウイルスに由来する妨害欠損ゲノムが、ＢＡＣベクター中でプロモーターの発現下にクローン化され、そして欠損ゲノム内での欠失が、再挿入される。この方法はさらに、複数の工程を包含し得る。ここでは、ウイルスゲノム中の毒性配列が、残存しているゲノムＤＮＡ中への再挿入の前に同定される。好ましくは、ウイルスゲノム中の毒性配列は、ゲノムが完成する前に再挿入される最後の配列である。本発明によれば、この方法は、コロナウイルスの感染性のクローンを得るために適切であり、これは、少なくとも80の世代について最近中で安定であり、そして非常に効率的なクローニングベクターを提供する。
【００４７】
本発明は、コロナウイルスに由来するｃＤＮＡの感染性のクローンの開発（Ａｌｍａｚａｎら、２０００）、ならびに上記の感染性のクローンから構築されるベクターの開発を提供する。これはまた、上記のクローン中に挿入される異種核酸を含む。本発明によって提供される感染性のクローンおよびベクターは、基本的および応用研究の両方において多数の適用、ならびに高いクローニング能力を有する。そしてこれは、それらの種特異性および向性が容易に制御され得るそのような方法に設計され得る。
【００４８】
本特許は、コロナウイルスの歴史においてはじめて、コロナウイルスのゲノムをコードする全長の感染性のｃＤＮＡを得ることを可能にする方法の開発を記載する。
【００４９】
コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする感染性のｃＤＮＡから作成された、コロナウイルスに基づく異種核酸を発現させるための、新しいベクターまたはシステムが、開発されている。本発明の１つの特定の現実化においては、コロナウイルスは、ブタの感染性の胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）である。
【００５０】
新しい発現システムが、基本的または応用研究において、例えば、目的（タンパク質、酵素、抗体など）の産生を得るために、ワクチンのベクターとして、あるいは、ヒトおよび動物における遺伝子治療において、使用され得る。感染性のｃＤＮＡクローンから得られた感染性のコロナウイルスは、従来の遺伝子操作技術によって操作され得、その結果、新しい遺伝子がコロナウイルスのゲノム中に挿入され得、そしてその結果、これらの遺伝子は、免疫応答を誘導するためまたは遺伝子治療のために、組織−および種−特異的様式で発現され得る。さらに、発現は、新しい転写調節配列（ＴＲＳ）の選択によって最適化されており、これによって、数百倍以上に発現レベルを増大させることを可能にする。
【００５１】
コロナウイルス（特に、ＴＧＥＶ）に由来するベクターは、それらの中では複製しない他の発現システムに関して、粘膜において免疫の誘導のためのいくつかの利点を示す：（ｉ）ＴＧＥＶは、胃腸および呼吸器の粘膜に感染する（ＥｎｊｕａｎｅｓおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｉｊｓｔ、１９５５）、すなわち、分泌性の免疫の誘導のための最適な部位；（ｉｉ）その向性が、Ｓ（スパイク）遺伝子を改変することによって制御され得る（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、１９９７）；（ｉｉｉ）相補性のウイルスに依存する発現のシステムの開発のための非病原株が存在する（Ｓａｎｃｈｅｚら１９９２）；および（ｉｖ）コロナウイルスが、中間体のＤＮＡ段階を通過することなく複製する細胞質性のＲＮＡであり（ＬａｉおよびＣａｖａｎａｇｈ、１９９７）、これによって、その細胞性の染色体への組込みを実際に不可能にする。
【００５２】
コロナウイルスのｇＲＮＡをコードするｃＤＮＡに由来する感染性のコロナウイルスを回収することを可能にした手順は、以下のストラテジーを含む：
（ｉ）適切なプロモーターの制御下でのコロナウイルスのＲＮＡの発現；
（ｉｉ）細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中へのコロナウイルスのＲＮＡのクローンニング；
（ｉｉｉ）細菌に対して直接または間接的に毒性であるコロナウイルスのｃＤＮＡの配列の同定；
（ｉｖ）コロナウイルスの感染性のＲＮＡをコードするｃＤＮＡの成分（プロモーター、転写終結配列、ポリアデニル化配列、リボザイムなど）の連結の正確な順序の同定；
（ｖ）一群の技術およびプロセスの同定（ＢＡＣの増殖、ＢＡＣ ＤＮＡの精製プロセスに対する改変、形質転換技術などについての条件）、その組み合わせによって、ｃＤＮＡの感染性のコロナウイルスの効率的なレスキューを可能にする。
【００５３】
プロモーターは、核内でのウイルスＲＮＡの発現を増大させることにおいて重要な役割を果たす。ここで、これが合成され、その後、細胞質に輸送される。
【００５４】
ＢＡＣの使用は、本発明の手順の重要な点の１つを構成する。公知であるように、細菌プラスミド中の真核生物配列のクローニングは、細菌について外因性である配列の毒性に起因して、しばしば不可能である。これらの場合においては、細菌は通常は、導入された配列を改変することによって毒性を排除する。それにもかかわらず、この場合に続くストラテジーにおいては、これらのウイルス配列の可能性のある毒性を回避するために、ＢＡＣ中のコロナウイルスの相補性ｃＤＮＡを得るために、必須のクローニングが行われた。これらのプラスミドは、１個の細胞あたり１個のみまたは最大２個のコピーで存在し、それらの毒性を相当制限し、そしてプラスミド間での組換えの可能性を減少させる。
【００５５】
コロナウイルスの細菌毒性のｃＤＮＡの同定を通じて、コロナウイルスの完全なゲノムをコードするｃＤＮＡの構築が、毒性の配列の排除を用いて完成させられ得る。これは、完全なゲノムの構築の最後の段階で、すなわち、それらの細菌による改変を回避するために、真核生物中でのトランスフェクションの直前に、付加される。
【００５６】
従って、本発明の１つの目的は、コロナウイルスのｇＲＮＡをコードする感染性の２本鎖のｃＤＮＡクローン、ならびにそれを得るための手順から構成される。
【００５７】
本発明のさらなる目的は、上記の感染性のクローンおよび上記の感染性のクローン中に挿入される異種核酸の配列を含む組換えウイルスベクターのセットから構成される。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、組換えコロナウイルスを産生するための方法から構成される。この方法は、宿主細胞中へ上記の感染性のクローンを導入する工程、感染性のクローンの複製を可能にする条件下で形質転換された細胞を培養する工程、および組換えコロナウイルスを産生する工程、ならびに培養物から組換えコロナウイルスを回収する工程を包含する。
【００５９】
本発明の別の目的は、改変された組換えコロナウイルスを産生するための方法から構成される。この方法は、宿主細胞中に組換えウイルスベクターを導入する工程、ウイルスベクターが複製することおよび産生された改変された組換えコロナウイルスが産生されることを可能にする条件下でこれを培養する工程、ならびに培養物から改変された組換えコロナウイルスを回収する工程を包含する。本発明の別の目的は、異種ＤＮＡの配列の発現を可能にする条件下で、上記の組換えウイルスベクターを含有している宿主細胞を培養する工程を包含する、目的の産物を産生するための方法から構成される。
【００６０】
上記の感染性のクローンまたは組換えウイルスベクターを含有している細胞は、本発明の別の目的を構成する。
【００６１】
本発明の別の目的は、感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御するワクチンのセットから構成される。これらのワクチンは、それぞれの感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原、または上記の感染性の病原体に対する防御を提供する少なくとも１つの抗体を発現する感染性のベクターを、薬学的に受容可能な賦形剤とともに含む。ワクチンは、ベクターが１つ以上の感染性の病原体に対する免疫応答を誘導し得る１つ以上の抗原、あるいは、１つ以上の感染性の病原体に対する防御を提供する１つ以上の抗体を発現するかどうかに依存して、一価または多価であり得る。
【００６２】
本発明によって提供される別の目的は、上記のワクチンの投与から構成される、動物の免疫化の方法を含む。
【００６３】
本発明は、コロナウイルスの感染性のＲＮＡをコードするｃＤＮＡクローン（従って、以下を含有している本発明の感染性のクローン）を提供する：（１）コロナウイルスまたはウイルス自体の感染性のゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に対する相補性ＤＮＡのコピー；および（２）最適化された転写促進配列を含む、さらなる遺伝子についての発現モジュール。
【００６４】
本発明の１つの特定の実施態様においては、コロナウイルスは、クローンＣ１１ ＴＧＥＶ単離物のＳ遺伝子、あるいはイヌまたはヒトのコロナウイルスのＳ遺伝子による、このウイルスのＳ遺伝子の置換によって改変された、ＴＧＥＶ単離物、特に、ＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物（Ｓａｎｃｈｅｚら１９９０）である。
【００６５】
転写を促進する配列（すなわち、プロモーター）は、それに対してウイルスのポリメラーゼＲＮＡが結合してメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を開始する、コロナウイルスのそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの５’−末端に配置されたＲＮＡ配列である。特定のそして好ましい実施態様においては、ウイルスのゲノムは、ＣＭＶのＩＥプロモーターを使用してｃＤＮＡから発現される。これは、このプロモーターを使用して得られる発現の高いレベルに（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、１９９６）、そしてＲＧＥＶコロナウイルスによって発現されるＲＮＡに由来する大きな欠損ゲノム（９．７ｋｂおよび１５ｋｂ）が、それらが合成される核から細胞質へのそれらの輸送の間にスプライシングを受けないことを示す本発明者らの研究室で得られた以前の結果に起因する。
【００６６】
本発明の欠損クローンはまた、ＢＧＨ遺伝子から来るような、転写終結配列およびポリアデニル化シグナルを含む。これらの終結配列は、ポリ（Ａ）テイルの３’末端に配置された。１つの特定の実施態様においては、本発明の欠損クローンは、２４個のＡ残基のポリ（Ａ）テイル、ならびにＨＤＶリボザイムの配列によるポリ（Ａ）テイルから分離されたＢＧＨの終結およびポリアデニル化配列を含む。
【００６７】
ウイルスの感染性のｃＤＮＡがその中に挿入されているプラスミドは、複製起点を保有しているＤＮＡ分子であり、そして従って、適切な細胞中で協力に複製することが可能である。使用されるプラスミドは、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような適切な宿主細胞中で、本発明の感染性のクローンを維持しそして増幅するためのレプリコンアダプターである。複製は、一般的には、それを保有している細胞の選択を可能にする、抗生物質に対する耐性の遺伝子を保有する（例えば、ｃａｔ）。
【００６８】
実施例１においては、ＣＭＶのＩＥプロモーターの制御下へのＴＧＥＶのクローンの構築が、記載される。ｃＤＮＡの３’末端に、２４ヌクレオチドのポリ（Ａ）配列、ＨＤＶリボザイム、およびＢＧＨの転写終結配列が隣接させられるようである。
【００６９】
本発明の感染性のクローンを得るための手順は、コロナウイルスのｇＲＮＡに由来する全長のｃＤＮＡを構築する工程、および転写調節エレメントを連結する工程を包含する。
【００７０】
コロナウイルスの感染性のｇＲＮＡをコードするｃＤＮＡは、ｃＤＮＡの安定性を増大させる目的のために、ＢＡＣ中の適切なプロモーターの制御下にｃＤＮＡとしてクローン化されたコロナウイルスに由来するＤＩゲノムから得られた。ついで、細菌毒性の配列が同定され、そしてその毒性を排除する目的のために、上記の毒性配列が除去され、そして完全なゲノムの構築の最後に、真核生物中でのトランスフェクションの直前に、挿入された。ウイルスの子孫は、ウイルスの複製をサポートする真核生物細胞中のコロナウイルスのゲノムを含む、ＢＡＣプラスミドのトランスフェクションによって再構築され得る。
【００７１】
転写調節エレメントは、従来技術の手段によって連結される（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）。
【００７２】
本発明の感染性のクローンは、決定された活性をコードする異種核酸の少なくとも１つの配列を、感染性のクローン中に存在しそして得られる発現ベクター中に含まれる調節配列のプロモーターの制御化に挿入するために、従来の遺伝子操作技術によって操作され得る。
【００７３】
本発明の感染性のクローンは、多数の適用を示す：例えば、これは、基礎的な研究（例えば、コロナウイルスの複製および転写機構を研究するため）、および応用的な研究（例えば、目的の産物（タンパク質、酵素、抗体など）の発現の効率的なシステムの開発において）の両方において使用され得る。
【００７４】
適切な細胞が、本発明の感染性のｃＤＮＡクローンによって形質転換され、そしてコロナウイルスの完全なゲノムを含有している得られたウイルス粒子が、回収され得る。従って、本発明はさらに、組換えコロナウイルスを産生するための方法を提供する。この方法は、宿主細胞中への本発明の感染性のｃＤＮＡの導入、感染性のクローンの発現および複製を可能にする条件下での上記の細胞の培養、ならびに、組換えコロナウイルス（これは、コロナウイルスの感染性のゲノムを含む）から得られたウイルス粒子の回収を含む。本発明の感染性のクローンは、種々の方法で（例えば、本発明の感染性のクローンからインビトロで転写されたＲＮＡでの宿主細胞のトランスフェクションによって、または本発明の感染性のｃＤＮＡクローンからインビトロで転写されたＲＮＡでの宿主細胞のトランスフェクションによって）宿主細胞中に導入され得る。本発明の感染性クローンを含む上記の宿主細胞は、本発明のさらなる目的を構成する。
【００７５】
本発明はまた、本発明の感染性のクローンに由来する組換えウイルスベクターのセットを提供する。従って、本発明のウイルスベクターは、上記の異種核酸が発現されることを可能にする条件下で、上記の感染性のクローン中に挿入された異種核酸を含むように改変された、本発明の感染性のｃＤＮＡクローンを含む。
【００７６】
用語「核酸」は、それが本明細書中で使用される場合には、遺伝子または遺伝子フラグメントを含み、そして一般的にはＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。
【００７７】
本明細書中で使用される意味においては、核酸について適用される用語「異種」は、宿主細胞中に異種核酸を導入するために使用される、ベクター中には通常は存在しない核酸をいう。
【００７８】
本発明のウイルスベクターを含み得る異種核酸は、目的のタンパク質、ペプチド、エピトープ、または任意の遺伝子産物（例えば、抗体、酵素など）をコードする遺伝子またはフラグメントであり得る。異種核酸は、ｃＤＮＡの任意の適切な領域中に（例えば、ＯＲＦ  １ｂの後ろ、または遺伝子Ｎと７との間、開始コドン（ＡＵＧ）の後ろ）、そして遺伝子を有するリーディングフレーム中に：または、あるいは、他のＯＲＦに対応している領域中に）従来の遺伝子操作技術の手段によって、本発明の感染性のクローン中に挿入され得る。本発明のウイルスベクターの構築においては、異種核酸の挿入が、任意の基本的なウイルス機能を妨害しないことが、不可欠である。
【００７９】
本発明のウイルスベクターは、１つ以上の活性を発現し得る。この後者の場合においては、ウイルスベクターは、１つもしくは数個のプロモーターに先行して、またはプロモーターもしくは種々のリボザイム認識部位（ＩＲＥＳ、内部リボザイム進入部位）によって、または種々のプロモーターおよびリボザイム認識部位によって、発現される活性のような、異種核酸の多くの配列として、含む。
【００８０】
従って、本発明は、目的の産物を産生するための方法を提供する。この方法は、異種核酸が発現されることが可能である条件下で、本発明のウイルスベクターを含む宿主細胞を培養する工程、および目的の産物の回収を包含する。本発明のウイルスベクターを含有している上記の宿主細胞は、本発明のさらなる目的を構成する。
【００８１】
本発明のウイルスベクターは、その種特異性および向性が、容易に制御され得るように設計され得る。これらの特徴に起因して、本発明のウイルスベクターの非常に興味深い適用は、目的の遺伝子のベクターとしての、または種々の病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチン用ベクターとしての、それらの使用である。
【００８２】
本発明はさらに、以下を含有する、感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して、動物を防御し得るワクチンを提供する：（ｉ）上記の感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原、または上記の感染性の病原体に対する防御を提供する抗体を必要に応じて、以下とともに（ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤。
【００８３】
本明細書中で使用される意味においては、「防御を誘導する」は、細胞性の応答を強化する物質（インターロイキン、インターフェロンなど）、細胞性の壊死因子、および感染性の病原体によって引き起こされる感染から動物を防御する同様の物質によて誘導されるような適切な機構を通じて、本発明のウイルスベクターによって誘導される受容している生物体（免疫化された動物）の免疫応答として、理解されるはずである。
【００８４】
用語「動物」には、任意の種の全ての動物（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物）である。
【００８５】
「感染性の病原体」は、本明細書中で使用される意味においては、任意のウイルス、真菌、寄生虫、または動物に感染し得そして病気を引き起こし得る他の感染性因子を含む。
【００８６】
１つの特定の実施態様においては、本発明によって提供されるワクチンは、呼吸器および胃腸粘膜において増殖する種々の感染性の病原体に対して、全身性の免疫応答および／または粘膜中の免疫応答を誘導し得る、少なくとも１つの抗原を発現する、１つ以上の本発明のウイルスベクターを含む。本発明のベクターは、粘膜における免疫および乳腺刺激性の免疫を誘導するためにきわめて適切であり、これは、胃腸管の感染に対して新生児を防御することにおける特異的な目的である。
【００８７】
別の特定の実施態様においては、本発明によって提供されるワクチンは、感染性の病原体に対して防御する、任意のイソ型抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡなど）の軽鎖および重鎖をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する、本発明の少なくとも１つのウイルスベクターを含む。
【００８８】
種特異性は、ウイルスベクターが、対応している種の細胞性の応答によって認識されるために適切である、所望される種（ヒト、イヌ、ネコ、ブタなど）に感染するコロナウイルスのエンベロープのＳタンパク質を発現し得るように、制御され得る。
【００８９】
本発明によって提供されるワクチンは、本発明のウイルスベクターが、１つ以上の感染性の病原体に対して免疫応答を誘導し得る１つ以上の抗原、または１つ以上の感染性の病原体に対して防御を提供する１つ以上の抗体を発現するかどうかに依存して、一価または多価であり得る。
【００９０】
本発明の特定の実施態様においては、種々の感染性のヒト、ブタ、イヌ、およびネコの因子に対してヒト、ブタ、イヌ、およびネコを防御し得る、そして向性が、所望される種特異性を有するコロナウイルスのＳ−糖タンパク質を発現することによって制御される、一価のワクチンが提供される。
【００９１】
ブタの感染性の病原体に対する一価のワクチンは、以下のブタの病原体の抗原から本質的に構成される群より選択される抗原：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ、ブタパルボウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｄｉｏｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｉａｅ、ブタの表皮下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ロタウイルス、または、以下を引き起こす病原体に対する抗原：ブタの呼吸器および生殖系の症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ症候群（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、ブタのインフルエンザ、または伝染性の胃腸炎、および萎縮性の鼻炎の原因論的な因子、および増殖性の回腸炎を発現するベクターを含み得る。イヌの感染性の病原体に対する一価のワクチンは、以下のイヌの病原体の抗原から本質的に構成される群から選択される抗原を発現する、発現ベクターを含み得る：イヌのヘルペスウイルス、１型および２型のイヌのアデノウイルス、１型および２型のイヌのパルボウイルス、イヌのレオウイルス、イヌのロタウイルス、イヌのコロナウイルス、イヌのパラインフルエンザウイルス、イヌのインフルエンザウイルス、ジステンパーウイルス、狂犬病ウイルス、レトロウイルス、およびイヌのカルシウイルス。
【００９２】
ネコの感染性の病原体に対する一価のワクチンは、以下のネコの病原体の抗原から本質的に構成される群から選択される抗原を発現する発現ベクターを含み得る：ネコカルシウイルス、ネコの免疫不全ウイルス、ネコのヘルペスウイルス、ネコの全白血球減少症ウイルス、ネコのレオウイルス、ネコのロタウイルス、ネコのコロナウイルス、ネコの感染性の腹膜炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコのＣｈｌａｍｙｄｉａ   ｐｓｉｔｔａｃｉ、およびネコ白血病ウイルス。
【００９３】
ベクターは、感染性の病原体（例えば、上記に記載されているもののような、ブタ、イヌ、またはネコの感染性の病原体）に対する防御を提供する抗体を発現し得る。１つの特定の実施態様においては、ベクターは、６Ａ．Ｃ３として同定された組換えのモノクローナル抗体を発現する。これは、ＴＧＥＶを中和し、ＩｇＧ１またはＩｇＡを用いて発現され、ここでは、イムノグロブリンの定常部分は、ブタの起源、またはヒトおよびブタのロタウイルスについての中和抗体である。
【００９４】
賦形剤として、生理食塩水または他の同様の生理的な溶液のような希釈剤が、使用され得る。同様に、これらのワクチンはまた、水性のワクチン（例えば、水酸化アルミニウム、ＱｕｉｌＡ、アルミナゲルなど）、ならびにミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸誘導体、およびそれらの混合物に基づく油性のワクチンの、両方の処方物中で通常使用されるものに由来するアジュバントを含み得る。
【００９５】
本発明のワクチンはまた、細胞応答を増強する（ＣＲＰ）物質、すなわち、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）のサブ集団を強化する物質（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、γ−ＩＦＮ（γ−インターフェロン）、細胞性の壊死因子、およびワクチン接種された動物において細胞性の免疫を理論的に誘発し得る同様の物質をもまた、含み得る。これらのＣＲＰ物質は、水性または油性のアジュバントを有するワクチン処方物中で使用され得る。細胞性の応答を調節しそして免疫刺激する別のタイプのアジュバントもまた、使用され得る（例えば、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、またはリポソーム）。
【００９６】
本発明は、種々の感染性の病原体によって引き起こされる感染から動物を予防および防御し得る、多価のワクチンを提供する。これらの多価のワクチンは、対応する抗原をコードする種々の配列が同じ組換えベクター中に挿入されている、本発明のウイルスベクターから、あるいは、結合の接種のために後に混合される依存性の組換えベクターを構築することによって、調製され得る。従って、これらの多価ワクチンは、１つ以上の抗原をコードする異種核酸、またはあるいは、種々のウイルスベクター（それらのそれぞれが、少なくとも１つの異なる抗原を発現する）を含むウイルスベクターを含む。
【００９７】
同様に、多価のベクターを含有している多価のワクチンは、抗原をコードする配列の代わりに感染性の病原体に対して防御する抗体をコードする配列を使用して調製され得る。
【００９８】
本発明の１つの特定の実施態様においては、種々のブタ、イヌ、およびネコの感染性病原体に対して、ヒト、ブタ、イヌ、およびネコを免疫化し得るワクチンが、提供される。これについて、ワクチン中に含まれるウイルスベクターは、上記のヒト、ブタ、イヌ、またはネコの病原体、あるいは他のものを発現しなければならない。
【００９９】
本発明のワクチンは、液体または凍結乾燥させられた形態で存在し得、そして賦形剤中で組換えシステムを懸濁することによって調製され得る。上記のシステムが、凍結乾燥させられた形態である場合には、賦形剤自体は、再構成物質であり得る。
【０１００】
あるいは、本発明によって提供されるワクチンが、それらの形成部分、または他の従来のもしくは組換えワクチンで希釈される希釈剤または凍結乾燥させられた画分としてのいずれかで、他の従来のワクチンと組み合わせて使用され得る。
【０１０１】
本発明によって提供されるワクチンは、動物に経口によって、鼻腔から、皮下で、経皮的に、腹膜内で、粘膜内で、または吸入によって、投与され得る。
【０１０２】
本発明はまた、動物（特に、ブタ、イヌ、およびネコ）の１つ以上の感染性の病原体に対して同時の免疫化のための方法を提供する。この方法は、本発明によって提供される組換えシステムの免疫学的に有効量を含むワクチンの、経口による、鼻腔から、皮下での、皮内、腹膜内、筋肉内、または吸入による投与（またはそれらの組み合わせ）を含む。
【０１０３】
さらに、本発明は、上記の動物を感染させる感染性の病原体に対する新生児の動物を防御するための方法を提供する。この方法は、妊娠期間の前またはその間での母体、あるいは、子孫に対する、本発明によって提供されるもののワクチンの、経口による、鼻腔から、皮下での、皮内、腹膜内、筋肉内、または吸入による投与（またはそれらの組み合わせ）から構成される。
【０１０４】
【実施例】
本発明は、以下の実施例によって説明される。これは、感染性のクローンを得ることおよび本発明のウイルスベクターの構築を詳細に記載する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するようには考えられないが、しかし、それらを説明すると考えられる。上記の実施例においては、細菌の形質転換および増殖、ＤＮＡ複製、配列分析、ならびにプラスミドの安定性を評価するためのアッセイは、以下に記載される方法論に従って行われた。
【０１０５】
細菌の形質転換
全てのプラスミドが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ株（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中にエレクトロポレーションされ、これによって以前に記載されたプロトコール（Ｓｈｉｚｕｙａら、１９９２）に対してわずかな改変を導入する。それぞれの形質転換のために、２μＬの連結物および５０μＬのコンピテント細胞を、０．２ｃｍの皿（ＢｉｏＲａｄ）中で混合され、そして２００Ω、２．５ｋＶ、および２５μＦでエレクトロポレーションされた。次いで、１ｍＬのＳＯＣ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）が、それぞれの形質転換体に添加され、細胞が３７℃で４５分間インキュベートされ、そして最後に、組換えコロニーが、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有するＬＢ  ＳＯＣ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）上で検出された。
【０１０６】
細菌の増殖条件
もともともプラスミドを含有している細菌（その中のＴＧＥＶの不完全なゲノムがクローン化された）が、３７℃で増殖させられ、これは、正常な増殖速度論を示す。一方、完全なｃＤＮＡ含むＢＡＣは、可能な限り不安定性を最小にする目的のために、３０℃で増殖させられた。なお、コロニーの大きさは、減少させられ、そして２４時間までのインキュベーション時間が、正常なコロニーの大きさを達成するために必要であった。
【０１０７】
ＤＮＡの精製
Ｗｏｏ（Ｗｏｏら、１９９４）によって記載されているプロトコールは、わずかな改変を有して、以下の通りであった。単一のコロニーから、４ＬのＬＢが、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍＬ）とともに接種された。１８℃で３０時間のインキュベーション時間の後、細菌が、６，０００Ｇでの遠心分離によって回収され、そしてプラスミドが、製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｕｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓキットを使用して精製された。この手順によって、得られたプラスミドＤＮＡが細菌のＤＮＡを混入していることを観察した。混入している細菌のＤＮＡを排除するために、プラスミドＤＮＡが、ＣｓＣｌ勾配上での１６時間の５５，０００ｒｐｍでの遠心分離の手段によって精製された。得られた収量は、プラスミドの大きさに依存して、１５から３０μｇ／Ｌの間であった。
【０１０８】
配列分析
ＤＮＡは、蛍光色素マークされたジデオキシヌクレオチドと、耐熱性ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動配列決定装置（３７３  ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で配列決定された。試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃｏｍｐａｎｙによるキット（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ   Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ Ｒｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）の方法によって得られた。配列決定反応を行うために使用されたサーマルサイクラーは、「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００」（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）であった。
【０１０９】
配列の連結およびＴＧＥＶのコンセンサス配列とのそれらの比較が、ＳｅｑＭａｎ  ＩＩ  ａｎｄ  Ａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡ）プログラムを使用して、それぞれ行われた。コンセンサス配列中には差異は検出されなかった。
【０１１０】
プラスミドの安定性
もともとのグリセロレートから、組換えのｐＢｅｌｏＢＡＣ１７プラスミドを含有している細菌が、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）を有する２０ｍＬのＬＢ中で３０℃及び３７℃で１６時間増殖させられた。この材料は、継代０と考えれらた。細菌は、１０６倍に希釈され、そして１６時間の間、３０℃および３７℃で増殖させられた。連続的な継代が、連続する８日間の間に実現された（それぞれの継代が、約２０世代を示す）。プラスミドＤＮＡが、継代０および８（１６０世代）でＭｉｎｉｐｒｅｐによって精製され、そして制限ヌクレオチドを用いて分析された。ＴＧＥＶのゲノムの一部を含む２つのプラスミドが、高度に安定であり、それにもかかわらず、ＴＧＥＶの完全なゲノムを含むプラスミドは４０世代の後で、一定の不安定性を示した（この時点で、ＤＮＡの約８０％が、正確な制限パターンを示した）。
【０１１１】
[実施例１]  ＴＧＥＶに由来する感染性のｃＤＮＡのクローンに基づく組換えベクターの構築
１．１  ＴＧＥＶの感染性のｃＤＮＡの生成
完全なＴＧＥＶゲノムをコードするｃＤＮＡを得る目的のために、本発明者らは、最初に、欠損ＤＩ−ＣゲノムをコードするｃＤＮＡを用いて開始した（Ｍｅｎｄｅｚら、１９９６）。ＴＧＥＶゲノムの約３分の１の長さを有するこのｃＤＮＡを、低コピーのｐＡＣＮＲ１１８０プラスミド（Ｒｕｇｇｌｉら、１９９６）中にクローン化し、そしてその配列を決定した。欠損ゲノムをコードするｃＤＮＡが、相補性ウイルスの助けを用いて、効率的にレスキューされた（複製され、そしてパッケージされた）（Ｍｅｎｄｅｚら、１９９６；Ｉｚｅｔａら、１９９９）。
【０１１２】
ＤＩ−Ｃゲノムには、約１０、１、および８キロベース（ｋｂ）の３つの欠損（Δ１、Δ２、およびΔ３）が、ＯＲＦ  １ａ、１ｂ、そして遺伝子Ｓおよび７の間にそれぞれ存在する（図１を参照のこと）。以下の感染性のＴＧＥＶゲノムをコードするｃＤＮＡの配列を完成させるためのストラテジーは、段階的に、ＤＩ−Ｃゲノム中の欠失させられた配列を段階的に取りこむこと、新しく作成された構築物の細菌毒性を分析することであった。この局面は非常に重要である。なぜなら、ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡを提示する組換えプラスミドが一般的にはあまり増殖せず、そして不安定であることが文献において広く記載されているからである（ＢｏｙｅｒおよびＨａｅｎｎｉ、１９９４；Ｒｉｃｅら、１９８９；Ｍａｎｄｌら、１９９７）。
【０１１３】
完成させられる第１の欠失は、ＯＲＦ  １ｂの１ｋｂの欠失Δ２であり、これによって安定な組換えプラスミドを生じた。ＯＲＦ  １ａを欠失している配列が、ｃＤＮＡフラグメントＡ、Ｂ、Ｃ，およびＤ（図１）を、レプリカーゼの遺伝子について必要とされる全ての情報が完成させられるそのような方法によって、クローニングすることによって導入された（Ａｌｍａｚａｎら、２０００）。得られた組換えプラスミドは、細菌中では不安定であり、これによって、フラグメントＢ中に取りこまれた付加および欠失を有する新しいプラスミドを作成した（Ａｌｍａｚａｎら、２０００）。興味深いことに、ヌクレオチド４，４１７から９，６１５の間を含むゲノムの領域を含む５，１９８ｂｐのＣｌａＩ−ＣｌａＩ制限酵素切断断片の排除（Ｐｅｎｚｅｓら、１９９９）によって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ株中で比較的安定なプラスミドを生じた。後者は、欠失Δ３の配列が、ＴＧＥＶゲのゲノムの３’末端の構造または非構造タンパク質についての全ての遺伝子情報をクローニングすることによって付加した（図１）。
【０１１４】
ＴＧＥＶ  ｃＤＮＡの安定性を増大させる目的のためには、これがｐＢｅｌ−ｐＢＡＣ１１プラスミド（Ｋｉｍら、１９９２）を使用してＢＡＣ中にサブクローン化されると決定した（図２を参照のこと）。ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１プラスミドを、Ｈ．ＳｈｉｚｕｙａおよびＭ．ｓｉｍｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から懇意によって譲りうけた。７，５０７ｂｐの大きさのプラスミドは、ｐａｒＢ、ｐａｒＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉＳ）に由来するＦ因子の複製起点、および１個の細胞あたり単一のプラスミドコピーを維持するために必要な遺伝子（ｐａｒＡおよびｒｅｐＥ）を含む。プラスミドはまた、選択マーカーとしてクロラムフェニコールに対する耐性の遺伝子（ｃａｔ）を示す。ｃＤＮＡを、このプロモーターを使用して得られる高いレベルの発現（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、１９９６）、そしてＲＧＥＶコロナウイルスによって発現されるＲＮＡに由来する大きな欠損ゲノム（９．７ｋｂおよび１５ｋｂ）が、それらが合成される核から細胞質へのそれらの輸送の間にスプライシングを受けないことを示す本発明者らの研究室で得られた以前の結果（Ｉｚｅｔａら、１９９９；Ｐｅｎｚｅｓら、１９９９；Ａｌｍａｚａｎら、２０００）に起因して、ＣＭＶのＩＥプロモーターの制御下にクローン化された。作成されたＴＧＥＶ  ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩ）は、５，１９８ｂｐのＣｌａＩフラグメントを除くレプリカーゼの遺伝子についての情報、および構造および非構造タンパク質の全ての情報を含んだ。ｃＤＮＡの３’末端には、２４ヌクレオチドのポリＡ配列、ＨＤＶのリボザイム、およびＢＧＨの転写終結配列が隣接している（Ｉｚｅｔａら、１９９９）。一方、ＴＧＥＶの完全なゲノムを作成するために必要なＣｌａＩフラグメントを、ＢＡＣ中にクローン化し、それによってプラスミドｐＢＡＣ−Ｂ＋Ｃ＋Ｄ５’を作成した。これは、４，３１０から９，７５８の間のＴＧＥＶゲノムの領域を含んだ（図３を参照のこと）。両方のプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株中で増殖させ、そしてそれらの全体を配列決定した。得れらた配列は、ヌクレオチド６，７５２（Ａ→Ｇ、サイレント）および１８，９９７（Ｔ→Ｃ、サイレント）の位置での２つの置換、ならびに単離物Ｃ１１のＤ遺伝子によって置換されているＰＲＵ４６−ＭＡＤのＳ遺伝子中での変化を除いて、本明細書の最後に提供するＴＧＥＶのＰＲＵ４６−ＭＡＤ単離物（配列番号１）のコンセント配列と同一であった（これらの変化は、図４に示される）。
【０１１５】
さらに、感染性のＴＧＥＶをコードするｃＤＮＡを作成する目的のために、ＰＵＲ４６−ＭＡＤのＳ遺伝子（これは、呼吸管で高いレベル（＞１０６ＰＦＵ／ｇ組織）で、そして胃腸管中で低いレベル（＜１０３ＰＦＵ／ｍＬ）で複製する）を、ＴＧＥＶクローンＣ１１（従って、Ｃ１１）のＳ遺伝子によって完全に置き換えた。これは、呼吸管（＞１０６ＰＦＵ／ｇ組織）および胃腸管（＜１０６ＰＦＵ／ｍＬ）の両方で上昇した力価で複製する（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）。Ｃ１１のＳ遺伝子は、ＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物のＳｉｄｅｎｎｓｉとは異なる１４個のヌクレオチドを示し、そしてＳ遺伝子の５’末端で６ｎｔの挿入を示す（図４を参照のこと）（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）。本発明者らの研究室での以前の結果（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）は、指向された組換えによって作成された変異体（ＴＧＥＶのＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物のＳ遺伝子がＣ１１腸内単離物のＳ遺伝子で置き換えられた）が、感染したブタの胃腸管中でわずかに複製するかまたは全く複製しないＴＧＥＶの天然のＰＲＵ４６‐ＭＡＤ単離物とは異なる、腸内向性および増大した感染性を獲得したことを示した。
【０１１６】
ｃＤＮＡを、完全なＴＧＥＶゲノムをコードするｃＤＮＡを含むｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドを作成するために、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩプラスミド中に、ｐＢＡＣ−Ｂ＋Ｃ＋Ｄ５’から得た５，１９８ｂｐのＣｌａＩ−ＣｌａＩフラグメントのクローニングの手段によって、腸内単離物Ｃ１１のＳ遺伝子を用いてＴＧＥＶのＰＵＲ４６‐ＭＡＤ単離物から構築した（図３）。
【０１１７】
感染性のｃＤＮＡ（ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩおよびｐＢＡＣ−ＣｌａＩＺ）、ならびに、完全なｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬ）のクローンの構築に使用したプラスミドの細菌中での安定性を、１６０の世代についてＥ．ｃｏｌｉ中での増殖の後で分析した。安定性を、精製したＤＮＡの制限酵素での消化の手段によって分析した。欠失または挿入は検出されなかったが、使用した分析技術によっては検出されない主要ではない変化の存在は、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩおよびｐＢＡＣ−Ｂ＋Ｃ＋Ｄ５’プラスミドの場合においては除外することができなかた。ｐＢＡＣ‐ＴｃＤＮＡプラスミド（これは、完全なＴＧＥＶのゲノムを含む）の場合においては、一定の不安定性が、４０の世代の後で検出された（この時点で、ＤＮＡの約８０％が、正確な制限パターンを示した）。しかし、このわずかな不安定性は、感染性のウイルスのレスキューについての障害は示さない。なぜなら、２０世代（４Ｌの培養物）の細菌の増殖が、ウイルスレスキューがされることを可能にするプラスミドＤＮＡの量を作成するためには充分であるからである。
【０１１８】
１．２  完全なゲノムをコードするｃＤＮＡに由来する感染性のＴＧＥＶのレスキュー
ＳＴ細胞を、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、培養物の上清を回収し、そして６回、ＳＴ細胞に継代させた（図５を参照のこと）。継代２で開始して、感染の１４時間で、細胞変性効果が現れ、これは感染後２０時間まで延長され、実際にこれらの細胞の全てが単層を形成するまで、延長された（図６を参照のこと）。一方、レスキューされたウイルスの力価は、継代とともに迅速に増大し、継代３で１０８ＰＦＵ／ｍＬの桁の値に到達する。実験を、５回繰り返し、そしてその全ての場合において、同様の力価を有する感染性のウイルスを回収したが、それにもかかわらず、トランスフェクトしていないＳＴ細胞または同様のプラスミド（ここでは、ＣｌａＩ−ＣｌａＩフラグメントが反対の方向で見られた）でトランスフェクトしたＳＴ細胞の場合には、ウイルスは全く回収されなかった。
【０１１９】
得られたウイルスが混入の産物である可能性を排除する目的のために、６，７５２および１８，９９７の位置での配列を、鋳型としてレスキューされたウイルスのゲノムＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅したｃＤＮＡフラグメントの配列決定の手段によって、決定した。配列に分析によって、６，７５２および１８，９９７の位置のヌクレオチドがｃＤＮＡ中に存在するものであることを決定した。さらに、レスキューされたウイルスは、Ｃ１１のＳ遺伝子について予想されるように、Ｓ遺伝子のｃＤＮＡ配列中に、２０，９９０の位置で制限部位ＤｒａＩＩＩを示した（図８）。これらの３個のゲノムマーカーの存在によって、単離したウイルスがｃＤＮＡから来たことを確認した。
【０１２０】
作成されたウイルスのさらに深い特徴付けにおいて、比較分析を、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドでのトランスフェクションの後に回収したウイルス（ＴｃＤＮＡ）で感染させた細胞、またはＴＧＥＶのＰＲＵ４６‐ＭＡＤ単離物で感染させた細胞の免疫蛍光によって行った。これについては、Ｃ１１単離物およびＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物の両方を認識する特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体、または後者のみを（図６Ａ．Ｃ３を参照のこと）、そしてＴｃＤＮＡおよびＰＵＲ４６−ＭＡＤの両方を認識するＭ（３Ｂ．Ｂ３）およびＮ（３Ｂ．Ｄ８）タンパク質の特異的なモノクローナル抗体を、使用した。得られたデータは、作成したウイルスが、ＰＵＲ４６−ＭＡＤのＭおよびＮタンパク質を提示し、そしてもともとのｃＤＮＡにおいて設計されたような、Ｃ１１単離物のＳタンパク質を提示したことを示した。
【０１２１】
１．３  インビボでの感染性および伝染性
ＴｃＤＮＡウイルスのインビボでの感染性を分析する目的のために、５匹の新生児のブタのグループに、継代６に由来するウイルスのクローンを接種し、そして死亡率を分析した。５匹の接種したブタは、接種後３から４日で死亡した。このことは、ＴｃＤＮＡウイルスが感染性であることを示す。対照的に、ウイルスの希釈液のみを接種しそして同じ条件下で維持した２匹のブタは、変化を受けないままであった。
【０１２２】
１．４  転写調節配列の改変による発現のレベルの最適化
コロナウイルス中のＲＮＡ合成を、ＲＮＡ依存性のプロセスの手段によって行った。ここでは、ｍＲＮＡを、負の極性を有する鋳型から転写した。ＴＧＥＶにおいては、保存されたコンセンサス配列であるＣＵＡＡＡＣが見られる。これは、遺伝子の大部分のすぐ前に配置される。これらの配列は、サブゲノムｍＲＮＡの転写のためのシグナルを示す。コロナウイルスにおいては、コロナウイルスのタイプおよび宿主のタイプに依存して変更可能な長さを有する、６から８個の間のｍＲＮＡが存在する。最大のものは、ゲノムＲＮＡに対応し、これは次いで、ＯＲＦ  １ａおよび１ｂのｍＲＮＡとして機能する。ｍＲＮＡの残りは、サブゲノムｍＲＮＡに対応した。これらのＲＮＡを、大きさの増大に伴ってｍＲＮＡ１から７と命名した。一方、最初に記載されたｍＲＮＡのセットが対応するｍＲＮＡの名称とともに命名された後で発見されたいくつかのｍＲＮＡを、ダッシュおよび数字を用いて、例えば、ｍＲＮＡ２−１と命名した。ｍＲＮＡは、ゲノムＲＮＡの構造に関係する両辺共有の（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）構造を示す。最小のｍＲＮＡを除いて、残りは構造的にポリシストロニック（ｐｏｌｙｃｙｓｔｒｏｎｉｃ）であるが、一般的には、５’にもっとも近く配置されたものだけが翻訳される。
【０１２３】
マーカー遺伝子（ＧＵＳ）の発現の効率を、内部（ＩＧ）配列ＣＵＡＡＡＣ（図１１）、ＩＧ配列の３’末端に隣接している種々の配列（図１２）、および種々の挿入部位（図１３）の５’末端に隣接している種々の配列を使用して実験した。得られた結果（図１１から１３）は、最適な発現が、以下からなるＴＲＳを用いて達成されたことを示した：（ｉ）ＴＧＥＶのＮ遺伝子のコンセント配列に隣接している−８８ヌクレオチド；（ｉｉ）ＩＧ配列；および（ｉｉｉ）Ｓ遺伝子のＩＧ配列の３’隣接配列。さらに、異種遺伝子の挿入の点との関係において得られた結果と一致して、最大の発現レベルは、異種遺伝子がゲノムの３’末端に配置された場合に達成された。記載されているようなＴＲＳは、ＧＵＳが１０６個の細胞あたり２から８μｇのレベルで発現されることを可能にする。
【０１２４】
１．５  発現システムの組織特異性
多くの病原体は、粘膜を通じて宿主中に進入する。このタイプの感染を防ぐためには、高レベルの分泌免疫の誘導を可能にする発現システムを開発することが重要である。これは、呼吸管および腸管に関係しているリンパ節中への抗原の投与を通じて、基本的には達成され得る。この目的を達成するために、そして一般的には、目的の組織で遺伝子の発現を指向するために、ＴＧＥＶの向性の分子基準を実験した。これらの実験は、ＴＧＥＶの組織特異性が、所望される向性を有するコロナウイルスのＳ遺伝子を含有している組換えウイルスの構築によって改変され得る（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、１９９７；Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）。この情報によって、呼吸器または腸内向性を有するコロナウイルスのｃＤＮＡゲノムに基づく発現システムを構築することを可能にする。
【０１２５】
１．６  感染性のｃＤＮＡを使用するＰＲＲＳＶのＯＲＦ５によってコードされるウイルス抗原の発現
異種遺伝子の発現のレベルを最適化する目的のために、構築物を、ベクター中にＴＲＳおよび異種遺伝子の交換を促進する配列をクローニングすることによって隣接させられた、内部交換が可能なモジュールのベクターから作成した。ウイルスのヌクレオカプシド（Ｎ）の遺伝子に隣接している−８８ヌクレオチドに先行する最小のＩＧＳコンセンサス配列（ＣＵＡＡＣ）およびＫｏｚａｋ（ＡＣ）ＧＡＣＣのものと同様の配列によって、５’末端で隣接されたＰＲＲＳＶ（ブタの呼吸器および生殖系の症候群ウイルス）は、最適な発現（約１０μｇ／１０６個の細胞）を生じた。原理的には、異種遺伝子のこれらの発現レベルは、免疫応答を誘導するために充分であるものを上回る。異種遺伝子を、重要ではないウイルスの遺伝子３ａおよび３ｂによって以前に占有されていた部位に挿入した。
【０１２６】
１．７  ｃＤＮＡに由来するウイルスベクターを用いて発現させた抗原に対する、ブタ中での免疫応答の誘導
ｃＤＮＡおよび上記のＴＲＳに由来するウイルスベクターの同じタイプを使用して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、高いレベル（ブタの睾丸（ＳＴ）細胞中の１００万個の細胞あたり２０μｇのタンパク質）で発現させた。発現レベルは、細胞培養物中で２０未満の継代について安定であった。さらに、ブタのセットを、生存しているウイルスベクターを用いて免疫した。これを、経口、鼻腔内で、および胃腸管の経路によって投与した。そして強力な体液性の免疫応答を、ウイルスベクターおよびＧＦＰの両方に対して検出した。興味深いことに、副作用は、ウイルスベクターの３回の用量の投与の後には、接種した動物中では観察されなかった。
【０１２７】
１．８  感染性のウイルスの作成を導く外来遺伝子を発現する安全なウイルスベクターの構築
ヒトについてのベクターを設計するためには、生体安全性が最優先事項である。この目的を達成するために、３つのタイプの安全性の保護がベクター中で操作される。これらのうちの２つは、２つのウイルス成分の欠損に基づく。これらは、ウイルスの複製のために不可欠であるウイルスゲノムの種々の位置にマップされる。これらの成分はパッケージング細胞株によってトランスで提供される。この細胞（ベビーハムスター腎臓、ＢＨＫ）は、ウイルスの必須の構造タンパク質（エンベロープＥおよび膜Ｍタンパク質）をコードする欠失ＴＧＥＶ遺伝子を発現する。第３の安全性の保護は、組換えによる感染性のウイルスの回収が妨げられ、それによって異種遺伝子の効率的に発現するが最も近い細胞に対してもなお増殖することを不可能にする、自殺ベクターの生成を導く方法におけるような、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルの再配置である。
【０１２８】
ヒトでの使用のための新しいベクターの設計を用いて、本発明者らは、ヒト種内で増殖させられ得る新しいウイルスを産生することはできない。なぜなら、このベクターは、ヒトにおいて細胞から細胞には伝達され得ないからである。ベクターは、複製欠損ウイルスに基づく。これは、ウイルスの欠損を相補するパッケージング細胞を使用することによってワクチン工場でのみ増殖し得る。これらの安全性の保護は、コロナウイルスの操作における新規の手順を示す。新しい向性を有する組換えウイルスは、ネコの細胞中で少なくとも複製能力がある。なぜなら、これらの細胞は、ブタ、イヌ、およびネコのコロナウイルスを複製するからである。
【０１２９】
微生物の寄託
本発明の感染性のクローンを有するプラスミドを保有しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬと同定した）を、登録番号ＣＥＣＴ  ５２５６のもとで、１９９９年１１月２４日に、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＣＥＣＴ）、Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ）に寄託した。
【０１３０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＴＧＥＶの感染性のＲＮＡをコードするｃＤＮＡクローンの構築を示す。図１Ａは、ＴＧＥＶのゲノム構造を示し、そして遺伝子の名称が、文字と数字で示される（１ａ、１ｂ、Ｓ、３ａ、３ｂ、Ｅ，Ｍ、Ｎ、および７）。図１Ｂは、ｃＤＮＡクローニングストラテジーを示す。こでは、ＤＩ−Ｃゲノムを完成させることからなる。欠失Δ１、Δ２、およびΔ３（これらは、ｃＤＮＡの全長を再度構築するように完成されている）が、示される。ＤＩ−ｃゲノムの構造のの下い配置された数字は、上記のＤＩ−Ｃ中のそれぞれの欠失が隣接しているヌクレオチドを示す。図１Ｃは、Δ１を完成させるために構築された４個のｃＤＮＡフラグメント、および結合の間に使用された重要な制限部位の位置を示す。フラグメントΔ１の挿入によって、ｃＤＮＡの毒性の増大を生じた。
【図２】  図２は、ＴＧＥＶの感染性のｃＤＮＡのクローニングに使用される、ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミド（Ｗａｎｇら、１９９７）の構造を示す。ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミドは、Ｈ．ＳｈｉｚｕｙａおよびＭ．Ｓｉｍｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって提供され、そしてＥ．ｃｏｌｉのＦ因子の複製起点（ｏｒｉＳ）を含む７，５０７塩基対を含む。この遺伝子は、１個の細胞あたりのプラスミドの１つの単一のコピー（ｐａｒＡ、ｐａｒＢ、ｐａｒＣ、およびｒｅｐＥ）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＭｒ）を維持することが不可欠である。Ｔ７およびＳＰ６プロモーター、ならびに特有の制限部位の位置が示される。ＣｏｓＮ：ｐＢＡＣプラスミドの構築を容易にするためのラムダのｃｏｓＮ部位；ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子。プラスミドの作成の間に使用した配列ｌｏｘＰもまた、示される。
【図３】  図３は、ＴＧＥＶ  ｃＤＮＡの構築の間に使用された基本的なプラスミドの構造を示す。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡΔＣｌａＩプラスミドは、５，１９８ｂｐの１つのＣｌａＩ−ＣｌａＩを除く、全てのＴＧＥＶの情報を含む。ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の発現の即時初期（ＩＥ）プロモーター下にクローン化され、そして２４個のＡ残基、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム、ならびにウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結およびポリアデニル化配列が隣接している。ｐＢＡＣ−Ｂ＋ＣＤ５’プラスミドは、ｃＤＮＡが全長であるまでのｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡΔＣｌａＩを完成させるために必要とされるＣｌａＩ−ＣｌａＩフラグメントを含む。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドは、ＴＧＥＶの全長のｃＤＮＡを含む。ＳＡＰ：エビのアルカリホスファターゼ。
【図４】  図４は、ＴＧＥＶ  ＲＵＲ４６−ＭＡＤ（ＭＡＤ）およびＣ１１のクローンのＳ遺伝子のヌクレオチド配列中の差異を示す。数は、それぞれの遺伝子のヌクレオチド１である開始コドンのＡと考えられる、置換されたヌクレオチドの位置を示す。棒の中の文字は、示される位置での対応しているヌクレオチドを示す。棒の下の文字は、示される位置の周辺のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸（ａａ）置換を示す。Δ６ｎｔは、６ヌクレオチドの欠失を示す。矢印は、Ｓ遺伝子の終結コドンの位置を示す。
【図５】  図５は、全長のＴＧＥＶ  ｃＤＮＡに由来する感染性のＴＧＥＶのレスキュに適用されるストラテジーを示す。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドがＳＴ細胞（ブタの睾丸細胞）に対してトランスフェクトされ、そしてトランスフェクションの４８時間後に、上清が、新しいＳＴ細胞を感染させるために使用された。ウイルスが、示される時間に継代された。それぞれの継代で、上清のアリコートおよび細胞性の単層が、ウイルスの滴定およびＲｔ−ＰＣＲアッセイのためのＲＮＡの単離のために、それぞれ回収された。ｖｇＲＮＡ：全長のウイルスＲＮＡ。
【図６】  図６は、トランスフェクトされたＳＴ細胞中のＴＧＥＶ  ｃＤＮＡによって生じる、細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。トランスフェクトされていない（コントロールの）ＳＴ細胞（図６Ａ）中にＣＰＥが存在しないこと、およびＳＴ細胞中でｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでのトランスフェクションの１４および２０時間後に観察されたＣＰＥが、示される（それぞれ、図６Ｂおよび６Ｃ）
【図７】  図７は、継代によるウイルス力価の展開を示す。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでのトランスフェクションの後の種々の継代での、細胞性の単層（１および２）の２つのシリーズの上清中のウイルス力価が、示される。Ｍｏｃｋ１および２は、トランスフェクトされていないＳＴ細胞をいう。ＴｃＤＮＡ１および２は、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでトランスフェクトされたＳＴ細胞をいう。
【図８】  図８は、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでのＳＴ細胞のトランスフェクションの後で回収されたウイルスの配列の分析結果を示す。ＴＧＥＶゲノムの構造が、図の上部に示される。同様に、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドならびにＴＧＥＶクローンＣ８およびＣ１１から回収されたウイルスの間でのヌクレオチドの配列における差異が、示される。ヌクレオチド間での差異の位置が、棒の上部に配置された数字によって示される。ＴｃＤＮＡウイルスおよびクローンＣ１１のｃＤＮＡ配列が、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応）によって得られたフラグメントを配列決定することによって決定された。クローンＣ８の配列は、公表されており（Ｐｅｎｚｅｓら、１９９９）、そしてこれは、本特許の最後に含まれる。制限パターンが、ＴｃＤＮＡおよびＣ８ウイルスのヌクレオチド１８，９９７および２０，９９０を含むＲＴ−ＰＣＲによって得られたフラグメントのＣｌａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて示される。制限パターンは、これらのウイルスのｃＤＮＡ中のＣｌａＩおよびＤｒａＩＩＩ部位の存在または非損じ亜を示す。この分析の結果は、ＴｃＤＮＡウイルスが、Ｃ１１を単離することが期待されるＳ−遺伝子配列を有することを示す。ＭＷＭ：分子量マーカー。
【図９】  図９は、回収されたウイルスのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ウイルスＲＮＡは、細胞性のポリメラーゼｐｏｌＩＩによって認識されるＣＭＶプロモーターの制御下で発現された。原理は、このＲＮＡが細胞質へのその輸送の間にスプライシングを受け得ることである。これが事実であるかどうかを実験するために、スプライシングの高い可能性を有するＲＮＡの部位が、人のＤＮＡの配列中のスプライシング部位を推定するためのプログラムを使用して、決定された（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１．５．９４、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｓｏｌｏｖｙｅｖら、１９９４）。切断の最大の可能性を有する可能性のあるスプライシング部位は、ヌクレオチド７，２４３にドナー部位を、そしてヌクレオチド７，５７０でレシーバー部位を有した（図９Ａ）。このドメインがスプライシングをうけたかどうかを実験するために、ｎｔ７，０７８およびｎｔ７，８０２によって隣接されるＲＴ−ＰＣＲフラグメント（図９Ｂ）が、トランスフェクトされていない培養物の継代０および２のＲＮＡ（コントロール）から、あるいは逆方向のまたは正確な方向の（ＴｃＤＮＡＦＬ）ＣｌａＩフラグメントを有するＴｃＤＮＡでトランスフェクトされたＳＴ細胞から、調製された。得られる結果が、図９Ｃ（継代０）および９Ｄ（継代２）に示される。
【図１０】  図１０は、ＴｃＤＮＡでトランスフェクトされたＳＴ細胞の培養物中で産生されるウイルスの免疫蛍光分析の結果を示す。免疫蛍光のための染色が、ＴＧＥＶ  ＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物について特異的な抗体、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドでのトランスフェクションの後で回収されたウイルスについて特異的な抗体を用いて、行われた。このために、両方の単離物に、またはＰＵＲ４６−ＭＡＤにのみ結合する、ＴＧＥＶ特異的モノクローナル抗体が、使用された（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）。結果によって、ＴｃＤＮＡウイルスが予想される抗原性を有することを確認した。ＴＧＥＶについて特異的なポリクローナル抗血清は、両方のウイルスに結合したが、感染していない培養物には結合せず、そしてＴｃＤＮＡウイルス（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）に結合したＳタンパク質について特異的なモノクローナル抗体（ＩＤ．Ｂ１２および６Ａ．Ｃ３）、Ｍタンパク質について特異的なモノクローナル抗体（３Ｂ．Ｂ３）、ならびにＮタンパク質について特異的なモノクローナル抗体（３Ｂ．Ｄ８）にのみ結合した。
【図１１】  図１１は、インタージェニック（ＩＣ）配列の５’隣接領域が変化する、種々の転写調節配列の下でのＧＵＳの発現を示す。ミニゲノムＭ３９が、ＣＭＶプロモーターの制御下にクローン化された。複数のクローニング配列（ＰＬ１、５’−ＣＣＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＡＡＧＧ−３’；配列番号２）、および選択された転写調節配列（ＴＲＳ）によって形成される転写ユニット、別の複数のクローニング配列（ＰＬ２、５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣ−３’；配列番号３；またはＰＬ３、５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’；配列番号４）、Ｋｏｚａｋ（Ｋｚ）ドメインの構造を有する配列、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ならびに別の複数のクローニング部位（ＰＬ４、５’−ＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣ−３；配列番号５）が、このミニゲノム中に挿入された。これらの配列は、ミニゲノムＭ３９の３’末端、ＨＤＶリボザイム、ならびにＢＧＨの終結配列およびポリアデニル化配列によって３’末端で隣接された。ＴＲＳは、異なる数（０、−３、−８、および−８８）のヌクレオチドをＩＧ配列（ＣＵＡＡＡＣ）注１の５’末端に有し、そして示されるように、Ｎ、Ｓ，またはＭ遺伝子に由来した。ＳＴ細胞が、種々のプラスミドでトランスフェクトされ、相補的なウイルス（ＰＵＲ４６−ＭＡＤ）で感染させられ、そして上清が、６回継代された。感染させられた細胞中でのＧＵＳ活性が、Ｉｚｅｔａ（Ｉｚｅｔａら、１９９９）によって記載されているプロトコールの手段によって決定された。継代された数に対するＧＵＳ活性の関係によって得られた結果が、図１１Ｂにまとめられる。
注１  本特許の目的にとって、ＣＴＡＡＡＣとＣＵＡＡＡＣは同じ意味を有することに注意すべきである。前者はＤＮＡの配列を示し、後者は対応するＲＮＡの配列である。
【図１２】  図１２は、ＩＧ配列の３’−隣接領域において変化する、種々のＴＲＳ下でのＧＵＳの発現を示す（図１１Ａを参照のこと）。ＴＧＥＶのＮ遺伝子の−８８ｎｔに対応しているこの転写ユニットおよびＩＧ配列（ＣＵＡＡＡＣ）を使用して、３’−隣接配列が改変された。これらの配列は、図１２Ａに示されるように、種々のＴＧＥＶ遺伝子のもの（Ｓ、３ａ、３ｂ、Ｅ，Ｍ、Ｎ、および７）に対応した。２つの場合においては、３’配列は、制限部位（ＳａｌＩ）および最適なＫｏｚａｋ配列（Ｋｚ）を含む他のものによって、またはウイルスのゲノムのリーダーに続いて配置された第１のＩＧ配列に続くものと同一の配列によって、置き換えられた。感染させられた細胞中でのＧＵＳ活性が、上記のプロトコールの手段によって決定された（Ｉｚｅｔａら、１９９９）。ｃＬ１２は、ＴＧＥＶゲノムの「リーダー」配列の３’末端のものと同一である１２個のヌクレオチドの配列を示す（最後に示されるウイルス配列を参照のこと）。継代された回数に対するＧＵＳの発現の関係によって得られた結果が、図１２Ｂにまとめられる。
【図１３】  図１３は、ＧＵＳの発現のレベルを上回る、ミニ遺伝子の発現におけるモジュールの挿入の部位の効果を示す。ＩＧ配列（ＣＵＡＡＣ）の５’末端に隣接しているＮ遺伝子の−８８ｎｔを含有している、ＧＵＳ転写ユニット、および３’末端に隣接しているＫｚ配列（図１２Ａを参照のこと）が、全てのこれらの部位が異種遺伝子の発現のために等しく許容性であるかどうかを決定するために、ミニゲノムＭ３９中の４個の単一の制限部位に挿入された（図１３Ａを参照のこと）。ＳＴ細胞が、これらのプラスミドでトランスフェクトされ、そして相補性ウイルス（ＰＵＲ４６−ＭＡＤ）で感染させられた。感染させられた細胞中のＧＵＳ活性が、上記に記載されるプロトコール（Ｉｚｅｔａら）に従って、継代０（Ｐ０）で決定された。得られた結果が、図１３Ｂにまとめられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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