(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト樹状細胞に感染する単離されたアルファウイルスであって、該アルファウイルスが野生型シンドビスウイルスに比較して、Ｅ２糖タンパク質の残基１６０でＧｌｕからＧｌｙへのアミノ酸置換を有し、但し、該アルファウイルスがＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６ではない、単離されたアルファウイルス。
【請求項２】
前記アルファウイルスが、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６４３である、請求項１に記載の単離されたアルファウイルス。
【請求項３】
請求項１に記載のアルファウイルスをコードする核酸分子を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
アルファウイルスをコードする前記核酸分子が図２Ｂに示される、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
アルファウイルス構造タンパク質発現カセットであって、請求項１から２のいずれか一項に記載のアルファウイルス由来のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセット。
【請求項６】
アルファウイルス構造タンパク質発現カセットであって、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで該核酸配列が糖タンパク質Ｅ２をコードする配列を含み、そしてここで該配列が、野生型シンドビスウイルスに比較して、Ｅ２糖タンパク質の残基１６０でＧｌｕからＧｌｙへのアミノ酸置換をコードする、発現カセット。
【請求項７】
アルファウイルスパッケージング細胞であって、宿主細胞、および、請求項５または６に記載のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む、パッケージング細胞。
【請求項８】
アルファウイルス産生細胞であって、請求項７に記載のパッケージング細胞、ならびにアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物層状ベクター開始系からなる群から選択されるベクターを含む、産生細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の産生細胞株から産生される粒子を含む、組換えアルファウイルス粒子。
【請求項１０】
請求項７に記載のパッケージング細胞株から産生される粒子を含む、組換えアルファウイルス粒子。
【請求項１１】
ヒト樹状細胞に感染する組換えアルファウイルス粒子であって、該アルファウイルスが野生型シンドビスウイルスに比較して、Ｅ２糖タンパク質の残基１６０でＧｌｕからＧｌｙへのアミノ酸置換を有し、但し、該組換えアルファウイルス粒子が、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６に由来しない、組換えアルファウイルス粒子。
【請求項１２】
異種ヌクレオチド配列を細胞に導入するための組成物であって、請求項９から１１のいずれか一項に記載の組換えアルファウイルス粒子を含有する、組成物。
【請求項１３】
前記異種配列が、タンパク質をコードする配列である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記タンパク質が、病原因子由来の抗原である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌に由来する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗原が、癌細胞に由来する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記タンパク質が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記異種配列がリボザイムまたはアンチセンスである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞がエキソビボで感染される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞がインビボで感染される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞が、樹状細胞を含む細胞の集団である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２２】
前記樹状細胞がヒト樹状細胞である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
アルファウイルスベクター構築物をさらに含む請求項１に記載の単離されたアルファウイルスであって、該アルファウイルスベクター構築物は、（ａ）ｃＤＮＡからインビトロでウイルスＲＮＡの合成を開始させる５’プロモーター、（ｂ）アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させる５’配列、（ｃ）４つのアルファウイルス非構造タンパク質の全てを作動可能にコードする核酸分子、（ｄ）アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列；および（ｅ）３’ポリアデニル化領域を含み、ここで該４つのアルファウイルス非構造タンパク質の全てを作動可能にコードする核酸配列が、野生型に比較して、ｎｓＰ１の残基３４６、４４１、４７３、ｎｓＰ２の残基４３８、６２２、６３４、７１５、ｎｓＰ３の残基４１７、４５６、５０５、およびｎｓＰ４の残基２６６における変異からなる群から選択される、少なくとも１つの非構造タンパク質における変異を含む、アルファウイルス。
【請求項２４】
真核生物層状ベクター開始系をさらに含む請求項１に記載の単離されたアルファウイルスであって、該真核生物層状ベクター開始系は、ｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成をインビボで開始させ得る５’プロモーター、該５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始させる配列、４つのアルファウイルス非構造タンパク質の全てを作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化領域を含み、ここで該４つのアルファウイルス非構造タンパク質の全てを作動可能にコードする核酸配列が、野生型に比較して、ｎｓＰ１の残基３４６、４４１、４７３、ｎｓＰ２の残基４３８、６２２、６３４、７１５、ｎｓＰ３の残基４１７、４５６、５０５、およびｎｓＰ４の残基２６６における変異からなる群から選択される、少なくとも１つの非構造タンパク質における変異を含む、アルファウイルス。
【請求項２５】
真核生物系において翻訳をし得るアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンをさらに含む請求項１に記載の単離されたアルファウイルスであって、該アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させる５’配列、４つのアルファウイルス非構造タンパク質の全てを作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化領域を含み、ここで該４つのアルファウイルス非構造タンパク質の全てを作動可能にコードする核酸配列が、野生型に比較して、ｎｓＰ１の残基３４６、４４１、４７３、ｎｓＰ２の残基４３８、６２２、６３４、７１５、ｎｓＰ３の残基４１７、４５６、５０５、およびｎｓＰ４の残基２６６における変異からなる群から選択される、少なくとも１つの非構造タンパク質における変異を含む、アルファウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年３月２２日に出願の米国仮出願第６０／１９１，３６３号；１９９９年８月９日出願の米国仮出願第６０／１４８，４８６号；１９９９年４月１４日出願の米国仮出願第６０／１２９，４９８号の優先権を主張する。これらの全ては、その全体を参考として援用する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、遺伝子に基づくワクチンおよび治療に関し、より詳細には、このようなワクチンおよび治療に使用されるアルファウイルスに基づくベクター系の有効性を増加させる組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
アルファウイルスは、節足動物の骨ウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミー）に遺伝子的、構造的、および立体的に関連するの群を含む。これらのウイルスは、世界中に分布し、そして天然において、蚊を通じて脊椎動物サイクルに存在する。トリ、げっ歯類、ウマ、霊長類、およびヒトは、とりわけ、同定されたあるアルファウイルス脊椎動物保有／宿主である。
【０００４】
２６種の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイを利用してアルファウイルス属に分類される。このアッセイにより、２６種のアルファウイルスを、３種の主な複合体：ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）複合体；セムリキ森林熱（ＳＦ）複合体；および西部ウマ脳脊髄炎（ＷＥＥ）複合体に分類する。さらに、４種の別のウイルス（東部ウマ脳脊髄炎（ＥＥＥ）、バルマハ（Ｂａｒｍａｈ）森林熱、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）およびヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ））は、ＨＩ血清アッセイに基づいて個々の分類に入れられる。
【０００５】
アルファウイルス属のメンバーは、さらに、ヒトの感染の結果として示される臨床学的症状に従って、２つの群の１つに分類される。第１の群は、主に脳炎に関連するアルファウイルス、および第２の群は、主に熱、発疹および多発性関節炎に関連するアルファウイルスである。第１の群に、ＶＥＥおよびＷＥＥ複合体、ならびにＥＥＥが含まれる。一般に、この群の感染は、死を含む永久続発症を生じ得る。第２の群において、ＳＦ複合体は、個々のアルファウイルスセムリキ森林熱、シンドビス、ロス川、チクングニヤ、オニョンニョン、およびマヤロ（Ｍａｙａｒｏ）からなる。重大な伝染病はが報告されているが、この群のウイルスによる感染は、永久続発症でなく、一般に自己抑制式である。
【０００６】
シンドビスウイルスは、ＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーのＡｌｐｈａｖｉｒｕｓ属のプロトタイプメンバーである。その複製ストラテジーは、十分に特徴付けられており、そして他のアルファウイルスのモデルとして役立つ（Ｓｔｒａｕｓｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｒｅｖ．５８：４９１−５６２，１９９４）。シンドビスウイルス（他のアルファウイルスと同様に）の遺伝子は、約１２ｋｂの単鎖であり、キャップされ、そしてポリアデニル化された正方向のＲＮＡ分子である。遺伝子ＲＮＡは、ウイルスコード化カプシドタンパク質シェル内に含まれ、これは、次に、２つのウイルス特異的グリコタンパク質Ｅ１およびＥ２がウイルス粒子表面のスパイクとしての突出する宿主誘導脂質エンベロープによって取り囲まれる。特定のアルファウイルス（例えば、ＳＦ）はまた、さらなるタンパク質Ｅを保持し、これは、Ｅ２前駆体タンパク質ＰＥ２由来の切断産物である。
【０００７】
標的細胞へのウイルス粒子の吸収、細胞質中へウイルス遺伝子ＲＮＡを放出するための浸透、およびヌクレオカプシドの未コート化後に、複製プロセスが、ウイルス遺伝子の５’の２／３から４つの非構造レプリカーゼタンパク質（ｎｓＰ１−ｎｓＰ４）の翻訳によって開始される。４つのｎｓＰｓは、２つのポリタンパク質（ｎｓＰ１２３またはｎｓＰ１２３４）の１つとして翻訳され、そしてｎｓＰ２のＣ−末端ドメインに活性化プロテアーゼによって成熟モノマータンパク質中に転写後にプロセス化される。非構造ポリタンパク質とその誘導体化モノマーユニットの両方は、ＲＮＡ複製プロセスに関与し得、このプロセスは、５’および３’末端、ならびに内部サブゲノム連結領域プロモーターに存在する、保存性ヌクレオチド配列要素（ＣＳＥ）に結合するｎｓＰを含む。
【０００８】
プラス鎖のゲノムＲＮＡは、相補的な全長マイナス鎖ＲＮＡのｎｓＰ触媒合成のためのテンプレートとして作用する。そのマイナス鎖ＲＮＡの合成は、プラス鎖ゲノムＲＮＡの３’末端ＣＳＥへのｎＳＰ複合体の結合により触媒される。次いで、そのマイナス鎖は、さらなるプラス鎖ゲノムＲＮＡならびに豊富なサブゲノムＲＮＡの合成のためのテンプレートとして作用し、これは接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）領域プロモーターで内部的に開始される。さらなるプラス鎖ゲノムＲＮＡの合成が、相補的なマイナス鎖のゲノム長のｍＲＮＡテンプレートの３’末端ＣＳＥにｎｓＰ複合体が結合した後、生じる。マイナス鎖ＲＮＡテンプレートからのサブゲノムＲＮＡの合成が、接合部領域プロモーターから開始される。従って、プラス鎖ゲノムＲＮＡの５’末端および接合部領域ＣＳＥは、マイナス鎖ＲＮＡ相補体へと転写された後にのみ、機能的である（すなわち、５’末端ＣＳＥは、それがゲノムのマイナス鎖相補体の３’末端である場合に、機能的である）。
【０００９】
アルファウイルス構造タンパク質（ｓＰ）は、ゲノムの３’側の３分の１を示すサブゲノムＲＮＡから翻訳され、そしてｎｓＰと同様に、翻訳後プロセシングされて、個々のタンパク質になる（図１を参照のこと）。このサブゲノムｍＲＮＡの翻訳は、構造タンパク質であるキャプシド（Ｃ）糖タンパク質Ｅ２および糖タンパク質Ｅ１、および小胞体への糖タンパク質の挿入のための対応するリーダー配列／シグナル配列（Ｅ３、６ｋ）からなる、単一のポリタンパク質を産生する。この構造遺伝子ポリタンパク質は、ウイルスプロテアーゼ（キャプシドオートプロテアーゼ）および細胞プロテアーゼ（例えば、シグナルペプチダーゼ）の組み合わせにより、天然のタンパク質種へとプロセシングされる。アルファウイルス構造タンパク質は、転写されるサブゲノムｍＲＮＡの豊富さ、ならびにキャプシド遺伝子コード配列中に位置する、そのｍＲＮＡ中の翻訳エンハンサーエレメントの存在に起因して、非常に高レベルで産生される（ＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｖｒｉｏｌ．６８：８１１１〜８１１７、１９９４；Ｓｊｏｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１１２７〜１１３１、１９９４）。すべての構造タンパク質がこのポリタンパク質の一部として、等モル比で合成されるので、この翻訳エンハンサーエレメントは、これら遺伝子各々に対して等しくその効果を発揮する。
【００１０】
アルファウイルス属のいくつかのメンバーは、発現ベクターとし開発されており、例えば、以下が挙げられる：シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２４３：１１８８〜１１９１；Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９〜２６８３、１９９２；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８〜５１９、１９９６）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６〜１３６１、１９９１）、およびベネズエラウマ脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９〜４０１、１９９７）。アルファウイルスに基づく発現ベクターの構築の一般的ストラテジーは、そのウイルス構造タンパク質遺伝子を異種遺伝子で置換し、その非常に活性なサブゲノムＲＮＡプロモーターを介する転写制御を維持している。この構成を有するＲＮＡベクターは、自己増幅性であり、そしてＲＮＡ「レプリコン」と呼ばれ、そしてバクテリオファージを使用してｃＤＮＡからインビトロで合成され得るか（Ｘｉｏｎｇら、同書、；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら、同書；Ｐｕｓｈｋｏら、同書）、または真核生物プロモーターに連結された場合にＤＮＡからインビボで直接生成される（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同書；米国特許第５，８１４，４８２号）。このベクターレプリコンは組換えアルファウイルス粒子中へのパッケージングに必要なアルファウイルス構造タンパク質を発現しないので、これらのタンパク質は、トランスで提供されなければならない。１つのアルファウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス）およびその由来する組換えベクターは、リンパ栄養性でありかつマウス樹状細胞に感染することが示されている（Ｃａｌｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０３１〜３０３８、１９９７；ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４：９１４〜２２、２０００）。しかし、どのアルファウイルスまたはアルファウイルス改変体も、ヒト樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞に感染することは、示されていない。
【００１１】
本発明は、アルファウイルスに基づくベクター系を使用して、増強した免疫応答を生成するための新規な組成物およびそのための方法を開示し、そしてさらに、他の関連する利点を提供する。
【００１２】
（発明の要旨）
手短かに言うと、本発明は、アルファウイルスに基づくベクター系を利用する増強した免疫応答を生成するための、組成物および方法を提供する。本発明の１つの局面において、ヒト樹状細胞に感染する、単離されたアルファウイルスおよび組換えアルファウイルスが提供される（ただし、このアルファウイルスは、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６でないし、またはこのアルファウイルス粒子は、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６から全部が生成されるわけでもない）。別の局面において、非ヒト樹状細胞に感染する、単離されたアルファウイルスおよび組換えアルファウイルス粒子が提供される（ただし、このアルファウイルスはベネズエラウマ脳炎ウイルスでもＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６でないし、またはこの組換えアルファウイルス粒子は、全体が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスからもしくはＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６から由来するわけでもない）。なお別の局面において、ヒトマクロファージに感染する、単離されたアルファウイルスおよび組換えアルファウイルスが提供される。関連する局面において、ヒト抗原提示細胞に感染する、単離されたアルファウイルスおよび組換えアルファウイルスが提供される（ただし、このアルファウイルスは、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６でないし、またはこのアルファウイルス粒子は、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６から全部が生成されるわけでもない）。
【００１３】
上記の特定の実施形態において、そのアルファウイルスまたは組換えアルファウイルス粒子は、野生型と比較して、例えば、残基１５８、１５９、１６０、１６１、または１６２にて、Ｅ２糖タンパク質にてアミノ酸置換を有する。好ましい実施形態において、このアミノ酸置換はＥ２残基１６０にある。他の実施形態において、このアルファウイルスは、Ｅ２糖タンパク質に、アミノ酸欠失または挿入を有する。さらなる実施形態において、このアルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、またはＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６４３である。また、上記のアルファウイルスをコードする（例えば、図２Ｂおよび図２Ｃに提供されるような）核酸分子が提供される。
【００１４】
本発明の他の局面において、上記のアルファウイルス由来の１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むアルファウイルス構造タンパク質発現カセットが、提供される。関連する局面において、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むアルファウイルス構造タンパク質発現カセットもまた提供され、この核酸配列は、糖タンパク質Ｅ２をコードする配列を含み、そしてこの配列はそのＥ２糖タンパク質中に変異（例えば、野生型と比較して、置換、欠失、または挿入）をコードする。種々の実施形態において、その変異は、Ｅ２の残基１５８、１５９、１６０、１６１、または１６２での置換である。好ましい実施形態において、その変異は、そのＥ２糖タンパク質とパッケージされたアルファウイルスまたは組換えアルファ粒子に、ヒト樹状細胞に感染する能力を付与する。関連する局面において、宿主細胞および上記のようなアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含むアルファウイルスパッケージング細胞株、ならびにこのようなパッケージング細胞株および以下：アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物層状（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始系からなる群より選択されるベクターを含むアルファウイルスプロデューサー細胞株が、提供される。さらに、上記のパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株から産生され得る組換えアルファウイルス粒子もまた、提供される。
【００１５】
本発明のなお他の局面において、選択された配列を細胞中に導入する方法が提供され、この方法は、上記の組換えアルファウイルス粒子を細胞中に、その選択された配列がその細胞中に導入されるように、感染させるかまたは導入する工程を包含する。広範な種々の選択された配列が、細胞（単数または複数）へと導入され得、このような配列としては、例えば、タンパク質（例えば、ペプチド、抗原、抗体）配列および非タンパク質配列（例えば、リボザイム）ような、異種配列が挙げられる。さらに、この組換えアルファウイルス粒子は、１つ以上の配列（例えば、免疫エンハンサー、サイトカイン、ケモカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、γインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、関連する機能を有する分子）を発現するように設計され得る。さらに、この組換えアルファウイルス粒子は、エキソビボまたはインビボでの技術を使用して、投与され得る。さらに、特定の実施形態において、この組換えアルファウイルス粒子は、広範な種々の細胞、細胞集団、または組織（例えば、樹状細胞を含む細胞の集団を含む）とともに、利用され得る。なおさらなる実施形態において、この組換えアルファウイルス粒子は、例えば、サイトカインまたはケモカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、γインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ）、他のベクター、またはアジュバントのようなエンハンサーとともに、組成物として導入され得る。
【００１６】
本発明のなおさらなる局面において、以下：（ａ）インビトロでのｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡへの合成を開始する、５’プロモーター、（ｂ）アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する、５’配列、（ｃ）４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする、核酸分子、（ｄ）アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、ならびに（ｅ）３’ポリアデニルレートトラクト、を含むアルファウイルスベクター構築物が提供され、この４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列は、ｎｓＰ１の残基３４６、４４１、４７３、ｎｓｐ２の残基４３８、６２２、６３４、７１５、ｎｓＰ３の残基４１７、４５６、５０５、およびｎｓＰ４の残基２６６における変異からなる群より選択される、少なくとも１つの非構造タンパク質における変異を含む。
【００１７】
本発明のなお別の局面において、真核生物層状ベクター（ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ）開始系が提供され、この系は、ｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成をインビボで開始し得る５’プロモーター、５’プロモーターの後ろにアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレートトラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔｒａｃｔ）を含む。ここで、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列は、野生型と比較して、ｎｓＰ１残基３４６、４４１、４７３、ｎｓＰ２残基４３８、６２２、６３４、７１５、ｎｓＰ３残基４１７、４５６、５０５、およびｎｓＰ４残基２６６における変異からなる群より選択される、少なくとも１つの非構造タンパク質における変異を含む。
【００１８】
さらなる実施形態において、真核生物系において転写を可能にするアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンが提供され、このレプリコンは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニレートトラクトを含む。ここで、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列は、野生型と比較して、ｎｓＰ１残基３４６、４４１、４７３、ｎｓＰ２残基４３８、６２２、６３４、７１５、ｎｓＰ３残基４１７、４５６、５０５、およびｎｓＰ４残基２６６における変異からなる群より選択される、少なくとも１つの非構造タンパク質における変異を含む。
【００１９】
本発明の別の局面において、温血動物における免疫応答を生成するための方法が提供される。この方法は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物または癌細胞由来の抗原をコードする異種配列をさらに含む上記の組換えアルファウイルス粒子のいずれかを温血動物に投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のさらなる局面において、温血動物における免疫応答を生成するための方法が提供される。この方法は、第１の方法（例えば、アルファウイルスベクター粒子、真核生物層状ベクター開始系、ＤＮＡ、タンパク質）により１つ以上の選択された抗原を温血動物に投与する工程、次いで第２の方法（例えば、アルファウイルスベクター粒子、真核生物層状ベクター開始系、ＤＮＡ、タンパク質）により同じかまたは類似の抗原を同じ動物に投与する工程を包含する。ここで、第１の方法または第２の方法またはその両方のいずれかが、アルファウイルスベクター粒子、ＲＮＡベクターレプリコンまたは真核生物層状ベクター開始系からなる群より選択されることを条件として、第１の方法および第２の方法は異なる。種々の実施形態において、免疫応答は、疾患を処置するため、そして／または疾患を予防するため（例えば、ワクチンとして）に生成され得る。
【００２１】
本発明の別の局面において、非リンパ指向性アルファウイルスが提供され、ここで、このアルファウイルスは、樹状細胞に感染し得る（ＤＣ指向性）。１つの実施形態において、樹状細胞は、未成熟樹状細胞（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ８６ｄｉｍ、ＣＤ８３-）である。別の実施形態において、このアルファウイルスは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびロス川ウイルスからなる群より選択される。なお別の実施形態において、このアルファウイルスは、糖タンパク質Ｅ２の残基１６０にコードされたアミノ酸（グルタミン酸ではない）を有するシンドビスウイルスである。さらなる実施形態において、このアルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスまたはシンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託された：ＶＲ−２５２６）ではない。さらなる実施形態において、このアルファウイルスは、図２Ｂに示される核酸配列、すなわち同じアミノ酸配列をコードする遺伝コードの重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を除く核酸配列を有する。本発明の他の局面において、例えば、図２Ｃに開示されるように、非リンパ指向性アルファウイルスがまた提供され、すなわち、同じアミノ酸配列をコードする遺伝コードの重複性を除く核酸配列が提供される。アルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター粒子、および真核生物層状ベクター開始系もまた提供され、この開始系は、上記のアルファウイルスのうちの１つ以上から、少なくとも一部、得られるかまたはこれらに由来する。
【００２２】
本発明の別の局面において、アルファウイルスベクター粒子が提供され、ここで、アルファウイルスベクター粒子は、マウス樹状細胞に感染することに関する有効性より高い感染の有効性（感染した割合）でヒト樹状細胞に感染し得る。１つの実施形態において、アルファウイルスベクター粒子は、マウス樹状細胞に感染する有効性より、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上の有効性でヒト樹状細胞に感染し得る。別の実施形態において、この樹状細胞はヒト未成熟樹状細胞（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ８６ｄｉｍ、ＣＤ８３-）である。なお別の実施形態において、このアルファウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロス川ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスに由来する。なお別の実施形態において、このアルファウイルスベクター粒子は、糖タンパク質Ｅ２の残基１６０にコードされたアミノ酸（グルタミン酸ではない）を有するシンドビスウイルスに由来する。さらなる実施形態において、このアルファウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託された：ＶＲ−２５２６）に由来しない。さらなる実施形態において、このアルファウイルスベクター粒子は、図２Ｂに示される核酸配列、すなわち同じアミノ酸配列をコードする遺伝コードの重複性を除く核酸配列に由来する。アルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ＲＮＡベクターレプリコン、および真核生物層状ベクター開始系もまた提供され、この開始系は、上記のアルファウイルスの１つ以上から、少なくとも一部、得られるかまたはこれらに由来する。
【００２３】
本発明の他の局面において、発現カセットが提供され、この発現カセットは、上記に由来するＤＣ指向性アルファウイルスの全長ｃＤＮＡクローンに作動可能に連結したプロモーター（例えば、インビトロでの使用のためのバクテリオファージプロモーター、またはインビボでの使用のためのＲＮＡ  ｐｏｌＩＩプロモーター）を含み、その結果、全長ｃＤＮＡクローンの転写により、感受生細胞の細胞質に導入された場合に生産的なウイルス感染を開始するＲＮＡを得る。アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡレプリコン、ｃＤＮＡベクター構築物、ＥＬＶＩＳなどもまた提供され、このＥＬＶＩＳは、上記のＤＣ指向性アルファウイルスに由来する。特定の実施形態において、アルファウイルスベクターｃＤＮＡ配列に作動可能に連結された５’プロモーター（バクテリオファージまたはＲＮＡ  ｐｏｌＩＩ）、サブゲノム接合領域プロモーター、発現される異種遺伝子、およびポリアデニレートトラクトを含む。
【００２４】
広範に種々の抗原は、アルファウイルスベースのベクター系から発現され得、これらの抗原としては、例えば、病原性因子（例えば、癌細胞、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物）に由来する抗原またはペプチドが挙げられる。
【００２５】
本発明の他の局面において、インビボまたはインビトロで（例えば、生物学的アッセイにおいて使用するために）ヒト樹状細胞において異種配列を導入および発現する方法が提供され、この方法は、樹状細胞および／または樹状細胞前駆体を含むヒト細胞の集団を、一定時間の間、かつ樹状細胞内でレプリコンにコードされた異種遺伝子の細胞内発現に必要な条件下で、本発明に従う組換えアルファウイルスベクター粒子に感染させる工程を包含する。このアルファウイルスベクター粒子は異種配列を含む。ただし、このアルファウイルスベクター粒子が、シンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託：ＶＲ−２５２６）に完全には由来しないことを条件とする。しかし、このような粒子は、ＣＭＣＣ＃４６３９の一部を含み得る。特定の実施形態において、このアルファウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスまたはロス川ウイルスの少なくとも一部に由来する。
【００２６】
本発明の別の局面において、ヒト樹状細胞において異種配列を導入し、そして発現し、そしてまたこの樹上細胞の活性化および／または成熟を誘導する方法が提供される。この方法は、樹上細胞および／または樹上細胞前駆体を含むヒト細胞の集団を、一定時間の間、かつレプリコンにコードされた異種遺伝子の細胞内発現ならびに樹上細胞の活性化および／または成熟に必要な条件下で、本発明に従う組み換えアルファウイルスベクター粒子に感染させる工程を包含し、このアルファウイルスベクター粒子は、異種配列を含む。ベクターレプリコン（以下でより詳細に記載される）および粒子形成のために必要な構造タンパク質を含有するアルファウイルスベクター粒子もまた提供される。ただし、ベクター粒子の少なくとも１つの構造タンパク質はＤＣ指向性アルファウイルス由来であり、そしてこのアルファウイルスベクター粒子はシンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託：ＶＲ−２５２６；しかしこのような粒子は、ＣＭＣＣ＃４６３９の一部を含み得る）に完全には由来しないことを条件とする。特定の好ましい実施形態において、このベクターレプリコンは、病原性因子に由来する抗原をコードする遺伝子をさらに含む。
【００２７】
本発明の他の局面において、樹状細胞に異種配列を導入し、発現させる方法が提供され、この方法は、樹状細胞および／または樹状細胞前駆体を含む細胞集団を組換えαウイルスベクター粒子で感染させる工程を包含し、αウイルスベクター粒子は、異種配列を含み、但し、このαウイルスベクター粒子は、必ずしもベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスまたはシンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託された：ＶＲ−２５２６（しかし、このような粒子は、ＶＥＥまたはＣＭＣＣ＃４６３９の部分を含み得る））から誘導されるわけではない。特定の実施形態において、αウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）またはロス川ウイルスの少なくとも１つの部分由来である。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、樹状細胞は、未熟樹状細胞である。本発明の別の実施形態において、樹状細胞に異種配列を導入し、発現させる上記の方法は、インビトロで実施される。そのような樹状細胞は、アフェレーシスもしくは他の手段によって末梢血から除去され得るか、および／あるいは骨髄または培養造血細胞および／または拡大された造血細胞または分化された造血細胞から、分離されるかまたは富化される（例えば、米国特許第４，９２７，７５０号、同第５，６４３，７８６号、同第５，６４６，００４号、同第５，６４８，２１９号、同第５，６４８，２４８号、同第５，６６３，０５１号、同第５，７８８，９６３号、同第５，８１１，２９７号、同第５，８５１，７５６号、同第５，８６６，１１５号および同第５，８７１，７２８号を参照のこと；実施例もまた参照のこと）。本発明のさらに別の実施形態において、樹状細胞で異種配列を導入し発現させる方法は、温血動物のインビボで実施される（例えば、皮下注射、皮内注射、筋内注射、鼻腔内注射、静脈内注射によって）。
【００２９】
本発明の他の局面において、インビボもしくはインビトロで（例えば、生物学的アッセイにおける使用のために）ヒトマクロファージまたは抗原提示細胞に異種配列を導入し発現する方法が、提供され、この方法は、ヒトマクロファージまたは抗原提示細胞を含む細胞集団を本発明に従う組換えαウイルスベクター粒子を用いて、樹状細胞での異種遺伝子をコードするレプリコンの細胞内発現に必要な時間および条件下で感染させる工程を含み、上記αウイルスベクター粒子は、異種配列を含み、但し、上記のαウイルスベクター粒子は、必ずしもシンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託された：ＶＲ−２５２６（しかし、このような粒子は、ＣＭＣＣ＃４６３９の部分を含み得る））から誘導されるわけではない。特定の実施形態において、αウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスまたはロス川ウイルスの少なくとも１つの部分由来である。
【００３０】
他の局面において、温血動物内で免疫応答を刺激するための方法が提供され、この方法は、樹状細胞に感染し、そして病原性因子から抗原またはその部分を発現する本明細書中に記載のαウイルスベクター粒子を、温血動物に投与する一般的な工程を包含する。１つの実施形態において、αウイルスベクター粒子は、必ずしもベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスまたはシンドビスウイルスＣＭＣＣ＃４６３９（１９９６年４月２日にＡＴＣＣに寄託された：ＶＲ−２５２６（しかし、このような粒子は、ＶＥＥまたはＣＭＣＣ＃４６３９の部分を含み得る））から誘導されるわけではない。特定の実施形態において、αウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスまたはロス川ウイルスの少なくとも１つの部分由来である。
【００３１】
他の局面において、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法が提供され、この方法は、病原性因子から抗原を発現する本明細書中に記載されるαウイルスベクター粒子と樹状細胞を感染させる工程を包含し、そしてＴ細胞が抗原特異的様式で刺激されるようにＴ細胞に対して樹上細胞による上記抗原の提示を可能にする。
【００３２】
本発明のさらなる局面において、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質遺伝子をコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、上記核酸分子は、コドン１６０において野生型グルタミン酸に対するアミノ酸置換または欠失を有し、但し、この糖タンパク質遺伝子は、ＶＥＥまたはＣＭＣＣ＃４６３９から得られない。１つの実施形態において、グリシン残基は、コドン１６０で置換される。さらに、そのような核酸分子を含む構造タンパク質発現カセットおよび上記のＥ２構造タンパク質を含むαウイルスベクター粒子が提供される。
【００３３】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図を参照することによって明確になる。さらに、種々の参考文献が本明細書中に示され、これらは、特定の手順および組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載し、それゆえその全体が参考として援用される。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明を説明する前に、本明細書中で以後使用される特定の用語の定義を最初に説明することは、本発明の理解の助けとなり得る。
【００３５】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていないか、または、ウイルスの場合においては、野生型ウイルスのゲノム中に含まれていない核酸分子である。単離された核酸分子の例は、化学合成された核酸分子、または組換え（例えば、ＰＣＲ）技術によって産生された核酸分子である。
【００３６】
「ゲノムＲＮＡ」とは、標的細胞中で、インビボのそれ自体の増幅または自己複製を指向するのに必要とされる遺伝情報のすべてを含むＲＮＡをいう。アルファウイルス由来のゲノムＲＮＡ分子は、以下の順番のエレメントを含むはずである：複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス性または欠損干渉ＲＮＡ配列（これは、発現された場合、生物学的に活性なアルファウイルスの非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする）、複製についてシスで必要とされる３’ウイルス配列、およびポリアデニル酸トラクト。アルファウイルス由来のゲノムＲＮＡベクターレプリコンもまた、ウイルスサブゲノム「接続領域」プロモーターおよび、発現された場合、生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列を含み得る。一般的に、用語ゲノムＲＮＡは、正の極性の分子、すなわち、「メッセージ」センスであり、そして、任意の公知の天然に存在するアルファウイルスの長さとは異なる長さであり得る。
【００３７】
「アルファウイルス構築物」とは、目的の遺伝子の配列の発現を指向し得るアセンブリをいう。このようなベクター構築物は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（背景技術において５’ＣＳＥともいわれる）、ならびに、発現された場合、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景技術において３’ＣＳＥともいわれる）、およびポリアデニル酸トラクトをコードする配列からなる。さらに、ベクター構築物は、ウイルスサブゲノム「接続領域」プロモーター、１以上の構造タンパク質遺伝子、またはそれらの一部、生存可能なウイルスの産生を可能にするに十分なサイズである外来性の核酸分子、インビトロまたはインビボでｃＤＮＡからウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、発現される異種配列、および異種配列の挿入のための１以上の制限部位を含み得る。
【００３８】
「アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン」「ＲＮＡベクターレプリコン」および「レプリコン」とは、標的細胞内で、それ自体の増幅またはインビボでの自己複製を方向付け得るＲＮＡ分子をいう。アルファウイルス由来のＲＮＡベクターレプリコンは、以下の順番のエレメントを含むはずである：発現された場合、生物学的に活性なアルファウイルスの非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする、複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列（背景技術において５’ＣＳＥともいわれる）、複製についてシスで必要とされる３’ウイルス配列、複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列（背景技術において３’ＣＳＥともいわれる）、およびポリアデニル酸トラクト。アルファウイルス由来のゲノムＲＮＡベクターレプリコンはまた、ウイルスサブゲノム「接続領域」プロモーター、１以上の構造遺伝子またはその一部由来の配列、生存可能なウイルスの産生を可能にするに十分なサイズである外来性の核酸分子、ならびに発現される異種配列を含み得る。
【００３９】
「組換えアルファウイルス粒子、アルファウイルスベクター粒子」とは、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン様構造単位をいう。一般的に、組換えアルファウイルス粒子は、１以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、組換えアルファウイルス粒子は、宿主細胞由来の脂質二重層（例えば、原形質膜）中に含まれるヌクレオカプシド構造を含む。この原形質膜中に、アルファウイルスによってコードされるエンベロープ糖タンパク質が埋め込まれている。用語「組換え」の使用は、アルファウイルスに言及する場合、分子遺伝子操作によって生成または改変されたアルファウイルス粒子を意味し、そして天然に見出されるような野生型アルファウイルスについては言及していない。しかし、組換えアルファウイルス粒子は、このようなアルファウイルスのすべてまたは一部が組換えアルファウイルス粒子を構築するか、またはさもなくば組換えアルファウイルス粒子を生成するために使用される場合に、天然において見出されるアルファウイルスから誘導され得る。
【００４０】
「アルファウイルスパッケージング細胞株」とは、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、そしてアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物層状ベクター開始系（ｅｕｋｅｒｙｏｔｉｃ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、または組換えアルファウイルス粒子の導入後、組換えアルファウイルス粒子を産生する細胞をいう。親の細胞は、哺乳動物または非哺乳動物起源であり得る。好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換される。
【００４１】
「真核生物層状ベクター開始系」または「ＥＬＶＩＳ」とは、目的の配列または遺伝子の発現を方向付け得るアセンブリをいう。真核生物層状ベクター開始系は、インビボで（すなわち、細胞中で）ｃＤＮＡからＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および真核生物中でそれ自体の複製を方向付け得、そしてまた異種配列を発現し得るウイルスベクター配列を含むべきである。好ましい実施形態において、核酸ベクター配列はアルファウイルス由来の配列であり、そしてアルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（背景技術においては、５’ＣＳＥともいわれる）、ならびに、発現された場合、生物学的に活性なアルファウイルスの非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景技術においては、３’ＣＳＥともいわれる）からなる。さらに、ベクター配列は、ウイルスサブゲノム「接続配列」プロモーター、１以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、最適な増幅を可能にするに十分なサイズである外来性の核酸分子、発現される異種配列、異種配列の挿入のための１以上の制限部位、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。真核生物層状ベクター開始系はまた、スプライシング認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、核輸送シグナル、および転写終結配列を含み得る。
【００４２】
「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して、体液性および／または細胞性抗原特異的応答を起こす１以上のエピトープ（線状、高次構造的、またはその両方）を含む分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に用いられる。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を含むが、３〜４アミノ酸まで小さくても可能である。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７と１５の間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５アミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、その抗原が天然に結合している生物全体から分離し、区別できる抗原）と、殺傷されるか、弱毒化されるか、または不活性化される細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、もしくは他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント、および抗原または抗原決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープ）もまた、本明細書中で使用され得る抗原の定義に入る。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用においてインビボで抗原または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドもまた、本明細書中の抗原の定義に含まれる。
【００４３】
本発明の目的のために、抗原は、以下でより十分に記載されるように、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物、および真菌に由来し得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図し得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、本明細書中に定義しているように、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般的には、保存性置換））を含むタンパク質またはペプチドをいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通してのような意図的なものであり得るか、または抗原を産生する宿主の変異を通してのような偶然によるものであり得る。
【００４４】
抗原または組成物に対する「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいうが、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫応答の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質に付随して存在するペプチド抗原、および細胞表面上で発現するペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊の誘導および促進を補助するか、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞表面上でＭＨＣ分子に結合するペプチド抗原を提示する細胞に対して、その機能を刺激すること、および非特異的エフェクター細胞の活性を集中することを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、および活性化されたＴ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞から誘導される白血球を含む）によって産生される他のそのような分子の産生をいう。
【００４５】
細胞性免疫応答を誘発する組成物およびワクチンは、細胞表面でのＭＨＣ分子と結合する抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。細胞表面免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞に、またはその細胞の近傍に方向付けられる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来の防御を可能にするために産生され得る。
【００４６】
特定の抗原が細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイ、または感作された被験体中で抗原について特異的なＴリンパ球についてアッセイすること）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９−４１９９、１９９３；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９−２３７６、１９９４を参照のこと。細胞媒介免疫応答を測定する最近の方法には、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）：１３６７−１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５、１９９７によって概説される）が含まれる。
【００４７】
従って、本明細書中で使用されるような免疫学的応答は、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／またはサプレッサーＴ細胞の活性化および／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原に特異的に方向付けられたＴ細胞。これらの応答は、感染性を中和するように、および／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するように働き、免疫された宿主に対する防御を提供し得る。このような応答は、当該分野で公知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００４８】
「未成熟樹状細胞」とは、以下に要約される特定の性質を有する細胞の集団をいう。サイトカインによって駆動される培地中と初代組織からの両方で、未成熟樹状細胞を同定するための判断基準には、樹状細胞の形態、運動性、食作用の活性が含まれる。未成熟樹状細胞は、表面ＣＤ１ａ、中程度の表面ＭＨＣの発現、および同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）を発現し、そしてＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ８３についてはネガティブである（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２、２４５−２５２、１９９８）。これらの細胞は、成熟免疫刺激性抗原提示細胞、樹状細胞およびマクロファージの両方に分化する能力を有する。この後者は、ＣＤ１４＋細胞中間体を介して生成される（Ｃｅｌｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０−１６、１９９７）。成熟樹状細胞（ＣＤ８６＋、ＭＨＣ＋およびＣＤ８３＋、ＣＤ１４−）およびマクロファージ（ＣＤ１４＋、ＭＨＣ＋、ｃ−ｆｍｓ＋、ＣＤ８３−）は、プロセスされた抗原を提示して細胞を免疫化し得、従って、専門的（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞（Ｈａｒｔ、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３２４５−３２８７、１９９７）といわれる。
【００４９】
「ヒト樹状細胞に感染する」とは、ヒト樹状細胞に効率よく感染するか、またはヒト樹状細胞に効率よく形質導入する、組換えアルファウイルス粒子またはアルファウイルスをいう。この状況において、形質導入または感染の効率は、組換えアルファウイルス粒子またはアルファウイルスが、宿主細胞の細胞質に、ＲＮＡベクターレプリコンまたはアルファウイルスゲノムを結合させ、浸透させ、そして送達し、それによって、異種配列（例えば、レポーターまたは抗原）のレプリコン媒介発現、または宿主細胞中での構造タンパク質のゲノム媒介発現を可能にする能力をいう。一般的に、組換えアルファウイルス粒子またはアルファウイルスは、１００以下のＭＯＩである同じ種の野生型アルファウイルスに対して、１０、２０、２５、または５０倍で、インビトロで宿主細胞に効率よく形質導入または感染する。あるいは、形質導入または感染の効率は、１００以下のＭＯＩでインビトロで実行した場合に、少なくとも２０、３０、４０、または５０％の細胞である。比較のための野生型アルファウイルス、ならびに対応するレプリコンおよび構造タンパク質発現カセットの構築の際に使用するｃＤＮＡクローンは、以下の刊行物中に参照される全長ウイルスクローンを「使用することによって得られ得る：シンドビスウイルス−Ｒｉｃｅら、１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３８０９−３８１９；セムリキ森林ウイルス−Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４１０７−４１１３；ロス川ウイルス−Ｋｕｈｎら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：４３０−４４１；ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス−Ｄａｖｉｓら、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１：１８９−２０４。
【００５０】
「単離されたアルファウイルス」とは、増殖された細胞から分離されたアルファウイルスをいう。アルファウイルスは、多くの技術（例えば、プラーク精製を含む）によってさらに精製され得る。
【００５１】
上記のように、本発明は、温血動物（例えば、ヒト、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、またはマウス）において免疫応答を生成するに適切な組成物および方法を提供し、この方法は、遺伝子送達ベクター（例えば、アルファウイルスベクター粒子、ＥＬＶＩＳ、ＤＮＡ）またはタンパク質を動物に投与する一般的工程、続いて、第２の遺伝子送達ベクター（例えば、アルファウイルスベクター粒子、ＥＬＶＩＳ、ＤＮＡ）またはタンパク質によって同じまたは類似の抗原を同じ動物に投与する工程を包含し、ここで、第１および第２の方法は異なる。２つの別個の遺伝子送達ベクター（またはベクターおよびタンパク質）を投与することによって、所望の抗原に対する温血動物の免疫応答をブーストし得る。
【００５２】
本発明のさらなる理解のために、（Ａ）アルファウイルスに基づく遺伝子送達ベクターおよびＤＮＡに基づく遺伝子送達ベクターを生成するための方法；および（Ｂ）種々の方法において１つまたは両方を使用する方法が、以下により詳細に記載される。
【００５３】
（Ａ．アルファウイルスに基づく遺伝子送達ベクター、およびＤＮＡに基づく遺伝子送達ベクター）
広範な種々のアルファウイルスに基づく遺伝子送達ベクターは、本明細書中に提供される開示を用いて容易に生成され得る。このようなベクターの代表的な例には、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および組換えアルファウイルス粒子が含まれる。手短に言えば、上記のベクターの調製の際の使用に適切な野生型アルファウイルスをコードする配列は、天然に存在する供給源から、または寄託物（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｕｌａｎｄ）から、容易に得られ得る。さらに、野生型アルファウイルスは、樹状細胞、マクロファージ、または抗原提示細胞を感染させる能力を、本発明のアルファウイルスおよび誘導ベクターと比較するために使用され得る。
【００５４】
適切なαウイルスの代表的な例には、以下が挙げられる：アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカン（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８；以下に記載されるＣＭＣＣ  番号４６４０を参照のこと）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（Ｔｒｉｎｉｔｙ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（Ｕｎａ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）。
【００５５】
αウイルスに基づくベクター系を構築するための適切な方法の代表的な例は、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８０８７ならびに米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号、同第５，８４３，７２３号、および同第５，７８９，２４５号に詳細に記載される。
【００５６】
本発明の１つの局面において、本明細書中に提供される１つ以上のαウイルス構造ポリペプチドをコードする配列を含みそしてこれを作動可能に発現する種々の発現カセットが提供される。一般的に、発現カセットは、以下の３つのカテゴリーの１つに含まれる：１）ＲＮＡ転写のＤＮＡプロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター）であって、構造タンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および転写終結／ポリアデニル化配列に直接的かつ作動可能に連結される、ＲＮＡ転写のＤＮＡプロモーター；２）インビトロまたはインビボで転写されるαウイルス欠損ヘルパーＲＮＡであって、αウイルス複製に対してシスで必要とされる順序付けられたエレメント５’ウイルスまたは不完全干渉ＲＮＡ配列（背景において、５’ＣＳＥとも呼ばれる）、ウイルスサブゲノム結合領域プロモーター、本発明のαウイルス構造タンパク質配列、複製に対してシスで必要とされる３’αウイルス配列（背景において、３’ＣＳＥとも呼ばれる）、およびポリアデニル化トラクトを含む、αウイルス欠損ヘルパーＲＮＡ；ならびに３）ＲＮＡ転写のＤＮＡプロモーターの順序付けられたエレメントを含むＤＮＡカセットであって、真核生物細胞内で機能（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター）し、αウイルス複製に対してシスに必要な５’ウイルスまたは不完全干渉ＲＮＡ配列、ウイルスサブゲノム結合領域プロモーター、本発明のαウイルス構造タンパク質配列、複製に対してシスで必要とされる３’αウイルス配列、ポリアデニル化トラクト、および転写終結／ポリアデニル化配列に作動可能に連結される、ＤＮＡカセット。好ましい実施形態において、本発明の構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコン自身またはいくつかの他の提供される刺激によって誘導後にのみカセットによって高レベルで合成される。さらなる実施形態において、構造タンパク質発現カセットは、すべてのαウイルス非構造タンパク質を発現するわけではない。
【００５７】
本発明のさらなる局面において、αウイルスパッケージング細胞株が提供される。特に、本発明の１つの局面において、ウイルス構造タンパク質が、１つ以上の安定に形質転換された発現カセットからトランスに供給され、そして細胞質において、トランスフェクトされるか、形質導入されるか、または細胞内で産生されるαウイルスベクターＲＮＡ転写物をキャプシドに包み得、血漿膜によって機能的にパッケージされたベクター粒子を放出し得るαウイルスパッケージング細胞株が提供される。好ましい実施形態において、パッケージングに必要な構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコン自身またはいくつかの他の提供される刺激による導入の後にのみ高レベルで合成され、そしてこれらの構造タンパク質をコードする転写物は、天然のウイルス感染の発現をまねるのに十分なレベルの発現を可能にする様式で細胞質増幅を可能にする（ＷＯ９７／３８０８７および米国特許第５，７８９，２４５号）。他の実施形態において、構造タンパク質は、αウイルスパッケージング細胞株における使用の前に特異的に改変され得る（例えば、ＶＥＥキャプシドタンパク質の核局在化シグナルをコードする配列が、この機能を妨げるために部位指向変異原性によって変化され得る）。さらに、他の実施形態において、選択マーカーの発現は、構造タンパク質発現カセットに作動可能に連結される。このような連結された選択マーカーは、安定なパッケージング細胞株の効率的な生成を可能にする。
【００５８】
本発明によって提供されるように、組換えαウイルスベクター粒子の生成（パッケージング）のための方法が提供され、そして例えば、インビトロで転写されたＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡとして欠失ヘルパー（ＤＨ）分子および相補的ベクターの同時トランスフェクションによって、あるいはウイルスを用いた同時感染によって容易に達成され得る（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１、１９８９、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６７３９−６４４６、１９９３、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９、１９９６および米国特許第５，８１４，４８２号、同第５，７３９，０２６号、同第５，７６６，６０２号、同第５，７８９，２４５号および同第５，７９２，４６２号）。あるいは、ベクター粒子は、ベクターＲＮＡの安定なαウイルスパッケージング細胞株つまり「ＰＣＬ」への導入によって生成され得る（Ｐｏｌｏら、ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−４６０３；米国特許第５，７８９，２４５号）。手短には、このようなＰＣＬおよびそれらの安定に形質転換された構造タンパク質発現カセットは、米国特許第５，７８９，２４５号に記載される方法を使用して、または本発明に記載される新規な方法を使用して誘導され得る。例えば、ＰＣＬによる組換えαウイルスベクター粒子の産生は、αウイルスベースのベクター分子のＰＣＬへの導入（このベクターは、インビトロで転写されるＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または以前に得られた組換えαウイルス粒子から誘導される）に続き、ＰＣＬをベクター粒子パッケージングに必要な条件および時間の間インキュベートし、そしてパッケージングされたベクター粒子の収穫によって達成され得る。パッケージング細胞株は、感染の高いまたは低い多様性に従ってαウイルスベクター粒子の一連の増殖のために使用され得る。
【００５９】
上記ウイルスベースのベクターに加えて、多数の非ウイルス遺伝子送達ビヒクルは、同様に本発明の文脈内で使用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルの代表的な例には、核酸発現ベクターまたは裸のＤＮＡのみの直接送達が挙げられる（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号および同第５，５８０，８５９号を参照のこと）。
【００６０】
（Ｂ．遺伝子治療ベクターの使用）
上記のように、本発明の１つの局面において、免疫応答をプライムし、そして追加免疫するために、１つ以上の遺伝子送達ベクター（例えば、αウイルスベクター）および／または組換えタンパク質を使用して免疫応答を生成または増加させるための方法が提供される。このような疾患標的の代表的な例には、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ  Ｉ、ＨＴＬＶ  ＩＩ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＲＳウイルス、ＨＰＶのようなウイルス感染、ならびに癌抗原（例えば、メラノーマ）が挙げられる。より詳細には、本発明の１つの局面において、病原因子に対する免疫応答を（体液性または細胞媒介のいずれかで）刺激するための組成物および方法が提供され、その結果、病原因子が殺されるかまたは阻害されるかのいずれかである。病原因子の代表的な例には、細菌、真菌、寄生生物、ウイルスおよび癌細胞が挙げられる。
【００６１】
このアプローチは、他のものとは別の利点を提示する。なぜなら、発現される抗原性エピトープが、αウイルスベクターへの抗原に対する遺伝子のサブフラグメントを選択的クローニングし、免疫原性エピトープに対する応答に導く（そうでなければ、免疫優勢エピトープによって影を落とし得る（ｏｖｅｒｓｈａｄｏｗｅｄ））によって変えられ得る。このようなアプローチは、複数のエピトープを有するペプチドの発現に拡張され得、１つ以上のエピトープが、異なるタンパク質から誘導される。さらに、本発明のこの局面は、抗原エピトープおよび遺伝子のサブフラグメントによってコードされる抗原のペプチドフラグメントに指向される細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の効果的な刺激を、細胞内合成およびこれらのペプチドフラグメントのＭＨＣクラスＩ分子との会合によって可能にする。このアプローチは、ＣＴＬ誘導に対する大きな免疫優勢エピトープを位置付ける（ｍａｐ）ために使用され得る。
【００６２】
免疫応答はまた、（必要な場合には適切なＭＨＣ分子の文脈で）目的の抗原を認識する特異的Ｔ細胞レセプターについて、目的の抗原を認識する免疫グロブリンについて、またはＭＨＣの非存在の文脈で、ＣＴＬ応答を提供する２つのハイブリッドについて、遺伝子を適切な免疫細胞（例えばＴのリンパ球）に移入することによって達成され得る。従って、遺伝子送達ビヒクル細胞が、免疫刺激剤、免疫改変剤またはワクチンとして使用され得る。
【００６３】
１つの特に魅力的なアルファウイルスベクターの使用は、ヒトワクチンおよび治療的な適用である。詳細な説明および以下の実施例に記載されるように、本発明は、このようなアルファウイルスに基づく系の効力を、特にワクチンの領域で増加させる組成物および方法を提供する。本発明により例示される１つのアプローチは、アルファウイルスベクターを、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ）に直接標的化することである。アルファウイルス属の多くのメンバーのうちでも、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスは、本来リンパ栄養性であるが、他のメンバーはそうではないことが、公知である（Ｃａｌｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０３１−３０３８、１９９７）。しかし、アルファウイルス群の１つのメンバーであるＶＥＥ（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９１４−９２２）が過去に、そして現在はＳＦＶおよびＳＩＮ（図８）が、マウス樹状細胞を比較的高効率で感染させ得ることもまた、観察されている。不運なことに、アルファウイルスがマウス樹状細胞を効率的に感染させる能力は、このウイルスがヒト樹状細胞（図８）を効率的に感染させる能力の予測とはならず、これは、これらのウイルスを用いるヒト使用のためのワクチンの最適化の目的である。ＶＥＥウイルスが、脳炎の散在性の局地的な流行の原因となる重要なヒト病原体であり、ウイルスに感染した個体において多数の死または永続的な中枢神経系の後遺症を生じさせることもまた、注目されるべきである。従って、ＶＥＥは、ＢＬ−３レベルの封じ込めのもとでの使用のために分類され、このことは、ワクチンベクターとしてのその開発がいくらか疑わしいことを示唆する。
【００６４】
以下に示すように、アルファウイルス（非リンパ栄養性アルファウイルスであると考えられるものを含む（Ｃａｌｅｙら、同書を参照のこと））は、ヒト樹状細胞の効率的な感染のために、改変または適合され得、次いでこれらのゲノムがクローン化され、配列決定され、次いで原因となる遺伝子改変を、ヒト樹状細胞への遺伝子送達のために有用なベクターおよびパッケージングカセットの構築において、使用する。所望のヒト細胞の型または集団を特異的に標的化するための、改変または適合のこの方法は、樹状細胞に限定されないこともまた、注目されるべきである。むしろ、この方法は、初代培養細胞を通して、ウイルスまたはベクターのサイクリングの同じプロセスを使用し、続いてベクターおよびパッケージングカセットをクローニングおよび構築することにより、他の関連する標的細胞型（例えば、癌細胞）まで拡張され得る。本発明はまた、アルファウイルスに基づくベクターのワクチン効力を、プライム−ブーストレジメンを利用することにより、増強するための、さらなるストラテジーを提供し、このストラテジーは、２つの別個の異なる方法を使用して、所望の抗原を投与または発現する工程を包含する。この抗原は、例えば、アルファウイルスベクター粒子、核酸（例えば、ＤＮＡ）または組換えタンパク質から選択され、そして任意の種々の順序で組み合わせられる。ただし、プライムまたはブーストのいずれかあるいは両方が、アルファウイルス由来のベクターである。
【００６５】
本発明のベクターおよび／または組換えタンパク質を、（例えばプライム／ブーストストラテジーにおいて）ワクチンに投与することは、種々の経路により達成され得る。例えば、１つの実施形態においては、温血動物が、所望の抗原に対する免疫応答を刺激する第一の方法（例えば、アルファウイルスベクター粒子、ＥＬＶＩＳ、ＤＮＡ、または組換えタンパク質）によりプライミングされ得る。広範な種々の接種経路が、この点において利用され得、例えば、眼内、鼻腔内、舌下、経口、局所、嚢内、鞘内、鞘膜内、直腸内、局所、静脈内、腹腔内、頭蓋内、筋内、皮内、または皮下が挙げられる。第一方法によるプライミングは、選択される方法の複数の投与を含み得る。プライミングに続いて、同じかまたは実質的に同じである抗原が、所望の抗原に対する免疫応答を刺激する第二の方法（例えば、アルファウイルスベクター粒子、ＥＬＶＩＳ、ＤＮＡ、または組換えタンパク質）により、同じ動物に投与される。プライミング工程と同様に、広範な種々の接種経路が、この点に関して利用され得る（上記列挙を参照のこと）。特定の実施形態においては、ブーストする工程が数回実施され得る。なぜなら、保護的かまたは治療的な免疫応答を生じさせるために最も適するからである。
【００６６】
本発明のなお他の局面において、上記アルファウイルスに基づくベクター系（例えば、アルファウイルスベクター粒子、ＲＮＡベクターレプリコン、真核動物層状ベクター開始系など）を、非ワクチン治療（例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および／または末梢血管疾患（ＰＶＤ）の処置）のために使用し得る。例えば、１つの実施形態において、ＥＬＶＩＳまたは組換えアルファウイルス粒子のような、アルファウイルスに基づくベクターは、ＣＡＤまたはＰＶＤを処置または予防するために、患者に投与され得る。心臓血管適応症（ＣＡＤおよびＰＶＤを含む）においては、ＤＮＡおよび粒子の両方に基づくアルファウイルスベクターを使用して、新脈管形成および／または新生血管形成を刺激する特定の期待物を送達し得る。これらの期待物のうちで、例えば、線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ１、２、４、５、１８）、脈管内皮増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ−２、Ｄ）、内皮一酸化窒素シンテターゼ（例えば、ＮＯＳ）が含まれる。治療効果のためのこれらのベクターの送達は、いくつかの代替の経路により達成され得、例えば、ＰＶＤについては筋内、およびＣＡＤについては歯冠内、心筋内、または脈管周囲が挙げられる。
【００６７】
アジュバントをまた使用して、プライミングまたはブーストのために使用されるワクチン化組成物の効果を増強し得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルジョン処方物（他の特異的な免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）もしくは細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）、例えば、（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙミクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなミクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含むが必要ではない）を含む、ＭＦ５９（国際公開公報ＷＯ９０／１４８３７）、（ｂ）サブミクロンエマルジョンにミクロ流体化されるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じるためにボルテックスされるかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含む、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ  Ａ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM））を含む、ＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント、例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）が使用され得るか、もしくはこれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））が生成され得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）免疫刺激性ＣｐＧモチーフをコードする、オリゴヌクレオチドまたはポリマー分子（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：８７０−８７６、１９９８；Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２−３５４、１９９６）または抗原／オリゴヌクレオチドの複合体。ポリマー分子としては、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにその骨格改変体（例えば、メチルホスホン酸結合）が挙げられる。さらに、このようなポリマー分子には、交互ポリマー骨格構造（例えば、限定されないが、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２０４：３９、１９７０ａ；Ｐｉｔｈａ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９：９６５、１９７０ｂ）およびモルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１４２，０４７号（０８／２５／９２発行）、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１８５，４４４号（０���／０９／９３発行）））が含まれる。他の種々の荷電したポリヌクレオチドアナログおよび荷電していないポリヌクレオチドアナログが、報告されている。多数の骨格改変が当該分野において公知であり、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、およびカルバメート）ならびに荷電した結合（例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）が挙げられるが、これらに限定されない；ならびに（７）ＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物の効果を増強する免疫刺激剤として作用する、他の物質。ａｌｕｍ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、およびＭＦ５９が好ましい。
【００６８】
ポリペプチド抗原をコードする、種々の遺伝子を、本発明の実施において使用し得る。抗原は、広範な種々のウイルス、細菌、真菌、原生動物、および他の寄生生物に由来し得る。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパク質またはペプチド（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２  ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ＶＰ１６およびＶＰ２２）由来のタンパク質；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ  ｇＢおよびｇＨを含む）由来の抗原；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原が挙げられる）に対する免疫応答を刺激するための使用を見出す。（例えば、サイトメガロウイルスの内容をコードするタンパク質の概説については、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）１２５〜１６９頁；種々のＨＳＶ−１にコードされるタンパク質の議論については、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４、１９８８；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２  ｇＢおよびｇＤタンパク質、ならびにこれらをコードする遺伝子の議論については、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定については、Ｂｅａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：２０７−２１１、１９８４；ならびにＶＺＶの概説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【００６９】
さらに、肝炎に関連するウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、およびＧ型肝炎ウイルスが挙げられる）由来の抗原に対する免疫応答もまた、本発明の構築物を使用して、刺激し得る。例によって、ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルス性タンパク質（構造コア、Ｅ１（Ｅとしても公知）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知）タンパク質、ならびに非構造タンパク質（例えば、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）が挙げられる）をコードし、これは、本発明での使用を見出す（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の機論については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：３８１−３８８、１９９１を参照のこと）。ＨＤＶ由来のδ−抗原もまた、使用され得る（例えば、δ−抗原の記載については、米国特許第５，３８９，５２８号を参照のこと）。
【００７０】
同様に、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。具体的には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答の生成のために特に興味深い。インフルエンザＡの多数のＨＡ亜型が、同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９：７５９−７６７、１９９０；Ｗｅｂｓｔｅｒら「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、１２７〜１６８頁：Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７１】
本発明の実施において使用されるために特に興味深い他の抗原としては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来の抗原およびそれから誘導されるポリペプチド（例えば、Ｅ６およびＥ７；ダニ媒介脳炎ウイルス；ならびにＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶなどとしても公知）を含む種々の初期のタンパク質の１つ以上であり、種々の分離菌（ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１SF170、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN、ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4、様々な亜型（例えば、亜型Ａ〜Ｇ、およびＯ）由来の他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および様々な亜型（例えば、ＨＩＶ−２UC1およびＨＩＶ−２UC2）が挙げられるがこれらに限定されない）由来の、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、Ｇａｇおよびｐｏｌのような抗原が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
【００７２】
他のウイルス由来のタンパク質（例えば、特にＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ属（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ属；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ属（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ属；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ属；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ属；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ属；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ属（例えば、狂犬病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ属；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ属（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ属（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスなど）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ属；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ属；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ属（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２）；サル免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）由来のタンパク質）はまた、本明細書中に記載の方法において用途を見出す。これらのウイルスおよび他のウイルスの説明としては、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編  １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編  １９９１；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ，ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと。
【００７３】
特に好ましい細菌抗原は、ジフテリア、破傷風、百日咳、髄膜炎およびその他の病原状態を引き起こす生物由来であり、その細菌抗原としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ、血清型Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷＩ３５（ＭｅｎＡ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷＩ３５）を含むＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｈｉｂ）、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。寄生生物の抗原の例としては、マラリアおよびライム病を引き起こす生物由来の抗原が挙げられる。
【００７４】
さらに、本明細書中に記載の方法は、種々の悪性癌を処置するための手段を提供する。例えば、本発明の系を使用して、問題の癌に特異的な特定のタンパク質に対する体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を増強し得る（例えば、活性化オンコジーン、胎児抗原、または活性化マーカー）。腫瘍抗原としては、特にＭＡＧＥ  １、２、３、４など（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年３月）：８２−８９）を含む種々のＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）のいずれか；種々のチロシナーゼのいずれか；ＭＡＲＴ  １（Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原）；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３；ｐ９７黒色腫抗原；ＣＥＡ（癌胎児抗原）が挙げられる。
【００７５】
（Ｃ．寄託物の情報）
以下の物質は、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された：
【００７６】
【表１】
0004637368.tif 000002
上記の物質は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下でＣｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによってアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。受託番号は、電話番号（３０１）８８１−２６００でＡＴＣＣから入手可能である。
【００７７】
これらの寄託物は、当業者に対する利便性として提供され、そして寄託物が米国特許法§１１２の下で必要とされるという承認はない。これらの寄託物の核酸配列およびこの核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書中に援用され、そしてそこに記載される配列において誤記のある場合には引用されるべきである。ライセンスは、寄託物を作製、使用、または販売するために必要であり得、そしてこのようなライセンスは、ここでは付与されない。
【００７８】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために含まれる。さらに、これらの実施例は、本発明の好ましい実施例を提供し、そして本発明の範囲を限定することを意味しない。以下の実施例において記載された多くの手順のための標準的な方法、あるいは適切な別の手順は、分子生物学の広く認識された説明書（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９０）ならびに米国特許第６，０１５，６８６号、同第５，８１４，４８２号、同第６，０１５，６９４号、同第５，８４２，７２３号、および同第５，７８９，２４５号（これらの各々はその全体が参考とされる））において提供される。
【００７９】
（実施例）
（実施例１）
（初代ヒト樹状細胞に感染するアルファウイルス改変体の選択およびクローニング）
以前に非リンパ刺激（ｎｏｎ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）として特徴付けられたウイルス、または以前にマウス樹状細胞への感染が示されたウイルスを含む、アルファウイルス属のウイルスが、ヒト樹状細胞において効果的に感染および伝播するように改変または適合され得ることを実証するために、シンドビスウイルスを、代表的な例として選択した。その他の類似のアルファウイルス（例えば、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラのウマの脳症ウイルスおよびロス川ウイルス）はまた、本明細書中に提供された開示を用いて当業者が容易に置換し得る。一般的な実験細胞株において非常に限定された数のサイクルのみ伝播された天然に存在するヘテロ遺伝子ウイルス試料を使用して、適合を、図１に概略したように実行した。簡潔には、このウイルスを、２９３細胞およびＢＨＫ−２１細胞における中間プラーク精製を用いて異なる供与体から得られた初代ヒト樹状細胞において４回継代した。
【００８０】
ウイルス継代のために用いた初代ヒト樹状細胞を、以前に記載されたように
末梢血単球から導いた（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９６：１２１，１９９６）。細胞のこの軟膜集団を、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）またはＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で健康な供与体から得た。ＣＤ１４+単球を、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔｓおよびミニＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いて製造業者の説明書に従いネガティブ枯渇（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって単離した。樹状細胞を、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１，０００Ｕ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１，０００Ｕ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地１ｍｌあたり０．６×１０6に培養することによってＣＤ１４+細胞から生成した。サイトカインを含む培養培地を、２日毎に補給した。単球順化培地（ＭＣＭ）を、以前に記載（Ｂｅｎｄｅｒら、同書）のように調製し、そして培養開始から５日目または６日目のいずれかに、未熟ＤＣ培養物に３０％（容量／容量）で添加し、さらに３日間培養して成熟を誘導した。ＭＣＭ処理の際の細胞表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８１】
樹状細胞適応に続いて、プラーク精製したクローン性ウイルス改変体のパネルをヒト一次樹状細胞中で効率的に増殖させて、１０8ＰＦＵ／ｍｌを超えるウイルス力価または１０００感染性ウイルス粒子／細胞を生じ得た。各クローン性改変体は、親ウイルスおよび他の一般的な研究室シンドビスウイルス株と比較して小さなプラークをＢＨＫ−２１細胞およびＶｅｒｏ細胞上に形成した。ＤＣ選択プラーク精製ウイルスの１つを、ｃＤＮＡクローン化のために選択し、そして最後のプラーク精製工程からのアガロースプラグを１ｍｌの培地（１０％  ＦＢＳを有するＭＥＭ）中で４時間、４℃にてインキュベートした。次いで、ウイルス溶出物の１００μｌのアリコートを用いて、１０6個のＢＨＫ−２１細胞を感染させた。ＣＰＥの発達後、培地（５ｍｌ）を収集した。ウイルスストックは、均質な小さなプラークをＢＨＫ−２１細胞およびＶｅｒｏ細胞の両方の上に産生し、そして力価は２×１０8ＰＦＵ／ｍｌであった。ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎと命名されたこの種株（ｓｅｅｄ）ストックからのウイルスを、アメリカンタイプカルチャーコレクションにブダペスト条約の要求に従って寄託した。
【００８２】
さらに、少数の自然の大きなプラーク改変体が、ＢＨＫ−２１細胞およびＶｅｒｏ細胞において散在して観察された。これらの改変体のプラークの大きさは、親ウイルスおよびシンドビスウイルスの他の一般的な研究室株よりも有意に大きかった。他のアルファウイルスと同様に、この大きなプラークウイルス改変体は、ヒト一次樹状細胞に感染する際に非効率的であり、そして非常に低い力価の子孫ウイルス（＜１０5ＰＦＵ／ｍｌ）を産生した。大きなプラーク改変体のうちの１つを、ｃＤＮＡクローン化のために選択し、そして最後のプラーク精製工程からのアガロースプラグを１ｍｌの培地（１０％  ＦＢＳを有するＭＥＭ）中で４時間、４℃にてインキュベートした。次いで、ウイルス溶出物の１００μｌアリコートを用いて、１０6ＢＨＫ−２１細胞に感染させた。ＣＰＥの発達後、この培地（５ｍｌ）を収集した。このウイルスストックは、均質で大きなプラークをＢＨＫ−２１細胞およびＶｅｒｏ細胞の両方で産生した。この種株ストックからのウイルスをＳｉｎＣｈｉｒｏｎＬＰと称した。
【００８３】
約１０7個のＢＨＫ−２１細胞を、樹状細胞適応ウイルス種株ストックまたは大きなプラークウイルス種株ストックのいずれかに１  ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させた。感染２４時間後、ＣＰＥの発達後、総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を製造業者の説明書に従って用いてこの細胞から単離した。精製後、ウイルスＲＮＡをヌクレアーゼを含まない水に溶解させ、アリコートにし、そしてｃＤＮＡクローン化（図２Ａ）でのその後の使用のために−８０℃にて保存した。
【００８４】
ｃＤＮＡの合成を、以下に示すプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅によって達成した（シンドビスヌクレオチドの番号付けを各プライマーについて示した）：
【００８５】
【化１】
0004637368.tif 000003
プライマー対１〜５をこのウイルスの構造遺伝子のクローン化に用い、一方、対６〜１４をこのウイルスの非構造遺伝子について用いた。対１〜５におけるオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩについての制限酵素部位を表すさらなる配列を含んでいた。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩは、シンドビスウイルスのサブゲノムＲＮＡには存在しない。オリゴヌクレオチド６〜１４は、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩについての部位を含んでいた。ＳａｃＩおよびＸｈｏＩは、以前に配列決定されたシンドビスウイルス株のゲノム全体に存在しない（これらの部位に下線を付す）。
【００８６】
各逆転写（ＲＴ）反応を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を製造業者の説明書に従って用いて５０μｌ容量で行った。反応混合物は、１０6個の細胞に等しい量のＲＮＡおよび５０ｐｍｏｌｅの以下に示す各プライマーを含んでいた。
【００８７】
混合物１：プライマー１、３および５、
混合物２：プライマー２および４、
混合物３：プライマー６、９および１２、
混合物４：プライマー８、１１および１４。
【００８８】
ＲＴ反応物を凍結し、次いでＰＣＲ増幅に直接用いた。ＰＣＲ反応を、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を製造業者によって推奨されるように用いて行った。各５０μｌ  ＰＣＲ反応物は、３μｌの上記のＲＴ混合物および５０ｐｍｏｌｅのプライマーを含んでいた。計１４の反応を行った（表１）。
【００８９】
【表２】
0004637368.tif 000004
フラグメント１〜５についてのＰＣＲ反応を、以下の条件を用いて行った：９５℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間および７４℃にて９０秒間を１２サイクル。フラグメント６〜１４について、サイクル数を、１２から１５へと変化させた。各反応混合物の少量のアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析して、予想された大きさのフラグメントの存在を確認した。残りをフェノール−クロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡフラグメントをエタノールを用いて沈澱させた。
【００９０】
クローン化のために、フラグメント１〜５を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、同じ酵素で処理したプラスミドｐＲＳ２（さらなる制限部位をポリリンカー中に有するｐＵＣ１９）と連結した。フラグメント６〜１４をＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてＳａｃＩおよびＸｈｏＩで処理した同じｐＲＳ２プラスミドと連結した。全ての組換え体プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に形質転換した。
【００９１】
さらに、サブゲノムプロモーター領域および３’末端非翻訳領域を示すｃＤＮＡクローンもまた、以下のプライマー対を用いて作製された：
【００９２】
【化２】
0004637368.tif 000005
各形質転換について３つのポジティブコロニーを、アンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）を補充した２×ＹＴ培地４０ｍｌ中で増殖させ、プラスミドをＱＩＡＧＥＮキットを製造業者の説明書に従って用いて精製し、そして挿入物を配列決定した。３つの独立したクローン由来の配列の比較により、各ウイルスのゲノム配列を決定し（図２Ｂおよび図２Ｃ）、そして他のシンドビスウイルス株について公開された配列に対して比較した。各ウイルスについての適切なｃＤＮＡフラグメント（３つの独立したクローンのコンセンサスに基づく）を、対応してｐ１〜ｐ１４と命名した。
【００９３】
配列データは、ＳｉｎＤＣＣｈｉｒｏｎ株（ＤＣ＋としても公知）およびＳｉｎＣｈｉｒｏｎＬＰ株（ＬＰとしても公知）がそのゲノム全体を通して単一のアミノ酸残基のみで異なることを実証した。ヒト樹状細胞（そして特に免疫ヒトＤＣ）の効率的な感染についての決定因子は、Ｅ２糖タンパク質残基残基１６０に位置し、これらの株は、アミノ酸ＧｌｙまたはＧｌｕをそれぞれ含んでいた。それゆえ、Ｅ２  １６０単独でのＧｌｕについてのＧｌｙの置換は、ヒトＤＣ適応表現型を付与することを担う。この部位での、またはこの部位のごく付近でのさらなるアミノ酸の置換、欠失または挿入は、標準的な部位特異的変異誘発プロトコルによって容易に生成され得、そして以下の全長ｃＤＮＡクローン中に挿入された場合、これはまた、同じヒトＤＣ適応増殖特性を生じ得る。
【００９４】
（実施例２：ヒト樹状細胞適応アルファウイルスからの全長ｃＤＮＡクローン、ベクターおよびパッケージングカセットの構築）
ヒト樹状細胞適応アルファウイルス（例えば、ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルス）からの全長ｃＤＮＡクローン、レプリコンベクター、および構造タンパク質発現（パッケージング）カセットの構築は、以下に提供される教示、ならびに米国特許第５，８１４，４８２号、同第５，７８９，２４５号および同第５，８４３，７２３号によって提供された以前の教示を用いて当業者によって容易に達成される。ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルスのクローンからのベクターレプリコン構築を、クローンｐ１〜ｐ１４（実施例１）を以下の通りに用いて達成した。ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーターおよびシンドビスウイルスゲノムＲＮＡの開始部を含むＡｐａＩ−ＭｓｃＩフラグメントを、ＡｐａＩ−ＸｈｏＩ消化したプラスミドｐＲＳ２のクローン化したフラグメント１４のＭｓｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントと連結した。得られるプラスミドをｐ１５と命名した。次いで、ｐ８のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、ｐ７のＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｐ６のＮｓｉＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ消化したｐＲＳ２に連結した。得られるプラスミドをｐ１６と命名した。次いで、ｐ１２のＳａｃＩ−ＭｕｎＩフラグメント、ｐ１１のＭｕｎＩ−ＮｈｅＩフラグメントおよびｐ１０のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ消化したｐＲＳ２プラスミドに連結した。得られたプラスミドをｐ１７と命名した。次いで、ｐ１５のＡｐａＩ−ＡｐａＬＩフラグメントおよびｐ１３のＡｐａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＡｐａＩ−ＸｈｏＩ処理ｐＲＳ２に連結して、ｐ１８と命名したプラスミドを得た。次いで、ｐ１８のＡｐａＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｐ１７のＮｓｉＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＡｐａＩ−ＸｈｏＩ処理ｐＲＳ２中に一緒に連結した。得られたプラスミドをｐ１９と命名した。最後に、ｐ１９のＡｐａＩ−ＡｖｒＩＩフラグメント、ｐ９のＡｖｒＩＩ−ＳａｌＧＩフラグメントおよびｐ１６のＳａｌＧＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ＧＦＰレポーター（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６、および米国特許第５，８４３，７２３号を参照のこと）を発現するＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ処理シンドビスレプリコンベクター中に一緒に連結した。ＧＦＰレポーターを発現する、得られた新に構築したレプリコンベクターを、ＳＩＮＣＲ−ＧＦＰと称した（ＤＣＳＰ６ＳＩＮｇｆｐとしても公知）。
【００９５】
ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルスのクローンからの欠損性ヘルパーベースのパッケージングカセットの構築は、以下の通りに達成され得る。以前に記載されたＤＨ−ＢＢヘルパープラスミド（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６、１９９３）由来のシンドビスウイルスサブゲノムプロモーターおよび５’サブゲノムＮＴＲを含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＩフラグメント、クローンｐ５由来のＳａｃｌＩ−ＮｒｕＩフラグメントおよびｐ４由来のＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２中に一緒にクローン化する。得られるプラスミドをｐ２０と命名する。次いで、クローンｐ３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＨＩフラグメント、クローンｐ２のＢｓｐＨＩ−ＳｐｌＩフラグメントおよびクローンｐ１のＳｐｌＩ−ＮｓｉＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２中にクローン化する。得られるプラスミドをｐ２１と命名する。最後に、ｐ２０のＢａｍＨＩ−Ｂｓｕ３６Ｉフラグメントおよびｐ２１のＢｓｕ３６Ｉ−ＮｓｉＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ消化したＤＨ−ＢＢヘルパープラスミド中にクローン化して、ＤＣＳＰ６ＳＩＮｄｈと命名される最終的なパッケージング構築物を得る。
【００９６】
欠損性ヘルパーベースの構造タンパク質発現カセット（パッケージング構築物）の他の改変体は、容易に構築され得る。これらとしては、「分断された（ｓｐｌｉｔ）」構成でアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を発現するカセット、ならびに安定なパッケージング細胞株の誘導のために用いられるＲＮＡポリメラーゼＩＩベースの構築物（米国特許第５，７８９，２４５号、同第６，０１５，６８６号、同第６，０１５，６９４号、同第５，８４２，７２３号および同第５，８１４，４８２号を参照のこと）が挙げられる。例えば、ＳＰ６ベースの欠損性ヘルパーを、ロス川ウイルス翻訳エンハンサーエレメントを有するシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子のみを含むように構築した。このようなプラスミドの構築を、以下の通りに段階的に行った。
【００９７】
４．４．２由来のＥｃｏＲＩ−Ｂｓｕ３６フラグメントおよび１．３．２由来のＢｓｕ３６−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２中にクローン化した（ｃｌ２０１と称される）。４．４．２由来のＥｃｏＲＩ−Ｂｓｕ３６フラグメントおよび４．３．２由来のＢｓｕ３６−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２中にクローン化した（ｃｌ２０２と称される）。４．２．２由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩフラグメントおよび１．１．２由来のＳｐｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２中にクローン化した（ｃｌ２０３と称される）。ｃｌ２０１由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＨＩフラグメントおよびｃｌ２０３由来のＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２中にクローン化した（ｃｌ２２１と称される）。ｃｌ２０２由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＨＩフラグメントおよびｃｌ２０３由来のＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＲＳ２（ｃｌ２２２）中にクローン化した。ｃｌ２２１のＳｔｕＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｔＲＮＡＢＢ／Ｃｄｅｌ３ｒｒｖ（Ｆｒｏｌｏｖら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２８１９−２８２９）のＢｓｐＨＩ−ＳｔｕＩフラグメントを、ＢｓｐＨＩ−ＮｓｉＩ消化したｔＲＮＡＢＢ／Ｃｄｅｌ３ｒｒｖ（ｃｌ２３１と称される）にクローン化した。ｃｌ２２２のＳｔｕＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｔＲＮＡＢＢ／Ｃｄｅｌ３ｒｒｖのＢｓｐＨＩ−ＳｔｕＩフラグメントを、ＢｓｐＨＩ−ＮｓｉＩ消化したｔＲＮＡＢＢ／Ｃｄｅｌ３ｒｒｖ中にクローン化した（ｃｌ２３２と称される）。
【００９８】
アルファウイルスベクターレプリコンをパッケージングするために用いる場合、糖タンパク質欠損性ヘルパークローン２３２（ｔＲＮＡＢＢ／Ｃｄｅｌ３ｒｒｖＤＣ）は、ヒト樹状細胞（特に、ＤＣの未成熟集団）に効率的に感染するベクター粒子を産生し、一方、糖タンパク質欠損性ヘルパークローン２３１（ｔＲＮＡＢＢ／Ｃｄｅｌ３ｒｒｖＮＤＣ）は、ヒト樹状細胞に効率的には感染しないベクターを産生する。
【００９９】
ヒト樹状細胞の親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を試験する際に使用するための、ならびにインビボで（例えば、ワクチン投与）に使用するためのアルファウイルスベクター粒子は、種々の以前に記載された方法論を用いて作製され得る。これらの方法としては、例えば、以下が挙げられる：インビトロ転写されたレプリコンベクターおよび欠損性ヘルパーパッケージングＲＮＡの同時トランスフェクション、プラスミドＤＮＡベースのベクターおよびパッケージングカセットの同時トランスフェクション、ならびに安定なパッケージング細胞株へのベクターレプリコンの導入（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７．６４３９−６４４６、１９９３；および米国特許第５，８４３，７２３号および同第５，７８９，２４５号を参照のこと）。
【０１００】
図３、４、５および８に示すように、ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルス由来の構造タンパク質中にパッケージングされたシンドビス−ＧＦＰレプリコンベクターは、ヒト一次樹状細胞（特に、未成熟樹状細胞）に効率的に感染する能力を獲得した。これらの実験では、ＦＡＣＳ分析を以下の通りに行った。発達中の樹状細胞を培養物から収集し、ＰＢＳ／１％  ＦＣＳ中で洗浄し、そしてトリパンブルー排除染色によって計数した。非特異的結合をヒトＩｇとのインキュベーションによってブロックし、そして細胞をヨウ化プロピジウムとともにインキュベートして、生存細胞のその後の分析を可能にした。細胞（１〜１０×１０6）を、蛍光色素結合体化抗体で４℃にて３０分間染色して、感染に感受性の細胞集団を分けた。以下の抗体（およびそれらの細胞特異性）を用いた：ＣＤ１ａ−ＰＥ（汎樹状細胞）、ＣＤ８６−ＰＥ（抗原提示細胞：樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）、ＣＤ８３−ＰＥ（成熟樹状細胞）、ＨＬＡ−ＡＢＣ−ＰＥ（多くの細胞型）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（抗原提示細胞：樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ５（Ｔ細胞およびＢ細胞）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１１ｃ−ＰＥ（樹状細胞およびマクロファージ）ならびにＣＤ１４−ＰＥ（単球）。全ての抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから得た。アイソタイプが一致したコントロールを用いて、象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）位置を確立した。分析を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行い、そしてＭａｃｉｎｔｏｓｈ  ７１００コンピューターに対してデータを得た。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ３．１ソフトウェアを用いてデータを分析およびディスプレイした。
【０１０１】
本発明者らは、ＩＬ４およびＧＭＣＳＦを用いて３〜５日間にわたって単球から分化させた未成熟ヒト樹状細胞が、ＧＦＰを発現するＤＣ親和性シンドビスベクター粒子での感染に対して非常に感受性であることを見出した。細胞表面マーカーに基づいた感受性細胞集団の表現型は、ＣＤ１ａ+ＣＤ８３-ＣＤ１４-ＣＤ３-ＣＤ８６+ＨＬＡ−ＤＲ+ＨＬＡ−ＡＢＣ+ＣＤ１１ｃ-であった。接着性マクロファージを、ＭＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を６日間にわたって１．５×１０6個の細胞／ｍｌの１２ウェルＣｏｓｔａｒプレート中で用いて単球から分化させた。これらの培養物由来の接着性マクロファージ（ＨＬＡ−ＤＲ+）を、特定のシンドビス改変体粒子に感染させた。この系において発達したマクロファージは、樹状細胞に極めて近縁であることが当該分野で公知であり、そして樹状細胞前駆体として機能し得る。精製したＣＤ３+  Ｔ細胞は等価なＭＯＩで感染せず、そして樹状細胞前駆体のサブセット（ＨＬＡ−ＤＲ+ＣＤ１４dimＣＤ３-ＣＤ１６-ＣＤ１ａ-ＣＤ５-は、不均質ＰＢＭＣ培養物をＳＩＮレプリコン粒子に曝露した場合に感染した。まとめて考えると、樹状細胞、ならびにマクロファージおよびＰＢＭＣ前駆体集団はシンドビス粒子での感染に対して感受性であり、そしてＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞は感染に対して不応性であった。
【０１０２】
同様の研究をマウス由来樹状細胞を用いて行った場合、野生型アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス）由来の構造タンパク質が、マウスＤＣの効率的なベクター粒子感染を可能にするがヒトＤＣの効率的なベクター粒子感染を可能にしないこと（図８、ＳＦＶまたはＳＩＮ  ＬＰを参照のこと）が実証された。改変されたかまたは適応された構造タンパク質を用いることによってのみ、これらのベクター粒子はヒト樹状細胞に効率的に感染し得る（ＳＩＮ  ＤＣ＋を参照のこと）。
【０１０３】
ヒト樹状細胞の感染はレセプター媒介性であった。そして抗ビリオンウサギポリクローナル抗体によって阻害され得る。例えば、ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎ構造タンパク質（２×１０7）と共にパッケージングしたＧＦＰ発現レプリコン粒子を、ＰＢＳ中での１００倍希釈の抗ビリオン抗体またはマウスＩｇを認識するコントロールウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ製、Ｃａｔ  ＃  Ｍ−６０２４）のいずれかと共に３０分間プレインキュベートした。未成熟ヒト樹状細胞（２×１０5；３日目）を１時間にわたって感染させ、そして２４時間後にＧＦＰ発現について分析した。抗ビリオン抗体はＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎ粒子による樹状細胞の感染をブロックし、一方、非特異的抗体は何の効果も有さなかった。
【０１０４】
本発明者らは次に、ヒトＤＣ親和性について選択したアルファウイルスベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれかでこのベクターで形質導入した樹状細胞における成熟および活性化を誘導する方法として用いられ得るかを決定しようとした。図９に示されるように、ＳＩＮ−ＧＦＰベクター粒子を用いてインビトロで形質導入したヒトＤＣは、細胞表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＭＨＣクラスＩＩ（これらは、成熟および活性化についての公知のマーカーである）の顕著なアップレギュレーションを示す。さらに、同様の結果がマウスモデルについてインビボで観察された。ＳＩＮ−ＧＦＰベクター粒子での末梢接種後、ＧＦＰ発現についてポジティブなＣＤ１１ｃ樹状細胞を、流入領域（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節から単離し、そして成熟および活性化マーカー（例えば、ＭＨＣ  ＩＩ）の顕著なアップレギュレーションを有することが示された。
【０１０５】
ＤＣ親和性シンドビス−ＧＦＰ粒子が樹状細胞にインビボで感染する能力をさらに実証するために、本発明者らは、８〜１０週齢の４匹の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスからなる群に耳の皮内に接種した。左耳に、２５μｌローダミンＢイソチオシアネート（アセトン／ジブチルフタレートに溶解した２％）を塗り、その後、２５μｌ  ＳＩＮ−ＧＦＰ粒子（処方緩衝液中１．７５×１０7総粒子）を注射した。右耳にはローダミンを塗らず、そしてＳＩＮ−ＧＦＰ粒子（１．７５×１０7）を単独で注射した。コントロール群に処方緩衝液を単独で与え、そして各動物の左耳にローダミンを塗った。各群からの２匹の動物に麻酔をかけ、そして注射後２４時間および４８時間に瀉血し、そして耳および流入領域下顎リンパ節を１％パラホルムアルデヒド中に直ちに収集した。組織を、７２時間、４℃で暗所で固定した後、パラフィン中に包埋した。組織切片（５μｍ）をクリオスタットでガラス顕微鏡スライド上で調製し、そしてレーザースキャニングサイトメーター（Ｃｏｍｐｕｃｙｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で定量分析したか、またはＣＣＤカメラに取り付けた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で光記録（ｐｈｏｔｏｄｏｃｕｍｅｎｔ）した（図６および７）。流入領域リンパ節におけるＧＦＰおよびローダミンを有する細胞の存在は、移動性樹状細胞が皮膚においてシンドビス粒子に感染し、そしてこの節へと輸送するという強力な証拠を提供する。この細胞は樹状の形態を示し、そしてこの節における隣接細胞と接触する多数の突起を有する。コントロール群においてＧＦＰ発現細胞は検出されなかった。
【０１０６】
免疫細胞（例えば、クラスＩ拘束Ｔ細胞応答）の抗原提示および刺激についてのインビトロアッセイの開発における「ツール」としてのヒトＤＣ適応アルファウイルスベクターの有用性を実証するために、本発明者らは、代表例として、マウスＴ細胞ハイブリドーマアッセイを利用した（図１０）。マウスＴ細胞ハイブリドーマ１２．２を、ＢＷＺ．３６融合パートナーを有するＨＩＶ−ｇａｇ−免疫したＣＢ６ＦＩマウス由来の脾細胞の融合によって作製し、続いてクローン化し、そしてＨＩＶ由来ペプチドを充填したＡＰＣに応じたＩＬ−２産生に基づいて選択した。１２．２  Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｈ−２Ｋｄの状況においてＨＩＶ−１  ＳＦ２  ｐ２４ｇａｇタンパク質のペプチド配列ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（ｐ７ｇ）を特異的に認識する。１２．２  Ｔハイブリドーマは、ｐ７ｇペプチドを充填したＨ−２Ｋｄ  ＤＣとの共存培養の際に用量応答様式でＩＬ−２を産生し、そして別のｇａｇ由来ペプチドＳＱＶＴＮＰＡＮＩ（ｇａｇｂ）を充填したＤＣには感受性が鈍い。ｐ７ｇ  ｇａｇ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ１２．２を、１０6細胞／ｍｌ、９６ウェルのＵ字型底マイクロタータープレート中１０5細胞／ウェルでプレーティングした。種々の数のＤＣを、２００μｌの合計容量でウェルに添加した。ＤＣ機能についてのポジティブコントロールとして、各条件由来のＤＣを１ｎｇ／ｍｌ  ｐ７ｇペプチドの存在下で、ならびに培地単独でアッセイした。ＤＣまたはＴ細胞ハイブリドーマ単独を含むネガティブコントロールウェルもまた、各実験で含め、そして＜２０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ２を信頼性良く生じた。各実験条件を二連でアッセイした。３７℃での２４時間の共存培養後、上清を除去しそしてＩＬ−２産生についてＥＬＩＳＡによって製造業者の説明書（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）に従ってアッセイした。均質な樹状細胞適応ウイルスの永続的供給源として、全長ｃＤＮＡクローン（これから、感染性ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルスゲノムＲＮＡがインビトロで転写され得る）を、ＤＣＳＰ６ＳＩＮｇｆｐベクターを出発材料として用いて構築し得る。詳細には、ＤＣＳＰ６ＳＩＮｇｆｐベクター由来のＡｐａＩ−ＳａｌＧＩフラグメントおよびＳａｌＧＩ−ＢａｍＨＩフラグメント＋ＤＣＳＰ６ＳＩＮｄｈパッケージング構築物由来のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩを、ＡｐａＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＲＳ２にクローン化する。得られる構築物をＤＣＳＰ６ＳＩＮｇｅｎと称する。感染性ウイルス種株ストックは、以前の刊行物（例えば、Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３８０９−３８１９，１９８７；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９、１９９６；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６、１９９３；および米国特許第５，８４３，７２３号を参照のこと）において広範に実証されたような、このプラスミドの線状化、インビトロでの転写およびＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクションによってこのプラスミドから作製され得る。
【０１０７】
（実施例３：アルファウイルスベクターについての開始−追加免疫ワクチンストラテジー）
最適に有効であるために、所定の病原因子（例えば、感染性疾患因子（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物））についてのワクチンは、強くかつ広範なベースの抗原特異的免疫応答を刺激しなければならない。ワクチン接種した個体は、存在する記憶細胞の刺激および抗原特異的エフェクター細胞への成熟の結果として、その後の抗原投与の際に感染性生物に特有の続発症の発達に対して耐性であり、抗原特異的エフェクター細胞は、害を与えている感染性因子の浄化を促進する。同様に、所定の感染性疾患のための治療的ワクチンはまた、強くかつ広範なベースの抗原特異的免疫応答を刺激して、感染性疾患を除去するかまたは感染性疾患の程度を低下させなければならない。
【０１０８】
一般的に、ワクチンは、１より多くの（しばしば多くの）用量で与えられる。このような免疫ストラテジーの原理は、「開始（ｐｒｉｍｅ）」応答を「追加免疫（ｂｏｏｓｔ）」して、個体が感染性生物の抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に耐える能力の上昇によって特徴付けられる、より永続性のある免疫応答をもたらすことである。抗原投与に対するこの上昇した耐性は、その感染性生物に対応する、しばしば、より広範な範囲の抗原性エピトープについての特異性を有する、より多数の既存の免疫記憶細胞に起因する。
【０１０９】
ワクチン接種がＴヘルパー細胞１（Ｔｈ１）応答およびＴヘルパー細胞２（Ｔｈ２）応答の両方を惹起する場合、広範なベースの抗原特異的免疫応答が生じる。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の増殖は、サイトカイン分泌、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＦＮ−γに対応するＴｈ１サブセット、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０に対応するＴｈ２サブセットのパターンによって区別される。ワクチン接種の結果として発現された抗原は、樹状細胞（ＤＣ）、いわゆる「プロフェッショナル（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞」を介して免疫系に対して提示される。ＤＣは、免疫応答を開始および調節する。特に、ＤＣは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の強力な刺激因子である（概説については、ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２、１９９８を参照のこと）。Ｔリンパ球およびＢリンパ球の抗原特異的エフェクターの刺激は、樹状抗原提示細胞による提示によって生じ、ここで、プロセシングされた抗原は、２つの代替的型（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ）の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合して、Ｔ細胞抗原レセプターを介してＴリンパ球に対してディスプレイされる。ＭＨＣクラスＩを介した抗原提示は、細胞性ＣＤ８＋細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＴＬ）応答をもたらし、一方、ＭＨＣクラスＩＩを介した抗原提示は、ＣＤ４＋細胞、続いてＢリンパ球の刺激をもたらし、体液性（抗体、Ａｂ）応答をもたらす。従って、「開始」−「追加免疫」ワクチン接種ストラテジーの原理は、広範かつ永続性のＴｈ１抗原特異的免疫応答およびＴｈ２抗原特異的免疫応答を惹起することである。
【０１１０】
伝統的なワクチン接種開始−追加免疫ストラテジーは、開始工程および追加免疫工程の両方について１回の様式しか用いず、そして特定の感染性疾患については、広範なＴｈ１／Ｔｈ２抗原特異的免疫応答を惹起しないかもしれない。従って、本発明の範囲内では、開始−追加免疫レジメのいくつかの「混合」様式が開示され、ここでは、種々のワクチン接種組成物が、指定された抗原をコードするアルファウイルスレプリコンベクター（例えば、組換え粒子、ＤＮＡまたはＲＮＡとして）と共に「開始」または「追加免疫」として投与され得る。アルファウイルスベクターレプリコンを取り込んだこのような開始−追加免疫の免疫ストラテジーは、ワクチン接種した個体において、よりずっと永続性でかつ広範なベースのＴｈ１／Ｔｈ２抗原特異的免疫応答を惹起する。合わせた開始−追加免疫の免疫様式は、例えば、プラスミドＤＮＡ（処方されたかまたは処方されていない）、ＥＬＶＩＳベクター、組換えアルファウイルス粒子、他の非アルファウイルスベクターおよび組換えタンパク質を含み得る。指定された抗原をコードするアルファウイルスベクターレプリコンを含むこれらのワクチン様式のいずれかは、アジュバントと共に与えられ得る。利用され得るアジュバントの代表例は、ＭＦ５９、ポリ−Ｄ−ガラクトシド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはモノホスホロ脂質（ｍｏｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏ  ｌｉｐｉｄ）である。
【０１１１】
本発明による開始−追加免疫レジメの有用性を実証するために、ＨＩＶ  ｇａｇを、一例の抗原として選択した。ＨＩＶ  ｇａｇを、プラスミドＤＮＡベクター、ＥＬＶＩＳベクターおよびアルファウイルスベクター粒子によって発現させ、そしてまた組換えタンパク質として産生させた。ＨＩＶ由来の他の抗原、ならびに他の病原性因子（例えば、ＨＣＶ）由来の抗原は同様に、本発明の教示に基づいて当業者によって用いられ得る。
【０１１２】
（Ａ．  ＨＩＶ  ｇａｇおよびエンベロープ発現ベクターの構築）
ＨＩＶ  ｇａｇコード配列を、ＨＩＶ−１ＳＦ２株（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６８６）：４８４−４９２，１９８５；本明細書中に参考として援用される、１９９２年１０月２０日に発行されたＬｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．ら、米国特許第５，１５６，９４９号；Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．ら、米国特許第５，６８８，６８８号、１９９７年１１月１８日）から選択した。これらの配列を直接または最初に操作して、それらの遺伝子産物の発現を最大にした。発現の最大化のために、ＨＩＶ−１コドン使用法パターンが改変され、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドン使用法に匹敵した。ＨＩＶコドン使用法は、コドントリプレットの第３の塩基としてのヌクレオチドＡまたはＴの高い含有量を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用法の効果は、翻訳能力の減少およびｍＲＮＡの不安定性をもたらし得る、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含有量である。対照的に、高度に発現されるヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを第３の塩基として好む。それゆえ、ｇａｇコード配列を、高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用法に匹敵するように改変した。
【０１１３】
ｇａｇについてのＤＮＡフラグメントを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６，１９９１）に由来しかつカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡ、続いて配列の挿入のためのクローニング部位、続いてウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む、真核生物発現ベクターｐＣＭＶＫｍ２中にクローン化した。ｇａｇ配列含有ベクターを、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２と命名した。このプラスミドを、１９９９年１月１８日に、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ、９４６６２−８０９７に、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した。
【０１１４】
次いで、ＨＩＶ  ｇａｇをコードするＤＮＡフラグメントを、組換えアルファウイルス粒子の作製のために用いられるアルファウイルスプラスミドＤＮＡベクター（ＥＬＶＩＳ）およびレプリコンベクター（ＳＩＮＢＶおよびＳＩＮＣＲ）中にクローン化した。特に、シンドビスウイルスＲＮＡベクターレプリコン（ｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１０：５０８−５１９、１９９６）のインビトロ転写のための構築物を改変して、プラスミド直鎖化のためのＰｍｅＩ部位および異種遺伝子の挿入のためのポリリンカーを含むようにした。最初に、部位ＸｈｏＩ、ＰｍｌＩ、ＡｐａＩ、ＮａｒＩ、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを含む２つのオリゴヌクレオチドを用いてポリリンカーを作製した。
【０１１５】
ＸＰＡＮＸＮＦ：５’ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣ、
ＸＰＡＮＸＮＲ：５’ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＧＣ。
【０１１６】
次いで、プラスミドｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化してルシフェラーゼ遺伝子挿入物を除去し、ＫｌｅｎｏｗおよびｄＮＴＰを用いて平滑末端化し、そして互いにアニーリングしたオリゴヌクレオチドと連結した。得られた構築物をＮｏｔＩおよびＳａｃＩで消化して、最小のシンドビス３’末端配列およびＡ40トラクトを除去し、そしてｐＫＳＳＩＮＩ−ＢＶ（ＷＯ  ９７／３８０８７）由来の、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩでの消化によって得た、約０．４ｋｂｐのフラグメントと連結した。このフラグメントは、完全なシンドビスウイルス３’末端、Ａ40トラクトおよび直鎖化のためのＰｍｅＩ部位を含んでいた。このレプリコンベクター構築物をＳＩＮＢＶＥと称した。他のレプリコンベクターＳＩＮＣＲは、以前に実施例２に記載した。
【０１１７】
ＨＩＶ  ｇａｇコード配列は、ＥｃｏＲＩでの消化、ＫｌｅｎｏｗおよびｄＮＴＰでの平滑末端化、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩでの精製、およびＳａｌＩでの消化によって親のｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２プラスミドから得られた。次いで、ＨＩＶ  ｇａｇコードフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰｍｌＩで消化したＳＩＮＢＶＥベクター中に連結した。得られたベクターをＳＩＮＢＶ−ｇａｇと称した。並行して、同じＨＩＶ  ｇａｇフラグメントを、ＮｏｔＩで消化しそして平滑末端化し、続いてＸｈｏＩで消化してＧＦＰレポーター遺伝子挿入物を除去したＳＩＮＣＲ−ＧＦＰベクターと連結することによって本発明の新たなレプリコン中に挿入した。このベクターをＳＩＮＣＲ−ｇａｇと称した。ベクターＲＮＡレプリコンを、以前に記載された方法（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６；Ｐｏｌｏら、ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−４６０３；および米国特許第５，７８９，２４５号、同第５，８４２，７２３号および同第６，０１５，６９４号（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）を用いることによって組換えアルファウイルス粒子中にパッケージングした。
【０１１８】
図２Ｂおよび図２Ｃに記載されたＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルス（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ−２６４３）またはＳｉｎＣｈｉｒｏｎＬＰウイルスから得られた非構造遺伝子配列を利用した新たなＳＩＮベクターレプリコンの構築は、野生型ＳＩＮウイルス（例えば、ＡＴＣＣ＃  ＶＲ−２５２６）由来のレプリコンと比較して優れた特性を有するレプリコンをもたらした。これらの特性としては、ヒト樹状細胞における発現の増強、野生型レプリコンよりも１０倍程度多いレベルでの組換えアルファウイルス粒子へのパッケージングの増加、および動物の免疫後に、より強い免疫応答を誘導する能力が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、図１１は、新たなＳＩＮレプリコン（ＳＩＮＣＲ）または以前に記載された野生型ＳＩＮレプリコン（ＳＩＮＢＶ）のいずれかを含む、ＤＣ親和性ベクター粒子での免疫後のマウスにおけるＨＩＶ  ｇａｇ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の誘導を比較する。１０5または１０7ＩＵのいずれかの用量では、ＳｉｎＤＣｃｈｉｒｏｎウイルスおよびＳｉｎＣｈｉｒｏｎＬＰウイルス由来の非構造遺伝子配列を含むＳＩＮＣＲレプリコンは、免疫誘導において明確により強力である。
【０１１９】
ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアルファウイルスＤＮＡベースのベクター（ＥＬＶＩＳ）の構築のために、プラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）をＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化して、β−ガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を除去し、そしてＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子を、ＳＩＮＢＶ−ｇａｇ由来のフラグメントの消化および精製の後に挿入した。得られる構築物をｐＤＳＩＮ−Ｇａｇと称した。同様に、ＨＩＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質を発現する構築物を、同じレプリコンおよびＥＬＶＩＳベクター骨格を用いて作製した。種々のエンベロープ配列をこれらの構築のために用い、そしてｅｎｖ遺伝子の単離のために用いた親のプラスミド（例えば、ｐＣＭＶｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４、ｐＣＭＶｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２、ｐＣＭＶｇｐ１４０．ｍｕｔ８．ｍｏｄＳＦ１６２）をＣＭＣＣおよびＡＴＣＣに寄託した。
【０１２０】
組換えｇａｇタンパク質を、バキュロウイルス発現系を用いて得た。合成ＨＩＶ  ｇａｇ配列を含むバキュロウイルスシャトルベクターを、以下の通りに構築した。合成ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ発現カセット（上記）を、制限酵素ＳａｌＩで消化し、続いてＴ４−ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。得られるフラグメントを単離し、次いで、ＢａｍＨＩで消化した。シャトルベクターｐＡｃＣｌ３（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２、１９９０）を、ＥｃｏＲＶでの消化によって直鎖化し、続いてＴ４−ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。直鎖化されたベクターをＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてフラグメントをアガロースゲルから単離した。単離された１．５ｋｂフラグメントを調製されたｐＡｃＣ１３ベクターと連結し、ｐＡｃＣ１３−Ｍｏｄｉｆ．ｐ５５ｇａｇと称されたクローンを得た。
【０１２１】
組換えバキュロウイルスの作製を、２μｇのＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇシャトルベクターを０．５μｇの直鎖化Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）野生型ウイルスＤＮＡと共にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞（Ｋｉｔｔｓ、Ｐ．Ａ．、Ａｙｒｅｓ  Ｍ．Ｄ．、ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ  Ｒ．Ｄ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５６６７−５６７２，１９９０）中に同時トランスフェクトすることによって達成した。ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇを発現する組換えウイルスの単離を、標準的な技術（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．ＭｉｌｌｅｒおよびＶ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）に従って行った。
【０１２２】
ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇの発現を、ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ組換えバキュロウイルスに１０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた、無血清培地（Ｍａｉｏｒｅｌｌａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１５０６−１５１０，１９８８）中で増殖させたＳｆ９細胞の５００ｍｌ懸濁培養物を用いて達成した。感染４８時間、上清を遠心分離によって分離し、そして０．２μｍフィルターを通して濾過した。次いで、上清のアリコートを、ＰｏｌｙｃｌｅａｒTM（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）超遠心分離器のチューブに移し、２０％（ｗｔ／ｗｔ）スクロースを下に置き、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターを用いて２時間の遠心分離に２４，０００ｒｐｍにて供した。
【０１２３】
得られたペレットをＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁し、２０％（ｗｔ／ｗｔ）〜６０％（ｗｔ／ｗｔ）のスクロース勾配上に重層し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ｔｉローターを用いて２時間の遠心分離に４０，０００ｒｐｍにて供した。次いで、勾配を、勾配の頂部（２０％スクロース）から始めて約１２個の０．７５ｍｌアリコートへと分画した。各画分のサンプルを、８％〜１６％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして得られたバンドをクーマシー染色後に可視化した。さらなるアリコートを屈折率分析に供した。
【０１２４】
この結果は、ｐ５５  ｇａｇ  ＶＬＰが、約１．１７ｇ／ｍｌをピークとして、１．１５ｇ／ｍｌ〜１．１９ｇ／ｍｌの範囲のスクロース密度でバンド形成することを示した。ピーク画分をプールし、そして２回目の２０％スクロースペレット形成によって濃縮した。得られたペレットを１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（上記）に懸濁した。総タンパク質収量を、Ｂｉｃｉｍｃｈｒｏｍｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって見積もった。
【０１２５】
組換えＨＩＶエンベロープタンパク質は、バキュロウイルス系からではなく、安定な哺乳動物細胞株から発現された。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ポリアミントランスフェクション試薬（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）を製造業者の説明書に従って用いて、合成ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、そして９６時間インキュベートした。９６時間後、培地を選択培地（２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加した（ｓｐｅｃｉａｌ  ｗｉｔｈ）Ｆ１２）に変更し、そして細胞を１：５に分け、そしてさらに４８時間インキュベートした。培地を、コロニーが形成し始めるまで５〜７日毎に変更し、コロニーが形成し始めた時点でコロニーを拾い、９６ウェルプレートにプレーティングし、そしてｇｐ１２０  Ｃａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ポジティブ  クローンを２４ウェルプレートにおいて拡大し、そして以前に記載されたようにＥｎｖタンパク質産生についてＣａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡによって数回スクリーニングした。２４ウェルプレート中でコンフルエンシーに達した後、ポジティブクローンをＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に拡大した。これらを、コンフルエンシーの後に数回スクリーニングし、そしてポジティブクローンをＴ７５フラスコに拡大した。
【０１２６】
ポジティブＴ７５クローンをＬＮ２中で凍結し、そして最大に発現するクローンを、０μＭ〜５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）をいくつかの濃度で用いて増幅し、そして１００ｍｍ培養ディッシュにプレーティングした。プレートを、コロニー形成についてスクリーニングし、そして全てのポジティブクローン（ｃｌｏｓｅｄ）を、上記のように再度拡大した。クローンを拡大し、増幅し、そしてｇｐ１２０捕捉ＥＬＩＳＡによって各工程でスクリーニングした。ポジティブクローンを、各メトトレキサートレベルで凍結した。最大に産生するクローンを、拡大のため、およびより大きなバイオリアクターへの規模拡大のための低血清懸濁培養条件への適応のために灌流バイオリアクター（３Ｌ、１００Ｌ）中で増殖させた。
【０１２７】
以下の表は、合成ＨＩＶ−ＳＦ１６２  Ｅｎｖポリペプチド（例えば、変異した切断部位、改変されたコドン使用法および／または欠失した超可変領域）をコードするカセットを保有するプラスミドベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの捕捉ＥＬＩＳＡデータを示す。従って、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０モノマー性、およびｇｐ１４０−オリゴマー性）を発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株が産生された。
【０１２８】
【表３】
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上記に示した結果は、本発明の構築物がＣＨＯ細胞においてＥｎｖポリペプチドの発現を提供する能力を実証する。ＣＨＯ細胞を用いたポリペプチドの産生は、以下を提供する：（ｉ）適切なグリコシル化パターンおよびタンパク質コンホメーション（ＭＡｂのパネルへの結合によって決定した場合）；（ｉｉ）ＣＤ４レセプター分子への適切な結合；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞夾雑物（例えば、昆虫ウイルスおよび／または昆虫細胞）が存在しないこと；および（ｉｖ）精製の容易さ。
【０１２９】
（Ｂ．開始−追加免疫ワクチン接種レジメによる増強の実証）
アルファウイルスベクターを利用した開始−追加免疫レジメ（ｒｅｇｉｍｅ）を用いてワクチンの免疫原性を改善する能力を実証するために、種々の異なる組み合わせが用いられ得る。例えば、アルファウイルスベクター粒子は、開始として投与され得、続いて組換えタンパク質またはＤＮＡベクターが追加免疫され得る。あるいは、プラスミドＤＮＡベクターまたはＥＬＶＩＳベクターは、開始として投与され得、続いてアルファウイルスベクター粒子が追加免疫され得る。また、ＥＬＶＩＳベクターの開始は、組換えタンパク質または非アルファウイルス（例えば、ポックスウイルス）ベクター追加免疫と共に投与され得る。上記の開始−追加免疫エレメントの多数の異なる組み合わせが交換され得ること、そして種々の抗原をコードするベクターが種々の免疫経路を用いて同様に投与され得ることが本明細書に提供される開示から明らかであるはずである。
【０１３０】
このような開始−追加免疫アプローチの利益を例示するために、動物研究を、上記からのＳＩＮＢＶ−ｇａｇベクター粒子およびｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２プラスミドを用いて行った。これらの研究は、高度に定量的なワクシニア抗原投与モデルを利用して、免疫した動物におけるＣＴＬ応答の差異を明らかに解明した。マウスに、１サンプルあたり３匹からなるマウスの群に、１００μｌ容量のＤＮＡまたはアルファウイルスベクター粒子を筋肉内に免疫した。４週間後、マウスに、プラスミドＤＮＡまたはベクター粒子（最初の開始免疫と同じかまたは逆のワクチン組成物）のいずれかを追加免疫した。追加免疫の４週間後、次いで、動物に、ＨＩＶ  ｇａｇを発現する１０7ＰＦＵの組換えワクシニアウイルスを腹腔内に抗原投与した。５日後、直接脾臓細胞ＣＴＬアッセイを、ｇａｇペプチドでパルスした51Ｃｒ標識標的細胞に対して行った。図１２に示すように、ＤＮＡ開始アルファウイルスベクター粒子追加免疫レジメは、ＤＮＡ単独またはベクター粒子単独よりも大きな免疫誘導をもたらした。
【０１３１】
送達されるワクチン成分（例えば、アルファウイルスベクター粒子、ＤＮＡ、ＥＬＶＩＳ、組換え体タンパク質）の順番、ならびに免疫のタイミング、用量および経路は、上記からの多数の可能な組み合わせを含むように変更され得ることが認識されるべきである。例えば、開始と追加免疫の免疫との間の間隔は、間隔なし（同時投与）から、１日以上、好ましくは少なくとも１４日間、そしてより好ましくは少なくとも２８日間までの範囲であり得る。さらに、投与経路は、筋肉内送達には制限されない；むしろ、他の経路（例えば、皮内、静脈内、皮下、鼻腔内および経口）もまた利用され得る。
【０１３２】
上記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されているが、種々の改変が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることが認識される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外には、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、αウイルスに対するヒト樹状細胞適用戦略の１つの代表的な流れ図の模式図である。
【図２】  図２Ａは、ヒト樹状細胞適用されたαウイルス（例えば、シンドビスウイルス）改変体のゲノムに関する一般的なクローニング戦略を記載する。
図２Ｂは、ＳｉｎＤＣＣｈｉｒｏｎウイルスのヌクレオチド配列である。
図２Ｃは、ＳｉｎＣｈｉｒｏｎＬＰウイルスのヌクレオチド配列である。
【図３】  図３は、ヒト樹状細胞のＳｉｎｄｂｉｓ−ＧＦＰベクター感染を示す。
【図４】  図４は、ＳｉｎＤＣＣｈｉｒｏｎ誘導エンベロープ糖タンパク質を有するＳＩＮ−ＧＦＰベクターによるヒトＤＣ感染の、シンドビスウイルスの別のＤＣ改変体由来の糖タンパク質と比較した場合の、増加した効果を示す。
【図５】  図５は、ＤＣ適用された糖タンパク質を有するＳＩＮ−ＧＦＰベクターが、成熟ＤＣと比較して、特異的に未熟ヒト樹状細胞を標的化することを示す。
【図６】  図６は、マウスへの投与後にリンパ節に輸送する（ｔｒａｆｆｉｃｋ）ＤＣ改変ＳＩＮ−ＧＦＰベクター感染細胞のレーザーサイトメトリー分析を示す。
【図７】  図７は、マウスへの投与の後にリンパ節にトラフィックされたＤＣ改変ＳＩＮ−ＧＦＰベクター感染細胞の顕微鏡検査を示す。
【図８】  図８は、αウイルス（例えば、ＳＦＶまたはＳＩＮ−ＬＰ）がマウスＤＣを感染し得るが、αウイルスがそのようなヒトＤＣ（例えば、ＳＩＮ  ＤＣ＋を参照のこと）の効果的な感染に対して最初に改変されそして適用されない限り、ヒトＤＣを感染し得ないことを示すグラフである。
【図９】  図９は、インビトロ形質導入後のヒトＤＣおよびインビボ形質導入後のマウスＤＣの、αウイルス（例えば、ＳＩＮ）ベクター誘導の成熟および活性化を示すグラフである。
【図１０】  図１０は、形質転換されたＤＣおよび免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の刺激によって抗原提示を測定するインビトロアッセイに対する、ヒトＤＣ適用されたαウイルスベクターの有用性を示す。
【図１１】  図１１は、新規ＳＩＮＣＲレプリコンまたは野生型ＳＩＮＢＶレプリコンのいずれかを含む組換えαウイルス粒子を使用する免疫誘導を比較するグラフである。
【図１２】  図１２は、選択されたプライム／ブースト（ｂｏｏｓｔ）ワクチン戦略によるＣＴＬ増強を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｂ−４】
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【図２Ｂ−５】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｃ−４】
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【図２Ｃ−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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