(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HPO42- 及びPO43-の間の酸化還元応答電流を測定することにより、リン酸又はリン酸エステルの脱リン酸反応又は加水分解反応の結果生じるPO43-を測定することを特徴とする、リン酸及び／又はリン酸エステルの電気化学的測定法。
【請求項２】
酸化還元応答電流が＋１００ｍＶより卑の範囲の定電位を印加することによって得られる、請求項１記載の電気化学的測定法。
【請求項３】
−５０ｍＶより卑の範囲の定電位を印加することによって得られるPO43-の還元電流を測定することを特徴とする、請求項２記載の電気化学的測定法。
【請求項４】
−２５０ｍＶの定電位を印加することによって得られるPO43-の還元電流を測定することを特徴とする、請求項３記載の電気化学的測定法。
【請求項５】
＋５０ｍＶ以上の定電位を印加することによって得られるHPO42- の酸化電流を測定することを特徴とする、請求項２記載の電気化学的測定法。
【請求項６】
リン酸を一旦エステル化した後、得られたリン酸エステルの化学反応の結果生じるPO43-を測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気化学的測定法。
【請求項７】
リン酸を脱プロトンした後に得られるPO43-を測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気化学的測定法。
【請求項８】
化学反応が触媒によって行われる、請求項６に記載の電気化学的測定法。
【請求項９】
触媒が、脱リン酸酵素、リン酸エステル加水分解酵素、及び、脱リン酸反応又は加水分解反応を触媒することができる人工酵素から成る群から選択される、請求項８に記載の電気化学的測定法。
【請求項１０】
二電極系又は三電極系による電気化学的測定法であって、触媒が電極界面への触媒層を形成していることを特徴とする、請求項８又は９記載の電気化学的測定法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の電気化学的測定法を実施する為の電気化学測定装置であって、脱リン酸酵素、リン酸エステル加水分解酵素、及び、脱リン酸反応又は加水分解反応を触媒することができる人工酵素から成る群から選択される触媒が電極界面への触媒層を形成していることを特徴とする、該電気化学測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在するリン酸及び／又はリン酸エステル類の濃度を電気化学的に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸エステル類には、アデノシン三リン酸（ATP）等のヌクレオチド、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)等の核酸、グリセロールリン酸、グルコースリン酸等の代謝中間物質等、生体内において重要な役割を担っている物質が多く存在し、それらを測定することは、環境、医学、臨床検査、食品衛生、バイオ研究の分野において非常に重要である。【０００３】
リン酸エステル類の中で、ATP等のヌクレオチドは、微生物や食物残澄等の汚れにも多く含まれているので、食品工場や厨房等における汚染度の指標としても適している。現在、汚染度の検査の指標には、タンパク質、糖、ATP等が用いられているが、タンパク質、糖は感度が不十分であり、タンパク質、糖をほとんど含まない汚れも多く存在する。ATPについては簡便な酵素（ルシフェラーゼ）を利用した酵素発光法が知られている。しかしながら、使用する試薬（ルシフェラーゼ及びルシフェリン等）は高価であり、その測定には高価な検出器が必要である。【０００４】
又、リン酸２分子によるエステル結合で形成される化合物であるピロリン酸は、遺伝子診断等においてDNAポリメラーゼ反応の反応量を示す指標となっている。ピロリン酸の検出方法としては、カルシウムやマグネシウムイオンとの沈殿反応や酵素を組み合わせた発色、発光反応を用いて測定する方法等があるが、これらは感度が低く、作業が複雑であり、検出装置の自動化や連続モニタリング化には適した方法ではなかった。従って、それらを簡便に測定する方法の開発が求められている。【０００５】
更に、リン酸エステルを含んでいる化学物質として、テトラエチルピロリン酸等の有機リン系農薬も挙げることができる。又、パラチオン及びマラチオン等有機リン系農薬等もリン酸エステルに類似した構造を有している。これらの有機リン系農薬も検査対象として非常に重要な物質であり、それらを測定する方法やセンサーは非常に有用であると言える。これらの物質は、ガスクロマトグラフイや液体クロマトグラフイ等を用いて測定されているが、高価で大掛かりな装置が必要であり、安価で簡便なセンサー、測定方法の開発が求められている。【０００６】
以上のように、試料中におけるリン酸エステル類の濃度を測定する方法としては、ATPについては簡便な酵素（ルシフェラーゼ）を利用した酵素発光法が知られているが、それは高価であり、その測定には高価な試薬及び検出器が必要である。又、その他のリン酸エステルについてはHPLCなどの機器分析による方法に依存し、in situ 測定（その場測定）に適用できる方法はない。【０００７】
一方、試料中におけるリン酸の濃度を測定する方法としては、これまでに、イオンクロマトグラフィー、及び原子吸光等が知られている。しかし、これらの方法では、試料を充分に精製しなくてはならず、更に、高額・大型の機器が必要である為にin situ 測定（その場測定）には適用できない。そのほかにイオノホアを用いる簡便なイオンセンサも知られているが、とくにリン酸に対しては選択性が低く、実際的な低濃度領域での測定の用に供することは困難である。【０００８】
特許文献１には、金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体、又は、金属イオンを保持する機能を有するポリマーと、金属イオンと、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体に係る発明が開示されており、その利用例の一つとして、該担体を用いるリン酸エステル類の測定方法が記載されている。【０００９】
具体的には、電気化学的センサーを用いて、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びピロリン酸を測定する例が実施例として記載されている。しかしながら、これらはいずれも＋１００ｍVで還元電流（マイナスの電流）を取得し、測定している。これは人工酵素中のＣｕにリン酸エステルのＰが配位した複合体を電気化学的に還元解離させていることによる電流である。
【特許文献１】国際公開WO03/078060 A1 パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明が解決しようとする課題は、試料中に存在するリン酸及び／又はリン酸エステルを簡便かつ迅速に高感度で測定することが出来る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、本発明者は、通常、水溶液中において殆どのリン酸はHPO42-(49.9973%) 及びH2PO4-(49.9973%)の間の平衡状態で安定化し、そのほかの H3PO4(0.00039%)及びPO43- (0.00016%)状態では殆ど存在していないにも関わらず、脱リン酸反応、あるいは加水分解反応の直後においてのみ、HPO42-及びH2PO4-（これらの分子種のどちらも電気化学的には測定できない）とが９９．９９％を占める平衡状態に至る前に、電気化学的に測定可能なPO43-の状態で短時間過渡的に存在することを見出し、PO43-を電気化学的に還元することによる還元電流、及び／又はその還元生成物であるHPO42- の電気化学的酸化による酸化電流の測定によりPO43-を定量できることを見出した。このように逆の電極反応を行うことにより電流値を全体で２倍することができ、感度の増幅が図られる。本発明はこのような新たな知見に基づき完成されたものである。【００１２】
従って、脱リン酸反応を行う触媒（酵素あるいは人工酵素）と電極系とを適切に配置することで、脱リン酸反応により脱離したリン酸がPO43-体（あるいはHPO42-体）で電極表面に到達し、電極電位で酸化または還元され、その応答電流によりリン酸及び／又はリン酸エスエルを定量することが可能となる。【００１３】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
１．リン酸又はリン酸エステルの化学反応の結果生じるPO43-を測定することを特徴とする、リン酸及び／又はリン酸エステルの電気化学的測定法。
２．化学反応が脱リン酸反応又は加水分解反応である、請求項１記載の電気化学的測定法。
３．HPO42- 及びPO43-の間の酸化還元応答電流を測定することを特徴とする、上記２記載の電気化学的測定法。
４．酸化還元応答電流が＋１００ｍＶより卑の（＋１００ｍV未満の）範囲の定電位を印加することによって得られる、上記３記載の電気化学的測定法。
５．−５０ｍＶより卑の範囲の定電位を印加することによって得られるPO43-の還元電流を測定することを特徴とする、上記４記載の電気化学的測定法。
６．−２５０ｍＶの定電位を印加することによって得られるPO43-の還元電流を測定することを特徴とする、上記５記載の電気化学的測定法。
７．＋５０ｍＶ以上の定電位を印加することによって得られるHPO42- の酸化電流を測定することを特徴とする、上記４記載の電気化学的測定法。
８．リン酸を一旦エステル化した後、得られたリン酸エステルの化学反応の結果生じるPO43-を測定する、上記１〜７のいずれか一項に記載の電気化学的測定法。
９．リン酸を脱プロトンした後に得られるPO43- を測定する、上記１〜７のいずれか一項に記載の電気化学的測定法。
１０．化学反応が触媒によって行われる、上記１〜９のいずれか一項に記載の電気化学的測定法。
１１．触媒が、脱リン酸酵素、リン酸エステル加水分解酵素、及び、脱リン酸反応又は加水分解反応を触媒することができる人工酵素から成る群から選択される、上記１０に記載の電気化学的測定法。
１２．触媒が電極界面への触媒層を形成していることを特徴とする、上記１０又は１１記載の電気化学的測定法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の電気化学的測定法によって、試料中に存在する数十μＭ〜数百μＭ程度の極めて微量なリン酸及び／又はリン酸エスエルを簡便かつ迅速にin situ測定することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１で作成したセンサデバイスの反応面（電極表面に触媒層を構築した状態）の拡大写真（倍率：５０倍）である。
【図２】図２は、−４００ｍV〜+４００ｍV（vs.AgAgCl）の範囲で電位走査を行った結果得られた電流応答を示す電流電位曲線である。
【図３】図３は、リン酸エステル類のひとつであるピロリン酸を図１に示すセンサデバイスで電気化学的に測定した結果得られた、ピロリン酸濃度とセンサデバイスからの応答電流との関係を示す検量線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明方法の測定対象である「リン酸エスエル」には、本明細書の「背景技術」中で記載したような当業者に公知の任意の化合物が含まれる。又、本発明方法で用いる化学反応としては、リン酸エステルからPO43-を生じさせることができる反応であれば、どのような化学反応でもよく、酵素等の触媒を介する反応の方が反応効率及び条件等の点で好ましいが、そのような触媒を使用しなくとも良い。【００１７】
このような化学反応の例として、脱リン酸反応又は加水分解反応がある。従って、本発明方法で使用する酵素の例として、各種生物由来の「ホスファターゼ」と呼ばれる生体分子中のリン酸モノエステル結合を加水分解して脱リン酸反応を触媒する脱リン酸酵素群、「ＡＴＰアーゼ」と呼ばれる、ＡＴＰのβ位リンとγ位リンとの間のリン酸エステル結合を加水分解するリン酸エステル加水分解酵素群、及び、脱リン酸反応又は加水分解反応を触媒することができる当業者に公知の任意の人工酵素（人工触媒）等を挙げることが出来る。【００１８】
このような人工酵素の一例として、人工酵素は国際公開WO03/078060 A1 パンフレットに記載されている触媒担体を挙げることが出来る。尚、このような触媒は当業者に公知の任意の方法で、電極界面へ形成された触媒層に含ませることが出来る。【００１９】
本発明方法において化学反応の結果生じるPO43-の測定は、HPO42-及びPO43-の間の酸化還元応答電流を測定することによって行うことが好ましい。このうち、PO43-の還元電流は、＋１００ｍＶより卑の範囲の定電位、好ましくは−５０ｍＶより卑の範囲の定電位、より好ましくは−２５０ｍＶの定電位を印加することによって得られる。又、HPO42- の酸化電流は、＋５０ｍＶ以上の定電位を印加することによって得られる。【００２０】
又、本発明方法において、試料中のリン酸を当業者に公知の任意の方法で一旦エステル化した後、得られたリン酸エステルの化学反応の結果生じるPO43-を測定することができる。或いは、リン酸を脱プロトンした後に得られるPO43-を測定することも出来る。【００２１】
本発明方法は、当業者に公知の任意の電気化学測定装置を用いて実施することが出来る。例えば、電極表面（又は、電極界面）等に適当な酵素等を展開し、試料中で二電極系あるいは三電極系を形成させ、定電位値を印加して測定する方法が挙げられる。このような二電極系あるいは三電極系は、当業者に公知の任意の手段で形成することが出来る。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。【００２３】
実施例１：ピロリン酸の電気化学的定量（ピロリン酸センサ）
リン酸エステル類のひとつであるピロリン酸の測定を行った。リン酸エステルを脱リン酸化する触媒としては、人工酵素を用いた。この人工酵素は国際公開WO03/078060 A1 パンフレットに触媒担体として記載されており、リン酸エステルのリン酸脱離反応を触媒する。【００２４】
具体的には、人工酵素は、以下のようにして調製した。
終濃度40mM塩酸水溶液に200mM CuC12を溶解し、その後、溶液をNaOH溶液にて中和しながら20mMポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを25℃にて一昼夜ポルテックスミキサーを用いて撹枠した後、20mMポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果、沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、人工酵素として用いた。この人工酵素を白金電極（５ｍｍｘ５ｍｍｘ０．１ｍｍ）の表面に薄膜化し、ピロリン酸センサデバイスとした（図１）。【００２５】
このセンサデバイスをピロリン酸が５０ｍM溶解した緩衝液中に漬け、３電極系（白金対極、銀塩化銀参照極）で構成される電気化学測定装置（北斗電工製HZ-3000システム）を用いて、電位を印加し、−４００ｍV〜+４００ｍV（vs.AgAgCl）の範囲で電位走査を行い、そのときの電流応答を記録した。その結果、−１００ｍV（vs.AgAgCl）を中心として、酸化還元電流応答が得られた（図２）。これはHPO42-とPO43-との間の酸化還元が電極表面で行われたことを示している。【００２６】
より詳細には、図２から、約−５０ｍＶ未満、特に、約−２５０ｍVの定電位を印加した場合にはPO43-の還元電流（マイナスの電流）が得られ、また、+５０ｍＶ以上ではHPO42-の酸化電流（プラスの電流）が得られることが解る。この反応では、PO43-の還元はおよそ−５０ｍＶ未満でしか行うことができず、+１００ｍＶでは還元反応（マイナスの電流）は全く進行することができない。従って、これらのことから、本発明方法で得られた酸化還元電流応答は、上記の国際公開WO03/078060 A1に記載の電気化学的測定とはその原理を異にするものであることが明らかである。【００２７】
およそ−２５０ｍV（vs.AgAgCl）でピロリン酸の脱リン酸反応生成物であるPO43-を電気化学的に還元できることが明らかになったため、緩衝溶液中に漬けたセンサデバイスに−２５０ｍV（vs.AgAgCl）定電位を印加した。緩衝液をスターラーで攪拌し、外部からピロリン酸を滴下したところ、滴下したピロリン酸濃度に対応した還元応答電流が得られた（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、とする課題は、試料中に存在する極めて微量なリン酸及び／又はリン酸エスエルを簡便かつ迅速にin situ測定することが出来る。リン酸エスエルはＡＴＰ等の生体エネルギー物質や、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の生体情報分子である。従って、本発明は、環境、医学、臨床検査、食品衛生、及びバイオ研究等の広範囲な分野における測定・計測手段として広い用途を提供するものである。
【図１】
0004755097.tif 000002
【図２】
0004755097.tif 000003
【図３】
0004755097.tif 000004