(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチドTyr-Pro及びその塩を有効成分として含有し、その有効投与量が0.1〜10mg/kg体重・日であることを特徴とする経口投与用血圧降下剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血圧降下作用を有し、医薬品、特定用保健用食品、健康食品等に利用でき、かつ、微量の投与量でも効果を発揮するジペプチドを有効成分として含有する血圧降下剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症の発症と高い相関性を有するアンギオテンシン変換酵素（Angiotensin Converting Enzyme，以下ＡＣＥという）は、主に肺や血管内皮細胞に存在し、レニンにより分解されたアンギオテンシンＩに作用して、血管壁平滑筋収縮作用を有する活性ペプチドであるアンギオテンシンIIを産生することにより、強い血圧上昇作用を示すことが知られている。更に、ＡＣＥは降圧作用を有するブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有する。このようにＡＣＥは血圧を上昇させる作用を有するので、この酵素活性を阻害することにより血圧上昇を抑制することが出来ると考えられている。
【０００３】
このようなＡＣＥ阻害作用を有する物質は既に種々の天然物及び合成物において見いだされ、それらの物質のいくつかは降圧剤として実用化されている。例えば化学合成物としては、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカトプロパノイル−Ｌ−プロリン）が有名である。しかし、このような化学合成物は、常に安全性の問題を考慮しなければならないという問題点がある。
【０００４】
一方天然物成分としては、乳蛋白質、大豆蛋白質あるいは魚肉蛋白質に、様々なＡＣＥ阻害ペプチドが含まれていることが報告されている。これら天然物由来のＡＣＥ阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤として実用化が検討されている。しかし、これらの天然物由来ペプチド群に含まれる血圧降下ペプチドは微量であり、現実的な経口での摂食量では大きい効果が期待出来ないものや、ＡＣＥ阻害活性は強いが血圧降下作用はあまり強くないものが多い。
【０００５】
近年、乳酸菌発酵乳から強いＡＣＥ阻害活性を有する２種のトリペプチド、即ちＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏとＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏとが報告されている（J. Dairy Sci. ７８：７７７−７８３）。更に、これらのトリペプチドの強い血圧降下作用が自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）にて確認された報告がある（J. Dairy Sci. ７８：１２５３−１２５７）。しかしながら、乳酸菌発酵乳中に産生されるトリペプチドは、乳酸発酵の進行と共に乳酸菌が産生する蛋白質分解酵素により生じるために、発酵条件によりトリペプチド量は変動しやすく、一定の含有量で得ることが困難である。
【０００６】
また、乳を原料として乳酸菌発酵により製造されたヨーグルトが血圧降下作用を有することが報告されている（特開平７−１２３９７７号公報）。しかし、その血圧降下作用の原因物質に関しては、明らかではない。
【０００７】
従って、血圧降下作用の原因物質が明らかで、工業的に安定した生産が可能であり、且つ微量の投与量において有効な安全性の高い天然物由来の血圧降下ペプチドが望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全性が高く、経口投与（摂取）で有効な天然物由来の医薬品、特定保健用食品、健康食品等に使用することができる血圧降下剤及びその製造方法を提供することにある。本発明の別の目的は、前記血圧降下剤を精製することにより、微量の経口投与（摂取）でも有効な天然物由来の血圧降下剤を提供することにある。
【０００９】
本発明によれば、ジペプチドTyr-Pro及びその塩を有効成分として含有し、その有効投与量が0.1〜10mg/kg体重・日であることを特徴とする経口投与用血圧降下剤が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いて、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）乳酸菌を培養し、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液を得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提供される。
【００１１】
更に、本発明によれば、前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液をさらに遠心分離し、上清液を逆相系樹脂により精製処理することを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提供される。
【００１２】
更に、本発明よれば、前記ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）であることを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の血圧降下剤は、有効成分として、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を含有する。前記塩としては、薬理学上許容されるジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏと酸等との塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
【００１４】
前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を有効成分として含む本発明の血圧降下剤は、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む食品素材を蛋白質分解酵素により処理する方法、公知の有機化学的合成法等の方法によっても製造することができるが、好ましくはアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いて、乳酸菌好ましくはラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）乳酸菌を培養し、前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液を得ることにより得ることができる。即ち、前記培地を乳酸菌好ましくはラクトバチルス属乳酸菌で発酵処理することにより前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを得ることができる。
【００１５】
前記ラクトバチルス属乳酸菌としては、例えばラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブルキィ・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）等を挙げることができるが、特にラクトバチルス・ヘルベチカスが好ましい。
【００１６】
前記培地としては、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む限り特に限定されないが、例えば、獣乳の全乳、脱脂乳、カゼイン等の獣乳蛋白質、とうもろこし、コーン蛋白質、小麦、小麦蛋白質、大豆、脱脂大豆、大豆蛋白質等の植物蛋白質等の各種食品素材等に由来する培地、又はブリッグス・リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）、ＭＲＳブロス等の市販の乳酸菌用培地等を挙げることができる。更に、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含む獣乳蛋白質及び／又は植物蛋白質等を含有する天然物由来の食品原料を水溶液状として、更に、必要に応じてその他の乳酸菌用培地、酵母エキス、ビタミン類、ミネラル類等を添加した培地等を用いることもできる。
【００１７】
前記乳酸菌の培養は、前記培地を加熱殺菌し所定の培養温度まで冷却後に、予め前培養しておいた乳酸菌スターターを添加することにより行なうことができる。前記乳酸菌スターターの接種量は、培地に対して乳酸菌数で１０5個／ｍｌ〜１０7個／ｍｌとするのが好ましい。また培養温度は通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃、培養時間は通常３〜４８時間、好ましくは６〜２４時間の範囲で行なうことができる。特に乳酸菌の培養を効果的に行なうためには、培地のｐＨを好ましくは３．５〜７、さらに好ましくは４〜５の範囲で行うのが望ましい。さらに、ｐＨ４〜７に維持するようにｐＨスタット培養を行なうのが望ましい。培養の終了点は、特に限定されないが、例えば乳酸菌数が１０8個／ｍｌ以上になった時点で反応を終了することができる。
【００１８】
前記方法等により得られたジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液をさらに遠心分離し、上清液を逆相系樹脂により精製処理することにより、有効成分であるジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの含有量を高めた血圧降下剤を得ることもできる。
【００１９】
前記遠心分離は、例えば、好ましくは回転数５，０００から２０，００回転／分において、１〜１０分間行なうことができる。また連続遠心分離機を用いることにより行なうこともできる。
【００２０】
前記逆相系樹脂による精製処理は、逆相系樹脂等を用いて吸着及び溶出する方法及び／又は逆相クロマトグラフィー等により行なうことができ、これによりジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの精製度を高めることができる。前記逆相系樹脂を用いて吸着及び溶出する方法としては、具体的には、例えば逆相系樹脂として「Preparative  Ｃ１８」（商品名、ウオーターズ社製）等の樹脂を用いて、カラム法又はバッチ法により処理し、次いで前記吸着画分を、例えば水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル等の極性溶媒、特に好ましくは２０容量％アセトニトリル−水混合溶液等により溶出した後、アセトニトリル及び水を留去することによりジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを濃縮する方法が挙げられる。
【００２１】
前記逆相クロマトグラフィーによる処理は、特に限定されないが、公知の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により行なうことができる。前記ＨＰＬＣは、好ましくは前記逆相系樹脂を用いて吸着及び溶出する方法で例示したものと同様の溶媒を用いて、直線濃度勾配法により精製度の高いジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを得ることができる。さらに前記逆相クロマトグラフィーによる処理を複数回繰り返し、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの精製度をさらに上げることもできる。
【００２２】
本発明の製造方法により得られる血圧降下剤は、通常ペプチド混合物を含むものとして得られ、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ以外の他のペプチド成分を含有してもよい。飲食品等に使用する場合には、前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液及び／又はそれを精製処理したものをそのまま用いることが出来る。また、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラムドライヤー乾燥等により粉末化した形で使用することも出来る。
【００２３】
本発明の血圧降下剤の有効投与量は、患者の年齢、症状により異なるが、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩として０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ・日である。好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／体重ｋｇ・日を投与するのが望ましい。０．０５ｍｇ／体重ｋｇ・日以下の投与量では十分な効果が期待できず、また１０ｍｇ／体重ｋｇ・日以上の投与量では効果の増強が認められないため不経済である。
【００２４】
前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを正常血圧値を示すＷＫＹラット（１８週齢、体重約３２０ｇ、ｎ−５）に１０ｍｇ／体重ｋｇ・日、１ヶ月間連続経口投与したが、ラットの行動、外観、血圧値、解剖所見に異常は認められなかった。ラクトバチルス属乳酸菌による発酵食品は、長年にわたり人類に食用されているものであり、本発明の血圧降下剤に含まれるＴｙｒ−Ｐｒｏの安全性は問題ないと思われる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の血圧降下剤は、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを有効成分として含有するので、これまでに報告されている食品素材由来の血圧降下ペプチドに比べて、極めて低い投与量で血圧を降下させることができ、安全性も高く、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に用いることが可能である。また、本発明の製造方法は、ペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いてラクトバチルス属乳酸菌を培養する製造方法であるので、天然物由来のペプチド、蛋白質等を原料として、安全性の高いジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを有効成分として含有する血圧降下剤を容易にしかも安価に製造することができる。
【００２６】
【実施例】
以下本発明を製造例及び実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
【製造例１】
乳酸菌スターターとしてラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰＮ４（工業技術院寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８３５）を用いた発酵乳３００ｇを９重量％の脱脂粉乳水溶液１０ｋｇに接種し、３７℃、８時間培養した。カード状組織形成し、ｐＨ４．２に達した時点で発酵を終了した後に冷却した。得られた発酵乳溶液中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが１．０ｍｇ／１００ｇ含有されていた。
【００２８】
得られた発酵乳溶液１０ｋｇを撹拌均質化後に１０，０００回転／分、１０分間遠心分離を行ない培養上清（ホエー）８．４ｋｇを回収した。培養上清中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが１．１ｍｇ／１００ｇ含有されていた。
【００２９】
【実施例１】
製造例１で得られたホエー１２０ｍｇをｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（ウオーターズ社製）１０個を用いて吸着させ、０．１重量％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）含有アセトニトリル（Ｂ液）を０．１重量％ＴＦＡ水溶液（Ａ液）で希釈した溶出液で表１に示す各種の条件にて溶出し、吸着せずに流出したもの及び各条件で溶出したものをそれぞれ画分▲１▼〜▲６▼とし、それぞれ凍結乾燥した後４０ｍｌの生理食塩水にて溶解し、試料▲１▼〜▲６▼とした。
【００３０】
分画前の前記得られたホエー及び試料▲１▼〜▲６▼を、それぞれ自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ：日本チャールズリバー社、１群５匹、２０−２２週齢雄）に胃ゾンデにて１ｍｌ／匹投与し、６時間後の最高血圧値の変化値をコントロール（生理食塩水投与）群と比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置（商品名「ＰＥ３００」、ナルコバイオシステムズ社製）を用い、tail cuff法にて求めた。その結果、表１に示す通り試料▲２▼について有意な降圧作用が確認され、画分▲２▼が活性画分であることが見いだされた。
【００３１】
【表１】
0004713053.tif 000002
【００３２】
次に試料▲２▼を以下の条件に従った逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により溶出し、表２に示す溶出時間に従って更に４つの画分に分画し、画分▲２▼−１〜▲２▼−４とした。尚、１回の溶出における試料▲２▼の供給量は１ｍｌとし、１５回の溶出を繰り返し、合計１５ｍｌの試料▲２▼を分画した。
【００３３】
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画分▲２▼−１〜▲２▼〜４をそれぞれ凍結乾燥した後１５ｍｌの生理食塩水に溶解し、試料▲２▼−１〜▲２▼−４とし、前記条件と同様にＳＨＲへ胃ゾンデにて１ｍｌ／匹経口投与し、６時間後の最高血圧値の変化値をコントロール群（生理食塩水投与）と比較して血圧降下作用を調べた。その結果、表２に示す通り試料▲２▼−２において強い血圧降下作用が確認され、画分▲２▼−２が活性画分であることが見いだされた。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
試料▲２▼−２の１０ｍｌを以下の溶出条件に従った他は前記と同様のＨＰＬＣにより、１ｍｌずつ１０回繰り返し溶出し、表３に示す溶出時間に溶出した５つの主要ペプチドピークを分取し、それぞれ画分▲２▼−２−１〜▲２▼−２−５とした。
【００３６】
溶出条件：Ｂ液５％（Ａ液９５％）〜Ｂ液２０％（Ａ液８０％）まで直線濃度勾配溶出（０〜６０分）
流速：１ｍｌ／分
得られた画分▲２▼−２−１〜▲２▼−２−５をそれぞれ凍結乾燥した後生理食塩水１０ｍｌに溶解し試料▲２▼−２−１〜▲２▼−２−５とし、前記条件と同様にそれぞれＳＨＲへ胃ゾンデにて１ｍｌ／匹経口投与し、６時間後の最高血圧値の変化値をコントロール群（生理食塩水投与）と比較して血圧降下作用を調べた。その結果、表３に示す通り試料▲２▼−２−２において強い血圧降下作用が確認された。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
試料▲２▼−２−２の１ｍｌを、試料▲２▼−２を溶出した際と同様のＨＰＬＣにより再び精製した後、島津製作所社製「全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」によりペプチドのＮ末端からのアミノ酸配列を分析した結果、Ｔｙｒ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を有することが確認された。また、精製ペプチドを６Ｎ塩酸にて１０５℃、２４時間加水分解し、高速アミノ酸分析装置（商品名：アミノ酸分析システム、日本分光工業株式会社製）にてアミノ酸分析を行った結果、Ｔｙｒ及びＰｒｏが等モル含まれることが確認された。従って、得られたペプチドはＴｙｒ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を有するジペプチドであると結論した。
【００３９】
【製造例２】
ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰＮ４（工業技術院寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８３５）発酵乳３ｋｇを９重量％の脱脂粉乳水溶液１００ｋｇに接種し、３７℃、２０時間培養した。得られた発酵乳溶液を１０，０００回転／分にてシャープレス型遠心分離機を用いて処理し、培養上清（ホエー）７８ｋｇを回収した。次いで、培養上清をPreparative  Ｃ１８充填カラム（容量３リットル、ウオーターズ社製）に通し、５％アセトニトリルを含む水溶液１０ｋｇにて洗浄後、１０％アセトニトリルを含む水溶液５ｋｇにて溶出した。溶出された画分は、凍結乾燥物１１８６ｍｇを得た。この凍結乾燥物中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが６５２ｍｇ含まれていた。ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの純度は５５％であった。
【００４０】
【実施例２】
製造例１で得られた発酵乳溶液を用いて血圧降下作用を確認した。血圧降下作用の測定はＳＨＲを用いて実施例１の方法に準じて行った。ＳＨＲに発酵乳溶液及び未発酵乳溶液を４ｍｌ／匹（１２ｍｌ／体重ｋｇ）経口投与し、６時間後の最高血圧値を測定した。その結果血圧降下作用が確認された。結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】
0004713053.tif 000006
【００４２】
【実施例３】
実施例１で特定された血圧降下ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを、島津製作所製ペプチド自動合成装置「ＰＰＳＭ  ８型」を用いて固相合成した。得られたペプチドＴｙｒ−ＰｒｏのＨＰＬＣでの溶出位置は実施例１において精製されたペプチドと同様であった。
【００４３】
この合成ペプチドの血圧降下作用を以下の方法で確認した。合成ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの０．０５、０．１、０．３、１．０、３．０、又は１０ｍｇ／体重ｋｇを、実施例１と同様にＳＨＲに経口投与し、投与６時間後の最高血圧値を測定し、コントロール群（生理食塩水投与群）の結果と比較した。結果を表５に示す。表５より０．０５〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用量依存的効果が確認された。
【００４４】
【表５】
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