(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の前立腺癌についての指標を提供するためのin vitroの方法であって、
（ａ）患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物について、前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡに特異的な第１プライマーペアを用いた第１のin vitroのＲＮＡ増幅アッセイを行い、但し、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも１個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡは以下の配列 (i)〜(iii)：
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するＲＮＡ配列からなるものであり、
（ｂ）患者から得た該尿サンプルまたはその核酸抽出物について、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ以外の前立腺特異的ｍＲＮＡに特異的な第２プライマーペアを用いた第２のin vitroのＲＮＡ増幅アッセイを行い、そして
（ｃ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡおよび該前立腺特異的ｍＲＮＡ、またはこれらの増幅産物を検出する
ことを包含する方法であって、
正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの存在量と比較して、検出した該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの存在量が増加しているという結果は、該患者に前立腺癌が発生する危険度が高いことまたは該患者に前立腺癌が存在することの指標となり、
正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの存在量と比較して、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡが検出されないまたはその存在量が減少しているという結果は、該前立腺特異的ｍＲＮＡが検出される場合には、該患者に前立腺癌が発生する危険度が低いことまたは前立腺癌が存在しないことの指標となる。
【請求項２】
ｍＲＮＡの増幅をリアルタイムで行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍＲＮＡの検出を、蛍光検出法、化学発光検出法または比色検出法で行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該前立腺特異的ｍＲＮＡの検出によって、該尿サンプル中に少なくとも１個の前立腺細胞が存在することを確認する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該前立腺特異的ｍＲＮＡが、ＰＳＡ ｍＲＮＡ、ヒト カリクレイン２ ｍＲＮＡ、ＰＳＭＡ ｍＲＮＡ、トランスグルタミナーゼ４ ｍＲＮＡ、酸ホスファターゼ ｍＲＮＡ、ＰＣＧＥＭ１ ｍＲＮＡ、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該前立腺特異的ｍＲＮＡがＰＳＡ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ＰＳＡ ｍＲＮＡが、ヒト カリクレイン２ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該ＲＮＡ増幅法が、
（ａ）核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、
（ｃ）転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、および
（ｄ）リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）
からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの増幅と該前立腺特異的ｍＲＮＡの増幅を同時に行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの増幅を、配列番号３と４の塩基配列からなるプライマーペアを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの検出を、分子ビーコンを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該分子ビーコンが配列番号６の塩基配列を有することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＰＳＡ ｍＲＮＡの増幅を、配列番号１と２の塩基配列からなるプライマーペアを用いて行うことを特徴とする、請求項６〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該ＰＳＡ ｍＲＮＡの検出を、ＰＳＡ分子ビーコンを用いて行うことを特徴とする、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該ＰＳＡ分子ビーコンが、配列番号５の塩基配列を有することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該同時に行う核酸の増幅を、１つの容器内で行うことを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＰＳＡ ｍＲＮＡの検出を、化学発光標識を用いたホモジニアス検出法で行うことを特徴とする、請求項６〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
該化学発光標識がアクリジニウムエステルであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該少なくとも１個の前立腺細胞からｍＲＮＡを抽出することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
該ｍＲＮＡを、
(a) シリカ系精製法、または
(b) ターゲットキャプチャー法
で抽出することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該尿サンプルが、前立腺細胞数が増加した、患者の排尿サンプルであることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物から前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡを増幅するための特異的な第１プライマーペアであって、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも１個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡは、以下の配列 (i)〜(iii)：
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するＲＮＡ配列からなるものであることを特徴とする、特異的な第１プライマーペア、
（ｂ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ以外の前立腺特異的ｍＲＮＡを増幅するための特異的な第２プライマーペア、および
（ｃ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡおよび該前立腺特異的ｍＲＮＡの少なくとも１種が存在する時に、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡと該前立腺特異的ｍＲＮＡの増幅産物の検出を可能とする試薬
を包含する、患者における前立腺癌の存在または前立腺癌発生危険度を判定するためのキットであって、
（ｉ）正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの存在量と比較して、検出した該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの存在量が増加しているという結果を、該患者に前立腺癌が発生する危険度が高いことまたは該患者に前立腺癌が存在することの指標に相関させ、そして
（ii）正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの存在量と比較して、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡが検出されないまたはその存在量が減少しているという結果を、該前立腺特異的ｍＲＮＡが検出される場合には、該患者に前立腺癌が発生する危険度が低いことまたは前立腺癌が存在しないことの指標に相関させる
ことが可能なキット。
【請求項２３】
該前立腺特異的ｍＲＮＡが、ＰＳＡ ｍＲＮＡ、ヒト カリクレイン２ ｍＲＮＡ、ＰＳＭＡ ｍＲＮＡ、トランスグルタミナーゼ４ ｍＲＮＡ、酸ホスファターゼ ｍＲＮＡ、ＰＣＧＥＭ１ ｍＲＮＡ、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
該前立腺特異的ｍＲＮＡがＰＳＡ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
（ａ）患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物を前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、但し、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも１個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡは、
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するＲＮＡ配列からなるものであり、
（ｂ）該尿サンプルまたはその核酸抽出物を、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ以外の前立腺特異的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｃ）該患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物中の該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量および該前立腺特異的ｍＲＮＡの量を測定し、そして
（ｄ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量および該前立腺特異的ｍＲＮＡの量を予め決められたカットオフ値と比較して、該尿サンプルまたはその核酸抽出物中に前立腺癌が存在するか否かを判定する
ことを包含する、患者における前立腺癌素因または前立腺癌の存在の危険度を検出するためのin vitroの方法。
【請求項２６】
該前立腺特異的ｍＲＮＡが、ＰＳＡ ｍＲＮＡ、ヒト カリクレイン２ ｍＲＮＡ、ＰＳＭＡ ｍＲＮＡ、トランスグルタミナーゼ４ ｍＲＮＡ、酸ホスファターゼ ｍＲＮＡ、ＰＣＧＥＭ１ ｍＲＮＡ、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡからなる群より選ばれる１種であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該前立腺特異的ｍＲＮＡがＰＳＡ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡと該前立腺特異的ｍＲＮＡを同時に同じ容器内で増幅する、
（ｂ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３増幅産物と該前立腺特異的増幅産物の検出を同じ容器内で行う、または
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）を共に行う
ことを特徴とする、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２９】
内部対照（ＩＣ）と共に、該内部対照を増幅、ハイブリダイズまたは検出するためのプライマー、プローブおよび試薬からなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含することを特徴とする、請求項２２、２３または２８に記載のキット。
【請求項３０】
該内部対象（ＩＣ）が、
（ａ）精製核酸、
（ｂ）細胞、
（ｃ）標的核酸を含有するウイルス粒子、および
（ｄ）細胞小器官
からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
該内部対照（ＩＣ）の検出、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３増幅産物の検出および該前立腺特異的増幅産物の検出を全て異なる方法で行うことを特徴とする、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡと前立腺特異的ｍＲＮＡの量を、
（ａ）ＲＮＡ増幅アッセイ法、および
（ｂ）ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ法
からなる群より選ばれるアッセイ法で求めることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３３】
該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡと該前立腺特異的ｍＲＮＡの量の測定を、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、
（ｂ）核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、
（ｃ）転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、および
（ｄ）リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）
からなる群より選ばれるアッセイ法で行うことを特徴とする、請求項２５、２６または３２に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物を、前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、但し、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも１個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡは、
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するＲＮＡ配列からなるものであり、
（ｂ）該尿サンプルまたはその核酸抽出物を、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ以外の前立腺特異的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｃ）該尿サンプルまたはその核酸抽出物中の、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ量および該前立腺特異的ｍＲＮＡ量を測定し、
（ｄ）経時的に該患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物を用いて上記工程（ａ）と（ｂ）を繰り返し、そして
（ｅ）工程（ｄ）で求めた該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ量を、工程（ｃ）で求めた該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ量と比較することで、患者中の前立腺癌の進行を観測し、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡは存在しないが、該前立腺特異的ｍＲＮＡは存在することをもって、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことを確認する
ことを包含する、患者中の前立腺癌の進行を観測するin vitroの方法。
【請求項３５】
該前立腺特異的ｍＲＮＡが、ＰＳＡ ｍＲＮＡ、ヒト カリクレイン２ ｍＲＮＡ、ＰＳＭＡ ｍＲＮＡ、トランスグルタミナーゼ４ ｍＲＮＡ、酸ホスファターゼ ｍＲＮＡ、ＰＣＧＥＭ１ ｍＲＮＡ、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該前立腺特異的ｍＲＮＡがＰＳＡ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
該前立腺特異的ｍＲＮＡがカリクレインファミリーに属する他のｍＲＮＡにもハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
該尿サンプルまたはその抽出物が、
（ａ）精製核酸、
（ｂ）細胞、
（ｃ）標的核酸を含有するウイルス粒子、および
（ｄ）細胞小器官
からなる群より選ばれる内部対象（ＩＣ）で強化したものであることを特徴とする、請求項１〜２１、２５、２６および３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
患者における前立腺癌の発見または前立腺癌発生危険度の判定のための診断キットであって、
（ａ）以下の配列（i）〜（iii）：
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれる１種のポリヌクレオチド配列に対応するＲＮＡ配列を有する前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った容器、
（ｂ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ以外の前立腺特異的ｍＲＮＡまたはその相補鎖に特異的にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー、および
（ｃ）該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡまたは該前立腺特異的ｍＲＮＡが存在する時に、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡと該前立腺特異的ｍＲＮＡの検出を可能とする試薬
を包含し、該前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ｍＲＮＡは存在しないが、該前立腺特異的ｍＲＮＡは存在することをもって、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことを確認することを特徴とするキット。
【請求項４０】
検出用の該試薬が、以下の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）放射性同位元素、
（ｂ）酵素、
（ｃ）蛍光基、
（ｄ）ビオチン、
（ｅ）化学発光基、および
（ｆ）色素粒子
からなる群より選ばれるレポーター基または標識を包含することを特徴とする、請求項３９に記載の診断キット。
【請求項４１】
前立腺細胞数が増加した該尿サンプルが、直腸指診（ＤＲＥ）に続いて採取した尿サンプルであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は前立腺癌に関する。より詳細には、本発明は、前立腺癌抗原ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡを検出することによって、患者サンプル中の前立腺癌についての指標を提供するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去十年間において、前立腺の癌は男性で最も多く診断される悪性腫瘍となり、肺がんに続いて、西洋社会における男性の癌死亡原因の２位となった。
【０００３】
前立腺癌が前立腺から広がる前に早期発見および治療することによって、この疾患の死亡率が低下する。これは、この悪性度が高いが進行の遅い悪性腫瘍によって死亡する危険度の高い若い男性において特に真実である。この認識は、早期診断および治療のための運動の増加を促した。実際、米国癌学会（American Cancer Society）および米国泌尿器科学会（American Urological Association）が、男性人口の全体に対して年１回の前立腺癌検診を５０歳から始めるよう推奨している。検診開始の推奨年齢は、前立腺癌の家族歴または他の危険因子を示す男性では４０歳に引き下げられている。
【０００４】
前立腺癌の検診に対して注目が集まる中、過去にないほど多くの男性が前立腺癌について慣例的な検診を受けている。前立腺癌発生率の見かけ上の増加と、前立腺癌と診断される平均年齢の見かけ上の低下に反映されているように、予想通り、この習慣は、前立腺癌の発生直後の早期発見を増加させた。前立腺癌を転移する前に早期発見することによって、全体の死亡率が下がることになると臨床で期待されている。早期治療はより保存的であり、成功率が高いので、少ない費用で患者一人当たりの治療が可能であることから、保険会社は、早期の検診と発見は医療費負担の低下に還元されると見ている。この目標を達成する鍵は、未だにより良い鑑別診断手段を提供することである。
【０００５】
今では前立腺癌の検診には、直腸指診（ＤＲＥ）による前立腺の触診と前立腺特異的抗原（ＰＳＡ／ｈＫ３／ｈＫＬＫ３）の血漿濃度解析の両方が含まれる。ＰＳＡは前立腺上皮の産生するセリンプロテアーゼであり、通常は精液を液化するために精液中に分泌されるものである。前立腺の健全な解剖学的状態の崩壊は、通常はＰＳＡを前立腺の精管内に留めておく細胞バリアーの欠陥を招くことがあり、その結果、血液または尿にＰＳＡが放出されることとなる。数多くの症状によってＰＳＡの血液中への洩れは生じる。このような症状には、前立腺の炎症、尿閉、前立腺の感染症、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）および前立腺癌が含まれる。前立腺の物理的操作も血清ＰＳＡ濃度を上昇させることがあるが、直腸指診（ＤＲＥ）などの穏やかな刺激は、通常、血清ＰＳＡ濃度を上昇させることはない。従って、血清ＰＳＡを前立腺癌の指示因子とした検診が正確な予測をできないことは、驚きに値しない。
【０００６】
測定した血中ＰＳＡ濃度が種々の要因によってもたらされた結果かもしれないという事実にもかかわらず、それは前立腺癌の一次検診の基礎となっている。前立腺癌を予測するための診断アッセイとしての総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）の測定は、１９９１年から用いられている。血清濃度が４ｎｇ／ｍｌ以上であることは異常であり、前立腺癌の可能性を示すと考えられる。しかし、このようなｔＰＳＡ濃度上昇の感度はたった７９％であり、従って患者の２１％において前立腺癌を発見しないまま放置している。４ｎｇ／ｍｌ以上のｔＰＳＡ値の全てにおいて、その特異性は非常に乏しい。更に、４．０ｎｇ／ｍｌを超えるｔＰＳＡ濃度の特異性は２０％〜５９％であり、平均は約３３％であると報告されている。偽陽性の大部分は、最終的には良性前立腺肥大（ＢＰＨ）であると示されている。一般にグレーゾーンと呼ばれる４〜１０ｎｇ／ｍｌの低い領域に含まれる、中庸に上昇したｔＰＳＡの特異性が最も低い。このような低レベルの特異性は、経直腸的超音波断層法や前立腺生検検査といった、より侵襲性が高く高価な診断方法を更に実施する結果となる。このような試験は、必要のない場合には患者にとって外傷性が高い。また、偽陽性であると証明されるまでの間、陽性であると診断されることの精神的衝撃も軽んじるべきではない。
【０００７】
ｔＰＳＡの欠点ゆえに、このあいまいな診断手法の感度と特異性を向上するためのＰＳＡ誘導体の開発の試みに研究の焦点が合わされてきた。
【０００８】
１つの修飾は遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）であり、これは１９９８年にＦＤＡの認可を受けている。血清中のＰＳＡは、未結合の型または循環プロテアーゼ阻害剤（最も一般的にはα−１−アンチトリプシン（ＡＣＴ））との複合体の型で存在する。臨床医は、前立腺癌を発生していないかＢＰＨを発症している男性に比べて、前立腺癌を保有する男性において、ＡＣＴに結合したＰＳＡの比率が顕著に高いことを示した。ガイドラインとしては、総ＰＳＡの２５％以下が遊離であることは、前立腺癌の可能性を示す。ｆＰＳＡアッセイは、ｔＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍｌの男性に用いる方法として認可されている。従って、ｆＰＳＡアッセイは、ｔＰＳＡのみによる検査の特異性を向上する方法と位置づけられている。しかし、ｆＰＳＡ試験の的中率は、ｔＰＳＡ濃度が本当に低いか本当に高いヒトではさほどよくない。ｆＰＳＡの測定値に係らず、非常に低いｔＰＳＡは癌が存在しないことの予兆であり、一方この逆もまた非常に高いｔＰＳＡについて真実である。ｆＰＳＡはＢＰＨと前立腺癌の両方に関連する因子であるため、その診断における有用性は比較的限られたものである。ｆＰＳＡをｔＰＳＡと組み合わせて用いる方法は、不必要な生検の数を約２０％減少することが示されている。
【０００９】
前立腺の生検が前立腺癌を確認するための黄金の基準であることは明確である。しかしながら、生検も常に１００％の精度を誇るわけではない。標準的な生検は、経直腸的超音波ガイド下で組織サンプルの採取を行う６ヶ所生検である。癌を検出するのに６個のサンプルでは不十分なことが多く、２回目の生検または６個を超える数のサンプルが必要である。
【００１０】
過去１０年間の前立腺癌検診の進歩にもかかわらず、現存の手段を組み合わせて使用しても満たされることのない、診断感度と特異性に関する多大な要求が存在する。この要求と、前立腺癌の高い発生率や早期の正確な癌発見の重要性とを組み合わせると、真の鑑別診断手段について考えられる有用性は極めて重要である。
【００１１】
新規な前立腺癌マーカーであるＰＣＡ３が、前立腺癌の発達と関連した遺伝子を見出すためのディファレンシャルディスプレイ法によって数年前に発見された。ＰＣＡ３は９番染色体に位置し、４つのエクソンからなる。これは選択的スプライシングおよびポリアデニル化によって生じる少なくとも４つの異なる転写産物をコードする。ＲＴ−ＰＣＲ解析によってＰＣＡ３の発現は前立腺に限定され、精巣、卵巣、乳房および膀胱を含む試験した他の組織には存在しないことが判明した。ノーザンブロット解析の結果は、ＰＣＡ３が試験した前立腺癌の大多数（５０人中４７人）で高度に発現されているが、同じ患者から得たＢＰＨ細胞または正常前立腺細胞では発現していないか、発現量が非常に低いことを示した（Cancer Res 1999 Dec 1;59(23):5975-9）。更に、前立腺癌に関する、ＲＮＡテロメラーゼ ＲＴの臨床試験とＲＮＡ ＰＣＡ３検出法との比較に関する最近の研究は、ＰＣＡ３遺伝子がより優れたマーカーであることを示した（Cancer Res 2002 May 1; 62(9):2695-8）。
【００１２】
ＰＣＡ３遺伝子は４つのエクソン（ｅ１〜ｅ４）と３つのイントロン（ｉ１〜ｉ３）からなる。ＰＣＡ３は今までに同定された前立腺癌マーカーの中で最も優れたものであると考えられるが、その特異性については文献で議論されている。例えば、Gandini et al. 2003は、ＰＣＡ３の前立腺特異的発現はＰＣＡ３遺伝子のエクソン４に限られていると主張している。しかし、本願の出願人は、最近の特許出願において、これは正しくないことを示した（カナダ特許願第2,432,365号）。
【００１３】
進行した前立腺癌が男性人口のかなりの割合において未だに生命を脅かす疾患であるという事実を鑑みると、最も特異的、選択的且つ迅速な前立腺癌検出方法およびキットを提供することに対する要求は今でも残っている。
【００１４】
本発明は、このような要求を、他の要求と共に満足させることを目的とする。
【００１５】
本明細書は数々の文献に参照するが、その内容は明細書中の記載によって完全に組み込まれているものとする。
【００１６】
発明の詳細の説明 
本発明は、従来技術の診断方法とキットよりも特異性と選択性が高い、前立腺癌についての指標を提供するための方法とキットに関する。
【００１７】
本発明は、患者、特に患者の尿サンプルから、ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡを検出することによって前立腺癌についての指標を提供するための方法に関する。
【００１８】
更に本発明は、患者における前立腺癌の存在の危険度または前立腺癌素因を検出するための方法に関する。また、患者の前立腺癌の進行を観測する方法も開示する。
【００１９】
１つの特定の態様において本発明は、ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡの存在を検出することによって、尿サンプル中の前立腺癌についての指標を提供するための方法に関する。１つの態様においては、サンプル中に含まれる第２前立腺特異的核酸配列も同時に増幅する増幅法を用いて、ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡを検出する。
【００２０】
本発明の更なる態様においては、増幅する第２前立腺特異的マーカーは、ＰＳＡ、ヒト カリクレイン２（ｈＫ２／ＫＬＫ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１ ＲＮＡからなる群より選ばれるものである。
【００２１】
本発明の他の態様においては、ＲＮＡはＲＮＡ増幅法で検出する。更なる態様においては、ＲＮＡ増幅法を、特異的な蛍光プローブを用いて増幅産物をリアルタイムで検出する方法と組み合わせて用いる。更なる別の態様においては、増幅法はＰＣＲ法である。更なる態様においては、ＰＣＲ法はリアルタイムＰＣＲ法または増幅産物の検出をリアルタイムで行うことが可能な関連した方法である。
【００２２】
関連する態様においては、ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡは、核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）と呼ばれるin vitro ＲＮＡ増幅法によって抽出した核酸から検出する。もちろん、他のＲＮＡ増幅法も知られており、本発明の方法とキットはＮＡＳＢＡ法に限定されるものではない。本発明を限定することのないＲＮＡ増幅法の具体例としては、転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）およびリガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が挙げられる。
【００２３】
更なる態様においては、蛍光プローブを用いて均質相で増幅産物を検出する。１つの態様においては、ビーコン手法を用いる。他の態様においては、蛍光検出法または比色検出法を用いて増幅産物を固相上で検出する。従って、ＲＮＡの検出および／または定量には、種々の蛍光検出法、比色検出法または酵素検出法を本発明に従って使用できることを理解されたい。他の種類の標識プローブや標識プライマー、または他の種類の検出方法も本発明で使用することができる（例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法やスロットブロット法などのハイブリダイゼーション解析方法と、放射性標識したプローブやプライマーとを使用することができる）。
【００２４】
１つの態様においては、ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡは、患者の排泄した尿から得た尿サンプルに含まれる細胞から得たものである。
【００２５】
他の態様においては、丁寧な直腸指診（ＤＲＥ）の後に尿サンプルを得る。増幅方法および／または検出方法が標的マーカー（ＰＣＡ３と第２マーカー）を検出するのに十分な感度を有する時には、当然のことながら、本発明の方法およびキットは、ＤＲＥを行わずに得た尿サンプルや、精子や、精子と尿の混合物（例えば、射精に続く最初の尿のサンプル）などの他の種類のサンプルに対しても使用可能であることを理解されたい。本発明の方法およびキットがこのようなサンプルでも実施可能であることは実験によって示されている。使用できる他のサンプルには、血液や血清が含まれる。
【００２６】
１つの態様においては、尿サンプルから回収した細胞を集め、総核酸抽出を実施する。１つの特定の態様においては、BOOM et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28: 495-503 の発表した、シリカビーズ上で行う固相バンド法（solid phase band method）を用いて総核酸抽出を行う。他の態様においては、別のターゲットキャプチャー法（下記参照）で核酸を精製する。当然のことながら、種々の核酸抽出法および核酸精製法が存在するので、本発明に従って他の方法を用いることができる点を理解されたい。本発明を限定することのない具体例としては、フェノール／クロロホルム抽出法およびターゲットキャプチャー精製法（下記参照）が挙げられる。他の方法も本明細書で参照する教科書に記載されている。尿サンプルまたは他のサンプルに含まれる前立腺細胞を安定化または保護するための数々の方法に加えて、前立腺細胞内に存在するＲＮＡを安定化または保護するための方法が当業界では知られている点も理解されたい。
【００２７】
他の態様においては、本発明の方法を、粗製、未精製または部分精製のサンプルを用いて行う。
【００２８】
１つの特定の態様においては、本発明は、サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在を検出するための、前立腺癌診断キットに関する。このようなキットは、通常、ＰＣＡ３核酸（例えば、ＰＣＡ３ ＲＮＡ）にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第１容器、および上記第２前立腺特異的配列にハイブリダイズする少なくとも１種の他のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブの入った第２容器を包含する。他の態様においては、ＰＣＡ３増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブの入った第３容器を更に包含する。好ましい態様においては、キットは更に補助成分の入った他の容器を包含し、補助成分は、更なるオリゴヌクレオチドやプライマー、および／または下記群から選ばれる少なくとも１種である：緩衝剤、アッセイに使用する試薬（例えば、洗浄試薬、ポリメラーゼ、内部対照（ＩＣ）など）、および結合した核酸プローブ／核酸プライマーの存在を検出することを可能にする試薬。もちろん、本発明のキットを数々の態様で提供することが可能である。例えば、増幅試薬と検出試薬の容器を分けることができる。このような態様の１つにおいては、本発明の標的核酸（例えば、ＰＣＡ３、第２前立腺特異的核酸および内部対照核酸）に特異的な増幅用またはハイブリダイゼーション用の試薬が第１の容器に入っており、検出用の試薬が第２容器に入っている。また、検出用試薬と増幅用試薬が同じ容器に入っていてもよい。
【００２９】
更に本発明は、サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在を検出するための前立腺癌診断キットに関する。このようなキットは、概して、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第１容器、および第２前立腺特異的配列のｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第２容器を包含する。他の態様においては、ＰＣＡ３増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブの入った第３容器を更に包含する。更に別の態様においては、第２前立腺特異的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブの入った第４容器を更に包含する。好ましい態様においては、キットは補助成分の入った他の容器を更に包含し、このような補助成分は、（例えば、内部対照用の）更なるオリゴヌクレオチドやプライマー、および／または下記群から選ばれる少なくとも１種である：緩衝剤、アッセイに使用する試薬（例えば、洗浄試薬、ポリメラーゼ、内部対照となる核酸や細胞など）、および結合した核酸プローブ／核酸プライマーの存在を検出することを可能にする試薬。当然のことながら、同じまたは異なる容器に試薬を分けるかまとめるかすることは、使用する抽出、増幅またはハイブリダイゼーションの方法および検出方法に加えて、安定性や保存の有無といった他のパラメーターによって決められる。
【００３０】
多数の方法およびキットが本発明の範囲内にある。例えば、ＰＣＡ３核酸配列を検出および／または増幅する方法は、第２前立腺特異的ポリヌクレオチドまたは他の標的配列を検出および／または増幅する方法と同一である必要はない。従って、例えば、ＲＮＡに基づく手法でＰＣＡ３を検出する方法やキットにおいて、第２前立腺マーカーや他の標的配列についてはＤＮＡに基づく手法を用いることもある。
【００３１】
当業者であれば、試験が陽性か陰性かを決定するために、本発明に関連して数々の統計方法を使用することができることを理解されたい。提供した決定樹は、本発明を限定することのないこのような統計方法の一例に過ぎない。
【００３２】
特に定義のない限り、本明細書で使用する科学用語と技術用語および命名は、本発明の技術分野に属する当業者によって一般に理解されるものとする。分子生物学用語の一般に理解されている定義は、例えば、以下の教科書に記載されている：“Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（微生物学および分子生物学辞典）”第２版（Singleton et al.著、１９９４年、John Wiley & Sons、ニューヨーク州、ニューヨーク）；“The Harper Collins Dictionary of Biology（ハーパーコリンズの生物学辞典）”(Hale と Marham著、１９９１年、Harper Perennial、ニューヨーク州、ニューヨーク）；Rieger et al.著、“Glossary of genetics: Classical and molecular（遺伝学小事典：古典と分子遺伝学）”第５版、Springer-Verlag、ニューヨーク、１９９１年；Alberts et al.著“Molecular Biology of the Cell（細胞の分子生物学）”第４版、Garland science、ニューヨーク、２００２年；および Lewin著、“Genes VII（遺伝子 VII）”、Oxford University Press、ニューヨーク、２０００年。概して、分子生物学的方法の手順などは、当業界で一般に用いられているものである。このような標準的な技術は参照したマニュアル、例えば、Sambrook et al.著（２０００年、“Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）”第３版、Cold Spring Harbor Laboratories）および Ausubel et al.著（１９９４年、“Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最近のプロトコル）”John Wiley & Sons、ニューヨーク）に記載がある。
【００３３】
本明細書の記載においては、種々の用語を広範にわたって使用する。本明細書と請求の範囲、並びにこのような用語によって含まれる範囲の理解を明瞭且つ一貫したものとするために、以下の定義を提供する。
【００３４】
用語の定義 
本明細書においては、ヌクレオチド配列は一本鎖で、５’から３'の方向を左から右に示し、当業界で一般的に使用されており、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）の推奨する記載方法に従って１文字ヌクレオチド記号を用いて示した。
【００３５】
本明細書では、数々の日常的に使用されている組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術用語に参照する。しかしながら、このようなｒＤＮＡ用語の定義を明瞭にし、一貫性を持たせるために、以下に選んだ用語の定義を説明する。
【００３６】
本明細書で使用するように、「核酸分子」や「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーを示す。例としては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびそれらのキメラが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸分子はクローニング技術や合成によって得ることができる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖（コード鎖または非コード鎖［アンチセンス鎖］）でもよい。従来のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）も「核酸」という用語に含まれ、ポリヌクレオチドやその類似体も同様である。核酸主鎖は、当業界では公知の種々の結合を含んでいてもよく、このような結合としては、１つまたは複数の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とも称する；Hydig-Hielsen et al., 国際公開番号 WO 95/32305）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合またはこれの組合せが挙げられる。核酸の糖構造は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは既知の置換を有する類似化合物、例えば、２’メトキシ置換体（２’−Ｏ−メチルリボフラノシル構造、国際公開番号 WO 98/02582を参照）および／または２’ハロゲン化合物置換体などである。窒素塩基は、通常の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その公知の類似体（例えば、イノシンなど；“The Biochemistry of the Nucleic Acids（核酸の生化学）”5-36、Adams et al.編、第１１版、１９９２年を参照）、プリン塩基またはピリミジン塩基の公知の誘導体（Cook、国際公開番号 WO 93/13121を参照）、あるいは主鎖に含まれる１つまたは複数の塩基が窒素塩基を含んでいない“脱塩基”残基（Arnold et al.、米国特許第5,585,481号）などである。核酸は、ＲＮＡやＤＮＡに見られるような通常の糖、塩基および結合のみを有するものでもよいし、通常の成分と置換体の両方を有するもの（例えば、メトキシ主鎖を介して結合した通常の塩基や、通常の塩基と共に塩基の類似体を１つまたは複数個有する核酸）でもよい。「ＰＣＡ３核酸」または「ＰＣＡ３ポリヌクレオチド」という用語は、本来のＰＣＡ３核酸配列を意味する。１つの態様においては、ＰＣＡ３核酸は配列番号９、１０または１３に示した塩基配列を有する。他の態様においては、ＰＣＡ３核酸は、ＰＣＡ３タンパク質をコードする。更なる態様においては、ＰＣＡ３核酸は非コード核酸配列である。更に別の態様においては、本発明の範囲に含まれるＰＣＡ３配列の標的となるＰＣＡ３配列は、患者サンプルに存在する天然のＰＣＡ３配列である。
【００３７】
「組換えＤＮＡ」という用語は、当業界で理解されているように、ＤＮＡセグメントを結合することによって得られるＤＮＡ分子を意味する。このような技術を、屡々、遺伝子工学と言う。「組換え核酸」も同じ意味である。
【００３８】
本明細書で用いる「ＤＮＡセグメント」という用語は、ヌクレオチドの直鎖状の伸長鎖または配列を含むＤＮＡ分子を意味する。この配列を遺伝子暗号（例えば、読み枠またはＯＲＦ）に従って解読すると、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片などと称することのできる、アミノ酸の直鎖状の伸長鎖または配列をコードしていることもある。
【００３９】
本明細書で用いる「増幅用ペア」または「プライマーペア」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチド（オリゴ体）のペアを意味し、選択した核酸配列を種々の増幅方法の１つによって増幅する際に２つ一緒に使用することを目的として選択したものである。
【００４０】
「増幅法」は、標的核酸配列、その相補鎖または断片のコピー（「アンプリコン」）を複数得るための、公知のin vitro方法の全てに該当する。In vitro増幅法は、増幅核酸を製造する方法を意味するが、増幅核酸は完全な標的領域よりも小さい部分やその相補鎖を含有するものでもよい。公知のin vitro増幅法には、転写媒介性増幅法、レプリカーゼ媒介性増幅法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅法およびストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）が挙げられる。レプリカーゼ媒介性増幅法は自己複製性ＲＮＡ分子とＱβ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、Kramer et al.、米国特許第4,786,600号）。ＰＣＲ増幅法は広く知られており、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの相補的な二本鎖のコピーを複数合成するために、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびサーマルサイクリング反応を使用する（例えば、Mullis et al.、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号と第4,800,159号）。ＬＣＲ増幅法は、少なくとも４種の異なるオリゴヌクレオチドを用い、ハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび変性からなるサイクルを複数回行うことによって、標的とその相補鎖を増幅する（例えば、ヨーロッパ公開公報第0 320 308号）。ＳＤＡ法は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を有するプライマーを用いることで、部分修飾したＤＮＡ二本鎖の、標的配列を含む一本鎖に制限エンドヌクレアーゼでニックを導入し、続いてプライマー伸長工程とストランド置換工程からなる一連の増幅反応を行う方法である（例えば、Walker et al. 米国特許第5,422,252号）。他のストランド置換増幅法は、エンドヌクレアーゼによるニックの導入を必要としない（Dattagupta et al. 米国特許第6,087,133号）。転写媒介性増幅法も本発明で使用する。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー配列が、ポリメラーゼによるプライマー伸長反応に基づくいかなるin vitro増幅法にも直ちに用いることができることを理解する（一般的記載についてはKwoh et al., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25を参照し、更にKwoh et al., 1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177、Lizardi et al., 1988、BioTechnology 6:1197-1202、Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260 および Sambrook et al.著、２０００年、“Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）”第３版、CSH Laboratoriesを参照）。当業界で一般的に知られているように、オリゴ体は選択した条件下で相補的配列を結合するように設計する。
【００４１】
本明細書で用いるように、「生理学的に関連する」という表現は、生理学的に関連する機能を制御することのできる相互作用を形容するために用いる。本発明においては、例えば、天然の条件下における遺伝子の転写が生理学的に関連する機能に含まれる。当然のことながら、ＰＣＡ３に対するタンパク質の結合も、これが天然の条件下で生じる場合には、生理学的に関連する機能とみなすことができる。
【００４２】
「ＤＮＡ」分子または配列という用語は（時には「オリゴヌクレオチド」という用語も）、デオキシリボヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および／またはシトシン（Ｃ）を概して含む分子である。「ＲＮＡ」では、Ｔがウラシル（Ｕ）で置換されている。本明細書で用いるように、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は通常の慣例に従って、５’から３’の方向の配列のみを示している。
【００４３】
アガロースゲル電気泳動．  二本鎖ＤＮＡを分画するために最も一般的に用いられている技術が、（これが唯一の技術というわけではないが）アガロースゲル電気泳動である。この方法の原理は、ゲルが最も大きい分子の移動を最大限に遅らせ、最も小さい分子の移動を最小限に遅らせる篩であるかのように、ＤＮＡ分子はゲルの中を移動するというものである。つまり、ＤＮＡ断片が小さいほど、電気泳動中のアガロースゲルにおける移動度が大きくなることに注目されたい。
【００４４】
アガロースゲル電気泳動によって分画されたＤＮＡ断片は、そのパターンに含まれる断片の数が少なければ、染色操作によって直接視覚化することができる。これらの断片の小さな部分集団を視覚化するために、ハイブリダイゼーション法（例えば、サザンハイブリダイゼーション法）と呼ばれる方法が適用できる。
【００４５】
「核酸のハイブリダイゼーション」は、一般的に、相補的な塩基配列を有する２本の一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションを意味し、適切な条件下においては熱力学的に好ましい二本鎖構造が形成される。ハイブリダイゼーション条件の例としては、上述した２冊の実験マニュアル（Sambrook et al., 2000, supra および Ausubel et al., 1994, supra）に記載されており、当業界で一般に知られている。ニトロセルロースフィルター（またはナイロンなどの他の支持体）に対するハイブリダイゼーション、例えば、よく知られているサザンブロット法では、ニトロセルロースフィルターは標識プローブと共に、高濃度の塩類（６×ＳＳＣまたは５×ＳＳＰＥ）、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ（例えば、サケ精子ＤＮＡ）を含む溶液中で、６５℃で一晩インキュベートすることができる。この後、非特異的結合プローブを洗い流すためにフィルターを０.２×ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳで数回洗浄するが、洗浄温度は所望のストリンジェンシーに基づいて選択することができる：室温（ストリンジェンシーの低い条件）、４２℃（ストリンジェンシーが中庸な条件）または６５℃（ストリンジェンシーの高い条件）。洗浄溶液の塩濃度およびＳＤＳ濃度も、所望のストリンジェンシーに適応するために調整することができる。選択した温度と塩濃度は、ＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）に基づくものである。当然のことながら、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、検出することもできる。このような場合に当業者は、よく知られた方法に従ってハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を適応させることができる。ストリンジェントな条件が好ましくは用いられる（Sambrook et al., 2000, supra）。当業界でよく知られているように、異なるアニーリング溶液や洗浄溶液を用いる他のプロトコルや市販のハイブリダイゼーション用キット（例えば、BD Biosciences Clonetech製のExpressHybTM）も用いることができる。
【００４６】
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸やその相補鎖中に存在する標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを包含し、標識配列またはその増幅核酸の検出を可能にするものである。検出は、直接的（即ち、プローブが標的配列または増幅配列に直接結合した結果）でも、間接的（即ち、プローブを標的配列または増幅配列に繋ぐ中間分子構造にプローブが結合した結果）でもよい。プローブの「標的」は、概して増幅核酸配列（即ち、増幅した配列からなる部分集合）の中の配列であって、少なくともプローブ配列の一部に標準的な水素結合または「塩基対形成」によってハイブリダイズするものである。「十分に相補的」な配列は、プローブ配列の標的配列への安定なハイブリダイゼーションを、２つの配列が完全に相補的でなくとも可能にする。プローブは標識されていても、標識されていなくともよい。
【００４７】
「十分に相補的な」配列とは、一連の相補的な塩基の間の水素結合によって、他の配列にハイブリダイズ可能な連続した核酸塩基配列である。相補的な塩基配列は、標準的な塩基対形成（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕの対形成）によって配列の全ての位置が相補的なものであるか、または標準的な塩基対形成では相補的ではない残基（そこには非塩基残基も含まれる）を１つまたは複数含有するが、適切なハイブリダイゼーション条件下で配列全体としては他の塩基配列に特異的にハイブリダイズするものでもよい。オリゴマーの連続した塩基は、オリゴマーが特異的にハイブリダイズする配列に、少なくとも約８０％（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％）相補的であることが好ましく、少なくとも約９０％相補的であることがより好ましい。当業者は適切なハイブリダイゼーションの条件をよく知っており、配列の構成や状態に基づいて容易に予測するか、または慣例的な試験によって実験的に決定することができる（Sambrook et al.著、“Molecular Cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング、実験マニュアル）”第２版（ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年）の§§1.90〜1.91、7.37〜7.57、9.47〜9.51および11.47〜11.57、特に§§9.50〜9.51、11.12〜11.13、11.45〜11.47および11.55〜11.57を参照）。
【００４８】
核酸配列は、相補的配列（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を用いたハイブリダイゼーションによって検出することができる（米国特許第5,503,980号（Cantor）、第5,202,231号（Drmanac et al.）、第5,149,625号（Church et al.）、第5,112,736号（Caldwell et al.）、第5,068,176号（Vijg et al.）および第5,002,867号（Macevicz））。ハイブリダイゼーション検出方法に（例えば、ＤＮＡチップ上の）プローブのアレイを用いることで、１ヌクレオチドのみ異なる４種の関連したプローブ配列のセットの中の完全に相補的なプローブ配列に選択的にハイブリダイズする標的核酸に関する配列情報を提供することができる（米国特許第5,837,832号と第5,861,242号（Chee et al.）を参照）。
【００４９】
検出工程では、プローブオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって核酸の存在を検出するための、種々の公知の方法を用いることができる。検出工程の特定の一例においては、既にArnold et al. Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989) ならびに米国特許第5,658,737号（Nelson et al.）および第5,118,801号と第5,312,728号（Lizardi et al.）に詳細に記載されているような、ホモジニアス検出法を使用する。
【００５０】
プローブを用いることのできる検出方法の種類には、サザンブロット法（ＤＮＡ検出）ドットブロット法またはスロットブロット法（ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびノーザンブロット法（ＲＮＡ検出）が挙げられる。標識したタンパク質も、それが結合する特定の核酸配列を検出するために用いることができる（例えば、far western technology社のタンパク質検出方法、Guichet et al., 1997, Nature 385(6616): 548-552 および Schwartz et al., 2001, EMBO 20(3): 510-519）。他の検出方法としては、本発明の試薬が計量棒などの形で含まれるキットが挙げられる。当然のことながら、自動化に対応可能な検出方法を用いることが好ましいこともある。具体例としては、１種または複数種の異なるプローブ（例えば、アレイ）を包含するチップや他の支持体が挙げられるが、これらに限定されることはない。 
【００５１】
「標識」とは、検出可能であるか、検出可能なシグナルをもたらす分子構造（molecular moiety）または化合物である。標識は、核酸プローブまたは検出する核酸（例えば、増幅した配列）に直接的または間接的に結合させる。直接的な標識は、標識を核酸に繋ぐ結合または相互作用（例えば、共有結合や非共有相互作用）によって行うことができ、一方、間接的な標識は、直接的または間接的に標識した、付加的なオリゴヌクレオチドなどの「リンカー」または架橋構造（bridging moiety）を介して行うことができる。架橋構造は検出可能なシグナルを増幅することもできる。標識には、検出可能ないかなる分子構造（例えば、放射性核種；ビオチンやアビジンなどのリガンド；酵素や酵素基質；反応性基；染料や着色粒子などの発色団；生物発光性化合物、蛍光発光性化合物や化学発光性化合物などの発光性化合物、および蛍光化合物）も含まれる。好ましくは、標識プローブ上の標識は、ホモジニアスなアッセイ系で検出可能なもの、即ち、混合物中で、結合した標識が未結合の標識と比べて検出可能な変化を生じるものである。
【００５２】
核酸鎖を断片化すると共に標識を付けるという、核酸を標識するための他の方法も知られており、この方法は、固定したＤＮＡプローブのアレイに対するハイブリダイゼーションによって検出する核酸を標識する際に有用である（例えば、国際出願番号 PCT/IB99/02073を参照）。
【００５３】
「ホモジニアスな検出可能なラベル」とは、標識したプローブが標的配列にハイブリダイズしているか否かに基づいて、その存在をホモジニアスな様式で検出することができるものである。ホモジニアスな検出可能なラベルは、ハイブリダイズした標識プローブをハイブリダイズしていないものから物理的に分けることなく検出することができる。ホモジニアスな検出可能なラベルとその検出方法については、他で詳細に説明されている（例えば、米国特許第5,283,174号、第5,656,207号および第5,658,737号を参照）。
【００５４】
本明細書で使用しているように、「オリゴヌクレオチド」や「オリゴ体」とは、２個以上のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）からなる分子である。オリゴ体の大きさは、特定の状況、最終的にはその特定の用途によって決まるものであり、当業者が状況に応じて適応させるものである。オリゴヌクレオチドは、公知の方法に従って、化学的に合成するか、クローニングによって誘導することができる。通常は一本鎖型であるが、二本鎖型でもよく、「制御領域」までも含有してもよい。天然では珍しいヌクレオチドや合成ヌクレオチドを含有してもよい。選択した基準、例えば、安定性、を向上させるように設計することもできる。
【００５５】
本明細書で使用しているように、「プライマー」とは、標的配列にアニーリングし、適切な条件下では核酸合成の開始点となる二本鎖領域を作製することが可能なオリゴヌクレオチドである。プライマーは、例えば、対立遺伝子特異的増幅に用いるために、ある種の対立遺伝子に特異的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、短いＰＣＡ３ ＲＮＡに相補的になるように設計することができ、短いＰＣＡ３ ＲＮＡは前立腺の悪性状態と関連するが、長いＰＣＡ３ ＲＮＡは、前立腺の非悪性状態（良性状態）と関連する（国際公開番号 WO 01/23550として発行された国際出願番号 PCT/CA00/01154）。プライマーの５’領域は標的核酸配列と非相補的でもよく、付加的な塩基、例えば、プロモーター配列が含まれてもよい（このようなプライマーを「プロモータープライマー」と称する）。当業者は、プライマーとして機能し得るいかなるオリゴマーも５’プロモーター配列を含むように修飾可能であり、そのようなオリゴマーはプロモータープライマーとして機能することを理解している。同様に、いかなるプロモータープライマーも、その機能的なプロモーター配列とは独立してプライマーとして働くことができる。当然のことながら、公知の核酸配列からプライマーを設計する方法は当業界で知られている。オリゴ体については、種々の異なるヌクレオチドを包含してもよい。
【００５６】
転写関連増幅法．  少なくとも２種のプライマーを用いた標的核酸配列の増幅は、種々の公知の核酸増幅法を用いて達成することができるが、実質的に等温性である転写関連増幅反応を用いることが好ましい。このようなin vitro増幅法を用いることで、標的核酸の単一コピーから複数本の核酸が製造されるので、増幅配列を１つ以上の検出用プローブに特異的に結合させることによってサンプル中の標的の検出が可能となる。転写関連増幅法については他で詳細に記載されている（例えば、米国特許第5,399,491号および第5,554,516号）。簡単に説明すると、転写関連増幅法は、２種のプライマー（その内の１種はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するプロモータープライマー）、２種の酵素活性（逆転写酵素（ＲＴ）とＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）と適切な塩類や緩衝剤を含む溶液を用いて、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写産物を製造する。初めに、プロモータープライマーは標的配列（例えば、ＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズし、逆転写酵素が第１の相補的ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）をプロモータープライマーの３’末端からの伸長によって作製する。次に、種々の方法、例えば、標的二本鎖ｃＤＮＡ分子の変性や、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖中のＲＮＡを分解する、ＲＴによって提供されるＲＮａｓｅ Ｈ活性を使用することによって、ｃＤＮＡを第２プライマーとのハイブリダイゼーションが可能な状態にせしめる。第２プライマーがｃＤＮＡに結合し、ＲＴ活性を用いて第２プライマーの末端から新たなＤＮＡ鎖が合成され、一方の末端に機能的プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を作製する。ＲＮＡポリメラーゼはｄｓＤＮＡのプロモーター配列に結合し、転写によって複数の転写産物（「アンプリコン」）を製造する。続く転写関連増幅プロセスの工程またはサイクルでは、アンプリコンを複製のための新しいテンプレートとして使用し、増幅した核酸のコピーをたくさん作製する（即ち、テンプレート当たり約１００〜３０００コピーのＲＮＡを合成する）。
【００５７】
ＮＡＳＢＡ法．  核酸増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ法）は、公知の技術（Malek et al. Methods Mol Biol, 28:253-260）に従って実施することができる。１つの態様においては、ＮＡＳＢＡ増幅法は、（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む）アンチセンスプライマーＰ１のｍＲＮＡ標的へのアニーリングから始まる。次に逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）が相補的ＤＮＡ鎖を合成する。ＲＮＡ鎖を消化するＲＮａｓｅＨは二本鎖のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識し、センスプライマーＰ２が結合できる一本鎖ＤＮＡ分子を残す。Ｐ２は、２番目のＤＮＡ鎖を合成するＲＴａｓｅのアンカーとして働く。その結果として得られる二本鎖ＤＮＡは、機能的なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有し、対応する酵素はこれを認識する。ＮＡＳＢＡ反応は続いて以下の６つの工程を包含する循環的な増幅反応を開始することができる：(1) Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる、短い一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子の合成（ＤＮＡテンプレート当たり１０1〜１０3コピー）、(2) プライマーＰ２のＲＮＡ分子へのアニーリング、(3) ＲＴａｓｅによる相補的ＤＮＡの合成、(4) ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の消化、(5) 一本鎖ＤＮＡへのプライマーＰ１のアニーリング、および (6) ＲＴａｓｅによる二本鎖ＤＮＡ分子の作製。ＮＡＳＢＡ反応は等温性（４１℃）なので、サンプル調製工程においてｄｓＤＮＡの変性を防止すれば、ｓｓＲＮＡの特異的増幅は可能である。従って、ゲノムｄｓＤＮＡによって生じる偽陽性結果を得ることなく、ｄｓＤＮＡのバックグラウンドからＲＮＡを取り出すことが可能である。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）．  ポリメラーゼ連鎖反応は公知の技術に従って実施することができる。例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号および第4,965,188号を参照されたい（これら４つの米国特許の内容はこの記載によって本明細書に組み込まれているものとする）。一般的に、ＰＣＲは、検出すべき特定配列の各核酸鎖に対して１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ハイブリダイゼーション条件下における核酸サンプルの（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下における）処理を含む。各プライマーの合成した伸長産物は２本の核酸鎖のそれぞれに相補的であり、プライマーは、特定配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である。各プライマーから合成した伸長産物は、同じプライマーを用いた伸長産物の更なる合成のためのテンプレートとしても機能する。伸長産物の合成を十分な回数行った後には、検出すべき配列が存在するか否かを求めるためにサンプルを解析する。増幅配列の検出は、ゲル電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色による視覚化、公知の技術などに従った検出可能なラベルの使用などによって行うことができる。ＰＣＲ技術の総論については、“PCR Protocols、A Guide to Methods and Amplifications（ＰＣＲプロトコル、方法と増幅に関する手引き）”、Michael et al. 編、Acad. Press、１９９０年を参照されたい。
【００５９】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、公知の技術（Weiss, 1991、Science 254:1292）に従って実施することができる。当業者は、プロトコルを所望の用途に適合させることができる。ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）も、公知の技術に従って実施したり、プロトコルを特定の用途に適合させたりできる（Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; および同上、1992, Nucleic Acids Res. 20:1691-1696）。
【００６０】
ターゲットキャプチャー法（Target capture）．  １つの態様においては、in vitro増幅を行う前に標的核酸の濃度または純度を上げるためのターゲットキャプチャー法が本発明の方法に含まれる。好ましくは、ターゲットキャプチャー法は、既に報告されている方法に記載されているように、標的核酸をハイブリダイズし単離するといった比較的簡単な方法を含むものである（例えば、米国特許第6,110,678号、第6,280,952号および第6,534,273号を参照）。一般的に、ターゲットキャプチャー法は２つのファミリー、即ち、配列特異的方法と配列非特異的方法に分けることができる。非特異的方法においては、試薬（例えば、シリカビーズ）を用いて核酸をそこに非特異的に捕捉する。配列特異的方法においては、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的核酸を含む混合物と接触させ、標的核酸を固体支持体に結合させることによって、他のサンプル成分からの標的核酸の精製を可能にする。ターゲットキャプチャーは、標的核酸と固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとの直接的なハイブリダイゼーションの結果でもよいが、標的核酸を固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに繋げるハイブリダイゼーション複合体を形成するオリゴヌクレオチドとの間接的なハイブリダイゼーションの結果であることが好ましい。固体支持体は、溶液から分離することのできる粒子であることが好ましく、容器に磁場を与えることで回収することのできる常磁性粒子であることが更に好ましい。分離した後には、固体支持体に結合した標的核酸を洗浄し、in vitro増幅反応系で適切なプライマー、基質および酵素と標的核酸を接触させることで増幅する。
【００６１】
一般的に、キャプチャー用オリゴマー配列としては、キャプチャー法が真に特異的な時には標的核酸配列に特異的に結合する配列が挙げられ、その他の場合には、固定化した配列に複合体をハイブリダイゼーションによって結合する「テール」配列が挙げられる。即ち、キャプチャー用オリゴマーには、ＰＣＡ３や他の前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＭＳＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼ、ＰＣＧＥＭ１）である標的配列に特異的に結合する配列や、共有結合した３’テール配列（例えば、固定化したホモポリマー配列に相補的なホモポリマー配列）が含まれる。テール配列は、例えば、５〜５０ヌクレオチドの長さで、標的含有複合体を固体支持体に結合するために固定化配列にハイブリダイズし、その結果、ハイブリダイズした標的核酸を他のサンプル成分から精製するものである。キャプチャー用オリゴマーはいかなる主鎖結合を有していてもよいが、いくつかの態様においては、１つまたは複数の２’−メトキシ結合を含む。当然のことながら、他のキャプチャー法も当業界で知られている。キャップ構造上に捕捉する方法（Edery et al., 1988, gene 74(2): 517-525 と米国特許第5,219,989号）やシリカ系の方法（silica based method）が他のキャプチャー法の２つの具体例であるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
「固定化プローブ」や「固定化核酸」は、キャプチャー用オリゴマーを、直接または間接的に、固体支持体に結合する核酸である。固定化プローブは、固体支持体に結合したオリゴマーであって、サンプル中の未結合の物質からの結合した標的配列の分離を容易にする。公知のいかなる固体支持体、たとえば、マトリックスや溶液中に遊離した粒子も用いることができ、その材質はいかなる公知の物質（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン化ポリプロピレン、金属粒子、好ましくは常磁性粒子）でもよい。好ましい支持体は、単分散性の常磁性球体（即ち、粒径±約５％の均一な大きさのもの）であり、これを用いることで固定化プローブが安定に、（例えば、直接的な共有結合、キレート化またはイオン相互作用を介して）直接的にまたは（例えば、１つまたは複数のリンカーを介して）間接的に結合し、溶液中の他の核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするので、一貫した結果が得られる。
【００６３】
「対立遺伝子」という用語は、染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のもう一方の形態を意味する。
【００６４】
遺伝子．  単鎖ポリペプチドまたはタンパク質と通常は関連するが、必ずしも関連する必要のないＤＮＡ配列であり、本発明においては、５’および３’の非翻訳領域を含む。タンパク質の機能的な活性が保持される限り、ポリペプチドは、全長塩基配列またはコード配列のあらゆる部分によってコードされうる。
【００６５】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）．  メッセンジャーＲＮＡ（“ＲＮＡ”）の逆転写によって合成される組換え核酸分子。
【００６６】
構造遺伝子．  ＲＮＡに転写され、次に特定のポリペプチドの特性を示すアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。
【００６７】
一般的に知られるように、「変異」とは、娘細胞に伝達することが可能な、遺伝物質中の検出可能な変化である。よく知られるように、変異は、例えば、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドの検出可能な変化である。例えば、ヌクレオチドを付加、欠失または置換するか、逆位するか、あるいは新しい位置に転位することができる。自然突然変異と、実験的に誘発した変異が存在する。このような変異核酸分子によって変異ポリペプチドがコードされている場合もある。
【００６８】
本明細書で使用するように「精製した」という用語は、元々存在していた組成物中の成分から分離した分子（例えば、核酸）について用いる。従って、例えば、「精製した核酸」は、自然界では見られない程度まで精製したものである。「実質的に純粋な」分子とは、他の成分をほとんど含んでいない（例えば、異物を３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％含んでいない）分子である。その反対に、「粗製」の分子は、存在していた元の組成物中の成分から分離していない分子である。簡潔にするために分子の量（例えば、６６、６７．．．８１、８２、．．．９１、９２％．．．）を特に記述しないが、いずれも本発明の範囲内である。
【００６９】
本明細書で使用するように「前立腺特異的マーカー」という用語は、サンプルにおけるその存在が、前立腺細胞（またはそのマーカー）がサンプルに含まれていることを示すいかなる分子も意味する。従って、「前立腺特異的配列」は、前立腺細胞に特異的に見出される核酸配列またはタンパク質配列であって、あるサンプルを「汚染」しうる他の組織に通常は存在しないものである。必然的に、尿サンプルを用いた時には、本発明の第２前立腺特異的マーカーが、前立腺でのみ発現されている必要はない。実際には、１つの器官または組織でのみ発現されているマーカーはほとんどない。しかし、第２前立腺特異的マーカーが前立腺以外の組織で発現されていても、第２前立腺特異的マーカーが発現している組織や器官の細胞が通常は尿サンプル中には存在しない時には、このような非前立腺組織における発現は第２前立腺特異的マーカーの特異性を脅かすことはない。従って、尿をサンプルとして用いる時には、第２前立腺特異的マーカーは、尿サンプルに見られる他の種類の細胞（例えば、泌尿器系の細胞）では通常は発現していないものである。
【００７０】
対照サンプル．  本明細書において「対照サンプル」または「正常サンプル」とは、特別に選択した癌を含まないサンプルである。特定の態様においては、対照サンプルは前立腺癌を含まないか、前立腺癌の不在を示すものである。対照サンプルは前立腺癌に罹患していない患者／個人から得ることができる。他の種類の対照サンプルを用いることもできる。例えば、サンプルに前立腺特異的細胞が含まれることを確認するために、前立腺特異的マーカーを用いることができる（このようなマーカーは、本明細書では通常、第２前立腺特異的マーカーと称する）。関連した状況においては、対照反応は方法そのものを制御するように設計することができる（制御することのできる方法としては、例えば、細胞抽出法、キャプチャー法、増幅反応や検出方法、サンプル中の細胞数、これらの組み合わせ、またはシグナル（例えば、ＰＣＡ３シグナル）の不在が１つまたは複数の工程における失敗によるものではないことを判定するために観測するこのできる全ての工程である）。
【００７１】
カットオフ値．  前立腺癌素因または前立腺癌の存在のカットオフ値は、前立腺癌を有していない患者の集団における、ＰＣＡ３（または他の前立腺癌抗原）のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその断片の平均シグナル＋標準偏差ｎ（またはその平均シグナル値の平均）から定義する。前立腺癌の存在を示すカットオフ値と前立腺癌素因を示すカットオフ値は同じでもよいが、異なってもよい。
【００７２】
変異体（Variant）．  本明細書において「変異体」とは、本発明のタンパク質または核酸と実質的に類似した構造および生物学的活性を有するタンパク質または核酸分子であって、生物活性の少なくとも１つを保持するものである。よって、２個の分子が共通の活性を有して互いに代替可能であれば、これらの分子の一方の組成または二次、三次または四次構造が他方のものと同一でなかったり、またはアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が同一でなかったりしても、これらの分子は本発明で定義した変異体と考える。
【００７３】
「生物学的サンプル」または「患者のサンプル」は、生存または死亡したヒトから得た組織または材料であって、ＰＣＡ３標的核酸および第２前立腺特異的マーカーを含むものを包含する。サンプルには、例えば、末梢血、血漿や血清、生検組織、消化器系組織、骨髄、尿、糞、精液や他の体液、組織や材料などの、ＰＣＡ３標的物（または第２前立腺特異的マーカー）に特異的な細胞を含むものが挙げられ、直腸指診（または尿中の前立腺細胞量を増加させる他の方法）に続いて採取した尿サンプルが好ましい。生物学的サンプルは、組織または細胞構造を物理的に破壊するように処理して、細胞内成分を溶液中に放出させることもでき、溶液は、分析用サンプルを調製するために用いる酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤などを含んでいてもよい。
【００７４】
本発明の他の諸目的、諸利益並びに諸特徴は、あくまで例示に過ぎず、具体的な態様に関する以下の非限定的な説明および添付の図面から明らかになる。
【００７５】
上記で本発明を簡単に説明したが、添付の図面に参照しながら、本発明の具体的な態様についても説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明を限定するためではなく、本発明をより明確に開示する目的で、本発明の詳細な説明を以下の項目に分けて記載した。
I．ＰＣＡ３核酸の検出によって、サンプル中の前立腺癌の存在を発見するための方法 
II．核酸の合成 
III．プローブとプライマー 
IV．サンプル中のＰＣＡ３核酸を検出するためのキット 
【００７７】
Ｉ．ＰＣＡ３核酸の検出によって、サンプル中の前立腺癌の 
存在を発見するための方法 
本発明は、生物学的サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在を、第２前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼやＰＣＧＥＭ１）の存在と共に検出する方法に加えて、サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在量を測定する方法も包含する。これらの方法はＰＣＡ３の過剰発現に関連した前立腺癌の診断に有用である。
【００７８】
前立腺癌を発生する素因または前立腺癌の存在は、患者の生物学的サンプル（例えば、尿）に存在するＰＣＡ３核酸の増加に基づいて検出することができる。前立腺癌の素因またはその存在の有無を暗示するＰＣＡ３ ＲＮＡ存在量を検出するために、ポリヌクレオチドプライマーやポリヌクレオチドプローブを使用することができる。一般的に、ＰＣＡ３核酸（例えば、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡやその断片）の量が、正常対照サンプル（または決められたカットオフ値）と比べてサンプル中で増加していることは、サンプルが前立腺癌を含んでいるか、前立腺癌を発生しうることを示す。１つの態様においては、第２前立腺特異的マーカーの検出も行うが、これはサンプル中に前立腺特異的細胞が存在することを示す対照となり、更にＰＣＡ３検出結果（例えば、ＰＣＡ３検出における陰性の結果）を判定することにもなる。
【００７９】
当然のことながら、前立腺ＲＮＡの対照として機能するものであれば、種々の異なる前立腺特異的マーカーを使用することができる。このような前立腺特異的マーカーの具体例としてはＰＳＡ（配列番号１１）やカリクレインファミリーに属する他のマーカーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他には、上述したように、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１を本発明に従って使用することができる。
【００８０】
生物学的サンプル中のＰＣＡ３核酸（例えば、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ）の検出方法の、本発明を限定することのない一例においては、（１）生物学的サンプルを、ＰＣＡ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、そして（２）生物学的サンプルにおいて、ＰＣＡ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド（即ち、プローブまたはプライマー）の存在量を検出する。サンプルは、第２前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼ、ＰＣＧＥＭ１ ｍＲＮＡやそれらの断片）の存在についても試験するが、これはサンプル中に前立腺細胞が存在すること（またはその数）の対照に加えて、ＰＣＡ３検出の陰性または陽性の結果の対照でもある。第２前立腺特異的マーカーは、前立腺癌とは関連しないが、前立腺細胞で発現している前立腺特異的ＰＣＡ３ ＲＮＡでもよい。検出したＰＣＡ３ポリヌクレオチドの量は予め決められたカットオフ値と比較し、そこから患者における前立腺癌の素因またはその存在の有無を判定する。
【００８１】
関連した状況においては、本発明の方法は、患者の前立腺癌の進行を観測するために用いることもできる。この特定の態様においては、上記のアッセイを経時的に行って、サンプル（例えば、尿サンプル）中のＰＣＡ３核酸の存在量の変化と他の前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ ｍＲＮＡ）の存在量の変化を評価する。一般的に前立腺癌は、検出されるＰＣＡ３核酸の相対量（即ち、細胞や細胞成分（例えば、細胞内に存在するタンパク質や核酸）に対して相対的な量）が時間と共に増加する時に、進行性であると考える。一方、ＰＣＡ３核酸の相対量が経時的に低下するか一定の時には、進行性ではないと考える。
【００８２】
当業者は、上述した公知技術に基づいて核酸プライマーを選択することができる。試験するサンプルとしてはヒト組織のＲＮＡサンプルが挙げられるが、これに限定されるものでない。
【００８３】
関連する状況においては、核酸の増幅および／または検出のみの効率は、核酸の増幅および／または検出用の反応混合物に添加した高度に精製した対照標的核酸を用いた外部対照反応を行うことによって確認することができる。また、細胞および／または細胞小器官からの核酸回収の効率や、核酸の増幅および／または検出の阻害（存在する場合のみ）の程度も、各試験サンプルに対照となる細胞または細胞小器官（例えば、ＰＣＡ３と第２マーカーを発現する前立腺癌細胞系の任意の数の細胞）を添加し、外部対照反応と比較することで、確認および概算することができる。サンプル調製の効率と増幅および／または検出の効率の両方を確認するためには、上記のような外部対照反応を、細胞、細胞小器官および／または対照核酸配列を含有するウイルス粒子で強化した参照用試験サンプルまたはブランクサンプルを用いて行うことができる。例えば、各試験サンプルに添加した細胞、ウイルスおよび／または細胞小器官に存在する内部対照（ＩＣ）配列からのシグナルが、外部対照反応で観測されるシグナルよりも弱いことは、その試験サンプルに関して生じた不完全な細胞溶解、および／または増幅工程および／または検出工程の阻害によって説明することができる。一方、ＩＣ配列のシグナルが外部対照反応で観測されるシグナルと同等であることによって、その試験サンプルに関して細胞溶解を含むサンプル調製が効率よく行われ、増幅工程および／または検出工程の顕著な阻害は生じなかったことが確認される。また、サンプル調製の効率のみを確認するには、核酸試験以外の方法（例えば、顕微鏡による分析、質量スペクトル法や免疫学的分析法）で解析した外部対照を用いることができる。
【００８４】
従って、１つの特定の態様において本発明の方法は、細胞溶解やサンプル調製の効率に加えて、核酸の増幅および／または検出の性能を確認するために、核酸試験アッセイにおいて内部対照（ＩＣ）の標的となる核酸配列を含有する、精製した核酸、前立腺細胞やウイルス粒子を用いる。もっと簡単に言うと、本発明の方法から選んだいずれの工程を確認するためにもＩＣを用いることができる。
【００８５】
ＰＣＲや関連する増幅技術におけるＩＣとしては、高度に精製したプラスミドＤＮＡが挙げられ、プラスミドＤＮＡはスーパーコイル状でも、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に再精製した直鎖状のものでもよい。スーパーコイル状ＩＣテンプレートの増幅は、直鎖化して再精製したＩＣ核酸テンプレートと比べて効率が低く（約１００分の１であり）、再現性も低い。従って、プラスミドＤＮＡをＩＣとして用いる時には、本発明で行う増幅および検出のためのＩＣ対照反応は、直鎖化して再精製したＩＣ核酸テンプレートを用いることが好ましい。
【００８６】
効率よく再現性の高いＩＣの増幅／検出を行うために、アッセイの最適化の際の試験に基づいて、核酸、細胞および／または細胞小器官を各試験サンプルに適切な濃度で導入する。添加した対照細胞の最適数はアッセイ方法に依存するが、核酸に基づくアッセイ方法において他の遺伝的標的の増幅および／または検出に著しく有害な影響を与えることがなく、再現性の高いＩＣ検出シグナルを生じる最少細胞数であることが好ましい。精製した直鎖状核酸、細胞、ウイルス粒子または細胞小器官を添加したサンプルは、通常、「強化サンプル（spiked sample）」と称する。
【００８７】
ある種の態様においては、ｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイで検出してもよい。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を逆転写と共に用いる。このようなアッセイにおいては、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて生物学的サンプルから誘導したＰＣＡ３ ｃＤＮＡの一部分を増幅することができるが、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドはＰＣＡ３ ＲＮＡに特異的（即ち、ハイブリダイズするもの）である。その後、当業界ではよく知られている技術、例えば、ゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって、増幅したｃＤＮＡを分離して検出することができる。増幅は、試験患者から採取した生物学的サンプルと前立腺癌を患っていない個人から採取した生物学的サンプル（対照サンプル）、あるいは他の種類の対照サンプルに対して行うことができる。増幅反応は、例えば、２桁に跨る何段階かの希釈を行ったｃＤＮＡに対して（または何段階かに希釈した生物学的サンプルに対して直接）行うことができる。予め決めておいたカットオフ値を超える値は、前立腺癌の存在または前立腺癌素因を示す。通常、対照サンプルと比べて生物学的サンプルにおいてＰＣＡ３核酸の発現が増加していることは、前立腺癌の存在または前立腺癌を発生する素因を示す。
【００８８】
更なる態様においては、核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）と呼ばれるin vitro ＲＮＡ増幅法によって、生物学的サンプルの核酸抽出物からＰＣＡ３ ＲＮＡを検出する。他の当業界でよく知られたｍＲＮＡ増幅法も用いることができ、そのような方法には転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）、Ｑβレプリカーゼシステムおよびリガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が含まれる（一般的記載については Kwoh et al., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25、Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177、Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202、Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260 および Sambrook et al., 2000 “Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）”第３版、CSH Laboratoriesを参照）。
【００８９】
前立腺癌特異的ＰＣＡ３ ＲＮＡ配列と前立腺特異的マーカーの増幅および／または検出は、（例えば、多重リアルタイム増幅アッセイによって）同時に行うことができる。
【００９０】
また、ストリンジェントな条件下でＰＣＡ３核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプル中の前立腺癌特異的ＰＣＡ３ポリヌクレオチドの存在および／または量を検出するために、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、in situ ハイブリダイゼーション法など）に用いることができる。
【００９１】
また、オリゴヌクレオチドとプライマーは、増幅工程に続いて患者サンプル中の前立腺癌特異的ＰＣＡ３配列の配列決定およびその存在の確認を直接行うように設計することができる。このような配列に基づく診断方法は自動化可能であり、本発明の範囲に含まれるものである。
【００９２】
II．核酸の合成 
本発明を実施するための核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ）は公知の方法に従って得ることができる。
【００９３】
本発明の単離された核酸分子には、クローニングによって得られたものと共に、化学的に合成された核酸分子も含まれる。同様に、核酸分子やそれを分割した断片に対応するオリゴマーも合成することができる。このような合成オリゴヌクレオチドは、例えば、Matteucci et al., J．Am．Chem．Soc. 103:3185-3191 (1981) のトリエステル法や自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成することができる。
【００９４】
オリゴヌクレオチドは、化学合成またはクローニングにより製造することができる。必要ならば、オリゴマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化することができる。過剰な酵素を用いることにより、アニーリング前の一本鎖核酸のリン酸化や標識のためのリン酸化が可能である。プローブを標識するためにリン酸化する時には、高い比放射能を有する放射性同位元素を含むＡＴＰを用いることができる。その後、得られたＤＮＡオリゴマーについて、アニーリングおよびＴ４ リガーゼによるライゲーションなどを行うことができる。当然のことながら、核酸配列の標識は、当業界で知られている他の方法で行うこともできる。
【００９５】
III．プローブとプライマー 
本発明は、前立腺癌に関連するＰＣＡ３核酸配列の存在を、サンプルから特異的に検出するための核酸に関し、該核酸は上記した核酸分子またはＰＣＡ３核酸にストリンジェントな条件下で結合するその断片を少なくとも含むものである。
【００９６】
１つの好ましい態様においては、本発明は、前立腺癌に関連するＰＣＡ３ ＲＮＡ配列を標的とし、その増幅を可能とするオリゴ体（即ち、プライマー）に関する。
【００９７】
他の態様においては、特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法など）によってＰＣＡ３ ＲＮＡを検出することができる。
【００９８】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーは、特定のアッセイ形式、特定の用途や使用する標的配列に基づいて、いかなる適切な長さでもよい。好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、少なくとも１０ヌクレオチド（好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２ヌクレオチド．．．）であり、選択した核酸増幅法に特に合うように適応させてもよい。より長いプローブやプライマーも本発明の範囲に含まれ、当業界でもよく知られている。ヌクレオチド数が３０超、４０超または５０超のプライマーや、ヌクレオチド数が１００超、２００超、３００超、５００超、８００超または１０００超のプローブも本発明の範囲内である。当然、長いプライマーはより高価であるという不利益が生じるため、当業界では１２〜３０ヌクレオチドの長さのプライマーを通常は設計して使用している。当業界で知られているように、本発明の方法では、１０〜２０００ヌクレオチドを超える長さのプローブを用いることができる。上述した相同性の％と同様に、大きさを特に記載しないプローブやプライマー（例えば、１６、１７、３１、２４、３９、３５０、４５０、５５０、９００、１２４０ヌクレオチド．．．のもの）も本発明の範囲に含まれる。１つの態様においては、本発明のオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＡ３ ＲＮＡ（またはその相補的配列）に特異的にハイブリダイズするものである。より好ましくは、プライマーやプローブは、前立腺癌に関連するＰＣＡ３ ＲＮＡを検出するために選択する。１つの態様においては、本発明で使用するプローブとプライマーは、ＰＣＡ３遺伝子とハイブリダイズしない（即ち、遺伝子と発現されたＰＣＡ３の特定を可能にする）。本発明の他のプライマーは、ＰＳＡ（配列番号１１）などの第２前立腺特異的マーカーに対して特異的である。当然のことながら、当業界で知られている他の変異体（米国特許第6,479,263号と第5,674,682号）も、 第２前立腺特異的マーカーとして用いることができる。ＰＳＡ遺伝子はカリクレイン遺伝子ファミリーに属する他の核酸と構造および配列上の類似性を示すので、ＰＳＡ特異的なプローブやプライマーとして働くＰＳＡ配列を適宜選択することは、ＰＳＡ特異的核酸を増幅および／または検出する方法において重要である。ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、増幅および検出に適したプライマーの例（例えば、米国特許第6,551,778号）は当業界でよく知られており、加えてトランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１についても知られている。１つの態様においては、ＰＳＡオリゴヌクレオチドは、カリクレイン２（ｈＫ２／ｈＫＬＫ２）などのカリクレインファミリーに属する他のマーカーにハイブリダイズするものでもよい。このようなオリゴヌクレオチドの一例は配列番号１２である。
【００９９】
当業界で一般に知られているように、オリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーは、その標的配列とのハイブリダイゼーション産物の融点を考慮して設計する（Sambrook et al.、１９８９年、“Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）”第２版、CSH Laboratories；“Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最近のプロトコル）”の中のAusubel et al., 1994、John Wiley & Sons Inc.、ニューヨーク州；および下記参照）。
【０１００】
本発明のアッセイ条件下でハイブリダイゼーションを行うためには、オリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＡ３ポリヌクレオチドの一部と少なくとも７０％（少なくとも７１％、７２％、７３％か７４％）、好ましくは少なくとも７５％（７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％か８９％）、更に好ましくは少なくとも９０％（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％か１００％）の相同性を示すオリゴヌクレオチド配列を包含しなければならない。本発明のプローブとプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＰＣＡ３核酸（例えば、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ）配列とハイブリダイズするもの、および少なくとも中庸なストリンジェシーの条件下でＰＣＡ３遺伝子の相同体とハイブリダイズするものである。特定の態様においては、本発明のプローブとプライマーはＰＣＡ３遺伝子配列（例えば、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ）と完全な配列相同性を有するものである。しかし、本来のＰＣＡ３遺伝子配列とは異なるが、ストリンジェントな条件下で本来のＰＣＡ３核酸配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブとプライマーも本発明で使用することができる。本明細書で開示するＰＣＡ３核酸配列（配列番号９、１０と１３）に基づいて、当業界で知られているコンピューターによるアライメントと配列解析の方法を用いて、他のプローブとプライマーも容易に設計・使用することが可能である点を理解されたい（“Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）”第３版、Cold Spring Harbor Laboratory編、２０００年を参照）。
【０１０１】
例えば、前立腺癌の悪性状態に関連する短いＰＣＡ３ ＲＮＡと相補的になるようにプライマーを設計することが可能であるが、対する長いＰＣＡ３ ＲＮＡは、非悪性（良性）の状態に関連するものである（国際公開番号 WO 01/23550として公開されているPCT/CA00/01154）。本発明によるとこのようなプライマーをその他の必要な試薬と用いることによって、前立腺癌に関連する短いＰＣＡ３ ＲＮＡ（例えば、配列番号８）が試料中に存在する時にのみ増幅産物を生じる。より長いＰＣＡ３（例えば、配列番号７）はアンプリコンを生じない。当然のことながら、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの短いものと長いものを増幅するように増幅反応を設計することもできる。このような形式においては、長いＰＣＡ３ ｍＲＮＡは第２前立腺特異的マーカーとして用いることができる。
【０１０２】
上述したような態様においては、短いＰＣＡ３に対する長いＰＣＡ３の増幅産物の定量は、前立腺癌に関する分子診断試験として働く他の前立腺特異的マーカーの検出と共に行うことができる。他の態様においては、ＰＣＡ３に特異的なプライマーペア（またはプローブ）を、ＰＣＡ３遺伝子やスプライシングを受けていないＰＣＡ３ ＲＮＡの検出を防止するように設計することができる。例えば、本発明で使用することのできるプライマー配列は、ＰＣＡ３遺伝子のエクソン／イントロン ジャンクションにハイブリダイズできないように、２つの連続したエクソンにわたるものでもよい。このようなプライマーを用いて得られる増幅産物は、選択した２つのエクソンの間のイントロンを有していない（このようなプライマーとプローブの具体例については下記の表１と表２を参照）。従って、スプライシングを受けていない変異体とゲノムＤＮＡは増幅されない。当業者は、種々のプローブの設計が可能であり、本発明の多様な態様に基づいて使用することができる点を理解するであろう。このような試験は、ＰＣＡ３の配列や第２前立腺特異的マーカーの配列を用いて適合させることができる。当然ではあるが、異なるプライマーペア（およびプローブ）を、ＰＣＡ３配列（配列番号７、８、９、１０と１３）のいかなる部分に加えて、ＰＳＡの配列（ジーンバンク アクセッション番号Ｍ２７２７４、配列番号１１）や選択した他のいかなる第２前立腺特異的マーカー（例えば、ＫＬＫ２（ジーンバンク アクセッション番号ＮＭ００５５５１）、ＰＳＭＡ（ジーンバンク アクセッション番号ＢＣ０２５６７２）、トランスグルタミナーゼ４（ジーンバンク アクセッション番号ＢＣ００７００３）、酸ホスファターゼ（ジーンバンク アクセッション番号ＢＣ０１６３４４）、ＰＣＧＥＭ１（ジーンバンク アクセッション番号ＡＦ２２３３８９））からも設計することができる。
【０１０３】
本発明のプローブとしては、天然に存在する糖−リン酸主鎖を有するものに加えて、ホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート、α−ヌクレオチドなどを含む修飾した主鎖を有するものも用いることができる。修飾した糖−リン酸主鎖の一般的な説明は、Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23:295 および Moran et al., 1987, Nucleic Acids Res., 14:5019 に記載されている。本発明のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれで構成されていてもよく、ＤＮＡが好ましい。
【０１０４】
本発明は特定の核酸配列の検出における標識の使用に特に依存するわけではないが、このような標識は検出感度を上げるので有利である。更に自動化も可能となる。プローブは種々の公知の方法（Sambrook et al., 2000, supra）に従って標識することができる。検出可能なマーカーやラベルの具体例としては、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐと35Ｓ、リガンド、蛍光団、化学発光性試薬、酵素および抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。プローブと共に用いる他の検出可能なマーカーであって、本発明の方法の感度を向上させるものには、ビオチンと放射性核種が挙げられる。当業者には、特定のラベルの選択がプローブに結合する様式を支配することは明かである。
【０１０５】
広く知られているように、放射性核種は、いくつかの方法で本発明のプローブに取り込むことができる。このような方法の例としては、γ−32Ｐ ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いてプローブの５’末端をリン酸化する方法、放射性ｄＮＴＰの存在下でE. coli Pol IのKlenow断片を用いる方法（例えば、ランダムなオリゴヌクレオチドプライマーを用いて均一に標識したＤＮＡプローブ）、１種以上の放射性ＮＴＰの存在下で、ＳＰ６／Ｔ７システムを用いてＤＮＡセグメントを転写する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
１つの態様においては、ホモジニアス検出アッセイで用いる標識は化学発光性の化合物（例えば、米国特許第5,656,207号、第5,658,737号と第5,639,604号）であり、より好ましくはアクリジニウムエステル（“ＡＥ”）化合物、例えば、標準ＡＥやその誘導体である。核酸に標識を付加する方法および標識を検出する方法はよく知られている（例えば、Sambrook et al.、“Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）”第２版（ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年）の第１０章；米国特許第5,658,737号、第5,656,207号、第5,547,842号、第5,283,174号と第4,581,333号；およびヨーロッパ特許願第0 747 706号を参照）。リンカーを介して結合したＡＥ化合物でプローブを標識するための好ましい方法は、他で詳細に説明されている（例えば、米国特許第5,639,604号の実施例８を参照）。
【０１０７】
選択した核酸配列または標的となる核酸配列の増幅は、種々の適切な方法で実施することができる。一般的な記載については、Kwoh et al., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25を参照されたい。数多くの増幅方法が報告されており、当業者の特定の要求に見合うように容易に適応させることができる。増幅技術の例にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅、ＱβレプリカーゼシステムおよびＮＡＳＢＡ（Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177、Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202、Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260 および Sambrook et al., 2000, supra）が含まれるが、これらに限定されるものではない。増幅方法の他の例としては、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification）（ＲＣＡ）、ＲＮＡ技術によるシグナル媒介増幅（signal mediated amplification of RNA technology）（ＳＭＡＲＴ）、スプリット コンプレックス増幅反応（split complex amplification reaction）（ＳＣＡＲ）およびＲＮＡのスプリット プロモーター増幅（split promoter amplification of RNA）（ＳＰＡＲ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０８】
増幅産物の存在を検出するのに適した方法の例として次の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない：アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルを用いる方法、およびＤＮＡ標識色素（エチジウムブロマイド、ピコグリーン、ＳＹＢＥＲグリーンなど）を増幅反応系に添加し、適切な装置（ほとんどの場合は蛍光測定装置）で検出する方法。その他の適切な方法としては、（手動または自動の）シークエンシング反応、（制限部位を増幅配列に組み込む）制限部位分析、または配列特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションを含む方法（サザンブロット法またはノーザンブロット法、TaqManTM プローブや分子ビーコンの使用など）が挙げられる。当然であるが、他の増幅方法も本発明には含まれる。本発明の方法に従って増幅産物を検出する方法の一例として、分子ビーコンの使用を例示した（下記参照）。
【０１０９】
当然であるが、いくつかの態様においては、特異的なプローブやプライマーを用いて、サンプル中のＰＣＡ３癌特異的配列に加えて他の前立腺特異的マーカーを直接（例えば、シークエンシングによって）検出することができる。
【０１１０】
１つの態様において本発明は、核酸を検出し同定するための方法における技術的進歩を利用する。従って、このような進歩技術の１つである分子ビーコンと呼ばれるツールも、本発明における検出に適切である。
【０１１１】
分子ビーコンは、ステムループ構造を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブ／プライマーである。ループは、標的配列に相補的なプローブ配列を含有し、ステム部分は、プローブ／プライマー配列のそれぞれの端に位置する相補的なアーム配列のアニーリングによって形成されるものである。蛍光団が１本のアームの末端に共有結合しており、もう一方のアームの末端にはクェンチャーが共有結合している。分子ビーコンは、溶液中で遊離状態では蛍光を発しない。しかし、標的配列を含む核酸鎖にハイブリダイズすると、強く蛍光を発することが可能な立体構造の変化を生じる（米国特許第5,925,517号と第6,037,130号を参照）。分子ビーコンはアンプリコン検出用プローブ／プライマーとして診断アッセイに用いることができる。ハイブリダイズしていない分子ビーコンは暗いので、例えば、アッセイの途中で合成されたアンプリコンの数を求めるために、プローブ−標的ハイブリッドを単離する必要がない。従って、分子ビーコンの使用は、従来の検出および同定手段を用いた際には大概必要な操作を簡略化する。
【０１１２】
異なる色の蛍光団を用いることで、例えば、ＰＣＡ３核酸と第２前立腺特異的核酸（例えば、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼとＰＣＧＥＭ１）を同時に増幅し検出することを目的としたアッセイなどの多重増幅アッセイにも分子ビーコンを用いることができる。分子ビーコン プローブ／プライマーの設計は当業界でよく知られており、設計の支援を目的としたソフトウエアが市販されている（例えば、 Premier Biosoft International製のBeacon designer）。分子ビーコン プローブ／プライマーは種々のハイブリダイゼーションおよび増幅アッセイ（例えば、ＮＡＳＢＡ法とＰＣＲ法）に用いることができる。
【０１１３】
本発明の１つの態様によると、増幅産物は、分子ビーコンをプライマーとして用いた増幅アッセイ（例えば、リアルタイム多重ＮＡＳＢＡやＰＣＲアッセイ）によって直接検出するか、プライマーペア結合部位の内部配列として、増幅産物に特異的にハイブリダイズする１８〜２５（例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４か２５）ヌクレオチドの長さの分子ビーコンプローブを用いて間接的に検出する。本発明で使用する際には、１８と２５ヌクレオチドの間の長さの分子ビーコン プローブやプライマーが好ましい（Tyagi et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 303-308）。より短い断片は少ない蛍光シグナルしかもたらさず、一方より長い断片は、シグナルを著しく増加することはほとんどない。しかし、当然ではあるが、より短いものやより長いものも、プローブやプライマーとして用いることができる。
【０１１４】
ＰＣＡ３ ＲＮＡ配列から誘導することのできる核酸プライマーの具体例を、以下の表１に示した。
【０１１５】
【表１】
0004824540.tif 000002
【０１１６】
表１に示したプライマーの配列とサイズは任意であり、本発明に従って多様な他の配列を設計し、使用することもできることを理解されたい。
【０１１７】
本発明は、ＰＣＡ３配列を標的とするプローブ（本発明で説明したＰＣＡ３のエクソン ジャンクションなど）を用いることなく実施することもできるが、このようなプローブは、本発明の方法およびキットに更なる特異性を付与することができる。本発明で使用することのできる（そして表１のエクソン配列に基づいて設計することのできる）特異的核酸プローブの具体例を以下の表２に示した。
【０１１８】
【表２】
0004824540.tif 000003
【０１１９】
当然であるが、当業者が理解するように、多様な更なるプローブを、配列番号９に加え、配列番号１０と１３や本発明の他の配列の同じまたは異なる領域から設計することが可能であり、それらはエクソン ジャンクションを標的としてもしなくてもよい。表２に示したプライマーのサイズは任意であり、本発明に従って多様な他の配列を設計し、使用することもできることは明かである。
【０１２０】
本発明の核酸配列（例えば、プローブとプライマー）は、当業界で知られている数々の確立されたキットの形態に組み込むことが可能であることを当業者は容易に理解する。
【０１２１】
上述した方法の１つに態様においては、核酸プローブは固体支持体に固定化されている。このような固体支持体の例としては、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースやセファロースなどの炭水化物錯体、ポリアクリルアミドなどのアクリル樹脂やラテックスビーズが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸プローブをこのような固体支持体に固定する方法は当業界でよく知られている。
【０１２２】
本発明の核酸プローブ法に適した試験サンプルの例としては、細胞や細胞の核酸抽出物、および体液（例えば、尿）が挙げられる。上述した方法で使用するサンプルは、アッセイの形式、検出方法、分析する組織、細胞または抽出物の性質によって異なる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当業界ではよく知られており、使用するアッセイ方法に適合するように抽出方法を対応させることは容易である。好ましいサンプルは尿試料である。尿試料を使用する時には、本発明の前立腺特異的マーカーの確認を可能にするために、少なくとも１つの前立腺細胞がサンプルに含まれていなければならない。実際、未処理の生物学的サンプルに含まれるＰＣＡ３ ｍＲＮＡの半減期が、この配列の完全性を容易に保存するには適していないと想定すると、採取したサンプルには、尿でもそれ以外のものでも、処理前に少なくとも１つの前立腺細胞が含まれていなければならない。サンプル中の細胞数は試験の判定と測定したＰＣＡ３（または第２前立腺特異的マーカー）の相対的存在量に影響を与える。
【０１２３】
IV．サンプル中のＰＣＡ３核酸を検出するためのキット 
別の態様においては、本発明は、高感度であり且つ特異的な（即ち、偽陽性の数を低減した）、前立腺癌を診断するためのキットに関する。このようなキットは、通常、前立腺癌特異的ＰＣＡ３核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第１の容器を包含する。１つの態様においては、本発明は、ＰＣＡ３の示す陰性の検出結果を判定するための、第２前立腺特異的マーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーの入った第２容器を更に包含する。
【０１２４】
本発明の特定の態様においては、このキット（Ｋ）は、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１の増幅を可能にするプライマーペアを包含する。当然のことながら、第３の前立腺特異的マーカーの使用も本発明の範囲に含まれる。
【０１２５】
キットのオリゴヌクレオチド（プローブやプライマー）は、例えば、ＮＡＳＢＡ法、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる。増幅アッセイは、複数の増幅産物のリアルタイムの検出（即ち、多重リアルタイム増幅アッセイ）に適合させることができる。
【０１２６】
関連する特定の態様においては、キットは補助成分の入った他の容器を更に包含し、補助成分は、更なるオリゴヌクレオチドやプライマーおよび／または下記群から選ばれる少なくとも１種である：緩衝剤、アッセイに使用する試薬（例えば、洗浄試薬、ポリメラーゼなど）、および結合した核酸プローブやプライマーの存在を検出することを可能にする試薬。検出試薬の例としては、放射性標識プローブ、酵素標識プローブ（西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）や親和性標識プローブ（ビオチン、アビジンやストレプトアビジン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。１つの態様においては、検出試薬は、増幅産物に特異的に結合する分子ビーコンプローブである。他の態様においては、検出試薬は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）などの化学発光性化合物である。
【０１２７】
例えば、本発明に従って区分けされたキットとしては、試薬類が別々の容器に入れられたキットが挙げられる。このような容器としては、小さなガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックや紙のストリップが挙げられる。このような容器は、サンプルと試薬が互いに汚染することなく、１つの区分から別の区分への試薬の効率よい移動が可能であり、各容器内の試薬や溶液は、定量的に１つの区分から別の区分に添加することが可能である。このような容器としては、試験サンプル（例えば、生物学的サンプルや細胞のＲＮＡ抽出物）を許容する容器、アッセイに使用するプライマーの入った容器、酵素の入った容器、洗浄試薬の入った容器、伸長産物を検出するために用いる試薬の入った容器が挙げられる。上述したように、試薬類の分離や組み合わせは、好ましいキットの種類（例えば、増幅法、検出法またはその両方に基づく診断キット）、使用する試薬の種類およびそれらの安定性や本来の性質に基づいて、本発明の関連する分野の当業者が適応させればよい。１つの態様においては、１つの容器に増幅試薬が入っており、別の容器に検出試薬が入っている。別の態様においては、増幅試薬と検出試薬が同じ容器に入っている。
【０１２８】
キットは、サンプルから標的核酸を精製するためのキャプチャー用オリゴマーとして働くオリゴヌクレオチドを含有してもよい。キャプチャー用オリゴマーの例としては、ＰＣＡ３標的核酸の一部に相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドからなる配列が挙げられる。キャプチャー用オリゴマーの態様によっては、標的核酸を捕捉するためのハイブリダイゼーション工程において機能する、ＰＣＡ３標的配列に相補的な配列の３’または５’末端に更なる塩基が付加していてもよい。このような付加的な配列としては、ポリＡ配列やポリＴ配列などのホモポリマーテール配列が好ましいが、他の態様のテール配列が本発明のキャプチャー用オリゴマーに含まれてもよい。１つの態様においては、ＣＡＰ結合タンパク質（例えば、ｅＩＦ４Ｇ−４Ｅ）やその部分を、ｍＲＮＡを含有するキャップ構造を捕捉するのに用いることができる（Edery et al., 1987,Gene 74(2): 517-525）。他の態様においては、非特異的なキャプチャー試薬（例えば、シリカビーズ）を用いる。
【０１２９】
本発明の方法を実施するのに有用なキットとしては、本明細書で開示する増幅用オリゴヌクレオチドおよび／または検出用プローブを、他の試薬と共にパッケージに含むキットが挙げられる。キットは、サンプルからＰＣＡ３標的核酸を精製するためのキャプチャー用オリゴマーを更に含んでいてもよく、キャプチャー用オリゴマーは増幅用オリゴヌクレオチドおよび／または検出用プローブと共にパッケージに含まれてもよい。
【０１３０】
更なる態様においては、丁寧な直腸指診（ＤＲＥ）の後に排泄した尿から得た尿サンプルに含まれる細胞を採取し、溶解緩衝液中で溶解する。そして核酸を抽出する（例えば、シリカビーズなどを用いた固相抽出法によって細胞溶解物から抽出する）。核酸抽出物からＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡの存在を検出する方法としては、in vitro特異的ＲＮＡ増幅法を、特異的な蛍光プローブを用いて増幅産物をリアルタイムで検出する方法と組み合わせて用いる。この方法では、ＰＣＡ３前立腺癌特異的ＲＮＡの増幅と同時に、尿サンプル中に前立腺細胞が存在することを確認するための対照として用いる第２前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ ＲＮＡ）の増幅も行う。
【０１３１】
本発明の検診方法および診断方法は、全長ＰＣＡ３ ＲＮＡ配列の検出を必要としない。むしろ、正常または病気の個人にＰＣＡ３核酸が存在すること、この核酸が存在しないこと、またはこの核酸の変化した形態（例えば、異常なスプライシングパターン）を検出するのに十分な核酸の断片または長さのみを検出すればよい。このような目的には、上述したいずれのプローブやプライマーを用いてもよく、更に多種にわたるものも、本明細書で開示する配列や当業界で公知の配列に基づいて、当業界で知られているように設計することができる。
【０１３２】
以下の考察は特にヒト患者に関するものであるが、本願の教示はＰＣＡ３を発現するいかなる動物にも適応可能であることを理解されたい。
【０１３３】
本発明の診断方法および検診方法は、ＰＣＡ３の発現量の変化を伴う疾患を発症する危険度が高いと家族歴に基づいて判断される患者や、ＰＣＡ３関連疾患（例えば、前立腺癌）の診断を望む患者に対して特に有用である。本発明の方法は、上述のような患者において前立腺癌の進行を観測するのにも用いることができる。
【０１３４】
本発明を、以下の本発明を限定することのない実施例によって説明する。実施例は、説明のために記載しているに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３５】
本発明の方法の１つの実施態様を用いた臨床検査 
本発明の方法の臨床性能を概算するために、超音波ガイド下穿刺生検を行うことが予定されている、モントリオールとケベックに存在する５つの大学付属病院の患者５１７人に対して、２００１年９月〜２００２年６月にかけてパイロット試験を行った。各サンプルは下記の手順に従って処理した。
【０１３６】
サンプルの採取 
丁寧な直腸指診に続いて、初めに排出した尿の２０〜３０ｍｌを滅菌８０ｍｌプラスチック容器に回収した（患者は滅菌容器に直接排尿した）。
【０１３７】
そこに等量のサンプルバッファー（０．１Ｍのリン酸塩（０．０６ＭのＮａ2ＨＰＯ4と０．０４ＭのＮａＨ2ＰＯ4）、０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を直ちに加え、反転させることによって溶液を混合した。
【０１３８】
直ちに処理しない時には、サンプルを２〜８℃で次の処理を行うまでの最長３日間冷蔵した。細胞回収工程を鑑みると、冷凍は避けるべきである。
【０１３９】
細胞の回収 
サンプルを反転によって混合し、容器を作業台に穏やかに打ち付けて、その内壁から細胞をはがした。次にサンプルを、１つまたは（必要であれば）２つのポリプロピレン製の円錐形チューブに移した（４０ｍｌ／チューブ）。
【０１４０】
細胞は、卓上遠心機による１４００ｇで１５分の遠心分離によってペレット化した。最後に上澄みをデカンテーションし、細胞を直ちに溶解した。
【０１４１】
細胞の溶解 
４００μｌの溶解バッファー（４．６８ＭのＧｕＳＣＮ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のTriton X-100TM、４６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を尿細胞ペレットに加えた。
【０１４２】
細胞ペレットをボルテックスで激しく２０秒間撹拌することで細胞を溶解した。ここで粒状の残渣が残らないことが重要である。溶解液は透明であまり粘性ではなかった。
【０１４３】
溶解液を１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ボルテックスで３０秒間撹拌した。
所望であれば、溶解細胞を今度は−７０℃以下で際限なく保存することができる。
【０１４４】
核酸の抽出 
シリカ懸濁液（６０ｇのシリカ（±８０％の粒径が１〜５μｍのもの）に終量が５００ｍｌとなるようにMilliQ水を加えたもの）を、半透明の均一な懸濁液が得られまで、初めにボルテックスで激しく３０秒間撹拌した。
【０１４５】
２００μ１の懸濁液を直ちに取り出して溶解した試料に添加した。続いて全てのチューブをボルテックスで激しく１５秒間撹拌して、核酸をシリカに結合させた。
【０１４６】
試験管ラックに、患者の番号によって識別したフィルターユニットの入ったMicrospinTMカラムの系列を準備した。
【０１４７】
溶解した細胞とシリカを含む各マイクロチューブの内容物を１つのMicrospinTMカラムのメンブランフィルターユニット内に移した。粒状物質の移動を容易にするために、マイクロチューブはボルテックスで簡単に（約５秒間）撹拌して内容物を再懸濁した。移動前にも同様に行った。各サンプル間でチップは変更した。
【０１４８】
冷蔵状態ではないマイクロ遠心機を用い、MicrospinTMカラムを室温（１８℃〜２５℃）、１０，０００ ＲＰＭで５分間の遠心分離に付した。メンブランフィルターはシリカ結合核酸を保持したが、他の細胞成分は濾液に残っていた。
【０１４９】
この間に、MicrospinTMカラムと同じ数の２ｍｌマイクロチューブの系列を用意した。
シリカを含有するメンブランフィルターユニットを新たな２ｍｌマイクロチューブに移した。５００μｌの洗浄バッファー（５．３Ｍ ＧｕＳＣＮ、５２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．４）を各メンブランフィルターユニットに加えた。次に、冷蔵状態でないマイクロ遠心機を用い、MicrospinTMカラムを室温、１０，０００ ＲＰＭで５分間の遠心分離に付した。
【０１５０】
２ｍｌマイクロチューブからなる新たな系列を試験管ラックに用意した。
シリカを含有するメンブランフィルターユニットを新たな２ｍｌマイクロチューブに入れた。６００μｌの７０％エタノール溶液をメンブランフィルターユニットに加えた。次に、冷蔵状態でないマイクロ遠心機を用い、MicrospinTMカラムを室温、１０，０００ ＲＰＭで５分間の遠心分離に付した。
【０１５１】
２ｍｌマイクロチューブの新たな系列を試験管ラックに用意した。
シリカを含有するメンブランフィルターユニットを新たな２ｍｌマイクロチューブに入れた。濾液の入った古いマイクロチューブは廃棄した。
【０１５２】
次にメンブランフィルターユニットの入ったマイクロチューブを、ドラフトチャンバー内に設置した６５℃±１℃の加熱ブロックに移した。
全てのチューブのふたを注意深く開けて蒸発を可能とし、シリカを乾燥するために約１０分間インキュベートした。
【０１５３】
２００μｌの溶出バッファー（Dnase/Rnaseを含まない水）を各メンブランフィルターユニットに添加した。
マイクロ遠心機を用い、メンブランフィルターユニットを室温、１０，０００ ＲＰＭで５分間の遠心分離に付した。
【０１５４】
この溶出工程をもう一度繰り返し、第２溶出液を得た。これらの工程によって核酸がシリカから溶出し、濾液に濃縮される。
マイクロフィルターユニットは廃棄し、溶出した核酸を含有する２本のマイクロチューブを残した。
各チューブの溶出液を約５０μｌずつに３等分し、−７０℃以下で保存した。
【０１５５】
In vitro ＲＮＡ増幅と検出 
試験のために核酸溶出サンプルを初めに氷上で溶解した。実施する反応の数に基づいて、反応混合物を用意した。各サンプルをそれぞれ少なくとも２本ずつ用意した。
【０１５６】
１０μｌの反応混合物を、識別したマイクロチューブに分配した［８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２４ｍＭのＭｇＣｌ2、１８０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、各ｄＮＴＰを２ｍＭ、４ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＵＴＰとＣＴＰ、３ｍＭのｒＧＴＰ、１ｍＭのＩＴＰ、３０％のＤＭＳＯ、３％のショ糖、１％のＤ−マンニトール、１％のデキストラン Ｔ−４０、２０８ｎＭのＰＳＡプライマー（N2psaP1B、配列番号１とN2psaP2B、配列番号２）、４１７ｎＭのＰＣＡ３プライマー（N0pcaP1A、配列番号３とN0pcaP2B、配列番号４）８４ｎＭのＰＳＡビーコン（BpsaRD-4、配列番号５）および１６６ｎＭのＰＣＡ３ビーコン（BpcaFD-4、配列番号６）］。
【０１５７】
核酸溶出サンプル５μｌを各チューブに加えて混合した。
チューブをサーモサイクラーTMに入れて６５℃±１℃で５分間加熱し、次に温度を４１℃で保持した。４１℃で５分間置いた後、チューブを取り出し、凝結による液滴をふたから取り除くために短時間の遠心分離に付した。
【０１５８】
次の工程は速やかに行うほうがよく、温度も４１℃に保持することが好ましい。
５μｌの酵素混合物（３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５μｇ／μｌのＢＳＡ、０．０８単位のＲｎａｓｅＨ、３２．０単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、６．４単位のＡＭＶ−ＲＴ）を速やかに各チューブに加え、穏やかに混合した。
チューブはEasyQTMインキュベーターに戻した。最後のチューブが入った時点からインキュベーターの温度を４１℃±０．５℃で５分間保持した。
【０１５９】
チューブを簡単に遠心した。速やかに全てのチューブを、in vitro ＲＮＡ増幅とリアルタイム増幅産物検出のための、以下の特徴を有する温度保持機能付き蛍光分光光度計に移した：（１）光源は石英ハロゲンランプであり、（２）ＲＯＸ（６−カルボキシ−ｘ−ローダミン Ｎ−サクシニミジルエステル）蛍光に使用したフィルターの透過波長は５５０〜６２０ｎｍであり、ＦＡＭ（６ーカルボキシフルオレセイン Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエステル）蛍光に使用したフィルターの透過波長は４８５〜５３０ｎｍであり、（３）各チューブの蛍光積算時間は２０ｍｓｅｃであり、そして（４）ＲＯＸ発光とＦＡＭ発光は３０秒ごとに測定し、チューブブロックの温度は４１℃±１℃に設定した。
【０１６０】
結果 
２時間の増幅の間に生じた蛍光データのあてはめを、以下のBrownの手法［“Computer Methods and Programs in Biomedicine（生物医薬における電算手法とプログラム）”６５（２００１年）１９１〜２００］に従って行った。
【０１６１】
ＰＳＡの比（fluo max/fluo min）に基づいてカットオフ値を１．３としたところ、試験した５１７人の患者の内４４３人の尿に適切な量の前立腺細胞が存在した。
この患者の集団においては、３４％（１５１／４４３）で組織学的に前立腺癌が確認された。
【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
本発明の方法の臨床特異性（Ｓｐ）および感度（Ｓｅ）は、蛍光計測の生データから開始する、S-plusTM ソフトウエア（米国、ワシントン州、シアトル、Insightful Corporation製）を用いた分類樹に従って概算した。血中総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）が４ｎｇ／ｍｌ未満、４〜１０ｎｇ／ｍｌの間、および１０ｎｇ／ｍｌを超えるという３種類の患者について、３種の分類樹を決定した（図２〜４と表４を参照）。
【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
【表５】
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【０１６６】
この研究においては、本発明の方法の陽性的中率（ＰＰＶ）は７５％であるが、対する総ＰＳＡ（＞４．０ｎｇ／ｍｌ）のＰＰＶはたった３８％だった。本発明の方法の陰性的中率は８４％であり、対してｔＰＳＡのそれは８１％だった。本発明の方法の全体的な精度は８１％であり、対するｔＰＳＡの精度は４７％だった。
【０１６７】
本発明について特定の実施態様を用いて上で説明したが、この開示を読むことによって当業者は、添付の請求の範囲によって定義された本発明の精神とその本質から逸脱することなく、本発明の形態および細部について種々の変更を加えることが可能である点を理解するであろう。例えば、種々の他の増幅アッセイや検出アッセイ、他のプローブ配列やプライマー配列に加えて、若干変更したインキュベーション時間や温度も本発明に基づいて使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】ＰＣＡ３遺伝子の構造と、本発明の１つの態様において用いるin vitro ＲＮＡ増幅および増幅産物検出のためのオリゴヌクレオチドおよびプローブの位置を示す。パネルＡはセンスＰＣＡ３プライマー（配列番号４）の標的領域であり、パネルＢはＰＣＡ３分子ビーコン（配列番号６）の標的領域であり、そしてパネルＣはアンチセンスＰＣＡ３プライマー（配列番号３）の標的領域である。
【図２】血中総ＰＳＡ濃度が４ｎｇ／ｍｌ未満の患者に対する、本発明の方法の陽性的中率を計算するために用いた決定樹である。
【図３】血中総ＰＳＡ濃度が４〜１０ｎｇ／ｍｌの患者に対する、本発明の方法の陽性的中率を計算するために用いた決定樹である。
【図４】血中総ＰＳＡ濃度が１０ｎｇ／ｍｌを超える患者に対する、本発明の方法の陽性的中率を計算するために用いた決定樹である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号５の１番目のｎはＲＯＸであり、２６番目のｎはＤＡＢＣＹＬである。
配列番号６の１番目のｎはＦＡＭであり、３０番目のｎはＤＡＢＣＹＬである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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