(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリー電気泳動システムによってベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）の立体異性体を分離する方法であって、該方法は、以下：
該ＢＰＤを含有するサンプルを注入した後、キャピラリー電気泳動システムによって立体異性体を分離する工程であって、ここでキャピラリー内部の直径、キャピラリー長、電界の強さ、分離温度、ｐＨ、緩衝液系、イオン強度、キラルセレクター、および有機溶媒が、ＢＰＤ立体異性体の分離を生じるように選択される、工程を包含し、
ここで、該ｐＨが９．２〜９．６であり、
該緩衝液系がボレートであり、そして
該キラルセレクターが胆汁酸塩である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記キャピラリー電気泳動システムが、レーザー誘起蛍光検出システムを備える、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記ＢＰＤが、ＢＰＤ−ＭＡ、ＢＰＤ−ＤＡまたはこれらの混合物より選択される、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記分離がベースライン分離である、方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記キャピラリー内部の直径が５０μｍである、方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記キャピラリー長が、２７〜５７ｃｍである、方法。
【請求項７】
前記キャピラリー長が３７ｃｍである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記電界の強さが、＋１５〜＋２５ＫＶである、方法。
【請求項９】
前記電界の強さが＋２０ＫＶである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記分離温度が、１５〜３０℃である、方法。
【請求項１１】
前記分離温度が２０℃である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐＨが９．２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記イオン強度が、２００〜３００ｍＭのボレートである、方法。
【請求項１４】
前記イオン強度が３００ｍＭのボレートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記胆汁酸塩がコール酸塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記コール酸塩がコール酸ナトリウムである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記有機溶媒が、ＤＭＦ、イソプロパノールまたはアセトニトリルからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
キャピラリー電気泳動システムによってベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）の立体異性体を分離する方法であって、該方法は、以下：
該キャピラリー電気泳動システムのキャピラリー内部の直径、キャピラリー長、電界の強さ、分離温度、ｐＨ、緩衝液系、イオン強度、キラルセレクター、および有機溶媒を、ＢＰＤ立体異性体の分離を生じるように選択する工程、
該ＢＰＤ立体異性体を含有するサンプルを該キャピラリー電気泳動システムに注入する工程、
該立体異性体を分離する工程
を包含し、
ここで、該ｐＨが９．２〜９．６であり、
該緩衝液系がボレートであり、そして
該キラルセレクターが胆汁酸塩である、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記キャピラリー電気泳動システムが、レーザー誘起蛍光検出システムを備える、方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法であって、ここで、前記ＢＰＤが、ＢＰＤ−ＭＡ、ＢＰＤ−ＤＡまたはこれらの混合物より選択される、方法。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記分離がベースライン分離を生じる、方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記キャピラリー内部の直径が５０μｍである、方法。
【請求項２４】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記キャピラリー長が、２７〜５７ｃｍである、方法。
【請求項２５】
前記キャピラリー長が３７ｃｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記電界の強さが、＋１５〜＋２５ＫＶである、方法。
【請求項２７】
前記電界の強さが＋２０ＫＶである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記分離温度が、１５〜３０℃である、方法。
【請求項２９】
前記分離温度が２０℃である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐＨが９．２である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記イオン強度が、２００〜３００ｍＭのボレートである、方法。
【請求項３２】
前記イオン強度が３００ｍＭのボレートである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記胆汁酸塩がコール酸塩である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記コール酸塩がコール酸ナトリウムである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記有機溶媒が、ＤＭＦ、イソプロパノールまたはアセトニトリルからなる群より選択される、方法。
【請求項３６】
前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮出願第６０／１１１，９５５号（１９９８年１２月１１日出願）、および米国特許出願第０９／３２１，８９３号（１９９９年５月２９日出願）の優先権を主張し、これらの出願は、完全に記載されるかのように、その全体が参考として本明細書中で援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、光増感剤分子の異性体および立体異性体の、キャピラリー電気泳動分離、ならびにこれらの検出の助けとなるレーザー誘起蛍光の使用に関する。例えば、これらの分離方法は、ＢＰＤ−ＭＡの４つ全てのエナンチオマーおよびＢＰＤ−ＤＡのその２つのエナンチオマーが、高分解能および高効率でベースライン分離によって完全に分離されることを可能にする。レーザー誘起蛍光検出の使用は、ＢＰＤのＣＥの分析感度および選択性を大いに改善する。本発明は、調製または分析の用途における、ＢＰＤの一酸および二酸のエナンチオマーを分離するための迅速かつ信頼性の高い方法として非常に適している。特定の用途の中でも、臨床的サンプルを用いての分析方法としての使用についての可能性がある。
【０００３】
（関連技術の説明）
光力学治療（ＰＤＴ）は、いくつかの光増感剤が、腫瘍組織におけるいくらかの選択性を蓄積するという観察に基づき、ここで、これらは、可視領域の波長の光によって活性化され得る。光増感剤は、可視光の光子を吸収し、そしてこの吸収されたエネルギーを使用して一重項酸素を生成し、これは、腫瘍細胞死および腫瘍剥離へと導く大部分の損傷を担うと考えられる（Ｄｅｌａｎｅｙら（１９８８））。多くの光増感剤が、現在、研究中であり、これらには、クロリン、プルプリン、フタロシアニン、およびベンゾポルフィリン誘導体、特にはベンゾポルフィリン誘導化一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）（ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）としてもまた公知；Ｓｔｅｒｍｂｅｒｇら（１９９６））が含まれる。
【０００４】
ＢＰＤ−ＭＡは、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（Ｒｉｃｈｔｅｒら（１９８７））よりもより低い皮膚光毒性を示すＰＤＴのための新規の第２世代の光増感剤であり、これは、世界中でＨｅａｌｔｈ  Ｂｏａｒｄｓによって既に承認されている。ＢＰＤ−ＭＡは、皮膚病変の処置のために；骨髄パージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）のためおよび白血病の処置のために有望な薬剤として（Ｊａｍｉｅｓｏｎら（１９９０））、血液および血液産物の浄化のための抗ウイルス剤として（Ｎｅｙｎｄｏｒｆｆら（１９９０））、ならびに最も最近では眼の老化に関連する黄斑変性の処置のために（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９３））、有効であることが示された。
【０００５】
化学化合物（特に、薬学的に重要な化合物）の、異性体、立体異性体およびキラルの形態を決定することの重要性は、強調されてもされ過ぎることはない。異性体は、同一の分子式を有する異なる分子である一方、立体異性体は、どの原子がどの他の原子へ結合されているかという点に関して同一であるが、原子が空間において配向されている様式で異なる異性体である。エナンチオマーは、互いの鏡像である立体異性体である。ジアステレオ異性体は、互いの鏡像でない立体異性体である。位置異性体は、本明細書中で使用される場合、２以上の原子または化学部分の位置以外は同一である異性体を示す。
【０００６】
米国において最も頻繁に処方される薬物のほぼ６０％が、その薬物分子中に１以上の不斉中心を保有する。これらラセミ薬物のエナンチオマーの生理学的効果は、常には試験されていない。現在使用される薬物および新規に開発される薬物の安全性および有効性を確実にするために、エナンチオマーを単離すること、および各エナンチオマーを別々に試験することが重要である。物質のエナンチオマー純度の正確な評価は、それらの毒物学的および薬理学的効果を調べるため、および薬物動態学プロフィールを研究するために、重要である。
【０００７】
伝統的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、以下の分離について最も一般的に使用される方法である：ポルフィリン（Ｌｉｎｅら（１９９８））、メタロポルフィリン（Ｗａｎら（１９９４）；Ｈｏら（１９９４）；Ｓａｔｏら（１９９４）；およびＢｅｕｋｅｖｅｌｄら（１９９４））、ポルフィリンダイマーおよびトリマー（Ｏｗｅｎｓら（１９９６））、ポルフィリン異性体（Ｒｉｃｈｔｅｒら（１９９２）およびＵｄａｇａｗａら（１９８２））、ならびにいくつかのポルフィリンエナンチオマー（Ｋｉｍｍｅｔｔら（１９９２）およびＷａｌｋｅｒら（１９８８））。典型的な薬物動態学研究の間にアッセイされる必要がある多数の生物学的サンプルおよびこれらのＨＰＬＣ技術における労働集約的な手順は、この種の分離のための代替の方法論を必要とした。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、新規でなく（Ｈｉｊｅｒｔｅｎら（１９６７）およびＪｏｒｇｅｎｓｏｎら（１９８１））、そして多くの引き続く研究が存在した（ＷａｌｌｉｎｇｆｏｒｄおよびＥｗｉｎｇ（１９８８）；Ｐｉｅｔｔａら（１９９４）；Ｍｏｒｉｎら（１９９３）；Ｈｏｎｄａら（１９９０）；Ｈｏｎｄａら（１９８９）；およびＨｏｆｆｓｔｅｔｔｅｒ−Ｋｕｈｎら（１９９１））。ＣＥの良好な再現性、感度、迅速性、自動化の容易さ、および少ないサンプル必要量によって、それは、ポルフィリンおよびそれらのアナログの分離のための有望な生物分析的技術（Ｋｕｈｎら（１９９３））となった（Ｋｕｈｎら（１９９３）；Ｙａｏら（１９９６）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら（１９９０）；Ｌｉｕら（１９９５）；Ｂｏｗｓｅｒ（１９９６）；およびＢｏｗｓｅｒら（１９９７））。それはポルフィリンの分離において特に有用であり、なぜならば、ポルフィリン蛍光は低い濃度での検出を可能にするからである。
【０００８】
ＰＤＴにおけるＢＰＤおよび他の光増感剤の重要性、ならびに薬学的用途研究用途および商業的／産業的用途のための特定の立体異性体を調製することの願望を考慮して、本発明は、このような光増感剤の異性体、立体異性体および位置異性体の分離のための新規のＣＥ方法に関する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、位置異性体、ジアステレオ異性体およびエナンチオマーを含む、光増感剤の異性体および立体異性体の、迅速かつ確実な分離のためのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法の使用に関し、さらに、本方法は、光力学療法（ＰＤＴ）において使用され得る。特に、レーザー誘起蛍光媒介検出が、ＢＰＤの立体異性体の分離における感度および選択性を改善するために、ＣＥ法と組み合わせて使用される。さらに、本発明の方法は、ベースライン分離を用いて、ＢＰＤのエナンチオマー（米国特許第５，１７１，７４９号に示され、これは、完全に記載されるかのように、本明細書によって参考として援用される）ならびにこれらの化合物の誘導体、特に、ＢＰＤ一酸（ＢＰＤ−ＭＡ）の４つのエナンチオマーおよびＢＰＤ二酸（ＢＰＤ−ＤＡ）の２つの異性体を、高分解能および高効率で完全に分離するために使用され得る。分離のためのさらなるＢＰＤは、ＥＡ６（関連出願０８／８５２，４９４に記載されており、これは、完全に記載されるかのように、本明細書によって参考として援用される）およびＢ３（関連出願０９／２６５，２４５に記載されており、これは、完全に記載されるかのように、本明細書によって参考として援用される）である。ＢＰＤに加えて、この分離法は、クロリン、プルプリン（例えば、スズエチルエチオプルプリン）、フタロシアニン（ｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）（例えば、フタロシアニン（ｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）テトラスルホネート）、フェオフォルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）（例えば、ピロフェオフォルビド（ｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）（ＨＰＰＨ））、クロロフィル、ベンゾポルフィリン、ポルフィリンおよびメタロポルフィリンを含むが、これらに限定されない他の光増感剤に適用可能である。この方法が適用され得る他の光増感剤は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗ．ＲｅｄｍｏｎｄおよびＪａｎｅｔ  Ｎ．Ｇａｍｌｉｎによる、「Ａ  Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｙｉｅｌｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，７０（４）：３９１−４７５）（これは、その全体が本発明書中に援用される）と題された論文において見出される。
【００１０】
本発明はまた、分取的または分析的な適用として、異性体、位置異性体、および／または立体異性体の分離の方法に関する。公知のＨＰＬＣ法を超える優位性のために、本発明の分取的および分析的な適用は、瞬間ＣＥ（ｉｎｓｔａｎｔ  ＣＥ）法の自動化バージョンならびに伝統的なＨＰＬＣ分離法よりも小さなサンプルサイズを利用するバージョンを含む。ＢＰＤを含む物質の臨床サンプルの分析のための瞬間方法は、格別好ましい。
【００１１】
さらに、本発明は、メタロポルフィリン、ポルフィリンマルチマーおよび異性体、ならびにこのような化合物の立体異性体を含むポルフィリン化合物の分離のために、緩衝系としてのボレート、およびキラルセレクター（例えば、コレート）の使用を含む。ボレートおよびコレートは、ＢＰＤのエナンチオマーに動力学的に相互作用し得、かつ複合体化し得、そしてそれらの電気泳動の性質および移動挙動に影響を与える。このような分離において特に好ましい条件は、５０μｍの内部直径および３７ｃｍの長さのキャピラリー（検出器まで３０ｃｍ）、＋２０ＫＶの電界の強さ、２０℃の分離温度、９．２のｐＨ、３００ｍＭの濃度のボレート、キラルセレクターとして２５ｍＭのコール酸ナトリウム、および１０％のアセトニトリルの使用を含む。好ましいベースライン分離時間は、２０分以内である。
【００１２】
さらに、エナンチオマーの完全な分離に加えて、本発明は、異なる化合物の立体異性体、所定の化合物の位置異性体ならびに所定の化合物のエナンチオマーを分離する方法を含む。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、光増感剤分子の異性体、位置異性体および／または立体異性体を分離するためのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）の使用方法を含み、この方法は、溶離中に分離される化合物間の検出可能な重なりがないとして定義される、ベースライン分離を用いて分離する工程を包含する。好ましい方法は、レーザー誘起蛍光を使用して検出を改善し、それ故、立体異性体の分離を改善する工程を包含する。これらの方法は、他の分離方法より優れた、自動化およびより小さなサンプルサイズの使用に対する適応性を提供しつつ、ＢＰＤエナンチオマーの単離において優れた有用性を有する。本発明の方法の最も好ましい用途は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡのエナンチオマーの単離のためである。ＢＰＤに加えて、これらの分離方法は他の光増感剤に適用可能であり、この増感剤には、クロリン、プルプリン（例えば、スズエチルエチオプルプリン）、フタロシアニン（例えば、フタロシアニンテトラスルホネート）、フェオフォルビド（例えば、ピロフェオフォルビド（ＨＰＰＨ））、クロロフィル、ベンゾポルフィリン、ポルフィリンおよびメタロポルフィリンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい光感光剤には、スズエチオプルプリン、フタロシアニンテトラスルホネートおよびＨＰＰＨが挙げられる。これらの方法が適用され得る他の光増感剤は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗ．Ｒｅｄｍｏｎｄら（１９９９）による上記の参考文献中に見出される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態は、緩衝化系としてのボレートの使用、およびキラルセレクターとしてのコレートの使用を含む。さらに、本発明は、エナンチオマーの完全な分離に限定されない。その代わり、本発明の方法は、分離が、異なる化合物を分離するか、所定の化合物の位置異性体を分離するか、または所定の化合物のエナンチオマーを分離するのに十分な条件下で使用され得る。しかし、分離されるべき化合物がキラル中心を有さない場合、キラルセレクター（例えば、コレート）を含む必要はない。
【００１５】
本発明の分離方法は、クロリン様光増感剤（例えば、ＢＰＤ−ＭＡ）に対して特に有用である。診療室において使用される場合、ＢＰＤ−ＭＡは２つの位置異性体（Ｉａ、Ｉｂ）の同じ割合の混合物からなる。各位置異性体は、図１に示されるような一組のエナンチオマー（Ｉａ−１、Ｉａ−２；Ｉｂ−１、Ｉｂ−２）からなる。主な代謝産物は２つのエナンチオマー（ＩＩ−１、ＩＩ−２）からなる二酸である。位置異性体の組織分布研究および効力が報告された（Ｒｉｃｈｔｅｒ（１９９１）；Ｗｏｏｄｂｕｒｎ（１９９２）；およびＲｉｃｈｔｅｒら（１９８８））。ＢＰＤ−ＤＡは２つのエナンチオマーからなる（図１）。
【００１６】
この化合物は、同じ発色団および同一の吸収スペクトル（図３ａ）を有する。このスペクトルは、ソーレー領域（４２０ｎｍ）に特徴的な主要な広いピーク、およびより長い波長でいくつかの他のピークを有する。最も興味深い長波長ピーク（ＰＤＴ中の適用に関しては）は、６８８ｎｍでピークである（有機溶媒中）。減衰係数を、１０％アセトニトリルおよび２５ｍＭコール酸ナトリウム（ｐＨ９．２）を含有する３００ｍＭボレートの緩衝液中で４３０ｎｍで決定し、そしてＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡについて、それぞれ、６１，０００Ｍ-1ｃｍ-1および７５，２００Ｍ-1ｃｍ-1であることを見出した。発光スペクトルはまた、図３ｂ中で示され、これは約６９２ｎｍ、近赤（Ｑバンド）（蛍光について約４ｎｍのＳｔｏｋｅシフトを有した）の特徴的発光を有した。上記を考慮すれば、光吸収には明白な機構的な差異は存在せず、従って、ＢＰＤは、各ＢＰＤ化合物の種々の立体異性体の間で損傷を媒介した。従って、任意の特定のＢＰＤエナンチオマーの使用による光吸収における利益はない。
【００１７】
低いｐＨでの遊離の塩基性ポルフィリンピロールは、プロトン化されてＰＨ3+、またはＰＨ42+型を産生し得る。約３．０より大きいｐＨで、遊離の塩基は中性であり、そして側鎖プロピオン酸残基のみがプロトン化される。より高いｐＨでは、プロピオン酸側鎖は、イオン化されて、ＢＰＤ−ＭＡの場合のＰ-またはＢＰＤ−ＤＡの場合のＰ2-を生じ得る。これらの化合物上の電荷は、キャピラリー電気泳動によるそれらの分離に重要な役割を果たす。
【００１８】
（キャピラリー電気泳動）
キャピラリー電気泳動による分離は、異なる移動度に基づく。移動度に影響する実験的パラメーターとしては、キャピラリーの内径および長さ、分離電圧、温度、緩衝液の型および濃度、ｐＨ、イオン強度、キラルセレクタの型および濃度、有機溶媒の型ならびに電解質の量が挙げられる。さらに、サイズ、正味の電荷および添加剤と分析物との相互作用がキャピラリー電気泳動内の移動度に影響する。分析物のサイズおよび電荷は、それらの分子量、構造ならびに水和およびイオン化の程度に関している。これらの種々のパラメーターの間の関わりおよび相互作用は、当業者に公知であり、そして慣用的に評価および最適化され得る。従って、適切な直径、長さ、電圧、温度、緩衝液の型および濃度、ｐＨ、イオン強度、キラルセレクターの型および濃度、有機溶媒および量、ならびに他のパラメーターの選択は、過度の実験なしに選択され得る。
【００１９】
考慮される初期ＣＥパラメーターとしては、キャピラリーの内径および長さ、ならびに分離電圧が挙げられる。ＢＰＤエナンチオマーについてのＣＥの評価において、約２．０秒の＋１０ＫＶの動電学的な注入が適用されるが、約＋１０〜約２５ＫＶの範囲がより長いかまたはより短い時間間隔で使用され得る。ＢＰＤエナンチオマーは、ＥＯＦの移動およびポンピング作用の両方によりキャピラリーに進入する。さらに、動電学的な注入は、「スタッキング」現象によりサンプルを濃縮することを補助する。この注入方法は、生物学的マトリクスまたは臨床的サンプル（通常、大量の塩化ナトリウムを含む）において特に有利である。
【００２０】
小さい内径のキャピラリーは、ジュール熱をより容易に散逸し、そして電流を下げて、よりよい分離効力を生じ得る。約５０μｍの内径のキャピラリーは、ＢＰＤエナンチオマーについて好ましいが、約４０〜約７５μｍにわたる内径もまた用いられ得る。小さい内径はしばしば、目詰まりの増大を伴う強力な内部キャピラリー壁吸着を導く。検出感度はまた、より短い検出窓で低下する。キャピラリーおよび泳動緩衝液の濾過の適切な調整は、各泳動の前の必要な通常の工程である。
【００２１】
非常に高い電場を印加して、分析物の移動時間を減少させるために、適切なキャピラリー長が必要である。６つのＢＰＤエナンチオマーの分離時間は、約５７ｃｍのキャピラリーを用いて約４５分であったが、約２７ｃｍのキャピラリー長では移動時間は約５分に減少した。従って、約２７〜約５７ｃｍの長さの範囲が用いられ得る。ＢＰＤエナンチオマーが検出窓を非常に迅速に通過し、そして十分な分離時間がないので、分離効率はまた低下した。受容可能な時間プロフィールを有するＢＰＤ化合物の良好な分離は、約３７ｃｍ長の好ましいキャピラリーを用いて得られた。
【００２２】
電気浸透流および電気泳動移動速度は、キャピラリーにわたって印加された電場の強度に直接比例する。高い電場強度ほど、より短い移動時間をもたらし、そして約＋１０ＫＶ〜＋２５ＫＶの範囲が用いられ得る。３つの電場強度をＢＰＤのエナンチオマーの分離について比較した。約＋１５ＫＶで、ＢＰＤのピーク２および３（このピークは、図４に規定される）は、約２５分後に重複した。これは、拡散に起因したようである。約＋２０ＫＶへの電圧の上昇により、全ての６つのＢＰＤエナンチオマーは、約１５分内にベースライン分離された。分離電圧を約＋２５ＫＶに増加した場合、移動時間はより短くなったが、高い電流およびジュール熱がサンプルプラグ拡散を生じ、そしてピーク２および３は、やはり重複した。さらに、ジュール熱は、内部キャピラリーの温度上昇を生じ、これは、ＢＰＤ蛍光量子収率が低下したために、シグナル低下を生じた。全ての６つのエナンチオマーについて完全なベースライン分離を得るためには、約＋２０ＫＶの電場が好ましい。
【００２３】
ＣＥにおける別のパラメーターは、温度である。上昇した分離温度または低下した分離温度は、緩衝液泳動速度、電気浸透流および分析時間を変化させ得る；分析物の化学平衡および分離プロセスにおける反応速度論もまた影響され得る。約１０〜約３５℃の範囲が用いられ得る。温度を約２５℃から約３５℃に上昇させた場合、移動時間は、泳動緩衝液速度の低下に起因して、より短くなり、これは引き続いてＥＯＦを低下させる。約３５℃では、ピーク２および３は、ジュール熱の結果として、またしても重複した。このジュール熱は、均一でない温度勾配、速度および密度の局所変化を生じ、そしてゾーンの歪みおよび引き続くゾーンの広がりを生じた。Ｐ／ＡＣＥ  ５５００は、５〜５０℃の範囲にわたるサーモスタットシステムを有するが、約１５℃で、分離は、有意な改善を示し、そしてそれは約１５分で平衡に達した。約２０℃の温度が分離温度として好ましい。
【００２４】
ＣＥによる分離はまた、用いられる緩衝化システムによっても影響される。緩衝液の型、濃度、イオン強度、およびｐＨは全てが考えられるパラメーターであり、そして種々の緩衝液が用いられ得る。以下の緩衝液を電解質として試験した：ｐＨ１１．０４、１００ｍＭ  ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）；ｐＨ６．７６，３０ｍＭ  酢酸アンモニウム；ｐＨ２．７６、５０ｍＭ  クエン酸；およびｐＨ９．２、１００ｍＭ  ボレート。ＢＰＤエナンチオマーをＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ＞１１）（この緩衝液は、高濃度の酢酸アンモニウム緩衝液であり、通常、キャピラリー中で電流の中断を生じる泡を生じる）を用いて高いｐＨで非常に容易に加水分解した。この次に、分離の中断かまたは過剰なスパイクおよびシグナルノイズのいずれかが生じた。クエン酸緩衝液中で、ＢＰＤエナンチオマーは、プロピオン側鎖でプロトン化され、脱プロトン化状態に基づいて分離をだめにする。有効な電荷がＢＰＤ−ＤＡおよびＢＰＤ−ＭＡについて同じであるので、電気泳動移動度の差異は、通常非常に小さい。高いｐＨでもＥＯＦは非常に小さく、そしてこれは移動時間を非常に長くした。この結果は過剰な拡散に起因して非常に乏しいシグナル分離であった。
【００２５】
しかし、ｐＨ約９．２のボレート緩衝液で、ＢＰＤ−ＤＡおよびＢＰＤ−ＭＡエナンチオマーが完全に分離された。これは、ボレートが、高い緩衝化能力で非常に安定な緩衝液を形成する能力およびボレートが非常に高い濃度で用いられるべき能力と組み合わせて、即時分離方法における使用のための好適な選択となった。ボレートはまた他の分離システム（Ｃｏｎｓｄｅｎら（１９５２）；Ｂｏｅｓｅｋｅｎ（１９４９）；およびＬａｎｄｅｒｓら（１９９２））においても用いられている。さらに、研究により、ＢＯＤ−ＭＡの分解がｐＨ９．２で１時間に１％未満であったことが示された。従って、分解（本質的に加水分解）は、ボレートにおけるキャピラリー電気泳動の約１５分の分析時間内では無視できる。
【００２６】
ＢＰＤエナンチオマーの側鎖プロピオン酸は、ボレート緩衝液のｐＨが約３．５を超えると脱プロトン化し始める。従って、約３．５を超えるｐＨが、本発明のＣＥ方法には好ましい。好ましいｐＨは約８．０５から約９．６にわたる。ＢＰＤ−ＭＡエナンチオマーは、１つのイオン性カルボン酸基を有する、そしてＢＰＤ−ＤＡは、２つの酸性基を有する。この電荷差は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡをＣＥにより容易に分離されるようにする。ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ分離に加えて、ｐＨの差異はまたＢＰＤエナンチオマーのキラルセレクター添加物との動的複合化を変化させ得る。これはそれらの移動度の差異を変化させる。図４は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡエナンチオマーのみがｐＨ８．０５で分離されたことを示す。ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡのエナンチオマーは、ｐＨ８．６である程度分離され、そしてｐＨ９．２で完全な分離が得られた。ｐＨを９．６に上昇することにより、ＢＰＤエナンチオマーはさらに分離されたが、そのシグナルは、より高いイオン強度に起因して低下した。これは蛍光に悪影響を及ぼした。さらに、移動時間はまた、ＥＯＦを阻害する高いイオン強度に起因して増大した。
【００２７】
ボレートのイオン強度の効果を、図５に示す。イオン強度増大の１つの不利な点は、キャピラリー中の電流増加および過剰なジュール熱から生じる。イオン強度増大のポジティブな性質としては、キャピラリー壁上のＢＰＤエナンチオマーの吸着の低下および電気泳動の拡散の抑制が挙げられる。これはまたＥＯＦを低下させ、そして分析物移動を遅らせてより良好な分離を提供する。より高いイオン強度はまた、ボレートとＢＰＤエナンチオマーとの動的な錯体化を増大し、そして分離分解能の影響した。４０〜３６０ｍＭボレートの範囲にわたるイオン強度は、即時方法において用いられ得るが、１２０〜３６０ｍＭの範囲が好ましく、そして２００〜３６０ｍＭの範囲がより好ましい。最も好ましいのは、３００ｍＭのイオン強度である。高いボレート濃度（約３６０ｍＭを超える）で、緩衝液の溶解度および安定性は悪化し、これは電流停止およびキャピラリー目詰まりを生じた。
【００２８】
生成定数、遊離の電気泳動移動度ならびにボレートおよびコレートとの錯体の移動度は、動的錯体化キャピラリー電気泳動理論に基づいて決定した（Ｐｅｎｇら（１９９７））。ボレートとのＢＰＤエナンチオマーの動的錯体化の生成定数は、表１に与えられる。生成定数（Ｋ）は、約１１．５１〜約１２．５１の範囲にあり、これは各場合において弱い相互作用を示すエナンチオマーの間でほとんど差異がない。Ｇｏｏｄａｌｌのグループ（Ｐｅｎｎら（１９９４））により提唱された式に基づいて、エナンチオマー移動度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）の差異（Δμ）は、２つのエナンチオマーの生成定数（ΔＫ）およびキラル添加濃度における差異に比例する。ＢＰＤ−ＭＡ  Ｉａ−２（約１１．９０のＫ）およびＢＰＤ−ＭＡ  Ｉｂ−１（約１１．９１のＫ）についてのΔＫは、わずか０．０１であるが、ボレート濃度の約４０ｍＭ〜約３６０ｍＭへの増加は、Δμを約９倍に増大させ、そして２つのレジオアイソマー（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）の分解能を劇的に増大させる。ボレートがＢＰＤエナンチオマーと相互作用する場合、複合体は複合体化されていないエナンチオマーよりもより緩徐に動くことがまた可能であり得る。例えば、遊離状態の移動度ＢＰＤ−ＭＡ  Ｉａ−１は、約−１．９５×１０-5ｃｍ2Ｖ-1ｓ-1であるが、その複合体の移動度は、約−２．９４×１０-5ｃｍ2Ｖ-1ｓ-1である。これは、ＢＰＤ−ＭＡ  Ｉａ−１がボレートと相互作用する場合、この複合体がサイズに対してより大きい電荷の比（ｑ／ｒ、ここでｑは電荷を示し、そしてｒは半径を示す。）を有することを意味する。このサイズ増大に起因して、ＢＰＤ−ＭＡ  Ｉａ−１は、ボレートと複合体化される場合、より負に荷電する。これは、より長い分離時間をもたらす。他のＢＰＤエナンチオマーの全ては、ＢＰＤ−ＭＡ  Ｉａ−１と類似の様式で挙動する。
【００２９】
【表１】
0004616994.tif 000002
ＣＥによるエナンチオマーの分離はまた、キラルセレクター（添加剤）の選択を含む。これらは、動的平衡錯化プロセスにおいてジアステレオ異性体対を形成し、このプロセスは、電気泳動的に十分区別する場合、キラル分離を可能にする。ＣＥにおける使用のための広範な範囲のキラルセレクター（例えば、金属錯体、ミセル系、マイクロエマルジョン、クラウンエーテル、シクロデキストリン、オリゴ糖およびタンパク質）は、当該分野で公知であり（Ａｖｅｌｉｎｅら（１９９５））、そして本発明の方法において使用され得る。
【００３０】
ＢＰＤ立体異性体について、異なる添加剤（図２に示される）である、ＨＰ−β−ＣＤ、ＤＭ−β−ＣＤ、β−ＣＤ、およびγ−ＣＤ、胆汁酸塩、β−エスシン（β−ｅｓｃｉｎ）、サリシン、リファマイシンナトリウムＳＶ、（＋）−ルチンヒドレートおよびグリチルリジンアンモニウムが、キラルセレクターとして試験されている。胆汁酸塩は、好ましいキラルセレクター剤である。胆汁酸塩は、生物学的界面活性剤であり、そして３〜１４モノマーの小さいかまたは一次凝集物を形成する。これらの凝集物は、負に荷電したコアおよび疎水性の荷電していない表面を有する「逆ミセル」の型を形成し、これは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）について示されるのと反対である。胆汁鎖塩の両親媒性性質は、疎水性部位および極性（または静電気的）部位の両方を提供する。モノマーの非極性表面は、疎水性化合物の安定化を助け、そして構造的に剛性のキラル胆汁酸塩は、ＰＢＤエナンチオマーと選択的に相互作用する。
【００３１】
４つの胆汁酸塩（コレート、タウロコレート、デオキシコレートおよびタウロデオキシコレート）はさらに、キラルセレクターとして試験された。これらの化学構造（図２）における小さな変化は、ＢＰＤエナンチオマーの認識に対して有意に衝撃を与えたが、４つ全てを、本発明の方法に使用し得る。コール酸ナトリウムは、最良の分離能力を有し（図６）、そして最も好ましいキラルセレクターであるが、コレートの他の塩もまた使用され得る。さらに、胆汁酸塩濃度の範囲（約１０〜約３５ｍＭの範囲）が使用され得る。約０ｍＭ〜約１０ｍＭのコール酸ナトリウム濃度の増加は、それらのエナンチオマーの部分分離のみを用いてＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡを分離することを可能にした。約１５ｍＭの濃度までコール酸ナトリウム濃度を増加させ、次いで約２０ｍＭに増加させることにより、２つのＢＰＤ−ＤＡエナンチオマーは、約１１分以内に完全なベースライン分離を生じるが、一方、ＢＰＤ−ＤＡエナンチオマーは、４つのピークを示し、それらの２つが重複した。コール酸ナトリウム濃度を約２５ｍＭおよび約３０ｍＭにさらに増加させることにより、４つのＢＰＤ−ＤＡおよび２つのＢＰＤ−ＤＡエナンチオマーの両方の完全なベースライン分離が観察された。分離のための好ましいコール酸ナトリウム濃度は、約２５ｍＭであるが、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲である。コール酸ナトリウム濃度が約３０ｍＭより高い場合、全てのピークは、分解能の劣化とともにより長い分析時間にシフトした（図６）。
【００３２】
コール酸ナトリウムのＢＰＤエナンチオマーとの生成定数（Ｋ）は、約２８．５、３０．５４、３０．９０、３６．５３、４９．０４、４８．４２であると決定された（表１）。生成定数における差異は、６つ全ての可能なエナンチオマーを分離し、そしてコレート濃度の至適化は、至適な分離を可能にする。エナンチオマーのコレートとの錯体の移動度は、それらの遊離の錯体化していない状態において対応するエナンチオマーよりも、より負の値を有する（表１）。
【００３３】
有機溶媒はまた、緩衝電解質の極性および粘性を変化させ得、電気泳動移動度およびＥＯＦの両方に対する変化を生じる。有機溶媒はまた、溶質の溶媒和を増加させるため、および疎水性溶質の親和性を改変するために、水溶液中で乏しい可溶性である分析物のための可溶化剤として幅広く使用される。ＢＰＤ誘導体は、水性媒体中で自己凝集するが、これは、有機溶媒を添加することによって、防止され得る（Ａｖｅｌｉｎｅ（１９９５））。このように、任意の有機溶媒が、本発明の方法において使用され得る。アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールの効果が評価された。ＢＰＤエナンチオマーが、ＤＭＦ、イソプロパノールまたはアセトニトリルの添加の際に、ベースライン分離され得ることが見出された。試験された全ての有機溶媒は、分離を改善した相乗効果を示した。図７は、ランニングバッファー中のアセトニトリル濃度を変化する結果を示す。約１０％〜約１５％の量のアセトニトリルが、分離を増強するために好ましい（図７）。アセトニトリルまたは別の有機溶媒を添加せずに、凝集は、分離を防止する。アセトニトリルが約２０％を超えた場合、ランニングバッファー溶質は不安定になり、ボレートおよびコール酸ナトリウムの沈殿が、キャピラリーのつまりをもたらす。
【００３４】
ＣＥにおける再現性が、効率的な分離のために非常に所望される。従って、適切なキャピラリー調整法および分析手順は、再生可能なキャピラリー表面を維持するため、および再生可能な分離を得るために重要である。調整は表面を一新し、シラノール基を脱プロトン化し、そして吸着した不純物を除去する。ＢＰＤエナンチオマーは、シリカ上で強力な吸着を示す。十分長いリンス時間は、接触コーティングの構築からキャピラリー内部壁を防止する。短すぎるリンス時間は、ＥＯＦを減少する接触コーティングを生じる。これは、より長いサンプル移動時間を生じ、そしてバンドの広幅化およびテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）をもたらし、従って分離を損なう。以下の実施例の節は、好ましい調整法を示し、これは、表２に示されるように十分行われ、相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、２．９０％〜４．６４％のみである。サンプル中の泳動電解質の全体のイオン強度およびＤＭＳＯの量に対する荷電したＢＰＤエナンチオマーの寄与は、それらの非常に低い濃度のために無視できる。
【００３５】
【表２】
0004616994.tif 000003
高感度レーザー誘起蛍光は、ＣＥによるＢＰＤ立体異性体分離の感度および選択性を非常に改善する。約５０ｎｍのより小さい内径のキャピラリーは、分析シグナルの減少を生じるが、高電流に起因して温度の増加も防止する。７５ｎｍの内径のキャピラリーで観察された過剰なジュール加熱は、上昇した温度での衝突の頻度の増加および外部変換による不活化に起因して、蛍光の定量効率を低下させる。アセトニトリルの添加はまた、そうでなければ、異常な分析シグナルを生じるＢＰＤの凝集および自己消光および自己吸収を防止する。
【００３６】
６９０±５ｍｍの波長のバンドパスフィルターはまた、バックグラウンドノイズおよび他の影響を取り除くために使用され得る。ＢＰＤ誘導体の複数の吸収バンドは、励起のための４８８ｎｍのレーザーの使用を可能にする。臨床サンプルにおけるほとんどのマトリックス（そうでなければ、夾雑する）化合物は、約４８８ｎｍで吸収せず、６９０ｎｍでも蛍光を発しない。マトリックスの影響はまた、導電注入モードを使用することによって、ある程度まで、防止され得る。
【００３７】
較正曲線は、ＣＥ分離を容易にする。５．０×１０-5Ｍ〜５．０×１０-2ＭのＢＰＤの濃度についての較正グラフを、フィールドサンプルにおけるＢＰＤエナンチオマーの分析のために使用した。サンプルを三連で注入し、そして平均ピーク面積を、ピーク高のかわりに使用して、較正曲線を構築した。ＢＰＤエナンチオマーの最小二乗線形回帰分析からの相関計数（ｒ2）は、０．９８１４〜０．９９９７の範囲であり、そして表３に列挙される。検出限界は、ＢＰＤエナンチオマーについて、２：１のシグナル対ノイズ比を用いて、６９４ｎｍの検出波長で、２．０６×１０-6〜３．２５×１０-6Ｍであった。同じ日の相対標準偏差は、２．９０％〜４．６４％（ｎ＝１０）であった。
【００３８】
ＢＰＤ立体異性体の分離についてのＨＰＬＣおよびＣＥの比較は、ＣＥにおける有意な優位性を実証する。ＨＰＬＣを用いて、至適条件が以下であることを見出した：ヘキサン：エタノール（８０：２０、１％ジメチルアミン）、０．７ｍＬ／分の流速、および５０μｌの０．１ｍｇ  ｍＬ-1のＢＰＤ溶液。Ｃｈｉｒａｌ  Ｐａｋ  ＡＤカラムを使用して、ＢＰＤ−ＭＡ（Ｉ）、ＢＰＤ−ＭＡ（ＩＩ）およびＢＰＤ−ＤＡエナンチオマーを分離した（図８）。ＢＰＤ−ＭＡおよｈびＢＰＤ−ＤＡを混合し、そして注入した。ＢＰＤ−ＭＡ（Ｉ）およびＢＰＤ−ＭＡ（ＩＩ）は、完全に重複し、そしてＢＰＤ−ＤＡは、ＢＰＤ−ＭＡ（Ｉ、ＩＩ）と部分的に重複した。ピーク形状は、テーリングによって変形され、そして分析移動時間は、３５分程度であった。ＣＥによって行われたＢＰＤエナンチオマーの分離電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｇｒａｍ）の比較において（図８）、ＣＥ法は、分解能を有意に改善した。分析時間を、全てのＢＰＤエナンチオマーの完全なベースライン分離を用いて１３分まで短くし、そしてシャープなピークをテーリングなしで観察した。１メートルのキャピラリーあたりの分解能および理論段数（Ｎ）を表３に列挙する。Ｎ／ｎは、ＣＥにおいて４６１００〜１１５４００の範囲である。これは、特にキラルＨＰＬＣ分析（Ｎ／ｍは１６５０以下である）と比較して満足であるとみなされ得る。
【００３９】
【表３】
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図１０〜１５は、どのようにＣＥ分離条件を適合して、種々の光増感剤の異性体、エナンチオマー、ジアステレオ異性体および位置異性体を分離し得るかを例示する。分離に使用した条件を、図面の簡単な説明に示す。ＢＰＤ−ＭＡ位置異性体の分離を、図１０に示し、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−Ｍａｅの混合物からの位置異性体の分離を、図１４に示し、そしてフタロシアニンテトラスルホネート異性体の分離を、図１５に示す。図１５におけるマルチピークプロフィールは、トリスルホン化材料を用いたフタロシアニンサンプルの共雑の結果であり得る。
【００４０】
ＨＰＰＨ（２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオフォルビド−ａ）の分離を、図１２に示す。スズエチオプルプリンのエナンチオマーの分離を、図１３に示す。蛍光プロフィールが等量の各エナンチオマーを示さないという事実は、おそらく、分離を促進するために使用したキラル剤とエナンチオマーの相互作用による示差的消光の結果である。ジエチルグリコールジエステルＢＰＡのエナンチオマーの分離を、図１１に示す。示されたいくつかの分離は、この系の各エレメント（イオン強度、緩衝液型、キラルセレクターなど）を、本明細書中においてＢＰＤ−ＭＡおよびＰＢＤ−ＤＡについて行ったように滴定することによってさらに改善され得るようである。
【００４１】
（適用）
本発明の方法は、ＢＰＤおよび他の光増感剤の位置異性体および立体異性体を分離するために使用され得る。このような分離技術は、研究適用、試験適用、または治療適用における使用に対して、特定の立体異性体、位置異性体またはエナンチオマーを調製するために使用され得る。あるいは、これらの方法は、混合物または複合体のサンプルから特定の立体異性体を同定するために、分析適用において使用され得る。これらの分析適用としては、所定のサンプル中の特定の立体異性体の量を定量する本発明の方法の使用が挙げられる。これらの適用は、種々の組織の臨床サンプルにおける光増感剤の送達および代謝の、経時的な研究において使用され得る。このように、これらは、医学的適用および治療的適用において潜在的に非常に価値がある。
【００４２】
１つの分析適用は、ウシ血清からのＢＰＤの抽出である。ＣＥにおいてアセトニトリル（×３）を使用する回収は、約９１．２％である。例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを用いる、この抽出物の最初の精製は、ほとんどのマトリックス成分（例えば、タンパク質、塩など）を除去する。濃縮後に、このサンプルは、ＣＥ分析のために直接的に注射され得る。このエバポレーション工程は、サンプルの調製に必要である。なぜなら、これは、さらなる不純物の沈殿および除去を可能にするからである。Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジを使用するサンプル調製の主な欠点は、ｐＨが十分に制御されない場合（ｐＨは、６．０と８．０との間に維持されなければならない）に、ＢＰＤ−ＤＡエナンチオマーへと部分的に加水分解することである。代替の方法が、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを０．２２μｍ溶媒フィルターに交換することによって開発された。リポソームに処方された薬物（ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、ＢＰＤ−ＭＡ）の標準的な溶液は、容易に分離され得る。これらの技術に基づくと、ラット、イヌおよびヒトの肝ミクロソームとともにインキュベートされた、リポソームに処方されたＢＰＤ−ＭＡの代謝物が、首尾よく分離された（図９）。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例示するがこれを限定しないことが意図される。
【００４４】
（実施例１）
（使用される材料）
（キャピラリー電気泳動システムおよび計装）
全ての実験を、オートサンプラー、減圧注入システム、サーモスタッドキャピラリー区画（５〜５０℃）およびＵＶ−Ｖｉｓ検出器、Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＤＡＤ）またはＬａｓｅｒ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＬＩＦ）検出器（３ｍＷ  Ａｒｇｏｎ  Ｌａｓｅｒモジュール（４８８ｎｍ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）およびバンド通過フィルター６９０±５ｎｍ（内径１インチ、ＯＲＩＥＬ）を備える）から構成されるＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ  ５５００システムを使用して実行した。コーティングしていない石英ガラスキャピラリーカラムを、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｎｏｌｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）から入手した。他に特定されない限り、寸法は、代表的に、５０μｍ内径、３５５μｍ外径、および３７ｃｍの全長（検出器まで３０ｃｍ）であった。この新しいキャピラリーを、１．０Ｍ  ＮａＯＨにより１５分間処理し、続いて脱イオン蒸留水により１５分間リンスし、そして使用前に、電気泳動泳動緩衝液により一晩平衡化した。データの収集、処理および分析を、Ｐ／ＡＣＥTMステーションソフトウェアパッケージ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して実行した。
【００４５】
ＡＭＩＮＣＯ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２ルミネセンス分光計（ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ）、８４５２Ａダイオードアレイ分光計（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）、９９１フォトダイオードアレイ検出器を備える６００Ｅ多溶媒（ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ）送達ＨＰＬＣシステム（ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）もまた、使用した。Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。ＧＬＣ−１  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  ＥTM（Ｂｅｃｋｍａｎ）およびＭｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ、０．２２μｍ孔サイズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）もまた、用いた。
【００４６】
（ＢＰＤアナログの合成）
ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ（図１）を、プロトポルフィリンおよびジメチルアセチレンジカルボキシレートのディールズ−アルダー付加物から合成した（Ｒｉｃｈｔｅｒら（１９８７））。２５％塩酸でのプロピオン酸ジメチルエステルの加水分解の時間は、形成される一酸（ｍｏｎｏ−ａｃｉｄ）と二酸（ｄｉ−ａｃｉｄ）との間の最終的な比率を示す。一酸アナログからの二酸の分離を、クロマトグラフィーにより達成する（Ｒｉｃｈｔｅｒら（１９９０））。ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡの溶液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に、１０ｍｇｍＬ-1の濃度で調製した。このストック溶液を、暗所にて０℃未満で凍結して貯蔵した。使用の直前に、少量のストック溶液を、ＤＭＳＯで希釈して、２．０×１０-2ｍｇｍＬ-1の濃度にした。
【００４７】
（化学物質）
ヒドロキシプロパル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、ヘプタキス（ｈｅｐｔａｋｉｓ）（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（ＤＭ−β−ＣＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、およびγ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏからであり、そしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、Ｆｉｃｈｅｒ  Ｉｎｃからであった。キラル添加剤の構造を、図２に示す。タウロコール酸（ナトリウム塩水和物）、（＋）−ルチン水和物、デオキシコール酸（ナトリウム塩）（１水和物）、グリチルリチン酸（１アンモニウム塩水和物）、サリシンおよびＢｒｉｊ  ３５を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ，Ｍｉｌｗ，ＷＩから入手した。コール酸（ナトリウム塩）、タウロデオキシコール酸（ナトリウム塩）、β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）およびリファマイシンＳＶ（ナトリウム塩）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。緩衝化ストック溶液は、１００ｍＭ  ３−［シクロヘキシルアミノ］−ｎ−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（ｐＨ１１．０４）；１００ｍＭ  Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ（Ｂｏｒａｘ）（ｐＨ９．２）；１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）および１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２．８）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）であった。これらを使用の前に希釈して、適切な濃度にした。
【００４８】
全ての溶液を、使用前に０．２２μｍフィルターに通してろ過した。水を蒸留し、そしてＮＡＮＯ  ｐｕｒｅ  ＩＩ  ｕｌｔｒａ  ｗａｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｍｏｌｙｎｅ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）で脱イオン化した。ＤＭＳＯ、アセトニトリル、１−プロパノール、イソ−プロパノールおよびメタノールは、ＨＰＬＣ等級（Ｆｉｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、そして全ての他の化学物質は、分析用等級であり、そしてさらに精製することなく使用した。
【００４９】
（サンプル）
リポソームに処方されたベンゾポルフィリン誘導体一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ，Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）は、ＱＬＴ  Ｐｈｏｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａにより提供された。ウシ血清およびミクロソームからの抽出物は、ラット、イヌおよびヒトとインキュベートされた、リポソームに処方されたＢＰＤ−ＭＡであり、そしてＤｒ．Ｊｕｌｉａ  Ｌｅｖｙ（Ｄｅｐａｒｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）により提供された。
【００５０】
（ウシ血清調製物）
ＢＰＤ−ＭＡストック溶液（１ｍＬ、０．１ｍｇｍＬ-1）を、ウシ血清（１．０ｍＬ）またはアセトンブランク（１ｍＬ）に添加し、十分に攪拌し、次いでアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加した。この混合液を十分に攪拌し、そして遠心分離した（２０００ｒｐｍで５分）。上清を回収し、そして血清を再懸濁し、そしてアセトニトリル中で２回洗浄した。合わせた上清を、０．２２μｍフィルターを使用してろ過した。回収量を、蛍光検出を使用して決定した。およそ０．５ｍＬまでこの抽出物をエバポレートした後に、最終容量を水により５．０ｍＬにした。次いで、この溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジにつめ、そして水により洗浄した。このＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジを、アセトニトリル（５×１ｍＬ）によりリンスした。この溶出液をエバポレートし、ＤＭＳＯ（２００μｌ）を添加し、そしてこの溶液を攪拌し、そして０．２２μｍフィルターを使用してろ過した。次いで、このサンプルをＣＥ分離のために準備した。
【００５１】
（実施例２）
（ＣＥ分離手順）
この装置を、キャピラリーが０．２Ｍ  ＮａＯＨで５分間、純水で５分間、次いで分離緩衝液で３分間、高圧でリンスされるようにプログラムした。次いで、サンプルを、＋１０ＫＶ界面動電（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）注入により２．０秒導入する。分離を、正常極性を有するキャピラリーの末端を横切って＋２０ＫＶを印加することによって、定電圧の様式において行った。レーザー励起波長は、４８８ｎｍであり、そして蛍光検出を、６９４ｎｍでモニターした（１０ｎｍ、１．０インチバンドバスフィルター）。検出セルウインドウ（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｗｉｎｄｏｗ）を、キャピラリー上のポリイミドコーティングを除去することによって作製した。このキャピラリーの温度を、２０℃で維持した。データを５Ｈｚにて収集した。実行の間に、このキャピラリーを清掃して、そして１．０Ｍ  ＮａＯＨおよび純水で５分間連続的にリンスすることで平衡化した。
【００５２】
（実施例３）
（ＢＰＤ−ＭＡリポソーム処方物からのＢＰＤ−ＭＡの分離）
リポソームに処方されたＢＰＤ−ＭＡ（２５ｍｇ）を含む２５ｍＬボトルに、１２．５ｍＬのＨ2Ｏを添加した。攪拌後に、これを使用まで暗所（０℃未満）で貯蔵した。このストック溶液（５．０μｌ）のサンプルを、ＤＭＳＯ（９５０μｌ）に添加した。この溶液を十分に攪拌し、そして５分間遠心分離し、そして０．２２μｍ溶媒フィルターを使用してろ過し、次いで使用まで暗所（４℃）で貯蔵した。１２．５μｌのこの溶液（２．０ｍｇｍＬ-1）を、２５％アセトニトリル／水に添加して、そして十分に攪拌した。次いで、この溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジに移し、そして２５％アセトニトリル／水で三回リンスした。Ｓｅｐ−Ｐａｃｋを、メタノール（５×１．０ｍＬ）で溶出した。この溶出液を合わせて、そして窒素流（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｔｒｅａｍ）下でエバポレートし、そしてこの沈殿をＤＭＳＯ（５．０ｍＬ）中に溶解し、０．２２μｍフィルターを使用してろ過し、そして暗所において４℃で貯蔵した。本明細書の上記および以下に引用される全ての参考文献は、以前に詳細に援用されているか否かにかかわらず、それらの全体において、本明細書によって参考として援用される。
【００５３】
本発明をここで十分に記載することで、同じものが、本発明の精神および範囲を逸脱することなくかつ過度の実験なしに、広範な範囲の等価なパラメータ、濃度、および条件において実行され得ることが、当業者により理解される。
【００５４】
本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、かつ本発明が関係する技術内の公知または慣習の実施内にあるような、そして添付の特許請求の範囲に従う通りに示される本明細書中上記の本質的な特徴に適用され得るような本発明の開示からの逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または適応を包含することが意図される。
【００５５】
（参考文献）
【００５６】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
本発明は、以下の図面を参照することによってより明白に理解される。
【図１】  図１は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡの立体異性体の構造。
ベンゾポルフィリン誘導体一酸（ＢＰＤ−ＭＡ、Ｉａ−１、Ｉａ−２、Ｉｂ−１、Ｉｂ−２）およびベンゾポルフィリン誘導体二酸（ＢＰＤ−ＤＡ、ＩＩ−１、ＩＩ−２）。ＩおよびＩＩは、それぞれ、ＢＰＤ一酸およびＢＰＤに酸を表し；ａおよびｂは位置異性体を表し；そして１および２はエナンチオマーを表す。
【図２】  図２は、キラル添加剤の構造。
ヒドロキシプロパル（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｌ）−β−シクロデキストリン（ＩＩＩ、ｎ＝２、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ヒドロキシプロピル）；ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（ＩＩＩ、ｎ＝２、Ｒ1＝Ｒ3＝メチル、Ｒ3＝Ｈ）；β−シクロデキストリン（ＩＩＩ、ｎ＝２、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ）；γ−シクロデキストリン（ＩＩＩ、ｎ＝３、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ）；コール酸ナトリウム塩（ＩＶ、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＯＨ、Ｒ4＝ＯＮａ）；デオキシコール酸ナトリウム塩（ＩＶ、Ｒ1＝Ｒ3＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ4＝ＯＮａ）；タウロコール酸ナトリウム塩（ＩＶ、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＯＨ、Ｒ4＝ＮＨ（ＣＨ2）ＳＯ3Ｎａ）；タウロデオキシコール酸ナトリウム塩（ＩＶ、Ｒ1＝Ｒ3＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ4＝ＮＨ（ＣＨ2）2ＳＯ3Ｎａ）；β−エキシン（ｅｘｉｎ）（Ｖ）；サリシン（ＶＩ）；リファマイシン  ＳＶナトリウム塩（ＶＩＩ）；（＋）−ルチン水和物（ＶＩＩＩ）；グリシルリジン（ｇｌｙｃｙｒｒｉｚｉｃ）酸（ＩＸ）。
【図３】  図３は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡのＵＶ−Ｖｉｓおよび蛍光スペクトル。
ａ．ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、１．０×１０-3ｍｇ  ｍｌ-1  ＢＰＤ−ＭＡ。ｂ．蛍光発光スペクトル、ＢＰＤ−ＭＡ  １．２５×１０-4ｍｇ  ｍｌ-1（ｐＨ  ９．２）、３００ｍＭ  ボレート、２５ｍＭ  コレート、および１０％  アセトニトリル溶液。ＢＰＤ−ＤＡは同様のスペクトルを示す。
【図４】  図４は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ分離に対する緩衝液のｐＨの影響。
ａ．ｐＨ  ８．０５、ｂ．ｐＨ  ８．６０、ｃ．ｐＨ  ９．２、ｄ．ｐＨ  ９．６０。３００ｍＭ  ボレートおよび２５ｍＭ  コール酸ナトリウムおよび１０％アセトニトリル。それぞれ、ＢＰＤ−ＤＡ  ２．５×１０-2ｍｇ  ｍｌ-1。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。＋２０ＫＶ、３７ｃｍ、２０℃、界面動電サンプリング  ２．０秒。
ピークの帰属：１，Ｉａ−１；２，Ｉｂ−１；３，Ｉａ−２；４，Ｉｂ−２；５，ＩＩ−１；６，ＩＩ−２。
【図５】  図５は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ分離に対する電解質濃度の影響。
ａ．４０ｍＭ、ｂ．８０ｍＭ、ｃ．１２０ｍＭ、ｄ．１６０ｍＭ、ｅ．２００ｍＭ、ｆ．２４０ｍＭ、ｇ．２８０ｍＭ、ｈ．３００ｍＭ、ｉ．３２０ｍＭ、ｊ．３６０ｍＭ。ボレート（ｐＨ  ９．２）。それぞれ２５ｍＭ  コール酸ナトリウムおよび１０％  アセトニトリルを含む。それぞれ、ＢＰＤ−ＤＡ  ２．５×１０-2ｍｇ  ｍｌ-1。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。＋２０ＫＶ、３７ｃｍ、２０℃、界面動電サンプリング  ２．０秒。ピークの帰属は図４と同じである。
【図６】  図６は、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ分離に対するコール酸ナトリウムの影響。
ａ．０ｍＭ、ｂ．１０ｍＭ、ｃ．１５ｍＭ、ｄ．２０ｍＭ、ｅ．２５ｍＭ、ｆ．３０ｍＭ、ｇ．３５ｍＭ、ｈ．４０ｍＭのコール酸ナトリウム、ｐＨ  ９．２、３００ｍＭ  ボレートおよび１０％  アセトニトリル。それぞれ、ＢＰＤ−ＤＡ  ２．５×１０-2ｍｇ  ｍｌ-1。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。＋２０ＫＶ、３７ｃｍ、２０℃、界面動電サンプリング  ２．０秒。ピークの帰属は図４と同じである。
【図７】  図７は、アセトニトリルの影響。
ａ．０％、ｂ．５％、ｃ．１０％、ｄ．１５％、ｅ．２０％のアセトニトリル、ｐＨ  ９．２、３００ｍＭボレートおよび２５ｍＭコール酸ナトリウム。それぞれ、ＢＰＤ−ＤＡ  ２．５×１０-2ｍｇ  ｍｌ-1。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。＋２０ＫＶ、３７ｃｍ、２０℃、界面動電サンプリング  ２．０秒。ピークの帰属は図４と同じである。
【図８】  図８は、ＨＰＬＣおよびＣＥによるＢＰＤエナンチオマーの分離。
ＨＰＬＣ：ａ．ＢＰＤ−ＭＡ／ＢＰＤ−ＤＡ、ｂ．ＢＰＤ−ＤＡ、ｃ．ＢＰＤ−ＭＡ。溶離液は、０．３％  ＴＴＡを含むヘキサン：エタノール（８０：２０）である。流速  ０．７ｍｌ  分-1。注入容量  ５０μｌの０．１ｍｇ  ｍｌ-1のＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ。４２０ｎｍで検出。１，Ｉａ−２、２，Ｉｂ−２、３，Ｉａ−１、４，Ｉｂ−１、５，ＩＩ−２、６，ＩＩ−１。
ＣＥ：ｄ．ｐＨ  ９．２、３００ｍＭ  ボレートおよび２５ｍＭ  コール酸ナトリウム。それぞれ、ＢＰＤ−ＭＡ／ＢＰＤ−ＤＡ  ２．５×１０-2ｍｇ  ｍｌ-1。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。＋２０ＫＶ、３７ｃｍ、２０℃、界面動電サンプリング  ２．０秒。ピークの帰属は図４と同じである。
【図９】  図９は、ＢＰＤエナンチオマーの電気泳動図。
（ａ）イヌ肝臓ミクロソーム、（ｂ）ヒト肝臓ミクロソーム、および（ｃ）ラット肝臓ミクロソームと共に１２０分間インキュベートした、リポソームで処方されたＢＰＤ−ＭＡを、サンプルとして使用した。ピークの帰属は図４と同じである。ｐＨ  ９．２、３００ｍＭ  ボレートおよび２５ｍＭ  コール酸ナトリウム。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。＋２０ＫＶ、３７ｃｍ、２０℃、界面動電サンプリング  ２．０秒。
【図１０】  図１０は、ベンゾポルフィリン誘導体一酸（ＢＰＤ−ＭＡ）位置異性体のキラル分離。
電解質：ｐＨ  ９．２、２８０ｍＭ  ボレートおよび３０％  アセトニトリルおよび７ｍＭ  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；サンプル：ＢＰＤ−ＭＡ  ２５ｎｇ  ｍｌ-1、＋２０ＫＶ、３７ｃｍキャピラリー長、２０℃。加圧サンプリング  ３．０秒（２０ｐｓｉ）。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４４２ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。
【図１１】  図１１は、ジエチルグリコールジエステルベンゾポルフィリン誘導体（ＤＥＧ−ＢＰＤ、またはＥＡ６）エナンチオマーのキラル分離。
電解質：ｐＨ  ９．２、８０ｍＭ  ボレートおよび３０％  アセトニトリルおよび１５０ｍＭ  コール酸ナトリウム。サンプル：ＤＥＧ−ＢＰＤ  ０．０１ｍｇ  ｍｌ-1、＋２５ＫＶ、３７ｃｍキャピラリー長、２０℃。加圧サンプリング  ３．０秒（２０ｐｓｉ）。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４４２ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。
【図１２】  図１２は、２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ）ジアステレオ異性体の分離。
電解質：ｐＨ  ９．２、２４０ｍＭ  ボレートおよび３０％  アセトニトリル＋１．５ｍＭ  ＳＤＳ。サンプル：ＨＰＰＨ  ０．０１ｍｇ  ｍｌ-1。＋２５ＫＶ、３７ｃｍキャピラリー長、２０℃。界面動電サンプリング  ２．０秒（＋１０ＫＶ）。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４８８ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。
【図１３】  図１３は、スズエチオプルプリンエナンチオマーのキラル分離。
電解質：ｐＨ  ９．２、１６０ｍＭ  ボレートおよび１０％  アセトニトリル（５ｍＭ  コール酸ナトリウムを含む）、および１５ｍＭ  セチルトリメチルアンモニウムブロミド。サンプル：０．０１ｍｇ  ｍｌ-1  スズエチオプルプリン。−２５ＫＶ、３７ｃｍキャピラリー長。２０℃、加圧サンプリング  ３．０秒（２０ｐｓｉ）。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４４２ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。
【図１４】  図１４は、ベンゾポルフィリン誘導体一酸およびベンゾポルフィリン誘導体一酸エチル（ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＭＡｅ）位置異性体の分離。
電解質：ｐＨ  ９．２、２４０ｍＭ  ボレートおよび３０％  アセトニトリルおよび１０ｍＭ  ＳＤＳ。サンプル：７５ｎｇ  ｍｌ-1  ＢＰＤ−ＭＡ＋２５ｎｇ  ｍｌ-1  ＢＰＤ−ＭＡｅ。＋２５ＫＶ、３７ｃｍキャピラリー長、２０℃、加圧サンプリング  ３．０秒（２０ｐｓｉ）。Ｅｍ．６９４ｎｍ／Ｅｘ．４４２ｎｍ。データ  ５Ｈｚ。
【図１５】  図１５は、フタロシアニンテトラスルホネート異性体の分離。
電解質：ｐＨ  ９．２、１２０ｍＭ  ボレート（５０％  アセトニトリルを含む）および１０ｍＭ  ＳＤＳ。サンプル：２．５ｍｇ  ｍｌ-1  フタロシアニンテトラスルホネート。＋２５ＫＶ、３７ｃｍキャピラリー長、２０℃、加圧サンプリング  ３．０秒（２０ｐｓｉ）。２１４ｎｍでＵＶ検出。データ  ５Ｈｚ。ピーク１〜８は異性体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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