(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト前駆細胞を得る方法であって、ヒト臍帯の脈管周囲ゾーンから該細胞を抽出する工程を含んで成る、上記方法。
【請求項２】
抽出工程が、臍帯から切除された１以上の血管で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
適切な細胞抽出媒体内で酵素消化されることにより、細胞が脈管周囲ゾーンからのウォートンジェリーから抽出される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵素消化が、ウォートンジェリーのコラーゲンマトリックスからの細胞の開放をもたらす、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヒト前駆細胞を含んでなる細胞集団の生産方法であって、請求項１〜４のいずれかに記載の方法によって得られた細胞を培養する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項６】
骨前駆細胞を富化するように該集団を処理する更なる工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＭＨＣダブルネガティブ表現型を有する前駆細胞を富化するように該集団を処理する更なる工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＭＨＣダブルネガティブ表現型を有する前駆細胞を富化するために、該集団が冷凍／解凍工程を受ける、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞集団が（１）ヒト臍帯の脈管周囲ゾーンのウォートンジェリーから抽出可能であり（２）脈管周囲ゾーンの外側のウォートンジェリーから抽出された他の前駆細胞集団よりも迅速に増殖し（３）骨前駆細胞を含んでなり（４）ＭＨＣダブルネガティブ表現型を有する前駆細胞を含んでなる、ヒト前駆細胞を含んでなる単離された細胞集団。
【請求項１０】
冷凍保存状態にある、請求項９記載の細胞集団。
【請求項１１】
請求項９記載の細胞集団を骨細胞への分化を誘導する条件下で成長させる工程を含んでなる、骨細胞の生産方法。
【請求項１２】
該細胞が骨形成性の補足物の不存在下で培養される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項９記載の細胞集団を脂肪細胞への分化を誘導する条件下で成長させる工程を含んでなる、脂肪細胞の生産方法。
【請求項１４】
請求項９記載の細胞集団を筋芽細胞への分化を誘導する条件下で成長させる工程を含んでなる、筋芽細胞の生産方法。
【請求項１５】
医学的病状、疾患および障害の処置のための薬剤の製造における請求項９及び１０のいずれかに記載の細胞集団の使用。
【請求項１６】
ヒト前駆細胞の集団が、帯の脈管構造から誘導される細胞を本質的に含まない、請求項１〜８および１１〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
該集団が、帯の血管構造から誘導される細胞を本質的に含まない、請求項９及び１０のいずれかに記載の単離された細胞集団。
【請求項１８】
ヒト前駆細胞を含んでなりそしてヒト臍帯の脈管構造に近接するウォートンジェリーの酵素消化により得られる、ウォートンジェリー抽出物。
【請求項１９】
臍帯血の細胞を本質的に含まない、請求項１８記載のウォートンジェリー抽出物。
【請求項２０】
近接ウォートンジェリーを担う臍帯脈管構造を適切な細胞抽出媒体内で酵素消化させて得られる、請求項１８または１９記載のウォートンジェリー抽出物。
【請求項２１】
酵素消化の工程が、ウォートンジェリーのコラーゲンマトリックスから細胞の開放をもたらす、請求項１８〜２０記載のウォートンジェリー抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯（ＵＣ）の結合組織から迅速に増殖するヒト細胞の集団の取得；骨原性、または骨形成条件におけるかかる細胞の培養；細胞表面組織適合抗原の欠失により示される、免疫学的不適格であるそれら集団内の細胞の高い割合の証明；および各種の細胞に基づく治療のための細胞の供給源として使用されるそれら細胞の能力に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＣは、腸胚形成に続いて形成される最初の構造の一つである（三つの胚芽層の形成）。折り返しが始まると、胚盤は、原始極小体（胚原始体）により原始卵黄嚢（外部胚原始体）に卵黄血管および尿膜血管を介して連結を初め、それらは一方では臍血管を形成するように発展する（非特許文献１１、１５、１７）。それらの血管は、ウォートンジェリー（ＷＪ）と呼ばれる初期胚外部派生物の初期間葉組織と一般に考えられているものの中に支持または囲まれている（非特許文献１６）。この初期段階から、妊娠の間にＵＣは成長し、出産の際に見られる３０〜５０ｃｍの帯となる。従って、ＷＪは、文献（下記参照）に記載の繊維芽細胞様、または筋繊維芽細胞様細胞のみならず、胚および胎児発達の間の帯の成長を支持するために必要なＷＪの増大する体積を細胞に与えることができる前駆細胞の集団も含むことを期待できる。
【０００３】
ＷＪは最初にＴｈｏｍａｓ  Ｗｈａｒｔｏｎにより報告され、かれの論文Ａｄｅｎｏｇｒａｐｈｉａを１６５６年に発表した。それはヒアルロン酸を含むプロテオグリカンからなる無定形の基礎物質内に分散した細胞から成るゼラチン状でゆるやかな粘膜質結合組織（非特許文献１３）、および各種の形式のコラーゲン（非特許文献９）としてその後定義された。マトリックス内に分散する細胞は、「繊維芽細胞様」と記述され、それは弛緩した帯では星状の形であり、増大した帯では伸長している（非特許文献１０）。平滑筋細胞が最初にマトリックス中で観察された（非特許文献６）が、これにはＰａｒｒｙ（非特許文献１０）の異論があり、かれは平滑筋細胞に表面的に類似したいくらか「異常な繊維芽細胞」としてそれを記述した。その後、１９９３年までほとんどそれら細胞を特性検討する研究はなかったが、その年にＴａｋｅｔｉら（１９９３）がそれら細胞の免疫組織化学研究を行った、彼らは、「無定形基礎物質（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）内に長い細胞質プロセスおよびコラーゲン繊維の網目構造を有する形状の融合形または星形」である「繊維芽細胞様」と細胞を記述した（非特許文献１４）。免疫組織化学的染色のために、かれらはアクチンおよびミオシン（細胞質収縮性タンパク質）、ヴィメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）（胚間葉起源の繊維芽細胞の特徴）およびデスミン（ｄｅｓｍｉｎ）（筋原性起源の細胞に独特）に対する一次抗体を、どの形式のミオシンがＷＪ繊維芽細胞に関連するかを決定するために使用した。彼らは、高レベルの化学的に抽出可能なアクトミオシンを観察し、そして繊維芽細胞は細胞質アクトミオシンを含有するけれども、それらはアクチンもミオシンも染色せず、一方ＷＪ繊維芽細胞は両者を確かにに染色することを観察した。さらに、ヴィメンチンおよびデスミンの両者への確かな染色性は、ＷＪ内のそれらの変性繊維芽細胞が初期間葉組織から誘導されたという結論に導かれると認められた（非特許文献１４）。その後の最近のＮａｎａｅｖら（非特許文献９）による研究は、予定日前の帯内の間葉前駆細胞を増殖する分化の５工程を明らかにした。かれらの所見は、筋繊維芽細胞がＷＪマトリックス内に存在するという示唆を支持した。ＷＪの細胞の免疫組織化学的特性研究は、骨形態発生における骨中の前駆細胞の主要な起源として知られる周細胞のそれとの著しい類似を示しそして培地内のコロニー形成単位骨芽細胞（ＣＦＵ−Ｏ）（非特許文献１）と呼ばれる骨小結節も形成できる（非特許文献４）。
【０００４】
最近の文献は、ＵＣ血液よりもむしろＵＣから細胞を採取する方法を報告している。Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（非特許文献８）は、臍血管を最初に除去破棄して残った組織を採取する方法を記載している。次いで残存するＷＪ（臍血管はＷＪ中で完全に包囲されているので一部は血管と一緒に破棄される）および羊膜上皮の両者を含む後者をさいの目切りにして組織培養プレートに移動させる小型組織断片を作製する。次いで、それらの組織断片を、それから細胞が培養基質上を移動する一次外植片として使用する。
【０００５】
別の出版物で、Ｒｏｍａｎｏｖら（非特許文献１２）は、かれらの培養物はＷＪからの細胞を含まなかったことは指摘しているが、帯脈管構造から間葉幹細胞様の細胞を単離することに成功したことを指摘している。具体的には、かれらは、臍血管内から一回の１５分間のコラゲナーゼ消化を利用し、これは血管内皮およびサブ内皮細胞の混合集団をもたらした。Ｒｏｍａｎｏｖらは、７日後にこの細胞取得物から少数の繊維芽細胞様細胞が現れたことを示した。
【０００６】
また、特許文献１は、ヒトＵＣのＷＪから「前−軟骨細胞」を単離する方法および軟骨を産生するためのその使用を記載している。具体的には、該方法は、帯の１インチ断片を長さ方向に切り明け、血管および「ケーシング（Ｃａｓｉｎｇ）」を切り取り、それは廃棄し、そしてＷＪを滅菌容器内に集め、そこでそれを培養のための２〜３ｍｍ３  断片に切断する。好ましい方法では、ＷＪの２〜３ｍｍ３  断片をペトリ皿の底にあるスライドガラス上に置いて細胞を単離し、それを他のスライドで覆い、そして「前−軟骨細胞」が培養皿表面に移動して出させるように１０〜１２日間培養する。
下記の引用文献は引用することにより本明細書に編入される。
【特許文献１】米国特許第５，９１９，７０２号明細書
【非特許文献１】Ａｕｂｉｎ，ＪＥ，１９９８，Ｂｏｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ，ｖ．３０−３１，ｐ．７３−８２．
【非特許文献２】Ｂｅｃｋｓｔｅａｄ，ＪＨ，Ｄ  Ｆ  Ｂａｉｎｔｏｎ，１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ：ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ２−ｍｉｃｒｏｎ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ：Ｂｌｏｏｄ，ｖ．５５，ｐ．３８６−３９４．
【非特許文献３】Ｂｅｃｋｓｔｅａｄ，ＪＨ，Ｐ  Ｓ  Ｈａｌｖｅｒｓｏｎ，Ｃ  Ａ  Ｒｉｅｓ，Ｄ  Ｆ  Ｂａｉｎｔｏｎ，１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｎ  ｂｉｏｐｓｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ：Ｂｌｏｏｄ，ｖ．５７，ｐ．１０８８−１０９８．
【非特許文献４】Ｃａｎｆｉｅｌｄ，ＡＥ，Ｍ  Ｊ  Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｂ  Ａ  Ａｓｈｔｏｎ，２０００，Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ，ｉｎ  ＪＥ  Ｄａｖｉｅｓ（ｅｄ），Ｂｏｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＥＭ  Ｓｑｕａｒｅｄ，Ｉｎｃ．，ｐ．１４３−１５１．
【非特許文献５】Ｃａｐｌａｎ，ＡＩ，１９９１，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ，ｖ．９，ｐ．６４１−６５０．
【非特許文献６】Ｃｈａｃｋｏ，ＡＷ，Ｓ  Ｒ  Ｍ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，１９５４，Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｅｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｉｓｔｅｎｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｖｅｉｎｓ．：Ｃａｍｅｇｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，ｖ．３５，ｐ．１３５−１５０．
【非特許文献７】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，ＡＪ，Ｊ  Ｆ  Ｇｏｒｓｋａｊａ，Ｎ  Ｎ  Ｋｕｌａｇｉｎａ，１９７６，Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｏｒｇａｎｓ：Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，ｖ．４，ｐ．２６７−２７４．
【非特許文献８】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ＫＥ，Ｍ  Ｌ  Ｗｅｉｓｓ，Ｂ  Ｍ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｌ  Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｂ  Ｈｅｌｗｉｇ，Ｍ  Ｂｅｅｒｅｎｓｔｒａｕｃｈ，Ｋ  Ａｂｏｕ−Ｅａｓａ，Ｔ  Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ｄ  Ｔｒｏｙｅｒ，２００３、Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｈａｒｔｏｎ′ｓ  Ｊｅｌｌｙ  Ｆｏｒｍ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｌｉａ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ｖ．２１，ｐ．５０−６０．
【非特許文献９】Ｎａｎａｅｖ，ＡＫ，Ｇ  Ｋｏｈｎｅｎ，Ａ  Ｐ  Ｍｉｌｏｖａｎｏｖ，Ｓ  Ｐ  Ｄｏｍｏｇａｔｓｋｙ，Ｐ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，１９９７，Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ：Ｐｌａｃｅｎｔａ，ｖ．１８，ｐ．５３−６４．
【非特許文献１０】Ｐａｒｒｙ，ＥＷ，１９７０，Ｓｏｍｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ，ｖ．１０７，ｐ．５０５−５１８．
【非特許文献１１】Ｐｅｒｅｄａ，Ｐ  Ｍ  Ｍｏｔｔａ，２００２，Ｎｅｗ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：ｍｏｒｐｈｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｙｏｌｋ  ｓａｃ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｖ．３２，ｐ．６７−７８．
【非特許文献１２】Ｒｏｍａｎｏｖ，ＹＡ，Ｖ  Ａ  Ｓｖｉｎｔｓｉｔｓｋａｙａ，Ｖ  Ｎ  Ｓｍｉｒｎｏｖ，２００３，Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ＭＳＣ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ｖ．２１，ｐ．１０５−１１０．
【非特許文献１３】Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ，ＭＤ，Ａ  Ｈｉｎｍａｎ，Ｒ  Ｄ  Ｍｏｏｒｅ，１９６０，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｖ，Ｆｅｂｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｗｈａｒｔｏｎ′ｓ  Ｊｅｌｌｙ．：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｖ．９．ｐ．３５０−３５５．
【非特許文献１４】Ｔａｋｅｃｈｉ，Ｋ，Ｙ  Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ  Ｍｉｚｕｎｏ，１９９３，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｗｈａｒｔｏｎ′ｓ  Ｊｅｌｌｙ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｌａｃｅｎｔａ，ｖ．１４，ｐ．２３５−２４５．
【非特許文献１５】Ｔｕｃｈｍａｎｎ−Ｄｕｐｌｅｓｓｉｓ，Ｈ，Ｇ  Ｄａｖｉｄ，Ｐ  Ｈａｅｇｅｌ，１９７２，Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ｐ．５４−６１．
【非特許文献１６】Ｗｅｉｓｓ，Ｌ，１９８３，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｅｌｓｅｉｖｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｉ，ｐ．９９７−９９８．
【非特許文献１７】Ｈａｙｎｅｓ  ｗｏｒｔｈ  １９９８
【発明の開示】
【０００７】
ヒト前駆細胞を含んでなる細胞集団を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
ヒト前駆細胞が抽出できる供給源を提供することが本発明の別の目的である。
【０００９】
ヒト前駆細胞の単離のための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１０】
骨組織の産生に有用なヒト骨前駆細胞（ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１１】
治療に有用なヒト免疫不適格前駆細胞（ｉｍｍｕｎｏ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を提供することが本発明のさらなる目的である。
【発明の要約】
【００１２】
ヒト臍帯のウォートンジェリーから細胞を抽出する方法は考案されており、それは主要組織適合マーカー（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ダブルネガティブ）のいずれも示さない免疫不適格細胞を含む、迅速な増殖、骨形成およびその他のヒト前駆細胞の存在を特徴とする独特の細胞集団をもたらす。細胞集団は、それから骨およびその他の結合組織を成長させ、そして治療目的で患者へ前駆細胞の自律および同種移動をさせる前駆細胞の有用な起源である。
【００１３】
さらに特定し、そして本発明の一つの局面によると、抽出物がヒト前駆細胞を含んでなり、そして脈管周囲ゾーンと呼ばれる有用な領域内でヒト臍帯の脈管構造に近接するウォートンジェリーの酵素消化により得られるウォートンジェリー抽出物を提供する。抽出物は、細胞の臍帯血液からの細胞、ＵＣおよび帯の脈管構造から誘導される外皮細胞または内皮細胞を本質的に含まない抽出物をもららすために適し、ここで血管構造は動脈または静脈の内膜、中膜、外膜として定義される。
【００１４】
その別の一つの局面によると、本発明は、本発明に従って得られるウォートン抽出物からの細胞を単離する工程を含んでなる、ヒト前駆細胞を得るための方法を提供する。
【００１５】
関連する局面では、本発明は、ウォートンジェリー抽出物内に存在する細胞の培養により得られる細胞集団を提供する。ある態様では、骨前駆細胞の集団を提供する。別の態様では、免疫不適格前駆細胞の集団を提供する。
【００１６】
本発明により、さもなければかかる分化に必要な補足物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）がなくて培養された、骨細胞への分化の性質を特徴とすることを約束（ｃｏｍｍｉｔ）された骨前駆細胞の集団も提供する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、ウォートンジェリー抽出物から得られた細胞にそれらの細胞を所望の結合組織表現型に分化するように導く条件を与える工程を含んでなる、結合組織および特には骨組織を産生するための方法を提供する。この観点では、本発明は、医学的病状、疾患および障害の細胞移植媒介処置を含む、細胞に基づく治療におけるかかる細胞の使用をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、骨前駆細胞を含むヒト前駆細胞を含んでなる迅速増殖細胞集団、ならびに免疫不適格細胞の供給源としてのウォートンジェリー（ＷＪ）の抽出物を提供する。
【００１９】
本明細書中に使用される場合、「前駆細胞」とい用語は、制御および／または規定された条件下で与えられた表現型の細胞に分化する細胞を呼ぶ。従って、骨前駆細胞は、骨芽細胞系統に約束された前駆細胞であり、そしてかかる約束および分化のために確立された条件下で培養された場合に最終的には骨組織を形成する。「免疫不適格」である前駆細胞は、クラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と関連する表面抗原に陰性である表現型を有する細胞である。かかる前駆細胞は、本明細書中でＨＬＡダブルネガティブとも呼ぶ。
【００２０】
ＷＪから抽出された細胞集団は、「迅速増殖」も特徴とし、それは前駆細胞増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に標準的な条件下で、他の既知の前駆細胞集団と比較した抽出細胞が増殖する速度を呼ぶ。本明細書中に提出する実験結果から認められるように、そして図１６に示すように、本前駆細胞集団は、少なくとも約２５時間、速ければ１５時間以内に倍増でき、従って、他の既知の骨前駆細胞集団およびその他のＷＪから抽出された前駆細胞集団よりさらに迅速に増殖する。
【００２１】
本発明の細胞および細胞集団は、ヒト臍帯のＷＪから抽出により得ることができる。先行技術とは異なり、本発明によると、かかる細胞は、臍脈管構造の外壁と関連すなわち近接するＷＪから抽出される。帯脈管構造の外表面と関連するかまたはそれにに非常に近いウォートンジェリーは、脈管周囲ゾーンと呼ばれる領域内にあり、そして典型的には、ウォートンジェリーを帯から抽出するか、または帯および関連するウォートンジェリーから血管を抽出するかのいずれかのために行われるように、帯から血管が切り取られた場合に、脈管構造と関連して残る。この脈管周囲ゾーン内にありそして先行技術の慣行では典型的には破棄されるウォートンジェリーは、本明細書中に記載の特性を有する前駆細胞の豊かな供給源であることが驚いたことに見いだされた。従って、本発明は、この特定の脈管周囲ゾーンからのウォートンジェリーを有用なヒト前駆細胞の供給として開拓する。
【００２２】
ヒト臍帯からかかるウォートンジェリーを抽出するために、好ましい態様では、抽出プロセスの間に、臍帯血管の細胞、ＵＣの外皮細胞または内皮細胞、および帯の血管構造から導かれる細胞の抽出を回避するために注意し、ここで血管構造は動脈または静脈の内膜、中膜および外膜として定義される。それらの望ましくない細胞を本質的に含まない抽出物を得ることは、切除の前の注意した臍帯のフラッシングおよび洗浄、次いで帯内からの血管の注意した切除により得られる。脈管周囲ウォートンジェリーが血管と共に除去される場合に周囲の帯組織から血管を注意して引き取ることができる。それらの望ましくない細胞抽出の回避を注意しても、それらは得られた抽出物内に少量存在するかも知れないことが認められる。これは、本明細書中に示す観察結果、すなわち間葉および特には中胚葉起源から導かれた細胞コロニーの観察、ＣＦＵ−Ｏの形成の頻度および迅速度、および培養した集団内に観察されるＨＬＡ表現型の特性検討を妨害するには低すぎる頻度で起きる限り許容できる。
【００２３】
脈管周囲ゾーンに存在するＷＪは、臍脈管構造の外壁に近接するウォートンジェリーであり、典型的には血管外壁から約３ｍｍまで及ぶゾーン内にある。適切には、標的抽出ゾーンは、３本の血管のいずれか一つの外壁から約２ｍｍ、例えば約１ｍｍ内にあることができる。この領域からのＷＪの抽出は、実施例中に記載の方法を用いて迅速に行える。この技術では、血管をＷＪの担体として利用し、そしてジェリーを担う血管自体は前駆細胞が抽出される基盤として利用される。従って、本発明の態様では、ＷＪの薄い皮膜を担う帯血管は、外科的または手作業で、すべての帯血液汚染物を本質的に除去するように徹底的に洗浄された新しい臍帯から切り取られる。近接ウォートンジェリーを担う血管またはその一部を次いで約３７℃で、所望の細胞が存在するＷＪのコラーゲンマトリックスを消化するために適する酵素を含む抽出媒体、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベーションする。この目的で、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲内またはそれ以上、例えば０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のコラゲナーゼを用いる消化が適当である。抽出の間に、血管の末端を結ぶかまたはクリップ止めし、そして血管内に含まれる薬剤による汚染を防ぐために抽出媒体に懸濁できる。従ってこのウォートンジェリー抽出物は、帯血液細胞および血管内皮細胞を本質的に含まないことが認められる。
【００２４】
抽出媒体内の約２４時間、例えば１２〜３６時間、例えば１８〜２４時間後に、血管を取り除き、ヒト前駆細胞を含むウォートンジェリー抽出物を残す。これらの細胞を前駆細胞の増大に標準的な条件下で増大させる。細胞は、例えば付着細胞を選択するためにポリスチレン上、例えばポリスチレン皿またはフラスコ内で選択でき、次いで適切な培養媒体内に保持される。本発明の一つの態様では、抽出された細胞を付着細胞の事前選択をするかまたはしないで増大するために、攪拌懸濁の条件下で培養し、これは例えばＢａｋｓｈらが国際公開（ＷＯ）第０２／０８６１０４号明細書に記載のようなものであり、その開示は引用することによりすべて本明細書中に編入される。
【００２５】
直接または増大の後、抽出物内に存在する細胞は、与えられた表現型の細胞を富化（ｅｎｒｉｃｈ）された増大可能なサブ集団を与える確立された技術を用いて分別できる。従って、本発明は、さらに、骨前駆細胞を富化したＥＪ抽出細胞集団、免疫不適格前駆細胞を富化した細胞集団、および免疫不適格である骨前駆細胞を富化した細胞集団を提供する。
【００２６】
図１７で明らかにしたように、前駆細胞集団内のＭＨＣマーカーの分布は冷凍−解凍により改変できることが認められる。新しい細胞を継代（ｐａｓｓａｇｅ）すると、ＭＨＣダブルネガティブ細胞の頻度は相対的に一定もしくは僅かに増加する。しかし、本明細書中の実施例から認められるように、前駆細胞集団中のＭＨＣダブルネガティブ細胞の頻度は冷凍後にプレートされた細胞中で著しく増加することが認められる。従って、本前駆細胞集団中で、ＭＨＣダブルネガティブ表現型の細胞は、冷凍後の頻度増加の性向をさらに特徴とする。かかる冷凍は、通常の方法で、最初に細胞のアリコートを作製し、次いで所望の期間細胞調製物を貯蔵して行われる。かかる細胞は、望む場合には多年にわたって貯蔵できることが認められる。
【００２７】
一つの態様では、本発明はウォートンジェリー抽出物を本明細書に記載のようにして、または抽出物またはその画分を冷凍し、次いで冷凍細胞を培養してそのＭＨＣダブルネガティブの富化画分を得て、ＭＨＣダブルネガティブ前駆細胞を産生するための方法をさらに提供する。上記のようにして得られた細胞は、ヒト患者内の組織形成または修復を誘導するために有用である可能性がある。
【００２８】
抽出物からまたは適当に富化したその画分から得られた細胞集団は、分化した細胞集団を提供するために直接またはそれらを増大した後のいずれでも有用である。それらの分別および富化のため、およびそれらの増大のために適するすべての手順は、先行技術で確立されており、そして本明細書中に例示される。増大は、例えば因子、例えばＩＬ−３および幹細胞因子、および当該技術分野では既知の同様の薬剤の存在下で進行できる。一つの態様では、本細胞集団、および特にはその中の骨前駆細胞は、それらから骨組織の成長のために確立された条件を用いて分化させる。注意すべきは、約束された骨前駆細胞と呼ばれる、本前駆細胞集団の培養物から生成した骨前駆細胞のサブ集団が、骨形成性補足物が存在しないでも分化する能力を示したことである。あるいは、骨前駆細胞は、１種またはそれ以上の骨形成を刺激する薬剤、例えばデキサメタゾンを補足した媒体内で培養される。さらに、前駆細胞は、軟骨、筋肉、腱、脂肪等を含む他の間葉誘導結合組織（Ｃａｐｌａｎ，１９９１、非特許文献５）内に、すべて当該技術分野での標準手順に従って、分化を刺激するために適する補足物と一緒に培養もできる。
【００２９】
本細胞集団内の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に代わる実際的な方法として、細胞は、患者内で直接所望の組織の形成を誘導するためにｉｎ  ｖｉｖｏ移植ができることが認められる。この経路によると、骨のｉｎ  ｓｉｔｕ形成は、特に骨折および骨粗鬆症を含む各種の骨の病状、疾患および障害に罹患している患者の利益のために、骨前駆細胞の移植により提供される。それらの移植後に予想できる拒絶反応がかなり減少するならば、細胞集団中に存在する免疫不適格前駆細胞は、これに関して特に価値がある。
【００３０】
本発明の態様は、以下の実施例中に記載する。
ヒトウォートンジェリーから前駆細胞の採取
ＵＣは、Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ  ＆  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａで出産直後の期間満了帝王切開幼児から採取された。ＵＣは媒体（７５％α−ＭＥＭ、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％抗生物質）を含む滅菌容器内に外科医により移され、そして直ちにＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏにある我々の実験室に輸送された。
【００３１】
この時点以降のすべての手順は、生物学的に安全なキャビネット内で無菌状態で行われた。ＵＣをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（−Ｍｇ２＋、−Ｃａ２＋）内で３回洗浄してＵＣ血をできるだけ除去し、そして媒体を入れた容器内に戻した。長さ約６ｃｍの帯を滅菌した鋏で切断しそして滅菌コルク解剖ボード上に置いた。残った帯（３０〜４５ｃｍ）を媒体を充満した容器に戻しそして３７℃のインキュベーター内に置いた。帯の６ｃｍ断片をそのらせんの反対に「捩じり」、そして両端をピンで止めてＵＣ外皮の平滑で真っ直ぐな表面を現した。小型の鋏を用いて、ＵＣをその長さに沿って深さ１〜２ｍｍで切ってＷＪを現した。切断外皮のそれぞれの「フラップ」から初めて、メスの刃のない側を用いてその内面からＷＪを細かく切り取りそして切り取った外皮（厚さ約０．５ｍｍ）をピンで止めた。この手順で、そしてその長軸に沿ってラセン状ではなく端から端まで直線状に走って埋まっている３本の血管と共にＷＪが暴露された。常に断片を３７℃のＰＢＳに浸すことに注意した。ピンセットで血管の一端を離し、それがＷＪマトリックスの本体から離れるまでその長さに沿ってＷＪから細かく切り取った。あるいは、血管の中央をマトリックスから切り取り、ピンセットで保持し、そしてその末端に向かって両方向にマトリックスから細断した。いずれかの方法で自由になると、細胞を有するＷＪマトリックスの約１〜２ｍｍで血管は囲まれた。次いで切断した血管を外科用クランプ、モスキートクリップまたは縫合して両端を止めて「ループ」を作り、血管を出入りする液体の動きを遮断した。「ループ」は直ちに鋏と一緒にＰＢＳ（−Ｍｇ２＋、−Ｃａ２＋）を加えた０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液を含む１５ｍｌ試験管内に入れ、そして３７℃でインキュベーター内に置いた。残った２本の血管を同様に切断し、ループを作り、そして同様にインキュベーター内にコラゲナーゼ溶液中で置いた。血管除去の後、ＷＪの断片は容易に外皮を取り去ることができそしてコラゲナーゼ溶液と一緒に１５ｍｌ試験管内に入れた。次いで残った外皮層は生物性有害物質容器内に廃棄した。残りの３０〜４５ｃｍのＵＣについても同じプロトコールを用いて「ループ」またはＷＪストリップの１５〜２５本の試験管が得られた。
ウォートンジェリー前駆細胞培養の開始
１８〜２４時間後に、それらに付属する懸垂クランプまたは縫合糸およびピペットを用いて「ループ」を除き、そして残った懸濁液をＴ−７５ｃｍ２  組織培養ポリスチレン皿上に直接置き、そして細胞をポリスチレン表面に付着させるように７２時間そのままにした。次いで媒体を２日毎に交換した。
【００３２】
付着した細胞を７日後に１％トリプシン溶液を用いて継代させ、その時点でそれらは光学顕微鏡で観察して８０〜９０％集密を示し、そして位相差顕微鏡で観察して「無機化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ）」凝集物形成の証拠があり、そして光学的性質に期待通りの変化を示した。継代の際、細胞を３５ｍｍ組織培養ポリスチレン皿または６ウエルプレートのいずれかに、７５％α−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０％抗生物質内で１ｘ１０４  細胞／ｃｍ２  としそして１０−８Ｍ  Ｄｅｘ、５ｍＭβ−ＧＰおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸で処理して、それらの細胞の骨形成能力を試験した。これらのプレートは、培養の２、３、４および５日目に、ＣＦＵ−Ｏ、あるいは「骨小結節」形成と呼ばれる物について培養物を観察した。
【００３３】
ウォートンジェリー前駆細胞培養物を得るためのその他の有用な方法では、下記のプロトコールを用いた。
【００３４】
１．帝王切開患者から滅菌した臍帯（ＵＣ）を入手しそして媒体（８０％α−ＭＥＭ、２０％抗生物質）内の生物学的安全キャビネットに輸送し、
２．滅菌した３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で二回ＵＣを洗浄し、
３．鋭い鋏を用いてＵＣを約１〜２インチの断片に切断し、
４．滅菌３７℃ＰＢＳ中で二回、各ＵＣ断片を洗浄して残留臍帯血（ＵＣＢ）をできるだけ除去し、
５．乾燥した滅菌皿上にＵＣ断片の一つを単離し、
６．鉗子２組を用いて、外皮を約２ｍｍ離れて掴み、そして互いに引き離して外皮を引裂き、
７．ＵＣ断片の長さに沿って外皮を掴み、外皮の引き裂きを続け、その下のＷＪを暴露し、
８．工程６と同様に、外皮の約半分が取り去られるまで「ストリップ」状に外皮を引裂き、
９．ＷＪを通じて臍血管が明瞭に見え、そしてＵＣ断片の切断端に末端が遊離し、
１０．鉗子一組を用いて外皮の残った部分を掴み、そして他の鉗子で血管の端を掴み、血管を本体ＷＪから周囲のＰＶＷＪと一緒に血管を「引き取る」ことができ、
１１．下にあるＷＪマトリックスから３本ともに離れるまでこの手順を各血管に反復し、
１２．離れると各血管を３７℃ＰＢＳ中に配置し、
１３．すべての血管が滅菌３７℃ＰＢＳ充填ビーカー内に単離されるまでＵＣの各断片を用いて工程５〜１２を反復し、
１４．次いで、清浄で滅菌した表面上に各血管を個別に置き、ダブルノットを用いる縫合を用いて「ループ」状に末端を一緒に括ることができ、
１５．すべての血管をループ状に括ると、ループを５０ｍｌ試験管の中の１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液内に入れ、
１６．５０ｍｌ試験管を３７℃、５％ＣＯ２  インキュベーター内で回転皿上に一晩置き、
１７．次の日に、１ｍｌウシ胎児血清（ＦＢＳ）１ｍｌを用いてコラゲナーゼを不活性化し、そしてループを懸濁液から取り出し
１８．残った懸濁液をＰＢＳで希釈し、１１５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を取り除き、
１９．ペレット内に残った細胞を補足媒体（ＳＭ）（７５％α−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、２０％抗生物質）中に再懸濁し、そしてアリコートを血球計で計数し、
２０．次いで細胞懸濁液をＴ−２５組織培養ポリスチレンフラスコ内にプレートしそして増殖させ、
２１．細胞がサブ集密となるまで２日毎にＳＭを交換し（１〜２週間）、その時点でそれらをサブ培養（継代）する。
前駆体アッセイ
細胞増殖アッセイ
週毎の継代手順（６日毎に実施）の間に、２ｘ１０５  細胞のアリコートを２０個のＴ−２５ｃｍ２  組織培養ポリスチレンフラスコ内にプレートした。培養の２、４、６、１０および１２日目に、Ｔ−２５フラスコ４個を継代し、そして細胞を計数した。それらの細胞の指数関数的増殖をプロットし、それらの培養物中の細胞について平均倍増時間を算出した。結果を図１６に示す。ＰＶＷＪ細胞培養物の倍増時間は全培養期間を通じて約２４時間であることが認められる。対数相の間に、倍増時間は注目に値する１６時間である。これは、骨髄間葉細胞の約３３時間（Ｃｏｎｇｅｔ  Ｐ．ＪＪ  Ｍｉｎｇｕｅｌｌ，１９９９，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖ．１８１，ｐ．６７−７３）および脂肪組織から誘導された間葉幹細胞の約３．２日（Ｓｅｎ  Ａ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖ．８１，ｐ．３１２−３１９）の文献報告の倍増時間と比較される。
【００３５】
図１５に示すように、脈管周囲ウォートンジェリー（ＰＶＷＪ）誘導前駆細胞は、前駆細胞の異なるサブ集団を含んでなる。この集団内に、かかる分化を誘導するために通常必要な培養補足剤なし、例えばデキサメタゾンの存在なしで培養して、本明細書に示すように、骨小結節を形成する能力を特徴とするいわゆる「約束された」骨前駆細胞がある。この約束された骨前駆細胞は、骨小結節を形成するように自発的に分化する。ＰＶＷＪ前駆細胞集団内にも、所要の因子、例えばデキサメタゾン、β−グリセロリン酸およびアスコルビン酸の存在下で培養すると、骨小結節を形成するように誘導できる骨前駆細胞がある。従って、図１５に図示した「全骨前駆細胞」サブ集団は、「約束された骨前駆細胞」集団、ならびに「約束されない骨前駆細胞」集団も含み、そして骨形成系統まで分化して誘導できる細胞の全数を示す。「約束された」と「約束されない」集団の間の実際の比率は約１：１であり、従って「全骨前駆細胞」集団と「約束された骨前駆細胞」集団との間の比率は約２：１である。前駆細胞の骨形成特性の解析は、下記のように行った。
ＣＦＵ−Ｏアッセイ
週毎の継代手順の間に、試験細胞集団のアリコートを、７５％α−ＭＥＭ、。１５％ＦＢＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，バッチ番号＃：Ｓ１３Ｅ４０）、１０％抗生物質溶液（ペニシリンＧ（１６７単位／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびアンフォテリシンＢ（０．３μｇ／ｍｌ）含有）、およびＤｅｘ（１０−８Ｍ）、βグリセロリン酸（５ｍＭ）およびＬ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を含む骨形成媒体中、１ｘ１０４  細胞／ｃｍ２  の細胞接種密度で、組織培養ポリスチレン上に直接プレートした。培養物を１２日間、二日目毎に再栄養供給した。骨小結節として検出される無機化小結節形成領域が観察されるまで（通常３日）培養物を維持し、その時点で培養物に最終培養再栄養供給において媒体を含むテトラサイクリンを再供給し、次いでＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液中に固定して分析に備えた。Ｌｅｉｔｚ  Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｅｓｓｅｌｔｅ  Ｌｅｉｔｚ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を位相コントラストならびにＵＶ蛍光下でテトラサイクリン標識培養物を可視化するために使用し、そして加速電圧１５ｋＶのＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ−２０００走査電子顕微鏡を形態的に同定できる骨マトリックスの存在を証明するための画像を得るために使用した。
データ解析
テトラサイクリン染色
テトラサイクリン（９μｇ／ｍｌ）を終結の前に培養物に加えた。終結の際に、細胞をＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液中で一晩固定し次いで小結節領域の無機成分のテトラサイクリン標識のＵＶ励起蛍光画像により観察した。
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
ＣＦＵ−Ｏ培養物の代表試料を最初に７０％。８０％。９０％および９５％エタノール中に１時間、次いで１００％エタノールに３時間浸漬してＳＥＭのために準備した。次いでそれらを臨界点乾燥した。約３ｎｍ層の金層をＰｏｌａｒｏｎ  ＳＣ５１５  ＳＥＭ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて試料上にスパッタリング被覆し、ついでこれを加速電圧１５ｋＶのＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ−２０００走査電子顕微鏡で種々の倍率で検査した。得られた画像を形態的に同定できる骨マトリックスの存在を証明するために使用した。
ＨＬＡ−分類のためのフローサイトメトリー
１ｘ１０５  細胞を越える試験細胞集団を２％ＦＢＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌバッチ番号＃Ｓ１３Ｅ４０）を含むＰＢＳ中で洗浄しそしてＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に下記の複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）マウスＩｇＧ１  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＰＥおよびＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ−ＦＩＴＣの飽和濃度（１：１００希釈）で、３０分間、４℃で再懸濁した。細胞懸濁液をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、１μｇ／ｍｌ  ７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色しそしてＥｘｐｏＡＤＣＸＬ４ソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いるフローサイトメトリー（ＸＬ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）の分析のためにＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に再懸濁した。陽性の染色は、マッチしたアイソタイプ抗体（ＦＩＴＣ−およびＰＥ−複合マウスＩｇＧ１、κモノクローナルアイソタイプ標準、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した対照集団からの細胞の９９％以上により得られたレベルを越える蛍光シグナルの発光として定義された。各試料に対して、少なくとも１０，０００リストモード（ｌｉｓｔ  ｍｏｄｅ）イベントが集められた。すべてのプロットはＥＸＰＯ  ３２  ＡＤＣ分析ソフトウエアで得られた。
結果
骨小結節コロニーの光学顕微鏡画像
図３、４および５は、３日目および５日目において培養物内に存在したＣＦＵ−Ｏを示す。それらは、骨−マトリックスを産生する多角形細胞の「凝集」により表される小結節領域を取り巻く「繊維芽細胞様」細胞の集密層を示す。これらのＣＦＵ−Ｏは、Ｄｅｘ（＋）およびＤｅｘ（−）培養物の双方で観察され、そして継続する継代でも同様の形態を示した。
ＣＦＵ−Ｏ培養物のテトラサイクリン標識
培養物のテトラサイクリン標識は、骨の生物学的無機相と関連する新規形成リン酸カルシウムを標識するために使用された。培養物のテトラサイクリン標識は、無機化小結節領域と一致し、それは培養物のＵＶ光への暴露により可視化された。図６および７は、ＷＪ前駆細胞の培養３日目および５日目のテトラサイクリン標識ＣＦＵ−Ｏ培養物を示す。それらの画像は、ＵＶ励起蛍光イメージングで発生し撮影された。
走査顕微鏡測定
ＣＦＵ−Ｏは、ＳＥＭ下で、成熟ＣＦＵ−Ｏ内の高密度無機化マトリックスへのコラーゲン形成の初期段階からのＣＦＵ−Ｏの形成を証明する無機化コラーゲンマトリックスの形成について観察された。図８、９、１０、１１、１２および１４は、ＣＦＵＯの走査顕微鏡画像を示す。
フローサイトメトリーおよびＨＬＡ分類
両方の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を表す細胞表面抗原を同定するフローサイトメトリーは、ＭＨＣ−／−  のような単離細胞の集団の７７．４％を示した。図１３は、陰性対照に関連するフローサイトメトリー結果を示す。図１７は、前駆細胞集団内のＭＨＣ−／−細胞の頻度に対する冷凍−解凍のインパクトを示す。冷凍−解凍の効果は、以下のように研究された。
【００３６】
１ｘ１０５  細胞を越える試験細胞集団を２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で洗浄しそして下記の複合マウスＩｇＧ１  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５５５５３，Ｌｏｔ  Ｍ０７６２４６）（ＭＨＣ  Ｉ）、ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５５５５８，Ｌｏｔ  Ｍ０７４８４２）（ＭＨＣ  ＩＩ）およびＣＤ４５−Ｃｙ−Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５５４８４，Ｌｏｔ  ０００００３５７４６）の飽和濃度（１：１００希釈）を有するＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に３０分間、４℃で再懸濁した。細胞懸濁液をＰＢＳ＋２％ＦＢＳを用いて２回洗浄しそしてＥｘｐｏＡＤＣＸＬ４ソフトウエアを用いるフローサイトメーター（ＸＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）での分析のためにＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に再懸濁した。陽性の染色は、マッチしたアイソタイプ抗体（ＦＩＴＣ−，ＰＥ−，ａｎｄ  Ｃｙ−ｃｙｃｈｒｏｍｅ複合マウスＩｇＧ１、κモノクローナルアイソタイプ標準、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した対照集団からの細胞の９９％以上で得られたレベルを越える蛍光シグナルの発光として定義され、これはヒトＢＭ試料の陽性蛍光により確認された。各試料に対して、少なくとも１０，０００リストモード（ｌｉｓｔ  ｍｏｄｅ）イベントが集められた。すべてのプロットはＥＸＰＯ  ３２  ＡＤＣ分析ソフトウエアで得られた。
サブ集団および細胞接種
付着した細胞は、７日後に０．１％トリプシン溶液を用いてサブ培養（継代）され、その時点で光学顕微鏡で観察して８０〜９０％の集密を示した。継代すると、ＰＶＷＪ（脈管周囲ゾーンウォートンジェリー）細胞がＭＨＣ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱおよびＣＤ４５の発現に関するフローサイトメトリーにより観察された。次いで、それらをＳＭ中４ｘ１０３  細胞／ｃｍ２  でＴ−７５組織培養ポリスチレンフラスコ中にプレートし、そして１０−８Ｍ  Ｄｅｘ、５ｍＭβ−ＧＰおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸で処理してそれらの細胞の骨原性能力を試験した。それらのフラスコを培養の２、３、４、５および６日目にＣＦＵ−Ｏまたは骨小結節、形成について観察した。継代手順からのあらゆる残留細胞は将来の使用のために冷凍保存した。
細胞の冷凍保存
１ｘ１０６  ＰＶＷＪ細胞のアリコートを、９０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−２６５０，Ｌｏｔ＃１１Ｋ２３２０）を含み全体積１ｍｌに調製し、そして１ｍｌポリプロピレン冷凍バイアル中にピペットで移した。該バイアルを−７０℃冷凍庫中に一晩置き、そして次の日に−１５０℃冷凍庫に長期保存のために移した。冷凍保存１週間後、ＰＶＷＪ細胞を解凍しそしてＭＨＣ−Ａ，Ｂ，Ｃ，ＭＨＣ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱおよびＣＤ４５の発現に関するフローサイトメトリーにより観察した。第二のアリコートは、ＰＶＷＪ細胞を冷凍保存１週間後に解凍し、１週間再培養し、サブ培養し次いでＭＨＣ−Ａ，Ｂ，Ｃ，ＭＨＣ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱおよびＣＤ４５の発現に関するフローサイトメトリーによる再分析に使用した。
【００３７】
結果を図１７に示す。新しい細胞集団内のＭＨＣ−／−の頻度は数回の継代を経ても維持されることが認められる。継代の後に新しい細胞を冷凍し、−１５０℃で１週間置き、次いでＭＨＣ表現型に関して直ちに分析すると、分析した集団はＭＨＣ−／−表現型の細胞の著しく増えた頻度を示す。これに従って、そして本発明の態様により、ＭＨＣ−／−表現型の細胞は、冷凍によりＰＶＷＪ細胞の集団から有用に富化できる。さらなる富化は、あらかじめ冷凍した細胞の培養物の継代により実現する。冷凍したＰＶＷＪ細胞自体は、そのれらが免疫不適格性であればヒト治療に非常に有用である可能性がある。
【００３８】
上記のように、ＰＶＷＪ先駆細胞集団は、かかる分化に適当な条件下で培養して、骨以外の間葉細胞および組織の増加を与えるように開発してもよい。例えば、脂肪細胞を発生させるために、前駆細胞を１０４  細胞／ｃｍ２  の濃度で調製しそして３５ｍｍ組織培養皿にプレートする。細胞を前脂肪細胞媒体（ＰＭ）（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０（１：１．ｖｏｌ／ｖｏｌ），１０％ウシ胎児血清、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）中に３日間維持する。３日後、ＰＭを取り去り、そして細胞に脂肪生成媒体（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０栄養ブロス、１：１．ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５ｍＭ）、ウシ胎児血清（３％）、ビオチン（３３μＭ）、パントテン酸（１７μＭ）、ヒトインスリン（１００ｎＭ）、デキサメタゾン（０．５μＭ）、ＰＰＡＲＹアゴニスト（１００ｎＭ）および抗生物質）を供給し、そして３日間培養する。３日間の誘導の後、脂肪生成媒体を取り除き、そして培養物を脂肪細胞媒体（ＡＭ）（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０（１：１．ｖｏｌ／ｖｏｌ）、３％ウシ胎児血清、１μＭデキサメタゾン、１００ｎＭヒトインスリン、３３μＭ  Ｄ−ビオチン、１７μＭ  パントテン酸Ｎａ、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）中に維持し、３日毎に定期的に供給し、媒体の半分を取り除き、等量のＡＭを供給するように注意し、それは媒体を取り除くと脂肪細胞が浮くからである。４回供給の後（１２日）、細胞は脂質小滴で丸くなったように見える。脂肪細胞内への分化した間葉細胞の陽性の同定は、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  ＯとＮｉｌｅ  Ｒｅｄを用いる染色により確認できる。
【００３９】
同様に、軟骨細胞は、１０４  細胞／ｃｍ２  の濃度で調製された細胞懸濁液を用いそして３５ｍｍ組織培養皿にプレートして生成してもよい。促進するために、軟骨細胞は血清を用いずそして形質転換成長因子β３を用いて培養される。細胞ペレットは、多層でマトリックスに富んだ形態を発生しそして組織学的には培養の間にプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスの増加を示す。
【００４０】
筋芽細胞を発生させるために、細胞懸濁液は、濃度１０４  細胞／ｃｍ２  で３５ｍｍ組織培養皿にプレートして調製できる。細胞は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＭＣＤＢ１２０媒体中に１週間保持される（筋芽細胞増殖媒体、ＭＰＭ）。１週間で、基礎媒体（ＭＰＭ）中の血清レベルは２％に低下し（筋芽細胞分化媒体、ＭＤＭ）そして培養を７日後に停止する。週に３回適当な培養媒体を培養物に供給する。
【００４１】
このように、本発明は、骨を含む種々の結合組織の産生に有用な性質を有するヒト前駆細胞を提供し、そしてさらに、骨疾患および障害を含む結合組織病状を処置するためのヒト患者への移植のために、免疫不適格でありそして理想的な前駆細胞も提供する。ヒト前駆細胞は、帯血管の外壁の近傍にいたる脈管周囲ゾーンと呼ばれるヒト臍帯ウォートンジェリーの特定のゾーンの抽出物から生成される。このゾーンから抽出された細胞集団は、迅速な増殖、細胞形態の変化を含む顕著な性質を示し、これはすべてのサブ培養フラスコ内で７日以内に起きる細胞コロニーの形成（約７〜１０回の倍増）および培地に骨形成性補足物を添加することなく骨小結節形成の出現、ならびにＭＨＣダブルネガティブ細胞の相対的に高い頻度、冷凍された細胞の培養の際に増加する頻度から見て取れる。
【００４２】
以下の参考文献が引用によって加えられる。
【００４３】
Ａｕｂｉｎ，ＪＥ，１９９８，Ｂｏｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ，ｖ．３０−３１，ｐ．７３−８２．
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【００４４】
本発明のこれらおよびその他の局面は、下記の図面を参照してさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ヒトＵＣ内で示される組織の３個の明確なゾーンを示す光学顕微鏡画像である。
【図２】コラゲナーゼ溶液内のループ状血管の代表的な図である。
【図３】ポリスチレン組織培養表面に付着したＷＪから単離された細胞の光学顕微鏡画像である。
【図４】ＣＦＵ−Ｏの初期形成を示す光学顕微鏡画像である。
【図５】成熟ＣＦＵ−Ｏを示す光学顕微鏡画像である。
【図６】３５ｍｍポリスチレン組織培養皿上でＵＶ蛍光下のテトラサイクリン標識ＣＦＵ−Ｏを示す。
【図７】同じテトラサイクリン標識ＣＦＵ−Ｏの位相差光学顕微鏡画像および蛍光顕微鏡画像を併置して示す。
【図８】組織培養ポリスチレン表面上の成熟したＣＦＵ−Ｏの走査電子顕微鏡画像である。
【図９】下地マトリックスが暴露されたＣＦＵ−Ｏの断面の走査電子顕微鏡画像である。
【図１０】ＣＦＵ−Ｏの前端に位置する軽く無機化したコラーゲン繊維の走査電子顕微鏡画像である。
【図１１】分化している骨原性細胞によるポリスチレン界面上に置いた非−コラーゲン性マトリックス（小球として見える）の走査電子顕微鏡画像である。
【図１２】成熟ＣＦＵ−Ｏの中心を含んでなる強く無機化したコラーゲンの走査電子顕微鏡画像である。
【図１３】ＷＪ誘導細胞が７７．４％ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ陰性であることを証明するフローサイトメトリーデータを示す。
【図１４】その中に細胞が捕捉（骨細胞）されているコラーゲンの分布およびいくらかが処理細胞外マトリックスにより囲まれ始めている周囲細胞の多層性を示す骨小結節のＭａｓｓｏｎの三色染色断面の黒白再現である。
【図１５】約束された骨形成サブ集団および全骨形成サブ集団の拡大に関連する付着脈管周囲ＷＪ集団の強力な拡大を示す。
【図１６】０〜１４４時間の脈管周囲ＷＪ細胞の増殖であって、０〜２４時間の遅延相、２４〜７２時間の対数相、よび７２〜１２０時間の平坦相を有する正常な増殖曲線示す。全培養期間の間の倍増時間は２４時間であるが、一方対数相ではこれは１６時間である。および
【図１７】５継代にわたり示されるＷＪ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）発現、自由解凍によるそれらの発現の変化、および再培養による引き続いての発現を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１】
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【図１３】
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【図１４】
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