(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコン基体にHFとHNO3の混合溶液を作用させる工程と、
前記シリコン基体にHFとHNO3とH2Oとの混合溶液を作用させる工程と
を含むことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法。
【請求項２】
シリコン基体をHFとHNO3の混合溶液の蒸気にさらす工程と、
前記シリコン基体をHFとHNO3とH2Oとの混合溶液に浸す工程とを含む
ことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記シリコン基体にシランカップリング剤を作用させる工程を含む
ことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項において、
前記シリコン基体からポーラスシリコンを分離する工程を含む
ことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記シリコン基体から分離された蛍光性シリコン粒子を液体クロマトグラフィーにより精製する工程を含む
ことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の蛍光性シリコン粒子の製造方法で製造された蛍光性シリコン粒子。
【請求項７】
請求項６に記載の蛍光性シリコン粒子を用いて生体細胞内もしくは細胞膜上の分子の運動を観察する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性シリコン粒子の製造方法、蛍光性シリコン粒子およびそれを用いて生体物質を観察する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノメートルの径をもつシリコン粒子は、蛍光性／発光性をもつことが知られており、蛍光体として使用する場合、従来の有機蛍光色素と比較して、著しく強固で光分解する確率が低くブリーチングを生じないという特性を持っている。このような蛍光性シリコン粒子は、電気化学的手法により製造できることが知られている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６５８５９４７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の方法は操作が複雑であり一般的ではない。そこで、本発明の目的は、より簡便な方法で蛍光性シリコン粒子を製造することにある。また、製造された蛍光性シリコン粒子を用いて、生物標本中の微量な生体物質を観察する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく請求項１に記載の発明によれば、シリコン基体にHFとHNO3の混合溶液を作用させる工程と、前記シリコン基体にHFとHNO3とH2Oとの混合溶液を作用させる工程とを含むことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法が提供される。
【０００６】
また、請求項２に記載の発明によれば、シリコン基体をHFとHNO3の混合溶液の蒸気にさらす工程と、前記シリコン基体をHFとHNO3とH2Oとの混合溶液に浸す工程とを含むことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法が提供される。
【０００７】
また、請求項３に記載の発明によれば、請求項１または２において、前記シリコン基体にシランカップリング剤を作用させる工程を含むことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法が提供される。
【０００８】
また、請求項４に記載の発明によれば、請求項１〜３のいずれか一項において、
前記シリコン基体からポーラスシリコンを分離する工程を含むことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法が提供される。
【０００９】
また、請求項５に記載の発明によれば、請求項４において、前記シリコン基体から分離された蛍光性シリコン粒子を液体クロマトグラフィーにより精製する工程を含むことを特徴とする蛍光性シリコン粒子の製造方法が提供される。
【００１０】
また、請求項６に記載の発明によれば、請求項４または５に記載の蛍光性シリコン粒子の製造方法で製造された蛍光性シリコン粒子が提供される。
【００１１】
また、請求項７に記載の発明によれば、請求項６の蛍光性シリコン粒子を用いて生体細胞内もしくは細胞膜上の分子の運動を観察する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．ポーラスシリコンの製造
＜ステップ１＞  まず、シリコンウエハ等のシリコン基体を用意し、適度な大きさ（例えば、約5cm×5cm）にカットする。次に、図１に示すように、容器２０中で、カットしたシリコン基体１０の端１５を２〜３ｍｍ程、濃フッ酸（HF）と濃硝酸（HNO3）の混合溶液３０に浸ける。
【００１３】
ここで用いる混合溶液中のHFとHNO3の混合比は、体積比において、２：１〜１：２の範囲である。混合溶液中のHNO3の割合が少なすぎると、十分にエッチングができず、多すぎると反応速度が速すぎて均一なエッチングができない。
【００１４】
また、この段階で、シリコン基体を完全に混合溶液に浸すと、均一にポーラスシリコンが形成されないので、上記の如く、シリコン基体の一部を浸すのが好ましい。
【００１５】
シリコン基体の端を混合溶液に浸す時間は、０．５〜５秒の範囲である。浸す時間が短いと十分なポーラスシリコンが得られない。一方、浸す時間が長すぎると一旦形成されたポーラスシリコンが溶出してしまう。この処理は、室温で行うことができる。
【００１６】
また、HFとHNO3の混合溶液は、蒸気を発生するので、シリコン基体の端を混合溶液に浸すことなく、シリコン基体全体（ポーラスシリコンを形成しようとする面の全体）に蒸気を作用させるようにしてもよい。例えば、図２に示すように、混合溶液３０を入れたシャーレ２５の直ぐ上に、シリコン基体１０を配置させて、０．５〜５秒保持するようにしてもよい。
【００１７】
＜ステップ２＞  次に、上記ステップ１で処理したシリコン基体を、ＨＦとＨＮＯ３と水の混合溶液に浸す。ここで用いる混合溶液中のＨＦとＨＮＯ３との混合比は、体積比において、ＨＦ：ＨＮＯ３＝１：１〜１：５である。またＨＦと水との混合比は、体積比において、１：３〜１：５である。後述の実施例で説明するように、混合溶液中の組成比を調整することにより、様々な蛍光波長を示すポーラスシリコンを製造することができる。
【００１８】
混合溶液に浸す時間は、目的とするポーラスシリコンや、用いる混合溶液の組成により適宜選択できるが、通常２〜１０分の範囲である。また、この処理は、室温で行うことができる。
【００１９】
なお、組成比を変えた複数の混合溶液を用いて、シリコン基体を混合溶液に浸す処理を、複数段階で行ってもよい。
【００２０】
＜ステップ３＞  その後、シリコン基体をエタノール等の洗浄液で洗い、乾燥させる。本方法によって作成したポーラスシリコンの蛍光スペクトルは、蛍光分光光度計によって測定することができる。
【００２１】
２．ポーラスシリコンのシラン化
上記で得られたポーラスシリコンの表面のシラン化は、シランカップリング剤を作用させることにより行うことができる。シラン化によって、ポーラスシリコンの表面にシランカップリング剤の有する官能基を導入することができる。シランカップリング剤の有する官能基としては、アミノ基、メルカプト基、ハロゲン基、ビニル基、グリシジル基、メタクリロキシ基、カルボキシル基、カルボニル基、などがあり、中でもアミノ基、メルカプト基が好ましい。例えば、シリコン基体をメタノール等で洗浄し、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン（3-aminopropyldimethylethoxysilane）、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（3-mercaptopropyltrimethoxysilane）等のシランカップラング剤の酸性メタノール溶液に浸す。
【００２２】
３．シリコン粒子の分離、精製
シラン化したシリコン基体の表面からシリコン粒子を分離する方法としては、カッターナイフのような鋭敏なエッジを持つ装置で、シリコン基体を擦り、ポーラスシリコンをそぎ落とす方法や、超音波洗浄装置によって、シリコン基体からシリコン粒子を分離する方法等を用いることができる。
【００２３】
シリコン粒子の精製は、例えば、緩衝液(pH6.0)に混入させた後、遠心分離機で分離し、上澄みを分取し、分取した上澄みをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離することにより行うことができる。
【００２４】
４．シリコン粒子への生体材料の結合
シラン化されたシリコン粒子への生体分子の結合は、公知の方法により実現することができる。例えば、シラン化されたシリコン粒子の有する官能基と生体分子の官能基とを、必要に応じて他の化合物の存在下または他の化合物を介して結合させる。より具体的には、アミノ基を持つシリコン粒子をカルボキシル基を持つ蛋白質を結合剤  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, hydrochloride）を用いて結合させる。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
＜実施例１−１＞  605nmの蛍光波長をもつポーラスシリコンの製造
シリコンウエハ（面方位（１００）、p-type、ホウ素ドープ、比抵抗１〜１０Ω・cm)を、約5cm×5cmの大きさにカットした。図１に示したように、カットしたシリコンウエハの端を２〜３mm程HFとHNO3の混合溶液（体積比１：１）に２秒間浸けた。次に、シリコンウエハの全体を、HFとHNO3とH2Oの混合溶液（体積比２：７：８)に3分間浸けた。その後エタノールで洗い、乾燥させた。図３に、本方法によって作成したポーラスシリコンを蛍光分光光度計によって275nm励起で取得した蛍光スペクトルを示す。
【００２７】
＜実施例１−２＞  650nmの蛍光波長をもつポーラスシリコンの製造
シリコンウエハ（面方位（１００）、p-type、ホウ素ドープ、比抵抗１〜１０Ω・cm)を、約5cm×5cmの大きさにカットした。図１に示したように、カットしたシリコンウエハの端を２〜３mm程度HFとHNO3の混合溶液（体積比１：１）に2秒間浸けた。次に、シリコンウエハの全体を、HFとHNO3とH2O溶液(体積比２：７：８)に3分間浸けた。さらに、シリコンウエハの全体を、HFとHNO3とH2Oの混合溶液(体積比２：５：８)に3分間浸けた。その後エタノールで洗い、乾燥させた。図４に、本方法によって作成したポーラスシリコンを蛍光分光光度計によって275nm励起で取得した蛍光スペクトルを示す。
【００２８】
＜実施例１−３＞  425nmの蛍光波長をもつポーラスシリコンの製造
シリコンウエハ（面方位（１００）、p-type、ホウ素ドープ、比抵抗１〜１０Ω・cm)を、約5cm×5cmの大きさにカットした。カットしたシリコンウエハの端を２〜３mm程度HFとHNO3の混合溶液（体積比１：１）に2秒間浸けた。次に、シリコンウエハの全体を、HFとHNO3とH2Oの混合溶液(体積比２：５：８)に７分間浸けた。その後エタノールで洗い、乾燥させた。図５に、本方法によって作成したポーラスシリコンを蛍光分光光度計によって275nm励起で取得した蛍光スペクトルを示す。
【００２９】
＜実施例２−１＞  3-aminopropyldimethylethoxysilaneを用いたシラン化
実施例１−１で得られたシリコンウエハをメタノールで洗浄した。そして、体積比0.8%の3-aminopropyldimethylethoxysilane酸性メタノール液(500m1のメタノールに4mlの氷酢酸を混入したもの)10mlに1時間浸けた。さらに12.5mlの純水(18Ωcm以上)を加え、さらに1時間浸けた。シリコンウエハを取り出して十分にメタノールで洗った後、真空中で24時間乾燥させた。
【００３０】
＜実施例２−２＞  3-mercaptopropyltrimethoxysilaneを用いたシラン化
実施例１−１で得られたシリコンウエハをメタノールで洗浄した。そして、体積比1.2%の3-mercaptopropyltrimethoxysilane酸性メタノール液(500mlのメタノールに4mlの氷酢酸を混入したもの)10mlに1時間浸けた。さらに12.5mlの純水(18Ωcm以上)を加え、さらに1時間浸けた。シリコンウエハを取り出して十分にメタノールで洗った後、真空中で24時間乾燥させた。
【００３１】
＜実施例３＞  分離と精製
実施例２−１でシラン化したシリコンウエハを、カッターナイフのような鋭敏なエッジを持つ装置で擦り、ポーラスシリコンをそぎ落とした。
【００３２】
得られたシリコンナノ粒子を0.025M  2-morpholinoethanesulfonic acid緩衝液(pH6.0)に混入し、遠心分離機（遠心加速度7000×ｇ）で10分間遠心し、シリコン粒子が含まれている上澄みを分取した。
【００３３】
分取した上澄みに含まれているシリコン粒子を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製した。使用したカラムはSuperdex75ge1で緩衝液は0.05Mリン酸pH7  0.15M  NaCl  流速は0.4ml/minである。図６、７に、溶出したシリコン粒子を示す。図６は、シラン化したあとのシリコン粒子である。図７は、参照用のシラン化する前のシリコン粒子である。各々、右側のピークは約直径3nmの粒子のピークである。左側のピークは対照用の分子であるRNase直径4nmである。
【００３４】
＜実施例４＞  生体細胞の観察
実施例３で得られたシリコン粒子を、0.6mM  1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy1)-carbodiimide, hydrochlorideに混入させ、15分後に、ターゲットとなる分子を混入させた。この操作によって、シリコン粒子上のアミノ基とタンパク質中のカルボキシル基が縮合し、シリコン粒子とタンパク質の複合体が形成された。
【００３５】
生細胞の表面で、単一シリコン粒子が結合したものを観察する方法は以下のとおりである。
【００３６】
シリコン粒子をレセプターと特異的に結合する分子と共有結合させ、あらかじめ生細胞の培養液(growth mediumもしくはbalanced salt solution)に混入して培養しておく。実施例としては、上述したようなアミノ基を持ったシリコン粒子をトランスフェリン(鉄イオンを細胞内に輸送するタンパク質)に結合させた。トランスフェリンとシリコンナノ粒子の複合体は細胞表面にあるトランスフェリン受容体に結合した。この際細胞はラットの腎臓由来の株細胞であるNRK細胞を使用した。培養にはFCS（ウシ胎児血清、fetal calf serum）10%を含むHamF12を使用した。細胞は最初にハンクス液中で37度で30分培養したあとで、トランスフェリンとシリコン粒子の複合体を混入した。この複合体は、NRK細胞表面のトランフェリン受容体に結合した。
【００３７】
観察は倒立顕微鏡を用い、全反射照明条件で観察した。開口数1.45油浸対物レンズを用い、落射照明装置の光路より543nmのHeNeレーザを対物レンズ内へ光軸と平行に導入し、対物レンズの後焦点面にレーザの焦点を結び、その焦点の位置をレンズの周辺部近くになるように調整することで、対物内全反射照明状態になるようにした。粒子像の撮影には、高感度CCDカメラもしくはSITカメラにイメージインテンシファイアーを設置したものを使用した。
【００３８】
その結果、細胞膜上のトランスフェリン受容体の運動の様子を明確に観察することができた。
【００３９】
以上、実施例により本願発明を詳細に説明した。
【００４０】
本願発明の蛍光性シリコン粒子の製造方法では、電気化学的手法を用いないので、操作が簡便である。また、近年、生細胞内もしくは細胞表面における単一の生体分子の挙動を観察することによって、分子の機能を解明し、これらの分子の機能の異常が原因となっているさまざまな病気の探求や治療法の開発がなされている。本願発明で製造された蛍光性シリコン粒子は、生物材料の標識として使用することができる。
【００４１】
また、上記実施例では、シリコン基体の表面からシリコン粒子を分離した後にシラン化するのではなく、生成したポーラスシリコンをシラン化した後にシリコン粒子を分離している。こうすることで、粒子のそれぞれに対して均一にシラン化を行うことができる。
【００４２】
なお、上記実施形態および実験例は、本願発明の技術的思想の範囲内で様々な変形が可能である。
【００４３】
例えば、上記で説明した方法でポーラスシリコンを生成し、シラン化し、さらに生体分子を結合させた後に、シリコン基体からシリコン粒子を分離するようにしてもよい。こうすれば、均一に生体分子が結合したシリコン粒子を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】シリコン基体をＨＦ＋ＨＮＯ３混合溶液に作用させる様子を示す図。
【図２】シリコン基体をＨＦ＋ＨＮＯ３混合溶液に作用させる様子を示す図。
【図３】実施例１−１のポーラスシリコンの蛍光スペクトル。
【図４】実施例１−２のポーラスシリコンの蛍光スペクトル。
【図５】実施例１−３のポーラスシリコンの蛍光スペクトル。
【図６】実施例３におけるＨＰＬＣの結果。
【図７】実施例３におけるＨＰＬＣの結果（参照用）。
【符号の説明】
【００４５】
１０…シリコン基体（シリコンウエハ）
２０…容器、２５…シャーレ
３０…混合溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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