(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に形成された少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層と、前記光触媒含有層上に形成され、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害層とを有し、
前記基材または前記光触媒含有層上に遮光部が形成され、
前記細胞接着阻害材料が、水和能の高い材料または表面に構造水を有する材料であることを特徴とするパターニング用基板。
【請求項２】
前記細胞接着阻害層が、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有する細胞接着材料を含有していることを特徴とする請求項１に記載のパターニング用基板。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のパターニング用基板の前記細胞接着阻害層が、パターン状に前記細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、前記細胞接着部以外の領域である細胞接着阻害部とを有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞培養用パターニング基板の、前記細胞接着部上に、細胞が接着していることを特徴とする細胞培養基板。
【請求項５】
細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料と、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有する細胞接着材料とを含有することを特徴とするパターニング用基板用コーティング液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板や、その細胞培養用パターニング基板の形成に用いられるパターニング用基板、そのパターニング用基板を形成するために用いられるパターニング用基板用コーティング液、および細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
【０００３】
一部の細胞、特に多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
【０００４】
一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。
【０００６】
さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
【０００７】
しかしながら、このような細胞培養部位のパターニングは、用途によっては高精細であることが要求される場合がある。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。
【０００８】
さらに、高精細な細胞接着性材料のパターンの形成方法として、マイクロ・コンタクトプリンティング法が、ハーバード大学のジョージ  Ｍ，ホワイトサイズ(George M. Whitesides)により提唱されている（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７等）。しかしながら、この方法を用いて工業的に細胞接着性材料のパターンを有する細胞培養基材を製造することは難しいといった問題があった。
【０００９】
【特許文献１】特開平２−２４５１８１号公報
【特許文献２】特開平３−７５７６号公報
【特許文献３】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献４】米国特許第５，５１２，１３１号公報
【特許文献５】米国特許第５，９００，１６０号公報
【特許文献６】特開平９−２４０１２５号公報
【特許文献７】特開平１０−１２５４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、基材上に細胞を高精細なパターン状に接着し、培養させるために用いられる細胞培養用パターニング基板や、細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、基材と、上記基材上に形成された少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層と、上記光触媒含有層上に形成され、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害層とを有することを特徴とするパターニング用基板を提供する。
【００１２】
本発明によれば、上記光触媒含有層上に上記細胞接着阻害層が形成されていることから、パターニング用基板にエネルギーを照射することによって、細胞接着阻害層中に含有される細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性が良好なものとすることができる。また、エネルギーが照射されていない領域においては、上記細胞接着阻害材料によって、細胞との接着性が低いものとすることができる。したがって、特別な装置や複雑な工程を必要とすることなく、細胞接着阻害材料が分解または変性されて細胞と接着性が良好な領域と、細胞接着阻害材料を含有し、細胞との接着性が低い領域とを容易に形成することが可能なパターニング用基板とすることができる。
【００１３】
上記発明においては、上記細胞接着阻害層が、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有する細胞接着材料を含有していることが好ましい。これにより、上記細胞接着阻害材料が分解または変性された領域の細胞との接着性を、より良好なものとすることができるからである。
【００１４】
また、上記発明においては、上記基材または上記光触媒含有層上に遮光部が形成されているものとすることができる。パターニング用基板の基材側から全面にエネルギーを照射した場合、遮光部が形成された領域上の細胞接着阻害層中の細胞接着阻害材料は分解または変性されることなく、遮光部が形成された領域以外の細胞接着阻害層に含有される細胞接着阻害材料のみを分解または変性させることができるからである。
【００１５】
また、本発明は、上記いずれかのパターニング用基板の上記細胞接着阻害層が、パターン状に上記細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の領域である細胞接着阻害部とを有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板を提供する。
【００１６】
本発明によれば、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されて細胞との接着性が良好な細胞接着部と、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されずに、細胞との接着性が低い細胞接着阻害部とを有することから、複雑な工程や、細胞に悪影響を及ぼすような処理液等が必要なく、細胞接着部のみに高精細に細胞を接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板とすることができる。
【００１７】
またさらに、本発明は、上記細胞培養パターニング基板の、上記細胞接着部上に、細胞が接着していることを特徴とする細胞培養基板を提供する。
【００１８】
本発明によれば、上記細胞接着部および細胞接着阻害部を有する細胞培養用パターニング基板を用いることによって、容易に細胞接着部上に細胞が接着されたものとすることができる。
【００１９】
また、本発明は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料と、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有する細胞接着材料とを含有することを特徴とするパターニング用基板用コーティング液を提供する。
【００２０】
本発明によれば、上記パターニング用基板用コーティング液を、例えば光触媒を含有する層等の上に塗布し、エネルギーを照射することによって、容易に細胞接着阻害材料を分解することができ、細胞との接着性を有するものとすることができる。またこのエネルギー照射された領域に、上記細胞接着材料が含有されていることから、細胞との接着性をより良好なものとすることができる。一方、エネルギーが照射されていない領域は、細胞接着阻害材料によって細胞と接着することが阻害されることから、細胞との接着性が低い領域とすることができる。したがって、容易に細胞との接着性が良好な領域と、細胞との接着性が低い領域とを形成することが可能なパターニング用基板用コーティング液とすることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、特別な装置や複雑な工程を必要とすることなく、細胞接着阻害材料が分解または変性されて細胞と接着性が良好な領域と、細胞接着阻害材料を含有し、細胞との接着性が低い領域とを容易に形成することが可能なパターニング用基板とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板や、その細胞培養用パターニング基板の形成に用いられるパターニング用基板、そのパターニング用基板を形成するために用いられるパターニング用基板用コーティング液、および細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等に関するものである。以下、それぞれについてわけて説明する。
【００２３】
Ａ．パターニング用基板用コーティング液
まず、本発明のパターニング用基板用コーティング液について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料と、細胞と接着性を有する細胞接着材料とを含有するものである。
【００２４】
本発明のパターニング用基板用コーティング液には、上記細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害材料を含有していることから、上記パターニング用基板用コーティング液を、光触媒を含有する層の上に塗布して層を形成した場合に、細胞との接着性を低いものとすることができる。また、この層にエネルギーを照射した場合には、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されて細胞との接着性が阻害されなくなり、また上記細胞接着材料が含有されていることから、細胞との接着性を良好なものとすることができる。したがって、細胞との接着性が良好な領域と細胞との接着性が低い領域とを、複雑な工程や、細胞に悪影響を及ぼす処理液等を用いることなく、容易に形成することができるのである。
以下、上記のようなパターニング用基板用コーティング液に用いられる各材料について説明する。
【００２５】
１．細胞接着阻害材料
まず、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着阻害材料について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着阻害材料は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。
【００２６】
ここで、上記細胞接着阻害性を有するとは、細胞が細胞接着阻害材料と接着することを阻害する性質を有することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞との接着を阻害する性質を有することをいう。
【００２７】
本発明に用いられる細胞接着阻害材料は、このような細胞接着阻害性を有しており、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性されて、細胞接着阻害性を有しなくなるものや、細胞との接着性が良好となるものが用いられる。
【００２８】
上記細胞接着阻害材料として、例えば水和能の高い材料を用いることができる。水和能の高い材料を用いた場合には、細胞接着阻害材料の周りに水分子が集まった水和層が形成される。通常、このような水和能の高い物質は水分子との接着性の方が細胞との接着性より高いことから、細胞は上記水和能の高い材料と接着することができず、細胞との接着性が低いものとなるのである。ここで、上記水和能とは、水分子と水和する性質をいい、水和能が高いとは、水分子と水和しやすいことをいうこととする。
【００２９】
上記水和能が高く細胞接着阻害材料として用いられる材料としては、例えばポリエチレングリコールや、ベタイン構造を有する両性イオン材料、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチル）フォスフォリルコリン等のリン脂質含有材料等が挙げられる。このような材料を上記細胞接着阻害材料として用い、エネルギーが照射された場合には、光触媒の作用によって、上記細胞接着阻害材料が分解または変質等され、表面の水和層が離れることにより、上記細胞接着阻害性を有しないものとすることができるのである。
【００３０】
また、細胞接着阻害材料として、表面に構造水を有する材料も用いることができる。このような材料を細胞接着阻害材料として用いた場合には、構造水によって細胞が細胞接着阻害材料と接着することが阻害され、細胞接着阻害材料と細胞との接着性を低いものとすることができる。このような構造水を有し、本発明において細胞接着阻害材料として用いられる材料としては、例えばベタイン構造を有する両性イオン材料、ポリ（２−メトキシエチル）アクリレート等が挙げられる。このような材料を上記細胞接着阻害材料として用い、エネルギーが照射された場合には、光触媒の作用によって、上記細胞接着阻害材料が分解または変質等され、表面の構造水が除去されることにより、上記細胞接着阻害性を有しないものとすることができるのである。
【００３１】
また、光触媒の作用により分解されるような、撥水性または撥油性の有機置換基を有する界面活性剤も用いることができる。このような界面活性剤としては、例えば、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ  ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のフッ素系あるいはシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
【００３２】
このような材料を細胞接着阻害材料として用いた場合、パターニング用基板用コーティング液を塗布して層を形成した際に、表面に上記細胞接着阻害材料が配向したり偏在したりすることとなる。これにより、表面の撥水性や撥油性を高いものとすることができ、細胞との相互作用が小さく、細胞との接着性が低いものとすることができるのである。また、この層にエネルギーが照射された場合には、光触媒の作用によって、容易に分解されて光触媒を含有する層等が露出し、上記細胞接着阻害性を有しないものとすることができるのである。
【００３３】
本発明においては、上記細胞接着阻害材料として、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞との接着性が良好となるものが用いられることが特に好ましく、このような細胞接着阻害材料としては、例えば撥油性や撥水性を有する材料が挙げられる。
【００３４】
細胞接着阻害材料として、上記撥水性または撥油性を有する材料を用いた場合には、細胞接着阻害材料の撥水性または撥油性によって、細胞と細胞接着阻害材料との間における、例えば疎水性相互作用等の相互作用が小さく、細胞との接着性を低いものとすることができる。
【００３５】
このような撥水性または撥油性を有する材料としては、例えば骨格が光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような撥水性または撥油性の有機置換基を有するもの等を挙げることができる。
【００３６】
骨格が光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような撥水性または撥油性の有機置換基を有するものとしては、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【００３７】
上記の（１）の場合、一般式：
ＹｎＳｉＸ（４−ｎ）
（ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基、またはこれらを含む有機基であり、Ｘはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）
で示される珪素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物もしくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される有機基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
【００３８】
また、上記有機基として、特にフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを好ましく用いることができ、具体的には、下記のフルオロアルキルシランの１種または２種以上の加水分解縮合物、共加水分解縮合物が挙げられ、一般にフッ素系シランカップリング剤として知られたものを使用することができる。
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）８ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ  ＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）８ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ  ＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）５（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）７（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＳＯ２Ｎ（Ｃ２Ｈ５）Ｃ２Ｈ４ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３。
【００３９】
上記のようなフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを細胞接着阻害材料として用いることにより、撥水性や撥油性を高いものとすることができ、細胞との相互作用が小さく、細胞との接着性が低いものとすることができる。また、上記のような材料にエネルギーが照射された場合には、容易にフッ素等を除去して表面にＯＨ基等を導入することができ、細胞との相互作用を大きなものとできることから、細胞との接着性を良好なものとすることができるのである。
【００４０】
また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。
【００４１】
【化１】
0004742599.tif 000002
【００４２】
ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ１，Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜１８の置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アリールあるいはシアノアルキル基であり、モル比で全体の４０％以下がビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルである。また、Ｒ１、Ｒ２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端もしくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。
【００４３】
また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物を別途混合してもよい。
【００４４】
上記のような反応性シリコーンを用いることにより、撥水性や撥油性を高いものとすることができ、細胞との相互作用が小さく、細胞との接着性が低いものとすることができる。また、上記のような材料にエネルギーを照射した場合には、容易に置換基を除去して表面にＯＨ基を導入することができるので表面自由エネルギーを制御することができる。その結果、細胞との相互作用を大きなものとできることから、細胞との接着性を良好なものとすることができるのである。
【００４５】
上記撥水性や撥油性を有する材料を細胞接着阻害材料として用いる場合、通常、水との接触角が８０°以上、中でも１００°〜１３０°の範囲内である材料を細胞接着阻害材料として用いることが好ましい。これにより、細胞との接着性を低いものとすることができるからである。なお、上記角度の上限は、平坦な基材上での細胞接着阻害材料の水との接触角の上限であり、例えば凹凸を有するような基材上での上記細胞接着阻害材料の水との接触角を測定した場合には、例えば資料ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・アプライド・フィジックス、パート２、３２巻、Ｌ６１４〜Ｌ６１５、１９９３年  Ｏｇａｗａら、に示されるように上限が１６０°程度となる場合もある。
【００４６】
また、この細胞接着阻害材料にエネルギーを照射し、細胞との接着性を有するものとする場合には、水との接触角が１０°〜４０°、中でも１５°〜３０°の範囲内とするようにエネルギーが照射されることが好ましい。これにより、細胞との接着性を高いものとすることができるからである。
【００４７】
なお、ここでいう水との接触角は、水、もしくは同等の接触角を有する液体との接触角を接触角測定器（協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型）を用いて測定（マイクロシリンジから液滴を滴下して３０秒後）し、その結果から、もしくはその結果をグラフにして得たものである。
【００４８】
上記のような細胞接着阻害材料は、材料の細胞接着阻害能により適宜最適化されるものであるが、通常、パターニング用基板用コーティング液中に０．０１重量％〜３０重量％、中でも０．１重量％〜１０重量％含有されることが好ましい。これにより、細胞接着阻害材料を含有する領域を細胞との接着性が低い領域とすることができるからである。
【００４９】
なお、エネルギーを照射して上記のような細胞接着阻害材料を分解または変性して、細胞との接着性が良好なものとして用いられる際には、目的とする細胞との接着性が良好となる程度にエネルギーが照射されて細胞接着阻害材料が分解または変性されればよく、完全に上記細胞接着阻害材料が分解または変性される必要はない。
【００５０】
２．細胞接着材料
次に、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着材料について説明する。本発明に用いられる細胞接着材料は、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有するものであれば、特に限定されるものではなく、例えばエネルギー照射される前から細胞と良好な接着性を有するものであってもよく、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞と良好な接着性を有するものとなるものであってもよい。ここで、細胞と接着性を有するとは、細胞と良好に接着することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞と良好に接着することをいう。
【００５１】
本発明においては、少なくともエネルギー照射された後に、上記細胞接着材料が細胞と良好な接着性を有するものであれば、細胞との接着が、例えば疎水性相互作用や、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力等の非共有結合により良好なものとされるものであってもよく、ビオチン−アビジンや抗原−抗体等に見られる生物学的相互作用により、良好なものとされるものであってもよい。
【００５２】
上記非共有結合により細胞と接着する材料として具体的には、ポリスチレン、親水化ポリスチレン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリリジンなどの塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランなどの塩基性化合物およびそれを含む縮合物等が挙げられる。
また、上記生物学的相互作用により細胞と接着する材料として具体的には、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。
【００５３】
本発明においては、このような細胞接着材料は、材料の細胞接着能により適宜最適化されるものであるが、通常、パターニング用基板用コーティング液中に０．０００１重量％〜３０重量％、中でも０．００１重量％〜１０重量％含有されることが好ましい。これにより、上記パターニング用基板用コーティング液を塗布して層を形成した際に、エネルギー照射された領域の細胞との接着性をより良好なものとすることができるからである。また、エネルギー照射される前から細胞と良好な接着性を有する材料を細胞接着材料として用いる場合には、パターニング用基板用コーティング液が塗布されて層が形成された後のエネルギーが照射されない領域において、上記細胞接着阻害材料の細胞接着阻害性を阻害しない程度含有されることが好ましい。
【００５４】
３．パターニング用基板用コーティング液
次に、本発明のパターニング用基板用コーティング液について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液は、上記細胞接着阻害材料および細胞接着材料を含有するものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜バインダ等の成分を含有しているものであってもよい。バインダを含有させることにより、パターニング用基板用コーティング液を、例えば光触媒を含有する層等の上に塗布する際の塗工が容易なものとすることや、形成された層に強度や耐性を付与する等、様々な特性を付与することが可能となるからである。このようなバインダとしては、パターニング用基板用コーティング液が必要とされる目的に応じて適宜選択される。なお、本発明においては、このバインダとしての役割を、上記細胞接着材料または細胞接着阻害材料が果たすものとしてもよい。
【００５５】
Ｂ．パターニング用基板
次に、本発明のパターニング用基板について説明する。本発明のパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成された少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層と、上記光触媒含有層上に形成され、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害層とを有するものである。
【００５６】
本発明のパターニング用基板は、例えば図１に示すように、基材１と、その基材１上に形成された光触媒含有層２と、その光触媒含有層２上に形成された細胞接着阻害層３とを有するものである。
【００５７】
本発明によれば、上記細胞接着阻害層に、上記細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害材料が含有されていることから、細胞が接着しないものとすることができる。また、上記細胞接着阻害層にエネルギーを照射した場合には、エネルギー照射に伴う光触媒含有層中の光触媒の作用により、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されて、細胞が接着することが可能となる。したがって、特別な装置や複雑な工程を必要とせず、パターン状にエネルギーを照射することにより、上記細胞接着阻害材料が分解除去されて、細胞との接着性が良好な領域と、上記細胞接着阻害材料が残存し、細胞との接着性が低い領域とを、容易に形成することが可能となる。
【００５８】
ここで、本発明のパターニング用基板においては、例えば図２に示すように、基材１上に遮光部４が形成されているものであってもよい。また、例えば図３に示すように、光触媒含有層２上に遮光部４が形成されているものであってもよい。このような遮光部が形成されていることにより、基材側からエネルギーを照射した場合等に、遮光部が形成された領域の光触媒が励起されないものとすることができ、遮光部が形成された領域上の細胞接着阻害層中に含有される細胞接着阻害材料は分解または除去されないものとすることができる。したがって、フォトマスク等を用いることなく、容易に細胞との接着性が良好な領域と、細胞との接着性が悪い領域とを形成することが可能となる。
以下、本発明のパターニング用基板の各構成について説明する。
【００５９】
１．細胞接着阻害層
まず、本発明のパターニング用基板に用いられる細胞接着阻害層について説明する。本発明の細胞接着阻害層は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料が含有されるものであれば、特に限定されるものではない。
【００６０】
このような細胞接着阻害層は、上記細胞接着阻害材料が含有されるコーティング液等を塗布して層を形成することにより、形成することが可能であるが、本発明においては特に上記細胞接着阻害材料および細胞接着材料を含有する、「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したようなパターニング用基板用コーティング液を塗布して層を形成したものであることが好ましい。これにより、細胞接着阻害層にエネルギーが照射された際に、エネルギーが照射された領域の細胞との接着性をより良好なものとすることができるからである。
【００６１】
このような細胞接着阻害層を形成する方法としては、上記パターニング用基板用コーティング液等を一般的な塗布方法により塗布すること等によって形成することができ、塗布方法として具体的には、スピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法、ロールコート法、ビードコート法等を用いることができる。また、吸着法も好適に用いることができる。
【００６２】
また、例えば後述する基材に凹部が形成されている場合には、上記基材の凹部に後述する光触媒含有層を形成した後、上記凹部にパターニング用基板用コーティング液等を滴下し、乾燥させて細胞接着阻害層とするキャスト法や、上記基材の凹部に後述する光触媒含有層を形成した後、パターニング用基板用コーティング液等を滴下し、所定時間後、洗浄する吸着法等も用いることができる。
【００６３】
ここで、本発明に用いられる細胞接着阻害層に用いられる細胞接着阻害材料、細胞接着材料等については、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。
またこのような細胞接着阻害層の膜厚としては、パターニング用基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．００１〜１μｍ程度、中でも０．００５〜０．１μｍ程度が好ましい。
【００６４】
２．光触媒含有層
次に、本発明のパターニング用基板に用いられる光触媒含有層について説明する。本発明のパターニング用基板に用いられる光触媒含有層は、少なくとも光触媒を含有する層であれば、特に限定されるものではなく、光触媒のみからなる層であってもよく、またバインダ等、他の成分を含有する層等であってもよい。
【００６５】
この光触媒含有層における、後述するような酸化チタンに代表される光触媒の作用機構は、必ずしも明確なものではないが、光の照射によって生成したキャリアが、近傍の化合物との直接反応、あるいは、酸素、水の存在下で生じた活性酸素種によって、有機物の化学構造に変化を及ぼすものと考えられている。本発明においては、このキャリアが光触媒含有層上に形成された細胞接着阻害層中の細胞接着阻害材料に作用を及ぼすものであると思われる。
【００６６】
本発明で使用する光触媒としては、光半導体として知られる例えば酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ2）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ3）、酸化タングステン（ＷＯ3）、酸化ビスマス（Ｂｉ2Ｏ3）、および酸化鉄（Ｆｅ2Ｏ3）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００６７】
本発明においては、特に酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本発明ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の酸化チタンが好ましい。アナターゼ型酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。
このようなアナターゼ型酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。
【００６８】
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
【００６９】
ここで、光触媒のみからなる光触媒含有層を用いた場合には、上記細胞接着阻害層中の細胞接着阻害材料の分解または変性に対する効率が向上し、処理時間の短縮化等のコスト面で有利である。一方、光触媒とバインダとからなる光触媒含有層を用いた場合には、光触媒含有層の形成が容易であるという利点を有する。
【００７０】
光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。真空製膜法により光触媒含有層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒含有層とすることが可能であり、これにより細胞接着阻害材料を均一に分解または変性させることが可能である。また、光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着阻害材料を分解または変性させることが可能となる。なお、後述する基材に凹部が形成されている場合にも、上記方法により光触媒含有層を形成することができる。
【００７１】
また、光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法の他の例としては、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。ここで用いられる無定形チタニアとしては、例えば四塩化チタン、硫酸チタン等のチタンの無機塩の加水分解、脱水縮合、テトラエトキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラブトキシチタン、テトラメトキシチタン等の有機チタン化合物を酸存在下において加水分解、脱水縮合によって得ることができる。次いで、４００℃〜５００℃における焼成によってアナターゼ型チタニアに変性し、６００℃〜７００℃の焼成によってルチル型チタニアに変性することができる。
【００７２】
また、バインダを用いる場合は、バインダの主骨格が上記の光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものが好ましく、例えばこのようなバインダとしては、上述した細胞接着阻害層の項で説明したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【００７３】
このようにオルガノポリシロキサンをバインダとして用いた場合は、上記光触媒含有層は、光触媒とバインダであるオルガノポリシロキサンを必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を後述する基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
【００７４】
また、例えば後述する基材に凹部が形成されている場合には、上記塗布液等を凹部に滴下し、乾燥させて光触媒含有層を形成するキャスト法等も行うことができる。
【００７５】
また、バインダとして無定形シリカ前駆体を用いることができる。この無定形シリカ前駆体は、一般式ＳｉＸ4で表され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
【００７６】
具体的には、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、テトラ−ｎ−プロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラメトキシシラン等が挙げられる。また、この場合には、無定形シリカの前駆体と光触媒の粒子とを非水性溶媒中に均一に分散させ、透明基材上に空気中の水分により加水分解させてシラノールを形成させた後、常温で脱水縮重合することにより光触媒含有層を形成できる。シラノールの脱水縮重合を１００℃以上で行えば、シラノールの重合度が増し、膜表面の強度を向上できる。また、これらの結着剤は、単独あるいは２種以上を混合して用いることができる。
【００７７】
光触媒含有層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。また、光触媒含有層の厚みは、０．０５〜１０μｍの範囲内が好ましい。
また、光触媒含有層には上記の光触媒、バインダの他に、上述した細胞接着阻害層の項で説明した界面活性剤等を含有させることもできる。
【００７８】
ここで、本発明においては上記光触媒含有層は、その表面は細胞との接着性が高いことが好ましい。これにより、上記細胞接着阻害層が分解等されて光触媒含有層が露出した場合に、その領域を細胞との接着性が高い領域とすることができるからである。
【００７９】
また、本発明においては、上述したように光触媒含有層上に遮光部が形成されていてもよい。これにより、上記細胞接着阻害層の全面にエネルギーを照射した場合に、遮光部が形成された領域の光触媒は励起されず、遮光部が形成された領域以外の細胞接着阻害層中に含有される細胞接着阻害材料を分解または変性させることができるからである。またこの場合、遮光部が形成されている領域の光触媒は励起されないことから、エネルギーが照射される方向が特に限定されない、という利点を有する。
【００８０】
このような遮光部としては、パターニング用基板に照射されるエネルギーを遮断することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、例えばスパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。
【００８１】
また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このような樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。
【００８２】
３．基材
次に、本発明に用いられる基材について説明する。本発明に用いられる基材は、上記光触媒含有層を形成可能な層であれば、特に限定されるものではなく、例えば金属、ガラス、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができる。
【００８３】
ここで、基材の可撓性等はパターニング用基板の種類や用途等によって適宜選択される。また、上記基材の透明性は、パターニング用基板の種類や、上記細胞接着阻害材料を分解または変性させるために照射されるエネルギーの照射方向等によって、適宜選択され、例えば基材が遮光部等を有しており、上記エネルギーの照射が、基材側から行われる場合等には、基材が透明性を有するものとされる。
【００８４】
なお、本発明においては、基材が平坦なものであってもよいが、基材に凹部が形成されていてもよい。このような基材としては、例えば図８（ａ）に示すように、１つの凹部が形成されているものであってもよく、また例えば図８（ｂ）に示すように、複数の凹部が形成されているものであってもよい。
【００８５】
またこの際、上記凹部を有する基材の側壁に上記光触媒含有層や細胞接着阻害層が形成されないように処理が施されたものであってもよい。このような処理としては、例えばマスク等を用いてＣＶＤ法により上記側壁のみに撥液性を有する材料を付着させる方法や、上記凹部全面に撥液性を有する材料を付着させた後、筒状のマスク等を用いて紫外線処理やプラズマ処理等を行い、上記凹部の底面のみ、親液化させる方法等が挙げられる。
【００８６】
ここで、本発明において、上記基材は、アルカリ洗浄等の薬液洗浄されたものであってもよく、また酸素プラズマ処理や紫外線処理等のドライ洗浄が行われたものであってもよい。この場合、上記光触媒含有層を形成するための塗布液等の濡れ性が向上する。またさらに表面に反応性の官能基が配置されることとなることから、光触媒含有層の密着性が向上する、という利点を有する。
【００８７】
ここで、本発明の基材には、上述したように、遮光部が形成されていてもよい。基材上に形成される遮光部としては、上述した光触媒含有層の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。なお、上記遮光部は、上記光触媒含有層が形成される側の面に形成されるものであってもよく、また反対側の面に形成されるものであってもよい。
【００８８】
また、基材上に上記遮光部を形成し、その遮光部上に上記光触媒含有層を形成する場合には、その光触媒含有層と遮光部との間にプライマー層を形成してもよい。このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、プライマー層を形成することにより、光触媒の作用による細胞接着阻害層中の細胞接着阻害材料の分解または変性を阻害する要因となる遮光部および遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、その結果、高解像度のパターンを得ることが可能となるのである。
【００８９】
なお、本発明においてプライマー層は、遮光部のみならず遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
本発明におけるプライマー層は、上記遮光部と上記光触媒含有層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
【００９０】
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
【００９１】
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。
【００９２】
４．パターニング用基板
次に、本発明のパターニング用基板について説明する。本発明のパターニング用基板は、基材上に、上記光触媒含有層が形成されており、その光触媒含有層上に細胞接着阻害層が形成されたものであれば、特に限定されるものではなく、例えば必要に応じて他の層が積層されたもの等であってもよい。
【００９３】
Ｃ．細胞培養用パターニング基板
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板は、上述したパターニング用基板の上記細胞接着阻害層が、パターン状に細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の領域である細胞接着阻害部とを有するものである。
【００９４】
本発明の細胞培養用パターニング基板は、例えば図４に示すように、基材１と、その基材１上に形成された光触媒含有層２と、その光触媒含有層２上に形成された細胞接着阻害層３とを有するものであり、細胞接着阻害層３が、細胞接着部５と、細胞接着阻害部６とを有するものである。
【００９５】
本発明によれば、上記細胞接着部においては、細胞接着阻害材料が分解または変性されていることから、細胞との接着性が阻害されることなく、細胞との接着性が高いものとすることができる。また上記細胞接着阻害部においては、細胞接着阻害材料が含有されており、細胞との接着性が低い。したがって、複雑な工程や、細胞に悪影響を及ぼす処理液等を用いることなく、細胞接着部にのみ細胞を接着させることが可能となるのである。
【００９６】
ここで、上記細胞接着阻害部とは、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する領域であり、目的とする細胞との接着性が低い領域である。
【００９７】
一方、細胞接着部とは、上記細胞接着阻害材料が分解または変性された領域であり、細胞との接着性を有する領域である。ここで、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されているとは、上記細胞接着阻害材料が含有されていない、もしくは上記細胞接着阻害部に含有される細胞接着阻害材料の量と比較して、細胞接着阻害材料が少ない量含有されていることをいう。例えば上記細胞接着阻害材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞接着部中にはその細胞接着阻害材料が少量含有されている、または細胞接着阻害材料の分解物等が含有されている、もしくは細胞接着阻害層が完全に分解除去されて光触媒含有層が露出すること等となる。また、上記細胞接着阻害材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞接着部中にはその変性物等が含有されていることとなる。本発明においては、上記細胞接着部に、少なくともエネルギー照射された後に、細胞との接着性を有する細胞接着物質が含有されていることが好ましい。これにより、細胞接着部の細胞との接着性をより高いものとすることができ、上記細胞接着部のみに、高精細に細胞を接着させることが可能となるからである。
【００９８】
ここで、本発明においては、例えば図５に示すように、上記細胞接着阻害層３の細胞接着阻害部６と同じパターン状に、基材１上に遮光部４が形成されていてもよい。また、光触媒含有層上に同様に遮光部が形成されていてもよい。このような遮光部が形成されていることにより、例えば、上述した「Ｂ．パターニング用基板」で説明したパターニング用基板を形成し、基材側等から全面にエネルギーを照射することによって、遮光部が形成されていない領域上のみの細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、上記細胞接着部が容易に形成されたものとすることができるからである。
【００９９】
ここで、本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる基材、光触媒含有層、および細胞接着阻害層については、上述したパターニング用基板の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略し、以下、上記細胞接着部の形成方法について説明する。
【０１００】
まず、例えば図６に示すように、基材１上に少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層２を形成し、この光触媒含有層２上に、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」で説明したパターニング用基板用コーティング液等を用いて、細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害層３を形成する（図６（ａ））。次にこの細胞接着阻害層３に、細胞接着部を形成するパターン状に、例えばフォトマスク８等を用いてエネルギー９を照射する（図６（ｂ））。これにより、光触媒含有層２中に含有される光触媒の作用によって、エネルギー照射された領域の細胞接着阻害層３の細胞接着阻害材料が分解または変性され、エネルギーが照射された領域を細胞接着部５、エネルギーが照射されていない領域を細胞接着阻害部６とすることができる（図６（ｃ））。なお、上記細胞接着阻害層および光触媒含有層の形成方法等については、上記「Ｂ．パターニング用基板」で説明した方法と同様であるので、ここでの説明は省略する。また、上述したように、上記細胞接着阻害層中には、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有する細胞接着材料が含有されていることが好ましい。これにより、細胞接着部の細胞との接着性をより高いものとすることができるからである。
【０１０１】
ここで、本発明でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、光の照射に限定されるものではない。
【０１０２】
通常このようなエネルギー照射に用いる光の波長は、４００ｎｍ以下の範囲、好ましくは３８０ｎｍ以下の範囲から設定される。これは、上述したように光触媒として用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
【０１０３】
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。
【０１０４】
上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。また、上述したように、基材が細胞接着部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、基材側からエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。また、光触媒含有層上に、細胞接着阻害部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、どの方向からでもエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。これらの場合、フォトマスク等が必要なく、位置あわせ等の工程が必要ない、という利点を有する。
【０１０５】
ここで、上述したように、上記基材が凹部を有しており、上記凹部内に上記光触媒含有層および細胞接着阻害層が形成されている場合、上述した方法によりエネルギー照射を行ってもよい。また、例えば上記凹部が複数形成されている場合には、例えば各凹部ごとにそれぞれ異なるパターン状に露光を行ってもよい。このように各凹部ごとにそれぞれ露光を行う方法としては、例えば１つ１つの凹部に異なるマスクを配置してエネルギー照射する方法や、例えば光ファイバの先に、クロムマスクやステンシルマスク等を配置し、エネルギー照射する方法等が挙げられる。
なお、上記凹部の側壁にエネルギーが照射されないように、例えば筒状のマスク等を用い、上記凹部の底面のみ露光を行う方法を用いてもよい。
【０１０６】
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒の作用によって細胞接着阻害材料が分解または変性されるのに必要な照射量とする。
この際、光触媒含有層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的に細胞接着阻害材料を分解または変性させることができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。
【０１０７】
また本発明におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および細胞接着阻害層側のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、細胞接着阻害層側からエネルギー照射を行う必要がある。
【０１０８】
また本発明においては、上記細胞培養用パターニング基板形成後、上記細胞培養用パターニング基板の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けたもの等を細胞培養用パターニング基板としてもよい。
【０１０９】
Ｄ．細胞培養基板
次に、本発明の細胞培養基板について説明する。本発明の細胞培養基板は、上述した細胞培養用パターニング基板における細胞接着部上に、細胞が接着したものである。
本発明の細胞培養基板は、例えば図７に示すように、上記細胞接着阻害層３の細胞接着部５上にのみ細胞７が接着し、細胞接着阻害部６上には、細胞７が接着していないものである。
【０１１０】
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板上には、細胞との接着性が良好な細胞接着部と、細胞との接着性を有しない細胞接着阻害部とが形成されていることから、例えば細胞を細胞培養用パターニング基板の全面に塗布した場合であっても、細胞接着部のみに細胞を接着させて、細胞接着阻害部上の細胞を容易に除去することができる。これにより、複雑な工程や細胞に悪影響を及ぼす処理液等を用いることなく、容易に形成されたものとすることができるのである。
以下、本発明の細胞培養基板に用いられる細胞について説明する。ここで、細胞培養用パターニング基板については、上記「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」で説明したものであるので、ここでの説明は省略する。
【０１１１】
（細胞）
本発明の細胞培養基板に用いられる細胞としては、上記細胞培養用パターニング基板の細胞接着部上に接着するものであり、細胞接着阻害部上には接着しないものであれば特に限定されるものではない。
【０１１２】
本発明に用いられる細胞としては例えば、神経組織、肝臓、腎臓、膵臓、血管、脳、軟骨等、血球系等の非接着細胞以外なら、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞とすることができる。また一般的に非接着性の細胞についても、近年、接着固定を行うために細胞膜を修飾する技術が考案されており、必要に応じてこのような技術を用いる事で本発明に用いる事が可能である。
【０１１３】
ここで、上述したような各組織は種々の機能をもつ細胞により形成されていることから、所望する細胞を選択し、使用する必要がある。例えば肝臓の場合、肝実質細胞以外にも上皮細胞、内皮細胞、クッパー細胞、繊維芽細胞、脂肪摂取細胞等から形成されることとなる。なおこの場合、細胞の種類により細胞接着阻害材料に対する接着阻害性が異なるため、細胞種に応じて、上記細胞接着阻害部に用いられる細胞接着阻害材料やその組成比の選択が必要となる。
【０１１４】
また、細胞を細胞接着部上に接着させる方法としては、上記細胞接着部と細胞接着阻害部とを有する上記細胞培養用パターニング基板の上記細胞接着部のみに細胞を接着させることが可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えばインクジェットプリンタやマニピュレータ等で細胞を接着させる方法等であってもよいが、細胞懸濁液を播種して上記細胞接着部に細胞を接着させた後、不要となった細胞接着阻害部上の細胞をリン酸バッファで洗浄し、細胞を除去する方法が一般的に用いられる。このような方法としては、例えば参考文献“Spatial distribution of mammalian cells dicated by material surface chemistry”、Kevin E.Healy 他,Biotech.Bioeng．(1994) p.792等に記載されている方法を用いること等ができる。
【０１１５】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【０１１６】
以下に実施例および比較例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【０１１７】
［実施例１］
（光触媒含有層の形成）
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランTSL8114（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇ、および光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施したガラス基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強固に固定された膜厚０．２μｍの光触媒含有層を基板上に形成した。
【０１１８】
（細胞接着阻害層の形成）
この基板にイソプロピルアルコール５ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇ、およびフルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン）０．０４ｇから成る溶液をスピンコーティングにより塗布し、その後基板を１５０℃で１０分間乾燥することにより細胞接着阻害層を形成した。
【０１１９】
（パターニング用基板のパターニング）
この基板にフォトマスク越しに水銀ランプにより６Ｊ／ｃｍ２(波長２５４ｎｍ)の紫外線照射を行い、未露光部が細胞接着阻害性、露光部が細胞接着性にパターン化された細胞接着性である表面を有する細胞培養用パターニング基板を得た。
【０１２０】
（細胞接着工程）
各種組織に由来する細胞の培養実験手順については、例えば“組織培養の技術 第三版 基礎編”、日本組織培養学会編,朝倉書店等にその詳細が述べられている。本出願においては、ラット肝実質細胞を用いて基板を評価した。
ラットより摘出した肝臓をシャーレに移してメスで5ｍｍ大に細分し、２０ｍｌのDＭＥＭ培地を加えてピペットで軽く懸濁した後、細胞濾過器で濾過した。得られた粗分散細胞浮遊液を５００〜６００ｒｐｍで９０秒間遠心処理し、上清を吸引して除去した。残留した細胞に新たにDＭＥＭ培地を加えて再び遠心処理した。この操作を３回繰り返すことにより、ほぼ均一な肝実質細胞を得た。得られた肝実質細胞に、DＭＥＭ培地20mlを加えて懸濁し、肝実質細胞懸濁液を調製した。
次にWaymouth MB752/1培地（Ｌ-グルタミン含有、ＮａＨＣＯ３非含有）（ギブコ社製）１４．１２ｇに蒸留水９００ｍｌを添加した。これにＮａＨＣＯ３２．２４ｇ、アンホテリシンＢ液（ＩＣＮ）１０ｍｌ、およびペニシリンストレプトマイシン液（ギブコ社製）１０ｍｌ加えて攪拌した。これをｐＨ７．４に調整した後、全量を１０００ｍｌとし、０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過減菌したものをWaymouth MB752/1培地液とした。
先に作製した肝実質細胞懸濁液を、同じく作製したWaymouth MB752/1培地液に懸濁した上で、細胞接着部と細胞接着阻害部とを有する、上述した細胞培養用パターニング基板上に播種した。この基板を３７℃、５％ＣＯ２付与したインキュベータ内に２４時間静置し、基板全面に肝実質細胞を接着させた。この基板をＰＢＳで２回洗浄することにより、非接着細胞や死細胞を除去した後、新しい培地液と交換した。
培地液を交換しながら48時間まで細胞の培養を続け光学顕微鏡で細胞を観察したところ、細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に沿いながら接着している事を確認した。
【０１２１】
［実施例２］
（細胞培養用パターニング基板の作製）
遮光部３００μｍスペース部８０μｍのストライプ状遮光層を基板の表面に設けた石英基板を用い、この遮光層付き基板の表面に実施例１と同様の操作で光触媒含有層ならびに細胞接着阻害層を形成した。次に、フォトマスクを使用する代わりに、基板の裏面側から実施例１と同じ条件で裏面全体に紫外線照射して細胞培養用パターニング基板を作製した。
【０１２２】
（細胞接着工程）
実施例１と同様に細胞を接着させたところ、本基板においても細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に沿って接着していることを確認した。
【０１２３】
［実施例３］
市販の直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（コーニング社製）の底面の中央部に、直径１４ｍｍの穴をあけた。続いて、厚さ約０．１ｍｍのガラス基板を用いて上記実施例１と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、切断された細胞培養用パターニング基板のガラス基板を、上記プラスチックディッシュに、接着剤ＫＥ４５Ｔ（信越シリコーン社製）を用いて貼りつけた。
（細胞の接着）
上記プラスチックディッシュを、７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。その後、実施例１と同様に、細胞を培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら接着している事を確認した。
【０１２４】
［実施例４］
厚さ約０．１ｍｍの遮光層付き石英基板を用いて実施例２と同様に、細胞接着阻害層を有する細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例３と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
（細胞の培養）
実施例３と同様の方法により、プラスチックディッシュ内で細胞を培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら接着している事を確認した。
【０１２５】
［実施例５］
（パターニング用基板の形成）
実施例１と同様に、光触媒含有層を基板上に形成した。続いて、イソプロピルアルコール５ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）０．１ｇ、およびＰＥＧ−シラン（Methoxypolyethylene glycol 5,000 trimethylsilyl ether、Fluka）０．１５ｇからなる溶液を上記光触媒含有層上にスピンコーティング法により塗布した。その後、上記基板を１５０℃で１０分間加熱することにより、細胞接着阻害層を形成して、パターニング用基板とした。
（パターニング用基板のパターニング、および細胞の接着）
実施例１と同様に、パターニング用基板のパターニングを行って、細胞培養用パターニング基板を形成した。その後、上記細胞培養用パターニング基板上に、実施例１と同様に細胞を接着させたところ、本実施例においても細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に沿って接着していることを確認した。
【０１２６】
［実施例６］
厚み約０．１ｍｍのガラス基板を用いる以外は、実施例５と同様に細胞培養用パターニング基板を作製し、これを２１ｍｍ角に切断した。次いで、実施例３と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板のガラス基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
（細胞の培養）
実施例３と同様の方法により、プラスチックディッシュ内で細胞を培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら接着している事を確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】本発明のパターニング用基板の一例を示す概略断面図である。
【図２】本発明のパターニング用基板の他の例を示す概略断面図である。
【図３】本発明のパターニング用基板の他の例を示す概略断面図である。
【図４】本発明の細胞培養用パターニング基板の一例を示す概略断面図である。
【図５】本発明の細胞培養用パターニング基板の他の例を示す概略断面図である。
【図６】本発明の細胞培養用パターニング基板における細胞接着阻害部の形成方法の一例を示す工程図である。
【図７】本発明の細胞培養基板の一例を示す概略断面図である。
【図８】本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる基材を説明するための概略断面図である。
【符号の説明】
【０１２８】
１…基板
２…光触媒含有層
３…細胞接着阻害層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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