(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
性質が異なる２種類の溶媒相を利用して生体高分子を検出する方法であって、
第１の溶媒相において、サンプル生体高分子と標識されたプローブ生体高分子とを反応させるステップと、
前記２種類の溶媒相間で界面活性を有する媒体を用いて、前記サンプル生体高分子とプローブ生体高分子との反応生成物を第２の溶媒相に移動させるステップと、
前記第２の溶媒相に含まれる前記反応生成物を前記標識により検出することを特徴とする生体高分子検出方法。
【請求項２】
性質が異なる２種類の溶媒相を利用して生体高分子を検出する方法であって、
第１の溶媒相において、サンプル生体高分子と標識されたプローブ生体高分子とを反応させるステップと、
前記２種類の溶媒相間で界面活性を有する媒体を用いて、前記サンプル生体高分子とプローブ生体高分子との反応生成物を第２の溶媒相に移動させるステップと、
前記第１の溶媒相に含まれるプローブ生体高分子、及び前記第２の溶媒相の含まれる前記反応生成物を、前記標識によりそれぞれ検出することを特徴とする生体高分子検出方法。
【請求項３】
前記第１の溶媒相に含まれるプローブ生体高分子の検出量と、前記第２の溶媒相の含まれる前記反応生成物の検出量とを比較することにより、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子との反応性を定量することを特徴とする請求項２に記載の生体高分子検出方法。
【請求項４】
前記第１の溶媒相は水相であり、前記第２の溶媒相は有機相であり、前記サンプル生体高分子は極性を有しており、前記プローブ生体高分子は極性をほとんど有さず、前記界面活性を有する媒体は極性を有する部位と極性をほとんど有しない部位とを含んでいることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の生体高分子検出方法。
【請求項５】
前記プローブ生体高分子は、ＰＮＡ又はＬＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の生体高分子検出方法。
【請求項６】
前記プローブ生体高分子は、粒子により標識されていることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の生体高分子検出方法。
【請求項７】
前記界面活性を有する媒体はカチオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の生体高分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ、たんぱく質、細胞等の生体高分子を、迅速かつ簡便に検出・測定する方法及びこれに用いる器具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体高分子の検出及び測定といった分野においては、平面基板上に既知の性質を持つ多数のプローブＤＮＡを固定化することにより前記検出・測定を行うＤＮＡチップや、既知の性質を持つ生体高分子を表面に固定化したビーズを利用するフローサイトメトリー技術などがあった。これらは、被検生体高分子の情報を大量に一括して得られる点で非常に有用である。また、特に近年研究が進み、少ない遺伝子数でも必要な情報が得られるようになってきている。
【０００３】
一方で、ＤＮＡが負電荷を持っていることに着目して、水相中に溶解した標識ＤＮＡサンプルをカチオン性界面活性剤によって捕捉し、この逆ミセルを有機相に取り込むことにより、ＤＮＡを精製し濃縮する方法が提案されている。例えば、非特許文献１には、カチオン性界面活性剤としてアンモニウム塩を用いて、ＤＮＡの負電荷と界面活性剤の正電荷との相互作用を利用してＤＮＡを相間移動させることにより、ＤＮＡの濃縮を行う技術が記載されている。
【０００４】
その他、本発明者らは、生体高分子サンプルとプローブをハイブリダイゼーションさせた後、反応サンプルと非反応サンプルとを電気的に分離し、各々の存在量を測定することにより被検生体高分子の精密な検出・測定を行う方法を公表し、実施している（特許文献１及び特許文献２参照）。さらに、本発明者らは、ｐＨ変化等に対する耐久性を与えるために半導体ナノ粒子の表面をコーティングする技術についても公表し、実施している（特許文献３参照）。
【０００５】
ところで、近年、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acids）やＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）といったＤＮＡと類似した構造を持つ非天然化合物の合成が行われている。ＰＮＡはＤＮＡと異なり、リン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているため、ＤＮＡのような負電荷を持っていない。また、ＰＮＡはＤＮＡに比べて、サンプルとより強くハイブリダイズし、相補鎖認識能がより高いため、短時間で高感度な検出・測定に貢献すると共に、配列中の１塩基置換も容易に検出可能であり、様々な応用用途が期待されている。ＬＮＡはリボヌクレオシドの2'部位の酸素原子と4'部位の炭素原子がメチレンを介して結合した２つの環状構造を持つ核酸であり、ＤＮＡのような負電荷を持っていない。
【特許文献１】特開2002-168864号公報
【特許文献２】特開2002-228664号公報
【特許文献３】特開2005-103746号公報
【非特許文献１】J. Chem. Eng. Jpn. 37(5) pp.662-668(2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的に、ＤＮＡチップやフローサイトメトリーを用いた生体高分子の検出・測定では、検出・測定の前工程として、被検生体高分子を分離・精製し標識物質を結合させるなどしてサンプルを調製する作業が必要である。この調製作業は非常に煩雑であり、サンプル調製を厳密に行うのが困難であるため、後の検出・測定工程においてサンプル生体高分子を高精度に定量することが困難となっている。また、サンプル調製工程から検出・測定結果が得られるまでにある程度の作業時間が必要である上に、装置が大がかりで高価なものであるので、例えば、医療の現場において緊急に血液サンプルの分析を行わなければならないなどといった場合には対応できないという問題点があった。
【０００７】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、生体高分子の検出・測定を簡易迅速にかつ高精度に行うことができる方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記解決課題に鑑みて鋭意研究の結果、本発明者らは、上記したＤＮＡサンプルをカチオン性界面活性剤によって捕捉した後、相関移動させて分離・精製する技術と、ＰＮＡ、ＬＮＡ等のＤＮＡ類似化合物とを組み合わせることにより、特別な装置を使うことなく、簡易迅速にかつ高精度に生体高分子の検出・測定を行うことが可能となることに想到した。
【０００９】
すなわち、本発明は、性質が異なる２種類の溶媒相を利用して生体高分子を検出する方法であって、第１の溶媒相において、サンプル生体高分子と標識されたプローブ生体高分子とを反応させるステップと、前記２種類の溶媒相間で界面活性を有する媒体を用いて、前記サンプル生体高分子とプローブ生体高分子との反応生成物を第２の溶媒相に移動させるステップと、前記第２の溶媒相に含まれる前記反応生成物を前記標識により検出することを特徴とする生体高分子検出方法を提供するものである。
【００１０】
本発明は、また、性質が異なる２種類の溶媒相を利用して生体高分子を検出する方法であって、第１の溶媒相において、サンプル生体高分子と標識されたプローブ生体高分子とを反応させるステップと、前記２種類の溶媒相間で界面活性を有する媒体を用いて、前記サンプル生体高分子とプローブ生体高分子との反応生成物を第２の溶媒相に移動させるステップと、前記第１の溶媒相に含まれるプローブ生体高分子、及び前記第２の溶媒相の含まれる前記反応生成物を、前記標識によりそれぞれ検出することを特徴とする生体高分子検出方法を提供するものである。この生体高分子検出方法では、さらに、前記第１の溶媒相に含まれるプローブ生体高分子の検出量と、前記第２の溶媒相の含まれる前記反応生成物の検出量とを比較することにより、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子との反応性を定量することを特徴とする。
【００１１】
本発明の生体高分子検出方法において、さらに、前記第１の溶媒相は水相であり、前記第２の溶媒相は有機相であり、前記サンプル生体高分子は極性を有しており、前記プローブ生体高分子は極性をほとんど有さず、前記界面活性を有する媒体は極性を有する部位と極性をほとんど有しない部位とを含んでいることを特徴とする。
【００１２】
本発明の生体高分子検出方法において、前記プローブ生体高分子は、ＰＮＡ又はＬＮＡなどの極性を持たない分子であるのが好ましい。また、前記プローブ生体高分子は、好ましくは、蛍光物質および半導体ナノ粒子に例示される分子又は粒子により標識されていることを特徴とする。さらに、前記界面活性を有する媒体はカチオン性界面活性剤であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
以上、説明したように、本発明の生体高分子検出方法によれば、特別な装置を使うことなく、簡易迅速にかつ高精度に生体高分子の検出・測定を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の生体高分子検出方法及び生体高分子検出用器具を実施するための最良の形態を詳細に説明する。図１〜図３は、本発明の実施の形態を例示する図であり、これらの図において、同一の符号を付した部分は同一物を表わし、基本的な構成及び動作は同様であるものとする。
【００１６】
以下に示す実施形態では、プローブ生体高分子として既知の配列を持つＰＮＡを用い、サンプル生体高分子としてＤＮＡを用いる。また、カチオン性界面活性剤としてアンモニウム塩を用いる。カチオン性界面活性剤は、２〜３個のアルキル鎖を有するものが好ましく、さらに各アルキル鎖の炭素鎖長が８〜１８であるものが好ましい。また、プローブＰＮＡの標識には、色素、半導体ナノ粒子、錯体等を用いるものとする。また、有機相の溶媒には、ヘキサン、イソオクタン、クロロホルム、酢酸エチルなどを利用することができる。
【００１７】
図１は、本発明の生体高分子検出方法におけるサンプル反応段階を示す図である。まず、有機溶媒にアンモニウム塩からなるカチオン性界面活性剤10を加えた溶液Ａ（有機相）を用意する。アンモニウム塩の濃度は反応条件によって変動するため特に規定しないが、数ｍＭ程度でよい。他方で、リン酸緩衝液中にサンプルＤＮＡ11を溶解させた溶液Ｂ（水相）を用意する。この溶液Ｂに、標識されたプローブＰＮＡ12を加え、サンプルＤＮＡ11とプローブＰＮＡ12をハイブリダイゼーション反応させる。このときの反応温度、反応時間、リン酸緩衝液の濃度・ｐＨ等は、扱うサンプルごとに適切な条件に設定しておくものとする。このとき、全てのサンプルＤＮＡ11がプローブＰＮＡ12と反応するとは限らず、反応後の溶液Ｂ中にはサンプル及びプローブの反応物（以下、「反応サンプル」という）、未反応サンプル、未反応プローブなどが存在している可能性がある。この後、次の反応サンプル分離段階に進む。
【００１８】
図２は、本発明の生体高分子検出方法における反応サンプル分離段階を示す図である。上記の溶液Ａと反応後の溶液Ｂとを混合すると有機相と水相とに分離するが、この混合溶液を激しく攪拌した後、遠心分離すると、再度有機相と水相とに相分離した状態となる。この攪拌により、水相中のサンプルＤＮＡ11は、プローブＰＮＡ12と反応しているかどうかに関わらず、カチオン性界面活性剤10の極性部と静電的に結合して、逆ミセル中に補足された状態で有機相中に抽出される。この抽出を速やかに行うためにアルコール等を加えてもよい。一方、プローブＰＮＡ12は極性をほとんど持たないため、カチオン性界面活性剤10とは結合せず、未反応のプローブＰＮＡ12はほぼ全てが水相に滞留することになる。
【００１９】
この後、検出・定量段階として、有機相と水相とを分離し、それぞれにおける標識物質の存在量を測定する。図２に示す通り、有機相には反応サンプル13と未反応サンプル14とが抽出されているが、本発明ではプローブＰＮＡ12に標識をしているため、有機相における標識物質の存在量は、そのまま有機相における反応サンプル13の存在量であるとみなすことができる。一方で、水相における標識物質の存在量は、そのまま水相における未反応プローブＰＮＡ15の存在量であるとみなすことができる。そこで、有機相及び水相での標識物質の存在量を相対的に比較することにより、サンプルＤＮＡとプローブＰＮＡとの反応性を評価することができる。
【００２０】
以上説明したように、本発明の生体高分子検出方法では、従来のようにサンプル側に標識をするのではなく、プローブ側に標識をするので、反応サンプルと未反応サンプルが混在する有機相の中から反応サンプルのみが標識物質を介して検出・測定されるようになっており、定量性に優れた検出方法となっている。また、実際の検出・測定作業においては、プローブは予め標識したものを用意しておけばよく、サンプルの標識作業は不要であるため、非常に簡便迅速に検出・測定を行うことが可能である。
【００２１】
また、本発明の生体高分子検出方法では、反応容器、反応溶液、プローブ、標識物質、実験器具等については、容易に入手可能なものを用いることができ、検出・測定方法についても、攪拌や遠心分離など一般的に用いられている実験手法を利用すればよいので、実験室や医療施設などにおいて既存の施設を利用して容易に低コストで実施することができる。
【００２２】
本発明の生体高分子検出方法を簡便に実施するために、図３に示すような生体高分子検出用器具を用いることができる。図３に示す器具は、水性溶液を含んだ密閉型容器であり、前記溶液中には標識されたプローブＰＮＡが含まれている。これに、注射針などを用いてこの容器中の水相にサンプルＤＮＡを注入し、一定時間待って反応を起こさせた後、さらに、注射針などを用いてこの容器中にカチオン性界面活性剤を含む有機溶液を注入し、攪拌、遠心分離を行えば、上記と同様の検出・測定を行うことができる。このような生体高分子検出用器具を事前に用意しておけば、緊急にサンプルの分析を行う必要が生じた場合に、非常に迅速に対処することが可能となる。また、このように密閉型容器を用いることにより、被測定サンプルを暴露させることなく検出・測定を行うことができるので、測定者の安全性も確保することができる。
【００２３】
さらに、本発明の生体高分子検出方法の応用例として、標識物質の種類を増やすことにより、同時に多数の情報を得ることも可能である。また、標識物質は色素等に限られるものではなく、反応サンプルと未反応サンプルを区別することができるものであれば、その形態は問わない。例えば、プローブをビオチン等のたんぱく質やカルボキシル基等の官能基により修飾し、抽出段階においてアビジン等やアミノ基等を親水基側に有する両親媒性分子を用いることにより、選択的にプローブ分子を認識し、本発明における目的を達することも可能である。さらに、標識物質を視覚的に認識できるものとすることで、測定装置を必要としない実施形態も考えられる。サンプルの検出・測定工程においては、標識物質を直接測定するのではなく、さらに化学反応させて、より明確なシグナルを発するようになった状態で測定するなどして、より高精度な検出・測定を行うこともできる。
【００２４】
以上、本発明の生体高分子検出方法及び生体高分子検出用器具について、具体的な実施の形態を示して説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、上記各実施形態又は他の実施形態にかかる発明の構成及び機能に様々な変更・改良を加えることが可能である。
【００２５】
例えば、上記したプローブＰＮＡ及びサンプルＤＮＡは、いずれもＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、たんぱく質、抗原、抗体、細胞等の生体高分子や、これらに類似する人工合成物で代替可能である。また、前記標識はプローブ生体高分子側に行うことが好ましいが、サンプル生体高分子側に行うことによっても可能であり、あるいはその両方について標識を行うことも考えられる。プローブの標識物質は、蛍光分子の他、電気化学的、磁気的、光学的手法等により検出・測定が可能なものであればよく、測定者は実験設備や実験目的に合わせて任意の標識物質を用いることができる。さらに、プローブ生体高分子を担持する担体としての分子および粒子を標識物質とし、前記担体を選択的に抽出することによっても同様の検出・測定を行うことも可能である。このとき、サンプル生体高分子は標識されているのが好ましい。そして界面活性剤についてもここではアンモニウム塩を用いた方法について例示したが、サンプルの性質やプローブの性質等により極性や構造について考慮する必要があり、これに限定されない。抽出前相、抽出後相に用いる溶媒についても、上記で示した物質に限定されるものではなく、使用するサンプル、プローブ、界面活性剤等との組み合わせを考慮して、本発明の目的を達成することができる任意の物質を用いればよい。プローブの標識については、プローブ群をグループ化して標識を行うことにより、グループ単位での反応を測定することも可能である。こうした場合、必要な結果を必要最小限の方法及び情報のみで得ることができ、特に診断・検査用途において効率的な測定・検査を行うことが可能となる。また、サンプルＤＮＡの配列を意識しない測定・検出も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の生体高分子検出方法及びこれに用いる生体高分子検出用器具は、遺伝子解析や医療等の現場において、生体高分子サンプルの検出・測定を簡易迅速に行うことを可能とするものであり、産業上利用することができる発明である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の生体高分子検出方法におけるサンプル反応段階を示す図である。
【図２】本発明の生体高分子検出方法における反応サンプル分離段階を示す図である。
【図３】本発明の生体高分子検出方法を簡便に実施するための器具を示す図である。
【符号の説明】
【００２８】
10  カチオン性界面活性剤（アンモニウム塩）
11  サンプルＤＮＡ
12  プローブＰＮＡ
13  反応サンプル
14  未反応サンプル
15  未反応プローブＰＮＡ
【図１】
0004616141.tif 000002
【図２】
0004616141.tif 000003
【図３】
0004616141.tif 000004