(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含有する二重鎖化合物であって、該各鎖は１２〜３５のヌクレオチドを含み、そして該化合物は、式：
【化１】
0004755972.tif 000015
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲＨからなる群から選ばれ、ここで、ＲＨはＨまたはＣ１〜４−アルキルであり；
Ｙは、ＣＨ２であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
ＺおよびＺ＊は独立して、存在しないか、あるいはヌクレオシド間連結基、および末端基からなる群から選ばれ；その結果、ＬＮＡモノマーが３’末端に位置する場合には、Ｚは末端基であって、かつ、Ｚ＊はヌクレオシド間連結基であり；ＬＮＡモノマーが５’末端に位置する場合には、Ｚは存在せず、かつ、Ｚ＊は末端基であり；そして、ＬＮＡモノマーがヌクレオチド配列内に位置する場合には、Ｚは存在せず、Ｚ＊はヌクレオシド間連結基であり；
該ヌクレオシド間連結基は、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ-、−Ｓ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｓ)２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ(ＲＨ)−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ３)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＲＨ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＢＨ３)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＨＲＨ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、および−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−からなる群から選択され、ここで、ＲＨは水素またはＣ１〜４−アルキルであり；
該末端基は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ｃ１〜６−アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲＨ)−、モノ−もしくはジ−(Ｃ１〜６−アルキル)アミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルケニルオキシ、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ２〜６アルキニルオキシ、モノホスフェート（保護されたモノホスフェートを含む）、モノチオホスフェート（保護されたモノチオホスフェートを含む）、ジホスフェート（保護されたジホスフェートを含む）、ジチオホスフェート（保護されたジチオホスフェートを含む）、トリホスフェート（保護されたトリホスフェートを含む）、トリチオホスフェート（保護されたトリチオホスフェートを含む）、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ２−、アミノメチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲＨ)−ＣＨ２−、カルボキシメチル、およびスルホノメチルからなる群から選択され、ここで、Ｐｒｏｔは−ＯＨ、ＳＨ、および−ＮＨ(ＲＨ)についての保護基であり、およびＲＨは水素またはＣ１〜６アルキルであり；
ホスフェートの保護基は、Ｓ−アセチルチオエチルおよびＳ−ピバロイルチオエチルからなる群から選択され；
−ＯＨおよび−ＳＨ基の保護基は、トリチルオキシ、９−(９−フェニル)キサンテニルオキシ、メトキシテトラヒドロピラニルオキシ；シリルオキシ；ｔｅｒｔ−ブチルエーテル；アセタール（２個のヒドロキシ基を含む）；アシルオキシ、メトキシメチルオキシ、およびベンジルエーテルからなる群から選択されるか、またはＺまたはＺ＊がヒドロキシルである場合には、それらは場合により連結基によって固体支持体と結合することによって保護されていてもよく；
アミンの保護基は、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ、ベンジルオキシカルボニルアミノ、モノメトキシトリチルアミノ、ジメトキシトリチルアミノ、フタロイルアミノ、および９−(９−フェニル)キサンテニルアミノからなる群から選択される］
で示される構造を有する少なくとも１個のロックト核酸（ＬＮＡ）モノマーを含む、該二重鎖化合物。
【請求項２】
センス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
センス鎖は１〜１０個のＬＮＡモノマーを含む、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
少なくとも１個のＬＮＡモノマーはセンス鎖の５’末端に位置する、請求項２または３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
少なくとも２個のＬＮＡモノマーはセンス鎖の５’末端に位置する、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも１個のＬＮＡモノマーはセンス鎖の３’末端に位置する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも２個のＬＮＡモノマーはセンス鎖の３’末端に位置する、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
アンチセンス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項９】
アンチセンス鎖は１〜１０個のＬＮＡモノマーを含む、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
少なくとも１個のＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の３’末端に位置する、請求項８または９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
少なくとも２個のＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の３’末端に位置する、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
少なくとも３個のＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の３’末端に位置する、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
ＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の５’末端に位置しない、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１４】
センス鎖は少なくとも１個のＬＮＡを含み、そしてアンチセンス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１５】
センス鎖は１〜１０個のＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は１〜１０個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
センス鎖は５’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマー、および３’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含み、ここで、アンチセンス鎖は３’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１４または１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
センス鎖は５’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマー、および３’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含み、ここで、アンチセンス鎖は３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
センス鎖は５’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマー、および３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含み、ここで、アンチセンス鎖は３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
センス鎖は５’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーおよび３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含み、ここで、アンチセンス鎖は３’末端に少なくとも３個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
ＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の５’末端に位置しない、請求項１４〜１９のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２１】
センス鎖は５’末端から数えて９〜１３番目の位置の少なくとも１つに少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む、請求項１〜２０のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２２】
センス鎖は１０位にＬＮＡモノマーを含む、請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
センス鎖は１１位にＬＮＡモノマーを含む、請求項２１または２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
センス鎖は１２位にＬＮＡモノマーを含む、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２５】
各鎖は１７〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１〜２４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２６】
各鎖は２０〜２２個のヌクレオチドを含む、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
鎖の少なくとも１個は３’オーバーハングを有する、請求項１〜２６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２８】
ＸはＯ、ＳおよびＮＨからなる群から選ばれる、請求項１〜２７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２９】
ＸはＯである、請求項２８記載の化合物。
【請求項３０】
ＬＮＡモノマーはベータ−Ｄ型である、請求項１〜２９のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１つに記載の化合物、および医薬的に許容し得る希釈物、担体またはアジュバントを含有する、医薬組成物。
【請求項３２】
該組成物は更に少なくとも１個の活性薬剤を含む、請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】
癌を処置するための請求項３１または３２記載の医薬組成物。
【請求項３４】
該活性薬剤は化学療法剤である、癌を処置するための請求項３２記載の医薬組成物。
【請求項３５】
該化学療法剤は、副腎皮質ステロイド；アルトレタミン；アミフォスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンドロゲン；アスパラギナーゼ；バシラスカルメッテ−グリン；ビカルタミド；ブレオマイシン；ブスルファン；カルボプラチン；カルムスチン；クロラムブシル；クロロデオキシアデノシン；シスプラチン；シトシンアラビノシド；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドセタキセル；ドキソルビシン；エピルビシン；エストラムスチン；エストロゲン；エトポシド；フルダラビン；フルタミド；５−ＦＵＤＲ；５−フルオロウラシル；ゲムシタビン；ゴセレリン；ハーセプチン；ヒドロキシ尿素；イダルビシン；イホスファミド；ＩＬ−２；インターフェロンアルファ；イリノテカン；ロイプロリド；レバミソール；ロムスチン；メクロラタミン；メルファラン；メルカプトプリン；メトトレキセート；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン；オクトレオチド；ペントスタチン；プリカマイシン；プロロカルバジン；ストレプトゾシン；タモキシフェン；タキソール；テニポシド；チオテパ；トポテカン；トレチノイン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；および、ビノレルビンからなる群から選ばれる、請求項３４記載の医薬組成物。
【請求項３６】
該化学療法剤はタキソールである、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
癌は固形腫瘍の形態である、請求項３３〜３６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
癌は癌腫である、請求項３３〜３７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３９】
癌腫は、悪性黒色腫、基底細胞腫、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部異形成、喉頭乳頭腫症、大腸癌、結腸大腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選ばれる、請求項３８記載の医薬組成物。
【請求項４０】
癌腫は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、および腎細胞癌からなる群から選ばれる、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４１】
悪性黒色腫は、表在拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性メラノーマ、メラニン欠乏性黒色腫、および線維形成性黒色腫からなる群から選ばれる、請求項４０記載の医薬組成物。
【請求項４２】
癌は肉腫である、請求項３３〜３７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４３】
肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選ばれる、請求項４２記載の医薬組成物。
【請求項４４】
癌は神経膠腫である、請求項３３〜３７のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４５】
医薬として使用するための、請求項１〜３０のいずれか１つの記載の化合物。
【請求項４６】
癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３０のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項４７】
癌は固形腫瘍の形態である、請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
癌は癌腫である、請求項４６または４７のいずれかに記載の使用。
【請求項４９】
癌腫は、悪性黒色腫、基底細胞腫、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部異形成、喉頭乳頭腫症、大腸癌、結腸大腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選ばれる、請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
癌腫は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、および腎細胞癌からなる群から選ばれる、請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
悪性黒色腫は、表在拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性メラノーマ、メラニン欠乏性黒色腫、および線維形成性黒色腫からなる群から選ばれる、請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
癌は肉腫である、請求項４６または４７のいずれかに記載の使用。
【請求項５３】
肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選ばれる、請求項５２記載の使用。
【請求項５４】
癌は神経膠腫である、請求項４６または４７のいずれか記載の使用。
【請求項５５】
癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３０のいずれか１つに記載の化合物の使用であって、該医薬は更に、副腎皮質ステロイド；アルトレタミン；アミフォスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンドロゲン；アスパラギナーゼ；バシラスカルメッテ−グリン；ビカルタミド；ブレオマイシン；ブスルファン；カルボプラチン；カルムスチン；クロラムブシル；クロロデオキシアデノシン；シスプラチン；シトシンアラビノシド；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドセタキセル；ドキソルビシン；エピルビシン；エストラムスチン；エストロゲン；エトポシド；フルダラビン；フルタミド；５−ＦＵＤＲ；５−フルオロウラシル；ゲムシタビン；ゴセレリン；ハーセプチン；ヒドロキシ尿素；イダルビシン；イホスファミド；ＩＬ−２；インターフェロンアルファ；イリノテカン；ロイプロリド；レバミソール；ロムスチン；メクロラタミン；メルファラン；メルカプトプリン；メトトレキセート；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン；オクトレオチド；ペントスタチン；プリカマイシン；プロロカルバジン；ストレプトゾシン；タモキシフェン；タキソール；テニポシド；チオテパ；トポテカン；トレチノイン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；および、ビノレルビンからなる群から選ばれる化学療法剤を含む、該使用。
【請求項５６】
該化学療法剤はタキソールである、請求項５５記載の使用。
【請求項５７】
癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３０のいずれか１つに記載の化合物の使用であって、該処置は更に、副腎皮質ステロイド；アルトレタミン；アミフォスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンドロゲン；アスパラギナーゼ；バシラスカルメッテ−グリン；ビカルタミド；ブレオマイシン；ブスルファン；カルボプラチン；カルムスチン；クロラムブシル；クロロデオキシアデノシン；シスプラチン；シトシンアラビノシド；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドセタキセル；ドキソルビシン；エピルビシン；エストラムスチン；エストロゲン；エトポシド；フルダラビン；フルタミド；５−ＦＵＤＲ；５−フルオロウラシル；ゲムシタビン；ゴセレリン；ハーセプチン；ヒドロキシ尿素；イダルビシン；イホスファミド；ＩＬ−２；インターフェロンアルファ；イリノテカン；ロイプロリド；レバミソール；ロムスチン；メクロラタミン；メルファラン；メルカプトプリン；メトトレキセート；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロン；オクトレオチド；ペントスタチン；プリカマイシン；プロロカルバジン；ストレプトゾシン；タモキシフェン；タキソール；テニポシド；チオテパ；トポテカン；トレチノイン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；および、ビノレルビンからなる群から選ばれる更なる化学療法剤を投与することを含む、該使用。
【請求項５８】
該化学療法剤はタキソールである、請求項５７記載の使用。
【請求項５９】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含有し、少なくとも１個のロックト核酸（ＬＮＡ）モノマーを含み、該各鎖は１２〜３５のヌクレオチドモノマーを含む請求項１記載の二重鎖化合物の製造方法であって、個々のモノマーを１Ｈ−テトラゾールまたは５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールを用いることによりカップリングすることを特徴とする、該製造方法。
【請求項６０】
２００〜１２００秒の範囲のカップリング時間を使用する、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
カップリング時間は４００〜１２００秒の範囲である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
カップリング時間は６００〜９００秒の範囲である、請求項６１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(技術分野)
本発明は、ロックト核酸（ＬＮＡ）モノマーを含有する新規な二重鎖短鎖干渉（short interfering)（ｓｉＲＮＡ）アナログに関する。該化合物は、ＲＮＡ干渉(interference)（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスによって、多数の生物中で配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘発する。本明細書中に開示する化合物は、非改変ｓｉＲＮＡと比較して改善された性質を有し、従って、例えば様々な癌形態の処置における治療薬として有用であることが分かった。
【０００２】
（背景技術）
線虫(C. Elegans)中でのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見は、Fireら（Nature, 1998, 391, 806-811）によってなされた。二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の長鎖ストレッチは、寄生虫における世代間で続き得る遺伝子発現において強力なノックダウン効果を有することが知られる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は直ぐに、線虫中での機能的なゲノムツールとなった（初期ＲＮＡ干渉は、Fire（TIG, 1999, 15, 358-363）、並びにBosherおよびLabouesse（Nature Cell Biology, 2000, 2, E31-E36）によって概説されている）。ＲＮＡ干渉が脊椎動物において作用することが実証された最初の研究は、ゼブラフィッシュ胎仔およびマウス卵母細胞中で行なわれた（Wargeliusらによる, Biochem. Biophys. Res. Com. 1999, 263, 156-161, WiannyおよびZernicka-Goetzによる, Nature Cell Biology, 2000, 2, 70-75）。ｄｓＲＮＡは哺乳動物細胞において非特異的な効果を誘発するので、これらの機序はマウス胎仔系において十分に発生しないと議論されてきた。（Alexopoulouらによる, Nature, 2001, 413, 732-738, Reviews：Starkらによる, Annu. Rev. Biochem., 1998, 67, 227-264；およびSamuel, Clin.による, Micro. Rev., 2001, 14, 778-809）。
【０００３】
線虫およびショウジョウバエに関する限り、長いＲＮＡｉ鎖が短い二本鎖（２１〜２３ヌクレオチド）に分解されて、そしてこれらの分解形態は該干渉を媒介する、ことが分かっている（Zamoreらによる, Cell, 2000, 101, 25-33；および、Elbashirらによる, Gen. Dev., 2001, 15, 188-200）。Elbashirら（Gen. Dev., 2001, 15, 188-200）は、センス標的またはアンチセンス標的が等しく切断され、そしてｓｉＲＮＡ中の両方の鎖がそれぞれ標的アンチセンスまたはセンスＲＮＡへの切断をガイドすることができることを示した。該ｓｉＲＮＡが様々な哺乳動物セルラインにおける強力なノックダウンを媒介し、そしておそらく哺乳動物細胞中での長鎖ｄｓＲＮＡの有害な非特異的な影響を回避することができるであろうことが、Elbashirら（Nature, 2001, 411, 494-498）によって明白に示されている。この発見は、最新生物学において折り紙つきであり、そしてｓｉＲＮＡの治療薬としての使用は直ぐに魅力的な研究分野となった（McManusおよびSharpによって総説, Nature Reviews Genetics, 2002, 3, 737-747；および、Thompson, DDT, 2002, 7, 912-917）。
【０００４】
ＤｓＲＮＡｓは、生物学的な媒質中でかなり安定である。しかしながら、該二重鎖のモーメントは個々の鎖に解離され、これらはＲＮＡによって直ぐに分解される。ｓｉＲＮＡに更なる安定性をもたらす１方法は、化学的に改変されたＲＮＡ残基を該ｓｉＲＮＡの個々の鎖中に導入することである。合成ＲＮＡアナログは生物学的な媒質中でずっとより安定であって、そして安定性の増大はまた近位の天然ＲＮＡ残基に誘発されることはよく知られている。安定性の増大は、主にヌクレアーゼ耐性の増大、および細胞取り込みがより良いことも、並びに組織分布が該改変によって与えられ得ること、を意味する。いくつかのｓｉＲＮＡアナログが記載されている。
【０００５】
プレ−ｓｉＲＮＡ（Parrishらによる, Mol. Cell, 2000, 6, 1077-1087）は、線虫中でのＲＮＡｉにとっての特定の骨格改変に対する耐性を示す。改変ヌクレオチドの存在下での２個の異なる鎖のインビトロ転写によって、ホスホロ−チオエートはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方において耐性であって、その結果ウラシルの代わりに２’−フルオロウラシルであることを示すのは不可能である。２’−アミノウラシルおよび２’−アミノシチジンは、センス鎖中に取り込まれるとＲＮＡｉ活性を低下し、そして該活性は、アンチセンス鎖中に取り込まれると完全に消滅する。センス鎖中でウラシルを２’−デオキシチミジンに交換する場合に、該効果はまた低下し、そして該交換がアンチセンス鎖中のものである場合にはより一層低下する。一方または両方の鎖がＤＮＡモノマーから完全に構成される場合には、該ＲＮＡｉ活性は消滅する。上記の研究において、塩基の改変もまた研究されている。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシルが両方の鎖中で許容されて、一方で５−ヨードウラシルおよび５−(３−アミノアリル)ウラシルが該センス鎖中での該効果を低下し、アンチセンス鎖中でより大きい、ことが分かった。グアノシンをイノシンで置き代えることにより、該活性を著しく低下し、このことは該改変がセンス鎖またはアンチセンス鎖中で行なわれるかどうかとは関係ない。
【０００６】
しかしながら、ＵＵ３’オーバーハングは、２’デオキシチミジンを３’オーバーハングで交換することができ、そしてこのものは十分に許容される（Elbashirらによる, Nature, 2001, 411, 494-498；およびBoutlaらによる, Curr. Biol., 2001, 11, 1776-1780）。
【０００７】
ＤＮＡモノマーは、活性を損なうことなく、センス鎖中に取り込むことができることもわかっている。
【０００８】
Elbashirら（EMBO, 2001, 20, 6877-6888）は、該ｓｉＲＮＡの各３’末端中に４個のデオキシヌクレオチドを含有する改変ｓｉＲＮＡが十分な活性を保つことを示した。その上、該ｓｉＲＮＡが該分子の「中間」に１個だけの塩基対ミスマッチを含む場合には、該活性は消滅することを示した。
【０００９】
しかしながら、１〜２個のミスマッチは、該ミスマッチがセンス鎖中に導入される限りには許容され得ることも報告されている（Holenらによる, NAR, 2002, 30, 1757-1766；Hohjohによる, FEBS Lett., 2002, 26179, 1-5；Hamadaらによる, アンチセンス and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309；および、Boutlaらによる, Curr. Biol., 2001, 11, 1776-1780)）。
【００１０】
Nykanenら（Cell, 2001, 107, 309-321）は、ｓｉＲＮＡをＲＮＡｉから製造する際にＡＴＰを必要とするが、このものはまたより遅い段階でｓｉＲＮＡ活性を発揮することを示した。ＡＴＰは、ＲＩＳＩ認識のために５’−ホスフェートをほどき(unwinding)そして保つのに必要である。該５’−ホスフェートは、ｓｉＲＮＡ活性に必要である。Martinezら（Cell, 2002, 110, 563-574）は、一本鎖がＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体を再構築することができ（RISC, Hammondらによる, Nature, 2000, 404, 293-296）、そして５’−リン酸化される場合に特に、１本のアンチセンス鎖が活性を有することを見出した。該センス鎖の３’末端および５’末端の両方を改変することができるが、５’−アンチセンス鎖の改変が活性を示す。
【００１１】
Amarzguiouiら（NAR, 2003, 31, 589-595）は、アンチセンス鎖の５’末端にあまり近位でない限りでは、ミスマッチが許容されると結論付けている。アンチセンス鎖の５’末端からの３〜５個のヌクレオシドのミスマッチは、該活性を著しく低下する。しかしながら、アンチセンス鎖の「中間」または３’末端方向に存在する場合には、２個のミスマッチは、活性がわずかに低下するが、許容されることが分かった。
【００１２】
改変（例えば、ホスホロチオエートおよび２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）は、ｓｉＲＮＡの末端において導入され（Amarzguiouiらによる, NAR, 2003, 31, 589-595）、そしてそれらは十分に許容される。アンチセンス鎖の５’末端に存在する場合には、２’−Ｏ−アリル化は該効果を低下する。
【００１３】
二環式ヌクレオシドアナログＥＮＡ（２’−Ｏ,４’−Ｃ−エチレンチミジン）（ＥＮＡチミジン、ｅＴ）もまた、ｓｉＲＮＡ中に取り込まれる（Hamadaらによる, Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309）。該センス鎖の５’末端中の２個のＥＮＡチミジンはその効果を低下させることが知られる。「２’−Ｏ,４’−Ｃ−エチレンチミジン（このものは、エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）の成分であり、ＲＮＡｉを完全に消滅する）の使用」は、Hamadaら（2002）によって結論付けられている。
【００１４】
より最近には、取り込まれたＬＮＡモノマーを含有する多数のｓｉＲＮＡが、Braaschら（Biochemistry 2003, 42, 7967-7975）によって記載されている。
【００１５】
結論として、アンチセンス鎖はセンス鎖よりも改変に対してより感受性であることが分かった。いずれの特定の理論に制限されるものでないが、この現象は少なくともいくらか、アンチセンス／標的二重鎖の構造が天然のＡ型ＲＮＡでなければいけないという事実に基づくと考えられる。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の標的への運搬にとってのビヒクルであるとみなすことができ、そしてセンス鎖はＲＮＡの酵素触媒分解には関与しない。従って、該アンチセンス鎖と対比して、例え該改変がｓｉＲＮＡのＡ−型構造への変化を誘発するとしても、センス鎖の改変はあるウィンドウ内では許容される。変化を該アンチセンス鎖中に導入する場合には、それらは天然ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の認識フレーム内で構造的に平衡でなければいけない。
【００１６】
現在入手可能なｓｉＲＮＡ化合物と比較した強力なインビボ性質、生物学的安定性の増大（Ｔｍの増大に相当する）、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞取り込みの改善、および／または組織分布の改善を有する新規で且つ改善されたｓｉＲＮＡアナログに対する要求が当該分野において存在することは明らかである。
【００１７】
従って、本発明の目的は、上記の改善された性質の１個以上を有する改善されたｓｉＲＮＡアナログを提供することである。従って、本発明は、改善されたｓｉＲＮＡアナログを提供し、このものはとりわけ、高い程度の生物学的安定性および／またはヌクレアーゼ安定性を示し、そしてＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくはプレ−ｍＲＮＡ、様々な構造的なＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、または調節ＲＮＡ（例えば、ミクロＲＮＡ）さえ）を有効に標的とする。
【００１８】
（発明の概要）
従って、第１の態様において、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含有する二重鎖化合物に関するものであって、ここで、各鎖は１２〜３５個のヌクレオチドを含み、該化合物は少なくとも１個のロックト核酸（ＬＮＡ）モノマーを含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明の化合物および医薬的に許容し得る希釈物、担体またはアジュバントを含有する医薬組成物に関する。
【００２０】
更なる態様において、本発明は、医薬としての使用のための本発明に記載の化合物に関する。
【００２１】
更に別の態様において、本発明は、癌または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の処置のための医薬の製造における、本発明の化合物の使用に関する。
【００２２】
更になお別の態様において、本発明は、癌または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の処置方法に関するものであって、該方法は、本発明の化合物または本発明の医薬組成物を処置が必要な患者に投与することを含む。
【００２３】
本発明の他の態様は、以下の記載および特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な記載）
（定義）
本明細書中の用語「ヌクレオチド」とは、窒素性塩基（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｕ）、またはウラシル（Ｕ））と１番の炭素原子を介して結合し、そしてヌクレオシド間の連結基（以下で定義する）または末端基（以下で定義する）と５番の炭素原子を介して結合する、２−デオキシリボース（ＤＮＡ）単位またはリボース（ＲＮＡ）単位を意味する。従って、本明細書中で使用する場合に用語「ヌクレオチド」とは、窒素性塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）と１番の炭素原子を介して結合し、およびホスフェート基または末端基と５番の炭素原子を介して結合する、リボース単位を含有するＲＮＡ単位（または、モノマー）を包含する。同様に、用語「ヌクレオチド」はまた、窒素性塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）と１番の炭素を介して結合し、そしてホスフェート基または末端基と５番の炭素を介して結合する、２−デオキシリボース単位を含有するＤＮＡ単位（または、モノマー）をも包含する。用語「ヌクレオチド」はまた、該ＲＮＡおよびＤＮＡモノマーの変異体またはアナログをも包含する。該ＲＮＡおよびＲＮＡモノマーの変異体またはアナログの詳細な開示を、以下に示す。
【００２５】
本明細書中の用語「ヌクレオシド」とは、窒素性塩基（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ））と１番の炭素を介して結合する、２−デオキシリボース（ＤＮＡ）単位またはリボース（ＲＮＡ）単位を意味する。従って、本明細書中の用語「ヌクレオシド」とは、窒素性塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）と１番の炭素を介して結合する、リボース単位を含有するＲＮＡ単位（または、モノマー）を包含する。同様に、用語「ヌクレオシド」はまた、窒素性塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）と１番の炭素を介して結合する、２−デオキシリボースを含有するＤＮＡ単位（または、モノマー）をも包含する。用語「ヌクレオシド」とはまた、該ＲＮＡおよびＤＮＡモノマーの変異体またはアナログをも包含する。個々のヌクレオシドは、ヌクレオシド間連結基によって一緒に結合すると理解される。
【００２６】
本明細書中で使用する用語「ロックト核酸モノマー」、「ロックト核酸残基」、「ＬＮＡモノマー」または「ＬＮＡ残基」とは、二環式のヌクレオチドアナログを意味する。ＬＮＡモノマーは、とりわけWO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、O 03/006475およびWO 03/095467中に記載されている。該ＬＮＡモノマーはまた、その化学式に関して定義することもできる。従って、本明細書中で使用する「ＬＮＡモノマー」は、以下の反応式２：
【化１】
0004755972.tif 000002
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲＨからなる群から選ばれ、ここで、ＲＨはＨまたはアルキル（例えば、Ｃ１〜４−アルキル）であり；
Ｙは、(−ＣＨ２)ｒ（式中、ｒは１〜４の整数であって、但し、Ｘ＝Ｏである場合にはｒは２でない）であり；
ＺおよびＺ＊は独立して存在しないか、またはヌクレオシド間連結基、末端基および保護基からなる群から選ばれ；
Ｂは、核酸塩基である］
中に示される化学構造を有する。好ましいＬＮＡモノマーの詳細な記載を、以下に示す。
【００２７】
用語「ヌクレオシド間の連結基」とは、２個のヌクレオシド、２個のＬＮＡモノマー、ヌクレオシドとＬＮＡモノマーなどが一緒に共有結合することができる基を意味すると意図する。具体的で且つ好ましい例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。
【００２８】
用語「核酸」とは、２個以上のヌクレオチドの共有結合によって生成する分子と定義する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で相互交換可能に使用する。本明細書中で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」は典型的に、３５個以上のヌクレオチドを含む。
【００２９】
本明細書中の用語「オリゴヌクレオチド」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＬＮＡモノマーのオリゴマー（このものは、オリゴとも呼ばれる）、並びにそれらの変異体およびアナログを意味する。本明細書中で使用する場合に、「オリゴヌクレオチド」は典型的に、２〜３５個のヌクレオチド（特に、１２〜３５個のヌクレオチド）を含む。
【００３０】
用語「改善された性質」とは、本発明のＳｉＬＮＡ化合物がその天然の対応物と比較してより良い全体の性能(overall performance)を示す１個以上の性質であると理解される。該パラメータとしては例えば、生産および生産コストの容易さ、より長い有効期間、標的に対するより高い結合アフィニティー（ｓｉＬＮＡまたはｍＲＮＡ標的における暫定補完(interim complement)）、細胞膜を透過するより高い能力、細胞外もしくは細胞内ヌクレアーゼに対するより良い耐性、医薬的に製剤化する容易さ、作用様式におけるより高い効力、より良い組織分布、より良い表現型の応答、およびより長い持続効果などを挙げられる。
【００３１】
用語「単位」または「残基」とは、モノマーであると理解される。
【００３２】
用語「少なくとも１個」とは、１以上の整数を包含し、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７などを挙げられる。
【００３３】
ヌクレオチド、ヌクレオシド、活性剤、ＬＮＡモノマーなどについて使用する用語「ａ」および「ａｎ」とは、１個以上を意味すると意図する。特に、「---からなる群から選ばれる（一）成分（例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシド、活性剤、ＬＮＡモノマーなど）」は、該引用成分の１個以上が選ばれ得ることを意味すると意図する。従って、表現「Ａ、ＢおよびＣからなる群から選ばれる（一）成分」とは、Ａ、ＢおよびＣの全ての組み合わせ（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃ）を含むと意図する。
【００３４】
用語「チオ−ＬＮＡ」とは、反応式２中のＸがＳであるロックトヌクレオチドを意味する。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ型およびアルファ−Ｌ型の両方であり得る。通常、チオ−ＬＮＡのベータ−Ｄ型が好ましい。チオ−ＬＮＡのベータ−Ｄ型を、化合物３Ｃとして反応式３中に示す。
【００３５】
用語「アミノ−ＬＮＡ」とは、反応式２中のＸがＮＨまたはＮＲＨ（ここで、ＲＨは水素またはＣ１〜４アルキルである）であるロックトヌクレオチドを意味する。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ型およびアルファ−Ｌ型の両方であり得る。通常、アミノ−ＬＮＡのベータ−Ｄ型が好ましい。アミノ−ＬＮＡのベータ−Ｄ型を、化合物３Ｄとして反応式３中に示す。
【００３６】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、反応式２中のＸがＯであるロックトヌクレオチドを意味する。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ型およびアルファ−Ｌ型の両方であり得る。オキシ−ＬＮＡのベータ−Ｄ型が好ましい。該ベータ−Ｄ型およびアルファ−Ｌ型を、それぞれ化合物３Ａおよび３Ｂとして反応式３中に示す。
【００３７】
用語「ｓｉＬＮＡ」とは、本発明の二重鎖化合物について広義に使用される。従って、本明細書中で使用する「ｓｉＬＮＡ」とは、常に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む。
【００３８】
本明細書中に使用する用語「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡモノマーの二重鎖ストレッチを意味する。典型的なｓｉＲＮＡ化合物の場合には、該２個の鎖は通常互いに相補的な１９個のヌクレオチドを有し、その結果、１９ヌクレオチド長である二重鎖を創製し、そして各鎖は２個のオーバーハングヌクレオチドの３’末端を有する。このことはｓｉＲＮＡの厳密な定義ではなく、このものは、わずかに長いかまたは短く、オーバーハングを有するかまたは有しないことがあり得る。ｓｉＲＮＡにおいて、１個の鎖はガイドされ(guiding)、そして標的ＲＮＡ（アンチセンス鎖）に対して相補的であり、そして他の鎖（センス鎖）は標的ＲＮＡと同じ配列を有し、従ってこのものはガイド／アンチセンス鎖に相補的である。ここで、調節ＲＮＡｓ（例えば、マイクロＲＮ（「ｍｉＲＮＡ」）および「短ＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」））、および様々な構造的なＲＮＡｓ（例えば、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ））は、用語「ｓｉＲＮ」と相互交換可能に使用する。
【００３９】
本明細書中で使用する用語「ｍＲＮＡ」とは、標的遺伝子の現在知られるｍＲＮＡ転写物、およびいずれかの更なる転写物（このものは、解明され得る）を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「標的核酸」とは、アンチセンス鎖によってガイドされる、調整、ターゲット切断、立体的な遮断（標的ＲＮＡの存在量を減少しおよび／または翻訳を阻害する）を受けるであろういずれかのＲＮＡを包含する。該標的ＲＮＡは例えば、ゲノムＲＮＡ、ゲノムウイルスＲＮＡまたはプレ−ＲＮＡであり得る。
【００４１】
本明細書中で使用する用語「標的特異的な核酸の改変」とは、標的核酸に対するいずれかの改変を意味する。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「遺伝子」とは、エキソン、イントロン、非コード５’および３’領域、調節要素、並びに全ての現在知られるその変異体およびいずれかの更なる変異体（このものは、解明され得る）を含む遺伝子を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「調整(modulation)」とは、遺伝子の発現の増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明において、阻害は遺伝子発現の調整の好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡは好ましい標的である。
【００４４】
本明細書中で使用する用語、ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡ化合物をある標的核酸に「標的（指向化）する」とは、該ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、該ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡ化合物が標的と結合しそして該標的の機能を調整するような様式で、細胞、動物またはヒトに供することを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間の水素結合を意味し、ワトソン−クリック，フーグステン(Hoogsteen)型水素結合、逆フーグステン水素結合などであり得る。ＤＮＡ中に通常見られる４個の核酸塩基は、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣであり、その内、ＧはＣと対形成し、そしてＡはＴと対形成する。ＲＮＡの場合は、Ｔは、ウラシル（Ｕ）によって置き代えられ、このものはＡと対形成する。標準的な二重鎖形成に関与する核酸塩基中の化学基は、ワトソン−クリック面(face)を構成する。フーグステンは数年後に、ワトソン−クリック面に加えて、プリン核酸塩基（ＧおよびＡ）が二重鎖の外側から認識することができるフーグステン面を有し、それを使ってピリミジンオリゴヌクレオチドと水素結合で結合することにより、三重らせん構造を形成することができることを示した。
【００４６】
本明細書中の「相補的」とは、２個のヌクレオチド配列間で相互に正確な対形成をする能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置でのヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の対応する位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合には、該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡまたはＲＮＡは、該位置で互いに相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の対応するヌクレオチドと水素結合を形成することができて、安定な複合体を形成することができる場合には、該ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖は互いに相補的であると考えられる。インビトロまたはインビボで安定であるためには、ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡ化合物の配列はその標的核酸分子に対して１００％相補的である必要はない。従って、用語「相補的」および「特異的にハイブリダイズ可能」とは、ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡ化合物が該標的分子と十分に強く且つ特異的に結合して、該標的の正常な機能を望ましく干渉し、一方で、非標的ｍＲＮＡの機能に影響を及ぼさないことを意味する。
【００４７】
本明細書中の用語「接合体」とは、本明細書中に記載する化合物と１個以上の非ヌクレオチド分子または非ポリヌクレオチド分子との共有結合によって生成する外来分子を意味すると意図する。非ヌクレオチド分子または非ポリヌクレオチド分子としては例えば、高分子(macromolecular)物質（例えば、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの組み合わせ）を含む。典型的なタンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的なポリマーは、ポリエチレン(polyethelene)グリコールであり得る。
【００４８】
本明細書中、用語「Ｃ１〜６−アルキル」とは、最長鎖が１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝の飽和炭化水素鎖を意味すると意図し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、およびヘキシルを挙げられる。分枝炭化水素鎖は、いずれかの炭素において炭化水素鎖で置換されたＣ１〜６−アルキルを意味することを意図する。
【００４９】
本明細書中の用語「Ｃ１〜４−アルキル」とは、最長鎖が１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝の飽和炭化水素鎖を意味すると意図し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを挙げられる。分枝炭化水素鎖は、いずれかの炭素において炭化水素鎖で置換されたＣ１〜４−アルキルを意味することを意図する。
【００５０】
本明細書中の用語「Ｃ１〜６−アルコキシ」とは、Ｃ１〜６−アルキル−オキシを意味すると意図し、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロピキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシおよびヘキシルオキシ(hexoxy)を挙げられる。
【００５１】
本明細書中の用語「Ｃ２〜６−アルケニル」とは、炭素数２〜６個を有し且つ１個以上の二重結合を含有する直鎖または分枝の炭化水素基を意味すると意図する。Ｃ２〜６−アルケニル基の例示としては例えば、アリル、ホモ−アリル、ビニル、クロチル(crotyl)、ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニルおよびヘキサジエニルを含む。不飽和（二重結合）の位置は、炭素鎖に沿ったいずれかの位置であり得る。
【００５２】
本明細書中、用語「Ｃ２〜６−アルキニル」とは、炭素数２〜６個を有し且つ１個以上の三重結合を含有する直鎖または分枝の炭化水素基を意味すると意図する。Ｃ２〜６−アルキニル基の例示としては例えば、アセチレン、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルを含む。不飽和（三重結合）の位置は、炭素鎖に沿ったいずれかの位置であり得る。１個以上の結合は不飽和であり得て、その結果、「Ｃ２〜６−アルキニル」は当該分野の当業者にとって知られるジインまたはエンジインである。
【００５３】
用語「癌腫」とは、上皮起源の悪性腫瘍を示すと意図する。上皮組織は、身体の内側および外側の体表の身体表面を覆うかまたは沿う(line)。上皮組織は例えば、皮膚、並びに腸菅、膀胱、子宮などの体腔および内臓に沿う粘膜および漿膜である。上皮組織はまた、腺（例えば、粘液分泌の腺）からより深い組織層にまでも拡張し得る。
【００５４】
用語「肉腫」とは、結合組織（例えば、軟骨、脂肪、筋肉、腱および骨）から増殖する悪性腫瘍を意味すると意図する。
【００５５】
本明細書中で使用する用語「神経膠腫」とは、膠細胞起源の悪性腫瘍を包含することを意図する。
【００５６】
（本発明の化合物）
本発明は、いくらか、ＬＮＡモノマーを二重鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖中に取り込むことによって、ＬＮＡを用いてＲＮＡ干渉を改善することができるという驚くべき発見に基づく。このことは、最小に改変したｓｉＲＮＡの場合でさえも、構造的に密接に関連するＥＮＡモノマーがＲＮＡ干渉を強く低下させるので、特に驚くべきことである（Hamadaらによる, Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309）。
【００５７】
ＬＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列に対する予期しない結合性質を示す。これらの著しいハイブリダイズ性質に加えて、ＬＮＡモノマーは混合され、そしてＤＮＡおよびＲＮＡモノマー、並びにヌクレオチドアナログ（例えば、２’−Ｏ−アルキル−改変ＲＮＡモノマー）と協同的に作用することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列に対するＬＮＡの予期しない結合アフィニティー、およびＬＮＡモノマーをＤＮＡおよびＲＮＡモノマー並びにある範囲のヌクレオチドアナログと自由に混合する能力は、有効で且つ安全なｓｉＲＮＡ似化合物の開発にとって重要な結果を有する。
【００５８】
天然のｄｓＤＮＡは、生理学的なｐＨでＢ型らせんとして存在し、一方でｄｓＲＮＡはＡ型らせんとして存在する。この形態学上の相違は、デオキシリボースおよびリボースの好ましい糖コンホメーションの差違に起因する。室温でデオキシリボースのフラノース環は、Ｃ’−エンド（Ｓ−タイプ）およびＣ３’−エンド（Ｎ−タイプ）コンホメーションの間での平衡で存在し、エネルギー障壁は〜２ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する（図１を参照）。該Ｃ２’−エンド（Ｓ−タイプ）コンホメーションはＢ型らせんを生じ、一方で該Ｃ３’−エンド（Ｎ−タイプ）コンホメーションはＡ型らせんを生じる。デオキシリボースの場合には、Ｓ−タイプのコンホメーションは、Ｎ−タイプと比較してエネルギーがわずかに低く、このことは、なぜＤＮＡがＳ−タイプのコンホメーションで存在するかを説明する。リボースの場合には、Ｎ−タイプのコンホメーションが好ましく、従って、ＲＮＡはＡ型らせんをとる。Ａ型らせんは、より高いハイブリダイゼーションの安定性と関係することが知られる。
【００５９】
ＬＮＡモノマーは、極端なＣ３’−エンドコンホメーションに対応するコンホメーションでのフラノース環のコンホメーションをロック(locking)する。従って、これらのモノマーはＲＮＡコンホメーションを模倣し、そしてオリゴヌクレオチドおよび該モノマーの二重鎖の構造はＲＮＡ−似であることが分かっている（Petersenらによる, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5974-82）。このことは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖（この中に、ＬＮＡモノマーが取り込まれる）の構造が、天然のＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖と比較して有意に変わらないことを意味する。その上、ＬＮＡモノマーはＤＮＡ中に導入されると、ＲＮＡ似のコンホメーションを誘発することが分かった。従って、該ＬＮＡモノマーは、特に３’末端において、強い大きさのＣ３’−エンドコンホメーション（ＲＮＡ似）を課される。例えば、ＤＮＡオリゴマー中のあらゆる第２番目および第３番目の残基をＬＮＡモノマーで置き代える場合には、該オリゴヌクレオチドの全体の構造はＲＮＡにずっと似るであろう。従って、該オリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖は、天然のＡ型二重鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡ）に似ている構造を達成するであろう。ＤＮＡのコンホメーションをＲＮＡ構造の方向に向けるために、ＬＮＡモノマーのこの性質を使用することは、本発明の一部分である。
【００６０】
ＬＮＡの予期しないアフィニティーを用いて、薬理学的な活性に必要なアフィニティーを損なうことなく、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの通常の長さを短く（２１〜３５マー(mer)から、例えば１２〜２０マーに）できることは認められるであろう。オリゴヌクレオチドの固有の特異性はその長さに逆相関するので、該短縮はＲＮＡ標的に対するｓｉＬＮＡ化合物の特異性を有意に増大する。従って、本発明の１目的は、ヒトゲノムの配列が入手可能であり、そしてその遺伝子のアノテーションが速く進歩しているという事実のため、標的ｍＲＮＡ中の最も短くあり得る特異な配列を同定することである。その上、オリゴヌクレオチドのサイズを低下し、その結果製造プロセスが容易となりそして該製造コストを下げることによって、ｓｉＬＮＡ化合物（例えば、本明細書中に開示するもの）は、ＲＮＡｉ療法にとっての基礎となり、そして様々な疾患に対して提供することができる商業的な競合処置となる可能性を有すると考えられる。
【００６１】
従って、最も広い態様において、本発明はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有する二重鎖化合物に関し、ここで、各鎖は１２〜３５個のヌクレオチドを含み、そして該化合物は少なくとも１個のロックト核酸（ＬＮＡ）モノマーを含む。本発明の二重鎖化合物は、ＬＮＡモノマーで完全に構成され得たり、あるいはＬＮＡモノマーをＤＮＡモノマー、ＲＮＡモノマーまたはヌクレオチドアナログとのいずれかの組み合わせで構成され得る。
【００６２】
上記の通り、用語「ヌクレオチド」とは、窒素性塩基（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ））と１番の炭素を介して結合し、そしてヌクレオシド連結基（上記で定義）または末端基（以下に記載）と５番の炭素を介して結合する、２−デオキシリボース（ＤＮＡ）単位またはリボース（ＲＮＡ）単位を意味する。従って、用語「ヌクレオチド」とは、窒素性塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）と１番の炭素を介して結合し、そしてホスフェート基または末端基と５番の炭素を介して結合するリボース単位を含有するＲＮＡ単位（またはモノマー）を包含する。上で説明する通り、用語「ヌクレオチド」とはまた、窒素性塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、またはＵ）と１番の炭素を介して結合し、そしてホスフェート基または末端基と５番の炭素を介して結合する２−デオキシリボース単位を含有するＤＮＡ単位（または、モノマー）を包含する。用語「ヌクレオチド」はまた、該ＲＮＡおよびＤＮＡモノマーの変異体またはアナログをも包含する。例えば、２’−ＯＨ（ＲＮＡ）または２’−Ｈ（ＤＮＡ）基は、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨまたはＦで置換され得る。ヌクレオチドアナログの他の例は、ＬＮＡモノマーである。また、該ヌクレオシド間連結基は、ホスフェート（−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−）に限定されるわけではなく、例えば−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｓ)２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ(ＲＨ)−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ３)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＲＨ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＢＨ３)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＨＲＨ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−（ここで、ＲＨは水素またはＣ１〜４−アルキルである）を含み得る。その上、該窒素性塩基はＡ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵに限定されず、他のプリンおよびピリミジン（例えば、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６−フルオロウラシル、５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、２,６−ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デアザグアニン、および２−クロロ−６−アミノプリン）を含み得る。ヌクレオチド変異体およびアナログの他の例（これは、「ヌクレオチド」の本明細書の定義の範囲内にある）は、FreierおよびAltmann（Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443）並びにUhlmann（Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3(2): 293-213）中に記載されている。以下の反応式１は、該ヌクレオチド変異体およびアナログの選択した例を例示する。結論として、本発明の化合物は、該化合物が少なくとも１個の該鎖中に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む限りは、上記のヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【化２】
0004755972.tif 000003
【００６３】
上記の通り、用語「ロックト核酸モノマー」または「ＬＮＡモノマー」とは、二環式ヌクレオチドアナログを意味し、このものは以下の反応式２：
【化３】
0004755972.tif 000004
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、およびＮＲＨからなる群から選ばれ、ここで、ＲＨはＨまたはアルキル（例えば、Ｃ１〜４アルキル）であり；
Ｙは、(−ＣＨ２)ｒ（ここで、Ｘ＝Ｏである場合にはｒは２でないという条件で、ｒは１〜４の整数である）であり；
ＺおよびＺ＊は独立して存在しないか、またはヌクレオチド連結基、末端基および保護基からなる群から選ばれ；そして、
Ｂは、核酸塩基である］
に示す化学構造を有する。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様はｒが１であり、すなわち、好ましいＬＮＡモノマーは以下の反応式３：
【化４】
0004755972.tif 000005
［式中、
Ｚ、Ｚ＊、ＲＨおよびＨは上で定義する通りである］
に示す化学構造を有する。
【００６５】
本発明のより好ましい実施態様において、ＸはＯでありそしてｒは１であり、すなわち、より好ましいＬＮＡモノマーは以下の反応式４：
【化５】
0004755972.tif 000006
［式中、
Ｚ、Ｚ＊およびＢは上で定義する通りである］
に示す化学構造を有する。
【００６６】
上記の３Ａおよび３Ｂ中に示す構造はまた、それぞれ「ベータ−Ｄ型」および「アルファ−Ｌ型」と呼ばれ得る。本発明の非常に好ましい実施態様において、該ＬＮＡモノマーはベータ−Ｄ型であり、すなわち、該ＬＮＡモノマーは上記３Ａに示す化学構造を有する。
【００６７】
上で示す通り、ＺおよびＺ＊（このものは、ヌクレオシド間連結として機能する）は独立して存在しないか、あるいは該化合物内のＬＮＡモノマーの実際の位置に応じてヌクレオシド間連結基、末端基および保護基からなる群から選ばれる。ＬＮＡモノマーが３’末端に位置する実施態様において、Ｚが末端基であり、そしてＺ＊がヌクレオシド間連結基であることは理解されるであろう。ＬＮＡモノマーが５’末端に位置する実施態様において、Ｚは存在せず、そしてＺ＊は末端基である。ＬＮＡモノマーがヌクレオチド配列内に位置する実施態様において、Ｚは存在せず、そしてＺ＊はヌクレオシド間連結基である。
【００６８】
ヌクレオシド間連結基の具体例は、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ-、−Ｓ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｓ)２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ(ＲＨ)−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ３)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＲＨ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＢＨ３)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＨＲＨ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−（ここで、ＲＨは水素またはＣ１〜４−アルキルである）を含む。
【００６９】
本発明の好ましい実施態様において、ヌクレオシド間連結基はホスフェート基（−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−Ｏ−）、ホスホロチオエート基（−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−）であるか、または該化合物はホスフェート基およびホスホロチオエート基の両方を含み得る。
【００７０】
末端基の具体例は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ａｃｔ−Ｓ−、Ｃ１〜６−アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲＨ)−、Ａｃｔ−Ｎ(ＲＨ)−、モノ−もしくはジ−(Ｃ１〜６−アルキル)アミノ、場合により置換されたＣ１〜６アルコキシ、場合により置換されたＣ１〜６アルキル、場合により置換されたＣ２〜６アルケニル、場合により置換されたＣ２〜６アルケニルオキシ、場合により置換されたＣ２〜６アルキニル、場合により置換されたＣ２〜６アルキニルオキシ、モノホスフェート（例えば、保護されたモノホスフェートを含む）、モノチオホスフェート（例えば、保護されたモノチオホスフェートを含む）、ジホスフェート（例えば、保護されたジホスフェートを含む）、ジチオホスフェート（例えば、保護されたジチオホスフェートを含む）、トリホスフェート（例えば、保護されたトリホスフェートを含む）、トリチオホスフェート（例えば、保護されたトリチオホスフェートを含む）（ここで、Ｐｒｏｔは−ＯＨ、ＳＨ、および−ＮＨ(ＲＨ)についての保護基であり、Ａｃｔは−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ(ＲＨ)についての活性化基であり、そしてＲＨは水素またはＣ１〜６アルキルである）からなる群から選ばれる末端基を含む。
【００７１】
ホスフェートの保護基としては例えば、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）およびＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）を含む。
【００７２】
末端基の更なる別の例は、ＤＮＡ挿入基(intercalators)、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、受容体基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ２−、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ２−、アミノメチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲＨ)−ＣＨ２−、Ａｃｔ−Ｎ(ＲＨ)−ＣＨ２−、カルボキシメチル、スルホノメチル（ここで、Ｐｒｏｔは−ＯＨ、ＳＨ、および−ＮＨ(ＲＨ)についての保護基であり、Ａｃｔは−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ(ＲＨ)についての活性化基であり、そしてＲＨは水素またはＣ１〜６アルキルである）を含む。
【００７３】
−ＯＨおよび−ＳＨ基の保護基の例としては、置換トリチル（例えば、４,４'−ジメトキシトリチルオキシ（ＤＭＴ）、４−モノメトキシトリチルオキシ（ＭＭＴ））；トリチルオキシ、場合により置換された９−(９−フェニル)キサンテニルオキシ（ピクシル(pixyl)）、場合により置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ（ｍｔｈｐ）；シリルオキシ（例えば、トリメチルシリルオキシ（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシ（ＴＩＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルシリルオキシ、フェニルジメチルシリルオキシ；ｔｅｒｔ−ブチルエーテル；アセタール（２個のヒドロキシ基を含む）；アシルオキシ（例えば、アセチル）またはハロゲン置換のアセチル（例えば、クロロアセチルオキシ、またはフルオロアセチルオキシ）、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、および置換ベンゾイル、メトキシメチルオキシ（ＭＯＭ）、ベンジルエーテルまたは置換ベンジルエーテル（例えば、２,６−ジクロロベンジルオキシ（２,６−Ｃｌ２Ｂｚｌ）を含む。その上、ＺまたはＺ＊がヒドロキシルである場合には、それらは場合により連結基によって固体支持体と結合することによって保護し得る。
【００７４】
アミン保護基の例としては、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ（ＢＯＣ）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（ａｌｌｏｃ、ＡＯＣ）、Ｚ−ベンジルオキシカルボニルアミノ（Ｃｂｚ）、置換ベンジルオキシカルボニルアミノ（例えば、２−クロロベンジルオキシカルボニルアミノ（２−ＣｌＺ））、モノメトキシトリチルアミノ（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチルアミノ（ＤＭＴ）、フタロイルアミノ、および９−(９−フェニル)キサンテニルアミノ（ピクシル）を含む。
【００７５】
該活性基は、他の残基および／またはヌクレオチドモノマーとのカップリングを媒介することが好ましく、そして該カップリングが完結した後には、該活性基は典型的にヌクレオシド間連結に変換される。該活性基としては例えば、場合により置換されたＯ−ホスホロアミダイト、場合により置換されたＯ−ホスホトリエステル、場合により置換されたＯ−ホスホジエステル、場合により置換されたＨ−ホスホネート、および場合により置換されたＯ−ホスホネートを含む。本明細書中の用語「ホスホロアミダイト」とは、式−Ｐ(ＯＲｘ)−Ｎ(Ｒｙ)２（式中、Ｒｘは、場合により置換されたアルキル基（例えば、メチル、２−シアノエチル、またはベンジル）であり、そして各Ｒｙは場合により置換されたアルキル基（例えば、エチルまたはイソプロピル）であるか、または基−Ｎ(Ｒｙ)２はモルホリノ基（−Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２)２Ｏを形成する、ことを意味する。Ｒｘは、２−シアノエチルであることが好ましく、そして該２個のＲｙは同じであって、イソプロピルであることが好ましい。従って、特に好ましいホスホロアミダイトは、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−(２−シアノエチル)ホスホロアミダイトである。
【００７６】
上記の通り、Ｂは天然または非天然の起源であり得る核酸塩基である。核酸塩基の具体例としては例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（ＭｅＣ）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６−フルオロウラシル、５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、２,６−ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デアザグアニン、および２−クロロ−６−アミノプリンを含む。好ましい核酸塩基は、Ａ、Ｃ、ＭｅＣ、Ｇ、ＴおよびＵ（特に、Ａ、Ｃ、ＭｅＣ、ＧおよびＵ）を含む。
【００７７】
本発明の１実施態様において、センス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマー、例えば１〜１０個のＬＮＡモノマー（例えば、１〜５個のＬＮＡモノマー）を含む。本発明の別の実施態様においては、アンチセンス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマー、例えば１〜１０個のＬＮＡモノマー（例えば、１〜５個のＬＮＡモノマー）を含む。本発明の更なる実施態様において、センス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む。例えば、センス鎖は典型的に１〜１０個のＬＮＡモノマー（例えば、１〜５個のＬＮＡモノマー）を含み、そしてアンチセンス鎖は典型的に１〜１０個のＬＮＡモノマー（例えば、１〜５個のＬＮＡモノマー）を含む。
【００７８】
本発明の化合物についての１つの利点は、生物学的な液体（例えば、血清）中での改善された安定性である。従って、本発明の１実施態様は、ＬＮＡモノマーの標準的なＤＮＡまたはＬＮＡオリゴヌクレオチド中への導入を含む。これにより、例えばヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）に対する耐性の増大によって、生物学的な液体中での生成ｓｉＬＮＡ化合物の安定性が増大する。従って、本発明の化合物は、ＬＮＡモノマーの導入により、融解温度の上昇および／またはヌクレアーゼ耐性の増大の結果として循環性半減期(circulation half-life)の増大を示す。安定性の大きさは、使用するＬＮＡモノマーの数、オリゴヌクレオチド中でのそれらの位置、および使用するＬＮＡモノマーのタイプに依存する。ＤＮＡおよひホスホロチオエートと比較して、ヌクレオチド分解(nucleolytic)に対してオリゴヌクレオチドを安定化する能力の以下の順序を確立することができる：ＤＮＡ＜＜ホスホロチオエート、ＬＮＡホスホロジエステル＜ＬＮＡ−ホスホロチオエート。
【００７９】
従って、特に好ましい本発明の化合物は、血清（例えば、ヒト、ウシまたはマウスの血清）（例えば、生理学的な塩溶液中での１０％胎仔ウシ血清）中、３７℃で５時間インキュベートする場合に、対応するｄｓＲＮＡ化合物よりも低い程度で分解される化合物である。本発明の化合物の最初の量の２５％以下が５時間後に分解されることが好ましく、本発明の化合物の最初の量の５０％以下が５時間後に分解されることがより好ましく、本発明の化合物の最初の量の７５％以下が５時間後に分解されることがより一層好ましい。別の実施態様において、本発明の化合物の最初の量の２５％以下が１０時間後に分解されることが好ましく、本発明の化合物の最初の量の５０％以下が１０時間後に分解されることがより好ましい。
【００８０】
ＬＮＡ合成が標準的なＲＮＡ／ＤＮＡ合成と適合し且つ該ＬＮＡモノマーが多数の現行核酸アナログと自由に混合するという事実からして、ｓｉＲＮＡ化合物のヌクレアーゼ耐性は、本発明に従って、増大したヌクレアーゼ安定性を示す他のアナログを取り込むかまたはヌクレアーゼ−耐性ヌクレオシド間連結（例えば、ホスホロモノチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、およびメチルホスホネート連結など）を利用するかのいずれかによって、更に増大することができる。
【００８１】
ＬＮＡモノマーは、センス鎖の３’オーバーハングおよび５’末端の両方でのｓｉＲＮＡの設計において自由に使用することができ、ｓｉＬＮＡ効果の十分な活性化およびタンパク質産生の下方調節（＞９０％低下）を有する。ＬＮＡモノマーは、高い下方調節性の能力（８０％低下）を保ちながら、ｓｉＬＮＡ中のセンス鎖よりも全く自由に分配することができる。ｓｉＲＮＡにおけるアンチセンス鎖の５’末端はまたＬＮＡモノマーによって改変し得て、その結果、５０〜７０％までの下方調節能力を生じ得る。組み合わせの特定のデザインがＲＮＡｉ効果を発揮することができることをあり得ないとすることはできないが、高度にＬＮＡモノマーで置換されたアンチセンス鎖を用いて、下方調節効果を与えるとは考えられない。ｓｉＬＮＡのセンス鎖の５’末端に加えて３’オーバーハングのＬＮＡモノマー置換は、タンパク質レベルの最大の低下を示す。該アンチセンス鎖の５’末端はＬＮＡモノマーの改変に対して最も感受性であって、一方で多数の改変の他の部位はより許容される。
【００８２】
１実施態様においては、ＬＮＡモノマーがｓｉＬＮＡ化合物中に、それらがセンス鎖の５’末端における二重鎖での塩基対を強化するような様式で取り込まれるように、ｓｉＬＮＡ化合物を設計する。該ヘリカーゼは、他の５’末端（アンチセンス鎖の５’末端）から巻き戻すように(unwinde)方向付けることができる。この方法において、アンチセンス／ガイド鎖のＲＩＳＣへの取り込みは、コントロールすることができる。該ヘリカーゼは、最も弱い結合末端でｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻しを開始する。おそらく、放出された３’末端は分解のために標的化され、一方で残りの鎖はＲＩＳＣ中に取り込まれる。有効なｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖／ガイド鎖の蓄積、および該アンチセンス／ガイド鎖の５’末端における弱い塩基対形成を示す。望まない副作用は、正しい鎖のみ（アンチセンス／ガイド鎖）（望まないセンス鎖（所望する標的ＲＮＡに対して相補的でない）ではない）をＲＩＳＣ中に有することによって避けることができるであろう。
【００８３】
アンチセンス鎖の５’末端にＬＮＡモノマーを取り込む効果は、図１１から知ることができる。５’−末端におけるＬＮＡ残基のＲＮＡｉ妨害効果は、逆(opposite)ミスマッチを取り込むことによっていくらか改善することができる。図１１に、このことはウミシイタケおよびホタルの両方の標的について示す。
【００８４】
アンチセンス鎖の５’末端において取り込まれたＬＮＡモノマーのＲＮＡｉ妨害効果は、ＬＮＡモノマーを３’末端方向に１塩基位置を動かすことによってほとんど排除することができる（図１２）。ＬＮＡモノマーをアンチセンス鎖の３’末端方向に更に動かすことは遺伝子発現に影響を及ぼさないが、しかし、ＬＮＡモノマーが１０または１２位にある場合には、ＲＮＡｉ効果の有意な低下が観察される。該ＲＩＳＣ複合体は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１０および１１の間の位置の反対側の位置でｍＲＮＡを切断し、そして外見上は、該位置に合成ＬＮＡモノマーを取り込むことにより、ＲＩＳＣ複合体による切断を妨害する。ＬＮＡモノマーを更にアンチセンス鎖の方向に動かす場合には、この妨害影響は低下する。
【００８５】
上記の通り、該ヘリカーゼはストランドバイアス(strand bias)を示し、そしてｓｉＲＮＡの最も弱い結合末端からｓｉＲＮＡを取り込むことが好ましい。従って、実際には、ｓｉＲＮＡ二重鎖における両方の鎖を取り込むことができる。ＲＩＳＣ＋ｓｉＲＮＡシステムの他の性質におけるこのものは、オフ−標的(target)効果を生じる。このものを低下させる１様式は、高アフィニティＬＮＡモノマーを取り込むことである。Ｒｅｎ１部位の場合には、アンチセンス鎖における５’−核酸塩基は、Ｕ（このものは、「低」結合残基を構築する）である。従って、該ＲＩＳＣ複合体はこの側から読み取られ、そしてこのものはアンチセンス鎖（正しい鎖）を取り込む。Ｒｅｎ２およびＲｅｎ３部位の場合には、５’−核酸塩基はＣ（このものは、「高い」結合部位を構築する）である。これらの部位の場合には、センス鎖の５’末端は、ＡおよびＵ核酸塩基（共に、「低い」結合部位のを構築する）によって位置づけられる。従って、ＲＩＳＣはこの場合にストランドバイアスを示し得て、そしてセンス鎖（間違った(wrong)鎖）から部分的に読みとることができる。５’−アデノシンおよびウリジン残基を対応するＡ−およびＵ−ＬＮＡ残基で置き代えることによって、該ストランドバイアスは除かれ、そしてアンチセンス鎖はＲＩＳＣ複合体中に取り込まれる（図１３）。従って、ＬＮＡ残基はストランドバイアスを低下し、そして二重鎖の効力を増大することができる。本発明のｓｉＲＮＡはアンチセンス配列を有し、このものは標的分子と少なくとも７０％（９０〜１００％の配列一致度がより好ましい）を有することが好ましい。
【００８６】
上記の通り、いくつかのある設計は天然ｓｉＲＮＡの全効力適用性を増強する：
（ａ）ＬＮＡを用いるｓｉＲＮＡの「エンドキャッピング(end capping)」は、ヌクレアーゼ安定性を改善し（図２および１５）；
（ｂ）センス鎖の５’末端の方向にＬＮＡモノマーを置くことは、天然ｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡの効力を改善する（「ロックする」）。このことは、中程度に有効な標的にとっての効力の増大によって例示される（図１３および１５）。
（ｃ）「ＬＮＡウォーク(walk)」（図１２）の場合には、ＲＩＳＣ複合体の切断部位上（例えば、アンチセンス鎖における５’末端から数えて１０位）にＬＮＡモノマーを置くことは、ｓｉＲＮＡの活性を低下する（「ブロック」）。
【００８７】
これらの基本的な観察は、ｓｉＲＮＡの全効力を改善するのに重要である。最適化された設計において、３’末端はＬＮＡモノマーで「キャップ」されるべきであり、その結果、ヌクレアーゼ耐性を確実とする（図１２および１５）。センス鎖の５’末端はまた、アンチセンス鎖との結合を増大させ、その結果、ヘリカーゼを該二重鎖の「正しい側」から取り込まれるよう方向付けるように改変したＬＮＡであるべきである。該二重鎖のセンス５’末端センス／アンチセンス３’側の該「ロック（する）」は、該二重鎖のいずれかの側に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを取り込むことによって行なわれ得る。該改変された二重鎖はまた、ＬＮＡ−ＬＮＡ水素結合塩基を含み得る。ＬＮＡがアンチセンス鎖の１０または１２位に取り込まれる場合に、遺伝子のサイレンシングは低下するという観察により、逆のシナリオで使用することができる。ＲＩＳＣ複合体がセンス鎖の部に取り込まれ、その結果、望まないオフ−標的効果を生じる場合には、該望まない取り込みの効力は、ＬＮＡをセンス鎖の１０および１２位に取り込むことによって低下する（「ブロックする」）ことができる（図１２に示す通り）。
【００８８】
従って、本発明の関心ある実施態様において、該センス鎖は５’末端から数えて９〜１３の位置の少なくとも１個（例えば、１個）に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む。該センス鎖は、５’末端から数えて１０〜１２の位置の少なくとも１個（例えば、１個）に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含むことが好ましい。本発明の特に関心ある実施態様において、センス鎖は、５’末端から数えて１０位、１２位または１０および１２の両方の位置にＬＮＡモノマーを含む。その上、１０位に取り込まれた場合には、ＬＮＡモノマーが窒素性塩基（これは、天然に存在するＲＮＡ塩基と異なる（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵとは異なる））を含むことが特に好ましい。特に好ましい実施態様において、１０位（５’末端から数えて）に存在するＬＮＡモノマーは窒素性塩基Ｔを含む。
【００８９】
オリゴ中に取り込まれたＬＮＡモノマーがオリゴおよびハイブリッド（形成し得る）のＲＮＡ似構造を誘発することは知られる。ＬＮＡ残基がＤＮＡ残基の構造を改変し、特にＬＮＡ残基が３’末端の近位に取り込まれる場合には、ＤＮＡ残基の構造を改変することも分かった。５’末端方向でのＬＮＡモノマーの取り込みは、より小さな影響を有するように考えられる。このことは、ＤＮＡモノマーを含むＲＮＡ鎖を改変することができ、そして１個以上のＬＮＡ残基がＤＮＡモノマーをフランクする場合には、それらもまたＲＮＡ似構造を達成するであろうことを意味する。従って、ＤＮＡおよびＬＮＡモノマーはＲＮＡモノマーに置き代えることができ、そして更に該オリゴは全ＲＮＡ似構造を達成するであろう。ＤＮＡモノマーはＲＮＡモノマーよりもかなり安価であり、合成が容易であり、そしてヌクレオチド分解に対してより安定であるので、従って、該改変はｓｉＲＮＡの全使用および利用性を改善するであろう（図１５を参照）。
【００９０】
従って、少なくとも１個（例えば、１個）のＬＮＡモノマーはセンス鎖の５’末端に位置することが好ましい。少なくとも２個（例えば、２個）のＬＮＡモノマーがセンス鎖の５’末端に位置することがより好ましい。
【００９１】
本発明の別の好ましい実施態様において、センス鎖は、該センス鎖の３’末端に位置する少なくとも１個（例えば、１個）のＬＮＡモノマーを含む。少なくとも２個（例えば、２個）のＬＮＡモノマーがセンス鎖の３’末端に位置することがより好ましい。
【００９２】
本発明の特に好ましい実施態様において、センス鎖は、該センス鎖の５’末端に位置する少なくとも１個（例えば、１個）のＬＮＡモノマーを含み、そして該センス鎖の３’末端に位置する少なくとも１個（例えば、１個）のＬＮＡモノマーを含む。センス鎖は、該センス鎖の５’末端に位置する少なくとも２個（例えば、２個）のＬＮＡモノマー、および該センス鎖の３’末端に位置する少なくとも２個（例えば、２個）のＬＮＡモノマーを含む。
【００９３】
少なくとも１個（例えば、１個）のＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の３’末端に位置することが好ましい。少なくとも２個（例えば、２個）のＬＮＡモノマーがアンチセンス鎖の３’末端に位置することがより好ましい。少なくとも３個（例えば、３個）のＬＮＡモノマーが、アンチセンス鎖の３’末端に位置することが一層より好ましい。本発明の特に好ましい実施態様において、ＬＮＡモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端またはその近くに（すなわち、１、２、または３個のヌクレオチド内）位置しない。
【００９４】
従って、本発明の更なる実施態様において、ＬＮＡモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端を除いて、センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかの位置に位置し得る。
【００９５】
本発明の非常に好ましい実施態様において、センス鎖は５’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを、および３’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は３’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含む。センス鎖は５’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを、および３’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含むことがより好ましい。センス鎖は５’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを、および３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含むことがより一層好ましい。センス鎖は５’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを、および３’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は３’末端に少なくとも３個のＬＮＡモノマーを含むことがなお一層好ましい。最も好ましい実施態様においては、上記の化合物のいずれも、アンチセンス鎖の５’末端に位置するＬＮＡモノマーを含まないと理解する。
【００９６】
本発明の更なる関心ある実施態様において、ＬＮＡモノマーは、３’末端の近く（すなわち、３’末端から数えて２、３または４位であって、２または３位が好ましく、２位が特に好ましい）に位置する。
【００９７】
従って、本発明の更に非常に関心ある実施態様において、センス鎖は、３’末端から数えて２位に位置するＬＮＡモノマーを含む。別の実施態様において、センス鎖は、３’末端から数えて２および３位に存在するＬＮＡモノマーを含む。
【００９８】
本発明の特に好ましい実施態様において、センス鎖は、５’末端に位置する少なくとも１個（例えば、１個）のＬＮＡモノマーを、および３’末端から数えて２位に位置するＬＮＡモノマーを含む。更なる実施態様において、センス鎖は、センス鎖の５’末端に位置する少なくとも２個（例えば、２個）のＬＮＡモノマーを、および３’末端から数えて２位）に位置するＬＮＡモノマーを含む。
【００９９】
その上、アンチセンス鎖は、３’末端から数えて２位にＬＮＡモノマーを含む。アンチセンス鎖は、３’末端から数えて２および３位にＬＮＡモノマーを含むことがより好ましい。アンチセンス鎖は、３’末端から数えて２、３、４位に位置するＬＮＡモノマーを含むことがより一層好ましい。本発明の特に好ましい実施態様において、ＬＮＡモノマーはアンチセンス鎖の５’末端またはその近くに（すなわち、１、２、または３個のヌクレオチド内に）位置しない。
【０１００】
本発明の非常に好ましい実施態様において、センス鎖は、５’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを、および２位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は、２位（３’末端から数えて）に位置するＬＮＡモノマーを含む。センス鎖は、５’末端に少なくとも１個のＬＮＡモノマーを、および２位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は、２および３位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含むことがより好ましい。センス鎖は、５’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを、並びに２および３位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は、２および３位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含むことがより一層好ましい。該センス鎖は、５’末端に少なくとも２個のＬＮＡモノマーを、並びに２および３位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含み、そしてアンチセンス鎖は、２、３、および４位（３’末端から数えて）にＬＮＡモノマーを含むことがなおより一層好ましい。最も好ましい実施態様において、上記の化合物のどれも、アンチセンス鎖の５’末端に位置するＬＮＡモノマーを含まないと理解される。
【０１０１】
上記の通り、各鎖は１２〜３５個のヌクレオチドを含む。これらの数は、該鎖中の天然ヌクレオチド、ヌクレオチド変異体およびアナログ、ＬＮＡモノマーなどの総数を意味すると理解される。従って、該天然ヌクレオチド、ヌクレオチド変異体およびアナログ、ＬＮＡモノマーなどの総数は、１２よりも低いことはなく、且つ３５を超えることもない。本発明の関心ある実施態様において、各鎖は、１７〜２５個のヌクレオチド（例えば、２０〜２２個または２０〜２１個のヌクレオチド）を含む。
【０１０２】
本発明の化合物は平滑末端し得て、そして１個のある実施態様において、本発明のｓｉＲＮＡ化合物は１９マーであり、そして平滑末端である。しかしながら、少なくとも１個の該鎖は３’オーバーハングを有することが好ましい。典型的には、該３’オーバーハングは、１〜７個のヌクレオチド（または、ヌクレオチド変異体もしくはアナログ、またはＬＮＡモノマー）であって、１〜３個のヌクレオチドが好ましい。従って、センス鎖が３’オーバーハングを含み得て、そしてアンチセンス鎖が３’オーバーハングを含み得るか、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が３’オーバーハングを含み得ると理解される。
【０１０３】
同様な方法で、該鎖の少なくとも１つは５’オーバーハングを有し得る。典型的には、該５’オーバーハングは１〜４個のヌクレオチド（または、ヌクレオチドの変異体もしくはアナログ、またはＬＮＡモノマー）であって、１〜３個のヌクレオチドが好ましい。従って、センス鎖が５’オーバーハングを含み得て、そしてアンチセンス鎖が５’オーバーハングを含み得るか、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が５’オーバーハングを含み得ると理解される。明らかに、センス鎖は３’および５’オーバーハングを含み得る。あるいは、アンチセンス鎖は、３’および５’オーバーハングの両方を含み得る。
【０１０４】
典型的には、本発明の化合物は、ＬＮＡモノマー以外の他の残基を含む。該他の残基は上記の「ヌクレオチド」の定義に関連して記載する残基のいずれかであり得て、そしてこのものは例えば、天然ＲＮＡモノマー、天然ＤＮＡモノマー、並びにヌクレオチドの変異体およびアナログ（例えば、上記の「ヌクレオチド」の定義に関連して記載するもの）を含む。該ヌクレオチドの変異体およびアナログの具体的な例は例えば、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’−Ｏ−(３−アミノプロピル)（ＡＰ）、ヘキシトール核酸（ＨＭＡ）、２’−Ｆ−アラビノ核酸（２’−Ｆ−ＡＮＡ）およびＤ−シクロヘキセニルヌクレオシド（ＣｅＮＡ）を含む。その上、ヌクレオシド間連結は、上記のホスホロジエステル、ホスホロチオエートまたはＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデートヌクレオシド間連結であり得る。
【０１０５】
通常、本発明の化合物の個々の鎖は、鎖中のヌクレオチドの総数を基準として、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％のＬＮＡモノマーを含む。ある実施態様において、本発明の化合物は、鎖中のヌクレオチドのの総数を基準として、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を含む。
【０１０６】
ＬＮＡモノマーに関する限り、反応式２および３中に示すＬＮＡモノマーのいずれかが本発明の目的において有用であると理解する。しかしながら、ＬＮＡモノマーはベータ−Ｄ型であり、このものは化合物３Ａ、３Ｃおよび３Ｄとして示すＬＮＡモノマーに相当することが現在好ましい。現在最も好ましいＬＮＡモノマーは、上記の反応式３および４に化合物３Ａとして示すモノマーであり、すなわち、現在最も好ましいＬＮＡモノマーはオキシ−ＬＮＡのベータ−Ｄ型である。
【０１０７】
本発明の更なる実施態様において、本発明の化合物は１個以上のリガンドと連結して、接合体を生成する。該リガンドは、非接合化合物と比べて接合体の細胞取り込みを増大する役割を果たしている。この接合は、末端５’−ＯＨおよび／または３’−ＯＨ位で起こり得るが、該接合はまた糖類および／または核酸塩基でも起こり得る。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが接合し得る増殖因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含み得る。トランスフェリン−ポリリシン−オリゴヌクレオチド複合体または葉酸−ポリリシン−オリゴヌクレオチド複合体は、高レベルのトランスフェリンまたは葉酸受容体を発現する細胞による取り込みにおいて製造され得る。接合体／リガンドの他の例はコレステロール分子、二重鎖挿入物（例えば、アクリジン、ポリ−Ｌ−リシン、１個以上のヌクレアーゼ耐性連結基（例えば、ホスホロモノチオエート）を有する「エンド−キャッピング」などである。
【０１０８】
細胞中へのオリゴヌクレオチド取り込みの担体としてのトランスフェリン複合体の製造は、Wagnerらによる, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記載されている。葉酸受容体エンドサイトーシスによる葉酸−高分子接合体の細胞運搬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの運搬を含む）は、Lowらによる, US 5,108,921およびLeamonらによる, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991)によって記載されている。
【０１０９】
本発明の化合物または接合体もまた接合し、あるいは更に活性な薬物物質（例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤、化学療法剤または抗生物質）と接合し得る。
【０１１０】
天然のＲＮＡ核酸塩基は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵである。ＬＮＡモノマーにおけるこれらの使用は、最小の改変を構築する。しかしながら、塩基ＭｅＣ（５’メチルシトシン）およびチミン（Ｔ）は、ＬＮＡモノマーとして容易に使用され、そしてこのものはまた本明細書中に示す（図１６を参照）ｓｉＲＮＡ二重鎖中で使用することもできる。ｓｉＬＮＡの末端において使用される塩基の性質は、それらが該分子中の塩基対形成位置を占有する場合には、相補的な塩基とハイブリダイズする能力を保持する限り、ｓｉＲＮＡ分子の官能性に有意に影響を及ぼさないと予想される。しかしながら、ＬＮＡ改変が二重鎖の内部位置に位置する場合（例えば、１０位（５’末端から数えて））には、核酸塩基の性質は重要であると予想しなければいけない。従って、天然の塩基であるＣおよびＵは、塩基の改変物、ＴおよびＭｅＣよりもより小さい程度にまで二重鎖を乱すであろう。このことにより、わずかなデザインの可能性を供する。例えば、切断部位（例えば、１０番目の位置）で該センス鎖を「ブロック」したい場合には、ＴまたはＭｅＣを使用しなければならないが（相補的である場合）、しかし、切断部位（例えば、１０位）で該アンチセンス鎖を改変するのが必要である場合には、ＵまたはＣを使用すべきである（相補的である場合）。従って、本発明の１実施態様は、改変された核酸塩基を含むことである。該核酸塩基の妨害は、メチルよりもバルキーな基（例えば、エチル、プロピル、フェニル、またはビオチンなどのレポーター基）を用いることによって得ることができる。従って、ＲＩＳＣ複合体または他の酵素による核酸塩基の区別された認識は、ＬＮＡ改変ｓｉＲＮＡの設計機会の余分なレベルを供する。従って、本発明の関心ある実施態様において、１０位（５’末端から数えて）はＴまたはＭｅＣを含む。
【０１１１】
環境の変化および他の変化に対する速い応答を可能とするために、生物学的なシステムは典型的に、動力学的なシステム（すなわち、平衡状態をアクチベーターおよびデアクチベーター(deactivator)の両方の作用によって保つシステム）として構築する。従って、該ＲＩＳＣ複合体に関心ある場合には、活性化された複合体（すなわち、標的の破壊を触媒する無傷のオリゴヌクレオチドを含有するタンパク質複合体）は、失活活性（例えば、例えば、該オリゴヌクレオチドの全てまたはその一部を除去し、その結果、活性化ＲＩＳＣ複合体の機能を無能にする、ヌクレアーゼ活性）を受けることが予想され得る。あるいは、ＲＩＳＣ複合体の失活は、ＲＩＳＣ複合体からのオリゴヌクレオチドのオフ速度（これは、解離後に、再結合(reassociate)することができないかもしれない）によって簡単に測定することができる。
【０１１２】
従って、１つの関心ある態様において、本発明は、活性ＲＩＳＣ複合体の寿命を増大し、その結果、その作用時間を増大するために、本明細書中に開示する化合物の使用に関する。本発明の１実施態様において、このことは、推定ＲＮＡｓｅ活性による分解に対するＲＩＳＣ複合体のＲＮＡ成分の耐性を増大することによるか、ＬＮＡおよび／または他の核酸アナログの取り込みによるか、あるいは化学的な改変によって、達成される。本発明の別の実施態様において、活性ＲＩＳＣ複合体の寿命の所望する増大は、ＬＮＡおよび／または他の核酸アナログの導入によるＲＩＳＣ複合体からＲＮＡオリゴヌクレオチドのオフ速度を低下させることによって、および／またはＲＩＳＣ複合体中の結合パートナーに対するオリゴヌクレオチドのアフィニティーを増大する化学的な改変によって、達成される。
【０１１３】
インヒビターとして設計する場合には、本発明のｓｉＬＮＡは標的核酸と結合し、そしてその同族タンパク質の発現を調整する。該調整により、正常な発現レベルと比較して、少なくとも１０％または少なくとも２０％（少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％がより好ましい）の発現の阻害を与えることが好ましい。
【０１１４】
（製造）
本発明の化合物は、核酸化学の重合技術（これは、有機化学の分野における当業者にとってよく知られる）を用いて製造することができる。通常、ホスホロアミダイト方法の標準的な重合サイクル（S. L. BeaucageおよびR. P. Iyerによる, Tetrahedron, 1993, 49, 6123；並びに、S. L. BeaucageおよびR. P. Iyerによる, Tetrahedron, 1992, 48, 2223）を使用できるが、しかし、他の化学（例えば、Ｈ−ホスホネート化学またはホスホロトリエステル化学）をまた使用することができる。
【０１１５】
いくつかのモノマーについて、より長いカップリング時間、および／または新しい試薬との繰り返しカップリング、および／またはより濃縮したカップリング試薬の使用が、必要であり得る。しかしながら、我々の思いのままに、使用するホスホロアミダイトを十分な＞９７％の工程毎のカップリング収率でカップリングする。該ホスフェートのチオール化は、通常の酸化（すなわち、ヨウ素／ピリジン／Ｈ２Ｏ酸化）をビューケイジ(Beaucage)試薬（商業的に入手可能）を用いる酸化プロセスで交換することによって実施することができる。当業者にとって明らかである通り、他の硫黄化(sulphurisation)試薬を使用することができる。
【０１１６】
個々の鎖の精製は、廃棄可能な逆相精製カートリッジおよび／または逆相ＨＰＬＣおよび／またはエタノールもしくはブタノールからの沈降を用いて行なうことができる。ゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、およびＥＳＩ−ＭＳを用いて、合成したＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの純度を確認することができる。その上、固定化された核酸塩基保護で且つ５’−ＯＨ保護のＬＮＡを有する固体の支持物質は特に、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＬＮＡモノマーは３’末端で含まれる）の合成に特に関心が持たれる。この目的のために、該固体の支持物質は、ＣＰＧまたはポリスチレン（３’−官能化され、場合により核酸塩基で保護され、そして場合により５’−ＯＨ保護されたＬＮＡモノマーが連結される）であることが好ましい。該ＬＮＡモノマーは、ある固体の支持物質についての供給者によって述べられている条件を用いて、該固体の支持体と結合することができる。
【０１１７】
本発明の１態様は、本発明の化合物の製造のための新規な方法に関するものであって、このものは、個々のモノマー、例えばＬＮＡモノマーおよびＲＮＡモノマーを、１Ｈ−テトラゾールまたは５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールを用いてカップリングすることを特徴とする。本態様の更なる実施態様は、該方法が２００〜１２００秒の範囲にある（例えば、４００から１２００秒の範囲にあり、６００〜９００秒の範囲にあることが好ましい）カップリング時間を含むものである、ことである。
【０１１８】
本発明に従って改変する標的は、多数の塩基性の生物学的な機序（例えば、赤血球の増殖、細胞増殖、イオン代謝、グルコースおよびエネルギー代謝、ｐＨ調節、およびマトリックス代謝を含む）に関与する標的であり得る。本明細書中に記載する本発明は、該処置が必要なヒトに治療学的に有効な量の標的調整ｓｉＲＮＡ化合物を含有する、癌を予防しまたは治療する方法を包含する。
【０１１９】
（治療および医薬組成物）
最初に説明した通り、本発明の化合物は、改善された性質を有する適当な薬物を構築する。強力で且つ安全なＲＮＡｉ薬物の設計は、多様なパラメータ（例えば、アフィニティー／特異性、生物学的な液体中での安定性、細胞による取り込み、作用様式、薬物動態学的な性質、および毒性）の微調整(fine-tuning)を必要とする。
【０１２０】
従って、更なる態様において、本発明は、本発明の化合物および医薬的に許容し得る希釈物、担体またはアジュバントを含有する医薬組成物に関する。
【０１２１】
更に別の態様において、本発明は、薬物としての使用のための本発明の化合物に関する。
【０１２２】
投薬は処置する疾患状態の激しさおよび応答性、並びに処置の期間（数日間から数ヶ月にまで続くか、あるいは治癒が有効となるまでかまたは該疾患状態の軽減が達成されるまで）に依存することは理解されるであろう。最適な投薬スケジュールは、患者の身体中での薬物の蓄積の測定から算出することができる。最適な用量は、個々のｓｉＬＮＡの相対的な効力に依存して変えることができる。通常、そのものは、インビトロおよびインビボでの動物モデルにおいて有効であることが分かる、ＥＣ５０に基づいて見積もることができる。通常、用量は、体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１ｇであり、そしてこのものは、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年１回以上、または２〜１０年毎に１回、あるいは数時間から数ヶ月の間での連続的な注入によって与えることができる。投薬の反復速度は、身体の液体または組織中での該薬物の測定される存在(residence)時間および濃度に基づいて見積もることができる。成功処置後に、該疾患状態の再発を防止するために、該患者が維持療法を受けることが望まれ得る。
【０１２３】
（医薬組成物）
本発明はまた医薬組成物に関するものであって、このものは、活性成分として少なくとも１個の本発明の化合物を含む。本発明の医薬組成物は場合により医薬的な担体を含み、そして該医薬組成物は場合により更なる化合物（例えば、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および／または免疫調整化合物）を含む、と理解されるべきである。
【０１２４】
本発明に含まれるオリゴマー化合物は、様々な医薬的に許容し得る塩で使用することができる。本明細書中で使用する該用語は、塩（このものは、本明細書中で同定される化合物の所望する生物学的な活性を保持し、そして最小の所望しない毒物学的な効果を示す）を意味する。該塩の非限定的な例は、有機アミノ酸および塩基の付加塩；金属カチオン（例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなど）と形成する塩；または、アンモニア、Ｎ,Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、もしくはエチレンジアミンから生成するカチオンと形成する塩を含む。
【０１２５】
本発明の１実施態様においては、オリゴマー化合物は、プロドラッグの形態であり得る。オリゴヌクレオチドは、負に荷電したイオンによる。細胞膜の親油性の性質のために、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の等価物と比較して低下する。この極性「障害」は、プロドラッグ方法（例えば、Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, 131巻, 頁103-140を参照）を用いることによって避けることができる。この方法において、該オリゴヌクレオチドは保護様式で製造し、その結果、該オリゴは投与の際に中性である。これらの保護基は、オリゴが細胞によって摂取されると除去され得るような様式で設計する。該保護基としては例えば、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、そして細胞内で選択的に除去される。
【０１２６】
医薬的に許容し得る結合剤およびアジュバントは、製剤化された薬物の部を含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤などは、例えば以下の化合物を含み得る：結合剤としての微結晶性セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤としてのデンプンおよびラクトース；滑沢剤としてのステアリン酸；様々な甘味剤または芳香剤。カプセル剤の場合には、投薬単位は液体担体（脂肪油など）を含み得る。糖類または腸溶剤の同様なコーティングは、該投薬単位の一部であり得る。該オリゴヌクレオチド製剤はまた、活性医薬成分およびミセル乳液を形成する脂質との乳剤であり得る。本発明の化合物は、所望する作用を損なわないいずれかの物質または所望する作用を補足する物質と一緒に混合することができる。これらは、例えば他のヌクレオチド化合物を含有する他の薬物を含む。非経口、皮下、皮内、または局所の投与の場合に、該製剤としては、減菌希釈剤、緩衝剤、張性の調節因子、および抗菌薬を含み得る。該活性化合物は、分解または身体からの速い排除を防止する担体（例えば、徐放性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む）と一緒に製造することができる。静脈内投与の場合には、好ましい担体は、生理学的な生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。
【０１２７】
オリゴマー化合物は単位製剤のものを含むことが好ましく、例えばこのものは処置する患者において重大な副作用を引き起こすことなく、治療学的に有効な量を患者に運搬するのに十分な量での医薬的に許容し得る担体または希釈物中のものが挙げられる。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、局所または全身のどちらの処置が所望されるかにおよび処置する領域に応じた多数の方法で投与することができる。投与は、（ａ）経口（ｂ）肺（例えば、散剤もしくはエアロゾル剤（例えば、ネブライザーを含む）の吸入もしくはガス注入による）；気管内、鼻腔内；（ｃ）局所（例えば、上皮、経皮、眼を含む）および粘膜（例えば、膣および直腸の運搬を含む）；または、（ｄ）非経口（例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射もしくは注入）；頭蓋内（例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内の投与を含む）であり得る。１実施態様において、医薬組成物は、ＩＶ投与、ＩＰ投与、経口投与、局所投与するか、ボーラス注射として投与するか、または標的器官に直接投与する。局所投与のための医薬組成物および医薬製剤としては、経皮パッチ剤、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、スプレー剤、坐剤、液剤および散剤を含み得る。通常の医薬的な担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは所望し得る。コーティングされたコンドーム、グローブなどもまた、有用であり得る。好ましい局所用製剤としては、本発明の化合物が局所用運搬剤（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤など）と混合されているものを含む。経口投与用の組成物および製剤としては、例えば散剤または顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒質中の懸濁剤もしくは溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、分包（sachet）、錠剤またはミニ錠剤などを含むが、これらに限定されない。非経口投与、髄腔内投与または脳室内投与用の組成物および製剤としては滅菌水溶液剤を含み得るが、このものはまた緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物および他の医薬的に許容できる担体または賦形剤などであるが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１２９】
本発明の医薬組成物としては、例えば液剤、乳剤、およびリボーソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、様々な成分（例えば、既製の液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体を含むが、これらに限定されない）から製造することができる。腫瘍組織への薬物の運搬は、担体媒介性運搬（例えば、カチオンリポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアを含むが、これらに限定されない）によって増大し得る（Dass C. R.による, J Pharm Pharmacol 2002；54(1): 3-27）。本発明の医薬製剤（このものは、単位投薬形態で便利に供し得る）は、製薬産業においてよく知られる通常の技術に従って製造することができる。該技術としては、活性化成分を医薬的な担体または賦形剤と組み合わせる工程を含む。一般に製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細に分けた固形担体またはその両方と均一かつ十分に混合した後、必要であれば製品を成型することによって製造する。本発明の組成物は、多数のあり得る投薬形態のいずれか（例えば、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤、ソフトゲル剤および坐剤などを含むが、これらに限定されない）に製剤化し得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性媒質、または混合媒質中での懸濁剤としても製剤化し得る。水性懸濁剤は更に、懸濁剤の粘性を増大する物質（例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む）を含み得る。該懸濁液剤はまた、安定化剤を含み得る。本発明の化合物はまた、活性薬物物質（例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質）とも接合し得る。
【０１３０】
別の実施態様において、本発明の組成物は、１個以上のｓｉＬＮＡ化合物（このものは、第１の核酸を標的化する）および１個以上の別のｓＩＬＮＡ化合物（このものは、第２の核酸標的を標的化する）を含み得る。２個以上の組み合わせ化合物は、一緒にまたは連続的に使用することができる。
【０１３１】
本明細書中に開示する化合物は、上記の多数の治療学的な利用法に有用である。通常、本発明の治療学的な方法としては例えば、治療学的に有効な量のｓｉＬＮＡを哺乳動物（特に、ヒト）に投与することを含む。ある実施態様において、本発明は、（ａ）１個以上の本発明の化合物、および（ｂ）１個以上の化学療法剤、を含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物と一緒に使用する場合には、該化学療法剤は、個別に、連続して、または１個以上の他の該化学療法剤もしくは放射線療法と組み合わせて使用することができる。当該分野における当業者にとって知られる全ての化学療法剤は、本発明載の化合物との組み合わせ処置として本明細書中に包含する。他の活性剤（例えば、抗炎症性薬）（このものは例えば、非ステロイド性抗炎症性薬およびコルチコステロイド、抗ウイルス薬、および免疫調整薬を含むが、これらに限定されない）はまた、本発明の組成物中で組み合わせることができる。２個以上の組み合わせ化合物は、一緒にまたは連続して使用することができる。
【０１３２】
（癌）
更になお別の態様において、本発明は、癌の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用に関する。別の態様において、本発明は、癌の治療または予防のための方法に関し、該方法は、本発明の化合物または本発明の医薬組成物を処置が必要な患者に投与することを含む。
【０１３３】
該癌としては例えば、リンパ網内性新生物(lymphoreticular neoplasia)、リンパ芽球性白血病(lymphoblastic leukemia)、脳腫瘍、胃癌、プラズマ細胞腫(plasmacytomas)、多発性骨髄腫、白血病、結合組織腫瘍、リンパ腫、および固形腫瘍を含む。
【０１３４】
癌の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用において、該癌は、固形腫瘍の形態であることが適当であり得る。同様に、本明細書中に開示する癌の処置方法において、該癌は固形腫瘍の形態であることが適当であり得る。
【０１３５】
その上、該癌はまた好適には、癌腫である。該癌腫は典型的に、悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部形成異常、咽頭乳頭腫症、結腸癌、および腎細胞癌からなる群から選ばれる。より典型的には、該癌腫は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌および腎細胞癌からなる群から選ばれる。悪性黒色腫は典型的には、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、先端黒色腫、メラニン欠乏症黒色腫および線維硬化性黒色腫からなる群から選ばれる。
【０１３６】
癌は好適には肉腫であり得る。肉腫は、典型的には骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫およびカポジ肉腫からなる群より選ばれる形態をとる。
【０１３７】
あるいは、癌は好適には神経膠腫であり得る。
【０１３８】
更なる実施態様は、癌の処置のための医薬の製造における本発明に記載する化合物の使用に関し、ここで、該医薬は更に、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン）；アルトレタミン（へキサレン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ））；アミフォスチン（エチロール）；アミノグルテチミド（シタドレン）；アムサクリン（Ｍ−ＡＭＳＡ）；アナストロゾール（アリミデックス）；アンドロゲン（例えば、テストステロン）：アスパラギナーゼ（エルスパル）；バシラスカルメッテ−グリン；ビカルタミド（カソデックス）；ブレオマイシン（ブレオキサン）；ブスルファン（ミレラン）；カルボプラチン（パラプラチン）；カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）；クロラムブシル（ルークラン）；クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ、クラドリビン、ロイスタチン）；シスプラチン（プラチノール）；シトシンアラビノシド（シタラビン）；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン）；ダウノルビシン（セルビジン）；ドセタキセル（タキソテール）；ドキソルビシン（アドリアマイシン）；エピルビシン；エストラムスチン（ｅｍｃｙｔ）；エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ））；エトポシド（ＶＰ−１６、ベプシド、エトホホス）；フルダラビン（フルダラ）；フルタミド（ユーレクシン）；５−ＦＵＤＲ（フロキシウリジン）；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ)；ゲムシタビン（ジェムザール）；ゴセレリン（ゾダレックス）；ハーセプチン（トラスツズマブ）；ヒドロキシ尿素（ハイドレア）；イダルビシン（イダマイシン）；イホスファミド；ＩＬ−２（プロリュウキン、アルデスリュウキン）；インターフェロンアルファ（イントロンＡ、ロフェロンＡ）；イリノテカン（カンプトスター）；ロイプロリド（ループロン）；レバミソール（エルガミソール）；ロムスチン（ＣＣＮＵ）；メクロラタミン（ムスタルゲン、ナイトロジェンマスタード）；メルファラン（アルケラン）；メルカプトプリン（ピュリネソール、６−ＭＰ）；メトトレキセート（メキセート）；マイトマイシン−Ｃ（ムタムシン）；ミトキサントロン（ノバントロン）；オクトレオチド（サンドスタチン）；ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン、ニペント）；プリカマイシン（ミトラマイシン、ミタラシン）；プロロカルバジン（マツラン）；ストレプトゾシン；タモキシフェン（ノルバデックス）；タキソール（パクリタキセル）；テニポシド（ブモン、ＶＭ−２６）；チオテパ；トポテカン（ハイカムチン）；トレチノイン（ベサノイド、オールトランスレチノイン酸）；ビンブラスチン（バルバン）；ビンクリスチン（オンコビン）；および、ビノレルビン（ナベルビン）からなる群から選ばれる化学療法剤を含む。該更なる化学療法剤は、タキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルなどのタキサンから選ばれることが好ましい。
【０１３９】
同様に、本発明は更に、癌の処置のための医薬の製造における本発明に記載の化合物の使用に関し、ここで、該処置は更に、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン）；アルトレタミン（へキサレン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ））；アミフォスチン（エチロール）；アミノグルテチミド（シタドレン）；アムサクリン（Ｍ−ＡＭＳＡ）；アナストロゾール（アリミデックス）；アンドロゲン（例えば、テストステロン）：アスパラギナーゼ（エルスパル）；バシラスカルメッテ−グリン；ビカルタミド（カソデックス）；ブレオマイシン（ブレオキサン）；ブスルファン（ミレラン）；カルボプラチン（パラプラチン）；カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）；クロラムブシル（ルークラン）；クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ、クラドリビン、ロイスタチン）；シスプラチン（プラチノール）；シトシンアラビノシド（シタラビン）；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン）；ダウノルビシン（セルビジン）；ドセタキセル（タキソテール）；ドキソルビシン（アドリアマイシン）；エピルビシン；エストラムスチン（ｅｍｃｙｔ）；エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ））；エトポシド（ＶＰ−１６、ベプシド、エトホホス）；フルダラビン（フルダラ）；フルタミド（ユーレクシン）；５−ＦＵＤＲ（フロキシウリジン）；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ)；ゲムシタビン（ジェムザール）；ゴセレリン（ゾダレックス）；ハーセプチン（トラスツズマブ）；ヒドロキシ尿素（ハイドレア）；イダルビシン（イダマイシン）；イホスファミド；ＩＬ−２（プロリュウキン、アルデスリュウキン）；インターフェロンアルファ（イントロンＡ、ロフェロンＡ）；イリノテカン（カンプトスター）；ロイプロリド（ループロン）；レバミソール（エルガミソール）；ロムスチン（ＣＣＮＵ）；メクロラタミン（ムスタルゲン、ナイトロジェンマスタード）；メルファラン（アルケラン）；メルカプトプリン（ピュリネソール、６−ＭＰ）；メトトレキセート（メキセート）；マイトマイシン−Ｃ（ムタムシン）；ミトキサントロン（ノバントロン）；オクトレオチド（サンドスタチン）；ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン、ニペント）；プリカマイシン（ミトラマイシン、ミタラシン）；プロロカルバジン（マツラン）；ストレプトゾシン；タモキシフェン（ノルバデックス）；タキソール（パクリタキセル）；テニポシド（ブモン、ＶＭ−２６）；チオテパ；トポテカン（ハイカムチン）；トレチノイン（ベサノイド、オールトランスレチノイン酸）；ビンブラスチン（バルバン）；ビンクリスチン（オンコビン）；および、ビノレルビン（ナベルビン）からなる群から選ばれる更なる化学療法剤の投与を含む。好適には、該処置は更に、例えばタキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルなどのタキサンから選ばれる更なる化学療法剤の投与を含む。
【０１４０】
別に述べると、本発明は更に癌の処置方法に関し、ここで、該方法は本発明の化合物または本発明の医薬組成物を処置が必要な患者に投与することを含み、そして更に更なる化学療法剤の投与を含む。該更なる投与は、該更なる化学療法剤が本発明の化合物と接合し、医薬組成物中に存在し、または別個の製剤として投与されるようにすることもできる。
【０１４１】
（感染性疾患）
本発明の特に関心ある実施態様において、本発明のｓｉＬＮＡ化合物は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）（このものは、2002年11月に中国において最初に出現した）を標的とするために使用する。ＷＨＯによれば、８,０００人を超える人々が世界中で感染し、その結果、９００人以上が死亡した。これまでに未知のコロナウイルスが、ＳＡＲＳ伝染病の原因物質として同定された（Drosten Cらによる, N. Engl. J. Med. 2003, 348, 1967-76；および、Fouchier R.A.らによる, Nature 2003, 423, 240）。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの同定は、多数の単離物のウイルスゲノムの速やかな配列決定による（Ruanらによる, Lancet 2003, 361, 1779-85；Rota P. A.らによる, Science 2003, 300, 1394-9；および、Marra M. A.らによる, Science 2003, 300, 399-404）。この配列情報は、核酸ベースのノックダウン技術によるＳＡＲＳ抗ウイルス剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の開発を直ぐに可能とした。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｐｏｌ）は、コロナウイルスファミリー全般にわたって高く保存される。該Ｐｏｌ遺伝子産物は、ポリタンパク質の一部としてゲノムＲＮＡから翻訳され、そしてマイナス鎖ＲＮＡおよびその後にサブゲノムｍＲＮＡを合成する鋳型として、ゲノムＲＮＡを使用する。従って、該Ｐｏｌタンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおいて早期に発現し、そしてウイルス複製にとって重要である（図１０を参照）。
【０１４２】
従って、更なる別の態様において、本発明は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用、並びに重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の処置方法に関し、ここで、該方法は、本発明の化合物または本発明の医薬組成物を処置が必要な患者に投与することを含む。
【０１４３】
本発明の化合物は、広範囲な感染性疾患（例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、Ｂ型肝炎、インフルエンザ菌(hemophilus influenza)、はしか、おたふく風邪、および風疹）に広く利用可能である。
【０１４４】
従って、更に別の態様において、本発明は、感染性疾患の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用、並びに感染性疾患の処置方法に関し、ここで、該方法は、本発明の化合物または本発明の医薬組成物を処置が必要な患者に投与することを含む。
【０１４５】
（炎症性疾患）
炎症性応答は、感染性物質の攻撃に対する生物の本質的な防御機序であって、そしてそのものはまた、多数の急性および慢性の疾患（例えば、自己免疫疾患を含む）の病因にも関係する。病原と闘うのに必要とされるのにもかかわらず、炎症性バースト(inflammatory burst)の効果は壊滅的となり得る。従って、抗炎症薬の使用により炎症の総体症状を制限するのが必要なことも多い。炎症は、組織損傷（このものは、多数の群の(a large array)酵素の活性化、血管透過性の増大、および血液の血管外遊出を含む）によって通常トリガーされる複雑なプロセスである。
【０１４６】
更に別の態様において、本発明は、炎症性疾患の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用、並びに炎症性疾患の処置方法に関し、ここで、該方法は、本発明の化合物または本発明の医薬組成物を処置が必要な患者に投与することを含む。
【０１４７】
本発明の好ましい実施態様において、炎症性疾患は、リウマチ疾患および／または結合組織疾患であり、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）もしくはループス、強皮症、多発性筋炎、炎症性腸疾患、皮膚筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、乾癬性関節炎、剥脱性乾癬性皮膚炎(exfoliative psoriatic dermatitis)、尋常性天疱瘡およびシェーグレン症候群(Sjorgren's syndrome)（特に、炎症性腸疾患およびクローン病）である。
【０１４８】
あるいは、炎症性疾患は、非リウマチ性炎症（例えば、滑液包炎、滑膜炎、被膜炎、腱炎、および／または外傷性および／または突然変異性(sportive)起源の他の炎症性病変など）であり得る。
【０１４９】
（他の用途）
本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、診断薬、治療薬および予防薬のための研究試薬として使用することができる。研究では、細胞および実験動物における標的遺伝子の合成を特異的に阻害し、その結果、標的の機能解析または治療的挿入物の標的としてのその有用性の評価を容易にするために、ｓｉＲＮＡを使用することができる。診断薬の場合は、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションまたは同様の技術によって、細胞および組織における標的発現を検出しおよび定量化するために、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用することができる。治療薬の場合は、標的の発現を調整することによって処置することができる疾患または障害を持つと予想される動物またはヒトを、本発明に従ってｓｉＲＮＡ化合物を投与することによって処置する。さらに、標的の発現に関係する疾患または病状を有するかまたはそのような疾患または病状を患い易いと予想される動物（特に、マウスおよびラットならびにヒト）を、治療学的な有効量または予防学的な有効量の１個以上の本発明のｓｉＲＮＡ化合物または本発明の組成物を投与することによって、処置する方法をも提供する。
【０１５０】
本発明は更に、以下の実施例によって非限定的な様式で例示する。
（実施例）
【数１】
0004755972.tif 000007
【０１５１】
（実施例１：モノマー合成）
ＬＮＡモノマーの製造は、引用文献：Koshkinらによる, J. Org. Chem., 2001, 66, 8504-8512、およびPedersenらによる, Synthesis, 2002, 6, 802-809、並びにそれらの中に記載されている刊行物中で非常に詳しく記載されている。ＺおよびＺ＊保護基がオキシ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−(２−シアノエチル)ホスホロアミダイトおよびジメトキシトリチルオキシである場合には、該化合物は、WO 03/095467；Pedersenらによる, Synthesis 6, 802-808, 2002；Sorensenらによる, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176, 2002；Singhらによる, J. Org. Chem. 63, 6078-6079, 1998；および、Rosenbohmらによる, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663, 2003に記載されている通り製造した。全てのシトシン含有モノマーは、全カップリングについて５−メチル−シトシンモノマーで置き換えた。使用した全てのＬＮＡモノマーは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ（化合物３Ａ）であった。
【０１５２】
（実施例２：オリゴヌクレオチド合成）
全ての合成は、MOSS Expedite instrument platform上で１μｍｏｌスケールで行なった。該合成方法は、装置マニュアル中に実質的に記載されている通り行なった。
【０１５３】
（ＬＮＡスクシニルヘミエステルの製造）
５'−Ｏ−ＤＭＴ−３''−ヒドロキシ−ＬＮＡモノマー（５００ｍｇ）、無水コハク酸（１．２当量）およびＤＭＡＰ（１．２当量）をＤＣＭ（３５ｍＬ）に溶解した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＮａＨ２ＰＯ４，０．１Ｍ，ｐＨ５．５（２回）および食塩水（１回）で抽出した後、該有機層を更に無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして蒸発した。該ヘミエステル誘導体を９５％収率で得て、そしてこれをさらに精製することなく使用した。
【０１５４】
（ＬＮＡ−ＣＰＧ（微細孔性ガラス）の製造）
上で製造したヘミエステル誘導体（９０μｍｏｌ）を最少量のＤＭＦに溶解した。ＤＩＥＡおよびｐｙＢＯＰ（９０μｍｏｌ）を加え、そして一緒に１分間混合した。このプレ活性化混合物を手動合成装置中でＬＣＡＡ−Ｃｐｇ（５００Å、８０〜１２０メッシュサイズ、３００ｍｇ）と混合し、そして撹拌した。室温で１．５時間撹拌後に、支持体をろ過して除き、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。乾燥後に、ロード量は５７μｍｏｌ／ｇと測定した（Tom Brown, Dorcas J. S. Brownによる, Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In；F. Eckstein編, Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14を参照）。
【０１５５】
（ホスホロチオエートサイクル）
ＣＰＧと結合した５'−Ｏ−ＤＭＴ（Ａ（ｂｚ）、Ｃ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、またはＴ）を、ジクロロメタン中の３％（容量比）のトリクロロ酢酸溶液を用いて脱保護した。該ＣＰＧは、アセトニトリルを用いて洗浄した。ホスホロアミダイト（Ａ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、５−メチル−Ｃ（ｂｚ））またはＴ−β−シアノエチルホスホロアミダイト）のカップリング反応は、５’−Ｏ−ＤＭＴ−保護アミダイトのアセトニトリル溶液（０．０８Ｍ）を使用することによって実施し、そして活性化はアセトニトリル中のＤＣＩ（４,５−ジシアノイミダゾール）（０．２５Ｍ）を用いることによって行なった。該カップリング反応は、２分間行なった。チオール化は、ビューケイジ試薬（０．０５Ｍのアセトニトリル溶液）を用いることによって行ない、そしてこのものを３分間反応させた。該支持体をアセトニトリルを用いて洗浄し、そしてその後のキャップ化(capping)は、標準溶液（ＣＡＰ  Ａ）および（ＣＡＰ  Ｂ）を用いることによって行なって、未反応の５’−ヒドロキシル基をキャップする。次いで、該キャップ化工程は、アセトニトリル洗浄によって停止した。
【０１５６】
（ＬＮＡ単位サイクル）
ＣＰＧと結合した５’−Ｏ−ＤＭＴ（Ａ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、またはＴ）を、上記と同じ方法を用いることによって脱保護した。カップリング反応は、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ａ（ｂｚ）、Ｃ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、またはＴ−β−シアノエチルホスホロアミダイト（０．１Ｍのアセトニトリル溶液）を用いることによって実施し、そして活性化はＤＣＩ（０．２５Ｍのアセトニトリル溶液）によって行なった。該カップリング反応を、７分間行なった。キャップ化は、標準溶液（ＣＡＰ  Ａ）および（ＣＡＰ  Ｂ）を３０秒間用いることによって行なった。該ホスファイトトリエステルを、Ｉ２およびピリジンのＴＨＦ標準溶液を３０秒間用いることによって、より安定なホスフェートトリエステルに酸化した。該支持体をアセトニトリルを用いて洗浄し、そしてキャップ化工程を繰り返した。該サイクルは、アセトニトリル洗浄によって停止した。
【０１５７】
（切断および脱保護）
該オリゴヌクレオチドを該支持体から切断し、そして該支持体を３５％ＮＨ４ＯＨを用いて室温で１時間処理することによって、β−シアノエチル保護基を除去した。該支持体をろ過して除き、そして温度を６５℃まで４時間かけて昇温することによって、該塩基保護基を除去した。次いで、アンモニアを蒸発によって除去した。
【０１５８】
（精製）
該オリゴを、逆相−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）またはアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥ）のいずれかによって精製した。
【表１】
0004755972.tif 000008
【表２】
0004755972.tif 000009
【０１５９】
（Ｔｍ測定）
融解曲線は、ＰＴＰ−６ペルチェ(peltier)システムと連結したパーキンエルマーＵＶ／ＶＩＳ分光光度計ラムダ４０を用いて記録した。オリゴヌクレオチドを、濃度が１．５μＭで経路長１ｃｍのセルを用いて、塩緩衝液（１０ｍＭ  リン酸緩衝液、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．０）中に溶解した。試料を９５℃で３分間変性し、そしてこのものを測定前に２０℃までゆっくりと冷却した。融解曲線は、加熱速度を１℃／分で、スリットが２ｎｍおよび応答が０．２秒で用いて、２６０ｎｍで記録した。Ｔｍ値は、該融解曲線の第１微分(derivative)の最大値から得た。
【０１６０】
（実施例３：ＬＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造）
（製造）
ＬＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、自動核酸合成装置（MOSS Expedite 8909）を用いておよび標準試薬を用いて、１．０μｍｏｌスケールでＤＭＴ−オフ(off)合成した。１Ｈ−テトラゾールまたは５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールを、アクチベーターとして使用した。該ＬＮＡ  ＡＢｚ、ＧｉＢｕおよびＴホスホラミダイト濃度は、無水アセトニトリル中で０．１Ｍとした。該ＭｅＣＢｚを、１５％のＴＨＦ／アセトニトリル中に溶解した。全モノマーのカップリングについてのカップリング時間は、６００秒とした。該ＲＮＡホスホラミダイト（Glen Research, Sterling, Virginia）は、Ｎ−アセチルおよび２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）で保護した。該モノマー濃度は０．１Ｍ（無水アセトニトリル）とし、そしてカップリング時間は９００秒とした。該酸化時間は、５０秒にセットした。該固体の支持体は、ＤＭＴ−ＬＮＡ−ＣＰＧ（１０００Å、３０〜４０μｍｏｌ／ｇ）であった。
【０１６１】
（ワークアップおよび精製）
樹脂からの切断および核酸塩基／ホスフェート脱保護は、メチルアミン溶液（３３％メチルアミン／エタノール：４０％メチルアミン／水の１：１）（１．５ｍＬ）を用いて３５℃で６時間または終夜放置することで処理することによって減菌管中で行なった。該管を遠心分離し、そして該メチルアミン溶液を第２の減菌管に移した。該メチルアミン溶液を、真空遠心分離機中で蒸発させた。２’−Ｏ−保護基を除去するために、該残渣を１．０Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中に溶解し、そしてこのものを５５℃にまで１５分間加熱し、そして３５℃で終夜放置した。該ＴＨＦを真空遠心分離機中で蒸発させることにより、明黄色ガムが残り、このものをＲＮａｓｅなしの１．０Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７）（６００μＬ（試料の総容量：１．０ｍＬ））を用いて中和した。該混合物を振り混ぜることによって均一とし、そして６５℃まで３分間加熱した。該オリゴヌクレオチドの脱塩は、ＮＡＰ−１０カラム（Amersham Biosciences社製、以下を参照）を用いて行なった。工程４（以下を参照）からのろ液を集め、そしてこのものをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびゲル電気泳動（１６％シークエンシングのアクリルアミドゲル（１ｍｍ）、０．９％ＴＢＥ［トリス：８９ｍＭ、ホウ酸：８９ｍＭ、ＥＤＴＡ：２ｍＭ、ｐＨ８．３］緩衝液）によって分析し、制限パラメータとして２０Ｗで２時間操作した。該ゲルを、サイバーゴールド(CyberGold)（Molecular Probes社製、０．９×ＴＢＥ中に１：１００００）中で３０分間染色し、続いてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＦＸ画像処理装置中でスキャンした。該オリゴヌクレオチドの濃度は、ＵＶ分光光度計によって２６０ｎｍで測定した。
【表３】
0004755972.tif 000010
【０１６２】
当業者によって認められるであろうが、標準的な方法と比較してＬＮＡ／ＲＮＡオリゴの合成における最も重要な問題は、以下の通りである：ｉ）良好なカップリング効率を達成するのに、長時間のカップリング時間が必要であること；および、ｉｉ）欠失断片の生成を最少とするために、酸化時間を延長しなければいけないこと。その上、２’−Ｏ−ＴＯＭ保護ホスホラミダイトのカップリングは、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳよりも優れていた。このことを考慮すると、粗オリゴヌクレオチドは、更なる精製を回避することができるような質とした。ＭＳ分析は、ＴＯＭ基を除去した後に行なうべきである。
【０１６３】
（実施例４：ｓｉＲＮＡと比較したｓｉＬＮＡの安定性の改善）
ｓｉＲＮＡと比較したｓｉＬＮＡの改善された安定性を、図２に示す。両方のわずかにおよびより高度に改変したｓｉＲＮＡは、安定性の改善を示した。安定性は、生理学的な食塩水溶液中に希釈した１０％胎仔ウシ血清中で評価した。該ｓｉＲＮＡおよびｓｉＬＮＡを、該血清中で３７℃でインキュベートした。標本を異なる時間で取り出し、そしてこのものを１５％ポリアクリルアミドＴＢＥゲルを用いて分析し、そしてＳＹＢＲ−ゴールド(gold)（Molecular probes社製)を用いて染色した。バンドを定量化し、そしてこのものをグラフにプロットした。未改変ｓｉＲＮＡ化合物については、中間体のバンドの蓄積を見ることができ（ｄｓＲＮＡおよびｓｓＲＮＡの間に）、二重鎖１９マー、すなわち分解された３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡであることが同定された。このことは、対応するｓｉＬＮＡの場合には観察されなかった。
【０１６４】
（実施例５：哺乳動物レポーターシステムにおけるｓｉＬＮＡの設計の試験）
異なるｓｉＲＮＡデザインおよび組み合わせの効力は、哺乳動物細胞培養物中のルシフェラーゼレポーター(reported)システム中で最初に評価した。使用するオリゴヌクレオチドを、表１に示す。センスおよび対応アンチセンスのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、二重鎖（すなわち、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＬＮＡ）を得た。
【０１６５】
使用する細胞は、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３セルラインであった。ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ（Invitorogen社製, Paisely, UK）（このものは、１０％胎仔ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを用いて補足する）中で保った。該プラスミドは、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーのコントロール下でホタルルシフェラーゼをコードするｐＧＬ３−コントロールとし、そしてＨＳＶ−ＴＫプロモーターのコントロール下でウミシイタケルシフェラーゼをコードするｐＲＬ−ＴＫとした。
【０１６６】
（トランスフェクション）
トランスフェクションの１日前に、細胞を２４ウェルプレート中、５００μＬの培地中に播種し、接着させ、そしてトランスフェクション時点で集密を７０〜９０％にまで到達させた。細胞を抗体のない培地中に播種し、そしてトランスフェクションミックスを細胞に加える直前に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（５００μＬ）に変えた。標準的な同時トランスフェクション混合物は、ｐＧＬ３−コントロール（５１０ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（５１ｎｇ）およびｓｉＲＮＡ（３４０ｎｇ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（インビトロゲン社(Invitrogen)製）（１５０μＬ）に、およびリポフェクタミン(LipofectAMINE)２０００（インビトロゲン社製）（３μＬ）を別のＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（１５０μＬ）に別々に加えることによって、３組のウェルとして調製した。該２個の溶液を混合し、そしてこのものを室温で２０〜３０分間インキュベートし、その後にこのものを該細胞に加えた。該トランスフェクションミックス（１００μＬ）を、該３個のウェルの各々に加えた。該媒地＋トランスフェクションミックスの最終的な容量は、６００μＬであった。該ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡの濃度は、約１３ｎＭに相当した。細胞を該トランスフェクションミックスと一緒に４時間インキュベートし、次いで該培地を十分に補足したＤＭＥＭに変えた。
【０１６７】
（デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ（プロメガ(Promega)社製））
細胞を受動溶解緩衝液(passive lysis buffer)中で収集し、そしてこのものを、基質ディスペンサー(substrate dispenser)（BMG Labtechnologies社製, Offenburg, 独国）を有するＮｏｖｏＳＴＡＲ  ９６ウェルフォーマット・ルミノメーターを用いて、プロトコール（プロメガ社製）に従ってアッセイした。試料（１０μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェル中に適用し、そしてルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（ホタルルシフェラーゼについての基質）（５０μＬ）をルミノメーターによってウェルに加え、そして測定した。次いで、ストップ・アンド・フロー(Stop and Glow)（ホタルルシフェラーゼの場合のストップ溶液およびウミシイタケルシフェラーゼの場合の基質）（５０μＬ）を加え、そして測定した。１０秒間測定したルシフェラーゼ活性の平均値を用いて、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼとの間の比率またはその逆を計算した。
【０１６８】
（実施例６：インビトロモデル：内因的な標的に及ぼす効力の評価）
使用する細胞は、ラットの副腎褐色細胞腫、ＰＣ１２セルラインである。ＰＣ１２を、ＤＭＥＭ（このものは、１０％ウマ血清、５％胎仔ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン(streptomycine)およびグルタミンを用いて補足する）中に保った。内因性遺伝子（ＰＣ１２細胞中のＮＰＹなど）についての該ｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡトランスフェクションプロトコールは上記の同じ方法に従うが、ルシフェラーゼプラスミドなしで且つＮＰＹを標的とするｓｉＲＮＡを加えるのみとする（その理由は、ＮＰＹ遺伝子はＰＣ１２細胞中で内因的に発現するからである）。最終的なｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡの濃度は、１〜１００ｎＭの範囲内である。細胞を通常、トランスフェクトの２４〜４８時間後に収集し、そしてｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。ＰＣ１２中での該ＮＰＹ標的の下方調節を、図３に示す。
【０１６９】
（実施例７：インビトロモデル：標的の阻害の分析）
（リアルタイムＰＣＲによる発現）
標的のｓｉＬＮＡまたはｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングは、当該分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、標的ｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競争的ポリメラーゼ連鎖反応(competitive polymetargete chain reaction)（ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲによって定量した。リアルタイム定量ＰＣＲが、現在好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて行なうことができる。ＲＮＡ単離およびＲＮＡ分析の方法（例えば、ノーザンブロット分析）は当該分野においてルーチンであり、そしてこのものは例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons中で教示されている。
【０１７０】
細胞を収集し、そしてｍＲＮＡを抽出した。標準的なリアルタイムＰＣＲプロトコールを用いて、遺伝子特異的なプライマー、および内部コントロールとしてのハウスキーピング遺伝子に対するプライマー対（例えば、サイクロフィリン）と一緒に、ｍＲＮＡから増幅した。下方調節を、コントロールｍＲＮＡの量に対する標的ｍＲＮＡの量の比率として表現した。リアルタイム定量（ＰＣＲ）を、商業的に入手可能なｉＱマルチカラーリアルタイム(Multi-Color Real Time)ＰＣＲ検出システム（BioRAD社製）を用いて容易に達成することができる。
【０１７１】
（実施例８：インビトロ分析：ｓｉＬＮＡオリゴヌクレオチドによるレポーター標的発現のＳｉＲＮＡ阻害）
ＬＮＡモノマーを用いて、ｓｉＲＮＡと比較した効果を維持しながら（未処理の試料と比較してホタルルシフェラーゼ発現を＞９０％阻害）、ｓｉＲＮＡ中のセンス鎖の両末端を改変することができる。該アンチセンス鎖はまた、効果の低下なしで３’末端で改変することができ、一方でアンチセンス鎖の５’末端での改変は該効果を２５〜５０％の阻害まで低下した。該センス鎖中の全てのウラシル含有残基をＬＮＡチミンに交換することによって、該効果を８０％阻害まで低下させた。該アンチセンス鎖の同様な改変は、該効果を消滅させた（図４）。ｓｉＬＮＡアンチセンス鎖の５’末端のリン酸化は、該低下を改善しなかった（２０〜３０％の低下、データは示さない）。ウミシイタケルシフェラーゼを標的とする同様な実験は、センス鎖の両末端をＬＮＡモノマーで改変することができ、一方でアンチセンス鎖は３’末端ＬＮＡモノマー改変を許容するが（全ての場合で９５％阻害）、しかし３’末端および５’末端でのＬＮＡ改変の両方について阻害の低下を示した。７５％までの阻害が観察された（図５）。ＬＮＡ／ＲＮＡの安定性は、１００％ラット血清中での全てのＲＮＡウラシルからＬＮＡチミジンのオリゴ（２１８９）について測定し、ここで、該安定性は裸ＤＮＡオリゴと同様であった。非改変ＲＮＡ一本鎖（ＧＬ−３）および非改変二重鎖（ＧＬ３＋／−）は、０時で既に分解した（図６）。
【０１７２】
（実施例９：ＳｉＬＮＡによる内因的な(Endogenious)標的のｓｉＲＮＡの阻害）
（細胞毒性の阻害）
細胞を、ｓｉＲＮＡもしくはｓｉＬＮＡのそれぞれ（８５ｎＭ）（ＳＡＲＳ１〜４、図７を参照）、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）もしくはラット神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）遺伝子を標的とするコントロールｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。モックのトランスフェクト細胞をリポフェクタミン２０００だけを用いて処理し、そしてこのものを正コントロールとして使用した。非感染性細胞を、負コントロールとして含む。トランスフェクト細胞を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの６０,０００、６,０００または６００のＴＣＩＤ５０のいずれかを用いて感染させた。感染の５０時間後に、該ＣＰＥおよび細胞毒性を測定した。モックのトランスフェクト細胞と比較して最も有効なｓｉＲＮＡ、ＳＡＲＳ  １を用いて処理した細胞間でのＣＰＥには、著しい差違が存在した（図８）。該細胞毒性を、モックのトランスフェクトコントロール細胞と比較した、処理細胞からのＬＤＨ放出パーセントとして測定した。細胞毒性の阻害パーセントは、ｓｉＲＮＡ処理試料における細胞毒性パーセントを１００として算出した。４個のＰｏｌ特異的なｓｉＲＮＡおよびｓｉＬＮＡは、細胞毒性における様々な効果を有した（図９）。最も有効なｓｉＲＮＡおよびｓｉＬＮＡはＳＡＲＳ  １部位を標的とするものであり、このものは細胞毒性を６００  ＴＣＩＤ５０で６５％にまで低下した。該ＳＡＲＳ  ３部位は、全て３つのウイルス用量でｓｉＲＮＡを用いた場合に中位に有効であった。しかしながら、ＳＡＲＳ  ３はまた、全ての３つのウイルス用量でｓｉＬＮＡを用いることによって、ＳＡＲＳ  １と同じく有効な部位であった。該ＳＡＲＳ  ２部位およびＳＡＲ  ４部位は、いずれかのウイルス用量でｓｉＲＮＡまたはｓｉＬＮＡによるいずれかの効果をも示さなかった。該データは、４組の内の３個の独立した実験によって決定される平均値および標準偏差を示す。
【０１７３】
（ウイルスおよび細胞）
ベロ細胞を、全ての細胞実験について使用した。細胞を、５％ＦＣＳおよび１％ＰＥＳＴを含有するフェノールレッドなしのイーグルＭＥＭ中、３７℃且つ５％ＣＯ２で培養した。フランクフルト(Frankfurt)１単離物（ジーンバンク寄託番号AY291315、このものはDr. H. W. Doerrによって好意で提供された）を、ベロ細胞中で高力価にまで増殖した。２個のＴ２２５細胞培養フラスコからの上清液を貯蔵し、そしてこのものを１ｍＬのバイアル中、−８０℃で冷蔵し、そしてこのものはウイルスストックを構成した。該ストックウイルスは、ＢＮＩｏｕｔＳ２およびＢＮＩｏｕｔＡｓ１１プライマー、並びにＣｏｒ−ｐ−Ｆ２およびＣｏｒ−ｐ−Ｒ１プライマー２を用いる、診断用逆転写ＰＣＲによってＳＡＲＳ−ＣｏＶと同定した。該ウイルスストックを１０倍希釈物でまたは一定の希釈物で使用して、９６ウェル細胞培養プレート中でベロ細胞を感染した。該ウイルスストックを６００,０００倍に希釈して（これは、Reed-Muench方法によって決定する）、９６ウェル細胞培養プレート中でＴＣＩＤ５０に達しさせた。
【０１７４】
該ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、上記の通り製造した。該配列を、図７に示す。
【０１７５】
（トランスフェクション）
リポフェクタミン２０００（インビトロゲン社製）を用いて、該細胞をｓｉＲＮＡおよびｓｉＬＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクト効果は高く、そしてほとんどの細胞はトランスフェクトされた。該トランスフェクション媒地を４時間後に、フェノールレッドなしのイーグルＭＥＭに変えて、そして細胞を終夜増殖させて、集密単層を得た。
【０１７６】
（細胞変性および細胞毒性）
感染細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）を、細胞の球体化(cell rounding)および細胞培養プレートからの脱離として検出した。該ＣＰＥを、光学顕微鏡中でスコアした。該細胞毒性を、細胞毒性検出キット（ＬＤＨ）（ロシュ社(Roche)製、独国）を用いて測定した。リポフェクタミン２０００だけを用いて処理したモックのトランスフェクト細胞を、各ウイルス希釈でのウイルス感染によって引き起こされる細胞毒性の１００％としてセットした。非感染細胞を用いて、バックグラウンドの細胞毒性を決定した。細胞毒性パーセントは、［（（Ａｂｓ４９０試料−バックグラウンド）／（Ａｂｓ４９０モックのトランスフェクトコントロール−バックグラウンド））×１００］として測定した。細胞毒性の阻害は、［（１−（Ａｂｓ４９０試料−バックグラウンド）／（Ａｂｓ４９０モックのトランスフェクトコントロール−バックグラウンド））×１００］として算出した。
【０１７７】
（実施例１０：オフサイト(Off-Site)効果の低下）
ホタルルスフェラーゼの３’ＵＴＲにおけるＳＡＲＳのセンス／アンチセンス標的の阻害は、プラスミド：ｐＳ３Ｘｓ（ＳＡＲＳセンス標的の場合のｐＧＬ３）、ｐＳ３Ｘａｓ（ＳＡＲＳアンチセンス標的の場合のｐＧＬ３）、およびｐＧＬ３（ＳＡＲＳ標的なしの場合）を用いて、１．６ｎＭのｓｉＲＮＡ／ｓｉＬＮＡで行なった。
【０１７８】
該ＳＡＲＳ  ３標的配列を、ｐＧＬ３中のルシフェラーゼコード領域およびポリＡの間のホタルルシフェラーゼ３’ＵＴＲ中のセンス（ＳＡＲＳ  ｍＲＮＡに相当する配列）およびアンチセンス方向（ＳＡＲＳ  ｍＲＮＡに相補的な配列）中でクローニングした。ｐＧＬ３を、ＸｂａＩ（ｌｕｃ．停止コドンとおよびポリＡの間）、およびＸｂａ  Ｉオーバーハングを有するＳＡＲＳ  Ｓ３標的配列ＤＮＡオリゴ二重鎖を用いて切断した。
（Ｘｂａ  Ｉオーバーハングを有する、ＳＡＲＳ  ３標的（ＳＡＲＳゲノム位置１４５９３）ＤＮＡオリゴ二重鎖）
【数２】
0004755972.tif 000011
【０１７９】
オリゴ二重鎖のライゲーションは、センスまたはアンチセンス標的のいずれかを有する２個のプラスミド生成物を与える（ｐＳ３Ｘｓ：センス方向における標的、ｐＳ３Ｘａｓ：アンチセンス方向における標的）。該２個の異なるプラスミドを、実施例５に記載するプロトコールに従って、コントロールプラスミドｐＲＬ−ＴＫおよびｓｉＲＮＡ標的ＳＡＲＳ３またはｓｉＬＮＡ標的ＳＡＲＳ３と一緒に別個のＨＥＫ２９３細胞培養物中でトランスフェクトした（最終濃度は１．６ｎＭである）。細胞を２４時間インキュベートし、細胞を収集し、そしてルシフェラーゼ活性を実施例５に記載する通り測定した。
【０１８０】
アンチセンス鎖の十分な効果を維持しながら、ｓｉＲＮＡは望まないセンス鎖を失活することができる。ｓｉＲＮＡは、両方の鎖の効果を示す。ＳＡＲＳ  ３標的配列を、ｓｉＬＮＡおよびｓｉＲＮＡを２個の異なるプラスミドに及ぼす阻害効果についてアッセイした後に、センスおよびアンチセンスの両方の方向でクローニングした。
【０１８１】
ｓｉＲＮＡは、センス標的（ＳＡＲＳ  ｍＲＮＡ配列由来の一部、ルシフェラーゼ活性の〜９０％を低下）、並びにアンチセンス標的（ＳＡＲＳ  ｍＲＮＡに相補的な配列）の両方の下方調節を示す（〜５０％低下）。従って、ｓｉＲＮＡ中のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、下方調節効果を有する。しかしながら、ｓｉＬＮＡ  ＳＡＲＳ  ３はセンス標的を下方調節する等しく良好な効果を示し（〜９０％低下）、一方でアンチセンス標的には全く活性を示さない（０％低下）。従って、ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖は十分な効果を維持する一方で、望まないセンス鎖の効果は消滅する。このことは、ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ干渉機構で失活させることによってセンス鎖によるオフ標的を最小とすることができることを意味する（図１７）。
【０１８２】
（実施例１１：ｓｉＬＮＡのインビボ効力）
この研究の目的は、ＬＮＡモノマーの導入によって改変される２個の抗ｅＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのインビボ効力を試験することである。使用する化合物は、３０２９／３０３１および３０３０／３０３１であった。
【０１８３】
要するに、雌性ヌードマウス（ＮＭＲＩ  nu/nu, Charles River Netherlands社製, Maastricht, オランダ国）を、１５ＰＣ３およびミアパカ(Miapaca)異種移植片を用いて注入した。該１５ＰＣ３細胞およびミアパカ細胞は、Fluiterらによる(2002) Cancer Research 62, 2024-2028によって記載されている通り、ｅＧＦＰを発現する。
【０１８４】
腫瘍増殖の２週間後に、マウスを浸透圧ミニポンプ（Alzet 1007D, ロット番号10052-02（７日ポンプ）（Durect Corporation, Cupertino, CA））を皮下にフィットさせた。これらのポンプを３０２９／３０３１または３０３０／３０３１のいずれかを用いて充填して、０．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量を得た。該マウスを、５日間処理した。５日目に、該マウスを殺し、そして腫瘍蛍光を画像処理し、そしてＬＡＳ３０００発光(luminesent)画像処理装置（富士フィルム社製）を用いて測定した。該蛍光を、ＡＩＤＡソフトウェア（Raytest GmbH, Straubenhardt, 独国）を用いて定量化した。画像処理後に、腫瘍を採り出し、そしてこのものをタンパク質分析（ウェスタンブロット法）のために保存した。１５ＰＣ３について得られる結果を、図１８に示す。観察することができる通り、ｓｉＲＮＡ化合物は、腫瘍増殖において有意な効果を有した。同様な結果が、ミアパカ異種移植片モデルを用いた場合に得られた。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡを、ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ分析を用いてインプラント前および実験後（ポンプ内に残る(leftover)）に調べた。該ｓｉＲＮＡを、ヌクレーブジェノタイピングキット(Nucleave genotyping kit)（Waters, Milford, MA, 米国）からの精製プレートを用いるイオン交換によって精製し、そしてBiflex III MALDI（ブルカーインスツルメント社(Brucker instruments)製、Leipzig、独国）によるマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて分析した。データを、図２０に示す。
【表４】
0004755972.tif 000012
【表５】
0004755972.tif 000013
【表６】
0004755972.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１は、２個のフラノースのコンホメーション（Ｓ−タイプおよびＮ−タイプ）を示す図面である。
【図２】図２は、生物学的な液体中でのｓｉＲＮＡを超えるｓｉＬＮＡの改善された安定性を示す図面である。ＧＬ３＋／−は速く分解するが、一方でわずかに改変されたｓｉＬＮＡ（２１８５／２１８６番）およびより高度に改変されたｓｉＬＮＡ（２７０３−０１／２１８６番）は、著しく改善された安定性を示す。該安定性の研究は、生理学的な塩溶液中での１０％胎仔ウシ血清中、３７℃で行なった。
【図３】図３は、ｓｉＬＮＡによるＰＣ１２細胞中での内因性ＮＰＹ遺伝子の下方調節を示す図面である。被験化合物は、以下の通りである（左から右）：第２目のバーは、非関連(unrelated)ｓｉＬＮＡ。３番目のバーは、ＮＰＹ＋／１。４番目のバーは、２７９６／ＮＰＹ−。５番目のバーは、２７９５／ＮＰＹ＋。６番目のバーは、ＮＰＹ＋／２７９７。７番目のバーは、２７９６／２７９７。
【図４】図４は、ホタルルシフェラーゼの標的化および該発現の調整における、ｓｉＲＮＡの効果を示す図面である。該左のラインはｓｉＬＮＡのセンス鎖を、そして右のラインはアンチセンス鎖を示す。個々のライン上のマークは、ＬＮＡモノマーの位置を示す。右側の最後の２個のラインは、コントロールｓｉＲＮＡを示す。１番目のバー（左側）は、十分な非調整性ルシフェラーゼレポーター発現を示し、全ての試料をこのものに対して正規化する。被験化合物は、以下の通りである（左から右）；２番目のバーは、ＧＬ３＋／−であり；３番目のバーは、ＧＬ３＋／２１８６であり；４番目のバーは、ＧＬ３＋／２１８７であり；５番目のバーは、２１８４／ＧＬ３−であり；６番目のバーは、２１８４／２１８６であり；７番目のバーは、２１８４／２１８７であり；８番目のバーは、２１８４／ＧＬ３−であり；９番目のバーは、２１８５／２１８６であり；１０番目のバーは、２１８５／２１８７であり；１１番目のバーは、２７０３−１／ＧＬ３−であり；１２番目のバーは、２７０３−１／２１８６であり；１３番目のバーは、ＧＬ３＋／２１８９であり；１４番目のバーは、非関連ｓｉＲＮＡである。
【図５】図５は、ウミシイタケルシフェラーゼの標的化および該発現の調整における、ｓｉＬＮＡの効果を示す図面である。左のラインはｓｉＬＮＡのセンス鎖を示し、そして右のラインはアンチセンス鎖を示す。個々のライン上のマークは、ＬＮＡモノマーの位置を示す。１番目は、十分な非調整ルシフェラーゼレポーター発現を示し、全ての試料をこのものに対して正規化する。被験化合物は、以下の通りである（左から右）；２番目のバーは、ＲＬ＋／−であり；３番目のバーは、ＲＬ＋／２６９９−１であり；４番目のバーは、２７００−１／２６９９−１であり；５番目のバーは、２７０２−１／２６９９−１であり；６番目のバーは、ＲＬ＋／２７０１−１であり；７番目のバーは、２７００−１／２７０１−１であり；８番目のバーは、２７０２−１／２７０１−１である。
【図６】図６は、ＬＮＡモノマーおよびＲＮＡモノマー、二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、並びに一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡを含有する一本鎖オリゴのラット血清中での安定性を示す図面である。ｄｓＲＮＡおよびｓｓＲＮＡは直ぐに分解するが、しかし、ＬＮＡモノマーおよびＲＮＡモノマーを含有する無傷の一本鎖オリゴは２０〜４０分後に検出することができる。被験オリゴは、２１８９、対応するｓｓＲＮＡ（ＧＬ３−）およびｄｓＲＮＡ（ＧＬ３＋／１）であった。
【図７】図７は、ＳＡＲＳを標的とするｓｉＬＮＡおよびｓｉＲＮＡ化合物を示す図面である。大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡモノマーであり、そして小文字はＲＮＡモノマーである。
【図８】図８は、ＳＡＲＳで感染した場合でのベロ細胞中での細胞変性影響（ＣＰＥ）、およびｓｉＲＮＡ処置後のＣＰＥの低下を示す図面である。ｓｉＲＮＡ  ＳＡＲＳ  １を示す。モックは、トランスフェクション剤であるリポフェクタミン２０００のみを用いて処理する。非感染細胞をも示す。
【図９】図９は、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＬＮＡによる、ＳＡＲＳ誘発性細胞毒性の阻害を示す図面である。被験化合物は、以下の通りである。ＳＡＲＳ  １：２８４２−１／２８４３−１；ＳＡＲＳ  ２：２８７２−１／２８４５−１；ＳＡＲＳ  ３：２８４６−１／２８４７−１；ＳＡＲＳ  ４：２８４８−１／２８４９−１、並びに対応する非改変ｓｉＲＮＡである。ｓｉＬＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いて処置する際の差違は、最も有効な部位であるＳＡＲＳ  １について検出することができる。中位に有効な部位であるＳＡＲＳ  ３はｓｉＬＮＡによって改善されて、ＳＡＲＳ  １部位と同じくらいに有効となった。全てのＳＡＲＳ  ２およびＳＡＲＳ  ４においてｓｉＲＮＡ効力を示さなかった２個の部位は、いずれのｓｉＲＮＡ処置によってもいずれの効果を示さなかった。該阻害効果は、高ウイルス用量で低下する（６０,０００  ＴＣＩＤ５０）。コントロールは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、並びに神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）ｓｉＲＮＡおよびｓｉＬＮＡとした。有害な効果は、ｓｉＬＮＡコントロールによっては観察されなかった。細胞毒性は、感染の５０時間後での乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出として測定した。異なるグラフは、異なるウイルス用量（組織培養感染用量５０、ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図１０】図１０は、ヘリカーゼが最も弱い結合末端でｓｉＲＮＡ二重鎖をほどく、ＲＩＳＣロードの推定機序を示す図面である。
【図１１】図１１は、アンチセンス鎖の５’末端の反対側に導入される一本鎖塩基対ミスマッチの効果を示す図面である。ラインはＲＮＡの取り込みを、円形はＬＮＡモノマーの取り込みを、そして十字形はミスマッチの取り込みを示す。被験化合物は、以下の通りである（左から右）。ウミシイタケルシフェラーゼ：２番目のバーは、ＲＬ＋／−であり；３番目のバーは、ＲＬ＋／２７０１−１であり；４番目のバーは、ＲＬ＋(ｐｏｓ．１９Ａ→Ｃ)／２７０１−１であり；５番目のバーは、ＲＬ＋(ｐｏｓ．１９Ａ→Ｃ)／−である。ホタルルシフェラーゼ：２番目のバーは、ＧＬ３＋／−であり；３番目のバーは、ＧＬ３＋／２１８７であり；４番目のバーは、ＧＬ３＋(ｐｏｓ.１９Ａ→Ｃ)／２１８７であり；５番目のバーは、ＧＬ３＋(ｐｏｓ.１９Ａ→Ｃ)／−である。
【図１２】図１２は、アンチセンス鎖におけるＬＮＡモノマーの位置の効果を示す図面である。ラインはＲＮＡを、そして円形はＬＮＡモノマーを示す。被験化合物は、以下の通りである（左から右）：２番目のバーは、ＧＬ３＋／−であり；３番目のバーは、ＧＬ３＋／２１８７であり；４番目のバーは、ＧＬ３＋／２７８９であり；５番目のバーは、ＧＬ３＋／２７９０であり；６番目のバーは、ＧＬ３＋／２７９２であり；７番目のバーは、ＧＬ３＋／２７９３であり；８番目のバーは、ＧＬ３＋／２７９４であり；９番目のバーは、ＧＬ３＋／２８６４あり；１０番目のバーは、ＧＬ３＋／２８６５であり；１１番目のバーは、ＧＬ３＋／２８６６であり；１２番目のバーは、ＧＬ３＋／２８６７である。
【図１３】図１３は、中程度に有効な標的部位のｓｉＬＮＡによる改善を示す図面である。モックは、非オリゴを示す。Ｒｅｎ１はｓｉＲＮＡに対する最適な標的部位であり、Ｒｅｎ２およびＲｅｎ３は力価が劣る部位である。ラインはＲＮＡを、そして円形はＬＮＡモノマーを示す。被験化合物は、以下の通りである：Ｒｅｎ１：ＲＬ＋／−；Ｒｅｎ２：２８６３／対応する非改変アンチセンス鎖；Ｒｅｎ３：２８２６／対応する非改変アンチセンス鎖、並びに対応する非改変ｓｉＲＮＡ。
【図１４】図１４は、ｓｉＬＮＡおよびｓｉＲＮＡの濃度依存性遺伝子サイレンシング効果を示す図面である。
【図１５】図１５は、ＤＮＡモノマーおよびＬＮＡモノマーの取り込みによる、改変ｓｉＲＮＡのデザインの改善を示す図面である。
【図１６】図１６は、アンチセンス鎖における切断部位１０でのバルキーな核酸塩基の代わりにＬＮＡモノマーを（Ｕの代わりにＴ）用いることによる、ｓｉＬＮＡ効力の低下を示す図面である。被験化合物は、以下の通りである：ｓｉＲＮＡ：ＧＬ３＋／−；ｓｉＬＮＡ１０Ｔ：ＧＬ３＋／２８６５；ｓｉＬＮＡ１０Ｕ：ＧＬ３＋／２８６５−Ｕ。
【図１７】図１７は、ホタルルシフェラーゼの３’−ＵＴＲにおけるＳＡＲＳセンス／アンチセンス標的の阻害を示す図面である。
【図１８】図１８は、１５ＰＣ３−ＥＧＦＰ異種移植片ＮＭＲＩマウスに及ぼす、２個の抗−ＥＧＦＰ  ｓｉＬＮＡ（３０２９／３０３１および３０３０／３０３１）のインビボ抗腫瘍効果を示す図面である。
【図１９】図１９は、Ａｌｚｅｔ  １００７Ｄミニポンプを用いる、ｓｉＬＮＡおよび生理食塩水で処置した１５ＰＣ３−ＥＧＦＰ異種移植片ＮＭＲＩマウスの腫瘍の大きさを示す図面である。該腫瘍を、０日目に実行(implement)した。該処置を７日目に開始し、そして１２日目に終止した。観察することができる通り、該ｓｉＬＮＡ処置マウスは、コントロールマウスのものに相当する腫瘍の大きさを有した。
【図２０】図２０は、ｓｉＬＮＡ二重鎖がＡｌｚｅｔ  １００７Ｄミニポンプ中で７日後に無傷であることを示す図面である。
【図１】
0004755972.tif 000016
【図２】
0004755972.tif 000017
【図３】
0004755972.tif 000018
【図４】
0004755972.tif 000019
【図５】
0004755972.tif 000020
【図６】
0004755972.tif 000021
【図７】
0004755972.tif 000022
【図８】
0004755972.tif 000023
【図９】
0004755972.tif 000024
【図１０】
0004755972.tif 000025
【図１１】
0004755972.tif 000026
【図１２】
0004755972.tif 000027
【図１３】
0004755972.tif 000028
【図１４】
0004755972.tif 000029
【図１５】
0004755972.tif 000030
【図１６】
0004755972.tif 000031
【図１７Ａ】
0004755972.tif 000032
【図１７Ｂ】
0004755972.tif 000033
【図１８】
0004755972.tif 000034
【図１９】
0004755972.tif 000035
【図２０Ａ】
0004755972.tif 000036
【図２０Ｂ】
0004755972.tif 000037
【配列表】
0004755972000001.app