(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有するバチルス・チューインゲンシス（Bacillus thuringiensis）  ＴＫ−Ｅ６株（FERM P-17981菌株）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な殺虫性細菌、殺虫性のタンパク質をコードする遺伝子、殺虫性タンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
地球温暖化及び都市温室効果による気温上昇に伴い、ハエやカ等の衛生害虫の生育域は年々拡大している。その結果、これまで熱帯特有とされていたマラリヤのようなカを媒介とする病気の発生地域も温帯まで広がり、近い将来世界的に深刻な被害をもたらすことが危惧される。このため双翅目昆虫をはじめとする衛生害虫の効果的な駆除方法の確立を急ぐ必要がある。
害虫の駆除には化学農薬が安価であり即効性も高いことから多用されてきたが他の生物や人類の生活環境への二次的、三次的影響が問題となっている。これに対し細菌、例えば Bacillus thuringiensis (Bt) を用いた害虫の駆除は、標的昆虫に対する選択活性が高くヒトや家畜への害や農作物の生育への影響は認められず、更に残留性が低いことから微生物農薬としての積極的な利用が世界的に注目されている。Bacillus thuringiensis (Bt)は土壌中に広く生息するグラム陽性菌で、胞子形成期にクリスタルと呼ばれる結晶性の殺虫タンパク質（Ｃｒｙタンパク質）を含む顆粒を菌体内に産生する。Ｃｒｙタンパク質の殺虫活性はその種類によって異なり、例えばＣｒｙ１は鱗翅目（アオムシ、ケムシ等）、Ｃｒｙ４は双翅目（ボウフラ、ウジ虫）というように高い殺虫特異性を示す。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
Bacillus thuringiensisの亜種 israelensis (Ｂｔｉ)は、双翅目昆虫特異的な殺虫活性を持ち、カの駆除を目的として実用化されている唯一の菌である。しかし１種類のＢｔの長期間にわたる使用は耐性昆虫の出現を促すことがこれまでの例から知られており、Ｂｔｉに対する耐性昆虫の出現も時間の問題であると考えられている。従って、Ｂｔｉに代わる双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有する細菌を見出すことが必要である。また、さらに殺虫活性の高いタンパク質に対する必要もある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者は鋭意研究を行なった。その結果、殺虫性のタンパク質を産性する新規細菌を土壌より発見した。この細菌はBacillus thuringiensisに属し、Bacillus thuringiensis TK-E6 と命名された。更に該細菌の遺伝子より殺虫性タンパク質をコードする３つの遺伝子をクローニングすることにも成功した。
【０００５】
従って、本発明は、新規な細菌、Bacillus thuringiensis TK-E6に関する。
【０００６】
本発明はまた、配列番号１の第１６１〜３９７３番目の塩基配列を含む遺伝子（ｃｒｙＥ６Ｌ）に関する。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｌ）をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｌ）に関する。
【０００７】
本発明はまた、配列番号３の第９１〜３９３３番目の塩基配列を含む遺伝子（ｃｒｙＥ６Ｓ）に関する。
本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｓ）をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｓ）に関する。
【０００８】
本発明はまた、配列番号５の第５６８〜４３３２番目の塩基配列を含む遺伝子（ｃｒｙＥ６Ｑ）に関する。
本発明はまた、配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｑ）をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｑ）に関する。
【０００９】
本発明の細菌Bacillus thuringiensis TK-E6は以下のような特性を有する。
（ａ）形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：  悍菌（１．０ｘ４．０μｍ）連鎖状
（２）運動性：有り
鞭毛の着生状態：周毛
（３）胞子：有り
胞子の形態：準端立、楕円形芽胞、芽胞による菌体の変化なし
【００１０】
（ｂ）培養的性質
（１）肉汁液体培養：沈降
（２）リトマス・ミルク：凝固
【００１１】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：＋
（２）硝酸塩の還元：−
（３）脱窒反応：＋
（４）ＭＲテスト：＋
（５）インドールの生成：−
（６）硫化水素の生成：−
（７）デンプンの加水分解：＋
（８）クエン酸の利用性
Koser 培地：−、 Christensen 培地：＋
（９）無機窒素源の利用性
硝酸塩：＋ｗ、アンモニウム塩：＋ｗ
（１０）ウレアーゼ：−
（１１）オキシダーゼ：−
（１２）カタラーゼ：＋
0004753108.tif 000002
（１４）嫌気培養：＋
（１５）カゼイン加水分解：＋
（１６）チロシン寒天：−
（１７）卵黄培地：−
（１８）ＮａＣｌ：２％  ＋；  ５％  ＋；  ７％  ＋；  １０％  −
（１９）馬尿酸塩の分解：−
（２０）フェニルアラニンの脱アミノ反応：−
（２１）ＮａＣｌ及びＫＣｌ要求性：−
（２２）Ｏ−Ｆテスト（Hugh  Leifson法）：−
0004753108.tif 000003
【００１２】
（ｄ）化学分類的性質
ＴＫ−Ｅ６の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５プライム末端の配列を配列番号７に示す（塩基数１５４８）。MicroSeq データベースと照合し近縁の上位１０菌株とその相違性を以下に示す。この結果ＴＫ−Ｅ６はBacillus thuringiensisに属するものと同定した。
【表１】
0004753108.tif 000004
【００１３】
（ｅ）ＴＫ−Ｅ６を特徴付ける性質
胞子形成期に菌体内にクリスタルと呼ばれる結晶性殺虫タンパク質を形成する。
この細菌Bacillus thuringiensis TK-E6は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８１として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。
【００１４】
更に本発明者は、この菌から殺虫性タンパク質をコードする３つの遺伝子がクローニングすることに成功した。
本発明は、配列番号１の塩基配列において第１６１番目のＡから第３９７３番目のＧを含む単離された遺伝子（ｃｒｙＥ６Ｌ）に関する。この遺伝子は殺虫性タンパク質をコードしている。
配列番号１の塩基配列において第１６１〜１６３番目の開始コドンＡＴＧから第３９７１〜３９７３番目の終止コドンＴＡＧに対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明は配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質（CｒｙＥ６Ｌ）をコードする単離された遺伝子にも関する。遺伝子暗号の縮重により配列番号２のアミノ酸配列をコードする多数の遺伝子が存在し得ることを当業者は理解するであろう。そのようなすべての遺伝子は本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
本発明は、配列番号３の塩基配列において第９１番目のＡから第３９３３番目のＡを含む単離された遺伝子（ｃｒｙＥ６Ｓ）に関する。この遺伝子は殺虫性タンパク質をコードしている。
配列番号３の塩基配列において第９１〜９３番目の開始コドンＡＴＧから第３９３１〜３９３３番目の終止コドンＴＧＡに対応するアミノ酸配列を配列番号４に示す。本発明は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｓ）をコードする単離された遺伝子にも関する。
【００１６】
本発明は、配列番号５の塩基配列において第５６８番目のＡから第４３３２番目のＧを含む単離された遺伝子（ｃｒｙＥ６Ｑ）に関する。この遺伝子は殺虫性タンパク質をコードしている。
配列番号５の塩基配列において第５６８〜５７０番目の開始コドンＡＴＧから第４３３０〜４３３２番目の終止コドンＴＡＧに対応するアミノ酸配列を配列番号６に示す。本発明は配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｑ）をコードする単離された遺伝子にも関する。
【００１７】
本発明の細菌を微生物農薬としてそのまま用いることもできるが、本発明の遺伝子を用いて周知の組換えＤＮＡ技術により該遺伝子がコードする殺虫性タンパク質を製造することができる。本発明者は組換えＤＮＡ技術により該殺虫性タンパク質（CｒｙＥ６Ｌ、ＣｒｙＥ６Ｓ、及びＣｒｙＥ６Ｑ）を発現させることにも成功した。
組換えＤＮＡ法による本発明のタンパク質の製造の基本的な工程は以下のようである。
（１）本発明の遺伝子であるＤＮＡを調製する。
（２）該タンパク質を発現させるのに適した方法で該遺伝子を発現ベクターに導入する。
（３）適当な真核又は原核宿主細胞を該ベクターで形質転換して組換え宿主細胞を形成する。
（４）該組換え細胞を培養して本発明のタンパク質を産性させる。
（５）当業者に周知のいずれかの適当な方法で該タンパク質を回収する。
【００１８】
本発明は、本発明による核酸分子を有するベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子操作で従来用いられる他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を用いて様々なプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、 Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 及び Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994) に記載の技術を参照。本発明に従い好ましく用いられるプラスミド及びベクターには当業者に周知のものが含まれる。或いは、本発明の遺伝子及びベクターを標的細胞に運搬するリポソーム中へ再構築することができる。
【００１９】
好ましい態様では、ベクター中に存在する核酸分子を原核又は真核細胞中で遺伝子を発現させることができるコントロール配列に結合する。
「コントロール配列」という用語は、それらが結合するコード配列を発現させるに必要な制御ＤＮＡ配列を言う。そのようなコントロール配列の性質は、宿主生物により異なる。原核生物では、コントロール配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物ではコントロール配列は一般にプロモーター、ターミネーター及びある場合にはトランスアクチベーター又は転写因子を含む。「コントロール配列」という用語は最小でもその存在が発現に必要であるすべての成分を含むことを意図し、更なる有用な成分をも含んでもよい。
【００２０】
「作動可能に結合した」という用語は、該成分がそれらの意図され方法で作用することを可能にする関係にある位置を言う。コード配列に「作動可能に結合した」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成されるような方法で結合される。コントロール配列がプロモーターである場合には、２本鎖核酸が好ましく用いられることは当業者に自明である。
【００２１】
従って本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択した宿主細胞を形質転換し、選択した宿主細胞中でコード配列を発現させるため用いることができる構築物である。発現ベクターは例えばクローニング、バイナリーベクター又はインテグレイティングベクターであり得る。発現は好ましくは翻訳可能なｍRNAへの核酸分子の転写を含む。原核及び／又は真核細胞中での発現を確実にする調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは通常転写の開始を確実にするプロモーター、及び場合により転写の終了及び転写物の安定化を保証するポリAシグナルを通常含む。一般的に用いられるプロモーターは、ポリユビキチンプロモーター、及び  発現の場合にはアクチンプロモーターである。更なる調節要素は転写エンハンサーを含みうる。原核宿主細胞での発現を可能にする可能な調節要素は、例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるＰL、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターであり、真核宿主細胞での発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター。哺乳動物及び他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−，ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハサー又はグロビンイントロンである。Okayama-Bergの発現ベクターｐｃＤＶ１(Pharmacia)、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３（In-vitorogen）、ｐＳＰＯＲＴ１（GIBCO  BRL）等の適当な発現ベクターが当業者に知られている。該タンパク質を発現させるのに用い得る別の発現システムは昆虫システムである。そのようなシステムの１つにおいて、Autographa california 核ポリヘドロシスウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて Spodoptera frugiperda 細胞又は Trichoplusia larvae中で外来遺伝子を発現させる。本発明の遺伝子のコード配列をポリヘドリン遺伝子等のウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置いてもよい。該コード配列を首尾よく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子が非活性になり、コートタンパク質を欠いた組換えウイルスが得られるであろう。その組換えウイルスを用いて、Spodoptera frugiperda 細胞又は Trichoplusia larvaに感染させ、その中で本発明のタンパク質を発現させる（Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227）。有利には本発明の上記ベクターは選択可能なマーカーを含む。
【００２２】
本発明はさらに核酸配列が宿主細胞にとって外来である、上記のベクター又は本発明の遺伝子を含む宿主細胞に関する。
「外来」とは核酸分子が宿主細胞に関して異種であるか（これは異なった遺伝的背景を有する細胞又は生物に由来することを意味する）、或いは宿主細胞に関してはホモロガスであるが、該核酸分子の天然に存在する対応物と異なる遺伝的環境にあることを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞に関してホモロガスであるなら、それは該宿主細胞のゲノムの天然の位置にはないこと、特に異なる遺伝子に取り囲まれていることを意味する。この場合、核酸分子はそれ自身のプロモーターの支配下にあるか、又はヘテロロガスなプロモーターの支配下にあってもよい。宿主細胞中に存在する本発明によるベクター又は遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよく、染色体外にある形で保持されていてもよい。これに関し、本発明の遺伝子はホモロガスな組換えにより変異体遺伝子を回復し、又は創出するのに用いてもよい（Paszkowski編, Homologous Recombination and Gene Sllencing in Plants, Kluwer Academic Publishers (1994)）。
【００２３】
従って、本発明は本発明のベクター又は遺伝子を含む宿主細胞に関する。
宿主細胞は（古）細菌、昆虫、菌類、植物、又は動物細胞等のいずれの原核又は真核細胞でありうる。好ましい菌類細胞は、例えば Saccharomyces 属の細胞、特に Saccharomyces cerevisiae の細胞である。
【００２４】
「原核」と言う用語は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡ又はＲＮＡで形質転換又はトランスフェクトされ得るすべての細菌、例えば古細菌を含むことを意図する。原核宿主は、例えばE. coli、 S. typhimurium、 Serratia marcescens、及び Bacillus subtilis 等のグラム陽性及びグラム陰性細菌を含み得る。「真核」と言う用語は、酵母、高等植物、昆虫、そして好ましくは哺乳動物細胞を含むことを意味する。組換え製造方法に用いる宿主によって、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質はグリコシル化されるかもしれないし、グリコシル化されないかもしれない。本発明のタンパク質は、最初のメチオニンアミノ酸残基を有していても、有していなくてもよい。当業者に一般的に知られたいずれかの技術を用いて本発明の遺伝子を用いて宿主を形質転換又はトランスフェクトすることができる。更に、融合し、機能的に結合した遺伝子の調製方法及びそれらを例えば哺乳動物及び細菌中で発現させる方法は当業者に周知である（Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。以下に本発明を実施例をもって説明するが本発明がこれら実施例によって限定されるものではないことは勿論である。
【００２５】
【実施例】
実施例１
ＰＣＲプライマーの設計
本発明の新規な細菌は、公知のＣｒｙタンパク質の保存配列に基づいて設計された縮重プライマーを用いたＰＣＲで増幅ＤＮＡ断片が得られるものとして検出し、分離された。Ｃｒｙタンパク質としてはいくつかのものが知られており、Ｎ−末端側半分には比較的保存されたアミノ酸配列を含む領域がある。
Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌を検出するために用いるＰＣＲプライマーを以下のように設計した。
Ｃｒｙタンパク質のＮ末端側半分にはＣｒｙタンパク質ファミリーで比較的保存されたアミノ酸配列を含む領域が５つ（ブロック 1〜ブロック 5）ある（図１参照）。Ｃｒｙ１Ａａ１（Accession No. M11250, Schnepf, H.E., Wong, H.C., and Whiteley, H.R., "The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence", J. Biol. Chem., 260, 6264-6272 (1985)）、Ｃｒｙ４Ａ、Ｃｒｙ４Ｂ（Accession No. D00248, D00247  Sen, K., Honda, G., Koyama, N., Nishida, M., Neki, A., Sakai, H., Himeno, M., and Komano, T., "Cloning and nucleotide sequences of the two 130 kDa insecticidal protein genes of Bacillus thuringiensis var. israelensis", Agric. Biol. Chem., 52, 873-878 (1988)）、Ｃｒｙ７Ａａ１（Accession No. M64478  Hofte, H.R., Annys, K., Lambert, B., Jansens, S., Soetaert, P., and Peferoen, M., "Novel Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein with a silent activity against coleopteran larvae", Appl. Environ. Microbiol., 58, 2536-2542 (1992)）及びＣｒｙ８Ａａ１（Accession No. U04364  Feitelson, J.S., Submitted (15-DEC-1993) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.(unpublished)）の該ブロック内のアミノ酸配列を比較することにより、センス鎖のプライマーはブロック１の中ほどにある８アミノ酸からなる保存された配列：Ｙ（Ｖ／Ａ）Ｑ（Ａ／Ｖ）ＡＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｈ／Ｎ）に対応する塩基配列をもとに、以下のような塩基配列を有する２３マーのオリゴヌクレオチド：
5'-TAYGYICARGYIGCIAAYYTHMA-3'
を合成した（配列番号８、以下ＢｔｉＦ４Ｂ１と呼ぶ）。
混合塩基による縮重を下げるため、Ｎの位置にはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃのいずれとも塩基対を形成できるイノシン（Ｉ）を挿入した。
同様にしてアンチセンス鎖のプライマーはブロック３の後半にある６アミノ酸残基からなる配列：Ｇ（Ｆ／Ｈ）ＴＧＧＤに対応する塩基配列の相補鎖の塩基配列をもとに１７マーのオリゴヌクレオチド：
5'-ATCYCCHCCYGTAWRHC-3'
を合成した（配列番号９、以下ＢｔｉＲ５Ｂ３と呼ぶ）。
【００２６】
実施例２
細菌の一次スクリーニング
細菌の一次スクリーニングとして、土壌細菌の中から実施例１のプライマーを用いたＰＣＲで増幅ＤＮＡ断片が得られるものを分離した。
土壌試料に滅菌水を加えて攪拌し、菌体及び胞子を抽出した。この抽出液を細菌培養用寒天培地に広げ、３０℃で１８時間培養してコロニーを形成させた。生じたコロニーそれぞれについて、実施例１のプライマーを用いたＰＣＲに供した。この段階でのＰＣＲは、菌体からＤＮＡを抽出することなく、菌体を直接反応液に懸濁させて行なうダイレクトＰＣＲ法を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は10mM Tris-HCl(pH 8.3)、 50mM KCl、 2.0mM MgCl2、 2.5mM dNTPs、 5.0μM プライマーBtiF4B１（センス）、5.0μM プライマーBtiR5B3（アンチセンス）、2.5U Taq ポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq）であった。ＰＣＲプログラムは、１）９４℃で２分、２）９４℃で３０秒、３）４２℃で３０秒、４）７２℃で１分、５）工程２以下を２９回、６）７２℃で５分とした。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、予想される長さ（約１ｋｂｐ）の断片の得られるコロニーからの菌体をＬＢ／１５％グリセロールに懸濁して−８０℃で保存した。
【００２７】
実施例３
細菌の二次スクリーニング
一次スクリーニングで得た土壌細菌からプラスミドを含む全ゲノムを抽出、精製し、一次スクリーニングで用いたのと同じプライマーを用いてPCRを行った。PCR産物の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。このアミノ酸配列と既知のCryタンパク質との相同性から新規Cryタンパク質をコードする遺伝子と予想される菌株を選抜した。
実施例１の一次スクリーニングで得た各土壌細菌のコロニーをLB培地５mlに植菌し、30℃で18時間モノード振盪培養した。遠心分離により集菌し、菌体をリゾチーム緩衝液に懸濁して30℃で３時間リゾチーム処理をした後、アルカリ法を用いてプラスミドの抽出、精製を行った。この方法では、プラスミドの他に少量のゲノムDNAが混入することになるが、このままPCRの鋳型DNAとして用いた。PCRは鋳型DNAを10 ng、プライマー濃度をBtiF4B1, BtiR5B3ともに５μM、酵素はExTaqを0.5単位用いて行った。反応は、変性を96℃で30秒間、アニーリングを42℃で30秒間、伸長反応を72℃で１分間とし、これを30回繰り返した。アニーリング温度は混合プライマーの最も低いTmにあわせた。
【００２８】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動（1% SeaPlaqueGTG（宝酒造）、TAE緩衝液）によって分離し、約１kbpのDNA断片をゲルから抽出した。抽出したDNA断片は、TAクローニングベクターpGEM-T easy（Promega）上のPCR産物挿入部位にクローン化し、大腸菌DH5αに導入した。この組換え体からプラスミドを調製し、挿入DNA断片の塩基配列をシーケンス用プライマーM13primerM4（宝酒造）およびM13primerRV（宝酒造）、シーケンス反応キットABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（アプライド  バイオシステムズ  ジャパン）を用いて決定した。
このスクリーニング法では、目的のDNA断片はcry遺伝子のORFの一部となるので、得られた塩基配列をアミノ酸配列に置き換え、タンパク質のデータバンクを対象に相同性検索を行った。
【００２９】
単離した菌株のうち、TK-E6と名付けた菌株からはdegenerate PCRにより３種類の異なる塩基配列を持つDNA断片が得られ、いずれも既知Cryタンパク質と相同性の高いアミノ酸配列をコードしていた。この結果から、TK-E6は既知cry遺伝子と相同性の高い３種類の遺伝子（cryE6L, cryE6S, cryE6Q）を有することが推測された。
【００３０】
この細菌は、Bacillus thuringiensisに属する胞子形成性を有するグラム陽性菌であり、その分類学的性質は前記した通りである（菌の同定は株式会社エヌシーアイエムビー・ジャパンに依頼して行なった）。この細菌はBacillus thuringiensis TK-E6 と命名され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８１として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。
【００３１】
実施例4
ＴＫ−Ｅ６のボウフラに対する殺虫活性
ＴＫ−Ｅ６の一晩培養液１ｍｌをSchaeffer 培地（8％ ブイヨン、２mM MgSO4、26mM KCl、1mM Ca(NO3）2、 10μM MnCl2、 1μM FeSO4)100ml に植菌し、３０℃で９６時間振盪培養した。９６時間後、ほとんどの菌は胞子とクリスタルを形成し、自己溶菌した。顕微鏡観察により完全に溶菌していることを確認後、遠心分離（10,000 x g、 4℃、15分）してクリスタル（胞子及び細胞残査を含む）を回収した。このペレットを等量の滅菌水に懸濁し、ボウフラアッセイに用いるまで−２０℃に保存した。
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにアカイエカ幼虫（３齢）１匹とミリＱ水１００μｌを入れた。適宜希釈した上記試料液を１００μｌ加え、２５℃に放置した。１８時間後、死虫数をカウントした。結果を表２に示す。
【表２】
0004753108.tif 000005
【００３２】
実施例５
ｃｒｙＥ６Ｌのクローニング
ＴＫ−Ｅ６が有するｃｒｙＥ６Ｌの全塩基配列をゲノムウォーキングの要領で決定した。
実施例３の二次スクリーニングで得られたｃｒｙＥ６Ｌの約１ｋｂＤＮＡ断片の塩基配列をもとにシーケンスプライマーを合成し、ＰＣＲの時と同様にして調製したＤＮＡ１μｇを鋳型としてシーケンスを行なった。新たに決定された塩基配列から次のシーケンスプライマーを合成することでシーケンスを繰り返し、ＣｒｙＥ６Ｌタンパク質のＯＲＦを含む約５ｋｂｐのＤＮＡ領域の塩基配列を決定した。
次に、このORFを挟むように位置する２つのプライマー：
5'-CACTGCAAGATCATGGCTGTCAC-3'
（E6LcryS1、配列番号１０）
5'-AATTAGCAGGCTTAGCACAGACTTA-3'
（E6LcryA2、配列番号１１）
を用いてＰＣＲを行った。得られた産物をpGEM-T easyのクローニングサイトに挿入し、ゲノムウォーキングで用いたプライマー及びユニバーサルプライマーM13primerM4, M13primerRVを用いて塩基配列を決定して、4226 bpからなるこのＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１）がゲノムウォーキングの結果と一致することを確認した。
決定した4226 bpのDNA断片（配列番号１）には、この塩基配列の5'末端の塩基を第１番とすると第161〜163番目の開始コドンから始まり、第3971〜3973番目の終止コドンで終わる3813塩基のコーディング領域を取ることができる。このＯＲＦは1270個のアミノ酸からなる分子量143 kDaのタンパク質（配列番号２）をコードしていると推測された。このタンパク質のN-末端側半分にはCryタンパク質で保存された領域（ブロック１〜ブロック５）が存在し、C-末端側のアミノ酸配列は他の既知Cryタンパク質と40％程度の相同性をもっていた。
【００３３】
実施例６
ｃｒｙＥ６Ｓのクローニング
TK-E6が有する三種類のcry遺伝子のうち、cryE6Sと名付けた遺伝子の全塩基配列をゲノムウォーキングおよび逆PCR法（Inverse PCR）によって決定した。
二次スクリーニングで得られたcryE6Sの約１kb DNA断片の塩基配列をもとにシーケンスプライマーを合成し、ゲノムウォーキングの要領でプライマーBtiF4B1より上流約800 bpおよびプライマーBtiR5B3より下流約500 bpの塩基配列を決定した。得られた塩基配列の上流部分でアンチセンスプライマーE6SinvA1、下流部分でセンスプライマーE6SinvS1を合成し、逆 PCR法（小笠原直毅、笠原康裕：細胞工学別冊Tipsシリーズ  改訂PCR Tips（真木寿治  監修）p.61-64, 1999年、秀潤社）によりcryE6SのN-末端およびC-末端の塩基配列で未決定部分を決定した。
【００３４】
鋳型DNAの調製：
二次スクリーニングの時と同様にしてTK-E6から調製したプラスミドおよびゲノムDNA 10 μgを制限酵素EcoRIで完全消化した。フェノール処理およびエタノール沈殿によりDNA断片を精製後、滅菌水500 μlに溶解して20 μg/ml濃度とした。この液にT4 DNA ligase (TaKaRa) 2 単位、10×ライゲーション緩衝液 500 μl、滅菌水を加えて全量５mlとし（DNAの最終濃度は2 μg/ml）、16℃、18時間反応してEcoRI断片の自己閉環化を行った。ライゲーション反応後、２-ブタノールでDNA溶液を濃縮し、２-プロパノール沈殿でDNAを精製した。その後、滅菌水を加えて100 μg/ml溶液とし、これを鋳型DNAとして以下の逆PCR反応に用いた。
【００３５】
逆 PCR：
逆 PCRは５〜10 kbpを増幅させるためにTaKaRa LA Taqを用いた。また、PCRプログラムは２ステップで行えるようにプライマーのTm値は65℃以上になるように設計した。次のインバースプライマーを用いた。
E6SinvA1 (38-66) 29 マー：
5'-TCTTGACTGATCGCCCCTGCCACCATTAT-3'      （配列番号１２）
E6SinvS1 (1751-1780) 30 マー：
5'-TCGGTGGAGGCGTAGAGGAATCGGAGAGCA-3'    （配列番号１３）
反応液組成（50μl）は次のようである；200 ng鋳型DNA、0.2 μM E6SinvA1、0.2 μM E6SinvS1、LA Taq 2.5 U、10 mM dNTPs (各2.5 mM)、2.5 mM MgCl2。緩衝液は酵素キットに添付のもの（Mg2+ を含まず）を用いた。
ＰＣＲプログラム（30サイクル）は以下のようである。変性  94℃  30秒、アニーリングおよび伸長反応  65℃  10分。
【００３６】
PCR産物をアガロース電気泳動（１％SeaPlaque GTG、TAE 緩衝液）で確認したところ、約7.5 kbpに単一の増幅産物が検出されたため、これを抽出精製してTAクローニングベクターpGEM-T easyにクローン化した。このプラスミドをシーケンス用プライマーM13 プライマー M4とM13 プライマー RVでシーケンスすることにより、挿入された7.5 kbpのDNA断片がインバースプライマー E6SinvA1およびE6SinvS1で増幅されたものであることを確認した。また、このプラスミドを制限酵素EcoRIで消化すると、挿入されたDNA断片は約3 kbpと約4.5 kbpの２本に分けられた。以上のことから、クローン化したDNA断片はcryE6Sを含むEcoRI断片が自己閉環したものを鋳型とした逆PCR産物であると判断した。そこで、このプラスミドを用いてE6SinvA1の上流約100bpおよびE6SinvS1の下流約2.5 kbpの塩基配列を決定した。この結果と、縮重 PCRおよびゲノムウォーキングの結果をあわせることにより、CryE6Sタンパク質のORFを含む3933 bpのDNA領域の塩基配列が決定できた。
【００３７】
決定した3933 bpのDNA断片（配列番号３）には、この塩基配列の5'末端の塩基を第１番とすると第91〜93番目の開始コドンに始まり、第3931〜3933番目の終止コドンで終わる3843塩基のコーディング領域を取ることができる。このORFは1280個のアミノ酸からなる分子量144 kDaのタンパク質（CryE6S）（配列番号４）をコードしていると推測された。また、開始コドンから7塩基おいて上流（第79〜83番目）にはリボソーム結合部位のコンセンサス配列（GGAGG）を取ることができ、第1〜3番目の終止コドン（TAG）はCryE6SのORFと同じフレーム（読み枠）で取ることができる。
【００３８】
ORFの塩基配列は、これを挟むように設計した２つのプライマーを用いて行ったPCR産物の塩基配列を決定することにより確認した。２つのプライマーは、センス鎖は開始コドンから下流40塩基を、アンチセンス鎖はC-末端のアミノ酸Valのコドン（GTA）を含み上流25塩基の相補鎖の塩基配列（下線部）をもとに設計し、それぞれのプライマーの5'側には制限酵素NcoIの認識配列（CCATGG）を連結した。
センス鎖プライマー：NcoE6SNM (48 マー)
5'-CCATGGGTATGAAACAAAATTACAATGATGAATATGACATTATAGATA-3'（配列番号１４）
アンチセンス鎖プライマー：NcoE6SCt (32 マー)
5'-CCATGGTTACATTGGTAGGTGGCATGATCGGT-3'（配列番号１５）
PCR後、約3.8 kbpの産物をpGEM-T easyにクローン化し、塩基配列がゲノムウォーキングおよび逆PCRで得られた結果と一致することを確認した。
CryE6SのN-末端側半分にはCryタンパク質で保存された領域（ブロック１〜ブロック５）が存在し、C-末端側半分のアミノ酸配列は他の既知Cryタンパク質と40％程度の相同性を持っていた。
【００３９】
実施例７
ｃｒｙＥ６Ｑのクローニング
TK-E6が有する三種類のcry遺伝子のうち、cryE6Qと名付けた遺伝子の全塩基配列をゲノムウォーキングおよび逆PCR法（Inverse PCR）によって決定した。
二次スクリーニングで得られたcryE6Qの約１kbDNA断片の塩基配列をもとにシーケンスプライマーを合成し、ゲノムウォーキングの要領でプライマーBtiF4B1より上流約1.2 kbpの塩基配列を決定し、cryE6Qの5'領域を検出した。
新たに決定した塩基配列のうち、cryE6Qの上流部分にあたる非翻訳領域の塩基配列に基づきアンチセンスプライマーE6QinvA1およびセンスプライマーE6QinvS1を設計し、逆PCR法によりcryE6Qの3'領域の塩基配列で未決定部分を決定した。
【００４０】
鋳型DNAの調製
cryE6Sの時と同様に、TK-E6から調製したプラスミドおよびゲノムDNA 10 μgを制限酵素XbaIで完全消化し、ライゲーション反応によって自己閉環化したものを鋳型DNAとして用いた。
【００４１】
逆ＰＣＲ
インバースプライマーは以下のものを用いた。
E6QinvA1 (32 マー)
5'-GGATGGTTTTTCTGCGCTTTTCTTCTATGACA -3（配列番号１６）
E6QinvS1 (36 マー)
5'-AAGTATTTGCCTAGATAATGTGCTGAAATGTGGTGT -3'（配列番号    １７）
反応液組成（50 μ）は次のようである：200 ng鋳型DNA、0.2 μM E6QinvA1、0.2 μM E6QinvS1、LA Taq 2.5 U、10 mM dNTPs (各2.5 mM)、2.5 mM MgCl2。緩衝液は酵素キットに添付のもの（Mg2+ を含まず）を用いた。
ＰＣＲプログラム（30サイクル）は次のようである：変性  94℃  30秒、アニーリングおよび伸長反応  65℃  10分。
【００４２】
PCR産物をアガロース電気泳動（１％SeaPlaque GTG、TAE buffer）で確認したところ、約7.3 kbpに単一の増幅産物が検出されたため、これを抽出精製してTAクローニングベクターpGEM-T easyにクローン化した。このプラスミドをシーケンス用プライマーM13 プライマー M4とM13 プライマー RVでシーケンスすることにより、挿入された7.3 kbpのDNA断片がインバースプライマー E6QinvA1およびE6QinvS1で増幅されたものであることを確認した。また、このプラスミドを制限酵素XbaIで消化すると、挿入されたDNA断片は約1.1 kbpと約6.2 kbpの２本に分けられた。以上のことから、クローン化したDNA断片はcryE6Qを含むXbaI断片が自己閉環したものを鋳型とした逆PCR産物であると判断した。そこで、このプラスミドを用いてE6QinvA1の上流約150bpおよびE6QinvS1の下流約4 kbpの塩基配列を決定した。この結果と、縮重PCRおよびゲノムウォーキングの結果をあわせることにより、CryE6Qタンパク質のORFを含む4332 bpのDNA領域の塩基配列が決定できた。
【００４３】
決定した4332 bpのDNA断片（配列番号５）には、この塩基配列の5'末端の塩基を第１番とすると第568〜570番目の開始コドンに始まり、第4330〜4332番目の終止コドンで終わる3765塩基のコーディング領域を取ることができる。このORFは1254個のアミノ酸からなる分子量143 kDaのタンパク質（CryE6Q）（配列番号６）をコードしていると推測された。また、開始コドンから７塩基おいた上流（第556〜560番目）にはリボソーム結合部位のコンセンサス配列（GGAGG）を取ることができる。第520〜522番目の終止コドン（TGA）はCryE6QのORFと同じフレーム（読み枠）にある。
【００４４】
ORFの塩基配列は、これを挟むように設計した２つのプライマーを用いて行ったPCR産物の塩基配列を決定することにより確認した。センス鎖プライマーは開始コドンを含み下流38塩基を、アンチセンス鎖プライマーはC-末端のアミノ酸Thrのコドン（ACA）を含み上流28塩基の相補鎖の塩基配列（下線部）をもとに設計し、それぞれのプライマーの5'側には制限酵素SphIの認識配列（GCATGC）を連結した。
センス鎖プライマー：SphE6QNM (46 マー)
5'-GCATGCAGATGAATTCAAATTATAACAATGAACATGAGATCTTAGA-3'（配列番号１    ８）
アンチセンス鎖プライマー：SphE6QCt (35 マー)
5'-GCATGCTTGTTAGATCCTGTTCTAAGTTTCCCGCC-3'（配列番号１９）
PCR後、約3.8 kbpの産物をpGEM-T easyにクローン化し、塩基配列がゲノムウォーキングおよび逆PCR法で得られた結果と一致することを確認した。
CryE6QのN-末端側半分にはCryタンパク質で保存された領域（ブロック１〜ブロック５）が存在し、C-末端側半分のアミノ酸配列は他の既知Cryタンパク質と40％程度の相同性を持っていた。
【００４５】
実施例８
cryE6Lの大腸菌内での発現
大腸菌の発現システムを用いてCryE6LのC-末端にヒスチジン残基６つが付加したHis-tag融合タンパク質を調製し、ウェスタンブロッティングにより確認した。用いた発現ベクターpQE-70（QIAGEN）は外来遺伝子挿入部位として制限酵素SphIの認識配列（GCATGC）をもち、配列中のATGを開始コドンとして使用する。挿入部位の上流にはT5プロモーター、２つのlacオペレーター、リボゾーム結合部位があり、IPTGにより外来遺伝子の発現を誘導することができる。また、下流には6×Hisタグが配置され、挿入された遺伝子の3'-末端と読み枠を合わせることによりC-末端にヒスチジン残基６つが付加したHis-tag融合タンパク質として産物を得ることができる。
【００４６】
cryE6Lアミノ酸コード領域の調製
cryE6Lの開始コドンから終止コドンの一つ前の塩基までをPCRにより増幅した。センス鎖プライマーSphE6LNMは開始コドンから下流36塩基（下線部）の配列と、その5'-側に発現ベクターと読み枠をあわせるための２塩基（AG）および制限酵素SphIの認識配列（GCATGC）を連結した。アンチセンス鎖プライマーSphE6LCtはCryE6Lタンパク質のC-末端アミノ酸のコドン（TTA）から上流32塩基の相補鎖配列（下線部）と、その5'-側に発現ベクターがもつ6×Hisタグと読み枠をあわせるための１塩基（T）および制限酵素SphIの認識配列（GCATGC）を連結した。
センス鎖プライマー：SphE6LNM（44マー）
5'- GCATGCAGATGAACCAAAATGACAACAAGAATGAATATGAAATA-3'  （配列番号２０）
アンチセンス鎖プライマー：SphE6LCt（39マー）
5'- GCATGCTTAAGTCGTCTTCCATCTGTTCCATACAAATGA-3'  （配列番号２１）
反応液組成（50μl）は5 ng鋳型DNA（二次スクリーニングの時と同じもの）、0.2μM SphE6LNM、0.2μM SphE6LCt、LA Taq 2.5 U、10 mM dNTPs（各2.5 mM）、2.5 mM MgCl2 。緩衝液は酵素キットに付属のもの（Mg2+を含まず）を用いた。PCRプログラムは、変性 94℃ 30秒、アニーリング60℃ 30秒、伸長反応72℃ 5分で30サイクル行った。
PCR後、約3.8 kbpの産物をpGEM-T easyにクローン化し、実施例５で用いたシーケンス用プライマーにより塩基配列を決定して挿入断片がSphE6LNMとSphE6LCtで増幅されたcryE6Lのアミノ酸コード領域であることを確認した。次に、このプラスミド 5μgを制限酵素SphIで消化（50 U、37℃、2時間）し、アガロース電気泳動（1% SeaPlaqueGTG、TAE緩衝液）によって約3.8kbpのcryE6L断片を分離精製した。
【００４７】
cryE6Lの発現ベクターへのクローニング
SphIで消化した約3.8kbpのcryE6L断片を発現ベクターpQE-70のSphI部位にクローン化し、挿入断片の向きがベクターのT5プロモーターの転写方向と一致すること、さらに、cryE6Lの読み枠がベクターの開始コドンおよび6×Hisタグの読み枠と一致することをユニバーサルプライマーpQEprimerPR、pQEprimerRVによる塩基配列決定で確認した。この組み換えプラスミドをpQE70-cryE6Lと名付け、CryE6Lタンパク質を発現誘導するために大腸菌M15[pREP4]（QIAGEN）に導入した。
【００４８】
CryE6L-Hisタグ融合タンパク質の発現誘導
pQE70-cryE6Lをもつ大腸菌M15[pREP4]をTB培地（500μg/mlカルベニシリン、25μg/mlカナマイシン、1%グルコースを添加）50 mlに植菌し、37℃で一晩振盪培養した。遠心分離後、菌体を新しいTB培地（1mM IPTGを含む）50 mlに懸濁し、さらに、37℃で一晩振盪培養することでCryE6L-Hisタグ融合タンパク質の発現誘導を行った。
【００４９】
CryE6L-Hisタグ融合タンパク質の精製および確認
IPTGによる誘導後、培地を遠心分離して集菌し、菌体をLysis Buffer（50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール）10 mlに懸濁した。この液を超音波破砕して菌体破砕液とし、遠心分離（15000 rpm、2分）して細胞残査を沈殿させた。回収した上清 4 mlに対してNi-NTA Agarose （QIAGEN）を1 mlの割合で加え、4℃で1時間穏やかに攪拌してHisタグ融合タンパク質を樹脂に吸着させた後、樹脂をポリプロピレンカラムに充填した。樹脂はWash Buffer （50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、20 mM イミダゾール）4 mlで2回洗浄した後、Elution Buffer （50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM イミダゾール）0.5 mlを4回通すことで、Hisタグ融合タンパク質を溶出し、精製Hisタグ融合タンパク質とした。
精製Hisタグ融合タンパク質（1μg）をSDS-PAGE（8%ポリアクリルアミドゲル）で泳動し、CBB染色を行うと、約160 kDaの位置にバンドが検出された。このバンドはウェスタンブロッティング（一次抗体：Tetra・HisTM Antibody、二次抗体：Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins (QIAGEN)）でも検出されたことから、CryE6L-Hisタグ融合タンパク質であることが確認できた（図２）。
【００５０】
実施例９
cryE6Sの大腸菌内での発現
センス鎖プライマー：NcoE6SNM（配列番号14）およびアンチセンス鎖プライマー：NcoE6SCt（配列番号15）によるPCR産物をクローン化したpGEM-T easy（実施例６）を制限酵素NcoIで消化し、得られた約3.8 kbp断片を発現ベクター pQE-60（QIAGEN）のNcoI部位にクローン化してpQE60-cryE6Sと名付けた。pQE-60は外来遺伝子挿入部位としてNcoI認識配列（CCATGG）をもち、配列中のATGを開始コドンとして使用する。他は、pQE-70と同じである。
挿入断片の向きおよび読み枠の確認、CryE6S-Hisタグ融合タンパク質の発現誘導、精製および確認はcryE6Lの場合と同様に行った。
【００５１】
実施例１０
cryE6Qの大腸菌内での発現
センス鎖プライマー：SphE6QNM（配列番号18）およびアンチセンス鎖プライマー：SphE6QCt（配列番号19）によるPCR産物をクローン化したpGEM-T easy（実施例７）を制限酵素NcoIで消化し、得られた約3.8 kbp断片を発現ベクター pQE-70（QIAGEN）のSphI部位にクローン化してpQE70-cryE6Qと名付けた。
挿入断片の向きおよび読み枠の確認、CryE6Q-Hisタグ融合タンパク質の発現誘導、精製および確認はcryE6Lの場合と同様に行った。
【００５２】
【配列表】
0004753108.tif 000006
0004753108.tif 000007
0004753108.tif 000008
【００５３】
0004753108.tif 000009
0004753108.tif 000010
0004753108.tif 000011
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0004753108.tif 000013
0004753108.tif 000014
0004753108.tif 000015
0004753108.tif 000016
0004753108.tif 000017
【００５４】
0004753108.tif 000018
0004753108.tif 000019
0004753108.tif 000020
【００５５】
0004753108.tif 000021
0004753108.tif 000022
0004753108.tif 000023
0004753108.tif 000024
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0004753108.tif 000028
0004753108.tif 000029
【００５６】
0004753108.tif 000030
0004753108.tif 000031
0004753108.tif 000032
【００５７】
0004753108.tif 000033
0004753108.tif 000034
0004753108.tif 000035
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0004753108.tif 000040
0004753108.tif 000041
【００５８】
0004753108.tif 000042
0004753108.tif 000043
【００５９】
0004753108.tif 000044
【００６０】
0004753108.tif 000045
【００６１】
0004753108.tif 000046
【００６２】
0004753108.tif 000047
【００６３】
0004753108.tif 000048
【００６４】
0004753108.tif 000049
【００６５】
0004753108.tif 000050
【００６６】
0004753108.tif 000051
【００６７】
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【００６８】
0004753108.tif 000053
【００６９】
0004753108.tif 000054
【００７０】
0004753108.tif 000055
【００７１】
0004753108.tif 000056
【００７２】
0004753108.tif 000057
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｃｒｙタンパク質の一般的な構造を示す。Ｃｒｙタンパク質で比較的保存されたアミノ酸配列を含む領域が５つ（ブロック１〜ブロック５）ある。
【図２】  大腸菌でのＣｒｙタンパク質（ＣｒｙＥ６Ｌ、ＣｒｙＥ６Ｓ，及びＣｒｙＥ６Ｑ）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上）及びウエスタンブロティング（下）である。
レーン３：精製したＣｒｙＥ６Ｌ、ＣｒｙＥ６Ｓ，又はＣｒｙＥ６Ｑの場合（タンパク質量１μｇ）。
レーン１及び２：本発明の遺伝子を含むプラスミド（pQE70-cry6L、pQE60-cryE6S,又はpQE70-cry6Q）で形質転換した大腸菌の培養液から菌体を分離し、菌体破砕した液（タンパク質量１０μｇ）の場合。レーン１はＩＰＴＧを添加して培養、レーン２はＩＰＴＧを添加せずに培養。
レーン４：本発明の遺伝子を含まない親のプラスミド（pQE70又はpQE60／Ｍ１５[ｐＲＥＰ４]で形質転換した大腸菌のＩＰＴＧを含む培養の培養液から菌体を分離し、菌体破砕した液（タンパク質量１０μｇ）の場合。
【図１】
0004753108.tif 000058
【図２】
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