(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［３］：
【化１】
0004753273.tif 000030
（式中、Ｑは酸素原子であり、Ｒ３は水素原子または塩素原子であり、Ｒ４は水素原子であり、Ｒ５は水素原子であり、Ｒ６は水素原子またはメチル基である）で示されるアセチルピリジン誘導体を、不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、立体選択的に還元することを特徴とする、一般式［４］：
【化２】
0004753273.tif 000031
（式中、Ｑ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、前記と同じであり、＊は不斉炭素を表す）で示される光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法であって、
前記光学活性ピリジンエタノールの絶対配置がＳ体であり、前記酵素または酵素源が、アシュベイ属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、クラビスポラ属、デバリオマイセス属、ディポダスカス属、ガラクトマイセス属、ゲオトリカム属、ギラモンデラ属、ハンセニアスポラ属、ハンセヌラ属、ハイホピキア属、イサッチェンキア属、クルイベロマイセス属、クライシア属、ロダロマイセス属、メシュニコワ属、オガタエア属、パキソレン属、ピキア属、ロドスポリディウム属、ロドトルーラ属、サッカロマイコプシス属、シュワニオマイセス属、スポリディオボラス属、スポロボロマイセス属、シゾブラストスポリオン属、ステファノアスカス属、トルラスポラ属、トリゴノプシス属、トリコスポロン属、ウイロプシス属、ヤマダジーマ属、チゴサッカロマイセス属、アルカリゲネス属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、セルロモナス属、コリネバクテリウム属、ジェンセニア属、オクロバクトラム属、シュードモナス属、ロドコッカス属、及びツカムレラ属からなる群より選ばれた微生物由来のものであるか、または、
前記光学活性ピリジンエタノールの絶対配置がＲ体であり、前記酵素または酵素源が、キャンディダ属、オガタエア属、ピキア属、ヤマダジーマ属、ブレビバクテリウム属、及びコリネバクテリウム属からなる群より選ばれた微生物由来のものである
製造方法。
【請求項２】
Ｑが酸素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６がいずれも水素原子である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド及び／又は酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドりん酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素、並びに、該還元のための基質を存在させて反応を行う請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
還元型へ還元する前記酵素がグルコース脱水素酵素であり、還元のための前記基質がグルコースである請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
還元型へ還元する前記酵素がギ酸脱水素酵素であり、還元のための前記基質がギ酸である請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
生成物である光学活性ピリジンエタノールの絶対配置がＳ体であり、前記酵素または酵素源が、アシュベイ属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、クラビスポラ属、デバリオマイセス属、ディポダスカス属、ガラクトマイセス属、ゲオトリカム属、ギラモンデラ属、ハンセニアスポラ属、ハンセヌラ属、ハイホピキア属、イサッチェンキア属、クルイベロマイセス属、クライシア属、ロダロマイセス属、メシュニコワ属、オガタエア属、パキソレン属、ピキア属、ロドスポリディウム属、ロドトルーラ属、サッカロマイコプシス属、シュワニオマイセス属、スポリディオボラス属、スポロボロマイセス属、シゾブラストスポリオン属、ステファノアスカス属、トルラスポラ属、トリゴノプシス属、トリコスポロン属、ウイロプシス属、ヤマダジーマ属、チゴサッカロマイセス属、アルカリゲネス属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、セルロモナス属、コリネバクテリウム属、ジェンセニア属、オクロバクトラム属、シュードモナス属、ロドコッカス属、及びツカムレラ属からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
生成物である光学活性ピリジンエタノールの絶対配置がＲ体であり、前記酵素または酵素源が、キャンディダ属、オガタエア属、ピキア属、ヤマダジーマ属、ブレビバクテリウム属、及びコリネバクテリウム属からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
以下の（１）から（７）の理化学的性質を有することを特徴とする酵素：
（１）作用：還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドを補酵素として、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元し、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する、
（２）特異性：ケトン及びアルデヒドに対して還元活性を有しているが、炭素環ケトン及びα−ケト酸のα位ケトンに対する還元活性は非常に低い、
（３）分子量：ゲル濾過分析において約６００００の分子量を示し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約２９０００の分子量を示し、
（４）キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｒｉｓ）に由来する、
（５）至適温度：５０℃〜５５℃、
（６）至適ｐＨ：５．０〜６．０、
（７）阻害剤：水銀イオンによって阻害される。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）の酵素：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素；
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する活性を有する酵素。
【請求項１０】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物に由来する請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｒｉｓ）に由来する請求項９〜１０のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１２】
キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ１０００３株に由来する請求項８〜１１のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１３】
前記酵素が請求項８〜１２のいずれか１項に記載の酵素であり、生成物である光学活性ピリジンエタノール誘導体の絶対配置がＲ体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１７】
グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを更に含有する請求項１６記載の組換えベクター。
【請求項１８】
前記グルコース脱水素酵素がバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものである請求項１７記載の組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項２０】
宿主が大腸菌である請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１６）である請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１７）である請求項２０記載の形質転換体。
【請求項２３】
請求項１４又は１５に記載のＤＮＡを含有する第１の組換えベクター、及び、グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを含有する第２の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項２４】
宿主が大腸菌である請求項２３に記載の形質転換体。
【請求項２５】
前記酵素源が請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の形質転換体であり、生成する光学活性ピリジンエタノール誘導体の絶対配置がＲ体である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項２６】
一般式［７］：
【化３】
0004753273.tif 000032
（式中、Ｑは酸素原子であり、Ｒ３は水素原子または塩素原子であり、Ｒ４は水素原子であり、Ｒ５は水素原子であり、Ｒ６は水素原子を示す）で示されるピリジンエタノール誘導体に、請求項８、１１及び１２のいずれか１項に記載の酵素及び／又は、請求項２１又は２２に記載の形質転換体を作用させ、Ｒ体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化し、残存するＳ体のピリジンエタノール誘導体を取得することを特徴とする、一般式［８］：
【化４】
0004753273.tif 000033
（式中、Ｑ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、前記と同じであり、＊は不斉炭素を表す）で示される絶対配置がＳ体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造法に関する。更に詳しくは、多環式アセチルピリジン誘導体に酵素または酵素源を作用させることによる光学活性な多環式ピリジンエタノール誘導体の製造法に関する。
また本発明は、上記製造法に使用できる新規の酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、及び、該組換えベクターを含む形質転換体に関する。
さらに本発明は、光学不活性な多環式ピリジンエタノール誘導体に上記新規の酵素または上記形質転換体を作用させることによる光学活性な多環式ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関する。
背景技術
光学活性ピリジンエタノール誘導体は、光学活性を必要とする医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
単環式の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法としては、アセチルピリジンを、パン酵母などの微生物を用いて、もっとも単純な光学活性ピリジンエタノール誘導体であるヒドロキシエチルピリジンに変換する方法などが知られている（特開昭６１−２２７９１）。
また、多環式の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法としては、ラセミ体の５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン、もしくは５−（１−ヒドロキシエチル）−３−メチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを、豚膵臓リパーゼ・タイプ２を用いた不斉エステル化反応により光学分割する方法（ＷＯ９６３５６７８）、ラセミ体の７−クロロ−５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンをキャンディダ・アンタクチカ・リパーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ｌｉｐａｓｅ）を用いた不斉エステル化反応により光学分割する方法（シンレット，４１（１９９９））などが知られている。しかしこれらの方法は光学分割であるため、一方の立体の収率は最高でも５０％と低く、満足いくものではない。
また、５−（１−アセチル）−７−クロロ−３−メチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンをテトラヒドロフラン中（−）−クロロジイソピノカンフェイルボラン（ｃｈｌｏｒｏｄｉｉｓｏｐｉｎｏｃａｍｐｈｅｙｌｂｏｒａｎｅ）を用いて化学的に還元することにより（Ｓ）−７−クロロ−５−（１−ヒドロキシエチル）−３−メチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを取得する方法（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー，６３，７８５１（１９９８））があるが、高価な還元剤を多量に使用するためにその工業的実施は困難である。
発明の開示
本発明者らは、光学活性な多環式ピリジンエタノール誘導体の効率的な製造法を開発すべく検討を重ねた結果、アセチルピリジン誘導体を立体選択的に還元し、光学活性ピリジンエタノール誘導体に変換する能力を有する今までに報告例のない酵素源を発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、一般式［１］：
0004753273.tif 000002
（式中、Ｒ１とＲ２は両者が互いに結合して、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を含み、かつ置換基を有していてもよい５〜８員の単環性複素環、又は、この単環性複素環に他の環が縮合してなり、かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、又は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルコキシ基を示す）で示されるアセチルピリジン誘導体を、不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、立体選択的に還元する、一般式［２］：
0004753273.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、前記と同じであり、＊は不斉炭素を表す）で示される光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関する。
好ましい実施態様としては、一般式［３］：
0004753273.tif 000004
（式中、Ｑは、酸素原子、硫黄原子、又は、一般式−Ｎ（Ｄ）−（ここで、Ｎは窒素原子であり、Ｄは水素原子または１価の保護基を表す）を示す。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、又は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルコキシ基を示す）で示されるアセチルピリジン誘導体を、不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、立体選択的に還元する、一般式［４］：
0004753273.tif 000005
（式中、Ｑ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、前記と同じであり、＊は不斉炭素を表す）で示される光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関する。
また本発明は以下の（１）から（３）の理化学的性質を有する酵素に関する：（１）作用：還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドを補酵素として、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元し、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する、
（２）特異性：ケトン及びアルデヒドに対して還元活性を有しているが、炭素環ケトン及びα−ケト酸のα位ケトンに対する還元活性は非常に低い、
（３）分子量：ゲル濾過分析において約６００００の分子量を示し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約２９０００の分子量を示す。
あるいは、以下の（ａ）又は（ｂ）の酵素にも関する：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素：
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する活性を有する酵素。
上記製造方法において、上記酵素としてこれらの酵素を用いると、絶対配置がＲ体である光学活性ピリジンエタノール誘導体が得られる。
更に本発明は、これらの酵素をコードするＤＮＡ、又は、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに関する。また、これらのＤＮＡを含有する組換えベクター、及び、該組換えベクターを含む形質転換体にも関する。
上記製造方法において、上記酵素源としてこの形質転換体を用いると、絶対配置がＲ体である光学活性ピリジンエタノール誘導体が得られる。
更にまた、本発明は、一般式［５］：
0004753273.tif 000006
（式中、Ｒ１とＲ２は両者が互いに結合して、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を含み、かつ置換基を有していてもよい５〜８員の単環性複素環、又は、この単環性複素環に他の環が縮合してなり、かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、又は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルコキシ基を示す）で示されるピリジンエタノール誘導体に、上記酵素及び／又は上記形質転換体を作用させ、Ｒ体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化し、残存するＳ体のピリジンエタノール誘導体を取得する、一般式［６］：
0004753273.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、前記と同じであり、＊は不斉炭素を表す）で示される絶対配置がＳ体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関する。
好ましい実施形態としては、一般式［７］：
0004753273.tif 000008
（式中、Ｑは、酸素原子、硫黄原子、又は、一般式−Ｎ（Ｄ）−（ここで、Ｎは窒素原子であり、Ｄは水素原子または１価の保護基を表す）を示す。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、又は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルコキシ基を示す）で示されるピリジンエタノール誘導体に、上記酵素及び／又は上記形質転換体を作用させ、Ｒ体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化し、残存するＳ体のピリジンエタノール誘導体を取得する、一般式［８］：
0004753273.tif 000009
（式中、Ｑ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、前記と同じであり、＊は不斉炭素を表す）で示される絶対配置がＳ体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関する。
以下、本発明について詳述する。
まず、アセチルピリジン誘導体［１］に不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、立体選択的に還元することによる光学活性ピリジンエタノール誘導体［２］の製造方法について、詳述する。
本発明の製造方法で基質として用いられるアセチルピリジン誘導体は、次の一般式［１］で示される。
0004753273.tif 000010
上記一般式［１］において、Ｒ１とＲ２は両者が互いに結合して、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を含み、かつ置換基を有していてもよい５〜８員の単環性複素環を形成するか、又は、この単環性複素環にさらに別の環が縮合してなり、かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。
具体的には、５員の単環性複素環としては、例えば、フラン環、ジヒドロフラン環、ピロール環、ピロリン環、デヒドロジオキソラン環、ピラゾール環、ピラゾリン環、イミダゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、オキサジアゾール環、トリアゾール環、チアゾール環、チオフェン環、及びジヒドロチオフェン環などが挙げられる。６員の単環性複素環としては、例えば、ピラン環、ジヒドロピラン環、ピリジン環、ジヒドロヒリジン環、テトラヒドロピリジン環、デヒドロジオキサン環、デヒドロモルホリン環、ピリダジン環、デヒドロピリダジン環、ピリミジン環、ジヒドロピリミジン環、テトラヒドロピリミジン環、ピラジン環、及びジヒドロピラジン環などが挙げられる。７員の単環性複素環としては、例えば、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置換された、シクロヘプタン環、シクロヘプタジエン環、シクロヘプタトリエン環、及びチアゼピン環などが挙げられる。８員の単環性複素環としては、例えば、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置換された、シクロオクテン環、シクロオクタジエン環、及びシクロオクタテトラエン環などが挙げられる。また、多環性複素環としては、例えば、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、クロメン環、インドリジン環、インドール環、イソインドール環、イソキノリン環、フタラジン環、ナフチリジン環、キノザリン環、ベンゾチオフェン環や、これらの水素化された環などが挙げられる。
これらの複素環は、いずれも置換基を有していても良い。このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、及び炭素数１〜１２のアルコキシ基などが挙げられる。
上記複素環のうち、５員の単環性複素環が好ましく、より好ましくは置換または無置換のフラン環であり、特に好ましいのはフラン環である。
また、上記一般式［１］において、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、又は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルコキシ基を示す。具体的には、水素原子、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、水酸基、メチル基、エチル基、メトキシ基、及びエトキシ基等を挙げることができる。上記アルキル基及びアルコキシ基が有していてもよい置換基としては、水酸基、ハロゲン原子、炭素数１〜１２のアルコキシ基などが挙げられる。Ｒ３及びＲ４としては水素原子または塩素原子が好ましく、より好ましくは水素原子である。
上記一般式［１］で示されるアセチルピリジン誘導体のうち、特に好ましいものは、次の一般式［３］で示される。
0004753273.tif 000011
上記一般式［３］において、Ｑは、酸素原子、硫黄原子、又は、一般式−Ｎ（Ｄ）−（ここで、Ｎは窒素原子であり、Ｄは水素原子または１価の保護基を表す）を示す。上記１価の保護基とは、アセチル基、メトキシカルボニル基、ベンジル基などの一般的によく知られた、アミノ基を保護するための基である。Ｑとしては酸素原子が好ましい。
また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキル基、又は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルコキシ基を示す。具体的には、上記一般式［１］におけるＲ３及びＲ４について例示したものと同様のものが挙げられる。
好適な態様によれば、本発明の製造方法で使用される基質は、Ｑが酸素原子であり、Ｒ３が水素原子または塩素原子であり、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子であり、Ｒ６が水素原子またはメチル基である一般式［３］で表される化合物である。
特に好適な態様によれば、本発明の製造方法で使用される基質は、Ｑが酸素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６がいずれも水素原子である一般式［３］で表される化合物、すなわち５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンである。
上記一般式［１］で示されるアセチルピリジン誘導体は、公知の製造方法で容易に入手できる。例えば、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンは、ヨーロッパ特許９１１３３５号明細書（ＥＰ９１１３３５）に記載された方法により合成可能である。また、５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンは、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３，７８５１（１９９８）に記載の方法により７−クロロ−５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを合成し、これの水酸基を酸化することにより取得できる。
本発明の製造方法で使用される酵素または酵素源は、アセチルピリジン誘導体［１］を光学活性なピリジンエタノール誘導体［２］に変換する能力を有する微生物に由来するものを用いることができる。例えば、このような微生物の菌体、培養液もしくはそれらの処理物、又は、このような微生物から得られる酵素などが使用できる。これらを単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。
アセチルピリジン誘導体［１］を光学活性なピリジンエタノール誘導体［２］に変換する能力を有する微生物は、以下に説明する方法によってスクリーニングすることができる。例えば、アセチルピリジン誘導体［１］として５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを用いた場合、以下のようにして行う。グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを試験管に入れて殺菌後、無菌的に微生物を接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する。その後、菌体を遠心分離により集め、グルコース２〜１０％を含んだリン酸緩衝液１〜５ｍｌに懸濁し、あらかじめ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを２．５〜２５ｍｇいれた試験管に加えて、２〜３日間３０℃で振とうする。この際、遠心分離により得た菌体をデシケーター中またはアセトンにより乾燥したものを用いることもできる。更に、このような微生物またはその処理物と５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを反応させる際に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略する）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略する）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸（以下、ＮＡＤＰ＋と略する）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸（以下、ＮＡＤＰＨと略する）などと、グルコース脱水素酵素またはギ酸脱水素酵素とを添加してもよい。変換反応ののち、反応液の５倍体積の酢酸エチルを加えて抽出を行ない、生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ、溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝９２／８／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温、溶出時間：５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン８．８分、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１１．７分、５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１７．５分）により分析する。
本発明に使用できる微生物としては、アセチルピリジン誘導体［１］を光学活性ピリジンエタノール誘導体［２］に変換する能力を有する微生物であればいずれも使用できる。例えば、アシュベイ（Ａｓｈｂｙａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ギラモンデラ（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ）属、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ハイホピキア（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ）属、イサッチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライシア（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）属、ロダロマイセス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、メシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、シゾブラストスポリオン（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ）属、ステファノアスカス（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ウイロプシス（Ｗｉｌｌｏｐｓｉｓ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属に属する微生物等が挙げられる。
特に、絶対配置がＳ体のピリジンエタノール誘導体に変換しようとする場合には、アシュベイ（Ａｓｈｂｙａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ギラモンデラ（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ）属、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ハイホピキア（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ）属、イサッチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライシア（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）属、ロダロマイセス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、メシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、シゾブラストスポリオン（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ）属、ステファノアスカス（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ウイロプシス（Ｗｉｌｌｏｐｓｉｓ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属に属する微生物が好ましい。
また、絶対配置がＲ体のピリジンエタノール誘導体に変換しようとする場合には、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物が好ましい。
具体的な例としては、絶対配置がＳ体のピリジンエタノール誘導体を得る場合には、アシュベイ・ゴシッピ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＩＦＯ  ０５６０、キャンディダ・フェンニカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｅｎｎｉｃａ）ＣＢＳ  ６０８７、キャンディダ・ギラモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＩＦＯ  ０４５４、キャンディダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＩＦＯ  ０７６１、キャンディダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）ＩＦＯ  ００１１、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）ＣＢＳ  ５６１２、キャンディダ・ヴァーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ  １９０８、キャンディダ・モギー（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）ＩＦＯ  ０４３６、キャンディダ・ノーベジェンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ  １０２０、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ  ０５８５、キャンディダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＡＭ  ４８４０、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）ＩＦＯ  ０７５０、キャンディダ・オレオフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）ＣＢＳ  ２２１９、キャンディダ・ステラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔａ）ＩＦＯ  ０７０１、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＦＯ  ０００６、キャンディダ・ボディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｄｉｎｉｉ）ＩＦＯ  １０５７４、キャンディダ・サイトアナ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｉｔｏａｎａ）ＩＦＯ  ０３８０、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＩＦＯ  ０７５９、キャンディダ・カリオシリグニコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｒｉｏｓｉｌｉｇｎｉｃｏｌａ）ＩＦＯ  １９１０、キャンディダ・ソラニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ  ０７６２、キャンディダ・テヌイス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｅｎｕｉｓ）ＩＦＯ  ０７１６、クリプトコッカス・アルビダス・バー・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ ｖａｒ．ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  ０３７８、クリプトコッカス・フミコーラ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｕｍｉｃｏｌａ）ＣＢＳ  １８９６、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）ＩＦＯ  ０７２７、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）ＩＦＯ  １０１９、デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＩＦＯ  ００８２、デバリオマイセス・マラマ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｍａｒａｍａ）ＩＦＯ  ０６６８、デバリオマイセス・カルソニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ  ０９４６、デバリオマイセス・カステリイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）ＩＦＯ  １３５９、ディポダスカス・オベテンシス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ ｏｖｅｔｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ  １２０１、ディポダスカス・テトラスパーマ（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ���ＣＢＳ  ７６５．７０、ガラクトマイセス・レシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｅｓｓｉｉ）ＣＢＳ  １７９．６０、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）ＣＢＳ  １７８．７１、ゲオトリカム・フラグランス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｒａｇｒａｎｓ）ＣＢＳ  １６４．３２、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）ＣＢＳ  １８７．６７、ギラモンデラ・セレノスポラ（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ ｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）ＩＦＯ  １８５０、ハンセニアスポラ・バルビエンシス（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｖａｌｂｙｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ  ０１１５、ハンセヌラ・ポリモーファ  ＤＬ１（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＤＬ１）ＡＫＵ  ４７５２、ハイホピキア・バートニイ（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＩＦＯ  ０８４４、イサッチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＩＦＯ  １２７９、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＩＦＯ  １０９０、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＩＦＯ  ０６６２、クライシア・カプスラータ（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ ｃａｐｓｕｌａｔａ）ＩＦＯ  ０７２１、ロダロマイセス・エロンギスポラス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）ＩＦＯ  １６７６、メシュニコワ・ビクスビダータ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｂｉｃｕｓｐｉｄａｔａ）ＩＦＯ  １４０８、メシュニコワ・グルエシ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｇｒｕｅｓｓｉｉ）ＩＦＯ  ０７４９、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ ｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）ＩＦＯ  ０９７５、オガタエア・ミヌータ・バー・ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ ｖａｒ．ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＩＦＯ  １４７３、オガタエア・ポリモーファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＩＦＯ  ０７９９、パキソレン・タンノフィラス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＦＯ  １００７、ピキア・ロダネンシス（Ｐｉｃｈｉａ ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ  １２７２、ピキア・トレハロフィラス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ  １２８２、ピキア・ウイッカーハミイ（Ｐｉｃｈｉａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）ＩＦＯ  １２７８、ロドスポリディウム・ディオボバツム（Ｒｈｏｄｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ）ＩＦＯ  ０６８８、ロドスポリディウム・スファエロカーパム（Ｒｈｏｄｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ）ＩＦＯ  １４３８、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ  ０５５９、ロドトルーラ・アラウカリエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ａｒａｕｃａｒｉａｅ）ＩＦＯ  １００５３、ロドトルーラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ  １０９９、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ ｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ  ０４１５、ロドトルーラ・グラミニス（Ｒｈ���ｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＩＦＯ  ０１９０、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）ＩＦＯ  ０１０４、サッカロマイコプシス・マランガ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｍａｌａｎｇａ）ＩＦＯ  １７１０、シュワニオマイセス・オシデンタリス・バー・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ ｖａｒ． ｏｃｃｉｄｅｔａｌｉｓ）ＩＦＯ  ０３７１、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ  ６９０３、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）ＩＡＭ  １２２４９、スポロボロマイセス・ロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｕｓ）ＩＦＯ  １１０６、シゾブラストスポリオン・コバヤシ（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ ｋｏｂａｙａｓｉｉ）ＩＦＯ  １６４４、ステファノアスカス・シフェリイ（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）ＩＦＯ  １８５４、トルラスポラ・グロボサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｇｌｏｂｏｓａ）ＩＦＯ  ００１６、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＩＦＯ  ０６７１、トリコスポロン・アクアチル（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｑｕａｔｉｌｅ）ＡＴＣＣ  ２２３１０、トリコスポロン・キュタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＩＦＯ  １１９８、トリコスポロン・ファーメンタンス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  １０６７５、ウイロプシス・サターナス・バー・シュアベロレンス（Ｗｉｌｌｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ ｖａｒ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）ＩＦＯ  ０８０９、ウイロプシス・サターナス・バー・ムラキイ（Ｗｉｌｌｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ ｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）ＩＦＯ  ０８９５、ヤマダジーマ・ハプロフィラ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ  ０９４７、チゴサッカロマイセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）ＩＦＯ  ０４８８、チゴサッカロマイセス・ルキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）ＩＦＯ  ０４９３、アルカリゲネス・キシロソオキシダント（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＩＦＯ  １３４９５、アルカリゲネス・キシロソオキシダント・サブスピーズ・デントリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｄｅｎｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＩＦＯ  １２６６９、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ  ３０２２、ブレビバクテリウム・インサータム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｃｅｒｔｕｍ）ＩＦＯ  １２１４５、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉ）ＩＡＭ  １２１０７、コリネバクテリウム・スピーシズ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ２１２４５、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ ｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）ＩＦＯ  １３９１４、オクロバクトラ���・スピーシズ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）ＩＦＯ  １２９５０、シュードモナス・スタッチェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＩＦＯ  １３５９６、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）ＩＦＯ  ３９０４、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）ＩＦＯ  １４１６２、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ  １２３２０、ロドコッカス・ロードクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＦＯ  ３３３８、ツカムレラ・パウロメタボラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ）ＩＦＯ  １２１６０などが挙げられる。
また、絶対配置がＲ体のピリジンエタノール誘導体を得る場合には、キャンディダ・エシェルシイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）ＩＦＯ  １９４２、キャンディダ・ラクティスコンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）ＩＦＯ  １２８６、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３、オガタエア・ウイッカーハミイ（Ｏｇａｔａｅａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）ＩＦＯ  １７０６、ピキア・ファリノーサ（Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６０２、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ  ０４６０、ピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）ＩＦＯ  １６７０、ヤマダジーマ・ファリノーサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ ｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０５３４、ブレビバクテリウム・イオディナム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｏｄｉｎａｍ）ＩＦＯ  ３５５８、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｃｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ  ２１４７６などが挙げられる。
これら微生物は一般に、入手または購入が容易な保存株から得ることができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせて本反応により有利な性質を有する菌株を得ることもできる。
これらの微生物の培養には、通常これらの微生物が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。
微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。アセチルピリジン誘導体［１］に微生物を反応させる場合においては、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することも出来る。
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より、不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
本発明において還元反応を行う際には、基質であるアセチルピリジン誘導体［１］を反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは５〜９の範囲である。反応液中の酵素または酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（ｗ／ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（ｗ／ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、酵素または酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。
本発明において還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を０．５〜３０％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。
一般に生物学的方法による還元反応に必要とされているＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。
また、還元反応を促進させるために、ＮＡＤ＋及び／又はＮＡＤＰ＋をそれぞれの還元型へ還元する酵素、並びに、該還元のための基質を存在させて反応を行うと、優れた結果が得られるのでより好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素を、還元のための基質としてグルコースを存在させるか、又は、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素を、還元のための基質としてギ酸を存在させることができる。
更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。アセチルピリジン誘導体［１］及び／又は光学活性なピリジンエタノール誘導体［２］による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの、水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。アセチルピリジン誘導体［１］の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの、水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
次に、本発明の酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、及び、該組換えベクターを含む形質転換体について詳述する。
本発明の酵素は、以下の（１）〜（３）の理化学的性質を有する：
（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元し、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する、
（２）特異性：ケトン及びアルデヒドに対して還元活性を有しているが、炭素環ケトン及びα−ケト酸のα位ケトンに対する還元活性は非常に低い、
（３）分子量：ゲル濾過分析において約６００００の分子量を示し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約２９０００の分子量を示す。
好ましくは、上記（１）〜（３）の理化学的性質に加えて、以下の（４）〜（６）の理化学的性質を有する酵素である。
（４）至適温度：５０℃〜５５℃、
（５）至適ｐＨ：５．０〜６．０、
（６）阻害剤：水銀イオンによって阻害される。
本発明において、酵素の還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ジメチルスルホキシド０．３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び酵素溶液を含む３．０ｍｌの反応液中、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより実施する。
特異性において「還元活性は非常に低い」とは、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンに対する還元活性を１００％とした場合、その基質に対する還元活性が１０％以下であることを意味する。また、「炭素環ケトン」とは、シクロヘキサノン、シクロペンタノンなどの脂環式化合物の環内の−ＣＨ２−を−Ｃ（＝Ｏ）−に置き換えた時に生ずるケトンを意味している。
分子量は、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質の相対溶出時間から算出することにより決定する。また、サブユニットの分子量は、２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、標準タンパク質の相対移動度から算出することにより決定する。
酵素の至適ｐＨ、至適温度は、例えば、還元活性測定系の反応ｐＨ、反応温度を変えて還元活性を測定することによって決定する。
阻害剤は、例えば、還元活性測定系に種々の化合物を添加して還元活性を測定することによって決定する。
本発明の酵素の起源として用いられる微生物は、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する酵素を有する微生物であればいずれでも良い。また、野生株または変異株のいずれでも良く、更に、細胞融合、遺伝子操作等の遺伝子学的手法により誘導される組換え微生物も用いることができる。好ましくはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物が用いられる。より好ましくは、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）であり、特に好ましくはキャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ１０００３株である。
以下に、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する酵素を有する微生物より、本発明の酵素を取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する酵素を有する微生物を適切な培地で培養し、培養液から菌体を遠心分離した後、菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、該菌体をグラスビーズ等の物理的手法、酵素などの生化学的手法などを用いて破砕または溶解し、更に、遠心分離により該溶液中の固形物を除去することにより、粗酵素液を得ることができる。あるいは、培養液から、上記と同様の精製法で粗酵素液を得ることができる。さらに、この粗酵素液を、当業者が通常用いる手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、クロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて用いて精製を行うことができる。クロマトグラフィーは、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを単独で、または組み合わせて用いることもできる。
本発明の酵素は、上述のように微生物から取得する天然酵素であってもよいし、組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素が挙げられる。
また本発明の酵素は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する活性を有するものであってもよい。ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換および／または付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されることを意味する。５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成する活性を有するとは、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンと反応させた場合、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、特に好ましくは６０％以上の収率で５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを生成することをいう。この収率を測定するには、上述した高速液体クロマトグラフィーを用いる。
なお、一旦精製した酵素が取得できれば、当業者に公知の方法により、該酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を取得し、これを培養すれば、本発明の製造方法で使用できる酵素源を大量に製造できる。
以下に、本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。まず、精製した酵素を適当なエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、プロテインシークエンサーにより部分アミノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えばＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該酵素をコードするＤＮＡの一部を増幅（コア配列）し、塩基配列決定を行う。塩基配列決定はジデオキシ・チェイン・ターミネーション法等により決定できる。例えば、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて実施可能である。コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかにするために、該微生物の染色体ＤＮＡを、コア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化させることにより逆ＰＣＲ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１６，８１８６（１９８８））用の鋳型ＤＮＡを調製する。次に、コア配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅する。こうして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることにより、目的酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を明らかにできる。ＤＮＡ配列が明らかになれば、ＰＣＲなどの方法により、該微生物の染色体ＤＮＡから本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
本発明の酵素をコードするＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体内で酵素遺伝子を発現させることができる。このために用いられるベクターとしては、適切な宿主内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが使用できる。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター）等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）等が好適に使用できる。
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動できる状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターを導入する宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡは定法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のＤＮＡを導入できる。
本発明の酵素又は形質転換体を用いて、アセチルピリジン誘導体［１］を立体選択的に還元して絶対配置がＲ体であるピリジンエタノール誘導体を取得、特に好ましくは５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを立体選択的に還元して５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを取得する場合、補酵素としてＮＡＤＨが必要となる。反応系にＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても実施できる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤ＋）を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力（以後、補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が用いられる。
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても実施できるが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を用いる場合は、補酵素再生能力を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できるし、また、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入することによっても製造できる。すなわち、本発明の酵素をコードするＤＮＡとグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡとを含有する組換えベクターを含む形質転換体や、本発明の酵素をコードするＤＮＡを含有する第１の組換えベクターと、グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを含有する第２の組換えベクターとを含む形質転換体を使用できる。
本発明の酵素もしくは形質転換体が補酵素再生能力を有している場合は、その再生のための基質を反応系に添加することによりＮＡＤＨの再生反応を同時に行うことができ、他の補酵素再生能力を有する酵素を反応系に追加添加しなくても、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。例えば、本発明の酵素もしくは形質転換体がイソプロパノールの酸化活性を有している場合は、還元反応系にイソプロパノールを添加することによってＮＡＤＨを再生することが可能となる。
本発明の形質転換体を用いたアセチルピリジン誘導体［１］からの光学活性ピリジンエタノール誘導体［２］の生産、特に５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの生産は以下のように実施できる。但し、以下の方法に限定されるわけではない。まず最初に、適当な溶媒中に基質５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン［１］、ＮＡＤ＋等の補酵素、及び、該形質転換体の培養物またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。この反応は１０〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応はバッチ式または連続方式で実施できる。バッチ方式の場合は、反応基質は０．１％〜７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加できる。ここで形質転換体の処理物などとは、例えば、粗酵素液、培養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、酵素自体または菌体のまま公知の手段で固定化されて使用できる。また、本反応を行う際、形質転換体として本発明の酵素とグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系に更にグルコースを添加することによって、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。
次に、上記酵素及び／又は形質転換体をピリジンエタノール誘導体に作用させ、Ｒ体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化し、残存するＳ体のピリジンエタノール誘導体を取得することによる、絶対配置がＳ体のピリジンエタノール誘導体の製造方法について、詳述する。
本発明の製造方法において基質として用いられるピリジンエタノール誘導体は、次の一般式［５］で示される。
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上記一般式［５］において、Ｒ１及びＲ２は上記一般式［１］で言及したものと同様である。なかでも、５員の単環性複素環が好ましく、より好ましくは置換または無置換のフラン環であり、特に好ましいのはフラン環である。
また、Ｒ３及びＲ４も上記一般式［１］で言及したものと同様であり、好ましくは水素原子または塩素原子であり、より好ましくは水素原子である。
ピリジンエタノール誘導体［５］は、光学純粋が１００％未満のものであれば特に限定されない。完全なラセミ体であってもよいし、ある程度の光学純度を持っているものでもよい。
ピリジンエタノール誘導体［５］のうち、特に好ましいものは、次の一般式［７］で示される。
0004753273.tif 000013
上記一般式［７］において、Ｑは上記一般式［３］で言及したものと同様である。Ｑとしては酸素原子が好ましい。また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６も上記一般式［３］で言及したものと同様である。
好適な態様によれば、本発明の製造方法で使用される基質は、Ｑが酸素原子であり、Ｒ３が水素原子または塩素原子であり、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子であり、Ｒ６が水素原子またはメチル基である一般式［７］で表される化合物である。
特に好適な態様によれば、本発明の製造方法で使用される基質は、Ｑが酸素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６がいずれも水素原子である一般式［７］で表される化合物、すなわち５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンである。
上記一般式［５］で示されるピリジンエタノール誘導体は、公知の製造方法で容易に入手できる。例えば、５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンは、ヨーロッパ特許９１１３３５号明細書（ＥＰ９１１３３５）に記載された方法により合成可能である。
ピリジンエタノール誘導体［５］に、本発明の酵素または形質転換体を作用させ、Ｒ体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化するためには、補酵素としてＮＡＤ＋が必要となる。反応系にＮＡＤ＋を必要な量だけ添加しても実施できる。しかし、還元された該補酵素を酸化型に変換する能力を有する酵素をその基質と共に、本発明の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。また、還元された該補酵素を酸化型に変換する能力を有する酵素を含有する微生物またはその処理物を使用しても良い。還元された該補酵素を酸化型に変換する能力を有する酵素としては、例えばＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＨ脱水素酵素等を用いることができる。
また、本発明の酵素もしくは形質転換体がＮＡＤ＋再生能力を有している場合は、その再生のための基質を反応系に添加することによりＮＡＤ＋の再生反応を同時に行うことができる。この場合、他のＮＡＤ＋再生能力を有する酵素を別に添加しなくても、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。例えば、本発明の酵素もしくは形質転換体がアセトンの還元活性を有している場合は、反応系にアセトンを添加することによってＮＡＤ＋を再生することが可能となる。
また、本発明の形質転換体を用いた場合では、菌体内に存在するＮＡＤ＋により反応が進行し、またＮＡＤ＋が還元されて生じるＮＡＤＨも菌体内で再酸化されるため、補酵素やＮＡＤ＋再生能力を有する酵素を別に添加しなくても実施できる。
上記のいずれかの方法で得られる光学活性ピリジンエタノール誘導体の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、または、菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、晶析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の光学活性ピリジンエタノール誘導体を容易に得ることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
（実施例１：種々の微生物を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンの不斉還元）
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表１、表２に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振とう培養した。培養後、各培養液０．５ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２６時間反応させた。反応後、各反応液に５ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機相の一部を下記ＨＰＬＣ条件で分析した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ、溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝９２／８／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温、溶出時間：５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン８．８分、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１１．７分、５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１７．５分
表１、表２に生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの反応液当たりの生成量、光学純度及び絶対配置をまとめた。
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（実施例２：種々の微生物を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンの不斉還元）
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表３に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振とう培養した。培養後、各培養液２ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを２．５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２６時間反応させた。反応後、実施例１と同様に分析を行った。表３に生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの反応液当たりの生成量、光学純度及び絶対配置をまとめた。
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（比較例１：種々の微生物を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンの不斉還元）
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表４に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振とう培養した。培養後、各培養液２ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを２．５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２６時間反応させた。反応後、実施例１と同様に分析を行った。表４に生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの反応液当たりの生成量、光学純度及び絶対配置をまとめた。
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上記の結果から、単環式のアセチルピリジンを光学活性なヒドロキシエチルピリジンに変換することが知られているサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、複素環アセチルピリジン誘導体である５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンには殆ど反応しないことが判る。
（実施例３：キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３による５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも９００ｍｌ当たり）の組成からなる液体培地４５ｍｌ、アデカノール１滴を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れて殺菌し、これに殺菌済みの４０％グルコース水溶液５ｍｌと実施例１記載の培養方法にて得られたキャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の培養液１ｍｌを無菌的に接種し、３０℃で２４時間振とう培養し、これを種母とした。５Ｌ容のジャーファーメンターに上記の組成からなる液体培地２．２５Ｌ、アデカノール５滴を入れて殺菌し、これに殺菌済みの４０％グルコース水溶液２５０ｍｌ及び種母５０ｍｌを無菌的に接種し、培養温度３０℃、攪拌数３５０ｒｐｍ、通気量０．７５Ｌ／分の条件で４０時間培養を行った。培養中、ｐＨが５．５を下回った場合には、５規定の水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ５．５に調整した。培養後、菌体を含む培養液２Ｌと、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１０ｇ及びグルコース６０ｇを５Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、３０℃で攪拌下２２．５時間還元反応を行った。反応中、反応液のｐＨは５規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６に保った。また反応開始後４．５時間目にグルコース６０ｇ、７．５時間目にグルコース８０ｇを添加した。反応終了後、反応液を酢酸エチル１Ｌで抽出し、水相を更に酢酸エチル１Ｌで抽出した。有機相をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去した。残渣に酢酸エチル３０ｍｌ、活性炭５００ｍｇを加えて室温で２時間攪拌した。濾過により活性炭を除去後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチルとメチルシクロヘキサンの混合溶液から結晶化を行い、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの白色結晶８．１ｇを得た。収率８１％、光学純度９８．７％ｅ．ｅ．、融点５９．５〜６０．５℃、比旋光度［α］Ｄ２０＝＋３７．０°（ＣＨＣｌ３、ｃ＝０．５６）。１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：１．５６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３５Ｈｚ）、４．１２（１Ｈ，ｓ）、５．００（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３５Ｈｚ）、６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９５Ｈｚ）、７．５４（１Ｈ，ｓ）、７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９５Ｈｚ）、８．８０（１Ｈ，ｓ）。
（実施例４：キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＦＯ  ０００６による５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも９００ｍｌ当たり）の組成からなる液体培地２２５ｍｌ、アデカノール２滴を２Ｌ容坂口フラスコに入れて殺菌し、これに殺菌済みの４０％グルコース水溶液２５ｍｌと実施例１記載の培養方法にて得られたキャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＩＦＯ  ０００６の培養液２．５ｍｌを無菌的に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養後、培養液３００ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００ｍｌに懸濁した。上記菌体懸濁液と、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１ｇ及びグルコース３ｇを５００ｍｌ容三口フラスコに入れ、３０℃で攪拌下５時間反応を行った。反応中、反応液のｐＨは５規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に保った。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、水相を更に酢酸エチルで抽出した。有機相をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去した。残渣をトルエンに室温で溶解後、氷水中で冷却することにより結晶化を行い、５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの白色結晶７５０ｍｇを得た。収率７５％、光学純度１００％ｅ．ｅ．。
（実施例５：キャンディダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＩＦＯ  ０７６１からの無細胞抽出液の調製、及びそれを用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
５Ｌジャーファーメンターでの培養を、攪拌数７００ｒｐｍ、通気量１．５Ｌ／分、培養時間を１６時間に変更した以外は、実施例３記載の培養方法と同じ方法で、キャンディダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＩＦＯ  ０７６１の培養を行った。培養後、得られた培養液９４０ｍｌを、遠心分離して菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）４００ｍｌで２回洗浄後、湿菌体を５ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２００ｍｌに懸濁し、菌体をビートビーター（バイオスペック・プロダクツ社製）で破砕した。遠心分離にて菌体残渣を除き、８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加後、遠心分離により上清を除去した。得られた沈殿を、５ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１５ｍｌに懸濁し、１ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して一晩透析し、無細胞抽出液６４．５ｍｌを取得した。５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１５ｍｇ、ＮＡＤＨ１０４．３ｍｇを入れた試験管に無細胞抽出液０．７５ｍｌを加えて、３０℃で４時間反応を行った。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率６０．７％、光学純度（Ｓ）９９．５％ｅ．ｅ．であった。
（実施例６：キャンディダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＩＦＯ  ０７６１の無細胞抽出液を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１５ｍｇ、ＮＡＤＰＨ１２６．４ｍｇを入れた試験管に実施例５で得られたキャンディダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＩＦＯ  ０７６１の無細胞抽出液０．７５ｍｌを加えて、３０℃で４時間反応を行った。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率５１．１％、光学純度（Ｓ）９９．４％ｅ．ｅ．であった。
（実施例７：キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３のアセトン乾燥菌体調製、及びそれを用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも９００ｍｌ当たり）の組成からなる液体培地４５ｍｌ及びアデカノール１滴を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れて殺菌し、これに殺菌済みの４０％グルコース水溶液５ｍｌと実施例１記載の培養方法にて得られたキャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の培養液１ｍｌを無菌的に接種し、３０℃で４８時間振とう培養した。培養後、得られた培養液４０ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、イオン交換水で２回洗浄し、湿菌体をイオン交換水４０ｍｌに懸濁した。氷冷下で攪拌しながらアセトン１．２Ｌを加え、氷中下で３０分間攪拌した。濾過後、濾紙上の菌体を冷却したアセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させ、アセトン乾燥菌体１．３ｇを取得した。アセトン乾燥菌体１０ｍｇ、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン５ｍｇ、ＮＡＤ＋０．２７５ｍｇ、ＮＡＤＰ＋０．２７５ｍｇ、グルコース５．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野製薬株式会社製）３０Ｕ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍｌを試験管に加えて、３０℃で２４時間還元反応を行った。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率９０．８％、光学純度（Ｒ）９９．９％ｅ．ｅ．であった。
（実施例８：キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３からの無細胞抽出液の調製、及びそれを用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
５Ｌジャーファーメンターでの培養を、攪拌数３００ｒｐｍ、通気量０．７５Ｌ／分、培養時間７６時間に変更した以外は、実施例３記載の培養方法と同じ方法で、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の培養を行った。得られた培養液２１５０ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００ｍｌで洗浄し、湿菌体を、５ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）４３０ｍｌに懸濁し、菌体をビートビーター（バイオスペック・プロダクツ社製）で破砕した。遠心分離にて菌体残渣を除き、５ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して一晩透析し、無細胞抽出液２８９ｍｌを取得した。５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン０．２５ｇ、ＮＡＤ＋３０ｍｇ、グルコース２．５ｇ、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野製薬株式会社製）３００Ｕを入れた三口フラスコに無細胞抽出液２４ｍｌを加えて還元反応を行った。反応は３０℃で、５規定の水酸化ナトリウム水溶液により反応液のｐＨを６．５に調整しながら攪拌しつつ行なった。反応液の一部を定期的にＨＰＬＣにより分析し、基質が枯渇している場合には更に基質０．２５ｇを追加して反応を継続させた。この操作を繰り返しつつ約７２時間反応を行なった。反応終了後の５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの生成量は２．２ｇであった。収率８８％、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．。
（実施例９：キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の無細胞抽出液を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例８で得られた無細胞抽出液２０ｍｌを入れた三口フラスコに、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン０．２５ｇ、ＮＡＤ＋４０ｍｇ、ギ酸ナトリウム０．２５ｇ、ギ酸脱水素酵素（フルカ（Ｆｌｕｋａ）社製）１２０Ｕを加えて還元反応を行った。反応は３０℃で、５規定のギ酸により反応液のｐＨを６．５に調整しながら攪拌しつつ行なった。反応液の一部を定期的にＨＰＬＣにより分析し、基質が枯渇している場合には更に基質０．２５ｇを追加して反応を継続させた。この操作を繰り返しつつ約９３時間反応を行なった。反応終了後の５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの生成量は１．８ｇであった。収率７２％、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．。
（実施例１０：キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３のアセトン乾燥菌体を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例７で得られたキャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３のアセトン乾燥菌体２０ｍｇ、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン２５ｍｇ、ＮＡＤ＋２．２ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．４ｍｌ、イソプロパノール０．１ｍｌを試験管に加えて、３０℃で３９．５時間還元反応を行った。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率４７．２％、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．であった。
（実施例１１：キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の無細胞抽出液を用いた５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例８で得られたキャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の無細胞抽出液０．４ｍｌ、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン２５ｍｇ、ＮＡＤ＋２．２ｍｇ、イソプロパノール０．１ｍｌを試験管に加えて、３０℃で３９．５時間還元反応を行った。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率５１．８％、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．であった。
（参考例１：７−クロロ−５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，，６３，７８５１（１９９８）に記載の方法により得られた７−クロロ−５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１．０ｇを塩化メチレン４．０ｍｌに溶解し、これに飽和重曹水３ｍｌ、１Ｍ臭化ナトリウム水溶液０．６２ｍｌ及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシラジカルを１Ｍになるように溶解した塩化メチレン溶液０．６２ｍｌを加えて、氷中で激しく攪拌した。これに予め重曹を飽和させた次亜塩素酸ナトリウム水溶液５．７４ｍｌを少しづつ添加し、氷中で３０分間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを加え、攪拌しながら１０％亜硫酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌを添加した。分液により有機相を取得後、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、トルエン−メチルシクロヘキサンより結晶化を行い、５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジン０．４３ｇを取得した。１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：２．７７（３Ｈ，ｓ）、７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９５Ｈｚ）、７．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ）、８．３２（１Ｈ，ｓ）。
（実施例１２：種々の微生物を用いた５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンの不斉還元）
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表５に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振とう培養した。次に、各培養液０．５ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ参考例１で得られた５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンを５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２６時間反応させた。反応後、各反応液に５ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合した。この一部を下記ＨＰＬＣ条件で分析した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ、溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝９２／８／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温、溶出時間：５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジン７．６分、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジン１０．３分、５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジン１５．７分
表５に生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンの反応液当たりの生成量、光学純度及び絶対配置をまとめた。
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（実施例１３：種々の微生物を用いた５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンの不斉還元）
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表６に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振とう培養した。次に、各培養液２ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ参考例１で得られた５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンを２．５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２６時間反応させた。反応後、実施例１２と同様に分析を行った。表６に生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンの反応液当たりの生成量、光学純度及び絶対配置をまとめた。
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（実施例１４：酵素の精製）
以後、還元活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に基質５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１ｍＭ、ＮＡＤＨ０．２５ｍＭ、ジメチルスルホキシド０．３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む３．０ｍｌの反応液中、３０℃、３分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。これを還元活性測定の標準反応条件とした。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも９００ｍｌ当たり）の組成からなる液体培地４５ｍｌ、アデカノール１滴を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れて殺菌し、これに殺菌済みの４０％グルコース水溶液５ｍｌ及びあらかじめ同一培地にて前培養しておいたキャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）ＩＦＯ  １０００３の培養液１ｍｌを無菌的に接種し、３０℃で２４時間振とう培養し、これを種母とした。
５Ｌ容のジャーファーメンターに上記の組成からなる液体培地２．２５Ｌ、アデカノール５滴を入れて殺菌し、これに殺菌済みの４０％グルコース水溶液２５０ｍｌ及び種母５０ｍｌを無菌的に接種し、培養温度３０℃、攪拌数３００ｒｐｍ、通気量０．３Ｌ／分の条件で１４０時間培養を行った。培養中、ｐＨが５．５を下回る場合は、５規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５．５に調整した。
上記の培養方法で得られた培養液１０Ｌについて、遠心分離により菌体を集め、生理食塩水５Ｌにて二回洗浄し、湿菌体を５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び０．１ｍＭのＰＭＳＦを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２００ｍｌに懸濁し、菌体をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕した。遠心分離にて菌体残渣を除去し、無細胞抽出液１７６０ｍｌを取得した。
この無細胞抽出液に硫酸プロタミン３ｇを加えて４℃で一晩攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清に３５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、０℃で一時間攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清に６５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、０℃で一時間攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により取得し、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌに懸濁し、同緩衝液３０Ｌで透析した。
これを５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（３４０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、塩化ナトリウム濃度（０ｍＭから５０ｍＭまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。この活性画分に終濃度０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び０．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）であらかじめ平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（７４ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、硫酸アンモニウム濃度（０．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの分子量は、約２９０００であった。また、溶離液として０．１Ｍの硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いたＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過分析を行ったところ、約６００００であった。以後、この酵素をＦＰＤＨと呼ぶことにする。
（実施例１５：ＦＰＤＨの作用至適温度）
実施例１４記載の還元活性測定の標準反応条件において、温度だけを２０〜８０℃に変化させて活性を測定を行った。その結果、至適温度は５０〜５５℃であった。
（実施例１６：ＦＰＤＨの作用至適ｐＨ）
実施例１４記載の還元活性測定の標準反応条件において、緩衝液として酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液を用いてｐＨ３．５〜９．０の範囲で変化させて活性測定を行った。その結果、至適ｐＨは５．０〜６．０であった。
（実施例１７：ＦＰＤＨの阻害剤に対する挙動）
実施例１４記載の還元活性測定の標準反応条件において、阻害剤として各種の化合物及び金属塩を、表７に記載の濃度となるように添加し、活性測定を行った。表７に、阻害剤を添加しない時の活性を１００％とした時の相対活性で示した。その結果、酵素活性は水銀イオンにより阻害された。
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（実施例１８：ＦＰＤＨの特異性）
ＦＰＤＨの種々の化合物に対する還元活性を調べた。実施例１４記載の還元活性測定の標準反応条件において、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンのかわりに、表８及び表９に示す各種カルボニル化合物を基質として活性測定を行った。表８、表９に、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンを基質としたときの還元活性を１００％とした時の相対活性で示した。その結果、ケトン、アルデヒドに対して還元活性を有しているが、炭素環ケトン及びカルボキシル基のα位のケトンに対する還元活性は非常に低かった。
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また、ＦＰＤＨの種々の化合物に対する酸化活性を調べた。酸化活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に基質１ｍＭ、ＮＡＤ＋０．２５ｍＭ、ジメチルスルホキシド０．３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む３．０ｍｌの反応液中、３０℃、３分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。これを酸化活性基質測定の標準反応条件とした。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。表１０に、５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンを基質としたときの酸化活性を１００％とした時の相対活性で示した。その結果、種々の化合物に対して酸化活性を有していた。
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（実施例１９：ＦＰＤＨによる５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例１４で得られたＦＰＤＨ０．５ｕｎｉｔ、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン５ｍｇ、グルコース２０ｍｇ、ＮＡＤ＋０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬製）４ｕｎｉｔを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍｌを３０℃で１７時間攪拌した。反応後、実施例１と同様に分析を行った。その結果、変換率１００％で光学純度１００％ｅ．ｅ．の５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンが生成していた。
（実施例２０：ＦＰＤＨによる５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの７−クロロ−５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例１４で得られたＦＰＤＨ０．５ｕｎｉｔ、５−アセチル−７−クロロフロ［２，３−ｃ］ピリジン５ｍｇ、グルコース２０ｍｇ、ＮＡＤ＋０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬製）４ｕｎｉｔを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍｌを３０℃で３時間攪拌した。反応後、実施例１２と同様に分析を行った。その結果、変換率６６．９％で光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の７−クロロ−５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンが生成していた。
（実施例２１：ＦＰＤＨ遺伝子のクローニング）
（染色体ＤＮＡの取得）
キャンディダ・マリス  ＩＦＯ１０００３の培養液から、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。
（ＦＰＤＨ遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）
実施例１４のようにして得られた精製ＦＰＤＨを８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片の配列をエドマン法により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、ＰＣＲプライマー２種（プライマー１：５’−ＧＧＮＧＣＮＡＴＨＧＴＮＡＡＹＡＴＧＧＧ−３’、プライマー２：５’−ＣＣＤＡＴＮＧＧＲＴＧＹＴＧＮＧＴＤＡＴ−３’）を合成した。
プライマー２種（プライマー１及びプライマー２）各１００ｐｍｏｌ、染色体ＤＮＡ６６０ｎｇ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造株式会社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９５℃、１分）、アニーリング（４０℃、１分）、伸長反応（６５℃、２分）を４０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。（ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニング）
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を含めて２３０塩基からなっていた。その配列は、図１に示したＤＮＡ配列において、二重下線を引いたＤＮＡ配列部分である。以後この配列を「コア配列」と記す。
（逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’−側に近い部分の相補配列ＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧ（プライマー３）及び３’−側に近い部分の配列ＡＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＣＣ（プライマー４）を基に、これらと同配列のＰＣＲプライマー２種（プライマー３及びプライマー４）を合成した。
逆ＰＣＲの鋳型として、まずキャンディダ・マリスＩＦＯ１０００３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩにより消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物６６０ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプライマー４）各１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造株式会社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９４℃、０．５分）、アニーリング（５５℃、０．５分）、伸長反応（７２℃、１分）を４０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、ＦＰＤＨをコードするＤＮＡの全塩基配列を決定した。全塩基配列及び該ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列を図１にまとめた。図１中、一重下線部は、精製ＦＰＤＨをリシルエンドペプチダーゼ消化して生じたペプチド断片において、エドマン法により決定できたアミノ酸配列を表す。キャンディダ・マリスＩＦＯ１０００３由来のＦＰＤＨのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示した。また、上記ＦＰＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列を、配列表の配列番号２に示した。
（実施例２２：ＦＰＤＨ遺伝子を含む組換えベクターの作製）
大腸菌においてＦＰＤＨを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＦＰＤＨの構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。実施例２１で決定した塩基配列に基づき、ＦＰＤＨの構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー５（５’−ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣ−３’）と、ＦＰＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー６（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＣＣ−３’）とを合成した。
プライマー２種（プライマー５及びプライマー６）各１００ｐｍｏｌ、キャンディダ・マリスＩＦＯ１０００３の染色体ＤＮＡ１３２ｎｇ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造株式会社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９４℃、０．５分）、アニーリング（６０℃、０．５分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＦＰを得た。ｐＮＴＦＰの作製法及び構造を図２に示す。
（実施例２３：ＦＰＤＨ遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えベクターの作製）
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後ＧＤＨと呼ぶことにする）の遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、更にその直前にＥｃｏＲＩ切断点を、また、終始コドンの直後にＳａｌＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。ＧＤＨ遺伝子の塩基配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、更にその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したプライマー７（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ−３’）と、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したプライマー８（５’−ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧ−３’）を常法に従って合成した。これら２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、実施例２２において構築したｐＮＴＦＰのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位に挿入した組換えベクターｐＮＴＦＰＧを得た。ｐＮＴＦＰＧの作製法及び構造を図２に示す。
（実施例２４：組換え大腸菌の作製）
実施例２２で得た組換えベクターｐＮＴＦＰ及び実施例２３で得た組換えベクターｐＮＴＦＰＧを用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、各々から組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）及びＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）を得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）及びＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１６（寄託日２０００年４月１１日）及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１７（寄託日２０００年４月１１日）として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
また、プラスミドｐＧＤＡ２（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，６３８１（１９８９））をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化して得られるバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＧＤＨ遺伝子を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳＴＶ２８（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して、組換えベクターｐＳＴＶＧを構築した。このｐＳＴＶＧで、予め塩化カルシウム法でコンピテント化しておいた大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）を高い導入率で形質転換し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ，ｐＳＴＶＧ）を容易に得た。
（実施例２５：組換え大腸菌におけるＦＰＤＨの発現）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）を１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で培養し、集菌後、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＦＰＤＨ活性を実施例１４に記載の方法で測定した。その結果を、比活性として表１１に表した。
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大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＦＰＤＨ活性の増加がみられた。
（実施例２６：組換え大腸菌におけるＦＰＤＨ及びＧＤＨの同時発現）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）及び組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ，ｐＳＶＴＧ）を、実施例２５と同様に処理して得られた無細胞抽出液について、ＦＰＤＨ活性及びＧＤＨ活性を測定した。ＧＤＨ活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ＋２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｍＭの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＦＰＤＨ活性についても実施例１４と同様に測定した。このようにして測定した無細胞抽出液のＦＰＤＨ活性及びＧＤＨ活性を、比活性として表１２に表した。
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大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）及び大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ，ｐＳＶＴＧ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＦＰＤＨ及びＧＤＨ活性の増加がみられた。
（実施例２７：反応系にイソプロパノールを添加した条件下での、ＦＰＤＨ遺伝子を導入した組換え大腸菌による５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌをｐＨ７．０に調整し、これに５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン５０ｍｇ、イソプロパノール１５０μｌ及びＮＡＤ＋０．２２ｍｇを添加して、３０℃で７．５時間攪拌した。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンへの変換率と光学純度を測定したところ、変換率９５．７％、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．であった。
（実施例２８：反応系にＧＤＨを別添加した場合の、ＦＰＤＨ遺伝子を導入した組換え大腸菌による５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液２０ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野製薬株式会社製）５４０ｕｎｉｔ、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１．０ｇ、ＮＡＤ＋３ｍｇ、グルコース３ｇを添加し、２．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２９時間攪拌した。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの変換率と光学純度を測定したところ、変換率９７．１％、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．であった。
（実施例２９：ＦＰＤＨ及びＧＤＨを同時発現させた組換え大腸菌による５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液２０ｍｌに５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１．０ｇ、ＮＡＤ＋３ｍｇ、グルコース３ｇを添加し、２．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応途中６時間目に５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１．０ｇ、グルコース３．０ｇを追加添加した。２９時間攪拌後、実施例１と同様の分析法で、生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの生成量と光学純度を測定したところ、生成量２．６６ｇ、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．であった。
（実施例３０：反応系に酢酸ブチルを添加した条件下での、ＦＰＤＨ及びＧＤＨを同時発現させた組換え大腸菌による５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｒ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液２０ｍｌに５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン４．０ｇ、ＮＡＤ＋３ｍｇ、グルコース６ｇ、酢酸ブチル２０ｍｌを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応途中９時間目に５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジン１．０ｇ、グルコース１．５ｇを追加添加した。適時ＮＡＤ＋を追加添加して７８時間攪拌後、実施例１と同様の分析法で、生成物である５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの生成量と光学純度を測定したところ、生成量４．９８ｇ、光学純度（Ｒ）１００％ｅ．ｅ．であった。
（実施例３１：ＦＰＤＨ遺伝子を導入した組換え大腸菌による５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌをｐＨ６．５に調整し、これに５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１０ｍｇ（光学純度は０％ｅ．ｅ．）、アセトン５０μｌ及びＮＡＤ＋０．１ｍｇを添加して、３０℃で７時間攪拌した。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンの生成量と、５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの残存量及び光学純度を測定した。その結果、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンが４．７１ｍｇ生成し、５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの残存量は５．２９ｍｇ、光学純度（Ｓ）８９．２％ｅ．ｅ．であった。
（実施例３２：ＦＰＤＨ遺伝子を導入した組換え大腸菌による５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンからの５−（１−（Ｓ）−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの合成）
実施例２４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌをｐＨ６．５に調整し、これに５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジン１０ｍｇ（光学純度は０％ｅ．ｅ．）を添加して、３０℃で７時間攪拌した。反応終了後、実施例１と同様の分析法で、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンの生成量と、５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの残存量及び光学純度を測定した。その結果、５−アセチルフロ［２，３−ｃ］ピリジンが４．９８ｍｇ生成し、５−（１−ヒドロキシエチル）フロ［２，３−ｃ］ピリジンの残存量は５．０２ｍｇ、光学純度（Ｓ）９９．２％ｅ．ｅ．であった。
産業上の利用可能性
本発明は、不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、アセチルピリジン誘導体を立体選択的に還元することにより光学活性ピリジンエタノール誘導体を高収率で製造することができる。また、新規酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、及び、該組換えベクターを含む形質転換体を提供する。また、該酵素及び該形質転換体を用いることにより、光学活性ピリジンエタノール誘導体の効率的な製造が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例２１で決定したＤＮＡの塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す。
図２は、実施例２２の組換えベクターｐＮＴＦＰ及び実施例２３の組換えベクターｐＮＴＦＰＧの作製法、並びに、これらの構造を示す。
【図１】
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【図２】
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