(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・パラプシロシスに属し、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６を用い、培地中の資化可能な炭素源濃度が１０〜３０（ｗ／ｖ）で、資化可能な炭素源として糖質を用いる、Ｄ−アラビトールの製造方法。
【請求項２】
Ｄ−アラビトールの製造にあたり、培地中のｐＨを１．０〜６．０とすることを特徴とする、請求項１に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
【請求項３】
受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６として寄託されている、カンジダ・パラプシロシスに属する新規微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
【０００２】
本発明は、Ｄ−アラビトールの製造方法及びその方法を実施するために用いる新規微生物に関し、詳細には、甘味料として有用であるだけでなく、キシロースやキシリトールの原料としても有用であるＤ−アラビトールについて、選択的且つ高収率で製造することを可能とするカンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）に属する新規微生物、及びそれを実施するために用いた資化可能な炭素源からのＤ−アラビトールの製造方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
【０００４】
従来、微生物を用いたＤ−アラビトールの生産には様々な方法が検討されていたが、何れも選択性や収率に問題が有り、これらの要望を同時に満たすことは困難であった。
【０００５】
例えば、カンジダ（キヤンジダ）属、サッカロミセス属、ピヒヤ属、デバリオミセス属に属する微生物を利用した、発酵法によるＤ−アラビトールの生成は既に知られているが、Ｄ−アラビトール以外にグリセロール、エリスリトールなどの多価アルコール類がかなりの割合で同時に生成するという欠点があり、また、原料消費量に対するＤ−アラビトールの生成収率においても満足できるものではなかった。
【０００６】
さらに、特開昭５４−１４５２８４号公報では、カンジダ・トルロプシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｏｒｕｒｏｐｓｉｓ）に属する微生物を採用することにより、グリセロール、エリスリトールなどの多価アルコール類を生成しない製造方法を紹介しているが、原料消費量に対するＤ−アラビトールの生成収率は十分なものとは言えなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、資化可能な炭素源を原料とした微生物によるＤ−アラビトールの生成反応において、グリセロールやエリスリトールなどの多価アルコール類を生産することが無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料消費量に対するＤ−アラビトールへの生成収率が高い、Ｄ−アラビトールの製造方法、及びＤ−アラビトールの生産能力を有する新規微生物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らの鋭意研究の結果、カンジダ・パラプシロシスに属し、山梨県の菓子工場の敷地内から発見された新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３（工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに平成１２年８月２９日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６として寄託されている。）が、Ｄ−アラビトールの製造において高選択性と高収率が望める菌体であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の課題を解決するための手段は、次のとおりである。
【００１２】
第１に、カンジダ・パラプシロシスに属し、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６を用いた、Ｄ−アラビトールの製造方法。
第２に、Ｄ−アラビトールの製造にあたり、培地中のｐＨを１．０〜６．０、好ましくは１．１〜５．０、更に好ましくは１．２〜４．０とすることを特徴とする、上記第１に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
第３に、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６として寄託されている、カンジダ・パラプシロシスに属する新規微生物。
【００１３】
以下、この新菌株の菌学的性質を説明する。
【００１４】
なお、以下の説明、発明の実施の形態、各実施例、比較例において使用する培地の成分構成は、次のとおりである。
【００１５】
【表１】
0004616940.tif 000002
【００１６】
カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６）の菌学的性質
【００１７】
（１）生育状態
▲１▼栄養細胞の大きさ：５．４×４．９μｍ（注１）
▲２▼栄養細胞の形：楕円形、卵形（注１）
▲３▼栄養細胞の増殖法：多極出芽（注１）
▲４▼菌糸体：偽菌糸を形成した（注２）
▲５▼コロニーの様子：なめらか、クリーム状
▲６▼Ｄ．Ｂ．Ｂ染色：呈色せず（子嚢菌と判定）
▲７▼胞子の形成：形成せず（注３）
【００１８】
（注１）カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をプレート状のＹＭ培地に１白金耳接種し、２５℃で２日間、菌体の前培養を行った。培養後の菌体を、Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ液体培地に１白金耳接種し２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪培養し、サンプリングした菌体を光学顕微鏡を用いて測定した。
（注２）注１と同様の方法で菌体を前培養した後、Ｃｏｒｎ  ｍｅａｌ  ａｇａｒプレートに１白金耳接種し２５℃で培養し、２日ごとに顕微鏡観察した。
（注３）注１と同様の方法で菌体を前培養した後、Ｆｏｗｅｌｌ’ｓ  ａｃｅｔａｔｅプレートとＭａＣｌａｒｙ’ｓ  ａｃｅｔａｔｅプレートにそれぞれ１白金耳ずつ接種し２５℃で１８日間培養し、顕微鏡で観察した。
【００１９】
（２）生理的性質
▲１▼酸素要求性：好気的
▲２▼生育温度：２０〜３７℃
▲３▼最適生育温度：２５℃
▲４▼ビタミンの要求性：Ｂｉｏｔｉｎ  ｆｒｅｅ、ビタミン９種（Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃａ−Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ、Ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ、Ｎｉａｃｉｎ、ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｒｙｄｏｘｉｎｅ、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ、Ｔｈｉａｍｉｎ）ｆｒｅｅで生育なし
【００２０】
（３）炭素源の発酵性
▲１▼発酵性試験用培地の調製
発酵性試験用基本培地を、Ｄｕｒｈａｍ管を逆さに入れた試験管に４．０ｍｌ分注し、次いで発酵性評価を行う炭素源を溶解した１０％（ｗ／ｖ）  炭素源溶液（ただし、Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｔａｒｃｈ  、Ｉｎｕｌｉｎは５％で実施）を１．０ｍｌ、ＢＴＢ溶液０．３ｍｌを無菌的に添加したものを調製した。
なお、発酵性評価を行う炭素源がＳｏｌｕｂｌｅ  ｓｔａｒｃｈ、Ｉｎｕｌｉｎ、Ｒａｆｆｉｎｏｓｅの場合、発酵性試験用基本培地の添加量を３．０ｍｌ、炭素源溶液の添加量を２．０ｍｌとして調製した。
▲２▼培養
カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をＹＭ液体培地に１白金耳摂取し、ＯＤ６６０≒１．０（分光光度計による６６０ｎｍでの濁度の測定値）となるまで振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ．）した。振盪培養後、遠心集菌を行い、滅菌蒸留水で２回洗浄を行った後、滅菌蒸留水でＯＤ６６０≒０．１の菌体懸濁液を調製した。
この菌体懸濁液０．１ｍｌを上記発酵性試験用培地に接種し、２５℃、静置培養を行い、Ｄｕｒｈａｍ管内の気体の蓄積の様子を観察した。炭素源の発酵性は表２に記載の基準に従って評価した。各種炭素源の発酵性の結果は表３に記載した。
【００２１】
【表２】
0004616940.tif 000003
【００２２】
【表３】
0004616940.tif 000004
【００２３】
（４）炭素源の資化性
▲１▼資化性試験用培地の調製
Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）水溶液（１３．４ｇ／１００ｍｌ）と、１０％（ｗ／ｖ）炭素源水溶液を調製し、それぞれの水溶液２５０μｌと滅菌蒸留水４．５ｍｌを、滅菌済みの試験管に無菌的に分注し、これを炭素源資化性試験用培地とした。なお、炭素源を含まない培地として、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｇｅｎ  ｂａｓｅ水溶液（１３．４ｇ／１００ｍｌ）２５０μｌと滅菌蒸留水４．７５ｍｌからなる培地も調製した。
▲２▼培養
カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をＧＰＹ液体培地に１白金耳接種し、ＯＤ６６０≒１．０となるまで振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ．）した。滅菌蒸留水による遠心洗浄を２回行った後、３〜６ｍｌの滅菌蒸留水を用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を炭素源資化性試験用培地がＯＤ６６０≒０．０１となるように接種し、振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ．）を行った。
▲３▼評価
振盪培養中の生育の様子について、１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目に肉眼比濁用黒線（３／４ｍｍ幅の黒線を引いた白い紙）を用いて、肉眼比濁用黒線の前に試験管（７ｍｌ／１８×１８０ｍｍ）を置き、その線の見え方を表４の基準で評価した。２１日間の培養終了時に菌の生育が観測されなかった培地については、培養液のＯＤ６６０の値を測定した。炭素源資化性については、菌体の生育状況と培地の濁度を総合した表５の基準に基づいた評価で判定し、その結果を表６にまとめた。
【００２４】
【表４】
0004616940.tif 000005
【００２５】
【表５】
0004616940.tif 000006
【００２６】
【表６】
0004616940.tif 000007
【００２７】
（６）窒素源の資化性
▲１▼資化性試験用培地の調製
Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）水溶液（２３．４ｇ／１００ｍｌ）と、窒素源水溶液を調製し、それぞれの水溶液２５０μｌと滅菌蒸留水４．５ｍｌを、滅菌済みの試験管に無菌的に分注し、これを窒素源資化性試験用培地とした。窒素源水溶液の濃度は、Ｎｉｔｒａｔｅ（硝酸カリウム）が０．７８ｇ／５０ｍｌ、Ｎｉｔｒｉｔｅ（亜硝酸ナトリウム）が０．２６ｇ／５０ｍｌ、Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅが０．６８ｇ／５０ｍｌ、Ｌ−ｌｙｓｉｎｅが０．５６ｇ／５０ｍｌ、その他の窒素源については３．５ｇ／５０ｍｌである。
なお、窒素源を含まない培地として、Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  ｂａｓｅ水溶液（２３．４ｇ／１００ｍｌ）２５０μｌと滅菌蒸留水４．７５ｍｌからなる培地を調製し、ブランクとして評価した。
▲２▼培養
炭素源資化性試験と同様に行った。
▲３▼評価
炭素源資化性試験と同様の評価方法を用いて資化性を判定し、結果を表７にまとめた。
【００２８】
【表７】
0004616940.tif 000008
【００２９】
【発明の実施の形態】
【００３０】
本発明を実施するために使用する微生物としては、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的かつ高収率に生産する能力を有するものであればよく、具体的にはカンジダ・パラプシロシスに属する、新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３（工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６として寄託されている。）を採用でき、また、その変異株を包含する。変異株は、親株から、たとえば紫外線、Ｘ線、γ線などの照射、または適当な変異剤による処理などの慣行法によって得ることができる。
カンジダ・パラプシロシスに属する菌体の培養方法は、液体培地を用いて好気的条件下で攪拌培養することにより実施されることが望ましい。
【００３１】
液体培地の主炭素源としてはグルコース、フルクトース、スクロース、糖蜜または、これらの混合物など、各種糖質の使用が可能である。なお、これら糖質の培地中における量的割合としては、Ｄ−アラビトールの生成を妨げない範囲であれば自由に選択できる。
液体培地に添加される糖類の濃度条件は、５〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０〜３０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは１５〜２０％（ｗ／ｖ）である。液体培地中の炭素源となる糖類の濃度が４０％（ｗ／ｖ）を超えると、浸透圧が高くなり、微生物によるアラビトールの生成能力が低下するため好ましくない。また、液体培地に添加される糖類の濃度が５％（ｗ／ｖ）を下回った場合、液体培地中に含まれる炭素源の絶対量が少なくなり、Ｄ−アラビトールの製造が効率的に行われなくなるため好ましくない。
【００３２】
液体培地に使用される窒素源としては、微生物が利用可能な窒素化合物であればよく、例えば酵母エキスなどが使用できる。
また、液体培地には必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの種々の無機塩類を添加することもできる。
Ｄ−アラビトールの生成は、液体培地に菌体を直接接種するか、または別に種培養液を調製しそれを液体培地に接種しても良い。種培養液は、Ｄ−アラビトールの生成に用いられる培地と同組成の液体培地に直接菌体を接種し、２５℃で１〜２日間程度培養することで得ることができる。
【００３３】
培養温度は微生物が発育し得る範囲内で適宜設定されるが、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃、更に好ましくは２５℃前後である。培地温度が４０℃を超えたり１０℃を下回ると、微生物の活性が急激に低下し、Ｄ−アラビトールの生成量が低下するため好ましくない。
Ｄ−アラビトールの生成に用いられる培地のｐＨは、１．０〜６．０、好ましくは１．１〜５．０、更に好ましくは１．２〜４．０である。ｐＨが７．０を超えると、Ｄ−アラビトールの生成量が著しく低下するため好ましくない。
本発明における培養期間は、培地の種類及び主炭素源である糖質の濃度により異なるため、各種条件に応じて適宜変更すべきであるが、培地中の炭素源が最大限に消費された時点か、もしくは培養液中のＤ−アラビトール生成量が最大となった時点で終了させることが望ましく、通常３〜１０日程度である。
培養の進捗度は、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどの方法を用い、培養液中のＤ−アラビトールを定量することで、容易に測定が可能である。また、培養の進行度、培養液調製、各種溶液の添加量などの目安として、それぞれの溶液の濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）を用いることも可能である。濁度は分光光度計によって特定波長の散乱光を測定することで、求めることができる。
【００３４】
本発明では、グリセロールやエリスリトールといった副生成物を生じること無く、選択的にＤ−アラビトールを生成することが可能であった。その結果、使用した炭素源消費量当たりのＤ−アラビトール生成収率（Ｄ−アラビトール生産量／炭素源消費量）は、３０％以上、好ましくは４０％以上であり、最大で５０％を超えるものであった。
【００３５】
このようにして得られた培養液中のＤ−アラビトールは、常法によって培養液中から単離、精製することが可能であり、ろ過、遠心分離、イオン交換さらには、吸着クロマトグラフィー、結晶化など公知の手段を適宜組み合わせることで実施できる。
例えば、培養液から遠心分離によって菌体を除去し、次いで活性炭処理により着色物質などを除き、さらにイオン交換樹脂により脱イオンし、生成した培養液を濃縮乾固する。これに熱エタノール等の有機溶媒を加えてＤ−アラビトールを抽出し、抽出液をそのまま室温または冷却下に放置すると白色のＤ−アラビトール結晶が晶析する。このようにして得たＤ−アラビトール結晶をエタノールなどの有機溶媒を用いて再結晶を行うことにより、純粋なＤ−アラビトール結晶を得ることができる。
以下に、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の例に制限されるものではない。
【００３６】
なお、以下の実施例、比較例で使用する液体培地の成分組成は、次のとおりである。
【００３７】
【表８】
0004616940.tif 000009
【００３８】
【実施例１】
【００３９】
カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６）の保存菌体を、０．２ＮのＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した５％グルコース液体培地（７ｍｌ／１８ｍｍ×１８０ｍｍ試験管）に１白金耳接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪培養を行い、液体培地の濁度が分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｍｏｄｅｌ  １０１  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）による測定でＯＤ６６０≒１．０になるまで振盪培養を行い、前々培養液を得た。この前々培養液を、ＹＭ液体培地の濁度がＯＤ６６０≒０．０１となるまで接種させ、その中の１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、４８時間振盪培養し前培養液を得た。この前培養液を滅菌済み遠沈管（５００ｍｌ容ポリアロマ製）に全量入れ、冷凍遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ・２０ＰＲ−５２Ｄ）を用いて遠心分離（４５００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）を行い、上清を廃棄し菌体を回収した。回収した菌体に、１２Ｍ−ＨＣｌでｐＨ１．８に調整した１５％グルコース液体培地を添加、懸濁させて、液体培地がＯＤ６６０≒１００になるように調製した。菌体を添加した上記液体培地１００ｍｌをメスシリンダーに計りとり、５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、これを２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪培養を行った。
振盪培養１２０時間目でこの培養液のＨＰＬＣ分析を行ったところ、培養液中のＤ−アラビトールの生産量は７０．７４ｇ／Ｌ（収率５０．７％＝Ｄ−アラビトール生産量／グルコース消費量）であった。
【００４０】
【実施例２】
【００４１】
カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００６）の保存菌体を、０．２ＮのＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した５％グルコース液体培地（８ｍｌ／１８ｍｍ×１８０ｍｍ試験管）に１白金耳接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪培養を行った。振盪培養は液体培地の濁度がＯＤ６６０≒１．０になるまで行い、これを前培養液とした。前培養終了後、前培養液を滅菌済み綿栓付き試験管に全量入れ、遠心機を用いて遠心分離を行い、菌体を回収した。その後滅菌水を加えて懸濁した後、再び遠心分離を行い菌体を回収する操作を２回行い、菌体洗浄を行った。集菌洗浄後、０．１ＮのＮａＯＨでｐＨを４．８に調整した１５％フルクトース液体培地に対して、ＯＤ６６０≒０．０１となるように洗浄済みの菌体を接種し、滅菌済み綿栓付き５００ｍｌ容振盪フラスコに１００ｍｌ分注した。この溶液を２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで１０日間振盪培養した。
振盪培養２４０時間目でこの培養液中に含まれるＤ−アラビトールは、７６．４０ｇ／Ｌ（収率５０．９％＝Ｄ−アラビトール生産量／フルクトース消費量）であった。
【００４２】
【比較例】
【００４３】
カンジダ・オレオフィラＮｏ．１６１の保存菌体を、実施例２と同様の方法で前培養及び前培養した菌体の集菌洗浄を行った。集菌洗浄後、０．１ＮのＮａＯＨでｐＨを５．５に調整した１５％グルコース液体培地に対して、ＯＤ６６０≒０．０１となるように洗浄済みの菌体を接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで１０日間振盪培養した。
Ｄ−アラビトール生産量は、３１．１４ｇ／Ｌ（収率２０．８％＝Ｄ−アラビトール生産量／グルコース消費量）であり、リビトール２．４５ｇ／Ｌ（収率１．６％）も同時に生成した。また、この菌体は培養時に高い発泡性を有した。
【００４４】
各実施例及び比較例の培養結果を、表９に示す。
【００４５】
【表９】
0004616940.tif 000010
【００４６】
【発明の効果】
【００４７】
本発明によれば、資化可能な炭素源を原料とした微生物によるＤ−アラビトールの生成反応において、グリセロールやエリスリトールなどの多価アルコール類を生産することが無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料からＤ−アラビトールへの生成収率が高いＤ−アラビトールの製造方法を提供できる。