(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）を有するＮ−６置換の７−デアザプリンまたはそれらの薬学的に許容可能な塩：
【化１】
0004611524.tif 000051
式中、
Ｒ１が水素であり；
Ｒ２が、置換若しくは無置換のシクロアルキルであるか、または
Ｒ１及びＲ２は、一緒になって置換又は無置換の飽和複素環を形成し；
Ｒ３が、無置換又は置換のアリールであり；
Ｒ４が水素原子であり；
Ｒ５及びＲ６が、それぞれ独立して、水素又はアルキルである。
【請求項２】
Ｒ３が無置換又は置換のフェニルであり、Ｒ５及びＲ６が、それぞれアルキルである請求項１に記載のデアザプリン。
【請求項３】
Ｒ２が少なくとも１つの水酸基で置換されている請求項２に記載のデアザプリン。
【請求項４】
Ｒ２がモノヒドロキシシクロペンチルである請求項３に記載のデアザプリン。
【請求項５】
Ｒ２がモノヒドロキシシクロヘキシルである請求項３に記載のデアザプリン。
【請求項６】
Ｒ２が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｅ（ここで、Ｅは置換又は無置換のＣ１−Ｃ４アルキルである）で置換されている請求項２に記載のデアザプリン。
【請求項７】
Ｅがアルキルアミンである請求項６に記載のデアザプリン。
【請求項８】
Ｅが、エチルアミンである請求項７に記載のデアザプリン。
【請求項９】
前記複素環が、アミンで置換されている請求項１に記載のデアザプリン。
【請求項１０】
前記複素環が、アセトアミドで置換されている請求項１に記載のデアザプリン。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩：
４−（シス−３−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（シス−３−（２−アミノアセトキシ）シクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンのトリフルオロ酢酸塩
４−（３−アセトアミド）ピペリジニル−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−Ｎ’−メチルウレアプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アセトアミドブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−Ｎ’−メチルウレアブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アミノシクロプロピルアセトアミドエチル）アミノ−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−（３−クロロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；および
４−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−（４−ピリジル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−フェノキシメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−フルオロフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−クロロフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−メトキシフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−ピリジルオキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−フェニルアミノ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン；および
４−（２−Ｎ’−メチルウレアエチル）アミノ−６−フェノキシメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
【請求項１３】
以下の構造を有する請求項１に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化２】
0004611524.tif 000052
【請求項１４】
以下の構造を有する請求項１に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化３】
0004611524.tif 000053
【請求項１５】
以下の構造を有する請求項１に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化４】
0004611524.tif 000054
【請求項１６】
以下の構造を有する請求項１に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化５】
0004611524.tif 000055
【請求項１７】
以下の構造を有する請求項１に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化６】
0004611524.tif 000056
【請求項１８】
以下の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化７】
0004611524.tif 000057
【請求項１９】
以下の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化８】
0004611524.tif 000058
【請求項２０】
以下の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化９】
0004611524.tif 000059
【請求項２１】
以下の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化１０】
0004611524.tif 000060
【請求項２２】
以下の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化１１】
0004611524.tif 000061
【請求項２３】
以下の構造を有する請求項９に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化１２】
0004611524.tif 000062
【請求項２４】
以下の構造を有する請求項９に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化１３】
0004611524.tif 000063
【請求項２５】
以下の構造を有する請求項９に記載のデアザプリンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【化１４】
0004611524.tif 000064
【請求項２６】
請求項１１〜２５のいずれか１項に記載のデアザプリンの治療的に有効な量および薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる薬剤組成物。
【請求項２７】
呼吸疾患又は胃腸疾患の治療において使用するための、請求項２６に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
前記胃腸疾患が下痢である請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
前記呼吸疾患が、ぜん息、アレルギー性鼻炎、又は慢性閉塞性肺疾患である請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
前記薬剤組成物が、眼用製剤である請求項２６に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
前記薬剤組成物が、眼周囲用注射製剤、眼球後用注射製剤、又は眼内用注射製剤である請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
前記薬剤組成物が、全身用製剤である請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
前記薬剤組成物が、外科用灌注溶液である請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
治療学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１１〜２５の何れか１項に記載のデアザプリンを収容している容器、及び哺乳類における前記Ｎ−６置換の７−デアザプリン敏感性状態の治療のための前記デアザプリンの使用に関する説明書を含む、哺乳類におけるＮ−６置換の７−デアザプリン敏感性状態の治療のための包装された薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
アデノシンは特に循環器と神経系において数多くの生理学的活性を有する偏在する調節物質である。アデノシンの作用は特異的な細胞表面受容体タンパク質によって仲介されるように見える。アデノシンは鎮静の誘導、血管拡張、心拍と心収縮の抑制、血小板凝集の阻害、糖新生の活性化と脂肪分解の抑制を含む種々の生理的機能を調節する。アデニル酸シクラーゼに対するそれらの作用に加え、アデノシンはカリウムチャンネルを開き、カルシウムチャンネルを通る流動を減少させ、受容体を介した機構によりホスホイノシチドのターンオーバーを阻害または活性化することが示されている（たとえば、C.E.Muller and B.Stein ”Adenosine Receptor Antagonists：Structures and Potential Therapeutic Applications, ”Current Pharmaceutical Design,2:501(1996) 及びC.E. Muller ”A1-Adenosine Receptor Antagonists,” Exp. Opin. Ther. Patents 7(5): 419(1997)を参照のこと）。
【０００２】
アデノシン受容体は現在Ｐ１（アデノシン）およびＰ２（ＡＴＰ、ＡＤＰおよび他のヌクレオチド）受容体とに分類される、プリン受容体のスーパーファミリーに属している。これまでのところ、ヒトを含めた様々な種から４つのヌクレオシドアデノシンの受容体サブタイプがクローン化されている。２つの受容体サブタイプ（Ａ１およびＡ２ａ）はナノモル範囲での親和性を示すが、他の周知のサブタイプＡ２ｂおよびＡ３は低親和性の受容体であり、アデノシンに対する親和性は低マイクロモルの範囲である。Ａ１およびＡ３アデノシン受容体の活性化はアデニル酸シクラーゼの活性の抑制をもたらすが、Ａ２ａとＡ２ｂの活性化はアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こす。
【０００３】
少数のＡ１アンタゴニストが、認識疾患、腎不全、心不整脈の治療のために開発されてきた。Ａ２ａアンタゴニストはMorbus Parkinson（パーキンソン病）に苦しむ患者に有効だろうと示唆されている。特に局所輸送の可能性の態様において、アデノシン受容体アンタゴニストはアレルギー性炎症と喘息の治療に有用であろう。入手可能な情報（例えば Nyce & Metzger ”DNA antisense Therapy for Asthma in an Animal Model” Nature(1997)385: 721-5）は、この病理生理学の見地において、Ａ１アンタゴニストは呼吸上皮下の平滑筋収縮を阻害し、一方、Ａ２ｂやＡ３受容体アンタゴニストは肥満細胞の脱顆粒を阻害し、ヒスタミンや他の炎症性仲介物質の放出を緩和するであろうことを示している。Ａ２ｂ受容体は消化器官全体、特に結腸と腸上皮で発見されている。Ａ２ｂ受容体はｃＡＭＰ応答を仲介することが示唆されている（Strohmeierら, J. Bio. Chem. (1995) 270: 2387-94）。
【０００４】
アデノシン受容体は、ウシ、ブタ、サル、ラット、モルモット、マウス、ウサギ、ヒトを含めた様々な哺乳動物の網膜にも存在していることが示されている（Blazynskiら, Discrete Distributions of Adenosine Receptors in Mammalian Retina, Journal of Neurochemistry, volume 54,pages 648-655(1990)；Woodsら, Characterization of Adenosine A1-Receptor Binding Sites in Bovine Retinal Membranes, Experimental Eye Research, volume 53, pages 325-331(1991);Braasら, Endogenous adenosine and adenosine receptors localized to ganglion cells of the retina, Proceedings of the National Academy of Science, volume 84, pages 3906-3910(1987)を参照のこと）。最近、Ｗｉｌｌｉａｍｓはヒト網膜培養細胞株のアデノシン輸送部位の観察について報告している（Williamsら, Nucleoside Transport Sites in a Cultured Human Retinal Cell Line Established By SV-40 T Antigen Gene, Current Eye Research, colume 13, pages 109-118(1994)）。
【０００５】
アデノシン取り込みを調節する化合物は、以前に網膜と視神経乳頭部損傷の治療の有用な治療薬物であると示唆されている。Ｓｈａｄｅに付与された米国特許第５，７８０，４５０号において、Ｓｈａｄｅは眼障害の治療にアデノシン取り込み阻害剤を用いることについて議論している。Ｓｈａｄｅは特異的Ａ３受容体阻害剤の使用については開示していない。米国特許第５，７８０，４５０号の全内容は、ここでの引用により本明細書の一部をなす参照として援用される。
【０００６】
付加的なアデノシン受容体アンタゴニストは薬物的ツールとして必要とされ、また上に参照した疾患状態および／または状況への薬物としてかなりの関心が持たれている。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、少なくとも部分的には、以下に記述されたあるＮ−６置換７−デアザプリンが、Ｎ−６置換７−デアザプリン応答状態の治療に用いることができるという発見に基づく。このような状態の例には、アデノシン受容体の活性が増加するようなもの、たとえば、気管支炎、消化器官障害、あるいは喘息が含まれる。これらの状態はアデノシン受容体活性化がアデニル酸シクラーゼ活性の阻害または活性化をもたらすことと特徴づけられる。本発明の組成物と方法はエナンチオマー的またはジアステレオマー的に純粋なＮ−６置換７−デアザプリンを含む。好ましいＮ−６置換７−デアザプリンはアセトアミド、カルボキサミド、たとえばシクロヘキサノールのような置換シクロヘキシル、またはアルキル鎖を介してＮ−６窒素に結合したウレア部分を有するものを含む。
【０００８】
本発明は、アデノシン受容体活性の調節が起こるような治療に効果的な量のＮ−６置換７−デアザプリンを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物のアデノシン受容体（類）を調節する方法に関する。適切なアデノシン受容体はＡ１、Ａ２、またはＡ３ファミリーを含む。好ましい実施態様においては、Ｎ−６置換７−デアザプリンはアデノシン受容体アンタゴニストである。
【０００９】
本発明は、さらに、哺乳動物内で障害の治療が生じるように、治療的に効果的な量のＮ−６置換７−デアザプリンを哺乳動物に投与することにより、Ｎ−６置換７−デアザプリン疾患、たとえば喘息、気管支炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、腎障害、消化器障害、及び眼障害などを治療する方法に関する。適切なＮ−６置換７−デアザプリンは一般式Ｉに図示するもの
【化２１】
0004611524.tif 000002
およびそれらの薬学的に許容可能な塩を含む。Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、水素原子または、置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分であるか、一緒に置換、非置換複素環式環を形成する。Ｒ３は置換または非置換のアルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。Ｒ４は水素原子または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、たとえば塩素、フッ素、または臭素のようなハロゲン原子、水素原子または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部位であり、またはＲ４およびＲ５またはＲ５およびＲ６は一緒に置換、非置換複素環式または炭素環式環を形成する。
【００１０】
特定の実施態様においては、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に置換または非置換シクロアルキルまたはヘテロアリールアルキル部位でありうる。別の実施態様においては、Ｒ３は水素原子、または置換または非置換ヘテロアリール部分である。さらに別の実施態様においては、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してヘテロアリール部分でありうる。好ましい実施態様においては、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２はたとえばトランス−シクロヘキサノールのようなシクロヘキサノールであり、Ｒ３はフェニルであり、Ｒ４は水素原子であり、Ｒ５はメチル基であり、そしてＲ６はメチル基である。さらに別の実施態様においては、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２は
【化２２】
0004611524.tif 000003
であり、Ｒ３はフェニルであり、Ｒ４は水素原子であり、Ｒ５およびＲ６はメチル基である。
【００１１】
本発明はさらに哺乳動物のＮ−６置換７−デアザプリン応答状態、たとえば喘息、気管支炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、腎障害、消化器障害、及び眼障害などの治療のための薬物組成物に関する。この薬物組成物は治療的に効果的な量のＮ−６置換７−デアザプリンおよび薬学的に許容可能な担体を含む。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物のＮ−６置換７−デアザプリン応答状態を治療するための包装された薬物組成物を含む。この包装された薬物組成物は、少なくとも１つのＮ−６置換７−デアザプリンの治療的に効果的な量を保持した容器および哺乳動物のＮ−６置換７−デアザプリン応答状態を治療するためのＮ−６置換７−デアザプリンの使用の指示を含む。
【００１３】
本発明はさらに式Ｉの化合物：
（式中：
Ｒ１は水素であり、
Ｒ２は置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換アルキル、またはＲ１およびＲ２が一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、
Ｒ３は非置換または置換アリールであり
Ｒ４は水素であり、そして
Ｒ５およびＲ６がそれぞれ独立して水素またはアルキルである）、また薬学的に許容可能な塩に関する。この実施態様のデアザプリンは有利に選択的Ａ３受容体アンタゴニストとなりうる。これらの化合物はたとえば、喘息、心不全に伴う腎不全、緑内障の治療のような、多数の治療的使用に有用であり得る。特に好ましい実施態様においては、デアザプリンは  インビボにおいて、たとえば、エステラーゼ触媒加水分解によって、活性薬物に代謝されることの可能な水溶性プロドラッグである。
【００１４】
また別の実施態様においては、本発明は細胞をＮ−６置換７−デアザプリン（たとえば、好ましくは、アデノシン受容体アンタゴニスト）に接触させることにより、アデノシン受容体（たとえばＡ３）の活性を阻害する方法を特徴とする。
【００１５】
別の態様において、本発明は、動物に効果のある量の式ＩのＮ−６置換７−デアザプリンを投与することにより、動物（たとえばヒト）の眼障害を治療する方法を特徴とする。好ましくは、Ｎ−６置換７−デアザプリンは動物の細胞のＡ３アデノシン受容体のアンタゴニストである。傷害は網膜または視神経乳頭部に対するものであり、また急性または慢性のものでありうる。傷害は、たとえば、緑内障、浮腫、虚血、低酸素症、または外傷の結果でありうる。
【００１６】
本発明はまた、式ＩのＮ−６置換７−デアザプリンを含む薬物学的実施態様を特徴とする。好ましくは、薬物調製は眼科的処方（例えば、眼球周囲、眼球後、または眼球内注射処方、全身的処方、または外科的灌流液）である。
【００１７】
また別の実施態様においては、本発明は式ＩＩを有するデアザプリンを特徴とし、
【化２３】
0004611524.tif 000004
（式中、
ＸはＮまたはＣＲ６であり、
Ｒ１およびＲ２は、共に両方とも水素でないという条件のもと、それぞれ独立して水素、または置換または非置換アルコキシ、アミノアルキル、アルキル、アリールまたはアルキルアリールであり、または一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、
Ｒ３は置換または非置換アルキル、アリールアルキル、またはアリールであり；
Ｒ４は水素または置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｌは水素、置換または非置換アルキル、またはＲ４とＬが一緒に置換または非置換複素環式または炭素環式環を形成し、
Ｒ６は水素、置換または非置換アルキル、またはハロゲンであり、
ＱはＣＨ２、Ｏ、ＳまたはＮＲ７であり、式中、Ｒ７は水素、または置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、そして
Ｗは非置換、または置換アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、バイアリール、ヘテロアリール、置換カルボニル、置換チオカルボニル、または置換スルホニルであり、
ただし、Ｒ３がピロリジノの場合は、Ｒ４はメチルでないという条件である。本発明はまた、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩とプロドラッグを含む。
【００１８】
有利な実施態様において、式ＩＩ中、ＸはＣＲ６であり、ＱはＣＨ、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、式中Ｒ６は上記に定義するとおりである。
【００１９】
式ＩＩの別の実施態様においては、ＸはＮである。
【００２０】
さらに本発明は細胞に本発明の化合物を接触させることにより、細胞のアデノシン受容体（たとえばＡ２ｂアデノシン受容体）の活性を阻害するための方法に関する。好ましくは、化合物は受容体のアンタゴニストである。
【００２１】
本発明はまた、式ＩＩ（たとえばＡ２ｂのアンタゴニスト）の効果的な量を動物に投与することにより、動物の消化管障害（たとえば下痢）または呼吸障害（たとえばアレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患）を治療するための方法にも関する。
【００２２】
【発明の詳細な記述】
本発明の特徴および他の詳細については、以下で更に説明すると共に、特許制窮の範囲で特定する。本発明の特定の実施様態が例示により示され、本発明を限定するものでないことが理解されるであろう。本発明の本質的な特徴は本発明の範囲から逸脱することなしに様々な実施様態で使用されうる。
【００２３】
本発明は哺乳動物のＮ−６置換７−デアザプリン反応状態の治療のための方法に関する。前記方法には、哺乳動物でＮ−６置換７−デアザプリン応答状態の治療が起こるように、下に記述したような、哺乳動物へのＮ−６置換７−デアザプリンの薬物的に効果的な量の投与を含む。
【００２４】
語句「Ｎ−６置換７−デアザプリン応答状態（N-6 substituted 7-deazapurine responsive state）」は以下に記述するような本発明のＮ−６置換７−デアザプリンでの治療への応答によって特徴づけられる疾病状態または状況を含むことを意図し、たとえば治療には本発明のＮ−６置換デアザプリンにて達成されたその状態の少なくとも１つの症状の減少または効果が含まれる。典型的にはそのような状態は、宿主がしばしば毒素の放出、炎症、昏睡、水貯留、体重増加または体重減少、膵炎、気腫、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、多重臓器不全、幼児および成人呼吸窮迫症候群、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、眼障害、消化管障害、皮膚腫瘍促進、免疫不全および喘息を含むが、限定されない病理学的症状を患うような宿主内のアデノシンの増加と関連する（たとえばC.E. Muller and B.Stein 「アデノシン受容体アンタゴニスト：構造および可能性のある治療的適用」、Current Pharmacerutical Design,2:501 (1996)およびC.E.Muller、「Ａ１−アデノシン受容体アンタゴニスト」、Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419(1997)およびI.Feoktistove,R.Polosa,S.T.Holgate and I.Biaggioni、「アデノシンＡ２Ｂ受容体：喘息の新規治療標的？」, TiPS 19;148(1998)を参照のこと）。効果はしばしば発熱、呼吸短縮、吐気、下痢、柔弱、頭痛および死をも含むが、限定されないような症状に関連する。１つの実施様態において、Ｎ−６置換７−デアザプリン応答状態は、細胞内のカルシウム濃度および／またはＰＬＣ（ホスホリパーゼＣ）の活性化が調節されるようなアデノシン受容体、たとえばＡ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ａ３などの刺激によって仲介されるような疾患状態を含む。好ましい実施様態において、Ｎ−６置換７−デアザプリン応答状態はアデノシン受容体（群）に関連し、たとえばＮ−６置換７−デアザプリンはアンタゴニストとして働く。たとえば生物学的効果を仲介するアデノシン受容体サブタイプのような本発明の化合物によって治療されうる適切な応答状態の例としては、中枢神経系（ＣＮＳ）効果、心臓血管効果、腎臓効果、呼吸効果、免疫学的効果、消化管効果及び代謝効果が含まれる。対象内のアデノシンの相対的な量は以下に列記した効果に関連しうる。すなわちアデノシンのレベルの増加がたとえば喘息発作などの好ましくない生理学的応答などの効果を引き起こしうる。
【００２５】
ＣＮＳ効果には伝達物質放出の減少（Ａ１）、沈静（Ａ１）、運動活性の減少（Ａ２ａ）、鎮痙性活性、化学受容器刺激（Ａ２）および感覚過敏が含まれる。本発明の化合物の治療的適用には痴呆、アルツハイマー病および記憶増強が含まれる。
【００２６】
心臓血管効果には血管拡張（Ａ２ａ）、（Ａ２ｂ）および（Ａ３）、血管収縮（Ａ１）、除脈（Ａ１）、血小板阻害（Ａ２ａ）、陰性心臓線維診断法および変伝導（Ａ１）、不整脈、頻拍および血管新生が含まれる。本発明の化合物の治療的適用には、たとえば心臓の虚血誘導傷害および狭心症の予防、心筋組織保護および心機能の修復が含まれる。
【００２７】
腎効果にはＧＦＲの減少（Ａ１）、糸球体間質細胞収縮（Ａ１）、坑利尿（Ａ１）、およびレニン放出の阻害（Ａ１）が含まれる。本発明の化合物の適切な治療的適用には利尿薬、ナトリウム排泄増加薬、カリウム保持性利尿薬、急性腎不全の腎臓保護／予防、坑高血圧薬、坑浮腫剤、坑腎炎薬としての本発明の化合物の使用が含まれる。
【００２８】
呼吸効果には、気管支拡張（Ａ２）、気管支収縮（Ａ１）、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、粘液分泌および呼吸抑制（Ａ２）が含まれる。本発明の化合物のための適切な治療的適用には坑肺炎適用、移植および呼吸不全の後の肺疾病の治療が含まれる。
【００２９】
免疫学的効果には免疫抑制（Ａ２）、好中球走化性（Ａ１）、好中球スーパーオキシド生成（Ａ２ａ）および肥満細胞脱顆粒（Ａ２ｂおよびＡ３）が含まれる。アンタゴニストの治療的適用には、たとえばヒスタミンまたは他の炎症仲介物質の放出などのアレルギー性および非アレルギー性炎症が含まれる。
【００３０】
消化管効果には、酸分泌抑制（Ａ１）が含まれる。治療的適用には還流および潰瘍性状態が含まれる。消化管効果はまた、たとえば直腸炎症に関連する下痢疾病（Ａ２ｂ）などの結腸、直腸および下痢疾病が含まれる。
【００３１】
眼の障害には、網膜および視神経乳頭傷害および不全に関連した外傷（Ａ３）が含まれる。好ましい実施様態において、眼の障害は緑内障である。
【００３２】
本発明の化合物の他の治療的適用には、肥満症（脂肪分解特性）の治療、高血圧、鬱病の治療、鎮静剤、坑不安薬、たとえば下痢を引き起こさない運動性に影響する防腐薬として、および緩下薬としての使用が含まれる。
【００３３】
用語「疾病状態(disease state)」は所望されないレベルのアデノシン、アデニルシクラーゼ活性、アデノシン受容体の異常刺激またはこれらに関連した生理的な活性の上昇および／またはｃＡＭＰの増加によって引き起こされる。１つの実施態様において、疾病状態はたとえば喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、気管支炎、腎障害、消化管障害または眼障害である。さらなる例には、慢性気管支炎および嚢胞性線維症が含まれる。炎症疾患の適切な例には非リンパ性白血病、心臓血管虚血、アンギナ、亀裂骨折、脳血管虚血、間欠性跛行、重症肢虚血、静脈高血圧、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍および動脈硬化症が含まれる。障害再灌流状態には、たとえば乳房再建手術などの任意の手術後損傷、血栓崩壊または血管形成などが含まれる。
【００３４】
「Ｎ−６置換７−デアザプリン応答状態の治療(treatment of a N-6 substituted 7-deazapurine responsive state)」または「Ｎ−６置換７−デアザプリン応答状態を治療すること(treating a N-6 substituted 7-deazapurine responsive state)」の用語は、哺乳動物での生理的症状が明らかに減少し、または縮小し得るように、上述したような疾患状態または状況の変化が含まれる。この用語はまた生理学的な症状の制御、予防または阻害、または異常量のアデノシンと関連する影響をも含む。１つの好ましい実施様態において、疾患状態または状況の制御は、疾患状態または状況が根絶するようなことである。他の好ましい実施様態において、制御は異常レベルのアデノシン受容体活性が他の生理学的な系およびパラメータが無効であるときに制御される様に選択性である。
【００３５】
用語「Ｎ−６置換７−デアザプリン(N-6 substituted 7-deazapurine)」は当技術分野で認識され、式Ｉを持つような化合物を含む。
【００３６】
【化２４】
0004611524.tif 000005
「Ｎ−置換  ７−デアザプリン(N-substituted 7-deazapurine)」には薬学的に許容可能なその塩が含まれ、そして１つの実施様態において、また本明細書に記述された特定のＮ−６置換プリンが含まれる。
【００３７】
ある実施様態において、Ｎ−６置換  ７−デアザプリンはＮ−６ベンジルまたはＮ−６フェニルエチル置換ではない。他の実施様態において、Ｒ４はベンジルまたはフェニルエチル置換ではない。好ましい実施様態において、Ｒ１およびＲ２は両方とも水素原子ではない。また他の好ましい実施様態では、Ｒ３は水素原子ではない。
【００３８】
以下記述された語Ｎ−６置換７−デアザプリンの「治療的に効果的な量(therapeutically effective amount)」はその哺乳動物内で意図した機能、たとえばＮ−６置換７−デアザプリン応答状態、または哺乳動物の疾患状態の治療を成し遂げるのに必要かまたは十分な治療的化合物の量のことである。効果的な量の治療的化合物は、哺乳動物にすでに存在している原因薬剤の量、哺乳動物の年齢、性別および体重、および哺乳動物でのＮ−６置換７−デアザプリン応答状態に作用する本発明の治療的化合物の能力に依存して変化できる。当業者は前述の因子について研究できるだろうし、実験を行わずに治療化合物の効果量に関した決定を行うことができるであろう。インビトロまたはインビボのアッセイはまた、以下に記述された治療的化合物の「効果的な量(effective amount)」を決定するのにも使用できる。当業者は前述したアッセイで、または治療処置として使用するための治療的化合物の好ましい量を選択するであろう。
【００３９】
治療的に効果的な量は、好ましくは処置されたＮ−６置換７−デアザプリン応答状態または状況に関連した少なくとも１つの症状または影響を、治療しない対象と比べて少なくとも約２０％まで（より好ましくは少なくとも約４０％まで、さらにより好ましくは少なくとも約６０％まで、さらに好ましくは少なくとも約８０％まで）減少させる。アッセイもまた当業者によってそのような症状および／または影響の減少を測定するために計画されうる。そのようなパラメータを測定することのできる任意の当技術分野で認識されたアッセイは本発明の一部分として含まれるつもりである。たとえば、喘息が治療される状態であった場合、ここで対象の肺より膨張された空気体積を、本発明分野で認識されている技術を用いて体積の増加の測定のために治療の前後で測定できる。同様に、炎症が治療されている状態である場合、そこで、炎症を起こしている領域を、当技術分野で認識されている技術を用いて炎症を起こしている領域の減少の測定のために治療の前後で測定できる。
【００４０】
「細胞(cell)」の用語は、真核細胞および原核細胞両方を含む。
【００４１】
「動物(animal)」の用語は、アデノシン受容体を持つ任意の有機体またはＮ−６−置換７−デアザプリン応答状態を受けやすい任意の有機体を含む。動物の例には酵母、哺乳動物、爬虫類、鳥類が含まれる。トランスジェニック動物も含まれる。
【００４２】
「哺乳動物(mammal)」の用語は、当技術分野で認識されており、動物、さらに好ましくは温血動物、最も好ましくはウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよびヒトを含む。たとえばＮ−６置換７−デアザプリン応答状態、炎症、気腫、喘息、中枢神経系状態または急性呼吸窮迫症候群を受けやすい哺乳動物がたとえば本発明の一部分として含まれる。
【００４３】
他の態様では、本発明は哺乳動物に治療的に効果的な量のＮ−６置換７−デアザプリンを投与することで哺乳動物内のアデノシン受容体（群）を調節するための方法に関し、それによって哺乳動物内のアデノシン受容体の調節が起こる。適切なアデノシン受容体には、Ａ１、Ａ２、またはＡ３のファミリーが含まれる。好ましい実施様態において、Ｎ−６置換７−デアザプリンはアデノシン受容体アンタゴニストである。
【００４４】
「アデノシン受容体を調節すること(modulating an adenosine receptor)」の用語は、化合物がアデノシン受容体（群）と相互作用し、結果アデノシン受容体に関連した増加した、減少したまたは異常な生理学的活性、または引き続くアデノシン受容体の調節の結果のカスケード効果を引き起こす例を含む。アデノシン受容体に関連した生理学的な活性には、鎮静、血管拡張、心速度および収縮の抑制、血小板凝集の阻害、糖新生の刺激、脂質分解の阻害、カリウムチャネルの開放、カルシウムチャネル流動の減少などが含まれる。
【００４５】
「調節する(modulate)」、「調節すること(modulating)」および「調節(modulation)」の用語は、たとえば本発明の治療的方法の文脈において、アデノシン受容体の異常な刺激に関連した望ましくない生理学的活性の結果の増加を予防すること、根絶させることまたは阻害することを含む。他の実施様態において、用語、調節は、たとえばアデノシン受容体（類）の過剰刺激の結果のアレルギーおよびアレルギー性炎症の伝達物質の活性または産出の減少のようなアンタゴニスト効果を含む。たとえば、本発明の治療的デアザプリンはアデノシン受容体と相互作用し、たとえばアデニル酸シクラーゼ活性を阻害する。
【００４６】
「異常なアデノシン受容体活性によって特徴づけられる症状(condition characterized by aberrant adenosine receptor activity)」の用語は、受容体の刺激が、直接的にまたは間接的に疾患、障害または症状と関連している生化学的なおよびまたは生理学的な連続的な事象を引き起こすような、アデノシン受容体の異常な刺激に関連した疾患、障害または症状を含む。このアデノシン受容体の刺激は、疾患、障害または症状の唯一の原因である必要はなく、単に試験されている疾患、障害または症状に典型的に関連した症候群の幾つかを引き起こす原因となるものである。受容体の異常な刺激が唯一の因子であってもよく、または少なくとも１つの他の試薬が治療されている状態に関連することができる。症状の例には、炎症、消化管障害およびアデノシン受容体活性の増加が存在することで明らかになったな疾病状態を含む以下に列記した疾患が含まれる。好ましい例には喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、気腫、気管支炎、消化管不全および緑内障に関連した症候群が含まれる。
【００４７】
「異常なアデノシン受容体活性によって特徴づけられる症状を治療することまたは治療(treating or treatment of a condition characterized by aberrant adenosine receptor activity)」の用語は、典型的には、その状態に関連している少なくとも１つの症状の緩和または減少を含む。治療はまた１つ以上の症状の緩和、または減少を含む。好ましくは、治療は、その状態と関連している症候を治療し、たとえば実質的に排除する。
【００４８】
本発明は式Ｉを含む化合物Ｎ−６置換７−デアザプリンに関し、
【化２５】
0004611524.tif 000006
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素原子、または置換または非置換アルキル、アリールまたはアルキルアリール部分であり、または一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、
Ｒ３は水素原子、または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分であり、
Ｒ４は水素原子、または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立にハロゲン原子、たとえば塩素、フッ素または臭素原子であり、または水素原子、または置換または非置換アルキル、アリールまたはアルキルアリール部分であり、またはＲ４およびＲ５、またはＲ５およびＲ６がともに置換または非置換複素環式環または炭素環式環を形成する。また、Ｎ−６置換７−デアザプリンの薬学的に許容可能な炎も含まれる。
【００４９】
特定の実施態様において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して置換または非置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル部分である。他の実施様態において、Ｒ３は水素原子、または置換または非置換へテロアリール部分である。また他の実施様態では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立にヘテロアリール部分である。
【００５０】
１つの実施様態において、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２は置換または非置換シクロヘキサン、シクロペンチル、シクロブチル、またはシクロプロパン部位であり、Ｒ３は置換または非置換フェニル部位であり、Ｒ４は水素原子であり、Ｒ５およびＲ６は両方ともメチル基である。
【００５１】
他の実施様態において、Ｒ２はシクロヘキサノール、シクロヘキサンジオール、シクロへキシルスルホンアミド、シクロヘキサンアミド、シクロヘキシルエステル、シクロヘキサン、シクロペンタノールまたはシクロペンテンジオールであり、Ｒ３はフェニル部分である。
【００５２】
また他の実施様態において、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２はシクロヘキサノールであり、Ｒ３は置換または非置換フェニル、ピリジン、フラン、シクロペンタンまたはチオフェン部分であり、Ｒ４は水素原子、置換アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分であり、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して水素原子、または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。
【００５３】
また他の実施様態において、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２は置換または非置換アルキルアミン、アリールアミン、またはアルキルアリールアミン、置換または非置換アルキルアミド、アリールアミド、またはアルキルアリールアミド、置換または非置換アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、またはアルキルアリールスルホンアミド、置換または非置換アルキルウレア、アリールウレア、アルキルアリールウレア、置換または非置換アルキルカルバメート、アリールカルバメート、アルキルアリールカルバメート、置換または非置換アルキルカルボキシル酸、アリールカルボキシル酸、アルキルアリールカルボキシル酸であり、Ｒ３は置換または非置換フェニル部分であり、Ｒ４は水素原子であり、Ｒ５およびＲ６はメチル基である。
【００５４】
また他の実施様態において、Ｒ２はグアニジン、修飾グアニジン、シアノグアニジン、チオウレア、チオアミドまたはアミジンである。
【００５５】
１つの実施様態において、Ｒ２は
【化２６】
0004611524.tif 000007
であることができ、式中Ｒ２ａ−Ｒ２ｃはそれぞれ独立して水素原子、または、飽和または不飽和アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分であり、Ｒ２ｄは水素原子または、飽和または不飽和アルキル、アリールまたはアルキルアリール部位、ＮＲ２ｅＲ２ｆまたはＯＲ２ｇであり、式中Ｒ２ｅ−Ｒ２ｇはそれぞれ独立して水素原子または、飽和または不飽和アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。あるいは、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは一緒にたとえばシクロプロピル、シクロペンチル、シクロへキシル基のような３〜８個の間の環サイズを持つ炭素環式または複素環式環を形成することができる。
【００５６】
本発明の１つの側面において、Ｒ５およびＲ６両方はメチル基ではなく、好ましくはＲ５およびＲ６の１つはアルキル基、たとえばメチル基であり、他は水素原子である。
【００５７】
本発明のもう一つの側面おいて、Ｒ４は１−フェニルエチルであり、Ｒ１は水素原子であるときは、Ｒ３はフェニル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、３，４−ジクロロフェニル、３−メトキシフェニルまたは４−メトキシフェニルではなく、Ｒ４およびＲ１が１−フェニルエチルである場合は、Ｒ３は水素原子ではなく、またはＲ４が水素原子でＲ３がフェニルの場合は、Ｒ１はフェニルエチルではない。
【００５８】
本発明の他の態様において、Ｒ５およびＲ６は一緒にたとえば
【化２７】
0004611524.tif 000008
ピリミド［４，５−６］インドールのような炭素環式環を形成する場合、Ｒ４が１−（４−メチルフェニル）エチル、フェニルイソプロピル、フェニルまたは１−フェニルエチルのときはＲ３はフェニルではなく、またはＲ４が１−フェニルエチルのときはＲ３は水素原子ではない。Ｒ５及びＲ５により形成される炭素環式環は、芳香族または脂肪族どちらでもありえ、ナフチル、フェニルシクロへキシルなどの４から１２炭素原子、好ましくはたとえばシクロペンチルまたはシクロへキシルなどの５から７の間の炭素原子を有し得るＲ５およびＲ６より形成される。あるいはＲ５およびＲ６は一緒に、以下に開示されるような複素環式環を形成しうる。典型的な複素環式環には、４〜１２炭素原子、好ましくは５〜７炭素原子が含まれ、芳香族または脂肪族のいずれかでありえる。複素環式環はさらに置換されることができ、環式構造の１つ以上の炭素原子の、１つ以上のヘテロ原子での置換が含まれる。
【００５９】
本発明の更にもう一つの側面において、Ｒ１およびＲ２は複素環式環を形成する。代表的な例には、モルフォリノ、ピペラジンおよびたとえば４−ヒドロキシピペリジン、４−アミノピペリジンなどの類似体のような以下に列記した複素環式環が含まれるが、限定されない。Ｒ１およびＲ２は一緒にピペラジノ基
【化２８】
0004611524.tif 000009
を形成し、Ｒ７は水素原子または、置換または非置換アルキル、アリールまたはアルキルアリール部分であり得る。
【００６０】
本発明のさらに他の側面において、Ｒ４およびＲ５は一緒に、たとえば
【化２９】
0004611524.tif 000010
のような複素環式環を形成しうる。複素環式環は芳香族または脂肪族のいずれかであり得、またたとえばナフチル、フェニルシクロへキシルなどの４〜１２炭素原子を有する環を形成でき、たとえばシクロへキシル、シクロペンチルのような芳香族または脂肪族のいずれかであり得る。複素環式環はさらに、置換されることができ、環式構造の炭素原子の、１つ以上のヘテロ原子での置換が含まれる。あるいはＲ４およびＲ５は一緒に以下に開示されたような複素環式環を形成できる。
【００６１】
特定の実施様態において、Ｎ−６置換７−デアザプリンはＮ−６ベンジルまたはＮ−６フェニルエチル置換ではない。他の実施様態において、Ｒ４はベンジルまたはフェニルエチル置換ではない。好ましい実施様態において、Ｒ１およびＲ２は両方とも水素原子ではない。さらに他の好ましい実施様態において、Ｒ３は水素原子ではない。
【００６２】
本発明の化合物は、たとえばエステラーゼ触媒加水分解によってインビボで活性薬剤に代謝される水溶性プロドラッグを含んでよい。可能性のあるプロドラッグの例には、たとえばＲ２が−ＯＣ（Ｏ）（Ｚ）ＮＨ２によって置換されたシクロアルキルで、式中Ｚが天然のまたは人工のアミノ酸またはその類似体、α、β、γまたはωアミノ酸、またはジペプチドの側鎖であるジアザプリンが含まれる。好ましいアミノ酸側鎖には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、アラニン−アラニンまたはグリシン−アラニンの側鎖が含まれる。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は水素であり、
Ｒ２は置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換アルキルであり、またはＲ１およびＲ２は一緒になって置換または非置換複素環式環を形成し、
Ｒ３は非置換または置換アリールであり、
Ｒ４は水素であり、
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に水素またはアリールである）のジアザプリンおよびその薬学的に許容可能な塩を特色とする。本実施様態のデアザプリンは潜在的に選択的Ａ３受容体アンタゴニストであってよい。
【００６４】
１つの実施様態において、Ｒ２は置換（たとえばヒドロキシ置換）または非置換シクロアルキルである。有利な副次的実施様態において、Ｒ１およびＲ４は水素であり、Ｒ３は非置換または置換フェニルであり、およびＲ５およびＲ６はそれぞれアルキルである。好ましくはＲ２はモノ−ヒドロキシシクロペンチルまたはモノ−ヒドロキシシクロへキシルである。Ｒ２はまた−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｅで置換されてよく、式中、Ｅは置換または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル（たとえばアルキルアミン、たとえばエチルアミン）である。
【００６５】
Ｒ１およびＲ２はまた一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、アミンまたはアセトアミド基で置換されうる。
【００６６】
他の側面において、Ｒ２は−Ａ−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｂであってよく、式中Ａは非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル（たとえばエチル、プロピル、ブチル）であり、Ｂは置換または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル（たとえばメチル、アミノアルキル、たとえばアミノメチルまたはアミノエチル、アルキルアミノ、たとえばメチルアミノ、エチルアミノ）であり、好ましくはＲ１およびＲ４が水素である場合、Ｒ３は非置換または置換フェニルであり、Ｒ５およびＲ６はそれぞれアルキルである。Ｂは置換または非置換シクロアルキル、たとえばシクロプロピルまたは１−アミノ−シクロプロピルである。
【００６７】
他の実施様態において、好ましくはＲ５およびＲ６がそれぞれアルキルであるとき、Ｒ３は置換または非置換フェニルであってよい。好ましくは、Ｒ３は１つ以上の置換基（たとえばｏ−、ｍ−またはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−フルオロフェニル）を有してよい。
【００６８】
有利には、好ましくはＲ５およびＲ６がそれぞれアルキルであるとき、Ｒ３は置換または非置換ヘテロアリールであってよい。ヘテロアリール基の例にはピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、トリアゾリル、チオアゾリル、オキサゾリル、オキサジアソリル、フラニル、メチレンジオキシフェニルおよびチオフェニルが含まれる。好ましくは、Ｒ３は２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジルまたは３−ピリミジルである。
【００６９】
好ましくは１つの実施様態において、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ水素である。他においてＲ５およびＲ６はそれぞれメチルである。
【００７０】
特に好ましい実施様態において、本発明のデアザプリンは、インビボでたとえばエステラーゼ触媒加水分解によって活性薬物に代謝されうる水溶性プロドラッグである。好ましくはプロドラッグには−ＯＣ（Ｏ）（Ｚ）ＮＨ２で置換されたシクロアルキルであって、式中、Ｚは天然のまたは人工のアミノ酸、その類似体、α、β、γまたはωアミノ酸、またはジペプチドの側鎖である、Ｒ２基を含む。好ましいアミノ酸側鎖の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、アラニン−アラニンまたはグリシン−アラニンの側鎖が含まれる。
【００７１】
特に好ましい実施様態において、Ｚはグリシンの側鎖であり、Ｒ２はシクロへキシルであり、Ｒ３はフェニルであり、Ｒ５およびＲ６はメチルである。
【００７２】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（シス−３−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００７３】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（シス−３−（２−アミノアセトキシ）シクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジントリフルオロ酢酸塩である。
【００７４】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（３−アセトアミド）ピペリジニル−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００７５】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（２−Ｎ’−メチルウレアプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００７６】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセトアミドブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００７７】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（２−Ｎ’−メチルウレアブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００７８】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（２−アミノシクロプロピルアセトアミドエチル）アミノ−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００７９】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（トランス−４−ヒドロキシシクロへキシル）アミノ−２−（３−クロロフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００８０】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（トランス−４−ヒドロキシシクロへキシル）アミノ−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００８１】
他の実施様態において、デアザプリンは４−（トランス−４−ヒドロキシシクロへキシル）アミノ−２−（４−ピリジル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【００８２】
また、他の実施様態において、本発明は、細胞をＮ−６置換７−デアザプリン（たとえば好ましくはアデノシン受容体アンタゴニスト）と接触させることによって、細胞内のアデノシン受容体（たとえばＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂまたは好ましくはＡ３）の活性を抑制する方法を特徴とする。
【００８３】
他の態様において、本発明は、動物に効果的な量のＮ−６置換７−デアザプリンを投与することにより、動物（たとえばヒト）の眼への障害を治療する方法を特色とする。好ましくはＮ−６置換７−デアザプリンは動物の細胞内のＡ３アデノシン受容体のアンタゴニストである。障害は網膜または視神経乳頭に対してであり、急性または慢性でありうる。障害はたとえば緑内障、浮腫、虚血、低酸素、外傷の結果でありうる。
【００８４】
好ましい実施様態において、本発明は以下の式ＩＩを持つジアザプリンを特徴とし、（式中、
ＸはＮまたはＣＲ６であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素、または置換または非置換あるアルコキシ、アミノアルキル、アルキル、アリール、またはアルキルアリールであり、または一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、ただし、Ｒ１およびＲ２は両方とも水素ではなく、
Ｒ３は置換または非置換アルキル、アリールアルキル、またはアリールであり、
Ｒ４は水素または、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｌは水素、置換または非置換アルキルであり、またはＲ４およびＬは一緒に置換または非置換複素環式または炭素環式環を形成し、
Ｒ６は水素、置換または非置換アルキル、またはハロゲンであり、
ＱはＣＨ２、Ｏ、ＳまたはＮＲ７であり、式中、Ｒ７は水素または、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗは置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アクケニル、アリール、アリールアルキル、バイアリール、ヘテロアリール、置換カルボニル、置換チオカルボニルまたは置換スルホニルであり、Ｒ３がピロリジノである場合、Ｒ４はメチルではない。
【００８５】
１つの実施様態において、式ＩＩの化合物中、ＸはＣＲ６であり、ＱはＣＨ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。他の実施様態において、ＸはＮである。
【００８６】
式ＩＩの化合物のさらなる実施様態において、Ｗは置換または非置換アリール、５−または６−員のヘテロアリールまたはバイアリールである。Ｗは１つ以上の置換基で置換されてよい。置換基の例には、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アミノカルボキサミド、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＯ２Ｒ８、ＣＯＮＨＲ８、ＣＯＮＲ８Ｒ９、ＳＯＲ８、ＳＯ２Ｒ８およびＳＯ２ＮＲ８Ｒ９が含まれ、式中、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立して水素、または置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアリールアルキルである。好ましくはＷは置換または非置換フェニル、たとえばメチレンジオキシフェニルであってよい。Ｗはまた、置換または非置換５員ヘテロアリール環、たとえばピロール、ピラゾール、オキサゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、フラン、チオフェン、チアゾールおよびオキサジアゾールであってよい。好ましくは、Ｗは６員ヘテロアリール環、たとえばピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジナルおよびチオフェニルであってよい。好ましい実施様態において、Ｗは２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジルまたは５−ピリミジルである。
【００８７】
式ＩＩの化合物の１つの有利な実施様態において、ＱはＮＨであり、Ｗは非置換、または置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、またはアリールアルキルによってＮ−置換された３−ピラゾール環である。
【００８８】
式ＩＩの化合物の他の実施様態において、Ｑは酸素であり、Ｗは非置換か、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアリールアルキルで置換された２−チアゾール環である。
【００８９】
式ＩＩの化合物の他の実施様態において、Ｗは置換または非置換アルキル、シクロアルキルであり、たとえばシクロペンチルまたはアリールアルキルである。置換基の例には、ハロゲン、ヒドロキシ、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはＮＨＲ１０が含まれ、式中、Ｒ１０は水素または、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアリールアルキルである。
【００９０】
また他の実施様態において、本発明は、式ＩＩのデアザプリンを特色とし、式中、Ｗは−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（＝Ｏ）Ｙまたは−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（＝Ｓ）Ｙであり、ａは０から３の整数であり、Ｙはアリール、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アルキニル、ＮＨＲ１１Ｒ１２であり、またはＱはＮＨ、ＯＲ１３であり式中Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立してハロゲンまたは、非置換または置換アルキル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルである。好ましくは、Ｙは５−または６−員ヘテロアリール環である。
【００９１】
さらにＷは−（ＣＨ２）ｂ−Ｓ（＝Ｏ）ｊＹであってよく、式中、ｊは１または２、ｂは０、１、２または３であり、Ｙはアリール、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、アルキニル、ヘテロアリール、ＮＨＲ１４Ｒ１５であり、ｂが１のときＱはＣＨ２であり、式中、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立してハロゲンまたは、非置換または置換アルキル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルである。
【００９２】
他の実施様態において、Ｒ３は置換および非置換フェニル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジナル、ピロリル、トリアゾリル、チオアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピラゾリル、フラニル、メチレンジオキシフェニル、およびチオフェニルからなる群より選択される。Ｒ３がフェニルの場合、たとえばヒドロキシル、アルコキシ８たとえばメトキシ）、アルキル（たとえばトリル）、およびハロゲン（たとえばｏ−、ｍ−またはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−クロロフェニル）で置換されてよい。有利にはＲ３は２−、３−、または４−ピリジルまたは２−、３−ピリミジルであってよい。
【００９３】
本発明はまた、Ｒ６が水素またはＣ１−Ｃ３アルキルであるデアザプリンにも関する。好ましくは、Ｒ６は水素である。
【００９４】
本発明はまた、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が置換または非置換アルキルまたはアルコキシ、置換または非置換アルキルアミン、アリールアミンまたはアルキルアリールアミン、置換または非置換アミノアルキル、アミノアリールまたはアミノアルキルアリール、置換または非置換アルキルアミド、アリールアミドまたはアルキルアリールアミド、置換または非置換アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミドまたはアルキルアリールスルホンアミド、置換または非置換アルキルウレア、アリールウレアまたはアルキルアリールウレア、置換または非置換アルキルカルバメート、アリールカルバメートまたはアルキルアリールカルバメート、または置換または非置換アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、アルキルアリールカルボン酸であるデアザプリンも含む。好ましくは、Ｒ２は置換または非置換シクロアルキル、たとえばモノ−、またはジヒドロキシ−置換シクロへキシルまたはシクロペンチル（好ましくは、モノヒドロキシ−置換シクロへキシルまたはモノヒドロキシ−置換シクロペンチル）である。
【００９５】
有利には、Ｒ２は以下の式のものであってよい：
【化３０】
0004611524.tif 000011
（式中、ＡはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、１〜７原子の鎖、または３〜７原子の環であり、任意にＣ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、チオールまたはアミノ基で置換されており、
Ｂはメチル、Ｎ（Ｍｅ）２、Ｎ（Ｅｔ）２、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、（ＣＨ２）ｒＮＨ３＋、ＮＨ（ＣＨ２）ｒＣＨ３、（ＣＨ２）ｒＮＨ２、（ＣＨ２）ｒＣＨＣＨ３ＮＨ２、（ＣＨ２）ｒＮＨＭｅ、（ＣＨ２）ｒＯＨ、ＣＨ２ＣＮ、（ＣＨ２）ｍＣＯ２Ｈ、ＣＨＲ１８Ｒ１９またはＣＨＭｅＯＨであり、式中ｒは０から２までの整数、ｍは１または２、Ｒ１８はアルキル、Ｒ１９はＮＨ３＋またはＣＯ２ＨまたはＲ１８およびＲ１９は一緒に
【化３１】
0004611524.tif 000012
であり、式中、ｐは２または３であり、
Ｒ１７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、１〜７原子の鎖、３〜７原子の環であり、任意にＣ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、またはアミノ基で置換されている）。
【００９６】
有利には、Ａは非置換または置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである。Ｂは非置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであってよい。
【００９７】
好ましい実施様態において、Ｒ２は式−Ａ−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｂである。特に有利な実施様態において、Ａは−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｂはメチルである。
【００９８】
本発明の化合物は、たとえばエステラーゼ触媒加水分解によってインビボで活性化薬剤に代謝される水溶性プロドラッグを含んでよい。可能性のあるプロドラッグの例には、たとえばＲ２が−ＯＣ（Ｏ）（Ｚ）ＮＨ２によって置換されたシクロアルキルであって、式中、Ｚが天然のまたは人工のアミノ酸またはその類似体、α、β、γまたはωアミノ酸、またはジペプチドの側鎖であるジアザプリンが含まれる。好ましいアミノ酸側鎖には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、アラニン−アラニンまたはグリシン−アラニンの側鎖が含まれる。
【００９９】
他の実施様態において、Ｒ１およびＲ２は一緒に
【化３２】
0004611524.tif 000013
であり、式中、ｎは１または２であり、および式中、環は任意に１つ以上のヒドロキシ、アミノ、チオール、カルボキシル、ハロゲン、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＮＨＣ（＝Ｏ）アルキル、またはＣＨ２ＮＨＣ（＝Ｏ）アルキル基によって置換されてよい。好ましくはｎは１または２であり、前記環は−ＮＨＣ（＝Ｏ）アルキルで置換される。
【０１００】
１つの有利な実施様態において、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ３は置換または非置換フェニルであり、Ｒ４は水素であり、Ｌは水素、または置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ＱはＯ、ＳまたはＮＲ７であり、式中、Ｒ７は水素または、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｗは置換または非置換アリールである。好ましくは、Ｒ２は−Ａ−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｂであり、式中、ＡおよびＢはそれぞれ独立して非置換または置換Ｃ１−Ｃ４アルキルである。たとえば、ＡはＣＨ２ＣＨ２であってよい。Ｂはたとえばアルキル（たとえばメチル）またはアミノアルキル（たとえばアミノメチル）であってよい。好ましくはＲ３は非置換フェニルであり、Ｌは水素である。Ｒ６はメチルまたは好ましくは水素であってよい。好ましくはＱはＯ、ＳまたはＮＲ７であり、式中、Ｒ７は水素または、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、たとえばメチルである。Ｗは非置換または置換フェニル（たとえばアルコキシ、ハロゲン置換）である。好ましくは、Ｗはｐ−フルオロフェニル、ｐ−クロロフェニルまたはｐ−メトキシフェニルである。Ｗはまたヘテロアリール、たとえば２−ピリジルであってよい。
【０１０１】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−フェノキシメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０２】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−フルオロフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０３】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−クロロフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０４】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−メトキシフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０５】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（２−ピリジルオキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０６】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−フェニルアミノ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０７】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０８】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは４−（２−Ｎ’−メチルウレアエチル）アミノ−６−フフェノキシメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンである。
【０１０９】
本発明はさらに、細胞を本発明の化合物に接触させることによって細胞内のアデノシン受容体（たとえばＡ２ｂアデノシン受容体）の活性を阻害するための方法に関する。好ましくは化合物は受容体のアンタゴニストである。
【０１１０】
本発明はまた、動物に効果量の本発明の化合物（たとえばＡ２ｂのアンタゴニスト）を投与することにより、動物の消化管障害（たとえば下痢）を治療するための方法に関する。好ましくは、動物はヒトである。
【０１１１】
他の実施様態において、本発明は本発明のＮ−６置換７−デアザプリンを含む薬物組成物および薬学的に許容可能な担体に関する。
【０１１２】
本発明はまた、Ｎ−置換７−デアザプリン応答状態が動物で起こるように、哺乳類動物に薬物的に効果的な量の本発明のデアザプリンを投与することにより、動物におけるＮ−６置換７−デアザプリン応答状態を治療するための方法に関する。有利には、疾病状態はアデノシンによって仲介される障害であってよい。好ましい疾病状態の例には、中枢神経系障害、心臓血管障害、腎障害、炎症障害、アレルギー性障害、消化管障害、眼障害および呼吸障害が含まれる。
【０１１３】
「アルキル(alkyl)」の用語は、飽和した脂肪族基を表し、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基が含まれる。アルキルの用語は、さらに１つ以上の炭化水素骨格の炭素原子を置換している酸素、窒素、硫黄またはリン原子、たとえば酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含んでよいアルキル基をさらに含む。好ましい実施様態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格には３０以下の炭素原子を有し（たとえば、直鎖ではＣ１−Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３−Ｃ３０）、さらに好ましくは２０以下である。同様に、好ましいシクロアルキル類は４−１０の炭素原子をその環構造内に持ち、さらに好ましくはその環構造内に５、６または７炭素を持つ。
【０１１４】
さらに、本明細書および請求項を通して使用するアルキルの用語は、「非置換アルキル(unsubstituted alkyls)」および「置換アルキル(substituted alkyls)」両方を含み、後者は炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置き換えている置換基を持つアルキル部分を指す。そのような置換基には、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニル、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）アミノ、（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）アシルアミノ、アミジノ、イミノ、スルフィドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルフォンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分が含まれる。当業者によって、もし適切であるならば炭化水素素上で置換した部位がそれ自身置換され得ることが理解されるであろう。シクロアルキル類はさらに、たとえば上記した置換基によって置換されうる。「アルキルアリール(alkylaryl)」部分は、アリールで置換されたアルキルである（たとえばフェニルメチル（ベンジル））。また、「アルキル(alkyl)」の用語は、上述したアルキルと長さおよび可能性のある置換が類似する不飽和脂肪族基を含むが、少なくとも１つの二重または三重結合をそれぞれ持つ。
【０１１５】
本明細書で使用する語「アリール(aryl)」は、０〜４ヘテロ原子を含みうる５−および６−員単環芳香族基、たとえばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジン等を含む基本アリール基を示す。アリール基はまた、ナフチル、キノリル、インドリル等のような多環式結合芳香族基も含む。環構造中にヘテロ原子をもつようなアリール基はまた、「アリール複素環(aryl heterocycles)」、「ヘテロアリール(heteroaryls)」または「ヘテロ芳香族(heteroaromatics)」と呼ぶ。芳香族環は１つ以上の環部分が以上で記述したような置換基、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカアルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）アミノ、（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）アシルアミノ、アミジノ、イミノ、スルフィドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルフォナンアド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部位で置換されうる。アリール基はまた多重環を形成するために、芳香族ではない脂環式またはヘテロ環と縮合するか架橋されうる（たとえばテトラリン）。
【０１１６】
「アルケニル(alkenyl)」および「アルキニル(alknyl)」の用語は、長さおよび可能な置換基の点で上述したアルキルと類似している不飽和脂肪基をいうが、少なくともそれぞれ１つ以上の二重または三重結合を含むものをいう。たとえば、本発明はシアノおよびプロパギル基を想定している。
【０１１７】
炭素数は特に明記しないかぎり、本明細書で使用する「低級アルキル(lower alkyl)」は上述したようなアルキル基を意味するが、１〜１０炭素、さらに好ましくはその骨格構造中に１〜６炭素原子を、さらに好ましくは１〜３炭素原子をその骨格構造内に持っている。同様に「低アルケニル(lower alkenyl)」および「低アルキニル(lower alkynyl)」は同様の鎖長を持つ。
【０１１８】
用語「アルコキシアルキル(alkoxyalkyl)」、「ポリアミノアルキル(polyaimoalkyl)」および「チオアルコキシアルキル(thioalkoxyalkyl)」は上述したようなアルキル基で、さらに炭化水素骨格の１つ以上の炭素を置換している酸素、窒素、または硫黄原子、たとえば炭素、窒素または硫黄原子を含むものを言う。
【０１１９】
用語「ポリシクリル(polycyclyl)」または「ポリシクリル基(polycyclic radical)」は、その中で２つ以上の炭素が２つの結合環において共通であり、たとえばその環が「縮合環(fused rings)」であるような２つ以上の環式環（たとえばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリル）の基を示す。非隣接原子を介して結合している環は、「架橋した(bridged)」環の用語で示す。多環式のそれぞれの環は上述したような置換基、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルノニルオキシ、アルコキシカアルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）アミノ、（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）アシルアミノ、アミジノ、イミノ、スルフィドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルフォンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分によって置換されうる。
【０１２０】
本明細書で使用する「ヘテロ原子(heteroatom)」の用語は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄およびリンである。
【０１２１】
用語「アミノ酸(amino acids)」は、グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンのようなタンパク質中にみられる天然または人工のアミノ酸をさす。アミノ酸類似体は伸長したまたは短縮した側鎖、または適切な官能基を持つ変形側鎖を持つアミノ酸が含まれる。アミノ酸は、アミノ酸の構造が立体異性体を許容する場合、アミノ酸のＤおよびＬ立体異性体型をも含む。用語「ジペプチド(dipeptide)」は互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む。好ましくは、ジペプチドはペプチド結合を介して連結している２つのアミノ酸である。特に好ましいジペプチドはたとえば、アラニン−アラニンおよびグリシン−アラニンを含む。
【０１２２】
本発明の化合物の幾つかの構造は不整炭素原子を含むことに注意されたい。よって特に示さない限り、そのような不整からできる異性体（たとえばすべての鏡像異性体およびジアステレオマー）が本発明の意図の範囲内に含まれることが理解される。そのような異性体は、古典的分離技術によって、および立体化学的に制御された合成によって、実質的に精製形態として入手できる。
【０１２３】
本発明はさらに、たとえば呼吸障害（たとえば喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺障害およびアレルギー性鼻炎）、腎障害、消化管障害および眼障害のような、哺乳動物でのＮ−６置換７−ジアザプリン応答状態を治療するための薬物組成物に関する。薬物組成物には、上に記述したような治療的な効果量のＮ−６置換７−ジアザプリンおよび、薬学的に許容可能な担体を含む。上述したすべてのジアザプリンが治療処置のために含まれることが理解される。さらに本発明のジアザプリンは単体で、または本発明の他のジアザプリンとの組合せで、またはたとえば抗生物質、坑炎症剤または坑腫瘍剤のようなさらなる治療化合物との組合せで使用できることが理解される。
【０１２４】
用語「抗生物質(antibiotic)」は当技術分野で理解されており、病原体の増殖を排除しまたは阻害し、感染した宿主対象に対して有害な効果が最小であるかまたはない一方、病原体に対して選択的に毒性である、微生物の増殖によって産出された物質およびその合成的派生物を含む。適切な抗生物質の例には、アミノグリコシド類、セファロスポリン類、クロロアンフェニコール類、フシジル酸、マクロライド類、ペニシリン類、ポリミキシン類、テトラサイクリン類およびストレプトマイシン類の原則的な部類が含まれるが、限定されない。
【０１２５】
用語「坑炎症剤(antiinflammatory)」は当技術分野で理解されており、グルココルチコイド、アスピリン、イブプロフェン、ＮＳＡＩＤＳなどのような、直接的に炎症の原因となる薬物を中和することなしに体機構上で働く薬剤を含む。
【０１２６】
「抗癌剤(anticancer agent)」という用語は当技術分野で受け入れられ、好ましくは、他の生理学的機能に影響せずに癌細胞の増殖を減少させ、根絶させ、あるいは予防する薬剤を含む。代表的な例には、シスプラチンおよびシクロフォスファミドが含まれる。
【０１２７】
本発明の化合物をヒトや哺乳動物に薬剤として投与した時、それ自体で、あるいは、例えば、薬学的に許容可能な担体との組合せで化合物の活性成分の０．１から９９．５％（さらに好ましくは０．５から９０％）を含む薬剤的化合物として与えられうる。
【０１２８】
本明細書で用いる「薬学的に許容可能な担体(pharmaceutically acceptable carrier)」の用語は、その意図した機能を発揮できるように対象中で、または対象に本発明の化合物を運搬や輸送することに関連する液体あるいは固体の溶加剤、希釈剤、補形薬、溶媒、被包性物質のような薬学的に許容可能な物質、化合物、あるいは賦形剤を意味する。典型的に、そのような化合物は１つの有機体あるいは体の一部から別の有機体あるいは体の一部へ運搬、輸送される。どの担体も、処方のほかの成分のそれぞれの作用に影響を及ぼさず、また患者に有害でないという意味で「許容可能(acceptable)」なものでなくてはならない。薬学的に許容可能な担体として使用できる物質の幾つかの例には、ラクト−ス、グルコース、スクロースのような糖類、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプンのようなデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、セルロースアセテートなどのセルロースおよびセルロース誘導体、粉末状のトラガカントゴム、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバターおよび座薬ロウのような補形薬、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油などの油類、プロピレングリコールのようなグリコール類、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールのような多価アルコール類、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルのようなエステル類、寒天、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギニン酸、発熱物質を含まない水、等張塩水、リンガー液、エチルアルコール、リン酸緩衝溶液、およびその他の薬剤的調剤物に使用された無害でそれぞれの作用に影響を及ぼさない物質が含まれる。
【０１２９】
上で述べたように、本化合物のある実施様態は、アミノ、アルキルアミノのような基本的な官能基を含むことができ、したがって薬学的に許容可能な酸とともに薬学的に許容可能な塩を作ることができる。この点での「薬学的に許容可能な塩(pharmaceutically acceptable salts)」という用語は、比較的無害な、本発明の化合物の無機酸、有機酸付加塩を指す。これらの塩は本発明の化合物の最終単離、精製段階で、または本発明の精製された化合物をその遊離塩基を適合する有機または無機酸と単独で反応させて形成された塩を単離することにより、インサイチューで調製できる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフタール酸塩、メスカリン酸塩、グルコヘプタン酸塩、重乳酸塩、ラウリン硫酸塩等が含まれる（例えば、Bergら, (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm, Sci. 66:1-19を参照のこと）。
【０１３０】
他の場合では、本発明の化合物は１つ以上の酸性官能基を持ちえ、それゆえ、薬学的に許容可能な塩基とともに薬学的に許容可能な塩を作ることができる。この場合での「薬学的に許容可能な塩(pharmaceutically acceptable salts)」”という言葉は、本発明の化合物の比較的無害な、無機酸、有機酸付加塩を指す。これらの塩は同様に化合物の最終単離、精製段階で、あるいは精製された化合物中の遊離の酸性基と薬学的に許容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩のような適合する塩と、アンモニアと、あるいは薬学的に許容可能な有機一級、二級、三級アミンとの単独反応により、インサイチューで調製できる。代表的なアルカリ塩、アルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩等が含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミン類には、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンとその類縁体が含まれる。
【０１３１】
用語「薬学的に許容可能なエステル(pharmaceutically acceptable esters)」は、比較的無害な、本発明の化合物のエステル化された生成物を指す。これらのエステルは、化合物の最終単離、生成段階、あるいは精製された化合物の遊離酸性基、または水酸基と、適合するエステル化試薬との単独反応によりインサイチューで調製できる。カルボン酸は、触媒存在下でアルコールでの処理によりエステルに変換できる。水酸基を含む誘導体はアルカノイルハロゲン化物のようなエステル化試薬処理によりエステルに変換できる。この用語はさらに生理的状況下で溶解されることのできる低炭化水素基、例えば、アルキルエステル類、メチル、エチル、プロピルエステル類も含むことが意図される。（例えば、Bergeら，supraを参照のこと）
本発明はさらにインビボで本発明の治療的化合物に変換されるプロドラッグの使用を企図している（例えば、R.B. Silverman, 1992, “The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”, Academic Press, Chp.8を参照のこと）。そのようなプロドラッグは生物的分解（例えば、化合物を典型的にはプロテアーゼの反応部位に入らないようにすること）、または治療的化合物の薬物動学を改変するために用いることができる。例えば、カルボン酸基は、たとえばメチル基やエチル基でエステル化し、エステルを得る。被験者にエステルを投与すると、エステルは酵素的に、あるいは非酵素的に、還元的にあるいは加水分解的に開裂して、アニオン基を生成する。アニオン基は、続いて分解される中間体を示すように開裂する部分（例えば、アシルオキシメチルエステル）でエステル化でき、活性化合物を産出する。他の実施様態では、プロドラッグは硫酸塩あるいはスルホン酸塩の還元型であり、例えばチオールは、インビボで治療的化合物へ酸化される。さらに、アニオン部分はインビボで活発に輸送される基、あるいは標的器官に選択的に取り込まれる基にエステル化できる。下で担体部位について述べたように、エステルは特異的反応部位への治療的部分の特異的標的を可能にするために選択できる。
【０１３２】
ラウリル硫酸ナトリウム塩およびステアリン酸マグネシウム塩のような湿潤剤、乳化剤、潤滑剤、および着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、薬味料、香料、保存料および抗酸化剤もまた、組成物の中に存在しうる。
【０１３３】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム塩、メタ重硫酸ナトリウム塩等ような水溶性抗酸化剤、アスコルビルパルミチン酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールおよびそれらの類縁体のような油溶性抗酸化剤、クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、それらの類縁体のような金属キレート試薬が含まれる。
【０１３４】
本発明の処方は経口、経鼻、局所、経皮、頬、舌下、直腸、膣および／または非経口投与に適したものが含まれる。この処方は簡単に単位投与形態に調製でき、調剤分野にて周知の任意の方法によって調製されよい。単一投与形態を作製するために担体物質と結合しうる活性成分の量は一般的に治療的効果を産出する化合物量であろう。一般的に、百パーセントのうち、この量は活性成分の約１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約５パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセントから約３０パーセントの範囲であろう。
【０１３５】
これらの処方または組成物の調製のための方法には、本発明の化合物の担体および任意に１つ以上の付属成分との会合を行う工程が含まれる。一般的に、処方は均一にそして詳細に本発明の化合物を液体担体、またはよく分離された固体担体、または両方と結合をさせ、ついで必要であれば産生物を成型することで調製する。
【０１３６】
経口投与に適切な本発明の処方は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、（調味主成分、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを使用している）菱形剤、粉剤、顆粒剤の形態であってよく、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油型または油中水型液体エマルションとして、またはエリキシルまたはシロップとして、または（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどのような不活性基材を使用した）トローチ剤としておよび／または口洗浄剤等としてあってよく、それぞれ活性成分として決められた量の本発明の化合物を含んでいる。本発明の化合物はまた巨丸剤、舐剤またはパスタとして投与されてよい。
【０１３７】
経口投与（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤、顆粒剤等）のための本発明の固体投与形態において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ジカルシウムなどの１以上の薬学的に許容可能な担体、および／または以下、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸などの充填剤または増量剤、たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムのような接着剤、グリセロールのような湿潤剤、アガー−アガー、カルボン酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギニン酸、特定のケイ酸塩およびカルボン酸ナトリウムのような崩壊剤、パラフィンのような溶液遅延剤、４級アンモニア化合物のような吸収促進剤、たとえばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアリン酸塩などの加湿剤、カオリンおよびベントナイトクレーのような吸着剤、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物のような潤滑剤および着色剤の任意のものと混合する。カプセル、錠剤、丸剤の場合、薬物組成物はまた緩衝剤を含んでよい。同様の型の固体組成物をまた、ラクトースまたは牛乳糖、および高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いて軟および硬充満ゼラチンカプセル中の充填剤として使用してよい。
【０１３８】
錠剤は任意に１つ以上の付属成分と圧縮または成形によって作製してよい。圧縮錠剤は（たとえばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースのような）結合剤、潤滑剤、不活性希釈液、保存薬、（たとえばグリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの）崩壊剤、表面活性または分散剤を用いて調製してよい。成形錠剤は適切な機械の中で、不活性液体希釈液でぬらした粉末状化合物の混合物を成形することで作製してよい。
【０１３９】
錠剤、および糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤のような本発明の薬物組成物の他の固体投与形態は、任意に腸溶性コーティングおよび他の薬物的処方分野で周知のコーティングのようなコーティングまたはシェルで刻み目を付けるか調製してよい。これらはまた、たとえば望ましい放出プロフィールを提供するために特性が変化するヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマー鋳型、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いてその活性成分の除放出性のまたは制御された放出を提供するために処方されてもよい。これらはたとえば細菌保持フィルターを通した濾過によって、または使用の直前に滅菌水、または他の滅菌注射可能溶媒に溶解することができるような滅菌固体組成物の形態での滅菌剤を組み込むことによって滅菌されてよい。これらの組成物はまた、任意に懸濁剤を含んでよく、またこれらが活性成分のみを、好ましくは消化管の特定の部位で、任意に遅延した様式で放出するような組成物であってよい。使用することのできる包埋組成物の例には重合物質およびロウが含まれる。活性成分はまた、適切な場合、１つ以上の上述した賦形剤による微小被包性形態でありうる。
【０１４０】
本発明の化合物の経口投与のための液体投与形態には、薬学的に許容可能なエマルション、ミクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体投与形態には、たとえば水または他の溶剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実、アメリカホドイモ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ベニバナおよびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびその混合物のような可溶性剤および乳化剤などの当技術分野で一般的に使用される不活性希釈液を含んでよい。不活性希釈液に加えて、経口組成物はまた加湿剤、乳化、浮遊剤、甘味剤、薬味剤、着色剤、香料および保存剤のような補助薬を含んでよい。
【０１４１】
活性化合物に加えて、懸濁液は、たとえばエトキシ化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガーおよびトラガカントゴムおよびこれらの混合物のような懸濁剤を含んでよい。
【０１４２】
直腸または膣投与のための本発明の薬物組成物の処方は、座剤として存在してよく、本発明の１つ以上の化合物を、たとえばココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ロウまたはサリチル酸塩などを含む１つ以上の好ましい非炎症性賦形剤または担体と混合することにより、調製してよく、室温で固体であり、しかし体温では液体であり、したがって腸または膣腔で溶解し、活性化合物を放出するであろう。
【０１４３】
膣投与に好ましい本発明の処方はまた、当技術分野で望ましいと知られているような担体を含む膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、パスタ、泡またはスプレー処方も含む。
【０１４４】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための投与形態には、粉剤、スプレー、軟膏、パスタ、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が含まれる。活性化合物は無菌条件下で薬学的に許容可能な担体、および必要である可能性のある任意の保存剤、緩衝液または促進剤と混合してよい。
【０１４５】
軟膏、パスタ、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物または植物脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース派生物、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび亜鉛酸化物またはそれらの混合物のような賦形剤を含んでよい。
【０１４６】
粉剤およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含みうる。スプレーはさらに、クロロフルオロ炭化水素およびブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような慣例促進剤を含みうる。
【０１４７】
経皮パッチは体への本発明の化合物の制御した輸送を提供するというさらなる利点を持つ。このような投与形態は適切な溶媒中に化合物を溶解させまたは拡散させること作製できる。吸収促進剤はまた皮膚を通した化合物の流量を増加させるのに使用できる。そのような流動速度は速度調節膜を提供すること、または重合マトリックスまたはゲル中で活性化合物を分散させることのいずれかで制御できる。
【０１４８】
眼病用処方、眼軟膏、粉剤、溶液等はまた本発明の範囲内にあると企画されている。好ましくは、薬物的調製は眼病用処方（たとえば、眼周辺、眼球後または眼内注射処方、全身処方、または外科的灌注溶液など）である。
【０１４９】
本発明の眼病用処方は、１つ以上のデアザプリンおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含んでよい。様々な形の賦形剤が使用されてよい。賦形剤は一般的にその特性が水性であろう。影響を受けている眼に１または２滴の溶液を垂らす方法によってそのような化合物を患者が簡単に得られるのと同時に、処方の場合を基準にして、水性溶液が一般的に好ましい。しかしながら、本発明のデアザプリンはまた容易に、懸濁液、粘性のまたは半粘性のゲルまたは他の型の固体または半固体組成物のような他の型の組成物内に組み入れることができてよい。本発明の眼用の組成物はまた、緩衝液、保存剤、共溶媒および粘性結合剤などの様々な他の成分も含んでよい。
【０１５０】
（たとえば硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウムなどの）適切な緩衝液系を保存状態下でのｐＨ変化を防ぐために加えてよい。
【０１５１】
眼病用産物は典型的に多投与形態で包装される。したがって使用中の微生物混合を防ぐために保存剤が必要である。好ましい保存剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクアテルニウム−１、または当業者に周知の他の試薬が含まれる。このような保存剤は典型的には０．００１から１．０％重量／容量（「％ｗ／ｖ」）までのレベルで使用される。
【０１５２】
本発明のデアザプリンが、眼後または眼周辺注射および眼内灌流または注射のような眼内外科手術中に投与される場合、賦形剤としてバランス塩灌流溶液の使用が最も好ましい。ＢＳＳ（登録商標）無菌灌流溶液およびＢＳＳ  Ｐｌｕｓ（登録商標）無菌眼内灌流溶液（Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Tex. USA）は薬物的なバランス眼内灌流溶液の例である。後者の型の溶液は米国特許第４，５５０，０２２号（Garabedian，ら）に記述されており、そのすべての内容が参考により本明細書に組み込まれる。眼球後および言及前注射は当業者に周知であり、たとえばOphthalmic Surgery: Principles of Pracrice, Ed., G.L. Spaeth. W.B. Sanders Co., Philadelphia, Pa, U.S.A., 85-87(1990)を含む多くの発行物に記述されている。
【０１５３】
上で示したように、細胞内レベルでの網膜および視神経乳頭組織への損傷を予防または減少させるデアザプリンの使用は、特に本発明の実施様態の重要な側面である。治療されうる眼状態には網膜症、黄斑変性、眼虚血、緑内障および虚血再灌流障害、光学活性障害などの眼の組織への損傷に関連した障害、および眼の外科的手術に関連した障害、特に光または外科的器具への曝露による網膜または視神経乳頭への障害が含まれるが、限定されない。この化合物はまた、眼の手術後の水晶体または結膜下注射によってのように、眼の手術への補助として使用してよい。この化合物は一時的状態の急性治療のために使用してよく、または特に退行性疾患の場合に、慢性的に投与されてよい。この化合物はまた、特に眼の手術または非浸潤性眼治療、または他の型の手術の前に、予防的に使用してもよい。
【０１５４】
非経口投与に好ましい本発明の薬物組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な無菌等張水性または非水性溶液、分散、懸濁液またはエマルション、または使用の直前に無菌の注射可能溶液または分散内に再構築されうる無菌粉末との組合せでの１つ以上の本発明の化合物を含み、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方等張が意図したレシピエンの血液と等張である溶質、または懸濁剤または濃化剤を含んでよい。
【０１５５】
本発明の薬物組成物中で使用しうる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびその類似体などの）ポリオール、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性はたとえばレシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散の場合要求された粒子サイズの保持によって、および界面活性剤の使用によって保持できる。
【０１５６】
これらの組成物はまた保存剤、加湿剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでもよい。微生物の活性の防止は、たとえばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等のようなさまざまな坑細菌および坑真菌剤の含有によって保証されうる。また糖、塩化ナトリウム、および類似体などの等張剤が組成物内へ含まれることが好ましい。さらに、注射可能な薬物形態の吸収が引き延ばされることは、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる試薬の含有によって行われる。
【０１５７】
幾つかの場合、薬剤の効果を引き延ばすために、皮内注射または筋肉内注射からの薬物の吸収をゆっくりさせることが望ましい。このことは、水溶性のほとんどない結晶性または非晶性物質の液体懸濁液によって成し遂げられ得る。薬物の吸収速度はそこで、その溶解速度に依存し、言い換えれば結晶の大きさおよび結晶性形態に依存してよい。あるいは、非経口投与薬物形態の遅延吸収は、油賦形剤中の薬物を溶解することまたは懸濁することによって行われる。
【０１５８】
注射可能な貯蔵形態はポリアクリルアミド−ポリグリコライドのような生物分解性重合体中の対象化合物の微小被包性鋳型形成によって生成される。薬物の重合体に対する比に依存して、特定の重合体の特性が用いられ、薬物放出の速度が制御されうる。他の生物分解性重合体の例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。貯蔵注射可能処方はまた、体組織に適合可能であるリポソームまたはミクロエマルション中に薬物を閉じこめることでも調製できる。
【０１５９】
本発明の調製品は、経口で、非経口で、局所で、または直腸で与えられる。これらはもちろんそれぞれの投与系に適用した形態によって与えられる。たとえば、錠剤またはカプセル形態で、注射、吸入、眼ローション、軟膏、坐薬などで与えられ、注射、点滴または吸入によって投与され、ローションまたは軟膏によって局所で、そして坐薬によって直腸で投与される。経口投与が好ましい。
【０１６０】
本明細書で使用する語句「非経口投与（parenteral administration)」および「非経口で投与した(administered parenterally)」は通常注射による腸および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、小管内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内注射または点滴を含むが限定されない。
【０１６１】
本明細書で使用する語句「全身投与(systemic administration)」、「全身性に投与した(administered systematicall)」。「末梢投与(peripheral administration)」、「末梢に投与した(administrated peripherally)」は、化合物、薬剤または他の物質を、たとえば皮下投与など、直接的に中枢神経系に投与する以外の投与を意味し、したがって、患者の経路に入り、代謝および類似の処理を受ける。
【０１６２】
これらの化合物は治療のために、たとえばスプレーによってのように経口、経鼻で、経頬、舌下を含む粉末、軟膏または滴下でのように直腸、膣内、非経口で、クモ膜下槽内および局所で、任意の好ましい投与経路によってヒトまたは動物に投与されうる。
【０１６３】
選択した投与経路に関わらず、適切な水和物形態および／または本発明の薬物組成物で使用されうる本発明の化合物は、当業者に知られている従来の方法によって薬学的に許容可能な投与形態中に処方される。
【０１６４】
本発明の薬物組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性でないように、特定の患者、組成物および投与方法に対して望ましい治療応答を起こすのに十分効果的である活性成分の量を持つように変化させてよい。
【０１６５】
選択した投与レベルは、使用した本発明の特定の化合物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用した特定の化合物の排出速度、治療期間、使用した特定の化合物との組合せで使用した他の薬物、化合物および／または物質、治療した患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康、以前の病歴および医学分野で周知の類似因子を含む様々な因子に依存するであろう。
【０１６６】
当分野の通常の技術を有する医者または獣医は、必要な薬物組成物の効果的な量をたやすく決定し、処方できる。たとえば医者または獣医は、適切な治療効果を得るために、必要な量よりも少ないレベルでの薬物組成物で本発明の化合物の投与をはじめ、徐々に望ましい異効果が得られるまで投与量を増加させることができる。
【０１６７】
一般的に、本発明の化合物の適切な日用量は、治療効果を産出するのに効果的な最も低い投与量の化合物量であるだろう。そのような効果的な投与量は一般的に上述した因子に依存する。一般的に、患者に対する本発明の化合物の静脈内および皮下投与量は、望ましい鎮静作用のために使用した場合、１日あたり体重キログラムあたり約０．０００１から約２００ｍｇ、また好ましくは１日あたりｋｇあたり約０．０１から約１５０ｍｇ、またさらに好ましくは１日あたりｋｇあたり約０．２から約１４０ｍｇの範囲であろう。
【０１６８】
望ましい場合、効果的な活性化合物の日用量は、１日を通して好ましい間隔で、任意には単位投与形態で、分割して投与した２、３、４、５、６またはそれ以上の補投与として投与してよい。
【０１６９】
本発明の化合物に対して、それのみで投与することも可能である一方、薬物組成物として化合物を投与することが好ましい。
【０１７０】
本発明はまた、Ｎ−６置換７デアザプリン応答状態、たとえば哺乳動物での望ましくないアデノシン受容体活性の上昇などを治療するための包装された薬物組成物に関する。この包装された薬物組成物には、上述したような少なくとも１つのデアザプリンの薬物的に効果的な量を保持している容器、および哺乳動物でのデアザプリン応答状態を治療するためのデアザプリンの使用のための指示が含まれる。
【０１７１】
本発明のデアザプリンは有機合成の標準の方法を用いて調製されうる。デアザプリンは逆相ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー、再結晶などによって精製でき、その構造は質量スペクトル解析、元素分析、ＩＲおよび／またはＮＭＲ分光学によって確認した。
【０１７２】
典型的に、本発明のデアザプリンと同様に、中間体の合成は溶液内で行う。１つ以上の保護基の添加および除去もまた典型的な実施であり、当業者に周知である。本発明のデアザプリン中間体の調製のための典型的な合成図式を図式Ｉでその概略をのべる。
【０１７３】
本発明はさらに、さらなる制限であるという解釈にはならない以下の実施例によって例証される。背景部分で引用したものを含む本明細書を通して引用された、出願中特許明細書および開示された特許明細書のすべての参考文献の内容は、本明細書で参考により組み込む。実施例を通して使用したモデルは受諾されたモデルであり、それらのモデルでの効果の立証はヒトでの効果の予測となることを理解すべきである。
【０１７４】
本発明のデアザプリンは有機合成の標準の方法を用いて準備されうる。デアザプリンは逆送ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー、再結晶などによって精製でき、その構造は質量スペクトル解析、元素分析、ＩＲおよび／またはＮＭＲ分光学によって確認した。
【０１７５】
典型的には、本発明のデアザプリンと同様に、中間体の合成は溶液内で行う。１つ以上の保護基の添加および除去もまた典型的な実施であり、当業者に周知である。本発明のデアザプリン中間体の調製のための典型的な合成図式について、スキームＩで概略をのべる。
【０１７６】
【化３３】
0004611524.tif 000014
式中Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は上で定義されたようなものである。
【０１７７】
一般的に、保護された２−アミノ−３−シアノ−ピロールはアシルハロゲン化物で処理でき、カルボキサミド−３−シアノ−ピロールを形成し、これは蟻酸メタノールと反応でき、ピロール［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンへの閉環を行う（Muller, C.E.ら、J.Med.Chem.40:4396(1997)）。ピロール保護基の除去と引き続くたとえばリン酸酸塩化物などの塩素化試薬での処理により置換または非置換４−クロロ−７Ｈ−ピロール［２，３ｄ］ピリミジンが生成される。クロロピリミジンのアミンでの処理で７−デアザプリンができる。
【０１７８】
たとえば図式Ｉで示したように、Ｎ−（１−ｄｌ−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−ピロールをピリジンおよびジクロロメタン中でアシルハロゲン化物で処理した。結果えられたＮ−（１−ｄｌ−フェニルエチル）−２−フェニルカルボキサミド−３−シアノ−ピロールを、メタノール／硫酸の１０：１混合液で処理し、閉環を行い、結果とし、てｄｌ−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ［２、３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを得た。ピリミジンのポリリン酸（ＰＰＡ）、引き続きＰＯＣｌ３での処理でフェニルエチル基を除去し、鍵となる中間体、４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンを得た。さらに４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンの、表１に列記した各種アミンでの処理で式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物を得た。
【０１７９】
【表１−１】
0004611524.tif 000015
【０１８０】
【表１−２】
0004611524.tif 000016
【０１８１】
【表１−３】
0004611524.tif 000017
６−置換ピロールの調製のための一般的なアプローチを以下の図式（スキームＩＩ）で描写する。
【０１８２】
【化３４】
0004611524.tif 000018
式中、Ｒ１からＲ５は上で定義したようなものである。
【０１８３】
エチルシアノ酢酸のα−ハロケトンでのエステル交換およびアルキル化でケトメチルエステルを得た。ケトンの保護と引き続く塩酸アミジン（たとえばアルキル、アリールまたはアルキルアリール）での処理により、ケタール保護ピリミジンを得た。保護基の除去と、引き続く環化およびリン酸酸塩化物での処理で塩化中間体を得、さらにアミノで処理してアミノ６−置換ピロールを得た。さらに、ピロール窒素のアルキル化を当技術分野で認められている条件下で行いうる。
【０１８４】
５−置換ピロールを調製するための一般的なアプローチを以下の図式（スキームＩＩＩ）で描写する。
【０１８５】
【化３５】
0004611524.tif 000019
式中、Ｒ１からＲ６は上述したように定義され、Ｒは除去可能な保護基である。
【０１８６】
マロンニトリルおよび過剰ケトンの濃縮とそれに引き続く産生物の臭素化で開始物質、アルキルアミン、アリールアミンまたはアルキルアリールアミンで処理したモノ臭素化およびジ臭素化産生物を得た。得られたアミン産生物を酸塩化物でアシル化し、モノシアン化ピロールを酸存在下環化し、相当するピリミジンを得た。ピロール保護基をポリリン酸で除去し、リン酸酸塩化物で処理して塩素化産生物を産出した。塩素化ピロールを続いてアミンで処理し、アミノ５−置換ピロールを産出した。ピロール窒素のアルキル化を当技術分野で知られている条件下で行うことができる。
【０１８７】
図式ＩＶおよびＶは本発明のデアザプリン１および２を調整するための方法を描写している。
【０１８８】
【化３６】
0004611524.tif 000020
式中Ｒ５およびＲ６は上述されたようであり、たとえばＣＨ３である。
【０１８９】
６−メチルピロロピリミジンの特異的調製
６−メチルピロロピリミジン（１）［Ｒ５＝ＣＨ３］への鍵となる反応は、シアノ酢酸のベンザミジンとのピリミジンへの環化であった。メチルシアノ酢酸はピリミジンへ、相当するエチルエステルよりもベンザミジンとより効率的に環化するであろうことが信じられていた。したがって、ＮａＯＭｅおよび過剰のα−ハロアセチル部分、たとえばクロロアセトンの存在下、エチルシアノ酢酸のエステル交換およびアルキル化で７９％の収率で望ましいメチルエステル（３）を得た（図式ＩＶ）。ケトエステル（３）を８１％の収率でアセタール（３）として保護した。ピリミジン（５）への新規環化方法を２当量のＤＢＵで塩酸アミジン、たとえば塩酸ベンザミジンでおこない、５４％の単離収率で５を得た。この方法はグアニジンでの環化の間ＮａＯＭｅを使用する公表された状態を用いた２０％より収率を改善した。ピロール−ピリミジン（６）への環化を７８％の収率で水和ＨＣｌ中でアセタールの脱保護を介して行った。還流での（６）のリン酸酸塩化物の反応で相当する４−クロロ派生物（７）を得た。１３５℃でのジメチルスルホキシド中のトランス−４−アミノシクロヘキサノールとのカップリングにより、（７）より５７％で（１）を得た。当業者は、試薬の選択が、望ましい置換基Ｒ５を選択するのに高い柔軟性を与えることを認めるであろう。
【０１９０】
【化３７】
0004611524.tif 000021
５−メチルピロロピリミジンの特異的調製
還流中でのマロノニトリルおよびたとえばアセトンのような過剰ケトンのノーベンゲル濃縮で蒸留後５０％の収率で８を得た。クロロホルム中ベンゾイルペルオキシドの存在下、Ｎ−ブロモスクシンイミドでの８の臭素化で、蒸留後、開始物質、モノ−（９）およびジ−臭素化産生物（５／９０／５）を得た（７０％）。混合液をたとえばα−メチルベンジルアミンなどのα−メチルアルキルアミンまたはα−メチルアリールアミンと反応させ、アミノピロール（１０）を得た。短いシリカゲルカラムを通した後、部分的に精製したアミン（３１％収率）をたとえば塩化ベンゾイルなどの酸塩化物でアシル化し、モノ−（１１）およびジアシル化（１２）ピロールを得、これをフラッシュクロマトグラフィーにて分離した。２置換ピロール（１２）の酸加水分解でアシルピロール（１１）対して２９％の合計収率を得た。濃硫酸およびＤＭＦ存在下での環化で（１３）を産出し（２３％）、ポリリン酸で脱保護し（１４）を得た。還流での（１４）のリン酸酸塩化物との反応で相当する４−クロロ派生物（１５）を得た。１３５℃でのジメチルスルホキシド中のトランス−４−アミノシクロヘキサノールとのカップリングで（１４）より３０％で（２）［Ｒ６＝ＣＨ３］を得た（図式Ｖを参照のこと）。当業者は、試薬の選択が、望ましい置換基Ｒ６を選択するのに高い柔軟性を与えることを認識するであろう。
【０１９１】
【化３８】
0004611524.tif 000022
Ｒ６−置換ピロール、たとえば５−メチルピロロピリミジンへの他の合成経路  このＲ６−置換ピロール、たとえば５−メチルピロロピリミジンへの他の経路には（１６）へのエチルシアノ酢酸のエステル交換およびアルキル化が伴う（図式ＶＩ）。（１６）の２当量のＤＢＵと塩酸ベンザミジンとの縮合でピリミジン（１７）を産出した。ピロール−ピリミジン（１４）への環化は水和ＨＣｌ中のアセタールの脱保護を介して行う。還流での（１４）のリン酸酸塩化物との反応で相当する４−クロロ派生物（１５）を得た。１３５℃でのジメチルスルホキシド中のトランス−４−アミノシクロヘキサノールとのカップリングにより、２を得た。この手順は標的化合物（２）への合成反応の数を９から４工程へ減少させる。さらに、収率が劇的に改善される。また、当業者は、試薬の選択が、望ましい置換基Ｒ６を選択するのに高い柔軟性を与えることを認識するであろう。
【０１９２】
【化３９】
0004611524.tif 000023
ｄｅｓ−メチルピロール
【化４０】
0004611524.tif 000024
への一般的なアプローチを以下の図式（図示ＶＩＩ）で描写する。
【０１９３】
【化４１】
0004611524.tif 000025
式中，Ｒ１からＲ３は上のように定義した。
【０１９４】
塩基の存在下、ジエチルアセタールでのアルキルシアノ酢酸のアルキル化でシアノジエチルアセテートを生成し、アミジン塩で処理してメチルピロールピリミジン前駆体を産出した。この前駆体を炭素化し、アミンで処理して上で示したようなｄｅｓ−メチルピロロピリミジンを形成した。
【０１９５】
たとえば、図式ＶＩＩＩは化合物（１８）の合成を描写する。
【０１９６】
【化４２】
0004611524.tif 000026
商業的に入手可能なメチルシアノ酢酸を炭酸カリウムおよびＮａＩ存在下において、ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールでアルキル化し、（１９）を生成した。ピリミジン（２０）への環化は２つの工程で行った。まず、ピリミジン−アセタールを２当量のＤＢＵと塩酸ベンザミジンでの（１９）の反応を介して形成させた。得られたピリミジン−アセタールを水和１Ｎ  ＨＣｌで精製することなしに脱保護し、得られたアルデヒドをピロール−ピリミジン（２０）へ環化し、濾過により単離した。還流での（２０）のリン酸酸塩化物との反応で相当する４−クロロ派生物（２１）を得た。ＤＭＳＯ中１３５℃でのこのクロロ派生物とトランス−４−アミノシクロヘキサノールのカップリングにより化合物（２１）から化合物（１８）を得た。
【０１９７】
図式ＩＩ−ＶＩＩＩは、ピロロピリミジン環の５−および６−位を官能基化できることを例証している。異なる出発試薬および上記反応図式のわずかな変更を使用することで、様々な官能基を式（Ｉ）および（ＩＩ）の５−および６−位に導入することができる。表２は幾つかの例を明示している。
【０１９８】
【表２】
0004611524.tif 000027
本発明はさらに、さらなる制限としては解釈されない以下の実施例によって例示される。
【０１９９】
背景部分で引用したものを含む本明細書を通して引用された、係属中の特許明細書および開示された特許明細書のすべての参考文献の内容は、本明細書で参考により組み込んだ。実施例を
３０通して使用したモデルは受諾されたモデルであり、それらのモデルでの効果の立証はヒトでの効果の予測となることを理解すべきである。
【０２００】
【実施例】
調製１：
Seela及びLupkeのアルキル化の方法を部分的に変更したものを用いた。1ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のシアノ酢酸エチル（６．５８ｇ、５８．１ｍｍｏｌ）の氷冷した（０℃）溶液に、ＮａＯＭｅ（２５％ｗ／ｖ；５８．１ｍｍｏｌ）溶液を徐々に添加した。１０分後に、クロロアセトン（５ｍＬ；６２．８ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。４時間後に、溶媒を除去した。褐色オイルをＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ、濾過し、濃縮して褐色オイル（７．７９ｇ；７９％）を得た。オイル（３）（スキームIV）は、メチル／エチルエステル生成物の混合物（９／１）であり、それを更に精製することなく用いた。
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ4.24(q, J=7.2Hz, OCH2), 3.91(dd, 1H, J=7.2, 7.0Hz, CH), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.42(dd, 1H, J=15.0, 7.1Hz, 1×CH2); 3.02(dd, 1H, J=15.0, 7.0Hz, 1×CH2); 2.44(s, 3H, CH3), 1.26(t, J=7.1Hz, エステル-CH3).
1Seela,F. ;Lupke,U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469。
【０２０１】
調製２：
Seela及びLupkeの方法を用いた。1ＴｓＯＨ（１００ｍｇ）の存在下にてエチレングリコール（４ｍＬ、６４．４ｍｍｏｌ）を用いてケトン（３）（スキームIV；５．０ｇ、３２．２ｍｍｏｌ）を保護し、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；３／７ ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、Ｒｆ ０．３５）をした後に、オイルとして（４）（スキームIV；５．２ｇ、８１．０）を得た。依然として〜５％のエチルエステルが含まれている。
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ4.24(q, J=7.2Hz, OCH2), 3.98(s, 4H, 2×アセタール-CH2), 3.79(s, 3H, OCH3), 3.62(dd, 1H, J=7.2, 7.0Hz, CH), 2.48(dd, 1H, J=15.0, 7.1Hz, 1×CH2), 2.32(dd, 1H, J=15.0, 7.0Hz, 1×CH2); 1.35(s, 3H, CH3),1.26(t, J=7.1Hz, エステル-CH3);
MS(ES): 200.1(M++1).
1Seela,F. ;Lupke,U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469。
【０２０２】
調製３：
乾燥したＤＭＦ（１５ｍＬ）中のアセタール（４）（スキームIV、１ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）、ベンズアミジン（７８６ｍｇ、５．０２ｍｏｌ）、及びＤＢＵ（１．５ｍＬ、１０．０４ｍｍｏｌ）の溶液を８５℃にて１５時間加熱した。該混合物をＣＨＣｌ3（３０ｍＬ）で希釈し、０．５Ｎ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）及びＨ2Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮して褐色オイルを得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；１／９ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ2Ｃｌ2、Ｒｆ ０．３５）を試みたが、カラム中で該物質が結晶化した。シリカゲルをＭｅＯＨで洗浄した。生成物（５）（スキームIV）を含むフラクションを濃縮し、更に精製することなく用いた：
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.24(m, 2H, Ar-H),7.45(m, 3H, Ar-H),5.24(br s, 2H, NH2),3.98(s, 4H, 2×アセタール-CH2),3.60-3.15(m, 2H, CH2),1.38(s, 3H, CH3);
MS(ES): 288.1(M++1)。
【０２０３】
化合物（２０）（スキームVIII）の調製：乾燥したＤＭＦ（２０ｍＬ）中のアセタール（１９）（４．４３ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）1、ベンズアミン塩酸塩（３．２２ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）、及びＤＢＵ（６．１５ｍＬ、４１．２ｍｍｏｌ）の溶液を８５℃にて１５時間加熱した。該混合液をＣＨＣｌ3１００ｍＬで希釈し、Ｈ2Ｏ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ、濾過し、濃縮して暗褐色オイルを得た。１Ｎ ＨＣＬ（１００ｍＬ）中にて該暗褐色オイルを室温にて２時間攪拌した。得られたスラリーを濾過して（２０）のＨＣｌ塩を黄褐色固体（３．６０ｇ、７０．６％）として得た；
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) 11.92(s, 1H), 8.05(m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 7.05(s, 1H, ピロール-H);
MS(ES): 212.1(M++1)。
【０２０４】
調製４：
１Ｎ ＨＣｌ（４０ｍＬ）中のアセタール（５）（７００ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）の溶液をＲＴにて２時間攪拌した。得られたスラリーを濾過して、２−フェニル−６−メチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オンのＨＣｌ塩を、黄褐色固体（４９８ｍｇ、７８．０％）として得た：
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ11.78(s, 1H), 8.05(m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 6.17(s, 1H, ピロール-H), 2.25(s, 3H, CH3);
MS(ES): 226.1(M++1)。
【０２０５】
調製５：
Chenらの環化の方法を部分的に変更したものを用いた。1イソプロピルアルコール（６０ｍＬ）中の臭化物（９）（スキームＶ；２０．０ｇ、１０８ｍｍｏｌ；９０％純粋）の氷冷（０℃）した溶液に、α−メチルベンジルアミン（１２．５ｍＬ、９７．３ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。黒色溶液をＲＴに加温し、１５時間攪拌した。該混合液をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、０．５Ｎ ＮａＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ、濃縮して黒色タール（１９．２ｇ；９４％）を得た。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；４／９６ ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2、Ｒｆ ０．３５）により部分的に精製し、黒色固体（６．３８ｇ、３１％）を化合物ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４−メチルピロールとして得た：
MS(ES): 226.1(M++1)。
1Chen, Y. L.;  Mansbach, R. S.; Winter, S. M.; Brooks, E.; Collins, J.; Corman, M. L.; Dunaiskis, A. R.; Faraci, W. S.; Gallaschun, R. J.; Schmidt, A.; Schulz; D. W. J. Med. Chem. 1997, 40, 1749-1754。
【０２０６】
調製６：
ジクロロメタン（５０．０ｍＬ）中のｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール1（１４．９ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）及びピリジン（１０．０ｍＬ）の溶液に、塩化ベンゾイル（９．３７ｇ、６６．７ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。０℃にて１時間攪拌した後に、生成物沈殿の助力としてヘキサン（１０．０ｍＬ）を添加した。真空中にて(in vacuo)溶媒を除去し、固体をＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏから再結晶させ、ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−フェニルカルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール１３．９ｇ（６５％）を得た。
mp:218-221℃；
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.72(s, 3H), 1.76(d, J=7.3Hz, 3H),1.98(s, 3H),5.52(q, J=7.3Hz, 1H),7.14-7.54(m, 9H),7.68-7.72(dd, J=1.4Hz, 6.9Hz, 2H),10.73(s, 1H);
MS(ES): 344.4(M++1).
1Liebigs Ann. Chem. 1986, 1485-1505。
【０２０７】
下記の化合物は、調製６と同様の方法で得られた。
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（３−ピリジル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=6.8Hz, 3H), 2.02(s, 3H), 2.12(s, 3H), 5.50(q, J=6.8Hz, 1H), 7.14-7.42(m, 5H), 8.08(m, 2H), 8.75(m, 3H);
MS(ES): 345.2(M++1).
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（２−フリル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.84(d, J=7.4Hz, 3H), 1.92(s, 3H), 2.09(s, 3H), 5.49(q, J=7.4Hz, 1H), 6.54(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.12-7.47(m, 7H);  MS(ES): 334.2(M++1), 230.1.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（３−フリル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.80(d, J=7Hz, 3H), 1.89(s, 3H), 2.05(s, 3H),5.48(q, J=7Hz, 1H), 6.59(s, 1H), 7.12-7.40(m, 6H), 7.93(s, 1H);
MS(ES): 334.1(M++1), 230.0.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−シクロペンチルカルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.82(d, J=7.4Hz, 3H), 1.88(s, 3H), 2.05(s, 3H), 1.63-1.85(m, 8H), 2.63(m, 1H), 5.43(q, J=7.4Hz, 1H), 6.52(s, 1H), 7.05-7.20(m,5H);
MS(ES): 336.3(M++1).
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（２−チエニル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.82(d, J=6.8Hz, 3H), 1.96(s, 3H), 2.09(s, 3H),5.49(q, J=6.8Hz, 1H), 7.05-7.55(m, 8H);
MS(ES): 350.1(M++1), 246.0.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（３−チエニル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=7.0Hz, 3H), 1.99(s, 3H), 2.12(s, 3H), 5.49(q, J=7.0Hz, 1H), 6.90(m, 1H), 7.18-7.36(m, 6H), 7.79(m, 1H);
MS(ES): 350.2(M++1), 246.1.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（４−フルオロフェニル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=7.4Hz, 3H), 1.96(s, 3H), 2.08(s, 3H), 5.51(q, J=7.4Hz, 1H), 7.16-7.55(m, 9H);
MS(ES): 362.2(M++1), 258.1.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（３−フルオロフェニル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=7.4Hz, 3H), 1.97(s, 3H), 2.10(s, 3H), 5.50(q, J=7.4Hz, 1H), 7.05-7.38(m, 7H), 7.67-7.74(m, 2H);
MS(ES): 362.2(M++1), 258.1.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−（２−フルオロフェニル）カルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.85(d, J=7.2Hz, 3H), 1.94(s, 3H), 2.11(s, 3H), 5.50(q, J=7.2Hz, 1H), 7.12-7.35(m, 6H), 7.53(m, 1H), 7.77(m, 1H), 8.13(m, 1H);
MS(ES): 362.2(M++1), 258.0.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−イソプロピルカルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.19(d, J=7.0Hz, 6H), 1.82(d, J=7.2Hz, 3H), 1.88(s, 3H), 2.06(s, 3H), 2.46(m, 1H), 5.39(m, J=7.2Hz, 1H), 6.64(s, 1H), 7.11-7.36(m, 5H);
MS(ES): 310.2(M++1), 206.1.
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４−メチルピロールのアシル化に関しては、モノアシル化されたｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−ベンゾイルアミノ−３−シアノ−４−ジメチルピロール及びジアシル化されたピロールであるｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−ジベンゾイルアミノ−３−シアノ−４−メチルピロールが得られた。
【０２０８】
モノアシル化されたピロール：
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ7.69(d, 2H, J=7.8Hz, Ar-H), 7.58-7.12(m, 8H, Ar-H), 6.18(s, 1H, ピロール-H), 5.52(q, 1H, J=7.2Hz, CH-CH3), 2.05(s, 3H, ピロール-CH3), 1.85(d, 3H, J=7.2Hz, CH-CH3);
MS(ES): 330.2(M++1);
ジアシル化されたピロール：
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ7.85(d, 2H, J=7.7Hz, Ar-H), 7.74(d, 2H, J=7.8Hz, Ar-H), 7.52-7.20(m, 9H, Ar-H), 7.04(m, 2H, Ar-H), 6.21(s, 1H, ピロール-H), 5.52(q, 1H, J=7.2Hz, CH-CH3), 1.77(d, 3H, J=7.2Hz, CH-CH3), 1.74(s, 3H, ピロール-CH3);
MS(ES): 434.1(M++1)。
【０２０９】
調製７：
メタノール（１０．０ｍＬ）中のｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−フェニルカルボキシアミド−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール（１．０ｇ、２．９２ｍｍｏｌ）の溶液に、濃硫酸（１．０ｍＬ）を０℃にて添加した。得られた混合液を１５時間還流させ、室温にまで冷却した。沈殿物を濾過し、ｄｌ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン０．４８ｇ（４８％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(d, J=7.4Hz, 3H), 2.04(s, 3H), 2.41(s, 3H), 6.25(q, J=7.4Hz, 1H), 7.22-7.50(m, 9H), 8.07-8.12(dd, J=3.4Hz, 6.8Hz, 2H), 10.51(s, 1H);
MS(ES): 344.2(M++1).
下記の化合物は、調製７と同様の方法にて得られた。
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（３−ピリジル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.03(d, J=7.2Hz, 3H), 2.08(s, 3H), 2.42(s, 3H), 6.24(q, J=7.2Hz, 1H), 7.09-7.42(m, 5H), 8.48(m, 2H), 8.70(m, 3H);
MS(ES): 345.1(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（２−フリル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.98(d, J=7.8Hz, 3H), 1.99(s, 3H), 2.37(s, 3H), 6.12(q, J=7.8Hz, 1H), 6.48(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.17-7.55(m, 7H), 9.6(s, 1H);
MS(ES): 334.2(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（３−フリル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.99(d, J=7Hz, 3H), 2.02(s, 3H), 2.42(s, 3H), 6.24(q, J=7Hz, 1H), 7.09(s, 1H), 7.18-7.32(m, 5H), 7.48(s, 1H), 8.51(s, 1H);
MS(ES): 334.2(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−シクロペンチル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.95(d, J=7.4Hz, 3H), 2.00(s, 3H), 2.33(s, 3H), 1.68-1.88(m, 8H), 2.97(m, 1H), 6.10(q, J=7.4Hz, 1H), 7.16-7.30(m, 5H),9.29(s, 1H);
MS(ES): 336.3(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（２−チエニル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(d, J=7.2Hz, 3H), 2.06(s, 3H), 2.41(s, 3H), 6.13(q, J=7.2Hz, 1H), 7.12(dd, J=4.8, 2.8Hz, 1H), 7.26-7.32(m, 5H) ,7.44(d, J=4.8Hz, 1H), 8.01(d, J=2.8Hz, 1H), 11.25(s, 1H);
MS(ES): 350.2(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（３−チエニル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.00(d, J=7.4Hz, 3H), 2.05(s, 3H), 2.43(s, 3H), 6.24(q, J=7.4Hz, 1H), 7.24-7.33(m, 5H), 7.33-7.39(m, 1H), 7.85(m, 1H),8.47(m, 1H), 12.01(s, 1H);
MS(ES): 350.2(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（４−フルオロフェニル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.01(d, J=6.8Hz, 3H), 2.05(s, 3H), 2.42(s, 3H), 6.26(q, J=6.8Hz, 1H), 7.12-7.36(m, 7H), 8.23-8.30(m, 2H), 11.82(s, 1H);
MS(ES): 362.3(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(d, J=7.4Hz, 3H), 2.06(s, 3H), 2.44(s, 3H), 6.29(q, J=7.4Hz, 1H), 7.13-7.51(m, 7H), 8.00-8.04(m, 2H), 11.72(s, 1H);
MS(ES): 362.2(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−（２−フルオロフェニル）−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.00(d, J=7.2Hz, 3H), 2.05(s, 3H), 2.38(s, 3H), 6.24(q, J=7.2Hz, 1H), 7.18-7.45(m, 8H), 8.21(m, 1H), 9.54(s, 1H);
MS(ES): 362.2(M++1).
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−イソプロピル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.30(d, J=6.8Hz, 3H), 1.32(d, J=7.0Hz, 3H), 2.01(s, 3H), 2.34(s, 3H), 2.90(m, 1H), 6.13(m, 1H), 7.17-7.34(m, 5H), 10.16(s, 1H);
MS(ES): 310.2(M++1)。
【０２１０】
調製８：
ＤＭＦ（１３ｍＬ）中の濃Ｈ2ＳＯ4（１ｍＬ）を有するｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−ベンゾイルアミノ−３−シアノ−４−ジメチルピロール（７８５ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）の溶液を１３０℃にて４８時間攪拌した。黒色溶液をＣＨＣｌ3（１００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＮａＯＨ（３０ｍＬ）及び塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ、濾過し、濃縮して、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；８／２ ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、Ｒｆ ０．３５）により精製し、褐色固体（１８４ｍｇ、２４％）をｄｌ−５−メチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オンとして得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.18(m, 2H, Ar-H), 7.62-7.44(m, 3H, Ar-H), 7.40-7.18(m, 5H, Ar-H), 6.48(s, 1H, ピロール-H), 6.28(q, 1H, J=7.2Hz, CH-CH3), 2.18(s, 3H, ピロール-CH3), 2.07(d, 3H, J=7.2Hz, CH-CH3);
MS(ES): 330.2(M++1)。
【０２１１】
調製９：
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール（９．６０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）及びギ酸（５０．０ｍＬ、９８％）の混合物を５時間還流させた。室温にまで冷却し、フラスコの側面を引っかいた後に、多量の沈殿物が形成し、それを濾過した。洗浄液が中性のｐＨを示すまで該物質を水で洗浄し、ｄｌ−５，６−ジメチル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.96(d, J=7.4Hz, 3H), 2.00(s, 3H), 2.38(s, 3H), 6.21(q, J=7.4Hz, 1H), 7.11-7.35(m, 5H), 7.81(s, 1H), 11.71(s,1H);
MS(ES): 268.2(M++1)。
【０２１２】
調製１０：
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（１．０ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）を、ポリリン酸（３０．０ｍＬ）に懸濁させた。該混合物を１００℃にて４時間加熱した。その熱い溶液を氷水に注ぎ、強攪拌させて懸濁液を分散させ、固体ＫＯＨを用いてｐＨ６にまで塩基性化した。得られた固体を濾過して収集し、５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン０．４９ｇ（６９％）を得た。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.17(s, 3H), 2.22(s, 3H), 7.45(br, 3H), 8.07(br, 2H), 11.49(s, 1H), 11.82(s, 1H);
MS(ES): 344.2(M++1)。
【０２１３】
下記の化合物は、調製１０と同様の方法にて得られた。
５−メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。MS(ES): 226.0(M++1).
５，６−ジメチル−２−（３−ピリジル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
MS(ES): 241.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−（２−フリル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.13(s, 3H), 2.18(s, 3H), 6.39(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H), 6.65(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.85(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H), 11.45(s, 1H), 11.60(s, 1H);
MS(ES): 230.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−（３−フリル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.14(s, 3H), 2.19(s, 3H), 6.66(s, 1H), 7.78(s, 1H), 8.35(s, 1H), 11.3(s, 1H), 11.4(s, 1H);
MS(ES): 230.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−シクロペンチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.57-1.91(m, 8H), 2.12(s, 3H), 2.16(s, 3H), 2.99(m, 1H), 11.24(s, 1H), 11.38(s, 1H);
MS(ES): 232.2(M++1).
５，６−ジメチル−２−（２−チエニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.14(s, 3H), 2.19(s, 3H), 7.14(dd, J=3.0, 5.2Hz, 1H), 7.70(d, J=5.2Hz, 1H), 8.10(d, J=3.0Hz, 1H), 11.50(s, 1H);
MS(ES): 246.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−（３−チエニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.17(s, 3H), 2.21(s, 3H), 7.66(m, 1H), 7.75(m, 1H), 8.43(m, 1H), 11.47(s, 1H), 11.69(s, 1H);
MS(ES): 246.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−（４−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.17(s, 3H), 2.21(s, 3H), 7.31(m, 2H), 8.12(m, 2H), 11.47(s, 1H);
MS(ES): 258.2(M++1).
５，６−ジメチル−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz,DMSO-d6) δ2.18(s, 3H), 2.21(s, 3H), 7.33(m, 1H), 7.52(m, 1H), 7.85-7.95(m, 2H), 11.56(s, 1H), 11.80(s, 1H);
MS(ES): 258.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−（２−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.18 (s, 3H), 2.22(s, 3H), 7.27-7.37(m, 2H), 7.53(m, 1H), 7.68(m, 1H), 11.54(s, 1H), 11.78(s, 1H);
MS(ES): 258.1(M++1).
５，６−ジメチル−２−イソプロピル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.17(d, J=6.6Hz, 6H), 2.11(s, 3H), 2.15(s, 3H), 2.81(m, 1H), 11.20(s, 1H), 11.39(s, 1H);
MS(ES): 206.1(M++1).
５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.13(s, 3H), 2.17(s, 3H), 7.65(s, 1H);
MS(ES): 164.0(M++1)。
【０２１４】
調製１１：
オキシ塩化リン（２５．０ｍＬ）中の５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（１．０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）の溶液を６時間還流させ、次に真空中で濃縮乾固させた。残渣に水を添加し、結晶化させ、得られた固体を濾過して収集し、４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン０．９０ｇ（８３％）を得た。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.33(s, 3H), 2.33(s, 3H), 7.46-7.49(m, 3H), 8.30-8.35(m, 2H), 12.20(s, 1H);
MS(ES): 258.1(M++1)。
【０２１５】
下記の化合物は、調製１１と同様の方法にて得られた。
４−クロロ−５−メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 244.0(M++1).
４−クロロ−６−メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 244.0(M++1).
４−クロロ−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) 8.35(2,2H), 7.63(br s, 1H), 7.45(m, 3H), 6.47(br s, 1H);
MS(ES): 230.0(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（３−ピリジル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 259.0(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（２−フリル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.35(s, 3H), 2.35(s, 3H), 6.68(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H), 7.34(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.89(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H);
MS(ES): 248.0(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（３−フリル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.31(s, 3H), 2.31(s, 3H), 6.62(s, 1H), 7.78(s, 1H), 8.18(s, 1H), 12.02(s, 1H);
MS(ES): 248.1(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−シクロペンチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.61-1.96(m, 8H), 2.27(s, 3H), 2.27(s, 3H), 3.22(m, 1H), 11.97(s, 1H);
MS(ES): 250.1(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（２−チエニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.29(s, 3H), 2.31(s, 3H), 7.14(dd, J=3.1Hz, 4.0Hz, 1H), 7.33(d, J=4.9Hz, 1H), 7.82(d, J=3.1Hz, 1H), 12.19(s, 1H);
MS(ES): 264.1(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（３−チエニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.32(s, 3H), 2.32(s, 3H), 7.62(dd, J=3.0Hz, 5.2Hz, 1H), 7.75(d, J=5.2Hz, 1H), 8.20(d, J=3.0Hz, 1H);
MS(ES): 264.0(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（４−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.33(s, 3H), 2.33(s, 3H), 7.30(m, 2H), 8.34(m, 2H), 12.11(s, 1H);
MS(ES): 276.1(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
【０２１６】
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.31(s, 3H), 2.33(s, 3H), 7.29(m, 1H), 7.52(m, 1H), 7.96(m, 1H), 8.14(m, 1H), 11.57(s, 1H);
MS(ES): 276.1(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（２−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.34(s, 3H), 2.34(s, 3H), 7.33(m, 2H), 7.44(m, 1H), 7.99(m, 1H), 12.23(s, 1H);
MS(ES): 276.1(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−イソプロピル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.24(d, J=6.6Hz, 6H), 2.28(s, 3H), 2.28(s, 3H), 3.08(q, J=6.6Hz, 1H), 11.95(s, 1H);
MS(ES): 224.0(M++1).
４−クロロ−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.31(s, 3H), 2.32(s, 3H), 8.40(s, 1H);
MS(ES): 182.0(M++1).
ｄｌ−４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
【０２１７】
調製１２：
ジオキサン（１００．０ｍＬ）及び水（１００．０ｍＬ）中のｄｌ−１，２−ジアミノプロパン（１．４８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（２．７３ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ジカーボネート（４．８０ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。得られた混合液を１４時間攪拌した。真空中にてジオキサンを除去した。沈殿物を濾過して取り除き、濾液を真空中で濃縮乾固した。ＥｔＯＡｃとともに残渣を砕き、次いで濾過した。該濾液を真空中にて濃縮乾固し、ｄｌ−１−アミノ−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ−プロパン及びｄｌ−２−アミノ−１−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ−プロパンの混合物を得、それらは標準的なクロマトグラフィ法によって分離しなかった。該混合物は例８の反応に用いられる。
【０２１８】
調製１３：
ジクロロメタン（２０．０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（１．０ｇ、３．２１２ｍｍｏｌ）及び塩化オキサリル（０．４２８ｇ、０．２９ｍＬ、３．３７３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃にてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド数滴を添加した。該混合液を室温にて１時間攪拌し、次にシクロプロピルメチルアミン（０．２２９ｇ、０．２８ｍＬ、３．２１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．６５ｇ、０．９０ｍＬ、６．４２４ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、該混合液を１Ｍ 塩酸（１０．０ｍＬ）で処理し、該水性混合物をジクロロメタン（３×３０．０ｍＬ）で抽出した。真空中にて有機相を濃縮乾固した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０．０ｍＬ）中の２０％ピペリジン溶液で、残渣を０．５時間処理した。真空中にて溶媒を除去した後に、残渣を１Ｍ 塩酸（２０．０ｍ）及び酢酸エチル（２０．０ｍＬ）で処理した。該混合物を分離させ、固体水酸化ナトリウムを用いて水相をｐＨ８にまで塩基性化した。沈殿物を濾過して取り除き、２０％ピペリジンを用いて溶出させるイオン交換カラムに水溶液を通して、Ｎ−シクロプロピルメチルβ−アラニンアミド０．２６２ｇ（５７％）を得た。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ0.22(m, 2H), 0.49(m, 2H), 0.96(m, 2H), 2.40(t, 2H), 2.92(t, 2H), 3.05(d, 2H);
MS(ES): 143.1(M++1)。
【０２１９】
調製１４：
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン。
ジクロロメタン（１００ｍＬ）中にトランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（６．０８ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を溶解させた。ジ−ｔ−ブチルジカーボネートの溶液（ジクロロメタン４０ｍＬ中に２．３２ｇ、１０．６５ｍｍｏｌ）を、カニューレ(cannula)を通して添加した。２０時間後、該反応液をＣＨＣｌ3及び水で分配させた。相を分離し、水相をＣＨＣｌ3（３×）で抽出した。有機相を合わせてＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して白色固体１．２０ｇ（５３％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3): δ1.0-1.3(m, 4H), 1.44(s, 9H), 1.8-2.1(m, 4H), 2.62(brm, 1H), 3.40(brs, 1H), 4.37(brs, 1H0);
MS(ES): 215.2(M++1)。
【０２２０】
４−（Ｎ−アセチル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン。
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中にＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（５３０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）を溶解させた。無水酢酸（２５０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を滴下した。１６時間後、該反応液を水及びＣＨＣｌ3で希釈した。相を分離し、水相をＣＨＣｌ3（３×）で抽出した。有機相を合わせてＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。再結晶（ＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ）を行い、白色結晶１９０ｍｇ（３０％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3): δ0.9-1.30(m, 4H), 1.43(s, 9H), 1.96-2.10(m, 7H), 3.40(brs, 1H), 3.70(brs, 1H), 4.40(brs, 1H), 4.40(brs, 1H);
MS(ES): 257.2(M++1), 242.1(M+-15), 201.1(M+-56)。
【０２２１】
４−（４−トランス−アセトアミドシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中に４−（Ｎ−アセチル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（１９０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を溶解させ、ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈した。１６時間後、該反応液を濃縮した。粗の固体、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）、ＮａＨＣＯ3（２００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（３５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をフラスコ内で混合し、１３０℃に加熱した。４．５時間後、該反応液を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ及び水で希釈した。相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。有機相を合わせてＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィ（シリカ分取用プレート；２０：１ ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＨ）を行い、黄褐色固体０．３ｍｇ（収率１％）を得た。
MS(ES): 378.2(M++1)。
【０２２２】
４−（Ｎ−メタンスルホニル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン。
ジクロロメタン（２００ｍＬ）中にトランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（５３０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）を溶解させ、ピリジン（２３３ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）で希釈した。メタンスルホニルクロリド（３００ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を滴下した。１６時間後、該反応液を水及びＣＨＣｌ3で希釈した。相を分離し、水相をＣＨＣｌ3（３×）で抽出した。有機相を合わせてＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。再結晶（ＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ）を行い、白色結晶２０６ｍｇ（２９％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3): δ1.10-1.40(m, 4H), 1.45(s, 9H), 2.00-2.20(m, 4H), 2.98(s, 3H), 3.20-3.50(brs, 2H), 4.37(brs, 1H);
MS(ES): 293.1(M++1), 278.1(M+-15), 237.1(M+-56)。
【０２２３】
４−（４−トランス−メタンスルファミドシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中に４−（Ｎ−スルホニル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（２０６ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を溶解させ、ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈した。１６時間後、該反応液を濃縮した。粗の反応混合物、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）、ＮａＨＣＯ3（１００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）及び１−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンをフラスコ内で混合し、１３０℃にて加熱した。１５時間後に、該反応液を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（３×）で希釈した。有機相を合わせてＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィ（シリカ分取用プレート、２０：１ ＣＨＣｌ3／ＥｔＯＨ）を行い、黄褐色固体２．６ｍｇ（収率５％）を得た。
MS(ES): 414.2(M++1)。
【０２２４】
例１：メチルスルホキシド（１０．０ｍＬ）中の４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（０．５０ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）及び４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシルアミン（２．２３ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）を１３０℃にて５時間加熱した。室温にまで冷却した後に、水（１００ｍＬ）を添加し、得られた水溶液をＥｔＯＡｃ（３×１０．０ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ溶液を合わせて、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濾液を真空中にて濃縮乾固し、残渣に対しシリカゲルクロマトグラフィを行い、４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン０．４９ｇ（７５％）を得た。mp 197-199℃；
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.25-1.59(m, 8H), 2.08(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.68-3.79(m, 1H), 4.32-4.38(m, 1H), 4.88(d, J=8Hz, 1H), 7.26-7.49(m, 3H), 8.40-8.44(dd, J=2.2, 8Hz, 2H), 10.60(s, 1H);
MS(ES): 337.2(M++1)。
【０２２５】
下記の化合物は、例１と同様の方法にて得られた。
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−６−メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ11.37(s, 1H, ピロール-NH), 8.45(m, 2H, Ar-H), 7.55(m, 3H, Ar-H), 6.17(s, 1H, ピロール-H), 4.90(br d, 1H, NH), 4.18(m, 1H, CH-O), 3.69(m, 1H, CH-N), 2.40-2.20(m, 2H), 2.19-1.98(m, 2H), 2.25(s, 3H, CH3), 1.68-1.20(m, 4H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
【０２２６】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５−メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ11.37(s, 1H, ピロール-NH), 8.40(m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 5.96(s, 1H, ピロール-H), 4.90(br d, 1H, NH), 4.18(m, 1H, CH-O), 3.69(m, 1H, CH-N), 2.38-2.20(m, 2H), 2.18-1.98(m, 2H), 2.20(s, 3H ,CH3), 1.68-1.20(m, 4H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
【０２２７】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
mp: 245.5-246.5℃；
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ8.33(m, 2H, Ar-H), 7.42(m, 3H, Ar-H), 7.02(d, 1H, J=3.6Hz, ピロール-H), 6.53(d, 1H, J=3.6Hz, ピロール-H), 4.26(m, 1H, CH-O), 3.62(m, 1H, CH-N), 2.30-2.12(m, 2H), 2.12-1.96(m, 2H), 1.64-1.34(m, 4H);
MS, M+1= 309.3;
元素分析（Ｃ18Ｈ20Ｎ4Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０２２８】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（３−ピリジル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.21-1.54(m, 8H); 2.28(s, 3H); 2.33(s, 3H); 3.70(m, 1H), 4.31(m, 1H), 4.89(d, 1H), 7.40(m, 1H), 8.61(m, 2H), 9.64(m, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２２９】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（２−フリル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.64(m, 8H), 2.22(s, 3H), 2.30(s, 3H), 3.72(m, 1H), 4.23(m, 1H), 4.85(d, 1H), 6.52(m, 1H), 7.12(m, 1H), 7.53(m, 1H), 9.28(s, 1H);
MS(ES): 327.2(M++1)。
【０２３０】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（３−フリル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.25-1.63(m, 8H), 2.11(s, 3H), 2.27(s, 3H), 3.71(m, 1H), 4.20(m, 1H), 4.84(d, 1H), 7.03(m, 1H), 7.45(m, 1H), 8.13(m, 1H), 10.38(m, 1H);
MS(ES): 327.2(M++1)。
【０２３１】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−シクロペンチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-2.04(m, 16H), 2.26(s, 3H), 2.27(s, 3H), 3.15(m, 1H), 3.70(m, 1H), 4.12(m, 1H), 4.75(d, 1H);
MS(ES): 329.2(M++1)。
【０２３２】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（２−チエニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.28-1.59(m, 8H), 2.19(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.74(m, 1H), 4.19(m, 1H), 4.84(d, 1H), 7.09(m, 1H), 7.34(m, 1H), 7.85(m, 1H), 9.02(s, 1H);
MS(ES): 343.2(M++1)。
【０２３３】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（３−チエニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.21-1.60(m, 8H), 1.98(s, 3H), 2.23(s, 3H), 3.66(m, 1H), 4.22(m, 1H), 7.27(m, 1H), 7.86(m, 1H), 8.09(m, 1H), 11.23(s, 1H);
MS(ES): 343.2(M++1)。
【０２３４】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（４−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.66(m, 8H), 1.94(s, 3H), 2.28(s, 3H), 3.73(m, 1H), 4.33(m, 1H), 4.92(d, 1H), 7.13(m, 2H), 8.41(m, 2H), 11.14(s, 1H);
MS(ES): 355.2(M++1)。
【０２３５】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.71(m, 8H), 2.06(s, 3H), 2.30(s, 3H), 3.72(m, 1H), 4.30(m, 1H), 4.90(d, 1H), 7.09(m, 1H), 7.39(m, 1H), 8.05(m, 1H), 8.20(m, 1H), 10.04(s, 1H);
MS(ES): 355.2(M++1)。
【０２３６】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−（２−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.30-1.64(m, 8H), 2.17(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.73(m, 1H),4.24(m, 1H), 4.82(d, 1H), 7.28(m, 2H), 8.18(m, 1H), 9.02(m, 1H), 12.20(s, 1H);
MS(ES): 355.3(M++1)。
【０２３７】
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−イソプロピル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.31(d, J=7.0Hz, 6H), 1.30-1.65(m, 8H), 2.27(s, 3H), 2.28(s, 3H), 3.01(m, J=7.0Hz, 1H), 3.71(m, 1H), 4.14(m, 1H), 4.78(d, 1H);
MS(ES): 303.2(M++1)。
【０２３８】
ｄｌ−４−（２−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−イソプロピル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) d 1.31-1.42(br, 4H), 1.75-1.82(br, 4H), 2.02(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.53(m, 1H), 4.02(m, 1H), 5.08(d, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.30(m, 2H), 10.08(s, 1H);
MS(ES): 337.2(M++1)。
【０２３９】
４−（３，４−トランス−ジヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【０２４０】
４−（３，４−シス−ジヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【０２４１】
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
mp 196-199℃；
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.72(s, 3H), 1.97(s, 3H), 2.31(s,3H), 3.59(m, 2H), 3.96(m, 2H), 5.63(br, 1H), 7.44-7.47(m, 3H), 8.36-8.43(dd, J=1Hz, 7Hz, 2H), 10.76(s, 1H);
MS(ES): 324.5(M++1)。
【０２４２】
ｄｌ−４−（２−トランス−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.62(m, 2H), 1.79(br, 4H), 1.92(s, 3H), 2.29(s, 3H), 4.11(m, 1H), 4.23(m, 1H), 5.28(d, 1H), 7.41-7.49(m,3H), 8.22(m, 2H), 10.51(s, 1H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
1２−トランス−ヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、PCT 9417090を参照。
【０２４３】
ｄｌ−４−（３−トランス−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.58-1.90(br, 6H), 2.05(s, 3H), 2.29(s, 3H), 4.48-4.57(m, 1H), 4.91-5.01(m, 2H), 7.35-7.46(m, 3H), 8.42-8.47(m, 2H), 10.11(s, 1H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
1３−トランス−ヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、EP-A-322242を参照。
【０２４４】
ｄｌ−４−（３−シス−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.82-2.28(br, 6H), 2.02(s, 3H), 2.30(s, 3H), 4.53-4.60(m, 1H), 4.95-5.08(m, 1H), 5.85-5.93(d, 1H), 7.35-7.47(m, 3H), 8.42-8.46(m, 2H), 10.05(s, 1H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
1３−シス−ヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、EP-A-32242を参照。
【０２４５】
４−（３，４−トランス−ジヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.92-1.99(br, 2H), 2.14(s, 3H), 2.20(br, 2H), 2.30(s, 3H), 2.41-2.52(br, 2H), 4.35(m, 2H), 4.98(m, 2H), 7.38-7.47(m, 3H), 8.38-8.42(m, 2H), 9.53(s, 1H);
MS(ES): 339.2(M++1)。
1３，４−トランス−ジヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、PCT 9417090を参照。
【０２４６】
４−（３−アミノ−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(s, 3H), 2.29(s, 3H), 2.71(t, 2H), 4.18(m, 2H), 5.75-5.95(m, 3H), 7.38-7.48(m, 3H), 8.37-8.41(m, 2H), 10.42(s, 1H);
MS(ES): 310.1(M++1)。
【０２４７】
４−（３−Ｎ−シクロプロピルメチルアミノ−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ0.51(q, 2H), 0.40(q, 2H), 1.79-1.95(br, 1H), 2.36(s, 3H), 2.40(s, 3H), 2.72(t, 2H), 2.99(d, 2H), 4.04(t, 2H), 7.58-7.62(m, 3H), 8.22-8.29(m, 2H);
MS(ES): 364.2(M++1)。
【０２４８】
４−（２−アミノ−オキソエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ2.31(s, 3H), 2.38(s, 3H), 4.26(s, 2H), 7.36(m, 3H), 8.33(m, 2H);
MS(ES): 396.1(M++1)。
【０２４９】
４−（２−Ｎ−メチルアミノ−２−オキソエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.99(s, 3H), 2.17(s, 3H), 2.82(d, 3H), 4.39(d, 2H), 5.76(t, 1H), 6.71(br, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.40(m, 2H), 10.66(s, 1H);
MS(ES): 310.1(M++1)。
【０２５０】
４−（３−ｔｅｒｔ−ブチルオキシル−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.45(s, 9H), 1.96(s, 3H), 2.29(s, 3H), 2.71(t, 2H), 4.01(q, 2H), 5.78(t, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.22-8.29(m, 2H);
MS(ES): 367.2(M++1)。
【０２５１】
４−（２−ヒドロキシエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.92(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.81-3.98(br, 4H), 5.59(t, 1H), 7.39-7.48(m, 3H), 8.37(m, 2H), 10.72(s, 1H);
MS(ES): 283.1(M++1)。
【０２５２】
４−（３−ヒドロキシプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.84(m, 2H), 1.99(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.62(t, 2H), 3.96(m, 2H), 3.35(t, 1H), 7.39-7.48(m, 3H), 8.36(m, 2H), 10.27(s, 1H);
MS(ES): 297.2(M++1)。
【０２５３】
４−（４−ヒドロキシブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.71-1.82(m, 4H), 1.99(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.68-3.80(m, 4H), 5.20(t, 1H), 7.41-7.49(m, 3H), 8.41(m, 2H), 10.37(s, 1H);
MS(ES): 311.2(M++1)。
【０２５４】
４−（４−トランス−アセチルアミノシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
４−（４−トランス−メチルスルホニルアミノシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
４−（３−ピリジルメチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
４−（３−メチルプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
【０２５５】
例２：
０℃に冷やしたＴＨＦ（１．０ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０４７ｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）及び安息香酸（０．０２２ｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、４−（４−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（０．０５ｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。次にアゾジカルボン酸ジエチル（０．０２８ｍＬ、０．１７９ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。続いて、該反応液を室温に加温した。ＴＬＣで反応が完了した後に、該反応混合液を炭酸水素ナトリウム水溶液（３．０ｍＬ）を用いて反応停止させた。水相を分離し、エーテル（２×５．０ｍＬ）で抽出した。有機抽出相を合わせて乾燥させ、真空中にて濃縮乾固した。エーテル（２．０ｍＬ）及びヘキサン（５．０ｍＬ）を残渣に添加し、それからトリフェニルホスフィンオキシドのバルクを濾過により除去した。濾液を濃縮し、粘性オイルを得、それをカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、４−（４−シス−ベンゾイルオキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン５．０ｍｇ（７．６％）を得た。
MS(ES): 441.3(M++1).
また、この反応は４−（３−シクロヘキセニル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン５０．０ｍｇ（８４％）を生じた。
MS(ES):319.2(M++1)。
【０２５６】
例３：エタノール（１．０ｍＬ）中の４−（４−シス−ベンゾイルオキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（５．０ｍｇ、０．０１１４ｍｍｏｌ）の溶液に、２Ｍ 水酸化ナトリウム１０滴を添加した。１時間後に、該反応液を酢酸エチル（３×５．０ｍＬ）で抽出し、有機相を乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮乾固させた。残渣に対し、カラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）を行い、４−（４−シス−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン３．６ｍｇ（９４％）を得た。
MS(ES): 337.2(M++1)。
【０２５７】
下記の化合物は、例３と同様の方法にて得られた。
４−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.01(s, 3H), 2.31(s, 3H), 2.73(t, 2H), 2.97(s, 6H), 4.08(m, 2H), 6.09(t, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.43(m, 2H), 10.46(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２５８】
４−（２−ホルミルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.26(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.59-3.78(m, 2H), 3.88-4.01(m, 2H), 5.48-5.60(m, 1H), 7.38-7.57(m, 3H), 8.09(s, 1H), 8.30-8.45(m, 2H), 8.82(s, 1H);
MS(ES): 310.1(M++1)。
【０２５９】
４−（３−アセチルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２６０】
例４：
トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン（１：１、５．０ｍＬ）に４−（３−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（７０．０ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）を溶解させた。得られた溶液を室温にて１時間攪拌し、次に２時間還流させた。室温にまで冷却した後に、該混合液を真空中にて濃縮乾燥固させた。残渣に対し分取薄層クロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：ＡｃＯＨ＝７：２．５：０．５）を行い、４−（３−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン４０．０ｍｇ（６８％）を得た。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ2.32(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.81(t, 2H), 4.01(t, 2H), 7.55(m, 3H), 8.24(m, 2H);
MS(ES): 311.1(M++1)。
【０２６１】
下記の化合物は、例４と同様の方法にて得られた。
４−（３−アミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 296.1(M++1), 279.1(M+-NH3)。
【０２６２】
例５：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）、ジオキサン（０．５０ｍＬ）及び水（０．２５ｍＬ）の混合液中に、４−（３−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（５０．０ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ）を溶解させた。この溶液に、メチルアミン（０．０２ｍＬ、水中に４０質量％、０．２４２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０８５ｍＬ）及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（６１．２ｍｇ、０．２０３ｍｍｏｌ）を添加した。室温にて１０分間攪拌した後に、該溶液を濃縮し、残渣に対し分取薄層フロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ）を行い、４−（３−Ｎ−メチル−３−オキソプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン３５．０ｍｇ（６７％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.92(s, 3H), 2.30(s, 3H), 2.65(t, 2H), 4.08(t, 2H), 5.90(t, 1H), 6.12(m, 1H), 7.45(m, 3H), 8.41(m, 2H), 10.68(s, 1H);  MS(ES): 311.1(M++1)。
【０２６３】
下記の化合物は、例５と同様の方法にて得られた。
４−（２−シクロプロパンカルボニルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 350.2(M++1)。
【０２６４】
４−（２−イソブチリルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 352.2(M++1)。
【０２６５】
４−（３−プロピオニルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.00-1.08(t, 3H), 1.71-2.03(m, 4H), 2.08(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.26-3.40(m, 2H), 3.79-3.96(m, 2H), 5.53-5.62(m, 1H), 6.17-6.33(m, 1H), 7.33-7.57(m, 3H), 8.31-8.39(m, 2H), 9.69(s, 1H);
MS(ES):352.2(M++1)。
【０２６６】
４−（２−メチルスルホニルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.18(s, 3H), 2.27(s, 3H), 2.92(s, 3H), 3.39-3.53(m, 2H), 3.71-3.88(m, 2H), 5.31-5.39(m, 1H), 6.17-6.33(m, 1H), 7.36-7.43(m, 3H), 8.20-8.25(m, 2H), 9.52(s, 1H);
MS(ES): 360.2(M++1)。
【０２６７】
例６：
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（０．７０ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）及び１，２−ジアミノエタン（１０．０ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）の混合物を、不活性雰囲気下にて６時間還流させた。過剰のアミンを真空中にて除去し、次にエーテル及びヘキサンで残渣を洗浄し、４−（２−アミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンを得た。
MS(ES); 282.2(M++1), 265.1(M+-NH3）。
【０２６８】
例７：
ジクロロメタン（２．０ｍＬ）中の４−（２−アミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（７０．０ｍｇ、０．２４９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５０．４ｍｇ、０．４９８ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化プロピオニル（２５．６ｍｇ、０．０２４ｍＬ、０．２７４ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。１時間後に、該混合液を真空中にて濃縮し、残渣に対し分取薄層クロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ）を行い、４−（２−プロピオニルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン２２．０ｍｇ（２６％）を得た。
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２６９】
下記の化合物は、例７と同様の方法にて得られた。
４−（２−Ｎ’−メチルウレアエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.13(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.53(d, 3H), 3.55(m, 2H), 3.88(m, 2H), 4.29(m, 1H), 5.68(t, 1H), 5.84(m, 1H), 7.42(m, 3H), 8.36(dd, 2H), 9.52(s, 1H);
MS(ES): 339.3(M++1)。
【０２７０】
４−（２−Ｎ’−エチルウレアエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【０２７１】
例８：
ジクロロメタン（２．０ｍＬ）中の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４１．１ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（２．４ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）及びピルビン酸（１８．９ｍｇ、０．０１５ｍＬ、０．２１５ｍｍｏｌ）の溶液に、４−（２−アミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（５５．０ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）を添加した。該混合液を室温にて４時間攪拌した。通常の後処理、続いてカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ）を行い、４−（２’−ピルビルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン１０．０ｍｇ（１５％）を得た。
MS(ES): 352.2(M++1)。
【０２７２】
例９：
ジクロロメタン（２．０ｍＬ）中の４−（２−アミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（６０．０ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−トリメチルシリルイソシアネート（４３．３ｍｇ、０．０５１ｍＬ，０．３２０ｍｍｏｌ）を添加した。該混合液を室温にて３時間攪拌し、続いて炭酸水素ナトリウム水溶液を添加した。少量のシリカゲルに通して濾過した後に、濾液を真空中にて濃縮乾固して４−（２−ウレアエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンを得た。
MS(ES): 325.2(M++1)。
【０２７３】
下記の化合物は、例９と同様の方法にて得られた。
ｄｌ−４−（２−アセチルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.28-1.32(d, J=8Hz, 3H), 1.66(s, 3H), 1.96(s, 3H), 2.30(s, 3H), 3.76-3.83(m, 2H), 4.10-4.30(m, 1H), 5.60-5.66(t, J=6Hz, 1H), 7.40-7.51(m, 3H), 8.36-8.43(m, 2H), 10.83(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２７４】
（Ｒ）−４−（２−アセチルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.31(d, 3H), 1.66(s, 3H), 1.99(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.78-3.83(m, 2H), 4.17-4.22(m, 1H), 5.67(t, 1H), 7.38-7.5(m, 3H), 8.39(m, 2H), 10.81(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２７５】
（Ｒ）−４−（１−メチル−２−アセチルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.41(d, 3H), 1.68(s, 3H), 2.21(s, 3H), 2.34(s, 3H), 3.46-3.52(br, m, 2H), 4.73(m, 1H), 5.22(d, 1H), 7.41-7.46(m, 3H), 8.36-8.40(m, 2H), 8.93(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２７６】
（Ｓ）−４−（２−アセチルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.31(d, 3H), 1.66(s, 3H), 2.26(s, 3H), 2.35(s, 3H), 3.78-3.83(m, 2H), 4.17-4.22(m, 1H), 5.67(t, 1H), 7.38-7.5(m, 3H), 8.39(m, 2H), 8.67(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２７７】
（Ｓ）−４−（１−メチル−２−アセチルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.41(d, 3H), 1.68(s, 3H), 2.05(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.46-3.52(m, 2H), 4.73(m, 1H), 5.22(d, 1H) ,7.41-7.46(m, 3H), 8.36-8.40(m, 2H), 10.13(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２７８】
例１０：例１と同様の方法にて、ｄｌ−１−アミノ−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ−プロパン及びｄｌ−２−アミノ−１−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ−プロパンの混合物との４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンの反応を行った。この反応により、ｄｌ−４−（１−メチル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ）エチルアミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン及びｄｌ−４−（２−メチル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ）エチルアミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンが得られ、それらをカラムクルマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：３）により分離した。第一のフラクションは、ｄｌ−４−（１−メチル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンであった：
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.29-1.38(m, 12H), 1.95(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.34-3.43(m, 2H), 4.62-4.70(m, 1H), 5.36-5.40(d, J=8Hz, 1H), 5.53(br, 1H), 7.37-7.49(m, 3H), 8.37-8.44(m, 2H), 10.75(s, 1H);
MS(ES): 396.3(M++1)。
【０２７９】
第二のフラクションは、ｄｌ−４−（２−１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジンであった：
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.40(m, 12H), 2.00(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.60-3.90(m, 2H), 3.95-4.10(m, 1H), 5.41-5.44(d, J=6.0Hz, 1H), 5.65(br, 1H), 7.40-7.46(m, 3H), 8.37-8.44(m, 2H), 10.89(s, 1H);
MS(ES): 396.2(M++1)。
【０２８０】
下記の化合物は、例１０と同様の方法にて得られた。
（Ｓ，Ｓ）−４−（２−アセチルアミノシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.43(m, 4H), 1.60(s, 3H), 1.83(m, 2H), 2.18(s, 3H), 2.30(m, 2H), 2.32(s, 3H), 3.73(br, 1H), 4.25(br, 1H), 5.29(d, 1H), 7.43-7.48(m, 3H), 8.35-8.40(m, 2H), 9.05(s, 1H)。
【０２８１】
４−（２−メチル−２−アセチルアミノプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.51(s, 6H), 1.56(s, 3H), 2.07(s, 3H), 2.36(s, 3H), 3.76(d, 2H), 5.78(t, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 7.93(s, 1H), 8.39(m, 2H), 10.07(s, 1H);
MS(ES): 352.3(M++1)。
【０２８２】
例１１：
ジクロロメタン（２．０ｍＬ）中にて、ｄｌ−４−（１−メチル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（６０．６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）で１４時間処理した。有機溶媒を真空中にて濃縮し乾固させた。残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）及びトリエチルアミン（２．０ｍＬ）中に溶解させた。該溶液に無水酢酸（１７．２ｍｇ、０．０１６、０．１６９ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。得られた混合液を室温にて４８時間攪拌し、次に真空中にて濃縮乾固させた。残渣に対し分取薄層クロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ）を行い、ｄｌ−４−（１−メチル−２−アセチルアミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン２７．０ｍｇ（５２％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.38-1.42(d, J=8Hz, 3H), 1.69(s, 3H), 2.01(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.38-3.60(m, 2H), 4.65-4.80(m, 1H), 5.23-5.26(d, J=6Hz, 1H), 7.40-7.51(m, 3H), 8.37-8.43(m, 2H), 10.44(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【０２８３】
例１２：
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）中にて、（Ｒ，Ｒ）−４−（２−アミノシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（例１と同様の方法にて、４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（０．１５ｇ、０．５８３ｍｍｏｌ）から調製）、及び（１Ｒ，２Ｒ）−（−）−１，２−ジアミノシクロヘキサン（０．６３ｇ、５．５１７ｍｍｏｌ）をトリエチルアミン（０．７２６ｇ、７．１７５ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（０．３２５ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）で室温にて２時間処理した。真空中にて溶媒を除去した後に、酢酸エチル（１０．０ｍＬ）及び水（１０．０ｍＬ）を残渣に添加した。該混合物を分離し、水相を酢酸エチル（２×１０．０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル溶液を合わせて乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過した。濾液を真空中にて濃縮乾固し、残渣に対してカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：１）を行い、（Ｒ，Ｒ）−４−（２−アセチルアミノシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン５７．０ｍｇ（２６％）を得た。   1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.43(m, 4H), 1.60(s, 3H), 1.84(m, 2H), 2.22(s, 3H), 2.30(m, 2H), 2.33(s, 3H), 3.72(br, 1H), 4.24(br, 1H), 5.29(d, 1H), 7.43-7.48(m, 3H), 8.35-8.39(m, 2H), 8.83(s, 1H);
MS(ES): 378.3(M++1)。
【０２８４】
例１３：
ピリジン（１．０ｍＬ）中の４−（２−ヒドロキシエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（４０．０ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（０．１０８ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。該混合液を室温にて４時間攪拌し、溶媒を真空中にて除去した。残渣に対して分取薄層クロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：１）を行い、４−（２−アセチルオキシエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン３２．３ｍｇ（７１％）を得た。   1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.90(s, 3H), 2.08(s, 3H), 2.31(s, 3H), 4.05(m, 2H), 4.45(t, 2H), 5.42(m, 1H), 7.41-7.49(m, 3H), 8.42(m, 2H), 11.23(s, 1H)。
【０２８５】
例１４：
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１滴を含むジクロロメタン（４．０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（９７．４ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）及び塩化オキサリル（３９．７ｍｇ、２７．３μＬ、０．３１３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃にて１時間攪拌し、次に４−（２−アミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（８０．０ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５７．６ｍｇ、７９．４μＬ、０．５７０ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。３時間後に、該混合物を真空中にて濃縮し、残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）中の２０％ピペリジン溶液で０．５時間処理した。真空中にて溶媒を除去した後に、残渣をジエチルエーテル：ヘキサン（１：５）で洗浄し、４−（６−アミノ−３−アザ−４−オキソヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン３．０ｍｇ（３％）を得た。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【０２８６】
例１５：
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルアミド１滴を含むジクロロメタン（４．０ｍＬ）中の４−（２−アミノエチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（７０．０ｍｇ、０．２４９ｍｍｏｌ）及び無水コハク酸（２７．０ｍｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて４時間攪拌した。該反応混合液を２０％水酸化ナトリウム（３×５．０ｍＬ）で抽出した。該水溶液を、３Ｍ塩酸を用いてｐＨ＝７．０にまで酸性化した。該混合液全体を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機溶液を合わせて乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過した。濾液を真空中にて濃縮乾固し、４−（７−ヒドロキシ−３−アザ−４，７−ジオキソヘプチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン１５．０ｍｇ（１６％）を得た。
MS(ES): 382.2(M++1)。
【０２８７】
例１６：
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）に、４−シス−３−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−２−フェニル−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン（７００ｍｇ）を室温にて添加し、続いてＮ−Ｂｏｃグリシン（４５５ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２０ｍｇ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（２９３ｍｇ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ）（６２２ｍｇ）を添加した。該反応混合液を一晩中攪拌した。次に減圧下にてＤＭＦを除去し、該反応混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）間で分配させた。更に水相部分を酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出し、有機相部分を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。酢酸エチル／ヘキサンで溶出させるシリカゲル精製を行い、所望の生成物：４−（シス−３−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−２−アミノアセトキシ）シクロペンチル）アミノ−２−フェニル−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン４１０ｍｇを得た（MS(ES)(M++1)= 480.2）。次に該エステルを、ジクロロメタン中の２０％トリフルオロ酢酸５ｍＬで室温にて一晩処理し、続いて濃縮した。酢酸エチルとともに粉砕し、灰白色固体；４−（シス−３−（２−アミノアセトキシ）シクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジントリフルオロ酢酸塩３００ｍｇを得た（MS(ES)(M++1)= 380.1）。
【０２８８】
下記の化合物が上述の方法によって合成可能であることは、当業者にとって明らかであろう：
４−（シス−３−ヒドロキシシクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 323.1。
４−（シス−（２−アミノアセトキシ）シクロペンチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジントリフルオロ酢酸塩。
【０２８９】
MS(ES)(M++1)= 380.1。
４−（３−アセトアミド）ピペリジニル−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 364.2。
４−（２−Ｎ’−メチルウレアプロピル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 353.4。
４−（２−アセトアミドブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 352.4。
４−（２−Ｎ’−メチルウレアブチル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 367.5。
４−（２−アミノシクロプロピルアセトアミドエチル）アミノ−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 309.1。
４−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−（３−クロロフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 342.8。
４−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−（３−フルオロフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 327.2。
４−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ−２−（４−ピリジル）−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 310.2。
【０２９０】
例１７：
【化４３】
0004611524.tif 000028
（７）（スキームIX）のピロールの窒素を塩基性条件下にてｔ−ブチルジカーボネートで保護し、相当するカルバーメート（２２）を得た。続いて（２２）のラジカル的臭素化を位置選択的に行い、臭素化物（２３）を得た。一般的に、化合物（２３）は、種々の求核的カップリングの相手としての重要な求電子性中間体として働いた。ナトリウムフェノラート三水和物を用いた臭化アルキルの置換により化合物（２４）を得た。続く塩化アリールの置換、及びｔ−ブチルカルバメート保護基の除去を一工程で行い、所望の化合物（２５）を得た。
【０２９１】
スキームIXに従った化合物（２２）〜（２５）の詳細な合成：
【化４４】
0004611524.tif 000029
ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（５．３７ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（１．１３ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を、（７）（１．５０ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）及びピリジン（３０ｍＬ）を含む溶液に添加した。２０時間後に、該反応液を濃縮し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2及び水間に分配させた。ＣＨ2Ｃｌ2相を分離し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して黒色固体を得た。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；１／９ＥｔＯＡｃ／ヘキサン Ｒｆ ０．４０）を行い、白色固体（２２）１．７０ｇ（８０％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.50 (m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 6.39(s, 1H, ピロール-H), 2.66(s, 3H, ピロール-CH3), 1.76(s, 9H, カルバメート-CH3);
MS, M+1: 344.1;
Mpt= 175-177℃。
【０２９２】
【化４５】
0004611524.tif 000030
Ｎ−ブロモスクシンイミド（５０８ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１１２ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を、（２２）（９３５ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）及びＣＣｌ4（５０ｍＬ）を含む溶液に添加した。該溶液を加熱還流させた。２時間後に、該反応液を室温に冷却し、真空中にて濃縮して白色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；１／１ ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサン、Ｒｆ ０．３０）を行い、白色固体（２３）９６０ｍｇ（８４％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.52 (m, 2H, Ar-H), 7.48(m, 3H, Ar-H), 6.76(s, 1H, ピロール-H), 4.93(s, 2H, ピロール-CH2Br), 1.79(s, 9H, カルバメート-CH3);
MS, M+1: 423.9;
Mpt= 155-157℃。
【０２９３】
【化４６】
0004611524.tif 000031
ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）及びＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた臭化物（２３）（４１０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムフェノキシド三水和物（１７３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。２時間後に、該反応溶液をＣＨ2Ｃl2及び水間に分配させた。水相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2相を合わせて水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮して黄色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；１／６ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、Ｒｆ ０．３０）を行い、白色固体（２４）２１０ｍｇ（５０％）を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.53(m, 2H, Ar-H), 7.48(m, 3H, Ar-H), 7.34(m, 2H, Ar-H), 7.03(m, 3H, Ar-H), 6.83(s, 1H, ピロール-H), 5.45(s, 2H, ArCH2O), 1.76(s, 9H, カルバメート-CH3);
MS, M+: 436.2。
【０２９４】
【化４７】
0004611524.tif 000032
（２４）（８５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−アセチルエチレンジアミン（２０１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）及びＤＭＳＯ（３ｍＬ）を含む溶液を１００℃に加熱した。１時間後に、温度を１３０℃に上昇させた。３時間後に、該反応液室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ及び水間に分配させた。水相をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。ＥｔＯＡｃ相を合わせて水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ2；１／１０ ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ3、Ｒｆ ０．２５）を行い、白色泡状固体（２５）７３ｍｇ（９３％）を得た。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ11.81(br s, 1H, N-H), 8.39(m, 2H, Ar-H), 8.03(br t, 1H, N-H), 7.57(br t, 1H, N-H), 7.20-7.50(m, 5H, Ar-H), 6.89-7.09(m, 3H, Ar-H), 6.59(s, 1H, ピロール-H), 5.12(s, 2H, ArCH2O), 3.61(m, 2H, NCH2), 3.36(m, 2H, NCH2), 1.79(s, 3H, COCH3);
MS, M+1: 402.6。
【０２９５】
下記の化合物は、例１７と同様の方法にて得られた。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−フェノキシメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
mp 196-197℃； MS(ES): 401.6(M++1)。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−フルオロフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 420.1(M++1)。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−クロロフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 436.1(M++1)。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（４−メトキシフェノキシ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 432.1(M++1)。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−ピリジン−２−オン）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 403.1(M++1)。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−フェニルアミノ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３]ピリミジン。
MS(ES): 400.9(M++1)。
４−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ）メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 414.8(M++1)。
４−（２−Ｎ’−メチルウレアエチル）アミノ−６−フェノキシメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ[２，３ｄ]ピリミジン。
MS(ES): 416.9(M++1)。
【０２９６】
ヒトアデノシンＡ１及びＡ２ａ受容体に対する酵母βガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイ
ヒトアデノシンＡ１（Ａ１Ｒ；ＣＡＤＵＳ株ＣＹ１２６６０）又はヒトＡ２ａ（Ａ２ａ；ＣＡＤＵＳ株ＣＹ８３６２）と、機能的な読み取りとして使用するためのｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）レポーター遺伝子の添加によって、酵母の株（サッカロミセス・セレビシアエ）を形質転換した。形質転換の完全な記載は、以下に列記されている（酵母株参照）。全てのアッセイには、Ａ１とＡ２ａ受容体に対して同等の親和性を有する強力なアデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）をリガンドとして使用した。テスト化合物は、８つの濃度（０．１〜１０，０００ｎＭ）で、ＣＹ１２６６０又はＣＹ８３６２によるＮＥＣＡ誘導性βガラクトシダーゼ活性を阻害する能力について調べられた。
【０２９７】
酵母ストック培養の調製  各酵母株それぞれ、ＣＹ１２６６０とＣＹ８３６２をＬＴ寒天プレート上に画線し、コロニーが観察されるまで、３０℃でインキュベートした。これらのコロニーからの酵母をＬＴ液（ｐＨ６．８）に添加し、３０℃で一晩増殖させた。続いて、各酵母株を、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶＭＡＸ）で測定したときにＯＤ６００＝１．０〜２．０（約１〜２×１０７細胞／ｍＬ）になるように希釈した。各６ｍＬの酵母液体培養に対して、４ｍＬの４０％グリセロール（１：１．５  ｖｏｌ：ｖｏｌ）を添加した（酵母／グリセロールストック）。この酵母／グリセロールストックから、１ｍＬの分取試料を１０個調製し、アッセイに必要になるまで−８０℃で保存した。
【０２９８】
酵母Ａ１ＲとＡ２ａＲアッセイ  １バイアルのそれぞれＣＹ８３６２とＣＹ１２６６０酵母／グリセロールストックを融解し、補充ＬＴ溶液培地、ｐＨ６．８（５ｍＬの４０％グルコース、０．４５ｍＬの１Ｍ  ＫＯＨ、及び２．５ｍＬのＰｉｐｅｓ、ｐＨ６．８が添加されているＬＴ液９２ｍＬ）を接種するために使用した。３０℃で１６〜１８時間（一晩）、液体培養を増殖させた。続いて、ＣＹ８３６２（Ａ２ａＲ）についてはＯＤ６００＝０．１５（１．５×１０６細胞／ｍＬ）が、ＣＹ１２６６０（Ａ１Ｒ）についてはＯＤ６００＝０．５０（５×１０６細胞／ｍＬ）が得られるように、４Ｕ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼ（ウシ小腸粘膜からのＶＩ型又はＶＩＩ型、シグマ）を含有するＬＴ培地に、一晩培養したものからの分取試料を希釈した。
【０２９９】
９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、全てのウェルにおいて２％ＤＭＳＯの最終濃度が達成されるように、１００μＬの最終容量を用いてアッセイを行った。一次スクリーニングについては、１〜２の濃度のテスト化合物を使用した（１０μＭ、１μＭ）。化合物のプロフィール決定の場合には、８つの濃度を（１００００、１０００、５００、１００．５０、１０、１、及び０．１ｎＭ）テストした。各マイクロタイタープレートに対して、「対照」と「トータル」のウェルには１０μＬの２０％ＤＭＳＯを添加し、「未知」のウェルには１０μＬのテスト化合物（２０％ＤＭＳＯ中）を添加した。続いて、「トータル」と「未知」のウェルには、１０μＬのＮＥＣＡ（Ａ１Ｒには５μＭ、Ａ２ａＲには１μＭ）を添加し、「対照」のウェルには、１０μＬのＰＢＳを添加した。最後の添加では、８０μＬの酵母株、ＣＹ８３６２又はＣＹ１２６６０を全てのウェルに添加した。続いて、全てのプレートを短時間攪拌し（ＬａｂＬｉｎｅ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ、２〜３分）、乾燥したオーブン中、３０℃で４時間インキュベートさせた。
【０３００】
比色（例えば、ＯＮＰＧ、ＣＰＲＧ）、冷光（例えば、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ）、又は蛍光性基質（例えば、ＦＤＧ、Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）基質の何れかを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を定量することができる。現在は、Ｓ／Ｎ比が優れ、相対的に妨害がなく、且つ低コストであるために、蛍光検出が好ましい。蛍光性のβ−ガラクトシダーゼの基質であるフルオレセインジガラクトピラノシド（ＦＤＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、２０μＬ／ウェル（最終濃度＝８０μＭ）で全てのウェルに添加した。５〜６秒間プレートを揺動させた後（Ｌａｂｌｉｎｅ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）、３７℃で９０分間インキュベートした（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２インキュベーター）。９０分のインキュベーション期間の終わりに、２０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を停止させ、全てのプレートを５〜６秒間揺動した。続いて、プレートを６秒間攪拌し、蛍光測定機（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ；励起＝４８５ｎｍ、蛍光＝５３５ｎＭ）を用いて、相対蛍光強度を決定した。
【０３０１】
計算  「対照」ウェルに対する相対蛍光値をバックグラウンドと解釈し、「Ｔｏｔａｌ」及び「Ｕｎｋｎｏｗｎ」の値から差し引いた。対数変換（Ｘ軸：化合物の濃度）した後、一部位の拮抗曲線のフィッティングを行ってＩＣ５０値を算出することにより（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）、化合物のプロフィールを分析した。
【０３０２】
酵母株  サッカロミセスセレビシアエ  ＣＹ１２６６０株［ｆａｒ１＊１４４２ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６  ｇｐａ１（４１）−Ｇαｉ３  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１：ｈｉｓ３；ＬＥＵ２  ＰＧＫｐ−Ｍｆα１Ｌｅａｄｅｒ−ｈＡ１Ｒ−ＰＨＯ５ｔｅｒｍ  ２ｍｕ−ｏｒｉｇ  ＲＥＰ３  Ａｍｐｒ］、及びＣＹ８３６２株［ｇｐａ１ｐ−ｒＧαｓＥ１０Ｋ  ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３；ＬＥＵ２  ＰＧＫｐ−ｈＡ２ａＲ  ２ｍｕ−ｏｒｉ  ＲＥＰ３  Ａｍｐｒ］を発育させた。
【０３０３】
ＬＴ培地  ＬＴ（Ｌｅｕ−Ｔｒｐ補充）培地は、１００ｇのＤＩＦＣＯ酵母窒素塩基（ｂａｓｅ）に、以下のもの：バリン１．０ｇ、アスパラギン酸１．０ｇ、フェニルアラニン０．７５ｇ、リシン０．９ｇ、チロシン０．４５ｇ、イソロイシン０．４５ｇ、メチオニン０．３ｇ、アデニン０．６ｇ、ウラシル０．４ｇ、セリン０．３ｇ、プロリン０．３ｇ、システイン０．３ｇ、アルギニン０．３ｇ、ヒスチジン０．９ｇ、及びトレオニン１．０ｇが補充されてなる。
【０３０４】
ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株の構築
この例では、酵母のフェロモン系経路中に機能的に組み込まれたヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株の構築について記載する。
【０３０５】
１．発現ベクターの構築
ヒトＡ１アデノシン受容体用の酵母発現ベクターを構築するために、ヒトＡ１アデノシン受容体の公表された配列に基づいてデザインされたプライマーと標準的な手法を用いて、ヒト海馬のｍＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲによって、Ａ１アデノシン受容体のｃＤＮＡを得た。酵母発現プラスミドｐＭＰ１５のＮｃｏＩ及びＸｂａＩ部位にＰＣＲ産物をサブクローニングした。
【０３０６】
ｐＭＰ１５プラスミドは、以下のようにｐＬＰＸｔから作成した。ＹＥＰ５１（Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ，  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ”，  ｐ．８３−１１７  ｉｎ  Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ（ｅｄ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を消化によって取り出し、末端を充填し（ｅｎｄ−ｆｉｌｌ）、再連結してＹｅｐ５１ＮｃｏＤＸｂａを作成した。ＹＥＰ５１ＮｃｏＸｔを作成するために、ＢａｍＨＩによる消化、末端充填、リンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、＃１０８１）の連結、ＸｂａＩ消化、及び再連結により、ＢａｍＨＩ部位に別のＸｂａＩ部位を作成した。Ｅｓｐ３１とＮｃｏＩで該プラスミドを消化しＰＣＲによって作成されたＬｅｕ２及びＰＧＫｐ断片に連結された。Ｅｓｐ３１とＢｇｌＩＩ部位を含有するプライマーを用いてＹＥＰ５１Ｎｃｏからの増殖によって、２ｋｂのＬｅｕ２ＰＣＲ産物を作成した。６６０塩基対のＰＧＫｐ  ＰＣＲ産物は、ＢｇｌＩＩとＮｃｏＩ部位を含有するＰＣＲプライマーを用いて、ｐＰＧＫαｓ（Ｋａｎｇ，  Ｙ．−Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２５８２−２５９０）からの増殖によって作成した。得られたプラスミドは、ｐＬＰＸｔと称する。ｐＬＰＸｔは、ａ因子プレプロリーダーのコード領域をＮｃｏＩ部位に挿入することによって修飾した。該プレプロリーダーは、ＮｃｏＩクローニング部位がリーダーの３’末端に維持され、５’末端に再生されないように挿入された。このように、受容体は、ＮｃｏＩとＸｂａＩによるプラスミドの消化によってクローニングされ得る。得られたプラスミドは、ｐＭｐ１５と称される。
【０３０７】
その中にヒトＡ１アデノシン受容体ｃＤＮＡが挿入されたｐＭＰ１５プラスミドは、ｐ５０９５と表記された。このベクターでは、受容体ｃＤＮＡは、酵母ａ因子プレプロリーダーの３’末端に融合されている。タンパク質の取扱い中に、プレプロペプチド配列は切除されて、成熟した完全長の受容体が作られる。これは、酵母分泌経路を介した受容体のプロセッシング中に起こる。該プラスミドは、Ｌｅｕ選別（すなわち、ロイシンを欠如する培地上での増殖）によって維持される。クローニングされたコード領域の配列を決定し、公表された文献のもの（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｓ４５２３５及びＳ５６１４３）と均等であることが見出された。
【０３０８】
２．酵母株の構築
ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株を作成するために、酵母株ＣＹ７９６７を初発の親株として使用した。ＣＹ７９６７の遺伝子型は以下のとおりである：ＭＡＴα  ｇｐａＤ１１６３  ｇｐａ１（４１）Ｇαｉ３  ｆａｒ１Ｄ１１４４２  ｔｂｔ−１  ＦＵＳ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３Ｄ１１５６  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３
遺伝マーカーを以下にまとめる。
【０３０９】
ＭＡＴａ・・・・・・・・・・・・・・・・・交配型ａ
ｇｐａ１Ｄ１１６３・・・・・・・・内在性酵母Ｇタンパク質ＧＰＡ１が欠失されているｇｐａ（４１）Ｇａｉ３・・・・ｇｐａ１（４１）−Ｇａｉ３が酵母のゲノムに組み込まれた。このキメラＧａタンパク質は、コグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｎ末アミノ酸が欠失された哺乳類のＧタンパク質Ｇａｉ３に融合された内在性酵母ＧａサブユニットＧＰＡ１の最初の４１アミノ酸から構成される。
【０３１０】
ｆａｒ１Ｄ１４４２・・・・・・・・ＦＡＲ１遺伝子（細胞周期の停止に必要とされる）が欠失している（これにより、フェロモン応答経路が活性化したときに細胞周期の停止が妨げられる）
ｔｂｔ−１・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・電気穿孔法による高形質転換効率を有する株ＦＵＳ１−ＨＩＳ３・・・・・・・・・・・・・・ＦＵＳ１プロモーターとＨＩＳ３コード領域との融合物（これにより、フェロモン誘導性のＨＩＳ３遺伝子が作り出される）ｃａｎ１・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・アルギニン／カナビニンパーミアーゼ
ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：ＬＹＳ２・・・ＳＴＥ１４、Ｃ−ファルネシルメチルトランスフェラーゼの遺伝子破壊（これにより、フェロモン経路を介した基礎シグナリングが低下する）
ｓｔｅ３Ｄ１１５６・・・・・・・・・・・・・・・内在性酵母ＳＴＲ、ａ因子フェロモン受容体（ＳＴＥ３）が破壊された
ｌｙｓ２・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２−アミノアジピン酸リダクターゼに欠損、酵母は増殖のためにリシンを必要とする
ｕｒａ３・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼに欠損、酵母は増殖するためにウラシルを必要とする
ｌｅｕ２・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｂ−イソプロピルマレイン酸デヒドロゲナーゼに欠損、酵母は増殖のためにロイシンを必要とする
ｔｒｐ１・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ホスホリボシルアンスラニレートに欠損、酵母は増殖するためにトリプトファンを必要とする
ｈｉｓ３・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・イミダゾールグリセロリン酸デヒドロゲナーゼに欠損、酵母は増殖するためにヒスチジンを必要とする
電気穿孔法によって、二つのプラスミド：プラスミドｐ５０９５（ヒトＡ１アデノシン受容体をコードする；上記）及びＦＵＳ１−β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子のプラスミドであるｐ１５８４をＣＹ７９６７株に形質転換した。プラスミドｐ１５８４は、ｐＲＳ４２６（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１１２２）に由来していた。プラスミドｐＲＳ４２６は、ヌクレオチド２００４〜２０１６にポリリンカー部位を含有している。ＦＵＳ１プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合体を制限部位ＥａｇＩとＸｈｏＩに挿入して、プラスミドｐ１５８４を作成した。ｐ１５８４プラスミドは、Ｔｒｐ選択（すなわち、ロイシンを欠く培地上での増殖）によって維持される。
【０３１１】
ｐ５０９５とｐ１５８４を担持する、ＣＹ１２６６０と称される得られた株は、ヒトＡ１アデノシン受容体を発現している。液体中又は寒天プレート上で該株を増殖させるために、ロイシンとトリプトファンを欠く最少培地を使用した。プレート上での増殖アッセイ（ＦＵＳ１−ＨＩＳ３をアッセイする）を行うために、プレートは、ｐＨ６．８であり、０．５〜２．５ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含有し、ロイシン、トリプトファン、及びヒスチジンを欠如していた。特異性の対照として、全ての実験で、１以上の他の酵母をベースとした７回膜貫通受容体スクリーンとの比較を含めた。
【０３１２】
ヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株の構築
この例では、酵母フェロモン系経路に機能的に組み込まれたヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株の構築が記載されている。
【０３１３】
１．発現ベクターの構築
ヒトＡ２ａアデノシン受容体に対する酵母発現ベクターを構築するために、Ｐｈｉ  Ｍｕｒｐｈｙ（ＮＩＨ）からヒトＡ２ａ受容体のｃＤＮＡを入手した。該クローンを受領して、Ａ２ａ受容体インサートを配列決定し、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号＃Ｓ４６９５０）と同じであることを見出した。ＶＥＮＴポリメラーゼを用いたＰＣＲによって、プラスミドから受容体ｃＤＮＡを切り出し、酵母で構成的ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターによる受容体の発現を駆動するプラスミドｐＬＰＢＸ中にクローニングした。インサート全体の配列をもう一度配列決定し、公表された配列と同じであることを見出した。しかしながら、使用したクローニング戦略のために、該受容体のカルボキシ末端には３つのアミノ酸ＧｌｙＳｅｒＶａｌ隣接して存在していた。
【０３１４】
２．酵母株の構築
ヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株を作成するために、酵母株ＣＹ８３４２を初発の親株として使用した。ＣＹ８３４２の遺伝子型は以下のとおりである：ＭＡＴａ  ｆａｒ１Ｄ１４４２  ｔｂｔ１−１  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ３Ｄ１１５６  ｇｐａＤ１１６３  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｇｐａ１ｐ−ｒＧαＳＥ１０Ｋ（又はｇｐａ１ｐ−ｒＧαＳＤ２２９Ｓ又はｇｐａ１ｐ−ｒＧαＳＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ）。
【０３１５】
Ｇタンパク質の変異を除いては、遺伝的マーカーは、例１に記載されているとおりである。ヒトＡ２ａ受容体発現のためには、内在性酵母Ｇタンパク質ＧＰＡ１が欠失し、哺乳類のＧαＳに置き換えられた酵母株を利用した。３つのラットＧαＳ変異体を利用した。これらの変異株は、それらを、酵母のβγに効率的に結合するタンパク質に転換する１又は２の点変異を含有している。それらは、ＧαＳＥ１０Ｋ（１０位のグルタミン酸がリシンで置き換えられている）、ＧαＳＤ２２９Ｓ（２２９位のアスパラギン酸がセリンで置き換えられている）、及びＧαＳ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ（両点変異を含有している）として同定されている。
【０３１６】
ＣＹ８３４２株（３つの変異ラットＧαＳタンパク質のうちの１つを担持している）を、親ベクターｐＬＰＢＸ（受容体−）又はｐＬＰＢＸ−Ａ２ａ（受容体＋）の何れかで形質転換した。フェロモン応答経路の活性化の規模を評価するために、βガラクトシダーゼのコーディング配列（下記に記載されている）に融合されたＦＵＳ１プロモーターを有するプラスミドを付加した。
【０３１７】
ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株を使用した機能的アッセイ
この例では、ヒトＡ１アデノシン受容体のモジュレーター用の酵母での機能的スクリーニングアッセイの開発が記載されている。
【０３１８】
１．アッセイで使用したリガンド
本アッセイの開発のために、該受容体の天然のアゴニストであるアデノシンと他の合成アゴニスト２つを使用した。サブセットの実験では、約７５ｎＭのＥＣ５０を有すると報告されているアデノシン、及び約５０ｎＭの親和性が報告されている（−）−Ｎ６−（２−フェニルイソプロピル）−アデノシン（ＰＩＡ）を使用した。増殖アッセイでは全て、５’−Ｎ−エチルカルボキサミド（ＮＥＣＡ）を使用した。増殖培地中にアデノシンが存在することによるシグナリングを阻害するために、全てのアッセイにアデノシンデアミナーゼ（４Ｕ／ｍＬ）を加えた。
【０３１９】
２．酵母での生物学的応答
異なるＧタンパク質サブユニットを発現した一連の酵母株の中に、Ａ１受容体発現ベクター（ｐ５０９５、上記）を導入することによって、異種酵母系において機能的に結合するＡ１アデノシン受容体の能力を評価した。これらの形質転換体の大部分は、Ｇαｉ又はＧα０サブタイプのＧαサブユニットを発現していた。さらなるＧαタンパク質も、生じ得る雑多な受容体−Ｇαタンパク質の結合についてテストした。様々な株において、ＳＴＥ１８又はキメラＳＴＥ１８−Ｇγ２構築物が、酵母のゲノム中に組み込まれた。該酵母株は、欠損のあるＨＩＳ３遺伝子とＦＵＳ１−ＨＩＳ３の組み込まれたコピーを有していることにより、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含有し（０．２、０．５、及び１．０ｍＭ）を含有し、ヒスチジンを欠如する選択培地中での選択が可能となる。形質転換体を単離し、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、４Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼを含有し、ヒスチジンを欠如する培地上で単一層を調製した。様々な濃度のリガンド５μＬ（例えば、０、０．１、１．０、及び１０ｍＭのＮＥＣＡ）を適用した。増殖は、２日間モニターした。リガンド依存性の増殖応答は、様々な酵母株においてこのようにテストした。結果は、下表１に要約されている。記号（−）は、リガンド依存性の受容体の活性化が検出されなかったことを示しており、（＋）は、リガンド依存性応答を示している。「ＬＩＲＭＡ」という語は、リガンド非依存性受容体に媒介された活性化（ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を意味している。
【０３２０】
【表３】
0004611524.tif 000033
表３に示されているように、最も強固なシグナリングは、ＧＰＡ１（４１）−Ｇαｉ３キメラを発現している酵母株で起こることが見出された。
【０３２１】
３．ｆｕｓ１−ＬａｃＺアッセイ
フェロモン応答経路の活性化をより完全に特性決定するために、アゴニスト刺激に応じたｆｕｓ１ＬａｃＺを介したβ−ガラクトシダーゼの合成を測定した。βガラクトシダーゼアッセイを行うために、Ｓｔｅ１８−Ｇγ２キメラとＧＰＡ４１−Ｇαｉ３を同時発現する酵母株で発現されたヒトＡ１アデノシン受容体の中期対数培養に、徐々に増加する濃度のリガンドを添加した。形質転換体を単離し、ヒスチジンと４Ｕ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩増殖させた。４Ｕ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼ及びリガンドと５時間インキュベートした後、βガラクトシダーゼの基質としてＣＰＲＧを用いて、βガラクトシダーゼの誘導を測定した。アッセイ当たり５×１０５細胞を使用した。
【０３２２】
ＮＥＣＡ刺激を用いて得られた結果は、１０−８Ｍの濃度のＮＥＣＡで、約２倍のβ−ガラクトシダーゼ活性の刺激が達成されることが示された。さらに、１０−５ＭのＮＥＣＡ濃度で、約１０倍の刺激指標が観察された。
【０３２３】
該アッセイの利用性は、該株に対するアンタゴニストの活性のヴァリデーションによって拡張された。２つの公知のアデノシンアンタゴニストＸＡＣとＤＰＣＰＸが、βガラクトシダーゼアッセイにおける活性に対して、ＮＥＣＡ（５ｍＭ）と拮抗する能力についてテストした。これらのアッセイでは、βガラクトシダーゼの誘導は、基質としてＦＤＧ、及び１．６×１０５細胞／アッセイを使用して測定した。ＸＡＣとＤＰＣＰＸは共に、強力な酵母発現されたＡ１アデノシン受容体として働き、それぞれ、４４ｎＭ及び４９ｎＭのＩＣ５０を有することを示していた。
【０３２４】
この阻害的な効果がＡ１サブタイプに特異的であるかどうかを決定するために、酵母をベースとしたＡ２ａ受容体アッセイ（例４に記載されている）を用いて一連の相補性実験を行った。Ａ２ａ酵母をベースとしたアッセイを用いて得られた結果は、公表された報告と一致して、ＸＡＣが相対的に有効なＡ２ａ受容体アンタゴニストであることを示していた。対照的に、ＤＰＣＰＸは、公表された報告から予測されたように、該受容体では相対的に不活性であった。
【０３２５】
４．放射性リガンドの結合
Ａ１アデノシン受容体アッセイは、受容体の放射性リガンド結合パラメータ−の測定によってさらに特性決定された。ヒトＡ１アデノシン受容体を発現している酵母から調製された膜を使用して、数個のアデノシン受容体参照化合物、ＸＡＣ、ＤＰＣＰＸ、及びＣＧＳによる［３Ｈ］ＣＰＸの置換結合を分析した。ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母膜を用いた結果は、結合の特異性を調べるために、ヒトＡ２ａアデノシン受容体又はヒトＡ３受容体を発現する酵母膜からのものと比較した。このアッセイを実施するために、０．４ｎＭ［３Ｈ］ＣＰＸ及び徐々に増加する濃度のアデノシン受容体リガンドと共に、５０ｍｇの膜をインキュベートした。インキュベーションは、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５％  ＢＳＡ、及び２Ｕ／ｍＬ  アデノシンデアミナーゼ中において、室温で６０分間行った。結合は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えた氷冷した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加した後、Ｐａｃｋａｒｄ ９６ウェル採集器を用いて、予め０．５％のポリエチエンイミンに浸したＧＦ／Ｂフィルター上で迅速に濾過することによって終結させた。データは、Ｐｒｉｓｍ２．０１ソフトウェアを用いた非線形最少二乗曲線フィッティング操作によって分析した。この実験で得られたＩＣ５０値は、下表４に要約されている。
【０３２６】
【表４】
0004611524.tif 000034
これらのデータは、参照化合物が、文献に報告されたものと一致する親和性を有することを示している。該データは、さらに、酵母をベースとするアッセイが、受容体のサブタイプ特異性を識別するのに十分な感度であることを示している。
【０３２７】
ヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現している酵母株を用いた機能的アッセイ
この例では、ヒトＡ１アデノシン受容体のモジュレーター用の酵母における機能的スクリーニングアッセイの開発が記載されている。
【０３２８】
１．アッセイで使用したリガンド
酵母の中で機能的に発現されたヒトＡ２ａ受容体の研究には、天然のリガンドアデノシンと、他の完全に特性決定された市販のリガンドを使用した。このアッセイの確立では、３つのリガンドが使用された。それらには、
リガンド 報告されたＫｉ 機能
アデノシン                                ５００ｎＭ          アゴニスト
５’−Ｎ−エチルカルボキサミド          １０〜１５ｎＭ        アゴニスト
アデノシン    （ＮＥＣＡ）
（−）−Ｎ６−（２−フェニルイソ      １００〜１２５ｎＭ      アゴニスト
プロピル）−アデノシン（ＰＩＡ）
が含まれる。
【０３２９】
増殖培地中のアデノシンの存在によるシグナリングを阻害するために、全てのアッセイにはアデノシンデアミナーゼ（４Ｕ／ｍＬ）を添加した。
【０３３０】
２．酵母での生物学的応答
Ａ２ａ受容体アゴニストが、Ａ２ａ受容体発現プラスミドで形質転換され、ＧαＳＥ１０Ｋ、ＧαＳＤ２２９Ｓ、又はＧαＳＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓの何れかを発現している酵母中のフェロモン応答経路を刺激する能力についてテストされた。受容体依存性の態様で、フェロモン応答経路を刺激するリガンドの能力は、酵母の表現型の変化によって示された。受容体の活性化は、ヒスチジンの栄養素要求性からヒスチジン原栄養性へと表現型を修正した（ｆｕｓ１−ＨＩＳ３の活性化）。
【０３３１】
３つの独立していない形質転換体を単離し、ヒスチジンの存在下で一晩増殖させた。ヒスチジンを除去するために細胞を洗浄し、２×１０６細胞／ｍＬになるように希釈した。５μＬの各形質転換体を、４Ｕ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼの不存在下、又は存在下で、（ヒスチジンを含む）非選択培地、選択培地（１ｍＭ  ＡＴ）上に滴下した。３０℃で２４時間プレートを増殖させた。ヒスチジン存在下では、受容体＋（Ｒ＋）と受容体−（Ｒ−）株は、ともに増殖することができた。しかし、ヒスチジンの不存在下では、Ｒ＋細胞のみが増殖した。これらのプレートにはリガントが全く添加されなかったので、この結果に対しては二つの説明が可能であった。１つの可能な解釈としては、受容体を有する酵母は、リガンド非依存性受容体に媒介された活性化（ＬＩＲＭＡ）により増殖に有利であるということであった。あるいは、該酵母は、リガンドであるアデノシンを合成することができたのかもしれない。これら２つの可能性を区別するために、増殖している酵母とプレートに、リガンドを分解する酵素、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を加えた。アデノシンデアミナーゼの存在下では、Ｒ＋細胞は、もはや、ヒスチジンの不存在下において増殖することができず、該酵母が実際にリガンドを合成していたことを示している。
【０３３２】
この解釈は、液体中でのＡ２ａ増殖アッセイによって確認された。この実験では、Ｒ＋酵母（Ａ２ａ受容体を発現しているＧαＳＥ１０Ｋ株）が、アデノシンデアミナーゼ（４Ｕ／ｍＬ）の存在下又は不存在下において、３つの密度（１×１０６細胞／ｍＬ；３×１０５細胞／ｍＬ；又は１×１０５細胞／ｍＬ）で播種された。アッセイのストリンジェンシーは、ＨＩＳ３遺伝子のタンパク質産物であるイミダゾールグリセロールＰ−デヒドラターゼの拮抗的アンタゴニストである３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（ＡＴ）の濃度が増加するにつれて（０、０．１、０．２、又は０．４ｍＭ）増強された。３−アミノ−１，２，４−トリアゾールの存在下では、酵母は、より不活発に増殖した。しかしながら、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールの不存在下では、アデノシンデアミナーゼは殆ど効果を有さなかった。このため、アデノシンデアミナーゼ自体は、フェロモン応答経路に対して直接的な効果を持たなかった。
【０３３３】
増殖を測定し、高処理量スクリーニングのために小型化することができる代替的なアプローチは、Ａ２ａ受容体リガンドのスポットアッセイである。Ａ２ａ受容体（Ａ２ａＲ＋）を発現している、又は受容体を欠いている（Ｒ−）ＧαＳＥ１０Ｋ株を、ヒスチジン及び４Ｕ／ｍＬアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩増殖した。ヒスチジンを除去するために細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬになるようになるように希釈した。４Ｕ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼ、及び０．５又は１．０ｍＭの３−アミノー１，２，４−トリアゾール（ＡＴ）を含有する選択的プレート上に
１×１０６細胞／ｍＬを広げて、１時間乾燥させた。５μＬの以下の試薬：１０ｍＭ  アデノシン、３８．７ｍＭ  ヒスチジン、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、１０ｍＭ  ＰＩＡ、又は１０ｍＭ  ＮＥＣＡを単一層にアプライした。３０℃で２４時間細胞を増殖した。結果は、受容体を持たない細胞は、ヒスチジンが培地に添加されたときだけ増殖できることを示した。対照的に、Ｒ＋細胞は、Ａ２ａ受容体リガンドＰＩＡとＮＥＣＡが滴下されている領域中だけで増殖した。プレートは、アデノシンデアミナーゼを含有していたので、アデノシンが滴下されたところでの増殖の欠如は、アデノシンデアミナーゼが活性であることを確認した。
【０３３４】
３．ｆｕｓ１ ＬａｃＺアッセイ
酵母の交配経路の活性化を定量するために、ｆｕｓ１ＬａｃＺを介したβガラクトシダーゼの合成を測定した。ＧαＳＥ１０Ｋ、ＧαＳＤ２２９Ｓ、及びＧαＳ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓを発現している酵母株は、ヒトＡ２ａ受容体をコードするプラスミド（Ｒ＋）又は受容体を欠如するプラスミド（Ｒ−）で形質転換された。形質転換体を単離し、ヒスチジンと４Ｕ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩増殖させた。１×１０７細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、徐々に増加する濃度のＮＥＣＡに４時間接触させた後、細胞中のβガラクトシダーゼ活性を測定した。結果は、Ｒ−株では、実質的にβガラクトシダーゼ活性が全く検出されなかったのに対して、ＧαＳＥ１０Ｋ、ＧαＳＤ２２９Ｓ、及びＧαＳ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓを発現している酵母株の何れかを発現しているＲ＋株では、ＮＥＣＡ濃度が増加するにつれて、増加する量のβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、増加したリガンド濃度への暴露に応じて検出されたβ−ガラクトシダーゼのユニットが用量依存的に増加することを示している。この用量依存性は、Ａ２ａ受容体を発現している細胞だけに観察された。さらに、Ａ２ａ受容体に対する最も強力なＧαＳ構築物は、ＧαＳＥ１０Ｋであった。ＧαＳＤ２２９Ｓ構築物は、Ａ２ａ受容体に対して２番目に強力なＧαＳ構築物であったのに対して、ＧαＳＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ構築物は、容易に検出可能な量のβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激したが、ＧαＳＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ構築物は、テストした３つのＧαＳ構築物の中で最も効力が弱かった。同定した本アッセイについてのさらなる記載については、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｅ」と題され、１９９８年６月２日に出願された米国出願第０９／０８８９８５号を参照されたい。この内容は全て、参照文献として本明細書に組み込まれる。
【０３３５】
ヒトアデノシン受容体サブタイプの薬理学的な特性決定
物質と方法
物質  ［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ［シクロペンチル−１，３−ヂプロピルキサンチン，８−［ジプロピル］−２，３−３Ｈ（Ｎ）］（１２０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）；［３Ｈ］−ＣＧＳ２１６８０、［カルボキシエチル−３Ｈ（Ｎ）］（３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び［１２５Ｉ］−ＡＢ−ＭＥＣＡ（［１２５Ｉ］−４−アミノベンジルベンジルー５’−Ｎ−メチルカルボキサミドアデノシン（２，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＲＢＩ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）からＸＡＣ（キサンチン  アミン  コンジェナー）；ＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）；及びＩＢ−ＭＥＣＡ。アデノシンデアミナーゼと完全プロテアーゼインヒビターカクテルタブレットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。ヒトアデノシン２ａ［ＲＢ−ＨＡ２ａ］；アデノシン２ｂ［ＲＢ−ＨＡ２ｂ］、又はアデノシン３［ＲＢ−ＨＡ３］受容体サブタイプを安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞からの膜は、それぞれ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。細胞培養試薬は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から入手した血清以外は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。
【０３３６】
酵母株．サッカロミセス・セレビシアエ  ＣＹ１２６６０株［ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６  ｇｐａ１（４１）−Ｇαｉ３  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１：ｈｉｓ３；ＬＥＵ２  ＰＧＫｐ−Ｍｆα１Ｌｅａｄｅｒ−ｈＡ１Ｒ−ＰＨＯ５ｔｅｒｍ  ２ｍｕ−ｏｒｉｇ  ＲＥＰ３  Ａｍｐｒ］、及びＣＹ８３６２株［ｇｐａ１ｐ−ｒＧαｓＥ１０Ｋ  ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３；ＬＥＵ２  ＰＧＫｐ−ｈＡ２ａＲ  ２ｍｕ−ｏｒｉ  ＲＥＰ３  Ａｍｐｒ］は、上述のように発育させた。
【０３３７】
酵母の培養  形質転換した酵母は、２％グルコースを補充したＬｅｕ−Ｔｒｐ［ＬＴ］培地（ｐＨ５．４）中で増殖させた。膜を調製するために、一晩培養物３０ｍＬから、１〜２×１０６細胞／ｍＬの開始力価で、２５０ｍＬのＬＴ培地に播種し、回転による恒常的な酸素化状態下、３０℃でインキュベートした。増殖から１６時間後、細胞を遠心によって採集し、以下に記載されているように膜を調製した。
【０３３８】
哺乳類組織の培養  １０％ウシ胎児血清と１×ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）中、５００ｍｇ／ｍＬのＧ４１８抗生物質を用いた選択的な圧力下、３７℃、湿気を含んだ５％ＣＯ２雰囲気中で、ヒトアデノシン２ａ受容体サブタイプ（Ｃａｄｕｓクローン＃５）が安定に発現されたＨＥＫ−２９３細胞を増殖させた。
【０３３９】
酵母細胞膜の調製  一晩インキュベートした後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００遠心装置中、２，０００×ｇでの遠心によって、２５０ｍＬの培養物を採集した。氷冷した水で細胞を洗浄し、４℃で遠心し、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（２５ｍＬの緩衝液につきタブレット１個）が補充された１０ｍＬの氷冷した溶解用緩衝液［５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；及び５ｍＭ  ＥＧＴＡ］中に、沈降物を再懸濁した。該懸濁液に、ガラスビーズ（１７ｇ；Ｍｅｓｈ  ４００〜６００；Ｓｉｇｍａ）を添加し、４℃５分間の激しいボルテックス操作によって細胞を破壊した。プロテアーゼインヒビターを加えた３０ｍＬのさらなる溶解用緩衝液でホモジネートを希釈し、３０００×ｇで、５分間遠心した。続いて、３６，０００×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ，タイプＳＳ３４ローター）で４５分間、膜を沈降させた。プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（緩衝液５０ｍＬ当たり１タブレット）を補充した５ｍＬの膜緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ；及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］中に、得られた膜沈降物を再懸濁し、さらなる実験のために−８０℃で保存した。
【０３４０】
哺乳類の細胞膜の調製  ＨＥＫ−２９３細胞膜は、以前記載したように調製した（Ｄｕｚｉｃ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，９８４４−９８５１，１９９２）。簡潔に述べれば、ＰＢＳで細胞を洗浄し、ラバーポリスマンで採集した。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００遠心機中、４℃、２００×ｇで、細胞を沈降させた。５ｍＬ／ディッシュの溶解用緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；５ｍＭ  ＥＧＴＡ；０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオライド；１０ｍｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ；及び１０ｍｇ／ｍＬ  アプロチニン）中に４℃で懸濁物を再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザーでホモゲナイズした。続いて、３６，０００×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ、タイプＳＳ３４ローター）で４５分間、細胞溶解物を遠心し、５ｍＬの膜緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオライド；１０ｍｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ；及び１０ｍｇ／ｍＬ  アプロチニン］の中に沈降物を再懸濁し、さらなる実験のために−８０℃で保存した。
【０３４１】
酵母と哺乳類の膜中に存在する全タンパク質濃度を決定するために、ブラッドフォードの色素結合操作（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９７６））を基礎としたＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを使用した。
【０３４２】
アデノシン１受容体サブタイプ飽和及び拮抗放射性リガンドの結合
ヒトＡ１受容体サブタイプで形質転換した酵母細胞からの膜上での飽和及び拮抗結合は、放射性リガンドとしてアンタゴニスト［３Ｈ］ＤＰＣＰＸを用いて実施した。膜は、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で、結合用緩衝液［１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５％  ＢＳＡ；２Ｕ／ｍＬ  アデノシン  デアミナーゼ、及びプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット１個／５０ｍＬ］を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈した。飽和結合では、徐々に増加する濃度の［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（０．０５〜２５ｎＭ）とともに、最終容量１００μＬの結合用緩衝液の中、２５℃で１時間、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、１０μＭの未標識ＸＡＣの不存在下及び存在下において、膜（５０μｇ／ウェル）をインキュベートした。
【０３４３】
拮抗結合では、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、１０μＭの未標識ＸＡＣ又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（１．０ｎＭ）とともに、最終容量１００ｍＬの結合用緩衝液の中、２５℃で１時間、膜（５０μＬ／ウェル）をインキュベートした。
【０３４４】
アデノシン２ａ受容体サブタイプ拮抗放射性結合
ヒトＡ２ａ受容体サブタイプを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞からの膜上への拮抗結合は、放射性リガンドとしてアゴニスト［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０を用いて実施した。膜は、結合用緩衝液［１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５％  ＢＳＡ；２Ｕ／ｍＬ  アデノシンデアミナーゼ、及びプロテアーゼインヒビターカクテルブレット１個／５０ｍＬを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４］中に、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈した。９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、５０μＭの未標識ＮＥＣＡ又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０（１００ｎＭ）とともに、最終容量１００ｍＬの結合用緩衝液の中で、２５℃で１時間、膜（１０μｇ／ウェル）をインキュベートした。
【０３４５】
アデノシン３受容体拮抗放射性リガンド結合
ヒトＡ３受容体サブタイプを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞から得た膜上での拮抗結合は、放射性リガンドとしてアゴニスト［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡを用いて行った。結合用緩衝液［１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５％  ＢＳＡ；２Ｕ／ｍＬ  アデノシンデアミナーゼ、及びプロテアーゼインヒビターカクテルブレット１個／５０ｍＬを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４］中に、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈した。９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、１０μＭの未標識ＩＢ−ＭＥＣＡ又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡ（０．７５ｎＭ）とともに、最終容量１００μＬの結合用緩衝液の中で、２５℃で１時間、膜（１０μｇ／ウェル）をインキュベートした。
【０３４６】
インキュベーションの終わりに、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２が補充された氷冷した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液を添加することによって、Ａ１、Ａ２ａ、及びＡ３受容体サブタイプ放射性リガンド結合アッセイを停止させた後、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ１９６細胞採集装置（Ｐａｃｋａｒｄ）中において、予め０．５％ポリエチレンイミンに前もって浸したガラス繊維フィルター（９６ウェルＧＦ／Ｂ  ＵｎｉＦｉｌｔｅｒｓ，Ｐａｃｋａｒｄ）上での迅速な濾過を行った。５０μＬ／ウェルのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）で、フィルタープレートを乾燥コートし、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）中でカウントした。アッセイは、３回反復して行った。非特異的な結合は、それぞれ、Ａ１Ｒ、Ａ２ａＲ、及びＡ３Ｒ結合アッセイにおける総結合の５．６±０．５％、１０．８±１．４％、及び１５．１±２．６％であった。
【０３４７】
アデノシン２ｂ受容体サブタイプ拮抗放射性リガンド結合
ヒトＡ２ｂ受容体サブタイプを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞から得た膜上での拮抗結合は、放射性リガンドとしてＡ１受容体アンタゴニスト［３Ｈ］ＤＰＣＰＸを用いて行った。結合用緩衝液［１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１ｍＭ  ベンズアミジン；２Ｕ／ｍＬ  アデノシンデアミナーゼを含有する１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４］中に、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で膜を希釈した。９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、１０μＭの未標識ＸＡＣ又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（１５ｎＭ）とともに、最終容量１００μＬの結合用緩衝液の中、２５℃で１時間、膜（１５μｇ／ウェル）をインキュベートした。
【０３４８】
インキュベーションの終わりに、氷冷した１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）緩衝液を添加することによって、アッセイを停止させた後、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ１９６細胞採集装置（Ｐａｃｋａｒｄ）中において、予め０．５％ポリエチレンイミンに前もって浸したガラス繊維フィルター（９６ウェルＧＦ／Ｃ  ＵｎｉＦｉｌｔｅｒｓ，Ｐａｃｋａｒｄ）上での迅速な濾過を行った。５０μＬ／ウェルのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）で、フィルタープレートを乾燥コートし、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）中でカウントした。アッセイは、３回反復して行った。非特異的な結合は、総結合の１４．３±２．３％であった。
【０３４９】
「３Ｈ」ＤＰＣＰＸ；［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０；［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡの特異的結合は、総結合と非特異的結合との差と定義した。化合物のパーセント阻害は、総結合に対して算出した。拮抗データは、一部位モデルへの反復曲線フィッティングによって分析し、Ｋｉ値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ２．０１ソフトウェアを用いて、ＩＣ５０値（Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｏｆ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２，３０９９−３１０９，１９７３）から算出した。
【０３５０】
結果
ある種の細胞表面受容体の第一次的な機能は、適切なリガンドを認識することである。従って、我々は、酵母に発現されたアデノシン１受容体サブタイプの機能的な完全性を確定するためにリガンド結合の親和性を決定した。ヒトアデノシン１受容体サブタイプ構築物を形質転換したサッカロミセス・セレビシアエから調製した粗膜は、４．０±０．１９ｎＭのＫｄで、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸの特異的な飽和性結合を示した。Ｋｄ及びＢｍａｘ値は、飽和等温式から算出し、データのキャッチャード転換は、単一クラスの結合部位を示した。酵母膜調製物中のアデノシン結合部位の密度は、７１６．８±４３．４ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質と概算された。ヒトＡ１受容体サブタイプで形質転換された組換え酵母細胞の薬理学的なサブタイプ特性は、サブタイプ選択的なアデノシンリガンド（ＸＡＣ、ＤＰＣＰＸ；ＣＧＳ−１５９４３；ＣＤＳ−０４６１４２；ＣＤＳ−０４６１２３；ＮＥＣＡ，（Ｒ）―ＰＩＡ；ＩＢ−ＭＥＣＡ、及びアロキサジン）を用いて調べた。それは、予想されたランクの順番で［３Ｈ］ＤＰＣＰＸと拮抗した。これらの化合物を用いて記録された置換曲線は、全てのリガンドと典型的な急峻さを示し、各リガンドに対するデータは、一部位フィットモデルに適合し得た。曲線から概算された各化合物に対する見かけの解離定数（表５）は、他の採取源から得られた受容体に対して公表された値と一致している。
【０３５１】
【表５】
0004611524.tif 000035
表６から１２は、本発明のデアザプリンの効力と構造活性プロフィールを実証している。表１３と１４は、デアザプリン構造付近の官能性をモジュレートすることによって、ヒトアデノシン受容体部位に対して選択性が達成され得ることを実証している。表１４も、そこに示された化合物がサブｎＭの活性を有しており、表１３の化合物と比較してＡ２ｂ受容体に対する選択性がより高いという驚くべき発見を実証している。
【０３５２】
表６：CDS-046142シリーズの活性：Ｎ6−置換基の効果
【０３５３】
【表６−１】
0004611524.tif 000036
【０３５４】
【表６−２】
0004611524.tif 000037
表７：CDS-046142シリーズの活性：Ｃ2−置換基の効果
【表７】
0004611524.tif 000038
表８：CDS-046142シリーズの活性：ピロール環置換基の効果
【表８】
0004611524.tif 000039
表９：
【表９】
0004611524.tif 000040
表１０：CDS-046123シリーズの活性：Ｎ6−置換基の効果
【０３５５】
【表１０−１】
0004611524.tif 000041
【０３５６】
【表１０−２】
0004611524.tif 000042
表１１：CDS-046123シリーズの活性：Ｎ6−置換基の効果
【０３５７】
【表１１−１】
0004611524.tif 000043
【０３５８】
【表１１−２】
0004611524.tif 000044
表１２：CDS-046123の「レトロ−アミド」類縁体
【表１２】
0004611524.tif 000045
表１３：選択的なアデノシン拮抗剤のプロファイル
【０３５９】
【表１３−１】
0004611524.tif 000046
【０３６０】
【表１３−２】
0004611524.tif 000047
【０３６１】
【表１３−３】
0004611524.tif 000048
【０３６２】
【表１３−４】
0004611524.tif 000049
表１４：選択的なＡ2b拮抗剤のプロファイル
【表１４】
0004611524.tif 000050
本明細書の一部をなす参照文献としての援用
ここで開示した全ての特許、公開された特許出願及び他の参照文献は、明らかに本明細書の一部をなす残照文献として本願に援用する。
【０３６３】
均等物
当業者は、ここに明確に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物に関して、ルーチンな実験を用いるだけで、理解し、確認することができるであろう。そのような均等物は、上記の特許請求の範囲内に包含されるものである。