(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも次の工程：
a) 末端に一本鎖の突出配列を有する二本鎖DNA断片を作製するタイプII制限酵素である少なくとも1つの第１の制限酵素での分析されるべき核酸サンプルの消化により二本鎖DNA断片を作製する工程；
b) 工程a)と同時に、前記DNA断片の末端を、二本鎖オリゴヌクレオチドアダプタに連結する工程であって、
前記アダプタが、センス鎖の5'から3'の方向に：
- 少なくとも6 bpの領域3、
- 切断部位が認識部位の下流に位置するタイプIISまたはFの制限酵素である第２の制限酵素の認識部位を含む領域2、
- 前記DNA断片の末端の突出配列に相補的な領域1、および
- 領域1と領域2との間に位置する少なくとも1つの塩基対であって、前記第１の制限酵素の認識部位中の領域1の相補配列に隣接する塩基対とは異なる塩基対
を含み、
前記アダプタが、アンチセンス鎖の5'末端に共有結合しているリン酸残基をさらに含む工程；
c) 前記アダプタに結合したDNA断片を、適切なプライマの対を用いて増幅する工程；および
d) 前記工程c) で得られた増幅断片を、前記第２の制限酵素を用いて短い断片をつくるように切断する工程
を含むことを特徴とするDNA断片を製造する方法。
【請求項２】
プライマの一方が、その5'末端で適切な標識に結合していることを特徴とする請求項1に記載のDNA断片を製造する方法。
【請求項３】
前記プライマが、それらの3'末端において、単数または複数の検出されるべき配列に特異的ないくつかの塩基を含むことを特徴とする請求項1または2に記載のDNA断片を製造する方法。
【請求項４】
工程c)で増幅される産物の鎖の一方が、その5'末端において適切な標識で保護されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載のDNA断片を製造する方法。
【請求項５】
いずれの適切な手段により、工程d)で得られる短い断片から一本鎖断片を得るさらなる工程e)を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載のDNA断片を製造する方法。
【請求項６】
工程d)で得られる短い断片を精製するさらなる工程e')または工程e)で得られる一本鎖断片を精製する工程f) を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載のDNA断片を製造する方法。
【請求項７】
センス鎖の5'から3'の方向に：
- 少なくとも6 bpの領域3、
- 切断部位が認識部位の下流に位置するタイプIISまたはFの制限酵素の認識部位を含む領域2、
- 分析されるべき核酸サンプルのタイプII制限酵素での消化により作製される二本鎖DNA断片の末端の突出配列に相補的な領域1、および
- 領域1と領域2との間に位置する少なくとも1つの塩基対であって、前記タイプII制限酵素の認識部位中の領域1の相補配列に隣接する塩基対とは異なる塩基対
を含む少なくとも10 bpの二本鎖オリゴヌクレオチドから形成され、
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、アンチセンス鎖の5'末端に共有結合しているリン酸残基をさらに含む
ことを特徴とするアダプタ。
【請求項８】
その配列が、請求項7に規定する二本鎖オリゴヌクレオチドアダプタのセンス鎖の配列、および分析されるべき核酸サンプルのタイプII制限酵素での消化により作製される二本鎖DNA断片の末端の突出配列の塩基がセンス鎖の3'の位置に付加された請求項7に規定する二本鎖オリゴヌクレオチドアダプタのセンス鎖の配列からなる群より選択されることを特徴とするプライマ。
【請求項９】
請求項7に記載の少なくとも1つのアダプタまたは請求項8に記載のプライマを含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA断片を製造する方法および特に核酸のハイブリダイゼーションのためのその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
相補配列を有する核酸分子のハイブリダイゼーションの原理に基づく多くの技術が、生物学の非常に多様な分野において、特に分析されるべきサンプルを用いて核酸(mRNA、DNA)の存在を検出するため、それらの配列内の可能性のある変異型を同定するためまたはその配列を決定するために用いられる。限定しない例としては、ゲノム分析、遺伝子マッピング、遺伝子フィンガープリント(DNAフィンガープリント)の調査によるジェノタイピングおよび種、変種または個体の同定(動物、植物、微生物)、多型の検出(SNPまたは一塩基多型)、表現型の特徴付けに関係する変異または遺伝子の探索およびミニシーケンシングならびにトランスクリプトーム分析、特に遺伝子発現のプロフィールの確立を挙げることができる。
【０００３】
一般に、ハイブリダイゼーションは、二本鎖DNA (ゲノムDNA抽出物またはRNA抽出物から合成されたcDNA)からなるサンプルに対して行なわれる。二本鎖DNAは、1種以上の制限酵素を用いて断片化され、約200〜400 bpの断片が精製され、ハイブリダイゼーション(付着末端)および次いでリガーゼを用いるライゲーション(平滑末端または付着末端)により、末端が該制限酵素の制限部位の配列に相当する二本鎖オリゴヌクレオチド(アダプタ)に共有結合され、そして断片を、上記の制限部位を含みかつその少なくとも一方が5'末端において標識されているオリゴヌクレオチドプライマを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅して、プローブとのハイブリダイゼーションのために充分な量の標識された標的を得る。
【０００４】
1つ以上のアダプタを用いるいくつかの方法が記載されている：Keygeneの名でのEP 0 534 858号、PCT国際出願WO 02/34939号、K. Katoらの名で文献に記載された方法(N.A.R., 1995, 23, 3685〜3690)、米国出願US 2002/072055号、PCT国際出願WO 94/01582号および米国出願US 2003/008292号。
【０００５】
このようにして得られるPCR産物は、適切な支持体(プラスチック、ナイロンメンブレン、ガラス、ゲル、シリコンなど)に固定化された1つ以上のプローブとハイブリダイズする標的を構成するが、各プローブは一本鎖核酸分子からなり、その配列は標的の配列の全体または一部分と相補的である。よって、多くのプローブが付着した小型化された支持体(DNAチップ)は、(標識された)標的断片の特異的プローブとのハイブリダイゼーションからなる何百もの反応を同時に視覚化することを可能にする。
【０００６】
PCR工程を用いない他の方法も記載されている：PCT国際出願WO 00/75368号およびPCT国際出願WO 98/10095号。
【０００７】
これらの方法のいずれも、核酸ハイブリダイゼーション方法の感度、特異性、単純性および迅速性を改善することを可能にするものではない。
【０００８】
多くの適用、特に標的の配列とプローブの配列の間の1塩基の区別に関係する適用(SNP検出)は、短いプローブの使用を必要とする。この場合、PCR産物、すなわち数百塩基対の標的の、10〜20塩基のプローブとのハイブリダイゼーションは、しばしば質に乏しい(低シグナル、偽陰性および偽陽性)が、これは次の理由からである：
【０００９】
- 標的内の二次構造の存在がプローブのハイブリダイゼーション効率を減少させる。これは標的への近づきやすさの減少と、同じプローブとハイブリダイズさせるべき異なる構造を有する多数の断片が存在するのでハイブリダイゼーション条件を最適化するのが不可能であるという事実とによる；および
- 標的配列と類似性(similarity)を有する「非標的」配列との非特異的ハイブリダイゼーションまたはクロスハイブリダイゼーションが偽陽性に導き、これが少量の特異的配列を検出する能力およびこれらの配列を区別する能力を、バックグラウンドノイズの増加により減少させる。
【００１０】
よって、これらの技術の感度(弱いシグナル、偽陰性)と特異性(偽陽性)とを増大させるために多様な改良法が提案されている。
- ハイブリダイゼーション時間の増加(12時間〜18時間程度；Daiら, NAR, 2002, 30 (13), e86；Ramakrishnanら, NAR, 2002, 30, 1〜12；Rodriguezら, Molecular Biotechnology, 1999, 11, 1〜12；Kaneら, NAR, 2000, 28, 4552〜4557)；検出されるべき配列に特異的な良好なハイブリダイゼーションシグナルを得ることを可能にするこのアプローチは、目下の目的である、多数のサンプルの迅速なプロセシング(小型化、並行した実験の運転など)を含むハイスループット分析と矛盾する。
【００１１】
- プローブの、非対称PCR反応により得られる一本鎖PCR産物とのハイブリダイゼーション(Guoら, Genome Research, 2002, 12, 445〜457)；ハイブリダイゼーションシグナルを4〜5倍に増加させることが可能なこの解決法は、二本鎖PCR産物の精製および標識一本鎖PCR断片の増幅のさらなる工程を含む。
- 適切なプログラムを用いる、プローブの配列の長さおよび組成の最適化、二次構造の数を制限しかつプローブハイブリダイゼーション温度を均一にすることによりハイブリダイゼーションの質を向上することを可能にするこの解決法は、標的のサイズおよび構造に関係する交差反応の問題を解決しない。
【００１２】
- 補助オリゴヌクレオチドの使用(Rodriguezら, 上記)、これは、プローブとのハイブリダイゼーションからなる工程の前の、ランダムで多様な短いオリゴヌクレオチド配列との標的のプレハイブリダイゼーションからなり、分析されるべき領域内の標的の二次構造を切断することと標的内の余分な配列の存在によるハイブリダイゼーション収率の低下を制限することとを目的とする。このストラテジは高価であり効率的ではない。なぜなら、末端に付加されたオリゴヌクレオチドがプローブと競合してハイブリダイゼーションシグナルを減少させるからである。
【００１３】
以上のことから、実際の必要性により適した、特に迅速で感度がよく、特異的でかつ実行が単純な核酸ハイブリダイゼーションの方法を提供する必要性が実際に存在することがわかる。DNAチップのタイプの支持体上の多数のサンプルを同時に分析することを可能にするこのような方法は、用いる技術に関わらず、ゲノミクスおよびプロテオミクスの分野における上記の適用の全てに非常に適するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この理由から、本発明者らは短いDNA断片を得ること、ひいては核酸分子(DNA、RNA)の迅速で効率的で特異的なハイブリダイゼーションを得ることを有利に可能にするDNA断片を製造する方法を開発した。該方法は、ヌクレオチドプローブ、特にオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし得る標的DNAを製造することと、標的核酸(DNA、RNA)とハイブリダイズし得るDNAプローブ、特にDNAチップを製造することとの両方に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
よって、本発明の主題は、少なくとも次の工程：
a) 分析されるべき核酸のサンプルから二本鎖DNA断片を作製する工程；
b) 該DNA断片の末端を、制限酵素の認識部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアダプタ(アダプタAA')に連結する工程(該制限酵素の切断部位は該認識部位の下流に位置する)；
c) 該アダプタに結合した断片を、適切なプライマの対であって少なくとも一方がその5'末端で任意に標識されていてもよいプライマの対を用いて増幅する工程；および
d) それらの末端の一方に近い該DNA断片を、該制限酵素を用いて短い断片をつくるように切断する工程
を含むことを特徴とするDNA断片を製造する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の目的のために、「短い断片」の用語は、100塩基または100塩基対未満、好ましくは約20〜50塩基または塩基対の断片を意味することを意図する。
【００１７】
本発明によるDNA断片を製造する方法は、短い断片、すなわちオリゴヌクレオチドプローブの長さと同等の長さの断片を得ることを有利に可能にする。このような短い断片の、ハイブリダイゼーション技術における標的またはプローブとしての使用は、従来技術のハイブリダイゼーション技術に比べて、次の利点を有する。
【００１８】
・感度および特異性
ハイブリダイゼーションの感度および特異性は：
- 「非標的配列」の排除による、クロスハイブリダイゼーション反応および偽陽性の減少、
- DNAの二次構造の減少によるハイブリダイゼーションシグナルの増大、
- ハイブリダイゼーション条件(温度)の整合化、
- DNAの純度(酵素、バッファーおよび残存する長いDNA断片の除去)
により増大する。
【００１９】
・単純性
DNA断片(標的またはプローブ)の製造は、実行が簡単な工程(酵素消化、ライゲーションおよびPCR増幅)を含む。さらに、DNA (標的またはプローブ)の最適化により、良好な質(偽陽性なし、バックグラウンドノイズがほとんどないなど)のハイブリダイゼーションを得ることができ、よって必要なコントロールの数を最少限にし、結果としてチップの複雑性を減少することができる。
・迅速性
ハイブリダイゼーション時間は有意に減少され、従来技術の方法における12〜18時間の代わりに、1時間未満(約15〜20分)である。
【００２０】
・比較的低コスト
本発明によるDNAの製造方法は、補助のオリゴヌクレオチドの使用に比べて、比較的安価である。
さらに、チップの複雑性の減少により、チップのコストを減少することが可能になる。
【００２１】
これらの種々の利点により、本発明によるDNA断片を製造する方法は、特に：
- 用いるハイブリダイゼーション技法がどんなものであっても、ひいては想定される適用がどんなものであっても(ミニシーケンシング、ジェノタイピング、SNPによる多型の探索、遺伝子発現プロフィールの確立)、DNAチップ上の多数の標的DNAサンプルの迅速な分析、
- 特に、プローブが固定されたDNAチップを製造するための、ゲノムDNAまたはRNAからの、小さくかつ制御されたサイズのプローブの製造
に特に適する。
【００２２】
本発明の方法によると、工程a)およびb)は連続的または同時に行われる。
【００２３】
本発明の方法によると、工程a)の二本鎖DNAは、それら自体で知られる通常の技法により得られる。例えば、分析されるべきサンプルから抽出されるゲノムDNAは、1000 bp未満、200〜400 bp程度の断片を得るように、分析されるべきDNAでの切断の頻度により選択される1種以上のエンドヌクレアーゼ(制限酵素)を用いて無作為に断片化される。RNA (mRNA、微生物からのゲノムRNAなど)は、分析されるべきサンプルから抽出され、逆転写により二本鎖cDNAに変換され、次いでゲノムDNAと同様の手法において断片化される。哺乳動物のDNAを切断するのに用い得るエンドヌクレアーゼのうち、認識部位とDNA切断部位とが組み合わされた制限酵素、例えば限定されないがEcoR I、Dra I、Ssp I、Sac I、BamH I、BbvC I、Hind III、Sph I、Xba IおよびApa IのようなタイプII制限酵素が挙げられる。
【００２４】
本発明の方法によると、工程b)のアダプタは、制限酵素の認識部位(領域2)を含む2つの相補鎖(AおよびA'、図2)から形成される少なくとも6 bpのオリゴヌクレオチドであり、該制限酵素の切断部位は該認識部位の下流に位置する。これらの制限酵素のうち、限定されないが、その認識部位の16ヌクレオチド下流を切断するBpm I、Bsg IおよびBpuE I、その認識部位のそれぞれ11、10、9、20および8ヌクレオチド下流を切断するEci I、BsmF I、Fok I、Mme IおよびMbo IIのようなタイプIISまたはFの制限酵素を挙げることができる。好ましくは、該アダプタは、そのそれぞれの配列が上記で規定する鎖AおよびA'の配列である2つの相補的オリゴヌクレオチドの組み合わせから形成される。上記のアダプタは、上記のDNA断片の末端に、それ自体で知られるいずれの適切な手段、特にT4リガーゼのようなDNAリガーゼを用いることにより結合される。
【００２５】
本発明の方法によると、工程c)における増幅は、アダプタのオリゴヌクレオチドAの配列を含むプライマを用いて行なわれる。例えば、プライマの配列は、オリゴヌクレオチドAの配列または上記で規定するように、工程a)で用いられるエンドヌクレアーゼにより作製された工程a)からの断片の末端の突出配列に対応する塩基が3'の位置に付加されたオリゴヌクレオチドAの配列(プライマB、図3)のいずれかである。
【００２６】
本発明の方法によると、工程d)における二本鎖DNA断片の末端での切断は、特異的ヌクレオチドプローブ、特に検出されるべき配列(情報付与配列(informative sequence))に相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出されるべき配列(情報付与配列)を含み得る短いDNA断片を得ることを可能にする。
【００２７】
本発明による方法の有利な実施形態によると、工程a)およびb)は同時に行われる。
【００２８】
本発明による方法の有利な実施形態によると、該方法は、連結工程b)の前に、1000 bp未満の断片を精製するさらなる工程を含む。該精製は、特にa)で得られる消化産物のアガロースゲル電気泳動による分離、得られる種々の断片に対応するバンドの視覚化、1000 bp未満の断片に対応するゲルのバンドの回収および通常の技術による該二本鎖DNA断片の抽出によるそれ自体で知られているいずれの適切な手段により行なわれる。
【００２９】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、少なくとも6 bpの上記のアダプタ(工程b)は、認識部位(領域2)の上流に、少なくとも6塩基対の領域3を含む。このような領域は、アダプタの伸長(extension)によりハイブリダイゼーションを改良することを可能にする(図2)。領域3の配列は、それ自体で知られているいずれの適切な手段、特にオリゴヌクレオチドの長さ、構造および組成(GCパーセンテージ、二次構造および／または自己対合の不在など)を最適化することを可能にする適切な配列を予測するプログラムを用いることにより選択される。
【００３０】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、該アダプタ(工程b)は、鎖の一方(AまたはA')上で、認識部位(領域2)の下流に、上記で規定するような工程a)で用いられるエンドヌクレアーゼにより作製される工程a)の断片の末端の突出配列に相補的な領域1を含む(図2)。好ましくは、該アダプタは、領域1と領域2との間に位置する少なくとも1つの塩基を含み、該塩基は制限部位中の上記の相補配列に隣接する塩基とは異なる。この塩基は、工程b)におけるアダプタの連結の後に上記の制限部位が再構築されないことを可能にし、それにより該二本鎖DNA断片の末端に連結されたアダプタが切断されることを防止することを可能にする。
【００３１】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、該アダプタ(工程b)は、鎖A'の5'末端に共有結合したリン酸残基を含む。このリン酸残基は、酵素(例えば、T4リガーゼのようなDNAリガーゼ)が該アダプタをホスホジエステル結合を介して二本鎖DNA断片の3'-OH末端に連結させることを可能にする。
【００３２】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、プライマの1つ(工程c)は、その5'末端で核酸ハイブリッド(DNA-DNA、DNA-RNA)を検出するための適切な標識、例えば蛍光体に結合する。
【００３３】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、該プライマ(工程c)は、特にチップが多すぎる数の標的DNA断片で飽和されるのを防止するために、いくつかの断片だけを増幅するように(示差的増幅 (differential amplification))プライマの3'末端において、検出されるべき単数または複数の情報付与配列に特異的ないくつかの塩基を含む。
【００３４】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、工程c)で増幅される産物の鎖の一方が、その5'末端で適切な標識で保護される。つまり、ホスファターゼ、次いで5'エキソヌクレアーゼの作用により、相補鎖を消去することができる。標識された鎖は、標識がエキソヌクレアーゼが鎖に沿って進行することと、それにより該鎖を消化することとを防止するので、酵素により破壊されない。
【００３５】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、該方法は、いずれの適切な手段により、工程d)で得られる短い断片から一本鎖断片を得るさらなる工程e)を含む。
【００３６】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、該方法は、いずれの適切な手段により、工程d)で得られる短い断片を精製するさらなる工程e')または工程e)で得られる一本鎖断片を精製する工程f)を含む。
【００３７】
本発明の方法によると、一本鎖DNAは、それ自体で知られるいずれの適切な手段により、例えばアルカリホスファターゼおよび次いで5'エキソヌクレアーゼの作用によって得られる。
本発明の方法によると、短く任意に一本鎖である断片は、それ自体で知られるいずれの適切な手段、例えば排除クロマトグラフィー、ろ過、エタノールと酢酸アンモニウムまたは酢酸ナトリウムとの混合物を用いる沈殿により精製される。
【００３８】
本発明の主題は、上記で規定する方法により得ることができる短い一本鎖DNA断片でもあり、該断片は、100塩基未満または100塩基対未満の長さでありかつ5'および3'末端において、認識部位から離れて切断する制限酵素のそれぞれ認識部位および切断部位と接する少なくとも1つの情報付与配列を含むことを特徴とする。
【００３９】
本発明によると、情報付与配列または標的配列は、ハイブリダイゼーションのために用いられるプローブにより特異的に検出される分析されるべき核酸のサンプルの配列に対応する。該情報付与配列は、例えば種、変種または個体(動物、植物、微生物)あるいは多型の領域あるいはタンパク質に特異的なcDNAマーカーの検出に有用な遺伝子マーカー、トランスクリプトームの研究および遺伝子発現プロフィールの確立に有用な遺伝子マーカーを表す。
【００４０】
本発明によると、上記の短い一本鎖DNA断片は、該制限酵素の認識部位の上流および／または下流に、上記で規定する領域1および領域3に対応する配列も含む。
【００４１】
本発明の有利な実施形態によると、該短い一本鎖DNA断片は、その5'末端において、DNA-DNAハイブリッドの検出用の適切な標識、例えば蛍光体で標識される。
【００４２】
本発明の別の有利な実施形態によると、該短い一本鎖DNA断片は適切な支持体に固定化される。その上に核酸が固定化され得る支持体はそれら自体で知られている。限定しない例としては、次の材料からつくられるものが挙げられる：プラスチック、ナイロン、ガラス、ゲル(アガロース、アクリルアミドなど)およびシリコン。
好ましくは、該DNA断片はDNAチップタイプの小型化された支持体上に固定化される。
【００４３】
本発明の主題は、上記で規定する短い一本鎖DNA断片を含むことを特徴とするDNAチップでもある。
【００４４】
本発明の主題は、
- 上記で規定する短い一本鎖DNA断片からなるプローブもしくは標的および／または
- 上記で規定する短い一本鎖DNA断片と該断片に相補的な配列の会合(the association of)により形成される短い二本鎖DNA断片からなるプローブ
を用いることを特徴とする核酸をハイブリダイズさせる方法でもある。
【００４５】
本発明の主題は、上記で規定する少なくとも1つのDNA断片(標的またはプローブ)と、該断片に相補的な核酸分子、特にオリゴヌクレオチドプローブとを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション方法を行うためのキットでもある。
【００４６】
本発明の主題は、上記で規定するアダプタの、上記で規定する短い一本鎖DNA断片を製造するための使用でもある。
本発明の主題は、上記で規定するプライマの、上記で規定する短い一本鎖DNA断片を製造するための使用でもある。
【００４７】
本発明の主題は、5'から3'に(図2)：
- 少なくとも6 bpの上記で規定する領域3、
- 切断部位が認識部位の下流に位置する制限酵素の認識部位を含む領域2、
- 上記で規定する工程a)で用いられるエンドヌクレアーゼにより作製される、上記で規定する方法の工程a)の断片の末端の突出配列に相補的な領域1、
- 領域1と領域2との間に位置する少なくとも1つの塩基であって、工程a)において用いられるエンドヌクレアーゼの制限部位中の領域1の相補配列に隣接する塩基とは異なる塩基、および
- 鎖A'の5'末端に共有結合しているリン酸残基
を含む少なくとも10 bpの二本鎖オリゴヌクレオチド(AA')から形成されるアダプタでもある。
【００４８】
本発明の主題は、アダプタのオリゴヌクレオチドAの配列を含むことを特徴とするプライマでもある。好ましくは、該プライマの配列は、オリゴヌクレオチドAの配列および上記で規定する工程a)において用いられるエンドヌクレアーゼにより作製される工程a)の断片の末端の突出配列に対応する塩基が3'の位置に付加されたオリゴヌクレオチドAの配列(プライマB、図3)からなる群より選択される。
【００４９】
本発明の主題は、上記の方法において規定される少なくとも1つのアダプタとプライマの対とを含むことを特徴とする上記で規定される方法を行うためのキットでもある。
【００５０】
上記の配置の他に、本発明は以下の記載から明らかになるその他の配置も含む。以下の記載は、本発明によるDNA断片の製造方法の実行の実施例および核酸の、特にオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイズのためのその使用に言及し、また添付の図面にも言及する。これらの図面において、
- 図1は、本発明によるDNA断片(標的またはプローブ)を製造する方法の原理を説明する；
- 図2は、アダプタ(AA')の一般的な構造を説明する；
【００５１】
- 図3は、本発明によるDNA断片を製造する方法の工程a)〜c)の例を表す；
- 工程a)：二本鎖DNA断片を、部位GAATTCを認識するEcoR Iでの切断により作製する；
- 工程b)：アダプタAA' (16/20 bp)は、それぞれ5'から3'に：10塩基対の配列(領域3：鎖A上で配列5' GGAAGCCTAG 3')、Bpm I酵素の認識部位(領域2：鎖A上で配列5' CTGGAG 3')、ならびにEcoR I部位に相補的な配列および付加的な塩基対、ならびに鎖A'の5'末端にリン酸残基(領域1：鎖A'上に配列5' リン酸-AATTG)を含む。DNAリガーゼは、アダプタを、ホスホジエステル結合を介してEcoR I断片の付着末端に連結させることを可能にする；および
- 工程c)：アダプタに連結された断片は、プライマB (21塩基)を用いてPCRにより増幅され、該プライマBは、その5'末端で蛍光体により標識されている。
【００５２】
- 図4は、本発明による標的DNAの製造方法の工程d)およびe)の例を示す。工程c)で得られる標識された断片を、認識部位の16ヌクレオチド下流(相補鎖の14ヌクレオチド下流)を切断するBpm I酵素を用いてその5'末端で切断して短い断片(32/30 bp)を作製し、これを精製し、次いで標識されていない相補鎖をアルカリホスファターゼおよび5'エキソヌクレアーゼを連続的に用いる消化により除去する。このようにして得られる標識DNA断片は長さ32塩基であり、これらの塩基は、分析される核酸配列に特異的な12塩基の情報付与配列を含む；
【００５３】
- 図5は、Bpm Iでの長い断片lf2およびlf4についての制限地図を示す；
- 図6は、長い断片lf2およびlf4をBpm Iで切断した後に得られる放射性標識された短い断片のポリアクリルアミド(20%)ゲルプロフィールを示す。Bpm I制限酵素との各インキュベーション時間(T) (0、15、30、75、120分および最後のT)について、レーン1はlf2 (157 bp)に対応し、レーン2はlf4 (49 bp)に対応し、レーン3および4はプライマ(17 bp)に対応する；
【００５４】
- 図7は、Bpm IおよびMme Iでの長い断片lf2についての制限地図を示す；
- 図8Aおよび8Bは、5'位置でCy3 (Aの中央のパネル)またはfam (フルオレセインアセトキシメチルエステル(fluorescein acetoxymethyl ester)) (Bの中央のパネル)で標識された長い断片lf2のBpm I での切断の後に得られる断片のプロフィールを示す。AおよびBの上のパネルは、Bpm Iで切断されていない断片lf2のプロフィールに対応する。AおよびBの下のパネルは、Bpm Iで切断されアルカリホスファターゼと5'エキソヌクレアーゼPDE IIで消化された断片lf2のプロフィールに対応する；
【００５５】
- 図9Aおよび9Bは、5'位置でCy3 (Aの中央のパネル)またはfam (Bの中央のパネル)で標識された長い断片lf2の Mme Iでの切断の後に得られる断片のプロフィールを示す。AおよびBの上のパネルは、Mme Iで切断されていない断片lf2のプロフィールに対応する。AおよびBの下のパネルは、Mme Iで切断されアルカリホスファターゼと5'エキソヌクレアーゼPDE IIで消化された断片lf2のプロフィールに対応する；
- 図10は、長い二本鎖標的と比較した短い二本鎖または一本鎖の標的についてのハイブリダイゼーションシグナルの強度の分析を示す。
【実施例】
【００５６】
実施例1：本発明の方法によるDNA断片(標的またはプローブ)の製造
核酸の調製、酵素消化、ライゲーション、PCR増幅およびそれにより得られる断片の精製は、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. Ausubel, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA)に記載されるような標準的なプロトコルに従う通常の技法を用いて行なった。
より具体的には、DNA断片は以下の方法で調製した：
ウシの血液(Bos taurus)からPAXgene Blood DNAキット(参照761133、Qiagen)を製造業者の使用説明に従って用いて、ゲノムDNAを抽出した。
【００５７】
次のアダプタおよびプライマをMWG Biotechにより合成した：
- アダプタ
- 鎖A：5'-GGAAGCCTAGCTGGAGC-3' (配列番号1)
- 鎖A'：5'-P-AATTGCTCCAGCTAGGCTTCC-3' (配列番号2)
- プライマ
B：5'-Cy-GGAAGCCTAGCTGGAGCAATT-3' (配列番号3)。
【００５８】
精製ゲノムDNA (5μg)およびアダプタ(5μg)を37℃で3時間、50 IUのEcoR Iおよび2 IUのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの50 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM ATPおよび1 mg BSA中にインキュベートした。このようにして得られたその末端でアダプタAA'に結合したDNA断片を、PCRによりプライマBを用いて、DNA断片1 ng、プライマ150 ngおよび2 IUのAmpliTaq Gold (登録商標) (Perkin Elmer)を15 mM Tris-HClバッファー、pH 8.0、10 mM KCl、5 mM MgCl2および200μM dNTPs中に含む反応容量50μl中で増幅した。増幅を、サーモサイクラーにおいて、94℃で30秒間の変性工程、続いて60℃で30秒間のハイブリダイゼーション工程および72℃で2分間の伸長工程を含む35サイクルで行った。PCR増幅断片をMinElute PCR Purificationキット(参照LSKG ELO 50、Qiagen)を製造業者の使用説明に従って用いて精製した。
【００５９】
増幅断片を37℃で1時間、2.5 IUのBpm I (NEB)を50 mM Tris-HClバッファー、pH 7.9、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、1 mM DTTおよび100μg/ml BSA中に含む反応混合物40μl中で消化した。
酵素およびバッファーを、ろ過(Microcon YM3、Millipore)により除去し、フィルタ上に保持されたDNAをMicropure-EZキット(Millipore)を用いて溶出させ、次いで短い断片をろ過(Microcon YM 30、Millipore)により精製した。100 bp未満のDNA断片は溶出物に対応し、より大きい断片はフィルタ上に保持された。
【００６０】
次いで、短い断片を37℃で1時間、5 IUのアルカリホスファターゼおよび3 IUの5'エキソヌクレアーゼを500 mM Tris-HCl-1 mM EDTAバッファー、pH 8.5中に含む反応容量40μl中に消化し、90℃で3分間の加熱により反応を停止させた。
このようにして得られた蛍光体で標識された一本鎖標的DNA断片を、単数または複数のヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションのためのその後の使用の観点で保存した。
【００６１】
実施例2：本発明の方法に従ってIISタイプの制限酵素での消化により得られた短い断片の分析
1) その末端の一方にIISタイプの制限酵素の認識部位を含む標識された長い断片の調製
a) PCR増幅
それぞれ配列番号4〜配列番号7の配列を有するlf1、lf2、lf4およびlf5とよばれる長い断片を、次のプライマ対を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅させた：
- lf1
- センスプライマ：5' CGATGAGTGCTGACCGA 3' (配列番号8)
- アンチセンスプライマ：5' GTAGACTGCGATGCG 3' (配列番号9)
- lf2、lf4およびlf5
- センスプライマ：5' CGATGAGTGCTGA 3' (配列番号：10)
- アンチセンスプライマ：5' GTAGACTGCGATGCG 3' (配列番号9)。
【００６２】
Bpm I制限酵素(5'CTGGAG3')またはMme I制限酵素(5'TCCPuAC3')の認識部位を、上記のようにして得られた産物の5'末端に、次のプライマ対を用いる第二のPCR増幅により導入した：
- Bpm I
- センスプライマ：5' CGATGACTGGAGACCGA 3' (配列番号11)
- アンチセンスプライマ：5' GTAGACTGCGATGCG 3' (配列番号9)
- Mme I
- センスプライマ：5' CGATGAGTTCCGACCGA 3' (配列番号12)
- アンチセンスプライマ：5' GTAGACTGCGATGCG 3' (配列番号9)。
【００６３】
b) 標識
a)で得られた修飾された長い断片を、その5'末端においてγ32P-ATPまたはシアニン3 (Cy3)もしくはfamのような蛍光体のいずれかで標識した。
より具体的には、a)で得られたPCR産物(2μl)を80℃での加熱により変性させ、直ちに液体窒素の中へ移し、最終容量50μlのこの酵素についてのバッファー中に、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK, 30 IU)を含む標識混合物1μlおよびATPγ32P 2μlを加えて、標識化を37℃で30分間行う。次いで、放射性標識された産物をG25排除カラムで精製する。
【００６４】
2) Bpm Iでの切断後に得られる放射性標識された短い断片の分析
a) Bpm Iでの切断
上記のようにして精製された放射性標識されたPCR産物をBpm I酵素バッファー(5×、4μl)中に溶解し、次いで80℃での加熱の後に周囲温度にゆっくりと戻すことにより再びハイブリダイズさせる。次いで、16μlのH2Oを加え、最終混合物(20μl)の4μlを消化のために移す。次いで制限酵素(2ユニット、すなわち1μl；New England Biolabs)を0.2μlのウシ血清アルブミン(10 mg/ml)および1μlの酵素バッファーとともに、最終容量10μl中に加える。2μlの一定量の画分を異なる時間(15、30、75および120分)において反応の進行を追跡するために回収する。反応をブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含有するホルムアミド溶液2μlを添加し、次いで混合物を80℃で3分間加熱することにより停止させる。残った2μlの切断産物を以下に記載のようにして消化する。
【００６５】
b) アルカリホスファターゼ(AP)および5'エキソヌクレアーゼ(PDE II)での消化
次いで、Bpm Iでの切断からの残りの産物(2μl)をアルカリホスファターゼ(P5521、Sigma、3.2M硫酸アンモニウムバッファー、pH 7中に1000 U/40μl)で15分間、37℃で処理し、次にPDE II (P9041、Sigma、2Mクエン酸アンモニウムバッファー、pH 5.5中に10-1 U/μl)で30分間、37℃で処理する。このようにして得られる消化産物は、以下、最終時間Tに対応する。
【００６６】
c) 得られた切断産物のポリアクリルアミドゲル分析
図5は、Bpm Iでの長い断片lf2およびlf4についての制限地図を示す。より具体的には、lf2のBpm Iを用いる切断により、次の断片、すなわちPCRにより作製された5'位に位置するBpm Iについての認識部位の下流の切断による28および131塩基対(bp)の断片、Bpm I についての第二の部位(lf2内にのみ存在する内部部位)の下流の切断による115および44 bpの断片、ならびに上記の2つの認識部位の下流の切断による28、85および44 bpの断片がつくられる。lf4のBpm Iでの切断により28および23ヌクレオチドの断片がつくられる。
【００６７】
断片lf2およびlf4のBpm Iでの切断の速度論のポリアクリルアミド(20%)ゲル分析(図6)は、lf2について約131、115、85および45 bpの断片、ならびにlf4について23および28 bpの断片の存在を示し、このことはBpm I酵素を用いる切断が、15分から先で有効であることを示唆する。最終時間Tでのシグナルの消失は、アルカリホスファターゼおよび5'エキソヌクレアーゼPDE IIでの消化が有効であることを示唆する。
【００６８】
3) Bpm IまたはMme Iでの切断後に得られる蛍光体で標識された短い断片の分析
Bpm IまたはMme Iでの切断後に得られる蛍光体で標識された短い断片を、ゲル電気泳動によるDNAの分離および二本鎖DNAに特異的なインターカレーティング剤により放射される蛍光の量を測定することによる種々の断片の検出を含むバイオアナライザー(Agilent)を用いて分析する。この技術は、25 bp未満のサイズの二本鎖DNA断片および一本鎖DNA断片の検出ができない。
【００６９】
a) プロトコル
上記のようにして調製した蛍光体(4μl)で標識された修飾断片lf2を37℃で3時間、1μlのバッファー番号3 (10×；New England Biolabs)、4.4μlのH2O、0.2μlのウシ血清アルブミンおよび0.5μlのBpm I (1ユニット；New England Biolabs)を含む反応混合物10μl中でインキュベートする。切断産物5μlをバイオアナライザーで分析し、残りの5μlをアルカリホスファターゼ(P5521、Sigma、3.2M硫酸アンモニウムバッファー、pH 7中に1000 U/40μl) 2μlとともに15分間37℃で処理し、続いてPDE II (P9041、Sigma、2Mクエン酸アンモニウムバッファー、pH 5.5中に10-1 U/μl) 0.5μlとともに30分間、37℃でインキュベートする。
【００７０】
代わりに、上記のようにして調製した蛍光体(4μl)で標識された修飾断片lf2を37℃で3時間、1μlのバッファー番号4 (10×；New England Biolabs)、3.5μlのH2O、1μlのSAM (S-アデノシルメチオニン)および0.5μlのMme I (1ユニット) を含む反応混合物10μl中でインキュベートする。この消化産物5μlをバイオアナライザーで分析し、残りの5μlをアルカリホスファターゼおよびPDE IIで上記のようにして処理する。
【００７１】
さらに、制限酵素で切断した後に発生した断片のサイズを同定するように、バイオアナライザーを用いる分析の前に混合物に分子量マーカーを加える。
【００７２】
b) 結果
Bpm IおよびMme Iでの断片lf2についての制限地図を図7に示す。
図8および9は、Cy3 (A)またはfam (B)で5'標識された長い断片lf2をそれぞれBpm IおよびMme Iで切断した後に得られた断片のプロフィールを示す。
【００７３】
コントロール(制限酵素なし；上のパネル)のプロフィールとの比較により、結果は、Bpm Iでの切断が完全である(図8Aおよび8B；中央のパネル)が、Mme Iでの切断は部分的である(図9Aおよび9B；中央のパネル)ことを示す。さらに、Bpm IまたはMme Iで切断されかつアルカリホスファターゼと5'エキソヌクレアーゼで消化されたCy3 (A)またはfam (B)で5'標識された断片のプロフィールはシグナルの減少を示し(図8A、8B、9Aおよび9B；下のパネル)、これらの酵素によりDNAは消化されるがその消化は部分的でしかないことを示唆する。しかしながら、二本鎖DNAに特異的なこの種類の分析は、蛍光体と5'結合していないDNA鎖の完全な消化、蛍光体と5'結合したDNA鎖の保護およびそれらに起因する5'標識された短い一本鎖断片の存在を証明することができない。
【００７４】
実施例3：オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションのための標的DNAの使用
1) 材料および方法
オリゴヌクレオチドプローブ(これらのいくつかは実施例1または2で得られた標的DNA断片に相補的である)が固定化されたDNAチップタイプのガラス支持体(Codelinkスライド)を、それ自体で公知の技法に従って製造した。次いで、該標的DNA (1.5μl)をハイブリダイゼーションバッファー(H7140、Sigma；1.5μl)中で希釈し、10μlをガラス支持体にスライドとカバースリップ(直径12 mmの円形のカバースリップ)との間に沈積させた(deposited)。次いで、ハイブリダイゼーションを湿性のチャンバ内でサーモサイクラー中に以下の条件下で行なった：80℃で3分、次に温度を0.1℃/sの段階で50℃まで上昇させ、最後に温度を50℃で10分間保持する。次いで、ハイブリダイゼーション反応を、ガラススライドを氷上に置くことにより停止する。あるいは、ハイブリダイゼーションを通気性オーブン中で39℃で30分間行う。
【００７５】
次いで、プローブに相補的でない過剰の標的DNA断片を連続的な洗浄により除去する：+4℃において、2×SSC (Sigma、S6639)で20〜30秒間1回洗浄、0.1% SDS を添加した2×SSC (L4522、Sigma)で20〜30秒間1回洗浄、および0.2×SSCで20〜30秒間3回洗浄。
次いでガラススライドを乾燥させ、ハイブリダイゼーションを視覚化し、スキャナ(Genetacモデル、Genomic Solution)を用いて分析した。
【００７６】
2) 結果
実施例2に記載のようにして調製した以下の標的のハイブリダイゼーションを比較した。
- Bpm Iでの切断により作製したCy3で5'標識した短い断片lf2；
- Bpm Iでの切断により作製し、アルカリホスファターゼと5'エキソヌクレアーゼPDE IIで消化したCy3で5'標識した短い断片lf2；
- 切断せず、消化していないCy3で5'標識した断片lf2 (コントロール)。
【００７７】
比較分析の結果(図10および表I)は、長い二本鎖標的についてのハイブリダイゼーションシグナルの強度が短い二本鎖断片の強度に比べて半分であることを示す。ハイブリダイゼーション強度は、短い二本鎖断片が一本鎖断片に変換されるときにさらに増加する。
【００７８】
【表１】
0004755973.tif 000002
【００７９】
上記から明らかなように、本発明はその履行の方法、実施およびここでより明確に記載した適用に限定されるものではない。逆に、本発明は、本発明の状況または範囲を逸脱せずに、当業者が想到し得るその全ての変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図1は、本発明によるDNA断片(標的またはプローブ)を製造する方法の原理を説明する。
【図２】図2は、アダプタ(AA')の一般的な構造を説明する。
【図３】図3は、本発明によるDNA断片を製造する方法の工程a)〜c)の例を表す。
【図４】図4は、本発明による標的DNAの製造方法の工程d)およびe)の例を示す。
【図５】図5は、Bpm Iでの長い断片lf2およびlf4についての制限地図を示す。
【図６】図6は、長い断片lf2およびlf4をBpm Iで切断した後に得られる放射性標識された短い断片のポリアクリルアミド(20%)ゲルプロフィールを示す。
【図７】図7は、Bpm IおよびMme Iでの長い断片lf2についての制限地図を示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、5'位置でCy3 (Aの中央のパネル)またはfam (フルオレセインアセトキシメチルエステル) (Bの中央のパネル)で標識された長い断片lf2のBpm I での切断の後に得られる断片のプロフィールを示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、5'位置でCy3 (Aの中央のパネル)またはfam (Bの中央のパネル)で標識された長い断片lf2の Mme Iでの切断の後に得られる断片のプロフィールを示す。
【図１０】図10は、長い二本鎖標的と比較した短い二本鎖または一本鎖の標的についてのハイブリダイゼーションシグナルの強度の分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004755973.tif 000009
【図８】
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【図９】
0004755973.tif 000011
【図１０】
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【配列表】
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