(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換すべきタンパク質又はペプチドに、
蟻酸と電子吸引性基を有するカルボン酸の酸無水物との混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物、及び蟻酸と電子吸引性基を有するカルボン酸との混合酸無水物から選ばれるホルミル化試薬と、
塩基触媒、酸触媒及びフェノール触媒から選ばれる触媒と
を加えることによって、前記カルボキシル基をアルデヒド基へ変換する、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基へ変換する方法。
【請求項２】
前記蟻酸と電子吸引性基を有するカルボン酸の酸無水物との混合物、及び前記蟻酸と電子吸引性基を有するカルボン酸との混合酸無水物における、電子吸引性基を有するカルボン酸は、トリフルオロ酢酸、オルトスルホ安息香酸、及びペンタフルオロプロピオン酸から選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を、請求の範囲第１項に記載の方法によってアルデヒド基へ変換する工程と、
アルデヒドに対する反応性基を有する求核試薬を前記アルデヒド基と反応させることによって、前記Ｃ末端を修飾する工程とを含む、タンパク質又はペプチドのＣ末端を修飾する方法。
【請求項５】
前記求核試薬を、蟻酸中で反応させる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルデヒドに対する反応性基は、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、及び活性メチレン基から選ばれる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項７】
前記求核試薬において、前記アルデヒドに対する反応性基は、芳香族環、イミダゾリン環、及び／又は蛍光性発色団に置換又は結合している、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項８】
前記求核試薬において、前記アルデヒドに対する反応性基は、電荷を有する基に置換又は結合している、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項９】
前記電荷を有する基が、電荷を有するアミノ酸残基である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
前記求核試薬は、カテコール、ｏ−アミノフェノール、ｏ−アミノチオフェノール、ヒドラジノベンゼン、ヒドラジノピリミジン、ヒドラジノイミダゾリン、システイン、５−ピラゾロン、及びそれらの誘導体から選ばれる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項１１】
前記求核試薬は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２−ヒドラジノ−４−トリフルオロメチルピリミジン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩、システイニルアルギニン、１−メチル−３−フェニル−５−ピラゾロン、及び３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロンから選ばれる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ末端を固定化すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を、請求の範囲第１項に記載の方法によってアルデヒド基へ変換する工程と、
アルデヒドに対する反応性基を有する担体を前記アルデヒド基と反応させることによって、前記タンパク質又はペプチドをＣ末端において前記担体に固定化する工程とを含む、タンパク質又はペプチドを担体に固定化する方法。
【請求項１３】
前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体を、蟻酸中で反応させる、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルデヒドに対する反応性基は、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、及び活性メチレン基から選ばれる、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルデヒドに対する反応性基は、芳香族環、イミダゾリン環、及び／又は蛍光性発色団を介して前記担体に結合している、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルデヒドに対する反応性基は、電荷を有する基を介して前記担体に結合している、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電荷を有する基は、電荷を有するアミノ酸残基である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体は、カテコール、ｏ−アミノフェノール、ｏ−アミノチオフェノール、ヒドラジノベンゼン、ヒドラジノピリミジン、ヒドラジノイミダゾリン、システイン、５−ピラゾロン、及びそれらの誘導体から選ばれる物質が前記担体に固定化されたものである、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２−ヒドラジノ−４−トリフルオロメチルピリミジン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩、システイニルアルギニン、１−メチル−３−フェニル−５−ピラゾロン、及び３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロンから選ばれる物質が前記担体に固定化されたものである、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、アルデヒドに対する反応性基を有する担体を用い、請求の範囲第１２項に記載の方法によってＣ末端の固定化を行う工程と、
タンパク質分解酵素で前記タンパク質又はペプチドを断片化して、前記担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントと、固定化されていないその他のペプチドフラグメントとを得る工程と、
前記担体を洗浄して、前記固定化されていないその他のペプチドフラグメントを除去する工程と、
前記固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントを前記担体から遊離させ、Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離する工程とを含む、タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを単離する方法。
【請求項２１】
前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体が、前記反応性基としてシステイニル基を有し、且つ前記システイニル基が電荷を有する基を介して前記担体に固定化されたものである場合に、
前記Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離する工程において、前記Ｃ末端ペプチドフラグメントを、前記電荷を有する基を含むように単離する、請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
解析すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、請求の範囲第４項に記載の方法によって修飾する工程と、
修飾されたタンパク質又はペプチドを質量分析に供する工程とを含む、タンパク質又はペプチドの解析方法。
【請求項２３】
解析すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、請求の範囲第４項に記載の方法によって修飾する工程と、
前記修飾されたタンパク質又はペプチドを断片化して、修飾されたＣ末端を有するＣ末端ペプチドフラグメントと、その他のペプチドフラグメントとを得る工程と、
前記Ｃ末端ペプチドフラグメントと前記その他のペプチドフラグメントとを、質量分析に供する工程とを含む、タンパク質又はペプチドの解析方法。
【請求項２４】
解析すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、アルデヒドに対する反応性基を有する担体を用い、請求の範囲第１２項に記載の方法によってＣ末端の固定化を行う工程と、
タンパク質分解酵素で前記タンパク質又はペプチドを断片化して、前記担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントと、固定化されていないその他のペプチドフラグメントとを得る工程と、
前記担体を洗浄して、前記固定化されていないその他のペプチドフラグメントを除去する工程と、
前記固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントを前記担体から遊離させ、Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離する工程と、
前記単離されたＣ末端ペプチドフラグメントを質量分析に供する工程とを含む、タンパク質又はペプチドの解析方法。
【請求項２５】
前記アルデヒドに対する反応性基は、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、及びシステイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）から選ばれ、且つ、
前記アルデヒドに対する反応性基は、電荷を有する基を介して前記担体に結合している、請求の範囲第２４項に記載のタンパク質又はペプチドの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質・ペプチド化学分野に関する。より詳しくは、本発明は、タンパク質又はペプチドのＣ末端修飾法、Ｃ末端固定化法、及び解析法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に関する。上記タンパク質又はペプチドのＣ末端修飾法は、タンパク質又はペプチドのＣ末端活性化法に関する。上記タンパク質又はペプチドのＣ末端固定化法は、タンパク質又はペプチドのＣ末端捕捉法に関する。上記タンパク質又はペプチドの解析法は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンパク質・ペプチドのＣ末端を修飾する方法として、以下のような方法が行われている。例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）のような縮合剤やＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）のような活性エステルを用いてタンパク質又はペプチドのＣ末端を活性化し、アミノ基、水酸基、チオール基などの求核基を有する化合物と反応させる方法が行われている。
しかし、これらの試薬を用いた方法では、タンパク質・ペプチドのアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基も求核試薬に対して活性化されるために、Ｃ末端を選択的に修飾することは原理的に不可能であった。それだけでなく、タンパク質・ペプチドの側鎖に存在する上記求核性官能基との分子内又は分子間の反応が非特異的に起るために、上記アミノ酸の側鎖官能基すべてをあらかじめ保護しておかなければならないという非現実的な必要もあった。
一方、タンパク質・ペプチドのＣ末端カルボキシル基と、アスパラギン酸残基やグルタミン酸残基側鎖のカルボキシル基とを化学的に区別するほぼ唯一の方法として、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をオキサゾロンとして活性化する反応が知られている。Ｌａｐｌａｗｙ，Ｍ．Ｔ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｅｎｎｅｒ，Ｇ．Ｗ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．１１，ｐａｇｅｓ  ３９−５１（１９６０）には、この反応をペプチド合成に用いた例が報告されている。
また、Ｄａｋｉｎ，Ｈ．Ｄ．，Ｗｅｓｔ，Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７８，ｐａｇｅｓ  ９１−１０４，７４５−７５６（１９２８）には、アミノ酸のα−カルボキシル基を無水酢酸で処理する場合に、塩基の存在下でオキサゾロンを経由してα−アシルアミノケトンが生じるＤａｋｉｎ−Ｗｅｓｔ反応が報告されている。
特開平１０−９０２２６号公報には、ペプチドのＮ末端やＣ末端に予め化学修飾を行い、プロダクトイオンを発生しやすくして得られるペプチド断片を簡素化し、ＭＳ／ＭＳ分析において修飾末端を含むペプチド断片を高感度に検出し、ペプチド断片の分子量差から直接アミノ酸配列を決定することが行われている。
特開２００５−１３９１６３号公報には、タンパク質又はペプチドのＣ末端においてオキサゾロン環を形成し、求核試薬を用いて開環することによってＣ末端修飾が行われている。オキサゾロン環からＣ末端修飾されたタンパク質又はペプチドを直接得る形態と、より高効率な形態として、オキサゾロン環を一旦活性エステルに変換した後、Ｃ末端修飾されたタンパク質又はペプチドを得る形態とが開示されている。
【非特許文献１】Ｌａｐｌａｗｙ，Ｍ．Ｔ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｅｎｎｅｒ，Ｇ．Ｗ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．１１，ｐａｇｅｓ  ３９−５１（１９６０）
【非特許文献２】Ｄａｋｉｎ，Ｈ．Ｄ．，Ｗｅｓｔ，Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７８，ｐａｇｅｓ  ９１−１０４，７４５−７５６（１９２８）
【特許文献１】特開平１０−９０２２６号公報
【特許文献２】特開２００５−１３９１６３号公報
【発明の開示】
【０００３】
発明の目的
従来のオキサゾロンによるタンパク質又はペプチドのＣ末端活性化／修飾においては、以下のような問題がある。例えば、活性化されたカルボキシル基が加水分解されて反応の効率が低下するという問題が挙げられる。特に、水溶液中に低濃度で存在するタンパク質又はペプチドのＣ末端を選択的に修飾する場合にこの方法は不利である。また、加水分解を防ぐために適当な有機溶媒は、タンパク質又はペプチドの溶解性が低く、かつ多くの副反応が起きるという問題も挙げられる。
また、タンパク質又はペプチドのＣ末端を活性エステルに変換することによるＣ末端修飾／活性化においても、水溶液中での加水分解による反応効率の低下という問題が十分には克服されていない。
さらに、このように活性エステルを経てＣ末端修飾を行う場合、当該Ｃ末端に、アミド（ペプチド）結合又はエステル結合を介して修飾基が導入される。そして、このようにして得られたＣ末端修飾タンパク質又はペプチドからＣ末端ペプチドフラグメントを得るためには、Ｃ末端修飾タンパク質又はペプチドは、タンパク質分解酵素の作用を受ける。ところが、Ｃ末端アミノ酸残基がタンパク質分解酵素の基質特異性と一致した場合、修飾によって生じたアミド（ペプチド）結合又はエステル結合が加水分解される。すなわち、修飾の効果が失われるという重大な問題がある。
そこで本発明の目的は、安価、簡単且つ効率の良いタンパク質又はペプチドのＣ末端修飾法を提供することにある。また本発明の目的は、タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを容易且つ確実に単離する方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、質量分析装置を用いた迅速且つ正確性及び確実性の高いタンパク質・ペプチドのアミノ酸配列決定法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、鋭意検討した結果、ギ酸と酸無水物を含む系でタンパク質又はペプチドを処理する場合、オキサゾロン環形成反応に付随してＣ末端のカルボキシル基が脱炭酸し、代わりに前記のギ酸由来のアルデヒド基が導入される反応を新たに発見した。そして、この反応を用い、導入されたアルデヒド基に対して修飾を行うことによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
１．  下記（１）〜（３）は、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換する方法に関する。
（１）Ｃ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換すべきタンパク質又はペプチドに、
蟻酸と酸無水物との混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物、及びホルミル基を有する酸無水物から選ばれるホルミル化試薬と、
塩基触媒、酸触媒及びフェノール触媒から選ばれる触媒と
を加えることによって、前記カルボキシル基をアルデヒド基へ変換する、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基へ変換する方法。
（２）前記蟻酸と酸無水物との混合物における酸無水物は、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸、及び無水ペンタフルオロプロピオン酸から選ばれる、（１）に記載の方法。
前記酸ハロゲン化物は、蟻酸塩基物、塩化アセチル、臭化アセチル、及び塩化ベンゾイルから選ぶことができる。
（３）前記ホルミル基を有する酸無水物は、蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物及び無水蟻酸から選ばれる、（１）又は（２）に記載の方法。
２．  下記（４）〜（１１）は、タンパク質又はペプチドのＣ末端を修飾する方法に関する。
（４）Ｃ末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法によってアルデヒド基へ変換する工程と、
アルデヒドに対する反応性基を有する求核試薬を前記アルデヒド基と反応させることによって、前記Ｃ末端を修飾する工程とを含む、タンパク質又はペプチドのＣ末端を修飾する方法。
（５）前記求核試薬を、蟻酸中で反応させる、（４）に記載の方法。
（６）前記アルデヒドに対する反応性基は、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、及び活性メチレン基から選ばれる、（４）又は（５）に記載の方法。
前記反応性基は、アルデヒドと反応することによって、当該アルデヒドに由来する炭素と直接的に二重結合や環構造を形成する。これら二重結合や環構造は、ペプチド結合やエステル結合とは異なり、一般のタンパク質分解酵素の作用を受けないものである。
上記二重結合は、アルデヒドに由来する炭素との間で形成されるものであり、Ｃ＝Ｎ  二重結合が挙げられる。このようなＣ＝Ｎ  二重結合を含む構造としては、好ましくは、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾンなどが挙げられる。
上記環構造は、アルデヒドに由来する炭素を環構成元素の一つとして形成されるものであり、一般のタンパク質分解酵素の作用を受けない安定な５員環或いは６員環が挙げられる。このような環構造としては、好ましくは、チアゾリン環などが挙げられる。
（７）前記求核試薬において、前記アルデヒドに対する反応性基は、芳香族環、イミダゾリン環、及び／又は蛍光性発色団に置換又は結合している、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記求核試薬において、前記アルデヒドに対する反応性基は、電荷を有する基に置換又は結合している、（４）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記電荷を有する基が、電荷を有するアミノ酸残基である、（８）に記載の方法。
（１０）前記求核試薬は、カテコール、ｏ−アミノフェノール、ｏ−アミノチオフェノール、ヒドラジノベンゼン、ヒドラジノピリミジン、ヒドラジノイミダゾリン、システイン、５−ピラゾロン、及びそれらの誘導体から選ばれる、（４）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記求核試薬は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２−ヒドラジノ−４−トリフルオロメチルピリミジン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩、システイニルアルギニン、１−メチル−３−フェニル−５−ピラゾロン、及び３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロンから選ばれる、（４）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
３．  下記（１２）〜（１９）は、タンパク質又はペプチドをＣ末端において固定化する方法に関する。
（１２）Ｃ末端を固定化すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法によってアルデヒド基へ変換する工程と、
アルデヒドに対する反応性基を有する担体を前記アルデヒド基と反応させることによって、前記タンパク質又はペプチドをＣ末端において前記担体に固定化する工程とを含む、タンパク質又はペプチドを担体に固定化する方法。
（１３）前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体を、蟻酸中で反応させる、（１２）に記載の方法。
（１４）前記アルデヒドに対する反応性基は、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、及び活性メチレン基から選ばれる、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）前記アルデヒドに対する反応性基は、芳香族環、イミダゾリン環、及び／又は蛍光性発色団を介して前記担体に結合している、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記アルデヒドに対する反応性基は、電荷を有する基を介して前記担体に結合している、（１２）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記電荷を有する基は、電荷を有するアミノ酸残基である、（１６）に記載の方法。
（１８）前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体は、カテコール、ｏ−アミノフェノール、ｏ−アミノチオフェノール、ヒドラジノベンゼン、ヒドラジノピリミジン、ヒドラジノイミダゾリン、システイン、５−ピラゾロン、及びそれらの誘導体から選ばれる物質が前記担体に固定化されたものである、（１２）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２−ヒドラジノ−４−トリフルオロメチルピリミジン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩、システイニルアルギニン、１−メチル−３−フェニル−５−ピラゾロン、及び３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロンから選ばれる物質が前記担体に固定化されたものである、（１２）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
４．  下記（２０）及び（２１）は、タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを選択的に単離する方法に関する。
（２０）Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、アルデヒドに対する反応性基を有する担体を用い、（１２）〜（１９）のいずれかに記載の方法によってＣ末端の固定化を行う工程と、
タンパク質分解酵素で前記タンパク質又はペプチドを断片化して、前記担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントと、固定化されていないその他のペプチドフラグメントとを得る工程と、
前記担体を洗浄して、前記固定化されていないその他のペプチドフラグメントを除去する工程と、
前記固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントを前記担体から遊離させ、Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離する工程とを含む、タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを単離する方法。
（２１）前記アルデヒドに対する反応性基を有する担体が、前記反応性基としてシステイニル基を有し、且つ前記システイニル基が電荷を有する基を介して前記担体に固定化されたものである場合に、
前記Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離する工程において、前記Ｃ末端ペプチドフラグメントを、前記電荷を有する基を含むように単離する、（２０）に記載の方法。
５．  下記（２２）〜（２４）は、タンパク質又はペプチドを解析する方法に関する。
（２２）解析すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、（４）〜（１１）のいずれかに記載の方法によって修飾する工程と、
修飾されたタンパク質又はペプチドを質量分析に供する工程とを含む、タンパク質又はペプチドの解析方法。
（２３）解析すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、（４）〜（１１）のいずれかに記載の方法によって修飾する工程と、
前記修飾されたタンパク質又はペプチドを断片化して、修飾されたＣ末端を有するＣ末端ペプチドフラグメントと、その他のペプチドフラグメントとを得る工程と、
前記Ｃ末端ペプチドフラグメントと前記その他のペプチドフラグメントとを、質量分析に供する工程とを含む、タンパク質又はペプチドの解析方法。
（２４）解析すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端を、（２０）又は（２１）に記載の方法によって単離する工程と、
前記単離されたＣ末端ペプチドフラグメントを質量分析に供する工程とを含む、タンパク質又はペプチドの解析方法。
本発明によると、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を選択的にアルデヒド基に変換することによって、安価、簡単且つ効率の良いタンパク質又はペプチドのＣ末端修飾法を提供することができる。本発明の修飾法では、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を選択的にアルデヒド基に変換することによって、他のタンパク質又はペプチドの側鎖に存在するカルボキシル基と完全に区別してＣ末端カルボキシル基の修飾を行うことが可能になる。前記アルデヒド基はオキサゾロンあるいは活性エステル型のＣ末端活性基に比べて、水溶液中における加水分解による反応効率の低下がなく、タンパク質又はペプチド中の他の官能基との区別が極めて容易であるため、生体試料中のタンパク質やペプチドに対して側鎖の保護などの前処理を施すことなく、Ｃ末端の選択的修飾を可能にするという重要な利点を有する。
また本発明によると、得られるＣ末端修飾タンパク質が、ペプチド結合やエステル結合以外の、一般のタンパク質分解酵素の作用を受けない結合（例えば、Ｃ＝Ｎ  二重結合を含むヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チアゾリジン環など）を介して修飾基が導入されるため、Ｃ末端ペプチドフラグメントを得る過程において、どのようなタンパク質分解酵素を用いても、当該結合を維持することができ、修飾の効果を確実に得ることができる。従って、本発明により、タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを容易且つ確実に単離する方法を提供することができる。さらに本発明によると、質量分析装置を用いた迅速且つ正確性及び確実性の高いタンパク質・ペプチドのアミノ酸配列決定法を提供することができる。本発明により単離されたＣ末端ペプチド断片を、質量分析法によるＣ末端からのアミノ酸配列決定に供することによって、確実性の高いプロテオーム解析が可能になる。さらに、本発明のアミノ酸配列決定法は、既知のタンパク質やペプチドのＮ末端アミノ酸配列決定法と組合せることによって、より確実性の高いプロテオーム解析を可能にするというさらに重要な利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本実施例１において、ホルミル化試薬としてギ酸と無水トリフルオロ酢酸との混合物、求核試薬として２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩を用いて、タンパク質試料（ダイズトリプシンインヒビター）を修飾し、得られた修飾タンパク質の消化物を質量分析した結果である。
図２は、本実施例２において、ホルミル化試薬としてギ酸と無水酢酸との混合物、求核試薬として２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩を用いて、タンパク質試料（ダイズトリプシンインヒビター）を修飾し、得られた修飾タンパク質の消化物を質量分析した結果である。
図３は、本実施例３において、ホルミル化試薬としてギ酸と無水トリフルオロ酢酸との混合物、求核試薬として２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩を用いて、タンパク質試料（ウマ・シトクロムｃ）を修飾し、得られた修飾タンパク質の消化物を質量分析により解析した結果である。
図４は、本実施例４において、ホルミル化試薬としてギ酸と無水トリフルオロ酢酸との混合物、求核剤としてシステイニルアルギニンが固定化された樹脂を用いて、タンパク質試料（ウマ・シトクロムｃ）を修飾し、得られた修飾タンパク質を消化し、得られた消化物から単離したＣ末端ペプチドフラグメントを質量分析した結果である。
図５は、本実施例５において、ホルミル化試薬としてギ酸と無水酢酸との混合物、求核試薬として２−イミダゾリノ−２−ヒドラジン臭化水素酸塩を用いて、ペプチド試料（ロイシンエンケファリン）を修飾し、得られたペプチド混合物を質量分析した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
＜１．タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基からアルデヒド基への変換＞
本発明における第１の方法は、タンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基を選択的に活性化しアルデヒド基へ変換する方法である。この方法では、具体的には、Ｃ末端をアルデヒドに変換すべきタンパク質又はペプチドに、ホルミル化試薬を適当な触媒の存在下で作用させることによって、Ｃ末端がアルデヒド基に変換されたタンパク質又はペプチドを得る。
第１の方法においては、タンパク質又はペプチドのＣ末端は、下記式（Ｉ）に示すような機構によりアルデヒド基へ変換されると考えられる。具体的には、Ｃ末端におけるオキサゾロン環の形成、オキサゾロン環におけるホルミル化、および脱炭酸が起こることによってアルデヒド基へ変換されると考えられる。なお下記式（Ｉ）においては、ホルミル化試薬として蟻酸と無水酢酸との混合物を用いた例を示す。ＮＨＣＨＲ１ＣＯ、ＮＨＣＨＲ２ＣＯ、…、ＮＨＣＨＲｎ−１ＣＯ、ＮＨＣＨＲｎＣＯは、アミノ酸残基を表す。
0004627086.tif 000002
ここでオキサゾロン環は、アスパラギン酸残基やグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基に対しては形成されない。従って、オキサゾロン環形成反応を経由すると考えられる本発明においては、タンパク質又はペプチドのＣ末端を選択的に変換することが可能になる。すなわち、従来のようにタンパク質又はペプチドの側鎖カルボキシル基、及び活性化されたカルボキシル基と反応する可能性があるアミノ基、水酸基等をあらかじめ保護しておく必要がなくなる。なお、Ｎ末端アミノ基は、（Ｉ）式に示すように、ギ酸中酸無水物によってオキサゾロンの生成と同時にホルミル化され、活性化されたカルボキシル基との反応から自動的に保護される。
ホルミル化試薬としては、タンパク質又はペプチドのＣ末端において起こると考えられるオキサゾロン環形成及びオキサゾロン環へのホルミル基の導入を実現する試薬であり、且つオキサゾロン環におけるホルミル化で導入されるホルミル基の供給源を含む試薬が用いられる。具体的には、蟻酸と酸無水物との混合物（蟻酸−酸無水物混合物）、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物（蟻酸−酸ハロゲン化物混合物）、及びホルミル基を有する酸無水物から少なくとも１種が選ばれる。
蟻酸−酸無水物混合物や蟻酸−酸ハロゲン化物混合物を用いる場合、蟻酸と、酸無水物又は酸ハロゲン化物とが反応することによって、ホルミル基を有する酸無水物が生じる。このようにして生じた、ホルミル基を有する酸無水物が、オキサゾロン環形成及びオキサゾロン環へのホルミル基の導入を実現する。
蟻酸−酸無水物混合物における酸無水物としては特に限定されないが、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸、無水ペンタフルオロプロピオン酸などを挙げることができる。また、電子求引性基を有する強酸性カルボン酸の酸無水物であることが好ましい。従って上述した酸無水物の中では、無水トリフルオロ酢酸及び無水ペンタフルオロプロピオン酸から選ばれることが好ましい。これらの酸無水物からは、１種又は複数種を選択することができる。
蟻酸−酸ハロゲン化物混合物における酸ハロゲン化物としては特に限定されないが、例えば、蟻酸塩基物、塩化アセチル、臭化アセチル、塩化ベンゾイルなど挙げることができる。これらの酸ハロゲン化物からは、１種又は複数種を選択することができる。
蟻酸−酸無水物混合物、及び／又は、蟻酸−酸ハロゲン化物混合物を、ホルミル化試薬として用いる場合、蟻酸は、酸無水物及び／又は酸ハロゲン化物に対して、モル基準で等量又は過剰量用いることが好ましい。酸無水物及び／又は酸ハロゲン化物が蟻酸より多く存在すると、酸無水物及び／又は酸ハロゲン化物が直接タンパク質又はペプチドに反応する可能性があるためである。具体的には、蟻酸と酸無水物及び／又は酸ハロゲン化物とは、モル基準で例えば１：１〜４：１、好ましくは２：１の混合比で用いることができる。ホルミル化試薬として、蟻酸−酸無水物混合物、及び／又は、蟻酸−酸ハロゲン化物混合物を用いる場合は、蟻酸以外の有機溶媒を特に用いなくても良い。
上記のホルミル化試薬は、タンパク質又はペプチドに対して過剰量用いる。例えば、ホルミル化試薬中、タンパク質又はペプチドを１ｍＭ以下の濃度で溶解させるほどの大過剰のホルミル化試薬を用いることが好ましい。なお、タンパク質又はペプチドの反応液中濃度が１ｍＭを超えると、タンパク質又はペプチド分子間にアミド結合又はエステル結合の形成に基づく架橋が生じる恐れがある。
一方、ホルミル基を有する酸無水物は、少なくとも蟻酸から誘導される酸無水物であり、蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物及び無水蟻酸が挙げられる。蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物としては、例えば、蟻酸と酢酸との混合酸無水物などが挙げられる。ホルミル化試薬としてホルミル基を有する酸無水物を用いる場合、無溶媒で反応させても良いし、蟻酸を溶媒として用いて反応させても良いし、蟻酸以外の有機溶媒を用いて反応させても良い。
上記のホルミル化試薬は、タンパク質又はペプチドに対して過剰量用いる。例えば、無溶媒で反応を行う場合、ホルミル化試薬中、タンパク質又はペプチドを１ｍＭ以下の濃度で溶解させるほどの大過剰のホルミル化試薬を用いることが好ましい。溶媒を用いて反応させる場合も、ホルミル化試薬と溶媒との混合液において、タンパク質又はペプチドが１ｍＭ以下の濃度で溶解することができ、且つホルミル化試薬がタンパク質又はペプチドに対して過剰に存在していれば良い。なお、タンパク質又はペプチドの反応液中濃度が１ｍＭを超えると、上記と同様、タンパク質又はペプチド分子間にアミド結合又はエステル結合の形成に基づく架橋が生じる恐れがある。
一方、オキサゾロン環形成後のＣ末端アミノ酸残基のＣα−水素の引き抜き、及び引き続くホルミル化と脱炭酸反応とにおいては、触媒が必要である。触媒は、塩基触媒、酸触媒及びフェノール触媒から１種又は複数種が選ばれる。このうち塩基触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの典型的な塩基が挙げられ、これらの塩基から１種又は複数種が選ばれる。また、フェノール触媒は、蟻酸或いはその他のホルミル基含有物質中で塩基触媒として作用すると考えられるが、場合により酸触媒として作用する可能性も考えられる。フェノール触媒の例としては、ペンタフルオロフェノール、ｐ−ニトロフェノールなどが挙げられる。このように本発明では、比較的酸性度の高いフェノール類を用いることも好ましい。
これら触媒は、例えば蟻酸など上記ホルミル化試薬において用いられうる物質や、溶媒中に、適当な濃度で溶解して使用することができる。
触媒の使用量としては、フェノール触媒の場合、モル基準でタンパク質又はペプチドの５０〜１００倍となる大過剰量を用いることによって良好な結果が得られる。フェノール以外の触媒については、当業者が適宜決定することができる。特に、フェノール触媒を塩基触媒と併用する場合、塩基触媒は、モル基準でタンパク質又はペプチドの１〜１０倍となる量を用いることができる。一方、酸触媒は、上記ホルミル化試薬としての蟻酸が溶媒としての量で用いられる場合には特に用いる必要は無いが、蟻酸以外の一般的な有機溶媒が用いられる場合には、酸触媒は、モル基準でタンパク質又はペプチドの１〜１０倍となる量を用いることができる。
タンパク質又はペプチドのＣ末端をアルデヒドに変換するためには、例えば３０℃〜７０℃、１０〜３０分の条件で反応させると良い。
また、アルデヒド基は空気中で酸化されやすいため、特にアルデヒド化されたタンパク質又はペプチドの量が少ない場合などは、反応を長時間行うことや、生成物を空気中に放置することは避けるようにする。たとえば、生じたアルデヒドを空気と接触させないようにするために、反応は窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。さらに、生じたアルデヒドは、次の反応を行うまで上記の不活性ガス雰囲気下に置き、空気との接触を避けるようにすると良い。
上記のタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基へ変換する方法は、以下に説明する第２〜第５の方法に有効に応用することができる。
＜２．タンパク質又はペプチドのＣ末端を修飾する方法＞
本発明における第２の方法は、タンパク質又はペプチドのＣ末端を修飾する方法である。この方法では、上記第１の方法を用いて、Ｃ末端を修飾すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換し、さらに求核試薬をアルデヒド基に作用させることによって、Ｃ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る。
第２の方法においては、上記式（Ｉ）に示したようにＣ末端がアルデヒド基へ変換された後、下記式（ＩＩ）に示すように、求核試薬によりアルデヒド基への求核付加反応が起こり、Ｃ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドが得られる。なお下記式（ＩＩ）においては、求核試薬として一般式Ｘ−ＮＨ２で表されるアミノ基含有化合物を用いた例を示す。ＮＨＣＨＲ１ＣＯ、ＮＨＣＨＲ２ＣＯ、…、ＮＨＣＨＲｎ−１ＣＯ、ＮＨＣＨＲｎＣＯは、アミノ酸残基を表す。
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求核試薬は、アルデヒド基に対する反応性基を有する試薬である。アルデヒドに対する反応性基としては、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、活性メチレン基などの求核基から選ぶことができる。この中でも、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、及びシステイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）から選ばれることが生成物の安定性の観点から好ましい。これらの反応性基は、１種又は複数種を選ぶことができる。  ここで、活性メチレン基は、カルボニル基に隣接したメチレン基、カルボニル基にはさまれたメチレン基、及び不飽和結合にはさまれたメチレン基をいう。
特に、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）などは、アルデヒドと反応することによって、当該アルデヒドに由来する炭素と直接的に二重結合を形成できる点で好ましい。ここでいう二重結合は、アルデヒドに由来する炭素との間で形成されるものであり、Ｃ＝Ｎ  二重結合が挙げられる。このようなＣ＝Ｎ  二重結合を含む構造としては、好ましくは、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾンなどが挙げられる。これら二重結合は、ペプチド結合やエステル結合とは異なり、一般のタンパク質分解酵素の作用を受けないものである。
また、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、及びシステイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）などは、アルデヒドと反応することによって、アルデヒドに由来する炭素と直接的に環構造を形成することができる点で好ましい。ここでいう環構造は、アルデヒドに由来する炭素を環構成元素の一つとして形成されるものであり、一般のタンパク質分解酵素の作用を受けない安定な５員環或いは６員環が挙げられる。このような環構造としては、好ましくは、チアゾリン環などが挙げられる。
求核試薬としては、上記反応性基が適当な構造に結合したものを用いることができる。例えば、上記反応性基は、芳香族環やイミダゾリン環などに置換又は結合していても良い。芳香族環としては、ベンゼン環の他、ピリミジン環などの複素環が挙げられる。また、上記反応性基は、蛍光性発色団に置換又は結合していても良い。
蛍光性発色団としては、７−アミノクマリン、７−ヒドロキシクマリンなどのクマリン誘導体、及び、フルオレセイン、フルオレセインアミンなどのフルオレセイン誘導体などが挙げられる。この場合、例えば、本方法によって修飾されたタンパク質又はペプチドを、適当な方法で断片化し、生じたペプチドフラグメント混合物を蛍光検出器でモニターしながら高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離すると、Ｃ末端ペプチドフラグメントを選択的且つ容易に分離・精製することができる。
上記反応性基は、電荷を有する基に置換又は結合していても良い。電荷を有する基としては、安定な正電荷又は負電荷を有する基であることが好ましく、安定な正電荷としてはグアニジノ基などに由来する電荷が挙げられ、安定な負電荷としてスルホニル基などに由来する電荷が挙げられる。電荷を有する基の具体例としては、上述のような正電荷又は負電荷を有するアミノ酸残基が挙げられる。
これらのうち、ヒドラジノ基を反応性基として有するヒドラジン誘導体や、ヒドロキシルアミノ基を有するヒドロキシアミン誘導体や、セミカルバジド基を有するセミカルバジド誘導体としては、一般的にカルボニル試薬として知られるものなどを、特に限定することなく用いることができる。ヒドラジン誘導体、ヒドロキシアミン誘導体、及びセミカルバジド誘導体は、アルデヒド基と反応することによって、それぞれ化学的に安定なヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾンを生じる。
具体的には、求核試薬は、カテコール、ｏ−アミノフェノール、ｏ−アミノチオフェノール、ヒドラジノベンゼン、ヒドラジノピリミジン、ヒドラジノイミダゾリン、システイン、５−ピラゾロン、及びそれらの誘導体から選ぶことができる。
さらに具体的には、カテコールの誘導体として、３，４−ジヒドロキシ安息香酸などが挙げられる。ヒドラジノピリミジン誘導体としては、２−ヒドラジノ−４−トリフルオロメチルピリミジンなどが挙げられる。ヒドラジノイミダゾリン誘導体としては、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩などが挙げられる。システインの誘導体としては、システイニルアルギニンなどが挙げられる。５−ピラゾロンの誘導体としては、１−メチル−３−フェニル−５−ピラゾロン、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロンなどが挙げられる。
特に、求核試薬が電荷を有する基を有する形態は、後述の第５の方法（タンパク質又はペプチドの解析方法）において有効である。すなわち、修飾されたタンパク質ペプチドをさらに断片化し、修飾されたＣ末端を有するＣ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとの混合物を得ると、Ｃ末端ペプチドフラグメントの単離を行うことなく直接混合物を質量分析に供することができる。従って、解析の効率を非常に高くすることができる。（このことについては、第５の方法にてさらに述べる。）
求核試薬の使用量としては、タンパク質又はペプチドに対してモル規準で１〜１００倍の量を用いることができる。特に、５０〜１００倍の大過剰量を用いることにより、良好な結果が得られる。用いる求核試薬は比較的低分子量であるので、大過剰用いてもＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて適当な測定法を用いることによって、その影響は抑えることができる。基本的には、タンパク質又はペプチドに対してモル規準で５０倍未満、例えば１〜１０倍量程度でも反応は進行する。しかしながら、反応時間を１０時間以内に抑えるためにはできるだけ高濃度の求核試薬を用いることが望ましい。
これら求核試薬は、例えば以下の溶媒中に溶解して使用することができる。
求核試薬とＣ末端をアルデヒドに変換したタンパク質又はペプチドとの反応は、例えば、蟻酸、水、及び、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドンなどの有機溶媒から選ばれる溶媒中で行うことができる。水を溶媒として用いた場合、タンパク質又はペプチドを溶解させるために、尿素、塩酸グアニジン、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させても差し支えない。タンパク質又はペプチドの溶媒における濃度としては、例えば０．１ｍＭ〜１ｍＭ程度の範囲とすると良い。ただし、溶媒中タンパク質又はペプチドの溶媒における濃度は、求核試薬の種類によって異なるため、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。
求核試薬とＣ末端をアルデヒドに変換したタンパク質又はペプチドとの反応は、一般的には水溶液中、ｐＨ７付近の中性からｐＨ９程度のアルカリ性条件で進行する。ｐＨの調節は、水を溶媒として反応を行う場合は、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウムなど一般的な塩基を用いて行うことができ、有機溶媒中で反応を行う場合は、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いて行うことができる。この反応は、例えば、２０℃〜５０℃、２時間〜１０時間の条件で行うと良い。
＜３．タンパク質又はペプチドのＣ末端を固定化する方法＞
本発明における第３の方法は、タンパク質またはペプチドをＣ末端において固定化する方法である。この方法においては、上記第１の方法を用いて、Ｃ末端を固定化すべきタンパク質又はペプチドのＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換し、さらにアルデヒドに対する反応性基を有する担体（以下において、求核剤と記載する場合がある。）を求核剤として作用させることによって、Ｃ末端が固定化されたタンパク質又はペプチドを得る。すなわち、第３の方法は、求核試薬の代わりに求核剤、すなわちアルデヒドに対する反応性基を有する担体を用いることを除いては、上記の第２の方法と同様である。
担体としては、不溶性の固体担体であれば特に限定されない。ここで、不溶性とは、担体が供される環境（例えばアルデヒド化されたタンパク質又はペプチドと求核剤との反応における環境）において不溶性であるという意味である。このような担体の具体例としては、合成樹脂やガラスビーズなどが挙げられる。
アルデヒドに対する反応性基としては、上記第２の方法において述べたものと同様であり、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、活性メチレン基などの求核基から選ぶことができる。これらの反応性基は、１種又は複数種を選ぶことができる。
求核剤としては、上記反応性基を有している担体であれば特に限定されない。反応性基は、担体に直接結合していても良いし、適当な構造を介して間接的に結合していても良い。例えば、上記反応性基は、芳香族環やイミダゾリン環などを介して担体に結合していても良い。芳香族環としては、ベンゼン環の他、ピリミジン環などの複素環が挙げられる。また、上記反応性基は、蛍光性発色団を介して担体に結合していても良い。蛍光性発色団としては、７−アミノクマリン、７−ヒドロキシクマリンなどのクマリン誘導体、及び、フルオレセイン、フルオレセインアミンなどのフルオレセイン誘導体などが挙げられる。
上記反応性基は、電荷を有する基を介して担体に結合していても良い。電荷を有する基としては、安定な正電荷又は負電荷を有する基であることが好ましく、安定な正電荷としてはグアニジノ基などが挙げられ、安定な負電荷としてスルホニル基などが挙げられる。電荷を有する基の具体例としては、上述のような正電荷又は負電荷を有するアミノ酸残基が挙げられる。これらの場合において、反応性基は、上記介在構造に置換又は結合することによって、介在構造を介して間接的に担体に結合している。
これらのうち、ヒドラジノ基を反応性基として有するヒドラジン誘導体や、ヒドロキシルアミノ基を有するヒドロキシアミン誘導体や、セミカルバジド基を有するセミカルバジド誘導体が担体に結合したものを求核剤として用いる場合、それら誘導体としては、一般的にカルボニル試薬として知られるものなどが挙げられる。ここで、ヒドラジン誘導体、ヒドロキシアミン誘導体、及びセミカルバジド誘導体は、アルデヒド基と反応することによって、それぞれ化学的に安定なヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾンを生じる。
具体的には、求核剤としては、カテコール、ｏ−アミノフェノール、ｏ−アミノチオフェノール、ヒドラジノベンゼン、ヒドラジノピリミジン、ヒドラジノイミダゾリン、システイン、５−ピラゾロン、及びそれらの誘導体から選ばれる物質が担体に固定化されたものを用いることができる。
さらに具体的には、カテコールの誘導体として３，４−ジヒドロキシ安息香酸などや、ヒドラジノピリミジン誘導体として２−ヒドラジノ−４−トリフルオロメチルピリミジンなどや、ヒドラジノイミダゾリンとして２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩などが担体に固定化されたものを求核剤として用いることができる。また、システインの誘導体としてシステイニルアルギニンなどが担体に固定化されたものを求核剤として用いることができる。さらに、５−ピラゾロンの誘導体としては、１−メチル−３−フェニル−５−ピラゾロン、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロンなどが担体に固定化されたものを求核剤として用いることができる。
特に、求核剤がアルデヒド基に対する反応性基としてシステイニル基を有する形態は、後述の第４の方法（タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを単離する方法）において有効である。すなわち、固定化されたタンパク質ペプチドをさらに断片化し、固定化されたＣ末端を有するＣ末端ペプチドフラグメントを単離し、そのＣ末端ペプチドフラグメントを担体から遊離する際に、固定化の際に用いた求核剤における介在構造（すなわち求核剤において担体と反応性基の間に介在していた構造）がＣ末端ペプチドフラグメントに保持された状態で遊離することができる。従って、タンパク質又はペプチドを、該介在構造の物性等を利用して解析する場合に大変有効である。（このことは、第４の方法にてさらに述べる。）
また、求核剤が、さらに介在構造として電荷を有する構造を有する形態は、後述の第５の方法（タンパク質又はペプチドの解析方法）において有効である。すなわち、上述のように、Ｃ末端ペプチドフラグメントが介在構造すなわち電荷を有する構造を保持した状態で遊離するため、質量分析において分子イオンの発生及び分解イオンの発生が容易になる。従って、質量分析によるタンパク質又はペプチドの解析の正確性及び信頼性を非常に高くすることができる。（このことは、第５の方法にてさらに述べる。）
求核剤の使用量としては、反応性基がタンパク質又はペプチドに対してモル規準で１〜１００倍となる量を用いることができる。特に、５０〜１００倍となるような大過剰量を用いることにより、良好な結果が得られる。基本的には、反応性基がタンパク質又はペプチドに対してモル規準で５０倍未満、例えば１〜１０倍となる程度の量でも反応は進行する。しかしながら、反応時間を１０時間以内に抑えるためにはできるだけ高濃度の求核剤を用いることが望ましい。
求核剤とＣ末端をアルデヒドに変換したタンパク質又はペプチドとの反応は、例えば、蟻酸、水、及び、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドンなどの有機溶媒から選ばれる溶媒中で行うことができる。水を溶媒として用いた場合、タンパク質又はペプチドを溶解させるために、尿素、塩酸グアニジン、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させても差し支えない。タンパク質又はペプチドの溶媒における濃度としては、例えば０．１ｍＭ〜１ｍＭ程度の範囲とすると良い。ただし、溶媒中タンパク質又はペプチドの溶媒における濃度は、求核剤の種類によって異なるため、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。
求核剤とＣ末端をアルデヒドに変換したタンパク質又はペプチドとの反応は、一般的には水溶液中、ｐＨ７付近の中性からｐＨ９程度のアルカリ性条件で進行する。ｐＨの調節は、水を溶媒として反応を行う場合は、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウムなど一般的な塩基を用いて行うことができ、有機溶媒中で反応を行う場合は、ピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いて行うことができる。この反応は、例えば、２０℃〜５０℃、２時間〜１０時間の条件で行うと良い。
＜４．タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを単離する方法＞
本発明における第４の方法は、タンパク質又はペプチドのＣ末端ペプチドフラグメントを単離する方法である。この方法においては、上記第３の方法を用いて、Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離すべきタンパク質又はペプチドを、そのＣ末端において担体に固定化する工程と、固定化されたタンパク質又はペプチドを断片化する工程と、担体を洗浄する工程と、Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離する工程とを含む。この方法においては、下記式（ＩＩＩ）に示すような機構によりＣ末端ペプチドフラグメントが単離される。なお下記式（ＩＩＩ）においては、求核剤として、システイニル基がアルギニン残基を介して結合した（すなわちシステイニルアルギニンが固定化された）樹脂（ｒｅｓｉｎ）を用いた例を示す。ＮＨＣＨＲ１ＣＯ、ＮＨＣＨＲ２ＣＯ、…、ＮＨＣＨＲｎ−１ＣＯ、ＮＨＣＨＲｎＣＯは、アミノ酸残基を表す。また、アルギニン残基においては、グアニジノ基がペンタメチルヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｄｆ）基によりスルホアミド基として保護されている。
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固定化工程は、上記第３の方法によって行う。なお、第４の方法においては、固定化の後の段階で行われる工程における条件を考慮し、求核剤に適当な保護を施しておくことができる。例えば、上記式（ＩＩＩ）の例のように、求核剤における介在構造の一部にグアニジノ基を有する場合、グアニジノ基を、ペンタメチルヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｄｆ）基や２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）基、２−メシチレンスルホニル（Ｍｔｓ）基などの保護基で保護することができる。Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）法に基づく固相ペプチド合成用の担体を用いた場合は、Ｆｍｏｃ法に適した保護基として、Ｐｂｆ基やＰｍｃ基などを採用することが好ましい。一方、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）法に基づく固相ペプチド合成用の担体を用いた場合は、Ｂｏｃ法に適した保護基としてＭｔｓ基などを採用することが好ましい。
グアニジノ基の保護は、後述する断片化工程でトリプシン処理する際に、アルギニン残基と担体とのエステル結合が分解されることを防ぐ効果を期待することができる。なお、後述する遊離工程で強酸性条件に供される際、担体からのＣ末端ペプチドフラグメントの遊離と同時に上記の保護基も除去される。
固定化工程においては、特に、システイニルアルギニンが固定化された樹脂を用いた例においては、上記式（ＩＩＩ）に示すように、アルデヒド基とシステイニル基との反応によって、チアゾリン環を形成する。
断片化工程においては、上記第３の方法によって固定化されたタンパク質又はペプチドを、断片化し、担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとを得る。断片化の手法としては、担体とＣ末端との結合が切れない条件であれば、化学的手法及び生化学的手法を問わない。好ましくは、キモトリプシン、トリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｖ８）プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼなどの比較的基質特異性の高いプロテアーゼ類を用いた生化学的手法により、或いは、臭化シアン（ＢｒＣＮ）のような化学試薬を用いた化学的手法により断片化を行うことができる。この点において、本発明では、固定化に用いたＣ末端アルデヒド基に由来する化学構造（すなわち、アルデヒドに由来する炭素との間で直接的に形成された二重結合や環構造）が、プロテアーゼ類の加水分解作用を受けない。当該二重構造や環構造に関しては、上述の第２の方法ですでに述べたとおりである。このため、Ｃ末端をアミド結合又はエステル結合で固定化する場合に比べて、断片化に用いることが可能な酵素は自由に選択できる。すなわち、用いることが可能な手法の選択範囲はより広くなる。従って、可能な断片化の手法としては、上記の例示に限らない。断片化の具体的な条件としては、用いる試薬や酵素により、当業者が適宜決定することができる。
洗浄工程においては、担体を洗浄することによって、担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとの混合物から、その他のペプチドフラグメントが除去され、担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントが残る。担体を洗浄するための洗浄液としては、一般的には酵素消化を行った緩衝液をそのまま用いるだけで十分である。不要なペプチド断片が不溶化したおそれがある場合には緩衝液に適当な界面活性剤を加えても良い。ただし、担体に固定化したタンパク質又はペプチドが遊離するような極端な酸性又はアルカリ性で洗浄することは避けなければならない。
単離工程においては、担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントに対して、化学的手法を行い、担体からＣ末端ペプチドフラグメントを遊離する。このとき、遊離するＣ末端ペプチドフラグメントが、固定化の際に用いた求核剤における介在構造（すなわち求核剤において担体と反応性基の間に介在していた構造）を保持するように、担体と介在構造との間で分解させることが好ましい。このためには、固定化の際に、アルデヒド基と求核剤との反応において化学的に安定な構造を形成するように、求核剤を設計すると良い。また、固定化の際にアルデヒド基と求核剤との反応において形成された構造に作用して不所望な分解が起こらないような遊離条件を当業者が適宜選択すると良い。
特に、上記式（ＩＩＩ）に示すように、固定化においてチアゾリン環を形成させることが好ましい。チアゾリン環は、例えば、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、或いはセミカルバジドと、アルデヒドとによってそれぞれ生成する、ヒドラゾン、オキシム、或いはセミカルバゾン等に比べて、化学的に安定である。従って、たとえば担体からＣ末端ペプチドフラグメントを遊離させる際に、強酸性条件にさらされても、チアゾリン環は分解しない。すなわち、上記式（ＩＩＩ）に示すように、Ｃ末端ペプチドフラグメントが介在構造を保持するように担体から切り離される。
遊離液の組成及び遊離のための反応条件は、担体に結合した反応性基などによって異なるため、用いる求核剤の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、上述のようにチアゾリン環を形成することができる求核剤、すなわち、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＳＨ）−）、又はアミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）を有する担体、システイン、ｏ−アミノチオフェノール、或いはそれらの誘導体が結合した担体などを用いた場合は、トリフルオロ酢酸など強酸を主成分とする強酸性の遊離液を用いることができる。このような遊離液を用いる場合、室温で、３〜５時間、好ましくは４時間程度の条件で遊離を行うことができる。
このように、介在構造を保持するようにＣ末端ペプチドフラグメントを単離することは、介在構造が、タンパク質又はペプチドの解析のために設定されたものである場合に有効である。この場合、タンパク質又はペプチドを、該介在構造の物性等を利用して解析することができる。例えば、介在構造が電荷を有する基である場合、タンパク質又はペプチドを、質量分析によって解析する場合に有効である。これについては、後述の第５の方法において述べる。
一方、固定化に用いたＣ末端アルデヒド基に由来する化学構造が、特にＣ＝Ｎ  二重結合である場合、Ｃ＝Ｎ  二重結合は、ペプチドを構成するアミド結合（ペプチド結合）とは全く異なる化学的条件で開裂させることができる。このため、担体に固定化されたＣ末端ペプチドフラグメントを、Ｃ＝Ｎ  二重結合の開裂によって遊離させた後、生じたアルデヒド基を、再び他の誘導体化に供することも可能である。このとき、Ｃ＝Ｎ  二重結合の開裂のための具体的な化学的条件は、当業者が適宜決定することができる。
＜５．タンパク質又はペプチドの解析方法＞
本発明における第５の方法は、タンパク質又はペプチドを質量分析によって解析する方法である。この方法においては、解析すべきタンパク質又はペプチドは、上記第２の方法によって修飾を行い、得られた修飾物をタンパク質又はペプチドを質量分析用試料としても良いし、上記第４の方法によって単離を行い、得られたペプチドフラグメントを質量分析用試料としても良い。
上記第２の方法において述べたように、求核剤として蛍光発色団を有する基を有する化合物を用いた場合、該方法によって修飾されたタンパク質又はペプチドを、適当な方法で断片化し、生じたペプチドフラグメント混合物を蛍光検出器でモニターしながら高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離することによって、Ｃ末端ペプチドフラグメントを分離・精製することができる。この分離操作を質量分析装置と組み合わせれば、ＬＣ−ＭＳにより、Ｃ末端ペプチド断片の分離と同定とを同時に行うことができる。さらにタンデム型またはイオントラップを装着した質量分析装置とＬＣとを組み合わせれば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ末端ペプチドのアミノ酸配列決定も可能となる。装置としては、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ及びＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いることができる。さらに、Ｃ末端に導入された蛍光発色団の蛍光強度の測定によるタンパク質又はペプチドの定量法にも道が開けると期待される。
一方、上記第２の方法において、求核試薬として電荷を有する基を有する化合物を用いた場合、該方法によって修飾されたタンパク質又はペプチドを、直接質量分析に供し、アミノ酸配列解析を行うことができる。タンパク質又はペプチドは修飾された後、適宜、修飾されたＣ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとに断片化されて良い。断片化の方法としては、上記第４の方法において述べたことと同様、化学的手法及び生化学的手法を問わない。この点においても、本発明では、修飾によって生じるＣ末端アルデヒド基に由来する化学構造（すなわち、アルデヒドに由来する炭素との間で直接的に形成された二重結合や環構造）が、プロテアーゼ類の加水分解作用を受けない。当該二重構造や環構造に関しては、上述の第２の方法ですでに述べたとおりである。このため、Ｃ末端をアミド結合又はエステル結合で固定化する場合に比べて、断片化に用いることが可能な酵素は自由に選択できる。すなわち、用いることが可能な手法の選択範囲はより広くなる。断片化の具体的な条件としては、用いる試薬や酵素により、当業者が適宜決定することができる。断片化されたペプチドフラグメント混合物は、単離等の操作を行うことなく直接質量分析試料とすることができる。
電荷を有する基は、タンパク質又はペプチドの末端に結合することによって、タンパク質又はペプチドが質量分析された際に、分子イオンの生成及び分解イオンの発生を容易にする効果がある。従って、上記ペプチドフラグメント混合物を直接質量分析すると、修飾されたＣ末端ペプチドフラグメントのピークとその他のペプチドフラグメントのピークとを区別することができるため、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによりＣ末端からのアミノ酸配列決定が可能である。装置としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを用いることができる。このように、本方法により解析の効率を非常に高くすることができる。
しかしながら、ペプチドフラグメントのアミノ酸配列、Ｃ末端における荷電状態、或いは使用したホルミル化試薬に起因するアルデヒド基への変換効率の違いなどによって、真のＣ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントのとの区別が容易に付かない場合もある。この場合は、Ｃ末端ペプチドフラグメントを精製すれば良い。そのためには、例えば上記第４の方法によってＣ末端ペプチドフラグメントを単離する方法を行うことが好ましい。
特に、第４の方法において、電荷を有する構造を保持した状態でＣ末端ペプチドフラグメントを単離する形態は、アミノ酸配列解析に有効である。このためには、上記第４の方法において、例えば、反応性基としてシステイニル基を有しさらに介在構造として電荷を有する担体を求核剤として用いる。この形態によって、Ｃ末端ペプチドフラグメントが精製されるとともに、質量分析において分子イオンの発生及び分解イオンの発生が容易になる。このため、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによるアミノ酸配列決定をより容易且つ正確に行うことが可能である。装置としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを用いることができる。このように、本方法により解析の正確性及び信頼性を非常に高くすることができる。
本発明の第５の方法においては、Ｃ末端からのアミノ酸配列決定を行い、正確性及び信頼性の高いプロテオーム解析が可能になる。さらに、この方法は、既知のタンパク質やペプチドのＮ末端アミノ酸配列決定法と組合せられることによって、より正確性及び信頼性の高いプロテオーム解析を可能にする。
【実施例】
【０００６】
以下、求核基を有する化合物として、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン又はシステイニルアルギニン樹脂を用いた例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
［実施例１］
本実施例では、ダイズ・トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）のすべてのシステイン残基を還元及びカルボキシメチル化（ＲＣＭ化）処理して得られたタンパク質ＲＣＭ−ＳＴＩを試料タンパク質とした。試料タンパク質のＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換し、その後、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリンと反応させ、ヒドラゾンを生じさせた。
ＲＣＭ−ＳＴＩ  ３．２ｍｇ（０．１５μｍｏｌ）を、ギ酸と無水トリフルオロ酢酸との等容混合物（ホルミル化試薬）０．５ｍｌに溶解して得られた混合溶液に、ペンタフルオロフェノール３ｍｇ（１５μｍｏｌ、ＳＴＩの１００等量）をギ酸中に含む溶液５０μｌを加えて、６０℃で２０分加熱した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮、乾固した。得られた残留物にさらに少量のトルエンを加え、減圧下での濃縮、乾固を２回繰り返した。得られた残留物を、２−ヒドラジノ−２−イミダゾリン臭化水素酸塩４．５ｍｇ（２５μｍｏｌ）を水中に含む水溶液１５０μｌに溶解させ、トリエチルアミン２μｌで溶液のｐＨが弱アルカリ性となるよう調節した。室温で３時間のカップリング（修飾）反応を行った後、キモトリプシン０．１ｍｇを含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液０．５ｍｌを加え、３７℃で１２時間インキュベートした。
得られた反応生成物は、分離を行うことなくＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（島津製作所製Ａｘｉｍａ  ＣＦＲ  ｐｌｕｓ）で確認を行った。図１に、このとき得られたスペクトルを示す。図１においては、横軸に質量／電荷比（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ）、縦軸にイオンピークの相対強度（％ｉｎｔ．）を示す（以下、全てのマススペクトルにおいて同じ）。図１によると、１３８７．６（ｍ／ｚ）のピークが最大の強度で検出されている。このことから、目的とするＣ末端ペプチド、すなわち、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（Ｆｏｒ）−Ｌｅｕ−Ｈの、２−イミダゾリノ−２−ヒドラゾン誘導体化によるペプチド誘導体（質量の計算値１３８４．７２）のイオン（Ｍ＋）に、水素２原子とプロトンとが付加したイオン［Ｍ＋Ｈ２＋Ｈ］＋が生成していることが確認された。ここで、Ｌｅｕ−ＨはＣ末端のロイシンのカルボキシル基がアルデヒド基に変換されていることを示し、またＬｙｓ（Ｆｏｒ）及びＳｅｒ（Ｆｏｒ）はそれぞれ、リジンの側鎖（ε−アミノ基）及びセリンの側鎖（β−水酸基）がホルミル化されていることを示す。
なお、質量の計算値よりも３Ｄａ質量数が大きいＭＡＬＤＩピーク［Ｍ＋Ｈ２＋Ｈ］＋が観測されたことは、生成物とマトリックスとの相互作用により、ヒドラゾン基の炭素−窒素間二重結合に水素分子が還元的に付加することによる特徴的な現象と推論できる（この現象については、実施例３及び実施例５も参照）。
［実施例２］
本実施例では、ホルミル化試薬としてギ酸と無水酢酸との等容混合物を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。得られたマススペクトルを図２に示す。図２の分析結果によると、Ｃ末端の活性化に前記の例における無水トリフルオロ酢酸の代わりに無水酢酸を用いても、同じ１３８７．７（ｍ／ｚ）のピークが検出された。
実施例１の結果（図１）及び実施例２の結果（図２）は、カルボキシル基からアルデヒド基への変換効率の違いがあるものの、いずれも、目的とするＣ末端ペプチドのＣ末端アミノ酸であるＬｅｕのアルデヒド基から誘導された、２−イミダゾリノ−２−ヒドラゾンのＣ＝Ｎ結合が、キモトリプシンによる加水分解を免れたことも示している。すなわち、当該Ｌｅｕのカルボキシル基をアルデヒド基に変換することなくアミド結合やエステル結合を介して修飾基が導入された場合では、当該アミド結合やエステル結合は、ペプチド鎖の末端にあるため立体的に酵素作用を受けやすく、容易にキモトリプシンによって分解される。このため、目的とするピークの検出に至らないが、これらの結果は、アミド結合やエステル結合を介して修飾基を導入する方法に比べて、アルデヒド基の生成を経由して修飾基を導入する本発明の方法の優位性が示された一例であるといえる。
［実施例３］
本実施例では、試料タンパク質としてウマ・シトクロムｃ（Ｃｙｔ．ｃ）のすべてのシステイン残基を還元及びカルボキシメチル化（ＲＣＭ化）処理して得られたタンパク質ＲＣＭ−Ｃｙｔ．ｃを用いた以外は、実施例１と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。得られたマススペクトルを図３に示す。図３の分析結果によると、７８５．６（ｍ／ｚ）のピークが最大の強度で検出されている。従って、目的とするＣ末端ペプチド、すなわち、Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｈ（配列番号２）の、２−イミダゾリノ−２−ヒドラゾン誘導体化によるペプチド誘導体（質量の計算値７８３．４２）のイオン（Ｍ＋）に、水素分子が付加したイオン［Ｍ＋Ｈ２］＋が生成していることが確認された。ここで、Ｇｌｕ−ＨはＣ末端のグルタミン酸のカルボキシル基がアルデヒド基に変換されていることを示し、Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）はリジンのε−アミノ基がホルミル化されていることを示す。
なお、この場合においても実施例１と同じく、質量の計算値よりも２Ｄａ質量数が大きいＭＡＬＤＩピーク［Ｍ＋Ｈ２］＋が観則されたことは、生成物が、炭素−窒素間二重結合を有するヒドラゾン基を含むことを強く示唆している。
［実施例４］
本実施例では、試料タンパク質としてウマ・シトクロムｃ（Ｃｙｔ．ｃ）のすべてのシステイン残基を還元及びカルボキシメチル化（ＲＣＭ化）処理して得られたタンパク質ＲＣＭ−Ｃｙｔ．ｃを試料タンパク質とした。試料タンパク質のＣ末端カルボキシル基をアルデヒド基に変換し、システイニルアルギニンが固定化された樹脂（Ｃｙｓ−Ａｒｇ−樹脂）を求核剤として用いて、タンパク質をＣ末端において樹脂に固定化し、Ｃ末端ペプチドフラグメントを単離した。
ウマ・シトクロムｃ（Ｃｙｔ．ｃ）のすべてのシステイン残基を還元及びカルボキシメチル化（ＲＣＭ化）処理して得られたタンパク質ＲＣＭ−Ｃｙｔ．ｃを試料タンパク質として用いた。試料タンパク質ＲＣＭ−Ｃｙｔ．ｃを、ギ酸とトリフルオロ無水酢酸との等容混合物（ホルミル化試薬）０．５ｍｌに溶解して得られた混合溶液に、ペンタフルオロフェノール３ｍｇ（１５μｍｏｌ、ＳＴＩの１００等量）をギ酸中に含む溶液５０μｌを加えて、６０℃で２０分加熱した。反応終了後、反応溶液を減圧下に濃縮、乾固した。得られた残留物にさらに少量のトルエンを加え、減圧下での濃縮、乾固を２回繰り返した。得られた残留物を、ＤＭＳＯ  ０．５ｍｌに溶解し、Ｃｙｓ−Ａｒｇ−樹脂（ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＡＴＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＆  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）０．１ｇ（０．２２ｍｅｑ／ｇ）を加え、１２時間、室温で反応させた。
樹脂を少量の１％ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（ｗ／ｗ）で洗浄後、キモトリプシン０．０６４ｍｇを含む１％ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（ｗ／ｗ）０．５ｍｌを加え、３７°Ｃで１２時間インキュベートした。インキュベート後、樹脂をまず少量の１％ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（ｗ／ｗ）で、次に０．１％のＴＦＡを含む７０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ／ｖ）で２回洗浄した。洗浄した樹脂を、４時間酸処理（８２．５％トリフルオロ酢酸、５％蒸留水、５％チオアニソール、３％エチルメチルスルフィド、２．５％エタンジチオール、２％チオフェノール（全て体積基準）の混合液に供する）し、結合しているＣ末端ペプチド断片を、Ｃｙｓ−Ａｒｇ基を含むように樹脂から遊離させた。得られた溶液を減圧下に濃縮し、残留物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した。
得られたマススペクトルを図４に示す。図４によると、正イオン検出モードで１０１８．６（ｍ／ｚ）が検出されている。従って、目的物が生成していることが確認された。この目的物は、下記式（ＩＶ）に示す構造を持つ化合物のプロトン付加イオン１０１８．５２（ｍ／ｚ）に一致する。下記式（ＩＶ）の化合物は、実施例３で検出されたＣ末端ペプチドフラグメントに対応するものであり、実施例３のＣ末端ペプチドフラグメントＬｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｈ（配列番号２：Ｇｌｕ−ＨはＣ末端のグルタミン酸のカルボキシル基がアルデヒド基に変換されていることを示し、Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）はリジンのε−アミノ基がホルミル化されていることを示す。）から、Ｔｈｒの側鎖水酸基がさらにホルミル化され、且つ、Ｃｙｓ−Ａｒｇ樹脂のシステイニル基（α−アミノ−β−チオール基）が縮合して生じたチアゾリン環を有するＣ末端ペプチドフラグメントである。
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［実施例５］
本実施例では、試料としてロイシンエンケファリンＨ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（配列番号３）を用い、キモトリプシン処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。得られたマススペクトルを図５に示す。
図５の分析結果によると、最大且つほぼ単一に近いピークは６５２．４（ｍ／ｚ）である。このピークは、ペプチドＦｏｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈが、２−イミダゾリノ−２−ヒドラゾン誘導体化して得られたペプチド誘導体（質量の計算値：６４９．３２）のイオン（Ｍ＋）に、水素２原子とプロトンとが付加したイオン［Ｍ＋Ｈ２＋Ｈ］＋のピークに相当する。ここで、Ｆｏｒ−Ｔｙｒは、Ｎ末端のチロシンのアミノ基がＮ−ホルミル基でブロックされていることを示し、Ｌｅｕ−Ｈは、Ｃ末端のロイシンのカルボキシル基がアルデヒド基に変換されていることを示す。従って、目的とするペプチド誘導体が生成していることが確認された。このように、上記ペプチド誘導体の質量の計算値よりも３Ｄａ質量数が大きいイオン［Ｍ＋Ｈ２＋Ｈ］＋が観測されたことは、実施例１や実施例３と同様に、生成物が、炭素−窒素間二重結合を有するヒドラゾン基を含むことを強く示唆している。
［Ｍ＋Ｈ２＋Ｈ］＋のイオンが観測された実施例１、［Ｍ＋Ｈ２］＋のイオンが観測された実施例３、及び、［Ｍ＋Ｈ２＋Ｈ］＋のイオンが観測された実施例５の結果から、２−イミダゾリノ−２−ヒドラジンを用いてペプチドを修飾した場合、測定条件によっては、質量の計算値に相当する質量数を有するＭＡＬＤＩピークよりも、当該計算値より２Ｄａ又は３Ｄａ大きい質量数を有するＭＡＬＤＩピークが観測される傾向があることが確認された。これは、既に述べたように、マトリックスとの相互作用によりヒドラゾン基の炭素−窒素間二重結合に水素分子が還元的に付加することによる特徴的な現象と推論できる。すなわち、生成物が、炭素−窒素間二重結合を有するヒドラゾン基を含むことを強く示唆している。
上記実施例においては、本発明の５つの具体的な例を示した。しかしながら、本発明は、これらに限定されることなく、全ての、タンパク質及びペプチド、ホルミル化試薬、触媒、及び、アルデヒドに対する反応性基を有する求核試薬及び担体、にも適用される。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、全て本発明の範囲内のものである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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