(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドホスホルアミダイトまたはヌクレオシドＨ−ホスホネートおよびそれより低い分子量の不純物を含む有機溶媒溶液をナノ濾過に付す工程を含み、それによってその溶液中におけるヌクレオシドホスホルアミダイトまたはヌクレオシドＨ−ホスホネート対該不純物の比をナノ濾過後に増大させる、ヌクレオシドホスホルアミダイトまたはヌクレオシドＨ−ホスホネートの精製方法であって、該ナノ濾過において、ポリイミド濾過膜を使用しそして該有機溶媒が酢酸エチルである、上記の方法。
【請求項２】
該ヌクレオシドホスホルアミダイトが式（１）：
【化１】
0004824931.tif 000004
の化合物であり、但し、上記の式において、Ｒ1は保護基であり、Ｂはヌクレオシド塩基であり、Ｒ2は−Ｈ、−Ｆ、−OR4、−NR5R6、−SR7または置換若しくは非置換脂肪族基を表し、各Ｒ3は独立にＣ1-6アルキル基であり、ＰＧは燐保護基であり、Ｒ4は−Ｈ、置換若しくは非置換脂肪族基、置換若しくは非置換アリール基、置換若しくは非置換アルアルキル基、アルコール保護基または−(CH2)q-NR9R10を表し、Ｒ5およびＲ6は各々独立に−Ｈ、置換若しくは非置換脂肪族基またはアミン保護基であるか、またはＲ5およびＲ6はそれらが結合される窒素と一緒になってヘテロシクリル基であり、Ｒ7は−Ｈ、置換または非置換脂肪族基またはチオール保護基を表し、Ｒ9およびＲ10は各々独立に−Ｈ、置換若しくは非置換アリール基、置換基若しくは非置換ヘテロアリール基、置換若しくは非置換脂肪族基、置換若しくは非置換アルアルキル基、置換若しくは非置換ヘテロアルアルキル基またはアミン保護基であるか、またはＲ9およびＲ10はそれらが結合される窒素と一緒になってヘテロシクリル基を形成し；そしてｑは１〜６の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＧがベータシアノエチル基であり、そして各Ｒ3がイソプロピル基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該有機溶媒溶液がクロロカーボン溶媒溶液からの酢酸エチルによる溶媒交換によって作られる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
４００の分画分子量を有するナノ濾過膜が用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該ナノ濾過膜がクロスフロー配置である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１５〜３５バールの圧力下で該ナノろ過膜を通して該有機溶媒溶液を通過させる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ナノ濾過膜を通過した容量に相当する新しい酢酸エチルが非透過の該ヌクレオシドホスホルアミダイトまたはヌクレオシドＨ−ホスホネート溶液中に加えられる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド類、特にヌクレオシドホスホルアミダイト類(nucleoside phosphoramidites)の合成において有用なシントン類の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成オリゴヌクレオチド類は、遺伝病およびウイルス病検出の重要な診断手段である。加えて、オリゴヌクレオチド類および修飾オリゴヌクレオチド類は、遺伝子発現または蛋白質機能を阻害する治療用候補化合物として興味あるものである。サイトメガロウイルス（CMV）治療用のオリゴヌクレオチド類似体、および他の幾つかのオリゴヌクレオチド類似体のFDAの承認は現在臨床試験をしているときであるから、治療用候補化合物として使用するためのオリゴヌクレオチド類の大規模合成の重要性が次第に増してきた。各臨床試験にはキログラムオーダーの量の精製オリゴヌクレオチド類似体が必要とされる。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの製造に現在用いられている主要な方法はホスホルアミダイト法である。より大量のオリゴヌクレオチド類の増大する需要は、それに対応してホスホルアミダイト化合物の需要を増大させた。ホスホルアミダイト化合物は、一般に、活性化剤の存在下におけるヌクレオシドのホスフィチル化剤（phosphitylation agent）によるホスフィチル化によって製造される。従来は、ホスホルアミダイト類は、長さが大きく、そして時間のかかるクロマトグラフィーの使用によって精製された。
【０００４】
オリゴヌクレオチド類を合成するためのもう１つ別のシントン類にＨ−ホスホネート化合物があるが、これら化合物を精製する現存する方法はホスホルアミダイト類と同様の欠点に悩む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
オリゴヌクレオチド用シントンを精製する別法、特に大規模製造に適用できる方法が従って必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の面によれば、オリゴヌクレオチド・シントンの精製方法であって、オリゴヌクレオチド・シントンおよびそれより低い分子量の不純物を含む有機溶液をナノ濾過に付す工程を含み、それによってその溶液中におけるオリゴヌクレオチド・シントン対低分子量不純物の比をナノ濾過後に増大させる上記の方法が提供される。
【０００７】
本発明による方法で精製することができるオリゴヌクレオチド・シントン類に、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホルアミダイト類、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドＨ−ホスホネート類、特に３’−または５’−末端リボまたはデオキシリボヌクレオシドＨ−ホスホネートモノエステル類、およびヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホルアミデート類がある。
【０００８】
本発明による方法は、保護されたヌクレオシドホスホルアミダイト類を精製するのに有利に用いられる。好ましい保護ヌクレオシドホスホルアミダイト類は、デオキシリボヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイトまたはリボヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト類である。本発明は５’−ホスホルアミダイト類にも等しく適用可能である。
【０００９】
好ましい保護ヌクレオシドホスホルアミダイト類の例は式（１）：
【００１０】
【化１】
0004824931.tif 000002
【００１１】
の化合物である；但し、上記の式において、Ｒ1は保護基、好ましくはトリチル、モノメトキシトリチルまたはジメトキシトリチル基であり、Ｂはヌクレオシド塩基であり、Ｒ2は−Ｈ、−Ｆ、−OR4、−NR5R6、−SR7、またはメチル若しくはアリルのような置換若しくは非置換脂肪族基を表す。ＰＧは燐保護基、一般的にはオリゴヌクレオチドの合成で用いられる開裂可能な燐保護基、好ましくは置換若しくは非置換脂肪族基、または式−OCH2CH2CN、−SCH2CH2CN、−OR8、−SR8、−O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、−O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、−O-CH2CH2-C6H4-NO2、−S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、−S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3または−S-CH2CH2-C6H4-NO2である。Ｒ4は−Ｈ、置換若しくは非置換脂肪族基（例えば、メチル、エチル、メトキシエチルまたはアリル）、置換若しくは非置換アリール基、置換若しくは非置換アルアルキル基、アルコール保護基、特に塩基不安定性保護基若しくはシリル保護基、または−(CH2)q-NR9R10を表す。Ｒ5およびＲ6は各々独立に−Ｈ、置換若しくは非置換脂肪族基またはアミン保護基である。或いはまた、Ｒ5およびＲ6はそれらが結合される窒素と一緒になってヘテロシクリル(heterocyclyl)基である。Ｒ7は−Ｈ、置換若しくは非置換脂肪族基またはチオール保護基を表す。Ｒ9およびＲ10は各々独立に−Ｈ、置換若しくは非置換アリール基、置換基若しくは非置換ヘテロアリール基、置換若しくは非置換脂肪族基、置換若しくは非置換アルアルキル基、置換若しくは非置換ヘテロアルアルキル基またはアミン保護基である。或いはまた、Ｒ9およびＲ10はそれらが結合される窒素と一緒になってヘテロシクリル基を形成する。ｑは１〜約６の整数である。各Ｒ3は独立にＣ1-6アルキル基、好ましくはイソプロピル基である。使用されるホスホルアミダイトは、一般に、ベータシアノエチルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
【００１２】
ヌクレオシド塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルのような天然産塩基、並びに７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノ−プリン、５−フルオロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾーロ−５−メチルチミン、４−トリアゾーロ−５−メチルウラシルおよびヒポキサンチンのような修飾塩基がある。
【００１３】
ヌクレオシド塩基は保護されていてもよい。適した保護基の例はこの技術分野で周知である。典型的には、ヌクレオシド塩基は、アミドまたはカルバメートのようなアミン保護基で保護されることができるアミン基を有する。例えば、アデニンおよびシトシンのアミン基は典型的にはベンゾイル保護基で保護され、またグアニンのアミン基は、典型的には、イソブチリル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基またはｔ−ブチルフェノキシアセチル基で保護される。しかし、ホルムアミジンのような他の保護方式を用いることもできる。例えば、速い脱保護のために、アデニンおよびグアニンの第一アミン基はフェノキシアセチル基で保護され、またシトシンのアミン基はイソブチリル基またはアセチル基で保護される。
【００１４】
式（１）は天然のヌクレオシド配置（Ｄ−異性体）によって表されるが、本発明は対応する合成または非天然配置（Ｌ−異性体）、アルファおよびベータアノマー体、および諸配置の混合物に対しても等しく適用可能である。
【００１５】
本発明の方法によって精製することができるＨ−ホスホネート類は、好ましくはヌクレオシドＨ−ホスホネートモノエステル類、特に一般化学式（２）：
【００１６】
【化２】
0004824931.tif 000003
【００１７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＢは式（１）について上記で述べられるとおりである。）
を有するものである。
本発明による方法によって精製することができるホスホルアミダイト類は、一般に遊離ヒドロキシ基を含む保護ヌクレオシドとホスフィチル化剤との間の反応の生成物である。
【００１８】
ホスフィチル化剤は、一般に、一般化学式PG-O-PX1X2を有し、ここでＰＧは前に定義したとおりであって、好ましくは式−CH2CH2CNの基であり；Ｘ1およびＸ2は同一であってもよいし、或いは異なっていてもよく、ハロ、一般的にはブロモ若しくはクロロ、または−NR11R12（式中、Ｒ11およびＲ12は、各々独立に、アルキル基、好ましくはＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ11とＲ12とがそれらが結合されるＮと一緒に結合されて５−７員環を形成する）のような離脱基を表す。一般に、Ｘ1およびＸ2の少なくとも１つは式−NR11R12の基である。最も好ましくは、Ｘ1およびＸ2は同一であり、そしてＸ1およびＸ2の両者が−N[CH(CH3)2]2基であることが特に好ましい。
【００１９】
好ましいホスフィチル化剤（phosphitylating agents）の例を挙げると、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（一般に「テトラホス（tetraphos）」として知られる）、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルホスホロジアミダイト、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニルメチルシリルエトキシホスフィンおよびＯ−β−シアノエチル−ビス（Ｎ−モルホリノ）ホスホロジアミダイトがある。
【００２０】
前記のより低い分子量の不純物は、主に、ホスフィチル化剤の分解および副反応生成物から成る。一般に、これら不純物は約３７５未満、好ましくは約３５０未満の分子量を有する。
【００２１】
ある特定の態様では、ホスフィチル化プロセスで生成されるホスホルアミダイト溶液中に存在する溶媒は、より広い範囲のナノ濾過膜と適合した溶液を生成させるために溶媒を変えることができる。例えば、ホスフィチル化プロセスがクロロカーボン溶媒、特にジクロロメタンを用いる場合、これを別の溶媒、例えばエステル、特に酢酸エチルと交換することができる。使用することができるさらなる溶媒に、テトラヒドロフランおよびジオキサンのようなエーテル、ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチルピロリジノンのようなアミド、アセトニトリルのようなニトリル、並びにヘキサンおよびトルエンのような炭化水素がある。本発明の特に好ましい態様は、ホスホルアミダイトのエステル溶媒中、特に酢酸エチル中溶液のナノ濾過を含む。
【００２２】
ホスホルアミダイト溶液は、好ましくは全ての溶媒交換前に、酸性不純物を中和するために塩基性溶液、例えば炭酸ナトリウム溶液と接触させることによって処理されるのが有利である。
【００２３】
本発明の方法によって精製することができるＨ−ホスホネートモノエステルオリゴヌクレオチド・シントン類中に存在する不純物は、主に、Ｈ−ホスホネートモノエステル部分をヌクレオシドに導入するのに用いられた試薬から誘導される副生成物から成り、ここでそのような試薬にアリールＨ−ホスホネートモノエステル、例えばフェニルまたはアルキルフェニルＨ−ホスホネート類のアンモニウム塩がある。
【００２４】
本発明の方法で用いることができるナノ濾過膜は、シントン溶液による分解に抵抗性であるように選ばれる。ナノ濾過膜の例を挙げると、ポリ（エチレン）、ポリ（プロピレン）、ポリ（スルホン類）、ポリ（エーテルスルホン類）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（ビニリデンジフルオリド）、ポリ（アミド類）、ポリ（イミド類）、ポリ（アクリロニトリル類）、酢酸セルロースおよびそれらの混合物がある。膜は支持体上に固定された成分、例えばポリ（アクリロニトリル）支持体上に固定されたシリコーンを含んでいてもよい。特定の例は、米国特許第４，３６８，１１２号、同第４，７４８，２８８号、同第４，９８５，１３８号、同第４，９９０，７２５号、同第５，０６７，９７０号、同第５，０９３，００２号、同第５，１０２，５５１号、同第５，２０５，９３４号および同第５，２６５，７３４号、並びにＷＯ００／０６２９３号明細書（参照することにより本明細書に含められる）に開示されるそれらの膜である。多くのオリゴヌクレオチド・シントン類、特にヌクレオシドホスホルアミダイト類およびＨ−ホスホネート類の精製のために、膜は一般に約４００の分画分子量を有するように選ばれる。即ち、膜は４００未満の分子量を有する化合物の通過は許すが、それより大きい分子量を有する化合物の通過は許さない。特に適した膜は米国特許第５，２６４，１６６号明細書（参照することにより本明細書に含まれる）に開示されるものである。
【００２５】
本発明による方法において、オリゴヌクレオチド・シントンを含んでいる「粗」溶液は、一般に高圧を用いてナノ濾過膜を通過せしめられる。このシントンはナノ濾過膜を通過することは許されないが、これに対してそれより低い分子量の不純物は通過し得る。シントン（非透過物：retentate）を含むナノ濾過残留物はさらなる新しい溶媒で洗浄することができる。一般に、膜を横切る通過はシントン溶液残留物の容量が原「粗」溶液より有意に少なくなるまで続き、それによってシントンの精製と濃縮とが同時に成し遂げられる。このプロセスは、ナノ濾過の技術分野で知られている装置を用いて、特にＷＯ０２／０７６５８８号明細書（参照することにより本明細書に含められる）に開示される装置を用いて行うことができる。全量濾過配置かクロスフロー濾過配置のいずれかが用いることができる。膜を横切る通過は、ポンプの使用によって、またはそれに代わる手段、例えば窒素のような気体の圧力によって成し遂げることができる。
【００２６】
ある特定の態様において、ナノ濾過膜を通過した容量に相当する容量の新しい溶媒が非透過（retained）シントン溶液中に加えられ、そしてその濾過プロセスは目的の純度が成し遂げられるまで続けられる。新しい溶媒はナノ濾過膜を通る通過速度に相当する速度で連続的に加えることもできる（一定容量）し、或いはこの精製中に間をおいて１つまたは２つ以上のバッチ中に加えることもできる（可変容量）。新しい溶媒の添加は、シントン溶液が過度に粘稠になるのを防いで、膜を横切る流束速度を維持するのを助けることができる。目的の純度が一旦達成されると、溶媒はナノ濾過膜を横断通過してシントンの濃度を増加させ続けることができる。
【００２７】
本発明による方法は、約０〜約５０℃の範囲内の温度、好ましくは約１５〜約３０℃のような周囲温度で行われることが多い。
高圧が用いられるとき、使用できる圧力の実際の上限は、膜がそのような圧力下でその保全性を保持できる能力によって決まることは認められるだろう。多くの態様において、６０バールまでの、特に５０バールまでの圧力、特に１５〜３５バールの範囲内の圧力、例えば約３０バールが用い得る。
【００２８】
本発明による方法によって精製することができる「粗」溶液は、一般に、約４０重量％まで、好ましくは約２−１０％重量／重量のシントンを含む。
精製されたシントンは、次に、その残留物から従来の方法によって回収することができる。
【００２９】
本発明は次の実施例によって限定することなく例証される。
【実施例】
【００３０】
実施例１
全量操作に合った形に形成された高圧濾過セルに、Grace Davison Membranes社から商業的に入手できる１４ｃｍ2のディスク形ポリイミドの４００分画分子量ナノ濾過膜（STARMEM（登録商標）２４０）、およびスチュアート攪拌機を備え付けた；ここで、高圧は高圧調節器経由で窒素シリンダーに接続することによって与えられた。酢酸エチルを一定流束が達成されるまで３０バールの圧力下で膜を通過させることによってその膜を予備調節した。テトラホスとの反応によるＮ−ベンゾイル保護５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（ｄＣアミダイト）の製造からの、３０％重量／重量のｄＣアミダイトを含有する反応生成物の酢酸エチル溶液３５ｃｍ3を上記濾過セルに入れ、そして膜を１６．５ｃｍ3の透過液が得られるまで３０バールの圧力下で通過させた。非透過物を濾過容器から取りだして、アミダイトおよび加水分解テトラホス（アミダイトの製造からの副生成物である不純物）含有量について分析した。
【００３１】
粗溶液中のｄＣアミダイト対加水分解テトラホスの重量比は２３．５：１であり、また精製非透過物中の対応する比は３１．１：１であった。
実施例２
Ｎ−ベンゾイル保護５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（ｄＡアミダイト）反応生成物３０％重量／重量の粗溶液を用い、そして１６ｃｍ3の透過液を得たことを除いて実施例１の方法を繰り返した。
【００３２】
粗溶液中のｄＡアミダイト対加水分解テトラホスの重量比は６２．４：１であり、また精製非透過物中の対応する比は７５．１：１であった。
実施例３
クロスフロー操作に合った形に形成された高圧フィルターセルに、Grace Davison Membranes社から商業的に入手できる７８．５ｃｍ2のディスク形ポリイミドの４００分画分子量ナノ濾過膜（STARMEM（登録商標）２４０）を備え付けた。酢酸エチルを一定流束が達成されるまで３０バールの圧力下で通過させることによって膜を予備調節した。テトラホスとの反応によるＮ−２−イソブチリル保護５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（ｄＧアミダイト）の製造からの、５％重量／重量のｄＧアミダイトを含有する反応生成物の酢酸エチル溶液２Ｌを保持タンクから３０バールの圧力において上記濾過セルを通して循環させ、そしてこの非透過物をその保持タンクに戻した。ナノ濾過膜を通る透過液を別個に採集した。上記の循環を１．５Ｌの透過液が得られるまで続けた。非透過物をアミダイトおよび加水分解テトラホス含有量について分析した。
【００３３】
粗溶液中のｄＧアミダイト対加水分解テトラホスの重量比は１５．５：１であり、また精製非透過物中の対応する比は２１．６：１であった。