(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有する、カテプシンＤに属する酸性プロテアーゼ。
（１）酵素作用：  タンパク質分子内部のペプチド結合鎖に作用して、低分子のペプチドを生産するエンド型プロテアーゼである。
（２） 基質特異性：  酸性条件下において乳カゼイン、ヘモグロビン、牛血清アルブミンおよび糖蛋白質である卵白アルブミンを良く分解する。また、カテプシンDの特異的基質の１つであるMOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2を Phe- -Pheの間で切断し、蛍光強度を増加させる。さらにb-セクレターゼの特異的基質の１つであるMOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu- Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH2を分解し、蛍光強度を増加させる。カイネティクパラメー ター(kｃａｔ/Kｍ)は、基質のP1位が疎水性のアミノ酸である場合が高い値を示す。
（３）至適ｐＨ：  カゼインを基質としたときの至適ｐＨが ２．４であり、ヘモグロビンを基質としたときの至適ｐＨが３．０である。また、MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe- Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2を基質とした場合、至適ｐＨは３．０であり、ｐＨ６．０においても約５０％の活性を示す。
（４）安定ｐＨ範囲：  ｐＨ２〜６のｐＨ域で安定である（基質としてヘモグロビンを用いて測定）。
（５）至適温度：  ３０℃である（基質としてカゼインを用いて測定）。
（６）安定温度範囲：  ２０〜５０℃の温度範囲で安定である（基質としてカゼインを用いて測定）。
（７）５５℃、１０分の加熱でほぼ完全に失活する（基質としてカゼインを用いて測定）。
（８）阻害剤：  ペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａにより完全に阻害され、１，２−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）−プロパン（ＥＰＮＰ）およびジアゾアセチル−ＤＬ−ノルロイシンメチルエステル（ＤＡＮ）により約５０％の活性が阻害される。
（９）相対分子質量：  ３６．５キロダルトン（ｋＤａ）である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。
（１０）等電点：  ８．３０である（等電点電気泳動による）。
（１１）Ｎ 末端アミノ酸配列：  A-P-T-P-E-P-L-S-N-Y-L-D-A-Q-Y-Y-G-V-I-S-I-G-T-P-A-Q-N-F-K-V-V- F-Dで示され、ミバエ(Drosophila melanogaster)のカテプシンDとは８４％、ヒトのカテプシンＤとは６３％の相同性がある。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質分子中のペプチド結合鎖に作用して低分子のペプチドを容易に製造することができ、例えば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有用な酸性プロテアーゼに関し、更に詳しくは、イカ肝臓由来の新規酸性プロテアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼはタンパク質、ペプチド中のペプチド結合を加水分解する一群の酵素であり、これまで微生物由来、動植物由来の種々の酵素が開発され、飲食品分野、医薬品分野、その他の分野で有効に利用されてきた。例えば、飲食品分野においては呈味の改善、物性の改善等に利用され、また、医薬品分野においては生理活性ペプチドの生産、生体の生理作用の制御等に利用されている。
【０００３】
プロテアーゼはその作用により、タンパク質のＣ末端、もしくはＮ末端のペプチド結合から順に作用してアミノ酸を１個ずつ切り離していくエキソ型ペプチダーゼと、タンパク質分子内部のペプチド結合鎖に作用して低分子のペプチドを生産するエンド型ペプチダーゼの２つに分類され、動物の筋肉中等に存在するカテプシン系の酵素群の中で、カテプシンＢ、Ｌ、ＨおよびＤはこのエンド型ペプチダーゼに属する。
【０００４】
イカの筋肉および肝臓中に存在するカテプシン系の酵素についてはこれまで種々の検討がなされ、例えば、イカ肝臓中に存在するカテプシンＢの精製およびその性質（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０（６），１１５９−１１６５（１９７６））、イカ外套膜中に存在するカテプシンＤ様のプロテアーゼの精製（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６８Ｂ（３），３８９−３９５（１９８１）、同，７０Ｂ（４），７９１−７９４（１９８１）、同，７５Ｂ（３），４０９−４１４（１９８３））、イカ消化腺中のカテプシンＤの精製およびその性質（Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．，３９，８５−９４（１９８７））、イカ塩辛熟成中の組織の軟化に及ぼすカテプシンの影響（日本水産学会誌，５９（９），１６２５−１６２９（１９９３））などが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述した如き、食品工業および医薬品分野等で利用できる生理活性ペプチドを安全かつ効率よく得ることができる、新規な酸性プロテアーゼの開発が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは先に、イカ肝臓より得られる新規酸性カルボキシペプチダーゼおよび該酸性カルボキシペプチダーゼを用いた蛋白質加水分解物の呈味改善方法について提案した（特許第２９０１２０７号公報、特開平７−１１５９１３号公報参照）。さらに鋭意研究を重ねた結果、イカ肝臓中に上記酸性カルボキシペプチダーゼ以外に新規な酸性のエンド型プロテアーゼが存在し、該酸性プロテアーゼが生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有用であることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００７】
かくして、本発明は、次の理化学的性質を有する新規な酸性プロテアーゼを提供するものである。
（１）酵素作用：タンパク質分子内部のペプチド結合鎖に作用して、低分子のペプチドを生産するエンド型プロテアーゼである。
（２）基質特異性：酸性条件下において乳カゼイン、ヘモグロビン、牛血清アルブミンおよび糖蛋白質である卵白アルブミンを良く分解する。また、カテプシンDの特異的基質の１つであるMOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH２（J. Biochem.，１２５（６），１１３７−１１４３（１９９９））をPhe- -Pheの間で切断し、蛍光強度を増加させる。さらにb-セクレターゼの特異的基質の１つであるMOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH２（J. Biochem.，１２６（１），２３５−２４２（１９９９））を分解し、蛍光強度を増加させる。
カイネティクパラメーター(kｃａｔ/Kｍ)は、基質のP1位が疎水性のアミノ酸である場合が高い値を示す。
（３）至適ｐＨ：カゼインを基質としたときの至適ｐＨが２．４であり、ヘモグロビンを基質としたときの至適ｐＨが３．０である。また、MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH２を基質とした場合、至適ｐＨは３．０であり、ｐＨ６．０においても約５０％の活性を示す。
（４）安定ｐＨ範囲：ｐＨ２〜６のｐＨ域で安定である（基質としてヘモグロビンを用いて測定）。
（５）至適温度：３０℃である（基質としてカゼインを用いて測定）。
（６）安定温度範囲：２０〜５０℃の温度範囲で安定である（基質としてカゼインを用いて測定）。
（７）５５℃、１０分の加熱でほぼ完全に失活する（基質としてカゼインを用いて測定）。
（８）阻害剤：ペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａにより完全に阻害され、１，２−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）−プロパン（ＥＰＮＰ）およびジアゾアセチル−ＤＬ−ノルロイシンメチルエステル（ＤＡＮ）により約５０％の活性が阻害される。
（９）相対分子質量：３６．５キロダルトン（ｋＤａ）である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。
（１０）等電点：８．３０である（等電点電気泳動による）。
（１１）Ｎ末端アミノ酸配列：A-P-T-P-E-P-L-S-N-Y-L-D-A-Q-Y-Y-G-V-I-S-I-G-T-P-A-Q-N-F-K-V-V-F-Dで示され、各種カテプシンDと高い相同性を有する。例えば、ミバエ(Drosophila melanogaster)のカテプシンDとは８４％、ヒトのカテプシンＤとは６３％の相同性がある。  以下、本発明の酵素の製法、理化学的性質等について、更に詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明により提供される新規酸性プロテアーゼはイカ類の肝臓から採取することができ、採取することのできるイカ類としては、例えば、アカイカ、スルメイカ、マイカ、アオリイカ、ヤリイカ、ケンサキイカ、コウイカ、ヒナイカ、ミミイカ、ホタルイカ、ドスイカ、ダイオウイカ、ソデイカ等の各種のイカ類を挙げることができるが、殊に、肝臓重量が大きく、また水揚げ量が多いスルメイカ、アカイカ及びマイカが好適である。これらのイカ類の肝臓は、生鮮品、冷凍品及び塩蔵品のいずれも利用することができる。
【０００９】
これらのイカ類の肝臓から酸性プロテアーゼを分離採取する方法としては、例えば、生鮮イカまたは冷凍イカの肝臓を分別し、これを磨砕処理した後、磨砕物１重量部に対して通常約３〜約２０重量部、好ましくは約５〜約１０重量部の水もしくはｐＨ約３〜６の緩衝液を加えて攪拌抽出し、好ましくは抽出液を再度ｐＨ約３〜４に調整した後、得られる抽出水層部を遠心分離し、脂肪を分離除去し、更にこの水層部をケイソウ土、セルロースなどの濾過助剤を用いて濾過し、清澄な粗酵素液を得る方法を例示することができる。得られる粗酵素液は、場合により、凍結濃縮、減圧濃縮、限外濾過などの適宜な濃縮手段を用いて、該酵素の活性低下をきたさない温度、例えば、約５０℃以下の温度で濃縮することにより粗酵素液濃縮物とすることができる。この濃縮物はそのまま粗酵素として利用することができるが、更に望ましくは該濃縮物を直接あるいはデキストリン類などの適当なバインダーを添加した後、真空乾燥、凍結乾燥等によって乾燥粉末化することが保存上有利である。
【００１０】
さらに、該濃縮物は、硫安アンモニウム塩析、陽イオン交換樹脂、例えば、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ、Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシアバイテク社製）など、あるいは疎水性カラム、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（ファルマシアバイテク社製）などで分離・溶出し、この溶出液について、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（ファルマシアバイテク社製）などのゲル濾過カラムを用いて活性画分を分取し、単一成分として分離精製することができる。
【００１１】
本発明のイカ肝臓由来の新規な酸性プロテアーゼは、タンパク質分子内のペプチド結合鎖に作用して低分子のペプチドを生産するエンド型プロテアーゼであり、イカ肝臓から初めて見いだされた新規な酵素である。
【００１２】
以下、本発明の酸性プロテアーゼの酵素学的性質について説明する。
【００１３】
（１）酵素作用
タンパク質分子内部のペプチド結合鎖に作用して、低分子のペプチドを生産するエンド型プロテアーゼである。
【００１４】
牛血清アルブミンを該酸性プロテアーゼにて作用した結果、図１に示すように低分子のペプチドに分解した。また、糖蛋白質である卵白アルブミンに作用した結果、低分子化していることが確認された。さらにアミロイドb-タンパク質（１〜４２）残基に該酸性プロテアーゼを作用した結果、図２のＨＰＬＣクロマトグラムが示すように３本のペプチド鎖に分解した。
【００１５】
（２）基質特異性
酸性条件下において乳カゼイン、ヘモグロビン、牛血清アルブミンおよび糖蛋白質である卵白アルブミンを良く分解した。また、カテプシンDの特異的基質の１つであるMOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH２１ｍｇをDMSO５７０mｌに溶解し、１ｍＭの基質溶液とし、Ｂｕｆｆｅｒ９８０mｌに上記保存液を加え、酵素活性を蛍光強度の増加（Ｅｘ＝３２８ｎｍ、Ｅｍ＝３９８ｎｍ）により測定した。その結果、MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH２をPhe- -Pheの間で切断し、蛍光強度を増加させた。さらにb-セクレターゼの特異的基質の１つであるMOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH２を分解し、蛍光強度を増加させた。カイネティクパラメーター(kｃａｔ/Kｍ)は、基質のP1位が疎水性のアミノ酸である場合が高い値を示した。
【００１６】
（３）至適ｐＨ
本発明の酸性プロテアーゼを基質としてヘモグロビンおよびカゼインを用い、ｐＨはそれぞれの基質について２種類の緩衝液にてｐＨ１〜３．５の範囲で測定を行い相対活性を求めた。その結果を図３に示すが、基質としてカゼインを用いたときの至適ｐＨは２．４であり、基質としてヘモグロビンを用いたときの至適ｐＨは３．０であった。この至適ｐＨより本発明の酸性プロテアーゼはカテプシンＤに属する酵素であることが推測された。
【００１７】
（４）安定ｐＨ範囲
本発明の酸性プロテアーゼを基質としてヘモグロビンを用い、ｐＨは５種類の緩衝液にてｐＨ１〜９の範囲での安定性を調べた。その結果を図４に示すが、本発明の酸性プロテアーゼはｐＨ２〜６の範囲で約８０％の活性を維持し、ｐＨ７においても５０％以上の活性を示した。
【００１８】
（５）至適温度
本発明の酸性プロテアーゼを基質としてカゼインを用い（ｐＨ２．４）、至適温度の測定を行った。その結果を図５に示すが、基質としてカゼインを用いたときの至適温度は３０℃であった。
【００１９】
（６）安定温度範囲
本発明の酸性プロテアーゼを基質としてカゼインを用い（ｐＨ２．４）、１０〜７０℃で１０分および３０分での残存活性を測定した。その結果を図６に示すが、１０分の反応では２０〜５０℃まで約８０％の活性を示したが、３０分の反応では５０℃で５０％以下の残存活性であった。
【００２０】
（７）温度による失活の条件
上記図６の結果より、本発明の酸性プロテアーゼの失活は５５℃、１０分の加熱で行えることがわかった。
【００２１】
（８）阻害剤
本発明の酸性プロテアーゼについて表１に示す１８種類のプロテアーゼ阻害剤の影響を調べた。反応条件は基質としてヘモグロビン溶液を用い、ｐＨ３．０、５℃にて２４時間（ＥＰＮＰおよびＤＡＮは４８時間）反応し、プロテアーゼ阻害剤を添加していないものの酵素活性との比較を行った。その結果を下記表１に示す。
【００２２】
【表１】
表１：阻害剤の影響
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【００２３】
＊コントロールは阻害剤を添加しないときの酵素活性で、表中の活性はこのコントロールを１００としたときの相対活性で示す。
【００２４】
＊＊各略記号の意味は次のとおりである。
ＥＰＮＰ：１，２−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）−プロパン
ＤＡＮ：ジアゾアセチル−ＤＬ−ノルロイシンメチルエステル
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス−b−アミノエチルエーテル
Ｅ−６４：L-3-トランスカルボキシラン-2-カルボニル-L-ロイシル-アグマチン
ＮＥＭ：Ｎ−エチルマレイミド
ＰＣＭＢ：パラクロロマーキュリー安息香酸
ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルフォニルフルオライド
ＡＰＭＳＦ：４−（アミヂノフェニル）メタンスルフォニルフルオライド
ＴＬＣＫ：トシルリジルクロロメタン
ＺＰＣＫ：ベンジロキシカルボニルフェニルアラニルクロロメタン
ＴＰＣＫ：トシルフェニルアラニルクロロメタン
この結果より、本発明の酸性プロテアーゼはペプスタチンＡにより完全に阻害され、ＥＰＮＰおよびＤＡＮにより半分以下の活性が阻害されたことから、本発明の酸性プロテアーゼは活性中心にアスパラギン酸残基を有するアスパルティックプロテアーゼであることがわかる。また、他のプロテアーゼ阻害剤によってはほとんど阻害を受けなかった。さらに、ペプスタチンＡの濃度の変化による阻害活性の影響（反応時間：３０分）について測定した結果を図７に示し、ＥＰＮＰおよびＤＡＮによる本発明の酸性プロテアーゼの阻害を経時的に測定した結果を図８に示すが、３０分の反応ではペプスタチンＡの濃度が１ｍＭ以上で完全に酵素活性が阻害され、ＥＰＮＰおよびＤＡＮによる阻害は７２時間までの測定で経時的に阻害されてくる傾向が確認された。図８の結果から、ＥＰＮＰと比較してＤＡＮによる阻害がつよいことから本発明の酸性プロテアーゼはカテプシンＤであると予測される。
【００２５】
（９）相対分子質量
本発明の酸性プロテアーゼの相対分子質量を非連続のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドスクラブゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０，１９７０）により求めたところ、図９に示した如く３６．４ｋＤａであった。
【００２６】
（１０）等電点
等電点電気泳動により等電点を測定したところ本発明の酸性プロテアーゼの等電点は図１０に明らかな如く、８．３０であった。
【００２７】
（１１）Ｎ末端アミノ酸解析
本発明の酸性プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーにより解析し、その結果を図１１に示す。図１１に示す３３残基のアミノ酸配列が確認され、この３３残基の分子量は約４．２ｋＤａとなり、全分子の約１／８．７である。このアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を試みた結果、本酵素のＮ末端アミノ酸配列は各種のカテプシンＤと非常に高い相同性をもつことが確認された。例えば、ミバエ（Drosophila melanogaster）のカテプシンＤとは８４％、ヒトのカテプシンＤとは６３％の相同性がある。この結果より、本発明の酸性プロテアーゼはカテプシンＤに属することが確認された。
【００２８】
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
【００２９】
【実施例】
実施例１
３０℃のイオン交換水４２００ｇに生のスルメイカ肝臓（北海道産）６００ｇを添加し、ｐＨ４．０に調整して充分にかき混ぜた後、３０℃で２時間静置した。次にデカント分離により水層部を得た。この水層部をセライト濾過し、抽出液３７５０ｇを得た。この抽出液のｐＨ３．０における０．６％ミルクカゼイン溶液を基質とする酵素活性を測定した結果、２．５６（ｎｋａｔ／ｍｌ）であった（以下、この抽出液を「酸性プロテアーゼ１」と称する）。
【００３０】
実施例２
実施例１で得られた酸性プロテアーゼ１の３７５０ｇを限外濾過により濃縮し、濃縮液６８７ｇを得た。この濃縮液の酵素活性を測定した結果、１３．１（ｎｋａｔ／ｍｌ）であった（以下、この抽出液を「酸性プロテアーゼ２」と称する）。
【００３１】
実施例３
実施例２で得られた酸性プロテアーゼ２の６８７ｇに硫酸アンモニウム１２０．９ｇを加え、かき混ぜて溶解した後、４℃で  １５時間静置した。次いで、遠心分離により不溶物を除き分離液８０２ｇを得た。この分離液に硫酸アンモニウム２５７．７ｇを加えて溶解し、４℃で１５時間静置して塩析処理をおこない析出物３５．７ｇを得た。この析出物をｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液４５ｇに溶解し、得られた溶液を透析チューブ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  ｃｏｒｐ．）を用いて同じ緩衝液で透析処理して脱塩したその結果、酵素液１２２．４ｇを得た。この酵素液の酵素活性を測定した結果、６４．９（ｎｋａｔ／ｍｌ）であった。
【００３２】
実施例４
３０℃のイオン交換水３．０Ｋｇに冷凍アカイカ肝臓（ニュージーランド産）６００ｇを添加し、ｐＨ４．０に調整して充分にかき混ぜた後、３０℃で２時間静置した。次にデカント分離により水層部を採取し、ケイソウ土濾過して濾液  ２８００ｇを得た。この濾液を減圧下に濃縮して濃縮液９００Ｋｇを得た。この濃縮液の酵素活性は７．２（ｎｋａｔ／ｍｌ）であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のイカ肝臓由来の酸性プロテアーゼは、酸性域でカゼイン、ヘモグロビンコラーゲンなどのタンパク質、ペプチドを選択的に分解する基質特異性を有し、ペプチドを容易に製造することができ、例えば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有用である。
【配列表】
0004717225.tif 000003
【００３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素の酵素作用を示す図である。
【図２】本発明酵素の酵素作用を示す図である。
【図３】本発明酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図４】本発明酵素の安定ｐＨ範囲を示す図である。
【図５】本発明酵素の至適温度を示す図である。
【図６】本発明酵素の安定温度範囲を示す図である。
【図７】本発明酵素のペプスタチンＡによる阻害作用を示す図である。
【図８】本発明酵素のＥＰＮＰおよびＤＡＮによる阻害作用を示す図である。
【図９】本発明酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１０】本発明酵素の等電点電気泳動を示す図である。
【図１１】本発明酵素のＮ末端アミノ酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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