(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル、又は、活性なタンパク質分解酵素及びα2−マクログロブリンの複合体を含む可能性のある別の生物学的液体サンプル中の活性なタンパク質分解酵素を評価する方法であって、前記サンプルと、シグナル基質に結合し１０ｋＤよりも大きい相対分子質量（以下、Ｍrとする）を有する分子を含む基質とを接触させる工程を含み、該シグナル基質は検出可能な脱離基を含み、該基質は該タンパク質分解酵素によって加水分解されるが、該複合体によっては加水分解されない、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記活性なタンパク質分解酵素が、トロンビン、活性化凝固因子、活性化線維素溶解因子及び補体系の活性化成分からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化タンパク質分解酵素がトロンビンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が、タンパク質、多糖及び合成ポリマーからなる群より選ばれる不活性分子である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が水溶性である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が、４０ｋＤのＭr及び少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が、２０ｋＤのＭr及び少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記脱離基が、吸光度シグナル又は蛍光シグナルを与える、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記脱離基が、ｐ−ニトロアニリド又は７−アミノ−４−メチル−クマリンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミン、Ｈ−アラニル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチル−クマリンに結合したオボアルブミン及びＨ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミンからなる群より選ばれる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が１以上の水素イオンの脱離基を含んでいる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記基質の量及び動力学的特性が、前記サンプル中で生成する量のタンパク質分解酵素が前記基質を完全に消費しないように選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
加水分解した基質の量が、前記タンパク質分解酵素の生成曲線下の領域に正比例する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記不活性分子がオボアルブミンである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、診断学分野に属し、より詳細には、血液及びその他の液体中のタンパク質分解酵素、例えばトロンビンの生物学的に活性な形態を決定する方法に関する。
従来技術
現在、西洋では、動脈及び静脈の血栓症並びにアテローム性動脈硬化症はともに、全死亡率に対する原因の５０％を上回り、深刻な病的状態である。数十年のうちに、このことは世界中で問題になるだろう（Murray, C.J. 及び A.D. Lopez, Science (1996) 274:740-743）。血栓症は、創傷からの出血を停止する責任を負う止血メカニズムの異常活動により引き起こされる。この止血−血栓系（HTS）は、血管壁、血球細胞、特に血小板及び血漿タンパク質間の複雑な相互作用である。例えば、Hemker H.C. Thrombin generation, an essential step in haemostasis and thrombosis. In: Haemostasis and thrombosis, A.L. Bloomら, eds., Churchill Livingstone, Edinburgh, (1994) 477-490を参照のこと。
血液中には、少なくとも３つの生物学上非常に重要なプロ酵素−酵素カスケード：血液凝固系、線維素溶解系及び補体系が存在する。これらの各系では、プロ酵素が活性化され、次いで阻害される。一般的に、各カスケードにおける活性化酵素の濃度を、各系の機能を評価するために測定することができることは重要である。以下の凝固系についての一般的な記述では、トロンビンが、最も重要な酵素として強調されるだろう。しかしながら、本発明はその他の凝固酵素並びに線維素溶解経路及び補体系路の酵素にも関連するものである。
トロンビン生成のメカニズムは、後述するようにやや詳細に説明することができる。血漿凝固系においては、Ｘａ因子が、組織因子／ＶＩＩａ因子複合体（ＴＦ−ＶＩＩａ）の作用により形成される。Ｘａ因子は組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に結合し、ＴＦＰＩ−Ｘａ複合体はＴＦ−ＶＩＩａ複合体を阻害する。トロンビンはＶ、ＶＩＩＩ及びＸＩ因子を活性化し、それゆえ自身の生成を促進するが、トロンボモジュリンにも結合して、Ｖ及びＶＩＩＩ因子を破壊し、間接的に更なるトロンビン生成を阻害するプロテインＣメカニズムを開始させる。凝固血漿中で形成した全トロンビンの重要な画分（〜〜３０％）はフィブリン血塊に結合する。血塊に結合したトロンビンは自身の血栓特性を保持し、フィブリノーゲンを凝固させ、Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸＩ因子並びに血小板を活性化させることができる（Beguin, S. 及び R. Kumar, Thromb. Haemost. (1997) 78:590-594; Kumar, R., S. Beguin, 及び H.C. Hemker, Thromb. Haemost. (1994) 72:713-721, 及び (1995) 74:962-968）。アンチトロンビンでは阻害されない。
【０００２】
トロンビン作用は、血小板膜の受容体のフィブリノーゲンへの結合を引き起こし、これは血小板凝集を引き起こす。血小板の活性化は、フォンビルブラント因子依存反応における凝血促進性リン脂質への曝露も誘導する（Beguin S., R. Kumar, I. Keularts, U. Seligsohn, B.C. Coller and H.C. Hemker, Fibrin-Dependent Platelet Procoagulant Activity Requires GPIb Receptors and Von Willebrand Factor, Blood (1999) 93:564-570; Beguin, S. 及び R. Kumar, 前出 (1997)）。これらのリン脂質は、Ｘ因子及びプロトロンビンの適切な活性化に必要とされる。以前は凝固の不活性な最終生成物であると考えられていたフィブリンが、それ自身で活性な役割を果たすという発見により、状況は複雑化している。フィブリンはフォンビルブラント因子に結合して活性化し、フォンビルブラント因子は血小板を活性化し、代替経路を経た凝血促進性リン脂質への曝露を誘発する。
血小板とフィブリンを含む凝固系との協同作用は、止血−血栓系の中心である。このメカニズムは、多数の正及び負のフィードバックループ、しばしばネスト化したフィードバックループを示す。異常な不活性は出血を引き起こし、過度の活性は血栓症を引き起こす。血栓症は、冠動脈梗塞形成、脳卒中、肺塞栓症及び頻度の低い多数の疾患として現れる。
前記の系の機能を評価するために、更に診断目的及び抗血栓剤の安全な使用のために、止血−血栓系の機能状態についてのプローブが必要とされる。ＨＴＳの重要な機能試験は、トロンビン生成時間曲線（ＴＧＣ）である。血小板に乏しい血漿中で行うと、血漿凝固系の機能に関する情報が提供される。血小板に富む血漿中では、血小板の機能も測定される。
従来技術にしたがい、ＴＧＣは、サブサンプリング（subsampling）により又は連続的に測定することができる。旧式のサブサンプリング法（Biggs, R. 及び R.G. Macfarlane, Human Blood Coagulation and its Disorders. 1953, Oxford: Blackwell; Quick, A.J., Haemorrhagic Diseases. 1957, Philadelphia: Lea & Febiger）では、サンプルを凝固混合物から採取し、トロンビン濃度を各サンプルにおいて測定する。
【０００３】
活性なトロンビンは、限られた時間期間（半減期は１６〜１７秒）のみ血漿中で生存する。これは、循環アンチトロンビンによるものである。ほとんどのトロンビン（６４％）は５７ｋＤの血漿タンパク質であるアンチトロンビン（ＡＴ）により不活性化され、２３％は７２５ｋＤの血漿タンパク質であるα2−マクログロブリン（α2Ｍ）により不活性化され、１３％はその他の種々の因子により阻害される（Hemker, H.C., G.M. Willems, 及び S. Beguin, A computer assisted method to obtain the prothrombin activation velocity in whole plasma independent of thrombin decay processes, Thromb. Haemost. (1986) 56: 9-17）。α2−マクログロブリン−トロンビン複合体（α2Ｍ−ＩＩａ）は、全ての高分子基質に対しては不活性であるが、低分子量の（人工）基質に対しては活性を保持するという特性を有している。α2−マクログロブリンはＭr７２５０００の糖タンパク質であり、血漿中に２５００ｍｇ／Ｌ又は３．５μＭの濃度で存在する。α2−マクログロブリンは、１８５ｋＤの同一サブユニットのテトラマーである。活性なプロテイナーゼ又は活性化凝固因子とα2Ｍとの不活性化反応は、以下の３工程プロセス：１．緩い複合体の形成、２．α2Ｍ中の標的ペプチドの加水分解、３．α2Ｍ分子内に酵素分子を物理的に包括する急速な構造変化である（Travis, J. 及び G.S. Salvesen, Human plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. (1983) 52:655-709を参照のこと）。
Hemkerのグループは、適切な基質からのトロンビンが触媒する生成物形成を直接モニターする連続法を開発した（Hemker, H.C.ら, Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. Thromb. haemost. (1993) 70:617-624）。基質の速度定数は、使用する濃度において、生成物形成速度が存在する酵素（トロンビン又はα2Ｍ−ＩＩａ）の量に比例するようになるものである。サンプル中の酵素活性の時間経過は、生成物−時間曲線の一次導関数として推定することができる。
この方法の欠点は、血漿中のトロンビンの一部がα2−マクログロブリンと結合することである。α2−マクログロブリンは、血漿に最も大量に存在する非特異的プロテアーゼ阻害剤である。α2−マクログロブリンは、プロテアーゼの生物活性（活性化凝固因子、活性化線維素溶解酵素及び活性化補体因子）を、その活性中心を占有することなしに失わせるので、有用なオリゴペプチドシグナル基質（signal-substrate）についての残留活性が存在する。
【０００４】
このトロンビン／α2−マクログロブリン複合体は、生理活性については未知であるが、発色性基質を切断することはできる。したがって、観察される生成物形成は、遊離のトロンビンとα2−マクログロブリン結合トロンビンとの組合せの活性の結果である。関連するデータ、すなわち遊離のトロンビンのみにより形成する生成物の量は、数学的操作による実験的生成物形成から抽出することができる。しかしながら、その操作は、生成物の生成曲線の全過程において行われなければならない。それゆえ、生成物の形成は連続的にモニターされる必要がある。この連続法の原理は、インタイム（in time）で測定可能な、例えば蛍光、電気化学又はＮＭＲシグナルにより測定可能な生成物を与える全ての基質に適用可能であるけれども、その適用は、現在、光学的に透明な媒体、すなわち脱線維素した血小板が少ない血漿（ＰＰＰ）中における発色性基質の使用に制限されている。
それゆえ、従来技術の欠点を取り除いた、血液及びその他の液体中でタンパク質分解酵素、例えばトロンビンの（活性化形態の）量を効率的に測定する方法についてのニーズが存在する。本発明はそのような方法を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明にしたがうと、血液、又は、活性なタンパク質分解酵素及びα2−マクログロブリンの複合体を含む可能性のある別の生物学的液体サンプル中で活性なタンパク質分解酵素を評価する方法であって、前記サンプルと、シグナル基質に結合した十分な大きさを有する分子を含む基質とを接触させる工程を含み、前記シグナル基質は検出可能な脱離基を含み、前記基質は前記タンパク質分解酵素によって加水分解されるが、前記の複合体によっては加水分解されないことを特徴とする方法が提供される。
活性なタンパク質分解酵素は、好ましくはトロンビン、活性化凝固因子及び補体系の活性化成分からなる群より選ばれる。トロンビンが最も好ましい。
十分な大きさを有する分子は、好ましくは不活性タンパク質、好ましくはオボアルブミン、多糖及び合成ポリマーからなる群より選ばれる。好ましくは、これらの不活性分子は水溶性であり、かつα2Ｍ分子の穴（cavity）に正しく適合しないような大きさを有している。好ましい不活性分子の群は、大きさが約４０ｋＤであり、かつ少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有している。最も好ましいのは、大きさが約２０ｋＤであり、かつ少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する不活性分子である。
本発明の側面は、後述する記載において更に概略されるだろう。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質分解酵素に対する特定のシグナル基質、特にトロンビン基質が、トロンビンによっては切断されるが、トロンビン／α2−マクログロブリン複合体によっては切断されないという驚くべき知見に基づいている。したがって、これらのシグナル基質は、α2−マクログロブリンに結合したときのタンパク質分解酵素の作用に対しては非感受性である。
本明細書で使用する「シグナル基質」なる用語は、媒体中に存在するタンパク質分解酵素により切断され、そこから脱離基が分割し、前記脱離基が光学的、ＮＭＲ又はその他の方法により検出可能である基質を意味する。光学的に検出可能な脱離基は、例えばｐ−ニトロアニリド及び７−アミド−４−メチル−クマリンである。ｐ−ニトロアニリドは４０５ｎｍで吸収し、７−アミド−４−メチル−クマリンは蛍光性である（３９０ｎｍで励起、４６０ｎｍで発光）。ＮＭＲに活性な脱離基の例は、31Ｐ、13Ｃ又はＮＭＲ若しくは類似の技術を用いて検出することができるその他全ての原子を含むものである。更に、ｐＨの変化を測定することにより検出することができるＨ+イオンも脱離基として使用することができる。
本発明は、凝固サンプル中の遊離トロンビンの一時的な酵素活性の全てを、転換される基質の総量から評価することができ、そのため数学的手順を省略することができるという利点を有する。
凝固血液又は血漿中のトロンビン形成は、プロトロンビナーゼと呼ばれる酵素的に制御された反応によりプロトロンビンから起こる。この反応は、最初は遅いが、速度は、形成したトロンビンがプロトロンビナーゼの失活剤を活性化し、プロトロンビンが使い尽くされるまで指数関数的に増加する。
本発明者等は、トロンビンの形成を以下の数式に適合させることができることを見出した。
ＦＩＩａt＝ＰＴ．（１−ｅ-b*t）ｃ          （ｉ）
（式中、ＦＩＩａtは、インタイムのトロンビン形成、ＰＴはプロトロンビンの最初の量、ｂ及びｃは定数であり、ｔは時間である。）実際に測定されたトロンビン生成曲線をこの式に適合させることにより、ｂ＝０．０２及びｃ＝４のときに、適合（fit）とデータとの間で非常に良好な一致を見出す。
【０００７】
形成したトロンビンは、ＡＴ及びα2Ｍが最も重要である血漿阻害剤と反応するだろう。これらの反応の反応定数（減衰定数）は、それぞれ約２００００（Ｍ．ｓ）-1及び１５００（Ｍ．ｓ）-1である。
トロンビンの量を連続的に測定する場合、トロンビン基質を反応混合物へ添加する。トロンビンの作用により、ある分子が基質から分割し、これを例えば光度計又は蛍光光度計で測定することができる。
広範囲の研究及び実験の後に、小さい基質とは対照的に、比較的かさ高なトロンビン基質を使用した場合、加水分解は全てのトロンビンが不活性化されたときに停止し、トロンビンの全酵素活性をエンドポイント法（end-point assay）として測定することができることを見出した。
したがって、本発明の１つの側面では、大きなサイズの発色性及び蛍光発生性並びにその他のシグナル基質であって、前記基質はα2Ｍ分子の穴へ侵入することができず、それゆえα2Ｍ−ＩＩａにより加水分解されない程度に大きい基質が提供される。これは、シグナル基質を不活性なかさ高担体分子へ結合して「基質」にすることにより達成される。結合は、好ましくは当業者に知られる方法により化学的に行われる。
活性なプロテアーゼが包括されるαＭ2の穴の排除限界は約１０ｋＤである（Barrett, A., Methods in Enzymol. (1981) 80:737-754）。したがって、適切な不活性担体分子は１０ｋＤよりも大きく、例えばタンパク質、多糖、合成ポリマーが含まれる。好ましくは、不活性分子は良好な溶解性を有している。１つの好ましい不活性分子の群は、α2Ｍ分子の穴へ正しく適合しない大きさを有している。別の好ましい不活性分子の群は約４０ｋＤの大きさを有し、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有している。最も好ましいのは、約２０ｋＤのサイズを有し、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する不活性分子である。
適切かつ好ましいタンパク質は、商業的に入手可能であり、例えばオボアルブミン（Ｍr＝４５ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（Ｍr＝６７ｋＤ）、ヒト血清アルブミン（Ｍr＝６７ｋＤ）及び鶏卵白リゾチーム（Ｍr＝１４．４ｋＤ）である。
適切な多糖は数ｋＤ（そのため、α2Ｍ分子の穴には正しく適合しない）から５００ｋＤ超まで変化してもよいＭrを有する。そのような多糖の例はデキストランである。
【０００８】
適切な合成ポリマーには、数ｋＤから５００ｋＤ超まで変化するＭrを有する親水性の水溶性ポリマー、例えばポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド、ポリ塩化ビニル、ポリ（１−ビニルピロリドン−コ−アクリル酸）、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）等が含まれる。
本発明の目的に適切なシグナル基質は、容易に検出することができるが、プロテアーゼ／α2−マクログロブリン複合体では分割しない脱離基を有する化合物である。好ましくは、脱離基は、吸光度シグナル又は蛍光シグナルを与える。そのような脱離基の例には、それぞれ、ｐ−ニトロアニリド及び７−アミノ−４−クマリンが含まれる。
本発明の目的に適切な基質には、比較的小さいＭrを有するシグナル基質を十分な大きさを有する不活性分子へ結合することにより得られる化合物が含まれる。適切な基質の例には、Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミン（「ＯＡ−Ｓ２２８８」とも呼ばれる）、Ｈ−アラニル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチル−クマリンに結合したオボアルブミン（「ＯＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ」とも呼ばれる）及びＨ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミン（「ＯＡ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ」とも呼ばれる）が含まれる。別の適切な基質の例は、脱離基として１以上の水素イオンを遊離するシグナル基質に結合したオボアルブミンである。
前記の基質を使用してトロンビン生成曲線（ＴＧＣ）を測定するとき、一時的なトロンビンは特定の量の基質を加水分解し、その後、更なる加水分解は起こらないだろう。基質の量及びその動力学的特性は、好ましくは血漿（又はその他の媒体）中で生成する量のトロンビンが基質を完全に消費しないように選択される。形成した転換生成物の最終レベルは測定することができ、これはＴＧＣ下の表面（surface）に正比例する。これは内在性トロンビンポテンシャル（endogenous thrombin potential）（ＥＴＰ）と呼ばれる。
基質は、血液及びα2−マクログロブリンを含むその他の液体中のタンパク質分解酵素の生物学的に活性な形態を測定するために適切に使用することができる。重要な適用は、止血−血栓系（ＨＴＳ）の重要な機能の試験である、凝固血液中のトロンビンの生成及び消失である。
本発明は、血液及びその他の生物学的液体中の（生成した）トロンビンの評価について典型的に記載されかつ例示されるが、本発明の方法は、当業者にとって明らかな可能な変形及び改良を用いて、前記の生物学的液体中の、その他のタンパク質分解酵素の評価にも適していることが理解されるだろう。そのような他のタンパク質分解酵素には、活性化凝固因子、活性化線維素溶解因子及び補体系の活性化成分が含まれる。
本発明を以下の実施例によってより詳細に説明するが、全ての観点において本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０００９】
実施例１
凝固血液又は血漿中のトロンビン基質の加水分解
血液又は血漿へ、０．５ｍＭ  トロンビン基質を添加し、石灰化及び適切な引き金（本実施例において、典型的にはトロンボプラスチン）により血液凝固を開始する。図１は、インタイムの転換生成物の形成の理論曲線を示している。
曲線（−●−又は−○−）は、凝固血漿中のトロンビン基質の加水分解を示している。本発明者等は、トロンビン形成が、本明細書で言及する定数で式（ｉ）に現れると仮定する。形成したトロンビンは、ＡＴ及びα2Ｍの両方と反応するだろう。ＡＴ濃度は２．５μＭに設定し、α2Ｍは３．５μＭに設定する。ＡＴによるトロンビン不活性化の反応定数は２００００（Ｍ．ｓ）-1であり、α2Ｍによるトロンビン不活性化の反応定数は１４５０（Ｍ．ｓ）-1である。曲線を設計するために、数的方法（numerical method）を使用した。本発明者等は１ｓの工程を使用した。１ｓの後、トロンビンの量は、式（ｉ）により示されるように形成される。１〜２秒、この量のトロンビンは、ＡＴ及びα2Ｍと、前記の定数で決定される速度で反応するだろう。この秒間の後、いくつかのＡＴ−トロンビン複合体（ＡＴ−ＩＩａ）及びα2Ｍ−ＩＩａが形成する。この量はトロンビンの現在の量から減算されるが、新規のトロンビンが、この秒間において、式（ｉ）にしたがい形成する。２〜３秒間、新しい量のトロンビンはＡＴ及びα2Ｍ（両方とも複合体について修正される）と反応し、新規のＡＴ−ＩＩａ及びα2Ｍ−ＩＩａが形成し、あるトロンビンは不活性化される。この過程を１５分間のタイムスパンで繰り返す。したがって、本発明者等は、この過程で、ＡＴ−ＩＩａ及びα2Ｍ−ＩＩａの形成及びトロンビンの一時的増加、続くＡＴ及びα2Ｍによるトロンビンの完全な不活性化を観察する。
小さいトロンビン基質をこの混合物へ添加することにより、２つの新規な反応：遊離トロンビンによる及びα2Ｍ−ＩＩａによるＳの加水分解が誘導される。Ｓが大きい基質のとき、遊離トロンビンによっては加水分解されるが、α2Ｍ−ＩＩａによっては加水分解されないだろう。これらの反応はミカエリス−メンテンの動力学：加水分解速度＝［トロンビン］．ｋcat．Ｓ／（Ｋm＋Ｓ）にしがたうだろう。
【００１０】
加水分解生成物の量は、前記の数的手順を用いて計算される。曲線−●−の場合、Ｓは小さいトロンビン基質であり、曲線−○−の場合、Ｓは大きなトロンビン基質である。
トロンビン基質（Ｓ）は、Ｋm＝５００μＭ及びｋcat＝０．５ｓ-1でトロンビンにより加水分解される。更にα2Ｍ−ＩＩａはＳを加水分解し、曲線−●−の場合、Ｋm＝５００ｍＭかつｋcat＝０．５ｓ-1であり、曲線−○−の場合、Ｋm＝１Ｍかつｋcat＝０である（すなわち、Ｓは加水分解されない）。
本実施例では、前記の動力学についてモデル基質を使用している。実際の例においては、このモデルに近い基質が利用可能である。そのような基質の適切かつ好ましい例は、ＳＱ６８、Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、ＤＥＭＺ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ及びペタクローム（Petachrome）ＴＨ／ＳＲである。
前記の手順は、連続的にはモニターされないが、サンプルを３０秒毎に採取し、形成した転換生成物（●又は○により示される）を測定する点において、やや修飾された形態で通常は適用される。
小さいトロンビン基質を使用するとき、この手順は本発明の前にルーチン的に使用され、曲線は−●−により示されるように得られる。遊離トロンビンの作用により形成した転換生成物の量を決定するために、曲線を２つの部分：遊離トロンビンによる生成物の形成及びα2Ｍ−ＩＩａによる生成物の形成に分割した。遊離トロンビンによる生成物の形成は、すべてのトロンビンが不活性化されたときに停止するが、α2Ｍ−ＩＩａによる生成物形成は持続するだろう。このことは、曲線−●−の端における進行中の直線的生成物形成を説明している。測定したデータの収集物は、遊離トロンビンによる生成物形成についての１つのセット及びα2Ｍ−ＩＩａによる生成物形成についての１つのセットへ分割しなければならない。この手順について、数学アルゴリズムを開発した（Hemker, H.C., S. Wielders, H. Kessels 及び S. Beguin, Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. Thromb. Haemost. (1973) 70:617-624）。原理は以下の通りである。ｔ＝０のとき、トロンビン及びα2Ｍ−ＩＩａは存在せず、シグナルは０に設定される。ｔ＝０．５分（第二の測定データポイント）においては、トロンビン及びα2Ｍ−ＩＩａによる遊離トロンビンによるＳの加水分解により、増加したシグナルが測定される。このシグナルのフラクション（fraction）（ｋ×α2Ｍ−ＩＩａ濃度）は、α2Ｍ−ＩＩａによるものである。ｔ＝１分において、トロンビン及びα2Ｍ−ＩＩａの存在する量による遊離トロンビンによるＳの加水分解により、シグナルが増加する。この手順は、最終のデータポイントに到達するまで続く。理論的に誘導された曲線及び実際の観察結果から、曲線の端において、全ての遊離トロンビンが不活性され、シグナルの増加は完全にα2Ｍ−ＩＩａによるＳの加水分解によるものであるということを知る。曲線の最終部分が最小になる（すなわち、生成物の形成がインタイムで一定になる）ｋを選択することにより、データセットを、遊離トロンビンによるＳの加水分解によるシグナル（−○−）及びα2Ｍ−ＩＩａの作用によるシグナル（−▽−）に分割することができる。
遊離トロンビンにより生ずるシグナルは定常状態（plateau）（使用する方法について独立して、同一のままである）に達することが注目される。小さいトロンビン基質を適用するとき、上限は数学アルゴリズムを用いて決定しなければならない。しかしながら、本発明の大きいトロンビン基質を使用するとき、定常状態は、シグナルの最終レベルを解読することにより容易に決定することができる。
【００１１】
実施例２
α2Ｍ−ＩＩａ及びトロンビンによるオボアルブミン基質ＯＡ−Ｓ２２８８の加水分解
本実施例においては、オボアルブミンのＳ２２８８への結合により、基質は、α2Ｍ−ＩＩａにより加水分解される能力を失うが、トロンビンによっては加水分解されることを示す。この基質（ＯＡ−Ｓ２２８８）は、以下に示す方法により調製した。１ｍＭ  Ｓ２２８８、５０ｍＭ  炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）、２０ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン及び３．６ｍｌ／ｍｌ  ビス（スルホスクシンイミジル）基質（ＢＳ3）を含む反応混合物を調製した。この混合物を室温下で３０分間インキュベートし、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）を添加し、混合物を室温下で３０分間維持した。この混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（１６×１．６ｃｍ3）に適用し、３ｍｌ／分の速度で溶離した。溶離緩衝液は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．３５）であった。カラムから溶離した最初のピークは、Ｓ２２８８に結合したオボアルブミン（ＯＡ−Ｓ２２８８）を含んでいた。
ＯＡ−Ｓ２２８８に対するヒトトロンビン及びヒトα2Ｍ−ＩＩａのアミド溶解（amidolytic）活性を測定した。反応混合物は、２２μＭ  ＯＡ−Ｓ２２８８、５０ｎｍ  トロンビン又はα2Ｍ−ＩＩａ及び１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミン（ｐＨ７．９）を含んでいた。
図２では、形成した遊離ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の量（４０５ｎｍにおけるミリ吸光度で示す）を、時間に対してプロットする。反応温度は３７℃であった。灰色の曲線は測定データであり、黒色の線は、生成物がミカエリス−メンテン動力学にしたがい起こったと推定した適合により得られたものである。
インタイムの生成物形成は、Ｅ．ｋcat．Ｓt／（Ｋm＋Ｓt）（式中、Ｓtはインタイムの基質濃度（すなわち、もともと存在する基質濃度（Ｓ0）−形成した生成物又は分割した基質である。）であり、Ｅは基質を分割する酵素で、トロンビン又はα2Ｍ−ＩＩａのいずれかである。）として記載することができる。
以下の定数が見いだされた。Ｓ0＝２２ｍＭ、Ｋm＝１．４７μＭ及びｋcatはＥに対しては０．３１ｓ-1であり、α2Ｍ−ＩＩａに対しては０．００２ｓ-1であった。
【００１２】
実施例３
遊離トロンビン及びα２Ｍにより不活性化されたトロンビンによるオボアルブミン基質ＯＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣの加水分解
本実施例は、オボアルブミンの蛍光性基質Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣへの結合により、前記基質は、α２Ｍの穴に包括されたトロンビンによってもはや分割されないことを示す。図３は、遊離トロンビンは蛍光性基（ＡＭＣ）を分割するが、α２Ｍにより不活性化されたトロンビンは分割することができないことを示している。
オボアルブミンのＡｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣへの結合は、以下の通りに行った。１ｍｇ／ｍｌ  オボアルブミンのＰＢＳ（＝１０ｍＭ  リン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）溶液１ｍｌに、５０ｍＭ  ＢＳ3の１００％ジメチルスルホキシド溶液６μｌを添加した。混合物を室温下で６０分間インキュベートし、２Ｌ  ＰＢＳに対して２回（それぞれについて２時間）透析した。次いで、１００ｍＭ  Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣの５μｌを添加し、室温下で６０分間インキュベートした。最後に、サンプルを前記と同様（２Ｌ  ＰＢＳに対して２回）に透析した。
図３は、温度自動調節ブロック、３９０ｎｍ励起及び４６０ｎｍ発光フィルターを備えたＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｃｓｅｎｔでの蛍光測定の結果を示している。このアッセイは、９６ウェル  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ  Ｗ  「Ｕ」字底マイクロタイタープレート（Dynex, London, UK）の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０２％  アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０中、２５℃で行った。−○−の場合、容器は５．５μＭ  ＯＡ−ＡＲ−ＡＭＣ（オボアルブミンに結合したＡｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）及び８５ｎＭ  ヒトトロンビンを含み、−▽−の場合、５．５μＭ  ＯＡ−ＡＲ−ＡＭＣ及び６５μＭヒトα2Ｍ−ＩＩａを含んでいた。黒色のシンボル（−●−及び−▼−）は、基質がミカエリス−メンテン動力学にしたがいトロンビンにより加水分解されたとの仮定に適合させることにより得た。適合により、トロンビンによる加水分解について以下の定数：基質濃度Ｓ0＝５．５μＭ、Ｋm＝１．２μＭ及びｋcat＝３．３ｓ-1を見出した。α2Ｍ−ＩＩａによる加水分解について、既に誘導されたＳ0及びＫmが見出され、ｋcat＝０．００８ｓ-1であった。
【００１３】
実施例４
ＳＱ６８及びＯＡ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ｌｙｓ−ｐＮＡを用いた血漿中のＥＴＰの決定
図４を参照のこと。トロンビン生成を既報（Hemker, H.C., Wielders, S., Kessels, H., Beguin, S. Continuous Registration of Thrombin Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin Potential. Thromb. Haemost. (1993) 70:617-624, 及び Hemker, H.C. 及び Beguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential. Thromb. Haemost. (1995) 74:134-138）と同様にして測定した。
凝固血漿に、ＳＱ６８（●）又はＯＡ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（▼）（式中、Ｐｉｐはピペコリルである。）を添加して、ｐＮＡを形成した。ｐＮＡ形成を、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することによりモニターした。両方の場合において、基質濃度は０．５ｍＭであった。ＳＱ６８を用いて得られたデータセットを分析し、実施例１に記載のアルゴリズムを使用して、遊離トロンビンにより形成したｐＮＡ（丸の中に×印のあるシンボル）及びα2Ｍ−ＩＩａにより形成したｐＮＡ（▽）に分割した。
本発明の基質を使用したとき、実験データが極めて効率的な方法で得られ、このデータは、従来の基質に由来する曲線の複雑な数学的分析により得られたデータと同一の生物活性（すなわち、遊離トロンビンにより分割される基質の量）を直接的に示す。
本発明の好ましい態様のための修飾及び改変を、本発明の精神及び範囲から離れることなしに行うことができることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、小さいトロンビン基質及び大きいトロンビン基質の加水分解により、凝固血漿又は血液中で形成した加水分解生成物の理論曲線を示している。
【図２】  図２は、それぞれα2Ｍ−ＩＩａ及びトロンビンの加水分解による、オボアルブミンと結合した基質Ｓ２２８８の加水分解生成物の曲線を示している。
【図３】  図３は、それぞれ遊離トロンビン及びα2Ｍ−Ｍにより不活性化されたトロンビンの加水分解による、オボアルブミンと結合した蛍光性基質Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣの蛍光パターンを示している。
【図４】  図４は、ＳＱ６８及びＯＡ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ｌｙｓ−ｐＮＡを用いた血漿中のＥＴＰ測定の結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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