(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の1100 mg/mlまでのイホスファミドと、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンとを含み、２-メルカプトエタンスルホン酸を含まない、非経口投与用の低減された毒性を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物。
【請求項２】
2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン中のヒドロキシプロピル基によるモル置換が0.05〜2である、請求項１記載のイホスファミド組成物。
【請求項３】
2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン中のヒドロキシプロピル基によるモル置換が0.3〜1.5である、請求項１又は２のいずれかに記載のイホスファミド組成物。
【請求項４】
イホスファミド対2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンのモル比が100：0.1〜1：300である、請求項１〜３のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項５】
イホスファミド対2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンのモル比が100：1〜1：20である、請求項１〜４のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項６】
イホスファミド対2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンのモル比が100：3.3〜1：2.5である、請求項１〜５のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項７】
緩衝剤、等張化剤、防腐剤、キレート化剤、酸化防止剤、結晶化防止剤のような物質群から選ばれる製薬上許容し得る添加剤をさらに含む、請求項１記載のイホスファミド組成物。
【請求項８】
前記組成物のイホスファミド含有量が1〜200mg/mlである、請求項１〜７のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項９】
前記組成物のイホスファミド含有量が200〜500mg/mlである、請求項１〜８のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項１０】
前記組成物のイホスファミド含有量が500〜1000mg/mlである、請求項１〜８のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項１１】
前記組成物のpHが3.0〜9.0である、請求項１〜１０のいずれか１項記載のイホスファミド組成物。
【請求項１２】
前記緩衝剤が、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸、ヒスチジンヒドロクロライド、水酸化ナトリウム、塩酸及びこれらの混合物から選ばれる、請求項７記載のイホスファミド組成物。
【請求項１３】
前記緩衝剤が、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの混合物である、請求項１２記載のイホスファミド組成物。
【請求項１４】
下記の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載のイホスファミド組成物の製造方法：
i) イホスファミド、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン及び水を緊密に接触させる工程；
ii) 工程(i)の終了時に得られた組成物を滅菌性とする工程。
【請求項１５】
イホスファミド、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン及び水を緊密に接触させながら、必要量の製薬上許容し得る添加剤を添加することをさらに含む、請求項１４記載のイホスファミド組成物の製造方法。
【請求項１６】
前記組成物を、滅菌0.2μm滅菌級フィルターに通すことによって滅菌性とする、請求項１４〜１５のいずれか１項記載のイホスファミド組成物の製造方法。
【請求項１７】
前記滅菌組成物を滅菌容器に無菌的に移し、前記容器のヘッドスペース内の空気を不活性ガスによって掃気し、そして前記容器を密封する各工程をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項記載のイホスファミド組成物の製造方法。
【請求項１８】
組成物が1ミリリットルあたり、イホスファミド：50 mg、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン：100 mg、リン酸二水素ナトリウム：0.3 mg及びリン酸水素二ナトリウム：0.5 mgを含む、請求項１記載の非経口投与用の低減された毒性を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物。
【請求項１９】
組成物が1ミリリットルあたり、イホスファミド：500 mgと、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン：400 mgとを含む、請求項１記載の非経口投与用の低減された毒性
を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物。
【請求項２０】
組成物が1ミリリットルあたり、イホスファミド：1000 mgと、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン：50 mgとを含む、請求項１記載の非経口投与用の低減された毒性を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非経口用途用のイホスファミド組成物に関する。詳細には、本発明は、非経口投与用の、低減された毒性を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、イホスファミド以外に2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(以下、“HPBCD”と称する)を含むイホスファミド組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性疾病の治療において使用される２つの主要群の薬物は、アルキル化剤と代謝拮抗剤である。イホスファミドは、アルキル化剤群に属する広汎に使用されている抗新生物薬である。
イホスファミドは、化学的には、3-(2-クロロエチル)-2-[(2-クロロエチル)アミノ]-テトラヒドロ-2H-1,3,2-オキサザホスホリン-2-オキシドであり、下記の式によって示される：
【化１】
0004611029.tif 000002
イホスファミドは、40℃の低融点を有する白色結晶性の吸湿性粉末である。この粉末は、約100mg/mlの水溶解性を有する。
イホスファミドは、子宮頚部、子宮内膜、肺、卵巣、睾丸及び胸腺の癌のような種々の固形癌の治療において、さらにまた肉腫の治療及びバーキットリンパ腫の治療において使用される。
イホスファミドによる治療は、出血性膀胱炎、骨髄抑制、心不整脈、CNS障害、腎臓毒性、血液反応及び胃腸反応のような重篤な副作用を伴う。静脈内投与に対するマウスのLD50は、338 mg/kg体重と報告されている。尿路保護剤メスナとの併用は、出血性膀胱炎の発生率を減じている。従って、通常は、メスナを、イホスファミド投与量の20％の投与量で、時間ゼロ(イホスファミドの投与時)、その後、4時間及び8時間で静脈内投与している。
【０００３】
イホスファミドは、4％質量/容量未満のイホスファミドを含有する希釈溶液として、注射又は輸注のいずれかによって静脈内投与される。イホスファミドは加水分解に対して極めて感受性であり、従って、そのような溶液は迅速な投与を一般に必要とする。従って、商業的には、イホスファミドは、主として乾燥形で入手し得、投与前に注射用水中に溶解させるための滅菌包装乾燥粉末として供給される。しかしながら、イホスファミドの低融点及び吸湿性は、該粉末を高度に注意して充填し、正確に制御された温度と湿度を保って滅菌製品を得ることを必要とする。さらに、乾燥粉末の長期保存も焼結化及び黄変化をもたらし、換言すれば、溶解速度の低下に至り、それによって再構成に要する時間を増大させる。
熱及び加水分解感受性に関連する困難性を克服するために、上記薬物の凍結乾燥が試みられている。しかしながら、凍結乾燥法は、特別な装置を必要とする全くの時間消費性である。凍結乾燥粉末の再構成中に起きる強い細胞毒性イホスファミドに対する人的暴露は、望ましいものではない。
従って、非経口投与用の一定期間安定である透明な液体イホスファミド組成物を調製する試みがなされている。
米国特許第4952575号は、96％〜100％のエタノールを含有するイホスファミドのエタノール系溶液の調製を開示している。イホスファミドの分解が最小限であることが証明されているにもかかわらず、そのような高濃度での溶媒の使用は、揮発性、製造中の取扱い性、投与時の血液との混和性のような他の問題をもたらす。そのように、アルコールは、薬理学的に活性であり、イホスファミドのアルコール溶液の投与時にも人に影響を及ぼし得る。
【０００４】
オキサゾホスホリン化合物の安定な液体組成物を製造するのにポリオール類を使用する２つの特許が存在する。
即ち、米国特許第4879286号は、シクロホスファミドを即希釈性溶液中に配合する発明を開示している。この発明は、溶媒としての有機ポリオール類、即ち、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物を、さらにまた0〜50％の水を使用している。水は、10〜30％のエタノールで部分的に置換え得る。
WO 0202125号は、イホスファミド、溶媒、並びに任意成分としての通常の製薬用担体及び賦形剤類を含む非経口投与用の液体製薬組成物を開示している。該発明によれば、溶媒は、35〜75％の低級アルコールと25〜65％のポリオールを含む。低級アルコール溶媒は通常エタノールであるが、ポリオール溶媒は、プロピレングリコール、グリセリン及び/又はポリエチレングリコールである。
米国特許第4879286号及びWO 0202125号の両特許においては、多めの量のポリオール類及びアルコール類の非経口投与は、注射時の疼痛又は刺激、溶血、中毒性難聴、心臓血管作用、CNS作用及び発作のような他の問題をもたらしている。また、この投与は、腎臓機能障害を有する患者においては高浸透圧血症及び乳酸アシドーシスももたらしている。
WO 9918973号は、塩化ナトリウムを安定化剤として使用するイホスファミドの安定な即使用液体を記載している。また、該発明は、尿素、塩化ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含有する10〜500 mg/mlイホスファミド組成物も開示している。該発明の組成物は安定であると説明されているが、該組成物の安全性と毒性については触れられていない。製剤中の高めの濃度の尿素は、溶血、刺激、注射部位での静脈炎及び血栓症、並びに肝臓及び腎臓機能障害を有する患者における血液アンモニア及び尿素濃度の上昇のような合併症をもたらす可能性がある。
WO 03/051297A2号は、製薬上許容し得る緩衝液中に40〜400 mM (10〜100 mg/ml)のイホスファミドを含む即使用水性組成物を記載している。該特許は、好ましくはNa2HPO4とNaH2PO4及びK2HPO4とKH2PO4の群からの緩衝剤の使用を示唆している。該特許に開示されたイホスファミド組成物の毒性についての報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、投与中の取扱いを容易にする安定な濃厚イホスファミド溶液が求められている。さらに、現在入手し得る組成物よりも低い毒性を示すイホスファミド製薬組成物も求められている。
即ち、本発明の主目的は、人及び他の哺乳類における非経口投与用の低減された毒性を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物を開発することである。
本発明のもう１つの目的は、そのような組成物の製造方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は、組成物の1100 mg/mlまでのイホスファミドと、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンとを含む非経口投与用の低減された毒性を有する安定で透明な水性イホスファミド組成物を提供する。
また、本発明は、下記の各工程を含むことを特徴とする、非経口投与用の低減された毒性を有するイホスファミド組成物の製造方法も提供する：
i) イホスファミド、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン及び水を緊密に接触させる工程；
ii) 工程(i)の終了時にそのようにして得られた組成物を滅菌性とする工程。
本発明の方法においては、イホスファミド、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン及び水を緊密に接触させながら、必要量の製薬上許容し得る添加剤を添加し得る。
緊密接触は、攪拌、混合、超音波処理、加熱、均質化のような方法によってもたらし得る。好ましくは、緊密接触は、無菌条件下及び不活性ガス雰囲気下において、40℃未満の温度で実施する。
さらに、本発明は、１種以上の製薬上許容し得る緩衝剤、等張化剤、防腐剤、キレート化剤、酸化防止剤、結晶化防止剤の添加も提供する。
また、本発明は、上記組成物を、好ましくは滅菌0.2μm滅菌級フィルターに通し、滅菌組成物を滅菌容器に無菌的に移し、その後、上記容器のヘッドスペース内の空気を窒素のような不活性ガスによって掃気し、そして上記容器を密封することによって滅菌性とすることも意図する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において開示する組成物中のイホスファミド含有量は、1100 mg/mlまでであり、好ましい範囲は1 mg/ml〜200 mg/mlであり、より好ましくは10 mg/ml〜100 mg/ml、最も好ましくは40 mg/ml〜50mg/mlである。本発明において開示する組成物中のイホスファミド含有量の他の好ましい範囲は、200 mg/ml〜500 mg/ml及び500 mg/ml〜1000 mg/mlである。
濃厚イホスファミド組成物においては、イホスファミド含有量は、200 mg/ml〜1100 mg/ml、好ましくは200 mg/ml〜1000 mg/ml、より好ましくは500 mg/ml及び1000mg/mlである。
2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HPBCD)は、ベータシクロデキストリンの部分置換ポリ(ヒドロキシプロピル)エーテルである。ヒドロキシプロピル基は上記シクロデキストリンのヒドロキシル基上にランダムに置換されており、その置換量は、平均置換度即ちシクロデキストリン当りのヒドロキシプロピル基数として報告される。また、置換量は、モル置換(MS)即ちシクロデキストリン環内のアンヒドログルコース単位当りの平均置換数としても報告される。モル置換は、HPBCDへのゲスト分子の結合性に対する効果を有し得る。低置換度においては、結合性は、未修飾ベータシクロデキストリンの結合性に極めて類似している。モル置換を増大させると、立体障害に基づく弱まった結合性がもたらされ得る。0.05〜約2のモル置換を有するHPBCDが本発明においては有用であり得る。0.3〜約1.5のモル置換を有するHPBCDが好ましく、0.5〜約1.2のモル置換を有するHPBCDはより好ましい。
HPBCDは、上記組成物中に、イホスファミド対HPBCDのモル比 100：0.1〜1：300、好ましくは100：0.25〜1：100、より好ましくは100：1〜1：20で存在し得る。イホスファミド対HPBCDの他の好ましいモル比は、100：3.3〜1：2.5である。
濃厚イホスファミド組成物を製造する場合、HPBCDの必要量は、イホスファミド濃度によって変動し得る。初期においては、HPBCD量はイホスファミド濃度と共に増大する。しかしながら、イホスファミド濃度の高い方の限界では、HPBCDと水との含有量は、容量限界によって制限される。従って、イホスファミド対HPBCDの比は、正しく選択すべきである。
本発明の組成物のpHは、3.0〜9.0であり得る。本発明における好ましいpHは、5.0〜8.0である。
【０００８】
また、本発明の組成物は、製薬上許容し得るpH安定化、防腐、等張性調節、酸化に対する安定化を目的とする添加剤、キレート化剤、結晶化防止剤及び他の適切な添加剤も含有し得る。幾つかの製薬上許容し得る添加剤は、イホスファミドとHPBCDを添加する及び/又は幾つかの製薬上許容し得る添加剤を、水中溶液として、最終組成物容量を構成させる前に別々に添加し得る水溶液中に存在し得る。
本発明の組成物は、pHを調整する又は安定化させるための適切な緩衝剤を必要とし得る。本発明の組成物における適切な緩衝剤としては、限定するものではないが、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ヒスチジンヒドロクロライド、水酸化ナトリウム、リン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、グリシン、クエン酸カリウム、塩酸及び水酸化カリウムのような通常使用される化合物又は化合物の混合物のいずれを含有するリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ヒスチジン緩衝液がある。好ましい緩衝剤は、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの混合物である。
他の製薬上許容し得る添加剤のうちで、本発明の組成物における適切な等張化剤は、グリセリン、塩化ナトリウム、マルトース、マンニトール、デキストロース及びこれらの混合物のような化合物の群から選択する。
同様に、本発明の組成物における適切な防腐剤としては、限定するものではないが、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、フェノール、ベンジルアルコール及び安息香酸ナトリウムがある。
本発明の組成物は、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)及びその塩並びにデスフェロキシミンメタンスルホネート(デスフェラル(Desferal))のような適切なキレート化剤を含有し得る。
また、本発明の組成物は、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール及びブチル化ヒドロキシトルエンのような適切な酸化防止剤も含有し得る。
【０００９】
また、本発明の組成物は、グリセリンのような物質も結晶化防止剤として含有し得る。
イホスファミドとHPBCDを含有する水溶液は、攪拌、混合、超音波処理、加熱、均質化のような方法によって緊密に接触させ得る。非経口投与量剤形による必要に応じての緩衝剤、等張化剤、防腐剤、キレート化剤、酸化防止剤、結晶化防止剤のような製薬上許容し得る添加剤は、イホスファミド及びHPBCDを添加する水溶液中に存在し得る。また、これらの製薬上許容し得る添加剤は、容量を構成する前に、水中溶液として別々に添加してもよい。濃厚イホスファミド組成物の製造においては、多めの量のイホスファミドを混入するために、HPBCDを最少量の水に溶解し、イホスファミドを緊密な攪拌により可溶化させる。必要な場合の製薬上許容し得る添加剤は、そのまま又は溶液として、イホスファミド-HPBCD溶液中に添加する。最後に、残りの量の水を添加して必要容量を構成し、次いで混合して均質溶液を得、その後、そのようにして得た組成物を滅菌性とする。該組成物は、必要に応じて、滅菌前にTangential Flow Filtration System (TFF)に通すことによって非発熱性とし得る。
上記組成物は、通常、滅菌級フィルターに通すことによって滅菌性とする。好ましくは、0.2μm滅菌級フィルターを使用し得る。
本発明の滅菌組成物は、バイアル、アンプル、プラスチック容器のような滅菌容器中に無菌的に充填し、容器のヘッドスペース内の空気を窒素のような不活性ガスで掃気し、充填容器を密封し得る。
理論によって拘束するものではないが、本発明者等は、上記イホスファミド、HPBCD及び水の３成分系は、安定な水性組成物であると信じている。そのような系は、種々の温度及び時間に亘る溶解性、複合体形成及びカプセル化のような種々の局面について現在研究中である。さらに、系の安定性に対する他の添加剤の効果も研究中である。
【００１０】
イホスファミドによる治療が出血性膀胱炎のような重篤な副作用を伴うことは周知であり、これに対抗するために、メスナをイホスファミド注入と一緒に常に投与している。しかしながら、今日現在入手し得るイホスファミド組成物による、管理されていない骨髄抑制、心不整脈、中枢神経系(CNS)障害、腎臓毒性、血液反応及び胃腸反応のような他の副作用が存在する。
本発明の組成物の毒性を、市場において入手し得る通常の投与量剤形(Holoxan)に対して比較した。スイス白マウス(swiss albino mouse)において試験したときの本発明の組成物は、低めの痙攣、骨髄抑制、肝臓毒性のような毒性作用を示していた。死亡率は、通常の市販製品と比較して、本発明の組成物で処置した動物においては有意に低いことが判明した。試験した各組成物のLD50値は、例において示している。
理論によって拘束するものではないが、本発明者等は、イホスファミド全体又はその１部が水溶液中のHPBCDキャビティー内で複合体化されているものと信じている。全身投与時に、上記薬物は、上記のキャビティーから血液流中に放出される。遊離薬物と薬物-HPBCD複合体とは平衡にあり、遊離イホスファミドの代謝により、上記の平衡がシフトして遊離薬物の放出をもたらす。複合体形のイホスファミドの存在及び血液中の遊離薬物の最適レベルは、イホスファミドと健常組織及び器官との相互作用を阻止し、それによって望ましくない副作用を予防し得る。
本発明においては、イホスファミドとHPBCDは、相乗的組合せを形成して、マウスにおけるLD50値及びラットにおける出血性膀胱炎試験によって示されるように、メスナの存在及び不存在の双方において低減された毒性を与える。低減された毒性を有する本発明のイホスファミド組成物は、子宮頚部、子宮内膜、肺、卵巣、睾丸及び胸腺の癌のような種々の固形癌の治療において、さらにまた肉腫の治療及びバーキットリンパ腫の治療において利点を有する。
イホスファミドの水中溶解性は、約100mg/mlである。本発明の方法は、100mg/mlよりも高い濃度でイホスファミドを含有する組成物の取得を可能にする。100mg/ml〜1100mg/mlを含有するこれらの濃厚溶液は、少ない取扱い、それによる投与中の細胞毒性イホスファミドへの臨床医師等の暴露の低さ及び無菌性担保の増大による安全性のようなさらなる利点を提供する。
【００１１】
実施例：
以下、本発明を例により具体的に説明する。以下の例は、例示目的のみであり、何ら本発明の範囲を限定するものではない。
これらの例において使用したイホスファミドは、米国薬局方仕様に従う非経口級であった。使用した2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HPBCD)は、Wacker Chemie社製であり、0.5〜1.2のヒドロキシプロピル基によるアンヒドログルコース単位当りモル置換を有していた。使用した装置は、通常使用されるものであった；処理全体を制御された環境を有する領域内で実施した。これらの例において使用した水は、“注射用水”仕様に従う非経口級であった。これらの例において使用した他の添加剤は、すべて非経口級であった。
例１
水中の20％HPBCD含有イホスファミド50mg/ml組成物の調製
下記の組成物を、以下に示す手順により調製した：
i.   イホスファミド    10gm
i.   HPBCD             40gm
ii.  水                200mlとする十分量
秤量した量のHPBCDを150mlの水中に溶解させた。秤量した量のイホスファミドを添加し、3時間混合した。容量を水により200mlまでにし、混合した。得られた溶液を0.2μフィルターにより濾過し、滅菌ガラスバイアル中に無菌的に充填した。各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフ(flip off)シールを使用して密封した。この例において得られた組成物を高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)法によりイホスファミド含有量について分析し、51.73mg/mlのイホスファミドを含有していることが判明した。該組成物は、6.5のpHを有していた。
例２
例１の組成物の安定性
例１で得られた組成物を2〜8℃での長時間安定性試験に供した。24ヶ月終了時での安定性データを表１に示す。
表１：例１の組成物の安定性データ
0004611029.tif 000003
上記のデータは、イホスファミド含有量のごくわずかな低下を示しており、良好な安定性を示唆している。
【００１２】
例３
例１の組成物の毒性試験
例１で得られた組成物を、マウスにおける急性毒性試験に供した。
試験細目は、下記の通りである：
使用動物：            雌雄どちらかのスイス白マウス
動物体重範囲：        20〜22gm
群数：                10
群当りの動物数：      10
環境順化：            制御された温度及び湿度下での試験条件下で1週間
試験物質：            イホスファミド注射液
本質：                例１の組成物
性状：                透明無色溶液
投与経路：            静脈内
比較物質：            HoloxanTM (再構成)
本質：                イホスファミド注射液米国薬局方
ロット番号：          G220
製造日：              2001年10月
有効期限：            2003年9月
性状：                注射用水による再構成用の乾燥粉末
力価：                再構成時で40mg/ml
製造業者：            German Remedies社
投与経路：            静脈内
両薬物溶液を5％デキストロース注射液で適切に希釈し、静脈内投与した。400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg及び800mg/kg体重の投与量のイホスファミドを、各群10匹の動物からなる異なる10群の動物において投与した。
各動物を14日間の観察下に置き、死亡率を7日目終了時に記録した。LD50投与量、即ち、動物の50％に対し致死性である投与量を表２に示す。
表２：例１の組成物とHoloxanTMのLD50投与量
0004611029.tif 000004
上記のデータは、例１の組成物が通常の製剤に比較して低い毒性であることを明白に示唆している。
【００１３】
例４
リン酸緩衝液中で10％のHPBCDを含有するイホスファミド組成物の調製
下記の組成物を、以下に示す手順により調製した：
i.   イホスファミド            10g
ii.   HPBCD                    20g
iii   リン酸水素二ナトリウム    0.1g
iv.   リン酸二水素ナトリウム    0.06g
v.    水                      200mlとする十分量
秤量した量のリン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを160mlの水中に溶解させた。秤量した量のHPBCDをこの緩衝溶液中に添加し、攪拌下にゆっくり溶解させた。秤量した量のイホスファミドを上記緩衝化HPBCD溶液に攪拌下に漸次添加し、3時間混合した。容量を水で200mlまでにし、混合した。得られた溶液を0.2μフィルターにより濾過し、滅菌ガラスバイアル中に無菌的に充填した。各バイアルのヘッドスペース内の空気を窒素で掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。
この例において得られた組成物を高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)法によりイホスファミド含有量について分析し、50.23mg/mlのイホスファミドを含有していることが判明した。該組成物は、7.2のpHを有していた。
【００１４】
例５(比較例)
リン酸緩衝液中のイホスファミド50mg/ml組成物の調製
毒性試験によりHPBCDの毒性低減性を確認するために、緩衝液中にイホスファミドを含有する比較用組成物を以下に示す手順によって調製した：
i.   イホスファミド            10g
ii   リン酸水素二ナトリウム     0.1g
iii.  リン酸二水素ナトリウム    0.06g
vi.  水                       200mlとする十分量
秤量した量のリン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを180mlの水中に溶解させた。秤量した量のイホスファミドを上記緩衝溶液に攪拌下に漸次添加し、3時間混合した。容量を水で200mlまでにし、混合した。得られた溶液を0.2μフィルターにより濾過し、滅菌10mlガラスバイアル中に無菌的に充填した。各バイアルのヘッドスペース内の空気を窒素ガスで掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。
この例において得られた組成物を高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)法によりイホスファミド含有量について分析し、50.1mg/mlのイホスファミドを含有していることが判明した。該組成物は、6.5のpHを有していた。
【００１５】
例６
例４と例５の急性毒性試験
試験細目は、下記の通りである：
使用動物：            雌雄どちらかのスイス白マウス
動物体重範囲：        20〜22gm
群数：                25
下位群当りの動物数：  8
環境順化：            制御された温度及び湿度下での試験条件下で1週間
試験物質：            イホスファミド注射液
本質：                例４の組成物
性状：                透明無色溶液
投与経路：            静脈内
比較物質１：          イホスファミド注射液
本質：                例５の組成物
性状：                透明無色溶液
投与経路：            静脈内
比較物質２：            HoloxanTM (再構成)
(HoloxanTMの詳細は、例３に示している)。
尿路保護物質：          UromitexanTM
本質：                  メスナ注射液
ロット番号：            G 168
製造日：                2001年10月
有効期限：              2004年9月
性状：                  静脈内注射用の透明無色溶液
力価：                  100mg/ml
製造業者：              German Renedies社
投与経路：              静脈内
【００１６】
例４と例５で得られた各組成物を、マウスでの急性毒性試験に供した。常用製剤のHoloxanTMを製造業者の指示通りに再構成し、対照として使用した。試験において選定したイホスファミド投与量は、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg及び800mg/kg体重であった。例４、例５及びHoloxanTMの各組成物のイホスファミド溶液を、そのままの5％デキストロース注射液によりさらにまたイホスファミド投与量の20％の投与量のメスナにより適切に希釈し、各群8匹の動物からなる異なる25群の動物において静脈内投与した。
各動物を14日間の観察下に置き、死亡率を7日目終了時に記録した。例４、例５及びHoloxanTMの各組成物のLD50値を表３に示す。
表３：例４、例５及びHoloxanTMの各組成物のLD50値
0004611029.tif 000005
上記のデータは、例４の組成物が、通常製剤及び緩衝化溶液中のイホスファミドと比較して、メスナの存在及び不存在の双方において低い毒性であることを明白に示唆している。
【００１７】
例７
例４の組成物の繰返し投与量毒性試験
例４で得られた組成物を、通常製剤のHoloxanTMと共に、マウスにおける繰返しの投与量毒性試験に供して、血液学及び生化学パラメーターに対するイホスファミド組成物の効果を評価した。
試験細目は、下記の通りである：
使用動物：            雌雄どちらかのスイス白マウス
動物体重範囲：        20〜22gm
群数：                7
群当りの動物数：      10
環境順化：            制御された温度及び湿度下での試験条件下で1週間
試験物質：            例４の組成物
比較物質：            HoloxanTM (再構成)
尿路保護物質：        UromitexanTM
(HoloxanTMとUromitexanTMの詳細は、例６に示している)。
各動物に、イホスファミドを、メスナ(イホスファミド投与量の20％として)と一緒に、80mg/kg、100mg/kg及び120mg/kgの投与日量で7日間静脈内注射した。未処置群は、対照として使用した。各動物を、14日の試験期間の間、死亡率、血液学及び生化学変化について観察した。総WBC計数は、例４の組成物及びHoloxanTMによる処置の前後で実施した。値を表４に示す。
表４：例４の組成物及びHoloxanTMにより処置した動物の総WBC数
0004611029.tif 000006
例４及びHoloxanTMで処置した動物は、総WBC数の低下を示していた。しかしながら、HoloxanTMで処置した動物は、例４の組成物に比較して、重篤な白血球減少症を示した。このことは、例４の組成物の低い毒性を示唆している。
【００１８】
例４の組成物とHoloxanTMの肝機能に対する作用を試験するために、処置群及び未処置対照群の血清グルタメートオキサロアセテートトランスアミナーゼ(SGOT)値を分析した。処置群及び未処置対照群のSGOT値を表５に示す。
表５：例４の組成物、HoloxanTMによる処置動物及び未処置対照の平均SGOT値
0004611029.tif 000007
上記のデータのとおり、例４により処置した動物におけるSGOT値の上昇は対照群の上昇よりも僅かに高かったのに対し、HoloxanTMで処置した動物においては、SGOT値の上昇は、極めて顕著であった。このことは、例４の組成物の低減された肝臓毒性を示唆している。
【００１９】
例８
組成物４の出血性膀胱炎試験
例４で得られた組成物を、通常製剤のHoloxanTMと共に、ラットにおける出血性膀胱炎試験に供してそれらの膀胱毒性を評価した。
試験細目は、下記の通りである：
使用動物：            雌雄どちらかのウィスターラット
動物体重範囲：        100〜150gm
群数：                9
群当りの動物数：      2
環境順化：            制御された温度及び湿度下での試験条件下で1週間
試験物質：            例４の組成物
比較物質：            HoloxanTM (再構成)
尿路保護物質：        UromitexanTM
(HoloxanTMとUromitexanTMの詳細は、例６に示している)。
試験設計：
動物を9群に分割し、各群が2匹の動物を含んでいた。単独及びメスナと一緒のイホスファミドを、400mg/kg及び500mg/kg体重の投与量で、静脈内経路により投与した。デキストロース注射液による処置群は、対照として使用した。
各動物は、注射後24時間で殺処分した。全動物の膀胱を集め、10％ホルマリン中で48時間固定した。該器官の組織病理学スライドを調製し、顕微鏡検査に供した。
【００２０】
観察：
表６は、２つのイホスファミド製剤の出血性膀胱炎についての評価結果を示している。
表６：出血性膀胱炎の採点
0004611029.tif 000008
N：正常
1+：軽微な出血性膀胱炎
2+：上皮異型を伴う又は伴わない中度の出血性膀胱炎
3+：上皮異型を伴う又は伴わない重篤な出血性膀胱炎
結果：
Holoxan：                  中度ないし重篤な出血性膀胱炎
メスナと一緒のHoloxan：    軽微ないし中度の出血性膀胱炎
例４：                     軽微ないし中度の出血性膀胱炎
メスナと一緒の例４         出血性膀胱炎無し
結論：
上記の知見は、結論として、例４の組成物が通常製剤のHoloxanTMよりも低い膀胱毒性を有していることを証明している。
【００２１】
例９
例４の組成物の安定性試験
例４で得られた組成物を2℃〜8℃での安定性試験に供した。6ヶ月及び12ヶ月終了時点でのサンプルをHPLC法により分析した。データを表７に示す。
表７：例４の組成物の安定性データ
0004611029.tif 000009
上記のデータは、2℃〜8℃でのイホスファミド含有量の有意でない低下を示しており、12ヶ月の期間に亘っての良好な安定性を示唆している。
【００２２】
種々の濃度のイホスファミドとHPBCDを含む本の他の組成物を表８に示す。
表８：本発明の他の組成物
0004611029.tif 000010
表８に示した組成物は、以下に示す手順により調製した。
【００２３】
例１０
イホスファミド(10g)とHPBCD(40g)、リン酸水素二ナトリウム(0.1g)とリン酸水素ナトリウム(0.06g)を目盛り付きフラスコ中に採取した。注射用水をフラスコ中に断続混合しながらゆっくり添加して200mlの透明均質溶液を得た。得られた溶液を滅菌0.2μmフィルターに通し、滅菌10mlガラスバイアル中に無菌的に充填した。ヘッドスペース内の空気を窒素ガスによって掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。
例１１
イホスファミド(10g)とHPBCD(80g)、リン酸水素二ナトリウム(10mlの水中0.1g)とリン酸水素ナトリウム(10mlの水中0.06g)を目盛り付きフラスコ中に採取した。注射用水をフラスコ中に断続混合しながらゆっくり添加して200mlの透明均質溶液を得た。得られた溶液を滅菌0.2μmフィルターに通し、滅菌10mlガラスバイアル中に無菌的に充填した。ヘッドスペース内の空気を窒素ガスによって掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。
例１２
HPBCD(20g)を40mlの水中に溶解させた。このHPBCD濃厚溶液に、イホスファミド(10g)を漸次的に添加し、混合物を適度の速度で1時間攪拌した。その後、透明溶液を水で200mlに希釈した。得られた溶液を0.2μmフィルターにより濾過し、滅菌10mlガラスバイアル中に無菌的に充填した。バイアルのヘッドスペース内の空気を窒素ガスによって掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。
例１３
組成物を、例４の手順に従い、表８に示した量の各成分を使用して調製した。
【００２４】
例１４
HPBCD(40g)を80mlの水中に溶解させた。このHPBCD濃厚溶液に、イホスファミド(100g)を漸次的に添加し、攪拌により溶解させた。容量を水で200mlまでにし、混合した。得られた溶液を0.2μmフィルターにより濾過し、滅菌10mlガラスバイアル中に無菌的に充填した。バイアルのヘッドスペース内の空気を窒素ガスによって掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。この例の組成物をイホスファミド含有量についてHPLCにより分析したところ、500.3mg/mlのイホスファミドを含有していることが判明した。
例１５
組成物を、例１４の手順に従い、表８に示した量の各成分を使用して調製した。この例の組成物をイホスファミド含有量についてHPLCにより分析したところ、500.28mg/mlのイホスファミドを含有していることが判明した。
例１６
イホスファミド(200g)とHPBCD(10g)を目盛り付きフラスコ中に採取した。注射用水をフラスコ中に断続混合しながらゆっくり添加して200mlの透明均質溶液を得た。得られた溶液を滅菌0.2μmフィルターに通し、滅菌10mlガラスバイアル中に無菌的に充填した。ヘッドスペース内の空気を窒素ガスによって掃気し、各ガラスバイアルを滅菌テフロン（登録商標）コーティングゴム栓で無菌条件下に閉じ、フリップオフシールを使用して密封した。この例の組成物をイホスファミド含有量についてHPLCにより分析したところ、1025.5mg/mlのイホスファミドを含有していることが判明した。