(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌属（Streptococcus ）および関連する４つの属であるエンテロコッカス属（Enterococcus）、双子菌属（Gemella ）、アビオトロフィア属（Abiotrophia ）、およびグラニュリカテラ属（Granulicatella）の細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片であって、
その配列が、
配列番号８〜３５からなる配列およびその相補配列のうちの一つからなることを特徴とする、ｒｐｏＢ遺伝子断片。
【請求項２】
連鎖球菌属およびその関連する４つの属であるエンテロコッカス属（Enterococcus）、双子菌属（Gemella ）、アビオトロフィア属（Abiotrophia ）、およびグラニュリカテラ属（Granulicatella）の細菌の種に特異的な配列からなり、かつ該連鎖球菌属および該その関連する４つの属を特異的に同定するための種プローブとして機能するオリゴヌクレオチドであって、配列番号８〜３５の配列のうちの１つに含まれる、少なくとも２０〜１００個の連続したヌクレオチドからなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを有する請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
（ｉ）以下の配列番号６および７の配列、すなわち
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’、および
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
−Ｎはイノシンまたは４種類のヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧのうちの１つであり、
−ＲはＡまたはＧであり
−ＭはＡまたはＣであり、
−ＹはＣまたはＴである）
からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号６または配列番号７のうちの１５個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を少なくとも１つ含み、前記連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の属を特異的に同定するための増幅プライマーまたは属プローブとして機能するオリゴヌクレオチド。および
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドの相補配列、
から選択されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、前記オリゴヌクレオチドの全てが異なる配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドがいずれも配列番号６に含まれる配列を含むか、またはいずれも配列番号７に含まれる配列を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項６】
請求項５に記載の３２種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、前記オリゴヌクレオチドが異なる配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドがそれぞれ、以下の配列：
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’
（ここで、
−ＲはＡまたはＧであり、
−ＹはＣまたはＴであり、
−ＭはＡまたはＣであり、
−ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである）、
およびその相補配列に含まれる少なくとも１８個の連続したヌクレオチドモチーフを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項７】
請求項５に記載の８種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、前記オリゴヌクレオチドが異なる配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドがそれぞれ、以下の配列：
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’
（ここで、
−ＲはＡまたはＧであり、
−ＹはＣまたはＴであり、
−ＭはＡまたはＣであり、
−Ｎはイノシンである）、
およびその相補配列に含まれる少なくとも１８個の連続したヌクレオチドモチーフを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項８】
請求項５に記載の１６種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、前記オリゴヌクレオチドが異なる配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドがそれぞれ、以下の配列：
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
−ＲはＡまたはＧであり、
−ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである）
およびその相補配列に含まれる少なくとも２１個の連続したヌクレオチドモチーフを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項９】
請求項５に記載の４種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、前記オリゴヌ
クレオチドが異なる配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドがそれぞれ、以下の配列：
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
−ＲはＡまたはＧであり、
−Ｎはイノシンである）
およびその相補配列に含まれる少なくとも２１個の連続したヌクレオチドモチーフを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項１０】
前記配列が配列番号６および７の配列（ここで、Ｎはイノシンである）またはその相補配列からなることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項１１】
前記連鎖球菌属および前記その関連する４つの属の細菌のための増幅プライマーまたは属プローブとしての、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物の使用。
【請求項１２】
連鎖球菌属および関連する４つの属であるエンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属の細菌を検出するための分子レベルの同定による検出方法であって、
請求項４〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物
がプライマーまたはプローブとして使用されることを特徴とする検出方法。
【請求項１３】
連鎖球菌属および関連する４つの属であるエンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属の細菌を検出するための方法であって、
以下の工程：
１−請求項６〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの混合物を含む少なくとも１つの属プローブを、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の少なくとも１つの細菌の核酸を含む標本または該核酸を含んでいる可能性のある標本と接触させる工程、ならびに
２−前記属プローブと標本の核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成されるか否かを決定することにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合、標本中の前記細菌の存在が確認される工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
連鎖球菌属および関連する４つの属であるエンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属の細菌を検出するための検出方法であって、
以下の工程：
１−請求項６〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの混合物を含む増幅プライマーを、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の少なくとも１つの細菌の核酸を含む標本または該核酸を含んでいる可能性のある標本、ならびに
−５’プライマーとして、請求項５、６、７、または１０のいずれか１項に記載の配列番号６の配列に含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物、および
−３’プライマーとして、請求項５、６、７、または１０のいずれか１項に記載の、配列番号７の配列に含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物
と接触させる工程と
２−核酸を酵素的重合反応によって増幅させて増幅産物が存在するか否かを決定することにより、増幅産物が生じる場合、標本中の前記細菌の存在が確認される工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
ストレプトコッカス−ミュータンス、ストレプトコッカス−オラーリス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、唾液連鎖球菌、ストレプトコッカス−サングイニス、ストレプトコッカス−スイス、ストレプトコッカス−アシドミニマス、ストレプトコッカス−アガラクティエ、ストレプトコッカス−アンギノーサス、ストレプトコッカス−コンステラータス、ストレプトコッカス−ディフィシリス、ストレプトコッカス−ディスガラクティエ、ストレプトコッカス−エクイ、ストレプトコッカス−エクイナス、ストレプトコッカス−インターメジウス、ストレプトコッカス−ミチス、ストレプトコッカス−ボビス、ストレプトコッカス−アラクトリティカス、ストレプトコッカス−ガロリティカス、ストレプトコッカス−マセドニカス、ストレプトコッカス−インファンタリウス、ストレプトコッカス−ホミニス、グラニュリカテラ−アドジャセンス、アビオトロフィア−デフェクティバ、エンテロコッカス−アビウム、エンテロコッカス−カセリフラブス、エンテロコッカス−フェカーリス、エンテロコッカス−フェシウム、エンテロコッカス−ガリナラム、エンテロコッカス−サカロリティカス、ゲメラ−ヘモリザンス、およびゲメラ−モルビロラムから選択される、連鎖球菌属およびその関連する４つの属であるエンテロコッカス属（Enterococcus）、双子菌属（Gemella ）、アビオトロフィア属（Abiotrophia ）、およびグラニュリカテラ属（Granulicatella）の細菌の特定の種を検出するための方法であって、連鎖球菌属（Streptococcus）の少なくとも１つの細菌の核酸を含む、または含んでいる可能性のある標本において、以下の工程：
ａ）特定の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子増幅断片の配列決定反応が、５’プライマーとして配列番号６の配列に含まれる配列および３’プライマーとして配列番号７の配列に含まれる配列ならびにその相補配列を含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの混合物からなるヌクレオチドプライマーを用いて行われる工程と、
ｂ）前記断片について得られた配列と、配列番号１〜３および５のいずれかの配列からなる前記細菌の完全なｒｐｏＢ遺伝子の配列もしくはそのｒｐｏＢ遺伝子断片、または請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの配列とを比較することによって、前記細菌の特定の種が存在するか否かを決定することにより、前記断片について得られた配列が、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子断片、またはオリゴヌクレオチドの既知配列と同一である場合、標本中の前記細菌の存在が確認される工程と
が実施されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法において使用するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断分野に関する。より詳細には、本発明は、連鎖球菌属（Streptococcus ）および関連する属であるエンテロコッカス属（Enterococcus）、双子菌属（Gemella ）、アビオトロフィア属（Abiotrophia ）、およびグラニュリカテラ属（Granulicatella）の細菌を、これらの細菌属の株に適用されるプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを使用した検出法ならびに/ または増幅法および配列決定法を用いて分子レベルで同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連鎖球菌属および関連する４つの属：エンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属の細菌はグラム陽性カタラーゼ陰性の球状細菌であり、およそ４０を超える種が現在知られている。以前はＮ群連鎖球菌として連鎖球菌に分類されていたラクトコッカス属（Lactococcus ）の細菌はヒトの病気にまれにしか現れず、＋１０℃での増殖によって連鎖球菌と容易に区別できるので本発明の範囲に入らない。連鎖球菌属は公式には５５の種を含んでいる。双子菌属は６つの種を含み、アビオトロフィア属は１つの種を含み、グラニュリカテラ属は３つの種を含み、エンテロコッカス属は２４の種を含む[www.springer-ny.com/bergeysoutline/main.htm] 。これらの種は、容易かつ頻繁に、環境試料、獣医学的臨床標本、およびヒト臨床標本から培養される（非特許文献１）。ヒトでは、連鎖球菌属の様々な種が市中感染の原因となっており、この感染は、問題の連鎖球菌が侵襲性であること、または感染部位とは離れた臨床徴候を示す、危険につながり得る毒素が産生されることによって重篤になる場合がある。例えば、化膿連鎖球菌（S treptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）は、咽頭感染、およびリウマチ熱を含む
連鎖球菌感染後症候群の原因である。リウマチ熱の際の炎症プロセスによる心臓弁の損傷は、死に至ることもある心臓弁疾患の原因となる。また、連鎖球菌属のいくつかの種（特に、Ａ群連鎖球菌、Ｃ群連鎖球菌、およびＣ群連鎖球菌）は、数年間にわたって述べられてきたように、命を脅かす侵襲性感染、特に、筋炎（すなわち、皮膚、皮下組織および筋肉組織に対する変性変化）の原因である。例えば、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（肺炎球菌）は、肺炎、髄膜炎、および敗血症も引き起こす。連鎖球菌属、エンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属の細菌は、ヒトにおいて、命を脅かす感染症の部類に入る心内膜炎（すなわち、心臓弁への感染）を引き起こすことがある（非特許文献２）。上記の細菌属の種の中には院内感染を引き起こすことがあるものもある。例えば、Ａ群連鎖球菌は消化器内視鏡検査後の菌血症の原因である。さらに、エンテロコッカス属の細菌は本来セファロスポリンに対する耐性を持っており、セファロスポリンを用いた予防的抗生物質療法後に院内泌尿器感染を引き起こすことがある。これらの細菌種はまた、抗生物質耐性の増加、肺炎連鎖球菌のペニシリンＧ耐性（非特許文献３）、およびエンテロコッカス属の複数の種のバンコマイシン耐性（非特許文献４；非特許文献５）という問題も提起する。
【非特許文献１】ルオフ  ケイ・エル(Ruoff Kl)、１９９９年、「臨床微生物学マニュアル（Manual of Clinical Microbiology ）」、２８３−２９６頁、エイエスエム・プレス（ASM Press ）
【非特許文献２】カサルタ  ジェイ・ピー（Casalta JP）ら、ジャーナル・クリニカル・マイクロバイオロジー誌（Journal Clinical Microbiology ）、２００２年、第４０巻、１８４５−１８４７頁
【非特許文献３】グラブ  ジェイ（Garav J.）、ランセット・インフェクシャス・ディジーズ誌（Lancet Infect. Dis. ）、２００２年、第２巻、４０４−４１５頁
【非特許文献４】ゴールド  エイチ・エス（Gold H.S. ）、クリニカル・インフェクシャス・ディジーズ誌（C lin. Infect. Dis.）、２００１年、第３３巻、２１０−２１９頁
【非特許文献５】ボンテン  エム・ジェイ（Bonten M.J. ）ら、ランセット・インフェクシャス・ディジーズ誌（Lancet Infect. Dis. ）、２００１年、第１巻、３１４−３２５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの様々な細菌種は、ヒトの病理学的標本における検出およびこのような試料から単離された時の同定という問題を提起する。従来の検出方法は、病理学的標本の直接的な検査によってグラム陽性球菌状細菌を証明することに頼っている。しかしながら、臨床標本に含まれる連鎖球菌属および関連する属の細菌を顕微鏡で検出する感度の閾値は１０４ＣＦＵ/ ｍｌであることが知られている。従って、ヒトまたは動物の病理学的標本の中に、この病理学的標本の直接的な顕微鏡検査によっては検出されない、問題の種の１つが含まれる可能性は十分にある。さらに、構造がグラム陽性細菌型の構造であっても、病理学的試料のグラム染色後に偽のグラム陰性結果を示し、誤った同定または決定的でない同定をもたらす可能性がある。これは、双子菌属の細菌において特に頻繁に起こる。ヒトでは、心内膜炎診断時の心臓弁の解剖病理学的検査および細菌学的検査の際に、このことが当てはまる。
【０００４】
上記の属の種の１つの細菌が研究室において単離される時、連鎖球菌属および関連する属に属する種の細菌を同定するために、従来の表現型同定法が最も一般的に用いられ、連鎖球菌属および関連する属の細菌の表現型同定を助けるために、いくつかの同定キットおよび自動分析器が開発されている。これに関して、日常的な慣行での同定の程度は一定しない。特に、連鎖球菌および関連する属の細菌の同定に用いられる試験の１つは、溶血反応（すなわち、血液寒天に含まれる赤血球の細菌による破壊）の検出であるが、この溶血反応は、連鎖球菌属の細菌が高濃度の二酸化炭素の存在下で培養されると、酸素の存在または過酸化物の存在によって阻害されることがある。さらに、連鎖球菌コロニーによる溶血の評価には、ある程度の主観性、従って、これらの細菌の同定の質に好ましくない作業者間のばらつきがあることが認められている。α溶血連鎖球菌の場合、第２の試験はオプトヒン感受性試験であり、この試験を用いると、この化合物に感受性のある肺炎連鎖球菌を同定することができる。しかしながら、オプトヒンに対して耐性のある肺炎連鎖球菌株が報告されている（ランド  イー（Lund E. ）、アクタ・パソロジカ・マイクロバイオロジカ・エ・イムノロジカ・スカンディナビア誌（Acta Patho. Microbiol. Immunol. Scand.）、１９５９年、第４７巻、３０８−３１５頁）。最後の表現型試験は血清型分類であるが、これも偽陽性結果を示すことがある（特に、血清型Ｄの連鎖球菌の場合、Ｄ群連鎖球菌とエンテロコッカス属とペジオコックス属（Pediococcus ）との交差抗原性のために偽陽性結果を示すことがある）。
【０００５】
連鎖球菌属の一部の血清型または一部の種を同定するために、いくつかの分子レベルのシステムが開発されている。特に、１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする特異的プローブのハイブリダイゼーションによる、Ａ群連鎖球菌（化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス−アギノーサス（Streptococcus aginosus）、ストレプトコッカス−コンステラータス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス−インターメジウス（Streptococcus intermedius ）およびＢ群連鎖球菌（ストレプトコッカス−アガラクティエ（Streptococcus agalactiae））（ダリー  ジェイ・エイ（Daly J.A. ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー誌（J. Clin. Microbiol. ）、１９９１年、第２９巻、８０−８２頁；ヘーラン  ジェイ・エス（Heelan J.S. ）ら、ダイアグノスティック・マイクロバイオロジー・アンド・インフェクシャス・ディジーズ誌（Diagn. Microbiol. Infect. Dis.）、１９９６年、第２４巻、６５−６９頁）ならびに肺炎連鎖球菌（デニス  ジー・エイ（Denys G.A.）およびカレイ  アール・ビー（Carrey R.B. 
）、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー誌、１９９２年、第３０巻、２７２５−２７２７頁）に対する分子レベルのシステムが開発されている。肺炎連鎖球菌とα溶血連鎖球菌を区別するために（サロ  ピー（Salo P. ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ誌（J. Infect. Dis. ）、１９９５年、第１７１巻、４７９−４８２頁；モリソン  ケイ（Morrisson K.）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー誌、２０００年、第３８巻、４３４−４３７頁；カイジャライネン
ティ（Kaijalainen T.）ら、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ誌（J. Microbiol. Meth. ）、２００２年、第５１巻、１１１−１１８頁）、ストレプトコッカス−アガラクティエを検出するために（マウン  ジェイ・エイ（Mawn J.A. ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー誌（J. Clin. Pathol.）、１９９３年、第４６巻、６３３−６３６頁）、毒素またはビルレンス因子をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅に基づく様々なシステムも開発されている。しかしながら、これらの様々なシステムは、連鎖球菌属の１つの種または数種しか同定できない。
【０００６】
１６Ｓ−２３Ｓスペーサーの増幅に基づく連鎖球菌属の３つの種の同定システムが開発されているが（フォルストマン  ピー（Forstman P. ）ら、マイクロバイオロジー誌（Microbiology）、１９９７年、第１４３巻、３４９１−３５００頁）、この研究では、同定は、関心対象の動物の数種：ストレプトコッカス−アガラクティエ、ストレプトコッカス−ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、およびストレプトコッカス−ウベリス（Streptococcus uberis）にのみ限定された。現時点では、１種類の標的を使用することに付きまとう分子汚染の危険を回避するために、連鎖球菌の検出および同定用の２種類の異なる分子標的を有することも検査室にとって重要である。
【０００７】
最後に、連鎖球菌属に関連する属、より詳細には、エンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属の細菌を検出および同定するためのシステムは開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ｒｐｏＢ遺伝子が、連鎖球菌属および関連する４つの属：エンテロコッカス属、双子菌属、アビオトロフィア属、およびグラニュリカテラ属のそれぞれの種の細菌の検出および特異的同定に使用することができる遺伝子マーカーとなることを本発明において示した。
【０００９】
この遺伝子は、様々な細菌属の細菌同定におけるツールとして有用であることが以前に示されているが、どの刊行物にも、連鎖球菌属および関連する４つの属の細菌の同定に使用できることは述べられておらず、この遺伝子配列がこれらの細菌の同定に有利であることは全く示唆されていない。一方、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）において利用可能な、いくつかの種のいくつかのｒｐｏＢ遺伝子部分配列はわずかな不均一性を示し、このために、これらの細菌の同定ツールとしてのこの遺伝子の利点には疑問があった。ようやく、本発明者らは、４つの細菌属を同時に同定するツールを開発した。これには、それぞれの種について決定されたどのｒｐｏＢ配列からも推定できなかった縮重プライマーの開発が必要であった。
【００１０】
さらに詳細に述べると、本発明は、連鎖球菌属および関連する属の属特異的またはそれぞれの種特異的な核酸配列に関し、そのヌクレオチド配列はこれらの細菌のｒｐｏＢ遺伝子に由来する。
【００１１】
ラズカノ（Lazcano ）ら（ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボリューション誌（J.
Mol. Evol. ）、１９８８年、第２７巻、３６５−３７６頁）によると、ＲＮＡポリメラーゼはその起源に関して２つのグループに分類され、一方は、ウイルスのＲＮＡ依存性ま
たはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなり、他方は、真核生物または原核生物（古細菌および真正細菌）由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる。真正細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’で示される「コア酵素」またはαββ’σで示される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な保存された多量体構造を特徴としている（ユラ（Yura）およびイシハマ（Ishihama）、アニュアル・レビューズ・オブ・ジェネティクス誌（Ann. Rev. Genet.）、１９７９年、第１３巻、５９−５７頁）。
【００１２】
非常に多くの研究によって、多量体の酵素複合体の中での、真正細菌のＲＮＡポリメラーゼβサブユニットの機能的な役割が証明されている。古細菌および真核生物のＲＮＡポリメラーゼの構造はさらに複雑であり、１０個のサブユニット、さらには３０個のサブユニットに達する可能性がある（プレト（Puehlet ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ．誌（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９８９年、第８６巻、４５６９−４５７３頁）。
【００１３】
真正細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの異なるαββ’σサブユニットをコードする遺伝子（それぞれ、遺伝子ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、およびｒｐｏＤ）は、リボソームサブユニットの構成タンパク質をコードする遺伝子またはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子を含む異なるグループに分類される（ユラおよびイシハマ、アニュアル・レビューズ・オブ・ジェネティクス誌、１９７９年、第１３巻、５９−５７頁）。ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の配列を用いて系統樹を構築し、異なる枝および小枝を生物界の中で分離できることを示した著者もいる（ローランド（Rowland ）ら、バイオケミカル・ソサイエティ・トランスアクションズ誌（Biochem. Soc. Trans.）、１９９２年、第２１巻、４０Ｓ頁）。
【００１４】
本発明をさらに詳細に示す前に、説明文および特許請求の範囲において用いられる様々な用語を以下に定義する。
−「細菌から抽出された核酸」は、全ての核酸、またはゲノムＤＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写から得られたＤＮＡのいずれかを意味する。
【００１５】
−「ヌクレオチド断片」または「オリゴヌクレオチド」は、天然核酸（または任意に改変されている核酸）の配列情報により特徴付けられたヌクレオチドモチーフ鎖を示す２つの同義の用語であり、所定の高ストリンジェンシー条件下で天然核酸と同様に相補的または実質的に相補的なヌクレオチド断片とハイブリダイズすることができる。鎖は、天然核酸とは異なる構造を有するヌクレオチドモチーフを含んでもよい。ヌクレオチド断片（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば、１００個までのヌクレオチドモチーフを含んでもよい。ヌクレオチド断片（またはオリゴヌクレオチド）は、一般的に、少なくとも８個の、特に、少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフ、さらには特に、１８〜３５個のヌクレオチドモチーフを含み、天然核酸分子から得られてもよく、ならびに/ または遺伝子組換えおよび/ もしくは化学合成によって得られてもよい。
【００１６】
−ヌクレオチドモチーフは単量体から構成されており、単量体は、構成要素が糖、リン酸基、および窒素塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）から選択される）である天然核酸ヌクレオチドでよい。または、単量体は、前述の３つの構成要素の少なくとも１つが改変されているヌクレオチドである。一例として、修飾塩基（例えば、任意の塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、もしくはＧとハイブリダイズすることができるイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、またはハイブリダイズすることができる他の任意の修飾塩基）を用いて塩基の改変が行われてもよく、糖において改変が行われてもよく（例えば、少なくとも１つのデオキシリボースをポリアミドで置換する（ニエルセン  ピーイー
（Nielsen PE）ら、サイエンス誌、１９９１年、第２５４巻、１４９７−１５００頁）、リン酸基が、例えば、ジホスフェート、アルキルホスホネート、およびホスホロチオエートから選択されるエステルで置換されることにより改変が行われてもよい。
【００１７】
−「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が安定した特異的な水素結合によって結合して、二本鎖を形成するプロセスを意味する。ハイブリダイゼーション条件は「ストリンジェンシー」すなわち作業条件の厳密さによって決定される。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイゼーションは特異的になる。ストリンジェンシーは、特に、プローブ/ 標的二重鎖の塩基組成および２つの核酸間のミスマッチの程度に左右される。ストリンジェンシーはまた、ハイブリダイゼーション反応のパラメータ（例えば、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度および種類、変性剤の種類および濃度、ならびに/ またはハイブリダイゼーション温度）とも関係がある場合がある。ハイブリダイゼーション反応が起きるべき条件のストリンジェンシーは、特に、使用するプローブに左右される。このデータは全て周知であり、それぞれの場合で、日常的な実験によって適切な条件を決定することができる。一般的に、使用するプローブの長さに応じて、ハイブリダイゼーション反応の温度は、約０．８〜１Ｍの濃度の生理食塩水中で約２０℃〜６５℃の間（特に、３５℃〜６５℃の間）である。
【００１８】
−「プローブ」は、核酸（この場合、メッセンジャーＲＮＡまたは転写産物であるメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡのいずれかに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸）と、決められた条件下で特異性にハイブリダイゼーションしてハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド断片である。プローブは診断目的（特に、捕捉プローブおよび検出プローブ）に用いられてもよく、治療目的に用いられてもよい。
【００１９】
−「捕捉プローブ」は、任意の適切な手段（例えば、共有結合、吸着、または固体上での直接合成）によって固体支持体上に固定化された、または固定化することができるプローブである。支持体の例として、マイクロタイタープレートおよびＤＮＡチップが挙げられる。
【００２０】
−「検出プローブ」は、例えば、放射性同位体、酵素（特に、発色基質、発蛍光基質、または発光基質に作用することができる酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ））、色素化合物、発色化合物、発蛍光化合物、または発光化合物、ヌクレオチド塩基のアナログ、およびリガンド（例えば、ビオチン）から選択される標識試薬で標識されたプローブである。
【００２１】
−「種プローブ」は、ある細菌の種を特異的に同定することができるプローブである。
−「属プローブ」は、ある細菌の属を特異的に同定することができるプローブである。
−「プライマー」は、例えば、１０〜１００個のヌクレオチドモチーフを有し、酵素的増幅反応のために決められた条件下でハイブリダイゼーション特異性を有するプローブである。
【００２２】
−「増幅反応」は、酵素的重合反応（例えば、プライマーオリゴヌクレオチドによって開始され、ＤＮＡポリメラーゼを使用する、ＰＣＲなどの増幅法における酵素的重合反応）を意味する。
−「配列決定反応」は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびジデオキシヌクレオチドを用いた不完全重合法（サンガー  エフ（Sanger F）、コールソン  エイ・アール（Coulson AR）、１９７５年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌（J. Mol. Biol. ）、第９４巻、４４１頁）によって、または固体支持体（例えば、ＤＮＡチップに用いられる固体支持体）上に固定された複数のプローブとの複数のハイブリダイゼーションに
よって核酸断片の配列または完全な遺伝子の配列を得ることを意味する。
【００２３】
肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス−ミュータンス（Streptococcus mutans）、およびストレプトコッカス−アガラクティエの細菌のｒｐｏＢ遺伝子の配列は文献において述べられている。
【００２４】
本発明者らは、連鎖球菌属および関連する属の他の細菌種：ストレプトコッカス−アンギノーサス（Streptococcus anginosus ）およびストレプトコッカス−エクイナス（Streptococcus equinus ）、アビオトロフィア−デフェクティバ（Abiotrophia defectiva ）のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列、ならびにストレプトコッカス−ミュータンスおよびエンテロコッカス−フェカーリス（Enterococcus faecalis ）のｒｐｏＢ遺伝子の大部分を決定している。これらの種を本発明者らが選択したのは、これらの種が連鎖球菌属および関連する属の細菌（この属において現在述べられている全ての種を含む）の１６Ｓ遺伝子の研究に基づいて決定された主要な遺伝学的グループを代表し、その結果、これらの種において得られたｒｐｏＢ配列のアラインメントは、これらの細菌属の全ての種の全てのｒｐｏＢ配列をまず間違いなく含んでいるからであり、従って、さらに正確に述べると、これらの種は、この属において現在述べられている全ての種の中でも系統学的観点から最も分岐した種であり、故にこれらの種において得られたｒｐｏＢ配列のアラインメントは、系統学的観点からまず間違いなくこの細菌属の全ての種の全てのｒｐｏＢ配列を包含するからである。
【００２５】
上記の完全配列またはほぼ完全な配列から、および以下の実施例１および２に報告するような非常に多くの失敗に終わった試みを経て、本発明者らは、特異的なコンセンサス配列である以下の配列番号６および７、すなわち
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’、および
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
Ｎはイノシンまたは４種類のヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧのうちの１つであり、
ＲはＡまたはＧであり
ＭはＡまたはＣであり、
ＹはＣまたはＴである）
ならびにその逆配列および相補配列を証明した。
【００２６】
本発明者らは、配列番号６および７の配列が連鎖球菌属およびその関連する４つの属の全ての細菌の間で共通しているだけでなく、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌群に特異的であることも確かめた。
【００２７】
配列番号６および７の配列中のヌクレオチドＮ、Ｙ、Ｍ、またはＲに対応する位置では、検討対象の細菌種についての標的相補配列において様々なヌクレオチドが見られるが、他の全てのヌクレオチドは、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の全ての種において保存されている。
【００２８】
このように定義された配列番号６および７の配列は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の全ての細菌のｒｐｏＢ遺伝子に存在し、かつ連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌に特異的であり、従って連鎖球菌属およびその関連する４つの属のあらゆる細菌を検出するための属プローブまたは増幅プライマーを提供することができる。
【００２９】
従って、この目的のために、本発明の主題の１つは、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１８〜３５個のヌクレオチドモチーフの配列を含み、こ
の中の８個、好ましくは１２個、さらに好ましくは１８個の連続したモチーフの少なくとも１つ配列が、以下の配列番号６および７の配列、すなわち
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’、および
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
Ｎはイノシンまたは４種類のヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧのうちの１つであり、
ＲはＡまたはＧであり、
ＭはＡまたはＣであり、
ＹはＣまたはＴである）
ならびにその逆配列および相補配列の１つに含まれるオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
本発明の別の主題は、全て異なる配列を有する本発明のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、該オリゴヌクレオチドがいずれも配列番号６に含まれる配列を含む、または配列番号７に含まれる配列を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドの混合物である。
【００３１】
さらに詳細に述べると、本発明のさらなる主題は、異なる配列の３２種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、それぞれのオリゴヌクレオチドが以下の配列、すなわち
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’
（ここで、
ＲはＡまたはＧであり、
ＹはＣまたはＴであり、
ＭはＡまたはＣであり、
ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである）、
ならびにその逆配列および相補配列に含まれる少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１８個の連続したヌクレオチドモチーフを含む、オリゴヌクレオチドの混合物である。
【００３２】
本発明のさらなる主題は、異なる配列を有する８種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、それぞれのオリゴヌクレオチドが以下の配列、すなわち
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＮＧＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’
（ここで、
ＲはＡまたはＧであり、
ＹはＣまたはＴであり、
ＭはＡまたはＣであり、
Ｎはイノシンである）、
ならびにその逆配列および相補配列に含まれる少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１８個の連続したヌクレオチドモチーフを含む、オリゴヌクレオチドの混合物である。
【００３３】
本発明のさらなる主題は、異なる配列を有する１６種類のオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなり、それぞれのオリゴヌクレオチドが以下の配列、すなわち
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
ＲはＡまたはＧであり、
ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである）、
ならびにその逆配列および相補配列に含まれる少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２１個の連続したヌクレオチドモチーフを含む、オリゴヌクレオチドの混合物である。
【００３４】
本発明のさらなる主題は、異なる配列を有する４種類のオリゴヌクレオチドの等モル混
合物からなり、それぞれのオリゴヌクレオチドが以下の配列、すなわち
配列番号７：５’−ＴＧＮＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
（ここで、
ＲはＡまたはＧであり、
Ｎはイノシンである）、
ならびにその逆配列および相補配列に含まれる少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２１個の連続したヌクレオチドモチーフを含む、オリゴヌクレオチドの混合物である。
【００３５】
前記オリゴヌクレオチドの混合物は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の全ての細菌のｒｐｏＢ遺伝子に含まれる相補配列とハイブリダイズすることができ、従って、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片を検出するための属プローブとして、または前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片を増幅するための増幅プライマーとして使用することができる。
【００３６】
当業者に周知のオリゴヌクレオチド合成法を用いてオリゴヌクレオチドの等モル混合物を調製するために、ＮまたはＫ、Ｎ、Ｒ、もしくはＹそれぞれに対応するヌクレオチド用の４種類または２種類のヌクレオチドの等モル混合物、すなわち、
Ｎ（ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである）に対応するヌクレオチド用の４種類のヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧの等モル混合物、ならびに
Ｋに対応するヌクレオチド用の２種類のヌクレオチドＴおよびＧの等モル混合物、
Ｎに対応するヌクレオチド用の２種類のヌクレオチドＡおよびＣの等モル混合物、
Ｒに対応するヌクレオチド用の２種類のヌクレオチドＡおよびＧの等モル混合物、ならびに
Ｙで表されるヌクレオチド用の２種類のヌクレオチドＣおよびＴの等モル混合物
が用いられる。
【００３７】
従って、配列番号６および７の２つの配列それぞれについて、３２（２３×４）種類および１６（２２×４）種類の異なる配列のヌクレオチドの等モル混合物が得られる。
本発明によるオリゴヌクレオチドの等モル混合物において、「Ｎ」は、任意の塩基とハイブリダイズすることができるイノシンまたは４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇの全ての等モル混合物であるので、配列番号６および７の配列は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の全ての細菌のｒｐｏＢ遺伝子に含まれる相補配列とハイブリダイズすることができる。
【００３８】
さらに、これらのコンセンサス配列（配列番号６および７）は連鎖球菌属のそれぞれの細菌種に特異的な配列を有する超可変配列に隣接している。従って、配列番号６および７に隣接するこれらの配列は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の種プローブとして使用することができる。
【００３９】
さらに、配列番号６および７の配列は、長さが様々で約７２０ｂｐである区画を含むｒｐｏＢ遺伝子断片に隣接し、かつ連鎖球菌属およびその関連する４つの属のそれぞれの細菌種に特異的な最も短い配列を含むことが確かめられた。
【００４０】
従って、本発明者らは、連鎖球菌属およびその関連する４つの属について調べた２８の細菌種のそれぞれに対する種プローブ（配列番号６および７のコンセンサス配列に隣接する、以下の実施例２に記載の配列番号８〜３５の配列に相当する）を証明することができた。
【００４１】
本発明のさらなる主題は、実施例２に記載の配列番号８〜３５の配列に示されるような配列を含むことを特徴とする、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌のｒｐｏｂ遺伝子または遺伝子断片（配列番号１１、１２、１４を除く）、ならびに化膿連鎖球菌、
肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス−ミュータンス、およびストレプトコッカス−アガラクティエの細菌のｒｐｏｂ遺伝子または遺伝子断片、その逆配列および相補配列である。
【００４２】
本発明のさらなる主題は、特に本発明の方法に使用することができる、配列番号１〜３の配列に示されるようなストレプトコッカス−アンギノーサス、ストレプトコッカス−エクイナス、およびアビオトロフィア−デフェクティバの細菌のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列である。
【００４３】
本発明のさらなる主題は、特に本発明の方法に使用することができる、配列番号５に示されるような細菌エンテロコッカス−フェカーリスのｒｐｏｂ遺伝子のほぼ完全な配列である。
【００４４】
説明の終わりにある配列表に示した配列番号１〜３および５ならびに８〜３５の配列において、
ヌクレオチドＭはＡまたはＣであり、
ヌクレオチドＫはＴまたはＧであり、
ヌクレオチドＲはＡまたはＧであり、
ヌクレオチドＷはＡまたはＴであり、
ヌクレオチドＹはＣまたはＴであり、
ヌクレオチドＮはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＩであり、
ヌクレオチドＳはＣまたはＧであり、
ヌクレオチドＶはＡ、Ｃ、またはＧである。
【００４５】
本発明によって証明された配列番号６および７に由来するコンセンサス配列は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の分子レベルの同定による検出法において、属プローブとして、増幅用プライマーまたは配列決定反応用プライマーとして使用することができる。
【００４６】
従って、配列番号６および７に由来する配列を使用すると、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の属プローブを調製することができるだけでなく、これらの配列をプライマーとして使用した増幅および配列決定において、これらの細菌種を検出および同定することもできる。
【００４７】
ｒｐｏＢ遺伝子の完全配列は、その一次配列の研究によって細菌を同定するのに使用することができるだけでなく、完全ＤＮＡ配列の転写から得られたメッセンジャーＲＮＡの二次構造および三次構造の研究によって細菌を同定するのに使用することもできる。
【００４８】
本発明のさらなる主題は、配列番号８〜３５の配列に含まれる配列または配列番号８〜３５の配列からなる配列を有し、従って、配列番号１１、１２、１４、および２２の配列（それぞれ、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス−ミュータンス、およびストレプトコッカス−アガラクティエの細菌の配列）を含むオリゴヌクレオチドまたはｒｐｏＢ遺伝子断片、ならびに前記で定義されたような逆配列または相補配列のオリゴヌクレオチドまたは断片である。
【００４９】
本発明者らは、上記の様々な配列を分析し、配列番号８〜３５の全ての配列を１対ずつ比較した後に、配列番号８〜３５の間での２つの異なる配列間の相同率は最大９８．７％であることを確かめた。配列間の相同性が９８．７％未満の場合、それらの配列により異なる種の細菌が同定される。したがって、本発明のさらなる主題は、配列番号８〜３５の配列、その逆配列、相補配列、ならびに配列番号８〜３５の配列、その逆配列および相補配列それぞれに関して少なくとも９８．７％の相同性を示す配列（すなわち、配列間で少
なくとも９８．７％の類似性を示す配列）に含まれる配列、または前記の配列からなる配列を有するオリゴヌクレオチドまたはｒｐｏＢ遺伝子断片である。
【００５０】
本発明の主題であるオリゴヌクレオチド、遺伝子断片、および遺伝子について、ＤＮＡ配列を含む（すなわち、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧを有する）ものとして説明してきた。しかしながら、本発明のさらなる主題は、対応するＲＮＡ配列を含む（すなわち、ＴがＵで置き換えられている）オリゴヌクレオチドである。
【００５１】
本明細書における説明において、「逆配列および相補配列」は、以下の配列、すなわち
前記配列の逆向きの配列、
前記配列に相補的な配列、および
前記配列の逆向きの配列に相補的な配列
を意味する。
【００５２】
配列番号１〜３５の配列は、当業者に周知の技法を使用した遺伝子操作および/ または化学合成（特に、自動合成）によって調製することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドの第１の応用は、生物学的標本における、配列番号６〜３５の配列およびその逆配列または相補配列のうち１つのヌクレオチド配列を含む、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌種の１つの検出用プローブとしての使用である。
【００５３】
配列番号６および７の配列を含むオリゴヌクレオチドは属プローブとして使用され、配列番号８〜３５の配列の１つに含まれる配列または配列番号８〜３５の配列の１つを含む配列を含むオリゴヌクレオチドは種プローブとして使用される。
【００５４】
さらに詳細に述べると、本発明の主題は、連鎖球菌属およびその関連する属の細菌種に特異的な配列を含み、好ましくは配列番号８〜３５の配列の１つに含まれる少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであるか、または任意選択で、異なる配列を有する前記オリゴヌクレオチドの等モル混合物である。
【００５５】
好ましくは、配列番号８〜３５の配列の１つに含まれ、好ましくは配列番号８〜３５の配列の１つに含まれる少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを有する前記配列は、異なるそれぞれの種に特異的な最も短い配列を形成し、検討対象の連鎖球菌属細菌およびその関連する４つの属の種プローブとして使用することができる。
【００５６】
本発明のプローブは、全ての既知のハイブリダイゼーション法（特に、「ドットブロット」法（マニアティス（Maniatis）ら、１９８２年、「分子クローニング（Molecular Cloning ）」、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor））、「サザンブロット」と呼ばれるＤＮＡ転写法（サザン  イー・エム（Southern E.M. ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌、１９７５年、第９８巻、５０３頁）、「ノザンブロット」と呼ばれるＲＮＡ転写法、または、特に捕捉プローブおよび/ もしくは検出プローブを使用する、いわゆる「サンドイッチ」法（これらのプローブは標的核酸の２つの異なる領域とハイブリダイズすることができ、プローブの少なくとも一方（一般的に、検出プローブ）が種に特異的な標的領域とハイブリダイズすることができ、捕捉プローブおよび検出プローブは少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を明らかに有する））を用いて、プローブと標本中の標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体の形成または非形成を確かめることによって、前述のように診断目的に使用することができる。
【００５７】
検出しようとする核酸（標的）はＤＮＡでもＲＮＡ（ＰＣＲ増幅後に得られる第１鎖）
でもよい。二本鎖核酸タイプの標的を検出する場合は、検出を開始する前に、二本鎖核酸を最初に変性させなければならない。調べようとする標本から標的核酸を抽出するための既知の方法を用いて、標的核酸を得ることができる。二本鎖核酸の変性は、既知の化学的方法、物理的方法、または酵素的方法を用いて（特に、適切な温度（８０℃を超える温度）まで加熱することによって）行うことができる。
【００５８】
前述のハイブリダイゼーション法（特に、「サンドイッチ」法）を実行するために、捕捉プローブと呼ばれる本発明のプローブが固体支持体上に固定化され、検出プローブと呼ばれる本発明の別のプローブが標識試薬で標識される。支持体および標識試薬の例は、前記に示したものである。
【００５９】
ある種プローブが固体支持体上に固定化され、別の種プローブが標識試薬で標識されると好都合である。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の応用は、既知の方法を用いたポリメラーゼ存在下での核酸合成において（特に、ポリメラーゼ存在下での核酸合成を用いた増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）によって）使用することができる、配列番号６〜３５の配列の１つに含まれる少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される一本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーとしての使用である。特に、本発明のプライマーは、対応する相補的ＤＮＡ配列を得るための、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌種のメッセンジャーＲＮＡ配列の特異的逆転写に使用することができる。この逆転写がＲＴ−ＰＣＲ法の最初の段階をなし、次の段階が、得られる相補的ＤＮＡのＰＣＲ増幅でもよい。本発明のプライマーは、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の種のｒｐｏＢ遺伝子の全ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応による特異的増幅にも使用することができる。
【００６０】
ある特定の場合では、本発明のオリゴヌクレオチドを含む前記プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター（例えば、プロモーターＴ７、Ｔ３、ＳＦ６（スチュディアー  エフ・ダブリュ（Studier FW）、ビー・エイ  モファット（BA Moffatt）、１９８６年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌、第１８９巻、１１３頁））のセンス配列またはアンチセンス配列も含む。前記プライマーは、転写段階を使用する核酸増幅法（例えば、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ法（ファンゲメン  ビー（Van Gemen B ）ら、イタリア国フィレンツェにて開催された第７回国際エイズ会議要旨集（Abstract MA ）１０９１頁、１９９１年）において使用することができる。
【００６１】
本発明のさらなる主題は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌種の任意の株のｒｐｏＢ遺伝子の完全な配列決定または部分的な配列決定に使用することができる、配列番号６〜３５の配列のうち１つを含む配列または配列番号６〜３５に含まれる配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーである。
【００６２】
連鎖球菌属および関連する属の任意の細菌のｒｐｏＢ遺伝子が完全にまたは部分的に配列決定されれば、この配列のバイオインフォマティクス解析によって、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の全ての細菌を同定することが可能になり、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の新たな未知の細菌種を認識することが可能になる。
【００６３】
好ましくは、本発明の前記オリゴヌクレオチドの混合物は、プライマーとして、またはｒｐｏＢ遺伝子の配列決定のために使用され、さらに好ましくは、前記オリゴヌクレオチドの混合物は配列番号６および配列番号７の配列からなる。
【００６４】
さらに正確に述べると、本発明は、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の種の１つ
の細菌を検出するための同定による検出方法を提供し、該方法は以下の：
本発明による前記細菌の完全もしくはほぼ完全なｒｐｏＢ遺伝子、ならびに化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス−ミュータンス、およびストレプトコッカス−アガラクティエの細菌のｒｐｏＢ遺伝子もしくは遺伝子断片（それぞれ、配列番号１１、１２、１４、および２２の配列に示されるような配列を含む）、その逆配列および相補配列（特に、種プローブとして使用することができる）、ならびに/ または
本発明による前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片であって、配列番号８〜３５の配列、その逆配列および相補配列の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む断片（これらは、特に、種プローブとして使用することができる）、ならびに/ または
本発明のオリゴヌクレオチドであって、配列番号８〜３５の配列、その逆配列および相補配列の１つに含まれる配列を含むオリゴヌクレオチド（特に、種プローブとして使用することができる）、ならびに/ または
本発明のオリゴヌクレオチドもしくは前記オリゴヌクレオチドの混合物であって、配列番号６および７の配列の１つに含まれる連続したヌクレオチドモチーフからなる配列を含む（特に、属プローブもしくは増幅プライマーとして使用することができる）
が使用されることを特徴とする。
【００６５】
好ましくは、本発明の前記検出方法では以下の：
配列番号８〜３５の配列の１つから選択される配列を含む前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片、もしくは配列番号８〜３５の配列、その逆配列および相補配列の１つに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド、ならびに/ または
少なくとも１種類の本発明によるオリゴヌクレオチドの混合物であって、オリゴヌクレオチドの好ましい配列が配列番号６および７の配列ならびにその逆配列および相補配列からなり、さらに好ましくはＮがイノシンであることを特徴とするオリゴヌクレオチド混合物
が使用される。
【００６６】
本発明の検出方法の第１の実施態様では、連鎖球菌属および関連する４つの属の細菌の存在を証明することを目的として、以下の工程、すなわち
１．本発明による配列番号６および７の配列、その逆配列および相補配列の１つを含む配列、または配列番号６および７の配列、その逆配列および相補配列の１つに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を含む少なくとも１つの属プローブを、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の少なくとも１つの細菌の核酸を含む、または含んでいる可能性のある標本と接触させる工程、ならびに
２．前記属プローブと標本の核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成されるか否かを決定する工程であって、ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の存在が確認される工程
が行われる。
【００６７】
連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の検出方法の第２の実施態様では、以下の工程、すなわち
１．本発明の配列番号６および７の配列、逆配列および相補配列に含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を含む増幅プライマーを、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の少なくとも１つの細菌の核酸を含む、または含んでいる可能性のある試料と接触させる工程であって、
５’プライマーとして、本発明の配列番号６の配列に含まれる配列（好ましくは、配列番号６の完全配列からなる配列）または相補配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物が用いられ、
３’プライマーとして、本発明の配列番号７の配列に含まれる配列（好ましくは、配列番号７の完全配列からなる配列）または相補配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物が
用いられる
ことを特徴とする工程と、
２．核酸を酵素的重合反応によって増幅し、増幅産物が存在するか否かを決定することにより、増幅産物が生じる場合、標本中の前記細菌の存在が確認される工程と
が行われる。
【００６８】
この第２の実施態様は、連鎖球菌属またはその関連する４つの属を特異的に検出するのに使用することができる。
しかしながら、この第２の実施態様の工程２では、ストレプトコッカス−ミュータンス、ストレプトコッカス−オラーリス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、唾液連鎖球菌、ストレプトコッカス−サングイニス（Streptococcus sanguinis ）、ストレプトコッカス−スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス−アシドミニマス（Streptococcus acidominimus）、ストレプトコッカス−アガラクティエ、ストレプトコッカス−アンギノーサス、ストレプトコッカス−コンステラータス、ストレプトコッカス−ディフィシリス、ストレプトコッカス−ディスガラクティエ、ストレプトコッカス−エクイ（Str eptococcus equi）、ストレプトコッカス−エクイナス、ストレプトコッカス−インターメジウス
、ストレプトコッカス−ミチス（Streptococcus mitis ）、ストレプトコッカス−ボビス（Streptococcus bovis ）から選択される連鎖球菌属の特定の細菌種、グラニュリカテラ−アドジャセンス（Granulicatella adjacens ）、アビオトロフィア−デフェクティバ、エンテロコッカス−アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス−カセリフラブス（En terococcus casselliflavus ）、エンテロコッカス−フェカーリス、エンテロコ
ッカス−フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス−ガリナラム（Enterococcus gallinarum ）、エンテロコッカス−サカロリティカス（Enterococcus sacharolyticus ）、ゲメラ−ヘモリジンス（Gemella haemolysins ）、およびゲメラ−モルビロラム（Gemella morbillorum ）を特異的に検出することが求められる場合がある。この工程については、前記細菌の１つの種に特異的な検出方法の変形実施態様において、以降に述べる。
【００６９】
序文において前述したように、連鎖球菌属、エンテロコッカス属、グラニュリカテラ属、アビオトロフィア属、および双子菌属は、本研究において効果的に配列決定された細菌より多くの細菌種を含む。しかしながら、配列決定された種は、これらの細菌属の既知の全ての種を含み、これらの属の種の同定へのｒｐｏＢ配列の適用を証明するのに十分な数になるように選択された。
【００７０】
前記細菌の種を特異的に検出する本発明の方法の変形実施態様では、以下の工程、すなわち
１．少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む、または含んでいる可能性のある標本を、本発明による、配列番号８〜３５の配列の１つに含まれる配列を含む前記遺伝子、前記遺伝子断片、または前記オリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号８〜３５の配列の１つからなるオリゴヌクレオチド）、その逆配列および相補配列からなる少なくとも１つの種プローブと接触させる工程、ならびに
２．前記プローブと標本中の核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成されるか否かを決定することにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合、標本中の前記細菌の存在が確認される工程
が行われる。
【００７１】
前記の２８の種から選択される連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌の特定の種を特異的に検出することを目的とする、本発明の方法の別の変形実施態様において、この方法は、少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む、または含んでいる可能性のある標本において、以下の工程、すなわち
ａ）前記の特定の細菌の増幅されたｒｐｏＢ遺伝子断片の配列決定反応を、５’プライマーとして配列番号６の配列に含まれる配列および３’プライマーとして配列番号７の配列に含まれる配列（好ましくは、配列番号６および７の配列からなる配列）ならびにその相補配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物からなるヌクレオチドプライマーを用いて行う工程、ならびに
ｂ）前記断片について得られた配列と、本発明の、前記細菌の完全なｒｐｏＢ遺伝子配列、または配列番号８〜３５の配列を含む前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片の配列および相補配列を比較することによって、前記細菌の特定の種が存在するか否かを決定する工程であって、断片について得られた配列が、その属の既知配列または前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片の既知配列と同一である場合、標本中の前記細菌の存在が確認される工程
を含む。
【００７２】
本発明のさらなる主題は、本発明の方法に使用することができる診断キットである。この診断キットは、本発明の配列番号８〜３５の配列に含まれる配列または配列番号８〜３５の配列からなる配列を有する少なくとも１つ遺伝子断片もしくはオリゴヌクレオチド、または配列番号６および７の配列の１つに含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの混合物、ならびに/ または配列番号８〜３５の配列を含む前記細菌の少なくとも１つのｒｐｏＢ遺伝子断片、ならびに相補配列を含む。
【００７３】
本発明のキットが、「バイオチップ」の形態で前記オリゴヌクレオチドを含む、すなわち、米国特許第５，７４４，３０５号明細書（アフィメトリクス（Affymetrix）、フォードル（Fodor ）ら）に記載の方法に従って、国際公開第９５/ １１９９５号パンフレット（アフィマックス（Affymax ）、チェ（Chee）ら）に記載のリシークエンシング法を用いて、またはエイ  トレシュ（A.Troesch ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー誌、第３７巻（１），４９−５５頁，１９９９年に記載の方法に従って、固体支持体（特に、ガラス）に固定化された形態で前記オリゴヌクレオチドを含むと好都合である。「バイオチップ」上に合成されたオリゴヌクレオチドは、ｒｐｏＢ遺伝子の超可変領域のリシークエンシングを行う。この方法は、これらの同定用配列を選択することによって、異なる種の同定の質を損ねることなく製造費に関してかなりの利益をもたらす。好ましくは、「バイオチップ」固体支持体上に固定されるこれらのオリゴヌクレオチドは１０〜３０塩基（例えば、２０塩基）からなり、調査対象となる位置は中心領域（例えば、２０塩基のオリゴヌクレオチドの場合では配列の３’を基準にして１２位）に位置する。別の例は、調査対象となる位置を２つ有する（一方は１０位にあり、他方は８位にある）１７塩基のオリゴヌクレオチドを使用することからなる。他のオリゴヌクレオチドの長さは１０〜２５ヌクレオチドである。さらに、調査対象となる位置はオリゴヌクレオチドの長さによって異なる。
【００７４】
分析は、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（Ｒ）リーダー、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）ハイブリダイゼーションオーブン、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）自動洗浄・染色装置、およびＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）分析ソフトウェアを備える完全なＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）システム（参考文献９００２２８，米国カリフォルニア州所在のアフィメトリクス）において行われる。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の種に属する菌株により引き起こされる感染症を治療するための遺伝子療法プローブとして使用することもできる。このプローブは、前記で定義されたようなオリゴヌクレオチドを含む。この遺伝子療法プローブは、前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび/ またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができ、翻訳および/  または転写および/ または複製現象
を阻害することができる。
【００７６】
遺伝子療法の原理は既知であり、特に、アンチセンス鎖に相当するプローブの使用に基
づく（すなわち、プローブとセンス鎖とのハイブリッド形成によって、遺伝情報を解読する段階の少なくとも１つを妨害することができる）。従って、遺伝子療法プローブは抗菌剤として使用することができ、これによって、連鎖球菌属およびその関連する４つの属の種に属する細菌により引き起こされる感染症と戦うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本発明は、本発明を実施するために行われた実験に関する実施例と、単なる例示のために示される実施例とに分けられる以下の説明の助けを借りて、さらに容易に理解されるだろう。
【実施例１】
【００７８】
（連鎖球菌属およびその関連する属の３つの種：アビオトロフィア−デフェクティバ、ストレプトコッカス−アンギノーサス、およびストレプトコッカス−エクイナスのｒｐｏＢ遺伝子の配列）
アビオトロフィア−デフェクティバ、ストレプトコッカス−アンギノーサス、およびストレプトコッカス−エクイナスの種に属する細菌のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を、連鎖球菌に使用することができる酵素的増幅および自動配列決定によって確かめた。これらの種の選択は、連鎖球菌の系統樹全体を網羅する遺伝子の分岐を示す１６Ｓの系統樹の分析に基づいた。
【００７９】
（戦略および配列決定）
以下の１０種類の連鎖球菌種：ストレプトコッカス−インターメジウス、ストレプトコッカス−サングイニス、肺炎連鎖球菌（Streptococcus penumoniae）、ストレプトコッカス−パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis ）、ストレプトコッカス−オラーリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス−ミチス（Streptococcus mitis ）、ストレプトコッカス−クリスタラス（Streptococcus cristalus ）、ストレプトコッカス−コンステラータス、ストレプトコッカス−アンギノーサス、およびグラニュリカテル−アドジャセンス（Granulicatell adjacens）について、ｒｐｏＢ遺伝子のいくつかの５１０ｂｐ部分配列をジェンバンクから入手可能であるが［マジェウスキー  ジェイ（Majewski J．）、ザワツキー  ピー（Zawadzki P. ）、ピケリル  ピー（Pickerill P.），コーハン  エフ・エム（Cohan F.M.）およびドーソン  シー・ジー（Dowson C.G. ）「細菌種間の遺伝子交換に対する障壁：肺炎連鎖球菌の形質転換（Barriers to genetic exchange between bacterial species: Streptococcus pneumoniae transformation ）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー誌（J. Bacteriol. ）、第１８２巻、１０１６−１０２３頁、２０００年］、これらの著者が使用したプライマーは連鎖球菌属の種の一部しか増幅しない。従って、このデータのみに基づいて本発明者らの研究を行うことは不可能であった。従って、連鎖球菌、エンテロコッカス、アビオトロフィア属、双子菌属、およびグラニュリカテラ属の全ての菌株を増幅することができるプライマーを決定する必要があった。これらのプライマーはまた、２つの種を区別できるのに十分な遺伝的多様性を示す領域に隣接している必要もあった。しかしながら、これらの公開された部分配列のアラインメントによって、以下の共通プライマーを決定することができた（プライマー番号は化膿連鎖球菌の完全配列を指している）。
【００８０】
配列番号３６：５’−ＡＧＡＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡ−３’（プライマー７４８Ｆ）
配列番号３７：５’−ＧＧＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＣＣＡＴＡＧＴＧ−３’（プライマー１１６Ｒ）、および
配列番号３８：５’−ＧＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＣＣＣＡＷＧＴＣＡＴ−３’（プライマー８３０Ｒ）。
【００８１】
これらのプライマーを使用すると、選択された５種（ストレプトコッカス−エクイナス、ストレプトコッカス−ミュータンス、ストレプトコッカス−アンギノーサス、エンテロコッカス−フェカーリス、およびアビオトロフィア−デフェクティバ）のｒｐｏＢ遺伝子の中心部（７１４ｂｐ）を配列決定することができた。いわゆるゲノムウォーキング法を用いて、この中心部の断片から配列決定を続けた。
【００８２】
この公開された区域［マジェウスキー  ジェイ（Majewski J．）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー誌、２００２年、第１８２巻、１０１６−１０２３頁］以外に、ジェンバンクから入手可能な２つの完全配列（肺炎連鎖球菌（ジェンバンクアクセス番号ＡＥ００８５４２）および化膿連鎖球菌（ジェンバンクアクセス番号ＡＥ００６４８０））のアラインメントによって、以下のプライマーを選択することができた：
配列番号３９：５’−ＧＴＣＴＴＣＷＴＧＧＧＹＧＡＴＴＴＣＣＣ−３’（プライマー２２１５Ｒ）
配列番号４０：５’−ＡＣＣＧＴＧＧＩＧＣＷＴＧＧＴＴＲＧＡＡＴ−３’（プライマー２０５７Ｒ）
配列番号４１：５’−ＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＧＹＡＴＹＧＧＴＹＴ−３’（プライマー１２５２Ｒ）
配列番号４２：５’−ＡＧＩＧＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＴＧＴＣ−３’（プライマー３７１Ｆ）
配列番号４３：５’−ＡＧＩＧＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣ−３’（プライマー７３０Ｆ）および
配列番号４４：５’−ＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡ−３’（プライマー５８５Ｒ）。
【００８３】
これらのプライマーを使用すると、５種類の選択された株の一部について配列決定領域を伸長することができた。全く予想外のことに、Ｅ．フェカーリスは、これらのプライマーによって増幅されない。上記の配列決定された部分的な区域は、リステリア菌（Listeria monocytogenes）のｒｐｏＢ遺伝子（すなわち、既存のデータからは全く推論できなかった異なる細菌属に属する細菌のｒｐｏＢ遺伝子）と相同性を示すことが観察された。従って、本発明者らは、エンテロコッカス−フェカーリスのｒｐｏＢ遺伝子を増幅するためにリステリア属のｒｐｏＢ遺伝子のプライマーを選択した。
【００８４】
配列番号４５：５’−ＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＡＡＣ−３’（プライマー１８０Ｆ）
配列番号４６：５’−ＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡ−３’（プライマー４１０Ｆ）
配列番号４７：５’−ＧＧＡＣＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴ−３’（プライマー９１０Ｆ）
配列番号４８：５’−ＡＧＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＴＧ−３’（プライマー２４３０Ｒ）
配列番号４９：５’−ＴＧＡＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’（プライマー３２８０Ｒ）
配列番号５０：５’−ＣＣＣＡＡＡＡＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＣ−３’（プライマー３３６０Ｒ）。
【００８５】
５種類の選択された株（ストレプトコッカス−エクイナス、ストレプトコッカス−ミュータンス、ストレプトコッカス−アンギノーサス、エンテロコッカス−フェカーリス、アビオトロフィア−デフェクティバ）から上記のように得られた部分配列を使用して、ゲノムウォーキングによってＣ末端およびＮ末端の区域を配列決定するための、以下のプライマー：
配列番号５１：５’−ＡＡＣＣＡＡＧＣＹＣＧＧＴＴＡＧＧＲＡＴ−３’（プライマー５２０Ｒ）
配列番号５２：５’−ＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴＩＧＧＧＧＴＧＣＣＡＴ−３’（プライマー２８８１Ｆ）
を選択することができた。
【００８６】
次いで、コード領域の確認ならびに該ヌクレオチド配列から翻訳されるタンパク質と２つの公開された肺炎連鎖球菌ｒｐｏＢタンパク質および化膿連鎖球菌ｒｐｏＢタンパク質とのアラインメントにより示されたように、配列決定が完了した。
【００８７】
一連の特異的プライマーを用いて連続的に伸長させることによってｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を得ることができる断片を得るために、いくつかのコンセンサスプライマー候補について調べた。
【００８８】
前記の段階のそれぞれにおいて、理論的または潜在的に適したプライマーを用いた多くの試みが失敗した後に、以下に記載のｒｐｏＢ遺伝子全体を連続して増幅および配列決定することができる前述のプライマーが決定された。
【００８９】
配列決定反応は、キット、すなわちＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅダイターミネーターサイクルシークエンシングレディーリアクションキット（ABI Prism dRhodamine Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ）（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Perkin Elmer Applied Biosystems ））の試薬を用いて、製造業者の推奨に従い、かつ以下のプログラム、すなわち９４℃１０秒の変性段階、５０℃１０秒のプライマーのハイブリダイゼーション段階、および６０℃２分の伸長段階を含むサイクルを３０サイクルとして行った。配列決定用の該産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動および３７７型ＤＮＡシーケンサー（パーキン）によって分離し、コンセンサス配列を得るためにシークエンスアセンブラー（Sequence Assembler）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）を用いて分析した。
【００９０】
このアプローチを用いて、本発明者らは、連鎖球菌属の２つの種およびアビオトロフィア−デフェクティバのｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を決定することができた。
配列番号１：ストレプトコッカス−アンギノーサスのｒｐｏＢ遺伝子の配列。この配列は長さが４５２３塩基対であり、グアノシン＋シトシン含有量が４１％であり、ジェンバンクに寄託されている（アクセッション番号ＡＦ５３５１８３）。
【００９１】
【化１】
0004717441.tif 000002
0004717441.tif 000003
配列番号２：ストレプトコッカス−エクイナスのｒｐｏＢ遺伝子の配列。この配列は長さが４１１８塩基対であり、グアノシン＋シトシン含有量が４１％であり、ジェンバンクに寄託されている（アクセッション番号ＡＦ５３５１８７）。
【００９２】
【化２】
0004717441.tif 000004
0004717441.tif 000005
配列番号３：アビオトロフィア−デフェクティバのｒｐｏＢ遺伝子の配列。この配列は長さが４３２５塩基対であり、グアノシン＋シトシン含有量が４７％であり、ジェンバンクに寄託されている（アクセッション番号ＡＦ５３５１７３）。
【００９３】
【化３】
0004717441.tif 000006
配列番号４：ストレプトコッカス−ミュータンスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列。この配列は長さが３１９８塩基対であり、グアノシン＋シトシン含有量が４２％であり、ジェンバンクに寄託されている（アクセッション番号ＡＦ５３５１６７）。
【００９４】
【化４】
0004717441.tif 000007
配列番号５：エンテロコッカス−フェカーリスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列。この配列は長さが３０９６塩基対であり、グアノシン＋シトシン含有量が４２％であり、ジェンバンクに寄託されている（アクセッション番号ＡＦ５３５１７５）。
【００９５】
【化５】
0004717441.tif 000008
前述の配列において、ＫヌクレオチドはＴまたはＧを示し、ＭヌクレオチドはＡまたはＣを示し、ＲヌクレオチドはＡまたはＧを示し、ＷヌクレオチドはＡまたはＴを示し、ＹヌクレオチドはＣまたはＴを示し、ＮヌクレオチドはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧを示す。
【実施例２】
【００９６】
（連鎖球菌属および関連する属の２８種類の種のｒｐｏＢ遺伝子の部分配列決定）
実施例１における連鎖球菌属の複数の種およびアビオトロフィア−デフェクティバのｒｐｏＢ遺伝子の完全配列とジェンバンクの既知配列（肺炎連鎖球菌ＡＥ００８５４２および化膿連鎖球菌ＡＥ００６４８０）のアラインメントから、これらの細菌属の２８種類の
株のｒｐｏＢ遺伝子の７０９ｂｐ〜７４０ｂｐ断片を増幅および配列決定するための一組のプライマーを選択した。これらのプライマーの配列は、
配列番号６：５’−ＡＡＲＹＴＩＧＭＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’
配列番号７：５’−ＴＧＩＡＲＴＴＴＲＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧ−３’
であった。
【００９７】
配列番号７の配列は３’プライマーとして使用し、従って、前述の配列番号１〜５の配列に示される直接的な鎖に相補的な逆配列に相当する。
これらのプライマーを、以下の条件、すなわち９５℃で１分間変性させた後に、９４℃１０秒の変性段階、５２℃１０秒のハイブリダイゼーション段階、および７２℃で３０秒の伸長段階を含むサイクルを３５サイクル実施する条件のＰＣＲの際に、細菌から抽出されたＤＮＡと混合した。
【００９８】
増幅産物を、同じプライマー配列番号６および配列番号７を用いて、以下の条件、すなわち９５℃で１分間変性させた後に、９５℃３０秒の変性段階、５２℃３０秒のハイブリダイゼーション段階、および６２℃１分のハイブリダイゼーション段階を含むサイクルを３０サイクル実施する条件で配列決定した。配列決定産物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）３１００シーケンサーで分析した。
【００９９】
本発明者らは、以下の基準を満たすように、これらの２つのプライマー配列番号６および配列番号７の位置を決定した。
１．細菌の種に特異的な配列が、これらの２つのプライマーに隣接すること。この条件は、約７２０ｂｐの断片と、情報データバンクにおいて入手可能なｒｐｏＢ細菌遺伝子の全配列とのアラインメントの後に確認された。
【０１００】
２．分子レベルの検出の感度が最大限高くなるように、可能な限り短い同定領域を検索する。
３．プライマー長が１８〜２２ｂｐである。
【０１０１】
４．融解温度の近いプライマー配列であること。
５．自己ハイブリダイゼーションせず互いに相補的でもないプライマー配列であること。
【０１０２】
連鎖球菌属およびその関連する属の細菌種について得られたｒｐｏＢ遺伝子断片は約７２０（７０９〜７３２）塩基対であり、これらの配列は、この属のそれぞれの種に特異的である。従って、これらの配列を使用すると、試験された２８の種の細菌を以下のように分子レベルで同定することができる。
【０１０３】
配列番号８：ストレプトコッカス−スイスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３２  １７Ｔ，７０９塩基対）
【０１０４】
【化６】
0004717441.tif 000009
配列番号９：ストレプトコッカス−サングイニスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ
５５．１２８Ｔ，７２５塩基対）
【０１０５】
【化７】
0004717441.tif 000010
配列番号１０：唾液連鎖球菌のｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０２５０３Ｔ，７２８塩基対）
【０１０６】
【化８】
0004717441.tif 000011
配列番号１１：化膿連鎖球菌のｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  ５６．４１Ｔ，７２５塩基対）
【０１０７】
【化９】
0004717441.tif 000012
配列番号１２：肺炎連鎖球菌のｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０２９１１Ｔ，７２４塩基対）
【０１０８】
【化１０】
0004717441.tif 000013
配列番号１３：ストレプトコッカス−オラーリスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ
１０２９２２Ｔ，６９４塩基対）
【０１０９】
【化１１】
0004717441.tif 000014
配列番号１４：ストレプトコッカス−ミュータンスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３２２０Ｔ，７２８塩基対）
【０１１０】
【化１２】
0004717441.tif 000015
配列番号１５：ストレプトコッカス−ミチスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３３３５Ｔ，７３０塩基対）
【０１１１】
【化１３】
0004717441.tif 000016
配列番号１６：ストレプトコッカス−エクイナスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ
１０２５０４Ｔ，６９７塩基対）
【０１１２】
【化１４】
0004717441.tif 000017
配列番号１７：ストレプトコッカス−コンステラータスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３２４７Ｔ，７３１塩基対）
【０１１３】
【化１５】
0004717441.tif 000018
配列番号１８：ストレプトコッカス−アンギノーサスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０２９２１Ｔ，６９７塩基対）
【０１１４】
【化１６】
0004717441.tif 000019
配列番号１９：ストレプトコッカス−ディスガラクティエのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列
（ＣＩＰ  １０２９１４Ｔ，７２８塩基対）
【０１１５】
【化１７】
0004717441.tif 000020
配列番号２０：ストレプトコッカス−ボビスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０２３０２Ｔ，７２８塩基対）
【０１１６】
【化１８】
0004717441.tif 000021
配列番号２１：ストレプトコッカス−アシドミニマスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  ８２．４Ｔ，７２８塩基対）
【０１１７】
【化１９】
0004717441.tif 000022
配列番号２２：ストレプトコッカス−アガラクティエのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（Ｃ
ＩＰ  １０３２２７Ｔ，７３３塩基対）
【０１１８】
【化２０】
0004717441.tif 000023
配列番号２３：ストレプトコッカス−ディフィシリスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３７６８Ｔ，７１４塩基対）
【０１１９】
【化２１】
0004717441.tif 000024
配列番号２４：ストレプトコッカス−インターメジウスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３２４８Ｔ，７２８塩基対）
【０１２０】
【化２２】
0004717441.tif 000025
配列番号２５：ストレプトコッカス−エクイのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １
０２９１０Ｔ，７２８塩基対）
【０１２１】
【化２３】
0004717441.tif 000026
配列番号２６：エンテロコッカス−ガリナラムのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３０１３Ｔ，６９４塩基対）
【０１２２】
【化２４】
0004717441.tif 000027
配列番号２７：エンテロコッカス−カセリフラブスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３０１８Ｔ，７２７塩基対）
【０１２３】
【化２５】
0004717441.tif 000028
配列番号２８：エンテロコッカス−サカロリティカス（Enterococcus saccharolyticus
）のｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３２４６Ｔ，７２１塩基対）
【０１２４】
【化２６】
0004717441.tif 000029
配列番号２９：エンテロコッカス−フェシウムのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３０１４Ｔ，７２７塩基対）
【０１２５】
【化２７】
0004717441.tif 000030
配列番号３０：エンテロコッカス−フェカーリスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ
１０３０１５Ｔ，７２４塩基対）
【０１２６】
【化２８】
0004717441.tif 000031
配列番号３１：エンテロコッカス−アビウムのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １
０３０１９Ｔ，５７０塩基対）
【０１２７】
【化２９】
0004717441.tif 000032
配列番号３２：アビオトロフィア−デフェクティバのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０３２４２Ｔ，７３２塩基対）
【０１２８】
【化３０】
0004717441.tif 000033
配列番号３３：ゲメラ−モルビロラムのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  ８１．１０Ｔ，７２７塩基対）
【０１２９】
【化３１】
0004717441.tif 000034
配列番号３４：ゲメラ−ヘモリザンスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩＰ  １０１１２６Ｔ，７２６塩基対）
【０１３０】
【化３２】
0004717441.tif 000035
配列番号３５：グラニュリカテラ−アドジャセンスのｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（ＣＩ
Ｐ  １０３２４３Ｔ，７１９塩基対）
【０１３１】
【化３３】
0004717441.tif 000036
以上の配列において、ＭヌクレオチドはＡまたはＣを示し、ＲヌクレオチドはＡまたはＧを示し、ＷヌクレオチドはＡまたはＴを示し、ＹヌクレオチドはＣまたはＴを示し、ＮヌクレオチドはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧを示す。
【０１３２】
前述の配列において、ＣＩＰ参照番号は、フランス国パリ所在のパスツール研究所にある国立微生物培養物コレクション（Collection Nationale de Culture des Microorganismes ：ＣＮＣＭ）への寄託に関する。
【実施例３】
【０１３３】
（連鎖球菌属および関連する属に属する細菌株１０種類を含む２０種類の細菌株の一群の盲検法による同定）
本願において説明された方法を用いて、盲検法による株の分子レベルの同定を行うために、以下の細菌種：化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス−サングイス（Streptococcus sanguis ）、グラニュリカテラ−アドジャセンス、アビオトロフィア−デフェクティバ、エンテロコッカス−アビウム、エンテロコッカス−フェカーリス、ゲメラ−ヘモリザンス、ゲメラ−モルビロラム（Gemella morbilorum）、ストレプトコッカス−エクイ、ストレプトコッカス−アンギノーサス、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）、シュードモナス−オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、マイコバクテリウム−アビウム（Mycobacterium avium ）、バチルス−セレウス（Bacillus cereus ）、アシネトバクター−アニトラタス（Acinetobacter anitratus ）、コリネバクテリウム−アミコラタム（Corynebacterium amycolatum）、クレブシエラ−テリゲナ（Klebsiella terrigena）、パスツレラ属（Pasteurella ）、ラクトバチルス−ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus ）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）に属する一群の２０種類の株を暗号化した（実験者には、株の正体を推測できるような情報は全く無い）。核酸の抽出およびｒｐｏＢ遺伝子断片の増幅は実施例２に記載のように行い、ＰＣＲ増幅では、Ｎがイノシンである配列番号
６（５’プライマー）および配列番号７（３’プライマー）の配列からなる配列を有する４種類のオリゴヌクレオチドの混合物からなるプライマーを混合した（図１）。これらの１０種類の増幅産物の配列決定は、配列決定用反応物に、実施例２に記載のプライマー配列番号６および配列番号７を混合することによって行った。得られた配列と配列番号１〜５および８〜３５の配列との比較によって、増幅のみられた１０種類の株が化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス−サングイニス、グラニュリカテラ−アドジャセンス、アビオトロフィア−デフェクティバ、エンテロコッカス−アビウム、エンテロコッカス−フェカーリス、ゲメラ−ヘモリザンス、ゲメラ−モルビロラム、ストレプトコッカス−エクイ、ストレプトコッカス−アンギノーサスであると同定することができた。これらの１０種類の株について復号すると、本発明の主題である方法を用いた分子レベルの同定と、表現型を用いる標準的な方法により以前に確立された同定とが１００％一致することが分かった。この結果は、プライマー配列番号６/ 配列番号７のセットの特異性を示している。
【０１３４】
ヒトまたは動物の臨床標本中に頻繁に単離され、連鎖球菌属の細菌を含む可能性もあるという理由で選択された他の細菌は増幅されなかった。これは、別の属の細菌と比較して連鎖球菌属およびその関連する４つの属の細菌を検出するための本発明の使用条件下において、連鎖球菌属およびその関連する４つの属に用いられる前記プライマーが特異性を有することを示している。
【０１３５】
図１は、１０種類の暗号化された細菌株（連鎖球菌属およびその関連する４つの属に属する７種類の株（レーン２、３、４、７〜１１）ならびに連鎖球菌属およびその関連する４つの属以外の属の３種類の細菌株（レーン５、６、および１２）を含む）から得られたＰＣＲ増幅産物を示す。レーン１および１３は分子量マーカーを示す。増幅産物は、前述のプライマー配列番号６および配列番号７を添加した後に得られ、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって視覚化される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】実施例３において得られた、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色による増幅産物の視覚化を示す図。
【図１】
0004717441.tif 000037
【配列表】
0004717441000001.app