(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む動物のコレシストキニン血中レベルを上昇させるための組成物の製造における、20−80 wt％のαラクトアルブミンを含有するα−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白を加水分解することにより得られるペプチドの使用。
【請求項２】
前記α−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白が、α−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の濃縮物またはα−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の単離物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ヒトを含む動物において満腹感を高めるための組成物の製造における、20−80 wt％のαラクトアルブミンを含有するα−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白を加水分解することにより得られるペプチドの使用。
【請求項４】
前記α−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白が、α−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の濃縮物またはα−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の単離物である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ペプチドが乳漿蛋白の酵素的開裂により調製される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、一または複数の酸性プロテアーゼまたはシステインプロテアーゼで乳漿蛋白を開裂することにより調製される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、ペプシン、パパインおよびブロメライン、およびその二以上の混合物から成る群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記乳漿蛋白が、1.5−3.5の間のpHでペプシンにより開裂される、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
前記乳漿蛋白が、2〜3の間のpHで開裂される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ペプチドが乳漿蛋白の単離物から得られる、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記ペプチドが乳漿蛋白の濃縮物から得られる、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記ペプチドが、
ａ）水性の乳漿蛋白の加水分解物を提供する工程、
ｂ）前記水性の乳漿蛋白の加水分解物のpHを4.0−6.0にコントロールし、ペプチドの沈殿を形成する工程、および
ｃ）前記沈殿したペプチドを単離する工程
を含む単離方法により入手される、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
工程ａ）が20℃未満の温度で行われる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ペプチドが脱塩される、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの新規使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
当該技術分野において、腸のコレシストキニン（CCK）レベルを上昇させるための幾つかの試みが為されており、たとえば、CCK放出を刺激するといわれる特別に設計された栄養剤を提供することにより為されている。かかる栄養剤は、US特許出願US2002/0119915に記載され、ここには、食後の満腹感を延長するため食前に摂取しなければならない、タンパク質、脂肪酸およびプロテイナーゼ阻害剤を含む粉末組成物が開示される。このプロテイナーゼ阻害剤は、CCK放出の刺激に重大であると記載されている。前記組成物において乳漿蛋白はタンパク質源として使用することができるが、乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドは開示されていない。更に、プロテイナーゼ阻害剤の存在は、加水分解物の形成を妨害する。
【発明の開示】
【０００３】
乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドが、ヒトを含む動物においてとりわけ血中のCCKレベルを上昇させるのにプラスの効果を奏することが驚くべきことに本発明で見出された。CCKは、動物において満腹シグナルを調節することにより、肥満および太り過ぎの治療および予防に重要な役割を果たすことが知られている（たとえば、A. Stafleu, Leads in Life Sciences, 2002, (14) pp. 9-10参照）。
【０００４】
したがって、本発明は、それを必要とするヒトを含む動物のコレシストキニン血中レベルを上昇させるため、並びに太り過ぎおよび/または肥満を予防または治療するための、医薬の有効成分または食品成分としての、乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの新規使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
「ペプチド」の用語は当該技術分野で知られており；本明細書においてこの用語は、好ましくは500−5000ダルトン、より好ましくは1000−3000ダルトンの分子量を有するアミノ酸鎖に関する。タンパク質が、加水分解により少数のアミノ酸から成るペプチドに断片化され得ることは、たとえば一般常識である。
【０００６】
本発明の使用のためのペプチドは、乳漿蛋白の加水分解により、より好ましくは乳漿蛋白の酵素的開裂により入手される。ペプチド、すなわちタンパク質のフラグメントを入手するためのタンパク質の加水分解および酵素的開裂は、当該技術分野において公知の技術である。
【０００７】
好ましい態様において、ペプチドは、一または複数の酸性プロテアーゼまたはシステインプロテアーゼ、好ましくはペプシン、パパインまたはブロメライン、またはその二以上の混合物から成る群より選択されるもので乳漿蛋白を開裂することにより調製される。好ましくは、タンパク質源は、好ましくは1.5−3.5の間のpH、より好ましくは2〜3の間のpHでペプシンにより開裂される。
【０００８】
ペプチドは、乳漿蛋白から得られる。乳漿蛋白は、比較的高いトリプトファン含量（約1.8 w/w％）を有することが観察される。本発明の非常に魅力ある態様において、ペプチドは、乳漿蛋白の単離物、好ましくは乳漿蛋白の濃縮物、最も好ましくはα−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の濃縮物（WPC）またはα−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の単離物（WPI）から得られる。「乳漿蛋白の単離物」および「乳漿蛋白の濃縮物」の用語は、当該分野で知られており、たとえば、Walstra et al., 1999, Dairy Technology, ISBN 0-8247-0228-Xが参照される。乳漿蛋白の濃縮物は、35−80 w/w％のタンパク質を有する乳漿蛋白産物であり、一方、乳漿蛋白の単離物は、90 w/w％以上のタンパク質含量を有する。WPCの例は、ARLA, DenmarkからのLacprodan 80であり；WPIの例は、Bio-isolates LtdからのBiproである。α−ラクトアルブミンリッチの乳漿蛋白の単離物および濃縮物は、乳漿蛋白から誘導され、高いα−ラクトアルブミン含量を有する。αWPCのα−ラクトアルブミン含量は、20−80 w/w％の間で、その調製物に依存して変化し得るが、通常のWPCのα−ラクトアルブミン含量は、約12−18 w/w％である。α−ラクトアルブミンは、約5.8 w/w％の高いトリプトファン含量を有する。約60 w/w％のα−ラクトアルブミンを含有する乳漿蛋白の単離物は、DMV International, the Netherlandsから入手することができ、EP 0 604 684に記載される。
【０００９】
本発明の好ましい使用において、ペプチドは、
ａ）水性の乳漿蛋白の加水分解物を提供する工程、
ｂ）水性の乳漿蛋白の加水分解物のpHを4.0−6.0にコントロールし、ペプチドの沈殿を形成する工程、および
ｃ）沈殿したペプチドを単離する工程
を含む単離方法により入手される。
【００１０】
上述のとおり、当業者であれば、乳漿蛋白の加水分解反応を実施するための適切な条件を知っている。pHを「コントロールする」の用語は、pHをペプチドの沈殿反応の間に上記pH値に調整または維持することを意味する。
【００１１】
沈殿したペプチドの単離は、当該技術分野で公知の方法により行うことができる。沈殿したペプチドは、たとえば、遠心分離、デカンテーション、または濾過などにより集めることができる。長い貯蔵寿命を得るために、単離は、好ましくは乾燥工程を含む。当業者であれば、適切な乾燥技術を知っている。実施例で示されるとおり、沈殿したペプチドは、CCKレベルを上昇させるのに効果的であり、太り過ぎおよび肥満に対して使用可能であることが見出された。
【００１２】
好ましくは、沈殿反応は、20℃未満の温度で行われる。前記温度未満において、ペプチドは非常に効率よく沈殿することが示されている。
【００１３】
上述のとおり、水性ペプチド混合物、すなわち乳漿蛋白の加水分解物は、好ましくは乳漿蛋白の酵素的開裂により調製され、より好ましくは、乳漿蛋白は、一または複数の酸性プロテアーゼまたはシステインプロテアーゼにより、とりわけペプシン、レンニン、酸性真菌プロテアーゼ、キモシン、パパイン、ブロメライン、キモパパインまたはフィシン、またはその二以上の混合物から成る群より選択される一または複数の酵素により、酸性pHにおいて開裂される。一または複数の前記酸性プロテアーゼ、とりわけペプシンを用いて、1.5−3.5のpH、好ましくは2−3のpHにおいて乳漿蛋白を開裂することにより、疎水性を有するペプチドが生成される。pHを4.0−6.0、好ましくはおよそ5.0にコントロールすることにより、これらペプチド混合物から、有効なペプチドを非常に効率よく選択的に単離できることが見出された。酵素的開裂の時のpHが4.0未満であった場合、ペプチドを沈殿させるためにpHを4.0−6.0に調整しなければならない。好ましくは、酵素活性は、沈殿の工程の前に酵素の不活性化により消失される。当業者であれば、タンパク分解酵素を不活性化する方法を知っている。上記pH範囲の4.5−6.0内にその最適pHを有する酵素、たとえばパパインまたはブロメラインを選択した場合、乳漿蛋白の開裂とペプチドの沈殿反応を同時に起こすことができるように単離方法を設計することができる。加水分解されたペプチド、優先的には沈殿；そうでなければ、一部の加水分解されたペプチドの沈殿を入手可能な条件で、沈殿反応が行われるように注意しなければならない。
【００１４】
好ましくは、ペプチド混合物は、pHをコントロールする工程（工程b）の前に脱塩される。pHコントロール工程の前の脱塩工程により、沈殿したペプチドの収率が高まることが見出された。脱塩は、公知の技術であり、たとえばナノフィルトレーション、限外濾過または電気透析により行うことができる。ペプチドを酵素的開裂により入手するときは特に、得られたペプチド混合物の脱塩により収率が高まる。脱塩は、好ましくは、開裂反応の間に存在する塩の50−95％がペプチド混合物から除去されるように行う。
【００１５】
上記単離方法により、たとえばCCKレベルを上昇させるため、並びに肥満および太り過ぎに対抗するための食品成分または医薬において有利に使用することができるペプチド混合物を入手することができる。
【００１６】
更に本発明は、それを必要とするヒトを含む動物のコレシストキニン血中レベルを上昇させるための方法であって、上述される乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの有効量を動物に投与する工程を含む方法に関する。投与は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができ；ペプチド混合物は、適切なキャリアを含む医薬として投与することができる。投与ルートは、当該技術分野で公知の任意のルートとすることができ、たとえば経口、経皮ルートが挙げられるが、これに限定されない。医薬は、任意の公知の形態とすることができ、たとえば丸剤、軟膏剤、または注射流体の形態が挙げられる。また、ペプチド混合物は、粉末として投与すること、または食品製品に組み込むことができる。
【００１７】
また本発明は、それを必要とするヒトを含む動物の太り過ぎおよび/または肥満を予防または治療するための方法であって、上述される乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの有効量を動物に投与する工程を含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、非限定的な実施例および図面により更に説明され、ここでは、ヒトボランティアの血漿中の平均CCK濃度（pmol/l、n=8）を、本発明のペプチド（黒四角）、トリプトファンを含むアミノ酸（白抜きの菱形）、アミノ酸としてのトリプトファン（黒三角）および参照物質（バツ印）の消費後の幾つかの時点において示す。
実施例におけるパーセントは、特に記さない限り重量パーセントである。
【００１９】
実施例１
乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの調製
75％ α−ラクトアルブミンを含有する乳漿蛋白の単離物の溶液（Davisco）を、脱塩水中に溶解し、2.8 w/w％ 乾燥固体および2 w/w％ α−ラクトアルブミンを含む溶液を得る。2 M リン酸を用いてpHを2.0に調整する。その後、前記混合物を50℃に加熱する。
0.5％ E/Sペプシン（Merck, USA）を添加することにより、加水分解反応を開始する。E/Sは、酵素/基質の比を表す。6時間後、90℃で10分間反応をインキュベートすることにより、反応を停止させる。続いて、pHを5.0に上げ、温度を4℃に下げた。この温度で20時間保存した後、沈殿したペプチドを、デカンテーションと遠心分離により集め、続いて凍結乾燥させる。
【００２０】
トリプトファンは、全体の酵素的加水分解に基づく特有の技術を用いて測定される（Garcia, S.E.; Baxter, J.H. (1992) Determination of tryptophan content in infant formulas and medical nutrition. J. AOAC Int. 75: 1112-1119）。アミノ酸フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンは、EGガイドライン98/64（3-9-1998；19-9-1998の出版物L257/14-23）に従って測定される。タンパク質（81.1％）は、標準的なケルダール法（IDF-FIL 20A, 1986）を用いて測定される。得られた産物は、産物に8.5％トリプトファンを含有し、ペプチドに10.4％含有する。
化学的分析およびアミノ酸分析を表１に示す。
【００２１】
【表１】
0004611752.tif 000002
【００２２】
実施例２
乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの調製２
60％ α−ラクトアルブミンを含有する乳漿蛋白の単離物（WPI）（DMV International, The Netherlandsの実験産物）を、水溶液中に溶解する。希釈リン酸を用いて水溶液のpHを調整し、45℃に加熱する。
加水分解は、2％ ペプシン（Merck, 2500 FIP-U/g）を添加することにより開始し、2時間行う。溶液を85℃で10分間低温殺菌することにより反応を停止させる。その後、pHを5.5に上げ、溶液を＜15℃に冷却する。10時間後、沈殿したペプチドを、マイクロフィルトレーションを用いて集める。典型的には、表示の分子量カットオフが1μmのメンブレンを使用する。その後、ペプチドをスプレー乾燥させる。得られた産物は、ペプチドに9.3％トリプロファンを含有する。
【００２３】
実施例３
乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの調製３
参照例１と同様の乳漿蛋白の溶液を、ペプシン（American Laboratories, USA）により、酵素/基質の比（E/S）を0.25％および0.75％のw/w％で用いて加水分解した。5時間後、1.0 M NaOHを用いてpHを5.2に上げ、溶液を＜15℃に冷却することにより、反応を停止させた。
沈殿したペプチドを、16時間後、遠心分離により回収した。
【００２４】
実施例４
乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの調製４
45％ α−ラクトアルブミンを含有する10％乳漿蛋白の溶液（DMV International, The Netherlands）を、脱塩水中に溶解した。1 M水酸化ナトリウムを用いてpHを7.0に調整した。その後、溶液を50℃に加熱した。
加水分解反応は、2％ ENZECO Bromelain 240（Enzyme Development Corporation）を添加することにより開始した。21時間後、85℃で10分間溶液を加熱することにより反応を停止させた。続いて、ペプチド混合物を室温に冷却し、リン酸を用いてpHを4.5に調整し、温度を10℃に下げた。この温度で12時間保存した後、沈殿したペプチドを遠心分離により集め、続いて凍結乾燥させた。
得られたペプチドのトリプトファン含量は8％であった。
【００２５】
実施例５
乳漿蛋白の加水分解物から得られるペプチドの調製５
100 Lの5％乳漿蛋白の単離物の溶液（Davisco）を調製し、次いで2％ペプシンを用いて加水分解した。溶液は、pH 3.0において12時間加水分解した。80℃で30分間溶液を加熱することにより反応を停止させた。その後、Celgard NF-PES-10メンブレンを用いてパイロットNFユニット上で、溶液を限外濾過した。残留物のpHを3.0にコントロールし、溶液を200％ダイアフィルトレーションまで濾過した。
脱塩した後、残留物のpHを5.5に調整し、溶液を＜10℃に冷却して、予見されるペプチドの沈殿反応を促進した。10時間保存した後、遠心分離を用いて沈殿を集めた。その後、ペプチドを乾燥させた。
サンプル中のトリプトファンおよびペプチドの濃度は、それぞれ9.5％および91％であった。
【００２６】
実施例６
トリプトファンリッチのペプチドの摂取に対するCCKレベルの増大
下記実験は、二重盲式、4ピリオド、ランダム化、交差、プラセボ比較の試験で実施した。
8人の健康なヒトボランティアを2人の4グループに分け、一晩食物を控えた。翌朝、被験者は、（25 gグルコース含有）オレンジジュースを摂取し、以下のとおり場合によっては試験物質を摂取した：
グループ１：単回投与のオレンジジュース（200 mL）あたり、実施例１で得たペプチド5.91 gを含有するオレンジジュース
グループ２：純粋なトリプトファン500 mg（Ajinomoto USA, Inc.）を含有するオレンジジュース
グループ３：グループ１のジュースと同一の組成および濃度で遊離のアミノ酸の混合物を含有するオレンジジュース（前記アミノ酸はAjinomoto USA, Inc.から購入した）
グループ４：試験物質を含有しないオレンジジュース
【００２７】
実験は、8人のボランティア全員が最終的に4つの試験物質をすべて摂取するように4回繰り返した。オレンジジュースの摂取後4時間にわたって、摂取からt=0、30、60、90、120、180および240分後に、被験者から血液を採取した。CCK分析は、Euro-Diagnostica（cat nr. #RB302）のラジオイムノアッセイ（RIA）キットを用いて、製造者の使用説明書に従って行った。
【００２８】
その結果を下記表２および図３に示し、摂取からt=30分後に最大CCKレベル3.25 pmol/Lを示す。ヒトの基底レベルは、通常約1 pmol/Lであり、食後3−8 pmol/Lに増大する（Becker et al., Am. J. Surg., 1984 (147) pp. 124-129）。CCKの最大レベルは、食事の摂取後10−45分の間に徐々に到達するため（Himeno, Am. J. Gastroenterol., 1983 (78) pp. 703-707）、最大CCKレベルが3.25 pmol/Lより高く、t=0分とt=30分の間に起こる可能性は充分にある。2−4 pmolの血漿レベルの増加は、満腹感の認識の高まりに関連すると考えられる。
【００２９】
【表２】
0004611752.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】トリプトファンリッチのペプチドの摂取に対するCCKレベルの増大を示すグラフ。
【図１】
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