(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミンの多量体をアルカリ性溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法であって、該ヒト血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存在下、ｐＨ９．０で、２〜８時間アルカリ性溶液で処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
ヒト血清アルブミンが遺伝子組換え技術により生産される組換えヒト血清アルブミンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルカリ性溶液での処理時間が、３〜５時間である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
アルカリ性溶液での処理が、０〜６５℃で行われる請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
アルカリ性溶液での処理が、室温で行われる請求項４記載の方法。
【請求項６】
アルカリ性溶液が、アルカリ性有機化合物又はアルカリ性無機化合物からなる群より選ばれる物質で調製される請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アルカリ性溶液が、アンモニア、アンモニウム塩、塩基性金属水酸化物、ホウ酸塩、リン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸塩、トリスヒドロキシアミノメタン及びこれらの２種以上の混合物からなる群より選ばれる物質で調製される請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ＳＨ基含有化合物の濃度が、０．１〜５０ｍＭである請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ＳＨ基含有化合物の濃度が、０．２〜１５ｍＭである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＳＨ基含有化合物の濃度が、０．５〜５ｍＭである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＳＨ基含有化合物が、低分子化合物である請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＳＨ基含有化合物が、システイン、システアミン、シスタミン、及びメチオニンからなる群より選ばれる物質である請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト血清アルブミンの精製方法に関する。より詳細には、血漿由来のヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）又は遺伝子組換え技術により得られる組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡと称することもある）を精製する際に、その製造工程において行われるアルカリ性溶液処理により形成されるヒト血清アルブミンの分子内又は分子間ジスルフィド結合の掛け違いによるミスホールディングを、ＳＨ基含有化合物を添加することによって抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血清アルブミン(以下、ＨＳＡと称することもある)は、血漿中の主要な蛋白成分で、585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダルトンの分子量を有する(Minghetti, P. P. et al.(1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。ＨＳＡは、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカルシウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリアーとしての役割を果たすことが知られている。純化したＨＳＡは、例えば、外科手術、出血性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アルブミン血症の治療に使用される。
【０００３】
従来、ＨＳＡは、ヒト血漿からコーンの低温エタノール分画法あるいは該方法に準じて、ＨＳＡ画分（ＨＳＡは画分Vに分画される）を得た後、更に、種々の精製方法を駆使して製造されている。また近年、原料をヒト血漿に依存しない方法として、遺伝子組換え技術を応用して酵母や大腸菌、枯草菌にヒト血清アルブミンを生産させる技術が開発されている。酵母については、(1) Production of Recombinant Human Serum Albumin from Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry 11, 273-287(1989)、(2) Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken. Okabayashi et.al, J. Biochemistry, 110, 103-110 (1991)、(3) Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1072(1991)、大腸菌については(4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular human serum albumin; Lawn, R. M., European Patent Appl. 73,646 (1983)、(5) Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et. al. Biotechnique 5, 1309-1314 (1987)、枯草菌については(6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis; Saunders, C. W. et. al, J. Bacteriol. 169, 2917-2925 (1987)参照。
【０００４】
ヒト血清アルブミンの精製方法としては、一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、ヒト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わせにより行われている。
【０００５】
ヒト血清アルブミンの工業的生産においては、ヒトの体内環境と異なる諸条件で処理する必要があり、そのためにヒト血清アルブミンの多量体が生成する。ヒト血清アルブミンの臨床応用でこれらの多量体が人体に悪影響を及ぼすという報告はまだされていないが、これらの多量体による新たな抗原性の発現等の懸念がある。このような医薬品としての安全性の観点より、「ヒト血清アルブミン」の医薬品としての規格試験において多量体の混入限度が規定されており、製剤中の多量体の含量を十分低下させることは製造上の非常に重要な課題となっている。
【０００６】
一般に、蛋白質溶液をアルカリ性にすると、蛋白質分子内のシステイン残基のSH基は、蛋白質分子内又は蛋白質分子間でジスルフィド結合を形成する(ジスルフィド結合交換反応を含む)。この時、ジスルフィド結合の掛け違いが起こり、本来の蛋白質とは異なる立体構造を有する蛋白質を生じることがある。このジスルフィド結合の掛け違いは、分子内及び分子間で起こり得る。したがって、種々の夾雑物が混在すると、該夾雑物との間でジスルフィド結合が形成され、新規物質を生成することもある。このような誤ったジスルフィド結合の形成をミスホールディングと称することがある。
【０００７】
本発明者等は、ＨＳＡ多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液をアルカリ性溶液で処理することによって該多量体を効率よく単量体に変換する方法を開発した。
【０００８】
この方法は、ＨＳＡの製造過程における損失を防ぐために非常に有用な方法であるが、上述したように、ＨＳＡの分子内ミスホールディング又はＨＳＡ自身若しくはＨＳＡと他の夾雑物との間の分子間ミスホールディングが起こる場合がある。一旦、ミスホールディングによって新規物質が形成されると、これを除去することは難しく、厄介である。該新規物質は、新たな抗原性の発現やその他の原因により、投与された患者にアレルギー等の副作用を発生させる可能性がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ヒト血清アルブミンの製造過程で行われるアルカリ性溶液処理(クロマト等を含む)工程において形成されるヒト血清アルブミンの分子内ミスホールディング又はＨＳＡ自身若しくはＨＳＡと他の夾雑物との間の分子間ミスホールディングを抑制する方法を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、ヒト血清アルブミンを製造する際に行われるアルカリ性溶液処理において、そのアルカリ性溶液で処理液中にシステインのようなＳＨ基含有化合物を添加すると、ＨＳＡの分子内及び／又は分子間ミスホールディングが抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、ヒト血清アルブミンの多量体をアルカリ性溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法であって、該ヒト血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存在下、アルカリ性溶液で処理することを特徴とする方法を提供するものである。
本発明はまた、該方法により得られた該複合体を含有しないＨＳＡを提供するものである。以下、本発明について詳述する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒト血清アルブミンの製造工程の中でヒト血清アルブミン多量体を単量体化する際に使用されるアルカリ性溶液に、ＳＨ基含有化合物を存在させることを特徴とする。この方法を実施することにより、ヒト血清アルブミンの分子内又は分子間ミスホールディングが抑制され、高純度のヒト血清アルブミンの製造が可能となる。
【００１４】
本発明に使用されるヒト血清アルブミン多量体の由来については特に制限はなく、血漿由来のＨＳＡ又は遺伝子組換え技術により生産されるｒＨＳＡから生じたものをアルカリ性溶液処理に供することができる。以下、ＨＳＡ及びｒＨＳＡの多量体を単に多量体と称することもある。
【００１５】
血漿からＨＳＡを製造する際、各製造工程で多量体を生じることが予測されるが、いずれの工程で生じた多量体含有水溶液も使用可能である。例えば、低温アルコール分画の画分Ｖの水溶液、画分Ｖを更なる精製工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際に生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられる。
【００１６】
ｒＨＳＡ製造の際に生じた各製造工程の多量体含有水溶液も同様に使用することができる。例えば、ｒＨＳＡ産生宿主の培養物、該培養物を更なる製造工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際に生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられる。ここで、培養物とは、上記宿主を培養した培養液及び宿主を通常使用される方法で破砕した宿主破砕液を含むものとする。
【００１７】
ｒＨＳＡの生産に用いる宿主としては、ｒＨＳＡを生産することができる宿主であれば特に制限はなく、例えば、酵母、細菌、動物細胞、植物細胞などが挙げられ、好ましくは、酵母が使用される。
【００１８】
製造過程でＨＳＡ又はｒＨＳＡ中に含まれる多量体をアルカリ性溶液処理する際のＨＳＡ又はｒＨＳＡの濃度は、該ＨＳＡ又はｒＨＳＡが溶解する濃度であれば特に制限はないが、好ましくは、100 mg/ml以下の濃度である。
【００１９】
ＨＳＡ又はｒＨＳＡの多量体を単量体化する際のアルカリ性溶液のｐＨは、好ましくは8〜11、さらに好ましくは、ｐＨ8.5〜9.5、最も好ましくは9.0である。
【００２０】
アルカリ処理液のｐＨをアルカリ性にするのに使用される化学物質は、特に限定されない。例えば、アルカリ性有機化合物、アルカリ性無機化合物、具体的には、アンモニア、アンモニウム塩、塩基性金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、ホウ酸塩、リン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸塩、トリスヒドロキシアミノメタン及びこれらの2種以上の混合物からなる群より選ばれる物質が挙げられる。
【００２１】
かかる化学物質は、多量体を含有する水溶液の濃度により異なるが、ＨＳＡ又はｒＨＳＡを変性させない濃度範囲で使用される。
ヒト血清アルブミンの多量体の単量体化は、多量体を含有する水溶液をアルカリ性にした後、所定時間、好ましくは15分以上、さらに好ましくは３時間以上放置することにより行われる。放置時間の上限は特に限定されない。
アルカリ処理を行う際の温度は、ＨＳＡ及びｒＨＳＡを変性させない温度以下であれば良く、例えば、0〜65℃、好ましくは10〜40℃、さらに好ましくは室温(約25℃)である。
アルカリ性溶液処理の際にＨＳＡ又はｒＨＳＡ溶液中に存在させるＳＨ基含有化合物としては、官能基ＳＨ基を含む化合物であれば特に限定されないが、ＳＨ基を有する低分子化合物が好ましい。具体的には、システイン、システアミン、シスタミン、メチオニンなどが挙げられるが、好ましくは、システインが用いられる。ＳＨ基含有化合物は、1〜100 mg/mlのＨＳＡ又はｒＨＳＡ濃度に対して、好ましくは0.1〜50 mM、さらに好ましくは0.2〜15 mM、最も好ましくは、0.5〜5mMの終濃度となるように添加される。
【００２２】
遺伝子組換え技術を応用した製造においては、ｒＨＳＡを分泌する宿主の培養液又は該ｒＨＳＡ産生宿主を破砕した直後の破砕物を低速遠心分離した後、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、塩析、キレートクロマト、疎水性クロマト及び吸着クロマトなどの種々の精製方法又はこれらの組み合わせによる方法により高純度に精製される。
【００２３】
また、血漿由来のＨＳＡは、例えば、ヒト由来の血漿を低温エタノール分画し、約90％のＨＳＡを含む画分Ｖを得た後、前記の精製方法を駆使して精製される。低温エタノール分画の前に、プロテアーゼによる分解を防ぐために加熱処理されることもある。
【００２４】
本発明の方法は、前記のＨＳＡ又はｒＨＳＡの製造過程におけるいずれの工程で使用しても良い。好ましくは、ｐＨが５以下の条件でヒト血清アルブミン溶液を処理する工程、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー後に生じた多量体をアルカリ性溶液処理して単量体化する際に使用するのが効果的である。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、血漿中のＨＳＡ又は遺伝子組換え技術を応用して得たｒＨＳＡの製造工程中の酸化雰囲気において、特異的に生じるヒト血清アルブミンの分子内又は分子間ミスホールディングを効果的に抑制することができる。
【００２６】
また、本発明の方法により、ヒトに投与された場合アレルギーなどの副作用の原因となり得るミスホールディングによって生じた新規物質が低減された高純度のヒト血清アルブミンを得ることができる。
【００２７】
【実施例】
調製例：多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液の調製
特表平１１−５０９５２５に述べられている方法に従って、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によりｒＨＳＡを生産させた。このｒＨＳＡを含む培養液を精製水で約２倍容量になるように希釈後、酢酸水溶液を用いてｐＨ4.5に調整した。50 mM塩化ナトリウムを含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化したストリームラインＳＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）(径60cm×16cm)に適用した。次に、カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄し、次に、300 mM塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)を送液してｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００２８】
調製例に従って得られたｒＨＳＡ含有画分50 mlに、終濃度0〜15 mMとなるようにシステインを添加し、さらに0.5 N水酸化ナトリウム液（2.8 ml）を添加してｐＨ約9.0に調整し、室温で５時間放置した。次いで、該溶液に酢酸水溶液を加え、ｐＨ7.0に調整し、アルカリ性溶液で処理を終了した。定法に従って、該溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(10-20%グラディエントゲル)に続き、ウェスターンブロットを行った。1次抗体には、ヤギ抗-ヒト血清アルブミン、2次抗体には抗-ヤギIgG-HRPコンジュゲートを用い、化学発光により発色させフィルムに転写後現像した。図1は、システイン無添加の際のアルカリ性溶液で処理前後のウェスターンブロット分析の結果を示す。アルカリ性溶液で処理後の試料▲２▼では、分子量約68,000に分子内ミスホールディングによるｒＨＳＡのバンドが見られる。各種濃度のシステインを添加し、アルカリ性処理して得られた試料について、このバンドをクマシー染色し、解析ソフト(Collage Ver.3)で各バンドの濃度を測定した。結果を表１に示す。各数値は、システイン無添加時のバンドの濃度を100%とした相対値である。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
アルカリ性処理の際にシステインを存在させることにより、ヒト血清アルブミンの分子内ミスホールディングが効果的に抑制されることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】調製例で得られたヒト血清アルブミン溶液のアルカリ性溶液で処理前後の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスターンブロットを行った結果を示す写真である。▲１▼はアルカリ性溶液で処理前、▲２▼はアルカリ性溶液で処理後の試料を示す。
【図１】
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