(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
0004713514.tif 000030
を有し、
ＡおよびＢは、互いに独立であり、ＲおよびＸから独立であり、
ＡおよびＢは、
（１）水素、
（２）三リン酸、
（３）リン酸、および
（４）ヌクレオチド残基の鎖
からなる群から選択され、
ただしＡは三リン酸であり得るが、Ｂは三リン酸ではあり得ず、
Ｒ＝Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、またはＯ−アルキニルであり、
Ｘは、蛍光実体を有するリンカーであり、該リンカーは４〜２０原子長を有する、
ことを特徴とする、化合物。
【請求項２】
Ｒ＝Ｈであることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ハイブリダイゼーションプローブとしての請求項１または２記載の化合物の使用であって、ＡまたはＢがヌクレオチド残基の鎖であることを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸の検出、分析および定量化のために、標識オリゴヌクレオチドプローブの両末端ならびに内部の基礎単位として置換されたインドールヌクレオシドを再び述べる。該置換基にはリンカーおよび検出可能な基、またはリンカーおよび合成後標識のための反応性基が含まれる。これらの修飾されたヌクレオシドにより広い応用領域への参入が認められる。これら新規の置換されたインドールヌクレオシドは、例えば最適なハイブリダイゼーションプローブ、Taqmanプローブまたは分子ビーコンプローブの簡便な調製のための標識試薬として用いられ得る。
【０００２】
（技術的背景）
植物相および動物相由来の、解読されてマッピングされたゲノム配列の数の安定した増加は、DNA技術が現在どれほど重要であるかということを印象的に示す。しかしDNAの配列決定だけが重要ではない。ゲノミクスおよびプロテオミクスの分野の知識の増大と共に、例えば変異のような細胞または生物体の将来に特異的な効果の影響が科学者にはっきり見えるようになる。一方で、核酸はしばしば非常に低い濃度で存在し、もう一方でしばしば、例えば細胞溶解後に、他の多くの固形物および／または溶解された物質の存在下で発見されるので、核酸を単離または測定することは困難である。
【０００３】
検出可能なプローブを用いた標的核酸のハイブリダイゼーションにより、検出、分析および定量化のための多様な方法が確立されている（サザンハイブリダイゼーション、ドットブロッティング、ゲルアッセイ、またはPCR等）。
【０００４】
例えばポリマー核酸の増幅のための核酸関連作業の主なツールは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。ここ数年において、PCRについての知識およびPCRの応用が著しく伸びてきた。
【０００５】
一般的にPCRの手順は3つの工程：試料の調製、増幅、および産物の分析からなる。これらの工程は通常連続して行なわれるが、増幅および分析は同時に行なわれ得る。DNA色素または蛍光プローブは、増幅前にPCR混合液に添加され得、増幅中のPCR産物の分析に使用され得る。器具を変えない、同一チューブ内での試料の同時の増幅および分析により、試料の取扱時間が減少し、次の反応について産物の汚染の危険が最小になる。増幅と分析を組み合わせる本アプローチは、「リアルタイム」PCRとして公知となっている（US 6,174,670）。
【０００６】
他の可能性のある増幅反応は、リガーゼ連鎖反応（LCR, Wu, D.Y., and Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569; Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193; US 5,494,810）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Barany, F., PCR Methods Appl. 1 (1991) 5-16）；ギャップ-LCR（WO 90/01069; US 6,004,286）；修復連鎖反応（Repair Chain Reaction）（EP 0 439 182 A2）；3SR（Kwoh, D.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08808）；およびNASBA（US 5,130,238）である。さらに、鎖置換型増幅（strand displacement amplification）（SDA, US 5,270,184; US 5,455,166）、転写媒介増幅（transcription mediated amplification）（TMA）およびQベータ増幅（Q-beta-amplification）（概説に関して、例えばWhelen, A.C., and Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D., and Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47を参照）および高効率等温遺伝子増幅法（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）（ICAN, Shimada, M., et al., Rinsho Byori. 51 (2003) 1061-1067）およびカスケードローリングサークル増幅（cascade rolling circle amplification）（CRCA, Thomas, D.C., et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 123 (1999) 1170-1176）がある。
【０００７】
上述核酸技術について検出可能標識が提供される、合成（デオキシ）オリゴヌクレオチドは、例えば広い範囲の多様な分子生物学および分子的診断方法を行なうために必要である。
【０００８】
単鎖オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログ配列の合成方法は、当該分野に公知である（例えばOligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait編., IRL Press, Oxford (1984); Kuijpers, W.H.A., et al., Nucleic Acids Research 18 (1990) 5197-5205; Dueholm, K.L., J. Org. Chem. 59 (1994) 5767-5773; Agrawal, S. (編), Methods in Molecular Biology, volume 20）。
【０００９】
第一の効果的で広範囲に応用可能な、オリゴおよびポリヌクレオチドの合成方法は、ホスホトリエステル法であった（例えばLetsinger, R.L., et al., J. Am. Chem. Soc. 91 (1969) 3360-3365参照）。合成中の分岐等の副反応を防ぐために、例えばベータシアノエチル基またはオルト-クロロフェニル基で反応性基を保護した。連結工程のアクチベーターとして、メシチルスルホニルクロリドおよびメシチルスルホニルニトロトリアゾールを用いた。
【００１０】
合成（デオキシ）オリゴヌクレオチドは通常、ホスホロアミダイト化学の補助により固相で調製される。固相として、通常規定の大きさの孔を有するガラスビーズ（以下のCPG=多孔性ガラス（controlled pore glass）と略される）を用いる。固相合成が完了した後に、基の切断によりオリゴヌクレオチドが解離し得るように、切断可能な基を介して第一の単量体を支持体に結合させる。さらに第一の単量体は保護されたヒドロキシル基を含有するが、ジメトキシトリチル（DMTr）は通常、保護基として利用される。保護基は酸処理により除去され得る。次いで、DMTr保護基も提供された（デオキシ）リボヌクレオシドの3’-ホスホロアミダイト誘導体は、DMTr保護基から解離した後に、各連続的な反応性基へ周期的なプロセスにおいて連結される。
【００１１】
先行技術に従って、3'末端で標識されたオリゴヌクレオチドを調製するために、三機能性支持物質が使用され得る。二つの反応性ヒドロキシル基およびさらなる反応性基を伴うこの三機能性スペーサーに関して、好ましくはアミノ基が提供される。検出可能標識を三機能性スペーサーの反応性アミノ基に結合させる。しかしながら、択一的に、検出可能標識は反応性アミノ基を介してだけでなく、第三のヒドロキシル基またはSH基を介しても三機能性スペーサーに連結する（US 5,451,463; WO 92/11388）。第三の工程において、三機能性スペーサーは、なおも解離しているヒドロキシル基を介して、切断可能な結合を提供される固相物質の結合基に結合する。
【００１２】
あるいは、検出可能標識は、オリゴヌクレオチドが実際に合成されるまで連結されない（US 5,141,837)）。しかしながら、このことには多数の独立した連結反応が必要であるので、かかる産生プロセスは困難で、費用が高く、自動化することができない。
【００１３】
C3〜C12リンカーを介してマーカー基がホスホロアミダイトに結合される、標識ホスホロアミダイトは、通常5'末端で標識されるオリゴヌクレオチドの合成に使用される。
【００１４】
従って、ホスホロアミダイト戦略により、検出可能標識も内部に導入され得る（Wojczewski, C., et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678）。CPG物質の合成に関する限り、同一の三機能性スペーサーがこのために使用され得る。ヒドロキシル基の一つが固相へ結合する代わりに、このプロセスにおいてこのヒドロキシル基はホスホロアミダイトに転換される。得られたホスホロアミダイトは標準アミダイトのようにオリゴヌクレオチド合成に使用され得る。原則として、合成周期中に標準ヌクレオシドホスホロアミダイトをフルオロフォア標識ホスホロアミダイトで置換することによる内部標識のために、かかるホスホロアミダイトも使用され得る。しかしながら、内部標識が、鎖中の塩基対形成を遮るので、好ましくは5'標識に使用される。
【００１５】
フルオレセイン等の蛍光標識を提供されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、PCR反応のリアルタイム測定等のため、分子生物学に使用される（WO 97/46707）。蛍光色素は、例えば先行技術による種々の方法で、三機能性スペーサーのアミノ基に連結され得る。
【００１６】
一方で、蛍光色素は、リンカーまたは核酸塩基のアミノ基と反応してチオ尿素結合を形成するイソチオシアネートとして導入される。別の過程において、フルオロフォア-カルボキン酸のN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル（NHS-エステル）は、スペーサーの遊離アミノ基と反応して、アミド結合を形成する。あるいは、リンカーはカルボキシル基により終結され、従ってアミノ修飾された標識と反応する。
【００１７】
これらの化学的方法のほかに、標識オリゴヌクレオチドの調製のために、酵素的方法が公知である。例えば、終結標識は、存在するポリデオキシヌクレオチド鎖の末端で付加的なヌクレオチドを導入する、酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて導入され得る。この酵素的に導入されたヌクレオチドは、シグナル実体を有する（例えばEP 0 122 614参照）。
【００１８】
リアルタイム法の大きな成功は、レポーターシグナルの検出または変化に密接に関係している。このシグナル変化は、プローブ分子と標的分子の相互作用から展開する。
【００１９】
PCRの各サイクル中の蛍光のモニタリングにはまず、エチジウムブロマイドの使用が含まれる。（Higuchi, R., et al., Bio/Technology 10 (1992) 413-417; Higuchi R., et al., Bio/Technology 11 (1993) 1026-1030; US 5,994,056）。かかる系において、蛍光は、産物濃度の相対的な測定としてサイクル当り一回測定される。エチジウムブロマイドは二重鎖DNAを検出し；鋳型が存在するならば、温度サイクルとともに蛍光強度は増加する。核酸濃度および配列に関するさらなるデータを提供し得る他の蛍光系が開発されている。
【００２０】
動的なリアルタイムPCRにおいて、PCRの各サイクル中のPCR産物の形成がモニタリングされる。通常、増幅反応中の蛍光シグナルを検出するための、さらなる装置を有する熱サイクルにおいて増幅は測定される。一般的に、増幅されたDNAのリアルタイム検出について種々の形式が存在し、以下のものの形式は当該分野で周知であり一般的に使用される：
【００２１】
DNA結合色素形式：二重鎖の増幅産物の量は通常、分析対象の試料中にもともと存在する核酸の量を上回っているため、二重鎖DNA特異的色素が使用され得、それらが二重鎖DNAに結合している場合のみ、適切な波長での励起において増強された蛍光を示す。好ましくは、例えばPCR反応の効率に影響しないSybr GreenＩのようなこれらの色素のみが使用され得る（US 6,174,670）。
【００２２】
当該分野に公知の他のすべての形式には、標的核酸と結合した際にのみ蛍光を発す、蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブの設計が必要である。
【００２３】
Taqmanプローブ：一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは二つの成分で標識される。第一の成分が適切な波長の光で励起される場合、吸収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）の原理に従って、第二の成分、いわゆる消光物質へと移行する。PCR反応のアニーリングの工程中に、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、以降の伸長段階中にTaqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、励起した蛍光性成分および消光物質は空間的に互いから分離され、従って第一成分の蛍光放出が測定され得る（US 5,538,848）。
【００２４】
分子ビーコン：これらのハイブリダイゼーションプローブも、第一の成分および第二の消光物質成分で標識され；好ましくは、標識はプローブの両末端に存在する。プローブの二次構造の結果として、両成分は溶液中で空間的に近位に存在する。標的核酸に対するハイブリダイゼーションの後、両成分は、適切な波長の光による励起の後、第一成分の放出が測定され得るように互いから分離される（US 5,118,801）。
【００２５】
FRETハイブリダイゼーションプローブ：FRETハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、同質のハイブリダイゼーションアッセイの全ての種類について特に有用である（Matthews, J.A., and Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25）。それは、同時に使用され、増幅された標的核酸の、同一鎖の隣接する部位に相補的である、二本の単鎖ハイブリダイゼーションプローブのペアにより特徴付けられる。両プローブは種々の蛍光性成分で標識される。適切な波長の光で励起した場合、両ハイブリダイゼーションプローブが検出対象の標的分子の隣接する位置に結合する際に第二の成分の蛍光放出が測定され得る蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って、第一の成分は吸収されたエネルギーを第二の成分に移行する。
【００２６】
標的配列にアニーリングする際に、一列に並んだ配置において、ハイブリダイゼーションプローブは互いに、非常に近接して存在するに違いない。通常、第一のプローブの標識された3'末端と第二のプローブの標識された5'末端の間のギャップは可能な限り小さい、すなわち1〜5塩基である。このことにより、FRET供与体およびFRET受容体成分の近接が可能になる。
【００２７】
PCRおよびリアルタイムPCRのほかに、FRETハイブリダイゼーションプローブおよび分子ビーコンが融解曲線分析に使用される。かかるアッセイ中、まず適切な増幅プライマーを有する典型的なPCR反応において、標的核酸は増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応中に先に存在しても良く、続いて添加されても良い。PCR反応の完了後に、試料の温度は本質的に増加し、ハイブリダイゼーションプローブが標的DNAに結合するほど長く蛍光は検出される。融解温度で、ハイブリダイゼーションプローブはその標的から遊離し、蛍光シグナルはすぐにバックグラウンドレベルにまで減少する。この減少は、蛍光減少の極大が観察される点で、一次導関数値が決定され得るように温度-時間プロットに対する適切な蛍光によりモニタリングされる。あるいは、蛍光標識プライマーの使用および片側標識オリゴヌクレオチドプローブの使用が可能である（Bernard, P.S., et al., Anal. Biochem. 235 (1998) 101-107）。
【００２８】
単一標識プローブ（SLP）形式：この検出形式は、単一の蛍光色素で5'または3'末端のいずれかを標識した単一のオリゴヌクレオチドからなる（WO 02/14555）。オリゴヌクレオチド標識に、二つの異なる設計：G-クエンチングプローブおよびニトロインドール脱クエンチングプローブが使用され得る。
【００２９】
G-クエンチングの態様において、蛍光色素はオリゴヌクレオチドの5'または3'末端でCと結合している。この場合、Cと向かい合った標的鎖中に二つのGが位置しており、相補的なオリゴヌクレオチドプローブのそばの位置1において、プローブが標的とハイブリダイズした場合に蛍光が有意に減少する。
【００３０】
ニトロインドール脱クエンチングの態様において、蛍光色素はオリゴヌクレオチドの5'または3'末端でニトロインドールに結合している。ニトロインドールは遊離プローブの蛍光シグナルを減少させる。プローブが標的DNAにハイブリダイズした場合、脱クエンチング効果のために蛍光が増加する。
【００３１】
US特許出願US 2003/0022177において、Wittwer et al.はプローブオリゴヌクレオチドの末端の修飾に、主に塩基アナログを導入した。
【００３２】
根本的に異なる二つの方法でPCR産物を定量し得る。
【００３３】
増幅反応のプラトー段階で形成されるPCR産物の量の終点決定：この場合、反応の終末での核酸の増幅はもはや指数的ではなく飽和に達しているため、形成されるPCR産物の量は最初のコピー数の量に関係ない。結果的に、異なる最初のコピー数は同じ量の形成されるPCR産物を示す。従って競合的PCRまたは競合的RT-PCR法は、通常本手順に使用される。これらの方法において、特異的な標的配列は、既知のコピー数の内部標準の連続希釈物と共に増幅される。標的配列の最初のコピー数は、標準および標的配列の同じPCR産物量を含有する混合液から推定される（Zimmermann, K., and Mannhalter, J.W., BioTechniques 21 (1996) 280-279）。この方法の不利な点はまた、増幅反応の飽和領域で測定を行うことである。
【００３４】
PCRの指数段階における動的なリアルタイム定量：この場合、PCR産物の形成は、PCRの各サイクルでモニタリングされる。通常、増幅は、増幅反応中の蛍光シグナルの測定のためのさらなる装置を有するサーモサイクラーで測定される。この典型的な例は、Roche Diagnostics LightCycler（Cat. No. 2 0110468）である。例えば、増幅産物は、標的核酸に結合した際に蛍光シグナルを放射するだけの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによって検出されるか、または特定の場合においては二重鎖DNAに結合する蛍光色素によって検出される。規定のシグナル閾値は、分析されるべき全反応に関して決定され、この閾値に達するために必要とされるサイクル数は、標的核酸、および標準またはハウスキーピング遺伝子等の参照核酸に関して決定される。標的分子の絶対的または相対的なコピー数は、標的核酸および参照核酸に関して得られた値に基づいて決定され得る（Gibson, U.E., et al., Genome Res. 6 (1996) 995-1001; Bieche, I., et al., Cancer Res. 59 (1999) 2759-2765; WO97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714）。かかる方法もリアルタイムPCRと言う。
【００３５】
核酸プローブの合成に関して、いくつかの化合物および単量体単位としての核酸への取り込みのためのそれらの使用が当該分野に公知である。かかる化合物は、レポーター基または標識の共有結合のための官能基および／または結合部分を提供する。オリゴマー化合物の化学合成の進行に伴い、「非ヌクレオチド化合物」または「修飾ヌクレオチド」の骨格構造が、例えばホスホジエステル結合を生じるホスホロアミダイトベースの化学によって、「オリゴヌクレオチド」主鎖に結合される。従って規定の取り込まれる化合物は、新たに合成された「修飾オリゴヌクレオチド」内の「修飾ヌクレオチド」を表す。標識は、「結合部分」等の上に官能基を介して結合され、骨格と官能基を結びつける骨格構造または「結合部分」上に存在するアミノ基によって例示されるが限定はされない。標識は、「修飾オリゴヌクレオチド」の合成前または合成後に、標識が結合される官能基からの任意の保護基の除去と同時に、化合物と共有結合され得る。
【００３６】
EP 0 135 587には、ヌクレオチド塩基の置換基に結合するレポーター基を有する、従来型のヌクレオシドの修飾が報告される。EP 0 313 219には、標識が結合し得る結合部分または側基を有する直鎖状の炭化水素骨格構造により特徴付けられる非ヌクレオシド試薬が報告される。EP 0 313 219には、他の型の骨格構造およびそれらの特別な性質は報告されていない。
【００３７】
US 5,451,463には、三機能性の非ヌクレオチド試薬、特に第一級アミノ基を有する1,3-ジオールベースの骨格構造が報告される。かかる試薬は、例えばオリゴヌクレオチドの3’末端の末端標識に使用され得る。WO 97/43451には、炭素環式（C5〜C7）骨格構造に基づいた非ヌクレオチド試薬が報告される。
【００３８】
要約すると、これらの技術は、内部取り込みの際にプローブ構造および塩基対形成の破壊を生じる非ヌクレオシドリンカー、または柔軟な内部標識のために四つの異なるホスホロアミダイトの合成を必要とする、特定の核酸塩基の修飾のいずれかに基づく。
【００３９】
従って、容易さならびに位置および色素非依存的な標識を可能にする、代替的な標識系を提供することによる、先に記載された課題を克服することが本発明の目的であった。別の局面において、本発明の目的は、核酸の増幅、検出および定量のための改善されたプローブを提供することであった。
【００４０】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【００４１】
［１］以下の式：
【化１】
0004713514.tif 000002
を有し、
ＡおよびＢは、互いから独立であり、ＲおよびＸから独立であり、ここで、
ＡおよびＢは、
（１）水素、
（２）保護基、
（３）リンカーを有する固相、
（４）ホスホロアミダイト、
（５）Ｈ−ホスホネート、
（６）三リン酸、
（７）リン酸、および
（８）ヌクレオチド残基の鎖
からなる群から選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
ただし、ＡまたはＢの１つがホスホロアミダイトまたはＨ−ホスホネートである場合、ＡおよびＢのもう１つは保護基であり、ＲはＯＨではない、
ただし、ＡおよびＢの１つのみがリンカーを有する固相であり、ここで、
Ｒ＝Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｏ−保護基、またはＦであり、
Ｘは、反応性基、または保護反応性基、または反応性基を有するリンカー、または保護反応性基を有するリンカー、またはシグナル実体、または保護シグナル実体、またはシグナル実体を有するリンカー、または保護シグナル実体を有するリンカーのいずれかである、ことによって特徴付けられる、化合物。
【００４２】
［２］Ｘが反応性基、または保護反応性基、またはリンカー基、または保護リンカー基またはシグナル実体のいずれかであることによって特徴づけられる、前記［１］記載の化合物。
【００４３】
［３］Ｒ＝Ｈであることによって特徴付けられる、前記［１］または［２］のいずれか記載の化合物。
【００４４】
［４］Ｂがホスホラミデート基、Ｈ−ホスホネート、またはＣＰＧのいずれかであり、Ａが保護基であることによって特徴付けられる、前記［１］〜［３］いずれか記載の化合物。
【００４５】
［５］Ａがホスホラミデート基、Ｈ−ホスホネート、またはＣＰＧのいずれかであり、Ｂが保護基であることによって特徴付けられる、前記［１］〜［３］いずれか記載の化合物。
【００４６】
［６］前記［１］〜［３］いずれか記載の化合物を含むオリゴヌクレオチド。
【００４７】
［７］前記［１］〜［３］いずれか記載の少なくとも２つの化合物を含むことによって特徴付けられる、前記［６］記載のオリゴヌクレオチド。
【００４８】
［８］少なくとも２つのシグナル実体を含むことによって特徴付けられる前記［６］または［７］いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
【００４９】
［９］前記シグナル実体が蛍光実体であることによって特徴付けられる、前記［６］〜［８］いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
【００５０】
［１０］オリゴヌクレオチド合成の間に前記［４］または［５］記載の化合物を組み込む工程を包含することによって特徴付けられる、前記［６］〜［９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドを合成する方法。
【００５１】
［１１］ａ）オリゴヌクレオチド合成の間に前記［４］または［５］記載の化合物を組み込む工程であって、ここで前記［４］または［５］記載の該化合物のＸが反応性基または反応性基を有するリンカーである工程；および
ｂ）該反応性基にシグナル実体を結合させる工程、
を包含することによって特徴付けられる、前記［６］〜［９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドを合成する方法。
【００５２】
［１２］ハイブリダイゼーションプローブとしての前記［６］〜［９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【００５３】
本発明に従うと、核酸の増幅、検出および定量のための改善されたプローブが提供され得る。
【００５４】
（発明の概要）
このように、本発明は、核酸プローブ標識に関する、新しい、検出可能な化合物に関する。該化合物は、核酸塩基として修飾インドールを有するヌクレオシドを包含する。このヌクレオシドは改善された合成特性および検出特性を示す。
【００５５】
より正確に、本発明は、核酸塩基として3-置換メタンスルホニルアミノインドールを有するヌクレオシドの合成および使用を包含する。このヌクレオシドのオリゴヌクレオチドへの取り込みにより、末端および内部標識がなされ得る。従って、位置非依存的なオリゴヌクレオチドの標識および、その結果のPCRプローブの標識がなされ得る。
【００５６】
このヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの任意の位置で取り込まれ得る。従って、オリゴヌクレオチド合成の間安定な色素の場合、合成後の標識は必要ない。いくつかの色素には、オリゴヌクレオチド合成に適合性であるように保護をする必要があり、例えばフルオレセインヒドロキシル基がピバロイル（pivaloyl）保護される。さらに、オリゴヌクレオチド合成の間不安定な色素に関して、反応性基は合成後標識のためのインドールベースの核酸塩基に結合され得る。
【００５７】
本発明は、式Ｉを有し
【化２】
0004713514.tif 000003
（式中
AおよびBは互いから独立であり、RおよびXから独立であり、
ここで、
AおよびBは、
（１）水素、
（２）保護基、
（３）リンカーを有する固相、
（４）ホスホロアミダイト、
（５）H-ホスホネート（phosphonate）、
（６）三リン酸、
（７）リン酸、および
（８）ヌクレオチド残基の鎖、
よりなる群より選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
ただしAまたはBの一つがホスホロアミダイトまたはH-ホスホネートである場合、AおよびBの他方が保護基であり、RはOHではなく、
ただしAおよびBの一つのみがリンカーを有する固相であり、
ここで、
R = H、OH、O-アルキル、O-アルケニル、O-アルキニル、O-保護基、またはFであり、
Xが反応性基もしくは保護された反応性基、または反応性基を有するリンカーもしくは保護された反応性基を有するリンカー、またはシグナル実体もしくは保護されたシグナル実体、またはシグナル実体を有するリンカーもしくは保護されたシグナル実体を有するリンカーのいずれかである）
という特徴を有する化合物を包含する。
【００５８】
本発明の一つの態様は、式Ｉの化合物を含むオリゴヌクレオチドである。
【００５９】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物に基づく少なくとも二つのシグナル実体を含むオリゴヌクレオチドである。
【００６０】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物を含む標識化合物であり、ここでBがホスホロアミダイト基、H-ホスホネート、またはCPGのいずれかであり、Aが保護基である。
【００６１】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物を含むオリゴヌクレオチドの合成方法であり、オリゴヌクレオチド合成の間に、本発明に従った標識化合物の取り込みの工程を含む。
【００６２】
本発明の別の態様は、
a）オリゴヌクレオチド合成の際に、本発明に従う標識化合物を取り込む工程であって、前記標識化合物が、シグナル実体の反応性基への連結のための反応性基を含有する工程、および
b）シグナル実体と前記反応性基の連結工程
を含む、式Ｉの化合物を含むオリゴヌクレオチドの合成方法である。
【００６３】
さらなる態様において、オリゴヌクレオチドに取り込まれる式Ｉの化合物は、シグナル実体を含む。
【００６４】
別の態様において、式Ｉの化合物を含有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用される。
【００６５】
別の態様において、式Ｉの化合物を含有するオリゴヌクレオチドは、一組のFRETハイブリダイゼーションプローブの一部として使用される。
【００６６】
別の態様において、それぞれが一つのシグナル実体を有する式Ｉの二つの化合物を含むオリゴヌクレオチドは、Taqmanプローブまたは分子ビーコンプローブとして使用される。
【００６７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸プローブのための新規の検出可能な化合物に関する。該化合物は、核酸塩基として、修飾された3-置換メタンスルホニルアミノインドールを有するヌクレオシドを包含する。このヌクレオシドは、改善された合成特性および検出特性を示す。
【００６８】
本発明の範囲において、使用されるいくつかの用語が以下のように定義される：
【００６９】
「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するかまたは修飾された単量体サブユニットの直鎖状オリゴマーであり、二つ以上の単量体サブユニットからなる配列からなる。これらのサブユニットはヌクレオチドと呼ばれる。任意に、オリゴヌクレオチドは天然の供給源から由来するが、しばしば化学的に合成される。それは任意の大きさである。
【００７０】
用語「ヌクレオチド」は、本発明に関して、（デオキシ-）オリゴ-リボヌクレオチドだけでなく、例えばメチルホスホネートまたはホスホチオエート等の全ての骨格修飾オリゴヌクレオチド、例えばLNA、NHA、2'-O-アルキル誘導体等の全ての糖修飾オリゴヌクレオチド、および7-デアザプリン等の全ての塩基アナログ、ならびに種々の型のヌクレオチドおよびそのアナログを含むキメラも包含する。
【００７１】
「オリゴヌクレオチドアナログ」は二つ以上の単量体サブユニットを有するポリマーについて言い、少なくとも一つのモノマーは、天然のヌクレオチドA（アデニン）、T（チミン）、C（シトシン）、G（グアニン）、およびU（ウラシル）の群には属さない。この非天然ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドと相互作用し得るという、天然に存在するヌクレオチドに共通するいくらかの構造的特徴を有する。
【００７２】
本出願において交換可能に使用される表現「ヌクレオチドの鎖」または「ヌクレオチド残基の鎖」は、二つ以上の単量体サブユニットを有するポリマーについて言い、これらのサブユニットは、上記に規定されるヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含む。「ヌクレオチドの鎖」は任意の大きさであり、好ましくは5〜70単量体サブユニットであり、より好ましくは10〜40単量体サブユニットである。
【００７３】
「ヌクレオシド」は通常ペントースグリコシドであるグリコシドであり、アグリコン、通常複素環式塩基は、糖部分、通常ペントースに結合する。
【００７４】
「保護基」は、分子の別の反応部位で起こる化学反応の際に、分子内のある反応部位をブロックするように設計された任意の基である。任意に、本明細書に記載される合成の保護基は、例えばGreene, et al., Protective Groups in Organic Chemistry, 2版, John Wiley & Sons, New York, NY, 1991に記載される任意のものであり得る。
【００７５】
「標識オリゴヌクレオチド」としては、少なくとも一つの標識を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は蛍光標識であっても良いが、任意の他の種類であっても良い。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの塩基に結合させる方法を含む種々の方法で標識を含有し得るか、または色素を用いて「仮想ヌクレオチド」構造の一部として塩基と置き換え得る。同一または異なる型であり得る一つより多い標識がオリゴヌクレオチドに結合される場合、本発明に従った化学により少なくとも一つの標識が結合される。他の一つまたは複数の標識は、当該分野に公知の他の方法で結合され得る。
【００７６】
「相補的な」は、互いに塩基対構造を形成する核酸配列について言う。「相補的な」は、向かい合っている鎖に対するオリゴヌクレオチドの場合、およびオリゴヌクレオチドの個々の塩基について議論する場合に言い、「相補的な」は向かい合う鎖の位置または塩基について言う。「一般的に相補的な」配列は、遺伝子コードの縮重のために、少なくとも80％の相同性を有する二つの核酸配列である。従ってかかる配列はミスマッチを有し得るが、互いに塩基対構造を形成するほど十分な相同性を有する。
【００７７】
「シグナル実体」または「検出可能標識」は、分析方法の補助を伴い検出され得る物質を意味する。これは、例えば分光学（可視-、UV-、IR-または質量分析）の補助、免疫学的アッセイまたはNMRの補助により検出され得る物質であり得る。特に用語「検出可能標識」としては、フルオレセイン、クマリン、オキサジン、シアニンまたはローダミン等の蛍光色素が挙げられる。挙げられる他の標識としては、消光分子、ハプテン、ビオチン、ルテニウム標識、スピン標識、質量タグおよび非直鎖光学標識がある。
【００７８】
両立しない種類以外のあるシグナル実体は、クマリン、フルオレセインおよびその誘導体等の蛍光標識（蛍光色素）（例えばJOE、FAM、ローダミン、Alexa Fluor 488、オレゴン緑色素、エリトロシン、エオシン）、フルオレセイン-シアニン結合体（例えばBig Dye）、ビスピロメテンボロン−ジフルオライド色素の誘導体（例えばBODIPY）、シアニン単量体および二量体（例えばTOTO、YOYO、TO-PRO、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、LCRed 705）である。好ましい蛍光標識はクマリンおよびローダミンである。他の標識は、例えば識別可能な支持体への固定または生体分子（例えばビオチン）への結合である。オリゴヌクレオチド合成に直接使用される場合、いくつかの標識には保護が必要であり、例えばフルオレセインがビスピバロエートとして保護される。
【００７９】
用語「リンカー」は原子の鎖を表す。この原子の鎖は、1〜30原子の長さを有し、4〜20原子の長さが好ましい。鎖は一重、二重および／もしくは三重結合、ならびに／または炭素環の一部である原子を含み得、かつ／あるいはアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール基ならびにヘテロ原子により置換され得る。リンカーは20ヘテロ原子までを含み得る。リンカーはまた、さらなる修飾のための反応部分を含み得る。少なくとも一つのアミド結合を含むリンカーが好ましい。直鎖状のリンカーも好ましい。
【００８０】
用語「炭素環」は、3〜10個の炭素原子を含み得る分子、好ましくはリンカーの環状部分を含む。「炭素環」は、1〜5個の非炭素原子も含み得る。5〜7個の原子を含むシクロアルキルが好ましい。
【００８１】
用語「二重および三重結合」は、前記の鎖が一つ以上のC-C二重および／またはC-C三重結合を含有し得ることを意味する。
【００８２】
用語「アルキル、アルケニル、アルキニル基により置換された」は、ヘテロ原子を有するかまたは有さない、C1〜C6の直鎖状、分岐状および環状基を含む。
【００８３】
用語「アリール基により置換された」は、4〜10個の環原子を有する、炭素環式および複素環式基を含む。
【００８４】
用語「ヘテロ原子により置換された」は、置換基 -OH、=O、-O-アルキル、-O-アルケニル、-O-アルキニル、-O-アリール、-NH2、-NH-アルキル、-NH-アルケニル、-NH-アルキニル、-NH-アリール、-SH、-SO3H、-S(O)2NH2、-NH-SO2-CH3、-Cl、-I、-Br、-Fを含む。
【００８５】
用語「20ヘテロ原子までを含み得る」は、前記直鎖が尿素または尿素誘導体、チオ尿素、-O-、-NH-、-N(CH3)-、-S-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(O)-、-OC(O)、-C(O)O-、-NHC(O)-または-C(O)NH-により、任意に5回まで中断および／または開始および／または終結されることを意味する。好ましくは、-O-、-NH-、-NHC(O)-または-C(O)NH-により、前記直鎖が任意に、中断または開始または終結される。
【００８６】
用語「反応性基」は、検出可能標識に結合し得る部分を含む。該反応性基は、オリゴヌクレオチド合成に適合性である適切な保護基により任意に保護される。前記反応性基は、N-スクシンイミジル-オキシカルボニル、マレインイミド（maleinimido）、4,6-ジクロロ-[1,3,5]トリアジン-2-アミノ-、N-ベンゾトリアゾリル-オキシカルボニル、N-フタルイミジル-オキシカルボニル、カルボン酸、アルキルカルボニル-オキシカルボニル、アリールカルボニル-オキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、イミデート、イミダゾリド、p-アミノベンゾイル、-C(O)Cl、-C(O)Br、-C(O)I、-SO2Cl、-SO2Br、-SO2I、-NH2、-N3、-N=C=O、-N=C=S、-N2+、-Cl、-Br、-I、-O-NH2またはRがC1〜C6のアルキル残基である-N(R)-NH2からなる群より選択される。好ましい反応性基は、N-スクシンイミジル-オキシカルボニル、マレインイミド、カルボン酸、アルキルカルボニル-オキシカルボニル、アリールカルボニル-オキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、-NH2、-N3、-N=C=O、-N=C=S、-N2+、-Cl、-Br、-I、-O-NH2、OH、SH、または-N(CH3)-NH2である。-NH2基、ならびにその変形体およびアナログは、最も好ましい反応性基であり、オリゴヌクレオチド合成に直接使用される場合、この反応性基はトリフルオロアセチルで保護される。反応性基はリンカーを介して任意に結合される。
【００８７】
用語「CPG」または「多孔性ガラス」は、オリゴヌクレオチドの合成に利用可能な支持体を意味する。用語CPGは、シグナル実体、反応性基、核酸塩基もしくはそのアナログまたはリン酸を、オリゴヌクレオチドに結合させるために、標準オリゴヌクレオチド合成に使用される合成支持体を含む。
【００８８】
「ホスホロアミダイト」は、ヌクレオシドまたはヌクレオシド誘導体の5’末端に結合し得る、三価のリン酸原子を有する分子を表す。従ってホスホロアミダイトを用いて、オリゴヌクレオチドを合成し得る。鎖の伸長に用いられる（デオキシ-）リボオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトに加えて、オリゴヌクレオチドの合成中、開始時、または終了時に、オリゴヌクレオチドの標識と類似の過程で使用され得る標識により誘導される、ホスホロアミダイトも存在する（Beaucage, Methods in Molecular Biology, S. Agrawal編, 20巻, p. 33-61 (1993); またWojczewski, C., et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678）。原則として、合成はまた、5'-3'方向になされ得る。このことは、ホスホロアミダイトの5'位置にホスホラミデート基および3'位置に保護基を必要とする。
【００８９】
化学的な必要条件および筋の通った論理に従って、先に規定された構成の適切な組み合わせは、当業者によって容易に組立てられ得る。
【００９０】
今日までに、オリゴおよびポリヌクレオチドに関する効果的な共有結合的標識系が、3'および5'末端位置においてのみで実現されている。これらの位置において、色素は化学的オリゴヌクレオチド合成中に取り込まれる。内部標識についての適切な標識、すなわち修飾塩基は、全部で四つの核酸塩基それぞれについて、例えばウリジンについてはTAMRAが合成される必要がある（例えばWalton, T.A., et al., Bioconjugate Chem. 13 (2002) 1155-1158参照）。
【００９１】
本発明により、改善された標識試薬が提供される。これらの試薬は、化学的および酵素的合成中に、任意の位置、すなわち3'位置で、5'位置で、置換基および挿入として内部で容易に取り込まれ得る（例えばVerma, S., and Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134参照）。
【００９２】
本発明の3-置換メタンスルホ二ルアミノインドールヌクレオシドは、以下の一般式Ｉを有する：
【化３】
0004713514.tif 000004
（式中、
AおよびBはお互いに独立して、RおよびXから独立し、
ここで、
AおよびBは、
（１）水素、
（２）保護基、
（３）リンカーを有する固相、
（４）ホスホロアミダイト、
（５）H-ホスホネート、
（６）三リン酸、
（７）リン酸、および
（８）ヌクレオチド残基の鎖、
よりなる群より選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
ただしAまたはBの一つがホスホロアミダイトまたはH-ホスホネートである場合、AおよびBの他方が保護基であり、RはOHではない、
ただしAおよびBの一つのみがリンカーを有する固相であり、
ここで、
R = H、OH、O-アルキル、O-アルケニル、O-アルキニル、O-保護基、またはFであり、
Xが反応性基もしくは保護された反応性基、または反応性基を有するリンカーもしくは保護された反応性基を有するリンカー、またはシグナル実体もしくは保護されたシグナル実体、またはシグナル実体を有するリンカーもしくは保護されたシグナル実体を有するリンカーのいずれかである）。
【００９３】
Bがホスホラミデート基、H-ホスホネートもしくはCPGのいずれかであり、Aが保護基であるか、またはその逆である式Ｉの化合物により、オリゴヌクレオチドについての択一的な二つの合成経路：
a）標識基存在下でのオリゴヌクレオチドの合成
b）合成後修飾／標識のための反応性基存在下でのオリゴヌクレオチドの合成
が可能である。
【００９４】
Bがホスホラミデート基、H-ホスホネートもしくはCPGのいずれかであり、Aが保護基であるか、またはその逆、すなわちAがホスホラミデート基、H-ホスホネートもしくはCPGのいずれかであり、Bが保護基である式Ｉの化合物は、オリゴヌクレオチド合成において標識化合物として、すなわちオリゴヌクレオチド合成中に検出可能標識または反応性基の取り込みにより、合成オリゴヌクレオチドの合成後標識を可能にする化合物として使用される。
【００９５】
オリゴヌクレオチドの合成に関する本発明の方法には、オリゴヌクレオチド合成中に本発明に従う標識化合物を取り込む工程が含まれる。
【００９６】
オリゴヌクレオチド合成に関する本発明の別の方法には、ｉ）オリゴヌクレオチド合成中に本発明に従う標識化合物を取り込む工程であって、前記標識化合物が反応性基にシグナル実体を連結させるための反応性基を含む工程、およびｉｉ）オリゴヌクレオチド合成中かまたは合成後のいずれか、好ましくはオリゴヌクレオチド合成後に、前記反応性基へのシグナル実体の連結工程を含む。
【００９７】
式Ｉの化合物を含む、本発明の化合物を用いたオリゴヌクレオチドの合成は可能である。かかるオリゴヌクレオチドは、反応性基を有するか、またはシグナル実体を有するかのいずれかの少なくとも一つの式Ｉの化合物を含む。一つの態様において、かかるオリゴヌクレオチドは、それぞれがシグナル実体を有する少なくとも二つの式Ｉの化合物を有し、好ましくはかかるオリゴヌクレオチドは、それぞれがシグナル実体を有する一つ、二つ、三つまたは四つの式Ｉの化合物を含む。
【００９８】
式Ｉの化合物は化学合成により入手可能である。A＝ジメトキシトリチル（DMTr）、B＝ホスホロアミダイト基、X＝リンカーを有する反応性基を有する式Ｉの化合物の例示的な合成手順は、図1a、1bおよび1cならびに実施例１に概略が述べられる。
【００９９】
合成の開始点は、第一の工程において3-位がヨウ素で置換される5-ニトロインドールである。3-位でのヨウ素置換基の導入に続くことは、ニトロインドールのN-原子に、保護されたデオキシペントースを導入することによるヌクレオシド塩基構造の集合である。ヒドロキシル基の脱保護の後、保護された反応性基を有するリンカー部分を導入する。このリンカー部分は主に炭素、酸素および窒素原子を含む。リンカーの役割は、一方では検出可能標識の導入のための反応性基を提供することであり、もう一方では検出可能標識を適切に配向させる柔軟なスペーサーを提供することである。
【０１００】
現時点で、二つの合成経路が分岐する。オリゴヌクレオチドの合成の間状態を許容しない標識が結合される場合、ホスホロアミダイト残基がこの段階で導入される。この標識されない保護反応性基を有するヌクレオチドホスホロアミダイトにより、オリゴヌクレオチド合成が行なわれ、合成および脱保護の後、検出可能標識が最終オリゴヌクレオチドに導入される。
【０１０１】
オリゴヌクレオチド合成の間状態を許容する標識が使用される場合、標識はアミダイトの形成前に導入される。
【０１０２】
ホスホロアミダイト化学法は当業者に周知である。一つのヌクレオチドの3'-リン酸基は、別のヌクレオチドの5'-ヒドロキシル部分と反応する。反応は、溶液中に送達される5'-ジメトキシトリチル保護単量体を有する各ホスホロアミダイトと不活性基体に結合される伸長中の3'反応性オリゴヌクレオチドとの間で、3'から5’へと進む。
【０１０３】
発生期のオリゴヌクレオチドは、各合成サイクルの後に発生期のオリゴヌクレオチド鎖の反応性5'-OH基を生成するために除去される必要がある、ジメトキシトリチル（DMTr）基で保護された5'-ヒドロキシル位を有する。生成物オリゴヌクレオチドに関して、精製方法として逆相HPLCが選ばれる場合、DMTr基は合成中に除去され得る（TRITYL OFF）か、または残され得る（TRITYL ON）。
【０１０４】
反応性基を有するホスホロアミダイトの合成についての例が実施例１aに与えられ、標識ホスホロアミダイトの合成が実施例１cに記載される。反応性基または標識を有する他のホスホロアミダイトは、相応じて合成され得る。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドの任意の位置で、標識または反応性基を有するオリゴヌクレオチドを提供するために、オリゴヌクレオチド合成時に本発明に従うホスホロアミダイトが使用され得る。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドは、種々の修飾ヌクレオチドおよび種々の標識の混合物を含み得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドは、標識を有するかまたは有さない、一つ、二つまたはそれ以上のいずれかの本発明に従った化合物を含み得る。代替的な態様において、オリゴヌクレオチドは、本発明に従った一つ以上の化合物、および同時に、同じかまたは異なるかいずれかの検出可能標識を、全てが有するような、一つ以上の他の化合物を含み得る。種々の標識および化合物の組み合わせは、オリゴヌクレオチドが合成されるための応用に依存する。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドの合成は、80年代初期にCaruthersにより開発された方法に基づく（Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tetrahed. Lett. 22 (1981) 1859-1862; McBride, L.J., and Caruthers, M.H., Tetrahed. Lett. 24 (1983) 245-248; さらなる参考のために: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait編., IRL Press, Oxford (1984); Kuijpers, W.H.A., et al., Nucleic Acids Research 18 (1990) 5197-5205; Dueholm, K.L., J. Org. Chem. 59 (1994) 5767-5773, Agrawal, S. (編.) Methods in Molecular Biology, volume 20参照）。第一の工程において、DMTr保護基を例えば、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸の弱酸性溶液で除去する。連結のために、脱保護されたヒドロキシル基に連結されるヌクレオシドをテトラゾールで活性化する。その後反応生成物を、例えばヨウ素／水／塩基混合液で酸化する。連結反応中に連結されなかったヒドロキシル基をキャッピングすることでサイクルを完了させる。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドの合成の例は、実施例２に与えられる。
【０１０９】
本発明に従う、オリゴヌクレオチドの任意の位置で取り込まれる標識塩基を用いて合成されたオリゴヌクレオチドは、多くのPCRの応用に有用である。これらは核酸化学の改善された、新しい応用への道を開く。
【０１１０】
一つの態様において、本発明に従った内部標識を含有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用される。内部標識は、Taqmanプローブ、分子ビーコン等の任意の種類のハイブリダイゼーションプローブの一体化された一部であり得るか、または一対のFRETハイブリダイゼーションプローブの一つまたは両方の成員の一体化された一部であり得る。本発明に従ったこれらのハイブリダイゼーションプローブは、ブロットにおけるハイブリダイゼーション、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、および特にリアルタイムPCRに使用され得る。
【０１１１】
本発明の一つの態様において、標識ヌクレオチドは、一組のFRETハイブリダイゼーションプローブの成員としてハイブリダイゼーションプローブに用いられる。本使用は単一の組には限定されないが、FRETの多様なハイブリダイゼーションアッセイの応用にまで拡張され得る。
【０１１２】
一つの態様において、本発明に従った、一つ以上の標識ヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーションプローブは、Taqmanプローブまたは分子ビーコンプローブとして使用される。
【０１１３】
一つの態様において、シグナル実体を有する式Ｉの二つの化合物はオリゴヌクレオチド中に存在し、好ましくは、シグナル実体は蛍光色素である。
【０１１４】
三つの上述されたハイブリダイゼーションプローブ形式において、少なくとも二つのシグナル実体の相互作用が必要とされる。好ましくは、これらの組は一つの蛍光色素および一つの消光物質、または二つの蛍光色素である。
【０１１５】
本発明の態様において、本発明に従った一組のFRETハイブリダイゼーションプローブを用いて、例えば融解曲線分析を行なうことで、ハイブリダイゼーションの温度依存性をモニターする。代替的な態様において、本発明に従ったハイブリダイゼーションプローブを、ハイブリダイゼーションの温度依存性のモニタリングのために使用する。
【０１１６】
PCR反応の終了後に、通常リアルタイムPCR融解曲線分析を行なう。最初の変性および冷却工程の後、アンプリコンの温度は連続的に上昇し、ハイブリダイゼーションプローブが標的DNAに結合している限り、蛍光は検出可能である。FRETハイブリダイゼーションプローブ形式の場合、両方のプローブは、蛍光シグナルを生成するために標的核酸にハイブリダイズし続ける必要がある。融解温度でハイブリダイゼーションプローブ（FRET形式の場合：ハイブリダイゼーションプローブの前記の組の少なくとも一つの成員）が標的から解離し、蛍光シグナルは即座にバックグラウンドレベルにまで落ち込む。
【０１１７】
適切な蛍光対温度-時間プロットにより、一次導関数値が決定され得るようにこの減少がモニターされ、従って蛍光減少の極大が観察される温度で減少が決定される。
【０１１８】
本発明の一つの局面は、異なる標識ハイブリダイゼーション試薬の使用に基づき、各試薬は、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）の原理に基づいて互いに相互作用する、一組の二つの蛍光色素を含む、一組のFRETハイブリダイゼーションプローブを含む。
【０１１９】
より正確に、かかるハイブリダイゼーション試薬は、近接してハイブリダイズする二つのオリゴヌクレオチドから構成されており、WO 97/46707、WO 97/46712、およびWO 97/46714に報告されるようにFRET-hybprobe検出形式に従って一緒に作用し得るように、適切に標識される。
【０１２０】
FRET-hybprobe形式の場合において、一組のオリゴヌクレオチドは、供与体プローブおよび受容体プローブとして一緒に作用する。しかし、他の場合において、検出される必要のある標的配列において多くの他の配列バリアントが存在し得る。従って、一組のFRETオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いることのみで、全ての成員の配列を検出することは不可能であり得る。
【０１２１】
例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわちポリヌクレオチド配列中の一塩基の変化の検出およびマッピングのための重要かつ有意な方法は、融解曲線分析である。二重鎖のポリヌクレオチド分子を加熱することによって、鎖を一緒に維持する水素結合ベースの相互作用が減少される。特定の温度で２つの鎖は解離する。この温度は、二重鎖のポリヌクレオチドの長さ、ＧＣ含量の程度および鎖の間の相補性の程度に依存する。二重鎖のポリヌクレオチドの５０％が単鎖になる温度は、融解温度Ｔｍと呼ばれる。
【０１２２】
この技術は、単鎖のポリヌクレオチド分子と配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとの間で形成されたヘテロ二重鎖の分析に特に重要である。すでに上記したように、融解温度は、２つの単鎖の相補性に依存する。このパラメーターは、非常に敏感であり、その結果、実際に１つの単一塩基のミスマッチが融解温度の低下によって検出可能である。このことは、１つのミスマッチのみを含むプローブ／ポリヌクレオチドヘテロ二重鎖が、完全に対形成したヘテロ二重鎖より低い温度で融解することを意味する。これは、非常に小さな不安定化効果でさえ検出および定量化され得ることを示す。
【０１２３】
融解曲線分析は、一般的に以下の３つの工程を含む：
（ｉ）第一の工程において、配列特異的蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブがＰＣＲ混合物に添加される、
（ｉｉ）第二の工程は、ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅を含む、および
（ｉｉｉ）第三の工程において、単鎖の標的ポリヌクレオチドとプローブとの間で形成されたヘテロ二重鎖はゆっくりと加熱され、蛍光の変化が、融解曲線の記録を生じる温度に依存して記録される。
【０１２４】
シグナル増強はまた、リアルタイムＰＣＲ応用について重要である。これらの応用において、増幅されたポリヌクレオチドおよび標識されたプローブオリゴヌクレオチドのヘテロ二重鎖から放射された蛍光シグナルは、ポリヌクレオチド数および濃度の相対的および絶対的定量のために使用される。特に、ウイルス量の決定または腫瘍の診断および遺伝子発現の決定は、定量的リアルタイムＰＣＲの適用領域である。
【０１２５】
加水分解プローブ形式、例えばＴａｑＭａｎにおいて、ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲの間にクマリンが切断されるので、加水分解の間にシグナルは増加する。図２から見られ得るように、リンカーは、シグナル増加に対して影響を有し、すなわちシグナル増加はリンカーの長さと共に増加し、従って、蛍光特性は異なる応用に適合し得る。加水分解プローブ形式について、高度に蛍光性のレポーターを有することが所望され、その一方で、Ｈｙｂｐｒｏｂｅ形式を用いて多重送信することについて、ＦＲＥＴ供与体シグナルが弱い場合、それは有利であり得る。
【０１２６】
以下の実施例、参照、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。改変は、本発明の精神を逸脱することなく示される手順においてなされ得ることが理解される。
【０１２７】
（配列の説明）
配列番号１  末端標識されたプローブ
配列番号２  二重標識されたプローブ
配列番号３  実施例３の順方向プライマー
配列番号４  実施例３の逆方向プライマー
【０１２８】
（実施例の説明）
実施例１：ａ）反応性基を保持するオリゴヌクレオチド合成のためのホスホロアミダイトの合成
ｂ）反応性標識の合成
ｃ）オリゴヌクレオチド合成のための標識されたホスホロアミダイト
の合成
実施例２：オリゴヌクレオチド合成
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるウイルス標的ＤＮＡの検出
【０１２９】
（実施例）
他に述べない限り、全ての薬品は試薬等級であり、Sigma-Aldrichから購入した。薬品を、製造業者または供給者から受け取ったままで使用した。
【０１３０】
（実施例１ａ）
インドールヌクレオシドの調製
ａ）３−ヨード−５−ニトロ−インドール
【化４】
0004713514.tif 000005
25.0 g (154.2 mmol) 5-ニトロインドール(Aldrich N1,760-2)および21.7 g (386.7mmol)水酸化カリウムを270 ml DMFに溶解した。この溶液に250 ml DMFに溶解した39.5 g (155.6 mmol)ヨウ素を１時間の間滴下した。その後、得られた混合物を室温で１時間攪拌した。その後、反応混合物を２．５ｌのスラッジ（sludge）に注いだ。形成された沈殿を濾過によって回収し、水で２回洗浄した。得られた残渣を真空下で乾燥した（収量：４３．０ｇ）。
【０１３１】
ｂ）5-クロロ-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フラン
【化５】
0004713514.tif 000006
45.0 g (335.5 mmol)の2-デオキシ-D-リボース(Fluka 31170)を５４０ｍｌの無水メタノールに溶解した。この溶液に９０ｍｌメタノールおよび１．５３ｍｌ(21.5 mmol)塩化アセチル(Aldrich 40,279-6)の混合物を室温で滴下した。得られた混合物を室温でさらに１５分間攪拌した。18.0 g (214.3 mmol)の炭酸水素ナトリウムの添加の後、得られた懸濁物を１５分間攪拌した。懸濁物の濾過の後、溶媒を蒸留によって除去した。油状茶色残渣に７５ｍｌの無水ピリジンを添加し、その後溶媒をロータリーエバポレータで真空中で除去した。この手順を３回繰り返した。残った残渣を２７０ｍｌの無水ピリジンに溶解し０℃まで冷却した。この温度で99 ml (748.6 mmol)の塩化p−トルオイル(Aldrich 10,663-1)を９０分間にわたって滴下した。その後、反応混合物を室温でさらに１２時間攪拌した。懸濁物を１．５ｌのスラッジに注ぎ、水層を各々６００ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を各々６００ｍｌの水で２回、各々６００ｍｌの２Ｍ塩酸で３回、各々６００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で２回、および各々６００ｍｌの水で２回洗浄した。その後、分離された有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポレータで真空中で乾燥状態まで蒸発させた。油状残渣を１８０ｍｌの氷酢酸に溶解し、２２８ｍｌの氷酢酸、４５．９ｍｌ（６４６ｍｍｏｌ）の塩化アセチルおよび１１．３ｍｌの水の２８０ｍｌの混合物を攪拌しながら氷上で冷却しながら添加した。パルプ（ｐｕｌｐ）を濾過によって除去し、各々２００ｍｌの氷冷ジエチルエーテルで２回洗浄した。残渣を真空下において水酸化カリウム上で乾燥した。（収量：９６．３ｇ）。
【０１３２】
c)5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フラン
【化６】
0004713514.tif 000007
１５ｍｌアセトニトリル中1.0 g (3.5 mmol)の3-ヨード-5-ニトロインドールの懸濁物に0.16 g (6.7 mmol)の水素化ナトリウム(Aldrich 223441-50G)を添加した。攪拌を継続し、懸濁物は赤に変わった。１５分後、2.02 g (5.2 mmol)の5-クロロ-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フランを少しずつ添加し、攪拌を室温でさらに６０分継続した。沈殿を濾過によって除去し、アセトニトリルで１回洗浄した。合わせた黄色の濾過物を生成物が沈殿するまで濃縮した。生成物の完全な沈殿のために５０ｍｌのエタノールを添加した。黄色の沈殿を濾過によって除去し、エタノールで洗浄した。残油を真空下において五酸化リンおよび水酸化カリウム上で乾燥した（収量：１．９ｇ）。
【０１３３】
d) 2-ヒドロキシメチル-5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)-テトラヒドロ-フラン-3-オール
【化７】
0004713514.tif 000008
６００ｍｌエタノール中12 g (18.7 mmol)のインドール誘導体5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フランの懸濁物に4.2 g (37.5 mmol)のカリウムｔｅｒｔ−ブチレートを添加した。懸濁物を室温で１２時間攪拌した。得られた黄色の溶液を、100 % ジクロロメタンで開始し85 % ジクロロメタン:15 % メタノールまでのグラジエントを用いてシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 230 x 100 mm)上でクロマトグラフした（収量：６．６ｇ）。
【０１３４】
e) 2,2,2-トリフルオロ-N-プロパ-2-イニル-アセトアミド
【化８】
0004713514.tif 000009
２７５ｍｌ無水メタノール中15 g (272.3 mmol)のプロパルギルアミンに３６．６g（２８５．９mmol）のトリフルオロ酢酸メチルを冷却しながら添加した。得られた反応混合物を室温でさらに４時間攪拌した。その後、溶媒を減圧下で蒸留により除去した。残渣を３００ｍｌのトリクロロメタンに溶解し、４回、各々３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で２回および各々３００ｍｌの水で２回抽出した。分離された有機層を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸留によって除去した（収量：２３．３ｇ）。
【０１３５】
f) 2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-ニトロ-1H-インドール-3-イル]-プロパ-2-イニル}-アセトアミド
【化９】
0004713514.tif 000010
19.8 g (48.99 mmol)の2-ヒドロキシメチル-5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)−テトラヒドロ−フラン−3−オールをアルゴン雰囲気下前もって加熱したフラスコに配置し、２００ｍｌの無水テトラヒドロフランに溶解した。27.2 ml (196.2 mmol)のトリエチルアミン(Merck, 8.08352.1000)、1.87 g (9.82 mmol)のヨウ化銅（Ｉ） (Merck, 8.18311.0100)および5.66 g (4.89 mmol)のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (Merck, 8.14761.005)を添加した。室温で５分後、19.8 mlの2,2,2-トリフルオロ-N-プロピル-2-イニル-アセトアミドを添加し、それをさらに４５分間攪拌した。溶媒を蒸留によって除去した。残渣を100 %ジクロロメタンで開始し5 %メタノールを有する95 %ジクロロメタンまでのグラジエントを用いたシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 400 x 70 mm)でクロマトグラフした（収量：１７．０６ｇ）。
【０１３６】
g) N-{3-[5-アミノ-1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド
【化１０】
0004713514.tif 000011
4.0 g (9.3 mmol)の2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-ニトロ-1H-インドール-3-イル]-プロパ-2-イニル}-アセトアミドおよび650mg 5% (w/w)のパラジウム炭(Fluka No: 75992)を１００ｍｌの無水エタノール中に懸濁し、アルゴン雰囲気下フラスコ中に配置した。アルゴンを水素と置換した(Whatman hydrogen generator)。水素化をＴＬＣ(Silica Gel Merck F60、展開溶媒: トルエン/酢酸エチルエステル/メタノール 4:1:1 (v/v/v))によってモニターし、開始物質がもはや検出されなくなった時に停止した。触媒を濾過によって除去し、溶媒を真空中でロータリーエバポレータで乾燥状態まで蒸発した。生成物をさらなる精製をせずに使用した（収量：３．７ｇ）。
【０１３７】
h) 2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-アセトアミド
【化１１】
0004713514.tif 000012
3.7 g (9.2 mmol)のN-{3-[5-アミノ-1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミドを３０ｍｌの無水ピリジン中に溶解した。0.72 ml (9.2 mmol)のメチルスルホニルクロリド（methylsulfonylchloride）を添加した。反応をＴＬＣ(Silica Gel Merck F60、トルエン/酢酸エチルエステル/メタノール 3:2:1 (v/v/v))によってモニターした。攪拌しながら２０分後、溶媒を真空下ロータリーエバポレータで除去した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、各々１００ｍｌのクエン酸の１０％（ｗ／ｖ）水性溶液で３回洗浄し、その後、１００ｍｌブライン（飽和塩化ナトリウム溶液）で１回洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。さらなる精製のために、残渣を移動相としてトルエン/酢酸エチルエステル/メタノール 3:2:1 (v/v/v)を用いるシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 185 x 85 mm)でクロマトグラフした。生成物を含む画分を合わせ、溶媒を真空中でロータリーエバポレータで除去した（収量：７２０ｍｇ）。
【０１３８】
i) N-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド
【化１２】
0004713514.tif 000013
0.7 g (1.45 mmol)の2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-アセトアミドおよび540 mg (1.5 mmol)の4,4’-ジメトキシトリフェニルメチルクロリド(Aldrich No: 10,001−3)をアルゴン雰囲気下加炎乾燥された５０ｍｌのフラスコに配置した。物質を１５ｍｌの無水ピリジンに溶解して、湿気を排除しながら３時間攪拌した。０．５ｍｌのメタノールを添加し、溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した。残渣を0.1% (v/v)トリエチルアミンを追加されたトルエン/酢酸エチル/メタノール 4:1:1 (v/v/v)を用いてシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 280 x 50 mm)でクロマトグラフした。画分をＴＬＣ(silica gel, トルエン/酢酸エチル/メタノール 4:1:1 (v/v/v))によってモニターした。所望の画分を合わせ、溶媒を３８℃の温度の水浴槽を伴ったロータリーエバポレータで真空下で除去した（収量：６６０ｍｇ）。
【０１３９】
j) ジイソプロピル-ホスホロアミダス酸（phosphoramidous acid） 2-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-メトキシメチル]-5-{5-メタンスルホニルアミノ-3-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピル]-インドール-1-イル}-テトラヒドロ-フラン-3-イルエステル 2-シアノ-エチル
【化１３】
0004713514.tif 000014
610 mg (0.77 mmol)のN-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド、0.44 ml (2.55 mmol)のN-エチル-ジイソプロピルアミン(Fluka No: 03440)および0.19 ml (0.85 mmol)のクロロ−2−シアノエトキシジイソプロピルアミノホスファン（phosphan）−モノクロリドを、アルゴン雰囲気下乾燥した反応フラスコ中の１５ｍｌの無水ジクロロメタン中に連続的に溶解した。密封した反応容器を５０分間攪拌した。反応を０．１ｍｌメタノールの添加で停止し、次いで、混合物を0.1 % (v/v)トリエチルアミンを有するジクロロメタンから0.1 % (v/v)トリエチルアミンを有するジクロロメタン:アセトン 95:5 (v/v)までのグラジエントを用いるシリカゲルカラム(silica gel 60, Merck, 120 x 30 mm)で直接クロマトグラフした。生成物含有画分を合わせ、溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した（浴槽温度２８〜３０℃）。得られた油を、１５ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、溶媒を蒸発した。残った残渣を２０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、ＡＢＩ  ＤＮＡ合成機と適合するガラス瓶に配分した。溶媒を、窒素の流れの中で除去した（収量：４１０ｍｇ）。
NMR、溶媒: d6-DMSO、モデル: Bruker DPX 300, 300 MHz, 31P-NMR: 148.79 (d), 1H: 9.45(t) [1H], 9.33(s) [1H], 7.58(d) [1H], 7.17-7.56 (m) [11H], 7.02 (d)[1H], 6.80 (m) [4H] 6.36 (dd) [1H], 4.75 (m) [1H], 4.05 (d)[1H], 3.54-3.73 (m)[5H], 3.71(s) [6H], 3.16 (s,br) [4H] 2.86(s) [3H], 2.49-2.79 (m,s,DMSO), 1.74 (m) [2H], 1.15 -0.99 (m) [12 H]
【０１４０】
（実施例１ｂ）
Ｉ）反応性標識の合成−クマリン３４３アミノヘキサン酸−ＮＨＳエステルの合成
ａ）クマリン３４３-アミノヘキサン酸
【化１４】
0004713514.tif 000015
クマリン３４３(5 mmol, Aldrich No. 393029) ならびに各々5.5 mmolの4-アミノヘキサン酸メチルエステルおよびHBTU (O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロ-リン酸)ならびに11 mmolのトリエチルアミンを１００ｍｌのＤＭＦに溶解し、室温で１．５時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレータで蒸発によって除去し、残油をトリクロロメタン中に溶解する。残余のＨＢＴＵを0.5 mol/lの塩酸を有する水を用いた抽出によって除去する。有機溶媒を分離し、ロータリーエバポレータで乾燥状態まで蒸発する。粗生成物（２．３７ｇ）をトリクロロメタン:酢酸エチル 2:1 (v/v)からなる移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー(silica gel 60, Merck, No: 11452134001)によって精製する（収量：１．０３ｇ）。
【０１４１】
b)クマリン343-アミノヘキサン酸
【化１５】
0004713514.tif 000016
クマリン３４３-アミノヘキサン酸メチルエステル(0.1 mmol)を、２００ｍｌのリン酸バッファ(10 mM, pH 7.0)中に溶解し、２０ｍｇのエステラーゼを添加した(EC 3.1.1.1.; Sigma No: E-3019)。周囲条件（室温）での３日間の攪拌の後、メチルエステルを定量的に切断した。生成物をトリクロロメタンを有する水層の抽出によって単離した。分離された有機層を、Ｈ２Ｏおよびブライン（ＮａＣｌで飽和したＨ２Ｏ）で洗浄した。硫酸マグネシウム上での乾燥および真空下ロータリーエバポレータでの溶媒の除去の後、残油をジオキサン中に溶解し、凍結乾燥する。
【０１４２】
c)クマリン343-アミノヘキサン酸-NHSエステル
【化１６】
0004713514.tif 000017
0.1 mmolのクマリン３４３−アミノヘキサン酸を２０ｍｌのＤＭＦ中に溶解し、２０％モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびモルホリノエチルイソシアニド（0.12 mmol）を添加した。NHS-エステルは、直接的かつ定量的に形成した。トリクロロメタンの添加ならびに５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液での２回の有機層の洗浄およびＮａＣｌ飽和Ｈ２Ｏでの１回の洗浄によって、単離を達成した。合わせた層の溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去し、残渣をジオキサンに溶解後凍結乾燥した。
【０１４３】
II)反応性標識の合成−クマリン３４３-アミノプロピオン酸−ＮＨＳエステルの合成
a)クマリン343-アミノプロピオン酸-tert-ブチルエステル
【化１７】
0004713514.tif 000018
285 mgのクマリン343 (1 mmol)、262 mgのアミノプロピオン酸 tert-ブチルエステル(1.2mmol)および343 mgのHBTU (1.2 mmol)を５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。２８０μｌのトリエチルアミンを添加し、溶液を室温で２時間攪拌した。溶媒を真空中でロータリーエバポレータで蒸発させ、生成物をカラムクロマトグラフィー（Silica gel６０, Merck、移動相：酢酸エチル／メタノール2:1 (v/v)）によって精製した。
【０１４４】
ｂ）クマリン３４３−アミノプロピオン酸
【化１８】
0004713514.tif 000019
工程a)のクロマトグラフされた生成物を２０ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で１５分間攪拌した。その後、液体成分を真空中でロータリーエバポレータで蒸発させた。アセトンを添加し、純粋生成物を沈殿として得る（収量：１３８ｍｇ（２工程））。
【０１４５】
ｃ）クマリン３４３−アミノプロピオン酸−NHSエステル
【化１９】
0004713514.tif 000020
５８．８ｍｇ(0.165 mmol)のクマリン３４３−アミノプロピオン酸を５０ｍｌのトリクロロメタンに溶解した。その後、0.165 mmolのモルホリノエチルイソシアニドおよび0.165mmolのN-ヒドロキシスクシンイミドを添加した。溶液を室温で２時間攪拌し、その後、１５０ｍｌのトリクロロメタンを添加した。有機層を80 mlの5% (w/v) NaHCO3溶液、80 mlの1 M HClおよび80 mlのH2Oで連続的に洗浄した。Na2SO4を用いた有機層の乾燥後、溶媒をロータリーエバポレータで真空中で除去した（収量：３５ｍｇ）。
【０１４６】
III)標識の合成−クマリン３４３−EDA-DSS
【化２０】
0004713514.tif 000021
クマリン３４３−EDA-DSSの合成のために、1 mmolの開始物質クマリン３４３−EDA(例えば、Webb, R.およびCorrie, J.E.T., Biophysical Journal 81 (2001) 1562-1569を参照)を５ｍｌの乾燥DMFに溶解し、１０ｍｌの乾燥DMF中の4 mmolのDSS（ジスクシンイミドスベレート（disuccinimido suberate））および２mmolのトリエチルアミンのDMF溶液にゆっくりと添加する。混合物を室温で１時間攪拌し、その後、溶媒を真空中で除去する。生成物をカラムクロマトグラフィー（Silica gel、溶出液：  １％(v/v)酢酸を有するトリクロロメタン：酢酸エチルエステル１：１(v/v)）によって精製する（収量：２３０ｍｇ）。
【０１４７】
（実施例１ｃ）
オリゴヌクレオチド合成のための標識されたホスホロアミダイトの合成
a) N-(3-(3-アミノ-プロピル)-1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-エトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-1H-インドール-5-イル)-メタンスルホンアミド
【化２１】
0004713514.tif 000022
490 mg (0.64 mmol)のN-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミドをメタノール中２０ｍｌの７Nのアンモニア溶液に溶解した。溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した。残渣(420 mg)をさらなる精製をせずに使用した。
【０１４８】
ｂ）クマリン色素のインドール塩基への結合
【化２２】
0004713514.tif 000023
実施例１ｂ  III部からの350 mgのNHSエステルクマリン343-EDA-DSS (0.60 mmol)および0.67 ml (5 mmol)トリエチルアミンを２０ｍｌジクロロメタン中420 mg (0.61mmol)のN-(3-(3-アミノ-プロピル)-1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-エトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-1H-インドール-5-イル)-メタンスルホンアミドの溶液に添加した。室温での１５時間の攪拌の後、溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した。生成物をカラムクロマトグラフィー (silica gel 60, Merck、移動相: 0.2% (v/v)トリエチルアミンを含むトルエン:酢酸エチル:メタノール 4:5:1 (v/v/v))によって精製した(収量: 290 mg)。
【０１４９】
ｃ）クマリンスルホメチルアミノインドールホスホロアミダイトの合成
【化２３】
0004713514.tif 000024
アルゴン雰囲気下で、65.8 mg (62μl, 0.27 mmol)のクロロ-2-シアノエトキシジイソプロピルアミノホスファンを２０ｍｌのジクロロメタン中290 mg (0.25 mmol)の工程ｂ）の生成物および98 mg (130μl, 0.76 mmol) N-エチルジイソプロピルアミンの混合物に室温で攪拌しながら添加した。６０分後、溶媒を真空中でロータリーエバポレータで除去し、生成物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60, Merck、移動相: 0.2% (v/v)トリエチルアミンを含むジクロロメタン:アセトン 1:1 (v/v))によって精製した(収量: 205 mg) 。
【０１５０】
（実施例２）
オリゴヌクレオチド合成
a)二重標識加水分解プローブの合成のための一般的方法
オリゴヌクレオチド合成を、ABI 394 Synthesizer上で１μmolの幅で実施した。Proligoから市販される標準tac保護ホスホロアミダイトを使用し、標準的合成のための薬品をGlen Researchから得た。
【０１５１】
3’ BHQ2標識オリゴヌクレオチドを得るために固相BHQ2 CPG (Biosearch)を使用した。実施例１a)および１ｃ）からのホスホロアミダイトを適切な瓶に充填し、無水アセトニトリルで１００μmol／ｌの濃度まで希釈し、合成機の外側位置に取り付けた。製造デフォルト１μmol合成サイクルを使用した。ホスホロアミダイト１ａおよび１ｃの結合時間を、５分まで延長した。
【０１５２】
ｂ）１ｃを使用する二重標識加水分解プローブの合成
ａ）の方法に従って合成されたオリゴヌクレオチドの、固相支持体からの除去および脱保護を、水性３３％(w/v)アンモニア溶液を用いて室温で２時間実施した。溶媒を真空中で除去した。残油をバッファＡ（水性、ｐＨ７．０に調製された０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液）中に溶解した。（標識された）オリゴヌクレオチドを、バッファＡ：水性、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液ｐＨ７．０およびバッファＢ：  水性０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液ｐＨ７．０:アセトニトリル1:1 (v/v)を使用することによってOligo R3カラム(4.6 x 50 mm)を使用する逆相クロマトグラフィーによって精製した。グラジエントは、２分間の０％Ｂおよび次いで４５分間の１００％Ｂまでの１ｍｌ／分の直線流を含む。各２分の大きさの得られた画分をダイオードアレイ検出器を備えるＨＰＬＣによって分析した。９０％以上の純度ならびに２６０、４５０および５７９ｎｍに吸収帯を有する画分を合わせた。溶媒を真空中で真空遠心分離を使用することによって除去した。残油を再蒸留水中に溶解し、次いで溶媒を真空遠心分離中で再度除去した。この手順を３回繰り返した。最終ペレットを水中に溶解し、凍結乾燥した。
【０１５３】
ｃ）実施例１ａ(ジイソプロピル-ホスホロアミダス酸2-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメチル]-5-{5-メタンスルホニルアミノ-3-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピル]-インドール-1-イル}-テトラヒドロ-フラン-3-イルエステル 2-シアノ-エチル)からのアミノ修飾体を使用することおよび後標識による修飾されたオリゴヌクレオチドの合成
ａ）の方法に従って合成されたオリゴヌクレオチドの、固相支持体からの除去および脱保護を、水性、３３％(w/v)アンモニア溶液を用いて室温で２時間実施した。溶媒を真空中で除去した。残油を６００μｌの再蒸留水中に溶解し、微小遠心管に移した。６０μｌの酢酸ナトリウムバッファ(3M, pH 8.5)を添加した。１．８ｍｌの冷（４℃）エタノールの添加の後、混合物を−１５℃で３時間保存した。得られた溶液を１００００×ｇで１５分間遠心分離した。上清をデカンテーションにより除去した。ペレットを２００μｌの冷エタノール（４℃）を用いて洗浄した。遠心分離の後、上清をデカンテーションにより除去した。ペレットを４００μｌのホウ酸ナトリウムバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に溶解し、当業者に公知の手順に従って標識した。従って、ＤＭＦ（１ｍｌ）中１ｍｇの実施例１ｂに従うクマリン色素ＮＨＳエステルの溶液を添加し、混合物を室温で１５時間振盪した。溶媒をロータリーエバポレータを使用して高真空（１ｍｂａｒ）中で除去した。精製を上記のように実施した。この方法を用いて以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
0004713514.tif 000025
および
0004713514.tif 000026
。
【０１５４】
ｄ）実施例１ａ(ジイソプロピル-ホスホロアミダス酸2-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメチル]-5-{5-メタンスルホニルアミノ-3-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピル]-インドール-1-イル}-テトラヒドロ-フラン-3-イルエステル 2-シアノ-エチル)からのアミノ修飾体を使用することおよび後標識による内部修飾された二重標識プローブの合成
【０１５５】
上記の手順と違って、標準ｄＴ−ＣＰＧ(Glen Research #20−2130−41)を固相として使用し、Biosearchからの５’−フルオレセインホスホロアミダイト(6-FAM)(Cat no. BNS-5025-100)を５’−標識として使用した。後標識反応のために、１ｍｇの６−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル(6-TAMRA-NHS-エステル) (Invitrogen # C6123)を０．７５ｍｌのアセトニトリル中に溶解し、０．２５ｍｌのホウ酸ナトリウムバッファ(0.1M, pH 8.5)中の実施例１ａ）のアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドと室温で一晩反応させた。二重標識オリゴヌクレオチドを、PRP1-物質(d=2 cm)カラム：クロマトグラフィー条件：バッファＡ：５％(v/v)アセトニトリルを有しｐＨ７．０に調製された水中の酢酸トリエチルアンモニウムの０．１Ｍ溶液；バッファＢ：水中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム:アセトニトリル1:1 (v/v)；グラジエント：６０分間で０〜４０％Ｂを使用して、逆相クロマトグラフィーによって精製した。得られた画分を、ダイオードアレイ検出器を用いてＨＰＬＣによって分析した。９０％を超える純度ならびに２６０、４９４および５５８ｎｍでの吸収帯を有する画分を合わせた。標識されたオリゴヌクレオチドを含むピークからの画分を回収し、溶媒を、真空遠心分離を使用して除去した。残油を再蒸留水中に溶解し、溶媒を、再度真空遠心分離を使用して除去した。この手順を３回繰り返した。得られたペレットを水中に溶解し、凍結乾燥した。この方法を用いて以下のオリゴヌクレオチドを合成した。：
0004713514.tif 000027
MALDI-MS: M.W. [g/mol] 計算値 8670.2; M.W. 実測値 8669.65。
【０１５６】
（実施例３）
実施例２からの加水分解プローブを使用するリアルタイムＰＣＲによるウイルス標的ＤＮＡの検出
ＰＣＲを、通常の備品と共にLightCycler（登録商標） 480装置を使用して実施した。ＰＣＲミックスを一般的なＰＣＲキット: LightCycler（登録商標） 480 Probes Masterに挿入されている製造業者の推奨に従って調製した。
試薬：
−LightCycler（登録商標） 480 Probes Master
−オリゴヌクレオチド
0004713514.tif 000028
プライマーの最終濃度：０．３μＭ、プローブ：０．０５μＭ
−精製された標的ＤＮＡ
【０１５７】
装置プロトコル：
【表１】
0004713514.tif 000029
【０１５８】
結果：
標的ＤＮＡの増幅を、消光されない（dequenched）シアン５００（４５０ｎｍで励起、５００ｎｍで放出検出）（図２）の蛍光測定によってモニターする。
【０１５９】
クマリンは、ＰＣＲの間Ｔａｑポリメラーゼによって切断されるので、５００ｎｍでのシグナルは、加水分解の間増加した。図２から見られ得るように、リンカーは、シグナル増加および高さに対して影響を有し、従って、蛍光特性は、異なる応用に適合され得る。加水分解プローブ形式について、高度に蛍光性のレポーターを有することが所望され、その一方で、Ｈｙｂｐｒｏｂｅ形式を用いて多重送信することについて、ＦＲＥＴ供与体シグナルが弱い場合、それは有利であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１ａ】図１ａは、反応性基を有するヌクレオシドへの合成経路である(1=5-ニトロ-1H-インドール; 2=3-ヨード-5-ニトロ-1H-インドール; 3=5-クロロ-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フラン; 4=5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フラン; 5=2-ヒドロキシメチル-5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)-テトラヒドロ-フラン-3-オール; 6=2,2,2−トリフルオロ−Ｎ−プロパ−2−イニル−アセトアミド; 7=2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-ニトロ-1H-インドール-3-イル]-プロパ-2-イニル}-アセトアミド)。
【図１ｂ】図１ｂは、反応性基を有するヌクレオシドへの合成経路である(7=2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-ニトロ-1H-インドール-3-イル]-プロパ-2-イニル}-アセトアミド; 8= N-{3-[5-アミノ-1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド; 9= 2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-アセトアミド; 10= N-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド, DMTr= ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-; 11=ジイソプロピル-ホスホロアミダス酸2-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-メトキシメチル]-5-{5-メタンスルホニルアミノ-3-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピル]-インドール-1-イル}-テトラヒドロ-フラン-3-イルエステル 2-シアノ-エチル)。
【図１ｃ】図１ｃは、クマリンホスホロアミダイトの合成である(10= N-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド, DMTr= ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-; 12=5-[3-(3-アミノ-プロピル)-5-メチルアミノ-インドール-1-イル]-2-メトキシメチル-テトラヒドロ-フラン-3-オール); 13=オクタン二酸{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-アミド{2-[(10-オキソ-2,3,5,6-テトラヒドロ-1H,4H,10H-11-オキサ-3a-アザ-ベンゾ[デ]アントラセン-9-カルボニル)-アミノ]-エチル}-アミド; 14=標識されたホスホロアミダイト)。
【図２】図２は、核酸増幅の間の蛍光変化である。
【図１ａ】
0004713514.tif 000031
【図１ｂ】
0004713514.tif 000032
【図１ｃ】
0004713514.tif 000033
【図２】
0004713514.tif 000034
【配列表】
0004713514000001.app