(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞内に外来物質を挿入するための外来物質で小胞を処理する方法において、
ａ）前記小胞と前記外来物質との懸濁液を、電極を含む少なくとも２ミリリットルのチャンバ体積を有するチャンバ中の処理体積中に保持する工程であって、
前記チャンバは電極ギャップの２乗（ｃｍ２）をチャンバ体積（ｃｍ３）で割った商によって定義される形態係数（ｃｍ−１）を有し、
前記形態係数は０．１（ｃｍ−１）以下であり、
前記小胞と前記外来物質との前記懸濁液は、０．０１ミリジーメンスから１．０ミリジーメンスにわたる範囲の伝導度を有するように調節された培養液中にあり、
前記懸濁液は処理の際に前記チャンバ中に閉じ込められる、工程と、
ｂ）前記チャンバ中に閉じ込められた前記懸濁液を１つ又は複数のパルス電界で処理する工程とを含み、
前記工程ａ）及びｂ）に従って、前記懸濁液の前記処理体積は拡大縮小可能であり、
前記チャンバ中の前記小胞の処理時間は実質的に均一である、外来物質で小胞を処理する方法。
【請求項２】
前記チャンバは閉鎖チャンバである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チャンバは少なくとも２ミリリットルの処理能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記チャンバ及びその含有物は無菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記チャンバは前記懸濁液の導入及び排出用の入口及び出口を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電極は平行板電極である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記電界は前記処理体積全体にわたって実質的に均一である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記電界は、前記処理体積全体にわたって実質的に均一な、１００ボルト／ｃｍより大きく５，０００ボルト／ｃｍより小さな均一パルス電界を、前記平行板電極間に発生させるような矩形電圧パルス波形を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記小胞は生体細胞であり、
前記培養液は生理的培養液であり、且つ５０μＳ／ｃｍと５００μＳ／ｃｍとの間の伝導度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理される生体細胞の数は少なくとも１０００万個である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記処理される生体細胞の数は少なくとも２０００万個である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記小胞は、外来物質での処理の後でドナーに戻すべき自己細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記小胞はドナー以外の受容菌に供与すべき同系細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記小胞は異系細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記小胞は人工リポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記パルス電界は、前記物質に対して１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する少なくとも３つの一連の非正弦波の電気パルスである電気パルスからのパルス電界であって、前記少なくとも３つの一連の非正弦波の電気パルスは、以下の特徴：（１）前記少なくとも３つのパルスのうち少なくとも２つはパルス振幅が互いに異なる；（２）前記少なくとも３つのパルスのうち少なくとも２つはパルス幅が異なる；（３）前記少なくとも３つのパルスのうちの第１の組の２つの第１パルス間隔は、前記少なくとも３つのパルスのうちの第２の組の２つの第２パルス間隔と異なる；のうちの１つ、２つ、又は３つを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
処理中の温度上昇は極めて少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
２ミリリットルから１０ミリリットルにわたる範囲で拡大縮小可能な、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
連続的なバッチで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記外来物質は治療物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
治療生成物が前記小胞の前記外来物質での前記処理から形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記外来物質はポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記外来物質はＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記外来物質はポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記外来物質はタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記外来物質は有機化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記外来物質は少なくとも８つの塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記チャンバはチャンバ体積を有し、前記懸濁液は懸濁液体積を有し、前記懸濁液体積は前記チャンバ体積より大きく、
前記懸濁液体積の初めの部分が、前記チャンバ中に移動され、保持され、前記チャンバ中で処理され、且つ前記チャンバから外へ移動され、また
前記懸濁液体積の追加の部分が、前記チャンバ中に移動され、保持され、前記チャンバ中で処理され、且つ前記チャンバから外へ移動される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記懸濁液体積の更なる部分が、連続的に前記チャンバ中に移動され、保持され、前記チャンバ中で処理され、且つ前記チャンバから外へ移動される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記懸濁液体積の更なる部分が、前記懸濁液体積が枯渇するまで連続的に前記チャンバ中に移動され、保持され、前記チャンバ中で処理され、且つ前記チャンバから外へ移動される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも２ミリリットルのチャンバ体積、前記チャンバ内に含まれる一対のエレクトロポレーション電極、及び電極ギャップの２乗（ｃｍ２）をチャンバ体積（ｃｍ３）で割った商によって定義される０．１（ｃｍ−１）以下の形態係数（ｃｍ−１）を有するチャンバと；
前記エレクトロポレーション電極間の前記チャンバ中に含まれる、懸濁液中に小胞を持つエレクトロポレーション培養液であって、５０μＳ／ｃｍと５００μＳ／ｃｍとの間の伝導度を有する培養液と；
前記エレクトロポレーション電極に電気的に接続されたパルス電圧源と；
内部でエレクトロポレーション処理するための、物質を前記チャンバに添加する手段、及び前記チャンバから処理済物質を排出する手段と；
を備える、エレクトロポレーション装置。
【請求項３２】
封止チャンバを提供するための、前記チャンバに接続された封止手段を更に備える、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記封止手段は大量のエラストマ材を含む、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記封止チャンバは前記チャンバ内部が無菌である、請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
前記封止チャンバは、液体が前記チャンバ内に移動するとき空気を排気する排気手段を備える、請求項３２に記載の装置。
【請求項３６】
前記排気手段は前記チャンバの壁面中にフィルタ部材を備える、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記排気手段は前記チャンバと流体連通した排気小室を備える、請求項３５に記載の装置。
【請求項３８】
前記チャンバはチャンバ入口とチャンバ出口を備える、請求項３１に記載の装置。
【請求項３９】
前記チャンバ内に導入する前に前記小胞担持エレクトロポレーション培養液を収容するための、前記チャンバ入口に流体連通した第１リザーバーと；
処理済み小胞担持培養液を前記チャンバから流し出すためにチャンバフラッシング材料を収容するための、前記チャンバ入口に流体連通した第２リザーバーと；
前記チャンバから流し出された処理済み小胞担持培養液を受け入れるための、前記チャンバ出口に流体連通した第３リザーバーと；
を更に備える、請求項３１に記載の装置。
【請求項４０】
前記第１リザーバー、前記第２リザーバー、及び前記第３リザーバーは可撓性バッグからなっている、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記チャンバ入口と前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとの間に接続された入口バルブと；
前記チャンバ出口と前記第３リザーバーとの間に接続された出口バルブと；
を更に備える、請求項３９又は４０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は、同時継続で２００３年３月１４日出願のウォルターズ及びキングの米国特許出願第６０／４５４，３６０号、「大量処理の生体外エレクトロポレーション法」に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般的に、生体外エレクトロポレーション法に関し、より具体的には、臨床及び産業用に特に適合したエレクトロポレーション法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体外又は試験管内のエレクトロポレーション法を用いて治療の目的で大きな分子を生体細胞内に供給することは長年文献に記載されてきた。エレクトロポレーション法の目的は、生体細胞又は非生体小胞内で分子運動を増進させることである。その実用分野は多く、供給する材料の複雑さ、供給サイト、及び供給目的に応じて変わる。
【０００４】
複雑さは、普通なら細胞内に入れることが困難な小さな薬物分子からポリヌクレオチドの複合混合物まで多岐にわたる。
【０００５】
供給サイトは生体内供給及び生体外供給に大きく分けられる。生体内サイトの選択は、処理すべき組織の位置及び局所的又は体系的な処理が望ましいかどうかに基づいている。
【０００６】
この方法の治療的及び工業的な用途が可能である。治療的及び工業的な用途においてしばしば、大きな分子を多数の細胞内に挿入すること及び全ての細胞を等しく処理することが望ましい。これを行うには、全てのセルを同じ処理条件にかけることを保証するために全ての細胞を同時に処理することが望ましい。
【０００７】
供給用の治療目的は多い。いくつかの例は、遺伝子置き換え療法、後天的疾病用の治療用遺伝子薬、ポリヌクレオチドワクチン、免疫療法、進んだ化学療法、及びその他の多くのものである。工業的及び農業的な用途も同様に多様である。工業的な用途のいくつかの例は、発酵槽中で生産した細胞からの材料抽出、組み換えタンパク生産のための大規模なトランスフェクション、工業用の細胞の一時変異、液体の殺菌、又はワクチン生産である。農業的な用途のいくつかの例は、家畜（有蹄類、鳥類、及び水生動物を含む）用のワクチン及び選択した形質を向上させるための遺伝子の一時変異である。
【０００８】
標準的な試験管内エレクトロポレーションの場合、キュベットを一般的に使用する。これらは、プラスチックに封入した平行板電極からなり限定された処理能力を有するチャンバである。これらのキュベットに使用される体積は１ミリリットル未満である。この限定された体積は細胞を処理する全体の処理能力を限定する。
【０００９】
典型的な細胞密度は、ミリリットル当り１００万個〜１０００万個の範囲にある。これらの細胞は、一般的に、センチメートル当り０．０１７ジーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）／ｃｍ（１７０００μＳ／ｃｍ）の伝導度を有するリン酸塩緩衝生理食塩水などの、高イオン含有量の生理的溶媒中に載置する。
【００１０】
エレクトロポレーション法において、細胞密度は重要なパラメータである。細胞が十分に高密度でない場合、治療物質又は他の物質は枯渇する。細胞が高密度になりすぎる場合、各細胞の近傍の電界は方向又は強度において均一でない。臨床用途に必要な首尾一貫した結果を発生させるためには、細胞の近くの電界は方向及び強度のどちらにおいても均一でなければならない。フォムコン（Fomekong）らの、「ＲＢＣ懸濁液の受動的な電気特性：細胞体積分率及び培養液伝導度に基づく緩和時間の分布に起因する変化（Passive electrical properties of RBC suspensions: changes due to distribution of relaxation times in dependence on the cell volume fraction and medium conductivity）」、生物電気化学及びバイオエナジェネティックス（Bioelectrochemistry and Bioenergenetics）、１９９８年、４７巻、頁８１〜８８、によれば、細胞懸濁液の電気特性への細胞の効果は、細胞の充填細胞容積に応じて変わる。充填細胞容積が１０％未満の場合、細胞間の距離が急激に増大し、従って、電界中で、ある１つの細胞が別の細胞に及ぼす干渉効果は、充填細胞容積が１０％未満で急激に減少する。直径１５ミクロンの典型的な細胞は、（０．０００００１７６７ｍｍ３／細胞の平均細胞体積を用いて計算して）細胞数約６０００万個／ｍｌで１０％の充填細胞容積になるはずである。即ち、細胞数６０００万個／ｍｌ未満の細胞密度を用いるべきであり、通常は、細胞数３０００万個／ｍｌ未満の細胞密度を用いる。
0004753119.tif 000002
【００１１】
臨床用途では、一般的に、１０００万〜５億個の細胞を必要とし、その中に大きな分子が適正に挿入される。処理に、ドーズ（処理）あたり１０００万個の細胞を必要とし５ドーズが必要な場合、少なくとも５０００万個の治療用細胞を準備しなくてはならない。エレクトロポレーション法の効率を５０％と仮定し、かつ細胞を細胞数２０００万個／ｍｌの濃度で処理する場合、処理能力５ｍｌの電極を必要とするはずである（５０００万×２／２０００万）。１億個の治療用細胞が必要な場合、処理能力１０ｍｌの電極を必要とするはずである
【００１２】
電極の大きさを単に増大させて所望の処理能力を実現するのは実用的ではない。というのは、そうすると電極の抵抗が減少するのでアンペア数が比例して増大するからである。使用する培養液の伝導度が一定である限り、電極の大きさが増大すると共に電極の抵抗は減少する。
【００１３】
１億個の治療用細胞が必要であり、入力細胞密度がミリリットル当り２０００万個の場合、２０ｍｌの電極が必要である。
【００１４】
この場合、２０ミリリットルまで電極の大きさを大きくすると機能しない。電極体積が増大すると共に培養液の伝導度が減少するため電極の抵抗が増大する。電極中の培養液の抵抗は以下のように計算する。
式１：
0004753119.tif 000003
式中、σは伝導度（ジーメンス／ｃｍ）、ギャップの単位はｃｍ、電極面積の単位はｃｍ２
更に、
式２：
0004753119.tif 000004
及び、
式３：
0004753119.tif 000005
【００１５】
式１、式２、及び式３は、上記で述べた、エベルハードノイマン（Eberhard Neumann）、アーサーソワーズ（Arthur Sowers）、及びキャロルジョーダン（Carol Jordan）著、「細胞生化学におけるエレクトロポレーション及び電気融合（Electroporation and Electrofusion in Cell Biology）」、プレナムプレス（Plenum Press）、１９８９年、から採用した。
【００１６】
以下の表２に、４ミリメートルのギャップ、０．０１７ジーメンス／ｃｍの培養液伝導度の場合における、電極チャンバ抵抗を体積の関数として示す。
0004753119.tif 000006
【００１７】
電極チャンバの体積が１ｍｌを越えると、イオン溶液の抵抗は非実用的に小さくなり、高パルス電流のため、重大な溶液の加熱が発生して細胞を破壊するであろう。
【００１８】
この問題を解決するために流動（flow though）技法が開発された。この方法では、大量の培養液が小さな処理チャンバを通って流れ、電圧パルス波形がチャンバ中の平行板に印加される。この方法の問題点は、
１）全ての細胞は同じ電界強度及び電界方向に露出されないこと、
２）挿入する物質の密度、及び細胞密度が一定である保証がないこと、
３）均一なパルス電圧のみを印加できることである。
米国特許第６，０１０，６１３号に開示されるような様々な矩形パルス波形は使用できない。
【００１９】
流動法では全ての細胞が同一電界強度及び電界方向に露出される保証はない。この点において、層流及び乱流の特性のため、流動法においては全ての細胞は同じ時間処理されないであろう。導管を通る流れの壁面近位の薄層は、壁面遠位の薄層よりもゆっくり移動する。流動法は、電界強度が２００００ボルト／ｃｍより大きな食物処理目的用、及び治療目的用の細胞内への分子挿入のどちらにも用いる。
【００２０】
従来技術の大きな本体がエレクトロポレーションの分野で存在し、この技術の本体のいくつかの態様は本明細書で特に関心がある。例えば、本明細書で特に関心があるのは、培養液パラメータに特別な注意を払ったエレクトロポレーション培養液の開示である。本明細書はこの点において、表３にエレクトロポレーション培養液のパラメータ、陽イオン、陰イオン、モル浸透圧濃度、緩衝作用に関するいくつかの参照文献を示す。
0004753119.tif 000007
【００２１】
より具体的には、表３に関して、米国特許第５，１２４，２５９号は、高トランスフェクション効率を提供するエレクトロポレーション培養液を記載している。この培養液は、カリウムイオン（３５〜１０５ミリグラム当量／リットル）と有機陰イオンとを有し、本質的に塩素イオンを有さない。この培養液は、カリウムイオンの効果として高伝導度である。大きなエレクトロポレーション電極の使用を可能にする低伝導率培養液の使用は論じられていない。
【００２２】
米国特許第６，０４０，１８４号、及び米国特許第６，３３８，９６５号は、本質的にイオンを有さないエレクトロポレーション培養液を記載している。この培養液は、糖類の使用によって且つ無機イオンを使用しないことによって非イオン性にされる。この特許は非イオン性の培養液を有するバクテリア中の向上したトランスフェクション効率を記載する。この特許は、いくらかの伝導度をもたらしそれによっていくらかの電流をもたらしてエレクトロポレーションの際に電界を維持するための少量の有機イオンの添加には言及していない。
【００２３】
米国特許第６，３６８，７８４号は、やはり抗凍結剤であるエレクトロポレーション緩衝液を記載している。この特許は、トランスフェクションの前に細胞凍結のためのこの材料の使用も記載している。使用した緩衝液は、細胞内の細胞質中のものと同様でかつ米国特許第５，１２４，２５９号に記載したものと同様な高濃度のカリウムイオンを有する。この特許は、より大きな処理能力の電極を使用可能にするより低い伝導度のエレクトロポレーション培養液の使用を記載していない。
【００２４】
培養液の伝導度は、材料の細胞内への移動に影響を及ぼす。デューゼノバ（Djuzenova）らは、この研究で使用した最小の伝導度である１ｍＳ／ｃｍまで培養液の伝導度が小さくなると共に、小さな分子の吸収量が増大することを示した（Biochemica et Biophysica Acta V 1284,1996, p 143-152）。他の研究者達も、エレクトロポレーションの際に低伝導度が小さな分子に対する細胞の透過性を向上させることに同意している（Kinosita, K, Tsong, TY, Proc. Natl. Acad Sci, USA, 1977 V74: 1923-1927）（Kinosita, K,Tsong, TY Nature, 1977 V268: 438-440）（Dimitrov, DS, Sowers, AE, Biochem. Biophys. Acta. 1990, V 1022: 381-392）。
【００２５】
キノシタ（Kinosita）は、所定の電界で、高伝導度の培養液が小さなイオン（ナトリウム及びカリウム）の漏出を可能にし、低伝導度の培養液がより大きな分子（ショ糖、タンパク質までではない）の赤血球膜の通過を可能にすることを見出した。より具体的には、キノシタらはエレクトロポレーションステップを用いるヒトの赤血球の溶血を開示している。エレクトロポレーション用に用いられた細胞に関しては、電極表面積の開示はない。従って、決定的に重要なことに、細胞チャンバの体積を確定できない。幅広い範囲の培養液伝導度が提示されている。幅広い範囲の電極ギャップが提示されている。それにも拘らず、培養液伝導度と電極ギャップとのいかなる特定の組をも選定するための教示は提供されていない。
【００２６】
ディミトロフ（Dimitrov）は、低伝導度の培養液中に比べて中間の伝導度の培養液中でエレクトロポレートした赤血球からの蛍光染料の漏出がより少ないことを示した。小さな分子の透過性用の感度のよい定量法を用いて、ある１つのグループ（ジー・プシラー（Pucihar, G）ら）は、エレクトロポレーション緩衝液の伝導度を低下させることは所定の電界での透過性の変化をもたらさないが、生存可能な細胞中で透過性が増大することを示した（Bioelectrochemistry 2001, V 54: 107-115）。使用したこの定量法、ブレオマイシンを用いるエレクトロポレーション法、は小さな分子の少量の吸収を検出し、所与の細胞中のエレクトロポレーション量の差には敏感ではないはずである。
【００２７】
他の研究者達（Rols, MP, Tiessie）は、「高伝導度緩衝液を用いるエレクトロポレーションの際に小さな分子に対する良好な透過性が見られた（Better permeability of cells to small molecules was seen during electroporation using media of higher conductivity）」に開示されているような丁度反対の効果を見出している（Eur. J Biochem 1989 V 179: 109-115）。ロルス（Rols）及びティージー（Tiessie）は、小さな分子、トリパンブルー（Trypan Blue）、に対する透過性が、同一電界及び同一パルス数のとき高ナトリウム培養液中で高くなることを示した。他の研究者達（vnd den Hoff,MJ, Christoffels, VM,Labruyere, WT, Moorman, AF,Lamers, WH）は、細胞の生存率を保つ試みにおいて模擬の細胞内イオン含有量に対して高レベルのカリウムを用いた（Electrotransfection with "intracellular" buffer, 1995, Methods Mol. Biol. V48:185-197）。もっと最近の研究では、高カリウム含有量の市販の培養液（VisSpan, Belzer UW cold-storage solution, DuPont Pharmaceuticals）を用いてエレクトロポレーション法の有効性を向上させている（Baron, S et al, J. Immunol. Meth. , 2000 V 242: 115-126）。この研究の際に供給した物質は、タンパク質やＤＮＡなどの巨大分子である。
【００２８】
上記の参照文献のどれも、巨大分子を哺乳類細胞内に移動させることを実現するために低伝導度の培養液を使用することを論じていない。上記の参照文献のどれも、より大きな処理能力の電極を可能にする低伝導度の培養液の使用を論じていない。
【００２９】
この培養液の他の成分は、トランスフェクション及び細胞の生存率のどちらにも寄与する。使用した成分の１つはカリウムである。細胞内の量と等しい生理学的レベルのカリウムは、エレクトロポレートした細胞における生存率を増大させる傾向がある。このことは、ファンデンホーフ（van den Hoff）及びその他の研究者によって示された（Nucleic Acids Res. , vol. 20, No. 11,1992, p. 2902）。カリウムをエレクトロポレーション培養液に添加すると、この培養液の伝導度が向上し、且つこの培養液がより大きな電極中での使用に望ましくなくなる。
【００３０】
カルシウムイオンもやはりエレクトロポレーションの後の細胞の生存率を向上させることが報告されている。生存率を向上させる理由は、エレクトロポレーションの後の再封止プロセスにおけるカルシウムによる寄与だと報告されている。カルシウムによる生存率の向上は、おそらくカルシウムによる気孔の増大と同じ機構によって、小さな分子の吸収の減少とはわずかにずれている。少量の（０．１ｍＭ）カルシウムによる生存率の向上は、伝導度を増大させる点から見て低コストで得られる。というのは、少量が使用されるからである。従って、カルシウムをエレクトロポレーション培養液に添加することが望ましい。
【００３１】
培養液のモル浸透圧濃度は、細胞の生存率及び大きな分子の細胞膜を通る移動効率に影響を及ぼす。ほとんどのエレクトロポレーションは、通常のモル浸透圧濃度の培養液を用いて行う。しかし、低浸透圧の培養液の使用は、ＤＮＡトランスフェクションの効率を向上させることができる（van den Hoff et al, Nucleic Acids Res. , vol. 18, No. 21, 1990, p. 6464) (Golzio etal., Biophys. J. , vol. 74, 1998, pp. 3015-3022）。モル浸透圧濃度は、糖類、糖アルコール類、他の無毒な有機化合物のアミノ糖類などの非イオン性化合物を用いてエレクトロポレーション培養液中で調節することができる。これらの材料は伝導度を増大させない。伝導度は、無機又は有機陽イオンと共に無機陰イオンを用いて正確に制御することができる。伝導度に影響を及ぼすことなくモル浸透圧濃度を調節するために非イオン性有機材料を使用することが望ましい。
【００３２】
他の参照文献は、メルコニアン（Melkonyan）らの、「哺乳類細胞中のエレクトロポレーション効率はジメチルスルホキシド（ＤＥＳＯ）」（Nucleic Acids Res. , vol. 24, No. 21,1996, pp. 4356-4357）、及び、ロルス（Rols）らの、「電圧誘導した哺乳類細胞膜透過化処理のＡＴＰ及びＡＤＰによる制御、遺伝子移入、並びにその結果得られる発現（Control by ATP and ADP of voltage-induced mammalian-cell-membrane permeabilization）」、（Eur. J. Biochem. , vol. 254, 1998, pp. 382-388）、を含む。
【００３３】
他のパラメータも、エレクトロポレーション法及び従来技術に開示された装置に関して、本明細書で重要である。特に重要なものは以下のパラメータ、処理能力、細胞処理のための環境（静的又は流動的）、処理した物質、臨床用途が提供されるかどうか、及び使用した培養液又は緩衝液である。表４に、これらのパラメータに関するいくつかの米国特許を説明する。
0004753119.tif 000008
【００３４】
より具体的には、表４に説明した米国特許第４，６９５，４７２号は、大量処理の流動チャンバを用いるエレクトロポレーションによる食物の処理を記載している。食物の伝導度を下げることができず、大きな実効処理能力を有し、臨床用途ではない。
【００３５】
米国特許第４，６９５，５４７号は、丸い組織培養プレート内のエレクトロポレーション用の丸い電極を記載している。低伝導度培養液ではなく、大きなサイズではなく、臨床用途ではない。
【００３６】
米国特許第４，８３８，１５４号は、大量処理の流動チャンバを用いるエレクトロポレーションによる食物の処理を記載している。食物の伝導度は下げることができず、大きな実効処理能力を有し、医療用途ではない。
【００３７】
米国特許第４，８４９，０８９号は、完全に囲まれたチャンバを用いるエレクトロポレーション用の丸い電極を記載している。低伝導度培養液ではなく、大きなサイズではなく、臨床用途ではない。
【００３８】
米国特許第４，８８２，２８１号は、丸い組織培養プレート内のエレクトロポレーション用の丸い電極を記載している。低伝導度培養液ではなく、大きなサイズではなく、臨床用途ではない。
【００３９】
米国特許第５，０４８，４０４号は、大量処理の流動チャンバを用いるエレクトロポレーションによる食物の処理を記載している。食物の伝導度は下げることができず、大きな実効処理能力を有し、医療用途ではない。
【００４０】
米国特許第５，０９８，８４３号は、細胞のトランスフェクション用の流動エレクトロポレーションチャンバを記載している。パルスは常にオンであり、有効パルス幅はチャンバ中の時間（流速）によって決定される。非イオン性培養液が記載されている、大量処理能力であり、臨床用途は可能であるが記載されていない。
【００４１】
米国特許第５，１２８，２５７号は、接着細胞として成長した細胞をトランスフェクトするための装置を記載している。装置は細胞の単層上に載置された多重平行板からなる。記載されている唯一の緩衝液は（高度にイオン性の）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水）
であり、大きな処理能力は細胞の単層のため困難である。臨床用途は記載されていない。
【００４２】
米国特許第５，１３４，０７０号は、光学的に透明な導電性表面上で細胞を培養するためのチャンバを記載している。このチャンバは接着細胞のエレクトロポレーション用である。低イオン性培養液が特許請求の範囲の中で述べられているが、具体的な処方箋は何も論じられていない。大きな処理能力は接着細胞のため困難である。臨床用途は何も言及されていない。
【００４３】
米国特許第５，１３７，８１７号は様々な電極を記載している。実施例では非イオン性培養液が使用されているが、この特許は様々な異なるイオン強度の培養液を使用できることに言及している。試験管内及び生体外の電極が記載されている。この生体外電極は、（容易に拡大縮小可能ではない）表面上にめっきした電極を有するので処理能力が小さい。低イオン性培養液が使用され、処理能力は小さく、生体外電極の場合臨床用途が言及されている。
【００４４】
米国特許第５，１７３，１５８号は非導電性膜の気孔中に捕捉された細胞のエレクトロポレーションに言及している。全ての電流が膜の気孔を通って流れるので、低電圧が可能である。エレクトロポレーション培養液の伝導度又はイオン含有量は言及されていない。臨床用途は何も言及されていない。気孔中に細胞を捕捉する必要があるため処理能力は小さい。
【００４５】
米国特許第５，１８６，８００号は原核生物（バクテリア）のトランスフェクションを記載している。低イオン培養液が使用される。哺乳類細胞を有する低イオン培養液の使用は記載されていない。小さい処理能力の状態が望ましい。臨床用途は何も記載されていない。
【００４６】
米国特許第５，２３２，８５６号は、１つの電極が部分的に導電性であるエレクトロポレーション法を記載している。傾斜した電極を電極の１つに使用して、１つの部分的な導電性電極を用いて生成された不均一な電界を補償することができる。特許請求の範囲において明確ではないが、この部分的な導電性電極はその表面に細胞を接着させるためのものである。培養液のイオン含有量は言及されていない。接着はサイズを制限するはずである。臨床用途は言及されていない。
【００４７】
米国特許第５，２３５，９０５号は、流動食を処理するためのエレクトロポレーションの使用を記載している。大きな処理能力の流動電極が記載されている。食物のイオン含有量は調節できない。大きな静的処理能力は記載されていない。臨床用途は記載されていない。
【００４８】
米国特許第５，２８３，１９４号は、非導電性膜の気孔中に捕捉された細胞のエレクトロポレーションに言及している。全ての電流が膜の気孔を通って流れるので低電圧が可能である。エレクトロポレーション培養液の伝導度又はイオン含有量は言及されていない。臨床用途は何も言及されていない。気孔中の細胞を補足する必要があるため処理能力は小さい。
【００４９】
米国特許第５，５１４，３９１号は、流動食を処理するためのエレクトロポレーションの使用を記載している。大きな処理能力の流動電極が記載されている。食物のイオン含有量は調節できない。大きな静的処理能力は記載されていない。臨床用途は記載されていない。
【００５０】
米国特許第５，５４５，１３０号及び米国特許第５，６７６，６４６号は、流動エレクトロポレーション装置を記載している。この装置は全血液を処理するように設計されている。材料はイオン性でない血液に添加することができるが、血液は高度にイオン性である。流動のため処理能力は大きい。処理能力を増大させる低伝導度は言及されていない。大きな静的処理能力は記載されていない。臨床用途は記載されている。
【００５１】
米国特許第５，７２０，９２１号は、流動エレクトロポレーションチャンバを記載している。圧力変化を緩和するための可撓性壁面を追加する修正が加えられている。供与された主な実施例は、細胞からの酸素の放出を増大させる物質を赤血球中に導入することによって赤血球を処理することである。導電性のエレクトロポレーション培養液が使用される。大きな処理能力は流動のためである。処理能力を増大させる低伝導度は言及されていない。大きな静的処理能力は記載されていない。臨床用途は記載されている。
【００５２】
米国特許第５，７７６，５２９号は、流動食を処理するエレクトロポレーションの使用を記載している。大きな処理能力の流動電極が記載されている。食物のイオン含有量は調節できない。大きな静的処理能力は記載されていない。臨床用途は記載されていない。
【００５３】
米国特許第５，８７４，２６８号は、接着細胞をエレクトロポレートするように設計されたエレクトロポレーションチャンバを記載している。この発明の意図は必要とされる細胞数を減少させることである。大きな処理能力は言及されていない。具体的なエレクトロポレーション緩衝液は言及されていない（任意のエレクトロポレーション緩衝液を用いることについての記述だけである）。臨床用途は記載されていない。
【００５４】
米国特許第６，００１，６１７号は、光学的に透明な接着細胞の処理用のエレクトロポレーションチャンバを記載している。大きさは接着細胞によって制限される。低イオン培養液は何も記載されていない。臨床用途は何も記載されていない。
【００５５】
米国特許第６，０７４，６０５号は、流動エレクトロポレーションチャンバを記載している。供与された主な実施例は、細胞からの酸素の放出を増大させる物質を赤血球中に導入することによって赤血球を処理することである。導電性のエレクトロポレーション培養液が使用される。大きな処理能力は流動のためである。処理能力を増大させる低伝導度は言及されていない。大きな静的処理能力は記載されていない。臨床用途は記載されている。
【００５６】
従来技術の別の態様は、表５に示すようなパラメータ、電極寸法（高さ、幅、及びギャップ）に連動する伝導度、キュベットの有無、体積、及び寸法に関する。
0004753119.tif 000009
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５７】
上記で従来技術を論じてきたが、従来技術の先の本体は以下の望ましい特徴、（１）生体外又は試験管内の全ての細胞をほぼ同じ処理条件にかける臨床目的又は治療目的に使用することができる、（２）実質的に大量の生体外又は試験管内細胞を比較的短時間に処理できるように拡大可能である、（３）電極の大きさを増大させて過剰に大きなアンペア数を必要とすることなく細胞処理能力の増大を実現し、（４）処理細胞内の加熱を低レベルに制限する、（５）ほぼ全ての生体外又は試験管内細胞を同一電界強度及び同一電界方向に露出させる、（６）処理チャンバ内に挿入される物質の密度が一定に保持できるようにする、（７）米国特許第６，０１０，６１３号に記載されているような様々な矩形パルス波形を使用可能にする、（８）層流及び乱流条件に起因する流動処理細胞における問題を回避する。（９）低伝導度の培養液の使用を可能にして巨大分子の哺乳類細胞内への移動を実現し、且つより大きな処理能力の電極の使用を可能にする、（１０）処理すべき細胞用の流動処理チャンバを用いないで大きな処理能力に容易に拡大可能であること、の組合せを有するエレクトロポレーション法及びエレクトロポレーション装置を教示又は提案していない。
【００５８】
前述の望ましい特徴は、以下の本発明の説明から明らかになるであろう本発明の独創的な大量処理の生体外エレクトロポレーション法によって提供される。本発明の従来技術に勝る他の利点も明らかにされるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００５９】
（発明の開示）
上記に鑑みて、本発明の目的は、臨床目的及び治療目的に使用することができる大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することであり、この方法では、生体外又は試験管内の全ての細胞がほぼ同一処理条件にかけられる。
【００６０】
本発明のさらに別の目的は、拡大縮小可能な生体外又は試験管内のエレクトロポレーション法を提供して実質的に大量の生体外又は試験管内の細胞を比較的短時間で処理できるようにすることである。
【００６１】
本発明のさらに別の目的は、電極サイズを増大させて過剰に大きなアンペア数を必要とすることなく、増大した細胞処理能力を実現する大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６２】
本発明のさらに別の目的は、処理細胞内部の加熱を低レベルに制限する大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６３】
本発明のさらに別の目的は、ほぼ全ての生体外又は試験管内の細胞を同一の電界強度及び電界方向に露出させる大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６４】
本発明のさらに別の目的は、処理チャンバ内に挿入する物質の密度を一定に保持することができるようにする大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６５】
本発明のさらに別の目的は、米国特許第６，０１０，６１３号に開示されたような様々な矩形パルス波形を使用可能にする大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６６】
本発明のさらに別の目的は、流動処理細胞における層流及び乱流の条件に起因する諸問題を回避する大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６７】
本発明のさらに別の目的は、巨大分子の哺乳類細胞内への移動を実現し、且つ大きな処理能力の電極の使用を可能にすることを許容する大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６８】
本発明のさらに別の目的は、処理すべき細胞用の流動処理チャンバを用いないで大きな処理能力に容易に拡大可能な大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することである。
【００６９】
これらは、本発明のさらに他の目的と共に、この開示に添付され且つこの開示の一部分を形成する特許請求の範囲において、本発明を特徴付ける新規性の様々な特徴と一緒に詳細に指摘されている。本発明、その動作の利点、及びその使用によって得られる具体的な目的をより良く理解するために、添付の図面及び本発明の好ましい実施形態が説明されている記述事項を参照すべきである。
【００７０】
前述及び他の利点を実現するために、簡単に説明したが、本発明は、全ての細胞を同一の電界強度及び電界方向にかけること並びに細胞及び物質の密度が均一になることを保証するために、大きな体積を有する静的なチャンバを提供する。本発明ではいかなる波形も用いることができる。本発明は、２０００万個以下の細胞密度と低伝導度の培養液とを有する平行板付きの電極に接続された電圧波形生成器である。本発明は、５０μＳ／ｃｍと５００μＳ／ｃｍとの間の伝導度を有する培養液を使用する。本発明は、臨床用途に使用することができ、また、細胞及び大きな分子が挿入され且つ除去される閉鎖無菌チャンバを有する。
【００７１】
本発明の一態様によれば、小胞内に外来物質を挿入するための外来物質で小胞を処理する方法であって、
ａ）小胞と外来物質との懸濁液を、電極を備えるチャンバ中の処理体積中に保持し、このチャンバは電極ギャップの２乗（ｃｍ２）をチャンバ体積（ｃｍ３）で割った商によって定義される形態係数を有し、この形態係数は０．１（ｃｍ−１）以下であり、この小胞と外来物質との懸濁液は培養液が０．０１ミリジーメンスから１．０ミリジーメンスにわたる範囲の伝導度を有するように調節された培養液中にあり、この懸濁液は処理の際にチャンバ中に閉じ込められる工程（ステップ）と、
ｂ）このチャンバ中に閉じ込められた懸濁液を１つ又は複数のパルス電界で処理する工程とを含み、
この懸濁液の処理体積は上記のａ）及びｂ）に従って拡大縮小可能であり、また、この小胞のチャンバ中での処理時間は実質的に一定である、方法が提供される。
【００７２】
好ましくはこのチャンバは閉鎖チャンバである。好ましくは、このチャンバは、少なくとも２ミリリットルの処理能力を有する。このチャンバ及びその内容物は無菌であってもよい。好ましくは、このチャンバは、懸濁液の受入用及び除去用の入口及び出口を備える。好ましくは、電極は平行板電極である。
【００７３】
この電界は処理体積全体にわたって実質的に均一である。この電界は、処理体積全体にわたってほぼ均一な１００ボルト／ｃｍより大きく５０００ボルト／ｃｍより小さい均一パルス電界を平行板電極間に発生させるように矩形電圧パルス波形を含むことができる。
【００７４】
この小胞は生体細胞であってもよく、また、この培養液は生理的培養液であってもよく、且つ５０μＳ／ｃｍと５００μＳ／ｃｍとの間の伝導度を有する。チャンバ中で一回に処理される生体細胞の数は１０００万個を超えることができる。更に、チャンバ中で一回に処理される生体細胞の数は２０００万個を超えることもできる。
【００７５】
この小胞は外来物質で処理した後でドナーに戻すべき自己細胞であってもよい。この小胞はドナー以外の受容菌に授与される同系細胞であってもよい。この小胞は異系細胞であってもよい。この小胞は人工リポソームであってもよい。
【００７６】
このパルス電界は、物質に対して１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する少なくとも３つの一連の非正弦波の電気パルスである電気パルスからのパルス電界であってもよい。この一連の非正弦波の電気パルスは、以下の特徴、（１）この少なくとも３つのパルスのうち少なくとも２つはパルス振幅が互いに異なる、（２）この少なくとも３つのパルスのうち少なくとも２つはパルス幅が異なる、（３）この少なくとも３つのパルスのうちの第１の組の２つの第１パルス間隔は、この少なくとも３つのパルスのうちの第２の組の２つの第２パルス間隔と異なる、のうちの１つ、２つ、又は３つを有する。
【００７７】
本発明のこの方法では、小胞処理中の温度上昇は極めて小さい。
【００７８】
本発明のこの方法は、２ミリリットルから１０ミリリットルにわたる範囲で拡大縮小可能である。本発明のこの方法は、連続バッチで実施することができる。
【００７９】
この外来物質は治療物質であってもよい。この外来物質は小胞の外来物質での処理から形成される治療生成物であってもよい。この外来物質は、以下の群、即ち、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、及び有機化合物から選択することができる。
【００８０】
この外来物質は多数の塩基対、例えば、少なくとも８つの塩基対を含むことができる。
【００８１】
本発明では、チャンバはチャンバ体積を有し、懸濁液は懸濁液体積を有し、また、この懸濁液体積はチャンバ体積より大きい。これに関して、懸濁液体積の初めの部分をチャンバ中に移動し、保持し、チャンバ中で処理し、且つチャンバから外へ移動する。次いで、この懸濁液体積の追加の部分をチャンバ中に移動し、保持し、チャンバ中で処理し、且つチャンバから外へ移動する。
【００８２】
この懸濁液容積のさらなる部分を連続的にチャンバ中に移動し、保持し、チャンバ中で処理し、且つチャンバから外へ移動する。これらのステップを懸濁液体積が枯渇するまで繰り返すことができる。
【００８３】
本発明の別の態様により、少なくとも２ミリリットルのチャンバ体積を有するチャンバを備えるエレクトロポレーション装置を提供する。一対のエレクトロポレーション電極をチャンバ内に含む。懸濁液中の小胞を運ぶエレクトロポレーション培養液をチャンバ中のエレクトロポレーション電極間に含む。この培養液は５０μＳ／ｃｍと５００μＳ／ｃｍとの間の伝導度を有する。パルス電圧の源をこのエレクトロポレーション電極、及び内部でのエレクトロポレーション処理用のチャンバに物質を添加する手段に電気的に接続する。処理済物質をチャンバから除去する手段も提供する。
【００８４】
好ましくは、封止チャンバを提供するチャンバに封止手段を接続する。この封止手段は、多量のエラストマ材を含むことができる。
【００８５】
好ましくは、この封止チャンバはチャンバ内部が無菌である。好ましくは、この封止チャンバは液体がチャンバ内に移動するとき空気を抜くガス抜き手段を備える。このガス抜き手段はチャンバ壁面中にフィルタ部材を備えることができる。代替として、このガス抜き手段は、チャンバに流体連通しているガス抜き小室を備えることもできる。
【００８６】
このチャンバはチャンバの入口とチャンバの出口とを備える。チャンバ内に導入する前に小胞担持のエレクトロポレーション培養液を収容するために、第１レザバーをこのチャンバ入口に流体連通して設けることができる。チャンバから出てくる処理済みの小胞担持培養液をフラッシングするチャンバフラッシング材を収容するために、第２レザバーをこのチャンバ入口に流体連通して設けることができる。チャンバから流し出された処理済の小胞担持培養液を受け入れるために、第３レザバーをこのチャンバ出口に流体連通して設けることができる。
【００８７】
これらの第１レザバー、第２レザバー、及び第３レザバーは可撓性のバッグからなってもよい。入口弁をチャンバ入口と第１レザバー及び第２レザバーとの間に接続することができ、また、出口弁をチャンバ出口と第３レザバーの間に接続することもできる。
【００８８】
以下の本発明の詳細な説明を学習した後で、本発明はよりよく理解されるであろう、また、上記の目的、並びに上記で説明した以外の目的がより明らかになるであろう。このような説明は添付の図面を参照している。
【００８９】
（発明の実施の形態）
先に述べた重要な問題は、エレクトロポレーション用の培養液の伝導度である。この方法では、低伝導度の培養液を使用してこの培養液の全抵抗を小さく保ち、また、実質的に加熱をなくす。いかなる培養液伝導度でも使用できるわけではない。培養液のイオン含有量が減少するにつれて、細胞膜を横切って電荷（電圧）を構築するのに役立つ自由イオンの数が減少する。この効果は膜を充電するのに必要となる時間量を増やすことである。この方法は、エベルハードノイマン（Eberhard Neumann）、アーサーソワーズ（Arthur Sowers）、及びキャロルジョーダン（Carol Jordan）によって編集された、細胞生化学におけるエレクトロポレーション及び電気融合（Electroporation and Electrofusion in Cell Biology）、プレナムプレス（Plenum Press）、１９８９年の７１頁の式によって記述される。１０ミクロンの典型的な細胞直径を仮定すると、８０μＳ／ｃｍで充電時間は２０マイクロ秒である。８０μＳ／ｃｍより下では、充電時間が長くなり過ぎ、また、細胞膜中の通路の形成が止まる。下の表６に培養液の抵抗を電極チャンバ体積及び伝導度の関数として示す。
0004753119.tif 000010
【００９０】
生体外エレクトロポレーション法は数多くの刊行された研究プロジェクトにおいて実証されている。現段階では、患者用のワクチンを製造するための臨床トランスフェクションなどの商業用途は一度に何百万もの細胞を処理する大きな電極又はチャンバを必要とする。静的な平行板チャンバは、いかなる使用可能な構成にも最も均一な振幅及び最も均一な電界方向を提供する。この均一性は対象細胞の均一な処理を保証するために必要とされる。細胞の周囲の均一な局所的電界強度を保証するために、細胞数３０００万個／ｍｌなどの極めて高密度な細胞濃度を使用しないことも重要である。本発明は１ミリリットルより大きなチャンバに適用される。
【００９１】
大きなチャンバを用いると、その結果、電圧を印加するとき高電流の流れが生じる。チャンバ抵抗と細胞及び培養液の混合物の伝導度、並びにチャンバ寸法との間の式は下式である。
0004753119.tif 000011
【００９２】
形態係数（ＧＦ）が存在し、これはいかなるチャンバ寸法の場合でも一定である。チャンバの体積が大きくなると共に、チャンバ中の物質の抵抗は小さくなり、その結果、電流の流れが増大する。
【００９３】
本発明は、大きな処理能力の電極を規定された低伝導度のエレクトロポレーション緩衝液と組み合わせて使用する。この方法は、全ての細胞を同一処理条件にかけ、必要なアンペア数の制御を提供し、且つ膨大な数の細胞を処理することができる。パルス電界の印加中、細胞の懸濁液はチャンバ中で静的なままなので、複雑な波形を使用することができる。
【００９４】
本発明の別の態様は、電極間のギャップを交互に充填し且つ空にすることによって、処理能力を更に増大させる。このようにして、全ての所望の特性は具体的な処理の際に満足され、また、電極は、間歇的なバッチ処理におけるその後の処理のために再使用することができる。
【００９５】
本発明は、チャンバ寸法に対して使用することができる物質の伝導度の範囲を指定し、体積が大きくなると共に伝導度は小さくなる。本発明は大きな体積の電極を使用する場合の動作領域を指定する。これは図２に示す。従来技術の掲載結果の動作点も図２に四角で表示する。０．１未満の形態係数を有するチャンバの場合、関連する２つの制限因子がある。その第１は、チャンバ抵抗の絶対値である。本発明ではこのチャンバ抵抗は１オーム以上である。１オームより下の動作は実現不可能だと考えられる。他の制約はチャンバ中の培養液の伝導度である。この伝導度が減少すると共に細胞膜の充電時間が増大する。というのは、この細胞膜の外部に少ないイオンしかないからである。
【００９６】
膜間電圧（ＴＭＶ）と伝導度と細胞直径と間の関係は、以下のようであり、下記に記載するノイマン（Neumann）らから採用した。
0004753119.tif 000012
参照文献：  細胞生化学におけるエレクトロポレーション及び電気融合（Electroporation and Electrofusion in Cell Biology）、エベルハードノイマン（Eberhard Neumann）、アーサーソワーズ（Arthur Sowers）、及びキャロルジョーダン（Carol Jordan）により編集、プレナムプレス（Plenum Press）、１９８９年 
【００９７】
１マイクロジーメンス／ｃｍより下では、イオンが極めて少なく細胞膜を変化させる時間が非現実的に大きくなる。
【００９８】
これによって、本発明の好ましい動作領域は、
細胞直径                            ＞  １ミリメートル
チャンバ体積                        ＞  １ミリリットル
処理すべき材料の伝導度              ＞  １マイクロジーメンス／ｃｍ
処理すべき材料のチャンバ中の全抵抗  ＞  １オーム
チャンバの形態係数                  ＜  ０．１ｃｍ−１
である。
【００９９】
本発明は、大きな体積の静的なチャンバを用いて全ての細胞が同一の電界強度及び電界方向に露出されること、並びに細胞の密度及び処理物質が均一であることを保証する。本発明ではどんな波形も使用することができる。本発明は、細胞数２０００万個以下の細胞密度と低伝導度の培養液とを有する平行板付きの電極に接続された電圧波形生成器である。
【０１００】
本発明の構成要素は、有効に細胞をエレクトロポレートするのに十分なイオンを提供しつつ同時にアンペア数及び加熱を制限するように、規定された範囲内の低伝導度の培養液を使用することである。一般的には、使用される培養液は、５０μＳ／ｃｍと５００μＳ／ｃｍとの間の伝導度を有するであろう。
【０１０１】
本発明は、臨床用途に使用することができ、また、細胞及び大きな分子が内部に挿入され且つ除去される閉鎖無菌チャンバと共に使用することができる。
【０１０２】
本発明の一態様は、電極を交互に充填し且つ空にすることによって処理能力を向上させる。このようにして、具体的な処理の際に全ての所望の特性が満足され、また、この電極は断続的なバッチプロセスにおけるその後の処理のために再使用することができる。
【０１０３】
エレクトロポレーションに使用したこの培養液の伝導度は、本発明の重要な態様である。この方法では、低伝導度の培養液を使用してこの培養液の全抵抗を小さく保ち、また、実質的に加熱をなくす。使用することができるより低い伝導度の培養液は限界がある。培養液のイオン含有量が減少すると共に、細胞膜を横切って電荷（電圧）を構築するのに役立つ自由イオンの数が減少する。この効果は、膜を充電させるのに要する時間の量を増大させることである。この方法はノイマンの７１頁における式によって記述される。１０ミクロンの典型的な細胞直径を仮定すると、８０μＳ／ｃｍで充電時間は２０マイクロ秒である。８０μＳ／ｃｍより下では、充電時間が長くなり過ぎ、又、細胞膜中の通路は形成が止まる。
【０１０４】
ギャップ４ｍｍの電極を用いて、表６に培養液の抵抗を電極チャンバの体積及び伝導度の関数として示す。
【０１０５】
本発明の一態様では、図１に示すように２つの電極を有するチャンバを使用する。使用することができる電極寸法の例は、ギャップ０．４ｃｍ、電極高さ２ｃｍ、電極長さ１０ｃｍである。このチャンバは、シトパルスサイエンス有限会社（Cyto Pulse Sciences, Inc.）のエレクトロポレータＰＡ−４００などの市販のエレクトロポレータと共に使用することができる。
【０１０６】
このチャンバと共に使用することができる培養液の例は、以下の処方箋を有するものである。
ソルビトール            ２８０ミリモル
カルシウムアセテート    ０．１ミリモル
マグネシウムアセテート  ０．５ミリモル
【０１０７】
図３は、生物細胞の充電時間（マイクロ秒）と、３つの異なる直径、即ち、１マイクロメートル、１０マイクロメートル、及び１００マイクロメートルを有する細胞用培養液の伝導度（マイクロジーメンス／ｃｍ）との間の関係を示すグラフである。図３から、１マイクロジーメンスより下の細胞用培養液の伝導度の場合、この充電時間は非常に大きくなるはずであり、エレクトロポレーションが機能しなくなるはずである。
【０１０８】
本発明の使用態様及び動作態様については、同じことが上記の開示から明らかであり、従って、使用態様及び動作態様に関して更なる議論をする必要はない。
【０１０９】
以上より、本発明が、全ての生体外又は試験管内細胞がほぼ同じ処理条件にかけられ、臨床目的及び治療目的に有利に使用することができる大量処理の生体外エレクトロポレーション法を提供することによって、説明した全ての目的を達成することは明らかである。本発明では、拡大縮小可能であって実質的に大量の生体外又は試験管内細胞を比較的短い時間間隔で処理することができる大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、電極の寸法を増加させて過剰に大きなアンペア数を必要とすることなく向上した細胞処理能力を実現する大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、ほぼ全ての生体外又は試験管内細胞を同じ電界強度及び電界方向に露出させる大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、処理チャンバに挿入すべき材料の密度を一定に保持することができる大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、米国特許第６，０１０，６１３号に開示されたような様々な矩形パルス波形を可能にする大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、流動処理細胞における層流及び乱流条件に起因する問題を回避する大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、低伝導度の培養液の使用を可能にして巨大分子の哺乳類細胞内への移動を実現し且つより大きな処理能力の電極の使用を可能にする大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。本発明では、処理すべき細胞用の流動処理チャンバを用いないで容易に大きな処理能力に拡大可能な大量処理の生体外エレクトロポレーション法が提供される。
【０１１０】
上記の説明に関して、寸法変動、形状関数、並びに動作、アセンブリ、及び使用を含むための本発明の部品の最適な寸法関係は、当業者には容易に明らか且つ自明になると見なされることを認識すべきであり、従って、図面に示し且つ明細書に記載したものと同等な全ての関係は添付の特許請求の範囲の範疇によってのみ包含されるものとする。
【０１１１】
本発明を図面で示し、現時点で最も実用的と見なされる事柄及び本発明の好ましい実施形態に関連して上記で具体的、詳細且つ完全に説明してきたが、当業者には、本明細書で説明した原理及び概念から逸脱することなく本発明の多くの修正形態を成し得ることが明らかになるであろう。それ故、本発明の適正な範疇は、全てのこのような修正形態及び均等物を包含するように添付の特許請求の範囲の最も広い解釈によってのみ決定すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明の方法を実施して採用された装置の概略図である。
【図２】三角形の内部が本発明の方法の作動領域を示し、且つこの作動領域がどのようにこの三角形の外側の小さなブロックで示す従来技術のエレクトロポレーション法の作動領域の外側にあるかを示すグラフである。
【図３】生物細胞の充電時間（ミリ秒）と、３つの異なる直径、即ち、１マイクロメートル、１０マイクロメートル、及び１００マイクロメートルを有する細胞の場合の培養液伝導度（マイクロジーメンズ／ｃｍ）との関係を示すグラフである。
【図４】本発明の方法に関係するとき、時間定数と伝導度との関係を示すグラフである。
【図１】
0004753119.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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