(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを有効成分として含んで成る運動ニューロン病の予防および／または治療するための製薬学的製剤。
【請求項２】
運動ニューロン病が筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、小児筋萎縮症および原発性側索硬化症からなる群より選ばれる請求項１に記載の製薬学的製剤。
【請求項３】
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを５〜５０ｍｇ含んで成る、請求項１または２に記載の製薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリン（ｅｒｇｏｌｉｎｅ）を運動ニューロン病（ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の予防および／または治療で用いることに関する。
【０００２】
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンまたは１−メチル−１０α−メトキシ−９，１０−ジヒドロリセルゴールはニセルゴリン（ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ）の代謝物の１つである（Ｆ．ＡＲＣＡＭＯＮＥ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.，２１（１６），２２０５−２０１３（１９７２））。そのような化合物は、低い度合ではあるがニセルゴリンと同様にα１−アドレナリン作用性および５ＨＴ１ａ−セロトニン作用性を示す。これはまたニセルゴリンを製造する時の中間体として用いるに有用である（フランス特許第２６１６７８８号）。
【０００３】
今回、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが運動ニューロンの生存性を高め、従ってそれを運動ニューロン病の予防および／または治療で用いることができることを見いだした。
【０００４】
運動ニューロン病には特に筋委縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、進行性脊髄筋萎縮（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、小児筋萎縮（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）および原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）が含まれる。
【０００５】
運動ニューロンの培養物に神経栄養因子であるＢＤＮＦまたはＧＤＮＦが供給する栄養支持物（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を存在させると、そのような培養物は、長い分枝を有する軸索を伴う幅広い均一なニューロンを含有するようになる。しかしながら、この培養を栄養支持物の存在無しに実施すると運動ニューロンが細胞消滅で死滅する。
【０００６】
従って、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの効果の測定を、培養した運動ニューロンから神経栄養因子を取り除くことで誘発した変性モデルを用いて行った。
【０００７】
更に、運動ニューロンの生存に適切な環境の維持管理に星状細胞が重要な役割を果たす。
【０００８】
従って、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの試験をまた運動ニューロンと星状細胞の共培養物を用いることでも行った。
【０００９】
下記のプロトコルを用いた：
運動ニューロンが豊富な培養物：
Ｒ．Ｌ．ＳＣＨＮＡＡＲおよびＡ．Ｅ．ＳＣＨＡＦＦＮＥＲ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.，１，２０４−２１７（１９８１）が記述しそしてＷ．ＣＡＭＵおよびＣ．Ｅ．ＨＥＮＤＥＲＳＯＮ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４，５９−７０（１９９２）が修飾した遠心分離方法を用いて運動ニューロンが豊富な培養物を調製する。この運動ニューロンを、Ａ．Ｇ．ＥＳＴＥＶＥＺ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.，１８（３），９２３−９３１（１９９８）の方法に従ってラミニン／オルニチンで前以て覆っておいた３５ｍｍの培養板に板１枚当たり２５００個の細胞から成る密度で広げる。次に、この培養物を重炭酸ナトリウム（２２ｍＭ）、コナルブミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、プトレシン（０．１ｍＭ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（３１ｍＭ）、グルコース（２０ｍＭ）、プロゲステロン（２１ｎＭ）、ペニシリン（１００（ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬ１５培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で維持する。
【００１０】
このようにして得た運動ニューロンは、長い分枝の軸索を有する大き（２５−３０μｍ）くて均一なニューロンから成る。その細胞の７０％を越える細胞がニューロトロフィンｐ７５レセプタおよび脊髄運動ニューロンのＩｓｌｅｔ  １／２マーカーに免疫反応性を示す。そのような培養を栄養因子の存在無しに実施すると、広げて２４時間後に運動ニューロンの約７０％が細胞消滅で死滅する。
脊髄星状細胞の培養：
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ａ．Ｊ．ＴＵＲＮＥＲおよびＨ．Ａ．Ｓｔ  ＪＯＨＮ）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ−Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣの２７−６３頁に記述されているようにＲ．Ｐ．ＳＡＮＥＴＯおよびＪ．ＤＥ  ＶＥＬＬＩＳの方法を若干修飾した方法を用いて、１日令の若いラットから星状細胞を得る。脊髄を無菌条件下の解剖で取り出して髄膜と背側神経節を除去する。ＰＢＳ（燐酸塩緩衝食塩水）に脊髄を５から１０個移した後、切断して、トリプシンを０．２５％添加しておいたＰＢＳに入れて３７℃で２５分間インキュベートする。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加しておいたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ媒体（ＤＭＥＭ）を１０ｍｌ添加して酵素処理を停止させた後、細胞を遠心分離で集める。１ｍｌピペットの末端部を用いて別の機械的分解段階も実施する。この細胞をＦＣＳが１０％入っているＤＭＥＭに培地２５ｃｍ2当たり１．５−２ｘ１０6個のセルから成る密度で広げる。インビトロで２日後から培養物に毎日餌を与える。目で見て細胞の単層の形成が完了した時点で培養物を２５０ｒｐｍで４８時間撹拌し、そして次の日、前記単層をシトシンアラビノシド（１０-5Ｍ）で４８時間処理する。次に、この星状細胞単層を最初２５ｃｍ2の培養フラスコの３５ｍｍの培養板上で密度が５になるまで増幅させる。
【００１１】
前記脊髄星状細胞培養物は９８％を越える度合で神経膠原線維酸蛋白質（ＧＦＡＰ）に免疫反応を示す平らな多角形の細胞を含有する。前記単層を試験を受けさせるべき製品に接触させた後、運動ニューロン培地と一緒にインキュベートすることで、条件付けした培地を得る。この培地を移していろいろな希釈度で試験を行うことで、それがニューロン生存に対して示す効果を測定する。
免疫化学
前記細胞をＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドと０．１％のグルタルアルデヒド（ｐＨ７．４）に４℃で１５分間入れそして冷メタノール溶液に入れることで固定する。次に、この培養物をＰＢＳ中１０％のヤギ血清と２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄して非特異的部位を遮断した後、弱い親和力を有するｐ７５ニューロトロフィンレセプタまたは２００ｋＤのニューロフィラメント蛋白質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に対する抗体を製造業者の指示で用いかつアビジン−ビオチン−ＤＡＢ／過酸化水素増強反応を用いた免疫化学処理を行う。
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンによる星状細胞の処理
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンによる星状細胞の処理を下記の様式で行う：この製品をメタノールに溶解させ、濾過で滅菌し、そして調製後直ちに用いる。試験を受けさせるべき製品が入っている溶液を一定分量でＬ１５培地に添加して広げることで、運動ニューロンが豊富な培養物に適用する処理を行う。前記星状細胞の単層を媒体にか或は試験を受けさせるべき化合物がいろいろいな濃度で入っている溶液に２４時間接触させる。星状細胞の単層をＤＭＥＭで３回洗浄した後、完全Ｌ１５培地と一緒にインキュベートする。２４時間後に星状細胞条件付け培地（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を回収しそして遠心分離に１８００ｇで１５分間かけた後、直ちに用いるか、或は−７０℃で栄養活性が失われないならば最大で２週間貯蔵する。
細胞の計数および統計学的解析
ニューロフィラメントに免疫反応性を示しかつ細胞の直径よりも大きな軸索を示す細胞は生存能力のある運動ニューロンであると見なす。２００倍に拡大した顕微鏡下で０．４−１ｃｍ2の面積に存在する標識付き細胞の数を数えることで運動ニューロンの数を推定する。この値を、全てのケースで、栄養因子を用いて維持した培養物に存在する運動ニューロンの数のパーセントとして表す。このような実験を少なくとも３回実施する。
【００１２】
Ｓｔｕｄｅｎｔの試験（ｔテスト）を用いて統計学的解析を実施する。
【００１３】
下記の結果を得た：
１  −  １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが星状細胞／運動ニューロン共培養物中のニューロン生存に対して示す効果：
【００１４】
【表１】
0004637360.tif 000002
【００１５】
前記結果は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリン（０．１−１μＭ）が前記共培養物に含まれるニューロンの死滅を防止しかつ大型運動ニューロンの数を多くすることを示している。
２  −  脊髄星状細胞がもたらす運動ニューロン神経栄養活性に対する１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの効果：
【００１６】
【表２】
0004637360.tif 000003
【００１７】
前記結果は、脊髄星状細胞単層がもたらす運動ニューロン栄養活性を１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが刺激することを示している。
３  −  星状細胞単層と運動ニューロンの共培養に対する１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの効果：
【００１８】
【表３】
0004637360.tif 000004
【００１９】
前記結果は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが星状細胞による運動ニューロン栄養活性を刺激してそれを産出させる効力を有することを示している。
４  −  １，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが運動ニューロンが豊富な培養物に入っているニューロンの死滅に対して栄養因子の存在無しに示す神経栄養様効果：
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンは栄養因子無しで運動ニューロンの生存率を６０％高く（ｐ＜０．００１）する一方でニューロンの分枝および細胞の形態は良好に保存されたままである。
【００２０】
このような結果は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンが前記変性モデル（培養した運動ニューロンから栄養因子を取り除くことで誘発）で神経栄養効果を及ぼしそして更に星状細胞による前記神経栄養因子の産出を刺激することを示唆している。
【００２１】
本発明は、また、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを運動ニューロン病、特に筋委縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮、小児筋萎縮および原発性側索硬化症の予防および／または治療で用いられる薬剤を製造する目的で用いることにも関する。
【００２２】
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの製造はフランス特許第２６１６７８８号に記述されている方法を用いて実施可能である。
【００２３】
そのような薬剤に少なくとも１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを高純度の状態または薬学的に適合していて不活性であるか或は生理学的活性を示す他の任意製品と組み合わせた組成物の形態で含める。本発明に従う薬剤は特に経口または非経口で使用可能である。
【００２４】
経口投与用固体状組成物として錠剤、ピル、粉剤（ゼラチンカプセルおよび錠剤）、経口用凍結乾燥品［Ｌｙｏｃ（商標）］または顆粒を用いることができる。このような組成物では、活性素を１種以上の不活性希釈剤、例えば澱粉、酒石酸、アラビアゴム、サッカリンナトリウム、バニリン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカなどと一緒にアルゴン流下で混合する。このような組成物にまた希釈剤以外の物質、例えば１種以上の滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはタルクなど、染料、コーティング（糖衣錠剤）またはワニスなどを含めることも可能である。
【００２５】
不活性希釈剤、例えば水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィン油などを含有する薬学的に受け入れられる溶液、懸濁液、乳液、シロップおよびエリキシルを経口投与用液状組成物として用いることができる。このような組成物に希釈剤以外の物質、例えば湿潤用、甘味用、増粘用、香気用または安定化用製品を含めることも可能である。
【００２６】
非経口投与用無菌組成物は好適には水性もしくは非水性溶液、懸濁液または乳液であり得る。水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、特にオリーブ油、注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルなど、または他の適切な有機溶媒などを溶媒または媒体として用いることができる。そのような組成物にまたアジュバント、特に湿潤剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、乳化剤、分散剤および安定剤を含めることも可能である。殺菌はいろいろな方法で実施可能であり、例えば無菌濾過、当該組成物への殺菌剤の添加、照射または加熱などで実施可能である。そのような組成物をまた無菌固体組成物の形態で調製してそれを使用時に無菌水または他の何らかの注射可能無菌媒体に溶解させることも可能である。
【００２７】
調合実施例：
カプセル：１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを１０ｍｇ、そして賦形剤としてタルク、ラクトースおよびステアリン酸マグネシウム。
経口用凍結乾燥品：１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを１０ｍｇ、そして賦形剤として酒石酸、ラクトース、アラビアゴム、サッカリンナトリウムおよびバニリン。
非経口使用用粉剤：１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを１０ｍｇ、そして賦形剤として酒石酸およびラクトース。
【００２８】
投薬量は求められる効果、治療期間および用いられる投与経路に依存し、成人の場合の経口による投薬量は一般に１日当たり３０から２００ｍｇであり、この場合、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンの単位投薬量を５から５０ｍｇの範囲にしてもよい。
【００２９】
一般的様式において、医者は治療を受けさせる被験者の体重および他の特別な要因全部に応じて適切な投薬量を決定するであろう。
【００３０】
本発明は、また、運動ニューロン病、特に筋委縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮、小児筋萎縮および原発性側索硬化症の予防および／または治療方法にも関し、この方法は、１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンを患者に投与することにある。