(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パントテネート化合物を過剰産生する、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する胞子形成欠損微生物であって、
低減したＳｉｇＥ活性を示し、かつ、ｓｐｏ０Ａ遺伝子を過剰発現するように；又は、
低減したＳｐｏ０Ａ活性および低減したＡｂｒＢ活性を示すように、改変された微生物。
【請求項２】
ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ、ｙｌｍＡ及びｇｃｖ遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子を過剰発現させた、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
パントテネート化合物を製造するための方法であって、
該パントテネート化合物が産生される条件で微生物を培養する工程、を含み、
前記微生物はパントテネート化合物を過剰産生する、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する胞子形成欠損微生物であって、
低減したＳｉｇＥ活性を示すように；
低減したＳｉｇＥ活性を示し、かつ、ｓｐｏ０Ａ遺伝子を過剰発現するように；又は、
低減したＳｐｏ０Ａ活性および低減したＡｂｒＢ活性を示すように、改変された微生物、である方法。
【請求項４】
細胞培養液から該パントテネート化合物を回収する工程、をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
パントテネート化合物を過剰産生できる、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する胞子形成欠損微生物の調製のための方法であって、以下の工程：
（ａ）ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ、ｙｌｍＡ及びｇｃｖ遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子を過剰発現させた、バチルス属の微生物を提供する工程、および
（ｂ）バチルス属の胞子形成欠損微生物が得られるように、
工程（ａ）の該微生物にＳｐｏ０Ａ活性の低減およびＡｂｒＢ活性の低減を引き起こす突然変異を導入するか、
もしくは工程（ａ）の該微生物にＳｉｇＥ活性の低減およびｓｐｏ０Ａ遺伝子の過剰発現を引き起こす突然変異を導入する工程；
を含む方法。
【請求項６】
パントテネート化合物の調製のための、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する胞子形成欠損微生物の使用であって、前記微生物が、
低減したＳｉｇＥ活性を示すように；
低減したＳｉｇＥ活性を示し、かつ、ｓｐｏ０Ａ遺伝子を過剰発現するように；又は、
低減したＳｐｏ０Ａ活性および低減したＡｂｒＢ活性を示すように、改変された微生物である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
パントテネートは、ビタミンＢ複合体のメンバーで、例えば食物源から、水溶性ビタミンのサプリメントとして、または飼料添加物としてヒトを含めた哺乳動物の栄養に必要とされる。細胞ではパントテネートは、コエンザイムＡおよびアシル担体蛋白質の生合成に主に用いられる。これらの必須補酵素は、これらの分子の４’−ホスホパンテテイン部分のスルフヒドリル基と共にチオエステルを形成するアシル部分の代謝に機能を果たす。
【０００２】
パントテネートは、通常は大量の化学物質から化学合成を経て合成されている。しかし、化学合成に必要となる基質は高価で、ラセミ中間体を光学的に分割しなければならない。従って、パントテネート生合成法に有用な酵素を産生する細菌系または微生物系が採用されてきた。特に、パントテン酸の好ましい異性体を好都合に製造する手段として生物変換法が評価された。さらに最近は、微生物による直接合成法がＤ−パントテネートの産生を容易にする手段として検討された。
【０００３】
特許出願ＷＯ０１／２１７７２、ＷＯ０２／０５７４７４、およびＷＯ０２／０６１１０８は、パントテネート産生に関与する生合成遺伝子をさらに高い発現レベルで有するＢ．スブチリス（B.subtilis）１６８株類を用いてパントテネートを製造する方法を記載している。これらの遺伝子には、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ（ｙｌｂＱ）、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｇｌｙＡ、およびｓｅｒＡがある。これらの遺伝子のさらに高レベルの発現を達成するために、当技術分野において公知である標準的な遺伝子組み換え法が使用された。これらの操作された株からのパントテネートの産生は流加培養による発酵４８時間で３７ｇ／リットルから８５ｇ／リットルの範囲にわたった。
【０００４】
環境および行政による規制の点から、もしも遺伝子修飾微生物が発酵過程の間またはバイオマスの処分の間に製造施設から漏れた場合に、その微生物が自然環境中で生存する能力を有さないことが重要である。この理由からＢ．スブチリスの胞子形成欠損株が、発酵過程（例えばリボフラビン（ＵＳ５８３７５２８）、ビオチン（ＵＳ６０５７１３６））に用いられる。概してｓｐｏ０Ａ突然変異が、胞子形成の停止に使用される。ｓｐｏ０Ａ遺伝子は、胞子形成の開始を調節するタンパク質をコードする。点突然変異、フレームシフト突然変異または欠失突然変異のいずれかによるｓｐｏ０Ａの不活性化は、最初期の工程で胞子形成を停止させる結果、化学溶媒、放射線および／または熱にもはや耐性ではない株をもたらす。ｓｐｏ０Ａにおける突然変異以外にＷＯ９７／０３１８５は、胞子形成できないＢ．スブチリス以外のバチルス属の細菌を得るために、胞子形成特異的転写のシグマ因子σＦをコードするバチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のｓｐｏＩＩＡＣにおける突然変異を使用して、商業的に重要な酵素を製造する方法を記載している。
【０００５】
Ｂ．スブチリスおよび他の関連グラム陽性細菌における内生胞子形成（胞子形成）過程は数工程からなる。胞子形成への加入は、ＤＮＡ結合性主応答調節因子であるリン酸化ｓｐｏ０Ａ（ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ）によって決定されている（Fawcettら、2000）。ｓｐｏ０Ａ〜Ｐは、二つの重要な役割を演じている（PhillipsおよびStrauch、2002）。低い細胞内濃度でｓｐｏ０Ａ〜ＰはａｂｒＢの転写を抑制し、それによってＡｂｒＢ依存性移行状態関連遺伝子の発現調節が高まる。次に、ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度がさらに高い限界レベルに達したならば、Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐは、胞子形成への加入および方向付けに必要な遺伝子（ｓｉｎＩ、ｓｐｏＩＩＧ、ｓｐｏＩＩＥ、ｓｐｏＩＩＡなど）を活性化する。Ｓｐｏ０Ａ〜ＰがａｂｒＢの転写を抑制してＡｂｒＢがｓｉｇＨの転写を抑制することから、ｓｐｏ０Ａ〜Ｐは、σＨのレギュロン内にある遺伝子を間接的に活性化する。σＨは増殖定常期および胞子形成の初期に関与する遺伝子（ｓｐｏ０Ａ、ｓｐｏ０Ｆ、ｓｐｏＩＩＡ、ｐｈｒＣ、ｐｈｒＥなど）の転写を決定する代替シグマ因子である（Brittonら、2002）。ｓｐｏ０Ａ〜ＰおよびＡｂｒＢのレベルを増加または減少させる遺伝子ならびに遺伝子産物の例には、ａｂｒＢ、ｋａｐＢ、ｋｂａＡ、ｋｉｎＡ、ｋｉｎＢ、ｋｉｎＣ、ｋｉｎＤ、ｋｉｎＥ、ｋｉｐＡ、ｋｉｐＩ、ｏｂｇ、ｐｈｒＣ、ｐｈｒＥ、ｒａｐＡ、ｒａｐＢ、ｒａｐＥ、ｓｉｇＨ、ｓｐｏ０Ａ，ｓｐｏ０Ｂ、ｓｐｏ０Ｅおよびｓｐｏ０Ｆがあるが、それに限定されるわけではない。プロモーター部位でのｓｐｏ０Ａ〜Ｐ依存性結合に作用して遺伝子発現を活性化させるタンパク質の例には、ｓｐｏ０ＪＡおよびｓｐｏ０ＪＢがあるが、それに限定されるわけではない。ｓｐｏ０Ａ〜ＰおよびＡｂｒＢのレベルを増加または減少させるシグナルの例には、栄養シグナル、代謝シグナル、ＤＮＡ状態シグナル、細胞密度（フェロモンおよび菌体密度感知分子）シグナルおよび細胞周期シグナルがあるが、それに限定されるわけではない。
【０００６】
これらの工程の後に、細胞は非対称に分裂してサイズが等しくなく異なる発達運命の二つの区画が発生する（PiggotおよびLosick、2002）。小さい方の区画である前胞子は、発達して胞子になるが、大きい方の区画である母細胞は発達中の胞子に栄養素を与える。胞子の形態形成が完了すると、母細胞は溶解して成熟した胞子を放出する。分化は、細胞特異的な四つのシグマ因子であるσＦ、σＥ、σＧおよびσＫの作用を必要とする。σＦ因子およびσＥ因子は非対称分裂（極性をもつ隔壁形成、第ＩＩ期）後すぐに活性化し、このときσＦは前胞子における遺伝子発現を指示し（Margolisら、1991）、σＥは母細胞における遺伝子発現を指示する（DirksおよびLosick、1991）。胞子形成の後期に前胞子ではσＦはσＧにより置き換わられ、母細胞ではσＥはσＫにより置き換わられる（LosickおよびStragier、1992; LiおよびPiggot、2001）。
【０００７】
σＥはプロσＥと呼ばれる不活性プロタンパク質から得られる（LaBellら、1987）。プロσＥの合成は、隔壁形成前に始まる（Satolaら、1992）が、プロσＥから成熟σＥへのタンパク質分解性プロセシングは、母細胞における非対称分裂後に起こる。この反応は、胞子形成特異的プロテアーゼであるＳｐｏＩＩＧＡによって仲介され、ＳｐｏＩＩＧＡはプロσＥのアミノ末端から２７個のアミノ酸を開裂させる（Stragierら、1988; Jonasら、1988; PetersおよびHaldenwang、1994）。プロセシング前にＳｐｏＩＩＧＡは、σＦの制御下で前胞子において産生する分泌されたシグナル伝達タンパク質（ＳｐｏＩＩＲ）によって活性化する（Londono-VallejoおよびStragier、1995; Hofmeisterら、1995; Karowら、1995)。σＥおよび他のシグマ因子の活性化についての追加の情報をHelmannおよびMoran(2002）が総説している。
【０００８】
胞子形成突然変異を他の突然変異と組み合わせて単一の細菌に導入した結果として予想外の遺伝子活性化がもたらされることが示された。例えば、ｓｐｏ０Ａ〜Ｐの非存在下で減少するγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子であるｇｇｔの発現は、ａｂｒＢおよびｓｐｏ０Ａの二重ヌル突然変異体において野生型の発現レベルの３〜４倍に増大しうる（XuおよびStrauch、1996）。そのような株は、胞子形成もできない。しかし、これらの株が対照細胞と同レベルまたは対照細胞より高いパントテネートの産生を示しうることは認識されていなかった。特に、ＸｕおよびＳｔｒａｕｃｈに記載された細胞は、パントテネート化合物を過剰産生できない。
【０００９】
興味深いことに、ＷＯ０１／２１７７２、ＷＯ０２／０５７４７４、およびＷＯ０２／０６１１０８に記載された遺伝子改変されたパントテネート産生Ｂ．スブチリス１６８株類は全て胞子形成について野生型である。胞子形成欠損株におけるパントテネートの産生を示す例は提供されていない。
【００１０】
パントテネートを過剰産生できる胞子形成欠損微生物を提供することが本発明の目的である。Ｂ．スブチリスにも適する胞子形成欠損微生物の調製のための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１１】
通常に使用されているｓｐｏ０Ａ突然変異がパントテネート産生の重大な減少をもたらすことが発見された。しかし、ＳｉｇＥ活性を欠くか、またはｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢの両方を欠くＢ．スブチリス細胞は、完全に胞子形成を欠き、対照細胞と同様またはそれよりも高いレベルでパントテネートの産生を示すことが見出された。
【００１２】
したがって本発明は、パントテネート化合物を過剰産生できる胞子形成欠損微生物に関するものである。微生物は、非改変型の微生物に比べてＳｉｇＥ活性が低減するように改変されうる。ＳｉｇＥは、ｓｐｏＩＩＧＢ遺伝子によりコードされる遺伝子産物である。ＳｉｇＥ活性の低減は、ｓｐｏＩＩＧＢ発現の欠如、ｓｐｏＩＩＧＡがコードするプロテアーゼの発現の減少または欠如、他の上流の調節遺伝子もしくはタンパク質の発現の減少または欠如などによって引き起こされうる。好ましくは微生物の改変は、ＳｉｇＥ活性の低減を引き起こす突然変異を含む。さらに好ましくは突然変異が、ｓｐｏＩＩＧＡ、ｓｐｏＩＩＧＢ、ｓｐｏＩＩＲおよびｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子に作用する。
【００１３】
Ｂ．スブチリスパントテネート過剰産生株において構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの使用によりｓｐｏ０Ａ遺伝子の発現を増加させることによって、パントテネートの産生がさらに増加することが、さらに見出された。この株は依然として胞子を形成することから、ｓｉｇＥ突然変異の導入の結果としてｓｐｏ０Ａ過剰産生親株に比べ同様の量のパントテネートを産生し胞子を形成しないＢ．スブチリスがもたらされるであろう。したがって本発明の好ましい態様において、高いｓｐｏ０Ａ〜Ｐレベルと共に低減したＳｉｇＥ活性を有する微生物は、胞子を形成せずにより多くのパントテネートを産生できる。
【００１４】
本発明の別の態様において微生物は、非改変型の微生物に比べてＳｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢの両方の活性が低減するように微生物は改変されうる。Ｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢは、それぞれｓｐｏ０ＡおよびａｂｒＢ遺伝子によりコードされる遺伝子産物である。Ｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢ活性の低減は、遺伝子発現の欠如、シグナル（栄養シグナル、代謝シグナル、ＤＮＡ状態シグナル、細胞密度［フェロモンおよび菌体密度感知分子］シグナルおよび細胞周期シグナル）の減少または欠如、他の上流の調節遺伝子もしくはタンパク質の発現の減少または欠如などによって起こりうる。好ましくは微生物の改変は、Ｓｐｏ０Ａ／ＡｂｒＢ活性の低減を引き起こす突然変異を含む。さらに好ましくは突然変異は、ａｂｒＢ、ｋａｐＢ、ｋｂａＡ、ｋｉｎＡ、ｋｉｎＢ、ｋｉｎＣ、ｋｉｎＤ、ｋｉｎＥ、ｋｉｐＡ、ｋｉｐＩ、ｏｂｇ、ｐｈｒＣ、ｐｈｒＥ、ｒａｐＡ、ｒａｐＢ、ｒａｐＥ、ｓｃｏＣ、ｓｉｇＨ、ｓｉｎＲ、ｓｉｎＩ、ｓｐｏ０Ａ、ｓｐｏ０Ｂ、ｓｐｏ０Ｅ、ｓｐｏ０Ｆ、ｓｐｏ０ＪＡおよびｓｐｏ０ＪＢ遺伝子からなる群より選択される一つ、二つまたはそれを超える遺伝子に作用する。
【００１５】
微生物は真核生物または原核生物でありうる。好ましくは微生物は、原核生物である。原核微生物は、グラム陽性またはグラム陰性でありうる。グラム陽性微生物には、バチルス属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococci）属およびストレプトミセス（Streptomyces）属の一つに属する微生物があるが、それに限定されるわけではない。好ましくは微生物は、バチルス属に属する。その例は、バチルス  リケニフォルミス、バチルス  アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス  スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス  プンティス（Bacillus puntis）、バチルス  ハロヅランス（Bacillus halodurans）などである。最も好ましくは微生物は、バチルス  スブチリスである。本発明の微生物に対応する野生型形態は、胞子形成微生物である。
【００１６】
「パントテネート化合物」は、好ましくはパントテネートである。パントテネート化合物にはさらに、パントイン酸塩、α−ケトパントイン酸塩、α−ケトイソ吉草酸塩などのようなパントテネート生合成の生合成経路における中間体化合物がある。
【００１７】
本発明は、ｓｉｇＥ遺伝子産物（ＳｉｇＥタンパク質）の機能低下を招く、微生物遺伝子に対する任意の突然変異を包含する。当業者に公知の胞子形成アッセイでＳｉｇＥの機能をアッセイできる。本発明の微生物は、ｓｐｏＩＩＧＢ（ｓｉｇＥ）遺伝子に突然変異を有する結果として機能的ｓｉｇＥ遺伝子産物の発現の不在または減少をもたらすおそれがある。本発明は、ｓｐｏＩＩＧＢ（ｓｉｇＥ）を活性化させることが公知である遺伝子における任意の突然変異をさらに包含する。これらには、ｓｐｏＩＩＧＡ、ｓｐｏＩＩＲ、およびｓｐｏＩＩＡＣ（ｓｉｇＦ）があるが、それに限定されるわけではない（ＨｅｌｍａｎｎおよびＭｏｒａｎ、２００２）。本発明の微生物は、ｓｐｏＩＩＧＡ遺伝子に突然変異を有する結果として機能的ｓｐｏＩＩＧＡ遺伝子産物の発現の不在または減少をもたらすおそれがある。本発明の微生物は、ｓｐｏＩＩＲ遺伝子に突然変異を有する結果、機能的ｓｐｏＩＩＲ遺伝子産物の発現の不在または減少が生じているおそれがある。本発明の微生物は、ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子に突然変異を有する結果として機能的ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子産物の発現の不在または減少がをたらすおそれがある。
【００１８】
「発現」という用語は、核酸配列の転写および／またはその後の転写された配列からアミノ酸配列への翻訳を表す。核酸の発現減少は、例えば遺伝子の欠失により；リーディングフレームのフレームシフトの形成または停止コドンの導入による翻訳の成熟前停止を介した、コードされたタンパク質の活性を不活性化または減少させるヌクレオチド付加またはヌクレオチド除去により；プロモーター、リボソーム結合部位、および本明細書において記載される他の手法のような調節配列を改変することにより、遺伝子に突然変異を導入することによって達成されうる。
【００１９】
「突然変異」は、遺伝子配列における欠失、置換または付加でありうる。突然変異は、破壊、フレームシフト突然変異、またはナンセンス突然変異でありうる。突然変異は、遺伝子の配列全体またはその一部に作用する破壊でありうる。突然変異は、遺伝子のコード配列または非コード配列、例えばプロモーターに作用しうる。突然変異は、遺伝子の転写の完全な欠如または翻訳の成熟前停止を招きうる。同様に突然変異は、先行（または「上流の」）遺伝子に位置し、極性と称する過程により隣接（または「下流の」）遺伝子（類）の転写を破壊しうる。または突然変異は、翻訳後のタンパク質が野生型タンパク質に比べてタンパク質を非機能性にする突然変異を保有するという作用を有しうる。
【００２０】
遺伝子に適当な突然変異を導入する方法は当業者に公知である。これらの方法には、細菌染色体への点突然変異の導入（CuttingおよびVander Horn、1990）、染色体ＤＮＡセグメントの除去およびそのセグメントから抗生物質耐性遺伝子への交換（Perego、1993）、トランスポゾンＴｎ９１７もしくはミニＴｎ１０（Youngman、1990; Petitら、1990）のような転移因子またはｐＭＵＴＩＮのようなプラスミド（Vagnerら、1998）の直接挿入があるが、それに限定されるわけではない。
【００２１】
好ましくは、ｓｉｇＥ遺伝子産物の機能の低減を有する胞子形成欠損微生物は、ｓｐｏ０Ａを過剰発現でき、さらに好ましくはその微生物は、ｓｐｏ０Ａを過剰発現する。ｓｐｏ０Ａの過剰発現は、本明細書に記載されるように達成されうる。
【００２２】
遺伝子の発現増加または過剰発現は、多様な方法で達成されうる。一つまたは複数の遺伝子を過剰発現する微生物を得る一つの取り組みは、例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは多数のプロモーターを追加することによって、または発現が構成的になるように調節配列を除去することによって、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列もしくは部位を変更または改変することである。さらなる手技について以下に記載する。
【００２３】
「プロモーター」は、遺伝子の転写開始の上流にあるＤＮＡ配列であり、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他のタンパク質の認識ならびに結合に関与して遺伝子の転写を開始させる。普通はプロモーターは、どのような条件で遺伝子が発現するかを決定している。
【００２４】
「誘導性プロモーター」は、遺伝子のｍＲＮＡ合成を特定の条件で一時的に開始させるものである。（ｉ）プロモーターは、レプレッサーまたはアクチベーターのような補助因子によって主に調節されうる。レプレッサーは、プロモーター活性を抑制する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。転写は、プロモーターのオペレーターにレプレッサーが結合するのを阻害する誘導因子の存在下でこのプロモーターから開始できる。グラム陽性微生物由来のそのようなプロモーターの例には、ｇｎｔ（グルコン酸オペロンプロモーター）；バチルスリケニフォルミス由来ｐｅｎＰ；ｇｌｎＡ（グルタミンシンテターゼ）；ｘｙｌＡＢ（キシロースオペロン）；ａｒａＡＢＤ（Ｌ−アラビノースオペロン）およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド［ＩＰＴＧ］のような誘導因子によって制御できるハイブリッドＳＰＯ１／ｌａｃプロモーターであるＰｓｐａｃプロモーター（YansuraおよびHenner、1984）があるが、それに限定されるわけではない。アクチベーターもプロモーター活性を誘導する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。グラム陽性微生物由来のそのようなプロモーターの例には、二成分系（ＰｈｏＰ−ＰｈｏＲ、ＤｅｇＵ−ＤｅｇＳ、ｓｐｏ０Ａ−リン酸リレー）、ＬｅｖＲ、ＭｒｙおよびＧｌｔＣがあるが、それに限定されるわけではない。（ii）二次シグマ因子の産生は、特異的プロモーターからの転写を主に担っている可能性がある。グラム陽性微生物からの例には、胞子形成特異的シグマ因子であるσＦ、σＥ、σＧおよびσＫならびに一般ストレスシグマ因子σＢにより活性化されるプロモーターがあるが、それに限定されるわけではない。σＢ介在性応答は、エネルギー制限および環境ストレスによって誘導される（HeckerおよびVolker、1998）。（iii）減衰および抗転写終結も転写を調節する。グラム陽性微生物からの例には、ｔｒｐオペロンおよびｓａｃＢ遺伝子があるが、それに限定されるわけではない。（iv）発現ベクターにおいて調節されている他のプロモーターは、ファージΦ１０５（Osbourneら、1985）からの温度感受性免疫レプレッサーおよびスクロース誘導性を付与するｓａｃＲ調節系（KlierおよびRapoport、1988）に基づいている。
【００２５】
「構成的」プロモーターは、事実上全ての環境条件で遺伝子が発現することを可能にするもの、すなわち一定の非特異的遺伝子発現を指令するプロモーターである。「強力な構成的プロモーター」は、天然宿主細胞に比べて高頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。強力な構成的プロモーターは、周知であり、宿主細胞において制御すべき特異的配列により適当なものを選択できる。グラム陽性微生物由来のそのような強力な構成的プロモーターの例には、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター）、およびａｍｙＥがあるが、それに限定されるわけではない。グラム陰性微生物由来のプロモーターの例にはｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰR、およびλ−ＰLがあるが、それに限定されるわけではない。
【００２６】
本発明は、ｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢの両方の機能の低減を招く、一つまたは複数の遺伝子に対する任意の突然変異をさらに包含する。γ−グルタミルトランスペプチダーゼに対する酵素アッセイ（XuおよびStrauch、1996）および当業者に公知のマイクロアレイ法でｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢの機能をアッセイできる。さらに、胞子形成アッセイでｓｐｏ０Ａの機能をアッセイでき、ＡｂｒＢ調節性プロモーター（ｓｐｏ０ＶＧ、ｔｙｃＡ、ａｂｒＢなど）に融合したｌａｃＺレポーター遺伝子でＡｂｒＢの機能をアッセイできる。微生物は、ｓｐｏ０Ａ遺伝子に少なくとも一つの突然変異およびａｂｒＢ遺伝子に少なくとも一つの突然変異を有しうる。突然変異は、機能的ｓｐｏ０Ａ遺伝子産物の不在または発現減少および機能的ａｂｒＢ遺伝子産物の不在または発現減少を招く。
【００２７】
ｓｐｏ０Ａの機能低減を招く一つまたは複数の遺伝子に対する突然変異には、ｓｐｏ０Ａを活性化することが公知である遺伝子に対する突然変異がある。これらにはｓｐｏ０Ｂ、ｓｐｏ０Ｆ、ｋｉｎＡ、ｋｉｎＢ、ｋｉｎＣ、ｋｉｎＤ、ｋｉｎＥおよびｓｉｇＨがあるが、それに限定されるわけではない。本発明の微生物は、ｓｐｏ０Ｂにおける突然変異を有する結果として機能的ｓｐｏ０Ｂ遺伝子産物の不在または発現減少をもたらしうる。本発明の微生物は、ｓｐｏ０Ｆにおける突然変異を有する結果として機能的ｓｐｏ０Ｆ遺伝子産物の不在または発現減少をもたらしうる。
【００２８】
本発明の具体的な態様において、ＳｉｇＥ機能の低減を招く突然変異ならびにｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢの両方の機能の低減を招く突然変異を組み合わせてもよい。したがって、本明細書において記載する様々な突然変異および改変の好ましい態様を組み合わせてもよい。これは以下に記載する方法に準用してあてはまる。
【００２９】
本発明の微生物は、適当な条件でパントテネート化合物を過剰発現できる。本明細書に使用する「パントテネート化合物を過剰発現する」という用語は、本発明の微生物によるパントテネート化合物の産生が前記微生物の野生型形態に比べ有意に増加していることを指す。好ましくはパントテネートの過剰産生は、培養液１リットルあたりパントテネート少なくとも５０mg、１００mg、２００mg、５００mg、１ｇ、３ｇ、５ｇまたは１０ｇの産生を意味する。
【００３０】
一態様において本発明の微生物集団は、実施例２に記載するような条件で培養した場合に培養液１リットルあたりパントテネートを少なくとも１００mg、好ましくは少なくとも１２５mg、さらに好ましくは少なくとも１４０mg、さらに好ましくは少なくとも２００mg、なおさらに好ましくは少なくとも３００mg、いっそうさらに好ましくは少なくとも４００mg、最も好ましくは少なくとも５００mg産生する。この実施例において最少培地で培養することが記載されている。または本発明の微生物集団は、実施例４または５に記載するような条件で培養した場合に培養液１リットルあたりパントテネートを少なくとも１００mg、好ましくは少なくとも１２５mg、さらに好ましくは少なくとも１４０mg、さらに好ましくは少なくとも２００mg、なおさらに好ましくは少なくとも３００mg、いっそうさらに好ましくは少なくとも４００mg、最も好ましくは少なくとも５００mg産生しうる。
【００３１】
別の局面において本発明の微生物集団は、実施例３に記載するような条件で培養した場合に培養液１リットルあたりパントテネートを少なくとも５ｇ、好ましくは少なくとも７．５ｇ、最も好ましくは少なくとも１０ｇ産生する。この実施例は、流加培養による発酵を記載している。
【００３２】
本発明の胞子形成欠損微生物によるパントテネートの産生レベルは、対照細胞によるパントテネート産生レベルに匹敵する。したがって、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、同一の条件で培養した場合に胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の５０％を超え、好ましくは７５％を超え、さらに好ましくは１００％を超えうる。実施例２に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の５０％を超え、好ましくは７５％を超えることが好ましい。実施例３に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の５０％を超え、好ましくは７５％を超え、最も好ましくは１００％を超えることが好ましい。実施例４に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の５０％を超え、好ましくは７５％を超え、最も好ましくは１００％を超えることが好ましい。実施例５に記載する条件で培養した場合、本発明の微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量は、胞子形成を欠損していない対応する微生物集団により産生されるパントテネート化合物の量の５０％を超え、好ましくは７５％を超え、最も好ましくは１００％を超えることが好ましい。
【００３３】
「胞子形成を欠損していない対応する微生物」は、好ましくは低減したＳｉｇＥ機能または低減したｓｐｏ０ＡおよびＡｒｂＢ機能を示すように改変されていない微生物である。例えば本発明の微生物がｓｐｏＩＩＧＡ遺伝子に突然変異を有するならば、胞子形成を欠損していない対応する微生物は、ｓｐｏＩＩＧＡ遺伝子に突然変異を有さない以外は実質的に同一の微生物である。同じことが他の遺伝子の突然変異にもあてはまる。
【００３４】
様々な方法でパントテネート化合物の過剰産生を達成できる。パントテネートを過剰産生するバチリススブチリス株の調製方法は、例えばＷＯ０１／２１７７２、ＷＯ０２／０５７４７４、およびＷＯ０２／０６１１０８に記載されている。パントテネート過剰産生微生物を得る一つの取り組みは、パントテネート生合成経路に関与する一つまたは複数の遺伝子を過剰発現させることである。「過剰発現した」または「過剰発現」という用語は、微生物の改変前に、または改変されていない比較できる微生物において発現したレベルよりも高レベルでの遺伝子産物の発現を含む。一態様において本発明の微生物は、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｇｌｙＡ、およびｓｅｒＡ、ｙｌｍＡならびにグリシン開裂経路に関与するｇｃｖ遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の遺伝子を過剰発現する。
【００３５】
遺伝子の脱調節および／または少なくとも一つの遺伝子の過剰発現を含めるがそれに限定されるわけではない本明細書に記載する任意の方法により、微生物における遺伝子の過剰発現を実施できる。一態様において、微生物を遺伝子操作、例えば遺伝子工学により加工して、微生物の改変前に、または改変されていない比較できる微生物において発現したレベルよりも大きなレベルの遺伝子産物を過剰発現させることができる。遺伝子操作には、例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは多数のプロモーターを付加することによって、または発現が構成的となるように調節配列を除去することによって、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列もしくは部位を改変または修飾すること、染色体での特定遺伝子の位置を改変すること、リボソーム結合部位または転写終結因子のような特定遺伝子に隣接する核酸配列を変更すること、特定遺伝子のコピー数を増加させること、特定遺伝子の転写および／または特定遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質、例えば調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなどを改変すること、あるいは当技術分野で慣例である、（例えばレプレッサータンパク質の発現を遮断するアンチセンス核酸分子を含めるがそれに限定されるわけではない）特定遺伝子の発現を脱調節する他の任意の通常の手段がありうるが、それに限定されるわけではない。適当なプロモーターの例は、Ｐｖｅｇ、Ｐ15およびＰ26であるが、それに限定されるわけではない（Lee et al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180:57-65およびMoran et al., 1982, Mol. Gen. Genet. 186:339-46。
【００３６】
別の態様において、微生物の操作前に、または操作されていない比較できる微生物において発現したレベルよりも大きいレベルの遺伝子産物を過剰発現するように微生物を物理的または環境的に操作できる。例えば、転写および／もしくは翻訳が増大または増加するように特定遺伝子の転写および／または特定遺伝子産物の翻訳を増加させることが公知であるか、そう推測される薬剤で微生物を処置でき、あるいはその薬剤の存在下で微生物を培養できる。または、転写および／または翻訳が増大または増加するように特定遺伝子の転写および／または特定遺伝子産物の翻訳を増加させるために、選択した温度で微生物を培養できる。
【００３７】
「脱調節された」または「脱調節」という用語は、微生物における遺伝子産物のレベルまたは活性が変更または改変されるような、その微生物における少なくとも一つの遺伝子の改変の変更を含む。好ましくは少なくとも一つの遺伝子は、遺伝子産物が増大または増加するように変更または改変される。
【００３８】
本発明はさらに、パントテネート化合物を過剰産生できる胞子形成欠損微生物を調製するための方法に関するものである。ＳｉｇＥの機能を調節する遺伝子における突然変異および場合によりｓｐｏ０Ａの機能の増加を含むように、パントテネート化合物を過剰産生できる微生物を改変できる。本態様によれば、その方法は、
（ａ）パントテネート化合物を過剰産生できる微生物を提供する工程、
（ｂ）場合により微生物にＤＮＡ配列（例えばプロモーター）またはｓｐｏ０Ａの機能の増加を引き起こす突然変異を導入する工程、および
（ｃ）胞子形成欠損微生物が得られるように工程（ａ）または（ｂ）の微生物にＳｉｇＥの機能の低減を引き起こす突然変異を導入する工程
を含む。
【００３９】
工程（ｂ）および（ｃ）の順序を入れ替えてもよい。
【００４０】
またはその方法は、
（ａ）パントテネート化合物を過剰産生できる微生物を提供する工程、および
（ｂ）胞子形成欠損微生物が得られるように工程（ａ）の微生物にｓｐｏ０Ａの機能の低減およびＡｒｂＢの機能の低減を引き起こす突然変異を導入する工程
を含みうる。
【００４１】
別の態様において、パントテネート化合物の過剰産生をもたらす突然変異の実施前にｓｉｇＥ遺伝子の突然変異またはｓｐｏ０Ａ遺伝子およびａｒｂＢ遺伝子の突然変異を導入してもよい。本態様によれば、その方法は、
（ａ）パントテネート化合物を過剰産生できない微生物を提供する工程、
（ｂ）胞子形成欠損微生物が得られるように、工程（ａ）の微生物にＳｉｇＥ活性の低減を引き起こす突然変異を導入、または工程（ａ）の微生物にｓｐｏ０Ａ活性の低減およびＡｂｒＢ活性の低減を引き起こす突然変異を導入する工程、ならびに
（ｃ）パントテネート化合物を過剰産生できるように工程（ｂ）で得られた胞子形成欠損微生物を改変する工程
を含む。
【００４２】
本発明の工程（ｂ）においてＳｉｇＥ活性の低減を引き起こす突然変異が導入されるならば、本方法は、工程（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の微生物に、Ｓｐｏ０Ａ機能の増加を起こすＤＮＡ配列（例えばプロモーター）または突然変異を導入する任意選択の工程を含みうる。
【００４３】
本発明の別の局面は、（ａ）パントテネート化合物が産生される条件で本発明の微生物を培養する工程、および（ｂ）場合により細胞培養液からパントテネート化合物を回収する工程を含む、パントテネート化合物を製造するための方法である。
【００４４】
本発明の方法は、パントテネート化合物が産生される条件で改変微生物を培養する工程を含む。「培養する」という用語は、本発明の生きた微生物を維持および／または増殖させることを含む。一態様において、液体培地で本発明の微生物を培養する。別の態様において、固体培地または半固体培地で微生物を培養する。好ましくは微生物の維持および／もしくは増殖に必須または有益な栄養素を含む液体培地で本発明の微生物を培養する。そのような栄養素には、例えば豆粉もしくは穀物粉、デンプン、糖、糖アルコール、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸およびアルコールのような複合糖質である炭素源または炭素基質；例えば穀物、豆、および塊茎由来の植物性タンパク質；ペプトン、ペプチドおよびアミノ酸、ならびに肉と、乳と、ペプトン、肉エキスおよびカゼイン加水分解物のような動物副産物とのような動物源由来のタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸；尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムのような無機窒素源；例えばリン酸、そのナトリウム塩およびカリウム塩であるリン源；例えばマグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデンおよび／またはコバルト塩である微量元素；のみならずアミノ酸、ビタミン、増殖促進剤などのような増殖因子があるが、それに限定されるわけではない。
【００４５】
微生物は制御されたpHで好ましくは培養される。一態様において、pH６．０から８．５の間で、さらに好ましくは約７のpHで微生物を培養する。当業者に公知の任意の方法により所望のpHを維持できる。
【００４６】
好ましくは、制御された通気および制御された温度で微生物をさらに培養する。一態様において制御された温度は、１５から７０℃の間を含み、好ましくは温度は２０から５５℃の間、さらに好ましくは３０から４５℃の間または３０から５０℃の間である。
【００４７】
液体培地で連続的または間欠的のどちらかで、静置培養、試験管培養、振盪培養、通気撹拌培養または発酵のような通常の培養法により微生物を培養できる。好ましくは、発酵装置で微生物を培養する。本発明の発酵法には、回分培養法、流加培養法および連続培養法の発酵がある。そのような多様なプロセスが開発され、当技術分野で周知である。
【００４８】
所望の量のパントテネート化合物を製造するのに十分な時間だけ培養を普通は継続する。
【００４９】
本発明の別の局面において本方法は、パントテネート化合物を回収する工程をさらに含む。「回収する」という用語は、培養液から化合物を単離、抽出、採取、分離または精製することを含む。通常の樹脂を用いた処理、通常の吸着剤を用いた処理、pHの変更、溶媒抽出、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥などを含めるが、それに限定されるわけではない当技術分野で公知の任意の通常の単離または精製法により化合物の単離を実施できる。例えば、まず培養物から微生物を除去することによって培養液からパントテネート化合物を回収できる。次に培養液に陽イオン交換樹脂内または樹脂上を通過させ、望ましくない陽イオンを除去し、次に陰イオン交換樹脂内または樹脂上を通過させて、望ましくない無機陰イオンと、関心対象の化合物、例えばパントテネートよりも強い酸性度を有する有機酸とを除去する。結果としてもたらされたパントテネートを次に本明細書に記載するように塩に転換できる。
【００５０】
化合物は、通常は結果としてもたらされる調製物が実質的に他の化合物を有さない場合に「単離」されている。一態様において調製物は、所望の化合物の純度が（乾燥重量で）約８０％を超え（例えば培地、成分または発酵副産物全てが約２０％未満）、さらに好ましくは約９０％を超える、なおさらに好ましくは約９５％を超える、かつ最も好ましくは約９８〜９９％の超える所望の化合物の純度を有する。
【００５１】
別の態様において所望の化合物は、微生物からも培養物からも精製されない。産物の供給源として培養物または培養上清全体を使用できる。具体的な態様において培養物または培養上清は、修飾なしに使用される。さらなる実施形態において、培養物または培養上清は濃縮、乾燥および／または凍結乾燥される。
【００５２】
本明細書に記載する本発明の様々な態様を相互に組み合わせてもよい。
【００５３】
以下の非限定的な実施例が、本発明をさらに例示する。
【００５４】
実施例
一般的な方法
株とプラスミド。本発明のバチルス  スブチリス株は、Ｂ．スブチリス菌１６８（ｔｒｐＣ２）の原栄養誘導体である１Ａ７４７株（Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、Ohio 43210、米国）から得られた。プラスミドｐＣ１９４（GeneBank M19465、Cat#1E17 Bacillus Genetic Stock Center、オハイオ州立大学、コロンバス、Ohio 43210、米国）からクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）カセットを得た。ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］：：［ｐＲＦ９３］由来ＳＰＯ１−１５プロモーター（Perkins et al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22:8-18）を含むプラスミドｐＸ１２（Humbelin et al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22:1-7）の誘導体であるプラスミドｐＸ１２３ｒｏＤＴＤ−ＳＰＯ１−１５から、Ｂ．スブチリスバクテリオファージＳＰＯ１のＰ15プロモーター（Lee et al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180:57-65）を得た。ＳＷＶ２１５株［ｔｒｐＣ２  ｐｈｅＡ１  ｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎ］（Xu and Strauch, 1996, J. Bacteriol. 178:4319-4322）、ＢＨＩ株［ｔｒｐＣ２  ｐｈｅＡｌ  ｓｐｏ０ＨΔＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ：：ｃａｔ］（参考文献Healy et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:477-487においてＢＨＩはＢＨ１００の誘導体である）、６５０株［ｔｒｐＣ２  ｉｌｖＢ２  ｌｅｕＢ１６  ｓｐｏＩＩＡＡＢＣ：：ｃａｔ］（Pragai et al., 2004, J Bacteriol. 186:1182-1190）、７３１株［trpC2 spoIIIG::ermC］（Partridge and Errington, 1993, Mol. Microbiol. 8:945-955）、および９０１株［ｔｒｐＣ２  ｓｐｏＩＩＧＡ：：ａｐｈＡ−３］（Wu and Errington, 1994, Science 264:572-575）から胞子形成遺伝子における突然変異体を得た。ＳＷＶ１１９株［ｔｒｐＣ２  ｐｈｅＡ１  ａｂｒＢ：：ｔｅｔ］（Xu and Strauch、1996）からａｂｒＢ遺伝子における突然変異体を得た。ｓｐｏ０Ａ遺伝子の過剰発現のために、ＡＨ１７６３株［trpC2 metC3 spo0A::neo amyE::Pspac spo0A(cat)］（Henriques, A、個人的な情報交換）からＰｓｐａｃｓｐｏ０Ａ融合体を得た。
【００５５】
培地。Ｂ．スブチリス用の標準最少培地は１×Spizizen塩類、０．０４％グルタミン酸ナトリウム、および０．５％グルコースを含有する。標準固体完全培地は、トリプトン血液寒天培地（ＴＢＡＢ、Difco）である。標準液体完全培地は、子ウシインフュージョン−酵母エキス培地（ＶＹ）である。これらの培地の組成を以下に記載する：
ＴＢＡＢ培地：Difcoトリプトン血液寒天培養基剤（カタログ＃０２３２）３３ｇ、水１Ｌ。オートクレーブ滅菌。
ＶＹ培地：Difco子ウシインフュージョン培地（カタログ＃０３４４）２５ｇ、Difco酵母エキス（カタログ＃０１２７）５ｇ、水１Ｌ。オートクレーブ滅菌。
最少培地（ＭＭ）：１０×Spizizen塩類１００ml；５０％グルコース１０ml；４０％グルタミン酸ナトリウム１ml、水で全量１Ｌとする。
１０×Spizizen塩類：Ｋ2ＨＰＯ4１４０ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4２０ｇ；ＫＨ2ＰＯ4６０ｇ；クエン酸Ｎａ3・２Ｈ2Ｏを１０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを２ｇ；水で全量１Ｌとする。
Ｐ培地：１０×ＰＡＭ１００ml；１０×Spizizen塩類１００ml；５０％グルコース１０ml；滅菌蒸留水７９０ml。
Ｐ寒天培地：１０×ＰＡＭ１００ml；１０×Spizizen塩類１００ml；５０％グルコース１０ml；寒天１５ｇを含有する滅菌蒸留水７９０ml。
１０×パントテネートアッセイ培地（１０×ＰＡＭ）：Difcoパントテネートアッセイ培地（カタログ＃２６０４１０）７３ｇ、水１Ｌ。オートクレーブ滅菌。
１０×ＶＦＢ最少培地（１０×ＶＦＢ  ＭＭ）：グルタミン酸Ｎａ２．５ｇ；ＫＨ2ＰＯ4１５．７ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4１５．７ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２７．４ｇ；ＮＨ4Ｃｌを４０ｇ；クエン酸１ｇ；（ＮＨ４）2ＳＯ4６８ｇ；水で全量１Ｌとする。
微量元素溶液：ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏを１．４ｇ；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏを０．４ｇ；（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏを０．１５ｇ；ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏを０．１ｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏを０．０７５ｇ；水で全量２００mlとする。
Ｆｅ溶液：ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏを０．２１ｇ；水で全量１０mlとする。
ＣａＣｌ2溶液：ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを１５．６ｇ；水で全量５００mlとする。
Ｍｇ／Ｚｎ溶液：ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを１００ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．４ｇ；水で全量２００mlとする。
ＶＦＢ  ＭＭ培地：１０×ＶＦＢ  ＭＭ１００ml；５０％グルコース１０ml；微量元素溶液２ml；Ｆｅ溶液２ml；ＣａＣｌ2溶液２ml；Ｍｇ／Ｚｎ溶液２ml；滅菌蒸留水８８２ml。
ＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地：１０×ＶＦＢ  ＭＭ１００ml；０．５Ｍトリス（pH６．８）１００ml；５０％グルコース４４ml；微量元素溶液２ml；Ｆｅ溶液２ml；ＣａＣｌ2溶液２ml；Ｍｇ／Ｚｎ溶液２ml；滅菌蒸留水７４８ml。
ＶＦ発酵回分培養用培地：所定の位置で溶液を滅菌：グルタミン酸ナトリウム０．７５ｇ；ＫＨ2ＰＯ4４．７１ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4４．７１ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを８．２３ｇ；ＮＨ4Ｃｌを０．２３ｇ；（ＮＨ4）2ＳＯ4１．４１ｇ；酵母エキス（Merck）１１．７７ｇ；Basildon消泡剤０．２ml；全量１Ｌ。
オートクレーブ後の溶液を発酵装置に入れる：グルコース・Ｈ2Ｏを２７．３ｇ；全量１Ｌ。
フィルターろ過滅菌した溶液を発酵装置に入れる：微量元素溶液２ml；ＣａＣｌ2溶液２ml；Ｍｇ／Ｚｎ溶液２ml；Ｆｅ溶液２ml；全量１Ｌ。
ＶＦ発酵流加用培地：グルコース・Ｈ2Ｏを６６０ｇ；全量１Ｌ。オートクレーブ滅菌。ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを２ｇ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏを１４．６mg；ＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏを４mg；全量１Ｌ（オートクレーブ滅菌）を加える。
【００５６】
パントテネートアッセイ。三つの生物学的方法と一つの物理学的（ＨＰＬＣ）方法でパントテネートをアッセイした：
生物学的アッセイＩ−平板バイオアッセイ：  公知の方法を使用したサルモネラチフムリウム（Salmonella typhimurium）由来の指示株を用いてパントテネートを寒天平板でアッセイした。ＤＭ３（ｐａｎＣ３５５）株（D. Downs、ウィスコンシン大学マジソン校、マジソン、ウィスコンシン州、米国）は、パントテネートに対してのみ応答する。標準的なペトリ皿にボトム寒天（bottom agar）として使用したＰ寒天培地２０mlの上に細胞１０7個／mlのＳ．チフムリウムＤＭ３（ｐａｎＣ３５５）指示株および４０μg／mlの２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Fluka；カタログ＃９３１４０）を含有するＰ寒天培地１０mlを重層した。滅菌ピペットチップを使用してＴＢＡＢ寒天上に増殖した単一コロニーからバイオアッセイ用Ｐ寒天平板に細菌を移した。３７℃で一晩インキュベートした後に、約１０mg／ｌを超えるＰａｎを産生したＢ．スブチリスコロニー周囲にＳ．チフムリウムＤＭ３の観察できる紫色のハロー（halo）が形成した。ハローのサイズはＢ．スブチリス株によるＰａｎ産生と相関した。
生物学的アッセイＩＩ−試験管バイオアッセイ：試験管培養物を使用して液体状態でパントテネートをアッセイした。Ｂ．スブチリス培養物をアッセイするために、上清をろ過滅菌し、試験管に１×パントテネートアッセイ培地（ＰＡＭ）で希釈液を調製した。希釈液の総体積を５．０mlとした。これらの希釈液を入れた試験管にＤＭ３指示株保存液を（１×ＰＡＭで）２００倍に希釈したもの０．１mlを加えた。次にローラドラム型振盪装置で３７℃で１８〜２４時間試験管を培養した。６００nmで濁度の読み取りを行い（ＯＤ600）、既知量のパントテネートの標準曲線と比較した。具体的には、基準パントテネートを０．８、４、２０、５０、および１００μg／ｌのレベルに希釈し、各希釈液に上記のように調製した指示株を加え、３７℃で１８〜２４時間後（未知試料と同じインキュベーション時間）に濁度を測定することによって標準曲線を調製した。対数回帰式を作るために標準曲線の直線部分を使用した。次にこの式を使用して希釈した試料のＯＤ600値から未知試料中のパントテネート濃度を計算した。
生物学的アッセイＩＩＩ−９６穴マイクロタイタープレートバイオアッセイ：９６穴マイクロタイタープレート形式を使用した液体状態でもパントテネートをアッセイした。９６穴マイクロタイタープレートの各穴に細胞５．５×１０5個／mlのＳ．チフムリウムＤＭ３を含有するパントテネートアッセイ培地（ＰＡＭ）１８０μlを入れた。Ｂ．スブチリス培養物をアッセイするために、ろ過滅菌した培養上清６０μlを第１列、Ｂ〜Ｈ行の穴に加えた。混合後、試料６０μlを第２列の次の穴に移した。これらの４倍希釈工程を第１２列まで繰り返した。第１２列で試料を混合後、６０μlを捨て、このようにして各穴は試料１８０μlを含んでいた。接着フィルムをプレートにかぶせ、蒸発を避け、３００rpmで培養物を撹拌しながら３７℃で１７ｈインキュベートした。濁度の読み取りを６００nmで行い、既知量のパントテネート（Ｐａｎ）の標準曲線と比較した。Ｐａｎ標準液（１００mg／ml）６０μlを各マイクロタイタープレートの第１列Ａ行の穴に加えることによって標準曲線を調製した。未知試料について上に記載したように、希釈、インキュベーションおよびＰａｎ標準液の濁度の測定を行った。
ＨＰＬＣアッセイ：恒温機能付きオートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムを用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＬＵＮＡ  Ｃ８カラムで試料のクロマトグラフィーを実施した。カラム寸法は、１５０×４．６ｍｍ、粒子サイズは５ミクロンである。カラム温度を２０℃に一定に保った。移動相は、０．１％酢酸（Ａ）とメタノール（Ｂ）との混液である。１５分間で１％Ｂから４５％Ｂへの勾配溶出を適用する。流速は１ml／minである。２２０nmでのＵＶ吸収からパントテネートをモニターした。パントテネートは約９．６分に溶出する。この方法のキャリブレーション範囲は、パントテネート１〜１００mg／ｌである。
【００５７】
分子的手法および遺伝的手法。標準的な遺伝的手法および分子生物学的手法は、当技術分野において一般的に公知であり、以前に記載されている。ＤＮＡ形質転換、ＰＢＳ１普遍形質導入、および他の標準的なＢ．スブチリスの遺伝的手法も当技術分野で一般的に公知であり、以前に記載されている（HarwoodおよびCutting、1992）。
【００５８】
胞子形成アッセイ。Ｂ．スブチリス培養物から試料１mlを採取し滅菌蒸留水で１０倍希釈系列を調製した。８０℃で２０分間熱処理後にＴＢＡＢ寒天平板に入れ、３７℃で２０ｈインキュベートしてから、オリジナルの培養物１ml中の「熱耐性」コロニー形成単位（cfu）の数を決定した。熱耐性胞子の力価（cfu／ml）を熱処理前の細菌細胞の力価（cfu／ml）で割ることによって胞子形成頻度を計算した。
【００５９】
発酵。グルコース／塩溶液を含むＶＦ発酵回分培養用培地１．４リットルを初めに含む撹拌発酵槽、例えばBIOFLO 3000 New Brunswickの２リットル容器でパントテネート産生株を増殖させた。NBS Biocommand 32市販ソフトウェア（New Brunswick Scientific Co., Inc.、エジソン、ニュージャージー州、米国）でコンピュータ制御を行った；データ収集およびグルコース流加の制御にLucullusソフトウェア（Biospektra AG、シュリーレン、スイス）を使用した。
【００６０】
発酵用の植菌を調製するために、二回の種培養プロトコルを使用した。第一の種は、１０ｇ／リットルのソルビトールを含有するＶＹ培地２５mlに凍結細菌保存培養液５０μlを植菌し、培養物を３７℃で６時間増殖させることからなる。次に、１０ｇ／リットルのソルビトールを含有するＶＹ発酵回分培養用培地６０ml（グルコースなし）に植菌するために１ＯＤの細胞を使用し、この第二の種を３７℃で８〜１２時間増殖させた。この第二の種を発酵容器に植菌するために使用し、植菌の量は通常、初発培地体積の４〜５％である。細菌をＶＹ培地で対数増殖後期（ＯＤ600＝０．８〜１．０）まで増殖させ、滅菌グリセロールを終濃度２０％まで添加し、次に１mlずつにした試料をドライアイスで凍結させ、凍結した細菌を−８０℃で貯蔵することによって凍結細菌保存液を調製した。
【００６１】
発酵の際に、水酸化アンモニウム溶液（２８％水溶液）を自動的に添加することでリアクター中のpHを６．８の一定に保った。発酵温度を３９℃とした。撹拌装置を自動的に（４００rpmから１０００rpmの範囲で）工程調節し、手動で通気速度を１〜２ｖｖｍに維持することによって溶存酸素（ｐＯ2）の最低濃度１５％を達成した。消泡剤（Basildon）を随時手動で加えた。
【００６２】
発酵は回分培養プロセスでありえるが、好ましくは糖質が制限された流加培養プロセスである。したがって、通常はプロセス時間６〜８時間後の状況である初発グルコースの消費後に規定のＶＦ発酵流加用溶液（上記参照）をリアクターに供給した。そのとき、１４ｇ／ｈの速度で流加用溶液の定常添加を開始した。
【００６３】
実施例１
本実施例は、Ｂ．スブチリスのパントテネート過剰産生株の構築について記述する。
【００６４】
Ｂ．スブチリス株ＰＡ１２
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、Ｂ．スブチリス原栄養菌株１Ａ７４７のｐａｎＢＣＤオペロンのプロモーター領域における欠失突然変異を発生させた。その突然変異ではｂｉｒＡとｐａｎＢの間の２１５ｂｐ長のヌクレオチド領域をスタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）（GeneBank M58515）由来のクロラムフェニコール耐性（ｃａｔ）カセットに交換した。これを行うために、ｐＢＲ３２２プラスミド（GeneBank J01749)のＮｈｅＩ部位とＣｌａＩ部位の間に、ｐａｎＢの転写方向と逆方向にｃａｔカセットをまず導入した。次に、二つのＰＣＲ断片の「アーム」を発生させた：製造業者（Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science）が説明するように４０mM  ｄＮＴＰを１μl、１０×緩衝液を５μlおよびＰＣＲ酵素（ＴａｑおよびＴｇｏ）を０．７５μlを含有する反応体積５０μlに溶かした１Ａ７４７染色体ＤＮＡ０．１μgに、プライマーｐａｎＢ／ｕｐ２／ｆｏｒ／Ｒ１およびｐａｎＢ／ｕｐ２／ｒｅｖ／ＣｌａＩまたはプライマーｐａｎＢ／ｄｏｗｎ２／ｆｏｒ／ＮｈｅＩおよびｐａｎＢ／ｄｏｗｎ２／ｒｅｖ／Ｂａｍ  （表１）の１００mM溶液０．２μlを加えた。アニーリング温度５８℃および伸長時間６０秒を使用して３０サイクルにわたりＰＣＲ反応を行った。結果としてもたらされたそれぞれＦ１およびＦ２と呼ぶ断片を精製し、それぞれ（Ｆ１では）ＥｃｏＲＩ部位とＣｌａＩ部位の間、および（Ｆ２では）ＮｈｅＩとＢａｍＨＩの間に連続的に挿入を行った。連結したＤＮＡを形質転換により大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen）に導入し、濃度１００μg／mlでアンピシリン耐性について選択を行った。この結果として大腸菌プラスミドｐＰＡ５がもたらされた。次に、ＤＮＡ形質転換によりＢ．スブチリス１Ａ７４７の染色体にΔｐａｎＢｐ：：ｃａｔ欠失カセットを導入し、５μg／mlクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含有するＴＢＡＢ寒天平板で標準条件を用いてクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）について選択を行った。ｐａｎＢプロモーター領域に欠失を含む単一Ｃｍｒコロニーを単離し、ＰＡ１（ΔｐａｎＢｐ：：ｃａｔ）と名付けた。予想どおりＰＡ１も最少培地での増殖にパントテネートを要求するパントテネート栄養要求株（Ｐａｎ-）であった。ｐａｎＢ／ｕｐ２／ｆｏｒ／Ｒ１プライマーおよびｐａｎＢ／ｄｏｗｎ２／ｒｅｖ／Ｂａｍプライマー（表１）を使用して、再び標準的な反応条件を用いた診断ＰＣＲで欠失突然変異を確認した。
【００６５】
【表１】
0004713469.tif 000002
【００６６】
次の工程は、ｐａｎＢ遺伝子上流に強力な構成的プロモーターを導入することであった。Ｂ．スブチリスのＳＰ０１バクテリオファージ由来のＰ15およびＰ26（Leeら、1980）を含めた任意の数のそのようなプロモーターが文献に記載されている。ｐａｎＢのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の上流にＰ15を含むＤＮＡ断片を発生させるためにロングフランキングホモロジーポリメラーゼ連鎖反応（ＬＦＨ−ＰＣＲ）を使用した。これを行うために二つのＰＣＲ断片である「アーム」をまず作製した：製造業者（Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science）が説明するように４０mM  ｄＮＴＰを１μl、１０×緩衝液を５μlおよびＰＣＲ酵素（ＴａｑおよびＴｇｏ）を０．７５μlを含有する反応体積５０μlに溶かした１Ａ７４７染色体ＤＮＡ０．１μgに、プライマーＰ１ｐａｎＢＣＤおよびＰ２ｐａｎＢＣＤまたはプライマーＰ３ｐａｎＢＣＤおよびＰ４ｐａｎＢＣＤ（表２）の１００mM溶液０．２μlを加えた。アニーリング温度５５．７℃および伸長時間４５秒を使用して３０サイクルにわたりＰＣＲ反応を行った。結果としてもたらされたそれぞれＦ３およびＦ４と呼ぶ断片を精製し、次に第二ラウンドのＰＣＲにおけるプライマーとして使用した。Ｆ３およびＦ４を５０倍に希釈し、それぞれ１μlを、反応体積５０μlに溶かした直鎖化したプラスミドｐＸ１２３ｒｏＤＴＤ−ＳＰＯ１−１５（Ｐ15プロモーターを含む）０．１μgに加えた。最初の１０サイクルにアニーリング温度６３℃および伸長時間６分を使用した。次の２０サイクルに伸長時間を１サイクル毎に２０秒間延長した。次に、結果としてもたらされた産物をテンプレートとして第三ラウンドのＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物を５０倍に希釈し、１μlを上記のようにｄＮＴＰ、緩衝液および酵素を含有する反応体積５０μlに溶かしたプライマーＰ１ｐａｎＢＣＤおよびＰ４ｐａｎＢＣＤの１００mM溶液０．２μlと混合した。ＰＣＲ反応のパラメーターは、第二ラウンドＰＣＲで使用したパラメーターと同一とした。次にＤＮＡ形質転換によりｐａｎＢプロモーター欠失株ＰＡ１に完成したＰＣＲ断片を導入し、標準条件を用いて最少培地寒天平板上でパントテネート原栄養性（Ｐａｎ＋）について選択した。これらのＰａｎ＋コロニーはクロラムフェニコール感受性（Ｃｍｓ）でもあり、プロモーターカセットの挿入を確認した。Ｐ15プロモーターから発現されたｐａｎＢＣＤオペロンを含む単一Ｐａｎ＋Ｃｍｓコロニー単離して、ＰＡ１２（Ｐ15ｐａｎＢＣＤ）と名付けた。再び標準的な反応条件を用いたＰ１５ｓｅｑプライマーおよびＰ４ｐａｎＢＣＤプライマー（表２）を使用した診断ＰＣＲによって、ｐａｎＢ遺伝子上流にＰ15プロモーターが存在することを確認した。振盪フラスコ培養においてＰＡ１２は、ＶＦＢ  ＭＭ培地で約１００mg／リットルのパントテネートを、ＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地で２５０mg／リットルのパントテネートを産生した（ＨＰＬＣ／ＭＳアッセイに基づく）が、１Ａ７４７対照は、１mg／リットル未満のパントテネートしか産生しなかった。ＶＦ培地および増殖条件を用いた標準的な流加培養による発酵では、ＰＡ１２は４８時間でおよそ１０〜１４ｇ／リットルのパントテネートを産生した。
【００６７】
【表２】
0004713469.tif 000003
【００６８】
Ｂ．スブチリスＰＡ４９株
ｐａｎＥ遺伝子上流に強力な構成的プロモーター（ｙｌｂＱ）も含む株を構築するために、まず欠失突然変異を構築した。ｐａｎＥ遺伝子の調査から二つの潜在的開始部位が明らかとなった：開始部位１（５’−ＡＡＡＴＴＧＧＧＴＧ−３’（ＲＢＳ）−７ｎｔ−ＡＴＧ）はＢｓpHＩ部位と重複し、ＢｓａＸＩ部位と重複する開始部位２（５’−ＧＧＡＧＧ−３’（ＲＢＳ）−５ｎｔ−ＴＴＧ）の３３ｂｐ上流である。結果として、Ｓ．アウレウスエリスロマイシン耐性（Ｅｍｒ）遺伝子（GeneBank V01278）を使用したＬＦＨ−ＰＣＲによってｐａｎＥ／ｙｌｂＱプロモーター領域の２１９ｂｐの欠失を構築した。これを行うために、二つのＰＣＲ断片の「アーム」をまず作製した：製造業者（Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science）が説明するように４０mM  ｄＮＴＰを１μl、１０×緩衝液を５μlおよびＰＣＲ酵素（ＴａｑおよびＴｇｏ）を０．７５μl含有する反応体積５０μlに溶かした１Ａ７４７染色体ＤＮＡ０．１μgに、プライマーＰ１ｐａｎＥおよびＰ２ｐａｎＥ／ＥｒまたはプライマーＰ３ｐａｎＥ／Ｅｒ／２およびＰ４ｐａｎＥ（表３）の１００mM溶液０．２μlを加えた。アニーリング温度５５．７℃および伸長時間４５秒を用いて３０サイクルにわたりＰＣＲ反応を行った。結果としてもたらされたそれぞれＦ１およびＦ２と呼ぶ断片を精製し、次に第二ラウンドのＰＣＲにおけるプライマーとして使用した。Ｆ１およびＦ２断片を５０倍に希釈し、それぞれ１μlを、反応体積５０μlに溶かした直鎖化したプラスミドｐＤＧ６４６（ｅｒｍカセットを含む；Guerout-Fleuryら、1995）０．１μgに加えた。最初の１０サイクルではアニーリング温度６３℃および伸長時間６分を使用した。次の２０サイクルでは１サイクル毎に伸長時間を２０秒延長した。次に、結果としてもたらされた産物をテンプレートとして第三ラウンドのＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物を５０倍に希釈し、その１μlを上記のようにｄＮＴＰ、緩衝液、および酵素を含有する反応体積５０μlに溶かしたプライマーＰ１ｐａｎＥおよびＰ４ｐａｎＥの１００mM溶液０．２μlと混合した。ＰＣＲ反応パラメーターは第二ラウンドＰＣＲに使用したものと同一とした。次に、形質転換によりＰＡ４（１Ａ７４７の染色体ＤＮＡを用いた形質転換によりＢ．スブチリスＣＵ５５０  ｔｒｐＣ２  ｉｌｖＣ４  ｌｅｕ−１２４から得られたＴｒｐ＋コロニー）に完成したＰＣＲ断片を導入した結果として、パントテネート栄養要求株であるＥｍｒコロニーがもたらされた。この株をＰＡ５（ΔｐａｎＥｐ：：ｅｒｍ  ｉｌｖＣ  ｌｅｕＣ）と呼んだ。欠失の構造を確認するために診断ＰＣＲを使用した。その後、議論しない濃度のＰＡ１染色体ＤＮＡの形質転換によって、ＰＡ５にｐａｎＢのプロモーター欠失を導入してＰＡ６（ｉｌｖＣ  ｌｅｕＣ  ΔｐａｎＢｐ：：ｃａｔΔｐａｎＥｐ：：ｅｒｍ）を発生させた。
【００６９】
【表３】
0004713469.tif 000004
【００７０】
次の工程は、ｐａｎＢおよびｐａｎＥの両方の上流に強力な構成的Ｐ15プロモーターを同時に導入することであった。ＬＦＨ−ＰＣＲを再び使用してｐａｎＢのオープンリーディングフレーム上流にＰ15を含みｐａｎＥのオープンリーディングフレーム上流にＰ15を含むＤＮＡ断片を発生させた。これを行うために、ＰＡ１２（上記参照）を構築するために用いたのと同じＰＣＲプロトコルを使用して、プライマーＰ１ｐａｎＢおよびＰ２ｐａｎＢ／Ｐ１５（Ｆ１）ならびにプライマーＰ３ｐａｎＢ／Ｐ１５およびＰ４ｐａｎＢ（Ｆ２）（表１および２、Ｐ15ｐａｎＢの構築）と、Ｐ１ｐａｎＥおよびＰ２ｐａｎＥ／Ｐ１５（Ｆ１）ならびにＰ３ｐａｎＥ／Ｐ１５およびＰ４ｐａｎＥ（Ｆ２）（表３および４、Ｐ15ｐａｎＥの構築）を使用してｐａｎＢおよびｐａｎＥについて二つのＰＣＲ断片の「アーム」を作製した。
【００７１】
【表４】
0004713469.tif 000005
【００７２】
次に、ＤＮＡ形質転換によりｐａｎＢおよびｐａｎＥのプロモーター欠失株ＰＡ６（ｉｌｖＣ  ＩｅｕＣ  ΔｐａｎＢｐ：：ｃａｔ  ΔｐａｎＥｐ：：ｅｒｍ）に完成したＰ15ｐａｎＢおよびＰ15ｐａｎＥのＰＣＲ断片を一緒に導入し、標準的な条件を用いて最少培地寒天平板でパントテン酸原栄養性（Ｐａｎ＋）について選択した。回収したＰａｎ＋コロニーもＣｍｓおよびエリスロマイシン感受性（Ｅｍｓ）であり、プロモーターカセットの挿入を確認した。Ｐ15プロモーターから発現したｐａｎＢＣＤオペロンおよびｐａｎＥ遺伝子の両方を含む単一Ｐａｎ＋ＣｍｓＥｍｓコロニーを単離してＰＡ３２と名付けた。再び標準的な反応条件を用いてＰ１５ｓｅｑおよびＰ４ｐａｎＢプライマーを使用した診断ＰＣＲで、ｐａｎＢ遺伝子上流にＰ15プロモーターが存在することを確認した（表１および２）。Ｐ１５ｓｅｑおよびＰ４ｐａｎＥプライマーを使用してｐａｎＥ遺伝子についての同一の制御を実施した（表３および４）。しかし、ｐａｎＥの前方のＰ15プロモーターのその後の配列決定から、Ｐ15プロモーターの部分欠失が明らかとなった。
【００７３】
部分欠失したＰ15ｐａｎＥ遺伝子を正しい構築に入れ替えるために、ＰＡ５（ΔｐａｎＥｐ：：ｅｒｍ  ｉｌｖＣ  ｌｅｕＣ）由来染色体ＤＮＡを使用したＤＮＡ形質転換によりΔｐａｎＥｐ：：ｅｒｍ突然変異をＰＡ３２に再導入し、エリスロマイシン耐性について選択した。この結果として、ＰＡ４１株（Ｐ15ｐａｎＢＣＤΔｐａｎＥｐ：：ｅｒｍ  ｉｌｖＣ  ｌｅｕＣ）が生じた。前に述べたようにＬＦＨ−ＰＣＲにより発生したＰ15ｐａｎＥのＤＮＡ断片を次に形質転換によりＰＡ４１に導入し、Ｐａｎ＋原栄養菌株を選択した。この結果としてＰＡ４３株（ｉｌｖＣ  ｌｅｕＣ  Ｐ15ｐａｎＢＣＤ  Ｐ15ｐａｎＥ）がもたらされた。このＩｌｖ-Ｌｅｕ-栄養要求株を、次に標準法を用いて野生型Ｂ．スブチリス１Ａ７４７で調製したＰＢＳ１ファージ溶解液を使用して形質導入してＩｌｖ＋Ｌｅｕ＋原栄養性にした。この結果としてＰＡ４９株（Ｐ15ｐａｎＢＣＤ  Ｐ15ｐａｎＥ）がもたらされた。
【００７４】
振盪フラスコ培養において、ＰＡ４９はＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地中で平均しておよそ４００mg／リットルのパントテネートを産生した（ＨＰＬＣ／ＭＳアッセイに基づく）。
【００７５】
実施例２
本実施例は、胞子形成欠損突然変異ｓｐｏ０Ａ、ｓｐｏ０Ｈ、ｓｐｏＩＩＡ（ｓｉｇＦ）ｓｐｏＩＩＧ（ｓｉｇＥ）およびｓｐｏＩＩＩＧ（ｓｉｇＧ）を含むＢ．スブチリスパントテネート過剰産生株の構築および試験を記述する。
【００７６】
胞子形成を欠損したＢ．スブチリス突然変異体の構築。
それぞれＳＷＶ２１５株（ｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎ）、ＢＨＩ株（ｓｐｏ０ＨΔＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ：：ｃａｔ）、６５０株（ｓｐｏＩＩＡＡＢＣ：：ｃａｔ）、９０１株（ｓｐｏＩＩＧＡ：：ａｐｈＡ−３）および７３１株（ｓｐｏＩＩＩＧ：：ｅｒｍＣ）からの染色体ＤＮＡの形質転換により胞子形成欠損突然変異を１Ａ７４７（野生型株）およびパントテネート過剰産生株であるＰＡ１２に導入した。染色体ＤＮＡの抽出および「Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ」法によるＢ．スブチリス株の形質転換はＢｒｏｎ（１９９０）にしたがった。ｅｒｍＣ遺伝子について０．３μg／mlのエリスロマイシン（Ｅｍ）および２５μg／mlのリンコマイシン（Ｌｍ）；ｃａｔ遺伝子について６μg／mlのＣｍ；ならびにｋａｎおよびａｐｈＡ−３遺伝子について１０μg／mlのカナマイシン（Ｋｍ）を含有するＴＢＡＢ寒天培地で形質転換体を選択した。形質転換効率は、染色体ＤＮＡ１μgあたり形質転換体およそ５×１０4個で、結果として以下の株の発生がもたらされた：
（ｉ）ＳＷＶ２１５のＤＮＡ由来のカナマイシン耐性（Ｋｍｒ）形質転換体を１Ａ７４７＿ｓｐｏ０ＡおよびＰＡ１２＿ｓｐｏ０Ａと名付け；
（ii）ＢＨＩのＤＮＡ由来Ｃｍｒ形質転換体を１Ａ７４７＿ｓｉｇＨおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＨと名付け；
（iii）６５０のＤＮＡ由来Ｃｍｒ形質転換体を１Ａ７４７＿ｓｉｇＦおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＦと名付け；
（iv）９０１のＤＮＡ由来Ｋｍｒ形質転換体を１Ａ７４７＿ｓｉｇＥおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＥと名付け；
（ｖ）７３１のＤＮＡ由来エリスロマイシン／リンコマイシン耐性（Ｅｍｒ／Ｌｍｒ）形質転換体を１Ａ７４７＿ｓｉｇＧおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＧと名付けた。
【００７７】
胞子形成の初期工程の主要調節因子である以外に、ｓｐｏ０ＡおよびシグマＨ（σＨ）は表面が関連したＢ．スブチリス群落内（surface associated B.subtilis communities）での胞子形成部位として働く気中構造（aerial structures）の形成に重大な役割も果たす（Brendaら、2001）。したがって、ｓｐｏ０Ａを欠如した１Ａ７４７＿ｓｐｏ０ＡおよびＰＡ１２＿ｓｐｏ０Ａは、ＴＢＡＢ寒天平板で構造化されていないムコイドのコロニーを産生し、σＨを欠如した１Ａ７４７＿ｓｉｇＨおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＨは、類似しているがあまり激しくない（寒天表面であまり強力に広がらない）表現型を示した。対照的にシグマＦ（σＦ）、シグマＥ（σＥ）およびシグマＧ（σＧ）を欠如した他の突然変異体は、野生型株と極めて類似したコロニー形態のコロニーを形成した。
【００７８】
Ｂ．スブチリスにおいて胞子形成欠損突然変異がパントテネート産生および胞子形成に及ぼす作用。
上記の各形質転換実験から、独立して単離した２５個のコロニーについて平板ハロー試験からパントテネート産生を試験した。大多数の被験コロニーを代表するハローのサイズを有する各突然変異体の二つのコロニーを振盪フラスコ培養で分析した。バッフル付き２５０ml容マイヤーフラスコ入れたＶＦＢ  ＭＭ２０mlに植菌するために、適当な抗生物質を補充したＴＡＢ平板上に増殖した単一コロニーを使用した。２５０rpmで攪拌しながら細菌を３７℃で培養した。培養が定常増殖後期（培養約１８時間後）に達したときに、細胞の濁度を６００nmで測定し（ＯＤ600）、「熱耐性」cfuの数を胞子形成アッセイで決定した。次に、孔径０．４５μｍのフィルターでろ過して細胞を除去し、生物学的方法とＨＰＬＣアッセイ法の両方を使用して培養後の培地中のパントテネート含量をアッセイした。結果は、突然変異体１Ａ７４７＿ｓｐｏ０Ａ、ＰＡ１２＿ｓｐｏ０Ａ、１Ａ７４７＿ｓｉｇＨおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＨの総パントテネート産生が親株に比べて２分の１から３分の１に減少したことを示した（表５）。これは、ｓｐｏ０ＡおよびσＨの機能の欠如がパントテネート産生に負に作用したことを示している。σＦまたはσＥを欠如した突然変異体において、パントテネートの産生は実験誤差内で対照レベルと同様であり、これは後期で胞子形成を遮断する突然変異がパントテネート産生にほとんどまたは全く効果を有さなかったことを示している。培養物のＯＤ600の測定によって決定された全突然変異体の細胞バイオマスは、親対照のバイオマスと同様であった。親株１Ａ７４７およびＰＡ１２の胞子形成頻度はおよそ０．３〜１％であった。ｓｐｏ０Ａ、σＨおよびσＥを欠如した突然変異体では胞子が全く検出されなかった。しかし、１Ａ７４７＿ｓｉｇＦおよびＰＡ１２＿ｓｉｇＦの培養物から少数の熱耐性細胞を検出した（表５）。これは、ｓｐｏＩＩＡＡＢＣ遺伝子における突然変異の結果として胞子形成の完全な欠如がもたらされなかったことを示している。これらの結果に基づき、シグマＥ遺伝子に突然変異を含む株のみが、対照レベルのパントテネートを産生し、かつ胞子形成細菌を完全に欠いていた。
【００７９】
σＧ突然変異を含む株は、他のｓｐｏ突然変異体が表現しない別個の表現型を作り出した。これを１Ａ７４７野生型細胞に導入した場合、結果としてもたらされる突然変異体は、正常レベルのパントテネートを産生し、胞子を産生しない。しかし、操作されたＰＡ１２株では、結果としてもたらされる株は非常に低レベルのパントテネートを産生し、胞子を産生しない（表５）。これらの結果は、タンパク質産物がパントテネート産生（または排出）に関与しているようなシグマＧにより転写される遺伝子の発現を阻害するか、極性によって下流の遺伝子の転写を遮断するかのどちらかによって、ｅｒｍ遺伝子によるσＧの破壊が、パントテネートの高レベルの発現を遮断したことを示唆した。ｓｐｏＩＩＩＧ下流のＤＮＡ配列の調査は、ｓｐｏＩＩＩＧと同時転写されうる単一遺伝子ｙｌｍＡの存在を明らかにした。ｙｌｍＡ遺伝子は、ＡＢＣ輸送体の構成要素の一つとして機能できる未知のＡＴＰ結合タンパク質を潜在的にコードする。その結果、タンパク質の個別の、または操作されたｐａｎおよび／またはｉｌｖ生合成遺伝子と組み合わせた過剰産生は、より高いパントテネート産生を招くことができた。さらに、パントテネートの産生を回復させるＳｐｏ-Ｐａｎ-表現型のサプレッサー宿主突然変異の結果としてより高いパントテネートの産生を有する株をもたらすことができた。
【００８０】
【表５】
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【００８１】
実施例３
本実施例は、胞子形成欠損突然変異ｓｐｏ０ＡまたはｓｐｏＩＩＧ（ｓｉｇＥ）を含むＢ．スブチリスパントテネート過剰産生株の発酵について記述する。実験室規模の２リットル容発酵装置を使用した標準的な流加培養による発酵でｓｉｇＥ突然変異体（ＰＡ１２＿ｓｉｇＥ）、ｓｐｏ０Ａ突然変異体（ＰＡ１２＿ｓｐｏ０Ａ）およびそれらの親株ＰＡ１２を４８時間増殖させた。パントテネートレベルと細菌の胞子形成頻度の両方を発酵過程中に測定した。表６に示すように、親株およびｓｉｇＥ突然変異体の両方でパントテネート産生は同様であったが、ｓｐｏ０Ａ突然変異体ではおよそ８５％低減していた。グルコースに対するパントテネートの収率は、ｓｉｇＥ突然変異体と親株の間でこれも同様であった。胞子は、親株では検出されたが、どちらの突然変異体でも検出されなかった。
【００８２】
【表６】
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【００８３】
本発明を実施例により例示したが、実施例は本発明の具体的な態様を単に示すものである。これを読んだ当業者には多くの態様が明らかであろうことから、これが本発明をそれに限定するものとして解釈すべきではない。
【００８４】
実施例４
本実施例は、ｓｐｏ０ＡおよびａｂｒＢにヌル突然変異を含むＢ．スブチリスパントテネート過剰産生株の構築および試験について記述する。
【００８５】
ＳＷＶ２１５株（ｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎ）およびＳＷＶ１１９株（ａｂｒＢ：：ｔｅｔ）由来染色体ＤＮＡを用いた形質転換によって、パントテネート過剰産生株であるＰＡ４９にａｂｒＢとｓｐｏ０Ａとの単一および二重突然変異を導入した。ｋａｎ遺伝子について１０μg／mlのＫｍ、ｔｅｔ遺伝子について１０μg／mlのテトラサイクリン（Ｔｃ）を含むＴＢＡＢ寒天培地で形質転換体を選択した。形質転換効率は、ｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎでは形質転換体２×１０3個／μgＤＮＡ、ａｂｒＢ：：ｔｅｔでは形質転換体４×１０2個／μgＤＮＡ、ならびにｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎおよびａｂｒＢ：：ｔｅｔ二重突然変異体では形質転換体４個／μgＤＮＡであった。結果として生じた株は以下の通りである：
（ｉ）ＳＷＶ２１５のＤＮＡからのＫｍｒ形質転換体をＰＡ１０３０と名付け；
（ii）ＳＷＶ１１９のＤＮＡからのテトラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）形質転換体をＰＡ１０３７と名付け；
（iii）ＳＷＶ２１５のＤＮＡとＳＷＶ１１９のＤＮＡとからのＫｍｒおよびＴｃｒ形質転換体をＰＡ１０５１と名付けた。
【００８６】
各突然変異体の四つのコロニーについて振盪フラスコ培養におけるパントテネート産生および胞子形成を分析した。適当な抗生物質を補充したＴＢＡＢ平板に増殖した単一コロニーを使用して、適当な抗生物質を補充したＶＹ培地１０mlに植菌を行った。２５０rpmで撹拌しながら細菌を３７℃で一晩（約１７ｈ）増殖させた。ＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地２０mlで一晩培養後の培養物を希釈（１：１００）し、対数増殖中期まで増殖させた（ＯＤ600＝０．６〜０．８）。初発濁度ＯＤ600＝０．０３でのＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地３０mlにこれらの培養物を植菌し、バッフル付き２５０ml容マイヤーフラスコで２５０rpmで撹拌しながら３７℃で細菌を増殖させた。増殖１８ｈ後に細胞濁度を６００nmで測定し（ＯＤ600）、胞子形成アッセイで「熱耐性」cfu数を決定した。次に孔径０．４５μｍのフィルターでろ過することにより細胞を除去し、ＨＰＬＣアッセイ法で培養後の培地中のパントテネート含量をアッセイした。結果は、培養物のＯＤ600の測定により決定された全ての突然変異体の細胞バイオマスが親対照と同様であったことを示した。ＰＡ１０３０（ｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎ）およびＰＡ１０３７（ａｂｒＢ：：ｔｅｔ）の総パントテネート産生は親ＰＡ４９株に比べて１／３〜１／４に減少した（表７）。これは、（実施例２でも示されたように）ｓｐｏ０ＡおよびＡｂｒＢの機能の欠如がパントテネート産生に負に作用することを示している。しかし、二重突然変異体ＰＡ１０５１（ｓｐｏ０Ａ：：ｋａｎ  ａｂｒＢ：：ｔｅｔ）は、ＰＡ４９対照よりも４０％多いパントテネートを産生し、胞子を産生しなかった。これらの結果に基づくと、ａｂｒＢおよびｓｐｏ０Ａの二重ヌル突然変異体においてパントテネート産生は野生型発現レベルを超えて増大しうる。
【００８７】
【表７】
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【００８８】
実施例５
本実施例は、ｓｐｏ０Ａを過剰発現し胞子形成欠損突然変異（ｓｐｏＩＩＧＡ）を含むＢ．スブチリスパントテネート過剰産生株の構築および試験について記述する。
【００８９】
Ｐｓｐａｃ−ｓｐｏ０ＡおよびｓｉｇＥ−ヌル突然変異を保有するＢ．スブチリス株の構築
実施例２においてｓｐｏ０Ａの欠如が親株に比べてパントテネート産生を２分の１から３分の１に減少させることが示された。ｓｐｏ０Ａ遺伝子の過剰発現がパントテネート産生に及ぼす効果を検討するために、ＡＨ１７６３株（ａｍｙＥ：：Ｐｓｐａｃｓｐｏ０Ａ［ｃａｔ］）由来染色体ＤＮＡを用いた形質転換によりＰＡ４９のａｍｙＥ遺伝子にＩＰＴＧ誘導性Ｐｓｐａｃ−ｓｐｏ０Ａ融合体を導入した。６μg／mlのＣｍを含むＴＢＡＢ寒天培地で形質転換体を選択し、結果としてもたらされたＣｍｒ株をＰＡ１０２５と名付けた。次に、９０１株（ｓｐｏＩＩＧＡ：：ａｐｈＡ−３）由来染色体ＤＮＡを用いた形質転換によってｓｐｏＩＩＧＡにおける胞子形成欠損突然変異をＰＡ１０２５に導入した。ｃａｔ遺伝子については６μg／mlのＣｍ、ａｐｈＡ−３遺伝子については１０μg／mlのＫｍを含むＴＢＡＢ寒天培地で形質転換体を選択し、結果としてもたらされたＣｍｒおよびＫｍｒ株をＰＡ１０６４と名付けた。
【００９０】
Ｂ．スブチリスにおけるパントテネート産生に及ぼすｓｐｏ０Ａ過剰発現の効果。
適当な抗生物質を補充したＶＹ培地１０mlに植菌するためにＰＡ４９、ＰＡ１０２５およびＰＡ１０６４の単一コロニーを使用した。２５０rpmで撹拌しながら３７℃で細菌を一晩（約１７ｈ）増殖させた。一晩培養後の培養物をＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地２０mlで希釈（１：１００）し、対数増殖中期（ＯＤ600＝０．６〜０．８）まで増殖させた。３０mlのＶＦＢ  ＭＭＧＴおよび１０mMのＩＰＴＧを含有するＶＦＢ  ＭＭＧＴ培地３０mlに初発濁度ＯＤ600＝０．０３でこれらの培養物を植菌し、バッフル付き２５０ml容マイヤーフラスコで２５０rpmで撹拌しながら３７℃で細菌を増殖させた。増殖１８ｈ後に細胞濁度を６００nmで測定し（ＯＤ600）、胞子形成アッセイで「熱耐性」cfu数を決定した。次に孔径０．４５μｍのフィルターでろ過することにより細胞を除去して、ＨＰＬＣアッセイ法で培養後の培地中のパントテネート含量をアッセイした。結果は、培養物のＯＤ600の測定により決定された全ての突然変異体の細胞バイオマスが親対照と同様であることを示した。誘導物質ＩＰＴＧの非存在下では、ＰＡ１０２５（Ｐｓｐａｃｓｐｏ０Ａ）およびＰＡ１０６４（Ｐｓｐａｃｓｐｏ０ＡｓｐｏＩＩＧＡ：：ａｐｈＡ−３）からの総パントテネート産生は、ＰＡ４９親株と同様であった（表８）。１０mMのＩＰＴＧを使用してＰｓｐａｃプロモーターからのｓｐｏ０Ａの発現を誘導した場合、ＰＡ１０２５は親対照に比べて７０％多いパントテネートおよび１０倍の胞子を産生した。一方、ＰＡ１０６４もＰＡ４９対照よりも７０％多いパントテネートを産生したが、胞子形成を欠損していた。
【００９１】
【表８】
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【００９２】
【表９】
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【配列表】
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