(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の多発性硬化症の診断を支援する方法であって、ここで該方法は以下、
回収した試験サンプルにおいて抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体を検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルを、コントロールサンプルと比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプルが、多発性硬化症症状を有し、かつ公知の多発性硬化症状態を有する１以上の個体の群または多発性硬化症の症状を示さない１以上の個体の群のいずれかであり、該コントロールサンプル中の該抗体のレベルと比較した該試験サンプル中の該抗体のレベルの上昇が、多発性硬化症を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで該方法は以下、
抗Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇａｌ（β）抗体、抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体、抗Ｌ−Ａｒａｆ（α）抗体、抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）］ＧａｌＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体、抗ＧｌｃＡ（β）抗体、抗ＧｌｃＡ（β）抗体および抗Ｘｙｌ（α）抗体からなる群から選択される第２抗体を検出する工程；および
前記試験サンプル中の第２抗体のレベルを、コントロールサンプル中の該第２抗体のレベルと比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプルが、多発性硬化症症状を有し、かつ既知の多発性硬化症状態を有する１以上の個体の群または多発性硬化症症状を示さない１以上の個体の群のいずれかであり、該コントロールサンプル中の該第２抗体のレベルと比較した該試験サンプル中の該第２抗体のレベルの上昇が、多発性硬化症を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項３】
前記第２抗体が抗Ｇｌｃ（α）抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、多発性硬化症症状を示さない１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、既知の多発性硬化症状態を含む多発性硬化症症状を有する１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項６】
前記試験サンプルが生物学的液体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的液体が、全血、血清、血漿、脊髄液、尿または唾液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的液体が血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体が雌性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が雄性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの抗体がＩｇＭ型抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの抗体がＩｇＡ型抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの抗体がＩｇＧ型抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗Ｇｌｃ（α）抗体がＩｇＭ型抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体がＩｇＭ型抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記診断が多発性硬化症の初期診断である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記コントロールサンプルが、拡大障害状態尺度（ＥＤＳＳ）評価または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）評価を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記コントロールサンプルが、拡大障害状態尺度（ＥＤＳＳ）評価を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、少なくとも２つの前記抗体を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、少なくとも４つの前記抗体を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、少なくとも６つの前記抗体を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
被験体の多発性硬化症の悪化の診断を支援する方法であって、ここで該方法は以下、
回収した試験サンプルにおいて抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルをコントロールサンプルと比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプルが、多発性硬化症状態が公知である１以上の被験体に由来し、該コントロールサンプル中の該抗体のレベルと比較した該試験サンプル中の該抗体のレベルの上昇が、多発性硬化症の悪化を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、公知の多発性硬化症状態を含む多発性硬化症の症状を有する１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、ここで該方法は以下、
抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）αＩｇＭ型抗体および抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を前記試験サンプル中に検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルを前記コントロールサンプルと比較する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法であって、ここで該方法は以下、
抗α−グルコースＩｇＭ型抗体および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）αＩｇＭ型抗体を前記試験サンプル中に検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルを前記コントロールサンプルと比較する工程
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、多発性硬化症の悪化症状を示さない回復多発性硬化症状態の１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、多発性硬化症状態が悪化し、多発性硬化症悪化の症状を示す１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項２８】
前記試験サンプルが生物学的液体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的液体が、全血、血清、血漿、脊髄液、尿または唾液である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的液体が血清である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体が雌性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が雄性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記診断が多発性硬化症悪化の初期診断である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体がインターフェロンβの皮下投与により処置される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体が酢酸グラチラマーの皮下投与により処置される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
被験体の多発性硬化症疾患の重篤度の評価を支援するための方法であって、ここで該方法は以下、
回収した試験サンプルにおいて抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルをコントロールサンプルと比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプルが、多発性硬化症疾患の重篤度が既知である１以上の被験体に由来し、該コントロールサンプル中の該抗体のレベルと比較した該試験サンプル中の該抗体のレベルの上昇が、多発性硬化症の重篤度を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、公知の多発性硬化症状態を含む多発性硬化症の症状を有する１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、ここで該方法は以下、
抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体および抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を前記試験サンプル中に検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルを前記コントロールサンプルと比較する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、ここで該方法は以下、
抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体および抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を前記試験サンプル中に検出する工程；および
該試験サンプル中の該抗体のレベルを前記コントロールサンプルと比較する工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法であって、ここで前記コントロールサンプルが、多発性硬化症疾患の重篤度が拡大障害状態尺度（ＥＤＳＳ）、ＥＤＳＳ評点の変化または磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）評価によって定義される１以上の個体の集団からなる、方法。
【請求項４１】
前記試験サンプルが生物学的液体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物学的液体が、全血、血清、血漿、脊髄液、尿または唾液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物学的液体が血清である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体が雌性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体が雄性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
多発性硬化症と関連する症状を診断するためのキットであって、該キットは以下：
抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体を特異的に検出する第一薬剤；
抗Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇａｌ（β）抗体、抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体、抗Ｌ−Ａｒａｆ（α）抗体、抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）］ＧａｌＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体、抗ＧｌｃＡ（β）抗体、抗ＧｌｃＡ（β）抗体および抗Ｘｙｌ（α）抗体からなる群から選択される第２抗体を特異的に検出する第二薬剤；および
該キットを使用するための指示書
を含む、キット。
【請求項４７】
ＩｇＭ型抗体を特異的に検出する薬剤をさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンからなる、被験体における多発性硬化症の診断において使用するための炭水化物試薬であって、該Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンは、その還元末端を通じて基材に共有結合される、炭水化物試薬。
【請求項４９】
単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカン、ならびにＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）グリカン、Ｇｌｃ（β）グリカン、Ｇａｌ（β）グリカン、Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）グリカン、ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）グリカン、Ｌ−Ａｒａｆ（α）グリカン、Ｌ−Ｒｈａ（α）グリカン、Ｇａｌ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）］ＧａｌＮＡｃ（α）グリカン、Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（α）グリカン、Ｇｌｃ（α）グリカン、Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（α）グリカン、Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）グリカン、ＧｌｃＡ（β）グリカン、またはＧｌｃＡ（β）グリカンおよびＸｙｌ（α）グリカンから選択される単離されたグリカンからなる、被験体における多発性硬化症の診断において使用するための炭水化物試薬であって、該単離されたグリカンは、その還元末端を通じて基材に共有結合される、炭水化物試薬。
【請求項５０】
前記炭水化物試薬が、抗Ｇｌｃ（α）抗体を検出する、請求項４９に記載の炭水化物試薬。
【請求項５１】
前記炭水化物試薬が、抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体を検出する、請求項４９に記載の炭水化物試薬。
【請求項５２】
前記炭水化物試薬が、抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体を検出する、請求項４９に記載の炭水化物試薬。
【請求項５３】
前記基材が平面である、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項５４】
前記基材がマイクロタイタープレートのウェルとして提供される、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項５５】
前記薬剤が、単糖またはオリゴ糖である、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項５６】
前記単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンが、リンカーを介して、その還元末端を通じて基材に共有結合される、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項５７】
前記基材がビーズである、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項５８】
前記単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンが、Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体に結合する、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項５９】
前記Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体が、ＩｇＭアイソタイプ抗体である、請求項５８に記載の炭水化物試薬。
【請求項６０】
前記単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンが、固相に付着される、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項６１】
前記単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンが、リンカーを介して前記固相に付着される、請求項６０に記載の炭水化物試薬。
【請求項６２】
前記単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンが、前記固相に共有結合される、請求項６０に記載の炭水化物試薬。
【請求項６３】
前記単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンが、固体基材上に固定される、請求項４８に記載の炭水化物試薬。
【請求項６４】
前記固体基材がマイクロアレイである、請求項６０に記載の炭水化物試薬。
【請求項６５】
単離されたＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカンを含む、被験体における多発性硬化症の診断において使用するための炭水化物試薬であって、該グリカンは、Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体に結合し、そしてその還元末端を通じて基材に共有結合される、炭水化物試薬。
【請求項６６】
前記Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体が、ＩｇＭアイソタイプ抗体である、請求項６５に記載の炭水化物試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、多発性硬化症を診断する方法に関連し、より詳細には、生物学的サンプル中のグリカンに対する抗体のレベルを測定することによって多発性硬化症を診断する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の慢性自己免疫疾患である。多発性硬化症は、若年成体の持続性障害の一般的な原因である。ＭＳを被った患者において、免疫系は脳および脊髄の軸索のミエリン鞘（ｍｙｅｌｉｎ  ｓｈｅｅｔ）を破壊し、それにより種々の神経学的病理を引き起こす。ＭＳの最も一般的な形態、再発−寛解型では、神経機能の急性悪化（悪化、発作）の発症後、疾患の進行のない（安定な）部分的または完全な回復期（回復）が続く。ＭＳ患者の９０％は、視神経、脳幹または脊髄における炎症性脱髄性損傷による臨床的に分離された症候群を始めに示す。臨床的に分離された症候群を有するそれらの患者の約３０％は、症状後１２ヶ月以内に臨床的に明確なＭＳへと進行する。疾患の後の進行は、患者によって顕著に変動し得る。その進行は、良性の経過から標準的な再発−寛解型、慢性進行性またはまれに劇症性に及び得る。
【０００３】
臨床的に明確なＭＳの初期の検出を容易にするＭＳ診断の方法は、疾患を管理するためおよび患者に助言を提供するための両方において有用である。例えば、臨床的に明確なＭＳを有する初期であると診断された患者は、初期ＭＳにおいて有益であることが最近示された疾患を緩和する処置を提供し得る。
【０００４】
ＭＳの進行を評価し、追跡する現在の方法は、発作における患者の機能および発作の間に蓄積した障害の評価および点数化に基づく。ＭＳを評価するために使用される１つの評価は、一般的に使用される拡大障害状態尺度（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃａｌｅ：ＥＤＳＳ）である。しかし、ＥＤＳＳは、患者の機能の主観的な評価に基づいている。
【０００５】
診断のための方法はまた、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による、またはオリゴクローナルバンド（ＯＣＢ）について脳脊髄液（ＣＳＦ）を試験することによる脳損傷の追跡を含み得る。ＭＲＩは、脳損傷の評価のための物理的な方法であって、かつ日常的に使用するには費用がかかる。さらに、ＭＲＩの結果と疾患活性との関係は、不十分である。脳脊髄の穿刺は、日常的に使用するには適さない不快な侵襲性手順である。さらに、両方の方法とも障害が生じた後しか障害を評価できない；両方の方法とも発作の発症を予測し得ない。ＭＳを診断するための方法としてのＣＳＦにおけるＯＣＢおよびＭＲＩに対する試験でのさらなる不都合は、ネガティブなＯＣＢまたはＭＲＩがＭＳの存在を除外しないことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＭＳを診断するための客観的に評価されたマーカーを使用する方法に対する必要性およびＭＳを被った患者における発作の発症を予測することに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、健常な個体のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭの自己抗体の血清レベルと比較して、ＭＳ患者の、グリカン構造Ｇｌｃ（α）またはＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）またはＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）に結合するこれらの自己抗体の血清レベルが増加するという発見に一部基づく。さらに、これらのグリカン構造に特異的な同一の自己抗体は、悪化状態の間に、回復期の患者および健常な個体において観察されるレベルと比較して増加される。雌性におけるＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）抗体血清レベルと臨床的に診断された（再発−寛解型）ＭＳ患者と女性のＥＤＳＳ（拡大障害状態尺度）スコアとの間で高い相関もまた観察されている。この高い相関は、血清中のＩｇＭ抗αグルコースのレベルが、疾患の活性に関して臨床代理終点マーカーとして、および臨床試験における薬物化合物の有効性を追跡する方法として作用し得ることを示す。
【０００８】
ＭＳと疑われる患者の血液におけるこれらの抗体のレベルをモニタリングすることは、ＭＳ患者の迅速かつ費用効果的な初期診断および疾患緩和薬物の初期の処方を容易にする。明確なＭＳ患者の血液中のこれらの抗体をモニタリングすることはまた、所定の薬物の効果の迅速かつ費用効果的なモニタリングならびに初期の予防的な処置を可能にする発作の早期検出を可能にする。
【０００９】
本発明のさらなる利点には、患者の症状が他の多くのＭＳ様疾患に似ている場合、患者におけるＭＳの存在が疾患の初期段階と決定され得ることが挙げられる。初期診断は、医師が疾患の経過の初期でＭＳを処置することを可能にし、その結果、ミエリンの破壊によって引き起こされる損傷およびこの破壊によってもたらされる障害を最小化するかまたは予防する。さらに、本明細書中で開示された方法は、疾患の重篤度を評価するため、治療をモニタリングするため、および発作が起きる徴候が見られたら処置を変更するために、医師がＭＳ患者を定期的に追跡することを可能にする。例えば、ＭＳ発作を示す生物マーカーにおける増加は、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）（これは、発作の間に一般的に投与される一般的な抗炎症剤である）の患者への投与を保証し得る。
【００１０】
本明細書中で開示された方法はまた、特定の患者に対する最も良い薬物処置を選択するために使用され得る。例えば、患者は、特定の薬物を用いる処置過程を開始し得、そしてマーカーのレベルにおける変化は、薬物の有効性を示す。マーカーレベルの減少状態への逆転は、薬物が効果を失ったことを示し、この薬物は短時間後に第２薬物で置換され得る。さもなければ、薬物がその特定の患者に対して有効である場合、医師は、決定するために次の発作を待たなければならない。
【００１１】
本明細書で開示された生物マーカーはさらに、費用効果的な方法における試験薬物に対する患者の反応を評価するための代理終点として作用し得る。血清学試験に基づいた代理終点は、新規の潜在的なＭＳ薬物の有効な試験を容易にする。
【００１２】
１つの局面では、本発明は被験体の多発性硬化症を診断する方法を特徴とする。この方法は、被験体から試験サンプルを提供する工程および試験サンプル中のグリカン構造に特異的に結合する抗体である少なくとも１つの生物マーカーを検出する工程を包含する。その抗体は、例えば、抗Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇａｌ（β）抗体；抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体、抗Ｌ−Ａｒａｆ（α）抗体、抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）］ＧａｌＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（α）、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）、抗ＧｌｃＡ（β）抗体または抗ＧｌｃＡ（β）抗体または抗Ｘｙｌ（α）抗体であり得る。試験サンプル中の抗体のレベルは、コントロールサンプルと比較され、このコントロールサンプルは、多発性硬化症症状を示し、かつ公知の多発性硬化症状態を伴う多発性硬化症症状を有する１以上の個体に由来するか、または多発性硬化症症状を示さない個体に由来する。ＭＳ状態は例えば、悪化、発作、回復および疾患の安定な段階を含み得る。
【００１３】
種々の実施形態では、これらの抗体の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個が検出される。いくつかの実施形態において、試験サンプル中で検出される抗体は、抗Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体または、抗Ｇｌｃ（α）抗体と抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体の両方である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、コントロールサンプルは、多発性硬化症の症状を示さない１以上の個体の集団から本質的になる。他の実施形態において、コントロールサンプルは、多発性硬化症の症状を示す集団から本質的になる。コントロールサンプル中のＭＳの存在は、当該分野で公知の技術（例えば、拡大障害状態尺度（ＥＤＳＳ）評価もしくは磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）評価またはその両方）を使用して決定され得る。
【００１５】
試験サンプルは、例えば、生物学的液体であり得る。生物学的液体の例としては、例えば、全血、血清、血漿、脊髄液、尿または唾液が挙げられる。
【００１６】
被験体は、雌性または雄性のいずれかであり得る。
【００１７】
検出された抗体は、例えば、ＩｇＭ型抗体またはＩｇＡ型抗体またはＩｇＧ型抗体であり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、検出された多発性硬化症の型は、初期多発性硬化症である。
【００１９】
被験体の多発性硬化症の悪化を診断する方法もまた、本発明により提供される。本方法は、被験体由来の試験サンプルを提供する工程、ならびに抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体および／または抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を試験サンプル中で検出する工程を包含する。試験サンプル中の抗体レベルは、コントロールサンプルと比較され、そのコントロールサンプルはその多発性硬化症状態が既知である１以上の個体に由来する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、コントロールサンプルは、多発性硬化症の悪化症状を示さず、かつその多発性硬化症状態が回復状態にある１以上の個体の集団から本質的になる。コントロールサンプルより試験サンプルに、抗Ｇｌｃ（α）抗体または抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体が多く存在する場合、多発性硬化症の悪化が被験体で診断される。他の実施形態では、コントロールサンプルは、多発性硬化症の悪化の症状を示す１以上の個体の集団から本質的になり、そして、抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体および／または抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体のレベルが試験サンプル中およびコントロールサンプル中で類似した量で存在する場合、多発性硬化症の悪化は、被験体において診断される。
【００２１】
試験サンプルは、例えば、生物学的液体であり得る。生物学的液体の例としては、例えば、全血、血清、血漿、脊髄液、尿または唾液が挙げられる。
【００２２】
被験体は、雌性または雄性のいずれかであり得る。
【００２３】
検出された抗体は、例えば、ＩｇＭ型抗体またはＩｇＡ型抗体またはＩｇＧ型抗体であり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、診断は、多発性硬化症の悪化の初期診断である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、被験体は皮下投与されるＭＳ治療薬剤（例えば、インターフェロンβまたは酢酸グラチラマー（ｇｌｉｔａｍｅｒｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ））を用いて処置されている。
【００２６】
被験体の多発性硬化症の重篤度を評価するための方法もまた本発明の範囲内である。その方法は、被験体由来の試験サンプルを提供する工程、および試験サンプルが抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体および／または抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ型抗体を含有するか否かを決定する工程を包含する。試験サンプル中の抗体の量は、コントロールサンプル中の抗体の量と比較され、このコントロールサンプルは、多発性硬化症疾患の重篤度が既知である１以上の個体に由来する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、コントロールサンプルは、１以上の個体の集団から本質的になり、その個体の多発性硬化症疾患の重篤度は、拡大障害状態尺度（ＥＤＳＳ）、ＥＤＳＳスコアの変化または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）評価によって規定される。
【００２８】
試験サンプルは、例えば、生物学的液体であり得る。生物学的液体の例としては、例えば、全血、血清、血漿、脊髄液、尿または唾液が挙げられる。
【００２９】
所望の場合、この方法はさらに、試験サンプルおよびコントロールサンプル中の抗体の相対レベルに基づいて、治療剤および投薬レジメンを選択することによって、多発性硬化症を処置するための治療剤を選択する工程を包含し得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、コントロールサンプルと比較して、より高い試験サンプルの抗体レベルは、治療剤および投薬レジメンの選択（すなわち、インターフェロンβ（ＢＥＴＡＦＥＲＯＮ（登録商標）、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標））の皮下投与または酢酸グラチラマー（ｇｌｉｔａｍｅｒｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ）（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の皮下投与）を示す。
【００３１】
被験体は、雌性または雄性のいずれかであり得る。
【００３２】
多発性硬化症に付随する症状を診断するためのキットがまた、本発明により提供される。このキットは、抗Ｇｌｃ（α）抗体を特異的に検出する第１試薬、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体を特異的に検出する第２試薬およびこのキットを使用するための指示書を備える。このキットは、必要に応じて、ＩｇＭ型抗体を特異的に検出する試薬を備える。
【００３３】
本明細書で開示される抗体（例えば、抗Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇｌｃ（β）抗体、抗Ｇａｌ（β）抗体；抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体、抗ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体、抗Ｌ−Ａｒａｆ（α）抗体、抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）］ＧａｌＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（α）抗体、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（α）、抗Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）、抗ＧｌｃＡ（β）抗体または抗ＧｌｃＡ（β）抗体または抗Ｘｙｌ（α）抗体）を特異的に検出する試薬を含む基板もまた本発明の範囲内である。その基板は、例えば、平面であり得る。
【００３４】
さらなる局面では、本発明は、多発性硬化症を処置するための治療剤を選択する方法を提供する。この方法は、多発性硬化症を診断される被験体または多発性硬化症の危険性のある被験体から試験サンプルを提供する工程および試験サンプルが抗Ｇｌｃ（α）抗体を含有するか否かを決定する工程を包含する。試験サンプルの抗体レベルをコントロールサンプルの抗体レベルと比較し、このコントロールサンプルは、多発性硬化症疾患の重篤度が既知である１以上の個体から本質的になる。治療剤および投薬レジメンは、被験体サンプルおよびコントロールサンプル中の抗体の相対レベルに基づいて選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、この方法はさらに、試験サンプルが抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体を含有するか否かを決定する工程および試験サンプル中の抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体のレベルをコントロールサンプル中の抗体のレベルと比較する工程を包含し、ここでこのコントロールサンプルは、多発性硬化症疾患の重篤度が既知である１以上の個体から本質的になる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、コントロールサンプルは、その状態が多発性硬化症ではないかまたは安定な多発性硬化症である１以上の個体から本質的になる。
【００３７】
他に定義されない場合、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と類似しているかまたはそれらと等価なものが、本発明の実施および試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。全ての出版物、特許出願、特許および本明細書で述べた他の参考文献は、参考としてその全体が援用される。抵触する場合には、定義を含む本明細書が制御する。さらに、材料、方法および実施例は、例示的なもののみであって、制限することを意図しない。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に提供される方法は、客観的に評価された生物マーカーレベルを使用して、初期の多発性硬化症および再発性多発性硬化症の早期診断を可能にする。ＭＳを有する患者を診断するための現在の決定樹は、図１に記載される。最初に神経性機能が急性的に悪化した患者は、明確なＭＳ患者として診断された後に、疾患改変薬物で処置するために適格となるべきである。医師は、患者がＭＳ様症状（例えば、若年性発作、狼瘡、ビタミンＢ−１２欠損症、抗リン脂質症候群、重篤な偏頭痛）を有するか否か、または患者が実際にＭＳを有するか否かを決定しなければならない。患者は、ＭＳ患者として診断される前に、神経機能の第２急性悪化（発作）に直面しなければならず、そして、ＭＳ治療薬剤（例えば、インターフェロンβまたは酢酸グラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ））で長期的な処置を開始し得る
現在、医師は、ＭＲＩを使用して脳傷害の存在を同定し、そして／または、オリゴクローナルバンド（ＯＣＢ）について脳脊髄液（ＣＳＦ）を試験する。ＭＲＩが、ＣＳＦにおける、脳傷害の存在またはＯＣＢの存在に関して明確な結果を示す場合、医師は、無症状の脳傷害を予防するために、処置をただちに開始し得る。完全なＭＳ診断の診断は現在、第２発作の後にのみ行なわれている。ＭＲＩが明確な結果を与えない場合、または患者ＣＳＦにＯＣＢが存在しない場合、ＭＳとは診断されず、第２発作が次に起こるまで処置が遅延する。
【００４０】
本明細書で開示された方法は、神経学的機能が急に悪化し、ＭＳを有すると疑われる患者から血液を抽出することにより行われ得る。この方法は、抗Ｇｌｃ（α）レベルおよび抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭレベルを測定することにより、ＭＳの存在を同定し得る。これらの抗体の少なくとも１つのレベルが、健常な個体の血清のこれらの抗体の平均レベルより有意に高い場合、その患者は、第２発作を待つ必要なく、ＭＳ患者と診断される。さらに、迅速な診断は、ただちに処置を開始することを可能にする。
【００４１】
ＭＳに対する一連の処置の第１は、インターフェロンＢ（例えば、ＩＮＦβ−１ａおよびＩＮＦβ−１ｂ）である。現在の効果の評価および必要な薬物の投薬量は、いくつかの臨床スコアの継続したモニタリングに基づく。現在、ＥＤＳＳスコアおよび時間の経過によるその変化（例えば、３〜６ヶ月毎に、ＥＤＳＳの違いを比較することによる）は、疾患の管理についての主要な臨床パラメーターである。評価の重要な要素は、患者が経験した疲労のレベルおよびうつ状態のレベルである。疲労およびうつ状態は、（自己免疫疾患としての）ＭＳの症状であり得るかまたはインターフェロンβの使用から生じる副作用であり得る。疲労の原因を同定することは、処置を管理するために重要である。例えば、疲労がインターフェロンの副作用の結果である場合、医師は投薬量を下げることを考え得るかまたは、別の薬物に交換することさえ考える。しかし、その疲労がＭＳ症状に起因する場合、医師は薬物投薬量を増加させることを考えなければならない（図２を参照のこと）。
【００４２】
患者の血液をスクリーニングすること、および本明細書で開示された生物マーカー（例えば、本明細書中のＩｇＭ抗体、抗Ｇｌｃ（α）および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α））のレベルを決定することは、治療の正確なモニタリングを可能にする。抗体レベルの有意な減少は、その患者が投与された薬物によく反応していることを示す。
【００４３】
（発作の早期の検出）
現在、ＭＳ患者における発作の開始を予測する方法はない。ＭＲＩおよび患者の臨床的評価は、既に生じた損傷を明らかにし得るのみである。本明細書中に記載された方法に従って、患者の血液中の少数の抗グリカン抗体（例えば、抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭまたは抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ）のレベルを定期的に測定することは、医師がこれらの抗体のレベルの増加に基づいて、次の発作を同定することを可能にする。ＭＳ発作状態の患者の血液のこれらの抗体のレベルは、安定な状態の患者に対して有意に高い（図７を参照のこと）。これらの抗体の増加の検出に基づいて、炎症を軽減するためおよびミエリンに対する損傷を予防するために、医師は積極的なステロイド処置を開始し得る（図３を参照のこと）。
【００４４】
グリカンに特異的な抗体生物マーカーを使用して、アテローム性動脈硬化の危険性のある個体を、安定なアンギナおよび不安定なアンギナに関して同定する方法、および評価する方法、ならびに目的の細胞を検出するための固定化したグリカンの使用もまた、本明細書中で提供される。
【００４５】
種々のグリカン構造が、本出願中で議論される。グリカンは、糖質の表示についての国際純正および応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の要約された形式か、またはＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ（登録商標）シンタックスのどちらかで表示される。ここで、ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥシンタックスの原理については、Ｂａｎｉｎ  Ｅ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  Ｙ．Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  Ｙ．Ｈａｌｅｖｉ  Ａ．Ｉｎｂａｒ  Ｏ．Ｄｏｔａｎ  Ｎ．およびＤｕｋｌｅｒ  Ａ．（２００２）  Ａ  Ｎｏｖａｌ  Ｌｉｎｅｒ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１４  Ｎｏ．７７  ｐｐ１２７〜１３７を参照のこと。ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ表示からＩＵＰＡＣ表示への変換は、表１に示す。本開示で議論される全てのグリカン構造は、他に言及しない限り、図１０Ａに記載されるように、リンカーを介して、示したアノマーαまたはアノマーβを区別して固相に結合する。
【００４６】
本発明は、以下の非限定的な実施例に例証される。
【実施例】
【００４７】
（実施例１．多発性硬化症（ＭＳ）患者集団と健常な集団との間の血清中の抗グリカン抗体の比較）
ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｄ、Ｉｓｒａｅｌ、カタログ番号９１００）を使用して、抗グリカン抗体（Ｉｇｓ）プロフィールを得た。ＷＯ００／４９４１２に記載される手順を使用して、アレイを構築した。４０の多発性硬化症患者の抗グリカン抗体プロフィールと、性別および年齢の一致する４０の健常な血液ドナーの抗グリカン抗体プロフィールとを比較した。
【００４８】
ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）プレート（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｄ、Ｉｓｒａｅｌ、カタログ番号９１００）（これは、体積を減じた３８４ウェルマイクロタイタープレートに共有結合した単糖およびオリゴ糖のアレイである）を使用して、全ての血清サンプルを試験した。アレイ上に提示された単糖およびオリゴ糖を、図４に列挙する。グリカン構造を記載するために使用したＬｉｎｅａｒＣｏｄｅ（登録商標）シンタックスの、ＩＵＰＡＣ命名法への転換は、表１に見出され得る。
【００４９】
インフォームドコンセントに署名した健常な志願者およびＭＳ患者志願者の血清を、空にしたシリコーン被覆ゲル含有チューブ（Ｅｓｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号  ６１６６０３  ＧＬＶ）中に回収した。その血清を血液細胞から分離し、使用するまで、−２５℃で凍結保存した。それらを２つの別々の実験で分析し、それぞれの試験は、別の日に２回繰り返した。
【００５０】
Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ２００  ロボットを使用して、志願者からの血清をＴＢＳＴに希釈（１：２０）し、ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）プレート中（１０μＬ／ウェル）に分配し、２５℃で３０分間インキュベートした。プレート上の各グリカンおよび血清サンプルについて４回繰り返した。
【００５１】
このプレートを、自動プレート洗浄器（Ｔｅｃａｎ、ＰｏｗｅｒＷａｓｈｅｒＴＭ中で、２５０μＬ／ウェルの高塩濃度緩衝液（０．１５Ｍ  ＫＮａ  ｐＨ７．２、ＮａＣｌ  ２Ｍ、ＭｇＳＯ４  ０．０８５Ｍ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を使用して洗浄した。１０μｌ／ウェルのＴＢＳＴ中１μｇ／ｍｌのビオチン化タンパク質Ａ（ＩＣＮ６２−２６５）を、手動で分配し、このプレートを２５℃で、３０分間インキュベートした。このプレートを、高塩濃度緩衝液で再度洗浄した。
【００５２】
ストレプトアビジン結合ユーロピウム（Ｗａｌｌａｃ、ＡＤ００６２、１μ／ｍｌ、１０μｌ／ウェル）を手動で添加し、その後暗所で、２５℃で３０分間インキュベートした。このプレートの高塩濃度緩衝液での洗浄を繰り返した。ＤｅｌｆｉａＴＭ増強緩衝液（Ｗａｌｌａｃ、７３０２３２、１０μｌ／ウェル）をウェルに添加し、このプレートを暗所で、少なくとも３０分間インキュベートした。発光６１２ｎｍおよび励起３４０ｎｍの時間分解蛍光設定を使用して、ウェルの蛍光をＶｉｃｔｏｒ１４２０（Ｗａｌｌａｃ）で読み取った。
【００５３】
試験した全ての患者のプロフィールを図４に示す。上部の４０列（ＭＳ）は、ＭＳサンプルの抗炭水化物レベルを表し、下部の４０列（ＮＣ）は、健常なコントロール集団からのサンプルの抗炭水化物レベルを表す。示した値は、バックグラウンド減算を行なわない、絶対値である。結合した抗体の検出は、ビオチン化したタンパク質Ａ（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに結合する）を用いて行なったので、このシグナルは、全てのサブタイプＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからの抗体の総結合を表わす。
【００５４】
ＭＳ集団と健常な集団との間の抗炭水化物抗体の平均値および中央値の比較は、ＭＳ患者由来のサンプルと健常な集団由来のサンプルとの間の顕著な違いを明らかにする（表５を参照のこと）。２つの群間で観察された主要な差の一例は、グリカンＧａ４Ｇｂに対する平均シグナルである。ｔ検定は、この差が非常に統計的に有意である（α＝０．０５；ｐ＜０．００１）ことを示す。別の例は、Ａｂ３（ＧＮｂ６）ＡＮａ（α＝０．０５；ｐ＜０．００１）である。以下のグリカンに結合する抗体に関して、ＭＳ集団と健常な集団との間のシグナルの中央値に有意な差が存在する：Ｇｌｃ（α）、Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）、Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（β）、Ｇｌｃ（β）、Ｇａｌ（β）、Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）、ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）、Ｌ−Ａｒａｆ（α）、Ｌ−Ｒｈａ（α）、Ｇａｌ（β１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）］ＧａｌＮＡｃ（α）、Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（α）、Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（α）、Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）、ＧｌｃＡ（β）、ＧｌｃＡ（β）、Ｘｙｌ（α）。ＭＳ群における結合した抗体からのシグナルは、通常のコントロール群のシグナルより高い。
【００５５】
図６は、集団間の抗グリカン抗体の平均結合値の間の差異を示す。
【００５６】
（実施例２．発作状態のＭＳ患者集団、安定なＭＳ患者集団および健常な集団間の血清における抗Ｇｌｃ（α）抗体、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体、ＩｇＭ抗体のレベルの差異）
健常な集団と多発性硬化症（ＭＳ）患者の群との間を識別するため、および悪化したＭＳ患者と回復段階のＭＳ患者との間を識別するための生物マーカーを、ヒト血清グリカン結合抗体レパートリーの中から探索するために、グリカンアレイを使用した。この実施例は、２個のＩｇＭ抗体（抗Ｇｌｃ（α）および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α））が、健常な人に比べてＭＳ患者で有意に高いレベルで見出され（それぞれ、６０％の感度および９３％の特異度）、回復段階の患者に比べて悪化状態の患者で有意に高いレベルで見出される（それぞれ、８９％の感度および７１％の特異度）。１３週の休止期間の間の変動の範囲を含む健常な集団に対する抗グリカン抗体プロフィールもまた提供される。
【００５７】
明らかに健康な個体における１３週より長い抗グリカン抗体プロフィールの一時的な安定性は高かった。健常な集団の抗Ｇｌｃ（α）および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭの低いレベル、ＭＳ患者におけるそれらの高いレベルならびに抗グリカン抗体の一時的な高い安定性は、抗Ｇｌｃ（α）および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭが、早期診断、薬物の早期処方、薬物の効果のモニタリングおよび発作の早期検出に対する生物マーカーとしての役目を果たし得ることを示唆する。
【００５８】
ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｄ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用して、全ての血清サンプルを試験した。グリカンは、以前に記載された（ＷＯ０２／０６４５５６）ように、リンカーを介してプラスチック表面に共有結合していた。試験した単糖およびオリゴ糖を記載する一覧表は、表１に提供される。
【００５９】
ＩｓｒａｅｌのＴｅｌ−ＡｖｉｖのＨｅｌｓｉｎｋｉ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｅｔｈｉｃａｌ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｌｉｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒおよびＩｓｒａｅｌのＨａｉｆａのＣａｒｍｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒによって承認されたインフォームドコンセントプロトコルの下で、明らかに健常な血液ドナーから血液サンプルを得た。ＩｓｒａｅｌのＨａｉｆａのＣａｒｍｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＭｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃに認められたＭＳ患者から血液サンプルを回収した。凝血塊から血清を分離するために、血液サンプルを、空にしたシリコーン被覆ゲル含有チューブ中に回収した（Ｅｓｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。血液の凝固の後、血清を遠心により分離し、回収した。サンプルは使用するまで、−２５℃で凍結保存した。
【００６０】
グリカンアレイに添加した全容液の体積は、１０μｌ／ウェルであった。血清を、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、０．０８５Ｍ  Ｍｇ２ＳＯ４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中に希釈（１：２０；飽和濃度）し、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ２００自動処理システムを使用してグリカンアレイプレートに分配し、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートを自動プレート洗浄器（Ｔｅｃａｎ、ＰｏｗｅｒＷａｓｈｅｒＴＭ）中で、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を含む２５０μＬ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。この時点で、１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴに希釈した以下の試薬を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４分配器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して添加し、そして、３７℃で６０分間インキュベートした：ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの決定については、それぞれのサブクラスの特定のビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）をそれぞれ２．８μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌおよび０．９μｇ／ｍｌ；総Ｉｇの決定については、ビオチン化タンパク質Ａ（１μｇ／ｍｌ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）。ＰＢＳＴで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中に希釈したストレプトアビジン結合ユーロピウム（０．１μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、その後３７℃で暗所で、３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳＴで洗浄した。次いで、ＤｅｌｆｉａＴＭ増強溶液を各ウェルに添加し、その後プレートを室温で暗所で、３０〜４５分間インキュベートした。ウェルの蛍光を、３４０／６１２ｎｍ（励起／発光）の時間分解蛍光設定を使用するＶｉｃｔｏｒ  １４２０（Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）プレートリーダーで読み取った。
【００６１】
（抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ抗体および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ抗体の血清中のレベルにおける、発作中のＭＳ患者と安定ＭＳ患者と健常集団との間の相違）
血清サンプルを、定期試験のために外来診療所を訪れたＭＳ患者から、彼らがインフォームドコンセント書類に署名した後で入手した。患者群は、８０％が女性であった。これは、一般的なＭＳ人口における男女比をほぼ反映している。公表されたデータ（Ｒｉｔｃｈｉｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１２：３６３−７０，１９９８）に従い、男性と比較した場合、健常女性およびＭＳ女性の両方由来の血清において、著しく高いレベルのＩｇＭ抗体が観察された（しかし、ＩｇＧまたはＩｇＡでは観察されなかった）（示さず）。従って、分析を、ＭＳ女性部分集団および健常女性部分集団のみに限定した。ＭＳとしての１つの急性脱髄性事象を有する患者を確認するマーカー、および疾患の悪化期にある患者と回復期にある患者とを識別するマーカーを同定する目的で、始めにＭＳ患者の血清を、５４のグリカン（表１）においてＩｇＧ抗グリカン抗体、ＩｇＭ抗グリカン抗体およびＩｇＡ抗グリカン抗体の存在についてスクリーニングした。５４のグリカンのうちの５つを用い、最初の回において見出された群の間の幾つかの相違について実験を２回繰り返した。
【００６２】
これらの研究において、ＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）抗体のレベルおよび抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体のレベルにおける再現性がありかつ統計的に有意な相違が、健常群とＭＳ群との間に見出された（図７Ａ）が、ＩｇＧレベルまたはＩｇＡレベルにおいて有意な相違は見出されなかった（示さず）。ＭＳ患者の両群の血清において、ＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）のレベルは、健常集団におけるより有意に高かった。抗体セット最適カットオフ値（「健常」集団のシグナルの百分率９７％）を使用し、カットオフ値より上の陽性サンプルおよびカットオフ値より下の陰性サンプルを同定した。従って、抗Ｇｌｃ（α）結合シグナルは、４２のＭＳサンプルから１９（４５％感度）を、および４４の明らかに健常な血清サンプルから４２（９６％特異度）を、正確に同定した。抗マルトース結合の測定は、ＭＳ血清の４８％および明らかに健常な血清サンプルの９５％を正確に同定した。抗Ｇｌｃ（α）アッセイまたは抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）アッセイのどちらかにおいて、シグナルがカットオフ値を上回るサンプルを陽性と定義することにより、感度を６０％まで改善し、かつ９３％の特異度を保つ（表２）。疾患の悪化期および回復期にある患者における抗Ｇｌｃ（α）抗体および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体の差次的分布は、前者の群において有意に高かった（図７Ｂ）。未処置患者とインターフェロンβで処置した患者との間に、相違は見出されなかった（示さず）。「安定」ＭＳ集団の百分率８０％のカットオフ値として使用して、抗Ｇｌｃ（α）結合シグナルが、１８の「発作」サンプルから１５（８３％感度）を、２４の「安定な」サンプルから１９（無徴候である安定に関して７９％特異度）を、そして４４の「健常」サンプルから４２（９５％特異度）を正確に同定したことを決定した。抗マルトース結合の測定は、発作血清の７２％、「安定」血清の７９％、および「健常血清」の９７％を正確に同定した。Ｇｌｃ（α）アッセイまたはマルトースアッセイにおいてシグナルがカットオフ値を上回るサンプルを陽性と定義することにより、「安定」サンプルまたは「健常」サンプルに関連して、それぞれ８９％の感度ならびに７１％および９５％の特異度を得る（表３）。抗Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ抗体および抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）ＩｇＭ抗体の高い特異度および感度は、これらの抗体を、ＭＳ患者の早期の診断および決定のための効率的なツールにする。ＭＳ発作状況におけるこれらの抗体のレベルが、安定状態より高いという事実は、これらの抗体を、再発回復ＭＳ患者における発作の早期の同定および予測のためのツールにする。
【００６３】
ＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）抗体の保有について陽性であると（上述のように）定義された、臨床的に診断された女性（再発−回復）ＭＳ患者におけるＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）抗体血清レベルと、女性のＥＤＳＳ（拡大障害状態尺度）スコアとの間に、高い相関関係が観察された（図８、左側のボックスを参照）。ＥＤＳＳと、ＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）抗体の保有について陰性であると定義された、臨床的に診断された女性（再発−回復）ＭＳ患者の血清におけるＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）抗体レベルとの間に、相関関係はなかった（図８、左側のボックスを参照）。この高い相関関係は、血清におけるＩｇＭ抗Ｇｌｃ（α）のレベルが、疾患の活性の評価のための分子代替生物マーカー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）として作用し得ることを示す。
【００６４】
（抗グリカン抗体レベルの時間的な範囲）
代替の生物マーカーとして使用するためのなんらかの生物学的パラメータを考慮する場合、正常集団において生物マーカーが時間における変数ではないことは、明らかに必要条件である。従って、７人の健常な志願者における、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの抗−Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体、抗ＧｌｃＮＡｃ（α）抗体、および抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）（βセロトリオース（Ｃｅｌｌｏｔｒｉｏｓｅ））抗体の血清レベルを、１３週間にわたって追跡した（図９）。一般に、血清抗体濃度は、別々の個体間で異なるが、時間にわたって極めて安定であることが見出される。例えば、血清番号９１６１および番号９１６２は、それぞれＩｇＡ抗ＧｌｃＮＡｃ（α）抗体およびＧｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体の非常に高くかつ時間的に安定な相対レベルを有するが、ＩｇＡ抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体ならびにＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の比較的正常なレベルを有する。抗体レベルにおける変化が起こる場合、これらは、しばしば漸進的であり、そして数週間にわたって続く（例えば、血清番号９１６２；ＩｇＡ抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β））が、急激でもまたあり得る（例えば、４週目と５週目との間で急激に上昇し、次いで再びその基本レベルまでゆっくりと戻る、血清番号９１７２；ＩｇＭ抗−Ｌ−Ｒｈａ（α））。
【００６５】
（実施例４．正常ヒト集団における抗グリカン抗体プロフィール（ＡＧＡＰ））
３４の単糖類およびオリゴ糖類への７２の独立した血清の総Ｉｇ抗体の結合（タンパク質Ａで検出される）（図１１および表５）、ならびに６の単糖類および多糖類への２００の血清のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの結合（図１５Ａ〜Ｃ）を、測定した。抗体について、ＧｌｃＮＡｃ（α）およびＬ−Ｒｈａ（α）に対して最強のシグナルが記録され、一方で、グルコースのβ４連結多糖類、ＧｌｃＮＡｃ（β）、ＧｌｃＮＡＣ（β１−４）ＧｌｃＮＡＣ（β）、Ｇａｌ（α）およびＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）に対して、最低のレベルが観察された。これは、以前に公開されたデータとよく一致する。このデータは、市販のヒト血清プールにおける抗グリカン抗体の分布を示す（ＷＯ０２／０６４５５６）。ＩｇＧサブクラスおよびＩｇＡサブクラスのＡＧＡＰは、総Ｉｇ  ＡＧＡＰに類似し、一方で、ＩｇＭのＡＧＡＰは、より低くかつ異なったグリカンの間でより均一である。集団の抗グリカン抗体は、対数正規分布に適合する傾向があった（図１５Ａ〜１５Ｃを参照）。試験した集団内の個体の間で抗グリカン抗体レベルのかなりの変動があることは明白であり、実際に独立したＡＧＡＰの存在を示唆するが、少量で存在する抗グリカン抗体に対するマーカーの検索を制限する。
【００６６】
グリカンをビーズ上に固定化し、また、アフィニティビーズは、グルコースおよびＬ−Ｒｈａ（α）のβ４連結オリゴ糖類に対する抗体を精製するために使用されている。これらの結合プロフィールおよび特異度を、図１３、図１４Ａおよび図１４Ｂに記載する。
【００６７】
（実施例８．受攻（ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ）プラークを有する高危険度アテローム硬化症患者と安定プラークを有する低危険度アテローム硬化症患者との間を区別するための抗グリカン抗体の使用）
受攻プラークを有するアテローム硬化症患者の血清中の抗グリカン抗体のレベルを、安定プラークを有するアテローム硬化症患者の血清およびアテローム硬化症でない個体の血清中の抗グリカン抗体のレベルと比較した。
【００６８】
アテローム硬化症は、先進国における有病率および死亡率の主要な原因である。これは、血管壁の全身性障害であり、血管壁上にアテローム硬化性プラークの発生をもたらす。これらのプラークの幾つかは、後に破裂しやすくなり（ｂｅｃｏｍｅ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｔｏ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心臓発作や卒中をもたらす凝血塊を生じる。
【００６９】
アテローム硬化性プラークの主成分は、プロテオグリカン、脂質、筋細胞および白血球（Ｔ細胞およびマクロファージ）である。さらに、アテローム硬化症は、自己免疫疾患として認知され、ここで、その発動因子の１つが細菌抗原に対する抗体と血管壁上の抗原との間で交差反応性である。
【００７０】
アテローム硬化症の発達における重要な点は、低危険度を有する安定プラーク（ＳＰ）から、高危険度を有する炎症性受攻プラーク（ＶＰ）への転換である。ＳＰとＶＰとの間の識別は、臨床的に不確かであり、決定的な区別は、死後の死体解剖によってのみ行われ得る。
【００７１】
血清サンプルの入手は、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｉｓｒａｅｌ）の循環器科のＪａｃｏｂ  Ｇｅｏｒｇｅ博士による。全ての患者は、３０〜６９の範囲の年齢の、非糖尿病男性であった。以下の型からの患者の３９の血清サンプルを、試験した：
不安定アンギナ−急性冠動脈症候群（Ｑ波心筋梗塞または非Ｑ波心筋梗塞）を有すると特徴付けた１３人のアテローム硬化症患者。両者は、受攻プラークの破裂から発達すると考えられる。不安定アンギナ群のメンバーに、胸部疼痛およびＥＧＧ変化または心臓マーカー上昇を有すると認めた急性冠動脈症候群患者を含めた。彼らは、アンギナの最近（＜３日）の発症を訴え、入院の間に連続の心電図（ＥＣＧ）遠隔測定モニタリングを受けた。静止アンギナの少なくとも１つの発症または最近の４８時間の間に２０分を超えて続く発症を、クレアチンキナーゼの上昇、ＭＢレベルまたはトロポニンレベルと共に検出した。この群のメンバーは、冠動脈造影を受けており（カテーテル法）、これは、冠動脈アテローム硬化症の存在を実証した。
【００７２】
安定アンギナ−１３人のアテローム硬化症患者を、安定アンギナを有すると特徴付けた。安定アンギナ群のメンバーは、冠動脈造影を受けており（カテーテル法）、これは、冠動脈アテローム硬化症の存在を実証した。ＥＧＧ変化もなく、クレアチンキナーゼの上昇、ＭＢレベルまたはトロポニンレベルも検出されなかった。
【００７３】
プラーク無し−正常な冠動脈を有する１３人の患者。「プラーク無し」群のメンバーは、カテーテル後の冠動脈アテローム硬化症の証拠を示さなかった。
【００７４】
ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｄ，Ｉｓｒａｅｌ，カタログ番号９１００）を使用して、ＷＯ００／４９４１２に記載の手順を用いて構築した抗グリカン抗体プロフィールを得た。単糖類およびオリゴ糖類に共有的に結合したアレイを含む、ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）プレート（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｄ，Ｉｓｒａｅｌ，カタログ番号９１００）を使用して、換算体積３８４ウェルマイクロタイタープレートで、全ての血清サンプルを試験した。アレイ上に提示した単糖類およびオリゴ糖類ならびにその整理番号のリストを、表４に示す。
【００７５】
血清を、ＴＢＳＴ中で希釈し（１：２０）、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ２００ロボットを使用して、ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）プレート中に分配し（１０μＬ／ウェル）、そして摂氏２５度で、３０分間インキュベートした。プレート上の各グリカンサンプルおよび血清サンプルを、８回試験した。
【００７６】
このプレートを、自動プレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ，ＰｏｗｅｒＷａｓｈｅｒＴＭ）中で、２５０μＬ／ウェルの高塩緩衝液（０．１５Ｍ  ＫＮａ（ｐＨ７．２）、ＮａＣｌ  ２Ｍ、ＭｇＳＯ４  ０．０８５Ｍ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。１０μＬ／ウェルのビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）（ＴＢＳＴ中１μｇ／ｍｌ）を、手動で分配し、そしてプレートを、２５℃で３０分間インキュベートした。プレートを、高塩緩衝液で再び洗浄した。
【００７７】
ストレプトアビジン結合ユーロピウム（Ｗａｌｌａｃ，ＡＤ００６２）（１μ／ｍｌ、１０μｌ／ウェル）を手動で加え、その後、暗所で２５℃で３０分間インキュベートした。高塩緩衝液でのプレートの洗浄を繰り返した。ＤｅｌｆｉａＴＭ強化緩衝液（Ｗａｌｌａｃ、７３０２３２、１０μｌ／ウェル）をウェルに添加し、暗所で少なくとも３０分間プレートをインキュベートした。ウェルの蛍光を、発光６１２ｎｍおよび励起３４０ｎｍの時間分解蛍光設定を用いて、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【００７８】
「プラーク無し」群について得られたグリカン結合シグナルを使用して、各グリカンについてのカットオフ値を計算した。このカットオフ値より上の患者を、陽性と見なした。これらのカットオフ値を、「プラーク無し」群＋１または２標準偏差の平均シグナルとして定義した。この定義に従い、患者群間のある程度の分離力を有する多くのグリカンを同定した（以下を参照）。特定のグリカンに基づく「分離」を、「不安定アンギナ」群または「安定アンギナ」群における少なくとも５０％（７／１３）陽性のサンプルおよび「プラーク無し」群における２以下の陽性サンプルとして定義した。
【００７９】
図１６Ａは、不安定アンギナまたは安定アンギナを罹患する患者の血清を試験するために使用されたグリカンの行列の図である。このグリカン構造を、表４に記載する。有意に異なる抗体レベルに対するグリカンを、別々の患者群において測定し、塗りつぶした四角（ｆｉｌｌｅｄ  ｓｑｕａｒｅ）で印をつけた。平均＋２標準偏差のカットオフレベルにおいて、「分離」は、ＩｇＡの２つの異なったグリカンへの結合によって達成された。ＩｇＧ抗体間を分離し得たが、ＩｇＭ抗体間を分離し得なかった。
【００８０】
最高の分離を示した１つのグリカンを、以下に示す：
【００８１】
【化１】
0004721703.tif 000002
「分離」と定義されなかった幾つかのグリカンは、まだある程度の分離を示す。組み合わせて使用される場合、分離は、１つのグリカンの分離を超えて改善され得る。グリカンを以下に示す。
【００８２】
【化２】
0004721703.tif 000003
図１６Ｂは、３患者群における、グリカン番号２および番号２９に対する抗体のレベルを示すグラフの図である。ボックスは、集団の５０％のシグナルを含む。ボックス内の太線および細線は、それぞれ平均および中央値を表す。０に最も近いボックスの境界は、２５％を示し、そして０から最も遠いボックスの境界は、７５％を示す。ボックスの上下のひげは、９０％および１０％を示す。
【００８３】
図１７は、３患者群におけるグリカン番号２またはグリカン番号２９に対する抗ＩｇＡ抗体について陽性な、サンプルの数を示す棒グラフである。
【００８４】
図１８Ａは、３患者群における、グリカン番号２およびグリカン番号１５に対する抗体レベルの分布を示す棒グラフである。ボックスは、集団の５０％のシグナルを含む。ボックス内の太線および細線は、それぞれ平均および中央値を表す。０に最も近いボックスの境界は、２５％を示し、そして０から最も遠いボックスの境界は、７５％を示す。ボックスの上下のひげは、９０％および１０％を示す。
【００８５】
図１８Ｂは、３患者群における、グリカン番号２またはグリカン番号１５に対する抗ＩｇＡ抗体について陽性なサンプルの数を示す棒グラフである。平均＋１標準偏差のカットオフレベルにおいて、「分離」は、ＩｇＡの６つの異なったグリカンへの結合によって達成された。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体レベルは、３群で異ならなかった。
【００８６】
組み合わせで得られた分離を、以下に示す（「安定アンギナ」群における陽性サンプルの数はＡｂを用いるより低く、従って「不安定アンギナ」群に対する分離を改善するので、Ａａを用いた）：
【００８７】
【化３】
0004721703.tif 000004
従って、ＡａおよびＧＮｂ４ＧＮｂを用いて「不安定アンギナ」を検出する試験の特異度および感度は、それぞれ６２％（８／１３）および８８％（２３／２６）であった。
【００８８】
３つのグリカン（Ａａ、ＧＮｂ４ＧＮｂ、およびＦｂ）の組み合わせにより、「安定アンギナ」群についてもまた、７５％（９／１３）の特異度を決定することが可能になった。これは、Ｆｂが主に「安定アンギナ」を検出する事実に由来する。組み合わせアッセイの特異度および感度を、図１９にまとめる。
【００８９】
これらの結果は、グリカン（Ｇａｌ（α）、ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）およびＦｕ（β））の組み合わせを使用して、安定アンギナ集団と不安定アンギナ集団との間を、６２％の特異度および８８％の感度で首尾よく識別し得ることを実証する。この結果は、不安定アンギナ患者と安定アンギナ患者との間を識別するＩｇＡ抗体に結合するグリカンに基づく生物マーカーを開発し得ることを示す。
【００９０】
（実施例９．受攻プラークを有する高危険度アテローム硬化症患者と安定プラークを有する低危険度アテローム硬化症患者との間を区別するための抗グリカン抗体の使用）
受攻プラークを有するアテローム硬化症患者の血清中の抗グリカン抗体のレベルを、安定プラークを有するアテローム硬化症患者の血清およびアテローム硬化症でない個体の血清中の抗グリカン抗体のレベルと比較した。
【００９１】
アテローム硬化症は、先進国における有病率および死亡率の主要な原因である。これは、血管壁の全身性障害であり、血管壁上にアテローム硬化性プラークの発生をもたらす。これらのプラークの幾つかは、後に破裂しやすくなり（ｂｅｃｏｍｅ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｔｏ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心臓発作や卒中をもたらす凝血塊を生じる。
【００９２】
アテローム硬化性プラークの主成分は、プロテオグリカン、脂質、筋細胞および白血球（Ｔ細胞およびマクロファージ）である。さらに、アテローム硬化症は、自己免疫疾患として認知され、ここで、その発動因子の１つが細菌抗原に対する抗体と血管壁上の抗原との間で交差反応性である。
【００９３】
アテローム硬化症の発達における重要な点は、低危険度を有する安定プラーク（ＳＰ）から、高危険度を有する炎症性受攻プラーク（ＶＰ）への転換である。ＳＰとＶＰとの間の識別は、臨床的に不確かであり、決定的な区別は、死後の死体解剖によってのみ行われ得る。
【００９４】
血清サンプルの入手は、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｉｓｒａｅｌ）の循環器科のＪａｃｏｂ  Ｇｅｏｒｇｅ博士による。全ての患者は、３０〜６９の範囲の年齢の、非糖尿病男性であった。以下の型からの患者の７２の血清サンプルを、試験した：
不安定アンギナ−急性冠動脈症候群（Ｑ波心筋梗塞または非Ｑ波心筋梗塞）を有すると特徴付けた２４人のアテローム硬化症患者。両者は、受攻プラークの破裂から発達すると考えられる。不安定アンギナ群のメンバーに、胸部疼痛およびＥＧＧ変化または心臓マーカー上昇を有すると認めた急性冠動脈症候群患者を含めた。彼らは、アンギナの最近（＜３日）の発症を訴え、入院の間に連続の心電図（ＥＣＧ）遠隔測定モニタリングを受けた。静止アンギナの少なくとも１つの発症または最近の４８時間の間に２０分を超えて続く発症を、クレアチンキナーゼの上昇、ＭＢレベルまたはトロポニンレベルと共に検出した。この群のメンバーは、冠動脈造影を受けており（カテーテル法）、これは、冠動脈アテローム硬化症の存在を実証した。
【００９５】
安定アンギナ−２４人のアテローム硬化症患者を、安定アンギナを有すると特徴付けた。安定アンギナ群のメンバーは、冠動脈造影を受けており（カテーテル法）、これは、冠動脈アテローム硬化症の存在を実証した。ＥＧＧ変化もなく、クレアチンキナーゼの上昇、ＭＢレベルまたはトロポニンレベルも検出されなかった。
【００９６】
プラーク無し−正常な冠動脈を有する２４人の患者。「プラーク無し」群のメンバーは、カテーテル後の冠動脈アテローム硬化症の証拠を示さなかった。
【００９７】
ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｄ，Ｉｓｒａｅｌ，カタログ番号９１００）を使用して、ＷＯ００／４９４１２に記載の手順を用いて構築した抗グリカン抗体プロフィールを得た。単糖類およびオリゴ糖類に共有的に結合したアレイを含む、ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）プレート（Ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｄ，Ｉｓｒａｅｌ，カタログ番号９１００）を使用して、換算体積３８４ウェルマイクロタイタープレートで、全ての血清サンプルを試験した。アレイ上に提示した単糖類およびオリゴ糖類ならびにその整理番号のリストを、表４に示す。
【００９８】
血清を、ＴＢＳＴ中で希釈し（１：２０）、Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ２００ロボットを使用して、ＧｌｙｃｏＣｈｉｐ（登録商標）プレート中に分配し（１０μＬ／ウェル）、そして摂氏２５度で、３０分間インキュベートした。プレート上の各グリカンサンプルおよび血清サンプルを、８回試験した。
【００９９】
このプレートを、自動プレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ，ＰｏｗｅｒＷａｓｈｅｒＴＭ）中で、２５０μＬ／ウェルの高塩緩衝液（０．１５Ｍ  ＫＮａ（ｐＨ７．２）、ＮａＣｌ  ２Ｍ、ＭｇＳＯ４  ０．０８５Ｍ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。１０μＬ／ウェルのビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）（ＴＢＳＴ中１μｇ／ｍｌ）を、手動で分配し、そしてプレートを、２５℃で３０分間インキュベートした。プレートを、高塩緩衝液で再び洗浄した。
【０１００】
ストレプトアビジン結合ユーロピウム（Ｗａｌｌａｃ，ＡＤ００６２）（１μ／ｍｌ、１０μｌ／ウェル）を手動で加え、その後、暗所で２５℃で３０分間インキュベートした。高塩緩衝液でのプレートの洗浄を繰り返した。ＤｅｌｆｉａＴＭ強化緩衝液（Ｗａｌｌａｃ、７３０２３２、１０μｌ／ウェル）をウェルに添加し、暗所で少なくとも３０分間プレートをインキュベートした。ウェルの蛍光を、発光６１２ｎｍおよび励起３４０ｎｍの時間分解蛍光設定を用いて、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１０１】
正常集団の８０％から、カットオフを計算した。この区別に従い、患者群間のある程度の分離力を有する多くのグリカンを同定した（以下を参照）。特定のグリカンに基づく「分離」を、「不安定アンギナ」群または「安定アンギナ」群における少なくとも５０％（１２／２４）陽性のサンプルおよび「プラーク無し」群における５以下の陽性サンプルとして定義した。
【０１０２】
【化４】
0004721703.tif 000005
これらの結果は、Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）、Ｇｌｃ（β）、ＧａｌＮＡｃ（α）、ＧａｌＮＡｃ（β）、ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）およびキシロース（α）のグリカンの組み合わせを使用し、安定アンギナ集団と不安定アンギナ集団との間を首尾よく識別し得ることを実証する。この結果は、不安定アンギナ患者と安定アンギナ患者との間を識別するＩｇＡ抗体に結合するグリカンに基づく生物マーカーを開発し得ることを示す。
【０１０３】
（実施例１０．固体基材に固定化された多数のグリカンへのＣＤ４＋細胞の結合）
７人の健常個体からのＣＤ４＋細胞の、マイクロアレイ上に固定化された４７の異なったグリカンフラグメントへの結合を試験した。
【０１０４】
（材料および方法）
１０ｍｌ  ＥＤＴＡ−バキュテイナー（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）を使用して、７個体のそれぞれから２０ｍｌの新鮮血を採取した。抹消細胞サンプルを、遠心分離した（２３０×ｇ、９００ＲＰＭ、室温で１０分間）。次いで、血漿を分離し、そして細胞画分の上部２ｍｌを１５ｍｌチューブに移した。ＣＤ４＋細胞の富化のために、１００μｌのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ試薬をチューブに加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、このサンプルをＰＢＳ／２％  ＦＣＳ中で２倍に希釈し、そしてガラスパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットを用いて、５ｍｌのＦｉｃｏｌｌを細胞懸濁液の下に層状に入れた。
【０１０５】
チューブを、遠心分離機のブレーキを切って、２４００ＲＰＭ（約７００×ｇ）で、３０分間室温で遠心分離した。遠心分離後、遠心分離機からチューブを注意深く取り出した。滅菌したピペットを用いて上層をゆっくりと吸い出し、境界を乱さないようにリンパ球層を残した。滅菌ピペットを用い、白血球層を清潔なチューブに移し、そしてチューブをＰＢＳ／２％  ＦＣＳで完全に満たした。細胞を、２３０×ｇ（１０００ＲＰＭ）で１０分間遠心分離することにより２回洗浄し、ＰＢＳ／２％  ＦＳＣに再懸濁した。遠心分離後、細胞を、５００μｌ  ＰＲＭＩ／１６４０  ２％  ＦＣＳ中に再懸濁した。
【０１０６】
細胞を、Ｔｕｅｒｋ溶液中で１：１０に希釈し、計数した。計数後、細胞を、ＲＰＭＩ／１６４０  ２％  ＦＣＳ中５×１０６細胞／ｍｌの濃度で希釈し、次いで、２４ウェルプレート中に１ｍｌ／ウェルで入れた。細胞懸濁液を、９５％湿度、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートした。
【０１０７】
細胞分離効率（ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄ）をＦＡＣＳ分離によって決定するため、２５０，０００個の細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、次いで２０００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離した。上清をデカントした。細胞を、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、５μｌの抗ＣＤ４抗体で標識した。細胞を、氷上で３０分間インキュベートし、光から保護した。１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、そして２０００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離した。次いで、細胞を、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、氷上で保存し、そしてＦＡＣＳ機器でスコアを記録した。
【０１０８】
ＧｌｙｃｏＣｈｉｐＴＭをスライドホルダーに置き、湿度を保つため、プラスチック容器内に湿らせた紙と共に入れた。細胞懸濁液を、ＧｌｙｃｏＣｈｉｐＴＭ上に１．２μｌ／ウェルで置き、次いで、５％  ＣＯ２インキュベーター（９５％湿度、３７℃）内で１時間インキュベートした。インキュベートした後、ＰＢＳ中に浸した遠心分離チャンバー内に、スライドをゆっくりと裏返して置いた。ＧｌｙｃｏＣｈｉｐＴＭを、７００ＲＰＭ（最小ｇ力、約５０×ｇ）で２分間遠心分離した。スライドを、顕微鏡で観察し、そしてＰＢＳ／３．７％  ホルムアミド中で、室温で少なくとも３０分間固定した。次いで、スライドを、ＤＤＷ中でゆっくりと３回洗浄し、そして風乾した。
【０１０９】
ヨウ化プロピジウム溶液をＰＢＳ中で調製し、そして１．２μｌ／ウェルで入れた。ＧｌｙｃｏＣｈｉｐＴＭを、湿潤条件下で１５分間インキュベートし、次いで、ＤＤＷ中に浸すことによって穏やかに３回リンスした。スライドを暗所で風乾し、ヨウ化プロピジウム設定（励起５３５ｎｍ、発光６５５ｎｍ）で、アレイスキャナでスキャンした。画像を分析し、細胞密度を決定した。
【０１１０】
（結果）
結合研究に使用したグリカンおよびコントロールを、以下の図２０に示す。構造は、ＬｉｎｅａｒＣｏｄｅ（登録商標）シンタックスに記載される。変換については、表１を参照のこと。
【０１１１】
種々のグリカンに対する単一個体由来のＣＤ４＋細胞の結合プロフィールを示す棒グラフを、図２０に示す。各グリカンまたはコントロールについて、結合をＤＬＵ／ｍｍ２で示す。グリカンまたはコントロールに結合する、７人の個体由来のＣＤ４＋細胞を、図２１Ａに示す。図２１Ａは、７人の各個体由来のＣＤ４＋細胞についての相対蛍光中央値を示す。
【０１１２】
これらの結果は、ＣＤ４＋細胞の結合が、種々のグリカンの間で異なることを実証する。最強の結合は、以下のグリカンに対してその相対的親和性の順番で観察された：ＣＤ４＋細胞は、ＬｉｎｅａｒＣｏｄｅ（登録商標）に提供された以下のグリカンを結合する；ＮＮａ３Ａｂ４（Ｆａ３）ＧＮｂ＞Ｍｂ４Ｇｂ＞ＧＮｂ４ＧＮｂ＞Ｍａ３Ｍａ＞Ａｂ６Ａｂ。また、末端マンノース残基を有するグリカンまたはＳｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ残基を有するグリカンへのＣＤ４＋細胞の結合を、検出した。また、特定のグリカンへのＣＤ４＋結合の変動を、種々の個体間で検出した。
【０１１３】
（他の実施形態）
本発明はその詳細な記載に関連して記載されているが、上記の記載は例証を意図し、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが理解される。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲の範囲内である。
【０１１４】
【表１−１】
0004721703.tif 000006
【０１１５】
【表１−２】
0004721703.tif 000007
【０１１６】
【表２】
0004721703.tif 000008
【０１１７】
【表３】
0004721703.tif 000009
【０１１８】
【表４−１】
0004721703.tif 000010
【０１１９】
【表４−２】
0004721703.tif 000011
【０１２０】
【表５】
0004721703.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、ＭＳが疑われる患者が実際にＭＳを有することを決定するための決定樹を示す。
【図２】図２は、抗Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）抗体またはＧｌｃ（α）抗体のレベルに基づいて、ＭＳ患者に対する薬物および投薬量を選択するための決定樹を示す。
【図３】図３は、ＭＳ患者における発作の予測および初期診断のための決定樹を示す。
【図４】図４は、ＭＳ患者ならびに正常な個体の種々の抗グリカン抗体の結合に由来する相対的な蛍光を示す表である。グリカン構造は、表の上部の行に、ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ（登録商標）シンタックスに示される。
【図５】図５は、ＭＳ患者から抽出される血清対正常なコントロール血清に由来する種々のグリカンに対する抗グリカン抗体の平均シグナルおよび中央値シグナルを示す。グリカン構造は、ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ（登録商標）シンタックスに示される。
【図６】図６は、ＭＳ個体と健常な個体との間の平均シグナルの違いを示すグラフであって、線は、標準偏差を示す。グリカン構造は、ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ（登録商標）シンタックスに示される。
【図７】図７Ａは、ＭＳ集団および健常な集団における抗Ｇｌｃ（α）、（グリカン＃１１）とＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）、（グリカン＃１２）ＩｇＭとの結合に由来する平均シグナルを示すグラフである。図７Ｂは、発作状態のＭＳ患者集団、安定なＭＳ患者集団および健常な集団における抗Ｇｌｃ（α）グリカン＃１１とＧｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α）グリカン＃１２ＩｇＭとの結合に由来する平均シグナルを示すグラフである。
【図８】図８は、抗Ｇｌｃ（α）ポジティブＭＳ患者（左の囲み）サンプルおよびネガティブＭＳ患者（右の囲み）サンプルにおける抗グルコースαＩｇＭ抗体の接着に由来する相対的な蛍光とそれらのＥＤＳＳレベルとの間の関係を示すグラフである。
【図９】図９は、７の健常な個体における１３週にわたるＩｇＭ抗グリカン抗体、ＩｇＧグリカン抗体およびＩｇＡ抗グリカン抗体の結合に由来するシグナルの一時的な安定性を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、グリカンアレイ、化学構造、レクチン相互作用の特異性および再現性を示す。図１０Ａは、リンカーを介してその還元末端で固体表面に共有結合したｐ−アミノフェニルＰ−サッカライドを示す。  図１０Ｂは、グリカンアレイに対するビオチン化ＷＧＡの結合のバッチ間の再現性を示す。アレイの３つの別のバッチを、ビオチン化ＷＧＡを使用して同時にアッセイした。  図１０Ｃは、Ｍａｎ（α）に結合するＣｏｎＡを用いた競合アッセイを示す。可溶性マンノースまたはＧａｌ（β１−４）Ｇｌｃの濃度を増加させて、ビオチン化ＣｏｎＡ（１．５μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートし、ユーロピウムに結合したストレプトアビジンを使用して検出した。  図１０Ｄは、種々のアノマーに結合するレクチンの特異性を示す。ＣｏｎＡは、ネガティブコントロールであるＧｌｙｃｅｒｏｌ（１９）、Ｍａｎ（α）（２６）およびＭａｎ（β）（２７）に結合する。ＧＳＩは、Ｇａｌ（α）（１）、Ｇａｌ（β）（２）、ＧａｌＮＡｃ（α）（７）およびＧａｌＮａｃ（β）（８）に結合する。  図１０Ｅは、グリカンアレイのプレート間の再現性を示す。ＧｌｃＮａｃ（β）を示す５つの同一のプレートを、ビオチン化ＷＧＡでプローブした。
【図１１】図１１は、健常なヒト集団のグリカン結合プロフィールを示す。７２個体に由来する血清サンプル中の類別されたグリカン（グリカン構造については、表５を参照のこと）に結合する抗炭水化物抗体を、ビオチン化タンパク質Ａで測定した。各点は、２つの実験の平均を示し、それぞれは、４連でなされた。この四角は、集団の５０％のシグナルを含む。四角中の太い線および細い線は、それぞれ平均値および中央値を表す。最も０に近い四角の境目は、２５％の点を示し、０から最も遠い四角の境目は、７５％の点を示す。四角の上のひげおよび下のひげは、９０％の点および１０％の点を示す。測定した非特異的なシグナルのレベルを、実験的に規定した。抗体のレベルが比較的低く、実験間で大きく変動することが見出されたグリカンを、バックグランドレベルを定義するために指定した（示さず）。これらのグリカンに対する平均シグナル値を、各血清サンプルおよび特定のグリカンから得たシグナルから計算し、減算した。平均バックグランドは、３×１０５ＲＦＵであった。ＴＢＳＴは、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水である（実験プロトコルを参照のこと。）。
【図１２】図１２は、一連のグリカンに対する個々の血清のシグナルを示す。相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した抗グリカン抗体結合を、単調で、非直線的なマッピングを用いるヒストグラム均等化様の方法（ｈｉｓｔｏｇｒａｍ  ｅｑｕａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して変換した。この方法で、ＲＦＵ値を０（青）と２５５（赤）との間の範囲で再評価した。このデータを、シミュレートしたアニーリングアルゴリズムを使用して、クラスター形成した。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、（Ａ）精製された抗Ｌ−Ｒｈａ（α）抗体の、３３グリカンのアレイに対する親和性の結合プロフィール、（Ｂ）精製された抗ＧｌｃＮＡｃ（α）および抗ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）の、３３グリカンのアレイに対する親和性の結合プロフィール、ならびに（Ｃ）精製された抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体および抗ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β）抗体の、３３グリカンアレイに対する親和性の結合プロフィールを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体の特異性を示す。（Ａ）抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体結合の競合阻害。親和性の結合の阻害は、Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ濃度またはＧａｌ（β１−４）Ｇｌｃ濃度の関数としての、ウェル表面に固定化されたｐ−アミノフェニル−β−Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）に対する精製抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体の結合親和性の阻害であった。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、結合した抗体の量を測定した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）抗体の特異性を示す。（Ｂ）結晶性セルロースまたは非晶質セルロースとインキュベーションした後の同系の糖類に対する抗Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β）（Ａ）抗体および抗Ｌ−Ｒｈａ（α）（Ｂ）抗体の結合。ビオチン化したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、結合した抗体の量を測定した。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、示したグリカンに対する健常な個体のＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプおよびＩｇＭアイソタイプの結合のグラフによる表示である。
【図１６】図１６Ａは、不安定なアンギナまたは安定なアンギナを罹患したアテローム性動脈硬化症患者の血清を試験するために使用されたグリカンのマトリックス表示である。種々の患者群で測定した、対する抗体レベルが有意に異なるグリカンを、四角形にうめて標識した。グリカンは、表４に列挙する。図１６Ｂは、３つの患者群：不安定なアテローム性動脈硬化症群、安定なアテローム性動脈硬化症群、および非アテローム性動脈硬化症群におけるグリカン＃２およびグリカン＃２９に対する抗体のレベルを示すグラフによる表示である。四角は、集団の５０％に由来するシグナルを含む。四角中の太い線および細い線は、それぞれ平均値および中央値を表す。０に最も近い四角の境目は、２５％の点を示し、０から最も遠い四角の境目は、７５％の点を示す。四角の上のひげおよび下のひげは、９０％の点および１０％の点を示す。
【図１７】図１７は、グリカン＃２またはグリカン＃２９に対する抗ＩｇＡ抗体に対してポジティブである３つの患者群のサンプルの数を示すヒストグラムである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、３つの患者群におけるグリカン＃２およびグリカン＃１５に対する抗体レベルの分布を示すヒストグラムである。四角は、集団の５０％に由来するシグナルを含む。四角中の太い線および細い線は、それぞれ平均値および中央値を表す。０に最も近い四角の境目は、２５％の点を示し、０から最も遠い四角の境目は、７５％の点を示す。四角の上のひげおよび下のひげは、９０％の点および１０％の点を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、グリカン＃２またはグリカン＃１５に対する抗ＩｇＡ抗体に対してポジティブである３つの患者群のサンプルの数を示すヒストグラムである。
【図１９】図１９は、グリカン＃２、グリカン＃１５、グリカン＃１７およびグリカン＃４９に対する抗ＩｇＡ抗体レベルに基づいた特異度および感度のグラフによる表示である。Ａ−アテローム性動脈硬化症；Ｓ−安定；ＵＳ；不安定；ＮＡ−非アテローム性動脈硬化症。
【図２０】図２０は、単一の個体に由来するＣＤ４＋細胞の種々のグリカンに対する結合プロフィールを示すヒストグラムである。グリカン構造は、ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ（登録商標）シンタックスに示される。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＬＩＮＥＡＲＣＯＤＥ（登録商標）シンタックスに示されるグリカン構造に対する、７の個体のそれぞれに由来するＣＤ４＋細胞についての相対的な蛍光の中央値を示すグラフである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、一連のグリカンに対する個々の血清のシグナルを示す。相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した抗グリカン抗体結合を、単調で、非直線的なマッピングを用いるヒストグラム均等化様の方法を使用して変換した。この方法で、ＲＦＵ値を０（青）と２５５（赤）との間の範囲で再評価した。このデータを、シミュレートしたアニーリングアルゴリズムを使用して、クラスター形成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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