(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養軟骨組織の移植特性を判定する方法であって、コラーゲンゲル包埋法でインビトロ培養された培養軟骨組織の質量を重量測定により測定し、当該測定結果と予め設定された移植適性の基準を比較し、当該比較結果に基づいて培養軟骨組織の移植適性を判定する、培養軟骨組織の移植適性判定方法。
【請求項２】
培養軟骨組織の移植適性を判定する方法であって、コラーゲンゲル包埋法でインビトロ培養された培養軟骨組織の質量を複数回測定し、当該測定結果から得られる質量変化率を算出し、当該質量変化率と予め設定された移植適性の基準を比較し、当該比較結果に基づいて培養軟骨組織の移植適性を判定する、培養軟骨組織の移植適性判定方法。
【請求項３】
培養軟骨組織の製造方法であって、コラーゲンゲル包埋法で軟骨組織をインビトロ培養する培養工程と、当該培養工程中において培養軟骨組織の質量を少なくとも１回は重量測定により測定する測定工程と、当該測定工程と予め設定された移植適性の基準を比較する比較工程と、当該比較結果に基づいて前記培養工程における培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整する調整工程と、を含む移植適性を有する培養軟骨組織の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養組織の移植適性判定方法及び培養組織の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体外（インビトロ）での細胞培養によってヒト組織を再構築し、再構築した培養組織を再び生体へ適用することにより治療を行う再生医療や組織工学が注目を浴びている。
【０００３】
細胞培養により再構築された培養組織を生体に適用する際には、培養組織が移植用組織として適切であるか否かを検査する必要がある。このような移植適性の判定方法の１つとして、培養時に細胞から産生される基質成分を染色剤で染め、その染色状態を基に検査を行う染色法を利用することが考えられる。例えば、軟骨組織の場合、軟骨細胞の産生基質である酸性ムコ多糖類をアルシアンブルーで染色できるので、その染色状態を基に移植用の培養組織として適切な状態であるか否かの判定に利用することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、染色法による検査では定量的な測定情報が得られず、染色時間等の染色条件によっては染色状態が異なるので、データの比較が困難であり、検査判断には経験や熟練が必要とされる。また、検査に際して複数の検査用組織片が別途必要になるので、移植用培養組織とは別に同一ロットの培養組織を検査用組織として多く準備する必要がある。
【０００５】
また、培養細胞は同一の培養期間であっても、採取者（ドナー）の年齢によって増殖能が異なったり、播種密度によって細胞増殖の状態が異なったりするので、培養期間のみによる品質管理では、品質の安定した培養組織を供給することが困難な場合がある。このような場合には、所定の培養時間経過ごとに作業者が顕微鏡観察等を行って個々の培養組織の培養状態を把握し、各々の培養状態に対応させて培養を調整することで品質の安定性を得ている。しかしながら、これらの方法では一連の作業を必要とするため、作業者への負担が大きかった。
【０００６】
本発明は上記従来技術の問題点を鑑み、培養組織の移植適性を客観的に且つ効率よく判定することが可能であり、また客観的な基準により効率よく、安定した品質の培養組織を供給することが可能な培養組織の移植適性判定方法及び製造方法を提供することを技術課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の培養組織の移植適正判定方法は、コラーゲンゲル包埋法でインビトロ培養された培養軟骨組織の質量を重量測定により測定し、当該測定結果と予め設定された移植適性の基準を比較し、当該比較結果に基づいて培養軟骨組織の移植適性を判定することを特徴としている。
【０００８】
本発明の培養組織の移植適正判定方法は、コラーゲンゲル包埋法でインビトロ培養された培養軟骨組織の質量を複数回測定し、当該測定結果から得られる質量変化率を算出し、当該質量変化率と予め設定された移植適性の基準を比較し、当該比較結果に基づいて培養軟骨組織の移植適性を判定することを特徴としている。
【０００９】
本発明の移植適性を有する培養組織の製造方法は、コラーゲンゲル包埋法で軟骨組織をインビトロ培養する培養工程と、当該培養工程中において培養軟骨組織の質量を少なくとも１回は重量測定により測定する測定工程と、当該測定工程と予め設定された移植適性の基準を比較する比較工程と、当該比較結果に基づいて前記培養工程における培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整する調整工程と、を含むことを特徴としている。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の培養組織の移植適性判定方法及び品質管理方法は、それぞれ、培養組織の質量に基づいて移植適性を判定し、又は品質を管理するものであり、また本発明の移植適性を有する培養組織の製造方法は、培養組織の質量を所定時に測定することを含むものである。
【００１１】
培養組織では、細胞の播種後に適切な培養条件で培養することによって、細胞が増殖し、細胞外マトリクス等の基質を産生する。このような培養組織は、基となる細胞の増殖能、殊にドナーの年齢によって増殖率、増殖速度が異なり、同一培養期間であっても培養組織の状態が異なるが、細胞増殖や基質産生等の状態は質量に反映されるため、質量を測定することで培養状態を知ることができる。このため、測定された質量から、客観的に且つ効率よく、移植適性可能な状態であるか否かを判定することができ、品質を管理することができる。また、質量に基づいて品質を管理しながら培養組織を製造するので、安定した品質の培養組織を確実に提供することができる。
【００１２】
ここで「培養組織の質量」とは、成育培地中で培養された組織自体の質量を主として意味する。即ち、培養組織は、培養された細胞と基質、及び基質に保持される成分（水やイオン）とで主として構成されており、このような培養組織自体の質量の他、質量測定時に培養組織に付着及び／又は浸透された培地など、培養組織自体以外であるが、培養組織自体の質量又は培養組織自体の質量の比較において、影響の少ない他の因子の質量が付加された場合も含む。また、本発明において培養組織の質量は、培養組織そのものを測定して直接的に得ることができるが、後述するような種々の測定方法により培養組織の質量を間接的に得ることもできる。本願発明では、このように直接的或いは間接的な測定のどちらであっても、同様の効果を得ることができる。
【００１３】
本発明における培養組織は、インビトロでの培養により再構築されたものであって、組織再生用担体と細胞及び／又は基質とを組み合わせた培養組織を利用する。また、細胞種は軟骨細胞を利用する。この細胞を培養するために用いられる培養液（培地）は、細胞種に応じた既知の如何なる培地をも選択することができる。なお、組織再生用担体と細胞及び／又は基質とを組み合わせた培養組織においては、軟骨細胞又はこの前駆細胞や、間葉系幹細胞を利用することが好ましい。
【００１４】
ここで適用可能な組織再生用担体としては、生体への適合性及び生体吸収性の観点から、コラーゲンを利用し、これは細胞増殖の足場として作用する。
【００１５】
培養組織の質量測定は、慣用の方法を用いて測定することができる。例えば、培養組織の重さを測定することで、実質的に質量を測定することができる。この場合、微量な値でも正確に測定することができる電子天秤が好ましく、市販されている種々のメーカーのものを使用することができる。
【００１６】
培養組織の質量の測定は、無菌的に測定することが好ましい。また、培養組織を培養容器に入れたままの状態で質量測定することは、非接触で培養状態を知ることができるので好ましい。このような場合には、培養容器の質量を補正して、実質的に培養組織の質量を算出してもよい。このように培養容器に入れた状態で測定することで、培養組織に対する汚染を防止することができる。また、移植に使用する培養組織そのものを検査できるので、別途検査用の培養組織を作製する必要がない。
【００１７】
次に、本発明の移植適性の判定方法について説明する。
移植適性の判定は、基準の質量となる適性基準を予め設定しておき、測定結果と適性基準とを比較することで移植適性の判定を行う。これにより、質量といった客観的な基準に基づいて容易に判定することができ、また対象となる培養組織に対して直接的に判定を行うことができるので、別途検査用の培養組織を作製する必要性がなく、効率よく培養組織の移植適性を判定することができる。
【００１８】
培養組織の移植適性は、細胞が充分に増殖し、基質も充分量産生している状態となったときの質量又は、そのような状態になるまでの質量変化率を設定し、これを適性基準とすることができる。標準化してより効率よく移植適性を判定する観点から、質量変化率を適正基準とすることが好ましい。適性基準は、細胞種や培養条件によって異なるので、細胞の播種条件、担体の種類、担体の設置量、培養容器の質量や培地量等を考慮して設定する必要がある。
【００１９】
この適性基準は、実験的に得られる質量データに基づいて設定することが好ましい。コラーゲン包埋法で培養された軟骨細胞の場合、例えば、２×１０6個／ｍｌの播種密度で培養を行うと、適性基準は培養開始時の質量に対して１．０〜１０．０倍であり、好ましくは１．５〜５．０倍である。フィーダーレイヤー（Feeder Layer）培養法で培養された表皮細胞の場合、例えば、培養フラスコの底面積が１５０ｃｍ2、層数が２〜６層程度の場合には、表皮細胞組織の重さは約８５０ｍｇ程度であり、これを適正基準とすることができる。このように設定された適性基準を超えた培養組織を、移植適性あり、と判定することができる。
【００２０】
なお、担体を用いて培養組織の培養を行う場合には、細胞数及び基質産生による質量が増加しても担体の分解による培養組織の質量減少の速度が大きいと培養組織の総質量が減少することも起こり得るため、用語「質量変化率」とは、培養組織の質量が増加する場合と減少する場合との双方を含む。
【００２１】
適性基準との対比は、適性基準の測定方法と同一の条件で測定された結果を利用することが好ましい。例えば、培養容器と共に測定したものを適性基準として適用した場合には、培養容器と共に測定した測定結果と対比する。
【００２２】
次に本発明の培養組織の品質管理方法について説明する。
上記の通り、培養組織の質量は適正な培養によって変化するため、培養組織の質量を測定し、その測定結果を基に測定時の培養状態を把握することができる。これにより、質量という具体的且つ客観的な適性基準により、移植適性を有する培養組織を適切な状態で提供できるように、培養組織の品質を管理することができる。
【００２３】
ここで「培養組織の品質」とは、移植後に効率よく生着し、或いは移植された個体における組織再生が効率よく行われるための要件を備えていることであり、「移植適性を有する」とは、このような能力を有していることを言う。
【００２４】
またここで「培養組織の品質管理」とは、移植適性を有する培養組織を提供可能とするために、提供時期との関係において、培養組織中の細胞数及び／又は基質量を所定範囲内に調整することを言う。この培養組織の品質管理は、一方では培養組織の提供時（出荷時）において、移植適性を有する培養組織のみを選択することを意味し、また一方では、培養過程における培養状態を把握し、培養期間や培養条件を調整することにより、培養組織の状態を制御することを意味する。これにより、提供される培養組織を常に一定の品質のものに維持することができる。以下に詳述するが、このような品質管理には、培養中の培養組織の移植適性の適合状態を把握し、把握された培養組織の状態に応じて、市場に供するのに適しているか否かを判定したり、培養に関する種々の因子（培地組成、培養期間など）を調整して培養組織の状態をコントロールするといった作業が挙げられる。
【００２５】
培養組織の品質管理は、上記の移植適性の判定方法と略同様に培養組織の質量を測定及び監視することにより行われる。
判定基準は、上述したものに加えて、培養期間の経過に応じた経時的な質量の変化を示す基準質量の経時変化曲線を作成し、この基準質量経時変化曲線を経時的な判定基準としてもよい。この場合には、この基準質量変化曲線と所定時期における質量とのずれ量に応じて培養状態を把握し、適切な時期に培養組織を提供するよう、品質を管理することができる。
【００２６】
培養組織の品質管理は、提供直前に質量を測定することにより、培養組織の品質を管理することができる。この場合、移植適性を有する培養組織のみを選択できるので、確実に、移植適性を有する培養組織のみを提供することができる。
【００２７】
また、培養開始後のいずれかの時期に質量を測定して細胞数及び／又は基質量を予測し、この予測に基づいて培養組織の品質を管理することもできる。即ち、培養開始後の特定時期で測定された質量から、培養組織を構成する細胞の増殖率を把握することができ、把握された増殖率に基づいて、細胞数及び／又は基質量のその後の増加量を予測することができる。このため、この予測結果に基づいて、移植適性を有する培養組織を提供できるように培養組織の品質を管理することができる。
【００２８】
培養組織の品質管理は、培養開始後の少なくとも１回質量を測定し、この測定結果に基づいて培養組織の培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整することによって行うことが好ましい。これにより、培養組織の品質を、より効率的に安定させることができる。
【００２９】
品質管理のための培養組織の質量の測定は、培養開始後であればいつでも行うことができるが、適切に品質管理を行い、移植適性を有する培養組織を効率よく提供するためには、測定結果に基づいて培養期間や培養条件を適切に調整することができる時期に行われることが好ましい。このため、細胞種類及び播種密度等によって増殖速度が異なるために、個々の場合に応じて測定時期を設定することが好ましい。
【００３０】
品質管理における培養組織の質量の測定は、培養開始後の少なくとも１回行えばよい。培養開始後に少なくとも１回測定することによって、得られた質量から、その後の質量変化の状態を予測することができ、この予測に基づいて培養組織の品質を管理することができる。より正確に且つ適切に培養組織の品質を管理する観点から、経時的に複数回測定することが好ましい。
【００３１】
品質管理のための質量測定の回数及び測定時期のインターバルは、個々の細胞の増殖速度や基質の種類及び産生速度などを考慮して、各細胞種類別及び／又は培養方法別に設定することが好ましい。
例えば軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋法の場合には、培養期間が４週間程度であるので、最初の測定を、測定に際して充分な量の細胞が増殖し、且つ充分な量の基質が産生される時期、例えば１４日目頃に行い、この後の各測定時期のインターバルを細胞の細胞増殖及び基質産生速度の観点から、３日〜１週間で行うことが好ましい。
一方、表皮細胞のフィーダーレイヤー培養法の場合、培養期間が１〜２週間程度であるので、測定時期のインターバルを１〜３日程度で行うと、正確なデータを得ることができる。
【００３２】
培養期間及び培養条件の調整は、培養期間を長短させて出荷時期を調整したり、培地交換時期、培地種類、培養温度等の培養条件等を調整したりすることによって行われる。培養期間の調整と培養条件の調整とは、いずれか一方を行ってもよく、これらを組合わせて行ってもよい。
【００３３】
培養期間の調整は、設定された適性基準を下回っていた場合には培養期間を延長し、適性基準を上回っていた場合には培養期間を短縮することにより行われる。また、細胞種類によって異なるが、適性基準からのずれと培養期間との相関関係を予め設定しておき、適性基準からのずれの大きさから培養期間の長短を一律に決定することもできる。基準質量値からのずれ量に応じた培養期間の調整は、個々の細胞の増殖速度などを考慮して、各細胞種類別及び／又は培養方法別に設定することが好ましい。例えば、軟骨細胞のコラーゲン包埋法による培養の場合、効率よく培養期間の調整ができる時期に測定したとき、適性基準から１０〜５０％下回っていた場合には、培養期間を２０〜７０％延長すると決定することができる。
【００３４】
例えば、培養を促進したい場合などは、成長因子（Growth Factor）等を添加するなど、培地の種類や添加成分を変更することで細胞増殖能を活性化させたり、培地交換のタイミングを早くしたり、等の方法が考えられる。逆に、培養を遅滞・停滞させたい場合には、種々のメーカーから市販されている保存用培地を利用したり、細胞活性の低くなる低温で保存したり、といった方法が考えられる。
【００３５】
次に本発明の培養組織の製造方法について説明する。
培養組織の製造方法は、培養組織の質量を培養開始から所定時間後に測定することを含む。培養組織の質量は細胞の増殖及び基質の産生によって増加するので、上記と同様に培養組織の質量を測定することによって、個々の培養組織の増殖率等が異なっていても、効率よく且つ適切な提供時期に確実に、移植適性を有する培養組織を製造することができる。
【００３６】
移植適性を有する培養組織の製造方法における培養組織の質量の測定は、特記しない限り、上記の培養組織の移植適性判定方法及び品質管理方法とほぼ同様に行うことができる。
【００３７】
培養組織の質量の測定は、培養開始後に少なくとも１回行えばよく、培養終了時に１回のみ測定してもよい。移植適性を有する培養組織を確実に提供するためには、培養組織の質量を経時的に複数回測定することが好ましい。
【００３８】
培養組織の質量の測定は、培養開始後であればいつでも測定することができるが、移植適性を有する培養組織を確実に提供する観点から、細胞増殖及び基質産生が安定して行われている時期以降に行うことが好ましく、例えば軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋法の場合には培養開始後１４日以降、表皮細胞のフィーダーレイヤー培養法の場合には培養開始後２日以降に、それぞれ測定することが好ましい。
【００３９】
【実施例】
以下、軟骨細胞を基に再構築した培養軟骨組織を一実施例として挙げ、本発明を説明する。
［実施例１］
＜培養軟骨組織の作製＞
日本白色家兎の膝、股、肩、肘関節から関節軟骨を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨細胞を洗浄後、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を加え、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）が１：４の割合になるように混合し、細胞−コラーゲン混合液を調整した。この混合工程により１×１０7個／ｍｌだった細胞密度は、２×１０6個／ｍｌに希釈される。この細胞−コラーゲン混合液１００μｌを培養皿にマウント（設置）した。但し、後述の図１では１ｍｌをマウントした場合を示している。
【００４０】
マウントした混合液は、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で０．５〜１時間静置してゲル化させ、培地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含有する１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを使用し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で５週間培養を行った。
【００４１】
＜移植適性の判定＞
移植適性の検査はディッシュ内の培地をアスピレータで吸引し、ディッシュ内に培養組織が載置された状態のまま、重量測定器（はかり）で測定を行う。本実施例における重量測定器には、微量な値でも正確な測定が可能な電子天秤（メトラー・トレド社製）を使用した。以下に記載される質量値は、測定した重量値を実質的な質量値として説明する。
【００４２】
図１は培養軟骨組織の質量の経時変化を示すグラフである。なお、質量は培養容器（ディッシュ）の質量を含む単位で示してある。図１には２つの試料（Ｎｏ．１及び２）の質量経時変化がプロットされており、これらの平均値に対する近似曲線をＡ．Ｃ．として示した。図２は培養軟骨組織の断面をアルシアンブルーにより染色した染色像を経時的に観察した観察像であり、（ａ）〜（ｅ）は各々培養７，１４，２１，２８，３５日目を示している。
【００４３】
図１から明らかなように、培養開始から時間が経過するにしたがって培養軟骨組織の質量が徐々に増加していることが一見して観察できる。図２からは培養日数の経過に伴って、培養軟骨組織の細胞及び産生基質が増加していることが観察でき、質量の増加を示す図１との関係から、細胞増殖及び基質産生を質量変化として捕えることができることが分かる。
【００４４】
図２において、培養２１日目以降の培養組織（図２（ｃ）〜（ｅ）を参照）には、その表面に十分な細胞層及び基質層が発達しており、移植時において移植先と早期に生着し、脱落する可能性が低く、十分な移植適性を有している。
【００４５】
これに基づいて、例えば、図１の近似曲線Ａ．Ｃ．を基に判定基準を設定すると、移植に十分な状態となる培養２１日目には近似曲線Ａ．Ｃ．は約２５．１ｇ（ディッシュ込）を示しているので、判定基準となる基準質量を２５．０ｇとし、上記手順で作製した培養軟骨組織の測定質量（ディッシュ込）が２５．０ｇを超えた時点で移植適性を有していると判断することができる。
【００４６】
このように、所定の条件で作製したときの培養組織が移植適性を満たしたときの質量を閾値として判定基準とすることにより、熟練者でなくとも容易に移植適性を判定することができる。
【００４７】
＜品質管理＞
近似曲線Ａ．Ｃ．を培養増殖の判定基準とし、ある培養日数での培養組織の質量が曲線Ａ．Ｃ．による質量を満たしていない場合には、例えば、培地に成長増殖因子を添加したり、培地交換間隔を短縮したりすることで、細胞増殖及び基質産生を促進させて、所定培養日数で所望の培養組織を得るように調整することができる。
【００４８】
逆に、培養組織の測定質量が曲線Ａ．Ｃ．の基準を大きく上回っているときには、例えば、保存用培地を利用したり、低温保存したりすることで細胞増殖及び基質産生を遅滞あるいは停滞させることで、所定時期に所望の培養組織を得られるように調整することが可能である。
【００４９】
なお、上記例では曲線Ａ．Ｃ．を境界として判定したが、判定基準に幅を持たせ、例えば、曲線Ａ．Ｃ．±０．１ｇの領域を所定基準とし、この領域を上下する範囲において、上記のような培養条件の調整を行うようにしてもよい。
【００５０】
このように培養組織の質量変化を経時的に測定し、質量曲線等の判定基準と比較することによって、培養条件や培養期間等を調整することで、出荷時の品質を安定させることができる。
【００５１】
さらに、測定質量が判定基準よりも下回っている場合には、その程度に応じて出荷までの培養日数を長く調整することで出荷時での品質を安定させることができる。逆に、測定質量が判定基準よりも大きく越えているような場合には、基準となる培養日数より早期に出荷することが可能となる。
【００５２】
［実施例２］
実施例２は、実施例１と同様の方法で作製された２つの培養軟骨組織を用いた他の実施例である。
図３は細胞を播種しない状態での担体（コラーゲンゲル１００μｌ）の質量の経時変化及び培養組織の質量の経時変化を示すグラフである。但し、図３では図１と異なり、培養容器（ディッシュ）の質量を総質量から減算することで担体及び培養組織のみの質量を示している。コラーゲンゲル担体のみの試料は、コラーゲン濃度を培養組織と同様にするために、培養組織の作製方法に準じて作製した。具体的には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと３％アテロコラーゲンインプラントを１：４の割合で混合した混合液を、培養皿にマウントし、ゲル化させた。
【００５３】
図３において、黒塗り丸及び黒塗り三角が培養組織の質量を示し、黒塗り菱形及び黒塗り四角が担体のみの質量変化を示している。図中の点線は培養組織及び担体質量の各々の平均値に対する近似曲線を示す。
【００５４】
培養組織の質量が増加するのに対して、コラーゲンゲル担体のみのものは時間の経過とともに質量が減少しているのが見て取れる。これは、コラーゲンゲルが液体培地中に徐々に溶出していることが原因と考えられる。培養組織においても担体となるコラーゲンゲルは溶出による質量の減少が考えられるが、担体のみの場合と比較すると、培養組織表面が産生基質によって被覆されるため、溶出する割合は少なくなる。培養組織質量は培養１１日目頃までは担体質量の減少に伴って減少するが、その後は徐々に質量が増加する。
【００５５】
図３では、例えば、コラーゲンゲル担体のみの質量に対して、培養組織の質量が所定の倍率になることで移植適性を判定する。例えば、細胞の増殖がプラトー（plateau）な状態になる質量変化率に相当する判定基準を設定する。図３の場合、担体質量に対して培養組織質量が２００％となることを判定基準とすれば、およそ培養２１日目以降の培養組織に対して移植適性が良好であると判定することができる。本実施形態におけるプラトーな状態とは、細胞数がほぼ一定になり、細胞増殖がほとんど行われなくなった状態をいう。
【００５６】
また、図１と同様に閾値となる質量を判定基準として設け、培養組織の質量が閾値を越えたか否かによって判定する。さらに経時変化を測定することによって、培養期間や培養条件を調整する。この場合、細胞増殖によって質量変化が生じる培養１１日目以降に測定することが好ましい。
【００５７】
［実施例３］
実施例３は、実施例２の測定結果を別の形式で処理したものである。
図４は、図３における培養組織質量から担体質量を減算することにより得た質量変化のグラフである。この場合に得られる質量は、細胞、産生基質及び基質に保持される成分（例えば、水やイオン）の質量が示される。図中の黒塗り丸は図３の黒塗り丸から担体質量の平均値（黒塗り菱形と黒塗り四角の平均値）を減算した値であり、黒塗り三角は図３の黒塗り三角から担体質量平均を減算した値を示している。これらの値は、実質的な細胞の増殖及び産生基質による質量増加と想定することができる。図中の点線は黒塗り丸と黒塗り三角の平均値による近似曲線を示している。
【００５８】
図４においても、図１の場合と同様に、予め閾値となる質量を適性基準として設定することにより、容易に移植適性の判定を行う。図４の細胞及び基質質量の変化グラフにおいて、軟骨細胞の増殖がプラトーな状態となる０．１ｇを閾値とした場合、黒塗り丸及び黒塗り三角ともに培養開始２１〜２６日目にかけて、移植用培養軟骨組織として使用しても良い状態になったと判定することができる。また、図中の点線を判定基準として、質量の経時変化を基に培養期間や培養条件の調整を行うことができる。
【００５９】
このように、測定質量を判定基準と照らし合わせて比較することによる移植判定方法では、実施例１（培養容器ごとの質量）、実施例２（培養組織での質量）及び、実施例３（細胞及び基質質量）のいずれでも、容易に移植適性を判定することができ、適切な判定基準を容易に設定することができる。
【００６０】
また、判定基準の設定としては特定の質量を設定しなくとも、培養０日目の質量に対する変化量を判定基準とすることもできる。例えば、測定質量が培養０日目の質量に対して２００％以上となった時点を適性基準する等である。これにより、培養開始時における播種密度等の多少の誤差を気にすることなく、適切な判定基準を設定することができ、適切な適性判定を容易に行うことができる。培養０日目の質量測定は、培養中あるいは培養後の培養組織の測定状態と同様になるように、混合液がゲル化した後、培地を一度加え、その培地を除去した状態で測定することが好ましい。これにより、培養組織に保持される水分等を加味した状態で測定でき、培養中あるいは培養後の培養組織の測定状態と同様な状態で測定することができる。
【００６１】
以上のことから、播種密度、培養条件等に基づいて、移植用組織としての培養軟骨組織の適切な質量値あるいは質量変化値を予め設定しておくことによって、組織断面像を確認することなく、質量あるいは質量変化のみによって移植適性を検査することができ、熟練者でなくとも容易に移植適性を判定することができる。さらに、培養容器ごと質量を測定することによって、非接触で培養組織の質量を測定することができるので、汚染等の心配が軽減される。
【００６２】
また、培養組織の質量を経時的に測定することによって培養組織の細胞増殖及び基質産生の状態を得ることができ、測定質量に応じて、培養期間を調整したり、培地交換時期、培地種類、培養温度等の培養条件を調整したりすることによって、細胞の増殖速度や、基質の産生状態を制御し、所望の状態の培養軟骨組織を安定して得ることができ、また、培養組織の品質を容易に管理することができる。
【００６３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、培養組織の質量を測定することによって、培養組織の移植適性を客観的に且つ効率よく判定することができる。また、培養組織の質量を測定することによって、客観的な基準により容易に且つ効率よく培養組織の品質を管理でき、さらに、移植適性を有する高い品質の培養組織を安定して提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例に係る培養軟骨組織の質量の経時変化を示すグラフである。
【図２】  （ａ）は培養７日目、（ｂ）は培養１４日目、（ｃ）は培養２１日目、（ｄ）は培養２８日目及び（ｅ）は培養３５日目の、本発明の実施例に係る培養軟骨組織の断面の染色像である。
【図３】  本発明の実施例に係る担体のみの質量と、培養組織及び担体の質量との双方の経時変化を示すグラフである。
【図４】  図３における培養組織の総質量から担体質量を減算することにより得た細胞＆基質の質量変化のグラフである。
【図１】
0004824201.tif 000002
【図２】
0004824201.tif 000003
【図３】
0004824201.tif 000004
【図４】
0004824201.tif 000005