(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重層化して扁平上皮になるNIKS細胞を含む、インビトロ培養皮膚組織であって、該NIKS細胞がプロモーターに機能的に結合された、VEGFおよびHIF-1からなる群より選択される外因性遺伝子により安定にトランスフェクションされ、かつ当該遺伝子を発現する、前記インビトロ培養皮膚組織。
【請求項２】
真皮層をさらに含む、請求項1記載のインビトロ培養皮膚組織。
【請求項３】
真皮層がコラーゲンおよび線維芽細胞を含む、請求項２記載のインビトロ培養皮膚組織。
【請求項４】
該遺伝子がVEGF-Aである、請求項1〜3のいずれか一項記載のインビトロ培養皮膚組織。
【請求項５】
該遺伝子がHIF-1である、請求項1〜3のいずれか一項記載のインビトロ培養皮膚組織。
【請求項６】
プロモーターが誘導性である、請求項1〜５のいずれか一項記載のインビトロ培養皮膚組織。
【請求項７】
熱傷治療又は創傷治療のための治療用組成物の調製における、請求項1〜６のいずれか一項記載のインビトロ培養皮膚組織の使用。
【請求項８】
移植を必要とする患者を、移植片が血管新生するような条件下で治療するための治療用組成物の調製における、請求項１〜６のいずれか一項記載のインビトロ培養皮膚組織の使用。
【請求項９】
インビトロで試験又はスクリーニングアッセイするための、請求項１〜６のいずれか一項記載のインビトロ培養皮膚組織の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、インビトロ培養皮膚組織、詳細には血管新生増殖因子をコードする外因性遺伝子を含む培養皮膚組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
熱傷および潰瘍に起因する皮膚の喪失は、主要な医学的問題である。米国では、毎年125万人の人が熱傷の医学的治療を必要すると推定されている。約51,000人の人が熱傷のために入院し、13,000人が皮膚移植を必要とする。これらのうち、1,500人が重度の熱傷であり広範囲にわたる移植を必要とする。皮膚潰瘍に関しては、米国の800,000人の糖尿病患者が、慢性で非治癒性の足の糖尿病性壊疽を患っている。これらの皮膚潰瘍の一部が感染することにより、毎年50,000件の切断を招く。糖尿病性潰瘍に加えて、静脈性潰瘍および圧迫潰瘍（褥瘡）に関しても新たな生成物が必要とされる。
【０００３】
いくつかの生成物はバイオ工学による皮膚組織を使用しており、そのうちのいくつかは真皮成分を含むまたは含まない培養ケラチノサイトを含む。全体表面積に大きく全層熱傷を有する患者では、壊死組織の分解による毒性を減じるためおよび創傷における微生物の増殖を減じるため、まず熱傷した皮膚を除去する。体液の喪失および感染を軽減するために、切除した創傷部分を一次的に屍体皮膚で覆う（Boyce ら、J. Burn Care Rehab. 20(6):453-461 (1999)）。1985年以来、RheinwaldおよびGreenの培養法により、病院で用いるための自己ケラチノサイトのシート化が可能となった。しかし、例えばGenzymeのエピセル(Epicel)といったこれらの生成物のうちのいくつかでは、真皮成分の欠如によりその有用性が限定される。例えばAdvanced Tissue Scienceのトランスサイト(Transcyte)およびダーマグラフト(Darmagraft)ならびにLifeCellのアロダーム(Alloderm)といった他の生成物は、真皮類似体のみからなる。これらの生成物は現在のところ自家分相植皮片ほど効果的ではなく、依然として自家分相植皮が全層皮膚喪失の治療に選択する方法である。しかし、自己移植は広範囲熱傷の患者に行えない可能性があり、感染の機会および機能的または美容上の欠陥の発生を含む自己移植ドナー部位の創傷治癒問題を起こす他の患者にさえも行えない可能性がある。
【０００４】
正常ケラチノサイトの器官型培養技法により、熱傷および皮膚損傷の治療のための培養皮膚組織の開発が近年促進された。複合移植片は、例えばOrganogenesisのアプリグラフ(Apligraf)生成物における線維芽細胞包埋コラーゲンのような真皮類似体の上に播種したケラチノサイトからなる。しかし報告によれば、複合移植片はより脆弱であり再血管新生に時間を要する。よって、熱傷および損傷治療への培養皮膚組織の使用は、移植片の不十分な血管新生によって限定され得る。自己移植片において、血管新生は新血管新生の吻合によって起こる。吻合は、創傷基盤内の毛細血管の、移植片の真皮における切断された血管の末端への連結により進行する。これが初期の血管新生の主要な機構である。複合移植片の血管新生は新血管新生にのみに依存するため、自己移植片よりも時間を要する。複合移植片の不十分な血管新生により、移植片の虚血がもたらされ移植の成功が滞る。
【０００５】
現行のバイオ工学による組織の制限により、熱傷および皮膚創傷の治療に改良生成物を使用する相当量の機会が存在する。明らかに、移植のための改良した特性を有する培養皮膚組織の大きな必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、インビトロ培養皮膚組織、詳細には血管新生増殖因子をコードする外因性遺伝子を含む培養皮膚組織に関する。したがって、いくつかの態様においては、本発明は誘導性プロモーターに機能的に結合させた少なくとも1つの外因性血管新生因子または活性化因子を含むケラチノサイトを含む組成物を提供する。本発明は、ケラチノサイトの特定の供給源に限定されない。実際に、ケラチノサイトの様々な供給源の使用を意図する。いくつかの態様において、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、不死化ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の態様において、組成物は真皮等価物をさらに含む。いくつかの好ましい態様において、真皮等価物はコラーゲンおよび線維芽細胞を含む。さらに他の態様においては、ケラチノサイトが重層化し、それにより培養皮膚組織が形成される。いくつかの好ましい態様においては、皮膚組織が重層化し扁平上皮になる。
【０００７】
本発明は、特定の血管新生因子の発現に限定されない。実際に、様々な血管新生因子または活性化因子の使用を意図する。いくつかの好ましい態様において、血管新生因子は、VEGF遺伝子、アンジオポエチン遺伝子、およびHIF1α遺伝子からなる群より選択される。他の好ましい態様において、VEGF遺伝子はVEGF-Aである。他の好ましい態様において、VEGF-A遺伝子は配列番号:1または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:1にハイブリダイズする配列によってコードされる。
【０００８】
さらに他の好ましい態様において、アンジオポエチン遺伝子はアンジオポエチン-1である。さらなる好ましい態様において、アンジオポエチン-1は、配列番号:2または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:2にハイブリダイズする配列によってコードされる。さらなる態様において、血管新生活性化因子はHIF-1αである。さらなる好ましい態様において、HIF-1α遺伝子は、配列番号:3または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:3にハイブリダイズする配列によってコードされる。いくつかの他の態様においては、ケラチノサイトにVEGF-A、ANG-1、およびHIF-1の組み合わせをトランスフェクションする。本発明は、特定の誘導性プロモーターに限定されない。実際に、Tet応答性プロモーターを含むがこれに限定されない様々な誘導性プロモーターの使用を意図する。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明は、移植および移植片を必要とする対象を準備する段階であって、移植片が誘導性プロモーターに機能的に結合させた少なくとも1つの外因性血管新生因子を含むケラチノサイトを含む段階；および移植片が血管新生化するような条件下で対象に移植片を移植する段階を含む、治療法を提供する。本発明は、ケラチノサイトの特定の供給源に限定されない。実際に、ケラチノサイトの様々な供給源の使用を意図する。いくつかの態様において、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、不死化ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の態様において、組成物は真皮等価物をさらに含む。いくつかの好ましい態様において、真皮等価物はコラーゲンおよび線維芽細胞を含む。さらに他の態様においては、ケラチノサイトが重層化し、それにより培養皮膚組織が形成される。いくつかの好ましい態様においては、皮膚組織が重層化し扁平上皮になる。
【００１０】
本発明は、特定の血管新生因子の発現に限定されない。実際に、様々な血管新生因子または活性化因子の使用を意図する。いくつかの好ましい態様において、血管新生因子は、VEGF遺伝子、アンジオポエチン遺伝子、およびHIF1α遺伝子からなる群より選択される。他の好ましい態様において、VEGF遺伝子はVEGF-Aである。他の好ましい態様において、VEGF-A遺伝子は配列番号:1または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:1にハイブリダイズする配列によってコードされる。
【００１１】
さらに他の好ましい態様において、アンジオポエチン遺伝子はアンジオポエチン-1である。さらなる好ましい態様において、アンジオポエチン-1は、配列番号:2または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:2にハイブリダイズする配列によってコードされる。さらなる態様において、血管新生活性化因子はHIF-1αである。さらなる好ましい態様において、HIF-1α遺伝子は、配列番号:3または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:3にハイブリダイズする配列よってコードされる。いくつかの他の態様においては、ケラチノサイトにVEGF-A、ANG-1、およびHIF-1αの組み合わせをトランスフェクションする。本発明は、特定の誘導性プロモーターに限定されない。実際に、Tet応答性プロモーターを含むがこれに限定されない様々な誘導性プロモーターの使用を意図する。いくつかのさらなる好ましい態様において、血管新生は、ドキシサイクリン等の薬剤の局所的投与により誘導する。
【００１２】
他の態様において、皮膚移植片組成物は、少なくとも、第1外因性血管新生因子をトランスフェクションしたケラチノサイトの第1亜集団および第2外因性血管新生因子をトランスフェクションしたケラチノサイトの第2亜集団を含む。いくつかの好ましい態様において、第1血管新生因子は、配列番号:1または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:1に結合する配列よってコードされる。さらに他の好ましい態様において、第2血管新生因子は、配列番号:2または低ストリンジェンシー条件下で配列番号:2に結合する配列よってコードされる。第1または第2血管新生因子は、HIF-1α等の血管新生活性化因子であってもよい。
【００１３】
定義
本明細書では、「皮膚等価物」および「皮膚代替物」という用語は互換的に用いられ、重層化して扁平上皮になったケラチノサイトのインビトロ由来培養物を指す。典型的には、培養皮膚組織は器官型培養により作製する。
【００１４】
本明細書で用いる「器官型」培養という用語は、培養細胞を用いて組織または器官をインビトロで再構築する三次元組織培養を指す。
【００１５】
本明細書で用いる「NIKS細胞」という用語は、細胞株ATCC CRL-12191として寄託された細胞の特徴を有する細胞を指す。
【００１６】
「試験化合物」という用語は、任意の化学物質、医用薬剤、薬剤、および疾患、疾病、病気、もしくは身体機能の障害を治療もしくは予防するため、またはさもなくば試料の生理的もしくは細胞状態を変化させるために用いられ得る同等物を指す。試験化合物には、既知の治療化合物および潜在的治療化合物の両方が含まれる。本発明のスクリーニング法を用いてスクリーニングすることにより、試験化合物が治療的であると判定することができる。「既知の治療化合物」とは、そのような治療または予防において効果的であることが示されている（例えば、動物試験またはヒトへの投与による事前経験による）治療化合物を指す。
【００１７】
本明細書では、反応という用語は、アッセイ法に関連して用いる場合、検出可能なシグナルの生成を指す（例えば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の増加、検出可能な化学産物の蓄積）。
【００１８】
本明細書で用いるレポーター遺伝子という用語は、アッセイされ得るタンパク質をコードする遺伝子を指す。レポーター遺伝子の例にはルシフェラーゼ（例えば、deWetら、Mol. Cell. Biol. 7:725 [1987]、ならびに米国特許第6,074,859号；第5,976,796号；第5,674,713号；および第5,618,682号を参照のこと；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）、緑色蛍光タンパク質（例えば、GenBankアクセッション番号U43284；多くのGFP変種がCLONTECH Laboratories、カリフォルニア州、パロアルトから入手可能である）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体（例えば、VEGFまたはANG-1）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えばDNA）配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列によって、あるいは全長もしくは断片の所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持される限りはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。この用語はまた、遺伝子が全長mRNAの長さに相当するように、両末端の約1 kbの距離に5'および3'末端でコード領域に隣接して位置する配列を含む構造遺伝子のコード領域も包含する。コード領域の5'側に位置し、かつmRNAに存在する配列を、5'非翻訳配列と称する。コード領域の3'側または下流に位置し、かつmRNAに存在する配列を、3'非翻訳配列と称する。「遺伝子」 という用語は、cDNAおよび遺伝子のゲノム型の両方を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列により中断されるコード領域を含む。イントロンは、核RNA(hnRNA)に転写される遺伝子の区域である；イントロンはエンハンサー等の制御エレメントを含む可能性がある。イントロンは、核転写産物または一次転写産物から除去または「スプライシング」される；したがって、イントロンはメッセンジャーRNA(mRNA)転写産物には存在しない。mRNAは、翻訳の過程で、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順番を特定するように機能する。
【００２０】
「VEGF-A遺伝子」という用語には、全長VEGF-Aヌクレオチド配列（例えば、配列番号:1に含まれる）が含まれる。しかし、この用語がVEGF-A配列の断片および全長VEGF-Aヌクレオチド配列内の他のドメインを包含することも意図する。したがって「VEGF-A遺伝子」という用語は、置換、付加、および欠失変異を含むVEGF-A相同体、ならびにVEGF-Aのスプライシング変種を包含する。さらに、「VEGF-Aヌクレオチド配列」または「VEGF-Aポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNA、およびRNA（例えばmRNA）配列を包含する。
【００２１】
「ANG-1遺伝子」という用語には、全長アンジオポエチン-1(ANG-1)ヌクレオチド配列（例えば、配列番号:2に含まれる）が含まれる。しかし、この用語がANG-1配列の断片および全長ANG-1ヌクレオチド配列内の他のドメインを包含することも意図する。したがって「ANG-1遺伝子」という用語は、置換、付加、および欠失変異を含むANG-1相同体、ならびにANG-1のスプライシング変種を包含する。さらに、「ANG-1ヌクレオチド配列」または「ANG-1ポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNA、およびRNA（例えばmRNA）配列を包含する。
【００２２】
「HIF-1α遺伝子」という用語には、全長低酸素誘導性因子(HIF-1α)ヌクレオチド配列（例えば、配列番号:3に含まれる）が含まれる。しかし、この用語がHIF-1α配列の断片および全長HIF-1αヌクレオチド配列内の他のドメインを包含することも意図する。したがって「HIF-1α遺伝子」という用語は、置換、付加、および欠失変異を含むHIF-1α相同体、ならびにHIF-1αのスプライシング変種を包含する。さらに、「HIF-1αヌクレオチド配列」または「HIF-1αポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNA、およびRNA（例えばmRNA）配列を包含する。
【００２３】
本明細書でアミノ酸配列を列挙して天然タンパク質分子のアミノ酸配列を参照する場合、アミノ酸配列およびポリペプチドまたはタンパク質等の同様の用語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子と関連した完全な天然アミノ酸配列に限定することを意図していない。
【００２４】
ゲノム型の遺伝子は、イントロンを含むことに加えて、RNA転写産物に存在する配列の5'および3'末端に位置する配列も含みうる。これらの配列は「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列は、mRNA転写産物に存在する非翻訳配列の5'または3'側に位置する）。5'隣接領域は、遺伝子の転写を調節するまたは転写に影響するプロモーターおよびエンハンサー等の制御配列を含み得る。5'隣接領域は、転写の終結、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００２５】
「野生型」という用語は、天然源から単離された遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団内に最も頻繁に認められ、したがって遺伝子の「正常」型または「野生型」と任意に命名されるものである。これに対して「改変した」、「変異体」、および「変種」という用語は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に配列および/または機能特性に変更（すなわち、特徴の変化）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の変異体が単離され得ることに留意されたい；これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実により同定される。
【００２６】
本明細書で用いる「コードする核酸分子」、「コードするDNA分子」、および「コードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または配列を指す。このデオキシリボヌクレオチドの順番により、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順番が決まる。したがって、DNA配列はアミノ酸配列をコードする。
【００２７】
本明細書で用いる「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸を意味する。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA型に存在し得る。DNA型に存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖であってよい。一次RNA転写産物の転写の適切な開始および/または正確なプロセシングを可能にすることが必要な場合には、エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の適切な調節エレメントを遺伝子のコード領域に近接して置いてよい。または、本発明の発現ベクターに使用するコード領域は、内因性のエンハンサー/プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナル等、または内因性および外因性調節エレメントの組み合わせを含んでもよい。
【００２８】
本明細書で用いる「制御エレメント」という用語は、核酸配列の発現のいくつかの局面を調節する遺伝子エレメントを指す。例えば、プロモーターは機能的に結合させたコード領域の転写の開始を促進する制御エレメントである。他の制御エレメントには、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル等が含まれる。
【００２９】
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）に関連して用いる。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は配列「5'-T-C-A-3'」に対して相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対規則に従って一致する「部分的」であってもよい。または、核酸間に「完全な」または「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して顕著な影響を有する。これは、増幅反応および核酸間の結合に依存する検出法において特に重要である。
【００３０】
「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的相同性または完全な相同性（すなわち同一性）が存在し得る。部分的に相補的な配列は、完全な相補的配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、「実質的に相同的」という機能的用語を用いて参照される。「結合の阻害」という用語は、核酸の結合に関連して用いる場合、相同的配列の標的配列への結合の競合によって起こる結合の阻害を指す。完全な相補的配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ法（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて試験することができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全な相補的配列の標的配列への結合（すなわちハイブリダイゼーション）を競合および阻害することになる。低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を許容すると言っているわけではない；低ストリンジェンシー条件は、2つの配列の相互の結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、部分的な相補性の程度さえも欠く（例えば、約30%未満の同一性）第2の標的を用いて試験することができる；非特異的結合が存在しない場合、プローブは第2の非相補的標的にハイブリダイズしないことになる。
【００３１】
当業者は、低ストリンジェンシー条件を構成するために多くの等価な条件を使用できることをよく理解している；プローブの長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成）、ならびに標的の性質（DNA、RNA、塩基組成、溶液中に存在するかまたは固定化されているか等）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）等の要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して上記の条件とは異なるが等価である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を作製することができる。さらに当業者は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件を理解している（例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄段階の温度を上げる、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを使用する等）。
【００３２】
「実質的に相同的」という用語は、cDNAまたはゲノムクローン等の二本鎖核酸配列に関連して用いる場合、以下に記載する低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列のどちらかまたは両方の鎖にハイブリダイズし得る任意のプローブを指す。
【００３３】
「実質的に相同的」という用語は、一本鎖核酸配列に関連して用いる場合、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列にハイブリダイズし得る（すなわち、その相補鎖である）任意のプローブを指す。
【００３４】
本明細書で用いる「結合を競合する」という用語は、第1ポリペプチドの変種または関連ポリペプチドもしくは異なるポリペプチドである活性を有する第2ポリペプチドが結合するのと同じ基質に結合する、活性を有する第1ポリペプチドに関連して用いる。第1ポリペプチドによる結合の効率（たとえば、動力学または熱力学）は、第2ポリペプチドによる基質の結合と同じ、それよりも高い、またはそれよりも低い可能性がある。例えば、基質への結合の平衡結合定数(KD)は、2つのポリペプチドで異なる可能性がある。本明細書で用いる「Km」という用語は酵素のミカエリス-メンテン定数を指し、所与の酵素が酵素触媒反応において最大速度の1/2をもたらす特定の基質の濃度と定義される。
【００３５】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対形成に関して用いる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比等の要因により影響を受ける。
【００３６】
本明細書で用いる「Tm」という用語は、融解温度に関連して用いる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の半数が一本鎖に解離する温度である。核酸のTmを計算する式は、当技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されるように、Tm値の簡単な概算値は、核酸が1 M NaClの水溶液中に存在する場合、以下の式により計算され得る：Tm = 81.5 + 0.41(% G＋C)（例えば、Nucleic Acid Hybridization [1985]のAndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hybridizationを参照のこと）。他の参考文献は、Tmの計算に構造特性および配列特性を考慮に入れたより精巧な計算を含んでいる。
【００３７】
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う温度、イオン強度、および有機溶媒等の他の化合物の存在の条件に関連して用いる。当業者は、記載されたパラメータを個々にまたは協調して変更することにより、「ストリンジェンシー」条件を変更し得ることを理解されよう。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸の塩基対形成は、高頻度で相補的塩基配列を有する核酸間でのみ起こることになる（例えば、「高ストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、約85〜100%同一性、好ましくは約70〜100%同一性を有する相同体間で起こり得る）。「中程度のストリンジェンシー」条件では、核酸の塩基対形成は、中程度の頻度で相補的塩基配列を有する核酸間で起こることになる（例えば、「中程度のストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、約50〜70%同一性を有する相同体間で起こり得る）。したがって、「弱い」または「低い」 ストリンジェンシー条件は、相補性配列の頻度が通常は低いことから遺伝的に異なる生物に由来する核酸で必要とされる場合が多い。
【００３８】
核酸のハイブリダイゼーションに関連して用いる場合の「高ストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、42℃での5X SSPE（43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.5% SDS、5Xデンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーション、その後の42℃での0.1X SSPE、1.0% SDSを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００３９】
核酸のハイブリダイゼーションに関連して用いる場合の「中程度のストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、42℃での5X SSPE（43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.5% SDS、5Xデンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーション、その後の42℃での1.0X SSPE、1.0% SDSを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００４０】
核酸のハイブリダイゼーションに関連して用いる場合の「低ストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、42℃での5X SSPE（43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.1% SDS、5Xデンハルト試薬［50Xデンハルト試薬は500 ml当たり以下を含む：5 gフィコール（タイプ400、Pharmacia）、5 g BSA（Fraction V；Sigma）］、および100g/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーション、その後の42℃での5X SSPE、0.1% SDSを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００４１】
以下の用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を示すために用いる：「参照配列」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的同一性」。「参照配列」とは、配列比較のための基本として用いられる所定の配列である；参照配列は、例えば配列リストに与えられた全長cDNA配列の一部として、より大きな配列の一部であってよく、または完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は少なくとも20ヌクレオチド長であり、高い頻度で少なくとも25ヌクレオチド長であり、多くの場合少なくとも50ヌクレオチド長である。2つのポリヌクレオチドはそれぞれ、(1) 2つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み得り、かつ(2) 2つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含み得るため、2つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は典型的に、「比較領域(window)」にわたって2つのポリヌクレオチドの配列を比較し、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより行う。本明細書で用いる「比較領域」とは、ポリヌクレオチド配列が少なくとも20個の連続したヌクレオチドの参照配列と比較され、かつ比較領域内にあるポリヌクレオチド配列の一部が、2つの配列の最適アラインメントを得るために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して20%以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含む場合の、少なくとも20の連続したヌクレオチド部分の概念的区域を指す。比較領域を整列させるための配列の最適アラインメントは、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム［SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)］、NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム［NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)］、Pearson およびLipmanの類似性検索法［Pearson およびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)］、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェアパッケージ・リリース7.0、遺伝学コンピューターグループ、575 Science Dr., Madison, WisのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または目視により行うことができ、様々な方法により作製された最も優れたアラインメント（すなわち、比較領域にわたって最も高い割合の相同性を生じる）を選択する。「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較領域にわたって同一である（すなわち、ヌクレオチドごとに基づいて）ことを意味する。「配列同一性の割合」という用語は、2つの最適に整列された配列を比較領域にわたって比較し、同一の核酸塩基（例えばA、T、G、U、またはI）が両方の配列に存在し一致位置数を生じる位置の数を決定し、一致位置数を比較領域内に存在する全位置数（すなわち領域サイズ）で割り、その結果に100をかけて配列同一性の割合を得ることにより計算する。本明細書で用いる「実質的同一性」という用語は、参照配列と、参照配列の全部で20%以下の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列とを比較領域にわたって比較することにより配列同一性の割合を計算する場合の、少なくとも20ヌクレオチドの位置の比較領域にわたって、多くの場合少なくとも25〜50ヌクレオチドの領域にわたって参照配列と比較して、少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少���くとも90〜95%の配列同一性、通常は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列の特徴を表す。参照配列は、例えば本発明において特許請求した組成物（たとえば、VEGFおよびANG-1）の全長配列の一部として、より大きな配列の一部であってよい。
【００４２】
ポリペプチドに適用する場合の「実質的同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、初期設定ギャップウェイトを用いたプログラムGAPまたはBESTFIT等により最適に整列させた場合に、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%以上の配列同一性（例えば、99%の配列同一性）を共有することを意味する。同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族-水酸基側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンである；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下の通りである：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミン。
【００４３】
本明細書で用いる「組換えDNA分子」 という用語は、分子生物学的技法を用いて結合したDNAの断片からなるDNA分子を指す。
【００４４】
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、1つの細胞から別の細胞へDNA断片を移行させる核酸分子を指す。「媒体」という用語は、「ベクター」と互換的に用いる場合がある。
【００４５】
本明細書で用いる「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および機能的に結合させたコード配列の特定の宿主生物における発現に必要な適切な核酸配列を含む組換えDNA分子を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列には、通常、多くの場合は他の配列とともに、プロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００４６】
本明細書で用いる「宿主細胞」という用語は、インビトロであろうとインビボであろうと、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、大腸菌等の細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）を指す。例えば、宿主細胞はトランスジェニック動物内にあってよい。
【００４７】
「過剰発現」および「過剰発現する」および文法的相当語句は、対照または非トランスジェニック動物の所与の組織で典型的に見られる発現レベルの約3倍高い発現レベルを示すmRNAのレベルに関して用いる。mRNAのレベルは、ノーザンブロット解析を含むがこれに限定されない、当業者に周知の多くの技法のいずれかを用いて測定する。解析する各組織から添加するRNA量の相違を調節するために、適切な対照をノーザンブロットに含める（例えば、各試料中の、本質的に全組織に同じ量で存在する豊富なRNA転写産物である28S rRNAの量を、ノーザンブロットで観察するVEGF mRNA特異的シグナルを規準化または標準化する手段として用いることができる）。正確にスプライシングされたVEGFまたはANG-1導入遺伝子RNAの大きさに相当するバンドに存在するmRNAの量を定量化する；導入遺伝子プローブにハイブリダイズする他の微量なRNA種は、導入遺伝子mRNAの発現の定量化においては無視する。
【００４８】
本明細書で用いる「トランスフェクション」という用語は、外来DNAの真核細胞内への導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈法、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション法、ポリブレンを介したトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、リポフェクション法、プロトプラスト融合法、レトロウイルス感染法、および遺伝子銃法を含む、当業者に周知の様々な手段によって達成し得る。「トランスフェクション」および「形質転換」という用語は、互換的に用いることができる。
【００４９】
「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクションした」という用語は、外来DNAの、トランスフェクションした細胞のゲノム内への導入および組み込みを指す。「安定なトランスフェクタント」という用語は、外来DNAがゲノムDNA内に安定して組み込まれた細胞を指す。
【００５０】
「一過性トランスフェクション」または「一過性にトランスフェクションした」という用語は、外来DNAがトランスフェクションした細胞のゲノム内に組み込まれない場合の外来DNAの細胞への導入を指す。外来DNAは、トランスフェクションした細胞の核内に数日間存続する。この間、外来DNAは、染色体内の内因性遺伝子の発現を支配する制御調節を受ける。「一過性トランスフェクタント」という用語は、外来DNAを取り込んだがこのDNAを組み込んでいない細胞を指す。
【００５１】
「リン酸カルシウム-DNA共沈法」という用語は、核酸を細胞内に導入する技法を指す。細胞による核酸の取り込みは、核酸がリン酸カルシウム-核酸共沈殿として存在する場合に亢進される。Grahamおよびvan der Ebの最初の技法は（Grahamおよびvan der Eb、Virol., 52：456 [1973]）、条件を特定の種類の細胞に最適化するために、いくつかのグループによって改変されている。当業者は、これらの多くの改変をよく理解している。
【００５２】
本明細書で用いる「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」とは、所与のポリヌクレオチド配列を含む任意の組成物を広く指す。組成物には、水溶液も含まれ得る。VEGF、ANG-1、またはHIF-1αをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号:1、2、または3）またはその断片を含む組成物を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この場合、VEGF、ANG-1、またはHIF-1αをコードするポリヌクレオチド配列は典型的に、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばSDS）、および他の成分（例えば、デンハルト溶液、ドライミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液中で使用する。
【００５３】
発明の説明
本発明は、インビトロ培養皮膚組織、詳細には血管新生増殖因子をコードする外因性遺伝子を含む培養皮膚組織に関する。
【００５４】
ヒトの皮膚は、細胞外タンパク質基質に包埋された線維芽細胞を含む真皮層、および、主に、分化して最も外側の不透過性皮膚層を形成するケラチノサイトからなる表皮層から構成される。分化したケラチノサイトは連続して表面から失われ、基底のケラチノサイトの増殖によって置き換えられる。基底細胞がその分化プログラムを開始し完了する速度は、制御の分子調節は明確に定義されていないものの、厳密に制御されているようである。インビボでは、最終分化過程の最終段階は、フィラグリンを介したケラチン中間径フィラメント束の形成、および膜コーティング粒子(membrane-coating granule)から細胞内空間への脂質の放出を含む多くの変化によって特徴づけられる。カルシウム依存性トランスグルタミナーゼの作用によって共有結合で架橋結合するいくつかのタンパク質からなる別の最終分化構造である角化膜(cornified envelope)(CE)もまた、分化過程のケラチノサイトにおいて形成される。表皮では、ケラチノサイトが細胞内の細胞小器官を失い、組織の上層で脱核し、高張力を有した「死んだ骨組み(dead shell)」を形成する。ケラチノサイトの脱核および最終分化を支配する分子機構はよく理解されていない。
【００５５】
正常ケラチノサイトの完全な重層化および組織学的分化は、三次元器官型培養法を用いることにより達成することができる（例えば、Bellら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1274-78 (1979)；Parenteauら、Cytotechnology 9:163-71 (1992)を参照のこと）。真皮線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの表面上で培養したケラチノサイトは、重層扁平上皮の正常組織構造に特有である基底膜およびヘミデスモソーム等の特殊化した構造を作製し得る。
【００５６】
本発明は、血管新生増殖因子をコードする外因性遺伝子を含む培養皮膚組織を提供する。この培養皮膚組織は、これらの外因性遺伝子を欠く培養皮膚組織と比較して血管新生特性が改善されることを意図する。便宜上、本発明の説明を以下の項目で示す：A) 培養皮膚組織を作製するためのケラチノサイトおよび他の細胞の供給源；B) 培養皮膚組織における外因性血管新生増殖因子の発現；およびC) 培養皮膚組織の用途。
【００５７】
A. 培養皮膚組織を作製するためのケラチノサイトおよび他の細胞の供給源
一般に、本発明においては、重層化して扁平上皮になり得る細胞または細胞株の任意の供給源が有用である。したがって本発明は、扁平上皮に分化し得る細胞の特定の供給源の使用に限定されない。実際に本発明は、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトを含む、扁平上皮に分化し得る様々な細胞株および供給源の使用を意図する。細胞の供給源には、ヒトおよび屍体ドナーから組織採取したケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞（Augerら、In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal 36:96-103；それぞれ参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,968,546号および第5,693,332号）、新生児包皮（Asbillら、Pharm. Research 17(9): 1092-97 (2000)；Meanaら、Burns 24:621-30 (1998); それぞれ参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,485,096号；第6,039,7760号；および第5,536,656号）、ならびにNM1細胞（Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol. 23(3):205-213 (1987)）、HaCaT細胞（Boucampら、J. cell. Boil. 106:761-771 (1988)）；およびNIKS細胞（細胞株BC-1-Ep/SL；参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,989,837号；ATCC CRL-12191）等の不死化ケラチノサイト細胞株が含まれる。これらの細胞株はそれぞれ、以下に記載するように培養または遺伝子改変することができる。
【００５８】
好ましい態様においては、NIKS細胞を使用する。新規ヒトケラチノサイト細胞株（正常不死化ケラチノサイトまたはNIKS）の発見により、移植片および新しいインビトロ試験法のためにヒトケラチノサイトを遺伝子改変する機会が提供される。NIKS細胞に特有の利点は、遺伝的に一定であり、病原体が存在しないヒトケラチノサイトの一貫した供給源である点である。そのため、NIKS細胞は、ヒトの皮膚に類似した特性を有する培養皮膚組織を提供するための遺伝子改変アプローチおよびゲノム遺伝子発現アプローチの適用に有用である。そのような系により、化合物および製剤を試験するための動物の使用の重要な代替法が提供されることになる。ウィスコンシン大学において同定され特徴づけられたNIKSケラチノサイト細胞株は非腫瘍形成性であり、単層培養および器官型培養の両方において正常な増殖および分化を示す。NIKS細胞は、培養において完全に重層化した皮膚組織を形成する。この培養物は、このように試験したすべての基準において、初代ヒトケラチノサイトから形成された器官型培養物と識別できない。しかし、不死化NIKS細胞は初代細胞とは異なり、永久に増殖し続けることになる。これにより、細胞を遺伝子操作する機会、および新規の有用な特性を有する細胞の新たなクローンを単離する機会が提供される（Allen-Hoffmannら、J. Invest. Dermatol., 114(3):444-455 (2000)）。
【００５９】
NIKS細胞株は遺伝的に同一であるヒトケラチノサイトの一貫した供給源を提供するため、インビトロアッセイ法において有用である。NIKS細胞は、明らかに正常な男児から単離したヒト新生児包皮ケラチノサイトのBC-1-Ep株から生じたものである。初期の継代では、BC-1-Ep細胞は、培養正常ヒトケラチノサイトに異例である形態学特性および増殖特性を示さなかった。培養したBC-1-Ep細胞は、重層化およびプログラム細胞死の特徴を示した。複製寿命を判定するため、100mmシャーレ当たり3 × 105細胞の密度で、BC-1-Ep細胞を標準的なケラチノサイト増殖培地中で老化するまで連続的に培養し、週に1度の間隔で継代した（約1:25分割）。大きく平らな細胞を示す多くの発育不全コロニーの存在により判断して、継代15代目までに、集団中のほとんどのケラチノサイトが老化したようであった。しかし継代16代目では、小さな細胞サイズを示すケラチノサイトが認められた。継代17代目までには、小さなケラチノサイトのみが培養物中に存在し、大きな老化したケラチノサイトは認められなかった。この想定される危機過程を生き残った、結果として生じた小さなケラチノサイトの集団は、形態学的に均一であるようであり、細胞-細胞接着および明らかな鱗片生成を含む典型的なケラチノサイト特性を示すケラチノサイトのコロニーを生じた。老化を生き残ったケラチノサイトを、100mmシャーレ当たり3 × 105細胞の密度で連続して培養した。典型的には、培養物は7日以内に約8 × 106細胞の細胞密度に到達した。細胞増殖のこの安定した速度は少なくとも59継代を通して維持され、これによりこの細胞が不死化を達成したことが実証された。元の老化集団から出現したケラチノサイトは、最初はBC-1-Ep/自然発生株と命名したが、現在はNIKSと称する。NIKS(商標)細胞株を、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2、HBV、HCV、EBV、CMV、HPV、およびB19ヒトパルボウイルスを含む特定のウイルス病原体に存在について詳細にスクリーニングした。これらのウイルスは検出されなかった。さらに、NIKS(商標)細胞抽出物を接種したマウスおよび孵化卵の試験により、未同定のウイルス付随的病原体も存在しないことが実証される。またNIKS(商標)細胞株には、ヘキストおよびブロス培養により判定されるマイコプラズマ汚染も存在しない。
【００６０】
継代3代目の親BC-1-Ep細胞ならびに継代31代目および54代目のNIKS細胞に対して、染色体解析を行った。親BC-1-Ep細胞は、46、XYの正常な染色体対を有する。継代31代目では、NIKS細胞はすべて、第8染色体の長腕の同腕染色体を余分に有する47染色体を含んでいた。他の肉眼的染色体異常またはマーカー染色体は検出されなかった。継代54代目では、NIKS細胞の細胞遺伝学的異常は同腕第8染色体の存在のみであった。したがって、NIKS細胞は安定的な二倍体に近い核型を示す。
【００６１】
NIKS細胞株およびBC-1-EpケラチノサイトのDNAフィンガープリントは、解析した12座位のすべてで同一である。NIKS細胞株が偶然の機会により親BC-1-Ep DNAフィンガープリントを有する確率は、4 × 10-16である。ヒトケラチノサイトの3つの異なる供給源、ED-1-Ep、SCC4、およびSCC13yのDNAフィンガープリントは、BC-1-Epのパターンと異なる。NIKS細胞株のDNAフィンガープリント解析のデータにより、この細胞株が親BC-1-Ep細胞から生じたことが証明される。またこのデータから、他のヒトから単離されたケラチノサイト、ED-1-Ep、SCC4、およびSCC13yが、BC-1-Ep細胞と、または互いに関連性のないことも示される。NIKSのDNAフィンガープリントのデータにより、NIKS細胞株を同定する明解な方法が提供される。
【００６２】
p53機能の喪失は、培養細胞における増殖能の亢進および不死性頻度の増加に関連する。NIKS細胞のp53の配列は、公表されたp53配列（GenBankアクセッション番号：M14695）と同一である。ヒトでは、p53は、コドン72のアミノ酸により識別される2つの顕著な多型の形で存在する。NIKS細胞におけるp53の両対立遺伝子は野生型であり、コドン72においてアルギニンをコードする配列CGCを有する。p53の他の一般的な形は、この位置においてプロリンを有する。NIKS細胞におけるp53の全配列は、BC-1-Ep前駆細胞と同一である。NIKS細胞では、Rbも野生型であることが認められた。
【００６３】
足場非依存性増殖は、インビボでの腫瘍形成能と大いに関連がある。このため、アガーまたはメチルセルロース含有培地におけるNIKS細胞の足場依存性増殖特性を検討した。4週間後、アガー含有培地またはメチルセルロース含有培地のいずれにおいても、NIKS細胞は単一細胞のままであった。増殖の遅いNIKS細胞変種を検出するため、アッセイ法を全部で8週間続けた。変種は全く認められなかった。
【００６４】
親BC-1-Epケラチノサイトの腫瘍形成能およびNIKSケラチノサイト細胞の不死性を判定するため、胸腺欠損ヌードマウスのわき腹に細胞を注射した。このマウスでの腫瘍形成の陽性対照として、ヒト扁平上皮癌細胞株、SCC4を用いた。試料の注射は、マウスが一方のわき腹にSCC4を受け取りもう一方のわき腹に親BC-1-EpケラチノサイトまたはNIKS細胞のいずれかを受け取るように計画した。この注射戦略によりマウスによる腫瘍形成のばらつきが除かれ、腫瘍形成細胞の活発な増殖を支持することが確認された。親BC-1-Epケラチノサイト（継代6代目）もNIKSケラチノサイト（継代35代目）も、胸腺欠損ヌードマウスにおいて腫瘍を形成しなかった。
【００６５】
液内培養および器官型培養において、NIKS細胞の分化する能力について解析した。液内培養での細胞では、扁平上皮分化のマーカーである角化膜(CE)の形成をモニタリングした。培養ヒトケラチノサイトでは、CE構築の初期で、成熟CEの最も内側の1/3を表す、インボルクリン、シスタチンα、および他のタンパク質から構成される未熟な構造を形成した。親およびNIKSケラチノサイトにおけるCE形成を検討した。接着性BC-1-Ep細胞またはNIKS細胞株に由来するケラチノサイトでは、その2%未満しかCEを生成しない。この知見は、活発に増殖しているサブコンフルエントなケラチノサイトが5%未満のCEしか生成しないことを示す以前の研究と一致する。ケラチンの分化発現およびCE形成を含む最終分化の多くの面は、ケラチノサイトの細胞-細胞および細胞-基層接着の喪失によってインビトロで誘発することができる。分化するように誘導された場合にNIKS細胞株がCEを産生し得るかどうかを判定するため、液内培養から細胞を取り出し、メチルセルロースで半固体にした培地中で24時間培養した。NIKSケラチノサイトは、親ケラチノサイトと同程度、通常はそれより多くのCEを生成した。これらの知見から、NIKSケラチノサイトがこの細胞種に特異的な分化構造の形成を開始する能力を欠いていないことが実証される。
【００６６】
NIKSケラチノサイトが扁平上皮分化を起こし得ることを確認するため、細胞を器官型培養で培養した。プラスチック基層上および液内培養で培養したケラチノサイト培養物は、複製するが限定的な分化を示す。具体的には、ヒトケラチノサイトはコンフルエントになり、3層以上からなるケラチノサイトのシートを生成する限定的な重層化を起こす。光学顕微鏡および電子顕微鏡観察によると、組織培養で形成される多層のシートの構造と完全なヒト皮膚の構造には顕著な相違が存在する。一方、器官型培養技法により、インビボ様の条件下でケラチノサイトの増殖および分化が可能となる。詳細には、細胞は、繊維状コラーゲン基部に包埋された真皮線維芽細胞からなる生理的基層に接着する。器官型培養物は、空気-培地の界面で維持される。このような方法で、増殖する基部の細胞がコラーゲンゲルを通して拡散することにより提供される栄養素の勾配に最接近したままで、上方のシート内の細胞は空気に曝される。これらの条件下において、正しい組織構造が形成される。分化する正常表皮のいくつかの特徴が明らかである。親細胞およびNIKS細胞株では、表皮と真皮等価物の接合部に単層の立方基底細胞が存在する。丸い形態および細胞質に対する高い核の比率は、ケラチノサイトの活発に分裂している集団を示す。正常ヒト表皮では、基底細胞は分裂しながら娘細胞を生じ、娘細胞は上方に向かって組織の分化している層に移動する。娘細胞は大きさを増し、平板化して扁平状になる。最終的に、これらの細胞は脱核し、角質化しケラチン化した構造を形成する。この正常な分化過程は、親細胞およびNIKS細胞の上層においても明らかである。平板化した扁平上皮細胞の出現はケラチノサイトの上層で明らかであり、このことから器官型培養物で重層化が起こったことが実証される。器官型培養物の最上部分において、脱核した鱗片が培養物の表面からはがれ落ちる。現在まで、器官型培養で培養した親ケラチノサイトとNIKSケラチノサイト細胞株の間には、光学顕微鏡レベルでの、分化における組織学的相違は認めらていない。
【００６７】
親（継代5代目）およびNIKS（継代38代目）器官型培養物の特徴をより詳細に観察するため、かつ組織学的知見を確認するため、電子顕微鏡を用いて試料を解析した。親細胞および不死化ヒトケラチノサイト細胞株、NIKSを器官型培養において15日経過した後に回収し、重層化の程度を示すために基底層に垂直に切片を作製した。親細胞およびNIKS細胞株はどちらも、器官型培養において高度に重層化し、正常ヒト表皮に特有の構造を形成する。親細胞およびNIKS細胞株の器官型培養物には、デスモソームが豊富に形成される。親細胞および細胞株の基底ケラチノサイト層における基底板および関連したヘミデスモソームの形成もまた認められた。ヘミデスモソームは、ケラチノサイトの基底板への結合を増して、組織の完全性および強度の維持を支持する特殊化した構造である。この構造の存在は、親細胞またはNIKS細胞がメッシュ担体に直接付着した部位で特に明らかであった。これらの知見は、線維芽細胞含有ナイロンメッシュ上で培養したヒト包皮ケラチノサイトを用いた以前の超微細構造の知見と一致する。光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルでの解析により、器官型培養におけるNIKS細胞株は、重層化し、分化し、正常ヒト表皮に認められるデスモソーム、基底板、およびヘミデスモソーム等の構造を形成することが実証される。
【００６８】
B. 培養皮膚組織における外因性血管新生増殖因子の発現
本発明の好ましい態様において、培養皮膚組織を形成するために用いるケラチノサイトは少なくとも1つの血管新生増殖因子を含む。いくつかの好ましい態様において、血管新生増殖因子はVEGFファミリーのメンバー（例えば、VEGF-A、-B、-C、およびPIGF）である。他の好ましい態様において、血管新生増殖因子はアンジオポエチンまたはアンジオポエチン関連タンパク質である。
【００６９】
密接に関連した5つのタンパク質（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、およびPIGF）は、VEGFファミリーを構成する（ErikssonおよびAlitalo、Curr Top Microbiol Immunol 237:41-57. (1999)、Persicoら、Curr Top Microbiol Immunol 237:31-40. (1999)）。これらの因子のほとんどが血管およびリンパの発生において非常に特異的な役割を果たすと思われるのに対して（Olofssonら、Curr Opin Biotechnol 10:528-35. (1999)、Carmeliet, Nat Med 6:389-95. (2000)、Bellomoら、Circ Res 86:E29-35. (2000)）、VEGF-Aは潜在的血管新生活性を有し、血管新生過程において多種多様な刺激により誘導され発現される。
【００７０】
VEGF-Aは最初、ウシ下垂体濾胞星状細胞および腫瘍の馴化培地中で同定された（Sengerら、Science 219:983-5. (1983)、FerraraおよびHenzel、Biochem Biophys Res Commun 161:851-8. (1989)、Ferraraら、Methods Enzymol 198:391-405. (1991)）。VEGF-Aはインビトロにおける微小血管内皮細胞の潜在的マイトジェンである二量体糖タンパク質であり（Detmarら、J Invest Dermatol 105:44-50. (1995)）、インビボにおいて血管新生活性を示す。選択的スプライシングにより、VEGF-A遺伝子から121、165、189、および206アミノ酸の4つのVEGF-Aアイソフォームが発現される（Houckら、Mol Endocrinol 5:1806-14. (1991)）。4つのアイソフォームはすべてN末端シグナルペプチドを含み、最も大きい2つの形はその効率的分泌を妨げる好塩基性の24アミノ酸ドメインを含む。分泌されたVEGF-Aホモ二量体およびヘテロ二量体は、微小血管内皮細胞の表面で独占的に発現される3つの膜貫通チロシンキナーゼ、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR)、およびVEGFR-3(Flt-3)に結合する（Yancopoulosら、Nature 407:242-8. (2000)）。VEGF受容体がこのように高度に限定して発現されることが、VEGF-Aが内皮細胞に対して高度に選択的に作用する原因であると思われる。VEGFR-2を介したシグナル伝達がVEGFの増殖効果および透過効果のほとんどに関与すると考えられるが（Shalabyら、Nature 376:62-6. (1995)）、その一方で、VEGF-AのVEGFR-1への結合がVEGFR-2を介したシグナル伝達を阻害するように作用する可能性がある（Fongら、Nature 376:66-70. (1995)）。
【００７１】
血管新生の過程は、静止状態の脈管構造の局所的かく乱、新たな血管を形成するための内皮細胞の認識および増殖、ならびにこれらの新生血管の安定な血管ネットワークへの成熟を含む。VEGF-Aは、微小血管内皮細胞の遊走および増殖を促進することにより、血管新生において初期の役割を果たすと考えられている。さらにVEGF-Aは、炎症および組織虚血に応答して血管の透過性亢進を促進する。VEGF-Aは胚の血管発生に必要であり、マウスにおいて一方のVEGF-A対立遺伝子が喪失するだけでも、脈管構造が十分に形成されないことから胚性致死を招く（Carmelietら、Nature 380:435-9. (1996)、Ferraraら、Nature 380:439-42. (1996)）。成体では、VEGF-Aは、卵巣および子宮内膜等の血管再構築部位において主に発現される（Maisonpierreら、Science 277:55-60. (1997)，Mollerら、Mol Hum Reprod 7:65-72. (2001)）。
【００７２】
VEGF-Aの発現はまた、炎症、創傷治癒（Brownら、J Exp Med 176:1375-9. (1992)）、乾癬（Detmarら、J Exp Med 180:1141-6. (1994)）、および腫瘍血管新生（Shweikiら、Proc Natl Acad Sci U S A 92:768-72. (1995)）を含む、血管新生を伴って生じる病的状態にも関連する。ヒトケラチノサイトは、創傷治癒の過程でVEGF121、VEGF165、およびVEGF189を発現し、ケラチノサイトにおけるこれらのタンパク質の発現は低酸素状態によって誘導される（Brownら、J Exp Med 176:1375-9. (1992)、Ballaunら、J Invest Dermatol 104:7-10. (1995)、Detmarら、J Invest Dermatol 108:263-8. (1997)）。創傷治癒過程におけるVEGF-Aの発現により、血管新生が亢進し、低酸素組織の血管新生が亢進する。VEGF-Aの透過効果により、血清タンパク質の漏出および凝固が起こり、これによって細胞外基質成分の沈着が促進される。VEGF-Aは内皮細胞の増殖および内皮細胞の創傷基盤への遊走を促進し、その結果血管新生が亢進される。創傷治癒におけるVEGF-Aの重要性は、VEGF-A発現の低下が糖尿病マウスにおける皮膚の創傷治癒の障害と関連があるという知見により説明される（Frankら、J Biol Chem 270:12607-13. (1995)、Rivardら、Am J Pathol 154:355-63. (1999)）。
【００７３】
血管新生におけるVEGF-Aの重要な役割は、VEGF-Aを過剰発現するように操作したマウスの血管新生が亢進されることによって説明される。トランスジェニックマウスの皮膚を標的としてVEGF-Aを発現させることにより、血管密度は顕著に増加したが、生じた血管は透過性が異常に高かった（Larcherら、Oncogene 17:303-11. (1998)、Detmarら、J Invest Dermatol 111:1-6. (1998)）。これらの知見から、VEGF発現単独では異常な血管新生が起こること、および正常な血管新生には他の因子が必要であることが示唆された。VEGF-Aは血管新生の初期段階を促進するが、生じた脈管構造の成熟および安定性には他の血管新生因子、特にアンジオポエチンの作用が必要である。
【００７４】
アンジオポエチンは、内皮細胞特異的Tie2受容体のリガンドとして最近になって同定された（Maisonpierreら、Science 277:55-60. (1997)、Davvisら、Cell 87:1161-9. (1996)）。アンジオポエチン-1(Ang-1)がTie2に結合し、そのチロシンキナーゼ活性を活性化するのに対して、アンジオポエチン-2(Ang-2)のTie2への結合ではこの活性化は起こらない。アンジオポエチンは他の血管新生因子と協調して働き、微小血管ネットワークの安定性を調節するようである（Maisonpierreら、Science 277:55-60. (1997)、Davisら、Cell 87:1161-9. (1996)、Suriら、Cell 87:1171-80. (1996)）。アンジオポエチン-1(Ang-1)は成体組織において広く発現し、PECAM-1の発現を増大させることによって隣接する内皮細胞間の相互作用を強化することにより、成熟血管の形成を促進すると考えられている（Gambleら、Circ Res 87:603-7. (2000)）。一方、Ang-2は血管再構築を起こしている部位で主に発現され、Ang-1の安定化効果を局所的に抑制することにより血管の柔軟性を促進すると考えられている（Maisonpierreら、Science 277:55-60. (1997)）。これらの知見から、Ang-1およびAng-2は互いに対抗して作用し、微細血管ネットワークの柔軟性を仲介するという仮説が導き出された。
【００７５】
マウスにおけるAng-1およびTie2受容体の喪失は、致死性および血管発生の欠損をもたらす（Suriら、Cell 87:1171-80. (1996)、Satoら、Nature 376:70-4. (1995)）。Ang-1またはTie2変異マウスでは、血管新生の初期段階は比較的正常に進行するものの、続く胚性血管の成熟および安定化が起こらない。このことは、Ang-1が、内皮細胞と平滑筋細胞との相互作用を強化することにより、血管の安定化を促進するという知見と一致する（Suriら、Cell 87:1171-80. (1996)、Papapetropoulosら、Lab Invest 79:213-23. (1999)）。マウスにおいてAng-2を過剰発現させることより、Ang-1またはTie2変異マウスで認められる欠損と類似した血管新生の欠損を伴う胚性致死が生じる。これらの知見は、Ang-2がAng-1によって媒介されるシグナル伝達経路の天然アンタゴニストとして機能するという仮説と一致する。
【００７６】
ケラチノサイト特異的ケラチン14プロモーターからVEGF-AまたはAng-1を過剰発現させることにより、トランスジェニックマウスの皮膚において血管新生が増加するが、生じた血管構造はかなり異なる。VEGF-Aの単独での発現により、透過性が亢進した多数の微小血管が形成される（Detmarら、J Invest Dermatol 111:1-6. (1998)、Thurstonら、Science 286:2511-4. (1999)）。一方、Ang-1の発現では主に、血管数がほとんど増加せずに血管の直径が増加する（Thurstonら、Science 286:2511-4. (1999)、Suriら、Science 282:468-71. (1998)）。VEGF-AとAng-1を両方発現するトランスジェニックマウスは、皮膚の血管新生の増加を示す。血管密度の増加は、血管数の増加および血管の直径の増大による。VEGF-A単独の過剰発現によって形成される血管とは異なり、VEGF/Ang-1トランスジェニックマウスの血管は透過性亢進性ではない（Thurstonら、Science 286:2511-4. (1999)）。これらの結果は、内皮細胞の増殖および遊走の初期段階を促進するというVEGF-Aの提唱される役割、ならびに新生血管の成熟および安定化を促進するというAng-1の提唱される役割と一致する。これらの知見に基づくと、VEGF-AとAng-1の共発現が相乗的に働き、成熟血管ネットワークの形成を促進すると推測することは妥当である。
【００７７】
VEGF-Aの潜在的血管新生効果のために、虚血組織の血管新生を増加させる戦略として、VEGF-Aの遺伝子治療が検討された。ラットにVEGF121 cDNAを局所的投与することにより、真皮血管密度が増加するとともに、実験的に誘導した虚血皮弁の残存が増加した（Taubら、Plast Reconstr Surg 102:2033-9. (1998)）。心筋微小血管虚血の動物モデルにおいて、VEGF-Aの投与により血管新生が増加し、血流が増加し、虚血が低減した（Tanakaら、J Thorac Cardiovasc Surg 120:720-8. (2000)）。現在、VEGF-A遺伝子治療は慢性心筋虚血の治療の臨床試験中である（O'BrienおよびSimari、Mayo Clin Proc 75:831-4. (2000)、Baumgartner, Curr Cardiol Rep 2:24-8. (2000)、Valeら、Circulation 102:965-74. (2000))。
【００７８】
熱傷治療および損傷治癒のための培養皮膚組織の性能を改善するため、2つのグループを、VEGFを過剰発現するようにケラチノサイトを遺伝子改変した。Suppらは、VEGF165を発現する複製不能レトロウイルスに感染したヒトケラチノサイトを用いて、マウスに移植した後に、VEGF-A発現により培養皮膚組織の血管新生が促進されることを見出した（Suppら、J Invest Dermatol 114:5-13 (2000)）。改変した移植片は、真皮血管数の増加および血管新生に要する時間の減少を示した。VEGF-Aを発現する培養皮膚組織は、対照よりも多く損傷基盤に付着し、切除の際にはより多く出血した。3日目までに、VEGF-Aを発現する培養皮膚組織の真皮層において血管が認められた。免疫組織化学的解析により、移植片の真皮層にマウス内皮細胞が検出された。改変した移植片が血管新生する時間は1週間短縮された。VEGF-Aケラチノサイトを用いて調製した培養皮膚組織は、インビトロ培養してから21日後にも高レベルの（〜140×対照）VEGF-Aを発現し続けた。発現レベルの増加は、移植してから少なくとも14日間持続した。
【００７９】
Del Rioらは、ケラチノサイト特異的ケラチン5プロモーターの調節下でVEGF-Aを過剰発現するブタケラチノサイトを作製するための非ウイルス性トランスフェクション法の使用を報告した。このケラチノサイトを線維芽細胞含有フィブリンゲルの複合培養で培養し、ヌードマウスの創傷に移植する際に強力な血管新生反応を誘発した（Del Rioら、Gene Therapy 6:1734-1741 (1999)）。VEGF-A発現の増加は、移植してから20日後にも検出可能であった。これらの結果から、VEGF-Aによる血管新生の亢進によって、慢性皮膚潰瘍等の損なわれた治癒環境または糖尿病損傷治癒において培養皮膚組織の使用が増える可能性がある。
【００８０】
上記の研究では、ウイルスまたはケラチン-5のプロモーターを用いて、移植片の培養および損傷治癒の過程でVEGF-Aを持続的に発現させた。損傷治癒過程の初期にのみ血管新生を促進するが、損傷治癒過程の後期には長期の持続したVEGF過剰発現を起こさないことが有利であると考えられる臨床設定では、これは望ましくないと考えられる。
【００８１】
これらの研究は血管新生を誘導するためのVEGF-Aの有用性を強調しているが、トランスジェニックマウスでのVEGF過剰発現の結果により、VEGF-A単独での発現は完全な血管新生を促進するためには不十分であることが示される。したがって、慢性損傷の治療および治癒を改善するためには、他の血管新生因子とともにVEGF-Aを発現させる治療的戦略の開発が非常に有望である。
【００８２】
損傷治癒の過程では、VEGF-Aの産生が一過性に増加し、これにより内皮細胞の増殖および損傷基盤への遊走が増加する。血管新生過程においては、VEGF-Aの発現の増加と同時に、Ang-2の局所的発現の増加がAng-1の血管安定化作用と拮抗し、脈管構造の柔軟性の増加をもたらす。血管新生が進行するにつれてVEGF-AおよびAng-2の産生は減少し、Ang-1の連続した発現により新生脈管構造が安定化する。
【００８３】
培養皮膚組織の移植過程でVEGF-1およびAng-1の時間的機能を再現するため、本発明は、損傷治癒の過程でVEGF-Aを一過性に発現し、VEGF-A発現が休止してからAng-1の持続的発現が提供される器官型皮膚培養物の作製を意図する。損傷治癒過程でのVEGF-1およびAng-1発現のタイミングおよび程度を調節するため、本発明は、誘導調節系を用いたケラチノサイトにおけるこれらのタンパク質の発現を意図する。
【００８４】
血管新生遺伝子の活性化因子の使用もまた意図する。詳細には、低酸素誘導性因子(HIF)は、HIF1αサブユニットおよび芳香族炭化水素受容体核輸送体(ARNT)から構成されるヘテロ二量体転写因子である。HIF1αサブユニットは多くの組織で構成的に発現されるが、正常酸素圧条件下ではユビキチン/プロテアソーム系により速やかに分解される。この分解は、HIF1αサブユニットの中央に位置する200アミノ酸の酸素依存性分解ドメイン(ODD)によって媒介される。低酸素条件下では、HIF1αは安定化し、ARNTとの会合、核への移行、およびVEGFを含む低酸素誘導性標的遺伝子の活性化をもたらす。ODDの欠失により、正常酸素条件下で安定であり、低酸素刺激の非存在下でVEGFおよび他の低酸素調節性遺伝子を誘導するHIF1αポリペプチドが産生される。したがって、本発明は、血管新生因子または血管新生因子の活性化因子をコードする少なくとも1つの外因性遺伝子を含むケラチノサイトを提供する。いくつかの態様では、血管新生因子はVEGFファミリーのメンバーである。さらに好ましい態様においては、血管新生因子はVEGF-A（配列番号:1）である。本発明は、野生型VEGF配列の使用に制限されない。実際に、様々なVEGF相同体の使用を意図する。いくつかの好ましい態様において、VEGF相同体は天然VEGF配列と少なくとも80%の同一性を共有し、より好ましい態様においては、VEGF相同体は天然VEGF配列と少なくとも90%の同一性を共有し、最も好ましい態様においては、VEGF相同体は天然VEGF配列と少なくとも95%の同一性を共有する。他の好ましい態様では、VEGF相同体は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で天然VEGF配列にハイブリダイズする。さらに別の態様では、VEGF相同体遺伝子配列によってコードされるVEGFタンパク質は、競合的結合アッセイ法において（例えば、VEGF受容体flt-1、flt-3、またはKDRへの結合）天然VEGFと競合する。さらに好ましい態様において、VEGF-A相同体は配列番号:1と少なくとも80%の同一性を共有し、より好ましい態様においては、VEGF-A相同体は天然の配列番号:1と少なくとも90%の同一性を共有し、最も好ましい態様においては、VEGF-A相同体は天然の配列番号:1と少なくとも95%の同一性を共有する。他の好ましい態様において、VEGF-A相同体は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で配列番号:1またはその相補鎖にハイブリダイズする。さらに別の態様では、VEGF相同体遺伝子配列によってコードされるVEGFタンパク質は、競合的結合アッセイ法において配列番号:1によってコードされるVEGF-Aと競合する。
【００８５】
他の態様において、ケラチノサイトは、アンジオポエチンをコードする少なくとも1つの外因性遺伝子を含む。いくつかの態様では、アンジオポエチンはアンジオポエチン-1(ANG-1)と実質的相同性を共有する。さらに好ましい態様においては、血管新生因子はANG-1（配列番号:2）である。本発明は、野生型アンジオポエチン配列の使用に制限されない。実際に、様々なアンジオポエチン相同体の使用を意図する。いくつかの好ましい態様において、アンジオポエチン相同体は天然アンジオポエチン配列と少なくとも80%の同一性を共有し、より好ましい態様においては、アンジオポエチン相同体は天然アンジオポエチン配列と少なくとも90%の同一性を共有し、最も好ましい態様においては、アンジオポエチン相同体は天然アンジオポエチン配列と少なくとも95%の同一性を共有する。他の好ましい態様では、アンジオポエチン相同体は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で天然アンジオポエチン配列にハイブリダイズする。さらに別の態様では、アンジオポエチン相同体遺伝子配列によってコードされるアンジオポエチンタンパク質は、競合的結合アッセイ法（例えばARNTとの）において天然アンジオポエチンと競合する。さらなる態様において、好ましいアンジオポエチン相同体は配列番号:2と少なくとも80%の同一性を共有し、より好ましい態様においては、アンジオポエチン相同体は天然の配列番号:2と少なくとも90%の同一性を共有し、最も好ましい態様においては、アンジオポエチン相同体は天然の配列番号:2と少なくとも95%の同一性を共有する。他の好ましい態様において、アンジオポエチン相同体は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で配列番号:2またはその相補鎖にハイブリダイズする。さらに別の態様では、アンジオポエチン相同体遺伝子配列によってコードされるアンジオポエチンタンパク質は、競合的結合アッセイ法において配列番号:2によってコードされるアンジオポエチンと競合する。
【００８６】
他の態様において、ケラチノサイトは、血管新生因子の活性化因子をコードする少なくとも1つの外因性遺伝子を含む。いくつかの好ましい態様では、活性化因子はHIF-1α（配列番号:3）である。本発明は、野生型HIF-1α配列の使用に制限されない。実際に、様々なHIF-1α相同体の使用を意図する。いくつかの好ましい態様において、HIF-1α相同体は天然HIF-1α配列と少なくとも80%の同一性を共有し、より好ましい態様においては、HIF-1α相同体は天然HIF-1α配列と少なくとも90%の同一性を共有し、最も好ましい態様においては、HIF-1α相同体は天然HIF-1α配列と少なくとも95%の同一性を共有する。他の好ましい態様では、HIF-1α相同体は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で天然HIF-1α配列にハイブリダイズする。さらに別の態様では、HIF-1α相同体遺伝子配列によってコードされるHIF-1αタンパク質は、競合的結合アッセイ法（例えばTIE2受容体との）において天然HIF-1αと競合する。さらなる態様において、好ましいHIF-1α相同体は配列番号:3と少なくとも80%の同一性を共有し、より好ましい態様においては、HIF-1α相同体は天然の配列番号:3と少なくとも90%の同一性を共有し、最も好ましい態様においては、HIF-1α相同体は天然の配列番号:3と少なくとも95%の同一性を共有する。他の好ましい態様において、HIF-1α相同体は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で配列番号:3またはその相補鎖にハイブリダイズする。さらに別の態様では、HIF-1α相同体遺伝子配列によってコードされるHIF-1αタンパク質は、競合的結合アッセイ法において配列番号:3によってコードされるHIF-1αと競合する。
【００８７】
上記の血管新生因子および活性化因子の機能的相同体または変種は、培養皮膚組織を作製するためのケラチノサイトを用いてケラチノサイトにおいて適切なベクター（以下で詳細に説明する）内の変種を発現させることにより、および培養皮膚組織を血管新生の増加について解析することにより、スクリーニングすることができる。
【００８８】
いくつかの態様において、変種（すなわち相同配列）は変異（すなわち、核酸配列の変化）により生じ、これにより一般に構造または機能が変化するまたはしない可能性のある変化したmRNAまたはポリペプチドが産生される。任意の所与の遺伝子は、変種の形を有さない場合、1つまたは複数の変種の形を有する場合がある。変種を生じる一般的変異変化は一般に、核酸の欠失、付加、または置換が原因とされる。これらの種類の変化はそれぞれ、所与の配列内で単独でまたは他との組み合わせで、1回または複数回の割合で起こる可能性がある。
【００８９】
血管新生因子または活性化因子（例えば、VEGF-A、ANG-1、またはHIF-1α）のそのリガンドへの結合親和性を亢進するような目的で、機能（例えば血管新生因子機能）を有するペプチドの構造を改変することが可能であることを意図する。そのような改変ペプチドは、本明細書で定義するVEGF-A、ANG-1、またはHIF-1αの活性を有するペプチドの機能的等価物であるとみなす。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、置換、欠失、または付加等によって変化した改変ペプチドが産生され得る。特に好ましい態様においては、これらの改変により、改変VEGF-A、ANG-1、またはHIF-1αの活性は有意に低下しない。すなわち、構築物「X」は、構造的ではなく機能的に定義される本発明の改変または変種血管新生因子の種類のメンバーであるかどうかを判定するために、評価することができる。好ましい態様においては、上記の方法により変種もしくは変異体VEGF-A、ANG-1、またはHIF-1αを評価する。
【００９０】
さらに、上記のように、VEGF-A、ANG-1、またはHIF-1αの変種の形が、本明細書でより詳細に説明するペプチドおよびDNA分子と同等であることを意図する。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる、アスパラギン酸のグルタミン酸による、スレオニンのセリンによる単独の置換、または構造的に関連したアミノ酸による同様の置換（すなわち保存的変異）は、生じる分子の生物活性に大きな影響を及ぼさないと考えられる。したがって、本発明のいくつかの態様では、保存的置換を含む本明細書で開示するVEGF-A、ANG-1、またはHIF-1の変種を提供する。保存的置換とは、側鎖が関連したアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝子のコードするアミノ酸を4つのファミリーに分類することができる：(1) 酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；(2) 塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；(3) 非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および(4) 無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類される場合もある。同様に、アミノ酸レパートリーを以下のように分類することができる：(1) 酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；(2) 塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；(3) 脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、選択的にセリンおよびスレオニンは脂肪族-水酸基として別に分類され得る；(4) 芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；(5) アミド（アスパラギン、グルタミン）；および(6) 硫黄含有（システインおよびメチオニン）（例えば、Stryer編、Biochemistry. 17〜21ページ、第2版、WH Freeman and Co., 1981）。ペプチドのアミノ酸配列における変化が機能的相同体を生じるかどうかは、変種ペプチドが野生型タンパク質と同様の様式で機能する能力を評価することにより、容易に判定することができる。2つ以上の置換を有するペプチドも、同様に容易に試験することができる。
【００９１】
より稀に、変種は「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンによる置換）を含む。類似の軽微な変異には、アミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方が含まれ得る。生物活性を消失することなくどのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかを判定する指針は、コンピュータープログラム（例えば、LASERGENEソフトウェア、DNASTAR Inc., ウィスコンシン州、マディソン）を用いて見出すことができる。
【００９２】
いくつかの好ましい態様において、本発明のケラチノサイトは、少なくとも1コピーのVEGF相同体、および/または少なくとも1コピーのアンジオポエチン相同体、および/または少なくとも1コピーのHIF-1相同体を含む。いくつかの好ましい態様において、本発明のケラチノサイトは、少なくとも1コピーのVEGF-A相同体（例えば配列番号:1）、および/または少なくとも1コピーのアンジオポエチン-1相同体（例えば配列番号:2）を含む。
【００９３】
さらなる好ましい態様においては、少なくとも1つの血管新生因子を誘導制御系に機能的に結合させてある。いくつかの好ましい態様において、誘導系はTet系である。この系により、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを含むがこれに限定されないテトラサイクリン誘導体の有無により調節される遺伝子発現の制御された誘導または抑制が可能になる（GossenおよびBujard、Proc Natl Acad Sci U S A 89:5547-51 (1992)、Gossenら、Curr Opin Biotechnol 5:516-20. (1994)、Gossenら、Science 268:1766-9 (1995)）。他の適切な誘導発現系にはGENESWITCHが含まれる。したがって本発明は、血管新生因子または活性化因子遺伝子（例えば、VEGF、ANG-1、またはHIF-1α）との機能的な結合において誘導性プロモーター系を含む、ケラチノサイトまたは他の細胞をトランスフェクションするための構築物を提供する。さらなる態様においては、外因性遺伝子を、誘導因子の局所的投与により（例えば、Tet-onプロモーターを誘導するためのドキシサイクリンの局所的投与；図4を参照のこと）誘導できるプロモーターに機能的に結合させる。
【００９４】
いくつかのさらなる好ましい態様においては、血管新生因子および/または活性化因子を、遺伝子が異なった時間に発現し得るように異なる誘導性プロモーターに機能的に結合させる。例えば、いくつかの態様では、VEGF遺伝子がまず移植組織で発現し、その後ANG-1遺伝子が発現することを意図する。さらに別の態様では、ケラチノサイト（例えばNIKS細胞）に1つの血管新生因子または活性化因子のみをトランスフェクションすることを意図する。異なる血管新生因子または活性化因子を発現するケラチノサイトの集団を様々な比率で混合し、それにより生じる移植組織における遺伝子産物の発現レベルを調節することができることを意図する。例えば、いくつかの態様では、移植片を形成するために用いる90%のケラチノサイトがVEGF-Aを発現し、10%のケラチノサイトがANG-1を発現する。他の態様では、移植片を形成するために用いる70%のケラチノサイトがVEGF-Aを発現し、30%のケラチノサイトがANG-1を発現する。他の態様では、移植片を形成するために用いる30%のケラチノサイトがVEGF-Aを発現し、70%のケラチノサイトがANG-1を発現する。他の態様では、移植片を形成するために用いる10%のケラチノサイトがVEGF-Aを発現し、90%のケラチノサイトがANG-1を発現する。これらの比率は限定的でなく、血管新生因子または活性化因子を発現する細胞の最適な比率を決定するための指針を提供することを目的とするものであることが認識されよう。
【００９５】
本発明の構築物は、様々な方法によりケラチノサイトに導入することができる。特に好ましい態様では、TRANSIT系（Mirus Corp.、ウィスコンシン州、マディソン）を介して構築物を導入する。一般に、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）を含むがこれらに限定されない多くの他の哺乳動物発現ベクターが本発明での使用に適していることが意図される。任意の他のプラスミドまたはベクターも、宿主内で複製可能であり生存可能である限りは用いることができる。本発明のいくつかの好ましい態様において、哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配列を含む。他の態様においては、SV40のスプライス部位およびポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供してもよい。さらに、レトロウイルスベクターを介して、外因性遺伝子を挿入してもよい。特に好ましい態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクター（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）である。トランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、微粒子照射法、リポソームを介するトランスフェクション法、またはレトロウイルス感染法を含むがこれらに限定されない当技術分野で周知の任意の方法により達成することができることを意図する。
【００９６】
いくつかの態様では、ケラチノサイトを用いて培養皮膚組織を形成する。好ましい態様において、ケラチノサイトは器官型で培養する。特に好ましい態様において、コラーゲンおよび線維芽細胞を含む真皮層を形成し培養する。次に、トランスフェクションしたケラチノサイトを真皮等化物上に播種する。続いて、播種した真皮等化物を空気界面で培養し、最終的に完全に重層化した培養皮膚組織を形成する。皮膚組織の器官型培養の好ましい方法は、実施例に記載する。しかしながら、本発明はこれらの好ましい培養法に限定されない。
【００９７】
C. 培養皮膚組織の用途
本発明の培養皮膚組織は様々な用途を有することを意図する。これらの用途には、化合物をスクリーニングするための使用、腫瘍および病原体（例えばヒトパピローマウイルス）を培養するための基質、創縫合、および熱傷治療、ならびに治療薬の送達が含まれるが、これらに限定されない。これらの用途を以下に詳細に説明する。
【００９８】
1. 化合物をスクリーニングするための使用
本発明の培養皮膚組織は、様々なインビトロ試験に使用できる。詳細には、培養皮膚組織は、皮膚治療生成物、薬物代謝、試験化合物に対する細胞応答、創傷治癒、光毒性、真皮刺激性、真皮炎、皮膚腐食性、および細胞障害の評価に使用される。培養皮膚組織は、6ウェル、24ウェル、および96ウェルプレートを含む様々な形式で提供される。さらに、標準的な解離法により培養皮膚組織を分割し、その後試験することができる。本発明の培養皮膚組織は、分化した角質層を伴う表皮層および真皮線維芽細胞を含む表皮層の両方を有し得る。上記のように、好ましい態様において、表皮層は不死化NIKS細胞に由来する。NIKS細胞を含む他の好ましい細胞株は、i) 不死化されていること；ii) 非腫瘍形成性であること；iii) 分化を誘導された場合に角化膜を形成すること；iv) 器官型培養において正常な扁平上皮分化を起こすこと；およびv) マイトマイシンC処理した3T3フィーダー細胞の存在下で標準的なケラチノサイト増殖倍地中で培養した場合の、正常ヒトケラチノサイトの形態学的特徴の提示；2) 増殖のための上皮増殖因子への依存性；および3) トランスフォーミング増殖因子β1による増殖の阻害を含む細胞種特異的増殖要求性を維持すること、によって特徴づけられる。
【００９９】
本発明は、様々なスクリーニングアッセイ法を包含する。いくつかの態様において、スクリーニング法は、本発明の培養皮膚組織および少なくとも1つの試験化合物または製品（例えば、保湿剤等のスキンケア製品、化粧品、色素、または香料；製品は、クリーム、ローション、液体、およびスプレーを含むがこれらに限定されない任意の形であってよい）を提供する段階、製品または試験化合物を培養皮膚細胞に添加する段階、および製品または試験化合物の培養皮膚組織に対する影響をアッセイする段階を含む。製品または試験化合物の培養皮膚組織に対する影響を判定するには、多種多様なアッセイ法が用いられる。これらのアッセイ法には、MTT細胞毒性アッセイ法（Gay, The Living Skin Equivalent as an In Vitro Model for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants, Toxic. In Vitro (1992)）ならびに炎症性修飾因子（例えば、プロスタグランジンE2、プロスタサイクリン、およびインターロイキン1α）および化学誘引物質の放出をアッセイするためのELISA法が含まれるが、これらに限定されない。さらにアッセイ法を、化合物もしくは製品の毒性、効力、または有効性に向けることもできる。さらに、増殖、バリアー機能、もしくは組織強度に対する化合物または製品の影響を試験することもできる。
【０１００】
特に、本発明はコンビナトリアルライブラリー（例えば、104個を超える化合物を含むライブラリー）から化合物をハイスループットスクリーニングための、培養皮膚組織の使用を意図する。いくつかの態様では、細胞表面受容体の活性化後のシグナル伝達をモニタリングする二次メッセンジャーアッセイ法に細胞を用いる。他の態様では、転写/翻訳レベルでの細胞応答をモニタリングするレポーター遺伝子アッセイ法に細胞を用いることができる。さらなる態様では、細胞を細胞増殖アッセイ法で使用し、外部刺激に対する細胞の全体的な増殖/非増殖もモニタリングすることができる。
【０１０１】
二次メッセンジャーアッセイ法では、1つの化合物または複数の化合物（例えばコンビンナトリアルライブラリー由来）で培養皮膚組織を処理し、二次メッセンジャー応答の有無についてアッセイする。いくつかの好ましい態様では、培養皮膚組織の作製に用いた細胞（例えばNIKS細胞）に、組換え細胞表面受容体、イオンチャネル、電位依存性チャネル、またはシグナル伝達カスケードに関与する関心対象のいくつかの他のタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクションする。コンビナトリアルライブラリー中の少なくともいくつかの化合物が、ベクターによってコードされる1つのタンパク質または複数のタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、活性化因子、または阻害剤として機能を果たし得ることを意図する。コンビナトリアルライブラリー中の少なくともいくつかの化合物が、シグナル伝達経路においてベクターによってコードされるタンパク質の上流または下流で働くタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、活性化因子、または阻害剤として機能を果たし得ることも意図する。
【０１０２】
いくつかの態様において、二次メッセンジャーアッセイ法では、膜受容体およびイオンチャネル（例えばリガンド依存性イオンチャネル；Denyerら、Drug Discov. Today 3:323-32 [1998]；およびGonzalesら、Drug Discov. Today 4：431-39 [1999]を参照のこと）の刺激による細胞内変化（例えばCa2+濃度、膜電位、pH、IP3、cAMP、アラキドン酸放出）に応答するレポーター分子からの蛍光シグナルを測定する。レポーター分子の例には、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）系（例えば、Cuo-脂質およびオキソノール、EDAN/DABCYL）、カルシウム感受性指標（例えば、Fluo-3、FURA 2、INDO 1、およびFLUO3/AM、BAPTA AM）、塩素感受性指標（例えば、SPQ、SPA）、カリウム感受性指標（例えばPBFI）、ナトリウム感受性指標（例えばSBFI）、およびpH感受性指標（例えばBCECF）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
一般に、培養皮膚組織を構成する細胞に指標を添加してから、細胞を化合物に曝露する。宿主細胞の化合物での処理に対する反応は、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡（例えばFCS系）、フローサイトメトリー、マイクロフルイディクス装置、FLIPR系（例えば、SchroederおよびNeagle、J. Biomol. Screening  1:75-80 [1996]を参照のこと）、およびプレート読み取り系を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の方法によって検出することができる。いくつかの好ましい態様では、未知活性の化合物によって生じる反応（例えば、蛍光強度の増加）を、既知アゴニストによって生じる反応と比較し、既知アゴニストの最大反応の割合として表す。既知アゴニストによって生じる最大反応を100%と定義する。同様に、既知または試験アンタゴニストを含む試料にアゴニストを添加した後に記録される最大反応は、100%反応よりも低く検出される。
【０１０４】
本発明の培養皮膚組織は、レポーター遺伝子アッセイ法においても有用である。レポーター遺伝子アッセイ法は、レポーター遺伝子のコード配列に結合させた標的遺伝子（すなわち、疾患標的または炎症反応の生物発現および機能を調節する遺伝子）の転写調節エレメントを含む核酸をコードするベクターをトランスフェクションした宿主細胞の使用を含む。したがって、標的遺伝子の活性化によりレポーター遺伝子産物の活性化が起こる。これは、炎症反応等の反応の指標となる。そのため、いくつかの態様では、レポーター遺伝子構築物は、レポーター遺伝子に機能的に結合させた、皮膚炎もしくは皮膚刺激性によって誘導されるタンパク質または炎症もしくは刺激性に応答して産生される化合物の合成に関与するタンパク質（例えば、プロスタグランジンまたはプロスタサイクリン）の5'制御領域（例えば、プロモーター/エンハンサー）を含む。本発明に用いられるレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ホタルおよび細菌ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、ならびに緑色蛍光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。緑色蛍光タンパク質を除いたこれらタンパク質の産生は、特定の基質（例えば、X-galおよびルシフェリン）の化学発光、比色、または生物発光生成物の使用により検出する。既知活性化合物と未知活性化合物との比較は、上記と同様に行うことができる。
【０１０５】
他の好ましい態様において、培養皮膚組織は、皮膚への薬剤導入の効率または皮膚に作用させた薬剤の影響をスクリーニングするために用いられる。これらの態様では、培養皮膚組織を薬物送達システムまたは薬物で処理し、薬剤の皮膚等化物への浸透、透過または保持をアッセイする。薬剤の浸透をアッセイする方法は、Asbillら、Pharm Res. 17(9): 1092-97 (2000)に提供されている。いくつかの態様では、培養皮膚組織を改変フランツ拡散細胞の上に載せる。培養皮膚組織を1時間水和した後、プロピレングリコールで1時間前処理する。次に、プロピレングリコールにモデル薬剤を溶かした飽和懸濁液を培養皮膚組織に添加する。次いで、培養皮膚組織を所定の間隔で試料採取する。次いで、培養皮膚組織をHPLCにより解析し、試料中の薬剤濃度を測定する。ACDプログラム（Advanced Chemistry Inc., カナダ、オンタリオ州）を用いて、薬剤の対数P値を決定することができる。経皮貼付または他の送達法を介した薬剤の送達を研究するために、これらの方法を適合化することが可能である。
【０１０６】
2. 腫瘍および病原体を培養するための基質
本発明の培養皮膚細胞はまた、皮膚で自然に発生する腫瘍の培養および研究ならびに皮膚を冒す病原体の培養および研究に有用である。したがって、いくつかの態様では、本発明の培養皮膚組織を悪性細胞と共に播種することを意図する。限定されない例として、培養皮膚組織を、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,989,837号に記載されている悪性SCC13y細胞と共に播種し、ヒト扁平上皮癌のモデルを提供し得ることを意図する。次に、これらの播種した培養皮膚組織を用いて、自然環境における腫瘍に対する効率について化合物または他の処理戦略（例えば、照射またはトモセラピー）をスクリーニングすることができる。したがって、本発明のいくつかの態様では、悪性細胞または腫瘍を含む培養皮膚組織および少なくとも1つの試験化合物を提供する段階、培養皮膚組織を化合物で処理する段階、および悪性細胞または腫瘍に対する処理の効果をアッセイする段階を含む方法を提供する。本発明の他の態様では、悪性細胞または腫瘍を含む培養皮膚組織および少なくとも1つの試験療法（例えば、照射または光線療法）を提供する段階、培養皮膚組織を療法で処理する段階、および悪性細胞または腫瘍に対する療法の効果をアッセイする段階を含む方法を提供する。
【０１０７】
他の態様では、培養皮膚組織を用いて皮膚病原体を培養および研究する。限定されない例として、培養皮膚組織にHPV18等のヒトパピローマウイルス(HPV)を感染させる。HPVに感染した培養皮膚組織の調製法については、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,115号に記載されている。したがって、本発明のいくつかの態様では、関心対照の病原体に感染した培養皮膚組織および少なくとも1つの試験化合物または試験治療を提供する段階、および試験化合物または試験治療で培養皮膚組織を処理する段階を含む方法を提供する。いくつかの好ましい態様において、本方法は、試験化合物または試験治療の病原体に対する効果をアッセイする段階をさらに含む。そのようなアッセイ法は、治療した後に培養皮膚組織中の病原体の有無または量をアッセイすることにより行うことができる。例えば、ELISAを行い、病原体を検出または定量化することが可能である。いくつかの好ましい態様では、病原体はHPV等のウイルス病原体である。
【０１０８】
3. 創縫合および熱傷治療
本発明の培養皮膚組織は、創縫合および熱傷治療への用途に用いられる。熱傷の治療および創縫合への自家移植片および同種移植片の使用は、Myersら、A. J. Surg. 170(1):75-83 (1995)、ならびにそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,693,332号、第5,658,331号、および第6,039,760号に記載されている。いくつかの態様では、培養皮膚組織をダーマグラフト等の真皮代替物と共に使用し得る。他の態様では、ケラチノサイトの標準的な供給源（例えばNIKS細胞）および移植片を受け取る患者由来のケラチノサイトの両方を用いて、培養皮膚組織を作製する。そのため、培養皮膚組織は2つの異なる供給源由来のケラチノサイトを含む。したがって、本発明は、本発明による改良した血管新生特性を有する培養皮膚組織および創傷を負った患者を準備する段階、ならびに創傷が閉鎖されるような条件下で患者を培養皮膚組織で治療する段階を含む、熱傷によって生じた創傷を含む創傷の治癒法を提供する。
【０１０９】
さらなる態様では、培養皮膚組織を操作し、対象に治療薬を提供する。いくつかの態様では、培養皮膚組織を形成するケラチノサイトに、治療タンパク質（例えば、インスリン、凝固因子IX、エリスロポエチン等）をコードするDNA構築物をトランスフェクションし、その培養皮膚組織を対象に移植する。次いで、移植片から治療薬が患者の血流に送達される。
【０１１０】
4. 治療薬の送達
さらなる態様では、皮膚組織を操作して治療薬を対象に提供する。本発明は、特定の治療薬の送達に限定されない。実際に、酵素、ペプチド、ペプチドホルモン、他のタンパク質、リボソームRNA、リボザイム、およびアンチセンスRNAを含むがこれらに限定されない様々な治療薬を対象に送達することを意図する。これらの治療薬は、遺伝的欠陥を修正する目的を含むがこれに限定されない様々な目的で、送達され得る。いくつかの好ましい態様では、代謝に遺伝性の先天性異常（例えばアミノ酸血症）を有する患者を解毒する目的で治療薬を送達し、移植片が野生型組織として機能させる。治療薬の送達により欠陥が修正されることを意図する。いくつかの態様では、皮膚等化物を形成するために用いるケラチノサイトに、治療薬（例えば、インスリン、凝固因子IX、エリスロポエチン等）をコードするDNA構築物をトランスフェクションし、対象にこの皮膚等化物を移植する。次いで、治療薬が移植片から患者の血流または他の組織に送達される。好ましい態様では、治療薬をコードする核酸を適切なプロモーターに機能的に結合させる。本発明は、任意の特定のプロモーターの使用に限定されない。実際に、誘導性、構成的、組織特異的、およびケラチノサイト特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない様々なプロモーターの使用を意図する。いくつかの態様では、治療薬をコードする核酸を直接ケラチノサイトに導入する（すなわち、リン酸カルシウム共沈法またはリポソームトランスフェクション法による）。他の好ましい態様では、治療薬をコードする核酸をベクターとして提供し、そのベクターを当技術分野で周知の方法によりケラチノサイトに導入する。いくつかの態様では、ベクターはプラスミド等のエピソームベクターである、他の態様では、ベクターはケラチノサイトのゲノムに組み込まれる。組み込みベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびトランスポゾンベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
実験
以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様および局面を示しさらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【０１１２】
以下の実験の開示においては、以下の略語を使用する：eq（等価物）；M（モル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；N（規定濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μ mol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）； g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；lまたはL（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；U（単位）；mU（ミリ単位）；min.（分）；sec.(秒)；%（パーセント）；Kb（キロベース）；bp（塩基対）；PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）；BSA（ウシ血清アルブミン）。
【０１１３】
実施例1
本実施例では、特記する場合を除いて以下の実施例に共通している培養法について説明する。
【０１１４】
培地
器官型培養過程では6種の異なる培地を用いる：3T3フィーダー細胞培地(TM)；線維芽細胞増殖培地(FM)；NIKS培地(NM)；プレーティング培地(PM)；重層化培地A(SMA)；および重層化培地B(SMB)。TMは、単層培養でのNIKS細胞のフィーダー細胞として働く3T3細胞を増殖させるために用いる。TMは、10%子ウシ血清（Hyclone）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DME、GibcoBRL）の混合物である。FMは、ハムF-12培地（GibcoBRL）と10% Fetal Clone II（Hyclone）血清との混合物である。NMは、NIKSケラチノサイトを培養するために用いる。NMは、2.5% Fetal Clone II（Hyclone）、0.4μg/mlヒドロコルチゾン（Calbiochem）、8.4 ng/mlコレラ毒素（ICN）、5μg/mlインスリン（GibcoBRL）、24μg/mlアデニン（Sigma）、および10 ng/ml上皮増殖因子（EGF、R&D systems）を添加したハムF-12培地（GibcoBRL）とDMEの3:1混合物である。PMは、NIKS細胞を真皮等価物上に播種する場合に用いる培地である。PMは、EGFを除き、最終カルシウム濃度が1.88 mMになるようにCaCl2（Sigma）を添加し、0.2%のみのFetal Clone II血清を添加することを除いて、NMと同じである。SMAは、1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、1μMイソプロテレノール、10μMカルニチン、10μMセリン、25μMオレイン酸、15μMリノール酸、7μMアラキドン酸、1μM α-トコフェノール、0.05 mg/mlアスコルビン酸（すべてSigma製）、および1 ng/ml EGFを添加したPMと同じである。SMBは、少量型式の皮膚等価物および移植片型式の皮膚等価物の培養の上皮重層化期で用いる。SMBは、Fetal Clone II血清添加物が存在しないこと以外はSMAと同じである。
【０１１５】
フィーダーの調製
試験型式の皮膚等価物または移植片型式の皮膚等価物の器官型培養を始める前に、3T3フィーダー細胞を調製し、これを新鮮なまま使用するか、または後に使用するために凍結する。3T3細胞はコンフルエントになるまで培養し、マイトマイシンC（TMに溶かして4μg/mlマイトマイシンCとする、Roche）で2時間処理する。次に細胞を洗浄して再懸濁し、NIKSの増殖を支持するため、100 mm組織培養シャーレ当たり1.25 × 106個の密度でプレーティングする。凍結フィーダーを用いる場合には、2.5 × 106個を含む1 mlの凍結アンプルを1本融解し、新鮮なTMで希釈し、1枚または複数枚の100 mm組織培養シャーレにプレーティングする。これは、NIKS細胞をプレーティングする1日前に、NIKS細胞の培養に必要なシャーレの枚数分行う。
【０１１６】
真皮等価物の調製
凍結NHDF細胞を融解し、プレーティングする。翌日、細胞にFMを添加し、残っている凍結保護剤を除去し、続いて細胞増殖を維持する。真皮等価物に使用するため、コンフルエントになる前にNHDF細胞を回収する。真皮等価物を調製するため、まずラット尾部の腱コラーゲン（I型、Becton-Dickinson）を0.03 N酢酸中で3 mg/mlになるように希釈し、氷上で冷却する。濃縮ハムF-12培地の混合液（8.7 × 通常濃度、HEPESでpH 7.5に緩衝）をFetal Clone IIと混合する。これらの2つの溶液は、最終溶液量の11.5%および10%である。培地混合物に1N NaOHを添加する（2.5%最終濃度）。次に、希釈したコラーゲン(74%)を混合物に添加する。2%量の懸濁線維芽細胞（試験型式の皮膚等価物には2.5 × 106細胞/ml、および移植片型式の皮膚等価物には1 × 106細胞/ml）を混合物に添加する。溶液を穏やかにしかし十分に混合する。試験型式の皮膚等価物については、100 mm組織培養シャーレに設置した組織培養インサート（Millipore Corp.のMILLICELL）に100μlずつ分注する。移植片型式の皮膚等価物では、CorningのTRANSWELLインサートを用いる。試験型式真皮等価物の場合のおよそ3倍の深さになるように、13 mlの真皮等価物を各インサートに分注する。30分間ゲル形成させた後、試験型式真皮等価物を含むシャーレにFM 20 mlを添加する。各試験型式真皮等価物の表面に、FMを1、2滴載せる。移植片型式の皮膚等価物については、150 mm組織培養シャーレ内のTRANSWELLインサートの周りにFM 80 mlを添加し、10 mlを皮膚等価物の上に載せる。使用するまで、インサートを37℃、5% CO2、相対湿度90%のインキュベーター内に置いておく。皮膚等価物をNIKS細胞と共に播種する1日前に、2つのウィッキングパッド（wicking pad）が付いた無菌のステンレススチールメッシュ（S&S Biopath）に皮膚等価物を載せて空気界面まで持ち上げ、組織培養インサートの底から培地を供給する。
【０１１７】
NIKSの培養および播種
NIKSをプレーティングする1日前に、新鮮なフィーダーを調製するかまたは融解し、TM中にプレーティングする。100 mmシャーレ当たり約3 × 105細胞の密度で、NIKS細胞をフィーダー上にプレーティングする。NIKS細胞を新たに融解した場合には、プレーティングしてから1日後に新鮮なNMを添加し、残っている凍結保護剤を除去する。NIKS細胞にNMを添加し、必要に応じて増殖を維持する。細胞がコンフルエントに到達した時点で、NIKS細胞を回収して計数し、PM中に再懸濁する。4.65 × 105細胞/cm2を、空気界面に1日持ち上げておいたMILLICELLまたはTRANSWELL表皮等価物の表面上に播種する。メタルリフターの底面まで浸るようにシャーレにPMを添加し、インキュベーターに戻す。2日後、培養物にSMAを添加する。さらに2日後、培養物にSMBを添加して75%湿度のインキュベーターに移し、成熟するまでさらにSMBを添加して維持し続ける。
【０１１８】
実施例2
発現ベクター構築物
公表された配列（Houckら、Mol Endocrinol 5:1806-14. (1991)）に基づいたプライマーを用いてPCRすることにより、VEGF165をコードするcDNAを単離した。VEGF165のコード領域をpTRE2発現ベクター（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）にクローニングした。このベクターは、Tetオペレーターの7回反復に隣接した最小CMVプロモーターを含む。クローニングしたVEGF-A PCR産物の完全性は、制限酵素解析およびVEGF特異的プライマーを用いたDNA配列決定により確認した。
【０１１９】
公表されたAng-1配列（Maisonpierreら、Science 277:55-60. (1997)）に基づいたプライマーを用いて全RNAからPCRすることにより、Ang-1のコード領域を単離した。Ang-1のコード領域をpTRE2発現ベクターにクローニングし、制限酵素解析および既知Ang-1配列由来のプライマーを用いたDNA配列決定により、Ang-1のコード領域の完全性を確認した。
【０１２０】
また、VEGF165およびAng-1のコード領域をケラチン14(K14)プロモーターの2.3 kb断片を含む発現ベクターにクローニングした。このベクターはまた、ウサギβグロブリン遺伝子のイントロンおよびポリアデニル化シグナルを含む1.2 kb DNA断片を含む。このベクターはまた、抗生物質ブラストサイジンに対する抵抗性を付与する発現カセットを含み、そのため発現構築物をゲノム内に安定に組み入れた細胞が選択され得る。最終的な発現構築物の構造は、制限酵素解析およびDNA配列決定により確認した。
【０１２１】
VEGF165のコード領域はまた、ヒトユビキチンC(Ub)プロモーターの1.2 kb断片を含む発現ベクターにもクローニングした。このベクターはまた、ウサギβグロブリン遺伝子のイントロンおよびポリアデニル化シグナルを含む1.2 kb DNA断片を含む。このベクターはまた、抗生物質ブラストサイジンに対する抵抗性を付与する発現カセットを含み、そのため発現構築物をゲノム内に安定に組み入れた細胞が選択され得る。最終的な発現構築物の構造は、制限酵素解析およびDNA配列決定により確認した。
【０１２２】
公表されたHIF1α配列に由来するプライマーを用いてPCRすることにより、HIF1αのコード領域を単離した。HIF1αのコード領域をPCR2.1ベクターにクローニングし、制限酵素解析および既知HIF1α配列由来のプライマーを用いたDNA配列決定により、HIF1αのコード領域の完全性を確認した。
【０１２３】
実施例3
VEGFの誘導発現
pTRE2/VEGF165ベクターの精製DNAを、tetリプレッサータンパク質の派生体をコードするpTet-Onプラスミド（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）と共にNIKS細胞に導入した。このタンパク質、rtTAはドキシサイクリンの存在下でtetオペレーターに結合し、培地中にドキシサイクリンが存在する場合にVEGF165の発現を誘導することになる（図4を参照のこと）。
【０１２４】
TransIt-ケラチノサイト試薬（Mirus Corporation）を用いて、NIKS細胞をトランスフェクションした。最初にトランスフェクションした細胞の非選択集団をVEGF165の発現について解析し、VEGF-A発現がドキシサイクリンの存在により誘導されることを確認した。トランスフェクションしてから24時間後、ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を含む培地で細胞をインキュベートし、VEGF-Aの発現および分泌を誘導した。ドキシサイクリンを添加してから24時間後に培地を回収し、市販の抗体（R&D Systems）を用いてウェスタンブロッティングすることによりVEGF165のレベルを測定した。
【０１２５】
pTet-ONベクターのみをトランスフェクションしたNIKS細胞由来の培地は、600 pg/ml VEGFを含んでいた。pTet-ONおよびpTRE-VEGFを同時にトランスフェクションした細胞由来の培地は、ドキシサイクリンの非存在下で1500 pg/ml VEGFを含んでおり、誘導なしではTRE-VEGF構築物からの発現が低レベルであることが示された。10 ng/mlまたは1000 ng/mlドキシサイクリンを添加した後、培地中のVEGFレベルは約6000 pg/mlまで増加した。したがって、一過性にトランスフェクションした細胞では、誘導されたVEGFのレベルは対照細胞よりも10倍高かった。
【０１２６】
実施例4
Ang-1の抑制発現
pTRE2/Ang-1ベクターの精製DNAを、tetリプレッサータンパク質の派生体をコードするpTet-Offプラスミド（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）と共にNIKS細胞に導入した。このタンパク質、tTAはドキシサイクリンの非存在下でtetオペレーターに結合し、培地中にドキシサイクリンが存在しない場合にAng-1の発現を誘導することになる。トランスフェクションした細胞の非選択集団をAng-1の発現について解析し、Ang-1発現がドキシサイクリンの存在により抑制されることを確認した。トランスフェクションしてから24時間後、ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を含む培地で細胞をインキュベートし、Ang-1の発現および分泌を阻害した。
【０１２７】
ドキシサイクリンを添加してから24時間後に培地を回収し、市販の抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いてウェスタンブロッティングすることによりAng-1のレベルを測定した。pTRE2/Ang-1およびpTet-Offプラスミドをトランスフェクションした細胞由来の培地試料中には、ウェスタンブロッティングにより様々なグリコシル化を示す複数のAng-1バンドが検出された。pTet-Offプラスミドのみをトランスフェクションした細胞由来の培地中には、Ang-1バンドは認められなかった。
【０１２８】
pTRE2/Ang-1ベクターから発現されたAng-1 RNAは増幅するが内因性Ang-1遺伝子から発現されたAng-1 RNAは増幅しないプライマーを用いてRT-PCRすることにより、トランスフェクションした細胞から単離した全RNAを解析した。pTRE2/Ang-1およびpTet-Offプラスミドをトランスフェクションした細胞由来のRNAには、強いAng-1 RT-PCR産物が認められた。ドキシサイクリンの添加後にこの産物の強度が減少し、このことからこのベクターによるAng-1の発現はドキシサイクリンによって抑制されることが示された。
【０１２９】
実施例5
K14プロモーターからのVEGFの発現
TransIt-ケラチノサイト試薬（Mirus Corporation）を用いて、pK14-VEGF165ベクターの精製DNAをNIKS細胞に導入した。トランスフェクションしてから24時間後、培地を回収し、ELISA法によりVEGFタンパク質のレベルを測定した。一過性にトランスフェクションしたNIKS細胞由来の培地（10.75 ng/ml）は、対照細胞由来の培地（0.89 ng/ml）の12倍のVEGFを含んでいた。
【０１３０】
またトランスフェクションした細胞から全RNAを単離し、RT-PCRによりK14-VEGF構築物からのVEGF165 mRNAの発現をモニタリングした。K14-VEGF構築物から発現されたVEGF165 mRNAは増幅するが、内因性VEGF遺伝子から発現されたVEGF RNAは増幅しないプライマーを用いて、導入遺伝子に特異的な発現を検出した。VEGF165 RT-PCR産物はトランスフェクションした細胞由来のRNA中に検出されたが、対照細胞由来のRNA中には検出されなかった。また、内因性遺伝子による3種類のVEGFスプライス変種のすべておよびK14-VEGF発現構築物から発現されるVEGF165 mRNAを増幅するプライマーを用いて、RT-PCR反応を行った。
【０１３１】
実施例6
ユビキチンプロモーターからのVEGFの発現
TransIt-ケラチノサイト試薬（Mirus Corporation）を用いて、pUb-VEGF165ベクターの精製DNAをNIKS細胞に導入した。トランスフェクションしてから24時間後、培地を回収し、ELISA法によりVEGFタンパク質のレベルを測定した。一過性にトランスフェクションしたNIKS細胞由来の培地（9.38 ng/ml）は、対照細胞由来の培地（0.89 ng/ml）の10倍のVEGFを含んでいた。
【０１３２】
またトランスフェクションした細胞から全RNAを単離し、RT-PCRによりpUb-VEGF構築物からのVEGF165 mRNAの発現をモニタリングした。pUb-VEGF構築物から発現されたVEGF165 mRNAは増幅するが、内因性VEGF遺伝子から発現されたVEGF RNAは増幅しないプライマーを用いて、導入遺伝子に特異的な発現を検出した。VEGF165 RT-PCR産物はトランスフェクションした細胞由来のRNA中に検出されたが、対照細胞由来のRNA中には検出されなかった。また、内因性遺伝子による3種類のVEGFスプライス変種のすべておよびpUb-VEGF発現構築物から発現されるVEGF165 mRNAを増幅するプライマーを用いて、RT-PCR反応を行った。
【０１３３】
実施例7
K14プロモーターからのAng-1の発現
TransIt-ケラチノサイト試薬（Mirus Corporation）を用いて、pK14-Ang1ベクターの精製DNAをNIKS細胞に導入した。トランスフェクションしてから24時間後、培地を回収し、ウェスタンブロット法によりAng-1タンパク質のレベルを測定した。おそらくAng-1の様々なグリコシル化によって生じた複数のAng-1バンドが、K14-Ang1発現構築物をトランスフェクションした細胞由来の培地中に認められた。空のK14ベクターをトランスフェクションした細胞由来の培地中には、Ang-1のバンドは認められなかった。
【０１３４】
またトランスフェクションした細胞から全RNAを単離し、RT-PCRによりK14-Ang1構築物からのAng-1 mRNAの発現をモニタリングした。K14-Ang1構築物から発現されたAng-1 mRNAは増幅するが、内因性Ang-1遺伝子から発現されたAng-1 RNAは増幅しないプライマーを用いて、導入遺伝子に特異的な発現を検出した。Ang-1 RT-PCR産物はトランスフェクションした細胞由来のRNA中に検出されたが、対照細胞由来のRNA中には検出されなかった。
【０１３５】
実施例8
安定なトランスフェクタントの選択および特徴づけ
VEGF-AおよびAng-1はどちらも分泌タンパク質であり、したがって血管新生を促進するために組織のすべての細胞で発現される必要はない。VEGF-AおよびAng-1の発現を個々に調節するため、VEGF-AまたはAng-1を発現する別の細胞株を作製した。次にこれらの細胞を混合し、VEGF-A発現細胞およびAng-1発現細胞をどちらも含む共培養物を形成することができる。
【０１３６】
ブラストサイジンを用いて、正常な表皮構造を再生し得る、安定にトランスフェクションされたケラチノサイトを選択した（Dengら、Biotechniques 25:274-80. (1998)）。pUb-VEGF165およびpK14-VEGF165発現構築物はブラストサイジンに対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含み、これにより安定にトランスフェクションされた細胞の選択が可能になる。NIKS細胞に、pK14-VEGF165およびpUb-VEGF165プラスミドをトランスフェクションした。プラスミドをゲノム内に組み入れなかったNIKS細胞を死滅させるブラストサイジン（2.5μg/ml）を含む培地中で培養することにより、トランスフェクションされた細胞を選択する。ブラストサイジンで選択したトランスフェクションされた細胞を、ブラストサイジン耐性3T3細胞のフィーダー層上に低密度で播種することにより、安定にトランスフェクションされたNIKS細胞のクローン集団を単離した。NIKS細胞にpK14-Ang1プラスミドをトランスフェクションすることによりAng-1を発現する細胞株を作製し、その後ブラストサイジンを用いて安定にトランスフェクションされた細胞を選択した。
【０１３７】
RT-PCRによって複数のクローン細胞株を試験することにより、pK14-VEGF165、pUb-VEGF165、およびpK14-Ang1プラスミドを含む安定な細胞株を同定した。pK14-VEGF165、pUb-VEGF165、およびpK14-Ang1導入遺伝子の完全なコピーを有する個々のクローン細胞株をブラストサイジンの存在下で拡大し、10%グリセロールを含む培地中で凍結して各株の永久貯蔵物を作製した。
【０１３８】
導入遺伝子から発現されたmRNAは増幅するが内因性遺伝子から発現されたmRNAは増幅しないプライマーを用いてRT-PCRすることにより、各クローンにおける導入遺伝子の発現のレベルをモニタリングした。また導入遺伝子の強い発現を示すクローンを、導入遺伝子の発現するmRNA種および内因性のmRNA種のどちらも増幅するプライマーを用いてRT-PCRすることにより試験した。pK14-VEGF165およびpUb-VEGF165構築物を用いて、VEGF121およびVEGF189アイソフォームと比較してVEGF165アイソフォームを特異的に過剰発現するクローンが同定された。
【０１３９】
実施例9
器官型培養におけるVEGF発現の解析
pK14-VEGF165発現構築物を安定にトランスフェクションしたNIKS細胞のクローンおよびトランスフェクションしていないNIKS細胞を器官型培養で培養し、培養皮膚組織を作製した。培養皮膚組織から全RNAを単離し、RT-PCRによりVEGF165導入遺伝子の発現を解析した。導入遺伝子特異的RT-PCR産物は、K14-VEGF165構築物を含む皮膚組織からは増幅されたが、トランスフェクションしていないNIKS細胞から調製した皮膚組織では検出されなかった。 
【０１４０】
対照細胞およびpK14-VEGF165発現構築物を安定にトランスフェクションしたNIKS細胞から調製した皮膚組織の培地試料中のVEGFのレベルを、ELISA法により測定した。対照およびK14-VEGF遺伝子組み換え皮膚組織において、同等のレベルのVEGFタンパク質が検出された。
【０１４１】
実施例10
細胞増殖アッセイ法
VEGF-Aは、微小血管内皮細胞(HMVEC)の強力かつ特異的マイトジェンである（Detmarら、J Invest Dermatol 105:44-50. (1995)）。VEGF-Aを発現する細胞由来の馴化培地は、微小血管内皮細胞の増殖を促進する（FerraraおよびHenzel、Biochem Biophys Res Commun 161:851-8. (1989)、Suppら、J Invest Dermatol 114:5-13 (2000)）。対照またはVEGF-Aを発現する培養物由来の馴化培地を、HMVEC（Cascade Biologics, オレゴン州、ポートランド）の三つ組培養物に様々な濃度で添加した。48時間後に細胞に新鮮な馴化培地を添加し、さらに48時間培養して細胞増殖させた。血球計算板内のトリプシン処理した培養物を計数することにより、VEGF-Aのマイトジェン効果を測定した。pK14-VEGF165発現構築物をトランスフェクションした細胞から回収した培地を添加した培養物（4× 104個）は、空のK14ベクターをトランスフェクションした細胞から回収した培地を添加した培養物（2× 104個）の2倍の細胞を含んでいた。
【０１４２】
実施例11
HIF-1αの誘導発現
HIF1αコード領域をpTRE2発現ベクター（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）にクローニングする。このベクターは、Tetオペレーターの7回反復に隣接した最小CMVプロモーターを含む。制限酵素解析およびHIF1α特異的プライマーを用いたDNA配列決定により、クローニングしたHIF1αPCR産物の完全性を確認する。
【０１４３】
pTRE2/ HIF1αベクターの精製DNAを、tetリプレッサータンパク質の派生体をコードするpTet-Onプラスミド（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）と共にNIKS細胞に導入する。このタンパク質、rtTAはドキシサイクリンの存在下でtetオペレーターに結合し、培地中にドキシサイクリンが存在する場合にHIF1αの発現を誘導することになる。
【０１４４】
TransIt-ケラチノサイト試薬（Mirus Corporation）を用いて、NIKS細胞をトランスフェクションする。最初にトランスフェクションした細胞の非選択集団をHIF1αの発現について解析し、HIF1α発現がドキシサイクリンの存在により誘導されることを確認する。トランスフェクションしてから24時間後、ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を含む培地で細胞をインキュベートし、HIF1αの発現を誘導する。
【０１４５】
実施例12
誘導性のVEGF165およびAng-1発現の解析
ブラストサイジン耐性コロニー由来の培養液をVEGF165の存在についてスクリーニングすることにより、誘導されてレベルの増加したVEGF165を発現するNIKSのクローンを同定する。ドキシサイクリンの存在下で、pTet-On(bsd)およびpTRE2/VEGF-Aプラスミドの完全なコピーを含む複数のクローンをVEGF-Aの発現について試験する。ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を含む培地で細胞をインキュベートし、VEGF-Aの発現および分泌を誘導する。ドキシサイクリンを添加してから24時間後に培地を回収し、市販の抗体（R&D Systems）を用いてウェスタンブロッティングすることによりVEGF165のレベルを測定する。
【０１４６】
pTRE2/Ang-1およびpTet-Off(bsd)プラスミドの完全なコピーを含む複数のクローン細胞株を、Ang-1の発現について試験する。ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を含む培地で細胞をインキュベートし、Ang-1の発現を阻害する。ドキシサイクリンを添加してから24時間後に培地を回収し、抗Ang-1抗体（Research Diagnostics, Inc.、ニュージャージー州、フランダース）を用いてウェスタンブロッティングすることによりAng-1のレベルを測定する。
【０１４７】
pTRE2/HIF1αおよびpTet-On(bsd)プラスミドの完全なコピーを含む複数のクローン細胞株を、HIF1αの発現について試験する。ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を含む培地で細胞をインキュベートし、HIF1αの発現を誘導する。ドキシサイクリンを添加してから24時間後に細胞を回収し、RT-PCRによりHIF1α mRNAのレベルを測定する。
【０１４８】
実施例13
器官型NIKS培養物における誘導性のVEGF165およびAng-1発現
ドキシサイクリン誘導性VEGF165発現およびドキシサイクリン抑制性Ang-1発現を示すNIKS細胞クローンを用いて、実施例1の方法および条件により器官型皮膚培養物を調製する。遺伝子改変したNIKS細胞により形成した器官型培養物の組織学的切片を、改変していないNIKS細胞から調製した培養物と比較する。組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、重層化した表皮層を可視化する。
【０１４９】
最初の発現研究における器官型培養物は、VEGF-AまたはAng-1を個々に発現する細胞を用いて調製する。次に、VEGF-A発現細胞およびAng-1発現細胞の混合物と共に真皮等価物を播種することにより、器官型培養物を調製する。この混合培養物では、培地中にドキシサイクリンが存在しない場合、Ang-1は発現されるがVEGF-Aは発現されない。培地にドキシサイクリンを添加した場合、Ang-1の発現は抑制されるのに対し、VEGF-Aの発現は誘導される。このような方法で、単一の誘導剤とのインキュベーションにより、Ang-1およびVEGFの異なる発現を達成することができる。器官型培養物を調製するために用いるVEGF発現細胞およびAng-1発現細胞の比率を変えることにより、VEGFおよびAng-1の、発現レベルの異なる比率を達成することができる。さらに、Ang-1発現NIKS細胞およびVEGF-A発現NIKS細胞を、改変していないNIKS細胞と共に用いて器官型培養物を調製し、培養物中のタンパク質発現にさらなる柔軟性を提供することが可能である。
【０１５０】
器官型培養物中のVEGF165およびAng-1の発現レベルの変化をモニタリングするために、ドキシサイクリンの添加前および添加後の様々な時点で培養物の下層の培地を回収する。器官型培養物を10日培養した時点で、ドキシサイクリン（0、1、10、100、1000 ng/ml）を培地に添加する。ドキシサイクリンの存在下で培養物を48時間インキュベートし、VEGF-Aの誘導およびAng-1の抑制を可能にする。ドキシサイクリンの存在下で48時間後、ドキシサイクリンを欠く培地を培養物に添加する。ドキシサイクリンを添加してから4日間、12時間ごとに培地を回収し、ELISA法により培地中のVEGF-AおよびAng-1タンパク質のレベルを測定する。
【０１５１】
実施例14
別の誘導発現系
本発明では、哺乳動物細胞において誘導性タンパク質発現を付与することが示されている別の異種発現系を用いることも可能である。GENESWITCH技術（Valentis, Inc. テキサス州、ウッドランド）では、KRAB転写抑制ドメインのVP16活性化ドメインに融合させたGAL4のDNA結合ドメインおよび切断型プロゲステロン受容体からなるキメラ転写制御因子を利用する（Wangら、Proc Natl Acad Sci U S A 91:8180-4. (1994)、Wangら、Gene Ther 4:432-41. (1997)）。ミフェプリストン(RU486)の存在下では、このタンパク質がGAL4結合部位と結合し、これに隣接する導入遺伝子からの転写を活性化または抑制する。6個のGAL結合部位および最小プロモーターを含むベクターに、VEGF-A、Ang-1、およびHIF1αコード領域をクローニングする。
【０１５２】
実施例15
VEGF-AおよびAng-1のバイオアッセイ法
遺伝子改変したNIKS(商標)器官型培養物から産生されるVEGF-AおよびAng-1が血管新生を促進することを実証するため、インビトロ血管新生アッセイ法を用いてVEGF-AおよびAng-1を特徴づけする。VEGF-Aのマイトジェン活性を別に示唆するものとして、馴化培地に曝露したHMVEC培養物中に存在する複製している細胞の割合を、mAB Ki67（Vector Labs）で免疫染色することにより測定する。この抗体は活発に循環している細胞内の核タンパク質と特異的に反応するため（Gerdesら、J Immunol 133:1710-5. (1984)、Lopezら、Exp Cell Res 210:145-53. (1994)）、増殖細胞の確実なマーカーである。NIKS/VEGF-A器官型培養物の馴化培地を含む内皮細胞増殖培地中で、細胞を48時間インキュベートする。細胞を回収してPBSで洗浄し、顕微鏡スライドグラスに固定し、Ki67を用いて記載されているように免疫細胞化学用に処理する（Lopezら、Exp Cell Res 210:145-53. (1994)）。各実験条件に関して、三つ組の培養物に対して増殖細胞の割合を測定する。
【０１５３】
インビトロ血管新生アッセイ法
VEGF-AおよびAng-1の血管新生特性を評価するには、いくつかのアッセイ法が利用できる。NIKS器官型培養物によって分泌されるVEGF-AおよびAng-1の生物活性は、ニワトリ絨毛尿膜アッセイ法およびフィブリンゲル内皮細胞出芽アッセイ法を用いて測定することができる。
【０１５４】
ニワトリ絨毛尿膜アッセイ法
血管新生増殖因子をニワトリ絨毛尿膜(CAM)に添加することにより、内皮細胞の増殖および新たな血管の形成が誘導される（Folkman, Cancer Res 34:2109-13 (1974)、Jakobら、Exp Pathol (Jena) 15:241-9. (1978)、Wiltingら、Cell Tissue Res 274:163-72. (1993)）。VEGF-AまたはAng-1を発現するNIKS培養物の馴化培地を限外濾過により10倍濃縮し、Thermanoxディスクに載せて風乾する。13日目のニワトリ胚のCAMにディスクを裏返して載せ、この胚を37℃で3〜5日間培養する。ブラシ様の血管の発達についてCAMを顕微鏡観察することにより、対照培地に曝露したCAMのものと比較して、馴化培地の血管新生活性を判定する。組換えVEGF-A（R&D systems、ミネソタ州、ミネアポリス）を、CAM血管新生アッセイ法の陽性対照として用いる。VEGFを中和する抗体（Mab203, R&D Systems）を用いて試料を予めインキュベートし、血管新生活性がVEGFに起因することを実証する。
【０１５５】
インビトロ内皮細胞出芽アッセイ法
フィブリンゲル内のマイクロキャリアビーズ上で培養した微小血管内皮細胞は、VEGF-AおよびAng-1を含む血管新生因子に応答してフィブリン基質内に毛細血管様の芽を突出させる（NehlsおよびDrenckhahn、Microvasc Res 50:311-22. (1995)、Koblizekら、Curr Biol 8:529-32. (1998)）。気道微小血管内皮細胞（HMVEC-L、Clonetics、メリーランド州、ウォーカーズビル）を、175  mマイクロキャリアビーズ（Sigma、ミズーリ州、セントルイス）上でコンフルエントになるまで培養する。200単位/mlアプロチニンおよび2.5単位/mlトロンビン（Sigma、ミズーリ州、セントルイス）を含むフィブリノーゲンゲル（2.5 mg/ml）に、マイクロキャリアビーズを懸濁する。VEGF-AまたはAng-1を発現する器官型培養物の馴化培地をフィブリンゲルに添加し、血管新生を促進させる。培養物には、馴化培地または精製組換えVEGFを含む培地を毎日添加する。培養してから3日後、位相差顕微鏡により試料を観察し、内皮の出芽を可視化する。馴化培地の存在下または非存在下で培養した10個のマイクロキャリアビーズから突出している芽の数および長さを測定することにより、インビトロ血管新生を定量化する。実験は三つ組で行う。
【０１５６】
上記明細書において言及した出版物および特許はすべて、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明で記載した方法および系に様々な修正および変更が行われ得ることは当業者に明白であると考えられる。本発明を特定の好ましい態様に関して説明したが、請求する本発明は特定の態様に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施するための上記形態の様々な修正は、医学、細胞生物学、分子生物学、遺伝学、または関連分野の技術者には自明であり、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】VEGF-Aの配列（配列番号:1）を提供する。
【図２】ANG-1の配列（配列番号:2）を提供する。
【図３】HIF-1αの配列（配列番号:3）を提供する。
【図４】血管新生因子の誘導発現の概略図を提供する。
【図１】
0004753577.tif 000002
【図２】
0004753577.tif 000003
【図３Ａ】
0004753577.tif 000004
【図３Ｂ】
0004753577.tif 000005
【図４】
0004753577.tif 000006
【配列表】
0004753577000001.app