(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）のレベルを判定するための試験手段であって、
配列番号１のアミノ酸残基２６〜５１内のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的な分離ポリクローナル抗体と、
配列番号１のアミノ酸残基１〜２５内のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的な分離モノクローナル抗体と、
を有し、
ここにおいて、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体はサンプル内においてＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと検出可能な免疫複合体を形成する、
ことを特徴とする試験手段。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体はビオチン化されていることを特徴とする請求項１に記載の試験手段。
【請求項３】
前記ポリクローナル抗体はビオチン化されていることを特徴とする請求項１に記載の試験手段。
【請求項４】
前記免疫複合体は直接的に検知されることを特徴とする請求項１に記載の試験手段。
【請求項５】
前記免疫複合体は間接的に検知されることを特徴とする請求項１に記載の試験手段。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体は、６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２と命名されアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−４８４４として寄託された、ハイブリドーマ細胞系により生成された、モノクローナル抗体により認識されるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの１つの領域に結合する、ことを特徴とする請求項１に記載の試験手段。
【請求項７】
サンプル中の脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）のレベルを判定するための方法であって、
サンプルをポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とに接触させるステップと、
ここにおいて前記ポリクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸残基２６〜５１内のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的であり、
分離された前記モノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２５内のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的であり、
前記サンプル内で生成された、前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの免疫複合体の量を計測するステップと、
からなることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体はビオチン化されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリクローナル抗体はビオチン化されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫複合体は直接的に検知されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫複合体は間接的に検知されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体は、６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２と命名されアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−４８４４として寄託された、ハイブリドーマ細胞系により生成された、モノクローナル抗体により認識されるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの１つの領域に結合する、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは血液、血清、血漿、および尿であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは血漿であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液、特にヒト血漿中の脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）濃度を測定するのに特異的で高感度の生体外の測定方法であるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質エライサ検定法および試験キットに関するものである。特に、この発明は、特に高い診断特異性を有し、これによりうっ血性心不全死の前兆となるように特に示されるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質エライサ検定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂタイプのナトリウム排泄増加性ペプチド（脳ナトリウム排泄増加性ペプチド、ＢＮＰ）は、構造的に類似しているが、遺伝的に別種のナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰｓ）の系統に属しており、デボールド（ｄｅ  Ｂｏｌｄ）ら（デボールド（ｄｅ  Ｂｏｌｄ）  ＡＪ．濾胞性心房：水−電解液バランス変化の効果。生物医学学会議事録（Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ）１９７９年、第１６１巻：５０８頁〜５１１頁；デボールド（ｄｅ  Ｂｏｌｄ）  ＡＪ、ボレンスタイン（Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）  ＨＢ、ベレス（Ｖｅｒｅｓｓ）  ＡＴ、およびソネンベルグ（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ）  Ｈ。ラットにおける心房性心筋抽出物の静脈注射に対して急速な効果のあるナトリウム排泄増加反応。ライフサイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ）  １９８１年、第２８巻、８９頁〜９４頁）によって記述されている。
上記ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰｓ）は、効果のある利尿性、ナトリウム排泄増加性および血管拡張性を有しており、心臓血管性疾患、特にニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）における患者のうっ血性心不全（ＣＨＦ）（ブームスマ（Ｂｏｏｍｓｍａ）  Ｆ  およびファンデンマイラケル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｍｅｉｒａｃｋｅｒ）  ＡＨ。血漿ＡタイプおよびＢタイプのナトリウム排泄増加性ペプチド：生理学、方法論および臨床用途。心臓血管研究（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）  ２００１年、第５１巻、４４２頁〜４４９頁）のクラスＩ〜ＩＶに有用な診断用および予後用マーカーとして報告されてきた。
上記脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）の遺伝子は、１０８個のアミノ酸残基を有する前駆分子、ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体（配列番号１）をコード化する。心筋細胞による分泌前に、このホルモン前駆体の分割は、ＣＯＯＨ末端からの生理活性ＢＮＰの生成を招く。１９９５年には、ハント（Ｈｕｎｔ）ら（ハント（Ｈｕｎｔ）  ＰＪ、ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）  ＴＧ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  ＭＧ、リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  ＡＭ、およびエスピナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）  ＥＡ。脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体（ＰｒｏＢＮＰ）のアミノ末端部のヒト血漿中での循環。生物化学生物物理学研究会（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ）１９９５年、第１４巻、１１７５頁〜１１８３頁；ハント（Ｈｕｎｔ）  ＰＪ、リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  ＡＭ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  ＭＧ、ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）  ＴＧ、ドウティ（Ｄｏｕｇｈｔｙ）  ＲＮおよびエスピナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）  ＥＡ。免疫活性アミノ末端脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体（ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ）：心臓機能障害の新規マーカー。臨床内分泌疾患（Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）１９９７年、第４７巻、２８７頁〜２９６頁）は、分割され、また血漿中で循環したホルモン前駆体、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰおよび同様のＢＮＰのＮ末端に対応するフラグメントが潜在的に重要であり、心不全としてより識別性の高いマーカーであったことを示した。
【０００３】
多くの研究は、アミノ末端脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体（ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ）を含むナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰｓ）の血漿濃度を測定する臨床的用途を示してきた。ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰｓ）は、心疾患を患う患者の診断およびリスク層別化用に選択されるバイオマーカーとして提案されてきた（クラリコ（Ｖｌｅｒｉｃｏ）  Ａ、デルリィ（Ｄｅｌ  Ｒｙ）  Ｓおよびジアネッシ（Ｇｉａｎｎｅｓｓｉ）  Ｄ。心臓ナトリウム排泄増加性ホルモン（心房ナトリウム排泄増加性ペプチド、脳ナトリウム排泄増加性ペプチドおよび関連ペプチド）の測定。臨床診療では、新世代の免疫検定法の必要性。臨床化学（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ）２０００年、第４６巻、１５２９頁〜１５３４頁：マイア（Ｍａｉｒ）  Ｊ、ハンメル−リヒアー（Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ）  Ａおよびプシェンドルフ（Ｐｕｓｃｈｅｎｄｏｒｆ）  Ｂ。心不全の診断および管理における心臓ナトリウム排泄増加性ペプチドの定量の効果。臨床化学的医学研究（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ）２００１年、第３９巻、５７１頁〜５８８頁；サグネラ  ジーエイ。血漿脳ナトリウム排泄増加性ペプチドおよび関連ペプチドの測定および意義。臨床生物化学年報２００１年、第３８巻、８３頁〜９３頁；セルバイス（Ｓｅｌｖａｉｓ）  ＰＬ、ドンキエール（Ｄｏｎｃｋｉｅｒ）  ＪＥ、ロバート  エイ（Ｒｏｂｅｒｔ）  Ａ、ラルー（Ｌａｌｏｕｘ）  Ｏ、ファンリンデン（ｖａｎ  Ｌｉｎｄｅｎ）  Ｆ、アン（Ａｈｎ）  Ｓ、ケテルスラガーズ（Ｋｅｔｅｌｓｌｅｇｅｒｓ）  ＪＭ、およびルソー（Ｒｏｕｓｓｅａｕ）  ＭＦ。心疾患の診断およびリスク層別化用の心臓ナトリウム排泄増加性ペプチド：心臓ホルモン活性化に対する左心室機能不全および冠状動脈疾患の影響。欧州臨床研究誌（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）１９９８年、第２８巻、６３６頁〜６４２頁；マクドノー（ＭｃＤｏｎａｇｈ）  ＴＡ、カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈｍ）  ＡＤ、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）  ＣＥ、マクマリーＭｃＭｕｒｒａｙ  ＪＪ、フォード（Ｆｏｒｄ）  Ｉ、モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）  ＪＪおよびダルジエ（Ｄａｒｇｉｅ）  ＨＪ。左心室機能不全、ナトリウム排泄増加性ペプチドおよび都市群における死亡率。心臓（Ｈｅａｒｔ）２００１年、第８６巻、２１頁〜２６頁）。数種の研究は、ＮＰ測定値を使用して、左心室機能不全を患う患者、徴候がない患者（すなわち、ＮＹＨＡクラスＩ）であっても、それを確認する実用性を示しており、選別手段としてのＮＰ測定値が高い危険率で、再評価および治療を必要とする心不全群（例えば、冠状動脈疾患、高血圧症、糖尿病、高齢）内に標的患者を効果的に助けることになることが示唆されてきた（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）  Ｄ、タルワー（Ｔａｌｗａｒ）  Ｓ、スクアイア（Ｓｑｕｉｒｅ）  ＩＢ、デイビス（Ｄａｖｉｅｓ）  ＪＥおよびエヌジー（Ｎｇ）  ＬＬ。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに関する免疫蛍光検定法：左心室機能不全用試験の開発。臨床科学（Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ）１９９９年、第９６巻、３７３頁〜３８０頁；オムランド（Ｏｍｌａｎｄ）  Ｔ、アークバーグ（Ａａｋｖａａｇ）  Ａ、ビクモ（Ｖｉｋ−Ｍｏ）  Ｈ。軽度左心室機能障害を患う患者確��用選別試験としての血漿心臓ナトリウム排泄増加性ペプチドの定量。心臓（Ｈｅａｒｔ）  １９９６年、第７６巻、２３２頁〜２３７頁；マクドー（ＭｃＤｏｎａｇｈ）  ＴＡ、ロブ（Ｒｏｂｂ  ＳＤ）、マードック（Ｍｏｒｄｏｃｈ）  ＤＲ、モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）  ＪＪ、フォード（Ｆｏｒｄ）  Ｉ、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）  ＣＥら。左心室収縮不全の生化学的検出。ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）１９９８年、第３５１巻、９頁〜１３頁；シュルツ（Ｓｈｕｌｚ）  Ｈ、ランビック（Ｌａｎｇｖｉｋ）、ランドセイゲン（Ｌｕｎｄ  Ｓａｇｅｎ）  Ｅ、スミス（Ｓｍｔｈ）  Ｊ、アーマジ（Ａｈｍａｄｉ）  Ｎおよびホール（Ｈａｌｌ）  Ｃ。ヒト血漿中における脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体の放射性免疫検定法。スカンジナビア臨床研究誌（Ｓｃａｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ）２００１年、第６１巻、３３頁〜４２頁；タルワー（Ｔａｌｗａｒ）  Ｓ、スクアイア（Ｓｑｕｉｒｅ）  ＩＢ、デイビス（Ｄａｖｉｅｓ）  ＪＥ、バレット（Ｂａｒｎｅｔｔ）  ＤＢおよびエヌジー（Ｎｇ）  ＬＬ。血漿中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび高い危険率群における左心室収縮不全の心電図評価。欧州心臓誌（Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ）１９９９年、第２０巻、１７３６頁〜１７４４頁；ハイスタッド（Ｈｙｓｔａｎｄ）  ＭＥ、ゲイラン（Ｇｅｉｒａｎ）  ＯＲ、アトラマダール（Ａｔｔｒａｍａｄａｌ）  Ｈ、スパークランド（Ｓｐｕｒｋｌａｎｄ）  Ａ、ベージ（Ｖｅｇｅ）  Ａ、シモンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）  Ｓおよびホール（Ｈａｌｌ）  Ｃ。局所的な心性徴候および重篤な慢性心不全を患う患者におけるナトリウム排泄増加性ペプチドの濃度。スカンジナビア生理学集（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ）  ２００１年、第１７１巻、３９５頁〜４０３頁；ホッブス（Ｈｏｂｂｓ）  ＦＤＲ、デイビス（Ｄａｖｉｓ）  ＲＣ、ロアルフ（Ｒｏａｌｆｅ）  ＡＫ、ヘアー（Ｈａｒｅ）  Ｒ、デービス（Ｄａｖｉｅｓ）  ＭＫおよびＫｅｎｋｒｅ（ＪＥ）。心不全の診断におけるナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端検定法の信頼性：代表および高い危険率の群落におけるコホート研究。ＢＭＪ２００２年、第３２４巻、１４９８頁）。ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰｓ）については、心不全における疾病率および死亡率の双方に対する良好な予後徴候の値を有することが示されてきた。数種の研究は、左心室機能不全の予知および急性心筋梗塞の生存におけるＮＰ測定値の実用性（リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  ＡＭ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  ＭＧ、ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）  ＴＧ、フラントン（Ｆｒａｍｐｔｏｎ）  Ｃ、エスピナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）  ＥＡ、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）  ＪＧら。血漿中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびアドレノメダリン。左心室の新規神経分泌ホルモン性予知剤および心筋梗塞後の予後。リンパ系１９９８年、第９７巻、１９２１頁〜１９２９頁；ラチナー（Ｌｕｃｈｎｅｒ）  Ａ、ヘングステンベルグ（Ｈｅｎｇｓｔｅｎｂｅｒｇ）  Ｃ、ロウエル（Ｌｏｗｅｌ）  Ｈ、トランスキ（Ｔｒａｗｉｎｓｋｉ）  Ｊ、バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）  Ｍ、リーゲル（Ｒｉｅｇｇｅｒ）  ＧＡＪら。心筋梗塞後のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ。心臓−腎機能のマー��ー。高血圧症（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）２００２年、第３９巻、９９頁〜１０４頁；キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）  ＤＪ、ムニール（Ｍｕｎｉｒ）  Ｖ、ヘネシー（Ｈｅｎｎｅｓｓｙ）  ＯＦおよびデント（Ｄｅｎｔ）  ＡＷ。緊急救命部にいる急性冠状症候群を疑われている被験者における血漿脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ末端量：追跡のために患者を選別する役割を与えることができるか？インターン医学誌（Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  Ｊ）２００１年、第３１巻、２１１頁〜２１９頁；ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）  ＪＣ、グロニング（Ｇｒｏｅｎｎｉｎｇ）  ＢＡ、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）  Ｇ、フリッツ・ハンセン（Ｆｒｉｔｚ−Ｈｎｓｅｎ）  Ｔ、トロインスキ（Ｔｒａｗｉｎｓｋｉ）  Ｊ、ヒルドブラント（Ｈｉｄｅｂｒａｎｄｔ）  ＰＲら。急性心筋梗塞後の１年における左心室のリモデリングおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの予測値。米国心臓誌（Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ）  ２００２年、第１４３巻、６９６頁〜７０２頁）。ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰ）量をモニターすることは、個別の患者の必要な強度を満たすために治療法を調整しかつ治療の有効性をモニターする上でのガイダンスをも与える可能性がある（リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  ＡＭ、ドーティ（Ｄｏｕｇｈｔｙ）  Ｒ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  Ｇ、マクマホン（ＭａｃＭｈｏｎ）  Ｓ、シャープ（Ｓｈａｒｐｅ）  Ｎ、マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）  Ｊら。血漿ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびアドレノメダリン。慢性の虚血性左心室機能不全におけるカーベディロール（Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ）からの恩恵の予後利用および予測。米国心臓学会誌（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｏｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ）  ２００１年、第３７巻、１７８１頁〜１７８７頁；トルートン（Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）  ＲＷ、フランプトン（Ｆｒａｍｐｔｏｎ）  ＣＭ、ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）  ＴＧ、エスピナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）  ＥＡ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  ＭＧおよびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  ＡＭ。血漿脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ末端（Ｎ−ＢＮＰ）の濃度によって誘導された心不全治療。ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２０００年、第３５５巻、１１２６頁〜１１３０頁）。
【０００４】
（先行技術）
ホール（Ｈａｌｌ）による国際出願ＷＯ９３／２４５３１号（特許文献１）（米国特許５，７８６，１６３号）（特許文献２）は、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ末端を同定する免疫学的方法およびこの方法に使用された抗体を記述するものである。上記抗体を得るためには、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ末端の配列から単独で合成されたペプチドが使用される。ペプチド免疫化による抗体の生成は基本的には可能であるが、分子全体に関する親和性は、概ね検査手順において必要な感度に到達するのに低すぎる。さらに、ペプチドを用いて得られた抗体が、例えば上記ペプチドのＣ末端を識別することができ、したがって分子全体のフラグメントにのみ結合することができ、これにより抗体が、一般に分子全体に結合することができず、あるいは限定的範囲にのみ結合することができるという結果になる危険性がある。国際出願ＷＯ９３／２４５３１号（特許文献１）では、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ末端由来の１つのペプチドに対する抗体が生成されている。生成された抗体が競合検査フォーマットにおける免疫化ペプチド（アミノ酸４７〜６４）に結合することが示されている。しかしながら、抗体が、サンプル中の分子全体として未変性の脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ末端に結合することができることについては示されていない。さらに、１つのサンプルにおける国際出願ＷＯ９３／２４５３１号（特許文献１）に記述されたサンドイッチ検査法は、適正な標準材料および２つの異なるエピトープに対する抗体が存在しないので、記述されているようには実行することができない。さらに、国際特許出願ＷＯ９３／２４５３１号（特許文献１）で実行された競合検査では、トレーサとして標識化されたペプチド４７〜６４がサンプルすなわち標識化されていない標準ペプチド４７〜６４と競合してラビット血清由来のポリクローナル抗体に結合し、非常に穏やかな競合のみが４８時間の培養後に達成され、その培養からは約２５０ｆｍｏｌ／ｍｌの下限検出限界だけがもたらされるという事実に苦慮している。この結果は、健常者と心不全を患う患者とを識別するのに十分ではなく、あるいは患者サンプルを心不全の重篤度で識別して層別化するのにも十分でない。さらに、競合検査における長期培養は、自動分析でのサンプルの定期的な測定にとって受け入れることができない。
【０００５】
ハント（Ｈｕｎｔ）ら（臨床内分泌学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）  １９９７年、第４７巻、２８７頁〜２９６頁）は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出する競合検査についても記述するものである。このため、血漿サンプルの複合抽出が測定前に必要であり、これは、分析物の破壊および測定ミスにつながる可能性がある。使用された抗血清は、合成ペプチドの免疫化によって、国際出願ＷＯ９３／２４５３１号（特許文献１）と同様に生成されており、ハントらは、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のアミノ酸１〜１３のＮ末端の免疫化によって抗血清を生成し、アミノ酸１〜１３のペプチドは標準試料として用いられている。このため、長期培養も必要である。２４時間の培養後に、１．３ｆｍｏｌ／ｍｌの下限検出限界が達成される。
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの同定法という名称でカールらにより出願された国際出願ＷＯ００／４５１７６号（特許文献３）は、組換え型のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの免疫原の使用によって分離されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を開示するものである。上記参考文献は、体液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して特異的な上記抗体を使用する検定情報を示唆するものである。より完全に記述されるように、この発明の検定法に対する上記検定法に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）図の曲線下領域（ＡＵＣ）の比較は、この発明が優れた診断特性を証明することを示している。
ナトリウム排泄増加性ペプチドフラグメントという名称で出願された国際出願ＷＯ００／３５９５１号（特許文献４）は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの配列の異なるエピトープに対する２つの抗体を利用するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの検定法に着目している。この検定法は、抗体が、免疫原としての合成ペプチドフラグメントに対して生成される点で、ホール（Ｈａｌｌ）（米国特許第５，７８６，１６３号）（特許文献２）の欠陥と同様の欠陥に苦しむことになる。
【特許文献１】国際出願ＷＯ９３／２４５３１号公報
【特許文献２】米国特許５，７８６，１６３号公報
【特許文献３】国際出願ＷＯ００／４５１７６号公報
【特許文献４】国際出願ＷＯ００／３５９５１号
【発明の開示】
【０００６】
この発明で開示されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質エライサ検定法および検査キットは、種々の体液、すなわち血液、血清、血漿、尿およびこれらと同等物である非限定サンプル中におけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度を測定することができる特異的で高感度の生体外の検定法である。次の実施例および記述は、ヒト血漿中での検定法の使用を例証することになる。
この明細書で使用されているように、用語「１つまたは複数の抗体」は、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体あるいはこれらの抗原結合部位を含むが、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦｖフラグメント、単一鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびＦａｂ発現ライブラリに限定されるものではない。
上記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰエライサ検定法は、ヒト血漿中で循環するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するサンドイッチ・エライサ技術を使用する。ヒトｐｒｏＢＮＰ内の標的アミノ酸配列に対する特異的結合特性を備えた抗体を得るために、組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰ（すなわちｒｈｐｒｏＢＮＰ）は、免疫原として使用するために発現させかつ精製された。配列番号１のｐｒｏＢＮＰ（１〜２５、２６〜５１、５２〜７６あるいは７７〜１０８）内のアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体（ＰＡｂ）は、その後、組換え型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（すなわちｒｈＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）が発現されかつ精製されるヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの定量法の較正に使用する材料を得るために経時的親和的精製手段によってヤギ血清から精製された。モノクローナルは、上記ヤギポリクローナル抗体と対にする際にＮＴ−ｐｒｏＢＮＰエライサ検定に使用する上清から生成された。モノクローナルは、抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ捕捉抗体に結合されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質に結合する検出用抗体としてビオチン化されて使用され、これによりサンドイッチを構成することができる。
【０００７】
したがって、この発明の目的は、組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰに対して生成され、ヒトｐｒｏＢＮＰ内の標的アミノ酸配列に特異的な親和性を示すように特異的に選択されたヤギポリクローナル抗体を提供することにある。
この発明の他の目的は、ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを定量し、これによって、うっ血性心不全患者の死亡率を精確に予測するための診断／選別ツールを確定することができる定量法を提供することにある。
この発明の他の目的は、先に選択されたヤギポリクローナル抗体と結合したときに、特に高感度で特異的な生体外の診断検定法を提供するのに有用なモノクローナル抗体を提供することにある。
この発明の他の目的は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量を確定する概略の診断／選別手順を実行する目的のためのエライサ検査キットを提供することにある。
【０００８】
（図面の簡単な説明）      
図１は、ｐｒｏＢＮＰ前駆蛋白質から開始するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび標的ペプチドを選択する方法を示す図である。
図２は、ヤギポリクローナル／６Ｇ１１モノクローナル検定法の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示すグラフである。
図３は、対照量に対するＮＹＨＡのクラスＩＩＩおよびＩＶにおけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量を示すボックス図である。
図４は、年齢によって階層化された対照被験者におけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量のボックス図である。
図５は、この発明のヤギポリクローナル／６Ｇ１１モノクローナル検定法を利用するエライサ手順の概要を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰエライサ検定法は、ヒト血漿中で循環するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するためにサンドイッチ・エライサ技術を使用する。ヤギポリクローナル抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ捕捉蛋白質で被覆されたマイクロプレート穴は固層を構成する。被験者用血漿、標準品および対照物は上記被覆された穴に添加され、培養緩衝液で培養される。サンプル抽出ステップは必要とされない。仮にＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質が検査サンプル中に存在する場合には、その蛋白質は、上記穴上に被覆されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的な抗体によって捕捉されることになる。培養および洗浄後、モノクローナル抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検査用抗体は上記穴に添加される。上記検査用抗体は、上記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質、あるいはこれらの免疫原性フラグメント、例えば上記抗体によって認識され、抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ捕捉抗体に結合されているポリペプチドフラグメントに結合し、これによりサンドイッチを形成することができる。培養および洗浄後、ワサビ大根パーキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識化されたポリクローナル・ロバ・抗マウスＩｇＧは上記穴に添加される。培養および洗浄に続けて、酵素基質は上記穴に添加されかつ培養される。酸性溶液は、その後、上記酵素反応を停止するために添加される。固定化されたＨＲＰの酵素活性度は、上記穴中で酸化された酵素生成物の吸光度を４５０ｎｍで測定することによって確認される。４５０ｎｍでの吸光度は、被験サンプル中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量に比例する。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標準品セットは、被験表品および対照物中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度が計算できる、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度に対する吸光度の標準曲線を作成するために使用される。免疫反応の検出がこの技術分野において周知の直接法あるいは間接法を介して達成できるものと理解される。
【００１０】
ヒトｐｒｏＢＮＰ内の標的アミノ酸配列に対する特異的結合特性を備えた抗体を得るために、組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰ（すなわちｒｈｐｒｏＢＮＰ）は、免疫原として使用するために発現されかつ精製された。ｐｒｏＢＮＰ−ｐＵＣ９プラスミド構成体は、アドルフォ  ジェイ．デボールド（Ａｄｏｌｆｏ  Ｊ．  Ｄｅ  Ｂｏｌｄ）博士（オタワ心臓研究所（Ｏｔｔａｗａ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））から入手された。ｒｈｐｒｏＢＮＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）およびｐＥＴ３２ｃ（ＮｃｏＩ／ＨｈｏＩ）へのサブクローニングによって得られた。上記ｐＥＴ３２ｃベクターは、最終融合蛋白質がＳ標識およびエンテロキナーゼ部位を含まないように８１個のヌクレオチドを除去することによって修正された。ｒｈｐｒｏＢＮＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端における配列は、チオレドキシン標識およびポリヒスチジン標識およびトロンビン分割部位で構成した。上記Ｃ末端には余分な配列が存在しなかった。上記蛋白質は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現され、未精製の細胞抽出物は非変性条件で調製された。次の親和的精製は、供給者により推奨されたＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによって終了された。注射前に、ｒｈｐｒｏＢＮＰ溶液中のエンドトキシン量は、供給者により推奨されたデトキシゲル（登録商標）エンドトキシン除去用樹脂を用いて許容レベルまで下げられた。
【００１１】
ポリクローナル抗体の生成および精製：
ヤギ（ラマンチャまたはトゲンバーグ種）は、精製された組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰ（ｒｈｐｒｏＢＮＰ）で免疫化された。完全フロイントアジュバント内に乳化された５００μｇの精製ｒｈｐｒｏＢＮＰの複数部位への主要な筋肉内注射が投与され、その後、不完全フロイントアジュバント内に乳化された５００μｇの精製ｒｈｐｒｏＢＮＰの複数部位への２５０μｇの筋肉内注射が隔週で投与された。免疫化されたヤギの力価は、ハーフサンドイッチエライサ技術を用いて血清を選別することによって定期的にモニターされた。
配列番号１のｐｒｏＢＮＰ（１〜２５、２６〜５１、５２〜７６あるいは７７〜１０８）内のアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体（ＰＡｂ）は、その後、供給者の推奨に従い、次の蛋白質またはペプチド配列：
１．ヒトＩｇＧ（ジャクソン免疫研究社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））
２．マウスＩｇＧ（ジャクソン免疫研究社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））
３．キーホールリンペットヘモシニアン（エイディーアイ社（ＡＤＩ  Ｉｎｃ．））に結合された配列番号１のｐｒｏＢＮＰアミノ酸配列＃１〜２５（ＨＰＬＧＳＰＧＳＡＳＤＬＥＴＳＧＬＱＥＱＲＮＨＬＱ）
または
３．キーホールリンペットヘモシニアン（エイディーアイ社（ＡＤＩ  Ｉｎｃ．））に結合された配列番号１のｐｒｏＢＮＰアミノ酸配列＃２６〜５１（ＧＫＬＳＥＬＱＶＥＱＴＳＬＥＰＬＱＥＳＰＲＰＴＧＶＷ）
または
４．キーホールリンペットヘモシニアン（エイディーアイ社（ＡＤＩ  Ｉｎｃ．））に結合された配列番号１のｐｒｏＢＮＰアミノ酸配列＃５２〜７６（ＫＳＲＥＶＡＴＥＧＩＲＧＨＲＫＭＶＬＹＴＬＲＡＰＲ）
５．キーホールリンペットヘモシニアン（エイディーアイ社（ＡＤＩ  Ｉｎｃ．））に結合された配列番号１のｐｒｏＢＮＰアミノ酸配列＃７７〜１０８（ＢＮＰ−３２、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ）に結合された臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）を用いてヤギ血清から精製された。
精製されたポリクローナル抗体は、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に対して透析され、限外ろ過によって濃縮され、−２０℃で保存された。
【００１２】
組換え型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの発現
ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの定量方法の検量に使用される材料を得るために、組換え型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（すなわちｒｈＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）が発現されかつ精製された。上記ｐｒｏＢＮＰ−ｐＵＣ９プラスミド構成体は、アドルフォ  ジェイ．デボールド（Ａｄｏｌｆｏ  Ｊ．  Ｄｅ  Ｂｏｌｄ）博士（オタワ心臓研究所（Ｏｔｔａｗａ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））から入手された。ｒｈｐｒｏＢＮＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）およびｐＥＴ３２ｃ（ＮｃｏＩ／ＨｈｏＩ）へのサブクローニングによって得られた。上記ｒｈＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのＮ末端における配列は、チオレドキシン、ポリヒスチジンおよびＳ標識、並びにトロンビンおよびエンテロキナーザ分割部位で構成した。上記Ｃ末端には余分な配列が存在しなかった。上記蛋白質は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現され、未精製の細胞抽出物は非変性条件で調製された。次の親和的精製は、供給者により推奨されたＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによって終了された。
【００１３】
モノクローナル抗体の選別
免疫法で使用され、この明細書において６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２および１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９として指定されたハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体は、ヒト脳ナトリウム排泄増加性因子ＢＮＰ（１〜２５）のＮ末端のアミノ酸１〜２５で構成されたポリペプチドに特異的であり、アドルフォ  ジェイ．デボールド（Ａｄｏｌｆｏ  Ｊ．  Ｄｅ  Ｂｏｌｄ）博士から入手された。これらのモノクローナル抗体は、上記ヤギポリクローナル抗体と対をなすＮＴ−ｐｒｏＢＮＰエライサ検定法で使用される上清から生成されたものであり、それぞれ６Ｇ１１および１Ｃ３と指定されている。これらのクローンは、この出願と同日に出願され、参照することによってこの明細書に組み込まれたものとされる米国出願１０／２９９，６０６号の主題であり、ブダペスト条約に準拠して、それぞれ受託番号ＰＴＡ−４８４４およびＰＴＡ−４８４５で、２００２年１２月５日に、２０１１０−２２０９米国バージニア州マナサスのブールバード大学１０８０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたものである。米国連邦規則３７ＣＦＲ１．８０８に準拠して、寄託者は、寄託された材料の公衆への利用可能性に課される全ての制約が特許許可時に取消し不能に解除されることを保証するものである。寄託者は、さらに寄託された材料が、仮に生育可能なサンプルが寄託によって分散できない場合には、交換されることを保証するものである。
【００１４】
選別は、次のように行われた：
ｉ）検出体としてのヤギポリクローナル抗体（ＰＡｂ）を含む潜在的な捕捉体ＭＡｂ（ｓ）
融合性ハイブリドーマ培養液の上清を、ｐＨ９．６の１００ｍＭ炭酸緩衝液中に２μｇ／ｍｌの濃度で含有されたロバ・抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）イムノグロブリン（ジャクソン免疫研究社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））で被覆された９６穴マイクロ滴定プレート（エヌユーエヌシー、マキシソープ（ＮＵＮＣ，  ＭａｘｉＳｏｒｐ）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）に添加した。過剰の結合部位は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で阻害された。洗浄用緩衝液（０．０５％（ｖ／Ｖ）のツイーン２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水）で上記プレートを洗浄した後、モノクローナル抗体を含有する５０μＬの各培養上清を、上記プレート上で培養された。炭酸ガス培養器中で３７℃、１時間の培養後、上記プレートは洗浄用緩衝液で洗浄した。
組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰ（シン−エックス、ファーマ（Ｓｙｎ−Ｘ  Ｐｈａｒｍａ））を、その後、３ｎｇ／ｍｌまたは０ｎｇ／ｍｌの濃度で、上記プレートに添加し、このプレートをシェーカ上で２時間、室温（ＲＴ）培養した。上記プレートを洗浄した後、ｐｒｏＢＮＰアミノ酸ペプチド配列１〜２５、２６〜５１あるいは５２〜７６（シン−エックス、ファーマ（Ｓｙｎ−Ｘ  Ｐｈａｒｍａ））に対する親和性を利用して精製され、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で適切に希釈されたビオチン化ヤギポリクローナル抗体を、適切な穴に添加した。ヤギポリクローナル抗体を、製造者により推奨されたロッシュから入手したビオチン標識キットを用いてビオチン化した。シェーカ上で１時間、室温（ＲＴ）培養した後、上記プレートを洗浄し、１／５０００まで希釈したストレプタビジン・ワサビ大根パーキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（ジャクソン免疫研究社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を添加し、シェーカ上で１時間、室温（ＲＴ）培養した。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（モス）を添加し、８分間、暗所で室温（ＲＴ）培養した後、上記反応を１規定の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で停止し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。クローンを、各ヤギポリクローナル抗体と対をなし、ｐｒｏＢＮＰ抗原を含む穴では特異的で高強度信号を生成しかつｐｒｏＢＮＰ抗原を含まない穴では最小の信号を生成する能力に基づいて腹水生成物を選択した。
ｉｉ）捕捉体としてのヤギポリクローナル抗体（ＰＡｂ）を含む潜在的な検出体ＭＡｂ（ｓ）
９６穴マイクロ滴定プレートを、ｐｒｏＢＮＰアミノ酸ペプチド配列１〜２５、２６〜５１あるいは５２〜７６（シン−エックス、ファーマ（Ｓｙｎ−Ｘ  Ｐｈａｒｍａ））に対する親和性を利用して精製され、ｐＨ９．６の１００ｍＭ炭酸緩衝液中に１μｇ／ｍｌの濃度で存在するヤギポリクローナル抗体で被覆した。過剰の結合部位は、上記方法（ｉ）と同様に阻害された。洗浄用緩衝液で洗浄した後、組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰ（シン−エックス、ファーマ（Ｓｙｎ−Ｘ  Ｐｈａｒｍａ））を、３ｎｇ／ｍｌまたは０ｎｇ／ｍｌの濃度で、上記プレートに添加し、このプレートをシェーカ上で２時間、室温（ＲＴ）培養した。洗浄後、モノクローナル抗体を含む融合性ハイブリドーマ培養液の上清を添加（穴ごとに５０μＬ）し、上記プレートを炭酸ガス培養器中で３７℃、１時間培養した。他の洗浄ステップ後、１／５０００まで希釈したワサビ大根パーキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ロバ・抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）イムノグロブリン（ジャクソン免疫研究社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を上記プレートに添加し、シェーカ上で１時間、室温（ＲＴ）培養した。ＴＭＢ基質を添加し、洗浄後、上記プレートを上記方法（ｉ）と同様に培養した。クローンを、各ヤギポリクローナル抗体と対をなし、ｐｒｏＢＮＰ抗原を含む穴では特異的で高強度信号を生成しかつｐｒｏＢＮＰ抗原を含まない穴では最小の信号を生成する能力に基づいて腹水生成物を選択した。
【００１５】
６Ｇ１１モノクローナル抗体の最終選択：
選択されたモノクローナル抗体の腹水による生成および、その後の公知の手順を用いて蛋白質Ｇ（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））により精製に続けて、精製された抗体を、ハイブリドーマ上清の選別のためであるが、上記精製された抗体がｐＨ９．６の１００ｍＭ炭酸緩衝液で適切に希釈し、捕捉体として選別用プレート上に直接被覆するか、あるいは検出体として選別用に０．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で適切に希釈したという現実のために、上述したように再検査した。
組換え型ヒトｐｒｏＢＮＰおよび組換え型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する最適なエライサの特異性および感度を、捕捉体としてのｐｒｏＢＮＰアミノ酸ペプチド配列２６〜５１に対する親和性を利用して精製されたヤギポリクローナル抗体と、検出体としての６Ｇ１１を指定するＭａｂクローンとの組み合わせを用いて得た。ここで図５を参照すると、この発明の上記エライサ検定法を実行する手順が明らかにされる。
その後、上記手順に従って検査されたヒト血漿サンプル由来のデータ分析を、心不全の患者に対して明らかな健常者のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量を測定する際に、優れた感度および特異性をもたらす上記抗体の組み合わせの有用性を示した。
この発明に従うエライサ検査キットは、上述した手順を実行する目的のために提供されている。
【００１６】
試薬供給品：
抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質被覆マイクロ滴定細片
マイクロ滴定用９６穴を含む１つの細片保持器にヤギポリクローナル抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ抗体で被覆した。期間満了まで、乾燥剤を入れたポーチ内に２〜８℃で保存する。
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質標準品
次の標準品：０、５０、１５０、３７５、１５００および３０００ｐｇ／ｍｌのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの１つをそれぞれ含む６つのバイアル瓶が用意される。各バイアル瓶は、０ｐｇ／ｍｌの対照物が１．０ｍｌを含むことを除き、０．５ｍｌを含むものである。仮に再検査が望ましい場合には、余分量は、３０００ｐｇ／ｍｌ以上の値を有するサンプルの希釈に余裕をとるものである。−７０±１０℃で保存する。この温度で維持し、上記標準品は、６ケ月まで、凍結／解凍の少なくとも３回の間で、安定である。
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ蛋白質対照物
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む各０．５ｍｌの２つのバイアル瓶は、蛋白質の低濃度および高濃度で制御する。−７０±１０℃で保存する。この温度で維持し、上記標準品は、６ケ月まで、凍結／解凍の少なくとも３回の間で、安定である。
【００１７】
培養緩衝液
１０ｍｌの培養緩衝液を含む１つのバイアル瓶。期間満了まで２〜８℃で保存する。
検出体としての抗体
１０ｍｌの抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ抗体を含む１つのバイアル瓶。期間満了まで２〜８℃で保存する。
ワサビ大根パーキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体
ワサビ大根パーキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識化された１０ｍｌのロバ抗マウス免疫グロブリンを含む１つのバイアル瓶。期間満了まで２〜８℃で保存する。
クロモゲン溶液
３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液１０ｍｌを含む１つのバイアル瓶。期間満了まで２〜８℃で保存する。
濃縮洗浄液
非イオン性界面活性剤を有するリン酸緩衝生理食塩水６０ｍｌを含む１つの瓶。使用前に、脱イオン水で２５倍に希釈する。２〜８℃で保存する。
停止溶液
１規定の硫酸１０ｍｌを含む１つの瓶。２〜８℃で保存する。
【００１８】
検定手順：
上記検定法を実行する際に、第１の穴へのサンプル、標準品および対照物の添加と、最終穴へのサンプル、標準品および対照物の添加との間隔が１０分を超えるべきである。多くのサンプルに関しては、少量のバッチでエライサを実施して、この時間枠に対応する。
使用されるべきマイクロプレートの穴に印を付ける。
半自動ピペットを用いて、５０μｌの培養緩衝液を各穴に添加する。
高精度マイクロピペットを用いて、５０μｌの各検査サンプル、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標準品あるいはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ対照物を適切な微小穴に添加する。標準曲線の整合性を保証するために、次のような上記プレートへの添加順が推奨される：検査サンプル、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標準品、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ対照物。
正副２つのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ標準品およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ対照物で検査することが推奨される。
粘着性プレートカバーを用いて微小穴を覆い、室温で、オービタル型マイクロプレートシェーカ上で２時間、培養する。
適切なマイクロプレート洗浄器を用いて、各穴について３回にわたって吸引しかつ洗浄液で洗浄を行う。吸収材料上に上記プレートを逆さにすることによって乾燥させる。
不完全な洗浄が逆に検定精度に影響を与えるので、マイクロプレート用自動洗浄器の使用は大いに推奨される。これに代えて、仮にマイクロプレート用自動洗浄器が入手できない場合には、洗浄は、微小穴の内容物を吸引しかつ３４０μｌの洗浄溶液を各微小穴に再充填するステップを３回反復することによって手動的に達成することができる。
半自動ピペットを用いて、各穴に１００μｌの検出用抗体溶液を添加する。
室温で、オービタル型マイクロプレートシェーカ上で１時間、上記穴を培養する。
適切なマイクロプレート洗浄器を用いて、各穴について３回にわたって吸引しかつ洗浄液で洗浄を行う。吸収材料上に上記プレートを逆さにすることによって乾燥させる。
半自動ピペットを用いて１００μｌのワサビ大根パーキシダーゼ（ＨＲＰ）結合溶液を各穴に添加する。
粘着性プレートカバーを用いて微小穴を覆い、室温で、オービタル型マイクロプレートシェーカ上で３０分間、培養する。
微小穴について３回にわたって吸引しかつ洗浄液で洗浄を行う。吸収材料上に上記プレートを逆さにすることによって乾燥させる。
半自動ピペットを用いて１００μｌのＴＭＢ溶液を各穴に添加する。
室温で、５分間で暗所中の穴を培養する。直接に日光に曝すことを避ける。
半自動ピペットを用いて１００μｌの停止溶液（１規定の硫酸）を各穴に添加する。
マイクロプレート読取器を用いて４５０ｎｍで上記溶液の吸光度を測定する。
【００１９】
計算結果：
標準品、対照物あるいは被験血漿を含む穴ごとに平均吸光度を計算する。
ｘ軸（一次）にとったＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対するｙ軸（二次）にとった標準品のグラフに平均吸光度をプロットする。
正副の点の平均を通過するように、最適な標準曲線を引く。
上記標準曲線に書き入れることによって、被験血漿および対照物の各ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度を確認する。
被験血漿試料の読みは、最も低い標準品より低いものとして報告されるべきである。
これに代えて、コンピュータプログラムは、エライサタイプのデータを取り扱って被験血漿および対照物の各ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度を評価するのに使用されてもよい。
次のデータは、この検定法を用いて用量反応曲線例を示すものである。
【００２０】
【表１】
0004610025.tif 000002
注意：上記値は、標準曲線に代えて使用されるべきではなく、検定時に調製されるべきである。
【００２１】
特徴的性能
標準品の品質管理を保証するために、上記キット内に用意され、低品質および高品質を示す２つの対照物が各検定法において分析されなければならない。各研究所が各検定例の変動用に追加の対照物を使用することが推奨される。
ヤギポリクローナル６Ｇ１１モノクローナルエライサ検定用のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ臨床データの概要
データは、融合性心不全（ＮＹＨＡのクラスＩＩＩおよびクラスＩＶ）であると診断された２０９人の被験者および１０１人の健常者対照被験者から提供されている。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は図２に示されており、０．９７４の曲線下領域（ＡＵＣ）はこれに対応する０．００８の標準誤差（ｓ．ｅ．）を含むようにして得られた。図３は、対照被験者および心不全被験者におけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのボックスプロットを示すものであり、上記心不全被験者に関する診断感度は９０．４％（カットオフ上の上記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを有する被験者２０９人中１８９人）であり、上記対照被験者に関する診断感度は９４．１％（カットオフ下の上記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを有する被験者１０１人中９５人）であった。
【００２２】
他のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびＢＮＰ検定との比較：
バイオサイトトリアージＢＮＰ検査への生成挿入物（トリアージ（Ｔｒｉａｇｅ）（著作権）脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）検査、生成挿入物、バイオサイト診断社（Ｂｉｏｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、２００１年）において、８０４人の心不全被験者および１２８６人の対照被験者から得られた臨床データにおける受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の分析は、０．９５５の曲線下領域（ＡＵＣ）（標準誤差＝０．００５３）を示した。ヘンリー（Ｈａｎｌｅｙ）およびマクニール（ＭｃＮｅｉｌ）（ヘンリー（Ｈａｎｌｅｙ）  ＪＡおよびマクニール（ＭｃＮｅｉｌ）  Ｊの手順（１９８２年）「受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の領域の意図および用途」放射線医学（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）第１４３巻、２９頁〜３６頁）に続けて、ここに開示されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定の曲線下領域（ＡＵＣ）と上記曲線下領域（ＡＵＣ）を比較すると、ここに開示されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定が優れた診断特性を示す、著しく高い曲線下領域（ＡＵＣ）（ｐ＜０．００１）を有することが分かる。
【００２３】
フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）  Ｙ、フィルツマイア（Ｆｉｌｚｍａｉｅｒ）  Ｋ、スチーグラー（Ｓｔｉｅｇｌｅｒ）  Ｈ、グラフ（Ｇｒａｆ）  Ｊ、フース（Ｆｕｈｓ）  Ｓ、フランク（Ｆｒａｎｋｅ）  Ａ、ジャンセンス（Ｊａｎｓｓｅｎｓ）  Ｕおよびグレスナー（Ｇｒｅｓｓｎｅｒ）  ＡＭ（２００１年）、「脳ナトリウム排泄増加性ペプチドの定量に関する新規で高速ベッドサイド検査」、臨床化学第４７巻、５９１頁〜５９４頁）は、潜在的な心臓疾患および疑わしい心不全を患う９３人の被験者に関するロッシュ診断に由来するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検査に上記トリアージＢＮＰ検査を比較したデータ特性を与えた。心室機能を低下させた被験者を、心室機能を維持した被験者から識別する際に、０．９１（標準誤差±０．０３３）の曲線下領域（ＡＵＣ）が上記トリアージＢＮＰ検査で得られ、０．８６（標準誤差±０．０４０）の曲線下領域（ＡＵＣ）がロッシュＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定で得られた。同一ケース由来の曲線下領域（ＡＵＣ）を比較し、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定がロッシュＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定（ｐ＜０．００５）よりも著しく高い曲線下領域（ＡＵＣ）を有することが分かる、ヘンリーおよびマクニール（ヘンリー（Ｈａｎｌｅｙ）  ＪＡおよびマクニール（ＭｃＮｅｉｌ）  ＢＪ）の手順（１９８３年）「同一ケース由来の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の領域を比較する方法」放射線医学第１４８巻、８３９頁〜８４３頁）に続けて、ｒ＝０．９４７の２つの神経ホルモン測定値間の報告された相関関係が与えられた。
【００２４】
ハーメル・レチェ（Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ）ら（ハーメル・レチェ（Ｈａｍｍｅｒｅｒ−Ｌｅｒｃｈｅｒ）  Ａ、ニューバル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）  Ｅ、ミューラ（Ｍｕｌｌｅｒ）  Ｓ、パチンゲル（Ｐａｃｈｉｎｇｅｒ）  Ｏ、プチェンドル（Ｐｕｓｃｈｅｎｏｄｏｒｆ）  Ｂおよびメイア（Ｍａｉｒ）  Ｊ（２００１年）、「診断中の左心室機能不全における脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端、脳ナトリウム排泄増加性ペプチドおよび動脈ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端の競合比較」、臨床化学第３１０巻、１９３頁〜１９７頁）は、安定した慢性心不全を患う５７人の患者の同一人数に関して、シオノギＩＭＲＡ  ＢＮＰ検定を、生物医学ＥＩＡＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定と比較した。心室機能を低下させた被験者を、心室機能を維持した被験者から識別する際に、０．７５（標準誤差±０．０６）の曲線下領域（ＡＵＣ）が上記ＢＮＰ検査で得られ、０．６７（標準誤差±０．０７）の曲線下領域（ＡＵＣ）が生物医学ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定で得られた。ヘンリー（Ｈａｎｌｅｙ）およびマクニール（ＭｃＮｅｌｌ）（ヘンリー（Ｈａｎｌｅｙ）  ＪＡおよびマクニール（ＭｃＮｅｉｌ）  ＢＪ）の方法（１９８３年）「同一ケース由来の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の領域を比較する方法」放射線医学（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）第１４８巻、８３９頁〜８４３頁）に続けて、シオノギＢＮＰ検定が生物医学ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定よりも著しく高い曲線下領域（ＡＵＣ）を有することが分かる、
【００２５】
ルヒナー（Ｌｅｒｃｈｅｒ）ら（ルヒナー（Ｌｅｒｃｈｅｒ）  Ａ、ヘングステンベルグ（Ｈｅｎｇｓｔｅｎｂｅｒｇ）  Ｃ、ロウエル（Ｌｏｗｅｌ）  Ｈ、トランスキ（Ｔｒａｗｉｎｓｋｉ）  Ｊ、バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）  Ｍ、リーゲル（Ｒｉｅｇｇｅｒ）  Ｇ、シュンカールト（Ｓｃｈｕｎｋｅｋｒｔ）  Ｈおよびホルマー（Ｈｏｌｍｅｒ）  Ｓ（２００２年）、「心筋梗塞後の脳ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体のＮ末端」、高血圧症（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）第３９巻、９９頁〜１０４頁）は、５９４人の心筋梗塞被験者および４４９人の健常被験者を含む被験者中において、心室機能を低下させた被験者を予測するロシュＥＩＡ  ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定の機能を確定するために大規模臨床研究を行った。上記作成者は、３５％未満の左心室駆出率を有する被験者を、より高い駆出率の被験者から識別する際に、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに関する０．７７（標準誤差±０．０５７）の曲線下領域（ＡＵＣ）を引用した。この曲線下領域（ＡＵＣ）は、ここに開示されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ検定（ｐ＝０．０００１）に関して引用されたものより著しく低い。
したがって、曲線下領域（ＡＵＣ）分析を基準にしてＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの存在を確認するための種々の利用可能な検定の定量化に基づいて、この発明の検定法は優れた診断特性を示すことが期待される。
【００２６】
この明細書に記述された全ての特許および刊行物は、この発明の属する技術分野における当業者のレベルで示されている。全ての特許および刊行物は、仮に各刊行物が参照することによって組み込まれるように詳細にかつ個別的に示された場合に、参照することによってこの明細書に組み込まれる。
この発明の特定の形態が示されているが、この明細書に記述されかつ示された特定の形態あるいは配置に限定されるものではないことは理解されるべきである。この発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更がなされてもよく、この明細書に示されかつ記述された事柄に限定されるものとみなされるべきではないことは、この技術分野における当業者にとって明白なことである。この技術分野における１人の当業者は、この発明が、目的を実行し、本来の目的および利点ばかりでなく、上述した目的および利点を得るのに適していることは容易に正当評価されるはずである。この明細書に記述された実施の形態、方法、手順および技術は、好適な実施の形態の現在、代表的なものであり、当該実施の形態は実施例と意図されたものであり、その実施例の範囲に限定されるものとして意図されたものではない。その変更および他の用途は、この発明の精神の範囲内に包含されかつ添付の請求項の範囲によって規定されたものと、この技術分野における当業者が考えるはずである。この発明が特定の好適な実施の形態に関連して記述されたが、請求項に記述された発明が上記特定の実施の形態に必要以上に限定されるべきでないと理解されるべきである。実際は、この技術分野における当業者にとって明白であり、この発明を実施するための記述されたモードの種々の修正は、次の請求項の範囲内にあるものと意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ｐｒｏＢＮＰ前駆蛋白質から開始するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび標的ペプチドを選択する方法を示す図である。
【図２】ヤギポリクローナル／６Ｇ１１モノクローナル検定法の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示すグラフである。
【図３】対照量に対するＮＹＨＡのクラスＩＩＩおよびＩＶにおけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量を示すボックス図である。
【図４】年齢によって階層化された対照被験者におけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ量のボックス図である。
【図５】この発明のヤギポリクローナル／６Ｇ１１モノクローナル検定法を利用するエライサ手順の概要を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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