(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検定タンパク質が耐熱性を有しているか否かを判別する方法であって、
被検定タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析による固有の分析値を、
生物種ごとに平均アミノ酸組成を算出して主成分分析により解析し、
主成分分析で得られた第２主成分に対応する固有ベクトルと、被検定タンパク質のアミノ酸組成ベクトルの内積として算出し、
耐熱性生物の有する、被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値を、
生物種ごとに平均アミノ酸組成を算出して主成分分析により解析し、
主成分分析で得られた第２主成分に対応する固有ベクトルと、被検定タンパク質と対応するタンパク質のアミノ酸組成ベクトルの内積として算出し、
算出された被検定タンパク質の上記分析値を、算出された被検定タンパク質と対応するタンパク質における上記分析値と比較することからなる、タンパク質の耐熱性を判別する方法。
【請求項２】
被検定タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析による固有の分析値の算出が、当該タンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列のデータに基づいて算出される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析による固有の分析値の算出方法が、電子計算機で処理できるようにプログラムされており、当該プログラムに当該タンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列のデータを入力することにより、電子計算機による処理で固有の分析値の算出する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値の算出手法が、請求項２又は３に記載の方法によるものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値が、当該タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析により算出されており、各タンパク質の種類に応じてリスト化されているものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
分析値のリストが、電子計算機による処理に供する情報として利用できるように、電子計算機で処理可能な記録媒体に蓄積されているものである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被検定タンパク質に固有の分析値と、耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値との比較が、電子計算機の処理により行われるものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析が、生物のゲノム中に同定された蛋白質をコードする遺伝子を抽出し、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸配列の配列長が５０アミノ酸未満のタンパク質を除外し、さらにＰＳＯＲＴプログラムを用いて２つ以上の膜貫通領域が予測された蛋白質も除外し、残ったタンパク質のアミノ酸配列を用いて、生物種ごとに平均アミノ酸組成を算出し、生物種を行、アミノ酸を列とする行列を入力して統計解析パッケージＲのプリンコンプ関数を用いる主成分分析法である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
耐熱性生物が、好熱菌である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
耐熱性生物の有する対応するタンパク質が、被検定タンパク質と生物学的にオルソロガスの関係にあるものである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質が、酵素である請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
タンパク質が、バチルス属又は当該属に関連する種の微生物が産生するものである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
被検定タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析による固有の分析値が、
被検定タンパク質のアミノ酸組成に基づく第２主成分得点であり、
耐熱性生物の有する、被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値が、
被検定タンパク質と対応するタンパク質のアミノ酸組成に基づく第２主成分得点である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
微生物ゲノムデータから、生物種ごとに平均アミノ酸組成が算出される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
生物のゲノム中に同定された蛋白質をコードする遺伝子を抽出し、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸配列の配列長が５０アミノ酸未満のタンパク質を除外し、さらに２つ以上の膜貫通領域が予測された蛋白質も除外し、残ったタンパク質のアミノ酸配列を用いて、生物種ごとに平均アミノ酸組成が算出される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物が産生するタンパク質に着目して、そのアミノ酸配列又は塩基配列のデータから、耐熱性に関する特性値を計算することにより、当該タンパク質が耐熱性を有するか否かを判別する方法に関する。より詳細には、本発明は、被検定タンパク質が耐熱性を有しているか否かを判別する方法であって、当該タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析により、被検定タンパク質に固有の分析値を算出し、当該分析値を、耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値と比較することからなる、タンパク質の耐熱性を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性酵素は、高温領域においても酵素活性を失わない酵素として産業界、研究開発分野などで広く使用されている。例えば、デンプンなどの糖類の加水分解における酵素反応工程に使用する酵素（特許文献１及び２参照）、生ゴミの処理やそれらからの堆肥などを製造する際の酵素反応における酵素（特許文献３及び４参照）、トレハロースなどの有用物質を製造する際の酵素反応における酵素（特許文献５及び６参照）などが挙げられる。
このように、産業的にも耐熱性酵素は非常に重要なものであるが、近年ではＰＣＲ法（特許文献７参照）や複製ＲＮＡベースの増幅系（特許文献８及び９参照）などに使用される耐熱性のＤＮＡポリメラーゼの開発が重要とされてきており、多数の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが主として好熱性微生物から単離されている。ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子操作技術における重要なツールのひとつとなってきており、遺伝子のクローニングや配列決定だけでなく、微量の遺伝子の検出や同定をするためのツールとして、遺伝子増幅のための酵素として重要となってきている。
【０００３】
現在、これらの目的で主として用いられる好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ．アクアティクス（T.aquaticus）に由来するＴａｑポリメラーゼのようなサーマス（Thermus）属に由来するものである。より適切な特性及び活性を有する新規なポリメラーゼの発見について関心が高まっており、サーマス属以外からのものとしては、例えば、アナエロセルム  サーモフィラム（Anaerocellum thermophilum）からのＤＮＡポリメラーゼを用いる方法（特許文献１０参照）、硫黄代謝好熱性古細菌パイロコッカス・ホリコシからのものを用いる方法（特許文献１１参照）などが報告されている。
【０００４】
このように、耐熱性酵素の重要性は益々高まってきているのであるが、耐熱性酵素の検索は多くの場合、好熱性菌や耐熱性菌をスクリーニングの対象として、対象とする酵素生産菌を自然界からスクリーニングし、培養条件を検討して生産された酵素の耐熱性を一つ一つ熱処理をして確認しなくてはならないため、膨大な手間と時間を要するのみならず、多くの場合偶然に左右されることが多かった。また、スクリーニングの対象が、好熱性菌、耐熱性菌あるいは中温菌に限定されており、好熱性菌や耐熱性菌は微生物全体の種類から考えるとごく限られた種にすぎないため、耐熱性酵素の多様性が限られていた。
偶然の発見に期待するだけでなく、産業上有用な耐熱性酵素を検索するための系統的かつ省力的な手法の確立が求められていた。
【０００５】
【特許文献１】特表平１０−５０６５２４号
【特許文献２】特開２０００−５０８７０号
【特許文献３】特開２００１−６１４７４号
【特許文献４】特開２００３−２１９８６４号
【特許文献５】特開平０８−３３６３８８号
【特許文献６】特開平０８−１４９９８０号
【特許文献７】特公平０４−６７９５７号
【特許文献８】特開平０２−５８６４号
【特許文献９】特開平０２−５００５６５号
【特許文献１０】特表２００１−５０２１６９号
【特許文献１１】特開２０００−４１６６８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、試行錯誤により耐熱性酵素を検索していた従来の手法を改善することを目的とするものであり、タンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列などのデータに基づいて簡便な手法で、当該タンパク質が耐熱性を有するか否かを判別することができる新規な方法を提供するものである。
また、本発明は、有用酵素等の耐熱性蛋白質の資源を広く工業用微生物と幅広く用いられている耐熱性酵素として、これまでにない多様性に富んだ耐熱性酵素を簡便に判別することができる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これまで全ゲノム配列が知られている１２０種類の微生物のゲノム中に予測された蛋白質のアミノ酸組成を用いて主成分分析を行い、その第２主成分の固有ベクトル(アミノ酸の重み係数)から個別の蛋白質の主成分得点を算出し、この値と当該タンパク質の耐熱性との相関を検討してきたところ、この値と当該タンパク質に対応する好熱菌の算出するタンパク質における値とが、極めて強い相関関係を有していることを見出した。そして、本発明者らは、この相関関係を利用することにより、当該タンパク質の耐熱性を判別できる方法を確立し、本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、被検定タンパク質が耐熱性を有しているか否かを判別する方法であって、当該タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析により、被検定タンパク質に固有の分析値を算出し、当該分析値を、耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質における分析値と比較することからなる、タンパク質の耐熱性を判別する方法に関する。
本発明は、タンパク質の耐熱性試験を行うことなく、タンパク質のアミノ酸配列、塩基配列データから予測されるタンパク質のアミノ酸組成に基づいた主成分分析から得られた固有の分析値を用いることにより、当該タンパク質が耐熱性を有するか否かを判別する方法を提供するものである。
本発明の方法は、電子計算機で処理できるようにプログラムすることもでき、当該プログラムに当該タンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列のデータを入力することにより、電子計算機の処理により、当該タンパク質が耐熱性を有するか否かを判別することができる方法を提供するものである。
【０００９】
全塩基配列決定が終了した微生物のゲノム配列から推測された全蛋白質のアミノ酸組成と微生物の生育温度には相関関係があることが知られている。特に、８０℃を越える超好熱性古細菌(アーキア)と一部の細菌の間で顕著に相関関係が見られることが知られている。しかし、これまで全ゲノム配列が決定された超好熱菌のほとんどがアーキアであることから、この相関関係がアーキア特有のものであるのか、好熱性菌の特徴であるのか、詳細な検討がなされてこなかった。また同様に、ゲノム配列決定が終了した一部の好熱性細菌についても、それらと類縁性の高い非好熱、非耐熱性菌が存在しないこと、あるいは存在してもゲノム配列情報がないため、好熱性細菌に見られたアミノ酸組成の特徴が、本当に好熱性細菌に特有な特徴であるのか、単に種の特異性を反映した結果なのかを正確に決定することは困難であった。
【００１０】
本発明者らは、同属内及び非常に類縁性の高い属内に７０℃前後を生育上限温度とする好熱性菌や、様々な生育上限温度を有する非好熱性菌が存在するバチルス（Bacillus）属関連種に着目して、ゲノム配列情報と耐熱性との相関を検討することにした。これらバチルス（Bacillus）属関連種では、これまで4つの非好熱性バチルスサブチリス（B. subtilis）、バチルスハロデュランス（B. halodurans）、オーシャノバチルスイヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）、バチルスセレウス（B. cereus）の全ゲノム配列が明らかにされてきたが、好熱性のバチルス（Bacillus）属関連種の全ゲノム情報については解析されてきていなかった。
そこで、好熱性のジオバチルスカウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）の１種である、ジオバチルスカウストフィラス  ＨＴＡ４２６（Geobacillus kaustophilus HTA426）（ＧＫ）のゲノムを解析することにした。この微生物は深海のマリアナ海溝から得られたものであり、生育上限温度は７４℃である。
これらのバチルス（Bacillus）属関連種の１６Ｓ ｒＤＮＡに基づいてネイバージョイニング法により作成した系統樹を図１に示す。図１の左下のバーは０．０１ケーヌック単位（Knuc unit）を示す。下方の線で示している部分（原図では赤色）は、好熱性菌であることを示す。以下の解析に使用した５種の微生物、上側からバチルスハロデュランス  Ｃ−１２５（B. halodurans C-125）（以下、ＢＨと略称する。）、バチルスサブチリス  １６８（B. subtilis 168）（以下、ＢＳと略称する。）、バチルスセレウス  ＡＴＣＣ１４５７９（B. cereus ATCC14579）（以下、ＢＣと略称する。）、オーシャノバチルスイヘエンシス  ＨＴＥ８３１（Oceanobacillus iheyensis HTE831）（以下、ＯＩと略称する。）、及びジオバチルスカウストフィラス  ＨＴＡ４２６（Geobacillus kaustophilus HTA426）（以下、ＧＫと略称する。）にはその右肩のアスタリスク印を付している。
【００１１】
まず、本発明者らは、好熱性のジオバチルスカウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ゲノムの全塩基配列を決定した。次に、このジオバチルスカウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）（ＧＫ）を含むこれら５種の微生物、及びこれまでに全ゲノム配列が明らかにされた１２０種の微生物が持つ蛋白質のアミノ酸組成を主成分分析法（ＰＣＡ）により解析したところ、従来知られているとおり、全体的に第１主成分 (ＰＣ１)はＧＣ含量、第２主成分 (ＰＣ２)は生育上限温度と強い相関を示すことが観察された。
この結果を図２に示す。図２の原図はカラーのグラフである。図２の横軸はＧＣ含量（ＰＣ１）の解析値を示し、縦軸は生育上限温度（ＰＣ２）の解析値を示す。ここで行った主成分分析法（ＰＣＡ）は通常の統計学における手法によっている。赤色の四角印（白黒の図では黒色）は好熱性細菌を示し、青色（白黒の図では黒色）はＧＣ含有量の低いグラム陽性菌を示し、緑色（白黒の図ではやや灰色）はＧＣ含有量の高いグラム陽性菌を示す。図２のＰＣ２における０．０１５２のラインは好熱性細菌（上側）と非好熱性細菌 (下側) の境界を示している。
また、バチルス（Bacillus）属関連種間に限っても、第２主成分得点と生育上限温度との間に相関が見られた。ただし、これは菌全体の平均アミノ酸組成を用いた結果であり、個々の蛋白質で見ると、ちらばりが大きいため、相関はそれほど明確ではなくなっている。
【００１２】
そこで、本発明者らは、解析に用いたバチルス属関連の前記した５種の微生物間において、各蛋白質の耐熱性指標を、第２主成分に対応する固有ベクトルを重み係数としてアミノ酸組成にかけることによりまず算出した。
ここで使用したアミノ酸組成に基づく主成分分析法としては、ＮＣＢＩで公開されているデータベースから１１９種類の微生物ゲノムデータを取得し、これと本発明において決定したジオバチルスカウストフィラス ＨＴＡ４２６（Geobacillus kaustophilus HTA426）のゲノムをあわせて１２０種類のゲノム中に同定された蛋白質配列を用いて行った。これらの配列のうち、配列長が５０アミノ酸未満の配列を除去し、さらにＰＳＯＲＴプログラムを用いて２つ以上の膜貫通領域が予測された蛋白質も除去した。残った蛋白質の配列を用いて、生物種ごとに平均アミノ酸組成を算出し、生物種を行、アミノ酸を列とする行列を入力して、統計解析パッケージＲのプリンコンプ（princomp）関数を用いる主成分分析法を行った。
次に、この結果を基に、好熱性ジオバチルスカウストフィラスの対応する蛋白質の主成分得点と非好熱菌４種の値の差分を算出した。この対応づけはホモロジー検索結果から推定されたオーソログ関係をもとに行い、１：１で対応関係がついた蛋白質を対象として解析を行った。（Kreil D.P. and Ouzounis, C. A. (2001) Identification of thermophilic species by the amino acid compositions deduced from their genome. Nucleic Acids Res. 29, 1608-1615）
選抜した９６５個のタンパク質は、２回以上の膜貫通領域を有さないタンパク質であって、かつほぼ同じ生育上限温度を有するジオバチルスステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus ）（以下、ＧＳと略称する。）のゲノムサーバーから５種に共通な９６５個のタンパク質を抽出した。なお、２回以上の膜貫通領域を有するかは、ＰＳＯＲＴプログラム（Nakai, K. & Horton, P., PSORT: Trends Biochem. Sci., 24, 34-36 (1999)）によって判定した。
この結果、算出された「主成分得点」の値を次の表１〜表１８に示す。これらの表の各欄は、左側から、ＧＫに基づく識別記号である「ＧＫ  ＩＤ」、各タンパク質の分類を示す「カテゴリー」、各タンパク質の名称等を示す「注釈」、そしてその右側が５種の微生物のそれぞれの識別記号と「主成分得点」の値であり、左からＧＫ、ＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、及びＯＩの順に配置されている。各微生物の識別記号に付されている色は、赤色が対応するＧＫの「主成分得点」との差（ＧＫとの差＝（各値）−各ＧＫ値）が、−０．００５以下であることを示し、青色が対応するＧＫの「主成分得点」との差が−０．０１０以下であることを示し、緑色が対応するＧＫの「主成分得点」との差が−０．０１５以下であることを示し、色が付されていないものは対応するＧＫの「主成分得点」との差が−０．０１５を超えていることを示している。
【００１３】
【表１】
0004616660.tif 000002
【００１４】
【表２】
0004616660.tif 000003
【００１５】
【表３】
0004616660.tif 000004
【００１６】
【表４】
0004616660.tif 000005
【００１７】
【表５】
0004616660.tif 000006
【００１８】
【表６】
0004616660.tif 000007
【００１９】
【表７】
0004616660.tif 000008
【００２０】
【表８】
0004616660.tif 000009
【００２１】
【表９】
0004616660.tif 000010
【００２２】
【表１０】
0004616660.tif 000011
【００２３】
【表１１】
0004616660.tif 000012
【００２４】
【表１２】
0004616660.tif 000013
【００２５】
【表１３】
0004616660.tif 000014
【００２６】
【表１４】
0004616660.tif 000015
【００２７】
【表１５】
0004616660.tif 000016
【００２８】
【表１６】
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【００２９】
【表１７】
0004616660.tif 000018
【００３０】
【表１８】
0004616660.tif 000019
【００３１】
この結果からも明らかなように、微生物全体としては明確な相関が見られないとしても、個々の対応するタンパク質同士を比較することにより、明確な相関が有る場合があることが明らかにされたのである。このことをより明確にするために、ＧＫと各種の微生物の相関をグラフ化してみた。
まずグラフ化するにあたっては、ＧＫとほぼ同じ生育上限温度を有するジオバチルスステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)(ＧＳ)とのオーソログの対応付けを以下のように行った。オクラホマ大のＦＴＰサイトからＧＳのドラフトゲノム配列を取得した。これらコンティグ配列に対して、ＧＫの各翻訳配列をクエリとしてＴＢＬＡＳＴＮプログラムで類似配列を検索し、最高スコアのヒットがクエリの長さの７０％以上の領域について７０％以上の一致を示したものをオーソログとした。次に、ＧＫとＧＳについて、各タンパク質における「主成分得点」の値に基づいた相関図を図３に示す。図３の横軸はＧＫの「主成分得点」の値を示し、縦軸はＧＳの「主成分得点」の値を示す。グラフ中の実線は両者の値が同じ箇所を示し、破線は前記の実線から±０．０１の範囲を示している。このように好熱性細菌同士で各タンパク質を比較した場合には、各タンパク質の「主成分得点」の値は極めて強い相関があることが分かる。同様に、非好熱性細菌であるＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、及びＯＩについてそれぞれＧＫとの相関をグラフ化して示したものを図４に示す。図４の左上 (ａ) はＧＫとＢＣとの相関であり、左下 (ｂ) はＧＫとＢＨとの相関であり、右上 (Ｃ) はＧＫとＢＳとの相関であり、右下はＧＫとＯＩとの相関である。それぞれのグラフの横軸はＧＫの「主成分得点」の値を示し、縦軸は各非好熱性細菌の「主成分得点」の値を示す。このグラフから、非好熱性細菌については、タンパク質の種類によりＧＫとよい相関を示すものも有るが、全く異なる値を示すものもあることがわかる。
【００３２】
前記したＧＫとＧＳの相関では、ほぼ全てのタンパク質において両者に強い相関が認められたが、非好熱性細菌との比較では相関がほとんど無いタンパク質もあることがわかる。これは、当該タンパク質が耐熱性を有していないことによるものとも考えられる。逆に、非好熱性細菌は、全体としては耐熱性を有していないのであるが、当該微生物が産生している全部のタンパク質が耐熱性を有していないのではなく、耐熱性を有していないのは一部のタンパク質であるとも考えられる。そして、仮に耐熱性を失ったタンパク質が生命維持に不可欠のタンパク質である場合には、他のすべてのタンパク質が耐熱性を有していたとしても、当該微生物は生命体全体としてはもはや耐熱性を有していないことになる。
このことは、本発明者らの本発明における新たな知見である。即ち、従来、耐熱性のタンパク質を検索する場合には、耐熱性の微生物をスクリーニングすることによっていた。これは、耐熱性の生命体は耐熱性のタンパク質を有しているからであり、そうでなければ高温の条件下で生命を維持することができないからである。しかしながら、非好熱性細菌が産生するタンパク質は全て非耐熱性でないといけなかというと、必ずしもそうではない。非好熱性細菌が耐熱性のタンパク質を産生していたとしても、生命の維持に問題が生じるかというと、必ずしもそうではなく、非好熱性細菌が非耐熱性になっているのは全てのタンパク質が非耐熱性になったのではなく、生命維持に必須のタンパク質が耐熱性を失った結果であるということも十分考えられる。
前記した表１〜１８、及び図４の結果は、非好熱性細菌であっても好熱性細菌が産生していると同様な耐熱性のタンパク質を産生している可能性を明らかにしているのである。
【００３３】
これらの結果を、各微生物の生育上限温度との関係でまとめたものを次の図５に示す。図５の横軸は温度を示し、縦軸は百分率（％）を示す。グラフ中の黒四角印（■）はＧＫを示し、黒丸印（●）はＢＨを示し、白丸印（○）はＢＳを示し、白三角印（△）はＢＣを示し、白四角印（□）はＯＩをそれぞれ示す。横軸には、それぞれの微生物の生育上限温度がプロットされ、縦軸は上のライン（原図では緑色）は、９６５個のタンパク質のうちＧＫとの「主成分得点」の値の差が−０．０１５を超えているタンパク質の数の全９６５個に対する百分率（％）を各微生物についてプロットした線であり、中程のライン（原図では青色）は同様に−０．０１０を超えているタンパク質の数の百分率（％）を各微生物についてプロットした線であり、下側のライン（原図では赤色）は同様に−０．００５を超えているタンパク質の数の百分率（％）を各微生物についてプロットした線である。「主成分得点」の値の差が−０．０１５を超えている（即ち、−０．０１５以上、絶対値では小さくなるが、負数であるから大きくなる。以下同じ。）タンパク質を耐熱性蛋白質として、ＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、及びＯＩについてこれらの菌の蛋白質の数及びその比率をまとめたものを次の表１９に示す。
【００３４】
【表１９】
0004616660.tif 000020
【００３５】
表１９は、前記した主成分分析法に基づいて各常温性バチルス（Bacillus）属の細菌から耐熱性の蛋白質を予測した結果をまとめたものである。表１９中の、−は各蛋白質とＧＫのＰＣ２値との差が−０．０１５よりも小さく耐熱性無しと判定されたものを示し、＋は各蛋白質とＧＫのＰＣ２値との差が−０．０１５より大きいもの、＋＋は−０．０１０よりも大きいもの、＋＋＋は−０．００５よりも大きいもので耐熱性有りと判定されたものをそれぞれ示す。表１９中の、＋＋、＋＋＋は前記した＋＋と＋＋＋の和を示し、＋、＋＋、＋＋＋は前記した＋と＋＋と＋＋＋の和を示す。表１９は、バチルス（Bacillus）５種間で１：１の対応がつく９６５種のオーソログ（orthlog）に基づく解析を行った結果をまとめたものである。
この結果、表１９に示したように、ＢＣでは９６５個の蛋白質の８３．５％が、ＢＨでは７９．１％、ＢＳでは７２．１％、ＯＩでは５９．５％が耐熱性蛋白質であると予測された。このグラフでは、ＢＣ（△）が少し異常な数値を示しているが、蛋白質の３種は同様な傾向を示していることがわかる。即ち、好熱性細菌の産生するタンパク質と同程度の「主成分得点」の値を有するタンパク質をたくさん産生している微生物であるほど、生育上限温度が高くなっていることが示されている。例えば、好熱性細菌の産生するタンパク質と同程度の「主成分得点」の値を有するタンパク質を最も少量しか産生していないＯＩは、これらの微生物の中で最も低い生育上限温度となっている。また、ＢＣ（△）はこれらの4種の非好熱性細菌の中では、最も多量の同種のタンパク質を有しているが、生育上限温度が異常に低くなっていることがわかる。これは、生命維持に必須のタンパク質がたまたま耐熱性を失った結果であると考えられる。
【００３６】
次に、このことを検証するために、これらの微生物からタンパク質を分離し、（１）非加熱、（２）６０℃で１０分間加熱、（３）７０℃で１０分間加熱、のそれぞれの処理した後でのネイティブＰＡＧＥのパターンを検討した。結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６の左側（図６ａ）は全タンパク質であり、クーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染色したものである。この結果、好熱性細菌のＧＫでは加熱処理後（レーン２及び３）であってもほとんど全てのタンパク質のバンドを確認することができるが、他の４種の非好熱性細菌では加熱処理により多くのタンパク質のバンドが消失することがわかる。しかし、ここで重要なことは、全部のタンパク質のバンドが消失するわけではないということである。いくつかのタンパク質のバンドは加熱処理後においても消失せずに残っていることがわかる。このことは、前記してきた、非好熱性細菌であっても産生する全てのタンパク質が非耐熱性であるということではない、ということを実証するものである。
図６の右側（図６ｂ）は、各微生物の全タンパク質を図６ａと同様にネイティブＰＡＧＥで分離した後、エステラーゼ (EC 3.1.1.1) 活性を有するタンパク質のバンドを活性染色法により検出したものである。各図のＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、ＧＫ、ＯＩはそれぞれの微生物を示し、各微生物の１〜３の各レーンは、１が非加熱、２が６０℃１０分、３が７０℃ １０分である。エステラーゼ（図６ｂ）におけるＯＩでは６０℃の加熱処理により（レーン２）バンドは消失している。また、ＢＣも未処理時に最も強く染色されたメインバンドが６０℃の加熱処理によって消失している。しかし、ＢＳでは加熱処理によりバンドは消失しておらず、ＢＨにおいてもわずかではあるが、６０℃の加熱処理によってもバンドが消失せず維持されている。
また、バチルスサブチリスにおける生育に必須のタンパク質の一つであるＧｒｏＥＳ、バチルス属関連種に共通に保存されている代表的なタンパク質のひとつであるＨａｇ (Flagellin)については、各微生物からこれらのタンパク質をコードしている遺伝子をＰＣＲにて増幅し、大腸菌を用いてクローン化したものを用いて先と同様に耐熱性の検証を行った。クローン化され精製された各タンパク質を（１）非加熱、（２）６０℃で１０分間加熱、（３）７０℃で１０分間加熱、のそれぞれの処理した後でのネイティブＰＡＧＥのパターンを検討した。結果を図７に図面に代わる写真で示す。左側（図７ａ）はＨａｇ、右側（図７ｂ）はＧｒｏＥＳであり、ネイティブＰＡＧＥで分離した後、クーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果を示したものである。各図のＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、ＧＫ、ＯＩはそれぞれの微生物を示し、各微生物の１〜３の各レーンは、１が非加熱、２が６０℃１０分、３が７０℃ １０分である。
【００３７】
ではどのようなタンパク質が耐熱性であるのかということが問題となる。エステラーゼの場合には、複数の蛋白質が染色法により染色される可能性があるので、実際的にはどのバンドに相当するかを一義的に特定することは困難であることがわかったので、蛋白質のＨａｇとＧｒｏＥＳに着目することにした。そこで、各微生物のＨａｇについて検証してみた結果が図７ａ、ＧｒｏＥＳについては図７ｂである。これらのタンパク質は、前記の表に記載されているＧＫの識別記号がＧＫ３１３１(Ｈａｇ)、ＧＫ０２４８(ＧｒｏＥＳ)のものである。
これらのタンパク質の各微生物における主成分得点の値は次のようになっている。Ｈａｇは、(ＧＫ，−０．０５１３；ＢＣ，−０．０６２２；ＢＨ，−０．０５６７；ＢＳ，−０．０５７８；ＯＩ，−０．０５２８)（表１７参照）、ＧｒｏＥＳは、(ＧＫ，０．１０１８；ＢＣ，０．０８２６；ＢＨ，０．１０１２；ＢＳ，０．０９４０；ＯＩ，０．０９８８）（表３参照）である。これらをまとめて示すと次の表２０となる。
【００３８】
【表２０】
0004616660.tif 000021
【００３９】
Ｈａｇタンパク質については、ＢＣ以外の全てについては、７０℃の加熱処理によりによっても未処理時とほぼ同様にバンドが維持されている。ＧｒｏＥＳタンパク質については、ＢＣとＢＳが６０℃以上の加熱処理によりわずかに薄いバンドしか確認されなかったことから、熱処理によってタンパク質が分解されたと考えられる。他のＧＫ、ＯＩ、ＧＫについては未処理とほぼ同様にバンドが維持されていた。このことは、非好熱性細菌では、その種類により、耐熱性を保持しているものと保持していないものがあるということを示している。
次に、図６ａで示された７０℃で１０分間熱処理後にも消失せず残ったタンパク質のバンドを上部から順にゲルから切り出し、各バンドに含まれるタンパク質の同定をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行った。その結果を表２１−２５に示す。
【００４０】
【表２１】
0004616660.tif 000022
【表２２】
0004616660.tif 000023
【００４１】
【表２３】
0004616660.tif 000024
【００４２】
【表２４】
0004616660.tif 000025
【００４３】
【表２５】
0004616660.tif 000026
【００４４】
表２１−２５は、熱処理実験により耐熱性が確認されたバチルスサブチリス（Bacillus subtilis (ＢＳ)）由来の蛋白質の内訳（表２１及び表２２）を、バチルスハロドランス（Bacillus halodurans(ＢＨ)）由来の蛋白質の内訳（表２３）を、オーシャノバチルスイヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis(ＯＩ)）由来の蛋白質の内訳（表２４）を、バチルスセレウス（Bacillus cereus(ＢＣ)）由来の蛋白質の内訳（表２５）をそれぞれ示したものである。各表の各欄は左から、ＢＳの遺伝子名、その産生物名、対応するＧＫの遺伝子名、予測の結果、産生物のアミノ酸数、ＧＫとＢＳの主成分分析の得点差をそれぞれ示す。「予測の結果」欄の、−はＧＫのＰＣ２値との差が−０．０１５よりも小さいさく耐熱性無しと判定されたことを示し、＋はその差が−０．０１５よりも大きいものを、＋＋は−０．０１０よりも大きいものを、＋＋＋は-０．００５よりも大きいもので耐熱性有りと判定されたものであることを示す。
表２１−２５に示したように少なくともＢＣとＢＨでは３８、ＢＳでは１１７、ＯＩでは５２の耐熱性タンパク質が同定された。そこで、耐熱性が確認されたタンパク質の耐熱性の有無がＧＫと他のBacillus属関連種との主成分得点の対比によりどのように予測されていたかを調べた。先に述べたように各Bacillus属関連種とＧＫの主成分得点の差が−０．０１５以上を耐熱性ありとすると、ＢＣでは表２５に示した３８個中３４個(８９．５％)が、ＢＨでは表２３に示した３８個中３６個（９４．７％）、ＢＳでは表２１及び表２２に示した１１７個中１０３個（８８．０％）、ＯＩでは表２４に示した５２個中４６個（８８．５％）が、本発明の方法により耐熱性ありと予測されていたことがわかる。
これらの結果をまとめて示すと次の表２６になる。表２６の各記号は表１９の場合と同様である。したがって、好熱性細菌の対応するタンパク質との相関を計算することにより、非好熱性細菌が産生しているタンパク質の耐熱性を判別することができるという本発明の方法が、当該タンパク質の耐熱性を示しているということである。
【００４５】
【表２６】
0004616660.tif 000027
【００４６】
本発明の方法をバチルス（Bacillus）属関連種に基づいて説明してきたが、本発明の方法は、例示してきたバチルス（Bacillus）属関連種に限定されるものではなく、被検定タンパク質に対応する耐熱性タンパク質が存在している限りいかなる生物種にも適用可能なものであることは当業者であれば容易に理解されるところである。
本発明における「耐熱性生物」とは、ヒトが生命を維持できる温度以上で、生命を維持できる生物であればよいが、具体的には約５０℃以上、好ましくは６０℃以上、より好ましくは６５℃以上の環境下で生命を維持できる生物をいう。例えば、好熱性菌、温泉生物、などが挙げられる。本発明の方法における「耐熱性生物」としては、被検定タンパク質を産生する生物と関連性を有する耐熱性生物が好ましい。ここで言う「関連性」としては、生物学における分類による近似性、発生学における遺伝子的な近似性、当該被検定タンパク質の有する機能的な近似性などを例示することができる。
本発明における「耐熱性生物が有するタンパク質」とは、当該耐熱性生物が産生するタンパク質であり、生命維持に必要なタンパク質であるか否かにかかわらず、当該耐熱性生物が産生しているタンパク質であればあればよい。
また、本発明における「耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質」としては、被検定タンパク質が有する機能と同種、好ましくは同等の機能を有するタンパク質であればよく、必ずしも生物学的又は発生学的な関連性を有する必要はないが、好ましくは生物学的又は発生学的な関連性を有するものが挙げられる。例えば、前記して例で挙げてきたように生物学的なオルソロガス遺伝子に基づく対応関係や、同属又は同種の生物間における同種の機能を有するタンパク質の関係などが挙げられる。
本発明の方法における「耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質」は、必ずしも１個のタンパク質である必要はなく、２個又はそれ以上のタンパク質であってもよい。そして、このようなタンパク質として２個以上のタンパク質を選定することができる場合には、これら相互と比較し、総合的に判定することも可能である。
【００４７】
本発明の方法における、「アミノ酸組成に基づく被検定蛋白質の耐熱性指標」を計算する手法としては、前記で例示してきた生物のゲノム中に同定される蛋白質をコードしている遺伝子に基づいて、タンパク質を抽出し、これらのタンパク質のうち、アミノ酸配列の配列長が５０アミノ酸未満のタンパク質を除去し、さらにＰＳＯＲＴプログラムを用いて２つ以上の膜貫通領域が予測されたタンパク質も除去し、次に残ったタンパク質についてそれらのアミノ酸配列を用いて、生物種ごとに平均アミノ酸組成を算出し、算出された平均アミノ酸組成について生物種を行、アミノ酸を列とする行列を入力して、統計解析パッケージＲのプリンコンプ（princomp）関数を用いる主成分分析法に基づく方法（Kreil D.P. and Ouzounis, C. A. (2001) Identification of thermophilic species by the amino acid compositions deduced from their genome. Nucleic Acids Res. 29, 1608-1615）が有効であるが、これに限定されるものではなく、実験的に耐熱性が検証された蛋白質の数が一定数以上あれば、判別分析や回帰分析などの手法によりその知見を取り込んで改善することも可能である。また、本発明においてはタンパク質全体(全長を)用いることが好ましいが、タンパク質の各ドメイン、部分長のみを対象に用いて行うことも可能である。
【００４８】
本発明の方法における「分析値の比較」としては、前記の例で示してきた、両者の差を取る方法が簡便で好ましいがこれに限定されるものではない。データ量が多数蓄積された場合には、全体の平均値との相違や、偏差のように統計的な処理がなされた値に基づいて比較することも可能である。
また、比較したときの判定基準は、被検定タンパク質が実際に耐熱性を有していることを確認できる範囲において、これを設定することができる。前記した例では、固有ベクトル値(各アミノ酸の重み係数)と各蛋白質のアミノ酸数から計算された主成分得点の差が−０．００５〜−０．０１５程度以下である範囲において耐熱性であると判定することができる。このような判定は、必ずしも、有るか無いかということだけでなく、耐熱性を有する可能性として百分率（％）で表示することも可能である。
【００４９】
本発明の方法における、被検定タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析による固有の解析値を算出するためのデータとしては、当該タンパク質のアミノ酸配列及び／又は塩基配列のデータなどが挙げられるがこれに限定されるものではなく、アミノ酸組成だけであってもよいこともあり得る。このようなデータとしては、判定精度を上げるために、情報量の多いものが好ましいが、前記の例で示したように当該タンパク質をコードする塩基配列が簡便で好ましい例としてあげることができる。これに加えて、タンパク質の３次元データなどをさらに加えることも可能であるが、どのようなデータが必要であるかということは、判定の精度の向上だけでなく、このデータを処理する処理手法に大きく依存している。
【００５０】
本発明の方法は、具体的には以下に示す（１）〜（６）のステップからなるものである。
（１）タンパク質のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする塩基配列を得ること。
（２）当該アミノ酸配列及び／又は塩基配列のデータに基づいて、当該タンパク質の
「固有の分析値」を算出すること。
（３）当該タンパク質を被検定タンパク質として、「耐熱性生物の有する被検定
タンパク質と対応するタンパク質」を選定すること。
（４）選定された「対応するタンパク質」の分析値データを得ること。
（５）両者を比較すること。
（６）比較の結果に基づいて判定すること。
これらのステップにおいて、（１）の配列の決定、及び（３）の選定以外の事項は予めその処理方法を設定しておくことができ、電子計算機による処理が可能である。また、前記ステップ（３）も、酵素分類などに基づいて予め分類しておけば、蓄積データの中から選定対象となる「対応するタンパク質」を選定させることも可能である。そうすると、前記（１）のステップ以外を電子計算機による処理とすることができる。
即ち、本発明は、前記してきた本発明の方法を、電子計算機で処理できようにプログラムされており、当該処理が、（ａ）当該プログラムに当該タンパク質のアミノ酸配列又は塩基配列のデータを入力することにより、電子計算機による処理で固有の分析値の算出する方法、（ｂ）当該タンパク質の分類記号、機能データ、由来データなどに基づいて当該タンパク質に「対応するタンパク質」を蓄積データの中から抽出する方法、（ｃ）前記の（ｂ）ステップで抽出されてきた「対応するタンパク質」の固有の分析値を算出又は蓄積データの値として参照する方法、（ｄ）当該タンパク質の固有の分析値と、「対応するタンパク質」の固有の解析値を比較する方法、（ｅ）比較した結果を表示（出力）する方法として、電子計算機により処理方法を提供するものである。
【００５１】
前記した電子計算機による処理においては、耐熱性生物の有する被検定タンパク質と対応するタンパク質における解析値を、その都度計算させることもできるが、当該タンパク質のアミノ酸組成に基づく主成分分析により算出された値を各タンパク質の種類に応じて分類してリスト化して蓄積データとしておくこともできる。このような蓄積データは、電子計算機による処理に供する情報として利用できるように、電子計算機で処理可能な記録媒体に蓄積することができる。このような記録媒体としては、ハードディスク、ＤＶＤディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、フレキシブルディスクなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の方法は、実験を伴わずにタンパク質の固有の分析値を計算することにより、またより簡便にはパーソナルコンピューター上で蛋白質の耐熱性予測ができるため、非常に迅速で安価である。また、本発明は、生物の個体ではなく、その生物が産生しているタンパク質単位で判定が可能であるために、従来は好熱性菌にその資源を頼らざるを得なかった耐熱性酵素の検索範囲を、中温菌が産生するタンパク質の範囲にまで広げることが出来るようになり、耐熱性タンパク質のスクリーニング範囲を拡大することができる。さらに、これまで非常に時間と労力を要した中温菌からの耐熱性酵素のスクリーニングにも予め耐熱性酵素候補の絞り込みが出来るようになったことで、様々なプロセスに対応できる耐熱性酵素の検索を容易に行うことができることになる。
【００５３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
１２０種の菌のデータの算出法。
ＮＣＢＩで公開されているデータベースから１１９種類の微生物ゲノムデータを取得し、これと本発明において決定したジオバチルスカウストフィラス ＨＴＡ４２６（Geobacillus kaustophilus HTA426）のゲノムをあわせて１２０種類のゲノム中に同定された蛋白質の配列を解析に用いた。これらの蛋白質の配列のうち、配列長が５０アミノ酸未満の蛋白質を除去し、さらにＰＳＯＲＴ（K. Nakai, P. Horton, Trends Biochem. Sci., 24, 34-6, 1999 ）プログラムを用いて２つ以上の膜貫通領域が予測された蛋白質も除去した。残った蛋白質の配列を用いて、生物種ごとに平均アミノ酸組成を算出し、生物種を行、アミノ酸を列とする行列を入力して、クレイルらの方法（D. Kreil, C. Ouzounis, Nucleic Acids Res, 29, 1608-15, 2001）にしたがって、主成分分析を行った。解析には統計解析パッケージＲのプリンコンプ（princomp）関数を用いた。
【実施例２】
【００５５】
９６５個のタンパク質の固有の解析値データの算出法
ＧＫ, ＢＣ, ＢＨ, ＢＳ, ＯＩ の５種間のオーソログの対応付けはウチヤマによるＭＢＧＤ（I. Uchiyama, Nucleic Acids Res 31, 58-62, 2003）サーバ上のクラスタリングプログラムを用いて行った。５種すべてに存在し、かつ１対１の対応がついたオーソロググループのみを解析に用いた。さらに、ＰＳＯＲＴで膜貫通領域が２つ以上あると予測された蛋白質が４つ以上含まれるグループは除いた。前記実施例１に記載の主成分分析で得られた第２主成分の固有ベクトルを用いて、各蛋白質の耐熱性指標を、アミノ酸組成ベクトルと固有ベクトルの内積として算出した。
【実施例３】
【００５６】
全タンパク質の分析
ＧＫ、ＢＳ、ＢＣはＬＢ培地（ｐＨ  ７）を用いて、ＢＨとＯＩはホリコシII（Horikoshi II）培地（PH 9.5）(Takami, H, Kobayashi, T., Aono, R., and Horikoshi, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 101-108, 1992)を用いて好気的に１８時間液体培養した。培養温度は、ＧＫの５５℃を除き３７℃で行った。培養菌体を遠心分離により取得し、５０ｍＭのリン酸バッファーで菌体を洗浄後、同バッファーに再懸濁して菌液とした。次にこの菌液をフレンチプレスに供試して作製した菌体破砕液を遠心分離し、菌体残渣を取り除いたものをタンパク質溶液として全タンパク質の分析に用いた。また、このタンパク質溶液をそれぞれ６０℃、７０℃で１０分間熱処理後急冷して熱処理タンパク質溶液をした。全タンパク質の分析は、ネイティブゲル電気泳動法によって行い、ゲル濃度は１２．５％のものを用いた。電気泳動後のゲルは、クーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）にて染色した。
【実施例４】
【００５７】
耐熱性蛋白質の同定
上記の実施例３に記載の方法で調製した各生物のタンパク質溶液を、実施例３と同様にして、ネイティブゲル電気泳動法によって分離し、クーマシーブリイアントブルーにて染色した。７０℃で１０分間熱処理したＧＫを除く４種のタンパク質溶液を電気泳動した図６のレーン３から、熱処理後も消失しなかったタンパク質のバンドをゲルから３ｍｍおきに切り出し、常法に従ってタンパク質をゲル中でトリプシン処理後ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いてペプチドを分画し、質量を算出した。質量分析は、サーモエレクトロン（Thermo Electron）社製のBioworks3.1, Xcalibourシステムを用いて解析し各バチルス（Bacillus）関連種のタンパク質データベースと照合することによって行い、それぞれのバンドに含まれるタンパク質の同定を行った。
この結果を表２１−２５に示す。
【実施例５】
【００５８】
エステラーゼの分析
上記の実施例３に記載の方法で調製した各生物のタンパク質溶液を、同様にネイティブゲル電気泳動法によって分離し、以下に示す方法によってエステラーゼ活性を有するバンドのみの検出を行った。
５０％アセトンに溶解した１％α−ナフチル酢酸（α-naphtyl acetate）を２ｍｌ、ファストブルーＢＢ（fast blue BB）塩１００ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸塩バッファー（ｐＨ  ７．４）１００ｍｌに加え撹拌し、プラスチック容器に移した後、電気泳動が終了したゲルを浸し遮光して３７℃で１０分間保温する。エステラーゼ活性を有するバンドが現れたら、先の溶液を捨て蒸留水にてゲルを洗浄した。
得られた各生物からのエステラーゼを、未処理溶液、それぞれ６０℃、７０℃で１０分間熱処理後急冷して熱処理タンパク質溶液として、ネイティブゲル電気泳動法を行った。ゲル濃度は１２．５％のものを用いた。
【実施例６】
【００５９】
フラジェリンの分析
５種類の菌株のｈａｇ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーセットを用いて、ＰＣＲにてｈａｇ遺伝子を増幅した。次に、Ｎ−末端にHis-tagを有するＴＡクローニング用のプラスミドベクター(pCRT7TOPOTA)にこれらのＰＣＲ産物をライゲーションして大腸菌（E.coli BL21 DE3）に形質転換した。形質転換した大腸菌はＯＤ６００が０．６になるまで培養し、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、３０℃で３−５時間発現させた。菌体を先と同様にフレンチプレスにて破砕し作製した菌体破砕液をHis-tagを有するタンパク質のみを簡便に精製するためのタロンメタルアフィニティー（TALON Metal Affinity）カラムに供試してタンパク質をカラムに付着させた後、１５０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌで目的タンパク質を精製した。精製したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製度を確認した。
精製したタンパク質を用いて、前記実施例４の方法に準じて熱処理を行い、ネイティブゲル電気泳動法によりタンパク質を分離後、クーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）にて染色した。
【実施例７】
【００６０】
ＧｒｏＥＳの分析
５種類の菌株のｇｒｏＥＳ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーセットを用いて、ＰＣＲにてｇｒｏＥＳ遺伝子を増幅し、実施例５と同様にタンパク質を精製した。また、精製タンパク質を用いて同様に熱処理、電気泳動を通してＧｒｏＥＳの分析を行った。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
耐熱性酵素などの耐熱性タンパク質は、糖工業、タンパク質工業、肥料工業などの様々な産業分野で利用されており、その重要性は極めて高い。また、ＤＮＡポリメラーゼなどのように、遺伝子操作技術においては耐熱性酵素の利用が不可欠とされている。
本発明の方法は、このような耐熱性酵素などの耐熱性タンパク質を簡便な手法で検索する新たな方法を提供するものであり、産業上極めて有用なものである。また、本発明の方法は、耐熱性タンパク質の検索範囲を従来の好熱性菌由来のものみから、更に拡大できることを教示するものであり、産業上極めて大きな貢献をするものである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本発明の方法の例示で使用したバチルス（Bacillus）属関連種の１６ＳｒＤＮＡに基づいてネイバージョイニング法により作成した系統樹を示す。
【図２】図２は、これまでに全ゲノム配列が明らかにされた１２０種の微生物が持つ蛋白質のアミノ酸組成を主成分分析法（ＰＣＡ）により、第１主成分をＧＣ含量（ＰＣ１）とし、第２主成分を生育上限温度（ＰＣ２）として解析した結果を示すカラーで作成したグラフである。
【図３】図３は、好熱性ジオバチルスカウストフィラス（Geobacillus kaustopilus）（ＧＫ）とほぼ同じ生育上限温度を有するジオバチルスステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）（ＧＳ）について、各タンパク質における「主成分得点」の値に基づいた相関図を示す。図３の横軸はＧＫの「主成分得点」の値を示し、縦軸はＧＳの「主成分得点」の値を示す。
【図４】図４は、好熱性ジオバチルスカウストフィラス（Geobacillus kaustopilus）（ＧＫ）と、非好熱性細菌であるＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、及びＯＩについてそれぞれＧＫとの相関をグラフ化して示したものである。図４の左上はＧＫとＢＣとの相関であり、左下はＧＫとＢＨとの相関であり、右上はＧＫとＢＳとの相関であり、右下はＧＫとＯＩとの相関である。それぞれのグラフの横軸はＧＫの「主成分得点」の値を示し、縦軸は各非非好熱性細菌の「主成分得点」の値を示す。
【図５】図５は、ＧＫ（黒四角印（■））、ＢＣ（白三角印（△））、ＢＨ（黒丸印（●））、ＢＳ（白丸印（○））、及びＯＩ（白四角印（□））の各微生物の生育上限温度と、９６５個のタンパク質のうちＧＫの「主成分得点」の値の差が異なるタンパク質の含有率の関係をまとめたグラフを示す。図５の横軸は温度を示し、縦軸は百分率（％）を示す。横軸には、それぞれの微生物の生育上限温度がプロットされ、縦軸は上のライン（原図では緑色）は、９６５個のタンパク質のうちＧＫとの「主成分得点」の値の差が−０．０１５を超えているタンパク質の数の全９６５個に対する百分率（％）を各微生物についてプロットした線であり、中程のライン（原図では青色）は同様に−０．０１０を超えているタンパク質の数の百分率（％）を各微生物についてプロットした線であり、下側のライン（原図では赤色）は同様に−０．００５を超えているタンパク質の数の百分率（％）を各微生物についてプロットした線である。
【図６】図６は、ＧＫ、ＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、及びＯＩの各微生物のタンパク質を分離した後でのネイティブＰＡＧＥのパターンを検討した結果を示す、図面に代わるカラー写真である。図６の左側（図６ａ）は全タンパク質であり、左側（図６ｂ）は、各微生物のエステラーゼ活性を有するバンドを示したものである。各図のＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、ＧＫ、ＯＩはそれぞれの微生物を示し、各微生物の１〜３のレーンは、１が非加熱、２が６０℃１０分、３が７０℃１０分である。
【図７】図７は、ＧＫ、ＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、及びＯＩの各微生物からＨａｇ、ＧｒｏＥＳタンパク質を分離した後でのネイティブＰＡＧＥのパターンを検討した結果を示す、図面に代わるカラー写真である。図７の左側（図７ａ）はＨａｇあり、左側（図７ｂ）は、各微生物のＧｒｏＥＳを単離して展開したものである。各図のＢＣ、ＢＨ、ＢＳ、ＧＫ、ＯＩはそれぞれの微生物を示し、各微生物の１〜３のレーンは、１が非加熱、２が６０℃１０分、３が７０℃１０分である。
【図１】
0004616660.tif 000028
【図２】
0004616660.tif 000029
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004616660.tif 000034