(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロ孔通路によって相互連結されたマクロ孔を規定する複数のポリマー支柱を含んでなる、少なくとも50％の多孔率を有するマクロ多孔性ポリマースカフォードであって、前記複数のポリマー支柱がその支柱を貫通するミクロ孔通路を有することにより、ある一つのポリマー支柱の両側にあるマクロ孔がそのポリマー支柱を通って連絡するようになっており、前記マクロ孔の平均直径が0.5〜3.5mmの範囲であり、マクロ孔を連結している前記マクロ孔通路の平均直径が200μm〜2mmの範囲であり、前記ミクロ孔通路の平均直径が200μm未満である、前記マクロ多孔性ポリマースカフォード。
【請求項２】
マクロ孔を規定する前記ポリマー支柱の厚さが0.4mm未満である、請求項１に記載のポリマースカフォード。
【請求項３】
生体適合性である、請求項１または２に記載のポリマースカフォード。
【請求項４】
生分解性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマースカフォード。
【請求項５】
ポリマーがポリ（ラクチド-コ-グリコリド）である、請求項３に記載のポリマースカフォード。
【請求項６】
ポリマーが、ラクチド75%およびグリコリド25%の割合のポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含む、請求項５に記載のポリマースカフォード。
【請求項７】
多孔率が少なくとも85%である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマースカフォード。
【請求項８】
マクロ多孔性ポリマースカフォードを製造する方法であって、
ポリマーをポリマー溶剤に溶解することによって液体ポリマーを形成する工程；
前記液体ポリマーと粒子を混合して液体ポリマーと粒子の混合物を形成する工程；
前記混合物を0℃未満の温度に冷却する工程；
前記混合物を前記液体ポリマーのための溶剤以外の溶剤に浸漬して前記液体ポリマーを沈殿させることにより、固化混合物を得る工程；および
前記固化混合物を、前記粒子を溶解する溶媒に、前記粒子を溶解させるのに十分な時間にわたり浸漬してマクロ多孔性ポリマースカフォードを得る工程
を含んでなる、前記方法。
【請求項９】
ポリマー溶剤がジメチルスルホキシドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
粒子の直径が0.5〜3.5mmの範囲である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子の平均直径が1.0〜2.0mmの範囲である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子が、多糖類、有機塩、無機塩、タンパク質、脂質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記多糖類がグルコースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記粒子が糖粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマースカフォードの表面を改質する工程を更に含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマースカフォードの表面を、酸処理、塩基処理、コラーゲン沈着およびリン酸カルシウム沈着からなる群より選択される処理を用いて改質する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記液体ポリマーが、ポリマーをその融点まで加熱してそのポリマーを液化することによって形成されたものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
液体ポリマーのための溶剤以外の前記溶剤が、水、アルコール、1,4-ジオキサンおよびアニリンからなる群より選択される、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記液体ポリマーがポリ（ラクチド-コ-グリコリド）から誘導される、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
液体ポリマーと粒子を混合して液体ポリマーと粒子の混合物を形成し、前記混合物を0℃未満の温度に冷却し、前記混合物を前記液体ポリマーのための溶剤以外の溶剤に浸漬して前記液体ポリマーを沈殿させることにより固化混合物を得、そして前記固化混合物を、前記粒子を溶解する溶媒に、前記粒子を溶解させるのに十分な時間にわたり浸漬することによって形成された、マクロ孔通路によって相互連結されたマクロ孔を規定するミクロ多孔性ポリマー支柱を有するマクロ多孔性ポリマースカフォードであって、少なくとも50％の多孔率を有し、前記マクロ孔の平均直径が0.5〜3.5mmの範囲であり、マクロ孔を相互連結している前記マクロ孔通路の平均直径が200μm〜2mmの範囲であり、前記ミクロ多孔性ポリマー支柱がその支柱を貫通する50μmより大きく200μmより小さい平均直径を有するミクロ孔通路を有する、前記マクロ多孔性ポリマースカフォード。
【請求項２１】
小柱構造を有する三次元マクロ多孔性ポリマースカフォードにおいてスカフォードのマクロ孔の平均サイズの少なくとも2.5倍の深度まで浸透分布させる組織移植片の製造方法であって、
マクロ孔通路によって相互連結されたマクロ孔を規定する複数のポリマー支柱を含んでなる、少なくとも50％の多孔率を有するマクロ多孔性ポリマースカフォードであって、前記複数のポリマー支柱がその支柱を貫通するミクロ孔通路を有することにより、ある一つのポリマー支柱の両側にあるマクロ孔がそのポリマー支柱を通って連絡するようになっており、前記マクロ孔の平均直径が0.5〜3.5mmの範囲であり、マクロ孔を連結している前記マクロ孔通路の平均直径が200μm〜2mmの範囲であり、前記ミクロ孔通路の平均直径が200μm未満である、前記マクロ多孔性ポリマースカフォードを提供する工程；
前記ポリマースカフォードに組織細胞を播種する工程；および
前記組織細胞を培養することにより組織移植片を製造する工程
を含んでなる前記方法。
【請求項２２】
前記マクロ多孔性ポリマースカフォードが生体適合性であり、かつ少なくとも85％の多孔率を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリマースカフォードへの播種に先立ち、ポリマースカフォードの表面を改質する工程を更に含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
ポリマースカフォードの表面を、酸処理、塩基処理、コラーゲン沈着およびリン酸カルシウム沈着からなる群より選択される処理を用いて改質する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織細胞が骨形成原細胞である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織細胞が骨基質を産生するものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織細胞がヒト起源である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織細胞が、歯根膜組織細胞、軟骨組織細胞、歯組織細胞、肝組織細胞および胸部組織細胞からなる群より選択される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞がin vitroおよびin vivo適用のために維持される、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は組織工学用の生分解性ポリマースカフォード（scaffold）の使用に関する。さらに詳しくは、本発明はマクロ孔(macropores)間に高レベルの相互連結性を有する新規なマクロ多孔性ポリマースカフォードに関する。
【０００２】
（発明の背景）
損傷、遺伝的奇形および疾病に対する骨治療にはしばしば移植片の移植が必要とされる。自己移植片および同種移植片が最も安全な移植片であることはよく知られているが、供給が限られ、また病気の伝染およびこれらの移植片に対して生じる拒絶反応のため、合成生体適合材料もまた移植片として広く使用されている。in vivoにおいては、機械的不適合（ストレスシールディング）や磨耗くずの発生が移植片周囲の骨萎縮、骨粗鬆症または骨溶解をもたらすので、これらの生体適合材料には問題が認められるものがある(Wooら, 1976; Terjesenら, 1988)。
【０００３】
近年、組織工学(TE)と定義される新しい試みに多大な関心が寄せられている。組織工学には、機能的な組織同等物を得るための、生体組織と特異的相互作用が可能な新世代の生体適合材料の開発が含まれる。基礎をなす概念は、患者から細胞を単離し、細胞培養で増やし、特殊な生体適合材料から製造されたスカフォードに播種して「TE構築物」と呼ばれるスカフォード／生体複合体を形成できるというものである。この構築物は次いで同患者に移植され、置換組織として機能し得る。かかる系のいくつかは、供与臓器の入手の可能性が限られている場合、あるいはある場合（例えば若年の患者）において天然の置換物が十分得られない場合の臓器組織置換に有用である。このスカフォード自体は増殖因子、遺伝子および薬剤に由来する生物学的に活性な成分の送達体として機能し得る。この外科手術への革命的なアプローチは患者の安寧およびヘルスケアシステムの進歩の双方に対して有益な広い用途を有する。
【０００４】
骨組織の増殖への組織工学の適用は骨形成原幹細胞を取得し、それらを播種し、in vitroでそれらを増殖させて新たな組織を形成させることを含む。新たに得られたこの組織は次いで自己移植片として使用できる。生分解性ポリエステル類、特にポリ（ラクチド-コ-グリコシド）は、数種の異なる細胞集団、例えば軟骨細胞（Freedら, J. of Biomed. Mater. Res. 27:11-13, 1993によって記載されたものなど）、肝細胞（Mooneyら, Journal of Biomedical Mat. Res. 29, 959-965, 1995によって記載されたものなど）および最も最近では骨髄由来細胞（Ishaugら, J. Biomed. Mat. Res. 36:17-28, 1997およびHolyら, Cells and Materials, 7, 223-234, 1997によって記載されたものなど）の組織工学用のスカフォードとして使用されてきた。具体的には、多孔構造のこれらポリエステル類が製造され、細胞が播種されたが、骨髄由来細胞をこれらの多孔構造上で培養した場合、骨の内植は三次元ポリマースカフォードの外縁でしか起こらなかった(Ishaugら, 前記；Holyら, 前記)。従ってこれらの場合において製造されたポリマースカフォードは、組織を移植にまたは自己移植片としての使用に適したものとするのに必要な細胞増殖を可能にするには不十分であった。
【０００５】
（発明の概要）
今般、小柱骨(travecular bone)に見られるような相互連結を有するミリメートルサイズのマクロ孔を特徴とするポリマースカフォードは、三次元組織の発達に重要である細胞の内植を可能とするので、組織工学に特に有用であることがわかった。かかるポリマースカフォードは相転移と粒子浸出の技術を組み合わせた新規な方法を用いて製造できる。
【０００６】
従って本発明の１つの態様では、大きさが0.5mm〜3.5mmの範囲であり、かつ、ヒト小柱骨で見られるものと同様の相互連結した多孔性を有するマクロ孔を含んでなるポリマースカフォードが提供される。
【０００７】
本発明のもう１つの態様では、液体ポリマーと粒子を配合して粒子-ポリマー混合物を形成する工程；
上記粒子-ポリマー混合物を非溶剤ポリマーに浸漬して粒子-ポリマー固化混合物を得る工程；および
上記粒子-ポリマー固化混合物を、粒子を溶解させるに十分な時間、粒子溶媒に浸漬する工程を含んでなるポリマースカフォードの製造方法が提供される。
【０００８】
本発明のもう１つの態様では、三次元ポリマースカフォードにおいてスカフォードのマクロ孔の平均サイズの少なくとも2.5倍の深度まで浸透分布させる組織増殖法であって、
約0.5〜約3.5mmの範囲の大きさのマクロ孔を含んでなり、そのマクロ孔を相互連結するマクロ孔通路およびミクロ孔通路を含むポリマースカフォードに組織細胞を播種する工程、および
上記細胞を培養する工程を含んでなる上記方法が提供される。
【０００９】
本発明のもう１つの態様では、多孔率が少なくとも50%であり、直径が約0.5〜約3.5mmの範囲のマクロ孔を含み、かつ、そのマクロ孔間に相互連結を含むマクロ多孔性ポリマースカフォードを含んでなる生体適合性ポリマー小柱(trabeculae)が提供される。
【００１０】
本発明のもう１つの態様では、三次元ポリマー小柱においてスカフォードのマクロ孔の平均サイズの少なくとも2.5倍の深度まで浸透分布させる組織増殖法であって、
多孔率が少なくとも50%であり、直径が約0.5〜約3.5mmの範囲の大きさのマクロ孔を含んでなり、そのマクロ孔間にマクロ孔相互連結およびミクロ孔相互連結を含むマクロ多孔性ポリマースカフォードを含んでなる生体適合性ポリマー小柱を合成する工程；
上記ポリマースカフォードに組織細胞を播種する工程；および
上記細胞を培養する工程
を含んでなる上記方法が提供される。
【００１１】
本発明のもう１つの態様では、相互連結マクロ孔を含み、その少なくとも50%が0.5〜3.5mmの範囲の直径を有するものであるマクロ多孔性ポリマースカフォードに組織細胞を播種する工程、およびその細胞を培養する工程を含んでなる三次元組織増殖法が提供される。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
図1は、マクロ多孔相互連結により互いに相互連結された2つのマクロ孔を示すポリマースカフォードの一部分を示す略図である。この2つのマクロ孔通路はミクロ孔通路(ミクロ孔ともいう)により周囲のマクロ孔とも連結されている。本発明により製造されたポリマースカフォードの説明中で使用される、これらおよび他のいくつかの用語を以下に定義する。
【００１３】
スカフォード：組織工学またはそれに関連する用途のための細胞担体として設計されたデバイス。このデバイスは細胞がコロニー形成する多孔性の形態を有することがが好ましい。発明者らの特定の場合においては、このスカフォードは開放孔(open pore)の形態を有する。
【００１４】
マクロ孔：ポリマー壁により規定されるポリマースカフォード中の空隙。典型的にはこのマクロ孔の直径は0.5〜3.5mmである。
【００１５】
孔壁：マクロ孔の輪郭を形成するポリマー支柱。このポリマー支柱が、同じ束内でミクロ孔相互連結が支柱を互いに分離している異方性の束を形成する時、孔壁の構造は「層板」と定義される。この支柱が等方性であるが束は形成せず、主としてマクロ孔相互連結により互いに遠く分離されている場合、この孔壁は「支柱様」と定義される。切片標本にした場合、層板および支柱様孔壁構造は双方ともナノ孔を呈する。
【００１６】
ミクロ孔相互連結(ミクロ孔またはミクロ多孔性通路とも称される)：層板孔壁に見出される空隙。ポリマーの各支柱または層板は、ミクロ孔と呼ばれる、長く伸びた平行な孔構造により互いに分離されている。これらの孔の大きさは200μm以下である。ミクロ孔はスカフォードの全体的な相互連結に寄与する。
【００１７】
マクロ孔相互連結：孔壁の層板アレイ間またはポリマー支柱間の通路。それらは主としてマクロ孔の相互連結に寄与し、大きさは200μmおよび2mmの間である。
【００１８】
ナノ孔：塊状のポリマー中に見られる空隙。孔壁支柱または孔壁層板構造の何れかに由来する塊状ポリマー材料の断面には、塊状ポリマー材料全体を貫通するか、または貫通していない円形の凹部が認められる。これらのナノ孔は、塊状ポリマー中に捕獲された非溶剤物質(non-solvent)由来のものであるか、または塊状ポリマーの自己触媒的分解の結果生ずるものであろう。ナノ孔はスカフォードの壁に分布する。ナノ孔が塊状材料全体を貫通する場合、それらはマクロ孔の全体的な相互連結のみに寄与する。
【００１９】
相互連結：マクロ孔を互いに連結する流路。この相互連結は、マクロ孔相互連結(通路)、ミクロ孔相互連結(通路)、および上記で定義された塊状材料全体を貫通するナノ孔を含む。
【００２０】
本発明は、マクロ孔および相互連結を含んでなるマクロ多孔性ポリマースカフォードを提供する。マクロ孔の直径の範囲は0.5〜3.5mmで、小柱骨中に認められる相互連結を有する。本明細書において開示されたこのポリマースカフォード(発泡体構造とも呼ばれる)の形態は、小柱骨の形態に基く。
【００２１】
小柱骨は、骨の中では代謝学的に最も活性の高い部位であることが示されている(Rodan GA, Bone 13, S3-S6 1992に記載)。小柱骨特有の開放孔形状は骨の形成および吸収に有利に作用し、このため骨組織工学に関連してかなり注目されている：実際、骨組織工学のための理想的なスカフォードの設計により、迅速な骨形成および吸収も可能になるべきである。このように、本明細書に開示された新規のポリマースカフォード構造を創生する際に小柱骨の形態がモデルとされている。
【００２２】
骨の小柱の構造は、その骨の解剖学的部位に依存し、より小さい程度で患者の年齢に依存する。
【００２３】
Martin RB(CRC Critical Reviews in Biomedical Engineering, 10(3), 179-222, 1984)は、小柱骨を「遮断壁および支柱の複雑な構造」と記載している。小柱の間にみられる空隙は「骨髄腔」と呼ばれる。小柱の方向は不規則である；しかしながら、小柱の形状の全体的な構成は、時に明らかであり、骨に作用している力に従う。小柱が所与の方向に従う部位は異方性であるのに対して、小柱が無作為に配置している部位は等方性である(図2参照)。
【００２４】
WhitehouseおよびDyson(前記)ならびにMartin(前記)は、大腿骨中の小柱骨の多孔率について詳細に記載した。WhitehouseおよびDysonが大腿骨のすべての部位に対して測定した種々の多孔率および小柱幅を表1.1に示す。
【００２５】
【表１】
0004636684.tif 000002
【００２６】
小柱骨の構造は、小柱幅、多孔率、異方性、ならびに連結性および星状体の容積などの一般的なパターンにより調べられている。公表された小柱骨の光学および走査電子顕微鏡写真は、1〜数mmの大きさの小柱(すなわち孔)により骨髄孔の輪郭が形成され、約0.3〜1mmの範囲の孔により相互連結されていることを示す。
【００２７】
本発明のポリマーにより製造された小柱を生理学的用途に用いる場合、ポリマースカフォードは生体適合性ポリマーのいずれかから製造するのが好ましい。本明細書において「生体適合性」とは、細胞に対して毒性を示さず、それらの上に細胞がコロニーを形成できるポリマーを包含することを意味する。好適なポリマーには、ポリ(ラクチド)、種々の比率のポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、ポリスチレン、ポリ(グリコリド)、ポリ(アクリレート)類、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(カーボネート)、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、ポリ(アンヒドリド)、ポリ(エチレン)、ポリ(プロピレン)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、ポリ(ヒドロキシ吉草酸)、ポリ(ウレタン)類、ポリ(エーテル ウレタン)、ポリ(エステルウレタン)、ポリ(アリレート)、ポリ(イミド)、ポリ(アンヒドリド−コ−イミド)、ポリ(アミノ酸)およびポリ(ホスファゼン)が含まれる。ポリ乳酸のような生分解性で脂肪族のポリエステル、およびそれらから誘導されたポリマーは、既にヒトにおける臨床学的使用が承認されているために、本発明のスカフォードの細胞移植に関連する用途において特に有用なポリマーのクラスである。これに関しては、スカフォードとしての使用にはPLGA、特にPLGA 85:15およびPLGA 75:25のような50%以上のポリ(DL−ラクチド)を含んでなる混合物が好ましい。
【００２８】
本発明のスカフォードに好適な用途はポリマー組成および構造により変化するであろう。例えば、生分解性のポリマースカフォードはin vitroおよび／またはin vivo細胞移植のいずれかにおける使用に対して好適である。次いでマトリックス(matrices)は、in vivoにおける移植に先立ちin vitroで細胞を増殖させるための支持体またはスカフォードとして役立ち得る。スカフォードはまた、細胞を前もって播種せずに直接、in vivoで直接使用し得る。双方の用途において(前もって細胞を播種するか否かにかかわらず)、本発明の生分解性ポリマーマトリックスは三次元の組織増殖に対して特に有用であり、骨、軟骨、歯根膜組織、ならびに歯組織および肝臓または胸部組織のような他の臓器の結合組織の増殖に利用し得る。
【００２９】
本発明のポリマースカフォードの重要な特性は、ヒト小柱骨に認められる代表的な範囲である直径0.5〜3.5mmの範囲のマクロ孔が少なくとも50%存在することである。このマクロ孔は少なくとも直径1.0mmであることが好ましく、最も好ましくは約1.0mm〜3.5mmの直径を有する。
【００３０】
そのマクロ孔の構造に加え、スカフォードは、細胞のスカフォードへの浸透および細胞への栄養の供給の双方を促進する高レベルの相互連結も特徴とする。少なくとも0.35mmのマクロ孔相互連結により、ポリマースカフォード中に「開放セル(open cell)」の環境が提供され、それはスカフォードを通しての組織増殖の促進、すなわち三次元の組織増殖のために重要である。
【００３１】
マクロ孔は、層板構造を有するまたは持たない多孔性ポリマー壁により規定される。孔壁の全体の厚さは約0.4mm未満で、好ましくは約0.3mm未満である。孔壁中の相互連結性の程度は他の因子、加工温度に依存する。
【００３２】
驚くべきかつ予期しなかった結果として、各マクロ孔は、マクロ孔−およびミクロ孔相互連結の双方を介して、かなりの数の隣接マクロ孔と連絡していることが挙げられる。
【００３３】
本明細書には、この新規な相転移粒子浸出工程を用いて、種々の加工温度で得られた種々の孔壁構造を有するスカフォードが記載される。
【００３４】
Northern Eclipse画像解析ソフトを用いて評価すると、ポリマースカフォードの多孔率は得られたすべてのスカフォードに対して少なくとも50%のレベルであり、50%以上のレベルが好ましい。本発明のポリマースカフォードの多孔率のレベルは、それらの「開放セル」という特性に寄与し、結果として本発明のスカフォードの高度に相互連結した性質を規定するマクロ孔間の重要な重なり(マクロ孔通路を生ぜしめる)が生じ、さらに細胞増殖のためのスカフォードとしての有用性を高める。これに関して、多孔率のレベルは約75%以上が好ましく、一方最も好ましい多孔率のレベルは約85%以上である。
【００３５】
本発明のスカフォードの相互連結したマクロ孔の網目を通して細胞が三次元的にコロニー化できる生体適合性のスカフォードを提供するので、本発明のスカフォードの特色により、該スカフォードは組織工学およびより注目すべきは細胞移植における使用に対し特に好適になる。このことは、組織、特に骨組織のような新生脈管形成を必要とする組織を生ぜしめる任意の細胞の移植を考慮する際に重要である。さらに、細胞移植に使用する際には、このスカフォードは生分解性であり、スカフォードの分解と同時に細胞が増殖するよう分解を制御できる。
【００３６】
細胞増殖のスカフォードとしての使用のための特性をさらに促進する目的で本発明のポリマースカフォードが改質されてよいことは、当業者により理解されよう。細胞増殖のための支持体として使用される構造に典型的に行われる改質も、本発明のポリマースカフォードを修飾するために好適であろう。かかる改質は生物学的反応を促進させるためになされ、例えば、コラーゲン、リン酸カルシウム、プロテオグリカン、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類による表面修飾、または酸／塩基処理を含む。これに加え、細胞機能を促進するタンパク質、増殖因子等の活性分子送達のための貯蔵部としてポリマースカフォードを供してよい。
【００３７】
本発明のポリマースカフォードは、粒子濾過法と相転移法を組み合わせた新規の工程により製造できる。最初の工程では、選択されたポリマースカフォードを液体ポリマーとして調製する。本明細書において液体ポリマーとは、単独または他の液体と混合した液体形態のポリマーを表す。これは、ポリマー溶液を形成するためにポリマーを溶剤中で混合することにより作られてよい。ジメチルスルホキシド(DMSO)、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン、ベンゼン、2-ブタノン、四塩化炭素、クロロホルム、n-へプタン、n-ヘキサンおよびn-ペンタンを含む、ポリマー溶液の調製に有用な、一般的な何れの溶剤を用いてもよい。当業者であれば認識するであろうが、細胞増殖に対し有害に作用しないようにDMSOのような非細胞障害性溶剤を溶液の調製に用いるのが好ましい。液体ポリマー中のポリマー濃度は、スカフォードの作製に用いられるポリマーの特徴により変わる。あるいは、融点まで加熱することによりポリマーを液体ポリマーにできる。
【００３８】
次いで、粒子濾過相の工程と関連させて、液体ポリマーを適切なサイズの粒子と混合する。ポリマースカフォード中のマクロ孔の所望の直径に相当する直径を有する粒子が好適であり、特に直径が0.5〜3.5mmの範囲の粒子が好適である。粒子の直径は1.0mm以上がより好ましく、また粒子の直径は1.0〜2.0mmが最も好ましい。ポリマーと混合するための好適な粒子の例には、ポリマーのための溶剤以外の溶剤(すなわち非溶剤ポリマー：polymer non-solvent)に溶解できる、適切な大きさの多糖類(グルコースのような)、有機および無機塩、タンパク質および脂質が含まれる。さらに、ポリマー溶液と混合する粒子の量は、本発明のスカフォードの作製に使用するポリマーの特徴により変化する。
【００３９】
粒子ポリマー混合物を形成するために、粒子を液体ポリマーと十分に混合した後、このポリマーを液体から固体に変換する相転移工程に供する。この工程では、粒子ポリマー混合物をポリマーが溶解しない溶剤である非溶剤ポリマーに浸漬する。かかる非溶剤ポリマーには、例えば水、アルコール、1-4ジオキサンおよびアニリンが含まれる。
【００４０】
特定の形の固体ポリマースカフォードを得るため、相転移工程の間にポリマー混合物を鋳型中に入れることができる。例えば、ポリマー粒子のスラリーを凍結させることにより、粒子の周囲の液体ポリマーを安定化させることが好ましい。それにより、鋳型を使用せずに、すべての外表面から同時に相転移工程が起こる。例えばポリマーの溶剤がDMSOの場合、DMSOの氷点である12℃かまたはそれ未満の温度にポリマー混合物を冷却する。0℃未満のような、より低い温度も使用できる。工程中のこの段階で低温度(例えば-20℃または-80℃)にすれば、次いで厚い皮膚構造のような種々の形態の(実施例4参照)ポリマースカフォードが形成されるが、これは実施例1で記載したように三次元細胞増殖にスカフォードを使用する前に除去してよい。冷却に加え、例えばゲル化(増粘)のような、ポリマー-粒子混合物を安定化させる他の方法も使用してよい。
【００４１】
ポリマー混合物を液体から固体相に変換した後に、このポリマーを粒子濾過する。この工程では、ポリマーを粒子溶剤、すなわちポリマー中に分散している粒子を溶解させるがポリマー自体は溶解させない機能を有する溶剤中に浸漬する。適切な粒子溶剤は、もちろん粒子およびポリマーの性質に依存する。適切な粒子溶剤の例としては、水、アルコール、1-4ジオキサンおよびアニリンが挙げられる。粒子溶剤の温度は、得られるポリマースカフォードに対する影響を最小限にするために変更できる。しかしながら、非溶剤温度の作用下でポリマーが融解したり粘性が増加しないように、一般にその温度は粒子溶剤の氷点とポリマーのガラス転移温度の間である。一例として、粒子溶剤が水でポリマーがPLGA 75:25の場合、約0℃〜45℃の間の粒子溶剤温度を適用する。
【００４２】
ポリマースカフォード中に分散した粒子を完全に溶解させるために適切な時間、ポリマーを粒子溶剤に浸漬する。一般に、ポリマースカフォード中の粒子を完全に溶解させるためには少なくとも24時間が必要であるが、少なくとも48時間が好ましい。粒子の能率的な溶解を促進するためには、例えば約8〜9時間間隔または循環溶剤槽を用いて、溶解中に新しい溶剤にポリマーを頻繁に浸漬することが望ましい。
【００４３】
相転移および粒子−濾過工程は、非溶剤ポリマーであると同時に粒子溶剤である溶剤を用いて一工程で行ってよい。一例として再蒸留水(ddH2O)を使用する。
【００４４】
適切な粒子溶解期間の後にポリマースカフォードを粒子溶剤から除去し、使用前に真空乾燥またはアルコール中での殺菌(70%エタノール等)の何れかを行い、それに次ぐ使用のために洗浄および培養液中での調整を行える。ポリマースカフォードをすぐに使用しない場合は、水分の保持および起こり得るポリマーの分解を防ぐために、デシケーター中に乾燥させて保存するのが望ましい。
【００４５】
本発明の工程は、独特の特徴を有するポリマースカフォードを有利に産生し、特に相互連結したマクロ多孔性ネットワークを有するポリマースカフォードを産生する。本発明の2段階工程のもう１つの重要な利点は、得られるポリマースカフォードの形態制御のための増幅法の提供である。言い換えれば、本工程はポリマースカフォードの形態に作用する２つの水準、粒子濾過および相転移を提供する。例えば粒子濾過および相転移段階の双方の工程中でマクロ孔径および分布を変えることができ、粒子サイズおよび分布により支配されるが、スカフォード加工温度にはあまり影響されない。これに加え、相転移速度を変化させることにより相互連結の形成およびサイズが影響され得る。温度、非溶剤ポリマーのタイプおよびポリマー濃度を含む多くの可変量を変化させることにより、相転移の速度を変えられる。このようにして最終的なスカフォードの形態を制御できる。この結果得られる形態はヒトの小柱骨に似ていることが好ましい。
【００４６】
本発明のもう１つの態様では、本明細書に記載されたポリマースカフォードを用いて培養細胞を三次元増殖させる方法を提供する。本発明のポリマースカフォードの、新規な相互連結マクロ多孔性構造は、特に組織工学、および現在利用可能な骨修復療法に代わる注目すべき骨組織工学に対して好適である。これに関連して、ポリマースカフォードへの骨髄由来細胞の播種は、当業者に十分公知の従来の方法を用いて行った(Maniatopoulos et al., Cell Tissue Res 254, 317-330,1988に記載)。細胞をポリマースカフォード上に播種し、好適な増殖条件下で培養する。それらの増殖を確立するために適当な培地をこの培養液に加える。
【００４７】
上記で説明したように、本発明のポリマースカフォードを通して種々のタイプの細胞が増殖できる。しかしながら、本発明のポリマースカフォードは特に骨形成原細胞、とりわけ合成骨基質細胞の増殖に適している。組織工学のためには、細胞はどのような由来であってもよい。ヒト由来の細胞が有利である。本発明の三次元ポリマースカフォード中で細胞を増殖させる方法によれば、例えば播種した骨形成原細胞をポリマースカフォードに浸透させて骨基質を合成させ、in vitro段階では、ポリマースカフォードの構造中で特に平均のマクロ孔サイズの少なくとも2.5倍の深さまで一面に広がって分布する。骨形成原細胞の浸透およびその結果としての骨基質合成は、機械的、超音波、電場または電子的な方法により促進できる。
【００４８】
【実施例】
以下、具体的な実施例により本発明の実施形態を説明するが、これは単に例示のためであり限定されるものではない。
【００４９】
実施例1−PLGA 75:25のポリマースカフォードの製造
本発明のPLGA 75:25のポリマースカフォードを、固有粘度0.87dL/gであるPLGA 75:25(Birmingham Polymer Incから入手)を用いて製造した。DMSO中0.1g/mlのPLGA 75:25 1mlを2gのグルコース結晶(粒子径の範囲0.8mm〜2mm)と、アルミニウム鋳型中で混合した。このPLGA 75:25-DMSO混合物を−20℃に冷却した。PLGA 75:25-DMSO混合物のこの温度をTmixと表す。次いで凍結したPLGA 75:25ブロックを、ポリマーにとって非溶剤であるddH2Oの0℃の氷−水スラリー中に浸漬する。水のこの温度をTnonsolventと表す。このブロックをddH2O中に48時間保持し、その間ddH2Oは約8時間毎に取り替えた。次いで得られたスカフォードを水から取り出し、0.01mmHgで72時間真空乾燥させ、使用まで真空デシケーター中で4℃にて保存した。次いで前記の条件を用いて得られたスカフォードを詳細に分析した。
【００５０】
図3Aに示したように、解剖顕微鏡を用いて、低倍率(16倍)で、2mm厚のポリマースカフォードの切片のマクロ多孔構造を観察した。ポリマースカフォードを通して約0.8〜1.5mmのサイズ範囲の相互連結マクロ孔の一様な分布が認められた。このマクロ孔は楕円形で、ミクロ孔を含む厚い孔壁(厚さ約300μm)を呈した。
【００５１】
次いでこのポリマースカフォードをTissue-Tek包埋培地(Miles#4583)に包埋し、-20℃にてクリオスタット中で切片標本を作製した。一連の20μm厚さの切片標本(50切片)をスライドガラス上に回収した(VWR Canlab)。解剖顕微鏡を用いて低倍率(16倍)にて切片の写真を撮影し、走査した。図3Bは、スカフォードの孔組成、マクロ孔、マクロ孔相互連結(孔路)およびミクロ孔相互連結(孔路)を同定する、走査スカフォードの切片である。ポリマーの薄膜(すなわち皮膚層)が、ポリマースカフォードの外表に観察された。この画像をTIFFファイルに変換してNorthern Eclipse画像解析ソフトを用いてPCコンピューターにより解析した。各走査切片に対して孔壁サイズ(面積、周囲長、直径等)を測定するために「単回測定」メニューを使用した。「データ測定」の常法により、走査したスライドあたりの面積および孔壁の支柱数を計算した。
【００５２】
ピクセル／mm比を決定するために前記のスキャン画像の倍率を用いてシステムを較正することにより、これらの測定値をピクセル単位からミリメートルに変換した。ポリマースカフォードの切片標本のデジタル画像上でソフトウエアツールを用いて、１つの孔壁から隣接する孔壁まで手動で線を描くことによりマクロ孔サイズを測定した。Northern Eclipse画像解析ソフトを用いて測定したポリマースカフォードの特徴を以下に示す。
【００５３】
マクロ孔サイズ           1.79 +/−0.42mm
マクロ孔相互連結       0.37+/−0.15mm
孔壁の厚さ               0.29+/−0.13mm
ミクロ孔               0.10+/-0.05mm
多孔度                   86.7+/-2.43%
【００５４】
また、水銀多孔度計(Quantachrome Autoscan 60)によってポリマー基質の多孔度も評価した。0.015〜0.020gの範囲のサンプルに対し5cm3の気泡軸容量を有する固体硬度計を使用した。水銀侵入容量をもとに隙間容量の値を算定した。水銀侵入容量をもとに多孔度は89.6%であると算定された。Northern Eclipse画像解析ソフトウエアを用いて評価された多孔度(〜87%)は、水銀多孔度計によって測定された〜90%というものと実質的に同等である（ただし、孔の直径が〜75μmより大きいポリマースカフォードを解析する場合には水銀多孔度法は正確ではない）。
【００５５】
また、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いる解析用にもポリマースカフォードを製造した。スカフォードを約2mmの厚さに横に切断し、アルゴン雰囲気下で金でスパッター被覆した（Polaron Instrument Inc., Doylestown, PA)。走査型電子顕微鏡はHitachi 2500 SEMを15kV加速電圧で使用した。SEM顕微鏡写真を用いてマクロ孔の直径が約1〜1.5mmであると確認されたが、各マクロ孔間には明確な分離は通常観察されず、これらのポリマースカフォードの非常に広がった相互連結構造を示した。
【００５６】
光学顕微鏡下で観察され、図3Cに示される孔壁のミクロ孔性をSEMによって確認した。
【００５７】
ポリマースカフォードを以下のように機械的に試験した。直径および高さが1.5cmの円柱の形のポリマースカフォードを製造しInstron Mechanical testerを用いて試験した。一軸性サーボ油圧試験機(2150シリーズのコントローラーを備えたInstron Model 1331 load frame)で機械的実験を行った。いずれの圧縮試験にも1kgのロードセル(Sensotec, Model 31/4680)を使用した。DC直線可変(linearly variable)差動変圧器(LVDT,intertechnology Model SE 374)によって作動器のたわみを測定した。試験を行う間、ロードセルおよびLVDTからの信号をデジタル型記憶装置オシロスコープ(Gould, Model 1425)に表示した。また、信号を加速型Apple lieコンピューターの16チャンネル、12ビットのアナログ-デジタル(A/D)変換器にインプットした。これらの実験に関するデータ獲得速度は1秒当たり430対のデータ点であった。ポリマースカフォードの圧縮は0.1mm/秒の速度で起こった。図4Aに示されるように、ポリマースカフォードのひずみパーセントに対する圧縮力のプロットにより2個の係数が示された。第１の弾性領域に対するヤング率(Y1と呼ばれる）は0.76±0.12MPaであり、第２の弾性領域に対するものは（Y2と呼ばれる）0.18±0.016MPaであった。
【００５８】
実施例2-ポリマースカフォード構造に対するポリマー濃度の作用
得られるポリマースカフォードの構造に対するDMSO中でのPLGA75:25濃度の作用を実施例１に詳細に概説されたプロトコールを用いて測定した。他のいずれの条件も実施例1に記載のように一定に維持しながら、DMSO中のPLGA75:25の3種の異なる濃度(0.05g/ml、0.1g/mlおよび0.2g/ml)を用いてポリマー基質を作製した。
【００５９】
かみそり刃を用いて製造した各ポリマースカフォードを半分に切断した。DMSO中のPLGA75:25の開始濃度にかかわらず、それぞれに皮層構造が見られた。3種の異なるポリマースカフォードの機械的特性を評価し図4Bに例示した。0.05mg/mlのDMSO中のPLGAを用いて製造されたポリマースカフォードでヤング率の有意な減少が観察され、他方2mg/mlのPLGA75:25濃度を用いて最も強固なスカフォードが得られた。
【００６０】
また、これらのスカフォードを光学顕微鏡およびSEM下で観察した。光学顕微鏡下では3種のポリマースカフォード間に構造中の差異は検出できなかった。しかしながら、SEM下で観察した場合には、DMSO中の0.05g/mlPLGAを用いて製造されたスカフォードはよりミクロ孔相互連結を有する、より多くの層状壁構造を示し(図5参照)、さらに、DMSO中の0.2g/mlのPLGAを用いて製造されたものではミクロ孔相互連結はほとんど見られなかった(図6参照)。
【００６１】
実施例3-ポリマースカフォード構造に対する粒子の作用
以下のように、PLGAポリマーと混合された種々の量および大きさ双方のグルコース粒子の、ポリマースカフォード構造に対する作用を測定した。種々の量のグルコース粒子(0.5g、1gおよび2g)を別々に1mlのポリマー溶液と混合し、他のいずれの条件も実施例１に記載のように一定に維持した。また、以下の篩分けした粒子:(標準試験篩、VWR、West Chester, PA)：1)NaCl結晶(<0.35mm)、2)スクロース結晶(0.54mm<結晶サイズ<0.8mm)および3)グルコース結晶(0.8mm<結晶サイズ<2mm)を用いて最終スカフォード形態に対する粒子の大きさの作用も評価した。光学顕微鏡によって、得られたポリマースカフォードを観察した。ポリマー溶液を粒子と混合した場合には、少量の粒子(すなわち0.5g/ml)ではポリマー溶液が粒子層中に十分には浸漬しないということが分かった。このポリマー溶液の層は、相転移の後、粒子が用いられない場合に見られるものと同様の膜構造となった。高い溶液密度の粒子(すなわち2.0g/ml)はポリマー溶液に完全に浸漬したので、得られたスカフォードはこの膜構造を有さずマクロ孔の分布を含んでいた。
【００６２】
マクロ孔の大きさは用いた粒子の大きさに正比例しており、例えば<0.35mmの粒子を用いた場合にはマクロ孔サイズが〜0.33mmであり（図7Aを参照)、また0.54〜0.8mmの範囲の粒子を用いた場合には〜0.75mmであった（図7Bを参照)。最後に、0.8mmより大きな粒子については、観察されたマクロ孔は〜1.4mmであった（図7Cを参照)。ポリマー-DMSO溶液に粒子を混合しなかった場合には、得られたポリマー構造は図８に例示されるようなミクロ孔を含有する厚い皮で構成される中空の円柱であった。この皮は正常な相転移過程から得られる膜構造に極めて似ていた。
【００６３】
実施例4-ポリマースカフォード構造に対する加工温度の作用
一定のTmix(0℃)で3種の異なるTmix(11℃、-20℃および-80℃)の作用を研究した。1)Tmix=11℃を用いて、および2)Tmix=-20℃およびTmix=-80℃を用いて2種の主要な異なるスカフォード構造を得た。Tmix=11℃およびTnonsolvent=0℃を用いて得られたスカフォードは皮がなく非常に開けた構造を示した。図9Aに示されるように、マクロ孔サイズは拡大したようであり、SEMによって〜2.72mmであると推定された。孔壁にはミクロ孔があまりなかったが、より多くのマクロ孔相互連結があり、これは通常、スカフォードにより開いた構造をもたらす。Tmix=-20℃および-80℃については、得られたスカフォードは双方とも皮構造を有していた。Tmix=-20℃についてはマクロ孔は高いTmixで得られたスカフォード上のものよりも小さいようでり、SEMによってそれらの大きさは〜1.8mmと推定された。孔壁は層状であり、マクロ孔相互連結はほとんどないがより多くのミクロ孔相互連結を有していた(図9Bを参照)。マクロ孔サイズは低いTmixで減少するということが観察された。マクロ孔サイズにおける差異はTmix=11℃およびTmix=-20℃で製造されたスカフォード間で特に重大であり、他方、Tmix=-20℃およびTmix=-80℃で製造されたスカフォード間ではマクロ孔サイズの小さな差異しか観察されなかった。Tmixでマクロ孔サイズが減少する一方で、孔壁構造もまた前記のように変化した。Tmixにおける差異はポリマー沈殿速度、ひいては孔壁構造の複雑性に影響を及ぼし得る。
【００６４】
また、一定の-20℃のTmixを用いて種々のTnonsolvent(40℃、20℃および0℃)を研究した。この場合には、全てのスカフォード間で主要な差異はそれらの孔壁の厚さであった。低いTnonsolventはより厚く、より複雑な孔壁をもたらし、他方、高いTnonsolventは各マクロ孔を描写するポリマー支柱に匹敵する薄い緻密な孔壁を製造した。図9Bおよび9Cは各々Tnonsolvent=0℃および40℃でのスカフォード構造の形態の差異を示す。ほとんどの構造上の差異はTnonsolvent=0℃およびTnonsolvent=20℃で製造されたスカフォード間で見られる。Tnonsolvent=20℃または40℃で得られたスカフォード間には差異はほとんど見られない。低いTnonsolvent(0℃)が層状孔壁をもたらすのに対し(図9Bを参照)、高いTnonsolvent(40℃)は支柱様孔壁形態をもたらす(図9Cを参照)。
【００６５】
SEMによって種々のTnonsolventで製造されたスカフォードの孔壁の厚さを推定した。Tnonsolvent=0℃では孔壁は0.29mm、他方、Tnonsolvent=20℃では孔壁の大きさは〜0.10mmと推定され、またTnonsolvent=20℃および40℃間では有意な差異は測定できなかった。前記の種々の温度で製造された全てのスカフォードを切断し、孔サイズおよび孔壁の厚さを測定した。また、Northen Eclipse image analysis softwareを用いてそれらの多孔率も推定した。以下の結果が得られた：
【表２】
0004636684.tif 000003
【００６６】
実施例5-ポリマースカフォードの表面改質
実施例1に記載のように得られたスカフォードを、酸/塩基処理;コラーゲン蒸着;リン酸カルシウム蒸着によってさらに表面改質させた。手順および結果は以下のとおりであった。：
【００６７】
酸/塩基処理は表面の荷電を増強し、また表面形態を変化させるよう開発した。スカフォードを数種の濃度(0.1M、1M、5M)の酢酸中に24時間維持した。また、スカフォードを種々の濃度のNaOH中に24時間維持して表面のポリマー鎖の加水分解を観察した。5Mの酢酸または0.1MのNaOHで24時間処理されたスカフォードはSEM下で微小孔の外観を有する表面形態に変化を示した。
【００６８】
コラーゲン蒸着実験はポリマー表面への細胞付着を増強するよう計画した。スカフォードを0.1%のコラーゲン中に1時間、5時間、8時間および24時間維持した。
【００６９】
リン酸カルシウム蒸着実験はスカフォード表面への細胞付着を増強するよう試験した。これらを十分な補足培地(実施例6に記載の)中に37℃で1週間維持した。フォン・コッサ染色によってスカフォード表面のリン酸カルシウム結晶を可視化した。
【００７０】
さらなるCaP蒸着実験を行った。この実験ではスカフォードを1.5mMのNa2HPO4中に室温で2時間浸漬し、さらに飽和Ca2+溶液中で一晩平衡化させた。次いで、スカフォードをSEM下で観察しところ、スカフォード構造上に葉状の形態を有する結晶が観察された（図10を参照)。
【００７１】
実施例6-ポリマースカフォード上での骨髄由来細胞の培養
前記のようにPLGA75:25ポリマースカフォードを製造した:2g/mlのグルコース結晶をジメチルスルホキシド(DMSO,BDH,Toronto,ON)中の0.1g/mlのPLGA75:25溶液中に分散させた。ポリマースラリーを11℃で凍結した。次いで、ポリマーを沈殿させ、40℃でddH2O中に沈殿したポリマーからグルコース結晶を抽出した。スカフォードを一定質量（constant mass）(10μm Hg,、72時間)まで乾燥させ、70%EtOH中で1/2時間殺菌し、α-MEMで3回リンスし、滅菌α-MEM中で37℃で6日間平衡化した。
【００７２】
他の文献(Maniatopoulosら、前記、およびDaviesら、Cells and Materials, 1:3-15,1991に記載のような)に詳細に記載されたプロトコールおよび培地を用いて、第1継代骨髄由来一次細胞を0.25cm3のスカフォード上に播種した。簡潔に言うと、若いおよび老いた雄のウィスターラット(約150g)の双方の大腿骨から骨髄由来細胞を十分な補足培地(FSM)：15%ウシ胎児血清、50mg/mLのアスコルビン酸、10mMのβ-グリセロリン酸および抗生物質(0.1mg/mLのペニシリンG、0.05mg/mLのゲンタマイシンおよび0.3mg/mLのフンジゾン)を添加したα-MEMに集め;Dex+培養のFSMにのみ10-8Mのデキサメタゾン(Dex)を加えた。
【００７３】
細胞を6日間培養し、2および5日目にFSMを再供給した。6日目にPBS中で0.01%トリプシンでDex-細胞をトリプシン処理し、他方、Dex+培養にはカルシウム沈着の徴候が見られ、PBS中で0.01%トリプシンおよび10μMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)でトリプシン処理した。次いで、Dex+およびDex-細胞を7.5×105細胞/スカフォードの濃度で別々の予め湿らしたスカフォード上に播種した。培養物を37℃および5%CO2に42日間維持し、FSMを2〜3日ごとに再供給した。Dex+細胞培養のFSMには各再供給に対し10-8Mの濃度でDexを加えた。
【００７４】
テトラサイクリンHCl粉末(Sigma, St. Louis, MO)をα-MEMに溶解させ90mg/mLの貯蔵溶液を調製した。新しいテトラサイクリンを含有する十分な補足培地(TFSM)（15%のウシ胎児血清、50mg/mLのアスコルビン酸、10mMのα-グリセロリン酸および9mg/mlのテトラサイクリンを含有するα-MEM）を調製した。TFSMを40日目の最終の再供給に用いた。42日目に培養物をα-MEM中で(10回、各〜3分)洗浄し、Karnovskyの固定剤(2.0%のパラホルムアルデヒド、2.5%のグルタルアルデヒドおよび0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.2〜7.4)中で一晩固定した。いくらかの培養物をSEM観察用に保存し、一連の段階付けしたアルコール溶液(70%、100%)中で脱水し、0.01mm Hgで2日間凍結乾燥した。他の全ての培養物は組織構造または共焦点観察のために0.1Mカコジル酸塩緩衝液中に保存した。
【００７５】
以下のように共焦点観察を行った。0.1Mカコジル酸塩緩衝液(BDHから得た)中のサンプルを特別注文のチャンバーに入れた。チャンバーをカバーグラスで密閉した。BHSフィルターを用いて、Bio-Rad MRC-600共焦点レーザー顕微鏡中で光学切断をすることによって蛍光シグナルを検出した。図11に示されるように、Dex(+)細胞を播種したスカフォードは約1mmの深度まで蛍光標識を示した。深い視野での共焦点顕微鏡は十分なものではないので、スカフォード内のさらに深くは蛍光を観察できなかった。従って、スカフォードを約2mmの厚さに切断して共焦点顕微鏡によって両側から分析した。全スカフォード中に蛍光を観察した。また、Dex(+)細胞を播種した細胞播種スカフォードの切片を用いても蛍光標識が見られた(図12参照)。UV光下でDex(-)およびDex(+)細胞を播種したポリマースカフォードの横断切片を観察した。全スカフォード中のうちDex(+)切片上にのみ鮮やかな蛍光シグナルが見られた。特に、蛍光シグナルによって観察されるように培養に使用したポリマースカフォードの0.5cmの深度全体で合成骨基質が可視化された。このアッセイにおける制限因子はポリマースカフォードの深度であり；従って、ポリマースカフォードの深度を増大すれば細胞浸透する深度が増大し、骨基質組成物がこのポリマースカフォード中に到達し得るであろう。
【００７６】
また、スカフォードをオステオカルシン用に免疫標識した。免疫組織化学法により、ヤギ抗ラットオステオカルシン抗血清(Biomedical Technologies Inc., Stoughton MA)を1:6000の最終希釈溶液で用いてDex+およびDex-培養の双方におけるオステオカルシン発現を評価した。1:250の濃度でセイヨウワサビペルオキシダーゼ抗血清と結合したロバ抗ヤギIgGでの第2抗体標識によってアッセイを終えた。ペルオキシダーゼ用の3,3-ジアミノベンジジン(DAB)基質キット(Vector laboratories, Burlingame CA)を塩化ニッケルを添加して使用して染色を展開した。図13はDex+細胞を播種し6週間培地中に維持した、オステオカルシン標識したスカフォードを示す。スカフォードの組織構造の切片を以下のように得た。サンプルをTissue Tek中に包埋し、垂直に6mmの厚さに切断した。また、組織構造切片を用いてスカフォード内の細胞増殖も観察した。LMによって低倍率で全スカフォード切片を可視化し得た。Dex+およびDex-培養の双方において、細胞適用範囲が全スカフォード構造中に見出された。外表面上ならびにスカフォードの中央にある、全てのマクロ孔に沿ってヘマトキシリンおよびエオシン染色が認められた。図14および15はDex+およびDex-培養された泡の低率の拡大図を示す。高率の拡大図で示されるように、Dex-培養で合成された基質の量はDex+培養よりも極めて豊富であった。Dex+培養では、孔壁を一列に並べ、孔壁に近接し並列した状態に基質を産生する数細胞層のみが見られたのに対し、他方、Dex-培養では全マクロ孔容量が基質で満たされていた。
【００７７】
実施例7-ポリマースカフォード上へのヒト髄細胞の播種
実施例1に記載のようにPLGA75:25基質を製造した。Parkerら(J. of Bone Min. Res., 12(1), S300:F298, 1997)によって詳細に記載されたプロトコールおよびデキサメタゾン(dex)含有培地を用いて、若い提供者からのヒト骨髄基質細胞を播種する前に、これらのスカフォードを70%エタノール中で30分間殺菌した。
実施例8:細胞侵入に対するマクロ孔サイズおよび相互結合度の作用
【００７８】
3種の異なるスカフォード形態を製造した：1)粒子浸出のみによって得られたスカフォードで、膜スカフォードと称され、先行技術の一部をなし、以下に簡単に論じられる図16A、16Bおよび16Cに示されているもの、2)実施例1に記載のような低処理温度を用いる粒子浸出相転移によって得られたスカフォードで、中間体スカフォードと称されるもの、3)実施例4に記載のような高処理温度を用いて粒子浸出相転移によって得られたスカフォードで、骨様スカフォードと称されるもの。これら3種の基本的な処理方法の各々によって、種々のマクロ孔サイズを有する3種のスカフォード構造を製造し、全部で9種の異なるスカフォード構造を得た。これらの9種の構造は図16A〜16Iに例示されている。
【００７９】
粒子浸出技術のみを用いて膜スカフォードを製造した(Mikosら,Biomaterials 14, 323-330, 1993に記載のように)（図16A、16Bおよび16Cに示される先行技術を参照）。簡潔に言うと、クロロホルム中のPLGA75/25(Birmingham Polymers)溶液を1)NaCl(大きさ<0.35mm)、2)スクロース結晶(0.54〜0.8mmの範囲の大きさ)または3)グルコース結晶(0.8〜2mmの範囲の大きさ)のいずれかで篩い分けた粒子上に投じた（cast over）。ポリマー構造を室温で放置してクロロホルムを蒸発させ、次いで粒子をddH2O中に溶解させた。
【００８０】
実施例1および4に記載のように、沈殿したポリマーから前記のような同様な種々の粒子を抽出することによって中間体および骨様スカフォードを製造した。-20℃のポリマー溶液温度および室温の非溶剤で中間体スカフォードを製造し、他方、11℃のポリマー溶液温度および室温の非溶剤で骨様スカフォードを製造した。得られたスカフォードを、細胞を播種する前に70%エタノール中で30分間殺菌した。
【００８１】
共焦点顕微鏡によってスカフォードの細胞のコロニー形成を確認し、実施例6に記載のオステオカルシン標識アッセイを用いてスカフォード構造中に細胞分化を確認した。以下の結果が観察された：
【表３】
0004636684.tif 000004
【００８２】
表2に報告したように、スカフォードの細胞のコロニー形成には0.35mmの最小相互連結サイズおよび0.7mmの最小マクロ孔サイズを必要とした。
【００８３】
この実施例では、1.1mmのマクロ孔サイズを有する膜スカフォードでは細胞はコロニー形成しなかったが、他方0.7mmのマクロ孔サイズを有する骨様スカフォードでは細胞は十分にコロニー形成した。結論として、本実施例は粒子浸出相転移技術によって得られたスカフォードは細胞のコロニー形成を全スカフォード形態中で可能にし、他方、従前に公開されたスカフォードでは細胞はそれらの表面の孔層内でのみコロニー形成したということを実証する。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態である前の記載が示され、本発明の原理を例示しているが、本発明は例示された特定の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、以下の請求項およびそれらに相当するものに包含される全ての実施形態により、定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
本発明の実施形態は、添付の図面およびコンピューターデジタル化顕微鏡写真によってさらに詳細に説明される。
【図１】  以下に定義される種々の成分を示すポリマー孔系の一部分を示した図である。
【図２】  等方性領域および異方性領域を示す大腿骨頸部の骨小柱の光学顕微鏡写真である(Tobin WJ, J. Bone Jt Surg 37A(1) 57-72, 1955の光学顕微鏡写真を改良したもの)。
【図３】  図3Aは、本発明のポリマー光学顕微鏡写真（視野幅＝1.8cm）である。
図3Bは、図3Aのポリマースカフォードの20μm切片の光学顕微鏡写真（視野幅＝3.5mm）である。
図3Cは、図3Aのポリマースカフォードの孔壁走査電子顕微鏡写真である。
【図４】  図4Aは、１秒あたり1%の変形率で圧縮試験を行った時のポリマースカフォードの応力／強度曲線を示すチャートである。
図4Bは、ポリマースカフォードの機械的特性に対するポリマー濃度の影響を示すチャートである。第１の弾性領域のヤング率をY1とし、第２の弾性領域のヤング率をY2とする。
【図５】  DMSO中0.05g/ml PLGA 75:25の濃度で調製したスカフォードの孔壁構造の走査電子顕微鏡写真である。
【図６】  DMSO中0.2g/ml PLGA 75:25の濃度で調製したスカフォードの孔壁構造の走査電子顕微鏡写真である。
【図７】  図7Aは、0.35mm未満の粒子を用いて得られたPLGA 75/25スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図7Bは、0.54〜0.8mmの範囲の粒子を用いて得られたPLGA 75/25スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図7Cは、0.8〜2.0mmの範囲の粒子を用いて得られたPLGA 75/25スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
【図８】  粒子の不在下で調製したPLGA 75/25膜の走査電子顕微鏡写真である。
【図９】  図9Aは、Tmix=11℃およびTnonsolvent=0℃で得られたPLGA 75/25フォームの走査電子顕微鏡写真である。
図9Bは、Tmix=-20℃およびTnonsolvent=0℃で得られたPLGA 75/25フォームの走査電子顕微鏡写真である。
図9Cは、Tmix=-20℃およびTnonsolvent=40℃で得られたPLGA 75/25フォームの走査電子顕微鏡写真である。
【図１０】  リーフレットCaP被覆PLGA 75/25スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
【図１１】  42日間培養したDex+スカフォードの共焦点顕微鏡写真である（視野幅=1.8mm）。
【図１２】  テトラサイクリンで染色したDex+スカフォードの紫外線照射光学顕微鏡写真である（視野幅=2.0cm）。
【図１３】  オステオカルシンで免疫標識したスカフォードの光学顕微鏡写真である（視野幅=1.1cm）。
【図１４】  ヘマトキシリンおよびエオシン染色したDex+培養スカフォード切片の光学顕微鏡写真である（視野幅=0.8cm）。
【図１５】  ヘマトキシリンおよびエオシン染色したDex-培養スカフォード切片の光学顕微鏡写真である（視野幅=0.6cm）。
【図１６】  図16Aは、0.35mm未満の粒子で作製した先行技術のPLGA 75/25膜状スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Bは、0.54〜0.8mmの範囲の大きさの粒子で作製した先行技術のPLGA 75/25膜状スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Cは、0.8〜2.0mmの範囲の大きさの粒子で作製した先行技術のPLGA 75/25膜状スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Dは、0.35mm未満の粒子で作製したPLGA 75/25中間体スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Eは、0.54〜0.8mmの範囲の大きさの粒子で作製したPLGA 75/25中間体スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Fは、0.8〜2.0mmの範囲の大きさの粒子で作製したPLGA 75/25中間体スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Gは、0.35mm未満の粒子で作製したPLGA 75/25骨様スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Hは、0.54〜0.8mmの範囲の大きさの粒子で作製したPLGA 75/25骨様スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
図16Iは、0.8〜2.0mmの範囲の大きさの粒子で作製したPLGA 75/25骨様スカフォードの走査電子顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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