(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体に少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸に外来酵素蛋白質を産生させた後、その絹糸腺または繭糸から外来酵素蛋白質を回収することを特徴とする、酵素活性を有する外来酵素蛋白質の製造法であって、
少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群は、
ｉ）絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合されたＧＡＬ４もしくはその類縁体であってＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７から選ばれるその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、
ｉｉ）ＵＡＳ遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子とを含む遺伝子群であって、
第二遺伝子内に、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、および産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子を含み、精製ペプチドをコードする遺伝子およびプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されている、遺伝子群であり、
融合蛋白質を産生させた後、その絹糸腺または繭糸から融合蛋白質を回収し、回収した融合蛋白質をプロテアーゼで処理して、融合蛋白質から絹糸腺特異的発現蛋白質を除去し、次いで、精製ペプチドに応じたアフイニテイー担体に担持させて、外来酵素蛋白質を精製する、
酵素活性を有する外来酵素蛋白質の製造法。
【請求項２】
絹糸腺特異的に発現するプロモーターがフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターであり、かつ、絹糸腺特異的発現蛋白質がフィブロインＬ鎖である、請求項１の製造法。
【請求項３】
絹糸腺特異的に発現するプロモーターがセリシン遺伝子のプロモーターであり、かつ、絹糸腺特異的発現蛋白質がフィブロインＬ鎖である、請求項１の製造法。
【請求項４】
第一遺伝子および第二遺伝子において、マーカー遺伝子を含む、請求項１から３のいずれかの製造法。
【請求項５】
遺伝子組換えカイコが、第一遺伝子をカイコの染色体に組み込まれた第一の遺伝子組換えカイコを製造し、それとは別に、第二遺伝子をカイコの染色体に組み込まれた第二の遺伝子組換えカイコを製造し、次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の組換えカイコとを交配させて製造したＦ１カイコである、請求項１から４のいずれかの製造法。
【請求項６】
第一遺伝子および第二遺伝子を、トランスポゾン由来のＤＮＡ配列を含むベクターとトランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミドとを利用してカイコ染色体に組み込む、請求項１から５のいずれかの製造法。
【請求項７】
外来酵素蛋白質が、ヘキソキナーゼ、アルカリ性フォスファターゼまたはペルオキシダーゼである、請求項１から６のいずれかの製造法。
【請求項８】
遺伝子組換えカイコが、さらに、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコであり、かつ、絹糸腺から絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質を回収する、請求項１から７のいずれかの製造法。
【請求項９】
遺伝子組換えカイコであって、
ｉ）絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合されたＧＡＬ４もしくはその類縁体であってＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７から選ばれるその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、
ｉｉ）ＵＡＳ遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質遺伝子とを含む第二遺伝子であって、第二遺伝子内に、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、および産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子を含み、精製ペプチドをコードする遺伝子およびプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されている、第二遺伝子とを
染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコ。
【請求項１０】
絹糸腺特異的に発現するプロモーターがフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターであり、かつ、絹糸腺特異的発現蛋白質がフィブロインＬ鎖である、請求項９の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１１】
絹糸腺特異的に発現するプロモーターがセリシン遺伝子のプロモーターであり、かつ、絹糸腺特異的発現蛋白質がフィブロインＬ鎖である、請求項９の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１２】
第一遺伝子および第二遺伝子において、マーカー遺伝子を含む、請求項９から１１のいずれかの遺伝子組換えカイコ。
【請求項１３】
遺伝子組換えカイコが、さらに、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコである、請求項９から１２のいずれかの遺伝子組換えカイコ。
【請求項１４】
遺伝子組換えカイコの製造法であって、
ｉ）絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合されたＧＡＬ４もしくはその類縁体であってＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７から選ばれるその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子をカイコの染色体に組み込んだ第一の遺伝子組換えカイコを製造し、
それとは別に、
ｉｉ）ＵＡＳ遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された少なくとも３．５万の分子量を有する外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子であって、第二遺伝子内に、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、および産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子を含み、精製ペプチドをコードする遺伝子およびプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されている、第二遺伝子をカイコの染色体に取り込ませて第二の遺伝子組換えカイコを製造し、
ｉｉｉ）  次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとを交配させて
製造することを特徴とする遺伝子組換えカイコの製造法。
【請求項１５】
第一遺伝子および第二遺伝子を、トランスポゾン由来のＤＮＡ配列を含むベクターとトランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミドとを利用してカイコ染色体に組み込む、請求項１４の遺伝子組換えカイコの製造法。
【請求項１６】
絹糸腺特異的に発現するプロモーターがフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターであり、かつ、絹糸腺特異的発現蛋白質がフィブロインＬ鎖である、請求項１４または１５の遺伝子組換えカイコの製造法。
【請求項１７】
第一遺伝子および第二遺伝子において、マーカー遺伝子を含む、請求項１４から１６のいずれかの遺伝子組換えカイコの製造法。
【請求項１８】
第一遺伝子を組み込む前のカイコ、第一の遺伝子組換えカイコ、第二遺伝子を組み込む前のカイコ、第二の遺伝子組換えカイコのいずれかのカイコを、あらかじめ、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコと交配させてＦ１カイコを製造し、そのＦ１カイコを、それぞれのカイコとして用いる請求項１４から１７のいずれかの遺伝子組換えカイコの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来酵素蛋白質遺伝子が染色体に組み込まれた遺伝子組換えカイコを利用した組換え型の外来酵素蛋白質の製造法に関する。また、絹糸腺または繭糸に組換え型の外来酵素蛋白質を産生することができる遺伝子組換えカイコ、並びに、その遺伝子組換えカイコの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子組換え蛋白質は、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、細菌、酵母、または COS 細胞のような哺乳類由来細胞などに導入し、培地中でその細胞を増殖させた後、合成された蛋白質を回収することにより生産されている。しかし、このような方法では、十分な量の蛋白質の生産が難しいという問題がある。また、バキュロウイルスにより蛋白質遺伝子を昆虫や昆虫細胞に感染させて遺伝子組換え蛋白質を生産することも知られている。この方法では、哺乳類に近い蛋白質の翻訳後修飾が得られる長所があるが、外来蛋白質遺伝子の導入にウイルスを用いることから、その不活性化や封じ込めが必要であり、また、ウイルス接種が煩雑であるなどの問題がある。
【０００３】
一方、最近、ミニコラーゲンやサイトカインのような分子量の小さい蛋白質をコードする遺伝子を、カイコの染色体に組み込ませて組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸に外来蛋白質を生産させる方法が開発されている（特許文献１、２および３）。しかし、このような昆虫染色体への外来蛋白質遺伝子の組み込みによる遺伝子組換え技術においては、生産される組換え型外来蛋白質の生産量は十分ではなく、更に、組換え型外来蛋白質は低分子量のもので成功しているのみであり、これらの点で各種の課題があるものである。
また、酵母の転写制御因子 GAL4 と標的配列UAS からなる遺伝子発現系制御システムを利用した組換えカイコによる遺伝子の発現についての検討もなされており、酵母の GAL4/UAS システムは遺伝子組換えカイコにおいても機能し、導入遺伝子の発現制御に有効であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この報告では、緑色蛍光蛋白質（GFP）の遺伝子を発現させた例のみである。一方、遺伝子組換えカイコにおいて、医薬品や診断薬として使用される酵素を発現させて分泌・回収することについては、酵素がさらに高分子量であることや高次構造の維持が難しい点などから検討されていないのが実情である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３２５１８８号公報
【特許文献２】特開２００４−１６１４４号公報
【特許文献３】特開２００４−２５４６８１号公報
【特許文献４】特開２００４−１３５５２８号公報
【非特許文献１】Morikazu Imamura et al., Genetics 165: 1329-1340                      (November 2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、遺伝子組換えカイコを用いて、簡便な方法で大量に高分子量の外来酵素蛋白質を製造する方法を提供することにある。また、それに用いる遺伝子組換えカイコおよび遺伝子組換えカイコの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果、目的とする高分子量の外来酵素蛋白質をコードする遺伝子がカイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合した構造を持つ DNA 配列を、トランスポゾン由来の DNA を利用してカイコ染色体に導入するとともに、酵母由来の遺伝子発現制御系である GAL4/UAS システムを機能させることにより、従来の遺伝子組換えカイコでは製造できなかった、高分子量の外来酵素蛋白質が、絹糸腺または繭糸中に大量に生産されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、染色体に外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸に外来酵素蛋白質を産生させた後、その絹糸腺または繭糸から外来酵素蛋白質を回収することを特徴とする外来酵素蛋白質の製造法に関する。
更に本発明は、遺伝子組換えカイコであって、
i) 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、
ii) UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子とを含む第二遺伝子とを
染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコに関する。
更に本発明は、
遺伝子組換えカイコの製造法であって、
i) 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子をカイコの染色体に組み込んだ第一の遺伝子組換えカイコを製造し、
それとは別に、
ii) UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子をカイコの染色体に取り込ませて第二の遺伝子組換えカイコを製造し、
iii) 次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとを交配させて
製造することを特徴とする遺伝子組換えカイコの製造法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造法では、目的とする高分子量の組換え型外来酵素蛋白質を大量に製造することができる。また、夾雑物を多く含まない絹糸腺または絹糸から回収することが可能なため、目的の外来酵素蛋白質の精製が容易であるという利点がある。更には、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しないことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安全に組換え酵素蛋白質の製造を実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で製造することができる外来酵素蛋白質としては、特に限定されないが、分子量が、好ましくは少なくとも 3.5 万、より好ましくは 4.0 万〜20 万、更に好ましくは 4.5 万〜15 万の酵素蛋白質である。そのような蛋白質として、例えば、ヘキソキナーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を例示することができる。
【００１０】
本発明において、外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群とは、その遺伝子群を染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコが、外来酵素蛋白質を絹糸腺または繭糸に産生させるように工夫した遺伝子群であれば特に限定しない。本発明においては、外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群が、機能的に結合した転写制御因子をコードする DNA/該転写制御因子の標的プロモーターのシステム、例えば、酵母由来の転写制御系であるGAL4/UAS システムの機能もしくはそれと同様の機能を有するものが好ましい。具体的には、本発明においては、外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群は、i) 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された転写制御因子、例えば、GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子と、ii) 該転写制御因子の標的プロモーター、例えば、UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子とを含む遺伝子群であることが、その外来酵素蛋白質を大量に産生できることから好ましい。
【００１１】
本発明に用いる絹糸腺特異的に発現するプロモーターとは、カイコ細胞内で有効に働くプロモーターであればいずれでもよいが、カイコ絹糸腺で特異的に蛋白質の発現を誘導するように工夫されたプロモーターが好ましい。例えば、フィブロイン L 鎖プロモーター、フィブロイン H 鎖プロモーター、p25 プロモーター、セリシンプロモーターなどのカイコ絹糸腺で特異的に発現される蛋白質遺伝子のプロモーターが挙げられる。そのうち、フィブロイン L 鎖蛋白質は後部絹糸腺で大量に産生され、少なくとも個体当たり約 30mg が分泌されている。これは絹糸腺中に分泌される主要な蛋白質の約 40% を占めており、p25 蛋白質の6 倍の発現量に当たる。よってフィブロイン L 鎖プロモーターは後部絹糸腺において高転写活性能を有している点から好ましい。また、セリシンプロモーターを用いると絹糸腺臓器が損なわれずに中部絹糸腺より、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を製造しやすく好ましい。
【００１２】
本発明に用いる GAL 4 もしくはその類縁体とは、酵母由来の転写制御系である GAL4/UAS (upstream activating sequence) システム (Nature 288: 672-675, 1988: Development 118: 410-415, 1994) の機能もしくはそれと同様の機能を発揮するものであれば限定しない。GAL4 の類縁体としては、UAS 遺伝子に結合し、もしくは UAS 遺伝子を認識し、その下流にある構造遺伝子の転写活性を促進する酵母由来のGAL1、GAL10、GAL7 などが挙げられる（J. Bacteriol 158: 705-712）。UAS 遺伝子は、構造遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の転写活性化因子、即ち、GAL4 もしくはその類縁体が結合・認識する遺伝子であり、例えば、プロモーター領域を含む５’非翻訳領域などが該当する。
【００１３】
本発明に用いる第二遺伝子は、UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む。UAS 遺伝子とは、上記したように転写活性化因子の結合もしくは認識部位であり（J. Bacteriol 158:705-712）、酵母由来の転写制御系である GAL4/UAS システムが機能するものであれば限定しない。
本発明において、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子とは、絹糸腺で大量に発現している蛋白質をコードする遺伝子が好ましく、そのような蛋白質としては、フィブロイン H 鎖、フィブロイン L 鎖、セリシン、p25 などを例示できる。そのうち、上記したように、フィブロイン L 鎖蛋白質は大量に分泌され、また目的とする外来酵素蛋白質と融合蛋白質の形態で組み換え蛋白質を発現させる場合、分子量がフィブロイン H 鎖よりも小さい点から好ましい。
しかし、本発明において、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を用いる場合、さらに巨大な融合外来酵素蛋白質が絹糸腺で発現されるが、意外にも、外来酵素蛋白質の高次構造を維持したまま発現され、その結果、絹糸腺特異的発現蛋白質を除去した後、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を生産することができる。
【００１４】
本発明の第二遺伝子においては、その他にも、産生される外来酵素蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードする遺伝子、産生される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から、外来酵素蛋白質を遊離させるためのプロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子などが含まれてもよい。
精製ペプチドとしては、His タグ、FLAG、STREP、GST などが一般的で主としてアフィニティー精製が可能となるペプチドが好ましい。例えば、His タグは、ヒスチジン残基が連続して 6〜10 個結合したものであり、目的の外来酵素蛋白質に結合させて用いる。この His タグはキレート担体と相互作用するため、産生される外来酵素蛋白質の精製が容易に行える。FLAG は 8 アミノ酸（配列番号１０のアミノ酸配列）のペプチド Tag で、組み換えタンパク質に結合した融合タンパク質として発現させ、融合タンパク質は Anti-FLAG抗体を用いて検出、精製を行なうことができる。STREP は、ストレプトアビジンに結合する 8 アミノ酸残基（配列番号１１のアミノ酸配列）から成るタグであり、ストレプトアビジン変異体タンパク質との可逆的な結合を利用して、組み換え体タンパク質を発現・精製・検出できる。GST は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼであり、組み換えタンパク質に結合した融合タンパク質として発現させれば、グルタチオンセファロース担体とアフィニティー結合させる事により比較的容易に産生される外来酵素蛋白質を精製できる。これらの精製ペプチドのなかでも、産生される外来酵素蛋白質の立体構造を保持させたい場合には、ペプチド残基の短い His を用いる事が好ましい。これらの精製ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流でかつ外来酵素蛋白質遺伝子の上流に挿入されていることが好ましい。
【００１５】
プロテアーゼ認識ペプチドとは、カイコの絹糸腺内に発現される絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との融合蛋白質から外来酵素蛋白質をプロテアーゼにより切断して、絹糸腺特異的発現蛋白質を融合外来酵素蛋白質から遊離・除去させることができるペプチドであれば、特に限定しない。プロテアーゼ認識ペプチドとしては、スロンビン、ファクター Xa、TEV プロテアーゼ、PreScission プロテアーゼなどのプロテアーゼによって認識されるペプチドなどが挙げられる。例えば、スロンビンの認識ペプチドは配列番号８で示すアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列のうちの Arg と Gly の部位がスロンビンによって消化される。プロテアーゼ認識ペプチドをコードする遺伝子は、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子と外来酵素蛋白質遺伝子との間に位置し、融合蛋白外来酵素蛋白質遺伝子の上流に存在するのが好ましい。また、絹糸腺特異的発現蛋白質を確実に除去するため、複数種類のプロテアーゼ認識ペプチド遺伝子を用いてもよい。さらに、絹糸腺特異的発現蛋白質と外来酵素蛋白質との間に、「第一のプロテアーゼ認識配列―精製ペプチド−第二のプロテアーゼ認識配列」を挿入すると、融合外来酵素蛋白質から絹糸腺特異的発現蛋白質を除去でき、しかも、得られる酵素を精製しやすいので好ましい。
【００１６】
また、第一遺伝子または第二遺伝子が染色体に組み込まれた第一または第二の遺伝子組換えカイコのスクリーニングを容易にするために、第一または第二遺伝子は、マーカー遺伝子を有するのが好ましく、マーカー遺伝子としては、適切な発現部位特異的プロモーターの下流に結合された蛍光蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。発現部位特異的プロモーターとしては、カイコ細胞で発現可能なプロモーターであればいずれでもよく、例えば特開平６−２６１７７０号公報や特開昭６２−２８５７８７号公報に記載されているショウジョウバエの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターやカイコアクチン遺伝子のプロモーター（Nature Biotechnology 18,81-84,2000）、ショウジョウバエの視神経で発現することが知られている 3xP3 プロモーターなどが挙げられる。好ましくは、カイコアクチン遺伝子のプロモーターまたは 3xP3 プロモーターが用いられる。マーカーとしての蛍光蛋白質としては、例えば、緑色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質等を例示できる。
【００１７】
以上に説明した外来酵素蛋白質遺伝子、絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子などの構造遺伝子の下流には、通常の遺伝子発現系の下流に設けられるポリ A 配列を結合させる。ポリ A 配列としては、例えば SV40 ポリ A やウシ成長ホルモンポリ A などの一般的に蛋白質の発現に実績のあるものなどが挙げられる。
【００１８】
染色体に外来酵素蛋白質を発現させる遺伝子群を組み込んだ遺伝子組換えカイコは、第一遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第一の遺伝子組換えカイコを製造し、それとは別に、第二遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第二の遺伝子組換えカイコを製造し、次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとを交配させ製造することが好ましい。
加えて、本発明に用いる遺伝子組換えカイコは、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を絹糸腺から得るため、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコであることが好ましい。ここで、「絹糸を構成するペプチド」とは、絹糸を構成する内因性ペプチドであり、例えば、外因性の絹糸腺特異的発現蛋白質は除いたものである。
本発明において、そのような「絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ」を製造する場合、第一遺伝子を組み込む前のカイコ、第一の遺伝子組換えカイコ、第二遺伝子を組み込む前のカイコ、第二の遺伝子組換えカイコのいずれかのカイコを、あらかじめ、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコと交配させて F1 カイコを製造し、その F1 カイコを、それぞれのカイコとして用いることが好ましい。
【００１９】
ここで、「絹糸を構成するペプチド」としては、特開２００４−１３５５２８号公報に記載のように、例えばフィブロイン L 鎖、H 鎖、セリシン、p25（fibrohexamarin）が挙げられるが、好ましくはフィブロイン L 鎖または H 鎖であり、より好ましくはフィブロインＬ鎖である。また、「絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ」としては、好ましくは絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ、より好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、さらに好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている裸蛹系統のカイコ、さらにより好ましくはＮｄ−ｓＤが挙げられるが、絹糸を構成するペプチドの生産抑制の原因が、人為的か否か、また、変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコも含まれる。
【００２０】
絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコは人為的に作出することが可能である。例えば、２重鎖の RNA を用いることにより、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製も可能である（Quan, G. X., Kanda, T. and Tamura, T.(2002):Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Molecular Biology 11217-222）。また、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製は、ウイルスをベクターとして用いることによっても行うことができる（Yamao, M., Katayama, N., Nakazawa, H., Yamakawa, M., Hayashi, Y., Hara, S., Kamei, K., & Mori, H. (1999).Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13(5), 511-516.）。
このように作出されたカイコにおいて、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているか否かは、絹糸腺の大きさで判断することができる。また、作出されたカイコの繭の重量、その繭の絹糸を構成するペプチドの含有量を計測することなどで判断することができる。
【００２１】
本発明において、第一遺伝子および第二遺伝子を、それぞれ、カイコの染色体に組み込ませる方法は、遺伝子が安定に染色体に組み込まれる方法であれば特に限定しない。カイコ卵に遺伝子をマイクロインジェクションする方法、遺伝子銃を用いる方法などを用いることができる。好ましくは、第一遺伝子または第二遺伝子を含み、トランスポゾン由来 DNA 配列を含有する外来遺伝子導入用ベクターを、トランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミド（Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000）と同時にカイコ卵にマイクロインジェクションする方法が採用される。
【００２２】
トランスポゾン由来の DNA 配列は、１対の末端逆位配列を含み、この１対の末端逆位配列の間に、上記した絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合された GAL4 もしくはその類縁体の遺伝子を含む第一遺伝子、あるいは、UAS 遺伝子の下流に絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子が結合され、かつ、その絹糸腺特異的発現蛋白質遺伝子の下流に結合された外来酵素蛋白質遺伝子を含む第二遺伝子を配置させることによって、カイコ染色体に目的遺伝子を組み込むための外来遺伝子導入用ベクターを構築することができる。
トランスポゾン由来の DNA 配列としては、ショウジョウバエ由来のトランスポゾンmariner（Third International workshop on transgenesis of invertebrate organisms,p37-38,1999）およびMinos（Insect Mol.Biol.9,277-281,2000）や鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンである piggyBac（Nature Biotechnology 18,81-84,2000) などを用いることが可能できる。なかでも、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンである piggyBac 由来の DNA 配列を持ったトランスポゾンが好適に使用される。
piggyBac 由来の DNA 配列は、TTAA 配列を含む１対の末端逆位配列を有するものであり、その DNA 配列の間に、上記した本発明の第一遺伝子または第二遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子導入用ベクターが構築される。
このように、トランスポゾン由来の DNA 配列を利用して外来遺伝子をカイコ染色体へ導入するためには、さらにトランスポザーゼをコードする遺伝子を発現できるヘルパープラスミドを同時に利用する。例えば、piggyBac 由来のトランスポザーゼを発現することが可能な DNA 配列を含むヘルパープラスミドを同時に導入することで、カイコ細胞内において転写・翻訳されたトランスポザーゼがその１対の末端逆位配列を認識してその間の第一遺伝子断片または第二遺伝子断片を切り出し、カイコ染色体へと転移させることにより、カイコ染色体へ第一遺伝子または第二遺伝子が導入される頻度を著しく向上させることができる。
【００２３】
このようにして、外来遺伝子導入用ベクターを使用し、トランスポザーゼをコードする遺伝子を持つヘルパープラスミドと同時にカイコ卵にインジェクションすることにより、第一遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第一の遺伝子組換えカイコ、並びに、第二遺伝子をカイコの染色体に組み込ませた第二の遺伝子組換えカイコを製造することができる。
これらの遺伝子組換えカイコを、通常の条件で催青し、孵化した幼虫を５令まで飼育し成虫を得る（G0 世代）。得られた G0 成虫の雌雄を交配し卵を得る。マーカーとして 3xP3 プロモーターまたはアクチンプロモーターを上流に有する蛍光蛋白質を持つようにした第一遺伝子または第二遺伝子を使用した場合、これらの卵のうち、蛍光を有するものを選別する。このとき、それぞれ、マーカーとして、緑色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質を用いたときは、緑色蛍光、青色蛍光、赤色蛍光、黄色蛍光があるものを卵の段階で選別できる。選別した卵を孵化させ、生育させる事により、目的とする第一または第二の遺伝子組換えカイコを簡便にかつ高確率で得ることができる。
次いで、第一の遺伝子組換えカイコと第二の遺伝子組換えカイコとの雄雌を交配させ、卵を得る。得られる卵を蛍光顕微鏡または PCR 法等との検出により、染色体に第一遺伝子と第二遺伝子とのいずれをも含む卵を選別する。その卵を孵化させ、生育させることにより、本発明の遺伝子組換えカイコを得ることができる。
こうして得られた組換えカイコの子孫は、その染色体上に目的遺伝子を安定に保持することが可能である。
【００２４】
本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、分子量の大きな蛋白質、すなわち、外来酵素蛋白質を発現させ、しかも、毒性があると考えられるＧＡＬ４／ＵＡＳ系システムを持つにもかかわらず、通常のカイコと同様な方法で、継代維持可能であり、しかも、子孫のカイコは、外来酵素蛋白質を発現させることが可能である。さらに、絹糸線からは、酵素活性を有する外来酵素蛋白質を製造することができる。
例えば、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化する。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明の遺伝子組換えカイコは、こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であり、また、大量に増やすことが可能である。
【００２５】
上記したように、本発明で用いられる遺伝子組換えカイコとは、外来酵素蛋白質遺伝子がカイコ染色体に導入されたカイコのことであり、そのカイコ染色体 DNA を常法に従って制限酵素処理したのち、常法に従って標識した外来酵素蛋白質遺伝子をプローブとしてサザンブロッティングを行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのことである。外来酵素蛋白質遺伝子が導入される染色体上の遺伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部位であれば特に制限はない。
【００２６】
このようにして得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸より、適当な、分離、抽出、精製の操作によって、外来酵素蛋白質を得ることができる。本発明においては、外来酵素蛋白質を酵素活性があるように製造するためには、遺伝子組換えカイコの絹糸腺から取り出すことが好ましい。
絹糸腺または絹糸からの外来酵素蛋白質を抽出する場合の 分解用バッファーについては特に制限はないが、外来酵素蛋白質の機能を有した状態で回収するためには、その外来酵素蛋白質の Km の至適 pH 付近が望ましい。さらに、プロテアーゼ認識ペプチドまたは精製ペプチド部位を付与した融合蛋白質として目的とする外来酵素蛋白質を発現させる場合、スロンビンなどの設計したプロテアーゼで処理した後、用いた精製部位に応じてキレート担体、グルタチオンセファロース、プロテイン G などの各種アフィニティー担体に担持させ、精製、濃縮させる事ができる。
【００２７】
絹糸腺または繭糸からの外来酵素蛋白質の抽出に使用する溶媒については特に制限はないが、外来酵素蛋白質を活性を保持した状態で回収するためには水溶媒系が好ましい。抽出に使用する水溶液は、外来酵素蛋白質の抽出を促進させるために適切な溶質を含むことが可能である。例えば、リン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸や、食塩、尿素、塩酸グアニジン、塩化カルシウムなどの塩類、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなどの極性有機溶媒などが挙げられる。また、抽出溶液の pH も特に限定はなく、目的とする外来酵素蛋白質を失活させない pH であれば、任意の pH を用いることができる。
【００２８】
抽出された外来酵素蛋白質を単離・精製するための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えば、目的とする外来酵素蛋白質が本来有する活性を指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体、抗体等を用いたクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離することができる。
例えば、ヘキソキナーゼは、ヘキソキナーゼ遺伝子を導入したカイコから絹糸腺を 20mM トリスバッファー（pH 7.4）中に摘出し、ホモジナイズによって得られる可溶性画分に回収することができる。さらに、得られた抽出液を、例えば HisTrap カラムに吸着させ、洗浄後、イミダゾールを含む緩衝液で溶出することにより、ヘキソキナーゼの純度を上げることができる。
このように製造されたヘキソキナーゼ等の酵素蛋白質は、従来の他の製造方法で製造された酵素蛋白質と同様に、医薬用途や各種の測定、診断用途に用いることができる。
【００２９】
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
本発明の遺伝子組換えカイコの繭からヘキソキナーゼを融合蛋白質として製造
実施例１は、本発明の遺伝子組換えカイコを製造しそのカイコの繭からヘキソキナーゼを融合蛋白質として製造する例である。すなわち、この例は、第一の遺伝子組換えカイコ（第一遺伝子、すなわち、3xP3-CFP/pBacFiL-GAL4の遺伝子を有する）と第二の遺伝子組換えカイコ（第二遺伝子、すなわち、pBac3xP-3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40の遺伝子を有する）との雌雄を交配させ、第一遺伝子および第二遺伝子を有する遺伝子組換えカイコを製造し、そのカイコの繭からヘキソキナーゼを含む融合蛋白質を生産させた例である。
１）第一遺伝子を含む第一の遺伝子組換えカイコの調製
第一の遺伝子組換えカイコとして、pBacFiL-GAL4/3xP3-CFP 遺伝子組み換えカイコを、Genetics 165: 1329-1340 に記載された方法に従って調製した。この組換えカイコは、フィブロイン L 鎖プロモーターの下流に結合された GAL4 遺伝子と、視神経発現プロモーターである 3xP3 および青色蛍光蛋白質 CFP 遺伝子とを含む第一遺伝子を、piggyBac 由来の TTAA 配列を含む１対の末端逆位配列の間に挿入した外来遺伝子導入用ベクターとヘルパープラスミドと併用して染色体に挿入して製造したカイコである。
【００３０】
２）第二の遺伝子を含む遺伝子組換えカイコの調製
(i) ヘキソキナーゼ（HXK）遺伝子
HXK 遺伝子は HXK1（GeneBank 登録番号 M14410 の 718 番目〜2175 番目）の配列から配列番号１及び配列番号２に示すプライマーを設計し、Genomic ・PS Library, Yeast S. cervisiae（フナコシ社）を Template としたＰＣＲを行った後、T7Blue（タカラバイオ社）を用い TA クローニング法にて獲得した。このプライマーの端側には後の遺伝子構築のために 5’末端プライマーに Bgl II、3’末端プライマーにBamH I を付加した。
ここで、HXK1 の Open Reading Frame 内部にシークエンス反応用のプライマーを設計し、ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer によってシークエンスを行った。ここでクローニングされた HXK 遺伝子の配列は配列番号３に示す。シーケンスされた配列をアミノ酸配列に置換し、NCBIのBlast検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/  Protein-protein blast）にかけたところ、Hexokinase isoenzyme 1（GeneBand 登録番号NP_116711）と99.4％の相同性を有し、また、hexokinase (HXK1) （GeneBand 登録番号AAA34698）と98.6％の相同性のあるクローンである事が確かめられた。
【００３１】
(ii) フィブロイン L 鎖（FibL）遺伝子
フィブロイン L 鎖遺伝子 (GeneBank 登録番号 X17291 の 28 番目-767 番号目 : J. Mol. Biol., 210, 127-139, 1989) は、pBac (3xP3-DsRed2 + L-chain promoter/normal L-chain cDNA) (Eur. J. Biochem., 271,356-366 2003) からPst I部位とBamH I 部位を切り出して、pBluescriptII KS(-)のPst I 部位と BamH I部位にクローニングした。さらに後の遺伝子構築の目的で pBluescriptII SK(-)を EcoR I で消化し、配列番号４に示す合成 DNA を挿入する事により Xba I サイトを作った。
【００３２】
(iii) FibL-THR-HXK  遺伝子
精製部位（以下 THR と記す）は、発現した蛋白質が精製できる様、フィブロイン L 鎖遺伝子と HXK 遺伝子の間に、プロテアーゼであるスロンビン認識配列（Leu Val Pro Arg Gly Ser）と、キレートと相互作用する His タグである 6 個のヒスチジン残基(（His）６)、そしてさらにプロテアーゼである PreScission 認識配列（Lwu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro）の順に設計した。
上記の如く設計した THR は、配列番号５の オリゴヌクレオチドと配列番号６のオリゴヌクレオチドを合成し、KODplus（東洋紡（株）製）及び、Zero Blunt TOPO PCR クローニングキット(インビトロジェン（株）製)を用いて下記の手順で調製した。すなわち、KODplus に添付の 10×PCR バッファーを 5μl、150μM の配列番号５のオリゴヌクレオチド 、150μM の配列番号６のオリゴヌクレオチド、１mM MgSO４、0.2mM dNTPs、２単位 KODplus となるように各試薬を加え、全量 50μl とし、Perkin-Elmer 社 の DNA サーマルサイクラーにて 94℃ 2 min 1 回、94℃ 15sec から 68℃ 30 sec のサイクルを15 回、68℃ 7min  1 回の伸長反応を行った。次いでこの反応産物を Zero Blunt TOPO PCR クローニングキットの添付文書に従い、サブクローニングした。
【００３３】
(iv) pBII-FibL-THR-HXK の構築
Zero Blunt TOPO クローニングキットにサブクローニングした精製部位（THR）を制限酵素 Bgl II とBamH I で切り出し、前出の pBluescriptII KS(-)にクローニングされたフィブロイン L 鎖遺伝子の下流に挿入した。次いで TA クローニングで得たヘキソキナーゼ遺伝子を Bgl II と BamH I で切り出し、精製部位（THR）の下流に結合させ、図１に示される pBII-FibL-THR-HXK を構築した。
【００３４】
(v) pBII UAS/SV40の構築
図２に示す pBII UAS/SV40 は次のようにして構築した。BacUAS-GFP (Genetics., 165,1329-1340 2003)を鋳型にし、PCR にて UAS-GFP-SV40term を含む領域を増幅させ、Zero Blunt TOPO クローニングキットにサブクローニングした。次いで、得られた UAS-GFP-SV40term領域 を pBluescriptII SK(-)のマルチクローニングサイトに挿入し、制限酵素 Bln I サイトを含む配列番号７およびおよび配列番号８のオリゴヌクレオチドをプライマーとした Inverse PCR を行い pBII UAS/SV40 を作製した。
(vi) pBII-UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の構築
pBII UAS/SV40を、制限酵素 Bln I で、また、pBII-FibL-THR-HXK を制限酵素Xba I で消化し、FibL-THR-HXK フラグメントをpBII-UAS/SV40 に挿入したし、図３に示される pBII UAS-FibL-THR-HXK-SV40 を構築した。このプラスミドをシークエンスすることにより、得られたプラスミドの塩基配列がUAS-FibL-THR-HXK-SV40 の順であることを確認した。
【００３５】
(vii) 第二遺伝子pBac3xP3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40 を含む遺伝子導入用プラスミド
の作製
遺伝子導入用プラスミドは、pBac [3xP3-EGFPafm] ベクター（Dev. Genes Evol.210,630-637,2000) の SV40 由来ポリ A 付加配列の下流にある EcoR I 部位に配列番号９のオリゴヌクレオチドを挿入し Nhe I 部位を付与した。
導入する遺伝子は pBII UAS-FibL-THR-HXK-SV40 を Spe I で消化し、pBac[3xP3-EGFPafm]ベクターの Nhe I 部位に挿入し、図４に示される様に遺伝子（pBac3xP3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40）を含む遺伝子導入用プラスミドを得た。
【００３６】
(viii) 第二の遺伝子組換えカイコの作製
第二遺伝子を含む遺伝子導入用プラスミドとヘルパープラスミド pHA3PIG（Nature Biotechnology 18,81-84,2000）をそれぞれ 200ng/ml の濃度で 0.5mM リン酸バッファー（pH7.0）、5mM KCl 中で調整し、15〜20nl を産卵後 4 時間以内のカイコ卵に対してマイクロインジェクションした。そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫（G0）を群内で掛け合わせ得られた次世代（G1）の卵を緑色蛍光タンパク質の蛍光観察から選択し、それを生育させることにより、HXK 遺伝子が染色体に導入されたカイコをスクリーニングした。カイコ卵へのインジェクションは 2 回実施し、合計 1434 個のカイコ卵に遺伝子をインジェクションし合計 7 蛾区から、第二の遺伝子組換えカイコが得られた。
【００３７】
３）本発明の遺伝子組換えカイコの製造
図５に示すようにして、上記２）で得られた第二の遺伝子組換えカイコと上記１）で得られた第一の遺伝子組換えカイコとの雄雌を交配させ、卵を得た。得られる卵の PCR 法による検出で、染色体に第一遺伝子と第二遺伝子とのいずれを含む卵を選別した。その卵を孵化させ、生育させることにより、本発明の UAS-FibL-THR-HXK/FiL-GAL4 交雑系統の遺伝子組換えカイコを得た。
【００３８】
４）本発明の遺伝子組換えカイコの繭からのヘキソキナーゼの製造
本発明の遺伝子組換えカイコに繭を生産させ、その繭を可溶化し、ヘキソキナーゼが製造していることをイムノブロッティングにより確認した。まず、本発明の遺伝子組換えカイコが生産した繭を 60% チオシアン酸リチウムで 10mg/ml となるよう室温で可溶化した。次いで、得られる可溶化したものを、5M 尿素、20mM Tris-HCl(pH8.0) に透析し、さらに 4.5M 尿素 20mM Tris-HCl (pH8.0) に透析した。透析物を 12000rpm 20min 室温で遠心し、得られた上清に 12% メルカプトエタノールを含む SDS-PAGE サンプルバッファー (3 X) を加え 10-20% アクリルアミドグラジエントゲルにて SDS-PAGE を行った。SDS-PAGE 終了後、PVDF 膜(ミリポア社製) に 0.8mA/cm２ 1 時間の条件で繭可溶化蛋白質を転写した。転写後の PVDF 膜をブロックエース（大日本製薬社製）でプロッキングし、ウサギ抗フィブロインL 鎖抗血清 (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 275: 40517-40528) を用いて１次抗体反応をさせ、次いで抗ウサギ Ig-HRP 標識抗体（アマシャムバイオサイエンス社）で２次抗体反応を行い、POD イムノステインセット（和光純薬工業社）で検出することにより、フィブロイン L 鎖と HXK が融合している蛋白質が得られることを確認した。
【００３９】
繭可溶化蛋白質のイムノブロッティング結果を図６に示す。図中レーン１は分子量マーカーであり、レーン２から４はネガティブコントロールである。レーン２はカイコ卵に遺伝子をインジェクションしていない系統、レーン３は UAS-FibL-THR-HXK-SV40 遺伝子組み換えカイコ系統、レーン４はFiL−GAL４ 系統に対応し、それぞれの繭可溶化蛋白質を試料としたものである。またレーン５と６はUAS-FibL-THR-HXK/FiL-GAL4 交雑系統の繭を可溶化した試料をイムノブロッティングしたものであり、フィブロイン L 鎖と精製部位とヘキソキナーゼの和に相当する分子量（７５Kda）にバンドが確認された。よって、UAS-FibL-THR-HXK/FiL-GAL4 交雑系統の繭中にヘキソキナーゼが分泌されている事が分かった。
【００４０】
実施例２
本発明の遺伝子組換えカイコの絹糸腺から酵素活性を有する組換えヘキソキナーゼの製
造
実施例２は、本発明の遺伝子組換えカイコを調製しそのカイコの絹糸腺から酵素活性を有するヘキソキナーゼを製造した例である。すなわち、この例は、第一の遺伝子組換えカイコ（第一遺伝子、すなわち、3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4 の遺伝子を有する）と第二の遺伝子組換えカイコ（第二遺伝子、すなわち、3xP3Pro-GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の遺伝子を有する）との雌雄を交配させ、第一遺伝子および第二遺伝子を有する遺伝子組換えカイコを製造し、そのカイコの絹糸腺から酵素活性を有するヘキソキナーゼを生産した例である。本実施例では、ヘキソキナーゼが絹糸腺から繭に移らず絹糸腺内に残るようにするため、本発明の遺伝子組換えカイコを、繭ができにくいように設計した。すなわち、第一の遺伝子組換えカイコとして、第一遺伝子を有するカイコとＮｄ−ｓＤ  カイコ（正常に絹蛋白質を製造できない突然変異カイコ）とを交配させて得られるカイコ、すなわち、Ｎｄ−ｓＤ  系の第一の遺伝子組換えカイコを用いた。
すなわち、本実施例ではフィブロイン L 鎖の遺伝子とこの遺伝子が欠失を起こしているため、正常に絹タンパク質を合成できない突然変異系統Ｎｄ−ｓＤ  （Mori K, Tanaka K,Kikuchi Y, Waga M, Waga S, Mizuno S.(1995) J Mol Biol. 251(2):217-28）を利用した。なお、この突然変異系統は独立法人農業生物資源研究所で保存・維持され、一般に提供されている。
【００４１】
１) 第一遺伝子（3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4）を含む遺伝子組換えカイコの調製
第一遺伝子を含む組換えカイコとして、3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4 遺伝子組換えカイコを、田村俊樹・内野恵郎・神田俊男・小林  功・小島  桂（2004）酵母のGAL4/UAS系を利用した中部絹糸腺特異的遺伝子発現系の作出．日蚕講要74,p51. に記載された方法に従って調製した。
この組換えカイコは、セリシンプロモーター（SerPro）の下流に結合された GAL4 遺伝子と、視神経発現プロモーターである 3xP3 および赤色蛍光蛋白質 DsRed 遺伝子とを含む第一遺伝子を、piggyBac 由来の TTAA 配列を含む１対の末端逆位配列の間に挿入した外来遺伝子導入用ベクターとヘルパープラスミドと併用して染色体に挿入して製造したカイコである。
【００４２】
２）Ｎｄ−ｓＤ  系の第一の遺伝子組換えカイコの製造
上記１)の第一の遺伝子（3xP3Pro-DsRed/SerPro−GAL4）を含む遺伝子組換えカイコと突然変異系のＮｄ−ｓＤ  のカイコ（独立法人農業生物資源研究所から入手）との雌雄を交配し卵を得て、次いで、その卵を孵化・生育させ、さらに、目が赤色蛍光を示すカイコを選択してＮｄ−ｓＤ  系の第一の遺伝子組換えカイコを得た。
【００４３】
３）Ｎｄ−ｓＤ  系の本発明の遺伝子組換えカイコの製造
上記２）で得られたＮｄ−ｓＤ  系の第一の遺伝子組換えカイコと、実施例１２）で得られた第二の遺伝子組換えカイコとの雌雄を交配させ、卵を得た。その卵を孵化・生育させ、得られるカイコの眼を実体蛍光顕微鏡で観察し、目が赤色蛍光と緑色蛍光を示すものを選択することにより、本発明の UAS-FibL-THR-HXK/Ser-GAL4 交雑系統でかつＮｄ−ｓＤ  系統の本発明の遺伝子組換えカイコを得た。
【００４４】
４）ヘキソキナーゼの酵素活性の評価
下記５）で得られる組換えヘキソキナーゼに酵素活性があるかどうかは、以下の方法により実施した。
第一試薬として、1ml中、グルコース 3.6mg、グルコース−６−リン酸脱水素酵素 1.5 単位、ATP 0.5mg、NADP 0.8mg、ジアホラーゼ 2.5 単位、ニトロテトラゾリウムブルー 1.0μmol を含む水溶液を用いた。第二試薬として 1ml 中 ATP 4.41mg を含む水溶液を用いた。
酵素活性の測定は、まず、サンプル（溶出画分）20μl、第一試薬 80μl、第二試薬 20μl の割合で添加した。これを室温で 3 時間保持した後、プレートリーダーにて 600nm の吸収波長を測定し吸光度の上昇するかどうかを調べた。なお、陰性コントロールには精製水を使用した。
【００４５】
５）本発明遺伝子組換えカイコの絹糸腺からの、酵素活性を有するヘキソキナーゼの製造
上記３）で得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺中で、ヘキソキナーゼ融合蛋白質、すなわち、フィブロイン L 鎖配列とスロンビン認識配列と精製ペプチド部位（ヒスチジン残基 6 個の部位）と PreScission プロテアーゼ認識配列とヘキソキナーゼ配列を含む融合蛋白質を発現させた。その融合蛋白質をスロンビンで処理して切断し、組換えヘキソキナーゼ（精製ペプチド部位配列を含む）を得、そのヘキソキナーゼの精製ペプチド部位を利用して、ニッケル結合キレート担体を用い、酵素活性を有する組換えヘキソキナーゼを得た。以下に、これらを詳述する。
上記３）で得た本発明の組換えカイコの 5 令吐糸0日目から 5 令吐糸 1 日目になる合計 9 頭のカイコ中部絹糸腺を摘出し、リン酸緩衝液(0.02M リン酸ナトリウム  pH7.4)を組織100μgあたり1mlとなるように添加した。これをガラスホモジナイザー（WHEATON社）でホモジナイズし、可溶性画分を取り分けた。次いで、その可溶性画分にスロンビン（アマシャムバイオサイエンス社）を 500unit 添加し、室温で 2 時間消化させ、さらに 4℃ で 16 時間の消化を行なうことにより組換え融合蛋白質から、フィブロイン L 鎖とプロテアーゼ認識配列を除去した。
【００４６】
図７は、プロテアーゼ消化による組換え融合蛋白質の切断前後の蛋白質の結果を示すイムノブロッティングである。このイムノブロッティングでは、1次抗体としてフィブロインL 鎖に対する抗体を使用しているため、スロンビン消化すると、融合蛋白質のバンド消失が確認された（図７のレーン３）。すなわち、融合蛋白質中、プロテアーゼ認識配列部位と精製部位との結合が切断され組換えヘキソキナーゼ（精製部位配列を含む）を製造していることが支持された。
次いで、HiTrap Chelating HP 1ml（アマシャムバイオサイエンス社）に予め硫酸ニッケルを担体に結合させ、結合バッファー（0.02M リン酸ナトリウム 0.5M NaCl pH7.4）10mlを送液してからスロンビン消化したサンプルをシリンジにて添加した。サンプル添加後に結合バッファーを10ml送液し、素通り画分を回収した。サンプルの溶出は、溶出バッファー（0.02M リン酸ナトリウム 0.5M NaCl 0.5M イミダゾールpH7.4）3mlを送液し、計13画分にして回収精製した。
この画分の酵素活性を、上記４）のヘキソキナーゼの酵素活性による評価方法で評価したところ、精製後の組換えヘキソキナーゼが酵素活性を有している事が明らかとなった（図８）。また、SDS-PAGEの結果は、図８の８番目の画分にクーマシーブルーで染色されるバンドが見られた。このバンドは、精製部位およびPreScissionプロテアーゼ認識配列を含むヘキソキナーゼの分子量にほぼ相当する位置に見られ、精製された組換えヘキソキナーゼが得られたことが判明した（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
以上に詳細に説明したように、酵母由来の転写制御系である GAL4/UAS システムの機能を持つ遺伝子組換えカイコを利用した本発明の製造法により、目的とする高分子量の組換え型外来酵素蛋白質を大量に製造することができる。また、夾雑物を多く含まない絹糸腺または絹糸から回収することが可能なため、目的の外来酵素蛋白質の精製が容易であるという利点がある。更には、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しないことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安全に組換え酵素蛋白質の製造を実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１で用いる第二遺伝子を構築するための pBII-FibL-THR-HXK の構成を示す。
【図２】実施例１で用いる第二遺伝子を構築するためのpBII-UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の作製に用いたベクター BII UAS/SV40 の構成を示す。
【図３】実施例１で用いる第二遺伝子を構築するためのpBII-UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の構成を示す。
【図４】実施例１で用いる第二遺伝子pBac3xP3GFP/UAS-FibL-THR-HXK-SV40 の構成を示す。
【図５】実施例１の遺伝子組換えカイコを製造するための交雑系統を示す。
【図６】実施例１の製造法により得られた繭可溶化ヘキソキナーゼ蛋白質のイムノブロッティングの結果を示す。
【図７】実施例２で絹糸腺からの融合ヘキソキナーゼを、スロンビン処理した前後のイムノブロッティング（抗体としてフィブロインＬ抗体を使用）の結果を示す。
【図８】実施例２でスロンビン処理した組換えヘキソキナーゼ溶液を、ニッケルキレート担体に保持・溶出させると、得られる画分が、ヘキソキナーゼの酵素活性を有していたことを示す結果である。
【図９】実施例２で得た精製組換えヘキソキナーゼのSDS-PAGEの結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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