(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９のオリゴヌクレオチドである、免疫反応に負の影響を与える物質の効果への阻害剤と、免疫反応に正の影響を与えるための、GM-CSF及びインターロイキン-4（IL-4）との組み合わせを含む薬剤。
【請求項２】
前記阻害剤が、免疫反応を抑制し、ダウンレギュレートし、又は負の影響を与える分子の合成又は機能を阻害している請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスヌクレオチドである請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
腫瘍の治療のための請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
高増殖疾患、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、気管支癌腫、食道癌腫、結腸癌腫、胃癌腫、腸腫瘍、肝臓腫瘍、胆嚢及び胆管腫瘍、膵臓癌腫、肛門癌腫、乳房癌腫、卵巣癌腫、頚管癌腫、子宮内膜癌腫、前立腺癌腫、膀胱癌腫、悪性黒腫、脳腫瘍、及び／又は肉腫の治療のための請求項４に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
腫瘍性細胞(neoplastic cells)に対する免疫反応を高めるために、先行技術では２つの異なるアプローチが用いられている。第１のアプローチは、インターロイキン-2(IL-2)のようなサイトカインの添加、あるいは腫瘍細胞のリンホタクチン(lymphotactin)でのトランスフェクション又はＴ-リンパ球のCD-40受容体リガンドでのトランスフェクションのように、腫瘍細胞及び／又は免疫細胞の、IL-2のようなサイトカインをコードする遺伝子若しくは免疫反応を高める他のタンパク質類でのトランスフェクションを使用する。
【０００２】
第２のアプローチは、腫瘍細胞に対する身体の免疫反応を高めるために、免疫抑制分子類の阻害を使用する。例えば、ヤヒメツァク(Jachimezak)ら(1993)のJ.NEUROSURG. 78(1993) 944-51及びシュリンゲンジーペン(Shlingensiepen)ら(1994)のWO 94/25588は、腫瘍誘発免疫抑制を逆転するためにTGF-βを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を教示する。
【０００３】
いくつかの先行技術文献は、これら２つのアプローチの組み合わせは、単独で使用されるこの２つのアプローチの一つの使用については、有効でもなく有益でもないということを教示する。
【０００４】
例えば、グリドリー(Gridley)らのCANCER BIOTHER.8(2),1993,159-170及びマオ(Mao)らのCANCER BIOTHER.9(4),1994,317-327は、いずれもIL-2と抗トランスフォーミング成長因子−β抗体との組み合わせが有意義な抗腫瘍効果を生じないことを教示する。
【０００５】
その上、ファキライ(Fakhrai)らのPROC.NATL.ACAD.SCI 93, (1996), 2909-2914は、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β) TGF-βmRNAに対するアンチセンス配列をコードする遺伝子でのトランスフェクションと、IL-2の腫瘍細胞中でのトランスフェクションとの組み合わせが、TGF-βアンチセンス単独でのトランスフェクションと比較して腫瘍に対する免疫反応を増加させないことを教示する。
【０００６】
それに反して、驚くべきことに刺激剤と阻害剤とのある組み合わせは、いずれか一方のアプローチだけよりも有効である。
【０００７】
本発明は、
・免疫反応に負の影響を与える物質の効果への少なくとも一つの阻害剤、但し、この物質は、TGF-βとその受容体、VEGFとその受容体、インターロイキン10(IL-10)とその受容体、及びPGE2とその受容体からなる群から選択され、この阻害剤は100ｋDaより少ない分子量を有する、及び
・免疫反応に正の影響を与える少なくとも一つの刺激剤
との組み合わせを含む薬剤を開示する。
【０００８】
好適な実施態様において、この阻害剤は、免疫反応を抑制し、ダウンレギュレートし(downregulating)、又は負の影響を与える分子の合成又は機能を阻害している。この阻害剤は、アンチセンスヌクレオチド若しくはリボザイムとして機能することのできるオリゴヌクレオチド、又は例えば、Fabフラグメント若しくは一本鎖抗体のような抗体由来の抗体フラグメントであることができる。
【０００９】
好ましくは、刺激剤は抗原の発現(presentation)を増加させるか、並びに／又は免疫細胞の増殖及び／若しくは機能を高めることにより免疫反応に正の影響を与える。
【００１０】
好適な実施態様において、刺激剤は、免疫反応を刺激し、高揚し、アップレギュレートし(upregulating)、及び／又は正の影響を与える分子の合成又は機能を高める。特に刺激剤は、GM-CSF,SCF,CSF,IFN-γ,FLT-3-リガンド、及び単球走化性タンパク質(MCP-1)、インターロイキン-2、インターロイキン-4,インターロイキン-12及び／又はインターロイキン-18のような因子の合成及び／又は機能を刺激及び／又は高めるか、又は前記インターロイキン類の一つであるか、又はウィルス類、ウィルス抗原類、通常細胞ではなく腫瘍細胞若しくは病原体中で発現した抗原類、例えば、前立腺細胞、卵巣細胞、乳細胞、メラニン生産細胞のような生体に本質的でない冒された器官中で発現した器官特異的抗原からなる群から選択される。
【００１１】
刺激剤は、好ましくは以下から選択される。
ａ）リンホタクチン及び／又は物質を引き付ける免疫細胞を含む走化性剤(Chemokines)  及び／又は
ｂ）レトロウィルス、アデノウィルス、パピローマウィルス、エプスタイン・バール・ウィルス、ニューカッスル病ウィルス、牛ポックスウィルスを包含する非病原菌性ウィルスを含むウィルス及び／又はウィルスの一部分  及び／又は
ｃ）自己由来及び／又は非相同のMHC-分子  及び／又は
ｄ）抗原工程に関係する分子  及び／又は
ｅ）抗原発現に関係する分子  及び／又は
ｆ）免疫細胞効果の調整に関係する分子  及び／又は
ｇ）免疫細胞の細胞毒性効果の調整に関係する分子  及び／又は
ｈ）抗原輸送に関係する分子  及び／又は
ｉ）補刺激性分子(co-stimulatory)
ｊ）免疫細胞による認識及び／又は免疫細胞の細胞毒性効果を高めるペプチド類ｋ）ある生体内において標的細胞中のタンパク質が他の細胞とは異なる１以上のアミノ酸を含有するペプチド類
ｌ）以下のｊ）によるペプチド類
−ラスタンパク質アミノ(ras protein amino)の１以上の変異及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−p53タンパク質の１以上の変異及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−EGF-受容体タンパク質の１以上の変異及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−融合ペプチド類及び／又は融合タンパク質類の１以上の変異、及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−１以上の変異及び／又はアミノ酸置換、及び／又は遺伝子再配列及び／又は遺伝子転座に起因したアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−網膜芽細胞腫タンパク質の１以上の変異及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−オンコジーン及び／又はプロトオンコジーンによりコードされたタンパク質の１以上の変異、及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−抗オンコジーン及び／又は腫瘍サプレッサージーンによりコードされたタンパク質の１以上の変異、及び／又はアミノ酸置換を含有するペプチド類  及び／又は
−同一の生体内の他の細胞により発現されたタンパク質とは、標的細胞が１以上のアミノ酸について異なるタンパク質から誘導されたペプチド類  及び／又は  −ウィルス抗原から誘導され及び／又はウィルス核酸によりコードされたペプチド類  及び／又は
−神経系、筋肉、造血系又は生存に不可欠な他の器官を除いた罹病器官で発現したタンパク質から誘導されるペプチド類。罹病器官は、例えば、前立腺細胞、卵巣細胞、乳細胞、メラニン生産細胞などである。
ｍ）腫瘍細胞抽出物及び／又は腫瘍細胞溶解物及び／又はアジバント類
ｎ）樹状細胞と腫瘍細胞の融合細胞
【００１２】
これらの融合細胞は、樹状細胞と腫瘍細胞の混合物に由来したハイブリドーマである。樹状細胞は、例えば、GM-CSFとIL-4、又はGM-CSF、IL-4とIFN-γ又はFLT-3リガンドの混合物でのPBMC処理により生成される。樹状細胞の腫瘍細胞との融合は、例えば、PEG(ポリエチレングリコール)又は電気融合を使用して行える。
【００１３】
驚くことに、VEGF-オリゴヌクレオチドでのPBMC処理は、樹状細胞の数及び／又は有効性を増加させた。
【００１４】
本発明の一実施態様において、阻害剤は、ある一つのオリゴヌクレオチドである。好ましくは図１のオリゴヌクレオチドが、本発明の薬剤に有用である。
【００１５】
さらなる実施態様では、本発明は図1-2から1-4に示される配列の一つを有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１６】
5'-又は3'-末端に１から10の付加的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドも本発明の一部である。
【００１７】
トランスフェクションのために使用されるオリゴヌクレオチド配列は、通常はアンチセンスオリゴヌクレオチドのために使用されるものよりもかなり長い配列であり、通常は30塩基長を超えず、短い一本鎖配列として用いられ、ベクター系に組み込まれない。
【００１８】
トランスフェクトされた配列は、通常はオリゴヌクレオチドよりもかなり長いので、もし一つのタンパク質系(family)の異なる部分の交差阻害がアンチセンス技術により起こるならば、標的mRNA以外のmRNA類のそのような交差阻害は、オリゴヌクレオチドと比べて、トランスフェクトされたアンチセンス配列の方がよりありそうである。しかしながら、ファング(Huang).FらのCell Growth Differ,Vol.6(12),1995年２月,1635-1642ページは、「K6トランスフェクタント(transfectant)だけが、TGFβ1mRNA及び親系統(parental line)の活性分泌TGFβ1タンパク質について、それぞれ39％と33％のレベルを示した。K6は、TGFβ2発現中に変化を示さず、かつTGFβ3発現は、親細胞とトランスフェクタント細胞系統のいずれも検出されなかったこと」を教示している。
【００１９】
したがって、例えば、TGF-β1-14、TGF-β1-15、TGF-β-17-c-2260、TGF-β-123-2262、TGF-β-23-2268、TGF-β2-4、TGF-β2-14、TGF-β2-15、TGF-β2-9、TGF-β2-14/1、TGF-β2-14/2、TGF-β1-136のようなTGF-β1及びTGF-β2の両者の発現を顕著に減少させることのできる、本発明のオリゴヌクレオチドを見出したことは驚くべきことであった。その上、驚くことに、このオリゴヌクレオチド類は、かなりTGF-β2及びTGF-β3の発現を顕著に減少させることができるように設計された。
【００２０】
さらに驚くことに、例えば、b1-N17、b1-N14、b1-N24、TGF-β2-9、TGF-β2-14、TGF-β2-15、TGF-β-17-c-2260、TGF-β-12-9/20−2261、TGF-β-123-2262、TGF-β-12-9/22-2263、TGF-β-23-2268、TGF-β1-98-11、TGF-β1-98-23、TGF-β3-98-7、 TGF-β3-98-10、TGF-β-1-rwk-5、TGF-β-3-rwk-2、TGF-β-1-rwk-5、TGF-β-3-rwk-9、TGF-β-3-rwk-23、TGF-β1-3、TGF-β1-10    のようなTGF-β2及びTGF-β2とTGF-β3の発現を顕著に減少させることのできるオリゴヌクレオチドが見出された。
【００２１】
このようにTGF-β1、TGF-β2及び／又はTGF-β3の少なくとも２つの発現に対して効果的であるオリゴヌクレオチドも本発明の一部である。
【００２２】
これらの発見は、TGF-β2、TGF-β1及びTGF-β3のmRNA間の配列の比較が、これら３つの異なるmRNA内で一致するであろう20塩基長の一本鎖配列を見出すことができないということを示す事実の観点からも驚くべきことであった。もしそのような仮説的配列が本当に存在していても、そのような仮説コンセンサス配列によるこれら３つのmRNAの阻害は全く生じ得ないであろう。というのは、あるmRNAに対して相補的なごく少数のアンチセンス配列は、実際にいわゆるアンチセンス効果を発揮する、すなわち各々のタンパク質の発現を阻害することが当該技術において周知であるからである。
【００２３】
単球走化性タンパク質-1(MCP-1)の内皮合成は、生理学的及び炎症性疾患の下で脈管外の貯蔵のための単球漸増の調整に関与している。
【００２４】
MCP-1アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単球の侵入を調節することができ、従って、抗炎症性であった。
【００２５】
これらのアンチセンス-オリゴヌクレオチドは、例えば喘息、クローン病、コリティスウルセロサ(collitis ulcerosa)、糖尿病、糸球体腎炎、急性呼吸器疲労症候群(acute respiratory distress syndrome)及びアーセロスクレロティックプラーク形成(artherosclerotic plaque formation)のような炎症疾患の治療のために有用である。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド及び／又はリボザイム及び／又は核酸は、オリゴヌクレオチドの一部分の塩基、糖及び／又はリン酸エステルでの修飾を有している。
【００２７】
本発明のさらに好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド及び／又はリボザイム及び／又は核酸は、ホスホロチオエート(S-ODN)インターヌクレオチド連鎖及び／又はメチルリン酸エステルインターヌクレオチド連鎖及び／又はホスホラミデート連鎖及び／又はペプチド連鎖及び／又は糖の2'-O-メチル若しくは2'-O-メトキシエトキシ修飾のような2'-O-誘導体及び／又は塩基の修飾のような修飾を有する。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド及び／リボザイム及び／又は核酸は、葉酸、ホルモン類、エストロゲン、プロゲステロン、コルチコステロイド、鉱質コルチコイド類のようなステロイドホルモン類、ペプチド類、プロテオグリカン、糖脂質、リン脂質、ポリエチレンイミン又は他のポリカチオン類及びそれらの誘導体と結合又は混合されている。
【００２９】
その上、本発明は、本発明の薬剤を、これを必要とする患者に投与することにより高増殖(hyperproliferative)疾患、腫瘍又は感染性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、特に白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、気管支癌腫、食道癌腫、結腸癌腫、胃癌腫、腸腫瘍、肝臓腫瘍、胆嚢及び胆管腫瘍、膵臓癌腫、肛門癌腫、乳癌、卵巣癌腫、頚管癌腫、子宮内膜癌腫、前立腺癌腫、膀胱癌腫、悪性黒腫、脳腫瘍、及び肉腫の治療に有用である。
【００３０】
本発明の薬剤の必要量は、疾患及び疾患の程度に依存する。レベルが高くなればなるほどより効果的であるが、しばしば高度の副作用を有する。適正量は、患者の血液中においてオリゴヌクレオチド濃度で0.1〜10 μmol/lの範囲及びサイトカイン濃度で10〜1,000 U/mlの範囲である。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様では、免疫反応に負の影響を与える物質の効果のある阻害剤が、腫瘍、他の病的作用部位又は器官に対して局所的に適用され、かつ、免疫反応に正の影響を与える刺激剤が全身的(例えば、静脈内又は皮下内又は経口で)に適用される。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、免疫反応に負の影響を与える物質の効果のある阻害剤が、腫瘍に対して全身的(例えば、静脈内、皮下内又は経口で)に適用され、かつ、免疫反応に正の影響を与える刺激剤が、腫瘍又は他の病的作用部位又は器官に局所的に適用される。本発明のもう一つの好ましい実施態様は、免疫反応に負の影響を与える物質の効果のある阻害剤が、腫瘍に対して全身的(例えば、静脈内、皮下内又は経口で)に適用され、かつ、免疫反応に正の影響を与える刺激剤が、全身的(例えば、静脈内又は皮下内又は経口で)に適用される。
【００３３】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、免疫反応に負の影響を与える物質の効果のある阻害剤が、腫瘍、他の病的作用部位又は器官に対して局所的に適用され、かつ、免疫反応に正の影響を与える刺激剤が、腫瘍、他の病的作用部位又は器官に対して局所的に適用される。
【００３４】
図１は、本発明において有用なオリゴヌクレオチドを示す。
図２Ａは、10％MEMダルベッコ培養液(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)中の神経膠腫細胞のTGF-β2分泌に対するオリゴヌクレオチド(最終濃度5μM)の効果を示す。
図２Ｂは、10％FCS RPMI 1640培養液(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)中のPBMCのTGF-β1分泌に対するオリゴヌクレオチド(最終濃度5μM)の効果を示す。
図３Ａは、10％FCS RPMI 1640培養液(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)中のPBMCのTGF-β1分泌に対するオリゴヌクレオチド(最終濃度5μM)の効果を示す。
図３Ｂは、10％FCS RPMI 1640培養液(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)中の神経膠腫細胞のTGF-β2分泌に対するオリゴヌクレオチド(最終濃度5μM)の効果を示す。
図４Ａは、神経膠腫細胞中のTGF-β1濃度(ELISA)(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)を示す。
図４Ｂは、神経膠腫細胞中のTGF-β2濃度(ELISA)(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)を示す。
図５は、腫瘍細胞の溶解；LAK-細胞毒性，神経膠腫細胞／PBMCの比：1：20を示す。
図６Ａは、PBMC(コントロールに対する％)、サイトカイン；GM-CSF(400 U/ml)＋IL-4(300 U/ml)から生成した樹状細胞を示す。
図６Ｂは、腫瘍細胞の溶解：LAK-細胞毒性に対する5μMVEGP-アンチセンス-オリゴの効果を示す。腫瘍細胞／DC／PBMCの比は、1:5:20であった。
図７Ａは、10％FCS RPMI 1640培養液(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)中のPBMCのTGF-β1分泌に対するオリゴヌクレオチド(最終濃度5μM)の効果を示す。
図７Ｂは、10％FCS RPMI 1640培養液(オリゴヌクレオチド類と３日間インキュベーション)中の腫瘍細胞のTGF-β2分泌に対するオリゴヌクレオチド(最終濃度5μM)の効果を示す。
図８は、腫瘍細胞の溶解：LAK-細胞毒性に対するオリゴヌクレオチドの効果を示す。腫瘍細胞／PBMCの比は、1:20であった。
【００３５】
実施例
PBMC及び腫瘍細胞の調製
末梢血液単核細胞(PBMC)は、標準フィコール−ハイパーク(Ficoll-Hypaque)傾斜遠心分離により健康な提供者の静脈血から単離された。しばらくの間ヘパリン化された血液は、同体積の完全培養液(10％(v/v)ウシ胎仔牛血清と1ｍMのL-グルタミンを補充したRMPI1640培養液)と混合され、フィコール−ハイパーク(ファーマシア,アップサラ,スエーデン(Pharmacia,Uppsala,Sweden))傾斜上に積層した。400ｇ30分間室温で遠心分離後、血漿−フィコール界面に集まったPBMCsが回収され、３回洗浄され、完全培養液中に再分散された。トリパンブルー除外により決定される細胞生存可能性は、97％以上であった。
ヒト神経膠腫細胞系は、未分化星状細胞腫(WHO Grad III)の患者の腫瘍標本又は膠芽腫(WHO Grad IV)から樹立された。
【００３６】
細胞増殖測定
PBMC-増殖測定法(3H-チミジン取り込み及び細胞計測)として、新たに分離されたPBMCsは、105セル／ウェル(100μCM)の最終濃度(f.c.)で96-ウェル丸底プレート(ナンク,コヘ゜ンハーゲン,デンマークNunc,Copenhagen,Denmark)中で72時間培養された。細胞数決定のため、細胞はヘマサイトメータによりカウントされた。細胞生存可能性は、トリパンブルー染色により決定された。処理された及び処理されていない細胞は、(S-ODNを用いて又は用いないで)試験管内(in vitro)成長により72時間後に95−100％生存可能性を示した。
【００３７】
腫瘍増殖実験のために、104/100μL膠腫細胞が96-ウェル平底プレート(ナンク,デンマーク(Nunc,Denmark))中に入れられ、サイトカイン及び／又はオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされた。DNA合成率は、標準3Hチミジン取り込み検定により測定され、かつ、細胞数の決定は上述のように行われた。
【００３８】
固相酵素免疫測定法(ELISA)による培地上清中のTGF-β1タンパク質の定量化
培養液は３日後に採取され、遠心分離により細胞成分を取り除き、濾過され、そしてさらに処理されるまで−70℃で貯蔵された。TGF-β1及びTGF-β2濃度は、製造者によって推薦されるように、TGF-β1及びTGF-β2 ELISA(R&Dシステム,ミネアポリス(Minneapolis),米国)で表面を酸性化した後に２回測定された。
【００３９】
図１−４及び７は、細胞中でのTGF-β分泌に対するオリゴヌクレオチドの効果を示す。このTGF-β濃度は、光学濃度として報告される。光学濃度が高くなればなる程、TGF-βの濃度も高くなる。
【００４０】
図１Ａ及び１Ｂは、TGF-β分泌に対するオリゴヌクレオチドの効果を示す。コントロールオリゴ類(GAA GGA ATT ACC ACT TTC)は、何ら効果を有しないが、図示されたオリゴヌクレオチドはTGF-β分泌の減少を示す。図１中のこれらのオリゴ類は、TGF-β1に対してより効果的である。
【００４１】
図２は、さらなるオリゴ類及びTGF-β分泌に対するそれらの効果を示す。TGF-β-14は特にTGF-β1及びβ2の分泌に対して効果的である。
【００４２】
図３は、さらにTGF-β1及びβ2の分泌に対して効果的であるさらなるオリゴヌクレオチド類を示す。これらのオリゴヌクレオチド類は、TGF-β2に対してより効果的であるが、TGF-β1に対しても効果的である。
【００４３】
図８は、いずれかのオリゴヌクレオチドのみを５μM用いた場合と比較したTGF-β1及びTGF-β2アンチセンスオリゴヌクレオチドの各々２μMの組み合わせにより腫瘍細胞の細胞毒性に対する上記添加物効果を示す。
【００４４】
細胞毒性PBMC活性を測定するためのCARE-LASS(カルセイン放出定量法)
PBMCの細胞毒性活性を決定するための標準カルセイン放出定量法(CARE-LASS定量法)は、リッチェンフェル,R,ビディジョン(Lichtenfels,R,
Biddision), W.E.,シュルツ(Schulz),H.,ボグト(Vogt),A.B.及びR.マーチン(Martin)ら、CARE-LASS(カルセイン放出定量法)細胞毒性のあるリンパ球活性を測定するための改良された蛍光基礎試験システム、J.Immunol.Meth.,172:227-239,1994により記載されるように用いた。
【００４５】
標的及びエフェクター細胞
定量の当日、悪性膠腫は採取され、５％FCS/PBSで２回洗浄され、及びカルセイン-AM(モレキュラープローブ,米国)を用いて37℃で30分間インキュベートした。標識された標的細胞は、５％FSC/PBSで２度洗浄され、100000/mlに調整され、そして最終体積100uL/wellで96-ウェルＵ型マイクロタイタープレート(ナンク,デンマーク(Nunc,Dennmark))中に置かれた。
PBMCは、5％FSC/PBSで洗浄され、最終濃度1-10Mio細胞/mlに調整された。
細胞は、個々の実験で述べるように、サイトカイン及びオリゴデオキシヌクレオチドで処理された。
【００４６】
定量法
CTL活性を測定するために、エフェクター細胞は96-ウェルＵ型マイクロタイタープレート中に標的：エフェクター比1：10〜1：100で置かれた。カルセインの自発放出と全放出を測定するために、ウェルにはそれぞれ200uL５％FCS/PBS又は200uL溶解バファー(50mMホウ酸ナトリウム、0.1％トリトン,pH9.0)がそれぞれ前添加された。インキュベータ中で37℃で４時間、このプレートをインキュベートし、100uLの上澄みが新しいウェル中に移し換えられ、そして自動蛍光スキャナー(Titertek Fluoroskan II, ドイツ)を用いて測定された。励起と放出の両方について、フィルターセッティング２が選択された(ex2-485nm,em2-538nm)。細胞毒性の割合は、次の式から決定された。
（F/CTL定量法−F 自発放出）/（F全放出−F自発放出）×100
＝％  細胞毒性
【００４７】
一連の実験では、膠腫細胞、樹状細胞(DC)及びPBMCは、結論付けられた。これらの実験において、DCはサイトカインGM-CSF及びIL4を用いるPBMCから生成した。細胞は、さらに本発明のアンチセンスVEGF-オリゴヌクレオチドで処理されたか、コントロール実験としてはオリゴヌクレオチド類で処理されなかった。その上、細胞は、オリゴヌクレオチドを用いるか、又は用いないでサイトカインGM-CSF及びIL4でも処理された。
【００４８】
PBMCは、本発明によるオリゴヌクレオチドでのみ処理されたが、サイトカインGM-CSF及びIL4では処理されなかった。オリゴは、図において別途記載さらた以外は5μMの濃度で使用された。
【００４９】
CARE-LASS(カルセイン放出定量法)は細胞毒性PBMC活性を測定するために使用された。
【００５０】
一連の実験では、膠腫細胞及びPBMCは、単一のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの組み合わせのいずれか一方で処理された。この単一のオリゴヌクレオチドは5μMの濃度で与えられた。組み合わせ実験では、各々のオリゴヌクレオチドは、2μMの濃度で与えられた。PBMC及び腫瘍細胞の両方は、オリゴヌクレオチド(類)を用いて72時間、別々にインキュベートされた。
【００５１】
CARE-LASS(カルセイン放出定量法)は、細胞毒性PBMC活性の測定をするために使用された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に有用なオリゴヌクレオチド（Fig1-1）を示す図である。
【図２】  本発明に有用なオリゴヌクレオチド（Fig1-2）を示す図である。
【図３】  本発明に有用なオリゴヌクレオチド（Fig1-3）を示す図である。
【図４】  本発明に有用なオリゴヌクレオチド（Fig1-4）を示す図である。
【図５】  オリゴ類及びTGF-β分泌に対するオリゴヌクレオチドの効果を示す図(Fig.2)である。
【図６】  TGF-β1及びβ2の分泌に対して効果的であるオリゴヌクレオチド類を示す図(Fig.3)である。
【図７】  神経膠腫細胞中のTGF-β濃度(ELISA)を示す図(Fig.4)である。
【図８】  腫瘍の溶解(LAK-細胞毒性，神経膠腫細胞／PBMC比：1：20)を示す図(Fig.5)である。
【図９】  PBMC及びサイトカインから生成した樹状細胞(Ａ)及び腫瘍細胞の溶解（Ｂ）を示す図(Fig.6AB)である。
【図１０】  10％FCS RPMI 1640培養液中のPBMCのTGF-β1分泌に対するオリゴヌクレオチドの効果(Ａ)、及び10％FCS RPMI 1640培養液中の腫瘍細胞のTGF-β2分泌に対するオリゴヌクレオチドの効果（Ｂ）を示す図(Fig.7AB)である。
【図１１】  腫瘍細胞の溶解(LAK-細胞毒性におけるオリゴヌクレオチドの効果)を示す図(Fig.8)である。
【図１】
0004627369.tif 000002
【図２】
0004627369.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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