(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
糞便から下記の腫瘍マーカーの組み合わせ：
ＣＯＸ−２及びＭＭＰ−７、
ＣＯＸ−２及びＳＮＡＩＬ又は
ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−７及びＳＮＡＩＬ
を検出することを含む、大腸腺腫を検出するための腫瘍マーカーの検出方法。
【請求項２】
前記腫瘍マーカーが、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、大腸癌及び大腸腺腫診断のためのＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）の検出方法、及びこれらの腫瘍マーカーを含む大腸癌及び大腸腺腫診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第２番目に多い癌である（１９９９年度癌死統計）。また、２０１５年の癌患者推計では、男女とも似に第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。【０００３】  癌の集団検診（ｍａｓｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。【０００４】  しかし、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度３０〜９０％、特異度７０〜９８％）、そのため偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。【０００５】  また、大腸癌の診断には、免疫学的便潜血法によるスクリーニングの後か、又は同時に、全大腸内視鏡検査又は注腸検査とＳ状結腸内視鏡検査とが組み合わせて用いられており、多大な時間と労力がかかるという欠点がある。【０００６】  便潜血検査の代替法としては、糞便中のＫ−ｒａｓ、ｐ−５３、ＡＰＣ遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等のＤＮＡを用いた方法が報告されている（非特許文献１〜４）。【０００７】  これらのＤＮＡを用いる方法は、非侵襲的で癌細胞の直接的変化を捉えることができる方法であり、特異度が高いという特徴を有し、将来性豊かな方法と考えられるが、従来技術である便潜血検査と比べると感度が低く、また、時間と労力もかなりかかるという欠点がある。【０００８】  また、さらなる便潜血検査の代替法として、遺伝子発現をより直接的に検出するために、糞便中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）等のｍＲＮＡを検出する方法も開発されている（非特許文献５〜７）。【０００９】  しかし、上記のＲＮＡを用いる方法によっても、少量の糞便から簡便かつ効率的にＲＮＡを抽出することができず、便潜血法を超える感度を得ることができなかった。【００１０】  ＰＣＲ法を逆転写酵素反応（ＲＴ）と組み合わせることによって、ＲＮＡを定性的に、また定量的に検出する方法が知られている。このＲＴ−ＰＣＲ法は、微量分子を検出することができる感度の高さで、ノーザンブロット法に優り、また、手技の速さや容易さでｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に優るものである。【００１１】  しかし、ＲＮＡは、ＤＮＡに比べて不安定であり、かつ、全ての生物学的試料中に普遍的に存在し、極めて安定であるＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常にさらされていることから、ＲＴ−ＰＣＲ法においても、ＲＮＡの精製過程及び精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないように厳密な管理が要求される。【００１２】  したがって、糞便という生物学的に極めて粗製の試料からＲＮＡを抽出する際には、ＲＮａｓｅの影響を排除するために、予め細胞画分を分離する工程が必要とされていた。【００１３】  したがって、極めて多量の微生物に由来する膨大な量の��Ｎａｓｅが存在する糞便中から直接ＲＮＡを検出することは、不可能であり、少なくとも微生物等に由来する外因性ＲＮａｓｅ除去のために細胞画分の分離は、必須であると考えられていた。【００１４】  本発明者は、すでに、場合により凍結した生物学的試料をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下に均質化することによって、大腸癌の診断に有用な腫瘍マーカーを糞便中から検出する方法を開発している（特許文献１）。【００１５】  最近、便潜血法代替大腸癌スクリーニング法として、便の細胞画分のＣＤ４４バリアントの発現を調べる方法が開発されたが、その感度は約６８％にすぎず、便潜血法の感度（約７５％）に及ばないものであった（非特許文献８）。【００１６】  本発明者は、驚くべきことに、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）を採用することによって、大腸癌及び大腸腺腫診断の感度、特異度及び臨床的有用度を改善することができることを発見し、本発明を完成させた。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８３８５６Ａ１
【非特許文献１】シドランスキー等著（Ｄ．Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、１９９２年４月３日、第１０２頁〜第１０５頁
【非特許文献２】ドン等著（Ｓ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、第９３巻、第１１号、２００１年６月１１日、第８５８頁〜第８６５頁
【非特許文献３】トラベルソ等著（Ｇ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ，ｅｔ  ａｌ．）、ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３４６巻、第５号、２００２年１月３１日、第３１１頁〜第３２０頁
【非特許文献４】トラベルソ等著（Ｇ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ，ｅｔ  ａｌ．）、ザ・ランセット（Ｔｈｅ  Ｌｎｃｅｔ）、第３５９巻、２００２年２月２日、第４０３頁〜第４０４頁）
【非特許文献５】デビッドソン等著（Ｌ．Ａ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）、カーシノジェネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、第１９巻、第２号、１９９８年、第２５３頁〜第２５７頁
【非特許文献６】アレキサンダー及びライハット等著（Ｒ．Ｊ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｒａｉｃｈｔ）、ダイジェスティブ・デジージス・アンド・サイエンス（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第４３巻、第１２号、１９９８年、第２６５２頁〜第２６５８頁
【非特許文献７】ヤマオ等著（Ｔ．Ｙａｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、第１１４巻、第６号、１９９８年、第１１９８頁〜第１２０５頁
【非特許文献８】サイトウ著（Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓａｉｔｏ）、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第８７巻、第１０号、１９９６年、第１０１１頁〜１０２４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】  したがって、本発明の目的は、大腸癌及び大腸腺腫診断のためのＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）の検出方法、及びこれらの腫瘍マーカーを含む大腸癌及び大腸腺腫診断用キットを提供することにある。【００１８】  より具体的には、本発明は、下記に関する。
１．下記工程：
ａ）糞便を採取し、凍結する工程、
ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、及び
ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程
を含む大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、
上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）であることを特徴とする、
腫瘍マーカーの検出方法。
２．上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２とＭＭＰ−７との組合せ、ＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとＭＭＰ−７との組合せ、又はＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとの組合せである、上記１記載の方法。
３．上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとＭＭＰ−７との組合せであり、大腸癌が早期大腸癌である、大腸癌診断のための上記１記載の方法。
４．下記手段：
ａ）糞便を採取し、凍結する手段、
ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、及び
ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段
を含む、大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キットであって、
上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）であることを特徴とする、大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。
５．上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２とＭＭＰ−７との組合せ、ＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとＭＭＰ−７との組合せ、又はＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとの組合せである、上記４記載の大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。
６．上記腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとＭＭＰ−７との組合せであり、大腸癌が早期大腸癌である、上記４記載の大腸癌及び大腸腺腫診断のための腫瘍マーカーの検出キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】  本発明のＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、チオシアン酸グアニジン、アイソジェン（Ｉｓｏｇｅｎｅ）、ウルトラスペックＩＩ（登録商標）（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ＩＩ）等が挙げられる。【００２０】  凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、−１〜−１９６℃、好ましくは、−２０〜−１９６℃、好ましくは、−７５〜−１９６℃、より好ましくは、−１１０〜−１９６℃、最も好ましくは−１９６℃である。【００２１】  凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、−７５〜−１９６℃、好ましくは、−１１０〜−１９６℃、より好ましくは−１９６℃である。保存期間は、１日〜１０年、好ましくは、１日〜３年、より好ましくは、１日〜１年である。【００２２】  本発明で用いられる腫瘍マーカーは、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）である。【００２３】  好ましくは、上記腫瘍マーカーは、ＣＯＸ−２とＭＭＰ−７との組合せ、ＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとＭＭＰ−７との組合せ、又はＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとの組合せである。【００２４】  また、早期大腸癌及び大腸腺腫診断のためには、上記腫瘍マーカーは、ＣＯＸ−２とＳＮＡＩＬとＭＭＰ−７との組合せである。【００２５】  ＣＯＸ−２は、アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に変換する誘導酵素であり、ＣＯＸ−２の発現が高まると、アポトーシスが阻害され、血管新生因子や浸潤時に必要とされる基質分解酵素が誘導される。ＳＮＡＩＬは、細胞間接着因子であるＥ−カドヘリンの負の転写調節因子であり、ＳＮＡＩＬの発現が高まるとＥ−カドヘリンの発現が低下し、細胞間の接着が低下し深部浸潤や転移に影響することが知られている。ＭＭＰ−７は、マトリックスメタロプロテアーゼの一種であり、癌の浸潤・転移に必要と考えられている。【００２６】  上記工程ｄ）〜ｆ）は、ＲＴ−ＰＣＲ法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、ＰＣＲ法最前線、１９９７年、共立出版、第１８７頁〜第１９６頁の記載にしたがって行うことができる。【００２７】  懸濁物からのＲＮＡの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）やＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような市販のキットを用いることができる。【００２８】  本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ２やＫＣｌ等の塩類、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質や界面活性剤等を添加することもできる。【００２９】  逆転写に続いて行われるｃＤＮＡの増幅は、通常、ＰＣＲが用いられる。ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ２やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。【００３０】  ｃＤＮＡの増幅は、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることもできる。【００３１】  本発明でプライマーとは、ｃＤＮＡ合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。【００３２】  逆転写反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素があるが、これらに限定されるものではない。【００３３】  ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。【００３４】  増幅されたＤＮＡの検出方法としては、アガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。【００３５】  本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。また、キットに含まれるものとして、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＤＮＡ合成酵素、各種デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）、各腫瘍マーカーに対する特異的プライマー、各腫瘍マーカーに対する陽性コントロール、ＲＮａｓｅ・ＤＮａｓｅを含まない蒸留水、蛍光・目視検出用試薬などを挙げることができる。
【実施例１】
【００３６】  以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。【００３７】  浜松医科大学第１内科に精査・治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によって大腸癌の存在が確認された患者、及び大腸に腫瘍又は炎症性変化のない（非大腸疾患）患者を対象とした。なお、すべての患者からインフォームドコンセントが得られている。【００３８】  糞便は、採便後可及的速やかに５ｍｌチューブに約０．５〜１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。また、比較対照のため、それぞれの試料について免疫学的便潜血検査法により便中のヒトヘモグロビン（Ｈｂ）を測定した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから−８０℃で保存した。その後、ホモジナイザーとグアニジン塩とフェノールを用いてホモジナイズし、クロロホルムとエタノールで全ＲＮＡを抽出した。【００３９】  得られたＲＮＡの１μｇをリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μｌ、和光純薬）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得、その一部をＧｅｎｅ  Ｔａｑ（和光純薬）を用いて、ネスティドＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ増幅産物を、４％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。【００４０】  なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、ＰＣＲでは、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７ともに独自に設計したものを使用した。ＰＣＲは、３つの分子とも第１ラウンドを２０サイクルで行い、第２ラウンドではＣＯＸ−２は２０サイクル、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７の両者は３５サイクルで行った。
使用したプライマーを下記に示す。
0004798514.tif 000002
【００４１】  結果
大腸癌６５例（早期癌１３例、進行癌５２例）と対照群３２例における糞便からのＲＴ−ＰＣＲによるＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７の検出結果を比較対照として行った免疫学的便潜血検査の検出結果と比較した（表１）。【００４２】
0004798514.tif 000003
【００４３】  大腸癌６５例における感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、臨床的有用度（Ａｃｃｕｒａｃｙ；癌を癌、正常を正常と診断したことを意味する）は、ＣＯＸ−２では各々８７．７％（５７／６５）、１００％（３２／３２）、９１．７％（８９／９７）であり、ＳＮＡＩＬでは各々４９．２％（３２／６５）、１００％（３２／３２）、６６．０％（６４／９７）であり、ＭＭＰ−７では各々６５．６％（４２／６４）、１００％（３１／３１）、７６．８％（７３／９５）であった。【００４４】  一方、比較対照として行った免疫学的便潜血検査では、感度７３．０％（４６／６３）、特異度８７．５％（２８／３２）、臨床的有用度７７．９％（７４／９５）であった。【００４５】  ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７のいずれか単独では、免疫学的便潜血検査と比べて感度、臨床的有用度において低い値であったが、ＣＯＸ−２は感度、特異度、臨床的有用度のいずれのパラメーターにおいても免疫学的便潜血検査より高い値を得た。しかし、表１でも示したように統計学的に有意な差はなく、ＣＯＸ−２のいずれのパラメーターの９５％信頼区間（９５％ＣＩ）も、ＣＯＸ−２と免疫学的便潜血検査の間で重複していた。【００４６】  ところが、ＣＯＸ−２が陰性であった８例中２例でＭＭＰ−７が陽性であることからＣＯＸ−２とＭＭＰ−７の二つのマーカーの組合せについて検討すると、ＣＯＸ−２またはＭＭＰ−７の一方が陽性である群（ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７）では、感度が９０．８％（５９／６５）、臨床的有用度が９３．８％（９０／９６）であった。この結果、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７群の感度、臨床的有用度は免疫学的便潜血検査に比し統計学的に有意差を認めた。また臨床的有用度においては９５％信頼区間が、８６．９％−９７．７％となり免疫学的便潜血検査の９５％信頼区間である６８．２％−８５．８％と重複を認めなくなった。同様に、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ又はＭＭＰ−７のいずれかが陽性である群（ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ又はＭＭＰ−７）と免疫学的便潜血検査群との間でも、感度に明らかな有意差があることを示した。さらに、臨床的有用度においても、ＣＯＸ−２、ＣＯＸ−２又はＳＮＡＩＬ、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７、及び、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ又はＭＭＰ−７について、免疫学的便潜血検査に比べて統計学的に有意な差があることを示した。【００４７】  次に、癌を臨床病期０期からＩＶ期に分類し、各症例を腺腫、腺腫から０期の癌、腺腫からＩ期の癌（腺腫、０期及びＩ期の癌）、腺腫からＩＩ期の癌（腺腫及び０期〜ＩＩ期の癌）、腺腫から癌全体（腺腫及び癌を含めた大腸腫瘍（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ））の４つの群に分けて、各群ごとに感度の検討を行った。【００４８】  その結果、ＣＯＸ−２単独であっても、腺腫からＩ期の癌、腺腫からＩＩ期の癌、腺腫から癌全体では感度が各々７３．１％、８３．６％、８３．３％であり、免疫学的便潜血検査は同一の各群で３６．０％、６０．４％、６５．８％であった。また、臨床的有用度が８８．２％（９７／１１０）、その９５％信頼区間は８０．６％−９３．６％であるのに対し、免疫学的便潜血検査の臨床的有用度は７２．２％（���８／１０８）であり、その９５％信頼区間６２．８％−８０．４％であった。【００４９】  すなわち、ＣＯＸ−２単独であっても、腺腫からＩ期の癌、腺腫からＩＩ期の癌、腺腫から癌全体の各群で、免疫学的便潜血検査の感度と臨床的有用度を上回り、統計学的に有意差を認め、また、統計的に両者の９５％信頼区間は重複しないことを示した。【００５０】  また、ＣＯＸ−２が陰性の腺腫５例のうち１例でＭＭＰ−７が陽性、腺腫５例のうち２例がＳＮＡＩＬ陽性であることから、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７、ＣＯＸ−２又はＳＮＡＩＬとＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７のいずれかを陽性とした場合についても検討した。【００５１】  その結果、腺腫のみで、ＣＯＸ−２又はＳＮＡＩＬの感度が７６．９％（１０／１３、９５％信頼区間４６．２％−９５．０％）、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７のいずれかを陽性した場合の感度が８４．６％（１１／１３、９５％信頼区間５４．６％−９８．１％）と免疫学的便潜血検査の感度である３０．８％（４／１３、９５％信頼区間９．１％−６１．４％）を共に大幅に上回った。また、腺腫から０期、腺腫からＩ期、腺腫からＩＩ期の癌、及び腺腫と癌全体においてもＣＯＸ−２又はＳＮＡＩＬ、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７、そしてＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７のいずれか陽性群で免疫学的便潜血検査と比し統計的に有意な差を認めた。さらにＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７において腺腫からＩＩ期の癌で、ＣＯＸ−２又はＳＮＡＩＬでは腺腫からＩ期で、そしてＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７のいずれか陽性群では腺腫から０期において９５％信頼区間で重複しない有意に高い感度を得ることができた。【００５２】  つまりＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７の組合せは、内視鏡や手術などで根治可能である比較的早期の大腸腫瘍のスクリーニングに優れ、しかも特異度の高い非常に有用な検査法である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】  本発明の方法は、特異度、感度及び臨床的有用性の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリーニング方法として従来の便鮮血法の代替となりうるものであり、臨床的に極めて有用なものである。