(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
アースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物に由来する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
微生物がアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９２）である請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｃ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列表の配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のいずれかのＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミド。
【請求項７】
ベクターがｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ１０１、又はｐＴ７Ｂｌｕｅ(登録商標)である請求項６記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
組換えプラスミドが、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡを含み、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９３）に含まれる、ｐＨＡ００２である請求項６又は７に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
形質転換体がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９３）である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１２】
宿主微生物が、アースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１３】
形質転換体が、アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９２）である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項９に記載の形質転換体を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするアミダーゼの製造方法。
【請求項１５】
形質転換体が請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換体である、請求項１４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミダーゼ活性を有するポリペプチド、その遺伝子、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及び当該微生物又は形質転換体を用いたアミダーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミダーゼ（酵素番号［ＥＣ３．５．１．４］）はカルボン酸アミドをカルボン酸とアンモニアに加水分解する酵素であり、例えばラセミ体α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して光学活性α−アミノ酸を生成するなど産業上有用な活性を持つことが知られている。なお、光学活性α−アミノ酸は医薬品の合成中間体や甘味料として有用な化合物である。また、アミダーゼがエステルを基質とした加水分解反応を触媒することも報告されている（非特許文献１）。【０００３】
光学活性α−アミノ酸の製造方法は数多く知られているが、特にＤ−α−アミノ酸は発酵法による大量生産が困難であることから、安価で効率の良い合成法の開発が望まれている。例えば、生物学的手法によるＤ−α−アミノ酸の合成方法として、アミダーゼ活性を有する微生物もしくは酵素を用いてラセミ体α−アミノ酸アミドから光学分割により製造する以下のような方法が知られている。
（１）ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物が有するＤ−α−アミノ酸アミドを特異的に加水分解する活性を用いて、ラセミ体α−アミノ酸アミドからＤ−α−アミノ酸を製造する方法（特許文献１）。
（２）アクロモバクター（Achromobacter）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、プロタミノバクター（Protaminobacter）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、又はストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物が生産するアミノペプチダーゼを用いて、ラセミ体α−アミノ酸アミドからＤ−α−アミノ酸を製造する方法（特許文献２）。
（３）アースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物が生産するアミダーゼを用いて、ラセミ体アラニンアミドからＤ−アラニンを製造する方法（特許文献３及び４）。
（４）アクロモバクター（Achromobacteｒ）属に属する微生物が有するＤ−α−アミノ酸アミドを特異的に加水分解する活性を用いて、ラセミ体α−アミノ酸アミドからＤ−α−アミノ酸を製造する方法（特許文献５）。
（５）遺伝子工学的手法を用いて改変を加えた、微生物由来のＤ−アミノ酸アミダーゼ遺伝子を有する形質転換体を用いて、ラセミ体α−アミノ酸アミドからＤ−α−アミノ酸を製造する方法（特許文献６）。【０００４】
しかしながら、上記（１）から（４）の方法は用いられている微生物が有する加水分解活性が低いため、工業的利用に際して十分とは言えない。【０００５】
また、（５）の方法ではオクロバクトラム（Ochrobactrum）属の細菌由来のＤ−アミノ酸アミダーゼについてのみ記載されており、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌については全く言及されていない。【０００６】
一方、アースロバクター（Arthrobacter）属の細菌がアミダーゼを生産することは一般に知られており、酵素を精製、単離し、その性質を明らかにした例もあるが（特許文献３及び４、非特許文献２及び３）、該酵素のアミノ酸配列、及び該酵素をコードする遺伝子の塩基配列についての報告はなされていない。
【特許文献１】特開昭６３−８７９９８
【特許文献２】特公平７−１０６１４９
【特許文献３】米国特許第５１３０２４０号
【特許文献４】米国特許第５２５２４７０号
【特許文献５】特開平２−２３４６７８
【特許文献６】特開２００２−２５３２５６
【非特許文献１】Eur. J. Biochem.、2000年、267巻、2028頁
【非特許文献２】Bioscience, Biotechnology and Biochemistry、1992年、56巻、12号、1980頁
【非特許文献３】Agricultural and Biological Chemistry、1982年、46巻、5号、1175頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記に鑑み、本発明の目的はラセミ体アミノ酸アミド及びラセミ体アミノ酸エステルの光学分割に利用可能な新規Ｄ−アミダーゼを提供することにある。また、本発明の目的は、当該Ｄ−アミダーゼのアミノ酸配列、その遺伝子の塩基配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体及びそれらを用いた当該酵素の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記に鑑み鋭意検討を行った結果、Ｄ−アミノ酸アミド及びＤ−アミノ酸エステルを立体選択的に加水分解する新規Ｄ−アミダーゼを生産するアースロバクター（Arthrobacter）属細菌を新たに土壌より分離した。そして、本細菌から当該アミダーゼを単離、精製し、アミダーゼ遺伝子の単離、及び宿主微生物での発現を達成し、発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチド。【００１０】
本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡである。【００１１】
本発明はまた、以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかのＤＮＡである：
（ｃ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列表の配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１２】
また、本発明は、上記のＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドである。【００１３】
また、本発明は上記のＤＮＡまたは組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。【００１４】
また、本発明は、上記ポリペプチドを生産する能力を有し、アースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物である。【００１５】
また、本発明は、上記のポリペプチドを生産する能力を有する微生物、又は上記形質転換体を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするアミダーゼの製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は上述の構成からなり、新規なアミダーゼを効率よく製造することができる。また、当該アミダーゼ、又は、当該アミダーゼを生産する微生物を利用して、アミノ酸アミド又はアミノ酸エステルから効率よくＤ−アミノ酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のアミダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＡ００１の図。
【図２】本発明のアミダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＡ００２の図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドはアミダーゼ活性を有するポリペプチドであって、Ｄ−アミノ酸アミド及びＤ−アミノ酸エステルを立体選択的に加水分解することが可能である。【００１９】
本発明において、ポリペプチドのアミダーゼ活性は、Ｄ−フェニルアラニンアミド５０ｍＭを含むトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、３０℃で反応を行い、生成するフェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて定量することにより検出・測定し得る。【００２０】
本発明のポリペプチドは、アミダーゼ活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばアースロバクター（Arthrobacter）に属する微生物が挙げられ、なかでもアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）が好ましく、より好ましくは、本発明者らが土壌より新たに分離したアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株である。【００２１】
上記のアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９２、原寄託日平成１５年１０月２２日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００２２】
以下に、アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株の菌学的性質を示す。
１．形態
１）直径０．７〜０．８μｍ、長さ１．０〜１．５μｍ程度の桿菌
２）グラム染色：陽性
３）運動性：なし
４）胞子形成：なし
５）細胞の多形性：なし
６）肉汁寒天平板培地上でのコロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色
２．培養的性質
１）ニュートリエントアガー（オキソイド製）培地
色：なし、光沢：なし、色素生産：なし
２）ニュートリエントブロス（オキソイド製）培地
表面発育：なし、培地の混濁：あり
３）ゼラチン穿刺培養
生育：なし、ゼラチン変化：なし
４）リトマスミルク
凝固：なし、液化：なし。
３．生理学的試験
１）硝酸塩の還元：−
２）脱窒反応：−
３）ＭＲテスト：−
４）ＶＰテスト：−
５）インドール産生：−
６）硫化水素の産生：−
７）デンプンの加水分解：＋
８）クエン酸の利用  Ｋｏｓｅｒ：＋、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：＋
９）無機窒素の利用  硝酸塩：＋、アンモニウム塩：＋
１０）ウレアーゼ活性：−
１１）オキシダーゼ活性：−
１２）カタラーゼ活性：＋
１３）β−ガラクトシダーゼ活性：＋
１４）アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
１５）リジンデカルボキシラーゼ活性：−
１６）トリプトファンデアミナーゼ活性：−
１７）ゼラチナーゼ活性：−
１８）ピラジナミダーゼ活性：＋
１９）ピロリドニルアリルアミダーゼ活性：＋
２０）アルカリフォスフォターゼ活性：＋
２１）β−グルクロニダーゼ活性：−
２２）Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ活性：−
２３）α−グルコシダーゼ活性：＋
２４）エスクリン（β−グルコシダーゼ）活性：＋
２５）ゼラチン加水分解活性：−
２６）生育の範囲
ｐＨ５：＋、ｐＨ９：＋、ｐＨ１０：＋
２０℃：＋、２５℃：＋、４０℃：＋Ｗ、４５℃：−
２７）生育条件  好気性：＋、嫌気性：−
２８）Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
２９）糖類からの酸及びガス産生（酸／ガス）
Ｌ−アラビノース：−／−
Ｄ−グルコース：＋／−
Ｄ−フラクトース：＋／−
マルトース：−／−
ラクトース：−／−
Ｄ−ソルビトール：−／−
イノシトール：−／−
Ｄ−キシロース：＋／−
Ｄ−マンノース：＋／−
Ｄ−ガラクトース：＋／−
サークロース：＋／−
トレハロース：＋Ｗ／−
Ｄ−マンニトール：＋／−
グリセリン：＋／−
３０）発酵性試験
ブドウ糖：−
リボース：−
キシロース：−
マンニトール：−
マルトース：−
乳糖：−
白糖：−
グリコーゲン：−
３０）主要メナキノン成分：ＭＫ−９（Ｈ2）
３１）菌体脂肪酸組成：【００２３】
【表１】
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【００２４】
なお、本発明のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。【００２５】
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。【００２６】
更に、アミダーゼの生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸アミド、脂肪酸アミド等のアミド類、あるいはアミノ酸エステル、脂肪酸エステル等のエステル類を少量添加することもできる。これらアミダーゼ生産増強物質の培地中濃度は、０．００１重量％以上、１０重量％以下、好ましくは０．０１重量％以上、１重量％以下の範囲から選ばれる。【００２７】
培養は通常、温度として１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下の範囲、ｐＨとしては３以上、１１以下、好ましくはｐＨ５以上、９以下の範囲で好気的に行い得る。培養時間は１日以上、５日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００２８】
培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。【００２９】
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。【００３０】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。【００３１】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、アミノ酸を欠失、追加、挿入及び／又は置換することにより取得可能である。具体的には、Nucleic Acid Res. 10, 6487(1982)、Methods in Enzymology 100, 448(1983)等の文献に記載されている。【００３２】
また、「アミダーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。【００３３】
次に、本発明のＤＮＡについて説明する。本発明のＤＮＡは上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよく、例えば、配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。【００３４】
また、配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良いし、配列番号３で示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有するＤＮＡであっても良い。上記のアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明のＤＮＡの範疇に含まれる。【００３５】
ここで「配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際に、配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、特異的にハイブリッドを形成し得るＤＮＡを言う。【００３６】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。【００３７】
また、「１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素増刊  遺伝子増幅ＰＣＲ法  ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編  加藤郁之進鑑訳  ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度の数の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されてなる塩基配列を意味する。【００３８】
本発明のＤＮＡ（アミダーゼ遺伝子）は、前述したようなアミダーゼ活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。【００３９】
まず、アミダーゼ活性を有する微生物より精製されたアミダーゼのＮ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーなどで決定する。また、精製されたアミダーゼにリジルエンドペプチダーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、ＨＰＬＣ等を用いて得られたポリペプチドを精製し、上記と同様の方法に従って内部アミノ酸配列を決定する。このようにして得られたＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。【００４０】
次に、アミダーゼの起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体のＤＮＡは、培養された細胞を界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、クロロホルム、フェノール等で溶解、処理後、抽出されたＤＮＡをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿をエタノールで洗浄することで得られる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)を参照）。【００４１】
この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的の遺伝子の一部を取得できる。【００４２】
次に、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするＤＮＡ断片をインバースＰＣＲ法により取得することができる（例えば、Nucleic Acids Res.16,8186(1988)を参照）。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端よりも上流と推定される部分、及び、Ｃ末端より下流と推定される部分のそれぞれの塩基配列にもとづきＤＮＡプライマーを作成する。このＤＮＡプライマーを用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことで目的アミダーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得できる。【００４３】
次いで、得られたアミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとＴ４  ＤＮＡリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したアミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片部分の塩基配列を解析、アミダーゼ酵素のＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位と終止コドンを確認することでオープンリーディングフレームを決定する。【００４４】
このようにして取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。【００４５】
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属またはストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物を用いることができる。【００４６】
ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴを挙げることができる。また、酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように改質したベクターを使用することもできる。【００４７】
形質転換体の一例として、上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）に組み込んだ組換えプラスミドｐＨＡ００２を用いてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）を得ることができる。【００４８】
本発明で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli)  ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９３、原寄託日平成１６年１月２２日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００４９】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。【００５０】
本発明のアミダーゼを生産しうる微生物（アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ若しくはその変異株、上記形質転換体等）を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｄ−アミノ酸の製造に利用することができる。【００５１】
微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス・ティープ・リカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。【００５２】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００５３】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行うこともできる。【００５４】
本発明のアミダーゼをアミノ酸アミドまたはアミノ酸エステルの立体選択的加水分解に利用するにあたっては、上記のようにして得られた培養物（培養液、微生物菌体）をそのまま作用させても良いし、培養物からアミダーゼを単離・精製して使用しても良い。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００５６】
（実施例１）アミダーゼの単離・精製
アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９２）を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地Ａ（肉エキス１０ｇ、イーストエキス５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ６．５）に植菌して３０℃で２４時間、好気的に振とう培養した。この培養液２ｍｌをフラスコ内で滅菌した２００ｍｌの培地Ａに植菌して３０℃で４８時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に４５％飽和濃度となるよう硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離で取得した。この画分を１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分に終濃度０．８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で０．８Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５(アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を限外濾過膜(分画分子量１０，０００）を用いて濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライしてＦＰＬＣによるゲルろ過を行い、１ｍＭのＤＴＴ及び０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、アミダーゼは単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。【００５７】
（実施例２）アミダーゼを用いたアミノ酸アミドの加水分解
実施例１で得られた精製アミダーゼ活性画分０．１ｍｌを、表２に示す化合物を０．５％含む０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．１ｍｌと混合し、３０℃にて１５時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、高速液体クロマトグラフィーにて生成したアミノ酸の収率及び光学純度を分析した結果を表２に示す。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
［アミノ酸の収率分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ２）／アセトニトリル＝１９／１、流速：０．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、測定波長：２１０ｎｍ
［アミノ酸の光学純度分析］
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）、溶離液：２ｍＭ硫酸銅／アセトニトリル＝８５／１５、流速：０．８ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、測定波長：２５４ｎｍ【００５８】
【表２】
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【００５９】
（実施例３）精製アミダーゼを用いたアミノ酸エステルの加水分解
実施例１で得られた精製アミダーゼ活性画分０．１ｍｌを、０．５％濃度のラセミ体フェニルアラニンエチルエステルを含む０．２Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌと混合し、３０℃にて１５時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、実施例２と同様の方法で生成したアミノ酸を分析したところ、Ｄ体フェニルアラニンが収率２９．７ｍｏｌ％、光学純度７２．８％ｅｅで得られた。【００６０】
（実施例４）アミダーゼ遺伝子の単離
まず、実施例１と同様の方法でアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＫＮＫ１１０１Ｊ株を培養して得た菌体を、ＣＴＡＢ、クロロホルム、フェノールを用いて溶解、処理後、抽出されたＤＮＡをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿をエタノールで洗浄することにより染色体ＤＮＡを調製した。（Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)を参照。）次いで、実施例１で精製したアミダーゼのアミノ末端のアミノ酸配列を気相プロテイン・シークエンサーを用いて決定した。さらに、実施例１で精製したアミダーゼにリジルエンドペプチダーゼを４Ｍの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミダーゼの内部アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号４）と、内部アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号５）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。この結果、目的のアミダーゼ遺伝子の一部（部分遺伝子と称す）を取得した。【００６１】
次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号６、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号７）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩで分解したもの断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端よりも上流と推定される部分の塩基配列に制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５：配列表の配列番号８）と、Ｃ末端より下流と推定される部分の塩基配列に制限酵素ＳａｃＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−６：配列表の配列番号９）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでアミダーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片（配列表の配列番号２）を取得した。得られたＤＮＡ断片の一部の塩基配列を解析し、アミダーゼ遺伝子の全長（配列表の配列番号３）が含まれていることを確認した。【００６２】
（実施例５）アミダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドの作成と遺伝子の解析
実施例４で得られたアミダーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片と、制限酵素ＥｃｏＲＶで切断したベクタープラスミドｐＴ７ＢｌｕｅをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図１の制限酵素地図で表され、アミダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＨＡ００１を取得した。【００６３】
取得したプラスミドｐＨＡ００１を用いて、実施例４で得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。この結果、精製したアミダーゼを用いて決定したＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認した。また、翻訳開始部位と終止コドンを確認し、オープンリーディングフレームを決定した。このようにして得られた、アミダーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号２に、オープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号３に、塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。【００６４】
（実施例６）アミダーゼ遺伝子を大量発現する組換えプラスミドの作成
実施例５で得られたアミダーゼ遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−７：配列表の配列番号１０、Ｐｒｉｍｅｒ−８：配列表の配列番号１１）を用いて、この間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することで配列表の配列番号３に示されるオープンリーディングフレームのＤＮＡ断片を取得した。【００６５】
このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｃＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図２の制限酵素地図で表され、アミダーゼ遺伝子をｐＨＡ００１よりも多く発現できるように設計されたｐＨＡ００２を取得した。【００６６】
（実施例７）アミダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例６で得られたプラスミドｐＨＡ００２をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地Ｂ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、アミダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）をコロニーとして取得した。【００６７】
得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ｃ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のアミダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液０．１ｍｌを、５０ｍＭのＤ体フェニルアラニンアミド塩酸塩を含む０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．１ｍｌと混合し、３０℃で１５時間反応を行ったところ、Ｄ体フェニルアラニンの生成が認められ、形質転換体にアミダーゼ活性があることが確認された。【００６８】
なお、得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）  ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９３、原寄託日平成１６年１月２２日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００６９】
（実施例８）組換え菌を用いたアミノ酸エステルの加水分解
実施例７で得られたエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＨＡ００２）の培養液０．１ｍｌを、１％濃度のラセミ体フェニルアラニンエチルエステルを含む０．２Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌと混合し、３０℃にて１５時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、実施例２と同様の方法で生成したアミノ酸を分析したところ、Ｄ体フェニルアラニンが収率３４．７ｍｏｌ％、光学純度５３．６％ｅｅで得られた。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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