(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の抗ＷＩＳＰ−１抗体を含んでなる哺乳動物における癌の浸潤又は転移を阻害又は低減させるための薬剤であって、
該抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ生成される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合するか、もしくは、
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ生成されるモノクローナル抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１の、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドに対する結合を競合的に阻害する、薬剤。
【請求項２】
前記癌が大腸癌又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、あるいは脳腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、図９Ａ−９Ｃ（配列番号１）のアミノ酸２３−３６７を含んでなるヒト天然ＷＩＳＰ−１、又は配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によりコードされるアミノ酸を含んでなるＷＩＳＰ−１ポリペプチドの１以上のドメインと結合する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１又は３に記載の薬剤。
【請求項５】
化学療法、放射線、プロドラッグ、細胞障害剤、成長阻害剤、又はサイトカインが前記哺乳動物に投与される場合に用いられる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、少なくとも１種類の哺乳動物細胞において、天然ヒトＷＩＳＰ−１ポリペプチドによるＨＡＳ２、ＨＡ、又はＣＤ４４の誘発又は分泌を阻害するか、又は中和する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマによりそれぞれ分泌される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１抗体から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマによりそれぞれ分泌される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１抗体から選択されるモノクローナル抗体のヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、非タンパク質様ポリマー、細胞障害剤、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、及び化学発光化合物からなる群から選択される１以上の薬剤とリンクした抗ＷＩＳＰ−１抗体である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、非タンパク質様ポリマー、細胞障害剤、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、及び化学発光化合物からなる群から選択される１以上の薬剤にリンクした抗ＷＩＳＰ−１抗体である、請求項７又は８に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記抗ＷＩＳＰ−１抗体が、哺乳動物の転移部位、又は哺乳動物の原発肺腫瘍部位とは異なる部位において、肺癌細胞の転移を阻害又は低減させる、請求項２に記載の薬剤。
【請求項１２】
請求項１、３又は４に記載の薬剤と担体とを含んでなる、癌の浸潤又は転移を阻害又は低減させるための組成物。
【請求項１３】
前記担体が製薬的に許容可能な担体である、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
（発明の分野）
本発明は、一般に、ＷＩＳＰポリペプチド、特にＷＩＳＰ−１ポリペプチドの活性の調節に使用される方法及び組成物に関する。本発明は、また、インビトロ、インサイツ、及び／又はインビボでのＷＩＳＰポリペプチドに関連する病的状態又は哺乳動物細胞の診断及び／又は治療のための方法及び組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、ＴＧＦ-βを含む多くの因子によって線維芽細胞において誘導される成長因子であり、形質転換された細胞の性質である付着依存性成長（ＡＩＧ）を誘導するＴＧＦ-βの能力に対して必須である。ＣＴＧＦはまた細胞に対して分裂促進的で化学走性であり、よってこのファミリーの成長因子は、ヒト組織の正常な発達、成長及び修復に所定の役割を担っているものと考えられている。Ｃｙｒ６１、Ｎｏｖ，ＷＩＳＰ−１、ＷＩＳＰ２、及びＷＩＳＰ−３を含む、ＣＴＧＦに関連した５つのタンパク質が単離され、クローニングされ、配列決定され、ＣＣＮ遺伝子ファミリーに属するものと特徴付けられている。Oemar及びLuescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 1483-1489 (1997); Brigstock, Endocrine Rev., 20:189-206 (1999)。Ｃｙｒ６１をコードしている遺伝子は血管形成、腫瘍成長及び血管新生を促進することが見出された。Babic等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6355-6360 (1998)。ｎｏｖ遺伝子は腎臓において本質的に胚形成期に発現され、正常な腎臓に対して、ｎｏｖ発現の変化が鳥類腎芽細胞腫とヒトウイルム腫瘍の双方で検出されている。Martinerie等, Oncogene, 9: 2729-2732 (1994)。Ｗｔ１はヒトｎｏｖ発現をダウンレギュレートし、このダウンレギュレーションが正常な及び腫瘍の腎形成におけるキーとなる要素を表しているかもしれない。Martinerie等, Oncogene, 12: 1479-1492 (1996)。
ＣＣＮファミリーの異なったメンバーは様々な可溶性又はマトリクス随伴巨大分子、特に硫酸化された複合糖質と相互作用する（Bork, FEBS Letters, 327:125-130）。この相互作用はヘパリン-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーによりＣｙｒ６１及びＣＴＧＦを精製するために使用された（Frazier等, J. Invest. Dermatol., 107:404-411 (1996); Kireeva等, Mol. Cell. Biol., 16:1326-1334 (1996)）。Ｃｙｒ６１は分泌されそのヘパリン硫酸に対する親和性のために細胞外マトリックスと細胞表面の双方に伴う（Yang等, Cell. Growth Diff., 2:351-357 (1991))。最近、ＷＩＳＰ−１は、デコリン（decorin）及びバイグリカン（biglycan）という分泌された２つのデルマタン硫酸プロテオグリカンと相互作用することが示された。（Desnoyers等, J. Biol. Chem., 276:47599-47607 (2001)。
【０００３】
最近マウスタンパク質ＥＬＭ１が低転移性細胞において同定された。Hashimoto等, J. Exp. Med., 187: 289-296 (1998)。以下に開示するＷＩＳＰ-１のマウスオルソログであるｅｌｍ１遺伝子は、ＣＮＮ遺伝子ファミリーの他のメンバーである。これは、インビボでのＫ-１７３５マウスメラノーマ細胞の腫瘍成長と転移を抑制する。以下に記載するＷＩＳＰ-２のラットのオルソログであるｒＣｏｐ-１に関する他の最近の文献は、細胞形質転換後のこの遺伝子の発現の消失を記載している。Zhang等, Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141 (1998)。
Ｗｎｔは、そのメンバーが回虫、昆虫、軟骨魚、及び脊椎動物で見出されている大きな遺伝子ファミリーによってコードされる。Holland等, Dev. Suppl., 125-133 (1994)。Ｗｎｔは、多くの広範な種が複数の保存Ｗｎｔ遺伝子を有しているので、様々な発生及び生理学的過程において機能するものと考えられる。McMahon, Trends Genet., 8: 236-242 (1992); Nusse及びVarmus, Cell, 69: 1073-1087 (1992)。Ｗｎｔ遺伝子は幾つかの原始細胞型において活性な傍分泌又は自己分泌シグナルとして機能すると考えられる分泌糖タンパク質をコードしている。上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)。Ｗｎｔ成長因子ファミリーは、ｃＤＮＡクローニングによって、マウスにおいて同定された１０を越える遺伝子（Ｗｎｔ-１、-２、-３Ａ、-３Ｂ、-４、-５Ａ、-５Ｂ、-６、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ａ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１、-１２、及び-１３）（例えば、Gavin等, Genes Dev., 4: 2319-2332 (1990); Lee等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2268-2272 (1995); Christiansen等, Mech. Dev., 51: 341-350 (1995)を参照）及びヒトにおいて同定された少なくとも９つの遺伝子（Ｗｎｔ-１、-２、-３、-５Ａ、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１）を含む。例えば、Vant Veer等, Mol. Cell. Biol., 4:2532-2534 (1984)を参照のこと。
【０００４】
Ｗｎｔ-１プロト癌遺伝子（ｉｎｔ-１）は、ウイルスＤＮＡ配列の挿入のためにマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）によって誘導される乳腺腫瘍から元々は同定された。Nusse及びVarmus, Cell 31: 99-109(1982)。成体マウスにおいて、Ｗｎｔ-１ｍＲＮＡの発現レベルは精子発生の後期段階において精巣にのみ検出される。Ｗｎｔ-１タンパク質は約４２ＫＤａであり、分泌のためのシグナル配列として機能しうるアミノ末端疎水性領域を含んでいる（上掲のNusse及びVarmus, 1992）。Ｗｎｔ-２の発現はマウス胎仔及び成体組織中で検出され、その分布はＷｎｔ-１の発現パターンとオーバーラップしない。Ｗｎｔ-３はマウス乳腺腫瘍形成に関連している。マウス胚でのＷｎｔ-３の発現は神経管と肢芽において検出されている。Ｗｎｔ-５ａ転写物は、９．５から１４．５日齢の発達中の前肢及び後肢において検出されており、最も高いレベルは肢の遠位端の外胚葉性頂に濃縮している。上掲のNusse及びVarmus (1992)。最近、Ｗｎｔ-ｘと呼ばれるＷｎｔ成長因子が、骨組織及び骨由来細胞でのＷｎｔ-ｘの発現の検出と共に記載されている（ＷＯ９５／１７４１６）。また記載されていることは、成熟骨芽細胞の維持におけるＷｎｔ-ｘの役割と、治療薬として又は骨関連疾病を治療するための他の治療薬の開発においてＷｎｔ-ｘ成長因子を使用することである。
Ｗｎｔは局所の細胞シグナル伝達に役割を担っている可能性がある。Peifer及びPolakis, Science, 287:1606-1609 (2000)を参照。生化学的研究により、分泌されたＷｎｔタンパク質の多くが、培地に自由に拡散するよりむしろ細胞表面又は細胞外マトリックスに付随して見出されうることが示された。Papkoff及びSchryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730 (1990)；Bradley及びBrown, EMBO J., 9: 1569-1575 (1990)。
【０００５】
Ｗｎｔ遺伝子における突然変異の研究は、成長調節及び組織パターニングにおけるＷｎｔの役割を示した。ショウジョウバエにおいて、無羽（ｗｇ）はＷｎｔ関連遺伝子をコードし（Rijsewik等, Cell, 50: 649-657 (1987)）、及びｗｇ変異は胚外胚葉、神経形成、及び成虫原基成長のパターンを変えた。Morata及びLawerence, Dev. Biol., 56: 227-240 (1977); Baker, Dev. Biol., 125: 96-108 (1988); Klingensmith及びNusse, Dev. Biol., 166: 396-414 (1994)。線虫においては、ｌｉｎ-４４が非対称的細胞分裂に必要なＷｎｔ相同体をコードする。Herman及びHorvitz, Development, 120: 1035-1047 (1994)。マウスにおけるノックアウト突然変異は、Ｗｎｔが脳の発達（McMahon及びBradley, Cell, 62: 1073-1085 (1990); Thomas及びCappechi, Nature, 346: 847-850 (1990)）、及び腎臓（Stark等, Nature, 372: 679-683 (1994)）、尾芽（Takada等, Genes Dev., 8: 174-189 (1994)）、及び肢芽についての胚原基の成長に必須であることを示した。Parr及びMcMahon, Nature, 374: 350-353 (1995)。乳腺におけるＷｎｔ−１の過剰発現は、乳腺過形成（上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)）、早熟性肺胞発達（Bradbury等, Dev. Biol., 170: 553-563 (1995)）、及び乳癌（Li等, Oncogene, 19:1002-1009 (2000)）をもたらす。
Ｗｎｔ-５ａ及びＷｎｔ-５ｂは７−８日齢のマウス胚の後及び側部中胚葉及び胚外中胚葉において発現される。上掲のGavin等, (1990)。これらの胚性ドメインは多能の造血前駆体及びＨＳＣが誘導されるＡＧＭ領域及び卵黄嚢組織に寄与する。Dzierzak及びMedvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995); Zon等, Gluckman及びCoulombel編, Colloque, INSERM, 235: 17-22 (1995)、１９９５年４月３−６日にフランス、パリにてのJoint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failureで紹介；Kanatsu及びNishikawa, Development, 122: 823-830 (1996)。Ｗｎｔ-５ａ、Ｗｎｔ-１０ｂ、及び他のＷｎｔは肢芽において検出され、Ｗｎｔ-７ｂに対して示されたように初期の骨の微環境の発達と様式における可能な役割を示している。上掲のGavin等(1990)；Christiansen等, Mech Devel., 51: 341-350 (1995);上掲のParr及びMcMahon (1995)。
【０００６】
Ｗｎｔに関するレビューには、Cadigan及びNusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305 (1997)を参照のこと。
Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)は、Ｗｎｔ-１によって形質転換されたマウス乳腺上皮細胞株Ｃ５７ＭＧにおいてアップレギュレートされる二つの遺伝子ＷＩＳＰ-１及びＷＩＳＰ-２、及び第３の関連する遺伝子ＷＩＳＰ-３のクローニングと特徴付けを記載している。（また、1999年5月6日公開のWO99/21998; 1999年5月6日公開のWO99/21999を参照のこと。）Pennica等は、これらのＷＩＳＰ遺伝子がＷｎｔ-１シグナル伝達の下流にあり、大腸癌でのＷＩＳＰ発現の異常なレベルが大腸腫瘍形成においてある役割を担っている可能性があると報告している。ＷＩＳＰ-１は最近β-カテニン調節遺伝子として同定されており、その発癌性活性の特徴付けは、ＷＩＳＰ-１がβ-カテニン媒介腫瘍形成に寄与しているかもしれないことを実証した（Xu等, Gene & Develop., 14:585-595 (2000)）。正常なラット腎臓細胞（ＮＲＫ-４９Ｆ）中でのＷＩＳＰ-１過剰発現は形態変換、加速された細胞成長及び亢進された飽和密度を誘導した。また、これらの細胞はヌードマウスに注入されると直ぐに腫瘍を形成し、ＷＩＳＰ-１が腫瘍形成にある種の役割を担っている可能性があることを示唆している（上掲のXu等, 2000）。ＷＩＳＰ−１はまた、特定の進行した徴候に関連する初期ヒト乳癌の４７％と、形質転換されたヒト乳癌細胞系とに過剰発現する。Xie等, Cancer Res., 61:8917-8923 (2001); Saxena等, Mol. Cell Biochem., 228:99-104 (2001); Michaelson等, Oncogene, 20:5093-5099 (2001)参照。また、特定のＷＩＳＰ−１変異体が、ヒトスキルス胃癌細胞の約８６％に過剰発現することが報告されている。Tanaka等, Oncogene, 20:5525-5532 (2001)参照。
【０００７】
Hurvitz等, Nature Genetics, 23:94-97 (1999)は、無関係の個人におけるＷＩＳＰ３の９つの異なった変異が常染色体性劣性骨格疾患である進行性疑性リウマチ様異形成症（ＰＰＤ）を伴うことが見出された。ヒト滑膜細胞、関節軟骨細胞、及び骨髄由来間葉前駆細胞においてＲＴ-ＰＣＲによるＷＩＳＰ３の発現がHurvitz等によって観察された。
１９９８年５月２２日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９８／２１２３６は、成長因子スーパーファミリーの２６ｋＤメンバーをコードしているヒト結合組織成長因子遺伝子-３（ＣＴＧＦ-３）を開示している。ＷＯ９８／２１２３６は、ＣＴＧＦ-３アミノ酸配列はヒト骨芽細胞ｃＤＮＡクローンから推定され、ＣＴＧＦ-３が卵巣、精巣、心臓、肺、骨格筋、副腎髄質、副腎皮質、胸腺、前立腺、小腸及び大腸のような複数の組織で発現されたことを開示している。
【０００８】
ヒアルロン酸（ＨＡ、ヒアルロネート又はヒアルロナンとも呼ばれる）は、文献において細胞外マトリックスの重要な成分として認識されている（例えば、Hardingham等, FASEB J., 6:861-870 (1992); Laurent等, FASEB J., 6:2397-2404 (1992)参照）。ＨＡは、皮膚及び間葉組織の成分であり、そこで傷の治癒、炎症、及び胚の形態形成の間の細胞遊走を促進する。（Knudson等, FASEB J., 7:1233-1241 (1993); Knudson等, CIBA Found. Symp., 143:150-169 (1989)。）ＨＡはまた、特定の種類の転移に関与することが報告されている（Naor等, CD44: Structure, Function and Association with the Malignate Process, Advances in Cancer Research, Academic Press (1997), 241-319頁。）ＨＡの最大濃度は皮膚と筋骨格に見られ、それが全身のＨＡのうちの50%を超える量を占める。（Banerji等, J. Cell Biol., 144:789-801 (1999)。）
様々な研究者により、ＨＡに結合するレセプターが報告されている。ＨＡについて同定されたレセプターの１つがＣＤ４４タンパク質である。（例えば、Culty等, J. Cell Biology, 111:2765-2774 (1990); Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990); Naor等, CD44: Structure, Function and Association with the Malignant Process, Advances in Cancer Research, Academic Press (1977), 241-319頁; Ropponen等, Cancer Res., 58:342-347 (1998); Masaki等, Cancer, 92:2539-2546 (2001)参照。）ＣＤ４４は、選択的スプライシングと差次的グリコシル化によって、単一の遺伝子から生成される細胞表面糖タンパク質のファミリーである。ＣＤ４４は、細胞外分子、特にヒアルロン酸を、細胞及び細胞骨格に連結する細胞接着レセプターとして機能すると考えられている（Wielenga等、上掲）。ＣＤ４４は上皮細胞、間葉細胞、及びリンパ球に発現する。（Lesley等, Adv. Immunol., 54:271-335 (1994)。）Wielenga等は、ＡＰＣ又はＴｃｆ−４に遺伝的欠陥を持つマウス及びヒトの腸管粘膜におけるＣＤ４４の発現を分析する特定の実験に基づいて、ＣＤ４４の発現をＷＮＴ経路により調節できることを報告した。（Wielenga等、上掲。）
【０００９】
現在までに特徴付けられているその他のＨＡレセプターには、ＲＨＡＭＭ（ヒアルロン酸媒介運動性のためのレセプターとも呼ばれる）という、形質変換されたリンパ球の表面に一過性に発現する５８ｋＤの細胞内タンパク質が含まれる（Hardwick等, J. Cell Biol., 117:1343-1350 (1992); Turley等, Exp. Cell Res., 207:277-282 (1993)）。繊維芽細胞におけるＲＨＡＭＭ発現が転移を早め、Ｈ−Ｒａｓ形質転換に重要な役割を果たすことが報告されている（Hall等、後述）。
ＨＡに結合する別のレセプターがBanerji等によって開示された（Banerji等、上掲）。Banerji等によって、「ＬＹＶＥ−１」と呼ばれるリンパ管壁上のレセプターが報告され、これは３２２残基のタイプ１の複合的膜ポリペプチドであり、ＣＤ４４レセプターと４１％の類似性を有する。ＨＡのＣＤ４４レセプターとは異なり、ＬＹＶＥ−１タンパク質は血管内には存在しない。加えて、ｌａｙｉｌｉｎ（Bono等, Mol. Biol. Cell, 12:891-900 (2001)）及びＨＡＲＥ（Zhou等, J. Biol. Chem., 275:37733-37741 (2000)）もまたＨＡレセプターとして開示された。
【００１０】
発明の概要
出願人は、驚いたことに、ＷＩＳＰ−１が、ＨＡＳ２（ヒアルロナン剛性２）、ＣＤ４４、及びＲＨＡＭＭ  ｍＲＮＡ発現、ＣＤ４４タンパク質合成、及びＨＡ分泌を誘発することができることを見出した。このような分子の誘発又は分泌は、癌細胞の成長、運動性及び／又は転移の可能性を促進させるか又は増大させ得る。よって、本発明により、例えばＷＩＳＰ−１アンタゴニストとそのようなアンタゴニストの使用法が提供される。ここに開示するアンタゴニストは、特に、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭに関連する哺乳動物の癌細胞又はその他病的状態のインビトロ、インサイツ、又はインビボでの診断又は治療にその用途を見出すことができる。
本発明の一実施態様では、単離させられたＷＩＳＰ−１アンタゴニストが提供される。   そのようなアンタゴニストは、ＷＩＳＰ−１抗体のような抗体を含んでもよい。   好ましい実施形態では、アンタゴニストは、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭのＷＩＳＰ−１誘導あるいは分泌を遮断してもよいし中和してもよい。そのような拮抗性の抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体あるいはヒト抗体であり得る。発明での使用が考慮されるＷＩＳＰ−１アンタゴニストは、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１変異体、その共有結合的な収束形態又はその融合タンパク質を含む。例えば、そのようなアンタゴニストは、ペグ化されたＷＩＳＰ−１、又は異種配列に融合したＷＩＳＰ−１、例えば、エピトープタグ又はロイシンジッパーを含む。本方法では、１種類のアンタゴニスト分子又は２種類以上のアンタゴニストの組合せの使用を考慮する。 
【００１１】
本発明の方法は、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの誘導或いは分泌を含め、ＷＩＳＰ−１に関連するか、それに起因する哺乳動物の病的状態又は疾病を治療する方法を含む。本治療方法では、ＷＩＳＰ−１アンタゴニストが、そのような病的状態又は疾病を有する哺乳動物に投与される。例えば、本発明は、癌細胞等の哺乳動物の細胞を、ＷＩＳＰ−１の誘導又はＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの分泌を減少、中和、又は遮断するのに有効な量の中の１以上のＷＩＳＰ−１アンタゴニストに接触させることを含む方法を提供する。細胞は、細胞培養、又は哺乳動物、例えば癌に苦しむ哺乳動物内にあってよい。
本発明は、さらに、１以上のＷＩＳＰ−１アンタゴニストを含む組成物を提供する。場合によっては、本発明の組成物は製薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。好ましくは、組成物は、病理的状態又は疾病を処置するために治療上有効な量の１以上のＷＩＳＰ−１アンタゴニストを含む。
【００１２】
本発明は、さらに、１以上のＷＩＳＰ−１アンタゴニストを含む製造品及びキットを提供する。
本発明は、さらに、小分子化合物、ポリペプチド又は抗体のような候補分子を同定するためのスクリーニングアッセイを行なう方法を提供し、それはＷＩＳＰ−１の誘導、或いはＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの分泌の遮断又は中和に対するアンタゴニストとして作用する。
【００１３】
本発明のさらなる特定の実施形態は単離されたＷＩＳＰ−１アンタゴニストを含み、それは少なくとも１種類の哺乳動物細胞において天然ＷＩＳＰ−１ポリペプチドによりＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４あるいはＲＨＡＭＭの誘導又は分泌を遮断するか、又は中和し、該アンタゴニストは、抗ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１変異体、又はその融合タンパク質から成る群から選択される。本アンタゴニストは、図９Ａ−９Ｃのアミノ酸２３−３６７を含む天然ヒトＷＩＳＰ−１ポリペプチド、或いはここに開示する配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によりコードされるアミノ酸を含むＷＩＳＰ−１の1以上のドメインに結合する抗ＷＩＳＰ−１抗体を含んでもよい。この抗ＷＩＳＰ−１抗体はキメラ、ヒト化、又はヒト抗体であり得る。
本発明は、さらに、ここに開示するアンタゴニストと担体を含む組成物を提供し、随意で担体は製薬的に許容可能な担体である。
【００１４】
その発明は、さらに、有効量のＷＩＳＰ−１アンタゴニストへ前記哺乳類細胞を露出することを含む、哺乳類細胞においてＷＩＳＰ−１誘導、或いはＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの分泌を遮断又は中和する方法を提供し、本方法の前記ＷＩＳＰ−１アンタゴニストは以下からなる群から選択される。
ａ）ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン；
ｂ）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンから成る群から選択される非タンパク質のポリマーに結合したＷＩＳＰ−１ポリペプチド；
ｃ）ＷＩＳＰ−１抗体；及び
ｄ）ＷＩＳＰ−１変異体
本方法で使用されるＷＩＳＰ−１ イムノアドヘシンは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＷＩＳＰ−１配列を含んでもよい。本方法で使用された抗ＷＩＳＰ−１抗体は、図９Ａ−９Ｃのアミノ酸２３−３６７、又は後述の実施形態に開示するＷＩＳＰ−１の領域の1つ以上に結合する天然ヒトＷＩＳＰ−１含んでもよい。本方法では、哺乳類細胞は癌細胞を含み、場合によっては、該細胞は大腸癌又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は脳腫瘍細胞（神経膠腫または膠芽腫等）を含む。
他の実施形態では、哺乳動物の癌の治療法が提供され、本方法は、前記哺乳動物に有効量のＷＩＳＰ−１アンタゴニストを投与することを含む。状況に応じて、前記方法において、アンタゴニストは、少なくとも１種類の哺乳類細胞の天然ヒトＷＩＳＰ−１ポリペプチドにより、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの誘発又は分泌を遮断、或いは中和し、前記アンタゴニストは抗ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１ イムノアドヘシン、及びＷＩＳＰ−１変異体から成る群から選択される。状況に応じて、アンタゴニストは癌細胞成長又は癌細胞転移を阻害するように作用できる。哺乳動物の癌は、大腸又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は神経膠腫または膠芽腫等の脳腫瘍細胞を含んでよい。状況に応じて、本方法に使用されるアンタゴニストは、癌細胞の成長又は転移を阻害又は低減する。また、本方法では、化学療法、放射線、プロドラッグ、細胞障害剤、成長阻害剤、又はサイトカインを哺乳動物に投与することもできる。
【００１５】
さらに別の特定の実施形態では、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１の配列によってコードされたアミノ酸を含むＷＩＳＰ−１ポリペプチド(実施例で後述する)の１以上の領域へ特異的に結合する抗体が提供される。状況に応じて、抗体はモノクローナル抗体である。状況に応じて、モノクローナル抗体は、ATCCに受入番号PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625あるいはPTA-4627としてそれぞれ寄託されたハイブリドーマによって分泌された3D11、11C2、9C10、5D4又は9C11抗体を含む。
さらに、ATCCに受入番号PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625又はPTA-4627として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産される3D11、11C2、9C10、5D4又は9C11モノクローナル抗体がそれぞれ結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体が提供される。
【００１６】
また別の特定の実施形態では、モノクローナル抗体3D11、11C2、9C10、5D4又は9C11を生産し、また受入番号PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625又はPTA-4627としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系、並びに受入番号PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625又はPTA-4627としてATCCに寄託されたハイブリドーマによってそれぞれ分泌されるモノクローナル抗体3D11、11C2、9C10、5D4又は9C11が提供される。
さらに、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドに結合し、ATCC受入番号PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625あるいはPTA-4627で寄託されたハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体の、前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドに対する結合を競争的に阻害する抗体を含む、単離された抗ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体がさらに提供される。
【００１７】
さらに、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドに特異的に結合し、(a) 受入番号PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625又はPTA-4627としてATCCに寄託されたハイブリドーマによってそれぞれ分泌される、3D11、11C2、9C10、5D4又は9C11抗体由来の配列を含むキメラ又はヒト化抗ＷＩＳＰ−１抗体が提供される。状況に応じて、このような抗体は、3D11、11C2、9C10、5D4又は9C11抗体由来の重鎖、軽鎖又は可変領域を含んでもよい。
抗ＷＩＳＰ−１抗体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンから成る群から選択される、1以上の非タンパク質ポリマー、或いは細胞障害剤又は酵素、或いは蛍光性化合物又は化学発光の化合物である放射性同位元素に結合し得る。
【００１８】
発明の詳細な説明
１．定義
「ＷＩＳＰポリペプチド」という用語は、天然配列ヒト及びマウスＷＩＳＰタンパク質及びその遺伝子が少なくともＷｎｔ-１によって誘導されるここに記載される変異体を意味する。この用語には、ＷＩＳＰ-１及びその変異体が含まれる。このようなＷＩＳＰ-１タンパク質は更に以下に記載され、１９９９年５月６日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／２１９９８、２００２年５月１４日発行の米国特許第６３８７６５７号及びPennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)に記載されている。
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-１相同体」及びそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-１タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって、あるいはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
【００１９】
「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」という用語は、天然由来のＷＩＳＰ-１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない、それぞれ図９のアミノ酸２３から３６７又は図９のアミノ酸１から３６７を含有する成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、図９のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基又は２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。本発明の他の実施態様では、図９のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基及び２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
【００２０】
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ＷＯ９９／２１９９８に示された配列番号：２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９を含む、ヒトＷＩＳＰ-１スプライス又は他の天然配列変異体の一つを含むヌクレオチド配列によってコードされるものであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
「ＷＩＳＰ-１変異体」という用語は、図９に示す推定アミノ酸配列又はその可溶性断片を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-１と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-１ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、図９の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失されたＷＩＳＰ-１ポリペプチド、或いはポリペプチドの内部配列又はドメインから一又は複数のアミノ酸残基が挿入され、又は欠失されたＷＩＳＰ−１ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは除かれる。好ましくは、このような変異体は後述するようにアンタゴニストとして作用する。
【００２１】
「細胞外ドメイン」、「ＥＣＤ」又は「分泌された」タンパク質は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的に有しない型を指す。タンパク質又はポリペプチドの「分泌された」型は、シグナル配列を含む場合と含まない場合がある。
ここで定義される「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄；又は（４）１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）のバッファー及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによるものである。
【００２２】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ニューヨーク: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＷＩＳＰの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２３】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２４】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（インシュリン及びここで記載されるインシュリン変異体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるＬ−α−アミノ酸すべてを意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含むことを意図する。アミノ酸はアルファベット１文字または３文字で表す：
Ａｓｐ    Ｄ    アスパラギン酸
Ｔｈｒ    Ｔ    トレオニン
Ｓｅｒ    Ｓ    セリン
Ｇｌｕ    Ｅ    グルタミン酸
Ｐｒｏ    Ｐ    プロリン
Ｇｌｙ    Ｇ    グリシン
Ａｌａ    Ａ    アラニン
Ｃｙｓ    Ｃ    システイン
Ｖａｌ    Ｖ    バリン
Ｍｅｔ    Ｍ    メチオニン
Ｉｌｅ    Ｉ    イソロイシン
Ｌｅｕ    Ｌ    ロイシン
Ｔｙｒ    Ｙ    チロシン
Ｐｈｅ    Ｆ    フェニルアラニン
Ｈｉｓ    Ｈ    ヒスチジン
Ｌｙｓ    Ｋ    リジン
Ａｒｇ    Ｒ    アルギニン
Ｔｒｐ    Ｗ    トリプトファン
Ｇｌｎ    Ｑ    グルタミン
Ａｓｎ    Ｎ    アスパラギン
配列表および図面において使用されている上記以外の1文字または３文字の略表記は、配列中の任意の位置における２つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを表す。
【００２５】
ここに同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ここで同定されたポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2プログラムの完全なソースコードを下記表に示す。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、以下の表に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下に登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有している。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００２６】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＷＩＳＰ−１の１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドのそのような生物学的活性の例には、少なくとも１種類の哺乳動物細胞におけるＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４、又はＲＨＡＭＭの誘発又は分泌が含まれる。アンタゴニストは直接的又は間接的に機能する。例えば、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドへの直接的結合の結果として、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和するよう機能することが可能である。また、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、例えば、他のエフェクター分子を遮断又は阻害した結果として、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和するために間接的にも機能する。
「ＷＩＳＰ−１ポリペプチドアンタゴニスト」なる用語は、ＷＩＳＰ−１の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和し、限定はされないが、抗体、イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１融合タンパク質、ＷＩＳＰ−１の共有結合的修飾形態、ＷＩＳＰ−１変異体及びその融合タンパク質、ＷＩＳＰ−１抗体、及びＷＩＳＰ−１の高次オリゴマー（二量体、凝集物）、或いはＷＩＳＰ−１のホモポリマー又はヘテロポリマー形態を含む。ＷＩＳＰ−１アンタゴニスト分子が部分的又は完全にＷＩＳＰ−１の生物学的活性を遮断、阻害又は中和するかどうかを決定するために、例えば、様々な細胞（実施例に記載）又は肺癌転移のインビボのマウスモデルへのアンタゴニスト分子の効果を評価するために、アッセイをおこなうことが可能である。そのようなアッセイは、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここに開示される方法で使用されるＷＩＳＰ−１アンタゴニストは、ここで記載されているようなアッセイで場合によっては測定することが可能な、少なくとも１種類のＷＩＳＰ−１活性を遮断又は中和することができる。
【００２７】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に、例えば単一のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和または阻害抗体を含む）、ポリペプチド特異性を持つ抗体組成物、一本鎖抗体、及び抗体断片を含む。本明細書で使用する「抗体」は、本明細書で述べる所望の拮抗的特性を示すものである限り、無傷免疫グロブリンまたは抗体分子、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（つまり、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体）、および免疫グロブリン断片（例えばFab、F(ab')2、またはFv）を含む。
典型的に、抗体は、特定の抗原に対する結合特性を示すタンパク質またはポリペプチドである。天然の抗体は、通常、２つの同一の軽(L)鎖および２つの同一の重(H)鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。通常、軽鎖の各々は、共有ジスルフィド結合により１つの重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのイソタイプによって異なる。また、各重鎖および軽鎖は、等間隔に並ぶ鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があって、それに複数の定常ドメインが続いている。各軽鎖の一端（ＶＬ）には可変ドメインが、他端には定常ドメインがある；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている（Chothia他, J. Mol. Biol., 186:651-663, 1985年; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596, 1985)。任意の脊椎動物の種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明確に区別される型の一方に割り当てることができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンを複数のクラスに分けることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG およびIgMがあり、これらのうち複数をさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3およびIgG-4、ならびにIgA-1およびIgA-2に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインを、それぞれ、α、δ、υ、γおよびμと呼ぶ。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、通常は無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；ダイアボディ(diabodies)；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２８】
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なる可変ドメインの特定の部分を表すために使用され、特定の抗原に対する特定の抗体の各々の結合および特異性に利用される。しかしながら、抗体の可変ドメインにおいて可変性は通常一様に分布してはいない。典型的には、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン両方の相補性決定領域（CDR）または高頻度可変領域と呼ばれる３つの染色体部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分をフレームワーク(FR)と呼ぶ。天然の重鎖および軽鎖の各可変ドメインは、大部分がβ−シート構造を取り入れ、３つのCDRにより連結された４つのFR領域を有しており、それらCDRはβ−シート構造を連結するループを形成するか、場合によってはβ−シート構造の一部を形成する。各鎖のCDRはFR領域によって互いに近接して保持されており、別の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat, E.A.他、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 米国国立衛生研究所（ＮＩＨ)，ベセズダ， メリーランド州、1987年参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与など、様々な作動体機能を示す。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。
【００２９】
ここで、モノクローナル抗体は特に、所望の生物学的活性、または特性を有するものである限りにおいて、指定の起源の種、免疫グロブリンのクラス、またはサブクラスに関係なく、定常ドメイン（例えば「ヒト化」抗体）、または重鎖を有する軽鎖、または別の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、または異種タンパク質との融合を有する対象とする抗体の（高頻度可変を含む）可変ドメインをスプライシングすることにより生成される「キメラ」抗体、ハイブリッド抗体、および組換え抗体、ならびに抗体断片（例えばFab、F(ab’)、F(ab’)2、およびFv）を含む。例えば米国特許第4,816,567号、およびMageらによるMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications 79-97ページ（Marcel Dekker, Inc.: ニューヨーク, 1987)を参照のこと。
このように、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは米国特許第4,816,567号に記載されたような組換えＤＮＡ法によって作ることができる(参照)。「モノクローナル抗体」は、また、例えばMcCaffertyらによるNature, 348:552-554（1990)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
【００３０】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の能力を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、および／またはヒト抗体をつくる既知の技術のいずれかを使用して、またはここに開示するようにして、つくられたものである。ヒト抗体のこのような定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチド、例えばマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は、様々な従来技術を使用して生成することができる。一実施態様では、ライブラリがヒト抗体を発現する場合、そのようなファージライブラリからヒト抗体を選択する（Vaughan他、 Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996年; Sheets他 PNAS, アメリカ合衆国、95:6157-6162,1998年; HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991年; Marks他, J. Mol. Biol., 222:581, 1991)。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が特異的にまたは完全に非活性化されているマウスに導入することにより生成することができる。実験によりヒト抗体の産生が確認されており、それは遺伝子の再配列、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含め、すべての面でヒトに見られる抗体産生に非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および以下の科学文献に開示されている：Marks他, Bio/Technology, 10: 779-783, 1992年; Lonberg他, Nature, 368: 856-859, 1994年; Morrison, Nature, 368:812-13, 1994年; Fishwild他, Nature Biotechnology, 14: 845-51, 1996年; Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826, 1996年; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995年。あるいは、ヒト抗体は、標的となる抗原を志向する抗体を産生するＢリンパ球（このようなＢリンパ球は個体から回収できるか、またはインビボで免疫することができる）の不死化により調製することもできる。 例えば、Cole他, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985年; Boerner他, J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991年; および米国特許第5,750,373号を参照のこと。
【００３１】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化により生成される免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界はまちまちであるが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、通常、約Cys226または約Pro230に位置するアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで延びていると定義される（ここではKabat他, 上掲による番号付けシステムを使用した）。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメインおよび１つのＣＨ３ドメインを含み、状況に応じてＣＨ４ドメインを含む。
ここで使用する「Ｆｃ領域鎖」という表現は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００３２】
ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」（「Cγ2」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基まで延びている。CH2ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのCH2ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、CH2ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、CH2ドメインは天然配列のCH2ドメインまたは変異体CH2ドメインとすることができる。
「CH3ドメイン」は、Fc領域におけるＣ末端からCH2ドメインまでの範囲（つまり、IgGの約341位のアミノ酸から約447位のアミノ酸）を含む。ここでは、CH3領域は、天然配列のCH3ドメインか、または変異体CH3ドメイン（例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたCH3ドメイン：米国特許第5,821,333号参照）とすることができる。このような変異体CH3ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性（例えば二重特異性）抗体をつくることができる。
【００３３】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトIgG1の約Glu216または約Cys226から約Pro230まで延びていると定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のIgGイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖S-S結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、または変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトIgG1ヒンジ領域である。
「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、C1q結合、補体依存性細胞障害作用（CDC）、Fｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ADCC）、食作用、細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター； BCR）の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Fc領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００３４】
「天然配列Fc領域」は、天然に由来するFc領域と同じアミノ酸配列を有する。「変異体ポリペプチドを含む。「変異体Fc領域」には、最低１つのアミノ酸修飾だけが天然配列のFc領域と異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異体Fc領域は、天然配列のFc領域、または親ポリペプチドのFc領域と比較した場合に、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域において少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここに開示する突然変異Fc領域は、天然配列のFc領域および／または親ポリペプチドのFc領域に対して、少なくとも約80%の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約90%、さらに好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用」および「ADCC」は、Fcレセプター（FcR）を発現する非特異性の毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞に境界抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ADCC、NK細胞を媒介する一次細胞はFcγRIIIのみを発現し、一方単核細胞はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、RavetchおよびKinetによる、Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)の、464ページの表３にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、インビボADCCアッセイ（例えば米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載）を行うことができる。そのようなアッセイに有用な作動体細胞には、抹消血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。あるいは、またはそれに加えて、目的とする分子のADCC活性をインビボで、例えばClynesらによる PNAS(アメリカ合衆国)、 95:652-656(1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００３５】
「ヒト作動体細胞」は、１以上のFcRsを発現する白血球であり、作動体機能を果たす。好ましくは、細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、ADCC作動体機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、抹消血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単核細胞、細胞障害性Ｔ細胞および好中球が含まれ、中でもPBMCとNK細胞が好ましい。作動体細胞はその天然供給源、例えば血液またはPBMCからここに開示するように単離することができる。
「Fcレセプター」および「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合するレセプターを表すために使用される。好ましいFcRは天然配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRはIgG抗体に結合するもの（ガンマレセプター）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラス のレセプターを含み、それには対立変異体およびそれらレセプターの変形スプライス形式が含まれる。FcγRIIレセプターはFcγRIIA（「活性化レセプター」）およびFcγRIIB（「抑制レセプター」）を含み、それらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであるFcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫レセプターのトリオシン（tryosine）に基づく活性化モチーフ（ITAM）を有する。阻害するレセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインにある免疫レセプター チロシンベース阻害モチーフ（ITIM）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997年に記載）。FcRはRavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991); Capel他, Immunomethods, 4:25-34(1994); およびde Haas他, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995)に説明されている。本明細書で使用する「FcR」という語は、将来同定されるものも含め、その他のFcRを包括する。この用語はまた、母性IgGの胎児への移転をつかさどる新生児レセプターであるFcRnを含む（Guyer他, J. Immunol., 117:587, 1976年;およびKim他, J. Immunol., 24:249, 1994)。
【００３６】
「補体依存性細胞障害作用」および「CDC」は、補体存在下における標的の溶解を指す。補体の活性経路は補体系（C1q）の第一成分の分子の、同族抗原と複合した分子（例えば抗体）への結合により開始される。補体の活性を評価するため、例えばGazzano-SantoroらによるJ. Immunol. Methods, 202:163(1996)に記載されているようなCDCアッセイを実行することができる。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、  Bio/Technology, 10:779-783(1992)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDRおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Schier他、Gene, 169:147-155 (1995);  Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「抗体の免疫特異的結合」に使用される「免疫特異的」という用語は、抗体の抗原混合部位と抗体により認識される特異的な抗原との間に発生する抗原に特異的な結合の相互作用を意味する。
【００３７】
「癌」、「癌性の」及び「転移」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌および肝細胞腫などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮癌、骨髄腫（多発性骨髄腫）、唾液腺癌、腎癌およびビルムス腫などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、、精巣癌、食道癌、並びに多種多様な頭部及び頸部の癌が含まれる。ここに開示する治療に好ましい癌には、乳癌、胃がん、肺癌、大腸癌又は直腸結腸癌、神経膠腫及び神経膠芽腫が含まれる。
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親-薬剤(parent drug)に比較して癌細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella ら, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等（編）, pp.147-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、後述の化学療法剤が含まれる。
【００３８】
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位体）、化学療法剤、及び小分子毒素または細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片および/または変異体を含むことを意図する。
「化学療法剤」は、癌などの状態の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１I及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジ��(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体���含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、例えば４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３９】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボにおいて、細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、S期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行を遮断する薬剤(S期以外の場所において)、例えばG1停止及びM期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なM期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール（登録商標）、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。G1を停止させるこれらの薬剤、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びara-CがS期停止へ波及する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００４０】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変化の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防、又は抑制（減少）することが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。関連疾患の治療では、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤による治療、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等に対してより敏感にし得る。
用語「有効量」とは、病理的状態の測定可能な改善又は縮小を引き起こす、誘発する又は結果的に生じるＷＩＳＰ−１アンタゴニストの最小濃度である。癌の治療法において、有効量とは、癌細胞の数、又は腫瘍容積の減少を引き起こす、誘発する、又は結果として生じるものである。更に、「治療的有効量」とは、少なくとも病理的症状を和らげるのに有効な、哺乳動物に対して投与されるＷＩＳＰ−１アンタゴニストの最小濃度（量）である。
【００４１】
「慢性」投与とは、急性の様式とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持するために連続的な様式で薬剤を投与することを指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ用、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ハムスターなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４２】
一又は複数の更なる治療薬と「組合わせた」投与には、いずれかの順番による同時的（併用の）及び継続的な投与が含まれる。
ここで用いられる「担体」は、製薬上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、使用用量及び濃度でそこに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性のものである。しばしば、生理学的に許容される担体の例は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(登録商標)、ヒアルロン酸（ＨＡ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００４３】
２．本発明の方法と組成物
以下の実施例で詳述するように、驚くべきことに、線維芽細胞におけるＷＩＳＰ-１の異所性発現により、ＨＡ生産、すなわち細胞表面及び培養培地におけるＨＡ生産の増大が引き起こされることがわかった。細胞表面のＨＡは、非足場依存性の成長及び腫瘍形成を亢進させ（Kosaki等, Cancer Res., 59:1141-1145(1999)、そして細胞増殖の接触阻止を低減させ、よって細胞移動を促進させる (Ichikawa等, J.Invest. Dermatol., 113: 935-939(1999); Itano等, Proc. Natl. Acad. Sci., 99:3609-3614(2002))。また、ヒアルロナン被膜形成は、細胞転移の可能性と関連付けられている(Zhang等, Cancer Res.,  55:428-433(1995); Toole等, J. Biol. Chem., 277:4593-4596(2002))。ＨＡシンターゼ(ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、及びＨＡＳ３)発現の分析により、ＷＩＳＰ−１がＨＡＳ２誘導を促進するが、ＨＡＳ１とＨＡＳ３ ｍＲＮＡのレベルは変化しないことが明らかになった。 ＨＡＳ２は成長因子とサイトカインにより上方制御されたＨＡ合成の主な標的である(Pienimaki等、J. Biol. Chem. 276:20428-20435(2001))。ＨＡＳ２の異所性発現は、ＨＡ分泌を増加させ、ヒアルロナン被膜形成を引き起こす(Kosaki等、上掲)。さらに、ＨＡＳ２は、心臓の形態形成の間における上皮の間葉へのヒアルロナン媒介性形質転換に重要であると考えられている(Camenisch等, J.Clin. Invest., 106:349-360 (2000))。上皮の間葉への移行は腫瘍湿潤及び転移においても重要であるので、 ＨＡＳ２は上皮性腫瘍の進行に重要な役割を果たすと思われる(Boyer等, Biochem.  Pharmacol., 60: 1091-1099(2000); Hay, Acta Anat., 154: 8-20(1995); Arias, Cell, 105:425-431(2001))。 これらの結果は、ＷＩＳＰ−１によって引き起こされたＨＡ分泌が腫瘍侵入と転移に重要であり得ることを示す。
ＷＩＳＰ−１はまた、２つのＨＡレセプター、即ちＣＤ４４とＲＨＡＭＭの発現を誘発する。ＨＡレセプターの発現を誘発し、ＨＡ生産を増大させることで、ＷＩＳＰ−１は、自己分泌及び／又はパラ分泌ループを活性化できる。ヒアルロナンがＣＤ４４及びＲＨＡＭＭと相互作用することにより、インビトロにおいて細胞運動と増殖が、インビボにおいて腫瘍成長と転移が促進される（Turley等, J. Biol. Chem., 277:4589-4592 (2002); Sy等, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 213:129-153 (1996); Hall等, J. Neurooncol., 26:221-229 (1995)）。
【００４４】
細胞遊走に対するＷＩＳＰ−１の影響を細胞創傷治癒アッセイにおいて時間経過顕微鏡観察により分析したところ、データによりＷＩＳＰ−１発現により細胞運動性が亢進されることが示された。さらに、単離された細胞において移動の増大がみられ、これによりＷＩＳＰ−１が自己分泌機構により作用できることが示された。但し、表面に付着したとき、精製された組換えＷＩＳＰ−１はＨＡＳ２とＣＤ４４の発現を促進した。この誘発は、ＷＩＳＰ−１がデコリンとの相互作用により係留されたときにさらに増大した。同様に、表面結合したときＷＩＳＰ−１は細胞運動性を促進し、これにより表面に係留されたときＷＩＳＰ−１がパラ分泌機構により作用できることも示された。本明細書の実施例は、ＷＩＳＰ−１によって誘発された細胞運動性はＣＤ４４により、抗ＣＤ４４抗体により移動を無くすことで媒介されたことを示す。ＷＩＳＰ−１が誘発した細胞運動性はまた、ＷｉＳＰ−１抗体により阻害された。さらに、ＷＩＳＰ−１の走触性活性は単細胞型に制限されず、ＷＩＳＰ−１は正常繊維芽細胞と大腸癌細胞遊走の両方を誘発した。
ＷＩＳＰ−１がＷｎｔ−１の下流のエフェクターであると考えられているので、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞系をＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１細胞に見られる表現型について分析した。 Ｗｎｔ−１の下流のＷＩＳＰ−１の役割と呼応して、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞はＨＡＳ２及びＣＤ４４を過剰発現し、親細胞系と比較してＣＤ４４タンパク質含有量が高かった。更に、Ｃ５７／Ｗｎｔ−１細胞は、培地中で自然に分散し、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞と同様の非分化反-微分されたspindloid形態を示した。
【００４５】
また、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１の乳房腫瘍のグループに対して発現分析行ったところ、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子導入マウス由来のすべての乳房腫瘍でＣＤ４４及びＨＡＳ２の発現の増大が検出された。これらの腫瘍では、ＷＩＳＰ−１表現は間質性線維芽細胞に局在化していたが、ＣＤ４４とＨＡＳ２は腫瘍上皮細胞に発現した。ＨＡＳ２発現についてはネガティブであったが、腫瘍周囲の間質は高レベルのＨＡを含み、一方腫瘍柔組織はＨＡについては弱い染色しか示さなかった。線維芽細胞がＨＡ生産の原因であると一般に受け取られているが、間質性ＨＡの起源は明確に確認されていない。ＨＡＳ２発現は柔組織にしか見られないので、ここで開示される実験結果は、腫瘍細胞が間質におけるＨＡ合成と蓄積の原因であることを示唆するものである。腫瘍周囲の間質におけるヒアルロナン蓄積は、いくつかの腫瘍タイプで頻繁に発生し、卵巣、胸部、前立腺、および大腸腺癌に報告されている(Ropponen等、Cancer Res., 58: 342-347(1998); Lipponen等、Eur. J. Cancer, 37: 849-856(2001); Auvinen等、Am.,  J. Pathol., 156: 529-536(2000); Anttila等、Cancer Res., 60、: 150-155(2000))。更に、高レベルのＨＡは不十分な分化、転移性の反応、及び好ましくない予後に関連していた。
ＨＡとＣＤ４４は腫瘍湿潤に関連しているため、ＷＩＳＰ−１を発現する細胞の転移の可能性をインビボで評価した。尾への接種後、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１細胞は、すぐに注射されたマウスの肺にコロニー形成し、ガン性腫瘍を形成した。 ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１細胞は有意な転移の可能性を示したが、ＮＲＫ細胞ではそのような可能性は示されなかった。組織学的な観察により、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１細胞が脈管構造に存在し、肺気道を湿潤したことが明らかになった。肺のコロニー形成は注射した細胞数、注射の時間、及びＷＩＳＰ−１発現に比例していた。さらに、転移性の可能性はＣＤ４４とＨＡＳ２の発現レベルに比例しており、またＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞を接種したマウスをＣＤ４４抗体又はＷＩＳＰ−１抗体で処置することにより、肺の腫瘍の数と大きさが大きく減少した。したがって、ＷＩＳＰ−１のレベルは、ヒアルロナン−ＣＤ４４メカニズムによって肺コロニー形成を促進したと考えられる。これは、肺の脈管構造における転移性細胞の腫瘍成長、転移、および保有に関するＣＤ４４の重要性とＨＡとの相互作用を示した既出の報告と一貫している(Sy等、上掲; Kogerman等、Proc. Natl. Acad. Sci.、94、: 13233-13238(1997))。
【００４６】
ＡＰＣ又はβカテニン突然変異によるＷｎｔ経路の活性化は典型的には結腸直腸癌に関連付けられるが、複数の証拠により、胸部腺癌を含む他の種類の癌にも寄与することが示唆されている（Polakis, Genes Dev., 14:1837-1851 (2000); Brown, Breast Cancer Res., 3:351-355 (2001)）。ヒト乳癌細胞系において、ＡＰＣのトランケーションとβカテニンレベルの上昇が認められた（Schlosshauer等, Carcinogenesis, 21:1453-1456 (2000)）。ＡＰＣ遺伝子の体細胞突然変異が原発性乳癌で見られた(Furuuchi等、Am. J. Pathol., 156:1997-2005 (2000))。加えて、突然変異を活性化するβカテニンはマウスの胸部腺癌を促進する（Michaelson等, Oncogene, 20:5525-5532 (2001)）。湿潤性乳腺管癌においてＷｎｔ−１とβカテニンのレベルの上昇が見られ、この場合予後も不良であった（Lin等, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:4262-4266 (2000)）。従って、特定の胸部腺癌に見られるＷＩＳＰ−１の発現は、Ｗｎｔ経路の活性に起因していると考えることができる。また、Ｔａｇｍａｎ分析により、ＷＩＳＰ−１が乳癌及び膠細胞腫瘍等の癌に過剰発現することが発見された。
少なくともこれらの理由で、ＷＩＳＰ−１アンタゴニストは癌等の様々な病理学的な異状の治療と診断に有用であると考えられる。よって、本発明は、所望の量のＷＩＳＰ−１アンタゴニストに細胞を接触させることを含む、哺乳動物の細胞におけるＷＩＳＰ−１の活性を調節、遮断、又は中和する方法を提供する。好ましくは、使用するＷＩＳＰ−１アンタゴニストの量は、癌細胞の成長、転移、又は運動性を低減、または阻害するのに有効な量である。これは例えば、実施例で後述する方法に従い、インビボ又はエクスビボで実施できる。このようなＷＩＳＰ−１アンタゴニストによって治療されるべき例示的状態又は疾病には、臨床的に癌と呼ばれる哺乳動物の状態が含まれる。
【００４７】
ここでは診断方法も提供される。例えば、アンタゴニストを使用して湿潤性又は転移性癌を検出できる。アンタゴニスト分子は、例えば試料中の転移性癌を検出又は定量化するためのアッセイに使用できる。試料、例えば哺乳動物から採取した細胞を標識したアンタゴニストの存在下でインキュベートし、試料中に結合した標識アンタゴニストの検出を実施することができる。
本方法に使用できるアンタゴニストは、限定しないが、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１を含む融合タンパク質、ＷＩＳＰ−１の供給結合的に修飾された形態、ＷＩＳＰ−１変異体、その融合タンパク質、及びＷＩＳＰ−１抗体を含む。アンタゴニストの作成に使用できる様々な技術がここに開示される。例えば、ＷＩ］ＳＰ−１ポリペプチド調製のための方法と技術が開示される。ポリペプチドのさらなる変形、及びＷＩＳＰ−１に対する抗体も開示される。
【００４８】
ここに開示される完全長天然配列ＷＩＳＰ−１ポリペプチドに加え、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド変異体が調製可能であることも考慮される。ＷＩＳＰ−１変異体は、コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入すること、及び／又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。本技術分野の当業者が周知のように、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、或いは膜固着特性の変更等のアミノ酸変化により、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの翻訳後のプロセスが変化し得る。
ここに開示されるＷＩＳＰ−１ポリペプチドの変異形態を、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載されているような保存的及び非保存的突然変異のための技術及びガイドのいずれかを用いて作成することができる。変異とは、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を生じさせるような、ポリペプチドをコードする１以上のコドンを置換、削除又は挿入することであってよい。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それ以外のアミノ酸がＷＩＳＰ−１ポリペプチドの１以上のドメインにあると変異となる。所望の活性に逆効果を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は削除したらよいかの判断は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの配列を既知の相同なタンパク質の配列と比較し、相同性の高い領域においてはアミノ酸配列の変更数を最小限にすれば指標となる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を同様の構造及び／又はキメラ特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばロイシンをセリンに置き換える、つまり保存的なアミノ酸の置き換えとしてよい。場合によっては、挿入又は削除は約１−５のアミノ酸の範囲で行われる。可能な変異は、配列中のアミノ酸を体系的に挿入、削除又は置換し、完全長又は成熟天然配列により示される活性に関して結果的に生じる変異を試験することにより決定できる。
【００４９】
ここにＷＩＳＰ−１ポリペプチド断片が提供される。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較したとき、例えば、Ｎ末端又はＣ末端で切断されているか、又は内部残基を欠損している。一部の断片は所望のＷＩＳＰ−１ポリペプチドの生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＷＩＳＰ−１ポリペプチド断片は、多数の従来技術のいずれかにより調製できる。所望のペプチド断片を化学的に合性することができる。別の方法では、酵素消化、例えば特定のアミノ酸残基によって画定される部位においてタンパク質を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することにより、ポリペプチド断片を生成する。また別の適切な技術では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片の単離と増幅を行う。ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ断片の所望の終端を画定するオリゴヌクレオチドを５’及び３’プライマーが使用される。
【００５０】
特定の実施形態における、対象となる保存的置換を以下の表の好ましい置換の欄に示す。このような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表の例示的置換の欄に示した置換、又はアミノ酸の分類に関して後述するような置換をさらに導入し、産出物をスクリーニングする。
表
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ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はら旋構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対して大きく効果を異にする置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe
【００５１】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このようにして置換された残基も、保存的置換部位、またはさらに好ましくは残りの（非保存的）部位に挿入することができる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット変異［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択変異［Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術などをクローニングされたＤＮＡに対して行ってＷＩＳＰ−１ポリペプチド変異ＤＮＡを生産することができる。
【００５２】
また、隣接する配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのに、スキャニングアミノ酸分析も用いることができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖高次構造を変える可能性が低いので、これらの群の中の典型的に好適なスキャンニングアミノ酸である[CunninghamおよびWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは、最も普通のアミノ酸であるので典型的に好ましい。さらに、隠れた及び露出した位置の両方で頻繁に見いだされる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が適当な量の変異を生じない場合、アイソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
また、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をＷＩＳＰ−１ポリペプチドに付加することにより、その安定性を向上させることができる。
【００５３】
以下の説明は、主として、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるＷＩＳＰ−１ポリペプチドの生産に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＷＩＳＰ−１ポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術を使用することによって又は自動によりインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するＷＩＳＰ−１ポリペプチドを生成させてもよい。開示される方法及び技術は、ＷＩＳＰ−１変異体、ＷＩＳＰ−１及びＷＩＳＰ−１抗体の修飾形態にも同様に適用可能である。
【００５４】
１．ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＷＩＳＰ−１ポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＷＩＳＰ−１ポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成法）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(ニューヨーク: コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1995)］。
【００５５】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られ、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００５６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＷＩＳＰ−１ポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００５７】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００５８】
グリコシル化ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【００５９】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＷＩＳＰ−１は直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＷＩＳＰ−１ポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６０】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバチルスのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
【００６１】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＷＩＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００６２】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【００６３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＷＩＳＰ−１ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００６４】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＷＩＳＰ−１ポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【００６５】
４．宿主細胞の培養
本発明のＷＩＳＰ−１ポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００６６】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＷＩＳＰポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＷＩＳＰ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００６７】
６．ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの精製
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＷＩＳＰ−１ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, ニューヨーク (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のＷＩＳＰ−１ポリペプチドの性質に依存する。
【００６８】
ＷＩＳＰ−１の可溶性型を本方法においてアンタゴニストとして使用することができる。このようなＷＩＳＰ−１の可溶性型は、以下に示すような変形を含む（イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーへの融合によるものなど）。イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシンは、完全長ポリペプチド、並びにＷＩＳＰ−１の可溶性型又はその断片のような、ＷＩＳＰ−１の様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
最も単純で最も直接的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン（例えばＷＩＳＰ−１）の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をＣ末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端融合は不可能である。
【００６９】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(ｂ)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
【００７０】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；IgMは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される： 
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ； 
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【００７１】
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3' 末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【００７２】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【００７３】
他の実施態様において、ＷＩＳＰ−１又はＷＩＳＰ−１アンタゴニストは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、又はポリグルタミン酸のような同様の分子に、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); 米国特許第5,716,805号; WO94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniateis等, Nature, 341:24 (1989); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＷＩＳＰ−１又はＷＩＳＰ−１アンタゴニスト分子の５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００７４】
また、本発明のＷＩＳＰ−１ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＷＩＳＰ−１ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
抗ＷＩＳＰ−１抗体は個々に開示する方法に使用できると考えられる。そのような分子の例には、癌細胞の成長、転移又は運動性を低減し得る中和又は遮断抗体を含む。抗−ＷＩＳＰ−１は、モノクローナル抗体であってもよい。
【００７５】
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)等により記載されたハイブリドーマ法によって調製することができる。ハイブリドーマ法においては、免疫剤を用いてマウス、ハムスター又はその他の適当な宿主動物通常通りに免疫し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＷＩＳＰ−１ポリペプチド又はその融合タンパク質、例えばＷＩＳＰ−１ ＩｇＧ融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBLs」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００７６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＷＩＳＰ−１に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【００７７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００７８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［Morrisonら, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、ＷＩＳＰ−１の特異性を持つ１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
【００７９】
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を用いる合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いることにより、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築できる。この目的のための適切な試薬の例は、iminothiolate及びメチル−４−mercaptobutyrimidateである。
一本鎖Ｆｖ断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産及び操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
【００８０】
(i)ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８１】
(ii)ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 及びBrodeur他, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【００８２】
Mendez他(Nature Genetics 15: 146-156 [1997年])はこの技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII（Xenomouse II）」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性JHセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖座および軽鎖座の生殖細胞系に取り込むことにより達成された。ゼノマウスIIは、約66VH遺伝子、完全なDH及びJH領域および３つの異なる定常領域（μ、δおよびχ）を含む1,020kbのヒト重鎖遺伝子座を有し、また32Vκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子再配列、構成、およびレパートリーを含め、ヒトに見られる抗体に全ての面で非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス座における遺伝子再配列を抑制する内因性JHセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks他, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子と軽鎖Ｖ領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したＶドメイン遺伝子の自然に生じる変異体（レパートリー）のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、nM範囲での親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー（「マザーオブオール ライブラリー（the Mother-of-all libraries）」とも呼ばれる）を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性および特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子と軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒ���抗体が得られる（1993年4月1日公開のPCT特許出願WO 93/06213を参照）。伝統的なCDR移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワークまたはCDR残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
後述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体、抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、そのような二量体または多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、または削除し、よって架橋結合を防止する。
【００８３】
(iii)二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＷＩＳＰ−１に対してである。例えば、ＷＩＳＰ−１又はＷＩＳＰ−１変異体及び別のＣＮＮファミリーメンバー（例えばＷＩＳＰ−２、ＷＩＳＰ−３、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、又はＮｏｖ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明に含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の発現に基づく。Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTrauneckerら, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【００８４】
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開第94/04690号に開示されている。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００８５】
(iv)ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために（WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【００８６】
(v)抗体断片
一部の実施態様においては、抗ＷＩＳＰ−１抗体（マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む）は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimotoら, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2を形成し、F(ab')2分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からFv、FabまたはF(ab')2断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日公開のWO94/29348および米国特許第4,342,566号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Fab断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。各Fab断片は単一の抗原結合部位、および残存性Fc断片を持つ。ペプシン処理により、２つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるF(ab')２が生成される。
抗原消化で生成されるFab断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（CH1）も含む。Fab’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む、重鎖のCH1ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてFab断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab'として、ここではFab'-SHと記載する。F(ab')２抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００８７】
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する（JefferisおよびLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; WrightおよびMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; WittweおよびHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、および、糖タンパク質の高次構造及び提示される3次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用（HefferisおよびLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、アガラクトシル化IgGにおいて、オリゴ糖部分はCH2内空間の外に「とび出し(flip)」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている（Malhotra他, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるCAMPATH-1H（ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgG1抗体）からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解（CMCL）が完全に低減したが（Boyd他, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、DMCLの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性（ADCC）に影響することが報告されている。特に、バイセクティングGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnTIII）のテトラサイクリン制御発現を持つCHO細胞で、ADCC活性が向上したことが報告されている（Umana他, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる１以上の炭水化物部分を除去し、抗体に１以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成（グリコシル化パターン）、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、１以上のグリコシル化部位の、除去、変更、および/または付加を行うことにより調製することができる。
【００８８】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。Ｏ−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つの付着を指す。５−ヒロドキシプロリン、または５−ヒドロキシリシンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ−結合グリコシル化部位について）上述のトリペプチド配列の１または複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、（Ｏ−結合グリコシル化部位について）元の抗体の配列に対して１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加または置換することにより行ってもよい。
【００８９】
抗体のグリコシル化（グリコシル化パターンを含む）は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療法としての、組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類、例えば抗体が、まれに天然細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される（例えばHse他, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え生産の間のグリコシル化に影響を与える因子には、成長形態、媒地、製剤、培養密度、酸素添加、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている（米国特許第5,047,335号、米国特許第5,510,261号および米国特許第5,278,299号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ（Endo H）の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら同様の技術は当技術分野において既知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、NMR、質量分析、HPLC、GPC、単糖成分分析、連続酵素消化、および高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するHPAEC-PADなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理（通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ／エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う）、主にＯ−結合構造を遊離するのに過酷なアルカリ環境を使用しての除去、およびＮ−結合とＯ−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
三重特異性抗体も本発明の範囲に含まれる。そのような抗体は、例えばIliades等、上掲尾帯Kortt等, 上掲に記載されている。
【００９０】
本発明の抗体は、細胞障害剤（例えば毒素分子）又はプロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145号を参照)を活性な抗ガン剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、修飾することができる。例えばWO88/07378及びUS4,975,278を参照されたい。この技術は「抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法」（ADEPT）とも呼ばれる。
ADEPTに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗ガン剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；カスパーゼ−３などのカスパーゼ；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００９１】
酵素は当該分野においてよく知られている技術、例えばヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えDNA技術を使用して作成することができる(Neubergerら, Nature 312:604-608(1984))。
さらなる抗体の修飾を考慮する。例えば、抗体を様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマー、或いはポリグルタミン酸等のその他の分子の１つに結合させることができる。または抗体を、例えばコアセルベーション技術又は界面重合（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）により、コロイド性薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に調製したマイクロカプセルに封入することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)に開示されている。抗体の血清半減期を増加させるため、例えば、米国特許第5,739,277号に記載のように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に包含してもよい。ここで使用する「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、インビボでＩｇＧ分子の血清半減期を増加させるＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【００９２】
製剤
ここに開示されるＷＩＳＰ−１アンタゴニストを状況に応じて担体に使用する。適切な担体とその製剤は、Osolらにより編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed.., 1980,Mack Publishing Co.に記載されている。典型的には、適当量の製薬的に許容可能な塩が製剤を等張にするために担体中に使用される。担体の例には、生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液が含まれる。担体のｐＨは好ましくは約５から約８、より好ましくは約７．４から約７．８である。例えば投与経路及び投与される薬剤の濃度に応じてある種の担体がより好ましいことは当業者には明らかであろう。担体は凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態をとりうる。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００９３】
また、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。
またここに開示されるアンタゴニストは、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.編(1980)に開示されている。
【００９４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、活性剤を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。
【００９５】
治療の形態
ここに開示される分子は様々な病理的状態の治療に有用である。これらの状態は、ここに開示されるアンタゴニストの１以上の投与により治療することができる。ここに開示される様々な病理的状態を持つ哺乳動物の診断は、専門の医師により行うことができる。診断技術は、例えば哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断又は検出を可能にする従来技術を使用できる。例えば、限定されないが、触診、血液分析、レントゲン、ＮＭＲ等を含む技術により癌を識別できる。
アンタゴニストは、公知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により投与される。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ流入によって実施することもできる。また、従来技術に開示されている遺伝子治療技術を使用してアンタゴニストを使用することもできる。
【００９６】
アンタゴニストの投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。１回、又は複数回の投与を行うことができる。単独に使用されるアンタゴニストの効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti等, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
アンタゴニストをインビボで投与する場合、通常の投与量は、投与経路に応じて、１日当たり哺乳動物の体重の約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。特定の容量及び投与方法は、例えば米国特許第4,657,760号、同第5,206,344号、又は5,225,212号等の文献に指標が開示されている。異なる製剤は異なる治療化合物及び異なる疾患に効果を有し、１器官又は組織を標的とする投与には、例えば、別の器官又は組織への投与とは異なる投与方法が必要となると考えられる。当業者であれば、投与されなければならないアンタゴニストの用量は、例えばアゴニスト又はアンタゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬物又は治療法に応じて変化することを理解するであろう。
【００９７】
細胞の型及び／又は病気の重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ)のアンタゴニスト抗体が患者への最初の候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。
本発明の方法では1種類のアンタゴニストを使用することができる。例えば、１のＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン分子を投与できる。或いは、専門の医師であれば本方法にアンタゴニストの組合せ、例えばＷＩＳＰ−１イムノアドヘシンとＷＩＳＰ−１抗体の組合せの使用を選択できる。また本発明に別の療法を加えることも考慮できる。１以上の療法は、限定されないが、従来技術に既知であり、上述の説明でさらに定義した放射線治療、サイトカイン、成長阻害剤、化学療法剤、細胞毒性剤、チロシンキナーゼ阻害薬、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、血管形成阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬を含む。加えて、腫瘍抗原を標的とする治療的抗体、例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、並びに抗血管形成抗体、例えば抗ＶＥＧＦに基づくものが含まれる。
【００９８】
化学療法剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、有能な実務家により経験的に決定されて使用される。このような化学療法剤の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams &amp; Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、アンタゴニスト等の投与の前でも後でもよく、またはそれと同時に与えてもよい。例えばアンタゴニストは、抗エストロゲン化合物、例えばそのような分子に知られている投与におけるonapristone（EP616812参照）等の抗プロゲステロン又はタモキシフェン等の抗エストロゲン化合物と組み合わせてもよい。
他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子（ＶＥＧＦ）、又はその他ＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）も投与することが望ましい。或いは、ここに開示される同じ抗原又は２以上の異なる抗原に結合する加えて２以上の抗体を患者に同時投与できる。場合によっては、加えて１以上のサイトカインを患者に投与することが効果的である。１実施形態では、ここに開示するアンタゴニストと成長阻害剤を同時投与した。例えば、成長阻害剤をはじめに投与し、続いて本発明のアンタゴニストを投与した。
アンタゴニストと１以上の他の療法は、同時に又は逐次的に投与することができる。アンタゴニストの投与に続いて、インビトロの治療細胞を分析することができる。インビボ治療があった場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家によく知られた様々な方法でモニターすることができる。
【００９９】
製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤はアンタゴニストを含む。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器を更に具備する。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
以下の実施例は例示のみを目的としており、如何なる意味でも本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書において引用した全ての特許文献及び非特許文献の全体ををここでの参照により本発明に包含する。
【実施例】
【０１００】
特に断らない限り、実施例で引用する市販の試薬は、製造者の指示に従って使用した。   ATCC受入番号によって、以下の実施例、および本明細書全体にわたって同定された細胞の供給源は、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス(VA)である。特に明記しない限り、本発明は、上記及び以下の教科書に記載されているような組換えＤＮＡ技術の標準的方法を使用する：Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールド  スプリング  ハーバー出版 ニューヨーク, 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, コールド  スプリング  ハーバー出版, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I.Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
以下の実施例において言及される分析および材料の説明は、以下の文献に提供されている：
タンパク質及び抗体：既に開示されているようにして、完全長ヒトＷＩＳＰ−１-Ｆｃ融合タンパクを発現し、精製した（Desnoyers等, J. Biol. Chem., 276:47599-47607 (2001)）。精製されたマウス抗ネズミCD44抗体（クローンOX49）はBD Bioscience（ベッドフォード・マサチューセッツ州）から入手した。マウスIgG2aアイソタイプ制御抗体は、Pharmingenから入手した。FITC抱合されたマウス抗ネズミCD44はSerotec（ローリー、ノースカロライナ州）から入手し、FITC抱合されたマウスIgG1アイソタイプ制御抗体はDAKO（デンマーク）から入手した。ネズミ抗マウスCD44（クローンKM114）はPharmingenから入手した。アクチン抗体（クローンC4）はICN biomedicals（オーロラ、オハイオ州）から入手した。ネズミの抗ヒトＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体を生成し、2002年5月14日発行の米国特許第6,387,657号の実施例に記載されている免疫原およびプロトコル及び試薬としてＷＩＳＰ−１−Ｆｃを使用して選択した。下に注記されているように、この種のモノクローナル抗体５つは、出願人によってATCCに寄託されたものである。
【０１０１】
細胞および組織標本：NRK-49FおよびSW480細胞系（ATCC、Manassas、VA）を、10%のウシ胎仔血清（FBS）で補充される高ブドウ糖ダルベッコ変法イーグル培地（HGDMEM）において維持した。親C57MG、Wnt-1（C57MG/Wnt-1）を発現しているC57MG、hWISP-1（NRK/WISP-1H）を高度に発現しているNRK-49F、低レベルのhWISP-1（NRK/WISP-1L）を発現しているNRK-49F/および空のベクター（NRK/の統制）を含むNRK-49Fは、アーノルド・レビン（プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州）から入手したもので、2.5の.mu.g ml-1ピューロマイシン（Xu等、Genes Dev.（14）：585-595（2000））を含んでいる培地で維持された。ハロルド・ヴァーマス（国立癌研究所、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド州）から入手したWnt-1遺伝子組換えマウスは、ジャクソンLaboratories（バー ハーバー、マサチューセッツ州）から入手したp53ヌルマウスを繁殖させ、Wnt-1遺伝子組換え／p53ノックアウト・マウスを生成した。胸部腫瘍および乳腺管上皮の標本を、分析のためのそれらのマウスから切除した。
分子除外アッセイ：上述のように、若干の変更を加えて赤血球沈降アッセイを用いた。（Knudson等、J. Cell Sci., 99：227-235（1991））。NRK/WISP-1（（WISP-1を形質移入した正常ラット腎臓繊維芽細胞;例えばXu等, Genes Dev.14：585-595（2000））、及びNRK／制御細胞（正常ラット腎臓繊維芽細胞;アーノルド・レビン、プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州から入手）（1×105細胞/ウェル）ファルコン６ウェルプレート（Becton Dickinson, Franklin Lanes, NJ）に接種し、37℃（5%のＣＯ２）で一晩10%のウシ胎児血清（FBS）（Life Technologies、Gaithersburg、MD）で補充される高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地で維持した。その翌日、培地を取り除き、750μｌ PBS/0.1%のBSA（Boehringer Mannheim, Indianapolis、IN）中の108のヒツジRBCs（Inter-Cell Technologies、Hopewell、NJ）を加え、15分間定着させた。細胞はNikon Diaphot 300倒立顕微鏡を使用して観察し、デジタル画像をSONY DKC-5000デジタル写真カメラ（日本）を使用して得た。
【０１０２】
培養細胞のヒアルロナン染色：前述の方法に若干の変更を加えてヒアルロナン染色を行った（Pienimaki等、J. Biol. Chem.,276：20428-20435（2001））。NRK/WISP-1およびNRK/制御細胞（8-10×103）を８つのウェルプラスチックチャンバースライドにおいて、一晩37度（5%のCO2）で維持した（上記）。その翌日、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、室温で20分間のPBSの4%のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞をPBSで洗浄し、非特異的結合部を1%のウシ血清アルブミン（BSA）および0.1%のトリトンX-100（Calbiochem、LaJolla、CA）を含む蒸留水で30分間飽和させた。ビオチン化されたHA結合タンパク質（HA-BP）（Seikagaku America, Falmouth、MA）（PBS/3%のBSA中5μg/ml）を加え、室温で一晩インキュベートした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、TBSおよび1%/BSA中の１：１０００でＦＩＴＣ抱合ストレプトアビジン（DAKO、Carpinteria、CA）で３０分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、1μｇ／ｍｌのHoechst 33342（Molecular Probe、Eugene、OR）を含むVectashield（Burlingame、CA）を使用して取り付けて、Nikon Eclipse800蛍光顕微鏡の下で視覚化した。画像は、アップル社のＧ３コンピュータにより−４０℃で作動するPhotometrics 300 CCDカメラによって得た。同じ手順を使用して、Wnt-1遺伝子組換えマウス由来の乳腺腫瘍の凍結切片を着色した）。
リアルタイムRT-PCR：報告されているように、リアルタイムRT-PCRを使用して相対的ＲＮＡ発現レベルを決定した（Winer等, Anal. Biochem., 270:41-49 (1999)）。完全ＲＮＡを、製造業者のプロトコル（Molecular Research Center）を使用してTri-Reagentを有する細胞から抽出した。特定のプライマーおよび蛍光発生プローブを設計して使用し、遺伝子発現レベルを増幅し、定量化した。遺伝子の特異的シグナルは、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ハウスキーピング遺伝子のそれに標準化した。３セットのデータを各状態について平均した。全てのTaqMan RT-PCR試薬は、Applied Biosystems (Foster City, CA）から購入した。遺伝子発現に関して組換え型WISP-1の効果を試験するために、シャーレ（35mm）をPBS中75μg／ml-1のhWISP-1-Fcにより4℃で一晩コーティングした。翌日、細胞（3×105細胞/皿）をコーティングした表面に広げ、18時間後に発現分析を行った。特定の場合には、細胞を蒔く前に、塗布面を洗浄し、室温でさらに2時間処理した。
【０１０３】
FAC分析：細胞をトリプシン処理によって収集し、PBSで洗浄し、１μｇ  ｍｌ−１のFITC抱合した抗CD44（Serotec, Raleigh, NC）またはアイソタイプ対照Ab（DAKO,デンマーク）を含むPBS 1% BSA/20%グルコース中でインキュベートした。細胞を同じ緩衝液で洗浄し、EPICS XL-MCL（Coulter, Miami, FL）で分析した。
ウエスタンブロット：NRK/CおよびNRK/W1Hを、10cm2のプレートで集密に培養した。細胞をPBSで洗浄し、5分間TBS中の1%トリトン-X100  300μｌで抽出した。抽出物にアセトンの10容量を加えることによってタンパク質を沈殿させた。試料を還元し、変性し、4-20%の勾配SDSポリアクリルアミドゲルに搭載した。ゲルをPVDF膜に移し、抗ラットCD44抗体（OX49）または抗マウスCD44（KM114）によって１μg/mlの濃度でプローブし、HRP抱合抗マウスIgG二次抗体およびアマシャムECL検出試薬を用いて検出した。試料中のアクチン検出をローディング対照として使用した。
【０１０４】
拡散（scatter）アッセイ：細胞を低濃度（〜1000細胞/ウェル）で24ウェルプレートに分配し、3日間に亘ってコロニーを形成させた。細胞はDiff-Quik（Dade Behring, Newark,DE）を使用して染色したところ、コロニーが顕微鏡で観察された。
細胞創傷治癒アッセイ：細胞移動は、若干の変更を加えた前述の細胞創傷治癒分析を使用して評価した（Pienimaki等、J. Biol. Chem. 276：20428-20435（2001））。簡潔には、集密になるまで細胞を培養した。使い捨ての黄色のチップを備えたマイクロピペットを使用して細胞層に1本の線（〜1mm）を引いた。不純物を除去した領域の細胞移動を15時間に亘って微速度鏡検によってモニターした。この期間の後、細胞によって新しく占有された領域を、段階的にμm単位で調整されるNIH画像ソフトウェアを使用して測定した。
経時的顕微鏡検査法：細胞をHGDMEM/10%のFBS中に分配し、それらのランダムな遊走を経時的顕微鏡検査法を使用して15時間観察した。細胞に覆われた距離を、段階的にμm単位で調整されるNIH画像ソフトウェアを使用して測定した。
【０１０５】
遊走アッセイ：前述のようにして、変更ボイデンチャンバシステムを使用して肝走性を測定した（Bourguignon等, J. Biol. Chem., 275:1829-1838 (2000)）。８μm多孔性24ウェルフォーマットPET膜フィルター（ファルコン）の下側をPBS中の５０μｌのタンパク質（50μg ml-1）で一晩４℃でコーティングした。コーティングされた挿入物を無血清培地ですすぎ、0.5ml中０．５×１０５のNRK細胞を上部チャンバに加えた。下部チャンバに同じメディア0.75mlで満たし、プレートは37℃で一晩インキュベートした。翌日、上部チャンバを綿棒で拭き、挿入物の下部に移動した細胞をDiff-Quik Stainキット（Dade Behring Inc.）で染色し、顕微鏡の下で数えた。３組のデータを各状態について平均した。
特定の場合、コーティングした挿入物を洗浄し、室温でさらに2時間処理した。
インサイツハイブリッド形成： NM_018865（上部-5’GGCTGCCATCTGTGACCCA（配列番号１２）及び下部-5’CATAGGACCT GCCGGGAGAA A（配列番号１３））のｎｔ４４０−１１８０に亘るマウスＷＩＳＰの７４０ｂｐ断片、又はNM_018865（上部-5’GCCGTGGCAGTCCTGAGGG（配列番号１４）及び下部-5’CAGCACCGGG CATTGACGTT A（配列番号１５））のｎｔ２０４−９１０に亘るマウスＷＩＳＰ−１の７０６ｂｐ断片、又はM27129（上部-5’TGGAGAAAAATGGCCGCTAC A（配列番号１６）及び下部5’TGGGGTGCTC TTCTCGATGG（配列番号１７））のｎｔ１４４−６０８に亘るマウスＣＤ４４の４６４ｂｐ断片、又はNM_008216（上部-5’GGACAAATCGGCCACGTACA T（配列番号１８）及び下部5’CTTGCTCCAT CGGGTCTGC（配列番号１９））のｎｔ９２７−１５５７に亘るマウスＨＡＳ２の６３０断片のいずれかを増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。プライマーは、増幅産物からセンスまたはアンチセンスプローブのインビトロでの転写を可能にする27-ヌクレオチドT7またはT3 ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードしている拡張部を含んでいた。（Lu等、Cell Vision（1）：169-176（1994））。全ての組織を4%のホルマリンに固定しパラフィン包埋した。3-5ミクロン厚の部分からパラフィンを除去し、３７℃で30分間4mg/mlのプロテイナーゼＫ中で除タンパクし、更に前述のようにしてインサイツハイブリッド形成のために処理した。（Holcomb等、EMBO J., Aug 2000 1;19(15):4046-55）センスおよびアンチセンスプローブと標識した33P-UTPを一晩55℃部分にハイブリッドさせた。ハイブリッドしなかったプローブは37℃で30分間20mg/mlの RNアーゼA中でインキュベートすることにより除去し、その後５５℃の０．１×ＳＳＣ中で2時間に亘り高度にストリンジェントに洗浄し、段階的なエタノールで脱水した。スライドをNBT2ニュークリア トラップ エマルジョンに浸漬し、dessicantを含むシールされたプラスチック製のスライドボックス内で露出させ、ヘマトキシリンとエオジンで対比染色した。
【０１０６】
実施例１
高レベル（NRK/WISP-1H）又は低レベル（NRK/WISP-1L）のＷＩＳＰ−１を発現している安定な繊維芽細胞細胞系および空のベクター（NRK/対照）を含む制御細胞系を使用して、HA生産上のWISP-1の効果を評価した。分子除外アッセイによって示されたように、NRK/WISP-1Hの細胞は、沈殿する赤血球を除外することができる大きなヒアルロナン細胞周囲皮膜を蓄積した（図1a）。NRK/WISP-1Ｌは小さな細胞周囲マトリックスを蓄積したが（図1b）、一方ヒアルロニダーゼで処理したNRK/WISP-1Ｈ（データ無し）又はNRK/対照（図1c）を取り囲むマトリックスは無かった。また、細胞表面に付随するHAの蓄積を、ビオチン化したHA結合タンパク質（bHABP）を使用して蛍光染色により評価した。染色によりNRK/WISP-1Hの細胞表面（図1d）におけるHA蓄積が明らかになったが、一方NRK対照細胞（図1e）染色は検出されなかった。
HA分泌に対するWISP-1の効果を、時間とともに、NRK/WISP-1Hの培養培地におけるHAの蓄積とNRK/対照細胞とを比較することによって評価した。24時間後、NRK/WISP-1H培地中のHA濃度はNRK/対照細胞培地の3.5倍であり、１４４時間後までに前進的に８倍となった（図1f）。これらの結果を総合すると、NRK細胞のWISP-1発現が細胞表面及び培養培地においてHA蓄積を促進することが分かる。
【０１０７】
実施例２
WISP-1誘発されたHA生産を行う酵素を同定するために、NRK/WISP-1H、NRK/WISP-1LおよびNRK/対照細胞における周知のHAシンターゼ（HAS1、HAS2およびHAS3）の発現を分析した。HAS2の発現がWISP-1を生成する細胞において10倍まで増加したのに対し、HAS1およびHAS3ｍＲＮＡレベルは対照群と同一だった（図2a）。また、CD44およびRHAMMのｍＲＮＡのレベルがNRK/WISP-1細胞系において増加したのに対し、ヒアルロニダーゼ発現に変化は見られなかった（図2a）。さらに、HAS2、CD44およびRHAMMのｍＲＮＡレベルはWISP-1の発現と比例していた。FACS分析（図2b）およびウエスタンブロット（図2c）によって示されたように、NRK/WISP-1Hの細胞におけるCD44ｍＲＮＡ発現の増加により、CD44タンパク質レベルが4倍に増加した。
【０１０８】
実施例３
HAは2つの細胞表面レセプター、CD44、及びRHAMMとの相互作用により細胞移動を刺激することがわかった（Hall等、上掲; Bourguignon等、上掲）。WISP-1がHA生産およびCD44およびRHAMM発現の両方を増大させたので、WISP-1を発現している細胞の運動性を評価した。低密度に広げたとき、NRK/対照細胞は増殖し、明確なコロニーを形成していた（図3a）。増殖するNRK/WISP-1L細胞は、若干の細胞が発達するコロニーから逸脱するため、それ程明確でないグループを形成した（図3b）。NRK/WISP-1Hのコロニーは見られず、細胞はランダムに点在していた（図3c）。対照群（図3d）と対照的に、WISP-1発現細胞は、運動性の高い拡張した膜状仮足の特徴を有する非常に細長い形態学を示した（図3e）。経時的顕微鏡検査法を用いて、対照細胞（図3f）と比較してNRK/WISP-1Hの泳動距離に4倍の増加が観察された。NRK/WISP-1Hも、細胞創傷治ゆアッセイにおいて遊走域の2.5倍の増加を示した（図3g）。総合的に、これらの結果により、WISP-1発現が細胞移動を促進できることが証明された。
【０１０９】
実施例４
WISP-1の異所性の追加を行うことによりHAS2発現および細胞移動を促進することができるかどうかを決定するために、精製された組換え型WISP-1-IgG（Desnoyers等、上掲）を使用してアッセイを行った。培養培地へのWISP-1追加は、HAS2発現を促進しなかった（データ無し）。NRK細胞をWISP-1-IgG塗布面上に広げたとき、コーティングしてないプラスチック上、又は無関係なIgGキメラタンパク質（TNFR-IgG）を塗布面上へ広げた細胞と比較してHAS2発現が増加した（図4a）。デコリンのみによりHAS2発現が促進されたが、この誘導は塗布面をWISP-1によってインキュベートした後３倍まで更に増加した。NRK細胞移動へのエピトープのWISP-1付加の効果も検討した。トランスウェル分析において、フィルターの下面（図4b）をコーティングしたとき、WISP-1-IgGはNRK細胞の接触戦術移動を誘発した。無関係なIgGキメラタンパク質（TNFR-IgG）のコーティングまたはWISP-1-IgGの下部チャンバへの追加は遊走を促進しなかった。CD44またはWISP-1抗体は、WISP-1に誘発される接触戦術遊走を阻害した（図4b）。さらに、SW480細胞（コロン腺癌細胞系）の移動を促進したので、WISP-1の接触戦術活性は繊維芽細胞に限られていなかった（図4c）。総合すると、これらの結果は、エピトープのWISP-1を追加することによりHAS2発現が増大し、CD44媒介機構により細胞移動を促進することが示された。完全に理解されたわけではないが、WISP-1の存在はこの活性を引き出すために基質に繋がれていることが必要になるかもしれないので、遊走に重要と考えられている。
【０１１０】
実施例５
WISP-1はWnt-1の下流のエフェクターであると考えられているので、Wnt-1（C57MG/Wnt-1）によって安定的に形質移入した乳房上皮細胞系におけるWISP-1、HAS2およびCD44発現を分析した。制御細胞系（C57MG）と比較したとき、C57MG/Wnt-1細胞はWISP-1、HAS2およびCD44ｍＲＮＡ発現がそれぞれ2.7、5.8および3倍に増加した（図5a）。ウエスタンブロットによって示されたように、C57/Wnt-1細胞もCD44タンパク含有量に6倍の増加を示した（図5b）。さらに、対照細胞系とは異なり、低密度で培養されたとき、Wnt-1発現細胞は個別のコロニーを形成することができず、分散した（図5c）。これらの結果は、HAS2およびCD44発現および細胞運動性が、Wnt-1によりWISP-1発現が誘発される細胞系において上昇することを示す。
【０１１１】
実施例６
乳房上皮におけるWnt-1の発現は遺伝子組換えマウスの腫瘍発達を促進する（Li等、Oncogene（19：1002-1009（2000））; Tsukamoto等, Cell 55：619-625（1988））。WISP-1がWnt-1の推論上の下流エフェクターであるので、MMTV-Wnt-1 遺伝子組換えマウス由来の自然発生乳癌におけるHAS2及びCD44のｍＲＮＡ発現を測定した。乳腺管上皮と比較して、HAS2  ｍＲＮＡ発現は、分析した全ての乳癌において2.5から5.5倍に増加した（n=5;図5d）。同様に、CD44ｍＲＮＡ発現誘発は、全ての腫瘍において2.2および4.2倍に増加した（n=5;図5e）。これらの結果は、HAS2およびCD44がWISP-1を発現しているMMTV-Wnt-1 遺伝子組換えマウス乳腺腫瘍において過剰発現することを示す。
【０１１２】
実施例７
インサイツハイブリダイゼーションは、MMTV-Wnt-1遺伝子組換えマウス乳腺腫瘍の腫瘍周囲ストローマに高いWISP-1発現を示した（図6a、b）。対照的に、HAS2（図6c-d）およびCD44（図6 ｅ-f）発現は、腫瘍上皮細胞だけに見られた。腫瘍実質におけるCD44の局在は、免疫組織化学によって確認された（図6g）。リンクタンパク質染色により、腫瘍ストローマ（図6h）を伴うヒアルロナンの蓄積がみられた。最大の染色強度が腫瘍小葉の近傍に見られたのに対し、正常乳腺管上皮に局所化していた染色は弱かった。これらの所見は、WISP-1が腫瘍とヒアルロン酸およびCD44を含む間質性細胞の間の相互作用を調整することができるという示唆と一貫している。
【０１１３】
実施例８
前述のように、形質転換系の転移および成長の可能性を評価した（Welch等, Cancer Res., 60:1552-1556 (2000)。9週間目のスイスのnu/nu雌マウスを用いた。簡潔には、細胞は、トリプシン処理によって収集し、PBSで二度洗浄した。各々のマウスの尾側面の静脈に、5×104または2.5×105個の細胞を含む懸濁液１００μｌを注射した。注射後2、3および4週目に、映写磁気共鳴画像（MRI）を使用してマウスの肺病変を示す影を検査し、剖検を行った。肺をブアン固定液に入れ、切除し、H&Eで染色した部分を肺腫瘍コロニー形成評価のために作成した。
左肺の縦方向部分、並びに右肺の頭蓋、内側、尾側、及び補助的な葉の単一の横断面を評価した。組織学的に、影響を受けた肺は、肺間質が浸透したspindloid新生細胞を有した。しかしながら、変化の重傷度は可変的だったので、以下の類別システムが決定された。
I：肺間質の関与が最小−肺の10-20%は、影響を受ける。spindloid新生細胞の病巣及びクラスターは、複数の点を中心にして肺間質を崩壊させる。影響を受けた焦点は共通に胸膜の表層に沿ってあり、間質に達する。血管または大きな気道は影響を受けない。
II ：肺間質の関与が中程度−20-50%の肺が影響を受ける。spindloid新生細胞の病巣及びクラスターは、複数の点を中心にして肺間質を崩壊させる。血管または大きな気道の一部は、spindloid細胞で満たされる。Spindloid細胞は、しばしば、下部胸膜に、間質に達する幅広い帯状の、または大きな集団を形成して間質へと伸びている。その上の中皮は大きい（反応性）。
III：肺間質の関与が重大−肺の50-100%が影響を受ける。spindloid新生細胞の病巣及びクラスターは、複数の点を中心にして肺間質を崩壊させる。血管および大きな気道は、spindloid細胞で満たされる。Spindloid細胞は、下部胸膜に、間質に達する幅広い帯状のまたは大きな集団を形成して間質へと伸びている。Spindloid細胞は、青白い好塩基球性からamphophilicの無細胞材料に包埋されていることが多い。その上の中皮は大きい（反応性）。ガス交換のための最小の無影響の領域が残っている。
【０１１４】
NRK/WISP-1H、NRK/WISP-1LおよびNRK/対照細胞を接種されたヌードマウスの肺コロニー形成の結果を、図7および10にまとめる。NRK/WISP-1HまたはNRK/WISP-1Lを接種されたマウスにおいて、細胞は、時間および用量依存性の肺塊を形成した。最も高度の病変は、2.5×105 のNRK/WISP-1Hを注射したマウスに見られ、注射の4週後に検死が行われた。注射後2および3週のマウスには、それ程重症でないが、進行性腫瘍形成が見られた（等級I−II;上記分類を参照）。2.5 ×105 のNRK/WISP-1Lを注射したマウスでは、注射後4週目までに最小の肺腫瘍形成が見られただけだった。注射後4週目の、0.5×105 のNRK/WISP-1L細胞を接種されたマウスは、正常であったか、または最小の腫瘍性の湿潤を有していた（等級I）のに対し、0.5×105 のNRK/WISP-1Hの細胞を注射されるマウスはさらなる腫瘍性の浸入（等級I〜II）を示した。組織学的観察により、NRK/対照細胞を接種される動物の肺が正常である（図7a-c）ことが分かった。NRK/WISP-1を注射された動物では、青白い好塩基球性からamphophilicの無細胞材料に包埋されていることが多い肺の胸膜から突出するか、その下部に、腫瘍性のspindloid細胞はまず小さいクラスターを内部に形成した（等級I；図7d-f）。さらに大きな影響を受けた動物において、新生細胞は、下部胸膜に幅広い帯状の集密域を形成した（等級II；図7g-i)。最も大きな影響を受けた動物においては、血管および大きな気道はspindloid細胞で満たされた（等級III；図7j-l）。MRI分析は、組織学的等級IIおよび等級IIIの浸潤を有する動物の胸膜に沿う左右の肺の周縁部における密度の上昇（hypersignal）を示した。MRI上の崩壊の大きさは、組織学的スコア（図7a、d、g、j）と整合していた。これらの結果は、WISP-1発現が細胞転移性成長能を促進することを示す。
【０１１５】
実施例９
NRK/WISP-1H細胞（2.5×105個）を、ヌードマウスの尾静脈に注射した。細胞接種の日から、マウスには週に２回CD44抗体、アイソタイプ対照抗体、又は緩衝液のみを、それぞれ10mg/kgで腹腔内注射された。肺は、固定し、4週後に肉眼解剖学的分析のために切除された。
4週後、CD44抗体で処置した動物（ｎ＝５）に見られる崩壊の大きさが正常から等級Iまでであったのに対し、対照抗体または食塩水で処置した全ての（n=10）動物で等級IIIの病変（図8a）が見られた。CD44抗体で処置した動物の肺の転移巣の平均面積は、対照抗体（図8b）で処置した動物と比較して、99%（P＜0.00003）減少した。
【０１１６】
実施例１０
特定のWISP-1抗体の結合特異性を検討するためにアッセイを行った。完全長マウスWISP-1（GenBank受入番号NM_018865）、及び完全長ヒトWISP-1（GenBank受入番号AF100779;図9）、WISP 1配列の下流でヒトIgG1 Fc領域をコードしている発現ベクターにクローニングした。結果として生じる組換え型融合タンパク質（WISP-1-Fc）を、Sf9昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現系において合成し、Protein A Sepharose 4 Fast Flow（Amersham Pharmacia Biotech）上のアフィニティークロマトグラフィーによって、無血清均し培地から均質になるまで精製した。また、完全長ヒトWISP 1は大腸菌株においてアミノ末端6-ヒスチジンタグ（WISP-1 His）で表された。細胞可溶化液に、Ni2+ NTAアガロースカラム（Qiagen）上のクロマトグラフィーを実施した。WISP-1-Hisを0〜500mMのイミダゾール勾配によって溶出した。次いで溶出されたWISP-1-Hisを含む画分をプールし、透析した。哺乳類の発現系由来のヒトWISP-1は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料緩衝液を用いてヒトWISP-1で安定に形質移入したNRK細胞を溶解させることによって得られた（アーノルド・レビン;プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州）。対照細胞溶出液は、空のベクターによって安定に形質移入したNRK細胞を用いて生成した。
さまざまな発現系由来のWISP-1(50ng)を、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけてpolyvinyldifluoride（PVDF）膜に電気形質移入し、異なるWISP-1モノクローナル抗体でプローブした。
【０１１７】
WISP-1抗体3D11.D7（本明細書において「3D11」とも称する）、11C2.C10（本明細書において「11C2」とも称する）、9C11.C7（本明細書において「9C11」とも称する）および5D4.F6（本明細書において、「5D4」とも称する）は、バキュロウィルス（細菌及び哺乳類の発現系（図11a））から発生するWISP-1に特異的に結合した。これらの抗体は、バキュロウイルス由来のマウスWISP-1に結合せず、対照可溶化液からいかなるタンパク質も認識しなかった。バキュロウイルス発現系（図11b）によって生成されたときのみ、WISP-1抗体6F8、3A7、10H12、3A11、6E3、3H10、5G1および10B1はヒト及びマウスWISP-1を認識した。これらの抗体は細菌又は哺乳動物の発現系で生成すると、ヒトWISP-1を認識しなかった。クローン9C10由来の抗体は、ウエスタンブロットの後、いかなる種類のタンパク質にも結合しなかった。
これらの結果は、WISP-1抗体3D11、11C2、9C11および5D4がヒトWISP-1を特異的に認識し、ウエスタンブロットによってWISP-1検出のために使用できることを示唆する。
【０１１８】
実施例１１
WISP-1抗体11C2、9C11、5D4および3D11によって認識されるエピトープを同定するためにアッセイを実行した。
完全長ヒトWISP-1（GenBank受入番号AF100779）を、WISP-1配列の下流で6つのヒスチジンをコードしているpIRESpuro2発現ベクター（Clontech Laboratories、Palo Alto, CA）にクローニングした。また、ヒトのWISP-1の1、2、又は3つの領域を取り除くことにより、欠失突然変異体を生成した。結果として生じるコンストラクトは、また、pIRESpuro2発現ベクターにクローニングされた。異なるWISP-1コンストラクトを同定するために使用した命名法はそれに含まれるドメインを意味する。（図12Bを参照）ドメイン1はインシュリン様成育因子結合タンパク質ドメイン（IFGBP）、ドメイン2はフォンビルブラント因子C（VWFc）ドメインである、ドメイン3はトロンボスポンジン（TSP）ドメイン、及びドメイン4はＣ末端（CT）ドメインである。可変領域は、ドメイン2と3の間に位置する。WISP-1のこれらの領域およびドメインは、図12Aに例示される。
【０１１９】
WISP-1のこれらのドメインをコードしている配列は、以下の通りである：
WISP-1コンストラクトの配列
ドメイン1：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTC（配列番号3)
ドメイン2：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC（配列番号4)
ドメイン3：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGT（配列番号5)
ドメイン4：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTG（配列番号6)
ドメイン1,2：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC（配列番号7)
ドメイン1,2,3：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGCCAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCgGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGA（配列番号8)
ドメイン1,2,4：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTCTGCAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTA（配列番号９）
ドメイン1,3,4：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCGCATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC（配列番号10)
ドメイン2,3,4：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGCCAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGA（配列番号11)
【０１２０】
細胞（HEK 293T）を異なるコンストラクトによって形質移入し、培養培地を48時間後に回収した。1ミリリットルの培養培地を、1時間コバルトアガロース20μlでインキュベートし、遠心分離し洗浄した。吸収されたタンパク質は、SDS-PAGE試料緩衝液20μlで5分間100℃でペレットを加熱することによって溶出した。試料を電気泳動にかけ、PVDF上に電気形質移入し、異なるWISP 1抗体でプローブした。
抗体11C2、9C11および5D4は、ドメイン2および3の間に位置する可変領域の最初の19のアミノ酸を含むWISP-1コンストラクトだけを認識した（図12C;12E;12G)。WISP-1抗体3D11は、ドメイン1を含むWISP-1コンストラクトだけを認識した（アミノ酸24〜117;図12D;12F)。
これらの結果は、抗体3D11がWISP-1のドメイン１を特異的に認識するのに対し、抗体11C2、9C11および5D4がWISP-1の可変部を特異的に認識することを示す。
【０１２１】
実施例１２
WISP-1抗体9C10.F5（本明細書において「9C10」とも称される）によって認識されるエピトープを同定するためにアッセイを行なった。
様々なWISP-1で形質移入したHEK293T細胞由来の培養培地を（実施例11で先に述べたように）、１μｇのWISP-1抗体9C10、及び20μｇのプロテインＡアガロースで室温で1時間インキュベートした。免疫複合体を、遠心分離によって沈殿させ、SDS PAGE試料緩衝液20μlで5分間100℃でペレットを加熱することによって溶出した。試料を電気泳動にかけ、PVDFに電気形質移入し、WISP-1抗体11C2でプローブした。
抗体9C10は、WISP-1のドメイン１を含むコンストラクトだけを免疫沈降させた（図13）。これらの結果は、抗体9C10がWISP-1のドメイン１を特異的に認識し、免疫沈降に使用できることを示す。
【０１２２】
実施例１３
WISP-1抗体9C10（炭酸塩緩衝液2μｇ／ｍｌ中100μl、pH 9.6）は、4℃で一晩Maxisorbプレートにコーティングした。プレートは、1時間に亘り200μｌのPBS/3%BSAによって遮断した。標準曲線をWISP-1 Fc（PBS/3%のBSA中100μl）の階段希釈で作成し、1時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを１００μｌのPBS/０．０５％のTWEENで洗浄し、PBS/3%のBSA（ビオチン化11C2または55B）中でWISP-1抗体（2μｇ／ｍｌの100μl）を1時間インキュベートした。ビオチン化11C2のために、プレートを2μg/mlのHRP抱合ストレプトアビジンによって更にインキュベートした。55Bのために、プレートを洗浄し、1時間に亘りHRP複合ロバ抗ウサギIgGによってインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを0.05%のTween-20を含むPBS  200μｌで６回洗浄し、１００μｌのワサビペルオキシダーゼ色原体基質TMB（Kirkegaard & Perry Laboratories）を使用して視覚化した。反応を1Mのリン酸100μlで止め、450ナノメートルでODを測定した。非特異的結合は、マイクロタイタウェルコーティングを除去することにより、平行インキュベーションにおいて決定された。WISP-1 FcまたはWISP-1抗体が除去されたとき、信号は発生しなかった。
捕獲のために抗体9C10を、検出のために抗体11C2及び55Bを用いて、最低0.4μg/mlのWISP-1の濃度を検出できるELISAを実施した（図14）。このELISAは、生物学的液（例えば血清）のWISP-1タンパク質の検出に有用であり得る。
【０１２３】
実施例１４
Maxisorbプレートは、10μｇ/mlのヘパリン（Sigma）50μl/ウェルを用いて4℃で一晩コーティングした。非特異的結合部位を、200μlのPBS/3%BSAで１時間遮断した。次にプレートを、WISP-1抗体の段階的希釈の存在下で50μlの6μg/mlのhWISP-1で1時間インキュベートした。プレートをPBS/0.05%のTweenによって洗浄し、PBS/3% BSA中2μg/mlのHRP抱合抗ヒトIgG-Fc  50μlで更に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、100μlのHRP基質（TMB）を加えた。発色現像を1Mのリン酸100μlで止め、450ナノメートルでODを測定した。
WISP-1、抗体11C2、5D4および9C11は、ヘパリンと、それぞれ1.9、2.5および3.7μg/ml）のIC50とのWISP-1結合を阻害した（図15）。抗体3D11は、試験した最高濃度（40μg/ml）において最大62%の抑制でヘパリンに結合するWISP-1を中程度に低減させた。抗体9C10は、無関係な抗体対照に類似の抑制曲線を示す結合WISP-1ヘパリンを減らさなかった。
これらの結果は、可変領域を認識する抗体がヘパリンへのWISP-1結合を阻害することができることを示す。ドメイン１を認識している2つのWISP-1抗体がヘパリンに対するWISP-1結合にほとんど影響を及ぼさないことから、現在、ドメイン１はこの相互作用に関与しないと考えられている。
【０１２４】
実施例１５
改良ボイデンチェンバーシステムを使用してHaptotaxisを測定した。8μmの多孔性24ウェルフォーマットPET膜フィルター（Becton Dickinson, Franklin Lakes、NJ）の下側を、PBS中タンパク質（50μg/ml）50μlを用いて４℃で一晩コーティングした。正常なネズミ腎臓細胞（NRK;5×104/0.5mlのHGDMEM/10%FBS）を上部チャンバに加え、下部チャンバを同じメディアで満たし、プレートを37℃でインキュベートした。翌日、上部チャンバを綿棒で拭き、挿入物の下部に移動した細胞を染色し、顕微鏡の下で数えた。3組のデータを各状態について平均した。特定の場合、コーティングした挿入物洗浄し、室温でさらに2時間処理した。
トランスウェルアッセイにおいて、フィルターの下面にコーティングしたWISP-1-FcはNRK細胞の接触戦術移動を誘発した（図16A）。無関係なIgGキメラタンパク質（TNFR-Fc）のコーティングまたはWISP-1- Fcの下部チャンバへの追加は、移動を促進しなかった。コーティングしたWISP-1 -Fcがある場合、5つの異なるWISP-1抗体（9C10、11C2、3D11、9C11、5D4）は顕著に細胞移動を阻害した。コーティングしたWISP-1 Fcの非存在下では、これらの抗体は、細胞移動に対していかなる効果も示さなかった。これらの結果は、WISP-1 が存在する場合、WISP-1抗体が細胞移動を調整することを証明する。細胞移動の遮断によって、癌進行を予防する上で、WISP-抗体が重要な治療的な役割を果たす。
上の実施例で述べられる3D11、9C10、11C2、5D4および9C11抗体の特徴および特性の概要は、図16Bにおいて提供される。
【０１２５】
実施例１６
9週間目のスイスnu/nu雌マウスに、2.5×105細胞を含む懸濁液100μlを尾静脈の横方向に注射した。接種の日から、マウスはWISP-1抗体（9C11、11C2、5D4、9C10、3D11）またはアイソタイプ対照抗体の腹腔内投与（10mg/kg）によって週２回治療した。3週後、肺を4%の中性緩衝ホルマリンを用いて灌流適用し、摘出し、H&Eで染色した部位を作成した。左肺の縦方向部分、並びに右肺の頭蓋、内側、尾側、及び補助的な葉の単一の横断面を評価した。各スライドについて、転移巣の数を数え、転移巣の平均面積をSPOT RTソフトウェア（Diagnostic Instruments Incorporated, Burlingame, CA）を使用して測定した。面積（μ/m2）を、肺の4つの部分の少なくとも5つの個々の転移巣について測定した。
3週後に、WISP-1抗体で治療した動物に見られる崩壊の大きさに、対照と比較して大きな減少が見られた（図17a、b）。WISP-1抗体で処置したマウス（n=5）に見られる小結節の数および平均面積は、対照抗体で処置したマウスと比較して小さかった（図17 c,d）。さらに、WISP-1抗体による処理後、病変に覆われた肺の面積は、アイソタイプ対照抗体で処理した動物と比較して82-97%減少していた（図17e）。これらの結果は、転移に関する腫瘍の重荷の軽減においてWISP-1抗体のインビボでの有効性を示すものである。WISP-1抗体の作用の機構は完全には理解されていないが、それらの有効性は、組織部位における癌細胞の運動性、浸潤および接種を阻害する能力および／または成長低減能によって媒介可能と考えられる。
【０１２６】
実施例１７
完全長マウスWISP-1（GenBank受入番号NM_018865）を、pRK哺乳類発現ベクターにクローニングした。結果として生じるコンストラクト（pRK-WISP-1;18ug）を、製造者の指示に従って、Fugene6（ロシュ）を用いて4T1マウス乳房腺癌細胞系（Dr. Fred Miller, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MIから入手）中で2μgのpSVi-ピューロマイシンプラスミドによって同時形質移入した。2日後、細胞を2μg/mlのピューロマイシン中で選択した。2週後、クローンを単離し、WISP-1発現を免疫蛍光法によって評価した。同じ手順を使用し、空のベクターを用いて対照細胞系を生成した。結果として生じる4T1/対照及び4T1/WISP-1細胞系を、10%のFBSおよび3μg/mlのピューロマイシンを含むIscove培地において維持した。
4T1/対照、4T1/WISP-1L、4T1/WISP-1H、NRK/対照、NRK/WISP-1LおよびNRK/WISP-1Hの細胞系線のWISP-1発現を、プライマーと、ヒトとマウスのWISP-1遺伝子を区別しないプローブを使用して半定量的RT-PCR（Taqman）により測定した。
WISP-1は4T1/の統制細胞系において発現しなかった。4T1/WISP-1H細胞系におけるWISP-1発現は、4T1/WISP-1Lの２倍であったが、NRK/WISP-1Hの700分の１であった（図18）。
【０１２７】
実施例１８
4T1細胞散乱に対するWISP-1効果を評価するため、100,000の4T1/対照、4T1/WISP-1Lまたは4T1/WISP-1H細胞を10%のウシ胎児血清を含むIscoveの培地の6ウェルプレートに接種した。低密度で分配したとき、4T1/対照細胞は増殖し、明確なコロニーを形成した（図19）。一部の細胞が発達するコロニーから逸脱したため、増殖している4T1/WISP-1Lの細胞が形成したグループははっきりしていなかった（図19）。4T1/WISP-1Hのコロニーは見られず、ランダムに分散していた（図19）。総合すると、これらの結果は、WISP-1発現が細胞移動を促進することを示唆する。
【０１２８】
実施例１９
4T1細胞浸潤に対するWISP-1の効果を、8μmの多孔性24ウェルフォーマットPET膜（Falcon）のMatrigel被膜改良型ボイデンチャンバシステムフィルターを使用して評価した。4T1/対照、4T1/WISP-1Lまたは4T1/WISP-1Hの細胞（100,000の細胞）を、0.5mlのIscove培地において上部チャンバに加えた。下部チャンバを5%のウシ胎児血清を含む0.75mlの同培地で満たし、プレートを37℃で一晩インキュベートした。翌日、上部チャンバを綿棒で拭き、挿入物の下部に移動した細胞をDiff-Quik Stainキット（Dade Behring Inc.）で染色し、顕微鏡の下で数えた。3組のデータを各状態について平均した。4T1/WISP-1Hおよび4T1/WISP-1L細胞は、4T1/対照と比較してそれぞれ12および6倍の浸潤増加を示した（図20）。これらの結果は、WISP-1が腫瘍形成性の乳房上皮細胞浸潤を促進し、転移に寄与し得ることを示唆するものである。
【０１２９】
実施例２０
乳房上皮細胞腫瘍形成に対するWISP-1効果は、6-8週間目の雌のBALB/cマウス（6つのマウス/グループ）の第4の乳房脂肪褥に1.5x 105細胞（4T1/対照1、4T1/対照2、4T1/WISP-1Lまたは4T1/WISP-1H）を注射することによって評価した。腫瘍体積を週3回計量した。注射後31日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を切除して重さを測定した。
4T1/WISP-1L細胞（図21a; sqaresは空）、及び4T1/WISP-1H細胞（図21a;sqaresは満杯）の接種により、4T1/対照1および4T1/対照2の細胞（図21a;サークルはそれぞれ空、及び満杯）。31日後、4T1/WISP-1L及び4T1/WISP-1Lの接種により形成された腫瘍は、重量比で、4T1/対照細胞によって形成された腫瘍の4倍（図21a）、及び3倍（図21b）であった。これらの結果は、WISP-1が乳房上皮腫瘍細胞の増殖を増大させることを示唆している。
【０１３０】
実施例２１
4T1/対照、4T1/WISP-1L及び4T1/WISP-1H細胞の接種により形成された腫瘍におけるHAS2及びCD44の発現を測定した。4T1/対照細胞腫瘍と比較したとき、4T1/WISP-1細胞腫瘍におけるCD44発現は5および23倍まで増加した（図22）。一方、HAS2発現は、分析した全ての腫瘍において同一のままだった。これらの結果は、WISP-1が4T1細胞を接種したマウスにおけるCD44の発現を増やすことを示唆するものである。これらの腫瘍におけるCD44の過剰発現は、転移の促進に寄与し得る。
【０１３１】
実施例２２
マウス乳房脂肪褥に4T1細胞を接種し、マイクロコンピュータ断層撮影および組織学によって転移の波及範囲を検討することにより、乳房上皮細胞転移に対するWISP-1の影響を評価した（実施例20を参照）。31日後、4T1/WISP-1Lまたは4T1/WISP-1H細胞を接種したマウスは、4T1/対照を注射したマウス（図23aおよび23c）と比較して、広範囲な肺転移を有していた（図23bおよび23d）。4T1/WISP-1Lと4T1/WISP-1H細胞の転移可能性に有意差は見られなかった。4T1/対照細胞を接種したマウスは0.68グラムの平均重量を有する平均2.11の肺病巣を有し、一方4T1/WISP-1細胞を接種したマウスは12.46グラムの平均重量を有する平均20.25の肺病巣を有していた。また、4T1/WISP-1細胞を注射されたマウスの肺の平均的組織学スコアは、NRK/対照細胞を注射されたマウスの0.11と比較して0.92であった。
また、免疫組織化学を用いて、4T1/WISP-1肺転移病巣が高レベルのCD44を発現することが観察された（図23e）。これらの腫瘍において、CD44は、4T1/WISP-1細胞（図23f）の原形質膜に局所化していた。総合すると、これらの結果は、肺転移巣（10倍）の数およびサイズ（18倍）が増大していることを示し、WISP-1が4T1細胞の転移の可能性を促進することを証明する。また、4T1/WISP-1が肺に転移した後、CD44発現増加は維持された。
4T1/対照1又は4T1/WISP-1細胞を接種したマウスの臨床的観察により、WISP-1発現が別の二次部位において転移を促進することが証明された。他のいかなるマウスにも腎臓腫瘍の証拠がなかったのに対して、4T1/WISP-1Hを接種された2匹のマウスは腎臓上に変色した白い部分を有した。
【０１３２】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA(ATCC)に寄託した：
材料                    ATCC寄託番号            寄託日
３Ｄ１１．Ｄ７          ＰＴＡ−４６２４        ２００２年９月４日
１１Ｃ２．Ｃ１０        ＰＴＡ−４６２８        ２００２年９月４日
９Ｃ１０．Ｆ５          ＰＴＡ−４６２６        ２００２年９月４日
５Ｄ４．Ｆ６            ＰＴＡ−２６４５        ２００２年９月４日
９Ｃ１１．Ｃ７          ＰＴＡ−２６２７        ２００２年９月４日
【０１３３】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886 OG 638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による開示は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。ここに例示した実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１Ａ−ＦはＷＩＳＰ−１によるヒアルロナン生産の促進を示す。粒子除外アッセイは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈの表面（Ａ）とＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ（Ｂ）にヒアルロナン被膜を示したが、ＮＲＫ／対照（Ｃ）には示されなかった。ｂＨＡＢＰを用いてＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ（Ｄ）とＮＲＫ／対照（Ｅ）をヒアルロナンについて染色した。Ｆは、時間の経過に伴うＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ及びＮＲＫ／対照培地におけるＨＡ蓄積を示す。
【図２】図２Ａ−Ｃは、ＷＩＳＰ−１がＨＡＳ２、ＣＤ４４及びＲＨＡＭＭ  ｍＲＮＡの発現とＣＤ４４タンパク質発現を増大させることを示す。Ａは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ及びＮＲＫ／対照細胞におけるＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ及びヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌ）ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＢはＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ及びＮＲＫ／対照細胞におけるＣＤ４４発現のフローサイトメトリー分析を示す。影の部分は二次抗体のみの蛍光強度を示す。ＣはＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ及びＮＲＫ／対照細胞におけるＣＤ４４タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。ローディング対照にはアクチン染色を使用した。
【図３】図３Ａ−ＧはＷＩＳＰ−１発現が細胞運動性を増大させ、細胞形態学を変化させることを示す。低密度で広げられたときＮＲＫ／対照細胞（Ａ）は明確なコロニーを作成し、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ（Ｂ）及びＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ（Ｃ）細胞は分散した。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ（Ｅ）は、ＮＲＫ／対照細胞（Ｄ）と比較した場合、Lamelipodiaを有する非分化spindloid形態学を示した。Ｆは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ及びＮＲＫ／対照細胞のランダムな分散を時間経過顕微鏡を用いて１５時間後に測定したものである。結果は、一領域での細胞の典型的な平均移動距離を示す。Ｇは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ及びＮＲＫ／対照細胞の運動性を細胞創傷治癒アッセイにより評価し、時間経過顕微鏡を用いて１５時間後に測定したものである。データは典型的実験結果を示す。
【図４】図４Ａ−Ｃは、ＷＩＳＰ−１の添加によりＮＲＫ細胞のhapototactic遊走及びＨＡＳ２  ｍＲＮＡ発現が誘発されることを示す。Ａは、コーティングした表面に蒔かれたＮＲＫ細胞におけるＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。一部のケースでは、ＷＩＳＰ−１を用いてさらにコーティングした基質をインキュベートした（処置）。その結果、非コーティング、非処置表面に広げたＮＲＫ細胞におけるＮＲＫの過剰発現が倍増した。改良ボイデンチャンバーフィルターの下側をコーティングし、ＮＲＫ細胞（Ｂ）又はＳＷ４８０細胞（Ｃ）を上部チャンバーに加えた。一部のケースでは、下部チャンバーに直接添加した。挿入物の下側へ移動した細胞の数を数えることにより細胞運動性を評価した。
【図５】図５Ａ−Ｅは、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞及びＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４過剰発現及び細胞運動性の上昇を示す。ＡはＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１及びＣ５７ＭＧ／対照細胞におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。結果はＣ５７ＭＧ／対照細胞における発現の何倍かで示す。Ｂは、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１及びＣ５７ＭＧ／対照細胞におけるＣＤ４４含有量のウェスタンブロット分析を示す。ローティング対照としてアクチン染色を用いた。Ｃは、低密度で広げたときにＣ５７ＭＧ／対照細胞が明確なコロニーを形成し、一方Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞は分散したことを示す。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウスの胸部腫瘍におけるＨＡＳ２（Ｄ）とＣＤ４４（Ｅ）の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を、正常な乳腺組織における発現の何倍かで示す。
【図６Ａ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ａは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｂは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｃは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＨＡＳ２のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｄは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＨＡＳ２のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｅは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＣＤ４４のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｆは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＣＤ４４のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｇ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｇは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるＣＤ４４の免疫組織化学を示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｈ】図６Ａ−ＨはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え胸部腫瘍におけるＷＩＳＰ−１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｈは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス胸部腫瘍におけるヒアルロナンのｂＨＡＢＰ傾向染色を示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図７Ａ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ａは、注射後一定の時間が経過した後のＭＲＩによる肺画像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は正常である。
【図７Ｂ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｂは、注射後一定の時間が経過した後で切除した肺の全体像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は正常である。
【図７Ｃ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｃは、注射後一定の時間が経過した後で切除した肺の組織学的特性を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は正常である。
【図７Ｄ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｄは、注射後Ａ−Ｂとは異なる時間が経過した後のＭＲＩによる肺画像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級１である。
【図７Ｅ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｅは、注射後Ａ−Ｂとは異なる時間が経過した後で切除した肺の全体像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級１である。
【図７Ｆ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｆは、注射後Ａ−Ｂとは異なる時間が経過した後で切除した肺の組織学的特性を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級１である。
【図７Ｇ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｇは、注射後Ａ−Ｆとは異なる時間が経過した後のＭＲＩによる肺画像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級２である。
【図７Ｈ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｈは、注射後Ａ−Ｆとは異なる時間が経過した後で切除した肺の全体像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級２である。
【図７Ｉ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｉは、注射後Ａ−Ｆとは異なる時間が経過した後で切除した肺の組織学的特性を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級２である。
【図７Ｊ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｊは、注射後Ａ−Ｉとは異なる時間が経過した後のＭＲＩによる肺画像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級３である。
【図７Ｋ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｋは、注射後Ａ−Ｉとは異なる時間が経過した後で切除した肺の全体像を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級３である。
【図７Ｌ】図７Ａ−ＬはＷＩＳＰ−１により転移性肺コロニー形成及び細胞成長が促進されることを示す。ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。Ｌは、注射後Ａ−Ｉとは異なる時間が経過した後で切除した肺の組織学的特性を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級３である。
【図８】図８Ａ−ＢはＣＤ４４抗体がＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞転移を防ぐことを示す。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞（２．５×１０５個）をヌードマウスの尾静脈に注射した。マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ４４抗体、アイソタイプ対照抗体又は緩衝液のみ（ＰＢＳ）で週に２回処置した。４週後肺を切除し、肉眼的解剖分析を行った。正常な肺の画像を比較のために示す。
【図９Ａ】天然ヒトＷＩＳＰ−１のヌクレオチド（配列番号２）及び推定上のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図９Ｂ】天然ヒトＷＩＳＰ−１のヌクレオチド（配列番号２）及び推定上のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図９Ｃ】天然ヒトＷＩＳＰ−１のヌクレオチド（配列番号２）及び推定上のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１０】ＮＲＫ転移可能性に対するＷＩＳＰ−１発現の影響を示す。
【図１１】図１１Ａ−Ｂは様々なＷＩＳＰ−１コンストラクト及び調製物に対するＷＩＳＰ−１抗体の結合特性を示す。
【図１２Ａ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｂ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｃ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｄ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｅ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｆ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｇ】ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１３】ＷＩＳＰ−１抗体９Ｃ１０により認識されるエピトープを同定するために行ったアッセイの結果を示す。
【図１４】ＷＩＳＰ−１抗体によるＷＩＳＰ−１の検出を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１５】ＷＩＳＰ−１の可変領域を認識するＷＩＳＰ−１抗体がヘパリンに対するＷＩＳＰ−１の結合を阻害することを示すＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。
【図１６Ａ】ＷＩＳＰ抗体によるＮＲＫ細胞の肝走性の阻害を検出するアッセイの結果を示す。
【図１６Ｂ】ＷＩＳＰ−１抗体の特性及び特徴をまとめたチャートである。
【図１７Ａ】図１７Ａ−ＥはＷＩＳＰ−１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。３週後、ＷＩＳＰ−１抗体で処置した動物に見られる病変の重症度は対照群と比較して大きく低減していた。
【図１７Ｂ】図１７Ａ−ＥはＷＩＳＰ−１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。３週後、ＷＩＳＰ−１抗体で処置した動物に見られる病変の重症度は対照群と比較して大きく低減していた。
【図１７Ｃ】図１７Ａ−ＥはＷＩＳＰ−１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。ＷＩＳＰ−１抗体（ｎ＝５）で処置したマウスに見られる転移病巣の小結節の数及び平均面積は、対照抗体で処置した動物群と比較して減少した。
【図１７Ｄ】図１７Ａ−ＥはＷＩＳＰ−１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。ＷＩＳＰ−１抗体（ｎ＝５）で処置したマウスに見られる転移病巣の小結節の数及び平均面積は、対照抗体で処置した動物群と比較して減少した。
【図１７Ｅ】図１７Ａ−ＥはＷＩＳＰ−１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。病変肺面積はアイソタイプ対照抗体で処置した動物と比較して８２−９７％減少した。
【図１８】判定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）で測定した、４Ｔ１／対照、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｈ、ＮＲＫ／対照、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ−１Ｌ、及びＷＩＳＰ−１Ｈ細胞系におけるＷＩＳＰ−１の発現を示す棒グラフである。
【図１９】４Ｔ１／対照、４Ｔ１ＷＩＳＰ−１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｈのコロニー形成に対するインビトロアッセイの結果を示す。
【図２０】Ｍａｔｒｉｇｅｌ改良型ボイデンチャンバーシステム及び４Ｔ１／対照、４Ｔ１ＷＩＳＰ−１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞系を用いた湿潤比を測定するインビトロアッセイの結果を示す。
【図２１】図２１Ａ−Ｂは、乳腺上皮細胞腫瘍形成におけるＷＩＳＰ−１発現の影響を示す。４Ｔ１／対照１、４Ｔ１／対照２、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｌ又は４Ｔ１／ＷＩＳＰＨ細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスに注射することによりＷＩＳＰ−１の影響を分析した。図２１Ａは腫瘍容積を、２１Ｂは腫瘍重量を示す。
【図２２】４Ｔ１／対照、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｌ及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞の注射により形成された腫瘍におけるＨＡＳ２及びＣＤ４４の相対的発現を示す棒グラフである。
【図２３】図２３Ａ−Ｆは、マウス乳房脂肪褥に4T1細胞を接種し、マイクロコンピュータ断層撮影および組織学によって転移の波及範囲を検討することにより、インビボで評価した乳房上皮細胞転移に対するWISP-1の影響を示す。３１日後、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｌ又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞を注射したマウスは、４Ｔ１／対照を注射したマウス（図２３ａ及び２３ｃ）と比較して肺転移が広がっていた。免疫組織化学を用いることにより、４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１肺転移病巣が高レベルのＣＤ４４を発現していることが観察された（図２３ｅ）。これらの腫瘍において、ＣＤ４４は４Ｔ１／ＷＩＳＰ−１細胞の原形質膜に局在していた（図２３ｆ）。
【図１】
0004636497.tif 000003
【図２】
0004636497.tif 000004
【図３】
0004636497.tif 000005
【図４】
0004636497.tif 000006
【図５】
0004636497.tif 000007
【図６Ａ】
0004636497.tif 000008
【図６Ｂ】
0004636497.tif 000009
【図６Ｃ】
0004636497.tif 000010
【図６Ｄ】
0004636497.tif 000011
【図６Ｅ】
0004636497.tif 000012
【図６Ｆ】
0004636497.tif 000013
【図６Ｇ】
0004636497.tif 000014
【図６Ｈ】
0004636497.tif 000015
【図７Ａ】
0004636497.tif 000016
【図７Ｂ】
0004636497.tif 000017
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0004636497.tif 000019
【図７Ｅ】
0004636497.tif 000020
【図７Ｆ】
0004636497.tif 000021
【図７Ｇ】
0004636497.tif 000022
【図７Ｈ】
0004636497.tif 000023
【図７Ｉ】
0004636497.tif 000024
【図７Ｊ】
0004636497.tif 000025
【図７Ｋ】
0004636497.tif 000026
【図７Ｌ】
0004636497.tif 000027
【図８】
0004636497.tif 000028
【図９Ａ】
0004636497.tif 000029
【図９Ｂ】
0004636497.tif 000030
【図９Ｃ】
0004636497.tif 000031
【図１０】
0004636497.tif 000032
【図１１】
0004636497.tif 000033
【図１２Ａ】
0004636497.tif 000034
【図１２Ｂ】
0004636497.tif 000035
【図１２Ｃ】
0004636497.tif 000036
【図１２Ｄ】
0004636497.tif 000037
【図１２Ｅ】
0004636497.tif 000038
【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
0004636497.tif 000040
【図１３】
0004636497.tif 000041
【図１４】
0004636497.tif 000042
【図１５】
0004636497.tif 000043
【図１６Ａ】
0004636497.tif 000044
【図１６Ｂ】
0004636497.tif 000045
【図１７Ａ】
0004636497.tif 000046
【図１７Ｂ】
0004636497.tif 000047
【図１７Ｃ】
0004636497.tif 000048
【図１７Ｄ】
0004636497.tif 000049
【図１７Ｅ】
0004636497.tif 000050
【図１８】
0004636497.tif 000051
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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