(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
0004616981.tif 000005
で表わされるPF1198A物質、および式（２）
【化２】
0004616981.tif 000006
で表わされるPF1198B物質、を生産するアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を培養し、その培養物から、それらの物質を採取することを特徴とするPF1198A物質およびPF1198B物質の製造法。
【請求項２】
アスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物が、受託番号FERM P-16681で寄託されたアスペルギルス  エスピー（Aspergillus sp．）PF1198であることを特徴とする請求項１記載のPF1198A物質およびPF1198B物質の製造法。
【請求項３】
式（２）
【化３】
0004616981.tif 000007
で表わされるPF1198B物質ならびに薬理学的に許容されるその塩。
【請求項４】
請求項１記載のPF1198A物質を含有してなる殺虫剤。
【請求項５】
請求項１記載のPF1198B物質を含有してなる殺虫剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬または殺虫剤として利用可能なGABA受容体−塩素イオンチャネル複合体（GRC）阻害活性を有する新規活性物質、その製造法および用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来様々な構造や作用性を有する殺虫剤が利用されてきたが、近年抵抗性を獲得した害虫個体群の出現、より高い選択毒性を有する薬剤に対する要望により、新しい系統の殺虫剤がさらに一層求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
γ−アミノ酪酸（GABA）は、昆虫の中枢および末梢神経における神経伝達物質であり、歩行、飛翔などの運動の制御に重要な働きをすることが知られているが、哺乳動物の場合GABAは中枢神経系でのみ作用することや，昆虫と哺乳動物の受容体の構造に違いがあることから昆虫のGABA作動性神経を撹乱する物質は、昆虫に高い選択性を示す新しい殺虫剤となることが期待される。一方、上記のようにGABAは哺乳動物の中枢神経系で抑制性神経伝達物質として重要な機能を担っており、GABA受容体に阻害活性を有する物質は医薬としても利用が可能であると思われる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、より有効かつ安全な新規殺虫活性物質を見出すべく、幅広く微生物を採取、培養し、GRCのピクロトキシニン結合部位に特異的に作用する化合物を、同部位の特異的阻害剤として知られている４'−エチニル−４−ｎ−プロピルビシクロオルソベンゾエート（EBOB）の結合阻害物質のスクリーニングを行うことにより検索した結果、アスペルギルス属に属する特定の菌を培養することによって、EBOB結合阻害物質が培養物中に生産、蓄積されることを見いだし、その有効成分を採取することに成功した。その有効成分の１つであるPF1198A物質は、ぺニシリウム（Penicillium）属の生産する代謝産物として報告されているアラントリピノン（J.Nat.Prod.,61,1154-1157,1998）と同一物質であり、もう１つの有効成分は、新規なPF1198B物質であることを明らかにした。これまでにぺニシリウム属でのアラントリピノンの報告はあるが、アスペルギルス属に属する微生物でのアラントリピノンの生産は、本発明が始めてである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
第１の本発明の要旨とするところは、前記の式（２）で表わされる、下記の理化学的性状を有する新規物質PF1198B物質にある。
1.  PF1198B物質の理化学的性状
(1) 色および性状              :  白色粉末
(2) 分子式                    :  C21H16N4O4
(3) マススペクトル (FAB-MS)   :  389 (MH＋)
(4) 融点（分解点）            :  250℃以上
(5) 比旋光度                  :  [α]D = +21.7゜（c 0.1, MeOH）
(6) 紫外線吸収スペクトル（MeOH  λmax nm）：  212（ε=40250）, 257(ε=11120), 266(ε=11430), 277（ε=9380）, 303(ε=5030), 316(ε=3700)
(7) 赤外線吸収スペクトル  (KBr cm−１) : 1710, 1622, 1472
(8) １H-NMRスペクトル  (400MHz, DMSO-d6)
δ(ppm) : 2.36 (1H, dd), 2.42 (1H, dd), 3.57 (1H, d), 3.72 (1H, d), 4.67 br (OH), 5.55 (1H, dd), 6.89 (1H, d), 7.08 (1H, dt), 7.22 (1H, d), 7.30 (1H, dt), 7.61 (1H, dt), 7.75 (1H, d), 7.89 (1H, ddd), 9.53 (NH, br), 10.52 (NH, br)
(9) 13C NMR スペクトル  (100MHz, DMSO-d6)
δ(ppm) : 37.5, 52.0, 52.5, 57.8, 64.9, 109.7, 120.1, 122.0, 123.8, 126.2, 127.2, 127.7, 129.0, 129.6, 134.6, 142.5, 146.6, 152.2, 158.2, 169.4, 176.8
(10) 溶解性            :  ピリジンに可溶、水に難溶。
【０００６】
第２の本発明の要旨とするところは、アスペルギルス属に属するPF1198A物質およびPF1198B物質の生産菌を培養し、その培養物からPF1198A物質およびPF1198B物質を採取することを特徴とするPF1198A物質およびPF1198B物質の製造法にある。本発明に使用できるPF1198A物質およびPF1198B物質の生産菌の一例としては、本発明者らにより新たに分離されたアスペルギルス属PF1198株がある。
【０００７】
2.  アスペルギルス属PF1198株の菌学的性状
本菌株の菌学的性状は次のとおりである。
【０００８】
（１） 生育状態
ツアペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径35〜40mmに達する。淡黄色、ベルベット状、放射状のシワを生じ、中央が盛り上がり、厚い菌糸層からなる。分生子は周辺部に多数生じる。裏面は黄褐色となる。
麦芽エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養の培養でコロニーの直径25〜28mmに達する。淡黄色、ベルベット状〜羊毛状、平坦、薄い菌糸層からなる。分生子はまばらに生じる。裏面は黄色となる。
ツアペック寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養の培養でコロニーの直径30〜35mmに達する。黄白色、ベルベット状、平坦、薄い菌糸層からなる。分生子はまばらに生じる。裏面は淡黄土色となる。
３７℃の培養では、どの培地でも２５℃の培養より生育が良い。
【０００９】
（２） 形態的特徴
分生子柄は、滑面、150〜250 x 5〜7.5 μm、アスペルジラは２段よりなり、頂のうは半球形、12.5〜17.5 μm、上部1/2よりメトレを生じる。メトレは5〜7.5 x 2〜2.5 μm、フィアライドは6.5〜8 x 1.5〜2 μmである。分生子は球形〜亜球形、2〜3 μm、滑面である。
以上の菌学的性状より本菌株はアスペルギルス属に属すると考えられる。
なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  P-16681として寄託されている。
【００１０】
PF1198株は他のカビに見られるようにその性状が変化し易い。例えば、PF1198株に由来する突然変異株（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換体であっても、PF1198A物質およびPF1198B物質を生産するものはすべて本発明に使用できる。
【００１１】
3.  PF1198A物質およびPF1198B物質の生産菌の培養法
本発明の方法では、アスペルギルス属に属するPF1198A物質およびPF1198B物質の生産菌を通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油などを使用し得る。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などを使用し得る。その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、PF1198A物質およびPF1198B物質の生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
【００１２】
培養法としては、好気的条件での培養法、特に静置培養法が最も適している。培養に適当な温度は25〜30℃であるが、多くの場合26℃付近で培養する。PF1198A物質およびPF1198B物質の生産は培地や培養条件によって異なるが、静置培養、振とう培養、タンク培養のいずれにおいても、通常2〜14日間でその蓄積が最高に達する。 培養物中のPF1198A物質およびPF1198B物質の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
【００１３】
4.  PF1198A物質およびPF1198B物質の製造法
培養物中に生産されるPF1198A物質およびPF1198B物質は、その理化学的性状に従って培養物から精製することが可能である。例えば、有機溶媒を用いて培養物よりPF1198A物質およびPF1198B物質を抽出した後、吸着剤を用いた吸脱着法、ゲル濾過剤を用いた分子分配法、 適当な溶剤からの再結晶法などを用いて精製することが可能である。例えば、有効成分を含む培養物を酢酸エチルにより抽出する。抽出液を減圧濃縮し、この抽出物を少量のクロロホルム、酢酸エチルなどの有機溶剤に溶解し、クロロホルム／メタノール、ヘキサン／アセトンまたはヘキサン／酢酸エチルなどの溶媒系で繰り返しシリカゲルクロマトグラフィ−を行うことによりPF1198A物質およびPF1198B物質の混合物として精製することができる。必要に応じてセファデックス LH-20（ファルマシアファインケミカルズ社製）等のゲル濾過をメタノール等で溶出することにより精製できる。 PF1198A物質および PF1198B物質を含む分画を減圧濃縮した後、分取薄層シリカゲルクロマトグラフィー(メルク社製  TLC  plates 20x20cm Silica gel 60 F254)などで有機溶剤を適宜用いて展開することにより、PF1198A物質およびPF1198B物質をそれぞれ単離することができる。
【００１４】
さらに第３の本発明の要旨とするところは、本発明のPF1198A物質および PF1198B物質の用途にある。すなわち、本発明のPF1198A物質および PF1198B物質は後記の試験例に示すようにGABA受容体阻害活性を有しており、ヒトを含む動物に医薬としての利用が期待される。またPF1198A物質および PF1198B物質は、後記の試験例に示すようにモモアカアブラムシに対する殺虫活性を有しており、殺虫剤として有用である。
【００１５】
本発明のPF1198A物質および PF1198B物質を医薬として投与する場合、種々の投与形態または使用形態に合わせて、常法にしたがって製剤化することができる。
【００１６】
経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、舌下剤などが挙げられる。また非経口投与のための製剤としては、注射剤、経皮吸収剤、吸入剤、座剤などが挙げられる。製剤化に際しては、界面活性剤、賦形剤、安定化剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解補助剤、等張剤、緩衝剤、着色剤などの医薬用添加剤を適宜使用できる。
【００１７】
医薬としての投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路により異なるが、ヒトに経口投与する場合には成人一人当たり一日に0.02mg/kg〜200mg/kg、静脈投与の場合には同じく0.01mg/kg〜100mg/kgの範囲で投与する。
【００１８】
本発明のPF1198A物質および PF1198B物質を殺虫剤として用いる場合には、適当な担体にこれらの有効成分を0.1〜80重量％含む殺虫剤組成物とする。用いられる担体としては、クレー、ベントナイト、酸性白土、タルク、珪藻土などの固体担体、ケロシン、トルエン、キシレン、メタノール、エタノール、エチレングリコール、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどの液体担体などが挙げられる。さらに、これらに界面活性剤、殺菌剤、香料などの製剤用の補助剤を含有してもよい。
【００１９】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではない。ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段を用い得ることは勿論のことである。
【００２０】
実施例１
種培地として、スターチ 2.0%、グルコース 1.0%、ポリペプトン 0.5%、小麦胚芽 0.6%、酵母エキス 0.3%、大豆粕 0.2%、炭酸カルシウム 0.2%の組成からなる培地を用いた。また、生産培地として、十分吸水させた米に大豆粕 2.5%を添加した固形培地を用いた。なお、殺菌前pHはすべてpH7.0に調整して使用した。
前記の種培地(20ml)を分注した100ml容三角フラスコを120℃で15分間殺菌し、これにアスペルギルス PF1198株の斜面寒天培養の１白金耳を接種し、25℃で２日間振とう培養して種培養とした。ついで、前記の生産培地(100g)を分注した500ml容三角フラスコ８０本を120℃で15分間殺菌し、これに前記の種培地(各３ml)を接種し、28℃で14日間静置培養した。この培養物に65％アセトン水溶液16L加え、ろ過後得られた培養液(15 L)を減圧下、アセトンを留去し、濃縮液(8 L)とした。この濃縮液を、酢酸エチル(10 L)で抽出後、減圧下溶媒を留去し、油状物質(３２ g)を得た。この油状物質をヘキサンで洗浄後、シリカゲルカラム(和光純薬社製  ワコーゲルＣ-３００, 1000g )の上部に載せ、クロロホルム−メタノール(20：１)を展開溶媒とするクロマトグラフィーを行い、溶出液を15mlずつ分画した。溶出されたEBOB結合阻害活性画分を合わせ濃縮乾固し、褐色粉末 (950mg)を得た。この粉末をメタノールとジエチルエーテル混合溶媒から再結晶し淡黄色粉末状のPF1198A物質およびPF1198B物質の混合物(700 mg)を得た。この混合物の一部80ｍｇを用いヘキサン／アセトン(１：１）の混合溶媒を展開溶媒とするシリカゲル薄層分取クロマトグラフィー(メルク社製  TLC  plates 20x20cm Silica gel 60 F254)を行いRf値0.57の画分よりPF1198A物質を12.7mg、Rf値0.46の画分よりPF1198B物質を6.4mg単離した。
【００２１】
試験例１ EBOB結合阻害活性
［イエバエ神経膜画分GABA受容体阻害試験］
羽化5〜10日後のイエバエ成虫頭部を0.25Msucrose /10mM Tris-HCl buffer(pH7.5)中でガラス−テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いて磨砕し、4重にした64μｍメッシュナイロンスクリーンでろ過した後、ろ液を500×gで5分間遠心分離した。上清を再度同様にろ過した後25,000×g で30分間遠心分離し、沈殿を300mM NaCl/ 10mM sodium phosphate buffer中に懸濁し氷冷下30分間放置した。この懸濁液を再び25,000×g で30分間遠心分離し、沈殿を300mM NaCl/ 10mM sodium phosphate buffer中に懸濁し、ただちに以下の実験に用いた。
供試化合物を微量のDMSOに溶解し、0.5nM[3H]EBOB（デュポン／NENリサーチプロダクツ社製）を添加した上記イエバエ頭部磨砕懸濁液1.0ml中22℃で70分間インキュベートした。その後、神経膜画分をGF/Bガラス濾紙（ワットマン社製）上に24穴セルハーベスタ（ブランデル社製）を用いてろ集し、氷冷した5mlの300mMNaCl / 10mM sodium phosphate buffer で2回洗浄した。濾紙上の膜画分に結合した[3H]EBOBの放射活性を液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて測定し、供試化合物添加区の全結合(dpm)を求めた。
供試化合物を用いない区を対照区として、各供試化合物処理区の非特異的結合(dpm)は、上記条件下5μMの非放射ラベルEBOBを添加して求めた。
上記膜画分にたいする[3H]EBOBの特異的結合を次式にしたがい求めた。
【式１】
0004616981.tif 000002
供試化合物の[3H]EBOB 特異的結合阻害度(%)を次式にしたがい求めた。
【式２】
0004616981.tif 000003
この結果、１０μM処理における[3H]EBOB 特異的結合阻害度はPF1198A物質で９１％、PF1198B物質で７３％であった。
【００２２】
試験例2
［モモアカアブラムシに対する殺虫試験］
直径50mmのプラスチックシャーレに調製した寒天上にキャベツリーフディスク（直径2.8cm）を載せ、少量のアセトンに溶解した後500ppmの濃度に希釈した供試化合物溶液0.5mlを、散布塔を用いて散布した。キャベツリーフディスクにモモアカアブラムシ仔虫10頭を放飼しシャーレに蓋をして室温25℃の恒温室内で放置した。試験は4反復で行い、散布3日後に生死虫数を調査して、次式にしたがい死虫率(%)を求めた。
【式３】
0004616981.tif 000004
この結果、PF1198A物質処理区の死虫率は100％、PF1198B物質処理区の死虫率は100％であった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のPF1198A物質およびPF1198B物質は、GABA受容体−塩素イオンチャネル複合体（GRC）を特異的に阻害する物質であり、医薬あるいは殺虫剤として使用することが可能である。