(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病抑制遺伝子のスクリーニング方法であって、
（ａ）アルツハイマー病に罹患した生物の患部またはその周辺の生き残った脳細胞から作製したcDNAライブラリーを非ヒト哺乳動物で、またはインビトロにおいて細胞で発現させる工程、
（ｂ）工程（ａ）あるいはその前または後においてアルツハイマー病に関連する細胞死を誘導し、該細胞死の抑制を指標にアルツハイマー病に対する抑制効果を検出する工程、
（ｃ）該効果を有する核酸を選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
アルツハイマー病抑制ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするアルツハイマー病抑制遺伝子のスクリーニング方法であって、
（ａ）アルツハイマー病に罹患した生物の患部またはその周辺の生き残った脳細胞から作製したcDNAライブラリー、または該cDNAライブラリーがコードするポリペプチドのライブラリーを非ヒト哺乳動物に、またはインビトロで細胞に投与する工程、
（ｂ）工程（ａ）あるいはその前または後においてアルツハイマー病に関連する細胞死を誘導し、該細胞死の抑制を指標にアルツハイマー病に対する抑制効果を検出する工程、
（ｃ）該効果を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を選択する工程、を含む方法。
【請求項３】
アルツハイマー病に対する抑制効果を検査する方法であって、
（ａ）アルツハイマー病に罹患した生物の患部またはその周辺の生き残った脳細胞から作製したcDNAライブラリーを非ヒト哺乳動物で、またはインビトロにおいて細胞で発現させる工程、
（ｂ）工程（ａ）あるいはその前または後においてアルツハイマー病に関連する細胞死を誘導し、該細胞死の抑制を指標にアルツハイマー病に対する抑制効果を検出する工程、を含む方法。
【請求項４】
アルツハイマー病に対する抑制効果を検査する方法であって、
（ａ）アルツハイマー病に罹患した生物の患部またはその周辺の生き残った脳細胞から作製したcDNAライブラリー、または該cDNAライブラリーがコードするポリペプチドのライブラリーを非ヒト哺乳動物に、またはインビトロで細胞に投与する工程、
（ｂ）工程（ａ）あるいはその前または後においてアルツハイマー病に関連する細胞死を誘導し、該細胞死の抑制を指標にアルツハイマー病に対する抑制効果を検出する工程、を含む方法。
【請求項５】
工程（ａ）に先立って、アルツハイマー病に罹患した生物の患部またはその周辺の生き残った単離された脳細胞からcDNAライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）に先立って、アルツハイマー病に罹患した生物の患部またはその周辺の生き残った単離された脳細胞からcDNAライブラリーまたは核酸ライブラリーがコードするポリペプチドのライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項２または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は疾患抑制遺伝子および疾患抑制ポリペプチドのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
背景技術
ヒトゲノムの解析が進展するにつれ、さまざまな疾患に関連する遺伝子が同定されている。これらの疾患関連遺伝子の解析により、これらの疾患において、疾患を惹起する原因遺伝子(群)の作用（もしくは疾患に関与する正常遺伝子の異常な作用）と、疾患に対して抑制的に働く遺伝子(群)の作用との複雑な関連性が解明されつつある。すなわちヒトに発生するほとんどすべての疾患は、疾患を惹起する異常遺伝子の作用（もしくは疾患に関与する正常遺伝子の異常な作用）とその作用に拮抗する正常の抑制遺伝子との作用均衡の破綻に基づいて発症すると考えられる。このような考え方は、胃潰瘍から神経変性疾患にいたるまで、ほぼすべての疾患に適用できる考え方である。これは、言い換えれば、大部分の疾患について、これを抑制する正常の遺伝子（もしくは疾患抑制遺伝子）が遺伝子ゲノム上に存在する可能性を示唆している。そのような遺伝子を効率的に探索する方法が開発されれば、治療法が見出されていない難治性疾患を含む、様々なヒト疾患について特効的な治療効果を示す遺伝子を発見、同定することができ、もたらされる有益性は疑う余地がない。
【０００３】
従来、特定の疾患に対する抑制遺伝子をスクリーニングするには、該当疾患の原因遺伝子が持つ生化学的な機能を指標に、これを抑制する分子を探索する手法が多く用いられて来た。しかし、そのような方法は、疾患原因遺伝子が持つ生化学的機能が不明の場合は適用できない。また、仮に生化学的機能が同定されていても、その機能が疾患発症の直接原因でない場合は、この機能を基にした薬剤の探索が、疾患を治療できる分子に直接結びつかない可能性もある。実際は、ある遺伝子が、疫学的、遺伝学的検討、あるいはその他の研究から、特定の疾患の原因遺伝子であることが明かとなっても、その遺伝子の生化学的機能を同定できないことが多く、また、仮に同定できたとしても、同定された機能が疾患発症の直接原因であるか否かを明らかにすることは更に困難である。例えば、パーキンソン病の同定された遺伝子の一つにαシヌクレイン（α-synuclein）という遺伝子がある（Polymeropoulos, M.H. et al., 1997, Science 276: 2045-2047）。この遺伝子産物に突然変異が生じるとパーキンソン病が発症することが確定的であるが、αシヌクレインの生化学的な機能は今尚、不明である。あるいは、ATMという Ataxia telangiectasia（毛細血管拡張を伴う脊髄小脳変性症）の原因遺伝子は、PI3キナーぜ様活性をもつことが唯一の知られた生化学的機能であるが、この生化学的機能異常が該当疾患発症の原因であるか否かは全く不明である。このように、単に疾患原因遺伝子が同定されただけでは、これを基に疾患に対する治療分子を開発することは著しく困難である。
【０００４】
疾患抑制分子を得るために、より機能的な方法でスクリーニングを試みる系が開発されている。その１つは疾患原因遺伝子が惹起する細胞死を抑制する遺伝子や分子を探索するスクリーニング方法であり、これは従来、デストラップ法（D'Adamio L et al., Semin. Immunol. 1997; 9:17-23）として知られている。しかしながら、単に従来のデストラップ法を用いるだけではスクリーニングの効率が著しく低く、有効な方法とはなり得なかった。
【０００５】
上述のように、ヒトに発生するほとんどすべての疾患は、疾患を惹起する異常遺伝子の作用（もしくは疾患に関与する正常遺伝子の異常な作用）とその作用に拮抗する正常遺伝子または疾患抑制遺伝子との作用均衡の破綻に基づいて発症すると考えられるので、大部分の疾患について、これを抑制する遺伝子がゲノム上に存在している可能性は高い。従って、デストラップ法を用いて、ヒト遺伝子ゲノムをカバーするcDNAライブラリーをスクリーニングすれば、理論的には疾患抑制遺伝子を発見できる可能性は存在する。しかしながら、実際にこれを行っても、広大なゲノムの中からそのような遺伝子を見出すことは極めて困難であり、実際、デストラップ法の確立後数年を経ても、この方法を用いて疾患抑制遺伝子は発見されていない。疾患抑制遺伝子をより効率的に検索できる方法が求められている。
［先行技術文献］
［非特許文献］
［非特許文献１］Polymeropoulos, M.H. et al., 1997, Science 276: 2045-2047
［非特許文献２］D'Adamio L et al., Semin. Immunol. 1997; 9:17-23
【０００６】
発明の開示
本発明は、疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドを効率的にスクリーニングする方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、疾患抑制遺伝子およびポリペプチドの検査方法を提供することを課題とする。
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明者は、細胞死を病態（の中心もしくは一部）とする疾患、すなわち細胞死を伴う疾患を対象に、この疾患の抑制遺伝子を効率的に検索する方法の開発を試みた。本発明者は、疾患抑制遺伝子をより効率的に検索するためには、検索の対象として単なるcDNAライブラリーではなく、疾患抑制候補遺伝子がより濃縮された集団を用いることが重要であると考えた。細胞死を伴う疾患においては、疾患の病態としての細胞死が起きている臓器、あるいは組織では、患部において細胞変性が生じる。通常、疾患状態にあるこのような臓器や組織は、疾患原因因子の探索の対象とはなっても、疾患抑制遺伝子を検索する対象とは考え難い。ここで本発明者は、細胞死を伴う疾患において、患部に含まれる細胞は必ずしも全てが細胞死を起しているわけではないことに注目した。また、患部周辺の比較的症状が軽度の組織や正常組織には、必ずしも疾患の原因が存在していないわけではなく、疾患原因が存在しているにも関わらず症状を発症しない可能性があると考えた。すなわち、正常組織が疾患を発症していないのは一見当然に見えるが、患部周辺の組織は疾患の発症を抑制する疾患抑制遺伝子を十分に発現しているために疾患を発症しないとも考えられるのである。このような考えに基づけば、疾患患部またはその周辺の組織からmRNAを調製し、これを基にcDNAライブラリーを作製すれば、疾患抑制遺伝子が濃縮されたライブラリーを構築できるはずである。
【０００８】
そこでこれを実証するため、本発明者は、細胞死を伴う疾患としてアルツハイマー病を例に、疾患抑制遺伝子のスクリーニングを試みた。アルツハイマー病（Alzheimer's disease; AD）は、効果的な治療法が確立されていない脳神経疾患の１つである。ADは、臨床的には進行性の記憶喪失および認知障害、病理学的には広範囲の神経喪失、神経細胞内集積物(intraneuronal tangles)、およびコンゴ−レッドに高親和性の核（congophilic dence core）を持つ細胞外老人斑により特徴付けられる。早発性の家族性AD（FAD）を引き起こす遺伝子として、これまでに V642I/F/G APP（数字は 695アミノ酸を持つAPPである APP695 に対応する）、K595N/M596L APP（NL-APP）、プレセニリン(PS)-1変異体、およびPS-2変異体が報告されている（Shastry, B.S. and Giblin, F.J. (1999) Brain Res. Bull. 48, 121-127）。これらの遺伝子の発現は、神経細胞株または初代培養神経等において細胞死を引き起こす（Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349-1352; Zhao, B. et al. (1997) J. Neurosci. Res. 47, 253-263; Luo, J. J. et al. (1999) J. Neurosci. Res. 55, 629-42; Wolozin, B. et al. (1996) Science 274, 1710-1713; Wolozin, B. et al. (1998) Neurobiol. Aging 19, S23-27; Guo,, Q. et al. (1996) Neuroreport 8, 379-83; Zhang, Z. et al. (1998) Nature 395, 698-702; Guo, Q. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96.,4125-30）。アルツハイマー病の臨床症状の多くは、進行性の神経細胞死により説明できることが一般に受け入れられており、ADにおける神経細胞死発症の病理機構を解明し、これを防ぐことは、これまでにない有効なAD治療法を確立するために必須の課題である。
【０００９】
本発明者はこれまでに、家族性アルツハイマー病型変異 V642I アミロイド前駆体蛋白質（V642I APP）を誘導的に発現する神経細胞系（F11/EcR/V642I）を確立している（国際公開番号 WO00/14204参照）。この系では、V642I APPが F11神経細胞においてエクダイソン処理に応答して発現する。F11/EcR/V642I 細胞をエクダイソンと２〜３日インキュベートすることにより、ほぼ全ての細胞が細胞死を起こすが、V642I APPを発現させない対照のインキュベーションではごく少数の細胞が細胞死を起こすに過ぎない。本発明者は、このF11/EcR/V642I 細胞を、V642I APPにより誘導される神経細胞に対するアンタゴニストとして作用する遺伝子の検索に利用した。
【００１０】
まず、孤発性アルツハイマー病と診断された患者由来の後頭葉よりポリA+ RNAを調製した。大脳を神経細胞死の主座とするアルツハイマー病において、後頭葉は神経障害をほとんど受けない部位である。ポリA+ RNAをcDNAに逆転写した後、発現ベクターに組み込みライブラリーを構築した。これを上記 F11/EcR/V642I 細胞にトランスフェクションし、エクダイソンによりV642I APPの発現を誘導した。72 時間後に神経細胞死から生き残った細胞からプラスミドを回収した。このデストラップ法によるスクリーニング操作を繰り返し行った結果、本発明者は、V642I APP による神経細胞死を保護する複数の遺伝子を同定することに成功した。
【００１１】
単離された遺伝子の１つである Humanin（HN）cDNAは、新規な24アミノ酸のポリペプチドをコードしており、ADに関連する神経細胞死、すなわち、既知の全てのタイプの早発型家族性AD遺伝子 [V642I APP、K595N/M596L APP、M146L プレセニリン(PS)-1、および N141I PS-2] およびAβ1-43により誘導される神経細胞死を抑制することが判明した。HN mRNA は中枢神経系およびそれ以外の幾つかの器官で産生されていた。HN cDNAを神経細胞にトランスフェクションしたところ、産生されたペプチドは培養液中に分泌されることが判明した。この培養上清には、V642I APPによる神経細胞死からの有意な保護を示すのに十分な活性が含まれていた。合成 HN ポリペプチドもまた、４種のAD遺伝子に対して同様の用量−応答特性で神経保護作用を示した。
【００１２】
このように、本発明者は、細胞死を伴う疾患に罹患した患者由来の試料をスクリーニングすることにより、該疾患に対する抑制遺伝子を得ることができることを実証した。本発明者が実施したこの方法は、アルツハイマー病に限らず細胞死を病態の一部とする疾患すべてに適用できる。すなわち本発明により、細胞死を伴う様々な疾患に対する抑制遺伝子を高い効率でスクリーニングすることが可能となる。また細胞死を伴う疾患に罹患した患者由来のポリペプチドを含む試料を用いれば、疾患抑制遺伝子をスクリーニングする場合と同様に、疾患抑制ポリペプチドをスクリーニングすることも可能である。また、本発明者は、細胞死を伴う疾患に罹患した患者由来の核酸および該核酸がコードするポリペプチド、並びにその改変体を用いて、疾患に対する抑制効果の試験を行った。これと同様の検査は、細胞死を伴う他の疾患に罹患した患者由来の試料に対しても適用することができ、これにより該疾患に対する抑制効果を検査することができる。スクリーニングや検査により得られる遺伝子やポリペプチドは、疾患に対する治療に用いられる他、新たな医薬品開発の標的分子として利用され得る。本発明は細胞死を伴う疾患に罹患した生物に由来する核酸またはポリペプチドを検索することを特徴とする、疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドのスクリーニング方法、および疾患抑制遺伝子およびポリペプチドの検査方法に関し、より具体的には、
（１）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来する核酸またはポリペプチドを検索することを特徴とする、疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドのスクリーニング方法、
（２）疾患抑制遺伝子のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来する核酸を細胞で発現させる工程、
（ｂ）該細胞における、該核酸の発現による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、
（ｃ）該効果を有する核酸を選択する工程、を含む方法、
（３）疾患抑制ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする疾患抑制遺伝子のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来するポリペプチド、または該細胞に由来する核酸がコードするポリペプチドを細胞に投与する工程、
（ｂ）該細胞における、該ポリペプチドの投与による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、
（ｃ）該効果を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を選択する工程、を含む方法、
（４）工程（ａ）あるいはその前または後において該疾患に関連する細胞死を誘導し、工程（ｂ）において該細胞死の抑制を指標に該疾患に対する抑制効果を検出する、（２）または（３）に記載の方法、
（５）疾患が脳神経系疾患である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）脳神経系疾患がアルツハイマー病である、（５）に記載の方法、
（７）核酸またはポリペプチドが神経または脳に由来する、（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（８）疾患に対する抑制効果を検査する方法であって、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来する核酸を細胞で発現させる工程、
（ｂ）該細胞における、該核酸の発現による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、を含む方法、
（９）疾患に対する抑制効果を検査する方法であって、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来するポリペプチド、または該細胞に由来する核酸がコードするポリペプチドを細胞に投与する工程、
（ｂ）該細胞における、該ポリペプチドの投与による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、を含む方法、
（１０）工程（ａ）あるいはその前または後において該疾患に関連する細胞死を誘導し、工程（ｂ）において該細胞死の抑制を指標に該疾患に対する抑制効果を検出する、（８）または（９）に記載の方法、
（１１）疾患が脳神経系疾患である、（８）から（１０）のいずれかに記載の方法、
（１２）脳神経系疾患がアルツハイマー病である、（１１）に記載の方法、
（１３）核酸またはポリペプチドが神経または脳に由来する、（８）から（１２）のいずれかに記載の方法、に関する。
【００１３】
本発明は、細胞死を伴う疾患に罹患した生物に由来する核酸またはポリペプチドを検索することを特徴とする、疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、該疾患に罹患した生物に由来する核酸またはポリペプチドを用いて、該疾患に対する抑制効果を検査する方法を提供する。細胞死を伴う限り、本発明のスクリーニング方法または検査方法が適用され得る疾患に特に制限はない。このような疾患には、アポトーシスおよび／またはネクローシスを惹起する疾患が含まれる。また、細胞変性を伴う疾患が含まれる。
【００１４】
「疾患に罹患した生物」には、疾患症状を発症した生物、および明白な症状を呈していなくとも、疾患の原因となる因子（もしくは要因）を有する生物が含まれる。例えば、疾患の原因遺伝子に変異を有していたり、発現に異常がある生物は、本発明において「疾患に罹患した生物」に含まれる。また、人為的に疾患状態を再現させたモデル動物なども含まれる。このようなモデル生物は、疾患原因となる因子を投与したり、疾患原因遺伝子の遺伝子操作などにより作製することができる。また本発明において「生物」は、個体および個体から分離された臓器や組織などの培養物が含まれる。これらの生物は遺伝的に改変されたものであってもよい。また、臓器や組織は他個体に移植されたものであってもよい。
【００１５】
本発明の方法を適用する対象となり得る疾患としては、細胞死を病態の中心、もしくは一部とするすべての疾患が挙げられる。具体的には、例えば神経疾患においては、すべての神経変性疾患、HIVを含むウィルスなどの外的因子による脳炎もしくは脳症、自己免疫機転のような内的因子による脳炎を含む。対象となる神経変性疾患は更に、2つに分類が可能である。一方が、特定の領域の神経細胞に変性が発生する疾患であり、他方が、広範囲の領域の神経細胞に変性が発生する疾患である。例えば、パーキンソン病は、大脳基底核黒質の神経細胞死によって疾患が引き起こされる為、前者に属する神経変性疾患である。この他、大脳基底核被殻および線条体に神経細胞死が発生するハンチントン病、網膜神経細胞に細胞死が発生する網膜色素変性症、脊髄神経細胞の細胞死が原因である筋萎縮性側索硬化症、小脳神経細胞に細胞死が発生する脊髄小脳変性症などが挙げられる。後者に属する神経変性疾患の例の代表はアルツハイマー病である。その他、び漫性レービー小体病、ピック病、あるいは前側頭葉痴呆症、更には、アルコール性脳症を含む。非神経疾患では、肺胞上皮細胞死が病態にある間質性肺炎、あるいは肺線維症、肝実質細胞死に起因する肝硬変症などがその代表であるが、その他に、腎硬化症、甲状腺機能低下症、動脈硬化症等も含まれる。
【００１６】
このように、本発明の方法は、細胞死を伴う疾患であればその適用対象は特に制限はないが、特に脳神経系疾患における抑制遺伝子または抑制ポリペプチドの検索ために好適に用いられる。脳神経系疾患とは、脳および／または神経系の障害を惹起する疾患を言う。代表的な脳神経系疾患としては、特に、上記のアルツハイマー病が挙げられる。これまでの研究からアルツハイマー病において神経細胞の細胞死が起こることが明らかにされている（I. Nishimoto et al.,1997, Adv. Pharmacol., 41: 337-368）。この細胞死には、APP（I. Nishimoto et al.,1998, Neurobiol. Aging., 19: S33-S38）やプレセニリン（Nishimura et al., 1999, Clin. Genet. 55: 219-225）のある種の活性化が関与していることが示唆されている。また、この細胞死には ApoE が関与していることも示唆されている（Namba, Y. et al., Brain Res. 541:163-166 (1991); Saunders, A.M. et al., Neurology 43:1467-1472 (1993); Corder, E.H. et al., Science 261:921-923 (1993); Ueki, A. et al., Neurosci. Lett. 163:166-168 (1993); Sorbi, S. et al., Ann. Neurol. 38:124-127 (1995); Isoe, K. et al., Acta Neurol. Scand. 94: 326-328 (1996)）。このため、本発明の方法は、アルツハイマー病に対する疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドのスクリーニングまたは検査に好適に用いられる。本発明の方法は、孤発性アルツハイマー病および家族性アルツハイマー病の両方に適用することが可能である。
【００１７】
またアルツハイマー病以外の脳神経系疾患としては、上記と重複するが、例えば脳虚血による神経細胞の細胞死に起因する疾患などの抑制遺伝子または抑制ポリペプチドをスクリーニングまたは検査することも可能である（T. Kirino, 1982, Brain Res., 239: 57-69）。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（M.H. Polymeropoulos et al., 1997, Science, 276: 2045-2047）、びまん性レービー小体(Lewy bodies)病（M.G. Spillantini et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 95: 6469-6473）、前頭葉痴呆（frontal dementia）等の他の神経変性疾患（Helisalmi, S. et al., Neurosci. Lett. 205:61-64 (1996)）や、血管性痴呆、虚血性脳血管障害に伴う痴呆、ある種のアルコール性痴呆（Muramatsu, T. et al., J. Neural. Transm. 104:913-920 (1997)）等の非AD型の痴呆（Helisalmi, S. et al., Neurosci. Lett. 205:61-64 (1996); Ji, Y. et al., Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 9:243-245 (1998)）、ダウン症に伴う痴呆や加齢に関係した記憶力の低下（Blesa, R. et al., Ann. Neurol. 39:548-551 (1996)）などに対する抑制遺伝子や抑制ポリペプチドのスクリーニングまたは検査も、本発明の方法を用いて行うことができる。
【００１８】
細胞死を伴う疾患の患部またはその周辺では、疾患に対して感受性の高い組織や細胞は細胞死により脱落するため、疾患に対してより抵抗力の高い細胞が残される。このような疾患生物の患部またはその周辺の組織から試料を採取すれば、該疾患に対する抑制遺伝子または抑制ポリペプチドを高い効率で単離することができるのである。「患部またはその周辺」とは、疾患に関連する変化または疾患症状を示す部位または周囲を言い、正常な細胞が含まれていてよい。例えば、疾患部位がある器官内に存在する場合、その器官全体は患部の周辺と言うことができるであろう。脳疾患において、例えば前頭部に細胞変性が見られる場合、例えば後頭部を含む脳全体は「患部またはその周辺」に含まれる。
【００１９】
患部またはその周辺の組織を採取する対象となる臓器は特に制限されず、疾患の病態としての細胞死が起きている臓器、あるいは組織（例えば、神経疾患であれば、神経系、肺疾患であれば、肺組織など）を採取すればよい。この組織や細胞からcDNAライブラリーを作製すれば、そのライブラリーは病態組織の中で生き残った細胞で発現しているmRNAを濃縮するライブラリーとなる。また、この組織や細胞から、公知の蛋白質分離方法に従いポリペプチドを抽出することができる。
【００２０】
患部またはその周辺において疾患症状に差が見られる場合、試料はなるべく患部に近く、かつ疾患症状が軽度の組織または細胞から調製することが好ましい。また、患部とは無関係に、病変臓器に存在する正常、若しくは正常に近い部分から組織または細胞を採取して試料を調製することも好ましい。このような細胞は、疾患抑制遺伝子の発現レベルが他の細胞に比べ高い可能性があり、疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドのスクリーニングを高い効率で行うことが期待できる。疾患症状が軽度とは、疾患に罹患した生物の中で、最も症状が重篤な部位と比べ、症状の程度が軽いことを指す。疾患に関連して複数の症状を呈する場合においては、少なくとも、そのいずれかの症状に関して比較される。例えば、疾患の病態としての細胞死が起きている臓器、あるいは組織の中で、効率的に細胞が生存する部位からRNAを抽出する。例えば、脳前頭皮質に重篤な症状が観察され、後頭皮質や小脳の症状が比較的軽い場合、後頭皮質または小脳頭から試料を調製することができる。例えば、実施例においては、アルツハイマー病の抑制遺伝子をスクリーニングするために、ADにおける神経細胞死の主座である大脳の中でほとんど神経細胞が障害を受けない後頭葉からcDNAライブラリーが構築された。他の疾患においても、同様に疾患患部またはその周辺の細胞からRNAを抽出し、cDNAライブラリーを構築することができる。
【００２１】
組織または細胞からの核酸またはポリペプチドの調製は、公知の方法に従って行うことができる（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）。本発明において「生物の細胞に由来するポリペプチド」には、細胞溶解物または抽出物、その分画物、粗精製または精製ポリペプチドなどが含まれる。細胞抽出物は、適当な分画法により適宜分画されていてよい。このような方法には、例えば硫安沈殿、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC等の公知の蛋白質分画法または精製法が挙げられる。ポリペプチドは遊離していてもよく、また担体に結合していてもよい。なお、本発明においてポリペプチドとは２またはそれ以上のアミノ酸が結合したペプチドまたは蛋白質を指す。ポリペプチドは、通常、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーなどと呼ばれるような短い鎖も含まれる。また、ポリペプチドは比較的短い鎖に限定されず、蛋白質と呼ばれるような長い鎖のものも含まれる。例えば300アミノ酸以上、500アミノ酸以上、あるいは1000アミノ酸以上の鎖長からなるポリペプチドであってもよい。すなわちポリペプチドは蛋白質を含む。
【００２２】
また、本発明において「生物の細胞に由来する核酸」には、生物から得た核酸および該核酸から合成した核酸、それらを含む核酸、およびその増幅産物が含まれる。核酸には、DNAおよびRNAが含まれる。例えば、生物から調製したDNA（例えば染色体DNAまたはオルガネラDNAなど）、その転写産物、生物から調製したRNA、該RNAから合成したcDNA、およびそれらの断片などが含まれる。また、生物に由来する核酸には、これらの核酸を含むベクター、該ベクターの増幅産物が含まれる。好ましくは、細胞から調製したmRNAを逆転写してcDNAを合成し、これを発現ベクターに挿入した発現cDNAライブラリーが構築される。RNAの逆転写によるcDNAの合成、およびcDNAからの発現ライブラリーの作製は、公知の方法に従って行うことができる（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）。発現ライブラリーの構築に用いられるベクターとしては、例えばプラスミドベクター（例えば pcDNA および pEF-BOS など）およびウイルスベクター等が挙げられる。
【００２３】
このように調製した核酸またはポリペプチドを検索して、疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドのスクリーニングを行う。核酸を検索するとは、核酸または該核酸を含む画分から、候補となる核酸またはそれを含む分画を同定または選別することを指す。また、ポリペプチドを検索するとは、ポリペプチド、または該ポリペプチドを含む画分から、候補となるポリペプチドまたはそれを含む分画を同定または選別することを指す。また、本発明によれば、これらの核酸またはポリペプチドを利用して、疾患に対する抑制効果を検査することも可能である。
【００２４】
組織からRNAを抽出する場合、RNAの分解を抑えるためにはできるだけ迅速に試料を回収し、核酸の調製を行う必要がある。本発明の方法は、疾患生物の患部またはその周辺の細胞から核酸の調製を行えば良く、組織染色や細胞選別などにより組織から特定の細胞を分離することは必須ではない。従って、疾患生物から即座に適切な組織を回収することが可能であり、核酸の分解を最小限に抑えることができる。
【００２５】
本発明のスクリーニングまたは検査方法に適用するために用いる核酸またはポリペプチドは、溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水、培地、血清、またはそれらを組み合わせた溶媒に、適宜溶解され得る。溶液には、塩や蛋白質、界面活性剤、保存剤等を溶解させることができる。また、核酸を細胞内の導入する場合には、LipofectAMINE（GIBCO BRL社）等の各種トランスフェクション試薬と組み合わせることができる。
【００２６】
本発明のスクリーニングは、細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来する核酸またはポリペプチドを用いることを特徴とする。患部またはその周辺の細胞で発現するRNAを調製することによって、疾患抑制遺伝子が濃縮されたライブラリーを構築することが期待できる。また同様に、患部またはその周辺の細胞で発現するポリペプチドを調製することによって、疾患抑制ポリペプチドが濃縮されたライブラリーを構築することが期待できる。このようにして構築されたライブラリーは、疾患抑制遺伝子またはポリペプチドを検索するための機能的スクリーニングやその他の様々なスクリーニングに適用され得る。例えば、疾患原因遺伝子や蛋白質が知られている場合に、この発現や活性を正常に近づけるように作用する疾患抑制遺伝子またはポリペプチドを上記のライブラリーを用いて検索することが考えられる。例えば疾患原因蛋白質の生化学的機能の制御により治療効果が期待できる場合においては、本発明の方法を用いて、この生化学的機能を指標に疾患抑制遺伝子またはポリペプチドが濃縮されていると考えられるライブラリーの検索を行うことは有効である。これらのスクリーニングは、疾患の病態解析や疾患原因遺伝子の機能解析で用いられる公知の系を利用して行うことができる。罹患患部またはその周辺から調製した核酸は、適宜発現ベクター中に組み込み、細胞に導入してその作用が検出される。
【００２７】
また、本発明のスクリーニングは、例えば被検核酸または被検ポリペプチドの疾患に対する抑制効果を検出することにより実施することができる。このスクリーニングは、疾患原因遺伝子の生化学的活性などに注目するのではなく、疾患に対する抑制効果を指標に抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドをスクリーニングする方法である。このスクリーニング方法の１つは、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来する核酸を細胞で発現させる工程、
（ｂ）該細胞における、該核酸の発現による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、
（ｃ）該効果を有する核酸を選択する工程、を含む。
【００２８】
また、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来するポリペプチド、または該細胞に由来する核酸がコードするポリペプチドを細胞に投与する工程、
（ｂ）該細胞における、該ポリペプチドの投与による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、
（ｃ）該効果を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を選択する工程、を含む方法によりスクリーニングを行うこともできる。
【００２９】
また、これと類似の工程により、被検ポリペプチド、被検核酸、または該核酸がコードするポリペプチドの疾患に対する抑制効果を検査することが可能である。この検査方法の１つは、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来する核酸を細胞で発現させる工程、
（ｂ）該細胞における、該核酸の発現による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、を含む。
【００３０】
また、
（ａ）細胞死を伴う疾患に罹患した生物の患部またはその周辺の細胞に由来するポリペプチド、または該細胞に由来する核酸がコードするポリペプチドを細胞に投与する工程、
（ｂ）該細胞における、該ポリペプチドの投与による該疾患に対する抑制効果を検出する工程、を含む方法により検査を行うこともできる。このような方法により、例えばスクリーニングにより単離された核酸やポリペプチドをアッセイすることもできる。
【００３１】
疾患に対する抑制効果は、対象とする疾患の症状のいずれかを測定し、被検核酸の発現や被検ポリペプチドの投与により、この症状が抑制されるかを調べることにより行うことができる。疾患の症状は巨視的なものであっても微視的なものであってもよい。例えば微視的な症状として、疾患に関連して起こる細胞の表現形の変化や、疾患に伴う遺伝子（群）の発現レベルの変化などを指標とすることもできる。
【００３２】
上記のスクリーニングまたは検査で核酸を発現、またはポリペプチドを投与する宿主細胞としては特に制限はないが、例えば哺乳動物細胞を用いることができる。哺乳動物細胞としては特に制限はなく、マウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を用いることができる。一般的な哺乳動物細胞株としては、CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、HEK293細胞などが挙げられる。また、対象とする疾患の患部組織と同じ組織に由来する細胞株を用いることができる。脳神経系疾患の抑制遺伝子または抑制ポリペプチドのスクリーニングまたは検査には、好ましくは神経細胞が用いられる。神経細胞としては、例えば、神経系細胞、神経系細胞に由来する細胞および神経前駆細胞等が含まれる。また、神経芽細胞腫、褐色細胞腫、奇形腫、神経系細胞を用いた融合細胞および胎児性胚細胞等が含まれる。本発明の方法に用いられ得る神経細胞株としては、F11細胞(D.Platikaら,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3499, T.Yamatsujiら,1996, Science,272:1349)、SH-SY5Y細胞(L. Odelstad et al., 1981, Brain Res., 224: 69-82)、PC12細胞(L.A. Greeneおよび A.S. Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2424-2428)、NTERA2細胞(J. Skowronskiおよび M. F. Singer, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6050-6054)、P19細胞、ならびにこれらに由来する細胞などが挙げられる。NTERA2細胞およびP19細胞においては、特に、レチノイン酸処理により神経分化を誘導したものが好ましい。F11細胞に由来する細胞としては、F11/EcR細胞（Y. Hashinoto et al., J. Biol. Chem. published on-line on August 3, 2000）、F11/EcR/V642I細胞（T. Niikura et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 273: 442-447）（いずれも実施例参照）を挙げることができる。また、初代神経培養（例えばラット脳皮質初代培養）を用いることもできる。細胞での核酸の発現は、核酸を発現ベクターに組み込み、細胞に導入することにより行うことができる。またポリペプチドの投与は、培地に添加したり、細胞内に注入することにより行うことができる。また、細胞は個体内の細胞であってもよい。個体で核酸を発現させるには、発現ベクターを個体に投与すればよい。発現ベクターとしては、例えばウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしは、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどの公知のベクター系が利用できる。ポリペプチドの投与は、組織または細胞への直接投与の他、静脈投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与などの公知の投与経路により行うことができる。スクリーニングまたは検査に用いられる生物としては、マウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。具体的には、in vivo または in vitro で構築される様々な疾患モデルを本発明の方法に適用することができる。このような疾患モデルは数多く知られている。
【００３３】
検出の結果、被検核酸の発現またはポリペプチドの投与が、疾患の発症、症状、および／または進行等に対して抑制的または正常に近づけるように作用する場合、疾患に対する抑制効果を有すると判定される。このように疾患に対する有意な抑制効果が認められる核酸またはポリペプチドは、それぞれ疾患に対し抑制効果を有する遺伝子またはポリペプチドと判定される。また検査においては、定量的な測定など、抑制効果のより詳細な測定を行うこともできる。
【００３４】
被検核酸またはポリペプチドの効果は直接的または間接的であり得る。例えば、核酸またはその発現産物自体（RNAまたはポリペプチド）が効果を有する場合や、核酸またはその発現産物が別の因子に作用することによって効果を発揮する場合が考えられる。上記のスクリーニング方法または検査方法により単離または選別され得るこれらの核酸は疾患抑制遺伝子となる。また、上記のスクリーニング方法または検査方法により単離または選別され得るポリペプチドは疾患抑制ポリペプチドとなる。単離されたポリペプチドは、例えば部分アミノ酸配列を解析し、これを基に作製したDNAプローブやプライマーによりゲノムDNAやcDNAをスクリーニングすることで、該ポリペプチドをコードする核酸（疾患抑制遺伝子）を取得することができる。
【００３５】
疾患に対する抑制効果を、細胞死により判別するスクリーニング系または検査系を構築することもできる。このスクリーニング方法または検査方法は、疾患の病態の一部である細胞死そのものを指標とする方法である。このスクリーニングまたは検査方法は、上記工程（ａ）あるいはその前または後において該疾患に関連する細胞死を誘導し、工程（ｂ）において該細胞死の抑制を指標に該疾患に対する抑制効果を検出する方法である。実施例において、本発明者はアルツハイマー病に関連する細胞死を誘導できる細胞系を利用して、該細胞死を抑制する遺伝子のスクリーニングを行った。この方法では、家族性アルツハイマー型変異APPを神経細胞で発現させ、誘導される細胞死を抑制する遺伝子がスクリーニングされる。神経細胞死の誘導は、実施例で用いられた V642I APPの発現に限定されず、細胞死を誘導する所望の処理により実施することができる（国際公開番号 WO00/14204 および 国際出願番号 PCT/JP00/02830 参照）。また、スクリーニングにより単離されたポリペプチド、遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、およびそれらの誘導体などは、例えば実施例に記載したように、各種のFAD遺伝子やAβで誘導される神経細胞死に対する抑制効果について詳細な検査を行うことができる。
【００３６】
具体的な方法を例示すれば、例えば V642I/F/G APP、NL-APP、M146L PS-1、または N141I PS-2などのFAD遺伝子を発現するベクターを単独で、または検定したい核酸を発現するベクターと共に神経細胞（例えばF11細胞）にトランスフェクトする。あるいは、初代神経培養（例えばラット脳皮質初代培養）へのAβ（例えばAβ1-43）の添加により細胞死を誘導してもよい。また、APPリガンド（APP抗体を含む）の添加、ApoE4などの ApoER-1リガンドの添加などによって細胞死を誘導することもできる。被検核酸を発現させて培養後、細胞死を測定する。FAD遺伝子は、誘導性プロモーターを用いてコンディショナルに発現させることもできる。検定したい核酸の非発現条件で誘導される細胞死に対して、該核酸を発現させた条件下における細胞死の比率が有意に低下すれば、この核酸は疾患に対して抑制効果を有する遺伝子であると判定される。被検試料としてポリペプチドを用いる場合は、このポリペプチドを含む試料の存在下または非存在下で細胞死を測定する。検定したいポリペプチドの非存在下で誘導される細胞死に対して、該ポリペプチドの存在下における細胞死の比率が有意に低下すれば、このポリペプチドは疾患に対して抑制効果を有するポリペプチドであると判定される。核酸の作用の検査やスクリーニングにおいては、被検核酸を発現させる代わりに、検定したい核酸がコードし得るポリペプチドを予め調製しておき、このポリペプチドの存在下または非存在下で細胞死を測定してもよい。
【００３７】
細胞死の抑制を指標とするスクリーニングや検出は、アルツハイマー病以外の疾患に対しても同様に適用することができる。疾患に関連する細胞死は、例えば疾患を再現する因子を与えたり、疾患原因遺伝子を発現させたりすることにより誘導し得る。具体的には、例えは、ポリグルタミンを神経細胞に発現して細胞死を誘導する系（de Cristofaro, T. et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 816-821）を利用することができる。この系は、脊髄小脳変性症やハンチントン病のモデルとして知られ、本発明において、これらの疾患に対する抑制遺伝子や抑制ポリペプチドの検査やスクリーニングに適用され得る。また、SOD1変異体を発現する系（Silani, V. et al., 2000, J. Neurol. 247 Suppl 1:I28-36）も挙げることができる。この系は、筋萎縮性側索硬化症のモデルとして知られており、この疾患の抑制遺伝子や抑制ポリペプチドの検索も本発明の方法の適用対象となる。また、プリオン部分ペプチド（116-126）を神経細胞に処理する系（Thellung, S. et al., 2000, Int. J. Dev. Neurosci. 18: 481-492）はプリオンによる脳症のモデルとして本発明において利用できる。また、ヒトアミリンを膵β細胞に処理する系（Bai, J.Z. et al., 1999, Biochem. J. 343 Pt 1:53-61）はI型糖尿病のモデルとして利用することができる。さらに、Jurkat細胞などのT細胞に抗Fas抗体を処理する系（Li, X.K. et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 273: 101-109）は劇症肝炎のモデルとして、同じくT細胞にT細胞受容体抗体を処理する系（Vito, P. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 31025-31028）は自己免疫疾患の系として利用され得る。また、ロドプシン変異体を発現する系（Liu, C. et al., 1999, J. Neurosci. 19: 4778-85）は網膜色素変性症のモデルとして本発明の方法の適用対象となる。これらのモデルにおいて、例えば疾患生物の患部またはその周辺に由来する核酸やポリペプチドを導入し、細胞死の比率を検出することにより本発明の検出またはスクリーニングを行うことができる。核酸またはポリペプチド試料の由来に制限はないが、例えば患者組織に由来するもの、または疾患モデル動物に由来するものなどが挙げられる。また、モデル培養系等に由来するものであってもよい。
【００３８】
実施例において、本発明者は72回の繰り返しを持つポリグルタミン Q79 による神経細胞死誘導系を用いて、HNペプチドの効果を検討している（実施例８）。上記のように、ポリグルタミン Q79 は、ハンチントン病（HD）や、ある種の脊髄小脳性運動失調症（spinocerebellar atazia; SCA）の原因になっていると考えられている（Ikeda, H. et al. (1996) Nat. Genet. 13, 196-202; Kakizuka, A. (1997) Curr. Opin. Neurol. 10, 285-90）。本発明者は、具体的には、エクダイソンにより発現が誘導される Q79 プラスミド（pDN-E/G5H-Q79）を F11/EcR 細胞にトランスフェクトし、エクダイソンの存在下または非存在下で神経細胞死を誘導し、HNポリペプチドの抑制効果を検査した。これと同じ系は、ハンチントン病（HD）や、脊髄小脳性運動失調症（SCA）の抑制遺伝子または抑制ポリペプチドのスクリーニングや検査に用いることができる。すなわち、罹患患部またはその周辺から調製したmRNAから構築した発現ライブラリーを上記の細胞にトランスフェクトし、細胞死を検出することにより実施することができる。
【００３９】
また、本発明者は、家族性筋萎縮性側索硬化症（familial amyotrophic lateral sclerosis; 家族性ALS）に関連した Cu/Zn依存性スーパーオキサイドディスムターゼ（SOD1）の変異体による神経細胞死を誘導する系を用いてHNペプチドの効果を検討している（実施例８）。この実験では、SOD1の A4T、G85R、または G93A 変異体により細胞死を誘導した。これと同様の系を本発明の方法に適用すれば、ALSの抑制遺伝子または抑制ポリペプチドの検査およびスクリーニングを行うことが可能である。同様に、その他の疾患モデル系を用いて、本発明のスクリーニングおよび検査を実施することが可能である。
【００４０】
細胞死の検出方法としては、細胞数測定、トリパンブルー排除法などによる生細胞測定、MTTなどを用いた生化学的アッセイ等が挙げられる。またLDH放出を測定してもよい。更に、アポトーシスを検出する方法を用いることもできる。アポトーシス検出法としては、TUNEL法、DNAラダー法、電子顕微鏡を用いた方法、あるいは核や細胞膜の特有の変化を検出する方法が挙げられる。最後者の例としては、アネキシンV測定法や、核の形態変化、またはカスパーゼ活性を測定する方法が挙げられる。
【００４１】
検出の結果、細胞死の比率を有意に低下させる効果が認められれば、スクリーニングまたは検査に用いた被検核酸またはポリペプチドは疾患に対し抑制効果を有する遺伝子またはポリペプチドと判定される。このとき、細胞死を完全には阻害できなくても、被検核酸を発現させない場合または被検ポリペプチド非存在下における場合に比べ、細胞死の比率を有意に低下させるものであればよい。このようにして疾患抑制遺伝子または疾患抑制ポリペプチドを単離または選別することができる。
【００４２】
上記に記載した本発明の方法により単離または選別された遺伝子やポリペプチドは、疾患の予防や治療のための利用が期待される。疾患抑制遺伝子はベクターに挿入して増幅や発現を行うことができる。このようなベクターは、遺伝子治療目的に利用することも可能である。遺伝子治療に用いるためのベクター系としては、アデノウイルスベクター、AAV（アデノ随伴ウイルス）ベクター、ヘルペスウイルスベクター（いずれも Robbins and Ghivizzani, Pharmacol. Ther. 80: 35-47, 1998）、レトロウイルスベクター（Engel and Kohn, Front. Biosci. 4: e26-33, 1999）、レンチウイルスベクター（Lundstrom, K., 1999, J. Recept. Signal. Transduct. Res. 19: 673-686）などを用いることが考えられるが、これらに制限されない。また、効果が維持される限り、遺伝子の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列は、欠失、付加、挿入、および/または置換などにより適宜変異を加えることができる。
【００４３】
単離された遺伝子がペプチドをコードする場合は、遺伝子を発現させることによりペプチドを産生させることができる。ポリペプチドの産生のために用いられる宿主に特に制限はなく、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などの細胞または個体を用いることができる。宿主−ベクター系としては、例えば、バキュロウイルス−Sf細胞系（Okamoto et al., J. Biol. Chem. 270: 4205-4208, 1995）、pcDNA-CHO細胞系（Takahashi et al., J. Biol. Chem. 270: 19041-19045, 1995）、および CMVプロモータープラスミド−COS細胞系（Yamatsuji et al., EMBO J. 15: 498-509, 1996）などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４４】
また、上記の核酸またはポリペプチドは、人工的に合成したり、誘導体とすることが可能である。「誘導体」とは、核酸またはポリペプチドの官能基を修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つ分子である。このような改変は既知の方法により行うことができる。官能基の改変は、例えば、核酸またはポリペプチドに存在する官能基の保護、安定性または組織移行性の制御、あるいは疾患を抑制する活性の制御等を目的として行われうる。
【００４５】
単離された核酸またはポリペプチド、あるいは該核酸によりコードされるポリペプチドは、疾患を抑制するための試薬とすることができる。核酸は適宜ベクターに組み込み、該ベクターを試薬することができる。核酸またはポリペプチドを含む試薬は、核酸やポリペプチド自体を試薬として用いる他、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（BSAなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬を含む）等と適宜組み合わせてもよい。これらは混ぜ合わさっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。
【００４６】
また、上記核酸（若しくはベクター）またはポリペプチドは、疾患に対する医薬組成物とすることができる。この医薬組成物は、核酸またはポリペプチド自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。核酸やポリペプチドの含有率は適宜決定すればよい。
【００４７】
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。脳神経系疾患の治療に用いる場合においては、上記医薬組成物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中枢神経系に導入するのが望ましい。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。投与量、投与方法は、医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００４８】
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。本実施例に記載された実験方法を以下に示す。
【００４９】
V642I APP cDNA は以前記載されている（Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349-1352）。PS-1 cDNA の M146L変異体および PS-2 cDNA の N141I 変異体は、それぞれ Peter St. George-Hyslop博士（Sherrington, R. et al. (1995) Nature 375, 754-760）、および Luciano D'Admio博士（Wolozin, B. et al. (1996) Science 274, 1710-1713）より寄贈された。本実施例で用いた全てのFAD遺伝子は pcDNA ベクター（Funk, C.D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5638-5642）にコードされている。SOD1 cDNA の ALS関連変異体（A4T、G85R、G93A）（Takahashi, H. et al. (1994) Acta Neuropathol. 88, 185-8）、および pDN-E/G5H-Q79 は、それぞれ Shoji Tsuji博士（Niigata University School of Medicine, Niigata, Japan）、および Akira Kakizuka博士（Osaka Biomedical Research Center, Osaka, Japan）より寄贈された。
【００５０】
Humanin をコードするプラスミド pHN は、HN cDNA を pFLAG-CMV-5aベクター（pFLAG）（Eastman Kodak）のポリクローニングサイトに挿入して構築した。すなわち、pFLAG-CMV-5aプラスミドを EcoRI および KpnI で切断し、HNをコードするセンスオリゴヌクレオチド（5'-AATTCACCATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCAGGTAC-3'／配列番号：１）とアンチオリゴヌクレオチド（5'-CTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGACAGCTGAACCCTCGTGGAGCCATGGTG-3'／配列番号：２）をライゲーションした。このプラスミドは、FLAGタグ（DYKDDDDK）がＣ末端に融合したHumaninポリペプチドを発現する。
【００５１】
変異HNをコードする pFLAGプラスミド（pHNGおよびpHNA）は、pHNから Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いて構築した。配列は、直接塩基配列決定法により確認した。合成 HN ポリペプチド（sHN）および構造改変した合成ポリペプチドは95％以上に精製したものを用いた。
【００５２】
合成HN（sHN）および他の幾つかの合成HN誘導ポリペプチドは２箇所の入手経路から独立して入手したが、どちらも本質的に同じ結果が得られた。抗FLAG抗体は Eastman Kodak（M2モノクローナル抗体, Cat. #IB13010）から購入した。Aβ1-43 は BACHEM（Cat. #H-1586）より購入した。他の試薬は全て商業的に入手可能なものを用いた。
【００５３】
F11細胞（Platika, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3499-3503; Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349-1352）は、18％ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を含む HamF-12 培地で培養した。6ウェルプレート上に 7×104 /ウェルのF11細胞を播き、18% FBSを含む HamF-12 培地で 12〜16時間培養した後、FAD遺伝子をコードするプラスミドを、HNをコードするプラスミド（pHN等）と共に、リポフェクションにより血清の非存在下３時間トランスフェクトし（FAD cDNA 発現プラスミド 1μg、HN cDNA 発現プラスミド 1μg、LipofectAMINE 4μl、Plus試薬 8μl）、18% FBSを含む HamF-12 培地で２時間培養した。その後培地を 10% FBSを含む HamF-12 培地に交換し、さらに67時間培養した。トランスフェクションから72時間後、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。合成 HN ポリペプチドを用いた実験では、F11細胞（６ウェルプレート上で 7×104 /ウェル）に血清非存在下で上記と同様に FAD遺伝子を３時間トランスフェクトし、18% FBSを含む HamF-12 培地で２時間培養した後、様々な濃度の HN ポリペプチドと共に 10% FBSを含む HamF-12 培地で 67時間培養し、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。SOD1のALS関連変異体 cDNA も同様にトランスフェクトし、その神経毒性の試験を行った。
【００５４】
pHNをトランスフェクトした F11細胞の培養上清（CM/F11-pHN）を得るためには、F11細胞に pHN をリポフェクションにて血清非存在下で３時間トランスフェクトし（pHN 1μg、LipofectAMINE 2μl、Plus試薬 4μl）、18% FBSを含む HamF-12 培地で２時間培養した。その後培地を 10% FBSを含む HamF-12 培地に交換し、さらに67時間培養した。この培養培地を１回凍結融解して CM/F11-pHN とした。CM/F11-vecは、pFLAGをトランスフェクトしたF11細胞から同様にして調製した。CM/F11-pHN、CM/F11-pHNG、および CM/F11-pHNA のイムノブロット解析では、凍結融解しない培養培地にプロテアーゼインヒビターカクテル（Boehringer Mannheim, Cat. #1697498; 2mlの蒸留水に1錠を溶かし、試料の 1/25 容を添加した）を加えた。細胞のライセートを用いたイムノブロット解析では、細胞をPBSで2回洗浄し、30μlのホモジェナイジングバッファー [10mM Tris/HCl (pH7.5), 1mM EDTA, 1% Triton X-100, および 1錠/50mlのプロテアーゼインヒビターカクテル] 中に懸濁した。２回凍結融解した後、細胞のホモジェネートを4℃で15,000rpmで10分遠心し、上清をTris/Tricineゲル電気泳動してイムノブロット解析に供した。Tris/Tricineゲル電気泳動は、以前記載されたように行った（Schagger, H. and von Jagow, G. (1987) Analytical Biochemistry 166, 168-179）。
【００５５】
F11/EcR/V642I 細胞は、エクダイソン誘導型 V642I APP 発現プラスミドを用いて樹立した。まず、共発現ベクター pVgRXR（Invitrogen）を F11細胞に導入し、それに続くZeocin選択により、エクダイソン受容体 EcR とレチノイドX受容体 RXR の両方を安定に過剰発現する F11細胞（F11/EcR細胞）を樹立した。多コピーのエクダイソン応答配列を有する pIND ベクター（Invitrogen）に V642I APP cDNA を挿入し、F11/EcR細胞にトランスフェクトした後、G418選択を行った。限界希釈により、F11/EcR/V642I 細胞をクローニングした。F11/EcR/V642I 細胞は、18% FBSと抗生物質を含む HamF-12 培地で培養した。エクダイソン処理の前に、細胞を 10% FBS存在下で 24 時間培養した。その後、10% FBS存在下で細胞培養液にエクダイソン（40μM Ponasterone; Invitrogen Cat. #H101-01）を添加した。エクダイソン処理に応答して、各F11/EcR/V642I 細胞で細胞死が起こり、全細胞中の細胞死の比率は処理後 72 時間で 60〜70％、処理後 96 時間で80〜90％に達した。F11/EcR/V642I 細胞の更に詳細な解析は、別途記載されている（国際公開番号 WO00/14204参照）。
【００５６】
エクダイソンを用いた F11/EcR細胞の実験では、F11/EcR細胞を６ウェルプレートに 7×104 /ウェルで播き、18% FBSを含む HamF-12 培地で 12〜16 時間培養し、エクダイソン誘導型プラスミド 1μgを単独で、または HNをコードするプラスミド 1μg と共に、血清非存在下で上記と同様に３時間トランスフェクトした。18% FBSを含む HamF-12 培地で 12〜16 時間培養した後、細胞を10% FBSを含む HamF-12 培地で２時間培養し、エクダイソン（Ponasterone）を培地に添加した（終濃度 40μM）。エクダイソンで処理後72時間での細胞死を測定した。合成 HN ポリペプチドを用いた実験では、細胞に FAD遺伝子を血清非存在下で３時間同様にトランスフェクトし、18% FBSを含む HamF-12 培地で 12〜16 時間培養し、様々な濃度の HN ポリペプチドと 10% FBSを含む HamF-12 培地で２時間培養し、40μM の Ponasterone を培地に添加した。エクダイソンで処理後72時間での細胞死を、トリパンブルー排除アッセイにより測定した。HD/SCA関連 Q79 cDNA も同様にトランスフェクトし、その神経毒性の試験を行った。
【００５７】
マウス皮質神経の初代培養は、ポリ-D-リジンコートした 24ウェルプレート（Sumitimo Bakelite）を用い、血清非存在下およびN2サプリメントの存在下で、以前記載されたように行った（Eksioglu, Y. Z. et al. (1994) Brain Res. 644, 282-90）。この方法により調製した神経の純度は>98％であった。調製した神経（1.25×105/ウェル， 250μl培地/ウェル）は、10nMまたは10μMの sHN ポリペプチド存在下または非存在下で 16 時間プレインキュベートを行い、同じ濃度の sHNポリペプチドの存在下または非存在下で、25μMの Aβ1-43 で 24〜72 時間処理を行った。初代培養神経は、培地交換に伴う一過的な乾燥でも傷害を受けるため、Aβ1-43 による細胞の処理は次のように行った。まず、古い培地の半量（125μl）を捨てた。そして、50μM の Aβ1-43 と先に示した濃度の sHN を含む予め温めておいた新鮮な培地 125μlを培養に加えた。
【００５８】
トリパンブルー排除アッセイは、次のようにして行った。プレウォッシュなしで細胞を血清不含の培地に穏やかにピペッティングして懸濁した。200μlの細胞懸濁液に 50μlの 0.4％トリパンブルー溶液（Sigma, Cat. #T-8154）を加え（終濃度 0.08％）、室温で混合した。トリパンブルー溶液を加えてから3分以内に、染色された細胞を計数した。これを基に細胞死の比率を決定した [100-細胞生存率(%)] 。LDHアッセイは、神経を培養した培地 6μlをサンプリングして、キット（LDH-Cytotoxic Test; Wako Pure Chemical Industries, Cat. #299-50601）を用いて行った。カルセイン染色は、以前記載されたようにして行った（Bozyczko-Coyne,D. et al. (1993) Journal of Neuroscience Methods 50, 205-216）。簡単には、6μMの Calcein-AM {3',6'-Di-(O-acetyl)-2',7'-bis[N,N-bis (carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester; Dojindo, Cat. #349-07201} を神経に添加し、Calcein-AM 処理後 30 分以上経過してから蛍光（ex=490nm, em=515nm）を蛍光顕微鏡により観察し、スペクトロメーターにより測定した。特異的な蛍光は、全蛍光から基底状態の蛍光を差し引いて計算した。基底状態の蛍光は、トリパンブルー陽性度−蛍光強度の直線関係から算出される、100％トリパンブルー陽性に対応する値とした。
【００５９】
アッセイは少なくとも３回、独立してトランスフェクションまたは処理を繰り返して行った。統計解析では Student のｔ検定を行った。
【００６０】
ノーザンブロット解析のためのオリゴヌクレオチドの放射標識は、Renaissance 3' end labeling system (NEN) を用いてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）により行った。すなわち、75pmolのプローブオリゴヌクレオチド、100pmolの 3'-[32P]-dATP (185TBq/mmol, NEN)、および 36 unit のTdTを37℃で30分インキュベートした後、標識されたオリゴヌクレオチドをゲル濾過により分離した。この操作により、1×106〜5×106 cpm/μl の標識プローブが得られた。プローブに用いたアンチセンスHNは 5'-CTG CCC GCC TCT TCA CGG GCA GGT CAA TTT CAC TGG TTA AAA GTA AGA GAC AGC TGA ACC CTC GTG GAG CCA TGT GGT G-3'(配列番号：３)である。cDNA断片は Ready-To-Go random labeling system (Amasham Pharmacia) により放射標識した。すなわち、50〜500ng の変性させたDNA断片および 1.85MBq [α-32P]dCTP を37℃で30分インキュベートした後、標識されたDNA断片をゲル濾過により分離した。この操作により、約5×107 cpm/μg DNA の標識プローブが得られた。ノーザンブロット解析は ExpressHyb（Clontech）を用いて行った。すなわち、プレハイブリダイゼーションの後、組織のポリA+-RNAがブロットされた膜（ヒト組織の膜は Clontech より、マウス組織の膜は Origene より入手）を放射標識されたプローブ（2〜5×107 cpm）に18時間浸漬させた。説明書に従って２ステップの洗浄を行った後、増感スクリーンを２枚使って膜をX線フィルムに-70℃で露光させた。
【００６１】
［実施例１］  発現cDNAライブラリーの構築
研究所のガイドラインに従って、生検により孤発性アルツハイマー病であることが確認された患者の脳試料（後頭皮質）からポリA+ RNAを抽出し、発現ベクターに組み込み発現cDNAライブラリーを構築した。発現ベクターには、エロンゲーションファクタープロモーターを持つ哺乳動物細胞発現ベクター pEF-BOS（Mizushima and Nagata, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 5322）を用いた。ポリA+ RNAは、NotI部位を含む改変オリゴdTプライマーを用いて逆転写した。二本鎖cDNAにEcoRI-BstXIアダプタープライマー（5'-pGAA TTC ACC ACA-3' および 3'-CTT AAG GTGp-5'）をライゲートし、NotIで切断した。低分子DNAを除いた後、cDNAは pEF-BOS の BstXI-NotI 断片にライゲートし、エレクトロポレーションにより XL1 Blue MRF'株へ形質転換した。初代ライブラリーサイズおよび挿入断片の平均サイズはそれぞれ 3.2×106 cfu/16ml および 0.9kb であった。
【００６２】
［実施例２］  Humaninの同定
F11細胞は、E17.5のラット初代培養神経とマウス神経芽細胞腫 NTG18 を細胞融合させて樹立された、初代培養神経の不死化細胞モデルである（Platika, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3499-3503）。分化刺激がなければ、この細胞は活動電位の生成などの初代培養神経に典型的な特徴を保持している（Platika, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3499-3503）。本発明者は、３種の FAD原因遺伝子である V642I/F/G APP をコードする cDNA を F11細胞にトランスフェクトすることにより、APPの V642 変異体の一過的な発現が細胞死を引き起こすことを見出した（Yamatsuji, T. et al. (1996) Science 272, 1349-1352）。そこで本発明者は、最近開発されたエクダイソン誘導系（No, D. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 3346-51）を用いて、 V642I APPを誘導できるF11クローンの構築を行った。まず、エクダイソン受容体と RXR の両者を過剰発現する F11クローン（F11/EcR）を樹立し、この細胞に、エクダイソン応答配列の制御下に置かれた HSV プロモーターにより発現される V642I APP cDNA をコードする pIND-V642I APP を安定にトランスフェクションすることにより、V642I APPの発現を誘導することができる F11細胞を樹立した。このようにして樹立されたクローン F11/EcR/V642I 細胞は、そのままでは V642I APP をほとんど発現しないが、エクダイソン処理によりコンディショナルに V642I APP を過剰発現することが確かめられた。そしてエクダイソン処理に応答して、各F11/EcR/V642I細胞で細胞死が誘導され、全F11/EcR/V642I細胞中の細胞死の比率は処理後 72 時間で 60〜70％、処理後 96 時間で80〜90％に達した。
【００６３】
これらの細胞を用いて、D'Adamio ら（D'Adamio, L. et al. (1997) Semin. Immunol. 9, 17-23）により開発された方法に基本的に従いながら、それに修正を加えた「デストラップスクリーニング」を行った。最初に記載された「デストラップスクリーニング」においては、Vitoらは正常Ｔ細胞 cDNAライブラリーをJurkat細胞にトランスフェクトし、T細胞受容体の刺激により細胞死を誘導し、細胞死をアンタゴナイズする遺伝子を回収した。本発明者は、デストラップスクリーニングを行い、AD遺伝子により誘導される細胞死をアンタゴナイズする遺伝子のスクリーニングを試みた。上記で作製したアルツハイマー病患者の脳試料から調製したcDNAを持つcDNA発現ライブラリーを F11/EcR/V642I 細胞にトランスフェクトし、この細胞をエクダイソンで 72 時間処理して生き残った細胞からプラスミドを回収した。この操作を３回繰り返し、最終的に約250クローンのプラスミドを得た。各プラスミドを用いたドットブロットハイブリダイゼーションにより、これらのクローンは互いにクロスハイブリダイズする 36 のグループに分類された。最も大きいグループは 28 のクローンからなっていた。
【００６４】
このグループの cDNA に着目し、各クローンのシークエンスを行った結果、このグループに属するクローンは総合すると、5'配列は Wnt-13 の非コード領域と相同性があり、3'配列は ミトコンドリア 16S リボソーム RNA と相同性があり、C末端にポリA領域を持つ1535bpの融合配列からなるcDNAをコードしていた。この配列全体は新規なものであった（図１）。各クローンの配列を決定したのち、各クローンの一過的なトランスフェクションが、pIND-V642I APP をコトランスフェクトした F11/EcR 細胞のエクダイソンにより誘導される細胞死を有意に抑制するかについてアッセイを行った。細胞死抑制活性を示した各々の配列を比較した結果、V642I APPにより誘導される細胞死をアンタゴナイズする活性は、新規な24アミノ酸のポリペプチド「MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA」（配列番号：５）をコードする 75bp のオープンリーディングフレーム（ORF）（5'-ATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCATGA-3'／配列番号：４）によりコードされていることが判明した。本発明者は、この分子を Humanin（HN）と名付けた。
【００６５】
［実施例３］  FAD遺伝子により誘導される細胞死における各クローンの抑制効果
図２〜４は、このグループに属する各クローンをコトランスフェクトしたときの効果を示す。F11/EcR 細胞（EcRとRXRとを安定に発現する F11 クローンで、エクダイソンにより pINDプラスミドによりコードされる遺伝子の発現が誘導される）にV642I APP をコードする pIND を一過的にトランスフェクトしたところ、エクダイソンの非存在下（V642I APP 非誘導条件）では、72時間後に約 20％の細胞が細胞死を起こしたのに対し、エクダイソンの存在下（V642I APP 誘導条件）では、有意に高い割合（50〜60％）の細胞が細胞死を起こした(図２）。F11/EcR 細胞に、V642I APP をコードするpINDに加え、DT63 をコードする pEF-BOS をトランスフェクトすると、エクダイソン存在下でも、エクダイソンにより誘導される細胞死の有意な増加は観察されなかった。これとは対照的に、pEF-BOS、または DT171 をコードする pEF-BOS を細胞にトランスフェクトした場合には、エクダイソンに応答した細胞死の有意な増加が観察された。図３は、単純な一過的トランスフェクションを用いて４つの各FAD遺伝子（V642I APP、NL APP、M146L PS-1、および N141I PS-2）により誘導される神経細胞死における DT63 の効果を確認した結果である。各FAD遺伝子（V642I APP、NL APP、M146L PS-1、または N141I PS-2 cDNA）をコードする pcDNA のいずれかに加え、空のpEF-BOS を F11 細胞にコトランスフェクションした場合、72時間のインキュベーションにより 50〜70％の細胞が細胞死を起こした。この条件におけるトランスフェクションの効率は約60〜70％であるため、各FAD遺伝子を発現する細胞の大部分が、トランスフェクト後 72 時間で細胞死を起こしたことになる。F11細胞に、各FAD遺伝子に加え、DT63をコードする pEF-BOS をトランスフェクトした場合、細胞死の増加は劇的に抑えられた。このことは、DT63 cDNA が４つのAD遺伝子により誘導される細胞死すべてを、高い効率でアンタゴナイズすることを示している。図４は、HN の全配列を含む他の DTクローンや全配列を含まない他のDTクローン（DT29、DT44、および DT171 cDNA）の効果を示す。HN の全配列をコードするクローンである DT29 および DT44 では、各FAD遺伝子により誘導される細胞死の顕著な抑制が認められたが、HN の第一ATGコドンを持たない DT171 では、細胞死をアンタゴナイズする作用は認められなかった。これらのデータは、HN がコードする ORF が、４つのすべてのFAD遺伝子による細胞死から神経細胞を保護することを示している。
【００６６】
そこで本発明者は、HN cDNAを pFLAG ベクターへサブクローニング（pHN）し、V642I APP、NL-APP、M146L PS-1、および N141I PS-2の各々のFAD遺伝子による神経細胞死に対する pHN の効果を直接調べた。予想された通り、F11細胞に対する pHN のトランスフェクションは、毒性をほとんど示さないばかりか、各FAD遺伝子による毒性を解消させた（図５）。このアンタゴナイズ活性は、pHN により各FAD遺伝子の発現が抑制されたことによるものではない。なぜなら、pHN のコトランスフェクションは、CMVプロモーターにより発現する EGFP の発現を変化させなかったことから（データ省略）、コトランスフェクトされた pHN は、同じ CMV プロモーターから発現される各FAD遺伝子の発現を変化させないことが示されたからである。さらに、V642I APP、NL-APP、および N141I PS-2 のイムノブロッティングによっても、各遺伝子の発現に pHN のコトランスフェクションがほとんど影響を与えないことが確認された（データ省略）。
【００６７】
［実施例４］  HN の細胞外分泌
実験の過程で、pHNをトランスフェクトした F11 細胞の培養上清（CM/F11-pHN）には、V642I APPを含むFAD遺伝子により誘導される細胞死を有意に抑制する活性があることが判明した。新鮮な培地または空のベクターである pFLAGをトランスフェクトしたF11細胞の培養上清（CM/F11-vec）の存在下で V642I APP cDNAをトランスフェクトした F11細胞では高率で細胞死が誘導されたのに対し、CM/F11-pHN存在下で V642I APP cDNAをトランスフェクトした F11細胞では、細胞死が劇的に減少した（図６）。同じことがDTクローンについても観察された。CM/DT29およびCM/DT63は V642I APP により誘導される F11 細胞の細胞死を完全に抑制したが、CM/DT171 は抑制しなかった。これは、HN または HNをコードする cDNA から転写される HNポリペプチドは、培養液中に分泌され、V642I APP による誘導される細胞死を抑制することを示唆している。図７は、CM/F11-pHN中の HN の免疫反応性を抗FLAG抗体で調べた結果を示している。CM/F11-pHN および pHN をトランスフェクトした細胞のライセートには、HNの免疫反応性を示す 3〜4 kDaの単一のバンドを含んでおり、FLAG融合HN の予想される分子量（3837Da; 図７左および中央）に一致していた。合成 FLAG融合HNポリペプチド（MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRAGTDYKDDDDK：下線は FLAGタグ）（配列番号：６）を用いて濃度を決定した結果、HNは CM/F11-pHN 中に 8〜9μM の濃度で含まれていることがわかった（図７右）。これらの知見は、HN は pHN から転写され培養上清中に分泌されることを示している。
【００６８】
［実施例５］  V642I APPにより誘導される細胞死における合成 HN ポリペプチドの抑制効果
本発明者は次に、合成 HN ポリペプチド MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA（配列番号：５）を合成し、V642I APP により誘導される神経細胞死において、このポリペプチドを細胞外から加えた場合の作用を調べた。F11細胞に V642I APP cDNA をトランスフェクトし、10μM の合成 HN ポリペプチド（sHN）存在下で培養したところ、V642I APP により誘導される細胞死は劇的に抑制された（図８）。10nM sHN では極弱い抑制を示すのみであったが、抑制作用は添加する sHN の濃度に依存しており、1〜10μM のポリペプチドのレベルで完全な抑制に達した。IC50 値は約100nMであった。この用量依存曲線は、CM/F11-pHN中に分泌された HN が 約10μMのレベルで V642I APP により誘導される細胞死を効果的に抑制した事実と一致している。
【００６９】
［実施例６］  V642I APPにより誘導される細胞死における HN ポリペプチドおよびその構造的誘導体の抑制効果
本発明者はさらに、sHN の細胞死抑制作用が特異的な一次構造によるものであるのかを検討した（図８）。ポリペプチドとして S14G（MAPRGFSCLLLLTGEIDLPVKRRA：下線のGはSから置換されている；HNGと称す）（配列番号：７）を用いると、V642I APP により誘導される細胞死に対し、10nM以下の濃度において完全なアンタゴナイズ効果が認められ、IC50 は約100pMであった。これに対して、C8A HN ポリペプチド（MAPRGFSALLLLTSEIDLPVKRRA：下線のAはCから置換された；HNAと称す）（配列番号：８）は 100μM までの濃度において、V642I APP により誘導される細胞死を有意に抑制することはできなかった。8位の Cys が重要であることは、8位の Cys を介した HN のダイマー（C8-C8 HN）により得られた結果からも示唆された。C8-C8 HN のアンタゴナイズ作用のレベルは、元々の HN と HNAの中間であった。また、対照的に、HN のＣ末端の KRRA を AAAA に置換した誘導体（配列番号：９）は、元々の HNポリペプチドと同様の作用能を示した。これらの結果は、HN の抑制活性に一次構造が本質的な役割をもつと共に、特定のアミノ酸残基が決まった役割を有していることを示している。
【００７０】
［実施例７］  FAD遺伝子により誘導される細胞死における HN ポリペプチドおよびその構造的誘導体の抑制効果
次に、他のFAD遺伝子、すなわち NL-APP、M146L PS-1、および N141I PS-2 により誘導される細胞死に対する sHN、合成 HNG（sHNG）、および合成 HNA（sHNA）の効果を調べた。図９に示したように、元々の sHN は３つのFAD遺伝子のいずれにおいても同様の用量−応答特性を示し、1μM の濃度で各FAD遺伝子により誘導される神経細胞死を妨げた。sHNA は 100μM までの濃度において、いずれのFAD遺伝子による細胞死もアンタゴナイズしなかった。これに対し、sHNG は 10nM 以下の濃度で、各FAD遺伝子による細胞死を抑制する完全な活性を有していた。これは、HN の作用は S14G の置換により 100から1000倍に高められることを示している。V642I APP により誘導される細胞死に対する sHNG の作用（図８）を合わせて考えると、sHNG は 10nM 以下の濃度で、４種の異なるタイプの FAD遺伝子により誘導される神経細胞死を、完全にアンタゴナイズすることができると結論される。
【００７１】
［実施例８］  HN の細胞死抑制効果の特異性
HNの作用の特異性を明らかにするため、次に HN cDNA または HN ポリペプチドが、他の神経変性疾患の原因遺伝子により誘導される細胞死をアンタゴナイズすることができるかを調べた。72回の繰り返しを持つポリグルタミン Q79 は、ハンチントン病（HD）や、ある種の脊髄小脳性運動失調症（spinocerebellar atazia; SCA）の原因になっていると考えられている（Ikeda, H. et al. (1996) Nat. Genet. 13, 196-202; Kakizuka, A. (1997) Curr. Opin. Neurol. 10, 285-90）。Q79の発現が神経細胞の細胞死を引き起こすことが報告されているように、Q79 の発現により F11 細胞は細胞死を起こした（図１０）。エクダイソンにより発現が誘導される Q79 プラスミド（pDN-E/G5H-Q79）を F11/EcR 細胞にトランスフェクトし、エクダイソンの存在下または非存在下で神経毒性の試験を行った。この系において、pDN-E/G5H-Q79 を空ベクター（pFLAG）と共に F11/EcR 細胞にトランスフェクションした場合は、エクダイソン処理に応答して細胞死の比率は顕著に増加した（図１０A）。F11/EcR 細胞に、pDN-E/G5H-Q79 を pHN、pHNG、または pHNA と共にトランスフェクトした場合でも、エクダイソン処理により、同じように高い比率の細胞死が誘導された。これに対し、エクダイソンにより誘導されるいずれのFAD遺伝子の発現により引き起こされる F11/EcR 細胞の細胞死も、pHNのコトランスフェクションにより効果的に抑制された（図１０B）。sHN を用いた実験においても、Q79により誘導される細胞死は抑制されなかった（図１０C）。F11/EcR 細胞に pDN-E/G5H-Q79 をトランスフェクトした場合、４種のFAD遺伝子による F11/EcR 細胞の細胞死を sHN や sHNG が完全に抑制できる濃度の sHN、sHNG、または sHNA の存在下においても、非存在下における場合と同様、エクダイソンによって大幅な細胞死が引き起こされた（図１０D）。
【００７２】
本発明者はまた、家族性筋萎縮性側索硬化症（familial amyotrophic lateral sclerosis; 家族性ALS）に関連した Cu/Zn依存性スーパーオキサイドディスムターゼ（SOD1）の A4T、G85R、または G93A 変異体により誘導される神経細胞死に対する HN の効果を調べた。家族性ALS関連 SOD1 変異体 の発現が哺乳動物神経細胞の細胞死を引き起こすという以前の報告（Rabizadeh, S. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 3024-8; Ghadge, G. D. et al. (1997) J. Neurosci. 17, 8756-66）と一致して、これらすべての変異体において、それぞれの変異体を発現する cDNA を F11 細胞にトランスフェクトすることにより、有意に細胞死が引き起こされた。そして、各SOD1変異遺伝子に加え、pHNを F11 細胞にコトランスフェクトした場合でも、同様の高い細胞死が誘導された（図１１A）。図１１Bに示したように、100μM のsHN、sHNG、または sHNA のいずれによっても、各家族性ALS関連 SOD1 変異体による細胞死の抑制は認められなかった。これらのデータは、HN は FAD 遺伝子により触発される細胞死実行機構を抑制する細胞内機構を活性化するが、他の神経変性疾患遺伝子による細胞死には機能しないことを示唆しており、HN cDNA および HN ポリペプチドのアンタゴナイズ効果は、ADに関連する神経細胞死に共通かつ特異的であることを証拠付ける。
【００７３】
［実施例９］  初代神経培養の細胞死における HN の抑制効果
本発明者は、HN による、初代培養神経のADに関連する傷害からの保護について調べた。Aβは老人斑の主要なペプチド成分で、AD脳を病理学的に特徴付ける細胞外沈着物であり、ADの病理機構に関与していると言われている（Selkoe, D. J. (1994) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-47; Cummings, J. L. et al. (1998) Neurology 51, S2-17; discussion S65-67）。Aβ処理は初代培養神経の細胞死を引き起こすことが報告されている（Loo, D. T. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7951-7955; Gschwind, M. and Huber, G. (1995) J. Neurochem. 65, 292-300）。図１２に示すように、初代培養皮質神経を 25μM のAβ1-43 で 48〜72時間処理すると、N2サプリメントの存在下または非存在下にて、軸索の異栄養変化（dystrophic neuritic changes）を伴う広範な細胞死が引き起こされた。初代培養神経を 10μM の sHN で前処理すると、Aβで誘導される細胞死と共に軸索の異栄養変化が劇的に抑制された。Aβ1-43処理により、トリパンブルー排除で測定した細胞死（図１３左パネル）と、細胞から放出された LDH により測定した細胞傷害（図１４）が観察されたが、10μM の sHN 処理により、細胞の生存を示すこれらの指標はベーサルな状態で観察されたレベルに完全に回復した。同じ条件で、100ng/ml の NGF は、Aβにより誘導される神経細胞の生存およびLDH放出の増加をアンタゴナイズする効果はなかった（データ省略）。Aβにより誘導される神経細胞死のアンタゴナイズに sHN が劇的な効果をあげたのに対して、10μM sHN で神経を同様に処理しても、初代培養神経に対する 20μM のエトポサイド（etoposide）の毒性を防ぐことはできなかった（図１３右パネルおよび図１４）。エトポサイドは抗癌剤であり、初代培養神経の細胞死を引き起こすことが報告されている（Nakajima, M. et al. (1994) Brain Res. 641, 350-2）。これらの知見は、HN は Aβ1-43 により誘導される神経細胞死を、選択的な機構でアンタゴナイズするという考えを支持する。F11 細胞を用いた FAD 遺伝子の実験で指摘したのと同様に、10nM sHNG は、Aβ1-43による細胞死および軸索の異栄養変化から神経を完全に保護したが、10nM sHN または 10μM sHNAは、いずれもAβの神経毒性に対し効果を示さなかった（図１２）。これらのデータは、細胞傷害のアッセイであるLDH放出アッセイ（図１４）およびトリパンブルー排除アッセイ（図１３）により確かめられたのみならず、生細胞のアッセイであるカルセイン（Calcein）染色アッセイ（図１５および１６）によっても確かめられた。このように、HN は初代培養神経においても、クローン化された神経細胞における場合と同様に効果を有していることが示された。さらに、これらのデータから、HN の構造を特異的に認識する受容体(群)が、F11細胞と初代培養神経に共通して存在していると考えることができる。
【００７４】
［実施例１０］  HN mRNA の発現
β-actin mRNAをポジティブコントロールとして、様々な組織におけるHN mRNAの発現を調べた。ヒト組織のノーザンブロット解析により、HN mRNAは心臓、骨格筋、腎臓、および肝臓において顕著に発現していることが判明した（図１７a）。それより少ないが、依然として有意な発現が脳および消化管（gastrointestinal tract）に認められた。胸腺、脾臓、および末梢血白血球を含む免疫系にはほとんどmRNAは検出されなかった。発現している主要なmRNAのサイズは約1.6kbであり、これは、HNを含む最も長いDT cDNAの予想されるサイズに相当する。約3kbおよび約1kbのサイズの異なるmRNAも存在した。HNの3'領域をコードし、HNをコードしていないDT77（図１参照）をプローブにした場合も、またHNの-440から-422の5'領域に対するアンチセンスプライマー（GGGTGTTGAGCTTGAACGC／配列番号：１０）をプローブとした場合も、上記と同様の結果が得られ、これら全てのバンドが検出されたことから、これらのmRNAは全長HN mRNAとそのスプライシングバリアントであると予想される。ヒト心臓cDNAライブラリーから、本発明者は DT44 の位置と事実上同一であり、1kbpを超えるcDNAを幾つか単離した。マウス組織においても、以下の点を除き類似した結果を得た（図１８）。第一点はマウスの骨格筋および肝臓はヒト組織に比べHN mRNA量が少なかったことである。しかしながら、他のマウスの骨格筋および肝臓のHN mRNAは多かった（データ省略）ことから、量的な差異は個体の条件が影響することが考えられる。第二点は、マウス心臓および腎臓において、1kbの小さなmRNAが、1.6kbのものと同等かそれ以上発現していることである。マウス脳、心臓、および骨格筋では特異的に、約0.4kbのmRNAがさらに発現していた。脳の発現領域を詳しく解析した結果、脳の各領域の中では、小脳および後頭葉で比較的多量のmRNAが発現していた。これらの結果は、HN mRNAは主に中枢神経系以外の器官で産生されていることを示している。このことからして、HNは血流に分泌され脳神経に運ばれている可能性が考えられる。または、脳内で局所的に合成されるHNが保護作用を発揮する可能性も想定される。これに関しては、AD脳で神経細胞死に対し最も抵抗力を示す領域である小脳および後頭葉で HN mRNA が最も合成されていることは興味深い。
【００７５】
産業上の利用の可能性
本発明によって、細胞死を伴う疾患に罹患した生物に由来する核酸またはポリペプチドを検索することを特徴とする、該疾患の抑制遺伝子または該疾患の抑制ポリペプチドのスクリーニング方法が提供された。疾患生物に由来する試料を用いることにより、該疾患に対する抑制遺伝子や抑制ポリペプチドを効率的にクローニングすることが可能となる。また、細胞死を伴う疾患に罹患した生物に由来する核酸およびポリペプチド、ならびに該核酸がコードするポリペプチドの疾患抑制効果を検査することにより、該核酸およびポリペプチドの特性を解析することができる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Keio University
<120> Methods for screening of disease-suppression genes
<130> KUV-102DP1PCT2
<140> PCT/JP00/06313
<141> 2000-09-14
<150> JP  1999-264679
<151> 1999-09-17
<150> JP  2000-201456
<151> 2000-06-29
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 1
aattcaccat ggctccacga gggttcagct gtctcttact tttaaccagt gaaattgacc 60
tgcccgtgaa gaggcgggca ggtac                                       85
<210> 2
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 2
ctgcccgcct cttcacgggc aggtcaattt cactggttaa aagtaagaga cagctgaacc 60
ctcgtggagc catggtg                                                77
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 3
ctgcccgcct cttcacgggc aggtcaattt cactggttaa aagtaagaga cagctgaacc 60
ctcgtggagc catgtggtg                                              79
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(72)
<400> 4
atg gct cca cga ggg ttc agc tgt ctc tta ctt tta acc agt gaa att   48
Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Thr Ser Glu Ile
1               5                  10                  15
gac ctg ccc gtg aag agg cgg gca tga                               75
Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Ala
20
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Thr Ser Glu Ile
1               5                  10                  15
Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Ala
20
<210> 6
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence (sHN-FLAG)
<400> 6
Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Thr Ser Glu Ile
1               5                  10                  15
Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Ala Gly Thr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20                  25                  30
Asp Lys
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence (HNG)
<400> 7
Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Thr Gly Glu Ile
1               5                  10                  15
Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Ala
20
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence (HNA)
<400> 8
Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ser Glu Ile
1               5                  10                  15
Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Ala
20
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 9
Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Thr Ser Glu Ile
1               5                  10                  15
Asp Leu Pro Val Ala Ala Ala Ala
20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 10
gggtgttgag cttgaacgc                                              19
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｈｕｍａｎｉｎ  ｃＤＮＡクローンにおける、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰによる細胞死をアンタゴナイズする活性をコードする領域を示す図である。
ＤＮＡ断片を、最も長い配列（−９３４から６００；１番目の塩基はＨｕｍａｎｉｎ  ＯＲＦの最初の塩基に対応し、その１塩基前は−１である）に対して整列させた。Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導されるＦ１１／ＥｃＲ細胞の細胞死に対するそれらの活性を横に示す。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐＩＮＤ（１μｇ）と共に、１μｇのｐＥＦ−ＢＯＳまたはそれぞれのＤＮＡ断片をコードするｐＥＦ−ＢＯＳを３時間トランスフェクトし、続いてエクダイソンで７２時間処理した。トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。ｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトした細胞とそれぞれのＤＮＡ断片をトランスフェクトした細胞との間で、細胞死に統計的に有意な差があった場合、このＤＮＡ断片にはアンタゴナイズ活性があると判定し、”Ｙ”で示した。”Ｎ”は有意なアンタゴナイズ活性がなかったことを示す。
図２は、エクダイソンにより誘導されるＶ６４２Ｉ  ＡＰＰの発現による神経細胞死におけるＤＴ６３とＤＴ１７１クローンの効果を示す図である。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰプラスミドと共に、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＤＴ６３、またはＤＴ１７１（ＤＴ６３とＤ１７１はｐＥＦ−ＢＯＳにクローン化されている）をトランスフェクトし、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ（エクダイソン）処理を行った。エクダイソン処理を行わない群も設定した。エクダイソン処理の７２時間後、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。また、エクダイソン処理を行わない群も同様に測定した。図中のエラーバーのある数値は、３回の独立したトランスフェクションの結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ＤＴ６３とＤＴ１７１は図１に示されている。
図３は、ＦＡＤ遺伝子の発現により誘導される神経細胞死におけるＤＴ６３クローンの効果を示す図である。Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ｖｅｃ）またはＤＴ６３をコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。図中のエラーバーのある数値は、３回の独立したトランスフェクションの結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
図４は、ＦＡＤ遺伝子のトランスフェクションによるＦ１１細胞の細胞死におけるＤＴ２９、ＤＴ４４、およびＤＴ１７１クローンの効果を示す図である。図３と同様に、Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ｐＢＯＳ）またはＤＴクローンをコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。ＤＴ２９とＤＴ４４は図１に示されている。３つの実験を同時に行ったところ、ベーサルな細胞死の比率（トランスフェクションなし、ｐｃＤＮＡ＋ｐＢＯＳ）は共通していた。同様の実験は少なくとも３回行った。図中のエラーバーのある数値は平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
図５は、ＦＡＤ遺伝子の発現により誘導される神経細胞死における、ＨｕｍａｎｉｎをコードするプラスミドｐＨＮの効果を示す図である。Ｆ１１細胞に空ベクター（ｐｃＤＮＡ）またはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、もしくはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２をコードするｐｃＤＮＡと共に、ｐＦＬＡＧまたはＨＮをコードするｐＦＬＡＧ（ｐＨＮ）をトランスフェクトし７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。値は３回の独立した実験結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
図６は、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞死における、ｐＨＮをトランスフェクトしたＦ１１細胞からの培養上清の抑制効果を示す図である。Ｆ１１細胞にｐｃＤＮＡまたはＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐｃＤＮＡを血清非存在下で３時間トランスフェクトし、１８％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２で２時間培養した後、ＣＭ／Ｆ１１−ｐＨＮ（ＣＭ／ｐＨＮ）、ＣＮ／Ｆ１１−ｖｅｃ（ＣＭ／ｖｅｃ）、または新鮮な培地（１８％ＦＢＳを含む新しいＨａｍＦ−１２）で６７時間培養した。トランスフェクション７２時間後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。値は３回の独立した実験結果の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ｐ＜０．０１はｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による。
図７は、ｐＨＮをトランスフェクトしたＦ１１細胞の培養上清に含まれるＨＮポリペプチドの免疫反応性を示す写真である。左と中央のパネルは、細胞抽出液（３０μｇｐｒｏｔｅｉｎ）および培養上清（２０μｌ）をＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った結果を示す（１：トランスフェクションなしの細胞；２：ｐＦＬＡＧをトランスフェクトした細胞；３：ｐＨＮをトランスフェクトした細胞）。右のパネルは、ｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清を同様に解析した結果である。右の３レーンは、培養上清中に含まれるＨＮポリペプチドのタイターを決定するために、図示した濃度のｓＨＮ−ＦＬＡＧ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡＧＴＤＹＫＤＤＤＤＫ：下線はＦＬＡＧタグ）（配列番号：６）のイムノブロットを行った結果を示す。同様の実験は４回以上繰り返した。
図８は、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰにより誘導される神経細胞死における、合成ＨＮ（ｓＨＮ）およびその構造的誘導体の効果を示す図である。Ｆ１１細胞にＶ６４２Ｉ  ＡＰＰをコードするｐｃＤＮＡをトランスフェクトし、様々な濃度のｓＨＮ（元々のＨＮ）（配列番号：５）、ｓＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ）（配列番号：７）、ｓＨＮＡ（Ｃ８Ａ）（配列番号：８）、Ｃ８を介したｓＨＮのダイマー型（Ｃ８−Ｃ８）、およびＣ末のＫＲＲＡをＡＡＡＡに置換したｓＨＮ（ＫＲＲＡ２１／２２／２３／２４ＡＡＡＡ）（配列番号：９）で処理した。トランスフェクション７２時間後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図９は、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、Ｎ１４１Ｉ  ＰＳ−２、またはＮＬ−ＡＰＰにより誘導される神経細胞死におけるｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの効果を示す図である。図８と同様に、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、Ｎ１４１Ｉ  ＰＳ−２、またはＮＬ−ＡＰＰ  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＦ１１細胞を、様々な濃度のｓＨＮ（元々のＨＮ）、ｓＨＮＧ（Ｓ１４Ｇ）、またはｓＨＮＡ（Ｃ８Ａ）で処理した。トランスフェクション７２時間後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞死を測定した。３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１０は、ポリグルタミンリピートＱ７９により誘導される神経細胞死におけるＨＮおよびその構造的誘導体の効果の欠如を示す図である。図は全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
Ａ：エクダイソンで誘導されるＱ７９の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｐＨＮ、ｐＨＮＧ、またはｐＨＮＡの効果の欠如。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型Ｑ７９発現プラスミドと共に、空ベクター（ｐＦＬＡＧ）、またはｐＨＮ、ｐＨＮＧ、もしくはｐＨＮＡをトランスフェクトし、エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｂ：エクダイソンで誘導されるＮＬ−ＡＰＰ、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｐＨＮのコトランスフェクションによる有意な抑制効果。Ａと同じ条件で、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型ＦＡＤ遺伝子プラスミドと共に、ｐＦＬＡＧまたはｐＨＮをトランスフェクトし、エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で７２時間培養した。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｃ：エクダイソンで誘導されるＱ７９の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの効果の欠如。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型Ｑ７９プラスミドをトランスフェクトし、１μＭのｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡで処理し、その後エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で培養した。エクダイソン処理開始の７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｄ：エクダイソンで誘導されるＮＬ−ＡＰＰ、Ｖ６４２Ｉ  ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ  ＰＳ−１、またはＮ１４１Ｉ  ＰＳ−２の発現により引き起こされる神経細胞死における、ｓＨＮの有意な抑制効果。Ｃと同じ条件で、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、エクダイソン誘導型ＦＡＤ遺伝子プラスミドをトランスフェクトし、１μＭのｓＨＮで処理した後、エクダイソン存在下（＋）または非存在下（−）で培養した。エクダイソン処理開始の７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
図１１は、ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体により誘導される神経細胞死におけるＨＮおよびその構造的誘導体の効果の欠如を示す図である。図は全て３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
Ａ：ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体の発現により誘導される神経細胞死における、ｐＨＮのコトランスフェクションの効果の欠如。Ｆ１１細胞に、ＡＬＳ関連変異ＳＯＤ１（ＳＯＤ１のＡ４Ｔ、Ｇ８５Ｒ、またはＧ９３Ａ変異体）をコードするｐＥＦ−ＢＯＳを、空ベクター（ｐＦＬＡＧ）、またはｐＨＮと共にトランスフェクトした。細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｂ：ＡＬＳ関連ＳＯＤ１変異体の発現により誘導される神経細胞死における、ｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの効果の欠如。Ｆ１１細胞に、Ａ４Ｔ、Ｇ８５Ｒ、またはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１をコードするｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクトし、１００μＭのｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡで処理した。その後、細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
図１２は、Ａβにより誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す位相差顕微鏡像を示す写真である。代表的な観察像を示した。初代培養皮質神経を、ｓＨＮ（１０ｎＭ，１０μＭ）、１０ｎＭ  ｓＨＮＧ、または１０μＭ  ｓＨＮＡの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３で７２時間処理した。Ａβ１−４３処理の開始１６時間前に、図示した最終濃度のＨＮポリペプチドを１回添加した。Ａβ１−４３の添加は、まず培地の半分を除去し、上記と同じ濃度のｓＨＮまたはｓＨＮＡと５０μＭのＡβ１−４３とを含む新鮮な培地を除去した培地と等量補充することによって行った。Ａβ処理しない未処理の細胞（ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）も観察した。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。
図１３は、Ａβにより誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す図である。初代培養皮質神経を、図示した濃度のｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１２と同様に行った。Ａβ処理の開始から７２時間後に細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。これらの実験の際、ポジティブコントロールとして、初代培養神経を１０μＭ  ｓＨＮまたはＨＮ誘導体の存在下または非存在下、２０μＭのエトポサイドで７２時間同様に処理した。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１４は、Ａβにより誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す図である。培養液中に放出されたＬＤＨ量により細胞傷害性をモニターした。初代培養皮質神経を、図示した濃度のｓＨＮ、ｓＨＮＧ、またはｓＨＮＡの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１２と同様に行った。Ａβ処理開始の２４、４８、または７２時間後に培養液中のＬＤＨ量を測定した。ＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で２０μＭのエトポサイドで処理した神経からのＬＤＨ放出も測定した。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１５は、Ａβ１−４３により誘導される初代培養神経の細胞死におけるＨＮの効果を示す写真である。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色の結果を蛍光顕微鏡像で示す。初代培養皮質神経を、図示した最終濃度のＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１２と同様に行った。Ａβ１−４３処理の７２時間後にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色を行った。Ａβ処理しない未処理の細胞（ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）も観察した。細胞質における蛍光は生細胞であることを表す。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は代表的な結果を示す。
図１６は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色の蛍光測定の結果を示す図である。初代培養皮質神経を、図示した最終濃度のＨＮポリペプチドの存在下または非存在下で２５μＭのＡβ１−４３を添加した。ＨＮポリペプチドの添加は図１２と同様に行った。Ａβ１−４３処理の７２時間後にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色を行い、蛍光強度を測定した。基底状態の蛍光強度は３６９６０（ｕｎｉｔ／ｗｅｌｌ）と計算され、これを各値から差し引いた。同様の実験は少なくとも３回行い、再現性のある結果を得た。図は３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
図１７は、ヒトの様々な組織中でのＨＮ  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。ヒト組織のポリＡ−ＲＮＡがブロットされたシートに放射標識したアンチセンスＨＮ（ａ）、５’領域をコードする１９ｍｅｒ（ｂ）、またはＤＴ７７（ｃ）をプローブとしてハイブリダイズさせた（１：脳、２：心臓、３：骨格筋、４：大腸、５：胸腺、６：脾臓、７：腎臓、８：肝臓、９：小腸、１０：膵臓、１１：肺、１２：末梢血白血球）。（ｄ）は同じシートを、β−ａｃｔｉｎをプローブにしてノーザンブロットを行った結果を示す。左側の数字は分子量サイズを示す。同様の実験は少なくとも３回行い、これと同様の結果を得た。
図１８は、マウス組織でのＨＮ  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。マウスの様々な器官から抽出したポリＡ−ＲＮＡ（２μｇ／レーン）を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ブロット後、標識したアンチセンスＨＮ（左上）またはβ−ａｃｔｉｎ（左下）をプローブにしてハイブリダイゼーションを行った（１：脳、２：心臓、３：骨格筋、４：胸腺、５：脾臓、６：腎臓、７：肝臓、８：小腸、９：胃、１０：皮膚、１１：肺）。
右のパネルはマウス脳におけるＨＮ  ｍＲＮＡの発現領域を示す図である。マウス脳の様々な領域由来のポリＡ−ＲＮＡがブロットされたシート（１：前頭葉、２：側頭葉、３：頭頂葉、４：後頭葉、５：小脳、６：肺）に、標識したアンチセンスＨＮ（右上）またはβ−ａｃｔｉｎ（右下）プローブをハイブリダイズさせた。シート間で量的な比較ができるように、左パネルと同じ量の肺由来のポリＡ−ＲＮＡをレーン６に泳動してハイブリダイゼーションを行った。
【図１】
0004628627.tif 000002
【図２】
0004628627.tif 000003
【図３】
0004628627.tif 000004
【図４】
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【図５】
0004628627.tif 000006
【図６】
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【図７】
0004628627.tif 000008
【図８】
0004628627.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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