(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質核内移行誘発物質の作用によって細胞質から核内に移行する蛋白質の核内移行を検出、定量する方法において、
プローブI、プローブIIおよび蛋白質核内移行誘発物質を培養細胞または非ヒト動物体内細胞に導入し、
プローブIは、inteinを２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［intein−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されおり、プローブIIは、標識蛋白を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドと、inteinを２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／intein−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核局在化シグナルが連結されているか、または、
プローブIは、標識蛋白を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドと、inteinを２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／intein−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されており、プローブIIは、inteinを２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［intein−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核局在化シグナルが連結されていて、
細胞質のプローブIが核内に移行し、核内に局在するプローブIIと接近することによって再構成された標識蛋白からのシグナルを測定することによって、蛋白質の核内移行を検出、定量することを特徴とする蛋白質核内移行検出・定量方法。
【請求項２】
蛋白質がアンドロゲン受容体、蛋白質核内移行誘発物質が５α−ジヒドロテストステロンであるか、
蛋白質がアリル炭化水素受容体、蛋白質核内移行誘発物質がダイオキシンであるか、
蛋白質が甲状腺ホルモン受容体、蛋白質核内移行誘発物質が甲状腺ホルモンであるか、
蛋白質がグルココルチコイド受容体、蛋白質核内移行誘発物質がcorticosteron、dexamethasone、progesteronまたはcortisolであるか、または
蛋白質がSignal Transducer and Activator of Transcription 3、蛋白質核内移行誘発物質がoncostatin Mである請求項１の検出・定量方法。
【請求項３】
inteinは、藍藻由来のDnaEである請求項１の検出・定量方法。
【請求項４】
標識蛋白は、ルシフェラーゼである請求項１の検出・定量方法。
【請求項５】
プローブIおよびプローブIIを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入する請求項１の検出・定量方法。
【請求項６】
核内移行蛋白質を細胞質から核内へ移行させる物質をスクリーニングする方法において、プローブI、プローブIIおよび候補物質を培養細胞または非ヒト動物体内細胞に導入し、
プローブIは、inteinを２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［intein−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核内移行蛋白質が連結されおり、プローブIIは、標識蛋白を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドと、inteinを２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／intein−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核局在化シグナルが連結されているか、または
プローブIは、標識蛋白を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドと、inteinを２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／intein−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核内移行蛋白質が連結されており、プローブIIは、inteinを２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［intein−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核局在化シグナルが連結されていて、
細胞質のプローブIが核内に移行し、核内に局在するプローブIIと接近することによって再構成された標識蛋白からのシグナルが観測された場合に、候補物質が蛋白質の核内移行を誘発する物質であると判定することを特徴とする蛋白質核内移行誘発物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
核内移行蛋白質はアンドロゲン受容体、アリル炭化水素受容体、甲状腺ホルモン受容体、グルココルチコイド受容体、Signal Transducer and Activator of Transcription 3またはSterol Regulatory Element-Binding Protein-2である請求項６のスクリーニング方法。
【請求項８】
inteinは、藍藻由来のDnaEである請求項６のスクリーニング方法。
【請求項９】
標識蛋白は、ルシフェラーゼである請求項６のスクリーニング方法。
【請求項１０】
プローブIおよびプローブIIを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入する請求項６のスクリーニング方法。
【請求項１１】
蛋白質核内移行誘発物質の作用によって細胞質から核内に移行する核内移行蛋白質の核内移行を阻害する物質のスクリーニング方法において、
プローブI、プローブIIおよび候補物質を培養細胞または非ヒト動物体内細胞に導入し、さらに蛋白質核内移行誘発物質を前記細胞に導入し、
プローブIは、inteinを２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［intein−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核内移行蛋白質が連結されおり、プローブIIは、標識蛋白を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドと、inteinを２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／intein−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核局在化シグナルが連結されているか、または、
プローブIは、標識蛋白を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドと、inteinを２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／intein−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核内移行蛋白質が連結されており、プローブIIは、inteinを２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［intein−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に核局在化シグナルが連結されていて、
蛋白質核内移行誘発物質のみを細胞に導入して細胞質のプローブIが核内に局在するプローブIIと接近することによって再構成された標識蛋白からのシグナルに比較して、候補物質と蛋白質核内移行誘発物質とを細胞に導入した場合のシグナルが小さい場合に、候補物質が蛋白質の核内移行を阻害する物質であると判定することを特徴とする蛋白質核内移行阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
蛋白質がアンドロゲン受容体、蛋白質核内移行誘発物質が５α−ジヒドロテストステロンであるか、
蛋白質がアリル炭化水素受容体、蛋白質核内移行誘発物質がダイオキシンであるか、
蛋白質が甲状腺ホルモン受容体、蛋白質核内移行誘発物質が甲状腺ホルモンであるか、
蛋白質がグルココルチコイド受容体、蛋白質核内移行誘発物質がcorticosteron、dexamethasone、progesteronまたはcortisolであるか、または
蛋白質がSignal Transducer and Activator of Transcription 3、蛋白質核内移行誘発物質がoncostatin Mである請求項１１のスクリーニング方法。
【請求項１３】
inteinは、藍藻由来のDnaEである請求項１１のクリーニング方法。
【請求項１４】
標識蛋白は、ルシフェラーゼである請求項１１のスクリーニング方法。
【請求項１５】
プローブIおよびプローブIIを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入する請求項１１のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、生物活性物質の作用により生じる蛋白質の核内移行を検出、定量するためのプローブ対に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、生物活性物質の作用により誘発される蛋白質の核内移行を精度高く検出、定量するためのプローブ対と、それを用いた蛋白質核内移行の検出・定量方法、並びに蛋白質の核内移行を誘発または阻害する物質をスクリーニングするための方法に関するものである。
【背景技術】  真核細胞における複雑なシグナル伝達ネットワークは、様々な蛋白質の区画化により制御されている。また、遺伝子発現の度合いや特異性の制御には、細胞内外からの刺激に対する応答としての蛋白質の核原形質輸送が深く関わっている。そして、このような核原形質輸送は、リガンド−レセプター結合、蛋白質リン酸化、蛋白質加水分解などの蛋白質の翻訳後修飾により制御されている。
一方、腫瘍細胞内ではしばしば核蛋白質が誤った場所に局在化することが明らかになっており、蛋白質を正しい区画に再輸送させる小分子が盛んに検討されている。同様の誤った蛋白質局在化は、特定の外来性化学物質に曝された細胞においても見られることから、これらの物質が生物に与える影響が懸念される。
そこで、核原形質輸送を高速で検出できるスクリーニング方法が確立されれば、抗腫瘍活性を有する物質の発見や、物質毒性試験方法の実現につながり、さらに、核原形質輸送のメカニズムに関する新たな知見が得られると期待される（非特許文献１〜４）。
単一生細胞内において蛋白質の動態をモニタリングする技術としては、一般に、イムノアッセイによる方法や、遺伝子的に標識された緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を使用する方法が知られている（非特許文献５）。これらの方法は、単一細胞内における対象蛋白質の動態を、空間的および時間的に画像化する上では効果的である。しかし、顕微鏡下で細胞内局在を確認し、定量するためには長時間を要し、さらに、生物内での動態を画像化するためには、オルガネラの抽出や切片化等の煩雑なアッセイ手順を要するという問題があった。
【非特許文献１】Ｋａｕ，Ｔ．Ｒ．＆  Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ８，７８−８５（２００    ３）．
【非特許文献２】Ｋａｕ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４，１−１２（２００４）．
【非特許文献３】Ｒｕｄｉｎ，Ｍ．＆  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２，１２３−１３    １（２００３）．
【非特許文献４】Ｇｒａｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １８１−１８２，３７１−３８２（２００２）．
【非特許文献５】Ｅｌｉｏｎ，Ｅ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５１，６０７−６２２（２００２）．
【非特許文献６】Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，２１１−２４７（２０００）．
【非特許文献７】Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，４４３８−４４４２（１９９１）．
【非特許文献８】Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６，８５−９１（１９７７）．
【非特許文献９】Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｒ．＆  Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５，１５８４−１５８９（２００３）．
【非特許文献１０】Ｋａｉｈａｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５，４１７６−４１８１（２００３）
【非特許文献１１】Ｂｈａｕｍｉｋ，Ｓ．＆  Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，３７７−３８２（２００２）．
【非特許文献１２】Ｓｕｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，１０２５−１０２９（２００１）．
【非特許文献１３】Ｗｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，９２２６−９２３１（１９９８）．
【非特許文献１４】Ｙａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，３５１３−３５１８（２００３）．
【非特許文献１５】Ｇｉｒｉａｔ，Ｉ．＆  Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，７１８０−７１８１（２００３）．
【非特許文献１６】Ｃｈｉｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，４５１０−４５１５（２００３）．
【非特許文献１７】Ｏｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，５８６６−５８７４（２００１）．
【非特許文献１８】Ｏｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５１６−２５２１（２００１）．
【非特許文献１９】Ｏｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，２８７−２９３（２００３）．
【非特許文献２０】Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１５６０８−１５６１３（２００２）．
【非特許文献２１】Ｍａｓｓｏｕｄ，Ｔ．Ｆ．＆  Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７，５４５−５８０．（２００３）．
【非特許文献２２】Ｇｒｅｅｒ，Ｌ．Ｆ．，３ｒｄ  ＆  Ｓｚａｌａｙ，Ａ．Ａ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １７，４３−７４（２００２）．
【非特許文献２３】Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．＆  Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ，Ｖ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１２３−１２８（２００３）．
【発明の開示】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、内在性および外来性の物質による蛋白質核内移行を、生細胞や生物個体の局所で検出するための簡便で精度高い方法を提供することを課題としている。
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、少なくとも、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されてなるプローブＩと、少なくとも、標識蛋白を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドと、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナルが連結されてなるプローブＩＩからなることを特徴とする蛋白質核内移行検出用プローブ対を提供する。また、この出願の発明は、第２には、少なくとも、標識蛋白を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドと、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されてなるプローブＩと、少なくとも、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナルが連結されてなるプローブＩＩからなることを特徴とする蛋白質核内移行検出用プローブ対を提供する。
この出願の発明は、第３には、ｉｎｔｅｉｎが藍藻由来のＤｎａＥである蛋白質核内移行検出用プローブ対を、また、第４には、標識蛋白がルシフェラーゼである蛋白質核内移行検出用プローブ対を提供する。
さらに、この出願の発明は、第５には、生物活性物質の作用によって誘発される蛋白質の核内移行を検出、定量するための方法であって、前記いずれかのプローブ対におけるプローブＩと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブＩＩを核内に局在化させ、核内における標識蛋白のシグナルを測定することを特徴とする蛋白質核内移行検出・定量方法を提供する。
この出願の発明は、第６には、前記いずれかのプローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、プローブＩと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブＩＩを核内に局在化させる蛋白質核内移行検出・定量方法を、第７には、前記いずれかのプローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブＩＩを核内に局在化させる蛋白質核内移行検出・定量方法を提供する。
さらに、この出願の発明は、第８には、蛋白質の核内移行を誘発する物質をスクリーニングするための方法であって、前記いずれかのプローブ対におけるプローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させ、核内移行誘発候補物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシグナルを測定することを特徴とする蛋白質核内移行誘発物質のスクリーニング方法を提供する。
この出願の発明は、また、第９には、蛋白質の核内移行を阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、前記いずれかのプローブ対におけるプローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させ、核内移行阻害候補物質を細胞質に導入した後、さらに蛋白質核内移行誘発物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシグナルを測定し、蛋白質核内移行誘発物質のみを細胞質に導入した場合の標識蛋白のシグナルと比較することを特徴とする蛋白質核内移行阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
この出願の発明は、第１０には、前記いずれかのプローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、プローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させる前記のスクリーニング方法を、そして、第１１には、前記いずれかのプローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させる前記のスクリーニング方法をも提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対の構成および作用を例示した概略模式図である。
図２は、ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＲｃ−ＡＲ発現ベクターを過渡的に形質移入した際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。（ａ：抗ＡＲ抗体；ｂ：抗Ｆｌａｇ抗体；１：ＤＨＴ未添加；２：ＤＨＴ添加）
図３は、この出願の発明の実施例において得られたウェスタンブロットを示した図である。（ａ：ＣＯＳ−７細胞の蛋白質抽出物；ｂ：プローブＩおよびＩＩを同時発現させた細胞（ＤＨＴ添加）；ｃ：プローブＩおよびＩＩを同時発現させた細胞（ＤＨＴ未添加））
図４は、細胞内に添加されたＤＨＴ濃度と再構築されたＲＬｕｃによる蛍光強度の関係を示した図である。
図５は、各種の内在性ホルモンおよび合成化学物質の濃度と再構築されたＲＬｕｃによる蛍光強度の関係を示した図である。（ａ：内在性ホルモン；ｂ：合成化学物質；ｃ：蛋白質核内移行阻害剤）
図６は、過渡的に形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウス体内における蛋白質核内移行を示すＣＣＤ画像である。（１：プローブなし；２：プローブＩＩのみ発現；３：プローブＩのみ発現；４：プローブＩおよびＩＩを発現）
図７は、過渡的に形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウス体内におけるフォトン値の平均を示した図である。（１：プローブなし；２：プローブＩＩのみ発現；３：プローブＩのみ発現；４：プローブＩおよびＩＩを発現）
図８は、過渡的に形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウスにセレンテラジンをｉ．ｐ．注射した後の発光動態の経時変化（１：プローブなし；２：プローブＩＩのみ発現；３：プローブＩのみ発現；４：プローブＩおよびＩＩを発現）
図９は、プローブＩおよびＩＩを同時形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウスのＤＨＴ未注射およびＤＨＴ注射後のＣＣＤ画像を示した図である。
図１０は、プローブＩおよびＩＩを同時形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウスのＤＨＴ未注射およびＤＨＴ注射後のフォトン値を示した図である。（４匹の平均値）
図１１は、プローブＩおよびＩＩを同時形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウスにおけるプロシミドンおよびＰＣＢによる蛋白質核内移行阻害を表すＣＣＤ画像である。（ａ：対照（ＤＭＳＯ刺激）；ｂ：ＤＨＴ；ｃ：ＤＨＴ＋プロシミドン；ｄ：ＤＨＴ＋ＰＣＢ）
図１２は、プローブＩおよびＩＩを同時形質移入されたＣＯＳ−７細胞を移植されたマウスにおけるプロシミドンおよびＰＣＢによる蛋白質核内移行阻害を表すグラフである。（ａ：対照（ＤＭＳＯ刺激）；ｂ：ＤＨＴ；ｃ：ＤＨＴ＋プロシミドン；ｄ：ＤＨＴ＋ＰＣＢ）
図１３は、この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対（蛋白質として、Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の構成および作用を例示した概略模式図である。
図１４は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐｃＤＲｃ−ＧＲ発現ベクターを過渡的に形質移入した際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。（ａ：抗ＧＲ抗体；ｂ：抗Ｆｌａｇ抗体；Ｃｏｒｔｉ−：ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ未添加；Ｃｏｒｔｉ＋：ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ添加）
図１５は、細胞内に添加されたＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ、Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、２ＤＧ、ＤＨＴ、Ｍｆ（ＲＵ４８６）、Ｅ２およびＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｎｌｙ（ｃｏｒｔｉ）それぞれの濃度と、再構築されたＲＬｕｃによる蛍光強度の関係を示した図である。
図１６は、過渡的に形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を移植されたマウス体内における蛋白質核内移行を示すＣＣＤ画像である。（１：プローブなし；２：プローブＩＩのみ発現；３：プローブＩのみ発現；４：プローブＩおよびＩＩを発現）
図１７は、この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対（蛋白質として、Ｓｔｅｒｏｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の構成および作用を例示した概略模式図である。
図１８は、細胞にｐｃＤＲｃ−ＳＲＥＢＰ発現ベクターを過渡的に形質移入した際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。（ａ：Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎの検出；ｂ：ＳＲＥＢＰ−２の検出；矢印１：核移行前（局在）の状態；矢印２から４：核移行後の状態；＋ｃｈｏｌ：コレステロール存在下；−ｃｈｏｌ：コレステロール非存在下）
図１９は、細胞内に添加されたコレステロール濃度（ｃｈｏｌ）と、再構築されたＲＬｕｃによる蛍光強度の関係を示した図である。
図２０は、この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対（蛋白質として、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）の構成および作用を例示した概略模式図である。
図２１は、ＨＥＫ２９３細胞にｐｃＤＲｃ−ＳＴＡＴ−３発現ベクターを過渡的に形質移入した際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。（ａ：抗Ｆｌａｇ抗体；ｂ：抗ＳＴＡＴ抗体；ＯＳＭ−：ＯＳＭ未添加；ＯＳＭ＋：ＯＳＭ添加）
図２２は、細胞内に添加されたＯＳＭ濃度と、再構築されたＲＬｕｃによる蛍光強度の関係を示した図である。
【符号の説明】
なお、図中の符号は次のものを示す。
１  蛋白質核内移行検出用プローブ対
１１  プローブＩ
１２  プローブＩＩ
２  蛋白質
３  標識蛋白
３ｃ  標識蛋白のＣ−末端側のポリペプチド
３ｎ  標識蛋白のＮ−末端側のポリペプチド
４  ｉｎｔｅｉｎ
４ｃ  ｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチド
４ｎ  ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド
５  核局在化シグナル
６  生物活性物質、蛋白質核内移行誘発物質
６’  核内移行誘発候補物質
６’’  核内移行阻害候補物質
７  リンカー
８  核膜
【発明を実施するための最良の形態】  図１にこの出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対の原理を表す概略摸式図を示した。すなわち、この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対（１）は、少なくとも、ｉｎｔｅｉｎ（４）を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチド（４ｃ）と、標識蛋白（３）を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチド（３ｃ）が順に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質（２）が連結されてなるプローブＩ（１１）と、少なくとも、標識蛋白（３）を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチド（３ｎ）と、ｉｎｔｅｉｎ（４）を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチド（４ｎ）が順に連結された［標識蛋白−Ｎ／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナル（５）が連結されてなるプローブＩＩ（１２）からなるもの、もしくは、少なくとも、標識蛋白（３）を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチド（３ｎ）と、ｉｎｔｅｉｎ（４）を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチド（４ｎ）が順に連結された［標識蛋白−Ｎ／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質（２）が連結されてなるプローブＩ（１１）と、少なくとも、ｉｎｔｅｉｎ（４）を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチド（４ｃ）と、標識蛋白（３）を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチド（３ｃ）が順に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナル（５）が連結されてなるプローブＩＩ（１２）からなるものである。
これらのプローブ対は、細胞内に導入されて使用されるが、そのときプローブＩ（１１）は細胞質に、プローブＩＩ（１２）は核内に局在化される。プローブＩ（１１）における蛋白質（２）が核内移行誘発物質（６）と結合した場合、プローブＩ（１１）は、細胞質（Ｃ）側から核内（Ｎ）へ移行し、プローブＩＩ（１２）と近接する。すると２分割されたｉｎｔｅｉｎ（４）の二つの部位（４ｃ、４ｎ）が接近して正しく折りたたまれ、これにより、スプライシングが起こり、プローブＩ（１１）およびプローブＩＩ（１２）からｉｎｔｅｉｎ（４）が切り出され、２分割された標識蛋白（３）の二つの部位（３ｃ、３ｎ）がペプチド結合により連結され、標識蛋白（３）が再構築される。
一方、プローブＩ（１１）における蛋白質（２）が核内移行誘発物質（６）と結合しない場合には、ｉｎｔｅｉｎ（４）のスプライシングが起こらないため、標識蛋白（３）は再構築されない。
したがって、この標識蛋白（３）のシグナルを測定することにより、蛋白質（２）の核内移行を検出することができる。
以上のとおりの蛋白質核内移行検出用プローブ対において、プローブＩ（１１）は、［蛋白質（２）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）／標識蛋白−Ｃ（３ｃ）］の構成を有する直列融合蛋白質、［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）／標識蛋白−Ｃ（３ｃ）／蛋白質（２）］の構成を有する直列融合蛋白質、［蛋白質（２）／標識蛋白−Ｎ（３ｎ）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）］の構成を有する直列融合蛋白質、または［標識蛋白−Ｎ（３ｎ）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）／蛋白質（２）］の構成を有する直列融合蛋白質のいずれかであるが、このようなプローブＩには、これらの部位以外にも、各部位の間等にリンカー配列（７）としてポリペプチド等が含まれていてもよい。
同様に、プローブＩＩ（１２）は、［標識蛋白−Ｎ（３ｎ）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）／核局在化シグナル（５）］の構成を有する直列融合蛋白質、［核局在化シグナル（５）／標識蛋白−Ｎ（３ｎ）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）］の構成を有する直列融合蛋白質、［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）／標識蛋白−Ｃ（３ｃ）／核局在化シグナル（５）］の構成を有する直列融合蛋白質、または、［核局在化シグナル（５）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）／標識蛋白−Ｃ（３ｃ）］の構成を有する直列融合蛋白質のいずれかであるが、これらの部位以外にも、各部位の間等に、リンカー配列（７）としてポリペプチド等を含んでいてもよい。
この出願の発明の核内移行検出用プローブ対（１）において、プローブＩ（１１）に含まれる蛋白質（２）は、核内移行を検出・定量したいものであればよく、とくに限定されない。例えば、よく知られた核ホルモン受容体であるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）が例示される。ＡＲは５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に結合することにより細胞質から核内へ移行することが知られている（非特許文献６）。また、ダイオキシンにより核内移行することが知られるアリル炭化水素受容体（ＡｈＲ）、甲状腺ホルモンにより核内移行することが知られる甲状腺ホルモン受容体（ＴｈＲ）、コレステロールセンサーとして知られるｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＥＢＰ）、細胞増殖シグナルに関与するｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）、アポトーシスを誘導するｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ（ＮＦκＢ）等も例示される。
一方、この出願の発明の核内移行検出用プローブ対（１）において、プローブＩＩ（１２）に含まれる核局在化シグナル（５）は、プローブＩＩ（１２）が細胞内に導入された際に、プローブＩＩ（１２）が核内（Ｎ）に局在化されるようにするためのものであり、その構造や配列はとくに限定されない。具体的には、配列番号１のものが例示される。もちろん、これ以外にも、Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ由来のもの（配列番号２）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ由来のもの（配列番号３）等の公知の核局在化配列（ＮＬＳ）が適用できる。
この出願の発明の核内移行検出用プローブ対（１）において２分割されて各々Ｃ−末端側のポリペプチド（３ｃ）、Ｎ−端側のポリペプチド（３ｎ）としてプローブＩ（１１）およびプローブＩＩ（１２）で使用される標識蛋白（３）は、ｉｎｔｅｉｎ（４）のスプライシングにより直接ペプチド結合し、再構築されて解析可能となるものであれば、どのようなものであってもよい。例えば、蛍光蛋白や発光触媒酵素が好ましく適用される。緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）などの蛍光蛋白は、連結されたとき発光し、可視的に解析でき、好ましい。また、ルシフェラーゼ等の発光触媒酵素も連結されて活性中心を形成し、ルミノメーターで容易に検出可能な光を発するため好ましい。とくに、レニラルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）は、分子量が３６−ｋＤａと小さく、活性化にＡＴＰや翻訳後修飾が不要であることから、好ましい（非特許文献７、８）。分割されたＲＬｕｃのＮ−およびＣ−末端が、夫々個々では蛍光を示さず、結合して再び活性を取り戻すようにするためには、活性中心を２つに分割するような分け方をするとよい。具体的には、Ｇ２２９とＫ２３０の間で切断することが好ましいことが報告されている（非特許文献９、１０）。またＲＬｕｃの基質である腔腸ルシフェリン（セレンテラジン）が細胞膜を透過し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの可視化に十分な強度の蛍光を生じることからも、ＲＬｕｃが好ましいといえる（非特許文献１１）。
さらに、この出願の発明の核内移行検出用プローブ対（１）において、２分割されて各々Ｃ−末端側のポリペプチド（４ｃ）、Ｎ−末端側のポリペプチド（４ｎ）としてプローブＩ（１１）およびプローブＩＩ（１２）で使用されるｉｎｔｅｉｎ（４）としては、種々の生物由来の公知のものが適用できる。プローブＩ（１１）における蛋白質（２）と核内移行誘発物質（６）が相互作用し、プローブＩ（１１）が核内（Ｅ）に移行してプローブＩＩ（１２）と近接することによりｉｎｔｅｉｎ（４）が自動的に切り出されるためには、ｉｎｔｅｉｎ（４）は、部位特異的エンドヌクレアーゼであることが好ましい。具体的には、酵母ＶＭＡ由来のｉｎｔｅｉｎや藍藻由来のＤｎａＥ  ｉｎｔｅｉｎが好ましく例示される。中でも藍藻由来のＤｎａＥは、ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３のＤＮＡ配列が明らかになっている上、天然の分割ｉｎｔｅｉｎであるため、扱い易い。（非特許文献１２〜２０）
さらに、この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対（１）において、ｉｎｔｅｉｎ（４）のスプライシングが有効に起こるためには、プローブＩ（１１）とプローブＩＩ（１２）が核内で近接した際に、プロテインスプライシングに関与する二つの部位が正しく折り畳まれ、かつ、正確に並べられなければならない。したがって、ｉｎｔｅｉｎとしては、生物由来のものをそのまま用いてもよいが、一部のアミノ酸残基を変換したり、削除したり、適当なリンカー配列を導入したりして、スプライシングが起こりやすいように設計されたものを使用してもよい。
この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対（１）では、例えば、２分割されたｉｎｔｅｉｎ（４）の一方のポリペプチド（例えば、Ｃ−末端側：４ｃ）が、２分割された標識蛋白（３）の一方のポリペプチド（この場合、３ｃ）に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）／標識蛋白−Ｃ（３ｃ）］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質（２）が連結されてプローブＩ（１１）を構成する。
また、プローブＩで使用されなかった標識蛋白（３）のもう一方のポリペプチド（前記の例では、３ｎ）が、プローブＩで使用されなかったｉｎｔｅｉｎ（４）のもう一方のポリペプチド（この場合、Ｎ−末端側：４ｎ）に順に連結された［標識蛋白−Ｎ（３ｎ）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナル（５）が連結されてプローブＩＩ（１２）を構成する。
このような蛋白質核内移行検出用プローブ対（１）において、ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）と標識蛋白−Ｃ（３ｃ）や［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ（４ｃ）／標識蛋白−Ｃ（３ｃ）］融合構造と蛋白質、標識蛋白−Ｎ（３ｎ）とｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）や［標識蛋白−Ｎ（３ｎ）／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ（４ｎ）］融合構造と核局在化シグナル（５）は、蛋白質（２）、核局在化シグナル（５）、各プローブ（１１、１２）等の作用に影響を及ぼさなければ、どのような方法で連結されたものであってもよい。例えば、通常用いられる化学的、生物化学的、あるいは、遺伝子工学的手法が適用できる。
この出願の発明では、以上のとおりの蛋白質核内移行検出用プローブ対（１）を用いて蛋白質（２）の核内移行を検出・定量する方法が提供される。具体的には、前記のプローブ対（１）におけるプローブＩ（１１）を細胞質中（Ｃ）で生物活性物質（６）と共存させ、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させ、核内（Ｎ）における標識蛋白（３）のシグナルを測定する。
このような蛋白質核内移行の検出・定量方法では、プローブＩ（１１）は細胞質（Ｃ）に留まり、プローブＩＩ（１２）は核局在化シグナル（５）の存在により核内（Ｎ）に局在化するが、蛋白質（２）が生物活性物質（６）を認識、結合することによりプローブＩ（１１）が細胞質（Ｃ）から核内（Ｎ）へ移行する。すると、プローブＩ（１１）とプローブＩＩ（１２）が近接し、これらにおける２分割されたｉｎｔｅｉｎ（４）がスプライシングにより切り出されて標識蛋白（３）が再構築される。したがって、標識蛋白（３）のシグナルを測定すれば、生物活性物質（６）による蛋白質（２）の核内移行を精度高く検出することが可能となる。また、予め標識蛋白（３）の濃度と標識蛋白（３）のシグナル強度の関係から検量線を求めれば、蛋白質（２）の核内移行量を定量することも可能となる。
この出願の発明の蛋白質核内移行の検出・定量方法において、プローブＩ（１１）と生物活性物質（６）を細胞質（Ｃ）中で共存させ、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させるためには、プローブ対（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することができる。あるいは、プローブ対（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩ（１１）と生物活性物質（６）を細胞質中で共存させ、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させることもできる。
この出願の発明では、さらに、蛋白質（２）の核内移行を誘発する物質をスクリーニングするための方法も提供される。すなわち、前記いずれかのプローブ対（１）におけるプローブＩ（１１）を細胞質（Ｃ）に導入し、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させ、核内移行誘発候補物質（６’）を細胞質（Ｃ）に共存させ、その後、核内（Ｎ）における標識蛋白質のシグナルを測定することにより核内移行誘発物質をスクリーニングできる。
核内移行誘発候補物質（６’）がプローブＩ（１１）における蛋白質（２）と相互作用し、この蛋白質（２）の核内移行が誘発されるとき、プローブＩ（１１）が細胞質（Ｃ）から核内（Ｎ）へ移行し、核内（Ｎ）に局在化されたプローブＩＩ（１２）と近接する。これにより２分割されたｉｎｔｅｉｎの一方のポリペプチド（例えば、Ｃ−末端側：４ｃ）ともう一方のポリペプチド（４ｎ）が近接し、スプライシングが起こり、次いで２分割された標識蛋白（３ｃおよび３ｎ）がペプチド結合して標識蛋白（３）が再構築される。したがって、この標識蛋白（３）のシグナルを測定すれば、核内移行が起こったか否かを確認でき、核内移行を起こした物質を核内移行誘発物質として判定することが可能となる。
この出願の発明の核内移行誘発物質のスクリーニング方法において、プローブＩ（１１）を細胞質（Ｃ）に導入し、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させるためには、プローブ対（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法が適用される。あるいは、プローブ対（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生すれば、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩ（１１）を細胞質に導入し、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させることができる。
さらに、この出願の発明では、蛋白質核内移行阻害物質をスクリーニングする方法が提供される。すなわち、前記いずれかのプローブ対（１）におけるプローブＩ（１１）を細胞質（Ｃ）に導入し、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させ、まず、核内移行阻害候補物質（６’’）を細胞質（Ｃ）に導入する。その後、蛋白質核内移行誘発物質（６）を細胞質に導入して核内（Ｎ）における標識蛋白のシグナルを測定し、その結果を、蛋白質核内移行誘発物質（６）のみを細胞質（Ｃ）に導入した場合の標識蛋白のシグナルと比較することにより核内移行阻害物質をスクリーニングできる。
核内移行阻害候補物質（６’’）がプローブＩ（１１）における蛋白質（２）と蛋白質核内移行誘発物質（６）の結合を阻害する場合、標識蛋白（３）のシグナル強度は、核内移行阻害候補物質（６’’）存在下で、核内移行阻害候補物質（６’’）非存在下（すなわち核内移行誘発物質（６）のみ存在時）に比べて減少する。したがって、このように、標識蛋白（３）のシグナルを減少させる物質を核内移行阻害物質として判定することができる。
このような核内移行阻害物質のスクリーニング方法においても、プローブＩ（１１）を細胞質（Ｃ）に導入し、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させるためには、プローブ対（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法が適用される。あるいは、プローブ対（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生すれば、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩ（１１）を細胞質に導入し、プローブＩＩ（１２）を核内（Ｎ）に局在化させることができる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】〔手順〕
（１）プラスミドの構築
ＰＣＲにより、ＲＬｕｃのＮ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＲＬｕｃ−Ｎ；１〜２２９  ＡＡ）のＣ−末端に配列番号４のペプチド（ＫＦＡＥＹＣ）を、またＮ−末端に配列番号５に示されるＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を導入した。さらに、修飾ＲＬｕｃ−ＮをエンコードするｃＤＮＡを、未変性のＨｉｎｄＩＩＩサイトにより、ＤｎａＥのＮ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＤｎａＥ−Ｎ；１〜１２３  ＡＡ）に融合した。そして、ＤｎａＥ−ＮのＣ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡを、ＮｃｏＩサイトにより、核局在シグナル（配列番号１：ＮＬＳ；（ＤＰＫＫＫＲＫＶ）３）のｃＤＮＡに融合した。
ＰＣＲにより、ＲＬｕｃのＣ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＲＬｕｃ−Ｃ；２３０〜３１１  ＡＡ）のＮ−末端に配列番号６のペプチド（ＦＮＬＳＨ）とユニークな酵素部位ＭｕｎＩを、またＣ−末端に配列番号７のリンカー（ＧＧＧＧＳＧ）とユニークな酵素部位ＮｏｔＩを導入した。
さらに、ＰＣＲにより、ＡＲをエンコードするｃＤＮＡ（１〜９１８  ＡＡ）のＮ−末端にユニークな酵素部位であるＮｏｔＩを、Ｃ−末端にＸｈｏＩを導入した。この修飾ＲＬｕｃ−ＣをエンコードするｃＤＮＡは、ＭｕｎＩ部位によりＤｎａＥのＣ−末端側断片をエンコードするｃＤＮＡ（ＤｕａＥ−Ｃ；１〜３６  ＡＡ）に融合し、ＮｏｔＩ部位により全長ＡＲをエンコードするｃＤＮＡに融合した。
これらは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の酵素部位ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にサブクローニングされた。
なお、ＰＣＲ生成物の忠実度は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔならびに遺伝子分析機ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３１０（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス解析により確認した。
（２）細胞培養と形質移入
ＣＯＳ−７細胞の培養は、１０％ステロイド除去ウシ胎児血清（木炭抽出ＦＢＳ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で行った。
細胞を１２ウェルの培養プレート上に播種した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記のプラスミド２μｇの形質移入を行った。
（３）ウエスタンブロット分析
ｐｃＲＤｎ−ＮＬＳまたはｐｃＤＲｃ−ＡＲをＣＯＳ−７細胞に形質移入し、２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、２００μｌの溶解緩衝液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセリン、１０％２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）中で可溶化した。等量の試料を６％アクリルアミドゲル中で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に転写した後、マウス抗ＡＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でブロット処理した。ブロットはアルカリホスファターゼ結合二次抗体存在下でインキュベートし、ケミルミネッセンス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により可視化した。
（４）免疫細胞化学手法
ＣＯＳ−７細胞の培養は、顕微鏡ガラススライド上で直接行い（２×１０５細胞／スライド）、構築されたプラスミドにより形質移入を行った。形質移入された細胞は、３％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。細胞を０．２％魚皮ゼラチンでブロッキングした後、マウス抗ＡＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはマウス抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）存在下でインキュベートした。さらに、細胞をＣｙ−５−複合化二次抗体によりインキュベートし、６４７ｎｍカットオフフィルタと６６５ｎｍ  Ｉ．Ｐ．フィルタを装着した共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて記録した。
（５）ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（細胞）
プラスミドを用いてＣＯＳ−７細胞に形質移入し、１２時間インキュベートした。培養液を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに置換し、その２４時間後に各ウェルにステロイドホルモンまたは合成化学物質を添加した。
さらに、ＣＯＳ−７細胞を２時間インキュベートし、細胞を収集して、ルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ルミノメータ（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＧｍｂＨ）（積分時間２０秒）を用いて評価した。
（６）ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング（マウス）
前記（１）で構築したプラスミドｐｃＲＤｎ−ＮＬＳおよびｐｃＤＲｃ−ＡＲを、ＣＯＳ−７細胞に個別に形質移入、または同時形質移入した。形質移入後、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で１２時間にわたりインキュベートし、細胞を収集した。この細胞をＰＢＳ中に懸濁し、１×１０６個細胞を含む分割量を、麻酔したＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（メス、５週齢、体重約１７ｇ）の背中の異なる４カ所に移植した。
移植１２時間後、１００μｌのＤＨＴ（１００μｇ／ｋｇ体重）または１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＭＳＯ（溶媒）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。注射の２時間後、１００μｌのセレンテラジン（２．８ｍｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．注射し、２分間隔でマウスのイメージングを行った。
ＲＬｕｃ活性に対するＤＨＴの影響を調べるため、２群のヌードマウスの背中に、ＣＯＳ−７細胞（１×１０６細胞）を直接注入した。２群のうち最初のマウス群には、１００μｌの１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＭＳＯ（溶媒）をｉ．ｐ．注射した。第２群には１００μｌのＤＨＴ（１００μｇ／ｋｇ体重）を注射した。３時間後に１００μｌのセレンテラジン（１．４ｍｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．注射し、１０分後にマウスのイメージングを行った（ｎ＝４）。
脳実験のために、前記のプラスミドｐｃＲＤｎ−ＮＬＳおよびｐｃＤＲｃ−ＡＲの両方を形質移入したＣＯＳ−７細胞（１×１０５細胞）を、１ｍｍの穿刺孔から３ｍｍの深さでヌードマウスの前脳に移植した。移植直後、４群のうち第１および第２マウス群には、１００μｌの１．０％ＤＭＳＯをｉ．ｐ．注射した。第３および第４マウス群には１．０％ＤＭＳＯに溶解した１００μｌのプロシミドンとＰＣＢ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）をそれぞれｉ．ｐ．注射した。
注射１時間後に、第２および第３マウス群に１．０％ＤＭＳＯに溶解した１００μｌのＤＨＴ（１０μｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．注射した。このホルモン刺激の２時間後、１０μｌのセレンテラジン（１．４ｍｇ／ｋｇ体重）を側脳室内（ｉ．ｃ．）注射し、各マウス群の代表（ｎ＝３）を取り、２分間隔で同時にイメージングを行った。
なお、全てのマウスイメージングは冷却ＣＣＤカメラ（ＩＶＩＳ１００  ｓｙｓｔｅｍ、Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて行った。マクス内への注入細胞より放出されたフォトンを収集し、１分間隔で積算した。画像処理はＬＩＶＩＮＧ  ＩＭＡＧＥ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて行った。測定光を定量するため、細胞注入領域上に解析対象領域（ＲＯＩ）を描き、平均発光強度（フォトン／秒／ｃｍ２）を計算した。
＜実施例１＞
ＲＬｕｃとＤｎａＥのＣ末端ドメインに連結されたＡＲ（すなわち、プローブＩ）が、哺乳動物細胞内の細胞下区画に正しく局在化されることを確認するために、ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＲｃ−ＡＲ発現ベクターを過渡的に形質移入した。
ＤＨＴの非存在下では、プローブＩは主として細胞質中に存在していた（図２ａ−１）が、ＤＨＴを添加したところ、プローブＩが核へ移行した（図２ａ−２）。一方、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有するＲＬｕｃドメインとＤｎａＥのＮ末端ドメイン（すなわち、プローブＩＩ）は、ＤＨＴの存在・非存在に関わらず、核内に局在化していた（図２ｂ）。
この結果は、ウエスタンブロット分析の結果とも一致した（図３）。ＤＨＴ非存在下では、ＡＲ抗体は、プローブＩプラスミドとプローブＩＩプラスミドを含む細胞粗抽出液において、スプライシングされていない前駆体、すなわちＲＬｕｃ−ＣとＤｎａＥ−Ｃに連結された１１５ｋＤａのＡＲという特定成分だけを認識した。
一方、ＤＨＴ存在下では、ＡＲ抗体は、スプライシングされていない前駆体とともに、１３５ｋＤａと１６０ｋＤａのポリペプチド物質を認識した。なお、これらの物質の電気泳動移動度は、スプライシング後の生成物とスプライシング中間体の予想分子量にそれぞれ合致していた。
以上の結果から、ＤＨＴがＡＲに結合することにより核内移行が起こり、プローブ対におけるスプライシングが起こることが確認された。
＜実施例２＞
次にこの出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対を用いてＡＲの核内移行を定量できることを確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイを用いて、ＤＨＴが誘発するプローブＩの核内移行を測定した。
ＣＯＳ−７細胞にｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＡＲの両方またはｐｃＲＤｎ−ＮＬＳ単独を形質移入し、それぞれのウェルに各種濃度のＤＨＴを添加した。細胞を収集し、その溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
蛍光測定を行ったところ、ＤＨＴ濃度の増加に伴い蛍光強度が増大することが確認された。また、その蛍光強度は、バックグラウンドの蛍光と十分区別できるレベルであった（図４）。
以上の結果より、この出願の発明のプローブ対を用いてＡＲの核内移行を定量できることが示された。
＜実施例３＞
この出願の発明のプローブ対を用いて、各種の内在性ホルモンや合成化学物質によるＡＲの核内移行を確認した。
図５より、テストステロンや１９−ノルテストステロンなどの内在性アンドロゲンは、１０−８Ｍから１０−５Ｍの濃度範囲で大きな蛍光強度を示すことが明らかになった。テストステロンと１９−ノルテストステロンの１０−６Ｍ濃度における相対強度は、それぞれ同濃度のＤＨＴに対する強度の７２％と６４％であった（図５ａ）。また、内在性ステロイドホルモンの１７β−エストラジオールとプロゲステロン、合成ステロイドホルモンの酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）、抗アンドロゲン合成化学物質のビンクロゾリンとフルタミドは、同様に蛍光強度を僅かに増加させた（図５ｂ）。逆にプロシミドンは試験対象の濃度範囲では、蛍光強度の特異的増加を全く誘発しなかった。
反対に、プロシミドンはＤＨＴに誘発される強い蛍光を阻害することが明らかになった（図５ｃ）ことから、ＡＲがプロシミドンに結合しても、ＡＲの核内移行が誘発されないことが示された。
他の試験物質ではｏ，ｐ’−ＤＤＴが少量のＡＲを核内移行させることが明らかになったが、ＰＣＢ同属種であるＡｒｏｃｌｏｒ  １２５４は、ＤＨＴが誘発するＡＲの核内移行を阻害することが確認された。
＜実施例４＞
次に、この出願の発明のプローブ対を用いて、化合物の動物細胞小器官における分布を観察できることを確認した。
冷却ＣＣＤカメラを用いた工学的な生物発光イメージング技術は、操作の容易性、習得時間の短さ、複数マウスを一度に同時測定できる等の利点を有し、高速イメージングを可能とする（非特許文献３、２１〜２３）。
生きたマウス内で再構築されたＲＬｕｃの発する蛍光強度がＣＣＤカメラによる検出に足りる十分な強度を有することを確認するため、１００万個の非形質移入ＣＯＳ−７細胞（参考例）、ｐｃＲＤｎ−ＮＬＳまたはｐｃＤＲｃ−ＡＲを過渡的に形質移入した細胞、もしくはｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＡＲの両者を同時形質移入した細胞を、生きたマウスの背面各箇所の真皮内部に注入した。
８〜３５分経過後に冷却ＣＣＤにより観察されたマウス画像には、ｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＡＲの作成物を含む細胞注入部位だけに顕著な蛍光シグナルが現れた（図６〜８）。１５分経過時点で２つを同時に形質移入した細胞による蛍光強度は、ｐｃＲＤｎ−ＮＬＳまたはｐｃＤＲｃ−ＡＲのいずれかを単独で形質移入した細胞による強度の２０倍を上回ったことから、生きたマウスの真皮層内部で、ＲＬｕｃの再構築による生体蛍光が精度高く検出できることが確認された。
＜実施例５＞
そこで、生きたマウス中でのＤＨＴ依存性のＡＲ核内移行を観察するために、２グループの生きたマウスの背面に、プラスミドｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＡＲの両方を同時に過渡的形質移入したＣＯＳ−７細胞を移植し、溶媒（ＤＭＳＯ）またはＤＨＴにより刺激した。
一方のマウス群４匹には２時間にわたり１．０％ＤＭＳＯ（溶媒）による刺激を行い、もう一方のマウス群４匹には同じ時間ＤＨＴ（１００μｇ／ｋｇ体重）による刺激を行った。ＤＨＴ刺激による蛍光強度は、溶媒刺激の場合と比べて３．５倍増加していた（図９、１０）。
以上の結果から生きたマウスを対象に、ＤＨＴ非存在下に対するＤＨＴ存在下でのＡＲの核内移行度の差を画像化し、定量評価できることが確認された。
＜実施例６＞
さらにまた、この出願の発明のプローブ対を用いて、マウス脳内におけるＡＲの核内移行に対する阻害物質の影響を調べた。
ｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＡＲを同時に形質移入した細胞をマウス脳内に３ｍｍの深さで注入し、１．０％ＤＭＳＯに１０−７Ｍ  ＤＨＴ単独、またはそれ以外に各濃度のプロシミドンかＰＣＢを加えた各種のホルモン混合液を腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。
脳より得られるフォトン計数値が、ＤＭＳＯ処置を行った対照のフォトン計数値と比較して顕著に増加した（図１１、１２）ことから、ＤＨＴによりＡＲの核内移行が誘発されたことが示唆された。
なお、３匹のマウスより得たデータを平均したところ、生物発光の増加量は対照の発光強度に比べて大きかった。ＤＨＴに加えてプロシミドンあるいはＰＣＢを同時に注射すると蛍光強度が減少したことから、これらが２時間以内に血液脳関門を通過し、ＡＲの核内移行を阻害できることが示唆された。
＜実施例７＞
Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（グルココルチコイド受容体：ＧＲ）の核内移行検出プローブによる、核内移行の検討を行った。
プラスミドの構築は、まず、実施例１から６で用いたプラスミドｐｃＤＲｃ−ＡＲを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで切断し，ＡＲをコードするｃＤＮＡを取り除いた。このプラスミドに、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＲ）をコードするｃＤＮＡをＮｏｔＩとＸｈｏＩサイトで連結し、プラスミドを構築した（図１３）。この作製したプラスミドを用いて、上記ＡＲの場合と同様の実験を行った。
なお、ＰＣＲにより、ＲＬｕｃのＮ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＲＬｕｃ−Ｎ；１〜２２９  ＡＡ）のＣ−末端には、配列番号８のペプチド（ＫＦＡＥＹ）を、また、ＲＬｕｃのＣ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＲＬｕｃ−Ｃ；２３０〜３１１  ＡＡ）のＮ−末端には配列番号９のペプチド（ＣＦＮＬＳＨ）を導入した。
（１）ＧＲの局在の確認
ＲｌｕｃとＤｎａＥのＣ末端ドメインに連結されたＧＲが動物細胞内の細胞内器官に正しく局在していることを確認するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐｃＤＲｃ−ＧＲ発現ベクターを遺伝子導入した。
結果、ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ非存在下では、プローブＩは主として細胞質中に存在していた（図１４の上段、図中の「Ｃｏｒｔｉ−」）。その一方で、ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅを添加したところ、プローブＩが核へ移行したことを確認できた（図１４の２段目、図中の「Ｃｏｒｔｉ＋」）。
（２）ＧＲの核内移行の定量
次に、このプローブを用いてＧＲの核内移行を定量できることを確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイを用いて、ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅが誘発するプローブＩの核内移行を測定した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＧＲの両方を遺伝子導入し、それぞれのウェルに各種濃度のｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅを添加した。細胞を収集し、その溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
発光測定を行ったところ、ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ濃度の増加に伴い、発光強度が増大することが確認された。また、その発光強度は、バックグラウンドの蛍光と充分区別可能であった。
この出願の発明のプローブ対を用いて、合成化学物質によるＧＲの核内移行を確認した。図１５に示したとおり、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ、ｃｒｔｉｓｏｌがＧＲの核内移行を誘導することがわかった。
（３）マウス個体におけるＧＲ核内移行
次にこの出願の発明のプローブを用いて、マウス個体内におけるＧＲ核内移行を観察できることを実証した。ＰｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＧＲを同時に遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、生きたマウスの背面各所の真皮内部に注入した（図１６）。１２時間後、マウスを１０分間水浴中で泳がせ、ストレスを与えた。１時間後セレンテラジンを投与して、ＣＣＤカメラにより発光強度測定を行った。
その結果、図１６に示したとおり、ストレスを与えたマウス（図中の「ｓｗｉｍｍｉｎｇ（＋）」）からは、ストレスを与えなかったマウス（図中の「ｓｗｉｍｍｉｎｇ（−）」）に対し、強い発光強度を観測できた。
以上から生きたストレス刺激によるマウスの生理的ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ濃度上昇を、Ｒｌｕｃの再構成により精度よく検出できることが確認できた。
＜実施例８＞
Ｓｔｅｒｏｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２（ＳＲＥＢＰ−２）核内移行検出プローブによる、核内移行検出の検討を、実施例７と同様の手法によって行った。
プラスミドの構築は、実施例１から６で用いたプラスミドｐｃＤＲｃ−ＡＲを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで切断し，ＡＲをコードするｃＤＮＡを取り除いた。このプラスミドに、ＳＲＥＢＰ−２をコードするｃＤＮＡをＮｏｔＩとＸｈｏＩサイトで連結し、プラスミドを構築した（図１７）。このプラスミドをｐｃＤＲｃ−ＳＲＥＢＰとした。
なお、ＰＣＲにより、ＲＬｕｃのＮ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＲＬｕｃ−Ｎ；１〜２２９  ＡＡ）のＣ−末端には、配列番号４のペプチド（ＫＦＡＥＹＣ）を、また、ＲＬｕｃのＣ−末端側ドメインをエンコードするｃＤＮＡ（ＲＬｕｃ−Ｃ；２３０〜３１１  ＡＡ）のＮ−末端には配列番号９のペプチド（ＣＦＮＬＳＨ）を導入した。
（１）ＳＥＲＢＰ−２の局在の確認
ＲｌｕｃとＤｎａＥのＣ末端ドメインに連結されたＳＥＲＢＰ−２が、動物細胞内の細胞内器官に正しく局在していることを確認するために、ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＲｃ−ＳＲＥＢＰ発現ベクターを遺伝子導入した。
結果、コレステロール存在下（図１８中の「＋ｃｈｏｌ」）では、ＳＲＥＢＰ−２を連結したプローブは主として細胞質中に存在していた（図１８の（１））。一方、コレステロール非存在下（図１８中の「−ｃｈｏｌ」）では、プローブが核へ移行した（図１８の（２）から（４））。
（２）ＳＥＲＢＰ−２の核内移行の定量
次に、ＳＥＲＢＰ−２の核内移行の定量を、実施例７と同様の手法で行った。ＣＯＳ−７細胞にｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＳＲＥＢＰの両方を遺伝子導入し，それぞれのウェルに各種濃度のコレステロールを添加した。細胞を収集し、その溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
発光測定を行ったところ、コレステロール濃度の減少に伴い、発光強度が増大することが確認された（図１９）。また、その発光強度は、バックグラウンドの蛍光と充分区別可能であった。以上から、ＳＲＥＢＰ−２の核内移行の程度を、発光強度を指標に検出できることが分かった。
＜実施例９＞
Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３（ＳＴＡＴ−３）核内移行検出プローブによる、核内移行検出の検討を、実施例７および８と同様の手法によって行った。
プラスミドの構築は、実施例１から６で用いたプラスミドｐｃＤＲｃ−ＡＲを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで切断し、ＡＲをコードするｃＤＮＡを取り除いた。次いで、このプラスミドに、ＳＴＡＴ−３をコードするｃＤＮＡをＮｏｔＩとＸｈｏＩサイトで連結して、プラスミドの構築を行った（図２０）。このプラスミドをｐｃＤＲｃ−ＳＴＡＴ３とし、これを用いた。
（１）ＳＴＡＴ−３の局在の確認
ＲｌｕｃとＤｎａＥのＣ末端ドメインに連結されたＳＴＡＴ−３が動物細胞内の細胞内器官に正しく局在していることを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞にｐｃＤＲｃ−ＳＴＡＴ３発現ベクターを遺伝子導入した。
結果、リガンドの一つであるｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ（ＯＳＭ）非存在下では，ＳＴＡＴ−３を連結したプローブは主として細胞質中に存在していた（図２１の「ＯＳＭ−」）。そして、ＯＳＭを添加したところ、プローブが核へ移行することが確認された（図２１の「ＯＳＭ＋」）。
（２）ＳＴＡＴ−３の核内移行の定量
次に、ＳＥＲＢＰ−２の核内移行の定量を、実施例７、８と同様の手法で行った。
ＨＥＫ２９３細胞にｐｃＲＤｎ−ＮＬＳとｐｃＤＲｃ−ＳＴＡＴ３の両方を遺伝子導入し、それぞれのウェルに各種濃度のＯＳＭを添加した。細胞を収集し、その溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
発光測定を行ったところ、ＯＳＭ濃度の増加に伴い、発光強度が増大することが確認された（図２２）。また、その発光強度は、バックグラウンドの蛍光と充分区別可能であった。以上から、ＳＴＡＴ−３核内移行の程度を、発光強度を指標に定量的に検出できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この発明によって、生細胞や生物での蛋白質の核内移行を非侵襲的にイメージングできる方法が提供される。また、この発明により、蛋白質核内移行の程度を簡便に定量する方法も提供される。この出願の発明のプローブ対を用いた蛋白質核内移行の検出・定量方法は、従来の蛍光技術と異なり、生物発光法によるためバックグラウンドシグナルが無いことから、高精度・高感度での検出が可能である。したがって、治療や毒性化学物質の特定等、薬品開発や創薬のプロセスへの応用が期待される。
上記第１の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対は、少なくとも、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されてなるプローブＩと、少なくとも、標識蛋白を２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドと、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちの残りのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナルが連結されてなるプローブＩＩからなる。
また、同様に、上記第２の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対は、少なくとも、標識蛋白を２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドと、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちのＮ−末端側のポリペプチドが順に連結された［標識蛋白−Ｎ／ｉｎｔｅｉｎ−Ｎ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されてなるプローブＩと、少なくとも、ｉｎｔｅｉｎを２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドと、標識蛋白を２分割したうちの残りのＣ−末端側のポリペプチドが順に連結された［ｉｎｔｅｉｎ−Ｃ／標識蛋白−Ｃ］融合構造のＮ−末端側またはＣ−末端側に、核局在化シグナルが連結されてなるプローブＩＩからなる。
これらのプローブ対を細胞に導入した場合、プローブＩは細胞質に留まり、プローブＩＩは核内に局在化される。プローブＩにおける蛋白質が生物活性物質を認識、結合し、その作用により細胞質から核内へ移行するとき、プローブＩは核内に局在化されたプローブＩＩと近接する。これにより、プローブＩおよびＩＩにおける２分割されたｉｎｔｅｉｎがスプライシングにより切り出され、標識蛋白が再構築される。したがって、標識蛋白のシグナルを測定することにより、生物活性物質による蛋白質の核内移行を精度高く検出することが可能となる。
上記第３の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対では、ｉｎｔｅｉｎが藍藻由来のＤｎａＥであることから、ｉｎｔｅｉｎが確実に自動的に切り出されるようになる。
上記第４の発明の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対では、標識蛋白が発光触媒酵素のルシフェラーゼであることから、プローブＩおよびＩＩの間でスプライシングが起こり、ルシフェラーゼが再構築された場合、活性中心が形成され、ルミノメーターで容易に検出可能な光を発するようになる。
上記第５の発明の蛋白質核内移行検出・定量方法では、プローブ対におけるプローブＩと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブＩＩを核内に局在化させ、核内における標識蛋白のシグナルを測定する。このとき、プローブＩは細胞質に留まるが、蛋白質が生物活性物質を認識、結合する場合には、その作用により細胞質から核内へ移行する。すると、プローブＩは核内に局在化されたプローブＩＩと近接し、プローブＩおよびＩＩにおける２分割されたｉｎｔｅｉｎがスプライシングにより切り出され、標識蛋白が再構築される。したがって、標識蛋白のシグナルを測定すれば、生物活性物質による蛋白質の核内移行を確度および精度高く検出することが可能となる。また、蛋白質の核内移行量を定量することも可能となる。
上記第６の発明の蛋白質核内移行検出・定量方法では、プローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、プローブＩと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブＩＩを核内に局在化させることができる。また、上記第７の発明の蛋白質核内移行検出・定量方法では、プローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブＩＩを核内に局在化させることができる。
上記第８の発明の核内移行誘発物質のスクリーニング方法では、プローブ対におけるプローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させ、核内移行誘発候補物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシグナルを測定する。候補物質がプローブＩにおける蛋白質と結合し、蛋白質の核内移行が誘発されると、プローブＩは核内に局在化されたプローブＩＩと近接し、プローブＩおよびＩＩにおける２分割されたｉｎｔｅｉｎがスプライシングにより切り出され、標識蛋白が再構築される。したがって、標識蛋白のシグナルを測定すれば、該候補物質が該蛋白質に対して、蛋白質核内移行誘発物質として作用するものであるか否かを高速で精度高くスクリーニングできる。
上記第９の発明の核内移行阻害物質のスクリーニング方法では、プローブ対におけるプローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させ、核内移行阻害候補物質を細胞質に導入した後、蛋白質核内移行誘発物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシグナルを測定する。このとき、候補物質が核内移行阻害物質として作用する場合には、まず、該候補物質が蛋白質と結合する。そのため、蛋白質核内移行誘発物質が蛋白質と結合できなくなり、核内移行が阻害される。したがって、標識蛋白のシグナルが、蛋白質核内移行誘発物質のみを細胞質に導入した場合の標識蛋白のシグナルと比較して減少する。一方、候補物質が核内移行阻害物質として作用しない場合には、該候補物質は蛋白質と結合しないため、蛋白質核内移行誘発物質を細胞質に導入した際に、蛋白質との結合が起こり、蛋白質が核内に移行する。したがって、標識蛋白のシグナルは、蛋白質核内移行誘発物質のみを細胞質に導入した場合の標識蛋白のシグナルと同等となる。
上記第１０の発明のスクリーニング方法では、プローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、プローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させることができる。そして、上記第１１の発明のスクリーニング方法では、プローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＩを細胞質に導入し、プローブＩＩを核内に局在化させることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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