(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母チオレドキシン、及び生理的に受容可能な液体の希釈剤および／または担体を含み、非還元条件下で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示し、そして、保存剤を含まない、溶液安定性のチオレドキシン液体組成物であって、
ヒトに対して適用される医薬用又は食品素材タンパク質の加工に使用するための、前記チオレドキシン液体組成物。
【請求項２】
酵母チオレドキシンが、下記の性質：
１）１ｍＭ  過酸化水素処理後でもダイマー化を認めない；および
２）ヒトのチオレドキシンレダクターゼに対して５０％以上の交差反応性を有する
のうちの少なくとも一つの性質を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
酵母チオレドキシンが、配列番号１のアミノ酸配列有するタンパク質であるか、あるいは当該配列に１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
酵母チオレドキシンが、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸によってコードされるタンパク質である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
１個以上のジスルフィド結合を分子間及び／又は分子内に有するタンパク質のジスルフィド結合を開裂する、及び／又はペルオキシダーゼとの組み合わせにより過酸化物を消去し活性酸素に対する防御反応を促進させるために使用される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
酸化され不活性となっているタンパク質の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を開裂し当該タンパク質を活性化させる、あるいは、酸化状態で活性である蛋白質の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を開裂し当該タンパク質を不活性化させる、ために使用される請求項１ないし５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１記載の組成物の製造方法であって、
ｉ）酵母チオレドキシンタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｉｉ）当該宿主細胞を酵母チオレドキシンタンパク質の発現を促進する条件下で培養し；
ｉｉｉ）当該宿主細胞から、組換え酵母チオレドキシンタンパク質を回収し；そして
ｉｖ）生理的に受容可能な希釈剤および／または担体を用いて処方する
ことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中で安定な、特に非還元条件化においても安定なチオレドキシン組成物およびその製法を提供することを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
近年、増殖及び細胞死を含む細胞内現象は、細胞内酸化還元状態によって調節されるということを示唆する一連の証拠が次々と挙がっている（Ｐａｈｌ，Ｈ．Ｌ．＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．（１９９４）  ＢｉｏＡｓｓａｙｓ  １６，４９７−５０２）。特に、チオール酸化還元調節機構によって制御される転写因子が試験管内ゲルシフト試験によって、次々と挙げられている（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｗａｋａｓｕｇｉ，Ｎ．，Ｖｉｒｅｌｉｚｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｙｏｄｏｉ，Ｊ．  ＆  Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．（１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０，  ３８２１−３０，；Ａｂａｔｅ，Ｃ．，Ｐａｔｅｌ，Ｌ．，Ｒａｕｓｃｈｅｒ，Ｆ．Ｊ．ｄ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９  １１５７−１１６１）。これには、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ、Ｄｏｒｓａｌ／Ｒｅｌファミリーの他のメンバー、Ｍｙｂ及びＥｔｓ等の既知の転写因子が含まれている。しかしながら、これらの転写因子の活性制御については、２−ＭＥやＤＴＴのような化学試薬が転写因子のＤＮＡ結合能を活性化することがわかっているが、細胞内のどの分子が酸化還元制御因子として働くかという問題は、まだ明らかにはされていない。
【０００３】
細胞内の酸化還元制御因子の有力な候補としてチオレドキシン（以下、「ＴＲＸ」という）が注目されている。ＴＲＸは生体内に普遍的に存在する分子量約１万ないし１．３万ｋＤａの電子伝達タンパク質で、２つのシステインを有する部位−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を活性中心に有し（Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｅ．Ｃ．，＆Ｒｅｉｃｈａｒｄ，Ｐ．（１９６４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２３９，３４３６−３４４４；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，２３７−２７１；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１３９６３−１３６６；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ，Ｐ．＆Ｌｏｚａｎｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１４，２５７−６０）、活性中心にあるジチオールの可逆的な酸化を通して酸化還元反応に関わる多面発現性の細胞性因子である。ＴＲＸは還元型及び酸化型のどちらででも存在し、遺伝子発現を含む細胞内現象の制御に重要な役割を果たしていると考えられている。また、ＨＴＬＶ−Ｉ白血病発生に関与する成熟Ｔ細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）としても知られている。ＴＲＸは細胞内（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｒ．ら、１９９２，上述；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｏｇｉｗａｒａ，Ｈ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｍｉｔｓｕｉ，Ａ．，Ｋａｗａｂｅ，Ｔ．＆Ｙｏｄｏｉ，Ｊ．（１９９２）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，８１１−９）及び細胞外で機能する。細胞内での機能の１つは、タンパク質−ヌクレオチド間相互作用を促進することが知られている。
【０００４】
ＴＲＸの活性酸素防御の生化学的機序としては、
１）蛋白の分子間及び／または分子内Ｓ−Ｓ結合を開裂する反応として、
【０００５】
【化１】
0004790891.tif 000002
【０００６】
という反応が、そして、
２）ペルオキシダーゼとの組合せ反応による過酸化物消去反応として、
【０００７】
【化２】
0004790891.tif 000003
【０００８】
というリサイクル反応が知られている。例えば、本明細書中に援用する井上善晴著、１９９９、日本農芸化学会誌７３巻１０号  第１０１３頁−第１０２１頁を参照されたい。
【０００９】
ＴＲＸは、大腸菌、酵母から高等植物、高等動物まで広く存在し、生体内の種々の酸化還元反応に関わっている。これまでに、大腸菌から高等生物に至る種々のＴＲＸの単離が試みられ、その構造の解明が進められている（特公平５−５５５１９号等）。また、チオレドキシン遺伝子のクローニングも進められている（特許第２６３３２９５号等）。
【００１０】
これらのうち、特にヒト型ＴＲＸ（場合により、「ＡＤＦ」ともいう）タンパク質は、そのアミノ酸配列の３２位、３５位、６２位、６９位および７３位の５カ所にシステイン残基を有する。このうち３２位と３５位の２つのシステインを有する部位−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−が酸化還元活性部位であることが知られている（Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．ら（１９６４）上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，上述；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．ら，（１９９４）上述）。よって、ヒト型ＴＲＸは酸化還元部位以外、即ち、６２位、６９位および７３位にＣｙｓ残基を有するため、溶液安定性が悪く、特に酸化的な条件下ではダイマー化し活性低下をきたすことが分かっている（Ｇａｓｄａｓｋａ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｖｏｌ．５２：１７４１−１７４７）。
【００１１】
ヒト型ＴＲＸの生理的な機能の一つとして活性酸素や紫外線照射による細胞障害を防ぐ働きがある（Ｓａｃｈｉ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．４４：１８９−１９３）。活性酸素障害や紫外線障害から細胞を守る手段には、細胞内でのＴＲＸ合成を亢進する方法と外部からＴＲＸを添加する方法とが考えられる。ＴＲＸ合成を亢進する方法としては、ＴＲＸを含む一連の酸化防御に関与する成分の合成を促進するＡＰ−１転写因子を活性化する方法があげられる。また、外部よりＴＲＸを添加する場合は上述のＴＲＸ反応系の中で作用可能な安定なＴＲＸが必要となる。すなわち、ヒト型チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）やヒト型チオレドキシンペルオキシダーゼ（ＴＰｘ）と有意に反応することができる安定なＴＲＸが必要となる。
【００１２】
安定なＴＲＸにとしては、Ｒｅｆ−１とＳ−Ｓ結合で結合しＡＰ−１転写因子を活性化するＣｙｓ残基置換ＴＲＸがすでに報告されている（特開平１０−１９１９７７）。当該Ｃｙｓ残基置換ＴＲＸは、チオレドキシンの有する活性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸残基に置換することにより、非還元条件下でも安定としたものである。
【００１３】
しかしながら、前記Ｃｙｓ残基置換ＴＲＸは天然ＴＲＸの改変体であり、一般に遺伝子工学技術によって突然変異誘発を行って得る必要がある。さらに、多方面での産業的利用を考えた際、とりわけ食品分野や化粧品などの医薬部外品分野では、安全性確認が容易な天然供給源からの素材が好ましい。よって、改変体のＴＲＸではなく、天然源由来のＴＲＸであって、特にヒト等の哺乳動物に安全に使用可能な、安定したＴＲＸを含む組成物が希求されている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、非還元条件下でも溶液安定性のチオレドキシンを含むチオレドキシン組成物を提供することを目的とする。本発明のチオレドキシンは、酵母チオレドキシンであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の一態様において、好ましくは、酵母チオレドキシンは、配列番号１のアミノ酸配列有するタンパク質であるか、あるいは当該配列に１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質である。
【００１６】
本発明はまた、溶液安定性の酵母チオレドキシンのチオレドキシン組成物への使用を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらに、前記酵母チオレドキシン、及び所望により生理的に受容可能な希釈剤および／または担体を含む組成物の製造方法を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前述したように、ＴＲＸは微生物から動植物まで広く存在する恒常的なタンパク質となっている。本願発明者は、上記問題の解決を目的として鋭意研究に努めた結果、酵母チオレドキシンが、１）１ｍＭ  過酸化水素処理後でもダイマー化を認めない；２）非還元条件下で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示す；そして３）ヒトのチオレドキシンレダクターゼに対して５０％以上の交差反応性を有する、ことを発見し、本願発明を想到した。本発明は、上記酵母チオレドキシンの上記性質を利用して、溶液中でも安定で長期保存可能な組成物を提供することを目的とするものである。
【００１９】
酵母ＴＲＸ
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２０】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は典型的には、本明細書の配列表の配列番号１に記載の１０４アミノ酸配列を有する。配列番号１は酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号ＡＡＡ８５５８４（Ｕ４０８４３），ｔｈｉｏｒｅｄｏｘ．．．［ｇｉ：１１６５２１４］，Ｊａｅ  Ｍａｈｎ  Ｓｏｎｇら，２４−Ｊａｎ−１９９６）。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。例えば、配列番号１は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列であるが、サッカロマイセス属の他の種に属する酵母、あるいは他の属、例えば、ピキア属等に属する種の酵母由来のＴＲＸも本発明において使用しうる。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は１に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。
【００２１】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２２】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
ただし、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、上述したような有利な物理化学的性質の少なくとも１つを保持していることが好ましい。本明細書中において「生物学的に活性で安定な」とは、ＴＲＸタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する場合であっても、上述したＴＲＸの酸化還元機能を有し、かつ上記物理化学的な性質を保持していることを意味する。限定されるわけではないが、ＴＲＸタンパク質のダイマー化を防ぎ、溶液安定性を保持するために、ＴＲＸタンパク質は、酸化還元活性部位以外にＣｙｓ残基を有しないことが好ましい。
【００２４】
酵母ＴＲＸ遺伝子
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、天然源から精製してもよく、あるいは、例えば後述した実施例に記載したように、酵母チオレドキシンをコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に発現させてもよい。より詳細には、例えば、
ｉ）酵母チオレドキシンタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｉｉ）当該宿主細胞を酵母チオレドキシンタンパク質の発現を促進する条件下で培養し；そして
ｉｉｉ）当該宿主細胞から、組換え酵母チオレドキシンタンパク質を回収する
ことによって、組換えタンパク質を得ることができる。
【００２５】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。当業者は本明細書の記載および慣用された遺伝子工学技術を用いて、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子を容易に得ることが可能である。
【００２６】
酵母ＴＲＸ遺伝子は典型的には、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する（Ｇｅｎｂａｎｋ，登録番号Ｕ４０８４３（ＡＡＡ８５５８４），ｔｈｉｏｒｅｄｏｘ．．．［ｇｉ：１１６５２１４］，Ｊａｅ  Ｍａｈｎ  Ｓｏｎｇら，２４−Ｊａｎ−１９９６）。配列番号２は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＸ２タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。しかしながら、これに限定されず、天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、上述した酵母ＴＲＸタンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
【００２７】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子であって配列番号２に記載された酵母ＴＲＸ２遺伝子の塩基配列を有するもの、さらに配列番号２以外の塩基配列を有するものも、本明細書中の配列番号１および２に記載された酵母ＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部に基づいて、例えば、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて得ることが可能である。これらの遺伝子工学的手法を用いて酵母、あるいは他の生物種からさらに同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することも可能である。
【００２８】
遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子も本発明の酵母ＴＲＸタンパク質を製造するために用いられ得る。
【００２９】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ  ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，ｐ．１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００３０】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する。
【００３１】
酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、酵母ＴＲＸ遺伝子を得るための核酸増幅反応に用いる増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作製できる。より詳細には、オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；および
３）各領域間の距離が約１００−約１０００塩基であること
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造することが可能である。当該オリゴヌクレオチド用いて、例えば本発明の酵母ＴＲＸ遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応に用いることが可能である(配列番号３および４）。
【００３２】
発明の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号１に記載された酵母ＴＲＸ２遺伝子の塩基配列以外の塩基配列を有するものは、また、本明細書中の配列番号１および２に記載された酵母ＴＲＸ２タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部を利用して、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）を施すことによって得ることもできる。
【００３３】
部位特異的変異誘発方は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき、例えばファージ等の一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて上記一本鎖ＤＮＡに相補的な鎖を合成させ、得られた二本鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された宿主細胞の培養物を観点にプレートし、上記ＤＮＡを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。すると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するＤＮＡを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、不一致のもの、即ち元の配列を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをラジオアイソトープ等で標識された合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプローブを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００３４】
酵母ＴＲＸタンパク質の製造
本発明の組換え酵母ＴＲＸタンパク質を発現するために、酵母ＴＲＸ遺伝子を含む組換えベクターを作製する。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造社製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ−ｃｏｉｌ  ＪＭ１０９，ＴＢ１，  ＬＥ３９２  またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００３５】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）」に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３６】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。
【００３７】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。好ましくは大腸菌用発現ベクターｐＴＲＰ（（ＣｌｉｎＣｈｉｍ  Ａｃｔａ．  １９９５  Ｊｕｎ  １５；２３７  （１−２）：４３−５８）である。
【００３８】
形質転換体は、所望の発現べクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現べクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００３９】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。特に好ましい宿主細胞は大腸菌、より好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（例えば、宝酒造社より入手可能）である。
【００４０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００４１】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００４２】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００４３】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００４４】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００４５】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００４６】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の酵母ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００４７】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００４８】
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００４９】
本発明の実施例においては、特に、酵母ＴＲＸ遺伝子を前述した大腸菌用発現ベクターｐＴＲＰに挿入後、大腸菌株ＪＭ１０９（宝酒造社製）を宿主細胞として形質転換した。得られた形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９は、平成１２年１月２５日に、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００４で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
【００５０】
上述にように遺伝子工学的に発現された組換え酵母ＴＲＸ、あるいは天然源由来のＴＲＸは、慣用されている精製技術、例えば、硫安沈殿法およびイオン交換カラムクロマトグラフィー等を用いて精製することができる。より詳細には、酵母ＴＲＸタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｂｕｔｈｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｃ６５０ゲル（東ソー製）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｇ７５（ファルマシア製）など）、イオン交換クロマトグラフィー、などのタンパク質の精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００５１】
酵母ＴＲＸを含む組成物
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、下記の物理化学的性質：
１）１ｍＭ  過酸化水素処理後でもダイマー化を認めない；
２）非還元条件下で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示す；そして
３）ヒトチオレドキシンレダクターゼに対して５０％以上の交差反応性を有する
の少なくとも１つを有する。
【００５２】
後述する実施例４（表４、図２−図３）で明らかにされたように、ヒトＴＲＸは１ｍＭの濃度の過酸化水素においてダイマー化がはっきりと認められたの対し、酵母ＴＲＸは、１ｍＭ濃度下はもちろん、１０ｍＭ濃度下においてもダイマー化は生じなかった。ＴＲＸがダイマー化を生じるか否かは、限定されるわけではないが、例えば、後述の実施例４に記載したようにして調べることが可能である。例えば、所定濃度の過酸化水素で例えば室温で約１５分ないし約１時間処理した後、非還元条件下でのポリアクリルアミド電気泳動を行う。銀染色バンドの電気移動度よりダイマー形成率を調べることが可能である。
【００５３】
本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、非還元条件下、例えばジチオスレイトールなどの還元剤を含まない条件下でＰＢＳ等の溶媒に溶解した状態で、例えば冷蔵保存（１０℃以下、好ましくは約２℃−約８℃）で１ヶ月間８０％以上の溶液安定性を示す。よって、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質含有組成物は溶液で長期間安定保存が可能なため、使用の都度凍結乾燥粉末を溶解する必要性がなく、簡便に使用可能である。
【００５４】
また、ＴＲＸは大腸菌、酵母から高等植物、高等動物まで広く存在し、これまでに、大腸菌から高等生物に至る種々のＴＲＸの単離が試みられれている。しかしながら、溶液安定性のＴＲＸとしてヒト等の哺乳動物へ適用される組成物を考慮した場合、ヒトのＴＲＸと同様に例えばヒト  チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）等のタンパク質と反応性を示すことが望ましい。微生物由来の、例えば大腸菌由来のＴＲＸはヒトのＴＲとは全く反応性を示さないことがわかった。これに対し、酵母ＴＲＸは、ヒトＴＲに対して５０％以上の交差反応性を有することが明らかとなり、哺乳動物等に適用しうることが明らかとなった。
【００５５】
よって、本発明の酵母ＴＲＸタンパク質は、例えば、医薬用、食品素材タンパク質の加工等に用いるための組成物としてそれが活性のある形で含まれるように処方されて利用することができる。この場合、酵母ＴＲＸタンパク質をコードするＤＮＡ配列を用いれば、先述のように例えば大腸菌や酵母などで機能する発現ベクターにそのＤＮＡを組み込んで大量に製造することもできる。
【００５６】
本発明のＴＲＸ組成物は、ＴＲＸの機能に基づき、１個以上のジスルフィド結合を分子間及び／又は分子内に有するタンパク質のジスルフィド結合を開裂する、及び／又はペルオキシダーゼとの組み合わせにより過酸化物を消去し活性酸素に対する防御反応を促進させるために使用することが可能である。
【００５７】
あるいは、ＴＲＸは酸化され不活性となっているタンパク質の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を開裂するため、本発明のＴＲＸ組成物はそのような不活性化されたタンパク質を活性化し、機能改善するために使用可能である。また、ＴＲＸは酸化状態で活性である蛋白質の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を開裂するため、本発明のＴＲＸ組成物は好ましくない（例えば、毒性を有する）タンパク質のジスルフィド結合を開裂し、そのようなタンパク質を不活性化するために使用可能である。例えば、オボムコイド等のプロテアーゼインヒビターが胃若しくは腸中に存在する場合、あるいはアミラーゼインヒビターが唾液中に存在する場合、消化に必要なプロテアーゼやアミラーゼの機能を阻害する。これらのインヒビタータンパク質は酸化状態（ジスルフィド結合した状態）で活性なため、本発明のＴＲＸ組成物によってこれらのジスルフィド結合を切断し、インヒビター活性を阻害することが可能である。
【００５８】
以下に、本発明のＴＲＸ組成物によるインヒビター活性の阻害の例として、穀物種子トリプシンインヒビターの不可逆的失活を記載する。
【００５９】
穀物種子中に見出されるトリプシンインヒビターは分子量が１０，０００前後と小さいため、熱処理やプロテアーゼ処理にても失活せず穀物タンパク質の消化吸収を抑制することがＩｋｅｄａらにより報告されている（Ｋ．Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｋｕｓａｎｏ  （１９８３）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（７）：１４８１−１４８６）。そのため、過剰に穀物種子タンパク質、例えば穀物粉を摂取した場合しばしば消化不良をきたす要因となる。また、ソバ種子タンパク質においてはトリプシンインヒビターがソバ  アレルゲンの代表的例ともなっている（Ｐａｒｋ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４００（１）：１０３−１０７）。そこで、穀物タンパク質の消化吸収を促進させる目的で、貯蔵タンパク質中に見出されるトリプシンインヒビター活性を効果的にかつ穀物がもともと含有する栄養性を損なうことなく失活させることが重要であると考える。すなわち、熱処理や酸アルカリ処理といった栄養素の分解やタンパク質変性を伴わない温和な条件で穀物種子トリプシンインヒビターを不可逆的に失活させることが重要と考える。穀物種子トリプシンインヒビターは、酸化状態（ジスルフィド結合状態）で活性なことが知られており、本発明のＴＲＸ組成物によって、穀物種子トリプシンインヒビターのジスルフィド結合を切断し、インヒビター活性を不可逆的に失活させることが可能である。
【００６０】
さらに、上述したような還元型ＴＲＸの反応をより促進するには、レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈとの組合せによる上述した化学式１及び２記載のリサイクル反応が望ましい。そのためには、溶液で安定なＴＲＸ組成物としてＴＲＸに加えて、レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを構成成分に含むことが望ましい。用いるレダクターゼとしては、溶液で安定な酵母ＴＲＸと反応しうるレダクターゼであれば微生物由来、酵母由来、動植物由来などの何れもものでもよい。好ましくは酵母由来のチオレドキシンレダクターゼ（ＥＣ．１．６．４．５）を用いる。
【００６１】
酵母チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）は、例えば、酵母培養菌体より天然型酵素を精製し取得することができる。天然酵素の精製法についてはＳｐｅｒａｎｚａ  ＭＬら  （１９７３）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １９７３  Ｄｅｃ  １９；３２７（２）：２７４−８１．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．」などに記載がある。あるいは、酵母ＴＲタンパク質は、酵母ＴＲ遺伝子を微生物や酵母菌体に遺伝子導入して得られる組換えタンパク質でもよい。
【００６２】
なお、本発明では本明細書の実施例７において後述するように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａ株より、配列番号５の塩基配列を有し、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵母ＴＲタンパク質をコードする、酵母ＴＲ遺伝子を単離した。配列番号５の塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている（登録番号Ｕ１０２７４，ＣＤＳ  ｆｏｒｍ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  （ＮＡＤＰＨ）  ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．，Ｃｈａｅ，Ｈ．Ｚ．ら，０５−ＡＰＲ−１９９５）公知のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲ遺伝子の配列と、５カ所で塩基配列が相違していた。本発明で得られた配列番号５の酵母ＴＲ遺伝子を用いて、組換え酵母ＴＲタンパク質を得た。当該組換えＴＲタンパク質を本発明の酵母ＴＲＸとともと共に用いると、ソバ粉のトリプシンインヒビター活性を著しく阻害することが判明した（実施例８、図５）。よって、限定されるわけではないが、本発明の酵母ＴＲＸとともに使用するチオレドキシンレダクターゼとしては、塩基配列６のアミノ酸配列を有する酵母ＴＲが好ましい。
【００６３】
また、上述したように本発明の酵母チオレドキシンはヒトＴＲと５０％以上の交差反応性を有するため、ヒトへの適用においてヒトＴＲともに使用することも可能である。
【００６４】
本発明のＴＲＸタンパク質含有組成物は、例えば、ＴＲＸの酸化還元反応が関与する細胞内酸化還元状態に関する障害、疾患等を予防および／または治療するために用いることが可能である。例えば、ＴＲＸの生体内機能の一つとして、活性酸素や紫外線照射による細胞障害を防ぐという機能がある。本発明の組成物はＴＲＸの当該機能を補完または補助するために使用することが可能である。
【００６５】
本発明の組成物は全身または局所的に、好ましくは静脈内、皮下、皮内、筋肉内に非経口的に、あるいは経口的に投与しうる。非径行的に投与可能な酵母ＴＲＸタンパク質含有組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
【００６６】
本発明の組成物の用量用法は、組成物の作用、例えば、患者の症状の性質および／または重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定される。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
【００６７】
本発明の組成物は、所望により生理学的に受容可能な希釈剤および／または担体と種々の方法で処方しても良い。例えば、これらは液体希釈剤および／または担体を含む組成物、例えばしばしば非経口投与の為に注射可能な形態をとり、そしてその為に滅菌され発熱物質を含まない、水性又は油性の溶液、懸濁液若しくは乳液として適用しても良い。非経口投与が本発明の好ましい化合物には好ましい。経口投与目的の組成物は、液体希釈剤若しくは担体を含んでいても良いが、固体、例えば澱粉、ラクトース、デキストリン若しくはステアリン酸マグネシウムのような慣用された固体担体物質、を使用するのが更に一般的である。このような固体組成物は、例えば錠剤、カプセル（スパンスルを含む）等のように、適宜に成型されたものであっても良い。本発明の組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。
【００６８】
このようにして得られる抗菌剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により添付することができる。
【００６９】
本発明の組成物は、保存剤を含まなくても長期間保存が可能である。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７０】
【実施例】
実施例１  酵母ＴＲＸ発現組換え体の作製
酵母ＴＲＸ２遺伝子のクローニング
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体ゲノムを鋳型とし、ＰＣＲによりＴＲＸ２遺伝子を増幅し、クローニングした。
【００７１】
ＴＲＸ２は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ，登録番号ＡＡＡ８５５８４およびＵ４０８４３，ｔｈｉｏｒｅｄｏｘ．．．［ｇｉ：１１６５２１４］，Ｊａｅ  Ｍａｈｎ  Ｓｏｎｇら，２４−Ｊａｎ−１９９６等に登録されており、そのアミノ酸配列および塩基配列を各々本明細書の配列表の配列番号１および２に記載してある。配列番号２の塩基配列に基づき、ＴＲＸ遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーを、以下のように作製した。
【００７２】
【化３】
５’プライマー（センスプライマー）
５'−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＧＣＴＴＣＴ−３'（配列番号３）
３’プライマー（アンチセンスプライマー）
５'−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＣＧＴＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＧ−３'（配列番号４）
５’プライマーは、配列番号２の塩基配列の塩基番号１−２７にさらに制限酵素部位ＥｃｏＲ１部位（ＧＡＡＴＴＣ）を加えて作製した。一方、３’プライマーは、配列番号２の塩基配列の塩基番号２８８−３１２にさらに制限酵素部位ＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＣＣ）加えて作製した。
【００７３】
一方、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１  Ａ株（遺伝子型：ＭＡＴα，ＳＵＣ２，ｍａｌ，ｍｅｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号：ＡＴＣＣ２０４５０４）をＹＰＤ液体培地にて３０℃一晩振盪培養した。培養物より遠心分離した菌体より、ザイモリアーゼ及びＲＮＡアーゼを用いて染色体ゲノムを調製した。染色体ゲノム抽出は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９０），ｐｐ．１２８−１２９に記載の方法に従った。抽出した酵母染色体ＤＮＡを鋳型に前述のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、９５℃を０．５分、５５℃を０．５分、７２℃を１．５分のサイクルを３０回繰り返した。得られたＰＣＲ増幅産物をＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１で制限酵素処理した。制限酵素処理ＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｉｔＩＩに挿入しＤＮＡシーケンス後データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）との照合により、酵母ＴＲＸ２遺伝子（配列番号２）が遺伝子増幅できたことを確認した。
【００７４】
次いで、酵母ＴＲＸ２遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理した。得られた断片を、内田らの方法（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．  １９９５  Ｊｕｎ  １５；２３７  （１−２）：４３−５８）に従い調製した大腸菌発現用ｐＴＲＰベクター（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．  １９９５，同上）中の強力なトリプトファンプロモーター下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位に連結し、ＴＲＸ２遺伝子の高発現を促すようｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２プラスミドを作製した。ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２プラスミドを用いて市販の大腸菌株ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）を常法に従い形質転換し、形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９を獲得した。形質転換操作については、例えばラボマニュアル遺伝子工学（村松正実編、１９８８年、丸善株式会社）第１０９頁に詳述されている。
【００７５】
形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９は、平成１２年１月２５日に、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００４で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
【００７６】
実施例２  組換え酵母ＴＲＸタンパク質の精製
実施例１で作製したＴＲＸ高発現株（ｐＴＲＰ−ｙＴＲＸ２／ＪＭ１０９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、１％  ＮａＣｌ）で３７℃、一晩フラスコしんとう培養した。得られた培養菌体を集菌分離し、１ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に菌体を懸濁した。そして、超音波破砕後の遠心分離上清をＴＲＸ抽出液とした。次いで、抽出液を６０℃、３０分間熱処理をおこない上澄み分画を７０％飽和硫安塩析にて沈殿物として回収した。塩析沈殿物を１．５Ｍ硫安濃度（ｐＨ７．５）にて溶解し、Ｂｕｔｈｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｃ６５０ゲル（東ソー製）を用いて疎水カラムクロマトグラフィーを実施した。ＴＲＸは１．０Ｍ硫安付近を溶出ピークとして回収された。疎水クロマトグラフィ溶出液を限外ろ過膜（ＹＭ１０、アミコン製）を用いて濃縮しＳｕｐｅｒｄｅｘＰｇ７５（ファルマシア製）ゲルろ過クロマトグラフィに供した。ＴＲＸは分子量１０，０００付近に主ピークとして溶出された。
【００７７】
ゲルろ過溶出分画の純度検定をポリアクリルアミド電気泳動にて調べた結果、分子量１２，０００の単一バンドを示した。本標品を最終精製品としＤＴＴを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）にバッファー交換後、凍結乾燥粉末を調製した。
【００７８】
実施例３  ＴＲＸ活性測定
Ｈｏｌｍｇｒｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９３）に従い、ＴＲＸ活性測定を行った。
【００７９】
詳細には、先ず、０．４ｍＭ  ＤＴＴ及び０．４ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）で３７℃、１５分間、サンプルを前処理した。次いで、以下の表１の成分を含む基質反応液中でＴＲＸによるインスリン還元反応を行った。酵母ＴＲＸサンプルは、最終反応液あたり０．２、０．５、１、２および５μＭ（各々およそ２．４、６１２、２４および６０μｇ／ｍＬ）になるように添加した。インスリンの還元反応に基づくＯＤ６５０ｎｍの吸光度上昇を室温で２０分間測定した。
【００８０】
【表１】
ＴＲＸ活性測定のための基質反応液組成
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）中
１ｍｇ／ｍＬ  牛膵インスリン（シグマ製）
１Ｍ  ＤＴＴ
１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
結果を、図１に示す。
【００８１】
また、酵母ＴＲＸのヒトへの適用の可能性を調べるため、酵母ＴＲＸとヒトのチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）との反応性を調べた。具体的には、上記基質反応液組成の１ｍＭ  ＤＴＴのかわりに１Ｕ／ｍＬヒト胎盤由来ＴＲと０．２７ｍＭ  ＮＡＤＰＨを添加し、同様にインスリン還元反応にもどつくＯＤ６５０ｎｍの吸光度上昇を測定した。対照として、酵母ＴＲＸの代わりにヒトＴＲＸ（特開平７−７９７８０；組換えＡＤＦ製法特許）と市販大腸菌ＴＲＸ（プロメガ社製、米国）を用いた。各種ＴＲＸサンプルは、最終反応液あたり１μＭ（およそ１２μｇ／ｍＬ）になるように添加した。
【００８２】
ヒトのＴＲとの反応度合いを下記の表２にまとめた。表２に示したように、ヒトＴＲとの反応度合いついて、酵母ＴＲＸはヒトＴＲＸと比較して５０％の相対反応速度を示した。
【００８３】
【表２】
（ヒトＴＲに対する反応度合い）
ＴＲＸ給源        相対反応速度
ヒト                １００％
酵母                  ５０％
大腸菌                  ０％
次いで、同様に、酵母ＴＲに対する各種ＴＲＸの反応度合いも調べた。結果を以下の表３に示した。表３に示したように、酵母ＴＲとの反応度合いついて、ヒトＴＲＸは酵母ＴＲＸと比較して８０％の相対反応速度を示した。
【００８４】
【表３】
（酵母ＴＲに対する反応度合い）
ＴＲＸ給源        相対反応速度
ヒト                  ８０％
酵母                １００％
大腸菌                  ０％
実施例４  過酸化水素に対する感受性
酵母ＴＲＸおよびヒトＴＲＸをそれぞれ種々の過酸化水素濃度を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し室温で１５分間処理をした。その後、非還元条件下でのポリアクリルアミド電気泳動を行った。銀染色バンドの移動度からダイマー形成率を調べた。
【００８５】
具体的には、ポリアクリルアミド電気泳動の銀染色における１２ｋｄバンド（モノマー）と２４ｋｄバンド（ダイマー）との染色像の濃淡比率をデンシトメトリーにて数値化し、ダイマー形成率又はモノマー残存率を算出することができる。また、過酸化水素に対する感受性を各種過酸化水素処理濃度に対してダイマー形成率又はモノマー残存率をプロットすることにより酸化条件に対するＴＲＸ感受性を比較することができる。
【００８６】
非還元条件下（各過酸化水素濃度で、１５分処理）で電気泳動を行った銀染色像を図２に示す。また、各過酸化水素濃度での処理に対するダイマー形成およびモノマー残存率を表４および図３に示す。
【００８７】
【表４】
0004790891.tif 000004
表４および図３に示したように、ヒトＴＲＸは１ｍＭの濃度の過酸化水素において、ダイマー化がはっきりと認められたの対し、酵母ＴＲＸは、１０ｍＭ濃度下においてもダイマー化は生じなかった。
【００８８】
実施例５  酵母ＴＲＸの非還元条件下での溶液安定性
酵母ＴＲＸ凍結乾燥粉末を還元剤を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し、溶解後の冷蔵（２℃−８℃）安定性を調べた。各経経過日数におけるＴＲＸ残存活性を実施例３に記載の活性測定方法に基づき行った。溶解直後のＴＲＸ活性値に対する各経過日数での残存活性率（％）を算出し、冷蔵保存日数に対してプロットした。
【００８９】
結果を図４に示す。図４より、酵母ＴＲＸは還元剤を含まない非還元条件下で２５日以上経過してもＴＲＸ残存活性率がほぼ１００％で、活性がほとんど変化せず溶液安定性が極めて良いことが見出された。これに対し、ヒトＴＲＸは、溶解直後から徐々に活性が下がり、１ヶ月経過後は溶解直後の４０％まで活性が低下した。また、ＴＲＸ溶解液を凍結し凍結融解がＴＲＸ活性に及ぼす影響も調べたところ、酵母ＴＲＸは凍結融解前後でも全く失活を認めなかった。
【００９０】
実施例６  酵母チオレドキシンレダクターゼ遺伝子のクローニング
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａ株（遺伝型：ＭＡＴα，ＳＵＣ２，ｍａｌ，ｍｅｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１）、アメリカンタイプカルチャーコレクション番号：ＡＴＣＣ２０４５０４をＹＰＤ液体培地にて３０℃一晩振盪培養した。遠心分離菌体より、ザイモリアーゼ及びＲＮＡアーゼを用いて染色体ゲノムを調製した。染色体ゲノム抽出は、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （１９９０）  ｐｐ１２８−１２９記載の方法に従った。
【００９１】
次いで、抽出した酵母染色体ＤＮＡを鋳型にセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（配列番号７及び８）を用いてＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲは、９５℃で０．５分、５５℃で０．５分、７２℃で１．５分のサイクルを３０回繰り返した。酵母チオレドキシンレダクターゼ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を得るために用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの配列を以下に示した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーにはそれぞれ制限酵素部位ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１サイトが導入して設計した。
【００９２】
【化４】
センスプライマー（配列番号７）
５’−ＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号８）
５’−ＡＣＡＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＧＧＧＡＡＧＴＴＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＡ−３’
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１処理した。次いで、制限酵素処理ＤＮＡ断片をＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１処理したクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｉｔＩＩに挿入した。ＤＮＡ配列決定後、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子が増幅されたことを確認した。配列決定により明らかにされた酵母ＴＲの塩基配列および推定アミノ酸配列を後述の配列表の配列番号５および６に示した。
【００９３】
本発明により解明された酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの塩基配列およびアミノ酸配列（配列番号５および６）をＧｅｎｂａｎｋの登録配列（登録番号Ｕ１０２７４，ＣＤＳ  ｆｏｒｍ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  （ＮＡＤＰＨ）  ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．，Ｃｈａｅ，Ｈ．Ｚ．ら，０５−ＡＰＲ−１９９５）とを比較した。すると、本発明で得られた酵母ＴＲは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録配列と比較して、５ヵ所で塩基置換が生じており、その内４ヵ所がアミノ酸残基の置換をもたらすことが明らかとなった。また、１ヵ所での塩基挿入ならびに１ヵ所での欠失がおこりアミノ酸１８０番目のシステインから１９６番目のアラニンまでの１７アミノ酸配列にフレームシフトがおこっていることを見出した。
【００９４】
さらに、本発明で得られた酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲのアミノ酸配列（配列番号６）、そのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ１０２７４）、並びに酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＴＲのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（登録番号Ｕ６３７１３，ＣＤＳ  ｆｏｒｍ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．，Ｃａｓｓｏ．Ｄ．ら，１９−ＤＥＣ−１９９５）の相同性を比較した。すると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ１０２７４）は、酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＴＲのＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ６３７１３）と相同性が６９．９％であったのに対し、配列番号６の本発明の酵母ＴＲのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録アミノ酸配列（Ｕ６３７１３）と７３．０％とより高い相同性を有していた。
【００９５】
実施例７  組換え酵母チオレドキシンレダクターゼタンパク質の調製およびＴＲ活性測定
次いで、実施例６で得られた酵母チオレドキシンレダクターゼ遺伝子を含む、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理したＰＣＲ増幅断片を、内田ら記載の方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．１９９５  Ｊｕｎ  １５；２３７（１０２）：４３−５８）に従い、調製した大腸菌発現用ｐＴＲＰベクターの強力なトリプトファンプロモーター下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位に連結し、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の高発現を促すようｐＴＲＰ−ｙＮＴＲプラスミドを作製した。ｐＴＲＰ―ｙＮＴＲを用いて市販大腸菌株ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を常法に従い形質転換し、大腸菌形質転換体ｐＴＲＰ―ｙＮＴＲ／ＪＭ１０９を得た。形質転換操作については、例えばラボマニュアル遺伝子工学（村松正実編１９８８丸善株式会社）第１０９ページに詳述されている。
【００９６】
形質転換体ｐＴＲＰ−ｙＮＴＲ／ＪＭ１０９は、平成１２年３月２日に、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０６７で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
【００９７】
チオレドキシンレダクターゼ高発現株（ｐＴＲＰ−ｙＮＴＲ／ＪＭ１０９）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、１％ＮａＣｌ）で３７℃、一晩フラスコしんとう培養した。得られた培養菌体を集菌分離し、０．１ｍＭ  ＦＡＤ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁した。そして、超音波破砕後の遠心分離上清をＴＲ抽出液とした。
【００９８】
Ｏｂｌｏｎｇ  ＪＥらの方法（Ｏｂｌｏｎｇ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：７２７１）に従い、組換えＴＲ活性を測定した。具体的には、以下の表５の基質反応液と酵母ＴＲ抽出液（１−１０Ｕ／ｍｌの酵母ＴＲ抽出液を０．０１−０．１ｍｌ使用）を混合して、ＴＲによるＤＴＮＢの還元作用を観察した。反応は、２５℃で１分間行った。ＴＲの１活性単位（１Ｕ）は、２５℃での１分間当たりの４１２ｎｍ吸光度変化量が１．０／分とした。
【００９９】
【表５】
基質反応液組成
バッファー：  ０．１Ｍ  Ｎａ−ＰＯ4  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−  ０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
補酵素濃度：  ０．２４ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母製）
基質濃度：    ４ｍＭ  ＤＴＮＢ  （ジチオニトロ安息香酸、和光純薬製）
次いで、抽出液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂカラムにチャージし０−０．２Ｍ  ＮａＣｌ濃度勾配にてイオン交換クロマトグラフィーを行った。組換えチオレドキンレダクターゼ活性は０．１２Ｍ  ＮａＣｌをピークとして溶出された。主分画を回収後限外ろ過膜（ＹＭ１０、アミコン製）を用いて濃縮しセファクリルＳ−２００ＨＲカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーを行った。分子量７０ｋｄ付近に単一ピークとして溶出されたゲルろ過溶出分画の純度検定をポリアクリルアミド電気泳動にて調べた結果、分子量３５，０００の単一バンドを示した。
【０１００】
本標品を最終精製品としＥＤＴＡを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）にバッファー交換後、黄色の凍結乾燥粉末を調製した。最終精製酵素は比活性１３Ｕ／ｍｇを示した。本発明の組換えチオレドキシンレダクターゼの諸性質を以下の表６に列記する。
【０１０１】
【表６】
作用ｐＨ  ：７−８、至適ｐＨは７．５
ｐＨ安定性：５−９（３７℃一晩保存）
熱安定性：４５℃まで（ｐＨ７．５、２０分間処理）
実施例８  酵母ＴＲＸによるそば粉トリプシンインヒビター阻害活性
市販のそば粉１００ｇにアセトンを１００ｍｌ混合し脱脂を行った。４℃、２時間靜置後遠心でアセトン溶液を取り除き、乾燥し脱脂そば粉を調製した。脱脂そば粉１００ｇに５００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５Ｍ  ＮａＣｌを添加した。次いで、スターラーを用いて４℃一晩撹拌し、遠心分離により上清を得た。上清を硫安沈殿（９０％飽和）し、得られた沈殿について最小容量の純水で懸濁した。懸濁液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ８．６）−１ｍＭ  ＥＤＴＡで透析しソバ粉トリプシンインヒビター抽出液を調製した。
【０１０２】
上述のＩｋｅｄａ  Ｋらの方法（Ｋ．Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｋｕｓａｎｏ（１９８３）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（７）：１４８１−１４８６）に従い、そば粉抽出液中のトリプシンインヒビター活性を測定した。得られたソバ粉抽出液タンパク質は、１ｍｇあたり１１０  ＢＡＥＥ単位のＴＰＣＫ−トリプシン（シグマ社製、米国）を阻害するインヒビター活性を有していた。
【０１０３】
次いで、酵母チオレドキシン処理によるソバ粉トリプシンインヒビター活性の変化を調べた。具体手には、調製したソバ粉抽出液を用い、以下の表７の条件にてチオレドキシン処理を行った。
【０１０４】
【表７】
反応液量              １００Ｌ
反応バッファー  ０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
？１ｍＭ  ＥＤＴＡソバ抽出タンパク質    １４ｇ
ＴＰＣＫ−トリプシン  ３．３  ＢＡＥＥ単位
酵母ＴＲＸ          ソバ抽出タンパク質に対して０−５０重量％添加
また、酵母ＴＲＸ単独のものに対し、さらに、実施例７で得られたレダクターゼ及びＮＡＤＰＨの添加したものについても、ソバ粉トリプシンインヒビター活性への影響を調べた。レダクターゼは１４ｇ（０．１５Ｕ）、ＮＡＤＰＨは０．８３ｍｏｌそれぞれ添加した
結果を、図５に示す。図５に示されたように、チオレドキシン単独で処理を行った場合（ｙＴＲＸ単独）、トリプシンインヒビター活性の２０％が失活した。さらに、ＴＲＸおよびＮＡＤＰＨを共存させた場合（ＮＴＲ＋ＮＡＤＰＨ共存）、トリプシンインヒビター活性の６０％が失活させた。特に後者では、還元型ＴＲＸリサイクル反応の促進効果が現われ、ソバ抽出タンパク質に対するＴＲＸの添加比率を０．５％にまで低減させてもトリプシンインヒビター活性の６０％が失活した。
【０１０５】
【配列表】
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0004790891.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各濃度の酵母ＴＲＸタンパク質のインスリン還元活性の時間変化を示す。
【図２】図２は、酵母およびヒトのＴＲＸを非還元条件下で電気泳動を行った銀染色像である。
【図３】図３は、各濃度の過酸化水素処理により酵母およびヒトのＴＲＸのモノマー残存率を示す。
【図４】図４は、酵母およびヒトのＴＲＸの冷蔵保存下における残存活性率の経時変化を示す。
【図５】図５は、酵母ＴＲＸ処理によるソバ粉のトリプシンインヒビターの残存活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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