(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅した標的核酸分子が細胞から漏出するのを防ぐ方法であって、
（i）該細胞を、核酸分子からなる分子テープであって、該細胞に入って増幅した標的核酸分子および少なくとも１のさらなる増幅した標的核酸分子または細胞内構成成分とハイブリダイズすることにより、該細胞の細胞膜に存在する開口部のサイズを超えたサイズの複合体を形成する分子テープに暴露する工程、または
（ii）該細胞を、核酸分子からなる分子テープであって、該細胞に入って増幅した標的核酸分子の１またはそれ以上のコピーとハイブリダイズすることにより、該細胞の細胞膜に存在する開口部のサイズを超えたサイズの複合体を形成する分子テープの複数のコピーに暴露する工程
を含む方法。
【請求項２】
該標的核酸分子が等温増幅によって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該標的核酸分子が熱サイクル増幅によって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該標的核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該標的核酸分子がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該標的核酸分子が組織切片内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該細胞が複数の浮遊細胞の一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該複合体を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該検出工程をインシトゥで行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該分子テープが検出可能な標識を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該等温増幅が等温転写ベースの増幅である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
該等温転写ベースの増幅が核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該熱サイクル増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
該熱サイクル増幅が逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
該分子テープが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該分子テープが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該分子テープの長さが少なくとも２０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該分子テープの長さが２０〜６０ヌクレオチドの範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該分子テープの長さが３０〜５０ヌクレオチドの範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該分子テープの３'末端をブロックする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該細胞が固定化細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該組織切片が固定化組織切片である、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
該分子テープがＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該分子テープがＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該分子テープがペプチド含有核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
該分子テープの第一の配列領域が増幅した標的核酸分子の第一のコピーの相補的領域とハイブリダイズし、該分子テープの第二の配列領域が増幅した標的核酸分子の第二のコピーの相補的領域とハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、標的核酸分子の増幅および検出に関する。さらに詳しくは、本発明は、インシトゥ（in situ）で増幅後に増幅核酸分子を細胞内に保持するための、並びに増幅した該分子を検出するための方法および試薬に関する。それゆえ、本発明は、インシトゥでの標的核酸分子の増幅および検出を改善するものである。
核酸分子のインシトゥでの増幅および検出は、診断、予後、医薬の有効性の決定、組織病理の評価、患者のモニタリング、その他の多くの臨床応用および研究応用に有用である。
【０００２】
（背景技術）
たとえば、細胞が如何にしてその種々の機能を果たしているか、病原体が如何にして宿主細胞に感染するか、あるいは細胞が如何にして悪性の状態にトランスフォームされるかに関する疑問に答えるため、遺伝子発現の様々な側面を研究する方法が開発されている。一つの方法では、ＲＮＡ分子を単離し、液相で増幅させ、ついで検出する。しかしながら、この方法ではどの細胞が目的とするＲＮＡ分子を産生しているかを明らかにできない。幾つかの場合には細胞集団の何パーセント、あるいは細胞集団の亜集団の何パーセントが特定のＲＮＡ分子を発現しているかを知ることが重要である。
【０００３】
たとえば、たいていのヘルペスウイルス感染では、臨床的な疾患が活性感染（active infections）ではある種のウイルスＲＮＡの産生に対応するのに対し、潜伏感染の際に産生される他のウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡの産生には対応しない。他の例として、カポジ肉腫の病原体であると考えられているＨＨＶ−８がカポジ肉腫の生検および末梢血試料で認められている。インシトゥでの研究は、病変の病理発生における中心的な細胞であると考えられている内皮細胞（紡錘細胞）にウイルス感染がターゲティングされることを示している。ある種の転写物がウイルスの複製を示すと考えられており、これら転写物の検出は活性な感染（active infections）から潜伏感染を区別できるかもしれない（Zhongら、PNAS 93: 6641 (1996)）。
【０００４】
インシトゥ増幅はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の検出および該ウイルスが子宮頚細胞（cervical cells）のトランスフォーメーションの際に果たす役割の決定にも有用である（米国特許第５,５０６,１０５号を参照）。ある種のＨＰＶ転写物が実際に悪性状態にトランスフォームされた細胞でのみ産生されており、それゆえ、これら転写物の検出は初期の悪性の検出に特異的に対応する。
【０００５】
核酸増幅はまた、ＨＩＶ−１血清陽性である個体の血清陰性の性的配偶者、ＨＩＶ−１血清陰性の幼児および子供、およびＨＩＶ−１陽性の血液または体液に不慮に暴露したヘルスケアワーカーでＨＩＶ−１暴露を検出するうえでも有利に用いられている。潜伏的にかまたは生産的に（productively）感染した個々の細胞を顕微鏡下で同定できることは、潜伏状態とそれからの出現を描写するうえで非常に有用であろう。このことは感染の進展を理解するうえのみならず、抗ウイルス療法の効果の一層直接的な定量手段としても有用であろう。さらに、個々の感染細胞を同定できることはＨＩＶ−１の伝播のメカニズムを理解するうえでも役立つであろう。
【０００６】
それゆえ、細胞および組織においてＲＮＡ分子の分布および／または発現を検出することに対して相当の興味がもたれている。ＲＮＡ標的のインシトゥ増幅は、たとえば、体細胞変異、病原感染、発癌性トランスフォーメーション、免疫適格および特異性、分化の状態、発生起源、遺伝子モザイク形成（genetic mosaichism）、サイトカイン発現、および真核生物において正常状態および病的状態の両者を理解するうえで有用な他の特性に関して組織化学的または細胞化学的調製物で隣接細胞を識別するための強力な技術を提供する。
【０００７】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
幾つかの場合には標的核酸のレベルは充分に高いため標的プローブを用いてインシトゥハイブリダイゼーションにより視覚化することができる。しかしながら、そのような技術に付随する少なくとも一つの制限は標的分子のコピー数である；ハイブリダイゼーションによりＲＮＡ分子を検出するには、一般に細胞当たり１０ないし１００コピーの標的核酸分子が必要である。多くの場合、目的とする標的核酸分子は低レベルでしか存在しないため、他の技術が必要となる。
【０００８】
ハイブリダイゼーションおよびその後の視覚化に充分な量の標的配列が利用できるように、ＰＣＲが低コピー数の核酸を増幅するのに用いられている（Haaseら、ＰＮＡＳ ８７：４９７１、１９９０）。この技術は低コピー数の問題は克服するものの、熱サイクルを含む方法であることが細胞および組織の構造に対して有害な作用を及ぼす。たとえば、熱サイクルの後では所望の転写物を含む細胞を同定および分類することは困難であり、ＰＣＲ法を用いて得られる利点および有用な情報を割引するものとなっている。
ＰＣＲ増幅の感度をインシトゥハイブリダイゼーションの標的局在化と組み合わせてインシトゥＰＣＲが得られており、その際、ＰＣＲは化学的に固定した細胞内で行われる（Haaseら、１９９０、ＰＮＡＳ ８７：４９７１）。Haaseらは、選択した生物のゲノム内の重複する標的核酸に特異的な一連の重複するプライマーペアを用い、細胞区画内での増幅核酸配列の保持を改善させた。
【０００９】
従来のＰＣＲの一つの変法はＲＴ／ＰＣＲであり、これは試験試料中の標的ＲＮＡを該標的ＲＮＡから逆転写した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列により検出するものである；ついで、このｃＤＮＡを通常のＰＣＲを用いて検出する（Kawasakiら、１９８８、ＰＮＡＳ ８５(１５)：５６９８、およびRappoleeら、１９８９、J. Cell. Biochem. 38: 1-11）。しかしながら、ＲＴ／ＰＣＲを用いた従来法もまた、形態に対する有害な影響に加えて、ＲＮＡがＤＮＡの背景でのみ増幅されることをＲＴ／ＰＣＲが要求することを含めてある種の制限を有する。インビトロＲＴ／ＰＣＲ法はこの問題を２つの一般的な仕方で解決する：（１）ＤＮアーゼ処理、および（２）ＤＮＡ増幅産物からのＲＮＡ増幅産物の識別。選択肢１は、溶液反応でよりもインシトゥ調製物で行う方が一層困難である。選択肢２は、通常、これら２つの可能な増幅産物が異なるサイズを有し、ゲル上で識別分離できることを必要とする。選択肢２はまた、これら２つの可能な産物が異なる配列および異なって標識したプローブにハイブリダイズすることをも必要とし、それゆえこの選択肢をインシトゥ法で用いる制限となる。
【００１０】
インシトゥ増幅法はまた、小さな分子である増幅産物が、増幅試薬を細胞内に導入させるべく細胞表面に施した透過性の結果、細胞から拡散してしまうという問題も有する。それゆえ、この漏出と呼ばれる現象が起こることを防ぐ必要がある。従って、インシトゥ増幅法は、第一に増幅試薬が標的核酸に到達することを可能するために充分に細胞膜を透過性にすること、および第二に増幅した標的物質の漏出を防ぎ検出を可能にするために充分な完全性を細胞膜で維持すること、との間でバランスをとることが要求される。
【００１１】
インシトゥＰＣＲ増幅の際の漏出の問題を解決する方法は複数のプライマーセットを用いることであった。そのような方法はサイズの異なる重複する増幅産物を産生し、その際、これら産物は部分的に二本鎖であって、各鎖は突出端を有して互いにハイブリダイズすることにより大きなコンカテマーを形成し、細胞からの拡散を遅らせることができる。しかしながら、標準インシトゥＰＣＲに付随する上記欠点（たとえば、熱サイクルによる不充分な形態）に加えて、複数のプライマーペアの使用は、その産生のための費用の増大や病原ウイルスなどの多くの標的生物の使用に伴って良好なプライマーおよびプローブ部位を作成するであろうわずかな短い配列でさえも見出すのが困難であるという固有の問題を含めてさらに不利な点を有する。複数のプライマーペアの使用はまた、非特異的なバックグラウンド増幅が起こりやすくなるという不利をも有する。さらに、活性化された癌遺伝子、不活化された腫瘍抑制遺伝子、および発癌性の染色体転座などの他の重要な異常標的配列には、単一のプライマーペアから増幅した場合にのみ親（正常）配列から識別しうる体細胞点突然変異や染色体再配置が関与する。
【００１２】
それゆえ、増幅させた標的核酸分子を細胞内に保持させ、それによって増幅および検出結果を改善するための改良法に対する必要性が存在する。
それゆえ、本発明の一つの目的は、インシトゥで増幅後の標的核酸分子の検出を改善する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、インシトゥで増幅後に増幅した標的核酸分子を細胞内に保持する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、インシトゥで増幅後に標的核酸分子を効率的に検出する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、細胞および組織切片の本来の形態を保持する方法を提供することである。
【００１３】
（その解決方法）
本発明は、標的核酸分子のインシトゥ増幅のための方法および試薬に関する。本発明は、増幅試薬を細胞内に導入することを可能にするために細胞膜を透過性にした結果としての漏出と称されるインシトゥ増幅に付随する問題を解決するものである。
それゆえ、本発明は、増幅した標的核酸分子が細胞から漏出するのを防ぐ方法を提供する。この方法は、「分子テープ」と呼ばれる新規な試薬に細胞を暴露させる工程を含み、この分子テープは細胞内に入りこんで増幅した標的核酸分子とハイブリダイズして複合体を形成する。そのような複合体を形成することにより、増幅した標的核酸分子は細胞から漏出するほどに充分に小さくない限り細胞内に保持されてインシトゥで検出することができる。
【００１４】
本発明は、熱サイクルを含む増幅、たとえばＰＣＲおよびＲＴ／ＰＣＲなどを含めて全てとはいわないまでも殆どの増幅反応で行うことができる。本発明の好ましい態様は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの等温転写ベースの増幅を含めて等温増幅を用いて行う。
本発明の幾つかの態様では、分子テープは増幅した標的分子と複合体を形成した後、さらにアクチンなどの１またはそれ以上の細胞内構成成分に結合する。
標的核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびそれらのアナログを含めていかなる核酸分子であってもよく、ＲＮＡが好ましい。
【００１５】
培養されているかまたは培養されていない細胞に加えて、本発明の方法および試薬は、組織切片を含む他の試料で標的核酸分子を増幅および検出するのに用いることができる。さらに、標的核酸分子を本発明に従って増幅および検出する細胞はまた複数の浮遊細胞のうちの一つであってよい。
増幅した標的核酸分子は、本発明に従い、インシトゥまたは細胞溶解後に増幅した標的分子の存在を確認できる種々の検出法を用いて検出することができる。
本発明の方法および試薬は、最小の増幅した標的核酸分子でさえも透過性にした細胞内で保持させてその検出を可能にするという利点を提供する。
【００１６】
（発明を実施するための最良の形態）
上記に記載したように、本発明はインシトゥで増幅後に増幅した標的核酸分子が細胞から漏出するのを防ぐ方法を提供する。「漏出」は、細胞内に入りこんで増幅分子とハイブリダイズして複合体を形成する「分子テープ」と称する試薬の結果として防がれる。この複合体の形成が漏出を防ぐ。一般に、分子テープは、インシトゥ反応において増幅した標的分子がどこで認められようとも増幅した標的分子と複合体を形成することができる。
【００１７】
「漏出」なる語は、増幅した標的核酸分子の細胞からの望ましくない流出として定義され、該流出は標的分子のインシトゥ増幅中および増幅後に生じるものである。漏出は、たとえば、増幅試薬を細胞内に導入してインシトゥ増幅を行うために細胞膜を透過性にした結果として生じる。透過性の結果として細胞膜中に残された開口は、これら開口を通り抜けるほど充分に小さな増幅産物が細胞から流出（すなわち、漏出）するのを可能にする。
「防ぐ」なる語は、漏出を抑制、低減および／または停止させることを広く包含して用いられる。
「分子テープ」なる語は、インシトゥ増幅後に増幅した標的核酸分子を細胞内に保持する機能を果たす、一本鎖分子および二本鎖分子を含めて種々の形態の核酸分子を包含するものとして定義される。分子テープは、増幅した標的核酸分子を種々のメカニズムにより細胞内に保持することができる。
【００１８】
本発明の一つの態様において、分子テープは増幅後に１またはそれ以上のコピーの標的分子とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、たとえば、分子テープ上の別々の核酸配列領域と増幅した標的分子上の相補的領域との間で生じる。それゆえ、この態様は、分子テープの第一の配列領域が増幅した標的分子（またはアンプリコン（amplicon））の第一のコピーの相補的領域とハイブリダイズし、該テープの第二の配列領域が増幅分子の第二のコピーの相補的領域とハイブリダイズした、１または２分子以上の分子テープを含む複合体またはコンカテマーを生成させる。本発明に従って形成される複合体またはコンカテマーは、典型的に１または２コピー以上の増幅した標的分子上の相補的領域とハイブリダイズした複数分子の分子テープを含み、それによって複数のコピーの増幅標的分子が互いに複合体を形成する。
【００１９】
たとえば、本発明の好ましい態様を図１に示してあるが、図１は、複数の分子テープ（灰色）が、第一に増幅標的分子の５'末端の相補的領域とハイブリダイズし、第二に該増幅標的分子の３'末端から上流の相補的領域にハイブリダイズすることを示している。上記に記載したように、本発明に従って生成した複合体またはコンカテマーのサイズは、上記に記載したように、たとえば細胞膜を透過性とした結果として細胞膜に存在する開口の全てではなくとも殆どのサイズを大部分が超えるものでなければならない。
本発明の他の態様において、増幅した標的分子と分子テープとの相互作用によって生成した複合体は、漏出を防ぐさらなる手段として細胞オルガネラや構造タンパク質（たとえば、アクチン）などの細胞内構成成分とさらに相互作用してよい。
【００２０】
分子テープは種々の異なる長さであってよく、長さの長い分子テープは複数のコピーの増幅標的分子との間で相互作用を引き起こすことができる。分子テープは、１または２コピー以上の増幅標的分子の複合体を形成できるか、あるいは少なくとも１コピーの増幅標的分子と細胞内構成成分との間で複合体を形成できるほど充分に長くなければならない。分子テープの長さは、約２０ヌクレオチドから、標的分子の長さに適合したヌクレオチド長、すなわち好ましくは標的分子のヌクレオチド長よりは短く、かつ標的分子の増幅を妨害しない長さまでの範囲であってよい。好ましい態様において分子テープの長さは約２０〜約６０ヌクレオチドの範囲であり、さらに好ましくは約３０〜約５０ヌクレオチドの範囲である。本発明による分子テープのさらなる特徴および利点は以下の記載および例示から明らかであろう。
【００２１】
さらに、必要であれば分子テープがプライマーとして機能しないことを確実にする手段を本発明に従って講じることもできる。これら手段としては、たとえば、プライマー反応を防ぐために分子テープの３'末端をブロックすることが挙げられる。
分子テープは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、またはそのアナログ、たとえばペプチド含有核酸を包含する。
本発明の一つの態様において、分子テープは検出可能な標識を含んでいてよく、それゆえ分子テープおよび検出プローブの両方として機能しうるものであってよい。図１はフルオレセイン化した分子テープの例を示しており、ここではフルオレセイン残基が分子テープの５'および３'の両末端に付着（たとえば、共有結合）されている。
【００２２】
本発明による分子テープは、該テープのヌクレオチド配列について前もって決定した明細に従って市販のオリゴヌクレオチド合成を用いて製造することができる。これら明細は、たとえば、標的核酸分子中の２つの別々の配列領域を選択し、これら領域に相補的な別々の領域を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより決定できる。この一例は実施例１に示してあり、これは本発明の好ましい態様を示すものである。ついで、分子テープを好ましいＮＡＳＢＡ反応などの増幅反応において実験的に試験することができ、その際、分子テープが増幅標的分子の漏出を防ぐ能力は本明細書に記載する検出法を用いて測定することができる。「核酸」なる語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびそのアナログを包含するものとして定義され、好ましくはＲＮＡである。さらに、本発明の方法はｍＲＮＡの検出に限られるものではない。興味のもたれる他のＲＮＡとしては、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｓｎＲＮＡが挙げられる。
【００２３】
「細胞内構成成分」なる語は、幾つかの場合には修飾後に、分子テープと反応して分子テープと増幅標的核酸分子との複合体をさらに細胞内に保持させることのできる、細胞内のいかなる構成成分をも意味する。それゆえ、細胞内構成成分は漏出を防ぐためのさらなる手段を提供する。細胞内構成成分としては、たとえば、細胞オルガネラおよびアクチンなどの細胞内構造タンパク質が挙げられる。
【００２４】
本明細書において使用する「プライマー」なる語は、ある核酸配列（鋳型または標的配列として）に相補的で、適当な条件下（たとえば、緩衝液、塩、温度およびｐＨ）、ヌクレオチドおよび核酸複製試薬、たとえばＤＮＡ依存およびＲＮＡ依存ポリメラーゼの存在下で該核酸配列（鋳型または標的配列として）の合成を促進することのできるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、適当な標的領域とハイブリダイズし、複製試薬の存在下で相補的な核酸配列の合成を促進することができるほどに充分に長くなければならない。典型的なプライマーは少なくとも１０ヌクレオチドの配列長を含み、標的配列に対して実質的に相補的または相同である。プライマーは好ましくは約１５〜２６ヌクレオチドを含むが、長いプライマーはまた、たとえばＮＡＳＢＡなどの転写ベースの方法においても有用であり、その際、プライマーの一つはポリメラーゼプロモーターをコードするさらなるプロモーター配列を含んでいる。
【００２５】
「プロモーター配列」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチドとして定義される。原則として、開始配列を認識することのできるポリメラーゼが知られており利用できるいかなるプロモーター配列をも用いることができる。知られており有用なプロモーターとしては、ある種のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるもの、たとえば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６が挙げられる。さらに、プライマーの一部、たとえば伸長反応の開始点としてのプロモーター配列の使用は本発明のある種の態様においては制限される（blocked）。特に好ましいプロモーター配列はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列（
【化１】
0004608162.tif 000002
）であり、該プロモーターは本発明に従って好ましい等温転写ベース増幅系であるＮＡＳＢＡに用いる。
【００２６】
Ａ．試料
上記に記載したように、本発明の方法および試薬は、組織切片および浮遊細胞を含む、種々のタイプの試料のインシトゥ増幅および検出に用いることができる。
本発明に関連して用いる組織および細胞試料は種々の異なる哺乳動物源から得てよく、ヒト組織および細胞の試料を含むがこれに限られるものではない。細胞試料は、組織吸引液または体液から得ることができる。本発明は、トランスフォームしたまたは過形成の細胞、または癌腫から得た細胞に用いることができる。たとえば、ヒトの血球、とりわけ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）がＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を研究するのにしばしば用いられる。
【００２７】
組織切片は、クリオスタット切片形成（cryostat sectioning）およびミクロトームスライス生成（microtome slicing）などを含む幾つかの異なる方法で得ることができる。組織は、固形臓器、たとえば脳、脾臓、骨、心臓、血管組織、肺、腎臓、肝臓、下垂体または内分泌腺、リンパ節、分散した初代培養細胞（dispersed primary cells）、腫瘍細胞その他を含む、多くの異なる採取源のいずれからも得てよい。臨床的な試料として特に重要であるのは、リンパ組織および疑いのもたれる腫瘍組織および細胞である。
【００２８】
組織は切片を形成する前に常法により前処理してよい。切片とした組織試料は、その後の処理を妨害することのない常法により固定することができる。組織試料を固定する特定の方法は、標的核酸分子の完全性が保持され、かつ固定手順がその後の処理工程を妨害しない限り重要ではない。
細胞および組織試料はまた、掻き取り（scraping）、洗浄法（lavage）または生検などの標準法によっても得ることができる。初代培養細胞または樹立細胞株を支持体上で培養増殖または浮遊増殖させることができ、支持体上に遠心分離することができる。
【００２９】
Ｂ．増幅前処理
細胞および組織試料の固定は、知られたいずれの通常の固定法によっても行うことができる。本発明に用いるのに好ましい固定法は、細胞のための架橋固定液および沈殿（precipitive）固定液の組合せ、および組織切片のための架橋固定液単独（１０％中性緩衝ホルマリン）を含む。こうして選択した標的核酸分子は細胞／組織の形態とともによく保存することができる。
【００３０】
組織および細胞試料は、顕微鏡観察のため、公知の溶媒を用いた試料の脱水および再水和、ついでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの標準緩衝液で洗浄することを含む常法により調製する。さらに、インシトゥ増幅のために調製した細胞は壊れやすいことが知られているので、遠心分離の時間および速度を注意深く選択して良好な結果が得られるようにしなければならない。たとえば、以下の実施例（Ｈ９細胞を用いている）で指定した遠心分離の時間および速度は異なる種類の細胞に対しては若干調節する必要があるかもしれない。
細胞試料は、適当な支持体、たとえば光学顕微鏡のためにはスライドまたは電子顕微鏡のためにはグリッド上で増殖させることができ、あるいは支持体なしで増殖させてその後に支持体に適用することができる。
【００３１】
Ｃ．増幅法
上記に記載したように、増幅は等温条件下で行うことができる。本発明の好ましい態様では、等温転写ベース増幅系を３つの酵素（逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ）と標的配列に特異的な２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド（以下、プライマーという）との共同した（coordinated）作用に基づいて行うことができる。この方法はＲＮＡ鋳型から出発し、交互にＤＮＡおよびＲＮＡを合成する。詳細には、所望のＲＮＡ鋳型、プライマー、ｄＮＴＰ、および逆転写酵素を出発物質としてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを生成させる。ＲＮＡをＲＮアーゼＨ活性により該ハイブリッドから分解させる。ついで、第二のプライマーを用いた逆転写により二本鎖ＤＮＡを生成させ、ついで該二本鎖ＤＮＡが、ＮＴＰの存在下でＲＮＡポリメラーゼを用いることにより大量のＲＮＡを合成するための鋳型として機能する。ついで、これら合成したＲＮＡ分子がその後の増幅サイクルにおいて鋳型としての機能を果たすことができる。これらプライマーの一つは、鋳型に相補的な配列に加えて、プロモーターおよび転写開始部位を生成するのに必要なさらなる配列を有している。好ましいプロモーターおよび転写開始部位は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるもの、たとえばＴ３、ＳＰ６およびＴ７などである。３つの酵素活性は、３つの別々の酵素、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼによって、または２つの酵素、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼのみによって（ＲＮアーゼ活性は逆転写酵素によって提供される）提供される。好ましくは、逆転写酵素はニワトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）であり、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
【００３２】
本発明に用いるのに好ましい等温転写ベース増幅系はＮＡＳＢＡである。ＮＡＳＢＡ法は米国特許第５,４０９,８１８号および同第５,５５４,５２７号に開示されている（参照のため本明細書に引用する）。ＮＡＳＢＡは、Ｔ７プロモーターを含む鋳型からＲＮＡの複数のコピーを転写するためにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの使用を包含する。
核酸の増幅のための他の方法は、いわゆる転写ベース増幅系（ＴＡＳ）である。ＴＡＳ法は国際特許出願第ＷＯ８８／１０３１５号に記載されている（参照のため本明細書に引用する）。転写ベース増幅系は、通常、標的核酸を一対のオリゴヌクレオチドで処理することを含み、これらオリゴヌクレオチドのうちの一つは機能性のプロモーターを含む鋳型を生成するためのプロモーター配列を含む。複数コピーのＲＮＡを鋳型から転写することができ、さらなる増幅のための基礎として機能することができる。
【００３３】
他の転写ベースの増幅法がＥＰ４０８２９５号に記載されている（参照のため本明細書に引用する）。ＥＰ４０８２９５号は主として２酵素転写ベース増幅法に関するものである。
上記に記載したように、増幅はまた熱サイクルを用いても行うことができる。好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは米国特許第４,６８３,２０２号および同第４,６８３,１９５号に記載されている（それぞれ、参照のため本明細書に引用する）。
【００３４】
ＰＣＲ法はまた所望のＲＮＡ標的を増幅させるのに用いることができる。この方法（ＲＴ−ＰＣＲとして知られる）は、逆転写酵素を用いてＲＮＡ標的に相補的な一本鎖ＤＮＡ配列を生成する予備工程を含む。ついで、このＤＮＡ配列を第二のプライマーと反応させて第一の鎖に相補的な第二のＤＮＡ鎖を生成させる。ついで、この二本鎖ＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅させることができる。
【００３５】
Ｄ．検出法
核酸のインシトゥ検出のための多くの方法が当該技術分野で知られており、そのいずれも本発明に用いることができる。検出法は、典型的に２つの一般的な方法の一つである：（１）増幅反応の際の標識ヌクレオチドの導入、および（２）増幅産物の所定の領域に特異的にハイブリダイズする標的核酸またはアナログとのハイブリダイゼーション。
いずれの一般的方法においても、標識は、放射性同位体、酵素、または検出可能なシグナルを生成しうる他の残基（比色シグナル、蛍光シグナル、化学ルミネセンスシグナルおよび電子密度シグナルを含む）であってよい。
【００３６】
同位体が塩基または糖残基の一部であるか、またはある種の連結基によってヌクレオチドに結合されている場合に、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ標識プローブのオートラジオグラフィーを用いることができる。他の標識としては、プローブに共有結合したリガンドが挙げられる。ついで、リガンドを抗リガンドに結合させる。抗リガンドはそれ自体検出可能であるか、または酵素、蛍光団または化学ルミネセンス化合物などの検出可能なシグナルに共有結合されている。興味のもたれる酵素としては、ホスファターゼ、エステラーゼまたはグリコシダーゼ、あるいはペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素が挙げられる。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学ルミネセンス化合物としては、ルシフェリンおよび２,３−ジヒドロフタラジンジオンが挙げられる。
【００３７】
たとえば、検出は、ビオチン−アビジン相互作用の結果として生じてよく、その際、アビジンは蛍光団、酵素または他の標識で標識されている。興味のもたれる蛍光団としては、フィコビリンタンパク質（phycobiliproteins）、フルオレセインなどが挙げられる。酵素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどが挙げられる。あるいは、コロイド金やフェリチンなどの標識を電子顕微鏡による検出に用いることができる。
【００３８】
分子標識（molecular beacons）もまた増幅産物を検出するのに用いることができる（TyagiおよびKramer, Nature Biotech. 14: 303, 1996）。分子標識は、標的核酸を認識し、その存在のシグナルを生成する核酸プローブである。詳細には、標識分子は、ステムおよびループ構造を有する一本鎖核酸または核酸アナログである。該分子のループ部分は標的配列に相補的なプローブ配列である。ステムは、該プローブ配列の両側の２つの相補的なアーム配列のアニーリングによって生成する。蛍光残基を一方のアームの端に結合させ、蛍光消光（quenching）残基をもう一方のアームの端に結合させる。ループ部分が標的配列とハイブリッドを形成すると蛍光団と消光団（quencher）とは分離され、それゆえ蛍光団は紫外線を照射したときに蛍光を発する。ループ部分が標的配列とハイブリダイズしない場合には、蛍光団と消光団とは近接位置に留まるため蛍光団は蛍光を発しない。
【００３９】
本発明の好ましい態様において、増幅した標的分子は分子テープ上の１またはそれ以上の検出可能な標識の結果として検出できる。検出可能な標識としては上記に記載した標識が挙げられる。
本発明の方法はまた、免疫染色や蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの免疫学的な方法とともに用いることもできる。たとえば、細胞表面抗原の複数の染色により細胞亜集団の感染率（infection rates）に基づく疾患の診断および予後が可能になる。インシトゥ増幅を他の染色法と組み合わせてＨＩＶ−１などのリンパ趨向性のレトロウイルスに感染していると思われる患者からの血液または生検試料に適用すると、特異的なウイルス遺伝子を発現するＣＤ４＋（表面抗原）細胞のフラクションなどのような価値ある予後情報が得られる。
【００４０】
上記に記載したように、増幅した標的分子は細胞溶解後、種々の検出法を用いて検出して増幅した標的分子の細胞内の存在を確認することができる。一つの方法はエレクトロケミルミネセンス（electrochemiluminescence）化学（ＥＣＬ）であり、これはビオチン−アビジン相互作用によりストレプトアビジンでコーティングしたマグネチックビーズの表面に固定化したビオチン化オリゴヌクレオチド捕捉プローブを用いるものである。この系はまた、増幅産物の独立した領域にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドデテクタープローブをも用いる。デテクタープローブはルテニウムで標識してあり、ＥＣＬシグナルを生じることができる。
【００４１】
本発明を以下の実施例により記載するが、これら実施例は説明のためのものであって、いかなる意味においても本発明を限定するこを意図するものではない。
実施例１
標準等温増幅法Ｉ（スライド上の細胞）
増幅前処理：
培養した細胞を回収し、１４００ｒｐｍ（３７７ｇ）にて１０分間回転させる。細胞を１×ＰＢＳで１２００ｒｐｍ（２７０ｇ）にて８分間、２回洗浄する。細胞を１×ＰＢＳ中に約５〜１０×１０６／ｍｌの濃度にて再浮遊させ、９容量の固定液（１：１ アセトン：メタノール）に対して１容量の細胞にて３０分間固定させる。ついで、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、１×ＰＢＳ中に約２×１０５／ｍｌの濃度にて再浮遊させる。細胞をシリカを被覆した（silianated）（Shandon Lipshaw）スライド上、７００ｒｐｍにて５分間、５×１０４／スライド（２×１０５細胞／ｍｌの２５０Ｆｌ／スライド）の細胞数にて回転させる。ついで、スライドを室温（Ｒ.Ｔ.）で３時間から一夜空気乾燥させ、ｄｄＨ２Ｏで室温にて２分間洗浄し、再び室温にて少なくとも３０分間空気乾燥させる。
【００４２】
ＮＡＳＢＡ増幅：
増幅を以下の成分を含む１５μＬ溶液を入れた２０μＬ反応容器で行う：４０ｍＭトリス、ｐＨ８.５；１２ｍＭ ＭｇＣｌ２；７０ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＤＴＴ；１ｍＭ ｄＮＴＰ（それぞれ）；各２.０ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、およびｒＵＴＰ（ＵＴＰおよびジゴキシゲニン標識ＵＴＰの混合物）；１.５ｍＭ ｒＧＴＰ；０.５ｍＭ ＩＴＰ；１５％ＤＭＳＯ；０.２μＭのプライマー１およびプライマー２；４ピコモルの分子テープ、１.５Ｍソルビトール、および２.１μｇのＢＳＡ；３２単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ；および２５.６単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）を含む５μＬの酵素混合液。ジゴキシゲニン−ＵＴＰを用いる場合は、ジゴキシゲニン−ＵＴＰの濃度はＵＴＰの全濃度の約１０〜２０％でなければならない。
【００４３】
増幅手順は以下のようにして行う：
１．第一の１５Ｆｌ反応混合液を充分に混合し、ついで第二の５Ｆｌ酵素混合液を加え、穏やかに（攪拌することなく）混合する。
２．合計２０Ｆｌをスライド上部の反応チャンバ（M J Research）に加え、チャンバを注意深く密封する。
３．スライドを「Ｈｙｂａｉｄ」スライドインキュベーター上、４１ＥＣにて２時間インキュベートする。
【００４４】
増幅後処理：
スライドを１×ＰＢＳで２回、０.５×ＰＢＳで２回、ついでｄｄＨ２Ｏで２回、各５分間洗浄する。エタノール（５０％、２分；７０％、２分；９０％、２分；９５％、２分；ついで１００％、２分）で脱水し、ついで約１０分間空気乾燥させる。ついで、試料を５％血清、１％ウシ胎仔血清、５％ＢＳＡで室温にて１時間、血清ブロックし（抗ジゴキシゲニンと同じ由来の血清を使用）、抗ジゴキシゲニン抗体を４ＥＣにて一夜適用する。ついで、試料を１×ＰＢＳで２回、ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄する。ついで、酵素結合抗ジゴキシゲニン抗体を用いる場合は基質を加え、またはＦＩＴＣ結合抗ジゴキシゲニン抗体またはフルオレセイン標識分子テープを用いる場合は細胞を直ちに顕微鏡下でモニターする。
【００４５】
実施例２
標準等温増幅法II（浮遊液中の細胞）
増幅前処理：
培養した細胞を回収し、１４００ｒｐｍ（３７７ｇ）にて１０分間回転させる。細胞を１×ＰＢＳで１２００ｒｐｍ（２７０ｇ）にて８分間、２回洗浄する。細胞を１×ＰＢＳ中に約５〜１０×１０６／ｍｌの濃度にて再浮遊させ、９容量の固定液（１：１アセトン：メタノール）に対して１容量の細胞にて３０分間固定させる。ついで、細胞を１×ＰＢＳで５３ｇにて１５分間、２回洗浄する。ついで、細胞をプロナーゼ消化に３７ＥＣにて５分間供する。ついで、消化の後に９０ＥＣにて１０分間熱不活化を行う。ついで、細胞を再び１×ＰＢＳで５３ｇにて１５分間、２回洗浄する。最後の洗浄の後、もしも最初の細胞数が２.５〜５.０×１０６細胞であったなら、細胞は１×ＰＢＳの容量内に留まり、３０Ｆｌを超えることはないであろう。
【００４６】
ＮＡＳＢＡ増幅：
増幅を、（１）以下の成分を含む１０μＬ溶液：４０ｍＭトリス、ｐＨ８.５；１２ｍＭ ＭｇＣｌ２；７０ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＤＴＴ；１ｍＭ ｄＮＴＰ（それぞれ）；各２.０ｍＭのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、およびｒＵＴＰ（ＵＴＰおよびジゴキシゲニン標識ＵＴＰの混合物）；１.５ｍＭ ｒＧＴＰ；０.５ｍＭ ＩＴＰ；１５％ＤＭＳＯ；０.２μＭのプライマー１およびプライマー２；４ピコモルの分子テープ、１.５Ｍソルビトール、（２）２.１μｇのＢＳＡ；３２単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ；および２５.６単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）を含む５μＬの酵素混合液（ジゴキシゲニン−ＵＴＰを用いる場合は、ジゴキシゲニン−ＵＴＰの濃度はＵＴＰの全濃度の約１０〜２０％でなければならない）、および（３）上記増幅前処理工程からの１×ＰＢＳ中の５Ｆｌの細胞、を入れた２０μＬ反応容器で行う：
【００４７】
増幅手順は以下のようにして行う：
１．第一の１０Ｆｌ反応混合液を充分に混合し、ついで第二の５Ｆｌ酵素混合液を加え、穏やかに（攪拌することなく）混合する。
２．上記１５Ｆｌ（成分１および２）をエッペンドルフ管中の５Ｆｌの細胞に加える。合計２０Ｆｌを管中で穏やかに混合する。
３．管を４１ＥＣにて２時間インキュベートする。
【００４８】
増幅後処理：
細胞を１×ＰＢＳで５３ｇにて１５分間洗浄する。ついで、試料を５％血清、１％ウシ胎仔血清、５％ＢＳＡで室温にて１時間、血清ブロックし（抗ジゴキシゲニンと同じ由来の血清を使用）、抗ジゴキシゲニン抗体を４ＥＣにて一夜適用する。ついで、試料を１×ＰＢＳで２回洗浄する。ついで、酵素結合抗ジゴキシゲニン抗体を用いる場合は基質を加え、またはＦＩＴＣ結合抗ジゴキシゲニン抗体または分子テープを用いる場合は細胞をＦＡＣＳ装置により分析する。もしも市販の蛍光システムを酵素結合抗ジゴキシゲニン抗体とともに用いる場合は、一夜の抗体インキュベーション後に製造業者によって推奨される手順に従う。
【００４９】
実施例３
標準等温増幅法III（組織切片）
増幅前処理：
標準固定組織切片をキシレンで２回（各５分）脱パラフィン処理し、ついで１００％エタノール中で２回（各５分）洗浄する。ついで、切片を９５％、９０％、７０％および５０％のエタノール（各２分処理）で再水和し、ついでｄｄＨ２Ｏで２分間処理する。ついで、切片を２つの方法のうちの一つによりプロテアーゼ消化に供する：（Ａ）ディスパーゼIIとプロナーゼとの混合物に３７ＥＣにて３０分間、または（Ｂ）プロテアーゼＫに３７ＥＣにて３０分間。いずれの方法でも酵素は３７ＥＣの後に９０ＥＣにて１０分間不活化しなければならない。プロテアーゼ消化後、切片を１×ＰＢＳで２回（各２分の洗浄）洗浄し、ついでｄｄＨ２Ｏで２回（各２分の洗浄）洗浄する。ついで、切片を５０％、７０％、９０％、９５％および１００％のエタノール（各２分処理）で脱水し、ついで約１０分間空気乾燥させる。
ＮＡＳＢＡ増幅：
実施例１と同じ。
増幅後処理：
実施例１と同じ。
【００５０】
実施例４
増幅した標的核酸分子を細胞内に保持するうえでの本発明の分子テープの有効性を試験した。
Ｈ９細胞（不死化したヒトＴ細胞株）の２つの培養液を培養し（１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ中）、カウンティングのためトリパンブルー染色した。一方の培養液にＨＩＶ−１ IIIBを感染させ、他方の培養液には感染させなかった。細胞を以下のように割り当てた：Ｉ群は０％の感染細胞を含んでいた；II群は５０％の感染細胞を含んでいた；III群は１００％の感染細胞を含んでいた。図２を参照。
【００５１】
各群の細胞の試料を増幅用に調製し、上記のようにジゴキシゲニン−ＵＴＰの導入を含む上記実施例１に記載の手順に従って増幅させた。使用したＮＡＳＢＡプライマーは、Organon Teknika, Durham N.C.から入手できるＮＡＳＢＡベースＨＩＶ増幅および検出キット（「Nuclisens HIV-QT」）に含まれている。各群の細胞の半分は脱水後に溶解させ、残りの半分は上記インシトゥ手順に従って処理した。ついで、全ての群を、インシトゥ検出のためにＦＩＴＣ結合抗ジゴキシゲニン抗体かまたは溶解した細胞のためにＥＣＬデテクターおよび捕捉プローブを用いて検出した。
【００５２】
表１に示すように、脱水後に溶解した細胞について、分子テープ（ＭＴ）の不在下では「陰性」と表示されているように増幅した標的分子が細胞内で検出できなかったのに対し、分子テープの存在下では「陽性」と表示されているように増幅した標的分子が細胞内で検出できたことがＥＣＬ検出を用いてわかった。分子テープは以下の配列を含んでいた：
【化２】
0004608162.tif 000003
細胞内のＥＣＬシグナル（分子テープを用いるか用いることなく）に対応する「陰性」および「陽性」の表示は、Ｉ〜III群に対して実験的に得られたＥＣＬ数に基づいて決定した。詳細には、ＥＣＬ数が前もって決定したＥＣＬアッセイ陰性値［ＥＣＬ系（Organon Teknikaからの「Nuclisens HIV-QT」キット（検出および捕捉プローブを含む）の一部でもある）で使用する標準アルゴリズムに基づいて計算］の２.５倍未満であるときはＥＣＬシグナルは陰性であるとみなす。
0004608162.tif 000004
【００５３】
実施例１のインシトゥ手順（ＦＩＴＣ−標識抗ジゴキシゲニン抗体の使用を含む）に従って処理した残りの半分の細胞については、図２が、II群（５０％感染）およびIII群（１００％感染）のＨＩＶ−感染細胞からの漏出が分子テープの存在下で防がれたことを示している。このことは、図２において（とりわけIII群のＨ９IIIB細胞において）フルオレセイン標識ＮＡＳＢＡシグナルが感染細胞の細胞質部分にのみ局在している（明るい内部側の核領域を取り囲む暗い領域によって同定されるように）ことによって示されている（このようなシグナルは細胞を取り囲む培地には存在しない）。
このようなタイプの実験から、本発明に従って分子テープを用いたインシトゥ等温増幅を行うための理想的な条件を確かめることができる。さらに、当業者であれば熱サイクルベース系のような別の増幅系を用いて本発明を実施するために、必要に応じて上記手順を改変できることが理解されるであろう。
【００５４】
実施例５
ＳＩＶに感染したサルおよびＳＩＶに感染していないサルからのリンパ節切片（ともにホルマリンで固定）をキシレン（各５分を２回）およびエタノール（各５分を２回）で脱水し、エタノール（９５％、９０％、７０％および５０％、各２分）で再水和した。ついで、切片をディスパーゼIIおよびプロナーゼ（それぞれ、０.６Ｕおよび１.２Ｕ）の混合液消化に３７ＥＣにて３０分間供した。消化の後に９０ＥＣにて１０分間熱不活化を行った。ついで、切片をＰＢＳで２回、ついで水で２回洗浄し、エタノール（５０％、７０％、９５％および１００％、各２分）で脱水し、空気乾燥させた。
【００５５】
ついで、ＳＩＶのＧＡＧ遺伝子からの以下のプライマーを用いて上記と同様にして等温増幅を行った。
【化３】
0004608162.tif 000005
ＦＩＴＣ−標識分子テープを、検出プローブとして、および本発明に従って漏出を防ぐために用いた。分子テープは下記配列：
【化４】
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を含んでおり、該分子の５'および３'の両末端でＦＩＴＣ標識してあった。図３の左のパネル（「ＳＩＶ感染リンパ節」）は、細胞の細胞質領域へのＮＡＳＢＡシグナルの局在および周囲の培地中のフルオレセイン標識の不在（それゆえ、感染細胞から周囲の培地への漏出の防止）を示している。
【００５６】
要約すると、本発明の方法は当該技術分野で知られた他のインシトゥ増幅法に比べて幾つかの有意の利点を提供する。
第一に、本発明の分子テープは小さな増幅産物の保持を可能にし、それゆえいかなるサイズの標的の増幅および検出をも可能にする。
第二に、等温転写ベースの増幅の好ましい態様はＤＮＡの背景でのＲＮＡの特異的な増幅を可能にする。
第三に、等温転写ベースの増幅の好ましい態様は細胞の形態を保存し、それゆえ熱サイクル法を用いて得られる情報を上回る情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の好ましい態様による分子テープと増幅した標的分子との複合体を示す。
【図２】  実施例４に記載するように、０％感染細胞、５０％感染細胞および１００％感染細胞の混合細胞集団でのＨ９細胞のインシトゥでのフルオレセイン結合抗ジゴキシゲニン検出を示す。
【図３】  実施例５に記載するように、ＳＩＶに感染したサルからのリンパ節切片のインシトゥでのフルオレセイン検出を示す。
【配列表】
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0004608162.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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