(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化されたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）溶液であって、
グリセロール、及びウシ血清アルブミンを含み、さらに、オルニチン又はシトルリンの何れかを含む５．５〜７．０のｐＨを有する液状のＯＴＣ溶液。
【請求項２】
標準物質として請求項１に記載の液状のＯＴＣ溶液を用いる、ＯＴＣ検出用キット。
【請求項３】
ＯＴＣ抗原と抗ＯＴＣ抗体との反応を、プロクリン（商品名）の存在下、ｐＨ６．５以上、ｐＨ１０．５以下の条件で行う、請求項２記載のＯＴＣ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化されたオルニチントランスカルバミラーゼ、それを用いたオルニチントランスカルバミラーゼの免疫学的測定法、及び当該測定に用いるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ornithine transcarbamylase:ＯＴＣ）は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase:ＯＣＴ）もしくはシトルリンホスホリラーゼ（citrulline phosphorylase）とも称され、臨床検査上、肝臓病の診断あるいは発症後の経過観察等に有用な酵素である。【０００３】
このようなＯＴＣを免疫学的に測定する場合、標準物質として用いるＯＴＣの安定性の問題と十分な測定感度を得るために長時間の抗原抗体反応を必要とするという測定上の問題の２つの重大な問題が指摘されていた。【０００４】
すなわち、分離精製されたネイティブＯＴＣあるいはＤＮＡ組換え手法により調製されたリコンビナントＯＴＣは、非常に不安定な酵素であり、その安定化のために５０％程度のグリセロールを共存させるなどの処理が必須とされていた（BioChem. J. 1997;322:625-631、J. Biol. Chem. 1978;253:3939-3944）。しかし、グリセロールだけではＯＴＣを長期間安定化することは難しいという問題があった。また、ＢＳＡや動物血清などの蛋白質成分を加えることで、酵素を安定化させることは一般によく知られていることではあるが、ＯＴＣに関しては、蛋白質成分だけでは長期の安定化を達成することはできなかった。【０００５】
また、ＯＴＣを免疫学的に測定する際、従来、生体内と同じ中性付近のｐＨであるｐＨ７．４の条件で測定されていたが（Enzyme Protein 1994-95;48:10-17、Enzyme Protein 1994-95;48:18-26）、このｐＨ条件では一晩の一次反応、３時間の二次反応、さらに２．５時間の三次反応時間を必要とし、結果として検査結果が得られるまでに２日間を要していた。【０００６】
さらに、上記問題以外にも、従来法では血清を希釈せずに使用しており、血清成分による影響などが懸念されるなど、従来法では解決すべき課題を数多く有していた。【０００７】
【非特許文献１】BioChem.J.,1997;322:625-631
【非特許文献２】J.Biol.Chem.,1978;253:3939-3944
【非特許文献３】Enzyme Protein,1994-95;48:10-17
【非特許文献４】Enzyme Protein,1994-95;48:18-26
【発明の開示】
【０００８】
一般に、測定系の感度が悪いと、反応時間を長くする必要が生じるほか、ばらつきが大きくなるなどの問題があり、信頼性のある正確な安定した結果が得られない。また、激症肝炎などの急性疾患の場合には、迅速に治療方針を決定するため、検査結果を少しでも早く知る必要があり、測定に要する時間は短いほど好ましいとされている。しかしながら、従来のＯＴＣの免疫学的測定法は、これらの要件を満足しうるものではなく、短時間で、高感度に、正確に、かつ安定してＯＴＣを測定する方法の開発が切望されていた。
【０００９】
また、標準物質としてＯＴＣを用いる場合、ＯＴＣ自体の安定性が悪いと長期の保存ができなくなり、結果としてキットの有効期限が極端に短くなったり、保存温度を−４０℃以下にするなどの処置が必要となり、使い勝手の悪いキットとならざるを得ないという問題を有していた。
【００１０】
本発明者は、従来のＯＴＣの免疫学的測定法の欠点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下のことを見出した。
【００１１】
（１）ＯＴＣを保存する緩衝液のｐＨを酸性、具体的には５．５〜７．０にすることにより、ＯＴＣの安定性が格段に向上すること、
（２）ＯＴＣの保存液中に、グリセロール、蛋白質成分、基質（または生成物及びその類似体）の少なくとも２種類を共存させることにより、ＯＴＣの安定性がさらに向上すること、
【００１２】
（３）ＯＴＣを免疫学的に測定する際、反応系のｐＨを７．５〜１０．５にすることにより、ＯＴＣと抗体との反応性を向上すること、および
（４）反応系にプロクリン（商品名）を共存させた場合、上述の塩基性のｐＨ範囲におけるＯＴＣと抗体の反応性をさらに向上させ、さらに、中性ｐＨ領域におけるＯＴＣの免疫学的反応性が増大し、ｐＨ６．５以上の範囲でも十分な感度を得られる様になること。
【００１３】
したがって、このような知見を基に完成された本願発明は、以下の通りのものである。
【００１４】
［１］５．５〜７．０のｐＨを有する安定化されたＯＴＣ溶液。
［２］さらに、グリセロール、蛋白質、ＯＴＣの基質又は反応生成物もしくはその類似体を含む、［１］記載のＯＴＣ溶液。
【００１５】
［３］ＯＴＣ溶液が液状で、蛋白質がウシ由来の蛋白質である、［２］
記載のＯＴＣ溶液。
［４］ＯＴＣ溶液が凍結状態で、蛋白質が乳由来の蛋白質である、［２］
記載のＯＴＣ溶液。
【００１６】
［５］ＯＴＣ溶液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥ＯＴＣであって、凍結乾燥の際に、安定化剤として蛋白質および糖を添加して得られたものである、安定化された凍結乾燥ＯＴＣ。
［６］凍結乾燥前のＯＴＣ溶液のｐＨが５．５〜７．０である、［５］記載の凍結乾燥ＯＴＣ。
【００１７】
［７］蛋白質がウシ由来の蛋白質で、糖が単糖又は二糖である、［５］記載の凍結乾燥ＯＴＣ。
［８］ＯＴＣ抗原と抗ＯＴＣ抗体との反応をｐＨ７．５以上、１０．５以下の条件下で行う、ＯＴＣの免疫学的測定法。
【００１８】
［９］抗原抗体の反応系にプロクリン（商品名）を共存させる、［８］記載の方法。
［１０］ＯＴＣ抗原と抗ＯＴＣ抗体との反応を、プロクリンの存在下、ｐＨ６．５以上、１０．５以下の条件下で行う、ＯＴＣの免疫学的測定法。
【００１９】
［１１］［８］〜［１０］いずれかに記載の方法でＯＴＣを測定するためのＯＴＣ検出用キット。
［１２］標準物質として［１］〜［７］いずれかに記載のＯＴＣ溶液又は凍結乾燥ＯＴＣを用いる、［１１］記載のキット。
【００２０】
本願発明の方法は、後述する実施例からも明らかなように、サンプル中のＯＴＣ濃度を高感度に短時間で測定することを初めて可能とした。また、ＯＴＣの保存期間を延長させることで、本発明を用いた測定用キットを安定して供給することを可能にした。従って、本発明の方法を用いることにより、サンプル中のＯＴＣ濃度を短時間で高感度に、正確に、かつ安定して定量、測定することが可能となり、肝臓病の診断あるいは発症後経過観察等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、リコンビナントＯＴＣの４℃、１５日間の保存安定性の結果を示したものである。
【図２】図２は、４℃、１０日間の保存安定性に及ぼすオルニチン及びシトルリン添加の影響を示したものである。
【図３】図３は、ＯＴＣのＥＬＩＳＡ法における標準曲線の一例を示したものである。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡにおけるリコンビナントＯＴＣとネイティブＯＴＣの抗体との反応性に及ぼすｐＨ（６．７）の影響を示したものである。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡにおけるリコンビナントＯＴＣとネイティブＯＴＣの抗体との反応性に及ぼすｐＨ（９．４）の影響を示したものである。
【図６】図６は、プロクリン無添加におけるネイティブＯＴＣの抗体との反応性に及ぼすｐＨの影響を示したものである。
【図７】図７は、プロクリン添加におけるネイティブＯＴＣの抗体との反応性に及ぼすｐＨの影響を示したものである。
【図８】図８は、抗体との反応性に及ぼすプロクリン濃度の影響を示したものである。
【図９】図９は、酵素活性測定法とＥＬＩＳＡ法の相関を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（１）ＯＴＣの安定化
本発明で使用するＯＴＣは、哺乳動物の肝細胞由来のＯＴＣであれば、いずれのものも使用可能である。
その中で、ヒト肝細胞由来のＯＴＣとしては、たとえば、ＢｉｏＣｈａｉｎ社などから購入可能なヒト肝臓組織の抽出物、あるいは当該抽出物から常法（J. Biol. Chem., 258(18):6464-6469 (1977), Arch. Biochem. Biophys., 309(2):293-299 (1994)）により単離精製したものをネイティブＯＴＣとして使用することができる。【００２３】
また、ヒト肝細胞由来のＯＴＣは、既にクローニングされ、その塩基配列は公知となっていることから、クローン化されたＯＴＣ遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該微生物の菌体よりＯＴＣを単離精製し、これをリコンビナントＯＴＣとして使用してもよい（Science,224:1068-1074(1984),J.BioChem.,103:302-308(1988),BioChem.J.322:625-631(1997)）。【００２４】
本発明の安定化されたＯＴＣ溶液は、５．５〜７．０のｐＨを有していることを特徴とする。このようなＯＴＣ溶解は、上記ｐＨを有する水、好ましくはリン酸緩衝液、ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液などのグッドの緩衝液、クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、β,β'−ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、カコジル酸ナトリウム−塩酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液等の緩衝液にＯＴＣを１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ程度の濃度になるように溶解することで調製することができる。【００２５】
ＯＴＣ溶液には、安定性を更に向上させる目的で、グリセロール、蛋白質、糖類、ＯＴＣの基質又は反応生成物もしくはその類似体等の安定化剤を添加してもかまわない。
安定化剤としてのグリセロールは、試薬として販売されているものでかまわないが、精製度高いものが好ましい。【００２６】
蛋白質としては、酵素の安定化剤として汎用されているものでよく、好ましくはウシ血液由来の蛋白質（たとえば、ＢＳＡ、ＦＣＳ、ウシ血清等）や乳由来の蛋白質（スキムミルク、カゼイン、ブロックエース（商品名）等）を例示することができる。
糖類としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖、シュクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース等の二糖を使用することができる。【００２７】
また、ＯＴＣの基質又は反応生成物としては、オルニチン及びシトルリンを挙げることができる。また、それらの類似体（アナログ）としては、たとえばノルバリン（基質アナログ）、Ｎδ−（フォスフォンアセチル）−Ｌ−オルニチン、アルギニンリン酸等を使用することができる。【００２８】
このような安定化剤は、１種でもかまわないが、好ましくは２種以上を併用することでＯＴＣのより長時間安定化することが可能である。安定化剤の組み合わせは、使用濃度などは、特に制限されるものではなく、小規模試験にて適宜決定すればよい。また、アジ化ナトリウムなどの防腐剤を併用してもかまわない。【００２９】
本発明のＯＴＣは、上述した液状のみならず、凍結状態もしくは凍結乾燥状態であってもかまわない。
凍結状態のＯＴＣの調製は、凍結による変性を防止するため、安定化剤、特に蛋白質、好ましくは乳由来の蛋白質（スキムミルク、カゼイン、ブロックエース等）を凍結前に添加後、凍結処理することにより実施できる。
また、凍結乾燥ＯＴＣの調製は、５．５〜７．０のｐＨを有するＯＴＣ溶解を調製後、好ましくは蛋白質と糖類の２種を添加し、常法により凍結乾燥処理することで実施できる。【００３０】
（２）免疫学的測定法およびキット
本発明の免疫学的測定法は、プロクリン非存在下の条件においては、反応系のｐＨを７．５〜１０．５、好ましくは８．２〜１０．２にすることを特徴とし、プロクリン存在下の条件においては、反応系のｐＨを６．５〜１０．５、好ましくは７．０〜１０．２にすることを特徴とする。このようなｐＨ条件を採用することで、後述実施例に示すように、OTCと抗体との反応性が向上し、短時間に、正確にサンプル中のＯＴＣを定量することができる。【００３１】
反応に添加するプロクリンは、臨床診断用防腐剤として汎用されており、プロクリン１５０、同２００、同３００、同９５０の４種が市販されている。いずれもイソチアゾロン（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン及び／又は２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）を有効成分とし、防腐剤として使用濃度は６〜１５ｐｐｍ（プロクリン１５０、同２００、同３００）又は４８〜９５ｐｐｍ（プロクリン９５０）が推奨されている。本発明においても、後述実施例に示すように、この推奨濃度の範囲あるいはそれ以上の濃度で使用すればよい。【００３２】
本発明の免疫学的測定法及びキットは、上述のｐＨ条件においてＯＴＣ抗原と抗体との反応を行わせる以外は、公知の方法に準じて実施あるいは調製すればよい。
すなわち、被検サンプルとしては、肝臓疾患の疑いがある患者の血清サンプル、血漿サンプル等が例示されるが、特にこれに限定されない。【００３３】
本発明で使用する抗体は、ＯＴＣに反応する抗体であればよく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもかまわない。また、このような抗体は、抗体自体あるいはそれらの活性フラグメント〔Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'など〕であってもよい。【００３４】
ここで、ＯＴＣに反応する抗体とは、ネイティブＯＴＣあるいはリコンビナントＯＴＣの両方に結合できる抗体を意味し、特定の特性を有する抗体に限定されない。【００３５】
このようなＯＴＣに反応する抗体は、文献公知の方法により作製することができる。たとえば、リコンビナントＯＴＣを抗原とし、常法に従ってＯＴＣに反応するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体をスクリーニングすることで調製することができる。【００３６】
このような抗体を用いた免疫測定法は、上述したように、ｐＨ条件を除き、従来行われている方法、手順など何等変わるものではない。【００３７】
すなわち、試料中のＯＴＣを捕獲（トラップ）するための抗体としては、担体に結合した固相抗体を例示することができる。
固相抗体を調製する際に使用する担体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示することができ、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入されたものであってもよい。【００３８】
担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であってもよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択すればよい。
担体と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチン、ＢＳＡ、スキムミルクなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。【００３９】
また、トラップされたＯＴＣを検出するための抗体としては、標識剤で標識された抗体を例示することができる。
標識剤としては、放射性同位体（たとえば３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネートなど）、ウンベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ−ル誘導体〔たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど〕などを例示することができる。
抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。【００４０】
このような固相抗体と標識抗体を用いての測定手順は、通常の免疫測定法の手順をそのまま採用すればよい。すなわち、固相抗体と被検試料を反応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに標識抗体を反応させる（ツーステップ法）か、固相抗体、被検試料及び標識抗体を同時に反応させ（ワンステップ法）、以後のそれ自体公知の方法により試料中のＯＴＣを検出または定量することができる。【００４１】
なお、免疫測定法の詳細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。
(1)入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
(2)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(3)臨床病理  臨時増刊  特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(4)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）【００４２】
(5)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical techniques (Part A)）
(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B)）
(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical techniques (Part C)）
(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D: 
Selected Immunoassay)）
(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E: 
Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）
［(5)〜(9)はアカデミックプレス社発行］【００４３】
上記免疫学的測定に使用するキットは、ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液中で安定化されたＯＴＣ（またはその凍結乾燥品）をキットの構成試薬（標準物質）とし、抗原抗体反応をｐＨ７．５〜１０．５（プロクリン存在下においてはｐＨを６．５〜１０．５）の条件下で行わせることを特徴とするものであり、キットの他の構成試薬は、採用した測定法により必要な試薬を適宜添付すればよい。具体的には、たとえば、ＥＬＩＳＡ法を実施するためのキットとしては、以下のような構成試薬からなるものを例示することができる。【００４４】
(1) 濃度を規定したＯＴＣ標準物質
(2) 抗ＯＴＣ抗体固相化プレート
(3) サンプル希釈液
(4) ペルオキシダーゼ標識抗ＯＴＣ抗体
(5) 標識抗体希釈液
(6) 洗浄液
(7) 発色液
(8) 発色停止液
【００４５】
上記キットにおいて、濃度を規定したＯＴＣ標準物質は、ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液中に保存するか、またはこの緩衝液で溶解しておいてから凍結乾燥してもよい。また、例えば、サンプル希釈液や標識抗体希釈液を緩衝能力の強い緩衝液として、最終的なアッセイ系のｐＨを７．５〜１０．５に調節できるように構成する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。なお、ＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular  Cloning」(Maniatisら編、Cold  Spring  Harbor  Laboratory,Cold  Spring  Harbor,New  YorK(1982)）に従って行った。制限酵素、LAＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはタカラバイオ（株）より入手した。【００４７】
実施例１：ＯＴＣの安定化
（１）ＯＴＣ  ｃＤＮＡの調製
ヒトＯＴＣｃＤＮＡとしては公知の組み換えＤＮＡ手法を用いて肝臓から調製したｍＲＮＡより人為的に合成したＯＴＣｃＤＮＡを用いた（Science,224:1068-1074(1984)、J.BioChem.,103:302-308(1988)、BioChem.J.322:625-631(1997)）。すなわち、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社、タカラバイオ社から購入）を添付されているマニュアルに従って、組換えファージを大腸菌へ感染させて増幅させた後に、プロテアーゼＫ処理（０．２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、６０分間）及びフェノール処理により除蛋白を行い、エタノール沈殿により組換えファージＤＮＡを沈殿させた。沈殿させたＤＮＡを滅菌水へ溶解して組み換えファージ溶液とした。また、ＯＴＣｃＤＮＡをＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから増幅・単離するために、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを合成した。【００４８】
ＯＴＣ蛋白は未成熟蛋白のＮ末端に３２アミノ酸残基からなるミトコンドリア移行シグナルが有る事が報告されているため、この配列を除去するために下記のセンスプライマー（Ａ）では成熟蛋白のＮ末端のアミノ酸である３３番目のアスパラギンの前に発現ベクタ−ｐＱＥ３１へクロ−ン化出来るようにＢａｍＨＩ部位を設けた。アンチセンスプライマー（Ｂ）では同様に、ＯＴＣ蛋白のＣ末端配列及びＴＧＡストップコドンの５'側にｐＱＥ３１へクロ−ン化するためにＸｂａＩ部位を設けた。ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーより調製したファージＤＮＡ溶液を鋳型として、上記２つのプライマーを用いてＰＣＲ法によりヒト肝臓由来ＯＴＣｃＤＮＡ（Submitted  to  NCBI,  Accession  No.K02100）を増幅した。【００４９】
プライマー（Ａ）：５'−CAA CCG GAT CCA AAT AAA GTG CAG CTG AAG−３'  
プライマー（Ｂ）：５'−AAC TCT AGA TCA AAA TTT AGG CTT CTG GAG−３'  【００５０】
ＰＣＲによるＯＴＣｃＤＮＡの増幅は、ＬＡＴａｇＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社より購入）を用い、１０ｘＬＡＰＣＲ緩衝液（５μｌ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５μｌ）、ｄＮＴＰ（８μｌ）、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）（それぞれ１０ｐｍｏｌ）およびＤＮＡ試料（約０．５μｇ）を加えて最終容量を５０μｌにし、タカラバイオ社製  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５９℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。【００５１】
遺伝子増幅後、ＤＮＡを文献（Molecular  Cloning）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ株式会社より購入）へ一度クローン化した。定法に従ってクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列はＡｋｉｒａ  Ｈａｔａらが報告しているＯＴＣｃＤＮＡの塩基配列（J.BioChem.,103:302-308(1988)）と完全に一致したため、これがＯＴＣ遺伝子である事を確認した。さらにこれをＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで切断し、同じくＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで切断したｐＱＥ３１（Ｑｉａｇｅｎ社より購入）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＱＥ３１：ＯＴＣプラスミドを構築した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より購入）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＱＥ３１：ＯＴＣを単離した。【００５２】
Ｈ．  Ｍｏｒｉｚｏｎｏらは大腸菌においてヒトＯＴＣ蛋白を発現させる際にＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳ遺伝子を共発現させる事により、大腸菌細胞内でのインクルージョンボディー形成を抑制し、ＯＴＣ蛋白が高い活性で回収される事を報告している（Biochem. J. (1997) 322）。したがって、大腸菌染色体ＤＮＡを定法に従って調製し、これを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ＧｒｏＥＳＬ遺伝子（Submitted  to  NCBI、Accession  No.AAC77102-3）を増幅した。【００５３】
以下に示すプライマー（Ｃ）（センスプライマー）の合成は、ＧｒｏＥＳ遺伝子の上流でプロモーターを含む領域のさらに上流の配列を用い、プライマー（Ｄ）（アンチセンスプライマー）の配列は、ＧｒｏＥＬ遺伝子の終止コドン下流の領域に相補的な配列を用いた。したがって、プライマー（Ｃ）とプライマー（Ｄ）を用いて大腸菌染色体ＤＮＡより増幅した断片は、ＧｒｏＥＳとＧｒｏＥＬの両遺伝子の暗号化領域およびそれらのプロモーターを含む２３１７塩基を含む。【００５４】
プライマー（Ｃ）：５'−CAT GGG TTG ATG TCC GAT TG  −３'  
プライマー（Ｄ）：５'−AAC CCC CAG ACA TTT CTG CC  −３'  【００５５】
遺伝子増幅後、ＤＮＡを文献（Molecular  Cloning）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、約２．３ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ断片を一度ｐＵＣ１１８プラスミド（タカラバイオ株式会社より購入）へクローン化した後に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社より購入）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＡＣＹＣ：ＧｒｏＥプラスミドを構築した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性形質転換株よりプラスミドｐＡＣＹＣ：ＧｒｏＥを単離・精製した。【００５６】
発現ベクターｐＱＥ３１は、開始コドンに続いて６個のヒスチジンのコドンが存在し、発現させる組換え蛋白のＮ末端に６個のヒスチジン（ヒスチジンタグ）が付加される。このヒスチジンタグはニッケルや亜鉛の２価イオンに吸着する事が知られているため、組み換え蛋白の精製方法として利用されている。ヒスチジンタグがＮ末端に付加されたＯＴＣ蛋白の抽出・精製のため、プラスミドｐＱＥ３１：ＯＴＣとｐＡＣＹＣ：ＧｒｏＥを大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、ＪＭ１０９／ｐＱＥ３１：ＯＴＣ，ｐＡＣＹＣ：ＧｒｏＥ形質転換株を造成した。【００５７】
この形質転換株をアンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール  １０ｍｇ／Ｌの割合で添加した２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩前培養した後、５００ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール  １０ｍｇ／Ｌ）に全量植継ぎしてさらに３７℃で振とう培養した。培養を続けてＯＤ６００が１．０になった時点で、ＩＰＴＧを最終濃度が０．０１ｍＭになるように添加し、２５℃で一晩振とう培養した。培養終了後に遠心して菌体を分離後、５０ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ，２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌアプロチニン）に懸濁後、氷冷しながら超音波破砕した。この超音波処理した細胞懸濁液を遠心して、残渣を分離後、上清液に最終的に２０％になる様にＧｌｙｃｅｒｏｌを添加した。【００５８】
蛋白濃度を測定して約１０ｍｇ量の調製したサンプルをＨｉｓｔｒａｐ  ＨＰカラム５ｍｌ（アマシャムバイオサイエンス社）に供し、２０ｍｌのＰＢＳ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌおよび１０ｍｌの８０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ＰＢＳ、２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌによりカラムを洗浄して共雑蛋白を溶出させた後に、１０ｍｌの３００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ＰＢＳ、２０％ＧｌｙｃｅｒｏｌによりＯＴＣ蛋白を溶出・精製した。【００５９】
精製ＯＴＣ蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約３万６千でほぼ単一のバンドとして検出された。精製ＯＴＣ蛋白はＯＴＣ酵素活性を有しており、ウェスタンブロッティングにより後述する抗ＯＴＣモノクローナル抗体との反応性が確認された。精製蛋白の濃度はローリー法によりウシ血清アルブミンを標準物質として定量した。【００６０】
ヒスチジンタグが免疫反応に影響を与えないことを確認するため、ヒスチジンタグを持たないリコンビナントＯＴＣの調製も上記と同様に行った。すなわち、以下に示す２種類のプライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片をｐＴ７ＢベクターにＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片として連結し、ＪＭ１０９株に形質転換して発現させた。なお、得られたＯＴＣは菌体抽出物を精製せずにそのまま用いた。【００６１】
プライマー（Ｅ）：５'−CAA CCC ATG GGA AAT AAA GTG CAG CTG AAG  −３'  
プライマー（Ｆ）：５'−AAC TCT AGA TCA AAA TTT AGG CTT CTG GAG  −３'  【００６２】
このように得られたリコンビナントＯＴＣ、及び肝臓由来のネイティブＯＴＣを用い、以下の安定化に影響する要因を検討した。なお、肝臓由来のネイティブヒトＯＴＣとしては、ヒト肝臓組織の抽出物（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用いた。【００６３】
（２）ＯＴＣの安定化に影響する要因
（２−１）ｐＨの影響
ＯＴＣの水溶液中における安定性を検討した。その結果、図１に示すように、ｐＨ５．０以下及びｐＨ７．５以上の条件下においては、４℃、１５日間の保存で既にその１０％以上の免疫活性が消失したのに対し、ｐＨ５．５〜７．０の範囲においては１５日間の期間においてその活性を保持できることを見いだした。【００６４】
（２−２）オルニチン、シトルリンの影響
ＯＴＣ水溶液（ｐＨ６．８）に基質であるオルニチン、あるいは生成物であるシトルリンを添加したところ、図２に示すように、添加しない場合と比べ、安定化することが明らかとなった。また、基質アナログであるノルバリンなどでも同様に安定化することが確認された。【００６５】
（２−３）防腐剤の影響
ＯＴＣ水溶液にアジ化ナトリウムを添加したところ、アジ化ナトリウム添加による反応性の影響がみられなかった。【００６６】
（２−４）グリセロール、蛋白質、オルニチン（またはシトルリン）の影響
ＯＴＣ溶液の長期保存安定性を検討した結果、４℃、１０日間の保存安定性の検討の結果、グリセロール、ＢＳＡ等の蛋白質、オルニチン、シトルリンのいずれか１つを用いた場合には、添加しない場合に比べて安定化したが、６ヶ月間の長期の安定性を検討したところ、その安定化能は必ずしも十分ではなかった。【００６７】
そこで、これらの内、二種以上を組み合わせ、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態の各態様でＯＴＣの安定化を検討した。その結果、下記表１に示すように、１０℃もしくは−２０℃での保存条件下、ＢＳＡ単独の場合（Ｎｏ．１）のＯＴＣの活性保持率はそれぞれ７８％であり、グリセロール単独の場合（Ｎｏ．２）の活性保持率は、高濃度ではその活性を十分に保持したが、低濃度（特に１００ｎｇ／ｍｌ以下）では著しく活性が低下した。【００６８】
これに対し、０．１％(w/v)ＢＳＡと１０％(w/v)グリセロールを共存させた場合（Ｎｏ．３）の活性保持率は、それぞれ８６％と９２％に改善された。さらに、ＢＳＡ、グリセロール及びオルニチンを共存させた場合（Ｎｏ．４）の活性保持率は、それぞれ８８％と９６％により改善された。また、Ｎｏ．３とＮｏ．５の結果より、ＢＳＡは溶液状態での安定化に適し、スキムミルクは凍結状態における安定化に適していることが判明した。なお、表１には例示しなかったが、蛋白質としてはウシ血清、オルニチンの代わりにシトルリン、ノルバリン（基質アナログ）を添加して同様の結果が得られ、安定化剤として使用できることを確認した。【００６９】
【表１】
0004824581.tif 000002
【００７０】
【表１】
0004824581.tif 000003
【００７１】
実施例２：ＯＴＣの免疫学的測定
（１）抗ＯＴＣモノクローナル抗体の作製
リコンビナントＯＴＣ５０μｇをフロインド完全アジュバンドと共に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに２〜３週間おきに４回腹腔内に投与した。４回免疫後、２週間目に部分採血し、ＯＴＣに対する抗体価を次のＥＬＩＳＡ法にて調べた。【００７２】
すなわち、リコンビナントヒトＯＴＣをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、フレキシブルアッセイプレート（ファルコン社）に５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、０．５％スキムミルク溶液を２００μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。スキムミルク溶液を除去し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで段階的に希釈したマウスの血清を５０μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメッド社）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１／１０００に希釈した溶液を５０μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、基質溶液（０．３ｍＭ  ３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン二塩酸塩、０．００５％過酸化水素水含有０．２Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．８）を１００μｌずつ分注し、室温で５分間静置して発色させた。１Ｎ硫酸を１００μｌずつ加えて反応を停止し、マイクロプレートフォトメーターを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【００７３】
生理食塩水に溶解したリコンビナントＯＴＣ１０μｇをマウスに静脈投与し、最終免疫を行った。最終免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）とをケラーとミルシュタインの方法に従って細胞融合した。すなわち、脾臓細胞と骨髄腫を１０：１で混合後、遠心分離して得たペレットに５０％ポリエチレングリコール含有ＲＰＭＩ１６４０溶液１ｍｌを徐々に加えて細胞を融合した。さらにこれにＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌとし、遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＳｐ２として３×１０４個／１００μｌとなるように懸濁させ、９６ウェルマイクロタイタープレート１０枚に各ウェル１００μｌずつ分注した。【００７４】
１日後、ＨＡＴ培地を１００μｌ添加し、その３〜４日おきに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換した。融合後７日目に培養上清をサンプリングし、上記ＥＬＩＳＡ法のマウス血清の代わりに培養上清を用いてスクリーニングを行った。ＯＴＣに対する抗体陽性ウェルを検索し、限界希釈法によりクローニングを行い、２回の細胞融合により、ＯＴＣに対する抗体産生ハイブリドーマを合計２２クローン確立し、ガラスバイアルに分注後、液体窒素中に凍結保存した。【００７５】
確立した各ハイブリドーマを培養し、あらかじめプリスタンを投与してあるマウスの腹腔内に１匹当たり３×１０６個を投与し、８〜１４日後に腹水を採取した。採取した腹水を３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ８．９と１：１に混合後、０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過し、同緩衝液で平衡化してあるプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社）カラムにかけた。十分量の同緩衝液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０にて抗体を溶出した。溶出液はＰＢＳにて透析後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて純度を確認し、精製モノクローナル抗体とした。【００７６】
（２）モノクローナル抗体の酵素標識
得られた精製モノクローナル抗体２０ｍｇを０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．９）２リットル（Ｌ）を用いて４℃で一晩透析した。ペプシンを１ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．９）で溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体溶液２ｍｌに対し、ペプシン溶液１００μｌを加え、３７゜Ｃで１６時間静置した。３Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．８）２００μｌで中和後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム（１ｘ４５ｃｍ、３５ｍｌ、ＰＢＳ）にかけ、２０ｍｌ／ｈ、０．７ｍｌずつ分取、Ａ２８０ｎｍの吸光度を測定しながら最初のピークをＦ（ａｂ'）２画分として回収した。【００７７】
得られたＦ（ａｂ'）２画分を０．０１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）２Ｌを用いて４℃で一晩透析した。ホースラデッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ：東洋紡社）を蒸留水で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、ＨＲＰ溶液０．５ｍｌに対し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１００μｌを加え、室温で正確に２０分間静置した。１ｍＭ酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．０）２Ｌを用いて４℃で一晩透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）を約２５μｌ加え、ｐＨ９．０〜９．５に調整した。セラムチューブ中でＨＲＰ溶液０．５ｍｌに抗体液０．５ｍｌを加え、室温で２時間緩やかに撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム４ｍｇ／ｍｌを５０μｌ加え、４℃、２時間静置し、ＰＢＳ  ２Ｌで一晩透析し、酵素標識抗体を得た。【００７８】
（３）ＥＬＩＳＡ法によるＯＴＣの測定
（３−１）標準曲線
マイクロタイタープレートに抗ＯＴＣモノクローナル抗体（３Ｂ１１または６Ｈ１１）を１０μｇ／ｍｌの濃度になるようＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルずつコートし、２５℃で一晩静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング液（０．５％スキムミルク、５％シュークロース、０．１％プロクリン３００）を３００μｌ／ウェルずつ分注し、２５℃、１時間静置してブロッキング処理を施した。【００７９】
ブロッキング溶液を除去後、ＨＲＰ標識抗ＯＴＣモノクローナル抗体（５Ｂ１１または４Ｇ６の各Ｆ（ａｂ'）２）を１μｇ／ｍｌの濃度になるよう、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ＢＳＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０含有０．２５Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．４）で希釈し、各ウェルに５０μｌ／ウェル分注し、続けてサンプルをサンプル希釈液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ＢＳＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０），０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）により１０倍希釈し、５０μｌ／ウェルずつ分注した。【００８０】
１分間撹拌後、室温で２時間静置し、洗浄液（０．１％ＢＳＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０，１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．４））にて３回洗浄した後、発色液（ＴＭＢＺ）を１００μｌ／ウェル分注し、室温にて１５分間静置して発色させ、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェル分注して発色を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプルと同時にスタンダードをのせ、標準曲線から各サンプルの濃度を計算した。【００８１】
上記操作法に従い、リコンビナントＯＴＣ標準液を測定し、その結果を図３に示す。なお、固相抗体に３Ｂ１１、標識抗体に５Ｂ１１（Ｆ（ａｂ'）２）を用いた測定系と固相抗体に６Ｈ１１、標識抗体に４Ｇ６（Ｆ（ａｂ'）２）を用いた２種類の測定系での結果を図３に併記したが、どちらの測定系でも同等の標準曲線が得られ、ＯＴＣに反応する抗体であれば、いずれの抗体でも使用可能であることが明らかとなった。【００８２】
（３−２）ネイティブＯＴＣとの反応性
ヒト肝臓組織抽出物をネイティブＯＴＣとして用い、ＯＴＣ酵素活性当たりのＥＬＩＳＡ反応性をリコンビナントＯＴＣと比較することにより、抗体のリコンビナントＯＴＣとネイティブＯＴＣに対する反応性の違いについて検討した。その結果、図４に示すように、アッセイ系のｐＨを６．７とするとネイティブＯＴＣに対する抗体の反応性はリコンビナントＯＴＣと比べて１０倍近く低くなったが、図５に示すように、アッセイ系のｐＨを９．４とすることによりネイティブＯＴＣに対する抗体の反応性はリコンビナントＯＴＣとほぼ等しくなった。【００８３】
（４）アッセイ系の高感度化に関する検討
（４−１）アッセイ系のｐＨによる影響
アッセイ系（固相抗体３Ｂ１１、標識抗体５Ｂ１１）のｐＨ、具体的には標識抗体を希釈する緩衝液のｐＨを変動させることで、ネイティブＯＴＣに対する抗体の反応性に与える影響を検討した。その結果、図６に示すように、ｐＨ７．５〜１０．５の範囲において良好な反応性が得られることが判明した。なお、リコンビナントＯＴＣに対してもヒスチジンタグの有り無しに関わらず同様の結果が得られている。また、使用する抗体の組み合わせを変えても、すなわち、固相抗体に６Ｈ１１、標識抗体に４Ｇ６を用いたアッセイ系においても同様の結果が得られ、このようなｐＨ依存性は、抗体の性質によるものではなく、ＯＴＣの構造がｐＨにより変化し、抗体が認識するエピトープが表面に出るなどの原因により抗体と反応しやすくなったことに由来するものであると推測される。【００８４】
（４−２）アッセイ系のプロクリン添加による影響
臨床検査用の防腐剤として汎用されているプロクリン（ProClin：  
SUPELCO社、シグマアルドリッチから入手可能）をアッセイ系に  
添加することにより、吸光度に与える影響(抗体の反応性)を検討した。  
その結果、プロクリンなしの条件ではｐＨ７．５〜１０．５でなけれ
ば十分な反応性が得られなかったが、図７に示すように、プロクリン
を添加することによりそれまではほとんど反応性が得られなかった
ｐＨ６．５〜７．５の範囲においても十分な反応性が得られると共に、
それ以外のｐＨにおいても反応性が向上することが判明した。
この結果は、ネイティブＯＴＣ、リコンビナントＯＴＣのいずれでも
観察される傾向であり、また、使用する抗体の組み合わせを変えても
やはり同様の結果が得られた。
【００８５】
（４−３）プロクリン濃度の影響
アッセイ系（ｐＨ７．５）にプロクリンを濃度を変えて加えたときの抗体の反応性への影響を検討した。その結果、図８に示すように、ｐＨ７．５においては、プロクリンを添加しない場合の反応性はほとんど見られないのに対して、添加濃度に応じて反応性が増大することが判明した。また、ｐＨ７．５以外のｐＨ（例えばｐＨ９．５）においても、プロクリンの濃度に応じて反応性が増大した。【００８６】
（５）酵素活性測定法との相関の検討
酵素活性測定キット（和光純薬工業製）を用いて測定した肝臓疾患患者の血清の測定値と上記ＥＬＩＳＡ法による測定値の相関を検討した。その結果、図９に示す通り、両測定法の測定値は非常によく相関した。また、酵素活性測定キットの標準操作法では血清５００μｌを必要とするが、ＥＬＩＳＡ法では５μｌで測定が可能であり、ＥＬＩＳＡ法によって、２時間の反応時間で、肝臓疾患患者の血清を十分に感度良く測定できていることを明らかとなった。【００８７】
（６）健常者血清の測定
９４例の健常者血清を測定した。その結果、健常者の測定値の平均は約３５ｎｇ／ｍｌであり、健常者測定値の上限は約１００ｎｇ／ｍｌであった。また、健常者でも他の肝臓疾患マーカーが陽性であった例では、１００ｎｇ／ｍｌ以上か、異常のない健常者の平均値と比べて高い傾向が観察された。
SEQUENCE LISTING                   
<110>Yamasa Corporation
<120> Stabilized ornithine transcarbamylase and immunoassay for ornithine transcarbamylase using the same
<130>   5043-002PCT
<150> JP P2005-002695
<151> 2005-1-7
<160> 6                             
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> primer for amplification of human OTC cDNA
<400> 1
caaccggatc caaataaagt gcagctgaag                        30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> primer for amplification of human OTC cDNA
<400> 2
aactctagat caaaatttag gcttctggag                          30
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> primer for amplification of GroEL gene
<400> 3
catgggttga tgtccgattg                             20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> primer for amplification of GroES gene
<400> 4
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> primer for amplification of human OTC cDNA
<400> 5
caacccatgg gaaataaagt gcagctgaag                             30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> primer for amplification of human OTC cDNA
<400> 6
aactctagat caaaatttag gcttctggag                          30
【図１】
0004824581.tif 000004
【図２】
0004824581.tif 000005
【図３】
0004824581.tif 000006
【図４】
0004824581.tif 000007
【図５】
0004824581.tif 000008
【図６】
0004824581.tif 000009
【図７】
0004824581.tif 000010
【図８】
0004824581.tif 000011
【図９】
0004824581.tif 000012