(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）油性脂肪相と、非イオン親水性界面活性剤と、２０℃で固体の親油性界面活性剤とを含有する油／水エマルションを製造し、
相転移温度（ＰＩＴ）を超えて温度Ｔ２まで温度を上げて水／油エマルションを得た後、温度Ｔ１まで温度を下げる（Ｔ１＜ＰＩＴ＜Ｔ２）ことによって、油／水エマルションの転相を行い、
半透明の懸濁液が見られるまで、Ｔ１とＴ２の間の転相域について少なくとも１回以上の温度サイクルを行い、
ｂ）Ｔ１域の温度で油／水エマルションをクエンチする
ことからなる操作を含む、室温で固体である脂質フィルムで被覆され、室温で液体である脂質核からなる、平均粒径が１５０ｎｍ未満のナノカプセルを含むナノカプセル医薬組成物の製造方法。
【請求項２】
Ｔ１域の温度がＴ１より高い温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）において、油性脂肪相に溶解もしくは分散する医薬上有効な成分または水相に溶解もしくは分散する医薬上有効な成分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
医薬組成物のナノカプセルが多分散指数５％〜１５％の間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
固相フィルムの厚さが２〜１０ｎｍの間である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ナノカプセルの核が脂肪性物質からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
脂肪性物質がトリグリセリドまたは脂肪酸エステルであり、ナノカプセルの重量の２０％〜６０％を占める、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
脂肪性物質がトリグリセリドまたは脂肪酸エステルであり、ナノカプセルの重量の２５％〜５０％を占める、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
固相フィルムが親油性界面活性剤からなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
脂肪性物質／親油性界面活性化合物比が１〜１５の間から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脂肪性物質／親油性界面活性化合物比が１．５〜１３の間から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脂肪性物質／親油性界面活性化合物比が３〜８の間から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
油性脂肪相がＣ８〜Ｃ１２トリグリセリドまたはＣ８〜Ｃ１８脂肪酸エステルである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ８〜Ｃ１２トリグリセリドがカプリン酸およびカプリル酸トリグリセリド、ならびにその混合物から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ８〜Ｃ１８脂肪酸エステルが、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、またはミリスチン酸オクチルドデシル、ならびにその混合物から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
非イオン親水性界面活性剤がポリエチレングリコール−６６０  ２−ヒドロキシステレートである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
親油性界面活性剤が、ホスファチジルコリンの割合が４０％〜８０％の間であるレシチンである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
油／水エマルションが
１％〜３％の親油性界面活性剤、
５％〜１５％の親水性界面活性剤、
５％〜１５％の油性脂肪性物質、
６４％〜８９％の水
（パーセンテージは重量ベースで示す）
を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
油／水エマルションが、塩１％〜４％もまた含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
塩が塩化ナトリウムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
親油性界面活性剤が３７℃で固体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
水溶性の医薬上有効な成分が工程ｂ）の後に得られたナノカプセルの自由表面に吸着される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
脂肪性物質が脂肪酸トリグリセリドであり、親油性界面活性剤がレシチンであり、親水性界面活性剤がポリエチレングリコール−６６０  ２−ヒドロキシステレートであり、Ｔ１が６０℃であり、Ｔ２が８５℃であり、温度サイクルの数が３である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は脂質ナノカプセル、それらの製造方法、および特に注射、経口または経鼻投与を意図した薬剤の製造を目的としたそれらの使用に関する。
【０００２】
近年、多くのグループが固体脂質ナノカプセルまたは液体ナノカプセルの処方を開発している(Muller, R.H. and Mehnert, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 41(1): 62-69, 1995; W., Gasco, M.R., Pharmaceutical Technology Europe: 52-57, December 1997: EP605497)。これはリポソームまたはポリマー粒子の使用の代替となる。これらの脂質粒子は溶媒の不在下で処方されるという利点を持つ。それは親油性生成物と親水性生成物の両者を例えばイオン対の形態でカプセル化することを可能とする(Cavali, R. et al., S.T.P. Pharma Sciense, 2(6): 514-518, 1992;およびCavali, R. et al., International Journal of Pharmaceutics, 117: 243-246, 1995)。これらの粒子は遮光状態で８℃にて数年安定である(Freitas, C. and Muller, R.H., Journal of Microencapsulation, 1(16): 59-71, 1999)。
【０００３】
脂質ナノ粒子を製造するには一般に２つの技術が使用される：
加熱エマルションのホモジナイズ(Schwarz, C. et al., Journal of Controlled Release, 30: 83-96, 1994; Muller, R.H. et al., European Journal of Pharmaceutics and Eiopharmaceutics, 41(1): 62-69, 1995)または低温エマルションのホモジナイズ(Zur Muhlen, A. and Mehnert W., Pharmazie, 53: 552-555, 1998; EP605497)または、
ブタノールなどの補助界面活性剤の存在下でのマイクロエマルションのクエンチ。得られるナノ粒子の大きさは通常１００ｎｍより大きい(Cavalli, R. et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 43(2): 110-115, 1996; Morel, S. et al., International Journal of Pharmaceutics, 132: 259-261, 1996)。
Cavalli et al. (International Journal of Pharmaceutics, 2(6): 514-518, 1992;およびPharmazie, 53: 392-396, 1998)は、大きさ５５ｎｍ以上のナノスフェアの形成のための注射による無毒の胆汁酸塩、タウロデオキシコレートの使用を記載している。
【０００４】
本発明はナノスフェアではなくナノカプセルに関する。「ナノカプセル」とは、マトリックス粒子、すなわち、全体が固体である粒子であるナノスフェアに対し、室温で固体のフィルムで被覆された、室温で液体または半液体の核からなる粒子を意味する。ナノスフェアは医薬上有効な成分を含む場合、この有効成分は固体マトリックスに微分散される。
【０００５】
本発明において「室温」とは、１５〜２５℃の間の温度を意味する。
本発明の一つの主題は、平均粒径が１５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満、より好ましくは５０ｎｍ未満のナノカプセルである。これらのナノカプセルは各々、室温で固体である実施的な脂質フィルムで被覆された、室温で液体または半液体である実質的な脂質核からなる。
【０００６】
それらの粒径からして、本発明のナノカプセルはコロイド状脂質粒子である。
【０００７】
本発明のナノカプセルの多分散指数は５％〜１５％の間が有利である。
【０００８】
固相フィルムの厚さは２〜１０ｎｍの間が有利である。それはまた粒径の約１０分の１である。
【０００９】
ナノカプセルの核はナノカプセルの重量の２０％〜６０％、好ましくは２５％〜５０％を占める、室温で液体または半液体である脂肪性物質、例えばトリグリセリドまたは脂肪酸エステルから本質的になる。
【００１０】
ナノカプセルを被覆する固相フィルムは好ましくは親油性界面活性剤、例えば、ホスファチジルコリンの割合が４０％〜８０％の間であるレシチンから本質的になる。この固相フィルムはまた、親水性界面活性剤、例えばＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５も含んでもよい。
【００１１】
ナノカプセルを被覆する固相フィルムに含まれる親水性界面活性剤は好ましくはナノカプセルの２重量％〜１０重量％の間を占め、約８％が好ましい。
【００１２】
ナノカプセルの核を構成するトリグリセリドはＣ８〜Ｃ１２トリグリセリド、例えばカプリン酸およびカプリル酸トリグリセリド、ならびにその混合物から実質的に選択される。
【００１３】
脂肪酸エステルはＣ８〜Ｃ１８脂肪酸エステル、例えばパルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよびミリスチン酸オクチルドデシル、ならびにその混合物から選択される。脂肪酸エステルは好ましくはＣ８〜Ｃ１２である。
【００１４】
本発明のナノカプセルは特に医薬上有効な成分を処方するのに好適である。この場合、親油性界面活性剤は２０℃では固体であり、約３７℃では液体であるのが有利である。
【００１５】
ナノカプセルを被覆する固相フィルムに含まれる親油性界面活性剤の量は、液体脂肪性物質／固体界面活性化合物の質量比が１〜１５の間、好ましくは１．５〜１３の間、より好ましくは３〜８の間となるように設定する。
【００１６】
本発明の主題はまた、上記のナノカプセルを製造する方法でもある。
【００１７】
本発明の方法は数回の温度の上下によってもたらされる油／水エマルションの転相に基づくものである。
【００１８】
本発明の方法は、
ａ）油性脂肪相と、非イオン親水性界面活性剤と、２０℃で固体の親油性界面活性剤と、所望により油性脂肪相に溶解または分散する医薬上有効な成分または水相に溶解または分散する医薬上有効な成分とを含有する油／水エマルションを製造し、
相転移温度（ＰＩＴ）を超えて温度Ｔ２まで温度を上げて水／油エマルションを得た後、温度Ｔ１まで温度を下げる（Ｔ１＜ＰＩＴ＜Ｔ２）ことによって、油／水エマルションの転相を行い、
半透明の懸濁液が見られるまで、Ｔ１とＴ２の間の転相域について少なくとも１回以上の温度サイクルを行い、
ｂ）Ｔ１域の温度、好ましくはＴ１より高い温度で油／水エマルションをクエンチして安定なナノカプセルを得る
ことからなる。
【００１９】
本発明の方法によって得られたナノカプセルは補助界面活性剤、例えばＣ１−Ｃ４アルコールを含まないことが有利である。
【００２０】
エマルションに適用されるサイクルの回数は、ナノカプセルの形成に必要なエネルギー量によって異なる。
【００２１】
転相は、水／油エマルションが形成される場合、形成の導電性を相殺することで視覚化すればよい。
【００２２】
本発明の方法は二工程を含んでなる。
【００２３】
第一の工程は、総ての構成要素を秤量し、穏やかに攪拌しながら（例えば磁気攪拌）温度Ｔ２を超えるように加熱し、次ぎに所望により温度Ｔ１まで冷却する（ただし、Ｔ１＜Ｔ２）ことを含む。ある回数の温度サイクルの後、水／油エマルションが得られる。
【００２４】
油／水エマルションおよび水／油エマルション間の転相は、それが相殺されるまで温度を上げた時の導電率の低下に反映される。転相域の平均温度は転相温度（ＰＩＴ）に相当する。ナノカプセルの形態での系の構築は最初の系の外観の変化で視覚的に反映され、乳白色から半透明の白色へと変化する。この変化はＰＩＴより低い温度で起こる。この温度は一般にＰＩＴより６〜１５℃低い。
【００２５】
Ｔ１は導電率が２０℃で測定した導電率の少なくとも９０〜９５％に相当する温度である。
【００２６】
Ｔ２は導電性が相殺された温度である。
【００２７】
第二の工程は、磁気攪拌しながら油／水エマルションを、２℃±１℃の脱イオン水を微分散エマルションに加えて３倍〜１０倍希釈することで、Ｔ１域の温度、好ましくはＴ１を超える温度まで急冷（またはクエンチ）することからなる。得られた粒子は５分間攪拌を続ける。
【００２８】
ある好ましい具体例では、脂肪相が脂肪酸トリグリセリドであり、固体親油性界面活性剤がレシチンであり、親水性界面活性剤はＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５である。これらの条件下で、Ｔ１＝６０℃、Ｔ２＝８５℃、かつ、サイクル数は３に相当する。
【００２９】
液体物質／固体界面活性化合物比は１〜１５の間、好ましくは１．５〜１３の間、より好ましくは３〜８の間から選択される。
【００３０】
油／水エマルションは、１％〜３％の親油性界面活性剤、５％〜１５％の親水性界面活性剤、５％〜１５％の油性脂肪性物質、６４％〜８９％の水（パーセンテージは重量ベースで示す）を含むのが有利である。
【００３１】
液体脂肪性物質のＨＬＢ値が高いほど、転相温度は高くなる。一方、脂肪性物質のＨＬＢ値はナノカプセルの大きさに影響するとは思われない。
【００３２】
このように、トリグリセリド末端基が大きくなると、それらのＨＬＢ値は小さくなり、転相温度は低くなる。
【００３３】
ＨＬＢ値、すなわち親水性／親油性バランスはC. LarpentがTreatise K. 342 of Editions TECHNIQUES DE L'INGENIEURで定義しているものである。
【００３４】
親水性界面活性剤の割合を大きくしたとき、また、界面活性剤（親水性および親油性）の割合を小さくしたときに粒径は減少する。特に界面活性剤は界面張力に低下をもたらすことから系の安定化をもたらし、小さな粒子の産生を促す。
【００３５】
さらに、オイルの割を大きくしたときに粒径は大きくなる。
【００３６】
ある好ましい具体例によれば、脂肪相はＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ１３４９であり、親油性界面活性剤はＬｉｐｏｉｄｏ（登録商標）Ｓ７５−３であり、非イオン親水性界面活性剤はＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５である。これらの化合物は以下の特徴を有する。
【００３７】
Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ１３４９(Gattefosse, Saint-Priest, France)。これはカプリル酸およびカプリン酸（Ｃ９およびＣ１０）中鎖トリグリセリドからなるオイルである。その密度は２０℃で０．９３０〜０．９６０である。ＨＬＢ値は約１である。
【００３８】
Ｌｉｐｏｉｄｏ（登録商標）Ｓ７５−３(Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)。Ｌｉｐｏｉｄｏ（登録商標）Ｓ７５−３は大レシチンに相当する。大豆レシチンは約６９％のホスファチジルコリンと９％のホスファチジルエタノラミンを含む。従ってそれらは界面活性化合物である。この成分は製剤中３７℃および室温で固体である唯一の成分である。これは通常、注射粒子製剤に用いられる。
【００３９】
Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５(BASF, Ludwigshafen, Germany)。これはポリエチレングリコール−６６０  ２−ヒドロキシステレートである。従って製剤中で非イオン親水性界面活性剤として働く。注射により使用可能である（静脈経路、マウスではＬＤ５０＞３．１６ｇ／ｋｇ、ラットでは１．０＜ＬＤ５０＜１．４７ｇ／ｋｇ）。
【００４０】
油／水エマルションの水相はまた、塩、例えば塩化ナトリウム１％〜４％を含んでもよい。塩濃度の変化させると転相域にシフトする。塩濃度が高くなると、転相温度が低くなる。この現象は疎水性熱感受性有効成分をカプセル化するのに有利である。それらの配合はより低い温度で行えばよい。
【００４１】
本発明のナノカプセルは有利には有効成分を含み、注射、特に静注、経口または経鼻投与される薬剤の組成の一部をなしてよい。
【００４２】
有効成分が油相に難溶性の場合、補助溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを添加する。
【００４３】
本発明のナノカプセルはより詳しくは以下の有効成分の投与に好適である：
抗菌剤および抗生物質をはじめ抗感染薬、
抗癌剤、
抗パーキンソン病薬および神経変性疾患を治療するためのより一般的な有効成分など血液脳関門を通過しなければならない中枢神経系を意図した有効成分。
【００４４】
これらの医薬上有効な成分はまず油性脂肪相に溶解または分散させればよく、この場合にはナノカプセルの核に配合する。このため、油性脂肪相、非イオン親水性界面活性剤および２０℃で固体の親油性界面活性剤もまた含む油／水エマルションを製造する第一の工程の段階でそれを配合する。
【００４５】
これらの医薬上有効な成分はまた、水溶性であっても、あるいは水相に分散するものであってもよく、このような場合、最終相が安定したナノカプセルを形成した後にはじめてナノカプセルの表面にそれを結合させる。かかる水溶性有効成分はタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミドをはじめとするいずれの性質のものであってもよい。かかる有効成分は、本発明の方法の後に得られた安定なナノカプセルを分散させた溶液に有効成分を導入することで、ナノカプセルの表面に結合させる。非イオン親水性界面活性剤の存在が水溶性有効成分とナノカプセルの自由表面との間の相互作用結合を促す。
【００４６】
水溶性有効成分はまた、最初の油／水調製物の第一工程中に水相に導入してもよい。
【００４７】
以下、図１〜４を参照しながら実施例により本発明を説明する。
【００４８】
実施例１：有効成分を含有しないナノカプセル
Ａ）ナノカプセルの製造
７５ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５−３、５０４ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ１３４９  ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ、５０４ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、３．８２９ｇの水および８８ｍｇの塩化ナトリウムを含有する５ｇのエマルションを調製する。
【００４９】
これらの成分を同じビーカーで合わせ、磁気攪拌下に置く。温度が８５℃に達するまで加熱する。この系を磁気攪拌しながら６０℃まで冷却する。このサイクル（８５℃〜６０℃間）を温度の関数として導電性の相殺が見られるまで行う（図４）。３サイクル後に転相が起こる。最終冷却時に、混合物に２℃±１℃の蒸留水１２．５ｍｌを加えることで７０℃にてクエンチを行う。次いで、この系を磁気攪拌下で５分間維持する。
【００５０】
３回の温度サイクル後、上記の条件下で得られる粒子の平均粒径は４３±７ｎｍである。それらのサイズの多分散度は０．０７１である。リンタングステン酸を用いた透過型電子顕微鏡により粒子の平均粒径が約５０ｎｍであることを確認することができる（図１参照）。さらに、原子間力顕微鏡のコンタクトモード(Park Scientific Instruments apparatus, Geneva, Switzerland)で観察すると、これらのナノカプセルが実際に２５℃で固体であることが分かる。
【００５１】
Ｂ）親水性界面活性剤の割合の変化
以下の表１は種々の濃度の親水性界面活性剤で製造された種々のナノカプセル製剤を示している。
【００５２】
【表１】
0004790187.tif 000002
【００５３】
Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５の濃度を下げると平均粒径が大きくなる（図２）。このように、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）の割合が製剤全体の３０％〜５％に及ぶ場合には、平均粒径が２３〜１２８ｎｍに及んでいることが分かる。従って、粒径は親水性界面活性剤濃度によって異なる。
【００５４】
Ｃ）Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）とＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）界面活性剤の割合の変化
以下の表２は種々の界面活性剤濃度で製造されたナノカプセル製剤を示している。
【００５５】
【表２】
0004790187.tif 000003
【００５６】
製剤中の界面活性剤の割合を大きくすると平均粒径が小さくなる。特に、製剤Ａでは、平均粒径が８５±７ｎｍ（Ｐ＝０．１２４）の粒子が得られる。製剤ＢおよびＣでは、平均粒径が各々４３±７ｎｍ（Ｐ＝０．０７１）および２９±８ｎｍ（Ｐ＝０．１４８）となっている。
【００５７】
Ｄ）ＮａＣｌ濃度の変化
以下の表３は２種類の異なる濃度のＮａＣｌ塩で製造された２種のナノカプセル製剤を示している。
【００５８】
【表３】
0004790187.tif 000004
【００５９】
塩濃度の変化すると転相域にシフトが起こる。塩濃度が高くなるほど転相温度は低くなる（図３）。この現象は疎水性熱感受性有効成分のカプセル化に有利なものとなる。それらの配合は比較的低い温度で行えばよい。
【００６０】
これらの製剤では、塩濃度に差があるにもかかわらず、上記の粒径と同じサイズの粒子が得られる。
【００６１】
実施例２：親油性有効成分、ＳｕｄａｎIIIのカプセル化
この製剤は実施例１のものに相当する：７５ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５−３、５０４ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ｌｉｐｏｐｈｉｌｅおよび５０４ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、３．８２９ｇの水ならびに８８ｍｇの塩化ナトリウムを秤量して５ｇの開始エマルションを調製する。液体石油ゼリーに溶解した２００ｍｇのＳｕｄａｎIIIを加える。混合物を同ビーカーにて秤量し、磁気攪拌下に置く。温度が８５℃に達するまで加熱する。この系を磁気攪拌しながら６０℃まで冷却する。このサイクル（８５℃〜６０℃間）を３回行う。最終冷却時に、２℃±１℃の蒸留水１２．５ｍｌを加えることで７０℃でのクエンチを行う。次いで、この系を磁気攪拌下で５分間維持する。
【００６２】
ＳｕｄａｎIIIのカプセル化では、界面活性剤および脂肪相の割合が同じ場合には実施例１の粒子と同サイズ、すなわち４５±１２ｎｍ（Ｐ＝０．１３８）の粒子を得ることができる。このサンプルは肉眼では一様なピンク色に見える。
【００６３】
実施例３：プロゲステロンのカプセル化
この製剤は実施例１のものに相当する：７５ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５−３、５０４ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ｌｉｐｏｐｈｉｌｅおよび５０４ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、３．８２９ｇの水ならびに８８ｍｇの塩化ナトリウムを秤量して５ｇの開始エマルションを調製する。１０ｍｇのプロゲステロンを加える。混合物を同ビーカーにて秤量し、磁気攪拌下に置く。温度が８５℃に達するまで加熱する。この系を磁気攪拌しながら６０℃度まで冷却する。このサイクル（８５℃〜６０℃間）を３回行う。最終冷却時に、２℃±１℃の蒸留水１２．５ｍｌを加えることで７０℃でのクエンチを行う。次いで、この系を磁気攪拌下で５分間維持する。
【００６４】
プロゲステロンのカプセル化では、実施例１の粒子と同サイズ、すなわち４５±１２ｎｍ（Ｐ＝０．１１２）の粒子を得ることができる。プロゲステロンは水相にはその溶解度を超えた濃度では見られない。特に、２０００００ｒｐｍで３０分間の遠心分離では淡色の沈殿が得られ、その組成をＤＳＣにより調べた。この沈殿にはプロゲステロンは含まれない。プロゲステロンは実質的に水に不溶であることから、これにより有効成分がナノカプセルへ封入されたことが分かる。
【００６５】
実施例４：ブスルファン（busulfan）懸濁液のカプセル化
Ａ）ブスルファン懸濁液（濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）
ブスルファンカプセル化の第一工程は、それをＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解することである。従って、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌ当たり２４ｍｇのブスルファンを含有する溶液を調製する。この溶液を１７５ｍｇとり、５０４ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）に加える。さらに、７５ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５−３、５０４ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、３．８２９ｇの水および８８ｍｇの塩化ナトリウムも秤量する。このように、開始エマルションは０．８８ｍｇ／エマルションｇの濃度である。これらの成分を同じビーカーで合わせ、磁気攪拌下に置く。温度が８５℃に達するまで加熱する。この系を磁気攪拌しながら６０℃の温度まで冷却する。このサイクル（８５℃〜６０℃間）を３回行う。最終冷却時に、２℃±１℃の蒸留水１２．５ｍｌを加えることで７０℃でのクエンチを行う。次いで、この系を磁気攪拌下で５分間維持する。クエンチ後の最終濃度、すなわち希釈度は０．２５ｍｇ／ｍｌである。
【００６６】
得られた粒子の粒径は脂肪相の割合が高い（６３±５ｎｍ）ため、実施例１のものよりも若干大きい。プロゲステロンの場合のように、ブスルファンは水相にその溶解度を超えた濃度では見られない。特に、カプセル化後の水相には光学顕微鏡により認められる結晶はない。ここで、ブスルファンが実質的に水に不溶であることから、これによりブスルファンがナノカプセルへ封入されたことが分かる。
【００６７】
Ｂ）ブスルファン懸濁液（濃度０．５０ｍｇ／ｍｌ）
０．５０ｍｇ／ｍｌの粒子懸濁液を上記と同じ条件下で５０ｍｇのブスルファンを１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解して調製する。この溶液を１７５ｍｇとり、５０４ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）に加える。さらに、７５ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５−３、５０４ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、３．８２９ｇの水および８８ｍｇの塩化ナトリウムも秤量する。このように、開始エマルションは１．７６ｍｇ／エマルションｍｌの濃度である。これらの成分を同じビーカーで合わせ、磁気攪拌下に置く。温度が８５℃に達するまで加熱する。この系を磁気攪拌しながら６０℃の温度まで冷却する。このサイクル（８５℃〜６０℃間）を３回行う。最終冷却時に、２℃±１℃の蒸留水１２．５ｍｌを加えることで７０℃でのクエンチを行う。次いで、この系を磁気攪拌下で５分間維持する。クエンチ後の最終濃度、すなわち希釈度は０．５０ｍｇ／ｍｌである。
【００６８】
実施例５：転相温度に対する脂肪性物質の性質の影響
カプリン酸およびカプリル酸トリグリセリドからなるオイル、Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）を脂肪酸エステルと比較する。転相温度に対するそれらの末端基サイズの影響を明らかにすることができた。基のサイズが大きくなるとともに転相温度の上昇が認められる。従って、ミリスチン酸系の場合、エチルエステルでは６９．５℃、イソプロピルエステルでは７１．５℃およびオクチルドデシルエステルでは８６．５℃で外観の変化が認められる。オイルのＨＬＢ値が低い（親油性が高い）場合、この上昇により水中油エマルションが比較的生じやすいということになる。特に、この親油性が著しいほど界面活性剤とオイルの間の疎水性結合が強化されるため、さらに大きなエネルギーがこの系の変換に必要となる。さらに、脂肪酸の炭素鎖長は粒径または転相温度（Ｃ１４〜Ｃ１６間）に影響を及ぼさない。しかしながら、オレイン酸エチルに存在する二重結合は実質的に転相温度を上昇させていると思われる。
【００６９】
結果を以下の表に示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
脂肪性物質のＨＬＢ値は粒径には有意な影響を及ぼさないものと思われる。
【００７２】
実施例６：ナノカプセルに対する粒径親油性界面活性剤の性質の影響
ホスファチジルコリンの割合が４０％〜９０％の範囲である種々のレシチンを用いた。平均粒径はレシチンのホスファチジルコリン含量が高まるにつれて大きくなる（以下の表５）。特に、４０％ホスファチジルコリンでは、ナノカプセルの粒径は３５±８ｎｍであり、レシチン中７５％および９０％ホスファチジルコリンの割合では、各々４３±７ｎｍおよび７８±１２ｎｍである。一方、荷電分子を使用した場合にはナノカプセルは得られなかった。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
実施例７：水溶性有効成分を表面に結合させた脂質ナノカプセル
実施例１に記載したように、有効成分を含有しない脂質ナノカプセルの分散液５００ｍｇを以下の処方：
Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５−３        ：１．５１重量％
Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）Ｗ１．１３４９：１０．０８重量％
Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５        ：１０．０８重量％
水                                        ：７６．６重量％
ＮａＣｌ                                  ：１．７６重量％
を用いて調製する。
【００７５】
得られた脂質ナノカプセルの粒径は４３±７ｎｍである。得られた脂質ナノカプセルの分散液５０ｍｇを１ｍｌの水で希釈し、子ウシ胸腺から得られたヒストン混合物（Boehringer Mannheim, Germany）の存在下、５０μｇのＤＮＡ（ｐＳＶ  β−ガラクトシダーゼ, Promega, France）を含有する水性溶液とともに１時間穏やかに攪拌しながらインキュベートする。タンパク質と縮合し、それらの表面に吸着されたＤＮＡ分子を含有する脂質ナノカプセルが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１で得られた本発明のナノカプセルの写真である。スケールは１ｃｍ〜５０ｃｍである。
【図２】  平均粒径の変化を親水性界面活性剤（Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標））の割合の関数として示す。
【図３】  導電率の変化を種々の塩濃度に対する温度の関数として示す。曲線１では、塩濃度は２．０重量％である。曲線２では濃度は３．４重量％である。
【図４】  実施例１に記載の油／水（Ｏ／Ｗ）エマルションの導電率の変化を６０℃〜８０℃の間の温度上下の３回の後の温度の関数として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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