(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記群から選択される１又は２以上のシクロデキストリン誘導体を有効成分として含有する、５０乃至１３０℃の加熱処理がされた血液、血清、血漿及び尿から選ばれる試料中に含まれるタンパク質又はポリペプチドの免疫学的測定用の反応性増強剤；
ヒドロキシエチル化α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル化β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル化γ−シクロデキストリン、ヒドロキシメチル化α−シクロデキストリン、ヒドロキシメチル化β−シクロデキストリン、ヒドロキシメチル化γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル化α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル化β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル化γ−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル化α−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル化β−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル化γ−シクロデキストリン。
【請求項２】
２０℃における溶解性が、水１００ｍＬに対して２５ｇ以上であるシクロデキストリン誘導体を有効成分として含有する、５０乃至１３０℃の加熱処理がされた血液、血清、血漿及び尿から選ばれる試料中に含まれるタンパク質又はポリペプチドの免疫学的測定用の反応性増強剤。
【請求項３】
試料が、界面活性剤を含有するものである、請求項１又は２に記載の反応性増強剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応性増強剤を用いることを特徴とする、試料中に含まれる物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロデキストリン誘導体を有効成分として含有する反応性増強剤、並びにこれを用いた検出方法及び免疫学的測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と略記する）は、Ｄ−グルコピラノースがα１→４結合した非還元性の環状オリゴ糖であり、これを化学修飾した化合物としては、ヒドロキシアルキル化した種々のＣＤ誘導体等が知られている。
【０００３】
特許文献１には、ＣＤ誘導体の存在下で行うコレステロールの定量法が記載されている。しかしながら、免疫学的測定方法においてＣＤ誘導体を使用することについては記載されていない。
【０００４】
【特許文献１】特許第３０９１２３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、免疫学的測定用の反応性増強剤、並びにこれを用いた検出方法及び免疫学的測定キット提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のＣＤ誘導体が、免疫学的測定における反応性を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、下記のものを提供する。
（１）下記群から選択される１又は２以上のＣＤ誘導体を有効成分として含有する、試料中に含まれる物質の免疫学的測定用の反応性増強剤（以下、「本発明反応性増強剤１」という）；
ヒドロキシエチル化α−ＣＤ、ヒドロキシエチル化β−ＣＤ、ヒドロキシエチル化γ−ＣＤ、ヒドロキシメチル化α−ＣＤ、ヒドロキシメチル化β−ＣＤ、ヒドロキシメチル化γ−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化α−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化β−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化γ−ＣＤ、ヒドロキシブチル化α−ＣＤ、ヒドロキシブチル化β−ＣＤ、ヒドロキシブチル化γ−ＣＤ。
（２）２０℃における溶解性が、水１００ｍＬに対して２５ｇ以上であるＣＤ誘導体を有効成分として含有する、試料中に含まれる物質の免疫学的測定用の反応性増強剤（以下、「本発明反応性増強剤２」という）。
（３）試料が界面活性剤を含有するものである、上記（１）又は（２）に記載の反応性増強剤。
（４）試料が生体由来の試料である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の反応性増強剤。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の反応性増強剤を用いることを特徴とする、試料中に含まれる物質の検出方法（以下、「本発明検出方法」という）。
（６）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の反応性増強剤を少なくとも含む、免疫学的測定キット（以下、「本発明免疫学的測定キット」という）。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、免疫学的測定において用いる非常に優れた反応性増強剤、並びにこれを用いた検出方法及び免疫学的測定キットを提供することから極めて有用である。また本発明は、生体由来の試料中に存在する物質の、非常に高感度な検出に応用できることから、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明反応性増強剤１
本発明反応性増強剤１は、下記群から選択される１又は２以上のＣＤ誘導体を有効成分として含有する、試料中に含まれる物質の免疫学的測定用の反応性増強剤である。
ヒドロキシエチル化α−ＣＤ、ヒドロキシエチル化β−ＣＤ、ヒドロキシエチル化γ−ＣＤ、ヒドロキシメチル化α−ＣＤ、ヒドロキシメチル化β−ＣＤ、ヒドロキシメチル化γ−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化α−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化β−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化γ−ＣＤ、ヒドロキシブチル化α−ＣＤ、ヒドロキシブチル化β−ＣＤ、ヒドロキシブチル化γ−ＣＤ
ここで、上記で選択されるＣＤ誘導体としては、単一種類のＣＤ誘導体であってもよく、複数種類のＣＤ誘導体であってもよい。なかでも、上記において選択されるＣＤ誘導体には、ヒドロキシプロピル化α−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化β−ＣＤ及びヒドロキシブチル化β−ＣＤから選択される１又は２以上のＣＤ誘導体が含まれることが、より顕著な反応性増強効果が期待できるといった観点から好ましい。
【００１０】
上記のＣＤ誘導体は、グルコースの分子中に存在する水酸基が、それぞれ種々の置換基に置換されていることを構造的な特徴としている。ここで、それぞれのＣＤ誘導体が有する上記のような置換基の種類は、単数であっても良く、複数であっても良い。置換基の種類が単数である場合、ヒドロキシエチル化α−ＣＤ、ヒドロキシエチル化β−ＣＤ及びヒドロキシエチル化γ−ＣＤにおける置換基はヒドロキシエチル基、ヒドロキシメチル化α−ＣＤ、ヒドロキシメチル化β−ＣＤ及びヒドロキシメチル化γ−ＣＤにおける置換基はヒドロキシメチル基、ヒドロキシプロピル化α−ＣＤ及びヒドロキシプロピル化β−ＣＤにおける置換基はヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル化α−ＣＤ、ヒドロキシブチル化β−ＣＤ及びヒドロキシブチル化γ−ＣＤにおける置換基はヒドロキシブチル基となる。また、置換基の種類が複数である場合、例えば上記に例示した置換基のうち複数の置換基を有していても良いが、上記以外の置換基として、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、硫酸基等、その他の置換基を有していても良い。あるいはＣＤ誘導体の水酸基がマルトシル化、ガラクトシル化、グルコシル化されたものであっても良い。
【００１１】
なお、上記のようなＣＤ誘導体の構造あるいは物性を示す一つの指標としては、１分子中に存在する置換基の平均数を示す置換度という概念が挙げられる。上記のＣＤ誘導体は、このような置換度によって限定されるものではないが、以下にＣＤ誘導体が有する置換基の種類が単数である場合について、好ましい置換度の例を示す。
【００１２】
例えば単数の種類の置換基を有するヒドロキシプロピル化α−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化β−ＣＤ又はヒドロキシプロピル化γ−ＣＤにおいて、置換度、すなわちヒドロキシプロピル化α−ＣＤ、ヒドロキシプロピル化β−ＣＤ又はヒドロキシプロピル化γ−ＣＤ１分子中に存在するヒドロキシプロピル基の平均数が、それぞれ１〜１０であることが好ましく、２〜８であることが好ましく、４〜６であることが最も好ましい。
【００１３】
また、以上のようなＣＤ誘導体は、置換基を有しないＣＤに比べ、優れた溶解性を有することを一つの特徴としている。上記のＣＤ誘導体は、このような溶解性によって限定されるものではないが、２０℃における溶解性が、水１００ｍＬに対して２５ｇ以上であることが好ましい溶解性として例示され、同条件において５０ｇ以上であることがより好ましい溶解性として例示され、同条件において１００ｇ以上であることが最も好ましい溶解性として例示される。
【００１４】
なお本明細書において、２０℃における溶解性は、水１００ｍＬに対してある重量のＣＤ誘導体を混合し、目視により溶解したか否かを確認することにより測定することができる。
【００１５】
本発明反応性増強剤１の状態は特に限定されず、溶液状態であっても、固体状態であってもよい。また必要に応じて、上記ＣＤ誘導体以外の他の成分をさらに添加したものであってもよい。このような成分としては、例えば、リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、グッド緩衝剤及びホウ酸緩衝剤等に例示される緩衝剤、安定化剤、防腐剤、糖類等の添加剤が例示される。
【００１６】
また、本発明反応性増強剤１において「試料」とは、免疫学的測定によって検出され得る物質を含有するか、これを含有する可能性がある試料である限りにおいて特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、唾液、関節液、組織液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、菌体培養液、菌体抽出物及びこれらの調製物等に例示される、生体由来の試料であることが好ましく、なかでも血液、血清若しくは血漿、尿、又はこれらの調製物であることがより好ましい。
【００１７】
ここで、上記の調製物としては、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤、糖類及び界面活性剤等の添加剤を添加した調製物、上記の各種生体由来の試料を、加熱等の処理により、滅菌又は除菌した調製物等が例示される。
【００１８】
上記の加熱における加熱温度は特に限定されないが、例えば５０乃至１３０℃であることが好ましく、５０乃至８０℃であることがより好ましく、５０乃至７０℃であることが極めて好ましく、６０乃至６５℃であることが最も好ましい。また、加熱時間についても特に限定されないが、例えば５０乃至７０℃にて加熱を行う場合、１乃至２０時間であることが好ましく、１０乃至２０時間であることがより好ましい。また、例えば６０乃至６５℃にて加熱を行う場合、１乃至３０時間であることが好ましく、６乃至２４時間であることがより好ましく、１０乃至２０時間であることが最も好ましい。また加熱は、加圧処理等の他の処理と組み合わせて行うこともできる。このような例としては、例えば６０乃至１３０℃にて５分間乃至２時間加熱加圧を行う、オートクレーブ処理等が例示される。
【００１９】
このような処理は、試料中に、例えばドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」と略記する）、ドデシル硫酸リチウム、ドデカンスルホン酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム等に例示される界面活性剤を添加した上で行うことが、蛋白の変質・変性に伴う試料の凝固を防止するといった観点から好ましい。なお、このような場合において、試料中における界面活性剤の濃度は特に限定されないが、良好な凝固防止効果が期待できるといった観点から、０．１重量％〜５重量％であることが好ましく、０．１重量％〜３重量％であることがより好ましく、約１重量％であることが最も好ましい。
【００２０】
上記のような加熱及び／又は加圧処理は、一般に、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ及びトリ等の人畜共通感染症を有する動物に由来する試料中の被験物質の検出を行う際に、作業者の安全を確保する目的等で行われる。
【００２１】
しかしこのような処理は、被験物質の検出感度の低下の原因となることがある。本発明反応性増強剤１は、このような検出感度の低下を補い、検出感度を改善する役割を果たすことから、加熱及び／又は加圧処理がなされた試料中の被験物質の測定において、特に有効に用いることができる。
【００２２】
一方、ある種の界面活性剤については、界面活性剤の存在自体が、被験物質の検出感度の低下を招くことがある。したがって本発明反応性増強剤１は、界面活性剤を含む試料中の被験物質の測定、とりわけ加熱及び／又は加圧処理がなされ、且つ界面活性剤を含む試料中の被験物質の測定においても、特に有効に用いることができる。
【００２３】
加熱及び／又は加圧処理、界面活性剤の添加等に伴う検出感度の低下は、被験物質によっても異なる。本発明反応性増強剤１は、検出感度の低下を補い、検出感度を向上する役割を果たすことから、加熱及び／又は加圧処理、界面活性剤の添加による検出感度の低下が懸念される物質の検出に、特に有効に用いることができる。このような物質としては、具体的には例えばレプチン、インスリン、インターロイキン（インターロイキン１〜１８等）、アンジオテンシン、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＴ、ＩｇＹ等）、サイトカイン類、キモカイン類、細胞外基質タンパク、感染物質（菌、ウイルス等）由来のタンパク質等のタンパク質、ポリペプチド、コレステロール等が例示される。
【００２４】
本発明反応性増強剤１は、免疫学的測定において用いる。
【００２５】
ここで、免疫学的測定としては、例えばＥＩＡ法及びＥＬＩＳＡ法等のエンザイムイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ法）及びラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等の標識イムノアッセイ、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、ラテックス凝集反応法、レーザーイムノアッセイ等の非標識イムノアッセイ法等の、公知の免疫学的測定が例示される。
【００２６】
免疫学的測定においては、検出の対象である上記の試料中に存在する物質（本明細書において、「被験物質」という）と、当該被験物質に特異的に結合する物質との間に惹起される、免疫学的な反応に基づいて被験物質を検出する。ここで、例えば被験物質が抗原である場合、当該抗原と特異的に反応する抗体を用いることにより、上記抗原を検出することができる。逆に、例えば被験物質が抗体である場合は、当該抗体と特異的に反応する抗原を用いることにより、上記抗体を検出することができる。
【００２７】
上記の抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びファージディスプレイ法などによって作製される抗体、並びにその活性断片、固相化物及び標識物質等が例示される。
【００２８】
本発明反応性増強剤１は、上記のような抗原と抗体との間の反応において、反応試料中でこれら二者と共存することにより、上記反応を増強する効果を発揮することができる。
【００２９】
反応試料中に共存させる本発明反応性増強剤１の濃度は特に限定されず、用いるＣＤ誘導体の種類、試料の種類、被験物質の種類、希望する反応性の増強の程度等によって適宜選択することができるが、反応性増強効果及びＣＤ誘導体の溶解性等の観点から、０．１〜３０重量％であることが好ましく、０．２〜２０重量％であることがより好ましい。より具体的には、加熱処理がなされた試料中の被験物質の検出においてヒドロキシプロピル化α−ＣＤを用いる場合、０．２〜１０重量％であることが好ましく、０．８〜６重量％であることがより好ましく、約６重量％であることが最も好ましい。また、加熱処理がなされた試料中の被験物質の検出においてヒドロキシプロピル化β−ＣＤを用いる場合、０．２〜２０重量％であることが好ましく、０．８〜１０重量％であることがより好ましく、５〜６重量％であることが最も好ましい。一方、加熱処理がなされていない試料中の被験物質の検出においてヒドロキシプロピル化α−ＣＤを用いる場合、０．２〜２０重量％であることが好ましく、０．５〜１０重量％であることがより好ましく、５〜６重量％であることが最も好ましい。また、加熱処理がなされていない試料中の被験物質の検出においてヒドロキシプロピル化β−ＣＤを用いる場合、０．２〜２０重量％であることが好ましく、０．５〜２０重量％であることがより好ましく、６〜１０重量％であることが最も好ましい。
【００３０】
また、本発明反応性増強剤１を反応試料中に共存させるタイミングについても特に限定されないが、免疫学的測定に先立って、被験物質を含む試料、又は被験物質を検出するために用いる溶液等（特に被験物質と特異的に結合する抗体を含む溶液等）に、予め本発明反応性増強剤１を混合させておくことが好ましい。
【００３１】
また、免疫学的測定の際の試料の温度も特に限定されないが、２０〜５０℃であることが好ましく、３０〜４０℃であることがより好ましく、３７℃であることが最も好ましい。
【００３２】
本発明反応性増強剤１において、「反応性を増強する」との用語は、上述したような免疫学的な反応が惹起される程度を増大させることを意味する。反応が惹起された程度は、例えば後述する実施例１に記載のように、吸光度に基づいて確認することができる。
【００３３】
ここで、強度の増大の程度は特に限定されないが、本発明反応性増強剤１を使用しない場合の反応の強度を１００％とした場合における、本発明反応性増強剤１を使用した場合の相対的な反応の強度が、１１０％以上であることが好ましく、１２０％であることが好ましく、１３０％以上であることが極めて好ましく、１５０％以上であることが最も好ましい。
＜２＞本発明反応性増強剤２
本発明反応性増強剤２は、２０℃における溶解性が、水１００ｍＬに対して２５ｇ以上であるＣＤ誘導体を有効成分として含有する、試料中に含まれる物質の免疫学的測定用の反応性増強剤である。
【００３４】
上記におけるＣＤ誘導体の２０℃における溶解性は、水１００ｍＬに対して２５ｇ以上である限りにおいて特に限定されないが、５０ｇ以上であることがより好ましく、１００ｇ以上であることが最も好ましい。
【００３５】
本発明反応性増強剤２における具体的なＣＤ誘導体の例としては、例えば上記＜１＞本発明反応性増強剤１で具体的に列挙したＣＤ誘導体の一部又は全部の他、ＭＣＴ−β−ＣＤ及びメチル−β−ＣＤ（ともに、横浜国際バイオ研究所製）等が例示される。
【００３６】
本発明反応性増強剤２の状態は特に限定されず、溶液状態であっても、固体状態であってもよい。また必要に応じて、上記ＣＤ誘導体以外の他の成分をさらに添加したものであってもよい。このような成分としては、例えば、リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、グッド緩衝剤及びホウ酸緩衝剤等に例示される緩衝剤、安定化剤、防腐剤、糖類等の添加剤が例示される。
【００３７】
また、上記において、「試料」、「試料中に含まれる物質」及び「免疫学的測定」なる用語の意義、反応性増強剤として用いる方法、並びに「反応性を増強する」との用語の意義等は、上記＜１＞本発明反応性増強剤１の説明を参照されたい。
＜３＞本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明反応性増強剤１又は２を用いることを特徴とする、試料中に含まれる物質の検出方法である。
【００３８】
上記の「試料」、「試料中に含まれる物質」及び「検出」との用語の意義ついては、前記＜１＞本発明反応性増強剤１に記載の通りである。
【００３９】
また、試料中に含まれる物質の検出において本発明反応性増強剤１又は２を用いる方法についても、＜１＞本発明反応性増強剤１及び＜２＞本発明反応性増強剤２で説明した通りである。
＜４＞本発明免疫学的測定キット
本発明免疫学的測定キットは、本発明反応性増強剤１又は２を少なくとも含む免疫学的測定キットである。
【００４０】
本発明免疫学的測定キットを用いることにより、上述した本発明検出方法をより効率的且つ簡便に行うことができる。本発明免疫学的測定キットに含まれる本発明反応性増強剤１又は２の状態、形態等も特に限定されないが、具体的には、例えば固体状態又は溶液状態の本発明反応性増強剤１又は２を容器に収容し、本発明免疫学的測定キットの構成成分とすることができる。
【００４１】
また本発明免疫学的測定キットは、本発明反応性増強剤１又は２以外の構成成分として、例えば抗体固相化担体（固相としては、プレート、ビーズ、メンブレン等が例示される）、検出用抗体（１次抗体、２次抗体、標識抗体）、反応バッファー、洗浄液、反応基質、基質溶解液、反応基質液、発色停止液、抗原標準溶液、緩衝剤、血清添加剤、界面活性剤等に例示される添加剤等のその他の構成成分を含むものであってもよい。
【００４２】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。なお、実施例においては以下の略号を用いる。
ＨＰ−α−ＣＤ：ヒドロキシプロピル化α−ＣＤ
ＨＰ−β−ＣＤ：ヒドロキシプロピル化β−ＣＤ
ＨＰ−γ−ＣＤ：ヒドロキシプロピル化γ−ＣＤ
ＨＢ−α−ＣＤ：ヒドロキシブチル化α−ＣＤ
ＨＢ−β−ＣＤ：ヒドロキシブチル化β−ＣＤ
ＨＢ−γ−ＣＤ：ヒドロキシブチル化γ−ＣＤ
【実施例１】
【００４３】
１）ＣＤ類の反応性増強効果の検証−その１
マウス血清に、１０重量％のＳＤＳ溶液をＳＤＳ濃度が１重量％となるように添加し、加熱処理（６０℃、１８時間）を行った。
【００４４】
マウスレプチン測定キット（森永生科学研究所製）の検体希釈液に、８ｇ／ＬのＮａＣｌ及び０．０５％のプロクリン３００を含む、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３〜７．７）溶液（以下、「ＴＢＳ」と略記する）を用いて５％となるように調製した表１に記載のＣＤ類（日本食品化工製）を、表1記載の試験濃度になる様に添加した。この反応液を用い、下記の手順でマウスレプチン測定キットを用いて反応性の測定を行った。
【００４５】
すなわち、抗体固相化プレートをフレームにセットし、各ウェルを３００μＬの洗浄液で２回洗浄した。続いて、各ウェルに検体希釈液を４５μＬ、モルモット抗マウスレプチン抗血清を５０μＬずつ添加した後、各ウェルに上記で調製した試験物質添加群の試料を５μＬ添加し、４℃で１６〜２０時間静置した（第一反応）。第二反応の後、各ウェルを３００μＬの洗浄液で５回洗浄した。その後、各ウェルに酵素標識抗モルモットIgG抗体原液を１００μＬずつ添加し、４℃で３時間静置した（第二反応）。第二反応の後、各ウェルを３００μＬの洗浄液で洗浄した。続いて、各ウェルに酵素基質（ＴＭＢ）液を１００μＬずつ添加し、常温（１５〜２５℃）で３０分間静置させ、発色させた（発色反応）。発色反応の後、各ウェルに反応停止液を１００μＬずつ添加し、発色反応を停止させ、プレートリーダーで各ウェルの吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：６３０ｎｍ）を測定した。
【００４６】
ＣＤ類無添加の反応液で測定した場合の吸光度差を１００％とした場合における、ＣＤ類を添加した反応液で測定した場合の吸光度差の割合（％）を求めた。なお、上記の吸光度差は、各測定により得られた吸光度から、検体希釈液の吸光度（ブランク）を減算することにより得た。結果を表１に示す。ＨＰ−α-ＣＤ、ＨＰ−β-ＣＤ、ＨＢ−β-ＣＤ、並びにＨＰ−α-ＣＤ、ＨＰ−β-ＣＤ及びＨＰ−γ-ＣＤの混合物が、顕著な反応性増強効果を有することが確認された。
[表１]  ＣＤ類の反応性増強効果
0004753740.tif 000002
＊１  ＨＰ−α-ＣＤ、ＨＰ−β-ＣＤ及びＨＰ−γ-ＣＤそれぞれの濃度を示す。
２）ＣＤ誘導体の濃度検討−その１
マウス血清に、１０重量％のＳＤＳ溶液をＳＤＳ濃度が１重量％となるように添加し、加熱処理（６０℃、１８時間）を行った。
【００４７】
ＨＰ−α−ＣＤ及びＨＰ−β−ＣＤを、それぞれＴＢＳを用いて１００％溶液（１００ｍＬに対し、１００ｇ溶解した溶液を１００％溶液とした）を作製し、表２に記載の各試験濃度の５倍濃度となるようにＴＢＳで調製し、更に、マウスレプチン測定キットの検体希釈液で５倍希釈し、各試験物質溶液を、表２に記載の試験濃度となるように調製した。この反応液を用いることの他、上記１）と同様の方法により、上記試料中に存在するマウスレプチンを測定した。
【００４８】
ＨＰ−α−ＣＤ及びＨＰ−β−ＣＤ無添加の反応液で測定した場合の吸光度差を１００％とした場合における、ＨＰ−α−ＣＤ又はＨＰ−β−ＣＤを各濃度に添加した反応液で測定した場合の吸光度差の割合（％）を求めた。
【００４９】
ＨＰ−α−ＣＤ又はＨＰ−β−ＣＤの各濃度における反応性を表２に示す。ＨＰ−α−ＣＤについては０．２〜１０％、ＨＰ−β−ＣＤについては０．２〜２０％の範囲において、反応性増強効果が確認された。
[表２]
0004753740.tif 000003
【実施例２】
【００５０】
１）ＣＤ類の反応性増強効果の検証−その２
マウス血清に、１０重量％のＳＤＳ溶液をＳＤＳ濃度が１重量％となるように添加した。
【００５１】
表３に記載のＣＤ類を、それぞれＴＢＳを用いて表３に記載の試験濃度の１０倍の濃度となるように調製し、試験物質溶液を得た。
【００５２】
マウスレプチン測定キットの検体希釈液に、各試験物質溶液を、表３に記載の試験濃度となるように添加した。この反応液を用い、上述した実施例１と同様の方法により、上記のマウス血清由来の試料中に存在するマウスレプチンを測定した。
【００５３】
ＣＤ類無添加の反応液で測定した場合の吸光度差を１００％とした場合における、ＣＤ類を添加した反応液で測定した場合の吸光度差の割合（％）を求めた。結果を表３に示す。ＨＰ−α-ＣＤ、ＨＰ−β-ＣＤ、ＨＢ−β-ＣＤ、並びにＨＰ−α-ＣＤ、ＨＰ−β-ＣＤ及びＨＰ−γ-ＣＤの混合物が、反応性増強効果を有することが確認された。
[表３]
0004753740.tif 000004
【００５４】
２）ＣＤ誘導体の濃度検討−その２
マウス血清に、１０重量％のＳＤＳ溶液をＳＤＳ濃度が１重量％となるように添加した。
【００５５】
ＨＰ−α−ＣＤ及びＨＰ−β−ＣＤを、それぞれＴＢＳを用いて表４に記載の各試験濃度の５倍の濃度となるように調製し、更に、マウスレプチン測定キットの検体希釈液で５倍希釈し、各試験物質溶液を、表４に記載の試験濃度となるように調製した。この反応液を用いることの他、上述した実施例１と同様の方法により、上記のマウス血清に由来する試料中に存在するマウスレプチンを測定した。
【００５６】
ＨＰ−α−ＣＤ及びＨＰ−β−ＣＤ無添加の反応液で測定した場合の吸光度差を１００％とした場合における、ＨＰ−α−ＣＤ又はＨＰ−β−ＣＤを各濃度に添加した反応液で測定した場合の吸光度差の割合（％）を求めた。
【００５７】
ＨＰ−α−ＣＤ又はＨＰ−β−ＣＤの各濃度における反応性を表４に示す。ＨＰ−α−ＣＤ及びＨＰ−β−ＣＤについて、０．２〜２０％の範囲で反応性増強効果が確認された。
[表４]
0004753740.tif 000005
【実施例３】
【００５８】
トウモロコシペプチドを、ＴＢＳを用いて１０％に調製した。このトウモロコシペプチド溶液をマウス血清に添加し、更に１０重量％のＳＤＳをＳＤＳ濃度が１％となるように添加した後、加熱処理（６５℃、１８時間）を行った。
【００５９】
また、ＨＰ−α−ＣＤを、ＴＢＳを用いて６０％及び８％に調製した。これらの溶液を６％、０．８％となるようにキット検体希釈液に添加した。この反応液を用いることの他、実施例１と同様の方法により、上記試料中に存在するマウスレプチンを測定した。
【００６０】
トウモロコシペプチド無添加のマウス血清を用い、且つＨＰ−α−ＣＤを添加しない検体希釈液を用いて測定した場合の吸光度差を１００％とした場合における、トウモロコシペプチド及びＨＰ−α−ＣＤを用いた場合の吸光度差の割合（％）を求めた。結果を下記表５に示す。トウモロコシペプチド及びＨＰ−α−ＣＤを併用することにより、さらに高い検出感度でレプチンを測定できることが明らかになった。
[表５]  トウモロコシペプチド及びＨＰ−α−ＣＤを用いたマウスレプチンの測定
0004753740.tif 000006
【実施例４】
【００６１】
（参考例１）
下記に加熱によって検出感度が低下するおそれのある被験物質の例について、参考例を示す。
【００６２】
ヒトアンギオテンシンII（３１．２５ｐｇ／ｍｌ）、ラットインスリン（３２０ｐｇ／ｍｌ）、マウスレプチン（６４００ｐｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−１α（ヒトインターロイキン−１α、２５０ｐｇ／ｍｌ）、ラットＩｇＥ（３２ｎｇ／ｍｌ）を含む標準溶液を６０℃、１８時間処理した後、下記のキットを用いて試料中に含まれる上記の各被験物質を測定した。測定には、ヒトアンギオテンシンII測定キット（ＳＰＬＢＩＯ製）、ラットインスリン測定キット（森永生科学研究所製）、マウスレプチン測定キット（森永生科学研究所製）、ヒトＩＬ−１α測定キット（Ｃａｙｍａｎ製）、ラットＩｇＥ測定キット（森永生科学研究所製）を用い、キットに添付の操作方法に準じて測定した。なお、加熱によって試料が凝固した場合には、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１５分）を行い、得られた上清を測定に用いた。上記試料中に含まれるそれぞれの被験物質について、加熱処理を行わなかった場合（未処理）の吸光度差を１００％とした場合における、吸光度差の割合（％）を求めた。結果を下記表６に示す。
[表６]
0004753740.tif 000007
【００６３】
以上のことから、特にインスリン、レプチン、IL-1α、IgEにおいては、加熱処理によって著しく検出感度が低下することが明らかになった。