(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
解糖系、TCA回路、ペントースリン酸経路、アミノ酸合成固有経路を代謝フラックスの反応経路を含む細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の、代謝物の同位体分布の分析値、菌体生成速度、アミノ酸生産速度、及び、有機酸生成速度を含む分析値から細胞内代謝フラックスを決定することを含む、細胞内代謝フラックスの解析方法であって、
下記の（ａ）〜（ｃ）の全てを満たす前記方法。
（ａ）細胞内代謝フラックスモデルは、アミノ酸とそのアミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質との交換反応を含み、細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれるアミノ酸の同位体分布及びタンパク質の分解物の同位体分布の分析値を含み、アミノ酸の同位体分布の分析値は、１）アミノ酸の同位体分布とタンパク質の分解物の同位体分布を測定する工程、２）工程１）で得られた結果から最適化アルゴリズムを用いて、交換反応係数で定義される変数として表現される、アミノ酸とタンパク質との合成と分解との度合いを最適化する工程により補正される。
（ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、アミノ酸及び／又はその代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、同位体で標識されていないアミノ酸の細胞への取り込み速度、並びに、前記アミノ酸及び／又はその代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、前記アミノ酸及び／又はその代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度からタンパク質に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による前記アミノ酸及び／又はその代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
（ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。
【請求項２】
最適化アルゴリズムが進化アルゴリズムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）において、タンパク質の分解物の同位体分布の分析値が、培地中の、同位体で標識されていないアミノ酸のタンパク質への取り込みの影響により補正される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸がイソロイシンである請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞が、前記アミノ酸の生産能を保持する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞の培養が回分培養又は流加培養である、請求項１〜５のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項７】
同位体分布が質量分析により測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
解糖系、TCA回路、ペントースリン酸経路、アミノ酸合成固有経路を代謝フラックスの反応経路を含む細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを記憶する手段、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の、代謝物の同位体分布の分析値、菌体生成速度、アミノ酸生産速度、及び、有機酸生産速度を含む分析値を入力する手段、細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段、ならびに、決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、下記（ａ）〜（ｃ）の全てを満たすように、細胞内代謝フラックスモデルが構築され、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出される前記プログラム。
（ａ）細胞内代謝フラックスモデルは、アミノ酸とそのアミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質との交換反応を含み、細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれるアミノ酸の同位体分布及びタンパク質の分解物の同位体分布の分析値を含み、アミノ酸の同位体分布の分析値は、１）アミノ酸の同位体分布とタンパク質の分解物の同位体分布を測定する工程、２）工程１）で得られた結果から最適化アルゴリズムを用いて、交換反応係数で定義される変数として表現される、アミノ酸とタンパク質との合成と分解との度合いを最適化する工程により補正される。
（ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、アミノ酸及び／又はその代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、同位体で標識されていないアミノ酸の細胞への取り込み速度、並びに、前記アミノ酸及び／又はその代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、前記アミノ酸及び／又はその代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度からタンパク質に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による前記アミノ酸及び／又はその代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
（ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。
【請求項９】
請求項８に記載のプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は代謝フラックス（流束）を解析する方法、すなわち代謝フラックス解析方法、その方法のプログラム、および、そのプログラムを記録した記録媒体に関する。更に詳しくは、同位体標識物質を用いる代謝フラックス解析方法、その方法のプログラム、および、そのプログラムを記録した記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝フラックス解析方法は、細胞内での代謝物質や同位体標識化合物のバランスを解析すること、核磁気共鳴法（NMR）あるいは質量分析（MS）などの分析手法を用いて、同位体化合物のトレース実験を行うことによって、定量的に細胞内の代謝フラックスの決定を行う方法であって、対象細胞の代謝反応経路中での各代謝物の量比（カーボンバランス）を化学量論的に解析する手法として近年注目されている（非特許文献１）。
【０００３】
代謝フラックス解析に適用する、正確な解析手法を開発すべく、種々の研究が行われている。同位体標識をした基質を用いた代謝フラックス解析に関する理論については、多くの研究報告があり、確立してきている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。代謝フラックス解析法の確立のために多くの実験が行われているが、正確な解析精度を得るため、理想的条件である合成培地を使用した連続培養法による研究が一般的である（非特許文献６）。また、より実用的な培養法である回分培養で代謝フラックス解析をしている例も一部には報告されているが、培地中に排出された幾つかの物質の同位体分布の測定が行われているのみであり、菌体内物質の同位体分布測定に基づく計算は全くなされていない。（非特許文献７）。一方、特許文献１、特許文献２または特許文献３に開示されているように、理論的に代謝フラックスを予測する試みも多数なされているが、応用例などの実用的な観点からは、同位体標識基質を用いた代謝フラックス解析法に大きく及ばない（非特許文献８、非特許文献９）。
【非特許文献１】メタボリック・エンジニアリング(Metabolic Engineering), 2001年, 第3巻, p.265-283
【非特許文献２】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1997年, 第55巻, p.101-117
【非特許文献３】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1997年, 第55巻, p.118-135
【非特許文献４】Biotechnology and Bioengineering, 1999年, 第66巻, p.69-85
【非特許文献５】バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering), 1999年, 第66巻, p.86-103
【非特許文献６】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry), 2000年, 第275巻, p.35932-35941
【非特許文献７】ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry), 2001年, 第268巻, p.2441-2455
【特許文献１】国際公開第WO 00/46405号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO 02/061115号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO 02/055995号パンフレット
【非特許文献８】ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー(Journal of Biotechnology), 2002年, 第94巻, p.37-63
【非特許文献９】メタボリック・エンジニアリング(Metabolic Engineering), 2001年, 第3巻, p.195-205
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでの技術では、通常の実験あるいは実際の工業生産に用いる培養方法あるいは培地における、実際の状態を反映した正確な代謝フラックス分布を予測することは困難であった。特に、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析においては、非標識の基質が混入するために発生する誤差を許容せざるを得ないのが現状である。実際の工業生産の場においては多くの場合、初期増殖速度を高くするために、窒素源や炭素源を含む天然原料由来の栄養素が培地に添加されており、これらの非標識炭素の影響を補正した、より精度の高い代謝フラックス解析法が望まれている。本発明は、解析誤差の少ない、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析法、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析における解析誤差を小さくする方法、前記方法を実行するためのプログラム及び前記プログラムを格納した記録媒体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討を行った結果、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析において、解析誤差を小さくする方法を見出した。すなわち、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する方法において、特定の補正または仮定を行うことが、解析誤差を小さくするのに有効であることを見出した。
【０００６】
より詳しくは、非標識化合物の影響を、細胞タンパク質と細胞内アミノ酸プールとの間でおこる交換反応を考慮した補正を行うことにより、解析誤差を小さくできることを見出した。
【０００７】
また、生育向上などを目的とした非標識化合物の取り込みおよび分解経路を含めた計算式を構築して、それら非標識化合物の各種細胞内物質の同位体分布に与える影響を考慮することにより、解析精度を向上させることができることを見出した。
【０００８】
また、カーボンバランスの計算にあたり、同位体標識基質以外の主要カーボン源である二酸化炭素の取り込みについて検討した結果、細胞が同位体標識基質を消費して発生した二酸化炭素の濃度は非常に高く、培養液中の二酸化炭素分圧は全て細胞が排出した二酸化炭素としてカーボンバランスの算出が行えることを見出した。
【０００９】
さらに、細胞タンパク質加水分解アミノ酸の同位体分布の分析値を用いて代謝フラックスを計算する際に、培地に添加される非標識炭素からなる化合物の細胞タンパク質への取り込みを補正することが有効であることを見出した。
【００１０】
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、その要旨は以下の通りである。
【００１１】
（１）解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに
基づいて、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを決定することを含む、細胞内代謝フラックスの解析方法であって、
下記の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを満たす前記方法。
（ａ）細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれる細胞内代謝物の同位体分布の分析値を含み、細胞内代謝物の同位体分布の分析値は、細胞内代謝物と細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との間の合成と分解の度合いにより補正される。
（ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞への取り込み速度、並びに、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度から細胞構成成分に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
（ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。
【００１２】
（２）（ａ）を満たし、かつ、細胞内代謝物の同位体分布の分析値が、細胞内代謝フラックスモデルを、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含むものとし、細胞の分析値に、細胞内代謝物及び細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含ませることにより補正される（１）記載の方法。
【００１３】
（３）（ａ）を満たし、かつ、細胞内代謝物の同位体分布の分析値が、１）細胞内代謝物の同位体分布と細胞構成成分の分解物の同位体分布を測定する工程、２）工程１）で得られた結果から最適化アルゴリズムを用いて、細胞内代謝物と細胞構成成分との合成と分解との度合いを最適化する工程により補正される（１）記載の方法。
【００１４】
（４）合成と分解の度合いを交換反応係数で定義される変数として表現する（３）記載の方法。
【００１５】
（５）最適化アルゴリズムが進化アルゴリズムである（３）又は（４）に記載の方法。
【００１６】
（６）細胞内代謝物がアミノ酸及び／又は有機酸であり、かつ細胞構成成分がタンパク質である（３）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（７）（ａ）を満たし、かつ、細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値が、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞構成成分への取り込みの影響により補正される（２）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
（８）同位体で標識されていない化合物がアミノ酸である（７）記載の方法。
【００１９】
（９）（ｂ）を満たし、かつ、同位体で標識されていない化合物がアミノ酸である（１）記載の方法。
【００２０】
（１０）アミノ酸がイソロイシンである（９）記載の方法。
【００２１】
（１１）細胞が、有用化合物の生産能を保持する微生物である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（１２）有用化合物がアミノ酸及び／又は有機酸である、（１１）記載の方法。
【００２３】
（１３）培養が回分培養又は流加培養である、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（１４）細胞内代謝物がアミノ酸及び／もしくは有機酸並びに／又はその主要代謝中間体である、（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（１５）同位体分布が質量分析により測定される、（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（１６）解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを記憶する手段、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値を入力する手段、細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段、ならびに、決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、下記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを満たすように、細胞内代謝フラックスモデルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出される前記プログラム。
（ａ）細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれる細胞内代謝物の同位体分布の分析値を含み、細胞内代謝物の同位体分布の分析値は、細胞内代謝物と細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との間の合成と分解の度合いにより補正される。
（ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞への取り込み速度、並びに、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度から細胞構成成分に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
（ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。
【００２７】
（１７）（１６）に記載のプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の効果】
【００２８】
解析誤差の小さい、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析の方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
本発明における細胞内代謝フラックスとは、細胞内の化学反応の化学量論モデルと代謝物間の質量作用則から導かれる細胞内の代謝物の流束（フラックス）である。
【００３１】
本発明における細胞内代謝物とは、細胞内で代謝される物質である。細胞内代謝物については、その生化学反応とともに多くの知見が得られており、データベース化されている（例えば、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）を参照のこと（http://www.genome.ad.jp/kegg/）。
【００３２】
本発明における細胞構成成分とは、細胞を構成する物質であって、細胞内代謝物が取り込まれて生じる物質である。例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質等の物質である。また、細胞構成成分の分解物とは、それに取り込まれる細胞内代謝物と同じレベルの分解物を意味する。例えば、細胞構成成分が、アミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質である場合には分解物はアミノ酸である。本明細書においては、細胞構成成分が、アミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質である場合、特に、それを細胞タンパク質ともいう。また、細胞タンパク質の分解物であるアミノ酸を細胞タンパク質加水分解アミノ酸ともいう。
【００３３】
本発明における解析対象となる細胞としては、どのようなものも対象となるが、とりわけ物質生産に用いられる細胞、例えば、各種培養細胞、カビ、酵母、各種バクテリア等が挙げられる。好ましくは、有用化合物、例えばアミノ酸、核酸、または有機酸を産生する能力を保持する微生物である。アミノ酸、核酸、または有機酸の生産能を保持する微生物としては、例えば、大腸菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌などが好適に用いられる。
【００３４】
本発明における同位体とは、通常には安定同位体であるが、放射性の同位体も同様の目的に使用することが出来る。同位体で標識された基質としては、同位体で標識されたグルコース、より詳しくは一位の炭素が安定同位体で標識されたグルコースおよび／又はすべての炭素が安定同位体で標識されたグルコースが挙げられる。同位体としては、１３Ｃが挙げられる。
【００３５】
本発明における細胞内代謝フラックスモデルは、解析する代謝フラックスに関して構築されたものであれば、特に限定されず、通常の構築方法に従って構築された細胞内代謝フラックスモデルでよい。代謝フラックスに関して構築されるとは、解析する代謝フラックスの反応（反応経路）が、構築された細胞内代謝フラックスモデルに含まれることを意味する。
【００３６】
代謝フラックスに関する細胞内代謝フラックスモデルの構築方法の例としては、Metabolic Engineering 3, 265-283, 2001（非特許文献１）、Wiechert, W. and de Graaf, A. A. Biotechnology and Bioengineering 55,101-117, 1997（非特許文献２）、Metabolic Engineering 3, 195-205, 2001（非特許文献９）、Metabolic Engineering 3, 173-191, 2001、Biotechnology and Bioengineering 55,831-840,等の方法が挙げられる。
【００３７】
代謝フラックスを解析する反応経路としては、細胞内主要代謝経路であればいずれでもよいが、とりわけ、解糖系、TCA回路、ペントースリン酸経路、各種アミノ酸合成固有経路については微生物醗酵による有用化合物生産の実用性から重要であることから、これらを含めることが好ましい。
【００３８】
細胞内代謝フラックスモデルの構築においては、分岐のない一連の反応を一つの反応として扱う、代謝速度の速い反応により変換される反応前後の代謝物を一つの代謝物として扱うなど、反応経路の簡略化を行ってもよい。
【００３９】
細胞の分析値とは、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の測定可能な分析値であり、例えば、代謝物における同位体分布の分析値の他、菌体生成速度、有用物質生産速度などが挙げられる。同位体分布の分析値は、同位体分布を反映する分析値であればよく、例えば、アイソトポマー分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 55,831-840）、質量分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 62,739-750）などが挙げられる。質量分析で測定できる点では、質量分布ベクトルが好ましい。
【００４０】
炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する工程は、通常に用いられる決定方法に従って決定することができる。分析値が同位体分布の分析値を含む場合には、通常には、アイソトポマーのバランス式を用いて決定が行われる（例えば、Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999（非特許文献４）参照）。
【００４１】
細胞の分析値が、代謝フラックスモデルにおける変数を計算する（代謝フラックスモデルが化学量論行列で表されるときには解を得る）のに十分な場合には、細胞の分析値に基づき代謝フラックスモデルにおける変数を決定し、これにより代謝フラックスを決定することができる。細胞の分析値が、代謝フラックスモデルにおける変数を計算するのに十分でない場合には、通常、代謝フラックスモデルにおける同位体分布の他の変数の一部を自由変数として、自由変数、同位体分布の分析値以外の細胞の分析値、および、用いた基質における標識の様式（同位体の位置および数ならびにこれらが異なる複数の基質を用いる場合にはそれら基質の割合）に基づいて代謝フラックスモデルから計算される同位体分布の計算値と、同位体分布の分析値との比較に基づく最適化を行い、代謝フラックスモデルにおける変数を決定し、これにより代謝フラックスを決定することができる。このような最適化の方法の例としては、Metabolic Engineering 3, 265-283, 2001（非特許文献１）、Biotechnology and Bioengineering 55, 118-135, 1997（非特許文献３）、Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999（非特許文献４）等に記載された方法が挙げられる。
【００４２】
炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞における代謝物の同位体分布の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する工程における、基質の標識の様式は通常の方法により決定することができる（例えば、Biotechnology and Bioengineering
66, 86-103, 1999（非特許文献５）、European Journal of Biochemistry 268, 2441-2455, 2001（非特許文献７）参照）。
【００４３】
本発明の方法は、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを解析する方法において、下記の（ａ）〜（ｃ）の条件の少なくとも一つを満たすことを特徴とする。
【００４４】
（ａ）細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれる細胞内代謝物の同位体分布の分析値を含み、細胞内代謝物の同位体分布の分析値は、細胞内代謝物と細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との間の合成と分解の度合いにより補正される。
【００４５】
（ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞への取り込み速度、並びに、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度から細胞構成成分に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による有用化合物及び／又はその主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
【００４６】
（ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。
【００４７】
以下、各条件について説明する。
（ａ）は、代謝フラックスの計算に際して、細胞内代謝物（例えばアミノ酸）の同位体分布を、細胞生育期に構成された細胞内構成成分（例えば細胞タンパク質）の分解により生成される細胞内代謝物から受ける影響、すなわち、細胞内代謝物プールと細胞内構成成分の分解により生成される細胞内代謝物との交換反応を考慮して補正するものである。補正の方法は、細胞内代謝物の同位体分布の分析値を交換反応に基づき補正したものとしてもよいし、細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませてもよい。細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませる場合には、細胞内代謝フラックスモデルは、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含み、細胞の分析値は、細胞内代謝物及び細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含む。細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませる場合には、細胞内代謝物の同位体分布の分析値の補正値を直接的に使用するものではないが、代謝フラックスモデルに基づいて細胞内代謝フラックスを決定することにより、結果として細胞内代謝物の同位体分布の分析値が補正されたことになる。
【００４８】
細胞内代謝物の同位体分布の補正の方法の具体例としては、細胞内代謝フラックスモデルを、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含むものとし、細胞の分析値に、細胞内代謝物及び細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含ませることが挙げられる。
【００４９】
また、１）細胞内代謝物の同位体分布と細胞構成成分の分解物の同位体分布を測定する工程、２）工程１）で得られた結果から最適化アルゴリズムを用いて、細胞内代謝物と細胞構成成分との合成と分解との度合いを最適化する工程により補正することが挙げられる。この態様においては、合成と分解の度合いを交換反応係数で定義される変数として表現することが好ましい。また、最適化の方法としては、進化アルゴリズム（Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999）等が挙げられるが、進化アルゴリズムが好ましい。この態様では、細胞内代謝物がアミノ酸及び／又は有機酸であり、かつ細胞構成成分がタンパク質であることが好ましい。
【００５０】
細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を用いる態様においては、細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞構成成分への取り込みの影響を考慮して補正することが好ましい。例えば、細胞構成成分がタンパク質である場合には、細胞タンパク質加水分解アミノ酸の同位体分布の分析値を用いて代謝フラックスを計算する際に、培地中の、同位体で標識されていないアミノ酸の細胞タンパク質への取り込みを補正する。
【００５１】
（ｂ）は、培地中に、同位体で標識されていない、細胞内代謝物と同じ化合物が含有されるときに、それらが細胞に取り込まれる速度を分析し、取り込み速度から細胞構成成分に使用される速度を差し引いた残りの速度が分解経路に流れる流束であると仮定して、細胞内の有用化合物及び／又は主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響を補正するものである。補正の方法は、細胞内代謝物の同位体分布の分析値を分解経路に流れる流束に基づき補正したものとしてもよいし、細胞内代謝フラックスモデルに上記流速を含ませてもよい。この態様では、同位体で標識されていない化合物がアミノ酸（好ましくはイソロイシン）であることが好ましい。
【００５２】
本発明において、有用化合物とは、調味料、食品添加剤及び医薬などに有用な化合物を意味し、例としては、アミノ酸、有機酸、核酸が挙げられる。
【００５３】
本発明において、主要代謝中間体とは、代謝フラックス解析モデルに含まれる全ての代謝中間体を意味し、例としては、ピルビン酸、グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、オキサロ酢酸等が挙げられる。
【００５４】
（ｃ）は、培養液中の二酸化炭素分圧は全て細胞が同位体標識基質を消費して排出した二酸化炭素と仮定してカーボンバランスを算出するものである。
【００５５】
本発明では、以上のような条件を満たすことにより補正または仮定が行われる。これにより、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析における解析誤差を小さくすることができる。
【００５６】
本発明においては、細胞が、有用化合物の生産能を保持する微生物であることが好ましい。このような細胞としては、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌が挙げられる。有用化合物はアミノ酸及び／又は有機酸であることが好ましい。
【００５７】
本発明においては、細胞の培養は回分培養又は流加培養であることが好ましい。回分培養とは、特定の栄養素を用いる閉鎖系の培養法であり、流加培養とは、培養系において注入培地に連続的又は間欠的に基質を添加する培養法である。本発明の解析方法は、培養が回分培養又は流加培養である場合に、解析誤差を小さくする効果が大きい。
【００５８】
本発明においては、細胞内代謝物がアミノ酸及び／もしくは有機酸並びに／又はその主要代謝中間体であることが好ましい。
【００５９】
本発明においては、同位体分布を質量分析により測定することが好ましい。
【００６０】
本発明は、本発明の解析方法を実施するためのプログラムも提供する。本発明のプログラムは、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを記憶する手段、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値を入力する手段、細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段、ならびに、決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、上記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを満たすように、細胞内代謝フラックスモデルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出されることを特徴とする。
【００６１】
また、本発明の別の態様は上記プログラムを記録したことを特徴とするコンピューター読み取り可能な記録媒体に関する。
【００６２】
解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデル、および、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値については本発明の解析方法に関し説明した通りである。細胞内代謝フラックスモデルは、通常には、細胞内代謝フラックスモデルの表現に通常に使用されるデータの形式で記憶される。例えば、代謝フラックスモデルが化学量論行列で表されるときには、モデルのデータは行列として記憶される。分析値を入力する手段は、記憶媒体からまたは伝送媒体を介して転送する手段を包含する。
【００６３】
細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段は、本発明の解析方法に関して説明した決定の工程を行うのに適した手段であればよい。
【００６４】
決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段は、記憶媒体へまたは伝送媒体を介して転送する手段を包含する。細胞内代謝フラックスの出力は、代謝フラックスモデルが構築された代謝ネットワークを図で示し、図中の代謝ネットワークの各反応に対応する位置
にフラックスの値を表示するものであってもよい。
【００６５】
本発明のプログラムのフローチャートを図８に示す。上記（ａ）〜（ｃ）およびそれらの好ましい態様については、本発明の解析方法について説明した通りであり、これらを満たすように、細胞内代謝フラックスモデルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出されるようにする他は、通常のプログラム化の方法に従って本発明のプログラムを作成することができる。
【００６６】
本発明のプログラムが記録される記録媒体は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ等の任意のリムーバブル物理媒体や、各種コンピュータシステムに内蔵されるＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の任意の固定物理媒体、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
【００６７】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。実施例では、以下に示す菌株および培地を使用した。
【００６８】
（１）大腸菌株とプラスミド
菌株：WYK050（Escherichia coli野生株W3110のS(2-aminoethyl)cysteine耐性かつリジン分解系遺伝子ldc及びcadA遺伝子欠損株（Kikuchi, Y. et al. J. Bacteriol. 179, 4486-4492, 1997））。
プラスミド：pCAB1（ベクターRSF1010にE. coli由来lysC、dapA、dapB 遺伝子を搭載）。
培養には、WYK050にpCAB1を導入した菌株を使用した。
【００６９】
（２）培地
LB寒天培地：1.0％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキストラクト、1％NaCl、1.5％寒天。必要に応じてストレプトマイシンを20μg/ml添加した。
主培養培地：硫酸アンモニウム 16g/L、リン酸二水素一カリウム 3g/L、酵母抽出物 4g/L、硫酸鉄七水和物 10mg/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、イソロイシン 400mg/L、グルコース 40g/L、硫酸マグネシウム七水和物 1g/L。pHは、水酸化カリウムで7.0に調整した。必要に応じてストレプトマイシンを20μg/ml添加した。主培養培地は大腸菌の液体培養に使用した。
流加溶液：グルコース 500g/L、硫酸アンモニウム 80g/L
【実施例１】
【００７０】
（１）代謝フラックス解析モデルの構築
細胞内代謝中間体の擬定常状態を仮定して、代謝フラックスを計算する化学量論式を構築した(Savinell and Palsson, Journal of Theoretical Biology 154, 421-454, 1992; Vallino and Stephanopoulos, Biotechnology and Bioengineering 41, 633-646, 1993)。このモデルに含まれる反応式は、第２表に示した通りであり、各略号の説明については第１表に記載する。分岐のないいくつかの反応は、式を単純化するため一つにまとめた。ペントースリン酸経路は複雑なため、２つの式にまとめて表記した。バイオマスの構成比率については以前報告されているデータを使用した(Neidhardt et al., Physiology of the Bacterial Cell, 1990)。また、細胞内タンパク質のアミノ酸の構成比は、実際に細胞内タンパク質を加水分解して得たアミノ酸の濃度比より求めた。このモデルの化学量論行列は自由度が８であり、解を得るためには、糖消費速度のほかに７つのフラックスを決めなければならない。７つのフリーフラックスとして、次のものを定義した。菌体生成速度、リジン生産速度、酢酸生成速度、蟻酸生成速度、ICLフラックス、G6PDHフラックス、リンゴ酸酵素(Malic Enzyme)フラックスである。菌体生成速度および各種生成速度について
は、培養実験より結果を得た。そして、残りの３つのフラックスについては、アミノ酸などの同位体分布の測定値を元に最適化アルゴリズムにより決定した(後述)。また、構築したモデルは１４の可逆反応を含む。その可逆性は、０から１の数値を取りうる交換係数として定義した(Dauner et al., Biotechnology and Bioengineering 76, 144-156, 2001; Wiechert and de Graaf, Biotechnology and Bioengineering 55, 101-117, 1997)。これらの交換係数もまた、先の３つのフリーフラックスと同様に同位体分布の測定値を元に決定する変数である。解糖系、ペントースリン酸経路、TCAサイクルの隣り合う反応の可逆性は簡単のため等しいと仮定した。感度分析の結果、第２表の反応リスト中の反応９，２９，３０については、同位体分布に影響をほとんど与えないことが明らかとなったため、０と仮定した。以上より、交換係数を決定しなければならない可逆反応は６つとなった。
【００７１】
モデル内のすべての物質のIDV(Isotopomer Distribution Vector)を計算するために、フリーフラックスと交換係数および基質のアイソトポマー分布の関数としてアイソトポマーバランス式を構築した。IDVという列ベクトルは、アイソトポマーの割合を表し、要素の合計は１となるものである(Schmidt et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997; Wittmann and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999)。アイソトポマーバランス式は、Schmitらにより詳細に説明されているアイソトポマーマッピングマトリックス（IMM）を用いて記述されている(Schmidt, et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997)。アトムマッピングマトリックス（AMM）は、反応物から生成物への炭素原子の移動を表記した行列で、これを元に、数値計算ソフトであるMATLAB(The MathWorks, Natick, MA)を用いて、反応物から生成物へのアイソトポマーの移動を表記する行列であるアイソトポマーマッピングマトリックス（IMM）を計算する。
【００７２】
アイソトポマーのバランス式は、フリーフラックスと交換係数を入力としてGause-Seidelの繰り返し法を用いて解くことができる。
【００７３】
グルコースの消費に加えて、微生物細胞は二酸化炭素を取り込み、生育の途中で酢酸を消費する。二酸化炭素は、同位体標識グルコースの代謝からも発生するため何割かは13C-二酸化炭素である。この割合は、二酸化炭素を発生するすべての反応を考慮した二酸化炭素のバランス式により計算された。正確な値は細胞内代謝フラックス分布に依存して異なるが、概して32%程度であった。この計算をするにあたり、大気中からの二酸化炭素を消費することはないと仮定した。なぜならば、細胞が同位体標識グルコースを消費して発生した二酸化炭素の濃度は非常に高く（実験では、排出二酸化炭素の濃度は、４〜５％に及んだ）、発酵槽中の二酸化炭素分圧はすべて細胞が排出した二酸化炭素と考えて差し支えないからである。
【００７４】
マススペクトロメトリーによる分析から各物質すべてのアイソトポマー分布を求めることはできないが、質量の分布は求めることができる。この情報は、質量分布ベクトル（MDV）として表すこととし、各要素は同じ質量からなるアイソトポマーを含んでいる（Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999）。従って、炭素数nの物質には、MDVの要素数はn+1個存在することとなる。MDVは、IDVから同じ質量の要素を合計して計算することができる。こうして計算されたMDVは、実験よりもとめたMDVと比較することにより、モデルの結果がどれだけ実験値とあっているかを評価することができる。
【００７５】
【表１−１】
0004742528.tif 000002
【００７６】
【表１−２】
0004742528.tif 000003
【００７７】
【表２−１】
0004742528.tif 000004
【００７８】
【表２−２】
0004742528.tif 000005
【００７９】
（２）天然に存在する炭素、水素、窒素、酸素、各原子の同位体を補正
実験により求めたMDVは、天然に存在する2H (0.01%)、15N (0.37%)、17O (0.04%) 、18O (0.20%)の補正を行ってから計算した。計算式は、以下の通りである。
【００８０】
【数１】
0004742528.tif 000006
【００８１】
炭素の自然同位体補正は、入力値として利用するグルコースのIDVの中に組み込んだため、上記の式には含まれていない。
【００８２】
（３）初発培地中に含有される非ラベルアミノ酸の補正
工業生産では初期増殖速度を高くするために、窒素源や炭素源を含む天然由来の栄養素が培地に添加される。モデルにより計算されたＭＤＶと実験から求めたＭＤＶを比較するときに、天然成分由来の非ラベル炭素の影響を補正する必要がある。細胞内アミノ酸（遊離アミノ酸）の分析とたんぱく質加水分解アミノ酸の分析とでそれぞれ異なった補正方法を採用した。サンプル取得時に残存しているアミノ酸（この場合は、イソロイシン）を除いてすべてのアミノ酸は、直接細胞内アミノ酸プールに取り込まれて代謝されないと仮定した。つまりそれらは直接たんぱく質の構成要素になったと仮定した。残存しているアミノ酸については、実験から取り込み速度を計算し、タンパク質に取り込まれる割合以上に細胞に取り込んでいるため、過剰分については代謝により分解されたとしてモデルに組み込み、その分解速度は、細胞取り込み速度から計算して特定した。
【００８３】
培養の初期、約12時間程度までは培地由来の非ラベルアミノ酸の取り込みがあり、それらは基質であるグルコースを菌が代謝して生成する細胞内アミノ酸プールと混ざる。細胞タンパク質は、これらのプールを元に構成されるので非ラベルアミノ酸を含んでいる。最初のサンプル取得時、すでに培地中の非ラベルアミノ酸は完全に消費されていたので、すなわち取り込み速度はゼロであるので化学量論行列とアイソトポマーバランス式には組み込まなかった。細胞内プールの交換が非常に遅くなければ、最初のサンプルの細胞内アミノ酸には培地由来の非ラベルアミノ酸は含まれていないはずであるが、実際にはそれらは含有されており、細胞内たんぱく質と細胞内アミノ酸プールとの間で常に交換反応が起こっていることが示唆された。この点を考慮するために細胞内アミノ酸分析データを解析す
るモデルには、この交換反応を表す係数Pexを導入した。Pexは、細胞たんぱく質から細胞内アミノ酸プールに戻る割合を表す係数で、リジンを除いてすべてのアミノ酸で同じ割合であると仮定した。
【００８４】
たんぱく質加水分解アミノ酸のMDVは、培養のはじめからたんぱく質に組み込まれたアミノ酸すべてを表すので、培地由来のアミノ酸の割合が細胞内アミノ酸中のそれらの割合よりも高い。全たんぱく量と比べて細胞内アミノ酸の濃度が非常に少ないと仮定すると、培養初期に消費された培地由来の非ラベルアミノ酸はすべて細胞タンパク質に組み込まれたと考えて差し支えない。
【００８５】
（４）代謝フラックス最適化
アイソトポマーのバランス式を用いてフリーフラックスと交換反応のフラックスを入力値としてMDVを計算し、実験で得たMDVとの差の2乗和が最小となるように先に入力したフリーフラックスと交換反応のフラックスの値を進化的アルゴリズム(Stephani et al, Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999)により最適化するというプログラムを構築した。最適化対象の変数は、ICL、Malic Enzyme、ペントースリン酸経路（G6PDH）のフラックスと、6つの交換反応の値、そして、タンパク質と細胞内アミノ酸プールとの交換反応を表すPexである。菌体収率、リジン収率については、入力値に対して20%のずれを許容するように設定した。これは、実験の際の測定誤差を加味するためである。タンパク質加水分解アミノ酸データと細胞内アミノ酸データはそれぞれ別々に解析した。
【００８６】
計算時間を短縮するために、一般的な進化的アルゴリズムに対していくつかの変更を加えた。種々検討した結果、解の空間内で最小値を探索するには要素数が50000、世代数が200という設定が最適であることがわかったので、解析にはそれらの設定値を用いた。
【００８７】
（５）感度分析
フリーフラックスの信頼区間は、各測定値の分散だけでなくヤコビアン行列にも依存する。ヤコビアン行列とは、最適値付近でフリーフラックスが変化したときの各IDVの変化しやすさを表現するものである。各アミノ酸測定値の分散は3回の分析値から求めた。これらを元に、Wiechertらの方法に従って感度行列を計算した。
【００８８】
培養実験を実施する前に、ラベルグルコースの最適な混合比を見つけるために解析モデルの感度分析を実施した。使用ラベルグルコースは1-13C-GlcとU-13C-Glcに限定して計算した結果、それぞれ50%ずつの混合比が最適であるという結果を得た。今回は、費用の都合もあり、十分な情報を得ることができる80：20の混合比を採用した。
【００８９】
（６）培養実験
LB寒天培地上にWYK050/pCAB1菌株細胞を塗布し、37度で24時間静置培養した。その静置培養プレート2枚の細胞を初発培地に植菌した。培地の構成成分については上記の通りである。培養には1Lジャーファーメンターを使用し、基質には1-13C-GlcとU-13C-Glcを80:20で混合した物を使用した。その混合比は、事前に実施した感度分析により決定した。培養の初発液量は300mlで、温度、pHはそれぞれ37℃、6.7で制御した。pHの制御には、アンモニアガスを使用した。通気は、300ml/minで制御した。培養液の溶存酸素濃度は常に5%以上を維持するように撹拌数を適宜制御した。糖液の流加は、培養17時間に開始した。これは、初糖を完全に消費する直前である。流加速度は、培地の残糖濃度が5g/L以下になるように適宜調節した。発酵サンプルの取得は、増殖期である培養17時間目と定常期である培養26時間目に実施した。それぞれ、細胞内代謝物をシリコンオイル法により抽出した。また、たんぱく質の加水分解アミノ酸を測定するための細胞も同じ時期に取得した。測定は、LC-MS及びCE-MSを使用して行った。
【００９０】
培養した結果の細胞の吸光度（OD）、比増殖速度μ、比糖消費速度ν、比リジン生産速度ρ、酸素吸収速度rabそして呼吸商RQを図２に示す。
培地中のアミノ酸濃度の経時変化を図３Ａ及び３Ｂに示す。酵母抽出物由来のアミノ酸はほとんど培養15時間までの間に完全に消費された。培養20時間付近に、イソロイシンが完全に消費された後、酸素吸収速度rabの上昇は停止し、μ、νも低下した。この前後、すなわち増殖期と定常期の代謝フラックス分布の違いを明確化するために、代謝フラックス解析を実施した。
最終的な発酵成績を第３表に示す。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
（７）代謝フラックス解析
＜タンパク質加水分解アミノ酸データを使用した代謝フラックス解析＞
細胞内たんぱく質加水分解アミノ酸をLC-MSで分析した結果、次のアミノ酸の同位体比率のデータを得た。グリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、メチオニンである。プロリンについては、増殖期のデータは他の分析値と比べて信頼性が低かったため使用せず、定常期のデータのみを使用した。
【００９３】
炭素以外の天然同位体の影響を補正した後、実験結果から各アミノ酸のIDVを計算した。細胞たんぱく質は、培養開始からサンプル取得までに生合成されたアミノ酸を含んでいるので、細胞たんぱく質加水分解から得られる解析データはこの区間の平均値となっていると思われる。従って、17時間で取得したデータの解析にはこの区間の平均値である次の数値を使用した。収率0.379g DCW/10 mmol グルコース、リジン収率2.82 mmol/10 mmol グルコース、酢酸取り込み速度 0.47 mmol/10 mmol グルコース。アイソトポマーバランスを計算したところ、計算により予測されたMDVと比べて実験結果のMDVは全体的に質量が軽い同位体の比率が高い傾向が見られた。これは、天然栄養源である酵母抽出物由来の非ラベルアミノ酸の影響であると考え、前述した方法で補正をすることとした。ここで述べている非ラベルアミノ酸とは、100%12Cからなるという意味ではなく、天然で存在する13Cの割合は含んでいることを意味する。
【００９４】
タンパク質加水分解アミノ酸のデータを用いたフリーフラックスの最適化は、数回実施したがどれもほぼ同様の結果を得た。進化的アルゴリズムによる最適化では、50000の要素数で世代数は200で計算した。第４表に実験結果のMDVと計算されたMDVを示した。この計算では実験と計算の誤差の和は21.19となった。最適化されたフリーフラックスの値は、第５表に示した。すべての代謝フラックス分布については、図４に示した。図４および図５に示されている代謝フラックス分布にはエネルギー代謝の反応も含まれている。エネ
ルギー代謝の反応については、炭素の移動を元に計算された結果から化学量論行列を用いて再計算して求めた。まとめると消費されたグルコースの16%はペントースリン酸経路へと流れ、このフラックスはリジンや細胞を生成するのに十分でないため、トランスヒドロゲナーゼを用いたNADHからNADPHの変換反応のフラックスが大きな値を示した。さらに、この解析では、ICL及びMalic Enzymeによるフラックスがゼロであった。可逆性が大きかった反応は、解糖系とペントースリン酸経路の反応であった。
【００９５】
定常期のタンパク質加水分解アミノ酸の分析データを用いて同様の分析を行ったが、先に述べた通り、この分析データは培養の開始時点からの情報を含んでいるために、増殖期と大差のない結果となった。図６および図７に結果を示す。
【００９６】
【表４−１】
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【００９７】
【表４−２】
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【００９８】
【表４−３】
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【００９９】
【表５】
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【０１００】
＜細胞内アミノ酸の分析データを使用した代謝フラックス解析＞
細胞内のアミノ酸をLC-MSで分析して、次に示すアミノ酸のMDVを得た。グリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、フェニルアラニン、チロシンである。解析モデルへの入力データは、サンプルを取得した時点のものを使用した。収率0.272g DCW/10 mmol グルコース、リジン収率3.30 mmol/10 mmol グルコース、酢酸取り込み速度 0 mmol/10 mmol グルコースというデータである。細胞内分析データは、サンプルを取得した瞬間のデータであるため先に示した平均値を表すタンパク質加水分解のデータとは大きく異なる。
【０１０１】
アイソトポマーのバランス式を用いて各アミノ酸のMDVを予測したところ、タンパク質加水分解アミノ酸のデータを用いた時ほどではないが、この場合も実際の実験結果から求めたMDVと比較して質量の軽い同位体の割合が高い傾向が見られた。サンプル取得時には、すでに培地由来の非ラベルアミノ酸は完全に消費されていたが、実験結果はそれらの影響を受けていることを示唆していた。ここで、その影響を加味するために細胞タンパク質の分解による細胞内アミノ酸プールとの交換反応の比率Pexを定義して、数値を最適化するアルゴリズムに変更した。Pexは、すべてのアミノ酸で同じであると仮定した。
【０１０２】
以上のことを踏まえて、進化的アルゴリズムで最適化を行った結果、実験により求めたMDVと計算により求めたMDVの誤差の和は7.57で最小となった。この場合も、進化的アルゴリズムで使用した要素数は50000、世代数は200とした。第５表に実験により求めたMDVと計算により求めたMDVを示す。最適化されたフリーフラックスの値は、第５表に示す。すべての代謝フラックス分布については、図６に示す。タンパク質加水分解アミノ酸データを用いた解析結果との大きな違いは、ICLとG6PDHのフラックスが大きいという点である。
【０１０３】
同様に定常期の細胞内アミノ酸データを用いて解析した結果、実験により求めたMDVと計算により求めたMDVの誤差の和は8.71で最小となった。解析モデルへの入力データは、サンプルを取得した時点のものを使用した。菌体収率0.055g DCW/10 mmol グルコース、リジン収率4.27 mmol/10 mmol グルコース、酢酸排出速度 0.9 mmol/10 mmol グルコースというデータである。
【０１０４】
定常期では増殖期に比べて、ICLのフラックスが３倍近く上昇しており、PEPCのフラックスがゼロとなった点が大きな違いである。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】培地由来の非ラベルアミノ酸の取り込みと細胞内タンパク質と細胞内アミノ酸プールの交換反応の関係を示した図。培養初期（培養12時間程度）では、培地由来の非ラベルアミノ酸を取り込んでいる。増殖期（培養17時間程度）では、酵母エキス由来の非ラベルアミノ酸はすべて消費されているが、増殖促進因子であるイソロイシンは培地中に残存している。その消費速度VIleを測定し、代謝により分解するとした。VYEは、培地から菌へのアミノ酸の取り込みフラックスを示す。Pexは、細胞内タンパク質と細胞内アミノ酸プールの交換反応係数を表す。Pexは、最適化アルゴリズムにより決定される変数である。
【図２】培養の分析値。細胞の吸光度（OD）、比増殖速度μ、比糖消費速度ν、比リジン生産速度ρ、酸素吸収速度rab、呼吸商RQ
【図３Ａ】培地中のアミノ酸および酢酸濃度。(Asp) アスパラギン酸 (Thr) トレオニン (Ser) セリン (Leu) ロイシン (Gly) グリシン (Ala) アラニン (Cys) システイン (Val) バリン (Met) メチオニン
【図３Ｂ】図３Ａの続き。 (Tyr) チロシン (Phe) フェニルアラニン (His) ヒスチジン (Arg) アルギニン (Glu) グルタミン酸 (Ile) イソロイシン (Lys) リジン (AcOH) 酢酸
【図４】タンパク質加水分解アミノ酸の同位体分布測定値から計算した代謝フラックス分布（増殖期：培養開始後17時間）。各数値の単位は、10mmol グルコースに対する各物質の変化量 mmolで表す。
【図５】タンパク質加水分解アミノ酸の同位体分布測定値から計算した代謝フラックス分布（定常期：培養開始後26時間）。各数値の単位は、10mmol グルコースに対する各物質の変化量 mmolで表す。
【図６】細胞内アミノ酸の同位体分布測定値から計算した代謝フラックス分布（増殖期：培養開始後17時間）。各数値の単位は、10mmol グルコースに対する各物質の変化量 mmolで表す。
【図７】細胞内アミノ酸の同位体分布測定値から計算した代謝フラックス分布（定常期：培養開始後26時間）。各数値の単位は、10mmol グルコースに対する各物質の変化量 mmolで表す。
【図８】細胞内代謝フラックスの解析プログラムのフローチャートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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