(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８型脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ８）コード配列の危険性のあるアレル内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検査するための方法であって、
（ａ）前記ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ここで前記２種類のオリゴヌクレオチドプライマーの第一オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８の連続したオリゴヌクレオチドから選ばれ、そして当該２種類のオリゴヌクレオチドプライマーの第二オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：１の連続したヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれ、ここで各プライマーが少なくとも１５個のヌクレオチドを有し；
（ｂ）当該プライマーを伸長させて前記リピート領域を含む所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；
（ｃ）このようにして増幅した前記フラグメントを検出し；そして
（ｄ）この増幅したＤＮＡフラグメントを少なくとも８０組のＣＴＧリピート又は少なくとも９２組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートを含んで成るリピート領域について分析する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記第一オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：５，配列番号：８及び配列番号：４から成る群より選ばれ、そして前記第二オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：６，配列番号：９及び配列番号：１２から成る群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において使用されるキットであって、配列番号：１の連続したヌクレオチド１〜４４８から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号：１の連続したヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含んで成り、ここで各プライマーが少なくとも１５個のヌクレオチドを有する、キット。
【請求項４】
前記分析の段階が、（ＣＴＧ）n リピート（式中、ｎは少なくとも８０である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記分析の段階が、少なくとも９２組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートを含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含む少なくとも一種のＤＮＡ分子の存在を検出するための方法であって：
（ａ）ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメントを得る；
（ｂ）当該ＤＮＡフラグメントを変性させてＤＮＡ分子を得、そしてこのＤＮＡ分子をハイブリダイゼーション条件下で検出可能式にラベルされたプローブでプロービングする、ここで当該プローブはＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡ分子にハイブリダイズする；
（ｃ）前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズした前記プローブを検出する；そして
（ｄ）当該ＤＮＡ分子を正常なＳＣＡ８コード配列又は危険性のある状態のＳＣＡ８コード配列を特徴とするリピート領域について分析する；
ここで、正常な状態のＳＣＡ８コード配列を特徴とするリピート領域は８０組より少ないＣＴＧリピートと９１組以下の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートから成り、及びここで、危険性のある状態のＳＣＡ８コード配列を特徴とするリピート領域は少なくとも８０組のＣＴＧリピート又は少なくとも９２組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートから成ることを含んで成る方法。
【請求項７】
前記プローブが配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８もしくは配列番号：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９、又はそれらの相補体から選ばれ、ここで当該プローブが少なくとも２０個のヌクレオチドを有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが配列番号：１のヌクレオチド１９〜４４９、又はその相補体を含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項９】
請求項６記載の方法において使われるキットであって、配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８もしくは配列番号：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９、又はその相補体から選ばれるプローブを含んで成り、ここで各プローブは少なくとも２０個のヌクレオチドを有するキット。
【請求項１０】
前記分析の段階が、（ＣＴＧ）n リピート（式中、ｎは少なくとも８０である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記分析の段階が、少なくとも９２組の組合せＣＴＧ及びＣＴＡリピートを含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患っているか又はそれを発症する危険性があるか否かを決定するための方法であって、８型脊髄小脳性運動失調症コード配列のリピート領域を分析することを含んで成り、ここで８型脊髄小脳性運動失調症の発症の危険性のない個体は８０組より少ないＣＴＧリピートと９１組以下の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートを含んで成るリピート領域を有し、及びここで８型脊髄小脳性運動失調症の発症の危険性のある個体は少なくとも８０組のＣＴＧリピート又は少なくとも９２組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートを含んで成る、方法。
【請求項１３】
ＳＣＡ８コード配列の危険性のあるアレル内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検出するための方法であって：
（ａ）前記ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の第一オリゴヌクレオチドプライマーペアーで処理する；
（ｂ）当該第一プライマーペアーを伸長させて、前記リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成する；
（ｃ）当該リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントを取り出す；
（ｄ）当該リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントの独立の相補鎖をモル過剰量の第二オリゴヌクレオチドプライマーペアーで処理する；
（ｅ）当該第二プライマーペアーを伸長させて、前記リピート領域を含む第二の所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成する；
（ｆ）このようにして増幅した当該第二の所望のＤＮＡフラグメントを検出する；そして
（ｇ）この増幅したＤＮＡフラグメントをリピート領域について分析し、ここでリピート領域は少なくとも８０組のＣＴＧリピート又は少なくとも９２組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートから成る；
ことを含んで成る方法。
【請求項１４】
前記第一オリゴヌクレオチドプライマーペアーが、配列番号：１の連続したヌクレオチド１〜４４８から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号：１の連続したヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含んで成り、ここで各プライマーが少なくとも１５個のヌクレオチドを有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第一オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：５，配列番号：８及び配列番号：４から成る群より選ばれ、そして前記第二オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：６，配列番号：９及び配列番号：１２から成る群より選ばれる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記第二オリゴヌクレオチドプライマーペアーが配列番号：１の連続したヌクレオチド４４９〜７２５から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号：１の連続したヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含んで成り、ここで各プライマーは少なくとも１５個のヌクレオチドを有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３記載の方法において使われるキットであって、配列番号：１の連続したヌクレオチド１〜４４８から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマーと配列番号：１の連続したヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含んで成る第一オリゴヌクレオチドプライマーペアー、及び配列番号：１の連続したヌクレオチド４４９〜７２５から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマーと配列番号：１の連続したヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含んで成る第二オリゴヌクレオチドプライマーペアーを含んで成り、ここで各プライマーは少なくとも１５個のヌクレオチドを有する、キット。
【請求項１８】
前記第二オリゴヌクレオチドプライマーペアーが３組のＣＴＧリピートが後続する３組のＣＴＡリピートを有する第一オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含んでなる第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含んで成る、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
前記分析段階が（ＣＴＧ）n リピート（式中、ｎは少なくとも８０である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
染色体１３の長腕内に位置する８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む核酸分子及び当該核酸分子の相補体であり、ここで前記核酸がＤＮＡを含んで成り、且つ前記ｃＤＮＡが配列番号：２を含んで成る、核酸分子。
【請求項２１】
染色体１３の長腕内に位置する８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む核酸分子及び当該核酸分子の相補体であり、ここで前記核酸がＤＮＡを含んで成り、且つ前記ｃＤＮＡが配列番号：３を含んで成る、核酸分子。
【請求項２２】
染色体１３の長腕内に位置する８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む核酸分子及び当該核酸分子の相補体であり、ここで前記核酸が配列番号：１を含んで成る、核酸分子。
【請求項２３】
配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成る核酸分子又はその相補体。
【請求項２４】
配列番号：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９を含んで成る核酸分子又はその相補体。
【請求項２５】
染色体１３の長腕内に位置する８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む核酸分子及び当該核酸分子の相補体であり、ここで前記ＳＣＡ８コード配列が、リピート領域の後続する配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成る、核酸分子。
【請求項２６】
染色体１３の長腕内に位置する８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む核酸分子及び当該核酸分子の相補体であり、ここで前記ＳＣＡ８コード配列が、リピート領域の先行する配列番号：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９を含んで成る、核酸分子。
【請求項２７】
ベクターの中に配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成る核酸分子。
【請求項２８】
配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８及びリピート領域を含んで成る核酸分子、又はその相補体。
【請求項２９】
配列番号：１のヌクレオチド１〜４４８由来の少なくとも連続した１５個のヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチド、又はその相補ヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９由来の少なくとも連続した１５個のヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチド、又はその相補ヌクレオチド。
【請求項３１】
異種ベクター配列に作用可能式を連結された配列番号：１のヌクレオチドを含んで成る組換ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野及び従来の技術】
運動失調症（ａｔａｘｉａ）は小脳、脳幹及び脊髄小脳管を多様に冒す神経変性病の臨床的且つ遺伝学的に不均質なグループである。いく例かの運動失調症及びその他の神経学的疾患にとってトリヌクレオチドリピートの拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）がその突然変異機構の原因であることが示されている。これらの病気に関係する病理の原因となる基礎的な分子機構は３つの広いカテゴリーに属する。第一に、トリプレットリピート疾患の最大のグループはポリグルタミントラクトに翻訳されるＣＡＧ拡張に関係するものである。ポリグルタミン拡張により惹起される病気には脊髄及び延髄筋萎縮、ハンチングトン病、並びに５種類の形態の優性遺伝脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ）が挙げられる。第二グループはぜい弱性Ｘ精神遅退を惹起する５’ＣＣＧ拡張及びフリードリッヒ運動失調症の原因となるイントロンＧＡＡ拡張を包含する。これらは共に対応のタンパク質生成物の発現の低下をもたらす。最後に、第三のグループは筋緊張性ジストロフィー−タンパク質キナーゼコード配列の３’未翻訳領域内の拡張ＣＴＧリピートを包含する。このリピートは筋緊張性ジストロフィーを惹起するが、どのようにしてこの突然変異が分子レベル効果を発揮するかは解明されていない。
【０００２】
運動失調症は優性もしくは劣性遺伝であるか、又は家系病歴なしで現れることがありうる。成人発症性優性脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ）のうち、７種類の遺伝子座がマッピングされている (S. GispertらNature Genet., 4, 295-299 (1993) ; Y. TakiyamaらNature Genet., 4, 300-304 (1993) ; K. Gardner らNeurology, 44, A361 (1994) ; S. Nagafuchi らNature Genet., 6, 14-18 (1994) ; L. P. W. Ranum らNature Genet., 8, 280-284 (1994) ; A. Benomar らNature Genet., 10, 84-88 (1995) ; L. G. GouwらNature Genet., 10, 89-93 (1995) ; O. ZhuchenkoらNature Genet., 15, 62-69 (1997))。優性運動失調症の約６０％がＳＣＡ１，２，３，６又は７遺伝子座のトリヌクレオチドＣＡＧリピートにおける拡張に由来する (S. NagafuchiらNature Genet., 6, 14-18 (1994) ; O. Zhuchenko らNature Genet., 15, 62-69 (1997) ; H. T. Orr らNature Genet., 4, 211-226 (1993) ; Y. Kawaguchi らNature Genet., 8, 221-228 (1994) ; R. Koide らNature Genet., 6, 9-13 (1994) ; G. Imbert らNature Genet., 14, 285-291 (1996) ; S. -M. PulstらNature Genet., 14, 269-276 (1996) ; K. Sanpei らNature Genet., 14, 277-284 (1996) ; G. DavidらNature Genet., 17, 65-70 (1997) ; M. D. KoobらNature Genet., 18, 72-75 (1988))。残り４０％の遺伝子的に特定されていない優性家系間での実質的な臨床変動は、数多くの他の運動失調症コード配列が同定されずに残っていることを示唆する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
運動失調症コード配列の同定はかかる病気を患う個体の診断のための改善された方法を提供でき、そして運動失調症の出生前／発症前診断又はより良い分類の可能性を高める。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
運動失調症の症状を示す個体が脊髄小脳性運動失調症を患っているか否かを決定するために、その個体において存在するＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ６又はＳＣＡ７コード配列のＣＡＧリピートの数を決定することができる。これと同じタイプの検査を、個人が将来において脊髄小脳性運動失調症の症状を発症しうるかの発症前同定のために利用できうる。一般に、特定のＳＣＡコード配列におけるＣＡＧリピートの概ね多い数は個体が脊髄小脳性運動失調症を患っているか、又は将来において脊髄小脳性運動失調症の症状を発症しうるかどうかを示唆する。脊髄小脳性運動失調症の指標であるＣＡＧリピートの数はＳＣＡのタイプによって一般に異なる。既知のタイプのＳＣＡのこのようなコード配列それぞれは中断のないグルタミンアミノ酸トラクト（ポリグルタミントラクト）を含むポリペプチドをコードする。しかしながら、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ６及びＳＣＡ７コード配列が原因となる優性運動失調症は約６０％にすぎない。
【０００５】
８番目の脊髄小脳性運動失調症、８型脊髄小脳性運動失調症のコード配列が同定及び単離された。このコード配列をＳＣＡ８と称する。驚くべきことに、ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ６及びＳＣＡ７コード配列によりコードされるｍＲＮＡはリピートを含み、そしてタンパク質へと翻訳されるが、ＳＣＡ８コード配列によりコードされるｍＲＮＡはリーディングクレーム全てにおいて停止コドンを有するリピートを含む。その結果、翻訳されるようなタンパク質は同定されていない。ＳＣＡ８コード配列の単離は脊髄小脳性運動失調症の更なるタイプ、即ち、８型脊髄小脳性運動失調症の診断を可能にする。
【０００６】
ＳＣＡ８コード配列は多形性ＣＴＡリピート及びＣＴＧリピートを含む。この２種類のリピートは約１．２kbのフラグメント内に位置し、一般にその候補領域の制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化により生成される。一般に、ＣＴＡリピートは不安定であり、そして異なる家系の個体間で変動するが、典型的にはリピート領域内のＣＴＡリピートの数は一家系内の個体間で変わらない。ＣＴＧリピートは不安定であり、そして典型的には８型脊髄小脳性運動失調症を有する個体間又は８型脊髄小脳性運動失調症の発症のおそれのある者の間で変わる（即ち、拡張しているか又は収縮している）。かかるＣＴＧリピートの数の変動は異なる家系の個体間及び一の家系内の個体間（即ち、一の世代と次の世代との間、及び同胞間）の双方で起こりうる。例えば、これらのリピートを含む領域のＰＣＲ分析は、改変したリピートのサイズと、少なくとも一つの８型脊髄小脳性運動失調症の症状を示す危険率との間での相関を実証する。このような結果はＳＣＡ８が、例えばＳＣＡ１、ぜい弱性Ｘ症候群、筋緊縮性ジストロフィー、Ｘ−連鎖型脊髄延髄筋萎縮及びハンチング病に関連する遺伝性運動失調症と同様に、少なくとも一組の不安定なトリヌクレオチドリピートの拡張を包含する突然変異機構を示す。
【０００７】
本発明は単離した８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む単離された核酸分子（当該コード配列は染色体１３の長腕内に位置する）及び当該核酸分子の相補体を提供する。好ましくは、この核酸はＤＮＡであり、そしてそれはゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。一定の態様において、ＳＣＡ８コード配列はリピート領域が後続するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成る。別の態様において、このＳＣＡ８コード配列はリピート領域が先行するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９を含んで成る。かかる核酸分子の例はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されている。
【０００８】
好適な態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１〜４４８を含んで成る単離された核酸分子及びそれに対する相補体を提供する。別の好適な態様はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成り、そして更にはリピート領域を含んで成る単離された核酸分子、及びその相補体を含む。更なる別の好適な態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の７２６〜１，１５９を含んで成る単離された核酸分子及びその相補体である。かかる分子は必要ならベクターに組込まれていてよい。
【０００９】
本発明はプローブ及び／又はプライマーとして利用できる単離されたオリゴヌクレオチドも提供する。一の態様において、この単離されたオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８に由来する少なくとも１５個のヌクレオチド及びその相補性ヌクレオチドを含む。別の態様において、この単離されたオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９由来の少なくとも１５個のヌクレオチド含んで成り、その相補性ヌクレオチドも含まれる。
【００１０】
別の態様において、本発明は単離されたＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含む核酸分子にハイブリダイズする単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。かかるオリゴヌクレオチドは少なくとも約１１個のヌクレオチドを含む。更なる別の態様において、本発明は異種ベクター配列に作用可能式に連結されたＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドを含んで成る単離された組換ベクターを提供する。
【００１１】
本発明は更に方法を提供する。一の態様において、本発明はＳＣＡ８コード配列の危険性を有するアレル内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検出するための方法を提供し、この方法は当該ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の２種類のオリゴヌクレオチドで処理し；当該プライマーを伸長させて前記リピート領域を含む所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；そしてＣＴＧリピートを含んで成るリピート領域についてこの増幅したＤＮＡフラグメントを分析する；ことを含んで成る。好ましくは、この２種類のオリゴヌクレオチドプライマーの第一オリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれ、そしてこの２種類のオリゴヌクレオチドプライマーの第二のオリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれ、ここで各プライマーは少なくとも１１個のヌクレオチドを有するものとする。より好ましくは、この第一オリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４から成る群より選ばれ、そしてこの第二オリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２から成る群より選ばれる。この方法は、個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患うか、又はそれを発症するおそれがあるかを決定するためのキットを利用して実施してよく、かかるキットも本発明により提供される。かかるキットは上記のプライマーを含む。好ましくは、この分析段階は（ＣＴＧ）n リピート（ここでｎは少なくとも約８０である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る。より好ましくは、この分析段階は組合せ（（ＣＴＧ）／（ＣＴＡ））n リピート（ＣＴＧとＣＴＡリピートの合計）（ここでｎは少なくとも約９２である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る。
【００１２】
本発明はＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含む少なくとも一のＤＮＡ分子の存在を検出するための別の方法を提供する。この方法は：ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメントを得；このＤＮＡフラグメントを変性させてＤＮＡ分子にし、そしてそのＤＮＡ分子をハイブリダイゼーション条件下で、単離されたＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡ分子にハイブリダイズする検出可能ラベル化プローブでプロービングし；当該ＤＮＡ分子にハイブリダイズしたプローブを検出し；そして当該ＤＮＡ分子を正常又は危険状態にあるＳＣＡ８コード配列の特徴的なリピート領域について分析する；ことを包括する。好ましくは、このプローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれるか、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９又はその相補体から選ばれ、ここでこのプローブは少なくとも２０個のヌクレオチドを有する。別の態様において、このプローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１９〜４４９又はその相補体を含んで成る。この方法は、個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患うか又はその発症のおそれがあるかを検査するためのキットで実施してよく、かかるキットも本発明により提供される。このキットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれるプローブ又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９又はその相補体から選ばれるプローブを含む。ここで各プローブは少なくとも２０個のヌクレオチドを有する。好ましくは、この方法において、分析段階は（ＣＴＧ）n リピート（ここでｎは少なくとも約８０である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る。より好ましくは、この分析段階は組合せ（（ＣＴＧ）／（ＣＴＡ））n リピート（ここでｎは少なくとも約９２である）を含んで成るリピート領域を分析することを含んで成る。
【００１３】
個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患う又はその発症の危険性があるかを決定するための別の方法は８型脊髄小脳性運動失調症のリピート領域を分析することを包含し、ここで８型脊髄小脳性運動失調症を発症する危険性のない者は当該リピート領域の中に８０未満のＣＴＧリピートしか有さない。
【００１４】
本発明の更なる別の方法はＳＣＡ８コード配列の危険性のあるアレル内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検出するための方法である。この方法は：ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の第一オリゴヌクレオチドプライマーペアーで処理し；この第一プライマーペアーを伸長させて前記リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；当該リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントを取り出し；当該リピート領域を含むこの第一の所望のＤＮＡフラグメントの独立の相補鎖をモル過剰量の第二のオリゴヌクレオチドプライマーペアーで処理し、この第二のプライマーペアーを伸長させて当該リピート領域を含む第二の所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；このようにして増幅させた第二の所望のＤＮＡフラグメントを検出し；そしてこの増幅したＤＮＡフラグメントをリピート領域について分析する；ことを含む。好ましくは、この第一のオリゴヌクレオチドプライマーペアーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含んで成り、ここで各プライマーは少なくとも１１個のヌクレオチドを有する。より好ましくは、この第一のオリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４から成る群より選ばれ、そしてこの第二のオリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２から成る群より選ばれる。好ましくは、この第二オリゴヌクレオチドプライマーペアーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド４４９〜７２５から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含んで成り、ここで各プライマーは少なくとも１１個のヌクレオチドを有する。より好ましくは、この第二オリゴヌクレオチドプライマーペアーは、３組のＣＴＧリピートが後続する３組のＣＴＡリピートを有する第一オリゴヌクレオチドプライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る。これらのプライマー含むかかる方法を実施するためのキットも提供する。
【００１５】
定義
本明細書で用いる「コード配列」及び「コード領域」とは、適当な調節配列のコントロール下に置かれたときにポリペプチドへと翻訳されうる又はされないｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、コード配列の発現は当該コード配列により発現されるｍＲＮＡのレベルをアッセイすることにより決定する。
【００１６】
本明細書で用いる「リピート領域」及び「トリヌクレオチドリピート領域」とは、典型的に一組のトリヌクレオチド、好ましくはトリヌクレオチドＣＴＧ（即ち、ＣＴＧリピート）及び一組のトリヌクレオチドＣＴＡ（即ち、ＣＴＡリピート）を含むＳＣＡ８コード配列の領域を意味する。このＳＣＡ８コード配列によりコードされるｍＲＮＡのリピート領域は典型的には一組のＣＵＡリピート及び一組のＣＵＧリピートを含む。このリピート領域のＣＴＧリピートは、トリヌクレオチドＣＴＧ以外のヌクレオチド、特にトリヌクレオチド又はその多量体を含んでよい。
【００１７】
本明細書で用いる８型脊髄小脳性運動失調症の症状には、軽い呼吸及び歩行不安定性、緊張温度及び失調性搆音障害、眼振、四肢及び歩行失調、四肢痙性及び振動知覚の低下が挙げられる。重篤な個体は歩行不能となりはじめることがある。
【００１８】
本明細書で用いるＳＣＡ８の「アレル」とは、染色体１３の長腕上に位置するＳＣＡ８コード配列の位置を占めているヌクレオチド配列のいくつかの異なる形態の一つを意味する。染色体１３の長腕上のＳＣＡ８コード配列の位置はＳＣＡ８座と呼ぶ。
【００１９】
本明細書で用いる「危険性にある」とは、８型脊髄小脳性運動失調症に関連するＳＣＡ８コード配列のアレルを有する個体を意味する。ここでは、これは脊髄小脳性運動失調症の少なくとも一の症状を示しうる個体、及び将来において脊髄小脳性運動失調症の少なくとも一の症状を発症しうる個体を含む。８型脊髄小脳性運動失調症に関連するＳＣＡ８コード配列のアレルを本明細書では「危険性のある」アレルと呼んでいる。ＳＣＡ８の危険性のあるアレルを有する個体はその寿命の間に少なくとも一の８型脊髄小脳性運動失調症もの症状を示しうる。ＳＣＡ８の「正常」なアレルを有する個体は生きている間に８型脊髄小脳性運動失調症の症状を示さないであろう。個体が危険性にあるかどうかの検試はＳＣＡ８コード配列のリピート領域の中のトリヌクレオチドリピートの数に一般に依存する。
【００２０】
本明細書で用いる「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドが標準の条件下で標的ＤＮＡ分子と非共有相互作用を形成することを意味する。標準のハイブリダイゼーション条件はオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることを可能とする条件である。かかる条件は当業界に周知の技術を利用し、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー及び標的ＤＮＡ分子について容易に決定される。例えばSambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harber Laboratory : New York (1989) を参照のこと。本発明において有用な好適なプローブ及びプライマーは下記の条件下でＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含む。ＤＮＡ分子にハイブリダイズする：Express Hybe (Clontech, Cat. No. 8015-1)中でのその製造者により提唱の通りの６０℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、Express Hybe中でのＤＮＡプローブ（その製造者により提唱の通り、Randam Primers DNA Labeling System, Gibco BRL, Cat. No. 18187-013 を利用して調製；４×１０7 カウント）との６０℃で３時間のハイブリダイゼーション、室温にて２×のＳＳＣ，０．０５％のＳＤＳの中での１５分づつ２回の洗浄、次いで５０℃において０．１％のＳＳＣ，０．１％のＳＤＳでの１５分づつ２回の洗浄。標準ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は一般にオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブに相補性の配列である。ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは非共有相互作用の形成を妨害しない非ハイブリダイゼーションヌクレオチド、例えばクローニングを促進する制限酵素認識部位を含みうる。かくして、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、標準ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションが起こる限り、標的ＤＮＡ配列のヌクレオチド全体に対する相補性を有さない。
【００２１】
本明細書で用いる語「ＤＮＡ分子」とはヌクレオチドの一本線形鎖を意味する。
【００２２】
本明細書で用いる語「ＤＮＡフラグメント」とは、互いと相補性であり、そして互いとハイブリダイゼーションし合ってＤＮＡの二量体を形成する２本のＤＮＡ分子を意味する。本明細書で用いる語「増幅したＤＮＡフラグメント」とはオリジナルＤＮＡフラグメントのコピーであるＤＮＡフラグメントを意味する。ＤＮＡフラグメントはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して増幅できる。ＤＮＡフラグメントはオリジナルのＤＮＡフラグメントをプラスミドにライゲーションさせ、そして得られるプラスミドを宿主細胞、例えばＥ．コリの中で増殖させることによっても増幅できる。増幅させたＤＮＡフラグメントは典型的にはオリジナルＤＮＡフラグメントの少なくとも一部に対してヌクレオチド配列同一性である。
【００２３】
本明細書で用いる語「相補体」及び「相補性」とは、２本のＤＮＡ分子が互いと塩基対合する能力を意味し、ここで一方のＤＮＡ分子上のアデニンは第二ＤＮＡ分子上のグアニンと塩基対合し、そして一方のＤＮＡ分子上のシトシンは第二ＤＮＡ分子上のチミンと塩基対合する。２本のＤＮＡ分子は、一方のＤＮＡ分子上のヌクレオチド配列が第二ＤＮＡ分子におけるヌクレオチド配列と塩基対合できるなら、互いと相補性である。例えば、２本のＤＮＡ分子５’ＡＴＧＣと５’ＧＣＡＴは相補性であり、そしてＤＮＡ分子５’−ＡＴＧＣの相補体は５’−ＧＣＡＴである。相補体及び相補性なる語は、２本のＤＮＡ分子であって、一方のＤＮＡ分子が第二ＤＮＡ分子上に存在する少なくとも１個のヌクレオチドに対して塩基対合しない少なくとも１個のヌクレオチド含む場合も含む。例えば、２本のＤＮＡ分子５’−ＡＴＴＧＣ及び５’−ＧＣＴＡＴの各々の３番目のヌクレオチドは塩基対合しないが、これら２本のＤＮＡ分子は本明細書における定義に従うと相補性である。典型的には、２本のＤＮＡ分子はそれらが上記の標準条件下でハイブリダイズするなら相補性である。典型的には、２本のＤＮＡ分子はそれらが少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有するなら相補性という。
【００２４】
本明細書で用いる語「プライマーペアー」とは、増幅すべきＤＮＡの領域に隣接する２本のオリゴヌクレオチドを意味する。一方のプライマーは増幅すべきＤＮＡフラグメントの一端にあるセンス鎖上に存在するヌクレオチドに対して相補性であり、そして他方のプライマーは増幅すべきＤＮＡフラグメントの他端にあるアンチセンス鎖上に存在するヌクレオチドに対して相補性である。増幅すべきＤＮＡフラグメントは鋳型ＤＮＡと呼ぶことができる。プライマーが相補性であるＤＮＡフラグメントのヌクレオチドは標的配列又は標的ＤＮＡと呼ぶ。プライマーは少なくとも約１１個のヌクレオチドを有してよく、そして好ましくは約１６個以上、約３５個以下のヌクレオチドを有しうる。典型的には、プライマーはそのプライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する。プライマーはＤＮＡポリメラーゼのための出発点を担うことができ、かかるポリメラーゼは必須物質の存在下で鋳型ＤＮＡに相補性のＤＮＡ分子を合成する。典型的には、プライマーペアーはＰＣＲによりＤＮＡフラグメントを増幅するのに利用する。
【００２５】
本明細書で用いる語「単離された」とは天然ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列又はオリゴヌクレオチドがそのもとの環境から取り出されていることを意味するか、又は合成分子又はクローン化生成物を意味する。好ましくは、ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列又はオリゴヌクレオチドは精製されており、即ち、任意のその他のＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列又はオリゴヌクレオチド、及び一体化した細胞性生成物又はその他の不純物を本質的に含まない。
【００２６】
本明細書で用いる語、「診断」とは運動失調症の危険性にある個体の発症前の同定であってよく、家系病歴のない個体の同定が含まれる。診断は、少なくとも一種の運動失調症を示す個体における少なくとも一種の症状の遺伝子基準の同定も意味しうる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
Ａ．診断方法
病気に関係するコード配列の同定はその病気の改善された診断を可能にする。かくして、本発明は８型脊髄小脳性運動失調症を発症する危険性のある個体及びかかる病気の症状を示している個体の診断方法に関連する。本発明の別の観点は危険性のない個体の診断方法に関連する。一般に、これらの方法はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ内のＤＮＡフラグメントの存在を検出できる。好ましくは、このＤＮＡフラグメントはゲノムＤＮＡ内に存在するヌクレオチドを含んで成る。好ましくは、このＤＮＡフラグメントは染色体１３の長腕のＳＣＡ８座内に位置する。このＳＣＡ８座は危険性のあるＳＣＡ８アレル又は正常ＳＣＡ８アレルを含みうる。このＳＣＡ８座は一般にリピート領域を含む。
【００２８】
典型的には、ＳＣＡ８アレルのリピート領域内に存在するＣＴＧリピートの数は決定できる。一般に、ＳＣＡ８の危険性のあるアレルはＳＣＡ８リピート領域内に少なくとも約８０組のＣＴＧリピートを有するアレルである。一般に、８０ＣＴＧリピート未満のＳＣＡ８アレルは正常アレルであり、これは８型脊髄小脳性運動失調症の症状を発症しないであろう個体の指標である。
【００２９】
好ましくは、ＳＣＡ８アレルのリピート領域内に存在するＣＴＧ及びＣＴＡリピートの数を決定することができる。危険性のあるアレルは好ましくはＳＣＡ８コード配列のリピート領域内に少なくとも約９２組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートを有するものである。組合せＣＴＡリピート及びＣＴＧリピートの数は（（ＣＴＧ）／（ＣＴＡ））n と呼ぶことができ、ここでｎはＣＴＡリピートとＣＴＧリピートの数である。ＳＣＡ８コード配列のリピート領域内で約９１組の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピート、好ましくは約３３組以下のそれを有するＳＣＡ８アレルは一般にＳＣＡ８コード配列のアレルが正常であることを示唆する。一般に、今日まで評価された正常アレルには多少のＣＴＡ及びＣＴＧリピート、典型的には約１６組のそれがある。
【００３０】
このリピート領域はリピート内に中断を有してよい。例えば、ＣＴＧリピートの５’側、即ち、ＣＴＡリピートに最も近いＣＴＧリピート側に非ＣＴＧトリヌクレオチドリピートがあってよい。ＣＴＧリピートは（ｉ）リピートの６又は９番目のトリプレットとしてのＣＣＧ、（ii）リピートの６〜８、又は６〜９番目のトリプレットとしてのＣＣＧトリヌクレオチド、(iii）リピートの６及び１４番目のトリプレットとしてのＣＣＧトリヌクレオチド、又は（iv）リピートの２０，２７，３３及び３８番目のトリプレットとしてのＣＣＧトリヌクレオチドを含みうることが認められた。また、ＣＴＧリピートはリピートの３及び５番目のトリプレットとしてＣＴＡトリヌクレオチドを含みうる。更に、ＣＴＡ及びＣＴＧリピートは６個までのヌクレオチドで隔てられていてよいこともわかった。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はリピート領域を構成するＣＴＡとＣＴＧリピートとの間に６個のヌクレオチド（ヌクレオチド４４９〜５５４）を開示する。ＣＴＡリピートとＣＴＧリピートとの間のこの領域を構成するヌクレオチドは種々のＳＣＡ８アレル間で変わり、そしていくつかのＳＣＡ８アレルには存在しない。かくして、８０のリピートを有するＣＴＧリピートが、最少数のＣＴＧではない介在トリヌクレオチドを有するものでありうる。
【００３１】
本発明の診断方法は特異的なＤＮＡフラグメントを検出するための公知の方法、例えばＤＮＡの直接検出又はＲＮＡの検出を介する間接検出を包括しうる。例えば、ＰＣＲ技術はＳＣＡ８コード配列のリピート領域を増幅させる新規のプライマーで利用できる。他方、ラベル化プローブを利用するサザン又はノーザンブロッティングハイブリダイゼーション技術を利用できる。その他の核酸配列決定技術もトリヌクレオチドリピートの数を決定するために利用できる。これらの方法はＳＣＡ８の症状を有する個体又は将来においてかかる症状を発症する危険性のある個体に適用できる。
【００３２】
本発明の一の態様において、ＤＮＡプローブをＳＣＡ８コード配列の危険性のあるアレルのＤＮＡフラグメント又はＤＮＡ分子を同定するために利用できる。ＤＮＡプローブは、同定しようとするコード配列に由来する相補ＤＮＡ分子とハイブリダイズする又は非共有結合するラベル化一本鎖ＤＮＡ分子である。このプローブは放射能及び非放射能ラベルを含む当業界周知の適当なラベルでラベルしてよい。典型的な放射能ラベルには32Ｐ，125 Ｉ，35Ｓ等が含まれる。非放射能ラベルには、例えばリガンド、例えばビオチン又はジゴキシゲニン、並びに酵素、例えばホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、又は様々な化学発光物質、例えばルシフェリン、又は蛍光化合物、例えばフルオレセイン及びその誘導体が含まれる。プローブは分離のし易さのために異なるタイプのラベルで両端をラベルしてもよく、例えば一端をアイソトープラベル、そして他端をビオチンラベルを用いてラベルしてよい。
【００３３】
本発明はリピート領域を含む少なくとも一種のＤＮＡ分子の存在を検出するための方法に関連し、これではゲノムＤＮＡのサンプルを例えば制限エンドヌクレアーゼによる消化により分断し、そして得られるＤＮＡフラグメントをオリゴヌクレオチドプローブでプロービングする。ＤＮＡプローブ分析を利用し、ＳＣＡ８コード配列を含む染色体１３の長腕由来のＤＮＡを含む多種多様なコード配列由来のＤＮＡを含む複合混合物を得るようにゲノムＤＮＡを酵素消化、分断及び変性にかけることにより標的ＤＮＡを誘導することができる。好ましくは、ＤＮＡプローブは標的ＤＮＡにだけハイブリダイズする。好ましくは、この標的ＤＮＡはＳＣＡ８コード配列、即ち、ＳＣＡ８コード配列の一部であるか、又は制限エンドヌクレアーゼによる消化を経たリピート領域の近くにあるＤＮＡ又は同じＤＮＡ分子であり、そして得られる複合体は当業界公知の技術により単離及び同定できる。一の態様において、この方法はゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメントを得、そのフラグメントを分断してＤＮＡ分子を得、その分子を標準のハイブリダイゼーション条件で検出可能式にラベルされたプローブでプロービングし（このプローブは単離されたＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡ分子にハイブリダイズする）、前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズするプローブＤＮＡを検出し、そしてこのＤＮＡフラグメントをＳＣＡ８コード配列の正常又は危険状態の特徴的なリピート領域について分析することを包括する。
【００３４】
本発明は更にプローブを提供する。このプローブはオリゴヌクレオチド又は長めのヌクレオチド配列であってよく、合成又は天然のいずれでもよく、リピート領域に隣接するＤＮＡ配列領域にハイブリダイズし、且つ任意的にリピート領域を含むＤＮＡ配列にハイブリダイズする。好ましくは、このプローブは染色体１３の長腕のＳＣＡ８コード配列にハイブリダイズする。このプローブはリピート領域を有するＳＣＡ８コード配列のフラグメント（好ましくは約１．２kbのＥｃｏＲＩフラグメント）の危険性のあるアレル又は正常アレルの鎖の一部に対して相補性なヌクレオチド配列を含む。このプローブは少なくとも約２０個のヌクレオチドであってよく、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドである。これらのプローブはそのヌクレオチド配列が危険性のある又は正常なＳＣＡ８アレルの鎖の一部に対し、リピート領域に直結する部分を含むリピート領域の５’側の好ましくは約４５０ヌクレオチド内で相補性となるように選定する。好ましくは、このプローブのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４９から選ばれる又はそれに対して相補性である。他方、これらのプローブはそのヌクレオチド配列が危険性のある又は正常なＳＣＡ８アレルの鎖の一部に対し、リピート領域に直結している部分を含むリピート領域の３’側の好ましくは約４３５ヌクレオチド内で相補性となるように選定する。好ましくは、このプローブのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９から選ばれる又はそれに対して相補性である。プローブの非限定例はＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１９〜４４９及びそれに対して相補性のヌクレオチドである。このプローブはニトロセルロースに転写したＳＣＡ８アレルに対して下記の条件下でハイブリダイズするであろう：Express Hybe (Clontech, Cat. No. 8015-1)中でのその製造者により提唱の通りの６０℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｅ中でのＤＮＡプローブ（その製造者により提唱の通り、Randam Primers DNA Labeling System, Gibco BRL, Cat. No. 18187-013 を利用して調製；４×１０7 カウント）との６０℃で３時間のハイブリダイゼーション、室温にて２×のＳＳＣ，０．０５％のＳＤＳの中での１５分づつ２回の洗浄、次いで５０℃において０．１％のＳＳＣ，０．１％のＳＤＳでの１５分づつ２回の洗浄。
【００３５】
一般に、ＳＣＡ８コード配列内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検出するため、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメントを得る。検査すべきゲノムＤＮＡの起源はＤＮＡを含む生物学的検体であってよい。その例には血液、精液、膣スワブ、組織、毛髪及び体液の検体が含まれる。制限エンドヌクレアーゼはゲノムＤＮＡを特定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ＤＮＡのフラグメントに切断するであろうものであってよい。数多くのエンドヌクレアーゼの特異性が周知であり、そして様々な公開物、例えばSambrookら ; Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory : New York (1989)に見い出せうる。好適な制限エンドヌクレアーゼ酵素にはＥｃｏＲＩ，ＴａｑＩ及びＢｓｅＮＩが含まれる。ＥｃｏＲＩが特に好適である。
【００３６】
病気の診断は他に新規のプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応配列増幅（ＰＣＲ）の利用を包括することができる。米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７年７月２８日特許）が核酸配列の増幅、検出及び／又はクローニングのための方法を述べている。この方法はＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し；これらのプライマーを伸長させて前記リピート領域を含む所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；このようにして増幅したフラグメントを検出し；そしてこの増幅したＤＮＡフラグメントをリピート領域について分析することを包含する。
【００３７】
より詳しくは、当該ＤＮＡフラグメントをプライマーで処理し、そしてそのプライマーを伸長させる方法工程は下記の段階を含む：オリゴヌクレオチドプライマーのペアーを添加する（ここでこのペアーの一方のプライマーは当該ＤＮＡフラグメントのセンス鎖内のヌクレオチド配列の一部に対して相補性であり、そして各ペアーの他方のプライマーは当該ＤＮＡフラグメントの相補アンチセンス鎖内の同じヌクレオチド配列の別の部分に対して相補性である）；この対合したプライマーをこの相補ＤＮＡ分子にアニーリングする；同時に、このアニーリングしたプライマーを各プライマーの３’末端から伸長し、各プライマーにアニーリングさせた鎖に相補性な伸長生成物を合成する（ここでこの伸長生成物はその相補体から分離させた後、各プライマーの他方のプライマーについての伸長生成物の合成のための鋳型を担う）；そしてこの伸長生成物を前記鋳型から分離させ、一本鎖分子を生成する。この方法の変法が米国特許第４，６８３，１９４号（Ｓａｉｋｉら、１９８７年７月２８日特許）に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応配列増幅方法はＳａｉｋｉらScience, 230, 1350-1354 (1985)及びScarf ら、Science, 324, 163-166 (1986)に記載されている。ＰＣＲはＳＣＡ８リピート領域を含むヌクレオチド配列を検出するために利用できる。
【００３８】
本発明は更にプライマーを提供する。これらのプライマーはオリゴヌクレオチドであり、合成又は天然のいずれでもよく、染色体１３の長腕のＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡ配列領域に対して相補性の生成物の合成の開始点を担うことができる。好ましくは、このプライマーはリピート領域を有するＳＣＡ８コード配列のフラグメントの危険性のあるアレル又は正常アレル（好ましくは約１．２kbのＥｃｏＲＩフラグメント）の鎖の一部に対して相補性なヌクレオチド配列を含む。このプライマー配列は少なくとも約１１個のヌクレオチド、そして好ましくは約１６以上、約３５以下のヌクレオチドを有しうる。典型的には、このプライマーはそれらが約７０塩基対〜約１００塩基対、好ましくは約１００塩基対〜約４５０塩基対のプライミング化生成物を供するように選ぶ。より好ましくは、これらのプライマーは危険性のあるアレル又は正常アレルの鎖の一部に対し、そのリピート領域に直結する部分を含むリピート領域のいずれかの例の約１５０ヌクレオチド以内に対して相補性である。
【００３９】
プライマーペアーの第一プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれ、そしてプライマーペアーの第二プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に対して相補性のヌクレオチドから選ばれうる。このプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８の中の及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に対して相補性なヌクレオチドの中のどこから選んでもよい。好ましくは、第一プライマーはＳＣＡ８−Ｆ３（５’−ＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＳＣＡ８−Ｆ４（ＧＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）又はＳＣＡ８−Ｆ５（ＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。好ましくは、第二プライマーはＳＣＡ８−Ｒ２（５’−ＣＣＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、Ｐ（ＧＣＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＡＧＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）又はＳＣＡ８−Ｒ４（ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）である。ＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２プライマーを利用するＤＮＡフラグメントの増幅のための条件は例えば２００μＭのｄＮＴＰ、１０mMのＴｒｉｓ  pH９．０、５０mMのＫＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．０mMのＭｇＣｌ2 、１０％のＤＭＳＯ、０．１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ））サイクル数３５回（９４℃で４５秒、５３℃で７５秒、及び７２℃で７５秒）でありうる。
【００４０】
他方、ＰＣＲは、センス鎖に由来する第一プライマーを含んで成る、即ち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドの一部を含んで成り、第一プライマーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相補性のヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーペアーを利用することにより、ＣＴＡリピートではなくＣＴＧリピートを増幅するのに利用できる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１にはリピート領域を構成するＣＴＡとＣＴＧリピートとの間の６個のヌクレオチド（ヌクレオチド４４９〜５５４）を開示する。ＣＴＡリピートとＣＴＧリピートとの間の領域を構成するヌクレオチドは異なるＳＣＡ８アレル間で変わり、そしていくつかのＳＣＡ８アレルの中にはない。第一プライマーはＣＴＡリピートを構成するヌクレオチドの少なくとも一部を含んで成るか、又は第一プライマーはＣＴＡリピートを構成するヌクレオチドの少なくとも一部とＣＴＧリピートを構成するヌクレオチドの少なくとも一部を含んで成ってよい。例えば、プライマーペアーの第一プライマーは３組以下のＣＴＡリピート、それに続く９組未満のＣＴＧリピートを含んで成ってよく、好ましくは３組のＣＴＡリピート、それに続く６組以下のＣＴＧリピートを含んで成ってよく、最も好ましくは３組以下のＣＴＡリピート、それに続く３組以下のＣＴＧリピートを含んで成ってよい。３種超のＣＴＧリピートを有する第一プライマーは、ＣＴＧリピートの長さが検査すべき個体のゲノムＤＮＡ内のその他の位置に存在するＣＴＧリピートとのこの第一プライマーの結合を及ぼしてしまうようなものでないことを条件に、利用できる。多重のＣＴＡ及びＣＴＧリピートを含んで成る第一プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするため、ハイブリダイゼーション温度は下げてよい。例えば、ハイブリダイゼーション温度は約５５℃にまで下げてよい。
【００４１】
一般に、本発明のこの観点のプライマーペアーの第二プライマーはセンス鎖内のヌクレオチド配列の一部に対して相補性であり、そしてハイブリダイズする。好ましくは、このプライマーがハイブリダイズするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９、即ち、ＣＴＧリピートの３’側のヌクレオチドの短い部分（少なくとも約１１ヌクレオチド、そして好ましくは約１６以上、約３５以下のヌクレオチド）を含んで成る。本発明のこの観点は、増幅するヌクレオチド配列が存在する全ＤＮＡのごくわずかである場合、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのサンプルで実施してよい。
【００４２】
他方、且つ好ましくは、本発明のこの観点は既に増幅したＤＮＡのフラグメントに対して実施してよい。例えば、リピート領域、即ち、ＣＴＡ及びＣＴＧリピートの双方を含む、ヌクレオチド配列を第一プライマーペアーを利用してゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのサンプルからＰＣＲ増幅することができ、そしてＰＣＲにより増幅したヌクレオチド配列をこの第一プライマーペアーから単離し、そして任意的に増幅していないゲノムＤＮＡ配列が単離してよい。この単離した増幅ヌクレオチド配列は、ＣＴＡリピートではなくリピート領域のＣＴＧリピートを増幅する第二プライマーペアーを利用する２回目の増幅にかけることができる。本発明のこの観点において、好ましくはこの第二プライマーペアーは第一プライマーペアーにより増幅したヌクレオチド配列の中に存在するＳＣＡ８コード配列のヌクレオチドに対してハイブリダイズし、そして第二プライマーペアーはＣＴＡリピートではなくＣＴＧリピートを増幅する。
【００４３】
別の態様において、リピート領域、即ち、ＣＴＡ及びＣＴＧリピートの双方を含むＤＮＡフラグメントは第一プライマーペアーを利用してゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのサンプルから増幅してよく、そして増幅ＤＮＡフラグメントを第一プライマーペアーから取り出し、そして任意的に増幅していないゲノムＤＮＡ配列から取り出してよい。この増幅したＤＮＡフラグメントを例えばポリアクリルアミドゲルで分解してＤＮＡフラグメント内のＣＴＡ及びＣＴＧリピートの数を決定することができる。単離した増幅ＤＮＡフラグメントはＣＴＧリピートではなくリピート領域のＣＴＡリピートを増幅する第二プライマーペアーを利用して２回目の増幅にかけることができる。本発明のこの観点において、好ましくは第二プライマーペアーは第一プライマーペアーにより増幅したヌクレオチド配列の中に存在するＳＣＡ８コード配列のヌクレオチドに対してハイブリダイズし、そして第二プライマーペアーはＣＴＧリピートではなくＣＴＡリピートを増幅する。本発明のこの観点はＳＣＡ８アレルのリピート領域内のＣＴＡリピートの数を決定するために利用できる。ＣＴＡリピートの数が決定できたら、それはＤＮＡフラグメント内のＣＴＧリピートの数を決定するために利用できる。
【００４４】
ＳＣＡ８のリピート領域に対して５’及び３’側の領域は一般に様々なＳＣＡ８アレル間で９９．９％保存されている。ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適するオリゴヌクレオチドはリピート領域の５’及び３’側双方のリピート領域は隣接する領域から選ばれうる。オリゴヌクレオチドプライマーを選定するＳＣＡ８コード配列の領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドから選ばれる。好適なプライマーペアーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９である。これらのプライマーペアーはそれぞれＰＣＲ技術を利用して注目のリピート領域を有効に増幅する。このようなオリゴヌクレオチドは脊髄小脳性運動失調症を患う又はその危険性のあると予測される個体から採取したＤＮＡ由来のＳＣＡ８コード配列からリピート領域を増幅するために有用である。この増幅フラグメントをゲル上で泳動させ、リピート領域の長さを検定し、そしてＳＣＡ８アレルを危険又は正常に分類することができる。他方、このプライマーペアーはＳＣＡ８遺伝子を配列決定するための様々な公知技術、例えばＣＴＧリピートの数又はＣＴＡ及びＣＴＧリピートの数を決定する技術に利用できうる。
【００４５】
本発明は更に、個体がリピート領域に関係する病気を発症する危険性を有するか否かを検査するためのキットに関連する。この個体がリピート領域に関係する病気を発症する危険性を有するか否かを検査するためのキットは上記のプローブ及び／又はプライマーを含む。典型的には、検出するリピート領域はＣＴＧリピート、好ましくはＣＴＧ及びＣＴＡリピートである。好ましくは、このリピート領域はＳＣＡ８コード配列の中に存在する又はそれによりコードされる。
【００４６】
前述の通り、その他の診断方法を同様に利用してよい。これらはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのリピート領域の単離及び同定を基礎としうる。これには、例えばＳＣＡ８コード配列のヌクレオチド配列内のささいな変化を検出する様々な電気泳動技術の利用が含まれる。更なる非限定例には変性勾配電気泳動、一本鎖コンホメーショナル多形態ゲル、非変性ゲル電気泳動技術、及びＤＮＡチップ又はＤＮＡのマイクロチップアレーが挙げられる。
【００４７】
ＳＣＡ８コード配列のマッピング及びクローニングは生物学的検体、例えば血液の簡易検査を利用する一のタイプの優性遺伝運動失調症の具体的な診断を可能にする。これは優性運動失調症の明確な分子分類に対する第一ステップとなる。運動失調症についての簡易且つ信頼できる分類システムは重要であり、なぜなら臨床症状はＳＣＡ８及び非ＳＣＡ８疾患形態で著しく重なっているからである。更に、唯一わかっているＳＣＡ８突然変異についての分子検査は既知のＳＣＡ８家系における病気の発症前診断を可能にし、そして家系病歴のない場合、散在又は単独ＳＣＡ８リピート領域拡張又は収縮の同定を可能にする。かくして、本発明は家族カウンセリング、医療処置計画、及び原因不明の運動失調症を患う患者の標準処置に利用される。
【００４８】
Ｂ．リピート領域に隣接する配列を利用しての全長遺伝子のクローニング
本発明はリピート領域を含むコード配列全体及びその一部に対応する核酸分子を含むリピート領域を含む核酸分子に関する。好ましくは、このリピート領域は単離されたＳＣＡ８コード配列のリピート領域であり、そして好ましくはこの核酸分子はＳＣＡ８コード配列全体及びその一部に対応する核酸分子である。本発明は更に、異種ベクター配列に作用可能式に連結されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチドを含んで成る単離された組換ベクターを含む、ＳＣＡ８コード配列全体及び一部を含んで成るベクター及び単離された組換ベクターに関する。
【００４９】
適当な複製可能ベクターへのＤＮＡのクローニングはリピート領域に隣接する配列の決定及び全長コード配列のその後の単離を供する。クローニングはコード配列によりコードされるｍＲＮＡの発現を可能にする。
【００５０】
１．ＤＮＡの単離
リピート領域を含むコード配列を含むＤＮＡは当該コード配列によりコードされるｍＲＮＡを保有し、且つ検出可能なレベルにおいてそれを発現するものと信じられている組織から調製したｃＤＮＡから得たライブラリーであってよい。他に、ＳＣＡ８コード配列はゲノムＤＮＡライブラリーから、又は完全ヌクレオチド配列からのｉｎ  ｖｉｔｒｏオリゴヌクレオチド合成により得られうる。
【００５１】
ライブラリーは注目のコード配列を同定するためにデザインされた適当なプローブでスクリーニングする。好ましくは、これらのプローブはリピート領域の両側のヌクレオチド配列に由来する。選定のプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは標準の手順を利用して成し遂げられうる。プローブとして合成オリゴヌクレオチドを利用するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは本発明の実施の好適な方法である。プローブとして選定されるオリゴヌクレオチドは偽陽性を最小限とするのに十分な長さ及び十分な精度を有するべきである。異なる種に由来するＤＮＡを含むライブラリーをスクリーニングする場合、プローブの実際のヌクレオチド配列は通常、最低限のコドン冗長性を有する伸長リピートに隣接するヌクレオチドの領域を基準に設計される。このオリゴヌクレオチドは１又は複数の位置において縮重していてよく、即ち、所定の位置において２種類以上のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに組込まれていてよく、これにより多重の合成オリゴヌクレオチドが得られる。縮重オリゴヌクレオチドの利用は、優先的なコドン用法のわかっていない種からライブラリーをスクリーニングするときに時に重要である。
【００５２】
このオリゴヌクレオチドは、スクリーニングするライブラリー内のＤＮＡに対するハイブリダイゼーションにより検出できるようにラベルしてよい。ラベリングの好適な方法はオリゴヌクレオチドの５’末端を放射性ラベリングするためのＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼの利用である。しかしながら、オリゴヌクレオチドをラベルするのにその他の方法、例えば限定することなく、ビオチニル化又は酵素ラベリングを利用してよい。
【００５３】
リピート領域を含むコード配列を単離するための別の手段はＰＣＲ方法論を利用することにある。この方法はＳＣＡ８コード配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマープローブの利用を必要とする。ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドの選択のための戦略は以下に説明する。
【００５４】
２．ベクターへのＤＮＡの挿入
リピート領域を含む当該コード配列を含む核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は好ましくは更なるクローニングのため（ＤＮＡの増幅）又は当該コード配列によりコードされるｍＲＮＡの発現のための複製可能ベクターの中に挿入する。多くのベクターが有用であり、そして適当なベクターの選択は：１）それがＤＮＡ増幅のため又はｍＲＮＡの発現のために利用されるかどうか；２）このベクターの中に挿入すべき核酸のサイズ；及び３）このベクターにより形質転換すべき宿主細胞；に依存する。
【００５５】
適当なベクターの構築は当業界において公知の標準のライゲーション技術を利用する。単離したプラスミド又はＤＮＡフラグメントを切断し、仕立し、そして必須のプラスミドを構築するのに所望される形態で再ライゲーションする。典型的には、Ｅ．コリを形質転換するためにライゲーション混合物を利用し、そして有効な形質転換体は適宜アンピシリン又はテトラサイクリン耐性により選別する。形質転換体由来のプラスミドは当業界公知の方法により調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は配列決定する。例えば、Messing ら、Nucl. Acids Res., 9, 309 (1981) 及びMaxam ら、Methods in Enzymology, 65, 499 (1980) を参照のこと。
【００５６】
複製可能なクローニング及び発現ベクター成分は一般に、限定することなく、１又は複数の下記の成分を含む：シグナル配列、複製起点、１又は複数のマーカーコード配列、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終止配列。現時点で、様々な有能な宿主細胞により認識されている数多くのこれらの成分各々が当業界に周知である。成分は標準の分子生物学技術を利用してその起源ＤＮＡから取り出し、そして特定の種に内因性であるその他の成分と一緒に利用できうることが当業界に周知でもある。他方、異種成分を一緒に利用し、クローン化ＤＮＡの安定な複製又はクローン化ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡの発現をもたらしてよい。トリヌクレオチドリピートを含むコード配列のクローニングに利用できる成分の非限定的な説明は１９９４年６月２８日に出願された米国出願第０８／２６７，８０３号に見い出うる。
【００５７】
３．宿主細胞
本明細書に記載のベクターをクローニング及び発現するのに適当な宿主細胞は原核細胞、糸状菌粒、酵母、原生動物並びに高等真核細胞、例えば脊椎動物、無脊椎動物及び植物細胞である。好ましくは、この宿主細胞は最少限量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。宿主細胞内でのクローン化ＤＮＡを含むベクターの増殖は近年ルーチン的な手順となっており、そして当業界において周知である。
【００５８】
他方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング方法、例えばＰＣＲ又はその他の核酸ポリメラーゼ反応が適当である。
【００５９】
４．トランスフェクション及び形質転換
宿主細胞を本発明の上述の発現又はクローニングベクターによりトランスフェクション及び好適には形質転換し、そしてプロモーターを誘導、形質転換体を選別、又は所望の配列をコードするコード配列を増幅するために適宜改良された慣用の栄養培地の中で培養する。
【００６０】
クローン化ＤＮＡを含むベクターの取り込みを促進するための宿主細胞の処理の数多くの方法が当業界に知られ、例えばリン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、塩化カルシウム処理、核注入、プロトプラスト融合又はマイクロプロジェクチルボンバードメインも利用されうる。
【００６１】
宿主細胞の活性及びクローニングベクターの運搬を助長する適当な培地の中でのクローニングベクターを含む宿主細胞の培養が当業界に周知である。当業者に公知の任意の必須添加物を適当な濃度で含ませてもよい。培養条件、例えば温度、pH等は当業者に明らかとなるであろう。本明細書中で言及する宿主細胞はｉｎｖｉｔｒｏ培養物及び宿主動物内のものを含む。
【００６２】
【実施例】
実験
コード配列の同定された全ての優性形態の脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ１，２，３，６及び７）はポリグラタミントラクトとして翻訳されるＣＡＧリピートの拡張を原因とする。その他の形質の運動失調症がこの突然変異機構を共有するかどうかを決定するため、ＣＡＧリピートについてのリピート拡張検出（ＲＥＤ）を未知の形態の優性遺伝運動失調症を有する運動失調症家系のコレクション由来のＤＮＡサンプルに対して実施した（L. P. W. Ranumら、Am. J. Hum. Genet., 57, 603-608 (1995)）。新規の形態の脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）の原因となる今まで発表されていないＣＴＧ拡張の同定を説明する。
【００６３】
ａ．方法
ＲＥＤ，２Ｄ−ＲＥＤ及びＲＡＰＩＤクローニング
ＳＣＡ８アレルのリピート拡張検出（ＲＥＤ）、二次元ＲＥＤ（２Ｄ−ＲＥＤ）及びＲＡＰＩＤクローニングを記載の通りに実施した（M. D. Koobら、Nature Genet., 18, 72-75 (1998))。簡単には、ゲノムＤＮＡを家系Ａのプロバンド（図２）から標準の手順を利用して単離した。この単離したＤＮＡを、１９９８年８月１８日に出願のL. P. W. Ranumらの米国出願第０９／１３５，９９４号に記載のその後の２Ｄ−ＲＥＤ及びＲＡＰＩＤクローニング手順に利用するため、ＥｃｏＲＩで消化した。ＲＥＤ陽性画分を約５×１０5 クローンから成るサブゲノムライブラリーの構築のために利用した。約５×１０4 クローンの内のクローンプールを個別にＲＥＤ+ クローンについてスクリーニングした。これらのプールのうちの一つがＲＥＤ８０生成物を構築する。このプール由来のプラスミドを記載の通りにして（M. D. Koobら、前掲）（ＣＴＧ）10オリゴを利用してＣＡＧ拡張を含むクローンについて濃縮し、そしてその結果得られたクローンを３６の個別のクローンのプールにおいてスクリーニングした。次に、ＲＥＤ+ プールの一つ由来のクローンを個別にスクリーニングした。ＲＥＤ８０生成物を構築する２つのクローンがこのプールから同定された。ＣＴＧ拡張及び隣接のゲノムＤＮＡを含む１．２kbのインサートを次に配列決定した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【００６４】
拡張ＳＣＡ８リピートのＰＣＲアッセイ
ＳＣＡ８リピート拡張アッセイをＳＣＡ８−Ｆ３（５’−ＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及びＳＣＡ８−Ｒ２（５’−ＣＣＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）プライマーにより、ＰＣＲ反応（２００μＭのｄＮＴＰ、１０mMのＴｒｉｓ  pH９．０、５０mMのＫＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．０mMのＭｇＣｌ2 、１０％のＤＭＳＯ、０．１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ））サイクル数３５回（９４℃で４５秒、５３℃で７５秒及び７２℃で７５秒）で実施した。ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザン分析を、ＰＣＲにより確実に増幅されるには大きすぎる拡張アレルのサイズを確認するために用いた（即ち、＞２００リピートを有するアレル）。このプローブはＣＴＧリピートの５’側の全てのエクソンＣ及びエクソンＡの一部を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド２６７〜６０４を含んで成る約３４０bpのｃＤＮＡ  ＳＣＡ８プローブであり、そしてKit Randam Prime (GIBCO BRL, Rockville, MD) でその製造者の提唱に従いラベリングした。４０の Center d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH)対照家族（Coriell, Canden, NJ)の祖父母及び既知の形質の運動失調症を有する患者の配偶者由来のＤＮＡをＳＣＡ８  ＰＣＲアッセイのための正常コントロールとして用いた。
【００６５】
ＳＣＡ８拡張のマッピング
ＳＣＡ８リピートを上記のＰＣＲアッセイによりＣＥＰＨヒトＹＡＣ  ＤＮＡプール（Research Genetics, Huntsville, AL 、製品番号95011A及び95011B）のスクリーニングにより物理的にマッピングした。簡単には、ＰＣＲ分析はＳＣＡ８  ＣＴＧリピートを含むＹＡＣクローンを同定するため、プライマーＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２を利用するプールしたＹＡＣのＤＮＡアリコートに対して実施した。３つの重複ＹＡＣ（７５８Ｂ１，７４４Ｆ１１及び８１０Ｇ９）が同定された。プライマーＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２を利用するその後のＰＣＲ分析は重複するＹＡＣがＳＣＡ８  ＣＴＧリピートを含むことを確証した。
【００６６】
これらのＹＡＣは染色体１３ｑ２１にマッピングされた大型ＹＡＣコンティグの一部である。染色体１３の位置決めは染色体細胞ハイブリドパネルＮＩＧＭＳパネル＃２（Ｃｏｒｉｅｌｌ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）を利用して個別に確認した。簡単には、ＰＣＲ分析をプライマーＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２を利用してＤＮＡアリコートに対して実施し、ＳＣＡ８  ＣＴＧリピートを含むヒト染色体を同定した。
【００６７】
連鎖分析
連鎖分析（例えばOtt. J., Analysis of Human Genetic Linkage, 改訂版、The Johns Hopkins University Press, Bultimore, 1991 参照）をＬＩＮＫＡＧＥパッケージコンピュータープログラム（バージョン５．１）を利用し、そのプログラムの開発者の提唱に従い実施した（G. M. Lathrop ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3443-3446 (1984)）。５つの年令依存性浸透クラスがその家系の年令発症プロフィールを基準に危険性のある発症していない個体について確立された（０〜２０才  １０％；２１〜３０才  ３０％；３１〜４５才  ５０％；４６〜６０才  ６０％；６０才超  ７０％）。発症した個体及び未発症の配偶者を別のクラスに分けた。一般集団の運動失調症の発症率は１／１０，０００と推定された。ＳＣＡ８マーカーについてのアレル頻度はＣＥＰＨ祖父母由来のデータを基礎とした。
【００６８】
ＳＣＡ８アレルのクローニング及び配列決定
ＰＣＲをＰｒｉｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ由来のＸＬ  ＰＣＲキット（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を利用し、供給バッファー１０mMのＭｇ（ＯＡＣ）を、１０％のＤＭＳＯ、３ＵのｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＸＬ及びプライマーＳＣＡ８−Ｆ４（ＧＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＳＣＡ８−Ｒ４（ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を用い、前述の「拡張ＳＣＡ８リピートのＰＣＲアッセイ」で述べた通りのサイクルで実施した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル精製し、リン酸化し（３３mMのトリス酢酸、pH７．８、６６mMの酢酸カリウム、１０mMの酢酸マグネシウム、５００mMのＤＴＴ、６２mMのＡＴＰ及び５ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅｄｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３７℃で３０分インキュベーション）、そしてＣＩＰ処理したＳｍａＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローニングした。プラスミドを標準のミニプレップ手順を利用して精製し、そして二本鎖ジデオキシ配列決定を一のＰＣＲ生成物につき少なくとも２つの独立のクローンで実施した。
【００６９】
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）
５’ＲＡＣＥシステム（バージョン２．０）（Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, Cat. No. 18374-041）をｃＤＮＡ  ５’末端の迅速増幅のために用いた。５’ＲＡＣＥシステムを利用する反応のため、第一鎖合成はＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃａｒｅｂｅｌｌｕｍ  ｍＲＮＡ（ヒト脳小脳ｍＲＮＡ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５４３−１）及び２．５ｐｍｄｅのｃＤＮＡ特異的プライマー（以下参照）を利用してその製造者の提唱に従い実施した。ｃＤＮＡの精製及びＴｄＴテーリングは５’ＲＡＣＥシステムの製造者のプロトコールに記載の通りに実施した。
【００７０】
第一ラウンドのＰＣＲはｃＤＮＡプライマーの５’側の配列からデザインした入れ子式プライマー及びこのキットに供与されている５’ＲＡＣＥ省略型アンカープライマーで実施した。反応はＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡポリメラーゼキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で実施し、そしてサイクル数は３５回とした（９４℃で５０秒、６５℃で４分）。
【００７１】
第二ラウンドＰＣＲは１：２０の希釈率の第一ラウンド生成物で実施した。この反応に用いたプライマーは第二の入れ子式プライマー及び５’ＲＡＣＥシステムに供与されている省略型万能増幅プライマー（ＡＵＡＰ）とした。Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＸＬ  ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）成分を下記のＰＣＲプロフィールで用いた：９４℃でのホットスタート、次いでサイクル数５回（９４℃で３０秒、７２℃で２分）；サイクル数５回（９４℃で３０秒、７０℃で２分）；そして最後にサイクル数３２回（９４℃で３０秒、６８℃で２分）。
【００７２】
第一の５’ＲＡＣＥ反応において、第一鎖合成は製造者の提唱に従いＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び２．５ｐｍｏｌｅのｃＤＮＡ−特異的プライマーＦ５（ＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を利用して実施した。第一ＰＣＲは製造者供給のＡＡＰプライマー及びＦ４プライマー（ＧＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を利用した。第二の入れ子式ＰＣＲは製造者供給のＡＡＵＰプライマー並びにＩ−ｌｏｎｇプライマー（ＧＴＣＴＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）及びＣ２５プライマー（ＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）の双方を利用した。この結果はＳＣＡ８転写物の５’末端となった。
【００７３】
第二の５’ＲＡＣＥ反応においては、第一鎖は製造者の提唱に従いＨｕｍａｎＢｒａｉｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び２．５ｐｍｏｌｅのｃＤＮＡ−特異的プライマーＦ２７Ｒ（ＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を利用して実施した。第一ＰＣＲは製造者供給のＡＡＰプライマー及びＦ２３Ｒプライマー（ＴＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を利用した。第二の入れ子式ＰＣＲは製造者供給のＡＡＵＰプライマー及びＥ２２Ｒプライマー（ＣＴＧＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を利用した。その結果はＢＫＲＰ転写物の５’末端であった。
【００７４】
Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（小脳ｃＤＮＡ，Ｃａｔ．ｎｏ．７４０１−１）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ｐｏｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を５’及び３’ｃＤＮＡ端の双方のために用いた。Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ反応に関しては、２ラウンドの入れ子式ＰＣＲラセットを上記の通り、そのキットに供与されているプライマーＡＰ１及びＡＰ２、並びに別のＳＣＡ８−特異的プライマー（下記参照）を利用して実施したが、ただし双方の反応は下記のＰＣＲプロフィールを利用した：９４℃でのホットスタート、次いでサイクル数５回（９４℃で３０秒、７２℃で２分）；サイクル数５回（９４℃で３０秒、７０℃で２分）；そして最後にサイクル数２５回（９４℃で３０秒、６８℃で２分）。
【００７５】
第一のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ反応において、第一のＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＦ４プライマーを利用した。第二の入れ子式ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＮプライマー（ＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を利用した。この結果はＳＣＡ８転写物の第一部であった。
【００７６】
第二のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ反応においては、第一ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＰプライマー（ＧＣＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＡＧＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を利用した。第二の入れ子式ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＲ４プライマー（ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を利用した。その結果はＳＣＡ８転写物の３’−ポリＡ末端であった。
【００７７】
第三のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ反応においては、第一ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＤ２３プライマー（ＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を利用した。第二の入れ子式ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＤ２４プライマー（ＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣＴＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を利用した。その結果はＳＣＡ８転写物の３’−ポリＡ末端であった。
【００７８】
生成物を１．２％のＳｅｕ  Ｐｌａｑｕｅ  ＧＴＧ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）低融点アガロースゲル上で１×のＴＡＥバッファー（４０mMのトリス酢酸、１mMのＥＤＴＡ）で分解した。分解したＰＣＲ生成物のバンドを無菌レーザーブレードで切り出し、そしてアガロースをＡｇａｒＡＣＥ（０．２Ｕ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により供給者の説明書に従い酵素的に除去した。ＤＮＡはＥｔＯＨ沈殿により濃縮し、乾かし、そして１０μｌの１０mMのトリス、１mMのＥＤＴＡ（pH７．５）バッファーに再懸濁した。そのＰＣＲ生成物をプラスミドベクターｐＢＳ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＳｍａＩ部位の中にクローニングした。ＰＣＲインサートのヌクレオチド配列を標準技術を利用して決定した。配列分析はNational Center for Biotechnology Information ウェブページ（www. ncbi. nlm. nih. gov）を通じて入手できるインターネットソフトウェアを利用して実施した。
【００７９】
ノーザン及びポリＡ+ ＲＮＡドットブロット分析
Human Brain Multiple Tissue Northern (Clontech) 及びRNA Master Blot (Clontech)をノーザン分析のために用いた。最初に、ＢＫＲＰ転写物の３’未翻訳領域由来の約７００bpのｃＤＮＡプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）をRandam Prime (GIBCO BRL, Rockville, MD) を利用してラベリングし、そしてExpress Hybe (Clontech) を利用して双方のブロットにハイブリダイズさせた。製造者の推奨はハイブリダイゼーション及び洗浄に関して利用した。次いでブロットをストリッピングし、そしてRandam Prime (GIBCO BRL)を利用してラベルしたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド２６７〜６０４を含んで成る３４０bpのｃＤＮＡ  ＳＣＡ８プローブと再ハイブリダイズさせた。
【００８０】
Ｂ．結果
運動失調症患者由来の拡張ＣＴＧリピートのＲＡＰＩＤクローニング
未知の形態の優性遺伝運動失調症を有する運動失調症家族の集団からの一の家系由来の疾患を有する母及び疾患を有する娘由来のＤＮＡサンプルは８０組のＣＡＧリピートを有するＲＥＤ生成物を構築した（ＲＥＤ８０）。娘由来のＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡの２Ｄ−ＲＥＤ分析はＲＥＤ８０生成物が既知のＣＡＧ拡張により構築されないことを示した（図１ａ）。このＣＡＧ拡張を更に特性決定するため、拡張を含む約１．２kbのＥｃｏＲＩフラグメントをＲＡＰＩＤクローニング手順を利用してクローニングし、そして得られるクローン内のゲノムインサートのヌクレオチド配列を決定した。
【００８１】
配列分析はこの拡張が８０組の中断のないＣＡＧリピート、それに続く１０組のＴＡＧリピートのストレッチから成ることを示した（図７ａ：ＣＴＧ及びＣＴＡリピートを含む相補鎖をこの図に示す）。この拡張に広がっている有意義なオープンリーディングフレームはなく、そして特にポリグルタミン拡張を供するであろうリーディングフレームは反復したＴＡＧ停止コドンを含む。ＰＣＲプライマーはゲノム配列からリピートをまたいで増幅するようにデザインされ、そして染色体ハイブリドパネルのＰＣＲ分析及びＣＥＰＨ  ＹＡＣライブラリーはこの拡張を多形態マーカーＤ１３Ｓ２７５及びＤ１３Ｓ１３５付近の染色体１３ｑ２１に物理的にマッピングした。今までこの座において運動失調症コード配列はマッピングされていない。
【００８２】
新規の優先運動失調症（ＳＣＡ８）を有する拡張したＣＴＧリピートの共分離ＣＴＧリピートのＰＣＲ分析は家系Ａ由来のゲノムサンプルに対して実施した（図２）。疾患を有する個体及び２人の危険性を有する個体の双方がこのアレルの一つにおいて拡張を有することが見い出され、そしてその拡張は３回の遺伝のうち２回においてサイズが大きくなった。運動失調症家族集団をこのＰＣＲアッセイでスクリーニングし、そしてこの拡張を有する運動失調症患者のいる別の７つの家系が同定された。図２は５組のこれらの家系の個体において見い出されたＣＴＧ拡張のサイズを示す。これらの家族のうちの最大の家族（家系Ｅ，図２）は７世代家系であり、その構成員８９人を臨床的に評価し、そして拡張について試験した。ＰＣＲ分析はこれらの家系における疾患を有する個体全員がこの遺伝子座に拡張アレルを有することを示した。家系Ｅについての運動失調症と拡張との間での連鎖分析（表Ｉ）は６．６の最大ＬＯＤ点を示した。この結果は、この遺伝子座での拡張が新規の形態の優性遺伝脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）の原因でありうることを示唆する。
【００８３】
これらのＳＣＡ８家系由来の家族構成員を診断した神経学者はこの遺伝子試験結果について目かくした。全員で２５人の臨床的に疾患を有する個体を同定した。発症年令は１０〜６０才に範囲した（３５±１７の平均±ＳＤ）、疾患を有する家族構成員の初期検査時の年令は３７〜６８才（平均４８±１２）に範囲し、検査時の疾患期間は０〜３５年であった。搆音障害、軽い呼吸及び歩行不安定性は一般に初期症状であった。検査発見には痙性及び運動失調症障害、眼振、四肢及び歩行運動失調症、回復痙性及び低下振動認知が挙げられる。ＳＣＡ８拡張についてホモ接合性である患者及びそのヘテロ接合同胞（図２、家系Ｅ、ＶＩ：２４−２６）は同程度の疾患を有し、発症及び病気の進行速度は同程度であった。
【００８４】
拡張リピートを有するが評価時に臨床的に疾患を有さない２１人の個体がいた。無症候キャリヤーの評価時の年令は１４〜７４才であり、その平均（４４±１７才）であり、疾患を有する家族構成員の年齢と同程度であった。この不完全な浸透度を理由に、ＳＣＡ８形態の運動失調症を有する個体は常に明確な運動失調症の優性家系歴を有するものではなかった。我々のコレクションにおいて同定した８組のＳＣＡ８家族のうち６組が優性運動失調症を有する家系歴として、１組（家系Ｄ）はおそらくは劣性形態の運動失調症として（即ち、多発的に疾患を有する同胞及び疾患のない親）、そして１組は（示していない）は運動失調症病歴のない疾患を有する個体（散発的）として分類された。後者の２家系を除くと、ＳＣＡ８は我々の家系コレクション中の優性遺伝運動失調症の３．４％（６／１７５）を占め、ＳＣＡ１（１０／１７５）及びＳＣＡ７（８／１７５）と似た頻度であった。
【００８５】
ＳＣＡ８病原性拡張は大きく、且つ不安定である
疾患を有する及びその危険性のある個体の多大なＳＣＡ８ＰＣＲ分析を実施し（図３）、そして６９２の疾患のないアレルを代表するコントロールゲノムＤＮＡサンプルのパネルを分析した。この分析の結果を図４にまとめる。ＣＴＧ及びＣＴＡリピートは共に多形性であるため、我々のＰＣＲアッセイはこれら２種類のリピートの組合さったサイズを決定するものであり、そしてこれが図４に示している値である。１６〜９１組の組合せＣＴＧ／ＣＴＡリピートを有する正常ＳＣＡ８アレルが見つかったが、正常アレルの＞９９％が１９〜３４の総リピートを有していた。ＳＣＡ８拡張を有する運動失調症患者の間で、９２〜１７９組の範囲の組合せＣＴＧ／ＣＴＡリピートが見つかった。疾患を有するアレルの配列決定はＣＴＡが３〜１７組のリピートのサイズで変動することを示したが、ＣＴＧリピートのみが一の世代から次の世代との間で拡張し、又はサイズ変化することがわかった。疾患を有する個体におけるＣＴＧ拡張のみのサイズは８０〜１７０組の中断のないリピートに範囲した。このように疾患を有するアレルのサイズはその他ＳＣＡを及ぼすどのＣＡＧ拡張について一般に認められるものよりも相当大きいが、成人発症ＤＭ患者間で見い出せるＣＴＧ拡張とサイズにおいて似かよっている（Ｔ．Ａｓｈｉｚａｗａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４２，１８７７−８３（１９９２））。疾患を有さない最大のアレルの一つ（８１組の組合せリピート）も配列決定し、そして６８組の中断のないＣＴＧリピートが見つかった。中断のないＣＴＧ及びＣＴＡリピートトラクトの間に見い出せたＣＴＧ／ＣＴＡリピートに対するささいな単一ヌクレオチド変化の数及び位置は配列決定したアレルの多くの間で幅広く変動した。
【００８６】
ＣＴＧリピート数の世代間変化は一般にその他の優性ＳＣＡよりもＳＣＡ８に関して大きいが、一般にＤＭほどは大きくない。ＳＣＡ８拡張の母方及び父方遺伝におけるＣＴＧリピート数の変化の棒グラフを図５に示す。ほとんどの父方遺伝はＣＴＧリピート（−３６〜＋７）の収縮をもたらし（即ち、この拡張は最大３６リピートの消失から最大７リピートの増加で変化した）、そしてほとんどの母方遺伝は拡張をもたらした（−７〜＋５７５）。筋緊張性ジストロフィーにおいて認められるものとサイズにおいて似かよったリピートの長さの３通りの非常に大きい増加（＋２５０，＋３５０，＋５７５）は全て母方遺伝に由来する。拡張の母方遺伝への片寄りはその他のＳＣＡ（ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ８及びＳＣＡ７）については報告されていないが、筋緊張性ジストロフィーについては似ている。
【００８７】
疾患浸透度の母方への片寄り
驚くべきことに、症候性ＳＣＡ８の２７の記録遺伝のうちの２５が母方であった（図２）。リピート拡張を有する１８の無症候個体のうち３人が母方遺伝であり、１５人が父方遺伝であった。家系Ｄ（図２）がＳＣＡ８の記録父方遺伝子を有する唯一の家系である。父は、臨床学的に疾患を有さないが、異常に大きいＳＣＡ８拡張を有し（２００リピート）、そして彼の臨床学的に疾患を有する子供はそれよりは小さいにしても大きいＣＴＧ拡張を受け継いでいた（１６４及び１７０リピート）。
【００８８】
ＳＣＡ８拡張のサイズは発症年令及び症度とは相関しない
その他の優性脊髄小脳性運動失調症とは異なり、ＳＣＡ８の発症年令はＣＴＧ拡張のサイズと有意に相関しないようである（図６）。図６の分析の中に含まれていない４人の発症前個体は更に、リピート長が発症年令を予測するのに利用できないことを示した。見つけられた最大のＳＣＡＰ拡張（約４００，５００及び７００リピート）は運動失調症徴候を示さない１５〜２４才の危険性のある個体に存在し、そして家系Ｄの無症候キャリヤー（図２）は２００のＣＴＧリピートを有したが、＞２式でもまだ発症していない。発症年令とリピート長との間での相関の似たような欠如が約５００未満のＣＴＧリピートを有するＤＭ患者についても認められている。
【００８９】
ＳＣＡ８患者間で幅広く変動する疾患の間の症度も患者のリピート長又は発症年令と有意な相関がないことがわかる。しかしながら、ＳＣＡ８疾患の期間は疾患を有する同胞間で似かよっており、このことはリピート長以外の環境的又は遺伝的要因がＳＣＡ８の病因に強い影響を有することを示唆しうる。
【００９０】
ＳＣＡ８トリヌクレオチドリピートは天然のアンチセンス転写物における非翻訳ＣＴＧである
ＳＣＡ８  ＣＡＧリピートを含むｃＤＮＡを同定するため、小脳ｍＲＮＡから構築したラムダｃＤＮＡライブラリーをスクーニングし、そしてたった一つのｃＤＮＡクローンが同定された。このクローン由来のインサートの配列決定はｃＤＮＡが明らかに、ＣＴＧ方向においてＳＣＡ８リピートを通じて転写されたポリアデニル化ｍＲＮＡに由来することを示した。この結果はゲノムＳＣＡ８配列の更なる分析を裏付けし、その分析はＣＴＧリピートの１０４bp３’側の共通ポリアデニル化シグナル及びＣＴＡリピートの１１２bp５’側の推定スプライシングアクセプター部位の存在を示した（図７）。
【００９１】
ＲＡＣＥの反復ラウンドを実施して全長プロセシング化ＳＣＡ８転写物を同定し、それを図８に模式的に示す。連鎖したｃＤＮＡの３’又は５’末端の両側を同定するＭａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ手順（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を利用した。ゲノム配列分析から予測の通り、多重スプライス変異体の配列決定は、ＣＴＧリピートが予測のスプライシングアクセプター部位で始まる３’末端エキソンの中に存在することを確証した。同定された最長の転写物はＣＴＧ／ＣＴＡリピートを除くと長さ１２００ntであり、そして４つのエクソンから成る。エクソンＢを有さない短めの変異体も同定された。これらの転写物は有意義なオープンリーディングフレームを有さず、また公知のコード配列との有意義な相同性を有さない。
【００９２】
驚くべきことに、長さ３kbまでの転写物の独立のセットが、ＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥ手順をＳＣＡ８転写物の５’エキソンＤ由来のプライマーを利用して実施したときに同定された。配列決定はこれらのポリアデニル化ｃＤＮＡが長いオープンリーディングフレームを有するが、ＳＣＡ８転写物とは反対方向で転写されたｍＲＮＡに由来することを示した。これらの転写物に特異的なプライマーを利用する反復した５’ＲＡＣＥ分析はエキソンＤ及びＣの接点に非常に近いＳＣＡ８転写物のエクソンＤ内に属する５’末端を同定した（図７参照のこと）。これらのデーターはＳＣＡ８転写物が、そのプロセシングされた形態において３．４kbのｍＲＮＡと５１６bpの重複を有する点で天然のアンチセンスＲＮＡであることを示唆する。５１６塩基対の重複はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の最初の５１６ヌクレオチドに対応する。ＳＣＡ８  ＣＴＧリピートはアンチセンスの中にあるが、センス転写物の中にはない。
【００９３】
センスｍＲＮＡ内のオープンリーディングフレームは長さが５４７個のアミノ酸であり、且つ環抗管のアクチン結合成分であるドロソフィラ・ケルヒ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｋｅｌｃｈ）タンパク質（Ｄ．Ｎ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３８，７９９−８１０（１９９７））との高い相同性を有するタンパク質をコードする。この新しいコード配列を脳ケルヒ−関連タンパク質（Ｂｒａｉｎ  Ｋｅｌｃｈ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＫＲＰ）と命名する。ＢＫＲＰは配列分析からケルヒ及び多数のジンクフィンガータンパク質の中に存在するＰＯＺ／ＢＴＢタンパク質：タンパク質相互作用ドメインを有することが予測され、そしてケルヒのアクチン結合ドメインを構成するものと考えられる６つの「ケルヒモチーフ」リピートも有するものと予測される。ＢＫＲＰは環状管に対するケルヒの局在化の時期を担うケルヒのアミノ末端に対する相同性を有さない。ＢＫＲＰのドメイン組織は最近発表されたケルヒ関連神経特異的ヒトコード配列ＮＲＰ／Ｂ（Ｔ．Ａ．Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４１，５５３−６６（１９９８））及び本質的に同一のマウスコード配列ＥＮＣ−１（Ｍ．Ｃ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，３０３８−５１（１９９７））のそれと非常に似ている（ＢＫＲＰはこれらのタンパク質と同一性２８％及び類似性４８％である）。脊椎動物における神経誘導の特異的な分子マーカーとして同定されたＥＮＣ−１タンパク質はアクチン細胞骨格の構造に関与するものと仮定され、そして神経過程情報に関与することの示されているＮＲＰ／Ｒは核マトリックスタンパク質であると信じられている。
【００９４】
５０人の成人及び胎児組織由来の標準化量のｍＲＮＡで作った多重組織ブロット（ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｂｌｏｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び８の脳式組織から作ったノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ  II，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から作ったノーザンブロットをＢＫＲＰ  ｍＲＮＡ及びＳＣＡ８アンチセンス転写物に特異的なプローブで順次プロービングした。
【００９５】
ＳＣＡ８プローブはドットブロット上に示されているほとんどの組織から非常に弱いシグナルを検出したが、このシグナルのレベルの低さはその他の転写物とのバックグランドハイブリダイゼーションから明確に区別できなかった。ＳＣＡ８  ｃＤＮＡが小脳ｍＲＮＡからＰＣＲベース法により作られたという事実とは関係なく、ＳＣＡ８プローブはノーザンブロット上の転写物を明確に検出できなかった。ポリＡ+ ドットブロットのＢＫＲＰプロービングは黒質由来のｍＲＮＡにおける最大レベルの転写物、小脳、前葉及び視床下部核における低めのレベルの発現、そして延髄、腎臓及び肺における更に低いレベルを検出した。全胎児脳由来のｍＲＮＡは全成人脳由来のｍＲＮＡよりも有共に高いレベルのＢＫＲＰ転写物を含んだ。長さ約３．５kbの単一のＢＫＲＰ転写物がノーザンブロット上で、小脳、延髄及び前葉由来のｍＲＮＡの中で検出され、大脳皮質、骨髄、後頭極、側頭葉及び被殻由来のｍＲＮＡでは検出されなかった。
【００９６】
配列表の説明
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はエクソンＤ，Ｃ，Ｂ及びＡを含んで成る人工配列：ｃＤＮＡである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３はエクソンＥ，Ｃ及びＡを含んで成る人工配列：ｃＤＮＡである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜９及び１１〜１８は人工配列：プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０はＢＫＲＰ転写物由来の人工配列：ｃＤＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＣＡ８拡張ＣＴＧリピートのＲＡＰＩＤクローニングを示す。
ａ）優性遺伝運動失調症を有する個体から単離したＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡの２Ｄ−ＲＥＤ分析（星付きの個体は図２の家系Ａ）。構築されたＲＥＤ生成物のサイズをパネルの横に示し、そしてＲＥＤ生成物を構築した４つの画分をパネルの下に示す。ＲＥＤ３０，ＲＥＤ７０及びＲＥＤ４０生成物を構築したゲノムＤＮＡサイズ画分は多くの疾患を有する個体に存在する大きな非病理性「バックグランド」ＣＴＧリピートを含む。ＲＥＤ８０  ＣＴＧ拡張を含むサイズ分画（星印で示す）はこの運動失調症患者に固有であり、従って記載の通りにクローニングした。
ｂ）ＲＥＤ陽性一次クローンプールに由来するＣＴＧ濃厚クローンプールのＲＥＤ分析（方法の欄参照のこと）。各プールは３６人の個体のクローンに由来するＤＮＡを含む。プール９の中の個別のクローン由来のプラスミドＤＮＡのＲＥＤ分析は拡張ＣＴＧリピートを含む２つのクローンを同定した。これらのクローンの配列分析は８０組の中断のないリピートを有する拡張したＣＴＧトラクトを示した。
【図２】ＳＣＡ８  ＣＴＧリピート拡張についての５組の運動失調症家系を示す。べた塗り記号は運動失調症を有する個体を示し、点付き記号はＣＴＧ拡張が遺伝されているが運動失調症の臨床的に発症していない個体を示す。拡張したアレルのＣＴＧリピート長は記号の下に示す。拡張ＣＴＧの単離された患者を家系Ａの中で黒を付けて示す。家族Ｅ内で見つかったＣＴＧリピート拡張の配列の中断は、Ｖ：１５及びＶ：１６により寄与される拡張アレルをその子孫から区別することを可能にする。「Ｍ」又は「Ｐ」はＣＴＧ拡張を含むアレルが母方又は父方遺伝のそれぞれであることを示す。
【図３】危険性のあるアレル及び正常アレルのＳＣＡ８  ＣＴＧのＰＣＲ分析。疾患を有する及び危険性のある個体におけるＳＣＡ８アレルのＰＣＲサイズ決定。拡張（Ｅ）及び正常（Ｅ）アレルはパネルの核に示す。Ｍ１３のサイズのはしごをサイズ対比のために含ませている。
【図４】図３と同様、危険性のあるアレル及び正常アレルのＳＣＡ８  ＣＴＧのＰＣＲ分析。コントロール染色体（ｎ＝６９２）とＳＣＡ８アレルとの間でのリピート領域長の分布を示す。安定に遺伝した多形態ＣＴＡ（３〜１７リピート）はＣＴＧストレッチの５’末端に位置する。
【図５】母方及び父方遺伝についてのリピート数の世代間変動。リピート変異をＣＴＧリピート単位の減少（−）又は増加（＋）で示す。母方遺伝は灰色の棒で示し、そして父方遺伝は黒色の棒で示す。
【図６】発症年令と拡張アレルのＣＴＧリピート長との関係の相関係数ｒ＝−０．３３１６５が計算され、発症分の変動のわずか１１％（ｒ2 ＝０．１１）が疾患染色体上のＣＴＧリピート長に原因しうることを示す。
【図７】ＳＣＡ８リピート領域のゲノム（ａ）及びｍＲＮＡ（ｂ）の内容を模式的に示す。
ａ）ＣＴＧ拡張のゲノムの内容。ＣＴＡ及びＣＴＧリピートのコンホメーションをＲＡＰＩＤクローニングにより単離されたリピート拡張について示す（「リピート領域」）。ＣＴＧ鎖のみ示す。スプライシングアクセブター部位はＣＴＧ拡張の５’側のゲノム配列の中にあり、そして共通ポリアデニル化シグナルはリピートの３’側の配列にある。ＳＣＡ８リピートはＣＴＧ方向で転写され、そして完全にプロセシングされたアンチセンス転写物の中にある。水平線分はｃＤＮＡ配列を示し、そして鉛直線分はおよそのスプライシング接点を示す。ＳＣＡ８転写物を４つのエクソン（Ａ〜Ｄ）と一緒に示すが、エクソンＤ，Ｂ及びＡ、又はエクソンＥ，Ｃ及びＡのみを含むスプライス変異体も単離された（エクソンＥは示さない）。エクソンＤは反対方向で転写されたｍＲＮＡの５’ＵＴＲに対して相補性である。
【図８】ヌクレオチド配列を示す。
Ａ）ＳＣＡ８のリピート領域を含むゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメントである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
Ｂ）ＳＣＡ８コード配列のｍＲＮＡである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。これらのｍＲＮＡはエクソンＤ，Ｃ，Ｂ及びＡを含む。
【図９】図８の続きである。
Ｃ）ＳＣＡ８コード配列のｍＲＮＡである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。このｍＲＮＡはエクソンＥ，Ｃ及びＡを含む。
【図１０】図９の続きである。
Ｄ）ＢＫＲＰ転写物の３’非翻訳領域由来の約７００bpのｃＤＮＡプローブを示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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