(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸菌を同定するためのプライマー対であって、（１）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（２）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（３）配列番号：４で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（４）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：７で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（５）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：８で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（６）配列番号：９で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１０で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（７）配列番号：１１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（８）配列番号：１３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１４で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対からなる群から選択されるいずれかのプライマー対。
【請求項２】
検体中の好酸菌を同定する方法であって、（１）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（２）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（３）配列番号：４で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（４）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：７で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（５）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：８で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（６）配列番号：９で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１０で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（７）配列番号：１１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（８）配列番号：１３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１４で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対からなる群から選択される少なくとも１種のプライマー対を用いてＰＣＲ法を実施する、好酸菌の同定方法。
【請求項３】
好酸菌がアリサイクロバシラス・アシドカルダリアスであり、用いられるプライマー対が（１）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（２）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（６）配列番号：９で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１０で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２に記載の好酸菌の同定方法。
【請求項４】
好酸菌がアリサイクロバシラス・アシドテレストリスであり、用いられるプライマー対が（３）配列番号：４で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（７）配列番号：１１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の好酸菌の同定方法。
【請求項５】
好酸菌がアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカスであり、用いられるプライマー対が（４）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：７で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（５）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：８で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（８）配列番号：１３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１４で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の好酸菌の同定方法。
【請求項６】
好酸菌がアリサイクロバシラス・アシドカルダリアス、アリサイクロバシラス・アシドテレストリスおよびアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカスからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、用いられるプライマー対が下記３群のそれぞれに属する少なくとも１種ずつである請求項２に記載の好酸菌の同定方法。
１群：（１）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（２）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（６）配列番号：９で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１０で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対２群：（３）配列番号：４で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（７）配列番号：１１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対３群：（４）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：７で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対、（５）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：８で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対および（８）配列番号：１３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１４で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対。
【請求項７】
検体が飲料である請求項２〜６のいずれかに記載の好酸菌の同定方法。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明は、好酸菌、特にアリサイクロバシラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する好酸菌に特異的な配列を有する核酸プライマー、および該核酸プライマーを用いて上記好酸菌を同定する方法に関する。
背  景  技  術
液性が酸性領域にある飲料、例えば果汁ジュース、乳酸菌飲料などでは、一般に細菌は生育し難く、従ってそれらの生育し難い細菌による汚染の問題はない。しかしながら、酸性領域で生育可能な好酸菌による汚染、特に通常の加熱殺菌操作では死滅し難い耐熱性の好酸菌による汚染は、重大な問題となる。
従来より、これらの飲料において問題となる好酸菌による汚染の検査法、そのための培地などがいくつか提案されている。例えば特開平８−１４０６９７号公報には、耐熱性好酸菌の検出用選択培地およびその検出法が開示されている。また特開平８−１４０６９６号公報には、果汁中で増殖性を持つ耐熱性好酸菌の検出法が提案されている。
しかしながら、これらの提案された方法における菌の検出は、いずれも菌体の脂肪酸組成の分析などの生化学的性状を試験する方法により行われている。この性状試験には時間と手間がかかる欠点がある。その上、検出された菌体の同定は、一般的生物学的試験により行われており、この生物学的試験にも多大な時間と煩雑な工程、操作が必要である。
最近、上記方法に代わって、特定の好酸菌について、その遺伝子の塩基配列の一部をプライマーとして利用してＰＣＲ法によってＤＮＡ解析を行い、飲料試料中に好酸菌が混入しているか否かを迅速且つ簡便に検出する方法が提案された（特開平１０−２３４３７６号公報参照）。
しかしながら、この方法に利用されるプライマーは、一つの耐熱性好酸菌が有するω−シクロヘキサン脂肪酸生合成に関与する酵素をコードする核酸配列の一部を有するものである。このプライマーを利用する方法で検出できる菌は、上記ω−シクロヘキサン脂肪酸生合成に関与する酵素を産生する能力を有する菌に限定される。即ち、この方法は、好酸菌を検出する方法というよりはむしろ、好酸菌であるか否かとは無関係に、特定の酵素産生能を有する菌を検出する方法である。しかるに、好酸菌と上記特定酵素の産生能とは直接関連はない。即ち、飲料などの汚染の原因となる好酸菌が共通して上記特定酵素産生能を有する訳ではない。一般に汚染原因となる好酸菌の大部分は、上記特定酵素産生能を有していない。このように、前記方法による検出結果から、飲食品の汚染による障害、例えば不快臭などの発生を予知することはできない。
以上のように、前記提案された方法は、飲料などの試料中に混入して、これを汚染するおそれのある好酸菌の検出法としては不適切である。被検飲料検体が安全であるか否か（有害な好酸菌による汚染があるか否か）を確認することはできない。しかも、この方法では好酸菌に属する種の同定はできない。
本発明は、好酸菌の選択的検出方法および同定方法を提供することを目的とする。
発  明  の  開  示
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、飲料などの検体中に混入するおそれのある有害な好酸菌の遺伝子に特異的な塩基配列をもとにしたプライマーの合成に成功するとともに、該プライマーを利用するＰＣＲ法によって、検体中に混入する有害な好酸菌を迅速かつ簡便に検出および同定し得る方法の開発にも成功し、ここに本発明を完成するに至った。
本発明は、配列番号：１乃至：１４のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーを提供する。
また本発明は、好酸菌の同定のためのプライマー対であって、下記（１）〜（８）に示されるいずれかのプライマー対を提供する。
（１）配列番号：１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（２）配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（３）配列番号：４で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：５で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（４）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：７で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（５）配列番号：６で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：８で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（６）配列番号：９で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１０で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（７）配列番号：１１で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１２で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対
（８）配列番号：１３で示される塩基配列からなる核酸プライマーと配列番号：１４で示される塩基配列からなる核酸プライマーとのプライマー対。
更に本発明は、上記（１）〜（８）の核酸プライマー対の少なくとも１種を用いて、ＰＣＲ法によって、検体中の好酸菌、特に飲料中の好酸菌、より詳しくはアリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）およびアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）のいずれか少なくとも１種を同定する方法を提供する。該好酸菌の同定方法は、更に詳しくは、下記（ａ）〜（ｃ）の態様を含んでいる。
（ａ）前記（１）、（２）および（６）に記載のプライマー対の少なくとも１種を用いて、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアスを同定する態様
（ｂ）前記（３）および（７）に記載のプライマー対の少なくとも１種を用いて、アリサイクロバシラス・アシドテレストリスを同定する態様
（ｃ）前記（４）、（５）および（８）に記載のプライマー対の少なくとも１種を用いて、アリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカスを同定する態様
特に、本発明は一度のＰＣＲによって、上記（ａ）〜（ｃ）を実施する方法を提供する。この方法は、本発明プライマー対のそれぞれが、いずれも同一ＰＣＲ条件下に前記３種の好酸菌のいずれかの所望の遺伝子領域を増幅させ得る性能を有することに基づいている。この方法に際して、例えば多穴プレートなどを利用してその各ウエル中に、上記３種の好酸菌のそれぞれに特異的な３種の本発明プライマー対を入れて、同一検体をＰＣＲ反応に供すれば、一度のＰＣＲ反応によって３種の好酸菌を同時に検出および同定することができる。かくして、検体中に混入するおそれのある有害な好酸菌を容易且つ迅速に確認することができる。即ち、この方法によれば、検体が汚染されているか否かを容易且つ迅速に予知することができる。
本発明による同定方法は、検体中に存在する好酸菌のＤＮＡが本発明核酸プライマーとハイブリダイズするか否かをＰＣＲ法にて調べることにより、検体中の好酸菌（アリサイクロバシラス属の特定微生物）の存否を決定する。
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号による表示法に従うものとする。
以下、本発明による核酸プライマー、プライマー対および好酸菌の同定方法につき順次詳述する。
本発明核酸プライマーは、配列番号：１〜１４で示されるいずれかの塩基配列からなることを必須とする。ここで、各配列番号で示される塩基配列は、基本的には、好酸菌１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列の部分配列に対応している。
本発明者は、各種好酸菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に着目し、この遺伝子の特定部分の塩基配列またはこれと相同する塩基配列、即ち上記１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列を有するプライマーを利用することにより、目的とする好酸菌を特異的に同定することが可能となることを見出した。
この１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、蛋白質合成に重要な細胞内小器官であるリボソームの構成成分であるリボソームＲＮＡをコードする遺伝子であり、全ての微生物に存在する。
飲料中に混入するおそれのある有害好酸菌であるアリサイクロバシラス属微生物についても、上記１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子自体は知られている。例えばアリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ，ＡＴＣＣ２７００９）については、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２として登録されたＤＳＭ４４６株由来の１５４８ｂｐが知られている〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４２（２），２６３−２６９（１９９２）〕。アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）については、北大山崎助教授の博士論文に示された寄託菌ＡＴＣＣ４９０２５の１６ＳリボソームＲＮＡ（１５２２ｂｐ）が知られている。また、アリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ，ＡＴＣＣ４９０２８）については、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８として登録された１５３７ｂｐが知られている〔Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１  ３２５−３２７（１９９０）〕。
これら１６ＳリボソームＲＮＡは、種特異的であり、従って、このＲＮＡ中の特定の部分配列は、前記飲料などの検体中に混入するおそれのある有害好酸菌の同定に有利に利用することができる。
本発明核酸プライマーの設計に関しては、増幅する領域の長さを１００〜２０００ｂｐ程度とし、プライマーの長さは、少なくとも１０ｍｅｒ、好ましくは１３〜３０ｍｅｒ程度、より好ましくは１３〜２３ｍｅｒ程度とするのがよい。
更に、２種のプライマー対のＴｍ値（「新版  バイオ実験イラストレイテッド  本当にふえるＰＣＲ」中山広樹著、秀潤社、２５頁（１９９８年６月１日第２版発行））をできるだけ近付けることが、増幅の再現性を高めるために好ましい。プライマーの塩基配列は、可能なかぎり遺伝子の塩基配列に一致させることが、増幅する遺伝子領域への特異な結合性の向上のために好ましいが、プライマーの塩基配列が完全に遺伝子の塩基配列と一致している必要はない。１もしくは数個の塩基が異なるプライマーの場合でも、遺伝子の所望の塩基配列を増幅させて好酸菌の同定を行い得る。その例としては、例えば、塩基配列：３および：８に示される塩基配列からなる各プライマーを例示できる。
本発明プライマーは、上記の条件を考慮して、公知の手段によって簡単に合成することができる。例えばホスホルアミダイト法またはトリエステル法によって化学合成することができる。また、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置、例えばパーキンエルマー社製などの自動ＤＮＡ合成装置を用いて、β−シアノエチル合成法を利用して合成することもできる。
二本鎖断片は、化学合成した一本鎖生成物を利用して、まずその相補鎖を合成し、次いで適当な条件下で該相補鎖を一本鎖生成物とアニーリングさせるか、または該一本鎖生成物に、適当なプライマー配列およびＤＮＡポリメラーゼを用いて、相補鎖を付加することによって得ることができる。
かくして得られる本発明プライマーは、特定好酸菌の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして規定することできる。ここで、ストリンジェントな条件とは、プライマーが利用される通常の条件を挙げることができる。この条件としては、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、５０℃の条件および０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中、６０℃の条件を挙げることができる。
本発明核酸プライマーの塩基配列の具体例としては、配列番号：１〜１４に示されるものを挙げることができる。ここで、配列番号：１の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＳＭ４４６の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２，１５４８ｂｐ）の１６１−１８０番目の塩基配列に相当する。また、配列番号：３の配列は、上記配列中その３番目のＡをＧに置換したものである。
配列番号：２の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＳＭ４４６の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２，１５４８ｂｐ）の５９１−６１１番目の塩基配列の相補鎖配列に相当する。
配列番号：４の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ４９０２５の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１５２２ｂｐ）の１７２−１９２番目の塩基配列に相当する。
配列番号：５の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ４９０２５の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１５２２ｂｐ）の５８７−６０９番目の塩基配列の相補鎖配列に相当する。
配列番号：６の塩基配列は、アリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８，１５３７ｂｐ）の１８６−２０７番目の塩基配列に相当する。
配列番号：７の塩基配列は、アリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８，１５３７ｂｐ）の５８３−６０３番目の塩基配列の相補鎖配列に相当する。
配列番号：８は、上記配列番号：７の１１−１４番目のｃｃｃｇをｔｔｃに置換した塩基配列である。
配列番号：９の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＳＭ４４６の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２，１５４８ｂｐ）の１６８−１８０番目の塩基配列に相当する。
配列番号：１０の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＳＭ４４６の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２，１５４８ｂｐ）の５９１−６０５番目の塩基配列の相補鎖配列に相当する。
配列番号：１１の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ４９０２５の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１５２２ｂｐ）の１７６−１９２番目の塩基配列に相当する。
配列番号：１２の塩基配列は、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ４９０２５の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１５２２ｂｐ）の５８７−６０６番目の塩基配列の相補鎖配列に相当する。
配列番号：１３の塩基配列は、アリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８，１５３７ｂｐ）の１９１−２０７番目の塩基配列に相当する。
配列番号：１４の塩基配列は、アリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８，１５３７ｂｐ）の５８３−５９５番目の塩基配列の相補鎖配列に相当する。
本発明方法に利用できる上記プライマーの組合せ（フォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対）としては、前記（１）〜（８）に記載の各プライマー対を例示できる。
本発明プライマー対の利用によれば、検体中のＤＮＡの増幅の有無を確認することにより、好酸菌（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓおよびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）を検出して、同定することができる。
本発明検査法において、検体としては、代表的には飲料を例示できる。他の検体としては、土壌、野菜、肉、菓子などを例示できる。これらの検体は、予め適当な培地で培養して得られるコロニーから釣菌して被検菌を分離しておくのが好ましい。
本発明方法によれば、まず、上記で分離された被検菌から公知のＤＮＡ抽出法、例えばフェノール抽出法などにより、ＤＮＡを抽出して試料とする。該ＤＮＡ試料の一部に特定の条件下で本発明プライマー対とＤＮＡ合成酵素を作用させてＰＣＲ反応を行う。これによって、ＤＮＡ試料中のある特定の遺伝子領域が増幅されるので、得られるＰＣＲ反応液を、例えば電気泳動法などに供して、増幅されたＤＮＡをサイズ別に分離して、ＤＮＡ増幅産物の存在を確認する。
かくして、本発明方法によれば、期待されるサイズのＤＮＡ増幅産物の存在の有無を調べることにより、検体中に好酸菌が混入するか否かを判定できる。更に、上記ＤＮＡ増幅産物の塩基配列を決定して、好酸菌の当該遺伝子領域の塩基配列と比較することによって、より信頼性の高い検出および同定が可能となる。
尚、上記ＰＣＲ反応は、常法に従い実施することができる（例えばＳｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）参照）。
また、増幅させたＤＮＡ断片の単離精製も、常法、例えばゲル電気泳動法などによることができる。
本発明プライマーおよび上記単離精製されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定も、常法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３（１９７７）〕、マキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕などに従って行うことができる。またこの塩基配列の決定は、簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて行うこともできる。
本発明プライマーは、これをプローブとして用いて、ＤＮＡハイブリダイゼーション法によって、好酸菌を同定することもできる。この方法は、例えば、検体からＤＮＡ試料を上記と同様にして調製し、ポリアミド製メンブランなどに吸着、固定し、ビオチンなどで標識したプローブとハイブリダイゼーションさせることにより実施できる。この方法によれば、被検ＤＮＡ試料がプローブと相補的であれば、上記メンブランなどの上に二本鎖が形成され、この二本鎖の標識活性を測定することにより、検定中の好酸菌を同定することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
実施例１
（１）供試菌
下記表１記載の各寄託菌を供試菌とした。
0004627951.tif 000002
（２）ＤＮＡ溶液の調製
各供試菌からインスタジーンＤＮＡピュアリフィケーションマトリックス（Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、同社マニュアルに従って、ＤＮＡ溶液を調製した。即ち、菌体１白金耳分を滅菌水８００μｌに懸濁し、遠心分離（１００００Ｇ、１０分）し、上清を除去して沈殿（菌体）を分離するという洗浄操作を、もう１回繰返した。次いで、得られた沈殿（菌体）に、インスタジーンＤＮＡピュアリフィケーションマトリックス２００μｌを添加し、５６℃で３０分間インキュベートした後、攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ使用）、煮沸（８分）により溶菌処理してＤＮＡ溶液を調製した。
（３）本発明プライマーの設計および合成
アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ）〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４２（２），２６３−２６９（１９９２）〕、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（北大山崎助教授の博士論文）およびアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ）〔Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，３２５−３２７（１９９０）〕の塩基配列から、下記表２に記載の本発明プライマーを設計し、合成した。該合成には、自動ＤＮＡ合成装置（パーキンエルマー社製）を使用した。
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（４）ＰＣＲ法による好酸菌の同定
（４−１）ＰＣＲ反応液の調製
下記表３の組成に従い、各試薬および前記（２）で調製した各ＤＮＡ溶液を、０．２ｍｌチューブ（宝酒造社製）に添加してＰＣＲ反応液を調製した。これらの操作は氷上で行った。
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（４−２）ＰＣＲ法
上記（４−１）で調製した反応液を入れた各チューブをサーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ，宝酒造社製）内のヒートブロックにセットし、下記表４に記載の温度条件でＰＣＲ反応を行った。即ち、９４℃４分の熱変性工程を行った後、９４℃３０秒、６０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを２９回行い、最後に９４℃３０秒、６０℃３０秒および７２℃５分の処理を行った。
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尚、各プライマー対としては、（Ａ）配列番号：１のプライマーと配列番号：２のプライマーの組合せ、（Ｂ）配列番号：３のプライマーと配列番号：２のプライマーの組合せ、（Ｃ）配列番号：４のプライマーと配列番号：５のプライマーの組合せ、（Ｄ）配列番号：６のプライマーと配列番号：７のプライマーの組合せおよび（Ｅ）配列番号：６のプライマーと配列番号：８のプライマーの組合せをそれぞれ使用した。また、試験は、１回目に上記（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）の各プライマー対を用いて実施し、２回目に上記（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｅ）の各プライマー対を用いて実施した。
（４−３）電気泳動
ＰＣＲ反応終了後、反応液２５μｌに６×Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）５μｌを添加し、その６μｌを１．５％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＯ３，宝酒造社製、１×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ）にて電気泳動させた（泳動装置；Ｍｕｐｉｄ，コスモバイオ社製使用）。
（４−４）観察
電気泳動後、ゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで２０分間染色し、水で１０分間洗浄した。このゲルについて、紫外線（Ｍｉｎｉ−Ｔｒａｎｓｉｌｕｍｉｎａｔｏｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）下で泳動パターンを観察し、ポラロイド写真を撮影した。
（４−５）結果
泳動結果（撮影写真）を、図１および図２に示す。
図１は、１回目の結果（プライマー対として前記（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）の組合せを使用）であり、図２は２回目の結果（プライマー対として前記（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｅ）の組合せを使用）である。図１および図２における各レーンは次の通りである。
図１：
レーンＭ  分子量マーカー
レーン１  Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ
レーン２  Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ
レーン３  Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ
レーン４  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
レーン５  Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ
レーン６  Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
レーン７  Ｃｌ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ
図２：
レーンＭ  分子量マーカー
レーン１  Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ
レーン２  Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ
レーン３  Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ
レーン４  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
レーン５  Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ
レーン６  Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
レーン７  Ｃｌ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ
上記写真結果に基づいて、各プライマー対の利用と各供試菌が検出できるか否か（＋；検出、−；検出されず）との関係を調べた。その結果を下記表５に示す。
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図１、図２および表５に示す結果より、本発明プライマー対の利用によって、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）およびアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の３種の供試菌の場合に、約４５０ｂｐ、４３０ｂｐおよび４００ｂｐの目的塩基長のＰＣＲ産物がそれぞれ生成され、それ以外の近種の場合には、ＰＣＲ産物の生成は確認できないことが明らかとなった。
このことから、本発明プライマー対のいずれかの利用によって、上記３種の好酸菌のいずれかが確実に検出および同定できることが判った。
また、上記試験は、同一ＰＣＲ条件下に行われるものであることから、３種の好酸菌のそれぞれに特異的な３種の本発明プライマー対を併用すれば、一度のＰＣＲ反応によって同時にこれら３種の好酸菌が検出および同定できることが明らかである。このことから、本発明方法によれば、検体中に混入するおそれのある有害好酸菌を選択的に、しかも容易且つ迅速に同定でき、かくしてこれら好酸菌による検体の汚染を予知できることが明らかである。
実施例２
（１）供試菌
前記表１記載の各寄託菌を供試菌とした。
（２）ＤＮＡ溶液の調製
実施例１の（２）と同様にしてＤＮＡ溶液を調製した。
（３）本発明プライマーの設計および合成
アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ６０７４２（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ）〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４２（２），２６３−２６９（１９９２）〕、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（北大山崎助教授の博士論文）およびアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５１９２８（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ）〔Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，３２５−３２７（１９９０）〕の塩基配列から、下記表６記載の本発明プライマーを設計し、合成した。該合成には、自動ＤＮＡ合成装置（パーキンエルマー社製）を使用した。
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（４）ＰＣＲ法による好酸菌の同定
（４−１）ＰＣＲ反応液の調製
前記表３の組成に従い、各試薬および上記（２）で調製した各ＤＮＡ溶液を、０．２ｍｌチューブ（宝酒造社製）に添加してＰＣＲ反応液を調製した。これらの操作は氷上で行った。
（４−２）ＰＣＲ法
上記（４−１）で調製した反応液を入れた各チューブをサーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ，宝酒造社製）内のヒートブロックにセットし、前記表４に記載の温度条件でＰＣＲ反応を行った。
尚、各プライマー対としては、（Ｆ）配列番号：９のプライマーと配列番号：１０のプライマーの組合せ、（Ｇ）配列番号：１１のプライマーと配列番号：１２のプライマーの組合せおよび（Ｈ）配列番号：１３のプライマーと配列番号：１４のプライマーの組合せを用いた。
（４−３）電気泳動および観察
ＰＣＲ反応終了後、反応液２５μｌに６×Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）５μｌを添加し、その６μｌを１．５％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＯ３，宝酒造社製、１×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ）にて電気泳動させた（泳動装置；Ｍｕｐｉｄ，コスモバイオ社製使用）。
電気泳動後、ゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで２０分間染色し、水で１０分間洗浄した。このゲルについて、紫外線（Ｍｉｎｉ−Ｔｒａｎｓｉｌｕｍｉｎａｔｏｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）下で泳動パターンを観察し、ポラロイド写真を撮影した。
（５）結果
泳動結果（撮影写真）を、図３に示す。
図３は、プライマー対として前記（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）の組合せを使用した結果を左から順にそれぞれ示すものであり、各レーンは図１におけるそれと同じである。
上記写真結果に基づいて、各プライマー対の利用と各供試菌が検出できるか否か（＋；検出、−；検出されず）との関係を調べた。その結果を下記表７に示す。
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図３および表７に示す結果より、本発明プライマー対のそれぞれの利用によって、アリサイクロバシラス・アシドカルダリアス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリサイクロバシラス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）およびアリサイクロバシラス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の３種の供試菌のそれぞれの場合に、約４５０ｂｐ、４３０ｂｐおよび４００ｂｐの目的塩基長のＰＣＲ産物が生成されることが判った。また、これら以外の近種では、ＰＣＲ産物の生成は確認できないことも明らかとなった。これらのことから、本発明プライマーの利用によって、上記３種の好酸菌のそれぞれが選択的に検出および同定できることが判った。
好酸菌による汚染のおそれがある飲料などを検体として上記試験を行い、その際、例えば多穴プレートなどを利用してその各ウエル中に、３種の好酸菌のそれぞれに特異的な３種の本発明プライマー対を入れて同一検体をＰＣＲ反応に供すれば、一度のＰＣＲ反応によって３種の好酸菌を同時に検出および同定することができる。このことから、本発明方法によれば、検体の好酸菌による汚染を容易且つ迅速に判定できることが明らかである。
産業上の利用可能性
本発明は、好酸菌に特異的な核酸プライマーを提供する。本発明プライマーを利用することにより、飲料などの検体の汚染原因菌である好酸菌を選択的に、しかも容易且つ迅速に検出および同定することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明プライマー対を用いた好酸菌同定試験における、ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図面である。
図２は、本発明プライマー対を用いた好酸菌同定試験における、ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図面である。
図３は、本発明プライマー対を用いた好酸菌同定試験における、ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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