(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ｌを含有している脂質膜を作製する方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａおよび以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
を脂質膜上に共存させる工程を包含する、作製方法。
【請求項２】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ｌを発現している形質転換体を作製する方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａおよび以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
を細胞に共発現させる工程を包含する、作製方法。
【請求項３】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａおよび以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
を脂質膜上に共存させる工程を包含する、方法。
【請求項４】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ｌの作働薬または拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａおよび以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
を脂質膜上に共存させてタンパク質複合体を生成する工程、ならびに
該タンパク質複合体を候補因子とともにインキュベートする工程
を包含する、方法。
【請求項５】
細胞内Ｃａ２＋濃度を測定する工程、または細胞内イノシトールリン酸の代謝を測定する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａを発現している形質転換体を作製する方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａが発現している細胞において、以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
の発現を抑制する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが内因性タンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドの発現を阻害する工程が、ＲＮＡｉ法によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡｉ法が、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを導入することによって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、外因性のＧタンパク質共役型受容体α１Ａを発現させている形質転換体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａが発現している細胞において、以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
の発現を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａの作働薬または拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
Ｇタンパク質共役型受容体α１Ａが発現している細胞において、以下のポリペプチド：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは
（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体α１Ａのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド
の発現を阻害する工程、ならびに
該細胞を候補因子とともにインキュベートする工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
細胞内Ｃａ２＋濃度を測定する工程、または細胞内イノシトールリン酸の代謝を測定する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体およびその利用に関するものであり、より詳細には、特定のタンパク質と複合体を形成することによりリガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体での反応の多くは、細胞外の情報が細胞内に伝播されることにより引き起こされる。膜受容体は、細胞外の情報を細胞内に伝達する入り口の１つであり、７つの細胞膜貫通部を有しているＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）がよく知られている。【０００３】
ＧＰＣＲはリガンド（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アミン類など）が結合すると、三量体Ｇタンパク質を介してその情報を細胞内に伝達する。ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質はＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑなどに分類され、それぞれ対応するエフェクター経路（例えば、ｃＡＭＰ経路、ｃＧＭＰ経路、ＰＬＣ経路など）が異なる。例えば、α１アドレナリン受容体は主としてＧｑと共役してエフェクター系であるホスホリパーゼＣ系を促進して、ジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸を増加させ、細胞内Ｃａ２＋を増加させ、α２アドレナリン受容体はＧｉと共役してアデニル酸シクラーゼ系を抑制し、ｃＡＭＰを減少させる。また、βアドレナリン受容体はＧｓと共役してエフェクター系であるアデニル酸シクラーゼ系を促進させ、ｃＡＭＰを増加させる。【０００４】
ＧＰＣＲの生体内での局在は、各受容体によって異なる。例えば、α１アドレナリン受容体は、血管平滑筋、前立腺などに局在し、これらの収縮に重要である。また、脳などの中枢神経系にも分布していることも知られている。βアドレナリン受容体は、心臓、脂肪組織などに局在し、心拍増加、脂肪分解に重要である。【０００５】
ＧＰＣＲを介する情報伝達系は、生体の恒常性を制御するとともに、種々の疾患の発症に関与することが知られている。よって、特定の疾患の発症に関与するＧＰＣＲを同定し、この受容体の活性を調節する薬剤（アゴニスト、アンタゴニストなど）を開発することは、疾患治療に非常に有効である。
【非特許文献１】Muramatsu, I. et al. Br. J. Pharmacol., 99: 197 (1990)
【非特許文献２】Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 (1995)
【非特許文献３】Morishima, S. et al. J. Urol. 117: 377-381 (2007)
【非特許文献４】Molenaar, P. and Parsonage, W.A. Trends Pharmacol. Sci., 26: 368-375 (2005)
【非特許文献５】Samaha, A.N. et al., J. Neurosci. 27: 2979-2986 (2007)
【発明の開示】
【０００６】
ＧＰＣＲに関する研究はかなり進んでおり、これまでに数多くのＧＰＣＲが同定されている。しかし、表現型が知られていても実体が不明であるＧＰＣＲも存在する。例えば、α１アドレナリン受容体は、その遺伝子からα１Ａ、α１Ｂ、α１Ｄの３つのサブタイプに分類されるが、α１アドレナリン受容体において、これらとは異なる表現型（薬理学的な特性）を示すサブタイプ（α１Ｌ）が同じ遺伝子から発現することが知られている。具体的には、このα１Ｌサブタイプは、代表的なα１遮断薬（例えば、ｐｒａｚｏｓｉｎ）に対する親和性が低く、組織片結合法を用いてのみその活性を検出し得る（非特許文献１〜３参照）。また、β１アドレナリン受容体においても、異なる表現型を示すサブタイプ（β１Ｈおよびβ１Ｌ）が同じ遺伝子から発現することが知られている（非特許文献４参照）。このようなサブタイプは表現型のみが知られており、その実体は不明である。同様のことが、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体またはエンドセリン受容体においても指摘されている（非特許文献５等参照）。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、実体が明らかにされていないＧタンパク質共役型受容体の機能を解析する技術を提供することにある。
【０００８】
本発明に係るタンパク質複合体は、Ｇタンパク質共役型受容体と、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチドとが、結合していることを特徴としている。
【０００９】
また、本発明に係るタンパク質複合体の作製方法は、Ｇタンパク質共役型受容体と、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチドとを、脂質膜上に共存させる工程を包含することを特徴としている。
【００１０】
上記構成を有することにより、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変することができる。すなわち、本発明に係るタンパク質複合体の作製方法は、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する方法でもあり得る。
【００１１】
本発明に係る脂質膜は、上記タンパク質複合体を含有していることを特徴としている。本発明に係る脂質膜の作製方法は、Ｇタンパク質共役型受容体と、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチドとを、脂質膜上に共存させる工程を包含することを特徴としている。
【００１２】
さらに、本発明に係る形質転換体は、上記タンパク質複合体を発現していることを特徴としている。本発明に係る形質転換体の作製方法は、上記タンパク質複合体を発現させる工程を包含していることを特徴としており、好ましくは、Ｇタンパク質共役型受容体をコードする遺伝子および上記ポリペプチドをコードする遺伝子を、細胞に導入する工程を包含する。
【００１３】
上記構成を有することにより、本発明は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体の機能解析を容易にする。
【００１４】
本発明に係るスクリーニング方法は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体の作働薬または拮抗薬をスクリーニングするために、〔Ｉ〕Ｇタンパク質共役型受容体と、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド、とを、脂質膜上に共存させてタンパク質複合体を生成する工程、ならびに〔ＩＩ〕このタンパク質複合体を候補因子とともにインキュベートする工程、を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法は、細胞内Ｃａ２＋濃度を測定する工程、または細胞内イノシトールリン酸の代謝を測定する工程をさらに包含することが好ましい。
【００１５】
本発明に係る形質転換体の作製方法は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体を発現している形質転換体を作製するために、Ｇタンパク質共役型受容体が発現している細胞において、以下のポリペプチド：（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは、（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド、の発現を抑制する工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
上記構成を有することにより、本発明は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体の機能解析を容易にするとともに、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変することができる。すなわち、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する方法でもあり得る。
【００１７】
本発明に係る作製方法において、上記ポリペプチドは内因性タンパク質であることが好ましく、上記ポリペプチドの発現を阻害する工程はＲＮＡｉ法によって行われることが好ましい。また、上記細胞は、外因性のＧタンパク質共役型受容体を発現させている形質転換体であってもよい。
【００１８】
本発明に係るスクリーニング方法は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体の作働薬または拮抗薬をスクリーニングするために、〔Ｉ〕Ｇタンパク質共役型受容体が発現している細胞において、以下のポリペプチド：（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは、（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド、の発現を阻害する工程、ならびに〔ＩＩ〕該細胞を候補因子とともにインキュベートする工程、を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法は、細胞内Ｃａ２＋濃度を測定する工程、または細胞内イノシトールリン酸の代謝を測定する工程をさらに包含することが好ましい。
【００１９】
本発明において、上記タンパク質複合体を構成するＧタンパク質共役型受容体は、アドレナリン受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体またはエンドセリン受容体であることが好ましく、上記アドレナリン受容体はα受容体であってもβ受容体であってもよい。また、上記ドーパミン受容体はＤ２受容体であるであることが好ましい。なお、上記α受容体はα１受容体であることが好ましく、さらにはα１Ａサブタイプであることがより好ましく、好ましい実施形態において、本発明に係るタンパク質複合体は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプまたはβ１Ｌサブタイプである。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】種々の濃度の［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎの、α１Ｌ細胞に対する飽和結合曲線を示す図である。
【図２】（ａ）は、α１Ｌ細胞およびα１Ａ細胞のｐｒａｚｏｓｉｎに対する感受性を示す図である。（ｂ）は、α１Ｌ細胞、α１Ｌ細胞のホモジネートおよびα１Ａ細胞のホモジネートを用いた、ｐｒａｚｏｓｉｎに対する感受性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
〔１：タンパク質複合体〕
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と特定のポリペプチドとのタンパク質複合体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「複合体」は複数の物質があわさって一体をなしているものが意図され、「複合体化」は「一体化」と交換可能に使用される。なお、複合体を形成する複数の物質は、近接して相互作用していればよく、互いに結合していても結合していなくてもよい。好ましい実施形態において、本発明に係るタンパク質複合体は、ＧＰＣＲと特定のポリペプチドとが近接して相互作用している状態であり、その結果、リガンド親和性が改変されたＧＰＣＲとして機能する。【００２３】
本明細書において、特定のポリペプチドと相互作用してリガンド親和性が改変されるＧＰＣＲとしてアドレナリン受容体（特に、α１Ａサブタイプ）を例に挙げて本発明を説明するが、本発明を構成するＧＰＣＲはアドレナリン受容体に限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、当業者であれば、本発明を構成するＧＰＣＲの配列情報を容易に入手し得る。【００２４】
受容体として最も初期に同定されたアドレナリン受容体（ＡＲ）は、生体において最も重要な受容体の１つであり、自律神経系（交感神経系）の働きを司ることが知られている。アドレナリン受容体は、アドレナリン、ノルアドレナリンなどが結合することにより、様々な部位において平滑筋の収縮および代謝の亢進を引き起こし、血圧および脈拍の上昇、瞳孔の散大、血中ブドウ糖の上昇といった生体反応を惹起する。【００２５】
研究の進歩や様々な新しい薬物の開発に伴い、アドレナリン受容体は様々なタイプに分類されることが明らかになってきた。アドレナリン受容体は、古くは、イソプロテレノール、フェントラミンなどの薬物に対する反応性の違いからα受容体とβ受容体に分類され、さらに、薬理学的なサブタイプ（α１受容体、α２受容体、β受容体）に分類された。各受容体は、組織ごとに異なった分布を示し、異なった働きをしていることが知られている。例えば、α１アドレナリン受容体は、血管平滑筋、前立腺などの収縮において特に重要な働きをすることが知られており、脳など中枢神経系にも分布して意識および情動の調節に関与していることが知られている。【００２６】
ヒトゲノム解析が終わり、多くのタンパク質の構造および機能が遺伝子レベルで示されるようになった。α１アドレナリン受容体の遺伝子においてもα１Ａ、α１Ｂ、α１Ｄの３つのサブタイプが同定された。これらの遺伝子によるサブタイプ分類は、薬理学的なサブタイプ分類とよく一致することが知られている。このように、基本的には１つの遺伝子から１種類のサブタイプ受容体タンパク質が生成されると考えられている。【００２７】
しかし、α１アドレナリン受容体において、薬理学的なサブタイプのいずれにも属さない受容体が存在することが、以前より指摘されている。この未知のα１サブタイプは、代表的なα１遮断薬（例えば、ｐｒａｚｏｓｉｎ）に対する親和性が低いため、α１Ｌサブタイプと呼ばれるが、その遺伝子は未だクローニングされていない。【００２８】
α１アドレナリン受容体の分類および薬物選択性を表１に示す。【００２９】
【表１】
0004824815.tif 000002
【００３０】
なお、表１に示した各化合物の効果についての典拠を以下に示す。
1. Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 (1995)
2. Ford, AP. et al. Mol. Pharmacol., 49: 209 (1996)
3. Murata, S. et al. J. Urol., 164: 578 (2000)
4. Hiraizumi-Hiraoka, Y. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 310: 995 (2004)
5. Murata, S. et al. Br. J. Pharmacol., 127: 19 (1999)。【００３１】
近年、薬理学的機能実験および薬理学的結合実験によって、種々の哺乳動物の下部尿路系（ヒト前立腺など）においてα１Ｌサブタイプの活性が検出されている。α１Ｌサブタイプの機能を明らかにすることは、α１アドレナリン受容体を標的とした、哺乳動物の下部尿路系に対する従来の治療をより発展させるために重要である。しかしながら、このようなα１Ｌサブタイプ活性は、組織をホモジナイズして行う従来の結合実験では検出されなかった。ホモジナイズした組織からはα１Ｌサブタイプ活性が検出されないということは、組織からのα１Ｌサブタイプの精製が非常に困難であることを意味する。α１Ｌサブタイプの実体を明らかにしない限り、α１Ｌサブタイプの機能解析、特に受容体の活性を調節する薬剤（アゴニスト、アンタゴニストなど）を開発することは非常に困難である。【００３２】
本発明者らは、実体が不明なα１Ｌサブタイプが、α１Ａサブタイプ分子に何らかの副次的な分子が結合することによって構成されていると考えた。すなわち、α１Ｌサブタイプを構成しているα１Ａサブタイプ分子とその副次的な分子は、組織をホモジナイズすることによって両者間の相互作用が解かれ、その結果、α１Ｌサブタイプがα１Ａサブタイプにその特性を変化させると考えた。鋭意検討を行った結果、本発明者らは、特定のタンパク質がα１Ａサブタイプに結合すること、およびこのタンパク質をα１Ａサブタイプとともに培養細胞に共発現させるとα１Ｌサブタイプの表現型が発現することを確認した。すなわち、本発明者らは、α１Ｌサブタイプがタンパク質複合体からなることを見出し、この複合体を構成するタンパク質を特定することにより、本発明を完成するに至った。【００３３】
一実施形態において、本発明は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプを形成するタンパク質複合体を提供する。すなわち、本実施形態に係るタンパク質複合体は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプである。本実施形態によれば、実体が明らかになったα１Ｌサブタイプの関連するあらゆる疾患に対する治療を提供することができる。【００３４】
本実施形態に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドは、ＣＲＥＬＤ（cysteine-rich with EGF-like domains）１αタンパク質としてすでに公知であり、そのミスセンス変異が房室中隔欠損に関連することが示唆されている（Gene 293: 47-57 (2002)、Am. J. Hum. Genet. 72: 1047-1052 (2003)）。このポリペプチドの配列情報はNCBIアクセッション番号NM_015513として提供され、本明細書において配列番号１（アミノ酸配列）および配列番号２（塩基配列）として示される。すなわち、本実施形態に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであってもよい。【００３５】
なお、本実施形態に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、その活性を保持した変異体ポリペプチドであってもよい。変異体ポリペプチドとしては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＰＣＲと複合体化してそのＧＰＣＲのリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチドが挙げられる。【００３６】
当業者は、当該分野の技術常識を用いれば、特定のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加した変異体ポリペプチドを容易に作製し得る。また、当業者は、本明細書の記載および技術常識に基づけば、その変異体ポリペプチドが元のポリペプチドと同じ活性を保持しているか否かを、容易に確認し得る。【００３７】
また、本実施形態に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、複合体化したＧＰＣＲのリガンド親和性を改変する活性を保持しているポリペプチドをコードする変異体ポリヌクレオチドであればよい。変異体ポリヌクレオチドとしては、例えば、（１）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、あるいは（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、またはそれ以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。【００３８】
当業者は、当該分野の技術常識を用いれば、特定のポリヌクレオチドの塩基配列において１もしくは数個の塩基を欠失、置換もしくは付加した変異体ポリヌクレオチド、特定のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る変異体ポリヌクレオチド、または特定のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有している変異体ポリヌクレオチドを容易に作製し得る。また、当業者は、本明細書の記載および技術常識に基づけば、その変異体ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが、元のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同じ活性を保持しているか否かを、容易に確認し得る。【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。【００４０】
なお、具体的なハイブリダイゼーション手順は、当該分野において周知の方法（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される。）に記載されている方法）に従って行われればよい。【００４１】
このように、本発明に係るタンパク質複合体を構成するＧＰＣＲとしてアドレナリン受容体を例に挙げて本発明を説明したが、本発明に係るタンパク質複合体は、ＧＰＣＲと、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（３）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；（４）配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；（５）配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチド；あるいは（６）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであり、かつ複合体化したＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する活性を有するポリペプチドとが、複合体化していればよいといえる。すなわち、本発明に係るタンパク質複合体を構成するＧＰＣＲはアドレナリン受容体に限定されず、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体またはエンドセリン受容体であってもよい。また、当業者であれば、本発明を構成するＧＰＣＲの配列情報を公知のデータベースから容易に入手し得るので、当業者は、本明細書の記載および技術常識に基づいて、所望のタンパク質複合体を容易に作製し得る。【００４２】
〔２：タンパク質複合体を含有している脂質膜〕
本発明はまた、ＧＰＣＲと特定のポリペプチドとのタンパク質複合体の作製方法を提供する。本発明に係るタンパク質複合体の作製方法は、ＧＰＣＲおよび特定のポリペプチドを脂質膜上に共存させる工程を包含することを特徴としている。すなわち、本発明は、タンパク質複合体を含有している脂質膜およびその作製方法を提供する。【００４３】
本発明に係る脂質膜は、上述したタンパク質複合体を含有していることを特徴としている。本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂質膜であっても、人工の脂質膜であってもよい。脂質膜が天然由来である場合、脂質膜は生体膜であることが意図され、脂質膜が人工である場合は、脂質膜は脂質平面膜またはリポソームであることが意図される。【００４４】
１つの局面において、本発明に係る脂質膜は、本発明に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体の生体膜であり得る。このような形質転換体は、上記ポリペプチドが生体膜状に発現され得るように、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを生物中に導入することによって取得される。なお、形質転換体に用いられる生物は、原核生物であっても真核生物であってもよい。【００４５】
他の局面において、本発明に係る脂質膜は、本発明に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドを含有している脂質二重層であり得る。脂質二重層は、極性脂質（特にリン脂質）が二層となった膜状の構造である。脂質二重層構造が二次元構造として安定化するのは球状であるが、末端を水分子から隔離すれば平面構造になり得る。本明細書中で使用される場合、人工的に作製される脂質二重層のうち球状のものをリポソーム、平面状のものを脂質平面膜という。当該分野において、人工的な脂質二重層は、膜タンパク質（例えば、チャネルタンパク質）の活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する際に使用されている。このように、当業者は、脂質平面膜を容易に作製し得、目的のタンパク質（ポリペプチド）を脂質平面膜に保持させ得る。また、リポソームは、ベジクルとも称される脂質人工膜であり、脂質（例えば、リン脂質）の懸濁液を激しく攪拌して分散させた後に超音波処理を施すことにより作製され得る。当該分野において、リポソームを用いた研究は広く行われており、細胞膜モデルとして利用されたり、薬物送達（ＤＤＳ）の手段の一つとして利用されたりしている。このように、当業者は、リポソームを容易に作製し得、目的のタンパク質（ポリペプチド）をリポソームに保持させ得る。【００４６】
一実施形態において、本発明は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプを含有している脂質膜を提供する。上述したように、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプは、アドレナリン受容体のα１ＡサブタイプとＣＲＥＬＤ１αタンパク質とのタンパク質複合体である。アドレナリン受容体のα１ＡサブタイプおよびＣＲＥＬＤ１αタンパク質はいずれも膜結合型のタンパク質であり、上述したように、ホモジナイズ（膜破壊）することによって互いの相互作用が解かれてしまう。すなわち、両者を脂質膜上に配置しかつ保持することにより、互いの相互作用が発現される。【００４７】
本実施形態に係る脂質膜が生体膜である場合、本実施形態に係る脂質膜の作製方法は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプを発現する形質転換体を作製する方法でもあり得、アドレナリン受容体のα１ＡサブタイプとＣＲＥＬＤ１αタンパク質とを共発現する工程を包含すればよいといえる。アドレナリン受容体のα１Ａサブタイプの配列情報はNCBIアクセッション番号U03866またはNM_000680として提供され、本明細書において配列番号３（アミノ酸配列）および配列番号４（塩基配列）として示される。すなわち、本実施形態に係るタンパク質複合体の作製方法は、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むベクターと配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むベクターとを用いて宿主を形質転換する工程を包含すればよい。【００４８】
上記ベクターは、目的のポリヌクレオチドを作動可能に連結した発現ベクターであることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結」は、目的のペプチド（またはタンパク質）をコードするポリヌクレオチドが、プロモータなどの制御領域の制御下にあって、このペプチド（またはタンパク質）を宿主中で発現し得る形態にあることが意図される。目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに「作動可能に連結」して所望のベクターを構築する手順は当該分野において周知である。また、発現ベクターを宿主に導入する方法もまた、当該分野において周知である。よって、当業者は、容易に所望のペプチドを宿主内に生成させることができる。【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体もまた意図される。形質転換の対象となる生物としても、特に限定されないが、各種微生物、植物および動物が挙げられる。なお、本発明に係る形質転換体は、少なくとも、本発明に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されており、これらのポリペプチドを発現していればよいといえる。すなわち、発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るタンパク質複合体を構成するポリペプチドが安定的に発現していることが好ましいが、目的のポリペプチドが一過性に発現するものであってもよい。なお、本実施形態に係るタンパク質複合体を共存させた形質転換体を用いれば、宿主細胞内のセカンドメッセンジャーの動態を観察することによりこの複合体の作働薬または拮抗薬をスクリーニングすることができる。【００５０】
本実施形態に係る脂質膜が人工の脂質膜である場合、本実施形態に係る脂質膜の作製方法は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプを含有している脂質平面膜またはリポソームを作製する方法でもあり得、より詳細には、アドレナリン受容体のα１ＡサブタイプとＣＲＥＬＤ１αタンパク質とを人工の脂質膜上に再構成する工程を包含すればよいといえる。当業者は、当該分野の技術常識に従えば、膜タンパク質を人工の脂質膜上に容易に再構成することができる。本実施形態に係るタンパク質複合体を共存させた人工の脂質膜を用いれば、この複合体のリガンド親和性を測定することができる。【００５１】
〔３：脂質膜の利用〕
上述した脂質膜の作製方法が、タンパク質複合体の作製方法であり得、ＧＰＣＲのリガンド親和性を改変する方法でもあり得ることを、当業者は容易に理解する。すなわち、本発明は、ＧＰＣＲのリガンド親和性を改変する方法を提供する。【００５２】
また、本発明に係る脂質膜を用いれば、リガンド親和性が改変されたＧＰＣＲの作働薬または拮抗薬をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明は、リガンド親和性が改変されたＧＰＣＲの作働薬または拮抗薬をスクリーニングする方法を提供する。【００５３】
本発明に係るスクリーニング方法は、上述したタンパク質複合体を脂質膜上に生成する工程、およびこのタンパク質複合体を候補因子とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、「インキュベートする」は複数の物質を共存させかつ互いに十分接触し得る状態に置くことが意図される。【００５４】
好ましい実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、目的のＧＰＣＲを含有している形質転換体（例えば、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプを発現させた細胞）を候補因子とともにインキュベートする工程を包含する。本実施形態に係るスクリーニング方法では、細胞におけるセカンドメッセンジャーの変動（例えば、Ｇタンパク質がＧｓまたはＧｉの場合はｃＡＭＰ量、Ｇｑの場合はイノシトール３リン酸およびＣａ２＋濃度）を測定することにより、目的のＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプ）の作働薬または拮抗薬をスクリーニングすることができる。【００５５】
アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプの作働薬は、失禁治療薬、散瞳薬、緑内障治療薬、中枢刺激薬として利用可能であり、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプの拮抗薬は、排尿障害治療薬、レイノー病治療薬、微小循環障害治療薬、降圧薬、中枢抑制薬、腎血流改善薬、利尿薬として利用可能である。また、アドレナリン受容体のβ１Ｌサブタイプは心臓病に関連し、ドーパミンＤ２受容体やムスカリン受容体は中枢神経疾患に関連することが知られているので、これらの作働薬または拮抗薬もまた有用である。【００５６】
〔４：ノックダウン細胞およびその利用〕
本発明はまた、ＧＰＣＲとタンパク質複合体を形成するポリペプチドをノックダウンした形質転換体およびその作製方法を提供する。本発明に係る形質転換体の作製方法は、内因性のポリペプチドの発現を阻害する工程を包含することを特徴としている。【００５７】
例えば、ＧＰＣＲと複合体化してタンパク質複合体を形成するポリペプチドの１つであるＣＲＥＬＤ１αタンパク質は種々の細胞に発現している。よって、内因性のＣＲＥＬＤ１αタンパク質の発現を阻害した形質転換体は、上記タンパク質複合体の機能を解析したり標的化合物（例えば、作働薬または拮抗薬）をスクリーニングしたりする際に用いるコントロール細胞として非常に有用である。本項で述べるノックダウン細胞は単独で利用されてもよいが、上述のタンパク質複合体またはタンパク質複合体含有脂質膜とともに利用されることが好ましい。なお、対象の細胞に発現しているＧタンパク質共役型受容体は、内因性であっても外因性であってもよい。【００５８】
１つの局面において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体が発現している細胞において内因性のＣＲＥＬＤ１αタンパク質の発現を阻害する工程を包含し得る。これにより、細胞に発現していたＧタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変することができる。すなわち、本発明に係る形質転換体の作製方法は、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体を発現している形質転換体の作製方法であり得、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変する方法でもあり得る。一実施形態において、本発明は、アドレナリン受容体のα１Ｌサブタイプを発現している細胞における内因性のＣＲＥＬＤ１αタンパク質の発現を阻害する工程を包含し得る。これにより、α１Ｌサブタイプの表現型を示す細胞をα１Ａサブタイプの表現型を示す細胞に改変し得る。【００５９】
内因性のＣＲＥＬＤ１αタンパク質の発現を阻害する手法としては、ＲＮＡｉ法を用いることが好ましい。ＲＮＡｉ法は当該分野において周知の技術であり、例えば、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の細胞に導入することによって内因性のＣＲＥＬＤ１αタンパク質の発現を首尾よく阻害することができる。なお、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の細胞に導入するためのベクターを用いる場合は、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスに用いることが好ましいが、これに限定されない。【００６０】
本発明はさらに、上述した形質転換体を用いることを特徴とする、リガンド親和性が改変されたＧタンパク質共役型受容体の作働薬または拮抗薬をスクリーニングする方法を提供する。【００６１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【００６２】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６３】
〔１．構築物〕
ヒトアドレナリン受容体ａｌｐｈａ−１Ａ遺伝子（ＡＤＲＡ１Ａ）を、ヒト前立腺ライブラリからＰＣＲ法を用いてクローニングした。クローニングした遺伝子は、全長１４６５ｂｐであり、ＯＲＦ配列が従来報告されているヒトａｌｐｈａ−１Ａ遺伝子（NCBIアクセッション番号：U03866またはNM_000680）と完全に一致した。また、その前後の配列も、Hirasawa et al. (1993)の報告のものと一致した。【００６４】
ＣＲＥＬＤ１α遺伝子を、ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリからクローニングした。配列決定の結果、クローニングした遺伝子は、Rupp et al. (2002)が報告したもの(NCBIアクセッション番号：NM_015513）と一致した。【００６５】
次いで、ＡＤＲＡ１Ａ遺伝子のコード領域をｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社Ｃａｔａｌｏｇ番号  ＰＴ３２６６−５）のマルチクローニングサイトＡのＥｃｏＲＩ制限酵素サイトにサブクローニングした。また、ＣＲＥＬＤ１αのコード領域をｐＩＲＥＳのマルチクローニングサイトＢのＸｂａＩ制限酵素サイトにサブクローニングした。なお、遺伝子の両端にはサブクローニングのために制限酵素のアダプターを付加した。【００６６】
〔２．形質転換体の作製〕
通常の方法で上記のベクターを増幅／精製し、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ卵巣由来細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクトの２日後より、抗生物質ジェネティシン（Ｇ４１８）  １２００μｇ／ｍｌをＤＭＥＭ培地に添加した。トランスフェクトしなかった細胞、すなわち、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００などの操作を全て同様に行い、ベクターのみを加えなかった細胞が完全に死滅するＧ４１８の濃度は、１０００μｇ／ｍｌであった。Ｇ４１８耐性細胞を１穴あたり平均０．５個の細胞が入るように希釈懸濁して、９６穴プレートに分注し、単一コロニーを選択した。この操作を３回繰り返すことにより、ＡＤＲＡ１Ａ遺伝子とＣＲＥＬＤ１α遺伝子を共発現したｓｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅ（α１Ｌ細胞）を作製した。また、コントロールとして、ＡＤＲＡ１Ａ遺伝子のみを安定発現した細胞（α１Ａ細胞）およびＣＲＥＬＤ１α遺伝子のみを安定発現した細胞（ＣＲＥＬＤ１α細胞）を作製した。【００６７】
〔３．結合実験〕
結合実験に用いた薬物とその正式化学名は以下の通り。ｓｉｌｏｄｏｓｉｎ，  ｐｒａｚｏｓｉｎ，  ｔａｍｓｕｌｏｓｉｎ，  ＲＳ−１７０５３  （Ｎ−［２−（２−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ］−５−ｃｈｌｏｒｏ−α，α−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌｅ−３−ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ），  ＢＭＹ  ７３７８  （８−［２−［４−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］８−ａｚａｓｐｉｒｏ［４，５］ｄｅｃａｎｅ７，９−ｄｉｏｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）。【００６８】
放射性リガンド［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎを用いた薬理学的結合法にてＳｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅを検討した。全細胞法ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄにて、実験を行った。即ち、実験２〜３日前にセミコンフルエントになるように細胞を播種し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後に、スクレーパーにて細胞を掻き取った。回収した細胞を、Ｋｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ溶液に再懸濁し、［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎおよび必要に応じて他の薬剤とともに、４℃で４時間インキュベートした。その後、細胞を、ポリエチレンイミンで前処理したＷｈａｔｍａｎｎ  ＧＣ／Ｆフィルタで濾過／洗浄し、液体シンチレーションカウンタにて、放射能を測定した。非特異的結合を、３０μＭ  ｐｈｅｎｔｏｌａｍｉｎｅ存在下での結合と評価した。【００６９】
〔Ａ〕全細胞法による飽和結合実験
α１Ｌ細胞に対して、種々の濃度（３０〜５００ｐＭ）の［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎの結合を調べた（図１）。図１は全細胞法で得られた飽和結合曲線を示す。［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎのα１Ｌ細胞に対する特異的結合は、最大結合量（Ｂｍａｘ）  １３４ｆｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、Ｋｄ値  ８４３ｐＭ（ｐＫＤ＝９．１）であった。【００７０】
〔Ｂ〕競合結合実験
ｓｉｌｏｄｏｓｉｎはα１Ａサブタイプとα１Ｌサブタイプにしか高親和性に結合しないことが知られている。ここで、高親和性とは、Ｋｄ値が１ｎＭ以下であることを意味する。α１Ｌ細胞に発現する受容体の薬理学的特性を同定するため、３００ｐＭ  ［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎの結合部位に対するｐｒａｚｏｓｉｎの競合結合実験を、全細胞結合実験法を用いて行った。対照には、α１Ａ細胞を用いた。上記の通り、この濃度では、［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎはα１Ａサブタイプおよびα１Ｌサブタイプにしか結合することができない。【００７１】
図２の（ａ）の競合曲線に示すように、α１Ｌ細胞は、大部分（８８％以上）の受容体が、ｐｒａｚｏｓｉｎに対して低い感受性を示した（ｐＫｉ＝７．６）。また、ＲＳ−１７０５３に対しても同様に感受性が低く、かつｔａｍｓｕｌｏｓｉｎに対しては高い感受性を有していた。また、ＢＭＹ  ７３７８に対しては、低い感受性しか示さなかった（表２）。これに対し、コントロールとして用いたα１Ａ細胞のｐｒａｚｏｓｉｎ（図２）、ｔａｍｓｕｌｏｓｉｎ、ＲＳ−１７０５３に対する感受性（ｐＫｉ値）はそれぞれ９．５、９．９、８．８と高値であり、これまで報告されているα１Ａの特性と一致した（表２）。【００７２】
【表２】
0004824815.tif 000003
【００７３】
なお、表中、α１Ｌ細胞、α１Ｌ細胞およびヒト前立腺組織片での［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎ結合に対する競合薬物の阻害定数（Ｋｉ）を、−ｌｏｇＫｉ（ｐＫｉ）の値として示す。ただし、［３Ｈ］−ｓｉｌｏｄｏｓｉｎは、飽和結合曲線より求めたｐＫＤ値（解離平衡定数）を示す（数値は３〜４例の平均値）。【００７４】
また、図２の（ｂ）には、α１Ｌ細胞とα１Ｌ細胞のホモジネートを用いてｐｒａｚｏｓｉｎに対する感受性を調べた結果を示す。ホモジネートにおいては、α１Ｌ細胞は、ｐｒａｚｏｓｉｎに対してα１Ａ細胞と同様の高い感受性を示した。この事実は、前立腺や脳などの組織をホモジナイズすると、α１Ｌ受容体が観察されなく事実とよく一致する。【００７５】
表２に、上記結果とヒト前立腺などで得られている結果を対比して示す。ＡＤＲＡ１Ａ遺伝子とＣＲＥＬＤ１α遺伝子を共発現させたα１Ｌ細胞の受容体特性は、α１Ａ受容体とはまったく異なるもので、ヒト前立腺などで報告されているα１Ｌ受容体に薬理学的特性はよく一致した。したがって、α１Ｌ細胞はα１Ａ細胞と異なり、生体でのα１Ｌ受容体を発現した細胞系と考えられた。【００７６】
〔４．細胞内Ｃａ２＋測定実験〕
さらに、α１Ａ細胞に内因性に発現している可能性のある、ＣＲＥＬＤ１αの影響を完全に取り除くために、ＲＮＡｉ法を用いて、ＣＲＥＬＤ１αの発現をノックダウンした細胞（以下、ＫＤ細胞）を作製した。ＲＮＡｉ法を用いて遺伝子発現を抑制するために、市販のpSilencerTM4.1-CMV hygro（Ambion社）に対して、その取扱説明書に従って、ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ＣＲＥＬＤ１αのｍＲＮＡのコード領域を含んだオリゴヌクレオチド（センス配列；ＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＡＣＴＴＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＧＴＣＧＣＣＴＴＴＡ：配列番号５、アンチセンス配列；ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＧＣＧＡＣＴＴＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＧＴＣＧＣＣＴＧ：配列番号６）を挿入したベクターを作製し、上述したα１Ａ細胞に上記と同様の手法でトランスフェクトした。このＫＤ細胞を用いて、蛍光色素Ｆｕｒａ−２を用いた蛍光比測光法により、ノルアドレナリンに対する細胞内Ｃａ２＋応答を調べた。ＫＤ細胞のノルアドレナリンによるＣａ２＋応答のｐＥＣ５０値は、７．９であった。一方、この細胞を、プラゾシン１０−８Ｍにて２分間予め処置しておくと、ノルアドレナリンに対するＣａ２＋応答の用量反応曲線は右方に移動し、プラゾシンのｐＫＢ値は９．３と計算された。このことから、ＫＤ細胞におけるノルアドレナリンに対するＣａ２＋応答は、α１Ａサブタイプの特性と一致した。【００７７】
このように、α１Ａサブタイプの遺伝子を発現させたＣＨＯ細胞における内因性のＣＲＥＬＤ１αの発現をＲＮＡｉ法にて抑制すると、完全にα１Ａ受容体特性を示した。なお、ＣＨＯ細胞にα１Ａサブタイプの遺伝子を発現させてＣａ２＋応答などの受容体機能を調べた実験が、これまでにいくつか存在する。しかし、それらの実験で示された受容体特性については、必ずしも一致した見解が得られていなかった。【００７８】
本発明を用いれば、実体が不明であったＧタンパク質共役型受容体を明らかにし、この受容体が関連するあらゆる疾患に対する治療を提供することができる。また、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド親和性を改変することができる。【００７９】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
α１Ｌ−ＡＲは、下部尿路系に発現していることが明らかになっており、我々の開発したα１Ｌ−ＡＲ発現細胞は、前立腺肥大や失禁などの排尿障害に対する治療薬の開発に極めて有用なものであると考えられる。また、α１Ｌ−ＡＲの関連するあらゆる疾患に対する治療薬のスクリーニング法としても、極めて有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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