(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、所望の標的DNAからRNAiライブラリーを製造する方法であって、前記（２）工程の前または後にDNA断片の他端に二重鎖断端型アダプターを接続する工程が含まれ、前記二重鎖断端型アダプターまたは前記（２）工程に記載のヘアピン型アダプターのいずれか一方にアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられており、前記制限酵素認識サイトを備えたアダプターが先に前記DNA断片に接続され、前記アウトサイドカッターの制限酵素によりDNA断片の長さが整えられて形成された端にもう一方のアダプターが接続される、方法。
（１）標的DNAをランダムに切断し、DNA断片を生成する工程、
（２）ヘアピン型アダプターを、前記DNA断片の一端に接続して、ヘアピン型のDNA断片を生成する工程、
（３）ヘアピン型のDNA断片をStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションを実行させ、インターフェアレンスRNAをコードしたiRNA発現構築物を生成させる工程。
【請求項２】
ヘアピン型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
二重鎖断端型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
プライマーエクステンション後にiRNA発現構築物を発現ベクターに接続する工程をさらに含む、請求項１記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項５】
発現ベクターが哺乳動物内で機能し得る、請求項４記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項６】
発現ベクターが宿主染色体内への組込み活性を有する、請求項４又は５記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項７】
標的DNAが、特定の遺伝子のcDNA、ｃDNAライブラリー、またはサブトラクション後のｃDNAのいずれかである、請求項１から６のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項８】
前記（１）工程において、ショットガンクローニングに使用し得るDNA消化酵素を用いて標的DNAが断片化される、請求項１記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項９】
アウトサイドカッターの制限酵素が、少なくとも第一のアダプター内の認識サイトから１９ｂｐ以上はなれた位置を切断する、請求項１から８のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法
【請求項１０】
Strand−displacing活性を有するポリメラーゼが耐熱性である、請求項１から９のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項１１】
Strand−displacing活性を有するポリメラーゼがBstポリメラーゼまたはVentポリメラーゼのいずれかである、請求項１から１０のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーからインターフェアレンスRNAをコードするiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、
標的DNAが発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程、
標的DNAの発現を測定する工程、を含むスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のスクリーニング方法において、
標的DNAをレポーター遺伝子と融合させた融合遺伝子として、
標的DNAの発現を測定する工程では、前記レポータータンパク質の活性を指標に標的DNAの発現が測定される、スクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーからインターフェアレンスRNAをコードするiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、
標的DNAとネガティブ選択マーカー遺伝子とを融合させた融合遺伝子が発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程と、
ネガティブ選択マーカーによる選択を実行しRNAi効果があった細胞のみを選択する工程とを含む、スクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法によりRNAiライブラリーを製造するためのキットであって、
前記ヘアピン型アダプターと、前記二重鎖断端型アダプターとを含み、
前記アダプターのいずれかにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、キット。
【請求項１６】
さらに、アウトサイドカッターの制限酵素および／またはStrand−displacing性を有するポリメラーゼを備えた、請求項１５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA発現ベクターに基づいたRNAiライブラリーの構築方法に関し、特に、標的配列に対する系統的なライブラリーを酵素的に構築する方法に関する。
本発明は、上記酵素的に構築されたRNAiライブラリーを用いて、標的遺伝子等をサイレンシングし得る適切なiRNA発現構築物を選択するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、利用可能な大量のゲノムデータ（非特許文献1-5）を利用して、機能欠失によってそれぞれの遺伝子の機能を決定するリバース遺伝学アプローチは、遺伝子と機能との関係を完全に解明するために重要な技術となっている。リバース遺伝学アプローチを実施するための技術として、遺伝子ターゲッティングによるノックアウト動物の創生、あるいはアンチセンス技法とがある。
相同的組換えによる遺伝子ターゲティング技術（非特許文献6）は、種々の遺伝子の機能を決定するために広く用いられている。しかし、そのプロセスは労力を要するために、簡便かつ広い用途に応用することができない。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドはより簡便に用いることができるが、その導入はしばしば毒性、不安定性、および非特異的作用をもたらす（非特許文献7）。
一方、二本鎖RNAによって誘発される遺伝子抑制現象であるRNA干渉（RNAi）（非特許文献８）は、通常特異的であること、その上、広範囲の生物において前例のない迅速さで遺伝子抑制体を得ることができることから遺伝子ターゲッティング技術やアンチセンス技術に代わる魅力的な方法となっている（非特許文献7,9）。RNAiは、線虫（C. elegans）におけるゲノムワイドなリバース遺伝学にも適用されている（非特許文献10）。しかし、高等脊椎動物では長い（＞30ヌクレオチド）二本鎖RNAsが有害なインターフェロン反応を誘発することから、当初RNAiの使用は無脊椎動物に限定されていた。この問題は、短鎖干渉RNA（siRNA）と呼ばれる短い（21〜23ヌクレオチド）の二本鎖RNAが、哺乳類において有害事象を引き起こすことなくRNAiを誘導するという知見によって克服された（非特許文献11）。オリゴsiRNA効果が一過性であるという特性は、siRNAまたはsiRNAを模倣した短いヘアピン構造の二重鎖RNA（shRNA）を細胞内で発現させるDNAベクターが開発されたことによって克服されている（非特許文献12-17）。
【非特許文献１】Consortium, T.C.e.S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science 282, 2012-2018 (1998).
【非特許文献２】Adams, M.D. et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287, 2185-2195 (2000).
【非特許文献３】Waterston, R.H. et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562 (2002).
【非特許文献４】Lander, E.S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921 (2001).
【非特許文献５】Venter, J.C. et al. The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351 (2001).
【非特許文献６】Capecchi, M.R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends Genet. 5, 70-76 (1989).
【非特許文献７】Opalinska, J.B. & Gewirtz, A.M. Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 503-514 (2002).
【非特許文献８】Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811 (1998).
【非特許文献９】Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D. & Sharp, P.A. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457-467 (2003).
【非特許文献１０】Kamath, R.S. & Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods 30, 313-321 (2003).
【非特許文献１１】Elbashir, S.M. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001).
【非特許文献１２】Brummelkamp, T.R., Bernards, R. & Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296, 550-553 (2002).
【非特許文献１３】Miyagishi, M. & Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
【非特許文献１４】Yu, J.Y., DeRuiter, S.L. & Turner, D.L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 6047-6052 (2002).
【非特許文献１５】Sui, G. et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520 (2002).
【非特許文献１６】Lee, N.S. et al. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
【非特許文献１７】Paul, C.P., Good, P.D., Winer, I. & Engelke, D.R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
RNAi技法の開発にもかかわらず、有効な遺伝子サイレンシング活性を有するsiRNA/shRNA発現構築物をデザインするための一般的な法則はまだなく、このため、適した構築物が同定されるまでには時間と費用を要する。
また、RNAiは特異的であると考えられたが、デザインした配列によっては「オフターゲットエフェクト」という標的以外の特定の遺伝子を抑制する現象も検出されている。そのため、オフターゲットエフェクトを回避するためには、標的遺伝子内のいずれの配列に対するｓiRNAまたはshRNAをデザインするかが重要になってきている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、系統的なスクリーニングを行い得るshRNA発現構築物のライブラリーの製造方法およびこのライブラリーを用いて所望のサイレンシング活性を有する発現構築物を選択し得るスクリーニング方法を提供することを目的とする。この目的のために、本願発明者らは、EPRIL（RNAiライブラリーの酵素的作製）と呼ばれる技術を開発した。すなわち、標的とする遺伝子等をランダムに切断して、このランダム断片の両端にアダプターを接続する。このうち、いずれか一方のアダプターをヘアピン構造とすることによりランダム断片を中央に備えたヘアピン型構造を有する断片となる。このヘアピン型構造に変換された断片をストランドディスプレイス活性を有するポリメラーゼで伸長させることにより、主としてヘアピン型二重鎖RNAを発現し得るiRNA発現構築物が製造される。【０００５】
また、本発明者らは標的遺伝子をレポーター遺伝子と融合させて、標的遺伝子のサイレンシングをレポーター遺伝子のサイレンシングを指標に選択し得るスクリーニング系、さらには、ネガティブ選択マーカーであるチミジンキナーゼ遺伝子を用いて、前記RNAiライブラリーから最も有効なサイレンシング活性を有するshRNA発現構築物を選択し得る技術を開発した。さらに本発明者らは、本発明のライブラリー作製方法がcDNAライブラリーから直接RNAiライブラリーを作製することに応用できることも示した。すなわち、本発明は以下に示す通りである。
１.  以下の（１）〜（３）の工程を含む、所望の標的DNAからRNAiライブラリーを製造する方法。
（１）標的DNAをランダムに切断し、DNA断片を生成する工程、
（２）ヘアピン型アダプターを、前記DNA断片の一端に接続して、ヘアピン型のDNA断片を生成する工程、
（３）ヘアピン型のDNA断片をStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションを実行させ、インターフェアレンスRNAをコードしたiRNA発現構築物を生成させる工程を含む、RNAiライブラリー製造方法。
２.  前記（２）工程の前または後にDAN断片の他端に二重鎖断端型アダプターを接続する工程が含まれ、
前記二重鎖断端型アダプターまたは前記ヘアピン型アダプターのいずれか一方にアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられ、
前記制限酵素認識サイトを備えたアダプターが先に、前記DNA断片に接続され、前記アウトサイドカッターの制限酵素によりDNA断片の長さが整えられて形成された端にもう一方のアダプターが接続される、上記１記載の方法。
３.  ヘアピン型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、上記２記載の方法。
４.  二重鎖断端型アダプターにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、上記２記載の方法。
５.  プライマーエクステンション後にiRNA発現構築物を発現ベクターに接続する工程をさらに含む、上記１記載のRNAiライブラリーの製造方法。
６．発現ベクターが哺乳動物内で機能し得る、上記５記載のRNAiライブラリーの製造方法。
７．発現ベクターが宿主染色体内への組込み活性を有する、上記５又は上記６記載のRNAiライブラリーの製造方法。  
８．標的DNAが、特定の遺伝子のcDNA、ｃDNAライブラリー、またはサブトラクション後のｃDNAのいずれかである、上記１〜７のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
９．前記（１）工程において、ショットガンクローニングに使用し得るDNA消化酵素を用いて標的DNAが断片化される、上記１記載のRNAiライブラリーの製造方法。
１０.  アウトサイドカッターの制限酵素が、少なくとも第一のアダプター内の認識サイトから１９ｂｐ以上はなれた位置を切断する、上記１〜９のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
１１． Strand−displacing活性を有するポリメラーゼが耐熱性である、上記１から１０のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
１２．Strand−displacing活性を有するポリメラーゼがBstポリメラーゼまたはVentポリメラーゼのいずれかである、上記１から１１のいずれかに記載のRNAiライブラリーの製造方法。
１３．上記１から１２のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリー。
１４.  上記１から１２のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーから所望のRNAi活性を有するsiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、
標的DNAが発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程、
標的DNAの発現を測定する工程、を含むスクリーニング方法。
１５．上記１４記載のスクリーニング方法において、
標的DNAをレポーター遺伝子と融合させた融合遺伝子として、
標的DNAの発現を測定する工程では、前記レポータータンパク質の活性を指標に標的DNAの発現が測定される、スクリーニング方法。
１６．上記１から１２のいずれかに記載の方法により製造されたRNAiライブラリーから所望のRNAi活性を有するsiRNA発現構築物をスクリーニングする方法であって、
標的DNAとネガティブ選択マーカー遺伝子とを融合させた融合遺伝子が発現している細胞に前記RNAiライブラリーを導入する工程、
ネガティブ選択マーカーによる選択を実行しRNAi効果があった細胞のみを選択する工程とを、スクリーニング方法。
１７．RNAiライブラリーを製造するためのシステムであって、
ヘアピン型アダプターと、二重鎖断端型アダプターとを含み、
前記アダプターのいずれかにアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトが備えられている、システム。
１８．さらに、アウトサイドカッターの制限酵素および／またはStrand−displacing性を有するポリメラーゼを備えた、上記１７記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】EPRILの概要を示す図である。（a）shRNA発現ライブラリへのcDNAの酵素的誘導の図示プロトコール。（b）酵素的誘導の過程におけるDNAsのPAGE。M、25 bpの梯子状DNAマーカー。レーン1、2および3は、第一のアダプターのライゲーションおよびMmeI消化後の産物、アダプター2-ライゲーション断片、ならびにポリメラーゼ反応後の断片を示す。それぞれのレーンに関して、産物を矢印の先で示す。
【図２】GFPをコードするcDNAから調製したRNAiライブラリによるGFP発現のサイレンシングを示す図である。（a）RNAi効率の分布を示すヒストグラム。バーは、shRNA発現構築物の数を表す。丸は、標準化した累積頻度を示す。（b）減少倍数の値によって示されるより大きい効率を有するshRNA発現構築物の分画毎の量を、減少倍数に対してプロットする。（c）個々のshRNA発現構築物の位置および効率。垂直方向の軸は、相対的な減少を表し、水平方向の軸はGFP配列の位置を表す。それぞれの短い水平方向のバーは、位置およびそのRNAi効率を表す。shRNA発現構築物の方向も同様にバーの色で示し、灰色および黒のバーはそれぞれ、ガイド配列が逆方向反復配列の5'および3'側に存在するshRNA発現構築物を示す。（d）GFP配列のそれぞれの位置に関して相対減少の平均値をプロットする（平均値±SD）。括弧内の数は、それぞれの群に関するデータの数を示す。
【図３】様々な形質導入操作によるRNAi効率プロフィールを示す図である。（a）プラスミド（左の垂直軸、黒丸）またはPCR増幅発現カセット（右の垂直軸、灰色の丸）のトランスフェクションによるGFPサイレンシングの効率を、レトロウイルス形質導入による効率と比較する（水平軸）。（b）ダイサー消化を行った（灰色の丸）および行わなかった（黒丸）場合のインビトロ転写shRNAのトランスフェクションによるGFPサイレンシングの効率を、プラスミドトランスフェクションによる効率に対してプロットする（水平軸）。
【図４】IP3R cDNAに由来するRNAiライブラリによる1型IP3R発現のサイレンシングを示す図である。（a）GFP蛍光強度に基づいて推定したRNAi効率。GFP蛍光強度の相対的減少値を示す。四角の枠は、IP3Rコード領域を表し、点は、それぞれのshRNA発現構築物の標的の位置を示す。shRNA発現構築物、SI2A5およびSI3G6に関するデータを記す。（b）shRNA発現構築物を有しない（対照）、GFP-サイレンシングshRNA発現ベクター（shGFP）を有する、またはIP3Rを標的とするshRNA発現構築物（SI2A5およびSI3G6）を有する、レトロウイルスを感染させたA7r5細胞のウェスタンブロッティング。アクチンは、ローディング対照としての役割を有する。編集した標準化IP3R発現レベルを下のパネルに示す（平均値±SEM、n＝3）。（c）IP3RターゲティングshRNA発現構築物を形質導入しない場合、およびSI2A5またはSI3G6を導入した場合の、バソプレッシンによって誘発したA7r5細胞の細胞内カルシウム反応を示す。バーはAVPの適用を示す。
【図５】効率的なRNAi構築物の選択に関するチミジンキナーゼに基づく系を示す図である。（a）選択戦略のスキーム。上の図は、選択マーカー遺伝子構築物を示す。TK-puroは、チミジンキナーゼとピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードするmRNAを示す。GCVは、GCVの毒性誘導体（GCV-ppp）に変換されて、細胞死に至る。（b）GSV選択後（左のパネル）および選択を行わない場合（右のパネル）のRNAiライブラリにおける再構成されたshRNA発現構築物の混合物によるRNAi効果。右のパネルの連続曲線は、親shRNAライブラリのデータを表す。破線の曲線は、shRNA発現構築物の形質導入を行わないGFP蛍光分布を表す。（c）GCV選択を行ったまたは行わない個々のRNAiライブラリクローンの分析。個々のクローンを、そのRNAi効率に従って四つに分類した；弱い（減少倍率値<1.5）、中等度（1.5〜2.5）、強い（2.5〜4.5）および非常に強い（>4.5）。標準化した集団は、クローンの総数に対して標準化したそれぞれの分類におけるクローンの数を表す（GCV選択を行ったおよび行っていないクローンに関してそれぞれ、n＝121および101）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
siRNA発現構築物
本発明により、所望の標的DNAからRNAiライブラリーを製造する方法が提供された。本発明で製造されるRNAiライブラリーは、哺乳動物、植物、昆虫、酵母などの遺伝学に応用し得るライブラリーである。従って、本書において「iRNA」は、哺乳動物細胞などの応用されている短い二重鎖RNA（一般に「siRNA」と呼ばれ、本書において同義でsiRNAの語を用いる）、短いヘアピン型の二重鎖RNA（これを一般に「shRNA」といい、本書においてもこの語を同義で用いる）および線虫、昆虫、植物、酵母などの遺伝子抑制に応用されているsiRNAなどと比べて長い二重鎖RNAを含む意味で用いる。
本発明のRNAiライブラリー製造方法では、第一に、標的DNAをランダムに断片に切断する工程が含まれる。ここで、標的DNAは、特定の遺伝子、複数の遺伝子、個体に含まれる遺伝子群、ゲノムあるいはｃDNAライブラリーなどであってもよい。また、ここで「遺伝子」はイントロンを含むゲノム配列であってもよく、また、ｃDNAなどであってもよい。これら遺伝子、ライブラリーなどが由来する種は、上述したようにヒトなどの哺乳動物、植物、昆虫、細菌など制限はない。【０００８】
この第一の工程では、所望の標的DNAを準備し、ランダムに断片化する。断片化する長さは、少なくともRNAiを誘導し得るRNAをコードした長さ、例えば、十数bp以上であればよい。適切な長さはサイレンシングを誘導したい細胞種により異なる。例えば、哺乳動物細胞では19〜400bp、好ましく19〜200bp、より好ましくは19〜50bpとすることができる。一方、植物や真菌などでは、例えば、500bp程度の長いiRNAでも遺伝子のサイレンシングを誘導し得る。したがって、本工程で使用し得る酵素は、上記サイレンシングを誘導したい細胞種に応じた長さあるいはそれ以上の断片を生成し得るものであればよく、また切断に用いる酵素の種類も制限はない。使用し得る酵素の例を挙げれば、DNaseIやショットガンクローニングに使用し得る制限酵素、例えば、CvilJI、HaeIII、RsaI、AluI、HpaIなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【０００９】
第二の工程は、ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドからなるアダプター（以下、「ヘアピン型アダプター」という）を用いて、上記DNA断片からヘアピン型DNAを生成する。ここで「ヘアピン型アダプター」は、上記二重鎖DNA断片の少なくとも一端をヘアピン形状につなぐリンカーとして機能するとともに、最終的に本方法で得られるiRNA発現構築物から発現されるiRNAのセンスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖とをヘアピン形状につなぐRNAリンカーをコードする。ヘアピン型アダプターは、RNA干渉を誘導するための効果的な長さであればよく、例えば、5〜50base、好ましくは6〜20baseとすることができる。ただし、ここに示す長さ以上のヘアピン型アダプターを用いることもできる。後述するiRNA発現構築物を構築する過程でトリミングして長さを調整することにより、iRNA発現構築物が生成された際に上記適切な長さに調節することもできる。また、ヘアピン部分にtRNAをコードさせたり、ハンマーヘッドリボザイムなどと組み合わせることにより、細胞内で長いヘアピンRNA部分がトリミングされて適切な長さのsiRNA等を生成し得るようにデザインすることもできる。ヘアピン型アダプターの配列は、特に限定はなく、人工的な配列、マイクロRNA由来の配列のいずれであってもよい。また、ヘアピン型アダプターは、DNAで構成することが好ましいが、RNAで構成してもよい。【００１０】
上記ランダムDNA断片にヘアピン型アダプターを付加する場合、DNA断片の末端構造を制御しなければ、一般に、DNA断片の両端にヘアピン型アダプターが結合することになる。DNA断片の両端にアダプターが結合すると後述するプライマーエクステンションの操作に支障が生じる。そのため、二重鎖DNAの一端のみにヘアピン型アダプターが結合したヘアピン型DNAを形成させるためには、DNA断片の両端にヘアピン型アダプターが結合し環状化したDNA断片の二重鎖部分を切断して、二つのヘアピン型DNAを生成することが考えられる。こうした環状化したDNA断片からへアピン型DNAを生成するためには、DNA断片に由来する二重鎖領域をランダムに切断する制限酵素を用いて切断することが一例として挙げられる。しかしヘアピン型DNAの生成効率およびヘアピン型DNAの長さの制御を行うためには、ヘアピン型アダプターの内部にアウトサイドカッターの制限酵素認識サイトを備え、二重鎖DNA領域をこの制限酵素により切断する手法を用いることが好ましい。ヘアピン型DNAの二重鎖DNA領域の長さの制御に関して、哺乳動物では19〜21bp程度の二重鎖RNAが効果的なRNA干渉を誘導し得るとされていることから、哺乳動物に適用するRNAiライブラリーの調製を行う場合にはアウトサイドカッターの制限酵素は、認識サイトから少なくとも19ｂｐ以上離れた部位を切断する酵素であることが好ましい。このような酵素としては、一例を示せば、MmeIが挙げられる。例えば、MmeIは認識サイトから20または21塩基離れた部位の二本鎖を切断する。したがって、ヘアピン型アダプターの端部にMmeIの認識サイトを備えることにより、このヘアピン型アダプターが接続しているDNA断片は、MmeI消化により、20〜21塩基のDNA断片の一端にヘアピン型アダプターが接続されたヘアピン型DNAが生成される。したがって、MmeIは、哺乳動物細胞内で標的遺伝子をサイレンシングさせる効果的な長さのiRNAをコードしたヘアピン型DNAを生成する好ましい制限酵素といえる。MmeI以外にもMmeIと同様に認識サイトから20〜21塩基離れた位置を切断する酵素は本工程において有効である。また、20〜21塩基以上はなれた部位を切断する制限酵素の場合には、アダプターの長さやアダプター内の制限酵素認識サイトの配置を調整することにより、iRNAをコードしたDNA断片の長さを所望に調整し得る。【００１１】
上記において長いへアピン型アダプターを用いた場合にはiRNA発現構築物生成過程のいずれかの過程でトリミングすることを説明したが、このトリミングの手法は、アダプターがDNAベースであるか、RNAベースであるかにより異なる。アダプターがDNAベースの場合には、アダプター内に任意のトリミング用の制限酵素認識サイトや切断サイトを設け、この制限酵素で消化、その後、ライゲーションにより再接続することにより、アダプターの長さを調整することができる。このトリミング用の制限酵素は特に限定はなく、アダプターの長さを短くし得る制限酵素であればよい。後述する実施例に示すように、認識サイトから双方向に切断を行うＢcgIを制限酵素の一例としてあげることができる。アダプター内にＢcgIの認識サイトを備えることにより、一つの制限酵素ＢcgIでアダプター内を二箇所切断することができるため、簡便にトリミングを行うことができる。また二つの制限酵素を組合わせて、アダプターの長さを調節することももちろん可能である。RNAベースのアダプターを用いた場合には、後述するプライマーエクステンションによりアダプターの領域はRNA/DNAハイブリッド二重鎖が形成される。こうしたRNA/DNAハイブリッド領域のトリミングは、先ず、RNaseＨでRNA鎖を消化し、その後一本鎖DNAを消化する酵素（ssDNA酵素）によりssDNAを消化することにより、トリミングを行うことができる。【００１２】
第三の工程は、上記DNA断片にヘアピン型アダプターが付加されて形成されたヘアピン型DNAを用いてiRNA発現構築物を生成する。上記ヘアピン型DNAの二重鎖をStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションさせることにより、相補的な配列がアダプターを挟んでヘッド−テイル結合したiRNA発現構築物が生成される。ここで、上記工程で生成されたヘアピン型DNAをそのままで、上記プライマーエクステンションによりiRNA発現構築物を生成してもよいが、好ましくはプライマーエクステンションを実行する前に、ヘアピン型DNAのアダプターが接続されていない他端を別のアダプターで保護することが好ましい。ここで末端保護用に接続するアダプターとしては、後にプライマーエクステンション操作に支障を与えない両末端が断端構造を備えたDNAアダプター（以下、便宜的に「二重鎖断端型アダプター」または「断端型アダプター」という）を用いる。このアダプターの配列は特に限定はない。また長さは、アダプターを合成するコスト等を考慮すれば、例えば5〜100base、好ましくは20〜40baseである。しかしこれ以上の長さであっても当然にDNA末端の保護が図れることから、実験操作に支障がない範囲であれば基本的に長さの上限に制限はない。【００１３】
また、断端型アダプターはDNA断片の保護目的で付加されていることから、プライマーエクステンションが完了した後に除去されることが好ましい。後に詳述するプライマーエクステンション後の断端型アダプターの除去を容易にするためには、断端型アダプターに切り出しのための制限酵素サイトあるいは切断サイトが備えられていることが好ましい。この断端型アダプターの切り出しを行い得る制限酵素は特に制限はないが、断端型アダプター配列をプライマーエクステンションにより得られるiRNA発現構築物上に残存させないためには、アウトサイトカッターの制限酵素を用いることが好ましい。例えば、後述する実施例に示すようにBpmIは認識サイトから一定距離の位置を切断する。したがって、この切断部位をDNA断片と断端型アダプターとの境界となるようにBpmI認識サイトを断端型アダプター内に設計することにより、iRNA発現構築物上から断端型アダプターをほぼ取り除き、残された粘着末端をさらにssDNA消化活性を有する酵素で消化することにより完全にアダプター配列が除去される。また、この断端型アダプター配列はiRNA発現構築物の両端に付加されているが、この両端を異なる制限酵素で切断することにより、後述するベクターへの接続方向を制御することも可能となる。後述する実施例で一例を示すように、一方の断端型アダプターをＢpmIにより、他方をＢbsIにより切除して両端の断端型アダプターを除去するとともにiRNA発現構築物の両末端の構造を制御し得るように断端型アダプターを設計することができる。【００１４】
上記断端型アダプターが接続されたヘアピン型DNAは、アダプターの末端にアニーリングし得るプライマーおよびStrand−displacing活性を有するポリメラーゼを用いてプライマーエクステンションが実施される。ここで用いるポリメラーゼは、最低限Strand−displacing活性を備えていればよいが、PCR装置を利用してこの操作を実行するためには耐熱性であることが好ましい。Strand−displacing活性を有するポリメラーゼとしては、Klenow Fragment、phi29など、さらに耐熱性を備えたものとしては、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼなどが挙げられる。また、エクステンションの条件は、使用するポリメラーゼにより適宜決定できる。例えば、Bstポリメラーゼを用いた場合の条件については、後述する実施例に一例を示す。また、ヘアピン型アダプターがRNAベースである場合には、上記Strand−displacing活性の他にも、逆転写活性を有する酵素を用いる必要がある。【００１５】
上記プライマーエクステンションを実施することにより、両末端に断端型アダプター配列を備え、その間に、ヘアピン型アダプターを挟んで標的DNAに由来するDNA断片がヘッド−テイル結合した構造を有する二重鎖DNAが形成される。この構造から末端の不要な断端型アダプター配列を除去して、iRNA発現構築物を生成する。不要な末端の断端型アダプター配列の除去は、断端型アダプター上に設けられたサイトを認識する制限酵素で切断する。制限酵素により断端型アダプターがトリミングされると、膨大なiRNA発現構築物が生成される。【００１６】
なお、iRNA発現構築物が生成されるまでの過程、アダプターの付加や制限酵素で消化した毎に、またはiRNA発現構築物が精製された最終の段階で目的とするフラグメントの精製を行って過剰なアダプターや、制限酵素で除去したいフラグメントを反応系から取り除くことが好ましい。精製の一例としては、電気泳動後のゲルから目的とする長さあるいは予想される長さの断片を抽出する方法あるいはタグなどを利用して目的のフラグメントを精製する方法が挙げられる。
上記実施形態では、標的DNAの断片化後、先に、ヘアピン型アダプターを付加し、その後に断端型アダプターを付加する例を示したが、逆の操作も可能である。【００１７】
上記において生成されたiRNA発現構築物はベクターに接続してRNAiライブラリーが構築される。ベクターとしては、本ライブラリーを適用したい細胞種によりにより選択し得るが、好ましくは大腸菌等のバクテリアで増幅が可能なプラスミド骨格を備えた発現ベクターを好適に利用し得る。こうした大腸菌等で増幅が可能なプラスミド骨格としては、例えば、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。こうしたバクテリア由来のプラスミドは大量に増幅を行うことができるため、ライブラリーの大量調製が容易であり、また、ヘアピン型アダプター配列のトリミングなどの処理を行う場合には便利である。上記バクテリア系のプラスミドには必要に応じてAmpなどの薬剤選択マーカー、栄養要求性遺伝子などを担持させることが好ましい。【００１８】
また、こうしたプラスミド骨格には実験対象の宿主に応じた発現カセットを備えることが好ましい。発現カセット内のプロモーターは宿主細胞に適したものであればよいが、哺乳動物細胞の場合にはsiRNA/shRNA等の短いRNAを発現させるためにRNAポリメラーゼIII駆動プロモーターを用いることが好ましい。RNAポリメラーゼIII駆動プロモーターとしては、マウスU6遺伝子由来のプロモーター、tＲＮＡプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ ＲＮＡプロモーター、Ｈ１ ＲＮＡプロモーターなどを挙げることができる。また、iRNA発現構築物を染色体に組み込み安定的にiRNAを発現させるためには、レトロウイルスの発現カセットを用い、このカセット内にiRNA発現構築物を組み入れることが好ましい。レトロウイルス発現カセットを用いた例としては、後述する実施例に示す。【００１９】
iRNAを発現させて動物細胞、植物細胞等でフォワードあるいはリバース遺伝学を実施するために、宿主細胞に応じたベクターを選択してもよい。例えば、哺乳動物由来の発現ベクター、例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8など、昆虫細胞由来の発現ベクター、例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8など、植物由来の発現ベクター、例えば、pMH1、pMH2など、動物ウィルス由来の発現ベクター、例えば、pHSV、pMV、pAdexLcwなど、レトロウィルス由来の発現ベクター、例えば、pZIPneoなど、酵母由来の発現ベクター、例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01など、枯草菌由来の発現ベクター、例えば、pPL608、pKTH50などが挙げられる。上記膨大なiRNA発現構築物が個別のベクターに挿入され、RNAiライブラリーが生成される。 【００２０】
ここで生成されたRNAiライブラリーは直接、フォワード、リバース遺伝学に利用し得る。その他にも、in vitroの転写系を用いて本発明のRNAiライブラリーからオリゴRNAiライブラリーを合成して、このオリゴRNAiライブラリーを生成した後にフォワード、リバース遺伝学の研究に利用してもよい。【００２１】
スクリーニング方法
本発明は、上記RNAiライブラリーから標的遺伝子の発現を抑制し得るiRNA発現構築物を保持したクローンを選択するスクリーニング方法を提供する。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、標的DNAが発現している細胞に上記方法により標的DNAから調整されたRNAiライブラリーを導入する工程と、標的DNAの発現を測定する工程、が含まれる。【００２２】
標的DNAが発現している細胞へのRNAiライブラリーの導入方法は、RNAiライブラリーを構築した際に使用したベクターにより適宜選択し得る。例えば、感染能力を有するウイルスベクターを用いた場合には、ウイルスの感染力によりRNAiライブラリーを細胞に導入する。また、プラスミドベクターの場合には、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ジーンガン法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法などから適宜選択して用いることができる。【００２３】
標的DNAの発現測定は、標的DNAの抗体を用いて蛋白質の発現量に基づいて測定してもよく、また、特定の遺伝子の活性が同定されている場合には、その活性に基づいて測定してもよい。例えば、当該標的DNAの活性として、下流の遺伝子がレギュレートされることがわかっている場合には、この下流の遺伝子の発現を測定することにより標的DNAの発現を間接的に測定してもよい。【００２４】
また、標的DNAの機能が未知であったり、活性測定が困難である場合には、標的DNAにレポーター遺伝子を接続した融合遺伝子を保持させた形質転換体を調整し、これを用いてスクリーニングを行うことが好ましい。【００２５】
例えば、レポーターとしては、蛍光蛋白質（ルシフェラーゼ、GFP、CFP、YFP、RFPなど）、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）、チミジンキナーゼ（TK）、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）などの酵素を用いることができる。こうしたレポータをコードした遺伝子に標的DNAを接続することにより、細胞内では融合遺伝子のmRNAが発現される。RNAiライブラリーから発現された標的DNAに対するiRNAは、この融合遺伝子の発現を抑制し、レポーター活性が低下することになる。したがって、このような標的DNAがレポーター遺伝子と融合された融合遺伝子を用いることにより、レポータ活性を指標にRNAiライブラリーの各クローンの標的DNAに対するサイレンシング活性を簡便に測定することが可能となる。例えば、上記蛍光蛋白質などのレポータ遺伝子に用いた場合には、蛍光蛋白質の発現の減少に基づいて、RNAiライブラリー中の各クローンのサイレンシング活性を測定することができる。一方、TKなどのネガティブ選択マーカーを用いた場合には、RNAiライブラリー中のサイレンシング活性を有しないクローンでは、TKの活性を抑制できずにガンシクロビルの添加により細胞は死滅し、一方、サイレンシング活性を有するクローンでは、TKの活性が抑制されてガンシクロビル添加によっても細胞は生存し得ることになる。このようにネガティブ選択マーカーをレポーターとして用いた場合には、サイレンシング活性を有するクローンが導入された細胞のみが選択的に生き残るため、効率よくサイレンシング活性を有するiRNA発現構築物を保持したクローンが得られる。ここで選択された細胞より、iRNA発現構築物を保持したベクターを回収することにより、標的DNA中のいなかる領域をiRNAの標的とすることが好ましいか同定することが可能となる。【００２６】
キット
本発明は、上記RNAiライブラリーの酵素的構築方法を実施するためのRNAiライブラリーキットを提供する。キットには、上述したヘアピン型アダプター、断端型アダプター、プライマーエクステンション用のプライマーおよび酵素、必要に応じてトリミングに使用する酵素、ランダムDNA断片を精製するための酵素などを含めることができる。また、iRNA発現構築物を挿入するためのベクターなども含めることができる。さらに上述したRNAiライブラリーの酵素的構築方法を実施するためのプロトコールを添付してもよい。このように本発明のライブラリー構築方法を実施するための材料をキット化することにより、より一層簡便かつ身近に本発明のRNAiライブラリー構築方法を実施することができる。
【実施例】
【００２７】
結果
RNAiライブラリーの作製
EPRILは、対象となるcDNAsからshRNA発現ベクターライブラリーを作製するために数段階の酵素処理を含む（図1a）。第一に、二本鎖DNAsをDNaseIによってほぼ無作為に断片化する（Anderson, S. Nucleic Acids Res. 9, 3015-3027 (1981)）。次に、MmeIの認識配列を含むヘアピン形状のアダプターを断片にライゲーションする。MmeIは、認識配列からそれぞれ、20および18塩基離れた部位で上部および下部の鎖を切断することが報告されているが（Boyd, A.C. et al.  Nucleic Acids Res. 14, 5255-5274 (1986)）、本発明者らは、MmeIが塩基21および19位でもDNAを切断することを発見した。したがって、MmeI消化は、標的cDNAsから20または21塩基の長さの配列を有する短い3'-突出DNA断片を生じる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、MmeI消化DNAを-40 bpのバンドとして示す（図1b）。MmeI消化後、生成された断片に第二のアダプターをライゲーションする。このアダプターは、MmeI消化物の3'突出末端が塞がれるように、一方の鎖の3'末端で二つの縮重塩基を有する。第二のアダプターをライゲーションした後、プライマー伸長反応を行って、一本鎖ヘアピンDNAを、ループ配列を介して結合された逆方向反復配列を備えた二本鎖DNAに変換する（図1）。プライマー伸長産物を適当な制限エンドヌクレアーゼによって消化して、逆方向反復配列の外側の余分な配列を除去して、下記のプラスミドベクターに挿入する。逆方向反復配列が隣接する長いループ内の余分な配列を適当な制限エンドヌクレアーゼによって除去した後、再環状化を行う。
ライブラリー構築とshRNA発現のために、本発明者らは、マウスU6遺伝子からRNAポリメラーゼIII駆動プロモーターを含むレトロウイルスベクターを有するプラスミドを用いた。shRNA発現カセットを導入するためにレトロウイルスベクターを用いることによって、安定なRNAi効果が確保される（Paddison, P.J. & Hannon, G.J. Cancer Cell 2, 17-23 (2002)）。【００２８】
GFPをコードするcDNAからのRNAiライブラリー
EPRILを評価するために、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするcDNAからshRNA発現ライブラリーを作製した。ライブラリーからの個々のクローンの配列分析により、配列データを有するクローン343個中290個が逆方向反復配列を有することが示された。これらのクローン39個は不完全な逆方向反復を有していたが、クローン251個はGFP配列に由来する19塩基またはそれ以上の長さの塩基の逆方向反復配列を有するGFPサイレンシングのための候補shRNA発現構築物であった。ほとんどのクローンの逆方向反復配列の長さは20または21ヌクレオチドのいずれかであり、クローン251個中18個（7.2％）、139個（55.4％）、および94個（37.5％）はそれぞれ、19、20、および21塩基の長さであった。第一のアダプターはDNaseI消化断片の両端に結合させることができるため、二つの異なる方向を有するshRNAを得ることができるはずである。mRNA配列と相補的であるガイド配列は、shRNAの5'または3'側にほぼ同じ頻度で存在する（54.6％対45.4％、p>0.1）。標的配列の分析から、様々なshRNA発現構築物が標的遺伝子の様々な部分から生成されたことが示された；完全な720 bpのGFPコード配列の全域に対して、独立したクローン251個から非重複shRNA発現構築物157個によって全体の96.3％がカバーされていた。このように、EPRILによって、対象となるcDNAからのshRNA発現構築物の膨大なアレイのハイスループット産生が可能となる。【００２９】
shRNA発現構築物を有するレトロウイルスを、96ウェルプレートフォーマットで個々のプラスミドから産生し、これによって本発明者らは、独立したウイルスの膨大なアレイを同時に得ることができる。GFPを発現するJurkat T細胞にも同じフォーマットでウイルスを感染させた。感染細胞のGFP発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定して、RNAi効率を定量した。shRNA発現構築物に応じてRNAi効率にかなりの変動を認めた。このように、本発明者らは、それぞれ重複していない構築物262個の測定結果からRNAi効率の分布を分析した（図2a）。構築物約56％が低いRNAi活性であった（1.5倍未満の減少）。所定の減少倍数（x）より大きいRNAi効率を有するshRNA発現構築物を発見する確率を推定するために、本発明者らは、その減少倍数がxを超えるshRNA発現構築物の分画毎の量をxに対してプロットした。おおよそ、30％が2倍を超えるRNAi効率の減少を示したのに対し、8倍を超える減少を有したのはごくわずかな割合であった。全体的な確率は、〜-1.7べき法則スケーリングで減少倍数と比例し、このことは5倍の減少効率を有するRNAi構築物を発見したい場合、例えば、15（51.7）倍多い候補構築物をスクリーニングしなければならないことを意味する。【００３０】
次に、本発明者らは、RNAi効率の領域依存性を分析した。効率的および非効率的shRNA発現構築物の双方が領域全体に分布した（図2c）。定量的分析の場合、本発明者らは、等しく亜分割した領域10個に従ってデータを分類して（図2d）、分散分析を行った。本発明者らは、有意な領域依存性を認めなかった（クラスカル・ウォリス検定；p<0.4）。特に結果は、その領域がRNAiにとって不良な基質であるというこれまでの推定にもかかわらず（Dykxhoorn, D.M. et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457-467 (2003)）、開始コドンから72 bp内の領域でさえも良好な標的として役立ちうることを示した。shRNA発現構築物の方向に関して、3'側に存在するガイド配列はより有効である、という全体的な傾向を認めた。【００３１】
RNAi効率の変動パターンは、調べた代表的な構築物10個が、HEK293またはHeLa細胞において類似の効率プロフィールを示したことから（データは示していない）、細胞タイプ非依存的である。プラスミドまたはPCR増幅した最小のshRNA発現カセットの直接トランスフェクションにより、レトロウイルス形質導入と類似のプロフィールが得られ（図3a）、ウイルス力価の差の影響は除外された。さらに、インビトロで転写されたshRNAの直接トランスフェクションによるRNAiプロフィールは、DNAに基づく発現のプロフィールと十分に相関した（図3b）。インビトロで転写したshRNAsをダイサーによって予め消化した場合でも、類似の結果を得た。これらの結果は、RNAi効率プロフィールを決定する要因が転写およびダイサー-プロセシング段階の下流に存在することを示している。
【００３２】
1型IP3受容体をコードするcDNAからのRNAiライブラリー
本発明者らは、上記の戦略が内因性の遺伝子に応用可能であるか否かを調べた。本発明者らは、標的として1型イノシトール1,4,5-三リン酸受容体（Mignery, G.A et al. J. Biol. Chem. 265, 12679-12685 (1990))（IP3R）をコードするDNAを用いた。GFPの場合と同様に、本発明者らはIP3Rに関して様々なshRNA発現構築物を得た。配列データを有するクローン256個の中で、214個はshRNA発現構築物を有することが判明し、これには異なる標的位置を有し互いに重複していない構築物199個が含まれた。有効なshRNA発現構築物を迅速にスクリーニングするために、本発明者らは、GFPおよびIP3Rのヘッド−テイル結合mRNAsを発現するレポーター構築物を保持したJurkat T細胞を作製した。shRNA発現構築物による標的mRNAの分解は、GFP蛍光の減少をモニターすることによって評価することができる（Kumar, R et al. Genome Res. 13, 2333-2340 (2003))。IP3Rを標的とするshRNA発現構築物も同様にRNAi効率を変化させた（図4a）。本発明者らは、最も有効な構築物の中で二つのshRNA発現構築物、SI2A5およびSI3G6を選択して、これらのクローンが血管平滑筋細胞株A7r5において内因性に発現されたIP3Rに関して有効なRNAiを誘導し得るか否かを調べた（De Smedt, H. et al. J. Biol. Chem. 269, 21691-21698 (1994)）。ウェスタンブロット分析によって、IP3R発現レベルが減少したことを確認した（図4b）。機能喪失はまた、バソプレッシン誘発細胞内Ca2+反応を測定することによっても確認した（図4c）。これらの結果は、EPRILが内因性の遺伝子を標的とする有効なshRNA発現構築物を検索するために有用であることを示している。【００３３】
有効なshRNA発現構築物の細胞内選択
ハイスループットスクリーニングを促進するために、本発明者らは、効率的なshRNA発現構築物の正の選択を行うために特殊な選択マーカー遺伝子に基づく新規細胞内選択スキームを開発した（図5a）。マーカー遺伝子は、二つのヘッド−テイル結合部分からなる；第一の部分は、チミジンキナーゼとピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質をコードして（Chen, Y.T. & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000)）、後者は標的mRNAをコードする。通常、ガンシクロビル（GCV）を適用すると、チミジンキナーゼの作用による（Chen, Y.T. & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000)）GCVの毒性誘導体の細胞内蓄積によって、このマーカー遺伝子を有する細胞が殺される。標的遺伝子に関して有効なRNAi活性を有するshRNAを細胞に形質導入すると、細胞は、チミジンキナーゼ発現がサイレンシングされることによって細胞死を免れることになる。本発明者らは、標的としてGFPを用いてそのようなマーカー遺伝子を構築して、これをJurkat T細胞に導入して、ピューロマイシン選択を行った。次に、本発明者らは、GFPを標的とするshRNAiライブラリーからの混合物としてshRNA-発現レトロウイルスを作製し、マーカー遺伝子発現細胞にこれらのレトロウイルスを感染させた。感染細胞にGCVによる48時間の処置を行い、GCV耐性細胞を培養した。本発明者らは、生存細胞からのPCR増幅によってshRNA発現構築物を回収して、それらをレトロウイルス発現ベクターに再構築して、選択されたライブラリーを得た。GCV選択が実際に有効なshRNA発現構築物を濃縮したか否かを調べるために、GFPを発現するJurkat T細胞に、再構築されたライブラリーから調製したウイルス混合物を感染させた。GCV-選択ライブラリーからのレトロウイルスを形質導入した細胞におけるGFP発現は、無処置または親ライブラリーからのレトロウイルスを形質導入した細胞での発現より大きく減弱されたことがフローサイトメトリーの結果によって示された。このことは、GCV選択によってより有効なshRNA発現構築物が濃縮されたことを示している（図5b）。GCV選択による有効なshRNA発現構築物の濃縮の成功はまた、個々のクローンの分析によっても確認した。高い効率を有するshRNA発現構築物集団の顕著な増加をGCV選択ライブラリーにおいて認めた（図5c）。これらの結果は、ライブラリーから有効なshRNA発現構築物を得るために、新規細胞内選択スキームが有用であることを示している。
【００３４】
cDNAライブラリー由来RNAiライブラリー
EPRILは、単一のcDNA起源よりむしろcDNAライブラリーのようなcDNAsの複雑な混合物からshRNAiライブラリーを構築する機会を提供する。そのようなshRNAiライブラリーは、特定の細胞機能に関与する遺伝子を包括的に検索するために極めて貴重となるはずである。このため、本発明者らはそのような目的のために本技術を実現可能であるか否かを調べた。マウス骨髄前駆細胞FL5.12細胞において発現されたmRNAから調製されたcDNAライブラリーにEPRILを行って、shRNAiライブラリーを作製した。無作為に選択したクローンをシークエンシングしたところ、得られた配列240個中215個が、逆方向反復配列を含むことが判明した（表1）。これらの中で、クローン35個からの逆方向反復配列は、おそらくmRNAsのポリAテールに由来するポリAまたはTの10塩基を超える鎖からなる配列を含んだ。したがって、残りのクローン180個にBLAST検索を行った。クローン165個の配列がcDNA配列および／またはESTsにマッチした（表２）。本発明者らは、ユニジーンクラスターに従って、遺伝子転写物に由来するこれらのクローンを分類し（Build 126）、クローン165個中146個が、ユニジーンクラスターの少なくとも一つに属することを発見した。これらの中で、いくつかのクローンは、同じクラスターに対応して、これらのクローンが同じ遺伝子に由来することを示唆した。これらには、熱ショックタンパク質8、ユビキチンBおよびリボソームタンパク質L41をコードする遺伝子が含まれ、その全てが多くの臓器において高度に発現されている。ユニジーンクラスターの大きさは、相対的発現レベルのほぼ推定値であることから、クラスターの大きさを同じ遺伝子の出現回数と比較した。1個より多い反復配列を有するクラスターの大きさは、反復配列を有しないクラスターより有意に大きかった（p<0.003、マンホイトニーU-検定）。これらの特徴は、RNAiライブラリーが当初の発現プロフィールを表すことを示唆している。本発明者らはさらに、転写物の標的位置を分析した。53％がコード領域に対応し、44％が3'-非翻訳領域に対応し、そして3％が5'非翻訳領域に対応した。このように、転写物の様々な部分からshRNA発現構築物が得られた。結果は、様々な遺伝子の複雑な混合物からなるcDNAライブラリーであってもEPRILを適用できることを示している。
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【００３５】
方法
細胞培養
Jurkat T細胞は、10％仔ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地（インビトロジェン（Invitrogen））において培養した。GP293、HEK293、A7r5、およびHeLa細胞は、10％FCSを含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ（Sigma）またはインビトロジェン）において維持した。FL5.12細胞（広島大学Inaba博士の寄贈）は、10％FCSおよび1 ng/ml IL-3（和光、日本）を含むRPMI 1640（シグマ）において維持した。【００３６】
プラスミドの構築
shRNA発現レトロウイルスベクターを有するプラスミドpNAMA-U6を含む全てのプラスミドは、標準的な分子生物学技術を用いて構築した。簡単に説明すると、pSilencer1.0-U6（アンビオン（Ambion））からのPCR増幅によって得られたU6プロモーターおよびターミネーションシグナルコードDNAを、pMXレトロウイルスベクター（東京大学、Kitamura博士の寄贈）からの3' LTRを有するプラスミドのNheI部位に挿入した。プライマー対、5’-CGCGGATCCGAATGCTTTTTTTAATTCCTGCAGCCCG-3’（配列番号：１）および5’-CGCGGATCCGAAGACCCCAAACAAGGCTTTTCTCCAAG-3’（配列番号：２）を用いてプラスミドにさらにPCR増幅を行い、shRNAコードDNA断片を挿入するためのBbsI/BsmI部位を形成して、pBsk-U63-3LTRを得た。pNAMA-U6を構築するために、NheI部位でU6プロモーターを含む3' LTRを有するHindIII/SalI断片を、pBsk-U63-3LTRから切除して、pDsRed2-N1に由来するDsRed2遺伝子（クロンテック（Clontech））と共に3' LTR欠損pMXベクターを有するpda5LTR-DeRed2-M4のHindIII/SalI部位に挿入した。【００３７】
SV40プロモーターの制御下で、チミジンキナーゼ-ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ融合タンパク質（Chen, Y.T. & Bradley, A. Genesis 28, 31-35 (2000)）を発現するレトロウイルスをコードするプラスミドpMS240-PNSを、チミジンキナーゼとピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするPCR増幅断片から構築した。チミジンキナーゼとピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むDNA断片を、自己不活化レトロウイルスベクターpMS240にサブクローニングして、pMS240-PNSを産生した。pMS240-PNSは、標的遺伝子をコードするDNA断片をクローニングするためのBamHI/NotI部位を有する。GFPを標的とする有効なshRNA発現構築物を選択するために、pd2EGFP-1（クロンテック）からのGFPコード断片をその部位に挿入した。【００３８】
IP3RサイレンシングをモニターするためのレトロウイルスベクターをコードするプラスミドであるpMX-d2EGFP-IP3Rを構築するために、脱安定化GFP変種をコードするDNAをpd2EGFP-1から調製して、これをpMXに挿入した。pBS-IP3RからのIP3RをコードするDNAをd3EGFPの下流の部位に挿入した。【００３９】
EPRIL
GFPを標的とするshRNA発現構築物を作製するために、GFPをコードするBamHI/NotI DNA断片をpEGFP-1（クロンテック）から得た。IP3Rの場合、ラット1型IP3Rの全コード領域をコードする断片をpBS-IP3R1のEcoRI/NotI消化によって調製した。cDNAライブラリーに由来するshRNA発現構築物を作製するために、Super SMART PCR cDNA合成キット（クロンテック）を用いて、FL5.12細胞から調製したmRNAから二本鎖cDNAライブラリーを作製し、これをサブクローニングせずにさらなる誘導のために直接用いた。次に、これらのDNA断片を用いて以下のような6段階プロトコールに従ってEPRILを適用した：【００４０】
段階1．ランダムDNA断片の調製
DNA断片は、1 mM MgCl2、0.1 mg/ml BSA、および50 mMトリス-塩酸（pH 7.5）の存在下でDNaseIによって限定的に消化して、0.1 U/μl T4 DNAポリメラーゼ（タカラ（Takara）、日本）によって末端を修復した。DNaseI（タカラ、日本）の濃度をそれぞれの調製物について経験的に決定して、PAGE上で平均の大きさ約100〜200 bpを有する消化物を得た。【００４１】
段階2．第一のアダプターのライゲーションとMmeI切断
消化物を、T4 DNAリガーゼ（DNAライゲーションキットバージョン2、タカラ、日本）によって、ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドであるアダプター1、5’-GTCGGACAATTGCGACCCGCATGCTGCGGGTCGCAATTGTCCGAC-3’（配列番号：３）にライゲーションした。ヘアピン形状のアダプター1は、使用前に化学合成したオリゴヌクレオチドから未変性PAGEによって精製した。アダプター1の5'末端と消化したDNAの3'末端との間のニックは、1.0または1.25 U/μl T4ポリヌクレオチドキナーゼによる処理後に、0.1 mM NAD、1.2 mM EDTA、10 mM (NH4)2SO4、4 mM MgCl2、および30 mMトリス-塩酸（pH 8.0）の存在下で、0.006 U/μl大腸菌リガーゼ（タカラ、日本）によって修復した。アダプターが結合した短いDNA断片をMmeIによる切断によって生成した。生成したDNA断片は、未変性のPAGE上で〜40 bpで移動する単一のバンドとして検出された。ゲルのバンドを切除して、MmeI-切断産物をフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって得た。【００４２】
段階3．第二のアダプターのライゲーション
オリゴヌクレオチド対、5’-CAAAGAGTCTTCGGCCCTCCAGACCGTGAGTC-3’（配列番号：４）および5’-GCCGAAGACTCTTTGNN-3’（配列番号：５）をアニールさせることによって両端が断端形状のアダプター2を調製した後、PAGEを用いて精製した。後者のオリゴヌクレオチドは、「N」と呼ばれる3'末端で二つの縮重塩基を含み、これはA、C、G、またはTを表す。T4 DNAリガーゼを用いて、アダプター2を段階2からのMmeI切断DNA断片にライゲーションした。PAGEによって精製した後、アダプター2-ライゲーション断片上のニックを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラ、日本）およびT4 DNAリガーゼによる処置によって修復した。【００４３】
段階4．プライマーの伸長
次に、段階3からの産物にプライマー伸長反応を行って、プライマーオリゴヌクレオチド、5’-GACTCACGGTCTGGAGGGCCGAA-3’（配列番号：６）と共に、0.1％トライトンX-100、0.2 mM dNTPs、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、2 mM MgSO4、および20 mMトリス-塩酸（pH 8.8）を含む反応緩衝液において94℃で135秒間インキュベートした後、62℃に冷却した。次に、0.02 U/μl Bst DNAポリメラーゼ大断片（NEB）を反応混合物に加えて、プライマー伸長反応を開始した。反応は65℃で300秒間行い、4℃に冷却することによって停止させた。反応産物はPAGEによって精製した。【００４４】
段階5．プラスミドへのサブクローニング
段階4からの産物をBpmIによって消化して、クレノウ断片（タカラ、日本）によって平滑末端にした後、BbsIによって消化した。pNAMA-U6をBsmIによって消化して、同様に平滑末端にしてからBbsIによって消化した後、細菌アルカリホスファターゼ（タカラ、日本）による処置を行った。消化した断片をゲル精製して、モル比約3：1でライゲーションした。ライゲーション混合物を精製後、電気穿孔によってElectroMAX DH5a-Eコンピテント細胞（インビトロジェン）に導入した。形質転換細胞を、100 μg/mlカルベニシリンを含む500 cm2 LB寒天プレートに播種した。一晩インキュベートした後、芝状に増殖した細菌をへらで採取して、プラスミド精製キット（プラスミドMIDIキット、キアゲン（Qiagen））を用いてプラスミドDNAを調製した。【００４５】
段階6．過剰なリンカーの切断
段階5から精製されたプラスミドをBcgIによって消化して、T4 DNAポリメラーゼによって平滑末端にして、自己ライゲーションによって再度環状化した。この処置によって、アダプター1からの配列のほとんどが除去されるが、短いリンカー配列、5’-TTGTCCGAC-3’（配列番号：７）は保持される。不完全に消化されたプラスミドの混入を可能な限り消失させるために、その認識配列がアダプター1からの配列のBcgI切除部分に存在するMfeIによってDNAを消化した。ElectroMAX DH5a-Eコンピテント細胞を、再環状化したプラスミドによって形質転換して、100 μg/mlカルベニシリンを含むLB-寒天プレート上で選択した。プレート上で一晩培養した後、プラスミドライブラリーのストックを得た。【００４６】
ゲノムからのshRNA発現構築物の回収
shRNA発現構築物を、形質導入したFL5.12細胞から調製したゲノムDNA 100 ngからPCR増幅によって回収した。PCRのために、Vent DNAポリメラーゼ（NEB）を、プライマー対、5’-GTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACC-3’（配列番号：８）および5’-GGCGTTACTTAAGCTAGCGATCCGACGCCGCCATC-3’（配列番号：９）と共に用いた。PCR増幅DNAをNotIおよびAflIIによって消化して、pBsk-3LTRにサブクローニングした。形質転換および精製後、回収されたshRNA発現構築物を含む3' LTRをコードするDNAをHindIIIおよびNotIによって切除して、pda5LTR-DsRed2-M4にサブクローニングした。得られたプラスミドは、pNAMA-U6と構造的に同じであり、回収されたshRNA発現構築物を有するレトロウイルスを産生するためにパッケージングを行うことができる。【００４７】
インビトロでのshRNAの調製
shRNAsはT7プロモーターに基づくインビトロ転写を用いることによって合成した。インビトロ転写のための鋳型を調製するために、二つの化学合成オリゴヌクレオチド、T7プロモーターコードオリゴヌクレオチド、5’-taatacgactcactataG-3’（配列番号：１０）およびshRNAコードオリゴヌクレオチド5’-AAAAN20-21GTCGGACAAN’20-21ctatagtgagtcgtatta-3’（配列番号：１１、N20-21およびN'20-21は、shRNAの基本構造に対応する配列を示し、小文字は、T7-プロモーターコードオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを示す）を、94℃で135秒間インキュベートした後、45℃で30秒間アニールした。次に、アニールしたオリゴヌクレオチドを、Bst DNAポリメラーゼ大断片（0.08 U/μl）を用いて、50℃で600秒間の伸長反応によって二本鎖DNA鋳型に変換した。shRNAは、CUGA7インビトロ転写キット（ニッポンジーン、日本）を用いて、製造元のプロトコールに従って精製鋳型から作製した。転写されたshRNAをゲル濾過スピンカラム（マイクロスピンG-25、アマシャム・バイオサイエンシズ（Amersham Bioeciences））を用いて精製した。ダイサー消化shRNAを作製する場合、shRNAを組換え型ヒトダイサー（ジーンセラピーシステムズ（Gene Therapy Systems））によって製造元のプロトコールに従って処理した。【００４８】
異なるshRNAコードオリゴヌクレオチドのN20-21配列は、
TCTCGGCATGGACGAGCTGT (shGFP1)（配列番号：１２）
CTTCACCTCGGCGCGGGTCT (shGFP5)（配列番号：１３）
CTACAAGACCCGCGCCGAGG (shGFP7)（配列番号：１４）
CCCCATCGGCGACGGCCCCGT (shGFP10)（配列番号：１５）
AGATCCGCCACAACATCGAGG (shGFP12)（配列番号：１６）
TCAGCTCGATGCGGTTCACC (shGFP13)（配列番号：１７）
CCACAAGTTCAGCGTGTCCGG (shGFP14)（配列番号：１８）
CTTCAAGTCCGCCATGCCCGA (shGFP17)（配列番号：１９）
TGCTGGTAGTGGTCGGCGAGC (shGFP18)（配列番号：２０）
TCGGCGCGGGTCTTGTAGTTG (shGFP19)（配列番号：２１）および
TTGTAGTTGCCGTCGTCCTT (shGFP20)（配列番号：２２）であった。
N'20-21配列は、N20-21配列と相補的であった。【００４９】
レトロウイルス産生と形質導入
ハイスループットスクリーニングの場合、shRNA発現構築物を有するレトロウイルスの作製および形質導入は、96ウェルプレートフォーマットで行った。プラスミドは、QIAウェル96ウルトラプラスミドキット（キアゲン）を用いて、製造元のプロトコールに従って96ウェルプレートのフォーマットで調製した。GP293パッケージング細胞株（クロンテック）に、レトロウイルスベクタープラスミド〜200 ngおよびVSG-Gコードプラスミド17 ngを、96ウェルプレートにおいてそれぞれのウェルに関してリポフェクタミン2000（インビトロジェン）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、レトロウイルスを含む培養培地を得た。レトロウイルス形質導入は、レトロウイルス粒子を含む培地50 μlをJurkat T細胞浮遊液（1.0×105個/ml）50 μlに加えることによって行った。中等度の規模でレトロウイルスを作製する場合、DNAをプラスミドMIDIキットによって精製して、レトロウイルスベクタープラスミド24 μgおよびVSG-Gコードプラスミド2 μgによるトランスフェクションによって、10 cm培養皿において増殖させたGP293においてレトロウイルスパッケージングを行った。必要であれば、レトロウイルス粒子を、一晩遠心することによって濃縮した後、適当な培養培地に再浮遊させた。【００５０】
フローサイトメトリーとRNAi効率の評価
相対的GFP発現レベルは、FACスキャンフローサイトメーター（BD）を用いて分析した蛍光強度に基づいて推定した。GFP蛍光の減少倍数（shRNA形質導入を行った細胞の蛍光強度で除した対照蛍光強度）を、RNAi効率の測定値として用いた。レトロウイルス力価の変動によるRNAi効率のバッチ毎の差を補正するために、一連の内部対照shRNA発現構築物をそれぞれの96ウェルプレートに含めた。【００５１】
ウェスタンブロット分析
A7r5細胞にshRNA発現構築物を有するレトロウイルスを感染させた。4日後、細胞をトリプシン処理によって回収して、可溶化し、SDS-PAGEを行った。SDS-PAGE産物をPVDFメンブレンに転写した後、IP3Rに対応するタンパク質を、一次抗体および二次抗体としてそれぞれ、ウサギIgG抗1型IP3R（アロモン（Alomone））およびHRP結合抗ウサギIgG（MBL、日本）によってプロービングして、化学発光によって検出した。イムノブロットシグナル強度の定量は、IPLabスペクトルソフトウェアを用いて行った（スキャンアナリティクスインク（Scananalytics, Inc））。IP3Rシグナルは、抗アクチン抗体（サンタクルズ（Santa cruz））を用いてプロービングしたアクチンのイムノブロットシグナルによって標準化した。【００５２】
細胞内カルシウム測定
細胞内カルシウムを測定するために、カバーグラスに播種したA7r5細胞をshRNA発現レトロウイルスに感染させて、感染4日後にCa2+指標物質Fura-2をローディングした。細胞内Ca2+濃度の変化は、既に記述されているように（Hirose, K. et al. Science 284, 1527-1530 (1999)）、CCDカメラ（フォトメトリクス（Photometrics））を備えた倒立顕微鏡において比測定による蛍光測定によって評価した。L型Ca2+チャンネル阻害剤であるニカルジピン（10 μM）の存在下で1 nMアルギニンバソプレッシン（AVP）を加えることによって細胞を刺激した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
上記の通り、本発明者らは、shRNA発現ライブラリーをcDNA鋳型から酵素的に誘導することができる技術「EPRIL」を確立した。本発明を単一のcDNA源に適用すると、ライブラリーは、ｃDNA上の様々な領域に対する候補shRNA発現構築物の膨大なアレイを提供し得る。EPRILをハイスループットスクリーニングおよび細胞内選択スキームと組み合わせると、あらゆる遺伝子に関して最善のshRNA発現構築物の大きいコレクションを作製するための一般化し得るプラットフォームを提供する。そのようなコレクションは一般的に、哺乳類におけるRNAiに基づくハイスループットリバース遺伝学に大きく貢献するであろう。【００５４】
本発明者らは、効率的なRNAiの配列選択性を同定しようと試みた。本発明者らは、ガイド配列の5'末端から4番目のヌクレオチドでUを有するshRNA発現構築物がGFPおよびIP3Rにとって有効である、という弱いが一般的傾向を認めたが、他の位置に対する選択性は必ずしも一貫しなかった。例えば、第二のヌクレオチドでのGはIP3Rにとっては好ましい傾向が見られたが、GFPではそのような傾向は認められなかった。明らかに、全般的な配列選択性を決定するために様々な遺伝子からより多くのデータが必要である。EPRILはそのような研究を大きく促進するであろう。【００５５】
EPRILによって、cDNAsの複雑な混合物からなるcDNAライブラリーから大きいshRNAiライブラリーを作製することができる。本発明者らは、ライブラリーが、独立したcDNA由来shRNA発現構築物3×105〜4×106個を含むと推定した。したがって、本発明の方法によって、絶対的な表現型の基準、例えば、細胞形態学、接着、細胞死、重要な分子の発現レベルおよび他の機能的指標に基づく選択によって遺伝子を同定することができるRNAiに基づくフォワード遺伝学を行うことができるであろう。shRNA配列は、ランダム配列を有する20および21-塩基の長さのタグを完全にマッチさせることができる（Saha, S. et al. Nat. Biotechnol. 20, 508-512 (2002)）確率9.1×10-13および2.3×10-13が、マウスまたはヒトゲノムのサイズ〜3×109 bpを考慮すると十分に小さいことから、遺伝子同定のための信頼できるタグとして役立ちうる。【００５６】
本発明のRNAiライブラリーを用いたフォワード遺伝学を動物レベルに適用してもよい。レンチウイルス媒介形質導入によって、shRNA発現構築物を有するマウスを作製できることから（Rubinson, D.A. et al. Nat. Genet. 33, 401-406 (2003)）、本発明者らは、異なる遺伝子を標的とするshRNA発現構築物によって変異動物の膨大なアレイを効率よく作製することができる。表現型に基づいて系統的にスクリーニングすると、特定の表現型に関与する遺伝子を容易に同定することができる。この特徴は、エチルニトロソウレア（ENU）を用いてマウスにおいて進行中の大規模な変異誘発プロジェクトの特徴とは対照的である（Kile, B.T. et al. Nature 425, 81-86 (2003)）。ENU-変異誘発は変異体動物を効率よく作製するが、座を決定するまでに単調で退屈なプロセスを要する。さらに、shRNA発現構築物のRNAi効率の変動によって、遺伝子サイレンシングの程度の変動により独自の表現型が発見される可能性がある。このように、EPRILは、哺乳類におけるフォワード遺伝学の新しいスタイルを提供し、RNAiに基づくリバース遺伝学におけるその役割と共に、全ゲノムレベルでの遺伝子と機能との関係の解明に大きく貢献するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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